Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
QUINTA SECCION  
SECRETARIA DE SALUD  
NORMA Oficial Mexicana NOM -131-SSA1 -2012, Productos y servicios. Fórmulas para lactantes, de continuación 
y para necesidades especiales de nutrición. Alimentos y bebidas no alcohólicas para lactantes y niños de corta edad . 
Disposiciones y especificaciones sanitarias y nutrimentales. Etiquetado y métodos de prueba (Continúa de la 
Cuarta Sección)  
(Viene de la Cuarta Sección)  
B.7.2.2  Materiales  
 Mecheros de Bunsen o Fischer.  
 Abrelatas sanitarios.  
 Pinzas, espátulas y cuch aras.  
 Charolas.  
 Pipetas serológicas de 10 ml con tapón de algodón.  
 Pipetas despuntadas o tubos de 8 mm de diámetro con tapón de algodón.  
 Propipeta o bulbo para pipeta.  
 Tubos de cultivo de 18 x 150 o de 22 x 175 mm.  
 Embudos grandes de tallo cort o. 
 Portaobjetos.  
 Cajas de Petri estériles.  
 Punzón para latas.  
 Asa de platino o nicromel en porta -asas.  
 Cepillo para lavar las latas.  
 Toallas o gasas estériles.  
 Solución de yodo al 4% (en etanol al 70%).  
 Sistema de anaerobiosis.  
 Varillas d e vidrio de 20 cm de longitud y 3 mm de grueso, dobladas en ángulo recto de 5 cm en uno 
de sus extremos.  
 Azul de metileno, cristal violeta o equipo para tinción de Gram.  
B.7.3 Aparatos e instrumentos  
 Autoclave con termómetro o manómetro.  
 Horno para e sterilizar a 180°C.  
 Incubadoras con termómetro y termostato que evite variaciones > de 0,1°C.  
 Potenciómetro de escala expandida.  
 Microscopio compuesto.  
B.7.4 Preparación de las muestras  
B.7.4.1  Llevar un registro en el laboratorio en donde se anoten:  
B.7.4.1.1  El número de lote (o señalar si éste no existe o está incompleto)  
B.7.4.1.2  Todos los datos importantes para la identificación del producto que aparezcan en la etiqueta; 
identificar la muestra en forma indeleble, antes de  remover la etiqueta. Co nservar el envase y la etiqueta.  
B.7.4.1.3  Los defectos físicos que se observen en el envase como abolladuras, golpes que lo deformen, 
oxidación, derrames, defectos aparentes de las cerraduras, abombamiento, etcétera.  
Según su apariencia externa clasificar las como sigue:        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.7.4.2  Latas  
B.7.4.2.1  Latas planas o normales.  
B.7.4.2.2  Abombamiento ligero (Flipper), Grado I. Unicamente uno de los extremos de la lata se encuentra 
ligeramente abombado, pero puede comprimirse fácilmente.  
B.7.4.2.3  Abombamiento elásti co (Springer), Grado II. Uno de los extremos se encuentra abombado; al 
presionarle el extremo opuesto se abulta.  
B.7.4.2.4  Hinchazón (Soft swell), Grado III. Ambos extremos se encuentran abombados, pero pueden 
comprimirse o ceden ligeramente a la presión.  
B.7.4.2.5  Hinchazón (Hard swell), Grado IV. Ambos extremos se encuentran abombados y no pueden 
comprimirse: la lata puede reventar.  
B.7.4.3  Frascos de vidrio  
B.7.4.3.1 Tapa normal  
B.7.4.3.2  Tapa abombada  
B.7.4.4  Incubación de los envases  
B.7.4.4.1  Incubaci ón de productos en envases de apariencia normal.  
La prueba más confiable para determinar la esterilidad comercial es la incubación del producto a 
temperaturas apropiadas y por un tiempo suficiente para que cualquier microorganismo que se encuentre 
pueda de sarrollarse bajo las condiciones del producto envasado, dando origen a manifestaciones ya sea en el 
envase o en el producto. Incubar de 30 a 35°C por 10 a 14 días.  
Observar diariamente los envases. La manifestación de crecimiento es la hinchazón en diferen tes grados y 
en los envases de vidrio se pueden observar los cambios en el alimento o la formación de burbujas. En cuanto 
se detecte hinchazón en el producto o cualquier otra desviación suspender la incubación.  
Al final del periodo de incubación, abrir las  latas para descubrir descomposición ácida (flat sour), por 
cambios en el color, olor, consistencia y pH del alimento. Preparar extensiones, teñirlas con azul de metileno o 
tinción de Gram y observarlas microscópicamente. El hallazgo de cualquier anormalid ad indica que el 
producto no está comercialmente estéril y se debe proceder como para los envases alterados.  
B.7.4.4.2 Incubación de envases sospechosos o alterados  
Analizar de inmediato una o varias unidades de la muestra e incubar el resto de las latas q ue no presenten 
alteración evidente o con abombamiento de grado I de 30 a 35°C por 10 a 14 días.  
Los envases con abombamiento muy evidente no deben incubarse.  Aquellas que se clasifiquen como 
grado III o IV de no analizarse en el momento, deberán refrigera rse. 
B.7.4.5  Apertura de las latas o envases  
B.7.4.5.1 Area de trabajo  
Se debe trabajar preferentemente en un gabinete de flujo laminar que proporcione un ambiente ultra -
limpio, clase 100 (el equipo debe proveer un ambiente libre de partículas de 0,3 micra s con una eficiencia del 
99,99% en un flujo de 100 pies 3/min).  La desinfección de la superficie de trabajo se puede hacer con alcohol 
o sales cuaternarias de amonio a la concentración recomendada por el fabricante. Posteriormente se debe 
poner a trabajar el flujo, 30 min antes de efectuar el trabajo.  
Para controlar la eficacia del flujo, se deben poner como testigos cajas con medio de cultivo abiertas, a los 
lados y al centro del área de trabajo, durante todo el tiempo que dure la operación.  
Si no se tiene  el equipo necesario, se puede utilizar un cuarto o cubículo perfectamente limpio, lavado con 
agua y jabón, desinfectándolo con un agente bactericida apropiado. En este caso se trabajará entre dos 
mecheros Bunsen.  
B.7.4.5.2 Personal  
El personal debe trabaj ar con bata limpia. Si tiene el pelo largo, debe usar turbante. El uso de mascarillas 
quirúrgicas es opcional. El personal enfermo con gripe o cualquier otro problema infeccioso no debe intervenir 
en el análisis.  
B.7.4.6  Preparación de latas o envases  norm ales Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Lavar el envase con un cepillo, usando agua caliente y jabón; enjuagar y dejar secar.  
Remojar con un sanitizante durante 10 a 15 min, la tapa contraria a donde está grabado el lote. Escurrir el 
líquido y secar con la flama de un mechero.  
Destapar con un abridor de latas sanitario estéril.  
En las latas de cierre de anillo o dispositivos abre fácil, abrir por la cara opuesta.  
B.7.4.6.1 Frascos de vidrio  
Lavar la tapa del frasco y sumergirlo durante 15 min en una solución sanitizante, de manera que quede 
cubierta la tapa; esta solución puede ser cloro 100 mg/kg. Colocar un algodón estéril en torno a la tapa y con 
un punzón estéril hacer un orificio en el centro, a fin de que se pierda el vacío y pueda abrirse con facilidad. 
Abrir el frasco sin contaminar l os bordes del mismo.  
B.7.4.7 Preparación de latas o envases alterados  
Lavar el envase con un cepillo, con agua caliente y jabón; enjuagar y secar. Si la lata está muy inflada, 
mantener en el refrigerador antes de abrirla. Limpiar y sanitizar la tapa con un a solución de cloro 100 mg/kg o 
yodo al 2% en alcohol al 70%; limpiar con una gasa estéril.  
En latas muy infladas de pH muy ácido, es necesario hacer una prueba para hidrógeno, con objeto de 
conocer si el gas se debe a la acción del ácido sobre el metal.  
Para ello, practicar una pequeña puntura en el centro de la tapa y recibir el gas en un tubo de ensayo 
invertido; inmediatamente ponerlo sobre la flama. Una pequeña explosión indica la presencia de hidrógeno. 
No debe flamearse directamente el orificio de la  lata. 
Para abrir latas infladas, colocar un embudo invertido con un algodón estéril  sobre la tapa y picar con un 
picahielo estéril, hasta desalojar el gas antes de abrir la lata.  
B.7.5 Procedimiento  
Abrir la lata entre dos mecheros Bunsen o en el gabinete  de flujo laminar vertical. Tomar porciones tanto 
del contenido sólido como del líquido; si es posible, homogeneizar. Utilizando utensilios adecuados a la 
naturaleza del producto (espátulas, pinzas, tubos de vidrio, pipetas, etcétera) transferir aproximada mente 2 g 
o 2 ml del producto a los tubos con el medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento.  
Conservar una muestra en un frasco estéril, para cualquier aclaración o para efectuar pruebas biológicas. 
Hacer una extensión en un portaobjetos d el contenido de la lata, ya que muchas veces los gérmenes 
causantes del deterioro mueren durante el almacenamiento y sólo el examen microscópico puede dar una 
idea de los microorganismos involucrados en la descomposición. Preparar las extensiones mediante un asa 
de platino. Si el alimento es sólido o muy espeso, agregar una pequeña cantidad de agua estéril. Si es muy 
grasoso, depositar sobre la extensión una pequeña cantidad de xilol con posterioridad a su fijación por calor.  
Una vez tomada la muestra, anot ar el estado del alimento: su olor, cambios en su color, consistencia, 
etcétera. No debe probarse. Determinar el pH y vaciar el contenido de la lata. Observar su interior, anotando 
el estado del barniz, la presencia de manchas, defectos del frasco o de la tapa, etcétera.  
B.7.5.1 Examen de alimentos envasados de baja acidez (pH > 4,6)  
Inocular aproximadamente 2 g o 2 ml, en cada uno de 4 tubos con caldo hígado, previamente calentado a 
100°C para expulsar el oxígeno disuelto, y enfriar rápidamente.  
Inocular a simismo, 4 tubos de caldo púrpura de bromocresol.  
Incubar según el siguiente esquema:  
MEDIO DE CULTIVO  TUBOS  TEMPERATURA  TIEMPO  INVESTIGACIO N 
Caldo hígado o CCC  2 35°C  96 h/120 h  Mesofílicos anaerobios  
Caldo hígado o CCC  2 55°C  24 h/72 h  Termofílicos ana erobios  
Caldo púrpura de bromocresol  2 35°C  96 h/120 h  Mesofílicos aerobios        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Caldo púrpura de bromocresol  2 55°C  24 h/48 h  Termofílicos aerobios  
 
Transferir los alimentos líquidos por medio de una pipeta, utilizando un bulbo o propipeta. ¡Precaución! 
Tener cuidado al manipular el producto, incluso cuando provenga de envases aparentemente normales. ¡La 
Toxina botulínica puede estar presente! Observar los tubos diariamente, hasta el término del tiempo de 
incubación si no hay crecimiento en todos los tubos, descartar e informar como NEGATIVO.  
Cuadro 1  
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA ALIMENTOS ENLATADOS DE  
BAJA ACIDEZ (> 4,6)  
CULTIVO 
ORIGINAL  TEMPERATURA  SUBCULTIVO   CULTIVO 
PURO  IDENTIFICACIÓN  
CH o CCC  
y 
CGPB   
35°C  
96/120 h  AN o AHT  
Aeróbico  
AN o A HT 
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CH o CCC  
Frotis  
CH o CCC  Tinción de Gram  
Anaeróbico  
AN o AHT  
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN o AHT  
CH o CCC  
y 
CGPB   
55°C  
24/72 h  AN o AHT  
Aeróbico  
AN o AHT  
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CH o CCC  
Frotis  
CH o CCC  Tinción de Gram  
Anaeróbico  
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN o AHT  
CH = Caldo Hígado de Ternera AN = Agar Nutritivo  
CCC = Caldo Carne Cocida AHT = Agar Hígado de Ternera  
CGPB = Caldo Púrpura de Bromocresol  
 
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO DE CULTIVO PARA AL IMENTOS ENLATADOS ACIDOS (> 4,6)  
CULTIVO 
ORIGINAL  TEMPERATURA  SUBCULTIVO   CULTIVO 
PURO  IDENTIFICACI ON 
 
CA,CEM   
30°C  
96/120 h  AN, ADS o ADP  
Aeróbico  
AN, ADS o ADP  
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CA, CEM  
Frotis  
CA, CEM  Tinción de Gram  
Anaeróbico  
AN, ADS o ADP  
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN, ADS o ADP  
CA  
55°C  
24/72 h  AN 
Aeróbico  
AN 
Anaeróbico  Crecimiento  
Crecimiento  Frotis  
CA 
Frotis  
CA Tinción de Gram  
Anaeróbico  
AN 
Tinción de Gram  
Aeróbico  
AN Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
CA = Caldo Acido AN = Agar Nutritivo  
CEM = Caldo Extracto  de Malta ADS = Agar Dextrosa Sabouraud  
ADP = Agar Papa Dextr osa 
Si hay crecimiento, hacer frotis y teñir -resembrar a placas de agar hígado de ternera (sin yema de huevo) 
o agar nutritivo. Incubar a 35°C y 55°C una placa en aerobiosis y anaeróbico (ver cua dro 1) continuar la 
incubación a 35°C de caldo de hígado (CH) o caldo carne cocida (CCC) hasta un máximo de 5 días y guardar 
para determinación de toxina (cuando proceda).  
Observar los agares y seleccionar un número representativo de los diferentes tipos d e colonias y 
resembrar a CH y CCC a la temperatura y las condiciones según se especifica en el cuadro 1 (a 35°C por 96 a 
120 h y 55°C por 24 a 72 h).  
Expulsar el oxígeno inmediatamente antes de utilizar el CH que se va a incubar en anaerobiosis. Mantener 
viables los cultivos puros aislados. Hacer tinción de Gram.  
B.7.5.1.1  Cuando se presente crecimiento microbiano durante las pruebas para esterilidad comercial en un 
enlatado y no haya evidencia de descomposición del alimento, efectuar la confirmación de la siguiente forma:  
B.7.5.1.1.1 Obtener cultivos puros de la cepa o cepas encontradas.  
B.7.5.1.1.2 Seleccionar otro envase del mismo producto y el mismo lote que el anterior.  
B.7.5.1.1.3  En condiciones asépticas, practicar una pequeña perforación en el extrem o de la lata o cerca 
del cierre.  
B.7.5.1.1.4 Inocular el producto con la cepa por abajo de la superficie.  
B.7.5.1.1.5  Flamear el orificio para crear vacío y sellar asépticamente con soldadura o un material similar.  
B.7.5.1.1.6  Después de inocular, incubar a 30 a 35°C durante 10 días.  
B.7.5.1.1.7  Abrir el enlatado y examinar el producto.  
El aspecto del producto debe ser igual al que se observó en el envase de donde se obtuvo el cultivo. Si en 
el primer enlatado el producto fue de apariencia normal, pero se o btuvo crecimiento y en el segundo, 
inoculado con la flora microbiana aislada del primero, se encuentra el producto alterado (gas, consistencia 
diferente, olor, etcétera), debe considerarse que el primer enlatado era comercialmente estéril y que el 
crecimie nto fue el resultado de un procedimiento deficiente por el laboratorio. Si se encuentra flora mixta 
únicamente en el CGPB, hacer informe de los tipos morfológicos. Si hay flora mixta en CH/CCC entre la cual 
se incluyan bacilos, hacer prueba toxina. Si se o bservan únicamente bacilos Gram positivo o Gram variable 
típicos del género Bacillus  o Clostridium  investigar presencia de esporas. En algunos casos las células 
vegetativas envejecidas pueden dar la apariencia de Gram negativo y debe considerarse como si f uera Gram 
positivo. Determinar la presencia de toxina. Esta prueba la podrá realizar un laboratorio oficialmente 
acreditado por las autoridades correspondientes.  
B.7.5.2 Examen microbiológico de alimentos envasados de acidez alta (pH < 4,6) 
Inocular 2 g o 2 ml de alimento en 4 tubos de caldo ácido y 2 tubos de caldo extracto de malta.  
Incubar según el esquema:  
MEDIO DE CULTIVO  TUBOS  TEMPERATURA  TIEMPO  INVESTIGACI ON 
Caldo ácido  2  30°C  96 h Lactobacilos, hongos y levaduras  
Caldo ácido  2 55°C  48 h Termofíli cos de descomposición 
ácida  
Caldo extracto de malta  2 30°C  96 h Lactobacilos, hongos y levaduras  
 
B.7.6 Expresión de resultados  
B.7.6.1  Envases normales  
Conviene extremar los cuidados al efectuar los ensayos, seleccionar las muestras e interpretar los 
resultados de las pruebas para demostrar la esterilidad comercial, ya que cualquier error basado en fallas de 
manipulación o interpretación, puede originar la destrucción de un lote comercialmente estéril, como       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
contaminado. Al incubar el enlatado o al recibi rse la lata, la presencia de hinchazón, principalmente cuando es 
muy acentuada, indica contaminación microbiana. Estas condiciones deben ser confirmadas demostrando la 
presencia de un gran número de microorganismos en las extensiones preparadas directament e a partir del 
alimento, descubriendo cambios en el aspecto del producto (consistencia, olor, coloración anormal) o 
variaciones en el pH, en comparación siempre con un producto normal. Los cultivos se practican por 
duplicado, cuando hay contaminación, en a mbos tubos se debe hallar una flora similar a la encontrada en las 
extensiones de la muestra original. Encontrar sólo uno de los tubos de cultivo positivo y otro negativo, puede 
indicar una contaminación por manipulación en el laboratorio, a menos que se c ompruebe que existe el mismo 
tipo de flora que en la extensión de la muestra original.  
A veces existe alguna dificultad en diferenciar partículas del alimento de microorganismos. Otras veces las 
levaduras o lactobacilos participan en la producción del alim ento, como sucede en algunos productos 
obtenidos por fermentación. En estos casos, aunque ya no sean viables, los microorganismos pueden 
aparecer en la extensión, y sólo la experiencia y el conocimiento de los procesos permiten interpretar 
correctamente lo s resultados.  
B.7.6.2 Envases alterados, con pH > 4,6.  
B.7.6.2.1  Presencia de mesofílicos aerobios  
La flora presente en este caso, puede estar constituida por bacilos o ser mixta.  
B.7.6.2.1.1 Presencia de bacilos esporulados  
Generalmente consiste en espora s termorresistentes de diferentes especies de bacilos. Regularmente el 
alimento no presenta alteraciones, ya que las esporas no pueden desarrollarse en condiciones de 
anaerobiosis; sin embargo, se han encontrado alteraciones producidas por bacilos con espo ras resistentes 
(Bacillus  mesentericus  y Bacillus subtilis ), en alimentos de acidez media, con tratamiento térmico adecuado, 
pero con vacío incompleto. También se ha encontrado Bacillus ß nigrificans , en conservas de betabeles con 
ennegrecimiento del produ cto. 
B.7.6.2.1.2 Presencia de flora mixta  
La presencia de flora mixta se debe generalmente a la penetración de gérmenes, con posterioridad al 
proceso térmico, actuando como vehículo el agua de enfriamiento. La flora que se observa puede ser muy 
variada.  
La penetración de los gérmenes se debe a defectos en las cerraduras, que permiten el paso de los 
microorganismos. Las latas generalmente se encuentran infladas y pueden mostrar defectos o derrames.  
El pH y el aspecto del producto varían.  
B.7.6.2.2 Presencia de mesofílicos anaerobios  
Consiste de anaerobios del género Clostridium , entre los que se encuentran B. sporogenes , B. putrificans, 
C. hystoliticum, C. bifermentans, C. perfringens  y C. botulinum ; este último es el de mayor importancia 
sanitaria, por produ cir una toxina muy potente. Las latas pueden estar parcialmente infladas y el producto 
parcialmente digerido; el olor es pútrido. El pH aumenta. En este caso, es necesario practicar la prueba en 
animales, tanto del producto como del filtrado del cultivo, p ara investigar la presencia de la toxina. Esta prueba 
la podrá realizar un laboratorio oficialmente acreditado por las autoridades correspondientes.  
B.7.6.2.3 Presencia de termofílicos aerobios  
Consta de bacilos termofílicos estrictos o facultativos, que p oseen esporas muy resistentes al calor 
(especie tipo B. stearothermophilus , causante de la descomposición ácida flat sour). Las latas son planas, sin 
alteración y con marcado aumento de la acidez del producto; puede haber olor anormal o enturbiamiento del 
líquido.  
B.7.6.2.4 Termofílicos anaerobios  
Pertenecen también al género Clostridium , con esporas muy resistentes al calor.  
La especie tipo C. thermosaccharolyticum,  es un anaerobio estricto no productor de sulfhídrico; las latas se 
encuentran infladas.  
Otro tipo de descomposición poco común, puede ser causada por C. nigrificans , que produce sulfhídrico 
con ennegrecimiento del producto.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.7.6.3  Interpretación de resultados en alimentos de acidez alta  
B.7.6.3.1 Presencia de mesofílicos aerobios  
B.7.6.3.1.1 Presencia de Lactobacillus . La descomposición por bacterias acidúricas no formadoras de 
esporas, puede deberse a varias especies del género Lactobacillus . Se han aislado L. lycoperci,  L. 
pentoaceticus, L. menitipolum  y L. pleofructi . 
B.7.6.3.1.2 Presencia d e levaduras. El hallazgo de levaduras indica falta de procesamiento. Las latas 
contaminadas generalmente se presentan muy hinchadas y el olor del producto es característico de levadura 
(olor ácido). Entre las levaduras se han aislado esporas del género Tor ula. 
B.7.6.3.1.3 Presencia de hongos. Otro tipo de descomposición puede ser causada por hongos como 
Byssochlamys fulva , que forma esporas muy resistentes al calor. Se han encontrado también algunas cepas 
de Penicillium; en estos casos generalmente las lata s se encuentran planas, sin alteración y el hongo crece en 
la superficie del producto.  
B.7.6.3.2  Mesofílicos anaerobios  
Clostridium pasteurianum  causa una descomposición poco frecuente, en que las latas se encuentran 
infladas y con olor butírico. Si se sos pecha este tipo de contaminación, sembrar un tubo con medio o caldo 
ácido en anaerobiosis a 35°C.  
B.7.6.3.3 Termofílicos aerobios  
La descomposición por termofílicos aerobios produce el tipo flat -sour, o sea la descomposición ácida. Las 
latas se encuentran planas y se observan cambios en el vacío; entre los gérmenes causantes está  B. 
coagulans , que es el responsable de la descomposición de productos derivados del jitomate y de la 
producción de grumos de leche evaporada.  
B.7.6.3.4 Termofílicos anaerobios  
La descomposición por termofílicos anaerobios es poco frecuente en productos ácidos. La producen 
anaerobios butíricos.  
En productos de acidez muy alta, con pH inferior a 3,7, como col agria, encurtidos, etcétera, la 
descomposición puede deberse a las bacteria s ya señaladas, pero generalmente la acidez inhibe el desarrollo 
de gérmenes. En muchos casos, la hinchazón de la lata se debe a causas químicas, por formación de 
hidrógeno.  
B.7.6.4 Observaciones generales  
Algunas veces se pueden encontrar cultivos negativ os, procedentes de latas anormales, o de latas 
normales con productos descompuestos. Esto puede deberse a que la alteración ocurrió antes del 
procesamiento térmico del enlatado y han muerto los microorganismos que la originaron, o bien a que en un 
producto  contaminado, los gérmenes murieron al agotarse el oxígeno o los nutrientes.  
En estos casos, un examen microscópico del producto puede ayudar al diagnóstico.  
METODOS FISICOQU IMICOS  
B.8 DETERMINACI ON DE CADMIO, ARS ENICO, PLOMO, ESTAÑO, COBRE, FIERRO, ZINC Y  
MERCURIO EN ALIMENTOS, AGUA POTABLE Y AGUA PURIFICADA POR ESPECTROFOTOMETR IA DE 
ABSORCI ON AT OMICA  
B.8.1 Fundamento  
El método de absorción atómica se basa en hacer pasar un haz de luz monocromática de una frecuencia 
tal que puede ser absorbido por el anali to que se encuentra presente en forma de vapor atómico. La medida 
de la intensidad luminosa antes y después de su paso por el vapor atómico permite determinar el porciento de 
absorción. La cantidad de absorción aumenta con la concentración de los átomos en  el medio absorbente, es 
decir, la medida de la absorción aumenta con la concentración del elemento en la muestra, ya sea que esté en 
su condición original o sujeta a pretratamiento.  
B.8.2 Reactivos y materiales  
B.8.2.1  Reactivos  
 Soluciones estándares de  referencia certificadas de cada uno de los metales.  
 Agua, debe ser destilada deionizada, con un grado máximo de conductividad de 1 µmho/cm a 25ºC.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
 Acido nítrico (densidad específica 1,41), grado suprapuro.  
 Acido nítrico (densidad específica 1,41), c ontenido de mercurio muy bajo.  
 Acido perclórico (densidad específica 1,67), grado suprapuro.  
 Acido clorhídrico (densidad específica 1,19), grado suprapuro.  
 Acido sulfúrico (densidad específica 1,84), grado suprapuro.  
 Acido sulfúrico 1 N a partir de  la solución grado suprapuro.  
 Acido nítrico 65% v/v grado RA.  
 Peróxido de hidrógeno (densidad específica 1,12).  
 Hidróxido de sodio granalla reactivo RA.  
 Aire comprimido seco y limpio.  
 Gases: acetileno, óxido nitroso, argón y nitrógeno, grado abso rción atómica.  
 Solución de nitrato de magnesio hexahidratado al 7% p/v. Disolver 70 g de Mg(NO3)2.6H2O en  1000 
ml de HCl 1 N.  
 Acido clorhídrico 1 N. Diluir 8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml de agua.  
 Acido nítrico al 50% v/v. Diluir 50 ml de HNO 3 al 65 % v/v grado suprapuro en 50 ml de agua.  
 Acido clorhídrico 8 M. Diluir 66,0 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.  
 Acido clorhídrico 0,5 N. Diluir 4,15 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.  
 Solución de yoduro de potasio al 15% p/v. Disolver 15 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe 
prepararse en el momento de usarse).  
 Solución de yoduro de potasio al 20% p/v. Disolver 20 g de KI en 100 ml de agua (esta solución debe 
prepararse en el momento de usarse).  
 Solución de cloruro de potasio (10 mg/ml  de K). Disolver 1,91 g de KCl en agua y diluir a 100 ml con 
agua.  
 Solución de nitrato de magnesio al 50% p/v. Disolver 50 g de Mg(NO 3)2.6H2O en 100 ml de agua.  
 Solución de ácido clorhídrico al 1,5% p/v. Diluir 1,5 ml de HCl en 100 ml de agua destilada  
deionizada.  
 Solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 1 g de hidróxido de sodio y diluir a 100 ml con agua 
destilada deionizada.  
 Solución de borohidruro de sodio al 4% p/v en solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Pesar 4 g de 
borohidruro de sodio en 100 ml de una solución de hidróxido de sodio al 1% p/v. Filtrar al vacío.  
 Solución reductora para mercurio. Mezclar 50 ml de ácido sulfúrico concentrado con 
aproximadamente 300 ml de agua. Enfriar a temperatura ambiente y disolver 15 g de clorur o de 
sodio, 15 g de sulfato o cloruro de hidroxilamina y 25 g de cloruro o sulfato estanoso en solución. 
Diluir a 500 ml.  
 Solución de dilución para mercurio. En un matraz de 1 l, conteniendo de 300 a 500 ml de agua 
destilada deionizada, agregar 58 ml de ácido nítrico concentrado de muy baja concentración de 
mercurio y 67 ml de ácido sulfúrico concentrado. Diluir al volumen con agua.  
 Solución de trabajo de As de 1 µg/ml. Diluir 1 ml de la solución patrón de 1000 µg/ml a 1 l con ácido 
sulfúrico 1 N prepar ada a partir de la solución grado suprapuro. Preparar fresca cada día.  
B.8.2.2  Materiales  
 Matraces Kjeldahl de 500 ml y 800 ml.  
 Sistema de reflujo con refrigerante.  
 Crisoles Vycor de 40 a 50 ml de capacidad.  
 Crisoles de platino de 40 a 50 ml de cap acidad.  
 Matraces Erlenmeyer de diferentes capacidades.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
 Matraces volumétricos de diferentes capacidades.  
 Matraces redondos de fondo plano de 50 ml.  
 Bombas Parr.  
 Micropipetas o pipetas de Eppendorf de diferentes capacidades.  
 Puntas de plástico pa ra micropipetas.  
 Papel filtro Whatman No. 2.  
 Perlas de ebullición.  
 Varillas de plástico.  
 Tubos de ensayo graduados de propilen o propileno de 15 ml.  
 Recipientes de propilen o propileno.  
 Embudos de filtración de diferentes capacidades.  
 Materia l común de laboratorio.  
Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones:  
- El jabón que se use debe ser de preferencia neutro.  
- Enjuagar perfectamente con agua corriente.  
- Sumergir el material de vidrio o pl ástico en un recipiente (de preferencia plástico) que contenga 
una solución de ácido nítrico grado RA al 30%.  
- Dejarlo tapado y reposando por un lapso de 24 h.  
- Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues (5 o 6 veces) con agua deionizada.  
- Dejar escurrir y secar.  
- Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.  
B.8.3 Aparatos e instrumentos  
B.8.3.1  Aparatos  
 Lámparas de cátodo hueco o de descarga sin electrodos para determinar arsénico, cadmio, cobre, 
estaño , fierro, mercurio, plomo y zinc.  
 Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga.  
 Automuestreador y recirculador de agua.  
 Placa de calentamiento con regulador que alcance una temperatura de 400 a 450ºC.  
 Horno de microondas.  
 Autocl ave que alcance 121 ± 5ºC o 15 lb de presión.  
 Centrífuga de laboratorio capaz de mantener 1600 rpm.  
B.8.3.2  Instrumentos  
Los instrumentos que a continuación se indican deben estar calibrados y ajustados antes de su operación.  
 Espectrómetro de absorción  atómica equipado con los accesorios para flama, horno de grafito, 
generador de hidruros o vapor frío, dependiendo del método a seguir.  
 Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg.  
 Mufla capaz de mantener una temperatura de 550 ± 10ºC.  
 Horno de cale ntamiento (estufa) con intervalo de temperatura de 120 ± 5ºC.  
B.8.4 Preparación de la muestra  
B.8.4.1  Digestión para la determinación de Cadmio, Cobre, Hierro, Plomo y Zinc.  
B.8.4.1.1  Digestión por vía húmeda.  
B.8.4.1.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, u na cantidad apropiada de muestra.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Para la determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limite el 
contenido de g rasa o aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.  
B.8.4.1.1.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión.  
B.8.4.1.1.3  Usar matraz de Kjeldhal o matraz conectado al sistem a de refrigerantes.  
B.8.4.1.1.4  Calentar suavemente.  
B.8.4.1.1.5  Digerir la muestra 3 h o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la adición de 
mayor cantidad de ácido nítrico) hasta la aparición del color traslúcido, si queda ámbar, adicion ar peróxido  de 
hidrógeno gota a gota con agitación continua (reacción exotérmica).  
B.8.4.1.1.6  Enfriar.  
B.8.4.1.1.7  Recuperar, filtrar y llevar a un volumen conocido en matraz volumétrico.  
B.8.4.1.1.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por  cada serie de digestión.  
B.8.4.1.1.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica por flama u horno  de 
grafito).  
B.8.4.1.2  Digestión por vía seca.  
B.8.4.1.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, una cantidad apropiada de muestra.  
Para l a determinación por el método de absorción por flama pesar como máximo 40 g de jugo o bebida,  
20 g de alimentos que contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos y semisólidos. Limite el 
contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el to tal de materia orgánica a 5 g.  
B.8.4.1.2.2  Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o iniciar directamente 
la digestión. En productos con alta concentración de proteínas adicionar una solución de nitrato de magnesio 
al 7,0% p /v y mezclar completamente, llevar a sequedad aproximadamente durante 6 h en estufa a una 
temperatura de 90 a 95ºC.  
B.8.4.1.2.3  Colocar la muestra en una mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4ºC por minuto 
hasta 350°C. Mantener la temperatura ha sta que cesen los humos.  
B.8.4.1.2.4  Elevar gradualmente la temperatura de 500 a 550ºC para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esa temperatura durante 16 h o toda la noche.  
B.8.4.1.2.5  Apagar la mufla y dejar enfriar.  
B.8.4.1.2.6  Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos de 
carbón, mediante el siguiente procedimiento:  
Lavar las paredes del crisol con 2 ml de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una placa de 
calentamiento puesta a 120ºC para remover el exceso de ácido. Colocar la muestra en una mufla fría y elevar 
la temperatura gradualmente de 500 a 550ºC, manteniéndola por el tiempo necesario. Repetir este 
procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que quede libre de carbón remanente.  
B.8.4.1.2.7  Disolver las cenizas completamente en 5 ml de ácido clorhídrico 1 N, transferir la muestra 
disuelta a un tubo de propileno o a un matraz de volumen conocido, enjuagar el crisol con dos alícuotas  de 5 
ml de ácido clorhídrico 1 N y transferir al mismo tubo o matraz para obtener un volumen de 15 ml en el 
primero y llevar al aforo en el segundo, tapar y mezclar, si existe presencia de partículas o materia insoluble, 
filtrar en papel Whatman No. 2, antes de la determinación.  
B.8.4.1.2.8  Correr un blanco de reac tivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B.8.4.1.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
B.8.4.2  Digestión por vía húmeda para la determinación de Estaño.  
B.8.4.2.1  Proceder igual q ue en el punto (B.8.4.1.1.1).  
B.8.4.2.2  No adicionar ácido nítrico si no se lleva a cabo la digestión total en el mismo día.  
B.8.4.2.3  Adicionar 30 ml de ácido nítrico concentrado al matraz y calentar suavemente por 15 min en 
campana para iniciar la digest ión, evitando una excesiva producción de espuma.  
B.8.4.2.4  Hervir suavemente hasta tener un remanente de 3 a 6 ml o hasta que la muestra empiece a 
secarse en el fondo. No dejar que la muestra se calcine.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.8.4.2.5  Retirar la muestra del calor.  
B.8.4.2.6  Al mismo tiempo correr dos blancos de reactivos.  
B.8.4.2.7  Adicionar 25 ml de ácido clorhídrico concentrado, calentar suavemente durante 
aproximadamente 15 min, hasta que todo el cloro sea liberado. Aumentar la temperatura gradualmente hasta 
ebullición.  
B.8.4.2.8  Evaporar hasta obtener de 10 a 15 ml, usando un matraz similar con 15 ml de agua como patrón 
de volumen.  
B.8.4.2.9  Adicionar aproximadamente 40 ml de agua.  
B.8.4.2.10  Agitar y pasar a un matraz de 100 ml y enjuagar con 10 ml de agua.  
B.8.4.2.11  Cuand o el ácido clorhídrico está presente en la digestión, las muestras se pueden quedar toda 
la noche o por más tiempo.  
B.8.4.2.12  Agregar 1 ml de solución de cloruro de potasio en cada matraz.  
B.8.4.2.13  Enfriar a temperatura ambiente.  
B.8.4.2.14  Diluir con a gua y agregar más agua para compensar el volumen de grasa en el matraz.  
B.8.4.2.15  Mezclar perfectamente y filtrar de 30 a 50 ml a través de un papel filtro Whatman No. 2 y 
recoger el filtrado en un recipiente de propileno, polipropileno o polietileno.  
B.8.4.2.16  No filtrar los blancos. Tapar las botellas durante el análisis. Las soluciones son estables por 
varios meses.  
B.8.4.2.17  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B.8.4.2.18  Leer en el aparato de elección (esp ectrómetro de absorción atómica: flama u horno de grafito).  
B.8.4.3  Digestión por vía húmeda para la determinación de Hg.  
B.8.4.3.1  Sistema de reflujo.  
B.8.4.3.1.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en un matraz de digestión y adicionar perlas de ebullición.  
B.8.4.3.1.2  Conectar el matraz al sistema de reflujo y agregar poco a poco la cantidad necesaria de ácido 
nítrico concentrado y calentar durante media hora o hasta que no se observen cambios e n la digestión.  
B.8.4.3.1.3  Dejar enfriar y agregar una mezcla de ácido nítrico y ácido sulfúrico concentrados (1 + 1).  
B.8.4.3.1.4 Calentar y agregar más ácido nítrico gota a gota sobre las paredes del recipiente, hasta que el 
color obscuro de la solución  desaparezca.  
B.8.4.3.1.5  Enfriar.  
B.8.4.3.1.6  Si existe grasa o cera filtrar la solución.  
B.8.4.3.1.7  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B.8.4.3.1.8  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción a tómica de vapor frío).  
B.8.4.3.2  Sistema cerrado.  
B.8.4.3.2.1  Pesar con precisión de ± 0,1 mg, la cantidad apropiada de muestra, dependiendo el tipo de 
ésta, en el recipiente de digestión.  
B.8.4.3.2.2  Agregar la cantidad necesaria de ácido nítrico concentr ado. 
B.8.4.3.2.3  Tapar y sellar perfectamente el recipiente de digestión.  
B.8.4.3.2.4  Si el recipiente de digestión es un matraz Erlenmeyer, colocar éste en una autoclave a 15 lb 
por 30 min. Si se utiliza bomba Parr, calentar en parrilla controlando la tem peratura a un máximo de 300ºC por 
30 min.  
B.8.4.3.2.5  Enfriar a temperatura ambiente.  
B.8.4.3.2.6  En caso de que la digestión no sea completa adicionar peróxido de hidrógeno y repetir la 
digestión.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.8.4.3.2.7  Filtrar en caso de que exista grasa o cera y a nalizar el contenido de Hg.  
B.8.4.3.2.8  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B.8.4.3.2.9  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica de vapor frío).  
B.8.4.4  Digestión para la determinación de As.  
B.8.4.4.1  Digestión por vía húmeda -seca.  
B.8.4.4.1.1  Proceder como en el punto (B.8.4.3.2) hasta que la digestión sea completa y posteriormente 
continuar con los siguientes pasos.  
B.8.4.4.1.2  Con una pipeta tomar una alícuota de la solución de muest ra digerida y colocarla en un crisol 
Vycor o vaso de precipitados.  
B.8.4.4.1.3  Añadir 1 ml de solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y calentar en una parrilla a 
temperatura baja, hasta sequedad.  
B.8.4.4.1.4  Incrementar el calor de la placa a un máximo de 375ºC.  
B.8.4.4.1.5  Colocar el matraz en la mufla a 450ºC para oxidar cualquier residuo de carbón y descomponer 
el exceso de nitrato de magnesio, por un tiempo mayor o igual a 30 min.  
B.8.4.4.1.6 Enfriar y disolver el residuo en 2 ml de ácido clorhídrico  8 M. 
B.8.4.4.1.7 Añadir 0,1 ml de yoduro de potasio al 20% p/v para reducir el As(V) a As(III).  
B.8.4.4.1.8  Dejar reposar por un tiempo mayor a 2 min y transferir a un matraz y llevar al aforo con agua.  
B.8.4.4.1.9  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B.8.4.4.1.10  Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno de grafito o generador de hidruros).  
B.8.4.4.2  Digestión por vía seca.  
B.8.4.4.2 .1 Pesar con precisión de ± 0 ,1 mg, la cantidad necesaria de muestra en un crisol Vycor o de 
platino.  
B.8.4.4.2.2  Añadir el volumen necesario de nitrato de magnesio al 50% p/v.  
B.8.4.4.2.3  Homogeneizar con una varilla limpia de plástico extendiendo la mezcla en el crisol.  
B.8.4.4.2.4  Colocar la muestra en una mufla subiendo gradualmente la temperatura hasta 300ºC por 2 h. 
Posteriormente subir gradualmente la temperatura hasta 500ºC por 16 h o durante toda la noche.  
B.8.4.4.2.5 Enfriar a temperatura ambiente y humedecer las cenizas con ácido nítrico al 50% v/v.  
B.8.4.4.2.6  Calentar en parrilla hasta la eliminación del ácido.  
B.8.4.4.2.7  Llevar los crisoles a una mufla elevando gradualmente la temperatura de 23 a 500ºC, 
manteniendo ésta 30 min hasta evaporación total.  
B.8.4.4.2.8 Transfer ir las cenizas del crisol a un matraz aforado usando una porción de 10 ml de ácido 
clorhídrico 0,5 N.  
B.8.4.4.2.9  Enjuagar los crisoles con 5 ml de agua destilada y transferir al matraz, añadir 1 ml de solución 
de yoduro de potasio al 15% y mezclar.  
B.8.4. 4.2.10  Dejar reposar durante 15 min y llevar al aforo.  
B.8.4.4.2.11  Correr un blanco de reactivos y muestra fortificada por cada serie de digestión.  
B.8.4.4.2.12 Leer en el aparato de elección (espectrómetro de absorción atómica con adaptación para 
horno d e grafito o generador de hidruros).  
B.8.4.5  Digestión para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, hierro, zinc y plata por 
horno de microondas.  
Pesar con precisión de ± 0,1 mg, 0,5 g como máximo de muestra, añadir 6 ml de ácido nítrico  concentrado 
y 2 ml de agua oxigenada al 30%, cerrar perfectamente el envase de reacción y proceder según el manual del 
fabricante.  
B.8.5 Procedimiento  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.8.5.1  Espectrometría de absorción atómica por flama.  
B.8.5.1.1  Calibración. Es necesario comprobar que  se tiene una calibración inicial y periódica aceptable.  
B.8.5.1.1.1  Se inicia la configuración operacional del instrumento y en el sistema de adquisición de datos. 
Permitir un periodo no menor a 30 min para el calentamiento de las lámparas de descarga sin  electrodos.  
B.8.5.1.1.2  Se debe verificar la estabilidad del instrumento mediante el análisis de una solución estándar 
20 veces más concentrada que el límite de detección del instrumento (LDI) para el analito, leída un mínimo de 
cinco veces y calculando l a desviación estándar resultante, la cual debe ser menor al 5%.  
B.8.5.1.1.3  El instrumento debe calibrarse para el analito a determinar usando el blanco de calibración y 
los estándares de calibración preparados a 3 o 4 niveles de concentración dentro del i ntervalo dinámico de 
concentración del analito.  
B.8.5.1.1.4  Ajustar el instrumento a 0 con el blanco de calibración. Introducir los estándares de calibración 
del analito de menor a mayor concentración y registrar al menos tres réplicas de la absorbancia de  cada uno.  
B.8.5.1.1.5  Elaborar una curva de calibración graficando absorbancia en función de la concentración.  
Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar s u concentración teórica.  
B.8.5.1.2  Operación del instrumento.  
El desempeño del instrumento se verifica mediante el empleo de blancos de calibración, estándares de 
calibración y una muestra de control de calidad (MCC).  
B.8.5.1.2.1  Después de que se ha reali zado la calibración, se debe verificar que el instrumento trabaje 
adecuadamente para el analito. Para ello se analiza una muestra de control de calidad. Si las mediciones 
varían en ± 10% o más, al valor establecido para la MCC, el análisis debe interrumpir se y buscar la posible 
causa de error, el instrumento se debe recalibrar y verificar la nueva calibración.  
B.8.5.1.2.2  Para verificar que el instrumento no presenta variación, por cada 10 análisis se debe analizar 
el blanco de calibración y un punto interm edio de la curva de calibración. Si el valor verdadero del analito 
difiere ± 10% o más, el instrumento debe recalibrarse. Si el error persiste debe identificarse el problema y 
corregirse.  
Si la matriz de la muestra es responsable de la variación o afecta l a respuesta del analito puede ser 
necesario trabajar por adiciones estándar.  
B.8.5.1.2.3  La demostración de la operatividad inicial del instrumento se hace estableciendo los límites de 
detección del método (LDM) para el analito y el intervalo de calibració n lineal. Para determinar el LDM se usa 
un blanco de reactivos fortificado con una concentración del analito equivalente de 2 a 5 veces el límite de 
detección estimado. Se hacen al menos 4 réplicas de lectura de absorbancia del blanco de reactivos 
fortific ado procesado a través de todo el método analítico. Los LDM se calculan de acuerdo con:  
 
