(Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
SECRETARIA DE SALUD 
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM- 186-SSA1/SCFI-2012, Cacao, chocolate y productos 
similares, y derivados del cacao. Especificaciones sanitarias. Denominación comercial. Métodos de prueba. 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretaría de Salud. 
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario y CHRISTIAN TUREGANO ROLDAN, Director General de No rmas de la Secretaría de Economía y Presidente 
del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Seguridad al Usuario, Información Comercial y Prácticas de Comercio, con fundamento en los artículos 34 y 39, de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4, de la Ley Federal de Proced imiento Administrativo; 3, fracción XXII, 17 Bis, 17 Bis 2, 194, fracción 
I, 195, 197, 199, 201, 205, 21 0, 212, 213, 214, 215, fracci ón I y 216, de la Ley General de Salud; 3,  fracción 
XI, 38, fracción II, 39, fracción V, 40, fracciones I, V, XI y XII, 41, 43, 44,  45, 47, fracción I, 51 y 52, de la Ley 
Federal sobre Metrología y Normalización; 28, 31, 32,  33, 34 y 39, del Reglamento de la Ley Federal sobre 
Metrología y Normalización; 1, fracción  IX, 4, 8, 14, 15, 25, 40, 124, 1 25, fracciones I y II, 126 y 163, del 
Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicio s; 2, apartado C, fracción X, del Reglamento Interior 
de la Secretaría de Salud; 3, fraccion es I, inciso c y II, 10 fracciones IV y VIII, del Reglamento de la Comisión 
Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios, 21,  fracciones I, IX, X, XV y XXI, del Reglamento Interior 
de la Secretaría de Economía, hemos tenido a bien ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación del Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NO M-186-SSA1/SCFI-2012, Cac ao, chocolate y productos 
similares, y derivados del cacao. Especificaciones S anitarias. Denominación Comercial. Métodos de Prueba. 
El presente Proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los siguientes 60 días 
naturales, contados a partir de la fecha de su publicac ión, presenten sus comentar ios por escrito en idioma 
español y con el sustento técnico suficiente ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, ubicado en Oklahoma  número 14, colonia Nápoles, Delegación Benito 
Juárez, código postal 03810, México, Distrito Federal, teléfono 5080 5200, extensión 1333, fax 5511 1499, 
correo electrónico rfs@cofepris.gob.mx y/o ante el Comi té Consultivo Nacional de Normalización de Seguridad 
al Usuario, Información Comercial y Prácticas de Comercio, ubicado en avenida Puente de Tecamachalco número 6, colonia Lomas de Tecamachalco, Sección Fuentes, Naucalpan de Juárez, código postal 53950, Estado de México, teléfono 57 29 93 00, extensión 43222, fax 55 20 97 15, página de Internet 
http://www.economia.gob.mx/?P=85. 
Durante el plazo mencionado, los documentos que sirvieron de base para la elaboración del proyecto, así 
como la Manifestación de Impacto Regulatorio (MIR), estarán a disposición del público para su consulta en el 
domicilio de los Comités. 
PREFACIO 
En la elaboración de la presente norma partici paron los siguientes organismos e instituciones: 
SECRETARIA DE SALUD. Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios. 
SECRETARIA DE ECONOMIA. 
Dirección General de Normas. 
ASOCIACION NACIONAL DE FABRICANTES DE  CHOCOLATES, DULCES Y SIMILARES A.C, 
(ASCHOCO). 
INDICE 
1. Objetivo y campo de aplicación 
2. Referencias 
3. Definiciones 
4. Símbolos y abreviaturas 
5. Clasificación 
6. Especificaciones sanitarias 
7. Muestreo 
8. Métodos de prueba 
9. Etiquetado Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
10. Envase y embalaje 
11. Concordancia con normas internacionales y mexicanas 
12. Bibliografía 
13. Observancia de la Norma 
14. Vigencia 
15. Apéndice informativo A. Contaminantes 
16. Apéndice normativo A. Métodos de Prueba 
1. Objetivo y campo de aplicación 1.1 Esta Norma, tiene por objeto establecer las especificaciones sanitarias y comerciales  que debe cumplir 
el cacao, el chocolate, los productos similares y los derivados del cacao. Asimismo, establece la 
denominación genérica y específica de dichos productos. 
1.2 Esta Norma es de observancia obligatoria para las personas físicas o morales que se dedican al 
proceso o importación de los productos objeto de la misma, que serán comercializados en el territorio 
nacional. 
2. Referencias Esta Norma se complementa con las siguientes Norma s Oficiales Mexicanas o las que las sustituyan: 
2.1 Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFI-2002, Sistema General de Unidades de Medida. 
2.2 Norma Oficial Mexicana  NOM-051-SCFI/SSA1-2010, Especificac iones generales de etiquetado para 
alimentos y bebidas no alcohólicas preenv asados-Información comercial y sanitaria. 
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM-086-SSA1-1994, Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales. 
2.4 Norma Oficial Mexicana  NOM-127-SSA1-1994, Salud ambiental, agua para uso y consumo humano- 
Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización. 
2.5 Norma Oficial Mexicana  NOM-243-SSA1-2010, Productos y servicio s. Leche, fórmula láctea, producto 
lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba. 
2.6 Norma Oficial Mexicana  NOM-251-SSA1-2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplementos alimenticios. 
3. Definiciones 3.1 Aditivos para alimentos,  a cualquier sustancia que en cuanto tal no se consume normalmente como 
alimento, ni tampoco se usa como ingrediente básico en alimentos, tenga o no valor nutritivo, y cuya adición al 
alimento con fines tecnológicos (incluidos los orga nolépticos) en sus fases de producción, elaboración, 
preparación, tratamiento,  envasado, empaquetado, transporte o almacenamiento,  resulte o pueda preverse 
razonablemente que resulte (directa o indirectament e) por sí o sus subproductos, en un componente del 
alimento o un elemento que afecte a sus caracterís ticas. Esta definición no incluye "contaminantes" o 
sustancias añadidas al alimento para mantener  o mejorar las cualidades nutricionales. 
3.2 Azúcares, a los monosacáridos y disacáridos presentes en un alimento o bebida no alcohólica. 
3.3 Cacao,  a la semilla  extraída de las mazorcas maduras de los árboles de la especie Theobroma cacao , 
de la familia de las esterculáceas, fermentado o no y secado. 
3.4 Cocoa (cacao en polvo), al producto que se obtiene a partir de la torta de cacao transformada en 
polvo. 
3.5 Chocolate,  al producto obtenido por la mezcla homogénea de cantidades variables de pasta de cacao, 
o manteca de cacao, o cocoa con az úcares u otros edulcorantes, ingr edientes opcionales y aditivos para 
alimentos, siempre que cumpla con las especificaciones de esta norma. 
3.6 Consumidor, a la persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados. 
3.7 Derivado del cacao,  a los productos obtenidos del cacao en grano descascarillado, tales como: pasta 
de cacao, torta de cacao, manteca de cacao, cocoa y mezclas de estos productos con azúcares y/o 
ingredientes opcionales.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
3.8 Embalaje,  al material que envuelve, contiene y prote ge los productos preenvasados para efectos de 
su almacenamiento y transporte. 
3.9 Envase, a cualquier recipiente, o envoltura en el cual es tá contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor. 
3.10 Etiqueta, a cualquier rótulo, marbete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepues ta o fijada al envase del 
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje. 
3.11 Grasa butírica, a la grasa que se obtiene de la leche, la cual se caracteriza por contener ácidos 
grasos saturados, incluyendo el ácido butírico. 
3.12 Inocuo,  a lo que no hace o causa daño a la salud. 
3.13 Ingredientes opcionales,  a lo que se pueden adicionar al producto, tales como: leche o sólidos de 
leche, semillas, especias, licores, ent re otros, permitidos por la normatividad aplicable sin rebasar el límite 
máximo establecido. 
3.14 Límite máximo, a la cantidad establecida de aditivos, mi croorganismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, metales pesados y metaloides, entre otros, que no se debe exceder en un alimento, bebida o 
materia prima. 
3.15 Manteca de cacao, al producto semisólido, de aspecto gr aso a temperatura ambiente, de color 
blanco o ligeramente amarillento, obtenido por el procesamiento de las semillas del árbol Theobroma cacao , 
que se obtiene por extracción mecánica o por solventes. 
3.16 Materia extraña, a cualquier sustancia, resto, desecho o ma terial, que se presenta en el producto 
pero que no forma parte de la composición normal de éste. 
3.17 Metal pesado y metaloide,  a los elementos químicos que causan efectos indeseables en el 
metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxicidad depende de las dosis en que se ingieran, así como 
de su acumulación en el organismo. 
3.18 Métodos de prueba, al procedimiento técnico utilizado para la determinación de parámetros o 
características de un producto, proceso o servicio.  
3.19 Pasta de cacao o licor de cacao,  al producto que se obtiene de la molienda del cacao fermentado o 
no, tostado, descascarillado y sin eliminar o agregar  ninguno de sus constituyentes, que puede tratarse 
químicamente. 
3.20 Plaguicida, a la sustancia o mezcla de sustancias que se destina a controlar cualquier plaga, 
incluidos los vectores que transmiten las enfermedades humanas y de animales, las especies no deseadas 
que causen perjuicio o que interfieran en el proceso de los productos. 
3.21 Prácticas de Higiene,  a las medidas necesarias para garantizar la inocuidad de los productos. 
3.22 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obt ención, elaboración, fabr icación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, enva sado, manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público de productos. 
3.23 Productos similares,  a los productos elaborados a partir de cacao en los que para su elaboración se 
ha sustituido total o parcialmente la manteca de caca o por otras grasas vegetales comestibles o sus 
fracciones, hidrogenadas o no y son elaborados bajo formatos o moldeados especiales y que por su 
presentación, aspecto, sabor o consumo son susc eptibles a ser confundidos con el chocolate. 
3.24 Productos lácteos,  a los productos obtenidos a partir de la leche o sus componentes y otros 
ingredientes funcionalmente necesarios para su elabor ación, incluidos los productos con grasa vegetal. 
3.25 Producto preenvasado,  al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, 
no se encuentra presente el consumidor y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada, a 
menos que el envase sea abierto o modificado perceptiblemente. 
3.26 Sólidos lácteos o sólidos de la leche, a los componentes propios de la leche como: suero de 
mantequilla, suero de queso, suero de  leche, concentrado de proteína de le che, proteína de suero o lactosa. 
3.27 Sólidos Totales de Cacao,  a la suma total de pasta y manteca de cacao presente en el producto 
terminado.  
3.28 Torta de cacao, al producto que se obtiene por presión de la pasta de cacao, después de la 
extracción parcial de la manteca de cacao. 
4. Símbolos y abreviaturas Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por: Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
BPF. buenas prácticas de fabricación. 
cm. Centímetro. 
º grado. 
ºC. grado Celsius. g. gramo. 
Kg. kilogramo. 
Kcal. kilocaloría. kJ. kilojoule. 
L. litro. 
mL. mililitro. µL. microlitro. 
µg. microgramo. 
m. masa. mg. miligramo. 
mm. milímetro. 
min. minuto. ≤ menor o igual a. 
m/m. masa en masa. 
≥ mayor o igual a. 
/ por. 
%  por ciento. 
POP Triglicérido de cadena estructurada de la siguiente forma: ácido palmítico-ácido oleico-ácido 
palmítico. 
POSt Triglicérido de cadena estructurada de la siguiente forma: ácido palmítico-ácido oleico-ácido 
esteárico. 
StOSt Triglicérido de cadena estructurada de la si guiente forma: ácido esteárico-ácido oleico-ácido 
esteárico. 
UFC unidades formadoras de colonias. Cuando en la presente Norma se mencione: - Acuerdo , debe entenderse que se trata del Acuerdo por el que se determinan los aditivos y 
coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias. 
- CICOPLAFEST , debe entenderse que se trata de la Comisión Intersecretarial para el Control del Proceso 
y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tóxicas. 
- Secretaría,  debe entenderse que se trata de la Secretaría de Salud. 
5. Clasificación 
Los productos objeto de esta Norma se clasifican en: 5.1 Cacao. 
5.2 Chocolate y Productos similares. 
5.3 Derivados del cacao. 
6. Especificaciones sanitarias 
Los productos objeto de esta Norma, deben ajustarse según corresponda a las siguientes especificaciones: 
6.1 El responsable de la obtención de los productos objeto de esta Norma, así como el comercializador, 
cada uno en el ámbito de su responsabilidad, deben observar que las sustancias empleadas para la eliminación de plagas en cualquier parte del proceso,  cumplan con las especificaciones establecidas en el 
Catálogo Oficial de Plaguicidas vigente, emitido por CICOPLAFEST.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
6.2 En el proceso de los productos objeto de esta norma, se deben aplicar las prácticas de higiene 
establecidas en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.6 del apartado de Referencias.  
6.3 El agua que se emplee en el proceso de los productos objeto de esta Norma, debe cumplir con lo 
establecido en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.4 del apartado de Referencias. 
6.4 Las materias primas utilizadas para la elaborac ión de los productos objeto de esta norma, deben 
ajustarse a la normativa vigente. 
6.5 Los productos objeto de esta Norma, que hayan sido modificados en su composición, deben sujetarse 
a lo establecido en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.3 del apartado de Referencias. 
6.6 Para la elaboración de los productos objeto de esta norma, se debe asegurar un secado completo de 
la superficie de equipo después de la limpieza del mismo y antes de iniciar operaciones. 
6.7 Los aditivos permitidos para los productos objeto de esta norma son los establecidos en el Acuerdo y 
sus modificaciones. 
6.8 Contaminantes. 
6.8.1 Los productos objeto de esta norma no deben contener más de 15 µg/kg de aflatoxinas, con 
excepción de los productos adicionados con semillas y/ o cereales, cuyo límite máximo será de 20 µg/kg. 
6.8.2 El productor o fabricante de los productos objet o de esta norma, debe establecer mecanismos de 
control que permitan determinar la presencia y cantidad  de metales pesados y metaloides en las materias 
primas, en el producto en proceso de elaboración o en el producto terminado. La información generada debe 
estar a disposición de la Secretaría cuando ésta así lo requiera. 
En el Apéndice Informativo A se señalan los metales específicos y los niveles de referencia correspondiente. 6.9 Grasas añadidas. 
6.9.1 En la elaboración de chocolate se permite el us o de grasas vegetales distintas a la manteca de 
cacao, siempre que cumplan con los siguientes criterios: 
6.9.1.1 Que sean grasas vegetales no láuricas ricas en triglicéridos monoinsaturados simétricos del tipo 
POP, POSt y StOSt. 
6.9.1.2  Que sean miscibles en cualquier proporción con manteca de cacao y que sean compatibles con 
sus propiedades físicas (punto de fusión, temperatura de cristalización, velocidad de fusión y necesidad de 
una fase de temperado). 
6.9.1.3  Que se hayan obtenido mediante tratamientos de refinado o de fraccionamiento; la modificación 
enzimática de la estructura del triglicérido queda excluida. 
6.9.2 Las grasas de origen vegetal que se  pueden utilizar para la elaborac ión de chocolates son las que se 
enlistan a continuación siempre que cumplan con los criterios señalados en 6.9.1. 
Denominación usual de las grasas  vegetales Deno minación científica de las plantas de las que 
pueden obtenerse dichas grasas 
1. Illipe, sebo de Borneo o Tengkawang. 
2. Aceite de palma. 3. Sal. 4. Shea. 5. Kokum gurgi. 6. Hueso de mango. Shorea ssp. 
Elaeis guineensis, Elaeis olifera. Shorea robusta. Butyrospermum parkii. Garcinia indica. Mangifera indica.  
 
6.9.3  Para los productos similares la sustitución de la manteca de cacao sólo podrá hacerse con grasas 
vegetales comestibles. 
6.9.4  No obstante, lo establecido en los numerales ant eriores, se podrá utilizar grasa proveniente de la 
leche, que se considerará como sólidos totales de leche para efectos de la Tabla 4. 
6.9.5 El contenido de ácidos grasos trans en los pr oductos objeto de esta norma no deberá ser mayor a 
5% del total de la grasa del producto. 
6.10 Los productos objeto de esta norma, debe cump lir con las siguientes especificaciones:  
6.10.1 Microbiológicas. 
Tabla 1. Especificaciones microbiológicas Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Determinación Cacao tostado Chocolate  sus variedades 
y productos similares Derivados del 
cacao 
 Límite máximo  
Coliformes totales UFC/g <10 <10 <10 
Salmonella spp  en 25g Ausente Ausente Ausente 
Mohos UFC/g <50 - - 
Levaduras UFC/g <50 - -  
6.10.2 Materia extraña. 
Tabla 2. Especificaciones materia extraña 
Materia Extraña Cacao 
tostado Chocolate  sus variedades y 
productos similares Derivados del 
cacao 
Límite máximo 
Madera, tallos, restos de 
mazorca, piedras y fibras 0.5% - - 
Insectos o sus fragmentos - 60 fr agmentos de insectos en promedio 
por 100g cuando se examinan 6 
submuestras de 100g ó 90 fragmentos 
de insectos en cualquier submuestra. 75 fragmentos de 
insectos y exento de 
insectos completos. 
Pelos de roedor - Un pelo de roedor en promedio por 
100g cuando se examinan 6 
submuestras de 100g ó 3 pelos de 
roedor en cualquier submuestra. 2 
Excretas de roedor 22 mg/kg Negativo. Negativo. 
 
