Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     1 
CUARTA SECCION  
PODER EJECUTIVO  
SECRETARIA DE SALUD  
NORMA Oficial Mexicana NOM -131-SSA1 -2012, Productos y servicios. Fórmulas para lactantes, de continuación 
y para necesidades especiales de nutrición. Alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños de corta edad. 
Disposiciones y e specificaciones sanitarias y nutrimentales. Etiquetado y métodos de prueba (Continúa en la 
Quinta Sección)  
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos. - Secretaría de  Salud.  
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Fede ral para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
con fundamento en lo dispuesto por el artículo 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 
de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3 fracción XXII, 17 Bis fracción III, 115 fracciones IV y VI, 
194 fracción I, 195, 199, 210, 212, 215 fracciones I, II, III y IV y 216 de la Ley General de Salud; 3 fracción XI, 
38 fracción II, 40 fracciones  I, XI y XII, 41, 43, 47 fracción IV, 51 y 52 de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización; 28 y 33 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 1 fracción XII, 25, 
137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 , 150 y 151 del Reglamento de Control 
Sanitario de Productos y Servicios; 2 inciso C fracción X y 36 del Reglamento Interior de la Secretaría de 
Salud; 3 fracciones I incisos c, d y l, y II, 10 fracciones IV y VIII del Reglamento de la Comisión Federal par a la 
Protección contra Riesgos Sanitarios, y  
CONSIDERANDO  
Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y 
Normalización, el Subcomité de Productos y Servicios presentó el 27 de abril de 2011 al Comité Con sultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, el anteproyecto de la presente Norma Oficial 
Mexicana.  
Que con fecha del 13 de febrero de 2012, en cumplimiento del acuerdo del Comité y de lo previsto en el 
artículo 47 fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó en el Diario Oficial de la 
Federación el proyecto de la presente Norma Oficial Mexicana, a efecto de que dentro de los siguientes 
sesenta días naturales posteriores a dicha publicación, los interesad os presentaran sus comentarios al Comité 
Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario.  
Que con fecha previa, fueron publicadas en el Diario Oficial de la Federación, las respuestas a los 
comentarios recibidos por el mencionado Com ité, en los términos del artículo 47 fracción III de la Ley Federal 
sobre Metrología y Normalización.  
Que en atención a las anteriores consideraciones, contando con la aprobación del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanit ario, tengo a bien expedir y ordenar la publicación 
en el Diario Oficial de la Federación la siguiente:  
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM -131-SSA1 -2012, PRODUCTOS Y SERVICIOS. F ORMULAS PARA 
LACTANTES, DE CONTINUACI ON Y PARA NECESIDADES ESPECIALES DE NUTRICI ON. AL IMENTOS 
Y BEBIDAS NO ALCOH OLICAS PARA LACTANTES Y NIÑOS DE CORTA EDAD. DISPOSICIONES Y 
ESPECIFICACIONES SANITARIAS Y NUTRIMENTALES. ETIQUETADO Y M ETODOS DE PRUEBA  
PREFACIO  
En la elaboración de la presente norma participaron los siguientes organismos e inst ituciones:  
Secretaría de Salud.  
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.  
Centro Nacional de Equidad de Género y Salud Reproductiva.  
Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición "Salvador Zubirán".  
Instituto Nacional de Pediatría . 
Instituto Nacional de Perinatología.  
Procuraduría Federal del Consumidor.  2     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Sistema para el Desarrollo Integral de la Familia del Distrito Federal.  
Instituto Politécnico Nacional.  
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.  
Escuela de Dietética y Nutrición de l ISSSTE.  
Asociación Mexicana de Productos Infantiles A.C.  
PBM Products México, S. de R.L. de C.V.  
Vázquez Tercero y Asociados, S.C.  
Asociación Pro Lactancia Materna.  
Cámara Nacional de Industriales de la Leche (CANILEC).  
Abbott Laboratories de México, S.A . de C.V.  
Bayer de México, S.A. de C.V.  
Danone de México, S.A. de C.V.  
Mead Johnson. Nutricionales de México, S. de R.L. de C.V.  
Nestlé México, S.A. de C.V.  
Wyeth, S. de R.L. de C.V.  
Cámara Nacional de la Industria de la Transformación (CANACINTRA)/Rama 61 . 
Confederación de Cámaras Industriales de los Estados Unidos Mexicanos (CONCAMIN).  
INDICE  
1. Objetivo y campo de aplicación  
2. Referencias  
3. Definiciones  
4. Símbolos y abreviaturas  
5. Clasificación  
6. Disposiciones sanitarias generales  
7. Disposiciones s anitarias para fórmulas  
8. Disposiciones sanitarias para alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños de corta edad  
9. Muestreo y métodos de prueba  
10. Etiquetado  
11. Envase y embalaje  
12. Concordancia con normas internacionales  
13. Bibliograf ía 
14. Observancia de la norma  
15. Vigencia  
16. Apéndices Normativos  
 "A" Sustancias nutritivas  
 "B" Métodos de prueba  
1. Objetivo y campo de aplicación  
1.1 Esta norma establece las disposiciones y especificaciones sanitarias, nutrimentales y de etiquetado  
que deben cumplir:  
- las fórmulas para lactantes,  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     3 
- las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición,  
- las fórmulas de continuación,  
- las fórmulas de continuación para necesidades especiales de nutrición, y  
- los alimentos y bebidas n o alcohólicas para lactantes y niños de corta edad.  
Así como los métodos de prueba.  
1.2 Esta norma es de observancia obligatoria para las personas físicas y morales que se dedican al 
proceso y/o importación de los productos objeto de la misma, que van a se r comercializados en el territorio 
nacional.  
2. Referencias  
Esta norma se complementa con las siguientes Normas Oficiales Mexicanas, sus modificaciones o las que 
las sustituyan:  
2.1 Norma Oficial Mexicana NOM -007-SSA2 -1993, Atención de la mujer durante el embarazo, parto y 
puerperio y del recién nacido. Criterios y procedimientos para la prestación del servicio.  
2.2 Norma Oficial Mexicana NOM -051-SCFI/SSA1 -2010, Especificaciones generales de etiquetado para 
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados. I nformación comercial y sanitaria.  
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM -086-SSA1 -1994, Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales.  
2.4 Norma Oficial Mexicana NOM -130-SSA1 -1995, Biene s y Servicios. Alimentos envasados en 
recipientes de cierre hermético y sometidos a tratamiento térmico. Disposiciones y especificaciones sanitarias.  
2.5 Norma Oficial Mexicana NOM -251-SSA1 -2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o  suplementos alimenticios.  
3. Definiciones  
Para fines de esta norma se entiende por:  
3.1 Ablactación o alimentación complementaria , a la incorporación a la dieta del lactante de alimentos 
distintos a la leche materna o su sucedáneo, realizándose gradual y progresivamente a partir de los 6 meses 
de edad o de acuerdo con las necesidades específicas de cada lactante.  
3.2 Acidos grasos trans , a todos los  isómeros geométricos de ácidos grasos monoinsaturados y 
poliinsaturados que poseen en la configuración trans  dobles enlaces carbono -carbono no conjugados.  
3.3 Aditivo alimentario (Aditivo) , cualquier sustancia que en cuanto tal no se consume normalmente 
como alimento, ni tampoco se usa como ingrediente básico en alimentos, tenga o no valor nutritivo, y cuya 
adición al producto con fines tecnológicos en sus fases de producción, elaboración, preparación, tratamiento, 
envasado, empaquetado, transporte o almacenamiento, resulte o pueda preverse razonablemente que resulte 
(directa o indirectamente) por sí o sus subpro ductos, en un componente del producto o un elemento que 
afecte a sus características (incluidas las organolépticas). Esta definición no incluye "contaminantes" o 
sustancias añadidas al producto para mantener o mejorar las cualidades nutrimentales.  
3.4 Agua  para uso y consumo humano (agua potable) , al agua que no contiene contaminantes 
objetables, químicos o agentes infecciosos y que no causa efectos nocivos para la salud.  
3.5 Alimento , a cualquier sustancia o producto, sólido, semisólido, natural o transfor mado, que 
proporciona al organismo elementos para su nutrición.  
3.6 Alimentos  a base de cereales para lactantes y niños de corta edad , a los productos elaborados 
principalmente con uno o más cereales molidos, que constituirán al menos el 25 % de la mezcla final en base 
seca, adicionados o no de otros ingredientes, destinados a complementar la dieta de los lactantes a partir de 
los seis meses en adelante y para los niños de corta edad como parte de una dieta progresivamente 
diversificada.  
3.7 Alimentos deshi dratados , aquellos en los que se ha eliminado agua por medios físicos a fin de evitar 
su descomposición y son reconstituidos mediante dilución, no incluye los alimentos a base de cereales.  4     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
3.8 Alimentos y bebidas no alcohólicas listos para ser consumidos , a los sometidos a tratamiento 
térmico antes o después de ser envasados en recipientes herméticamente cerrados, los cuales deben ser 
comercialmente estériles . 
3.9 Alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños de corta edad , son los productos 
industrializados que se utilizan principalmente durante el período normal de ablactación de los lactantes o en 
la alimentación de los niños de corta edad. Se preparan para ser consumidos directamente o deshidratados 
para ser reconstituidos.  
3.10 Bajo peso al nacer , el que se refiere a un lactante que pesa al nacimiento menos de 2500 g.  
3.11 Bebida no alcohólica , cualquier líquido, natural o transformado, que proporcione al organismo 
elementos para su nutrición.  
3.12 Contaminante , a cualquier agente biológico o  químico, materia extraña u otras sustancias no 
añadidas intencionalmente a los alimentos y bebidas, que puedan comprometer la inocuidad o la aptitud de 
los alimentos.  
3.13 Chupón , al objeto de goma o plástico con forma de pezón que se les da a los bebés p ara que 
succionen la leche.  
3.14 Destete , a la suspensión de la lactancia al pecho.  
3.15 Envase , a cualquier recipiente o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor.  
3.16 Etiqueta , a cualquier rótulo, marbete, i nscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepuesta o fijada al envase del 
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del producto, al embalaje.  
3.17 Fórmula para lactantes , al sucedáneo de la leche materna especialmente fabricado para satisfacer, 
por sí solo, las necesidades nutrimentales de los lactantes durante sus primeros meses de vida hasta la 
introducción  de la ablactación o ali mentación complementaria correspondiente.  
3.18 Fórmula de continuación , al alimento destinado a ser utilizado como componente líquido de la dieta 
de destete del lactante a partir del sexto mes y para niños de corta edad.  
3.19 Fórmula de continuación para n ecesidades especiales de nutrición , al alimento destinado a ser 
utilizado como componente líquido de la dieta de destete del lactante a partir del sexto mes de vida y para 
niños de corta edad, en casos de trastornos, enfermedades o condiciones médicas espe cíficas.  
3.20 Fórmula para lactantes con necesidades especiales de nutrición , al sucedáneo de la leche 
materna o de la fórmula para lactantes, especialmente fabricado para satisfacer, por sí solo, las necesidades 
nutrimentales de los lactantes con trastorn os, enfermedades o condiciones médicas específicas durante sus 
primeros meses de vida hasta la introducción de la ablactación o alimentación complementaria 
correspondiente. Incluye a los fortificadores de leche materna o humana.  
3.21 Fortificador de leche materna o humana , al producto que puede añadirse a la leche de la especie 
humana para proporcionar nutrimentos adicionales en la alimentación de los lactantes con bajo peso al nacer 
y recién nacidos pretérmino.  
3.22 Inocuo , lo que no hace o causa daño a la  salud.  
3.23 Información nutrimental , a toda descripción destinada a informar al consumidor sobre las 
propiedades nutrimentales de un alimento o bebida no alcohólica preenvasado. Comprende dos aspectos:  
- La declaración nutrimental obligatoria.  
- La declar ación nutrimental complementaria.  
3.24 Lactantes , a los niños hasta los doce meses de edad.  
3.25 Leche materna o humana , a la secreción producida por las glándulas mamarias de la especie 
humana después del calostro y cuya función es alimentar al lactante. Esta leche contiene los nutrimentos, así 
como una serie de compuestos bioactivos y componentes celulares que ejercen diferentes efectos biológicos 
que el lactante requiere para su crecimiento y desarrollo. Representa el único alimento del lactante en los 
primeros meses de vida.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     5 
3.26 Límite , a la cantidad establecida de nutrimentos, aditivos, microorganismos, materia extraña, 
plaguicidas, biotoxinas, residuos de medicamentos y metales pesados.  
3.27 Limpieza , a la acción que tiene por objeto quitar la sucieda d. 
3.28. Materia extraña , aquella sustancia, resto o desecho orgánico o inorgánico, que se presenta en el 
producto sea por contaminación o por manejo poco higiénico del mismo durante su elaboración, distribución y 
comercialización que resultan perjudiciale s para la salud.  
3.29 Metal pesado o metaloide , aquellos elementos químicos que causan efectos indeseables en el 
metabolismo, aun en concentraciones bajas. Su toxicidad depende de la dosis en que se ingieren, así como 
de su acumulación en el organismo.  
3.30 Métodos de prueba , a procedimientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que un 
producto satisface las especificaciones que establece la norma.  
3.31 Niños de corta edad , a los mayores de doce meses y hasta los treinta y seis meses de ed ad. 
3.32 Nivel superior de referencia , al que se aplica a los nutrimentos sobre los que no se dispone de 
suficiente información para realizar una evaluación de riesgos basada en conocimientos científicos, dichos 
niveles son valores derivados considerando l as necesidades nutrimentales de los lactantes y un historial 
establecido de uso aparente inocuo. Pueden ajustarse de acuerdo con los progresos científicos y tecnológicos 
pertinentes. La finalidad de un nivel superior de referencia es proporcionar orientaci ón a los fabricantes y no 
deben interpretarse como valores deseables.  
3.33 Prácticas de higiene , a las medidas necesarias para garantizar la inocuidad de los productos.  
3.34 Proceso , al conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabrica ción, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, almacenamiento  y 
expendio o suministro al público de productos.  
3.35 Recién nacido pretérmino , al producto de la concepción de 28 semanas a meno s de 37 semanas 
de gestación.  
3.36 Sucedáneo de la leche materna o humana , a las fórmulas comercializadas presentadas como 
sustituto parciales o totales de la leche materna o humana.  
4. Símbolos y abreviaturas  
Cuando en esta norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:  
A absorbancia  
ARA ácido araquidónico  
BPF Buenas Prácticas de Fabricación  
°C grados Celsius  
cm centímetro  
cm2 centímetro cuadrado  
DHA  ácido docosahexaenoico  
EPA ácido eicosapentaenoico  
eq equivalente  
g gramo 
h hora 
IDR Ingesta Diaria Recomendada  
IDS Ingesta Diaria Sugerida  
kcal kilocalorías  
kg kilogramo  
kJ kilojoules  
l litro 6     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
L levógiro  
m masa  
mg miligramo  
min minutos  
ml mililitro  
mM milimolar  
mm milímetro  
m/m masa masa  
mOsm  miliosmol  
mv milivolt  
M molar  
N normal  
NaCl  cloruro de sodio  
N.A. no aplica  
ng nanogramo  
nm nanómetro  
NMP  Número Más Probable  
No. número  
NSR  Nivel Superior de Referencia  
oz onza  
pH potencial de hidrógeno  
REP Relación de Eficiencia Proteica  
rpm revoluciones por minuto  
T transmitancia  
UFC Unidades Formadoras de Colonias  
U.I. Unidad Internacional  
µg microgramo  
µm micrómetro  
S.E. sin especificación  
seg segundos  
VNR  Valores Nutrimentales de Referencia  
v/v volumen a volumen  
/ por 
% por ciento  
= menor o igual  
> mayor que  
< menor que  
Cuando en est a Norma se mencionen los siguientes términos, debe entenderse:  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     7 
Acuerdo , el "Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y 
suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias".  
CICOPLAFEST , la Comisión Intersec retarial para el Control del Proceso y uso de Plaguicidas, Fertilizantes 
y Sustancias Tóxicas.  
Fórmula , las fórmulas reguladas por este ordenamiento.  
Productos , los regulados por este ordenamiento, según corresponda.  
Reglamento , el Reglamento de Control Sa nitario de Productos y Servicios.  
Secretaría , la Secretaría de Salud.  
5. Clasificación  
Los productos se clasifican en:  
5.1 Fórmulas:  
5.1.1 Para lactantes.  
5.1.2 Para lactantes con necesidades especiales de nutrición.  
5.1.3 De continuación.  
5.1.4 De continu ación para necesidades especiales de nutrición.  
5.2 Alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños de corta edad:  
5.2.1  A base de cereales:  
5.2.1.1  Cereales que deben ser preparados para el consumo añadiendo leche u otros líquidos nutritivos 
idóneos (fórmulas).  
5.2.1.2  Cereales que deberán utilizarse después de ser cocidos en agua hirviendo u otros líquidos 
apropiados, incluidas las pastas.  
5.2.1.3  Galletas y otros productos de panificación.  
5.2.2  Listos para ser consumidos.  
5.2.3  Deshidratados.  
6. Disposiciones sanitarias generales  
Los establecimientos que se dediquen al proceso de los productos objeto de esta norma, deben:  
6.1 Cumplir con lo establecido en la NOM -251-SSA1 -2009, señalada en el apartado de referencias y para 
los productos importad os lo correspondiente a esta Norma.  
6.2 Instrumentar un plan de análisis de peligros y puntos críticos de control de conformidad con lo 
establecido en el Apéndice Normativo A de la Norma Oficial Mexicana NOM -251-SSA1 -2009, señalada en el 
apartado de refere ncias.  
6.3 Los productos y materias primas utilizadas en su elaboración deben cumplir con lo establecido en el 
Reglamento, las materias primas además:  
6.3.1 Deben estar limpias y ser inocuas.  
6.3.2 No deben exceder los límites máximos residuales de plaguic idas establecidos en el Catálogo Oficial 
de Plaguicidas de la CICOPLAFEST, ni contener cualquiera de los plaguicidas prohibidos en dicho Catálogo, 
según corresponda por la naturaleza de la materia prima.  
6.3.3  Cumplir con las normas oficiales mexicanas cor respondientes.  
6.4 Los productos y las materias primas que se utilicen en su elaboración no deben ser tratados con 
radiaciones ionizantes.  
6.5 Todos los procedimientos de elaboración y de desecación de los productos se deben llevar a cabo de 
manera que la pérdida de nutrimentos en los productos sea mínima, y se garanticen las cantidades de éstos 
que se declaran en la etiqueta.  
6.6 Los productos no deben contener residuos de hormonas, antibióticos y otros contaminantes o 
sustancias farmacológicamente activas . 8     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
6.7 El responsable del producto debe contar con la evidencia documental que demuestre que cumple con 
las especificaciones establecidas en esta norma, para cada producto que elabore o comercialice.  
6.8 En la elaboración de los productos objeto de esta nor ma se podrán utilizar los aditivos listados en el 
Acuerdo, bajo las especificaciones establecidas en el mismo.  
6.9 El responsable de la fabricación del producto debe disponer de:  
6.9.1  Medios tecnológicos y procedimientos de elaboración que permitan la inc orporación de los 
nutrimentos en forma satisfactoria, y  
6.9.2  Métodos de medición y control de las concentraciones de los nutrimentos añadidos a los productos.  
6.10 Los productos no podrán usar como ingrediente aceites o grasas hidrogenadas comercialmente.  
7. Disposiciones sanitarias para fórmulas  
7.1 Los responsables del expendio o suministro al público de fórmulas deben cumplir con el  Código 
Internacional de Comercialización de Sucedáneos de la Leche Materna y Resoluciones Posteriores de la 
Organización Mundial de la Salud.  
7.2 En las unidades médicas, no se permite la distribución gratuita ni la promoción de fórmulas para 
lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición directamente a las madres, queda 
sujeta la entrega y/o ind icación de estas fórmulas a menores de seis meses de edad únicamente bajo 
prescripción médica y con justificación por escrito en las unidades de atención del parto y en las de consulta 
externa.  
7.3 En las unidades médicas, guarderías o cualquier otro estab lecimiento similar en donde se preparan o 
administran fórmulas, los responsables de su preparación deben seguir al pie de la letra las indicaciones 
sugeridas por el fabricante, en la reconstitución y conservación de la misma.  
7.4 Las fórmulas deben ser pre paradas a base de leche de vaca o de otros animales o de mezclas de ellos 
y/o de otros ingredientes que se haya demostrado científicamente que son idóneos para la alimentación del 
grupo de edad al que van dirigidas y elaboradas de tal manera que eviten su deterioro o contaminación en 
todas las condiciones normales de manipulación, conservación y distribución.  
7.5 Una vez preparada según las instrucciones de uso dadas en la etiqueta, la fórmula estará exenta de 
grumos o partículas gruesas, para que pueda ser  administrada mediante un chupón de goma o de plástico.  
7.6 Especificaciones  
7.6.1  Microbiológicos  
7.6.1.1 Las fórmulas, deben cumplir con los criterios microbiológicos establecidos en la Tabla No. 1.  
Tabla No.  1 
Fórmulas en polvo  
Microorganismos  n c m M Clase del 
Plan  
Enterobacter sakazakii  
(especie de Cronobacter ) * 30 0 0 UFC/10 g  N.A. 2 
Salmonella spp. 60 0 0 UFC/25 g  N.A. 2 
Bacterias aerobias mesófilas 
** 5 2 500 UFC/g  5 000 UFC/g  3 
Enterobacteriaceas  10 2 0 UFC/10 g  N.A. 2 
n: número de muestras a  ser analizadas  
c: máximo número admisible de unidades de muestras defectuosas en un plan de dos clases, o de unidades de 
muestras marginalmente aceptables en un plan de tres clases  
m: un límite microbiológico que separa la buena calidad de la calidad defe ctuosa en un plan de dos clases o la 
buena calidad de la calidad marginalmente aceptable en un plan de 3 clases  
M: un límite microbiológico que separa, en un plan de tres clases, la calidad marginalmente aceptable de la 
defectuosa  
*Solo aplica para fórmula  para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición en 
polvo y cuando se detecte presencia de Enterobacterias  
**No aplica para aquellos productos que contienen probióticos en su formulación  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     9 
7.6.1.2 Las fórmulas líquidas sujeta s a tratamiento térmico y envasadas en recipientes de cierre hermético, 
además de cumplir con lo establecido en este ordenamiento, deben cumplir con la NOM -130-SSA1 -1995, 
señalada en el apartado de referencias.  
7.6.2 Fisicoquímicos  
7.6.2.1  Metales pesados o metaloides  
Tabla No. 2  
Especificaciones  Límite máximo (mg/kg)  
Arsénico (As)  0,10 
Mercurio (Hg)  0,05 
Plomo (Pb)  0,02*  
* Límite establecido para producto listo para ser consumido  
7.6.2.2  Materia extraña. Las fórmulas deben estar exentas de materia extr aña. 
7.6.3 Nutrimentales  
7.6.3.1  Contenido energético  
7.6.3.1.1  Las fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición 
deben proporcionar no menos de 60 kcal (o 250 kJ) y no más de 70 kcal (o 295 kJ) por 100 ml del pr oducto 
listo para ser consumido, comercializado tal cual o reconstituido según las instrucciones del fabricante.  
7.6.3.1.2  Las fórmulas de continuación y fórmulas de continuación para necesidades especiales de 
nutrición deben proporcionar no menos de 60 kc al (o 250 kJ) y no más de 85 kcal (o 355 kJ) por 100 ml del 
producto listo para ser consumido, comercializado tal cual o reconstituido según las instrucciones del 
fabricante.  
7.6.3.2  Vitaminas y nutrimentos inorgánicos (minerales)  
7.6.3.2.1 Las vitaminas y  nutrimentos inorgánicos (minerales) que se adicionen a las fórmulas debe 
hacerse  bajo las formas que se señalan en el Apéndice Normativo A.  
7.6.3.2.2  Las fórmulas deben contener las siguientes vitaminas dentro de los límites que se señalan a 
continuación:  
Tabla No. 3  
Vitaminas  Fórmulas para lactantes y fórmulas para 
lactantes con necesidades especiales de 
nutrición  Fórmulas de continuación y 
fórmulas de continuación para 
necesidades especiales  de 
nutrición  
Mínimo/100 kcal  Máximo/100 kcal  NSR/ 100 
kcal Mínimo/100 kcal  Máximo/100 kcal  
Vitamina A  200 U.I. o 60 µg 
expresados en 
retinol  600 U.I. o 180 µg 
expresados en 
retinol  - 250 U.I. o 75 µg 
expresados en 
retinol  750 U.I. o 225 µg 
expresados en 
retinol  
Vitamina D  1 µg o 40 U.I.  2,5 µg o 100 U.I.  - 40 U.I.  o 1 µg  120 U.I. o 3 µg  
Vitamina C ( Ac. 
ascórbico)  10 mg  S.E. 70 mg(1) 8 mg  S.E. 
Tiamina (B1) 60 µg  S.E. 300 µg  40 µg  S.E. 
Riboflavina (B2) 80 µg  S.E. 500 µg  60 µg  S.E. 
Niacina (B3) 300 µg  S.E. 1500 µg  250 µg  S.E. 
Piridoxina (B6) 35 µg(2) S.E. 175 µg  45 µg(2) S.E. 
Acido fólico (B9) 10 µg  S.E. 50 µg  4 µg S.E. 
Acido pantoténico (B5) 400 µg  S.E. 2000 µg  300 µg  S.E. 
Cianocobalamina (B12) 0,1 µg  S.E. 1,5 µg  0,15 µg  S.E. 
Vitamina K 1 4 µg S.E. 27 µg  4 µg S.E. 
Biotina (H)  1,5 µg  S.E. 10 µg  1,5 µg  S.E. 
Vitamina E (alfa 
tocoferol)  0,5 mg de alfa 
tocoferol/g de 
ácidos grasos 
poliinsaturados (3) S.E. 5 0,7 U.I./g de 
ácido linoleico o 
por gramo de 
ácidos grasos 
poliinsaturados S.E. 10     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
expresados en 
ácido linoleico 
pero en ningún 
caso menos de 
0,7 U.I. por 100 
kcal uti lizables  
(1) En el caso de productos en polvo debería procurarse conseguir NSR más bajos.  
(2) Las fórmulas que contengan más de 1,8 g de proteínas por cada 100 kcal, deben incrementar el 
contenido de piridoxina en al menos 15 µg de piridoxina por cad a gramo de proteína arriba de dicho valor, en 
la fórmula lista para ser consumida de acuerdo con las instrucciones descritas en la etiqueta.  
(3) Aplicando los siguientes factores de equivalencia para adaptar el contenido mínimo de vitamina E al 
número de d obles enlaces de ácidos grasos en el preparado: 0,5 mg de alfa tocoferol/1g de ácido linoleico; 
0,75 mg de alfa tocoferol/1g de ácido alfa linolénico; 1 mg de alfa tocoferol/1g de ARA; 1,25 mg de alfa 
tocoferol/1g de EPA; 1,5 mg alfa tocoferol/1g de DHA.  
7.6.3.2.3  Las fórmulas deben contener los siguientes nutrimentos inorgánicos (minerales) dentro de los 
límites que se señalan a continuación:  
Tabla No. 4  
Nutrimentos 
inorgánicos 
(minerales)  Fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes 
con necesidades e speciales de nutrición  Fórmulas de continuación y fórmulas 
de continuación para necesidades 
especiales de nutrición  
Mínimo/100 kcal  Máximo/100 Kcal  NSR/100 kcal  Mínimo/100 kcal  Máximo/100 kcal  
Sodio (Na)  20 mg  60 mg  - 20 mg  85 mg  
Potasio (K)  60 mg  180 mg - 80 mg  S.E. 
Cloro (Cl)  50 mg  160 mg  - 55 mg  S.E 
Calcio (Ca)  50 mg(1) S.E. 140 mg(1) 90 mg  S.E. 
Fósforo (P)  25 mg(1) S.E. 100 mg(1) 60 mg  S.E. 
Magnesio (Mg)  5 mg  S.E. 15 mg  6 mg  S.E. 
Hierro (Fe)  0,45 mg  S.E. S.E. 1 mg  2 mg  
Yodo (I)  10 µg  S.E. 60 µg 5 µg S.E. 
Cobre (Cu)  35 µg(2) S.E. 120 µg(2) - - 
Cinc (Zn)  0,5 mg  S.E. 1,5 mg  0,5 mg  S.E. 
Manganeso (Mn)  1,0 µg  S.E. 100 µg  - - 
Selenio (Se)  1 µg S.E. 9 µg - - 
(1) La relación Ca:P no será menor de 1,1 ni mayor de 2,1.  
(2) En los lugares con sumin istro hídrico con elevado contenido de cobre es necesario ajustar estos niveles.  
7.6.3.2.4 No debe añadirse fluoruro a las fórmulas para lactantes. En todo caso, su nivel no deberá ser 
superior a 100 µg/100 kcal (24 µg/100 kJ) en las fórmulas para lactante s listas para ser consumidas, según las 
instrucciones del fabricante.  
7.6.3.2.5  El contenido de nutrimentos en las fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con 
necesidades especiales de nutrición no debe superar los NSR a menos que no puedan evita rse niveles de 
nutrimentos más elevados debido a su contenido alto o variable en los ingredientes de las fórmulas o debido a 
razones tecnológicas. Cuando un tipo o forma de producto ha contenido normalmente niveles inferiores a los 
NSR los fabricantes no d eben aumentar los niveles de nutrimentos a fin de aproximarse a los NSR.  
7.6.3.2.6  Las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición y las fórmulas de 
continuación para necesidades especiales de nutrición, se ajustarán a las disposiciones  establecidas en los 
numerales 7.6.3.1, 7.6.3.2, 7.6.3.3, 7.6.3.4 y 7.6.3.5, excepto en determinadas especificaciones sobre la 
composición, que deberá modificarse para satisfacer los requerimientos nutrimentales especiales Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     11 
consecuentes al trastorno, condic iones médicas específicas o afección para cuyo tratamiento dietético se 
haya formulado, etiquetado y presentado cada tipo de fórmula.  
7.6.3.2.7  Además de los requisitos estipulados en el numeral 7.6.3.2.5, las fórmulas para lactantes con 
necesidades especi ales de nutrición destinadas a recién nacidos pretérmino deben cumplir con las 
especificaciones nutrimentales señaladas en las Tablas No. 3 y 4 a excepción de las siguientes vitaminas:  
Tabla No. 5  
Vitamina  Límite mínimo /100 kcal  Límite máximo /100 kcal  
Vitamina A  204 µgER(1) o 700 U.I.  380 µgER(1) o 1254 U.I.  
Vitamina D  1,8 µg calciferol o 75 U.I.  6,75 µg calciferol o 270 U.I.  
Vitamina E  2mg -TE(2) o 3 U.I.  8 mg -TE(2) o 12 U.I.  
(1) ER equivalentes de retinol  
(2) -TE Alfa tocoferoles  
7.6.3.2.8  Las f órmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición 
podrán adicionar además:  
Tabla No. 6  
Nutrimento  Fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades 
especiales de nutrición  
Mínimo/100 kcal  Máximo/100 kcal NSR/100 kcal  
Colina  7 mg  S.E. 50 mg  
Mioinositol  4 mg  S.E. 40 mg  
L-carnitina  1,2 mg  S.E. - 
Taurina  - 12 mg  - 
DHA*  - S.E. 0,5 % de los ácidos grasos  
Nucleótidos  1,9 mg  16 mg  - 
* si se añade ácido docosahexaenoico (DHA), el contenido de ácido araq uidónico debe ser al 
menos el mismo que el de DHA y el contenido de ácido eicosapentaenoico (EPA) no debe 
exceder el contenido de DHA.  
7.6.3.2.9  Además, las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición podrán adicionar 
los nutrimentos si guientes en los límites señalados:  
Tabla No. 7  
Nutrimento  Fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición  
Mínimo/100 kcal  Máximo/100 kcal  NSR/100 kcal  
Cromo (Cr)  1,5 µg  S.E. 10 µg  
Molibdeno (Mo)  1,5 µg  S.E. 10 µg  
 