En donde:  
t = valor de la "t" de Student a un intervalo de confianza de 95% y una desviación estándar estimada para 
n-1 grados de libertad. t = 3,14 para 7 réplicas.  
s = desviación estándar de las réplicas del análisis.  
El intervalo lineal de calibración se establece a partir de por lo menos 4 estándares de diferente 
concentración, uno de los cuales debe estar próximo al límite superior del intervalo lineal.  
B.8.5.1.3  Determinación  
B.8.5.1.3.1 Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito de acuerdo con las indicaciones del manual del instrumento.  
B.8.5.1.3.2 Introducir el blanco de reactivos y la muestra a an alizar y registrar los valores de absorbancia. 
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada grupo de muestras. Los valores obtenidos ponen 
de manifiesto la calidad de los reactivos usados y el grado de contaminación del laboratorio.  
B.8.5.1.3. 3 En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración 
del elemento en las unidades de concentración utilizadas.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.8.5.1.3.4 Se debe analizar al menos un blanco de reactivos fortificado para cada grupo de muestras. Se  
calcula la exactitud como el porciento de recuperación (de acuerdo con el apartado B.8.5.1.3.6).  
B.8.5.1.3.5 Se debe fortificar al menos una muestra por grupo o el 10% de ellas lo que resulte mayor. La 
concentración añadida debe ser de aproximadamente 0,1  unidades de absorbancia.  
B.8.5.1.3.6 Se debe calcular el porciento de recuperación para el analito, de acuerdo con:  
 
En donde:  
CM = Concentración de la muestra fortificada  
C = Concentración de la muestra  
CA = Concentración equivalente de analito añadido a la muestra.  
Si la recuperación del analito en la muestra fortificada está fuera del intervalo previamente establecido y el 
blanco de reactivos fortificado está correcto, puede existir un problema relacionado con la matriz de la 
muestra. Los datos se debe n verificar por el método de las adiciones estándar.  
B.8.5.2  Espectrometría de absorción atómica por horno de grafito.  
B.8.5.2.1  Calibración  
B.8.5.2.1.1  Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.1.1 a B.8.5.1.1.4).  
B.8.5.2.1.2  Elaborar una curva de calib ración graficando área de pico o altura máxima contra 
concentración del analito.  
La calibración mediante el uso de una computadora o una calculadora basada en el ajuste sobre los datos 
de concentración respuesta es aceptada.  
Lo anterior puede llevarse a ca bo en equipos que se programan directamente, en los cuales sólo es 
necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
B.8.5.2.2  Operación del instrumento.  
B.8.5.2.2.1  Proceder de acuerdo con (B.8.5.1.2.1 a B.8.5.1.2.3).  
B.8.5.2.3  Determ inación  
B.8.5.2.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación del analito, de acuerdo con las recomendaciones del manual del instrumento.  
El programa de temperaturas para el horno de grafito puede variar  dependiendo de la matriz de la 
muestra. En el caso de existir interferencias no específicas (absorción molecular o dispersión de la luz), se 
recomienda consultar la bibliografía existente en cuanto a los métodos disponibles para eliminarlas, así como 
en el caso de interferencias de matriz.  
B.8.5.3  Espectrometría de absorción atómica por generador de hidruros.  
B.8.5.3.1  Calibración  
B.8.5.3.1.1  Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.1.1 a B.8.5.1.1.4).  
B.8.5.3.1.2  A partir de la solución estándar de As de 1000 mg/l, preparar una solución de As de 1 mg/l en 
ácido clorhídrico de concentración apropiada al método. Trazar una curva de calibración de absorbancia 
(máximo de la altura de pico) en función de la concentración del analito para un intervalo de conc entración de 
0 a 10 µg/l de As bajo las mismas condiciones de la matriz de la muestra.  
B.8.5.3.2  Operación del instrumento.  
B.8.5.3.2.1  Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.2.1 a B.8.5.1.2.3).  
B.8.5.3.3  Determinación  
B.8.5.3.3.1  Ajustar el instrumen to de absorción atómica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de As: longitud de onda de 193,7 nm y lámpara de descarga sin electrodos. Colocar y ajustar  
la celda de absorción de acuerdo con el manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas ( nitrógeno o argón).  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.8.5.3.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración de ácido clorhídrico al 1,5% siguiendo 
las instrucciones del manual del fabricante.  
B.8.5.3.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al  analito (por lo general, 
10 ml de una solución de 5 µg/l de As da una absorbancia de 0,2), ajustando el tiempo de purga I, el tiempo 
de reacción y el tiempo de purga II.  
B.8.5.3.3.4  Tomar un volumen conocido de la muestra dirigida y seguir el mismo proced imiento que con 
los estándares de calibración.  
B.8.5.4  Espectrometría de absorción atómica por vapor frío.  
B.8.5.4.1  Calibración  
B.8.5.4.1.1  Proceder igual que en los puntos (B.8.5.1.1.1 a B.8.5.1.1.4.).  
B.8.5.4.1.2  A partir de la solución de trabajo de 1 µg/ml preparar estándares de calibración que contengan 
0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1,0 µg de Hg a frascos de reacción. A cada frasco agregar 100 ml de la solución  de 
dilución y 20 ml de la solución de reducción. Trazar la curva de calibración de absorbancia ( altura máxima de 
pico) en función de la concentración del analito.  
B.8.5.4.2  Operación del instrumento.  
B.8.5.4.2.1  Proceder de acuerdo con los puntos (B.8.5.1.2.1 a B.8.5.1.2.3).  
B.8.5.4.3  Determinación  
B.8.5.4.3.1  Ajustar el instrumento de absorción atóm ica en las condiciones adecuadas para la 
determinación de Hg: longitud de onda de 253,6 nm, slit 0,7 nm y lámpara de cátodo hueco. Colocar y ajustar 
la celda de absorción de acuerdo con el manual del fabricante. Ajustar el flujo de gas (nitrógeno o argón).  
B.8.5.4.3.2  Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración (solución de dilución y de reducción) 
siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.  
B.8.5.4.3.3  Optimizar con un estándar de calibración la respuesta del instrumento al analito.  
B.8.5.4.3.4  Tomar 25 ml de la muestra digerida y seguir el mismo procedimiento que con los estándares 
de calibración.  
B.8.6 Expresión de resultados  
B.8.6.1 Método de cálculo  
Interpolar los valores de absorbancia o altura de pico de la muestra analizada en la curva de calibración y 
obtener los mg/kg del elemento en la muestra y realizar los cálculos empleando la siguiente fórmula:  
 
En donde:  
A = Concentración en mg/kg de la muestra a interpolar en la curva de calibración.  
B = Volumen final al que se llevó l a muestra (ml).  
C = Peso de la muestra (g) o volumen de la muestra (ml) en el caso de agua.  
En los equipos que pueden programarse, la lectura obtenida da directamente la concentración del 
elemento en mg/kg o µg/kg.  
B.8.7 Informe de la prueba  
Los resultados  se informarán en mg/kg o µg/kg del elemento a determinar.  
B.9 DETERMINACI ON DE MATERIA EXTRAÑA EN LECHE, F ORMULA L ACTEA O PRODUCTO 
LACTEO COMBINADO  
B.9.1  Principio del método  
Los insectos enteros, fragmentos de los mismos, pelos de roedor o alguna materia  extraña se separan de 
la muestra por filtración para su identificación al microscopio.  
B.9.2. Equipo        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.9.2.1 Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad  
B.9.2.2 Equipo de filtración al vacío.  
B.9.2.3  Microscopio binocular estereoscopio con objetivos que pueden ser de 3, 6, 7 y 10 X, oculares 
apareados de amplio campo visual de 10, 30 y 100 X, respectivamente.  
B.9.2.4 Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente.  
B.9.3  Materiales  
B.9.3.1 Embudo Büchner.  
B.9.3.2 Matraz Kitazato.  
B.9.3.3 Vasos de pr ecipitados de 1000 ml.  
B.9.3.4 Caja Petri.  
B.9.3.5 Papel de filtración rápida para conteo con líneas paralelas de aproximadamente 5 mm de 
separación.  
B.9.3.6 Material común de laboratorio.  
B.9.4. Reactivos  
Los reactivos que a continuación se mencionan debe n ser grado analítico a menos que se indique otra 
especificación y por agua debe entenderse agua destilada.  
B.9.4.1  Solución de carbonato de sodio (Na 2 CO3) al 2%.  
Disolver 2 g de carbonato de sodio en agua y llevar al volumen de 100 ml.  
B.9.4.2  Solución d e oxalato de sodio (Na 2 C2 O4) al 3%.  
Disolver 3 g de oxalato de sodio Na 2 C2O4 en agua y llevar al volumen de 100 ml.  
B.9.4.3  Mezcla de glicerina:etanol 1:3 (v/v) (opcional).  
B.9.5 Procedimiento  
B.9.5.1 Preparación de la muestra  
B.9.5.1.1  Productos líquid os 
Mezclar bien todo el contenido de la muestra.  
B.9.5.1.2  Productos deshidratados  
Pesar por duplicado 50 g de leche descremada o 65 g de leche entera y reconstituir ajustando el volumen 
a 500 ml con agua a 40ºC.  
B.9.5.2  Determinación  
B.9.5.2.1 Filtrar tod a la muestra sobre un embudo de succión preparado con papel filtro para conteo, 
tratando de vertirlo uniformemente.  
B.9.5.2.2 Durante la filtración lavar continuamente el papel filtro con agua a 80ºC aproximadamente, para 
evitar la acumulación de partícula s que tapen los poros del papel.  
B.9.5.2.3 Pasar el papel filtro a una caja Petri y humedecerla con la mezcla glicerina -etanol (opcional). 
Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte que muestre los detalles en el papel filtro.  
B.9.5. 2.4 Contar con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea por línea y explorar 
cada pieza del material dado que algunos fragmentos son irreconocibles a menos que se muevan.  
B.9.6 Expresión de resultados  
B.9.6.1 Productos deshidratados  
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos de roedor y 
cualquier materia extraña que se encuentre en 50 g o 65 g de muestra  
 
B.9.6.2 Productos líquidos  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos, pelos d e roedor y 
cualquier materia extraña que se encuentre en la cantidad de ml que contenga el 
envase analizado  
 
METODOS PARA LA DETERMINACI ON DE NUTRIMENTOS  
B.10 DETERMINACI ON DE VITAMINA A POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCI ON 
(HPLC EN FASE REVERSA)  
B.10.1 Principio del método  
Los lípidos son ésteres que en presencia de un álcali cáustico se hidrolizan liberando el material 
insaponificable, el cual es extraído con un disolvente orgánico. Posteriormente la vitamina A contenida en este 
material, es cuan tificada por medio de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución.  
B.10.2 Equipo  
B.10.2.1. Sistema de HPLC que incluye:  
B.10.2.1.1 Bomba HPLC.  
B.10.2.1.2 Inyector automático o manual de muestras.  
B.10.2.1.3 Detector espectrofotométrico de longitud de onda  variable UV -Visible LC.  
B.10.2.1.4 Integrador computarizado LC.  
B.10.2.1.5 Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 µm, longitud 250 mm x diámetro interno 
4,6 mm.  
B.10.2.2 Balanza analítica, con capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg.  
B.10.2.3 Placas  de agitación con calentamiento.  
B.10.2.4 Cilindro para gas comprimido de nitrógeno pureza 95%.  
B.10.2.5 Cilindro para gas comprimido de helio pureza 95%.  
B.10.2.6 Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño maría.  
B.10.2.7 Equipo de filtración para la  preparación de la fase móvil.  
B.10.2.8 Cronómetro o reloj.  
B.10.3 Materiales  
B.10.3.1 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón con tapón de vidrio o teflón de 50 y 100 ml.  
B.10.3.2 Matraces actínicos o de color marrón de fondo plano, cuello corto  de 250 ml.  
B.10.3.3 Matraces, en forma de pera actínicos o de color marrón, de cuello corto y boca esmerilada  de 
500 ml (que embone en el rotavapor).  
B.10.3.4 Matraces volumétricos actínicos o de color marrón de 10 ml.  
B.10.3.5 Vasos de precipitados de 5 00 ml.  
B.10.3.6 Embudo de separación cónico, actínicos o de color marrón, con llave de teflón 500 ml.  
B.10.3.7 Embudo tallo corto diámetro 12 cm.  
B.10.3.8 Tapones de teflón huecos hexagonales o actínicos o de color marrón.  
B.10.3.9 Refrigerante con macho y  hembra, manguito 300 ml, de 50 cm de longitud aproximadamente.  
B.10.3.10 Manguera de látex.  
B.10.3.11 Papel filtro mediano No. 1 con diámetro de 18,5 cm.  
B.10.3.12 Pipetas volumétricas con marca de 5 y 4 ml.  
B.10.3.13 Jeringa de vidrio sin aguja desechabl e de 10 ml.  
B.10.3.14 Jeringa de vidrio de 50 µl con aguja sin punta.  
B.10.3.15 Filtros para jeringa (acrodiscos para HPLC) de 0,45 µm de tamaño de poro y diámetro de  25 
mm, para solventes orgánicos y fase móvil.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.10.3.16 Membranas de filtración de fluor uro de polivinilideno, utilizada para fases móviles (solventes 
orgánicos y acuosos), cuyos extractables sean de absorción en UV, u otro filtro para fines similares.  
B.10.3.17 Magnetos para placa de agitación.  
B.10.4 Reactivos  
Los reactivos que a continuaci ón se mencionan deben ser grado analítico y por agua debe entenderse 
agua destilada.  
B.10.4.1 Estándar de retinol (vitamina A) cristalizada (C 20H30O) all trans RETINOL con certificado de 
pureza.  
B.10.4.2 Hidróxido de potasio en lentejas (KOH).  
B.10.4.3 Alcohol etílico absoluto (C 2H5OH).  
B.10.4.4 Eter de petróleo intervalo de ebullición 40 a 60°C.  
B.10.4.5 Fenolftaleína en solución etanólica al 1%, indicador (C 20H14O4). 
B.10.4.6 Metanol grado HPLC (CH 3OH).  
B.10.4.7 Agua destilada filtrada (sólo para la prepa ración de fase móvil).  
B.10.4.8 Agua destilada que se utilizará en los lavados del saponificado (verificar que el valor de pH no 
sea mayor de 6,0).  
B.10.4.9 Sulfato de sodio anhidro (Na 2SO4). 
B.10.4.10 Acido ascórbico (C 6H8O6). 
B.10.4.11 Fase móvil metanol : agua (95:5) para HPLC.  
Pasar agua destilada a través de una membrana de filtración para soluciones acuosas. Pasar metanol a 
través de una membrana de filtración para solventes orgánicos. Posteriormente mezclar 50 ml de agua 
destilada en 950 ml de metanol  (fase móvil). Degasificar la fase móvil pasando una ligera corriente de gas 
helio o por ultrasonido 15 min a temperatura ambiente.  
B.10.4.12 Soluciones patrón de vitamina A  
B.10.4.12.1 Solución concentrada (150 µg equivalentes de retinol). Justo antes de emplearse, pesar 15 mg 
de retinol cristalizado (A -OH) y registrar el peso exacto. Colocar el estándar pesado en un matraz volumétrico 
de 100 ml. Disolver con metanol y llevar al volumen.  
B.10.4.12.2 Solución intermedia (15 µg equivalentes de retinol)  
Diluir 5 ml de la solución concentrada a 50 ml con el mismo metanol para obtener una solución de 
aproximadamente 50 U.I./ml.  
B.10.4.12.3 Solución de trabajo (6 µg equivalentes de retinol)  
Añadir 4 ml de la solución estándar intermedia al matraz marcado como est ándar y adicionar los reactivos 
al igual que al blanco y muestra como se indica en el apartado de saponificación. Esta solución tendrá 
aproximadamente 20 U.I./ml de vitamina A, al final del proceso de recuperación, en el matraz volumétrico de 
10 ml.  
Nota 1 : Si el certificado de % de pureza en el estándar es inferior al 85% no debe prepararse la solución 
patrón, siendo necesario un nuevo estándar de otro lote con una pureza superior a la antes indicada.  
Nota 2: La vitamina A -OH (A -alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir una 
ampolleta nueva de vitamina A -cristalizada, pesar la cantidad de estándar requerida y guardar la ampolleta 
bajo atmósfera de nitrógeno o en condiciones similares.  
B.10.5 Procedimiento  
Nota 3: La vitamina A e s sensible a la luz. Utilizar material actínico o de color marrón o bien, proteger el 
material con papel aluminio. Por otra parte efectuar las evaporaciones con rotavapor a una temperatura 
máxima de 40ºC. No evaporar a sequedad. Romper el vacío e inmediata mente introducir nitrógeno al sistema 
o al matraz. Evaporar los últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno sin llegar a la sequedad.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.10.5.1 Toma de muestra  
En el caso de productos deshidratados, reconstituir con agua, de acuerdo con las instr ucciones señaladas 
en la etiqueta o 130 g del producto llevados a 1 l con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de 
homogeneizarla por completo.  
Medir de preferencia por duplicado una cantidad de muestra tal, que contenga de 30 a 90 µg equivalentes 
de re tinol (100 a 300 U.I. de vitamina A) o la cantidad correspondiente a lo declarado en la etiqueta de la 
muestra. En caso de no contar con esta información no es conveniente realizar el análisis.  
B.10.5.2 Saponificación  
B.10.5.2.1 Marcar 4 matraces actínicos  de cuello corto y esmerilado con fondo plano de 250 ml (cuando la 
muestra se trabaje por duplicado) de la siguiente manera: blanco, estándar y muestra.  
B.10.5.2.2 Añadir los siguientes reactivos a cada uno de los matraces antes mencionados: 7 g de 
hidróxi do de potasio y a continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto. Mezclar para disolver. Agregar 0,5 g 
de ácido ascórbico así como una barra magnética. Adicionar una ligera corriente de nitrógeno a cada uno de 
los matraces.  
B.10.5.2.3 Montar un sistema de r eflujo y calentar durante 30 min en placas de calentamiento o baño de 
agua en ebullición con agitación constante.  
Nota 4: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
B.10.5.3 Extracción del insaponificable  
B.10.5.3.1 Una vez concluido el tiempo de saponificación, enjuagar con máximo 30 ml de agua destilada 
(evitar el exceso de agua para prevenir la formación de emulsiones) por las paredes internas del refrigerante 
sin quitar el matraz del saponificado. Enfriar el matraz aú n instalado al refrigerante sumergiéndolo 
parcialmente en un vaso de precipitados que contenga agua fría, lo anterior con la finalidad de llevarlo a 
temperatura ambiente, evitando enfriarlo demasiado. Trasvasar la suspensión a un embudo de separación de 
500 ml.  
B.10.5.3.2 Enseguida enjuagar el matraz con 100 ml de éter de petróleo que se añaden al embudo de 
separación. Extraer la vitamina A agitando ligeramente. Dejar separar las fases. Vaciar la fase acuosa a otro 
embudo de 500 ml. Recoger la fase orgánica  a un tercer embudo de separación de 500 ml. Repetir la 
operación dos veces más, enjuagando el matraz con dos porciones de 100 ml de éter cada una.  
B.10.5.3.3 Efectuar esta extracción 3 veces en total (un lavado de 50 ml y 2 lavados de 100 ml). Hacer las 
agitaciones con mucho cuidado para evitar emulsiones.  
B.10.5.3.4 Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del 
embudo, agitando suavemente, hasta que el agua del lavado ya no dé reacción colorida con la fenolft aleína. 
Después del último lavado, esperar de 15 a 30 min antes de vaciar la fase acuosa y volver a revisar con el 
indicador que no exista reacción colorida.  
B.10.5.3.5 Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamen te 10 g 
de sulfato de sodio anhidro y recoger el filtrado en un matraz de pera de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Al final 
enjuagar el sulfato de sodio contenido en el filtro con 50 ml de éter de petróleo.  
B.10.5.3.6 Evaporar el disolvente en un rotavap or a 40ºC y dejar un remanente de aproximadamente 6 ml. 
Tratar de reducir esta cantidad del disolvente a un volumen de 2 ml aproximadamente mediante una corriente 
de nitrógeno.  
B.10.5.3.7 Disolver el remanente obtenido con 3 ml de la fase móvil y recolecta r cuantitativamente la 
solución con una jeringa de vidrio. Filtrar la solución a través de un filtro acrodisco de 0,45 µm a un matraz 
actínico de 10 ml. Lavar el matraz pera con porciones de 2 ml de fase móvil y repetir el mismo procedimiento 
hasta llegar al aforo del matraz. Hacer lo mismo para cada filtro de blanco, estándar y probar por duplicado.  
Nota 5: Se recomienda acondicionar el acrodisco de 0,45 µm con metanol antes de utilizarlo en la filtración 
del recuperado.  
B.10.5.4 Condiciones cromatográfica s 
B.10.5.4.1 Fijar los siguientes parámetros de acuerdo con las instrucciones de operación del cromatógrafo. 
Columna Octadecil ODS (20), tamaño de partícula 5 µm, longitud 250 mm x diámetro interno 4,6 mm.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Loop de inyección: 20 µl.  
Fase móvil: metanol: agu a 95:5.  
Flujo: 1 ml/min.  
Detector: Longitud de onda ajustada a 325 nm.  
Registrador: 5 mm/min.  
B.10.5.5 Determinación de vitamina A  
Inyectar dos veces los siguientes analitos: primero 20 µl del blanco, después 20 µl de la solución estándar 
para HPLC (20 U.I ./ml aprox.) y por último 20 µl de la muestra (del saponificado).  
B.10.5.5.1 En el cromatograma, identificar el pico y tiempo de retención de la vitamina A correspondiente 
al estándar. Con estos datos, identificar el pico y tiempo de retención de la vitami na A contenida en la 
muestra.  
B.10.5.5.2 Calcular la altura del pico de la solución patrón y de las muestras en los cromatogramas 
obtenidos.  
B.10.6 Cálculos  
El contenido de vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por litro de producto es igual a:  
 
