Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
SEGUNDA SECCION  
PODER EJECUTIVO  
SECRETARIA DE SALUD  
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY -NOM -201-SSA1 -2013, Productos y servicios . Agua y hielo para 
consumo humano , envasados y a granel . Especificaciones sanitarias . 
Al margen un sello con el Escudo Naci onal, que dice: Estados Unidos Mexicanos. - Secretaría de Salud.  
MIKEL ANDONI ARRIOLA  PEÑALOSA , Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos 
Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, 
con fundamento en los artículos 39, de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4, de la Ley 
Federal de Procedimiento Administrativo; 3o. , fracción XXII, 13, Apartado A, fracciones I, II y IX, 116, 118, 
fracciones II, IV y VII, 119, fracción I I, 120, 122, 194, 205 y 207, de la Ley General de Salud; 40, fracciones III, 
VII y XI, 41, 43, 44 y 47, fracción I, de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 33, del Reglamento  de 
la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 4o., 15, 20, 25, 30, 101, 102 y 103, del Reglamento de 
Control Sanitario de Productos y Servicios; 2o., fracciones I, inciso a), 12, 209, 210, 211, 213, 215, 216, 217, 
220, 221, 222, 223, 224 y 1336, del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario  
de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; 36, del Reglamento Interior de la Secretaría de 
Salud; 3 o., fracción I, incisos, b), e), i) y k) y 10, fracciones IV y VIII, del Reglamento de la Comisión Federal 
para la Protección contra Riesgos S anitarios,  he tenido a bien ordenar la publicación del  
PROYECTO DE NORMA OFICIAL MEXICANA PROY -NOM -201-SSA1 -2013,  PRODUCTOS Y SERVICIOS. 
AGUA Y HIELO PARA CONSUMO HUMANO,  ENVASADOS Y A GRAN EL. ESPECIFICACIONES 
SANITARIAS  
El presente proyecto se publica a  efecto de que los interesados, dentro de los siguientes 60 días naturales, 
contados a partir de la fecha de su publicación presenten sus comentarios por escrito, en idioma español  y 
con el sustento técnico suficiente ante el Comité Consultivo Nacional de  Normalización de Regulación y 
Fomento Sanitario, sito en  Oklahoma número 14 planta baja, colonia Nápoles, código postal 03810 ,  México, 
D.F.; teléfono 50 -80-52-00, extensión 1333, fax 55 -11-14-99, correo electrónico rfs@cofepris.gob.mx.  
Durante el plazo m encionado, los documentos que sirvieron de base para la elaboración del proyecto y la 
Manifestación de Impacto Regulatorio (MIR) quedan a disposición del público para su consulta, en el domicilio 
del Comité.  
PREFACIO  
En la elaboración de este Proyecto de N orma Oficial Mexicana participaron las unidades administrativas, 
instituciones y organismos siguientes:  
SECRETARÍA DE SALUD.  
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.  
ANALYSIS AND RESEARCH LAB, S.A. DE C.V.  
ASOCIACIÓN NACIONAL DE PRODU CTORES DE REF RESCOS Y AGUAS CARBONATADAS, A. C. 
ASOCIACIÓN NACIONAL DE PRODUCTORES Y DISTRI BUIDORES DE AGUA PURIFICADA, A. C. 
BONAFONT S.A. DE C.V.  
COCA COLA DE MÉXICO.  
CORPORATIVO DE SERVICIOS EN AGUA Y AMBIENTE, S.A. DE C.V.  
GRUPO CENCON.  
GRUPO EMBOTELLADO RAS UNIDAS, S.A. B. C.V.  
GRUPO PEÑAFIEL S.A. DE C.V.  
LABORATORIO DE ANÁLISIS DE RIESGOS DEL D.F.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
LABORATORIO DE SERVICIOS AMBIENTALES.  
NESTLÉ MÉXICO S.A. DE C.V.  
SERVICIOS PROFESIONALES QUÍMICOS BIOLÓGICOS S.A. DE C.V.  
SERVICIOS DE AGUA Y DRENAJE DE MONTERR EY S.A. DE C.V.  
TECNOLOGÍA AMBIENTAL INTEGRAL S.A. DE C.V.  
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.  
Facultad de Química.  
ÍNDICE  
1. Objetivo y campo de aplicación.  
2. Referencias.  
3. Definiciones.  
4. Símbolos y abreviaturas.  
5. Disposiciones sanitarias.  
6. Control Sanitario del agua y hielo para consumo humano.  
7. Procedimiento de evaluación de la conformidad.  
8. Etiquetado.  
9. Concordancia con normas internacionales.  
10. Bibliografía.  
11. Observancia de la Norma.  
12. Vigencia.  
 APÉNDICE A NORMATIVO. MÉTODOS  DE PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS.  
 APÉNDICE B NORMATIVO. MÉTODOS DE PRUEBAS FISICOQUÍMICAS.  
1. Objetivo y campo de aplicación  
1.1 Esta Norma establece las características y especificaciones sanitarias que deben cumplir el agua y el 
hielo para consumo humano que  se comercialice preenvasado o a granel  y los establecimientos que se 
dediquen al proceso o importación de dichos productos.  
1.2 Esta Norma es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional para las personas físicas o morales 
que se dedican al proces o o importación de agua y hielo para consumo humano que se comercialicen 
preenvasados o a granel.  
2. Referencias  
Para la correcta aplicación de esta Norma, se sugiere consultar las siguientes normas oficiales o las que 
las sustituyan:  
2.1 Norma Oficial Mex icana NOM -008-SCFI -2002, Sistema General de Unidades de Medida.  
2.2 Norma Oficial Mexicana NOM -026-STPS -2008, Colores y señales de seguridad e higiene, e 
identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías.  
2.3 Norma Oficial Mexicana NOM -051-SCFI/ SSA1 -2010, Especificaciones generales de etiquetado para 
alimentos y bebidas no alcohólicas preenvasados -Información comercial y sanitaria.  
2.4 Norma Oficial Mexicana NOM -251-SSA1 -2009, Prácticas de higiene para el proceso de alimentos, 
bebidas o suplement os alimenticios.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
3. Definiciones  
Para fines de esta Norma  se entiende por:  
3.1 A granel:  al producto que debe pesarse, medirse o contarse en presencia del consumidor por no 
encontrarse preenvasado al momento de su venta.  
3.2 Agua para consumo humano:  a tod a aquella cuya ingestión no cause efectos nocivos a la salud. Se 
considera que no causa efectos nocivos a la salud, cuando se encuentra libre de gérmenes patógenos y de 
sustancias tóxicas, y cumpla, además con los requisitos que se señalan en la presente n orma.  
3.3 Agua tipo I: al Agua con una conductividad < 0.010 mS/m.  
3.4 Agua mineral:  a la que se caracteriza por: contenido de determinada sales minerales y sus 
proporciones relativas, obtenerse directamente de manantiales o fuentes perforadas procedentes de estratos 
acuíferos, en los cuales, dentro de los perímetros protegidos, deberán adoptarse las medidas para evitar que 
la calidad química o física del agua sufran algún tipo de contaminación, composición y calidad constante, 
envasarse cerca del punto de surgencia de la fuente, en condiciones que garantiza la pureza microbiológica y 
la composición química original en sus constituyentes esenciales, no someterse a otros tratamientos que los 
permitidos por esta Norma.  
3.5 Área de llenado:  a la zona donde se e nvasa y tapa el producto.  
3.6 Área de producción:  a la zona del establecimiento donde se realizan las operaciones para procesar 
agua y hielo para consumo humano.  
3.7 Blanco de curva de  calibración del instrumento: a la disolución del ácido usado como diluy ente.  
3.8 Blanco de reactivos:  a la disolución que contiene todos los reactivos usados en los mismos 
volúmenes y concentraciones en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe seguir los pasos de 
digestión y preparación de la muestra.  
3.9 Blanco de re activos fortificado:  a la disolución que se prepara a partir de una alícuota del blanco de 
reactivos, añadiendo una alícuota de la disolución estándar concentrada "disolución madre", para dar una 
concentración final que produzca una absorbancia aceptable ( aproximadamente 0,1) para el analito. El blanco 
de reactivos fortificado debe seguir el mismo esquema de digestión y preparación de la muestra.  
3.10 Blanco de método:  a la alícuota de agua destilada a la cual, junto a las muestras de control de 
calidad, de  control de calidad interno y fortificada, se le sigue todo el procedimiento.  
3.11 Carbono inorgánico:  a los carbonatos, bicarbonatos y CO 2. 
3.12 Carbono orgánico:  a todo aquel carbono enlazado covalentemente a moléculas orgánicas.  
3.13 Carbono orgánico di suelto:  a la fracción del carbono orgánico que pasa a través de filtro de fibra de 
vidrio con poro de 0.45 µm de diámetro.  
3.14 Carbono orgánico no purgable:  a la fracción de carbono orgánico remanente después de la purga 
mediante gas de arrastre.  
3.15 Cisterna o tanque de almacenamiento:  al depósito que sirve para almacenar el producto o materia 
prima en establecimientos o en transporte.  
3.16 Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos:  al grupo de parámetros analíticos que 
comprende a los halogenad os no volátiles como las dioxinas y furanos, herbicidas clorados, bifenilos 
policlorados, plaguicidas clorados y semivolátiles clorados.  
3.17 Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables:  al grupo de parámetros analíticos 
que comprende a los halo genados volátiles como los halometanos, hidrocarburos clorados de bajo peso 
molecular y volátiles clorados.  
3.18 Compuestos orgánicos no halogenados:  al grupo de parámetros analíticos que comprende a los 
carbamatos, hidrocarburos poliaromáticos, plaguicida s fosforados, compuestos orgánicos semivolátiles no 
clorados, endotal, glifosato y plaguicidas derivados de la urea.  
3.19 Carbono orgánico purgable:  al grupo de parámetros analíticos que comprende a los compuestos 
orgánicos volátiles no halogenados.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
3.20 Desinfección:  a la reducción del número de microorganismos presentes, por medio de agentes 
químicos y/o métodos físicos, a un nivel que no comprometa la inocuidad o la aptitud del alimento, bebida o 
suplemento alimenticio.  
3.21 Espectrometría de absorción a tómica: a una rama del análisis instrumental en el cual un elemento 
es atomizado en forma tal que permite la observación, selección y medida de su espectro de absorción.  
3.22 Espectrometría de absorción atómica por flama:  al método por el cual el elemento se determina 
mediante un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un sistema de nebulización y una 
fuente de atomización.  
La fuente de atomización es un quemador que utiliza diferentes mezclas de gases, las más frecuentes son 
aire-acetilen o y óxido nitroso -acetileno.  
3.23 Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito:  al método mediante el cual el 
elemento se determina por un espectrómetro de absorción atómica, usado en conjunto con un horno de 
grafito. El principio es esencialme nte el mismo que en absorción atómica de aspiración directa en flama, 
excepto que se usa un horno en lugar de la flama para atomizar la muestra.  
3.24 Espectrometría de absorción atómica por generación de hidruros:  es un método similar al del 
vapor frío. La s muestras reaccionan en un dispositivo externo con un agente reductor, generalmente 
borohidruro. Los productos gaseosos de reacción se llevan a una celda de muestreo que se encuentra en el 
paso óptico del espectrómetro de absorción atómica, en este caso, los productos de reacción son hidruros 
volátiles. Estos compuestos moleculares no son capaces de dar una señal de absorción atómica, por lo tanto 
la celda se calienta para disociar el hidruro gaseoso en átomos libres. Cuando el hidruro gaseoso se disocia 
en la celda calentada en átomos libres, la absorción atómica crece y cae a medida que se crean los átomos y 
escapan de la celda de absorción. Se mide el máximo de absorción o altura de pico, como señal analítica. Los 
elementos que se pueden determinar con e sta técnica son: As, Pb, Sb, Se.  
3.25 Espectrometría de absorción atómica por vapor frío:  al método que es otra aproximación para 
mejorar la sensibilidad de la absorción atómica, optimizando la eficiencia de muestreo en el quemador de  pre-
mezcla, en donde  el mercurio se reduce químicamente al estado atómico libre haciendo reaccionar la muestra 
con un reductor fuerte (cloruro estanoso o borohidruro de sodio) en un recipiente de reacción cerrado. El 
mercurio volátil libre se arrastra del matraz de reacción b urbujeando aire o nitrógeno a través de la disolución. 
Los átomos del mercurio que se arrastran son transportados a una celda de absorción que se coloca en el 
paso de luz del espectrómetro de absorción atómica. A medida que los átomos de mercurio pasan por  la celda 
de muestreo, la absorbancia medida se incrementa indicando el aumento de concentración en el paso de luz.  
3.26 Envase:  a cualquier  recipiente, o envoltura en el cual está contenido el producto preenvasado para 
su venta al consumidor.  
3.27 Fuente de abastecimiento:  al lugar a partir del cual se obtiene el agua como materia prima, incluye 
pero no limita a pozos, manantiales, entre otros, sin considerar los sistemas de abastecimiento de  agua 
potable.  
3.28 Hielo para consumo humano:  al producto obten ido por congelación del agua para  consumo 
humano.  
3.29 Inocuo , a lo que no hace o causa daño a la salud.  
3.30 Límite de detección, sensibilidad, y rangos de concentración:  La sensibilidad del espectrómetro 
de absorción atómica de flama es definido como la  concentración que el metal produce en una absorción del 
1% (una absorbancia de aproximadamente 0.0044). El límite de detección del instrumento es definido como la 
concentración que produce la absorción equivalente a dos veces la magnitud de la fluctuación  de fondo. La 
sensibilidad y el límite de detección varían de acuerdo al instrumento.  
3.31 Límite máximo permisible:  a la cantidad establecida de los parámetros que no se debe exceder en 
el producto terminado.  
3.32 Limpieza:  a la acción que tiene por objet o quitar la suciedad.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
3.33 Lote,  a la cantidad de un producto elaborado en un mismo ciclo, integrado por unidades homogéneas 
e identificadas con un código específico.  
3.34 Materia extraña:  a la sustancia, resto o desecho orgánico o no, que se presenta en e l producto, sea 
por contaminación o por manejo no higiénico del mismo durante su elaboración, o comercialización, 
considerándose entre otros: excretas, pelos de cualquier especie, huesos e insectos.  
3.35 Materia prima:  a todas las sustancias que se emplean  en la producción o elaboración y que forman 
parte del producto terminado.  
3.36 Material sanitario:  al que no cede sustancias tóxicas a los productos, que entran en contacto con él 
y es de fácil limpieza y desinfección.  
3.37 Métodos de prueba:  a los proced imientos analíticos utilizados en el laboratorio para comprobar que 
un producto satisface las especificaciones que establece la Norma.  
3.38 Método de adiciones estándar:  al que implica la preparación de estándares en la matriz de la 
muestra, añadiendo cant idades conocidas de un estándar a una o más alícuotas de la muestra y que 
compensa los efectos de exaltación o depresión de la señal del analito, pero no corrige interferencias aditivas 
que causan una desviación de la línea de base y en la cual los resulta dos obtenidos son válidos si: La curva 
analítica es lineal, la forma química del analito es la misma que en la muestra, el efecto de interferencia es 
constante en el intervalo de trabajo, la señal se corrige por interferencia aditiva.  
3.39 Muestra de contr ol de calidad: a una muestra externa al laboratorio, que contiene una alícuota de 
concentración conocida del analito, cuyos valores de absorbancia deben estar comprendidos en el intervalo 
lineal del método.  
3.40 Muestra de control de calidad Interno: a una  disolución con el analito a determinar, preparada a 
partir de una marca o número de lote diferente al estándar utilizado en la curva de calibración.  
3.41 Muestra fortificada:  a la muestra a la cual se le adiciona una alícuota de concentración conocida del  
analito, diluida en el ácido apropiado de tal forma que la disolución resultante tenga una absorbancia dentro 
del intervalo lineal de la curva.  
3.42 Personal:  a todo aquel individuo que interviene en cualquier etapa del proceso.  
3.43 Proceso:  al conjunto de actividades relativas a la obtención, elaboración, fabricación, preparación, 
conservación, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulación, transporte, distribución, 
almacenamiento y expendio o suministro al público de los productos.  
3.44 Producto p reenvasado:  al producto que fuera del punto de venta es colocado en un envase de 
cualquier naturaleza, en ausencia del consumidor final, y la cantidad de producto contenido en él no puede ser 
alterada a menos que el envase sea abierto o modificado percepti blemente  
3.45 Producto terminado:  al producto que se ofrecerá al consumidor final, ya sea preenvasado  o a 
granel.  
3.46 Riesgo:  a la probabilidad de que se desarrolle cualquier propiedad biológica, química o física que 
cause daño a la salud del consumidor.  
3.47 Salmuera:  a la solución saturada de cloruro de sodio y que puede contener aditivos.  
3.48 Tratamiento:  a la operación o serie de operaciones a la que es sometida el agua o el hielo durante 
su elaboración, con el propósito de eliminar o reducir su cont aminación.  
4. Símbolos y abreviaturas  
4.1 Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entenderá por:  
4.1.1  HCN  Ácido cianhídrico  
4.1.2  HCI Ácido clorhídrico.  
4.1.3  NWRI -HPCA  Agar cuenta en placa heter otrófica del N WRI.  
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
4.1.4  m-HPCA  Agar membrana cuenta de placa heterotrófica.  
4.1.5  R2A Agar Resorner´s 2A  
4.1.6  PSE Agar Selectivo para Enterococos Pfizer.  
4.1.7  ACUERDO  Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, 
bebidas y suplemento s alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias.  
4.1.8  ATCC  American Type Culture Collection (por sus siglas en inglés)  
4.1.9  Sb Antimonio.  
4.1.10 As Arsénico.  
4.1.11 AOAC  Association of Official Analytical C hemists (por sus siglas en inglé s) 
4.1.12  Bq/L Bequerel por litro.  
4.1.13 Co2 Bióxido de carbono.  
4.1.14 Cd Cadmio.  
4.1.15 EC Caldo E. coli.  
4.1.16 BHI Caldo infusión cerebro corazón.  
4.1.17 cm Centímetro.  
4.1.18 cm2 Centímetro cuadrado.  
4.1.19 KCN  Cianuro de potasio.  
4.1.20 CNCI  Cloruro de cianógeno  
4.1.21 AOX  Compuestos orgánicos halogenados absorbibles  
4.1.22 Co  Cobalto.  
4.1.23 Cu Cobre.  
4.1.24 DGN  Dirección General de Normas.  
4.1.25 SPA Establecimientos Salud por Agua . 
4.1.26 Fe Fierro.  
4.1.27 °C Grado Celsius.  
4.1.28 g Gramo.  
4.1.29 h Hora.  
4.1.30 F- Ión fluoruro.  
4.1.31 kg Kilogramo.  
4.1.32 kPa Kilopascal  
4.1.33 Ley  Ley General de Salud.  
4.1.34 L Litro.  
4.1.35 ± Más o menos.  
4.1.36 > Mayor que  
4.1.37 < Menor que.  
4.1.38 Hg Mercurio.  
4.1.39 P-A Método de presencia ausencia.  
 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
4.1.40 µ
 Microohm.  
4.1.41 µg Microgramo.  
4.1.42 µL Microlitro.  
4.1.43 µ Micrómetro.  
4.1.44 µm Micró metros.  
4.1.45 mL Mililitro.  
4.1.46 mg Miligramo.  
4.1.47 mg/L  Miligramo por litro.  
4.1.48 mm Milímetro.  
4.1.49 ms/m MiliSiemens por met ro. 
4.1.50 mv Milivolts.  
4.1.51 RMV  Milivolts relativos.  
4.1.52 min Minuto.  
4.1.53 M Molar  
4.1.54 MCC  Muestra de control de calidad.  
4.1.55 MCI Muestra de control de calidad interno.  
4.1.56 DPD  N,N-dietil-p-difenildiamina.  
4.1.57 nm Nanómetro.  
4.1.58 NWRI  National Water Research Institute  (Por sus siglas en inglés)  
4.1.59 No. Número.  
4.1.60 NMP  Número Más Probable.  
4.1.61 ppm Partes por millón  
4.1.62 p Peso.  
4.1.63 pg Picogramo.  
4.1.64 Pt  Platino.  
4.1.65 Pb Plomo.  
4.1.66 PTFE  Politerafluor oetileno.  
4.1.67 % Por ciento.  
4.1.68 pH Potencial de hidrógeno.  
4.1.69 Reglamento  Reglamento de Control Sanitario de Productos y Servicios.  
4.1.70 rpm Revoluciones por minuto.  
4.1.71 SPANDS  Sal trisódica del ácido 1,8 -dihidroxi -2-(4- sulfofenilazo) n aftalen -3,6-disulfónico.  
4.1.72 FIAS  Sistemas automatizados de inyección en flujos continuos.  
4.1.73 seg Segundo.  
4.1.74  Se Selenio.  
4.1.75 N Solución normal.  
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
4.1.76 ABS Sulfonato de Aquil Benceno.  
4.1.77 TFE Tetrafluoroetileno.  
4.1.78 THM  Triahalo metanos.  
4.1.79 mol Unidad con que se mide la cantidad de una sustancia.  
4.1.80 UFC  Unidades Formadoras de Colonias.  
4.1.81 UNT  Unidades Nefelométricas de Turbiedad.  
4.1.82 UV  Ultravioleta.  
4.1.83 v Volumen.  
4.1.84 M-PA Medio Pseudomonas Aeruginos a 
4.1.85 M-PAC Medio Pseudomonas Aeruginosa  Compuesto  
4.1.86 DRCM  Medio diferencial reforzado para clostridia   
 
5. Disposiciones sanitarias  
Los establecimientos, además de cumplir con lo establecido en la Ley, el Reglamento y la Norma Oficial 
Mexicana N OM-251-SSA1 -2009  (véase punto 2.4, del capítulo de Referencias, de esta Norma), se deberán 
ajustar a las siguientes disposiciones:  
5.1 Agua.  
5.1.1 Abastecimiento sanitario del agua. En caso de que la materia prima se obtenga directamente de una 
fuente de a bastecimiento:  
5.1.1.1  No deben construirse obras de captación en fuentes de abastecimiento cuyas cargas de 
contaminantes por su magnitud y peligrosidad pongan en riesgo la salud humana . 
5.1.1.2  La fuente de abastecimiento y las obras de captación deben pr otegerse mediante separación 
física, con la altura o distancia suficiente que impida la deposición de desechos sólidos, líquidos o excretas y 
el paso de animales. Sólo se permitirá el acceso a personal autorizado . 
5.1.1.3  Las tuberías, bombas y otros dispo sitivos que estén en contacto con el agua para consumo 
humano y que sean utilizados para la captación, deben ser de material sanitario.  
5.1.2 Establecimientos.  
5.1.2.1  Además de lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM -026-STPS -2008 (véase punto 2.2 , 
del capítulo de Referencias, de esta norma), las tuberías que conduzcan agua en distintas etapas del p roceso 
o fluidos diferentes de é sta, se deben identificar de acuerdo con el código propio de la empresa, que debe 
proporcionarse durante la verificación . Cualquier forma de identificación debe ser visible para el personal.  
5.1.2.2  El agua que se utilice para propósitos no relacionados con el producto, debe transportarse por 
tuberías diferentes, separadas, sin que haya alguna conexión ni sifonado de retroc eso con las tuberías que 
transportan la de proceso y el agua lista para envasarse.  
5.1.2.3  Las áreas de lavado y desinfección, llenado y de producción deberán contar con:  
5.1.2.3.1  El área de llenado debe estar completamente aislada de las demás áreas, dur ante dicha 
operación, los accesos de recepción y salida del envase deben mantenerse cerrados o protegidos de manera 
que se evite la contaminación del producto.  
5.1.2.3.2  Las boquillas de llenado, así como las válvulas y el maneral deben ser de material san itario, 
limpiarse y desinfectarse al inicio de la operación.  
5.1.2.3.3  Al paro de operaciones, el agua no debe permanecer en reposo en las tuberías. En caso de no 
haber un sistema que permita su desalojo, deben existir los procedimientos y sistemas para ga rantizar que el 
agua que permaneció en las tuberías regrese al principio del proceso donde se le someta a las operaciones 
necesarias que garanticen su inocuidad.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
5.1.2.4  Las áreas de expendio deberán contar con:  
5.1.2.4.1  En el caso de venta directa al con sumidor de agua a granel, además de los puntos señalados 
anteriormente, deberá contar con un área cerrada para el lavado de garrafones  y un área de llenado ubicada 
fuera de tránsito vehicular, en el que el dispositivo de llenado debe contar con mecanismos de cierre 
automático de la puerta con ajuste al marco que impida el inicio de la operación de llenado del garrafón en 
tanto la puerta no esté cerrada.  
5.1.2.4.2  En caso de que el establecimiento suministre o expenda agua a granel, debe colocar letreros 
visibles que señalen el riesgo que representa para la salud el llenado de envases sucios o que hayan 
contenido sustancias tóxicas y su manejo inadecuado. Las letras deben tener un tamaño de 5 cm de altura 
como mínimo y ser de colores contrastantes, refiriéndo se a alguno de los siguientes temas: “TRANSPORTA 
TUS ENVA SES Y GARRAFONES BIEN TAPADOS” o  “NO UTILICES ENVASES QUE HAYAN  CONTENIDO 
SUSTANCIAS TÓXICAS” o  “LAVA Y DESINFECTA TU GARRAFÓN ANTES DE LLENARLO”.  
5.1.3 Transporte.  
5.1.3.1  Cuando se lleven a cabo la s operaciones de carga y descarga, tanto para el caso de materia prima 
como producto terminado, las conexiones entre la cisterna, válvulas y mangueras de distribución, así como el 
equipo en general del transporte de agua a granel, no debe presentar fugas. Durante el recorrido las bocas de 
las mangueras de las cisternas deben mantenerse protegidas con dispositivos de material sanitario, a fin  de 
evitar su contaminación con el medio ambiente.  
5.1.3.2  Los medios de transporte del agua destinada al envasado no  deberán ser utilizados para 
transportar otro tipo de agua.  
5.1.3.3  El agua para consumo humano trasportada a granel no deberá ser comercializada directamente al 
consumidor final por este medio.  
5.1.4 Condiciones sanitarias de los envases.  
5.1.4.1  Las tapa s deberán ser nuevas de material inocuo y lavarse previamente a su utilización. En caso 
de contaminación, éstas deberán lavarse y desinfectarse con soluciones que no modifiquen, reaccionen o 
alteren sus características y evitando la contaminación por arras tre. 
5.1.4.2  En caso que el establecimiento ponga envases vacíos o tapas a disposición del consumidor, éstos 
deberán ser nuevos, estar limpios, desinfectados y empacados.  
5.1.5 Especificaciones sanitarias del producto terminado.  
5.1.5.1  Límites máximos  permisibles  del agua para consumo humano.  
5.1.5.1.1  Organolépticas y físicas.  
ESPECIFICACIÓN.  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE.  
Color.  15 (Pt/Co).  
Turbiedad.  3,0 (UNT).  
 
5.1.5.1.2  Microbiológicas.  
ESPECIFICACIÓN.  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE(1) 
 (NMP/100 mL)  UFC/100  mL Organismos/100mL  
Coliformes Totales.  <1,1 CERO  Ausencia  
Pseudomonas aeruginosa(2). <1,1 CERO  No aplica  
Enterococos fecales(3). <1,1 CERO  Ausencia  
Esporas de Clostridium  sulfito reductores(2, 3). <1,1 CERO  No aplica  
Mesofílicos Aerobios.  No aplica  (4) No aplica  
(1) La unidad a reportar será de acuerdo al método utilizado.  
(2) Especificaciones sólo para agua mineral natural.  
(3) La autoridad sanitaria establecerá los casos en que se realizará la determinación de  estas 
especificaciones.  
(4) Se determi na en base al cálculo establecido en el punto 6.1.1, de esta Norma, en unidades de UFC/mL.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
5.1.5.1.3  Metales, metaloides y compuestos inorgánicos.  
ESPECIFICACIÓN  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE  
(mg/L)  
Antimonio.  0,005  
Arsénico.  0,01 
Bario.  0,70 
Borato como B.  5,00 
Cadmio.  0,003  
Cromo total.  0,05 
Cobre.  1,00 
Cianuro.  0,07 
Fluoruros como F -. 0,70(5) 
5,00(6) 
Manganeso.  0,40 
Mercurio.  0,001  
Níquel.  0,02 
Nitrógeno de nitratos.  10,00  
Nitrógeno de nitritos.  0,06 
Plomo.  0,01 
Selenio.  0,01 
(5)No aplica par a aguas minerales naturales.  
(6)Aplica para aguas minerales naturales, ver apartado de Etiquetado.  
5.1.5.1.4  Compuestos orgánicos sintéticos.  
ESPECIFICACIÓN.  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE  
(mg/L).  
Compuestos orgánicos 
halogenados adsorbibles 
fijos. 0,0005  
Comp uestos orgánicos 
no halogenados.  0,01 
Compuestos orgánicos 
halogenados adsorbibles 
purgables.  0,001  
Carbono Orgánico 
Purgable.  0,01 
Sustancias activas al 
azul de metileno.  0,5 
 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
5.1.5.1.5  Desinfectantes.  
ESPECIFICACIÓN.  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE  
(mg/L).  
Cloro residual libre.  0,1 
 
5.1.5.1.6  Subproductos de desinfección.  
DESINFECTANTE  
UTILIZADO.  ESPECIFICACIÓN.  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE  
(mg/L).  
Cloro  Formaldehído.  0,9 
Bromodiclorometano.  0,06 
Bromoformo.  0,1 
Dibromoclorometano.  0,1 
Cloroformo.  0,2 
Ozono  Formaldehído.  0,9 
Bromato.  0,01 
 
5.1.5.1.6.1  En aguas minerales naturales, los subproductos de desinfección deberán estar ausentes.  
5.1.5.1.7  Radiactivos.  
ESPECIFICACIÓN.  LÍMITE MÁXIMO PERMISIBLE  
(Bq/L).  
Radiactividad beta total (7). 1,85 
Radiactividad alfa total (7). 0,56 
(7) Aplica s ólo para aguas minerales naturales.  
5.1.5.2  Aditivos y coadyuvantes de proceso.  
Cuando se adicione al producto dióxido de carbono o anhídrido del ácido carbónico, nitrógeno o 
poliacrilamida se deberá sujetar a lo  especificado en el ACUERDO.  
5.1.5.3  Materia Extraña.  
5.1.5.3.1 Ausente en cualquier presentación del producto terminado.  
5.2 Hielo.  
5.2.1 El proceso de fabricación de hielo debe cumplir con las especificaciones sanitarias del agua para 
consumo humano, ade más de las siguientes disposiciones:  
5.2.1.1  Establecimientos.  
5.2.1.1.1  Se debe contar con un dispositivo con solución para desinfección de calzado al ingreso de las 
áreas de llenado de moldes, desmoldado, corte, almacenamiento y envasado. Las personas qu e ingresen 
deberán desinfectar su calzado en estos dispositivos.  
5.2.1.1.2 El andén de despacho debe ser desinfectado al inicio de las operaciones.  
5.2.1.1.3 En los casos en que por operación sea necesario desplazar el hielo sobre el piso o cualquier otra 
superficie en las áreas d e proceso o almacenamiento, ésta s deberán limpiarse diariamente y desinfectarse 
con la frecuencia que sea necesaria, de tal forma que durante el manejo del hielo se evite el riesgo de 
contaminación del producto.  
5.2.1.1.4 El llenad o de los moldes debe hacerse a través de tubería fija.  
5.2.1.1.5  Los moldes no deben sumergirse por completo en la salmuera.  
5.2.1.1.6  Para el despegue del producto se deberá usar agua que se utiliza como materia prima.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
5.2.2  Especificaciones sanitarias de l producto.  
5.2.2.1  El producto terminado deberá cumplir con las especificaciones establecidas para el agua de 
consumo humano de esta Norma y comercializarse preenvasado.  
6. Control Sanitario del agua y hielo para consumo humano  
6.1 Se debe contar con un p rograma de muestreo, el cual debe indicar como mínimo, el número de 
muestras que deben examinarse, el tamaño de esas muestras, el método de análisis empleado y su 
sensibilidad, el número de muestras y cantidad de microorganismos que harán que el lote se co nsidere 
inaceptable o fuera de especificaciones.  
6.1.1 El parámetro de control de proceso, con excepción del proceso del agua mineral natural, será la 
cuenta total de mesofílicos aerobios. El límite máximo particular del establecimiento, se determinará de 
acuerdo a lo siguiente:  
6.1.1.1  Se colectará un mínimo de 30 datos con una frecuencia semanal, que deberán estar dentro del 
intervalo de 0 a 1,000 UFC/mL.  
6.1.1.2  Intervalo de tiempo para la colecta de datos deberá establecerse en un plazo no mayor a un añ o, a 
partir de la entrada en vigor de esta Norma o de inicio de operaciones del establecimiento.  
6.1.1.3  El límite máximo permisible del establecimiento, será la media aritmética de los 30 datos más dos 
veces la desviación estándar.  
6.1.2  Se podrá exentar la frecuencia semanal para aplicar una frecuencia mensual, sólo cuando sea 
sustentado mediante información asentada en bitácora, que no se excede el límite máximo en análisis 
realizados a lo largo de un año, posteriores a la determinación de la desviación estándar.  
6.2 La frecuencia mínima de análisis de las especificaciones del producto terminado debe ser de acuerdo 
a los requisitos establecidos en el Cuadro 1 de esta Norma y deberá documentarse en bitácoras o registros.  
Cuadro 1. Frecuencia mínima de anál isis de agua y hielo.  
ESPECIFICACIÓN.  FRECUENCIA.  
Organolépticos y físicos.  Mensual.  
Coliformes totales.  Semanal.  
Metales, metaloides y compuestos inorgánicos.  Anual.  
Compuestos orgánicos sintéticos.  Anual.  
Desinfectantes.  Cada cuatro horas.  
Subprodu ctos desinfección.  Anual.  
Radiactivos.  Cada cinco años.  
 
6.3 Para metales, metaloides y compuestos inorgánicos, compuestos orgánicos sintéticos y radiactivos, se 
modificará la  frecuencia de muestreo señalada en el Cuadro 1 de esta Norma a trimestral, cua ndo la fuente de 
abastecimiento contenga niveles más altos de los límites máximos permisibles señalados en esta Norma.  
6.4 En la prueba de Pseudomonas aeruginosas la frecuencia debe ser mensual y cuando se demuestre 
mediante información asentada en bitácor a que se encuentra ausente a lo largo de 12 meses, la frecuencia 
será trimestral.  
7. Procedimiento de evaluación de la conformidad  
7.1 La evaluación de la conformidad podrá ser solicitada por el representante legal o la persona que tenga 
facultades para el lo, ante la autoridad competente o las personas acreditadas y aprobadas para tales efectos.  
8. Etiquetado  
8.1 La información sanitaria que debe figurar en la etiqueta de los productos preenvasados objeto de esta 
Norma, así como en los envases que pongan la s empresas a disposición del consumidor, además de cumplir 
con lo establecido en la Norma Oficial Mexicana NOM -051-SCFI/SSA1 -2010 (véase punto 2.3, del capítulo de 
Referencias, de esta Norma), deberá ajustarse a lo siguiente:  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
8.2 Se debe declarar:  
8.2.1  En el caso de agua envasada, contenido de sodio en mg por 100 mL.  
8.2.2  Cuando s e utilice anhídrido carbónico, é ste debe reportarse con el nombre común o los sinónimos 
establecidos en el ACUERDO, el agua adicionada con anhídrido carbónico podrá nombrarse com o agua 
carbonatada o gasificada.  
8.2.3  En el caso del hielo deberá ostentar la leyenda “Hielo para consumo humano”.  
8.2.4  Para el agua mineral natural, si el producto contiene más de 0.7 mg/L de fluoruro, en la etiqueta 
aparecerá, como parte del nombre del  producto o muy cerca de é ste, o en un algún otro lugar destacado, la 
siguiente frase: “Contiene fluoruro”. Además, cuando el producto contenga más de 1.5 mg/L de fluoruro, se 
deberá incluir en la etiqueta la siguiente frase: “Este producto no es apto para  lactantes y niños menores de 
siete años”.  
8.3 No se permite además de lo especificado en la Norma Oficial Mexicana NOM -051-SCFI/SSA1 -2010 
(véase punto 2.3, d el capítulo de Referencias, de e sta Norma) , lo siguiente en el etiquetado y la publicidad del 
producto terminado:  
8.3.1  Declaraciones que indiquen que el producto ha adquirido un valor especial o superior gracias a la 
adición de minerales o la modificación de sus propiedades tales como pH, estructura molecular, 
conductividad, cantidad de oxígeno, entre  otros.  
8.3.2.  Ostentar le yendas de que el producto por sí  solo sirve para adelgazar, variar las proporciones del 
cuerpo o bien para el control de peso.  
8.3.3.  Declarar u ostentar de forma escrita, gráfica o descriptiva, que los productos, su uso, ingredie ntes o 
cualquier otra característica, están recomendados, respaldados o aceptados por centros de investigación, 
asociaciones, entre otros.  
9. Concorda ncia con normas internacionales  
9.1 Esta Norma es parcialmente equivalente con la CODEX STAN 108 -1981. Rev isiones: 1997, 2008.  
10. Bibliografía  
10.1 Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyuvantes en alimentos, bebidas y suplementos 
alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias. Publicado el 16 de julio de 2012.  
10.2 ISO 7704: 1985 Water quality -Evaluation of membrane filters used for microbiologial analyses.  
10.3 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Asso ciation. 
21th Ed. Washington D. C. 2005. EUA.  
10.4 WHO Guidelines for Drinking -Water Quality. 3th  Edition, Vol. 1. World Health Organization.  Geneva, 
2004.  
11. Observancia de la Norma  
11.1 La vigilancia del cumplimiento de esta Norma Oficial Mexicana corresponde a la Secretaría de Salud 
y a los Gobiernos de las Entidades Federativas en sus respectivo s ámbitos de competencia.  
12. Vigencia  
12.1 Esta Norma entrará en vigor a los 60 días naturales después de su publicación en el Diario Oficial de 
la Federación.  
TRANSITORIO  
ÚNICO. - La entrada en vigor de esta norma, deja sin efectos a la Norma Oficial Mexi cana NOM -201-SSA1 -2002,  
Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasados a granel. Especificaciones sanitarias, 
publicada en el Diario Oficial de la Federación el 18 de octubre de 2002.  
Sufragio Efectivo. No Reelección.  
México, D.F., a 19  de diciembre de 2013 .- El Comisionado Federal y Presidente del Comité Consultivo 
Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario , Mikel Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbrica.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
Apéndice A Normativo.  
Métodos de pruebas microbiológicas.  
A.1. Método de  prueba para la determinación de Coliformes.  
A.1.1. Fundamento.  
Las bacterias coliformes son un grupo heterogéneo compuesto por varias especies. Existe poca evidencia 
que indique que estas bacterias coliformes pertenezcan a un solo género taxonómico. La fa lta de certeza en 
cuanto a su filiación taxonómica y la imprecisa correlación entre los métodos recomendados para la detección 
de coliformes han presentado problemas. El primero, es que Escherichia coli  es aceptada como bacteria 
coliforme, la especie conti ene variantes que no producen gas de la lactosa lo hacen después de 48 horas, por 
lo que no se les identifica por medio de este método. Segundo, la capacidad de fermentar la lactosa está 
frecuentemente asociada a genes localizados en plásmidos. Estos deter minantes extracromosomales son 
fácilmente transferidos entre otras bacterias Gram negativas no relacionadas a las coliformes, que pueden, en 
consecuencia, ser recuperadas en la etapa inicial del análisis. No obstante en la práctica, la técnica ha 
demostrad o su efectividad.  
Coliformes, bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos, que a 35°C 
fermentan la lactosa con la producción de gas bajo las condiciones especificadas en esta Norma.  
El método se basa en que las bacterias coli formes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ±1°C durante 24 a 
48 h, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación.  
A.1.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.  
A.1.2.1 Trabajar  en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.  
A.1.2.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante 
horno, durante 2 h de 170 a 175°C o 1 h a 180°C o autoclave a 121 ±1.0°C durante 15 min como  mínimo.  
A.1.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios  de 
cultivo.  
A.1.2.4 El laboratorio debe tener claramente definido un sistema de control de calidad para asegurar que 
los materiales, equipos, reac tivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
A.1.2.5 Cuando se indique agua debe entenderse como agua destilada con pH de 5 a 7.  
A.1.2.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse materia l 
de vidrio dañado por la esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.  
A.1.3. Materiales.  
A.1.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 mL y 1 mL (o sí es necesario de 11 mL y 2 mL), con 
tapón de algodón. Las pipetas pueden ser graduad as en volúmenes iguales a una décima de su  volumen 
total.  
A.1.3.2 Frascos de vidrio de 250 mL con tapón de rosca.  
A.1.3.3 Utensilios esterilizables para la obtención de muestras: cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, 
espátulas, etc.  
A.1.3.4 Tubos de culti vo 20 x 200 mm y de 16 x 160 mm con tapones metálicos o de rosca.  
A.1.3.5 Campanas de fermentación (tubos de Durham).  
A.1.3.6 Gradillas de plástico o metal.  
A.1.3.7 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3 mm de diámetro.  
A.1.4 Medios de cultivo y re activos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser  grado 
analítico.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.1.4.1 Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada).  
Ingrediente.  Cantidad.  
Fosfato monopotásico.  34.0 g  
Agua.  1.0 L  
 