7.6.3.3 Proteínas  
7.6.3.3.1  Las fórmulas de acuerdo con su fuente de proteína se sujetarán a los siguientes límites:  
Tabla No. 8  
Fuente de proteína  Fórmulas para lactantes  Fórmulas de continuación  
Mín g/100 kcal Máx g/100 kcal Mín g/100 kcal Máx g/100 kcal 12     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
utilizables  utilizables  utilizabl es utilizables  
a) Leche de vaca  1,8 3 3,0 5,5 
b) Hidrolizados de proteína  2,25 3 2,25 S.E. 
c) Aislados de proteína de soya 
sola o mezclada con proteínas 
de leche de vaca.  2,25 3 2,25 S.E. 
 
7.6.3.3.2  La Relación de Eficiencia Proteica (RE P) de las proteínas no debe ser inferior al 85% de la 
calidad de la caseína.  
7.6.3.3.3  Para mejorar la calidad nutritiva de las proteínas, podrán añadirse aminoácidos indispensables, 
únicamente en las cantidades estrictamente necesarias, los cuales deben s er en su forma natural L, de 
acuerdo a lo que se indica en la Tabla A3. del Apéndice Normativo A.  
7.6.3.4 Acidos grasos y lípidos o grasas  
7.6.3.4.1  El contenido de lípidos o grasas y ácidos grasos en las fórmulas deben cumplir con lo establecido 
en la Tab la No. 9.  
Tabla No. 9  
Nutrimento  Fórmulas para lactantes y fórmulas para 
lactantes con necesidades especiales  de 
nutrición  Fórmulas de continuación y fórmulas 
de continuación para necesidades 
especiales de nutrición  
Mínimo/100 kcal  Máximo/100 kcal  Mínimo /100 kcal  Máximo/100 kcal  
Grasas  4,4 g  6 g 3 g 6 g 
Acido linoléico  300 mg  1400 mg NSR  300 mg  S.E. 
Acido alfa -linolénico  50 mg  S.E. 50 mg  S.E. 
La proporción de ácido linoleico/alfa -linolénico mínimo 5:1, máximo 15:1.  
7.6.3.4.2  El contenido de ácidos gr asos trans no será superior al 3% del contenido total de ácidos grasos 
en las fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición.  
7.6.3.5  Hidratos de carbono  
7.6.3.5 .1 El contenido mínimo de hidratos de carbono totale s en fórmulas para lactantes y fórmulas para 
lactantes con necesidades especiales de nutrición debe ser de 9 g/100 kcal y máximo de 14 g/100 kcal.  
7.6.3.5. 2 La lactosa y polímeros de glucosa deben ser los hidratos de carbono preferidos para las fórmulas 
para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición a base de proteínas de la 
leche de vaca y de proteínas hidrolizadas.  
7.6.3.5 .3 En las fórmulas para lactantes y en las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de 
nutrición, sólo podrán añadirse almidones naturalmente exentos de gluten precocidos y/o gelatinizados hasta 
un máximo de 30% del contenido total de hidratos de carbono y hasta un máximo de 2 g/100 ml.  
7.6.3.5 .4 En las fórmulas para lactantes y fórmulas para la ctantes con necesidades especiales de nutrición 
debe evitarse el uso de sacarosa, así como la adición de fructosa como ingrediente, salvo cuando sea 
necesario por justificación tecnológica.  
7.6.3.5.5 En las fórmulas de continuación y las fórmulas de contin uación para necesidades especiales de 
nutrición el contenido de hidratos de carbono debe ajustarse al contenido energético indicado en el numeral 
7.6.3.1.2. El producto debe contener hidratos de carbono nutrimentalmente asimilables que sean adecuados 
para la alimentación de los lactantes mayores de seis meses de edad y los niños de corta edad.  
7.6.3.6  Nutrimentos o ingredientes opcionales  
7.6.3.6 .1 En las fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición 
podrán añadir se otros nutrimentos/ingredientes normalmente presentes en la leche materna o humana en 
cantidad suficiente con la finalidad de lograr el efecto nutrimental o fisiológico de ésta, sobre la base de las Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     13 
cantidades presentes en la leche materna y para asegura rse que sea adecuado como fuente única de la 
nutrición del lactante. Su idoneidad e inocuidad debe estar demostrada científicamente.  
7.6.3.6 .2 En las fórmulas de continuación y fórmulas de continuación para necesidades especiales de 
nutrición, además de la s vitaminas y minerales señalados, pueden añadirse otros nutrimentos/ingredientes, 
cuando sean necesarios para asegurar que el producto sea adecuado para formar parte de un plan de 
alimentación mixta, destinado a ser utilizado después del sexto mes de edad . 
7.6.3.6 .3 Se debe contar con evidencia científica que demuestre la utilidad de los nutrimentos/ingredientes 
opcionales que se utilicen y estar a disposición de la Secretaría cuando ésta lo solicite.  
7.6.3.6 .4 Para las fórmulas de continuación y las fórmu las de continuación para necesidades especiales 
de nutrición las concentraciones de sodio y potasio que derivan de los ingredientes vitamínicos y minerales 
deben ajustarse a los límites establecidos para el sodio y el potasio en la Tabla No. 4.  
7.6.3.6 .5 Sólo se podrán utilizar cultivos que produzcan ácido láctico L(+), para el caso de las fórmulas 
para lactantes con necesidades especiales de nutrición y las fórmulas de continuación para necesidades 
especiales de nutrición se podrán utilizar siempre y cuand o se haya comprobado que son inocuos y 
adecuados para estas poblaciones vulnerables, el sustento debe estar a disposición de la Secretaría cuando 
ésta lo solicite.  
8. Disposiciones sanitarias para alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños d e corta 
edad  
8.1 Los productos que se modifiquen en su composición, deben cumplir con lo establecido en la  NOM -
086-SSA1 -1994, señalada en el apartado de referencias.  
8.2 Los ingredientes como carne de aves, bovino o pescado deben someterse a operaciones q ue 
aseguren la eliminación de trozos de hueso y espinas.  
8.3 Para los productos a base de cereales podrán utilizarse todos los cereales molidos aptos para el 
consumo humano.  
8.4 Las leguminosas deben ser sometidas a tratamiento térmico para eliminar, en la  medida de lo posible, 
los factores antinutricios presentes normalmente, tales como las lectinas (hemaglutininas), así como los 
inhibidores de la tripsina y quimotripsina.  
8.5 No se permite el uso de las habas ( Vicia faba L. ) como ingrediente en estos prod uctos, debido al 
peligro de favismo.  
8.6 Los cereales, leguminosas y semillas oleaginosas deben tratarse previamente para disponer de 
materias primas limpias y de buena calidad. Dentro de los tratamientos se pueden considerar los siguientes:  
8.6.1  Limpieza  o lavado: para eliminar la suciedad, granos dañados, granos extraños y semillas nocivas, 
insectos y excrementos de insectos y cualquier material adherido.  
8.6.2  Descascarado: en caso de ser necesario, para: leguminosas, semillas oleaginosas y determinados  
cereales, tales como avena, cebada, sorgo y mijo. Estos deben ser descascarados lo más completamente 
posible para reducir el contenido de fibra cruda a niveles aceptables y para eliminar los taninos y otras 
sustancias fenólicas que puedan reducir la diges tibilidad de las proteínas.  
8.7 Los productos comercialmente estériles deben cumplir con lo establecido en las disposiciones 
sanitarias de la NOM -130-SSA1 -1995, señalada en el apartado de referencias.  
8.8 El cacao se podrá adicionar únicamente en aquellos productos que se destinen a niños mayores de 
nueve meses de edad, en una cantidad que no exceda de 5% m/m en base seca.  
8.9 Especificaciones  
8.9.1  Microbiológicas  
8.9.1.1  Deben estar exentos de microorganismos patógenos.  
8.9.1.2  Los alimentos a base de cer eales, deben cumplir con lo siguiente:  
Tabla No. 10  14     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Alimentos a base de cereales para lactantes (6 a 12 meses de edad) para  consumirse directamente, 
incluye las galletas y los bizcochos  
Microorganismos  n c m M Clase del Plan  
Bacterias aerobias 
mesófilas  5 2 1 000 UFC  10 000 UFC  3 
Enterobacteriaceas  5 1 < 0,3 NMP  9,3 NMP  3 
Salmonella spp. 60 0 0 UFC/25 g  N.A. 2 
n: número de muestras a ser analizadas  
c: máximo número admisible de unidades de muestras defectuosas en un plan de dos clases, o de 
unidades de  muestras marginalmente aceptables en un plan de tres clases  
m: un límite microbiológico que separa la buena calidad de la calidad defectuosa en un plan de 
dos clases o la buena calidad de la calidad marginalmente aceptable en un plan de 3 clases  
M: un lím ite microbiológico que separa, en un plan de tres clases, la calidad marginalmente 
aceptable de la defectuosa  
Tabla No. 11  
Alimentos a base de cereales para niños de corta edad (mayores de 12 a 36 meses de edad)  para 
consumirse directamente  
Microorganismos  n c m M Clase del Plan  
Bacterias aerobias 
mesófilas  5 2 3 000 UFC  30 000 UFC  3 
Enterobacteriaceas  5 1 2,9 NMP  21 NMP  3 
Salmonella spp. 60 0 0 UFC /25 g  N.A. 2 
n: número de muestras a ser analizadas  
c: máximo número admisible de unidades de muestras de fectuosas en un plan de dos clases, o 
de unidades de muestras marginalmente aceptables en un plan de tres clases  
m: un límite microbiológico que separa la buena calidad de la calidad defectuosa en un plan de 
dos clases o la buena calidad de la calidad marg inalmente aceptable en un plan de 3 clases  
M: un límite microbiológico que separa, en un plan de tres clases, la calidad marginalmente 
aceptable de la defectuosa  
Tabla No. 12  
Alimentos a base de cereales para lactantes y niños de corta edad (6 a 36 meses d e edad)  que llevan 
tratamiento térmico antes de su consumo  
Microorganismos  n c m M Clase del Plan  
Bacterias aerobias 
mesófilas  5 3 10 000 UFC  100 000 UFC  3 
Enterobacteriaceas  5 2 100 UFC  1 000 UFC  3 
Salmonella spp. 10 0 0 UFC /25 g  N.A. 2 
n: número de muestras a ser analizadas  
c: máximo número admisible de unidades de muestras defectuosas en un plan de dos clases, o de 
unidades de muestras marginalmente aceptables en un plan de tres clases  
m: un límite microbiológico que separa la buena calidad de la ca lidad defectuosa en un plan de dos clases 
o la buena calidad de la calidad marginalmente aceptable en un plan de 3 clases  
M: un límite microbiológico que separa, en un plan de tres clases, la calidad marginalmente aceptable de 
la defectuosa  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     15 
8.9.1.3 Los pro ductos deshidratados deben cumplir con lo siguiente:  
Tabla No. 13  
Alimentos deshidratados  
Microorganismos  Límite máximo  
Bacterias aerobias mesófilas  2 500 UFC/g o  
100 000 UFC/g*  
Salmonella spp 0 UFC/25 g  
Coliformes totales  20 NMP/g  
* Si deben ser some tidos a tratamiento térmico antes de su consumo.  
8.9.2 Contaminantes  
8.9.2.1  Los productos para lactantes y niños de corta edad deben cumplir con las especificaciones de 
metales pesados y materia extraña perjudicial a la salud establecidas en el punto 7.6. 2 para fórmulas, excepto 
en el límite de plomo, el cual debe ser 0,20 ppm.  
8.9.2.2  Los alimentos a base de cereales no deben exceder de 20 µg aflatoxinas/kg de producto.  
8.9.3 Nutrimentales  
8.9.3 1 El contenido energético de los productos elaborados a base  de cereales no debe ser inferior a 0,8 
kcal/g.  
8.9.3.2 Contenido de sodio  
8.9.3.2.1 Para los alimentos a base de cereales el contenido de sodio en el cereal seco y harinas de cereal 
no debe exceder los 100 mg/100 kcal del producto, calculado en relación c on el producto preparado listo para 
ser consumido con base en las instrucciones de empleo.  
8.9.3.2.2 Los demás alimentos para lactantes y niños de corta edad no deben exceder de 200 mg/100 g o 
de 200 mg/100 kcal de producto, calculado en relación con el pr oducto preparado listo para ser consumido de 
conformidad con las instrucciones de empleo, ni agregar sal (NaCl) a los productos de fruta y a los postres a 
base de fruta.  
8.9.3.3 Contenido de vitaminas  
8.9.3.3.1 En los alimentos a base de cereales la cantid ad de vitamina B 1 (tiamina) no deberá ser inferior a 
50 µg/100 kcal.  
8.9.3.4  Contenido de proteínas  
8.9.3.4.1 Podrán añadirse aminoácidos indispensables (isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, 
treonina, triptófano, valina, arginina e histidi na) en sus formas L, sólo en las cantidades necesarias para 
mejorar la calidad de la proteína presente, de acuerdo con lo que se establece en la Tabla A3. del Apéndice 
Normativo A.  
8.9.3.5  Contenido de hidratos de carbono  
8.9.3.5.1  Se podrán añadir los sig uientes hidratos de carbono: lactosa, maltosa, sacarosa, glucosa, 
fructosa, miel y jugo de frutas, maltodextrina, jarabe de glucosa, jarabe de glucosa deshidratada y sus 
combinaciones, almidón pretostado, almidón gelatinizado; los dos últimos deben ser sin  gluten.  
8.9.3.5.2  La cantidad total de hidratos de carbono en néctares no debe exceder de 14 g/100 g del producto 
listo para ser consumido y en las papillas preparadas con fruta y/o cereal y/o yogurt y postres no debe ser 
superior a 20 g/100 g del product o listo para ser consumido.  
8.9.3.5.3 Para los alimentos a base de cereales, excepto las pastas, la cantidad de azúcares añadidos no 
podrá ser superior a 7,5 g/100 kcal cuando se agregue como sacarosa, glucosa, jarabes de glucosa o miel, si 
se añade como f ructosa no podrá ser superior a 3,75 g/100 kcal.  
8.9.3.6  Contenido de lípidos  16     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
8.9.3.6.1 Los cereales que deben ser preparados para el consumo añadiendo leche u otros líquidos 
idóneos (fórmulas) y las galletas y otros productos de panificación, no deben exc eder un contenido máximo de 
3,3 g/100 kcal de lípidos.  
8.9.3.7 Ingredientes facultativos  
8.9.3.7.1 Sólo podrán utilizarse cultivos productores de ácido láctico.  
9. Muestreo y métodos de prueba  
9.1 El procedimiento de muestreo para los productos objeto de e sta Norma se sujeta a lo que establece la 
Ley General de Salud.  
9.2 Para la verificación de las especificaciones sanitarias y nutrimentales que se establecen en esta 
Norma se deben aplicar los métodos de prueba señalados en el Apéndice Normativo B.  
10. Eti quetado  
10.1 La etiqueta de los productos debe cumplir con lo establecido en el Reglamento y en la  NOM -051-
SCFI/SSA1 -2010 señalada en el apartado de referencias, en lo que no se oponga con la presente norma.  
10.2 Deben ostentar fecha de caducidad, a excep ción de los alimentos y bebidas no alcohólicas para 
niños de corta edad comercialmente estériles que podrán declarar fecha de consumo preferente.  
10.3 Fórmulas  
10.3.1 Deben denominarse conforme con la clasificación señalada en el numeral 5.1, según corresp onda.  
10.3.2 No se deben utilizar términos como "humanizado" , "maternizada"  o similares . 
10.3.3 Las fórmulas que no contengan leche ni algún derivado lácteo deben incluir en la denominación el 
término " no láctea ". 
10.3.4 Las fórmulas para lactantes y fórmu las para lactantes con necesidades especiales de nutrición que 
contengan como mínimo 1 mg de hierro por 100 kcal utilizables, podrán ostentar dentro de la denominación 
“con hierro ”. 
10.3.5 Las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición  y las fórmulas de continuación 
para necesidades especiales de nutrición, deben indicar en términos descriptivos adecuados como parte de la 
denominación, la característica esencial de la fórmula, pero no el trastorno, la enfermedad o la condición 
médica es pecífica a la que están destinadas, ejemplos: “proteína hidrolizada ”, “libre de lactosa ”. La única 
condición médica específica que puede ser incluida es el uso de los términos “ pretérmino ” o “de bajo peso al 
nacer ”. 
10.3.6  Para el caso de las fórmulas que contengan nutrimentos o ingredientes opcionales, diferentes de 
los establecidos en las Tablas No. 3, No. 4, No. 6 y No. 7 se permite incluir dentro de la denominación la 
presencia de éstos , siempre y cuando cumplan con los numerales 7.6.3.6.1, 7.6.3.6.3, 7 .6.3.6.5 y 10.3.8.2. 
Por ejemplo “ con probióticos ”, “con prebióticos ”, “con luteína ”. 
10.3.7 En la etiqueta figurará la lista completa de ingredientes, por orden decreciente de proporciones, 
salvo las vitaminas y/o nutrimentos inorgánicos (minerales), que se podrán indicar como grupos separados.  
10.3.8  Información nutrimental, debe declararse el valor nutritivo del producto, como sigue:  
10.3.8.1  La cantidad en gramos de proteínas, hidratos de carbono y grasas o lípidos por 100 kcal, 
indicando la cantidad de  producto equivalente a 100 kcal del producto listo para ser consumido.  
10.3.8.2  La cantidad total en las unidades correspondientes de vitaminas y nutrimentos inorgánicos 
(minerales), colina y de cualquier otro nutrimento declarado en la lista de ingredien tes por 100 kcal.  
10.3.8.3  Adicionalmente se podrá declarar el contenido de nutrimentos por 100 g o por 100 ml del producto 
listo para ser consumido que se haya preparado de acuerdo con las indicaciones señaladas en la etiqueta.  
10.3.8.4  En las fórmulas pa ra lactantes líquidas, además, se debe declarar el contenido energético y la 
cantidad en gramos de proteínas, hidratos de carbono, grasas y demás nutrimentos por presentación 
(envase).  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     17 
10.3.8.5  Las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutr ición y las fórmulas de 
continuación para necesidades especiales de nutrición, deben declarar la cantidad total de los nutrimentos 
específicos a los que se debe la característica esencial que hace que la fórmula se destine a esa necesidad 
especial por 100 kcal y opcionalmente por 100 g o 100 ml del producto comercializado tal cual.  