En donde:  
m = toma de ensayo en g o ml.  
hP = altura del pico de la muestra, en mm.  
hS = altura del pico de la solución estándar final, en mm.  
C = concentración de la solución estándar final inyectada, en U.I./ml para la vitamina A.  
V = volumen de soluci ón estándar final, en el cual ha sido diluido el remanente antes de la cromatografía.  
Los resultados deben reportarse como µg equivalentes de retinol.  
B.10.7 Expresión de resultados  
µg equivalentes de retinol/l  
1 U.I.= 0,3 µg equivalentes de retinol (todos  los retinoles trans)  
B.11 DETERMINACI ON DE LAS VITAMINAS A Y E POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA 
PRESI ON (HPLC EN FASE NORMAL)  
B.11.1 Fundamento  
Saponificación de la muestra; extracción de los compuestos insaponificables; evaporación y redisolución 
en n-hexano e inyección en la columna en fase normal  
B.11.2 Material y equipo  
Todo el material utilizado debe estar estéril  
Instalación HPLC isocrática  
Uno o dos registradores  
Balanza analítica con capacidad de 160 g lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión con capac idad de 1600 g lectura 0,01 g  
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)  
Baño maría con agitadores magnéticos de 4 plazas  
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño  
Matraces aforados vidrio marrón con tapón de vidrio de 50 y 100 ml  
Matraz de f ondo plano con cuello corto de 250 ml  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Matraces en forma de pera con vidrio marrón de 10 y 500 ml  
Embudo de separación cónico vidrio marrón con llave de 500 ml  
Embudo vidrio marrón, diámetro 12 cm  
Tapones huecos hexagonales vidrio marrón  
Refrigerante con ma cho y hembra manguito 300 mm  
Alargadera para introducción de gas  
Ampolleta de vidrio marrón de 5 ml  
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm  
Pipetas aforadas con una marca de 3 y 5 ml  
Jeringuillas de 1 y 5 ml  
Aguja para jeringuillas  
Cilindro para gas  comprimido de nitrógeno  
Monodetentor para gas comprimido, nitrógeno  
Filtro de 0,45 µ de diámetro  
Columna de 5 µ, 4,6 X 250  
Aparato de filtración  
Filtro 0,5 µ  
B.11.3 Reactivos  
Retinol (vitamina A) cristalizada (C 20H30O) 
DL-alfa-tocoferol (vitamina E) para fines bioquímicos (C 29H50O2) 
Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH)  
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C 2H5OH) 
Hidroquinona (C 6H4(OH) 2) 
Eter de petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 - 60ºC  
Fenolftaleína en solución etanólica  al 1%, indicador ((C 6H4OH) 2COC 6H4CO) 
diastasa (para productos de almidón)  
2-propanol ((CH 3)2CHOH)  
n-hexano (CH 3(CH 2)4CH3) 
Sulfato de sodio anhidro para análisis (Na 2SO4) 
Nitrógeno (N 2) 
Acido ascórbico (C 6H8O6) 
B.11.3.1 Fase móvil para HPLC, 2 -propanol al 1% en n -hexano.  
Degasificar el n -hexano bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 10 ml de 2 propanol 
con 990ml de n -hexano degasificado.  
B.11.3.2 Solución patrón de vitamina A  
B.11.3.2.1 Solución concentrada  
Justo antes del uso, pesar e n un matraz aforado de 100 ml aproximadamente 15 mg de retinol cristalizado 
(A - OH) y tomar el peso exacto, disolver en n -hexano y llevar a volumen con el mismo disolvente (= solución 
de aproximadamente 500 U.I./ml).  
Esta solución permanece estable 1 sema na a 4ºC.  
B.11.3.2.2 Solución para HPLC  
Diluir 5 ml de solución (B.11.3.2.1) a 50 ml con el mismo disolvente para obtener una solución de 
aproximadamente 50 U.I./ml  
Medir la extinción (E) a 325 nm y determinar la concentración de la vitamina A -OH, en U.I./ ml, según:  
1%       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
E1cm en n-hexano = 1815  
Para 1 U.I. A -OH/ml E = 0,0545  
Si el contenido es inferior a 85 % del valor teórico no puede utilizarse esta solución patrón, es necesaria 
una nueva preparación. Si se obtiene otro valor debe considerarse en los cálculo s finales.  
NOTA:  
La vitamina A -OH (A -alcohol) se oxida con gran rapidez y es muy sensible a la luz. Al abrir una nueva 
ampolleta de vitamina A -alcohol cristalizada, distribuir el contenido a razón de 50 mg en pequeñas ampolletas 
marrones. Trabajar en una c ámara oscura. Las ampolletas deben cerrarse inmediatamente bajo nitrógeno.  
B.11.3.3 Solución patrón de vitamina E  
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 100 mg de alfa - tocoferol (E -OH), disolver en  n-
hexano y llevar al volumen con el mismo dis olvente.  
Diluir esta solución 5 veces con el mismo disolvente para obtener una solución de 0,2 mg/ml. Esta solución 
permanece estable una semana a 4ºC.  
B.11.4 Procedimiento  
NOTAS:  
Las vitaminas A y E son sensibles a la luz. Utilizar material de vidrio marr ón, o proteger el material 
corriente con papel aluminio.  
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 
40ºC. No debe evaporarse a seco. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los 
últimos mililitros mediante una corriente de nitrógeno.  
B.11.4.1 Toma de ensayo  
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una 
toma de ensayo que contenga 100 a 300 UI de vitamina A y 0,5 a 1 mg de v itamina E, lo que corresponde en 
general a 10 g.  
B.11.4.1.1 Productos con almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 ml de agua destilada a 45 a 50 ºC. Mezclar bien para obtener 
una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 
30 min en una estufa a 45ºC.  
B.11.4.1.2 Productos sin almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello  esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
máximo 30 ml de agua destilada a 45 a 50ºC.  
B.11.4.2 Saponificación  
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz B.34.3.3.1 o B.34.3.1.2, y mezclar para 
disolver. A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.  
Montar sobre un sistema de reflujo, introducir una ligera corriente de gas nitrógeno y calentar durante 30 
min en un baño maría ebulliendo provisto de agitadores magnéticos.  
NOTA:  
Durante la sapon ificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
B.11.4.3 Extracción del insaponificable  
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y trasvasar la suspensión a 
un embudo de separación de 500 ml.  
Enjuagar con  máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo 
de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.  
Enseguida enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 a 60 ºC) e n varias porciones que 
se añaden al embudo de separación. Extraer las vitaminas A y E agitando ligeramente. Dejar separar las 
fases. Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 500 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer 
embudo de separación de 500 ml.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar 
emulsiones.  
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionándola por las paredes del embudo, 
sin agitar, hasta que el agua de lava do ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último 
lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa.  
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de 
sodio anhidro o  en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera 
de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 ml de éter de petróleo.  
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a  40ºC, y eliminar los últimos mililitros 
mediante una corriente de nitrógeno.  
Disolver el residuo en 3 ml de la fase móvil (B.11.2.1) y filtrar la solución inmediatamente a través de un 
filtro de 0,45 µ de tamaño de poro y adecuado para solventes orgánicos , recoger el filtrado en un matraz. El 
filtrado debe ser límpido.  
La solución está lista para la cromatografía.  
B.11.5 Cromatografía  
Condiciones:  
Columnna:  Spherisorb Sílice, 5 µm, 4,6 X 250 mm  
Loop de inyeccción:  20 µl  
Fase móvil:  1% 2 -propanol en n -hexan o (34.3.1)  
Caudal:  2 ml/min  
Detector:  ya sea: espectrofotómetro, longitud de onda  variable, ajustada a 292 nm, 0,2 AUFS  
 ya sea: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 325 nm,  0,2 
AUFS, para la vitamina A, en serie con espectrofluorímetro  para vitamina E.  
Ex: 294 nm, Em: 236 nm.  
Registrador:  10 mm/min  
Inyectar primero 20 µl de solución patrón de vitamina E (B.11.3.3) y determinar el tiempo de retención: 
debe ser aproximadamente 8 min. En seguida inyectar 20 µl de extracto obtenido bajo B.1 1.3. 
B.11.6 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados  
B.11.6.1 Evaluación  
Identificar los picos de las vitaminas A y E en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de 
retención definido por cromatografía de la solución de la muestra y de  la solución patrón correspondiente.  
El contenido en vitamina A, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, y el contenido 
en vitamina E, expresado en mg por 100 g de producto, es igual a:  
 
En donde:  
m = toma de ensayo, en g.  
hP = altura  del pico de la muestra, en mm  
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm  
C = concentración de la solución patrón inyectada, en U.I./ml para la vitamina A, y en mg/ml para la 
vitamina E  
V = volumen, en ml, en el cual ha sido diluido el residuo antes  de la cromatografía (3.3)  
B.11.6.2 Límite de detección de acuerdo con la sensibilidad del equipo.  
1 mg de D - á - tocoferil acetato es = 1 U.I. de vit. E        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
1 mg de DL - á - tocoferol = 1,1 U.I. de vit. E  
Vitamina A: aproximadamente 50 U.I./ 100 g  
Vitamina E: espectrofotometría: aprox. 0,5 mg/100 g  
fluorimetría: aprox. 0,2 mg/100 g  
B.11.6.3 Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un co rto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos resultados.  
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fuertemente influida por 
el grado de homogeneidad del producto.  
NOTA: Para la determinación de  vitamina A, en leche seguir la metodología anterior leyendo con el 
detector de UV a 325 nm.  
La determinación de vitamina A y vitamina E puede hacerse de manera conjunta contando con un detector 
de UV programable o con detector de UV y un fluorómetro. Si n o se cuenta con detector de UV programable o 
fluorómetro, inyectar dos veces la muestra para determinar las vitaminas por separado.  
B.11.6.4 El contenido de tiamina en los productos objeto de esta Norma no debe ser inferior a  100 µg/100 
g del producto lis to para ser consumido.  
Debe decir:  
B.11.6.5 El contenido de tiamina en los productos objeto de esta Norma no debe ser inferior  a 100 µg/100 
kcal. 
B.12 DETERMINACI ON DE VITAMINA D 3 POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA PRESI ON 
(HPLC)  
B.12.1 Preparación de la mu estra  
En el caso de productos deshidratados reconstituir con agua, de acuerdo con las instrucciones señaladas 
en la etiqueta o 130 g de producto llevado a 1 l con agua. Disolver y agitar la muestra a fin de homogeneizarla 
por completo. Medir de preferencia  por duplicado una cantidad de muestra que contenga de 0,5 a 1 µg de 
vitamina D3  (20 a 40 U.I.).  
B.12.2 Fundamento  
Saponificación alcalina de la muestra; extracción con éter de compuestos insaponificables; evaporación 
del éter; solución del residuo seco en  hexano e inyección de una alícuota en columna preparativa de HPLC 
(fase normal, Sílice). Colección del eluato que contiene la fracción de vitamina D; evaporación de esta fracción 
a sequedad, disolución en la fase móvil de HPLC (Analítica, Acetonitrilo: Cl oruro de metileno: Isopropanol), 
inyección en HPLC (fase reversa C 18) y determinación de la vitamina D con el pico máximo a 264 nm por 
calibración del estándar externo.  
B.12.3 Material  
Instalación de bomba HPLC  
Uno o dos registradores  
Balanza analítica, co n capacidad de 160 g, lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión, con capacidad de 1600 g, lectura 0,01 g  
Estufa de laboratorio (para productos con almidón)  
Baño de agua con agitadores magnéticos, 4 plazas  
Evaporador rotatorio con elevador rápido y baño  
Matraces aforados, vidrio marrón, tapón de vidrio de 5, 50 y 100 ml  
Matraz de fondo plano, cuello corto, vidrio marrón de 250 ml  
Matraces, en forma de pera, vidrio marrón de 10 y 500 ml  
Embudo de separación cónico, vidrio marrón, con llave de 500 ml  
Embudo, vidrio marrón, diámetro 12 cm  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Tapones huecos hexagonales, vidrio marrón  
Refrigerante con macho y hembra, manguito 300 mm  
Alargadera para introducción de gas  
Filtro plisado mediano con diámetro de 18,5 cm  
Pipeta aforada, con una marca de 2 ml  
Jeringuillas de 1 y 5  ml 
Aguja para jeringuillas  
Cilindro para gas comprimido, nitrógeno  
Monodetentor para gas comprimido, N 2 
Filtro de 0,45 µ de diámetro  
2 Columnas de 5 µ, 4,6 X 250  
Aparato de filtración  
Filtro 0,5 µ  
B.12.4 Reactivos  
Colecalciferol, vitamina D3, cristalizada  para fines bioquímicos (C 27H44O) 
Hidróxido de potasio en lentejas para análisis (KOH)  
Alcohol etílico absoluto, para análisis (C 2H5OH) 
Hidroquinona (C 6H4(OH) 2) 
Eter de petróleo para análisis intervalo de ebullición 40 -60°C  
Fenolftaleína en solución etanó lica al 1%, indicador ((C 6H4OH) 2C6H4COOC)  
Diastasa (para productos de almidón)  
2-propanol (CH 3)2CHOH  
n-hexano CH 3(CH 2)4CH3 
Acetonitrilo (CH 3CN) 
Diclorometano (CH 2C12) 
Sulfato de sodio anhidro para análisis (Na 2SO4) 
Nitrógeno (N 2) 
Acido ascórbico (C 6H8O6) 
B.12.4.1 Fase móvil para HPLC preparativa, 2 -propanol al 1% en n -hexano  
Degasificar el n -hexano bajo presión reducida y pasar sobre un filtro. Mezclar 100 ml de diclorometano con 
900 ml de acetonitrilo degasificado.  
B.12.4.2 Fase móvil para HPLC analítica  
Degasificar 1 l de acetonitrilo bajo presión reducida y pasar a través de un filtro. Mezclar 100 ml de 
diclorometano con 890 ml de acetonitrilo degasificado y 10 ml de 2 -propanol.  
Nota: La proporción diclorometano/acetonitrilo debe adaptarse de modo que la vitamina D3 dé un tiempo 
de retención de aproximadamente 8 -9 min. Sin embargo, no debería rebasar 20:100.  
B.12.4.3 Fase móvil para lavar la columna preparativa, 2 -propanol al 10% en n -hexano  
Mezclar 100 ml de 2 -propanol con 900 ml de n -hexano degasificado.  
B.12.4.4 Solución patrón de vitamina D 3 para HPLC preparativa  
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 50 mg de colecalciferol (D 3) cristalizado, disolver en 
n-hexano y llevar al volumen con el mismo disolvente (= solución de 20,000 U.I./ml).  
Diluir esta solución 1000 veces con el mismo disolvente para obtener una solución de 20 U.I./ml. Esta 
solución permanece estable de 3 a 4 semanas a + 4°C.  
B.12.4.5 Solución patrón de vitamina D 3 para HPLC analítica        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Evaporar 2 ml de solución patrón de 20 U.I./ ml (B.12.4.4) y tomar el residuo en 2 ml de fase móvil 
(B.12.4.2).  
B.12.5 Procedimiento  
Notas: La vitamina D 3 es sensible a la luz. Utilizar material de vidrio marrón o proteger el material corriente 
con papel aluminio.  
Efectuar todas las evaporaciones de disolventes bajo presión reducida a una temperatura máxima de 
40°C. No se debe evaporar a sequedad. Romper el vacío introduciendo nitrógeno en el sistema. Evaporar los 
últimos ml mediante una corriente de nitrógeno.  
Al final de la jornada, lavar la columna  preparativa durante 15 min con 2 -propanol al 10% en n -hexano 
(B.12.4.3) con un caudal de 2 ml/min.  
B.12.5.1 Toma de ensayo  
Mezclar o moler la muestra a fin de homogeneizarla por completo. Pesar, con una precisión de 10 mg, una 
toma de ensayo que contenga 20 a 40 U.I. de vitamina D 3, lo que corresponde en general a 10 g.  
B.12.5.1.1 Productos con almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 250 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
10% de su peso de diastasa. Añadir máximo 30 ml de agua d estilada a 45 -50°C. Mezclar bien para obtener 
una suspensión homogénea. Eliminar el aire del matraz mediante nitrógeno, tapar y colocar el matraz durante 
30 min en una estufa a 45°C.  
B.12.5.1.2 Productos sin almidón  
En un matraz redondo de fondo plano de 2 50 ml con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
máximo 30 ml de agua destilada a 45 -50°C.  
B.12.5.2 Saponificación  
Añadir 7 g de hidróxido de potasio grado analítico en el matraz (B.12.5.1.1 o B.12.5.1.2), y mezclar para 
disolver.  
A continuación añadir 60 ml de alcohol absoluto y 0,5 g de ácido ascórbico o hidroquinona.  
Montar sobre el matraz una alargadera para introducción de un gas refrigerante. Introducir una ligera 
corriente de gas nitrógeno, y calentar durante 30 min a 70°C en un baño de agu a en ebullición provisto de 
agitadores magnéticos.  
Nota: Durante la saponificación, asegurar una buena agitación del medio de reacción.  
B.12.5.3 Extracción del insaponificable  
Una vez terminada la saponificación, enfriar el matraz a temperatura ambiente y transferir la suspensión a 
un embudo de separación de 500 ml.  
Enjuagar con máximo 30 ml de agua fría en 3 porciones de 10 ml que se añaden al contenido del embudo 
de separación. Evitar un exceso de agua, ya que favorece la formación de emulsiones.  
En segui da enjuagar el matraz con 50 ml de éter de petróleo (rango de 40 a 60°C) en varias porciones que 
se añaden al embudo de separación.  
Extraer la vitamina D 3 agitando ligeramente.  
Dejar separar las fases.  
Vaciar la fase acuosa a otro embudo de separación de 5 00 ml. Recoger la fase orgánica en un tercer 
embudo de separación de 500 ml.  
Efectuar esta extracción 5 veces en total. Haciendo las agitaciones con mucho cuidado para evitar 
emulsiones.  
Lavar la solución orgánica con porciones de 100 ml de agua adicionánd ola por las paredes del embudo, 
sin agitar, hasta que el agua de lavado ya no dé reacción coloreada con fenolftaleína. Después del último 
lavado, esperar al menos 15 min antes de vaciar la fase acuosa.  
Filtrar la solución lavada en continuo a través de un filtro que contiene aproximadamente 5 g de sulfato de 
sodio anhidro o en un papel separador de fases tipo 1 PS, y recoger el filtrado en un matraz en forma de pera 
de 500 ml, sin dejar secar el filtro. Y al final enjuagar el filtro con 50 ml de éter de pet róleo.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Evaporar el disolvente bajo presión reducida en un rotavapor a 40°C, y eliminar los últimos mililitros 
mediante una corriente de nitrógeno.  
Transferir el residuo cuantitativamente a un matraz aforado de 5 ml, mediante pequeñas porciones de fase 
móvi l (B.12.4.1) llevar al volumen y filtrar la solución inmediatamente a través de un filtro de 0,45  de tamaño 
de poro y adecuado para solventes orgánicos, por ejemplo Acrodisc -CR o equivalente; recoger el filtrado en 
un matraz en forma de pera. El filtrado  debe ser límpido.  
La solución está lista para la cromatografía.  
B.12.5.4 Cromatografía preparativa  
Condiciones:  
Columna: Spherisorb Si, 5 mcm, 4,6 x 250 mm  
Loop de inyección: 500 l 
Fase móvil: 1% 2 -propanol en n -hexano (B.12.4.1)  
Caudal: 1 -3 ml/min (el t iempo de retención de la vitamina D 3 debe ser de aproximadamente 5 min).  
Detector: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm (o eventualmente 
espectrofotómetro de longitud de onda fija a 254 nm, únicamente utilizable para la etapa pre parativa),  0,05 
AUFS para el patrón y 0,5 AUFS para el extracto de muestra  
Registrador: 10 mm/min.  
Inyectar primero 500 l de solución patrón de vitamina D3 (B.12.4.4) y determinar el tiempo de retención:  
Debe ser aproximadamente 5 min. Inyectar a continu ación la solución de la muestra obtenida bajo el 
numeral (B.12.5.3) y recoger la fracción que contiene la vitamina D 3 en un matraz en forma de pera de 10 ml.  
Comenzando a recoger aproximadamente 1 min antes de la elución de la vitamina D 3 y parar 
aproximad amente 1 min después de la elución de la vitamina D 3. 
B.12.5.5 Cromatografía analítica  
Evaporar a seco la fracción recogida bajo (B.12.5.4), mediante una ligera corriente de nitrógeno.  
Enfriar el matraz a fin de evitar errores de volumen a una evaporación eventual de disolvente; luego tomar 
el residuo en 300 l de fase móvil (B.12.4.2), agitar ligeramente para disolver bien el residuo. Condiciones:  
Columna: Spherisorb ODS, 5 mcm, 4,6 x 250 mm  
Loop de inyección: 100 l 
Fase móvil: 10% diclorometano, 89% acet onitrilo y 1% de 2 -propanol  
Caudal: 2 ml/min  
Detector: espectrofotómetro, longitud de onda variable, ajustada a 264 nm; 0,01 AUFS  
Registrador: 10 mm/min  
Inyectar primero 100 µl de solución patrón (B.12.4.5) y determinar el tiempo de retención: debe ser 
aproximadamente 8 -9 min (adaptar la proporción de diclorometano/acetonitrilo si es necesario). Luego 
inyectar 100 l de la fracción obtenida bajo B.12.5.4.  
B.12.6 Cálculo, expresión e interpretación de los resultados  
B.12.6.1 Evaluación  
Identificar el pico de  la vitamina D 3 en el cromatograma de la muestra mediante el tiempo de retención 
definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos obtenidos durante la 
cromatografía de la solución patrón y de la solución muestra.  
El contenido en vitamina D 3, expresado en Unidades Internacionales por 100 g de producto, es igual a:  
 
En donde:        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
m = toma de ensayo, en g  
hP = altura del pico de la muestra, en mm  
hS = altura del pico de la solución patrón, en mm  
C = concentración de la solución patró n inyectada, en U.I./ml  
V0 = volumen en el cual ha sido diluido el residuo antes de la cromatografía preparativa (B.12.5.3) (en 
general 5 ml = matraz aforado)  
V1 = volumen del extracto inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml=volumen del lo op de 
inyección)  
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en general 
0,300 ml)  
Nota: es superfluo un factor de corrección para la isomerización de la vitamina D 3, en previtamina D 3, ya 
que este fenómeno e s despreciable en las condiciones de saponificación aplicadas.  
B.12.6.2 Límite de detección de acuerdo con la sensibilidad del equipo.  
Aproximadamente: 20 U.I./100 g  
B.12.6.3 Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la mi sma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos resultados.  
Cuando las vitaminas han sido añadidas por mezcla en seco, la repetibilidad está fu ertemente influida por 
el grado de homogeneidad del producto  
B.13 DETERMINACI ON DE VITAMINA C ( ACIDO ASC ORBICO)  
B.13.1  Determinación visual  
B.13.1.1  Fundamento  
Extracción del ácido ascórbico mediante ácido metafosfórico. Valoración visual oxidométrica del ácido 
ascórbico en el extracto con una solución de 2,6 -diclorofenol -indofenol.  
B.13.1.2  Reactivos y materiales  
B.13.1.2.1  Reactivos  
Acido ascórbico  
Acido sulfúrico  
Acido metafosfórico  
Yodo  
Sal sódica de 2,6 -diclorofenol -indofenol  
B.13.1.2.2  Materiales  
Pipetas 
Matraces aforados  
Material común de laboratorio  
B.13.1.3  Aparatos e instrumentos  
Parrilla de calentamiento  
Estufa  
B.13.1.4  Preparación de soluciones  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.13.1.4.1  Solución estándar de ácido ascórbico 0,5 mg/ml  
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido ascórbico,  introducirlos en un matraz aforado de 100 ml, si es 
posible, de vidrio pardo. Disolver con ácido metafosfórico al 2% y llevar a volumen con el mismo ácido. Esta 
solución debe prepararse inmediatamente antes del empleo.  
B.13.1.4.1.1  Verificación de la pure za del ácido ascórbico  
En caso de duda sobre la pureza del ácido ascórbico, pesar aproximadamente 400 mg con una precisión 
de 1 mg, disolver en una mezcla de 100 ml de agua destilada hervida y enfriada, y 25 ml de ácido sulfúrico al 
10%. Valorar rápidament e bajo luz difusa con una solución de yodo, 0,1 N en presencia de una solución de 
almidón como indicador.  
1 ml de yodo 0,1 N corresponde a 8,806 mg de ácido ascórbico.  
B.13.1.4.2  Solución de ácido meta -fosfórico al 2%  
B.13.1.4.2.1  Preparación de la solució n base al 10%  
Pesar 60 -70 g de ácido meta -fosfórico. Eliminar la capa blanca que se forma generalmente en la 
superficie, lavando las barritas con agua destilada. Secarlas, con papel filtro y triturarlas en un mortero. Pesar 
50 g de este ácido limpio y trit urado, y disolverlo sin calentar en 500 ml de agua destilada en un frasco pardo, 
agitando este último mecánicamente hasta disolución.  
Filtrar, si es necesario, sobre un filtro plegado en un frasco de vidrio pardo.  
El ácido meta -fosfórico se transforma grad ualmente en ácido orto -fosfórico, pero esta solución al 10% 
puede conservarse en un refrigerador durante tres semanas.  
B.13.1.4.2.2 Preparación de la solución al 2%  
Preparar la cantidad necesaria en el día de empleo, diluyendo cinco veces con agua destilad a un volumen 
dado de la solución al 10%.  
B.13.1.4.3  Solución de la sal sódica de 2,6 -diclorofenol -indofenol (D.I.) al 0,05%  
Disolver 100 mg de D.I. en un vaso de 50 ml que contenga 20 ml de agua destilada. Llevar rápidamente a 
ebullición, removiendo con un a varilla de vidrio. Enfriar y transferir a un matraz aforado de 200 ml. Llevar  a 
volumen con agua destilada. Filtrar en un frasco pardo. Esta solución se conserva en un refrigerador durante 8 
días.  
Verificar la concentración antes de cada serie de determ inaciones.  
La solución es azul en un medio alcalino (sal de Na+) y rosa en un medio ácido.  
B.13.1.4.4  Acido acético al 10%  
Diluir 100 ml de ácido acético glacial a 1 l con agua destilada.  
B.13.1.4.5  Eventualmente: solución de yodo 0,1 N con factor conocido  (determinado con tiosulfato).  
B.13.1.4.6  Eventualmente: solución de ácido sulfúrico al 10%  
Añadir cuidadosamente 57 ml de ácido sulfúrico concentrado a 500 ml de agua destilada. Enfriar a la 
temperatura ambiente y diluir a 1 l con agua destilada.  
B.13.1.4 .7 Eventualmente: solución de almidón estabilizada al 1%  
Disolver 140 g de cloruro de sodio grado purísimo en 375 ml de agua destilada, añadir 5 g de almidón 
soluble disuelto en 5 ml de agua destilada, calentar a ebullición durante 2 o 3 min, enfriar y fil trar. 
B.13.1.5  Procedimiento  
B.13.1.5.1  Determinación del título de la solución de 2,6 -diclorofenol -indofenol (D.I.)  
Pipetear 3 ml de solución estándar de ácido ascórbico (B.13.1.4.2) en un vaso de 100 ml, añadir 
aproximadamente 30 ml de ácido meta -fosfóri co al 2% y 5 ml de ácido acético al 10%. Valorar con la solución 
D.I. utilizando un agitador mecánico hasta la aparición de una coloración rosa que persista durante 15 seg.  
Ejemplo:  
Para 2 ml de solución estándar (= 1,5 mg de ácido ascórbico), volumen empl eado 5,84 ml de reactivo:        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
 
es decir, 1 ml de solución D.I. corresponde a 0,257 mg de ácido ascórbico.  
B.13.1.5.2  Preparación de la porción para ensayo  
B.13.1.5.2.1  Producto sin o con poco almidón. Por ejemplo leche en polvo.  
Pesar con una precisión de 0,1  g una cantidad del producto a analizar que contenga aproximadamente 5 a 
10 mg de ácido ascórbico; en la mayoría de los casos se pesan 10 g en un matraz aforado de 100 ml.  
Añadir 20 ml de ácido meta -fosfórico al 10% y 50 ml de agua destilada a 55°C. Sacudi r vigorosamente 
durante 10 min. Enfriar y llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar rápidamente sobre un filtro plegado, al abrigo de la luz. Las soluciones que filtran demasiado lento 
deben centrifugarse a 3000 rpm durante 10 min, decantarse y filtrars e por un filtro plegado o sobre lana de 
vidrio.  
B.13.1.5.2.2  Productos con almidón, por ejemplo cereales  
En un vaso de 100 ml pesar exactamente una porción para ensayo de 10 a 20 g. Añadir 5% (0,5 a 1 g) de 
diastasa y 20 ml de agua destilada. Mezclar media nte una varilla de vidrio de modo que se obtenga una 
papilla homogénea e incubar 15 min en una estufa a 40°C. Transferir cuantitativamente a un matraz aforado 
de 100 ml con 20 ml de solución de ácido meta -fosfórico al 10%; llevar a volumen con agua destila da y agitar 
vigorosamente. Filtrar sobre un filtro plegado con una velocidad de filtración media.  
B.13.1.5.2.3  Productos heterogéneos, por ejemplo verdura, fruta  
Homogeneizar una muestra de 50 a 100 g con un volumen de ácido meta -fosfórico de 10% represent ando 
1/5 del volumen total al que será ajustada la mezcla.  
Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml y llevar a volumen con agua destilada.  
Centrifugar o filtrar la solución obtenida sobre un filtro plegado.  
B.13.1.6  Determinación  
Tomar un a parte alícuota del filtrado correspondiente, de 1 -2 mg de ácido ascórbico. Añadir 5 ml de ácido 
acético al 10% (10 ml para un volumen de filtrado de 30 a 50 ml), valorar luego con D.I. hasta que se obtenga 
una coloración rosa que persista durante 15 seg.  
Generalmente, deben utilizarse 5 a 10 ml de reactivo para la valoración. Un volumen de reactivo que 
excede 10 ml no es aconsejable, ya que la solución tiene tendencia a volverse grisácea en estas condiciones.  
Nota:  
Preparar las muestras a medida que se va loran.  
B.13.1.7  Cálculo y expresión de los resultados  
B.13.1.7.1  Cálculo y fórmula  
El contenido de ácido ascórbico expresado en mg por 100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
a = ml de reactivo empleados  
T = título del reactivo  
v = ml de filtrado emplead os 
V = ml de solución de la toma de ensayo  
m = toma de ensayo  
Expresar el valor obtenido con una precisión de 0,1 mg.  
B.13.2  Valoración con un potenciómetro (medidor de pH)  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.13.2.1  Preparación de la toma de ensayo  
La solución se prepara según las indicaci ones dadas para la valoración visual.  
Tomar una parte alícuota de la solución a valorar que contenga 1 a 2 mg de ácido ascórbico. Añadir 5 ml 
de ácido acético al 10%.  
B.13.2.2  Determinación  
Colocar el recipiente de valoración, que contiene la solución a va lorar y una barrita magnética, sobre un 
agitador magnético.  
Sumergir un electrodo de platino combinado en la solución.  
Ajustar el potenciómetro a una alta sensibilidad y llevar la aguja hacia el punto 0, o a un valor que 
corresponda a aproximadamente 1/6 d e la escala, si el punto 0 se encuentra al comienzo de la misma.  
Añadir, mediante una bureta motorizada, porciones de reactivo de 0,1 ml a intervalos de 5 seg. La aguja 
del potenciómetro sube ligeramente con cada adición de reactivo, pero baja de nuevo inm ediatamente.  
El punto alcanzado por la aguja, 5 seg después de cada adición de reactivo comienza por ser cada vez 
más bajo para subir de nuevo progresivamente.  
Cuando la amplitud de oscilación de la aguja aumente y el punto alcanzado 5 seg después de la ad ición 
del reactivo es netamente más alto, añadir el reactivo en porciones de 0,05 ml y esperar antes de cada nueva 
adición hasta que la aguja baje de nuevo ligeramente.  
Proseguir de esta manera hasta que la aguja baje de nuevo muy poco, añadir luego muy pe queñas 
porciones de reactivo hasta que la aguja no baje más, sino que permanezca en el punto alcanzado después 
de la última adición de reactivo.  
Este punto será considerado como el punto de equivalencia. Anotar el número de ml de reactivo utilizados 
para a lcanzar dicho punto.  
B.13.2.3  Cálculo y expresión de los resultados  
B.13.2.3.1  Cálculo  
El contenido en ácido ascórbico expresado en mg/100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
a = ml de reactivo correspondiente al punto de equivalencia  
T = concentración d el reactivo  
v = ml de filtrado empleados  
V = volumen en ml de la solución de la toma de ensayo  
m = toma de ensayo en g  
B.13.2.3.2  Expresar el valor obtenido con una precisión de 0,1 mg.  
B.13.2.4  Repetibilidad  
s = 0,24 mg (0 = 10)  
 
 
La diferencia entre lo s resultados de dos determinaciones, simultáneamente o rápidamente una después 
de otra por el mismo analista, no debe exceder 0,8 mg para un producto que contenga aproximadamente 50 
mg de ácido ascórbico por 100 g.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.14 DETERMINACI ON DE TIAMINA (VITAMINA B 1) Y RIBOFLAVINA (VITAMINA B 2) POR 
CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCI ON (HPLC)  
B.14.1 Fundamento  
La vitamina B 1, es extraída de la muestra por hidrólisis ácida y oxidada a tiocromo, su contenido es 
determinado por HPLC en fase inversa con detección flu orométrica.  
B.14.2 Reactivos y materiales  
B.14.2.1 Reactivos  
Acido clorhídrico fumante, 37% para análisis (HCl)  
Acetato de sodio trihidratado, para análisis  
(CH 3 x CO 2Na x 3H 2O) 
Acido orto -fosfórico PO 4H3 (P2O5 x 3H 2O) 
Ferricianuro de potasio, para análisi s Fe(CN)  6K4 x 3H 2O 
Hidróxido de sodio en lentejas, para análisis.  
Monohidrato de tiamina (nitrato de tiamina, Vitamina B 1 monohidratada), calidad alimentaria 
(C12H17N5O4S) 
Papaína soluble.  
Amilasa  
Diastasa  
N,N - Dimetilformamida HCON(CH 3) 3 
fosfato, ácido  de-potasio, para análisis (K 2HPO 4 x 3H 2O) 
B.14.2.2 Materiales  
Matraces en forma de pera, 100 ml  
Tapones huecos hexagonales  
Matraces aforados, de vidrio de 1000, 100, 50 y 10 ml  
Embudos de vidrio de 100 mm de diámetro  
Matraces Erlenmeyer, de cuello estrech o, 250 ml  
Refrigerante, Allihn, manguito 300 mm  
Filtros plisados medianos 185 mm de diámetro  
Pipetas aforadas con una marca de 2, 3, 5 y 40 ml  
Pipetas graduadas hasta la punta de 1 ml: 0,005  
Probetas graduadas, en forma alta, de 50 ml: 0,5; 100 ml: 1,0  
1000 ml: 10  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.  
B.14.2.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica, 162 g, lectura 0,1 mg  
Balanza de precisión electrónica, 2100 g, lectura 0,01 g  
Baño de agua en línea con soportes, 6 pla zas. 
Estufa de laboratorio  
Jeringuilla para HPLC, de un 1 ml  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Aguja para jeringuilla  
Columna ODS o C 18, 5 µm, 250 x 4,6 mm; o equivalente  
Dispositivo de filtración sobre membrana  
Membrana para filtro  
B.14.4 Preparación de soluciones  
B.14.4.1 Solución de ác ido clorhídrico  
En un matraz aforado de 1000 ml que contenga aproximadamente 500 ml de agua destilada, añadir con 
cuidado 82 ml de ácido clorhídrico al 37% y llevar a volumen con agua destilada. Trabajar en campana de 
extracción.  
B.14.4.2 Solución de aceta to de sodio 2,5 M.  
En un matraz aforado de 1000 ml disolver 340 g de acetato de sodio trihidratado en agua destilada y llevar 
a volumen.  
B.14.4.3 Hidróxido de sodio, solución de 150 g/l  
En un matraz aforado de 1000 ml, disolver 160 g de hidróxido de sodio en lentejas en agua destilada, 
llevar a volumen.  
Conservar en un matraz provisto de un tapón de polietileno.  
B.14.4.4 Solución de oxidación  
B.14.4.4.1 Solución de ferricianuro de potasio 1g/100 ml  
En un matraz aforado de 100 ml disolver, 1 g de ferricianur o de potasio en agua destilada y llevar a 
volumen.  
B.14.4.4.2 Solución a preparar justo antes del uso  
En un matraz aforado de 50 ml, llevar a volumen 2 ml de solución (B.14.4.4.1) con solución (B.14.4.3).  
B.14.5  Fase móvil para HPLC  
B.14.5.1 Solución de fo sfato ácido de -potasio, 10 mM pH 7,2.  
En un vaso de 1000 ml pesar exactamente 2,28 g de fosfato de -potasio, disolver en aproximadamente 800 
ml de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con ácido clorhídrico 1 N (B.14.4.1). Transferir a un matraz aforado 
de 10 00 ml y llevar a volumen con agua destilada. Degasificar bajo presión reducida y filtrar.  
B.14.5.2 Solución de dimetilformamida al 15% en fosfato ácido de potasio.  
En un matraz aforado de 1000 ml agregar 150 ml de dimetilformamida y llevar a volumen con so lución 
(B.14.5.1).  
B.14.6 Solución patrón de vitamina B 1 
B.14.6.1  Solución concentrada  
En un matraz aforado de 50 ml de vidrio, pesar exactamente 50,0 mg de monohidrato de tiamina y disolver 
en agua destilada. Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 1 N (B.14.4.1 ) y llevar a volumen con agua destilada. Esta 
solución contiene 1 mg/ml.  
B.14.6.2  Soluciones diluidas  
En un matraz aforado de 50 ml, agregar mediante una pipeta, 5 ml de solución (B.14.6.1) y llevar a 
volumen con agua destilada. Luego verter mediante una p ipeta, 5 ml de esta solución (100 µg/ml) en un 
matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen con agua destilada. Esta solución contiene 10 µg/ml.  
Verter, mediante una pipeta, 5 ml de esta solución en un matraz aforado de 50 ml y llevar a volumen con 
agua dest ilada. Esta solución contiene 1 µg/ml.  
B.14.6.3  Preparar de la misma manera solución concentrada de riboflavina y de manera subsecuente las 
soluciones diluidas. No es necesario utilizar matraces de vidrio.  
B.14.6.4 Solución patrón oxidada para HPLC  
Mediant e una pipeta, verter 5 ml de solución (B.14.6.2) en un matraz aforado de 10 ml de vidrio. Añadir 3 
ml de solución de ferricianuro de potasio básico (B.14.4.4.2). Agitar durante 2 min, añadir 0,45 ml de ácido       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
fosfórico concentrado, mezclar, enfriar y llevar  a volumen con agua destilada. Cromatografiar esta solución 
inmediatamente.  
B.14.7 Procedimiento  
La vitamina B 1 no es sensible a la luz; en cambio el producto oxidado, el tiocromo, sí lo es. Durante la 
etapa de oxidación, utilizar material de vidrio actíni co, o material de vidrio corriente protegido con papel 
aluminio.  
B.14.7.1 Toma de ensayo  
Homogeneizar toda la muestra, mezclando o moliendo y pesar con una aproximación de 10 mg, una toma 
de ensayo de 5 g.  
Para la determinación de vitamina B 2 adicionar 0,5  g de amilasa y 0,25 g de papaína, independientemente 
de si el producto contiene almidón o no.  
B.14.7.1.1 Productos con almidón  
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio con cuello esmerilado, mezclar la toma de ensayo con 
0,5 g de diastasa y 0,25 g de papaína. Añadir máximo 15 ml de agua destilada de 45 a 50°C. Mezclar bien, a 
fin de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matraz y colocarlo durante 30 min en una estufa a 40°C. 
Añadir a continuación 30 ml de agua destilada de 45 a 50°C.  
B.14.7.1 .2 Productos sin almidón, inclusive polvos para bebidas que contengan cacao  
En un matraz en forma de pera de 100 ml de vidrio con cuello esmerilado mezclar la toma de ensayo con 
45 ml de agua destilada de 45 a 50°C. Mezclar bien, a fin de obtener una suspe nsión homogénea.  
B.14.7.2 Hidrólisis  
B.14.7.2.1 Productos con o sin almidón, excepto polvos para bebidas que contengan cacao  
Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 1 N al matraz (B.14.7.1.1 o B.14.7.1.2). Mezclar bien, calentar durante 30 
min bajo el reflujo en un baño de agua en ebullición. Al cabo de 15 min, agitar el matraz para deshacer los 
aglomerados.  
Enfriar y añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M (B.14.4.2). Mezclar bien. Transferir cuantitativamente el 
contenido del matraz a un matraz aforado de 100 ml y  llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar a través de un filtro plisado. La solución está lista para la oxidación.  
B.14.7.2.2 Polvos para bebidas que contengan cacao  
Proceder según (B.14.7.2.1) hasta el enfriamiento después de la hidrólisis. Transferir  cuantitativamente el 
contenido del matraz a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar a través de un filtro plisado. Luego verter, mediante una pipeta, 40 ml de filtrado en un matraz 
aforado de 50 ml (procedimiento especia l para bebidas que contienen cacao por tener polifenoles que 
interfieren en la reacción de B 1). Añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M (B.14.4.2) y llevar a volumen con agua 
destilada.  
La solución está lista para la oxidación  
B.14.7.3 Oxidación  
En un matraz  aforado de 10 ml de vidrio verter, mediante una pipeta, 5 ml de solución (B.14.7.2.1 o 
B.14.7.2.2). Añadir 3 ml de solución de ferricianuro de potasio básico (B.14.4.4.2). Agitar durante 2 min. Añadir 
0,45 ml de ácido fosfórico concentrado, mezclar, enfri ar y llevar a volumen con agua destilada. Cromatografiar 
esta solución inmediatamente.  
B.14.7.4 HPLC  
Condiciones  
Columna:  ODS o C 18, 5 µm; 250 X 4,6 mm o equivalente  
Loop de inyección:  50 µl  
Fase móvil:  ver punto 15.5.2  
Caudal:  1,5 ml/min  
*Detector:  espectrofluorímetro, excitación: 368 nm  
emisión: 440 nm  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Registrador:  10 mm/min  
 