A.1.4.1.1 Preparación.  
A.1.4.1.1.1  Disolv er el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 con solución reguladora de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera.  
A.1.4.1.1.2 Llevar a un litro con agua.  
A.1.4.1.1.3 Esterilizar durante 15 min a 121 ±1.0°C.  
A.1.4. 1.1.4 Conservar en refrigeración (solución concentrada).  
A.1.4.1.1.5 Tomar 1.25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua.  
A.1.4.1.1.6 Distribuir en porciones de 99, 90 y 9 mL para tener disponible cuando se requiera realizar 
dilución de l a muestra.  
A.1.4.1.1.7 Esterilizar durante 15 min a 121 ±1°C.  
A.1.4.1.1.8 Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deben ser 
iguales a los iniciales.  
A.1.4.1.1.9 Si este diluyente no es usado inmediatamente, alm acenar en lugar obscuro a una temperatura 
entre 0 a 5°C en un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen  o 
composición.  
A.1.4.2 Caldo lactosado (medio de enriquecimiento para agua potable y hielo).  
Ingrediente.  Medio de conc entración  
1.5 Medio de concentración 
sencilla.  
Extracto de carne.  4.5 g  3.0 g  
Peptona de gelatina.  7.5 g  5.0 g  
Lactosa.  7.5 g  5.0 g  
Agua destilada.  1000.0 mL  1000.0 mL  
 
A.1.4.2.1 Preparación.  
A.1.4.2.1.1 Disolver los ingredientes en 1 L de agua, cale ntando si es necesario o el medio completo 
deshidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante.  
A.1.4.2.1.2 Ajustar el pH final con disolución de hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N 
según se requiera, de tal manera que después de la esterilización é ste sea de 6.9 ±0.2 a 25°C.  
A.1.4.2.1.3 Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de 
concentración sencilla y de 20 mL en tubos de 20 x 200 mm el medio de concentración 1.5, cada tubo debe 
tener ca mpana de fermentación.  
A.1.4.2.1.4  Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ±1.0°C.  
A.1.4.2.1.5 Enfriar rápidamente para evitar una exposición excesiva al calor. El aspecto del caldo es claro 
y de color beige.  
A.1.4.2.1.6 Se puede utilizar una concentraci ón doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán  10 
mL del caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de la muestra.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.1.4.3 Caldo lauril sulfato triptosa (medio de enriquecimiento selectivo).  
Ingrediente.  Medio de  
concentración  
1.5 Medio de concen tración  
Sencilla.  
Triptosa.  30.0 g  20.0 g  
Lactosa.  7.5 g  5.0 g  
Fosfato dipotásico.  4.125 g  2.75 g  
Fosfato monopotásico.  4.125 g  2.75 g  
Cloruro de sodio.  7.50 g  5.0 g  
Lauril sulfato de sodio.  0.15 g  0.1 g  
Agua destilada.  1.0 L  1.0 L  
 
A.1.4.3.1 Prepa ración.  
A.1.4.3.1.1 Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o cuando utilice medio 
de cultivo deshidratado siga las instrucciones del fabricante.  
A.1.4.3.1.2 Ajustar el pH con disolució n de hidróxido de sodio 0.01 N o  una disolu ción de HCl 0.01 N 
según se requiera, de tal manera qu e después de la esterilización é ste sea de 6.8 ±0.2 a 25°C.  
A.1.4.3.1.3 Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm el medio de 
concentración sencilla y de 20 mL en tubos de  20 x 200 mm, el medio de concentración 1.5, cada tubo debe 
tener campana de fermentación (Durham).  
A.1.4.3.1.4 Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ±1.0°C.  
A.1.4.3.1.5 Se recomienda almacenar en refrigeración el medio una vez preparado.  
A.1.4.3.1.6 Las campanas de fermentación no deben de contener burbujas de aire una vez atemperadas 
después de la esterilización.  
A.1.4.3.1.7 Alternativamente a las campanas de Durham utilizar p úrpura de bromocresol a una 
concentración de 0.01 g/L al caldo de lauriltrip tosa, la producción de ácido se observará por el vire de  este 
indicador.  
A.1.4.3.1.8 Se puede utilizar una concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 
mL de caldo preparado, cuando se agreguen 10 mL de muestra.  
A.1.4.4 Caldo bil is verde brillante (medio de confirmación).  
Ingrediente.  Cantidad  
Peptona.  10.0 g  
Lactosa.  10.0 g  
Sales biliares.  20.0 g  
Verde brillante.  0.0133 g  
Agua.  1.0 L  
 
A.1.4.4.1 Preparación.  
A.1.4.4.1.1 Disolver los componentes o el medio completo deshidrata do en agua, calentar si es necesario.  
A.1.4.4.1.2 Ajustar el pH con disolució n de hidróxido de sodio 0.01 N o  una disolución de HCl 0.01 N 
según se requiera, de tal manera qu e después de la esterilización é ste sea de 7.2 a 25°C.  
A.1.4.4.1.3 Distribuir el m edio en cantidades de 10 mL en tubos de 16 x 160 mm conteniendo campana de 
fermentación.  
A.1.4.4.1.4 Esterilizar en autoclave por 15 min a 121 ±1.0°C.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.1.4.4.1.5 Las campanas de fermentación no deben contener burbujas de aire después de la 
esterilización.  
A.1.4.5 Caldo EC.  
Ingrediente.  Medio de concentración  
Sencilla.  
Triptosa.  20.0 g  
Lactosa.  5.0 g  
Fosfato dipotásico.  4.0 g  
Fosfato monopotásico.  1.5 g  
Cloruro de sodio.  5.0 g  
Mezcla de sal de bilis.  1.5 g  
Agua destilada.  1.0 L  
 
A.1.4.5.1 Preparació n. 
A.1.4.5.1.1 Disolver los componentes en 1 L de agua, calentando si es necesario o cuando utilice medio 
de cultivo deshidratado siga las instrucciones del fabricante.  
A.1.4.5.1.2 Distribuir en volúmenes de 10 mL en tubos con dimensiones de 16 x 160 mm ca da tubo debe 
tener campana de fermentación (Durham) invertida.  
A.1.4.5.1.3 Ajustar el pH con disolució n de hidróxido de sodio 0.01 N o  una disolución de HCl 0.01 N 
según se requiera, de tal manera que después de la esterilización éste sea de 6.9 ±0.2 a 25° C. 
A.1.4.5.1.4 Esterilizar en autoclave por 12 min a 121 ±1.0°C.  
A.1.4.5.1.5 Se recomienda almacenar en refrigeración el medio una vez preparado.  
A.1.5 Aparatos e instrumentos.  
A.1.5.1 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C, con  termómetro calibrado 
y/o verificado.  
A.1.5.2 Incubadora que evite variaciones mayores a 0.5°C y termómetro calibrado y/o verificado.  
A.1.5.3 Incubadora con recirculación de agua que evite variaciones mayores a 0.5°C y termómetro 
calibrado y/o verificado.  
A.1.5.4 Termómetro de máximas y mínimas.  
A.1.5.5 Autoclave que alcance una temperatura mínima de 121 ±1.0°C con termómetro calibrado  y/o 
verificado.  
A.1.5.6 Potenciómetro con una escala mínima de 0.1 unidades de pH a 25°C.  
A.1.6 Recomendaciones generales previas al análisis de la muestra.  
A.1.6.1 Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse por 
inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a 3/4 de lleno, deberán agitarse 25 
movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 seg, para asegurar una 
unidad analítica representativa.  
A.1.6.2 Como alternativa al uso de campanas de f ermentación (Durham) utilizar pú rpura de bromocresol a 
una concentración de 0.01 g/L al m edio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de  este 
indicador.  
A.1.6.3  Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una 
concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplear án 10 mL de caldo preparado, cuando se 
agreguen 10 mL de muestra.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.1.6.4 Procedimiento.  
A.1.6.4.1 Coliformes totales presuntivo.  
A.1.6.4.1.1 Inoculación. Agitar la muestra. Transferir volúmenes de 10 mL de muestra a cada uno de 5 
tubos con 20 mL de caldo lactosado de mayor concentración o caldo lauril sulfato triptosa de concentración 
1.5 y 1.0 mL y 0.1 mL de muestra a cada uno de los tubos de las series de 5 respectivamente con 10 mL de 
caldo lactosado de concentración sencilla o caldo lauril sulfato trip tosa con purpura de bromocresol.  
A.1.6.4.1.2 Incubación. Incubar los tubos a 35°C. Examinar a las 24 ±2 h y observar si hay formación de 
gas o la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ±2 h.  
A.1.6.4.2 Coliformes totales confirmativo.  
A.1.6.4.2.1 De cada tubo de la prueba con caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa con p úrpura de 
bromocresol que muestre hidr ólisis del medio y formación de gas, agitar y tomar una azada, procediendo a 
sembrar en un No. igual de tubos con medio de  confirmación, caldo bilis verde brillante incubar a 35 ±0.5°C 
por 24 ±2 h o si la formación de gas no se observa en este tiempo, incubar por 48 ±2 h  
A.1.6.4.3 Coliformes fecales confirmativo.  
A.1.6.4.3.1  Como una alternativa de cada tubo que muestre hidr ólisis del medio o formación de gas, agitar 
y tomar una azada, procediendo a sembrar en un No. igual de tubos con medio EC . Incubar en incubadora 
con recirculación de agua a 44.5 ±0.2°C por 24 ±2 h, observando que el tiempo entre la inoculación y la 
colocac ión de los tubos en el baño no exceda de 30 min y que el agua de incubación cubra por entero al 
medio de cultivo en los tubos.  
A.1.7 Expresión de los resultados.  
A.1.7.1 Del procedimiento coliformes totales confirmativo considerar los tubos con medio bilis  verde 
brillante en los que se observe formación de gas después del periodo de incubación requerido y leer el NMP 
de coliformes totales/100 mL (véase tabla A.1.1).  
A.1.7.2  Del procedimiento coliformes fecales confirmativo considerar los tubos con medio EC en los que 
se observe formación de gas después del periodo de incubación requerido y leer el NMP de coliformes 
fecales/100 mL (véase tabla A.1.1.).  
A.1.8 Consideraciones generales.  
A.1.8.1 Cuando sólo una dilución muestr a tres tubos positivos, elegir é sta y las diluciones  mayores 
posteriores.  
A.1.8.2 Cuando más de una dilución muestra tres tubos positivos y la ú ltima da menos de tres, elegir é sta 
última y las dos diluciones anteriores más bajas.  
A.1.8.3 Cuando en ninguna dilución hay tres tubos positivos y  éstos se encuentran en más de tres 
diluciones, seleccionar las dos diluciones mayores positivas y la siguiente.  
A.1.8.4 Cuando los tubos positivos s ólo se encuentran en la muestra sin diluir (10 mL) y en la primera 
dilución (1 mL), seleccionar las tres pr imeras diluciones para el cálculo del NMP.  
A.1.8.5 En cada caso se obtiene un número de tres cifras, lo cual es representado (véase tabla A.1.1). En 
la columna que indica el número de tubos positivos se busca el índice del NMP.  
A.1.8.6 La técnica de NMP pu ede admitir gran cantidad de variaciones. Los resultados obtenidos con esta 
técnica deben ser utilizados con precaución.  
A.1.8.7 Evitar imprecisiones en los conteos debidos a descuido o fallas para reconocer colonias.  
A.1.9 Índices de reproducibilidad y re petibilidad.  
A.1.9.1 La precisión del anali sta deberá estar dentro de un 5% y entre analistas del 10 %. 
A.1.10 Informe de prueba.  
A.1.10.1. Informar como:  
A.1.10.1.1 NMP Coliformes totales/100 mL.  
A.1.10.1.2  NMP Coliformes fecales/100 mL.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
Tabla. A.1.1 - Núme ro más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se utilizan 5 porciones en 
cada una de 3 diluciones con series geométricas.  
No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
 Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  
1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 
0 0 0 <1.
8 1 0 0 2 2 0 0 4.
5 3 0 0 7.
8 4 0 0 1
3 5 0 0 23 
0 0 1 1.8 1 0 1 4 2 0 1 6.
8 3 0 1 11 4 0 1 1
7 5 0 1 31 
0 0 2 3.6 1 0 2 6 2 0 2 9.
1 3 0 2 13 4 0 2 2
1 5 0 2 43 
0 0 3 5.4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 2
5 5 0 3 58 
0 0 4 7.2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 3
0 5 0 4 76 
0 0 5 9.0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 3
6 5 0 5 95 
0 1 0 1.8 1 1 0 4 2 1 0 6.
8 3 1 0 11 4 1 0 1
7 5 1 0 33 
0 1 1 3.6 1 1 1 6.
1 2 1 1 9.
2 3 1 1 14 4 1 1 2
1 5 1 1 46 
0 1 2 5.5 1 1 2 8.
1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 2
6 5 1 2 64 
0 1 3 7.3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 3
1 5 1 3 84 
0 1 4 9.1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 3
5 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 4
2 5 1 5 130 
0 2 0 3.7 1 2 0 6.
1 2 2 0 9.
3 3 2 0 14 4 2 0 2
2 5 2 0 49 
0 2 1 5.5 1 2 1 8.
2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 2
6 5 2 1 70 
0 2 2 7.4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 3
2 5 2 2 95 
0 2 3 9.2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 3
8 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 4
4 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 5
0 5 2 5 180 
0 3 0 5.6 1 3 0 8.
3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 2
7 5 3 0 79 
0 3 1 7.4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 3
3 5 3 1 110 
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
0 3 2 9.3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 3
9 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 4
5 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 5
2 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 5
9 5 3 5 250 
0 4 0 7.5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 3
4 5 4 0 130 
0 4 1 9.4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 4
0 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 4
7 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 5
4 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 6
2 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 6
9 5 4 5 430 
0 5 0 9.4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 4
1 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 4
8 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 5
6 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 6
4 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 7
2 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 8
1 5 5 5 >160
0 
Fuente: AOAC 18a.. Edición. Revisión 2, 2007.  
A.2 Método de prueba para la determi nación Pseudomonas aeruginosa.  
A.2.1 Método de prueba para el NMP.  
A.2.1.1 Fundamento.  
Es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una muestra, basada en 
la dilución de la misma, sembrada e incubada en réplicas de tubos con caldo asparagina, que en presencia de 
luz UV produce un pigmento verde fluorescente (prueba presuntiva). La prueba confirmativa consiste en 
sembrar cada uno de los tubos que producen fluorescencia en medio de acetamida. La Pseudomonas 
aeruginosa  tiene la capacidad de desaminar la acetamida en amoniaco alcalinizando el medio y desarrollando 
un color rojo que se detecta con ayuda del indicador rojo de fenol.  
Las Pseudomonas aeruginosa , es un bacilo Gram negativo, aerobio, con flagelos polares que pertenec e a 
la Familia Pseudomonadaceae . En medios adecuados produce un pigmento azulado llamado piocianina. 
Muchas cepas también producen pigmentos pero de color verde fluorescente (fluoresceína). Son catalasa y 
oxidasa positivas y producen amoniaco a partir de l a arginina. Crecen en citrato como única fuente  de 
carbono.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
La Pseudomonas aeruginosa  es un organismo común en el medio ambiente y se puede encontrar en 
heces, tierra, agua y aguas residuales. Se multiplica en el agua y se considera como una de las princi pales 
causas de enfermedades nosocomiales.  
Pseudomonas aeruginosa  es una bacteria que rara vez causa enfermedad seria en individuos sanos y se 
le considera como patógeno oportunista. Predominantemente causa daños en quemaduras, heridas, tracto 
respiratorio  de personas enfermas e infecciones en ojos. En pacientes inmunocomprometidos puede causar 
fibrosis quística e infecciones pulmonares. También produce foliculitis asociadas a aguas de albercas y SPA 
contaminados. Muchas cepas son resistentes a varios agent es antimicrobianos.  
No hay evidencias de que el agua contaminada con Pseudomonas aeruginosa  haya sido fuente de 
infección para la población en general, pero en personas con alta susceptibilidad como niños, ancianos y 
personas inmunocomprometidas constituye  un riesgo para la salud, por lo que se convierte en un 
microorganismo de importancia sanitaria. La presencia de altos índices de Pseudomonas aeruginosa  está 
asociada a quejas acerca del sabor, olor y turbiedad y no así a brotes.  
A.2.1.2 Condiciones de pru eba, medidas de seguridad y de control de calidad.  
A.2.1.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.  
A.2.1.2.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá esterilizarse mediante 
horno, durante 2 h de 170°C a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min  como 
mínimo.  
A.2.1.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios  
de cultivo.  
A.2.1.2.4 El laboratorio debe tener claramente defin ido un sistema de control de calidad, para asegurar 
que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
A.2.1.2.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con un pH de 5 a 7.  
A.2.1.2.6 El mater ial de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse 
material de vidrio dañado  por esterilización repetida y é ste debe ser químicamente inerte.  
A.2.1.3. Materiales.  
A.2.1.3.1 Pipetas bacteriológicas para distribuir 10 mL y 1 mL , con tapón de algodón y divisiones de 0.1 mL.  
A.2.1.3.1.1  Las pipetas pueden ser graduadas en volúmenes iguales a una décima de su volumen total o 
un dispensador de líquidos equivalente.  
A.2.1.3.2 Frascos de vidrio de 500 mL y un litro con tapón de rosca.  
A.2.1.3.3 Tubos de 16 x 150 mm y 18 x 200 mm con tapón de rosca.  
A.2.1.3.4 Botellas de dilución de borosilicato de boca ancha con tapón de rosca.  
A.2.1.3.5 Mechero de Bunsen.  
A.2.1.3.6 Gradillas de plástico o metal.  
A.2.1.3.7 Asas bacteriológicas de 3 mm a 3.5 mm de diámetro con portaasa.  
A.2.1.3.8 Lentes protectores.  
A.2.1.3.9 Termómetro de inmersión parcial con división mínima de 1°C para incubadora calibrado  o 
verificado.  
A.2.1.3.10 Termómetro de máximas para autoclave con división mínima de 0.5°C cali brado o ciclos de 
esterilización validados.  
A.2.1.3.11 Cinta testigo para procesos de esterilización por calor húmedo.  
A.2.1.3.12 Probetas de 100, 500 y 1000 mL.  
A.2.1.4 Medios de cultivo, reactivos y soluciones.  
A.2.1.4.1 Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.  
A.2.1.4.1.1 Caldo asparagina.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
Ingrediente.  Cantidad.  
Concentración 
sencilla (1X).  Concentración 
doble (2X).  Concentración 
triple (3X).  Concentración 
séxtuple (6X).  
1mL o 0.1 mL de 
muestra con 10 
mL de caldo.  10 m L muestra 
con 10 mL de 
caldo.  100 mL de 
muestra con 50 
mL de caldo.  100 mL de 
muestra con 20 
mL de caldo.  
Asparagina, DL  3.0 g  6.0 g  9.0 g  18.0 g  
K2HPO 4, fosfato 
dipotásico anhidro 
monohidrogenado.  1.0 g  2.0 g  3.0 g  6.0 g  
MgSO 4•7H 2O, 
Sulfato de magnesio . 0.5 g  1.0 g  1.5 g  3.0 g  
Agua.  1 L 1 L 1 L 1 L 
 
A.2.1.4.1.1.1 Preparación.  
A.2.1.4.1.1.1.1 Disolver todos los ingredientes en un litro de agua y ajustar a pH de 6.9 a 7.2 con 
disolució n de hidróxido de sodio 0.01 N o  una disolución de HCl 0.01N según se  requiera. Distribuir en 
volúmenes adecuados de acuerdo a la concentración sencilla, doble o según se requiera. Esterilizar durante 
15 min a 121°C ±1.0°C. Después de la esterilización, el pH debe estar dentro del intervalo descrito y los 
volúmenes finales deben ser iguales a lo indicado en la tabla (véase tabla A.1.1).  
NOTA : En caso de no contar con fórmula comercial deshidratada, preparar por ingredientes.  
A.2.1.4.1.2 Caldo acetamida.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Acetamida.  10.0 g  
NaCl, cloruro de sodio.  5.0 g  
K2HPO 4, fosfato dipotásico 
anhidromonohidrogenado.  1.39 g  
KH2PO 4, fosfato monopotásico anhidro 
dihidrogenado.  0.73 g  
MgSO 4•7 H 2O, Sulfato de magnesio  0.5 g  
Agua.  1 L 
 
A.2.1.4.1.2.1 Preparación:  
A.2.1.4.1.2.1.1 Disolver todos los ingredientes en un li tro de agua y ajustar el pH con solución reguladora 
de hidróxido de sodio 0.01 N y una disolución reguladora de HCl 0.01N a 7.2 ±0.1.  
A.2.1.4.1.2.1.2 Pesar 1.2 g de rojo de fenol y disolver en 100 mL de solución de NaOH 0.01N y adicionar  1 
mL por litro de caldo acetamida. La solución de rojo de fenol concentrada se puede utilizar hasta 1 año 
después de su preparación.  
A.2.1.4.1.2.1.3 Distribuir en volúmenes de 10 mL. Esterilizar durante 15 min a 121°C ±1.0°C. Después de 
la esterilización, el pH debe ser de 7.0 ±0.2.  
A.2.1.4.1.2.1.4  Sí se prefiere utilizar agar inclinado, adicionar 15 g de agar por litro de medio. Calentar 
para disolver el agar y distribuir 8 mL en tubos de 16 x 150 mm. Esterilizar y enfriar inclinando los tubos para 
obtener un bisel largo.  
NOTA:  En caso de no contar con fórmula comercial deshidratada, preparar por ingredientes.  
A.2.1.4.1.3 Etanol al 70%.  
Ingrediente.  Cantidad.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
Etanol al 95%.  700 mL  
Agua destilada.  Adicionar hasta un volumen final de 
1000  mL 
 
A.2.1.4.1.4 Soluciones diluyent es. 
A.2.1.4.1.4.1  Solución concentrada reguladora de fosfatos.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Fosfato de sodio monobásico.  34.0 g  
Agua.  1.0 L  
 
A.2.1.4.1.4.1.1 Preparación:  
A.2.1.4.1.4.1.1.1 Disolver el fosfato en 500  mL de agua y ajustar el pH a 7.2 ±0.2 con di solución de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera. Llevar a un litro con agua. 
Esterilizar durante 15 min a 121°C ±1.0°C. Conservar en refrigeración.  
A.2.1.4.1.4.1.2 Solución de trabajo.  
A.2.1.4.1.4.1.2.1  Medir 1.25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro con agua. Distribuir en 
porciones de 450 mL, 225 mL, 99 mL, 90 mL y 9 mL según se requiera. Esterilizar a 121°C ±1.0°C durante 15 
min. Después de la esterilización los volúmenes finales de la solución de traba jo deberán ser de acuerdo a lo 
requerido y el pH debe estar dentro del intervalo descrito.  
A.2.1.4.1.5 Agua peptonada.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Peptona.  1.0 g  
Cloruro de sodio.  8.5 g  
Agua.  1.0 L  
 
A.2.1.4.1.5.1 Preparación.  
A.2.1.4.1.5.1.1  Disolver los co mponentes en un litro de agua. Ajustar el pH a 7.0 ±0.1 con disolución de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera. Si este diluyente no es usado 
inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura entre 2°C a 5°C por un tiempo no mayor de  1 
mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composición.  
A.2.1.5 Aparatos e instrumentos.  
A.2.1.5.1 Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de ±1.0°C, provista con termómetro 
calibrado y/o verificado.  
A.2.1.5.2 Horno para esterilizar que alcance una temperatura mínima de 170°C, con termómetro calibrado 
y/o verificado.  
A.2.1.5.3 Termómetro de máximas calibrado o ciclo de esterilización validado.  
A.2.1.5.4 Lámpara de luz UV de longitud de onda de 360 ±20 n m. 
A.2.1.5.5 Potenciómetro con sensibilidad de 0.1 de unidad de pH.  
A.2.1.5.6 Autoclave que alcance una temperatura de 121°C con termómetro calibrado y previamente 
evaluada con esporas de Geobacillus stearothermophilus . 
A.2.1.5.7 Balanza granataria con sen sibilidad de 0.1 g.  
A.2.1.6 Preparación y conservación de las muestras.  
A.2.1.6.1 Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.2.1.6.2 Realizar diluciones decimales cuando proceda.  
A.2.1.7 Recomendaciones g enerales previas para al análisis de la muestra.  
A.2.1.7.1  Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse 
por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a ¾ de lleno, deberán agitarse 25 
movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 seg, para asegurar una 
unidad analítica representativa.  
A.2.1.7.2  Como alternativa al uso de campanas de fermentación (Durham) utilizar p úrpura de bromocresol 
a una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de este 
indicador.  
Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una 
concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se 
agreguen 10 mL de muestra.  
A.2.1.7.2.1  Procedimiento.  
A.2.1.7.2.1.1 Prueba presuntiva.  
A.2.1.7.2.1.1.1 Utilizar 5 tubos con caldo asparagina por cada porción de 10 mL, 1 mL y 0.1 mL de 
muestra. Para inóculos de  10 mL de agua, preparar el medio a doble concentración y para volúmenes de 1 y 
0.1 mL a concentración sencilla. Hacer diluciones decimales de la muestra cuando se considere necesario con 
solución reguladora de fosfatos o agua peptonada.  
A.2.1.7.2.1.1.2 Incubar los tubos de 35°C ±1°C por 24  y 48 h. Examinar los tubos con una lámpara de luz 
UV en cuarto oscuro. La producción de un pigmento verde fluorescente se considera como una prueba 
presuntiva positiva.  
A.2.1.7.2.1.2 Prueba confirmativa.  
A.2.1.7.2.1.2.1 Inocular 0.1 mL de cada uno de los tubos positivos en caldo acetamida o en la superficie 
de agar acetamida inclinado.  
A.2.1.7.2.1.2.2 Incubar los tubos de 35°C ±1°C. El desarrollo de un color rojo (pH alcalino) dentro de las 24 
a 36 h se considera como una  prueba confirmativa para Pseudomonas aeruginosa . 
A.2.1.8 Expresión de los resultados.  
A.2.1.8.1 Cálculos.  
A.2.1.8.1.1 Calcular la densidad de Pseudomonas aeruginosa  por el número más probable en 100 mL con 
el número de tubos confirmados (véase tabla A.2.1 ). 
A.2.1.8.1.2 Considerar en el cálculo del resultado final la(s) dilución(es) realizada(s) cuando proceda.  
A.2.1.8.2 Interpretación de resultados.  
A.2.1.8.2.2  El desarrollo de un color rojo en los tubos con caldo acetamida o placas con agar acetamida 
dentro de las 24 h a 36 h incubados de 35°C ±1°C se considera como una prueba confirmativa para 
Pseudomonas aeruginosa . 
A.2.1.8.3 Criterios de validez de la prueba.  
A.2.1.8.3.1 Esta prueba tiene validez cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivo s y todos 
los tubos de la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga 
Pseudomonas aeruginosa y cuando se inocule un cultivo control con 100 UFC . 
A.2.1.8.4 Índices de reproducibilidad y repetibilidad.  
A.2.1.8.4.1 Basad o en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados 
analíticos deben estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.  
A.2.1.8.4.2 La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%.  
A.2.1.9 Inf orme de prueba.  
A.2.1.9.1  Informar como:  
A.2.1.9.1.1  Pseudomonas aeruginosa : (véase tabla A.2.1) NMP/100 mL.  
Tabla A.2.1 - Número más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se utilizan 5 porciones 
en cada una de 3 diluciones con series geométricas.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
 Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  
1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 
0 0 0 <1.
8 1 0 0 2 2 0 0 4.
5 3 0 0 7.
8 4 0 0 1
3 5 0 0 23 
0 0 1 1.8 1 0 1 4 2 0 1 6.
8 3 0 1 11 4 0 1 1
7 5 0 1 31 
0 0 2 3.6 1 0 2 6 2 0 2 9.
1 3 0 2 13 4 0 2 2
1 5 0 2 43 
0 0 3 5.4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 2
5 5 0 3 58 
0 0 4 7.2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 3
0 5 0 4 76 
0 0 5 9.0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 3
6 5 0 5 95 
0 1 0 1.8 1 1 0 4 2 1 0 6.
8 3 1 0 11 4 1 0 1
7 5 1 0 33 
0 1 1 3.6 1 1 1 6.
1 2 1 1 9.
2 3 1 1 14 4 1 1 2
1 5 1 1 46 
0 1 2 5.5 1 1 2 8.
1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 2
6 5 1 2 64 
0 1 3 7.3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 3
1 5 1 3 84 
0 1 4 9.1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 3
5 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 4
2 5 1 5 130 
0 2 0 3.7 1 2 0 6.
1 2 2 0 9.
3 3 2 0 14 4 2 0 2
2 5 2 0 49 
0 2 1 5.5 1 2 1 8.
2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 2
6 5 2 1 70 
0 2 2 7.4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 3
2 5 2 2 95 
0 2 3 9.2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 3
8 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 4
4 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 5
0 5 2 5 180 
0 3 0 5.6 1 3 0 8.
3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 2
7 5 3 0 79 
 
0 3 1 7.4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 3
3 5 3 1 110       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
0 3 2 9.3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 3
9 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 4
5 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 5
2 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 5
9 5 3 5 250 
0 4 0 7.5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 3
4 5 4 0 130 
0 4 1 9.4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 4
0 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 4
7 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 5
4 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 6
2 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 6
9 5 4 5 430 
0 5 0 9.4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 4
1 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 4
8 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 5
6 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 6
4 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 7
2 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 8
1 5 5 5 >160
0 
Fuente: AOAC 18 a. Edición. Revisión 2, 2007 Table 978.23.  
A.2.2 Método de presencia ausencia (P -A). 
A.2.2.1 Fundamento.  
Es una modificación del método de NMP simplificado, que permite utilizar volúmenes grandes d e muestra 
(100 mL) para obtener información cualitativa de presencia ausencia de Pseudomonas aeruginosa . 
Transferir 100 mL de muestra de agua a un volumen de 50 mL o 20 mL de caldo asparagina. Considerar el 
volumen final de muestra y caldo para ajustar la concentración de medio (véase A.2.1.4), continuar de 
acuerdo a lo indicado (véase A.2.1.7.2.1.1.2).  
A.2.2.2 Expresión de los resultados.  
A.2.2.2.1  El desarrollo de un color rojo en los tubos con caldo acetamida o placa o agar acetamida dentro 
de las 24 h a  36 h incubados de 35°C ±1°C, se considera como una prueba confirmativa para la presencia de 
Pseudomonas aeruginosa . 
A.2.2.3 Informe de prueba.  
A.2.2.3.1  Presencia de Pseudomonas aeruginosa  en 100 mL. o  
A.2.2.3.2  Ausencia de Pseudomonas aeruginosa  en 100 m L. 
A.2.3 Método de filtración por membrana.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.2.3.1 Fundamento.  
Es un método que se basa en la filtración de un volumen específico de agua a través de un filtro de 
membrana con tamaño de poro de 0.45 
 m. El filtro es colocado en un agar selectivo incubado a 41.5 ±0.5°C.  
Las colonias cafés con centro oscuro son confirmadas en agar leche en el cual se hidroliza la caseína 
produciendo un pigmento de amarillo a verde que se difunde en el agar.  
A.2.3.2 Materiales.  
A.2.3.2.1 Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60 x 15 mm o 50 x 9 mm u otro 
tamaño apropiado.  
A.2.3.2.2 Portafiltros esterilizables de plástico, porcelana, acero inoxidable o vidrio.  
A.2.3.2.3 Matraz Kitazato.  
A.2.3.2.4 Membranas para filtración estériles con poro de 0.45 µm.  
A.2.3.2.5 Pinzas de acero inoxidable para membrana.  
A.2.3.2.6 Contador mecánico o manual de Tally o equivalente.  
A.2.3.2.7 Portaasa y asa bacteriológica.  
A.2.3.3 Aparatos e instrumentos.  
A.2.3.3.1 Bomba de vacío (20 -27 pulgadas Hg), tubería y aditamentos he rméticos para mantener el vacío.  
A.2.3.3.2 Sistema de filtración.  
A.2.3.3.3 Balanza granataria con sensibilidad de 0.1 g.  
A.2.3.3.4 Balanza analítica con sensibilidad de 0.0001 g, calibrada.  
A.2.3.3.5 Incubadora que evite variaciones mayores de ±0.5°C term ómetro calibrado y/o verificado.  
A.2.3.3.6 Microscopio estereoscópico, óptico o equivalente.  
A.2.3.4 Medios de cultivo y reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser  grado 
analítico.  
A.2.3.4.1 Agar M -PA. 
Ingrediente.  Cantidad.  
L-Lisina HCl.  5.0 g  
Cloruro de sodio, NaCl.  5.0 g  
Extracto de levadura.  2.0 g  
Xilosa.  2.5 g  
Sacarosa.  1.25 g  
Lactosa.  1.25 g  
Rojo de fenol.  0.08 g  
Citrato férrico amoniacal.  0.8 g  
Tiosulfato de sodio, Na 2S2O3. 6.8 g  
Agar,  15.0 g  
Agua,  1 L 
 
A.2.3.4.1. 1 Preparación.  
A.2.3.4.1.1.1 Disolver todos los ingredientes en un litro de agua, ajustar el pH a 6.5 ±0.1 con disolución de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera y esterilizar en autoclave. Enfriar 
de 55°C a 60°C, reaj ustar el pH a 7.1 ±0.2 y adicionar los siguientes antibióticos en polvo por cada L de base 
de agar: sulfapiridina*, 176 mg; kanamicina*, 8.5 mg; ácido nalid íxico*, 37.0 mg; y cicloheximida*, 150 mg. 
Mezclar y distribuir 3 mL en cajas petri de 50 x 12 mm. A lmacenar las placas de 2 a 8°C. No usar el medio 
después de un mes de su preparación.  
* Sigma Chemical o equivalente.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.2.3.4.2 Agar M -PAC modificado.  
A.2.3.4.2.1  Este medio se encuentra comercialmente disponible en forma deshidratada y la diferencia en 
la fórmula del M -PA-C original, es el contenido de sulfato de magnesio 1.5 g, kanamicina 8 mg y ácido 
nalid íxico 37.0 mg por L.  
A.2.3.4.2.2  No usar el medio después de una semana de su preparación.  
A.2.3.4.3 Agar leche (Brown y Scott Foster modificado).  
Mezc la A.  
Leche descremada.  100 g  
Agua.  500 mL  
 
Mezcla B.  
Caldo nutritivo.  12.5 g  
Cloruro de sodio, NaCl.  2.5 g  
Agar.  15.0 g  
Agua.  500 mL  
 
A.2.3.4.3.1 Preparación.  
A.2.3.4.3.1.1  Disolver los ingredientes por separado y esterilizar. Enfriar rápidamente a 55°C. Combinar la 
mezcla A y B y distribuir porciones de 20 a 25 mL en cajas petri. Dejar solidificar.  
A.2.3.5 Procedimiento.  
A.2.3.5.1 Prueba presuntiva.  
A.2.3.5.1.1 Instalar el equipo de filtración. Filtrar 100 mL de muestra a través del filtro. Enjuag ar el embudo 
mientras se está filtrando, con 1 a 3 porciones de 10 mL a 30 mL de diluyente estéril mientras el filtro continúa 
en su lugar. Colocar la membrana en placas con agar M -PA modificado. Evitar burbujas de aire entre la 
membrana y la superficie de l agar. Invertir las placas e incubar a 41.5 ±0.5°C por 72 h. Si se sospecha de 
cuentas altas de Pseudomonas aeruginosa , filtrar 2 porciones por separado de 50 mL o 4 porciones de 25 mL.  
A.2.3.5.1.2 Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa  son de 0.8  mm a 2.2 mm de diámetro, cafés 
con centro oscuro elevado.  
A.2.3.5.1.3 Con ayuda de un cuenta colonias y/o un lente amplificador de 15 a 20 aumentos, seleccionar 
cajas que contengan entre 20 colonias a 80 colonias típicas y contar el No. de UFC.  
A.2.3.5.2 Prueba confirmativa.  
A.2.3.5.2.1.  Seleccionar colonias aisladas típicas y atípicas y sembrar una estría de 2 cm a 4 cm de 
longitud en agar leche. Incubar a 36 ±1.0°C por 24 h. La Pseudomonas aeruginosa  hidroliza la caseína 
produciendo un pigmento de amaril lo a verde que se difunde en el agar.  
A.2.3.5.2.1.1 Cálculos.  
A.2.3.5.2.1.1.1 Si se filtraron 2 porciones de 50 mL por separado y se obtuvieron en una membrana 5 y en 
otra 3 colonias, aplicar la siguiente fórmula:  
Fórmula A.2.1  
 
A.2.3.6 Expresión de los r esultados.  
A.2.3.6.1  La presencia de colonias aisladas en agar leche incubadas a 35°C ±1.0°C por 24 h, que 
producen un pigmento de amarillo a verde que se difunde en el agar, se considera la confirmación de la 
presencia de Pseudomonas aeruginosa . Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.2.3.7. Criterios de validez de la prueba.  
Esta prueba tiene validez si se obtienen cajas que contengan entre 20 UFC a 80 UFC.  
A.2.3.8 Informe de prueba.  
A.2.3.8.1 Informar como:  
A.2.3.8.1.1  UFC de Pseudomonas aeruginosa  (colonias contadas)/100 mL  
A.2.3.8.2 Si no se observan colonias informar como:  
A.2.3.8.2.1  < 1 UFC de Pseudomonas aeruginosa /100 mL  
A.2.3.8.3 Si se filtraron 2 porciones de muestra de 50 mL por separado o 4 porciones de 25 mL o menos, 
aplicar la fórmula A.2.1.  
A.3 Método de prueba para la determina ción de Enterococos fecales.  
A.3.1 Método del NMP.  
A.3.1.1 Fundamento.  
Es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una muestra, basada en 
la dilución de la misma y sembrada en réplicas de tubos con caldo selectivo (caldo  azida dextrosa), en los 
cuales después de un peri odo de incubación de 24 h –48 h a 35°C ±0.5°C, se observa la presencia de 
turbiedad en cada tubo. La prueba confirmativa consiste en sembrar cada uno de los tubos que presenten 
turbiedad, en medio selectivo para enterococos fecales de Pfizer. Después de un periodo de incubación, las 
colonias de color café a negro y un halo café debido a la hidrólisis de la esculina, son sembradas en caldo BHI 
con 6.5% de NaCl e incubadas a 45°C ±0.5°C. El desarrollo en este m edio confirma la presencia de 
enterococos fecales.  
Los enterococos fecales son un subgrupo de los estreptococos fecales, en el cual se encuentran las 
especies Enterococcus faecalis , E. faecium , E. durans  y E. hirae . Este grupo fue separado del resto de los  
estreptococos fecales debido a que son relativamente específicos para la contaminación fecal. Sin embargo, 
algunos enterococos fecales aislados de agua, pueden ocasionalmente tener un origen de otras fuentes, 
incluyendo suelos aun en ausencia de contamina ción fecal. El grupo enterococos fecales puede ser usado 
como un índice de contaminación fecal.  
Los enterococos fecales son relativamente tolerantes al cloruro de sodio y pH alcalino. La mayoría de las 
especies no se multiplican en agua. La ventaja de este  grupo es su tendencia a sobrevivir en medios 
acuáticos más que E. coli  (o coliformes termotolerantes), son más resistentes a la desecación y a la cloración.  
Enterococos fecales, es un Subgrupo de los estreptococcus que incluye Enterococcus faecalis , E. faecium , 
E. durans  y E. hirae . Son cadenas cortas o en pares de cocos Gram positivos, anaerobios facultativos, 
inmóviles, catalasa negativos. Al desarrollarse en los medios adecuados son capaces de reducir el  2,3,5 – 
trifeniltetrazolio e hidrolizar la esculi na a 44°C.  
La presencia de enterococos fecales evidencia una contaminación fecal reciente, así como la necesidad 
de llevar a cabo acciones en aquellas fuentes de abastecimiento con un adecuado tratamiento  de 
potabilización.  
A.3.1.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.  
A.3.1.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.  
A.3.1.2.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá esterilizarse mediante 
horno, durante 2 h de 17 0°C a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min  como 
mínimo.  
A.3.1.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios  
de cultivo.  
A.3.1.2.4 El laboratorio debe tener claramente definido u n sistema de control de calidad, para asegurar 
que los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
A.3.1.2.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con un pH de 5 a 7.  
A.3.1.2.6 El material d e vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse 
material de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.  
A.3.1.3 Materiales.  
A.3.1.3.1 Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de polipropileno.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.3.1.3.2 Pipetas serológicas de 1 y 10 mL.  
A.3.1.3.3 Asas bacteriológicas.  
A.3.1.3.4 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm con tapón de rosca.  
A.3.1.3.5 Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 100 x 150 mm.  
A.3.1.3.6 Propi peta.  
A.3.1.3.7 Gradillas.  
A.3.1.4 Medios de cultivo y reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser  grado 
analítico.  
A.3.1.4.1.  Caldo Azida Dextrosa.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Concentración 1X  Concentración 2X  Concentración 3X  Concent ración 6X  
1mL o 0.1 mL de 
muestra con 10 
mL de caldo.  10 mL muestra 
con 10 mL de 
caldo.  100 mL de muestra 
con 50 mL de caldo.  100 mL de muestra 
con 20 mL de 
caldo.  
Extracto de 
Carne.  4.5 g  9.0 g  13.5 g  27.0 g  
Triptona o 
polipeptona.  15.0 g  30.0 g  45.0 g 90.0 g  
Glucosa.  7.5 g  15.0 g  22.5 g  45.0 g  
NaCl.  7.5 g  15.0 g  22.5 g  45.0 g  
Azida de sodio, 
NaN 3. 0.2 g  0.4 g  0.6 g  1.2 g  
Agua.  1 L 1 L 1 L 1 L 
 