10.3.9 No podrán incluir ningún tipo de declaración de propiedades nutrimentales ni saludables.  
10.3.10 Instrucciones para su almacenamiento, conservación, uso, preparación y con sumo.  
10.3.10.1 Las fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición 
deben incluir instrucciones en forma escrita y gráfica, sobre la manera de prepararla y utilizarla de modo que 
no induzca a desistir de la lactanc ia materna. Asimismo, deben incluirse instrucciones sobre la conservación 
del producto, antes y después de abrir el envase y una vez preparado el producto, y una declaración que 
indique que el almacenamiento prolongado y temperaturas excesivas deben evitar se. En el caso de fórmulas 
líquidas las instrucciones gráficas podrán incluirse en el envase colectivo únicamente.  
10.3.10.2 Las fórmulas de continuación y fórmulas de continuación para necesidades especiales de 
nutrición deben contener instrucciones sobre  la preparación en forma escrita y gráfica, uso, su 
almacenamiento y conservación antes y después de abrir el envase y en su caso una vez preparado el 
producto, incluyendo una declaración que indique que el almacenamiento prolongado y temperaturas 
excesiva s deben evitarse.  
10.3.10.3 Las fórmulas deben ostentar una leyenda que indique que deben ser preparadas con agua 
hervida por cinco minutos y enfriada hasta que quede tibia. En caso de no contar con ésta se podrá utilizar 
agua purificada a temperatura ambi ente.  
10.3.10.4 Con la finalidad de evitar el riesgo de causar graves quemaduras, en las fórmulas se debe incluir 
una leyenda indicando que no se debe calentar usando horno de microondas.  
10.3.11 No deben ostentar imágenes o textos que sugieran a las fórmu las para lactantes y fórmulas para 
lactantes con necesidades especiales de nutrición como idénticas y superiores a la leche materna o humana, 
conforme con las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud para la comercialización de 
sucedáneos de la leche materna.  
10.3.12  Se debe indicar cerca de la denominación, el intervalo de edad al que está dirigida la fórmula, sin 
que esto sea parte de la misma.  
10.3.13  Opcionalmente puede ser incluida en cualquier parte de la etiqueta la presentación de las 
fórmulas, siendo ésta líquida o en polvo, sin que esto sea parte de la denominación de las mismas.  
10.3.14 Deben ostentar la leyenda " Aviso Importante" o  su equivalente. Posteriormente lo siguiente:  
10.3.14.1 Una leyenda donde se afirme la superioridad de la lactancia materna, por ejemplo: "La leche 
materna es el mejor alimento para el bebé", "La leche materna contiene hormonas, enzimas activas y 
otros compuestos que no pueden ser duplicados en ninguna fórmula para lactantes" , y señalar en las 
fórmulas para  lactantes, "El uso de este producto debe hacerse bajo orientación médica"  y en el caso de 
las fórmulas de continuación, "El uso de este producto debe hacerse bajo orientación de un profesional 
de la salud (médico o nutriólogo)”  o leyendas equivalentes, co n un tamaño de letra que sea fácilmente  
visible, con negritas y en un fondo contrastante.  
10.3.15 Las fórmulas para lactantes y fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición 
deben contener una declaración referente a que los lactantes, ad emás del consumo de la fórmula, también 
deben ser ablactados a partir de una edad que sea apropiada para su crecimiento específico y necesidades 
de desarrollo según la orientación del profesional de salud (médico o nutriólogo) y en cualquier caso a partir 
de los seis meses de edad.  18     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
10.3.16 Las fórmulas de continuación y fórmulas de continuación para necesidades especiales de nutrición 
deben contener una declaración que indique que son parte de la ablactación o alimentación complementaria y 
no deben ser intr oducidas antes del sexto mes de vida.  
10.3.17 Una leyenda sobre las consecuencias de una preparación y uso inadecuado del producto, tal 
como "La salud de su hijo depende de que siga cuidadosamente las instrucciones para la preparación 
y uso"  o alguna  equiv alente.  
10.3.18 Las fórmulas para lactantes con necesidades especiales de nutrición y las fórmulas de 
continuación para necesidades especiales de nutrición deben incluir una declaración destacada y en negritas 
que diga "UTILICESE BAJO SUPERVISION MEDICA"  separada de toda información  escrita, impresa o 
gráfica.  
10.3.19 Los fortificadores de leche materna o humana deben incluir una declaración destacada y en 
negritas que diga “EXCLUSIVAMENTE PARA USO HOSPITALARIO” . 
10.4 Alimentos y bebidas no alcohólicas para  lactantes y niños de corta edad.  
10.4.1 La denominación debe indicar el grupo de edad al que va dirigido el producto, ejemplo "cereal seco 
para lactantes (y/o para niños de corta edad)", "galletas para lactantes (y/o para niños de corta edad)" . 
10.4.2  La sal yodada, debe declararse como tal en la lista de ingredientes . 
10.4.3  Cuando la declaración de fibra dietética, vitaminas y nutrimentos inorgánicos (minerales) se haga 
en porcentaje de los VNR se deben considerar los valores que corresponda al grupo de edad al que va 
dirigido el producto, conforme con la Tabla No. 14.  
Tabla No. 14  
Valores Nutrimentales de Referencia para la Población Mexicana por segmento  
Nutrimento/unidad de medida  Edad  
0 a 6 meses  7 a 12 meses  1 a 3 años  
Fibra g  s.i. s.i. 14** (1) 
Vitamina A µgER  s.i. s.i. 300**  
Vitamina D µg (como colecaliciferol)  5** 5** 5** 
Vitamina E mg (equivalente de tocoferol)  4** 5** 6* 
Vitamina K1 µg 2** 2,5**  30** 
Tiamina (B1) mg  0,2**  0,3**  0,4* 
Riboflavina (B2) mg  0,3**  0,4**  0,4* 
Piridoxina (B 6) mg 0,1**  0,3**  0,4* 
Niacina mg  2** 4** 6* 
Vitamina B12 µg (cobalamina)  0,3**  0,5**  0,8* 
Acido fólico µg (folacina)  76** 96** 168**  
Vitamina C mg (ácido ascórbico)  40* 50* 15* 
Acido pantoténico mg  1,7**  1,8**  2** 
Calcio mg  210**  270**  500**  
Cobre µg  220** 220**  340* 
Cromo µg  0,2**  5,5**  11** Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     19 
Fósforo mg  100**  275**  460* 
Flúor mg  0,01**  0,45**  0,6**  
Hierro mg  s.i. 16** 13** 
Yodo µg  110**  130**  65* 
Magnesio mg  36** 90** 80* 
Selenio µg  14** 21** 20* 
Zinc mg  s.i. 3,8**  4* 
(1) Corresponde al interva lo de edad de 2 a 3 años  
* Corresponden a IDR  
** Corresponden a IDS  
s.i. sin información suficiente para establecer una IDS  
10.4.4 Las instrucciones para su preparación y uso, así como sobre su almacenamiento y conservación 
antes y después de que se haya a bierto el envase debe figurar en la etiqueta.  
10.4.5  Se debe indicar cerca de la denominación, el intervalo de edad al que está dirigido el producto. 
Para los productos destinados a la ablactación o alimentación complementaria, la edad de inicio no deberá ser 
inferior a los seis meses de edad para ningún producto; asimismo, la etiqueta debe contener la indicación de 
que la decisión sobre el momento preciso en que se comenzará la ablactación incluida cualquier excepción 
con respecto al límite de los seis mes es de edad debe adoptarse en consulta con un profesional de la salud 
(médico o nutriólogo), basándose en las necesidades específicas de crecimiento y desarrollo del lactante.  
10.4.6 Cuando el producto contenga remolacha o espinacas, se debe indicar en la e tiqueta  "Para niños 
de más de doce semanas de edad".  
10.4.7  Cuando el producto esté compuesto de ingredientes y aditivos exentos de gluten podrá incluirse en 
la etiqueta la declaración "exento de gluten".  
10.4.8  En los cereales que deben ser preparados par a el consumo añadiendo leche u otros líquidos 
nutritivos idóneos debe indicarse la leyenda "Utilícese leche o fórmula pero no agua"  para prepararlo o una 
indicación equivalente.  
10.4.9  En los cereales que deben ser preparados para el consumo añadiendo lech e u otros líquidos 
nutritivos idóneos debe incluirse una leyenda que indique que dichos ingredientes añadidos deben ser 
recomendados por un profesional de la salud (médico o nutriólogo).  
11. Envase y embalaje  
11.1 Envase  
Los productos objeto de esta Norma se deben envasar en recipientes elaborados con materiales inocuos y 
resistentes a distintas etapas del proceso, de tal manera que no reaccionen con el producto o alteren sus 
características físicas, químicas y sensoriales.  
11.2 Embalaje  
Se debe usar materi al resistente que ofrezca la protección adecuada a los envases para impedir su 
deterioro exterior, a la vez que faciliten su manipulación, almacenamiento y distribución.  
12. Concordancia con normas internacionales  
Esta Norma es parcialmente equivalente con  las siguientes normas:  
12.1 Codex Alimentarius. Norma para preparados para lactantes y preparados para usos medicinales 
especiales destinados a los lactantes. CODEX STAN 72 -1981. Rev. 2007. Enmienda 2011.  
12.2 Codex Alimentarius. Norma del Codex para Alim entos envasados para lactantes y niños. CODEX 
STAN 73 -1981. Enmienda 1989.  
12.3 Codex Alimentarius. Norma del Codex para alimentos elaborados a base de cereales para lactantes y 
niños pequeños. CODEX STAN 74 -1981. Rev. 2006.  
12.4 Codex Alimentarius. Norma del Codex para preparados complementarios. CODEX STAN 156 -1987. 
Enmienda 2011.  20     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
12.5 Codex Alimentarius. Listas de referencia de compuestos de nutrientes para su utilización en 
alimentos para fines dietéticos especiales destinados a los lactantes y niños pe queños. CAC/GL 10 -1979. 
Enmienda 2009.  
12.6 World Health Organization. International Code of Marketing of Breast -milk Substitutes. Ginebra: WHO, 
1981.  
13. Bibliografía  
13.1 Secretaría de Economía. Ley Federal sobre Metrología y Normalización. México, 2009 . 
13.2 Secretaría de Salud. Ley General de Salud. México, 2012.  
13.3 Secretaría de Economía. Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización. México, 
1999.  
13.4 Secretaría de Salud. Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios. Mé xico, 1999  
13.5 Secretaría de Salud. Reglamento de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios. México, 2004.  
13.6 Norma Oficial Mexicana NOM -Z-013/02. 1981. Guía para la Redacción, Estructuración y Presentación 
de las Normas Oficiales  Mexicanas.  
13.7 Norma Oficial Mexicana NOM -008-SCFI -2002. Sistema General de Unidades de Medida.  
13.8 Norma Oficial Mexicana NOM -031-SSA2 -1999. Para la atención a la salud del niño.  
13.9 Codex Alimentarius. Norma general para el etiquetado y declaración d e propiedades de alimentos 
preenvasados para regímenes especiales. CODEX STAN 146 -1985. Enmienda 2009.  
13.10 Codex Alimentarius. Directrices sobre etiquetado nutricional. CAC/GL 2 -1985. Enmienda 2010.  
13.11 Codex Alimentarius. Código de prácticas de higien e para los preparados en polvo para lactantes y 
niños pequeños. CAC/RCP 66 –2008.  
13.12 Codex Alimentarius. Directrices generales sobre declaraciones de propiedades. CAC/GL 1 -1979. 
Enmienda 2009.  
13.13 Codex Alimentarius. Directrices para el uso de declarac iones nutricionales y saludables. CAC/GL 
23-1997. Enmienda 2011.  
13.14  Directiva 2006/141/CE de la Comisión del 22 de diciembre de 2006 relativa a los Preparados para 
lactantes y preparados de continuación y por lo que se modifica la Directiva 1999/21/CE.  
13.15  Directiva 2006/125/CE de la Comisión de 5 de diciembre de 2006 relativa a los alimentos elaborados 
a base de cereales y alimentos infantiles para lactantes y niños de corta edad.  
13.16  FDA/DEA/ONDCP. Code of Federal Regulations. 21CFR107. USA, 2011.  
13.17  Agostoni, C., Braegger, C. Breast -feeding: A Commentary by the ESPGHAN Committee on Nutrition. 
J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2009; 49: 112 –125. 
13.18  Agostoni, C., Buonocore, G. Enteral Nutrient Supply for Preterm Infants: Commentary From the 
Europea n Society for Pediatric , Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition Committee on Nutrition. J Pediatr 
Gastroenterol Nutr. 2010; 50 (1):1 -9. 
13.19  Bourges R.H., Casanueva E., Rosado J.L. (ed). Recomendaciones de ingestión de nutrimentos para 
la población m exicana. Bases Fisiológicas. I. México. Editorial Médica Panamericana, 2005.  
13.20  Bourges R.H., Casanueva E., Rosado J.L (ed). Recomendaciones de ingestión de nutrimentos para 
la población mexicana. Bases Fisiológicas. II. Energía, proteínas, lípidos, hid ratos de carbono y fibra. México. 
Editorial Médica Panamericana, 2008.  
13.21  Canadian Food Inspection Agency and Health Canada. Letter to industry: Requirements Related to 
Nutrition Information and Nutrition and Health Claims for Infant Formula. Canadá: 20 07. 
13.22  European Commission. Report of the Scientific Committee on Food on the Revision of Essential 
Requirements of Infant Formulae and Follow -on Formulae. SCF/CS/NUT/IF/65. 2003.  
13.23  Food and Agriculture Organization/World Health Organization. Entero bacter sakazakii and 
Salmonella in powdered infant formula. Meeting Report. Microbiological Risk Assessment. Series 10. Roma: 
FAO/WHO, 2010.  
13.24  García, A.J. Papel de los cereales en la alimentación de ablactación, nutrición del lactante y 
preescolar. Acta Pediatr Mex, 1998; 19(S): 17 -21. 
13.25  Makihiro S., Norifumi S., Taku N., Tadahi I., Ichiro N. Profile of Nucleotides and Nucleosides of 
Human Milk. Received November 5. 1994.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     21 
13.26  Koletzco B, Baker S, Cleghorn G, Neto UF, Gopalan S, Hernell O, Hock QS , Jirapinyo P, Lonnerdal 
B, Pencharz p, Pzyrembel H, Ramírez -Mayans J, Shamir R, Turck D, Yamashiro Y, Zong -Yi D. Global 
standard for the composition of infant formula: recomendations of an ESPGHAN coordinated international 
expert group. J Pediatr Gastroen terol, 2001; 5:584 -599. 
13.27  Real Decreto 867/2008, de 23 de mayo, por el que se aprueba la reglamentación técnico -sanitaria 
específica de los preparados para lactantes y de los preparados para lactantes y de los preparados de 
continuación. España.  
13.28  Sisk M.P., Lovelady A.Ch., Dillard, G.R., Gruber J.K. Lactation counseling for mothers of very low birth 
weight infants: effect on maternal anxiety and infant intake of human milk. Pediatric, 2006; 117(1): e67 -e75. 
13.29  Udaeta -Mora E., Toussaint -Martínez. G. Uso de una fórmula para prematuros adicionada con ácidos 
poliinsaturados de cadena larga: aceptabilidad y tolerancia. Gac Med Mex, 2005; 141(1): 1 -5. 
14. Observancia de la norma  
La vigilancia en el cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secr etaría de Salud y a los 
Gobiernos de las Entidades Federativas en el ámbito de sus respectivas competencias.  
15. Vigencia  
15.1 La presente norma entrará en vigor a los ciento veinte días naturales posteriores al de su publicación 
en el Diario Oficial de la  Federación.  
15.2 El numeral 6.8 entrará en vigor el mismo día en que entre en vigor el Acuerdo por el que se 
determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios.  
15.3 El cumplimiento del Apartado 10 de Etiquetado, será aplicable a los productos elaborados a partir de 
la fecha de entrada en vigor de la presente norma.  
Sufragio Efectivo. No Reelección.  
México , D.F., a 16 de agosto de 2012. - El Comisionado Federal para la Protección contra  Riesgos 
Sanit arios y Presidente de l Comité Consultivo  Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario , 
Mikel Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbrica.  
Apéndice Normativo A.  
Sustancias nutritivas  
Tabla A1. Sales  Minerales  
Nutrimento  Fuente  
Calcio  Carbonato de calcio  
Cloruro de calcio  
Citrato de calcio  
Fosfato cálcico monobásico  
Fosfato cálcico dibásico  
Fosfato cálcico tribásico  
Glicerofosfato cálcico  
Gluconato cálcico  
Hidróxido de cálcico  
L-Lactato de calcio  
Oxido cálcico  
Sulfato cálcico  
Fósforo  Acido fosfórico  
Fosfato cálcico monobá sico 
Fosfato cálcico dibásico  
Fosfato cálcico tribásico  22     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Fosfato magnésico dibásico  
Fosfato magnésico tribásico  
Fosfato potásico monobásico  
Fosfato potásico dibásico  
Fosfato sódico dibásico  
Ortofosfato férrico  
Glicerofosfato magnésico  
Fosfato diácido de sod io (fosfato sódico 
monobásico)  
Fosfato Trisódico (Fosfato sódico tribásico)  
Glicerofosfato potásico  
Glicerofosfato de manganeso (II)  
 
Hierro  Bisglicinato ferroso  
Carbonato ferroso estabilizado con sacarosa  
Citrato ferroso  
Citrato ferroamónico  
Citrato férr ico 
Difosfato férrico (pirofosfato férrico)  
Fumarato ferroso  
Gluconato ferroso  
Hierro reducido de hidrógeno  
Hierro electrolítico  
Hierro carbonilo  
Lactato ferroso  
Ortofosfato férrico  
Sacarato férrico  
Succinato ferroso  
Sulfato ferroso  
Difosfato férrico de so dio 
Magnesio  Acetato magnésico  
Carbonato de magnesio  
Carbonato ácido de magnesio  
Cloruro magnésico  
Oxido magnésico  
Fosfato magnésico dibásico  
Fosfato magnésico tribásico  
Gluconato magnésico  
Glicerofosfato magnésico  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     23 
Hidróxido magnésico  
Lactato magnésico  
Sales magnésicas de ácido cítrico  
Sulfato magnésico  
Sodio  Bicarbonato de sodio  
Carbonato de sodio  
Cloruro sódico  
Citrato sódico  
Gluconato sódico  
L- Lactato de sodio  
Fosfato sódico monobásico  
Fosfato sódico dibásico  
Fosfato sódico tribásico  
Sulfato sódico  
Hidróxido de sodio  
 