*Para la determinación de vitamina B2 se inyecta directamente del filtrado y se modifica la siguiente 
condición:  
Detector:  espectrofluorímetro; excitación: 450 nm  
 emisión:  530 nm  
 
Inyectar primero 50 µl de solución patrón oxidada B.14.6.4 y determinar el tiempo de retención: debe ser 
de aproximadamente 5 -6 min. A continuación inyectar 50 µl de la solución obtenida B.14.7.3.  
B.14.8 Cálculo, expresión e interpretación de los r esultados  
B.14.8.1  Evaluación  
Identificar el pico del tiocromo o de la riboflavina en el cromatograma de la toma de ensayo mediante el 
tiempo de retención definido por cromatografía de la solución patrón. Medir la altura de los picos obtenidos al 
cromatogr afía la toma de ensayo y la solución patrón.  
El contenido de vitamina B 1, expresado en mg por 100 g de producto, es igual a:  
 
En donde:  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
hP = altura del pico del extracto, en mm  
hS = altura del pico de la solución patrón , en mm  
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml  
V = volumen, en mililitros, en el cual se ha diluido el extracto antes del análisis por HPLC (250 para polvos 
para bebidas que contengan aromas, 200 para los demás productos)  
B.14.8.2 Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones (analista, aparato, laboratorio) en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de 
la media entre ambos resultados.  
B.15 DETERMINACI ON DE NIACINA (VITAMINA B 3) POR M ETODO MICROBIOL OGICO  
B.15.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de niacina utilizando Lactobacillus 
plantarum  ATCC 8014, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando  directamente el 
crecimiento celular con la concentración de niacina. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un 
medio libre de niacina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en la curva 
se determina l a concentración de la muestra.  
B.15.2 Reactivos y materiales  
B.15.2.1 Reactivos  
Acido nicotínico para fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante 37% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
B.15.2.2 Materiales  
Micropipeta  
Vasos de precipitados        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Pipetas volumétricas  
Matraces Erlenmeyer  
Matraces volumétricos  
Tubos de ensaye  
B.15.3  Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
B.15.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus plantarum ATCC 8014  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo micro inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli  
Medio de prueba para niacina  
B.15.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Prepar ar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferenci a con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
B.15.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio (B.15.4.1) cada cuatro semanas, 
efectuar un cul tivo intermedio de 18 h en el medio líquido (B.15.4.3). Preparar el número de tubos necesarios 
para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
B.15.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del  microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C . 
B.15.5 Preparación de soluciones  
B.15.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a  4°C. 
B.15.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N  
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de 1000 
ml con agua destilada. Para ello verter el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.  
B.15.5.3 Solución de hidróxido de sodio 15 N.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml 
en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.  
B.15.5.4 Soluc ión de Hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
B.15.5.5 Solución patrón  
Justo antes del uso, pesar exactamente 50,0 mg de ácido  nicotínico; disolver en agua destilada y llevar a 
volumen en un matraz aforado de 500 ml.  
B.15.6 Procedimiento  
B.15.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último 
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
B.15.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar  de 1 a 3 g de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 200 µg de vitamina, añadir 50 ml de solución de ácido clorhídrico 1N en pequeñas 
cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el grifo de agua corriente después de cada adición.  
Cubrir el matra z con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 15 min a 120°C. Enfriar.  
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamente 3 ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml 
mientras se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de sodio 1 N. Tr ansferir cuantitativamente a un 
matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 µg de vi tamina por ml.  
B.15.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 16.5.5 como sigue:  
5 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml  
 
B.15.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio de prueba para niacina  
Preparar el v olumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio actínico de 100 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
 
B.15.6.5 Preparación del ensayo        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.15.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados:  
bl, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.:  bl 0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución 
patrón: (ml)  0,00 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 
Agua: (ml)  5,00 5,00 4,75 4,50 4,25 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  
 
Los tubos del e nsayo en blanco (bl) no se inoculan.  
B.15.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante un pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo 
para el ensayo.  
Tubo No.:  9 10 11 12 13 
Solución de la 
muestra:  0,25 0,50 0,75 1,0 1,50 ml  
Agua:  4,75 4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecua da que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
B.15.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 121°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
B.15.6.7 Inoculación  
B.15.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo ante s de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.15.6.1) a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavado s más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensay o, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.15.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(B.15.6.4). Este tubo es el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo (B.15.6.1) entre 0,2 y 0,4 (después de sustraer l a extinción propia 
del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.15.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
-extinción inferior a 0,2: introducir propo rcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).  
-extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (B.15.6.4).  
 
B.15.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el 
medio.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.15.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durant e aproximadamente 18 a 24 h a 35°C. Observar los tubos con 
regularidad al cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la 
primera y la última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la  incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
B.15.6.9 Lecturas  
Medi ante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100%  de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota:  Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en  transferencia.  
B.15.7 Cálculos  
B.15.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico, o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de vitamina a l a abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  media  1 2 3 
0 0,00 0,0000  88,7 88,6 88,2 88,5 
1 0,25 0,0125  73,4 72,6 71,1 72,4 
2 0,50 0,0250  62,1 61,5 62,6 62,1 
3 0,75 0,0375  53,3 53,2 55,5 54,0 
4 1,00 0,0500  47,3 48,0 49,1 48,1 
5 1,50 0,0750  36,8 37,7 40,5 38,3 
6 2,00 0,1000  31,0 (45,6)  39,5 35,3 
7 2,50 0,1250  30,5 27,2 27,2 28,3 
8 3,00 0,1500  29,0 24,8 24,0 25,9 
( )= valor aberrante  
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte qu e ocupa 
la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
B.15.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  
media  µg* µg/ml  
1 2 
9 0,25 (88,0)  79,0 79,0 0,0070  0,028  
10 0,50 59,2 58,2 58,7 0,0300  0,060  
11 0,75 52,0 52,2 52,1 0,0413  0,055  
12 1,00 43,8 45,8 44,8 0,0580  0,058  
13 1,50 35,1 35,5 35,3 0,1000  0,067        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
     Media 0,0503 = (C)  
( ) = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El conteni do de vitamina, expresado en mg de ácido nicotínico por 100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuot a de V 1 en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
272 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 2 ml (V 2), que se ha diluido en un mat raz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de niacina leídas en la curva de calibración es 0,0576 µg/ml (C).  
El contenido de vitamina es:  
 
B.16 DETERMINACI ON DE PIRIDOXINA (VITAMINA B 6) POR M ETODO MICROBIOL OGICO  
B.16.1 Fundamento  
Este mét odo permite cuantificar concentraciones desconocidas de vitamina B6 utilizando Saccharomyces 
carlsbergensis ATCC 9080, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente 
el crecimiento celular con la concentración de Piridoxina . Para preparar la muestra y la curva estándar se 
utiliza un medio libre de Piridoxina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación 
en la curva se determina la concentración de la muestra.  
B.16.2 Reactivos y materiales  
B.16 .2.1 Reactivos  
Clorhidrato de Piridoxina para fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Acetato de sodio trihidratado para análisis  
B.16.2.2 Materiales  
Micropipeta  
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Matraz aforado de vidrio de 100, 250 y 500 ml  
Tapón de vidrio  
Frascos con cápsula de polietileno a presión  
Material común de laboratorio  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con al uminio.  
B.16.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 30 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
B.16.4 Cepa y medios de cultivo  
Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080  
Agar de micro ensayo  
Medio de prueba para Piridoxina  
B.16.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Agar de microensayo  
Preparar 1 l de medio según las indicaciones de la etiqueta. Repartir a razón de 6 ml en tubos  (de 
preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición inclinada, a fin de obtener una pendiente lo 
más larga pos ible (agar inclinado).  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.16.4.2  Mantenimiento de la cepa  
Inocular por estría Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080 en superficie en el medio (B.16.4.1) cada 
dos semanas. Preparar el número de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para 
el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
B.16.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Piridoxina y medio para prueba, solución 1:1, enriquecida con 1 ng de vitamina B6/ml . 
Diluir 1 ml de solución patrón B.16.5.7 a 100 ml. Añadir 1 ml de esta dilución a 500 ml de medio de cultivo 
B.16.6.4 y completar a 1 l con agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar los tubos con 
capuchones y esterilizar según las indicaci ones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.16.5  Preparación de soluciones  
B.16.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esteri lizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.16.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0,44 N  
Bajo una campana de extracción diluir 36,5 ml de ácido clorhídrico al 37% a 100 ml con agua destilada. 
Para ello verter el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.  
B.16.5.3 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 0,055 N  
Bajo una campana de extracción diluir 4,5 ml de ácido clorhídrico al 37% a 1000 ml con agua destilada. 
Para ello verter el ácido en el matraz af orado que ya contiene agua.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.16.5.4 Solución de hidróxido de sodio, 60 g/100 ml  
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo agua del grifo. Completar a 500 ml 
en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietil eno o de goma.  
B.16.5.5 Solución de hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
B.16.5.6 Solución de acetato de sodio aproximadamen te 2,5 M  
En un matraz aforado de 500 ml disolver 170 g de acetato de sodio trihidratado en agua destilada y llevar 
a volumen.  
B.16.5.7 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de piridoxina; disolver en agua destilada y llevar a volumen en un matraz 
afora do de 500 ml. Conservar esta solución congelada en fracciones de 5 ml durante máximo 6 meses.  
B.16.6  Procedimiento  
La vitamina B6 es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se 
debe utilizar material actínico o cub rir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o paño negro.  
B.16.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Tres días antes de la inoculación del ensayo, efectuar dos cultivos sucesivos de 24 h en superficies de 
agar. Un día antes del ensayo, subcultiva r el microorganismo tomado del último cultivo sobre agar, en un tubo 
del medio líquido B.16.4.3.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
B.16.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 2 g de muestra homogénea, que contenga p or lo menos 
2 µg de vitamina. Poner en suspensión en 180 ml de:  
Solución de ácido clorhídrico 0,44 N si el producto contiene almidón.  
Solución de ácido clorhídrico 0,055 N si el producto no contiene almidón.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar lo en el autoclave durante 1 h a 125°C. Enfriar.  
Después de enfriar añadir:  
3 ml de solución de hidróxido de sodio (B.16.5.4) si el producto contiene almidón.  
8 ml de solución de acetato de sodio (B.16.5.6) si el producto no contiene almidón.  
Ajustar el pH  a 4,6 con solución de hidróxido de sodio 1 N. Transferir cuantitativamente a un matraz 
aforado de 250 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de 
filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obte nga una solución de aproximadamente 5 ng de vitamina por ml.  
B.16.6.3 Solución patrón, 5 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución B.10.5.7 como sigue:  
5 ml a 100 ml  
 
5 ml a 100 ml  
 
5 ml a 250 ml = 5 ng/ml  
 
B.16.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Medio Y para prueba de piridoxina  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patró n: 30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
 
B.16.6.5  Preparación del ensayo  
B.16.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensayo, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerado s bl, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución 
patrón: 0,0  0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2 2,5 3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada tubo  
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
B.16.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas fil as, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, co mpletar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 0,25  0,50 0,75 1,0 1,50 ml  
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  
 
Tapar los tubos con cap uchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en  el 
soporte.  
B.16.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
B.16.6.7 Inoculación  
B.16.6.7.1 Preparación y est andarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.16.4.1) a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 1000 rpm durante 2 min. Decantar la solución y lavar el sedimento 3       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
veces co n 10 ml de solución fisiológica estéril, centrifugando y decantando la solución después de cada 
lavado.  
Suspender el sedimento en 5 ml de solución fisiológica. Diluir de 3 a 4 gotas de esta suspensión en un 
tubo que contenga 10 ml de solución fisiológica. Este tubo es el inóculo.  
B.16.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligerament e a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el 
medio.  
B.16.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 19 h a 30°C. Dado que Saccharomyces 
carlsbergensis  es aerobio, inclinar los tubos al máximo a fin de que la superficie  de contacto entre el líquido y 
el aire sea la mayor posible.  
Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución 
de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obten ga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
B.16.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de  ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
B.16.7 Cálculo s 
B.16.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de vitamina a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  
media  
1 2 3 
0 0,0 0,0 91,2 90,6 90,5 90,7 
1 0,25 1,25 70,4 70,0 70,2 70,2 
2 0,50 2,5 51,5 54,6 55,5 53,9 
3 0,75 3,75 42,2 44,4 44,5 43,7 
4 1,0 5,0 33,8 33,2 34,5 33,8 
5 1,5 7,5 23,2 24,3 26,0 24,5 
6 2 10 20,0 18,5 19,2 19,2 
7 2,5 12,5 15,1 15,2 15,7 15,3 
8 3,0 15,0 14,2 13,2 13,2 13,5 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa 
de la escala de transmisión.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento  esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
B.16.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibraci ón la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  
media  µg* µg/ml  
1 2 
9 0,25 (80) 68,3 68,3 1,20 4,78 
10 0,50 51,5 54,5 53,0 2,435  4,85 
11 0,75 43,5 41,1 42,3 3,615  4,81 
12 1 34,9 33,7 34,3 4,95 4,95 
13 1,5 23,9 25,1 24,5 7,47 4,987  
 Media 4,87 =(C)  
( ) = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular  el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de vitamina, expresado en mg de clorhidrato de piridoxina por 100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V 1 en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
232 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 250 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de piridoxina leídas en la curva de cal ibración es 4,87 ng/ml (C).  
El contenido de vitamina es:  
 
B.17 DETERMINACI ON DE ACIDO F OLICO (VITAMINA B 9) POR M ETODO MICROBIOL OGICO  
B.17.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar ácido fólico utilizando Lactobacillus casei  ATCC 7469, microorganismo 
que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la concentración 
de folato presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio comercial libre de folato. 
El crecimiento celular se mide turbid imétricamente y por interpolación en la curva se determina la 
concentración en la muestra.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.17.2 Reactivos y materiales  
B.17.2.1 Reactivos  
Cloruro de calcio fundido o granulado para análisis  
Fosfato diácido de potasio anhidro  
Fosfato ácido di -potásico anh idro 
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Alcohol etílico absoluto  
-amilasa  
Lactosa  
B.17.2.2 Materiales  
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml  
Matraz aforado de vidrio de 100,  250 y 500 ml  
Tapones de vidrio  
Micropipetas  
Material común de laboratorio  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.  
B.17.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
B.17.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus casei ATCC 7469  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo Micro Inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS  
Medio de prueba para ácido fólico  
B.17.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli M RS-agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacteriológico, según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
B.17.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus casei en profundidad en el medio (B.17.4.1) cada cuatro se manas, 
efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido (B.17.4.3). Preparar el número de tubos 
necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
B.17.4.3 Medio de cultiv o para el desarrollo del microorganismo  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Caldo Micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
B.17.5 Preparación de soluciones  
B.17.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1 000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conse rvar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.17.5.2 Solución tampón pH 6,1  
Disolver 2 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
B.17.5.3 Solución de cloruro de calcio, CaCl 2, al 2%  
Disolv er 2 g de cloruro de calcio en agua destilada y completar a 100 ml en un matraz aforado.  
B.17.5.4 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de ácido fólico (ácido pteroilglutámico), disolver en agua destilada en un 
matraz aforado de vidrio de 500 ml, añadi r 50 ml de NaOH 0,1 N, 100 ml de alcohol y llevar a volumen con 
agua destilada.  
Conservar esta solución a 4°C durante máximo 6 meses.  
B.17.6 Procedimiento  
El ácido fólico es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina  se 
debe utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o un paño 
negro.  
B.17.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (B.17.4.3).  
Incubar durante 18 h  a 35°C.  
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último 
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
B.17.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
B.17.6.2.1 Productos sin almidón  
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, pesar de 1 a 3 g de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 1 µg de ácido fólico. Disolver en 30 ml de solución tampón pH 6,1 (B.17.5.2). A fin de evitar 
la formación de grumos, añadir la soluci ón tampón en pequeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer 
bajo el grifo de agua caliente.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 20 min a 102°C. Enfriar.  
Transferir cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de 10 0 ml. Añadir al contenido del matraz 0,8 ml 
de solución de cloruro de calcio al 2% y agitar. Dejar reposar durante 15 min, luego llevar a volumen con agua 
destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrad o de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de ácido fólico por ml.  
B.17.6.2.2 Productos con almidón  
Proceder según el primer apartado bajo (B.17.6.2.1).        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Antes de colocar la solución en el autoclave, añadir una cantidad de mezcla al 6% de -amilasa 
pancreática en lactosa, correspondiente a 1% de la toma de ensayo.  
Incubar durante 30 min a 42°C. Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocar en el autoclave durante 
20 min a 102°C. Enfriar. A continuación tra nsferir cuantitativamente a un matraz aforado de vidrio de 100 ml y 
proseguir como se describe en (B.17.6.2.1)  
Nota:  Con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.  
Mediante una pipeta tomar 10 ml de solución patrón (B.17.6.3) dilución d. Aña dir 30 ml de agua. Añadir 
100 mg de mezcla al 6% de -amilasa pancreática en lactosa. Incubar durante 30 min a 42°C. Transferir 
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml. Llevar a volumen y filtrar.  
La curva de calibració n obtenida con esta solución debe ser comparable a aquella obtenida con la solución 
patrón no tratada.  
B.17.6.3 Solución patrón 0,2 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución 18.5.4 como sigue:  
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
2 ml a 100 ml  
 
10 ml a 10 0 ml 
 
10 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml  
 
B.17.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio para prueba de ácido fólico.  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la soluci ón en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 ml a 100 ml de exceso  
B.17.6.5 Preparación del ensayo  
B.17.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte met álico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0,..., 8; el primero corresponde al blanco.  
Mediante una pipeta vertir en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución  patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución  
patrón: 0,0  0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2 2,5 3,0 ml 
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2 ml 
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
B.17.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de am bas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmen es crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la 
muestra: 0,25  0,50 0,75 1,0 1,50 ml  
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
B.17.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 121°C, luego enfriarlos en un b año de agua fría.  
B.17.6.7 Inoculación  
B.17.6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.17.6.1) a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximada mente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.17.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(B.17.6.4). Este tubo es el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo (B.17.6.1) entre 0,40 y 0,60 (después de sustraer la extinción 
propia del medio), introducir 5 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.17.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zo na arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 0,40: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas)  
- extinción superior a 0,60: introducir menos gotas o diluir proporcionalmente con el medio (B.17.6.4 ). 
B.17.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el  microorganismo uniformemente  en el 
medio.  
B.17.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 19 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad al 
cabo de las 19 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficie nte entre la primera y la 
última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo si multáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.17.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cube ta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
B.17.7 Cálculos  
B.17 .7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión lineal, 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de ácido fólico a la abscisa.  
*Nota:  Si la determina ción se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  
media  
1 2 3 
0 0,0 0,0 88,1 87,6 87,5 87,7 
1 0,25 0,05 78,4 78,5 79,5 78,8 
2 0,50 0,1 70,5 70,4 71,3 70,7 
3 0,75 0,15 64,1 64,6 64,6 64,4 
4 1,0 0,20 58,9 59,6 59,3 59,3 
5 1,5 0,30 50,8 51,3 51,4 51,2 
6 2 0,40 44,7 44,1 45,5 44,8 
7 2,5 0,50 39,7 39,7 38,2 39,2 
8 3,0 0,60 35,6 36,1 35,2 35,6 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vi tamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que 
ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por sep arado.  
B.17.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lectura s 
media  µg* µg/ml  
1 2 
9 0,25 80,2 79,4 79,8 0,045  0,18 
10 0,50 71,6 73,7 72,6 0,095  0,19 
11 0,75 66,1 67,7 66,9 0,135  0,18 
12 1 61,4 (56,5)  61,4 0,185  0,185  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
13 1,5 53,7 52,1 52,9 0,280  0,187  
 Media 0,184 (=C)  
( ) = valor aberrante  
* = valores l eídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración  en la muestra diluida.  
El contenido de ácido fólico, expresado en µg/100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V 1, en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
1 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml(V 1). Se ha tomado una parte alícuota 
de 10 ml (V 2), que se ha dilu ido en un matraz aforado de 250 ml (V 3). 
La media de las concentraciones en ácido fólico leídas en la curva de calibración es 0,184 ng/ml (C).  
El contenido en ácido fólico es:  
 
B.18 DETERMINACI ON DE PANTOTENATO DE CALCIO POR M ETODO MICROBIOL OGICO  
B.18.1 F undamento  
Este método permite cuantificar pantotenato de calcio utilizando un microorganismo que no es capaz de 
sintetizarlo ( Lactobacillus plantarum ATCC 8014); el crecimiento celular se relaciona directamente con la 
concentración de pantotenato presente.  
Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio basal libre de pantotenato. El crecimiento 
celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se determina la concentración de  la 
muestra.  
B.18.2 Reactivos y materiales  
B.18.2.1 Reactivos  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Calcio D(+) pantotenato para fines bioquímicos  
Acido acético glacial 100% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Papaína  
Diastasa  
B.18. 2.2 Materiales        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Mortero de porcelana, interior esmaltado, diámetro 80 mm.  
Pistilo de porcelana, cabeza esmaltada, longitud 75 -80 mm (serruchado, si es demasiado largo)  
Probeta graduada de 100 ml  
Material común de laboratorio  
B.18.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Micropipeta  
Centrífuga  
B.18.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus plantarum , ATCC 8014  
Caldo Micro Inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS  
Medio de prueba para pantotenato  
B.18.4.1 Medio  de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio de agar bacteriológico con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g agar 
bacteriológico, según las indicaciones de la etiqueta del caldo MRS+1,5% de leche descrema da (reconstituida 
al 10% en agua destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y 
enfriar en posición vertical.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
B.18.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lacto bacillus plantarum en profundidad en el medio (B.18.4.1) cada cuatro semanas, 
efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido B.18.4.3. Preparar el número de tubos necesarios 
para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimie nto de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
B.18.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Caldo micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuc hones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
B.18.5 Preparación de soluciones  
B.18.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos,  
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador a 4°C.  
B.18.5.2 Solución de ácido acético aproximadamente 1 N  
Diluir 29 ml de ácido acético glacial en 500 ml con agua destilada.  
B.18.5.3 Solución de hidróxido de sodio, aproximadamente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.18.5.4 Solución tampón pH 4,6  
En un matraz aforado de 500 ml, mezclar 100 ml de ácido acético 1 N  con 50 ml de hidróxido de sodio 
(B.17.5.3) y llevar a volumen con agua destilada.  
B.18.5.5 Solución patrón  
Justo antes del uso, pesar exactamente 50,0 mg de pantotenato de calcio; disolver en agua destilada y 
llevar a volumen en un matraz aforado de 500 m l. 
B.18.6 Procedimiento  
B.18.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (B.18.4.3).  
Incubar durante 18 a 24 h a 35°C.  
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml)  del último 
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
B.18.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
Próximo a la determinación, pesar en pequeñ os morteros de porcelana de 1 -2 g de muestra homogénea, 
que contenga  aproximadamente 50 µg de pantotenato de calcio. Añadir 100 mg de papaína y 50 mg de 
diastasa. Moler todo cuidadosamente mediante el pistilo.  
Mojar la mezcla con 10 ml de solución tampón pH 4,6 (B.18.5.4). Cubrir los morteros y los pistilos con 
papel de al uminio y a continuación colocarlos en una estufa.  
Incubar una noche a 42°C.  
Después de la incubación, verificar el pH y ajustarlo a 4,6 si es necesario. Transferir cuantitativamente a 
un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtr ar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 µg de pantotenato de 
calcio por ml.  
Observación : Con cada nuevo lote de diastasa y de papaína, efectuar un en sayo en blanco:  
Tratar 5 g de papaína o de diastasa como la toma de ensayo. Sin diluir, proceder según (B.18.6.5.2). El 
contenido de pantotenato de calcio de la enzima no debe rebasar 1 mg/100 g.  
B.18.6.3 Solución patrón, 0,05 µg/ml  
Justo antes del uso dil uir la solución 17.5.5 como sigue:  
5 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml  
 
10 ml a 100 ml = 0,05 µg/ml  
B.18.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio de prueba para pantotenato.  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder  según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
 
B.18.6.5 Prepar ación del ensayo  
B.18.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución 
Patrón: 0,0  0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2 2,5 3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada tubo  
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
B.18.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18 y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una  pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de  
la muestra:  0,25 0,50 4,75 1,0 1,50 ml  
Agua:  4,75 4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
Esterilizar los tubos durante 15 min  a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
B.18.6.6 Inoculación  
B.18.6.6.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.18.6.1) a 
un tu bo de centrífug a estéril, centri fugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a  fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.18.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(B.18.6.4). Este tubo es el inóculo.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Así pues, para una extinción del cultivo  (B.18.6.1) entre 0,2 y 0,4 (después de sustraer la extinción propia 
del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.18.6.4). S i la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).  
- extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir pr oporcionalmente con el medio (B.18.6.4).  
 
B.18.6.6.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los  tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el 
medio.  
B.18.6.7 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 16 h a 35°C. Observar los tubos con regularidad al 
cabo de las 16 h. Verificar si la diferencia de de sarrollo del microorganismo es suficiente entre la primera y la 
última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpi r el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
B.18.6.8 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transfe rir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl). *  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del  microorganismo.  
* Nota:  Si la determinación se hace en absorbancia, buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
B.18.7 Cálculos  
B.18.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico, o mediante  una calculadora con regresión lineal 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de pantotenato de calcio a  la 
abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo No.  ml µg lecturas  
media  
1 2 3 
0 0,0 0,0 99,0 98,9 99,7 99,2 
1 0,25 0,0125  93,0 92,2 91,0 92 
2 0,50 0,025  82,8 83,3 82,9 83,0 
3 0,75 0,0375  72,3 70,2 73,0 71,8 
4 1,0 0,050  57,4 58,9 64,2 60,1 
5 1,5 0,075  39,8 36,5 39,8 38,7 
6 2 0,100  26,9 27,0 27,2 27,0 
7 2,5 0,125  22,4 20,2 21,0 21,2 
8 3,0 0,150  18,9 17,1 18,9 18,3 
Observacio nes: 
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que 
ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio  de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
B.18.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la úl tima dilución de la muestra.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Ejemplo:  
Tubo No.  ml lecturas  
media  µg* µg/ml  
1 2 
9 0,25 (81) 92,1 92,1 0,0119  0,0476  
10 0,50 82,7 81,7 82,2 0,0252  0,0504  
11 0,75 71,4 72,2 71,8 0,038  0,0507  
12 1 57,2 58,8 58,0 0,050  0,0500  
13 1,5 37,9 39,1 38,5 0,076 0,0507  
 Media 0,0498(=C)  
( ) = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de product o, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de pantotenato de calcio expresado en mg/100 g de producto es igual a:  
 
 
En donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en  µg/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V 1, en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
1,127 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforad o de 100 ml(V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de pantotenato de calcio leídas en la curva de calibración es  0,0498 
µg/ml (C).  
El contenido de pantoten ato de calcio es:  
 
B.19 DETERMINACI ON DE CIANOCOBALAMINA (VITAMINA B 12) POR M ETODO MICROBIOL OGICO  
B.19.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar cianocobalamina utilizando Lactobacillus leichmannii  ATCC 7830, 
microorganismo que no puede sintetizar esta  vitamina, relacionando directamente el crecimiento celular con la 
concentración de cianocobalamina presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se utiliza un medio 
comercial libre de cianocobalamina. El crecimiento celular se mide turbimétricame nte y por interpolación en la 
curva se determina la concentración de la muestra. El análisis debe realizarse con baja intensidad de luz 
porque la vitamina B 12 es fotosensible.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.19.2 Reactivos y materiales  
B.19.2.1 Reactivos  
Vitamina B 12 para fines bioquím icos 
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis  
Cianuro de sodio (CN) para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Hipoclorito de sodio  
Diastasa  
B.19.2.2 Materiales  
Micropipetas  
Centrífuga  
Matraz en forma de pera de vidrio de 100 ml  
Matraz  aforado de vidrio de 100 y 500 ml  
Matraz Erlenmeyer de vidrio de 250 ml  
Baño de agua  
Refrigerante Allihn  
Frascos con cápsula de polietileno a presión de 8 ml  
Tapón de vidrio  
Pera de goma, propipeta  
Material común de laboratorio  
Todo el material de vidrio debe ser actínico o forrado con papel aluminio.  
B.19.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
B.19.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus leichmannii ATCC 7830  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo micro inocul um 
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS  
Medio de prueba para vitamina B 12 
B.19.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacterioló gico, según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en e l refrigerador de 2 a 8°C.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.19.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus leichmannii en profundidad en el medio (B.19.4.1) cada cuatro 
semanas, efectuando un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido (B.19.4.3). Preparar el núme ro de 
tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
B.19.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.19.5 Preparación de soluciones  
B.19.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador 2 a 8°C.  
B.19.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 1 N  
Bajo una campana de extracción diluir 82 ml de ácido clorhídrico al 37% llevándolos a un volumen de  
1000 ml con agua destilada, para ello vertir el ácido en el matraz aforado que ya contiene agua.  
B.19.5.3 Solución de cianuro de sodio, 10 g /100 ml  
CUIDAD O: VENENO. UTILIZAR GUANTES.  
En un matraz aforado de 100 ml disolver 10 g de cianuro de sodio en agua destilada y llevar a volumen.  
Conservar en el refrigerador 2 a 8°C.  
B.19.5.4 Solución de cianuro de sodio al 1%  
Justo antes del uso, tomar mediante una pi peta y una pera de goma, 1/ml de solución de cianuro de sodio 
(B.19.5.3) y diluir a 10 ml con agua destilada en un matraz aforado de 10 ml.  
Nota: La solución sobrante de cianuro de sodio al 1% debe destruirse mediante adición de solución de 
hipoclorito de sodio al 15% (aproximadamente 1 ml por 10 ml de solución de cianuro de sodio). Dejar 
reaccionar durante 2 días bajo una campana de extracción.  
B.19.5.5 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de vitamina B 12; disolver en agua destilada y llevar a volumen  en un matraz 
aforado de vidrio de 500 ml. Verificar la concentración de la solución como sigue:  
Diluir 1 ml de solución con 3 ml de agua destilada. Medir la extinción de dicha solución en una cubeta de  1 
cm a 360 nm.  
 