A.3.1.4.1.1 Preparación.  
A.3.1.4.1.1.1  Disolver los ingredientes en un L de agua. Esterilizar a 121°C du rante 15 min. El pH después 
de la esterilización debe ser de 7.2 ±0.2 a 25°C.  
A.3.1.4.2 Agar selectivo para Enterococos fecales (PSE).  
Ingrediente.  Cantidad.  
Peptona C.  17.0 g  
Peptona B.  3.0 g  
Extracto de levadura.  5.0 g  
Bilis bacteriológica.  10.0 g  
Cloruro de sodio.  5.0 g  
Citrato de sodio.  1.0 g  
Esculina.  1.0 g  
Citrato férrico amónico.  0.5 g  
Azida de sodio, NaN 3. 0.25 g  
Agar.  15.0 g  
Agua.  1.0 L  
A.3.1.4.2.1 Preparación.  
A.3.1.4.2.1.1  Disolver los ingredientes en un L de agua. Esterilizar a 121°C  durante 15 min. El pH después 
de la esterilización debe ser de 7.1 ±0.2 a 25°C. Dejar enfriar y mantener el medio no más de 4 h antes de 
vaciarlo a una temperatura de 45°C a 50°C.  
A.3.1.4.3 Caldo infusión de cerebro corazón con 6.5% de cloruro de sodio.  
Ingrediente.  Cantidad.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
Infusión de cerebro de ternera.  200.0 g  
Infusión de corazón de res.  250.0 g  
Proteosa peptona.  10.0 g  
Glucosa.  2.0 g  
Cloruro de so dio NaCl.  65.0 g  
Fosfato disódico hidrogenado Na 2HPO 4. 2.5 g  
Agua.  1 L 
 
A.3.1.4.3.1 Preparación.  
A.3.1.4.3.1.1  Disolver los ingredientes en un L de agua, distribuir en tubos de ensaye, esterilizar a 121°C 
durante 15 min, el pH después de la esterilización debe ser de 7.4 ±0.2.  
A.3.1.5 Aparatos e instrumentos.  
A.3.1.5.1 Incubadora que evite variaciones  mayores de ±0.5°C con termómetro calibrado o verificado.  
A.3.1.5.2 Autoclave que alcance una temperatura de 121°C con termómetro calibrado y previamente 
evaluada con esporas de Geobacillus stearothermophilus . 
A.3.1.5.3 Balanza granataria con sensibilidad de al menos 0.1 g.  
A.3.1.6 Preparación de las muestras.  
A.3.1.6.1 Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%.  
A.3.1.6.2 Realizar diluciones decimales cuando se estime que la carga de enterococos fecales es a lta. 
A.3.1.7 Recomendaciones generales previas al análisis de la muestra.  
A.3.1.7.1  Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse 
por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a ¾ de lle no, deberán agitarse 25 
movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 seg, para asegurar una 
unidad analítica representativa.  
A.3.1.7.2  Como alternativa al uso de campanas de fermentación (Durham) utilizar purpura de bromocr esol 
a una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de  este 
indicador.  
A.3.1.7.3  Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una 
concentración doble de l medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se 
agreguen 10 mL de muestra.  
A.3.1.8 Procedimiento.  
A.3.1.8.1 Prueba presuntiva.  
A.3.1.8.1.1 El tamaño de la porción de muestra analizada dependerá de su tipo (agua para uso y consumo 
humano, agua envasada y hielo). Utilizar 5 porciones de 20 mL o  10 porciones de 10 mL inoculados a tubos 
con caldo azida dextrosa (véase apéndice A.3.1.5) para las concentraciones diferentes de medio de cultivo.  
A.3.1.8.1.2 Incubar a 35°C ±0.5°C de  24 a 48 h.  
A.3.1.8.1.3 La presencia de turbiedad en los tubos debida al desarrollo microbiano, se considera como 
prueba presuntiva positiva.  
A.3.1.8.2 Prueba confirmativa.  
A.3.1.8.2.1 A partir de los tubos con turbiedad, transferir una asada a placas de a gar PSE.  
A.3.1.8.2.2 Incubar las placas invertidas a 35°C ±0.5°C por 24 h.  
A.3.1.8.2.3 El desarrollo de colonias de color café oscuro a negro con halos cafés, confirman la presencia 
de enterococos fecales.  
A.3.1.8.2.4 Transferir las colonias característica s a tubos con caldo BHI con 6.5% de NaCl.  
A.3.1.8.2.5 Incubar a 45°C ±0.5°C.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.3.1.8.2.6 El crecimiento en este medio confirma la presencia de enterococos fecales.  
A.3.1.9 Expresión de los resultados.  
A.3.1.9.1 Cálculos.  
A.3.1.9.1.1 Calcular la densidad de  Enterococos fecales por el NMP en 100 mL con el No. de tubos 
confirmados consultando (véase tablas A.3.1 o  A.3.2) . 
A.3.1.9.1.2 Considerar en el resultado final la(s) dilución(es) realizada (s), cuando proceda.  
A.3.1.9.1.3 Para el caso de agua con salinida d alta,  5 tubos con caldo azida dextrosa por cada porción de 
10 mL, 1 mL y 0.1 mL de muestra. Para inóculos de 10 mL de agua, preparar el medio a doble concentración 
y para volúmenes de 1 mL y 0.1 mL a concentración sencilla. Hacer diluciones decimales de la muestra 
cuando se considere necesario con solución reguladora de fosfatos o agua peptonada.  
A.3.1.9.1.4 Incubar a 35°C ±0.5°C por 24 a 48 h.  
A.3.1.9.1.5 La presencia de turbiedad en los tubos debida al desarrollo microbiano, se considera como 
prueba pre suntiva positiva.  
A.3.1.9.2 Prueba confirmativa.  
A.3.1.9.2.1 A partir de los tubos con turbiedad, transferir una asada a placas de agar PSE.  
A.3.1.9.2.2 Incubar las placas invertidas a 35°C ±0.5°C por 24 h.  
A.3.1.9.2.3 El desarrollo de colonias de color ca fé oscuro a negro con halos cafés, confirman la presencia 
de enterococos fecales.  
A.3.1.9.2.4 Transferir las colonias característica s a tubos con caldo BHI con 6.5 % de NaCl.  
A.3.1.9.2.5 Incubar a 45°C ±0.5°C.  
A.3.1.9.2.6 El crecimiento en este medio confir ma la presencia de enterococos fecales.  
A.3.1.9.2.7 Calcular la densidad de enterococos fecales por el NMP en 100 mL con el No. de tubos 
confirmados (véase tabla A.3.3).  
Tabla A.3.1. - Número más probable por 100 mL de muestra de agua o hielo con un interva lo de 
confianza del 95%, utilizando 5 tubos con 20 mL de muestra.  
No. de tubos positivos.  NMP/100  mL 95% de Límite de confianza 
(aproximado).  
Inferior.  Superior.  
0 <1.1 - 3.5 
1 1.1 0.051  5.4 
2 2.6 0.40 8.4 
3 4.6 1.0 13 
4 8.0 2.1 23 
5 >8.0 3.4 - 
Fuente: American Public Health Association. Standard Methods for the  
Examination of Water and Wastewater.  21thedition 2005. Washington DC  
Tabla A.3.2. - Número más probable por 100 mL de muestra de agua o hielo con un intervalo 
confianza del 95%, utilizando 10 tubos con 10 mL de muestra.  
No. de tubos 
positivos.  NMP/100mL  Límite de confianza.  
Inferior.  Superior.  
0 <1.1 - 3.4 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
1 1.1 0.051  5.9 
2 2.2 0.37 8.2 
3 3.6 0.91 9.7 
4 5.1 1.6 13 
5 0.9 2.5 15 
6 9.2 3.3 19 
7 12 4.8 24 
8 16 5.8 34 
9 23 8.1 53 
10 >23 13 ¯ 
 
A.3.1.9.3 Interpretación de los resultados.  
El crecimiento en caldo BHI con 6.5% de NaCl incubado a 45°C ± 0.5°C confirma la presencia de 
enterococos fecales.  
A.3.1.9.4 Criterios de validez de la prueba.  
A.3.1.9.4.1  Esta prueba tiene validez cu ando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos 
los tubos de la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga 
enterococos fecales o cuando se trate de un cultivo control inoculado con 100 UFC . 
A.3.1.9.5  Índices de reproducibilidad y repetibilidad.  
A.3.1.9.5.1 Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados 
analíticos deben estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.  
A.3.1.9.5.2 La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%.  
A.3.1.10 Informe de prueba.  
A.3.1.10.1  Informar como:  
A.3.1.10.2  NMP de enterococos fecales/100  mL. 
Tabla A.3.3 - Número más probable (NMP) para 100 mL de muestra cuando se usan 5 porciones en 
cada una de 3 diluciones con series geométricas.  
No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
 Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  No. de Tubos  
Positivos  
1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 1
0 
m 
L 1.
0 
m 
L 0.
1 
m 
L N 
M 
P 
0 0 0 <1.
8 1 0 0 2 2 0 0 4.
5 3 0 0 7.
8 4 0 0 1
3 5 0 0 23 
0 0 1 1.8 1 0 1 4 2 0 1 6.
8 3 0 1 11 4 0 1 1
7 5 0 1 31 
0 0 2 3.6 1 0 2 6 2 0 2 9.
1 3 0 2 13 4 0 2 2
1 5 0 2 43 
 
0 0 3 5.4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 2
5 5 0 3 58 
0 0 4 7.2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 3
0 5 0 4 76 
0 0 5 9.0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 3
6 5 0 5 95       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
0 1 0 1.8 1 1 0 4 2 1 0 6.
8 3 1 0 11 4 1 0 1
7 5 1 0 33 
0 1 1 3.6 1 1 1 6.
1 2 1 1 9.
2 3 1 1 14 4 1 1 2
1 5 1 1 46 
0 1 2 5.5 1 1 2 8.
1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 2
6 5 1 2 64 
0 1 3 7.3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 3
1 5 1 3 84 
0 1 4 9.1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 3
5 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 4
2 5 1 5 130 
0 2 0 3.7 1 2 0 6.
1 2 2 0 9.
3 3 2 0 14 4 2 0 2
2 5 2 0 49 
0 2 1 5.5 1 2 1 8.
2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 2
6 5 2 1 70 
0 2 2 7.4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 3
2 5 2 2 95 
0 2 3 9.2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 3
8 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 4
4 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 5
0 5 2 5 180 
0 3 0 5.6 1 3 0 8.
3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 2
7 5 3 0 79 
0 3 1 7.4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 3
3 5 3 1 110 
0 3 2 9.3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 3
9 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 4
5 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 5
2 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 5
9 5 3 5 250 
 
0 4 0 7.5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 3
4 5 4 0 130 
0 4 1 9.4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 4
0 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 4
7 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 5
4 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 6
2 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 6
9 5 4 5 430 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
0 5 0 9.4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 4
1 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 4
8 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 5
6 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 6
4 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 7
2 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 8
1 5 5 5 >160
0 
 
A.3.2 Método de sustrato cromogénico.  
A.3.2.1. Fundamento.  
Este método de prueba se basa en la detección de enterococos fecales, tales como E. faecium , E. faecalis  
en agua  potable, fuentes de abastecimiento, agua de uso recreativo, agua envasada y hielo. Cuando el 
reactivo (comercialmente disponible) es adicionado a la muestra e incubado a 41°C ±0.5°C por 24 h. Esta 
prueba detecta, 1 UFC de enterococos fecales/100 mL. La fl uorescencia se produce cuando los enterococos 
fecales metabolizan el indicador nutritivo. El medio puede utilizarse como presencia/ausencia o por 
cuantificación de: 5 tubos, 10 tubos, series de 15 tubos o el sistema de charolas de cuantificación 
(comercial mente disponibles).  
A.3.2.2 Medios de cultivo y reactivos.  
A.3.2.2.1  Medio que contiene el sustrato cromogénico definido (comercialmente disponible).  
A.3.2.2.2  Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.  
A.3.2.3 Materiales.  
A.3.2.3.1 Vasos estériles no fluorescentes.  
A.3.2.3.2 Charolas con 51 celdas de un solo tamaño o  
A.3.2.3.3 Charolas con 48 celdas pequeñas y 48 celdas grandes.  
A.3.2.3.4 Tubos de ensaye de 20 x 150 mm.  
A.3.2.3.5 Tubos de ensaye de 16 x 150 mm.  
A.3.2.4 Aparato s e instrumentos.  
A.3.2.4.1 Selladora de charolas de cuantificación (comercialmente disponibles).  
A.3.2.4.2 Lámpara de luz UV de 6 watts con una longitud de onda de 366 nm.  
A.3.2.4.3 Incubadora a 41°C ±0.5°C de aire o baño de agua.  
A.3.2.4.4 Termómetro con  variaciones de ±0.5°C con un intervalo de 10°C a 50°C calibrado y/o verificado.  
A.3.2.5 Procedimiento.  
A.3.2.5.1  Interferencia: La presencia de Bacillus spp  puede interferir con la prueba en muestras de agua 
con una conductividad por arriba de 20,000 µSie mens/cm a 25°C. Por lo que es necesario hacer una dilución 
1:10 con agua estéril (desionizada o destilada).  
A.3.2.5.1.1 Presencia/Ausencia.  
A.3.2.5.1.1.1 Las muestras deben alcanzar una temperatura ambiente (18°C a 30°C).  
A.3.2.5.1.1.2 Separar cuidadosamen te un paquete (que contiene el reactivo) de la tira.  
A.3.2.5.1.1.3 Golpear el paquete para asegurarse que todo el polvo se vaya al fondo.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.3.2.5.1.1.4 Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la parte expuesta 
de la mism a. 
A.3.2.5.1.1.5 Agregar el reactivo a 100 mL de una muestra de agua, la cual está en un recipiente estéril, 
transparente y no fluorescente o comercialmente disponible.  
A.3.2.5.1.1.6 Cubrir y sellar asépticamente el recipiente.  
A.3.2.5.1.1.7 Agitar hasta d isolución del polvo.  
A.3.2.5.1.1.8 Incubar por 24 h a 41°C ±0.5°C.  
A.3.2.5.1.1.9 Observar la fluorescencia a las 24 h con la lámpara de UV de 6 watts y 366 nm de longitud 
onda en un cuarto oscuro. Asegurarse que la luz se encuentre alejada de sus ojos y di rigida hacia la muestra. 
Si se observa fluorescencia, se confirma entonces la presencia de enterococos fecales.  
A.3.2.5.1.1.10 Si la muestra se incuba por más de 28 h, aplicar lo siguiente: Si no hay fluorescencia 
después de 28 h, se considera una prueba n egativa válida. Si hay fluorescencia después de 28 h, se 
considera como un resultado inválido.  
A.3.2.5.1.2 NMP. - Procedimiento de enumeración para 100 mL de muestra.  
A.3.2.5.1.2.1 Las muestras deben alcanzar una temperatura ambiente (18°C a 30°C).  
A.3.2.5. 1.2.2 Separar cuidadosamente un paquete (que contiene el reactivo) de la tira.  
A.3.2.5.1.2.3 Golpear el paquete para asegurarse que todo el polvo se vaya al fondo.  
A.3.2.5.1.2.4 Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la  parte expuesta 
de la misma.  
A.3.2.5.1.2.5 Agregar el reactivo a 100 mL de una muestra de agua, la cual está en un recipiente estéril, 
transparente y no fluorescente o comercialmente disponible.  
A.3.2.5.1.2.6 Cubrir y sellar asépticamente el recipiente.  
A.3.2.5.1.2.7 Agitar hasta disolución del polvo.  
A.3.2.5.1.2.8 Vaciar la muestra con el reactivo dentro de la charola de cuantificación, evitar el contacto con 
la hoja de la charola y el sello (consultar el instructivo del reactivo).  
A.3.2.5.1.2.9 Incubar 24  h a 41°C ±0.5°C.  
A.3.2.5.1.2.10 Seguir las mismas instrucciones de interpretación en los siguientes incisos (véase 
A.3.2.5.1.1.9. y A.3.2.5.1.1.10.) y contar el No. de celdas positivas (fluorescencia). Interpolar en las tablas 
(véase tabla A.3.1 y A.3.2),  proporcionada por el fabricante para determinar el NMP de enterococos 
fecales/100 mL. El NMP de enterococos fecales en 100 mL de muestra equivale, en un 95% de confianza a 
las unidades formadoras de colonias de enterococos fecales presentes en 100 mL.  
A.3.2.5.1.3 NMP. Serie de 5 tubos con 20 mL y 10 tubos con 10 mL.  
A.3.2.5.1.3.1 Las muestras deben alcanzar una temperatura ambiente (18°C a 30°C).  
A.3.2.5.1.3.2 Separar cuidadosamente un paquete (que contiene el reactivo) de la tira.  
A.3.2.5.1.3.3 Golpear el  paquete para asegurarse que todo el polvo se vaya al fondo.  
A.3.2.5.1.3.4 Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la parte expuesta 
de la misma.  
A.3.2.5.1.3.5 Agregar el reactivo a 100 mL de una muestra de agua, la cual  está en un recipiente estéril, 
transparente y no fluorescente o comercialmente disponible.  
A.3.2.5.1.3.6 Cubrir y sellar asépticamente el recipiente.  
A.3.2.5.1.3.7 Agitar hasta disolución del polvo.  
A.3.2.5.1.3.8 Transferir 20 mL a cada uno de 5 tubos o 1 0 mL a cada uno de 10 tubos de la muestra con el 
reactivo. Asegurarse que los tubos no emitan fluorescencia por sí mismos.  
A.3.2.5.1.3.9 Incubar 24 horas a 41°C ±0.5°C.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.3.2.5.1.3.10 Seguir las mismas instrucciones de interpretación en los siguientes inci sos  (véase 
A.3.2.5.1.1.9 y A.3.2.5.1.1.10.) y contar el No. de celdas positivas (fluorescencia). Referirse en las tablas 
(véase tabla A.3.1 y A.3.2), para el NMP de enterococos fecales/100 mL.  
A.3.2.5.1.3.11 NMP. Serie de 15 tubos de dilución.  
A.3.2.5.1.4 . Muestra directa.  
A.3.2.5.1.4.1 Agregar un reactivo de sustrato cromogénico definido a un frasco (estéril) que contenga  100 
mL de la muestra. Cerrar y homogeneizar hasta disolución del polvo.  
A.3.2.5.1.4.2 Pipetear 5 veces 10 mL de la mezcla anterior y co locarlos en cada uno de 5 tubos de  20 x 
150 mm con tapón de rosca, cerrar e identificar.  
A.3.2.5.1.5 Muestra diluida 1:10.  
A.3.2.5.1.5.1 Separar cuidadosamente un paquete (que contiene el reactivo) de la tira.  
A.3.2.5.1.5.2 Golpear el paquete para asegura rse que todo el polvo se vaya al fondo.  
A.3.2.5.1.5.3 Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la parte expuesta 
de la misma.  
A.3.2.5.1.5.4 Agregar el reactivo del paquete con el sustrato cromogénico definido a un frasco estéril que 
contenga 100 mL de agua estéril (desionizada o destilada). Tapar y mezclar hasta disolución del reactivo.  
A.3.2.5.1.5.5  Pipetear 9 mL de esta mezcla a cada uno de 10 tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca 
estériles (5 tubos para la dilución 1: 10 y 5 para la dilución 1:100) e identificarlos.  
A.3.2.5.1.5.6 Pipetear 1 mL de la muestra (esto constituye una muestra diluida 1:10) dentro de cada uno 
de los primeros 5 tubos, preparados como se indicó anteriormente.  
A.3.2.5.1.5.7 Cerrar y mezclar.  
A.3.2 .5.1.6 Dilución 1:100.  
A.3.2.5.1.6.1 Pipetear 10 mL de la muestra homogeneizada a un frasco estéril que contenga 90 mL de 
agua estéril (desionizada o destilada). Cerrar y homogeneizar. Pipetear 1.0 mL de esta dilución dentro  de 
cada uno de los 5 tubos res tantes, preparados como anteriormente se indicó.  
A.3.2.5.1.6.2 Tapar y mezclar.  
A.3.2.5.1.7 Diluciones adicionales.  
A.3.2.5.1.7.1 Para cualquier dilución adicional, seguir los lineamientos anteriormente mencionados.  
A.3.2.5.1.7.2 Incubación.  
A.3.2.5.1.7.3 Incubar las series de tubos inoculados a 41°C ±0.5°C por 24 h. Al cabo de este tiempo 
observar con una lámpara de luz UV de 6 watts con una longitud de onda de 366 nm. Determinar el NMP de 
enterococos fecales/100 mL (véase tabla A.3.3).  
A.3.2.6 Expresión d e los resultados.  
A.3.2.6.1 Cálculos.  
A.3.2.6.1.1 Para determinar:  
A.3.2.6.1.1.1  Presencia de enterococos fecales o  
A.3.2.6.1.1.2  Ausencia de enterococos fecales no hay cálculos que realizar.  
A.3.2.6.1.2 Para la cuantificación referirse a las tablas de NMP  correspondientes. Considerar en los 
cálculos la dilución cuando proceda.  
A.3.2.6.2 Interpretación de resultados.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.3.2.6.2.1 Si se observa fluorescencia en los frascos, tubos o charolas, se confirma entonces la presencia 
de Enterococos fecales.  
A.3.2.6.3 Criterios de validez de la prueba.  
A.3.2.6.3.1 Revisar y registrar las temperaturas de las incubadoras diariamente, a fin de asegurarse que 
se encuentran dentro de los límites establecidos.  
A.3.2.6.3.2 Deberá llevarse a cabo un control de calidad en cada n uevo lote de reactivo, el cual consiste 
del siguiente protocolo:  
A.3.2.6.3.2.1 Para cada tipo de cepa ATCC enlistadas más adelante, estriar en agar soya tripticasa (AST) 
o a placas de agar sangre e incubar a 35°C por 18 a 24 h.  
A.3.2.63.2.2 De cada cepa ba cteriana, tomar una asada de 1 µL de cada colonia e inocular un tubo de 
ensaye con 5 mL de agua desionizada estéril. Cerrar y agitar completamente.  
A.3.2.6.3.2.3 A continuación tomar una asada de 1 µL del tubo de ensayo y usar para inocular un frasco 
con 1 00 mL de agua desionizada o destilada estéril debidamente etiquetada. Seguir los siguientes pasos:  
A.3.2.6.3.2.3.1 Las muestras deben alcanzar una temperatura ambiente (18°C a 30°C).  
A.3.2.6.3.2.3.2 Separar cuidadosamente un paquete (que contiene el reacti vo) de la tira.  
A.3.2.6.3.2.3.3 Golpear el paquete para asegurarse que todo el polvo se vaya al fondo.  
A.3.2.6.3.2.3.4 Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la parte 
expuesta de la misma.  
A.3.2.6.3.2.3.5 Agregar el rea ctivo a 100 mL de una muestra de agua, la cual está en un recipiente estéril, 
transparente y no fluorescente o comercialmente disponible.  
A.3.2.6.3.2.3.6 Cubrir y sellar asépticamente el recipiente.  
A.3.2.6.3.2.3.7 Agitar hasta disolución del polvo.  
A.3.2. 6.3.2.3.8 Incubar por 24 h a 41°C ±0.5°C.  
A.3.2.6.3.2.9 Observar la fluorescencia a las 24 h con la lámpara de UV de 6 watts y 366 nm de longitud 
de onda en un cuarto oscuro. Asegurarse que la luz se encuentre alejada de sus ojos y dirigida hacia la 
muestr a. Si se observa fluorescencia, se confirma entonces la presencia de enterococos fecales.  
A.3.2.6.3.2.10 Si la muestra se incuba por más de 28 h, aplicar lo siguiente: Si no hay fluorescencia 
después de 28 h, se considera una prueba negativa válida. Si hay  fluorescencia después de 28 h, se 
considera como un resultado inválido.  
A.3.2.6.3.2.11 Comparar los resultados de esta prueba con los resultados esperados (véase tabla 
Resultados esperados del control).  
Tabla - Resultados esperados del control.  
Control.  ATCC.  Resultados esperados.  
Enterococcus faecium.  335667  Fluorescencia .  
Serratia marcescens  (Gram –). 43862  No fluorescencia.  
Aerococcus viridians  (Gram +).  10400  No fluorescencia.  
 
A.3.2.7.1 Informe de prueba.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.3.2.7.1.1  Informar como presencia/ausen cia o el resultado basado en el cálculo de la densidad de 
enterococos fecales determinado en la tabla de NMP apropiada.  
A.4 Método de prueba para la determinación de esporas de Clostridium sulfito reductores.  
A.4.1 Fundamento.  
Para la detección de esporas anaerobias sulfito -reductoras (clostridia) en una muestra de agua, requiere 
de las siguientes etapas:  
Selección de esporas. La selección de esporas se realiza por la aplicación de calor en un tiempo suficiente 
para destruir las células vegetativas.  
Enrique cimiento del cultivo. La detección y recuento de esporas anaerobias sulfito -reductoras se realiza 
por inoculación de diferentes volúmenes de la muestra en medio de enriquecimiento líquido, seguido de la 
incubación a 37°C ±1°C por 44 ±4 horas en condiciones  de anaerobiosis.  
Este método es aplicable a todo tipo de agua, incluso agua turbia.  
Las esporas anaerobias sulfito reductoras (clostridia), están ampliamente distribuidas en el medio 
ambiente. Presentes en la materia fecal humana y animal, en agua contami nada y en tierra. A diferencia de 
Escherichia coli  y otros organismos coliformes, las esporas sobreviven en agua por largos periodos por ser 
más resistentes que las formas vegetativas a la acción de factores químicos y físicos. Por lo tanto, nos pueden 
dar una indicación de contaminación remota o intermitente. Pueden resistir incluso la cloración a niveles 
normalmente utilizados para el tratamiento del agua y por lo tanto, son útiles para fines de control.  
Clostridia: microorganismos anaerobios, formadores de esporas, sulfito -reductores, que pertenecen a la 
familia Bacillaceae  y al género Clostridium . 
Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir fielmente 
y controlar cuidadosamente las condiciones en que se llevan a cabo estos métodos.  
A.4.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.  
A.4.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.  
A.4.2.2 Todo el material que esté en contacto con la muestra debe estar  estéril.  
A.4.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios  de 
cultivo.  
A.4.2.4 El laboratorio debe tener implementado un sistema de control de calidad para asegurar que los 
materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
A.4.3 Materiales.  
A.4.3.1 Frascos con tapa de rosca o viales y tapones de vidrio de borosilicato de 200 mL, 100 mL y 25 mL 
de capacidad.  
A.4.3.2 Pipetas de 10 y 1 mL de capacidad.  
A.4.3.3 Tubos de  prueba de 150 mm x 13 mm.  
A.4.3.4 Alambre de fierro.  
A.4.4 Medios de cultivo, reactivos y diluyentes.  
A.4.4.1 Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.  
A.4.4.2 Para mejorar la reproducibilidad de los resultados es recomendab le que para la preparación de los 
diluyentes y el medio de cultivo, sean utilizados componentes básicos deshidratados o el medio completo 
deshidratado, con su correspondiente certificado de calidad.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.4.4.3 El agua utilizada debe ser destilada o desionizad a, libre de substancias que puedan inhibir el 
desarrollo de microorganismos en las condiciones de la prueba.  
A.4.4.4 Si el medio de cultivo preparado no se utiliza de inmediato, se debe guardar en la oscuridad, a 
4°C, por no más de 1 mes.  
A.4.5 Diluyente.  
A.4.5.1 Los diluyentes que a continuación se describen son los que comúnmente se utilizan en 
microbiología. Después de su preparación se distribuye en botellas y esterilizar a 121°C ±3°C por 15 min.  
A.4.5.2  Alternativamente se puede distribuir asépticament e después de la esterilización. Almacenar a 
temperatura ambiente o en refrigeración 5°C ±3°C por un máximo de 6 meses. Si el diluyente presenta algún 
cambio de su normal apariencia descartarlo.  
A.4.6 Solución salina.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Cloruro de sodi o. 8.5 g  
Agua.  1 L 
 
A.4.7 Preparación.  
A.4.7.1 Disolver los ingredientes en agua, si es necesario por calentamiento. Ajustar el pH con disolución 
de hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera, después de la esterilización el 
pH debe ser 7.0 ±0.5 a 25°C  
A.4.8 Diluyente de peptona.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Peptona de caseína.  1.0 g  
Agua.  1 L 
A.4.8.1 Preparación.  
A.4.8.1.1 Disolver los ingredientes en agua, si es necesario por calentamiento. Ajustar el pH con disolución 
de hi dróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera, después de la esterilización el 
pH debe ser 7.0 ±0.5 a 25°C.  
A.4.9 Solución buffer de fosfatos.  
Ingrediente.  Cantidad.  
KH2PO 4. 34.0 g  
Agua.  1 L 
A.4.9.1 Preparación.  
A.4.9.1.1 Disolver el KH 2PO 4 en 500 mL de agua. Ajustar el pH con disolució n de hidróxido de sodio  0.01 
N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera a 7.2 ±0.2 a 25°C, adicionar más agua hasta 1000 mL, si 
la solución necesita ser almacenada esterilizar a 121°C ±3° C. 
A.4.10 Medio diferencial reforzado para clostridia. (DRCM)  
A.4.10.1 Medio basal concentración simple.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Peptona de carne.  10.0 g  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
Extracto de carne.  10.0 g  
Extracto de levadura.  1.5 g  
Almidón.  1.0 g  
Acetato de sodio hidratado.  5.0 g 
Glucosa.  1.0 g  
Clorhidrato de L -cisteína.  0.5 g  
Agua.  1 L 
 
A.4.10.1.1 Preparación.  
A.4.10.1.1.1 Mezclar la peptona de carne, el extracto de carne, el acetato de sodio y el extracto de 
levadura con 800 mL de agua.  
A.4.10.1.1.2 Con los 200 mL de agu a destilada restantes, preparar una solución de almidón de esta 
manera: mezclar el almidón en un poco de agua fría hasta formar una pasta. Calentar el resto del agua hasta 
ebullición y lentamente agregar la pasta con agitación constante.  
A.4.10.1.1.3 Agreg ar la solución de almidón a la mezcla y caliente a ebullición hasta que se disuelva.  
A.4.10.1.1.4 Finalmente, adicionar la glucosa y el clorhidrato de L -cisteína hasta que se disuelvan.  
A.4.10.1.1.5 Ajustar el pH entre 7.1 y 7.2 con disolución de hidróxido  de sodio 0.01 N una disolución de 
HCl 0.01 N según se requiera.  
A.4.10.1.1.6 Transferir alícuotas de 25 mL del medio en frascos con tapón de rosca con capacidad  de 25 
mL. Esterilizar en autoclave a 121°C ±1°C por 15 min.  
A.4.10.2 Medio basal doble concen tración.  
A.4.10.2.1 Preparar el medio a doble concentración como en el inciso anterior, pero reducir el v del agua a 
la mitad.  
A.4.10.2.2 Transferir alícuotas de 10 mL y 50 mL del medio en frascos con tapa de rosca de 25 mL y de 
100 mL de capacidad respect ivamente.  
A.4.10.3 Solución de sulfito de sodio (Na 2SO 3) al 4%.  
A.4.10.3.1 Disolver 4 g de sulfito de sodio anhidro en 100 mL de agua. Esterilizar por filtración a través de 
membrana con tamaño de poro de 0.45 micras.  
A.4.10.3.2 Almacenar entre 2 a 5°C.  
A.4.10.3.3 Se recomienda preparar una solución reciente cada 14 días.  
A.4.10.4 Solución de citrato férrico (C 6H507Fe) al 7%.  
A.4.10.4.1 Disolver 7 g de citrato férrico en 100 mL de agua. Esterilizar por filtración a través de membrana 
con tamaño de poro de 0 .45 micras.  
A.4.10.4.2 Almacenar entre 2 a 5°C.  
A.4.10.4.3 Se recomienda preparar una solución reciente cada 14 días.  
A.4.10.5 Medio completo.  
A.4.10.5.1 El día del análisis, mezcle volúmenes iguales de las soluciones de sulfito de sodio (véase 
A.4.10.3) y  de citrato férrico (véase A.4.10.4).        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.4.10.5.2 Adicionar 0.5 mL de la mezcla (véase A.4.10.5.1) a cada frasco de medio de concentración 
simple (véase A.4.10.1.), que haya sido calentado y enfriado recientemente.  
A.4.10.5.3 Adicionar 0.4 mL de la mezcla ( véase A.4.10.5.1) a cada frasco con 10 mL de medio de doble 
concentración (véase A.4.10.2) y 2 mL a cada frasco con 50 mL de medio de doble concentración  (véase 
A.4.10.2). Tratamiento similar a (véase A.4.10.5.2).  
A.4.11 Aparatos e instrumentos.  
A.4.11.1 Baños de agua con termostato regulador a 75°C ±5.0°C.  
A.4.11.2 Filtros de membrana estériles, de un poro de 0.2 µ.  
A.4.11.3 Incubadora que mantenga una temperatura de 37°C ±1.0°C.  
NOTA:  La calidad de los filtros de membrana puede v ariar de acuerdo a la mar ca y au n de lote a lote. Por 
lo tanto, es aconsejable revisar la calidad regularmente de acuerdo a la ISO 7704.  
A.4.12.  Preparación de las muestras.  
A.4.12.1 Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra  con etanol o isopropanol al 70 %. 
A.4.1 2.2 Realizar diluciones decimales cuando se estime que la carga de esporas de anaerobios sulfito 
reductores (clostridia), es alta.  
A.4.13 Recomendaciones generales previas al análisis de la muestra.  
A.4.13.1  Las muestras en frascos con un espacio vacío (de  al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse 
por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a ¾ de lleno, deberán agitarse 25 
movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 seg, para asegurar una 
unidad analítica representativa.  
A.4.13.2  Como alternativa al uso de campanas de fermentación (Durham) utilizar p úrpura de bromocresol 
a una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de  este 
indicador.  
A.4.13.3  Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color amarillo. Se puede utilizar una 
concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se 
agreguen 10 mL de muestra.  
A.4.14 Procedimiento analí tico. 
A.4.14.1 Técnica de selección de esporas.  
A.4.14.1.1  Antes de iniciar la prueba, calentar la muestra en baño de agua a 75°C ±5.0°C por 15 min a 
partir de que se alcance la temperatura. Utilizar periódicamente un frasco similar que contenga el mismo v  de 
agua que el de la muestra como control para confirmar que durante el tiempo de calentamiento requerido, la 
temperatura se mantenga monitoreando con un termómetro.  
A.4.14.2 Inoculación e incubación . 
A.4.14.2.1 Adicionar 50 mL de la muestra (véase A.4.14 .1) a un frasco con tapa de rosca de 100 mL que 
contenga 50 mL de medio completo de doble concentración (véase A.4.10.5.3).  
A.4.14.2.2 Adicionar 10 mL de la muestra (véase A.4.14.1) a una serie de 5 frascos con tapa de rosca de 
25 mL que contenga 10 mL de medio completo de doble concentración (véase A.4.10.5.2).  
A.4.14.2.3 Si es necesario, adicionar 1 mL de una dilución 1:10 de la muestra (véase A.4.14.1) a una serie 
de 5 frascos con tapa de rosca de 25 mL que contengan 25 mL de medio de concentración simpl e  (véase 
A.4.10.5.2).  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.4.14.3 Presencia -Ausencia.  
A.4.14.3.1 Para realizar un examen cualitativo de 100 mL de agua potable o de agua envasada sin hacer 
una cuenta por NMP, utilizar un frasco de 200 mL con una mezcla de 100 mL de medio completo de doble 
concentración (véase A.4.10.5.3) y adicionar 100 mL de la muestra (véase A.4.14.1).  
A.4.14.3.2 Asegurarse que el v de aire remanente en todos los frascos, con medio completo de 
concentración simple (véase A.4.10.5.3) para alcanzar el nivel del v del líquido  con el cuello del frasco. Sellar 
los frascos asegurando no tener burbuja o incubar en condiciones de anaerobiosis.  
A.4.14.3.3 Incubar los frascos inoculados a 37°C ±1°C por 44 ±4 horas.  
A.4.14.3.4 Volúmenes grandes de cultivos en frascos de vidrio sellado s herméticamente pueden explotar 
por la producción de gas. La adición de un alambre de fierro, calentado a rojo vivo y puesto en el medio antes 
de la inoculación, creará una atmósfera de la anaerobiosis.  
A.4.15 Interpretación de resultados.  
A.4.15.1  Se con sidera como una prueba positiva los frascos en donde se observe obscurecimiento como 
resultado de la reducción del sulfito y la precipitación de sulfuro ferroso (II).  
A.4.16 Criterios de validez de la prueba.  
A.4.16.1  Esta prueba tiene validez cuando todos  los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los 
tubos de la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga esporas 
de C lostridium sulfito reductores o cuando se trate de un cultivo control inoculado con 100 UF C. 
A.4.17 Índices de reproducibilidad y repetibilidad.  
A.4.17.1 Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados analíticos 
deben estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.  
A.4.17.2 La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%.  
A.4.18 Informe de prueba.  
A.4.18.1 Expresar los resultados como NMP. En el informe de prueba debe establecerse el método 
empleado y expresar los resultados como NMP de esporas de Clostridium sulfito re ductores por 100 mL de 
muestra. Además debe mencionarse cualquier modificación no especificada en documento o mencionarse 
como opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que pudiera influir en los resultados.  
A.4.18.2 El informe de prueba debe  incluir toda la información necesaria para la identificación completa de 
la muestra.  
NMP de esporas de Clostridium  sulfito reductores/100 mL.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
 
 
A.4.19 Método de filtración por membrana.  
A.4.19.1 Fundamento.  
La detección de esporas de Clostridium  sulfito reductores en una muestra de agua requiere de las 
siguientes etapas:  
Selección de esporas. La selección de esporas en una muestra se realiza por aplicación de calor en un 
periodo de tiempo suficiente para destruir formas bacterianas vegetativas.  
Filtración  por membrana y cultivo.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
El recuento de esporas de anaerobios sulfito -reductoras se basa en la filtración de un v determinado de 
una muestra de agua, a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro suficiente para retener las 
bacterias (0.2 µm). La  membrana es colocada en el medio selectivo agar sulfito de fierro seguido de una 
incubación a 37°C ±1°C, por 20 horas ±4 horas y 44 horas ±4 horas, y contar todas las colonias negras.  
A.4.19.2 Materiales.  
A.4.19.2.1 Matraces de vidrio (Matraces Erlenmeyer , matraces de bola o matraces de forma cónica), con 
capacidad de 2 L.  
A.4.19.2.2 Tubos de ensayo de 160 mm x  16 mm.  
A.4.19.2.3 Pipetas graduadas, de capacidad de 10 mL, graduadas con divisiones de 0.1 mL.  
A.4.19.2.4 Cajas Petri.  
A.4.19.2.5 Filtros de membr ana estériles, de un poro de 0.2 µ.  
NOTA: La calidad de los filtros de membrana puede variar de acuerdo a la marca y a un de lote a lote. Por 
lo tanto, es aconsejable revisar la calidad regularmente de acuerdo a la ISO 7704.  
A.4.19.3 Medios de cultivo y rea ctivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser  grado 
analítico.  
A.4.19.3.1 Agar sulfito de fierro.  
A.4.19.3.1.1 Medio base (agar nutritivo).  
Ingrediente.  Cantidad.  
Extracto de carne.  3.0 g  
Peptona.  10.0 g  
Cloruro de sodio (NaCl).  5.0 g 
Agar.  15.0 g  
Agua.  1 L 
 
A.4.19.3.1.1.1 Preparación.  
A.4.19.3.1.1.1.1 Disolver a vapor fluyente para disolver los ingredientes, aforar a 1 L de agua y ajustar el 
pH a 7.6 ±0.1 con disolución de hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N s egún se requiera. 
Esterilizar a 121 ±1°C en autoclave por 20 minutos.  
A.4.19.3.1.1.1.2 Guardar en el refrigerador después de que solidifique.  
A.4.19.3.1.1.2 Solución de sulfito de sodio (Na 2S03). 
A.4.19.3.1.1.2.1 Disolver 10 g de sulfito de sodio en 100 mL  de agua.  
A.4.19.3.1.1.2.2 Se recomienda preparar la solución cada dos semanas.  
A.4.19.3.1.1.3 Solución de sulfato de Fierro (II) (FeSO 4). 
A.4.19.3.1.1.3.1 Disolver 8 g de sulfato de Fierro (II) cristalizado en 100 mL de agua.  
A.4.19.3.1.2 Medio completo.  
A.4.19.3.1.2.1 Inmediatamente antes de utilizarse, mezclar el medio base (véase A.4.19.3.1.1), por cada 
18 mililitros adicionar 1 mL de la solución de sulfito de sodio (véase A.4.19.3.1.1.2) y cinco gotas de la 
solución de sulfato de Fierro (II) (véase A.4 .19.3.1.1.3).  
A.4.19.3.1.2.2 Adicionar 1 mililitro de la solución de sulfito de sodio y cinco gotas de la solución de sulfato 
de Fierro (II) a los tubos de agar antes de iniciar el análisis.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.4.19.3.2 Agar sulfito -triptosa (medio alternativo).  
Ingrediente . Cantidad.  
Triptosa.  15.0 g  
Soytona.  5.0 g  
Extracto de levadura.  5.0 g  
Metabisulfito de sodio.  1.0 g  
Citrato férrico (III) amoniacal.  1.0 g  
Agua.  1 L 
 