Potasio  Bicarbonato potásico  
Carbonato de potasio  
Cloruro potásico  
Citrato potásico  
Glicerofosfato potásico  
Gluconato potásico  
Fosfato potásico monobásico  
Fosfato potásico dibásico  
Fosfato potásico tribásico  
L- Lactato de potasio  
Hidróxi do de potasio   
Cobre  Gluconato de cobre  
Carbonato cúprico  
Citrato cúprico  
Sulfato cúprico  
Yodo  Yoduro potásico  
Yoduro sódico  
Yodato potásico  
Yodato sódico  
Zinc Acetato de zinc  
Carbonato de zinc  
Cloruro de zinc  
Gluconato de zinc  24     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Lactato de zinc  
Oxido de zinc 
Sulfato de zinc  
Manganeso  Carbonato de manganeso  II 
Cloruro de manganeso II  
Citrato de manganeso II  
Glicerofosfato de manganeso II  
Gluconato de manganeso II  
Sulfato de manganeso II  
Selenio  Selenato sódico  
Selenito sódico  
Selenito sódico hidrógeno  
 
Cromo  Sulfato de cromo III  
Cloruro de cromo III  
Molibdeno  Molibdato de sodio  
Molibdato de amonio  
Flúor  Fluoruro de sodio  
Fluoruro de potasio  
Fluoruro de calcio  
 
Tabla A2.  Vitaminas  
Vitamina  Fuente  
Vitamina A  Todo trans retinol  
Acetato de retinilo  
Palm itato de retinilo  
Provitamina A  Beta caroteno  
Vitamina D2 Ergocalciferol  
Vitamina D3 Colecalciferol  
Vitamina E  d-alfa tocoferol  
dl-alfa tocoferol  
d-alfa tocoferil acetato  
dl-alfa tocoferil acetato  
Succinato ácido d -alfa tocoferil  
Succinato ácido dl -alfa tocoferil  
Succinato de dl -alfa tocoferil polietileno glicol 1000  
Tiamina (Vitamina B1) Hidrocloruro de tiamina cloruro  
Tiamina mononitrato  
Riboflavina  (Vitamina 
B2) Riboflavina  
Riboflavina 5´ -fosfato sódico  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     25 
Niacina  Nicotinamida  
Acido nicotínico  
Vitamina B6 Hidrocloruro de piridoxina  
Piridoxal 5 - fosfato  
Biotina (vitamina H)  D-biotina  
Acido fólico  Acido N -pteroil -L-glutámico  
L-metilfolato cálcico  
Acido pantoténico  D-Pantotenato cálcico  
D-Pantenol  
DL-Pantenol  
D-pantotenato sódico  
Vitamina B12 Cianocobalamina  
Hidroxocobalamina  
Vitamina K1 Fitomenadiona (2 -metil -3-fitil-1,4-
naftoquinona/filoquinona/fitonadiona)  
Vitamina C  Acido L -ascórbico  
L-Ascorbato sódico  
L-Ascorbato cálcico  
Acido 6 - palmitil -L-ascórbico (palmitato de ascorbilo)  
L-Ascorbato pot ásico  
 
Tabla A3.  Aminoácidos y otros nutrimentos nitrogenados  
L-ácido glutámico  
L-glutamina  
L-alanina  
L-arginina -L aspartato  
L- cistina  
Diclorhidrato de L -cistina  
L-arginina  
Clorhidrato de L -arginina  
L-ácido aspártico  
L-citrulina  
L-ornitina  
Monocl orhidrato de L -ornitina  
N-acetil –L-cisteína  
N-acetil –L-metionina  
Acetato de L -lisina  
L-aspartato de L -lisina  
L-glutamato dihidrato de L -lisina  
L-aspartato de magnesio  
L-glutamato de calcio  
L-glutamato de potasio  
Citidina 5 -monofosfato  
L-histidi na 
Clorhidrato de L -histidina  
Glicina  26     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
L-isoleucina  
Clorhidrato de L -isoleucina  
L-leucina  
Clorhidrato de L -leucina  
L-lisina  
Monoclorhidrato de L -lisina  
L-cisteína  
Clorhidrato de L -cisteina  
L-metionina  
L-fenilalanina  
L-prolina  
L-serina  
L-treonina  
L-triptófano  
L-tirosina  
L-valina  
L-carnitina  
Clorhidrato de L -carnitina  
Tartrato de L -carnitina  
Adenosina 5´ -monofosfato  
Uridina 5´ -monofosfato y su sal disódica  
Guanosina 5´ -monofosfato y su sal disódica  
Inosina 5´ -monofosfato y su sal disódica  
Bitartrato de colina  
Citrato de colina  
Colina  
Cloruro de colina  
Hidrógeno tartrato de colina  
Mioinositol  
Taurina  
APENDICE NORMATIVO B  
METODOS MICROBIOL OGICOS  
B.1 PREPARACI ON Y DILUCI ON DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU AN ALISIS 
MICROBIOL OGICO  
B.1.1 Funda mento  
Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible 
de los microorganismos presentes en la porción de muestra.  
B.1.2 Reactivos y materiales  
B.1.2.1  Reactivos  
Los reactivos que a continuación se men cionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada.  
B.1.2.1.1  Preparación de reactivos  
B.1.2.1.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1 N  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Hidróxido de sodio  4 g 
Agua  100 ml  
Preparación : Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 ml con agua.  
B.1.2.1.1.2  Soluciones diluyentes  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     27 
B.1.2.1.1.2.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Fosfato de sodio monobásico  34 g 
Agua  1000 ml  
 
Preparació n: Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C. Conservar en refrigeración 
(solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución conce ntrada y llevar a un litro con agua (solución de 
trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 min. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser  iguales a los 
iniciales.  
B.1.2.1.1.2.2  Agua peptonada  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  1 g 
Cloruro de sodio  8,5 g  
Agua  1000 ml  
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con hidróxido de 
sodio 1 N. Dist ribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se 
requiera. Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 min. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de 
la solución de trabajo deberán ser iguales a los inicial es. Si este diluyente no es usado inmediatamente, 
almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en 
condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
B.1.2.2  Materiales  
- Pipetas bacteriológicas para d istribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 1 ml y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
- Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.  
- Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosc a. 
- Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.  
- Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán 
esterilizarse mediante:  
- Horno, durante 2 h a 1 70 a 175°C o 1 h a 180°C o Autoclave, durante 15 min como mínimo a 121 ± 1°C.  
- El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repeti da y éste debe ser 
químicamente inerte.  
B.1.3 Aparatos e instrumentos  
- Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.  
- Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.  
- Baño de agua con control de  temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado 
con divisiones de 0,1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0,5°C.  28     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
- Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher).  
- Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
- Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.  
B.1.4 Procedimiento  
B.1.4.1  Preparación de la dilución primaria.  
B.1.4.1.1  A partir de muestras líquidas:  
Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de 
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación, etc.) . 
Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o  licuable, fundir por completo en baño de 
agua de 40 a 45°C un tiempo máximo de 15 min y homogeneizar agitando vigorosamente.  
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cual sea considerada suficientemente representativa 
de la muestra total (Por e jemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).  
B.1.4.1.1.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de 7 seg. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual deb e 
encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.  
B.1.4.1.1.2  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la mis ma forma que se describió anteriormente.  
B.1.4.1.2  A partir de muestras sólidas o semisólidas.  
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigeración de 4 a 8°C durante 
18 h y no más de 24 h antes de proceder a su análisis.  
B.1.4.1.2.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado.  
B.1.4.1.2.2  Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la  de la 
muestra.  
B.1.4.1.2 .3 Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 min hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica correspondiente para cada alimento. Aun 
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 min.  
B.1.4.1.2.4  Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de 
las capas superiores de la suspensión.  
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en 
cuent a para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.  
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo, 
aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser u tilizado sólo 
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren 
significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.  
B.1.4.2  Preparación de las diluciones decimales adicionales.  
B.1.4.2.1  Transfe rir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10-1), en otro 
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el 
contacto entre la pipeta y el diluyente.  
B.1.4.2.2  Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe 
en (B.1.4.1.1.1).  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     29 
B.1.4.2.3  La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos  en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia 
total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.  
B.1.4.2.4  Utilizar pi petas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan 
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.  
B.1.4.2.5  Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen d e líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.  
B.1.4.2.6  Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del fra sco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.  
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 
0,1 ml o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.  
El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es:  
Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 ml de la dilución más alta.  
Para  la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el caso de 
otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana 
correspondiente.  
B.1.4.3  Duración del procedimiento.  
En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cu ltivo dentro de los 20 min posteriores a su preparación.  
B.2 DETERMINACI ON DE BACTERIAS COLIFORMES. T ECNICA DEL N UMERO M AS PROBABLE  
B.2.1  Fundamento  
El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 
a 48 h, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación.  
B.2.2 Reactivos y materiales  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua des tilada con pH cercano a la neutralidad.  
B.2.2.1  Reactivos  
B.2.2.1.1  Soluciones diluyentes  
B.2.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Fosfato monopotásico  34 g 
Agua  1000 ml  
 
Preparación : Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1 N. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C. Conservar en refrigeración 
(solución concentrada). Tomar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar  a un litro con agua. Distribuir en 
porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C. Después de la 
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a los iniciales.  30     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
B.2.2.1.1.2 . Agua peptonada  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  1 g 
Cloruro de sodio  8,5 g  
Agua  1000 ml  
 
Preparación: Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio  1 
N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cual quier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C. Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de 
trabajo deben ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacen ar en lugar 
obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no 
alteren su volumen o composición.  
B.2.2.1.2  Medios de cultivo.  
Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo).  
Caldo lau ril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo).  
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación).  
En el caso del análisis de agua potable y hielo puede utilizarse caldo lactosado o caldo lauril sulfato 
triptosa con púrpura de bromocre sol (concentración 0,01 g/l de medio), como alternativa al uso de campanas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo.  
B.2.2.1.2.1  Caldo lactosado  
Ingrediente  Medio de concentración  
1,5 Medio de concentra ción sencilla  
Extracto de carne  4,5 g  3 g 
Peptona de gelatina  7,5 g  5 g 
Lactosa  7,5 g  5 g 
Agua destilada  1000 ml  1000 ml  
Disolver los ingredientes en 1 l de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, 
siguiendo las instruccione s del fabricante. Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización 
éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el 
medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 m m el medio de concentración 1,5, cada 
tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ± 1°C. Enfriar 
rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige. Se 
puede utili zar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 ml del caldo 
preparado, cuando se agreguen 10 ml de la muestra.  
B.2.2.1.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa.  
Ingrediente  Medio de concentración  
1,5 Medio de concentración sencilla  
Triptosa  30 g 20 g 
Lactosa  7,5 g  5 g 
Fosfato dipotásico  4,125 g  2,75 g  
Fosfato monopotásico  4,125 g  2,75 g  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     31 
Cloruro de sodio  7,5 g  5 g 
Lauril sulfato de sodio  0,15 g  0,1 g  
Agua destilada  1000 ml  1000 ml  
 
Disolver los componentes en 1 l de agua,  calentando si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. Ajustar el pH de tal manera que después de la 
esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25°C. Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos con di mensiones de  16 
x 160 mm el medio de concentración sencilla y de 20 ml en tubos de 20 x 200 mm el medio  de concentración 
1,5, cada tubo debe tener campana de fermentación. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ± 1°C. Se 
recomienda almacenar el medio un a vez preparado. Las campanas de fermentación no deben contener 
burbujas de aire después de la esterilización. Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, 
en cuyo caso se emplearán 10 ml de caldo preparado, cuando se agreguen 10 ml de m uestra.  
B.2.2.1.2.3  Lactosa bilis verde brillante  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  10 g 
Lactosa  10 g 
Sales biliares  20 g 
Verde brillante  0,0133 g  
Agua  1000 ml  
 
Preparación:  Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, cale ntar si es 
necesario. Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 7,2 a 25°C. Distribuir el 
medio en cantidades de 10 ml en tubos de 16 x 160 mm conteniendo campana de fermentación. Esterilizar en 
autoclave por 15 min a 121 ± 1°C. Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire 
después de la esterilización.  
B.2.2.2  Materiales  
- Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduad as en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
- Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.  
- Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas, etc.  
- Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de  16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca.  
- Campanas de fermentación (tubos de Durham).  
- Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 ml  
- Gradillas.  
- Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro  
- Todo el material que tenga contacto  con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante:  
- Horno, durante 2 h a 170 -175°C o 1 h a 180°C o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121 ± 1°C.  32     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
- El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificac iones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe 
ser químicamente inerte.  
B.2.3 Aparatos e instrumentos  
- Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.  
- Incubadora con termostato  que evite variaciones mayores de ± 1°C, provista con termómetro 
calibrado.  
- Termómetro de máximas y mínimas.  
- Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1°C.  
- Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25°C.  
B.2.4 Preparació n de la muestra  
Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo con el Método de 
Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico.  
B.2.5 Procedimiento  
B.2.5.1  Para alimentos.  
Preparar suficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la última 
dilución rindan un resultado negativo.  
B.2.5.1.1  Prueba presuntiva  
B.2.5.1.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 ml de la muestra si es líquida o 10 ml de la dilución primaria inicial, 
en el caso de otros productos.  
B.2.5.1.1.1.1  Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 ml de la muestra si es líquida o 1 ml de la dilución 
primaria en el caso de otros productos.  
B.2.5.1.1.1.2  Para las diluciones subsecuentes, continuar como se indica en el párrafo anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio.  
B.2.5.2.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C por 24 ± 2 h y observar si hay formación de gas, en 
caso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 h.  
B.2.5.1.2  Prueba confirmativa  
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5°C por 24 ± 2 h o si la formación de gas no se observa en este 
tiempo, prolongar la incubación p or 48 ± 2 h.  
En esta Norma Oficial Mexicana se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. 
Para algunos productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los resultados, será necesario 
inocular una serie de cinco o diez tubos.  
B.2.6 Expresión de los resultados  
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en los cuadros correspondientes.  
El Cuadro 3 muestra algunos ejemplos que se pued en presentar.  
Ejemplos:  
Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones mayores 
posteriores.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     33 
Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la última da menos de tres, elegir 
esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.  
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de tres 
diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.  
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos pos itivos s ólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 ml o 1 g) y en la 
primera dilución (1 ml o 10-1), seleccionar las tres primeras diluciones para el cálculo del número más 
probable.  
En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es represen tado en los cuadros 4 al 7, según 
corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP.  
La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta técnica 
deben ser utilizados co n precaución. Los límites de confianza están representados en los cuadros 4 al 7. Por 
ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los límites de confianza en el 95% 
de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo  3 del Cuadro 3) y en un producto con 24 de 
NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes por gramo (ejemplo 2 
Cuadro 3).  
CUADRO 3  
Ejemplos de la selección de resultados po sitivos para el cálculo del NMP  
E 
J 
E 
M 
P 
L 
O Número de tubos positivos obtenidos de tres   NMP  
Tubos incubados, para las siguientes cantidades de muestra inoculada por tubo    
Producto    
Líquido  (ml) 10 1 10-1 10-2 10-3  Producto  Otros  
Otros Productos  (g) 1 10-1 10-2 10-3 10-4 Líquido  Otros  
Mayor dilución = menor concentración  
 
       ml-1  g-1 
1 3 3 2 1 0 15 (5) 150 (6) 
2 3 3 3 0  24 (5) 240 (6 
3 2 2 1 1 0 7 (6) 70 (7) 
4 3 3 0 0 0 2,4 (4) 24 (5) 
5 2 2 0 1 0 0,21 (4) 2,1 (5) 
CUADRO 4  
Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias c ombinaciones de resultados positivos  cuando 
son usados varios números de tubos. (Diluciones 10, 1 y 0,1 g)  
 3 TUBOS POR DILUCI ON 5 TUBOS POR DILUCI ON 
Combinación 
de positivos  Indice del NMP 
por g  95% Límites de confianza  Indice del NMP 
por g  95% Límites d e confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 < 0,03  <0,005  <0,09  <0,02  <0,005  <0,07  
0-0-1 0,03 <0,005  <0,09  0,02 <0,005  0,07 
0-1-0 0,03 <0,005  0,13 0,02 <0,005  0,07 
0-2-0 --- --- --- 0,04 <0,005  0,11 
1-0-0 0,04 <0,005  0,20 0,02 <0,005  0,07 34     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005  0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005  0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005  0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005  0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005  0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,17 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,21 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 ---- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 0,12 0,03 0,28 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,19 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,25 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 --- --- --- 
3-1-0 0,43 0,07 2,1 0,11 0,02 0,25 
3-1-1 0,75 0,14 2,3 0,14 0,04 0,34 
 
3-1-2 1,20 0,30 3,8 --- --- --- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 -- -- -- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 -- -- -- 
3-3-1 4,60 0,71 24 -- -- -- 
3-3-2 11,0 1,50 48 -- -- -- 
3-3-3 >11.0  >1,50  >48 -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 0,13 0,03 0,31 
4-0-1 -- --- --- 0,17 0,05 0,46 
4-1-0 -- --- --- 0,17 0,05 0,46 
4-1-1 -- -- --- 0,21 0,07 0,63 
4-1-2 -- -- --- 0,26 0,09 0,78 
4-2-0 -- -- --- 0,22 0,07 0,67 
4-2-1 -- --- --- 0,26 0,09 0,78 
4-3-0 -- --- --- 0,27 0,09 0,80 
4-3-1 -- --- --- 0,33 0,11 0,93 
4-4-0 -- --- --- 0,34 0,12 0,93 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     35 
5-0-0 -- --- --- 0,23 0,07 0,70 
5-0-1 -- --- --- 0,31 0,11 0,89 
5-0-2 -- --- --- 0,43 0,15 1,14 
5-1-0 -- --- --- 0,33 0,11 0,93 
5-1-1 -- --- ---- 0,46 0,16 1,2 
5-1-2 -- --- --- 0,63 0,21 1,5 
5-2-0 -- --- --- 0,49 0,17 1,3 
5-2-1 -- --- --- 0,70 0,23 1,70 
5-2-2 -- --- --- 0,94 0,28 2,2 
5-3-0 -- --- --- 0,79 0,25 1,9 
5-3-1 -- --- --- 1,10 0,31 2,5 
5-3-2 -- --- --- 1,4 0,37 3,4 
5-3-3 -- --- --- 1,80 0,44 5,0 
5-4-0 -- --- --- 1,30 0,35 3,0 
5-4-1 -- --- --- 1,70 0,43 4,9 
5-4-2 -- --- --- 2,20 0,57 7,0 
 
5-4-3 -- --- --- 2,80 0,90 8,5 
5-4-4 -- --- --- 3,50 1,20 10 
5-5-0 --- --- --- 2,40 0,68 7,5 
5-5-1 --- --- --- 3,50 1,60 10 
5-5-2 --- --- --- 5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---- --- --- 9,20 3,0 32 
5-5-4 --- --- --- 16,09  6,40 58,0 
5-5-5 ---- --- --- --- --- --- 
 
CUADRO 5  
Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos  cuando 
son usados varios números de tubos. (Diluciones 1, 0,1 y 0,01 g)  
 3 TUBOS POR DILUCI ON 5 TUBOS POR DILUCI ON 
Combinación 
de positivos  Indice del 
NMP por g  95% Límites de confianza  Indice del NMP 
por g  95% Límites de confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <0,3 <0,05  <0,9 <0,2 <0,05  <0,7 
0-0-1 0,3 <0,05  <0,9 0,2 <0,05  0,7 
0-1-0 0,3 <0,05  1,3 0,2 <0,05  0,7 
0-2-0 --- --- --- 0,4 <0,05  0,11 36     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
1-0-0 0,4 <0,05  2 0,2 <0,05  0,7 
1-0-1 0,7 0,1 2 0,4 <0,05  1,1 
1-1-0 0,7 0,1 2,3 0,4 <0,05  1,1 
1-1-1 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05  1,5 
1-2-0 1,1 0,3 3,6 0,6 <0,05  1,5 
2-0-0 0,9 0,1 3,6 0,5 <0,05  1,3 
2-0-1 1,4 0,3 3,7 0,7 0,1 1,7 
2-1-0 1,5 0,3 4,4 0,7 0,1 1,7 
2-1-1 2 0,7 8,9 0,9 0,2 2,1 
2-2-0 2,1 0,4 4,7 0,9 0,2 2,1 
2-2-1 2,8 1,0 15,0 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 1,2 0,3 2,8 
3-0-0 2,3 0,4 12 0,8 0,1 1,9 
3-0-1 3,9 0,7 13,0 1,1 0,2 2,5 
3-0-2 6,4 1,5 38,0 -- -- -- 
3-1-0 4,3 0,7 21,0 1,1 0,2 2,5 
 
3-1-1 7,5 1,4 23,0 1,4 0,4 3,4 
3-1-2 12 3,0 38,0 -- -- -- 
3-2-0 9,3 1,5 38,0 1,4 0,4 3,4 
3-2-1 15,0 3,0 44,0 1,7 0,5 4,6 
3-2-2 21,0 3,5 47,0 -- -- -- 
3-3-0 24,0 3,6 130,0  -- -- -- 
3-3-1 46,0 7,1 240,0  -- -- -- 
3-3-2 110 15,0 480,0  -- -- -- 
3-3-3 >110  >15,0  >480,0  -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 1,3 0,3 3,1 
4-0-1 -- --- --- 1,7 0,5 4,6 
4-1-0 -- --- --- 1,7 0,5 4,6 
4-1-1 -- --- --- 2,1 0,7 6,3 
4-1-2 -- --- --- 2,6 0,9 7,8 
4-2-0 -- --- --- 2,2 0,7 6,7 
4-2-1 -- --- --- 2,6 0,9 7,8 
4-3-0 -- --- --- 2,7 0,9 8,0 
4-3-1 -- --- --- 3,3 1,1 9,3 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     37 
4-4-0 -- --- --- 3,4 1,2 3,0 
5-0-0 -- --- --- 2,3 0,7 7,0 
5-0-1 -- --- --- 3,1 1,1 8,9 
5-0-2 -- --- --- 4,3 1,5 11,4 
5-1-0 -- --- --- 3,3 1,1 9,3 
5-1-1 -- --- --- 4,6 1,6 12 
5-1-2 -- --- --- 6,3 2,1 15,0 
5-2-0 -- --- --- 4,9 1,7 13,0 
5-2-1 -- --- --- 7,0 2,3 17,0 
5-2-2 -- --- --- 9,4 2,8 22 
5-3-0 -- --- --- 7,9 2,5 19,0 
5-3-1 -- --- --- 11,0 3,1 25,0 
5-3-2 -- --- --- 14,0 3,7 34,0 
5-3-3 -- --- --- 18,0 4,4 50,0 
5-4-0 -- --- --- 13,0 3,5 30,0 
5-4-1 -- --- --- 17,0 4,3 49,0 
 
