II 
(Actos no legislativo s) 
DECISIONES 
DECISIÓN DE EJECUCIÓN (UE) 2015/1554 DE LA COMISIÓN 
de 11 de septiembre de 2015 
por la que se establecen disposiciones de aplicación de la Directiva 2006/88/CE en lo que respecta 
a los requisitos de vigilancia y los métodos de diagnóst ico 
[notif icada con el númer o C(2015) 6188] 
(Texto pertinente a efectos del EEE) 
LA COMISIÓN EUR OPEA, 
Visto el Tratado de Funcionamiento de la Unión Europea, 
Vista la Directiva 2006/88/CE del Consejo, de 24 de octubre de 2006, relativa a los requisitos zoosanitar ios de los 
animales y de los product os de la acuicultura, y a la prevención y el control de deter minadas enfermedades de los 
animales acuáticos (1), y, en particular , su artículo 49, apar tado 3, su artículo 50, apar tado 4, su artículo 57, letra b), y 
su artículo 61, apar tado 3, 
Considerando lo siguient e: 
(1)  La Directiva 2006/88/CE establece medidas preventivas mínimas para la vigilancia y la detección precoz en los 
animales acuáticos de las enfe rmedades que enumera en su anex o IV (en lo sucesiv o, «las enfer medades de la 
lista»), y las medidas de control que deben aplicarse en caso de sospec ha o de apar ición de un brote de dichas 
enfermedades. Asimismo establece los requisitos para que los Estados miembros o las zonas o compar timent os 
de los Estados miembros obte ngan la calificación de «libre de enfe rmedad». 
(2)  La erradicación de las enfe rmedades de la lista y la obte nción de la calif icación de libre de enfe rmedad por parte 
de un Estado miembro, zona o compar timento deben basarse en los mismos principios y seguir el mismo 
enfoque científico en toda la Unión. Por esta razón, es necesar io establecer a nivel de la Unión requisitos 
específicos para los sistema s de erradicación y vigilancia, así como para los métodos de muestreo y diagnóstico 
que deben utilizar los Estados miembros a fin de obtener la calif icación de libre de enfer medad, ya sea en todo su 
territorio o en una zona o compar timent o. 
(3)  Los exámenes de laborat orio que deben efectuarse en caso de sospech a o conf irmación de la presencia de las 
enfermedades de la lista deben ser los mismos en toda la Unión y han de seguir normas y protocolos científi cos 
idénticos. De conf ormidad con la Directiva 2006/88/CE, es necesar io establecer los métodos y procedimiento s 
específicos de diagnóstico que deben utilizar los laborat orios designados a tal efecto por las autoridades 
compet entes de los Estados miembros. 
(4)  El Código Sanitar io para los Animales Acuáticos, adoptado por la Org anización Mundial de Sanidad Animal (OIE) 
(«el Código Acuático»), establece normas para mejorar la sanidad de los animales acuáticos y el bienestar de los 
peces de cultivo en el mundo a través de textos normativ os para un comercio intern acional seguro de animales 
acuáticos y sus productos. Varios capítulos del Código Acuático formulan recomendaciones sobre el uso de 
determinadas pruebas de diagnóstico. La OIE regula dichas pruebas en su Manual de Pruebas de Diagnóstico para 
los Animales Acuáticos («el Manual Acuático»). Para garantizar que los requisitos de la Unión en relación con el 
diagnóstico de las enfermedades de los animales acuáticos sean coherente s con las normas internacionales, las 
disposiciones de la present e Decisión deben tener en cuenta las normas y recomendaciones del Código Acuático. 23.9.2015 L 247/1 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    
(1)DO L 328 de 24.11.2006, p. 14. (5)  A este respecto, para muchas de las enfermedades de la lista, el Manual Acuático contiene varias pruebas y 
procedimiento s que deben utilizarse en los exámenes de laborat orio. Con objeto de unif ormar la base científi ca 
del diagnóstico de las enfer medades de la lista a nivel de la Unión, es necesar io elegir entre las pruebas y procedi ­
mient os de diagnóstico recomendados por la OIE y especifi car las pruebas que deben ser obligat orias con fines de 
examen de laboratori o cuando se lleven a cabo programas de vigilancia y cuando se trate de descar tar la sospec ha 
o confir mar la presencia de las enfe rmedades de la lista. Ya que también será necesar io disponer de métod os y 
procedimiento s altern ativos en ciertos casos, deben proporcionarse descr ipciones y algunas explicaciones 
científicas sobre cuándo y cómo podrían ser aplicados los métodos alternati vos. Esto es especialmente necesar io 
para los procedimiento s de diagnóstico más detallados. 
(6)  A fin de producir resultados diagnósticos precisos y reproducibles, es importante que los procedimientos y 
prot ocolos detallados que vayan a usarse sean validados de conf ormidad con las normas de calidad pertinentes a 
las que se refiere la parte I del anex o VI de la Directiva 2006/88/CE. Un element o necesar io de los prot ocolos de 
diagnóstico para muchos de los métodos establecidos en la present e Decisión es el uso de kits de pruebas 
comerciales, que han sido validados en ensa yos acreditados por los laboratorio s de referencia de la Unión 
Europea para las respectivas enfer medades. En inter és de la segur idad jurídica, es convenient e mencionar en la 
present e Decisión los nombres comerciales de dichos kits de pruebas validados. 
(7)  Para deter minados Estados miembros, la obtención de la calif icación de libre de una o varias enfermedades de la 
lista, en todo su territorio o en una zona o compar timent o, puede plant ear dificultades. En tales situaciones, es 
posible que el Estado miembro no desee obtener o recuperar la calif icación de libre de dichas enfer medades. Las 
medidas mínimas de control que deben aplicarse en los casos en que el Estado miembro no desee obtener o 
recuperar la calificación de libre de enfer medades han de ser las mismas a nivel de la Unión y deben basarse en 
los mismos criterios. Por tanto , de conf ormidad con la Directiva 2006/88/CE, es necesar io establecer normas 
detalladas para el conf inamient o de las enfer medades de la lista y requisitos mínimos para levantar tales medidas 
de conf inamient o. 
(8)  La Decisión 2001/183/CE de la Comisión (1) establece los requisitos relativ os a los planes de muestreo y los 
métodos de diagnóstico para la detección y conf irmación de la necrosis hemat opo yética infecciosa y la sept icemia 
hemor rágica viral, enfe rmedades que figuran en la lista. La Decisión 2003/466/CE de la Comisión (2) establece 
requisitos relativ os a los planes de muestreo y los métod os de diagnóstico para la detección de la anemia 
infecciosa del salmón, así como criterios para la delimitación de zonas y la adopción de medidas oficiales de 
vigilancia ante la sospech a o la confir mación de dicha enfermedad. La Decisión 2002/878/CE de la Comisión (3) 
establece los requisitos relativ os a los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y 
confir mación de la presencia de bonamiosis y mar teiliosis en los moluscos. Para que tales requisitos queden 
actualizados, estas tres decisiones deben ser sustituidas por la presente Decisión. En consecuencia, conviene 
deroga r las Decisiones 2001/183/CE, 2002/878/CE y 2003/466/CE. 
(9)  Dado que algunos Estados miembros necesitan cierto tiempo para poner al día sus laboratori os nacionales de 
referencia a fin de cumplir los requisit os que establece la present e Decisión, esta debe aplicarse a partir del 
1 de abril de 2016. 
(10)  Las medidas previstas en la presente Decisión se ajustan al dictamen del Comité Permanente de Vegetales, 
Animales, Alimentos y Piensos. 
HA ADOPT ADO LA PRESENTE DECISIÓN: 
Artículo 1 
Objet o 
La present e Decisión establece normas relativas a: 
a)  la vigilancia, las zonas tampón, el muestreo y los métodos de diagnóstico que deben aplicar los Estados miembros en 
relación con la calificación sanitar ia de sus territori os, o de zonas o compar timent os de estos, con respecto a las 
enfe rmedades no exóticas de los animales acuáticos que figuran en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE («las enfer medades de la lista»); 23.9.2015 L 247/2 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    
(1)Decisión 2001/183/CE de la Comisión, de 22 de febrero de 2001, por la que se establecen los planes de muestreo y los métodos de 
diagnóstico para la detecc ión y confir mación de deter minadas enfer medades de los peces y se deroga la Decisión 92/532/CEE (DO L 67 
de 9.3.2001, p. 65). 
(2)Decisión 2003/466/CE de la Comisión, de 13 de junio de 2003, por la que se establecen los criterios para la delimitación de zonas y la 
adopción de medidas oficiales de vigilancia ante la sospecha o la confir mación de anemia infecciosa del salmón (AIS) (DO L 156 
de 25.6.2003, p. 61). 
(3)Decisión 2002/878/CE de la Comisión, de 6 de noviembre de 2002, por la que se establecen planes de muestreo y métodos de 
diagnóstico para la detección y confir mación de la presencia de bonamiosis (Bonamia ostreae) y mar teiliosis (Mar teilia refringen s) en los 
moluscos (DO L 305 de 7.11.2002, p. 57). b)  los métodos de diagnóstico que deben usarse para los exámenes de laborat orio en caso de sospecha o confir mación 
de la presencia de enfermedades de la lista, y 
c)  las medidas mínimas de control que deben aplicarse en caso de sospecha o confir mación de una enfer medad de la 
lista en un Estado miembro, zona o compar timent o que no hayan sido declarados libres de dicha enfermedad. 
Artículo 2 
Def iniciones 
A efect os de la present e Decisión, se aplicarán las siguientes definiciones:  
a) «sep ticemia hemor rágica viral» («SHV»): enfe rmedad causada por el virus de la septicemia hemor rágica viral (VSHV), 
también conocido como Egtved virus, perteneciente al género Novirhab dovir us y a la familia Rhabdovir idae;  
b) «necrosis hemat opo yética infecciosa» («NHI»): enfe rmedad causada por el virus de la necrosis hemat opo yética 
infecciosa (VNHI), perteneciente al género Novirhab dovir us y a la familia Rhabdovir idae;  
c) «her pesvirosis de la carpa koi» («HCK »):enfermedad causada por el herpesvir us de la carpa koi (HVK), pertenecient e a 
la familia Alloher pesvir idae, y conocido por el nombre científic o de herpesvir us de los ciprínidos tipo 3 (HV Cy-3);  
d) «anemia infecciosa del salmón» («AIS»): enfer medad causada por la infección por el virus de la anemia infecciosa del 
salmón (ISAV) con supresión en la HPR, pertenecient e al género Isavir us, de la familia Orthomyxovir idae;  
e) «infecci ón por Mar teilia refrin gens»:enfermedad causada por una infección por el prot ozoo Mar teilia refringens, del 
orden Paramyxida;  
f) «infecci ón por Bonamia ostreae» :enfermedad causada por una infec ción por el protozoo Bonamia ostreae, del filo 
Haplospor idia;  
g) «enfermedad de las manchas blancas» (o «EMB»): enfer medad causada por el virus del síndrome de las manc has 
blancas (VSMB), que es un virus con ADN bicatenar io del género Whispovir us, dentro de la familia Nimavir idae. 
Artículo 3 
Requisit os mínimos aplicables a los prog ramas de erradicación y vigilancia 
Los Estados miembros velarán por que se cumplan las disposiciones sobre programas de vigilancia y erradicación, zonas 
tampón, muestreo y métodos de diagnóstico establecidos en el anex o I y los métodos específicos y procedimiento s 
detallados establecidos en el anex o II cuando deba concederse, retirarse o devol verse a un Estado miembro, o a una zona 
o compar timent o dentro de un Estado miembro, la calif icación de libre de una o varias enfe rmedades de la lista. 
Artículo 4 
Requisit os mínimos para los métodos de diagnóst ico y procedimientos específ icos 
Los Estados miembros velarán por que se apliquen los métodos de control establecidos en el anex o I y los métodos de 
diagnóstico específi cos y procedimiento s detallados establecidos en el anex o II cuando se efectúen exámenes de 
laborat orio a fin de confir mar o descar tar la presencia de una enfermedad de la lista. 
Artículo 5 
Medidas mínimas de control del conf inamiento de las enfermedades de la lista y requisit os mínimos para el 
levantamiento de las medidas de conf inamiento establecidas en Estados miembros, zonas o compar timentos no 
declarados libres de enfer medades de la lista 
Los Estados miembros velarán por que se apliquen las medidas mínimas de control y los requisitos mínimos para el 
levantamiento de las medidas de conf inamient o que se establecen en el anex o I cuando lleven a cabo medidas de control 
o levanten las medidas de conf inamient o de una o varias enfermedades de la lista en un Estado miembro o en una zona 
o compar timent o que no estén declarados libres de tales enfer medades de la lista. 23.9.2015 L 247/3 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Artículo 6 
Derogaciones 
Quedan derogadas las Decisiones 2001/183/CE, 2002/878/CE y 2003/466/CE. 
Artículo 7 
Fecha de aplicación 
La present e Decisión será aplicable a partir del 1 de abril de 2016. 
Artículo 8 
Dest inatar ios 
Los destinatar ios de la present e Decisión serán los Estados miembros. 
Hecho en Bruselas, el 11 de septiemb re de 2015. 
Por la Comisión 
Vytenis ANDRIUKAITIS 
Miembro de la Comisión  23.9.2015 L 247/4 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    ANEX O I 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL 
I.  Introducción 
El presente anex o establece: 
a)  requisitos para los programas de erradicación y vigilancia conte mplados en el artículo 44 de la Directiva 
2006/88/CE y para los métodos de muestreo y diagnóstico que deben utilizarse a fin de conceder la calificaci ón 
de libre de enfer medad a Estados miembros, zonas o compar timent os con arreglo al capítulo VII de dicha 
Directiva; 
b)  métodos de muestreo y diagnóstico que deben utilizarse en los exámenes de laborat orio realizados en caso de 
sospecha y destinados a conf irmar la presencia de las enfermedades no exóticas enumeradas en la parte II del 
anex o IV de la Directiva 2006/88/CE («las enfe rmedades de la lista»), de conf ormidad con lo dispuesto en el 
artículo 28, letra a), y el artículo 57, letra b), de la citada Directiva; 
c)  las medidas de conf inamient o que deben adoptarse en caso de conf irmación de una enfermedad de la lista, con 
arreglo al artículo 39 de la Directiva 2006/88/CE, y las medidas que deben adopta rse a fin de obtener la 
calif icación sanitar ia de la catego ría III en un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la catego ría V. 