A.4.19.3.2.1 Preparación.  
A.4.19.3.2.1.1 Calentar a vapor fluyente para disolver los ingredientes  y ajustar el pH a 7.6 ±0.1 con 
disolución de hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera.  
A.4.19.3.2.1.2 Distribuir en volúmenes de 18 mL en tubos de ensaye. Esterilizar el medio por 15 min  a 
121 ±1°C.  
A.4.19.3.2.1.3 Guarda r en el refrigerador a 4°C a 5°C.  
A.4.19.3.2.1.4 Descartar el medio que no se ha utilizado después de 2 semanas de su preparación.  
A.4.19.4 Aparatos e instrumentos.  
A.4.19.4.1 Jarras de anaerobiosis.  
A.4.19.4.2 Olla de presión para generar vapor fluyente.  
A.4.19.4.3 Baño de agua.  
A.4.19.4.4 Equipo para filtración de membrana.  
A.4.19.4.5 Incubadora que mantenga una temperatura de 37°C ±1.0°C.  
A.4.19.5 Procedimiento.  
A.4.19.5.1 Para la selección de esporas: Antes de iniciar la prueba, calentar la muestra en b año de agua a 
75°C ±5.0°C por 15 min a partir de que se alcance la temperatura. Utilizar periódicamente un frasco similar 
que contenga el mismo v de agua que el de la muestra como control para confirmar que durante el tiempo de 
calentamiento requerido, la temperatura se mantenga monitoreando con un termómetro.  
A.4.19.6. Inoculación e incubación.  
A.4.19.6.1 Filtración e incubación.  
A.4.19.6.2 Conectar el equipo de filtración a la bomba de vacío.  
A.4.19.6.3 Utilizando pinzas estériles, colocar la membrana con  la cuadrícula hacia arriba sobre  el 
portafiltro.  
A.4.19.6.4 Colocar cuidadosamente el embudo sobre el receptáculo y asegurarlo en su lugar.  
A.4.19.6.5 Abrir la llave de paso y filtrar a través de la membrana, 100 mL de muestra aplicando suficiente 
vacío ( aproximadamente 70 kPa). Cerrar la llave de paso tan pronto como la muestra haya sido filtrada. Es 
aconsejable enjuagar el embudo mediante la filtración de 1 a 3 porciones de 10 a 30 mL de diluyente estéril, 
mientras la membrana permanezca en su lugar. Inm ediatamente después cerrar la llave de paso.  
A.4.19.6.6 Retirar el embudo para dejar expuesta la membrana de filtración. Colocar la membrana con 
pinzas estériles en el agar Slanetz & Bartley. Evitar la formación de burbujas entre la membrana y la superfici e 
del agar.  
A.4.19.6.7 Incubar las placas invertidas a 36°C ±2°C durante 44 h ±4 h.  
A.4.19.7 Confirmación y Recuento.  
A.4.19.7.1 Las esporas de Clostridium  sulfito reductores son elevadas, de color rojo, marrón o rosado.  
A.4.19.7.2 Si hay colonias típicas,  transferir la membrana con pinzas estériles a una placa con agar bilis 
esculina azida.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.4.19.7.3 Incubar a 44°C ±0.5°C durante 2 h.  
A.4.19.7.4 Leer la placa inmediatamente después de la incubación.  
A.4.19.7.5 Las colonias típicas de esporas de Clostridiu m sulfito reductores presentan un color marrón a 
negro alrededor de la colonia.  
A.4.19.7.6 Con ayuda de un cuenta colonias, seleccionar cajas que contengan entre 20 y 80 colonias 
típicas y contar el número de UFC.  
NOTA:  Una distribución desigual de las col onias o la presencia de flora competitiva, puede interferir con la 
diferenciación de colonias positivas debido a la difusión del color a las colonias adyacentes.  
A.4.19.7.7 Filtrar 100 mL de agua con baja contaminación de esporas de Clostridium  sulfito red uctores.  
A.4.19.7.8 Para agua altamente contaminada, usar volúmenes similares, pero filtrar en porciones de  10 
mL que deben ser mezclada con 10 a 100 mL de agua estéril o diluyente.  
A.4.19.7.9 Ajustar las diluciones de tal forma que las colonias negras re sultantes estén bien separadas y 
puedan fácilmente contarse.  
A.4.19.7.10 Después de la filtración, quitar la membrana con pinzas estériles y colocarla cuadrícula hacia 
arriba en el fondo de la caja Petri, asegurarse que no existan burbujas de aire atrapada s debajo de la 
membrana. Cuidadosamente vaciar 18 mL del medio de cultivo completo fundido, sobre la membrana, 
previamente mantenido a 50°C. Después de depositar el medio, incubar en condiciones de anaerobiosis o en 
otras condiciones que aseguren anaerobio sis a una temperatura de 37 ±1°C por 20 ±4 h y 44 ±4 h. Si se 
utiliza una jarra de anaerobiosis o una incubadora de anaerobiosis, el filtro de membrana deberá ser colocado 
sobre la superficie del agar.  
A.4.19.8 Expresión de los resultados.  
A.4.19.8.1 Cálcu los. 
A.4.19.8.1.1  Aplicar la siguiente fórmula para determinar la cantidad de esporas de Clostridium sulfito 
reductores : 
 
Ejemplo.  
Volumen probado.  Cuentas.  
100 mL  82 colonias.  
10 mL  11 colonias.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
 
A.4.19.8.1.2 Interpretación.  
A.4.19.8.1.2.1  Contar tod as las colonias negras después de incubar las placas por 20 ±4 h y 44 ±4 h.  
A.4.20 Informe de prueba.  
A.4.20.1 Informar como:  
A.4.20.1.1 UFC de esporas de Clostridium  sulfito reductores/100  mL. 
A.4.20.1.2 Si se observan menos de 20 colonias aplicar la fórm ula 4.1 e informar como valor estimado.  
A.4.20.1.3 Placas sin colonias, informar c omo 
  UFC de esporas de Clostridium  sulfito 
reductores/100 mL e informar como valor estimado.  
A.4.20.1.4 Donde: V tot es la suma del volumen total de las porciones probadas de  muestra o dilución 
(véase punto A.4.19.8.1.1)  
A.4.20.1.5 También se puede informar como “Cero” u “organismos no detectables” indicando el volumen 
de muestra analizada.  
A.4.20.1.6 En el informe de prueba debe establecerse el método empleado y expresar los resultados como 
UFC. El recuento a las 44 ±4 h de ser reportado normalmente. Si esto no fuera posible, el recuento de las  20 
±4 h deberá reportarse sólo como una aproximación UFC de esporas de Clostridium  sulfito reductores/100 mL.  
A.4.20.1.7 Además debe mencionarse cualquier modificación no especificada norma o mencionarse como 
opcional, junto con los detalles de cualquier incidente que pudiera influir en los resultados.  
A.4.20.1.8 El informe de prueba debe incluir toda la información necesaria para la id entificación plena de la 
muestra.  
A.5 Método de prueba para la determinación Cuenta total de mesofílicos aerobios.  
A.5.1 Fundamento.  
La cuenta heterotrófica en placa, formalmente conocida como cuenta estándar, es un producto de la 
estimación del No. de bac terias heterotróficas vivas, cuyo objetivo es determinar la efectividad de tratamiento 
y distribución del agua o hielo. Las colonias de bacterias pueden estar formadas por células agrupadas en 
pares, cadenas, racimos o separadas; todas ellas se incluyen en  el término UFC. Su cuenta final dependerá 
de la interacción entre los microorganismos, el medio de cultivo elegido y el tiempo de incubación. Los 
métodos más comunes son: Vaciado en placa, filtración por membrana y extensión en placa. Se deben aplicar 
y controlar las condiciones en que se llevan a cabo estos métodos.  
La cuenta heterotrófica en placa, formalmente conocida como cuenta estándar o cuenta en placa, es un 
producto de la estimación del No. de bacterias heterotróficas vivas en agua o hielo.  
El mét odo de vaciado en placa es sencillo de realizar y utiliza volúmenes de muestra o sus diluciones en 
un intervalo de 0.1 a 2.0 mL. Las colonias producidas son relativamente pequeñas y compactas, mostrando 
menos tendencia a encimarse unas a otras, que aquella s producidas en extensión superficial. Por otro lado, 
las colonias inmersas tienen lento desarrollo y son difíciles de transferir, además están sometidas a un choque 
térmico producido cuando se vierte el medio de cultivo a una temperatura de 45°C a 46°C.  
El método de filtración por membrana permite analizar mayores volúmenes de agua con escasa turbiedad 
y es el método de elección para aguas con cuentas entre 1 y 10 UFC/mL. En este método no existe un 
choque térmico, pero se agrega el costo de los filtros de  membrana. Muchas desventajas incluyen: un área 
más pequeña de conteo, la necesidad de detectar colonias a través de luz reflejada contra un fondo blanco, 
daños a las células por una excesiva presión de filtración, así como posibles variaciones en la calid ad de las 
membranas.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.5.2 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.  
A.5.2.1 Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y descontaminada.  
A.5.2.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá e sterilizarse mediante 
horno, durante 2 h de 170°C a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min  como 
mínimo.  
A.5.2.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios  de 
cultivo.  
A.5.2.4 El labo ratorio debe tener claramente definido un sistema de control de calidad, para asegurar que 
los materiales, equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
A.5.2.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con u n pH de 5 a 7.  
A.5.2.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse material 
de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.  
A.5.2.7 Evitar imprecisiones en los conteos debidos a descuido o fallas para reconocer colonias. La 
precisión del anali sta deberá estar dentro de un 5% y entre analistas 10 %. 
A.5.3 Aparatos e instrumentos.  
A.5.3.1 Contador manual tipo Tally.  
A.5.3.2 Contador de colonias Quebec o equivalente.  
A.5.3.3 Incubad ora que evite variaciones mayores a 0.5°C y termómetro calibrado y/o verificado.  
A.5.3.4 Baño de agua a 45°C que evite variaciones mayores a 1°C.  
A.5.3.5 Cajas de Petri de vidrio de borosilicato o desechables de 15 x 90 mm a 15 x 100 mm.  
A.5.4. Medios de c ultivo y reactivos. Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado 
analítico.  
A.5.4.1 Agar cuenta en placa (agar triptona extracto de levadura).  
Ingrediente.  Cantidad (g).  
Triptona.  5.0 
Extracto de levadura.  2.5 
Glucosa.  1.0 
Agar.  15.0 
 
A.5.4.1.1 Preparación.  
A.5.4.1.1.1  Disolver los ingredientes en 1 L de agua, dejar reposar 15 min y calentar en baño de agua 
hasta disolución completa. Distribuir en frascos de acuerdo con el v requerido. Esterilizar a 121°C durante  15 
min, ajustar el pH  final 7.0 ±0.2 con disolució n de hidróxido de sodio 0.01 N o  una disolución de HCl 0.01 N 
según se requiera.  
A.5.4.1.2 Solución amortiguadora de fosfatos (agua diluyente).  
A.5.4.1.2.1 Solución madre.  
A.5.4.1.2.1.1  Disolver 34.0 g de KH 2PO 4 en 500 mL de ag ua. Ajustar el pH 7.2 ±0.5 con disolución de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera  y diluir a 1 L con agua. Esterilizar 
a 121°C durante 15 min. Almacenar en refrigeración.  
A.5.4.1.2.2 Solución de trabajo.  
A.5.4.1.2.2.1  Agregar a 1 L de agua, 1.25 mL de la solución madre más 5.0 mL de solución de cloruro de 
magnesio (81.1 g de MgCl 2•6H 2O por 1 L de agua). Distribuir en frascos o tubos 99 ±2.0 mL o 9 ±0.2 mL. 
Esterilizar a 121°C durante 15 min.  
A.5.5 Preparación de la mues tra. 
A.5.5.1  Seleccionar las diluciones apropiadas donde el No. de UFC está entre 30 –300.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.5.5.2  Cuando se sospeche de una cuenta estándar mayor a 3000 UFC, preparar diluciones hasta 10-2  
(1 mL de muestra + 99 mL de solución amortiguadora de fosfatos com o diluyente) (véase el diagrama 
Preparación de las disoluciones.)  
A.5.6 Recomendaciones generales previas al análisis de la muestra.  
A.5.6.1  Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5 cm), pueden homogeneizarse por 
inversión rápida 25 ve ces. Las muestras en frascos que tengan de 2/3 a ¾ de lleno, deberán agitarse 25 
movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm completados en un tiempo de 7 seg, para asegurar una 
unidad analítica representativa.  
A.5.6.2  Como alternativa al uso de campan as de fermentación (Durham) utilizar purpura de bromocresol a 
una concentración de 0.01 g/L al medio de cultivo, la producción ácida se observará por el vire de este 
indicador.  
A.5.6.3  Los tubos positivos se manifiestan por el vire del indicador a color am arillo. Se puede utilizar una 
concentración doble del medio de cultivo, en cuyo caso se emplearán 10 mL de caldo preparado, cuando se 
agreguen 10 mL de muestra.  
A.5.7 Procedimiento.  
A.5.7.1 Vaciado en placa.  
A.5.7.1.1 Depositar en el centro de cada una de 2 cajas de Petri, una alícuota de 1 mL de la muestra 
directa o de su dilución.  
A.5.7.1.2 Vaciar 15 –20 mL de agar triptona extracto de levadura, previamente fundido y mantenido a 45°C 
±1°C. El tiempo transcurrido desde la preparación de la primera dilución y el vaciado del agar no debe exceder 
de 20 min.  
A.5.7.1.3 Mezclar suavemente, en una superficie lisa, con 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en 
sentido opuesto y 6 de atrás hacia delante.  
A.5.7.1.4 Preparar una caja testigo con medio de cultivo única mente.  
A.5.7.1.5 Dejar solidificar, incubar las cajas invertidas a 35°C ±0.5°C durante 48 h ±2 h.  
A.5.7.1.6 Con la ayuda de un cuenta colonias contar, inmediatamente después de concluido el período de 
incubación, todas las colonias de las cajas de Petri el egidas que tengan entre 30 –300 UFC, incluir hasta las 
colonias puntiformes. Si las cuentas no caen dentro de este intervalo, seleccionar aquellas cajas que tengan 
cuentas lo más cercano a éste. Anotar el resultado en la bitácora correspondiente.  
A.5.7.1.7 Anotar el control de esterilidad en la bitácora correspondiente.  
Diagrama -Preparación de las diluciones.  
 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.5.8 Expresión de los resultados.  
A.5.8.1 Cálculos.  
A.5.8.1.1 Calcular el promedio de la cuenta (media aritmética) de los duplicados.  
A.5.8.1.2 Cuando reporte los resultados, redondear las 2 primeras cifras significativas al momento de 
multiplicar por el inverso de la dilución. Redondear a la cifra más alta cuando el tercer dígito sea 6, 7, 8 o  9 y a 
la cifra más baja cuand o el tercer dígito sea 1, 2 , 3 o 4. Cuando el tercer dígito sea 5 redondear hacia abajo 
cuando  el segundo dígito sea menor a é ste y redondear hacia arriba cuando el segundo dígito sea igual o 
mayor a 5 (por ejemplo 2 850 como 2 900).  
A.5.8.1.3 En cuentas directas, para valores menor es de 30 incluyendo el cero, reportar < 30 UFC de 
mesofílicos aerobios/mL, vaciado en placa, 35°C/48 h en agar cuenta estándar.  
Ejemplo:  
Cuenta calculada.  UFC 
12 700  13 000  
12 400.  12 000  
15 500.  16 000  
14 500.  14 000  
 
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
En donde:  
d es el factor de di lución en la cual se obtuvo el primer conteo.  
 Dilución 1:100  Dilución 1:1000  Resultado UFC/mL  
Cuentas.  18 2 < 3,000  
0 0 < 3,000  
 
Placas con cuentas mayores a 300 UFC.  
 Dilución 1:100  Dilución 1:1000  UFC/mL  
estimado  
Cuentas.  Incontable.  640 640,000  
 
 Dilución 1:100  Dilución 1:1000  UFC/mL  
Estimado.  
Cuentas.  Incontable.  Incontable.  > 6,500 000 A  
   > 5,900 000 B  
En donde:  
A es considerando que el área de la placa es de 65 cm2; 
B es considerando que el área de la placa es de 59 cm2; 
Debido a la gran d iversidad de productores de cajas de Petri, se sugiere recalcular el área de las placas 
mediante la siguiente:  
 
En donde:  
 es 3.1416 y  
r es el radio de la placa en cm.  
A.5.9 Informe de prueba.  
A.5.9.1 Informar como:  
A.5.9.1 .1 UFC mesofílicas aerobias/mL, vaciado en placa, 35°C/48 h en agar cuenta estándar.  
A.6 Método de prueba para la determinación de Filtración por membrana.  
A.6.1 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de calidad.  
A.6.1.1 Trabajar en condi ciones asépticas en área limpia y descontaminada.  
A.6.1.2 Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio deberá esterilizarse mediante 
horno, durante 2 h de 170°C a 175°C o 1 h a 180°C o en autoclave, a 121 ±1.0°C durante 15 min como 
mínimo. 
A.6.1.3 Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios  de 
cultivo.  
A.6.1.4 El laboratorio debe tener claramente definido un sistema de control de calidad, para asegurar que 
los materiales, equipos, reactiv os, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
A.6.1.5 Cuando se indique agua, debe entenderse agua destilada, con un pH de 5 a 7.  
A.6.1.6 El material de vidrio puede sustituirse por material desechable no tóxico. No debe usarse material 
de vidrio dañado por esterilización repetida y éste debe ser químicamente inerte.  
A.6.1.7 Evitar imprecisiones en los conteos debidos a descuido o fallas para reconocer colonias. La 
precisión del anali sta deberá estar dentro de un 5% y entre analistas 10 %. 
A.6.2 Materiales.  
A.6.2.1 Frascos de dilución de vidrio de borosilicato o frascos de polipropileno.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
A.6.2.2 Pipetas serológicas de 10 mL.  
A.6.2.3 Pipetas serológicas de 1 mL.  
A.6.2.4 Pinzas estériles para membrana.  
A.6.2.5 Matraces Kitazato de 1000 mL.  
A.6.2.6 Filtros de membrana estériles de tamaño de poro de 0.45 µm.  
A.6.2.7 Cajas de Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60 x 15 mm a 50 x 9 mm.  
A.6.2.8 Manguera de hule para equipo de filtración.  
A.6.2.9 Propipeta.  
A.6.3 Medios de cultivo  y reactivos.  
A.6.3.1 Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico.  
A.6.1 Agar cuenta estándar m -HPCA.  
Ingrediente.  Cantidad.  
Peptona.  20.0 g  
Gelatina.  25.0 g  
Glicerol.  10.0 mL  
Agar.  15.0 g  
 
A.6.1.1 Preparación:  
A.6.1.1.1  Disolver los ingredientes en 1 L de agua, excepto el glicerol, ajustar el pH a 7.1 con disolución de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera, dejar reposar 15 min y calentar 
en baño de agua hasta disolución completa, agreg ar el glicerol. Distribuir en frascos de acuerdo con el v 
requerido. Esteriliza r a 121° C durante 15 min, el pH final debe ser 7.1 ± 0.2.  
A.6.2 Agar R2A (este medio además se puede utilizar en el método de vaciado en placa).  
Ingrediente.  Cantidad (g).  
Extracto de levadura.  0.5 
Proteosa peptona No. 3 o polipeptona.  0.5 
Casaminoácidos.  0.5 
Glucosa  0.5 
Almidón soluble.  0.5 
K2HPO 4 0.3 
MgSO 4.7H 2O 0.05 
Piruvato de sodio.  0.3 
Agar.  15.0 
 
A.6.2.1 Preparación:  
A.6.2.1.1  Disolver los ingredientes, excepto e l agar en 1 L de agua, ajustar el pH a 7.2 con disolución de 
hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N según se requiera. Agregar el agar y calentar hasta 
su disolución. Distribuir en frascos de acuerdo con el v requerido y esterilizar a 121 °C durante 15 min.  
A.6.3 Agar NWRI -HPCA (este medio no se encuentra disponible comercialmente, lo que requiere de 
ingredientes básicos para su preparación).  
Ingrediente.  Cantidad (g).  
Peptona.  3.0 
Caseína soluble.  0.5 
K2HPO 4 0.2 
MgSO 4 0.05 
FeCl 3 0.001 
Agar.  15.0       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
A.6.3.1 Preparación:  
A.6.3.1.1 Ajustar el pH a 7.2 con disolución de hidróxido de sodio 0.01 N o una disolución de HCl 0.01 N 
según se requiera, antes de esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 min.  
A.6.3.1.2 Preparación de las placas.  
A.6.3.1.3 Distribuir porciones de 5 mL de cualquiera de los medios estériles, anteriormente mencionados, 
dentro de cajas de Petri. Dejar solidificar a temperatura ambiente. Las cajas preparadas pueden almacenarse 
en el refrigerador, invertidas en bolsas de plástico o en recipiente hermético, por no más de 2 semanas.  
A.6.3.1.4 Alícuota.  
A.6.3.1.5 El v filtrado variará de acuerdo con las muestras. Seleccionar un tamaño máximo de alícuota que 
entre 20 –200 UFC por filtro.  
A.6.4 Aparatos e instrumentos.  
A.6.4.1 Equipo de filtración por membrana con trampa.  
A.6.4.2 Bomba de vacío.  
A.6.4.3 Microscopio estereoscópico.  
A.6.4.4 Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 35°C ±2°C con termómetro calibrado y/o 
verificado.  
A.6.5 Procedimiento.  
A.6.5.1 Filtración.  
A.6.5.1.1  Filtrar un v adecuado, a través de un filtro de membrana estéril de 47 mm de diámetro y 0.45 µm 
de poro utilizando vacío. Enjuagar el embudo con porciones de 20 a 30 mL de agua diluyente estéril.  
A.6.5.1.2  Colocar el filtro sobre el agar en las caj as de Petri.  
A.6.5.2 Incubación.  
A.6.5.2.1  Colocar las cajas de Petri en recipientes con cierre hermético o bolsas de plástico que contengan 
toallas de papel húmedas. Incubar a 35°C ± 0.5°C por 48 ±2 h.  
A.6.6 Cálculos.  
A.6.6.1  Con la ayuda del microscopio estereoscópico, contar inmediatamente después de concluido el 
periodo de incubación, las colonias de las cajas que contengan entre 20 -200 UFC. Si las cuentas no caen 
dentro de este intervalo, seleccionar aquellas placas que t engan cuentas lo más cercano a éste. 
A.6.7 Informe de resultados.  
A.6.7.1  Informar como:  
A.6.7.1.1  UFC de mesofílicos aerobios/mL filtración por membrana, 35°C/48 ±2 h en medio utilizado.  
 
Apéndice B Normativo.  
Métodos fisicoquímicos.  
B.1 Método para la determinación de color por compar ación visual.  
B.1.1 Fundamento.  
El color se mide mediante una comparación visual de la muestra con una escala estandarizada de  platino -
cobalto. La unidad platino –cobalto es la que se produce al disolver 1 mg de platino en un L  de disolución 
acuosa ácida,  en forma de ion cloroplatinato.  
El color verdadero es el que se determina en muestras a las que se les ha eliminado la turbiedad mediante 
filtración.  
El color aparente es el que se determina en muestras que no han sido filtradas.  
El color en el agua se de be principalmente a la presencia de materia orgánica natural, especialmente 
humus y ácido fúlvico, así como de algunos metales como hierro.  
B.1.2 Interferencias.  
B.1.2.1  La turbiedad interfiere en la determinación del color verdadero y debe eliminarse medi ante 
filtración.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.1.2.2 El color verdadero y el aparente son dependientes del pH por lo que es necesario registrar el valor 
de pH de la muestra junto al reporte de color verdadero y aparente.  
B.1.3 Aparatos e instrumentos.  
B.1.3.1 Balanza analítica con pr ecisión de 0.1 mg, calibrada y verificada.  
B.1.3.2 Potenciómetro con electrodo combinado para medición de pH, con sensibilidad de 0.01 unidades 
de pH, verificado con disoluciones trazables a patrones nacionales o internacionales.  
B.1.3.3 Comparador manual para tubos Nessler de 50 mL con escala de disoluciones coloreadas 
estandarizadas o comparador electrónico de color o comparador visual de discos coloreados.  
B.1.3.4 Sistema de filtración con membrana de celulosa de 0.45 µm.  
B.1.3.5 Baño marí a de temperatur a constante o compensador de temperatura para potenciómetro.  
B.1.4 Reactivos y materiales.  
B.1.4.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada libre de color.  
B.1.4.1.1 Ácido clorhídrico concentrado (HCl).  
B.1.4.1.2 Cloruro de Cobalto (II) hexahidratado (CoCl 2•6H 2O). 
B.1.4.1.3 Hexacloroplatinato de potasio (K 2PtCl 6). 
Todo el material volumétrico utilizado en este procedimiento debe ser clase A, calibrado y/o verificado.  
B.1.4 .1.4 Tubos Nessler de 50 mL de capacidad.  
B.1.4.1.5 Matraces volumétricos de 50 mL.  
B.1.4.1.6 Membranas para filtración estériles con poro de 0.45 µm.  
B.1.5 Procedimiento.  
B.1.5.1 Preparación de la solución madre de cloroplatinato de 500 unidades de color.  
B.1.5.1.1 Pesar 1.246 g con precisión de 0.0001 g de hexacloroplatinato de potasio (equivalente a 500 mg 
de platino metálico) y 1.000 g con precisión de 0.0001 g de cloruro de cobalto hexahidratado (equivalente a 
250 mg de cobalto metálico) y disolver en 500 mL de agua con 100 mL de HCl. Aforar a 1 L con agua. La 
solución se mantiene estable durante 3 meses.  
B.1.5.2 Preparación de la escala de color.  
B.1.5.2.1  Preparar soluciones de concentración intermedia (véase tabla Escala de color en unidades de 
color  Pt-Co.), colocar los volúmenes de la solución madre en tubos Nessler y diluir con agua a 50 mL.  
Tabla. - Escala de color en unidades de color Pt -Co 
Unidades de color  
Pt
Co Volumen de disolución 
madre de platino -cobalto de 
500 unidades de color (mL).  
0.0 0.0 
5.0 0.5 
10.0 1.0 
15.0 1.5 
20.0 2.0 
25.0 2.5 
30.0 3.0 
35.0 3.5 
40.0 4.0 
45.0 4.5 
50.0 5.0 
60.0 6.0 
70.0 7.0 
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.1.5.2.2 Estos patrones se emplean para poder verificar la calibración de la escala de vidrios color eados, 
protegerlos contra la evaporación o contaminación cuando no se usen, las disoluciones son estables por un 
mes manteniéndolas en la oscuridad.  
B.1.5.3 Determinación de color aparente.  
B.1.5.3.1 Determinar el pH de la muestra conforme al método establ ecido en esta Norma.  
B.1.5.3.2 Medir en un tubo de Nessler, 50 mL de la muestra previamente homogenizada y comparar con 
las soluciones patrón. Efectuar la observación, mirando verticalmente hacia abajo a través de los tubos contra 
una superficie blanca.  
B.1.5.3.3 Para la determinación con discos coloreados llenar una de las celdas de lectura con la muestra  
y la segunda celda con agua destilada hasta el aforo y comparar.  
B.1.5.4 Determinación del color verdadero.  
B.1.5.4.1 Determinar el pH de la muestra con forme al método establecido en esta Norma.  
B.1.5.4.2 Remover la turbiedad de las muestras por filtración.  
B.1.5.4.3 Medir en un tubo de Nessler, 50 mL de la muestra y comparar con las soluciones patrón. 
Efectuar la observación, mirando verticalmente hacia abajo a través de los tubos contra una superficie blanca.  
B.1.5.4.4 Para la determinación con discos coloreados llenar una de las celdas de lectura con la muestra y 
la segunda celda con agua destilada hasta el aforo y comparar.  
B.1.6 Expresión de resultado s. 
B.1.6.1 El resultado de las lecturas se deberá reportar en unidades de color (UC), expresar el valor en No. 
enteros.  
B.1.6.2 Si el color excede de 70 unidades, reportar el result ado como mayor a 70 unidades Pt -Co. 
B.1.6.3 El valor de pH de la muestra de be reportarse junto con el valor del color verdadero o aparente.  
B.2 Método para la determinación de turbiedad.  
B.2.1 Fundamento.  
El método se basa en la comparación entre la intensidad de la luz dispersada por la muestra bajo 
condiciones definidas y la in tensidad de luz dispersada por una suspensión de referencia en condiciones 
semejantes. Las lecturas se realizan empleando un turbidímetro obteniendo una curva patrón con una 
suspensión de referencia de formacina preparada bajo condiciones específicas. El p olímero de formacina es 
la referencia de turbiedad más aceptada, debido a que es fácil prepararlo y tiene propiedades reproducibles 
de dispersión de la luz, en comparación con otros como arcilla o agua turbia natural.  
La turbiedad del agua es producida por  materias en suspensión, como arcilla, cieno o materias orgánicas e 
inorgánicas finamente divididas, compuestos orgánicos solubles coloreados, plancton y otros 
microorganismos.  
La turbiedad es una expresión de la propiedad óptica que origina que la luz se disperse y absorba en vez 
de transmitirse en línea recta a través de la muestra.  
B.2.2 Interferencias.  
B.2.2.1 La presencia de residuos flotantes y materia fina las cuales pueden sedimentarse rápidamente 
dará lecturas bajas. El color verdadero, es decir el  color del agua debido a sustancias disueltas que absorben 
luz, causará valores bajos de turbiedad.  
B.2.2.2 Existen algunas fuentes de error como son la presencia de burbujas en las paredes de la celda al 
momento de realizar la lectura, empañamiento de las  celdas, suciedad del vidrio y los efectos de vibración 
alteran la visibilidad superficial de la muestra originando errores en las lecturas.  
B.2.3 Aparatos e Instrumentos.  
B.2.3.1 Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg, calibrada y verificada.  
B.2.3. 2 Turbidímetro: La sensibilidad del instrumento debe permitir la detección de diferencias de 
turbiedad de 0.02 unidades y debe cubrir un intervalo de 0 a 40 unidades. Equipado con una lámpara  de 
tungsteno. El detector y sistema de filtro debe tener una re spuesta pico entre 400 y 600 nm.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.2.4. Reactivos y materiales.  
B.2.4.1 Sulfato de hidracinio (N 2H6SO 4), con una pureza mayor de 99.95% o avalado por la DGN. 
Compuesto sumamente tóxico con características cancerígenas por lo que debe manipularse con extrem o 
cuidado, evitando su inhalación, ingestión y contacto con ojos, piel y mucosas.  
B.2.4.2 Hexametilentetramina (C 6H12N4), con una pureza mayor de 99.95% o avalado por la DGN.  
B.2.4.3 Agua libre de turbiedad. Se obtiene filtrando agua destilada a través de un filtro de tamaño de poro 
de 0.2 
 m. O algunas otras aguas desmineralizadas comerciales que tengan una baja turbiedad. Verificar que 
tengan una turbiedad equivalente a la del agua destilada filtrada.  
B.2.4.4  Todo el material volumétrico utilizado en este  procedimiento debe ser clase A, verificado y/o 
calibrado.  
B.2.4.5  Matraces volumétricos de 100 mL.  
B.2.4.6  Pipetas volumétricas de diferentes volúmenes.  
B.2.4.7  Celdas de vidrio de cristal incoloro y transparente, deben mantenerse limpios por dentro y por  
fuera y evitar que se rayen o estrellen.  
B.2.4.8  Sistema de filtración con membrana de celulosa de 0.2 
 . 
B.2.5. Procedimiento.  
B.2.5.1 Preparación de la suspensión patrón concentrada de formacina de 400 UNT.  
B.2.5.1.1 Solución I. Pesar 1.000 g con precis ión de 0.0001 g de sulfato de hidracinio, disolver en agua y 
aforar a 100 mL. Esta disolución es estable un mes.  
B.2.5.1.2 Solución II. Pesar 10.00 g con precisión de 0.0001 g de hexametilentetramina, disolver en agua  
y aforar a 100 mL. Esta disolución es  estable un mes.  
B.2.5.1.3 Mezclar en un matraz volumétrico de 100 mL, 5 mL de la solución I y 5 mL de la solución II, dejar 
en reposo 24 h a 25 ±3°C y llevar al v con agua. Preparar la solución en cada uso.  
B.2.5.2 Preparación de la suspensión patrón conc entrada de formacina de 40 UNT.  
B.2.5.2.1  Diluir 10.0 mL de la suspensión patrón concentrada en un matraz volumétrico de 100 mL y aforar 
con agua.  
B.2.5.3 Preparación de patrones de turbiedad diluidas.  
Diluir porciones de la suspensión patrón de turbiedad con agua. Preparar por lo menos cinco puntos de la 
curva de calibración incluyendo como punto medio de la curva 5 UNT.  
NOTA: Pueden utilizarse patrones comerciales con certificado o trazables a patrones nacionales o 
internacionales.  
B.2.5.4 Calibración del  Turbidímetro.  
B.2.5.4.1 Seguir las instrucciones del fabricante. Si la escala no está pre -calibrada, preparar la curva de 
calibración para el rango establecido.  
B.2.5.4.2 Medir la Turbiedad.  
B.2.5.4.3 Acondicionar el equipo de acuerdo con las instruccione s del fabricante. Agitar perfectamente la 
muestra, esperar hasta que las burbujas desaparezcan y transferirla a la celda del aparato. Limpiar la celda 
con papel óptico o equivalente, evitando dejar residuos adheridos. Leer la turbiedad directamente de la e scala 
del instrumento.  
B.2.6 Expresión de resultados.  
B.2.6.1 Reportar los resultados de la siguiente forma con la precisión correspondiente.  
Margen de turbiedad 
(UNT).  Informe de cifra UNT  
más próxima.  
0-1.0 0.05 
1-10 0.1 
 
