(Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
SECRETARIA DE SALUD  
PROYECTO de Norma Oficial Mexic ana PROY -NOM -186-SSA1/SCFI -2012,  Cacao, chocolate y productos 
similares, y derivados del cacao. Especificaciones sanitarias . Denominación comercial . Métodos de prueba . 
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos. - Secretaría de Salud.  
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Pres idente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario 
y CHRISTIAN TUR EGANO ROLD AN, Director General de Normas de la Secretaría de Economía y Presidente 
del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Seguridad al Usuar io, Información Comercial y Prácticas 
de Comercio, con fundamento en los artículos 34 y 39, de la Ley Orgánica de la Administración Pública 
Federal; 4, de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3, fracción XXII, 17 Bis, 17 Bis 2, 194, fracción 
I, 195, 197, 199, 201, 205, 210, 212, 213, 214, 215, fracción I y 216, de la Ley General de Salud; 3,  fracción 
XI, 38, fracción II, 39, fracción V, 40, fracciones I, V, XI y XII, 41, 43, 44, 45, 47, fracción I, 51 y 52, de la Ley 
Federal sobre Metrología y N ormalización; 28, 31, 32, 33, 34 y 39, del Reglamento de la Ley Federal sobre 
Metrología y Normalización; 1, fracción IX, 4, 8, 14, 15, 25, 40, 124, 125, fracciones I y II, 126 y 163, del 
Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2, apartad o C, fracción X, del Reglamento Interior 
de la Secretaría de Salud; 3, fracciones I, inciso c y II, 10 fracciones IV y VIII, del Reglamento de la Comisión 
Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios, 21, fracciones I, IX, X, XV y XXI, del Reglamen to Interior 
de la Secretaría de Economía, hemos tenido a bien ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación 
del Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY -NOM -186-SSA1/SCFI -2012 , Cacao, chocolate y productos 
similares, y derivados del cacao. Es pecificaciones Sanitarias. Denominación Comercial. Métodos de Prueba.  
El presente Proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los siguientes 60 días 
naturales, contados a partir de la fecha de su publicación, presenten sus comentarios po r escrito en idioma 
español y con el sustento técnico suficiente ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de 
Regulación y Fomento Sanitario, ubicado en Oklahoma número 14, colonia Nápoles, Delegación Benito 
Juárez, código postal 03810, México, D istrito Federal, teléfono 5080 5200, extensión 1333, fax 5511 1499, 
correo electrónico rfs@cofepris.gob.mx y/o ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Seguridad 
al Usuario, Información Comercial y Prácticas de Comercio, ubicado en avenida Pu ente de Tecamachalco 
número 6, colonia Lomas de Tecamachalco, Sección Fuentes, Naucalpan de Juárez, código postal 53950, 
Estado de México, teléfono 57 29 93 00, extensión 43222, fax 55 20 97 15, página de Internet 
http://www.economia.gob.mx/?P=85.  
Durante el plazo mencionado, los documentos que sirvieron de base para la elaboración del proyecto, así 
como la Manifestación de Impacto Regulatorio (MIR), estarán a disposición del público para su consulta en el 
domicilio de los Comités.  
PREFACIO  
En la elaboració n de la presente norma participaron los siguientes organismos e instituciones:  
SECRETAR IA DE SALUD.  
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.  
SECRETAR IA DE ECONOM IA. 
Dirección General de Normas.  
ASOCIACI ON NACIONAL DE FABRICANTES DE CH OCOLATES, DULCES Y SIMILARES A.C, 
(ASCHOCO).  
INDICE  
1. Objetivo y campo de aplicación  
2. Referencias  
3. Definiciones  
4. Símbolos y abreviaturas  
5. Clasificación  
6. Especificaciones sanitarias  
7. Muestreo  
8. Métodos de prueba  
9. Etiquetado  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
10. Envase y emba laje 
11. Concordancia con nor mas internacionales y mexicanas  
12. Bibliografía  
13. Observancia de la Norma  
14. Vigencia  
15. Apéndi ce informativo A. Contaminantes  
16. Apéndice  normativo A. Métodos de Prueba  
1. Objetivo y campo de aplicación  
1.1 Esta Norma, t iene por objeto establecer las especificaciones sanitarias y comerciales  que debe cumplir 
el cacao, el chocolate, los productos similares y los derivados del cacao. Asimismo, establece la 
denominación genérica y específica de dichos productos.  
1.2 Esta Nor ma es de observancia obligatoria para las personas físicas o morales que se dedican al 
proceso o importación de los productos objeto de la misma, que serán comercializados en el territorio 
nacional.  
2. Referencias  
Esta Norma se complementa con las siguient es Normas Oficiales Mexicanas o las que las sustituyan:  
2.1 Norma Ofici al Mexicana NOM -008-SCFI -2002,  Sistema General de Unidades de Medida.  
2.2 Norma Oficial Mexicana  NOM -051-SCFI/SSA1 -2010 , Especificaciones generales de etiquetado para 
alimentos y bebida s no alcohólicas preenvasados -Información comercial y sanitaria.  
2.3 Norma Ofi cial Mexicana NOM -086-SSA1 -1994,  Bienes y servicios. Alimentos y bebidas no alcohólicas 
con modificaciones en su composición. Especificaciones nutrimentales.  
2.4 Norma Oficial Me xicana  NOM -127-SSA1 -1994 , Salud amb iental, agua para uso y consumo  humano - 
Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización.  
2.5 Norma Oficial Mexicana  NOM -243-SSA1 -2010,  Productos y servicios. Leche, fórmul a láctea, producto 
lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.  
2.6 Norma Oficial Mexicana  NOM -251-SSA1 -2009 , Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplementos alimenticios.  
3. Definiciones  
3.1 Aditivos para alimentos,  a cualquier sustancia que en cuanto tal no se consume normalmente como 
alimento, ni tampoco se usa como ingrediente básico en alimentos, tenga o no valor nutritivo, y cuya adición al 
alimento con fines tecnológico s (incluidos los organolépticos) en sus fases de producción, elaboración, 
preparación, tratamiento, envasado, empaquetado, transporte o almacenamiento, resulte o pueda preverse 
razonablemente que resulte (directa o indirectamente) por sí o sus subproductos , en un componente del 
alimento o un elemento que afecte a sus características. Esta definición no incluye "contaminantes" o 
sustancias añadidas al alimento para mantener o mejorar las cualidades nutricionales.  
3.2 Azúcares, a los monosacáridos y disacárid os presentes en un alimento o bebida no alcohólica.  
3.3 Cacao,  a la semilla  extraída de las mazorcas maduras de los árboles de la especie Theobroma cacao , 
de la familia de las esterculáceas, fermentado o no y secado.  
3.4 Cocoa (cacao en polvo), al producto  que se obtiene a partir de  la torta de cacao transformada  en 
polvo.  
3.5 Chocolate,  al producto obtenido por la mezcla homogénea de cantidades variables de pasta de cacao, 
o manteca de cacao, o cocoa con azúcares u otros edulcorantes, ingredientes opcional es y aditivos para 
alimentos, siempre que cumpla con las especificaciones de esta norma.  
3.6 Consumidor, a la persona física o moral que adquiere o disfruta como destinatario final productos 
alimenticios y bebidas no alcohólicas preenvasados.  
3.7 Derivado del cacao,  a los productos obtenidos del cacao en grano descascarillado, tales como: pasta 
de cacao, torta de cacao, manteca de cacao, cocoa y mezclas de estos productos con azúcares y/o 
ingredientes opcionales.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
3.8 Embalaje,  al material que envuelve, cont iene y protege los productos preenvasados para efectos de 
su almacenamiento y transporte.  
3.9 Envase, a cualquier recipiente, o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para su 
venta al consumidor.  
3.10 Etiqueta, a cualquier rótulo, marb ete, inscripción, imagen u otra materia descriptiva o gráfica, escrita, 
impresa, estarcida, marcada, grabada en alto o bajo relieve, adherida, sobrepuesta o fijada al envase del 
producto preenvasado o, cuando no sea posible por las características del prod ucto, al embalaje.  
3.11 Grasa butírica, a la grasa que se obtiene de la leche, la cual se caracteriza por contener ácidos 
grasos saturados, incluyendo el ácido butírico.  
3.12 Inocuo,  a lo que no hace o causa daño a la salud.  
3.13 Ingredientes opcionales,  a lo que se pueden adicionar al producto, tales como: leche o sólidos de 
leche, semillas, especias, licores, entre otros, permitidos por la normatividad aplicable sin rebasar el límite 
máximo establecido.  
3.14 Límite máximo, a la cantidad establecida de adi tivos, microorganismos, parásitos, materia extraña, 
plaguicidas, metales pesados y metaloides, entre otros, que no se debe exceder en un alimento, bebida o 
materia prima.  
3.15 Manteca de cacao, al producto semisólido, de aspecto graso a temperatura ambient e, de color 
blanco o ligeramente amarillento, obtenido por el procesamiento de las semillas del árbol Theobroma cacao , 
que se obtiene por extracción mecánica o por solventes.  
3.16 Materia extraña, a cualquier sustancia, resto, desecho o material, que se pr esenta en el producto 
pero que no forma parte de la composición normal de éste.  
3.17 Metal pesado y metaloide,  a los elementos químicos que causan efectos indeseables en el 
metabolismo aun en concentraciones bajas. Su toxicidad depende de las dosis en que se ingieran, así como 
de su acumulación en el organismo.  
3.18 Métodos de prueba, al procedimiento técnico utilizado para  la determinación de parámetros  o 
características de un producto, proceso o servicio.  
3.19 Pasta de cacao o licor de cacao,  al producto que se obtiene de la molienda del cacao fermentado o 
no, tostado, descascarillado y sin eliminar o agregar ninguno de sus constituyentes, que puede tratarse 
químicamente.  
3.20 Plaguicida, a la sustancia o mezcla de sustancias que se destina a controlar cua lquier plaga, 
incluidos los vectores que transmiten las enfermedades humanas y de animales, las especies no deseadas 
que causen perjuicio o que interfieran en el proceso de los productos.  
3.21 Prácticas de Higiene,  a las medidas necesarias para garantizar la inocuidad de los productos.  
3.22 Proceso, al conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público de productos.  
3.23 Productos similares,  a los productos elaborados a partir de cacao en los que para su elaboración se 
ha sustituido total o parcialmente la manteca de cacao por otras grasas vegetales comestibles o sus 
fracciones, h idrogenadas o no y son elaborados bajo formatos o moldeados especiales y que por su 
presentación, aspecto, sabor o consumo son susceptibles a ser confundidos con el chocolate.  
3.24 Productos lácteos,  a los productos obtenidos a partir de la leche o sus com ponentes y otros 
ingredientes funcionalmente necesarios para su elaboración, incluidos los productos con grasa vegetal.  
3.25 Producto preenvasado,  al producto que cuando es colocado en un envase de cualquier naturaleza, 
no se encuentra presente el consumid or y la cantidad de producto contenido en él no puede ser alterada, a 
menos que el envase sea abierto o modificado perceptiblemente.  
3.26 Sólidos lácteos o sólidos de la leche, a los componentes propios de la leche como: suero de 
mantequilla, suero de ques o, suero de leche, concentrado de proteína de leche, proteína de suero o lactosa.  
3.27 Sólidos Totales de Cacao,  a la suma total de pasta y manteca de cacao presente en el producto 
terminado.  
3.28 Torta de cacao, al producto que se obtiene por presión de l a pasta de cacao, después de la 
extracción parcial de la manteca de cacao.  
4. Símbolos y abreviaturas  
Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
BPF.  buenas prácticas de fabricación.  
cm. Centímetro.  
º grado.  
ºC. grado Celsius.  
g. gramo.  
Kg. kilogramo.  
Kcal.  kilocaloría.  
kJ. kilojoule.  
L. litro. 
mL. mililitro.  
µL. microlitro.  
µg. microgramo.  
m. masa.  
mg. miligramo.  
mm. milímetro.  
min. minuto.  
≤ menor o igual a.  
m/m.  masa en masa.  
≥ mayor o igual a.  
/ por. 
%  por ciento.  
POP  Triglicérido de cadena estructurada de la siguiente forma: ácido palmítico -ácido oleico -ácido 
palmítico.  
POSt  Triglicérido de cadena estructurada de la siguiente forma: ácid o palmítico -ácido oleico -ácido 
esteárico.  
StOSt  Triglicérido de cadena estructurada de la siguiente forma: ácido esteárico -ácido oleico -ácido 
esteárico.  
UFC unidades formadoras de colonias.  
Cuando en la presente Norma se mencione:  
- Acuerdo , debe entenders e que se trata del Acuerdo por el que se determinan los aditivos y 
coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias.  
- CICOPLAFEST , debe entenderse que se trata de la Comisión Intersecretarial para el Control  del Proceso 
y Uso de Plaguicidas, Fertilizantes y Sustancias Tóxicas.  
- Secretaría,  debe entenderse que se trata de la Secretaría de Salud.  
5. Clasificación  
Los productos objeto de esta Norma se clasifican en:  
5.1 Cacao.  
5.2 Chocolate y Productos similare s. 
5.3 Derivados del cacao.  
6. Especificaciones sanitarias  
Los productos objeto de esta Norma, deben ajustarse según corresponda a las siguientes especificaciones:  
6.1 El responsable de la obtención de los productos objeto de esta Norma, así como el comerc ializador, 
cada uno en el ámbito de su responsabilidad, deben observar que las sustancias empleadas para la 
eliminación de plagas en cualquier parte del proceso, cumplan con las especificaciones establecidas en el 
Catálogo Oficial de Plaguicidas vigente, e mitido por CICOPLAFEST.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
6.2 En el proceso de los productos objeto de esta norma, se deben aplicar las prácticas de higiene 
establecidas en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.6 del apartado de Referencias.  
6.3 El agua que se emplee en el proce so de los productos objeto de esta Norma, debe cumplir con lo 
establecido en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.4 del apartado de Referencias.  
6.4 Las materias primas utilizadas para la elaboración de los productos objeto de esta norma, deben  
ajustarse a la normativa vigente.  
6.5 Los productos objeto de esta Norma, que hayan sido modificados en su composición, deben sujetarse 
a lo establecido en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.3 del apartado de Referencias.  
6.6 Para la elabora ción de los productos objeto de esta norma, se debe asegurar un secado completo de 
la superficie de equipo después de la limpieza del mismo y antes de iniciar operaciones.  
6.7 Los aditivos permitido s para los productos objeto de e sta norma son los establec idos en el Acuerdo y 
sus modificaciones.  
6.8 Contaminantes.  
6.8.1 Los productos objeto de esta norma no deben contener más de 15 µg/kg de aflatoxinas, con 
excepción de los productos adicionados con semillas y/o cereales, cuyo límite máximo será de 20 µg/kg . 
6.8.2 El productor o fabricante de los productos objeto de esta norma, debe establecer mecanismos de 
control que permitan determinar la presencia y cantidad de metales pesados y metaloides en las materias 
primas, en el producto en proceso de elaboración o en el producto terminado. La información generada debe 
estar a disposición de la Secretaría cuando ésta así lo requiera.  
En el Apéndice Informativo A se señalan los metales específicos y los niveles de referencia correspondiente.  
6.9 Grasas añadidas.  
6.9.1 En la elaboración de chocolate se permite el uso de grasas vegetales distintas a la manteca de 
cacao, siempre que cumplan con los siguientes criterios:  
6.9.1.1 Que sean grasas vegetales no láuricas ricas en triglicéridos monoinsaturados simétricos del t ipo 
POP, POSt y StOSt.  
6.9.1.2  Que sean miscibles en cualquier proporción con manteca de cacao y que sean compatibles con 
sus propiedades físicas (punto de fusión, temperatura de cristalización, velocidad de fusión y necesidad de 
una fase de temperado).  
6.9.1.3  Que se hayan obtenido mediante tratamientos de refinado o de fraccionamiento; la modificación 
enzimática de la estructura del triglicérido queda excluida.  
6.9.2 Las grasas de origen vegetal que se pueden utilizar para la elaboración de chocolates son  las que se 
enlistan a continuación siempre que cumplan con los criterios señalados en 6.9.1.  
Denominación usual de las grasas vegetales  Denominación científica de las plantas de las que 
pueden obtenerse dichas grasas  
1. Illipe, sebo de Borneo o Tengkawan g. 
2. Aceite de palma.  
3. Sal. 
4. Shea.  
5. Kokum gurgi.  
6. Hueso de mango.  Shorea ssp.  
Elaeis guineensis, Elaeis olifera.  
Shorea robusta.  
Butyrospermum parkii.  
Garcinia indica.  
Mangifera indica.  
 
6.9.3  Para los productos similares la sustitución de la man teca de cacao sólo podrá hacerse con grasas 
vegetales comestibles.  
6.9.4  No obstante, lo establecido en los numerales anteriores, se podrá utilizar grasa proveniente de la 
leche, que se considerará como sólidos totales de leche para efectos de la Tabla 4.  
6.9.5 El contenido de ácidos grasos tr ans en los productos objeto de e sta norma no deberá ser mayor a 
5% del total de la grasa del producto.  
6.10 Los productos objeto de e sta norma, debe cumplir con las siguientes especificaciones:  
6.10.1 Microbiológicas.  
Tabla 1. E specificaciones microbiológicas  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Determinación  Cacao tostado  Chocolate  sus variedades 
y productos similares  Derivados del 
cacao  
 Límite máximo  
Coliformes totales UFC/g  <10 <10 <10 
Salmonella spp  en 25g  Ausente  Ausente  Ausente  
Mohos UFC/g  <50 - - 
Levaduras UFC/g  <50 - -  
6.10.2 Materia extraña.  
Tabla 2. E specificaciones materia extraña  
Materia Extraña  Cacao 
tostado  Chocolate  sus variedades y 
productos similares  Derivados del 
cacao  
Límite máximo  
Madera, tallos, restos de 
mazorca, piedras y f ibras  0.5%  - - 
Insectos o sus fragmentos  - 60 fragmentos de insectos en promedio 
por 100g cuando se examinan 6 
submuestras de 100g ó 90 fragmentos 
de insectos en cualquier submuestra.  75 fragmentos de 
insectos y exento de 
insectos completos.  
Pelos de roe dor - Un pelo de roedor en promedio por 
100g cuando se examinan 6 
submuestras de 100g ó 3 pelos de 
roedor en cualquier submuestra.  2 
Excretas de roedor  22 mg/kg  Negativo.  Negativo.  
 