5-4-2 -- --- --- 22 5,7 70,0 
5-4-3 -- --- --- 28,0 9,0 85,0 
5-4-4 -- --- --- 35,0 12 100,0  
5-5-0 -- --- --- 24,0 6,8 75,0 
5-5-1 -- --- --- 35,0 12 100,0  
5-5-2 -- --- --- 54,0 18,0 140,0  
5-5-3 -- --- --- 92 30,0 320,0  
5-5-4 -- --- --- 161,0  64,0 580,0  
5-5-5 -- --- --- >161,0  >64,0  >580,0  
CUADRO 6  
Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando 
son usados varios números de tubos. (Diluciones 0,1, 0,001 y 0,0001 g)  
 3 TUBOS POR DILUCI ON 5 TUBOS POR DILUCI ON 
Combinación 
de positivos  Indice del 
NMP por g  95% Límites de confianza  Indice del NMP 
por g 95% Límites de confianza  
bajo Alto bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 <9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 38     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
0-2-0 --- --- --- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2 21 
2-2-0 21 4 47 9 2 21 
2-2-1 28 10 150 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 12 3 28 
3-0-0 23 4 120 8 1 19 
3-0-1 39 7 13,0 11 2 25 
3-0-2 64 15 380 -- -- -- 
3-1-0 43 7 210 11 2 25 
 
3-1-1 75 14 230 14 4 34 
3-1-2 120 30 380 -- -- -- 
3-2-0 93 15 380 14 4 34 
3-2-1 150 30 440 17 5 46 
3-2-2 210 35 470 -- -- -- 
3-3-0 240 36 130,0  -- -- -- 
3-3-1 460 71 240,0  -- -- -- 
3-3-2 1100  150 480,0  -- -- -- 
3-3-3 >1100  >150  >480,0  -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 13 3 31 
4-0-1 -- --- --- 17 5 46 
4-1-0 -- --- --- 17 5 46 
4-1-1 -- --- --- 21 7 63 
4-1-2 -- --- --- 26 9 78 
4-2-0 -- --- --- 22 7 67 
4-2-1 -- --- --- 26 9 78 
4-3-0 -- --- --- 27 9 80 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     39 
4-3-1 -- --- --- 33 11 93 
4-4-0 -- --- --- 34 12 93 
5-0-0 -- --- --- 23 7 7 
5-0-1 -- --- --- 31 11 89 
5-0-2 -- --- --- 43 15 114 
5-1-0 -- --- --- 33 11 93 
5-1-1 -- --- --- 46 16 120 
5-1-2 -- --- --- 63 21 150 
5-2-0 -- --- --- 49 17 130 
5-2-1 -- --- --- 70 23 170 
5-2-2 -- --- --- 94 28 220 
5-3-0 -- --- --- 79 25 190 
5-3-1 -- --- --- 110 31 250 
5-3-2 -- --- --- 140 37 340 
5-3-3 -- --- --- 180 44 500 
5-4-0 -- --- --- 130 35 300 
5-4-1 -- --- --- 170 43 490 
 
5-4-2 -- --- --- 220 57 700 
5-4-3 -- --- --- 280 90 850 
5-4-4 -- --- --- 350 120 1000  
5-5-0 -- --- --- 240 68 750 
5-5-1 -- --- --- 350 120 1000  
5-5-2 -- --- --- 540 180 1400  
5-5-3 -- --- --- 920 300 3200  
5-5-4 -- --- --- 1600  640 5800  
5-5-5 -- --- --- >1600  >640  >5800  
 
CUADRO 7  
Indice del  NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados positivos cuando 
son usados varios números de tubos. (Diluciones 0,01, 0,001 y 0,0001 g)  
 3 TUBOS POR DILUCI ON 5 TUBOS POR DILUCI ON 
Combinación 
de positivos  Indice del NMP 
por g  95% L ímites de confianza  Indice del NMP 
por g  95% Límites de confianza  
bajo Alto bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 40     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 --- --- --- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500  --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200  80 10 190 
3-0-1 390 70 1300  110 20 250 
3-0-2 640 150 3800  -- -- -- 
 
3-1-0 430 70 2100  110 20 250 
3-1-1 750 140 2300  140 40 340 
3-1-2 1200  300 3800  -- -- -- 
3-2-0 930 150 3800  140 40 340 
3-2-1 1500  300 4400  170 50 460 
3-2-2 2100  350 4700  -- -- -- 
3-3-0 2400  360 13000  -- -- -- 
3-3-1 4600  710 24000  -- -- -- 
3-3-2 11000  1500  48000  -- -- -- 
3-3-3 >11000  >1500  >48000  -- -- -- 
4-0-0 -- --- --- 130 30 310 
4-0-1 -- --- --- 170 50 460 
4-1-0 -- --- --- 170 50 460 
4-1-1 -- --- --- 210 70 630 
4-1-2 -- --- --- 260 90 780 
4-2-0 -- --- --- 220 70 670 
4-2-1 -- --- --- 260 90 780 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     41 
4-3-0 -- --- --- 270 90 800 
4-3-1 -- --- --- 330 110 930 
4-4-0 -- --- --- 340 120 930 
5-0-0 -- --- --- 230 70 700 
5-0-1 -- --- --- 310 110 890 
5-0-2 -- --- --- 430 150 1140  
5-1-0 -- --- --- 330 110 930 
5-1-1 -- --- --- 460 160 1200  
5-1-2 -- --- --- 630 210 1500  
5-2-0 -- --- --- 490 170 1300  
5-2-1 -- --- --- 700 230 1700  
5-2-2 -- --- --- 940 280 2200  
5-3-0 -- --- --- 790 250 1900 
5-3-1 -- --- --- 1100  310 2500  
5-3-2 -- --- --- 1400  370 3400  
5-3-3 -- --- --- 1800  440 5000  
5-4-0 -- --- --- 1300  350 3000  
 
5-4-1 -- --- --- 1700  430 4900  
5-4-2 -- --- --- 2200  570 7000  
5-4-3 -- --- --- 2800  900 8500  
5-4-4 -- --- --- 3500  1200  10000  
5-5-0 -- --- --- 2400  680 7500  
5-5-1 -- --- --- 3500  1200  10000  
5-5-2 -- --- --- 5400  1800  14000  
5-5-3 -- --- --- 9200  3000  32000  
5-5-4 -- --- --- 16000  6400  58000  
5-5-5 -- --- --- >16000  >6400  >58000  
B.2.7 Informe de la prueba  
Para el informe  de resultados multiplicar el valor obtenido en tablas por el factor de concentración de 
muestra correspondiente y reportar como "número más probable (NMP) de coliformes por gramo o mililitro  de 
muestra".  
En caso de muestras de agua informar NMP/100 ml.  
B.3 DETERMINACI ON DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA  
B.3.1 Fundamento  42     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan  bacterias a 35°C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sales biliares.  
B.3.2 Reactivos y materiales  
B.3.2.1  Reactivos  
Los reactivos que a continuación se  mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada.  
B.3.2.1.1  Soluciones diluyentes  
B.3.2.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Fosfato monopotásico  34 g 
Agua  1000 ml  
 
Preparación : Disolver el fosfato en 500 ml de agua y ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con solución de hidróxido de 
sodio 1 N. Llevar con agua a un litro. Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 min. Conservar en refrigeración 
(solución concentrada). T omar 1,25 ml de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de 
trabajo). Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml según se requiera. Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de l a solución de trabajo deben ser iguales a los 
iniciales.  
B.3.2.1.1.2  Agua peptonada  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  1 g 
NaCl  8,5 g  
Agua  1000 ml  
 
Preparación:  Disolver los componentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,2 con hidróxido de sodio 
1 N. Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 ml o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera. 
Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C. Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de 
trabajo deben ser iguales a los in iciales. Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar 
obscuro a una temperatura entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no 
alteren su volumen o composición.  
B.3.2.1.2  Medio de Cultivo  
Agar -rojo- violeta -bilis-lactosa (RVBA)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  7 g 
Extracto de levadura  3 g 
Lactosa  10 g Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     43 
Sales biliares  1,5 g  
Cloruro de sodio  5 g 
Rojo neutro  0,03 g  
Cristal violeta  0,002 g  
Agar  15 g 
Agua  1000 ml  
 
Preparación:  Mezclar los componente s en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar 
perfectamente y ajustar el pH a 7,4 ± 0,2 con ácido clorhídrico 0,1 N o con hidróxido de sodio 0,1 N a 25°C, de 
forma que después del calentamiento se mantenga en este valor. Calentar con agitac ión constante y hervir 
durante 2 min. Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 45°C. Evitar el 
sobrecalentamiento del medio. No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras 
horas después de su prep aración. En el caso de utilizar medio de cultivo deshidratado, seguir las 
instrucciones del fabricante.  
B.3.2.2  Materiales  
- Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 ml (o si es necesario de 11 y 2 ml), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser gr aduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
- Frascos de vidrio de 250 ml con tapón de rosca.  
- Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.  
- Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas,  espátulas, 
etc. 
- Cajas Petri.  
- Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante:  
- Horno, durante 2 h a 170 -175°C, o 1 h a 180°C; o en autoclave, durante 15 min como mínimo  a 121 ± 
1°C. 
- El mater ial de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe 
ser químicamente inerte.  
B.3.3 Aparatos e instrumentos  
- Horno par a esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C.  
- Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas.  
- Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro calibrado 
o verifica do y que mantenga la temperatura entre 45 a 48°C o equivalente.  
- Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
- Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1°C, provista con termómetro 
calibrado.  
- Contador de colonias de campo oscuro, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador o 
equivalente.  
- Registrador mecánico o electrónico.  
- Microscopio óptico.  
- Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25°C.  
B.3.4 Prepa ración de la muestra  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo con lo establecido en el método B.1 PREPARACI ON Y 
DILUCI ON DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU AN ALISIS MICROBIOL OGICO.  
B.3.5 Procedimiento  44     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
B.3.5.1  Colocar en cajas Petri por duplicado 1 ml  de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.  
B.3.5.2  Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada diluc ión. 
B.3.5.3  Verter de 15 a 20 ml del medio RVBA fundido y mantenido entre 45 a 48°C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 ml del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y  el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder  de 20 
min. 
B.3.5.4  Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en  el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.  
B.3.5.5  Preparar una caja con trol con 15 ml de medio para verificar la esterilidad.  
B.3.5.6 Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente 4 ml 
del medio RVBA mantenido entre 45 a 48°C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifi que. 
B.3.5.7  Invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35 ± 1°C, durante 18 a 24 h y en productos 
lácteos a 32 ± 1°C.  
B.3.5.8  Después del periodo especificado para la incubación, contar las colonias con el contador de 
colonias.  
B.3.5.9  Selecciona r las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es  semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 
0,5 a 2 mm.  
B.3.6 Expresión de los resultados  
B.3.6.1 Cálculo del método  
B.3.6.1.1  Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.  
Separar las placas que contienen el número antes mencionado d e colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes. Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los  criterios del método para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.  
B.3.6.1.2  Placas que contienen menos de 15 colonias características.  
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido 
de la diluci ón correspondiente.  
B.3.6.1.3  Placas con colonias no características.  
Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme  por 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución.  
B.3.7 Informe de la prueba  
Informar: UFC/g o ml en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 35°C durante 24 ± 2 h.  
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución 
más baja utilizada, por ejemplo dilución 10-1. 
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrollo de coliformes  por 
ml". 
B.4 DETERMINACI ON DE Salmonella  EN ALIMENTOS  
B.4.1 Fundamento  
La presente técnica para la detección de  Salmonella  en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos:  
B.4.1.1  Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, 
que permite restaurar las células de  Salmonella  dañadas a una condición fisiológica estable.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     45 
B.4.1.2  Enriquecimiento sel ectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de 
Salmonella  e inhibir otros organismos presentes en la muestra.  
B.4.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros género s diferentes a Salmonella  y permite el reconocimiento visual de colonias 
sospechosas.  
B.4.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella  
y la eliminación de cultivos presuntivos.  
B.4.1.5  Serotipifi cación, es una técnica serológica que permite la identificación específica de un cultivo.  
B.4.2 Reactivos y materiales  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su  preparación.  
Las sustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado 
analítico.  
B.4.2.1 Reactivos  
B.4.2.1.1 Medios de pre -enriquecimiento  
B.4.2.1.1.1  Agua peptonada  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  10 g 
Cloruro sódico  5 g 
Fosfato sódico dibásico  3,5 g  
Fosfato potásico monobásico  1,5 g  
Agua  1000 ml  
 
Preparación:  Disolver los componentes en el agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, si es 
necesario, después de la esterilización a 7 ± 0,2. Distri buir en recipientes de vidrio esterilizables con la 
capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar por 15 min a 121 ± 1°C.  
B.4.2.1.1.2  Caldo lactosado  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne  3 g 
Peptona  5 g 
Lactosa  5 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  
Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentando a 65°C. Distribuir en porciones de 225 ml, en 
frascos de 500 ml. Esterilizar durante 15 min a 121 ± 1°C  
B.4.2.1.2 Caldo de enriquecimiento  
B.4.2.1.2.1  Caldo selenito -cistina  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  46     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Triptona o polipeptona  5 g 
Lactosa  4 g 
Fosfato disódico  10 g 
Selenito ácido de sodio  4 g 
L-cistina  0,01 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,0 ± 0,2 a 25°C  
Preparación : Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 
y 225 ml en recipientes estériles, según se requiera. El caldo así preparado es transparente. De preferencia 
usarlo el mismo día de su preparación. Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al 
calor en autoclave por 5 min a 110 ± 1°C, tomando entonces un color salmón.  
B.4.2.1.2.2  Caldo tetrationato  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Proteosa peptona o tristona  5 g 
Sales biliares  1 g 
Carbonato de calcio  10 g 
Tiosulfato de sodio pentahidratado  30 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,0 ± 0,1  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril. Distribuir, agitando 
constantemente, en porciones de 10 y 225 ml, en recipientes estérile s. Guardar en refrigeración. Antes de 
usar el medio, agregar 2 ml de una solución yodo -yoduro y 1 ml de solución de verde brillante al 0,1% por 
cada 100 ml de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe calentarse y debe usarse el mismo día 
de su pr eparación.  
B.4.2.1.2.3  Vassiliadis -Rappaport  
Solución A  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Tristona  5 g 
Cloruro de sodio  8 g 
Fosfato de potasio dihidrogenado  1,6 g  
Agua destilada  1000 ml  
 
Preparación:  Disolver los componentes en el agua por calentamiento cercano a 70°C.  
Solución B  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Cloruro de magnesio hexahidratado  400 g  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     47 
Agua destilada  1000 ml  
 
Preparación:  Disolver el cloruro de magnesio en el agua. Como esta sal es muy higroscópica es 
conveniente disolver el contenido ent ero de cloruro de magnesio desde un recipiente recientemente abierto de 
tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/ml. Conservar en frasco ámbar a temperatura 
ambiente  
Solución C  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Oxalato de verde de malaquita  0,4 g  
Agua destilada  100 ml  
 
Preparación:  Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua. Conservar en frasco ámbar a 
temperatura ambiente.  
Medio completo  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Solución A  1 000 ml  
Solución B  100 ml  
Solución C  10 ml  
 
Preparación:  Adicionar 1 000 ml de la solución A, 100 ml de la solución B y 10 ml de la solución C. Ajustar 
el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5,2 ± 0,2. Distribuir antes de usar 
dentro de tubos en cantidades de 10 m l. Almacenar en refrigeración.  
B.4.2.1.2.4  Caldo de Soya Tripticasa  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Tripticasa o triptosa  17 g 
Fitona  3 g 
Glucosa  2,5 g  
Cloruro de sodio  2,5 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,3 ± 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredi entes en 1 l de agua destilada, calentando lentamente hasta su 
disolución completa. Distribuir porciones de 225 ml dentro de matraces de 500 ml y esterilizar en autoclave 
durante 15 min a 121 ± 1°C.  
B.4.2.1.2.5  Leche descremada reconstituida  
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml. Esterilizar a 121 ± 1°C por 
15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 ml. 
B.4.2.1.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio.  
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1000 ml de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el sulfito d e potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual.  48     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
B.4.2.1.3 Medios de aislamiento  
B.4.2.1.3.1  Agar verde brillante (VB)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de levadura  3 g 
Polipeptona (Proteosa peptona No. 3)  10 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Lactosa  10 g 
Sacarosa  10 g 
Rojo de fenol  0,08 g  
Agar  20 g 
Verde brillante  0,0125 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta 
disolución completa.  Ajustar el pH. Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ± 1°C. El sobrecalentamiento del 
medio disminuye su selectividad. Enfriar el medio a 50°C y distribuirlo en cajas de petri estériles. El aspecto 
del medio es obscuro, de color marrón.  
B.4.2.1.3.2  Agar con sulfito de bismuto  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne de res  5 g 
Mezcla de peptonas  10 g 
Glucosa  5 g 
Fosfato disódico (anhidro)  5 g 
Sulfato ferroso (anhidro)  0,300 g  
Sulfito de bismuto  8 g 
Verde brillante  0,025 g  
Agar  20 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,6 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolución completa, 
agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45°C y verter en cajas de petri estériles, distribuyendo de 
maner a homogénea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido 
y deben usarse el mismo día de su preparación. Si la coloración es parda, no deben utilizarse. El medio no 
debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalent amiento afecta su selectividad.  
B.4.2.1.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     49 
Xilosa  3,75 g  
L-lisina  5 g 
Lactosa  7,5 g  
Sacarosa  7,5 g  
Cloruro de sodio  5 g 
Extracto de levadura  3 g 
Rojo de fenol  0,08 g  
Agar  15 g 
Desoxicolato de sodio  2,5 g  
Citrato férrico -amónico  0,8 g  
Tiosulfato de sodio  6,8 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 
55°C, agitando frecuenteme nte, hasta disolución completa. Ajustar el pH. Enfriar a 50°C y verter en cajas de 
petri estériles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio 
puede ser satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeñ as. El aspecto del medio es claro y de color 
rojo brillante.  
B.4.2.1.3.4  Agar para Salmonella y Shigella (SS)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne  5 g 
Polipeptona *  5 g 
Lactosa  10 g 
Sales biliares  8,5 g  
Citrato de sodio dihidratado  8,5 g  
Tiosulfato de sodio pentahidratado  8,5 g  
Citrato férrico  1 g 
Agar  13,5 g  
Rojo neutro  0,025 g  
Verde brillante  0,33 mg  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,0 ± 0,2  
* La polipeptona se puede sustituir por 2,5 g de peptona de caseína y 2,5 g de peptona de carne.  
Preparación:  Suspender los ingredientes en 1 l de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta 
disolución completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50°C y distribuir en cajas de petri 
estériles en condiciones asépticas.  El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.  
B.4.2.1.3.5  Agar entérico Hektoen  
FORMULA  50     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Ingredientes  Cantidad  
Proteosa peptona  12 g 
Extracto de levadura  3g 
Lactosa  12 g 
Sacarosa  12 g 
Salicina  2 g 
Sales biliares  9 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Tiosulfato de sodio  5 g 
Citrato amónico férrico  1,5 g  
Azul de bromotimol  0,064 g  
Fuscina ácida  0,1 g  
Agar  13,5 g  
Agua  1000 ml  
pH final: 7,5 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa 
disoluci ón del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar a 55 -60°C y distribuir en cajas de petri estériles en 
condiciones asépticas.  
B.4.2.1.4 Medios para pruebas bioquímicas  
B.4.2.1.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona de carne *  1 g 
Peptona de caseína *  1 g 
Cloruro de sodio  0,5 g  
Lactosa  1 g 
Sacarosa  1 g 
Glucosa  0,1 g  
Agar  1,3 g  
Rojo de fenol  2,5 mg  
Sulfato ferroso amónico -Pentahidratado  20 mg  
Tiosulfato de sodio  20 mg  
Agua destilada  100 ml  
pH final: 7,3 ± 0,2  
* Estas peptonas se pueden sustituir por 2 g de polipeptona.  
Preparación:  Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando 
ocasionalmente, hasta disolución completa. Enfriar a 60°C y ajustar el pH. Distribuir en volúme nes de 3 ml en 
tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio de 
cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.  
B.4.2.1.4.2  Agar de hierro y lis ina (LIA)  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     51 
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona de gelatina  0,5 g  
Extracto de levadura  0,3 g  
Glucosa  0,1 g  
L-lisina  1 g 
Citrato férrico -amónico  50 mg  
Tiosulfato de sodio anhidro  4 mg  
Púrpura de bromocresol  2 mg  
Agar  1,5 g  
Agua destilada  100 ml  
pH final: 6,7 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición 
con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir en volúmenes de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm , con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 12 min. Dejar que 
los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4 cm y una 
superficie inclinada de 2 cm.  
El medio ya preparado es de color púr pura.  
B.4.2.1.4.3  Agar nutritivo  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne  3 g 
Peptona  5 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,8 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min. Calentar a ebullición 
hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de 1/3 de su volumen. 
Esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min. Inclinar los tubos antes que el agar solidifique.  
B.4.2.1.4.4  Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne  3 g 
Peptona  30 g 
Hierro peatonizado  0,2 g  
Tiosulfato de sodio  0,025 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,3 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando 
frecuen temente hasta lograr una disolución completa. Enfriar a 50°C y ajustar el pH. Distribuir el medio en 
volúmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min. Se dejan 
enfriar los tubos en posición vertical.  
B.4.2.1.4 .5 Agar citrato de Simmons  52     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Fosfato de amonio  1 g 
Fosfato dipotásico  1 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Citrato de sodio  2 g 
Sulfato de magnesio  0,20 g  
Azul de bromotimol  0,08 g  
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,8 ± 0,2 
Preparación : Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave  a 121 ± 1°C durante 15 min. Dejar enfriar los tubos en 
posición inclinada.  
B.4.2.1.4.6  Caldo MR -VP (Rojo de metilo -Voges Proskauer)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  7 g 
Dextrosa  5 g 
Difosfato de potasio  5 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando 
frecuentemente hasta lograr una disolución completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio en volúmenes de 3 ml 
en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autocla ve a 121 ± 1°C durante 15 min.  
B.4.2.1.4.7  Caldo manitol  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne  1 g 
Proteosa peptona  10 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Rojo de fenol  0,018 g  
Manitol  10 g 
Agua  1000 ml  
pH final: 7,4 ± 0,2  
Preparación: Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH. 
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 min.  
B.4.2.1.4.8  Caldo malonato  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     53 
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de levadura  1 g 
Sulfato de amonio  2 g 
Fosfato dipotásico  0,6 g  
Fosfato monopotásico  0,4 g  
Cloruro de sodio  2 g 
Malonato  3 g 
Glucosa  0,25 g  
Azul de bromotimol  0,025 g  
Agua  1000 ml  
pH final: 6,7 ± 0,2  
Preparación:  Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar  el pH. Distribuir en tubos de 13 x 100 
mm en cantidades de 3 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C durante 15 min.  
B.4.2.1.4.9  Caldo Urea  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Urea  20 g 
Extracto de levadura  0,1 g  
Fosfato monopotásico  9,1 g  
Fosfato disódic o 9,5 g  
Rojo de fenol  0,01 g  
Agua  1000 ml  
pH final: 6,8 ± 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a 
través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de presión durante 15 min. Distribuir  asépticamente 
de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm.  
B.4.2.1.4.10  Caldo de urea rápido  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Urea  20 g 
Extracto de levadura  0,1 g  
Fosfato monopotásico  0,091 g  
Fosfato disódico  0,095 g  
Rojo de fenol  0,01 g  
Agua  1000  ml 
pH final: 6,8 ± 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada. NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a 
través de membrana 0,45 µm. Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 ml en tubos estériles de 13 x 100 mm.  
B.4.2.1.4.11  Caldo infusión c erebro corazón  54     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Infusión cerebro corazón  200 g  
Infusión de corazón de res  250 g  
Proteosa peptona  10 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Fosfato disódico dodecahidratado  2,5 g  
Dextrosa  2 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,4 ± 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes en agua destilada, calentar suavemente. Distribuir y esterilizar a 
121 ± 1°C durante 15 min.  
B.4.2.1.5 Soluciones  
B.4.2.1.5.1  Solución verde brillante al 0,1% (1:1000)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Verde brillante  0,1 g 
Agua destilada estéril  100 ml  
 