6.11 El cacao no debe tener más de 7.5% de humedad. 
6.12 En la elaboración de chocolates rellenos  se permite el empleo de alcohol etílico anhidro. 
6.13 Los derivados del cacao deben cumplir c on las siguientes especificaciones: 
Tabla 3. Especificaci ones físicas y químicas 
Producto Acidez máxima (% como ácido 
oleico) Humedad máxima (% m/m) 
Manteca de cacao  2.0 ----------  
Pasta de cacao  2.0 ----------  
Mezclas de cocoa y azúcar, 
chocolate en polvo  ---------  7.0 
 
7. Muestreo 7.1 El procedimiento de muestreo para los productos, objeto de esta Norma, debe sujetarse a lo que 
establece la Ley General de Salud y las disposiciones jurídicas aplicables. 
8. Métodos de prueba 8.1 Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta Norma, se 
deben aplicar los métodos que se señalan en el Apéndice Normativo A.  
9. Etiquetado 
Las etiquetas de los productos objeto de esta norma, deben cumplir con las disposiciones generales de 
etiquetado establecidas en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.2 del apartado de Referencias, 
así como las siguientes disposiciones particulares:  
9.1 Información sanitaria.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Las etiquetas de los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el 
Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios, deben cumplir con lo siguiente: 
9.1.1 Cuando se trate de productos con modificaciones  en su composición, deben ostentar en la 
denominación los términos establecidos en la Norma Oficial Mexicana. Dichos términos deben figurar en la misma superficie, a renglón seguido con el mismo tipo, color y tamaño de letra. 
9.1.2 Cuando se trate de productos en polvo, deshi dratados, concentrados o condensados, destinados a 
ser reconstituidos, pueden presentar los ingredientes por orden cuantitativo decrec iente (m/m) en el producto 
reconstituido, siempre que se incluya una indicación como  la que sigue: "ingredientes del producto cuando se 
prepara según las instrucciones de la etiqueta." 
9.1.3 Los productos objeto de esta norma que contengan alcohol etílico o bebidas alcohólicas en 
cantidades superiores al 0,5%, deben incluir en la superfici e principal de exhibición de la etiqueta, la siguiente 
leyenda: "Este producto contiene __ ____% de alcohol. No recomendable para niños". (En el espacio en 
blanco citar el contenido de alcohol en %). 
9.1.4 En caso de contener una cantidad mayor al 10% de polioles, se deberá ostent ar la siguiente leyenda 
precautoria: Un consumo excesivo de ______ puede te ner efectos laxantes. (En el espacio en blanco deberá 
citarse la denominación específica del poliol empleado).  
9.1.5 En el caso de que los productos objeto de esta Norma contengan o incluyan productos alimenticios 
preenvasados como parte de promociones u obsequios , el envase de este último debe cumplir con las 
especificaciones de etiq uetado correspondientes. 
9.2 Información Comercial. 
9.2.1  Denominación comercial y factores esenciales de composición. 
9.2.1.1 Cobertura de chocolate, al producto homogéneo que cumple con las características del tipo de 
chocolate del que proviene de acuerdo a su formulación y características físicas, y que debe cumplir con los 
mínimos previstos en la Tabla 4. 
9.2.1.2 Chocolate amargo y semiamargo, a los productos homogéneos elaborados a partir de la mezcla de 
dos o más de los siguientes ingredientes: pasta de cac ao, manteca de cacao, coc oa, adicionado de azúcares 
u otros edulcorantes, así como de otros ingredientes opc ionales, tales como productos lácteos y aditivos para 
alimentos, y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4. 
9.2.1.3  Chocolate blanco, al producto homogéneo elabor ado a partir de manteca de cacao, productos 
lácteos, azúcares u otros edulcorant es, aromatizantes e ingredientes opcionales, que cumple con los mínimos 
previstos en la Tabla 4. 
9.2.1.4 Chocolate con leche, al producto homogéneo elaborado a partir de la mezcla de dos o más de los 
siguientes ingredientes: pasta de cacao, manteca de  cacao, cocoa, adicionado de azúcares u otros 
edulcorantes, extracto seco de leche referido a la adición de ingredientes lácteos en sus proporciones 
naturales, salvo que la grasa de leche podrá agregar se o eliminarse, así como de otros ingredientes 
opcionales y aditivos para alimentos y que debe cu mplir con los mínimos previstos en la Tabla 4. 
9.2.1.5 Chocolate en polvo, al producto homogéneo elabora do de la mezcla de cocoa, azúcares y otros 
ingredientes opcionales, y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4. 
9.2.1.6 Chocolate para mesa, al producto homogéneo elabor ado a partir de la pasta de cacao, azúcar sin 
refinar con un tamaño de partícula mayor de 70 micras con la adición de ingredientes opcionales y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4. 
9.2.1.7 Chocolate para mesa amargo o semiamargo, al producto homogéneo elaborado a partir de la pasta 
de cacao, azúcar sin refinar con un tamaño de partícul a mayor de 70 micras con la adición de ingredientes 
opcionales y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4. 
9.2.2  La etiqueta de los productos objeto de esta Norm a, además de cumplir con lo establecido en los 
puntos anteriores, debe sujetarse a lo siguiente: 
9.2.2.1 Deberá ostentar la denominación genérica y específica de conformidad con la Tabla 4. 
Tabla 4. Composición % m/m en base seca 
Producto Manteca 
de cacao 
total Cocoa 
desgrasada 
totalmente Sólidos 
totales de 
cacao Grasa 
butírica 
total Sólidos 
totales 
de leche Sólidos 
totales 
de cacao Grasa 
vegetal 
diferente a 
la manteca Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
y leche de cacao* 
Chocolate ≥ 18.0 ≥ 14.0 ≥ 35.0    ≤ 5.0 
Chocolate amargo  ≥ 22.0 ≥ 18.0 ≥ 40.0    ≤ 5.0 
Chocolate semiamargo ≥ 15.6 ≥ 14.0 ≥ 30.0    ≤ 5.0 
Chocolate con leche ≥ 20.0 ≥ 2.5 ≥ 25.0 ≥ 2.5 ≥ 14.0 ≥ 40.0 ≤ 5.0 
Chocolate con alto 
contenido de leche ≥ 17.0 ≥ 2.5 ≥ 20.0 ≥ 5.0 ≥ 20.0 ≥ 40.0 ≤ 5.0 
Chocolate con leche 
descremada ≥ 20.0 ≥ 2.5 ≥ 20.0 ≤ 0.5 ≥ 14.0 ≥ 40.0 ≤ 5.0 
Chocolate blanco ≥ 20.0  ≥ 20.0 ≥ 3.5 ≥ 14.0 ≥ 34.0 ≤ 5.0 
Chocolate para mesa ≥ 11.0 ≥ 9.0 ≥ 20.0    ≤ 5.0 
Chocolate para mesa 
semiamargo ≥ 15.6 ≥ 14.0 ≥ 30.0    ≤ 5.0 
Chocolate para mesa 
amargo  ≥ 22.0 ≥ 18.0 ≥ 40.0    ≤ 5.0 
Chocolate en polvo ≥ 1.8  ≥ 18.0    ≤ 5.0 
*La adición de grasas vegetales distin tas a la manteca de cacao, no debe exceder del 5% de la masa del producto 
terminado, después de deducir el peso total de cualquier otro producto alimenticio comestible añadido al chocolate y sin 
reducir el contenido mínimo de las materias de cacao. 
9.2.2.2  Los productos similares podrán utilizar el término chocolate siempre y cuando se anteponga el 
texto: "Sabor a", usando la misma tipografía, tamaño y color que la de la denominación. 
9.2.2.3 Cuando en la elaboración de los productos objeto de esta Norma, se utilice grasa diferente a la 
manteca de cacao se deberá declarar como grasa vegetal. 
9.2.2.4  Los productos objeto de esta Norma, podrán ser adicionados con frutas en conserva, cereales, 
semillas oleaginosas, las cuales deberán estar limpias y sanas, en cantidad no menor de 8% para que dichas 
características puedan ostentarse en la etiqueta, sin embargo no podrán exceder el 60% del peso total del 
producto. 
10. Envase y embalaje 
10.1 Los productos objeto de esta Norma se deben env asar en recipientes elaborados con materiales 
inocuos y resistentes a distintas et apas del proceso, de tal manera que no reaccionen con el producto o 
alteren las características fís icas, químicas y sensoriales. 
10.2 Se debe usar material resistente que ofrezca la protección adecuada a los envases para impedir su 
deterioro, a la vez que faciliten su mani pulación, almacenamiento y distribución. 
11. Concordancia con normas internacionales y mexicanas Esta Norma es parcialmente equivalente a las siguientes normas: 11.1 Norma de Codex para el cacao en pasta (licor de ca cao/chocolate) y torta de  cacao. Codex Stan 141-
1983 Rev. 1-2001.  
11.2 Norma del Codex para el cacao en polvo (cacaos) y mezclas de cacao y azúcar. Codex Stan 105-
1981 Rev. 1-2001, Enmienda 1, 2010. 
11.3 Norma del Codex para el chocolate.  Codex Stan 87-1981 Rev. 1-2003. 
11.4 Norma del Codex para la manteca de cac ao. Codex Stan 86-1981 Rev. 1-2001. 
12. Bibliografía 12.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
12.2 Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización. 
12.3 Ley General de Salud. 
12.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
12.5 Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos 
alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias.  
12.6 AOAC International. Official Meth ods of Analysis. 2006. 18th Ed., 1s t Rev. (Chapter 31: Cacao bean 
and its products). 
12.7 Comisión del Codex Alimentarius. 2001. Informe de la 18a. reunión del Comité del Codex sobre 
productos del cacao y el chocolate. 
12.8 Directiva 200/36/CE del Parlamento Europeo y del Consejo del 23 de junio de 2000. 
12.9 Fernández, E.E. Microbiología sanitaria, agua y a limentos. Universidad de Guadalajara, México. 
12.10 Frazier, W.C. y Westhoff, D.C. Microbiol ogía de los alimentos. Zaragoza, España. 
12.11 ICMSF. Ecología microbiana de los alimentos. Zaragoza, España. 
12.12 Jay, M. J. Microbiología moderna de los alimentos. Zaragoza, España. 
12.13 Food and Agriculture Organization of the United Na tions. International Programme on Chemical 
Safety. World Health Organization. Summary of Ev aluations Performed by the Joint FAO/WHO Expert 
Committee on Food Addittives (JECFA). 
12.14 Salvador Villalpando. Grasas, Dieta y Salud. Tabl as de composición de Acidos Grasos de alimentos 
frecuentes en la dieta mexicana. Instit uto Nacional de Salud Pública, México. 
13. Observancia de la Norma 
13.1 La vigilancia del cumplimiento de las especificaciones sanitarias de la presente Norma corresponde a 
la Secretaría de Salud y a los gobiernos de las entid ades federativas, en el ámbito de sus respectivas 
competencias. 
13.2 La vigilancia en el cumplimiento de las especif icaciones comerciales de la presente Norma 
corresponde a la Secretaría de Economía, a la Procur aduría Federal del Consumidor (PROFECO) y a los 
organismos privados que para el efecto se establezcan. 
14. Vigencia La presente Norma entrará en vigor a los sesenta días naturales contados a partir del día siguiente de su 
publicación en el Diario Oficial de la Federación, a exce pción del límite de 15 µg/kg de aflatoxinas establecido 
en el numeral 6.8.1, para el cual contarán con 365 dí as naturales para su cumplimiento a partir de la entrada 
en vigor de la misma. 
Sufragio Efectivo. No Reelección. 
México, D.F., a 15 de febrero de 2013.- El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacio nal de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
Mikel Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbrica.- El Director General de Normas y Presidente del Comité 
Consultivo Nacional de Normalización de Seguridad al Usuario, Información Comercial y Prácticas de 
Comercio, Christian Turégano Roldán .- Rúbrica. 
 15. Apéndice Informativo A. Contaminantes 
Tabla A.1 Límites máximos de contaminantes 
Metales 
pesados y 
metaloides  Límite máximo mg/Kg  
 Cacao Chocolate y 
Productos 
Similares Cocoa Pasta y/o 
Torta de 
cacao Manteca de 
cacao Mezclas de cocoa y 
azúcar, chocolate 
en polvo 
Arsénico 1.0 0.5 1.0  0.5  
Plomo 1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 1.0 
16. Apéndice Normativo A. Métodos de prueba 
A.1. Símbolos y abreviaturas para los métodos de prueba Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Los siguientes símbolos y abreviaturas se complem entan con los enlistados en el cuerpo de la presente 
Norma: 
» aproximado ± más, menos 1/d inversa de la dilución As arsénico Bi bismuto Cd cadmio cbp cuanto basta para Cu cobre 
etc. etcétera 
Fe  fierro Ge germanio H hora Hg mercurio Lb libras LDI límite de detección del instrumento LDM límite de detección del método µm micrómetro µmho micromho N normal Ng nanogramo Nm nanómetro NMP. número más probable No. número M molar MCC muestra de control de calidad P peso Pb plomo p. ejem. por ejemplo Ph potencial hidrógeno RA reactivo analítico Rpm revoluciones por minuto RVBA agar rojo-violeta-verde-brillante Sb  antimonio Se selenio Seg segundo Sn estaño Te teluro V volumen Zn zinc 
A.2. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. 
A.2.1 Fundamento.  
Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible 
de los microorganismos presentes en la porción de muestra.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.2.2 Definiciones. 
A.2.2.1  Dilución primaria , es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una 
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente. 
A.2.2.2  Diluciones decimales adicionales , las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un 
determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas 
para la inoculación de medios de cultivo. 
A.2.3 Reactivos y materiales  
A.2.3.1 Reactivos Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
A.2.3.1.1  Preparación de reactivos 
A.2.3.1.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N 
Tabla A.2.1 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de Sodio 4.0g 
Agua 100.0ml 
 
Preparación: Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL con agua. 
A.2.3.1.1.2  Soluciones diluyentes. 
A.2.3.1.1.2.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). 
Tabla A.2.2 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de sodio monobásico 34.0g  
Agua 1.0L 
 
Preparación: Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. 
Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1,0 °C. Conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar  a un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121° ± 1,0 °C durante 15 minutos. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a 
los iniciales. 
A.2.3.1.1.2.2  Agua peptonada 
Tabla A.2.3 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1.0g Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Cloruro de sodio 8.5g 
Agua 1.0L 
 
Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. Esterilizar a 121 ± 1,0 °C durante 15 minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a 
los iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 0a 5 °C 
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
A.2.3.2 Materiales. 
A.2.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
A.2.3.2.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
A.2.3.2.3  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
A.2.3.2.4  Utensilios esterilizables para la obtención de m uestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
Todo el material e instrumentos que tengan contacto c on las muestras bajo estudio deberán esterilizarse 
mediante: Horno para esterilizar o autoclave. 
El material de vidrio puede sustituirse por mate rial desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por  esterilización repetida y éste debe ser químicamente 
inerte. 
A.2.4 Aparatos e instrumentos.  
A.2.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatur a mínima de 170 °C. Durante 2 h a 170 a 175 °C  
 o 1 h a 180 °C. 
A.2.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
Durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 °C. 
A.2.4.3  Baño de agua con control de temperatura y ci rculación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5 °C. 
A.2.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
A.2.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bo lsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
A.2.4.6  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
A.2.5 Procedimiento  
A.2.5.1  Preparación de la dilución primaria. 
A.2.5.1.1  A partir de muestras líquidas. 
Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refresco s, etc.) en las cuales la distribución de 
microorganismos es homogénea o fácilmente homogenei zable por medios mecánicos (agitación, etc.). 
Para muestras congeladas de un alimento originalment e líquido o licuable, fundir por completo en baño de 
agua de 40 a 45 °C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente. 
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada sufi cientemente representativa 
de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales). 
A.2.5.1.1.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimi entos de arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la  muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual 
debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evita ndo el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
A.2.5.1.1.2  Siempre que la cantidad de muestra lo pe rmita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.2.5.1.2  A partir de muestras sólidas o semisólidas. 
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben de scongelarse en refrigeración de 4 a 8 ºC durante 
18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis. 
A.2.5.1.2.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado. 
A.2.5.1.2.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la 
muestra. 
A.2.5.1.2.3  Operar la licuadora o el homogeneizador pe ristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aun 
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos. 
A.2.5.1.2.4  Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de 
las capas superiores de la suspensión. 
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en 
cuenta para las operaciones subsecue ntes o expresión de resultados. 
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, 
aquellos con partículas agudas o constituyentes que no  se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo 
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos compar ativos) de que los resultados obtenidos no difieren 
significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. 
A.2.5.2  Preparación de las diluciones decimales adicionales. 
A.2.5.2.1  Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en 
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la tem peratura apropiada, evitando 
el contacto entre la pipeta y el diluyente. 
A.2.5.2.2  Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyent e siempre de la misma manera que se describe 
en A.2.5.1.1.1 
A.2.5.2.3  La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 
A.2.5.2.4  Utilizar pipetas diferentes para cada diluci ón inoculando simultáneamente las cajas que se hayan 
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta. 
A.2.5.2.5  Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido. 
A.2.5.2.6  Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario. 
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 
0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores. 
El criterio para seleccionar las diluciones a pre parar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es: 
Para la técnica del número más probable utiliz ar tres tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta. 
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquel las en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de 
otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana correspondiente. 
A.2.5.3  Duración del procedimiento. 
En general, las diluciones de la muestra deben ser pr eparadas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dent ro de los 20 minutos posteriores a su preparación. 
A.3. Determinación de materia extraña para chocolate, cocoas y pasta de cacao.  
A.3.1 Fundamento. Después de someter la muestra a un proceso de des engrasado, los fragmentos de insecto, pelos de 
roedor y otros residuos se extraen utilizando el matraz trampa de Wildman. 
A.3.2 Equipo. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.3.2.1  Balanza analítica con + 0,1 mg de sensibilidad. 
A.3.2.2  Equipo de succión para filtración al vacío. 
A.3.2.3  Placa de calentamiento con agitación magnét ica y barra magnética recubierta con teflón. 
A.3.2.4  Microscopio binocular estereoscópico, con objetiv os 1, 3 y 6 o 7X, respectivamente, y oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 15 y 30X, respectivamente. 
A.3.2.5  Lámpara para el microscopio. 
A.3.2.6  Batidora con agitador (opcional). 
A.3.2.7  Rallador de cocina. 
A.3.3 Materiales. A.3.3.1  Tamiz de 0,063 mm de abertura de malla (NOM 0100M, 230 U.S.). 
A.3.3.2  Regadera de hule, para llave de cocina. 
A.3.3.3  Matraz trampa de Wildman: Matraz Erlenmeyer de 2 L provisto de un buzo formado por una varilla 
metálica con un tapón émbolo de hule en un extremo. 
A.3.3.4  Embudo de Hirsch o Büchner para filtración al vacío. Colocar al final del tallo del embudo un tubo 
de hule de aproximadamente 10 cm de largo que pueda ser tapado con tapón de plástico o corcho. 
A.3.3.5  Pinzas para ropa. 
A.3.3.6  Matraz volumétrico de 100 mL. 
A.3.3.7  Cajas de Petri o placas de vidrio grueso. 
A.3.3.8  Papel de filtración rápida rayado para cont eo o rayado a lápiz con líneas paralelas de 
aproximadamente 5 mm de separación. 
A.3.3.9  Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
A.3.3.10  Vasos de precipitados de 500 y de 1000 mL. 
A.3.3.11  Aguja de disección. 
A.3.3.12  Pinza. 
A.3.3.13  Lápiz graso. 
A.3.4 Reactivos Los reactivos deben ser grado analítico, a menos que se indique otra especificación, cuando se mencione 
agua, debe entenderse agua destilada. 
A.3.4.1  Lauril sulfato de sodio C12H25O4SNa  al 2% (solución detergente). 
En un matraz volumétrico de 100 mL disolver 2,0 g de la uril sulfato de sodio con agua y llevar al volumen. 
A.3.4.2  Heptano C7H6, puede emplearse n-heptano comercial con un contenido máximo de 8% de tolueno. 
A.3.4.3  Solución de hipoclorito de sodio NaOCl, aproximadamente 0,25%. 
Diluir con agua 5 mL de solución comercial de hipoclorito de sodio al 5,25% en masa y llevar al volumen 
de 100 mL, debe prepararse fresca diariamente y guardarse en recipiente cerrado y protegido de la luz. 
A.3.4.4  Mezcla glicerina C3H8O3- Etanol C2H6O (1:3) (v/v). 
A.3.5 Procedimiento. 
A.3.5.1  Preparación de la muestra. 
A.3.5.1.1  Para cocoas y chocolates en polvo, mezclar bien y tomar 50 g de muestra. 
A.3.5.1.2  Para chocolate, rallar finamente la muestra y tomar 100 g para el análisis. 
A.3.5.1.3  En el caso de cocoas y otros productos prensado s duramente, calentarlos en estufa durante 2 o 
3 horas a una temperatura entre 60 y 70 ºC. Desm oronar las pastillas prensadas en pedazos de 
aproximadamente 1 cm; tomar 50 g de muestra para el análisis. 
A.3.5.2  Determinación. 
A.3.5.2.1  Mezclar en el vaso de precipitados la muestra para analizar con 500 mL de la solución 
detergente al 2% a una temperatur a entre 55 y 70 ºC. En el caso de los productos duramente prensados; 
dejarlos en remojo durante toda la noche o bien agitarl os con la batidora a baja velocidad o agitación 
magnética durante 2 o 3 horas, hasta  que se dispersen completamente.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.3.5.2.2  Remover muy bien, verter en porciones en un tamiz con malla número 230 y lavar con fuerte 
chorro de agua caliente entre 55 y 70 ºC. La llave debe  estar provista de regadera de hule que proporcione el 
chorro en forma de lluvia. 
A.3.5.2.3  Eliminar la grasa del producto inclinando el tamiz a 20º aproximadamente y dejar correr una 
suave corriente de agua a través del líquido que se junta a un lado del tamiz. 
A.3.5.2.4  Cuando se ha eliminado la grasa y los materiales finos, y se ha desprendido la espuma que al 
principio se forma, transferir el residuo completamente a un matraz trampa de Wildman de 2 L usando agua. 
A.3.5.2.5  Añadir aproximadamente 500 mL de agua y hervir por unos 10 min. 
A.3.5.2.6 Enfriar hasta la temperatura ambiente y añadir agua para completar 1 L de líquido en el matraz. 
A.3.5.2.7  Añadir 50 mL de heptano utilizando la varilla de metal del matraz. 
A.3.5.2.8  Introducir la barra magnética en el matraz colo cándola sobre el tapón émbolo de hule. Levantar 
la varilla hasta que el tapón de hule quede por encima del nivel del líquido y fijarla con unas pinzas. 
A.3.5.2.9  Agitar la mezcla utilizando el ag itador magnético. Aumentar la ag itación y evitando incorporarle 
aire, mantenerla durante 5 min. 
A.3.5.2.10  Después de agitar, bajar la varilla de metal y el tapón émbolo de hule y añadir el agua 
necesaria, para que la capa de heptano suba al cuello del matraz. 
A.3.5.2.11  Dejar reposar durante 30 min, agitando suavemente la capa del fondo cada 4-5 min con la 
barra magnética, durante los primeros 20 min de reposo. 
A.3.5.2.12 Girando la varilla de metal, para remover el sedimento fino que se acumuló en la superficie del 
tapón émbolo, atrapar la capa de heptan o levantándolo e introduciéndolo lo más que se pueda en el cuello del 
matraz. 
A.3.5.2.13  Asegurar que la capa de heptano y por lo menos 1 cm de agua que está abajo de la interfase 
queden sobre el émbolo. 
A.3.5.2.14  Mantener el émbolo en su lugar y decantar lo s líquidos que estén sobre él en un vaso de 
precipitados. Enjuagar el material que quede en la varilla y en el cuello del matraz con heptano y 
reincorporarlo al vaso de precipitados. 
A.3.5.2.15 Introducir el émbolo al cuerpo del matraz aproximadamente a la mitad de éste y fijar 
nuevamente la varilla con las pinzas. 
A.3.5.2.16  Añadir 35 mL de heptano al matraz trampa, para hacer una segunda extracción, agitar 
suavemente a mano durante 1 min, dejar reposar durante 15 min y se lava con heptano. Los líquidos de la 
segunda extracción y el heptano de lavado se juntan con los de la primera extracción, recibiéndolos en el 
mismo vaso de precipitados. 
A.3.5.2.17  Colocar el papel filtro rayado para conteo dentro del embudo de succión y verter uniformemente 
en él, el contenido del vaso de precipitados utilizan do un agitador. Enjuagar abundantemente el vaso con 
heptano y verterlo en el embudo. 
A.3.5.2.18  Pasar el filtro con el residuo a una caja de Petri, es opcional humedecerla con la mezcla 
glicerina: etanol. Contar al microscopio los pelos ut ilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre 
los detalles en el papel filtro a través del microscopi o. Cuente explorando con una aguja de disección sobre 
toda la superficie del papel, línea por línea. Volt ear y explorar cada pieza del material, pues algunos 
fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan. No contar el material dudoso. 
A.3.5.2.19  En caso de que existan en el papel demasiados residuos, proceder con la técnica de blanqueo 
después de haber examinado el papel para conteo de pelos. 
A.3.6 Técnica de blanqueo. A.3.6.1 Regresar el papel filtro al embu do de filtración, en caso de haber adicionado la mezcla de glicerol-
etanol, lavarlo con etanol al 95%, seguido de agua. Ap licar vacío hasta que el papel parezca seco y suspender 
el vacío. 
A.3.6.2  Poner un tapón de plástico o corcho en el extremo del tubo de hule colocado en el embudo. 
A.3.6.3  Cubrir el papel filtro con 5-7 mL (alcance un  nivel de 3 a 4 mm) de solución de hipoclorito sin 
permitir que fluya para la orilla del papel. Mantener en reposo el nivel de la solución hasta que esté completo 
el blanqueo de la muestra (30 min máximo).  Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.3.6.4  Quitar del tubo de hule el tapón de plástico o corcho, aplicar vacío y lavar con agua. 
A.3.6.5  Pasar el papel filtro a una caja Petri y contar  al microscopio los fragmentos de insectos. 
A.3.7 Expresión de resultados. 
Número promedio de insectos enteros o sus fragmento s, así como pelos de roedor contenidos en la 
cantidad de muestra tomada  
 
A.4. Determinación de aflatoxinas totales por método de columna de inmunoafinidad. A.4.1 Fundamento. La porción de prueba es extraída con metanol. La muestra extraída es filtrada, diluida con agua, y aplicada 
a la columna de afinidad la cual contiene un anticue rpo monoclonal específico para aflatoxinas B1, B2, G1 y 
G2. Las aflatoxinas son aisladas, purificadas y conc entradas en la columna y removidas de los anticuerpos 
con metanol. Las aflatoxinas totales son cuantificadas por medición fluorométrica después de reaccionar con 
solución de bromo (método SFB). Las aflatoxinas indi viduales son cuantificadas por cromatografía de líquidos 
con detección de fluorescencia y derivatización con yodo postcolumna (método PCD). 
A.4.2  Equipo.  
A.4.2.1  Licuadora a alta velocidad, con vaso de 500 mL y tapa. 
A.4.2.2  Balanza granataria con una sensibilidad de 0,1 g. 
A.4.2.3  Fluorómetro con lámpara pulsada de xenón o cuar zo-halógeno y con filtros de excitación a 360 nm 
y emisión a 450 nm. 
A.4.2.4  Agitador tipo vortex. 
A.4.2.5  Bomba manual. Jeringa de 20 mL y émbolo con tubo de polietileno unida a un tapón a la salida. 
A.4.2.6  Bomba para cromatógrafo de líquidos. Adecuada para una tasa de flujo de 1 mL/min. 
A.4.2.7  Sistema de inyección. Jeringa con válvula de inyección de cargado con loop de 50 µL o 
equivalente. 
A.4.2.8  Sistema de derivatización postcolumna. Una segunda bomba sin pulso, pieza tipo T con cero 
volumen muerto, tubería de teflón de 610 cm x 0,5 mm de di ámetro interno, y baño de calentamiento o reactor 
postcolumna. 
A.4.2.9  Detector de fluorescencia con filtros de excitación a 360 nm y emisión > 420 nm. 
A.4.3 Materiales  
A.4.3.1  Papel filtro aflautado de 24 cm  (Whatman 2V o equivalente). 
A.4.3.2  Papel filtro de fibra de vidr io (Whatman 934AH o equivalente). 
A.4.3.3  Jeringa de 20 mL, tipo Luer para depósito de la muestra. 
A.4.3.4  Celda de borosilicato de 12 x 75 mm. 
A.4.3.5  Dispensador automático. Botella de 2 onzas de color ámbar con dispensador automático de 1,0 mL 
A.4.3.6  Matraz volumétrico de 2 mL. 
A.4.3.7  Columna de afinidad Aflatest-P. La columna pu ede ser almacenada durante 1 año a temperatura 
ambiente sin pérdida de su eficiencia. Recuperaciones para una solución patrón de aflatoxinas de 15 mL de 
metanol-agua (3+1) que contiene 25 ng B1, 5 ng de B2, 15 ng de G1 y 5 ng de G2 deben ser al menos de 90, 
80, 90 y 60%, respectivamente. 
A.4.4 Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada. 
A.4.4.1  Metanol (CH4O). 
A.4.4.2  Metanol grado HPLC. 
A.4.4.3  Acetonitrilo (C2H3N) grado HPLC. 
A.4.4.4  Agua (H2O) grado HPLC.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.4.4.5  Cloruro de sodio (NaCl). 
A.4.4.6  Yodo (I2). 
A.4.4.7  Benceno grado espectroscópico (C6H6). 
A.4.4.8  Sulfato de quinina dihidratada. 
A.4.4.9  Acetato de zinc (C4H6O4Zn. 2H2O). 
A.4.4.10 Cloruro de aluminio (AlCl3). 
A.4.4.11 Soluciones acuosas de metanol. 
Tabla A.4.1 Fórmulas 
Solución de metanol mL de metanol mL de agua destilada Vol. total de solución (mL) 
20% 200 800 1000 
60% 600 400 1000 
70% 700 300 1000 
 
A.4.4.12  Solución de acetato de zinc/cloruro de aluminio . Pesar 200 g de acetato de zinc y 5 g de cloruro 
de aluminio. Llevar a un volumen de 1 L con agua. 
A.4.4.13  Solución reveladora de bromo al 0,01%. 
A.4.4.14 Solución reveladora de bromo al 0,002%. Mezclar 10 mL de solución al 0.01% con 40 mL de 
agua. Preparar diariamente y al macenar en frasco ámbar. 
A.4.4.15 Estándares de calibración para el fluorómetro.  Utilizar una solución de 34 mg de sulfato de 
quinina en 1 mL de ácido sulfúrico 0,1N como solución patrón de 20 ng aflatoxina/g. Emplear ácido sulfúrico 
0,1N como blanco. Alternativamente se dispone de estándares comerciales en ampolletas selladas (ampolleta 
verde = 0 ng/g, ampolleta roja = 20 ng/g y ampolleta amarilla = 10 + 2 ng/g). 
A.4.4.16 Fase móvil para cromatografía de líquidos. A gua-acetonitrilo-metanol (3 +1+1), degasificada. 
A.4.4.17  Reactivo postcolumna. Disolver 100 mg de yodo en 2 mL de metanol. Adicionar 200 mL de agua, 
agitar 1 hora, y filtrar a través de por o de 0,45 mm. Preparar diariamente. 
A.4.4.18 Soluciones patrón de aflatoxinas para cromatografía de líquidos. 
A.4.4.18.1 Solución madre de mezcla de aflatoxinas. Preparar una solución que contenga 500 ng B1, 125 
ng de B2, 250 ng G1 y 125 ng G2/mL en benceno:acetonitrilo (98+2). 
A.4.4.18.2 Soluciones patrón de trabajo. 
Transferir cada cantidad indicada en la Tabla A.4.2,  de solución madre en series de tres matraces 
volumétricos de 2 mL. Evaporar las soluciones casi  a sequedad bajo corriente de nitrógeno a temperatura 
ambiente. Adicionar a cada matraz, 1 mL de meta nol, mezclar, diluir con agua y mezclar. Preparar 
diariamente. 
Tabla A.4.2 Fórmulas de soluciones estándar de trabajo 
Solución 
patrón  de 
trabajo µL tomados de 
solución  
madre ng aflatoxina/50 m L 
  B1 B2 G1 G2 
1 60 0.750 0.188 0.375 0.188 
2 40 0.500 0.125 0.250 0.125 
3 20 0.250 0.063 0.125 0.063 
 