B.2.6.2 Reportar el resultad o como: UNT (Unidades Nefelométricas de Turbiedad).        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.2.6.3 Si la turbiedad excede 10 UNT, reportar como: Mayor a 10 UNT.  
B.3. Métodos de prueba para la determinación de antimonio, arsénico, bario, cadmio, cobre, cromo, 
manganeso, mercurio, níquel, plomo y  selenio por espectrometría de absorción atómica.  
B.3.1 Fundamento.  
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el analito que se encuentra presente en forma de vapor a tómico.  
La medida de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar 
el % de absorción.  
La cantidad de absorción aumenta con la concentración de los átomos en el medio absorbente, es decir, la 
medida de la absorció n aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en su 
condición original o sujeta a pre tratamiento.  
B.3.2 Interferencias  
B.3.2.1 Principales tipos de interferencias y correcciones en la determinación de metales y 
metaloides.  
Tipo  de interferencia.  Corrección.  
La ionización química de algunos elementos 
como el sodio, el potasio, el magnesio y el 
calcio causa error en la lectura originando 
mayor o menor absorbancia.  La adición de un elemento que sea más ionizable que el 
analito que  se va a determinar por ejemplo el uso del 
óxido o sal de lantano, el cloruro de potasio u otro 
equivalente.  
Cuando en la flama hay presencia de átomos 
unidos en combinación molecular, se presenta 
una disminución en la absorbancia. Esto puede 
ocurrir cuan do la flama no alcanza 
temperaturas altas, las cuales son necesarias 
para disociar las moléculas o cuando el átomo 
disociado es inmediatamente oxidado a un 
compuesto que no se disocia más a esa 
temperatura de la flama.  Estas interferencias pueden ser reduc idas o eliminadas 
utilizando una llama más oxidante: óxido  nitroso -
acetileno, en lugar de aire -acetileno.  
La absorción de fondo se produce debido a que 
no todos los materiales de la matriz 
necesariamente se atomizan en un 100%. Las 
formas moleculares no disociadas de los 
materiales de la matriz pueden tener espectros 
de absorción muy ensanchados; las partículas 
sólidas en la llama pueden dispersar luz en una 
amplia región de longitudes de onda.  Con una fuente continua se puede realizar 
automáticamente la corrección de fondo empleando una 
lámpara de arco de deuterio en la zona de ultravioleta o 
una lámpara de yoduro de tungsteno para las longitudes 
de onda visibles.  
La corrección de Zeeman se basa en el principio de un 
campo magnético en el que se divide la  línea espectral 
en dos haces de luz linealmente polarizada, paralela y 
perpendicular al campo magnético. Se puede comparar 
la absorción en presencia y ausencia de un campo 
magnético, siendo la diferencia la absorción atómica de 
interés.  
En horno de grafi to altas concentraciones de 
Cl– pueden causar bajos resultados debido a 
que la volatilidad de muchos elementos se 
incrementa y el analito se pierde durante el 
proceso de pirolisis.  Los efectos de matriz pueden disminuirse parcialmente o 
completamente con l a optimización del programa de 
temperatura.  
El uso de tubos recubiertos pirolíticamente y plataformas.  
El uso de modificadores químicos como el nitrato de 
magnesio o el fosfato de amonio.  
La técnica de adición de estándar.  
Con el uso del corrector de fondo . 
 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.3.3 Medidas de control de calidad.  
B.3.3.1 El coeficiente de correlación (r) de la curva deberá ser > 0.995.  
B.3.3.2 Leer en el equipo el blanco de curva y un punto de la curva de calibración (MCI) antes de iniciar la 
lectura de las muestras, después  de la lectura de cada 10 muestras y al final del análisis. El resultado deberá 
encontrarse dentro del ±10% del valor esperado. Si dicho valor no se encuentra en el intervalo, interrumpir el 
análisis y buscar las posibles causas, posteriormente volver a ca librar y repetir las lecturas del último lote de 
muestras.  
B.3.4 Aparatos e instrumentos.  
B.3.4.1  Los límites de detección, sensibilidad y rangos de trabajo de los metales pueden variar con la 
matriz y los modelos del espectrómetro de absorción atómica.  
B.3.4.2  Espectrómetro de absorción atómica calibrado y verificado equipado con:  
B.3.4.2.1  Flama.  
B.3.4.2.2  Horno de grafito.  
B.3.4.2.3  Generador de hidruros o vapor frío, y/o FIAS.  
B.3.4.2.4  Sistema de corrección de fondo.  
B.3.4.2.5  Lámparas de cátodo hueco (LCH) y/o Lámparas multi -elemento y/o Lámpara de descarga sin 
electrodos (LDE) de cada uno de los elementos a analizar.  
B.3.4.2.6  Sistema de ventilación para eliminar el humo y los vapores que son peligrosos para la salud del 
analista.  
B.3.4.2.7  Fuente de radiofrecuencia en caso de usar LDE.  
B.3.4.2.8  Celda de cuarzo para mercurio y celda de cuarzo para otros elementos como arsénico y 
antimonio.  
B.3.4.2.9  Soporte de la celda.  
B.3.4.2.10  Tubo de aireación.  
B.3.4.2.11 Frasco de reacción, botella de 250 mL con  un tapón de caucho para mantener el tubo de 
aireación.  
B.3.4.2.12  Tubo de secado y tubo de conexión.  
B.3.4.2.13  Automuestreador (opcional)  
B.3.4.2.14 Recirculador de agua para enfriamiento.  
B.3.4.2.15  Balanza analítica con sensibilidad de ±0.1 mg calibrad a y/o verificada.  
B.3.4.2.16 Horno de microondas o sistema de reflujo o sistema de digestión abierto.  
B.3.4.2.17  Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.  
B.3.4.2.18  Micropipetas automáticas de diferentes capacidades; calibradas y/o verificadas . 
B.3.5 Material.  
B.3.5.1  Todo el material volumétrico utilizado en este procedimiento debe ser clase A, calibrado y/o 
verificado.  
B.3.5.2  Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones.  
B.3.5.3 El jabón que se use debe ser neutro.  
B.3.5.4 Enjuagar perfectamente con agua corriente.  
B.3.5.5 Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia de plástico) que contenga 
una disolución de ácido nítrico al 10%.  
B.3.5.6 Dejarlo tapado y reposan do por un lapso mínimo de 2 h.  
B.3.5.7 Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua desionizada.  
B.3.5.8 Dejar escurrir y secar.  
B.3.5.9 Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.3.5 .10 Para la determinación de niveles traza de algunos elementos como cadmio es necesario utilizar 
material exclusivo y seguir un estricto procedimiento de limpieza como se describe a continuación:  
B.3.5.11 Sumergir en una disolución de HNO 3 al 50% v/v míni mo 2 h, los frascos reservorios del  auto-
muestreador del horno de grafito, los viales y todo el material involucrado, enjuagar con Agua Tipo I varias 
veces.  
B.3.5.12 Secar en un ambiente libre de polvo.  
B.3.5.13 Tapar con papel parafinado o en bolsas cerr adas de plástico.  
NOTA: Se observa que el HCl, es más efectivo para el lavado de material de polietileno o polipropileno, 
mientras que el HNO 3 es preferible usarlo con el material de PTEF o de vidrio.  
B.3.5.14 Viales.  
B.3.5.15 Tubos de grafito, cubiertos p irolíticamente con plataforma L'vov, preferentemente para elementos 
de alta y medianamente volátiles.  
B.3.5.16 Matraces volumétricos de diferentes capacidades.  
B.3.5.17 Puntas de plástico para micropipetas.  
B.3.5.18 Filtros con tamaño de poro de 0.45 µm.  
B.3.5.19 . Recipientes de polipropileno o PTFE.  
B.3.5.20 . Embudos de filtración de diferentes capacidades.  
B.3.5.21 Papel filtro de filtración media.  
B.3.5.22 . Material común de laboratorio.  
B.3.6  Reactivos y disoluciones.  
B.3.6.1  Todos los reactivos deben s er grado analítico a menos que se indique otra especificación.  
B.3.6.2 Aire comprimido libre de agua y libre de partículas, cuyo contenido de oxígeno sea <20%.  
B.3.6.3 Acetileno grado absorción atómica en acetona.  
B.3.6.4 Óxido nitroso de alta pureza grado  absorción atómica, el regulador debe ser no congelable o debe 
colocarse un serpentín de calentamiento alrededor del regulador de flujo.  
B.3.6.5 Argón o nitrógeno de alta pureza grado absorción atómica.  
B.3.6.6 Agua Tipo I.  
B.3.6.7 Disoluciones de estándar es de referencia trazables a patrones nacionales o internacionales de 
cada uno de los metales.  
NOTA: Las disoluciones pueden prepararse a partir de las sales, y deben tener una pureza >99.95%. 
Todas las sales deben ser secadas por 1 h a 105°C, a menos que se especifique otra cosa.  
B.3.6.8 Disolución de Nitrato de Magnesio hexahidratado [Mg(NO 3)2•6H 2O)] de alta pureza (con contenido 
de metales a niveles traza).  
B.3.6.9 Ácido clorhídrico de alta pureza (con contenido de metales a niveles traza).  
B.3.6.10 Ácido clorhídrico 6 N. Medir 56 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
B.3.6.11 .  Ácido clorhídrico 4 N. Medir 33 mL de HCl y llevar a 100 mL con agua.  
B.3.6.12 .  Disolución de ácido clorhídrico al 50%. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 400 mL de 
agua, agregar 500 mL de ácido clorhídrico concentrado. Llevar al v con agua.  
B.3.6.13 Ácido sulfúrico (H 2SO 4) (densidad específica 1.84).  
B.3.6.14 Ácido nítrico de alta pureza (HNO 3) al 65% v/v (con contenido de metales en niveles traza).  
B.3.6.15 Ácido nítrico al 50% v/v. Medir 50 mL de HNO 3 en 50 mL de agua.  
B.3.6.16 Disolución de ácido nítrico/ácido sulfúrico. En un matraz de 1 L, conteniendo de 300 a 500 mL de 
agua, agregar 58 mL de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración de mercurio y 67 mL de ác ido 
sulfúrico concentrado. Llevar al v con agua.  
B.3.6.17 Ácido nítrico (HNO 3) (Para la descontaminación del material).  
B.3.6.18 Yoduro de Potasio de alta pureza (con contenido de metales en niveles traza).  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.3.6.19 . Disolución de yoduro de potasio al 10% p/v. Disolver 10 g de KI en agua y 10 g de ácido 
ascórbico, llevar a 100 mL con agua (esta disolución debe prepararse en el momento de usarse).  
B.3.6.20 Ácido ascórbico (C 6H8O6) 
B.3.6.21 Dicromato de potasio (K 2Cr2O7). 
B.3.6.22 Disolución de dicromato de p otasio: Pesar 0.5 g de dicromato de potasio, pasar a un matraz 
volumétrico de 1 L que contenga agua, agregar 5 mL de ácido nítrico concentrado y 0.5 mL de ácido 
clorhídrico concentrado. Llevar a v con agua.  
NOTA: Las disoluciones y concentraciones pueden v ariar según lo recomendado por el fabricante del 
equipo de absorción.  
B.3.6.23 Hidróxido de sodio (NaOH).  
B.3.6.24 Disolución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y llevar al v a 100 mL 
con agua.  
B.3.6.25 Borohidruro de sodio (N aBH 4) 
B.3.6.26  Disolución reductora de borohidruro de sodio al 4% p/v en disolución de hidróxido de sodio  al 1% 
p/v. Pesar 4 g de borohidruro de sodio en 100 mL de una disolución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al 
vacío.  
NOTA: La concentración de  esta disolución puede variar según lo recomendado por el fabricante del 
equipo de absorción.  
B.3.6.27 Disolución de paladio (Pd) con niveles traza de metales (de alta pureza).  
B.3.6.28 Fosfato de amonio monobásico (NH 4H2PO 4) con niveles traza de metales ( de alta pureza).  
B.3.6.29 Sulfato ácido de hidroxilamina [(NH 2OH) 2•H2SO 4] o Clorhidrato de hidroxilamina (NH 2OH•HCl).  
B.3.6.30 Cloruro estanoso (SnCl 2) o sulfato estanoso (SnSO 4). 
B.3.6.31 Disolución reductora de estaño. Mezclar 50 mL de ácido sulfúrico co ncentrado con 
aproximadamente 300 mL de agua. Enfriar a temperatura ambiente y 15 g de cloruro de sodio, 15 g de sulfato 
o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en disolución; disolver completamente y llevar a 
500 mL con agua.  
NOTA:  Las disoluciones y concentraciones pueden variar según lo recomendado por el fabricante del 
equipo de absorción.  
B.3.7 Procedimiento.  
B.3.7.1  Preparación de las muestras.  
B.3.7.1.1  Las muestras se pueden analizar directamente por espectrometría de absorci ón atómica sin 
realizar la digestión si son inodoras, incoloras y transparentes.  
B.3.7.1.2  Previo al análisis adicionar a 100 mL de muestra, 1 mL de ácido nítrico de alta pureza. En caso 
que se observe un precipitado realizar una digestión adicionando 1 mL  de ácido nítrico de alta pureza 
concentrado, calentar a 85°C hasta reducir el v a 20 mL cuidando que no hierva.  
B.3.7.1.3  Calentar a reflujo por 20 min y transferir a un matraz volumétrico de 50 mL.  
B.3.7.1.4  Centrifugar a 1600 rpm por 30 min o dejar repo sar toda la noche y analizar el sobrenadante.  
B.3.7.1.5  Se puede utilizar el horno de microondas para digerir las muestras si se forma un precipitado al 
adicionar el ácido nítrico. Proceder de acuerdo a las condiciones recomendadas por el fabricante.  
B.3.7 .1.6 Preparar un blanco fortificado por cada lote, y una muestra fortificada por cada 10 muestras o 
por grupo si son menos.  
B.4. Método para la determinación de Cobre, Manganeso y Bario por la técnica de flama.  
B.4.1 Preparación de disoluciones de Cobre.  
B.4.1.1 Disolución estándar de cobre de 100 mg/L. Tomar 10 mL de la disolución estándar de 1000 mg/L y 
depositar en un matraz volumétrico de 100 mL, que contiene agua desionizada posteriormente agregar 5 mL 
de HNO 3 de alta pureza y llevar al v con agua desi onizada.  
B.4.1.2 A partir de la disolución anterior preparar un blanco y 5 puntos de calibración (véase tabla Curva 
de calibración de Cobre).  
B.4.2 Preparación de la curva de calibración de Cobre.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
Tabla. - Curva de calibración de Cobre.  
Concentración 
(mg/L) . Volumen de disolución 
estándar de 100 mg/L.  Volumen de 
HNO 3  adicionado 
(mL).  Volumen de 
aforo con agua 
(mL).  
Blanco de curva  0 2 100 
0.25 250 µL  2 100 
0.50 500 µL  2 100 
1.0 1 mL  2 100 
2.0 2 mL  2 100 
4.0 4 mL  2 100 
 
B.4.3 Preparación de disolucion es de Manganeso.  
B.4.3.1 Disolución estándar de manganeso de 100 mg/L. Medir 10 mL de la disolución estándar de  1000 
mg/L y depositar en un matraz volumétrico de 100 mL que contiene agua desionizada, posteriormente agregar 
5 mL de HNO 3 de alta pureza y af orar con agua desionizada.  
B.4.3.2 A partir de la disolución anterior preparar un blanco y 5 puntos de calibración (véase tabla Curva 
de Calibración de Manganeso.).  
B.4.4 Preparación de la curva de calibración de Manganeso.  
Tabla - Curva de calibración de Manganeso.  
Concentración 
(mg/L).  Volumen de disolución 
estándar de 100 mg/L.  Volumen de HNO 3 
adicionado (mL).  Volumen de aforo 
con agua (mL).  
Blanco de curva  0 2 100 
0.10 100 µL  2 100 
0.20 200 µL  2 100 
0.40 400 µL  2 100 
1.0 1 mL  2 100 
2.0 2 mL  2 100 
 
B.4.5 Preparación de disoluciones de Bario.  
B.4.5.1 Disolución estándar de Bario de 100 mg/L.  
B.4.5.2  Disolver 0.1516 g de BaCl 2 (secar a 250°C por 2 h), adicionar 10 mL de (5 mL agua +5 mL de 
HCl), adicionar 10 mL de (5 mL agua +5 mL de HCl) y llevar al  v de 1000  ml con agua. 1 mL es 
aproximadamente 100 µg de Ba. A partir de esta disolución preparar una curva de calibración (Véase tabla de 
curva de calibración de Bario) (agregar Solución de Cloruro de Potasio, lantano o cesio (10 mg/mL de K) a los 
estánd ares y a las muestras).  
Tabla. - Curva de calibración de Bario . 
Concentración 
en (mg/L).  Volumen de 
disolución de 
100 µg de Ba.  Volumen de 
aforo con 
agua (mL).  
Blanco de curva  0 100 
0.25 250 µL  100 
0.5 500 µL  100 
0.7 700 µL  100 
2.0 2 mL  100 
4.0 4 mL  100 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.4.6 Condiciones de operación para Cobre, Bario y Manganeso  
B.4.6.1 Cobre:  Mezcla de Aire - Acetileno con quemador de 10 cm con nebulizador, longitud de onda 324.7 nm.  
B.4.6.2 Manganeso:  Mezcla de Aire - Acetileno con quemador de 10 cm con nebulizador, longitud de onda 
279.5 nm.  
B.4.6.3 Bario : Mezcla de Óxido nitroso -Acetileno con quemador de 5 cm con nebulizador, longitud de 
onda 553.6 nm.  
B.4.6.4. Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, encender la 
lámpara y dejar calentar al menos 15 minutos las LCH y al menos 45 min las LDE. Usar una disolución 
estándar de concentración conocida de cobre para verificar el equipo, una vez que se ha ajustado con la 
disolución estándar de cobre.  Leer por quintuplicado esta disolución . 
B.4.6.5 Leer por triplicado en el equipo el blanco y los puntos de la curva de Cobre o de Manganeso según 
sea el caso del metal que se va a determinar. Elaborar una curva de calibración dentro del intervalo lineal, 
graficando la absorbancia en función de  la concentración. Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados 
(regresión lineal) o calcular la concentración directamente en el equipo que se programe.  
B.4.6.6 Leer cada una de las muestras por triplicado, registrar la absorbancia y calcular la concen tración 
del elemento a partir de la curva de calibración. Cuando se use el equipo programable realizar los cálculos 
finales.  
B.4.6.7 Asegurarse que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo lineal de 
calibración, de no ser así realizar la dilución correspondiente.  
B.5 Método para la determinación de Arsénico, Cadmio, Cromo, Níquel y Plomo por horno de 
grafito.  
B.5.1  Reducción de As (V) a As (III)  
B.5.1.1  Tomar una alícuota de la muestra y agregar 10 mL de la disolución de KI al 10% y 10 mL de HCl 
concentrado, llevar al v de 100 mL con agua y esperar 2 h antes de poder leer en el equipo.  
NOTA: La reducción del As (V) a As (III) puede adecuarse a las condiciones que recomienda el manual 
del fabricante.  
B.5.2  Preparación de disoluciones y cu rvas de calibración.  
B.5.2.1  Medir un v apropiado de disolución estándar (aprox. 1 -10 mL) para el aforo inicial y hacer las 
diluciones necesarias para cada elemento en particular, utilizando material volumétrico verificado para su 
preparación. Para la prep aración de las disoluciones más concentradas utilizar HNO 3 de alta pureza de tal 
forma que la concentración final del ácido sea del 2 al 5% para poder preservar las disoluciones estándar por 
mayor tiempo, mantener estas disoluciones bien tapadas y en recip ientes de PTFE de preferencia.  
B.5.2.2  Para la preparación de las disoluciones de trabajo y de la curva de calibración utilizar HNO 3 de alta 
pureza y la concentración final del ácido debe es tar entre 0.1 a 0.2%. Preparar é stas el mismo día del análisis. 
Preparar 5 niveles de concentración dentro del intervalo lineal para cada elemento.  
B.5.2.3  Los intervalos de trabajo óptimos para cada uno de los elementos (véase tabla de intervalos de 
trabajo para cada uno de los elementos) para un v de muestra de 20 µL. Dicho intervalo depende de la 
sensibilidad del instrumento, del tipo de matriz y del uso de modificadores.  
Tabla. - Intervalos de trabajo para cada uno de los elementos.  
Elemento.  Masa 
característica  
(pg).  Límite de 
detección  
(µg/L).  Intervalo de 
trabajo (µ g/L).  
As 15 1 5 a 100  
Cd 0.7 0.1 0.4 a 4  
Cr 3 0.5 5 a 100  
Ni 13 1 7 a 70  
Pb 15 1 5 a 100  
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.5.2.4  Preparar una disolución de una concentración conocida de cada uno de los analitos que se van 
analizar (As, Cd, Cr, Ni y Pb) para verificar el equipo par a cada uno de los elementos que se van a analizar.  
B.5.3  Condiciones de operación del horno de grafito.  
B.5.3.1  Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, encender la 
lámpara y dejar calentar al menos 15 min las LCH y al menos 45 min las LDE.  
B.5.3.2  Siempre utilizar la corrección de fondo.  
B.5.3.3  El programa de temperatura del horno de grafito (secado, pirolisis, atomización y limpieza) 
depende del analito, de la matriz y de la marca del equipo utilizado. Optimizar utili zando como guía las 
recomendaciones del fabricante. En la Tabla de Parámetros de ajuste en el horno de grafito (véase Tabla). Se 
muestran los principales parámetros utilizados para ajustar el equipo.  
B.5.3.3.1  En el caso de la determinación del Cromo se su giere usar tubos con plataforma L'vov.  
Tabla - Parámetros de ajuste en el horno de grafito  
Elemento.  Longitud de 
onda  
(nm).  Ancho 
de rejilla 
(slit)  
en nm.  Temperatura  
de pirolisis  
(°C). Temperatura de atomización  
(°C). 
Sin 
modificador.  Con 
modificador.  Sin 
modificador.  Con 
modificador.  
As 193.7  0.7 300 1400/1300  1900  2200/2500  
Cd 228.8  0.7 300 900 1250  1100/1800  
Cr 357.9  0.7 1050  1650  2300  2600  
Ni 232.0  0.2 1100  1400  2400  2400  
Pb 283.3  0.7 600 1200/600  1500  2000/1900  
 
B.5.3.4  Utilizar modificadores  de matriz para eliminar los efectos de matriz ya que su uso permite elevar la 
temperatura de pirolisis y poder eliminar las interferencias sin que se pierda el analito que se va a medir. Si se 
utilizan modificadores de matriz en las muestras, adicionar ta mbién al blanco de la curva, a la curva de 
calibración, a las disoluciones estándar de verificación, a las muestras fortificadas y a las disoluciones 
estándar de control de calidad (MCC o MCI). (Véase Tabla Principales modificadores de matriz utilizados en  el 
análisis por horno de grafito.) Se muestran los modificadores más utilizados en el análisis por horno de grafito, 
dicha cantidad está calculada para v  de muestra de 10 µL.  
Tabla. - Principales modificadores de matriz utilizados en el análisis por horno de grafito.  
Elemento.  Modificador Químico.  Cantidad  
(µg).  
As Pd + Mg(NO 3)2 15 + 10  
Cd Pd + Mg(NO 3)2 o 
NH 4H2PO 4 + Mg(NO 3)2 15 + 10  
200 + 10  
Cr Mg(NO 3)2 50 
Ni Mg(NO 3)2 50 
Pb Pd + Mg(NO 3)2 
o NH 4H2PO 4 + Mg(NO 3)2 15 + 10  
200 + 10  
Los modificadores y las c antidades pueden variar, se pueden utilizar los 
recomendados por el fabricante.  
 
B.5.3.5  Si el equipo cuenta con automuestreador, colocar los puntos de la curva, el blanco de reactivos, 
las muestras y los modificadores de matriz en los viales, los cuales han sido previamente enjuagados con 
ácido nítrico al 3% y posteriormente con la disolución a analizar.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.5.4  Lectura en el equipo.  
B.5.4.1 Leer por triplicado el blanco de curva para verificar que no haya contaminación y posteriormente 
leer la disolución d e verificación también por triplicado.  
B.5.4.2 Leer por duplicado en el equipo el blanco y los puntos de la curva. Elaborar una curva de 
calibración dentro del intervalo lineal, graficando la absorbancia (área o altura de pico) en función de la 
concentraci ón. La absorbancia integrada como área de pico es más recomendable.  
B.5.4.3 Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal) o calcular la concentración 
directamente en el equipo que se programe.  
B.5.4.4 Leer cada una de las muestras por duplicado, registrar la absorbancia y calcular la concentración 
del elemento a partir de la curva de calibración. Cuando se use el equipo programable realizar los cálculos 
finales.  
B.5.4.5 Asegurarse que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo lineal de 
calibración, de no ser así realizar la dilución correspondiente.  
B.5.5  Medidas de control de calidad.  
B.5.5.1  El coeficiente de correlación (r) de la curva deberá ser > 0.995  
B.5.5.2  Leer en el equipo el blanco de curva y un punto de la  curva de calibración (MCI) antes de iniciar la 
lectura de las muestras, después de la lectura de cada 10 muestras y al final del análisis. El resultado deberá 
encontrarse dentro del ±15% del valor esperado. Si dicho valor no se encuentra en el intervalo, interrumpir el 
análisis y buscar las posibles causas, posteriormente volver a calibrar y repetir las lecturas del último lote de 
muestras.  
B.6. Método para la determinación de merc urio por la técnica de vapor frí o. 
B.6.1 Preparación de disoluciones y curva s de calibración.  
B.6.1.1 Disolución estándar de 10 mg/L. Medir 1 mL de la disolución estándar de 1000 mg/L, adicionar 
1mL de HNO 3 concentrado y llevar al aforo con agua en un matraz de 100 mL.  
B.6.1.2 Disolución estándar de 0.1 mg/L. Diluir 1 mL de la dis olución estándar de 10 mg/L de Hg, adicionar 
1 mL de HNO 3 concentrado y llevar al aforo con agua en un matraz de 100 mL.  
B.6.1.3 A partir de la disolución de 0.1 mg/L preparar la curva de calibración de acuerdo a la siguiente Tabla:  
Tabla. - Curva de calibr ación de Mercurio.  
Concentración 
(µg/L).  Volumen de 
disolución 
estándar de Hg de 
0.1 mg/L.  Volumen de HCl 
concentrado 
(mL).  Volumen de disolución 
de dicromato de 
potasio  
(mL).  Volumen de 
aforo con agua  
(mL).  
Blanco de 
calibración.  0 10 10 100 
0.5 500 µL  10 10 100 
0.75 750 µL  10 10 100 
1.0 1.0 mL  10 10 100 
2.0 2 mL  10 10 100 
5.0 5 mL  10 10 100 
10.0 10 mL  10 10 100 
 
NOTA: En lugar de la disolución de dicromato de potasio se puede utilizar otro agente oxidante como el 
permanganato de potasio o proceder  de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.  
B.6.1.4. Adicionar a las muestras, a las muestras fortificadas y a las disoluciones estándar de control de 
calidad (MCC o MCI) el mismo v de disolución de dicromato de potasio o el agente oxidante seleccion ado. 
B.6.2 Condiciones de operación del instrumento.  
B.6.2.1  Ajustar las siguientes condiciones del instrumento de absorción atómica conforme al manual  del 
fabricante:        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.6.2.2  Colocar y encender la lámpara.  
B.6.2.3  Seleccionar la longitud de onda. Generalm ente se trabaja a una longitud de onda de 253.6 nm.  
B.6.2.4  Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo al manual del fabricante.  
B.6.2.5  Seleccionar la apertura de la rejilla (slit).  
B.6.2.6  Ajustar los flujos del gas acarreador (argón o nitrógeno) . 
B.6.2.7  Ajustar la celda.  
B.6.2.8  Para equipos con sistema automatizado, colocar en uno de los reservorios la disolución de HCl al 
50% v/v y en el otro la disolución de borohidruro de sodio al 4%. (Véase B.4.2.2).  
NOTA: En lugar de la disolución reductor a de borohidruro de sodio al 4% se puede utilizar otro agente 
reductor como la disolución reductora de estaño o proceder de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.  
B.6.2.9 Ajustar la bomba peristáltica de acuerdo a las condiciones del fabricante y pr oceder a la lectura en 
el equipo.  
B.6.2.10  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de la curva de calibración  siguiendo las instrucciones 
del manual del fabricante.  
B.6.2.11  Optimizar la respuesta con la disolución estándar de verificación de Hg.  
B.6.3 Le ctura en el equipo.  
B.6.3.1 Leer por quintuplicado el blanco de la curva de calibración para verificar que no haya 
contaminación y posteriormente leer la disolución de verificación también por quintuplicado.  
B.6.3.2 Leer por triplicado en el equipo el blan co y los puntos de la curva. Elaborar una curva de 
calibración graficando la absorbancia en función de la concentración.  
B.6.3.3 Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal) o calcular la concentración 
directamente en el equipo que se  programe.  
B.6.3.4 Leer cada una de las muestras por triplicado, registrar la absorbancia promedio y calcular la 
concentración de Hg a partir de la curva de calibración.  
B.6.3.5 Asegurarse que las concentraciones de las muestras están dentro del intervalo lineal de 
calibración, de no ser así realizar la dilución correspondiente.  
B.6.4 Medidas de control de calidad.  
B.6.4.1 El coeficiente de correlación (r) de la curva deberá ser >0.995.  
B.6.4.2 Leer en el equipo el blanco de curva y un punto de la curva de calibración (MCI) antes de iniciar la 
lectura de las muestras, después de la lectura de cada 10 muestras y al final del análisis. El resultado deberá 
encontrarse dentro del ±10% del valor esperado. Si dicho valor no se encuentra en el intervalo, interrumpi r el 
análisis y buscar las posibles causas, posteriormente volver a calibrar y repetir las lecturas del último lote  de 
muestras.  
B.7 Método para la determinación de arsénico y selenio por generador de hidruros.  
B.7.1 Preparación de disoluciones y curvas de  calibración.  
B.7.1.1 A partir de las disoluciones estándar de As y Se de 1000 mg/L, preparar disoluciones de trabajo de 
As y Se de 1 mg/L en ácido clorhídrico de concentración apropiada al método.  
B.7.1.2 Preparar una disolución blanco y 5 niveles de conc entración de cada uno de los metales para un 
intervalo de concentración lineal (generalmente de 0 a 20 µg/L).  
B.7.1.3 Llevar a cabo la reducción de As (V) a As (III) y de Se (VI) a Se (IV)  
B.7.2 Reducción de As (V) a As (III).  
B.7.2.1 Tomar una alícuota de  la muestra y agregar 10 mL de la disolución de KI al 10% y 10 mL de HCl 
concentrado, llevar al vde 100 mL con agua y esperar 2 h antes de poder leer en el equipo.  
B.7.2.2 La reducción del As (V) a As (III) puede adecuarse a las condiciones que recomienda el manual 
del fabricante.  
B.7.3 Digestión de la muestra para el análisis de selenio y reducción de Se (VI) a Se (IV).  
B.7.3.1 Para la determinación de selenio, tomar una alícuota de la muestra y agregar 2 mL de HCl 4 N, 
mantener a ebullición por 1 h. Dejar  enfriar y llevar al aforo.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.7.3.2 Se puede utilizar HCl 6 N, en este caso mantener a ebullición por 10 min.  
B.7.3.3 Tener cuidado para evitar una reoxidación del selenio. La eficiencia en la reducción depende de la 
temperatura, tiempo de reducción y conc entración del HCl. Para optimizar el método, analizar muestras 
fortificadas con una concentración de selenio conocida.  
B.7.3.4 No utilizar material de vidrio que haya sido utilizado para la reducción de As (V) con yoduro  de 
potasio.  
B.7.3.5 Preparar de ig ual forma un blanco, la curva de calibración, las muestras, la muestra fortificada, 
MCC y/o MCI.  
B.7.4 Condiciones de operación del instrumento.  
B.7.4.1 Ajustar las siguientes condiciones del instrumento de absorción atómica conforme al manual  del 
fabrican te. 
B.7.4.1.1 Colocar y encender la lámpara.  
B.7.4.1.2 Seleccionar la longitud de onda. Generalmente se trabaja a una longitud de onda de 193.7 nm 
para As y de 196.0 nm para Se. Colocar y ajustar la celda de absorción de acuerdo al manual del fabricante.  
B.7.4.1.3 Seleccionar la apertura de la rejilla (slit).  
B.7.4.1.4 Ajustar los flujos de los gases (acetileno, aire, argón o nitrógeno).  
B.7.4.1.5 Ajustar la celda.  
B.7.4.1.6 Para equipos con sistema automatizado, colocar en 1 de los reservorios la disolució n de HCl al 
50% v/v y en el otro la disolución de borohidruro de sodio al 4%.  
B.7.4.1.6.1 Disolución reductora de borohidruro de sodio al 4% p/v en disolución de hidróxido de sodio al 
1% p/v. Pesar 4 g de borohidruro de sodio en 100 mL de una disolución de  hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar 
al vacío.  
B.7.4.1.7 Ajustar la bomba peristáltica de acuerdo a las condiciones del fabricante y proceder a la lectura 
en el equipo.  
B.7.4.1.8  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de la curva de calibración siguien do las instrucciones 
del manual del fabricante.  
B.7.4.1.9  Optimizar la respuesta con la disolución estándar de verificación la respuesta del instrumento  al 
analito.  
B.7.5 Lectura en el equipo.  
B.7.5.1 Leer por quintuplicado el blanco de reactivos para ver ificar que no haya contaminación y 
posteriormente leer la disolución de verificación también por quintuplicado.  
B.7.5.2 Leer por triplicado en el equipo el blanco y los puntos de la curva. Elaborar una curva de 
calibración dentro del intervalo lineal, graf icando la absorbancia en función de la concentración.  
B.7.5.3 Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal) o calcular la concentración 
directamente en el equipo que se programe.  
B.7.5.4 Leer cada una de las muestras por triplicado, re gistrar la absorbancia y calcular la concentración 
del elemento a partir de la curva de calibración. Cuando se use el equipo programable realizar los cálculos 
finales.  
B.7.5.5 Asegurarse que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo lin eal de 
calibración, de no ser así realizar la dilución correspondiente.  
B.7.6 Medidas de control de calidad.  
B.7.6.1 El coeficiente de correlación (r) de la curva deberá ser > 0.995.  
B.7.6.2 Leer en el equipo el blanco de curva y un punto de la curva de ca libración (MCI) antes de iniciar la 
lectura de las muestras, después de la lectura de cada 10 muestras y al final del análisis. El resultado deberá 
encontrarse dentro del ±10% del valor esperado. Si dicho valor no se encuentra en el intervalo, interrumpir el 
análisis y buscar las posibles causas, posteriormente volver a calibrar y repetir las lecturas del último lote  de 
muestras.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.7.7 Expresión de Resultados.  
B.7.7.1 Método de Cálculo.  
B.7.7.1.1 Interpolar los valores de absorbancia, área o altura del pico  de la muestra analizada en la curva 
de calibración y obtener los resultados en mg/L del elemento en la muestra empleando la siguiente fórmula:  
 
En donde:  
Concentración del elemento en la muestra leída directamente del equipo o de la curva de calibración , 
en mg/L;  
es el volumen de la disolución de la muestra digerida (aforo), en mL;  
es el factor para pasar de µg a mg=1000 (En el caso de la técnica de horno de grafito, generador de 
hidruros y vapor frio ya que la curva está en µg/L). Para la técnica de f lama el factor de dilución es 1, ya que la 
concentración interpolada de la curva de calibración está en mg/L;  
es el volumen de la muestra, en mL;  
NOTA: Sí la muestra ha sido diluida, debe aplicarse el factor de dilución.  
B.7.8 Informe de la Prueba.  
B.7.8. 1 Informar como:  
B.7.8.1.1  mg/L del metal analizado.  
B.8 Método para la determinación de boro.  
B.8.1 Fundamento.  
En la presencia de boro, una disolución de carmín o de ácido carmínico en ácido sulfúrico concentrado 
cambia de tonalidades de rojo a azul, dep endiendo de la concentración presente de boro.  
B.8.2. Interferencias.  
B.8.2.1 Los iones comúnmente encontrados en el agua no interfieren.  
B.8.3 Aparatos e instrumentos.  
B.8.3.1 Espectrofotómetro calibrado y verificado, para utilizarse en una longitud de on da de 585 nm con 
celda de paso de luz mínima de 1 cm.  
B.8.3.2  Balanza analítica con sensibilidad de ±0.1 mg calibrada y/o verificada.  
B.8.4 Material.  
B.8.4.1  Todo el material volumétrico utilizado en este procedimiento debe ser clase A, calibrado y/o 
verificado.  
B.8.4.2 Material común de laboratorio.  
B.8.4.3 Micropipetas calibradas y/o verificadas.  
B.8.4.4 Bureta de 50 mL.  
B.8.4.5  Pipetas volumétricas.  
B.8.4.6 Perillas de succión.  
B.8.4.7  Matraces volumétricos de 100 mL.  
B.8.4.8 Tubos de 30 mL.  
B.8.5. React ivos.  
B.8.5.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada Tipo I.  
B.8.5.2  Almacenar todos los reactivos en contenedores de polietileno o libres de boro.  
B.8.5.3 Ácido clorhí drico concentrado (HCl).  
B.8.5.4 Ácido sulfúrico concentrado (H 2SO 4). Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.8.5.5 Ácido Bórico Anhidro (H 3BO 3), no es recomendable secarse, por lo tanto debe almacenarse  en un 
desecador.  
B.8.5 .6 Reactivo carmín: pesar 92 mg de carmín N.F. 40 o de ácido carmíni co y disolverlo en 100 mL de 
H2SO 4 concentrado. Si el espectrofotómetro no alcanza el cero, diluir este reactivo al 50% con H 2SO 4 
concentrado usá ndolo como reactivo para desarrollar el color.  
B.8.5 .7 Disolución patrón de boro de 100 mg/L.  
B.8.5 .8 Pesar 57. 16 mg de ácido bórico en agua y llevar a un volumen de 100 mL. Esta disolución es 
estable durante 6 meses.  
B.8.5.9  Se puede utilizar una disolución comercial de concentración certificada o avalado por la DGN.  
B.8.6 Procedimiento.  
B.8.6.1 Preparación de la curva de calibración.  
B.8.6.1.1  Medir los siguientes volúmenes de disolución patrón de boro y llevar al aforo de 100 mL con 
agua, véase la siguiente Tabla:  
Tabla - Curva de calibración de Boro.  
Volumen de 
disolución 
patrón de boro  
mL. Concentración mg 
de boro/L.  Volumen de aforo 
con agua  
(mL).  
0 Blanco  100 
1.0 1.0 100 
2.5 2.5 100 
5.0 5.0 100 
7.5 7.5 100 
10.0 10.0 100 
 
B.8.6.2 Preparación de la muestra.  
B.8.6.2.1  Medir con una pipeta 2.00 mL de la muestra y seguir el mismo procedimiento usado para la 
curva de calibración.  
B.8.7 Desarrollo de color.  
B.8.7.1 Medir con una pipeta de 2.00 mL cada disolución patrón de la curva y transferir a un frasco o tubo 
de prueba de 30 mL.  
B.8.7.2 Añadir dos gotas (0.1 mL) de HCl concentrado, cuidadosamente introducir 10.0 mL H 2SO 4, 
concentrado,  mezclar y dejar enfriar a temperatura ambiente. Añadir 10.0 mL de reactivo carmín, mezclar bien 
y después de 45 a 60 min medir la absorbancia en 585 nm en una celda de 1 cm, usando el blanco como 
referencia.  
B.8.7.3 Para evitar errores, asegúrese de que no haya burbujas en la celda óptica mientras las lecturas 
fotométricas se están realizando. Las burbujas pueden aparecer como resultado de una mezcla incompleta de 
los reactivos. Dado que el reactivo carmín se deteriora, verificar  la curva de calibración diariamente.  
B.8.8 Expresión de Resultados.  
B.8.8.1 Método de Cálculo.  
B.8.8.1.1  De la ecuación de la recta obtenida.  
 
En donde:  
es la absorbancia obtenida en la muestra ya procesada;  
es la pendiente;  
son mg/L de boro en la mue stra, y  
es la ordenada al origen.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.8.8.1.2  En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida es directamente la concentración 
del elemento en mg/L.  
B.8.9 Informe de la prueba.  
B.8.9.1 Informar como:  
B.8.9.1.1  mg de boro/L con dos cifras decimale s. 
B.9 Método Espectrofotométrico Ultravioleta para la de terminación de nitrógeno de nitratos.  
B.9.1 Fundamento.  
B.9.1.1  Se basa en la medición de la absorción de luz UV a las longitudes de onda de 220 y 275 nm. A 
220 nm los nitratos presentes y la materia  orgánica tienen una absorbancia máxima, a 275 nm sólo la materia 
orgánica absorbe. La diferencia de lecturas de la absorbancia a 220 nm menos 2 veces la absorbancia  a 275 
nm es proporcional a la concentración de nitratos.  
B.9.1.2 Este método es utilizado  en muestras de agua sin contaminación, y bajo contenido de materia 
orgánica.  
B.9.2 Interferencias.  
B.9.2.1  El tratamiento de filtración puede ser utilizado para eliminar la interferencia por sólidos 
suspendidos. La adición de ácido clorhídrico es para eli minar la interferencia por presencia de carbonatos o 
hidróxidos, hasta una concentración de 1 000 mg CaCO 3/L. 
B.9.2.2  Interfiere en este método cromo hexavalente, cloritos y cloratos, para lo cual es conveniente 
determinar su concentración en muestras trat adas con ozono y compensarlo en el cálculo final.  
B.9.3 Aparatos e instrumentos.  
B.9.3.1 Balanza analítica con sensibilidad de ±0.1 mg calibrada y/o verificada.  
B.9.3.2 Espectrofotómetro calibrado y verificado para utilizarse a una longitud de onda de 220 y 275 nm 
con celda de cuarzo de 1 cm de paso de luz.  
B.9.3.3 Estufa de secado.  
B.9.3.4 Parrilla con agitación.  
B.9.4 Material.  
B.9.4.1  Todo el material volumétrico utilizado en este procedimiento debe ser clase A, calibrado y/o 
verificado.  
B.9.4.2 Matraz E rlenmeyer de 125, 250, 500 mL.  
B.9.4.3 Matraz volumétrico 50, 100, 500, 1 000 mL.  
B.9.4.4 Bureta de 50 o 100 mL.  
B.9.4.5 Probeta graduada de 50 mL.  
B.9.4.6 Pipeta volumétrica de 1, 4 y 50 mL.  
B.9.4.7 Desecador.  
B.9.4.8 Termómetro calibrado y/o verificado.  
B.9.4.9 Pizeta.  
B.9.4.10 Papel secante, para las celdas de lectura.  
B.9.4.11 Frasco de plástico, para desechos.  
B.9.4.12 Papel filtro Whatman o equivalente No. 40 o 41, sin cenizas.  
B.9.4.13 Filtro de nitrocelulosa o vidrio, de tamaño de poro de 0.45 µm.  
B.9.4.14 Agitador magnético con cubierta de teflón.  
B.9.4.15 Micropipeta automática calibrada y/o verificada.  
B.9.5 Reactivos.  
B.9.5.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua desti lada.  
B.9.5.2 Nitrato de potasio (KNO 3) con una pureza mayor de 99.95% o avalado por la DGN.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.9.5.3 Sulfato de aluminio y potasio dodecahidratado (AlK(SO 4)2•12H 2O) o Sulfato de aluminio amonio 
dodecahidratado (AlNH 4 (SO 4)•12H 2O). 
B.9.5.4 Hidróxido de amon io (NH 4OH).  
B.9.5.5 Cloroformo (CHCl 3). 
B.9.5.6 Ácido Clorhídrico concentrado  (HCl).  
B.9.6 Preparación de d isoluciones.  
B.9.6.1 Suspensión de hidróxido de aluminio Al(OH) 3. 
B.9.6.1.1 Disolver 125 g de AlK(SO 4)2•12H 2O, o AlNH 4(SO 4)•12H 2O en un L de agua des tilada.  
B.9.6.1.2 Calentar a 60°C y agregar mientras se agita, lentamente 55 mL de NH 4OH. Dejar reposar la 
mezcla durante una hora.  
B.9.6.1.3 Decantar el sobrenadante y desecharlo, lavar el precipitado con sucesivas adiciones de agua 
destilada, agitar, rep osar y decantar, para eliminar amonio, cloruros, nitratos y nitritos.  
B.9.6.1.4 Finalmente, después de reposar, decantar lo más posible el líquido sobrenadante, recuperando 
sólo la suspensión concentrada.  
B.9.6.2 Disolución concentrada de nitratos.  
B.9.6.2 .1 Secar nitrato de potasio (KNO 3) en una estufa a 105°C por 24 h.  
B.9.6.2.2 Enfriar en un desecador.  
B.9.6.2.3 Pesar 0.7218 g de nitrato de potasio anhidro. Ajustar este p a la pureza del reactivo patrón 
utilizado.  
B.9.6.2.4 Llevar al v de 1 000 mL con ag ua destilada.  
B.9.6.2.5 Preservar con 2 mL de cloroformo (CHCl 3), por esta razón tener cuidado al tomar las alícuotas 
de esta disolución, decantando cuidadosamente en otro recipiente o introduciendo una pipeta, de tal manera 
que no se succione parte del cl oroformo.  
B.9.6.2.6 Esta disolución contiene: 1 mL = 0.100 mg N —NO 3– y es estable por 6 meses.  
B.9.6.3 Disolución patrón de nitrato.  
B.9.6.3.1 Diluir 50 mL de disolución madre de nitrato a 500 mL con agua destilada.  
B.9.6.3.2 Preservar con 2 mL de clorofor mo (CHCl 3). 
B.9.6.3.3 Esta disolución contiene: 1 mL = 0.010 mg N —NO 3– y es estable por 6 meses.  
B.9.6.4 Disolución de ácido clorhídrico.  
B.9.6.4.1  Diluir 83 mL de ácido clorhídrico concentrado (HCl) a 1 000 mL con agua.  
B.9.7 Procedimiento analítico.  
B.9.7.1 Curva de calibración.  
B.9.7.1.1 Diluir los siguientes volúmenes de la disolución patrón y aforar a 50 mL.  
Tabla - Curva de calibración de N–NO 3- 
Volumen de disolución 
patrón (mL).  Concentración (mg 
de N–NO 3-/L). Volumen de 
aforo (mL).  
0.0 0.0 50 
1.0 0.20 50 
3.0 0.60 50 
5.0 1.00 50 
7.0 1.40 50 
9.0 1.80 50 
12.0 2.40 50 
15.0 3.00 50 
21.0 4.20 50 
25.0 5.00 50 
35.0 7.00 50 
50.0 10.00  50 
       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.9.7.1.2 Añadir exactamente 1 mL de disolución de HCl a cada una de las disoluciones de la curva y 
agitar vi gorosamente.  
B.9.7.1.3 Medir las absorbancias de los patrones a una longitud de onda de 220 nm y 275 nm.  
B.9.8 Tratamiento de la muestra.  
B.9.8.1 Si es necesario eliminar la presencia de color proceder de la siguiente forma:  
B.9.8.1.1 Colocar en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, 200 mL de muestra.  
B.9.8.1.2 Agregar 4 mL de la suspensión de Al(OH) 3, agitar.  
B.9.8.1.3 Dejar reposar por 5 min.  
B.9.8.1.4 Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 40 o 41, sin cenizas, o filtro de malla de 0.45 
 m. 
B.9.9 Determi nación.  
B.9.9.1. Con una alícuota de 50 mL de muestra o clarificado, añadir exactamente 1 mL de disolución de 
HCl y agitar vigorosamente.  
B.9.9.2 Hacer las lecturas de absorbancia en la muestra, primero a una longitud de onda de 220  y 
después a 275 nm.  
B.9.10 Expresión de los resultados.  
B.9.10.1 Cálculos.  
B.9.10.1.1 Obtener la ecuación de la curva de calibración, representada por la siguiente ecuación:  
 