Preparación:  Disolver 0,1 g de verde brillante en el agua destilada estéril hasta completar 100 ml.  
B.4.2.1.5.2  Solución de yodo -yoduro  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Cristales de yodo  6 g 
Yoduro de potasio  6 g 
Agua  destilada  100 ml  
 
Preparación:  Disolver los cristales y el yoduro de potasio en el agua destilada hasta completar 100 ml. 
Conservar en frasco ámbar.  
B.4.2.1.5.3  Solución salina al 0,85%  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Cloruro de sodio  0,85 g  
Agua destil ada 100 ml  
Preparación:  Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121 ± 1°C durante 15 min.  
B.4.2.1.5.4  Solución salina formalizada  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Solución de formaldehído (36 -38%)  6 ml 
Cloruro de sodio  8,5 g  
Agua destilad a 1000 ml  
 
Preparación:  Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 l de agua destilada. Esterilizar a 121 ± 1°C durante 
15 min. Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 ml de la solución de formaldehído. No esterilizar después 
de la adición de formaldehíd o. 
B.4.2.1.5.5  Reactivo de Kovac  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     55 
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
p-dimetil -aminobenzaldehido  5 g 
Alcohol amílico  75 ml  
Acido clorhídrico concentrado  25 ml  
 
Preparación:  Disolver el p -dimetil -aminobenzaldehído en el alcohol amílico y después agregar el á cido 
clorhídrico lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración.  
B.4.2.1.5.6  Solución de alfa -naftol al 5%  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Alfa-naftol  5 g 
Alcohol  100 ml  
 
Preparación:  Disolver 5 g de alfa -naftol en alcohol hasta completar 100 ml.  
B.4.2.1.5.7  Solución de rojo de metilo  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Rojo de metilo  0,1 g  
Alcohol etílico  300 ml  
Agua destilada c.b.p  500 ml  
 
Preparación:  Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar el agua hasta completar 500 ml.  
B.4.2.1.5.8  Solución de hidróxido de potasio al 40%  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Hidróxido de potasio  40 g 
Agua destilada  100 ml  
 
Preparación:  Disolver 40 g de hidróxido de potasio en el agua hasta completar 100 ml.  
B.4.2.1.5.9  Solución de gelatinasa al  5% 
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Gelatinasa  5 g 
Agua  100 ml  
 
Preparación:  Disolver 5 g de gelatinasa en 100 ml de agua destilada. NO CALENTAR.  
B.4.2.1.6 Antisueros  
- Antisuero polivalente somático (O)  
- Antisuero polivalente flagelar (H)  
- Antisuero V i 
B.4.2.2 Material  56     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
- Matraces Erlenmeyer de 500 ml  
- Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestras simples y 
compuestas  
- Angulos de vidrio  
- Cucharas, bisturís, cuchillos y pinzas  
- Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 1 00 mm  
- Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm  
- Pipetas bacteriológicas de 10 y 5 ml, graduadas en 0,1 ml y protegidas con tapón de algodón.  
- Pipetas de 1 ml, con graduaciones de 0,01 ml  
- Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables  
- Rejillas para tubos de ensaye  
- Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro  
- Papel pH (intervalo de 6 -8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios de color  
Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudi o debe esterilizarse mediante:  
horno, durante 2 h, a 170 -175°C o autoclave, durante 15 min como mínimo, a 121 ± 1°C.  
B.4.3 Equipo  
- Horno para esterilizar que alcance los 180°C  
- Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0,1°C y termóm etro. 
- Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas.  
- Baño maría con termostato y termómetro.  
- Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g  
- Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con vasos esteriliza bles (vidrio o 
aluminio).  
- Mecheros Bunsen o Fisher  
- Potenciómetro  
B.4.4 Procedimiento  
B.4.4.1 Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella  
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la muestra analítica en una proporción  de 1:9 
de muestra/ caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más.  
B.4.4.1.1  Procedimiento general para la preparación de muestras  
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca 
y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el 
pH aproximado con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1 N o ácido 
clorhídrico 1 N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.  
Incubar 18 ± 2 h a 37 ± 1°C. Continuar como se indica en B.4.4.2.1.  
B.4.4.1.2  Procedimiento específico para la preparación  
B.4.4.1.2.1  Productos que contienen huevo en su formulación (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); 
ensaladas preparadas (jamón, huevos, pollo, atún, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustáceos 
(camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     57 
Preferentemente no descongelar la muestra antes de su análisis, si esto es necesario, utilizar caldo 
lactosado como medio de preenriquecimiento, licuar dos min. Continuar después de la incubación como en 
B.4.4.2.1.  
B.4.4. 1.2.2  Carnes, sustitutos de carnes, derivados cárnicos, sustancias de origen animal, productos 
glandulares y harinas (pescado, carne y hueso).  
B.4.4.1.2.2.1  Productos procesados térmicamente y productos secos. Se sigue el procedimiento señalado 
en B.4.4.1. 1 hasta la homogenización. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Después 
de reposar, mezclar bien y ajustar el pH como se indica en el procedimiento general. Para emulsionar las 
grasas, agregar los detergentes en las mismas proporc iones y con las mismas recomendaciones que para el 
coco. La cantidad de los mismos dependerá en gran medida de la composición del alimento. Los detergentes 
no serán necesarios en los productos glandulares en polvo. Incubar las muestras como se indica en B. 4.4.1.1.  
B.4.4.1.2.2.2  Productos crudos o altamente contaminados. Pesar porciones de 25 g de producto en dos 
vasos para licuadora. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y el producto puede 
pesarse directamente en matraces Erlenmeyer  estériles de 500 ml. Adicionar 225 ml de caldo selenito cistina 
o 225 ml de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra analítica. Licuar por dos min y pasar 
asépticamente a matraces Erlenmeyer de 500 ml. Dejar reposar y ajustar el pH como se indica en B.4.4.1.1.  
Adicionar 2,25 ml de solución de verde brillante 0,1% y 4,5 ml de solución yodo -yoduro a la muestra que 
se enriquecerá con caldo tetrationato. Homogenizar e incubar. Continuar como se indica en B.4.4.2.1.  
B.4.4.2  Aislamiento de  Salmone lla 
B.4.4.2.1  Cerrar firmemente el tapón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo 
tetrationato y a otro con 10 ml de caldo seleni to cistina. Como alternativa, en sustitución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis -Rappaport.  
B.4.4.2.2  Incubar de 18 a 24 h a 35°C o, para alimentos fuertemente conta minados a 42°C por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fuer on directamente enriquecidos en medios selectivos.  
B.4.4.2.3  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar 
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (ag ar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).  
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.  
Incubar las placas 24 ± 2 h a 35°C.  
B.4.4.2.4  Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella,  de acuerd o 
con las siguientes características:  
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras.  
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rod eadas por medio enrojecido; las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.  
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las 
colonias pueden aparecer completamente negras.  
Agar Sulfito de Bi smuto: las colonias típicas de  Salmonella  pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas 
cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscu ro. Si las placas no muestran colonias típicas o 
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.  
Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias 
fermentadoras de la lactosa son rojas.  
B.4.4.3  Identificación bioquímica  
B.4.4.3.1  Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren bien 
aisladas.  
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y 
otro con agar hier ro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por punción en el fondo.  58     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Incubar por 24 ± 2 h a 35°C.  
Almacenar en refrigeración de 5 a 8°C las placas con medios selectivos por sí es necesario retomar más 
colonias.  
B.4.4.3.2  Observar el crecimient o en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella  las 
colonias que den las siguientes reacciones:  
B.4.4.3.2.1  Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medi o se observa un color rojo más intenso que el medio original debido a la no 
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido sulfihídrico.  
B.4.4.3. 2.2 Agar LIA, se observa intensificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  producen ácido sulfihídrico en este medio con ennegrecimiento 
a lo largo de la punción.  
B.4.4.3.2.3  Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella  en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en B.4.4.3. 3. 
B.4.4.3.3  Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar  S. arizonae  y cepas atípicas de Salmon ella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios.  
B.4.4.3.4  Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este  medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.  
B.4.4.3.5  Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se 
recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de 
ambos medios de enriquecimiento.  
B.4.4.3.6  Prueba de ureasa  
B.4.4.3.6.1  Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del cultiv o 
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de 
medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el co lor del medio original. Incubar  24 ± 2 
h a 35°C.  
B.4.4.3.6.2  Prueba de urea sa (rápida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0,5°C en baño 
de agua.  
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los  cultivos que den la prueba negativa  (sin 
cambio de color del medio).  
B.4.4.4  Identificación serológica  
B.4.4.4.1  Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella  (Antisuero polivalente O).  
B.4.4.4.1.1  Colocar con una asa dos gotas separadas de solución sal ina estéril sobre un portaobjetos o en 
dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI.  
B.4.4.4.1.2  Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezcl ar con el canto 
del asa o empleando aplicadores de madera.  
B.4.4.4.1.3  Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.  
B.4.4.4.1.4  Considerar cualquier grado de  aglutinación como positiva.  
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.  
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba  no es definitiva y se debe continuar con las pruebas 
bioquímicas complementarias.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     59 
B.4.4.4.2  Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más frecuentes).  
B.4.4.4.2.1  Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polival ente O.  
B.4.4.4.2.2  Si no se cuenta con los sueros grupoespecíficos, solicitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o 
esta Comisión Federal para la Protección  contra Riesgos Sanitarios.  
B.4.4.4.3  Si se requiere, practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella  (Antisuero 
polivalente H).  
B.4.4.4.3.1  Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de 4  a 6 
h a 35  °C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseína 
e incubar por 24 ± 2 h a 35°C (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 ml de solución salina formalizada a 
5 ml del cultivo en caldo o al cultivo e n agar cerebro corazón (BHI).  
B.4.4.4.3.2  Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) prep arado en un tubo para serología  (13 x 
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0, 5 ml de solución salina formalizada con 0,5 ml del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en 
baño de agua a 48 -50°C. Observar a intervalos de 15 min por espacio de 1 h. Una prueba positiva es cuando 
se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no  en el control. Debe interpretarse como negativa una 
prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se 
considera la prueba inespecífica.  
B.4.4.5  Pruebas bioquímicas complementarias  
Cuando las pruebas seroló gicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación:  
B.4.4.5.1  Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, 
caldo manitol y cald o RM -VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia de la especie S. arizonae.  
B.4.4.5.2  Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme con lo siguiente:  
B.4.4.5.2.1  Agar citrato Simmons  
Inocular por estría el tubo.  
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2°C. 
- Prueba positiva: crecimiento acompañado de un cambio de color de verde a azul.  
- Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.  
B.4.4.5.2.2  Medio SIM  
Inocular por punción.  
Incubar 24 h a 35 ± 2°C.  
Movilidad:  
- Prueba positiva: creci miento a lo largo de la punción y en el seno del medio de cultivo.  
- Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.  
Producción de ácido sulfihídrico:  
- Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el 
medio.  
- Prueba negativa: ausencia de color negro.  
Producción de indol:  
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de reactivo de Kovac.  
- Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.  
- Prueba negativa: sin cambio de color.  60     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
B.4.4.5.2.3  Caldo RM -VP 
Inocular un tubo con el medio.  
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2°C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.  
B.4.4.5.2.3.1  Prueba de Voges -Proskauer (VP)  
Transferir a un tubo un ml del cultivo de 48 h.  
Adicionar 0,6 ml de solución de alfa naftol.  
Adicionar 0,2 ml de solución de hidróxido de potasio 40%.  
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).  
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2°C o 4 h a temperatura ambiente:  
- Prueba p ositiva: desarrollo de color rojo ladrillo.  
- Prueba negativa: sin cambio de color.  
Reincubar el resto del medio RM -VP 48 h más a 35 ± 2°C.  
B.4.4.5.2.3.2  Prueba de rojo de metilo (RM)  
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.  
Interpretar los resultados inmediatamente:  
- Prueba positiva: desarrollo de color rojo.  
- Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.  
B.4.4.5.2.4  Caldo malonato  
Inocular un tubo conteniendo el medio.  
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2°C.  
- Prueba positiva: desarrollo de color azul.  
- Prueba negativa: sin cambio de color.  
B.4.4.5.2.5  Caldo manitol  
Inocular un tubo conteniendo el medio.  
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2°C.  
- Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.  
- Prueba negativa: si n cambio de color.  
B.4.4.5.3  Consultar los resultados obtenidos en el cuadro 2 para la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas.  
Nota : Los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bio químicas convencionales.  
B.4.5 Cálculo y expresión de resultados  
B.4.5.1  Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas.  
CUADRO 1  
REACCIONES 
BIOQU IMICAS  REACCIONES SEROL OGICAS  INTERPRETACI ON 
Típica  Antígeno O, Vi o H positivo  
Cepas consideradas c omo Salmonella  
Típica  Todas las reacciones negativas  
Típica  No probada  
Puede ser Salmonella  
Reacciones atípicas  Antígeno O, Vi o H positivo  
Reacciones atípicas  Todas las reacciones negativas  No debe ser considerada Salmonella  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     61 
B.4.5.2  Reacciones bi oquímicas y serológicas de Salmonella  
CUADRO 2  
PRUEBA O SUSTRATO  POSITIVO  NEGATIVO  REACCI ON 
Glucosa (TSI)  amarillo  rojo + 
Lisina descarboxilasa(LIA)  púrpura  amarillo  + 
H2S (TSI y LIA)  negro  no negro  + 
Ureasa  rojo-púrpura  no hay cambio de color  - 
Caldo de lisina descarboxilasa  púrpura  amarillo  + 
Caldo dulcitol rojo de fenol  ³ amarillo o gas  no hay ³ cambio de color, ni gas  +b 
Caldo KCN  crecimiento  no hay crecimiento  - 
Caldo malonato  azul no hay cambio de color  - 
Prueba de indol  superficie colo r violeta  superficie color amarillo  - 
Prueba del antígeno flagelar  aglutinación  no hay aglutinación  + 
Prueba del antígeno somático  aglutinación  no hay aglutinación  + 
Caldo lactosa rojo fenol  amarillo o gas  no hay cambio de color, ni gas  - 
Caldo sacaro sa rojo fenol  amarillo o gas  no hay cambio de color, ni gas  - 
Prueba Voges -Proskauer  de rosa a rojo  no hay cambio de color  - 
Prueba rojo de metilo  rojo difuso  amarillo difuso  + 
Citrato de Simmons  crecimiento color azul  no hay crecimiento no hay cambio 
de color  v 
a +, 90 % o más positivos en 1 ó 2 días; -, 90 % o más negativas en 1 ó 2 días; v, variable.  
b La mayoría de los cultivos S. arizonae  son negativos.  
c La mayoría de los cultivos S. arizonae  son positivos.  
B.4.5.3  Informe de Resultados  
Informar:  presencia o ausencia de Salmonella  en ___________ g o _______________ ml de muestra.  
B.5 M ETODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA  
B.5.1  Fundamento  
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de e lección 
después de un cierto tiempo y temperatura de incubación, presuponiendo que cada colonia proviene de un  
microorganismo de la muestra bajo estudio. El método admite numerosas fuentes de variación, algunas de  
ellas controlables, pero sujetas a la infl uencia de varios factores.  
B.5.2 Reactivos y materiales  
B.5.2.1  Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico.  
Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con pH cercano a la neutralidad.  
Medio de Cultivo.  
Agar Triptona -Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de levadura  2,5 g  
Triptona  5 g 
Dextrosa  1 g 
Agar  15 g 
Agua  1 l 
 
Preparación:  Suspender los componentes del medio deshidratado en un litro de ag ua. Hervir hasta total 
disolución.  62     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Distribuir en recipientes de vidrio esterilizables de capacidad no mayor de 500 ml, cantidades de 
aproximadamente la mitad del volumen del mismo. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C, durante 15 min. El pH 
final del medio  debe ser 7 ± 0,2 a 25°C.  
Si el medio de cultivo es utilizado inmediatamente, enfriar a 45 ± 1°C en baño de agua y mantenerlo a esta 
temperatura hasta antes de su uso. El medio no debe de fundirse más de una vez.  
En caso de medios deshidratados seguir las instrucciones del fabricante.  
El medio de cultivo anterior es el de uso más generalizado. Para algunos alimentos en particular se 
requerirá de un medio de cultivo especial que se debe indicar al describir la técnica para ese alimento.  
B.5.2.2  Materiales  
Todo el material que tenga contacto con las muestras o los microorganismos debe estar estéril.  
Se requieren los materiales mencionados en B.1.2.2.  
B.5.3  Aparatos e instrumentos  
Se requiere, además de los mencionados en B.1.3, los siguientes:  
Incubadora con t ermostato que evite variaciones mayores de ± 1°C, provista con termómetro calibrado.  
Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador.  
Registrador mecánico o electrónico.  
Microscopio óptico.  
Baño d e agua con o sin circulación mecánica, provista con termómetro calibrado con divisiones de hasta 
1°C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1°C.  
B.5.4  Preparación de la muestra  
Para la preparación de la muestra, seguir el método señalado en B.1 PREPARACI ON Y DILUCI ON DE 
MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU AN ALISIS MICROBIOL OGICO.  
B.5.5  Procedimiento  
B.5.5.1  Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación; la adición de 
medio de cultivo y homogenización, se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las cajas en sus tapas 
con los datos pertinentes previamente a su inoculación y correr por duplicado.  
B.5.5.2  Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas según el método señalado en B.1 
PREPARACI ON Y DILUCI ON DE MUESTRA S DE ALIMENTOS PARA SU AN ALISIS MICROBIOL OGICO, en 
las cajas Petri agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a 
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelan te, sobre una 
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el 
medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.  
B.5.5.3  Incluir una caja sin inóculo por cada lote de medio y diluyente pre parado como testigo de 
esterilidad.  
B.5.5.4  El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que 
finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 min.  
B.5.5.5 Incubar las cajas en posici ón invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se 
requieran, según el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, véase el Cuadro 1.  
CUADRO 1  
Grupo Bacteriano  Temperatura  Tiempo de Incubación  
Termofílicos aerobios  55 ± 2°C  48 ± 2 h  
Mesofílicos aerobios*  35 ± 2°C  48 ± 2 h  
Psicrotróficos  20 ± 2°C  3 - 5 días  
Psicrofílicos  5 ± 2°C  7 - 10 días  
* En el análisis de agua potable y agua purificada se debe incubar a 35 ± 2°C durante 24 h.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     63 
B.5.5.6  En la lectura seleccionar aquellas  placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el 
error en la cuenta.  
B.5.5.7  Contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y 
levaduras), incluyendo las colonias puntiformes. Hacer uso del microscopio  para resolver los casos en los que 
no se pueden distinguir las colonias de las pequeñas partículas de alimento.  
B.5.6  Expresión de resultados  
B.5.6.1  Cálculo del método  
B.5.6.1.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el interval o de 25 a 250 
colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de tres diluciones deben 
estar en el intervalo de 25 a 250. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, véase el Cuadro 2, 
ejemplo 1. Calcular la cuenta promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.  
B.5.6.1.2  Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por 
cada dilución antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo o 
mililitro, véase el Cuadro 2, ejemplo 2.  
B.5.6.1.3 Con el fin de uniformar los criterios para el reporte de las cuentas en ensayos donde las placas 
presenten situaciones no contempladas en los ejemplos anteriores, se presentan l as siguientes guías:  
B.5.6.1.3.1 Placas con menos de 25 colonias. - Cuando las placas corridas para la menor dilución 
muestran cuentas de menos de 25 colonias, contar el número de colonias presentes en dicha dilución, 
promediar el número de colonias y multi plicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de 
cuenta en placa.  
Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda "valor estimado", véase el Cuadro 2, ejemplo 3.  
B.5.6.1.3.2 Placas con más de 250 colonias. - Cuando el número de c olonias por placa exceda de 250, 
contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. 
Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 ó 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri 
de 100 mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en el informe esta 
situación agregando la leyenda "valor estimado", vé ase el Cuadro 2, ejemplo 4.  
B.5.6.1.3.3  Colonias extendidas. - Las colonias extendidas pueden presentarse en las siguientes formas:  
B.5.6.1.3.3.1  Cadenas de colonias no separadas claramente entre sí, que parecen ser causadas por la 
desintegración de un cúmu lo de bacterias.  
B.5.6.1.3.3.2  Colonias que se desarrollan en película entre el agar y el fondo de la caja.  
B.5.6.1.3.3.3  Colonias que se desarrollan en película en la orilla de la caja sobre la superficie del agar.  
B.5.6.1.3.3.4  Colonias de crecimiento ex tendido y en algunas ocasiones acompañadas de inhibición del  
crecimiento, que en conjunto exceden el 50% de la caja o represión del crecimiento que por sí mismo excede 
el 25% de la superficie de la caja.  
B.5.6.1.3.5  Cuando es necesario contar en cajas que contienen colonias extendidas que no están 
incluidas en B.5.6.1.3.3.4, contar cualquiera de los tipos B.5.6.1.3.3.1, B.5.6.1.3.3.2 o B.5.6.1.3.3.3, como 
provenientes de una sola fuente. En el caso de las colonias del tipo B.5.6.1.3.3.1, si la caja contiene  una sola 
cadena, contar como una sola colonia, si la caja contiene varias cadenas que parecen originarse de fuentes 
separadas, contar cada cadena como colonia individual. No contar cada colonia de la cadena individualmente. 
Las colonias del tipo B.5.6.1.3 .3.2 y B.5.6.1.3.3.3 generalmente se observan como crecimiento diferenciable 
de otras colonias y se cuentan como tales. Los crecimientos tipo B.5.6.1.3.3.4, reportarlos como crecimiento 
extendido. En caso de que una dilución se encuentre dentro del rango y  otra dilución presente colonias de 
crecimiento extendido, reportar la dilución en la que se pueden contar las colonias, véase el Cuadro 2, 
ejemplo 5.  
B.5.6.1.4  Placas sin colonias. - Cuando las placas de todas las diluciones no muestran colonias,  reportar  
la cuenta en placa como menor que una vez el valor de la di lución más baja usada, véase el  Cuadro 2, 
ejemplo 6.  
B.5.6.1.5  Placas corridas por duplicado, una con crecimiento dentro del intervalo adecuado y otra con más 
de 250 colonias. - Cuando una placa ti ene entre 25 y 250 colonias y su duplicado más de 250 colonias, contar 
ambas placas incluyendo la que está fuera del intervalo para determin ar la cuenta en placa, véase el  Cuadro 
2, ejemplo 7.  64     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
B.5.6.1.6  Placas corridas por duplicado, una placa de cada dilu ción dentro del intervalo de 25 a 250 
colonias. - 
Cuando una placa dentro de diferentes diluciones contiene el número de colonias especificadas en el 
intervalo, contar el número de colonias de las cuatro placas para calcular la cuenta en placa, véase el Cua dro 
2, ejemplo 8.  
B.5.6.1.7  Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilución dentro del intervalo de 25 a 250 y 
sólo una de la otra dilución dentro del mismo. Contar las cuatro cajas incluyendo aquélla con menos de 25 o 
más de 250 colonias, para  calcular la cuenta en placa, véase el Cuadro 2, ejemplo 9.  
B.5.6.1.8  Después de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas, multiplicar por la inversa de la 
dilución para obtener el número de UFC por mililitro o gramo de la muestra. Redondear l a cifra obtenida  en la 
cuenta de manera que sólo aparezcan dos dígitos significativos al inicio de esta cifra. Para redondear, elevar 
el segundo dígito al número inmediato superior cuando el tercer dígito de la derecha sea cinco o mayor (por 
ejemplo: 128 redondear a 130). Si el tercer dígito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dígito con cero y el 
segundo dígito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):  
B.5.7  Informe de la prueba  
Reportar como: Unidades formadoras de colonias,___ UFC/g o ml, de bact erias aerobias en placa en agar 
triptona extracto de levadura o agar para cuenta estándar, incubadas ________ horas a _______ °C.  
CUADRO 2  
Cálculo de los valores de la cuenta en placa  
(Ensayos por duplicado)  
Ejemplo  
número  Colonias contadas  
UFC/g o ml  
1: 100  1: 1000  1: 10000  
1 > 250a  
> 250  178 
190 16 
17 180000  
2 > 250  220 
238 25 
28 250000  
3 18 
14 2 
0 0 
0 1600b  
4 
5 > 250  
> 250  
> 250  > 250  
> 250  
240 512 
495 
34 5000000b  
290000  
 > 250  235 crecimiento  
extendido   
6 0 0 0 < 100c  
7 > 250  
> 250  240 
268 24 
19 250000  
8 > 250  
> 250  216 
262 23 
42 280000  
9 > 250  
> 250  215 
235 20 
26 230000  
 > 250  
> 250  275 
225 32 
26 270000  
a Cuenta por arriba de 250 colonias.  
b Debe aclararse "valor estimado" por encontrarse los valores fuera del intervalo de 
25 a 250.  
c Deb e informarse de acuerdo con la menor dilución ensayada y contada, en este 
caso 1:100.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     65 
B.6 DETERMINACI ON DE LA ESTIMACI ON DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA T ECNICA DEL 
NUMERO M AS PROBABLE. DETERMINACI ON DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES 
Y Escheric hia coli POR LA T ECNICA DE DILUCIONES EN TUBO M ULTIPLE  
Este método es aplicable a cualquier grupo bacteriano de interés sanitario, especialmente en productos 
que se encuentran en bajas concentraciones de microorganismos (10 por g o ml). Ejemplo: Leche, agu a, 
alimentos; que por su consistencia pueden interferir con la exactitud de la cuenta de Unidades Formadoras de 
Colonias (UFC).  
B.6.1 Fundamento  
Se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los tubos de la menor 
dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución más alta sean negativos. El resultado positivo se 
demuestra por la presencia de gas o crecimiento microbiano.  
Para obtener el Número Más Probable (NMP) en los resultados se aplica la teoría de la probabilidad , lo 
cual tiene como condición lo siguiente:  
- Una distribución aleatoria de las bacterias que existen en la muestra.  
- Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas.  
- Los microorganismos presentes en la muestra crecerán en el medio, cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo.  
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimal es y usando un 
inóculo en series de 3, 5 o 10 tubos en serie. A medida que el número de tubos inoculados para cada dilución 
aumentan se reducen los límites de confianza.  
B.6.2 Equipo, materiales y reactivos . 
No aplica.  
B.6.3 Procedimientos  
B.6.3.1 Uso de t ablas de NMP con 95% de límite de confianza  
Las tablas 1 -3 presentan la estimación estadística de los valores del NMP que corresponden al 95% de 
límite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10 tubos. Otras combinaciones de resultados positivos y 
negativos  no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados 
no están incluidos en las tablas, se deberá repetir la prueba a partir de la muestra original. Si no es posible, el 
NMP se puede obtener (para las combinac iones de 3 y 5 tubos) de las tablas 4 y 5; también se puede aplicar 
una ecuación (véase punto B.2) para obtener el NMP aproximado.  
El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número real de 
microorganismos cae d entro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. El valor 
del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto.  
Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir de tres 
diluciones consecutivas (usando tablas 1 -3). Primero, para todas las diluciones que tengan todos los tubos 
positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en las tablas 
6 y 7). Cuando en ninguna de las dilucion es probadas hubiera crecimiento en todos los tubos, seleccionar (si 
es posible) las primeras tres diluciones consecutivas (volumen de muestra) para que la dilución media 
contenga resultados positivos (C de tablas 6 y 7).  
Con frecuencia es necesario el NMP desde el inicio con volúmenes diferentes de los enlistados en las 
tablas 1 -5. Si el volumen de muestra es mayor que 0,01 g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10. El 
resultado de una determinación de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0,01 g; 2 t ubos positivos en 0,001 g y 1 
tubo positivo en 0,0001 g (3 -2-1) leer en la tabla No. 2 como 17 y multiplicar por 10 para así obtener 170 como 
el NMP actual por gramo de muestra. De igual forma si la cantidad más grande utilizada para la tabla de 
referencia  es 1 g en lugar de 0,1 g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el resultado de la 
determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que dé 3 tubos positivos en 1 g; 1 tubo positivo  en 0,1 
g y ningún positivo en 0,01 g (3 -1-0) leer en la tabla No. 1 como 43 y dividir entre 10, lo que da 4,3 como el 
NMP presuntivo por gramo de muestra.  66     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     67 
 