En donde:  
f = contenido de vitamina  B12, en %  
E = extinción leída  
Corregir la concentración de la solución proporcionalmente según el ejemplo:  
 
para f = 76  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Eliminar la solución si el valor de f es inferior a 70%  
Conservar esta solución congelada en porciones de 5 ml en matraces actínicos d urante máximo 6 meses.  
B.19.6 Procedimiento  
La vitamina B 12 es fotosensible. Por lo tanto, para todas las soluciones que contienen dicha vitamina se 
debe utilizar material de vidrio actínico o cubrir el material de vidrio corriente con papel de aluminio o un  paño 
negro.  
B.19.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum (B.19.4.3).  
Incubar durante 18 h a 35°C.  
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último 
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 18 a 24 h a 35°C.  
B.19.6.2 Preparación de la toma de ensayo  
En un matraz de 100 ml con esmerilado normalizado, pesar de 3 a 4 g de muestra homogénea, que 
contenga aproximadamente  100 ng de vitamina B 12. 
Disolver la toma de ensayo en 25 ml de agua destilada a 50°C. A fin de evitar la formación de grumos, 
añadir el agua destilada en pequeñas cantidades agitando cada vez.  
Añadir 0,2 ml de solución de cianuro de sodio (B.19.5.4) recié n preparada (CUIDADO: VENENO) y agitar.  
Dejar la solución durante 30 min a temperatura ambiente, al abrigo de la luz y agitar de vez en cuando.  Al 
cabo de este tiempo, ajustar el pH de 4,8 - 5 con solución de ácido clorhídrico 1 N. A continuación calentar   el 
matraz durante 35 min en un baño de agua en ebullición. Enfriar (*). Ajustar el pH a 4,6. Transferir 
cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un 
filtro plisado con velocidad de filtraci ón media.  
* Para productos con almidón se recomienda aplicar un tratamiento enzimático a fin de obtener un filtrado 
límpido. Añadir a la solución la cantidad de diastasa equivalente al 10% de la toma de ensayo. Incubar 
durante 30 min a 42°C.  
Diluir el filt rado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,05 ng de vitamina B 12/ml. 
Nota: con cada nuevo lote de diastasa efectuar un ensayo en blanco.  
Tratar 3 g de diastasa como la toma de ensayo. El contenido de vitamina B 12 de la diastasa no debe 
rebasar 0,5 µg/100 g.  
B.19.6.3 Solución patrón 0,05 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución (B.19.5.5) como sigue:  
10 ml a 100 ml  
 
5 ml a 100 ml  
 
5 ml a 100 ml  
 
2 ml* a 100 ml = 0,05 ng/ml  
 
* + 0,2 ml de cianuro de sodio (CUIDADO VENENO)  
B.19.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio para prueba de vitamina B 12 
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de 1000 ml. Proceder según las 
indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
+ 50 ml a 100 ml de exceso  
 
B.19.6.5 Preparación del ensayo  
B.19.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas d e 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl, 
0,..., 8; el primero corresponde al blanco.  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución patrón: 0,0  0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2 2,5 3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2 ml 
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
B.19.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la s olución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 0,25  0,50 0,75 1,0 1,50 ml  
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo: 5 ml en cada tubo  
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
B.19.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
B.19.6.7 Inoculación  
B.19 .6.7.1 Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.19.6.1) a 
un tubo de centrífuga estéril, centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el pa quete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse  sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo (B.19.6.1) en un tubo que contenga 10 ml de medio 
(B.19.6.4). Este tubo es el inóculo.  
Así pues, para una extinción de l cultivo (B.19.6.1) entre 1,10 y 1,25 (después de sustraer la extinción 
propia del medio), introducir 2 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.19.6.4). Si la 
extinción no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución c omo sigue:  
-extinción inferior a 1,10: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 3 gotas)  
-extinción superior a 1,25: diluir proporcionalmente con el medio (B.19.6.4).  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
 
B.19.6.7.2 Inoculación  
Mediante una micropipeta de punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el 
medio.  
B.19.6.8 Incubación  
Incubar  los tubos inoculados durante aproximadamente 18 a 24 h a 35°C. Observar los tubos con 
regularidad al cabo de las 14 h. Verificar si la diferencia de desarrollo del microorganismo es suficiente entre la 
primera y la última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría. 
B.19.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbanci a a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl). *  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
* Nota: Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores  de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
B.19.7 Cálculos  
B.19.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o mediante una calculadora con regresión lineal, 
llevando la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada  y los ng de vitamina B 12 a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  
media  
1 2 3 
0 0,0 0,0 95,1 95,0 95,1 95,0 
1 0,25 0,0125  82,2 80,9 82,4 81,8 
2 0,50 0,025  67,5 67,0 66,1 66,9 
3 0,75 0,0375  55,0 56,5 57,5 56,3 
4 1,0 0,050  48,5 48,9 47,2 48,2 
5 1,5 0,075  37,1 37,8 36,8 37,2 
6 2 0,100  30,5 30,5 30,3 30,4 
7 2,5 0,125  25,4 23,2 24,4 24,3 
8 3,0 0,150  20,2 21,2 20,0 20,5 
Observaciones:  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que 
ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
B.19.7.2 Contenido de vitamina en el producto        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  media  µg* µg/ml  
1 2 
9 0,25 (93) 81,8 81,8 0,013 1 0,0524  
10 0,50 66,1 65,3 65,7 0,0263  0,0526  
11 0,75 54,8 56,8 55,8 0,038  0,0507  
12 1 48,5 48,1 48,3 0,049  0,0490  
13 1,5 37 38 37,5 0,077  0,0513  
 Media 0,0512(=C)  
( ) = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctu aciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de vitamina B 12, expresado en µg/100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V 1, en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
246 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 100 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota de 20 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media  de las concentraciones en vitamina B 12 leídas en la curva de calibración es 0,0512 ng/ml (C).  
El contenido en vitamina B 12 es: 
 
B.20 DETERMINACI ON DE VITAMINA K 1 POR CROMATOGRAF IA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCI ON 
(HPLC)  
B.20.1  Fundamento  
Se extrae la fracción liposoluble de una muestra en un tubo de centrífuga o mediante una columna de 
tierra de infusorios. Se separan las grasas en una columna HPLC preparativa y se recoge la fracción que 
contiene la vitamina K 1. Se inyecta esta fracción en una columna HPLC anal ítica y se determina el contenido 
de vitamina K 1 mediante un detector espectrofotométrico.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.20.2 Reactivos y materiales  
B.20.2.1  
Dimetilsulfóxido (DNSO) para síntesis  
Alcohol etílico absoluto para análisis  
n-Hexano grado purísimo  
Isooctano para análisis  
Acetonitrilo para cromatografía  
Vitamina K1  
Pirogalol para análisis  
Diclorometano para cromatografía  
Papaína soluble  
Tetrahidrofurano para análisis  
20 columnas preparadas para extracción de sustancias lipófilas de soluciones acuosas  
Envase de repuesto para 50 rellenos de la columna  
Diastasa  
B.20.2.2 Materiales  
Tubos para centrífuga de vidrio de 40 ml  
Tapones huecos hexagonales de diferentes medidas  
Matraces en forma de pera de 10 ml  
Matraces en forma de pera de vidrio de 25 y 250 ml  
Pipetas graduadas hasta l a punta de 1 ml: 0,005; 5 ml: 0,05; 10 ml: 0,10 y 20 ml: 0,10  
Micromatraz aforado de precisión de 2 ml  
Matraces aforados de vidrio de 10, 50 y 100 ml  
Filtro con poro de 0,45 µm  
Nota:  Utilizar material de vidrio actínico cuidadosamente lavado, con el fin de  evitar que sea fuente de 
contaminación.  
B.20.3 Aparatos e instrumentos  
Jeringuilla para HPLC de 1 ml y de aguja intercambiable  
Aguja para jeringuilla de HPLC  
Cilindro para gas comprimido, N 2 
Manodentor para gas comprimido, N 2 
Agitador para tubos de ensaye  
Estufa de laboratorio  
Instalación de HPLC que consta de:  
Para cromatograf ía preparativa: una bomba, un inyector (loop de 500 µl), una columna preparativa, un 
detector de longitud de onda variable, un registrador para cromatografía analítica: una bomba, un  inyector 
(loop de 100 µl), una columna analítica, un detector de longitud de onda variable, un registrador.  
Para una determinación por día, basta con un detector de longitud de onda variable y un solo registrador 
para ambos sistemas.  
Balanza de precisión        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Balanza analítica, 162 g; 0,1 mg  
Centrífuga  
Placa con pinzas para tubos de centrífuga  
Mesa vibrante, movimiento alternante  
Baño ultrasónico  
B.20.4 Preparación de soluciones  
B.20.4.1 Solución de pirogalol de 1 g/100 ml  
El día de la determinación disolver en  un matraz aforado de 25 ml, 250 mg de pirogalol en alcohol etílico.  
B.20.4.2 Fase móvil para HPLC preparativa: 1% de acetato de etilo en isooctano.  
En un matraz aforado de 1 000 ml, mezclar 10 ml de acetato de etilo con isooctano previamente 
degasificado bajo presión reducida y filtrado. Llevar a volumen.  
B.20.4.3 Fase móvil para purificar la columna preparativa: 10% de acetato de etilo en isooctano.  
En un matraz aforado de 500 ml, mezclar 50 ml de acetato de etilo con isooctano previamente 
degasificado ba jo presión reducida y filtrado. Llevar a volumen.  
B.20.4.4 Fase móvil para HPLC analítica: acetonitrilo -diclorometano -propanol -2 89:10:1 v/v/v  
Degasificar 1 litro de acetonitrilo bajo presión reducida y filtrar sobre una membrana.  
En un matraz aforado de 1  000 ml, mezclar 100 ml de diclorometano y 10 ml de propanol -2 con acetonitrilo 
y llevar a volumen.  
B.20.4.5 Soluciones patrón de vitamina K 1 
En un matraz aforado de 100 ml, pesar exactamente 40 mg de vitamina K 1 (fitomenadiona). Disolver y 
llevar a volume n con n -hexano. Esta es la solución 1 de 0,40 mg/ml. Se conserva una semana a 4°C.  
Justo antes de la determinación, efectuar las diluciones siguientes con n -hexano:  
Solución 2: diluir 5 ml de solución 1 en un matraz aforado de 50 ml (40 µg/ml).  
Solución 3:  diluir 5 ml de solución 2 en un matraz aforado de 50 ml (4 µg/ml). Determinar la concentración 
exacta de vitamina K 1 midiendo la extinción (E) a 248 nm.  
E1% en n -hexano = 435  
1 cm  
 
Solución 4: diluir 5 ml de solución 3 en un matraz aforado de 50 ml (0,4  µg/ml). Utilizar esta solución como 
patrón en la cromatografía preparativa para determinar el tiempo de retención.  
Solución 5: Mediante una pipeta, vertir 1 ml de solución 3 en un matraz aforado de 10 ml; evaporar a 
sequedad el disolvente bajo una ligera corriente de nitrógeno. Disolver y llevar a volumen con la fase móvil 
(B.23.4.4). Utilizar esta solución (0,4 µg/ml) como patrón en la cromatografía analítica.  
B.20.5 Procedimiento  
B.20.5.1 Preparación de la toma de ensayo  
B.20.5.1.1 Extracción en tubos de  centrífuga  
B.20.5.1.1.1 Productos sólidos  
Pesar 20 g de producto en un matraz aforado de 100 ml. Añadir 50 ml de agua a 45°C, luego 0,1 g de 
diastasa; a continuación, incubar durante 20 min a 40°C. Introducir 0,1 g de papaína e incubar de nuevo Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
durante 20  min a 40°C. Llevar a volumen con agua a temperatura ambiente. La suspensión debe ser 
homogénea; si no, colocar el matraz en un baño ultrasónico durante unos 5 min. Tomar 5 ml de suspensión e 
introducir en un tubo de centrífuga de vidrio provisto de un esm erilado. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y 
mezclar. Introducir 5 ml de solución de pirogalol y agitar. Luego añadir 10 ml de n -hexano y agitar el tubo 
vigorosamente durante 10 min mediante una mesa vibrante. Centrifugar el tubo, a fin de separar las dos f ases 
líquidas.  
Transferir la fase superior a otro tubo de centrífuga.  
Añadir 10 ml de n -hexano al primer tubo y agitar, luego centrifugar igual que arriba. Tomar la fase superior 
y añadir a la que ya se ha recuperado.  
B.20.5.1.1.2 Productos líquidos  
Pesar 5 g de producto homogéneo en un tubo de centrífuga de vidrio provisto de un esmerilado. Añadir 10 
ml de dimetilsulfóxido y mezclar bien. Añadir 5 ml de solución de pirogalol y agitar. Luego añadir 10 ml de  n-
hexano y agitar el tubo vigorosamente durante 5 min mediante una mesa vibrante. Centrifugar el tubo, a fin de 
separar las dos fases líquidas.  
Transferir la fase superior a otro tubo de centrífuga.  
Añadir 10 ml de n -hexano al primer tubo y agitar, luego centrifugar igual que arriba. Tomar la fase superio r 
y añadir a la que ya se ha recuperado.  
B.20.5.1.1.3 Lavado del extracto  
En el tubo de centrífuga que contiene la fase orgánica, añadir 10 ml de agua destilada. Agitar 
vigorosamente durante 5 min mediante la mesa vibrante y centrifugar.  
Mediante una pipet a Pasteur tomar lo mejor posible la fase orgánica, que debe ser límpida y transferirla a 
un matraz en forma de pera de vidrio de 50 ml. Añadir 2 ml de n -hexano en la superficie de la fase acuosa, 
tomar de nuevo la fase orgánica e introducir en el matraz.  
B.20.5.1.2 Extracción mediante la columna de tierra de infusorios.  
B.20.5.1.2.1 Productos sólidos  
En un matraz aforado de 100 ml de vidrio, pesar 2 g de producto. Añadir 0,200 g de papaína, luego 25 ml 
de agua a 45°C. Mezclar bien, utilizar un baño ultrasón ico si es necesario para deshacer los grumos. Incubar 
durante 30 min en la estufa a 40°C. Añadir 10 ml de dimetilsulfóxido y agitar el matraz durante 5 min mediante 
una mesa vibrante. Enfriar el matraz si es necesario y añadir 40 ml de tetrahidrofurano. Ag itar el matraz 
vigorosamente durante 10 min. Llevar a volumen con agua y mezclar bien.  
B.20.5.1.2.2 Productos líquidos  
En un matraz aforado de 10 ml de vidrio, pesar 10 g de producto. Añadir 0,200 g de papaína y mezclar 
bien. Incubar durante 30 min en la e stufa a 40°C. A continuación añadir 20 ml de agua y 10 ml de 
dimetilsulfóxido y agitar el matraz durante 5 min mediante una mesa vibrante. Enfriar el matraz si es necesario 
y añadir 40 ml de tetrahidrofurano. Agitar el matraz vigorosamente durante 10 min. Llevar a volumen con agua 
y mezclar bien.  
B.20.5.1.2.3  Preparación de la columna de extracción  
Colocar el filtro circular de 10 mm en el portafiltro inferior e introducir éste en el cuerpo de la columna. 
Rellenar la columna con el contenido de un sobre y a gitar de 10 a 20 seg mediante un vibrador de reactivos.  
Presionar el filtro circular de 24 mm en el anillo con borde reforzado del recambio y deslizar éste dentro del 
cuerpo de la columna hasta que el filtro se encuentre sobre la superficie del relleno.  
Fijar una aguja a la conexión Luer, situada en el extremo inferior de la columna; sujetar ésta mediante  una 
pinza.  
B.20.5.1.2.4  Llenado de la columna y elución  
Mediante una pipeta aforada transferir 20 ml del contenido del matraz aforado (B.20.5.1.2.1 o B.2 0.5.1.2.2) 
a la columna de extracción B.20.5.1.2.3. Evitar arrastrar sedimento durante esta operación. Al cabo de 15 min 
eluir lentamente con 100 ml de n -hexano. La fase acuosa debe permanecer absorbida en la columna. Recoger       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
el eluato en un matraz en form a de pera de 250 ml de vidrio. Interrumpir la operación a más tardar 30 min 
después que todo el n -hexano haya penetrado en la columna.  
B.20.5.2  Evaporación del extracto y preparación del extracto final de la toma de ensayo.  
Evaporar la solución (B.20.5.1.1 .3 o B.20.5.1.2.4) bajo presión reducida y eliminar las últimas trazas de 
disolvente mediante una ligera corriente de nitrógeno. Recuperar el residuo cuantitativamente con la fase 
móvil y transferir a un matraz aforado de 5 ml para la extracción en tubos d e centrífuga o de 2 ml para la 
extracción en columnas. Filtrar sobre una membrana antes de inyectar en la columna HPLC.  
B.20.5.3  Cromatografía preparativa  
Mantener el sistema HPLC preparativo con las características siguientes:  
Columna:  Lichrosorb -Si 60, 5  µm, 8 x 120 mm, o equivalente.  
Loop:  500 µl  
Fase móvil:  ver punto 23.4.2  
Caudal:  3 ml/min  
Detector:  Espectrofotómetro 254 nm, 0,05 AUFS  
Registrador:  10 mm/min  
 
Inyectar primero 0,500 ml de solución patrón 4 y determinar el tiempo de retención aproxi mado debe ser 
de 5 a 7 min. A continuación inyectar 0,500 ml de solución de extracto y recoger la fracción que contiene la 
vitamina K 1 en un matraz en forma de pera de 10 ml de vidrio, comenzando unos 30 seg antes de que se 
eluya la vitamina K 1; interrumpi r la operación unos 30 seg después de que haya sido eluida la vitamina K 1. 
B.20.5.4  Limpieza de la columna preparativa  
A fin de eliminar rápidamente todas las impurezas retenidas por la columna durante la cromatografía 
preparativa, aumentar la polaridad de  la fase móvil utilizando una mezcla al 10% de acetato de etilo en 
isooctano (B.20.4.3). Esta operación dura aproximadamente de 10 a 15 min.  
Volver a introducir la fase móvil (B.20.4.2) y eluir hasta obtener una línea de base estable 
(aproximadamente 10 mi n). La columna está lista para otra inyección preparativa.  
B.20.5.5  Cromatografía analítica  
Evaporar a sequedad bajo una ligera corriente de nitrógeno la fracción recogida bajo (B.20.5.3). Recuperar 
el residuo con 250 µl de fase móvil (B.20.4.4); agitar su avemente para disolver bien el residuo.  
Montar el sistema HPLC analítico con las características siguientes:  
Columna:  Spherisorb ODS, 5 µm, 4,6 x 250 mm, o equivalente.  
Loop:  100 µl  
Fase móvil:  ver punto 23.4.4  
Caudal:  2 ml/min  
Detector:  espectofotómet ro 248 nm, 0,01 AUFS  
Registrador:  10 mm/min  
Inyectar primero 0,100 ml de solución patrón 5 y determinar el tiempo de retención aproximado: debe ser 
aproximadamente de 5 min. A continuación inyectar 0,100 ml de la fracción obtenida más arriba.  
Medir la al tura de los picos correspondientes a la vitamina K 1 en el patrón así como en el extracto.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Nota:  El grado de silanización de la columna en fase inversa puede variar. Si es necesario, ajustar el 
porcentaje de diclorometano contenido en la fase móvil B.20.4.4  a fin de obtener un tiempo de retención de 
unos 5 min. Si el tiempo de retención es demasiado largo o demasiado corto, aumentar o disminuir 
respectivamente la cantidad de diclorometano.  
B.20.6  Cálculo y expresión de resultados . 
El contenido de vitamina K 1 (fitomenadiona), en µg/100 g de producto, es igual a:  
Productos líquidos, con tratamiento de extracción en tubos de centrífuga:  
 
Productos sólidos, con tratamiento de extracción en tubos de centrífuga; productos sólidos y líquidos con 
tratamiento de extr acción en columnas:  
 
En donde:  
h2 = altura del pico del extracto, en mm  
C = concentración de la solución patrón, en µg/ml (en general 0,4 µg/ml)  
V0 = volumen de extracto obtenido bajo B.20.5.2 (en general 5 ó 2 ml)  
V2 = volumen en el cual ha sido diluida la fracción después de la cromatografía preparativa (en general 
0,250 ml)  
V = volumen en el cual ha sido disuelta la toma de ensayo, en ml (en general 100 ml)  
h1 = altura del pico del patrón, en mm  
V3 = parte alícuota de V vertida en la columna de extracci ón en ml (en general 20 ml), o parte alícuota de 
V introducida en el tubo de extracción, en ml (para productos sólidos, en general 5 ml)  
V1 = volumen del extracto (V 0) inyectado en la columna preparativa (en general 0,500 ml)  
m = masa de la toma de ensayo,  en g 
B.20.7  Sensibilidad del método  
El límite de detección es de aproximadamente 3 µg/100 g de producto; así pues, es posible medir con 
precisión aceptable contenidos de vitamina K 1 a partir de una concentración de 5 µg/100 g.  
B.20.8  Repetibilidad  
La dife rencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, en las 
mismas condiciones en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 10% de la media de los resultados.  
B.21 DETERMINACI ON DE BIOTINA (VITAMINA H) POR M ETODO MICROBI OLOGICO  
B.21.1 Fundamento  
Este método permite cuantificar concentraciones desconocidas de biotina utilizando Lactobacillus 
plantarum  ATCC 8014, microorganismo que no puede sintetizar esta vitamina, relacionando directamente el 
crecimiento celular con la co ncentración de biotina presente. Para preparar la muestra y la curva estándar se 
utiliza un medio libre de biotina y el crecimiento celular se cuantifica turbidimétricamente. Por interpolación en 
la curva se determina la concentración de la muestra.  
B.21.2  Reactivos y materiales  
B.21.2.1 Reactivos        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
D (+) - Biotina para fines bioquímicos  
Acido sulfúrico 95 -97% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Alcohol etílico absoluto  
B.21.2.2 Material  
Micro pipeta  
Material común de laboratorio  
B.21.3 Aparatos e instrumentos  
Centrífuga  
Autoclave  
Incubadora a 35 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
B.21.4 Cepa y medios de cultivo  
Lactobacillus plantarum ATCC 8014  
Leche descremada en polvo grado reactivo  
Caldo micro inoculum  
Agar bacteriológico  
Caldo Bacto Lactobacilli MRS (MRS -agar)  
Medio de prueba para biotina  
B.21.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Bacto Lactobacilli MRS -agar (MRS -agar)  
Preparar 1 l de medio con 55 g de caldo Bacto Lactobacilli MRS + 15 g de agar bacter iológico, según las 
indicaciones de la etiqueta del caldo MRS + 1,5% de leche descremada (reconstituida al 10% en agua 
destilada). Repartir a razón de 6 ml en tubos (de preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en 
posición vertical.  
Conservar en el refrigerador 2 a 8°C.  
B.21.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por punción Lactobacillus plantarum en profundidad en el medio (B.21.4.1) cada cuatro semanas, 
efectuar un cultivo intermedio de 18 h en el medio líquido B.21.4.3. Preparar el número de  tubos necesarios 
para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 18 a 24 h a 35°C.  
B.21.4.3 Medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo  
Caldo Micro Inoculum  
Preparar 1 l de solución según las indicaciones de la etiqueta y repartir a razón de 10 ml en tubos. Tapar 
los tubos con capuchones y esterilizar según las indicaciones del fabricante.  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.21.5 Preparación de soluciones  
B.21.5.1. Solución fisiológica  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.21.5.2  Solución de ácido sulfúrico aproximadamente 3 N 
Disolver 85 ml de ácido sulfúrico 95 - 97% a 1000 ml con agua destilada. Para ello verter al ácido con 
PRECAUCI ON en el matraz aforado que ya contiene agua. Enfriar el matraz durante la operación. Llevar a 
volumen.  
B.21.5.3 Solución de Hidróxido de sodio , 60 g/100 ml  
Disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando bajo el agua del grifo. Completar a  500 
ml en una probeta graduada. Conservar en un frasco con tapón de polietileno o de goma.  
B.21.5.4 Solución de Hidróxido de sodio aproxima damente 1 N  
Disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua destilada y llevar a volumen en un matraz aforado de 500 ml 
con tapón de polietileno.  
B.21.5.5 Solución patrón  
Pesar exactamente 50,0 mg de biotina; disolver en una mezcla 1:1 agua destilada/alcohol e tílico y llevar a 
volumen en un matraz aforado de 500 ml. Conservar esta solución en un frasco actínico a 4°C durante 
máximo 6 meses.  
B.21.6 Procedimiento  
B.21.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Un día antes, subcultivar en 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 18 a 24 h a 35°C.  
Seis horas antes de la inoculación del ensayo, inocular 2 gotas (aproximadamente 0,1 ml) del último 
cultivo de 18 h en otro tubo de 10 ml de caldo Micro Inoculum.  
Incubar durante 6 h a 35°C.  
B.21.6.2 Preparación de la toma d e ensayo  
En un matraz Erlenmeyer de 150 ml, pesar de 1 a 2 g de muestra homogénea, que contenga 
aproximadamente 1 µg de vitamina, añadir 50 ml de ácido sulfúrico 3 N y dispersar bien el producto. A fin de 
evitar la formación de grumos, añadir el ácido en p equeñas cantidades pasando el matraz Erlenmeyer bajo el 
grifo de agua caliente después de cada adición.  
Cubrir el matraz con papel de aluminio y colocarlo en el autoclave durante 1 h a 120°C. Enfriar.  
Ajustar el pH a 4,6 añadiendo primero aproximadamente 3  ml de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml 
mientras se enfría el matraz Erlenmeyer, y luego hidróxido de sodio 1 N. Transferir cuantitativamente a un 
matraz aforado de 250 o 300 ml y llevar a volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro plisado con 
velocidad de filtración media.  
Diluir el filtrado de modo que se obtenga una solución de aproximadamente 0,2 ng de vitamina por ml.  
B.21.6.3 Solución patrón, 0,2 ng/ml  
Justo antes del uso diluir la solución (B.21.5.5) como sigue:  
1 ml a 100 ml  
 
1 ml a  100 ml  
 
2 ml a 100 ml = 0,2 ng/ml  
B.21.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio de prueba para biotina        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Preparar el volumen necesario en un matraz Erlenmeyer de vidrio de material actínico de 1000 ml. 
Proceder según las indicaciones de la etiqueta, cale ntando la solución en una parrilla con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  10 tubos 10 x 5 ml = 50 ml  
+ 50 a 100 ml de exceso  
 
B.21.6.5 Preparación del ensayo  
B.21.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados  bl, 
0, ..., 8; el primero corresponde al blanco (bl).  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución patrón: 0,0  0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2 2,5 3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,5 2 2 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada tubo  
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.  
B.21.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar dos filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los pri meros cinco tubos de ambas filas van 
destinados a un producto, los otros cinco de ambas filas, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 18, y 
así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en duplicado en ambas series  de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la solución de la muestra, completar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de 
cultivo para el ensayo.  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 
0,25 0,50 0,75 1,0 1,50 ml  
Agua: 4,75  4,50 4,25 4,0 3,50 ml  
Medio de cultivo:  5 ml en cada tubo  
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra ambas filas de tubos en el 
soporte.  
B.21.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 15 min a 115°C,  luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
B.21.6.7 Inoculación  
B.21.6.7.1  Preparación y estandarización del inóculo  
Justo antes de inocular el ensayo, transferir una cantidad suficiente del cultivo preparado bajo (B.21.6.1) a 
un tubo de centrífuga estéril , centrifugar a 2600 rpm durante 5 min, decantar y resuspender el paquete celular 
en 10 ml de solución salina. Hacer dos lavados más. Transferir a una cubeta de 1 cm y efectuar la lectura en 
el espectrofotómetro a 575 nm. Estandarizar el cultivo a fin de o btener siempre aproximadamente la misma 
extinción. No debe olvidarse sustraer de la extinción del cultivo la del medio de ensayo, que es un medio 
coloreado.  
Según la extinción, diluir "n" gotas del cultivo B.21.6.1 en un tubo que contenga 10 ml de medio (B .21.6.4). 
Este tubo es el inóculo.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Así pues, para una extinción del cultivo (B.21.6.1) entre 0.2 y 0,4 (después de sustraer la extinción propia 
del medio), introducir de 4 a 8 gotas de cultivo en el tubo que contiene 10 ml de medio (B.21.6.4). Si la 
extinc ión no se encuentra en la zona arriba mencionada, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 0,2: introducir proporcionalmente más gotas en el tubo (no más de 10 gotas).  
- extinción superior a 0,4: introducir menos gotas o diluir proporcionalm ente con el medio (B.21.6.4)  
 
B.21.6.7.2  Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocular 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos lige ramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en el 
medio.  
B.21.6.8  Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 18 a 24 h a 35°C. Observar los tubos con 
regularidad al cabo del final del tiempo de incubación. Verificar si la  diferencia de desarrollo del 
microorganismo es suficiente entre la primera y la última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se reco mienda interrumpir el crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  
B.21.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microo rganismo. Transferir la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% de T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).*  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar l a sedimentación del microorganismo.  
* Nota:  Si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los valores de los ejemplos, 
dados en transmitancia.  
B.21.7 Cálculos  
B.21.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milim étrico o utilizar una calculadora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de vitamina a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  
media  
1 2 3 
0 0,0 0,0 96,6 96,5 96,8 96,6 
1 0,25 0,05 89,9 89,1 90,1 89,7 
2 0,50 0,10 80,9 82 82,1 81,7 
3 0,75 0,15 75,1 74,8 74,9 74,9 
4 1,0 0,20 69,0 68,1 68,9 68,7 
5 1,5 0,30 59,9 59,0 58,9 59,3 
6 2 0,40 51,8 51,8 51,2 51,6 
7 2,5 0,50 46,0 45,7 45,1 45,6 
8 3,0 0,60 41,5 40,5 40,0 40,7 
Observaciones:        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
La curva de calibración es característica de cada vitamina. Es mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa 
de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada; esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo; que deben verificarse por separado.  
B.21.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilució n de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  
media  µg* µg/ml  
1 2 
9 0,25 (82) 87,5 87,5 0,065  0,26 
10 0,50 80,2 78,2 79,2 0,120  0,24 
11 0,75 71,8 72,6 72,2 0,175  0,23 
12 1 64,7 66,1 65,4 0,235  0,24 
13 1,5 54,1 53,8 53,9 0,37 0,25 
 Media 0,244 =(C) 
( ) = valor aberrante  
* = valores leídos en la curva de calibración  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas de los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en µg/100 g de producto, teniendo en cuenta las  diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido en vitamina, expresado en µg de biotina/100 g de producto es igual a:  
 
 
En donde:  
C= media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en ng/ml  
V1= volumen en el qu e se ha disuelto la toma de ensayo, en ml  
V2= parte alícuota de V 1, en ml  
V3= volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
1,032 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 250 ml (V 1). Se ha tomado  una parte 
alícuota de 20 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de biotina leídas en la curva de calibración es 0,244 ng/ml (C).  
El contenido en vitamina es:  
 
B.22 DETERMINACI ON DE SODIO (NA) POR E SPECTROFOTOMETR IA DE ABSORCION AT OMICA 
CON ADITAMENTO DE FLAMA  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.22.1 Método de espectrofotometría de absorción atómica con aditamento de flama  
B.22.2.1 Fundamento  
La muestra se somete a una digestión ácida con ácido nítrico concentrado para que el analito  liberado sea 
cuantificado por espectrofotometría de absorción atómica.  
B.22.2.2 Reactivos y materiales  
B.22.2.2.1 Reactivos  
Acido nítrico (HNO 3) concentrado grado suprapuro  
Acido nítrico (HNO 3) concentrado G.R.  
Estándar certificado de Na de 1000 g/ml 
Agua deionizada  
B.22.2.2.2 Materiales  
Sistema de reflujo  
Material común de laboratorio  
Papel filtro No. 1  
B.22.2.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica con una sensibilidad de 0,1 mg  
Espectrofotómetro de absorción atómica con aditamento de flama  
Parrilla  de calentamiento  
Lámpara de cátodo hueco de sodio  
B.22.2.3 Preparación de la muestra para ensayo  
B.22.2.3.1 Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Ev itar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
B.22.2.3.2 Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipiente de vidrio o de 
plástico descontaminado. Guardar en el refri gerador (4°C). Mezclar bien antes del uso.  
B.22.2.4 Descontaminación del material  
En una cubeta de polietileno (volumen aproximado de 15 l) introducir 10 l de mezcla ácido nítrico/  agua 
(1:1).  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces  aforados, tapones, recipientes de 
polietileno o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada.  
Secar.  
B.22.2.5 Procedimiento  
Se pesa de 1 a 2 g de muestra en un matraz de fondo plano de 250 ml con boca esmeri lada, se le añaden 
10 ml de HNO 3 grado suprapuro y se digieren por calentamiento en un sistema de reflujo durante 2 h o hasta 
digestión completa.  
La muestra se enfría y se filtra a través de papel filtro No. 1 y se recibe en un matraz aforado de 100 ml.  
Se lava tres veces el matraz de la digestión con tres porciones de 10 ml de agua deionizada y los lavados 
se filtran y se reciben en el matraz aforado, se lleva a volumen con agua deionizada.  
Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo con las recomendaciones de l fabricante usando un estándar 
certificado. Se leen las muestras y se anotan los resultados obtenidos en g/ml.  
Longitud de onda: 589,6 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante  
Nota:  Se recomienda meter una muestra añadida para valorarla y hacer un blanco de re activos para cada 
serie de digestiones.  
B.22.2.6 Cálculo        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
 