6.11 El cacao no debe tener más de 7.5% de humedad.  
6.12 En la elaboraci ón de chocolates rellenos  se permite el empleo de alcohol etílico anhidro.  
6.13 Los derivados del cacao deben cumplir con las siguientes especificaciones:  
Tabla 3. Espe cificaciones físicas y químicas  
Producto  Acidez máxima  (% como ácido 
oleico)  Humedad máx ima (% m/m)  
Manteca de cacao  2.0 ----------  
Pasta de cacao  2.0 ----------  
Mezclas de cocoa y azúcar, 
chocolate en polvo  ---------  7.0 
 
7. Muestreo  
7.1 El procedimiento de muestreo para los productos, objeto de esta Norma, debe sujetarse a lo que 
establ ece la Ley General de Salud y las disposiciones jurídicas aplicables.  
8. Métodos de prueba  
8.1 Para la verificación oficial de las especificaciones sanitarias que se establecen en esta Norma, se 
deben aplicar los métodos que se señalan en el Apéndice Norma tivo A.  
9. Etiquetado  
Las etiquetas de los productos objeto de esta norma, deben cumplir con las disposiciones generales de 
etiquetado establecidas en la Norma Oficial Mexicana citada en el numeral 2.2 del apartado de Referencias, 
así como las siguientes d isposiciones particulares:  
9.1 Información sanitaria.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Las etiquetas de los productos objeto de esta norma, además de cumplir con lo establecido en el 
Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios, deben cumplir con lo siguiente:  
9.1.1 Cuando se trate de productos con modificaciones en su composición, deben ostentar en la 
denominación los términos establecidos en la Norma Oficial Mexicana. Dichos términos deben figurar en  la 
misma superficie, a renglón seguido con el mismo tipo, color y tamaño de letra.  
9.1.2 Cuando se trate de productos en polvo, deshidratados, concentrados o condensados, destinados a 
ser reconstituidos, pueden presentar los ingredientes por orden cuantitativo decreciente (m/m) en el producto 
reconstituido, siempre que se incluya una indicación como la que sigue: "ingredientes del producto cuando se 
prepara según las instrucciones de la etiqueta."  
9.1.3 Los productos objeto de esta norma que contengan alcohol etílico o bebidas alcohólicas en 
cantidades superiores al 0,5%, deben inc luir en la superficie principal de exhibición de la etiqueta, la siguiente 
leyenda: "Este producto contiene ______% de alcohol. No recomendable para niños". (En el espacio en 
blanco citar el contenido de alcohol en %).  
9.1.4 En caso de contener una cantida d mayor al 10% de polioles, se deberá ostentar la siguiente leyenda 
precautoria: Un consumo excesivo de ______ puede tener efectos laxantes. (En el espacio en blanco deberá 
citarse la denominación específica del poliol empleado).  
9.1.5 En el caso de que lo s productos objeto de esta Norma contengan o incluyan productos alimenticios 
preenvasados como parte de promociones u obsequios, el envase de este último debe cumplir con las 
especificaciones de etiquetado correspondientes.  
9.2 Información Comercial.  
9.2.1  Denominación comercial y factores esenciales de composición.  
9.2.1.1 Cobertura de chocolate, al producto homogéneo que cumple con las características del tipo de 
chocolate del que proviene de acuerdo a su formulación y características físicas, y que debe cumplir con los 
mínimos previstos en la Tabla 4.  
9.2.1.2 Chocolate amargo y semiamargo, a los productos homogéneos elaborados a partir de la mezcla de 
dos o más de los siguientes ingredientes: pasta de cacao, manteca de cacao, cocoa, adicionado de azúcares  
u otros edulcorantes, así como de otros ingredientes opcionales, tales como productos lácteos y aditivos para 
alimentos, y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4.  
9.2.1.3  Chocolate blanco, al producto homogéneo elaborado a partir de mant eca de cacao, productos 
lácteos, azúcares u otros edulcorantes, aromatizantes e ingredientes opcionales, que cumple con los mínimos 
previstos en la Tabla 4.  
9.2.1.4 Chocolate con leche, al producto homogéneo elaborado a partir de la mezcla de dos o más de los 
siguientes ingredientes: pasta de cacao, manteca de cacao, cocoa, adicionado de azúcares u otros 
edulcorantes, extracto seco de leche referido a la adición de ingredientes lácteos en sus proporciones 
naturales, salvo que la grasa de leche podrá agregar se o eliminarse, así como de otros ingredientes 
opcionales y aditivos para alimentos y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4.  
9.2.1.5 Chocolate en polvo, al producto homogéneo elaborado de la mezcla de cocoa, azúcares y otros 
ingrediente s opcionales, y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4.  
9.2.1.6 Chocolate para mesa, al producto homogéneo elaborado a partir de la pasta de cacao, azúcar sin 
refinar con un tamaño de partícula mayor de 70 micras con la adición de ingredi entes opcionales y que debe 
cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4.  
9.2.1.7 Chocolate para mesa amargo o semiamargo, al producto homogéneo elaborado a partir de la pasta 
de cacao, azúcar sin refinar con un tamaño de partícula mayor de 70 micras co n la adición de ingredientes 
opcionales y que debe cumplir con los mínimos previstos en la Tabla 4.  
9.2.2  La etiqueta de los productos objeto de esta Norma, además de cumplir con lo establecido en los 
puntos anteriores, debe sujetarse a lo siguiente:  
9.2.2 .1 Deberá ostentar la denominación genérica y específica de conformidad con la Tabla 4.  
Tabla 4. Composición % m/m en base seca  
Producto  Manteca 
de cacao 
total  Cocoa 
desgrasada 
totalmente  Sólidos 
totales de 
cacao  Grasa 
butírica 
total  Sólidos 
totales 
de lec he Sólidos 
totales 
de cacao Grasa 
vegetal 
diferente a 
la manteca Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
y leche  de cacao*  
Chocolate  ≥ 18.0  ≥ 14.0  ≥ 35.0     ≤ 5.0  
Chocolate amargo  ≥ 22.0  ≥ 18.0  ≥ 40.0     ≤ 5.0  
Chocolate semiamargo  ≥ 15.6  ≥ 14.0  ≥ 30.0     ≤ 5.0  
Chocolate con leche  ≥ 20.0  ≥ 2.5 ≥ 25.0  ≥ 2.5  ≥ 14.0  ≥ 40.0  ≤ 5.0  
Chocolate con alto 
contenido de leche  ≥ 17.0  ≥ 2.5  ≥ 20.0  ≥ 5.0  ≥ 20.0  ≥ 40.0  ≤ 5.0  
Chocolate con leche 
descremada  ≥ 20.0  ≥ 2.5  ≥ 20.0  ≤ 0.5  ≥ 14.0  ≥ 40.0  ≤ 5.0  
Chocolate blanco  ≥ 20.0   ≥ 20.0  ≥ 3.5  ≥ 14.0  ≥ 34.0  ≤ 5.0 
Chocolate para mesa  ≥ 11.0  ≥ 9.0  ≥ 20.0     ≤ 5.0  
Chocolate para mesa 
semiamargo  ≥ 15.6  ≥ 14.0  ≥ 30.0     ≤ 5.0  
Chocolate para mesa 
amargo  ≥ 22.0  ≥ 18.0  ≥ 40.0     ≤ 5.0  
Chocolate en polvo  ≥ 1.8   ≥ 18.0     ≤ 5.0  
*La adición de grasas vegetales distin tas a la manteca de cacao, no debe exceder del 5 % de la masa del producto 
terminado, después de deducir el peso total de cualquier otro producto alimenticio comestible añadido al chocolate y sin 
reducir el contenido mínimo de las materias de cacao.  
9.2.2.2  Los productos similares podrán utilizar el término chocolate siempre y cuando se anteponga el 
texto: "Sabor a", usando la misma tipografía, tamaño y color que la de la denominación.  
9.2.2.3 Cuando en la elaboración de los productos objeto de esta Norma, s e utilice grasa diferente a la 
manteca de cacao se deberá declarar como grasa vegetal.  
9.2.2.4  Los productos objeto de e sta Norma, podrán ser adicionados con frutas en conserva, cereales, 
semillas oleaginosas, las cuales deberán estar limpias y sanas, en c antidad no menor de 8% para que dichas 
características puedan ostentarse en la etiqueta, sin embargo no podrá n exceder el 60% del peso total  del 
producto.  
10. Envase y embalaje  
10.1 Los productos objeto de esta Norma se deben envasar en recipientes elabora dos con materiales 
inocuos y resistentes a distintas etapas del proceso, de tal manera que no reaccionen con el producto o 
alteren las características físicas, químicas y sensoriales.  
10.2 Se debe usar material resistente que ofrezca la protección adecuada  a los envases para impedir su 
deterioro, a la vez que faciliten su manipulación, almacenamiento y distribución.  
11. Concordancia con nor mas internacionales y mexicanas  
Esta Norma es parcialmente equivalente a las siguientes normas:  
11.1 Norma de Codex par a el cacao en pasta (licor de cacao/chocolate) y torta de cacao. Codex Stan  141-
1983 Rev. 1 -2001.  
11.2 Norma del Codex para el cacao en polvo (cacaos) y mezclas de cacao y azúcar. Codex Stan  105-
1981  Rev. 1 -2001, Enmienda 1, 2010.  
11.3 Norma del Codex para  el chocolate. Codex Stan 87 -1981 Rev. 1 -2003.  
11.4 Norma del Codex para la manteca de cacao. Codex Stan 86 -1981 Rev. 1 -2001.  
12. Bibliografía  
12.1 Ley Federal sobre Metrología y Normalización.  
12.2 Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normaliza ción.  
12.3 Ley General de Salud.  
12.4 Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
12.5 Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos 
alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias.  
12.6 AOAC  International. Official Methods of Analysis. 2006. 18th Ed.,  1st Rev. (Chapter 31: Cacao bean 
and its products).  
12.7 Comisión del Codex Alimentarius. 2001. Informe de la 18a. reunión del Comité del Codex sobre 
productos del cacao y el chocolate.  
12.8 Directiva 200/36/CE del Parlamento Europeo y del Consejo del 23 de junio de 2000.  
12.9 Fernández, E.E. Microbiología sanitaria, agua y alimentos. Universidad de Guadalajara, México.  
12.10 Frazier, W.C. y Westhoff, D.C. Microbiología de los alimentos. Zaragoza , España.  
12.11 ICMSF. Ecología microbiana de los alimentos. Zaragoza, España.  
12.12 Jay, M. J. Microbiología moderna de los alimentos. Zaragoza, España.  
12.13 Food and Agriculture Organization of the United Nations. International Programme on Chemical 
Safety. World Health Organization. Summary of Evaluations Performed by the Joint FAO/WHO Expert 
Committee on Food Addittives (JECFA).  
12.14 Salvador Villalpando. Grasas, Dieta y Salud. Tablas de composición de Acidos Grasos de alimentos 
frecuentes en la dieta  mexicana. Instituto Nacional de Salud Pública, México.  
13. Observancia de la Norma  
13.1 La vigilancia del cumplimiento de las especificaciones sanitarias de la presente Norma corresponde a 
la Secretaría de Salud y a los gobiernos de las entidades federati vas, en el ámbito de sus respectivas 
competencias.  
13.2 La vigilancia en el cumplimiento de las especificaciones comerciales de la presente Norma 
corresponde a la Secretaría de Economía, a la Procuraduría Federal del Consumidor (PROFECO) y a los 
organismos  privados que para el efecto se establezcan.  
14. Vigencia  
La presente Norma entrará en vigor a los sesenta días naturales contados a partir del día siguiente de su 
publicación en el Diario Oficial de la Federación, a excepción del límite de 15 µg/kg de afl atoxinas establecido 
en el numeral 6.8.1, para el cual contarán con 365 días naturales para su cumplimiento a partir de la entrada 
en vigor de la misma.  
Sufragio Efectivo . No Reelección . 
México , D.F., a 15 de febrero de 2013. - El Comisionado Federal para l a Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario , 
Mikel Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbrica. - El Director General de Normas y Presidente del Comité 
Consultivo Nacional de No rmalización de Seguridad al Usuario, Información Comercial y Prácticas  de 
Comercio , Christian Turégano Roldán .- Rúbrica.  
 
15. Apéndi ce Informativo A. Contaminantes  
Tabla A.1 L ímites máximos de contaminantes  
Metales 
pesados y 
metaloides  Límite máximo mg/Kg  
 Cacao  Chocolate y 
Productos 
Similares  Cocoa  Pasta y/o 
Torta de 
cacao  Manteca de 
cacao  Mezclas de cocoa y 
azúcar, chocolate 
en polvo  
Arsénico  1.0 0.5 1.0  0.5  
Plomo  1.0 1.0 1.0 1.0 0.1 1.0 
16. Apéndice Normativo A. Métodos de prueba  
A.1. Símbolos y ab reviaturas para los métodos de prueba  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Los siguientes símbolos y abreviaturas se complementan con los enlistados en el cuerpo de la presente 
Norma:  
» aproximado  
± más, menos  
1/d inversa de la dilución  
As arsénico  
Bi bismuto  
Cd cadmio  
cbp cuanto basta para  
Cu cobre  
etc. etcétera  
Fe  fierro  
Ge germanio  
H hora 
Hg mercurio  
Lb libras  
LDI límite de detección del instrumento  
LDM  límite de detección del método  
µm micrómetro  
µmho  micromho  
N normal  
Ng nanogramo  
Nm nanómetro  
NMP.  número más probable  
No. número  
M molar  
MCC  muestra de control de calidad  
P peso  
Pb plomo  
p. ejem.  por ejemplo  
Ph potencial hidrógeno  
RA reactivo analítico  
Rpm  revoluciones por minuto  
RVBA  agar rojo -violeta -verde -brillante  
Sb  antimonio  
Se selenio  
Seg segundo  
Sn estaño  
Te teluro  
V volumen  
Zn zinc 
A.2. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.  
A.2.1 Fundamento.  
Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible 
de los microorganismos presentes en la porció n de muestra.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.2.2 Definiciones.  
A.2.2.1  Dilución primaria , es la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una 
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.  
A.2.2.2  Diluc iones decimales adicionales , las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un 
determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición 
de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas 
para la inoculación de medios de cultivo.  
A.2.3 Reactivos y materiales  
A.2.3.1 Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua desti lada.  
A.2.3.1.1  Preparación de reactivos  
A.2.3.1.1.1  Solución de hidróxido de sodio 1,0 N  
Tabla A.2.1 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Hidróxido de Sodio  4.0g 
Agua  100.0ml  
 
Preparación:  
Disolver el hidróxido de sodio y llevar a 100 mL con agua.  
A.2.3.1.1 .2 Soluciones diluyentes.  
A.2.3.1.1.2.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
Tabla A.2.2 Fórmu la 
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato de sodio monobásico  34.0g  
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1,0 N.  
Llevar a un litro con agua.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121° ± 1, 0 °C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución d e trabajo).  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esterilizar a 121° ± 1, 0 °C durante 15 minutos.  
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a 
los iniciales.  
A.2.3.1.1.2.2  Agua peptonada  
Tabla A.2.3 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1.0g Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Cloruro de sodio  8.5g 
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.  
Distribuir en porciones de 99, 90  y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.  
Esterilizar a 121 ± 1, 0 °C durante 15 minutos.  
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a 
los iniciales.  
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar  oscuro a una temperatura entre  0a 5 °C 
por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
A.2.3.2 Materiales.  
A.2.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y  1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
A.2.3.2.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
A.2.3.2.3  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de ro sca. 
A.2.3.2.4  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc.  
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio deberán esterilizarse 
mediante: Horno para ester ilizar o autoclave.  
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente 
inerte.  
A.2.4 Aparatos e ins trumentos.  
A.2.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 17 0 °C. Durante 2 h a 170 a 17 5 °C 
 o 1 h a 18 0 °C. 
A.2.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
Durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1, 0 °C. 
A.2.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0, 1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 0, 5 °C. 
A.2.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un re óstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher).  
A.2.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
A.2.4.6  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.  
A.2.5 Procedimiento  
A.2.5.1  Preparació n de la dilución primaria.  
A.2.5.1.1  A partir de muestras líquidas.  
Para muestras líquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribución de 
microorganismos es homogénea o fácilmente homogeneizable por medios mecánicos (agitación,  etc.).  
Para muestras congeladas de un alimento originalmente líquido o licuable, fundir por completo en baño  de 
agua de 40 a 4 5 °C un tiempo máximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.  
Para la parte líquida de una muestra heterogénea la cu al sea considerada suficientemente representativa 
de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).  
A.2.5.1.1.1  Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm 
efectuados en un tiempo de  7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual 
debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.  
A.2.5.1.1.2  Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas  mayores, por ejemplo 
volúmenes de 10 u 11 mL, diluidos con 90 o 99 mL, de la misma forma que se describió anteriormente.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.2.5.1.2  A partir de muestras sólidas o semisólidas.  
Las muestras sólidas y semisólidas congeladas, deben descongelarse en refrigerac ión de 4 a 8  ºC durante 
18 horas y no más de 24 horas antes de proceder a su análisis.  
A.2.5.1.2.1  Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica 
estériles de tamaño adecuado.  
A.2.5.1.2.2  Adicionar un volumen d e 90 a 99 mL del diluyente llevado a una temperatura similar a la de  la 
muestra.  
A.2.5.1.2.3  Operar la licuadora o el homogeneizador peristáltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una 
suspensión completa y homogénea según se indique en la técnica corres pondie nte para cada alimento. Au n 
en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.  
A.2.5.1.2.4  Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de 
las capas superiores de la suspensión.  
Cuando la d ilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en 
cuenta para las operaciones subsecuentes o expresión de resultados.  
El homogeneizador peristáltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ej emplo, 
aquellos con partículas agudas o constituyentes que no se dispersen fácilmente). Debe ser utilizado sólo 
cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren 
significativamente con aquellos obten idos con licuadora.  
A.2.5.2  Preparación de las diluciones decimales adicionales.  
A.2.5.2.1  Transferir 1 mL o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1), en 
otro recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente esté ril a la temperatura apropiada, evitando 
el contacto entre la pipeta y el diluyente.  
A.2.5.2.2  Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe 
en A.2.5.1.1.1  
A.2.5.2.3  La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, 
dependen del número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis 
previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia 
total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.  
A.2.5.2.4  Utilizar pipetas diferentes para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan 
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de l a capacidad total de la pipeta.  
A.2.5.2.5  Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, 
escurrir aplicando la punta de la pipeta una sola vez en un área de la caja Petri sin líquido.  
A.2.5.2.6  Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello 
del frasco y mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.  
En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determina da especie de microorganismos en 
0,1 mL o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.  
El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el número de microorganismos 
esperado es:  
Para la técnica del número más probable utilizar t res tubos: donde sea posible demostrar el 
microorganismo en 10 mL de la dilución más alta.  
Para la técnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias 
en un mínimo de una de tres diluciones en el método de cuent a de bacterias aerobias en placa. En el caso de 
otros grupos microbianos, considerar el número especificado de colonias en la Norma Oficial Mexicana 
correspondiente.  
A.2.5.3  Duración del procedimiento.  
En general, las diluciones de la muestra deben ser pre paradas inmediatamente antes del análisis y éstas 
deben ser usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparación.  
A.3. Determinación de materia extraña para chocolate, cocoas y pasta de cacao.  
A.3.1 Fundamento.  
Después de someter la muestra a un proceso de desengrasado, los fragmentos de insecto, pelos de 
roedor y otros residuos se extraen utilizando el matraz trampa de Wildman.  
A.3.2 Equipo.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.3.2.1  Balanza analítica con + 0,1 mg de sensibilidad.  
A.3.2.2  Equipo de succión para filtración al vacío.  
A.3.2.3  Placa de calentamiento con agitación magnética y barra magnética recubierta con teflón.  
A.3.2.4  Microscopio binocular estereoscópico, con objetivos 1,  3 y 6 o 7X, respectivamente, y oculares 
apareados d e amplio cam po visual de 10, 15  y 30X, respectivamente.  
A.3.2.5  Lámpara para el microscopio.  
A.3.2.6  Batidora con agitador (opcional).  
A.3.2.7  Rallador de cocina.  
A.3.3 Materiales.  
A.3.3.1  Tamiz de 0,063 mm de abertura de malla (NOM 0100M, 230 U.S.).  
A.3.3.2  Regadera de hule, para llave de cocina.  
A.3.3.3  Matraz trampa de Wildman: Matraz Erlenmeyer de 2 L provisto de un buzo formado por una varilla 
metálica con un tapón émbolo de hule en un extremo.  
A.3.3.4  Embudo de Hirsch o Büchner para filtración al vacío. Colocar a l final del tallo del embudo un tubo 
de hule de aproximadamente 10 cm de largo que pueda ser tapado con tapón de plástico o corcho.  
A.3.3.5  Pinzas para ropa.  
A.3.3.6  Matraz volumétrico de 100 mL.  
A.3.3.7  Cajas de Petri o placas de vidrio grueso.  
A.3.3.8  Papel de filtración rápida rayado para conteo o rayado a lápiz con líneas paralelas de 
aproximadamente 5 mm de separación.  
A.3.3.9  Matraces volumétricos de diferentes capacidades.  
A.3.3.10  Vasos de precipitados de 500 y de 1000 mL.  
A.3.3.11  Aguja de disecció n. 
A.3.3.12  Pinza.  
A.3.3.13  Lápiz graso.  
A.3.4 Reactivos  
Los reactivos deben ser grado analítico, a menos que se indique otra especificación, cuando se mencione 
agua, debe entenderse agua destilada.  
A.3.4.1  Lauril sulfato de sodio C12H25O4SNa al 2% (soluci ón detergente).  
En un matraz volumétrico de 100 mL disolver 2,0 g de lauril sulfato de sodio con agua y llevar al volumen.  
A.3.4.2  Heptano C7H6, puede emplearse n -heptano comercial con un contenido máximo de 8% de tolueno.  
A.3.4.3  Solución de hipoclorito d e sodio NaOCl, aproximadamente 0,25%.  
Diluir con agua 5 mL de solución comercial de hipoclorito de sodio al 5,25% en masa y llevar al volumen 
de 100 mL, debe prepararse fresca diariamente y guardarse en recipiente cerrado y protegido de la luz.  
A.3.4.4  Mezcla glicerina C3H8O3 - Etanol C2H6O (1:3) (v/v).  
A.3.5 Procedimiento.  
A.3.5.1  Preparación de la muestra.  
A.3.5.1.1  Para cocoas y chocolates en polvo, mezclar bien y tomar 50 g de muestra.  
A.3.5.1.2  Para chocolate, rallar finamente la muestra y tomar 100 g p ara el análisis.  
A.3.5.1.3  En el caso de cocoas y otros productos prensados duramente, calentarlos en estufa durante  2 o 
3 horas a una temperatura entre 60 y 7 0 ºC . Desmoronar las pastillas prensadas en pedazos de 
aproximadamente 1 cm; tomar 50 g de muestr a para el análisis.  
A.3.5.2  Determinación.  
A.3.5.2.1  Mezclar en el vaso de precipitados la muestra para analizar con 500 mL de la solución 
detergente al 2% a una temperatura entre 55 y 7 0 ºC. En el caso de los productos duramente prensados; 
dejarlos en rem ojo durante toda la noche o bien agitarlos con la batidora a baja velocidad o agitación 
magnética durante 2 o 3 horas, hasta que se dispersen completamente.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.3.5.2.2  Remover muy bien, verter en porciones en un tamiz con malla número 230 y lavar con fuerte  
chorro de agua caliente entre 55 y 7 0 ºC. La llave debe estar provista de regadera de hule que proporcione el 
chorro en forma de lluvia.  
A.3.5.2.3  Eliminar la grasa del producto inclinando el tamiz a 20º aproximadamente y dejar correr una 
suave corriente de agua a través del líquido que se junta a un lado del tamiz.  
A.3.5.2.4  Cuando se ha eliminado la grasa y los materiales finos, y se ha desprendido la espuma que al 
principio se forma, transferir el residuo completamente a un matraz trampa de Wildman de 2  L usando agua.  
A.3.5.2.5  Añadir aproximadamente 500 mL de agua y hervir por unos 10 min.  
A.3.5.2.6 Enfriar hasta la temperatura ambiente y añadir agua para completar 1 L de líquido en el matraz.  
A.3.5.2.7  Añadir 50 mL de heptano utilizando la varilla de m etal del matraz.  
A.3.5.2.8  Introducir la barra magnética en el matraz colocándola sobre el tapón émbolo de hule. Levantar 
la varilla hasta que el tapón de hule quede por encima del nivel del líquido y fijarla con unas pinzas.  
A.3.5.2.9  Agitar la mezcla uti lizando el agitador magnético. Aumentar la agitación y evitando incorporarle 
aire, mantenerla durante 5 min.  
A.3.5.2.10  Después de agitar, bajar la varilla de metal y el tapón émbolo de hule y añadir el agua 
necesaria, para que la capa de heptano suba al c uello del matraz.  
A.3.5.2.11  Dejar reposar durante 30 min, agitando suavemente la capa del fondo cada 4 -5 min con la 
barra magnética, durante los primeros 20 min de reposo.  
A.3.5.2.12 Girando la varilla de metal, para remover el sedimento fino que se acumu ló en la superficie del 
tapón émbolo, atrapar la capa de heptano levantándolo e introduciéndolo lo más q ue se pueda en el cuello  del 
matraz.  
A.3.5.2.13  Asegurar que la capa de heptano y por lo menos 1 cm de agua que está abajo de la interfase 
queden sobre el émbolo.  
A.3.5.2.14  Mantener el émbolo en su lugar y decantar los líquidos que estén sobre él en un vaso de 
precipitados. Enjuagar el material que quede en la varilla y en el cuello del matraz con heptano y 
reincorporarlo al vaso de precipitados.  
A.3.5.2 .15 Introducir el émbolo al cuerpo del matraz aproximadamente a la mitad de éste y fijar 
nuevamente la varilla con las pinzas.  
A.3.5.2.16  Añadir 35 mL de heptano al matraz trampa, para hacer una segunda extracción, agitar 
suavemente a mano durante 1 min, d ejar reposar durante 15 min y se lava con heptano. Los líquidos de la 
segunda extracción y el heptano de lavado se juntan con los de la primera extracción, recibiéndolos en  el 
mismo vaso de precipitados.  
A.3.5.2.17  Colocar el papel filtro rayado para conte o dentro del embudo de succión y verter uniformemente 
en él, el contenido del vaso de precipitados utilizando un agitador. Enjuagar abundantemente el vaso con 
heptano y verterlo en el embudo.  
A.3.5.2.18  Pasar el filtro con el residuo a una caja de Petri, e s opcional humedecerla con la mezcla 
glicerina: etanol. Contar al microscopio los pelos utilizando una luz suficientemente fuerte para que muestre 
los detalles en el papel filtro a través del microscopio. Cuente explorando con una aguja de disección sobre 
toda la superficie del papel, línea por línea. Voltear y explorar cada pieza del material, pues algunos 
fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan. No contar el material dudoso.  
A.3.5.2.19  En caso de que existan en el papel demasiados residuos, pr oceder con la técnica de blanqueo 
después de haber examinado el papel para conteo de pelos.  
A.3.6 Técnica de blanqueo.  
A.3.6.1 Regresar el papel filtro al embudo de filtración, en caso de haber adicionado la mezcla de  glicerol -
etanol, lavarlo con etanol al  95%, seguido de agua. Aplicar vacío hasta que el papel parezca seco y suspender 
el vacío.  
A.3.6.2  Poner un tapón de plástico o corcho en el extremo del tubo de hule colocado en el embudo.  
A.3.6.3  Cubrir el papel filtro con 5 -7 mL (alcance un nivel de 3 a 4 mm) de solución de hipoclorito sin 
permitir que fluya para la orilla del papel. Mantener en reposo el nivel de la solución hasta que esté completo 
el blanqueo de la muestra (30 min máximo).  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.3.6.4  Quitar del tubo de hule el tapón de plástico o corcho, a plicar vacío y lavar con agua.  
A.3.6.5  Pasar el papel filtro a una caja Petri y contar al microscopio los fragmentos de insectos.  
A.3.7 Expresión de resultados.  
Número promedio de insectos enteros o sus fragmentos, así como pelos de roedor contenidos en la  
cantidad de muestra tomada  
 