A.4.5 Procedimiento. A.4.5.1  Preparación de la muestra. 
A.4.5.1.1  Grano entero de cacao. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Eliminar la cáscara del grano y moler la muestra completa hasta pasar por un tamiz de malla número 20. 
Para el caso de muestras con alto contenido de grasa, moler con un cortador de carne hasta la obtención de 
una pasta. Homogeneizar la muestra, de pref erencia con la ayuda de una mezcladora. 
A.4.5.1.2 Productos de chocolate. 
Enfriar aproximadamente 200 g de la muestra hasta que se endurezca, y rallar o raspar hasta la obtención 
de un producto granular fino. Mezclar completamente y guardar en recipiente con cierre hermético. Colocar en un lugar frío. 
A.4.5.1.3 Chocolate en polvo. 
Mezclar completamente y guardar en recipientes con cierre hermético. A.4.5.2  Extracción de las muestras. 
A.4.5.2.1  Muestras de grano de cacao. 
Pesar 25 g de muestra en un vaso de licuadora. Adicionar 5 g de cloruro de sodio y 125 mL de metanol al 
70%. Licuar durante 2 minutos a alta velocidad. 
Filtrar a través de papel aflautado. Medir 15 mL de es te filtrado y colocar en un matraz Erlenmeyer de 125 
mL. Añadir 30 mL de agua y mezclar. Filtrar a través de  filtro de fibra de vidrio < 30 minutos antes de pasar a 
la columna de afinidad. El filtrado debe  ser claro, de no ser así, refiltrar. 
A.4.5.2.2 Muestras a base de chocolate. 
Pesar 25 g de muestra en un vaso de licuadora. Adicionar 5 g de cloruro de sodio y 100 mL de metanol al 
100%. Licuar durante 2 minutos a alta velocidad. 
Filtrar a través de papel aflautado. Medir 10 mL de este  filtrado y diluir con 40 mL de solución de acetato 
de zinc/cloruro de aluminio. Mezclar. Filtrar a través de fi ltro de fibra de vidrio < 30 minutos antes de pasar a la 
columna de afinidad. El filtrado debe ser claro. De no ser así, refiltrar. 
A.4.5.3 Cromatografía en columna de afinidad. 
A.4.5.3.1 Asegurar el depósito de la jeringa a un soporte. Quit ar la tapa superior de la columna. Cortar la 
tapa y usarla como un conector entre la columna y la jeringa. 
A.4.5.3.2  Adicionar 15 mL del filtrado obtenido en la extracción del grano de cacao (equivalente a 1 g de 
porción de prueba) o 10 mL del filtrado obtenido de  la extracción de productos a base de chocolate 
(equivalente a 0,5 g de porción de prueba) dentro del  depósito de la jeringa. Conectar a la bomba manual 
previamente llenada de aire. Quitar la tapa inferior de la columna. 
A.4.5.3.3 Pasar el extracto a través de la columna a un flujo de 2 gotas/seg (6mL/min). Desconectar la 
bomba manual del depósito de la jeringa y llenar la bomba con aire. 
A.4.5.3.4 Conectar nuevamente la bomba a la jeringa, y pasar de 2-3 mL de aire a través de la columna. 
Desconectar la bomba y adicionar 10 mL de agua al depós ito. Para el caso de productos a base de chocolate 
sustituir por 10 mL de metanol al 20%. Llenar  la bomba con aire y conectar a la jeringa. 
A.4.5.3.5 Empujar el líquido a través de la columna a un flujo de 6 mL/min. Repetir con otros 10 mL de 
agua o 10 mL de metanol al 20% según sea el caso. Descartar estos lavados. 
A.4.5.3.6 Desconectar la bomba, llenarla con aire, conectarla nuevamente a la jeringa y pasar de 2-3 mL 
de aire a través de la columna. 
A.4.5.3.7 Desconectar la bomba y adicionar 1 mL de metanol grado HPLC al depósito de la jeringa. 
A.4.5.3.8 Llenar la bomba con aire, conectar la jeringa y pasar el metanol a través de la columna. 
A.4.5.3.9 Para cuantificación por método SFB, colectar el eluido en una celda para fluorómetro. 
Inmediatamente proceder con la  determinación fluorométrica. 
A.4.5.3.10  Para cuantificación por método PCD, colectar el eluido en un matraz volumétrico de 2 mL. Diluir 
al volumen con agua grado HPLC, mezclar y proceder c on la cuantificación por cr omatografía de líquidos. 
A.4.5.4 Determinación fluorométrica (SFB). 
A.4.5.4.1 Calibración del fluorómetro. 
Calentar el fluorómetro por espacio de 20 minutos. Inse rtar la celda o ampolleta que contiene el blanco y, 
usar la perilla ZERO, para ajustar el instrumento a una le ctura de 0. Insertar la ce lda o ampolleta que contiene 
el estándar de 20 ng de aflatoxina/g, y con la perilla SPA N, ajustar a una lectura de 20. Para los productos a      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
base de chocolate ajustar a una lectura de 40. Utilizar u na ganancia fija (empezar en 50) para asegurar que el 
blanco dé una lectura de 0 y el estándar una de 20 o 40.  Calibrar el fluorómetro justo antes de la lectura del 
eluido de la columna, para evitar cualqu ier posible desviación del instrumento. 
A.4.5.4.2  Cuantificación. 
Adicionar 1 mL de solución reveladora de bromo al 0, 002% al eluido obtenido en 3.5.3.9. Mezclar en 
vortex durante 5 segundos. Si existe adherencia de bur bujas en las paredes de la celda, golpearla ligeramente 
para dispersarlas. Insertar la celda en el fluorómetro y esperar 60 segundos. Al cabo de este tiempo, registrar 
la lectura obtenida, la cual es equivalente a µg de aflatoxinas totales/kg porción de prueba. 
A.4.5.5 Determinación por cromatografía de líquidos con detección de fluorescencia y derivatización 
postcolumna. 
A.4.5.5.1 Conectar la salida de una columna HPLC a un brazo de una pieza T de acero inoxidable, de bajo 
volumen muerto, usando una pieza de tubería cort a de 0,01 pulgadas (0,25 mm) de diámetro interno. 
A.4.5.5.2 Conectar la salida de una segunda bomba, la cual distribuye los reactivos postcolumna, al 
segundo brazo de la pieza T. Conectar una terminal de t ubería de teflón en espiral (tubo de reacción) de 610 x 
0,5 mm de diámetro interno a un tercer brazo de la pi eza T. La otra terminal del espiral, conectarla a la 
entrada del detector de fluorescencia. 
A.4.5.5.3 Mantener el tubo de reacción a una temperatura de 70 ºC, utilizando un horno o un baño a 
temperatura constante. 
A.4.5.5.4 Fijar las siguientes tasas de flujo: 
Fase móvil (columna): 1,0 mL/min. Reactivo postcolumna: 0,3 mL/min. Tasa total a través del tubo  de reacción: 1,3 mL/min. 
A.4.5.5.5 El volumen del tubo de reacción es de aproximadamente 1,2 cm
3 y dado que la tasa de flujo total 
es de 1,3 mL/min, el tiempo de reacción postcolumn a es de aproximadamente 55 segundos. Dejar estabilizar 
el sistema durante 10-20 min. 
A.4.5.5.6 Si se utiliza un integrador de datos, ajustar los controles de sensibilidad del detector de 
fluorescencia o del integrador, para dar una respues ta razonable (señal: ruido = 5:1) para 0,125 ng de 
aflatoxina G2/50 µL. 
A.4.5.5.7 Si se emplea un graficador, ajustar el control de l detector de fluorescencia para dar una deflexión 
de 30-40% de la escala con 0,125 ng de aflatoxina G2/50 µL. 
A.4.5.5.8 Inyectar 50 µL de la mezcla patrón de trabajo dentro del inyector, usando un exceso de 20-30 µL, 
para garantizar que el loop esté completamente lleno. Las  aflatoxinas eluyen en el siguiente orden: G2, G1, 
B2 y B1, con tiempos de retención aproximados de 6, 8,  9 y 11 minutos, respectivamente. Además los picos 
en el cromatograma deben estar bien resueltos. 
A.4.5.5.9  Si es necesario ajustar los tiempos de retención,  cambiar la concentración del metanol de la fase 
móvil. Inyectar 50 µL de cada una de las soluciones de trabajo y preparar curvas de calibración para cada una 
de las aflatoxinas. 
A.4.5.5.10 Inyectar 50 µL del extracto de la muestra dent ro del inyector. Identificar cada pico de las 
aflatoxinas, en el cromatograma de análisis de la porción de prueba, comparando los tiempos de retención 
con los correspondientes a los patrones de referencia. 
A.4.5.5.11 Determinar la cantidad de cada aflatoxina en el eluido inyectado, comparando con la curva de 
calibración correspondiente. 
A.4.5.5.12  Calcular la concentración de cada aflatoxina en  la muestra de prueba, usando la siguiente fórmula: 
µg/kg aflatoxina = A x (Tv) x (1) = A x 40  
  Iv W donde: W = peso representado por el eluido (1 g) A = ng aflatoxina en el eluido, obtenido de la curva de calibración Tv = Volumen final del eluido (2000 mL) Iv = Volumen inyectado del eluido (50 mL) Sumar las concentraciones de las cuatro aflatoxina s para obtener la concentración total de las mismas. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.4.6 Informe de la prueba. 
mg aflatoxinas totales/kg 
 
A.5. Determinación de mohos y levaduras en alimentos. A.5.1 Fundamento.  
El método se basa en inocular una cantidad conoc ida de muestra de prueba en un medio selectivo 
específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a un a temperatura de 25 ± 1 °C, dando como resultado el 
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos. 
A.5.2 Definiciones.  
A.5.2.1 Colonias , agrupamiento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo. 
A.5.2.2 Levaduras , son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un 
núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La 
reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca. 
A.5.2.3 Mohos , grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se 
caracterizan por tener un cuerpo formado por estructura  filamentosa con ramificaciones, que se conocen con 
el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el mi celio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción 
pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o 
manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25 °C. 
A.5.3 Reactivos y materiales.  
A.5.3.1 Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua 
debe entenderse como agua destilada. 
A.5.3.1.1  Medios de cultivo. 
Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada. Preparación del medio de cultivo. Seguir instrucciones del fabricante y después de esterili zar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1 °C, acidificar 
a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido tartárico por 100 mL 
de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una 
porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado. 
A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido tartárico. A.5.3.1.2  Soluciones. 
A.5.3.1.2.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). 
Tabla A.5.1 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de potasio monobásico 34.0g 
Agua 1.0L 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N. Llevar a 1,0 L de agua. 
Esterilizar a 121 °C durante 15 minutos. Cons ervar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y ll evar a 1,0 L con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. 
Esterilizar a 121 ± 1 °C durante 15 minutos. 
A.5.3.1.2.2  Solución estéril de ácido tartárico al 10%. 
Tabla A.5.2 Fórmula      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Ingredientes Cantidades 
Acido tartárico  10.0g 
Agua destilada 100.0mL 
 
Preparación: Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por  filtración a través de 
membrana de 0,45 µm. 
A.5.3.2 Materiales. 
A.5.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
A.5.3.2.2  Cajas Petri. 
A.5.3.2.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
A.5.3.2.4  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. 
A.5.3.2.5  Utensilios esterilizables para la obtención de m uestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio, deben esterilizarse 
mediante: horno o autoclave. 
A.5.4 Aparatos e instrumentos.  
A.5.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C. Durante 2 h de 170 a 175 
°C o por 1h a 180 °C. 
A.5.4.2  Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1,0 °C provista con termómetro 
calibrado. 
A.5.4.3  Autoclave que alcance una temperatura míni ma de 121 ± 1,0 °C. Durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0 °C. 
A.5.4.4  Baño de agua con control de temperatura y ci rculación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C. 
A.5.4.5  Contador de colonias de campo oscuro, con lu z adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
A.5.4.6  Registrador mecánico o electrónico. 
A.5.4.7  Microscopio óptico. 
A.5.4.8  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
A.5.5 Preparación de la muestra.  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el método A.2 del presente 
documento “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”. 
A.5.6 Procedimiento.  
A.5.6.1  Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propós ito una pipeta estéril. 
A.5.6.2  Repetir el procedimiento tantas veces como dilu ciones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
A.5.6.3  Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa ac idificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en un 
baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. 
A.5.6.4  Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido 
de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. 
Permitir que la mezcla se solidifique dejando las ca jas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 
A.5.6.5  Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad. 
A.5.6.6  Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1 °C. 
A.5.6.7  Contar las colonias de cada placa después de 3,  4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, 
seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colo nias bien aisladas, considerar los conteos de 4 días 
de incubación y aun de 3 días. En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis. 
A.5.6.8  Si es necesario, cuando la morfología colonial  no sea suficiente, examinar microscópicamente 
para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bacterias. 
A.5.7 Expresión de resultados.  
Cálculo del Método Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias  como las adecuadas para el informe. Multiplicar 
por el inverso de la dilución, tomando en consideració n los siguientes criterios, para la expresión de 
resultados: 
A.5.7.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 10 a 150 
colonias, usando el contador de colonias y el registrado r. Las placas de al menos una de las diluciones deben 
estar en el intervalo de 10 a 150. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar. 
A.5.7.2 Cuando dos diluciones están en el intervalo apr opiado, determinar la cuenta promedio dada por 
cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o mililitro. 
A.5.7.3 Placas con menos de 10 colonias: cuando las placas corridas para la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 10 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, promediar el 
número de colonias y multiplicar por el factor de diluci ón para obtener el valor estimado de cuenta en placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda “valor estimado”. 
A.5.7.4 Placas con más de 150 colonias: cuando el número de colonias por placa exceda de 150, contar 
las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos  cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda “valor estimado”. 
A.5.7.5 Calcular las UFC/g o mL de produc to utilizando la siguiente fórmula: 
N= ∑c 
[(1x n 1) + (0.1xn 2)x(d)] 
donde: 
N: número de UFC por mL o g de producto. 
∑c: Suma de todas las colonias en todas las placas. 
n1: número de placas contadas de la primera dilución. 
n2: número de placas contadas en la segunda dilución. 
d: dilución de la que se obtuv ieron las primeras cuentas. 
Ejemplo: 
Dilución 1:100 1:1000 
# colonias 132, 144 33, 28 
 
N= (132 + 144 + 33 + 28)   [(1x2) + (0.1x2)] x 10-2 
N= 337 / 0.022 N= 15,318.18 
N
≈ 15,300 UFC/g o mL 
A.5.8 Informe de la prueba.  
Informar:      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa - dextrosa 
acidificado, incubadas a 25 ± 1 °C durante 5 días. 
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro  (UFC/g o mL) de levaduras en agar papa-dextrosa 
acidificado, incubadas a 25 ± 1 °C durante 5 días. 
A.6. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. 
A.6.1 Fundamento.  
El método se basa en que las bacterias coliformes,  fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1 °C durante 24 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación. 
A.6.2 Definiciones.  
A.6.2.1 Coliformes , bacilos Gram negativos, no esporulados, aer obios o anaerobios facultativos, que a 35 
°C fermentan la lactosa con la producción de gas  bajo las condiciones especificadas en esta norma. 
A.6.3 Reactivos y materiales. 
A.6.3.1 Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad. 
A.6.3.1.1  Soluciones diluyentes. 
A.6.3.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). 
Tabla A.6.1 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34.0g 
Agua 1.0L 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N. 
Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1 °C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a 
los iniciales. 
A.6.3.1.1.2  Agua peptonada. 
Tabla A.6.2 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1.0g 
Cloruro de Sodio 8.5g 
Agua 1.0L 
 Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1 N. 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, alma cenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 
°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
A.6.3.1.2  Medios de cultivo. 
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo). 
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo). 
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación). 
En el caso del análisis de agua potable y hielo pue de utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/L de medio), como alternativa al uso de campanas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. 
A.6.3.1.2.1  Caldo lactosado. 
Tabla A.6.3 Fórmula 
Ingrediente Medio de C oncentración 1.5 Medio de  Concentración sencilla 
Extracto de carne 4.5g 3.0g 
Peptona de gelatina 7.5g 5.0g 
Lactosa 7.5g 5.0g 
Agua destilada 1000.0mL 1000.0mL 
 
Preparación: Disolver los ingredientes en 1 L de agua, calentando si  es necesario o el medio completo deshidratado, 
siguiendo las instrucciones del fabricante. 
Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25 °C. Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dim ensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medi o de concentración 1,5, c ada tubo debe tener campana 
de fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL del 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra. 
A.6.3.1.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa 
Tabla A.6.4 Fórmula 
Ingrediente Medio de C oncentración 1.5 Medio de  Concentración sencilla 
Triptosa 30.0g 20.0g 
Lactosa 7.5g 5.0g 
Fosfato dipotásico 4.125g 2.75g      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Fosfato monopotásico 4.125g 2.75g 
Cloruro de sodio 7.5g 5.0g 
Lauril sulfato de sodio 0.15g 0.1g 
Agua destilada 1000.0mL 1000.0mL 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las in strucciones del fabricante. 
Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25 °C. 
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dim ensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medi o de concentración 1,5, c ada tubo debe tener campana 
de fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado. Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire después de la esterilización. 
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra. 
A.6.3.1.2.3  Caldo lactosa bilis verde brillante. 
Tabla A.6.5 Fórmula 
Ingrediente Cantidades 
Peptona 10.0g 
Lactosa 10.0g 
Sales biliares 20.0g 
Verde brillante 0.0133g 
Agua 1.0L 
 
Preparación: 
Disolver los componentes o el medio completo des hidratado en agua, calentar si es necesario. 
Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25 °C. 
Distribuir el medio en cantidades de 10 mL en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de 
fermentación. 
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la esterilización. 
A.6.3.2 Materiales. 
A.6.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
A.6.3.2.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
A.6.3.2.3  Utensilios esterilizables para la obtención de m uestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.6.3.2.4  Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca. 
A.6.3.2.5  Campanas de fermentación (tubos de Durham). 
A.6.3.2.6  Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 mL. 
A.6.3.2.7  Gradillas. 
A.6.3.2.8  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro. 
Todo el material que tenga contacto con las muestr as bajo estudio debe ester ilizarse mediante horno o 
autoclave. 
El material de vidrio puede sustituirse por mate rial desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio daña do por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser 
químicamente inerte. 
A.6.4 Aparatos e instrumentos. 
 A.6.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatur a mínima de 170 °C. Durante 2 horas a 170 a 
175 °C o 1 h a 180 °C. 
A.6.4.2  Incubadora con termostato que evite variaciones  mayores de ± 1,0 °C, provista con termómetro 
calibrado. 
A.6.4.3  Termómetro de máximas y mínimas. 
A.6.4.4  Autoclave que alcance una temperatura míni ma de 121 ± 1,0 °C. Durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0 °C. 
A.6.4.5  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
A.6.5 Preparación de la muestra. Las muestras deben prepararse y diluirse, siempr e que sea posible, de acuerdo al método A.2 del 
presente documento “Preparación y Dilución de Muestr as de Alimentos para su Análisis Microbiológico”. 
A.6.6 Procedimiento. A.6.6.1  Para alimentos. 
Preparar suficiente número de diluciones para asegurar  que todos los tubos correspondientes a la última 
dilución rindan un resultado negativo. 
A.6.6.1.1  Prueba presuntiva. 
A.6.6.1.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enr iquecimiento de mayor concentración. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilución primaria inicial, en el caso de otros productos. 
A.6.6.1.1.1.1  Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL de la dilución primaria en el caso de otros productos. 
A.6.6.1.1.1.2  Para las diluciones subsecuentes, continuar co mo se indica en el párrafo anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio. 
A.6.6.1.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de 
gas, en caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas. 
A.6.6.1.2  Prueba confirmativa. 
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si la formación de gas no se observa en este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas. 
En esta Norma se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. Para algunos 
productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los resultados, será necesario inocular una serie 
de cinco o diez tubos.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.6.7 Expresión de los resultados. 
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en las tablas correspondientes. 
La Tabla A.6.5 muestra algunos ej emplos que se pueden presentar. 
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones 
mayores posteriores. 
Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tu bos positivos y la última da menos de tres, elegir 
esta última y las dos diluciones anteriores más bajas. 
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de tres 
diluciones, seleccionar las dos dilucion es mayores positivas y la siguiente. 
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se enc uentran en la muestra sin diluir (10 mL o 1 g) y en 
la primera dilución (1 mL o 10-1 g), seleccionar las tres primeras diluciones para el cálculo del número más 
probable. 
En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo c ual es representado en las T ablas A.6.7 a la A.6.10, 
según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP. 
La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variac iones. Los resultados obtenidos con esta técnica 
deben ser utilizados con precaución. Los límites de conf ianza están representados en las Tablas A.6.7 a la 
A.6.10. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 co liformes por gramo, los límites de 
confianza en el 95% de los casos variarán de 10 a 230 co liformes por gramo (ejemplo 3 de la Tabla A.6.6) y 
en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes 
por gramo (ejemplo 2 de la Tabla A.6.6). 
Tabla A.6.6 Ejemplos de la selección de resultados positivos para el cálculo del NMP  Número de tubos positivos obtenidos de tres 
tubos incubados, para las siguientes 
cantidades de muestra inoculada por tubo NMP 
Productos 
líquidos 
(mL) 10 1 10-¹ 10-² 10-³ 
Producto líquido Otros productos 
Otros 
productos 
(g) 1 10-¹ 10-² 10-³ 10- ⁴ 
  
  mayor dilución = menor 
concentración mL -¹ g -¹ 
1 3 3 2 1 0 15 [5] 150 [6] 
2 3 3 3 0   24 [5] 240 [6] 
3 2 2 1 1 0 7 [6] 70 [7] 
4 3 3 0 0 0 2.4 [4] 24 [5] 
5 2 2 0 1 0 0.21 [4] 2.1 [5] 
 