En donde:  
A = g/ml de Na+ en la muestra  
B = g/ml de Na+ en el blanco  
C = ml de aforo de la muestra  
D = peso de la muestra en g tomada para el análisis  
B.22.2.7 Sensibilidad del método  
0,15 g/ml para 1% de absorción  
B.23 DETERMINACI ON DE POTASIO (K) POR ESPECTROFOTOMETR IA DE ABSORCI ON AT OMICA  
B.23.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por emisión de 
llama.  
B.23.2  Reactivos y materi ales 
B.23.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Acido clorhídrico fumante 37%  
Solución patrón de potasio mínimo para análisis  
Solución patrón de potasio lista para el uso, 1000 mg/l  
B.23.2.2  Materiales  
Matraces aforados 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 l 
Pipetas ajustables 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas forma alta  10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer cuello estrecho 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos  (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible cuello estrecho de 100 y 1000 ml  
Cubeta de polietileno 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l se mezcla de ácido nítrico/agua (1:1)  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno  
o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y secar.  
B.23.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión capacidad 4100/60 0g: 0,1/0,001  
Lámpara de potasio de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
B.23.4  Preparación de soluciones  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.23.4.1  Solución de ácido clorhídrico 1,2 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximada mente 500 ml de agua destilada y 100 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar a volumen con agua destilada.  
B.23.4.2  Solución de ácido clorhídrico, 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml  de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.23.4.3  Solución de ácido clorhídrico, 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enf riar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.23.4.4  Solución patrón de potasio, 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de potasio. Enjuagar 
la ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conserv ada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de potasio de 1000 mg/l lista para el uso.  
B.23.4.5  Soluciones patr ón diluidas de potasio  
En matraces aforados de 100 ml vertir mediante una pipeta 0 - 100 - 200, 500 y 1000 ml de  solución 
B.23.4.4. Y llevar al volumen con solución B.23.4.1. Estas soluciones contienen respectivamente  0 - 1,0 - 2 - 
5,0 y 10 µg de potasio /ml. Transferir inmediatamente a frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
B.23.5  Preparación de la muestra para ensayo  
B.23.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante es ta manipulación. Mezclar bien.  
B.23.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipiente de vidrio o de 
plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su u so. 
B.23.6  Procedimiento  
B.23.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g; 1g de producto en polvo o 10g de 
producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml  de 
solución  de ácido clorhídrico 6 N (B.23.4.3). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar 
enfriar a temperatura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolecta r el resto del filtrado.  
B.23.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la solución de toma de ensayo 
(B.23.6.1), tal que la concentración final esté comprendida entre 1 y 10 µg/ml. Llevar al volumen con solución 
de ácido clorhídrico 1,2 N.  
B.23.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben resp etarse 
las siguientes condiciones:  
Longitud de onda: 766,5 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante  
Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el equilibrio. Colocar el quemador y ajustar el 
fotomultiplicador de manera óptima; para ello aspírese el pa trón más concentrado.  
Aspirar las soluciones patrón (B.23.4.5), luego las soluciones de la toma de ensayo (B.23.6.2). Después de 
cada medida, aspirar un poco de solución (B.23.4.2), luego agua destilada a fin de evitar que el capilar se       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
obstruya. Después d e aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando una 
solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos  
5 seg. Efectuar cada m edida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe rebasar 
la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (B.23.6.2).  
B.23.7  Cálculo y expresión de resultados  
B.23.7.1  Modo de cálculo  
Calcula r o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de potasio en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
En donde:  
C = concentración de potasio en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de potasio en el blanco (solución patrón de 0 µg de  potasio por ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo, en ml  
D = factor de dilución  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
B.23.7.2  Expresión de los resultados  
Contenidos inferiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con dos cifra s significativas.  
Contenidos superiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con tres cifras significativas.  
B.23.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto inte rvalo de tiempo, no debe exceder el 5% de su valor medio.  
B.24 DETERMINACI ON DE CLORURO (Cl) POR VALORACI ON 
B.24.1  Fundamento  
Haciendo una solución o suspensión del producto en ácido nítrico, se valora por potenciometría directa 
mediante un electrodo de vi drio y una solución valorada de nitrato de plata hasta un potencial final 
previamente establecido.  
B.24.2  Reactivos y materiales  
B.24.2.1  Reactivos  
Solución de nitrato de plata de 0,1 mol o nitrato de plata para análisis  
Solución de cloruro de sodio 0,1 mo l o cloruro de sodio para análisis  
Gelatina en polvo  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
B.24.2.2  Materiales  
Vasos de forma alta de 150 ml  
Pipetas automáticas de báscula de 1 ml  
Material común de laboratorio  
Bureta de 20 o 25 ml  
Agitador magnético  
B.24. 3 Aparatos e instrumentos  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Los aparatos de medidas descritos se refieren al método más utilizado, es decir, la determinación 
semiautomática.  
Desecadores  
Pesafiltros de forma alta con tapón esmerilado de 10 ml  
Soportes para desecadores  
Estufa de laboratorio  
Electrodo anular de plata  
La valoración potenciométrica puede efectuarse de tres maneras y el equipo para cada una de ellas es el 
siguiente:  
B.24.3.1  Determinación manual  
Medidor de pH/milivoltímetro con escala de lectura de ± 700 mV  
Electrodo de plata con  superficie tan grande como sea posible (para mayor estabilidad), y electrodo de 
referencia. O bien un solo electrodo anular de plata combinado.  
B.24.3.2  Determinación semiautomática  
Puesto de valoración automático, compuesto de: aparato de medida (milivol tímetro); aparato de mando 
programable (valorador, generador de impulsos) y bureta de pistón motorizada.  
Imprimente o trazador de curvas (facultativo)  
Electrodo ver (B.24.3.1)  
B.24.3.3  Determinación automática  
Además de los aparatos citados en (B.24.3.2):  
Cambiador de muestras automático con unidad de mando y puesto de valoración  
Valorador según (B.24.3.2) con bureta de pistón motorizada, pero con distribución y llenado a control 
remoto, así como trasmisión de datos a la imprimente.  
Nota:  Según los instrume ntos disponibles se puede optar por una solución intermedia.  
B.24.4  Preparación de soluciones  
B.24.4.1  Solución de nitrato de plata 0,1 N  
En un matraz aforado de 1000 ml diluir el contenido de una ampolleta de solución 0,1 N lista para el uso,  
o bien: si no se dispone de solución valorada lista para el uso, pesar, con una aproximación de 0,5 mg; 
16,9890 g de nitrato de plata previamente secado durante 2 h a 102 ± 2°C. Disolver en agua destilada y llevar 
a volumen en un matraz aforado de 1000 ml. Comprobar el título, por valoración según (B.24.5.3), de 20 ml de 
solución exactamente 0,1 N de cloruro de sodio.  
B.24.4.2  Solución de cloruro de sodio 0,1 N  
En un matraz aforado de 1000 ml diluir el contenido de una ampolleta de solución 0,1 N lista para uso, o 
bien: si no se dispone de solución valorada lista para el uso, pesar, con una aproximación de 0,5 mg; 5,8440 g 
de cloruro de sodio previamente secado durante 2 h a 102 ± 2°C. Disolver en agua destilada y llevar a 
volumen en un matraz aforado de 1000 ml.  
B.24. 4.3 Solución de gelatina aproximadamente 5g/100 ml (volumen aproximado de 15 ml), justo antes del 
uso, disolver, calentando 1 g de gelatina en 20 ml de agua destilada. Enfriar.  
B.24.5  Procedimiento  
La preparación de la muestra, la toma de ensayo y la disol ución son idénticas para las tres variantes. No 
es preciso clarificar la solución a valorar, ya que ni el color del producto ni su contenido en sustancias 
insolubles influyen en el potencial final. En general, una adición de ácido nítrico elimina las inter ferencias.  
B.24.5.1  Toma de ensayo y disolución        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
En un recipiente de valoración o en un vaso pesar con una aproximación de 0,1 mg, entre 1 y 5 g de 
producto, según el contenido supuesto en cloruro y la homogeneidad del producto. Para productos líquidos, 
añadir mediante una pipeta un volumen exacto correspondiente a los mismos criterios. La toma de ensayo 
debe consumir entre 1 y 15 ml de nitrato de plata. Añadir agua destilada para obtener un volumen final de 
unos 50 ml, así como un imán mezclador. Colocar so bre un agitador magnético y agitar hasta obtener una 
solución o una suspensión fina, sin grumos. La duración varía entre 1 y 30 min, según la naturaleza del 
producto. Mediante una pipeta automática añadir 1 ml de ácido nítrico concentrado y mezclar. El pH de la 
solución debe ser inferior a 1,5. En caso de duda, verificarlo mediante un medidor de pH y, si es necesario 
añadir más ácido nítrico.  
B.24.5.2  Determinación manual  
B.24.5.2.1  Preparación del aparato  
Conectar los electrodos al aparato de medida y, si es necesario, precalentar el mismo según las 
instrucciones del fabricante. Sumergir el o los electrodos, pero nunca la punta de la bureta, en una mezcla de 
50 ml de agua destilada y 1 ml de ácido nítrico concentrado (solución de calibración) y colocar sobr e un 
agitador magnético. Ajustarlo de modo que mezcle bien sin salpicar durante las valoraciones ulteriores. 
Consultar el manual del aparato para ajustar la escala de los milivoltios mediante una contratensión a fin de 
obtener un potencial cercano al medio  de la escala de lectura (ese será el potencial final). Después de esta 
calibración no se deben efectuar más ajustes en el milivoltímetro.  
Ver notas B.24.8.  
B.24.5.2.2  Valoración  
Sumergir los electrodos en la solución acidificada de la toma de ensayo. Si s e utiliza un agitador 
magnético y una bureta de pistón, sumergir asimismo la punta de la bureta a media altura del electrodo  de 
plata, o a la altura del anillo de plata si se utiliza un electrodo combinado, a aproximadamente 1 cm delante de 
éste (en el se ntido de rotación del líquido). Así es posible valorar con la mayor precisión, ya que el electrodo 
señala inmediatamente un exceso de reactivo.  
Agitando continuamente, sin tocar los electrodos, valorar mediante la solución de nitrato de plata 0,1 N, 
primer o rápidamente hasta unos 100 mV antes del potencial final, luego lentamente con porciones cada vez 
más pequeñas hasta el potencial final, que debe permanecer estable durante al menos 10 seg. Una ejecución 
minuciosa con bureta de pistón permite determinar e l punto final con una precisión de 0,01 ml.  
Variante: Para determinaciones aún más precisas, sobre todo para determinar contenidos muy bajos en 
cloruro, la valoración a "potencial final" puede reemplazarse ventajosamente por la valoración  "en 
incrementos"  o porciones. El volumen de reactivo correspondiente al punto de equivalencia puede encontrarse 
ya sea gráficamente, o por cálculo.  
B.24.5.2.3  Enjuague de los electrodos  
Enjuagar los electrodos con agua destilada inmediatamente después de cada valoración. Si se pega 
materia grasa a los electrodos, eliminarla sumergiéndolos brevemente en acetona.  
B.24.5.2.4  Verificación del potencial de fin de reacción  
Al efectuar grandes series de valoraciones hasta potencial final, debe verificarse la concordancia entre el  
potencial final fijado y aquel medido por los electrodos sumergidos en la mezcla agua/ácido nítrico. Para ello, 
después de 30 a 60 min de valoración y después de apartar la punta de la bureta, sumergir los electrodos en 
el vaso que contiene la mezcla agua /ácido nítrico y agitar. Si es necesario, corregir el potencial.  (Una 
diferencia de más de 10 mV indica que los electrodos están sucios)  
B.24.5.2.5  Verificación del método  
Periódicamente valorar según el punto (B.24.5.2.2); 20 ml de solución 0,1 N de clor uro de sodio.  
Al valorar soluciones puras de cloro, el cloruro de plata precipitado tiende a adherirse a la superficie activa 
del electrodo de plata o al anillo de plata del electrodo combinado, lo cual impide el buen funcionamiento. Para 
evitar este incon veniente, se recomienda añadir antes de comenzar la valoración unos mililitros de solución de 
aproximadamente 5g/100 ml de gelatina recién preparada. Corregir mediante un ensayo en blanco si la 
gelatina contiene cloruro.  
B.24.5.3  Determinación semiautomáti ca Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.24.5.3.1  Preparación del aparato  
Montar el aparato, efectuar las manipulaciones y verificar el funcionamiento del valorador según las 
instrucciones del fabricante.  
La disposición de los electrodos y de la punta de la bureta en el recipiente de valorac ión debe ser 
exactamente la misma como para la valoración manual.  
Antes de cada valoración comprobar:  
El llenado del sistema de la bureta y, si es necesario, la posición de la llave.  
La puesta a cero de la bureta y, si es necesario, del registrador.  
La pos ición de la punta de la bureta  
La velocidad del motor de la bureta si es manual. La velocidad mínima ofrece mayor precisión.  
La velocidad del agitador  
La velocidad del papel y la escala deseada en el registrador.  
B.24.5.3.2  Valoración  
Dado que la valoració n es automática se necesita vigilar el aparato cuando menos la primera vez después 
del ajuste. El valorador se para automáticamente en caso de valoración a potencial final; en cambio, si la 
valoración se registra gráficamente, debe interrumpírsele cuando e l milivoltímetro indica unos 120 mV más 
allá del punto final.  
Al efectuar grandes series de valoraciones hasta potencial final, debe verificarse la concordancia entre el 
potencial final fijado y aquel medido por los electrodos sumergidos en la mezcla agua/ ácido nítrico. Apartar la 
punta de la bureta. Ver punto (B.24.5.2.4).  
Para la limpieza de los electrodos después de cada valoración, ver (B.24.5.2.3) y (B.24.8).  
B.24.5.4  Determinación automática  
Montar y utilizar la instalación siguiendo estrictamente las  instrucciones del fabricante.  
Normalmente ajustar el valorador como para la determinación semiautomática. Sólo pueden efectuarse 
valoraciones a potencial final.  
Deben observarse estrictamente todos los detalles indicados más arriba: disposición de los ele ctrodos en 
el recipiente de valoración, tratamiento de los electrodos, etc.; si es necesario puede adaptarse el volumen de 
la solución a valorar a la capacidad del recipiente de valoración. La cantidad de ácido nítrico debe ser de al 
menos 1 ml por 50 ml d e solución a valorar.  
Antes de comenzar la valoración, además de los controles indicados bajo (B.24.5.3.1), ajustar el 
programador del cambiador de muestras y comprobar los puntos siguientes:  
Posición correcta de los recipientes de valoración en el cambiad or de muestras.  
Cantidad suficiente de reactivo, de agua de enjuague y de papel en el registrador.  
Comprobar el buen funcionamiento del aparato durante la primera valoración. Basta con verificar de vez 
en cuando la reserva de reactivo, de agua de enjuague y de papel en el registrador, así como el 
funcionamiento correcto de la valoración y de la impresión.  
B.24.6  Cálculo y expresión de resultados  
B.24.6.1  Cálculo  
El contenido de cloruro en el producto, expresado en porcentaje de masa, es igual a:  
 
En donde:  
A = número de ml de solución de nitrato de plata 0,1 N utilizados para la valoración (lectura en la bureta  o 
determinados gráficamente o por cálculo)  
35,45 = peso atómico del cloro  
N = normalidad exacta de la solución de nitrato de plata (0,1)  
m = masa de  la toma de ensayo, en g; o volumen en ml  
B.24.6.2  Expresión de resultados        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Expresar los resultados en g de cloruro/100 g o 100 ml.  
Para expresar el resultado en mg de cloruro/100 g, multiplicar el porcentaje por 100.  
Si es necesario, también se puede dar e l resultado en cloruro de sodio, reemplazando en la fórmula de 
cálculo, el peso atómico del cloro (35,45) por el del cloruro de sodio (58,44)  
B.24.7  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra para ensayo, e n las 
mismas condiciones en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder 1% de su valor medio.  
La heterogeneidad de una muestra puede influir desfavorablemente en la repetibilidad y la 
reproducibilidad.  
B.24.8  Notas  
B.24.8.1  Agua destilada  
Utilizar agua d estilada totalmente exenta de cloruro.  
B.24.8.2  Mantenimiento de los electrodos  
B.24.8.2.1  Electrodo de plata  
- Normalmente: enjuagar con agua destilada y secar.  
- Electrodo grasiento: sumergir en acetona, enjuagar con agua destilada y secar.  
- Electrodo m anchado, sucio u oscuro (violeta): frotar con un paño mojado y detergente para vajilla, 
enjuagar con agua destilada y secar.  
- Conservar en un lugar seco, en una caja u otro recipiente hermético, a fin de retrasar la oxidación  de la 
plata.  
B.24.8.2.2  Electrodo de referencia  
- Enjuagar con agua destilada y secar.  
- Para el mantenimiento, sírvase consultar las instrucciones del fabricante. En general debe renovarse 
periódicamente el electrolito.  
- Conservar en un lugar seco o en agua.  
B.24.8.2.3  Electrodo an ular de plata combinado  
- Enjuagar con agua destilada y secar.  
- Tratar la parte de plata como un electrodo de plata.  
- Para el mantenimiento, sírvase consultar las instrucciones del fabricante. En general debe renovarse 
periódicamente el electrolito.  
- Conservar en un lugar seco o en agua.  
B.24.8.2.4  Enjuague de los electrodos  
Cuidado:  Enjuagar los electrodos previamente con agua destilada y apartar la punta de la bureta, ya que 
incluso trazas de iones Ag+ o C1 - pueden interferir en la calibración y acarre ar errores en toda la serie de 
análisis. Esta observación también es válida para las calibraciones de control, que deben efectuarse 
aproximadamente cada 60 min durante las series de análisis. Un desvío importante en estas calibraciones 
indica que los elect rodos están sucios.  
B.24.9  Cálculos para la valoración con adiciones constantes  
Después de cada adición, leer el potencial cuando se haya estabilizado. Calcular la diferencia de potencial 
entre las adiciones. El punto de equivalencia se sitúa entre los dos  volúmenes con la mayor diferencia de 
potencial.  
Sean V 1, V2, V3, V4 los volúmenes cuyos potenciales son P 1, P2, P3, P4; las diferencias de potencial son 
P2 - P1, P3 - P2, P4 - P3, y P 3 - P2 es la diferencia mayor. V 2 = V1 + V; V 3 = V2 + V; V 4 = V3 + V; V = volumen 
de la adición.  
El punto de equivalencia exacto se sitúa en:  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
 
Ejemplo numérico:  
AgNO 3 Lectura  diferencia  
[ml] [mV]  [mV]  
9,0 58,0  
9,1 59,6 1,6 para 0,1 ml AgNo 3 
9,2 62,5 2,9 
9,3 64,6 2,1 
9,4 68,1 3,5 
9,5 70,9 2,8 
9,6 73,9 3,0 
9,7 79,3 5,4 
9,8 83,9 4,6 
9,9 92,4 8,5 
10 102,7 P 1 10,3 
10,1 114,9 P 2 12,2 
10,2 155,7 P 3 40,8 mayor  
10,3 196,0 P 4 40,3 
10,4 218,5  22,5 
10,5 227,3  8,8 
10,6 234,2  6,9 
 V2 = 10,1 ml  V = 0,1 ml  
 
 
 
B.25. DETERMINACI ON DE CALCIO (Ca) POR ESPECTROFOTOMETR IA DE AB SORCI ON AT OMICA  
B.25.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscop ia 
de absorción atómica.  
B.25.2  Reactivos y materiales  
B.25.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Oxido de lantano (III) (máximo 0,0005% Ca) para espectroscopía de absorción atómica  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de calcio  
Solución patrón de calcio lista para el uso, 1000 mg/l  
B.25.2.2  Materiales        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Matraces aforados 50,  100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajustables 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas forma alta  10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer cuello estrecho de 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible cuello estrecho de 100 ml y 1000 ml  
Cubeta de polietileno 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l de mezcla de ácido 
nítrico/agua (1:1).  
En este baño descontaminar una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno  o 
de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y secar . 
B.25.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión  capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de calcio de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
B.25.4  Preparación de  soluciones  
B.25.4.1  Solución de lantano 5 g/100 ml  
En un matraz aforado de 1000 ml pesar 58, 6 g de óxido de lantano. Añadir aproximadamente 200 ml de 
agua destilada, agitar hasta que todo el óxido esté bien mojado. Añadir lentamente 250 ml de ácido clorhídrico 
concentrado (mínimo 37%). Enfriar y llevar al volumen con agua destilada.  
Debe verifica rse el contenido de calcio de cada nuevo lote de óxido de lantano preparando una solución 
de lantano de 1 g/100 ml y comparando su contenido en calcio con aquél de una solución patrón de calcio de 
0 µg/ ml procedente de un lote anterior.  
B.25.4.2  Solución de ácido clorhídrico 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.25.4.3  Solución de ácido clorhídrico 6 N  
En un matraz a forado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.25.4.4  Solución patrón de calcio 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el conte nido de una ampolleta de cloruro de calcio. Enjuagar la 
ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservar en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de calcio de 1000 mg/l lista para el uso.  
B.25.4.5  Soluciones patrón diluidas de calcio  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0, 100, 200, 300, 500 y 1000 µl de solución 
patrón de calcio, 100 0 mg/l. Añadir 20 ml de solución de lantano (B.25.4.1) y llevar al volumen con agua 
destilada. Estas soluciones contienen respectivamente 0 - 1 - 2 - 3 - 5 y 10µg de calcio/ml. Transferir 
inmediatamente a frascos de polietileno o polipropileno descontamina dos. 
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
B.25.5  Preparación de la muestra para ensayo  
B.25.5.1  Productos sóli dos 
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
B.25.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipiente de vidrio o de 
plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su uso.  
B.25.6  Procedimiento  
B.25.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar , con una precisión de 0,01 g, 1  g de producto en polvo o 10  g de 
producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml  de 
solución de ácido clorhídrico 6 N. Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min.  Dejar enfriar a 
temperatura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de cenizas, 
eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
B.25.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pi peta un volumen de la solución de toma de ensayo, 
que la concentración final esté comprendida entre 1 y 10 µg/ml. Añadir 20 ml de solución de lantano. Llevar al 
volumen con agua destilada. Esta solución contiene 1 g de lantano/100 ml.  
B.25.6.3  Determinació n 
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de calcio de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 422,7 nm  
Llama: aire -acetileno, reductora  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 min. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera óptima.  
Aspirar las so luciones patrón (B.25.4.5), luego las soluciones de la toma de ensayo (B.25.6.2). Después de 
cada medida, aspirar un poco de solución (B.25.4.2), luego agua destilada a fin de evitar que el capilar  se 
obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando una 
solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos  
5 seg. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ning una solución de toma de ensayo no debe rebasar 
la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (B.25.6.2)  
B.25.7  Cálculo y expresión de resultados  
B.25.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curva de calibración l levando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El con tenido de calcio en el producto, en mg/100 g, es igual a:        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
 
En donde:  
C = concentración de calcio en las soluciones de las tomas de ensayo en µg/ml  
B = concentración de calcio en el blanco (solución patrón de 0 µg de calcio/ml)  
V = volumen inicial en las s oluciones de las tomas de ensayo en ml  
D = factor de dilución (B.25.6.2)  
m = masa de la toma de ensayo en g  
B.25.7.2  Expresión de los resultados  
Contenidos inferiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con dos cifras significativas.  
Contenidos superio res a 100 mg/100 g: expresar los resultados con tres cifras significativas.  
B.25.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 5% de su valor medio.  
B.26 DETERMINACI ON DE F OSFORO (P) POR COLORIMETR IA CON AZUL DE MOLIBDENO  
B.26.1  Fundamento  
Calcinación de la muestra. Reacción del fósforo con molibdato de sodio y sulfato de hidracinio como 
reductor. Medir espectrofotométricamente a 700 nm la absorbancia del complejo de azul de molibdeno que se 
ha formado.  
B.26.2  Reactivos y materiales  
B.26.2.1  Reactivos  
Acido clorhídrico fumante 37% para análisis  
Acido nítrico 65% para análisis  
Acido sulfúrico 95 - 97% para análisis  
Sulfato de hidrac inio para análisis  
Fosfato diácido de potasio para análisis  
Carbonato de sodio anhidro para análisis  
Molibdato de sodio dihidratado para análisis  
B.26.2.2  Materiales  
Vasos de forma alta de 1000 ml  
Varillas de vidrio de extremos redondeados de 4 mm de diáme tro y 100 mm de longitud  
Embudos 60° de 120 mm de diámetro  
Recipiente para guardar líquidos de 20 l  
Pipetas graduadas hasta la punta de 10, 20 y 25 ml  
Pipetas ajustables de 5 ml  
Puntas blancas de polipropileno  
Filtros redondos rápidos de 125 mm de diámetro  
Baño de agua redondo y su tapa  
Cubeta de polietileno de 15 l  
Nota:  Evite utilizar detergentes a base de polifosfatos para lavar el material. Toda la vajilla debe 
enjuagarse abundantemente con agua destilada antes del uso.  
B.26.3  Aparatos e instrumentos  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Cubetas ópticas de vidrio de 10 x 10 mm  
Balanza analítica electrónica  
Cronómetro de mesa  
Placa calefactora  
Espectrofotómetro con accesorios  
Cápsulas de porcelana o platino  
Si es necesario, descontaminar durante una noche, en una cubeta de polietileno que con tenga 15 l de 
mezcla de ácido nítrico/agua (1:1), todos los matraces aforados, tapones, recipientes de plástico, así como las 
cápsulas. Enjuagar con agua destilada. Secar en estufa a 80°C.  
B.26.4  Preparación de soluciones  
B.26.4.1  Solución de ácido clorhíd rico 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml vertir 400 ml de agua destilada y 500 ml de ácido clorhídrico. Enfriar y 
llevar a volumen con agua destilada.  
B.26.4.2  Solución de ácido sulfúrico aproximadamente 10 N  
En un vaso de 1000 ml que contenga 500 ml de ag ua destilada, añadir con cuidado 270 ml de ácido 
sulfúrico. Mezclar bien y enfriar a temperatura ambiente. Transferir a un matraz aforado de 1000 ml, enjuagar 
el vaso y llevar a volumen con agua destilada.  
B.26.4.3  Solución de molibdato de sodio 2,5 g/100 ml 
En un matraz aforado de 500 ml, disolver 12,5 g de molibdato de sodio, en 200 ml de ácido sulfúrico 10 N. 
Dejar enfriar a temperatura ambiente, transferir a un matraz aforado de 500 ml y llevar a volumen con 
(B.26.4.2).  
B.26.4.4  Solución de sulfato de h idracinio, 0,15 g/100 ml  
CUIDADO: El sulfato de hidracinio es tóxico.  
En un matraz aforado de 200 ml introducir 0,30 g de sulfato de hidracinio. Disolver y llevar a volumen con 
agua destilada.  
B.26.4.5  Reactivo de molibdato de sodio y sulfato de hidracinio  
Justo antes del uso, mezclar 125 ml de solución (B.26.4.3) y 50 ml de solución (B.26.4.4) en un matraz 
aforado de 500 ml. Llevar a volumen con agua destilada.  
Nota:  Esta solución no se conserva.  
B.26.4.6  Solución patrón de fósforo, 1000 mg/l  
Secar 5 g de fosfato diácido de potasio, durante 2 h a 105°C.  
En un matraz aforado 500 ml agregar 2,197 g de fosfato diácido de potasio seco. Disolver con agua 
destilada y añadir 15 ml de solución 25.4.1. Llevar a volumen con agua destilada y mezclar bien.  
En un recipi ente de polietileno o de polipropileno, esta solución se conserva durante un mes.  
B.26.4.7  Solución patrón de fósforo, 10 µg/ml  
El día del uso, verter mediante una pipeta, en un matraz aforado de 100 ml; 1,0 ml de solución (B.26.4.6). 
Llevar a volumen con agua destilada y mezclar bien.  
B.26.4.8  Solución de carbonato de sodio e hidróxido de sodio  
En un matraz aforado de 200 ml, introducir 10 g de carbonato de sodio y 1,2 g de hidróxido de sodio. 
Disolver en agua destilada. Enfriar a temperatura ambiente y ll evar a volumen con agua destilada.  
B.26.5  Preparación de la muestra para ensayo  
B.26.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario, moler el producto mediante 
un molino o mortero.  
B.26.5.2  Productos semi -líquidos        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Transferir el contenido del bote a un vaso de capacidad suficiente. Homogenizar mediante una batidora. 
Mezclar bien.  
B.26.5.3  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipiente de vi drio o de 
polipropileno. Guardar en el refrigerador (4°C). Deje alcanzar la temperatura ambiente antes de pesar.  
B.26.6  Procedimiento  
Efectuar cada determinación por duplicado.  
B.26.6.1  Calcinación  
B.26.6.1.1  Productos no acidificados  
Calcinar a una temper atura máxima de 550°C.  
Mojar las cenizas con un poco de agua destilada, luego añadir 10 ml de ácido clorhídrico 6 N. Calentar 
sobre un baño maría en ebullición hasta disolución completa de las cenizas. Dejar enfriar a temperatura 
ambiente. Filtrar la soluc ión a través de un filtro exento de cenizas y recoger el filtrado en un matraz aforado 
de 100 ml. Enjuagar la cápsula y el filtro con agua destilada. Llevar a volumen con agua destilada.  
B.26.6.1.2  Productos acidificados  
A fin de evitar pérdida de fósforo,  proceder como sigue:  
En una cápsula de platino o equivalente, pesar con una aproximación de 0,1 mg de 2 a 5 g de muestra 
para ensayo. Añadir 10 ml de solución. Mezclar bien con una varilla de vidrio. Enjuagar la varilla con un poco 
de agua destilada. En u na campana, evaporar a sequedad la toma de ensayo sobre una placa calefactora. 
Luego calcinar el producto y disolver las cenizas como se describe arriba.  
B.26.6.2  Dilución  
Si la concentración de fósforo en la solución de la toma de ensayo rebasa 90 µg/l, d iluir con agua 
destilada. La solución a analizar debe contener entre 10 y 90 µg de fósforo/ml.  
B.26.6.3  Determinación  
En matraces aforados de 50 ml, verter mediante una pipeta, según el esquema siguiente:  
Solución  Patrones (1) (ml) Toma de ensayo (ml)  Blan co (ml)  
De la toma de 
ensayo  
Agua destilada  
B.33.4.7  
B.33.4.5   
 24 23 20 15 
 1 2 5 10 
 20 20 20 20 1,0 (2) 
24 (3) 
20  
25 
20 
(1) Estas soluciones contienen 10 - 20 - 50 y 100 µg de fósforo.  
(2) Verter más si el contenido en fósforo es muy bajo.  
(3) Ajusta r el volumen de agua según el volumen de solución de la toma de ensayo, a fin de obtener un 
volumen total de aproximadamente 25 ml.  
Mezclar bien, llevar a volumen con agua destilada. Tapar los matraces. Mezclar bien y dejar reaccionar 
durante 15 min en un baño de agua en ebullición para el revelado del color. Enfriar a temperatura ambiente.  
B.26.6.4  Medida espectrofotométrica  
Medir la extinción de las soluciones arriba indicadas en cubetas de vidrio de 10 mm a la longitud de onda 
de 700 nm contra el blanco (B). 
Notas:  
Todas las medidas, tanto las soluciones patrón como las tomas de ensayo, deben efectuarse en el 
intervalo de una hora después del final de la reacción, debido a la inestabilidad de la coloración.  
El complejo de azul de molibdeno presenta el máx imo de absorción a 830 nm, no obstante, la sensibilidad 
aún es buena a 700 nm. Así pues, es posible utilizar una gama más amplia de espectrofotómetros.  
B.26.7  Cálculo y expresión de resultados  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.26.7.1  Cálculo  
Trazar la curva de calibración llevando a la a bscisa el contenido en fósforo (en µg) y a la ordenada la 
extinción leída en el espectrofotómetro.  
Leer en la curva de calibración el valor en µg de fósforo correspondiente a la extinción media (C).  
El contenido de fósforo en mg/100 g de producto, es igual  a: 
 