A.4. Determinación de aflatoxinas totales por método de columna de inmunoafinidad.  
A.4.1 Fundamento.  
La porción de prueba es extraída con metanol. La muestra extraída es filtrada, diluida con agua, y aplicada 
a la columna de a finidad la cual contiene un anticuerpo monoclonal específico para aflatoxinas B1, B2, G1 y 
G2. Las aflatoxinas son aisladas, purificadas y concentradas en la columna y removidas de los anticuerpos 
con metanol. Las aflatoxinas totales son cuantificadas por medición fluorométrica después de reaccionar con 
solución de bromo (método SFB). Las aflatoxinas individuales son cuantificadas por cromatografía de líquidos 
con detección de fluorescencia y derivatización con yodo postcolumna (método PCD).  
A.4.2  Equipo.  
A.4.2.1  Licuadora a alta velocidad, con vaso de 500 mL y tapa.  
A.4.2.2  Balanza granataria con una sensibilidad de 0,1 g.  
A.4.2.3  Fluorómetro con lámpara pulsada de xenón o cuarzo -halógeno y con filtros de excitación a 360 nm 
y emisión a 450 nm.  
A.4.2.4  Agitador tipo vortex.  
A.4.2.5  Bomba manual. Jeringa de 20 mL y émbolo con tubo de polietileno unida a un tapón a la salida.  
A.4.2.6  Bomba para cromatógrafo de líquidos. Adecuada para una tasa de flujo de 1 mL/min.  
A.4.2.7  Sistema de inyección. Jeringa con válv ula de inyección de cargado con loop de 50 µL o 
equivalente.  
A.4.2.8  Sistema de derivatización postcolumna. Una segunda bomba sin pulso, pieza tipo T con cero 
volumen muerto, tubería de teflón de 610 cm x 0,5 mm de diámetro interno, y baño de calentamiento  o reactor 
postcolumna.  
A.4.2.9  Detector de fluorescencia con filtros de excitación a 360 nm y emisión > 420 nm.  
A.4.3 Materiales  
A.4.3.1  Papel filtro aflautado de 24 cm (Whatman 2V o equivalente).  
A.4.3.2  Papel filtro de fibra de vidrio (Whatman 934AH o e quivalente).  
A.4.3.3  Jeringa de 20 mL, tipo Luer para depósito de la muestra.  
A.4.3.4  Celda de borosilicato de 12 x 75 mm.  
A.4.3.5  Dispensador automático. Botella de 2 onzas de color ámbar con dispensador automático de 1,0 mL  
A.4.3.6  Matraz volumétrico de 2 mL.  
A.4.3.7  Columna de afinidad Aflatest -P. La columna puede ser almacenada durante 1 año a temperatura 
ambiente sin pérdida de su eficiencia. Recuperaciones para una solución patrón de aflatoxinas de 15 mL de 
metanol -agua (3+1) que contiene 25 ng B1, 5 ng de B2, 15 ng de G1 y 5 ng de G2 deben ser al menos de 90, 
80, 90 y 60%, respectivamente.  
A.4.4 Reactivos.  
Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por agua se 
entiende agua destilada.  
A.4.4.1  Metanol (CH 4O). 
A.4.4.2  Metanol grado HPLC.  
A.4.4.3  Acetonitrilo (C2H3N) grado HPLC.  
A.4.4.4  Agua (H2O) grado HPLC.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.4.4.5  Cloruro de sodio (NaCl).  
A.4.4.6  Yodo (I2).  
A.4.4.7  Benceno grado espectroscópico (C6H6).  
A.4.4.8  Sulfato de quinina dihidratada.  
A.4.4.9  Aceta to de zinc (C4H6O4Zn. 2H2O).  
A.4.4.10 Cloruro de aluminio (AlCl3).  
A.4.4.11 Soluciones acuosas de metanol.  
Tabla A.4.1 Fórmulas  
Solución de metanol  mL de metanol  mL de agua destilada  Vol. total de solución (mL)  
20% 200 800 1000  
60% 600 400 1000  
70% 700 300 1000  
 
A.4.4.12  Solución de acetato de zinc/cloruro de aluminio. Pesar 200 g de acetato de zinc y 5 g de cloruro 
de aluminio. Llevar a un volumen de 1 L con agua.  
A.4.4.13  Solución reveladora de bromo al 0,01%.  
A.4.4.14 Solución reveladora de bromo al 0,002%. Mezclar 10 mL de solución al 0.01% con 40 mL de 
agua. Preparar diariamente y almacenar en frasco ámbar.  
A.4.4.15 Estándares de calibración para el fluorómetro. Utilizar una solución de 34 mg de sulfato de 
quinina en 1 mL de ácido sulfúrico 0,1N com o solución patrón de 20 ng aflatoxina/g. Emplear ácido sulfúrico 
0,1N como blanco. Alternativamente se dispone de estándares comerciales en ampolletas selladas (ampolleta 
verde = 0 ng/g, ampolleta roja = 20 ng/g y ampolleta amarilla = 10 + 2 ng/g).  
A.4.4.1 6 Fase móvil para cromatografía de líquidos. Agua -acetonitrilo -metanol (3+1+1), degasificada.  
A.4.4.17  Reactivo postcolumna. Disolver 100 mg de yodo en 2 mL de metanol. Adicionar 200 mL de agua, 
agitar 1 hora, y filtrar a través de poro de 0,45 mm. Prepara r diariamente.  
A.4.4.18 Soluciones patrón de aflatoxinas para cromatografía de líquidos.  
A.4.4.18.1 Solución madre de mezcla de aflatoxinas. Preparar una solución que contenga 500 ng  B1, 125 
ng de B2, 250 ng G1 y 125 ng G2/mL en benceno:acetonitrilo (98+2) . 
A.4.4.18.2 Soluciones patrón de trabajo.  
Transferir cada cantidad indicada en la Tabla A.4.2, de solución madre en series de tres matraces 
volumétricos de 2 mL. Evaporar las soluciones casi a sequedad bajo corriente de nitrógeno a temperatura 
ambiente. A dicionar a cada matraz, 1 mL de metanol, mezclar, diluir con agua y mezclar. Preparar 
diariamente.  
Tabla A.4.2 Fórmulas de  soluciones estándar de trabajo  
Solución 
patrón  de 
trabajo  µL tomados de 
solución  
madre  ng aflatoxina/50 m L  
  B1 B2 G1 G2 
1 60 0.750 0.188  0.375  0.188  
2 40 0.500  0.125  0.250  0.125  
3 20 0.250  0.063  0.125  0.063  
 
A.4.5 Procedimiento.  
A.4.5.1  Preparación de la muestra.  
A.4.5.1.1  Grano entero de cacao.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Eliminar la cáscara del grano y moler la muestra completa hasta pasar por un tamiz d e malla número 20. 
Para el caso de muestras con alto contenido de grasa, moler con un cortador de carne hasta la obtención de 
una pasta. Homogeneizar la muestra, de preferencia con la ayuda de una mezcladora.  
A.4.5.1.2 Productos de chocolate.  
Enfriar aprox imadamente 200 g de la muestra hasta que se endurezca, y rallar o raspar hasta la obtención 
de un producto granular fino. Mezclar completamente y guardar en recipiente con cierre hermético. Colocar en 
un lugar frío.  
A.4.5.1.3 Chocolate en polvo.  
Mezclar co mpletamente y guardar en recipientes con cierre hermético.  
A.4.5.2  Extracción de las muestras.  
A.4.5.2.1  Muestras de grano de cacao.  
Pesar 25 g de muestra en un vaso de licuadora. Adicionar 5 g de cloruro de sodio y 125 mL de metanol al 
70%. Licuar durante  2 minutos a alta velocidad.  
Filtrar a través de papel aflautado. Medir 15 mL de este filtrado y colocar en un matraz Erlenmeyer de  125 
mL. Añadir 30 mL de agua y mezclar. Filtrar a través de filtro de fibra de vidrio < 30 minutos antes  de pasar a 
la colum na de afinidad. El filtrado debe ser claro, de no ser así, refiltrar.  
A.4.5.2.2 Muestras a base de chocolate.  
Pesar 25 g de muestra en un vaso de licuadora. Adicionar 5 g de cloruro de sodio y 100 mL de metanol al 
100%. Licuar durante 2 minutos a alta velo cidad.  
Filtrar a través de papel aflautado. Medir 10 mL de este filtrado y diluir con 40 mL de solución de acetato 
de zinc/cloruro de aluminio. Mezclar. Filtrar a través de filtro de fibra de vidrio < 30 minutos antes de pasar a la 
columna de afinidad. El filtrado debe ser claro. De no ser así, refiltrar.  
A.4.5.3 Cromatografía en columna de afinidad.  
A.4.5.3.1 Asegurar el depósito de la jeringa a un soporte. Quitar la tapa superior de la columna. Cortar la 
tapa y usarla como un conector entre la columna y l a jeringa.  
A.4.5.3.2  Adicionar 15 mL del filtrado obtenido en la extracción del grano de cacao (equivalente a 1 g de 
porción de prueba) o 10 mL del filtrado obtenido de la extracción de productos a base de chocolate 
(equivalente a 0,5 g de porción de prueb a) dentro del depósito de la jeringa. Conectar a la bomba manual 
previamente llenada de aire. Quitar la tapa inferior de la columna.  
A.4.5.3.3 Pasar el extracto a través de la columna a un flujo de 2 gotas/seg (6mL/min). Desconectar la 
bomba manual del dep ósito de la jeringa y llenar la bomba con aire.  
A.4.5.3.4 Conectar nuevamente la bomba a la jeringa, y pasar de 2 -3 mL de aire a través de la columna. 
Desconectar la bomba y adicionar 10 mL de agua al depósito. Para el caso de productos a base de chocolate  
sustituir por 10 mL de metanol al 20%. Llenar la bomba con aire y conectar a la jeringa.  
A.4.5.3.5 Empujar el líquido a través de la columna a un flujo de 6 mL/min. Repetir con otros 10 mL de 
agua o 10 mL de metanol al 20% según sea el caso. Descartar est os lavados.  
A.4.5.3.6 Desconectar la bomba, llenarla con aire, conectarla nuevamente a la jeringa y pasar de 2 -3 mL 
de aire a través de la columna.  
A.4.5.3.7 Desconectar la bomba y adicionar 1 mL de metanol grado HPLC al depósito de la jeringa.  
A.4.5.3.8 Llenar la bomba con aire, conectar la jeringa y pasar el metanol a través de la columna.  
A.4.5.3.9 Para cuantificación por método SFB, colectar el eluido en una celda para fluorómetro. 
Inmediatamente proceder con la determinación fluorométrica.  
A.4.5.3.10  Para cuantificación por método PCD, colectar el eluido en un matraz volumétrico de 2 mL. Diluir 
al volumen con agua grado HPLC, mezclar y proceder con la cuantificación por cromatografía de líquidos.  
A.4.5.4 Determinación fluorométrica (SFB).  
A.4.5.4.1 Calibración del fluorómetro.  
Calentar el fluorómetro por espacio de 20 minutos. Insertar la celda o ampolleta que contiene el blanco y, 
usar la perilla ZERO, para ajustar el instrumento a una lectura de 0. Insertar la celda o ampolleta que contiene 
el estándar  de 20 ng de aflatoxina/g, y con la perilla SPAN, ajustar a una lectura de 20. Para los productos a      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
base de chocolate ajustar a una lectura de 40. Utilizar una ganancia fija (empezar en 50) para asegurar que el 
blanco dé una lectura de 0 y el estándar una de 20 o 40. Calibrar el fluorómetro justo antes de la lectura del 
eluido de la columna, para evitar cualquier posible desviación del instrumento.  
A.4.5.4.2  Cuantificación.  
Adicionar 1 mL de solución reveladora de bromo al 0,002% al eluido obtenido en 3.5.3 .9. Mezclar en 
vortex durante 5 segundos. Si existe adherencia de burbujas en las paredes de la celda, golpearla ligeramente 
para dispersarlas. Insertar la celda en el fluorómetro y esperar 60 segundos. Al cabo de este tiempo, registrar 
la lectura obtenida , la cual es equivalente a µg de aflatoxinas totales/kg porción de prueba.  
A.4.5.5 Determinación por cromatografía de líquidos con detección de fluorescencia y derivatización 
postcolumna.  
A.4.5.5.1 Conectar la salida de una columna HPLC a un brazo de una p ieza T de acero inoxidable, de bajo 
volumen muerto, usando una pieza de tubería corta de 0,01 pulgadas (0,25 mm) de diámetro interno.  
A.4.5.5.2 Conectar la salida de una segunda bomba, la cual distribuye los reactivos postcolumna,  al 
segundo brazo de la pi eza T. Conectar una terminal de tubería de teflón en espiral (tubo de reacción)  de 610 x 
0,5 mm de diámetro interno a un tercer brazo de la pieza T. La otra terminal del espiral, conectarla a la 
entrada del detector de fluorescencia.  
A.4.5.5.3 Mantener el tubo de reacción a una temperatura de 7 0 ºC, utilizando un horno o un baño a 
temperatura constante.  
A.4.5.5.4 Fijar las siguientes tasas de flujo:  
Fase móvil (columna): 1,0 mL/min.  
Reactivo postcolumna: 0,3 mL/min.  
Tasa total a través del tubo de reacción:  1,3 mL/min.  
A.4.5.5.5 El volumen del tubo de reacción es de aproximadamente 1,2 cm3 y dado que la tasa de flujo total 
es de 1,3 mL/min, el tiempo de reacción postcolumna es de aproximadamente 55 segundos. Dejar estabilizar 
el sistema durante 10 -20 min.  
A.4.5.5.6 Si se utiliza un integrador de datos, ajustar los controles de sensibilidad del detector de 
fluorescencia o del integrador, para dar una respuesta razonable (señal: ruido = 5:1) para 0,125 ng  de 
aflatoxina G2/50 µL.  
A.4.5.5.7 Si se emplea un grafic ador, ajustar el control del detector de fluorescencia para dar una deflexión 
de 30 -40% de la escala con 0,125 ng de aflatoxina G2/50 µL.  
A.4.5.5.8 Inyectar 50 µL de la mezcla patrón de trabajo dentro del inyector, usando un exceso de 20 -30 µL, 
para garant izar que el loop esté completamente lleno. Las aflatoxinas eluyen en el siguiente orden: G2, G1, 
B2 y B1, con tiempos de retención aproximados de 6, 8, 9 y 11 minutos, respectivamente. Además los picos 
en el cromatograma deben estar bien resueltos.  
A.4.5.5 .9 Si es necesario ajustar los tiempos de retención, cambiar la concentración del metanol de la fase 
móvil. Inyectar 50 µL de cada una de las soluciones de trabajo y preparar curvas de calibración para cada una 
de las aflatoxinas.  
A.4.5.5.10 Inyectar 50 µL  del extracto de la muestra dentro del inyector. Identificar cada pico de las 
aflatoxinas, en el cromatograma de análisis de la porción de prueba, comparando los tiempos de retención 
con los correspondientes a los patrones de referencia.  
A.4.5.5.11 Determi nar la cantidad de cada aflatoxina en el eluido inyectado, comparando con la curva de 
calibración correspondiente.  
A.4.5.5.12  Calcular la concentración de cada aflatoxina en la muestra de prueba, usando la siguiente fórmula:  
µg/kg aflatoxina = A x ( Tv) x (1) = A x 40   
  Iv W 
donde: 
W = peso representado por el eluido (1 g)  
A = ng aflatoxina en el eluido, obtenido de la curva de calibración  
Tv = Volumen final del eluido (2000 mL)  
Iv = Volumen inyectado del eluido (50 mL)  
Sumar las concentraciones de las cuat ro aflatoxinas para obtener la concentración total de las mismas.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.4.6 Informe de la prueba.  
mg aflatoxinas totales/kg  
 