Los requisitos que se establecen en el present e anex o se aplican a las siguient es enfermedades de la lista: 
1. Septicemia hemor rágica viral (SHV) Parte 1 
2. Necrosis hematopo yética infecciosa (NHI) Parte 1 
3. Herpesvirosis de la carpa koi (HCK) Parte 2 
4. Anemia infecciosa del salmón (AIS) Parte 3 
5. Infección por Mar teilia refrin gens Parte 4 
6. Infección por Bonamia ostreae Parte 5 
7. Enfe rmedad de las manc has blancas (EMB) Parte 6  
II.  Def iniciones 
A efectos de los anex os I y II, se entenderá por:  
a) «compar timent o continental»: una o varias explotaciones situadas en la parte continental de uno o varios Estados 
miembros, sujetas a un sistem a de biosegur idad común y que contienen una población de animales acuáticos con 
una calif icación sanitar ia particular con respecto a una enfermedad específica;  
b) «explotación continental»: explotación que cría animales de acuicultura situada en la parte continental del 
territori o de un Estado miembro;  
c) «zona continental»: zona geográfic a precisa situada en la parte continental de uno o varios Estados miembros con 
un sistema hidrológico homogéneo que comprende partes de una cuenca hidrográf ica desde las fuent es hasta una 
barrera natural o artificial que impide la migración hacia arriba de los animales acuáticos desde tramos inferiores 
de la cuenca hidrográf ica, una cuenca hidrográfica compl eta desde sus fuente s hasta su estuar io o más de una 
cuenca hidrográf ica, incluidos sus estuar ios, debido a la relación epidemiológica entre las cuencas hidrográf icas a 
través del estuar io; 23.9.2015 L 247/5 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    d) «explotación oficialmente declarada infectada»: explotación que cría animales acuáticos en la que la autori dad 
compet ente ha conf irmado una o varias enfe rmedades de la lista con arreglo al artículo 28, letra a), al artículo 29 
y al artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE.  
e) «explotación en contact o»: explotación que cría animales acuáticos que se ha demostrado o se sospec ha 
firmemente que ha sido contaminada por mater ial infeccioso procedent e de una explotación oficialment e 
declarada infectada. 
PARTE 1 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL DE LA SEPTICEMIA HEMORRÁ GIC A VIRAL (SHV) Y LA NECR OSIS HEMA TO­
POYÉTIC A INFECCIOSA (NHI) 
I.  Requisit os para los prog ramas de vigilancia y erradicación a fin de obtener y mantener la calif icación de libre de 
SHV y NHI y medidas de conf inamiento para dichas enfer medades de la lista 
I.1.  Requisito s generales para las inspecciones sanitar ias y el muestreo en relación con la SHV y la NHI: 
a)  Las inspecciones sanitar ias y, en su caso, el muestreo se efectuarán durante el período del año en el que la 
temperatura del agua sea infer ior a 14 °C o cuando sea más probable que el agua alcance sus temperaturas 
mínimas anuales. 
b)  Cuando sea precisa una vigilancia específi ca de las poblaciones salva jes de conf ormidad con la parte I, 
punt o 2, párrafo segundo, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, se deter minarán el número y la 
distr ibución geográfica de los punt os de muestreo para obtener una cober tura razonable del Estado 
miembro, zona o compar timent o. Los puntos de muestreo serán representativ os de los diferentes ecosistem as 
en los que se encuentren las poblaciones salva jes de especies sensibles. 
c)  Cuando las explotaciones o las poblaciones salvajes vayan a ser sometidas a inspecciones sanitar ias o 
muestreo más de una vez al año, los inter valos entre las inspecciones sanitar ias y entre las tomas de muestras 
serán de al menos cuatro meses y lo más largos posible, teniendo en cuenta los requisitos de temperatura de 
la letra a). 
d)  Todas las unidades de producción, como estanques, tanques y jaulas de red, serán sometidas a inspecciones 
sanitar ias para detec tar la presencia de peces muer tos, débiles o con compo rtamient o anómalo. Se prestará 
especial atención a la zona de salida de agua, donde tienden a acumularse los peces débiles a causa de las 
corrientes de agua. 
e)  Los peces de especies sensibles que vayan a recoger se como muestras se seleccionarán como sigue: 
i)  si hay truchas arco iris, solo se seleccionarán para el muestreo los peces de esta especie, a menos que 
estén presentes peces de otras especies sensibles que muestren síntom as típicos de SHV o NHI; si no hay 
truchas arco iris, la muestra será representativa de toda s las demás especies sensibles presentes, 
ii)  si hay peces débiles, con compor tamient o anómalo o recién muer tos pero no descompuest os, se 
seleccionarán; si se utiliza más de una fuent e de agua para la producción piscícola, se incluirán en la 
muestra peces que represente n todas las fuent es de agua, 
iii)  los peces se seleccionarán de modo que estén representadas proporcionalmente en la muestra todas las 
partes de la explotación y todas las clases anuales. 
I.2.  Requisito s específicos para obtener la calif icación sanitar ia de libre de enfermedad (categoría I) con respecto a 
la SHV y la NHI 
I.2.1.  Programas de vigilancia: 
a)  Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calificación sanitar ia de la catego ría III de 
conf ormidad con la parte B del anex o III de la Directiva 2006/88/CE con respecto a la SHV , la NHI o ambas 
podrá obtener la categoría I con respecto a dichas enfer medades de la lista a condición de que todas las 
explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro 
de ese Estado miembro, zona o compar timent o cumplan los requisitos establecidos en el anex o V de la 
misma Directiva y de que todas las explotaciones y, en caso de que lo exija la parte I, punt o 2, 
párrafo segundo, de su anex o V, todos los puntos de muestreo de poblaciones salvajes seleccionados de 
conf ormidad con dicha parte hayan sido sometidos a uno de los siguient es programas de vigilancia: 23.9.2015 L 247/6 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    i)  Modelo A. Programa de vigilancia de dos años: 
Las explotaciones o puntos de muestreo habrán sido sometidos a inspecciones sanitar ias y muestreo 
durant e un período mínimo de dos años consecutivo s, conf orme a lo establecido en el cuadro 1.A de la 
sección II. 
Durant e ese período de dos años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métodos de 
diagnóstico del punto II.2 habrán dado resultados negativ os por lo que respecta a la SHV , a la NHI o a 
ambas y cualquier sospech a de SHV , NHI o de ambas se habrá descar tado de conf ormidad con los 
métodos de muestreo y de diagnóstico del punt o II.3. 
ii)  Modelo B. Programa de vigilancia de cuatro años con una muestra reducida: 
Las explotaciones o puntos de muestreo habrán sido sometidos a inspecciones sanitar ias y muestreo 
durant e un período mínimo de cuatro años consecutivos, conf orme a lo establecido en el cuadro 1.B de la 
sección II. 
Durant e ese período de cuatro años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métodos de 
diagnóstico del punto II.2 habrán dado resultados negativ os por lo que respecta a la SHV , a la NHI o a 
ambas y cualquier sospech a de SHV , NHI o de ambas se habrá descar tado de conf ormidad con los 
métodos de muestreo y de diagnóstico del punt o II.3. 
b)  Si durant e la aplicación del programa de vigilancia al que se refiere la letra a) queda conf irmada la infec ción 
por SHV , NHI o ambas en una explotación incluida en ese programa de vigilancia y, por tanto , le ha sido 
retirada la calif icación sanitar ia de la catego ría II a la explotación, esta podrá recuperar inmediatament e su 
calificación sanitar ia de la cate goría II y seguir aplicando el programa de vigilancia para obtener la 
calificación de libre de enfer medad sin aplicar un programa de erradicación con arreglo al punt o I.2.2 a 
condición de que cumpla las siguiente s condiciones: 
i)  es una explotación continental cuya calificación sanitar ia con respecto a la SHV , la NHI o ambas es 
independiente de la calif icación sanitar ia de las poblaciones de animales acuáticos de las aguas naturales 
circundantes con respecto a esas enfe rmedades de la lista, de conf ormidad con la parte II, punto 3, del 
anex o V de la Directiva 2006/88/CE; 
ii)  ha sido vaciada, limpiada, desinfe ctada y puesta en barbec ho; la duración del barbec ho será de al menos 
seis semanas; 
iii)  ha sido repoblada con peces procedent es de Estados miembros, zonas o compar timentos con una 
calif icación sanitar ia de la catego ría I con respecto a la SHV , la NHI o ambas. 
I.2.2.  Programas de erradicación 
I.2.2.1.  Requisito s generales 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la SHV , la NHI o ambas podrá obtener la cate goría I con respecto a dichas enfer medades de la lista a condición 
de que todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar timent o hayan sido sometidas a un programa de 
erradicación que cumpla lo dispuesto en las letras a) a e) siguiente s: 
a)  Las medidas de control mínimas establecidas en el capítulo V, sección 4, de la Directiva 2006/88/CE se 
habrán aplicado eficazmente y se habrá establecido en las inmediaciones de las explotaciones oficialment e 
declaradas infectadas por la SHV , la NHI o ambas enfe rmedades de la lista una zona de confinamiento 
conf orme al artículo 32, letra b), de dicha Directiva que incluya una zona de prote cción y una zona de 
vigilancia. 
La zona de conf inamient o habrá sido definida caso por caso teniendo en cuenta los factores que influye n en 
los riesgos de propagaci ón de la enfe rmedad de la lista a los peces de piscicultura y salva jes, como son: el 
número de peces muer tos y la tasa y distr ibución de la mor talidad de peces en la explotación infectada por 
la SHV , la NHI o ambas; la distancia y densidad de las explotaciones vecinas; la proximidad a mataderos; las 
explotaciones en contacto; las especies present es en las explotaciones; las prácticas de cría aplicadas en las 
explotaciones afectadas y en las explotaciones vecinas a estas; las condiciones hidrodinámicas y otros factores 
de importancia epidemiológica. 23.9.2015 L 247/7 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Para el establecimiento de las zonas de protección y de vigilancia se aplicarán los siguient es requisitos 
mínimos en lo que respecta a la delimitación geográfica de dichas zonas: 
i)  Se establecerá una zona de prote cción en las inmediaciones de una explotación oficialmente declarada 
infectada por la SHV , la NHI o ambas enfer medades de la lista, que corresponderá:  
1) en las zonas costeras: a una zona incluida en un círculo de un radio mínimo de una ampli tud de 
marea, o al menos 5 km, con su centro en la explotación oficialment e declarada infectada por la SHV , 
la NHI o ambas, o una zona equivalente determinada conf orme a datos hidrodinámicos o epidemio ­
lógicos adecuados;  
2) en zonas interi ores: a toda la cuenca hidrográf ica de la explotación oficialmente declarada infec tada 
por la SHV , la NHI o ambas; la autoridad compet ente podrá limitar la extensión de la zona a partes de 
la cuenca hidrográf ica o de la superf icie de explotación, a condición de que no se vea comprometida la 
prevención de la propagaci ón de la SHV , la NHI o ambas. 
ii)La autori dad compet ente establecerá una zona de vigilancia fuera de la zona de prote cción, que corres­
ponderá:  
1) en las zonas costeras: a una zona circundant e de la zona de protección donde se super pongan varias 
amplit udes de marea; o a una zona circundante de la zona de prote cción e incluida en un círculo 
de 10 km de radio desde el centro de la zona de prot ección; o a una zona equivalent e determinadas 
conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos adecuados;  
2) en zonas interiores : a una zona ampli ada fuera de la zona de protección establecida. 
b)  Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por la SHV , la NHI o ambas que críen especies 
sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de protección 
serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos los siguient es element os: 
i)  la toma de muestras para pruebas de 10 peces cuando se obser ven signos clínicos o post mortem 
compati bles con una infección por la SHV , la NHI o ambas, o de un mínimo de 30 peces cuando no se 
obser ven signos clínicos o post mortem; 
ii)  una inspección sanitar ia en las explotaciones en las que las pruebas contem pladas en el inciso i) hayan 
dado resultados negativ os; las inspecciones sanitar ias continuarán una vez al mes durante el período en el 
que la temperatura del agua es infer ior a 14 °C, excep to cuando los estanques o jaulas de red estén 
cubier tos de hielo, hasta que se retire la zona de prot ección de conf ormidad con el punto I.2.2.1, letra c). 
c)  Todas las explotaciones oficialment e declaradas infectadas por la SHV , la NHI o ambas serán vaciadas, 
limpiadas, desinfectadas y puestas en barbec ho. La duración del barbec ho será de al menos seis semanas. 
Cuando todas las explotaciones oficialment e declaradas infectadas dentro de la misma zona de protección se 
vacíen, se dejarán en barbec ho de forma sincronizada durant e al menos tres semanas. El presente apar tado se 
aplicará también a las nuevas explotaciones oficialmente declaradas infectadas durant e la aplicación del 
programa de erradicación. 
Cuando se pongan en barbecho las explotaciones oficialment e declaradas infectadas, las zonas de protección 
se conver tirán en zonas de vigilancia. 
La autori dad compet ente podrá decidir si exige el vaciado, la limpieza, la desinfección y la puesta en 
barbec ho de otras explotaciones dentro de las zonas de protección y vigilancia establecidas. La autori dad 
compet ente determinará la duración del barbec ho de dichas explotaciones tras una evaluación de riesgos caso 
por caso. 
d)  Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por la SHV , la NHI o ambas enfe rmedades de la 
lista y todas las demás explotaciones puestas en barbec ho dentro de las zonas de prot ección y vigilancia 
establecidas a las que se refie re la letra c) serán repobladas con peces procedent es de Estados miembros, 
zonas o compar timentos con una calificación sanitar ia de libre de enfer medad (categoría I) con respecto a 
la SHV , la NHI o ambas. 23.9.2015 L 247/8 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialment e declaradas infectadas hayan sido 
vaciadas, limpiadas, desinfe ctadas y puestas en barbecho con arreglo al punt o I.2.2.1, letra c). 
e)  Todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE dentro del Estado miembro, zona o compar timento cubier tos por el programa de erradicación 
y, cuando se exija la vigilancia de poblaciones salva jes, los punt os de muestreo seleccionados con arreglo al 
punt o I.1, se someterán posteri ormente al sistema de vigilancia establecido en el punto I.2.1. 
I.2.2.2.  Requisito s para que recuperen la calif icación de libre de enfermedad los compar timentos continentales que 
const en de una sola explotación previamente declarada libre de NHI, de SHV o de ambas 
Un compar timento continental que const e de una sola explotación previamente declarada libre de SHV , de NHI 
o de ambas enfer medades de la lista, cuya calif icación sanitar ia en lo que se refie re a estas enfermedades de la 
lista sea independiente de las aguas naturales circundante s con arreglo a la parte II, punto 3, del anex o V de la 
Directiva 2006/88/CE y cuya calificación sanitar ia de la catego ría I haya sido retirada con arreglo al artículo 53, 
apar tado 3, de dicha Directiva podrá recuperar la calif icación sanitar ia de la catego ría I inmediatament e después 
de que la autoridad compet ente haya conf irmado que se cumplen las siguient es condiciones: 
a)  La explotación oficialment e conf irmada como infectada por la SHV , la NHI o ambas ha sido vaciada, 
limpiada, desinf ectada y puesta en barbec ho. La duración del barbec ho será de al menos seis semanas. 
b)  La explotación oficialment e conf irmada como infec tada por la SHV , la NHI o ambas ha sido repoblada con 
peces procedent es de Estados miembros, zonas o compar timentos con una calificación sanitar ia de la 
cate goría I con respecto a la SHV , la NHI o ambas. 