Tabla A.6.7 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del 
NMP por 
g 95% Límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 < 0,03 <0,005 <0,09 <0,02 <0,005 <0,07 Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
0-0-1 0,03 <0,005 <0,0 9 0,02 <0,005 0,07 
0-1-0 0,03 <0,005 0,13  0,02 <0,005 0,07 
0-2-0 --- --- --- 0,04 <0,005 0,11 
1-0-0 0,04 <0,005 0,20  0,02 <0,005 0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21  0,04 <0,005 0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23  0,04 <0,005 0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36  0,06 <0,005 0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36  0,06 <0,005 0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36  0,05 <0,005 0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37  0,07 0,01 0,17 
2-1-0 0,15 0,03 0,44  0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89  0,09 0,02 0,21 
2-2-0 0,21 0,04 0,47  0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 ---- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 0,12 0,03 0,28 
3-0-0 0,23 0,04 1,20  0,08 0,01 0,19 
3-0-1 0,39 0,07 1, 3 0,11 0,02 0,25 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 --- --- --- 
3-1-0 0,43 0,07 2,10  0,11 0,02 0,25 
 
3-1-1 0,75 0,14 2,30  0,14 0,04 0,34 
3-1-2 1,20 0,30 3,80 --- --- --- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80  0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40  0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 --- --- --- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 --- --- --- 
3-3-1 4,60 0,71 24,0 --- --- --- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 --- --- --- 
3-3-3 >11,0 >1,50 >48,0 --- --- --- 
4-0-0 ---   0,13 0,03 0,31 
4-0-1 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-0 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-1 ---   0,21 0,07 0,63 
4-1-2 ---   0,26 0,09 0,78 
4-2-0 ---   0,22 0,07 0,67 
4-2-1 ---   0,26 0,09 0,78 
4-3-0 ---   0,27 0,09 0,80 
4-3-1 ---   0,33 0,11 0,93 
4-4-0 ---   0,34 0,12 0,93 
5-0-0 ---   0,23 0,07 0,70 
5-0-1 ---   0,31 0,11 0,89 
5-0-2 ---   0,43 0,15 1,14 
5-1-0 ---   0,33 0,11 0,93 
5-1-1 ---   0,46 0,16 1,20      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
5-1-2 ---   0,63 0,21 1,15 
5-2-0 ---   0,49 0,17 1,30 
5-2-1 ---   0,70 0,23 1,70 
5-2-2 ---   0,94 0,28 2,20 
5-3-0 ---   0,79 0,25 1,90 
5-3-1 ---   1,10 0,31 2,50 
5-3-2 ---   1,40 0,37 3,40 
5-3-3 ---   1,80 0,44 5,00 
5-4-0 ---   1,30 0,35 3,00 
5-4-1 ---   1,70 0,43 4,90 
5-4-2 ---   2,20 0,57 7,00 
5-4-3 ---   2,80 0,90 8,50 
5-4-4 ---   3,50 1,20 10,0 
5-5-0 ---   2,40 0,68 7,50 
5-5-1 ---   3,50 1,60 10,0 
5-5-2 ---   5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---   8,20 3,00 32,0 
5-5-4 ---   16,09 6,40 58,0 
5-5-5 ---   --- --- ---  
Tabla A.6.8 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 1,0, 0,1 y 0,01 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del 
NMP por 
g 95% Límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <0,30 <0,05 <0,90 <0,20 <0,05 <0,70 
0-0-1 0,30 <0,05 <0,90 0,20 <0,05 0,70 
0-1-0 0,30 <0,05 1,30 0,20 <0,05 0,70 
0-2-0 --- --- --- 0,40 <0,05 0,11 
1-0-0 0,40 <0,05 2,0 0,20 <0,05 0,70 
1-0-1 0,70 0,10 2, 0 0,40 <0,05 1,10 
1-1-0 0,70 0,10 2,30  0,40 <0,05 1,10 
1-1-1 1,10 0,30 3,60  0,60 <0,05 1,50 
1-2-0 1,10 0,30 3,60  0,60 <0,05 1,50 
2-0-0 0,90 0,10 3,60  0,50 <0,05 1,30 
2-0-1 1,40 0,30 3,70  0,70 0,10 1,70 
2-1-0 1,50 0,30 4,40  0,70 0,10 1,70 
2-1-1 2,00 0,70 8,90  0,90 0,20 2,10 
2-2-0 2,10 0,40 4,70  0,90 0,20 2,10 
2-2-1 2,80 1,00 15,0 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 1,20 0,30 2,80 
3-0-0 2,30 0,40 12, 0 0,80 0,10 1,90 
3-0-1 3,90 0,70 13, 0 1,10 0,20 2,50 Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
3-0-2 6,40 1,50 38,0 --- --- --- 
3-1-0 4,30 0,70 21, 0 1,10 0,20 2,50 
3-1-1 7,50 1,40 23, 0 1,40 0,40 3,40 
3-1-2 12,0 3,00 38,0 --- --- --- 
3-2-0 9,30 1,50 38, 0 1,40 0,40 3,40 
3-2-1 15,0 3,00 44,0 1,70 0,50 4,60 
3-2-2 21,0 3,50 47,0 --- --- --- 
3-3-0 24,0 3,60 130,0 --- --- --- 
3-3-1 46,0 7,10 240,0 --- --- --- 
3-3-2 110,0 15,0 480,0 --- --- --- 
3-3-3 >110,0 >15,0 >480,0 --- --- --- 
4-0-0 ---   1,30 0,30 3,10 
4-0-1 ---   1,70 0,50 4,60 
4-1-0 ---   1,70 0,50 4,60 
4-1-1 ---   2,10 0,70 6,30 
4-1-2 ---   2,60 0,90 7,80 
4-2-0 ---   2,20 0,70 6,70 
4-2-1 ---   2,60 0,90 7,80 
4-3-0 ---   2,70 0,90 8,00 
4-3-1 ---   3,30 1,10 9,30 
 
4-4-0 ---   3,40 1,20 9,30 
5-0-0 ---   2,30 0,70 7,00 
5-0-1 ---   3,10 1,10 8,90 
5-0-2 ---   4,30 1,50 11,4 
5-1-0 ---   3,30 1,10 9,30 
5-1-1 ---   4,60 1,60 12,0 
5-1-2 ---   6,30 2,10 15,0 
5-2-0 ---   4,90 1,70 13,0 
5-2-1 ---   7,00 2,30 17,0 
5-2-2 ---   9,40 2,80 22,0 
5-3-0 ---   7,90 2,50 19,0 
5-3-1 ---   11,0 3,10 25,0 
5-3-2 ---   14,0 3,70 34,0 
5-3-3 ---   18,0 4,40 50,0 
5-4-0 ---   13,0 3,50 30,0 
5-4-1 ---   17,0 4,30 49,0 
5-4-2 ---   22,0 5,70 70,0 
5-4-3 ---   28,0 9,00 85,0 
5-4-4 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-0 ---   24,0 6,80 75,0 
5-5-1 ---   35,0 12,0 100,0 
5-5-2 ---   54,0 18,0 140,0 
5-5-3 ---   92,0 30,0 320,0      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
5-5-4 ---   161,0 64,0 580,0 
5-5-5 ---   >161,0 >64,0 >580,0 
 
Tabla A.6.9 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 0,1, 0,01 y 0,001 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del 
NMP por 
g 95% Límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 --- --- --- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2,0 21 
2-2-0 21 4 47 9 2,0 21 
 
2-2-1 28 10 150 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 12 3,0 28 
3-0-0 23 4 120 8 1,0 19 
3-0-1 39 7 13 11 2,0 25 
3-0-2 64 15 380 --- --- --- 
3-1-0 43 7 210 11 2,0 25 
3-1-1 75 14 230 14 4,0 34 
3-1-2 120 30 380 --- --- --- 
3-2-0 93 15 380 14 4,0 34 
3-2-1 150 30 440 17 5,0 46 
3-2-2 210 35 470 --- --- --- 
3-3-0 240 36 130 --- --- --- 
3-3-1 460 71 240 --- --- --- 
3-3-2 1100 150 480 --- --- --- 
3-3-3 >1100 >150 >480 --- --- --- 
4-0-0 ---   13 3,0 31 
4-0-1 ---   17 5,0 46 
4-1-0 ---   17 5,0 46 
4-1-1 ---   21 7,0 63 
4-1-2 ---   26 9,0 78 
4-2-0 ---   22 7,0 67 
4-2-1 ---   26 9,0 78 
4-3-0 ---   27 9,0 80 
4-3-1 ---   33 11,0 93 
4-4-0 ---   34 12,0 93 
5-0-0 ---   23 7,0 70 Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
5-0-1 ---   31 11,0 89 
5-0-2 ---   43 15,0 114 
5-1-0 ---   33 11,0 93 
5-1-1 ---   46 16,0 120 
5-1-2 ---   63 21,0 150 
5-2-0 ---   49 17,0 130 
5-2-1 ---   70 23,0 170 
5-2-2 ---   94 28,0 220 
5-3-0 ---   79 25,0 190 
5-3-1 ---   110 31,0 250 
5-3-2 ---   140 37,0 340 
5-3-3 ---   180 44,0 500 
5-4-0 ---   130 35,0 300 
5-4-1 ---   170 43,0 490 
5-4-2 ---   220 57,0 700 
5-4-3 ---   280 90,0 850 
5-4-4 ---   350 120,0 1000 
5-5-0 ---   240 68,0 750 
5-5-1 ---   350 120,0 1000 
5-5-2 ---   540 180,0 1400 
5-5-3 ---   920 300,0 3200 
5-5-4 ---   1600 640,0 5800 
5-5-5 ---   >1600 >640,0 >5800  
Tabla A.6.10 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados va rios números de tubos. (Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g) 
 3 TUBOS POR DILUCION 5 TUBOS POR DILUCION 
Combinación 
de positivos Indice del 
NMP por g 95% Límites de confianza Indice del 
NMP por 
g 95% Límites de confianza 
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 --- --- --- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200 80 10 190      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
3-0-1 390 70 1300 110 20 250 
3-0-2 640 150 3800 --- --- --- 
3-1-0 430 70 2100 110 20 250 
3-1-1 750 140 2300 140 40 340 
3-1-2 1200 300 3800 --- --- --- 
3-2-0 930 150 3800 140 40 340 
3-2-1 1500 300 4400 170 50 460 
3-2-2 2100 350 4700 --- --- --- 
3-3-0 2400 360 13000 --- --- --- 
3-3-1 4600 710 24000 --- --- --- 
3-3-2 11000 1500 48000 --- --- --- 
3-3-3 >11000 >1500 >48000 --- --- --- 
4-0-0 ---   130 30 310 
4-0-1 ---   170 50 460 
4-1-0 ---   170 50 460 
4-1-1 ---   210 70 630 
4-1-2 ---   260 90 780 
4-2-0 ---   220 70 670 
4-2-1 ---   260 90 780 
4-3-0 ---   270 90 800 
 
4-3-1 ---   330 110 930 
4-4-0 ---   340 120 930 
5-0-0 ---   230 70 700 
5-0-1 ---   310 110 890 
5-0-2 ---   430 150 1140 
5-1-0 ---   330 110 930 
5-1-1 ---   460 160 1200 
5-1-2 ---   630 210 1500 
5-2-0 ---   490 170 1300 
5-2-1 ---   700 230 1700 
5-2-2 ---   940 280 2200 
5-3-0 ---   790 250 1900 
5-3-1 ---   1100 310 2500 
5-3-2 ---   1400 370 3400 
5-3-3 ---   1800 440 5000 
5-4-0 ---   1300 350 3000 
5-4-1 ---   1700 430 4900 
5-4-2 ---   2200 570 7000 
5-4-3 ---   2800 900 8500 
5-4-4 ---   3500 1200 10000 
5-5-0 ---   2400 680 7500 Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
5-5-1 ---   3500 1200 10000 
5-5-2 ---   5400 1800 14000 
5-5-3 ---   9200 3000 32000 
5-5-4 ---   16000 6400 58000 
5-5-5 ---   >16000 >6400 >58000 
 
A.6.8 Informe de la prueba.  
Informar "Número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro de muestra". En caso de 
muestras de agua informar NMP/100 ml. 
A.7. Determinación de microorganismos coliformes totales en placa. A.7.1 Fundamento.  
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis ) en el que se desarrollan bacterias a 35 °C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la produ cción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sales biliares. 
A.7.2 Definiciones.  
A.7.2.1 Coliformes , bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 35 
ºC fermentan la lactosa con formación de ácido, ocas ionando en las colonias desarrolladas el vire del 
indicador rojo neutro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares. 
A.7.3 Reactivos y materiales.  
A.7.3.1 Reactivos. 
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada. 
A.7.3.1.1  Soluciones diluyentes. 
A.7.3.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada). 
Tabla A.7.1 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato monopotásico 34.0g 
Agua 1.0L 
 
Preparación: 
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N. Llevar con agua a un litro. 
Esterilizar a 121± 1,0 °C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada). 
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar  a un litro con agua (solución de trabajo). 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1,0 °C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a 
los iniciales. 
A.7.3.1.1.2  Agua peptonada. 
Tabla A.7.2 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 1.0g 
Cloruro de sodio 8.5g 
Agua 1.0L      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
 
Preparación: 
Disolver los componentes en un litro de agua. 
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales. 
Si este diluyente no es usado inmediatamente, alma cenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5 
°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición. 
A.7.3.1.2  Medio de cultivo: Agar-rojo- violeta-bilis-lactosa (RVBA). 
Tabla A.7.3 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7.0g 
Extracto de levadura 3.0g 
Lactosa  10.0g 
Sales biliares 1.5g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Rojo neutro 0.03g 
Cristal violeta 0.002g 
Agar 15.0g 
Agua 1.0L 
 