Tabla No. 1  
Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación utilizando  3 
tubos: con porciones de 0,1,  0,01 y 0, 001 g (ml) de muestra  
No. de tubos positivos  NMP/g 
(ml)a 95% de límite de 
confianza  No. de tubos positivos  NMP/g 
(ml)a 95% de límite de 
confianza  
0,1 0,01 0,001   Inferior  Superior  0,1 0,01 0,001   Inferior  Superior  
0 0 0 <3,0 – 9,5 2 2 0 21 4,5 42 
0 0 1 3,0 0,15 9,6 2 2 1 28 8,7 94 
0 1 0 3,0 0,15 11 2 2 2 35 8,7 94 
0 1 1 6,1 1,2 18 2 3 0 29 8,7 94 
0 2 0 6,2 1,2 18 2 3 1 36 8,7 94 
0 3 0 9,4 3,6 38 3 0 0 23 4,6 94 
1 0 0 3,6 0,17 18 3 0 1 38 8,7 110 
1 0 1 7,2 1,3 18 3 0 2 64 17 180 
1 0 2 11 3,6 38 3 1 0 43 9 180 
1 1 0 7,4 1,3 20 3 1 1 75 17 200 
1 1 1 11 3,6 38 3 1 2 120 37 420 
1 2 0 11 3,6 42 3 1 3 160 40 420 
1 2 1 15 4,5 42 3 2 0 93 18 420 
1 3 0 16 4,5 42 3 2 1 150 37 420 
2 0 0 9,2 1,4 38 3 2 2 210 40 430 
2 0 1 14 3,6 42 3 2 3 290 90 1,000  
2 0 2 20 4,5 42 3 3 0 240 42 1,000  
2 1 0 15 3,7 42 3 3 1 460 90 2,000  
2 1 1 20 4,5 42 3 3 2 1100  180 4,100  
2 1 2 27 8,7 94 3 3 3 >1100  420 – 
a Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml),  
 68     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Tabla No. 2  
Selecció n del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación utilizando  5 
tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestraa 
No. de tubos positivos  NMP/g 
(ml)a 95% de límite de 
confianza  No. de tubos positivos  NMP/g 
(ml)a 95% de lí mite de 
confianza  
0,1 0,01 0,001   Inferior  Superior  0,1 0,01 0,001   Inferior  Superior  
0 0 0 <1,8 – 6,8 4 0 2 21 6,8 40 
0 0 1 1,8 0,09 6,8 4 0 3 25 9,8 70 
0 1 0 1,8 0,09 6,9 4 1 0 17 6 40 
0 1 1 3,6 0,7 10 4 1 1 21 6,8 42 
0 2 0 3,7 0,7 10 4 1 2 26 9,8 70 
0 2 1 5,5 1,8 15 4 1 3 31 10 70 
0 3 0 5,6 1,8 15 4 2 0 22 6,8 50 
1 0 0 2 0,1 10 4 2 1 26 9,8 70 
1 0 1 4 0,7 10 4 2 2 32 10 70 
1 0 2 6 1,8 15 4 2 3 38 14 100 
1 1 0 4 0,7 12 4 3 0 27 9,9 70 
1 1 1 6,1 1,8 15 4 3 1 33 10 70 
1 1 2 8,1 3,4 22 4 3 2 39 14 100 
1 2 0 6,1 1,8 15 4 4 0 34 14 100 
1 2 1 8,2 3,4 22 4 4 1 40 14 100 
1 3 0 8,3 3,4 22 4 4 2 47 15 120 
1 3 1 10 3,5 22 4 5 0 41 14 100 
1 4 0 11 3,5 22 4 5 1 48 15 120 
2 0 0 4,5 0,79 15 5 0 0 23 6,8 70 
2 0 1 6,8 1,8 15 5 0 1 31 10 70 
2 0 2 9,1 3,4 22 5 0 2 43 14 100 
2 1 0 6,8 1,8 17 5 0 3 58 22 150 
2 1 1 9,2 3,4 22 5 1 0 33 10 100 
2 1 2 12 4,1 26 5 1 1 46 14 120 
2 2 0 9,3 3,4 22 5 1 2 63 22 150 
2 2 1 12 4,1 26 5 1 3 84 34 220 
2 2 2 14 5,9 36 5 2 0 49 15 150 
2 3 0 12 4,1 26 5 2 1 70 22 170 
2 3 1 14 5,9 36 5 2 2 94 34 230 
2 4 0 15 5,9 36 5 2 3 120 36 250 
3 0 0 7,8 2,1 22 5 2 4 150 58 400 
3 0 1 11 3,5 23 5 3 0 79 22 220 
3 0 2 13 5,6 35 5 3 1 110 34 250 
3 1 0 11 3,5 26 5 3 2 140 52 400 
3 1 1 14 5,6 36 5 3 3 180 70 400 
3 1 2 17 6 36 5 3 4 210 70 400 
3 2 0 14 5,7 36 5 4 0 130 36 400 
3 2 1 17 6,8 40 5 4 1 170 58 400 
3 2 2 20 6,8 40 5 4 2 220 70 440 
3 3 0 17 6,8 40 5 4 3 280 100 710 
3 3 1 21 6,8 40 5 4 4 350 100 710 
3 3 2 24 9,8 70 5 4 5 430 150 1,100  
3 4 0 21 6,8 40 5 5 0 240 70 710 
3 4 1 24 9,8 70 5 5 1 350 100 1100  
3 5 0 25 9,8 70 5 5 2 540 150 1700  
4 0 0 13 4,1 35 5 5 3 920 220 2600  
4 0 1 17 5,9 36 5 5 4 1600  400 4600  
 5 5 5 >1600  700 – 
a Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml) , Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     69 
Tabla No. 3  
Selección del NMP con un límite de confianza de 95% para la prueba de fermentación utilizando  10 
tubos: con porciones de 0,1, 0,01 y 0,001 g (ml) de muestraa 
No. de tubos positivos  NMP/g 
(ml)a 95% de límite de 
confianza  No. de tubos positiv os NMP/g 
(ml)a 95% de límite de 
confianza  
0,1 0,01 0,001   Inferior  Superior  0,1 0,01 0,001   Inferior  Superior  
0 0 0 <,90 – 3,1 8 2 0 17 7,7 34 
0 0 1 0,9 0,04 3,1 8 2 1 19 9 34 
0 0 2 1,8 0,33 5,1 8 2 2 21 10 39 
0 1 0 0,9 0,04 3,6 8 2 3 23 11 44 
0 1 1 1,8 0,33 5,1 8 3 0 19 9 34 
0 2 0 1,8 0,33 5,1 8 3 1 21 10 39 
0 2 1 2,7 0,8 7,2 8 3 2 24 11 44 
0 3 0 2,7 0,8 7,2 8 3 3 26 12 50 
1 0 0 0,94 0,05 5,1 8 4 0 22 10 39 
1 0 1 1,9 0,33 5,1 8 4 1 24 11 44 
1 0 2 2,8 0,8 7,2 8 4 2 26 12 50 
1 1 0 1,9 0,33 5,7 8 4 3 29 14 58 
1 1 1 2,9 0,8 7,2 8 5 0 24 11 44 
1 1 2 3,8 1,4 9 8 5 1 27 12 50 
1 2 0 2,9 0,8 7,2 8 5 2 29 14 58 
1 2 1 3,8 1,4 9 8 5 3 32 15 62 
1 3 0 3,8 1,4 9 8 6 0 27 12 50 
1 3 1 4,8 2,1 11 8 6 1 30 14 58 
1 4 0 4,8 2,1 11 8 6 2 33 15 62 
2 0 0 2 0,37 7,2 8 7 0 30 14 58 
2 0 1 3 0,81 7,3 8 7 1 33 17 73 
2 0 2 4 1,4 9 8 7 2 36 17 74 
2 1 0 3 0,82 7,8 8 8 0 34 17 73 
2 1 1 4 1,4 9 8 8 1 37 17 74 
2 1 2 5 2,1 11 9 0 0 17 7,5 31 
2 2 0 4 1,4 9,1 9 0 1 19 9 34 
2 2 1 5 2,1 11 9 0 2 22 10 39 
2 2 2 6,1 3 14 9 0 3 24 11 44 
2 3 0 5,1 2,1 11 9 1 0 19 9 39 
2 3 1 6,1 3 14 9 1 1 22 10 40 
2 4 0 6,1 3 14 9 1 2 25 11 44 
2 4 1 7,2 3,1 15 9 1 3 28 14 58 
2 5 0 7,2 3,1 15 9 1 4 31 14 58 
 70     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
3 0 0 3,2 0,9 9 9 2 0 22 10 44 
3 0 1 4,2 1,4 9,1 9 2 1 25 11 46 
3 0 2 5,3 2,1 11 9 2 2 28 14 58 
3 1 0 4,2 1,4 10 9 2 3 32 14 58 
3 1 1 5,3 2,1 11 9 2 4 35 17 73 
3 1 2 6,4 3 14 9 3 0 25 12 50 
3 2 0 5,3 2,1 12 9 3 1 29 14 58 
3 2 1 6,4 3 14 9 3 2 32 15 62 
3 2 2 7,5 3,1 15 9 3 3 36 17 74 
3 3 0 6,5 3 14 9 3 4 40 20 91 
3 3 1 7,6 3,1 15 9 4 0 29 14 58 
3 3 2 8,7 3,6 17 9 4 1 33 15 62 
3 4 0 7,6 3,1 15 9 4 2 37 17 74 
3 4 1 8,7 3,6 17 9 4 3 41 20 91 
3 5 0 8,8 3,6 17 9 4 4 45 20 91 
4 0 0 4,5 1,6 11 9 5 0 33 17 73 
4 0 1 5,6 2,2 12 9 5 1 37 17 74 
4 0 2 6,8 3 14 9 5 2 42 20 91 
4 1 0 5,6 2,2 12 9 5 3 46 20 91 
4 1 1 6,8 3 14 9 5 4 51 25 120 
4 1 2 8 3,6 17 9 6 0 38 17 74 
4 2 0 6,8 3 15 9 6 1 43 20 91 
4 2 1 8 3,6 17 9 6 2 47 21 100 
4 2 2 9,2 3,7 17 9 6 3 53 25 120 
4 3 0 8,1 3,6 17 9 7 0 44 20 91 
4 3 1 9,3 4,5 18 9 7 1 49 21 100 
4 3 2 10 5 20 9 7 2 54 25 120 
4 4 0 9,3 4,5 18 9 7 3 60 26 120 
4 4 1 11 5 20 9 8 0 50 25 120 
4 5 0 11 5 20 9 8 1 55 25 120 
4 5 1 12 5,6 22 9 8 2 61 26 120 
4 6 0 12 5,6 22 9 8 3 68 30 140 
5 0 0 6 2,5 14 9 9 0 57 25 120 
5 0 1 7,2 3,1 15 9 9 1 63 30 140 
5 0 2 8,5 3,6 17 9 9 2 70 30 140 
5 0 3 9,8 4,5 18 10 0 0 23 11 44 
5 1 0 7,3 3,1 15 10 0 1 27 12 50 
5 1 1 8,5 3,6 17 10 0 2 31 14 58 
 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     71 
5 1 2 9,8 4,5 18 10 0 3 37 17 73 
5 1 3 11 5 21 10 1 0 27 12 57 
5 2 0 8,6 3,6 17 10 1 1 32 14 61 
5 2 1 9,9 4,5 18 10 1 2 38 17 74 
5 2 2 11 5 21 10 1 3 44 20 91 
5 3 0 10 4,5 18 10 1 4 52 25 120 
5 3 1 11 5 21 10 2 0 33 15 73 
5 3 2 13 5,6 23 10 2 1 39 17 79 
5 4 0 11 5 21 10 2 2 46 20 91 
5 4 1 13 5,6 23 10 2 3 54 25 120 
5 4 2 14 7 26 10 2 4 63 30 140 
5 5 0 13 6,3 25 10 3 0 40 17 91 
5 5 1 14 7 26 10 3 1 47 20 100 
5 6 0 14 7 26 10 3 2 56 25 120 
6 0 0 7,8 3,1 17 10 3 3 66 30 140 
6 0 1 9,2 3,6 17 10 3 4 77 34 150 
6 0 2 11 5 20 10 3 5 89 39 180 
6 0 3 12 5,6 22 10 4 0 49 21 120 
6 1 0 9,2 3,7 18 10 4 1 59 25 120 
6 1 1 11 5 21 10 4 2 70 30 150 
6 1 2 12 5,6 22 10 4 3 82 38 180 
6 1 3 14 7 26 10 4 4 94 44 180 
6 2 0 11 5 21 10 4 5 110 50 210 
6 2 1 12 5,6 22 10 5 0 62 26 140 
6 2 2 14 7 26 10 5 1 74 30 150 
6 2 3 15 7,4 30 10 5 2 87 38 180 
6 3 0 12 5,6 23 10 5 3 100 44 180 
6 3 1 14 7 26 10 5 4 110 50 210 
6 3 2 15 7,4 30 10 5 5 130 57 220 
6 4 0 14 7 26 10 5 6 140 70 280 
6 4 1 15 7,4 30 10 6 0 79 34 180 
6 4 2 17 9 34 10 6 1 94 39 180 
6 5 0 16 7,4 30 10 6 2 110 50 210 
6 5 1 17 9 34 10 6 3 120 57 220 
6 5 2 19 9 34 10 6 4 140 70 280 
6 6 0 17 9 34 10 6 5 160 74 280 
6 6 1 19 9 34 10 6 6 180 91 350 
6 7 0 19 9 34 10 7 0 100 44 210 
 72     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
7 0 0 10 4,5 20 10 7 1 120 50 220 
7 0 1 12 5 21 10 7 2 140 61 280 
7 0 2 13 6,3 25 10 7 3 150 73 280 
7 0 3 15 7,2 28 10 7 4 170 91 350 
7 1 0 12 5 22 10 7 5 190 91 350 
7 1 1 13 6,3 25 10 7 6 220 100 380 
7 1 2 15 7,2 28 10 7 7 240 110 480 
7 1 3 17 7,7 31 10 8 0 130 60 250 
7 2 0 13 6,4 26 10 8 1 150 70 280 
7 2 1 15 7,2 28 10 8 2 170 80 350 
7 2 2 17 7,7 31 10 8 3 200 90 350 
7 2 3 19 9 34 10 8 4 220 100 380 
7 3 0 15 7,2 30 10 8 5 250 120 480 
7 3 1 17 9 34 10 8 6 280 120 480 
7 3 2 19 9 34 10 8 7 310 150 620 
7 3 3 21 10 39 10 8 8 350 150 620 
7 4 0 17 9 34 10 9 0 170 74 310 
7 4 1 19 9 34 10 9 1 200 91 380 
7 4 2 21 10 39 10 9 2 230 100 480 
7 4 3 23 11 44 10 9 3 260 120 480 
7 5 0 19 9 34 10 9 4 300 140 620 
7 5 1 21 10 39 10 9 5 350 150 630 
7 5 2 23 11 44 10 9 6 400 180 820 
7 6 0 21 10 39 10 9 7 460 210 970 
7 6 1 23 11 44 10 9 8 530 210 970 
7 6 2 25 12 46 10 9 9 610 280 1300  
7 7 0 23 11 44 10 10 0 240 110 480 
7 7 1 26 12 50 10 10 1 290 120 620 
8 0 0 13 5,6 25 10 10 2 350 150 820 
8 0 1 15 7 26 10 10 3 430 180 970 
8 0 2 17 7,5 30 10 10 4 540 210 1300  
8 0 3 19 9 34 10 10 5 700 280 1500  
8 1 0 15 7,1 28 10 10 6 920 350 1900  
8 1 1 17 7,7 31 10 10 7 1200  480 2400  
8 1 2 19 9 34 10 10 8 1600  620 3400  
8 1 3 21 10 39 10 10 9 2300  810 5300  
 10 10 10 >2300  1300  – 
a Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml),  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     73 
Tabla No. 4  
Número más pro bable (NMP) para 1 g de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones  de 0,1, 0,01 y 
0,001 g (ml)  
Tubos Positivos  Tubos Positivos  Tubos Positivos  Tubos Positivos  
0,1 0,01 0,001  NMP  0,1 0,01 0,001  NMP  0,1 0,01 0,001  NMP  0,1 0,01 0,001  NMP  
0 0 0 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23 
0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39 
0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 
0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 
0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43 
0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 
0 1 2 9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 
0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 
0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 
0 2 1 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 
0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 
0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 
0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 
0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 
0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100  
0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 >1100  
 
Tabla No. 5  
Número más probable (NMP) para 100 ml de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de 3 
diluciones con series geométricas  
No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  No. de Tubos 
Positivos  
10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 10 1 0,1 
ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N 
M 
P ml ml ml N M 
P 
0 0 0  1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95 
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 74     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81     
 
Tabla No. 6  
Ejemplos para determ inar el NMP estimado en series de tres tubos con 1 g (ml) de m uestra por tubo  
Ejemplo  Cantidad de muestra (g o ml)a 
Valores positivos 
reportados  NMP estimado/g o mlb 
0,10 0,001  0,001  0,0001  0,00001  
A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930 
B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300  
C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30 
D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100  
E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 110000  
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para e xpresarlos como NMP/100 g (ml).  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     75 
Tabla No. 7  
Ejemplos para determinar el NMP estimado en series de 5 tubos c on 1 g (ml) de muestra por tubo  
Ejemplo  Cantidad de muestra (g o ml)a Valores positivos  
reportados  NMP estimado/g o mlb 
0,1 0,01 0,001  0,0001  0,000 01 
A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490 
B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900  
C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 20 
D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-2-2 1400  
E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 160000  
a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
b Multiplicar todos los valores de NMP/g (ml) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (ml).  
 