I.3.  Requisito s específicos para mantener la calif icación sanitar ia de libre de enfermedad (categoría I) con respecto a 
la SHV , la NHI o ambas 
Cuando sea precisa una vigilancia específica para manten er la calif icación sanitar ia de la categoría I de 
conf ormidad con el artículo 52 de la Directiva 2006/88/CE, todas las explotaciones que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro del Estado miembro, la zona o el compar ­
timent o en cuestión serán sometidas a una inspección sanitar ia y se tomar án muestras de los peces de 
conf ormidad con el cuadro 1.C de la sección II de la present e parte, teniendo en cuenta el nivel de riesgo que 
present e la explotación de contraer SHV , NHI o ambas enfermedades de la lista. 
Al deter minar la frecuencia de las inspecciones sanitar ias de los compar timent os con calificación sanitar ia de la 
catego ría I respecto a la SHV , la NHI o ambas situados en zonas continentales y en los que la calificación 
sanitar ia con respecto a la SHV o la NHI dependa de la calif icación sanitar ia de las poblaciones de animales 
acuáticos de las aguas naturales circundantes de conf ormidad con la parte II, punt o 2, del anex o V de la 
Directiva 2006/88/CE, el riesgo de contraer SHV , NHI o ambas se considerará alto. 
La calif icación de libre de enfer medad solo se manten drá mientras todas las muestras analizadas utilizando los 
métodos de diagnóstico del punt o II.2 den resultados negativos por lo que respecta a la SHV , a la NHI o a 
ambas y cualquier sospecha de SHV , NHI o de ambas quede descar tada de conf ormidad con los métod os de 
diagnóstico del punto II.3. 
I.4.  Requisito s para el levantamiento de las medidas de conf inamient o establecidas en el artículo 39 de la Directiva 
2006/88/CE, a saber , para el cambio de una calificación sanitar ia de la catego ría V a una calif icación sanitar ia de 
la cate goría III 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la SHV , la NHI o ambas podrá obtener la calif icación sanitar ia de la cate goría III con respecto a dichas 
enfermedades de la lista a condición de que: 
a)  se cumplan los requisitos establecidos en el punt o I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea 
técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida altern ativa que 
proporcione una garant ía similar de exterm inio del VNHI, del VSHV o de ambos desde el entor no de la 
explotación; 
b)  todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas y todas las demás explotaciones puestas en 
barbec ho o sometidas a medidas alternativas con arreglo a la letra a) dentro de las zonas de protección y 
vigilancia establecidas hayan sido repobladas con peces procedentes de Estados miembros, zonas o compar ti­
mentos con una calif icación sanitar ia de la cate goría I, II o III con respecto a la SHV , la NHI o ambas; 23.9.2015 L 247/9 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    c)  la repoblación solo se haya efectuado después de que todas las explotaciones oficialmente declaradas 
infectadas hayan sido vaciadas, limpiada s, desinfectadas y puestas en barbecho o sometidas a medidas 
alternativas con arreglo a la letra a). 
II.  Méto dos de diagnóstico y muestreo 
II.1.  Órg anos objeto de muestreo 
El mat erial tisular que deberá examinarse será el bazo, el riñón anterior y el corazón o el encéf alo. Cuando se 
tome n muestras de peces reproductores, también podrá examinarse fluido ovárico o seminal. 
En caso de alevines, los peces enteros de menos de 4 cm de longitud podrán desmenuzarse con unas tijeras o 
un escalpelo estér iles tras haberse eliminado la parte del cuer po poste rior a la cloaca. Si una muestra consta de 
peces enteros de una longitud comprendida entre 4 y 6 cm, se recoger án las vísceras, sin descar tar los riñones. 
Podrán mezclarse trozos de órganos de un máximo de 10 peces. 
II.2.  Métod os de diagnóstico para obtener y mantener la calificación de libre de SHV , NHI o ambas 
El métod o de diagnóstico, de conf ormidad con los métodos y procedimiento s de diagnóstico aprobados 
establecidos en la parte 1, punt o I, del anex o II, para obtener o manten er la calif icación de libre de SHV , NHI o 
ambas será uno de los siguient es: 
a)  aislamient o del virus en cultivo s celulares seguido de identif icación mediante el ensa yo de inmunoadsorción 
enzimática (ELISA ), la prueba de inmunof luorescencia indirecta (IFAT), la prueba de neutralización viral o la 
retrotranscr ipción asociada a reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR); o bien 
b)  RT-qPCR. 
II.3.  Métod os de muestreo y diagnóstico para descar tar o conf irmar la SHV o NHI 
Cuando sea preciso confir mar o descar tar una sospecha de SHV , NHI o ambas de conf ormidad con el 
artículo 28 de la Directiva 2006/88/CE, se aplicarán los siguiente s procedimientos de inspección, muestreo y 
ensa yo: 
a)  La explotación sospechosa será sometida al menos a una inspección sanitar ia y un muestreo de 10 peces, 
cuando se obser ven signos clínicos o post mortem compati bles con una infección por SHV , NHI o ambas, o 
de un mínimo de 30 peces, cuando no se obser ven signos clínicos o post mortem. Las muestras se 
examinarán con uno o varios de los métod os de diagnóstico que se establecen en los incisos i) y ii), de 
acuerdo con los métodos y procedimiento s detallados de diagnóstico de la parte 1, punt o II, del anex o II: 
i)  aislamiento convencional del virus en cultivo celular seguido de identif icación inmunoquímica o 
molecular del virus, 
ii)  detec ción del virus por RT-qPCR, 
iii)  otras técn icas de diagnóstico con eficacia similar demostrada, como la prueba de inmunof luorescencia 
indirecta (IFAT), el ensa yo de inmunoadsorción enzimática (ELISA ), la RT-PCR y la inmunohist oquímica 
(IHC). 
b)  La SHV se considerará conf irmada si uno o más de estos métodos de diagnóstico dan positivo al VSHV . 
La NHI se considerará conf irmada si uno o más de estos métodos de diagnóstico dan positiv o al VNHI. 
La conf irmación del primer caso de SHV o NHI en Estados miembros, zonas o compar timent os no 
infectados previamente se basará en el aislamiento convencional del virus en cultivo celular o mediante la 
RT-qPCR. 
c)  La sospech a de VSHV , VNHI o ambos virus podrá descar tarse si el cultivo celular o la RT-qPCR no apor tan 
ninguna otra prueba de la presencia del VSHV ni del VNHI. 23.9.2015 L 247/10 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuadro 1.A 
Sistema de vigilancia de zonas y compar timento s para el período de control de dos años contemplado en el 
punto I.2.1, letra a), inciso i), anter ior a la obtención de la calif icación de libre de SHV o NHI 
Tipo de explotación Número de 
inspecciones 
sanitar ias anuales 
(dos años) Número de 
muestreos 
anuales 
(dos años) Número de peces de la muestra (1) 
Número de peces en 
crecimient o Número de peces 
reproductores (2) 
a)Explotaciones con reproduc ­
tore s 2 2 50 (primera inspec ­
ción) 
75 (segunda inspec ­
ción) 30 (primera o segunda 
inspecciones) 
0 (primera o segunda 
inspecciones) 
b)Explotaciones que solo con­
tienen reproductores 2 1 0 75 (primera o segunda 
inspecciones) 
c)Explotaciones sin reproduc ­
tores 2 2 75(3) (primera y se­
gunda inspecciones) 0 
Número máximo de peces por muestra conjunta: 10 
(1)  Las muestras se recogerán como muy pronto tres semanas después del traslado de los peces de agua dulce a agua salada. 
(2)El fluido ovárico o seminal de los reproductor es se recogerá en el momento de la maduración, con ocasión del «stripping» u or­
deño. 
(3)  Deberán recogerse muestras de un número de peces que garantice la detecc ión del VSHV o del VNHI con una confianza del 95 % si 
la prevalencia prevista es del 5 %.  
Cuadr o 1.B 
Sistema de vigilancia con un tamaño de mues tra reducido para el período de control de cuatro años 
contemplado en el punto I.2.1, letra a), inciso ii), anter ior a la obtención de la calif icación de libre de SHV 
o NHI 
Tipo de explotación Número de 
inspecciones 
sanitar ias anuales Número de mues ­
treos anuales Número de peces de la muestra (1) 
Número de peces en 
crecimient o Número de peces 
reproductores (2) 
Primeros dos años del período de vigilancia 
a)Explotaciones con reproduc ­
tore s 2 1 0 (primera inspección) 
30 (segunda inspec ­
ción) 0 (primera inspección) 
0 (segunda inspección) 
b)Explotaciones que solo con­
tienen reproductores 2 1 0 30 (primera o segunda 
inspecciones) 
c)Explotaciones sin reproduc ­
tores 2 1 30(3) (primera o se­
gunda inspecciones) 0 
Últimos dos años del período de vigilancia 
a)Explotaciones con reproduc ­
tore s 2 2 30 (primera inspec ­
ción) 
0 (segunda inspección) 0 (primera inspección) 
30 (segunda inspec ­
ción) 23.9.2015 L 247/11 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Tipo de explotación Número de 
inspecciones 
sanitar ias anuales Número de mues ­
treos anuales Número de peces de la muestra (1) 
Número de peces en 
crecimient o Número de peces 
reproductores (2) 
b)Explotaciones que solo con­
tienen reproductores 2 2  30 (primera y segunda 
inspecciones) 
c)Explotaciones sin reproduc ­
tores 2 2 30(3) (primera y se­
gunda inspecciones)  
Número máximo de peces por muestra conjunta: 10 
(1)  Las muestras se recogerán como muy pronto tres semanas después del traslado de los peces de agua dulce a agua salada. 
(2)El fluido ovárico o seminal de los reproductor es se recogerá en el momento de la maduración, con ocasión del «stripping» u or­
deño. 
(3)  Deberán recogerse muestras de un número de peces que garantice la detecc ión del VSHV o del VNHI con una confianza del 95 % si 
la prevalencia prevista es del 10 %.  
Cuadr o 1.C 
Sistemas de vigilancia de zonas o compar timentos para mantener la calif icación de libre de SHV o NHI con 
arreglo al punto I.3 
Nivel de riesgo Número de inspecciones sanitar ias Número de peces de la muestra (3) 
Alto 2 cada año 30(1)(2) 
Medio 1 cada año 30(1) 
Bajo 1 cada dos años 30(1) 
Número máximo de peces por muestra conjunta: 10 
(1)  Las muestras se recogerán como muy pronto tres semanas después del traslado de los peces de agua dulce a agua salada. 
(2)  Deberán recogerse muestras de un número de peces que garantice la detecc ión del VSHV o del VNHI con una confianza del 95 % si 
la prevalencia prevista es del 10 %. 
(3)  Se tomará como mínimo una muestra por cada inspección sanitar ia.  
PARTE 2 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL DE LA HERPESVIR OSIS DE LA CARP A KOI (HC K) 
I.  Requisit os aplicables a los prog ramas de vigilancia y erradicación para obtener y mantener la calif icación sanitar ia de 
libre de HCK y para conf inar la infecci ón por el herpesvir us de la carpa koi (HVK) 
I.1.  Requisito s generales 
Cuando sea precisa una vigilancia específi ca de las poblaciones salva jes de conf ormidad con la parte I, punto 2, 
párrafo segundo, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, se deter minarán el número y la distr ibución 
geográfi ca de los punt os de muestreo para obtener una cober tura razonable del Estado miembro, zona o 
compar timent o. Los puntos de muestreo también serán representativ os de los diferent es ecosistem as en los que 
se encuentren las poblaciones salva jes sensibles, como sistemas fluviales y lagos. 23.9.2015 L 247/12 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    La vigilancia específica se basará en el seguimiento regular de los lugares con especies sensibles. Los lugar es 
serán sometidos a seguimiento cuando las temperaturas del agua hayan alcanzado niveles que permitan el 
desar rollo de la enfer medad (> 15 °C) y como muy pronto dos semanas después de la fecha en que se alcancen 
dichas temperaturas. Todos los peces enfermos o con compo rtamient o anómalo que se encuentren en el lugar 
serán sometidos a muestreo y ensa yo. 
Siempr e que sea posible, serán sometidos a muestreo los peces que se hayan mantenido durante un tiempo 
prolongad o (de dos a tres semanas) en el inter valo de temperaturas que permite el desar rollo del virus, es decir , 
entre 15 y 26 °C. No obstante, podrá aceptarse el siguient e enfoque: 
a)  recoger una subpoblación en el momento del traslado de los estanques de invierno a los de verano y 
conser var los peces en la misma masa de agua del estanque de verano hasta que se obteng an los requisitos 
mínimos de temperatura, o 
b)  recoger muestras en el momento de la recolección o durante otras manipulaciones de los peces que formen 
parte de las prácticas normales de gestión. Si es posible, las muestras se recoger án entre 24 y 72 horas 
después de este tipo de prácticas de gestión, a fin de aumentar las posibilidades de detección del HVK. 
Cuando las explotaciones o las poblaciones salva jes vayan a ser sometidas a inspecciones sanitar ias o muestreo 
más de una vez al año, los inter valos entre las inspecciones sanitar ias o las tomas de muestras serán lo más 
largos posible en la estación en la que sea más probable que el agua alcance sus temperaturas máximas anuales, 
sin rebasar el límite de 28 °C. 
Todas las unidades de producción, como estanques y tanques, serán sometidas a inspecciones sanitar ias para 
detectar la presencia de peces muer tos, débiles o con compo rtamiento anómalo. 
Cypr inus carpio y sus híbr idos, como Cypr inus carpio × Carassius auratus, se recoge rán cuando estén present es en la 
explotación. 
Los peces que vayan a recoger se como muestras se seleccionarán como sigue: 
i)  si hay peces débiles, con compo rtamient o anómalo o recién muer tos pero no descom puestos, se 
seleccionarán, 
ii)  si se utiliza más de una fuent e de agua para la producción piscícola, se incluirán en la muestra peces que 
representen todas las fuent es de agua, 
iii)  los peces se seleccionarán de modo que estén representadas proporcionalment e en la muestra todas las 
partes de la explotación y todas las clases anuales. 
I.2.  Requisito s específicos para obtener la calif icación sanitar ia de libre de HCK (categoría I) 
I.2.1.  Programas de vigilancia 
a)  Un Estado miembro, zona o compar timento que tenga la calif icación sanitar ia de la catego ría III con respecto 
a la HCK podrá obte ner la calif icación sanitar ia de la cate goría I cuando todas las explotaciones que críen 
especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado 
miembro, zona o compar timento cumplan los requisit os para la calificaci ón de libre de enfermedad 
establecidos en el anex o V de dicha Directiva y todas esas explotaciones y, en caso de que lo exija la parte I, 
punt o 2, párrafo segundo, de dicho anex o, los punt os de muestreo de poblaciones salva jes seleccionados de 
conf ormidad con dicha parte, hayan sido sometidos a uno de los siguientes programas de vigilancia: 
i)  Modelo A. Programa de vigilancia de dos años: 
Las explotaciones o puntos de muestreo habrán sido sometidos a inspecciones sanitar ias y muestreo 
durant e un período mínimo de dos años consecutivo s, conf orme a lo establecido en el cuadro 2.A de la 
sección III. 