En donde: 
49.01 mL/50 mL es el factor de corrección por dilución de las muestras sometidas a clarifica ción.  
Se toman 200 mL de muestra y se lleva a un v final de 204 mL por la adición de 4 mL de suspensión de 
alúmina, de la disolución clarificada se miden 50 mL para realizar la determinación, por lo tanto el v real 
tomado de la muestra es el siguiente:  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
 
B.9.11 Informe de la prueba.  
B.9.11.1. Informar como:  
B.9.11.1.1  Los resultados se reportan como mg de N –NO 3-/L de muestra.  
B.10 Método espectrofotométrico visible para la determinación de nitrógeno de nitritos.  
B.10.1 Fundamento.  
Los nitritos presentes rea ccionan en medio ácido (pH=0 a 2.5) por diazotación con la sulfanilamida para 
formar una sal de diazonio, la cual por copulación con el dihidrocloruro de N – (l–Naftil) etilendiamina forma un 
colorante azoico de color púrpura rojizo que se mide espectrofoto métricamente a 543 nm.  
B.10.2 Aparatos e instrumentos.  
B.10.2.1 Balanza analítica con sensibilidad de ±0.1 mg calibrada y/o verificada.  
B.10.2.2 Espectrofotómetro calibrado y verificado, para utilizarse en una longitud de onda de 543 nm con 
celda de paso d e luz de 1 cm o mayor.  
B.10.2.3 Potenciómetro calibrado y/o verificado.  
B.10.3 Material.  
B.10.3.1 Todo el material volumétrico utilizado en este procedimiento debe ser clase A, calibrado y verificado.  
B.10.3.2 Matraces volumétricos de 50, 100, 500 y 1000 m L. 
B.10.3.3 Matraces Erlenmeyer de 125, 250 y 500 mL.  
B.10.3.4 Desecador.  
B.10.3.5 Termómetro calibrado y/o verificado.  
B.10.3.6 Pizeta.  
B.10.3.7 Papel secante para las celdas de lectura.  
B.10.3.8 Frasco de plástico para desecho.  
B.10.3.9 Filtro de membran a con tamaño de poro de 0.45 
 m. 
B.10.3.10 Pipetas volumétricas de 1, 25 y 50 mL.  
B.10.3.11 Micropipetas de 100 a 1000 
 L calibradas y/o verificadas.  
B.10.3.12 Agitador magnético con cubierta de teflón.  
B.10.3.13 Parrilla de agitación.  
B.10.3.14 Estufa de secado.  
B.10.3.15 Perlas de vidrio.  
B.10.4 Reactivos.  
B.10.4.1  Todos los reactivos que a continuación se indican deben ser grado analítico a menos que se 
indique otra especificación.  
B.10.4.2 Agua destilada Tipo I.  
B.10.4.3 Ácido sulfúrico concentrado (H 2SO4). 
B.10.4.4  Aminobencensulfanilamida (NH 2C6H4SO 2NH 2).       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.10.4.5 Ácido clorhídrico concentrado (HCl).  
B.10.4.6 Dihidrocloruro de N –1–naftil etilendiamina (NEDA).  
B.10.4.7 Oxalato de sodio (Na 2C2O4) con una pureza mayor de 99.95% o avalado por la DGN.  
B.10. 4.8 Permanganato de potasio (KMnO 4). 
B.10.4.9 Nitrito de sodio (NaNO 2) con una pureza mayor de 99.0%.  
B.10.4.10 Cloroformo (CHCl 3). 
B.10.5 Disoluciones.  
B.10.5.1 Disolución de ácido sulfúrico (H 2SO 4) 1 N.  
B.10.5.2 Disolución de HCl 1 N.  
B.10.5.3 Disolución  de HCl al 10%.  
B.10.6 Reactivos para desarrollo de color.  
B.10.6.1 Disolución de sulfanilamida: 4 aminobencensulfanilamida.  
B.10.6.1.1  Disolver 5.0 g de sulfanilamida en una mezcla de 50 mL de HCl concentrado en 300 mL de 
agua, llevar al volumen de 500 mL  con agua. La disolución es estable por varios meses. Deberá almacenarse 
en frascos ámbar y en refrigeración a 4°C ±2°C.  
B.10.6.2 Disolución de dihidrocloruro de N -(1-naftil) -etilendiamina.  
B.10.6.2.1  Disolver 500 mg de dihidrocloruro de N –(1–naftil) –etilendiamina y aforar a 500 mL con agua, 
almacenar en frasco ámbar y poner en refrigeración a 4°C ±2°C. Renovar la disolución mensualmente o si 
aparece un color café intenso.  
B.10.6.3. Disolución de permanganato de potasio (KMnO 4) 0.05 N.  
B.10.6.3.1 Disolver 1 .60 g de KMnO 4 y llevar al aforo de 1000 mL con agua; almacenarlo en frasco ámbar 
durante una semana y decantar evitando agitar el sedimento, filtrar con membrana de poro de 0.45 
 m. 
Inmediatamente se procede a la valoración de la disolución.  
B.10.6.3.2 También se puede preparar a partir de una disolución concentrada comercial.  
B.10.6.4 Valoración de la disolución:  
B.10.6.4.1 Secar aproximadamente 1 g de Na 2C2O4 a 105°C, al menos 12 h. Pesar por triplicado de 100 a 
200 mg, y transferir a matraces Erlenmeyer  de 250 o 500 mL. A cada recipiente agregar 100 mL de agua 
destilada, agitar para disolver.  
B.10.6.4.2 A cada uno de los matraces con disolución de oxalato de sodio, adicionar 10 mL de ácido 
sulfúrico 1:1, calentar de 90 a 95°C y titular con la disolución de permanganato. Agitar y finalizar hasta obtener 
un vire ligeramente rosado el cual debe persistir al menos un min. Evitar que la temperatura descienda por 
debajo de 85°C. Correr un blanco.  
B.10.6.4.3 Calcular la concentración de KMnO 4 con la siguiente ec uación:  
 
En donde:  
A son mL de titulante por muestra;  
B son mL de titulante del blanco.  
B.10.6.5 Preparación de la curva de calibración  
B.10.6.5.1 Disolución madre de nitritos (250 mg/L)  
B.10.6.5.1.1 Pesar 1.232 g de este reactivo, disolverlo y llevarlo a l aforo a 1000 mL con agua.  
B.10.6.5.1.2 Preservar con 1 mL de cloroformo. Por esta razón tener cuidado al tomar las alícuotas de 
esta disolución, decantando cuidadosamente en otro recipiente o introduciendo una pipeta, de tal manera que 
no se succione par te del cloroformo.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.10.6.5.1.3  
  
B.10.6.6 Valoración de la disolución:  
B.10.6.6.1 Tomar 50 mL de la disolución de KMnO 4, transferir a un matraz Erlenmeyer de 250 mL, 
adicionar perlas de vidrio, agregar 5 mL de H 2SO 4 y 50 mL de la disolución madre de nitri tos, de tal forma que 
la pipeta descargue bajo la superficie de la disolución en el matraz. Agitar y calentar aproximadamente a 80°C.  
B.10.6.6.2 Titular con la disolución de oxalato de sodio hasta decoloración.  
B.10.6.6.3 Titular el exceso de oxalato con l a disolución KMnO 4 hasta la obtención de un color rosa tenue 
estable por 30 seg.  
B.10.6.6.4 Calcular la concentración de la disolución madre de nitritos (A) en mg/mL con la siguiente 
ecuación:  
 
En donde:  
A son mg de N –NO 2-/mL de disolución madre de nitrit o de sodio;  
B es el v de la disolución de KMnO 4 adicionado para la valoración, 50 mL iniciales más el v  empleado en la 
titulación;  
C es la concentración de la disolución de KMnO 4, cercano a 0.05 N;  
D es el v de la disolución de Na 2C2O4 agregado;  
E es la co ncentración de la disolución de Na 2C2O4, cercano a 0.05 N;  
F es el v de la disolución madre de nitritos que se valora, 50 mL, y  
7 es el peso equivalente del nitrógen.;  
B.10.6.6.5 1 mL de disolución de KMnO 4 (0.05 N) consumido por la disolución de NaNO 2 corresponde  a 1 
750 
 g de N –NO 2-. 
B.10.6.6.6 Disolución intermedia de nitritos (50 mg/L).  
B.10.6.6.7 Calcular el v (G) de la disolución madre de nitritos de manera que la alícuota contenga 12.5 mg 
de nitrógeno de nitritos, requerido para la disolución interm edia por medio de la siguiente ecuación:  
 
En donde:  
A es la concentración de la disolución madre de nitritos en mg/mL.  
B.10.6.6.7.1  Medir con bureta el v calculado (G), aproximadamente 50 mL de la disolución madre de 
nitritos, diluir y llevar al aforo de 250 mL con agua.  
B.10.7 Procedimiento.  
B.10.7.1 Curva de calibración  
B.10.7.1.1 Medir una serie de alícuotas de la disolución patrón en matraces volumétricos de 50 mL, como 
se indica en la siguiente tabla:  
Tabla. -Curva de calibración de N –NO 2- 
Volumen de s olución 
de nitritos (mL).  Concentración (mg de  
N–NO 2–/L de muestra).  Volumen de 
aforo con 
agua (mL)  
0.0 blanco  50 
0.1 0.010  50 
0.2 0.020  50 
0.4 0.040  50 
0.6 0.060  50 
1.0 0.100  50 
1.4 0.140  50 
1.7 0.170  50 
2.0 0.200  50 
2.5 0.250  50       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.10.9 Info rme de la prueba.  
B.10.9.1 Informar como:  
B.10.9.1.1  Los resultados se reportan en mg N –NO 2–/L con 3 cifras decimales.  
B.11 Método para la determinación de Compuestos Orgánicos Halogenados adsorbibles (fijos  y 
purgables).  
B.11.1 Fundamento.  
Este método co nsiste en una acidificación de la muestra de agua con ácido nítrico, seguida de una 
adsorción sobre carbón activado de los compuestos orgánicos contenidos en la muestra, para lo cual se utiliza 
una de las siguientes técnicas; agitación, cavitación o por ad sorción en columna.  
La filtración de la muestra antes del análisis permite la determinación separada de compuestos orgánicos 
adsorbibles disueltos y orgánicos adsorbibles fijos (unidos a halógenos).  
La separación de los compuestos volátiles mediante gas de  arrastre, permite la cuantificación de los 
compuestos orgánicos adsorbibles purgables. Determinando los compuestos orgánicos adsorbibles fijos por 
cuantificación posterior a la extracción de los purgables.  
Con fines de calidad del agua para uso y consumo humano, se considera compuestos orgánicos 
adsorbibles fijos, aquellos a los que no se les da un filtrado previo.  
El desplazamiento posterior de haluros inorgánicos, se realiza por enjuague del carbón activado con 
solución de nitrato de sodio acidificada co n ácido nítrico, seguida de combustión del carbón en presencia de 
oxígeno y absorción posterior de los haluros hidrogenados en una trampa con solución acida, para 
posteriormente hacer la determinación de los iones haluro por titulación argentométrica o mic rocoulometría.  
B.11.2 Interferencias.  
B.11.2.1 Es imprescindible un tiempo de 8 h entre la colecta de la muestra y el análisis, principalmente en 
la determinación de adsorbibles purgables, en cuyo caso ante ninguna circunstancia es aceptable un tiempo 
mayo r de 24 h entre la colecta y el análisis. Cuando esto no sea posible, se deberá acidificar la muestra en el 
sitio de muestreo y preferentemente congelarla hasta su recepción en el laboratorio. Considerando que  el 
tiempo de almacenamiento repercutirá inver samente proporcional a la recuperación de halógenos. Por lo que 
es conveniente, asegurar un tiempo máximo de 48 h entre el muestreo y el análisis para el caso de 
adsorbibles fijos.  
B.11.2.2 Interferencia positiva resulta de concentraciones de cloro libre r esidual, por lo que las muestras 
deberán ser tratadas con sulfito de sodio inmediatamente después de su colecta.  
B.11.2.3 Algunos compuestos orgánicos bromados o iodados, pueden descomponerse a su forma 
elemental durante la combustión, dando una pérdida en  la cuantificación final.  
B.11.2.4 La presencia de algas repercute en valores altos, debido al contenido intracelular de cloruros. En 
este caso se deberá esperar un mínimo de 8 h, entre la acidificación y el análisis, para eliminar dicha 
interferencia.  
B.11.2.5 Compuestos aromáticos y ácidos carboxílicos, interfieren negativamente en la determinación.  
B.11.3 Aparatos e instrumentos.  
B.11.3.1 Instrumental que cuente con sistema de adsorción por procedimiento de columna. Con tubos de 
adsorción, diámetro inter ior 3 mm y longitud 40 a 50 mm, conectados en serie empacados con 50 mg  de 
carbón activado. Pudiéndose utilizar otras dimensiones de columna, en tal caso, su desempeño deberá ser 
evaluado y demostrar que se cumple con los requisitos de límite de detección . 
B.11.3.2 Sistema de combustión, con horno capaz de alcanzar calentamiento de por lo menos 959°C, 
equipado con tubo de cuarzo, de diámetro interior de 2 a 4 cm y longitud de cerca de 30 cm (véase Diagrama 
de un aparato de combustión –titulación para AOX), pudiéndose utilizar cámaras de combustión horizontal  o 
vertical.  
B.11.3.3 Compartimiento absorbedor con ácido sulfúrico.  
B.11.3.4 Titulador argentométrico acoplado, adecuado para la determinación de 0.1 
 g de cloruro, con 
coeficiente de variación de 10% (precisión), o similar.  
B.11.3.5 Pipeta automática, adecuada para volúmenes de 10 a 100 
 L.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
Diagrama de un aparato de combustión –titulación para AOX  
 
1. Entrada de la muestra para AOX.  
2. Muestra  para AOX.  
3. Horno.  
4. Tubo de combustión.  
5. Absorbedor lleno con ácido sulfúrico.  
6. Celda de titulación.  
7. Agitador.  
8. Instrumento de control de temperatura, flujo de gas.  
9. Entrada del gas de combustión.  
B.11.4 Material.  
B.11.4.1  El material a util izar, deberá ser lavado con ácido y enjuagado con agua exenta de carbono 
orgánico.  
B.11.4.1.1 Matraz Erlenmeyer 100 mL.  
B.11.4.1.2 Matraz Erlenmeyer 250 mL.  
B.11.4.1.3 Matraz volumétrico 100 mL.  
B.11.4.1.4 Matraz volumétrico 1 000 mL.  
B.11.4.1.5 Probeta gr aduada 100 mL.  
B.11.4.1.6 Pipeta volumétrica 5 mL.  
B.11.4.1.7 Pipeta volumétrica 50 mL.  
B.11.5 Muestreo.  
B.11.5.1  La muestra se colectará en frascos de vidrio ámbar, de 205 mL de capacidad mínima, 
previamente lavados con ácido, cubiertos con papel aluminio  y esterilizados a 400°C por al menos 1 h. La 
tapa del frasco, con sello de TFE, se debe lavar con detergente, enjuagándolo al menos 3 veces con agua 
exenta de carbono orgánico, envolver en papel aluminio y esterilizada a 100°C durante 1h. Preferentemente 
utilizar tapas tipo septum.  
B.11.6. Reactivos.  
B.11.6.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación.  
B.11.6.1.1 El contenido de AOX deberá ser insignificante cuando se compare con el contenido más bajo 
de AOX a ser determinado. El contenido total de AOX en el agua, químicos y gases pueden ser corroborados 
con la medición del blanco total.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.11.6.1.2 Agua destilada, grado 1 con conductividad <0.1 µSiemens/cm a 25°C.  
B.11.6.1.3 SiO 2<0.05 mg/L.  
B.11.6.1.4 Compuestos  orgánicos exentos, por adsorción en columna de carbón activado.  
B.11.6.1.5 Carbón activado (malla 100 a 200), preferentemente 10 µm a 50 µm, de diámetro. El valor del 
blanco del carbón activado debe de contener menos de 15 µg de cloruro equivalente por g de carbón activado.  
B.11.6.1.6 Yoduro de potasio (KI).  
B.11.6.1.7 Solución de almidón, al 1%.  
B.11.6.1.8 Ácido nítrico, HNO 3 (conc).  
B.11.6.1.9 Ácido nítrico dilui do (HNO 3) 0.02 M.  
B.11.6.1.10 Ácido clorhídrico (HCl) 0.010 M.  
NOTA: La molaridad debe ser pr ecisa, porque el ácido es usado para verificar la microtitulación.  
B.11.6.1.11 Ácido sulfúrico H 2SO 4 (conc).  
B.11.7 Preparación de disoluciones.  
B.11.7.1 Disolución madre de Nitrato (NaNO 3) 0.2 M.  
B.11.7.1.1 Disolver 17 g de nitrato de sodio (NaNO 3) en 400  mL de agua destilada, después adicionar  25 
mL de HNO 3 (conc)  y posteriormente aforar a 1 000 mL en matraz volumétrico.  
B.11.7.1.2 Si se almacena en un frasco ámbar, la solución es estable por 3 meses.  
B.11.7.2 Disolución de lavado de Nitrato (NaNO 3) 0.01  M, pH ≈ 1.7. 
B.11.7.2.1 Pipetear 50 mL de la solución madre de nitrato, en un matraz volumétrico de 1 000 mL  y 
aforarlo con agua destilada.  
B.11.7.2.2 Si se almacena en un frasco ámbar, la solución es estable por 1 mes.  
B.11.7.3 Disolución de sulfito de sodio (Na 2SO 3) 1 M.  
B.11.7.3.1 Disolver 126 g de nitrato de sodio (Na 2SO 3) en 400 mL de agua destilada, y posteriormente 
transferir a matraz volumétrico de 1 000 mL y aforarlo con agua destilada.  
B.11.7.3.2 La solución es estable por 1 mes si se almacena d e 2 a 8°C.  
B.11.7.4 Disolución madre de 4 –Clorofenol (200 mg Cl – AOX/L).  
B.11.7.4.1 Disolver 72.5 mg de 4 –Clorofenol (C 6H5ClO) en 40 mL de agua destilada y posteriormente 
trasvasar a matraz volumétrico de 100 mL y aforarlo con agua destilada.  
B.11.7.4.2 Por razones de seguridad, se recomienda usar soluciones disponibles comercialmente.  
B.11.7.4.3 La solución madre puede ser almacenada por 1 mes de 2 a 8°C en frasco de vidrio.  
B.11.7.5 Disolución patrón de 4 –Clorofenol (1 mg Cl –AOX/L).  
B.11.7.5.1 Pipetear 5 mL de la solución madre de 4 –Clorofenol (200 mg Cl – AOX/L) a un matraz 
volumétrico de 1 000 mL y aforarlo con agua destilada.  
B.11.7.5.2 La solución de trabajo puede ser almacenada por 1 mes de 2 a 8°C en frasco de vidrio.  
B.11.7.6 Disolución madre de ácid o 2–Clorobenzoico (250 mg Cl – AOX/L).  
B.11.7.6.1 Disolver 110.4 mg de ácido 2 –Clorobenzoico (ClC 6H4COOH) en 40 mL de agua destilada y 
trasvasar a matraz volumétrico de 100 mL, aforándolo posteriormente con agua destilada.  
B.11.7.6.2 El ácido 2 –Clorobenzoic o se disuelve lentamente por lo que deberá prepararse esta solución 
desde 1 día antes.  
B.11.7.6.3 Esta solución madre puede ser almacenada a una temperatura de 2 a 8°C en frasco de vidrio.  
B.11.7.7 Disolución patrón de ácido 2 –Clorobenzoico (1 mg Cl – AOX/L ). 
B.11.7.7.1 Pipetear 4 mL de la solución madre de ácido 2 –Clorobenzoico (250 mg Cl – AOX/L) a 1 matraz 
volumétrico de 1 000 mL y aforarlo con agua destilada.  
B.11.7.7.2 Esta solución de trabajo puede ser almacenada por 1 semana entre 2 a 8°C, en frasco de  vidrio.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.11.7.7.3 Gases de combustión, puede ser oxígeno (O 2), o una mezcla de oxígeno y un gas inerte.  
B.11.7.8 Disolución de estándares internos.  
B.11.7.8.1 Preparar una serie de estándares en matraces volumétricos de 100 mL.  
B.11.7.8.2 Considerar el r ango de operación del instrumento, preparar un mínimo de 5 estándares a partir 
de cada solución patrón.  
B.11.7.8.3 Preparar soluciones estándares nuevas el día que se van a usar.  
B.11.8 Calibración del equipo y material.  
B.11.8.1 Llevar un registro diario del comportamiento de operación de refrigeradores y congeladores.  
B.11.8.2 En el caso de determinación microcoulométrica, verificar el instrumento diariamente dentro de su 
rango de trabajo, usando por lo menos 1 de las soluciones siguientes:  
B.11.8.2.1 Con una jeringa, inyectar directamente un v a una concentración entre 50 y 80 µg/L de solución 
de ácido clorhídrico, 0.01 M en la celda de titulación.  
B.11.8.2.2 Medir la cantidad de carga transferida en esta prueba.  
B.11.8.3 Asumiend o teóricamente un 100 % de  transferencia electrónica. Obtener el factor de prueba a, 
utilizando la ecuación siguiente:  
 
El instrumento de medida es adecuado, con factor de prueba a, en el rango de 0.97 a 1.03.  
B.11.9 Condiciones de prueba, medidas de seguridad y de control de cali dad. 
B.11.9.1 Analizar un blanco de muestra y 5 soluciones estándar y compare los resultados.  
B.11.9.2 Calcular con valores nominales.  
B.11.9.3 Pruebe la correlación de los valores medidos, comparándolos con los valores nominales de AOX 
(por ciento de recu peración).  
B.11.9.4 Los resultados son aceptables si el coeficiente de correlación es <0.999.  
B.11.9.5 La varianza alta o % de recuperación no lineal puede causar resultados insatisfactorios.  
B.11.9.6 En las pruebas de los estándares el valor obtenido y el  valor teórico no presentarán una 
desviación mayor al 10% (recuperación del 90% al 110%).  
B.11.10 Muestreo y pretratamiento de la muestra.  
B.11.10.1 En el sitio de muestreo se debe determinar cloro libre residual (oxidantes) los cuales se deben 
eliminar po r adición de solución de sulfito de sodio.  
B.11.10.2 Si se considera que están presentes compuestos halogenados orgánicos volátiles, como 
solventes clorados, se recomienda realizar el análisis dentro de las 24 h después del muestreo. No se puede 
dar un tie mpo máximo de almacenamiento, dadas las circunstancias individuales las cuales dictarán  los 
requerimientos.  
B.11.10.3 En caso de sospecha de presencia de otros oxidantes, se determina su presencia por análisis 
de una alícuota, paralela a la muestra; agreg ando un par de cristales de KI, y una vez disueltos se les adiciona Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
1 o 2 gotas de solución de almidón. La generación de un color azul en la alícuota confirma la presencia de 
oxidantes. Se determina el v adecuado para la eliminación de los oxidantes, por p rueba y error en alícuotas  
de la muestra.  
B.11.10.4 Una vez determinado el v de sulfito de sodio necesario para eliminar la interferencia por 
oxidantes, se colecta la muestra, se adiciona el v proporcional de sulfito calculado y se acidifica con ácido 
nítrico de la siguiente manera:  
B.11.10.4.1 Colecta de muestra en frasco de vidrio, dejando un espacio de aproximadamente 5% del v 
total, adicionar el v proporcional de sulfito de sodio, adicionar 2 mL de HNO 3 por L de muestra y llenar 
completamente el recipi ente de la muestra para evitar burbujas de aire. Usualmente la cantidad de ácido 
adicionado es suficiente para bajar el pH<2. Puede ser necesario adicionar más HNO 3 para lograr este pH.  
B.11.10.4.2 Analizar la muestra de agua tan pronto como sea posible de spués del muestreo, en presencia 
de algas, analizar después de 8 h del muestreo.  
B.11.10.4.3 Si no es posible analizarla de inmediato y es necesario almacenarla, conservar la muestra 
acidificada a 4°C, o congelar.  
B.11.11. Procedimiento.  
B.11.11.1 Previo a l análisis de muestras se recomienda determinar el límite de cuantificación a partir de la 
medición de una serie de blancos del método, como una estimación preliminar. El límite de cuantificación 
puede ser igualado al valor de 9 veces la desviación estánda r de la media del blanco.  
B.11.11.2 La muestra de prueba tomada para análisis deberá tener un valor dentro del rango óptimo de 
trabajo del instrumento, que es generalmente entre 1.0 y 300 µg/L. Puede ser necesario verificar que el pH  de 
la muestra sea <2 antes de iniciar el análisis.  
B.11.11.3 Cuando sea necesaria la dilución no use menos de 5 mL de la muestra original. Anote el factor 
de la dilución (v final dividido entre el v original) y tomarlo en cuenta en el cálculo. Si el factor de dilución es 
mayor  de 10 diluir por lo menos 2 veces.  
B.11.11.4 Homogenización.  
B.11.11.4.1 Asegurar que la muestra es atemperada y homogenizada, por agitación o movimiento de la 
muestra en el frasco de muestreo, hasta que se observe una mezcla completa.  
B.11.12 Medición in strumental de compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables.  
B.11.12.1 Inicializar el equipo, permitiendo el tiempo de estabilización recomendada por el fabricante, 
verificando la temperatura de purga (45 ±5°C), la temperatura de combustión (800 ± 10°C), y el flujo de gas.  
B.11.12.2 Verificar la calibración del instrumento, mediante la prueba de 3 estándares preparados a partir 
de solución patrón de 100 µg de Cl –/L, preferentemente con concentración de 0.5, 1.0 o 1.5 µg de Cl –/L. 
Considerando acepta ble una desviación estándar menor a 5% y un coeficiente de correlación mayor a 0.99.  
B.11.12.3 Tomar una muestra homogenizada de 100 mL. Analizando blancos preparados con solución de 
ácido nítrico diluido (HNO 3) 0.02 M, y al menos 3 testigos estándares, co njuntamente con las muestras.  
B.11.12.4 Quitar el embolo del inyector, y verter en su interior 10 mL de la muestra. Volviendo a colocar el 
embolo y proceder a ejercer presión para eliminar burbujas dentro del inyector, mediante su expulsión por la 
válvula de purga. Asegurar el inyector al instrumento de purgado. Ver ificando que el instrumento esté  en el 
modo de integración para orgánicos purgables. Inmediatamente después proceder a abrir la válvula e inyectar 
la muestra en la cámara.  
B.11.12.5 Cerrar las vá lvulas y proceder al purgado durante 10 min.  
B.11.12.6 Una vez concluida la integración, abrir las válvulas del inyector y proceder a drenar la muestra.  
B.11.12.7 Registrar la lectura del instrumento ( Qpox)). 
B.11.12.8 Enjuagar perfectamente el inyector y cámara de purgado entre cada muestra a analizar.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.11.12.9 Medición instrumental de compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos  
B.11.12.10 Inicializar el equipo, permitiendo el tiempo de estabilización recomendada por el fabricante, 
verificando temp eratura de combustión y flujo de gas.  
B.11.12.11 Tomar una muestra homogenizada de 100 mL. Analizando blancos preparados con solución 
de ácido nítrico diluido (HNO 3) 0.02 M, y al menos 3 testigos estándares, conjuntamente con las muestras.  
B.11.12.12 Adici onar 5 mL de la solución madre de nitratos a cada una de las muestras, estándares  y 
blanco.  
B.11.12.13 Procediendo a inyectar la serie de muestras, patrones y blanco de acuerdo a las 
especificaciones del fabricante.  
B.11.12.14 Registrar la lectura del ins trumento ( Qs). 
B.11.12.15 Al inicio de las determinaciones y después de una serie de 10 muestras, realizar lavado de las 
columnas por adición de 25 mL de solución de lavado de nitratos, verificando que la velocidad de flujo de 
muestra sea de 3 mL/min.  
B.11 .13. Expresión de los resultados.  
B.11.13.1 Cálculos.  
B.11.13.1.1  Algunos instrumentos cuentan con programas para el cálculo de la concentración de los 
compuestos halogenados adsorbibles, considerando los valores de los estándares preparados. En caso 
contr ario calcular la concentración de los compuestos orgánicos halogenados adsorbibles (AOX) utilizando la 
siguiente ecuación:  
 
B.11.14 Informe de prueba.  
B.11.14.1. Informar como:  
B.11.14.1.1  mg de compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos por L de solución (mg COAF/L).  
B.11.14.1.2  mg de compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables por L de solución  (mg 
COHAP/L).  
B.12. Método para la determinación de Carbono Orgánico Purgable.  
B.12.1. Fundamento.  
El carbono orgánico presente en agua es oxi dado a bióxido de carbono mediante combustión, ya sea por 
oxidación química, radiación UV o radiación de alta energía. Una vez transformado en CO 2, éste es 
cuantificado por uno de los diversos instrumentos existentes; como son: Espectrometría infrarroja, 
Coulometría, electrodos de ión selectivo, etc.  
En muestras en que la concentración de carbono inorgánico  es menor al carbono orgánico, é ste se calcula 
restando el carbono total determinado, menos el carbono inorgánico total purgado. En caso contrario, la Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
eliminación de la interferencia por carbón inorgánico, puede llevarse a cabo mediante acidificación de  la 
muestra a pH < 2 para transformar el carbono inorgánico a CO 2. Posteriormente el CO 2 producido es purgado.  
Durante la purga, el benceno, tolueno, ciclo hexano y cloroformo son arrastrados junto a CO 2, por lo que es 
conveniente, ante la presencia de estos compuestos orgánicos, determinarlos previamente.  
B.12.2. Aparatos e instrumentos  
B.12.2.1  Se deberá llevar un registro diario del comportamiento de opera ción de refrigeradores  y 
congeladores.  
B.12.2.2  Los analizadores y potenciómetros se calibrarán previamente a su utilización.  
B.12.2.3 Equipo de filtración.  
B.12.2.4 pH-metro.  
B.12.2.5 Agitador magnético.  
B.12.2.6 Instrumento analizador de carbono orgánic o total.  
B.12.3 Material.  
B.12.3.1 Perillas para pipetas.  
B.12.3.2 Lentes protectores.  
B.12.3.3 Guantes estériles.  
B.12.3.4 Microjeringas; 0 a 50 µL, 0 a 250 µL y 0 a 1 mL.  
B.12.3.5 Frascos ámbar de 1 L, con boca ancha y tapa con sello TFE  
B.12.4 Reactivos  y soluciones.  
B.12.4.1 Agua destilada:  exenta de CO 2, se puede preparar por filtración en carbón activado o llevándola 
a ebullición.  
B.12.4.2 H 3PO 3. 
B.12.4.3. Ácido sulf úrico H2SO 4. 
B.12.4.4 Solución patrón de carbono orgánico.  
B.12.4.4.1  Pesar 2.1254 g C 8H5KO 4 grado patrón primario y disolver en agua bidestilada exenta de CO 2, 
aforando a 1 L.  
B.12.4.4.2  La solución preparada se puede preservar adicionando; H 3PO 3 o H 2SO 4, hasta un pH<2  
B.12.5 Toma de muestra.  
B.12.5.1 La muestra se colectará en frascos de vidrio ámbar, de 1 L. de capacidad mínima, previamente 
lavados con ácido, cubiertos con papel aluminio y esterilizados a 400°C por al menos 1 h. La tapa del frasco, 
con sello de TFE, se debe lavar con detergente, enjuagándolo al menos 3 veces con agua exen ta de carbono 
orgánico, envolver en papel aluminio y esterilizada a 100°C durante 1 h. Preferentemente utilizar tapas  tipo 
septum.  
B.12.5.2 Colectar la muestra, teniendo el cuidado de su representatividad, ante la presencia de sustancias 
no disueltas y ll enando el frasco hasta el ras una vez que se le adicione el ácido. Una vez tapado el frasco se 
debe verificar no dejar burbujas de aire en el interior.  
B.12.5.3 Manteniendo la muestra entre 2°C y 8°C hasta su recepción en el laboratorio. En caso de no 
pode r ser analizada de inmediato, o ante la presencia de actividad biológica, preservar con H 3PO 3 o H 2SO 4, 
adicionando hasta lograr un pH<2.  
B.12.6 Procedimiento.  
B.12.6.1 Se inicializa el instrumento de acuerdo a las especificaciones del fabricante, hasta log rar  la 
estabilización.  
B.12.6.2 Se prepara la muestra o serie de muestras en conjunto con un mínimo de 3 patrones, preparados 
en concentraciones entre los límites de determinación del procedimiento establecido en el laboratorio y blanco       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
de método. Las mue stras deberán estar perfectamente homogenizadas, para evitar taponamientos en las 
jeringas del automuestreador.  
B.12.6.3 Cuando se requiera determinar el carbono orgánico disuelto, se inicia filtrando la muestra a través 
de filtro de fibra de vidrio con po ro de 0.45 µm. Los cuales deberán ser previamente acondicionados, 
sumergiéndolos por al menos 12 h en solución HNO 3 50%. Utilizando un filtro y soporte de filtro limpios  por 
cada muestra.  
B.12.6.4 Inyección de la muestra.  
B.12.6.4.1  Utilizando una jeringa  de acuerdo a las especificaciones del fabricante del equipo analizador, 
seleccionar el diámetro de la aguja o puntilla de acuerdo con las características del material suspendido en la 
muestra. Utilizando agitador magnético, para una correcta homogenizació n, e inyectar la muestra en el 
equipo, anotando la lectura como dato preliminar, repetir la inyección, hasta que la reproducibilidad de la 
lectura este dentro de ±10%, tomando el último dato como lectura final. En cada corrida de muestras incluir al 
menos 3 patrones de concentración dentro del rango de trabajo.  
B.12.6.5 Preparación de la curva de calibración.  
B.12.6.5.1  Preparar un mínimo de 7 patrones, en concentraciones entre 0 y 4 mg/L, utilizando la solución 
patrón de biftalato de potasio, considerando en todo momento el blanco de método (blanco de agua destilada) 
como la lectura blanco, la cual se restará a la lectura de cada patrón. Calculando a partir de ellos la curva  de 
calibración.  
En el caso de equipo automatizado, los ajustes por blanco, son cal culados por el software.  
B.12.7 Medidas de control de calidad.  
B.12.7.1 Para demostrar adecuadamente la aptitud técnica del analista se deberán realizar un mínimo de 
10 repeticiones, de muestras pareadas, en 2 diferentes diluciones, con alícuotas de muestr a. 
B.12.7.2 Se considera aceptable el desempeño del analista, demostrando como máximo, recobro entre 90 
y 110% y desviación estándar de 10%.  
B.13 Método para la determinación de Sustancias de Azul de Metileno.  
B.13.1 Fundamento.  
Se basa en la reacción de l as sustancias surfactantes aniónicas, incluyendo alquilsulfonatos, alquilsulfatos 
y alquilpolietoxil sulfatos con el azul de metileno, que da lugar a la formación de una sal de coloración azul, 
soluble en cloroformo, y cuya intensidad de color es medida es pectrométricamente a una longitud de onda de 
652 nm.  
B.13.2 Interferencias.  
B.13.2.1 Los sulfatos orgánicos, sulfonatos, carboxilatos, fosfatos y fenoles son complejos formados con el 
azul de metileno.  
B.13.2.2 Los cianatos inorgánicos, cloruros, nitratos y tiocianatos, interfieren formando pares iónicos con el 
azul de metileno.  
B.13.2.3 Las aminas compiten con el azul de metileno en la reacción produciendo bajos resultados.  
B.13.3 Aparatos e instrumentos.  
B.13.3.1 Espectrómetro UV –Visible disponible para u tilizarse a una longitud de onda de 652 nm y provisto 
de celdas de 1 cm de paso de luz.  
B.13.3.2 Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg.  
B.13.4 Material.  
B.13.4.1  Todo el material de vidrio empleado en esta determinación debe lavarse con mezcla crómi ca, 
enjuagarse con solución caliente de HCl (1:1) y enjuagarse 2 o 3 veces más con agua. Asegurarse que no 
queden residuos de mezcla crómica. Nunca usar detergentes.  
B.13.4.2 Fibra de vidrio.  
B.13.4.3 Material común de laboratorio.  
B.13.4.4 Embudo de separ ación de 500 mL, preferentemente con llave de vidrio.  
B.13.4.5 Termómetro.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.13.5 Reactivos.  
B.13.5.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada.  
B.13.5.2 Sulfonato de alqu il benceno. ABS (C 6H4O3 SnaR).  
B.13.5.3. Fenolftaleína (C 20H14O4). 
B.13.5.4 Hidróxido de sodio (NaOH).  
B.13.5.5 Alcohol etílico (C 2H6O) o isopropílico (C 3H8O). 
B.13.5.6 Ácido sulfúrico (H 2SO 4). 
B.13.5.7 Cloroformo grado espectrométrico (CHCl 3). 
B.13.5.8 Azul de metileno (C 16H18N3SCl•3H 20). 
B.13.5.9 Fosfato de sodio monobásico monohidratado (NaH 2PO 4•H2O). 
B.13.6 Preparación de soluciones.  
B.13.6.1 Solución madre de ABS de 1 mg/mL.  
B.13.6.1.1  Pesar 1.0 g de ABS, disolver en agua y llevar a un volumen de un 1 L. Mezclar suavemente 
para prevenir la formación de espuma. Es necesario prepararla cada semana y refrigerar (se recomienda 
aforar sólo cuando todo el sulfonato de alquil benceno se haya disuelto y la espuma desaparezca).  
B.13.6.2 Solución patrón de ABS de  10 mg/mL.  
B.13.6.2.1  Diluir 10 mL de la solución madre de ABS de 1 mg/L y aforar a 1 L con agua. Esta solución se 
debe preparar diariamente.  
B.13.6.3 Solución indicadora de fenolftaleína.  
B.13.6.3.1  Disolver 0.5 g de fenolftaleína en 50 mL de alcohol etíl ico y llevar a un volumen de 100 mL  con 
agua.  
B.3.6.4 Solución de hidróxido de sodio 1 N.  
B.13.6.4.1  Disolver 40 g de NaOH en agua y aforar a un litro.  
B.13.6.5 Solución de ácido sulfúrico 1 N.  
B.13.6.5.1  Diluir cuidadosamente 28 mL de H 2SO 4 concentrado e n agua. Dejar enfriar y aforar a 1 L.  
B.13.6.6 Reactivo azul de metileno de 30 mg/L.  
B.13.6.6.1  Disolver 0.1 g de azul de metileno, en 100 mL de agua. De esta solución se transfieren 30 mL a 
un matraz volumétrico de 1 L y agregar 500 mL de agua, 6.8 mL de H2SO 4 concentrado y 50 g de 
NaH 2PO 4•H2O. 
B.13.6.6.2  Agitar hasta su completa disolución y aforar a 1 L.  
B.13.6.7 Solución de lavado.  
B.13.6.7.1  En un matraz volumétrico de 1 L que contenga 500 mL de agua, agregar 6.8 mL H 2SO 4 
concentrado y 50 g de NaH 2PO 4•H2O. Agitar hasta su completa disolución y aforar.  
B.13.7 Procedimiento.  
B.13.7.1. Preparación de la curva de calibración.  
B.13.7.1.1  Colocar los siguientes volúmenes de solución patrón de ABS (véase Tabla Curva de 
Calibración para Sustancias de Azul de Me tileno.) en embudos de separación. Agregar agua hasta un v  de 
100 mL.  
Tabla. - Curva de Calibración para Sustancias de Azul de Metileno.  
Volumen de 
solución patrón 
de ABS (mL).  Concentración 
de µg de ABS.  Volumen 
de aforo  
(mL).  
0 Blanco  100 
1 10 100 
3 30 100 
5 50 100       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
7 70 100 
9 90 100 
11 110 100 
13 130 100 
15 150 100 
20 200 100 
B.13.7.2 Preparación de la muestra.  
B.13.7.2.1 El v de la muestra de agua para ser analizada, se mide de acuerdo con la concentración 
probable de ABS, (véase Tabla Concent ración probable de ABS.) Asimismo, efectuar 1 prueba testigo con 
agua destilada (blanco de muestras).  
Tabla. - Concentración probable de ABS.  
Concentración 
esperada de ABS en 
mg/L.  Volumen de muestra 
en mL.  
0.025 —0.080  400 
0.080 —0.40 250 
0.40—2 100 
2—10 20 
10—100 2 
 