En donde:  
C = contenido de fósforo en la solución de la toma de ensayo leído en la curva de calibración, en µg  
D = factor de dilución, si es necesario  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
V = total de la solución de la toma de ensayo en 100 ml  
A = par te alícuota de la solución de la toma de ensayo para la determinación  
B.26.7.2  Expresión de los resultados  
Expresar los resultados en mg/100 g con tres cifras significativas.  
B.26.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos po r el mismo método con la misma materia 
sometida al ensayo, en las mismas condiciones y corto intervalo de tiempo, no debe exceder 2% del valor 
medio.  
B.27 DETERMINACI ON DE MAGNESIO (Mg) POR ESPECTROFOTOMETR IA DE ABSORCI ON 
ATOMICA  
B.27.1  Fundamento  
Hidrólis is parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
B.27.2  Reactivos y materiales  
B.27.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Oxido de lantano (III) (máximo 0,0005% Ca) para espectroscopía de absorción atómica.  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de magnesio  
Solución patrón de magnesio lista para el uso 1000 mg/l  
B.27.2.2  Materiales  
Matraces aforados, 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 - 200 µl y 200 - 1000 µl  
Pipetas ajustables, 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas forma alta 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer cuello estrecho 100 ml        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de ceni zas) 
Frascos de polietileno flexible cuello estrecho de 100, 1000 ml  
Cubeta de polietileno de 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l de mezcla de ácido 
nítrico/agua (1:1).  
En este baño descontaminar una noche todos  los matraces aforados, tapones, recipientes de polietileno, 
así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y secar.  
B.27.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión, capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de calcio de tipo c átodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
B.27.4  Preparación de soluciones  
B.27.4.1  Solución de lantano 5 g/100 ml  
En un matraz aforado de 1000 ml pesar 58,6 g de óxido de lantano. Añadir aproximadamente 200 ml de 
agua destilada, agitar hasta que todo el óxido esté bien mojado. Añadir lentamente 250 ml de ácido clorhídrico 
concentrado (mínimo 37%). Enfriar y llevar al volumen con agua destilada.  
Debe verificarse el contenido de magnesio de cada nuevo lote de óxido de  lantano preparando una 
solución de lantano de 1 g/100 ml y comparando su contenido en magnesio con aquel de una solución patrón 
de magnesio de 0 µg/ml procedente de un lote anterior.  
B.27.4.2  Solución de ácido clorhídrico 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.27.4.3  Solución de ácido clorhídrico 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de  agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.27.4.4  Solución patrón de magnesio 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de magnesio. 
Enjuag ar la ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de m agnesio de 1000 mg/l lista para el uso.  
B.27.4.5  Solución patrón de magnesio de 100 mg/l  
En un matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta 10 ml de solución (B.27.4.4). Llevar a volumen 
con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o p olipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un mes a temperatura ambiente.  
B.27.4.6  Soluciones patrón diluidas de magnesio  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0 - 0,2 - 0,5 - 1,0 y 1,5 ml de solución 
(B.27.4.5). Añadir 20 ml de solución de lantano (B.27.4.1) y llevar al volumen con agua destilada. Estas 
soluciones contienen respectivamente 0 - 0,2 - 0,5 - 1,0 y 1,5 µg de magnesio/ml. Transferir inmediatamente a 
frascos de polietileno o polipropileno des contaminados.  
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
B.27.5  Preparación de la muestra para ensayo  
B.27.5.1  Produ ctos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
B.27.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipiente de vidrio o de 
plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su uso.  
B.27.6  Procedimiento  
B.27.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50  ml pesar, con una precisión de 0,01 g, 1g de producto en polvo o 10g de 
producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (B.27.4.3). Calentar en un baño maría en ebullició n durante 30 min. Dejar 
enfriar a temperatura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
B.27.6.2  Dilución  
En un matraz aforado de 100 ml ve rter mediante una pipeta un volumen de la solución de toma de ensayo 
(B.27.6.1), tal que la concentración final esté comprendida entre 0,2 y 1,5 µg/ml. Añadir 20 ml de solución de 
lantano. Llevar al volumen con agua destilada. Esta solución contiene 1 g de  lantano/100 ml.  
B.27.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de magnesio de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 282,2 nm  
Llama: aire -acetileno, reductora  
Dejar calentar la lámpara durante 15 a 20 min. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el q uemador de manera óptima.  
Aspirar las soluciones patrón (B.27.4.6), luego las soluciones de la toma de ensayo (B.27.6.2). Después de 
cada medida, aspirar un poco de solución (B.14.4.2), luego agua destilada a fin de evitar que el capilar se 
obstruya. Despu és de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando una 
solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos 5 
seg. Efectuar cad a medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe rebasar la 
concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario (B.27.6.2).  
27.7 Cálculo y expresión de resultados        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.27.7.1  Modo de cálculo  
Calcul ar o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B)  de aquellos de los productos.  
El contenido de magnesio en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
En donde:  
C = concentración de magnesio en las soluciones de las tomas de ensayo en µg/ml  
B = concentración de magnesio en el blanco (solución patrón de 0 µg  de magnesio/ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo en ml  
D = factor de dilución (B.14.6.2).  
m = masa de la toma de ensayo en g  
B.27.7.2  Expresión de los resultados  
Contenidos inferiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con  dos cifras significativas.  
Contenidos superiores a 100 mg/100 g: expresar los resultados con tres cifras significativas.  
B.27.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 5% de su valor medio.  
B.28 DETERMINACI ON DE HIERRO (Fe) POR ESPECTROFOTOMETR IA DE ABSORCI ON AT OMICA  
B.28.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
B.28.2  Reactivos y materiales  
B.28.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para análisis  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de hierro  
Solución patrón de hierro lista para el uso, 1000 mg/l 
28.2.2  Materiales  
Matraces aforados 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 a 200 µl y 200 a 1000 µl  
Pipetas ajustables 5 ml  
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas forma alta 10, 25 y 500 ml  
Matra ces Erlenmeyer cuello estrecho 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible cuello estrecho de 100 y 1000 ml  
Cubeta de polietileno 15 l  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l se mezcla de ácido nítrico/agua (1:1)  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, recipientes de 
polietileno o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada  y 
secar.  
B.28.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión, capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de hierro de tipo cátodo hueco  
Espectrofotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
B.28.4  Preparación de soluciones  
B.28.4.1  Solución de ácido clorhídr ico 1,2 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 100 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar a volumen con agua destilada.  
B.28.4.2  Solución de ácido clorhídrico 4 N  
En un matraz aforado de 1000 m l introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.28.4.3  Solución de ácido clorhídrico 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  
B.28.4.4  Solución patrón de hierro 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de hierro. Enjuagar la  
ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de hierro  de 1000 mg/l lista para el uso.  
B.28.4.5  Soluciones patrón diluidas de hierro  
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0 - 100 - 200 - 500 y 1000 µl de solución 
(B.28.4.4). Añadir 20 ml de solución de ácido clorhídrico 6 N y llevar al vol umen con agua destilada. Estas 
soluciones contienen respectivamente 0 - 1,0 - 2 - 5,0 y 10 µg de hierro/ml. Transferir inmediatamente a 
frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda com parar las nuevas soluciones con 
otras preparadas anteriormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
B.28.5 Preparación de la muestra para ensayo  
B.28.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es  necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
B.28.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipien te de vidrio o de 
plástico descontaminado. Guardar en el refrigerador (4°C).  
Mezclar bien antes de su uso.  
B.28.6  Procedimiento        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.28.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g; 1g de producto en polvo o 10g de 
produ cto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml  de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (B.28.4.38). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar 
enfriar a temperatura ambiente. Llevar al volumen co n agua destilada. Filtrar a través de un filtro exento de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
B.28.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la solución de toma de ensayo 
(B.28.6.1) , tal que la concentración final esté comprendida entre 1 y 8 µg/ml. Llevar al volumen con solución 
de ácido clorhídrico 1,2 N.  
B.28.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mej or 
un quemador provisto de un nebulizador de hélice, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de hierro de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 248,3 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante (azul, pobre en acet ileno)  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 min. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera óptima.  
Aspirar las soluciones patrón (B.28.4.5), luego las soluciones de la toma de ensayo (B.28.6.1 o  B.28.6.2). 
Después de cada medida, aspirar un poco de solución (B.28.4.2), luego agua destilada a fin de evitar que el 
capilar se obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando 
una solución patrón y efe ctuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con la opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos  
5 seg. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe rebasar 
la concentración del pat rón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si es necesario.  
B.28.7  Cálculo y expresión de resultados  
B.28.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml, a la abscisa. Determinar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de hierro en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
En donde:  
C = concent ración de hierro en las soluciones de las tomas de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de hierro en el blanco (solución patrón de 0 µg de hierro por ml)  
V = volumen inicial (B.28.6.1), en ml (en general 50)  
D = factor de dilución (B.28.6.2).  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
B.28.7.2  Expresión de los resultados  
Expresar los resultados con dos cifras significativas.  
B.28.8  Repetibilidad  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto int ervalo de tiempo, no debe exceder el 10% de su valor medio.  
B.29 DETERMINACI ON DE IODO (I) POR ELECTRODO DE I ON SELECTIVO  
B.29.1  Fundamento  
La proteína es removida por precipitación con ácido. El iodo en el filtrado se mide usando el electrodo de 
ión selec tivo, seguida de otra medición después de agregar una solución estándar de adición conocida. Las 
interferencias para las respuestas del electrodo son eliminadas con Nitrato de Níquel.  
B.29.2  Aparatos  
Balanza analítica con sensibilidad de ± 0,1 mg.  
Potenció metro digital con escala de 0,1 mV.  
Licuadora con motor a prueba de explosión.  
Electrodos:  1) Electrodo de ión -selectivo de I- 
 2) Electrodo de referencia Ag/AgCl  
B.29.3  Reactivos y materiales  
B.29.3.1  Materiales  
Matraces volumétricos  
Frascos de vidrio col or ámbar  
Material común de laboratorio  
Agitador magnético, cubierto con una capa de estireno espumoso o material aislante para prevenir 
calentamiento de la muestra.  
Papel filtro, de filtración rápida, doblados, con retención de partículas de 20 -25 µm (sust itutible por papel 
filtro No. 541)  
B.29.3.2  Reactivos  
B.29.3.2.1  Agua destilada  
B.29.3.2.2  Solución de ácido acético glacial (C 2H40) al 3% v/v. Transferir 15 ml de ácido acético glacial a 
un matraz volumétrico de 500 ml que contenga aproximadamente 250 ml de agua. Llevar a volumen con agua 
y mezclar bien.  
B.29.3.2.3  Yoduro de potasio (KI) o yoduro de sodio (NaI), se recomienda usar preferentemente 
estándares de referencia.  
B.29.3.2.4  Solución estándar de Iodo  
B.29.3.2.4.1  (Solución I) Solución estándar de r eferencia de I -, de 0,100 ± 0,001 M (12,6 g de iodo/l) 
estandarizada. Pesar 16,998 g de KI o 14,898 de NaI y disolverlos en un matraz aforado de 1000 ml, llevar al 
volumen con agua, almacenar en un frasco ámbar a temperatura ambiente y protegido de la luz,  descartar 12 
meses después de la estandarización o 6 meses después de haberse abierto el frasco.  
B.29.3.2.4.1.1  Estandarización de la solución I  
Preparar los siguientes reactivos:  
- Solución estándar titulante de nitrato de plata (AgNO 3) 0,0141 M (0,0141) . Disolver 2,395 g de AgNO 3 en 
agua destilada y diluir a un litro con agua destilada, almacenar en frasco ámbar.  
- Solución indicadora de cromato de potasio (K 2CrO 4). Disolver 50 g de K 2CrO 4 en un poco de agua, 
agregar de la solución de nitrato de plata an teriormente preparada hasta que se forme un precipitado rojo. 
Dejar reposar por 12 h, filtrar y diluir a un litro con agua destilada.  
- Acido Sulfúrico (H 2SO4) 0,1 N o  
- Hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 N        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Procedimiento: medir lo más exactamente posible 10 ml de la solución I de referencia de Iodo y transferir a 
un matraz volumétrico de 100 ml y diluir a la marca con agua destilada, llevar a un pH entre 7 y 10 usando 
ácido sulfúrico o hidróxido de sodio 0,1 N. Tomar alícuotas de 25 ml y completar con agua desti lada hasta 
aproximadamente 100 ml, agregar 1 ml de la solución indicadora de cromato de potasio y titular con la 
solución de nitrato de plata, hasta un vire color rojizo, asegurar la consistencia del punto final. Correr 
paralelamente un blanco de reactivos . 
Cálculos:  
 
En donde:  
A = ml gastados de nitrato de plata en la muestra  
B = ml gastados de nitrato de plata en el blanco  
N = Normalidad del nitrato de plata  
126 900 = miliequivalentes del I - por 100 ml  
B.29.3.2.4.2  Solución II. Solución stock de Iodo 101 ,5 mg/l. Colocar 8 ml de solución estándar de 
referencia de Iodo dentro de un matraz volumétrico de 1 l. Diluir a volumen con agua y mezclar bien. Guardar 
en frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. Desechar después de dos semanas.  
B.29.3.2.4 .3 Solución III. Solución estándar intermedia de iodo, 1 mg/l. Colocar con una pipeta 5 ml de la 
solución II (stock de Iodo), dentro de un matraz volumétrico de 500 ml. Diluir a un volumen con agua y mezclar 
bien. Guardar en frasco de color ámbar o en otro  que proteja de la luz. Desechar después de dos semanas.  
B.29.3.2.4.4  Solución IV. Solución estándar intermedia de iodo, 0,1 mg/l. Colocar con una pipeta 10 ml de 
solución III (estándar intermedia de Iodo, dentro de un matraz de 100 ml. Diluir a volumen co n agua y mezclar 
bien. Guardar en frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. Desechar después de dos semanas.  
B.29.3.2.4.5  Solución V. Solución estándar de adición conocida. Colocar con una pipeta 10 ml de solución 
II (stock de Iodo), dentro de  un matraz volumétrico de 1 l. Diluir a volumen con agua y mezclar bien. Tomar 
una alícuota de 100 ml de esta solución y adicionar 1 ml de cada una de las siguientes soluciones: AFI, 
solución de nitrato de níquel y agua. Preparar solución fresca diariament e. 
B.29.3.2.5  Solución para guardar el electrodo. Solución de Iodo 0,1 mg/l. Diluir 1 ml de la solución II (stock 
de Iodo) a 1 l con agua y mezclar bien. Guardar en frasco de color ámbar o en otro que proteja de la luz. 
Desechar la solución después de 3 me ses. Guardar el electrodo de ión selectivo en esta solución cuando no 
se use, reemplazar la solución semanalmente.  
B.29.3.2.6  Ajustador de fuerza iónica (AFI). Solución de nitrato de sodio 5 M. Disolver 42,5 g de nitrato de 
sodio, NaNO 2, en aproximadamente  50 ml de agua en un matraz volumétrico de 100 ml, diluir al volumen con 
agua y mezclar bien.  
B.29.3.2.7  Solución de nitrato de níquel 2 M, Ni(NO 3)26H20. Disolver 58,2 g de nitrato de níquel 
hexahidratado en aproximadamente 50 ml de agua en un matraz volum étrico de 100 ml. Diluir a volumen con 
agua y mezclar muy bien.  
B.29.4  Preparación de la muestra  
Si la muestra es líquida tomar directamente 100 ml. Si la muestra es sólida, pesar una cantidad de 
muestra tal que contenga entre 75 y 150 µl/l de Iodo y recon stituirla con agua hasta un volumen de 100 ml.  
Colocar la muestra en un matraz volumétrico de 250 ml, adicionar 10 ml de solución de ácido acético al 
3%, diluir al volumen con agua y mezclar bien. Pasar el contenido del matraz a una licuadora y mezclar a b aja 
velocidad por 2 min. Filtrar para obtener un filtrado claro, si el filtrado es turbio descartar los primeros 10 ml.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.29.5  Determinación  
Precaución: Agitar todas las soluciones con agitador magnético antes de medir el potencial con el 
electrodo.  
B.29.5 .1 Calibración de la pendiente del electrodo. En un vaso de precipitados tomar 100 ml de la solución 
IV estándar intermedia de iodo (0,1 mg/l), introducir los electrodos y agregar con agitación 1 ml de cada una 
de las siguientes soluciones: solución AFI, s olución de nitrato de níquel y agua, cuando la lectura del potencial 
sea estable aproximadamente de 2 a 5 min, registrar hasta décimas de mV como E1.  
Retirar los electrodos, enjuagarlos con agua y secarlos.  
En otro vaso de precipitados colocar 100 ml de la  solución III estándar intermedia de iodo (1,0 mg/l), 
introducir los electrodos y adicionar con agitación 1 ml de las siguientes soluciones: solución AFI, solución de 
nitrato de níquel y agua, cuando la lectura del potencial sea estable aproximadamente de 2 a 5 min registrar la 
lectura hasta décimas de mV como E2.  
Retirar los electrodos enjuagarlos con agua y secar.  
Calcular la pendiente (S) del par de electrodos de la siguiente manera:  
 
Medir la pendiente cada 4 h cuando el electrodo esté en uso continuo.  Usar el valor de la pendiente más 
reciente para calcular los resultados de las subsecuentes mediciones de iodo.  
B.29.5.2  Valoración de la muestra. En un vaso de precipitados tomar 100 ml de la muestra filtrada y 
agitarla con un agitador magnético, adicion ar 1 ml de las siguientes soluciones: solución AFI, solución de 
nitrato de níquel y ácido nítrico concentrado. Colocar los electrodos en la solución a analizar. Cuando la 
lectura del potencial sea estable aproximadamente 2 min registrar la lectura hasta dé cimas de mV como E3, 
inmediatamente con una pipeta adicionar 10 ml de la solución V estándar de adición conocida y agitar. 
Cuando sea estable aproximadamente 2 min registrar hasta décimas de mV como E4.  
       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.30 DETERMINACI ON DE CINC (Zn) POR ESPECTROFOTOMET RIA DE ABSORCI ON AT OMICA  
B.30.1  Fundamento  
Hidrólisis parcial del producto con ácido clorhídrico. Filtración. Dilución y determinación por espectroscopía 
de absorción atómica.  
B.30.2  Reactivos y materiales  
B.30.2.1  Reactivos  
Acido nítrico mínimo 65% para a nálisis  
Acido clorhídrico fumante mínimo 37% para análisis  
Solución patrón de zinc  
Solución patrón de zinc lista para el uso, 1000 mg/l  
B.30.2.2  Materiales  
Matraces aforados 50, 100 y 1000 ml  
Micropipetas de 50 a 200 µl y 200 a 1000 µl  
Pipetas ajustables 5  ml 
Puntas amarillas de 50 a 200 µl  
Puntas azules de 200 a 1000 µl  
Puntas blancas  
Probetas graduadas forma alta 10, 25 y 500 ml  
Matraces Erlenmeyer cuello estrecho 100 ml  
Embudos  
Filtros redondos (< 0,007% de cenizas)  
Frascos de polietileno flexible, cuell o estrecho de 100 y 1000 ml  
Cubeta de polietileno 15 l  
Descontaminación del material: En una cubeta de polietileno introducir 10 l se mezcla de ácido nítrico/agua (1:1).  
En este baño descontaminar durante una noche todos los matraces aforados, tapones, rec ipientes de 
polietileno o de polipropileno, así como todo el material de vidrio necesario. Enjuagar con agua destilada y 
secar.  
B.30.3  Aparatos e instrumentos  
Balanza de precisión capacidad 4100/600g: 0,1/0,001  
Lámpara de zinc de tipo cátodo hueco  
Espectro fotómetro de absorción atómica  
Destilador de agua  
Baño de agua  
B.30.4  Preparación de soluciones  
B.30.4.1  Solución de ácido clorhídrico 1,2 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 100 ml de ácido 
clorhídrico c oncentrado. Enfriar. Llevar a volumen con agua destilada.  
B.30.4.2  Solución de ácido clorhídrico 4 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 500 ml de agua destilada y 330 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen c on agua destilada.  
B.30.4.3  Solución de ácido clorhídrico 6 N  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir aproximadamente 300 ml de agua destilada y 500 ml de ácido 
clorhídrico concentrado. Enfriar. Llevar al volumen con agua destilada.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.30.4.4  Solución pa trón de zinc 1000 mg/l  
En un matraz aforado de 1000 ml introducir el contenido de una ampolleta de cloruro de zinc. Enjuagar la 
ampolleta y llevar al volumen con agua destilada.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta so lución es estable durante 
aproximadamente un año a temperatura ambiente.  
También puede utilizarse una solución patrón de zinc de 1000 mg/l lista para el uso.  
B.30.4.5  Solución patrón de zinc de 10 mg/l  
En un matraz aforado de 100 ml verter mediante una pip eta 1 ml de solución (B.30.4.4). Llevar a volumen 
con ácido clorhídrico.  
Conservada en un frasco de polietileno o polipropileno descontaminado, esta solución es estable durante 
aproximadamente una semana a temperatura ambiente.  
B.30.4.6  Soluciones patrón d iluidas de zinc  
En matraces aforados de 100 ml verter mediante una pipeta 0 - 1 - 2,5 - 5 - 7,5 y 10 ml de solución 
(B.30.4.5). Añadir 20 ml de solución de ácido clorhídrico 6 N y llevar al volumen con agua destilada. Estas 
soluciones contienen respectivam ente 0 - 0,1 - 0,25 - 0,50 - 0,75 y 1,0 µg de zinc/ml. Transferir 
inmediatamente a frascos de polietileno o polipropileno descontaminados.  
Estas soluciones deben prepararse cada semana. Se recomienda comparar las nuevas soluciones con 
otras preparadas ante riormente a fin de detectar cualquier error grave de preparación.  
B.30.5  Preparación de la muestra para ensayo  
B.30.5.1  Productos sólidos  
Tomar una cantidad representativa de la muestra a analizar. Si es necesario moler el producto mediante 
un molino o un mortero. Evitar cualquier contaminación durante esta manipulación. Mezclar bien.  
B.30.5.2  Productos líquidos  
Mezclar bien el producto antes de abrir el recipiente. A continuación transferir a un recipiente de vidrio o de 
plástico descontaminado. Guardar en  el refrigerador (4°C). Mezclar bien antes de su uso.  
B.30.6  Procedimiento  
B.30.6.1  Toma de ensayo  
En un matraz aforado de 50 ml pesar, con una precisión de 0,01 g; 1 g de producto en polvo o 10  g de 
producto líquido. Añadir agua destilada hasta un volumen  de aproximadamente 15 ml. Añadir 10 ml de 
solución de ácido clorhídrico 6 N (B.30.4.3). Calentar en un baño maría en ebullición durante 30 min. Dejar 
enfriar a temperatura ambiente. Llevar al volumen con agua destilada. Filtrar a través de un filtro exent o de 
cenizas, eliminar los primeros 5 ml. Recolectar el resto del filtrado.  
B.30.6.2  Dilución  
En matraz aforado de 100 ml verter mediante una pipeta un volumen de la solución de toma de ensayo 
(B.30.6.1), tal que la concentración final esté comprendida ent re 0,1 y 0,8 µg/ml. Llevar al volumen con 
solución de ácido clorhídrico 1,2 N.  
B.30.6.3  Determinación  
Ajustar el aparato de absorción atómica según las indicaciones del fabricante. Se recomienda utilizar mejor 
un quemador provisto de un nebulizador de héli ce, que un nebulizador con bola de impacto. Deben respetarse 
las siguientes condiciones:  
Lámpara de zinc de tipo cátodo hueco  
Longitud de onda: 213,9 nm  
Llama: aire -acetileno, oxidante (azul, pobre en acetileno)  
Dejar calentar la lámpara durante 15 - 20 mi n. Encender la llama y esperar unos 15 min a que alcance el 
equilibrio. Colocar el quemador de manera óptima.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Aspirar las soluciones patrón (B.30.4.6), luego las soluciones de la toma de ensayo (B.30.6.1 o B.30.6.2). 
Después de cada medida, aspirar un poco  de solución (B.30.4.2), luego agua destilada a fin de evitar que el 
capilar se obstruya. Después de aspirar diez soluciones de tomas de ensayo, verificar la calibración aspirando 
una solución patrón y efectuando un "reslope".  
Trabajar de preferencia con l a opción "integración"; la duración de las medidas debe ser de por lo menos  
3 seg. Efectuar cada medida por lo menos tres veces. Ninguna solución de toma de ensayo no debe rebasar 
la concentración del patrón más concentrado. Efectuar una nueva dilución si  es necesario (B.30.6.2).  
B.30.7  Cálculo y expresión de resultados  
B.30.7.1  Modo de cálculo  
Calcular o trazar la curva de calibración llevando la absorbancia a la ordenada y la concentración de las 
soluciones patrón diluidas, en µg/ml a la abscisa. Determi nar la concentración de las soluciones de las tomas 
de ensayo (C). Restar el valor del blanco (B) de aquellos de los productos.  
El contenido de zinc en el producto, en mg/100 g, es igual a:  
 
En donde:  
C = concentración de zinc en las soluciones de las tom as de ensayo, en µg/ml  
B = concentración de zinc en el blanco (solución patrón de 0 µg de zinc por ml)  
V = volumen inicial en las soluciones de las tomas de ensayo en ml  
D = factor de dilución B.30.6.2  
m = masa de la toma de ensayo, en g  
B.30.7.2  Expresión  de los resultados  
Expresar los resultados con dos cifras significativas.  
B.30.8  Repetibilidad  
La diferencia entre dos resultados individuales obtenidos con la misma muestra, en las mismas 
condiciones, en un corto intervalo de tiempo, no debe exceder el 4%  de su valor medio.  
B.31 DETERMINACI ON DE ARS ENICO, CADMIO, COBRE, CROMO, ESTAÑO, HIERRO, MERCURIO, 
NIQUEL, PLATA, PLOMO, SELENIO Y ZINC POR ESPECTROFOTOMETR IA DE ABSORCI ON AT OMICA  
B.31.1 Principio del método  
La propiedad que tienen los elementos en su est ado atómico basal de absorber radiación 
electromagnética emitida por una fuente constituida por el mismo elemento de tal manera que al hacer pasar 
un haz de luz monocromática de una frecuencia específica pueda ser absorbido por el analito que se 
encuentra presente. La cantidad de radiación absorbida es proporcional a la concentración de los átomos de 
acuerdo con la Ley de Lambert -Beer.  
B.31.2 Equipo  
B.31.2.1 Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con:  
B.31.2.1.1 Sistema de atomización por flama dir ecta.  
B.31.2.1.2 Horno de grafito.  
B.31.2.1.3 Sistema generador de hidruros y vapor frío.  
B.31.2.1.4 Sistema de corrector de fondo (Deuterio, Zeeman o Smith -Hieftje).  
B.31.2.1.5 Automuestreador, aspiración o inyección manual.  
B.31.2.1.6 Sistema de lectura directa, digital o analógica, registrador o sistema de datos apropiado para el 
control del instrumento.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.31.2.2 Fuente de radiofrecuencia en caso de usar lámparas de descarga sin electrodos.  
B.31.2.3 Horno de digestión por microondas.  
B.31.2.4 Balanza ana lítica con sensibilidad de 0,1 mg.  
B.31.2.5 Mufla.  
B.31.2.6 Parrilla de calentamiento con control de temperatura.  
B.31.2.7 Autoclave que alcance las 15 lb de presión u horno de calentamiento.  
B.31.3 Materiales  
B.31.3.1 Lámparas de cátodo hueco o de descarg a sin electrodos para determinar plata, arsénico, cadmio, 
cromo, cobre, hierro, mercurio, níquel, plomo, selenio, estaño y zinc.  
B.31.3.2 Tubos de grafito pirolizados.  
B.31.3.3 Vasos para digestión de teflón. Enjuagar con acetona, lavar con agua desionizad a, y mantener 
los vasos cubiertos con una solución de ácido nítrico 1 M por al menos 30 min. Enjuagar con agua 
desionizada y secar.  
B.31.3.4 Matraces volumétricos de 10, 25, 50, 100, 250 y 1000 ml.  
B.31.3.5 Matraces apropiados para el generador de hidruros . 
B.31.3.6 Recipientes y tapas de plástico.  
B.31.3.7 Micropipeta o dosificador.  
B.31.3.8 Matraces Kjeldahl.  
B.31.3.9 Sistema de reflujo con refrigerante.  
B.31.3.10 Bombas Parr (opcionales).  
B.31.3.11 Crisoles o cápsulas adecuados.  
B.31.3.12 Material común de laboratorio.  
Lavar todo el material de vidrio y plástico primero con agua y detergente. En seguida enjuagar con agua 
de la llave y después con agua destilada. Sumergir en un recipiente que contenga una solución de ácido 
nítrico al 30%. Tapar y dejar en reposo por un lapso de 24 h. Quitar el exceso de ácido nítrico con varios 
enjuagues (5 o 6 veces) de agua desionizada. Dejar escurrir y secar.  
B.31.4 Reactivos  
Todos los reactivos deben ser grado suprapuro o su equivalente a menos que se indique otra 
espec ificación y por agua se entiende agua desionizada o tridestilada.  
B.31.4.1 Soluciones patrón de referencia certificadas de plata, arsénico, cadmio, cromo, cobre, hierro, 
mercurio, níquel, plomo, selenio, estaño y zinc a una concentración de 1000 mg/l.  
B.31 .4.2 Acido nítrico concentrado, 65% p/p (HNO 3). 
B.31.4.3 Peróxido de hidrógeno al 30% p/p (H 2O2). 
B.31.4.4 Acido sulfúrico concentrado, 96% p/p (H 2SO4). 
B.31.4.5 Acido clorhídrico concentrado, 37% p/p (HCl).  
B.31.4.6 Fosfato monobásico de amonio RA (NH 4)H2PO4. 
B.31.4.7 Nitrato de magnesio hexahidratado RA (Mg(NO 3) 2.6H2O). 
B.31.4.8 Borohidruro de sodio RA (NaBH 4). 
B.31.4.9 Cloruro de potasio RA (KCl).  
B.31.4.10 Permanganato de potasio RA (KMnO 4).       (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.31.4.11 Cloruro estanoso (SnCl 2). 
B.31.4.12 Yoduro de potas io (KI).  
B.31.4.13 Modificador de matriz.  
Pesar 10 g de fosfato monobásico de amonio y 0,5 g de nitrato de magnesio en un matraz volumétrico de 
200 ml, disolver y llevar al volumen con agua.  
B.31.4.14 Solución de nitrato de magnesio al 7% p/v.  
Pesar 7 g de  nitrato de magnesio y mezclar con 100 ml de ácido clorhídrico 1 N.  
B.31.4.15 Acido clorhídrico 1 N.  
Medir 8,3 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.  
B.31.4.16. Solución de ácido nítrico al 50% v/v.  
Diluir 50 ml de HNO3 concentrado en 50 ml de agua.  
B.31.4. 17 Solución de nitrato de magnesio al 50% p/v.  
Pesar 50 g de nitrato de magnesio y mezclar con 100 ml de ácido clorhídrico 1 N.  
B.31.4.18 Solución de ácido clorhídrico 0,5 N.  
Diluir 4,15 ml de HCl y llevar a 100 ml con agua.  
B.31.4.19 Solución de cloruro d e potasio de 10 mg de K/ml.  
Pesar 1,91 g de KCl y llevar a un volumen de 100 ml con agua.  
B.31.4.20 Solución de permanganato de potasio al 5% p/v.  
Pesar 5 g de KMnO4 y mezclar con 100 ml de agua.  
B.31.4.21 Solución reductora.  
Preparar de acuerdo con el man ual de operación del equipo.  
B.31.4.22 Solución de ácido nítrico al 2% v/v.  
Agregar lentamente 2 ml de ácido nítrico concentrado a 100 ml de agua.  
B.31.4.23 Aire comprimido seco y limpio.  
B.31.4.24 Acetileno grado absorción atómica.  
B.31.4.25 Oxido nitroso  grado absorción atómica.  
B.31.4.26 Argón grado absorción atómica.  
B.31.4.27 Nitrógeno grado absorción atómica.  
B.31.5 Preparación de la muestra  
B.31.5.1 Digestión por microondas para la determinación de arsénico, cadmio, cromo, cobre, hierro, 
mercurio, ní quel, plomo, selenio, estaño y zinc.  
B.31.5.1.1 Pesar en un vaso de digestión como máximo 0,5 g de muestras secas y de 5 a 10 g de 
muestras líquidas.  
B.31.5.1.2 Adicionar 5 ml de ácido nítrico concentrado y 2 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. Tapar los 
vasos y colocarlos en el horno de microondas.  
B.31.5.1.3 Fijar el programa de calentamiento del horno de acuerdo con las instrucciones del fabricante.  
B.31.5.1.4 Sacar los vasos del horno y dejar enfriar a temperatura ambiente. Transferir la solución digeri da 
a un matraz volumétrico adecuado y llevar al volumen con agua.  
B.31.5.2 Digestión por vía húmeda para la determinación de cadmio, cromo, cobre, hierro, niquel, plomo  y 
zinc. Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.31.5.2.1 Pesar como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 g de alimentos que cont engan de 50 al 75% de 
agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limitar el contenido de grasa o aceite a un máximo de 4 g y el 
total de materia orgánica a 5 g.  
B.31.5.2.2 Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar toda la noche o inici ar directamente la 
digestión, dependiendo del comportamiento de la muestra.  
B.31.5.2.3 Digerir en un sistema Kjeldahl o en un sistema de reflujo refrigerante e iniciar el calentamiento 
gradualmente para evitar pérdidas de muestra.  
B.31.5.2.4 Digerir la mue stra durante 3 h o más tiempo si es necesario (algunas muestras requieren la 
adición de mayor cantidad de ácido nítrico) hasta que la solución sea traslúcida. Si esto no sucede, adicionar 
peróxido de hidrógeno gota a gota con agitación continua hasta logra r una solución traslúcida.  
B.31.5.2.5 Enfriar, filtrar y llevar a un volumen conocido con agua.  
B.31.5.3 Digestión por vía seca para la determinación de Cu, Fe, Cr, Ni y Zn.  
B.31.5.3.1 Pesar en un crisol o cápsula como máximo 40 g de jugo o bebida, 20 g de  alimentos que 
contengan del 50 al 75% de agua y 10 g de alimentos sólidos o semisólidos. Limitar el contenido de grasa o 
aceite a un máximo de 4 g y el total de materia orgánica a 5 g.  
B.31.5.3.2 Añadir 10 ml de ácido nítrico concentrado y dejar reposar t oda la noche o iniciar directamente la 
digestión dependiendo del comportamiento de la muestra. En productos con alta concentración de proteínas 
adicionar una solución de nitrato de magnesio al 7% p/v y mezclar completamente. Llevar a sequedad 
aproximadamen te durante 6 h en estufa a una temperatura de 90 a 95°C.  
B.31.5.3.3 Colocar la muestra en mufla y elevar la temperatura lentamente de 2 a 4°C por minuto hasta 
350°C. Mantener la temperatura hasta que cesen los humos.  
B.31.5.3.4 Elevar gradualmente la tempe ratura hasta 500 a 550°C para evitar que la muestra se incinere y 
mantener esta temperatura durante 16 h o toda la noche.  
B.31.5.3.5 Un segundo paso de calcinación puede ser requerido para remover algunos residuos, para ello 
lavar las paredes del crisol co n 2 ml de ácido nítrico al 50%. Colocar la muestra en una parrilla de 
calentamiento a 120°C para remover el exceso de ácido y hasta la eliminación de vapores. Colocar la muestra 
en mufla fría y elevar la temperatura gradualmente hasta 500 a 550°C, mantenié ndola por el tiempo necesario. 
Repetir este procedimiento cuantas veces sea necesario hasta que la muestra quede libre de  carbón 
remanente.  
B.31.5.3.6 Disolver las cenizas completamente en ácido clorhídrico 1 N. Transferir la muestra disuelta a un 
matraz volumétrico adecuado, enjuagando el crisol con dos porciones de 5 ml de ácido clorhídrico 1 N.  
Adicionar los enjuagues al matraz y llevar al volumen con agua.  
B.31.6 Procedimiento  
B.31.6.1 Determinación de cadmio, cromo, cobre, hierro, ní quel, plomo, estañ o y zinc. EAA por flama 
directa.  
B.31.6.1.1 Preparación de las curvas patrón.  
Preparar un blanco y al menos 3 diluciones de la solución patrón para cada metal, en el intervalo lineal de 
trabajo utilizar ácido nítrico al 2% para hacer las diluciones.  
Nota: Las soluciones patrón de Estaño deben contener 1 ml de solución de cloruro de potasio por cada 
100 ml.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.31.6.1.2 Determinación  
B.31.6.1.2.1 Dejar estabilizar el equipo y fijar las condiciones para cada metal de acuerdo con las 
instrucciones del fabricante . Utilizar como guía el siguiente cuadro:  
Elemento  Longitud de onda (nm)  Mezcla de gases  
Cadmio  228,8  Aire/acetileno  
Cromo  357,9  Aire/acetileno  
Cobre  324,7  Aire/acetileno  
Hierro  248,3  Aire/acetileno  
Níquel 232 Aire/acetileno  
Plomo  217,3 o 283,3  Aire/acetileno  
Estaño  235,5  Oxido nitroso/acetileno  
Zinc 213,8  Aire/acetileno  
 