Durant e ese período de dos años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métodos de 
diagnóstico del punt o II.2 habrán dado resultados negativ os por lo que respecta al HVK y cualquier 
sospec ha de HCK habrá sido descar tada de conf ormidad con los métodos de diagnóstico del punto III.2. 23.9.2015 L 247/13 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    ii)  Modelo B. Programa de vigilancia de cuatro años con una muestra reducida: 
Las explotaciones o puntos de muestreo habrán sido sometidos a inspecciones sanitar ias y muestreo 
durant e un período mínimo de cuatro años consecutivos, conf orme a lo establecido en el cuadro 2.B de la 
sección III. 
Durant e ese período de cuatro años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métodos de 
diagnóstico del punt o II.2 habrán dado resultados negativ os por lo que respecta al HVK y cualquier 
sospec ha de HCK habrá sido descar tada de conf ormidad con los métodos de diagnóstico del punto III.2. 
b)  Si durant e los cuatro años de aplicación del programa de vigilancia establecido en la letra a) queda 
confir mada la infec ción por el HVK en una explotación incluida en este programa de vigilancia y, por tanto , 
le ha sido retirada su calif icación sanitar ia de la catego ría II, la explotación podrá recuperar inmediatament e 
la calificaci ón sanitar ia de la catego ría II y seguir aplicando el programa de vigilancia para obtener la 
calificación de libre de enfer medad sin aplicar un programa de erradicación con arreglo al punt o I.2.2 a 
condición de que cumpla las siguiente s condiciones: 
i)  es una explotación continental cuya calificación con respecto a la HCK es independiente de la calif icación 
sanitar ia de las poblaciones de animales acuáticos de las aguas naturales circundante s con respecto a 
dicha enfer medad de la lista, de conf ormidad con la parte II, punt o 3 del anex o V de la Directiva 
2006/88/CE, 
ii)  haya sido vaciada, limpiada, desinfectada y puesta en barbecho; la duración del barbecho será de al 
menos seis semanas, 
iii)  ha sido repoblada con peces procedent es de Estados miembros, zonas o compar timentos con una 
calif icación sanitar ia de la catego ría I con respecto a la HCK. 
I.2.2.  Programas de erradicación 
I.2.2.1.  Requisito s generales 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la HCK podrá obtener la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a dicha enfermedad de la lista 
cuando todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la 
Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar timent o hayan sido sometidas al menos al 
siguient e programa de erradicación: 
a)  Las medidas de control mínimas establecidas en el capítulo V, sección 4, de la Directiva 2006/88/CE han sido 
aplicadas eficazmente y se ha establecido una zona de conf inamient o conf orme al artículo 32, letra b), de 
dicha Directiva que incluye una zona de prote cción y una zona de vigilancia en las inmediaciones de las 
explotaciones oficialment e declaradas infectadas por el HVK. 
La zona de confinami ento debe haber sido definida caso por caso teniendo en cuenta los factores que 
influyen en los riesgos de propagación de la HCK a los peces de piscicultura y salvajes , como son: el número 
de peces muer tos y la tasa y distr ibución de la mor talidad de peces en la explotación infectada por el HVK; la 
distancia y densidad de las explotaciones vecinas; la proximidad a mataderos; las explotaciones en contact o; 
las especies presentes en las explotaciones; las prácticas de cría aplicadas en las explotaciones afectadas y 
vecinas; las condiciones hidrodinámicas y otros factores de impor tancia epidemiológica. 
Para el establecimiento de las zonas de protección y de vigilancia se aplicarán los siguient es requisitos 
mínimos en lo que respecta a la delimitación geográfica de dichas zonas: 
i)  Se establecerá una zona de prote cción en las inmediaciones de una explotación oficialmente declarada 
infectada por el HVK, que corresponderá a toda la cuenca hidrográfica de la explotación oficialment e 
declarada infectada por el HVK; la autori dad compet ente podrá limitar la extensión de la zona a partes de 
la cuenca hidrográf ica, a condición de que no se vea compr ometida la prevención de la propagaci ón de 
la HCK. 
ii)  Se establecerá una zona de vigilancia fuera de la zona de prote cción, que corresponderá a una zona 
ampli ada circundante de la zona de prote cción establecida. 23.9.2015 L 247/14 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    b)  Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por el HVK que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de prote cción serán 
sometidas a una investig ación oficial que incluirá al menos los siguient es elementos: 
i)  la toma de muestras para pruebas de 10 peces cuando se obser ven signos clínicos o post mortem 
compati bles con la HCK, o de 30 peces cuando no se obser ven signos clínicos o post mortem, 
ii)  una inspección sanitar ia en las explotaciones en las que las pruebas contem pladas en el punt o III.2 hayan 
dado resultados negativ os; las inspecciones sanitar ias continuarán una vez al mes en la estación en la que 
la temperatura del agua alcance probablement e más de 15 °C, hasta que se retire la zona de prote cción de 
conf ormidad con el punt o I.2.2.1, letra c). 
c)  Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por el HVK serán vaciadas, limpiadas, desinfe ctadas 
y puestas en barbec ho. La duración del barbec ho será de al menos seis semanas. Cuando todas las 
explotaciones situadas dentro de la misma zona de prote cción que estén oficialmente declaradas infectadas 
hayan sido vaciadas, se dejarán en barbec ho de forma sincronizada durant e al menos tres semanas. El 
present e apar tado se aplicará también a las nuevas explotaciones oficialmente declaradas infectadas durante 
la aplicación del programa de erradicación. 
Cuando se pongan en barbecho las explotaciones oficialment e declaradas infectadas, las zonas de protección 
se conver tirán en zonas de vigilancia. 
La autori dad compet ente podrá decidir si exige el vaciado, la limpieza, la desinfección y la puesta en 
barbec ho de otras explotaciones dentro de las zonas de protección y vigilancia establecidas. La autori dad 
compet ente deter minará la duración del barbec ho tras una evaluación de riesgos caso por caso. 
d)  Todas las explotaciones oficialment e declaradas infec tadas por el HVK y toda s las demás explotaciones 
puestas en barbecho dentro de las zonas de protección y vigilancia establecidas serán repobladas: 
i)  con peces procedent es de Estados miembros, zonas o compar timent os con una calif icación sanitar ia de la 
catego ría I con respecto a la HCK, o bien 
ii)  durant e un período transitor io hasta el 31 de diciembre de 2020, con peces procedent es de Estados 
miembros, zonas o compar timentos con un programa de vigilancia aprobado de la HCK. 
La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialment e declaradas infec tadas por el 
HVK hayan sido vaciadas, limp iadas, desinfect adas y puestas en barbecho con arreglo al punt o I.2.2.1, 
letra c). 
e)  Todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE dentro del Estado miembro, zona o compar timento cubier tos por el programa de erradicación 
y, cuando se exija la vigilancia de poblaciones salva jes, los punt os de muestreo seleccionados con arreglo al 
punt o I.1, se someterán posteri ormente, al menos, al programa de vigilancia establecido en el punt o I.2.1. 
I.2.2.2.  Requisito s para que recuperen la calif icación de libre de enfermedad los compar timentos continentales que 
const en de una sola explotación previamente declarada libre de HCK 
Un compar timent o continental que conste de una sola explotación con calificación sanitar ia de la cate goría I 
respecto a la HCK, cuya calificación sanitar ia en lo que se refie re a esta enfer medad sea independiente de las 
aguas naturales circundantes con arreglo a la parte II, punto 3, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE y cuya 
calificación de la catego ría I haya sido retirada con arreglo al artículo 53, apar tado 3, de dicha Directiva podrá 
recuperar la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a la HCK inmediatament e después de que la 
autoridad compet ente haya conf irmado que se cumplen las siguient es condiciones: 
a)  ha sido vaciado, limpiado, desinfectado y puest o en barbec ho; la duración del barbec ho será de al menos seis 
semanas; 
b)  ha sido repoblado con peces procedentes de Estados miembros, zonas o compar timentos con una 
calificación sanitar ia de la catego ría I o de compar timent os con un programa de vigilancia de la HCK 
aprobado (calificación sanitar ia de la categoría II). 23.9.2015 L 247/15 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.3.  Requisito s específicos para manten er la calif icación de la catego ría I con respecto a la HCK 
Cuando sea precisa una vigilancia específica para mantener la calificación sanitar ia de catego ría I de 
conf ormidad con el artículo 52 de la Directiva 2006/88/CE, todas las explotaciones que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro del Estado miembro, la zona o el compar ­
timent o en cuestión serán sometidas a una inspección sanitar ia y se tomarán muestras de conf ormidad con el 
cuadro 2.B de la sección III de la presente parte, teniendo en cuenta el nivel de riesgo que presente la 
explotación de contraer el HVK. 
La frecuencia de las inspecciones sanitar ias de los compar timent os de la categoría I con respecto a la HCK 
situados en zonas continentales y que comprendan una o varias explotaciones cuya calificación sanitar ia con 
respecto a la HCK dependa de la calificación sanitar ia con respecto a dicha enfermedad de la lista de las aguas 
naturales circundantes , de conf ormidad con la parte II, punto 2, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, estará 
en consonancia con el número fijado para el nivel de riesgo alto en el cuadro 2.C. 
En los Estados miembros, zonas o compar timentos en los que el número de explotaciones sea limitado y la 
vigilancia específi ca de estas explotaciones no proporcione suficie ntes datos epidemiológicos, los sistema s de 
vigilancia para manten er la calif icación de libre de enfe rmedad incluirán puntos de muestreo seleccionados con 
arreglo a los requisit os establecidos en el punt o I.1. 
Esos punt os de muestreo serán inspeccionados y muestreados por rotación del 50 % de los punt os de muestreo 
de cada año. El muestreo se efectuará de conf ormidad con el cuadro 2.C de la sección III. Las muestras serán 
seleccionadas, preparadas y examinadas con arreglo a lo descr ito en la sección II y los exámenes de laboratori o 
serán negativ os por lo que respecta al HVK. 
La calif icación de libre de enfer medad solo se manten drá mientras todas las muestras analizadas utilizando los 
métodos de diagnóstico del punto II.2 den resultados negativ os por lo que respecta a la HCK y cualquier 
sospec ha de HCK quedará descar tada de conf ormidad con los métod os de diagnóstico del punt o III.2. 
I.4.  Requisito s específicos para el levantamiento de las medidas de confinamiento establecidas en el artículo 39 de la 
Directiva 2006/88/CE a fin de obtener la calif icación sanitar ia de la catego ría III con respecto a la HCK en 
Estados miembros, zonas o compar timent os que tengan la calif icación sanitar ia de la cate goría V 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la HCK podrá obtener la calificación sanitar ia de la catego ría III con respecto a dicha enfer medad de la lista a 
condición de que: 
a)  se cumplan los requisitos establecidos en el punt o I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea 
técnicamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida altern ativa que 
proporcione una garantía similar de exterm inio del HVK desde el entor no de la explotación; 
b)  todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas y todas las demás explotaciones puestas en 
barbec ho o sometidas a medidas alternativas con arreglo a la letra a) dentro de las zonas de protección y 
vigilancia establecidas hayan sido repobladas con peces procedentes de Estados miembros, zonas o compar ti­
mentos con una calif icación sanitar ia de la cate goría I, II o III con respecto a la HCK; 
c)  la repoblación solo se haya efectuado cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas 
hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbec ho o sometidas a medidas altern ativas con 
arreglo a la letra a). 
II.  Méto dos de diagnóstico y muestreo para la vigilancia a fin de obtener y mantener la calif icación de libre de HCK 
II.1.  Muestras 
El mater ial tisular que deberá examinarse consistirá en partes de las branquias y del riñón. Podrán mezclarse 
trozos de órganos de un máximo de dos peces. 
II.2.  Métod os de diagnóstico para la vigilancia a fin de obtener y mantener la calificación de libre de HCK 
El método de diagnóstico para obtener o mantener la calificación de libre de HCK será la PCR en directo (qPCR), 
de conf ormidad con los métodos y procedimientos detallados de diagnóstico de la parte 2, punt o II, del 
anex o II. 23.9.2015 L 247/16 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    III.  Méto dos de diagnós tico y muest reo para las investigaciones oficiales a fin de conf irmar o descar tar una sospecha 
de HCK 
III.1.  Muestras 
El mater ial tisular que deberá examinarse consistirá en partes de las branquias y del riñón. Podrán mezclarse 
trozos de órganos de un máximo de dos peces. 
III.2.  Investigación oficial y métodos de diagnóstico para descar tar o conf irmar la infección por el HVK 
Cuando sea preciso conf irmar o descar tar una sospecha de HCK de conf ormidad con el artículo 28 de la 
Directiva 2006/88/CE, se aplicará el siguient e procedimiento de inspección, muestreo y ensa yo: 
a)  La inve stigación oficial incluirá al menos una inspección sanitar ia y un muestreo de 10 peces cuando se 
obser ven signos clínicos o post mortem compati bles con una infección por el HVK, o de 30 peces cuando no 
se obser ven signos clínicos o post mortem. Las muestras se examinarán utilizando los métod os de diagnóstico 
que se establecen en la letra b), de acuerdo con los métodos y procedimiento s detallados de diagnóstico de la 
parte 2, punt o II, del anex o II. 
b)  La infección por el HVK se considerará conf irmada si se detec ta el HVK mediante PCR. 
La sospech a de HCK podrá descar tarse si este ensa yo no apor ta ninguna otra prueba de la presencia del HVK. 
Cuadro 2.A 
Sistema de vigilancia de zonas y compar timentos con arreglo al punto I.2.1 para el período de control de dos 
años anter ior a la obtención de la calif icación de libre de HCK   
Número de inspec ­
ciones clínicas 
anuales (dos años) Número de 
exámenes de labo ­
ratori o anuales 
(dos años) Número de peces 
de la muestra 
Explotaciones o zonas 
de muestreo Primeros dos años del período 
de vigilancia 2 2 75(1)  
Número máximo de peces por muestra conjunta: 2 
(1)Deberán recogerse muestras de un número de peces que garantice la detecc ión del HVK con una confianza del 95 % si la prevalen ­
cia prevista es del 5 %.  
Cuadr o 2.B. 