Preparación: 
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. 
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N a 25 
°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor. 
Calentar con agitación constant e y hervir durante 2 minutos. 
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45 °C. 
Evitar el sobrecalentamiento del medio. 
No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación. 
En el caso de utilizar medio de cultivo deshid ratado, seguir las instrucciones del fabricante. 
A.7.3.2 Materiales. A.7.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total. 
A.7.3.2.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca. 
A.7.3.2.3  Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca. 
A.7.3.2.4  Utensilios esterilizables para la obtención de m uestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc. 
A.7.3.2.5  Cajas Petri. 
Todo el material e instrumentos que tengan contacto  con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante horno o autoclave. 
El material de vidrio puede sustituirse por mate rial desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio daña do por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser 
químicamente inerte. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.7.4 Aparatos e instrumentos.  
A.7.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C. Durante 2 h a 170 - 175 °C, 
o 1 h a 180 °C. 
A.7.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
Durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1,0 °C. 
A.7.4.3  Baño de agua con control de temperatura y ci rculación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0,1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1,0 °C. 
A.7.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher). 
A.7.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bo lsas estériles para homogeneizador peristáltico. 
A.7.4.6  Incubadora con termostato que evite variaciones  mayores de ± 1,0 °C, provista con termómetro 
calibrado. 
A.7.4.7  Contador de colonias de campo oscuro, con lu z adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador. 
A.7.4.8  Registrador mecánico o electrónico. 
A.7.4.9  Microscopio óptico. 
A.7.4.10  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
A.7.5 Preparación de la muestra.  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el método A.2 del presente 
documento "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico". 
A.7.6 Procedimiento.  
A.7.6.1  Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propós ito una pipeta estéril. 
A.7.6.2  Repetir el procedimiento tantas veces como dilu ciones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución. 
A.7.6.3  Verter de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mant enido a 45 ± 1,0 °C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en qu e se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 
minutos. 
A.7.6.4  Mezclar cuidadosamente el inóculo con el m edio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del relo j, seis movimientos en el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, so bre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría. 
A.7.6.5  Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la esterilidad. 
A.7.6.6  Después de que está el medio completamente so lidificado en la caja, verter aproximadamente 4 
mL del medio RVBA a 45 ± 1,0 °C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique. 
A.7.6.7  Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35 °C, durante 24 ± 2 horas. 
A.7.6.8  Después del periodo especificado para la incuba ción, contar las colonias con el contador de 
colonias. 
A.7.6.9  Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un ha lo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial  es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 
0,5 a 2,0 mm. 
A.7.7 Expresión de los resultados.  
A.7.7.1  Cálculo del método. 
A.7.7.1.1  Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características. 
Separar las placas que contienen el número ant es mencionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes . Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, tomando los criterios citados en el método A.5.  Determinación de mohos y le vaduras en alimentos.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.7.7.1.2  Placas que contienen menos de 15 colonias características. 
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias  características, reportar el número obtenido seguido 
de la dilución correspondiente. 
A.7.7.1.3  Placas con colonias no características. 
Si en las placas no hay colonias características, repor tar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución. 
A.7.8 Informe de la prueba.  
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35 °C durante 24 ± 2 h. En caso de emplear diluciones y no observar crecimient o, informar utilizando como referencia la dilución 
más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. 
En caso de no observar crecimiento en la muestra si n diluir se informa: "no desarrollo de coliformes por 
mL". 
A.8. Determinación de Salmonella en alimentos. 
A.8.1 Fundamento. La presente técnica para la detección de Salmonella  en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos: 
A.8.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en  un medio nutritivo no selectivo, 
que permite restaurar las células de Salmonella  dañadas a una condición fisiológica estable. 
A.8.1.2  Enriquecimiento selectivo, empleado con el  propósito de incrementar las poblaciones de 
Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra. 
A.8.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se  utilizan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas. 
A.8.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la id entificación genérica de los cultivos de Salmonella 
y la eliminación de cultivos sospechosos falsos. 
A.8.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo. 
A.8.2 Definiciones. 
A.8.2.1 Detección de Salmonella , determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos 
en una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta Norma. 
A.8.2.2 Salmonella , microorganismo patógeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram 
negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos y que presentan 
además las características bioquímicas y serológicas de scritas cuando los proced imientos se efectúan de 
acuerdo con esta Norma. 
A.8.3 Reactivos y materiales. 
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación. 
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico. A.8.3.1 Reactivos. A.8.3.1.1  Medios de pre-enriquecimiento. 
A.8.3.1.1.1  Agua de peptona tamponada. 
Tabla A.8.1 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 10.0g 
Cloruro sódico 5.0g 
Fosfato sódico dibásico 3.5g Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Fosfato potásico monobásico 1.5g 
Agua 1.0L 
 
Preparación Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0. 
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables co n la capacidad necesaria para obtener las porciones 
necesarias para la prueba. 
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1 °C. A.8.3.1.1.2  Caldo lactosado. 
Tabla A.8.2 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3.0g 
Peptona 5.0g 
Lactosa 5.0g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 6,9 ±0,2 
Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65 °C. 
Distribuir en porciones de 225 ml, en frascos de 500 mL. 
Esterilizar durante 15 min a 121 °C ±1 °C. 
A.8.3.1.2  Caldo de enriquecimiento 
A.8.3.1.2.1  Caldo selenito-cistina 
Tabla A.8.3 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Triptona o polipeptona 5.0g 
Lactosa 4.0g 
Fosfato disódico 10.0g 
Selenito ácido de sodio 4.0g 
L-cistina 0.01g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 7,0 ±0,2 a 25 °C. 
 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en 
recipientes estériles, según se requiera. 
El caldo así preparado es transparent e. De preferencia usarlo el mismo día de su preparación. 
Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a 110 °C 
±1 °C, tomando entonces un color salmón. 
A.8.3.1.2.2  Caldo tetrationato. 
Tabla A.8.4 Fórmula      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona o triptona  5.0g 
Sales biliares 1.0g 
Carbonato de calcio 10.0g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 30.0g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 7,0 ±0,1 
 
Preparación: Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril. Distribuir, agitando const antemente, en porciones de 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar en 
refrigeración. 
Antes de usar el medio, agregar 2 mL de una solución yodo-yoduro y 1 mL de solución de verde brillante al 
0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez ad icionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el 
mismo día de su preparación. 
A.8.3.1.2.3  Vassiliadis-Rappaport. 
Tabla A.8.5 Fórmula Solución A 
Ingredientes Cantidades 
Triptona 5.0g 
Cloruro de sodio 8.0g 
Fosfato de potasio dihidrogenado 1.6g 
Agua destilada 1.0L 
 
Preparación: Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 70 °C. 
Tabla A.8.6 Fórmula Solución B 
Ingredientes Cantidades 
Cloruro de magnesio hexahidratado 400.0g 
Agua destilada 1.0L 
 
Preparación: Disolver el cloruro de magnesio en agua. 
Como esta sal es muy higroscópica es conveniente di solver el contenido entero de cloruro de magnesio 
desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Tabla A.8.7 Fórmula Solución C 
Ingredientes Cantidades 
Oxalato de verde de malaquita 0.4g 
Agua destilada 100.0mL 
 
Preparación: Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua. 
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente. 
Tabla A.8.8 Fórmula Medio Completo Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Ingredientes Cantidades 
Solución A 100mL 
Solución B 100mL 
Solución C 10mL 
 
Preparación: 
Adicionar 1 000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de la solución C. 
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2. Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantidades de 10 mL. 
Almacenar en refrigeración. 
A.8.3.1.2.4  Caldo de soya tripticasa. 
Tabla A.8.9 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Tripticasa o triptosa  17.0g 
Fitona 3.0g 
Glucosa 2.5g 
Cloruro de sodio 2.5g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 7,3 ±0,2. 
 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa. 
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min a 
121 °C ±1 °C. 
A.8.3.1.2.5  Leche descremada reconstituida 
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matraces  Erlenmeyer de 500 mL. Esterilizar a 121 °C ±1 °C 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 mL. 
A.8.3.1.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio. 
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 mL de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adic ionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual. 
A.8.3.1.3  Medios de aislamiento. 
A.8.3.1.3.1  Agar verde brillante (VB). 
Tabla A.8.10 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 3,0g 
Polipeptona (Proteosa peptona No. 3) 10.0g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Lactosa 10.0g 
Sacarosa 10.0g 
Rojo de fenol 0.08g 
Agar 20.0g 
Verde brillante 0.0125g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 6,9 ±0,2.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
 
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 °C ± 1 °C . El sobrecalentamiento del medio disminuye su 
selectividad. 
Enfriar el medio a 50 °C y distribuirlo en cajas de Petri estériles. El aspecto del medio es obscuro, de color 
marrón. 
A.8.3.1.3.2  Agar con sulfito de bismuto. 
Tabla A.8.11 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne de res 5.0g 
Mezcla de peptonas 10.0g 
Glucosa 5.0g 
Fosfato disódico (anhidro) 5.0g 
Sulfato ferroso (anhidro) 0.3g 
Sulfito de bismuto 8.0g 
Verde brillante 0.025g 
Agar 20.0g 
Agua destilada 1.0L 
 
Preparación: Suspender los ingredientes en un litro de agua. Ca lentar hasta su disolución completa, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH. 
Enfriar a 45 °C y verter en cajas de Petri estéri les, distribuyendo de manera homogénea el precipitado 
propio del medio. 
El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. 
Si la coloración es parda, no deben utilizarse. 
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. 
A.8.3.1.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD). 
Tabla A.8.12 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Xilosa 3.75g 
L-lisina 5.0g 
Lactosa 7.50g 
Sacarosa 7.50g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Extracto de levadura 3.0g 
Rojo de fenol 0.08g 
Agar 15.0g 
Desoxicolato de sodio 2.50g 
Citrato férrico-amónico 0.80g 
Tiosulfato de sodio 6.80g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 6,9 ± 0,2. 
 
Preparación: Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 55 °C, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH. 
Enfriar a 50 °C y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilice. 
El sobrecalentamiento produce una prec ipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las 
colonias suelen ser muy pequeñas. 
El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante. 
A.8.3.1.3.4  Agar para Salmonella  y Shigella  (SS) 
Tabla A.8.13 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 5.0g 
Polipeptona * 5.0g 
Lactosa 10.0g 
Sales biliares 8.50g 
Citrato de sodio dihidratado 8.50g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado 8.50g 
Citrato férrico 1.0g 
Agar 13.50g 
Rojo neutro 0.025g 
Verde brillante 0.33g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 7,0 ± 0,2. 
 
Preparación: 
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada  estéril y calentar a ebullición hasta disolución 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. 
Enfriar a 50 °C y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. A.8.3.1.3.5  Agar entérico Hektoen. 
Tabla A.8.14 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Proteosa peptona  12.0g 
Extracto de levadura 3.0g 
Lactosa 12.0g 
Sacarosa 12.0g 
Salicina 2.0g 
Sales biliares 9.0g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Tiosulfato de sodio 5.0g 
Citrato amónico férrico 1.5g 
Azul de bromotimol 0.064g 
Fuscina ácida 0.10g 
Agar 13.5g 
Agua 1.0L 
pH final: 7,5 ± 0,2.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
 
Preparación: Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir c on agitación hasta completa disolución del agar. No 
sobrecalentar. 
Dejar enfriar a 55-60 °C y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas. A.8.3.1.4  Medios para pruebas bioquímicas. 
A.8.3.1.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI). 
Tabla A.8.15 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de carne * 1.0g 
Peptona de caseína * 1.0g 
Cloruro de sodio 0.5g 
Lactosa 1.0g 
Sacarosa 1.0g 
Glucosa 0.1g 
Agar 1.3g 
Rojo de fenol 2.5 mg 
Sulfato ferroso amónico pentahidratado 20.0 mg 
Tiosulfato de sodio 20.0 mg 
Agua destilada 100.0 mL 
pH final: 7,3 ± 0,2. 
 Preparación: Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destila da. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, 
hasta disoluci ón completa. 
Enfriar a 60 °C y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 10 0 mm y esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min. 
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el  fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad 
de 4 cm. El medio es de color rojo. 
A.8.3.1.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA). 
Tabla A.8.16 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona de gelatina 0.5g 
Extracto de levadura 0.3g 
Glucosa 0.1g 
L-lisina 1.0g 
Citrato férrico-amónico 50.0mg 
Tiosulfato de sodio anhidro 4.0mg 
Púrpura de bromocresol 2.0mg 
Agar 1.5g 
Agua destilada 100.0mL 
pH final: 6,7 ± 0,2. 
 
Preparación: Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezc lar bien, calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca. 
Esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1 °C durante 12  min. Dejar que los tubos se enfríen en posición 
inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. 
El medio ya preparado es de color púrpura. A.8.3.1.4.3  Agar nutritivo. 
Tabla A.8.17 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3.0g 
Peptona 5.0g 
Agar 15.0g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2. 
 Preparación: 
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min. 
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Distri buir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 
de su volumen. 
Esterilizar a 121 °C ± 1 °C por 15 min. Inc linar los tubos antes que el agar solidifique. 
A.8.3.1.4.4  Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad). 
Tabla A.8.18 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 3.0g 
Peptona 30.0g 
Hierro peptonizado 0.2g 
Tiosulfato de sodio 0.025g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 7,3 ± 0,2. 
Preparación: 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Enfriar a 50 °C y ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1 °C 
durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en posición vertical. 
A.8.3.1.4.5  Agar citrato de Simmons. 
Tabla A.8.19 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Fosfato de amonio 1.0g 
Fosfato dipotásico 1.0g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Citrato de sodio 2.0g 
Sulfato de magnesio 0.2g 
Azul de bromotimol 0.08g      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Agar 15.0g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2. 
 
Preparación: 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1 °C 
durante 15 min. 
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada. 
A.8.3.1.4.6  Caldo MR-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer). 
Tabla A.8.20 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Peptona 7.0g 
Dextrosa 5.0g 
Difosfato de potasio 5.0g 
Agua destilada 1.0L 
 
Preparación: 
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa. 
Ajustar el pH. 
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1 °C 
durante 15 min. 
A.8.3.1.4.7  Caldo manitol. 
Tabla A.8.21 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de carne 1.0g 
Proteosa peptona 10.0g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Rojo de fenol 0.018g 
Manitol 10.0g 
Agua 1.0L 
pH final: 7,4 ± 0,2 
 Preparación: 
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min. 
A.8.3.1.4.8  Caldo malonato. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Tabla A.8.22 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Extracto de levadura 1.0g 
Sulfato de amonio 2.0g 
Fosfato dipotásico 0.6g 
Fosfato monopotásico 0.4g 
Cloruro de sodio 2.0g 
Malonato 3.0g 
Glucosa 0.25g 
Azul de bromotimol 0.025g 
Agua 1.0L 
pH final: 6,7 ± 0,2. 
 
Preparación: 
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 mL. 
Esterilizar en autoclave a 121 °C ± 1 °C durante 15 min. 
A.8.3.1.4.9  Caldo urea. 
Tabla A.8.23 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Urea 20.0g 
Extracto de levadura 0.10g 
Fosfato monopotásico 9.10g 
Fosfato disódico 9.50g 
Rojo de fenol 0.01g 
Agua 1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2. 
 Preparación: 
Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de 
presión durante 15 min. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. A.8.3.1.4.10  Caldo de urea rápido. 
Tabla A.8.24 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Urea 20.0g 
Extracto de levadura 0.10g 
Fosfato monopotásico 0.091g 
Fosfato disódico 0.095g 
Rojo de fenol 0.01g 
Agua 1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2. 
      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Preparación: 
Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtra ción a través de membrana 0,45 µm. 
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm. A.8.3.1.4.11  Caldo infusión cerebro corazón. 
Tabla A.8.25 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Infusión cerebro corazón 200.0g 
Infusión de corazón de res 250.0g 
Proteosa peptona 10.0g 
Cloruro de sodio 5.0g 
Fosfato disódico dodecahidratado 2.5g 
Dextrosa 2.0g 
Agua destilada 1.0L 
pH final: 7,4 ± 0,2. 
 Preparación: Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente. 
Distribuir y esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min. A.8.3.1.5  Soluciones. 
A.8.3.1.5.1 Solución verde brillante al 0,1% (1:1000). 
Tabla A.8.26 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Verde brillante 0.1g 
Agua destilada estéril 100.0mL 
 
Preparación: Disolver 0,1 g de verde brillante en agua des tilada estéril hasta completar 100 mL. 
A.8.3.1.5.2  Solución de yodo-yoduro. 
Tabla A.8.27 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Cristales de yodo 6.0g 
Yoduro de potasio 6.0g 
Agua destilada 100.0mL 
 
Preparación: Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 mL. Conservar en frasco ámbar. A.8.3.1.5.3  Solución salina al 0,85%. 
Tabla A.8.28 Fórmula 
Ingredientes Cantidades Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Cloruro de sodio 0.85g 
Agua destilada 100.0mL 
 
Preparación: Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min. A.8.3.1.5.4  Solución salina formalizada. 
Tabla A.8.29 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Solución de formaldehído (36-38%) 6.0ml 
Cloruro de sodio 8.5g 
Agua destilada 1.0L 
 
Preparación: Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua de stilada. Esterilizar a 121 °C ± 1 °C durante 15 min. 
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar después de 
la adición de formaldehído. 
A.8.3.1.5.5  Reactivo de Kovac. 
Tabla A.8.30 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
p-dimetil-aminobenzaldehído 5.0g 
Alcohol amílico 75.0mL 
Acido clorhídrico concentrado 25.0mL 
 
Preparación: 
Disolver el p-dimetil-aminobenzaldehído en el alcohol  amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración. 
A.8.3.1.5.6  Solución de alfa -naftol al 5%. 
Tabla A.8.31 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Alfa-naftol 5.0g 
Alcohol 100.0mL 
 
Preparación: 
Disolver 5 g de alfa-naftol en alcohol hasta completar 100 mL. A.8.3.1.5.7  Solución de ro jo de metilo. 
Tabla A.8.32 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Rojo de metilo 0.10g 
Alcohol etílico 300.0g 
Agua destilada c.b.p. 500.0mL      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
 
Preparación: 
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL. 
A.8.3.1.5.8  Solución de hidróxido de potasio al 40%. 
Tabla A.8.33 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Hidróxido de potasio 40.0g 
Agua destilada 100.0mL 
 
Preparación: Disolver 40 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 mL. 
A.8.3.1.5.9  Solución de gelatinasa al 5%. 
Tabla A.8.34 Fórmula 
Ingredientes Cantidades 
Gelatinasa 5.0g 
Agua 100.0mL 
 