A.5. Determinación de mohos y levaduras en alimentos.  
A.5.1 Fundamento.  
El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra  de prueba en un medio selectivo 
específico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 ± 1 °C , dando como resultado el 
crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos.  
A.5.2 Definiciones.  
A.5.2.1 Colonias , agrupam iento de células en forma de masas visibles, sobre el agar de cultivo.  
A.5.2.2 Levaduras , son microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular. Poseen un 
núcleo y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por gemación o por fisión transversal. La 
reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas contenidas en un saco o asca.  
A.5.2.3 Mohos , grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungi, que se 
caracterizan por tener un cuerpo formado por estructu ra filamentosa con ramificaciones, que se conocen con 
el nombre de hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción 
pudiendo propagarse por esporas flageladas o no, las paredes celulares pueden ser de quer atina, celulosa o 
manana. Crecen formando colonias en un medio selectivo a 25 °C. 
A.5.3 Reactivos y materiales.  
A.5.3.1 Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser de grado analítico y cuando se indique agua 
debe entenderse como agua  destilada.  
A.5.3.1.1  Medios de cultivo.  
Agar papa - dextrosa, comercialmente disponible en forma deshidratada.  
Preparación del medio de cultivo.  
Seguir instrucciones del fabricante y después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1 °C, acidificar 
a un pH de 3,5 ± 0,1 con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 mL de ácido tartárico por 100 mL 
de medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro. Dejar solidificar una 
porción del medio. Hacer esto en cada lote de medio preparado.  
A fin de preservar las propiedades gelificantes del medio, no calentar después de agregar el ácido tartárico.  
A.5.3.1.2  Soluciones.  
A.5.3.1.2.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
Tabla A.5.1 Fórmula  
Ingrediente s Cantidades  
Fosfato de potasio monobásico  34.0g  
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con hidróxido de sodio 1 N.  
Llevar a 1,0 L de agua.  
Esterilizar a 12 1 °C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a 1,0 L con agua (solución de trabajo).  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esterilizar a 121 ± 1 °C durante 15 minutos.  
A.5.3.1.2.2  Solución estéril de ácido  tartárico al 10%.  
Tabla A.5.2 Fórmula       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Ingredientes  Cantidades  
Acido tartárico  10.0g  
Agua destilada  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver el ácido en el agua y esterilizar a 121 ± 1,0 °C por 15 minutos o por filtración a través de 
membrana de 0,45 µm.  
A.5.3.2  Materiales.  
A.5.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 1 mL y 2 mL), con tapón 
de algodón. Pueden utilizarse pipetas graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
A.5.3.2.2  Cajas Petri.  
A.5.3.2.3  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
A.5.3.2.4  Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca.  
A.5.3.2.5  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc.  
Todo el material e instrumentos que t engan contacto con las muestras bajo estudio, deben esterilizarse 
mediante:  horno o autoclave.  
A.5.4 Aparatos e instrumentos.  
A.5.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 17 0 °C. Durante 2 h de 170 a  175 
°C o por 1h a 18 0 °C. 
A.5.4. 2 Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 ± 1, 0 °C  provista con termómetro 
calibrado.  
A.5.4.3  Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1, 0 °C . Durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1, 0 °C. 
A.5.4.4  Baño de agua con control de te mperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0, 1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1, 0 °C. 
A.5.4.5  Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente 
amplificador.  
A.5.4.6  Registrador mecánico o electrónico.  
A.5.4.7  Microscopio óptico.  
A.5.4.8  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 25 °C. 
A.5.5 Preparación de la muestra.  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en el método  A.2 del presente 
documento “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”.  
A.5.6 Procedimiento.  
A.5.6.1  Colocar por duplicado en cajas Petri 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, 
utilizando para t al propósito una pipeta estéril.  
A.5.6.2  Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución.  
A.5.6.3  Verter de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa acidificado, fundid o y mantenido a 45 ± 1 °C en un 
baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que es 
vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.  
A.5.6.4  Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimiento s de derecha a izquierda, seis en el sentido 
de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa. 
Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie hori zontal fría.  
A.5.6.5  Preparar una caja control con 15 mL de medio, para verificar la esterilidad.  
A.5.6.6  Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 ± 1 °C. 
A.5.6.7  Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Despué s de 5 días, 
seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte de la caja muestra Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar los cont eos de 4 días 
de incubación y au n de 3 días.  En este caso, informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados 
del análisis.  
A.5.6.8  Si es necesario, cuando la morfología colonial no sea suficiente, examinar microscópicamente 
para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las bac terias.  
A.5.7 Expresión de resultados.  
Cálculo del Método  
Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar 
por el inverso de la dilución, tomando en consideración los siguientes criterios, para la expre sión de 
resultados:  
A.5.7.1 Después de la incubación, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 10 a 150 
colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una de las diluciones deben 
estar en el intervalo de 10 a 150. Cuando sólo una dilución está en el intervalo apropiado, calcular la cuenta 
promedio por gramo o mililitro de dicha dilución y reportar.  
A.5.7.2 Cuando dos diluciones están en el intervalo apropiado, determinar la cuenta promedio dada por 
cada diluc ión antes de promediar la cuenta de las dos diluciones para obtener la cuenta en placa por gramo  o 
mililitro.  
A.5.7.3 Placas con menos de 10 colonias: cuando las placas corridas para la menor dilución muestran 
cuentas de menos de 10 colonias, contar el núm ero de colonias presentes en dicha dilución, promediar el 
número de colonias y multiplicar por el factor de dilución para obtener el valor estimado de cuenta en placa. 
Aclarar en su informe esta situación agregando la leyenda “valor estimado”.  
A.5.7.4 Placas con más de 150 colonias: cuando el número de colonias por placa exceda de 150, contar 
las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribución de colonias. Contar 
por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del área de la  caja y multiplicar el valor obtenido por 4 o 2, 
respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri 
de 100  mm de diámetro contiene 65 cuadros de la cuadrícula del contador. Aclarar en su informe esta 
situación agregando la leyenda “valor estimado”.  
A.5.7.5 Calcular las UFC/g o mL de producto utilizando la siguiente fórmula:  
N= ∑c 
[(1x n 1) + (0.1xn 2)x(d)]  
donde: 
N: número de UFC por mL o g de producto.  
∑c: Suma de todas las colonias en todas las placas.  
n1: número de placas contadas de la primera dilución.  
n2: número de placas contadas en la segunda dilución.  
d: dilución de la que se obtuvieron las primeras cuentas.  
Ejemplo:  
Dilución  1:100  1:1000  
# colonias  132, 144  33, 28  
 
N= (132 + 144 + 33 + 28)    [(1x2) + (0.1x2)] x 10-2 
N= 337 / 0.022  
N= 15,318.18  
N≈ 15,300 UFC/g o mL  
A.5.8 Informe de la prueba.  
Informar:       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos en agar papa - dextrosa 
acidificado, incubadas a 25 ± 1 °C durante 5 días.  
Unidades formadoras de colonias por gramo o mil ilitro (UFC/g o mL) de levaduras en agar papa -dextrosa 
acidificado, incubadas a 25 ± 1 °C durante 5 días.  
A.6. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable.  
A.6.1 Fundamento.  
El método se basa en que las bacterias coliformes, ferm entan la lactosa incubadas a 35 ± 1 °C durante  24 
a 48 horas, resultando una producción de ácidos y gas el cua l se manifiesta en las campanas  de 
fermentación.  
A.6.2 Definiciones.  
A.6.2.1 Coliformes , bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaero bios facultativos, que  a 35 
°C fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en esta norma.  
A.6.3 Reactivos y materiales.  
A.6.3.1 Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico. Cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada con pH cercano a la neutralidad.  
A.6.3.1.1  Soluciones diluyentes.  
A.6.3.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
Tabla A.6.1 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato monopotásico  34.0g 
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 con solución de hidróxido de sodio 1 N.  
Llevar a un litro con agua.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1 °C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la soluci ón de trab ajo deben ser iguales  a 
los iniciales.  
A.6.3.1.1.2  Agua peptonada.  
Tabla A.6 .2 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1.0g 
Cloruro de Sodio  8.5g 
Agua  1.0L 
 Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Preparación:  
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de  sodio 1 N.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualquier volumen múltiplo de nueve según se requiera.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales  a los 
iniciales.  
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre  0 a 5 
°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
A.6.3.1.2  Medios de cultivo.  
Caldo lac tosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo).  
Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo).  
Caldo lactosa bilis verde brillante (medio de confirmación).  
En el caso del análisis de agua potable y hielo puede utilizarse c aldo lactosado o caldo lauril sulfato 
triptosa con púrpura de bromocresol (concentración 0,01 g/L de medio), como alternativa al uso de campanas 
de fermentación. Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo.  
A.6.3.1.2.1  Caldo lactosado.  
Tabla A.6.3 Fórmula  
Ingrediente  Medio de Concentración 1.5  Medio de Concentración sencilla  
Extracto de carne  4.5g 3.0g 
Peptona de gelatina  7.5g 5.0g 
Lactosa  7.5g 5.0g 
Agua destilada  1000.0mL  1000.0mL  
 
Preparación:  
Disolver los ingredient es en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio completo deshidratado, 
siguiendo las instrucciones del fabricante.  
Ajustar el pH final de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,9 ± 0,2 a 25 °C. 
Distribuir en volúmenes de 10 mL e n tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1,5, cada tubo debe tener campana 
de fermentación.  
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Enfriar rápida mente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro y de color beige.  
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL del 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.  
A.6.3.1.2.2  Caldo lauril sulfato triptosa  
Tabla A.6.4 Fórmula  
Ingrediente  Medio de Concentración 1.5  Medio de Concentración sencilla  
Triptosa  30.0g  20.0g  
Lactosa  7.5g 5.0g 
Fosfato dipotásico  4.125g  2.75g       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Fosfato monopotásico  4.125g  2.75g  
Cloruro de s odio 7.5g 5.0g 
Lauril sulfato de sodio  0.15g  0.1g 
Agua destilada  1000.0mL  1000.0mL  
 
Preparación:  
Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o el medio de cultivo completo 
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.  
Ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6,8 ± 0,2 a 25 °C. 
Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de concentración 
sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentr ación 1,5, cada tubo debe tener campana 
de fermentación.  
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Se recomienda almacenar el medio una vez preparado.  
Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire después de la esteriliza ción.  
Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de 
caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.  
A.6.3.1.2.3  Caldo lactosa bilis verde brillante.  
Tabla A.6.5 Fórmula  
Ingrediente  Cantidades  
Peptona 10.0g  
Lactosa  10.0g  
Sales biliares  20.0g  
Verde brillante  0.0133g  
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver los componentes o el medio completo deshidratado en agua, calentar si es necesario.  
Ajustar el pH, de tal manera que después de la esterilización ést e sea de 7,2 a 25 °C. 
Distribuir el medio en cantidades de 10 mL en tubos de 16 X 160 mm conteniendo campana de 
fermentación.  
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 121 ± 1,0 °C. 
Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de  la esterilización.  
A.6.3.2 Materiales.  
A.6.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total.  
A.6.3.2.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
A.6.3.2.3  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.6.3.2.4  Tubos de cultivo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca.  
A.6.3.2.5  Campanas de fermentación (tubos de Durham).  
A.6.3.2.6  Pipetas bacteriológicas graduadas de 10 y 1 mL.  
A.6.3.2.7  Gradillas.  
A.6.3.2.8  Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro.  
Todo el material que tenga contacto con las muest ras bajo estudio debe esterilizarse mediante horno  o 
autoclave.  
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste  debe ser 
químicamente inerte.  
A.6.4 Aparatos e instrumentos.  
 A.6.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170 °C. Durante 2 horas a 170 a 
175 °C o 1 h a 180 °C. 
A.6.4.2  Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1,0 °C, provista con termómetro 
calibrado.  
A.6.4.3  Termómetro de máximas y mínimas.  
A.6.4.4  Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ± 1,0 °C. Durante 15 minutos como 
mínimo a 121 ± 1,0 °C. 
A.6.4.5  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unid ades de pH a 25 °C. 
A.6.5 Preparación de la muestra.  
Las muestras deben prepararse y diluirse, siempre que sea posible, de acuerdo al método A.2 del 
presente documento “Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico”.  
A.6.6  Procedimiento.  
A.6.6.1  Para alimentos.  
Preparar suficiente número de diluciones para asegurar que todos los tubos correspondientes a la última 
dilución rindan un resultado negativo.  
A.6.6.1.1  Prueba presuntiva.  
A.6.6.1.1.1  Inoculación. Tomar tres tubos de  medio de enriquecimiento de mayor concentración. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada tubo 10 mL de la muestra si es líquida o 10 mL de la dilución primaria 
inicial, en el caso de otros productos.  
A.6.6.1.1.1.1  Tomar tres tubos de concentración sencilla del medio selectivo de enriquecimiento. Usar una 
pipeta estéril para transferir a cada uno de estos tubos 1 mL de la muestra si es líquida o 1 mL de la dilución 
primaria en el caso de otros productos.  
A.6.6.1.1.1.2  Para las diluciones subsecuentes , continuar como se indica en el párrafo anterior, usando 
una pipeta diferente para cada dilución. Mezclar suavemente el inóculo con el medio.  
A.6.6.1.1.2  Incubación. Incubar los tubos a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas y observar si hay formación de 
gas, en c aso contrario prolongar la incubación hasta 48 ± 2 horas.  
A.6.6.1.2  Prueba confirmativa.  
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número igual de tubos con 
medio de confirmación. Incubar a 35 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas o si  la formación de gas no se observa en este 
tiempo, prolongar la incubación por 48 ± 2 horas.  
En esta Norma se considera una combinación de tres tubos por cada dilución de la serie. Para algunos 
productos y siempre que se requiera una mayor precisión en los  resultados, será necesario inocular una serie 
de cinco o diez tubos.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.6.7 Expresión de los resultados.  
Tomar la serie de tubos de la prueba confirmativa que dé formación de gas después del periodo de 
incubación requerido y buscar el NMP en las tablas cor respondientes.  
La Tabla A.6.5 muestra algunos ejemplos que se pueden presentar.  
Ejemplos: Ejemplo 1. Cuando sólo una dilución muestra tres tubos positivos, elegir ésta y las diluciones 
mayores posteriores.  
Ejemplo 2. Cuando más de una dilución muestra tres  tubos positivos y la última da menos de tres, elegir 
esta última y las dos diluciones anteriores más bajas.  
Ejemplo 3. Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y éstos se encuentran en más de tres 
diluciones, seleccionar las dos diluciones mayo res positivas y la siguiente.  
Ejemplos 4 y 5. Cuando los tubos positivos sólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 mL o 1 g) y en 
la primera dilución (1 mL o 10 -1 g), seleccionar las tres primeras diluci ones para el cálculo del número  más 
probable.  
En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado en las Tablas A.6.7 a la A.6.10, 
según corresponda. En la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP.  
La técnica de NMP puede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta técnica 
deben ser utilizados con precaución. Los límites de confianza están representados en las Tablas A.6.7 a la 
A.6.10. Por ejemplo, para una muestra sólida con un NMP de 70 coliformes por gramo, los límite s de 
confianza en el 95% de los casos variarán de 10 a 230 coliformes por gramo (ejemplo 3 de la Tabla A.6.6) y 
en un producto con 24 de NMP de coliformes por gramo, los límites de confianza son de 3,6 a 130 coliformes 
por gramo (ejemplo 2 de la Tabla A.6. 6). 
Tabla A.6.6 Ejemplos de la selección de resultados positivos para el  cálculo del NMP   Número de tubos positivos obtenidos de tres 
tubos incubados, para las siguientes 
cantidades de muestra inoculada por tubo  NMP  
Productos 
líquidos 
(mL)  10 1 10-¹ 10-² 10-³ 
Producto líquido  Otros productos  
Otros 
productos 
(g) 1 10-¹ 10-² 10-³ 10-⁴ 
  
  mayor dilución = menor  
concentración  mL -¹ g -¹ 
1 3 3 2 1 0 15 [5] 150 [6] 
2 3 3 3 0   24 [5] 240 [6] 
3 2 2 1 1 0 7 [6] 70 [7] 
4 3 3 0 0 0 2.4 [4] 24 [5] 
5 2 2 0 1 0 0.21 [4] 2.1 [5] 
 
Tabla A.6.7 Indice del NMP y límites de confianza 95 % para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 10, 1,0 y 0,1g)  
 3 TUBOS POR DILUCION  5 TUBOS POR DILUCION  
Combinación  
de positivos  Indice del  
NMP por g  95% Límites de confianza  Indice del  
NMP por  
g 95% Límites de confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 < 0,03  <0,005  <0,09  <0,02  <0,005  <0,07  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
0-0-1 0,03 <0,005  <0,09  0,02 <0,005  0,07 
0-1-0 0,03 <0,005  0,13 0,02 <0,005  0,07 
0-2-0 --- --- --- 0,04 <0,005  0,11 
1-0-0 0,04 <0,005  0,20 0,02 <0,005  0,07 
1-0-1 0,07 0,01 0,21 0,04 <0,005  0,11 
1-1-0 0,07 0,01 0,23 0,04 <0,005  0,11 
1-1-1 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005  0,15 
1-2-0 0,11 0,03 0,36 0,06 <0,005  0,15 
2-0-0 0,09 0,01 0,36 0,05 <0,005  0,13 
2-0-1 0,14 0,03 0,37 0,07 0,01 0,17 
2-1-0 0,15 0,03 0,44 0,07 0,01 0,17 
2-1-1 0,20 0,07 0,89 0,09 0,02 0,21 
2-2-0 0,21 0,04 0,47 0,09 0,02 0,21 
2-2-1 0,28 0,10 1,50 ---- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 0,12 0,03 0,28 
3-0-0 0,23 0,04 1,20 0,08 0,01 0,19 
3-0-1 0,39 0,07 1,3 0,11 0,02 0,25 
3-0-2 0,64 0,15 3,80 --- --- --- 
3-1-0 0,43 0,07 2,10 0,11 0,02 0,25 
 
3-1-1 0,75 0,14 2,30 0,14 0,04 0,34 
3-1-2 1,20 0,30 3,80 --- --- --- 
3-2-0 0,93 0,15 3,80 0,14 0,04 0,34 
3-2-1 1,50 0,30 4,40 0,17 0,05 0,46 
3-2-2 2,10 0,35 4,70 --- --- --- 
3-3-0 2,40 0,36 13,0 --- --- --- 
3-3-1 4,60 0,71 24,0 --- --- --- 
3-3-2 11,0 1,50 48,0 --- --- --- 
3-3-3 >11,0  >1,50  >48,0  --- --- --- 
4-0-0 ---   0,13 0,03 0,31 
4-0-1 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-0 ---   0,17 0,05 0,46 
4-1-1 ---   0,21 0,07 0,63 
4-1-2 ---   0,26 0,09 0,78 
4-2-0 ---   0,22 0,07 0,67 
4-2-1 ---   0,26 0,09 0,78 
4-3-0 ---   0,27 0,09 0,80 
4-3-1 ---   0,33 0,11 0,93 
4-4-0 ---   0,34 0,12 0,93 
5-0-0 ---   0,23 0,07 0,70 
5-0-1 ---   0,31 0,11 0,89 
5-0-2 ---   0,43 0,15 1,14 
5-1-0 ---   0,33 0,11 0,93 
5-1-1 ---   0,46 0,16 1,20      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
5-1-2 ---   0,63 0,21 1,15 
5-2-0 ---   0,49 0,17 1,30 
5-2-1 ---   0,70 0,23 1,70 
5-2-2 ---   0,94 0,28 2,20 
5-3-0 ---   0,79 0,25 1,90 
5-3-1 ---   1,10 0,31 2,50 
5-3-2 ---   1,40 0,37 3,40 
5-3-3 ---   1,80 0,44 5,00 
5-4-0 ---   1,30 0,35 3,00 
5-4-1 ---   1,70 0,43 4,90 
5-4-2 ---   2,20 0,57 7,00 
5-4-3 ---   2,80 0,90 8,50 
5-4-4 ---   3,50 1,20 10,0 
5-5-0 ---   2,40 0,68 7,50 
5-5-1 ---   3,50 1,60 10,0 
5-5-2 ---   5,40 1,80 14,0 
5-5-3 ---   8,20 3,00 32,0 
5-5-4 ---   16,09  6,40 58,0 
5-5-5 ---   --- --- ---  
Tabla A.6.8 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 1,0, 0,1 y  0,01 g)  
 3 TUBOS POR DILUCION  5 TUBOS POR DILUCIO N 
Combinación  
de positivos  Indice del  
NMP por g  95% Límites de confianza  Indice del  
NMP por 
g 95% Límites de confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <0,30  <0,05  <0,90  <0,20  <0,05  <0,70  
0-0-1 0,30 <0,05  <0,90  0,20 <0,05  0,70 
0-1-0 0,30 <0,05  1,30 0,20 <0,05 0,70 
0-2-0 --- --- --- 0,40 <0,05  0,11 
1-0-0 0,40 <0,05  2,0 0,20 <0,05  0,70 
1-0-1 0,70 0,10 2,0 0,40 <0,05  1,10 
1-1-0 0,70 0,10 2,30 0,40 <0,05  1,10 
1-1-1 1,10 0,30 3,60 0,60 <0,05  1,50 
1-2-0 1,10 0,30 3,60 0,60 <0,05  1,50 
2-0-0 0,90 0,10 3,60 0,50 <0,05  1,30 
2-0-1 1,40 0,30 3,70 0,70 0,10 1,70 
2-1-0 1,50 0,30 4,40 0,70 0,10 1,70 
2-1-1 2,00 0,70 8,90 0,90 0,20 2,10 
2-2-0 2,10 0,40 4,70 0,90 0,20 2,10 
2-2-1 2,80 1,00 15,0 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 1,20 0,30 2,80 
3-0-0 2,30 0,40 12,0 0,80 0,10 1,90 
3-0-1 3,90 0,70 13,0 1,10 0,20 2,50 Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
3-0-2 6,40 1,50 38,0 --- --- --- 
3-1-0 4,30 0,70 21,0 1,10 0,20 2,50 
3-1-1 7,50 1,40 23,0 1,40 0,40 3,40 
3-1-2 12,0 3,00 38,0 --- --- --- 
3-2-0 9,30 1,50 38,0 1,40 0,40 3,40 
3-2-1 15,0 3,00 44,0 1,70 0,50 4,60 
3-2-2 21,0 3,50 47,0 --- --- --- 
3-3-0 24,0 3,60 130,0  --- --- --- 
3-3-1 46,0 7,10 240,0  --- --- --- 
3-3-2 110,0  15,0 480,0  --- --- --- 
3-3-3 >110,0  >15,0  >480,0  --- --- --- 
4-0-0 ---   1,30 0,30 3,10 
4-0-1 ---   1,70 0,50 4,60 
4-1-0 ---   1,70 0,50 4,60 
4-1-1 ---   2,10 0,70 6,30 
4-1-2 ---   2,60 0,90 7,80 
4-2-0 ---   2,20 0,70 6,70 
4-2-1 ---   2,60 0,90 7,80 
4-3-0 ---   2,70 0,90 8,00 
4-3-1 ---   3,30 1,10 9,30 
 