Sistema de vigilancia de zonas y compar timento s con arreglo al punto I.2.1 para el período de control de 
cuatro años anter ior a la obtención de la calif icación de libre de HCK   
Número de inspec ­
ciones clínicas 
anuales Número de 
exámenes de labo ­
ratori o anuales Número de peces 
de la muestra 
Explotaciones o zonas 
de muestreo Primeros dos años del período 
de vigilancia 1 1 30 
Explotaciones o zonas 
de muestreo Últimos dos años del período de 
vigilancia 2 2 30  
Número máximo de peces por muestra conjunta: 2  23.9.2015 L 247/17 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuadr o 2.C 
Sistemas de vigilancia de zonas o compar timentos con arreglo al punto I.3 para mantener la calif icación de 
libre de HCK 
Nivel de riesgo Número de inspecciones sanitar ias Número de peces de la muestra 
Alto 2 cada año 30 
Medio 1 cada año 30 
Bajo 1 cada dos años 30 
Número máximo de peces por muestra conjunta: 2  
Cuadr o 2.D 
Sistema de vigilancia con arreglo al punto I.3 para mantener la calif icación de libre de HCK en los Estados 
miembros, zonas o compar timentos en los que el número de explotaciones es limit ado y la vigilancia específ ica 
en estas explot aciones no proporciona suficientes datos epidemiológicos  
Número de inspecciones 
clínicas anuales Número de exámenes de 
laborato rio anuales Número de peces de la muestra 
Punt os de muestreo 1 cada dos años 1 cada dos años 30 
Número máximo de peces por muestra conjunta: 2  
PARTE 3 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL DE LA ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN (AIS) 
I.  Requisit os aplicables a los prog ramas de vigilancia y erradicación para obtener y mantener la calif icación sanitar ia de 
libre de AIS y para conf inar la infección por el VAIS con supresión en la HPR 
I.1.  Requisito s generales 
Cuando sea preciso efectuar las inspecciones sanitar ias y los muestreos de explotaciones de conf ormidad con la 
parte I, punto 2, párrafo segundo, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE más de una vez al año, los inter valos 
entre las inspecciones sanitar ias o las tomas de muestras serán lo más largos posible. 
Cuando sea precisa una vigilancia específi ca de las poblaciones salva jes de conf ormidad con la parte I, punto 2, 
párrafo segundo, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, se deter minarán el número y la distr ibución 
geográfi ca de los punt os de muestreo para obtener una cober tura razonable del Estado miembro, zona o 
compar timent o. Los puntos de muestreo también serán representativ os de los diferent es ecosistem as en los que 
se encuentren las poblaciones salva jes sensibles. 
Las inspecciones se efectuarán en todas las unidades de producción, como estanques, tanques y jaulas de red, 
para detectar la presencia de peces muer tos, débiles o con compor tamiento anómalo. Se prestará especial 
atención a la zona de salida de agua, donde tienden a acumularse los peces débiles a causa de las corriente s de 
agua. 23.9.2015 L 247/18 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Los peces que vayan a recoger se como muestras se seleccionarán como sigue: 
a)  Únicamente se seleccionarán peces mor ibundos o recién muer tos, pero no descom puestos. En particular , se 
dará prioridad en la toma de muestras a los peces que muestren anemia, hemor ragias u otros signos clínicos 
que indiquen trastor nos circulat orios. 
b)  Si el salmón del Atlántico es una de las especies sensibles present es en el lugar , se dará prioridad a las 
muestras de salmón del Atlántico. Si no hay salmón del Atlántico en la explotación piscícola, se tomará n 
muestras de otras especies sensibles. 
c)  Si se utiliza más de una fuent e de agua para la producción piscícola, se incluirán en la muestra peces que 
represent en todas las fuentes de agua. 
d)  Los peces se seleccionarán de modo que estén representadas proporcionalment e en la muestra todas las 
unidades de producción de la explotación, como jaulas de red, tanques y estanques, y todas las clases anuales. 
I.2.  Requisito s específicos para obtener la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a la AIS 
I.2.1.  Programas de vigilancia 
Un Estado miembro, zona o compar timento que tenga la calificaci ón sanitar ia de la categoría III con respecto a 
la AIS de conf ormidad con la parte B del anex o III de la Directiva 2006/88/CE podrá obte ner la calificación 
sanitar ia de la cate goría I con respecto a dicha enfer medad de la lista cuando todas las explotaciones que críen 
especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro de ese Estado miembro, zona 
o compar timent o cumplan los requisit os pertinentes establecidos en el anex o V de la misma Directiva y todas 
esas explotaciones y, en caso de que lo exija la parte I, punt o 2, párrafo segundo, de su anex o V, todos los 
punt os de muestreo de poblaciones salvajes seleccionados de conf ormidad con dicho punto, hayan sido 
sometidos al siguient e programa de vigilancia: 
a)  Las explotaciones o puntos de muestreo habrán sido sometidos a inspecciones sanitar ias y muestreo durante 
un período mínimo de dos años consecutivo s, conf orme a lo establecido en el cuadro 3.A de la sección II. 
b)  Durant e ese período de dos años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métod os de diagnóstico 
del punt o II.2 habrán dado resultados negat ivos por lo que respecta al VAIS con supresión en la HPR y 
cualquier sospecha de AIS habrá sido descar tada de conf ormidad con los métod os de diagnóstico del 
punt o II.3. 
c)  Si durante la aplicación del programa de vigilancia queda confir mada la AIS en una explotación incluida en 
dicho programa de vigilancia y, por tanto, le ha sido retirada la calif icación sanitar ia de la categoría II, debe 
efectuarse un programa de erradicación con arreglo al punto I.2.2. 
I.2.2.  Programas de erradicación 
I.2.2.1.  Requisito s generales 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la AIS podrá obte ner la calificación sanitar ia de la catego ría I con respecto a dicha enfer medad de la lista cuando 
toda s las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar timent o hayan sido sometidas al menos a un 
programa de erradicación que cumpla las letras a) a e) siguiente s: 
a)  Las medidas mínimas de control establecidas en el capítulo V, sección 3, de la Directiva 2006/88/CE habrán 
sido aplicadas eficazmente y, en particular , se ha establecido una zona de conf inamient o conf orme al 
artículo 32, letra b), de dicha Directiva que incluye una zona de protección y una zona de vigilancia en las 
inmediaciones de las explotaciones oficialmente declaradas infec tadas por el VAIS con supresión en la HPR o 
con AIS conf irmada. 
La zona de conf inamient o habrá sido definida caso por caso teniendo en cuenta los factores que influye n en 
los riesgos de propagación de la AIS a los peces de piscicultura y salva jes, como son: el número de peces 
muer tos y la tasa y distr ibución de la mor talidad de peces en la explotación infectada por el VAIS con 
supresión en la HPR o con AIS conf irmada; la distancia y densidad de las explotaciones vecinas; la 
proximidad a mataderos; las explotaciones en contact o; las especies presentes en las explotaciones; las 
prácticas de cría aplicadas en las explotaciones afectadas y vecinas; las condiciones hidrodinámicas y otros 
factores de impor tancia epidemiológica. 23.9.2015 L 247/19 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Para el establecimiento de las zonas de protección y de vigilancia se aplicarán los siguient es requisitos 
mínimos en lo que respecta a la delimitación geográfica de dichas zonas: 
i)  Se establecerá una zona de prote cción en las inmediaciones de una explotación oficialmente declarada 
infectada por la AIS que corresponderá:  
1) en las zonas costeras: a una zona incluida en un círculo de un radio mínimo de una ampli tud de 
marea, o al menos 5 km, con su centro en la explotación oficialment e declarada infectada por AIS, o a 
una zona equivalente deter minada conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos adecuados;  
2) en zonas interi ores: a toda la cuenca hidrográf ica de la explotación oficialmente declarada infec tada 
por la AIS; la autori dad compet ente podrá limitar la exte nsión de la zona a partes de la cuenca 
hidrográf ica, a condición de que no se vea comprometida la prevención de la propagación de la AIS. 
ii)  Se establecerá una zona de vigilancia fuera de la zona de prot ección que corresponderá:  
1) en las zonas costeras: a una zona circundant e de la zona de protección donde se super pongan varias 
amplit udes de marea; o a una zona circundante de la zona de prote cción e incluida en un círculo 
de 10 km de radio desde el centro de la zona de prot ección; o a una zona equivalent e determinadas 
conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos adecuados, o bien  
2) en zonas interiores : a una zona ampli ada fuera de la zona de protección establecida; 
b)  Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por la AIS que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de prote cción serán 
sometidas a una investig ación oficial que incluirá al menos los siguient es elementos: 
i)  la toma de muestras para pruebas de 10 peces mor ibundos como mínimo cuando se obser ven signos 
clínicos o post mortem compati bles con la AIS, o de 30 peces como mínimo cuando no se obser ven 
signos clínicos o post mortem; 
ii)  una inspección sanitar ia en las explotaciones en las que las pruebas del inciso i) hayan dado resultados 
nega tivos, las inspecciones sanitar ias continuarán una vez al mes hasta que se retire la zona de prote cción 
con arreglo al punto I.2.2.1, letra c). 
c)  Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por el VAIS con supresión en la HPR o con AIS 
confir mada serán vaciadas, limpiadas, desinfect adas y puestas en barbec ho durant e un período de al menos 
tres meses. Las zonas de prot ección y de vigilancia podrán levantarse cuando todas las explotaciones situadas 
dentro de la zona de protección hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y, posterior mente, puestas en 
barbec ho de forma sincronizada durant e al menos seis semanas. 
Cuando se pongan en barbecho las explotaciones oficialment e declaradas infectadas, las zonas de protección 
se conver tirán en zonas de vigilancia. 
La autori dad compet ente podrá decidir si exige el vaciado, la limpieza, la desinfección y la puesta en 
barbec ho de otras explotaciones dentro de las zonas de protección y vigilancia establecidas. La autori dad 
compet ente determinará la duración del barbec ho de dichas explotaciones tras una evaluación de riesgos caso 
por caso. 
d)  Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por el VAIS con supresión en la HPR o con AIS 
confir mada y todas las demás explotaciones puestas en barbec ho dentro de las zonas de protección y 
vigilancia establecidas serán repobladas con peces procedentes de Estados miembros, zonas o compar ti­
mentos con una calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a la AIS. 
La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialment e declaradas infectadas hayan sido 
vaciadas, limpiadas, desinfe ctadas y puestas en barbecho con arreglo al punt o I.2.2.1, letra c). 
e)  Todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE dentro del Estado miembro, zona o compar timento cubier tos por el programa de erradicación 
y, cuando se exija la vigilancia de poblaciones salva jes, los punt os de muestreo seleccionados con arreglo al 
punt o I.1, se someterán posteri ormente al sistema de vigilancia establecido en el punto I.2.1. 23.9.2015 L 247/20 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.2.2.2.  Requisito s relativ os a la recuperación de la calif icación de libre de enfe rmedad por los compar timent os 
continentales que conste n de sola explotación que fue previamente declarada con la calificación sanitar ia de la 
catego ría I 
Un compar timent o continental que conste de una sola explotación con calificación sanitar ia de la cate goría I 
respecto a la AIS, cuya calif icación sanitar ia sea independiente de las aguas naturales circundante s con arreglo a 
la parte II, punto 3, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE y cuya calif icación sanitar ia de la catego ría I haya 
sido retirada con arreglo al artículo 53, apar tado 3, de dicha Directiva podrá recuperarla inmediatament e 
después de que la autori dad compet ente haya confir mado que cumple las siguient es condiciones: 
a)  ha sido vaciado, limpiado, desinfe ctado y puesto en barbecho; la duración del barbec ho será de al menos 
seis semanas; 
b)  ha sido repoblado con peces procedentes de Estados miembros, zonas o compar timentos con una 
calificación sanitar ia de la categoría I con respecto a la AIS. 
I.3.  Medidas mínimas de control para mante ner la calif icación de la catego ría I con respecto a la AIS 
Cuando sea precisa una vigilancia específica para manten er la calif icación sanitar ia de la categoría I de 
conf ormidad con el artículo 52 de la Directiva 2006/88/CE, todas las explotaciones que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro del Estado miembro, la zona o el compar ­
timent o en cuestión serán sometidas a inspecciones sanitar ias y se tomar án muestras de conf ormidad con el 
cuadro 3.B (1) de la sección II de la present e parte, teniendo en cuenta el nivel de riesgo que present e la 
explotación de contraer la AIS. 
Al deter minar la frecuencia de las inspecciones sanitar ias para la calif icación sanitar ia de la cate goría con 
respecto a la AIS en los compar timent os situados en las zonas continentales y cuya calif icación sanitar ia con 
respecto a la AIS depende de la calif icación sanitar ia de las aguas naturales circundantes donde vive el salmón 
del Atlántico (Salmo salar), el riesgo de contraer la AIS se considerará alto. 
La calif icación de libre de AIS solo podrá manten erse mientras todas las muestras analizadas utilizando los 
métodos de diagnóstico del punto II.2 hayan dado resultados negativos por lo que respecta al VAIS con 
supresión en la HPR y cualquier sospech a de AIS haya sido descar tada de conf ormidad con los métod os de 
diagnóstico del punto II.3. 
I.4.  Requisito s específicos para obte ner la calif icación sanitar ia de la categoría III con respecto al VAIS con supresión 
en la HPR en Estados miembros, zonas o compar timent os que tenían anteriormente la calif icación sanitar ia de 
la cate goría V 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la AIS podrá obtener la calif icación de la catego ría III a condición de que: 
a)  se cumplan los requisitos establecidos en el punt o I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea 
técnicamente posible el barbec ho, las explotaciones se somet erán a una medida alternativa que proporcione 
una garantía similar de exterm inio del VAIS desde el entorno de la explotación; 
b)  todas las explotaciones oficialmente declaradas infec tadas y todas las demás explotaciones en barbec ho o 
sometidas a medidas altern ativas con arreglo a la letra a) dentro de las zonas de prot ección y vigilancia 
establecidas hayan sido repobladas con peces procedent es de Estados miembros, zonas o compar timent os 
con una calif icación sanitar ia de la catego ría I, II o III con respecto a la AIS; 
c)  dicha repoblación solo se haya efectuado después de que toda s las explotaciones oficialment e declaradas 
infectadas hayan sido vaciadas, limpiada s, desinfectadas y puestas en barbecho o sometidas a medidas 
alternativas con arreglo a la letra a); 
d)  no se haya confir mado el VAIS con supresión en la HPR durante el período de dos años que sigue a la 
finalización de las medidas mencionadas en las letras a), b) y c) y las sospechas durante este período hayan 
sido descar tadas con arreglo a los procedimiento s establecidos en el punto II.3. 23.9.2015 L 247/21 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    
(1)Esto no se aplicará a las explotaciones que críen únicamente trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), trucha común (Salmo trutta) o ambas, 
y cuyo suministro de agua se base exclusivament e en fuentes de agua dulce donde no vive el salmón del Atlántico (Salmo salar). II.  Méto dos de diagnóstico e investigaciones oficiales 
II.1.  Muestras 
El mat erial tisular que deberá examinarse será: 
a)  estudio histo lógico: riñón anterior, hígado, corazón, páncreas, intes tino, bazo y branquias; 
b)  pruebas inmunohist oquímicas: riñón medio y corazón, incluidos válvulas y bulbus arteriosus; 
c)  pruebas de RT-qPCR: riñón medio y corazón; 
d)  cultivo del virus: riñón medio, corazón, hígado y bazo. 
Podrán mezclarse trozos de órganos de un máximo de cinco peces. 