Preparación: 
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua destilada. NO CALENTAR. A.8.3.1.6  Antisueros 
Antisuero polivalente somático (O) 
Antisuero polivalente flagelar (H) Antisuero Vi 
A.8.4.2 Materiales.  
A.8.4.2.1  Matraces Erlenmeyer de 500 mL. 
A.8.4.2.2  Recipientes de boca ancha, de capacidad apr opiada para contener las muestras simples y 
compuestas. 
A.8.4.2.3  Angulos de vidrio. 
A.8.4.2.4  Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas. 
A.8.4.2.5  Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm. 
A.8.4.2.6  Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm. 
A.8.4.2.7  Pipetas bacteriológicas de 10,0 y 5,0 mL, grad uadas en 0,1 mL y protegidas con tapón de 
algodón. 
A.8.4.2.8  Pipetas de 1 mL, con graduaciones de 0,01 mL. 
A.8.4.2.9  Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables. 
A.8.4.2.10  Rejillas para tubos de ensaye. 
A.8.4.2.11  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro. 
A.8.4.2.12  Papel pH (intervalo de 6-8) con graduaciones  máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de 
color. 
Todo el material que tenga contacto con las muestr as bajo estudio debe ester ilizarse mediante horno o 
autoclave. 
A.8.5 Equipo. 
A.8.5.1  Horno para esterilizar que alcance los 180 °C. Durante 2 horas a 170-175 °C. 
A.8.5.2  Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1 °C y termómetro. 
A.8.5.3  Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas. Durante 15 min 
como mínimo a 121 °C ± 1 °C. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.8.5.4  Baño maría con term ostato y termómetro. 
A.8.5.5  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g. 
A.8.5.6  Licuadora de una o dos velocidades controladas po r un reóstato, con vasos esterilizables (vidrio o 
aluminio). 
A.8.5.7 Mecheros Bunsen o Fisher. 
A.8.5.8  Potenciómetro. 
A.8.6 Procedimiento. 
A.8.6.1  Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella  
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción de 1:9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse si empre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más. 
A.8.6.1.1  Procedimiento general para la preparación de muestras. 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso esté ril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar  225 mL del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indiqu e otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el 
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido 
clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa. 
Incubar 24 ± 2 h a 35 °C. Continuar como se indica en A.8.6.2.1. 
A.8.6.1.2  Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto. 
A.8.6.1.2.1  Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate). 
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso para licuadora agregando 225 ml de leche 
descremada reconstituida. Licuar por dos min. Manejar ig ual que en 8.6.1.1 hasta después de ajustar el pH. 
Adicionar 0,45 ml de la solución verde brillante al 0,1% y mezclar bien. Incubar como se indica en 8.6.1.1. 
A.8.6.2  Aislamiento de Salmonella. 
A.8.6.2.1  Cerrar firmemente el tapón de rosca de los ma traces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL  de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo 
tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina.  Como alternativa, en sust itución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis-Rappaport. 
A.8.6.2.2  Incubar de 18 a 24 h a 35 °C o, para alimento s fuertemente contaminados a 42 °C por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron direct amente enriquecidos en medios selectivos. 
A.8.6.2.3  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar 
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS). 
Efectuar el mismo procedimient o para el caldo tetrationato. 
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35 °C. A.8.6.2.4  Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella , de acuerdo 
con las siguientes características: 
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser tr ansparentes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas. 
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azul ve rdes con o sin centro negro. En algunos casos las 
colonias pueden aparecer completamente negras. 
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella  pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medi o circundante (halo) es café, torn ándose posteriormente negro. Algunas 
cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias típicas o 
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales. 
Agar SS: colonias translúcidas, oc asionalmente opacas. Algunas colonias  dan centro negro. Las colonias 
fermentadoras de la lactosa son rojas. 
A.8.6.3  Identificación bioquímica      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.8.6.3.1  Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas. 
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y 
otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la  superficie inclinada y por punción en el fondo. 
Incubar por 24 ± 2 h a 35 °C. 
Almacenar en refrigeración de 5 a 8 °C las placas c on medios selectivos por si es necesario retomar más 
colonias. 
A.8.6.3.2  Observar el crecimiento en los tubos y c onsiderar presuntivamente positivas para Salmonella  las 
colonias que den las siguientes reacciones: 
A.8.6.3.2.1  Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico. 
A.8.6.3.2.2  Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos  que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento 
a lo largo de la punción. 
A.8.6.3.2.3  Retener todos los cultivos que mues tren las reacciones características de Salmonella  en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adic ionales, indicadas en A.8.6.3.3. 
A.8.6.3.3  Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella  pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positi vos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar S. arizonae  y cepas atípicas de Salmonella  que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios. 
A.8.6.3.4  Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adic ionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente. 
A.8.6.3.5  Continuar la identificación bioquímica y serológica  a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se 
recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de 
ambos medios de enriquecimiento. 
A.8.6.3.6  Prueba de ureasa. 
A.8.6.3.6.1  Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del cultivo 
presumiblemente positivo de  cada tubo de medio TSI e inocular tubo s de caldo urea. Utilizar un control de 
medio para comparar el vire púrpura de las reacciones pos itivas con el color del medio original. Incubar 24 ± 2 
h a 35 °C. 
A.8.6.3.6.2  Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas  de crecimiento del cu ltivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5 °C en baño 
de agua. 
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin 
cambio de color del medio). 
A.8.6.4  Identificación serológica. 
A.8.6.4.1  Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella  (Antisuero polivalente O). 
A.8.6.4.1.1  Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portaobjetos o en 
dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender  en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI. 
A.8.6.4.1.2  Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto 
del asa o empleando aplicadores de madera. 
A.8.6.4.1.3  Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro. 
A.8.6.4.1.4
 Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva. 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinac ión en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina. 
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no  es definitiva y se debe continuar con las pruebas 
bioquímicas complementarias. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.8.6.4.2  Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes). 
A.8.6.4.2.1  Si la aglutinación con el antisuero O es negativa,  utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O. 
A.8.6.4.2.2  Si no se cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o al 
Laboratorio Nacional de Salud Pública. 
A.8.6.4.3  Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella  (Antisuero 
polivalente H). 
A.8.6.4.3.1  Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4 a 6 
h a 35 °C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina 
e incubar por 24 ± 2 h a 35 °C (para ensayo al día sigu iente). Adicionar 2,5 mL de solución salina formalizada 
a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI). 
A.8.6.4.3.2  Colocar 0,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para serología (13 x 
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en baño de agua a 48-50 °C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas  muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica. 
A.8.6.5  Pruebas bioquímicas complementarias.k 
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación: 
A.8.6.5.1  Inocular los cultivos positivos  provenientes de TSI y LIA en: me dio SIM, agar citrato de Simmons, 
caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae . 
A.8.6.5.2  Interpretar los ca mbios en los medios inoculados conforme lo siguiente: 
A.8.6.5.2.1  Agar citrato Simmons 
Inocular por estría el tubo. Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2 °C. Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul. 
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color. 
 A.8.6.5.2.2  Medio SIM 
Inocular por punción. Incubar 24 h a 35 ± 2 °C. Movilidad. Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo. 
Prueba negativa: crecimiento a lo la rgo de la punción exclusivamente. 
Producción de ácido sulfihídrico. 
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio. 
Prueba negativa: ausencia de color negro. Producción de indol. 
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crec imiento, de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac. 
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo. Prueba negativa: sin cambio de color. 
A.8.6.5.2.3  Caldo RM-VP 
Inocular un tubo con el medio. Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2 °C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM. 
A.8.6.5.2.3.1  Prueba de Voges-Proskauer (VP) 
Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h. Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
Adicionar 0,2 mL de solución de hidróxido de potasio 40%. 
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). 
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2 °C o 4 h a temperatura ambiente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo. Prueba negativa: sin cambio de color. 
Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h más a 35 ± 2 °C. 
A.8.6.5.2.3.2  Prueba de rojo de metilo (RM) 
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo. 
Interpretar los resultados inmediatamente. 
Prueba positiva: desarrollo de color rojo. Prueba negativa: desarrollo de color amarillo. 
A.8.6.5.2.4  Caldo malonato 
Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2 °C. 
Prueba positiva: desarrollo de color azul. 
Prueba negativa: sin cambio de color. A.8.6.5.2.5  Caldo manitol 
Inocular un tubo conteniendo el medio. 
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2 °C. Prueba positiva: desarrollo de color amarillo. 
Prueba negativa: sin cambio de color. 
A.8.6.5.3  Consultar los resultados obtenidos en la Tabla A.8.36 para la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas. 
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales. 
A.8.7 Cálculo y expresión de resultados. 
A.8.7.1  Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas. 
Reacciones bioquímicas Reacciones serológi cas Interpretación 
Típica Antígeno O, VI o H positivo Cepas consideradas como 
Salmonella  
Típica Todas las reacciones negativas  
Típica No probada Puede ser  Salmonella  
Reacciones atípicas Antígeno O, VI o H positivo  
Reacciones atípicas Todas las reacciones negativas No debe ser considerada 
Salmonella  
Nota: Ver apéndice  informativo A. 
A.8.7.2  Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella. 
Tabla A.8.36 
Prueba o Sustrato Positivo Negativo  Reacción 
Glucosa (TSI) amarillo rojo + 
Lisina descarboxilasa (LIA) púrpura amarillo + 
H2S (TSI y LIA) negro no negro + 
Ureasa rojo-púrpura no hay cambio de color - 
Caldo de lisina descarboxilasa púrpura amarillo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol amarillo o gas no hay cambio de color 
ni gas + b 
Caldo KCN crecimiento no hay crecimiento - Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
Caldo malonato azul no hay cambio de color - c 
Prueba de indol superficie de color violeta superficie color amarillo - 
Prueba del antígeno flagelar aglutinación no hay aglutinación + 
Prueba del antígeno somático aglutinación no hay aglutinación + 
Caldo lactosa rojo fenol amarillo o gas no hay cambio de color 
ni gas - c 
Caldo sacarosa rojo fenol amarillo o gas no hay cambio de color 
ni gas - 
Prueba Voges-Proskauer de rosa a rojo no hay cambio de color - 
Prueba rojo de metilo rojo difuso amarillo difuso + 
Citrato de Simmons crecimiento co lor azul no hay crecimiento, no 
hay cambio de color v 
 