4-4-0 ---   3,40 1,20 9,30 
5-0-0 ---   2,30 0,70 7,00 
5-0-1 ---   3,10 1,10 8,90 
5-0-2 ---   4,30 1,50 11,4 
5-1-0 ---   3,30 1,10 9,30 
5-1-1 ---   4,60 1,60 12,0 
5-1-2 ---   6,30 2,10 15,0 
5-2-0 ---   4,90 1,70 13,0 
5-2-1 ---   7,00 2,30 17,0 
5-2-2 ---   9,40 2,80 22,0 
5-3-0 ---   7,90 2,50 19,0 
5-3-1 ---   11,0 3,10 25,0 
5-3-2 ---   14,0 3,70 34,0 
5-3-3 ---   18,0 4,40 50,0 
5-4-0 ---   13,0 3,50 30,0 
5-4-1 ---   17,0 4,30 49,0 
5-4-2 ---   22,0 5,70 70,0 
5-4-3 ---   28,0 9,00 85,0 
5-4-4 ---   35,0 12,0 100,0  
5-5-0 ---   24,0 6,80 75,0 
5-5-1 ---   35,0 12,0 100,0  
5-5-2 ---   54,0 18,0 140,0  
5-5-3 ---   92,0 30,0 320,0       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
5-5-4 ---   161,0  64,0 580,0  
5-5-5 ---   >161,0  >64,0  >580,0  
 
Tabla A.6.9 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados var ios números de tubos. (Diluciones 0,1, 0,01 y 0,001 g)  
 3 TUBOS POR DILUCION  5 TUBOS POR DILUCION  
Combinación  
de positivos  Indice del  
NMP por g  95% Límites de confianza  Indice del  
NMP por 
g 95% Límites de confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <3 <0,5 <9 <2 <0,5 <7 
0-0-1 3 <0,5 9 2 <0,5 7 
0-1-0 3 <0,5 13 2 <0,5 7 
0-2-0 --- --- --- 4 <0,5 11 
1-0-0 4 <0,5 20 2 <0,5 7 
1-0-1 7 1 21 4 <0,5 11 
1-1-0 7 1 23 4 <0,5 11 
1-1-1 11 3 36 6 <0,5 15 
1-2-0 11 3 36 6 <0,5 15 
2-0-0 9 1 36 5 <0,5 13 
2-0-1 14 3 37 7 1,0 17 
2-1-0 15 3 44 7 1,0 17 
2-1-1 20 7 89 9 2,0 21 
2-2-0 21 4 47 9 2,0 21 
 
2-2-1 28 10 150 --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 12 3,0 28 
3-0-0 23 4 120 8 1,0 19 
3-0-1 39 7 13 11 2,0 25 
3-0-2 64 15 380 --- --- --- 
3-1-0 43 7 210 11 2,0 25 
3-1-1 75 14 230 14 4,0 34 
3-1-2 120 30 380 --- --- --- 
3-2-0 93 15 380 14 4,0 34 
3-2-1 150 30 440 17 5,0 46 
3-2-2 210 35 470 --- --- --- 
3-3-0 240 36 130 --- --- --- 
3-3-1 460 71 240 --- --- --- 
3-3-2 1100  150 480 --- --- --- 
3-3-3 >1100  >150  >480  --- --- --- 
4-0-0 ---   13 3,0 31 
4-0-1 ---   17 5,0 46 
4-1-0 ---   17 5,0 46 
4-1-1 ---   21 7,0 63 
4-1-2 ---   26 9,0 78 
4-2-0 ---   22 7,0 67 
4-2-1 ---   26 9,0 78 
4-3-0 ---   27 9,0 80 
4-3-1 ---   33 11,0 93 
4-4-0 ---   34 12,0 93 
5-0-0 ---   23 7,0 70 Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
5-0-1 ---   31 11,0 89 
5-0-2 ---   43 15,0 114 
5-1-0 ---   33 11,0 93 
5-1-1 ---   46 16,0 120 
5-1-2 ---   63 21,0 150 
5-2-0 ---   49 17,0 130 
5-2-1 ---   70 23,0 170 
5-2-2 ---   94 28,0 220 
5-3-0 ---   79 25,0 190 
5-3-1 ---   110 31,0 250 
5-3-2 ---   140 37,0 340 
5-3-3 ---   180 44,0 500 
5-4-0 ---   130 35,0 300 
5-4-1 ---   170 43,0 490 
5-4-2 ---   220 57,0 700 
5-4-3 ---   280 90,0 850 
5-4-4 ---   350 120,0  1000  
5-5-0 ---   240 68,0 750 
5-5-1 ---   350 120,0  1000  
5-5-2 ---   540 180,0  1400 
5-5-3 ---   920 300,0  3200  
5-5-4 ---   1600  640,0  5800  
5-5-5 ---   >1600  >640,0  >5800   
Tabla A.6.10 Indice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de resultados 
positivos cuando son usados varios números de tubos. (Diluciones 0 ,01, 0,001 y 0,0001 g)  
 3 TUBOS POR DILUCION  5 TUBOS POR DILUCION  
Combinación  
de positivos  Indice del  
NMP por g  95% Límites de confianza  Indice del  
NMP por 
g 95% Límites de confianza  
bajo alto bajo alto 
0-0-0 <30 <5 <90 <20 <5 <70 
0-0-1 30 <5 <90 20 <5 70 
0-1-0 30 <5 130 20 <5 70 
0-2-0 --- --- --- 40 <5 110 
1-0-0 40 <5 200 20 <5 70 
1-0-1 70 10 210 40 <5 110 
1-1-0 70 10 230 40 <5 110 
1-1-1 110 30 360 60 <5 150 
1-2-0 110 30 360 60 <5 150 
2-0-0 90 10 360 50 <5 130 
2-0-1 140 30 370 70 10 170 
2-1-0 150 30 440 70 10 170 
2-1-1 200 70 890 90 20 210 
2-2-0 210 40 470 90 20 210 
2-2-1 280 100 1500  --- --- --- 
2-3-0 --- --- --- 120 30 280 
3-0-0 230 40 1200  80 10 190      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
3-0-1 390 70 1300  110 20 250 
3-0-2 640 150 3800  --- --- --- 
3-1-0 430 70 2100  110 20 250 
3-1-1 750 140 2300  140 40 340 
3-1-2 1200  300 3800  --- --- --- 
3-2-0 930 150 3800  140 40 340 
3-2-1 1500  300 4400  170 50 460 
3-2-2 2100  350 4700  --- --- --- 
3-3-0 2400  360 13000  --- --- --- 
3-3-1 4600  710 24000  --- --- --- 
3-3-2 11000  1500  48000 --- --- --- 
3-3-3 >11000  >1500  >48000  --- --- --- 
4-0-0 ---   130 30 310 
4-0-1 ---   170 50 460 
4-1-0 ---   170 50 460 
4-1-1 ---   210 70 630 
4-1-2 ---   260 90 780 
4-2-0 ---   220 70 670 
4-2-1 ---   260 90 780 
4-3-0 ---   270 90 800 
 
4-3-1 ---   330 110 930 
4-4-0 ---   340 120 930 
5-0-0 ---   230 70 700 
5-0-1 ---   310 110 890 
5-0-2 ---   430 150 1140  
5-1-0 ---   330 110 930 
5-1-1 ---   460 160 1200  
5-1-2 ---   630 210 1500  
5-2-0 ---   490 170 1300  
5-2-1 ---   700 230 1700  
5-2-2 ---   940 280 2200  
5-3-0 ---   790 250 1900  
5-3-1 ---   1100  310 2500  
5-3-2 ---   1400  370 3400  
5-3-3 ---   1800  440 5000  
5-4-0 ---   1300  350 3000  
5-4-1 ---   1700  430 4900  
5-4-2 ---   2200  570 7000  
5-4-3 ---   2800  900 8500  
5-4-4 ---   3500  1200  10000 
5-5-0 ---   2400  680 7500  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
5-5-1 ---   3500  1200  10000  
5-5-2 ---   5400  1800  14000  
5-5-3 ---   9200  3000  32000  
5-5-4 ---   16000  6400  58000  
5-5-5 ---   >16000  >6400  >58000  
 
A.6.8 Informe de la prueba.  
Informar "Número más probable (NMP) de colifo rmes por gramo o mililitro de muestra". En caso de 
muestras de agua informar NMP/100 ml.  
A.7. Determinación de microorganismos coliformes totales en placa.  
A.7.1 Fundamento.  
El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, 
utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 3 5 °C en 
aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el 
indicador de pH y precipitan las sale s biliares.  
A.7.2 Definiciones.  
A.7.2.1 Coliformes , bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que  a 35 
ºC fermentan la lactosa con formación de ácido, ocasionando en las colonias desarrolladas el vire del 
indicador rojo neu tro presente en el medio y la precipitación de las sales biliares.  
A.7.3 Reactivos y materiales.  
A.7.3.1 Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan, deben ser grado analítico y cuando se indique agua debe 
entenderse como agua destilada.  
A.7.3 .1.1 Soluciones diluyentes.  
A.7.3.1.1.1  Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
Tabla A.7.1 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato monopotásico  34.0g  
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7,2 co n solución de hidróxido de sodio 1,0 N.  
Llevar con agua a un litro.  
Esterilizar a 121± 1, 0 °C durante 15 minutos. Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
Tomar 1,25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua (solución de trabajo) . 
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL según se requiera.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121± 1, 0 °C. 
Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales a 
los iniciales.  
A.7.3.1.1.2  Agua peptonada.  
Tabla A.7.2 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  1.0g 
Cloruro de sodio  8.5g 
Agua  1.0L      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
 
Preparación:  
Disolver los componentes en un litro de agua.  
Ajustar el pH a 7,0 con hidróxido de sodio 1,0 N.  
Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL o en cualqu ier volumen múltiplo de nueve según se requiera.  
Esterilizar durante 15 minutos a 121 ± 1, 0 °C. 
Después de la esterilización, los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser iguales  a los 
iniciales.  
Si este diluyente no es usado inmediatamente, a lmacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a  5 
°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
A.7.3.1.2  Medio de cultivo: Agar -rojo- violeta -bilis-lactosa (RVBA).  
Tabla A.7.3 Fórm ula 
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  7.0g 
Extracto de levadura  3.0g 
Lactosa  10.0g  
Sales biliares  1.5g 
Cloruro de sodio  5.0g 
Rojo neutro  0.03g  
Cristal violeta  0.002g  
Agar  15.0g  
Agua  1.0L 
 
Preparación:  
Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante alg unos minutos.  
Mezclar perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con ácido clorhídrico 0,1N o con hidróxido de sodio 0,1N  a 25 
°C, de forma que después del calentamiento se mantenga en este valor.  
Calentar con agitación constante y hervir durante 2 minutos.  
Enfriar inmediatamente el medio en un baño de agua hasta que llegue a 4 5 °C. 
Evitar el sobrecalentamiento del medio.  
No debe esterilizarse en autoclave.  
Usar el medio dentro de las tres primeras horas después de su preparación.  
En el caso de utilizar medio de c ultivo deshidratado, seguir las instrucciones del fabricante.  
A.7.3.2 Materiales.  
A.7.3.2.1  Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 y 1 mL (o si es necesario de 11 y 2 mL), con tapón de 
algodón. Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a un a décima de su volumen total.  
A.7.3.2.2  Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
A.7.3.2.3  Tubos de 16 X 150 mm con tapón de rosca.  
A.7.3.2.4  Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, e tc. 
A.7.3.2.5  Cajas Petri.  
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse 
mediante horno o autoclave.  
El material de vidrio puede sustituirse por material desechable que cumpla con las especificaciones 
deseadas. No debe usarse material de vidrio dañado por las esterilizaciones repetidas y éste debe ser 
químicamente inerte.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.7.4 Aparatos e instrumentos.  
A.7.4.1  Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 17 0 °C. Durante 2 h a 170 - 175 °C, 
o 1 h a 18 0 °C. 
A.7.4.2  Autoclave con termómetro y manómetro, calibrada con termómetro de máximas y mínimas. 
Durante 15 minutos como mínimo a 121 ± 1, 0 °C. 
A.7.4.3  Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica, provista con termómetro 
calibrado con divisiones de 0, 1 °C y que mantenga la temperatura a 45 ± 1, 0 °C. 
A.7.4.4  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato o bien un homogeneizador 
peristáltico (Stomacher).  
A.7.4.5  Vasos para licuadora con tapa esterilizables o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
A.7.4.6  Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ± 1, 0 °C, provista con termómetro 
calibrado.  
A.7.4.7  Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada  y lente 
amplificador.  
A.7.4.8  Registrador mecánico o electrónico.  
A.7.4.9  Microscopio óptico.  
A.7.4.10  Potenciómetro con una escala mínima de 0,1 unidades de pH a 2 5 °C. 
A.7.5 Preparación de la muestra.  
La preparación de la muestra debe ser de acuerdo a l o establecido en el método A.2 del presente 
documento "Preparación y Dilución de Muestras de Alimentos para su Análisis Microbiológico".  
A.7.6 Procedimiento.  
A.7.6.1  Colocar en cajas Petri por duplicado 1 mL de la muestra líquida directa o de la dilución p rimaria, 
utilizando para tal propósito una pipeta estéril.  
A.7.6.2  Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera sembrar, utilizando 
una pipeta estéril diferente para cada dilución.  
A.7.6.3  Verter de 15 a 20 mL del medio RVBA fundido y mantenido a 45 ± 1, 0 °C en baño de agua. En el 
caso de utilizar cajas de Petri de plástico se vierte de 10 a 15 mL del medio. El tiempo transcurrido entre la 
preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, n o debe exceder de  20 
minutos.  
A.7.6.4  Mezclar cuidadosamente el inóculo con el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, 
seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las 
manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla 
solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie horizontal fría.  
A.7.6.5  Preparar una caja control con 15 mL de medio para verificar la ester ilidad.  
A.7.6.6  Después de que está el medio completamente solidificado en la caja, verter aproximadamente  4 
mL del medio RVBA a 45 ± 1, 0 °C en la superficie del medio inoculado. Dejar que solidifique.  
A.7.6.7  Invertir las placas y colocarlas en la incubad ora a 3 5 °C, durante 24 ± 2 horas.  
A.7.6.8  Después del periodo especificado para la incubación, cont ar las colonias con el contador  de 
colonias.  
A.7.6.9  Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias típicas son de color 
rojo os curo, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el 
cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 
0,5 a 2,0 mm.  
A.7.7 Expresión de los result ados.  
A.7.7.1  Cálculo del método.  
A.7.7.1.1  Placas que contienen entre 15 y 150 colonias características.  
Separar las placas que contienen el número antes mencionado de colonias características en dos 
diluciones consecutivas. Contar las colonias presentes.  Calcular el número de coliformes por mililitro o por 
gramo de producto, multiplicando el número de colonias por el inverso de la dilución correspondiente, 
tomando los criterios citados en el método A.5. Determinación de mohos y levaduras en alimentos.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.7.7.1.2  Placas que contienen menos de 15 colonias características.  
Si cada una de las placas tiene menos de 15 colonias características, reportar el número obtenido seguido 
de la dilución correspondiente.  
A.7.7.1.3  Placas con colonias no características.  
Si en las placas no hay colonias características, reportar el resultado como: menos de un coliforme por 1/d 
por gramo, en donde d es el factor de dilución.  
A.7.8 Informe de la prueba.  
Informar: UFC/g o mL en placa de agar rojo violeta bilis, incubados a 3 5 °C durante 24 ± 2 h.  
En caso de emplear diluciones y no observar crecimiento, informar utilizando como referencia la dilución 
más baja utilizada, por ejemplo dilución 10 -1. 
En caso de no observar crecimiento en la muestra sin diluir se informa: "no desarrol lo de coliformes  por 
mL". 
A.8. Determinación de Salmonella  en alimentos.  
A.8.1 Fundamento.  
La presente técnica para la detección de Salmonella  en alimentos, describe un esquema general que 
consiste de 5 pasos básicos:  
A.8.1.1  Preenriquecimiento, es el paso  donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, 
que permite restaurar las células de Salmonella  dañadas a una condición fisiológica estable.  
A.8.1.2  Enriquecimiento selectivo, empleado con el propósito de incrementar las poblaciones de  
Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra.  
A.8.1.3  Selección en medios sólidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el 
crecimiento de otros géneros diferentes a Salmonella y permite el reconocimiento visual de col onias 
sospechosas.  
A.8.1.4  Identificación bioquímica, este paso permite la identificación genérica de los cultivos de Salmonella 
y la eliminación de cultivos sospechosos falsos.  
A.8.1.5  Serotipificación, es una técnica serológica que permite la identificac ión específica de un cultivo.  
A.8.2 Definiciones.  
A.8.2.1 Detección de Salmonella , determinación de la presencia o ausencia de estos microorganismos 
en una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta Norma.  
A.8.2.2  Salmonella , microorganismo patógeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram 
negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias típicas en medios selectivos sólidos y que presentan 
además las características bioquímicas y serológicas descr itas cuando los procedimientos se efectúan  de 
acuerdo con esta Norma.  
A.8.3 Reactivos y materiales.  
En caso de disponerse de fórmulas comerciales deshidratadas, se deben seguir las instrucciones 
impresas en la etiqueta respectiva para su preparación.  
Las s ustancias químicas usadas para preparar los medios de cultivo y los reactivos deben ser grado analítico.  
A.8.3.1 Reactivos.  
A.8.3.1.1  Medios de pre -enriquecimiento.  
A.8.3.1.1.1  Agua de peptona tamponada.  
Tabla A.8.1 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  10.0g  
Cloruro sódico  5.0g 
Fosfato sódico dibásico  3.5g Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Fosfato potásico monobásico  1.5g 
Agua  1.0L 
 
Preparación  
Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario.  
Ajustar el pH, si es necesario, después de la esterilización a 7,0.  
Distribui r en recipientes de vidrio esterilizables con la capacidad necesaria para obtener las porciones 
necesarias para la prueba.  
Esterilizar por 20 min a 121 ± 1 °C. 
A.8.3.1.1.2  Caldo lactosado.  
Tabla A.8.2 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  3.0g 
Peptona  5.0g 
Lactosa  5.0g 
Agua destilada  1.0L 
pH final: 6,9 ±0,2  
Preparación:  
Disolver los ingredientes en agua, calentando a 6 5 °C. 
Distribuir en porciones de 225 ml, en frascos de 500 mL.  
Esterilizar durante 15 min a 12 1 °C ±1 °C. 
A.8.3.1.2  Caldo de  enriquecimiento  
A.8.3.1.2.1  Caldo selenito -cistina  
Tabla A.8.3 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Triptona o polipeptona  5.0g 
Lactosa  4.0g 
Fosfato disódico  10.0g  
Selenito ácido de sodio  4.0g 
L-cistina  0.01g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 7,0 ±0,2 a 2 5 °C. 
 