II.2.  Métod os de diagnóstico para obtener o mante ner la calif icación de libre de AIS 
El método de diagnóstico que debe utilizarse para obtener o mantener la calif icación de libre de AIS con arreglo 
a los puntos I.2 y I.3 será la RT-qPCR, seguida de la secuenciación de muestras positivas de conf ormidad con los 
métodos y procedimiento s detallados establecidos en la parte 3 del anex o II. 
En caso de resultado positiv o de la RT-qPCR, se someterán a ensa yo otras muestras antes de aplicar las medidas 
de control iniciales contem pladas en el artículo 28 de la Directiva 2006/88/CE. 
Tales muestras se somete rán a las siguiente s pruebas de conf ormidad con los métodos y procedimiento s 
detallados establecidos en la parte 3 del anex o II: 
a)  cribado de las muestras mediante RT-qPCR, incluida la secuenciación del gen HE para verificar la supresión 
en la HPR; 
y 
b)  examen en preparaciones tisulares mediante anticuer pos específicos contra el VAIS (a saber , IHC en cortes 
fijados o IFAT en imp rontas tisulares); o 
c)  aislamient o e identif icación del VAIS en cultivo celular de al menos una muestra de cualquier pez muestreado 
de la explotación. 
II.3.  Investigación oficial y métodos de diagnóstico para descar tar o conf irmar la AIS 
Cuando se deba confir mar o descar tar una sospec ha de AIS de conf ormidad con el artículo 28 de la Directiva 
2006/88/CE, se aplicará el siguiente procedimiento de inspección, muestreo y ensa yo: 
a)  La investigación oficial, que incluirá al menos una inspección sanitar ia y un muestreo de 10 peces 
mor ibundos, cuando se obser ven signos clínicos o post mortem compati bles con la AIS. Si no se obser van 
signos clínicos o post mortem compatibles con la AIS, la inspección sanitar ia irá seguida de un muestreo 
selectiv o de como mínimo treinta peces mor ibundos o recién muer tos con constitución normal, de 
conf ormidad con el punt o I.1. Las muestras se someterán a ensa yo de conf ormidad con los métodos de 
diagnóstico que se establecen en la letra b). 
b)  En caso de resultado positiv o de la RT-qPCR para la detección del VAIS con supresión en la HPR, se 
somet erán a ensa yo otras muestras antes de aplicar las medidas de control iniciales cont empladas en el 
artículo 28 de la Directiva 2006/88/CE. Un caso sospechoso de infección por VAIS se confir mará de 
conf ormidad con los siguient es criterios, utilizando los métod os y procedimiento s detallados establecidos en 
la parte 3 del anex o II: 
i)  detección del VAIS mediante RT-qPCR, incluida la secuenciación del gen HE para verificar la supresión en 
la HPR, y detección del VAIS en preparaciones tisulares mediante anticuer pos específico s contra dicho 
virus (a saber , IHC en cortes fijados o IFAT en improntas tisulares), 
o 23.9.2015 L 247/22 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    ii)  detección del VAIS mediante RT-qPCR, incluida la secuenciación del gen HE para verificar la supresión en 
la HPR, y 
aislamiento e identif icación del VAIS en cultivo celular de al menos una muestra de cualquier pez 
procedent e de la explotación. 
c)  Cuando se obser ven signos clínicos, alteraciones patoló gicas macroscópicas o constataciones histopat ológicas 
compati bles con la AIS, las conclusiones serán corroboradas por la detección del virus mediante dos métodos 
de diagnóstico con principios de detec ción independiente s, como RT-qPCR e IHC, de conf ormidad con la 
parte 3 del anex o II. 
La sospecha de AIS podrá descar tarse si se constata que, a lo largo de doce meses a partir de la fecha de la 
sospec ha, los ensa yos y las inspecciones no apor tan ninguna otra prueba de la presencia de AIS. 
Cuadro 3.A 
Sistema de vigilancia de zonas y compar timento s para el período de control de dos años anter ior a la 
obtención de la calif icación de libre de AIS con arreglo al punto I.2.1 
Año de vigilancia Número de inspecciones sani ­
tarias anuales (dos años) Número de exámenes de labo ­
ratori o anuales (dos años) Número de peces de los que 
deben tomarse muestras 
por año 
Año 1 6 2(1) 2 * 75(2) 
Año 2 6 2(1) 2 * 75(2) 
(1)  Las muestras se recogerán , almacenarán y examinarán durante dos períodos anuales de ensa yos de un mes (primavera y otoño), o 
cuando proceda atendiendo a consideraciones prácticas. 
(2)  Número máximo de peces por muestra conjunta: 5.  
Cuadr o 3.B. 
Sistemas de vigilancia de zonas o compar timento s para mantener la calif icación de libre de AIS con arreglo al 
punto I.3(2) 
Nivel de riesgo Número de inspecciones 
sanitar ias anuales Número de exámenes de 
laborato rio anuales Número de peces de los que 
deben tomarse muestras 
por año 
Alto 2 2(1) 2 * 30 
Medio 1 1(1) 30 
Bajo 1 cada dos años 1 cada dos años 30 cada dos años 
(1)  Las muestras se recogerán y examinarán durante dos períodos anuales de ensa yos de un mes (primavera y otoño), o cuando proceda 
atendiendo a consideraciones prácticas. 
(2)  Esto no se aplicará a las explotaciones que críen únicamente trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), trucha común (Salmo trutta) o 
ambas, y cuyo suministro de agua se base exclusivamente en fuent es de agua dulce donde no vive el salmón del Atlántico (Salmo 
salar).  
PARTE 4 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL DE LA INFECCIÓN POR MARTEILIA REFRINGENS 
I.  Requisit os aplicables a los prog ramas de vigilancia y erradicación para obtener y mantener la calif icación sanitar ia de 
libre de infección por Mar teilia refringens 
I.1.  Requisito s generales 
Las inspecciones sanitar ias y, en su caso, la toma de muestras para exámenes de laborat orio se efectuarán durante 
el período del año en el que se sepa que la prevalencia del parásito en el Estado miembro, zona o compar timent o 
es máxima. Cuando esta información no esté disponible, el muestreo se efectuará inmediatament e después de que 
la temperatura del agua haya superado los 17 °C. 23.9.2015 L 247/23 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuando los moluscos deban muestrearse con arreglo a los requisitos establecidos en la parte 4, se aplicarán los 
criterios siguient es: 
a)  Si Ostrea spp. y Mytilus spp. están present es en las unidades de producción o en la zona de producción, ambos 
géneros tendrán la misma presencia en el tamaño de la muestra. Si solo uno de ellos está presente, ese género 
será objeto de muestreo. Si no están presentes los géneros Ostrea ni Mytilus, la muestra será representativa de 
toda s las demás especies sensibles presentes. 
b)  Si en las unidades de producción hay moluscos débiles, mor ibundos o recién muer tos pero no descompuest os, 
se seleccionarán estos principalment e. Si no los hay, se seleccionarán los moluscos sanos de más edad. 
c)  Al tomar muestras en explotaciones que utilicen más de una fuent e de agua para la producción de moluscos, 
se incluirán en el muestreo moluscos que represente n todas las fuent es de agua, de modo tal que todas las 
partes de la explotación estén proporcionalmente representadas en la muestra. 
d)  Al tomar muestras en zonas de cría de moluscos, se incluirán en la muestra moluscos de un número sufic iente 
de puntos de muestreo, de modo tal que todas las partes de la zona de cría estén proporcionalmente 
representadas en la muestra. Los principales factores que deben considerarse para seleccionar estos punt os de 
muestreo son los anteriores punt os de muestreo donde se detectó Mar teilia refrin gens, la densidad de cría, los 
flujos de agua, la presencia de especies sensibles, la presencia de especies portadoras, la batimetría y las 
prácticas de gestión. Los bancos naturales se incluirán en el muestreo. 
I.2.  Requisito s específicos para obtener la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a Mar teilia refringens 
I.2.1.  Programas de vigilancia 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calif icación sanitar ia de la categoría III con respecto a la 
infección por Mar teilia refrin gens podrá obte ner la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a dicha 
enfermedad de la lista cuando todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar ­
timent o hayan sido sometidas al menos al siguient e programa de vigilancia, que incluye inspecciones sanitar ias y 
la toma de muestras para pruebas. 
Programa de vigilancia de dos años: 
a)  Las explotaciones o zonas de cría de moluscos habrán sido sometidas a inspecciones sanitar ias y muestreo 
durant e un período mínimo de dos años consecutivo s, conf orme a lo establecido en el cuadro 4.A de la 
sección II. 
b)  Durant e ese período de dos años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métod os de diagnóstico del 
punt o II.2 habrán dado resultados negativ os por lo que respecta a Mar teilia refrin gens y cualquier sospecha de 
Mar teilia refringens habrá sido descar tada de conf ormidad con los métodos de diagnóstico del punto II.3. 
c)  Cuando vayan a incluirse en la muestra Ostrea edulis, Mytilus edulis o Mytilus galloprovincialis procedent es de un 
Estado miembro, zona o compar timento de calif icación sanitar ia de la cate goría I, habrán sido introducidos en 
la explotación o zona de cría de moluscos al menos en la primavera inmediatament e anterior al período en el 
que se lleve a cabo el programa de vigilancia. 
I.2.2.  Programas de erradicación 
La erradicación de Mar teilia refringens se considera imposible en la mayoría de los casos; no obstante, cuando el 
Estado miembro la juzgue viable, se aplicará el siguiente modelo de programa de erradicación. 
Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calif icación sanitar ia de la categoría V con respecto a la 
infección por Mar teilia refrin gens podrá obte ner la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a dicha 
enfermedad de la lista cuando todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar ­
timent o hayan sido sometidas al menos al siguient e programa de erradicación: 
a)  Las medidas del capítulo V, sección 3, de la Directiva 2006/88/CE habrán sido aplicadas eficazmente y, en 
particular , se habrá establecido una zona de conf inamient o conf orme al artículo 32, letra b), de la Directiva 
2006/88/CE, que incluya una zona de prote cción y una zona de vigilancia, en las inmediaciones de las 
explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas por Mar teilia refringens. 23.9.2015 L 247/24 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    La zona de conf inamient o se definirá caso por caso teniendo en cuenta los factores que influyen en los riesgos 
de propagación de Mar teilia refrin gens, como son: el número de moluscos muer tos, su edad y la tasa y 
distr ibución de la mor talidad de moluscos en la explotación o zona de cría de moluscos infectada por Mar teilia 
refringens, incluidos los moluscos salva jes; la distancia y densidad de las explotaciones o zonas de cría vecinas, 
incluidos los moluscos salva jes; la proximidad a centros de transf ormación, explotaciones en contact o o zonas 
de cría de moluscos; las especies, en particular las sensibles y portadoras, present es en las explotaciones o 
zonas de cría de moluscos; las prácticas de cría aplicadas en las explotaciones y zonas de cría de moluscos 
afectadas y vecinas; las condiciones hidrodinámicas y otros factores de importancia epidemiológica. 
Para el establecimiento de las zonas de prote cción y de vigilancia se aplicarán los siguient es requisitos 
mínimos: 
i)  Se establecerá una zona de prot ección en las inmediaciones de una explotación o zona de cría de moluscos 
oficialmente declarada infectada por Mar teilia refringens, que corresponderá a una zona determinada 
conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos adecuados. 
ii)  Se establecerá una zona de vigilancia fuera de la zona de protección, que corresponderá a una zona 
circundante de la zona de prot ección deter minada conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos 
adecuados. 
b)  Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos no oficialmente declaradas infectadas por Mar teilia 
refringens que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro 
de la zona de protección serán sometidas a una inve stigación oficial que incluirá al menos la recogida de 
muestras para pruebas de 150 moluscos después del comienzo del período de transmisión de Mar teilia 
refringens. Cuando se desconozca el período de transmisión, el muestreo comenzará después de que la 
temperatura del agua supere los 17 °C. 
c)  toda s las explotaciones y zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas por Mar teilia refringens 
serán vaciadas, puestas en barbec ho y, de ser posible, limpiadas y desinf ectadas. 
La duración del barbec ho será de al menos: 
i)  dos meses en el caso de explotaciones y zonas de cría de moluscos con comunicaciones limitadas con las 
aguas circundantes , como los criaderos y viveros, 
ii)  dos meses en el caso de explotaciones y zonas de cría de moluscos con comunicaciones ilimitadas con las 
aguas circundantes, siempr e que los moluscos de especies sensibles que estén infectados o tengan lazos 
epidemiológicos con la explotación o zona de cría de moluscos infec tada hayan sido recolectados o 
sacados antes del período del año en el que se sepa que la prevalencia de Mar teilia refringens es máxima o, 
cuando dicho período no se conozca, antes de que la temperatura del agua supere los 17 °C, 
iii)  catorce meses en el caso de explotaciones y zonas de cría de moluscos con comunicaciones ilimitadas con 
las aguas circundantes, siempre que los moluscos de especies sensibles que estén infectados o tengan lazos 
epidemiológicos con la explotación o zona de cría de moluscos infectada no hayan sido recolectados ni 
sacados antes del período del año en el que se sepa que la prevalencia de Mar teilia refringens es máxima o, 
si no se conoce esta información, cuando los moluscos de especies sensibles no hayan sido recolectados ni 
sacados antes de que la temperatura del agua supere los 17 °C; 
Cuando todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos oficialment e declaradas infec tadas hayan sido 
vaciadas, se dejarán en barbec ho de forma sincronizada durante al menos cuatro semanas. 
La autori dad compet ente podrá decidir si exige el vaciado, la limpieza, la desinf ección y la puesta en barbec ho 
de otras explotaciones o zonas de cría de moluscos dentro de las zonas de prote cción y vigilancia establecidas. 
La autori dad compet ente deter minará la duración del barbec ho tras una evaluación de riesgos caso por caso. 
d)  Todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas y todas las demás 
explotaciones o zonas de cría de moluscos puestas en barbecho dentro de las zonas de prote cción y vigilancia 
establecidas serán repobladas con moluscos procedentes de Estados miembros, zonas o compar timentos con 
una calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a la infección por Mar teilia refrin gens. 23.9.2015 L 247/25 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialment e declaradas infec tadas hayan sido 
vaciadas, limpiadas, desinfe ctadas y puestas en barbecho con arreglo al punt o I.2.2, letra c). 
e)  Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del 
anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro del Estado miembro, zona o compar timent o cubier tos por el 
programa de erradicación se somet erán posterior mente al sistema de vigilancia establecido en el punt o I.2.1. 
I.3.  Requisito s específico s para mantener la calif icación sanitar ia de libre de la enfermedad (categoría I) con respecto a 
la infección por Mar teilia refrin gens 
Cuando sea precisa una vigilancia específi ca para mantener la calif icación sanitar ia de la categoría I de 
conf ormidad con el artículo 52 de la Directiva 2006/88/CE, toda s las explotaciones o zonas de cría de moluscos 
que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro del Estado 
miembro, la zona o el compar timent o en cuestión serán sometidas a inspecciones sanitar ias y se tomar án 
muestras de conf ormidad con el cuadro 4.B de la sección II, teniendo en cuenta el nivel de riesgo que presente la 
explotación o zona de cría de moluscos de infectarse por Mar teilia refringens. 