B.31.6.1.2.2 Ajustar el instrumento a 0 de absorbancia con el blanco de calibración. Aspirar las soluciones 
patrón de calibración del analito de menor a mayor concentración y regi strar al menos dos réplicas de la 
absorbancia de cada uno.  
B.31.6.1.2.3 Elaborar una curva de calibración, graficando la absorbancia en función de la concentración 
de cada metal. Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal).  
B.31.6.1. 2.4 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo es necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
B.31.6.1.2.5 Aspirar las muestras preparadas en (B.31.5.1 o B.31.5.3) y registrar l a absorbancia de cada 
una ellas. Calcular la concentración de cada metal a partir de la curva de calibración correspondiente.  
Se debe analizar al menos un blanco de reactivos con cada lote de muestras.  
B.31.6.1.2.6 Asegurarse de que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo de 
calibración de la curva patrón. De no ser así, efectuar la dilución correspondiente y volver a analizar.  
Nota: Esta metodología no aplica para la determinación de Cadmio y Plomo cuando las muestras son 
digeridas po r horno de microondas.  
B.31.6.2 Determinación de As y Se. EAA por generador de hidruros.  
B.31.6.2.1 Preparación de la curva patrón.  
B.31.6.2.1.1 Preparar un blanco y al menos 3 soluciones patrón en el intervalo lineal de trabajo.  
B.31.6.2.1.2 Antes de afor ar adicionar la solución reductora de acuerdo con el manual del fabricante. Dejar 
reposar = 30 min y llevar al volumen con agua.  
B.31.6.2.2 Determinación  
B.31.6.2.2.1 Conectar el generador de hidruros al espectrofotómetro y ajustar la longitud de onda, la celda, 
el flujo de gases y tiempos de purga de acuerdo con las instrucciones del fabricante.  
B.31.6.2.2.2 Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco de calibración y optimizar la respuesta del 
instrumento con la solución patrón establecida en el manual de op eración del equipo.  
B.31.6.2.2.3 Llevar a cabo la reacción para la formación de hidruros con cada una de las soluciones patrón 
de menor a mayor concentración y registrar al menos dos réplicas de la absorbancia de cada uno.  
B.31.6.2.2.4 Elaborar una curva d e calibración, graficando la absorbancia en función de la concentración 
de As. Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal).  
B.31.6.2.2.5 Lo anterior puede llevarse a cabo en equipos que se programan directamente, en los cuales 
sólo e s necesario introducir los estándares y marcar su concentración teórica.  
B.31.6.2.2.6 Analizar la muestra digerida en (B.31.5.1), de la misma forma que las soluciones patrón. 
Analizar un blanco de reactivos con cada lote de muestras.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.31.6.2.2.7 Asegurars e de que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo de 
calibración de la curva patrón. De no ser así, repetir la determinación con una alícuota más pequeña.  
B.31.7 Expresión de resultados  
B.31.7.1. Cálculos  
 
En donde:  
A = concentración del metal en la muestra leído directamente del instrumento o de la curva de calibración  
B = concentración del metal en el blanco de reactivos del instrumento leído directamente del instrumento o 
de la curva de calibración  
V = volumen de la solución de la m uestra digerida  
M = peso de la muestra  
Si la muestra ha sido diluida, el factor de dilución debe ser tomado en cuenta.  
B.31.8 Informe de la prueba  
mg metal/kg o l  
B.32 DETERMINACI ON DE INOSITOL POR M ETODO MICROBIOL OGICO  
B.32.1 Fundamento  
Este método permit e cuantificar Inositol utilizando Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080, 
microorganismo que no es capaz de sintetizar inositol, relacionando directamente el crecimiento celular con la 
concentración de Inositol presente. Para preparar la muestra y la curva  estándar se utiliza un medio comercial 
basal libre de Inositol. El crecimiento celular se mide turbidimétricamente y por interpolación en la curva se 
determina la concentración de la muestra.  
B.32.2 Reactivos y materiales  
B.32.2.1 Reactivos  
myo-inositol p ara fines bioquímicos  
Acido clorhídrico fumante al 37% para análisis  
Hidróxido de sodio en lentejas para análisis  
Cristales de cloruro de sodio para análisis  
Metanol para análisis  
- amilasa pancreática 25 U/mg  
Fosfatasa  
Lactos a monohidratada  
B.32.2.2 Materiales  
Micropipetas  
Material común de laboratorio  
C32.3 Aparatos e instrumentos  
Autoclave  
Incubadora a 35 ± 1°C  
Espectrofotómetro  
Centrífuga  
Termorreactor        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.32.4 Cepa y medios de cultivo  
Saccharomyces carlsbergensis ATCC 9080  
Medio para la prueba de Inositol modificado. Por cada 100 ml agregar (NH4) SO4: 1,5 g, Ascorbato de 
sodio: 25 g, ZnSO 4 7H2O: 15 mg, CuSO4: 15 mg, NaMoO 4 x 2H 2O :15 mg, Nitrato de tiamina: 0,5 mg, 
Nicotinamida: 5 mg, Lactosa: 23,45 g.  
Agar de microensayo  
B.32.4.1 Medio de mantenimiento de la cepa  
Agar de microensayo (Micro Assay)  
Preparar 1 l de medio según las indicaciones de la etiqueta. Repartir a razón de 6 ml en tubos (de 
preferencia con tapón de rosca), esterilizar y enfriar en posición inclinada, a fin  de obtener una pendiente lo 
más larga posible (agar inclinado).  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.32.4.2 Mantenimiento de la cepa  
Inocular por estría  Saccharomyces carlsbergensis en superficie en el medio B.32.4.1 cada dos semanas. 
Preparar el nú mero de tubos necesarios para el análisis y guardar por lo menos dos tubos para el 
mantenimiento de la cepa.  
Incubar durante 24 h a 30°C.  
B.32.5 Preparación de soluciones  
B.32.5.1 Solución fisiológica  
Disolver 9 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua des tilada. Repartir a razón de 10 ml en tubos, 
taparlos con capuchones y esterilizar durante 15 min a 121°C.  
Conservar en el refrigerador de 2 a 8°C.  
B.32.5.2 Solución de ácido clorhídrico aproximadamente 3 N  
Bajo una campana de extracción vertir en un matraz  aforado de 1000 ml que ya contenga agua destilada, 
250 ml de ácido clorhídrico al 37% y llevar a volumen.  
B.32.5.3 Solución de ácido clorhídrico - metanol 1:1  
En una probeta graduada de 500 ml, mezclar 250 ml de metanol con 250 ml de ácido clorhídrico 3 N  
B.32.5.4 Solución de hidróxido de sodio, 60 g/100 ml  
En una probeta graduada de 500 ml, disolver 300 g de hidróxido de sodio en agua destilada, enfriando 
bajo el agua del grifo. Completar a 500 ml. Conservar en un matraz con tapón de polietileno o de goma . 
B.32.5.5 Solución de hidróxido de sodio aproximadamente 1 N  
En un matraz aforado de 500 ml con tapón de polietileno, disolver 20 g de hidróxido de sodio en agua 
destilada y llevar a volumen.  
B.32.5.6 Solución patrón  
Justo antes del uso, pesar exactamente  25,0 mg de Inositol. Disolver en agua destilada y llevar a volumen 
en un matraz aforado de 250 ml.  
B.32.5.7 Mezcla de enzimas para hidrólisis  
En un mortero, mezclar 0,50 g de -amilasa pancreática de aproximadamente 25 unidade s/mg y 0,10 g de 
fosfatasa con 9,4 g de lactosa monohidratada.  
B.32.6 Procedimiento  
B.32.6.1 Desarrollo del microorganismo  
Tres días antes de la inoculación del ensayo, efectuar tres cultivos sucesivos de 24 h en superficie  de 
agar.  
Incubar durante 24 h a  30°C.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.32.6.2 Preparación de la toma de ensayo e hidrólisis  
En un matraz aforado de 50 ml, pesar 5 g de muestra para ensayo. Añadir aproximadamente 40 ml de 
agua destilada a 50°C, luego agitar hasta obtención de una suspensión homogénea. Enfriar y llevar  a volumen 
con agua.  
De cada muestra tomar una parte alícuota de 10 ml que contenga aproximadamente 0,2 a 0,3 mg de 
inositol e introducir en un tubo de hidrólisis. En cada tubo añadir 100 mg de mezcla de enzimas (B.32.5.7), 
cubrir con papel de aluminio e i ncubar durante 15 min a 42°C. A continuación añadir 20 mg de papaína e 
incubar otros 15 min a la misma temperatura.  
Luego introducir en cada tubo 15 ml de solución de hidrólisis B.32.5.3 y tres perlas de vidrio.  
Conectar los refrigerantes, luego calentar a  reflujo a 110°C durante 6 h. Dejar enfriar.  
Nota:  
Los hidrolizados pueden conservarse una noche.  
Transferir cuantitativamente el contenido de los tubos a matraces Erlenmeyer de 250 ml. Llevar el pH a 5,2 
con solución de hidróxido de sodio de 60 g/100 ml, luego con solución de NaOH 1 N. A continuación transferir 
cuantitativamente a matraces aforados de 100 o 150 ml. Llevar a volumen con agua destilada.  
Filtrar sobre papel filtro plisado con velocidad de filtración media. La solución final debe contener de 3   a 4 
µg de inositol/ml.  
B.32.6.3 Solución patrón de 4/µg de Inositol por ml.  
Justo antes del uso diluir la solución B.32.5.6 como sigue:  
10 ml a 250 ml = 4 µg/ml  
B.32.6.4 Medio de cultivo para el ensayo  
Medio para prueba de Inositol  
En un matraz Erlenmeye r de vidrio actínico de 1000 ml, preparar el volumen necesario para los tubos 
utilizados en el ensayo. Proceder según las indicaciones de la etiqueta, calentando la solución en una parrilla 
con agitación magnética.  
Cálculo del volumen necesario:  
patrón:  30 tubos 30 x 5 ml = 150 ml  
cada producto:  15 tubos 15 x 5 ml = 75 ml  
+ 50 ml a 100 ml de exceso  
 
B.32.6.5 Preparación del ensayo  
B.32.6.5.1 Serie patrón  
En un soporte metálico para tubos de ensaye, colocar 3 filas de 10 tubos (180 x 18 mm), numerados bl,  
0,...., 8; el primero corresponde al blanco.  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de tubos, volúmenes crecientes de la última 
dilución de la solución patrón, completar a 5 ml con agua destilada y mediante una bureta o una jeringa 
automática, añadir 5 ml de medio de cultivo para el ensayo según la tabla siguiente:  
Tubo No.: bl  0 1 2 3 4 5 6 7 8 
Solución patrón: 0,0  0,0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,5 2 2,5 3,0 ml  
Agua: 5  5 4,75 4,5 4,25 4,0 3,5 3,0 2,5 2 ml 
Medio de cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Los tubos del ensayo en blanco (bl) no se inoculan.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.32.6.5.2 Serie producto  
En otro soporte colocar tres filas de 10 tubos (180 x 18 mm). Los primeros cinco tubos de las tres filas van 
destinados a un producto, los otros cinco tubos de las tres fila s, a otro producto. Numerar de 9 a 13 y de 14 a 
18 y así sucesivamente para todos los productos analizados.  
Mediante una pipeta verter en triplicado en las tres series de cinco tubos, volúmenes crecientes de la 
última dilución de la toma de ensayo, complet ar a 5 ml con agua destilada y añadir 5 ml de medio de cultivo 
para el ensayo, según la tabla siguiente:  
Tubo No.: 9  10 11 12 13 
Solución de la muestra: 
0,75 1,0 1,50 2 2,50 ml  
Agua: 4,25  4,0 3,50 3,0 2,50 ml  
Medio de Cultivo:  5 ml en cada  tubo 
 
Tapar los tubos con capuchones o mediante una tapa adecuada que cubra las tres filas de tubos en el 
soporte.  
B.32.6.6 Esterilización del ensayo  
Esterilizar los tubos durante 10 min a 115°C, luego enfriarlos en un baño de agua fría.  
B.32.6.7 Inoculación  
B.32.6.7. 1 Lavado del cultivo  
Unos instantes antes de la inoculación del ensayo, poner en suspensión el microorganismo del último 
cultivo sobre agar (B.32.6.1), adicionando 10 ml de solución fisiológica en el tubo que contiene el cultivo. 
Transferir a un tubo de ce ntrífuga estéril y centrifugar durante 2 min a 1000 rpm (aproximadamente 100 g).  
Decantar la solución fisiológica. Tomar aproximadamente 2 ml de esta suspensión e introducirla en una 
cubeta óptica de 1 cm. Medir la absorbancia a 575 nm.  
B.32.6.7.2 Preparac ión del inóculo.  
Estandarizar el cultivo a fin de obtener siempre más o menos la misma extinción.  
Según la extinción obtenida, diluir en un tubo que contenga 10 ml de solución fisiológica "n" gotas del 
cultivo (B.32.6.7.1); este tubo constituye el inóculo.  
Así pues, para una extinción del cultivo (B.32.6.7.1) superior o igual a 1,5 (después de sustraer la extinción 
propia del medio), es necesario introducir 1 gota del mismo en el tubo que contiene 10 ml del medio 
(B.32.6.4). Si la extinción no se encuentra dentro de los valores arriba citados, adaptar la dilución como sigue:  
- extinción inferior a 1,5: introducir dos gotas en el tubo  
- extinción inferior a 1,2: introducir tres gotas  
 
B.32.6.7.3 Inoculación  
Mediante una micropipeta con punta estéril, inocul ar 0,1 ml del inóculo en cada tubo de las series patrón y 
producto. Los tubos del blanco (bl) no se inoculan.  
Después de inocular, agitar los tubos ligeramente a fin de repartir el microorganismo uniformemente en  el 
medio.  
B.32.6.8 Incubación  
Incubar los tubos inoculados durante aproximadamente 21 h a 30°C. Dado que Saccharomyces 
carlsbergensis  es aerobio, inclinar los tubos al máximo a fin de que la superficie de contacto entre el líquido y 
el aire sea lo mayor posible. Verificar si la diferencia de desar rollo del microorganismo es suficiente entre la 
primera y la última dilución de la solución patrón.  
Si es necesario, prolongar la incubación hasta que se obtenga un crecimiento óptimo del microorganismo.  
Después de la incubación se recomienda interrumpir e l crecimiento del microorganismo simultáneamente 
en todos los tubos, colocándolos en un baño de agua fría.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.32.6.9 Lecturas  
Mediante un agitador para tubos de ensaye, poner en suspensión el depósito formado por el desarrollo del 
microorganismo. Transferir  la suspensión a un tubo o una cubeta óptica, según el fotómetro. Medir la 
transmitancia o absorbancia a 575 nm ajustando el 100% T o a 0% de A del aparato con el blanco (bl).  
NOTA:  si la determinación se hace en absorbancia buscar el equivalente de los va lores de los ejemplos 
dados en transmitancia.  
Agitar y leer un tubo después de otro, a fin de evitar la sedimentación del microorganismo.  
B.32.7 Cálculos  
B.32.7.1 Curva de calibración  
Trazar la curva de calibración en papel milimétrico o utilizar una calcu ladora con regresión lineal, llevando 
la lectura media de cada grupo de tres tubos a la ordenada y los µg de inositol a la abscisa.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml µg lecturas  
media  
1 2 3 
0 0,0 0,0 95,7 95,9 96,0 95,8 
1 0,25 1,0 91,2 90,5 91,2 91,0 
2 0,50 2 85,6 85,9 85,1 85,5 
3 0,75 3,0 79,5 79,5 80,9 80,0 
4 1,0 4,0 73,5 72,6 72,5 72,9 
5 1,5 6,0 58,4 57,6 55,8 57,3 
6 2 8,0 50,4 50,4 50,1 50,3 
7 2,5 10 48,5 45,4 48,5 47,5 
8 3,0 12 4,0 41,6 44,3 42,6 
 
Observaciones:  
La curva de calibración es característ ica de cada vitamina.  
Es tanto mejor cuanto mayor sea la parte que ocupa de la escala de transmisión.  
Repetir el ensayo cuando la curva de crecimiento esté mal desarrollada, esto puede deberse a la cepa o al 
medio de cultivo para el ensayo, que deben verif icarse por separado.  
B.32.7.2 Contenido de vitamina en el producto  
La media de las lecturas de cada par de tubos permite leer en la curva de calibración la cantidad de 
vitamina y calcular su concentración en la última dilución de la muestra.  
Ejemplo:  
Tubo 
No. ml lecturas  
media  µg* µg/ml  
1 2 3 
9 0,75 78,7 80,4 80,2 79,8 2,9 3,87 
10 1,0 73,7 74,6 74,2 74,2 3,7 3,70 
11 1,5 61,9 62,3 62,8 62,3 5,5 3,67 
12 2 49,0 49,6 49,8 49,5 8,3 4,15 
13 2,5 40,8 40,8 40,3 40,3 ** ** 
 Media 3,85 (=C)  
* = valores le ídos en la curva de calibración  
** = punto fuera de la curva        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
Observación:  
Fluctuaciones pequeñas en los valores de la última columna son prueba de un buen ensayo.  
Calcular el contenido de vitamina en mg/100 g de producto, teniendo en cuenta las diluciones sucesivas y 
la concentración en la muestra diluida.  
El contenido de inositol, expresado en mg/100 g de producto es igual a:  
 
En donde:  
C = media de las concentraciones leídas en la curva de calibración, en µg/ml  
V1 = volumen en el que se ha disuelto la to ma de ensayo, en ml  
V2 = parte alícuota de V 1, en ml  
V3 = volumen al que se ha diluido la parte alícuota V 2, en ml  
m = toma de ensayo, en g  
Ejemplo:  
5,025 g (m) de producto se han pesado en un matraz aforado de 50 ml (V 1). Se ha tomado una parte 
alícuota d e 10 ml (V 2), que se ha diluido en un matraz aforado de 100 ml (V 3). 
La media de las concentraciones de Inositol leídas en la curva de calibración es 3,85 µg/ml (C).  
El contenido de Inositol es:  
 
B.33. DETERMINACI ON DE PROTE INA CRUDA POR KJELDAHL -GUNNING  
B.33.1  Fundamento  
Las proteínas y demás materias orgánicas son oxidadas por el ácido sulfúrico y el nitrógeno orgánico de 
las proteínas se fija como sulfato de amonio; esta sal se hace reaccionar con una base fuerte para desprender 
amoniaco que se destila y se recibe en un ácido débil, en el cual se puede titular el amoniaco con un ácido 
fuerte. En este método de Kjeldahl -Gunning, se usa el sulfato de cobre como catalizador y el sulfato de sodio 
para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar la digest ión. 
B.33.2 Material  
Matraz de Kjedahl de 800 ml  
Matraz Erlenmeyer de 500 ml  
Bureta de 50 ml  
Pipetas volumétricas de 5 ml  
Probeta  
Cuerpos de ebullición  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
Digestor -destilador de Kjeldahl  
B.33.3 Reactivos  
Acido sulf úrico (H 2SO4) 
Sulfato de cobre (CuSO 4 5 H2O) 
Granalla de zinc (malla 20)  
Sulfato de sodio anhidro (Na 2SO4) 
Acido bórico al 4% en agua (H 3BO3) 
Solución concentrada de hidróxido de sodio 1:1 m/v (NaOH)  
Acido clorhídrico 0,1 N (HCl)  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.33.3.1 Indicador de Wess low 
B.33.3.1.1 Rojo de metilo al 0,2% en una mezcla de 60 ml de alcohol etílico y 40 ml de agua 
(CH 3)NC 6H4N=NC 6H4COOH y C 2H5OH y H 2O. 
B.33.3.1.2  Azul de metileno al 0,2% en agua C 16H18N3SCl.Cl 2Zn.H 2O. 
Mezclar dos partes de (B.33.3.1.1) y una parte de (B.33 .3.1.2.)  
B.33.4 Procedimiento  
Pesar exactamente 1 g de muestra en un matraz de Kjedahl, agregar 2 g de sulfato de cobre, 10 g de 
sulfato de sodio anhidro, 25 ml de ácido sulfúrico y unos cuerpos de ebullición; colocar a baja temperatura, 
hasta que todo el material esté carbonizado y aumentar gradualmente la temperatura hasta que el contenido 
del matraz esté completamente claro, dejar por 30 min más.  
Dejar enfriar y agregar 400 ml de agua destilada para disolver completamente el residuo del matraz;  dejar 
enfriar, agregar 6 -7 granallas de zinc, estratificando, y sin agitar, agregar 50 ml de solución de hidróxido de 
sodio. Conectar el matraz al destilador y recibir el destilado en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, que contenga 
50 ml de ácido bórico y unas gotas del indicador de Wesslow (la parte terminal del tubo del destilador debe 
estar dentro del ácido). Destilar hasta aproximadamente 300 ml. Retirar el matraz y titular con ácido clorhídrico 
0,1 N.  
B.33.5 Cálculos  
 
En donde:  
V = ml de ácido clorhídrico 0,1 N requeridos en la titulación  
N = normalidad del ácido clorhídrico  
M = ml de muestra  
6,38 = factor para convertir nitrógeno a proteínas de la leche  
B.33.6 Según el método de Kjeldahl para determinar el contenido de nitrógeno total (N2) de la fórmula, 
seguido  del cálculo del contenido de proteína cruda como sigue:  
N2 x factor = proteína cruda  
Factores que deben usarse  
Proteína de trigo  5,70 
Proteína de soya  6,25 
Proteína derivada de la leche  6,38 
Proteínas mixtas:  
Cuando el alimento contiene más de por ejemplo  el 90% (peso seco) de proteína de trigo, soya o derivada 
de leche, el factor proteína debe ser 5,70; 6,25 y 6,38 respectivamente.  
Cuando el alimento está constituido por una cantidad importante conocida (por ejemplo 80%) de peso 
seco de proteína de trigo,  soya o derivada de leche, el factor para dicha proteína debe ser el factor apropiado 
según se indica arriba. Cuando la proteína remanente está constituida por una mezcla desconocida de estas 
proteínas, debe aplicarse el factor 6,25 a la cantidad remanente  de proteína.  
Cuando se conoce la cantidad de cada una de las proteínas de trigo, de soya o derivada de leche 
contenida en el alimento, el factor proteína empleado deberá ser el derivado proporcionalmente usando los 
factores arriba citados.  
B.33.7 Los resu ltados se expresan como g de proteína cruda por 100 g del alimento tal como se vende y 
por 100 kcal.        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.34  DETERMINACI ON DE GRASA  
B.34.1 Método del Extracto etéreo. Para productos como chocolates, granos, polvos con chocolate, 
entre otros.  
B.34.1.1 Fundamen to 
El método para la extracción de los lípidos libres, utiliza un agente deshidratante que absorbe la humedad 
de la muestra y arena de mar que provoca un medio poroso que permite que el disolvente pase con mayor 
facilidad a través de ésta, extrayendo la gr asa presente. En la extracción de lípidos combinados se utiliza el 
medio ácido para disolver las proteínas y así permitir la separación de la grasa.  
B.34.1.2 Reactivos y materiales  
B.34.1.2.1 Reactivos  
Acido clorhídrico (HCl) diluido al 33% v/v. Diluir 100  ml de HCl concentrado con 200 ml de agua destilada.  
Arena de mar tratada  
Eter de petróleo G.R. (P.E. 30 -60°C), libre de grasa o éter etílico G.R. libre de peróxidos.  
Sulfato de sodio anhidro G.R.  
Tierra de diatomáceas (celite 503)  
B.34.1.2.2 Materiales  
Agitador de vidrio de 20 cm  
Algodón libre en grasa  
Cartucho de extracción de tamaño adecuado al extractor  
Cuerpo de ebullición  
Embudo de vidrio de 9 cm de diámetro  
Extractor de Soxhlet  
Matraz de boca esmerilada 24/40 de 250 ml  
Matraz Erlenmeyer de 250 ml  
Papel filtro Whatman No. 1 y No. 540  
Papel indicador de pH  
Material común de laboratorio  
Vaso de precipitado de 50 ml  
Vidrio de reloj de 4 cm de diámetro  
B.34.1.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
Baño de agua  
Estufa con reg ulador de temperatura para mantener a 100 ± 2°C  
B.34.1.4 Procedimiento  
B.34.1.4.1 Extracción de lípidos libres  
Pesar de 1 a 2 g de muestra finamente molida dentro de un cartucho de extracción, agregar igual cantidad 
de sulfato de sodio, mezclar con un agit ador de vidrio.  
Agregar de 1 a 2 g de arena de mar, mezclar nuevamente y sin retirar el agitador, colocar el cartucho en 
un vaso de precipitado de 50 ml. Secar en la estufa durante 6 h.  
Cubrir la mezcla contenida en el cartucho, con una porción de algodón,  colocar en el extractor de Soxhlet, 
ajustar en la parte inferior del extractor un matraz con cuerpos de ebullición a peso constante. Lavar el vaso 
donde fue secada la muestra con varias porciones de éter adicionando los lavados al extractor. Agregar 
suficiente éter hasta obtener de 2 -3 descargas del extractor. Conectar el refrigerante al extractor y hacer 
circular el agua. Calentar el matraz hasta obtener un mínimo de condensación de 3 -6 gotas por segundo.  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
Efectuar la extracción durante 4 a 6 h. Suspender el calentamiento, quitar el extractor del matraz y dejar 
caer una gota de éter del extractor sobre un papel filtro o un vidrio de reloj, si al evaporarse el éter se observa 
una mancha de grasa, ajustar el Soxhlet de nuevo al matraz y continuar la extracció n. 
Terminada la extracción, evaporar a baja temperatura el disolvente del matraz; secar en la estufa a 100°C 
hasta peso constante, enfriar en desecador y pesar.  
B.34.1.4.2 Extracción de lípidos combinados  
Pesar de 1 a 2 g de muestra finamente molida dentro  de un matraz Erlenmeyer de 250 ml, agregar 50 ml 
de HCl diluido, unos cuerpos de ebullición y tapar con un vidrio de reloj.  
Calentar en baño de agua durante 1 h manteniendo el volumen constante por la adición de agua destilada.  
Agregar 150 ml de agua cali ente, alrededor de un gramo de tierra de diatomáceas o alrededor de 100 cm 2 
de papel filtro cortado en pequeñas piezas.  
Filtrar a través de papel filtro Whatman No. 540 húmedo de 15 cm de diámetro (si se prefiere se puede 
usar doble), lavar el matraz Erlen meyer y el vidrio de reloj con agua caliente agregando los lavados al papel 
filtro. Secar el matraz y el vidrio de reloj en la estufa.  
Continuar lavando el papel filtro con agua caliente hasta que el filtrado esté libre de ácido.  
Secar el papel filtro a 12 0°C sobre un vidrio de reloj o a 60°C por toda la noche si fue agregado de papel 
filtro cortado en piezas.  
Con la ayuda de unas pinzas pasar el papel filtro seco al cartucho de extracción, tapar con una porción de 
algodón y colocar en el extractor de Soxhl et, ajustar en la parte inferior del extractor un matraz con cuerpos  
de ebullición a peso constante. Lavar el matraz Erlenmeyer y el vidrio de reloj secos con éter adicionando los 
lavados al extractor. Agregar suficiente éter hasta obtener de 2 -3 descarga s del extractor.  
Proceder como se indica en la extracción de lípidos libres donde dice: "Conectar el refrigerante al 
extractor..."  
B.34.1.4.3 Cálculos  
 
En donde:  
PG = Peso del matraz con grasa seca en g  
PB = Peso del matraz con cuerpos de ebullición a pes o constante en g  
PM = Peso de la muestra en g  
B.34.2 M ETODO DE ROESE -GOTTLIEB (HIDR OLISIS ALCALINA). PARA F ORMULAS PARA 
LACTANTES, F ORMULAS DE CONTINUACI ON, LECHES EN POLVO, ENTRE OTROS  
B.34.2.1 Fundamento  
El método descrito es una modificación al de Roese -Gottlieb. Se utiliza amoniaco para suavizar la caseína, 
alcohol etílico para romper la emulsión y la combinación grasa -proteína, así como favorecer la extracción de la 
grasa por el éter etílico. Se usa también éter de petróleo que disminuye la solubilidad  del éter etílico en la 
capa acuosa. Extraída la grasa ésta se estima por diferencia de peso.  
B.34.2.2 Reactivos y materiales  
B.34.2.2.1 Reactivos  
Hidróxido de amonio G.R.  
Alcohol etílico de 96°  
Eter etílico (libre de peróxidos)  
Eter de petróleo (P.E. 30 -60°C) 
B.34.2.2.2 Materiales  
Tubos de Roese -Gottlieb o de Mojonier  
Vasos de precipitados de 125 ml  
Pipetas de 10 ml graduadas en 0,1 ml  
Perlas de vidrio        (Quinta Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 10 de septiembre de 2012  
B.34.2.3 Aparatos e instrumentos  
Desecador  
Estufa para secar que alcance una temperatura entre 70 a 80°C  
Baño de agua caliente o placa caliente  
Balanza analítica con sensibilidad de 0,1 mg  
B.34.2.4 Procedimiento  
B.34.2.4.1  Pesar de 1 a 2 g de muestra y colocarlos en el tubo, agregar 9 ml de agua hirviendo y agitar 
vigorosamente hasta que la muestra esté disue lta, enfriar a la temperatura ambiente. Agregar 1,5 ml de 
hidróxido de amonio y mezclar perfectamente. Agregar 10 ml de alcohol etílico, tapar y agitar fuertemente; 
agregar 25 ml de éter etílico, tapar y agitar vigorosamente por 90 seg. Agregar 25 ml de ét er de petróleo, tapar 
y volver a agitar suavemente por 90 seg. Centrifugar a 600 rpm o dejar reposar hasta que el líquido superior 
esté prácticamente claro. Decantar la capa etérea en un vaso de precipitado a peso constante. Lavando el 
labio y el tapón del  tubo con una mezcla de partes iguales de los dos éteres. Agregar estos lavados al vaso. 
Repetir la extracción del líquido sobrante en el tubo, dos veces más utilizando 25 ml de cada disolvente. 
Efectuar una tercera extracción con 20 ml de cada disolvente.  Evaporar los disolventes del vaso en una placa 
caliente o un baño de vapor, a una temperatura apropiada que permita la eficiente evaporación, secar la grasa 
en estufa a 80°C, enfriar y pesar.  
B.34.2.4.2  Después de introducir el producto en el tubo Mojonni er, añadir aproximadamente 0,1 g de 
amilasa y un agitador magnético, para facilitar la suspensión, luego adicionar de 8 a 10 ml de agua destilada a 
45°C, evitando que el nivel de agua suba demasiado.  
Colocar el tubo Mojonnier tapado por 2 h al baño de agua  a 65°C. Remuévase ligeramente de vez  en 
cuando.  
Comprobar que el almidón se haya degradado por completo: al añadir dos gotas de solución de yodo 
aproximadamente 0,1 N no debe formarse coloración azul. En caso contrario, volver a colocar el tubo al baño 
de agua hasta que desaparezca la coloración. Enfriar el tubo Mojonnier y continúe con el procedimiento.  
B.34.2.5 Cálculos  
 
En donde:  
PG = Peso de la grasa extraída  
PM = Peso de la muestra  
B.34.2.6 Reproducción de la prueba  
En la reproducción de la prueba, la diferencia máxima permisible para la determinación efectuada por 
duplicado, no debe ser mayor de 0,1%, en caso contrario se recomienda repetir la determinación.  
B.34.3 POR HIDR OLISIS ACIDA. PARA HARINAS, PAN, CEREALES Y AQUELLOS PRODUCTOS 
CUYA PRESENTAC ION SEA EN GALLETAS, BARRAS, ENTRE OTROS  
B.34.3.1 Fundamento  
Se basa en la disolución de la proteína en el ácido y la grasa que se separa, puede ser extraída utilizando 
como disolvente orgánico, una mezcla de éter etílico -éter de petróleo.  
B.34.3.2 Reactiv os y materiales  
B.34.3.2.1 Reactivos  
Acido clorhídrico (25+11) v/v  
Alcohol etílico, G.R.  
Eter de petróleo (P.E. 40 - 60°C) G.R. libre de grasa  
Eter etílico grado reactivo libre de grasa  Lunes 10 d e septiembre de 2012  DIARIO OFICIAL  (Quinta Sección)      
B.34.3.2.2 Materiales  
Algodón absorbente libre de grasa  
Cuerpos de ebu llición  
Embudo de filtración, tallo corto  
Probetas graduadas  
Tubo de extracción de Mojonnier  
Vasos de precipitados, cápsulas de vidrio, níquel o aluminio de 125 ml  
Material común de laboratorio  
B.34.3.3 Aparatos e instrumentos  
Balanza analítica con sensibi lidad de 0,1 mg  
Baño de agua con sistema eléctrico para mantener a 70 -80° C 
Estufa con regulador de temperatura para mantener a 100°C  
B.34.3.4 Procedimiento  
B.34.3.4.1  Pesar de 1 a 2 g de muestra finamente molida en un vaso de precipitado de 50 ml (la mues tra 
puede ser pesada directamente en el tubo de extracción de Mojonnier), agregar 2 ml de alcohol etílico y agitar 
adecuadamente para humedecer la muestra. Agregar 10 ml de ácido clorhídrico 25:11, dos cuerpos de 
ebullición, mezclar y colocar en baño de ag ua durante 30 -40 min, agitando ocasionalmente durante este 
tiempo. Agregar 10 ml de alcohol etílico, mezclar y dejar enfriar.  
B.34.3.4.2  Vaciar la mezcla al tubo de extracción, lavar el vaso con 3 porciones y un total de 25 ml de éter 
etílico (pasando cada  lavado al tubo de extracción). Tapar el tubo con un tapón de hule sintético y agitar 
vigorosamente durante un min. Agregar 25 ml de éter de petróleo y agitar nuevamente durante un min. Dejar 
el tubo en posición vertical hasta que el líquido superior esté prácticamente claro o centrifugar 20 min a 
aproximadamente 600 rpm.  
B.34.3.4.3  Decantar tanto como sea posible la solución éter -grasa, sobre un filtro de algodón empacado 
con firmeza en el embudo de filtración, recibiendo el éter en un vaso o cápsula de 12 5 ml a peso constante 
(puede ser llevado a peso constante con cuerpos de ebullición). Lavar la boca del tubo de extracción y el 
tapón con varios ml de una mezcla de disolventes en partes iguales recibiendo en el mismo vaso.  
B.34.3.4.4  Reextraer el líquido sobrante del tubo dos veces más, utilizando para este propósito 15 ml de 
cada disolvente en cada ocasión. Agitar bien después de cada adición de éter. Decantar la solución éter -grasa 
en el mismo embudo utilizado anteriormente; lavar el embudo y el tallo de l embudo con varios ml de una 
mezcla de disolventes en partes iguales.  
B.34.3.4.5  Evaporar la mezcla de disolventes lentamente sobre baño de vapor (en un sistema de 
extracción) secar la grasa en una estufa a 100°C hasta peso constante, enfriar en desecador  y pesar.  
Corregir el resultado por la determinación de un blanco de reactivos.  
B.34.3.5 Cálculos  
 
En donde:  
P2 = Peso del vaso o cápsula con grasa a peso constante  
P1 = Peso del vaso o cápsula vacía a peso constante  
PM = Peso de la muestra en g  
PRECAUCIO N: El éter etílico es un disolvente orgánico extremadamente flamable. Se pueden formar 
peróxidos inestables cuando se almacenan mucho tiempo o se exponen a la luz solar. Puede reaccionar con 
explosión cuando está en contacto con el óxido de cloro, litio o con agentes fuertemente oxidantes. Por ello es 
recomendable el empleo de extractores de vapores efectivos y evitar la electricidad estática.  
______________________