Preparación:  
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y distribuir en volúmenes de 10 y 225 mL en 
recipientes estériles, según se requiera.  
El caldo así preparado es transparente. De preferencia usarlo el mismo día de su prepara ción.  
Si se desea conservar el medio por varios días, puede exponerse al calor en autoclave por 5 min a  110 °C 
±1 °C, tomando entonces un color salmón.  
A.8.3.1.2.2  Caldo tetrationato.  
Tabla A.8.4 Fórmula       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Ingredientes  Cantidades  
Proteosa peptona o triptona   5.0g 
Sales biliares  1.0g 
Carbonato de calcio  10.0g  
Tiosulfato de sodio pentahidratado  30.0g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 7,0 ±0,1  
 
Preparación:  
Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estéril.  
Distribuir, agitando constantemente, en  porciones de 10 y 225 mL, en recipientes estériles. Guardar en 
refrigeración.  
Antes de usar el medio, agregar 2 mL de una solución yodo -yoduro y 1 mL de solución de verde brillante al 
0,1% por cada 100 mL de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no d ebe calentarse y debe usarse  el 
mismo día de su preparación.  
A.8.3.1.2.3  Vassiliadis -Rappaport.  
Tabla A.8.5 Fórmula Solución A  
Ingredientes  Cantidades  
Triptona  5.0g 
Cloruro de sodio  8.0g 
Fosfato de potasio dihidrogenado  1.6g 
Agua destilada  1.0L 
 
Prepa ración:  
Disolver los componentes en agua por calentamiento cercano a 7 0 °C. 
Tabla A.8.6 Fórmula Solución B  
Ingredientes  Cantidades  
Cloruro de magnesio hexahidratado  400.0g  
Agua destilada  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver el cloruro de magnesio en agua.  
Como e sta sal es muy higroscópica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio 
desde un recipiente recientemente abierto de tal modo que la concentración de la solución sea de 0,4 g/mL.  
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.  
Tabla A.8.7 Fórmula Solución C  
Ingredientes  Cantidades  
Oxalato de verde de malaquita  0.4g 
Agua destilada  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver el oxalato de verde de malaquita en agua.  
Conservar en frasco ámbar a temperatura ambiente.  
Tabla  A.8.8 Fórmula Medio Com pleto  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Ingredientes  Cantidades  
Solución A  100mL  
Solución B  100mL  
Solución C  10mL  
 
Preparación:  
Adicionar 1 000 mL de la solución A, 100 mL de la solución B y 10 mL de la solución C.  
Ajustar el pH si es necesario, de tal manera que después de la esterili zación sea de 5,2.  
Distribuir antes de usar dentro de tubos en cantidades de 10 mL.  
Almacenar en refrigeración.  
A.8.3.1.2.4  Caldo de soya tripticasa.  
Tabla A.8.9 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Tripticasa o triptosa  17.0g  
Fitona  3.0g 
Glucosa  2.5g 
Cloruro de sodio  2.5g 
Agua destilada  1.0L 
pH final: 7,3 ±0,2.  
 
Preparación:  
Disolver los ingredientes en 1 litro de agua destilada, calentando lentamente hasta su disolución completa.  
Distribuir porciones de 225 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave durante 15 min a 
121 °C ±1 °C. 
A.8.3.1.2.5  Leche descremada reconstituida  
Suspender 100 g de leche descremada en polvo en un litro de agua destilada. Agitar circularmente hasta 
disolución. Distribuir en volúmenes de 225 mL en matraces Erlenmey er de 500 mL. Esterilizar a 12 1 °C ±1 °C 
por 15 min. El volumen final debe corregirse para mantener 225 mL.  
A.8.3.1.2.6  Caldo soya tripticasa estéril adicionado con sulfito de potasio.  
Adicionar al caldo soya tripticasa 5 g de sulfito de potasio por cada 1 000 mL de medio, quedando una 
concentración final de sulfito de potasio del 0,5%. Adicionar el sulfito de potasio antes de esterilizar en 
autoclave en la forma habitual.  
A.8.3.1.3  Medios de aislamiento.  
A.8.3.1.3.1  Agar verde brillante (VB).  
Tabla A.8.10 F órmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de levadura  3,0g 
Polipeptona (Proteosa peptona No.  3) 10.0g  
Cloruro de sodio  5.0g 
Lactosa  10.0g  
Sacarosa  10.0g  
Rojo de fenol  0.08g  
Agar  20.0g  
Verde brillante  0.0125g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 6,9 ±0,2.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar a ebullición, hasta disolución completa. 
Ajustar el pH.  
Esterilizar en autoclave por 15 min a 12 1 °C  ± 1 °C . El sobrecalentamiento del medio disminuye  su 
selectividad.  
Enfria r el medio a 5 0 °C y distribuirlo en cajas de Petri estériles. E l aspecto del medio es obscuro,  de color 
marrón.  
A.8.3.1.3.2  Agar con sulfito de bismuto.  
Tabla A.8.11 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne de res  5.0g 
Mezcla de peptonas  10.0g  
Glucosa  5.0g 
Fosfato disódico (anhidro)  5.0g 
Sulfato ferroso (anhidro)  0.3g 
Sulfito de bismuto  8.0g 
Verde brillante  0.025g  
Agar  20.0g  
Agua destilada  1.0L 
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en un litro de agua. Calentar hasta su disolución com pleta, agitando 
frecuentemente. Ajustar el pH.  
Enfriar a 4 5 °C  y verter en cajas de Petri estériles, distribuyendo de manera homogénea el precipitado 
propio del medio.  
El aspecto de las placas es opaco, de color verde pálido y deben usarse el mismo día de su preparación. 
Si la coloración es parda, no deben utilizarse.  
El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad.  
A.8.3.1.3.3  Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD).  
Tabla A.8.12 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Xilosa 3.75g  
L-lisina  5.0g 
Lactosa  7.50g  
Sacarosa  7.50g  
Cloruro de sodio  5.0g 
Extracto de levadura  3.0g 
Rojo de fenol  0.08g  
Agar  15.0g  
Desoxicolato de sodio  2.50g  
Citrato férrico -amónico  0.80g  
Tiosulfato de sodio  6.80g  
Agua destilada  1.0L 
pH final:  6,9 ± 0,2.  
 
Preparación:  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar en baño de agua a 5 5 °C, agitando 
frecuentemente, hasta disolución completa. Ajustar el pH.  
Enfriar a 5 0 °C y verter en cajas de Petri estériles. No se esterilic e. 
El sobrecalentamiento produce una precipitación; la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las 
colonias suelen ser muy pequeñas.  
El aspecto del medio es claro y de color rojo brillante.  
A.8.3.1.3.4  Agar para Salmonella  y Shigella  (SS) 
Tabla  A.8.13 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  5.0g 
Polipeptona *  5.0g 
Lactosa  10.0g  
Sales biliares  8.50g  
Citrato de sodio dihidratado  8.50g  
Tiosulfato de sodio pentahidratado  8.50g  
Citrato férrico  1.0g 
Agar  13.50g  
Rojo neutro  0.025g  
Verde brillante  0.33g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 7,0 ± 0,2.  
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada estéril y calentar a ebullición hasta disolución 
completa. Ajustar el pH. No esterilizar en autoclave.  
Enfriar a 5 0 °C y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.  
El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado.  
A.8.3.1.3.5  Agar entérico Hektoen.  
Tabla A.8.14 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Proteosa peptona  12.0g  
Extracto de levadura  3.0g 
Lactosa  12.0g  
Sacarosa  12.0g  
Salicina  2.0g 
Sales biliares  9.0g 
Cloruro de sodio  5.0g 
Tiosulfato de sodio  5.0g 
Citrato amónico férrico  1.5g 
Azul de bromotimol  0.064g  
Fuscina ácida  0.10g  
Agar  13.5g  
Agua  1.0L 
pH final: 7,5 ± 0,2.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
 
Preparación:  
Suspe nder los ingredientes en agua destilada, hervir con agitación hasta completa disolución del agar.  No 
sobrecalentar.  
Dejar enfriar a 55 -60 °C y distribuir en cajas de Petri estériles en condiciones asépticas.  
A.8.3.1.4  Medios para pruebas bioquímicas.  
A.8.3 .1.4.1  Agar de tres azúcares y hierro (TSI).  
Tabla A.8.15 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona de carne *  1.0g 
Peptona de caseína *  1.0g 
Cloruro de sodio  0.5g 
Lactosa  1.0g 
Sacarosa  1.0g 
Glucosa  0.1g 
Agar  1.3g 
Rojo de fenol  2.5 mg  
Sulfato ferros o amónico pentahidratado  20.0 mg  
Tiosulfato de sodio  20.0 mg  
Agua destilada  100.0 mL  
pH final: 7,3 ± 0,2.  
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en 100 mL de agua destilada. Calentar a ebullición, agitando ocasionalmente, 
hasta disolución completa.  
Enfriar a 6 0 °C y ajustar el pH.  
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 12 1 °C ± 1 °C durante 15 min. 
Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad 
de 4 cm. El m edio es de color rojo.  
A.8.3.1.4.2  Agar de hierro y lisina (LIA).  
Tabla A.8.16 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona de gelatina  0.5g 
Extracto de levadura  0.3g 
Glucosa  0.1g 
L-lisina  1.0g 
Citrato férrico -amónico  50.0mg  
Tiosulfato de sodio anhidro  4.0mg 
Púrpura de bromocresol  2.0mg  
Agar  1.5g 
Agua destilada  100.0mL  
pH final: 6,7 ± 0,2.  
 
Preparación:  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta ebullición con agitación 
frecuente hasta conseguir la disolución complet a. Ajustar el pH.  
Distribuir en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm, con tapón de rosca.  
Esterilizar en autoclave a 12 1 °C  ± 1 °C  durante 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición 
inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 4  cm y una superficie inclinada de 2 cm.  
El medio ya preparado es de color púrpura.  
A.8.3.1.4.3  Agar nutritivo.  
Tabla A.8.17 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  3.0g 
Peptona  5.0g 
Agar  15.0g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2.  
 
Prepar ación:  
Suspender los ingredientes en agua. Dejar reposar de 5 a 10 min.  
Calentar a ebullición hasta disolución completa. Distribuir en tubos de 13 x 100 mm, en cantidades de  1/3 
de su volumen.  
Esterilizar a 12 1 °C ± 1 °C por 15 min. Inclinar los tubos ante s que el agar solidifique.  
A.8.3.1.4.4  Medio de SIM (para Sulfuro, Indol y Movilidad).  
Tabla A.8.18 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carne  3.0g 
Peptona  30.0g  
Hierro peptonizado  0.2g 
Tiosulfato de sodio  0.025g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 7,3 ± 0,2.  
Preparación:  
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa.  
Enfriar a 5 0 °C y ajustar el pH.  
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y  esterilizar en autoclave a 12 1 °C ± 1 °C 
durante 15 min. Se dejan enfriar los tubos en posición vertical.  
A.8.3.1.4.5  Agar citrato de Simmons.  
Tabla A.8.19 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Fosfato de amonio  1.0g 
Fosfato dipotásico  1.0g 
Cloruro de sodio  5.0g 
Citrato de sodio  2.0g 
Sulfato de magnesio  0.2g 
Azul de bromotimol  0.08g       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Agar  15.0g  
Agua destilada  1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2.  
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr  una disolución completa.  
Ajustar el pH.  
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 12 1 °C ± 1 °C 
durante 15 min.  
Dejar enfriar los tubos en posición inclinada.  
A.8.3.1.4.6  Caldo MR -VP (Rojo de metilo -Voge s Proskauer).  
Tabla A.8.20 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Peptona  7.0g 
Dextrosa  5.0g 
Difosfato de potasio  5.0g 
Agua destilada  1.0L 
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullición agitando frecuentemente hasta 
lograr una disolución completa.  
Ajustar el pH.  
Distribuir el medio en volúmenes de 3 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 12 1 °C ± 1 °C 
durante 15 min.  
A.8.3.1.4.7  Caldo manitol.  
Tabla A.8.21 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de carn e 1.0g 
Proteosa peptona  10.0g  
Cloruro de sodio  5.0g 
Rojo de fenol  0.018g  
Manitol  10.0g  
Agua  1.0L 
pH final: 7,4 ± 0,2  
 
Preparación:  
Suspender 26 g del medio deshidratado en un litro de agua, mezclar y ajustar el pH.  
Distribuir en volúmenes de 2 a 3 mL  en tubos de 13 x 100 mm.  
Esterilizar a 12 1 °C ± 1 °C durante 15 min.  
A.8.3.1.4.8  Caldo malonato.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Tabla A.8.22 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Extracto de levadura  1.0g 
Sulfato de amonio  2.0g 
Fosfato dipotásico  0.6g 
Fosfato monopotásico  0.4g 
Cloruro d e sodio  2.0g 
Malonato  3.0g 
Glucosa  0.25g  
Azul de bromotimol  0.025g  
Agua  1.0L 
pH final: 6,7 ± 0,2.  
 
Preparación:  
Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH.  
Distribuir en tubos de 13 x 100 mm en cantidades de 3 mL.  
Esterilizar en autoc lave a 12 1 °C ± 1 °C durante 15 min.  
A.8.3.1.4.9  Caldo urea.  
Tabla A.8.23 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Urea  20.0g  
Extracto de levadura  0.10g  
Fosfato monopotásico  9.10g  
Fosfato disódico  9.50g  
Rojo de fenol  0.01g  
Agua  1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2.  
 
Preparación:  
Disolver los ingredientes en agua destilada.  
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm o en autoclave de 5 a 8 lb de 
presión durante 15 min.  
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.  
A.8.3.1.4.10  Caldo de urea rápido.  
Tabla A.8.24 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Urea  20.0g  
Extracto de levadura  0.10g  
Fosfato monopotásico  0.091g  
Fosfato disódico  0.095g  
Rojo de fenol  0.01g  
Agua  1.0L 
pH final: 6,8 ± 0,2.  
      (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Preparación:  
Disolver los ingre dientes en agua destilada.  
NO CALENTAR. Esterilizar por filtración a través de membrana 0,45 µm.  
Distribuir asépticamente de 1,5 a 3 mL en tubos estériles de 13 x 100 mm.  
A.8.3.1.4.11  Caldo infusión cerebro corazón.  
Tabla A.8.25 Fórmula  
Ingredientes  Cantid ades  
Infusión cerebro corazón  200.0g  
Infusión de corazón de res  250.0g  
Proteosa peptona  10.0g  
Cloruro de sodio  5.0g 
Fosfato disódico dodecahidratado  2.5g 
Dextrosa  2.0g 
Agua destilada  1.0L 
pH final: 7,4 ± 0,2.  
 
Preparación:  
Disolver los ingredientes  en agua destilada, calentar suavemente.  
Distribuir y esterilizar a 12 1 °C ± 1 °C durante 15 min.  
A.8.3.1.5  Soluciones.  
A.8.3.1.5.1 Solución verde brillante al 0,1% (1:1000).  
Tabla A.8.26 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Verde brillante  0.1g 
Agua destilad a estéril  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver 0,1 g de verde brillante en agua destilada estéril hasta completar 100 mL.  
A.8.3.1.5.2  Solución de yodo -yoduro.  
Tabla A.8.27 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Cristales de yodo  6.0g 
Yoduro de potasio  6.0g 
Agua des tilada  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver los cristales y el yoduro de potasio en agua destilada hasta completar 100 mL.  
Conservar en frasco ámbar.  
A.8.3.1.5.3  Solución salina al 0,85%.  
Tabla A.8.28 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Cloruro de sodio  0.85g  
Agua destilada  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 12 1 °C ± 1 °C durante 15 min.  
A.8.3.1.5.4  Solución salina formalizada.  
Tabla A.8.29 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Solución de formaldehído (36 -38%)  6.0ml  
Cloruro  de sodio  8.5g 
Agua destilada  1.0L 
 
Preparación:  
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 litro de agua destilada. Esterilizar a 12 1 °C ± 1 °C durante 15 min.  
Enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 6 mL de la solución de formaldehído. No esterilizar de spués de 
la adición de formaldehído.  
A.8.3.1.5.5  Reactivo de Kovac.  
Tabla A.8.30 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
p-dimetil -aminobenzaldehído  5.0g 
Alcohol amílico  75.0mL  
Acido clorhídrico concentrado  25.0mL  
 
Preparación:  
Disolver el p -dimetil -aminobenza ldehído en el alcohol amílico y después agregar el ácido clorhídrico 
lentamente. Conservar en frasco ámbar en refrigeración.  
A.8.3.1.5.6  Solución de alfa -naftol al 5%.  
Tabla A.8.31 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Alfa-naftol  5.0g 
Alcohol  100.0mL  
 
Prepar ación:  
Disolver 5 g de alfa -naftol en alcohol hasta completar 100 mL.  
A.8.3.1.5.7  Solución de rojo de metilo.  
Tabla A.8.32 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Rojo de metilo  0.10g  
Alcohol etílico  300.0g  
Agua destilada c.b.p.  500.0mL       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
 
Preparación:  
Disolver el rojo de metilo en el alcohol etílico y adicionar agua hasta completar 500 mL.  
A.8.3.1.5.8  Solución de hidróxido de potasio al 40%.  
Tabla A.8.33 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Hidróxido de potasio  40.0g  
Agua destilada  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver 4 0 g de hidróxido de potasio en agua hasta completar 100 mL.  
A.8.3.1.5.9  Solución de gelatinasa al 5%.  
Tabla A.8.34 Fórmula  
Ingredientes  Cantidades  
Gelatinasa  5.0g 
Agua  100.0mL  
 