B.13.7.2.2 Si el v de muestra es menor a 100 mL, se debe diluir con agua a este v. Si es mayor de 100 mL 
extraer la muestra completa. Transferir las muestras y blanco a embudos de separación.  
B.13.7.3. Extracción y desarrollo de color.  
B.13 .7.3.1 Adicionar 3 gotas de solución indicadora de fenolftaleína a las soluciones patrón y muestras y 
agregar suficiente solución de hidróxido de sodio 1 N para producir un color rosa.  
B.13.7.3.2 Adicionar solución diluida de ácido sulfúrico, en pequeñas c antidades hasta que el color rosa 
desaparezca.  
B.13.7.3.3 Agregar 10 mL de cloroformo y 25 mL de azul de metileno. Agitar vigorosamente durante  30 
seg y dejar en reposo hasta la separación de las fases. Liberar la presión con sumo cuidado.  
B.13.7.3.4 Pasar  la fase orgánica a un segundo embudo y lavar el tubo de descarga del primero con un 
poco de cloroformo. Repetir la extracción por 3 veces, usando 10 mL de cloroformo en cada ocasión. Si el 
color azul en la fase acuosa desaparece, descartar la muestra y re petir la determinación utilizando un v menor 
de muestra. Con frecuencia se presentan problemas de emulsificación la cual puede romperse con agitación 
suave con el extremo plano de una varilla de vidrio. La transferencia de la fase orgánica al segundo embud o 
de separación se efectúa sólo hasta que las 2 fases estén completamente separadas.  
B.13.7.3.5 Combinar todos los extractos clorofórmicos en el segundo embudo de separación. Agregar  50 
mL de solución de lavado y agitar vigorosamente durante 30 seg. Dejar reposar y filtrar la capa de cloroformo 
a través de la fibra de vidrio, a un matraz aforado de 100 mL.  
B.13.7.3.6 Repetir el lavado por 2 veces empleando 10 mL de solución de lavado en cada ocasión.  
B.13.7.3.7 Lavar la fibra de vidrio y el embudo con cloro formo, recoger los lavados en el matraz aforado, 
aforar con cloroformo y mezclar perfectamente.  
B.13.7.3.8 Acondicionamiento del método.  
B.13.7.3.9 Fijar la longitud de onda del equipo a 652 nm de acuerdo con las instrucciones del manual  de 
operación.  
B.13.7.3.10 Ajustar el instrumento a 0 absorbancia con el blanco de soluciones patrón.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.13.7.3.11 Leer las soluciones patrón de menor a mayor concentración y registrar al menos 3 réplicas de 
la absorbancia de cada uno. La absorbancia debe medirse después de 15 min y antes de 30 min de haberse 
desarrollado el color. Una vez transcurrido ese tiempo la solución ya no es estable.  
B.13.7.3.12 Elaborar una curva de calibración graficando el promedio de absorbancia para cada solución 
patrón en función de su concentr ación (en g de ABS).  
B.13.7.3.13 Ajustar la curva de calibración obtenida mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Calcular la pendiente, el coeficiente de correlación y la ordenada al origen. Obtener la ecuación 
de la recta.  
B.13.7.3.14 Leer del mismo modo las muestras y blanco de muestras. Si la lectura de alguna de las 
muestras rebasa el intervalo de trabajo, diluir a una concentración adecuada con cloroformo (factor de 
dilución).  
B.13.7.3.15 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos q ue se programan directamente en los cuales 
sólo es necesario leer los patrones y marcar su concentración teórica.  
B.13.8 Expresión de los resultados.  
B.13.8.1. Cálculos.  
B.13.8.1.1  De la ecuación de la recta obtenida:  
y = mx + b  
En donde:  
y = Absorbancia o btenida en la muestra analizada.  
m = Pendiente (coeficiente de absortividad).  
x =µg de ABS en la muestra obtenidos de la curva de calibración.  
B = Ordenada al origen.  
Despejar x para obtener directamente los µg de ABS en la muestra.  
Para obtener la concent ración de ABS en mg/L aplicar la siguiente ecuación:  
 
En donde:  
A =µg de ABS en la muestra, se pasan a mg  
B = µg de ABS en el blanco de muestras, se pasa a mg  
V = volumen de muestra.  
F.D. = Factor de dilución.  
En los equipos que pueden programarse, la lec tura obtenida es directamente la concentración del 
elemento en mg/L.  
B.13.9 Informe de prueba.  
B.13.9.1 Informar como:  
B.13.9.1.1  mg/L de sustancias activas al azul de metileno.  
B.14  Método para la determinación de Cloro Residual Libre.  
B.14.1 Introducción . 
La desinfección del agua es un factor esencial para el control de las enfermedades diarreicas y 
gastrointestinales, de ello depende que un sistema de abastecimiento de agua mantenga un servicio confiable 
que suministre el líquido de calidad sanitaria ade cuado para el uso y consumo humano. La mejor manera de 
poder garantizar dicha calidad, es mediante el monitoreo regular de cloro residual libre a través de diferentes 
metodologías e instrumentos de medición, del cloro residual libre en la red municipal de abastecimiento de 
agua, lo cual nos permitirá medir la eficiencia del método de desinfección y corregir de manera inmediata las 
posibles desviaciones que se detecten. Siempre que los niveles de cloro residual libre se mantengan dentro 
de lo señalado por la  reglamentación oficial podremos disminuir el riesgo de enfermedades de origen hídrico.  
B.14.2 Interferencias.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.14.2.1  La presencia de residuos flotantes y materia fina las cuales pueden sedimentarse rápidamente 
dará lecturas bajas. El color verdadero, es  decir el color del agua debido a sustancias disueltas que absorben 
luz, causará valores bajos de turbiedad.  
B.14.2.2  Existen algunas fuentes de error como son la presencia de burbujas en las paredes de la celda al 
momento de realizar la lectura, empañamie nto de las celdas, suciedad del vidrio y los efectos de vibración 
alteran la visibilidad superficial de la muestra originando errores en las lecturas.  
B.14.3 Equipo.  
B.14.3.1 Kit para determinar cloro residual libre y pH.  
B.14.3.2 Componentes del kit para la determinación de cloro residual para la determinación de cloro 
residual libre y pH.  
B.14.3.3 El estuche para determinar cloro residual libre consta de:  
B.14.3.3.1 Comparador colorimétrico con 2 celdas unidas con escala de medición. Para la medición de 
cloro residual libre, cuenta con una escala colorimétrica que va de una tonalidad rosa tenue a intenso, con 
parámetros entre 0.0 y 3.0 ppm y con valores intermedios de 0.2 y 1.5 ppm (miligramo por litro). Para pH, las 
tonalidades son de amarillo a rojo con parámetros entre 6.8 a 8.2;  
B.14.3.3.2 Ambas celdas tienen marcadas en la parte superior el aforo;  
B.14.3.3.3 Dos tapas, una para cada celda;  
B.14.3.3.4 Reactivo DPD, en tabletas o a través de dosificador, conteniendo la cantidad exacta para ser 
utilizado en el equipo y apropiado para la medición de cloro residual libre;  
B.14.3.3.5 Frasco gotero con solución o b líster con pastillas de rojo fenol;  
B.14.3.3.6 Tarjeta blanca que se utiliza de fondo para la lectura de la prueba.  
Escala de cloro Residual.  
 
B.14 .4 Procedimiento.  
B.14.4.1. Previo al monitoreo de cloro residual libre y pH, revisar que el kit para el monitoreo de cloro 
residual y pH se encuentre completo y en buenas condiciones es decir, limpio, sin residuos de la lectura 
anterior, sin ralladuras o fugas.  
B.14.4.2 Liberar la llave o grifo de aditamentos conectados, tales como mangueras, a fin de que la 
determinación de cloro residual y pH sea directa y no interfieran en el resultado.  
B.14.4.3 Abrir la llave o grifo, dejar correr el agua por un espaci o de 30 seg a 1 min, para garantizar que el 
agua contenida en la tubería ha sido vaciada, ésta podrá ser colectada en un recipiente, para evitar  su 
desperdicio.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.14.4.4 El agua deberá provenir directamente del sistema de abastecimiento, no se deberá moni torear si 
el grifo presenta fugas entre el tambor y el cuello, ya que el agua podrá correr por la parte exterior del grifo y 
contaminar la muestra.  
B.14.4.5 Registrar la ubicación del punto de muestreo y demás datos que solicita el Formato 2 Registro de 
Actividades Diarias “Hoja de Campo”.  
B.14.4.6 Enjuagar las celdas con el agua a monitorear por 3 veces con agitación.  
B.14.4.7  Llenar con agua a monitorear las 2 celdas hasta el aforo sin sobrepasar.  
B.14.4.8 Agregar 1 pastilla de DPD a la celda de prueba pa ra cloro residual libre, abriendo la envoltura con 
las manos, evitando el contacto de la pastilla con los dedos, en caso de utilizar dosificador, cerciorarse que la 
totalidad de la dosis sea colectada en la celda.  
B.14.4.9 Agregar 5 gotas de solución rojo fenol o en su defecto la pastilla, a la celda de prueba de pH.  
B.14.4.10 Colocar las tapas a las celdas e invertirlos varias veces para mezclar la solución y la disolución 
de la pastilla y agitar.  
B.14.4.11 Comparar cada celda de prueba con su respectiva e scala colorimétrica colocando un fondo 
blanco para poder observar el color que presenta el agua.  
B.14.4.12 Registrar el resultado del monitoreo de cloro residual libre y pH en el Formato 2. Registro de 
Actividades Diarias “Hoja de Campo”, respectivamente.  
B.14.4.13 Si la coloración no alcanza la escala de 0.2 ppm se deberá de reportar como menor de  0.2 
(<0.2), si por el contrario la coloración rebasa la escala de 1.5 ppm se deberá registrar como mayor de 1.5 
(>1.5).  
B.14.4.14 El contenido de las celdas podr á arrojarse al drenaje, enjuagar hasta que no contenga residuos 
y secar el equipo después de cada determinación.  
B.15 Método para la determinación de Trihalometanos.  
B.15.1 Principio.  
Los trihalometanos (THM) son extraídos de la muestra con pentano, el ext racto obtenido es inyectado en 
un cromatógrafo de gases equipado con un detector de captura de electrones para separación y análisis. Los 
trihalometanos se refieren a los compuestos bromoformo, bromodiclorometano, dibromoclorometano y 
cloroformo que pueden  ser encontrados como subproductos de aguas que han sido cloradas.  
B.15.2 Interferencias.  
B.15.2.1 Impurezas contenidas en el solvente de extracción usualmente provocan problemas analíticos. 
Por ello se hace necesario analizar blancos de solventes cada que  se use un frasco nuevo. Se deben 
descartar solventes que tengan niveles de THM mayores de 10 µg/mL.  
B.15.2.2 Niveles bajos de interferencia pueden ser eliminados por destilación o cromatografía en columna.  
B.15.2.3 Un solvente se considera libre de interf erencias si contiene menos de 0.4 µg/mL de 
triclorometano de forma individual.  
B.15.3. Equipo.  
B.15.3.1  Cromatógrafo de gases, de preferencia con temperatura programable, sistema de enfriamiento 
del horno de columna e inyector con camisa de cuarzo tipo sep tum, equipado con detector de captura  de 
electrones.  
B.15.4 Material.  
B.15.4.1 Frascos y matraces con tapón de rosca con interior recubierto de PTEF  
B.15.4.2 Microjeringas de 1 µL.  
B.15.4.3 Microjeringas de 10 a 100 µL.  
B.15.4.4 Microjeringas de 25 µL.  
B.15.4.5 Jeringas hipodérmicas de vidrio de 10 mL.  
B.15.4.6 Válvula para jeringa tipo Luer de 2 pasos.  
B.15.4.7 Columna cromatográfica. Puede emplearse cualquiera de las que a continuación se indican:        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.15.4.7.1 Columna 1. Columna de vidrio de 2 m de longitu d y 4 mm de diámetro interno, empacada con 
3% de SP –1000 en Supelcort (malla 100/120).  
B.15.4.7.2 Columna 2. Columna de vidrio de 2 m de longitud y 4 mm de diámetro interno, empacada con 
10% de escualeno en Chromosorb WAW (malla 100/120).  
B.15.4.7.3 Column a 3. Columna de vidrio de 2 m de longitud y 2 mm de diámetro interno, empacada con 
6% OV –11 y 4% SP –2100 en Supelcort (malla 100/120).  
B.15.4.7.4 Columna 4. Columna capilar de sílica fundida DB -624 o equivalente, con dimensiones de 30 m 
de longitud y 0.53 mm de diámetro interno, espesor de película de 3 µm.  
B.15.5 Reactivos.  
B.15.5. 1 Pentano grado análisis orgánico de trazas (C 5H12). 
B.15.5 .2 Metanol grado análisis orgánico de trazas (CH 4O). 
B.15.5 .3 Carbón activado.  
B.15.5 .4 Bromoformo pureza mayor a 98% ( CHBr 3). 
B.15.5 .5 Bromodiclorometano pureza mayor a 97% (CHBrCl 2). 
B.15.5 .6 Dibromoclorometano pureza mayor a 98% (CHBr 2Cl). 
B.15.5 .7 Cloroformo pureza mínimo del 99.8% (CHCl 3). 
B.15.5 .8 Helio grado cromatográfico.  
B.15.5 .9 Argón con 5% de metano grado crom atográfico.  
B.15.5 .10 Agua libre de THM.  
B.15.5 .11 Preparar pasando agua desionizada a través de un filtro conteniendo carbón activado o 
hirviendo agua y purgándola con un gas inerte por una 1 h manteniendo la temperatura a 90°C. Conservar en 
frascos con t apa de rosca con el interior recubierto de PFTE.  
B.15.5 .12 Soluciones madre de THM individuales.  
B.15.5 .13 Colocar 9.8 mL de metanol en un matraz volumétrico de 10 mL. Dejar en reposo 
aproximadamente 10 min o hasta que todas las paredes humedecidas con el alcohol estén secas. Pesar con 
una precisión de 0.1 mg. Utilizando una jeringa de 100 µL, adicionar inmediatamente de 2 –3 gotas del 
trihalometano y volver a pesar.  
B.15.5 .14 Asegurarse que el trihalometano cae directamente en el alcohol sin tener contacto con el cuello 
del matraz. Diluir al v y mezclar. Transferir la solución madre a un recipiente de 15 mL con tapón de rosca y 
recubierto en su interior con PTFE. Efectuar la misma operación con los 4 THM en forma individual. Calcular 
la concentración en µg/mL a partir de la diferencia de peso registrada. Las soluciones son estables durante  4 
semanas almacenadas a 4°C.  
B.15.5.14.1  Precaución: Los trihalometanos son tóxicos, preparar las soluciones en una campana de 
extracción y utilizar mascarilla apropiada.  
B.15.6  Procedimiento.  
B.15.6 .1 Preparación de las curvas de calibración.  
B.15.6 .1.1 De acuerdo con la concentración calculada para cada solución madre de trihalometanos, 
preparar 3 diluciones de cada uno, de tal forma que cubran el intervalo de concentració n de las muestras.  
B.15.6 .2 Extracción de Trihalometanos.  
B.15.6 .2.1 Quitar los émbolos de las jeringas hipodérmicas y sujetar a una válvula tipo Luer.  
B.15.6 .2.2 Abrir la botella que contiene la muestra. Si ningún agente reductor ha sido adicionado, coloc ar 
directamente 1 mg del mismo en el matraz de extracción.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.15.6 .2.3 Verter la muestra al depósito de la jeringa. Colocar el émbolo y comprimir la muestra. Abrir la 
válvula de la jeringa y ventilar algún residuo de aire mientras se ajusta el v de muestra a 10 mL. Cerrar  la 
válvula.  
B.15.6 .2.4 Medir 2 mL de pentano en otro matraz de extracción e inyectar con mucho cuidado la muestra 
contenida en la jeringa. Tapar y agitar vigorosamente durante 1 min. Dejar separar las fases. Centrifugar si es 
necesario.  
B.15.6.2.5 Inyectar la fase orgánica al cromatógrafo.  
B.15.6 .3 Acondicionamiento del equipo.  
B.15.6.3.1  Fijar los parámetros cromatográficos indicados (véase Tabla Condiciones Cromatográficas ) de 
acuerdo con el manual de operación y al tipo de columna utiliz ada: 
Tabla. - Condiciones Cromatográficas.  
Columna.  Parámetros  
Gas 
acarreador.  Flujo del gas 
acarreador.  Temperatura del horno 
de la columna.  
1 Argón con 5% 
de metano  60 mL/min  50°C  
2 Argón con 5% 
de metano  25 mL/min  67°C  
3 Argón con 5% 
de metano  25 mL /min 45°C por 12 minutos y 
1°C/min a 70°C  
4 Helio  75 mL/min  5°C por 2 minutos y 
5°C/min a 200°C  
 
B.15.6.3.2  Asimismo fijar los parámetros correspondientes (temperatura y voltaje) para el detector de 
captura de electrones.  
B.15.6.4  Acondicionamiento del m étodo.  
B.15.6.4.1  Inyectar 3 µL para columna de vidrio y 1 µL para columna capilar de cada solución patrón de 
THM de menor a mayor concentración.  
B.15.6.4.2  Obtener los cromatogramas correspondientes.  
B.15.6.4.3  Elaborar una curva de calibración para cada trihalometano, graficando el área obtenida del pico 
para cada solución patrón en función de su concentración ( µg de THM/L).  
B.15.6.4.4  Ajustar la curva de calibración obtenida mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Calcular la pendiente, el coeficiente de correlación y la ordenada al origen. Obtener la ecuación 
de la recta.  
B.15.6.4 .5 Inyectar del mismo modo 3 o 1 µL de muestra y blanco de muestras. Obtener los 
cromatogramas, identificar los picos correspondientes a cada THM en función de su tiempo de retención. 
Calcular el área del pico.  
B.15.6.4 .6 En caso de ser necesario diluir las muestras con pentanol, para llevar al intervalo de trabajo 
(factor de dilución).  
B.15.6.4 .7 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan dire ctamente en los cuales 
sólo es necesario leer los patrones y marcar su concentración teórica.  
B.15.7  Expresión de los resultados.  
B.15.7.1 Cálculos.  
B.15.7.1.1  De la ecuación de la recta obtenida:  
 
En donde:        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
es el área del pico correspondiente a cada THM ; 
es la pendiente;  
es la concentración en µg de cada THM/L de la muestra;  
es la ordenada al origen.  
Despejar x, para obtener directamente la concentración de µg de THM/L en la muestra. Multiplicar por el 
factor de dilución utilizado. Sumar la concentrac ión de los trihalometanos detectados.  
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida es directamente la concentración del 
compuesto en µg/L 
La suma de la concentración de µ g de trihalometanos/L, considerando la dilución, son los trihalometanos 
totales.  
B.16 Método para la determinación de formaldehído total por cromatografía de líquidos.  
B.16.1 Fundamento.  
El formaldehído presente en la muestra es derivatizado con 2,4 -dinitrofenilhidracina en medio ácido y 
extraído con cloroformo. Después que el  solvente es intercambiado por metanol, el producto es separado  y 
cuantificado usando fase reversa y detección UV a 365 nm.  
B.16.2 Equipo.  
B.16.2.1 Sistema de cromatógrafo de líquidos:  
B.16.2.2 Sistema desgasificador por Helio, membrana de vacío o ultraso nido.  
B.16.2.3 Sistema de bombas capaz de desarrollar un flujo de 1 mL/min.  
B.16.2.4 Inyector tipo jeringa (intervalo de 1 -25 µL) o loop de 25 µL.  
B.16.2.5 Detector de arreglo de diodos o UV -Visible capaz de medir a 365 nm.  
B.16.2.6 Sistema de datos: grafi cador, integrador o computadora compatible con la salida de voltaje  del 
detector.  
B.16.2.7 Columna C 18 u ODS (Octadecilsilanos), dimensiones de 250 x 4.6 mm, tamaño de partícula de  7 
µm. 
B.16.2.8 Evaporador rotatorio.  
B.16.3 Material.  
B.16.3.1 Material c omún de laboratorio.  
B.16.4 Reactivos y soluciones.  
B.16.4.1 Cloroformo (CHCl 3). 
B.16.4.2 Metanol grado CLAR (CH 4O). 
B.16.4.3 Agua grado CLAR (H 2O). 
B.16.4.4 Etanol (C 2H6O2). 
B.16.4.5 Ácido clorhídrico (HCl).  
B.16.4.6 2,4–Dinitrofenilhidracina (DNPH).  
B.16 .4.7 Formaldehído en solución al 37% (CH 2O). 
B.16.4.8 Indicador de timolftaleína grado ACS. Intervalo de viraje de pH 9.0 a 9.5 (incoloro –azul).  
B.16.4.9 Sulfito de sodio anhidro (Na 2SO 3). 
B.16.4.10 Ácido clorhídrico 0.100 N, 1 N, 2 N y 12 N.  
B.16.4.11 Determinar la concentración exacta del HCl 0.100 N usando procedimiento de titulación.  
B.16.4.12 Solución de DNPH.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.16.4.12.1  Saturar 1 L de HCl 2 N con DNPH (solubilidad aproximada de 300 mg/L).  
B.16.4.13 Solución stock de formaldehído aproximadamente de 4 mg/L.  
B.16.4.13.1 Medir 5 mL de formaldehído al 37% en un matraz volumétrico de 500 mL y llevar al v con 
agua. Calentar la solución a aproximadamente 30°C para disolver completamente la formalina y enfriar a 
temperatura ambiente.  
B.16.4.13.2 Valoración de la solución.  
B.16.4.13.2.1 Medir 125 mL de solución de sulfito de sodio 1 M en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. 
Adicionar 3 gotas del indicador de timolftaleína. La solución debe ser de un color azul pálido. Añadir HCl 0.1 N 
gota a gota hasta que la solució n se vuelve incolora (usualmente se requieren de 2 –5 gotas). Adicionar 
exactamente 25 mL de solución stock de formaldehído a la solución acidificada de sulfito de sodio. Titular con 
HCl 0.1 N hasta la desaparición de la coloración que persista 3 min.  
B.16. 4.13.2.2 Efectuar 3 titulaciones y calcular el valor promedio.  
B.16.4.13.2.3. Calcular la concentración exacta de formaldehído aplicando la siguiente ecuación:  
 
B.16.4.14 Solución de sulfito de sodio 1 M.  
B.16.4.14.1  Disolver 63.02 g de sulfito de sodio e n 500 mL de agua.  
B.16.4.15 Solución indicadora.  
B.16.4.15.1 Disolver 40 mg de indicador de timolftaleína en 40 mL de etanol.  
B.16.4.15.2 Solución patrón derivatizada de formaldehído de 50 mg/L.  
B.16.4.15.3 De acuerdo con la concentración calculada de la s olución stock, medir un v equivalente a  2.5 
mg de formaldehído.  
B.16.5 Procedimiento.  
B.16.5.1 Preparación de la curva patrón.  
B.16.5.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de formaldehído (véase Tabla Curva de 
calibración de Formaldehído)  en matraces volumétricos de 50 mL. Llevar al v con metanol. Filtrar a través  de 
un filtro de tamaño de poro de 0.45 µm.  
Tabla. - Curva de calibración de Formaldehído.  
Volumen de solución 
patrón de 
formaldehído (mL).  Concentración 
(mg de CH 2O/L).  Volumen de 
aforo con 
metanol (mL).  
0.00 Blanco  50 
0.25 0.25 50 
0.50 0.50 50 
1.00 1.00 50 
2.50 2.50 50 
5.00 5.00 50 
 
B.16.6 Preparación de las muestras.  
B.16.6.1 Medir 60 mL de muestra y agua destilada (blanco de muestras) en un embudo de separación. 
Adicionar 165 mL de HCl 12 N y 300 mg de DNPH. Agitar por varios min.  
B.16.6.2 Extraer 2 veces con porciones de 50 mL de cloroformo. Dejar separar las fases y descartar la 
fase acuosa.  
B.16.6.3 Lavar la fase clorofórmica, 2 veces con porciones de 50 mL de HCl 1 N y 1 vez con 100 mL de 
agua. Descartar la fase acuosa.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.16.6.4 Evaporar el cloroformo casi a sequedad. Diluir el residuo a un v de 25 mL con metanol. Filtrar a 
través de filtro con tamaño de poro de 0.45 µm.  
B.16.7 Acondicionamiento del equipo.  
B.16.7.1 Fijar los siguientes parámetros cromatográficos  de acuerdo con el manual de operación:  
B.16.7.1.1 Flujo: 1  mL/min.  
B.16.7.1.2 Fase móvil: Metanol 70% Agua 30%.  
B.16.7.1.3 Longitud de onda: UV a 365 nm.  
B.16.7.1.4 Velocidad del integrador o software en sistemas  automatizados.  
B.16.7.1.5 Bombear fase móvil a través del sistema del cromatógrafo hasta la obtención de una línea  
base estable.  
B.16.8 Acondicionamiento del método.  
B.16.8.1 Inyectar 25 µL de cada solución patrón de menor a mayor concentración.  
B.16.8.2  Obtener los cromatogramas correspondientes. El pico que corresponde al formaldehído 
derivatizado eluye a un tiempo aproximado de 8 min bajo las condiciones de este método.  
B.16.8.3 Elaborar una curva de calibración, graficando el área obtenida del pico pa ra cada solución patrón 
en función de su concentración (mg de CH 2O/L).  
B.16.8.4 Ajustar la curva de calibración obtenida mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Calcular la pendiente, el coeficiente de correlación y la ordenada al origen. Obtener la ecuación 
de la recta.  
B.16.8.5 Inyectar del mismo modo que se inyecto la solución patrón, para 25 µL de muestra y blanco de 
muestras. Obtener los cromatogramas, identificar el pico correspondiente al formaldehído derivatizado en 
función de su ti empo de retención. Calcular el área del pico.  
B.16.8.6 En caso de ser necesario diluir las muestras con metanol, para llevar al intervalo de trabajo 
(factor de dilución).  
B.16.8.7 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente e n los cuales sólo 
es necesario leer los patrones y marcar su concentración teórica.  
B.16.9  Expresión de los resultados.  
B.16.9.1 Cálculos.  
B.16.9.1.1  De la ecuación de la recta obtenida:  
 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.16.9.1.2  En los equipos que pueden programarse, la lectura obteni da es directamente la concentración 
del elemento en mg/L.  
B.16.10. Informe de prueba.  
B.16.10.1 Informar como:  
B.16.10.1.1  mg de formaldehído/L.  
B.17 Método  potenciométrico para la determinación de Fluoruros.  
B.17.1 Principio.  
Se basa en la reacción entre el ion fluoruro y los iones zirconio en medio ácido para producir un 
compuesto colorido que es medido espectrométricamente a una longitud de onda de 570 nm.  
El ion fluoruro es determinado potenciométricamente usando un electrodo de ion selectivo para fluor uros, 
en combinación con un electrodo de referencia o combinado.  
B.17.2 Equipo.  
B.17.2.1 Balanza analítica con sensibilidad de 0.1 mg calibrada y verificada.  
B.17.3 M étodo espectrométrico.  
B.17.3.1 Espectrómetro de UV -Visible para ser usado a 570 nm con ce ldas de 1 cm de paso óptico.  
B.17.4 M étodo potenciométrico.  
B.17.4.1 Potenciómetro con escala expandida en milivoltios o analizador de ion específico o bien un 
electrodo combinado.  
B.17.4.2 Electrodo específico de flúor (combinado o simple).  
B.17.4.3 Elect rodo de referencia (cuando no se cuenta con electrodo de flúor combinado).  
B.17.4.4 Agitador magnético.  
B.17.5 Material.  
B.17.5.1  Se recomienda que el material sea de Nalgene.  
B.17.5.2 Vasos de precipitados de 25 o 50 mL.  
B.17.5.3 Vasos de precipitados de 1000 mL.  
B.17.5.4 Matraces volumétricos de 100, 500 y 1000 mL.  
B.17.5.5 Bureta de 50 mL graduada en 0.1 mL.  
B.17.5.6 Pipetas volumétricas de 1, 5, 10 y 20 mL.  
B.17.5.7 Barra magnética.  
B.17.6 Reactivos y soluciones.  
B.17.6.1  Todos los reactivos deben ser g rado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada.  
B.17.6.2 Fluoruro de sodio anhidro (NaF).  
B.17.6.3. Reactivos y soluciones para método Espectrométrico . 
B.17.6.3.1 Sal trisódica del ácido 1,8 -dihidroxi -2-(4- sulfofenilazo) naftalen -3,6-disulfónico (SPANDS).  
B.17.6.3.2 Ácido clorhídrico concentrado (HCl).  
B.17.6.3.3 Oxicloruro de zirconio IV octahidratado (ZrOCl 2•8H 2O). 
B.17.6.3.4 Arsenito de sodio (NaAsO 2). 
B.17.6.4 Solución de SPANDS.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.17.6.4.1  Disolver 958 mg de sal trisódica del ácido 1,8 –dihidroxi –2–(4–sulfofenilazo),  naftalen –3,6–
disulfónico en agua destilada y llevar a un v de 500 mL. Esta solución es estable indefinidamente si se 
conserva protegida de la luz.  
B.17.6.5 Reactivo de ácido zirconílico.  
B 17 .6.5.1  Disolver 133 mg de Oxicloruro de zirconio IV octahidratado en aproximadamente 25 mL de 
agua. Adicionar 350 mL de HCl concentrado y llevar a un v de 500 mL con agua.  
B.17.6.6 Reactivo de ácido zirconílico -SPANDS.  
B.17.6.6.1  Mezclar volúmenes iguales de solución de SPANDS y reactivo de ácido zirconílico. La solución 
es estable al menos 2 años si se almacena en refrigeración.  
B.17.6.7 . Solución de referencia.  
B.17.6.7.1  Adicionar 10 mL de solución de SPANDS a 100 mL de agua. Diluir por separado 7 mL de HCl 
concentrado a 10 mL de agua y adicionarlo a la solución de SPANDS. Utilizar esta solución como blanco de 
reactivos. Es estable 1 año  
B.17.6.8  Solución de arsenito de sodio  
B.17.6.8.1  Disolver 5.0 g de NaAsO 2 y llevar a un vo de 1 L con agua.  
B.17.6.9 R eactivos y soluciones para método Potenciométrico . 
B.17.6.9.1 Ácido acético glacial (C 2H4O2). 
B.17.6.9.2 Ácido 1,2 ciclohexilendiaminotetracético (CDTA).  
B.17.6.9.3 Hidróxido de sodio 6 N.  
B.17.6.9.4 Disolver 120 g de hidróxido de sodio en agua y llevar a un v de 500 mL.  
B.17.6.9.5 Cloruro de sodio (NaCl).  
B.17.6.10 Solución madre de fluoruros de 100 mg de F –/L. 
B.17.6.10.1  Disolver 221.0 mg de NaF en agua destilada y llevar a un v de 1 L.  
B.17.6.11 Solución patrón de fluoruros de 10 mg de F –/L. 
B.17.6.11.1  Medir 10 mL de solución madre y llevar a un v de 100 mL.  
B.17.6.12 Solución amortiguadora (TISAB II).  
B.17.6.12.1  Colocar aproximadamente 500 mL de agua en un vaso de 1 L. Añadir 57 mL de ácido acético 
glacial, 58 g de NaCl y 4.0 g de CDTA. Agitar para di solver. Colocar el vaso en baño de agua fría y ajustar el 
pH de la solución entre 5.0 y 5.5 adicionando lentamente NaOH 6N (aproximadamente 125 mL) con agitación. 
Trasvasar a un matraz volumétrico de 1 L y llevar al v con agua. Puede obtenerse preparado co mercialmente.  
B.17.7 Procedimiento.  
B.17.7.1 Preparación de la curva de calibración para método espectrométrico.  
B.17.7.1.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de fluoruros (véase Tabla a) Curva de 
calibración de Flúor para método espectométr ico) y llevar a un v  de 100 mL con agua.  
Tabla a). - Curva de calibración de Flúor para método espectrométrico.  
Volumen de Solución 
patrón de fluoruros de 10 
mg de F –/L (mL).  Concentración  
(mg de F–/L). Volumen de 
aforo con agua  
(mL).  
0 Blanco  100 
1 0.10 100 
2 0.20 100 
4 0.40 100 Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
8 0.80 100 
14 1.40 100 
 
Concentración  (mg de 
F–/L). Volumen de 
Solución patrón 
de fluoruros  
(mL).  Volumen de r eactivo 
de ácido 
zirconílico —SPANDS  
(mL).  
Blanco  50 10 
0.10 50 10 
0.20 50 10 
0.40 50 10 
0.80 50 10 
1.40 50 10 
 
o 
Tabla b). - Curva de calibración de Flúor para método Espectrométrico  
Concentración  
(mg de F–/L) Volumen de 
Solución patrón 
de fluoruros  
(mL)  Volumen de r eactivo 
de ácido zirconílico - 
(mL)  Volumen de solución 
de SPANDS  (mL)  
Blanco  50 5 5 
0.10 50 5 5 
0.20 50 5 5 
0.40 50 5 5 
0.80 50 5 5 
1.40 50 5 5 
 
B.17.7.1.2  Si la muestra de agua contiene cloro residual, adicionar 1 gota de solución de arsenito de sodio 
por cada mg de Cl – y mezclar (concentraciones de arsenito de sodio de 1300 mg/L produce un err or de  0.1 
mg de F–/L a 1.0 mg de F –/L). 
B.17.7.1.3  Medir la absorbancia a una longitud de onda 570 nm.  
B.17.7.2 Preparación de la curva de calibración para método Potenciométrico.  
B.17.7.2.1  Medir los siguientes volúmenes de solución patrón de fluoruros (1 0 mg F–/L) midiendo con 
bureta de (Véase Tabla Curva de calibración de Fluoruro para el método de Potenciométrico) en matraces 
volumétricos de 100 mL y llevar al v con agua.  
Tabla. - Curva de calibración de Fluoruro para el método Potenciométrico.  
Volumen d e solución 
patrón de fluoruros de  
10 mg de F –/L 
(mL).  Concentración 
(mg de F –/L). Volumen de aforo 
(mL).  
0.1 0.01 100 
1.0 0.10 100 
10.0 1.0 100       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
50.0 5.0 100 
100.0  10.0 100 
 
B.17.8 Desarrollo del método potenciométrico para la determinación de fluorur os. 
B.17.8.1 Calibrar el potenciómetro de acuerdo al manual de operación y ajustar la temperatura, de 
preferencia a temperatura ambiente. En el caso de tomar lecturas en RMV (calibrar el aparato con solución  
de 1 µg de flúor (sin solución amortiguadora y registrar en el aparato una lectura de 100 RMV).  
B.17.8.2 Tomar 10 mL (con pipeta volumétrica) de cada una de las concentraciones de la curva y 
colocarlas en vasos de precipitados de 30 mL (nalgene), y adicionar a cada uno 10 mL de la solución 
amortiguador a. 
B.17.8.3 Mezclar cada solución con agitador magnético. Sumergir los electrodos y dejar que se estabilicen 
por lo menos 3 min, o esperar la indicación del aparato, antes de efectuar la lectura en RMV o mg/kg. 
Mantener la agitación durante la lectura.  
B.17.8.4 Aplicar el mismo procedimiento para las muestras.  
B.17.9. Acondicionamiento de los métodos.  
B.17.9.1 Leer las soluciones patrón de menor a mayor concentración y registrar la lectura. Obtener una 
curva de calibración con absorbancia o mv contra concen tración.  
B.17.9.2 Ajustar la curva de calibración obtenida mediante mínimos cuadrados. Calcular la pendiente, el 
coeficiente de correlación y la ordenada al origen. Obtener la ecuación de la recta.  
B.17.9.3 Seguir el mismo procedimiento para 2 réplicas de cada muestra. Si la lectura de alguna de las 
muestras rebasa el intervalo de comparación, diluir a una concentración adecuada (tomar en cuenta el factor 
de dilución).  
B.17.9.4 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente en lo s cuales sólo 
es necesario leer los patrones y marcar su concentración teórica.  
B.17.10 Expresión de los resultados.  
B.17.10.1 Cálculos.  
B.17.10.1.1  Cálculos para el método potenciométrico usando lecturas en RMV.  
B.17.10.1.2  De la ecuación de la recta obte nida.  
 
En donde:  
Antilog es la operación directa de calculadora obtenida por 10x; Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
m y b son constantes obtenidas en el ajuste con mínimos cuadrados;  
RMV son los milivolts relativos (para muestras y patrones de la curva).  
B.17.11 Informe de prueba.  
B.17.11 .1 Informar como:  
B.17.11.1.1  mg de F– /L. 
B.18. Métodos para la determinación de cianuros.  
B.18.1 Medidas precautorias en el manejo de cianuros.  
B.18.1.1  Las sales de cianuro se descomponen en contacto con agua, humedad, carbonatos alcalinos  y 
ácidos prod uciendo cianuro de hidrógeno.  
B.18.1.2  La mezcla de cianuros metálicos con cloratos, percloratos, nitratos o nitritos metálicos, causa 
explosiones violentas.  
B.18.1.3  Riesgos:  
B.18.1.3.1  En presencia de agua, CO 2 y disoluciones ácidas, se genera ácido cian hídrico ( HCN) el cual es 
inflamable.  
B.18.1.3.2  El HCN es tóxico y puede ser fatal si se absorbe a través de la piel, se ingiere o se inhala.  
B.18.1.3.3  La absorción de 50 a 100 mg de cianuros en una sola dosis puede causar un colapso 
inmediato, cesando la  respiración.  
B.18.2 Protección personal.  
B.18.2.1  Realizar la determinación en área específica con campana extractora de gases.  
B.18.2.2 Utilizar un respirador con filtro o mascarilla con filtro adecuado.  
B.18.2.3  Utilizar guantes y protectores de mangas.  
B.18.2.4  Lentes de seguridad ajustados y careta.  
B.18.2.5  Traje de protección y zapatos cerrados.  
B.18.2.6  En caso de derrames o fugas:  
B.18.2.6.1  Regadera de seguridad y lavaojos.  
B.18.2.6.2  Traje de protección completo incluyendo equipo autónomo de resp iración.  
B.18.2.6.3  Evacuar la zona de peligro. Limpiar la sustancia derramada e introducirla en un recipiente 
hermético y confinar en un lugar seguro. NUNCA poner en contacto directo con el agua.  
B.18.2.7  En caso de incendio y explosión:  
B.18.2.7.1  Utiliz ar polvo químico alcalino. No utilizar agua, espuma y CO 2. 
B.18.3 Método de Flujo Segmentado mediante digestión UV y destilación para la determinación de 
Cianuros.  
B.18.3. 1 Fundamento.  
Los cianuros son liberados como HCN, por reflujo de la muestra con un á cido fuerte. El HCN se absorbe 
en una disolución de NaOH. El i on cianuro en la disolución absorbente se hace reaccionar con cloramina T a 
un pH menor de 8, para formar el cloruro de cianógeno. Después de que la reacción termine, se adiciona el 
reactivo de ácido piridin barbitúrico formando un compuesto colorido que es medido espectrométricamente a 
una longitud de onda de 570 nm. La determinación se realiza mediante destilación por digestión UV y análisis 
por flujo segmentado (SFA).  
B.18.3.2 Interferencias.  
B.18.3.2.1 La mayoría de las interferencias se reducen o eliminan por destilación antes de la formación  de 
color.  
B.18.3.2.2 Los tiocianatos se descomponen a cianuro por radiación UV produciendo una interferencia 
positiva.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.18.3.2.3 Se deben eliminar de la muestra sulfuros y agentes oxidantes.  
B.18.3.3 Equipo.  
B.18.3.3.1  Equipo para SFA. (Véase Diagrama para el sistema de flujo segmentado).  
B.18.3.3.2 Bomba peristáltica multicanal.  
B.18.3.3.3  Automuestrador acceso directo o aleatorio.  
B.18.3.3.4  Detector con longitud de onda a 570 nm.  
B.18.3.3.5  Digestor UV.  
B.18.3.3.6  Cartucho de destilación para cianuros en línea.  
B.18.3.3.7  Cartucho reactor específico para prueba de cianuros.  
B.18.3.3.8 . Baño criogénico con bomba de recirculación.  
B.18.3.3.9  Equipo de m uestras, bote de muestra frascos ámbar con PTFE.  
B.18.3.3.10  Balanza analítica con precisión de 0.1 mg, calibrada y verificada.  
B.18.3.3.11 . Balanza granataria con precisión de 0.1 g, calibrada y/o verificada.  
B.18.3.3.12 . Potenciómetro verificado.  
B.18.3. 3.13 Agitador tipo vórtex.  
Diagrama para el sistema de Flujo Segmentado.  
 