a) +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días; v, variable. 
b) La mayoría de los cultivos S. arizonae  son negativos. 
c) La mayoría de los cultivos S. arizonae  son positivos. 
A.8.8 Informe de resultados. Informar: presencia o ausencia de Salmonella  en __________ g o ____________ ml de muestra. 
A.9. Determinación de humedad en alimentos por tratamiento térmico. Método de arena o gasa. A.9.1 Fundamento. Este método se basa en que al añadir arena o gasa, se incrementa la superficie de contacto y la 
circulación del aire en la muestra, favoreciéndos e así la evaporación durante el tratamiento térmico. 
A.9.2 Definiciones.  
A.9.2.1 Humedad , es la pérdida en peso por evaporación que sufre el producto al someterlo a las 
condiciones prescritas, expresada en por ciento. 
A.9.2.2 Precisión , es una medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad del método analítico bajo 
las condiciones normales de operación.  
A.9.2.3 Producto heterogéneo , es aquel cuya consistencia o diferentes fases hacen que la distribución 
de sus componentes no sea homogénea, tales como sopas de lata, frijoles re fritos, moles, etc. 
A.9.2.4 Repetibilidad , es la precisión de un método analítico,  expresado como la concordancia obtenida 
entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, usando los mismos datos y técnicas. 
A.9.3 Reactivos y Materiales.  
A.9.3.1 Reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico, cuando se indique agua, debe 
entenderse agua destilada. 
A.9.3.1.1 Sílica gel con indicador de humedad.  
A.9.3.1.2 Arena de mar purificada con ácido y calcinada (tamaño de partícula, 0,1 a 0,3 mm) o gasa. 
A.9.3.1.3 Agua. 
A.9.3.2 Materiales. 
A.9.3.2.1  Desecadores con placa. 
A.9.3.2.2  Cápsulas de níquel, aluminio o vidrio de 20 mm de altura y 50 mm de diámetro, con tapa de 52 
mm de diámetro por 6 mm de altura y base cóncava o plana según se requiera. 
A.9.3.2.3 Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro. 
A.9.3.2.4  Pinzas para crisol. 
A.9.3.2.5 Material común de laboratorio. 
A.9.4 Aparatos e Instrumentos  
Los aparatos que a continuación se indican deben esta r calibrados y ser ajustados antes de su operación:      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.9.4.1  Baño maría, o bien, placa cale factora eléctrica termostatizada. 
A.9.4.2  Balanza analítica con ± 0,1 mg de sensibilidad. 
A.9.4.3  Estufa con termostato para mante ner una temperatura de 100 ± 2 °C. 
A.9.5 Preparación de la muestra.  
A.9.5.1  Preparación de las cápsulas. Para cada muestra preparar dos cápsulas y las tapas respectivas 
con las siguientes características: 
Cápsulas de níquel, aluminio o vidrio, con 30 g de arena como máximo, o gasa recortada al tamaño del 
fondo de la cápsula y una varilla de vidrio de longitud  apropiada para reposar oblicuamente en la cápsula sin 
que se impida el tapado de ésta. Secar previamente las cápsulas entreabiertas (con arena o gasa, varilla y 
tapas), durante un mínimo de 2 horas a 100 ± 2 °C, t aparlas e introducir en un desecador y dejar enfriar a 
temperatura ambiente y pesar con precisión de 0,1 mg (masa M1) 
A.9.5.2  Preparación de la muestra. 
Justo antes de tomar la muestra, hom ogeneizarla bien, si es necesario, colocar el envase original en baño 
maría a 40 ºC para poner en suspensión los component es que hayan podido separarse. (Por ejemplo grasa y 
fibras). 
A.9.6 Procedimiento.  
A.9.6.1  Colocar en la cápsula preparada una cantidad de producto inferior a 10 g, volver a tapar la cápsula 
y pesar con precisión de 0,1 mg (masa M2). 
Para que se cumpla el grado de precisión, se recomie nda utilizar una cantidad de muestra superior a 1 g y 
en los productos heterogéneos utilizar de 3 a 5 veces más de la cantidad mínima propuesta. 
A.9.6.2  Después de pesar, mezclar bien la muestra con arena o colocarla sobre la gasa. Si es necesario, 
añadir unos centímetros cúbicos de agua destila da, lo cual facilita una mezcla uniforme. 
A.9.6.3  Si la muestra lo requiere, evaporar a sequedad,  sin tapa, por medio de un baño maría o placa 
calefactora a un máximo de 100 °C. Durante la evapor ación, el contenido de la cápsula debe removerse de 
vez en cuando al principio y más a menudo al final. Evitar las pérdidas de sustancia y arena. 
A.9.6.4  Introducir en la estufa las cápsulas con la muestra previamente evaporada, colocar las tapas de 
manera que al final del tiempo de secado puedan taparse rápidamente, cerrar la estufa y secar durante 4 horas a 100° ± 2 °C. Abrir la estufa, tapar las cápsulas  y colocarlas en los desecadores, dejar enfriar hasta 
temperatura ambiente y pesar inmediatamen te con precisión de 0,1 mg (masa M3). 
A.9.7 Expresión de resultados.  
A.9.7.1  Método de cálculo. 
El contenido de humedad en la muestra se calcula con la siguiente fórmula expresada en por ciento: 
Humedad en %= M2 – M3 x 100 
 M2 – M1 En donde: 
M1 = Peso de la cápsula con arena o gasa (g). 
M2 = Peso de la cápsula con arena o gasa más muestra húmeda (g). 
M3 = Peso de la cápsula con arena o gasa más muestra seca (g). 
Nota: Indicar el valor medio de la determinación por duplicado con un decimal. A.9.7.2  Grado de precisión 
Repetibilidad: no debe exceder de 0,1 g por 100 g de muestra. Si el producto es homogéneo y la diferencia exce de 0,1 g/100 g, debe repetirse la determinación. Sin 
embargo para ciertas materias heterogéneas las difere ncias admisibles pueden alcanzar de 0,3 a 0,5 g/100 g. 
A.9.8 Informe de la prueba.  
Informar: humedad en %. A.10. Determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en 
alimentos, agua potable y agua purificada por espectrometría de absorción atómica. 
A.10.1 Fundamento.  
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encu entra presente en forma de vapor atómico. La medida Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por  el vapor atómico permite determinar el porciento de 
absorción. 
La cantidad de absorción aumenta con la  concentración de los átomos en el  medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorción aumenta con la concentración del  elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento. 
A.10.2 Definiciones.  
A.10.2.1  Blanco de calibración del instrumento , es la solución del ácido usado como diluyente. 
A.10.2.2  Blanco de reactivos , a la solución que contiene todos los reactivos usados en los mismos 
volúmenes y concentraciones en el procesamiento de la  muestra. Este blanco debe seguir los pasos de 
digestión y preparación de la muestra. 
A.10.2.3  Blanco de reactivos fortificado , a la solución que se prepara a partir de una alícuota del blanco 
de reactivos, añadiendo una alícuota de la solución estándar concentrada "solución madre", para dar una 
concentración final que produzca una absorbancia aceptabl e (aproximadamente 0,1) para el analito. El blanco 
de reactivos fortificado debe seguir el mismo esqu ema de digestión y preparación de la muestra. 
A.10.2.4  Espectrometría , a la rama de la espectroscopia relacionada con la medición de espectros. 
A.10.2.5  Espectrometría de absorción atómica , a la rama del análisis instrumental en el cual un 
elemento es atomizado en forma tal que permite la observación, selección y medida de su espectro de 
absorción. 
A.10.2.5.1  Espectrometría de absorción atómica por flama , al método por el cual el elemento se 
determina mediante un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un sistema de 
nebulización y una fuente de atomización. 
La fuente de atomización es un quema dor que utiliza diferentes mezclas de gases, las más frecuentes son 
aire-acetileno y óxido nitroso-acetileno. 
A.10.2.5.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito , al método mediante el cual el 
elemento se determina por un espectrómetro de abs orción atómica, usado en conjunto con un horno de 
grafito. El principio es esencialmente el mismo qu e en absorción atómica de aspiración directa en flama, 
excepto que se usa un horno en lugar de la flama para atomizar la muestra. 
A.10.2.5.3  Espectrometría de absorción at ómica por generación de hidruros , al método similar al del 
vapor frío. Las muestras reaccionan en un disposit ivo externo con un agente reductor, generalmente 
borohidruro. Los productos gaseosos de reacción se llevan a una celda de muestreo que se encuentra en el paso óptico del espectrómetro de absor ción atómica, en este caso, los productos de reacción son hidruros 
volátiles. Estos compuestos moleculares no son capaces  de dar una señal de absorci ón atómica, por lo tanto 
la celda se calienta para disociar el hidruro gaseoso en  átomos libres. Cuando el hidruro gaseoso se disocia 
en la celda calentada en átomos libres, la absorción at ómica crece y cae a medida que se crean los átomos y 
escapan de la celda de absorción. Se mide el máximo de  absorción o altura de pico, como señal analítica. Los 
elementos que se pueden determinar con esta técn ica son: As, Bi, Ge, Pb, Sb, Se, Te y Sn. 
A.10.2.5.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío , al método que es otra aproximación 
para mejorar la sensibilidad de la absorción atómica, optimizando la eficiencia de muestreo en el quemador de 
pre-mezcla, en donde el mercurio se reduce químicament e al estado atómico libre haciendo reaccionar la 
muestra con un reductor fuerte (cloruro estanoso o bo rohidruro de sodio) en un recipiente de reacción cerrado. 
El mercurio volátil libre se arrastra del matraz de reacción burbujeando aire o nitrógeno a través de la solución. Los átomos del mercurio que se arrastran son transpor tados a una celda de absorción que se coloca en el 
paso de luz del espectrómetro de absorción atómica. A medida que los átomos de mercurio pasan por la celda de muestreo, la absorbancia medida se incrementa indi cando el aumento de concentración en el paso de luz. 
A.10.2.6  Espectroscopia , al área de la física y la química dedicada al estudio de la generación, medición 
e interpretación de los espectros de energía (electroma gnético o partícula) que resulta ya sea de la emisión o 
absorción de energía radiante o partículas de una su stancia cuando se le bombardea con radiación 
electromagnética, electrones, neutrones , protones, iones o bien por calentamiento, excitación con un campo 
eléctrico magnético, usada para invest igar estructura nuclear y atómica. 
A.10.2.7  Método de adiciones estándar , al que implica la preparación de estándares en la matriz de la 
muestra, añadiendo cantidades conocidas de un está ndar a una o más alícuotas de la muestra y que 
compensa los efectos de exaltación o depresión de la seña l del analito, pero no corrige interferencias aditivas 
que causan una desviación de la línea de base y en la cual los resultados obtenidos son válidos si: 
La curva analítica es lineal. La forma química del analito es la misma que en la muestra.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
El efecto de interferencia es cons tante en el intervalo de trabajo. 
La señal se corrige por interferencia aditiva. A.10.2.8  Muestra de control de calidad , es una muestra externa al laboratorio, que contiene una alícuota 
de concentración conocida del analito, cuyos valores de absorbancia deben estar comprendidos en el rango 
lineal del método. 
A.10.2.9  Muestra fortificada , a la muestra a la cual se le adiciona una alícuota de concentración conocida 
del analito, diluida en el ácido apropiado de tal forma que la solución resultante t enga una absorbancia de 0,1 
aproximadamente. 
A.10.3 Reactivos y materiales  
A.10.3.1 Reactivos A.10.3.1.1 Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales. 
A.10.3.1.2 Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 
25ºC. 
A.10.3.1.3 Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro. 
A.10.3.1.4 Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo. 
A.10.3.1.5 Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro. 
A.10.3.1.6 Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro. 
A.10.3.1.7 Acido sulfúrico (densidad específ ica 1,84), grado suprapuro. 
A.10.3.1.8 Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro. 
A.10.3.1.9 Acido nítrico 65% v/v grado RA. 
A.10.3.1.10 Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12). 
A.10.3.1.11 Hidróxido de sodio granalla reactivo RA. 
A.10.3.1.12 Aire comprimido seco y limpio. 
A.10.3.1.13 Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado absorción atómica. 
A.10.3.1.14 Solución de Nitrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O 
en 1000 mL de HCl 1 N. 
A.10.3.1.15 Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL  de HCl y llevar a 100 mL de agua. 
A.10.3.1.16 Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO 3 al 65% v/v grado suprapuro en 50 mL de agua. 
A.10.3.1.17 Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua. 
A.10.3.1.18 Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL  de HCl y llevar a 100 mL con agua. 
A.10.3.1.19 Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 mL de agua (esta 
solución debe prepararse en el momento de usarse). 
A.10.3.1.20 Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 mL de agua (esta 
solución debe prepararse en el momento de usarse). 
A.10.3.1.21 Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 
mL con agua. 
A.10.3.1.22 Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 mL de 
agua. 
A.10.3.1.23 Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Dilui r 1,5 mL de HCl en 100 mL de agua destilada 
deionizada. 
A.10.3.1.24 Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL 
con agua destilada deionizada. 
A.10.3.1.25 Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 
4 g de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío. 
A.10.3.1.26 Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g 
de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de clorur o o sulfato estanoso en solución. Diluir a 500 mL. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.10.3.1.27 Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 500 mL de 
agua destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido n ítrico concentrado de muy baja concentración  de 
mercurio y 67 mL de ácido sulfúrico co ncentrado. Diluir al volumen con agua. 
Solución de trabajo de As de 1 µg/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000 µg/mL a 1 L con ácido 
sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grado suprapuro. Preparar fresca cada día. 
A.10.3.2 Materiales 
A.10.3.2.1  Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL. 
A.10.3.2.2  Sistema de reflujo con refrigerante. 
A.10.3.2.3  Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad. 
A.10.3.2.4  Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad. 
A.10.3.2.5  Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades. 
A.10.3.2.6  Matraces volumétricos de diferentes capacidades. 
A.10.3.2.7  Matraces redondos de fondo plano de 50 mL. 
A.10.3.2.8  Bombas Parr. 
A.10.3.2.9  Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades. 
A.10.3.2.10  Puntas de plástico para micropipetas. 
A.10.3.2.11  Papel filtro Whatman No. 2. 
A.10.3.2.12  Perlas de ebullición. 
A.10.3.2.13  Varillas de plástico. 
A.10.3.2.14  Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL. 
A.10.3.2.15  Recipientes de propilen o propileno. 
A.10.3.2.16  Embudos de filtración de diferentes capacidades. 
A.10.3.2.17  Material común de laboratorio. 
A.10.3.2.17.1 Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes 
instrucciones: 
A.10.3.2.17.1.1 El jabón que se use debe ser de preferencia neutro. 
A.10.3.2.17.1.2 Enjuagar perfectamente con agua corriente. 
A.10.3.2.17.1.3 Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que 
contenga una solución de ácido nítrico grado RA al 30%. 
A.10.3.2.17.1.4 Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas. 
A.10.3.2.17.1.5 Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada. 
A.10.3.2.17.1.6 Dejar escurrir y secar. 
A.10.3.2.17.1.7 Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire. 
A.10.4 Aparatos e instrumentos.  
A.10.4.1 Aparatos. A.10.4.1.1  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, 
cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc. 
A.10.4.1.2  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga. 
A.10.4.1.3  Automuestreador y recirculador de agua. 
A.10.4.1.4  Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC. 
A.10.4.1.5  Horno de microondas. 
A.10.4.1.6  Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión. 
A.10.4.1.7  Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm. 
A.10.4.2 Instrumentos      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.10.4.2.1  Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su 
operación. 
A.10.4.2.2  Espectrómetro de absorción atómica equipado con lo s accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir. 
A.10.4.2.3  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg. 
A.10.4.2.4  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10 ºC. 
A.10.4.2.5  Horno de calentamiento (estufa) con in tervalo de temperatura de 120 ± 5ºC. 
A.10.5 Preparación de la muestra.  
A.10.5.1  Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn. 
A.10.5.1.1  Digestión por vía húmeda. 
A.10.5.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
A.10.5.1.1.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar 
directamente la digestión. 
A.10.5.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes. 
A.10.5.1.1.4  Calentar suavemente. 
A.10.5.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es  necesario (algunas muestras requieren la 
adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la apar ición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar 
peróxido de hidrógeno gota a gota con agit ación continua (reacción exotérmica). 
A.10.5.1.1.6  Enfriar. 
A.10.5.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico. 
A.10.5.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
A.10.5.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectróm etro de absorción atómica por flama u horno de 
grafito). 
A.10.5.1.2  Digestión por vía seca. 
A.10.5.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g. 
A.10.5.1.2.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar 
directamente la digestión. En productos con alta conc entración de proteínas adicionar una solución de nitrato 
de magnesio al 7,0% p/v y mezclar completamente, ll evar a sequedad aproximadamente durante 6 horas en 
estufa a una temperatura de 90 a 95ºC. 
A.10.5.1.2.3  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4 ºC por minuto 
hasta 350 °C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos. 
A.10.5.1.2.4  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550 ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura dur ante 16 horas o toda la noche. 
A.10.5.1.2.5  Apagar la mufla y dejar enfriar. 
A.10.5.1.2.6  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento: 
A.10.5.1.2.6  .1 Lavar las paredes del crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una 
placa de calentamiento puesta a 120 ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y elevar la temperatura gradualmente de 500 a 5 50 ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir 
este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente. 
A.10.5.1.2.7  Disolver las cenizas completamente en 5 mL de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volume n conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 
mL de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo  o matraz para obtener un volumen de 15 mL en el Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si  existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2,  antes de la determinación. 
A.10.5.1.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
A.10.5.1.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
A.10.5.2  Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn. 
A.10.5.2.1  Proceder igual que en el  punto A.10.5.1.1.1. 
A.10.5.2.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día. 
A.10.5.2.3  Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos 
en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma. 
A.10.5.2.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine. 
A.10.5.2.5  Retirar la muestra del calor. 
A.10.5.2.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos. 
A.10.5.2.7  Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico c oncentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro se a liberado. Aumentar la temperatura gradualmente 
hasta ebullición. 
A.10.5.2.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL, usando un matraz similar con 15 mL de agua como 
patrón de volumen. 
A.10.5.2.9  Adicionar aproximadamente 40 mL de agua. 
A.10.5.2.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar con 10 mL de agua. 
A.10.5.2.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda 
la noche o por más tiempo. 
A.10.5.2.12  Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz. 
A.10.5.2.13  Enfriar a temperatura ambiente. 
A.10.5.2.14  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz. 
A.10.5.2.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL  a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno. 
A.10.5.2.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses. 
A.10.5.2.17  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
A.10.5.2.18  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito). 
A.10.5.3  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg. 
A.10.5.3.1  Sistema de reflujo. 
A.10.5.3.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad  apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición. 
A.10.5.3.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de ácido 
nítrico concentrado y calentar durant e media hora o hasta que no se observen cambios en la digestión. 
A.10.5.3.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1). 
A.10.5.3.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a go ta sobre las paredes del recipiente, hasta que 
el color obscuro de la solución desaparezca. 
A.10.5.3.1.5  Enfriar. 
A.10.5.3.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución. 
A.10.5.3.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
A.10.5.3.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
A.10.5.3.2  Sistema cerrado.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.10.5.3.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad  apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión. 
A.10.5.3.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado. 
A.10.5.3.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión. 
A.10.5.3.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se utiliza bomba Parr, calentar en pa rrilla controlando la temperatura a un máximo de 300 
ºC por 30 minutos. 
A.10.5.3.2.5  Enfriar a temperatura ambiente. 
A.10.5.3.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir la 
digestión. 
A.10.5.3.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg. 
A.10.5.3.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
A.10.5.3.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío). 
A.10.5.4  Digestión para la determinación de As. 
A.10.5.4.1  Digestión por vía húmeda-seca. 
A.10.5.4.1.1  Proceder como en el punto A.10.5.3.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos. 
A.10.5.4.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados. 
A.10.5.4.1.3  Añadir 1 mL de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad. 
A.10.5.4.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375 ºC. 
A.10.5.4.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450 ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y 
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 minutos. 
A.10.5.4.1.6  Enfriar y disolver el residuo en 2,0 mL de ácido clorhídrico 8 M. 
A.10.5.4.1.7  Añadir 0,1 mL de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III). 
A.10.5.4.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un matraz y llevar al aforo con 
agua. 
A.10.5.4.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. 
A.10.5.4.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómet ro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
A.10.5.4.2  Digestión por vía seca. 
A.10.5.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o de 
platino. 
A.10.5.4.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v. 
A.10.5.4.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol. 
A.10.5.4.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradu almente la temperatura hasta 300 ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualment e la temperatura hasta 500 ºC por 16 horas o durante toda la noche. 
A.10.5.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v. 
A.10.5.4.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido. 
A.10.5.4.2.7  Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500 ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total. 
A.10.5.4.2.8  Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 mL de ácido 
clorhídrico 0,5 N. 
A.10.5.4.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 mL de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 mL de 
solución de yoduro de potasio al 15% y mezclar. 
A.10.5.4.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo. 
A.10.5.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fo rtificada por cada serie de digestión. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.10.5.4.2.12  Leer en el aparato de elección (espectrómet ro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros). 
A.10.5.5  Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas. 
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como má ximo de muestra, añadir 6 mL de ácido nítrico 
concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar pe rfectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante. 
A.10.6 Procedimiento.  
A.10.6.1  Espectrometría de absorción atómica por flama. 
A.10.6.1.1  Calibración. Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable. 
A.10.6.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del inst rumento y en el sistema de adquisición de datos. 
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos. 
A.10.6.1.1.2  Se debe verificar la estabilidad del instrument o mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%. 
A.10.6.1.1.3  El instrumento debe calibrarse para el analit o a determinar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 nive les de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito. 
A.10.6.1.1.4  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de 
calibración del analito de menor a mayor concentración y re gistrar al menos tres réplicas de la absorbancia de 
cada uno. 
A.10.6.1.1.5  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica. 
A.10.6.1.2  Operación del instrumento. 
El desempeño del instrumento se verifica mediante el  empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC). 
A.10.6.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC,  el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe re calibrar y verificar la nueva calibración. 
A.10.6.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analit o difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse. 
Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar. 
A.10.6.1.2.3  La demostración de la operatividad inicial del  instrumento se hace estableciendo los límites 
de detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se 
usa un blanco de reactivos fortificado con una concentraci ón del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de  lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a: 
LDM= t x s t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada para 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas. 
s = desviación estándar de las réplicas del análisis. 
El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próx imo al límite superior del intervalo lineal. 
A.10.6.1.3  Determinación 
A.10.6.1.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las in dicaciones del manual del instrumento.      (Primera Sección) DIARIO  OFICIAL Lunes 8 de abril de 2013 
A.10.6.1.3.2  Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen de manifiesto la calidad de los reactivos usados  y el grado de contaminación del laboratorio. 
A.10.6.1.3.3  En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la 
concentración del elemento en las unidades de concentración utilizadas. 
A.10.6.1.3.4  Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fortificado para cada grupo de muestras. 
Se calcula la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo al apartado A.10.6.1.3.6). 
A.10.6.1.3.5  Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia. 
A.10.6.1.3.6  Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo a: 
R = CM – C x 100 
 CA R = % recuperación. CM = Concentración de la muestra fortificada. C = Concentración de la muestra. CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra. Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar. 
A.10.6.2  Espectrometría de absorción at ómica por horno de grafito. 
A.10.6.2.1  Calibración. 
A.10.6.2.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos  A.10.6.1.1.1 al  A.10.6.1.1.4. 
A.10.6.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito. 
La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos 
de concentración respuesta es aceptada. 
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se  programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica. 
A.10.6.2.2  Operación del instrumento. 
A.10.6.2.2.1  Proceder de acuerdo al A. 10.6.1.2.1 al A.10.6.1.2.3. 
A.10.6.2.3  Determinación. 
A.10.6.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las re comendaciones del manual del instrumento. 
El programa de temperaturas para el horno de graf ito puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no específi cas (absorción molecular o di spersión de la luz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto  a los métodos disponibles para eliminarlas, así como 
en el caso de interferencias de matriz. 
A.10.6.3  Espectrometría de absorción atóm ica por generador de hidruros. 
A.10.6.3.1  Calibración. 
A.10.6.3.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos  A.10.6.1.1.1 al  A.10.6.1.1.4. 
A.10.6.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al méto do. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en función de la concentraci ón del analito para un intervalo de concentración de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra. 
A.10.6.3.2  Operación del instrumento. 
A.10.6.3.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos  A.10.6.1.2.1 al  A.10.6.1.2.3. 
A.10.6.3.3  Determinación. Lunes 8 de abril de 2013 DIARIO OFIC IAL (Primera Sección)       
A.10.6.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar la 
celda de absorción de acuerdo al manual del fabric ante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
A.10.6.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante. 
A.10.6.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito (por lo 
general, 10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el 
tiempo de reacción y el tiempo de purga II. 
A.10.6.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración. 
A.10.6.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío. 
A.10.6.4.1  Calibración. 
A.10.6.4.1.1  Proceder igual que en los puntos  A.10.6.1.1.1 al  A.10.6.1.1.4. 
A.10.6.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/mL preparar estándares de calibración que 
contengan 0, 0,2, 0,4,  0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de r eacción. A cada frasco agregar 100 mL de la 
solución de dilución y 20 mL de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura máxima de pico) en función de la concentración del analito. 
A.10.6.4.2  Operación del instrumento. 
A.10.6.4.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos  A.10.6.1.2.1 al  A.10.6.1.2.3. 
A.10.6.4.3  Determinación. 
A.10.6.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómic a en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit  0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo al manual del fabr icante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón). 
A.10.6.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante. 
A.10.6.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito. 
A.10.6.4.3.4  Tomar 25 mL de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración. 
A.10.7 Expresión de resultados.  
Método de cálculo. Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula: 
mg/ kg = A x B 
 C donde: A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración. B = Volumen final al que se llevó la muestra (mL). 
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (mL) en el caso de agua. 
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg. 
A.10.8 Informe de la prueba.  
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar. 
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