B.6.3.3  Determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli  por la técnica de 
diluciones en tubo múltiple  
B.6.3.3.1  Fundamento  
Este método se basa en la propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de 
glucosa y fermentación de lactosa dentro de las 48 h de incubación a 35 ± 1°C (coliformes) y 44,5 ± 0,2°C 
(coliformes fecales y E. coli ). 
B.6.3.3.2  Equipo y materiales  
 Además de los mencionados en el método Preparación y dilución de muestras de alimentos para 
análisis microbiológico, lo siguiente:  
 Baño de agua con agitación continua cubierto y con termostato que evite variaciones mayores a 
0,2°C.  
 Termómetro calibra do y verificado 1/10  
 Tubos de cultivo de 20 x 200 y de 16 x 160 mm con tapón de rosca  
 Campanas de fermentación (tubos de Durham)  
 Gradillas  
 Asas bacteriológicas de 3 mm de diámetro  
 Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts.  
 Lentes p rotectores.  
 Medios de cultivo:  En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se debe demostrar 
que cumplen con lo indicado en este método de prueba, para su preparación deben seguir las 
instrucciones impresas en la etiqueta respectiva. Cua ndo se mencione agua debe entenderse que se 
trata de “agua destilada” los reactivos a emplear en el método de esta norma deben ser grado 
analítico.  
Caldo lauril  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Bacto triptosa  20 g 
Bacto lactosa  5 g 
Fosfato potásico, dibás ico 2,75 g  
Fosfato potásico, monobásico  2,75 g  
Cloruro de sodio  5 g 
Lauril sulfato de sodio  0,1 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,8 ± 0,2 a 25°C.  76     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Ajustar el pH. Distribuir en tub os de 
ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml de medio para cada tubo. Esterilizar en autoclave durante 
15 min a 121°C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75°C para que no queden burbujas 
en las campanas de Durham.  
Preparación  de caldo lauril triptosa  
INOCULO (ml)  CANTIDAD DE MEDIO POR 
TUBO (ml)  VOLUMEN DE MEDIO MAS 
INOCULO (ml)  CALDO LAURIL TRIPTOSA 
REQUERIDO g/l  
1 10 o más  11 o más  35,6 
10 10 20 71,2 
10 20 30 53,4 
20 10 30 106,8  
100 50 150 106,8  
100 35 135 137,1  
100 20 120 213,6  
 
Caldo EC ( E. coli .) 
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Bacto triptosa  20 g 
Bacto lactosa  5 g 
Bacto sales biliares No. 3  1,5 g  
Fosfato dipotásico  4 g 
Fosfato monopotásico  1,5 g  
Cloruro de sodio  5 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  a 25°C.  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para que se 
disuelva por completo. Ajustar el pH. Distribuir en tubos de ensaye con campanas de Durham. Adicionar 10 ml 
de medio para cada tubo. Esteriliza r en autoclave durante 15 min a 121°C. Antes de abrir el autoclave, dejar 
bajar la temperatura a 75°C para evitar que queden burbujas en las campanas de Durham.  
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación)  
Lactosa bilis verde brillante  
FORMU LA 
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  10 g 
Lactosa  10 g 
Sales biliares  20 g 
Verde brillante  0,0133 g  
Agua  1 l 
 
Preparación:  Disolver los componentes o  el medio completo deshidratado en agua, calentar si es 
necesario. Ajustar el pH, de tal manera que desp ués de la esterilización éste sea de 7,2 a 25 °C. Distribuir el 
medio en cantidades de 10  ml en tubos de 16 x  160 mm conteniendo campana de fermentación. Esterilizar en 
autoclave por 15 min a 121 ± 1 °C. Las campanas de fermentación no deben contener burbu jas de aire 
después de la esterilización.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     77 
Agar McConkey  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Proteasa peptona o polipeptona  3 g 
Peptona o gelizante  17 g 
Lactosa  10 g 
Sales biliares No. 3  1,5 g  
Cloruro de sodio  5 g 
Rojo neutro  0,03 g  
Cristal violeta  0,001 g 
Agar  13,5 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,1 ± 0,2 a 25°C  
Preparación:  Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada. Calentar hasta ebullición para 
disolver por completo. Ajustar el pH. Esterilizar a 121°C durante 15 min. Enfriar a 50 -60°C y vaciar en cajas 
Petri.  
Agar eosina azul de metileno de Levin (EMB -L) 
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona  10 g 
Lactosa  10 g 
K2HPO 4 2 g 
Eosina Y  0,4 g  
Azul de metileno  0,065 g  
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 7,1 ± 0,2  
Preparación:  Disolver l a peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua. Calentar hasta ebullición para la 
disolución completa. Distribuir en porciones de 100 o 200 ml y esterilizar a no más de 121°C por 15 min. 
Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100 ml.  
a) 5 ml de solución de lactosa al 20%.  
b) 2 ml de solución acuosa de eosina al 2%.  
c) 4,3 ml de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.  
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones 
del fabrican te. 
Caldo triptona al 1% (triptofano)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Triptona o tripticasa  10 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes. Distribuir en porciones de 5 ml en tubos de ensaye de 16 x 125 o 
16 x 150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 min.  78     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Caldo MR -VP 
Medio 1  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona tamponada  7 g 
Glucosa  5 g 
K2HPO 4 5 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final: 6,9 ± 0,2  
Preparación:  Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesar io. Distribuir en volúmenes 
de 10 ml en tubos de ensaye de 16x150 mm. Esterilizar a 121°C por 15 min.  
Caldo citrato de Koser  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5 g  
KH2PO4 (monobásico)  1 g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2 g  
Citrato de sodio  •2H 2O 3 g 
Agua  destilada  1000 ml  
pH final: 6,7 ± 0,2.  
Preparación:  Distribuir preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca. Esterilizar a 121°C por  15 
min. Esta formulación se recomienda en los Métodos de Análisis Oficial de AOAC y en los Métodos 
Estándares par a el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Este difiere de la composición del medio 
deshidratado disponible comercialmente y es recomendable su uso.  
 Reactivos  
Reactivo de Kovacs  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
p-dimetilaminobenzaldehído  5 g 
Alcoho l amílico (normal)  75 ml  
HCI concentrado  25 ml  
 
Preparación:  Disolver el p -Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal. Adicionar lentamente el 
HCl. Almacenar a 4°C.  
Para la prueba de indol  
1. Adicionar 0,2 -0,3 ml del reactivo a 5 ml del cultivo d e bacteria en caldo triptona.  
Se considera una prueba positiva cuando desarrolla un color rojo en la superficie del tubo.  
Reactivo de Voges -Proskauer (VP)  
Solución 1  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
alfa-naftol  5 g 
Alcohol absoluto  100 g  
 Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     79 
Solución 2  
FORMU LA 
Ingredientes  Cantidad  
Hidróxido de potasio  40 g 
Agua destilada  para llevar a 100 ml  
 
Prueba de Voges -Proskauer (VP)  
1. Transferir 1 ml del cultivo a probar con 48 h de incubación a un tubo de ensaye.  
2. Adicionar 0,6 ml de la solución 1 y 0,2 ml de la solución 2.  
3. Agitar después de la adición de cada solución.  
4. Para intensificar y acelerar la reacción adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar.  
5. Dejar a temperatura ambiente.  
6. Leer resultados después de 4 h de adicionar los reactiv os. 
El desarrollo de una coloración rosa es una prueba positiva.  
Reactivos para la coloración de Gram  
Cristal violeta  
Solución A  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Cristal violeta (colorante 90%)  2 g 
Etanol 95%  20 ml  
 
Solución B  
Oxalato de amonio  0,8 g  
Agua destilada  80 ml  
 
Indicador rojo de metilo (R44)  
1. Mezclar la solución A y B. Almacenar por 24 h.  
2. Filtrar a través de un papel filtro áspero.  
lodo de Gram  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
lodo 1g 
Ioduro de potasio (Kl)  2 g 
Agua destilada  300 ml  
 
1. Colocar el Kl en un mortero.  
2. Adicionar el yodo.  
3. Triturar con el pistilo por 5  a10 seg.  
4. Adicionar 1 ml de agua y triturar.  
5. Adicionar 5 ml de agua y triturar.  
6. Adicionar 10 ml de agua y triturar.  
7. Vaciar esta solución en una botella de react ivo. 
8. Enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria para completar 300 ml.  
Colorante de contraste (solución concentrada)  80     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Safranina O  2,5 g  
Etanol al 95%  100 ml  
 
Solución de trabajo: Adicionar 10 ml d e la solución concentrada a 90 ml de agua destilada.  
Procedimiento para la tinción de Gram  
1. Fijar con calor moderado los frotis de la muestra a teñir.  
2. Adicionar la solución de cristal violeta al frotis.  
3. Dejar actuar por un minuto.  
4. Lavar con agua  corriente y escurrir.  
5. Aplicar la solución de yodo por un minuto.  
6. Lavar con agua corriente y escurrir.  
7. Decolorar con etanol al 95% hasta que la coloración azul deje de fluir (aproximadamente 30 seg).  
8. Inmediatamente después enjuagar con agua cor riente.  
9. Escurrir.  
10. Aplicar el colorante de contraste (safranina) por 30 seg.  
11. Enjuagar, escurrir y secar al aire. Examinar al microscopio.  
Medio EC -MUG  
Preparar el caldo EC y adicionar 50 mg de 4 -metilumbelliferyl -beta-D-glucurónido (MUG) por litr o antes de 
esterilizar (121°C por 15 min). El caldo EC -MUG está comercialmente disponible.  
B.6.3.3.3  Procedimiento  
B.6.3.3.3.1 Alimentos  
B.6.3.3.3.1.1 Prueba presuntiva  
B.6.3.3.3.1.1.1 Preparar la muestra como se indica en el método Preparación y dilución de muestras de 
alimentos para análisis microbiológico; y de acuerdo con el tipo de producto, utilizar las diluciones apropiadas, 
según se indica en el procedimiento de la densidad microbiana por la técnica del número más probable.  
Utilizar como medio de en riquecimiento caldo lauril triptosa y continuar como en el punto (B.6.3.3.3.1.1.2).  
B.6.3.3.3.1.2 Prueba confirmativa. Continuar como en el punto (B.6.3.3.3.1.3).  
B.6.3.3.3.1.3 Prueba confirmatoria  
Confirmar la presencia de Escherichia coli  en por lo menos  el 10% de las pruebas con resultados positivos 
a coliformes fecales por cultivo en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la 
presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 ± 0,5°C durante 24 ± 2 h, observar las 
colonias típicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares. 
Seleccionar 1 o más colonias aisladas y pasar a tubos de fermentación con caldo lauril triptosa, continuar 
como se indica en el punto (B.6.3.3.3.1.1) . Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las 
colonias.  
B.6.3.3.3.1.4 Interpretación de resultados  
La formación de gas en el tubo de fermentación secundario dentro de las 48 ± 3 h y la demostración de 
bacilos Gram ( -) no esporulados conf irma un resultado positivo de la prueba demostrándose la presencia del 
grupo coliforme.  
B.6.3.3.3.1.5 Cálculos  
Calcular la densidad microbiana en número más probable conforme con el procedimiento señalado 
anteriormente, para estimar la población de bacteri as coliformes y bacterias coliformes fecales de acuerdo con 
las diluciones empleadas y expresar en NMP/g o ml para alimentos y NMP/100 ml para agua. En el caso de 
usar volúmenes de 20 ml de muestras de agua en 5 tubos o 10 ml de muestras de agua en 10 tubo s, utilizar 
las siguientes tablas:  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     81 
TABLA 1  
Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y 
negativos cuando se usan 5 tubos con 2 0 ml de muestra de agua o hielo  
No. DE TUBOS 
Positivos  NMP/100 ml  95% DE L IMITE DE CONFIANZA (APR OXIMADO)  
Inferior  Superior  
0 1,1 0 3,0 
1 1,1 0,05 6,3 
2 2,6 0,3 9,6 
3 4,6 0,8 14,7 
4 8,0 1,7 26,4 
5 8,0 4,0 Infinito  
 
TABLA 2  
Indice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y 
negativos cuando se usan 10 tubos con 10 ml de m uestra de agua o hielo  
No. de Tubos 
Positivos  NMP/100 ml  95% de Límite de Confianza 
(aproximado)  
Inferior  Superior  
0 1,1 0,0 3,0 
1 1,1 0,03 5,9 
2 2,2 0,26 8,1 
3 3,6 0,69 10,6 
4 5,1 1,3 13,4 
5 6,9 2,1 16,8 
6 9,2 3,1 21,1 
7 12 4,3 27,1 
8 16,1 5,9 36,8 
9 23,0 8,1 59,5 
10 23,0 13,5 Infinito  
 
B.7 M ETODO DE PRUEBA PARA EL AN ALISIS MICROBIOL OGICO DE ALIMENTOS ENVASADOS 
HERM ETICAMENTE Y/O ESTERILIZADOS COMERCIALMENTE  
B.7.1 Fundamento  
B.7.1.1 Examen microb iológico de latas no alteradas  
Este examen tiene por objeto determinar la presencia de microorganismos viables latentes, que resistieron 
el tratamiento  térmico debidamente aplicado y que en determinadas circunstancias pudieran desarrollarse, 
produciendo al teraciones en el alimento y representando un riesgo para el consumidor.  
Los envasados, aun los bien procesados, pueden contener esporas de bacilos termofílicos, las cuales son 
muy resistentes al calor, pero no se desarrollan en las condiciones normales de almacenamiento y no 
producen problemas de descomposición del producto ni representan un peligro para el consumidor.  82     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
La prueba de esterilidad comercial, puede efectuarse por la observación y análisis del contenido del 
producto, su apariencia, color, olor, p H y examen microscópico.  
Estas observaciones se hacen después de la incubación de las latas y siempre comparándolas con otras 
no incubadas.  
Si es necesario efectuar el cultivo o si el producto después de incubarse presenta cualquier cambio,  ya 
sea en apar iencia, olor, color, pH, o bien presencia de gas o espuma, proceder como se indica en  (B.7.1 o 
B.7.2), dependiendo del pH del alimento.  
B.7.1.2  Examen microbiológico de latas alteradas  
Este análisis tiene por objeto determinar el origen de la alteración, la cual puede ser causada por 
microorganismos que sobreviven al tratamiento térmico o por la introducción de éstos después del 
tratamiento, por defectos de las cerraduras o por golpes que lesionen el envase. Conociendo la naturaleza del 
alimento y su trata miento, es posible predecir el tipo de organismo responsable de la alteración.  
Numerosas investigaciones han demostrado que el tipo de alteraciones guarda relación con el grado de 
acidez del alimento procesado, por lo que éstos se dividen en dos grandes gr upos:  
B.7.1.2.1  Alimentos de baja acidez, con pH > 4,6, entre los que se encuentran productos cárnicos, lácteos, 
marinos, algunos vegetales, guisados, sopas, etcétera.  
B.7.1.2.2  Alimentos ácidos, con pH < 4,6, entre los que se encuentran tomates, frutas, j ugos de cítricos, 
encurtidos, entre otros.  
B.7.2 Reactivos y materiales  
A continuación se presentan las fórmulas y los procedimientos para preparar los medios y reactivos 
empleados en el análisis microbiológico de los productos envasados herméticamente y s ometidos a 
esterilización comercial. En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas equivalentes, se 
deben seguir las instrucciones del fabricante.  
B.7.2.1  Medios de cultivo y soluciones  
B.7.2.1.1 Caldo glucosa púrpura de bromocresol (CGPB)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Glucosa  100 g  
Extracto de carne  30 g 
Peptona (P. Ej. caseína)  50 g 
Púrpura de bromocresol  20 ml  
(1 6% en etanol)  
Agua destilada  1 0000 ml  
pH final = 7,0 ± 0,2  
Procedimiento:  Disolver los ingredientes en el agua, aju star el pH y envasar en tubos de 22 x 175 mm, en 
volúmenes de 12 a 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min.  
7.2.1.2  Caldo de hígado picado o caldo carne cocida (CH o CCC)  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Hígado o carne magra de res  500 g  
Agua destilada  800 ml  
Peptona  10 g 
Fosfato dipotásico  1 g 
Almidón soluble  1 g 
pH final = 7,0 ± 0,2  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     83 
Procedimiento: Poner el hígado o la carne picada en agua, calentar a ebullición y dejar a fuego lento 
durante una hora. Enfriar, retirar la capa de gra sa, ajustar el pH y hervir otros 10 min. Filtrar a través de gasa o 
manta de cielo, presionando para quitar el exceso de líquido. Enfriar y agregar al caldo la peptona, el fosfato y 
el almidón soluble. Ajustar el pH y llevar el volumen del caldo a 1 000 ml  con agua destilada. Filtrar a través de 
papel filtro grueso; en este paso el caldo y la carne pueden guardarse en refrigeración, si el medio no puede 
terminarse el mismo día. Envasar en tubos de 22 x 175 mm volúmenes de 10 a 12 ml de caldo y depositar 
suficiente hígado o carne picada para que ocupe una altura de 1,25 cm del fondo del tubo. Esterilizar  a 121  ± 
1°C por 15 min.  
B.7.2.1.3 Caldo extracto de malta  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de malta  6 g 
Maltosa  1,5 g  
Glucosa  6 g 
Extracto de levadura  1 g 
Agua destilada  1 000 ml  
pH final = 4,7 ± 0,2  
Procedimiento: Disolver los ingredientes con agitación constante. Ajustar el pH a 4,7 ±  0,2, envasar en 
tubos de 22 x 175 mm en volúmenes de 12 -15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15  min. Exponer al 
calor el menor tiempo posible.  
B.7.2.1.4  Caldo ácido  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Proteosa peptona  5 g 
Extracto de levadura  5 g 
Glucosa  5 g 
Fosfato dipotásico  4 g 
Agua destilada  1 000 ml  
pH final = 5,0 ± 0,2  
Procedimiento: Disolver los ingredientes en 1 l de agua y envasar en tubos de 22 x 175 mm en 
volúmenes de 12 a 15 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C por 15 min.  
B.7.2.1.5  Agar papa dextrosa o dextrosa Sabouraud  
B.7.2.1.5.1 Agar papa dextrosa  
FORMULA  
Ingredientes  Cant idad 
Infusión de papa  200 ml  
Glucosa  20 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1 000 ml  
pH final = 3,5  84     (Cuarta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiemb re de 2012  
Procedimiento: Lavar, pelar y rebanar papas de tamaño mediano (250 g). Hervir durante 30 min en  290 
ml de agua destilada. Filtrar varias veces a través de g asa y algodón. En esta infusión, disolver los demás 
ingredientes. Añadir agua destilada hasta completar el volumen (1000 ml). Calentar a ebullición, hasta la 
disolución total de los ingredientes. Ajustar el pH a 5,6 ± 0,2. Distribuir en volúmenes de 100 ml  y esterilizar en 
autoclave a 121 ± 1°C. Enfriar a 45 -48°C y acidificar a pH 3,5 con solución estéril de ácido tartárico  al 10% 
(aproximadamente 1,4 ml de ácido por cada 100 ml de medio). Una vez que se ha agregado el ácido tartárico, 
no se vuelve a calent ar el medio.  
B.7.2.1.5.2  Agar dextrosa Sabouraud  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Polipeptona o neopeptona  10 g 
Dextrosa  40 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final = 5,6 ± 0,2  
Procedimiento: Calentar hasta disolución completa. Esterilizar en aut oclave a 118 -121°C por 15 min, no 
exceder de 121 ± 1°C.  
B.7.2.1.6  Agar hígado de ternera  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Infusión de hígado  50 g 
Infusión de ternera  500 g  
Proteosa peptona  20 g 
Neopeptona  1,3 g  
Triptona  1,3 g  
Glucosa  5 g 
Almidón  soluble  10 g 
Caseína isoeléctrica  5 g 
Cloruro de sodio  5 g 
Nitrato de sodio  2 g 
Grenetina  20 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final = 7,3 ± 0,2  
Procedimiento: Mezclar los ingredientes con agua destilada y calentar a ebullición hasta su disolución 
total. Ajustar el pH y esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min.  Lunes 10 de septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Cuarta Sección)     85 
B.7.2.1.7  Agar nutritivo  
FORMULA  
Ingredientes  Cantidad  
Extracto de carne  3 g 
Peptona  5 g 
Agar  15 g 
Agua destilada  1000 ml  
pH final = 7,3 ± 0,2  
Procedimiento: Suspender los ingr edientes en agua destilada y disolverlos por ebullición. Ajustar el pH. 
Distribuirlo en volúmenes adecuados en matraces o botellas y esterilizar a 121 ± 1°C por 15 min.  
B.7.2.1.8  Solución estéril de ácido tartárico al 10%  
Disolver 10 g de ácido tartárico y  llevar a 100 ml con agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121 ± 1°C.  
B.7.2.1.9  Colorante de azul de metileno  
Solución A:  
 Azul de metileno (pureza no < 90%) 0,3 g  
 Etanol (95%) 90,0 ml  
Solución B:  
Solución 0,01% de hidróxido de potasio100 ml  
Mezclar A y B.  
B.7.2.1.10 Colorante de cristal violeta  
Cristal violeta (pureza no < 90%) 2 g  
Etanol (95%) 20,0 ml  
Agua destilada 80,0 ml  
B.7.2.1.11  Colorante de Gram  
Solución A;  
Cristal violeta (pureza no < 90%) 2 g  
Etanol (95%) 20,0 ml  
Solución B:  
Oxalato de amon io 0,8 g  
Agua destilada 80,0 ml  
Mezclar solución A y B, dejar reposar 24 h al abrigo de la luz, filtrar por papel filtro grueso.  
B.7.2.1.12  Solución de yodo para Gram  
Yodo (cristales) 1 g  
Yoduro de potasio 2 g  
Agua destilada 300,0 ml  
Mezclar el yodo y el y oduro de potasio en un mortero y triturar hasta fino polvo. Agregar 1 ml de agua y 
mezclar, agregar 5 ml de agua y mezclar, agregar 10 ml de agua y mezclar. Vaciar esta solución a un frasco 
reactivo, lavar el mortero y el pistilo con suficiente agua hasta completar los 300 ml.  
(Continúa en la Quinta Sección)