B.18.3.4 Material.  
B.18.3.4.1  Todo el material volumétrico utilizado debe ser clase A verificado.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
El material debe lavarse con detergente y agua, enjuagarse 2 veces con agua desioni zada y secarse entre 
110 a 150°C durante una h.  
B.18.3.4.2  No someter a secado térmico el material volumétrico.  
B.18.3.4.3 Tubos vial de teflón para automuestreador.  
B.18.3.4.4 Gradillas para tubos.  
B.18.3.4.5 Papel filtro No. 41, de 185 mm de diámetro.  
B.18.3.4.6  Papel filtro No. 1, de 185 mm de diámetro.  
B.18.3.4.7  Vasos de precipitado de 1000 mL de plástico.  
B.18.3.4.8  Vasos de precipitado de 10, 50, 100 y 500 mL.  
B.18.3.4.9  Perillas.  
B.18.3.4.10  Pipetas Pasteur.  
B.18.3.4.11  Micro bureta de 10 mL graduada  en 0.1 mL . 
B.18.3.4.12  Matraces Erlenmeyer de 500, 1000, 2000 y 3000 mL.  
B.18.3.4.13  Matraces volumétricos de 100 mL, 500 mL, 1000 mL.  
B.18.3.4.14  Contenedores de plástico.  
B.18.3.4.15  Pipetas volumétricas de 1, 5, 10 y 20 mL o micropipeta automática cali brada y/o verificada.  
B.18.3.4.16  Barra magnética recubierta con teflón.  
B.18.3.4.17  Papel adsorbente.  
B.18.3.5  Reactivos y soluciones.  
B.18.3.5.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación.  
B.18.3.5.2  Filtrar y desgasificar todos los reactivos antes de su uso.  
B.18.3.5.3  Ácido barbitúrico (C 4H4N2O3). 
B.18.3.5.4  Cloramina T trihidratada (C 7H7SO 2NNaCl•3H 2O). 
B.18.3.5.5  Agua desionizada (Tipo I).  
B.18.3.5.6  Dowfax 2AI.  
B.18.3.5.7  Ácido clorhídrico concentrado (HCl ). 
B.18.3.5.8  Ácido hipofosfo roso 50% p/v (H 3PO 2). 
B.18.3.5.9  Ácido fosfórico concentrado (H 3PO 4). 
B.18.3.5.10  Cianuro de potasio KCN, o disolución patrón de cianuro trazable a patrones nacionales o 
internacionales.  
B.18.3.5.11  Fosfato monobásico de potasi o (KH 2PO 4). 
B.18.3.5.12  Piridina (C 5H5N). 
B.18.3.5.13  Hidróxido de sodio (NaOH).  
B.18.3.5.14  Fosfato dibásico de sodio (Na 2HPO 4). 
B.18.3.5.15  p–dimetilamino benzal rodanina (C 12H12N2OS 2). 
B.18.3.5.16  Acetona (C 3H6O). 
B.18.3.5.17  Agua.  
B.18.3.5.17.1  Desgasi ficar y desionizar el agua por 1 de las siguientes formas:  
B.18.3.5.17.1.1  Coloque agua desionizada a vacío con agitación magnética o por sonicación en un periodo 
de 15 a 20 min.  
B.18.3.5.17.1.2  Purgar el agua desionizada con una corriente de nitrógeno (u otro gas inerte) a través de 
un contenedor de vidrio por aproximadamente 5 min.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.18.3.5.17.1.3  Hervir el agua desionizada en un matraz Erlenmeyer por 15 a 20 min. Quitar el matraz de 
la fuente de calor y tapar con otro matraz en posición invertida y permi tir enfriar a temperatura ambiente.  
B.18.3.5.17.1.4  Preparar el agua al momento de su uso o almacenarla en un contenedor perfectamente 
tapado y sellado o bajo ligero vacío para protegerla de la reabsorción de gases atmosféricos.  
B.18.3.5.18.  Disolución de arranque.  
B.18.3.5.18.1  Adicionar 2 mL de disolución DOWFAX 2Al en aproximadamente 800 mL de agua 
desionizada en un matraz volumétrico de 1 L. Llevar al v con agua desionizada y mezclar perfectamente.  
B.18.3.5.19 Reactivos de destilación.  
B.18.3.5.19.1 Agregar 125 mL de ácido fosfórico y 25 mL de ácido hipofosforoso en aproximadamente  
250 mL de agua en un matraz volumétrico de 500 mL.  
B.18.3.5.19.2 Enfriar a temperatura ambiente. Llevar al v  con agua desionizada y mezclar perfectamente. 
Preparar esta disol ución semanalmente.  
B.18.3.5.20 Buffer de fosfatos pH 5.2.  
B.18.3.5.20.1  Disolver 13.6 g de fosfato monobásico de potasio y 0.28 g de fosfato dibásico de sodio en 
aproximadamente 800 mL de agua desionizada en un matraz volumétrico de 1.0 L. Llevar al v con  agua 
desionizada y mezclar, almacenarla en refrigeración.  
B.18.3.5.21 Buffer de fosfatos disolución de trabajo.  
B.18.3.5.21.1  Agregar 1 mL de DOWFAX 2AI a 500 mL de la disolución buffer de fosfatos pH  5.2 y 
mezclar perfectamente. Preparar esta disolución diariamente.  
B.18.3.5.22 Reactivo de cloramina  T. 
B.18.3.5.22.1 Disolver 2.0 g de cloramina T trihidratada en aproximadamente 400 mL de agua desionizada 
en un matraz volumétrico de 500 mL.  
B.18.3.5.22.2 Llevar al v de aforo con agua desionizada y mezclar p erfectamente. Preparar esta disolución 
diariamente.  
B.18.3.5.23 Reactivo piridina –ácido barbitúrico.  
B.18.3.5.23.1 Pesar 7.5 g de ácido barbitúrico y transferir a un vaso de precipitado de 500 mL, enjuagar 
las paredes del vaso con 50 mL de agua desionizada . 
B.18.3.5.23.2 Con agitación agregar 37.5 mL de piridina y 7.5 mL de ácido clorhídrico concentrado.  
B.18.3.5.23.3 Agregar 300 mL de agua desionizada y agitar has ta que el ácido barbitúrico esté  
completamente disuelto.  
B.18.3.5.23.4 Transferir el contenido  del vaso cuantitativamente a un matraz volumétrico de 500 mL, llevar 
al v con agua desionizada y mezclar.  
B.18.3.5.23.5 Filtrar la disolución a través de un filtro con tamaño de poro de 0.45 
 m. 
B.18.3.5.23.6 Preparar esta disolución semanalmente.  
B.18.3. 5.24 Hidróxido de sodio 1 N.  
B.18.3.5.24.1  Pesar aproximadamente 40.0 g de hidróxido de sodio, disolver y llevar a un v de 1 L con 
agua desionizada, mezclar.  
B.18.3.5.25 Hidróxido de sodio 0.1 N.  
B.18.3.5.25.1  Medir 100 mL de la disolución de hidróxido de sodio 1 N, transferir a un matraz volumétrico 
de 1 L y llevar al v con agua desionizada, mezclar.  
B.18.3.5.26 Disolución indicadora de rodanina al 0.02%.  
B.18.3.5.26.1  Disolver 20 mg de p -dimetilamino benzal rodanina en 100 mL de acetona. Mantener esta 
disolución almacenada en frasco ámbar y en refrigeración.  
B.18.3.5.27 Disolución patrón de cloruro de sodio 0.0141 N.  
B.18.3.5.27.1  Disolver 0.8241 g de NaCl (previamente secado a 140°C durante 2 h), en agua destilada y 
llevar a 1000 mL en un matraz volumétri co. Bajo estas condiciones 1.00 mL equivale a 500 µg del ion Cl –. Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.18.3.5.27.2  Ajustar esta equivalencia al peso registrado.  
B.18.3.5.28 Disolución de cromato de potasio al 5%.  
B.18.3.5.28.1  Disolver 50 g de K 2CrO 4 en aproximadamente 100 mL de agua. Añadi r disolución de  AgNO 3 
0.1 N hasta la formación de un precipitado color rojo. Dejar reposar 12 h; filtrar y diluir a 1 L con agua.  
B.18.3.5.29 Disolución patrón de nitrato de plata 0.02 N.  
B.18.3.5.29.1 Disolver 3.27 g de AgNO 3 en agua y llevar a un v de 1 L. Guardar la disolución en frasco 
color ámbar y en refrigeración.  
B.18.3.5.29.2 Si se utiliza una disolución comercial de nitrato de  plata 0.1 N, diluir 200 mL de é sta a un v 
de 1000 mL con agua.  
B.18.3.5.30 Valoración de la disolución.  
B.18.3.5.30.1 Toma r por triplicado una alícuota de 10 mL de la disolución de NaCl con material 
volumétrico y transferir a matraces Erlenmeyer de 250 mL llevar a un v aproximado de 100 mL con agua. 
Adicionar 1 mL de disolución de cromato de potasio y titular con la disolució n patrón de (AgNO 3) 0.02 N hasta 
la apar ición de la coloración amarillo -rojizo permanente.  
B.18.3.5.30.2 Preparar un blanco de reactivos utilizando 100 mL de agua conteniendo 1 mL de disolución 
de cromato de potasio.  
B.18.3.5.30.3 Calcular la normalidad de  la disolución aplicando la siguiente ecuación:  
 
Solución patrón de AgNO 3 0.02 N.  
En donde:  
N es la Normalidad;  
V es la alícuota tomada de la disolución patrón (10 mL.);  
A son los mL gastados de AgNO 3 0.02 N en la valoración del patrón;  
B son los mL gasta dos de AgNO 3 0.02 N en la valoración del blanco;  
Esta disolución deberá valorarse semanalmente o antes de su uso.  
B.18.3.5.31 Disolución patrón de cianuro de 100 mg/L.  
B.18.3.5.31.1 Disolver 2 g de hidróxido de sodio en aproximadamente 900 mL de agua desio nizada en un 
matraz volumétrico de 1.0 L.  
B.18.3.5.31.2 Agregar 0.2505 g de cianuro de potasio y agitar hasta que se disuelva.  
B.18.3.5.31.3 Llevar al volumen de 1000 mL con agua desionizada y mezclar perfectamente.  
B.18.3.5.31.4 Almacenar en recipiente ám bar y refrigerar. Si se almacena adecuadamente este reactivo es 
estable hasta por 4 semanas.  
B.18.3.5.32 Valoración de la disolución.  
B.18.3.5.32.1 Medir 25 mL de esta disolución y diluir a 100 mL con disolución de NaOH 0.1 N, añadir 
aproximadamente 0.5 mL  del indicador de rodanina. Titular con disolución valorada de AgNO 3 0.02 N, hasta el 
primer cambio de color amarillo canario a salmón.  
B.18.3.5.32.2 1 mL de solución de AgNO 3 0.02 N equivale a 1.00 mg de CN –. 
B.18.3.5.32.3 Esta disolución deberá valorarse  semanalmente o antes de su uso.  
B.18.3.5.33 Disolución de trabajo de cianuro de 10 mg/L.  
B.18.3.5.33.1  Con una pipeta volumétrica agregar 10 mL de disolución patrón de cianuro (100 mg/L) en 
aproximadamente 80 mL de agua desionizada en un matraz volumétric o de 100 mL. Llevar a v de 100 mL con 
agua desionizada y mezclar perfectamente. Preparar previamente a su uso y mantener en una botella de 
vidrio cerrada.  
B.18.3.5.34 Disolución intermedia de cianuro 1.0 mg/L (100 mL).  
B.18.3.5.34.1 Con una pipeta volumétr ica agregar 10 mL de disolución de trabajo de cianuro (10 mg/L) en 
aproximadamente 80 mL de agua desionizada en un matraz volumétrico de 100 mL. Llevar a v de 100 mL con       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
agua desionizada y mezclar perfectamente. Preparar previamente a su uso y mantener en una botella de 
vidrio cerrada.  
B.18.3.5.34.2 Puede utilizarse una disolución patrón comercial de 1 mg/mL trazable a patrones nacionales 
o internacionales la cual ya no requiere valoración.  
B.18.3.6 Procedimiento.  
B.18.3.6.1 Preparación de la curva de calib ración.  
B.18.3.6.1.1  Medir los siguientes volúmenes de disolución patrón de cianuros (Véase Tabla Curva de 
calibración de Cianuros .) en matraces volumétricos de 100 mL. Adicionar 1.0 mL de hidróxido de sodio 1 N, 
llevar al v de 100 mL cada disolución con a gua desionizada y mezclar perfectamente. Preparar la curva de 
calibración diariamente.  
Tabla. - Curva de calibración de Cianuros.  
Volumen de  
disolución de trabajo  
10.0 mg de CN –/L 
(mL).  Volumen de  
disolución intermedia  
1.0 mg de CN –/L 
(mL).  Concentración de l 
ion cianuro  
(mg/L).  
0.0 0.0 Blanco  
0.0 0.5 0.005  
0.0 1.0 0.010  
0.0 5.0 0.050  
1.0 0.0 0.100  
5.0 0.0 0.500  
10.0 0.0 1.000  
B.18.3.6.1.2 Analizar cada punto de la curva de calibración en orden creciente de concentración.  
B.18.3.6.2 Acondicionamiento del equipo para Análisis por Flujo Segmentado.  
B.18.3.6.2.1 Estabilización del instrumento.  
B.18.3.6.2.1.1 Conecte las mangueras de reactivos de la bomba al contenedor con la disolución de inicio.  
B.18.3.6.2.2 Establezca la velocidad de la bomba al 40% par a permitir que fluya la disolución de inicio a 
través de todo el sistema.  
B.18.3.6.2.3 Verifique que la celda del detector esté libre de burbujas y el flujo sea constante con la 
disolución de inicio hasta la obtención de una línea base estable a 570 nm.  
B.18.3.6.3 Manejo del instrumento.  
B.18.3.6.3.1 Instale el cartucho como se muestra en el diagrama de flujo.  
B.18.3.6.3.2 Encienda el equipo excepto la bomba y el digestor UV.  
B.18.3.6.3.3 Encienda la bombilla de condensación y enfriamiento.  
B.18.3.6.3.4 Programe la temperatura de destilación del calentador con el controlador del módulo a 160°C.  
B.18.3.6.3.5 Verifique que el módulo  de destilación del cianuro esté  encendido y configurado como ilustra 
el diagrama de flujo.  
B.18.3.6.3.6 Conecte la línea de los r eactivos de destilación, al contenedor de agua desionizada, así como 
el buffer de fosfatos, piridina ácido barbitúrico y cloramina T.  
B.18.3.6.3.7 Cuando la temperatura del calentador del módulo de destilación alcance aproximadamente 
150°C encender la bomb a y hacer fluir los reactivos a través del sistema. Encender el digestor UV.  
B.18.3.6.3.8 Una vez que la temperatura se ha estabilizado aproximadamente a 160°C verifique que:  
B.18.3.6.3.8.1 No haya líquido acumulado de reflujo en la bombilla de la cabeza d e destilación.  
B.18.3.6.3.8.2 El líquido de condensación de la columna tenga una apariencia homogénea y brillante en la 
pared interna.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.18.3.6.3.8.3 Permita estabilizar la línea base.  
B.18.3.6.3.9 Analizar la curva de calibración, blancos, muestras y mues tras control.  
B.18.3.6.3.10 Una vez finalizado el análisis apagar el módulo de calentamiento y permita a la columna de 
vidrio regresar a temperatura ambiente. Purgue con disolución de inicio en todo el sistema al menos de 10 a 
15 min, detenga la bomba, lib ere la tensión en todas las mangueras y apague el equipo.  
B.18.3.6.3.11 Notas de operación.  
B.18.3.6.3.11.1 Adicione hidróxido de sodio al contenedor del desecho para asegurar que no se 
desprenda gas de ácido cianhídrico.  
B.18.3.6.3.11.2 Periódicamente (1 o 2 veces a la semana) enjuague con hidróxido de sodio 1N durante  
10-15 min a temperatura ambiente la cabeza de destilación y reflujo para prevenir la acumulación de 
depósitos, posteriormente enjuague con grandes cantidades de agua desionizada.  
B.18.3.6.3 .11.3 Advertencia: Nunca ensamble la disolución de hidróxido de sodio 1N a través del sistema 
de destilación.  
B.18.3.6.3.11.4 No bombee líquidos que contengan surfactantes a través del sistema de destilación  en 
caliente.  
B.18.3.6.3.11.5. En el módulo de d estilación utilizar una manguera prehumedecida de polietileno para 
reducir daños o rupturas por lo caliente.  
B.18.3.6.3.11.6 Si se acumula el líquido en la bombilla de reflujo de la cabeza de destilación:  
B.18.3.6.3.11.7 Desconecte la manguera ácida del de secho no volátil y permita que se drene el líquido.  
B.18.3.6.3.11.8 Reconecte la manguera y verifique que el baño de destilación esté funcionando 
adecuadamente, asegúrese q ue la bobina de destilación esté  situada adecuadamente sobre él así como el 
calentad or y que la cabeza de destilación est é purgada con la bobina del calentador.  
B.18.3.6.3.11.9 Si persisten los problemas apague el baño del calentador del destilador y espere a que el 
vidrio regrese a temperatura ambiente. Purgue el sistema con NaOH 1N, enj uague con agua desionizada y 
seque con acetona.  
B.18.3.6.3.11.10 Si el problema aún continua, eleve la temperatura en 5.0°C hasta que la destilación se 
realice de manera suave. No incremente la temperatura por encima de 180°C.  
B.18.3.7 Expresión de los res ultados.  
B.18.3.7.1 Cálculos.  
B.18.3.7.1.1 Obtener el resultado en mg de CN –/L directamente de la curva de calibración.  
B.18.3.7.1.2 En caso de que alguna de las muestras rebasa el intervalo de trabajo hacer una dilución de la 
muestra y considerar este fac tor en el cálculo final.  
B.18.3.8 Informe de prueba.  
B.18.3.8.1 Informar como:  
B.18.3.8.1.1  mg de CN –/L. 
B.18.4 Método Espectrométrico para la determinación de Cianuros.  
B.18.4.1 Fundamento.  
Los cianuros son liberados como HCN (ácido cianhídrico) por reflu jo de la muestra con un ácido fuerte. El 
HCN se absorbe en una disolución de NaOH. El ion cianuro en la disolución absorbente se hace reaccionar 
con cloramina –T a un pH menor de 8 para formar el cloruro de cianógeno; el CNCl forma un color rojo -azul al 
reaccionar con la disolución de ácido piridina -barbitúrico. La absorbancia máxima del color en disolución 
acuosa se encuentra entre 575 nm y 582 nm, la cual es proporcional a la concentración del ion cianuro.  
B.18.4.1.2 Precaución el HCN y el CNCl son tóxicos ; evitar su inhalación.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.18.4.2 Interferencias.  
B.18.4.2.1 Los agentes oxidantes como el cloro pueden destruir la mayoría de los cianuros durante el 
almacenamiento y la manipulación, por lo cual esta interferencia debe ser eliminada al momento del muestre o. 
B.18.4.2.2 Una elevada concentración de carbonato puede afectar la destilación causando gasificación 
excesiva cuando se añade el ácido. El dióxido de carbono liberado puede reducir significativamente el 
contenido de NaOH del absorbedor.  
B.18.4.2.3 El ác ido sulfhídrico o sulfuros metálicos.  
B.18.4.2.4 La presencia de nitratos y/o nitritos pueden interferir en los resultados.  
B.18.4.3 Equipo.  
B.18.4.3.1 Balanza analítica con precisión de 0.1 mg, calibrada y verificada.  
B.18.4.3.2 Balanza granataria con pre cisión de 0.1 g, calibrada y/o verificada.  
B.18.4.3.3 Mantilla o parrilla de calentamiento.  
B.18.4.3.4 Potenciómetro verificado.  
B.18.4.3.5 Aparato de destilación. El matraz de destilación Claissen modificado debe ser de 1 L de 
capacidad con un tubo de ent rada y un condensador. El absorbedor de gas puede ser un frasco lavador  de 
gases tipo Fisher -Milligan. (Véase figura Aparato para destilación de cianuros).  
B.18.4.3.6 Equipo de vacío para el arrastre de gases en el destilador durante el pretratamiento de  la 
muestra.  
B.18.4.3.7 Espectrómetro calibrado y verificado disponible para utilizarse a 578 nm con celdas de 1 cm de 
paso óptico.  
Figura - Aparato para destilación de cianuros.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
 
B.18.4.4. Material.  
Todo el material volumétrico utilizado debe ser clase A verificado.  
B.18.4.4.1 Vasos de precipitados de 25 o 50 mL.  
B.18.4.4.2 Vasos de precipitados de 1000 mL.  
B.18.4.4.3 Matraces volumétricos de 50, 100, 250, 500 y 1000 mL.  
B.18.4.4.4 Bureta de 50 mL graduada en 0.1 mL.  
B.18.4.4.5 Pipetas volumétricas de 1, 5 , 10 y 20 mL o micropipeta calibrada y/o verificada.  
B.18.4.4.6 Barra magnética con cubierta de teflón.  
B.18.4.5 Reactivos.  
B.18.4.5.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua dest ilada.  
B.18.4.5.2 Cromato de potasio (K 2CrO 4). 
B.18.4.5.3 Cianuro de potasio (KCN) o  disolución patrón de cianuro trazable a patrones nacionales o 
internacionales.  Reactivo altamente tóxico, evitar el contacto o su inhalación.  
B.18.4.5.4 Acido sulfúrico co ncentrado (H 2SO 4). 
B.18.4.5.5 Acido sulfámico (H 2NSO 3H). 
B.18.4.5.6 Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl 2•6H 2O). 
B.18.4.5.7 Hidróxido de sodio (NaOH).        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.18.4.5.8 Nitrato de bismuto [(Bi)NO 3)3]. 
B.18.4.5.9 Cloruro de sodio (NaCl). Con una pureza mayor de  99.95% o avalado por la DGN.  
B.18.4.5.10 Nitrato de plata (AgNO 3). 
B.18.4.5.11 p-dimetilamino benzal rodanina (C 12H12N2OS 2). 
B.18.4.5.12 Acetona (C 3H6O). 
B.18.4.5.13 Cloramina -T trihidratada (C 7H7ClNNaO 2S•3H 2O). 
B.18.4.5.14 Ácido Barbitúrico (C 4H4N2O3). 
B.18.4.5.15 Ácido Clorhídrico concentrado (HCl).  
B.18.4.5.16 Acetato de sodio trihidratado (C 2H3NaO 2•3H 2O). 
B.18.4.5.17 Tiosulfato de sodio (Na 2S2O3). 
B.18.4.5.18 Carbonato de plomo (PbCO 3). 
B.18.4.5.19 Almidón.  
B.18.4.5.20 Yoduro de potasio (KI).  
B.18.4.5. 21 Ácido acético glacial (CH 3COOH).  
B.18.4.5.22 Acetato de plomo [Pb(CH 3COO) 2]. 
B.18.4.5.23 Papel indicador de acetato de plomo comercial.  
B.18.4.5.24 Piridina (C 5H5N). 
B.18.4.5.25 Disolución indicadora de rodanina al 0.02%.  
B.18.4.5.25.1  Disolver 20 mg de  p-dimetilamino benzal rodanina en 100 mL de acetona. Mantener esta 
disolución almacenada en frasco ámbar y en refrigeración.  
B.18.4.5.26 Disolución concentrada de hidróxido de sodio.  
B.18.4.5.26.1  Pesar aproximadamente 40.0 g de hidróxido de sodio, disolv er y llevar a un v de 1 L con 
agua previamente hervida y enfriada para eliminar la presencia de CO 2 (dióxido de carbono).  
B.18.4.5.27 Disolución diluida de hidróxido de sodio.  
B.18.4.5.27.1  Diluir 40 mL de la disolución concentrada de hidróxido de sodio y llevar a un v de 1 L en un 
matraz volumétrico con agua libre de CO 2 (dióxido de carbono).  
B.18.4.5.28 Disolución patrón de cloruro de sodio 0.0141 N.  
B.18.4.5.28.1  Disolver 0.8241 g de NaCl (previamente secado a 140°C durante 2 h), en agua destilada y 
llevar a 1000 mL en un matraz volumétrico. Bajo estas condiciones 1.00 mL equivale a 500 
 g del ion Cl –. 
B.18.4.5.28.2  Ajustar esta equivalencia al peso registrado.  
B.18.4.5.29 Disolución de cromato de potasio al 5%.  
B.18.4.5.29. 1 Disolver 50 g de K 2CrO 4 en aproximadamente 100 mL de agua. Añadir disolución de  AgNO 3 
0.1 N hasta la formación de un precipitado color rojo. Dejar reposar 12 h; filtrar y diluir a 1 L con agua.  
B.18.4.5.30 Disolución patrón de nitrato de plata 0.02 N.  
B.18.4.5.30.1 Disolver 3.27 g de AgNO 3 en agua y llevar a un v de 1  L. Guardar la disolución en frasco 
color ámbar y en refrigeración.  
B.18.4.5.31 Si se utiliza una disolución comercial de nitrato de  plata 0.1 N, diluir 200 mL de é sta a un v de 
1000 mL con a gua. 
B.18.4.5.32 Valoración.  
B.18.4.5.32.1 Tomar por triplicado una alícuota de 10 mL de la disolución de NaCl con material 
volumétrico y transferir a matraces Erlenmeyer de 250 mL llevar a un v aproximado de 100 mL con agua. 
Adicionar 1 mL de disolución d e cromato de potasio y titular con la disolución patrón de (AgNO 3) 0.02 N hasta 
la aparición de la coloración amarillo - rojizo permanente.  
B.18.4.5.32.2 Preparar un blanco de reactivos utilizando 100 mL de agua conteniendo 1 mL de disolución 
de cromato de potasio.  
B.18.4.5.32.3 Calcular la normalidad de la disolución aplicando la siguiente ecuación:  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
 
B.18.4.5.32.4  Esta disolución deberá valorarse semanalmente o antes de su uso.  
B.18.4.5.33 Disolución madre de 1 mg de CN –/mL. 
B.18.4.5.33.1  Disolver 1.6 g de  NaOH y 2.51 g de KCN en un matraz volumétrico de 1 L. Llevar al v  con 
agua.  
B.18.4.5.34 Valoración de la disolución.  
B.18.4.5.34.1 Medir 25 mL de esta disolución y diluir a 100 mL con disolución diluida de NaOH añadir 
aproximadamente 0.5 mL del indicador  de rodanina. Titular con disolución valorada de AgNO 3 0.02 N, hasta el 
primer cambio de color amarillo canario a salmón.  
B.18.4.5.34.2 1 mL de solución de AgNO 3 0.02N equivale a 1.00 mg de CN –. 
B.18.4.5.34.3 Esta disolución deberá valorarse semanalmente o  antes de su uso.  
B.18.4.5.34.4 Puede utilizarse una disolución patrón comercial de 1 mg/mL trazable a patrones nacionales 
o internacionales la cual ya no requiere valoración.  
B.18.4.5.35 Disolución de nitrato de bismuto.  
B.18.4.5.35.1  Pesar aproximadament e 30.0 g de nitrato de bismuto, disolver en 100 mL de agua, 
manteniéndose en agitación, adicionar 250 mL de ácido acético glacial. Agitar hasta que se disuelva el nitrato 
de bismuto y llevar a un v de 1 L con agua.  
B.18.4.5.36 Disolución de ácido sulfámico . 
B.18.4.5.36.1  Pesar aproximadamente 40.0 g de ácido sulfámico, disolver en 500 mL de agua y llevar a un 
v de 1 L.  
B.18.4.5.37 Ácido sulfúrico 1:1.  
B.18.4.5.37.1  Añadir lentamente 500 mL de ácido sulfúrico concentrado a 500 mL de agua.  
B.18.4.5.38 Disoluc ión de cloruro de magnesio.  
B.18.4.5.38.1  Pesar aproximadamente 510.0 g de cloruro de magnesio, disolver y aforar a 1 L con agua.  
B.18.4.5.39 Disolución de cloramina T.  
B.18.4.5.39.1  Pesar aproximadamente 1.0 g de cloramina T y ll evar a un v de 100 mL con agua.  
B.18.4.5.39.2  Almacenar en refrigeración. Preparar semanalmente.  
B.18.4.5.40 Disolución intermedia de cianuros de 10 mg CN –/L. 
B.18.4.5.40.1  Basado en la concentración para la disolución madre de cianuros, calcular el v requerido 
(aproximadamente 10 mL) y llevar a 1 L con disolución diluida de NaOH.  
B.18.4.5.41 Disolución patrón de cianuros de 1 mg CN –/L. 
B.18.4.5.41.1  Medir 10 mL de la disolución intermedia de cianuros y llevar a un v de 100 mL con disolución 
diluida de NaOH. Preparar previamente a s u uso y mantener en una botella de vidrio cerrada.  
B.18.4.5.42 Disolución de ácido piridina -barbitúrico.  
B.18.4.5.42.1  Pesar aproximadamente 15.0 g de ácido barbitúrico, colocar en un matraz volumétrico de 
250 mL, lavar las paredes del matraz con máximo 5 mL de agua. Adicionar 75 mL de piridina y mezclar. 
Adicionar 15 mL de HCl concentrado, mezclar y dejar enfriar a temperatura ambiente. Diluir al v con agua y 
mezclar hasta que el ácido barbitúrico se disuelva. Almacenar en frasco ámbar y en refrigeración. Desechar si 
presenta precipitación.  
B.18.4.5.43 Disolución amortiguadora de acetato de sodio.        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.18.4.5.43.1  Pesar aproximadamente 410.0 g de acetato de sodio, disolver y llevar a un v de 500 mL con 
agua. Ajustar a un pH de 4.5 con ácido acético glacial.  
B.18.4.6 Procedimiento.  
B.18.4.6.1 Preparación de la curva de calibración de cianuros.  
B.18.4.6.1.1  Medir los siguientes volúmenes de disolución patrón de cianuros (véase Tabla Curva de 
calibración de cianuros) en matraces volumétricos de 50 mL. Diluir con 4 0 mL de disolución diluida de NaOH y 
desarrollar el color como se indica en el apartado de desarrollo de color.  
Tabla. - Curva de calibración de cianuros.  
Volumen de disolución  
patrón de KCN  (mL).  Concentración 
de la solución 
(mg de CN –/L). Volumen de 
disol ución diluida 
de NaOH  
(mL).  Volumen 
de aforo 
(mL).  
0.0 Blanco  40 50 
1.0 0.02 40 50 
2.5 0.05 40 50 
5.0 0.10 40 50 
7.5 0.15 40 50 
10.0 0.20 40 50 
 
B.18.4.6.1.2 Leer las soluciones patrón de menor a mayor concentración y registrar al menos 3 réplicas d e 
la lectura de cada uno.  
B.18.4.6.1.3 Elaborar una curva de calibración, graficando el promedio de la lectura de absorbancia en 
función de su concentración en mg de CN –/L de cada uno de los puntos de la curva patrón.  
B.18.4.6.1.4 Ajustar la curva de calib ración obtenida mediante regresión lineal (método de mínimos 
cuadrados). Calcular la pendiente, el coeficiente de correlación y la ordenada al origen. Obtener la ecuación 
de la recta.  
B.18.4.6.1.5  Destilación de la muestra.  
B.18.4.6.1.5.1 Medir 500 mL de m uestra, conteniendo no más de 10 mg de CN –/L en el matraz de 
destilación de 1 L.  
B.18.4.6.1.5.2 Medir una alícuota de 10 mL de la disolución concentrada de NaOH, colocarla dentro del 
tubo de adsorción, añadir agua hasta que la espiral esté cubierta. No uti lizar un v total de disolución de 
adsorción mayor a 225 mL. Conectar el matraz de ebullición, el condensador, el absorbedor y la trampa, tal 
como se muestra en la Figura 1.  
B.18.4.6.1.5.3 Ajustar la bomba de vacío, empezar con un flujo de aire lento que en tre por el matraz tipo 
Claissen y dejar que se estabilice entre 2 o 3 burbujas de aire por segundo desde el tubo de entrada.  
B.18.4.6.1.5.4 Utilizar papel de acetato de plomo para verificar que la muestra no contenga sulfuros. Si el 
papel se torna negro, l a prueba es positiva; en este caso, tratar la muestra por adición de 50 mL de la 
disolución de nitrato de bismuto a través del tubo de entrada de aire después de que la tasa de entrada de 
aire esté estable.  
B.18.4.6.1.5.5  Mezclar por 3 min antes de la adic ión de ácido sulfúrico. Otra forma de eliminar los sulfuros 
es adicionar 50 mg de PbCO 3 a la disolución de absorción antes de la destilación. Filtrar el destilado antes del 
desarrollo del color.  
B.18.4.6.1.5.6 Para eliminar la interferencia de nitratos y/o  nitritos adicionar 50 mL de disolución de ácido 
sulfámico a la muestra a través del tubo de entrada de aire y lavar con agua; mezclar por 3 min antes de la 
adición de ácido sulfúrico.  
B.18.4.6.1.5.7 Lentamente añadir ácido sulfúrico 1:1 a través del tubo de entrada de aire y lavar con agua, 
permitir que el flujo de aire mezcle el contenido del matraz por 3 min. Adicionar 20 mL de la disolución de 
cloruro de magnesio dentro del tubo de entrada de aire y lavar con agua.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.18.4.6.1.5.8 Calentar la disolución hasta ebullición. Dejar en reflujo por lo menos 1 h. Al cabo de este 
tiempo apagar la fuente de calor y continuar con el flujo de aire por lo menos durante 15 min más. Al finalizar 
enfriar el matraz de ebullición, desconectar el adsorbedor y cerrar la bomb a de vacío.  
B.18.4.6.1.5.9 Drenar la disolución del adsorbedor dentro de un matraz volumétrico de 250 mL. Lavar el 
tubo conector y el adsorbedor con agua, colectando en el mismo matraz. Llevar al v con agua. Esta disolución 
es estable durante 24 h.  
B.18.4. 6.1.5.10 Destilar una muestra de agua de forma simultánea como blanco de reactivos.  
B.18.4.6.1.6 Desarrollo de color.  
B.18.4.6.1.6.1 Medir una alícuota de 40 mL de la disolución obtenida en la destilación de la muestra y del 
blanco de reactivos en matraces  volumétricos de 50 mL.  
B.18.4.6.1.6.2 A cada uno de los matraces adicionar 1 mL de disolución amortiguadora de acetato de 
sodio y 2 mL de la disolución de cloramina T, mezclar. Dejar estabilizar durante 2 min.  
B.18.4.6.1.6.3 Adicionar 5  mL del reactivo de  ácido piridi n barbitúrico y llevar al v con disolución diluida de 
NaOH. Mezclar y dejar que la muestra se estabilice durante 8 min pero no más de 15 min.  
B.18.4.6.1.6.4 Leer la absorbancia a una longitud de onda de 578 nm y registrar al menos 3 réplicas d e la 
lectura de cada uno.  
B.18.4.6.1.6.5 Si la lectura de alguna de las muestras rebasa el intervalo de trabajo tomar una alícuota 
menor de muestra, llevar a 500 mL con disolución diluida de NaOH y destilar nuevamente.  
B.18.4.7 Expresión de los resultados.  
B.18.4.7.1 Cálculos.  
B.18.4.7.1.1  Obtener los mg de CN – en la muestra y en el blanco de reactivos con la siguiente ecuación:  
 
En donde:  
A es la concentración (mg de CN –/L) en la muestra calculados con la ecuación de la recta;  
B es la concentración (mg de  CN–/L) en el blanco de reactivos calculados con la ecuación de la recta;  
250 es el volumen total del destilado en m;  
50 es el volumen de aforo de la alícuota del destilado en mL;  
C es el volumen original de la muestra utilizada para la destilación en m, y  
40 es el volumen de la alícuota del destilado en mL;  
B.18.4.8 Informe de prueba.  
B.18.4.8.1 Informar como:        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
B.18.4.8.1.1  mg de CN –/L. 
B.19 Método  para la determinación de Radiactividad alfa y beta total.  
B.19.1  Fundamento.  
La técnica de recuento por centel leo líquido tuvo su comienzo a principios de los años 50’ del siglo XX, 
cuando la búsqueda de neutrinos requería detectores de radiación de gran v. En esa época comenzó el 
interés, desde un punto de vista bioquímico, por el estudio de productos de fisión, tanto en animales como  en 
humanos.  
En 1953, Hayes y Gould presentaron en la revista Science, el recuento por centelleo líquido de esteroides 
tritiados en una solución 2,5 difeniloxazol en tolueno, con una eficiencia del 6%, así como el recuento de ácido 
benzoico marcado con 14C, con una eficiencia cercana al 55%.  
El recuento interno de la muestra es la característica principal asociada a un detector de centelleo líquido. 
Presenta la ventaja de que no existen problemas de autoabsorción en la muestra y dado que la geometría de 
recuento es 4  π, es decir, la radiación se emite de una manera isotrópica, la eficiencia de recuento alcanzada 
será muy alta. Sin embargo esta técnica de recuento interno lleva consigo algunos problemas. En el recuento 
externo de la mue stra con otro tipo de detectores la geometría del detector en relación con la muestra, 
determina la eficiencia del recuento. Por lo contrario, en la técnica de centelleo líquido (recuento interno), el 
líquido centelleador (sensor) y l a solución portadora d el radionú clido están mezclados, constituyendo fuente 
radiactiva y detector todo en uno y la eficiencia de recuento viene determinada por la naturaleza de la 
muestra. La eficiencia de recuento se relaciona con la fuente misma y no con la geometría detector -fuente, 
como ocurre en la espectrometría ϒ. Esto tiene la desventaja de que cuando variemos las condiciones de 
medida, tipo de muestra, tipo de centellador, etc. Debe calcularse la eficiencia de recuento en esas 
condiciones.  
La aparición en equipos comerc iales de los sistemas de discriminación de las radiaciones alfa y beta en 
los detectores de centelleo líquido supuso un gran paso hacia adelante dentro de la técnica del centelleo 
líquido. Ya que a partir de ese momento, mediante el centelleo líquido es po sible la medida no sólo ya de 
emisores alfa, sino también la medida de emisores beta puros, es decir emisores que se hallarán siempre en 
presencia de emisores alfa, cuyos descendientes alfa interfieran en la medida del emisor beta.  
En general, las medidas de actividad de emisores alfa y beta en muestras ambientales requieren niveles 
de fondo muy bajos, lo que hace necesario sistemas de reducción drástica del fondo del espectrómetro que se 
va a utilizar. Para obtener niveles bajos de fondo, se ha n diseñado e spectrómetros con 2 sistemas de blindaje, 
un blindaje pasivo y otro activo, además de ciertos dispositivos para la reducción del ruido electrónico. El 
efecto global es la obtención de niveles de fondo tan bajos como los que presentan equipos convencionales  
de centelleo líquido que operan en instalaciones subterráneas y laboratorios especiales. Aun así, estos niveles 
de fondo pueden reducirse aún más colocando el espectrómetro de centelleo líquido en una instalación 
subterránea de manera que el fondo cósmico  quede reducido también drásticamente.  
B.19.2  Preparación de las muestras.  
B.19.2.1  Las muestras deben ser colectadas en envases de plástico en un mínimo de 1 L, acidificándolas 
en el momento del muestreo con ácido nítrico hasta obtener un pH entre 1.5 y 2 .5, verificar el pH final con  tira 
reactiva.  
B.19.3  Calibración.  
B.19.3.1  Para la calibración es necesario preparar:  
B.19.3.1.1 Fuentes estándar en agua destilada, para emisores beta se utilizan principalmente 3H, 210Pb, 
210Bi, 99Tc, 90Sr -, 90Y y 40K, par a emisores alfa 239Pu.  
B.19.3.1.2  Líquidos centelladores, comercialmente se puede obtener preferentemente aqu éllos con alto 
grado admisión de agua.  
B.19.3.1.3  Agente extintor, cromato de sodio Na 2CrO 4 o cloruro férrico FeCl 3 . 6H 2O. 
B.19.3.2  Preparación de  patrones de calibración.  
B.19.3.2.1  Trasferir a viales diferentes cantidades de solución estándar de emisores alfa y de beta y llevar 
a 10 ml con agua destilada, adicionar un v de 10 ml de solución de centelleo. Dejar en reposo por al menos  18 
días para a segurar el equilibrio. Ajustar el pH en caso de requerir a 1.5  
B.19.4 Material.  
B.19.4.1  Balanza analítica.  Miércoles 12 de febrero de 2014  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)      
B.19.4.2 Espectrómetro con detector de centelleo líquido.  
B.19.4.3 Viales de polietileno recubiertos de PTFE.  
B.19.4.4 Agitador magnético con regula dor de temperatura.  
B.19.4.5 Potenciómetro.  
B.19.5 Reactivos.  
B.19.5.1  Todos los reactivos deben ser grado analítico a menos que se indique otra especificación y por 
agua se entiende agua destilada.  
B.19.5.2 Solución de Centelleo, no miscible en agua y pre parada para separación alfa y beta . 
B.19.5.3 Ácido nítrico (HNO 3). 
B.19.5.4 Etanol 95%.  
B.19.5.5 Cromato de sodio Na 2CrO 4. 
B.19.5.6 Cloruro férrico FeCl 3 . 6H 2O. 
B.19.6 Procedimiento.  
B.19.6.1 Preparación de blanco y muestras.  
B.19.6.1.1  Acidificar un v de  10 ml de agua destilada hasta un pH de 1.5, adicionar 10 ml de solución de 
centelleo, contenidos en un vial, agitar y colocar junto con los patrones previamente preparados.  
B.19.6.1.2 Las muestras a determinar se preparan en un v de 10 ml en serie de vial es, adicionando a cada 
muestra 10 mL. De solución de centelleo y se dejan en reposo por al menos 2 días para asegurar el equilibrio.  
B.19.6.2 Acondicionamiento de equipo.  
B.19.6.2.1  Se realiza la verificación del equipo, ajustándolo según especificaciones del fabricante en la 
eficiencia de detección establecida por el laboratorio.  
B.19.6.3 Medición directa.  
B.19.6.3.1  Se procede a medir colocando la serie de patrones, blanco y muestras en el equipo de 
centelleo el tiempo necesario para obtener una estadísti ca adecuada.  
Siguiendo el procedimiento para actividad alfa y para actividad beta.  
B.19.6.4 Expresión de resultados.  
B.19. 6.4.1  Cálculo de actividad alfa.  
 
En donde:  
rg, α Medición de actividad alfa;  
r0, α Medición del blanco de la medición alfa;  
εα Eficiencia de medición alfa, y  
α Volumen de muestra.  
B.19.6.4.2  Cálculo de actividad beta.  
 
En donde:  
rg,  Medición de actividad beta;  
r0, Medición del blanco de la medici ón beta;  
ε Eficiencia de medición beta, y        (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Miércoles 12 de febrero de 2014  
 Volumen de muestra.  
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