La calificación de libre de enfe rmedad solo se manten drá mientras todas las muestras analizadas utilizando los 
métodos de diagnóstico del punt o II.2 hayan dado resultados negativ os por lo que respecta a Mar teilia refringens y 
cualquier sospec ha de Mar teilia refringens haya sido descar tada de conf ormidad con los métod os de diagnóstico del 
punt o II.3. 
I.4.  Requisito s para el levantamient o de las medidas de conf inamient o establecidas en el artículo 39 de la Directiva 
2006/88/CE (cambio de la calificación sanitar ia de la categoría V a la catego ría III) con respecto a la infección por 
Mar teilia refringens 
Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calif icación sanitar ia de la categoría V con respecto a 
Mar teilia refringens podrá obtener la calif icación sanitar ia de la categoría III con respecto a dicha enfermedad de la 
lista a condición de que: 
a)  se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2, letras a), b) y c); en caso de que no sea técn icamente 
posible el barbec ho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garan tía 
similar de exterminio de Mar teilia refringens desde el entorno de la explotación; 
b)  toda s las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas y todas las demás 
explotaciones o zonas de cría de moluscos puestas en barbec ho o sometidas a medidas alternati vas con arreglo 
a la letra a) dentro de las zonas de prote cción y vigilancia establecidas hayan sido repobladas con moluscos 
procedent es de Estados miembros, zonas o compar timent os con una calif icación sanitar ia de la catego ría I, II 
o III con respecto a Mar teilia refrin gens; 
c)  la repoblación solo se haya efectuado cuando todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente 
declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfe ctadas y puestas en barbecho o sometidas a 
medidas alternativas con arreglo a la letra a); 
d)  no se haya confir mado la infección por Mar teilia refringens durante el período de dos años que sigue a la 
finalización de las medidas mencionadas en las letras a), b) y c) y las sospech as durant e este período hayan sido 
descar tadas con arreglo a los procedimiento s establecidos en el punto II.3. 
II.  Méto dos de diagnóstico e investigaciones oficiales 
II.1.  Muestras 
Para la realización de las pruebas de diagnóstico establecidas en los punt os II.2 y II.3 se presentará al laborat orio 
el animal entero. 
II.2.  Métod os de diagnóstico para obtener o manten er la calif icación de libre de infección por Mar teilia refrin gens 
Los métod os de diagnóstico que deben utilizarse para obte ner o mantener la calif icación de libre de infección por 
Mar teilia refrin gens con arreglo a los métodos y procedimiento s detallados de diagnóstico establecidos en la parte 4 
del anex o II serán la histopat ología, las improntas tisulares o la PCR. 23.9.2015 L 247/26 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    II.3.  Investigación oficial y métodos de diagnóstico para conf irmar o descar tar la sospecha de infección por Mar teilia 
refrin gens 
Cuando sea preciso conf irmar o descar tar una sospech a de infección por Mar teilia refrin gens de conf ormidad con el 
artículo 28 de la Directiva 2006/88/CE, se aplicará el siguient e procedimiento de inspección, muestreo y ensa yo: 
a)  La investigación oficial incluirá al menos un muestreo de 30 moluscos de las especies sensibles si la sospec ha 
se basa en un informe de mor talidad o, en caso contrar io, de 150 moluscos de las especies sensibles después 
del comienzo del período de transmisión de Mar teilia refringens. Cuando se desconozca el período de 
transmisión, el muestreo comenzará después de que la temperatura del agua supere los 17 °C. 
b)  Las muestras se examinarán utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen en el inciso i), de acuerdo 
con los métod os y procedimiento s detallados de diagnóstico que figur an en la parte 4, sección I, del anex o II: 
i)  La presencia de Mar teilia refringens se considerará conf irmada cuando un resultado positiv o obtenido 
mediante histo patología, improntas tisulares o hibr idación in situ se combine con un resultado positiv o en 
la PCR compl etada por una secuenciación. 
ii)  La sospech a de infección por Mar teilia refrin gens podrá descar tarse si los ensa yos conte mplados en el inciso 
i) no apor tan ninguna otra prueba de la presencia de Mar teilia refrin gens. 
Cuadro 4.A 
Sistema de vigilancia de Estados miembros, zonas o compar timentos en el período de control anter ior a la 
obtención de la calif icación de libre de Mar teilia refringens con arreglo al punto I.2.1  
Número de inspecciones 
sanitar ias anuales Número de exámenes de 
laborato rio anuales Número de moluscos de 
la muestra 
Explotaciones/zonas de cría de 
moluscos 1 1 150  
Cuadr o 4.B 
Sistemas de vigilancia de Estados miembros, zonas o compar timento s para mantener la calif icación de libre de 
Mar teilia refringens con arreglo al punto I.3 
Nivel de riesgo Número de inspecciones 
sanitar ias Número de exámenes de 
laboratorio Número de moluscos de 
la muestra 
Alto 1 cada año 1 cada dos años 150 
Medio 1 cada dos años 1 cada dos años 150 
Bajo 1 cada dos años 1 cada cuatro años 150  
PARTE 5 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL DE LA INFECCIÓN POR BONAMIA OSTREAE 
I.  Requisit os aplicables a los prog ramas de vigilancia y erradicación para obtener y mantener la calif icación sanita rias de 
libre de infección por Bonamia ostr eae 
I.1.  Requisito s generales 
Las inspecciones sanitar ias y, en su caso, la toma de muestras en las unidades de producción se efectuarán durant e 
el período del año en el que se sabe que la prevalencia de Bonamia ostreae en el Estado miembro, zona o compar ­
timent o es máxima. Cuando esta información no esté disponible, el muestreo se efectuará en inviern o o al 
principio de la primavera. 23.9.2015 L 247/27 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuando los moluscos vayan a muestrearse con arreglo a los requisitos establecidos en la parte 5, se aplicarán los 
criterios siguient es: 
a)  Si Ostrea edulis está present e, solo se seleccionarán para muestreo las ostras de esta especie. Si Ostrea edulis no 
está present e, la muestra será representativa de todas las demás especies sensibles present es. 
b)Si hay moluscos débiles, mor ibundos o recién muer tos pero no descom puestos, se seleccionarán estos princi­
palmente. Si no los hay, se seleccionarán los moluscos sanos de más edad. 
c)  Al tomar muestras en explotaciones que utilicen más de una fuent e de agua para la producción de moluscos, 
se incluirán en el muestreo moluscos que represente n todas las fuent es de agua, de modo tal que todas las 
partes de la explotación estén proporcionalmente representadas en la muestra. 
d)  Al tomar muestras en zonas de cría de moluscos, se incluirán en la muestra moluscos de un número sufic iente 
de puntos de muestreo. Los principales factores que deben considerarse para seleccionar dichos punt os de 
muestreo son los anterior es puntos de muestreo donde se detect ó Bonamia ostreae, la densidad de cría, los 
flujos de agua, la presencia de especies sensibles, la presencia de especies portadoras, la batimetría y las 
prácticas de gestión. Los bancos naturales que se encuentren dentro de las zonas de cría o contiguos a estas se 
incluirán en el muestreo. 
I.2.  Requisito s específicos para obtener la calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a Bonamia ostreae 
I.2.1.  Programas de vigilancia 
Un Estado miembro, zona o compar timento que teng a la calif icación sanitar ia de la categoría III con respecto a la 
infección por Bonamia ostreae podrá obtener la calificación sanitar ia de la catego ría I con respecto a dicha 
enfermedad de la lista cuando toda s las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del 
anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar timent o hayan sido sometidas 
al menos al siguient e programa de vigilancia, que incluye inspecciones sanitar ias y la toma de muestras para 
pruebas. 
Programa de vigilancia de dos años: 
a)  Las explotaciones y zonas de cría de moluscos que crían especies sensibles enumeradas en la parte II del 
anex o IV de la Directiva 2006/88/CE habrán sido sometidas a inspecciones sanitar ias y muestreo durant e un 
período mínimo de dos años consecutivo s, conf orme a lo establecido en el cuadro 5.A de la present e parte. 
b)  Durant e ese período de dos años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métod os de diagnóstico del 
punt o II.2 habrán dado resultados negativ os por lo que respecta a Bonamia ostreae y cualquier sospecha de 
Bonamia ostreae habrá sido descar tada de conf ormidad con los métodos de diagnóstico del punto II.3. 
c)  Cuando vaya a incluirse en la muestra Ostrea edulis procedente de un Estado miembro, zona o compar timento 
de calif icación sanitar ia de la catego ría I, habrá sido introducida en la explotación o zona de cría de moluscos 
al menos en el otoño inmediatamente anter ior al período en el que se lleve a cabo el programa de vigilancia. 
I.2.2.  Programas de erradicación 
La erradicación de Bonamia ostreae se considera imposible en la mayoría de los casos; no obstante, cuando el 
Estado miembro la juzgue viable, se aplicará el siguiente modelo de programa de erradicación. 
Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calif icación sanitar ia de la categoría V con respecto a 
Bonamia ostreae podrá recuperar la calificación sanitar ia de la catego ría I con respecto a dicha enfer medad de la 
lista cuando todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos que críen especies sensibles enumeradas en la 
parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar timento hayan 
sido sometidas al menos al siguient e programa de erradicación: 
a)  Las medidas mínimas de control establecidas en el capítulo V, sección 3, de la Directiva 2006/88/CE habrán 
sido aplicadas eficazment e y, en particular , se habrá establecido una zona de confinami ento conf orme al 
artículo 32, letra b), de dicha Directiva que incluya una zona de protección y una zona de vigilancia en las 
inmediaciones de las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas por Bonamia 
ostreae. 23.9.2015 L 247/28 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    La zona de conf inamient o se definirá caso por caso teniendo en cuenta los factores que influyen en los riesgos 
de propagación de dicha enfermedad de la lista, como son: el número de moluscos muer tos, su edad y la tasa y 
distr ibución de la mor talidad de moluscos en la explotación o zona de cría de moluscos infectada por Bonamia 
ostreae, incluidos los moluscos salva jes; la distancia y densidad de las explotaciones o zonas de cría vecinas, 
incluidos los moluscos salva jes; la proximidad a centros de transf ormación, explotaciones en contact o o zonas 
de cría de moluscos; las especies present es en las explotaciones o zonas de cría de moluscos, en particular las 
especies sensibles y las especies portadoras; las prácticas de cría aplicadas en las explotaciones y zonas de cría 
de moluscos afectadas y vecinas; las condiciones hidrodinámicas y otros factores de importancia epidemio ­
lógica. 
Para el establecimiento de las zonas de prote cción y de vigilancia se aplicarán los siguient es requisitos 
mínimos: 
i)  Se establecerá una zona de prot ección en las inmediaciones de una explotación o zona de cría de moluscos 
oficialmente declarada infectada por Bonamia ostreae, que corresponderá a una zona deter minada conf orme 
a datos hidrodinámicos o epidemiológicos adecuados; 
ii)  Se establecerá una zona de vigilancia fuera de la zona de protección, que corresponderá a una zona 
circundante de la zona de prot ección deter minada conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos 
adecuados. 
b)  Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos no oficialment e declaradas infectadas por Bonamia ostreae 
que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la 
zona de protección serán sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos la recogida de muestras 
para pruebas de 150 moluscos después del comienzo del período de transmisión de Bonamia ostreae. Cuando se 
desconozca el período de transmisión, el muestreo comenzará en invierno o al principio de la primavera. 
c)  Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas por Bonamia ostreae 
serán vaciadas, puestas en barbec ho y, de ser posible, limpiadas y desinfe ctadas. La duración del barbecho será 
de al menos seis meses. 
Cuando todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas hayan sido 
vaciadas, se dejarán en barbec ho de forma sincronizada durante al menos cuatro semanas. 
La autori dad compet ente podrá decidir si exige el vaciado, la limpieza, la desinf ección y la puesta en barbec ho 
de otras explotaciones o zonas de cría de moluscos dentro de las zonas de prote cción y vigilancia establecidas. 
La autori dad compet ente deter minará la duración del barbec ho tras una evaluación de riesgos caso por caso. 
d)  Todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas y todas las demás 
explotaciones o zonas de cría de moluscos puestas en barbecho dentro de las zonas de prote cción y vigilancia 
establecidas serán repobladas con moluscos procedentes de Estados miembros, zonas o compar timentos con 
una calif icación sanitar ia de la cate goría I con respecto a la infección por Bonamia ostreae. La repoblación solo 
se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiada s, 
desinf ectadas y puestas en barbec ho con arreglo al punt o I.2.2, letra c). 
e)  Todas las explotaciones y zonas de cría de moluscos que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del 
anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro del Estado miembro, zona o compar timent o cubier tos por el 
programa de erradicación se somet erán posterior mente al programa de vigilancia establecido en el punto I.2. 
I.3.  Requisito s específicos para manten er la calif icación sanitar ia de libre de infección por Bonamia ostreae (categoría I) 
Cuando sea precisa una vigilancia específi ca para mantener la calif icación sanitar ia de la categoría I de 
conf ormidad con el artículo 52 de la Directiva 2006/88/CE, toda s las explotaciones o zonas de cría de moluscos 
que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro del Estado miembro, 
zona o compar timent o en cuestión serán sometidas a inspecciones sanitar ias y se tomarán muestras de 
conf ormidad con el cuadro 5.B de la sección II de la presente parte, teniendo en cuenta el nivel de riesgo que 
present e la explotación o zona de cría de moluscos de contraer una infección por Bonamia ostreae. 
La calificación de libre de infección por Bonamia ostreae solo podrá manten erse mientras todas las muestras 
analizadas utilizando los métodos de diagnóstico del punt o II.2 hayan dado resultados negativ os por lo que 
respecta a Bonamia ostreae y cualquier sospecha de Bonamia ostreae haya sido descar tada de conf ormidad con los 
métodos de diagnóstico del punto II.3. 23.9.2015 L 247/29 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.4.  Requisito s para el levantamient o de las medidas de conf inamient o establecidas en el artículo 39 de la Directiva 
2006/88/CE (cambio de la calificación sanitar ia de la categoría V a la catego ría III) con respecto a la infección por 
Bonamia ostreae 
Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calif icación sanitar ia de la categoría V con respecto a 
Bonamia ostreae podrá obtener la calif icación sanitar ia de la catego ría III con respecto a dicha enfermedad a 
condición de que: 
a)  se cumplan los requisitos establecidos en el punto I.2.2, letras a), b) y c); en caso de que no sea técn icamente 
posible el barbec ho, las explotaciones serán sometidas a una medida alternativa que proporcione una garan tía 
similar de exterminio de Bonamia ostreae desde el entorno de la explotación; 
b)  toda s las explotaciones o zonas de cría de moluscos oficialmente declaradas infectadas y todas las demás 
explotaciones o zonas de cría de moluscos puestas en barbec ho o sometidas a medidas alternati vas con arreglo 
a la letra a) dentro de las zonas de prote cción y vigilancia establecidas hayan sido repobladas con moluscos 
procedent es de Estados miembros, zonas o compar timent os con una calif icación sanitar ia de la catego ría I, II 
o III con respecto a Bonamia ostreae; 
c)  la repoblación solo se haya efectuado después de que todas las explotaciones o zonas de cría de moluscos 
oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfect adas y puestas en barbec ho o 
sometidas a medidas altern ativas con arreglo a la letra a); 
d)  no se haya conf irmado la infección por Bonamia ostreae durant e el período de dos años que sigue a la 
finalización de las medidas mencionadas en las letras a), b) y c) y las sospech as durant e este período hayan sido 
descar tadas con arreglo a los procedimiento s establecidos en el punto II.3. 