Preparación:  
Disolver 5 g de gelatinasa en 100 mL de agua destilada. NO CALE NTAR.  
A.8.3.1.6  Antisueros  
Antisuero polivalente somático (O)  
Antisuero polivalente flagelar (H)  
Antisuero Vi  
A.8.4.2 Materiales.  
A.8.4.2.1  Matraces Erlenmeyer de 500 mL.  
A.8.4.2.2  Recipientes de boca ancha, de capacidad apropiada para contener las muestra s simples y 
compuestas.  
A.8.4.2.3  Angulos de vidrio.  
A.8.4.2.4  Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas.  
A.8.4.2.5  Tubos de ensaye de 16 x 150 mm y de 20 x 100 mm.  
A.8.4.2.6  Tubos para serología de 10 x 75 mm o de 13 x 100 mm.  
A.8.4.2.7  Pipetas bacteriológi cas de 10,0 y 5,0 mL, graduadas en 0,1 mL y protegidas con tapón  de 
algodón.  
A.8.4.2.8  Pipetas de 1 mL, con graduaciones de 0,01 mL.  
A.8.4.2.9  Cajas de Petri estériles de vidrio o desechables.  
A.8.4.2.10  Rejillas para tubos de ensaye.  
A.8.4.2.11  Asa de pla tino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro.  
A.8.4.2.12  Papel pH (intervalo de 6 -8) con graduaciones máximas de 0,4 unidades de pH para cambios  de 
color.  
Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante horno  o 
autoclave.  
A.8.5 Equipo.  
A.8.5.1  Horno para esterilizar que alcance los 18 0 °C. Durante 2 horas a 170 -175 °C. 
A.8.5.2  Incubadora con termostato para evitar variaciones mayores de ± 0, 1 °C y termómetro.  
A.8.5.3  Autoclave con termómetro o manómetro, probado con termómetro de máximas. Durante 15 min 
como mínimo a 12 1 °C ± 1 °C. Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.8.5.4  Baño maría con termostato y termómetro.  
A.8.5.5  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.  
A.8.5.6  Licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstat o, con  vasos esterilizables (vid rio o 
aluminio).  
A.8.5.7  Mecheros Bunsen o Fisher.  
A.8.5.8  Potenciómetro.  
A.8.6 Procedimiento.  
A.8.6.1  Preparación de los alimentos para el aislamiento de Salmonella  
Los siguientes métodos se basan en el análisis de 25 g de la mue stra analítica en una proporción de 1:9 
de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporción. Se 
recomienda una muestra de 25 g o más.  
A.8.6.1.1  Procedimiento general para la preparación de muestras.  
Pesar asépticament e 25 g de la muestra en un vaso estéril de licuadora o en bolsa estéril para trabajar en 
homogeneizador peristáltico (stomacher). Adicionar 225 mL del medio de preenriquecimiento estéril 
(generalmente caldo lactosado, a menos que se indique otro) y licuar si es necesario durante un min. 
Transferir asépticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estéril de boca ancha con tapón de rosca 
y dejar reposar por 60 min a temperatura ambiente con la tapa bien enroscada. Mezclar bien y determinar el 
pH aproxima do con papel pH. Ajustar, si es necesario, a un pH 6,8 ± 0,2 con hidróxido de sodio 1N o ácido 
clorhídrico 1N estériles. Mezclar y cubrir el recipiente enroscando suavemente la tapa.  
Incubar 24 ± 2 h a 3 5 °C. Continuar como se indica en A.8.6.2.1.  
A.8.6.1. 2 Procedimiento específico para la preparación de muestra según el producto.  
A.8.6.1.2.1  Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate).  
Pesar asépticamente 25 g de la muestra en un vaso para licuadora agregando 225 ml de leche 
descremada reconstituida. Licuar por dos min. Manejar igual que en 8.6.1.1 hasta después de ajustar el pH. 
Adicionar 0,45 ml de la solución verde brillante al 0,1% y mezclar bien. Incubar como se indica en 8.6.1.1.  
A.8.6.2  Aislamiento de Salmonella.  
A.8.6.2.1  Cerrar firmemente el t apón de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y 
agitar suavemente, transferir respectivamente 1 mL de la mezcla a un tubo que contenga 10 mL de caldo 
tetrationato y a otro con 10 mL de caldo selenito cistina. Como alternativa, en sus titución del caldo tetrationato 
puede emplearse el medio Vassiliadis -Rappaport.  
A.8.6.2.2  Incubar de 18 a 24 h a 3 5 °C o, para alimentos fuertemente contaminados a 4 2 °C por el mismo 
periodo. Estriar los productos que fueron directamente enriquecidos en me dios selectivos.  
A.8.6.2.3  Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), agar 
verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios selectivos adicionales (agar entérico 
Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).  
Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.  
Incubar las placas 24 ± 2 h a 3 5 °C. 
A.8.6.2.4  Examinar las placas para investigar la presencia de colonias típicas de Salmonella , de acuerdo 
con las siguientes característi cas: 
Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos 
las colonias pueden aparecer completamente negras.  
Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido;  las 
bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.  
Agar entérico Hektoen: colonias verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunos casos  las 
colonias pueden aparecer completamente negras.  
Agar Sulfito de Bismuto: las colonias típicas de Salmonella  pueden ser cafés, grises o negras; con o sin 
brillo metálico. Generalmente el medio circundante (halo) es café, tornándose posteriormente negro. Algunas 
cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro. Si las placas no muestran co lonias típicas o 
no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.  
Agar SS: colonias translúcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias 
fermentadoras de la lactosa son rojas.  
A.8.6.3  Identificación bioquímica       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.8.6.3.1  Seleccionar al menos dos colonias típicas de cada medio selectivo, que se encuentren  bien 
aisladas.  
Tocar levemente el centro de cada colonia e inocular dos tubos, uno con agar triple azúcar hierro (TSI) y 
otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en l a superficie inclinada y por punción en el fondo.  
Incubar por 24 ± 2 h a 3 5 °C. 
Almacenar en refrigeración de 5 a 8 °C las placas con medios selectivos por si es necesario retomar más 
colonias.  
A.8.6.3.2  Observar el crecimiento en los tubos y considerar pr esuntivamente positivas para Salmonella  las 
colonias que den las siguientes reacciones:  
A.8.6.3.2.1  Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentación de la 
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo más  intenso que el medio original debido a la no 
fermentación de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayoría de los casos se observa coloración negra a lo 
largo de la punción debido a la producción de ácido sulfhídrico.  
A.8.6.3.2.2  Agar LIA, se observa intens ificación del color púrpura en todo el tubo por la descarboxilación 
de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del 
agar. La mayoría de las cepas de Salmonella  producen ácido sulfihídrico en este  medio con ennegrecimiento 
a lo largo de la punción.  
A.8.6.3.2.3  Retener todos los cultivos que muestren las reacciones características de Salmonella  en los 
medios TSI y LIA para las pruebas adicionales, indicadas en A.8.6.3.3.  
A.8.6.3.3  Los cultivos con T SI que no parecen de Salmonella  pero que presentan reacciones en LIA 
típicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitirá 
detectar S. arizonae  y cepas atípicas de Salmonella  que utilicen lactosa o sac arosa. Descartar solamente los 
cultivos que muestren reacciones atípicas en ambos medios.  
A.8.6.3.4  Continuar el análisis a partir de los tubos de TSI con reacciones típicas. Si el cultivo presenta 
reacciones atípicas en este medio, tomar colonias adiciona les de las placas de donde se obtuvo el cultivo 
atípico anterior y sembrar las pruebas bioquímicas nuevamente.  
A.8.6.3.5  Continuar la identificación bioquímica y serológica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se 
recomienda trabajar seis cultivos p or cada 25 g de unidad analítica seleccionando colonias procedentes de 
ambos medios de enriquecimiento.  
A.8.6.3.6  Prueba de ureasa.  
A.8.6.3.6.1  Prueba de ureasa (convencional). Con una asa estéril, tomar crecimiento del cultivo 
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de 
medio para comparar el vire púrpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar  24 ± 2 
h a 3 5 °C. 
A.8.6.3.6.2  Prueba de ureasa (rápida). Tomar dos asadas  de crecimiento del cultivo presumiblemente 
positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rápida). Incubar 2 h a 37 ± 0, 5 °C en baño 
de agua.  
Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa  (sin 
cambio de color del medio).  
A.8.6.4  Identificación serológica.  
A.8.6.4.1  Ensayo de los antígenos somáticos de Salmonella  (Antisuero polivalente O).  
A.8.6.4.1.1  Colocar con una asa dos gotas separadas de solución salina estéril sobre un portao bjetos o en 
dos secciones de una placa para aglutinación. Suspender en cada una de las gotas, una porción del cultivo 
desarrollado en TSI.  
A.8.6.4.1.2  Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somático (O) y mezclar con el canto 
del asa o e mpleando aplicadores de madera.  
A.8.6.4.1.3  Agitar inclinando la lámina hacia atrás y hacia adelante durante aproximadamente un min. 
Observar bajo buena iluminación sobre un fondo oscuro.  
A.8.6.4.1.4  Considerar cualquier grado de aglutinación como positiva . 
La prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinación en la gota con el cultivo y el antisuero y no 
aglutinación en la gota que contiene el cultivo y la solución salina.  
Si se observa aglutinación en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe  continuar con las pruebas 
bioquímicas complementarias.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.8.6.4.2  Cuando la aglutinación es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo 
empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los más f recuentes).  
A.8.6.4.2.1  Si la aglutinación con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la prueba. Si 
hay aglutinación con Vi calentar el cultivo a ebullición y repetir la aglutinación con el antisuero polivalente O.  
A.8.6.4.2.2  Si no s e cuenta con los sueros grupo específicos, solicitar la tipificación de la cepa al 
Laboratorio de Enterobacterias del Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia de la Secretaría de Salud o  al 
Laboratorio Nacional de Salud Pública.  
A.8.6.4.3  Si se requiere , practicar el ensayo de los antígenos flagelares de Salmonella  (Antisuero 
polivalente H).  
A.8.6.4.3.1  Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusión de cerebro corazón e incubar de  4 a 6 
h a 3 5 °C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en  el mismo día), o bien, en caldo soya tripticaseina 
e incubar por 24 ± 2 h a 3 5 °C (para ensayo al día siguiente). Adicionar 2,5 mL de solución salina formalizada 
a 5 mL del cultivo en caldo o al cultivo en agar cerebro corazón (BHI).  
A.8.6.4.3.2  Colocar 0 ,5 mL del antisuero polivalente flagelar (H) prep arado en un tubo para serología  (13 x 
100 mm aproximadamente). Adicionar 0,5 mL del cultivo formalizado. Preparar un control de solución salina 
mezclando 0,5 mL de solución salina formalizada con 0,5 mL del antígeno formalizado. Incubar las mezclas en 
baño de agua a 48 -50 °C . Observar a intervalos de 15 min por espacio de una h. Una prueba positiva es 
cuando se observa aglutinación en la mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como 
negativa  una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinación. Cuando ambas mezclas se 
aglutinan, se considera la prueba inespecífica.  
A.8.6.5  Pruebas bioquímicas complementarias.k  
Cuando las pruebas serológicas o bioquímicas iniciales, dan resultados atípicos o no concluyentes, 
realizar las pruebas que se describen a continuación:  
A.8.6.5.1  Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de Simmons, 
caldo manitol y caldo RM -VP. Usar caldo malonato para confirmar la  presencia de la especie S. arizonae . 
A.8.6.5.2  Interpretar los cambios en los medios inoculados conforme lo siguiente:  
A.8.6.5.2.1  Agar citrato Simmons  
Inocular por estría el tubo.  
Incubar 96 ± 2 h a 35 ± 2 °C. 
Prueba positiva: crecimiento acompañado de u n cambio de color de verde a azul.  
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.  
 A.8.6.5.2.2  Medio SIM  
Inocular por punción.  
Incubar 24 h a 35 ± 2 °C. 
Movilidad.  
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la punción y en el seno del medi o de cultivo.  
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la punción exclusivamente.  
Producción de ácido sulfihídrico.  
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la punción que puede extenderse a todo el medio.  
Prueba negativa: ausencia de color negro.  
Producción de indol.  
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 mL de reactivo de Kovac.  
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.  
Prueba negativa: sin cambio de color.  
A.8.6.5.2.3  Caldo RM -VP 
Inocular  un tubo con el medio.  
Incubar 48 ± 2 h a 35 ± 2 °C para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.  
A.8.6.5.2.3.1  Prueba de Voges -Proskauer (VP)  
Transferir a un tubo un mL del cultivo de 48 h.  
Adicionar 0,6 mL de solución de alfa naftol.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
Adicionar 0,2 mL de  solución de hidróxido de potasio 40%.  
Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional).  
Interpretar los resultados después de incubar 2 h a 35 ± 2 °C o 4 h a temperatura ambiente.  
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.  
Prueba negativa: si n cambio de color.  
Reincubar el resto del medio RM -VP 48 h más a 35 ± 2 °C. 
A.8.6.5.2.3.2  Prueba de rojo de metilo (RM)  
Adicionar al medio de cultivo de 96 h de incubación de dos a tres gotas de solución de rojo de metilo.  
Interpretar los resultados inmedi atamente.  
Prueba positiva: desarrollo de color rojo.  
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.  
A.8.6.5.2.4  Caldo malonato  
Inocular un tubo conteniendo el medio.  
Incubar 40 ± 2 h a 35 ± 2 °C. 
Prueba positiva: desarrollo de color azul.  
Prueba negativa: sin cambio de color.  
A.8.6.5.2.5  Caldo manitol  
Inocular un tubo conteniendo el medio.  
Incubar 24 ± 2 h a 35 ± 2 °C. 
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.  
Prueba negativa: sin cambio de color.  
A.8.6.5.3  Consultar los resultados obtenidos en la Tabl a A.8.36 para la identificación de los géneros de las 
bacterias investigadas.  
Nota: los sistemas bioquímicos comerciales validados pueden ser usados como alternativa para las 
pruebas bioquímicas convencionales.  
A.8.7 Cálculo y expresión de resultados.  
A.8.7.1 Interpretación de reacciones bioquímicas y serológicas.  
Reacciones bioquímicas  Reacciones serológicas  Interpretación  
Típica  Antígeno O, VI o H positivo  Cepas consideradas como 
Salmonella  
Típica  Todas las reacciones negativas   
Típica  No probada  Puede  ser Salmonella  
Reacciones atípicas  Antígeno O, VI o H positivo   
Reacciones atípicas  Todas las reacciones negativas  No debe ser considerada 
Salmonella  
Nota: Ver apéndice informativo A.  
A.8.7.2  Reacciones bioquímicas y serológicas de Salmonella.  
Tabla A. 8.36 
Prueba o Sustrato  Positivo  Negativo  Reacción  
Glucosa (TSI)  amarillo  rojo + 
Lisina descarboxilasa (LIA)  púrpura  amarillo  + 
H2S (TSI y LIA)  negro  no negro  + 
Ureasa  rojo-púrpura  no hay cambio de color  - 
Caldo de lisina descarboxilasa  púrpura  amaril lo + 
Caldo dulcitol rojo de fenol  amarillo o gas  no hay cambio de color 
ni gas  + b 
Caldo KCN  crecimiento  no hay crecimiento  - Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
Caldo malonato  azul no hay cambio de color  - c 
Prueba de indol  superficie de color violeta  superficie color amarillo  - 
Prueba  del antígeno flagelar  aglutinación  no hay aglutinación  + 
Prueba del antígeno somático  aglutinación  no hay aglutinación  + 
Caldo lactosa rojo fenol  amarillo o gas  no hay cambio de color 
ni gas  - c 
Caldo sacarosa rojo fenol  amarillo o gas  no hay cambio de  color 
ni gas  - 
Prueba Voges -Proskauer  de rosa a rojo  no hay cambio de color  - 
Prueba rojo de metilo  rojo difuso  amarillo difuso  + 
Citrato de Simmons  crecimiento color azul  no hay crecimiento , no 
hay cambio de color  v 
 
a) +, 90% o más positivos en 1 o 2 días; -, 90% o más negativas en 1 o 2 días; v, variable.  
b) La mayoría de los cultivos S. arizonae  son negativos.  
c) La mayoría de los cultivos S. arizonae  son positivos.  
A.8.8 Informe de resultados.  
Informar: presencia o ausencia de Salmonella  en ______ ____ g o ____________ ml de muestra.  
A.9. Determinación de humedad en alimentos por tratamiento térmico. Método de arena o gasa.  
A.9.1 Fundamento.  
Este método se basa en que al añadir arena o gasa, se incrementa la superficie de contacto y la 
circulación d el aire en la muestra, favoreciéndose así la evaporación durante el tratamiento térmico.  
A.9.2 Definiciones.  
A.9.2.1 Humedad , es la pérdida en peso por evaporación que sufre el producto al someterlo a las 
condiciones prescritas, expresada en por ciento.  
A.9.2.2 Precisión , es una medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad del método analítico bajo 
las condiciones normales de operación.  
A.9.2.3 Producto heterogéneo , es aquel cuya consistencia o diferentes fases hacen que la distribución 
de sus compo nentes no sea homogénea, tales como sopas de lata, frijoles refritos, moles, etc.  
A.9.2.4 Repetibilidad , es la precisión de un método analítico, expresado como la concordancia obtenida 
entre determinaciones independientes realizadas por un solo analista, u sando los mismos datos y técnicas.  
A.9.3 Reactivos y Materiales.  
A.9.3.1 Reactivos.  
Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico, cuando se indique agua, debe 
entenderse agua destilada.  
A.9.3.1.1 Sílica gel con indicador de humed ad. 
A.9.3.1.2 Arena de mar purificada con ácido y calcinada (tamaño de partícula, 0,1 a 0,3 mm) o gasa.  
A.9.3.1.3 Agua.  
A.9.3.2 Materiales.  
A.9.3.2.1  Desecadores con placa.  
A.9.3.2.2  Cápsulas de níquel, aluminio o vidrio de 20 mm de altura y 50 mm de diáme tro, con tapa de  52 
mm de diámetro por 6 mm de altura y base cóncava o plana según se requiera.  
A.9.3.2.3 Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro.  
A.9.3.2.4  Pinzas para crisol.  
A.9.3.2.5 Material común de laboratorio.  
A.9.4 Aparatos e Instrumentos  
Los apara tos que a continuación se indican deben estar calibrados y ser ajustados antes de su operación:       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.9.4.1  Baño maría, o bien, placa calefactora eléctrica termostatizada.  
A.9.4.2  Balanza analítica con ± 0,1 mg de sensibilidad.  
A.9.4.3  Estufa con termostato pa ra mantener una temperatura de 100 ± 2 °C. 
A.9.5 Preparación de la muestra.  
A.9.5.1  Preparación de las cápsulas. Para cada muestra preparar dos cápsulas y las tapas respectivas 
con las siguientes características:  
Cápsulas de níquel, aluminio o vidrio, con 30 g de arena como máximo, o gasa recortada al tamaño del 
fondo de la cápsula y una varilla de vidrio de longitud apropiada para reposar oblicuamente en la cápsula sin 
que se impida el tapado de ésta. Secar previamente las cápsulas entreabiertas (con arena  o gasa, varilla y 
tapas), durante un mínimo de 2 horas a 100 ± 2 °C, taparlas e introducir en un desecador y dejar enfriar a 
temperatura ambiente y pesar con precisión de 0,1 mg (masa M1)  
A.9.5.2  Preparación de la muestra.  
Justo antes de tomar la muestra,  homogeneizarla bien, si es necesario, colocar el envase original en baño 
maría a 4 0 ºC para poner en suspensión los componentes que hayan podido separarse. (Por ejemplo grasa  y 
fibras).  
A.9.6 Procedimiento.  
A.9.6.1  Colocar en la cápsula preparada una cant idad de producto inferior a 10 g, volver a tapar la cápsula 
y pesar con precisión de 0,1 mg (masa M2).  
Para que se cumpla el grado de precisión, se recomienda utilizar una cantidad de muestra superior a 1 g y 
en los productos heterogéneos utilizar de 3 a 5  veces más de la cantidad mínima propuesta.  
A.9.6.2  Después de pesar, mezclar bien la muestra con arena o colocarla sobre la gasa. Si es necesario, 
añadir unos centímetros cúbicos de agua destilada, lo cual facilita una mezcla uniforme.  
A.9.6.3  Si la muest ra lo requiere, evaporar a sequedad, sin tapa, por medio de un baño maría o placa 
calefactora a un máximo de 10 0 °C. Durante la evaporación, el contenido de la cápsula debe removerse de 
vez en cuando al principio y más a menudo al final. Evitar las pérdida s de sustancia y arena.  
A.9.6.4  Introducir en la estufa las cápsulas con la muestra previamente evaporada, colocar las tapas de 
manera que al final del tiempo de secado puedan taparse rápidamente, cerrar la estufa y secar durante 4 
horas a 100° ± 2 °C. Abr ir la estufa, tapar las cápsulas y colocarlas en los desecadores, dejar enfriar hasta 
temperatura ambiente y pesar inmediatamente con precisión de 0,1 mg (masa M3).  
A.9.7 Expresión de resultados.  
A.9.7.1  Método de cálculo.  
El contenido de humedad en la mue stra se calcula con la siguiente fórmula expresada en por ciento:  
Humedad en %= M2 – M3 x 100 
 M2 – M1 
En donde:  
M1 = Peso de la cápsula con arena o gasa (g).  
M2 = Peso de la cápsula con arena o gasa más muestra húmeda (g).  
M3 = Peso de la cápsula con aren a o gasa más muestra seca (g).  
Nota: Indicar el valor medio de la determinación por duplicado con un decimal.  
A.9.7.2  Grado de precisión  
Repetibilidad: no debe exceder de 0,1 g por 100 g de muestra.  
Si el producto es homogéneo y la diferencia excede 0,1 g/ 100 g, debe repetirse la determinación. Sin 
embargo para ciertas materias heterogéneas las diferencias admisibles pueden alcanzar de 0,3 a 0,5 g/100 g.  
A.9.8 Informe de la prueba.  
Informar: humedad en %.  
A.10. Determinación de cadmio, arsénico, plomo, esta ño, cobre, fierro, zinc y mercurio en 
alimentos, agua potable y agua purificada por espectrometría de absorción atómica.  
A.10.1 Fundamento.  
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una  frecuencia 
tal que puede se r absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor atómico. La medida Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar el porciento de 
absorción.  
La cantidad de absorción aumenta con la concen tración de los átomos en el medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pretratamiento.  
A.10.2 Definiciones.  
A.10.2.1  Blanco de calibraci ón del instrumento , es la solución del ácido usado como diluyente.  
A.10.2.2  Blanco de reactivos , a la solución que contiene todos los reactivos usados en los mismos 
volúmenes y concentraciones en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe seguir los pasos de 
digestión y preparación de la muestra.  
A.10.2.3  Blanco de reactivos fortificado , a la solución que se prepara a partir de una alícuota del blanco 
de reactivos, añadiendo una alícuota de la solución estándar concentrada "solución madre", para dar u na 
concentración final que produzca una absorbancia aceptable (aproximadamente 0,1) para el analito. El blanco 
de reactivos fortificado debe seguir el mismo esquema de digestión y preparación de la muestra.  
A.10.2.4  Espectrometría , a la rama de la espectro scopia relacionada con la medición de espectros.  
A.10.2.5  Espectrometría de absorción atómica , a la rama del análisis instrumental en el cual un 
elemento es atomizado en forma tal que permite la observación, selección y medida de su espectro  de 
absorción.  
A.10.2.5.1  Espectrometría de absorción atómica por flama , al método por el cual el elemento  se 
determina mediante un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un sistema  de 
nebulización y una fuente de atomización.  
La fuente de atomización es un quemador que utiliza diferentes mezclas de gases, las más frecuentes son 
aire-acetileno y óxido nitroso -acetileno.  
A.10.2.5.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito , al método mediante el cual el 
elemento se determina por un espectr ómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un horno de 
grafito. El principio es esencialmente el mismo que en absorción atómica de aspiración directa en flama, 
excepto que se usa un horno en lugar de la flama para atomizar la muestra.  
A.10.2.5.3  Espectrometría de absorción atómica por generación de hidruros , al método similar al del 
vapor frío. Las muestras reaccionan en un dispositivo externo con un agente reductor, generalmente 
borohidruro. Los productos gaseosos de reacción se llevan a una celda de muestreo que se encuentra en el 
paso óptico del espectrómetro de absorción atómica, en este caso, los productos de reacción son hidruros 
volátiles. Estos compuestos moleculares no son capaces de dar una señal de absorción atómica, por lo tanto 
la celda se calienta para disociar el hidruro gaseoso en átomos libres. Cuando el hidruro gaseoso se disocia 
en la celda calentada en átomos libres, la absorción atómica crece y cae a medida que se crean los átomos y 
escapan de la celda de absorción. Se mide el máx imo de absorción o altura de pico, como señal analítica. Los 
elementos que se pueden determinar con esta técnica son: As, Bi, Ge, Pb, Sb, Se, Te y Sn.  
A.10.2.5.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío , al método que es otra aproximación 
para me jorar la sensibilidad de la absorción atómica, optimizando la eficiencia de muestreo en el quemador de 
pre-mezcla, en donde el mercurio se reduce químicamente al estado atómico libre haciendo reaccionar la 
muestra con un reductor fuerte (cloruro estanoso o  borohidruro de sodio) en un recipiente de reacción cerrado. 
El mercurio volátil libre se arrastra del matraz de reacción burbujeando aire o nitrógeno a través de la solución. 
Los átomos del mercurio que se arrastran son transportados a una celda de absorc ión que se coloca en el 
paso de luz del espectrómetro de absorción atómica. A medida que los átomos de mercurio pasan por la celda 
de muestreo, la absorbancia medida se incrementa indicando el aumento de concentración en el paso de luz.  
A.10.2.6  Espectrosc opia, al área de la física y la química dedicada al estudio de la generación, medición 
e interpretación de los espectros de energía (electromagnético o partícula) que resulta ya sea de la emisión o 
absorción de energía radiante o partículas de una sustanci a cuando se le bombardea con radiación 
electromagnética, electrones, neutrones, protones, iones o bien por calentamiento, excitación con un campo 
eléctrico magnético, usada para investigar estructura nuclear y atómica.  
A.10.2.7  Método de adiciones estándar , al que implica la preparación de estándares en la matriz de la 
muestra, añadiendo cantidades conocidas de un estándar a una o más alícuotas de la muestra y que 
compensa los efectos de exaltación o depresión de la señal del analito, pero no corrige interf erencias aditivas 
que causan una desviación de la línea de base y en la cual los resultados obtenidos son válidos si:  
La curva analítica es lineal.  
La forma química del analito es la misma que en la muestra.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
El efecto de interferencia es constante en el in tervalo de trabajo.  
La señal se corrige por interferencia aditiva.  
A.10.2.8  Muestra de control de calidad , es una muestra externa al laboratorio, que contiene una alícuota 
de concentración conocida del analito, cuyos valores de absorbancia deben estar comp rendidos en el rango 
lineal del método.  
A.10.2.9  Muestra fortificada , a la muestra a la cual se le adiciona una alícuota de concentración conocida 
del analito, diluida en el ácido apropiado de tal forma que la solución resultante tenga una absorbancia de 0 ,1 
aproximadamente.  
A.10.3 Reactivos y materiales  
A.10.3.1 Reactivos  
A.10.3.1.1 Soluciones estándares de referencia certificadas de cada uno de los metales.  
A.10.3.1.2 Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm  a 
25ºC. 
A.10.3.1.3 Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro.  
A.10.3.1.4 Acido nítrico (densidad específica 1,41), contenido de mercurio muy bajo.  
A.10.3.1.5 Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro.  
A.10.3.1.6 Acido clor hídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro.  
A.10.3.1.7 Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro.  
A.10.3.1.8 Acido sulfúrico 1 N a partir de la solución grado suprapuro.  
A.10.3.1.9 Acido nítrico 65% v/v grado RA.  
A.10.3.1.10 Peró xido de hidrógeno (densidad específica 1,12).  
A.10.3.1.11 Hidróxido de sodio granalla reactivo RA.  
A.10.3.1.12 Aire comprimido seco y limpio.  
A.10.3.1.13 Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado absorción atómica.  
A.10.3.1.14 Solución de N itrato de Magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O 
en 1000 mL de HCl 1 N.  
A.10.3.1.15 Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 mL de HCl y llevar a 100 mL de agua.  
A.10.3.1.16 Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 mL de HNO3 al 65% v/v grado  suprapuro en 50 mL de agua.  
A.10.3.1.17 Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
A.10.3.1.18 Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
A.10.3.1.19 Solución de Yoduro de Potasio al 15% p/v. D isolver 15 g de KI en 100 mL de agua (esta 
solución debe prepararse en el momento de usarse).  
A.10.3.1.20 Solución de Yoduro de Potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 mL de agua  (esta 
solución debe prepararse en el momento de usarse).  
A.10.3.1.21 Solución de Cloruro de Potasio (10 mg/ml de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a  100 
mL con agua.  
A.10.3.1.22 Solución de Nitrato de Magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO3)2.6H2O en 100 mL  de 
agua.  
A.10.3.1.23 Solución de ácido clorhídrico al  1,5% p/v. Diluir 1,5 mL de HCl en 100 mL de agua destilada 
deionizada.  
A.10.3.1.24 Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 mL 
con agua destilada deionizada.  
A.10.3.1.25 Solución de borohidruro de sodio al 4 % p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 
4 g de borohidruro de sodio en 100 mL de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío.  
A.10.3.1.26 Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico concentrado con  
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de cloruro de sodio, 15 g 
de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en solución. Diluir a 500 mL.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.10.3.1.27 Solución de dilución para mercuri o. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 500 mL de 
agua destilada deionizada, agregar 58 mL de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración  de 
mercurio y 67 mL de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua.  
Solución de trabajo de A s de 1 µg/mL. Diluir 1 mL de la solución patrón de 1000 µg/mL a 1 L con ácido 
sulfúrico 1N preparada a partir de la solución grado suprapuro. Preparar fresca cada día.  
A.10.3.2 Materiales  
A.10.3.2.1  Matraces Kjeldahl de 500 mL y 800 mL.  
A.10.3.2.2  Sistema de reflujo con refrigerante.  
A.10.3.2.3  Crisoles Vycor de 40 a 50 mL de capacidad.  
A.10.3.2.4  Crisoles de platino de 40 a 50 mL de capacidad.  
A.10.3.2.5  Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.  
A.10.3.2.6  Matraces volumétricos de diferentes capacidad es. 
A.10.3.2.7  Matraces redondos de fondo plano de 50 mL.  
A.10.3.2.8  Bombas Parr.  
A.10.3.2.9  Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.  
A.10.3.2.10  Puntas de plástico para micropipetas.  
A.10.3.2.11  Papel filtro Whatman No. 2.  
A.10.3.2.1 2 Perlas de ebullición.  
A.10.3.2.13  Varillas de plástico.  
A.10.3.2.14  Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 mL.  
A.10.3.2.15  Recipientes de propilen o propileno.  
A.10.3.2.16  Embudos de filtración de diferentes capacidades.  
A.10.3.2.17  Mate rial común de laboratorio.  
A.10.3.2.17.1  Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes 
instrucciones:  
A.10.3.2.17.1.1 El jabón que se use debe ser de preferencia neutro.  
A.10.3.2.17.1.2 Enjuagar perfectamente con agua cor riente.  
A.10.3.2.17.1.3 Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia plástico) que 
contenga una solución de ácido nítrico grado RA al 30 %. 
A.10.3.2.17.1.4 Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 horas.  
A.10.3.2.17.1.5 Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada.  
A.10.3.2.17.1.6 Dejar escurrir y secar.  
A.10.3.2.17.1.7 Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.  
A.10.4 Aparatos e instrumentos.  
A.10.4.1 Aparatos.  
A.10.4.1.1  Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, 
cobre, estaño, fierro, mercurio, plomo y zinc.  
A.10.4.1.2  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.  
A.10.4.1.3  Automuestreador y recirculador de agua.  
A.10.4.1.4  Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450 ºC.  
A.10.4.1.5  Horno de microondas.  
A.10.4.1.6  Autoclave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión.  
A.10.4.1.7  Centrífuga de laborat orio capaz de mantener 1600 rpm.  
A.10.4.2 Instrumentos       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.10.4.2.1  Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su 
operación.  
A.10.4.2.2  Espectrómetro de absorción atómica equipado con los accesorios para flama,  horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir.  
A.10.4.2.3  Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.  
A.10.4.2.4  Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 1 0 ºC. 
A.10.4.2.5  Horno de calentamiento (estufa) c on intervalo de temperatura de 120 ± 5ºC.  
A.10.5 Preparación de la muestra.  
A.10.5.1  Digestión para la determinación de Cd, Cu, Fe, Pb y Zn.  
A.10.5.1.1  Digestión por vía húmeda.  
A.10.5.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestr a. 
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  20 
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g  y el total de materia orgánica a 5 g.  
A.10.5.1.1.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar 
directamente la digestión.  
A.10.5.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistema de refrigerantes.  
A.10.5.1.1 .4 Calentar suavemente.  
A.10.5.1.1.5  Digerir la muestra 3 horas o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la 
adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición del color traslúcido, si queda ámbar, adicionar 
peróxido de hidrógeno  gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica).  
A.10.5.1.1.6  Enfriar.  
A.10.5.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico.  
A.10.5.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digest ión. 
A.10.5.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno de 
grafito).  
A.10.5.1.2  Digestión por vía seca.  
A.10.5.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.  
Para la determinación po r el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 
g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgá nica a 5 g.  
A.10.5.1.2.2  Añadir 10 mL de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar 
directamente la digestión. En productos con alta concentración de proteínas adicionar una solución de nitrato 
de magnesio al 7,0% p/v y mezclar compl etamente, llevar a sequedad aproximadamente durante 6 horas en 
estufa a una temperatura de 90 a 95 ºC. 
A.10.5.1.2.3  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4  ºC por minuto 
hasta 35 0 °C. Mantener la temperatura hasta que ces en los humos.  
A.10.5.1.2.4  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 55 0 ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura durante 16 horas o toda la noche.  
A.10.5.1.2.5  Apagar la mufla y dejar enfriar.  
A.10.5.1.2.6  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento:  
A.10.5.1.2.6  .1 Lavar las paredes del crisol con 2 mL de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una 
placa de calentamiento puesta a 12 0 ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla 
fría y elevar la temperatura gradualmente de 500 a 55 0 ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir 
este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanent e. 
A.10.5.1.2.7  Disolver las cenizas completamente en 5 mL de ácido clorhídrico 1N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas de 5 
mL de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 mL en el Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinación.  
A.10.5.1.2.8  Correr un  blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
A.10.5.1.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
A.10.5.2  Digestión por vía húmeda para la determinación de Sn.  
A.10.5.2.1  Proceder igual que en el punto A.10.5.1.1.1.  
A.10.5.2.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva cabo la digestión total en el mismo día.  
A.10.5.2.3  Adicionar 30 mL de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 minutos 
en campana para iniciar la digestión, evitando una excesiva producción de espuma.  
A.10.5.2.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 mL o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine.  
A.10.5.2.5  Retirar la muestra del calor.  
A.10.5.2.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.  
A.10.5.2.7  Adicionar 25 mL de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 minutos, hasta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmen te 
hasta ebullición.  
A.10.5.2.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 mL, usando un matraz similar con 15 mL de agua como 
patrón de volumen.  
A.10.5.2.9  Adicionar aproximadamente 40 mL de agua.  
A.10.5.2.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 mL y enjuagar con 10 mL de agua.  
A.10.5.2.11  Cuando el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda 
la noche o por más tiempo.  
A.10.5.2.12  Agregar 1 mL de solución de cloruro de potasio en cada matraz.  
A.10.5.2.13  Enfriar a temperatura am biente.  
A.10.5.2.14  Diluir con agua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.  
A.10.5.2.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 mL a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno,  polipropileno o polietileno.  
A.10.5.2.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses.  
A.10.5.2.17  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
A.10.5.2.18  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
A.10.5.3  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg.  
A.10.5.3.1  Sistema de reflujo.  
A.10.5.3.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiad a de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición.  
A.10.5.3.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de ácido 
nítrico concentrado y calentar durante media h ora o hasta que no se observen cambios en la digestión.  
A.10.5.3.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1).  
A.10.5.3.1.4  Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota sobre las paredes del recipiente,  hasta que 
el color obscuro de la solución desaparezca.  
A.10.5.3.1.5  Enfriar.  
A.10.5.3.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución.  
A.10.5.3.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
A.10.5.3.1.8  Leer en el apa rato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).  
A.10.5.3.2  Sistema cerrado.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.10.5.3.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión.  
A.10.5.3.2.2  Agrega r la cantidad necesaria de ácido nítrico concentrado.  
A.10.5.3.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión.  
A.10.5.3.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 minutos. Si se util iza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la temperatura a un máximo de  300 
ºC por 30 minutos.  
A.10.5.3.2.5  Enfriar a temperatura ambiente.  
A.10.5.3.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir  la 
digesti ón. 
A.10.5.3.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y analizar el contenido de Hg.  
A.10.5.3.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
A.10.5.3.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción  atómica de vapor frío).  
A.10.5.4  Digestión para la determinación de As.  
A.10.5.4.1  Digestión por vía húmeda -seca.  
A.10.5.4.1.1  Proceder como en el punto A.10.5.3.2 hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos.  
A.10.5.4.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muestra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados.  
A.10.5.4.1.3  Añadir 1 mL de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hast a sequedad.  
A.10.5.4.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375  ºC. 
A.10.5.4.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 45 0 ºC  para oxidar cualquier residuo de carbón y 
descomponer el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 mi nutos.  
A.10.5.4.1.6  Enfriar y disolver el residuo en 2,0 mL de ácido clorhídrico 8 M.  
A.10.5.4.1.7  Añadir 0,1 mL de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).  
A.10.5.4.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 minutos y transferir a un m atraz y llevar al aforo  con 
agua.  
A.10.5.4.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
A.10.5.4.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generado r de hidruros).  
A.10.5.4.2  Digestión por vía seca.  
A.10.5.4.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad necesari a de muestra en un crisol Vycor  o de 
platino.  
A.10.5.4.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v.  
A.10.5.4.2.3  Homo geneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol.  
A.10.5.4.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 30 0 ºC por 2 
horas. Posteriormente subir gradualmente la temperatura hasta 50 0 ºC por 16  horas o durante toda la noche.  
A.10.5.4.2.5  Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v.  
A.10.5.4.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido.  
A.10.5.4.2.7  Llevar los crisoles a una mufla elevando gradua lmente la temperatura de 23 a 50 0 ºC , 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total.  
A.10.5.4.2.8  Transferir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 mL de ácido 
clorhídrico 0,5 N.  
A.10.5.4.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 mL de  agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 mL de 
solución de yoduro de potasio al 15% y mezclar.  
A.10.5.4.2.10  Dejar reposar durante 15 minutos y llevar al aforo.  
A.10.5.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de diges tión. Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.10.5.4.2.12  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros).  
A.10.5.5  Digestión para la determinación de Cd, As, Pb, Sn, Cu, Fe, Zn y Hg por horno de microondas.  
Pesar  con precisión de ± 0,1 mg, 0,500 g como máximo de muestra, añadir 6 mL de ácido nítrico 
concentrado y 2 mL de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reacción y proceder según 
el manual del fabricante.  
A.10.6 Procedimiento.  
A.10.6.1  Espec trometría de absorción atómica por flama.  
A.10.6.1.1  Calibración. Es necesario comprobar que se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.  
A.10.6.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de datos . 
Permitir un periodo no menor a 30 minutos para el calentamiento de las lámparas de descarga sin electrodos.  
A.10.6.1.1.2  Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite  de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando la desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%.  
A.10.6.1.1.3  El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de c alibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del intervalo dinámico de 
concentración del analito.  
A.10.6.1.1.4  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de 
calibració n del analito de menor a mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia  de 
cada uno.  
A.10.6.1.1.5  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración.  
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipo s que se programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
A.10.6.1.2  Operación del instrumento.  
El desempeño del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración, están dares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC).  
A.10.6.1.2.1  Después de que se ha realizado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC, el análisis debe interrumpirse y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración.  
A.10.6.1.2.2  Para verificar que el instrumento  no presenta deriva, por cada 10 análisis se debe analizar el 
blanco de calibración. Si el valor verdadero del analito difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. 
Si el error persiste debe identificarse el problema y corregirse.  
Si la matriz de la muestra es responsable de la deriva o afecta la respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar.  
A.10.6.1.2.3  La demostración de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites 
de detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibración lineal. Para determinar el LDM se 
usa un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectu ra de absorbancia del blanco de reactivos 
fortificado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo a:  
LDM= t x s  
t = valor de la "T" de Student a un intervalo de confianza de 99% y una desviación estándar estimada para 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas.  
s = desviación estándar de las réplicas del análisis.  
El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próximo al l ímite superior del intervalo lineal.  
A.10.6.1.3  Determinación  
A.10.6.1.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo a las indicaciones del manual del instrumento.       (Primera Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 8 de abril de 2013  
A.10.6.1.3.2  Introducir el blanco de reactivos y la muestra a analizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen 
de manifiesto la calidad de los reactivos usados y el gr ado de contaminación del laboratorio.  
A.10.6.1.3.3  En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la 
concentración del elemento en las unidades de concentración utilizadas.  
A.10.6.1.3.4  Se debe analizar al menos un blanco de rea ctivos fortificado para cada grupo de muestras. 
Se calcula la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo al apartado A.10.6.1.3.6).  
A.10.6.1.3.5  Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
conce ntración añadida debe ser de aproximadamente 0,1 unidades de absorbancia.  
A.10.6.1.3.6  Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo a:  
R = CM – C x 100  
 CA 
R = % recuperación.  
CM = Concentración de la muestra fortificada.  
C = C oncentración de la muestra.  
CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra.  
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido  y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se deben verificar por el método de las adiciones estándar.  
A.10.6.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito.  
A.10.6.2.1  Calibración.  
A.10.6.2.1.1  Proceder de acuerdo a  los puntos A.10.6.1.1.1 al A.10.6.1.1.4.  
A.10.6.2.1.2  Elaborar una curva de calibración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito.  
La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre  los datos 
de concentración respuesta es aceptada.  
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
A.10.6.2.2  Operación del instrumento . 
A.10.6.2.2.1  Proceder de acuerdo al A.10.6.1.2.1 al A.10.6.1.2.3.  
A.10.6.2.3  Determinación.  
A.10.6.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo a las recomendaciones del manu al del instrumento.  
El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), se 
recomienda consultar la bibli ografía existente en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así como 
en el caso de interferencias de matriz.  
A.10.6.3  Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros.  
A.10.6.3.1  Calibración.  
A.10.6.3.1.1  Proceder de acuerdo a los puntos A.10.6.1.1.1 al A.10.6.1.1.4.  
A.10.6.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al método. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo d e la altura de pico) en función de la concentración del analito para un intervalo de concentración de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.  
A.10.6.3.2  Operación del instrumento.  
A.10.6.3.2.1  Proceder de acuerdo a los pun tos A.10.6.1.2.1 al A.10.6.1.2.3.  
A.10.6.3.3  Determinación.  Lunes 8 de abril de 2013  DIARIO OFICIAL  (Primera Sección)       
A.10.6.3.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajus tar la 
celda de absorción de acuerdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
A.10.6.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabrica nte. 
A.10.6.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito (por lo 
general, 10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el 
tiempo de reacción y el tiempo de purga  II. 
A.10.6.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo procedimiento que con 
los estándares de calibración.  
A.10.6.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.  
A.10.6.4.1  Calibración.  
A.10.6.4.1.1  Proceder igual que  en los puntos A.10.6.1.1.1 al A.10.6.1.1.4.  
A.10.6.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/mL preparar estándares de calibración que 
contengan 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 mL de la 
solución  de dilución y 20 mL de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia (altura 
máxima de pico) en función de la concentración del analito.  
A.10.6.4.2  Operación del instrumento.  
A.10.6.4.2.1  Proceder de acuerdo a los puntos A.10.6.1 .2.1 al A.10.6.1.2.3.  
A.10.6.4.3  Determinación.  
A.10.6.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la cel da de absorción de acuerdo al manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
A.10.6.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabrican te. 
A.10.6.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito.  
A.10.6.4.3.4  Tomar 25 mL de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración.  
A.10.7 Expresión de resultados.  
Método  de cálculo.  
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula:  
mg/ kg = A x B  
 C 
donde: 
A = Conce ntración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración.  
B = Volumen final al que se llevó la muestra (mL).  
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (mL) en el caso de agua.  
En los equipos que pueden programarse, la lectura obteni da da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg.  
A.10.8 Informe de la prueba.  
Los resultados se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar.  
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