II.  Méto dos de diagnóstico y criter ios de diagnós tico 
II.1.  Muestras 
Para la realización de las pruebas de diagnóstico establecidas en los punt os II.2 y II.3 se presentará al laborat orio 
el animal entero. 
II.2.  Métod os de diagnóstico para obtener o manten er la calif icación de libre de infección por Bonamia ostreae 
Los métod os de diagnóstico que deben utilizarse para obte ner o mantener la calif icación de libre de infección por 
Bonamia ostreae serán la histo patolo gía, las improntas tisulares o la PCR. Al aplicar estos métodos de diagnóstico, 
se seguirán los correspondiente s métodos y procedimiento s detallados establecidos en la parte 5 del anex o II. 
II.3.  Métod os de diagnóstico para conf irmar o descar tar la sospec ha de infección por Bonamia ostreae 
Cuando sea preciso confir mar o descar tar una sospecha de infección por Bonamia ostreae de conf ormidad con el 
artículo 28 de la Directiva 2006/88/CE, se aplicará el siguient e procedimiento de inspección, muestreo y ensa yo: 
La investig ación oficial incluirá al menos un muestreo de 30 moluscos de las especies sensibles si la sospec ha se 
basa en un informe de mor talidad o, en caso contrar io, de 150 moluscos de las especies sensibles después del 
comienzo del período de transmisión de Bonamia ostreae. Cuando se desconozca el período de transmisión, el 
muestreo comenzará en inviern o o al principio de la primavera. Las muestras se examinarán utilizando los 
métodos de diagnóstico que se establecen en el inciso i), de acuerdo con los métod os y procedimiento s detallados 
de diagnóstico que figuran en la parte 5, sección I, del anex o II. 
i)  La presencia de Bonamia ostreae se considerará confir mada cuando un resultado positiv o obteni do mediante 
histo patolo gía, improntas tisulares o hibr idación in situ se combine con un resultado positiv o en la PCR 
compl etada por secuenciación, de conf ormidad con los métodos y procedimiento s aprobados establecidos en la 
parte 5 del anex o II. 
ii)  La sospecha de infección por Bonamia ostreae se descar tará si dichos ensa yos no apor tan ninguna otra prueba 
de la presencia de Bonamia ostreae. 23.9.2015 L 247/30 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuadro 5.A 
Sistema de vigilancia de Estados miembros, zonas o compar timentos para el período de control anter ior a la 
obtención de la calif icación de libre de Bonamia ostr eae con arreglo al punto I.2.1  
Número de inspecciones sani ­
tarias anuales Número de exámenes de 
laborato rio anuales Número de moluscos de la 
muestra 
Explotaciones/zonas de cría de 
moluscos 1 1 150  
Cuadr o 5.B 
Sistemas de vigilancia de Estados miembros, zonas o compar timento s para mantener la calif icación de libre de 
Bonamia ostr eae con arreglo al punto I.3 
Nivel de riesgo Número de inspecciones 
sanitar ias Número de exámenes de 
laboratorio Número de moluscos de la 
muestra 
Alto 1 cada año 1 cada dos años 150 
Medio 1 cada dos años 1 cada dos años 150 
Bajo 1 cada dos años 1 cada cuatro años 150  
PARTE 6 
MÉTODOS DE VIGIL ANCIA Y CONTR OL DE LA ENFERMED AD DE LAS MANCH AS BLANC AS (EMB) 
I.  Requisitos aplicables a los prog ramas de vigilancia y erradicación para obtener y mantener la calif icación sanita ria de 
libre de EMB y para conf inar la infección por el VSMB 
I.1.  Requisito s generales de inspección y muestreo 
El muestreo de los crustáceos para exámenes de laborat orio se efectuará cuando sea más probable que el agua 
alcance su temperatura máxima anual. Este requisito relativ o a la temperatura del agua se aplicará también a las 
inspecciones sanitar ias cuando esto sea viable y adecuado. 
Cuando los crustáceos de cría deban muestrearse con arreglo a los requisit os establecidos en la present e parte, 
se aplicarán los criterios siguientes: 
a)  Si en las unidades de producción hay crustáceos débiles o mor ibundos, se seleccionarán estos principalmente. 
Si no los hay, se seleccionarán crustáceos de distintos tamaños, es decir , juveniles y adultos de las especies 
sensibles seleccionadas, representadas proporcionalment e en la muestra. 
b)  Si se utiliza más de una fuent e de agua para la producción de crustáceos, se incluirán en la muestra 
crustáceos que representen todas las fuente s de agua. 
Cuando sea precisa una vigilancia específica de las poblaciones salva jes de conf ormidad con la parte I, punto 2, 
párrafo segundo, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, se determinarán el número y la distr ibución 
geográf ica de los puntos de muestreo para obtener una cober tura razonable del Estado miembro, zona o 
compar timent o. Los punt os de muestreo también serán representativos de los diferent es ecosistem as en los que 
se encuentren las poblaciones salvajes de especies sensibles, como sistemas mar inos, estuar ios, ríos y lagos. 23.9.2015 L 247/31 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuando sea precisa una vigilancia específica de las poblaciones salva jes de conf ormidad con la parte I, punto 2, 
párrafo segundo, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, los crustáceos de los que deben tomarse muestras se 
seleccionarán como sigue: 
i)  En los sistem as mar inos y estuar ios, se seleccionarán una o varias de las siguientes especies: Carcinus maenas, 
Cancer pagur us, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depur ator, Liocarcinus puber , Crangon crangon, Homar us gammar us, 
Palaemon adspersus o gambas de la familia de los peneidos, como Penaeus japonicus, Penaeus kerath urus o 
Penaeus semisulcatus. Si no están present es estas especies, la muestra será representativa de otras especies de 
decápodos sensibles present es. Habida cuenta de la amplia gama de hospedadores sensibles, los 
hospedadores podrán ser seleccionados de entre géneros o familias de decápodos cuya sensibilidad haya sido 
demostrada de forma exper imental o natural. 
ii)  En los sistemas fluviales y lagos, se seleccionarán una o varias de las siguientes especies: Pacifastacus 
leniusculus, Astacus leptodacty lus, Austro potamobius pallipes o Orconectes limosus. Si no están present es estas 
especies, la muestra será representativa de otras especies de decápodos sensibles presentes. Habida cuenta de 
la amplia gama de hospedadores sensibles, los hospedadores podrán ser seleccionados de entre géneros o 
familias de decápodos cuya sensibilidad haya sido demostrada de forma exper imental o natural. 
iii)  Si hay crustáceos débiles o mor ibundos, se seleccionarán estos principalmente. Si no los hay, se 
seleccionarán crustáceos de distintos tamaños, es decir , juveniles y adultos de las especies sensibles 
seleccionadas, representadas proporcionalment e en la muestra. 
I.2.  Requisito s específicos para obtener la calif icación sanitar ia de la catego ría I con respecto a la EMB 
I.2.1.  Programas de vigilancia 
a)  Un Estado miembro, zona o compar timent o que teng a la calif icación sanitar ia de la catego ría III de 
conf ormidad con la parte B del anex o III de la Directiva 2006/88/CE con respecto a la EMB podrá obtener la 
calif icación sanitar ia de la catego ría I con respecto a dicha enfe rmedad de la lista cuando todas las 
explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro 
de ese Estado miembro, zona o compar timento cumplan los requisitos pertinente s establecidos en el anex o V 
de la misma Directiva y todas esas explotaciones y, en caso de que lo exija la parte I, punto 2, 
párrafo segundo, de su anex o V, todos los punt os de muestreo de poblaciones salvajes seleccionados de 
conf ormidad con dicho punto, hayan sido sometidos al menos al siguiente programa de vigilancia, que 
incluye inspecciones sanitar ias y la toma de muestras para pruebas: 
Las explotaciones o punt os de muestreo habrán sido sometidos a inspecciones sanitar ias y muestreo durant e 
un período mínimo de dos años consecutivos, conf orme a lo establecido en el cuadro 6.A de la sección II. 
Durante ese período de dos años, las pruebas con todas las muestras utilizando los métodos de diagnóstico 
del punto II.2 habrán dado resultados negat ivos por lo que respecta a la EMB y cualquier sospec ha de EMB 
habrá sido descar tada de conf ormidad con los métod os de diagnóstico del punt o II.3. 
b)  En caso de que, durant e la aplicación del programa de vigilancia conte mplado en la letra a), la infec ción por 
el VSMB se confir me en una explotación incluida en dicho programa de vigilancia y, por tanto, le haya sido 
retirada su calif icación sanitar ia de la catego ría II, la explotación podrá recuperar inmediatament e la 
calif icación sanitar ia de la categoría II y seguir aplicando el programa de vigilancia para obtener la 
calif icación de libre de enfer medad sin aplicar programas de erradicación con arreglo al punto I.2.2 a 
condición de que: 
i)  sea una explotación continental cuya calificación sanitar ia con respecto a la EMB es independiente de la 
calificación sanitar ia de las aguas naturales circundante s con respecto a dicha enfe rmedad de la lista con 
arreglo a la parte II, punto 3, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE, 
ii)  haya sido vaciada, limpiada, desinfe ctada y puesta en barbecho; la duración del barbec ho será de al 
menos seis semanas, 
iii)  haya sido repoblada con crustáceos procedent es de Estados miembros, zonas o compar timent os con una 
calificación sanitar ia de la categoría I con respecto a la EMB. 23.9.2015 L 247/32 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.2.2.  Programas de erradicación 
I.2.2.1.  Requisito s generales 
Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la EMB podrá obte ner la calificación sanitar ia de la catego ría I con respecto a dicha enfer medad de la lista 
cuando todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la 
Directiva 2006/88/CE dentro de ese Estado miembro, zona o compar timento hayan sido sometidas al menos al 
siguiente programa de erradicación: 
a)  Las medidas de control mínimas establecidas en el capítulo V, sección 4, de la Directiva 2006/88/CE habrán 
sido aplicadas eficazmente y se habrá establecido una zona de conf inamient o conf orme al artículo 32, 
letra b), de dicha Directiva que incluya una zona de protección y una zona de vigilancia en las inmediaciones 
de la explotación o explotaciones oficialmente declaradas infectadas por la EMB. 
La zona de conf inamient o habrá sido definida caso por caso teniendo en cuenta los factores que influyen en 
los riesgos de propagaci ón de la EMB a los crustáceos de cría y salva jes, como son: el número de crustáceos 
muer tos y la tasa y distr ibución de su mor talidad en la explotación infectada por la EMB; la distancia y 
densidad de las explotaciones vecinas; las explotaciones en contact o; las especies presentes en las 
explotaciones; las prácticas de cría aplicadas en las explotaciones afectadas y vecinas; las condiciones hidrodi ­
námicas y otros factores de importancia epidemiológica. 
Para el establecimiento de las zonas de prot ección y de vigilancia se aplicarán los siguient es requisitos 
mínimos: 
i)  Se establecerá una zona de protección en las inmediaciones de una explotación oficialmente declarada 
infectada por la EMB que corresponderá:  
1) en las zonas mar inas o de estuar io: a la zona incluida en un círculo de un radio mínimo de una 
amplitud de marea, o al menos 5 km, con su centro en la explotación oficialmente declarada infectada 
por la EMB, o una zona equivalent e determinada conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos 
adecuados, o  
2) en las aguas dulces: a toda la cuenca hidrográfica de la explotación oficialment e declarada infectada 
por la EMB; la autori dad compet ente podrá limitar la extensión de la zona de protección a partes de la 
cuenca hidrográf ica, a condición de que no se vea comprome tida la prevención de la propagaci ón de 
la EMB. 
ii)  Se establecerá una zona de vigilancia fuera de la zona de prote cción que corresponderá:  
1) en las zonas mar inas: a una zona circundant e de la zona de prot ección donde se super pongan varias 
amplitudes de marea; o a una zona circundante de la zona de prote cción e incluida en un círculo 
de 10 km de radio desde el centro de la zona de protección; o a una zona equivalent e determinadas 
conf orme a datos hidrodinámicos o epidemiológicos adecuados; o  
2) en las aguas dulces: a una zona ampli ada fuera de la zona de prote cción establecida. 
b)  Todas las explotaciones no oficialmente declaradas infectadas por la EMB que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE dentro de la zona de prot ección serán 
sometidas a una investigación oficial que incluirá al menos los siguient es elementos : 
i)  la toma de muestras para pruebas de 10 crustáceos cuando se obser ven signos clínicos o post mortem 
compati bles con una infec ción por la EMB, o de 150 crustáceos cuando no se obser ven signos clínicos o 
post mortem, y 
ii)  una inspección sanitar ia en las explotaciones en las que las pruebas del inciso i) hayan dado resultados 
negativ os, las inspecciones sanitar ias continuarán una vez al mes durante la estación en la que sea más 
probable que el agua alcance sus temperaturas máximas anuales, hasta que haya sido retirada la zona de 
protección con arreglo al punto I.2.2.1, letra c). 23.9.2015 L 247/33 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    c)  Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por la EMB serán vaciadas, limpiadas, desinf ectadas 
y puestas en barbec ho. La duración del barbecho será de al menos seis semanas. Cuando todas las 
explotaciones oficialmente declaradas infectadas hayan sido vaciadas, se dejarán en barbec ho de forma 
sincronizada durante al menos tres semanas. El present e apar tado se aplicará también a las nuevas 
explotaciones oficialmente declaradas infec tadas durante la aplicación del programa de erradicación. 
Cuando se pongan en barbec ho las explotaciones oficialmente declaradas infectadas, las zonas de protección 
se conver tirán en zonas de vigilancia. 
La autor idad compe tent e podrá decidir si exige el vaciado, la limp ieza, la desinf ección y la puesta en 
barbec ho de otras explotaciones dentro de las zonas de prote cción y vigilancia establecidas. La autori dad 
compet ente determinará la duración de dicho barbec ho tras una evaluación de riesgos caso por caso. 
d)  Todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas y todas las demás explotaciones puestas en 
barbec ho dentro de las zonas de prote cción y vigilancia establecidas serán repobladas: 
i)  con crustáceos procedent es de Estados miembros, zonas o compar timent os con una calificación sanitar ia 
de la catego ría I con respecto a la EMB, o 
ii)  durante un período transito rio hasta el 31 de diciembre de 2020, con crustáceos procedent es de Estados 
miembros, zonas o compar timentos con un programa de vigilancia aprobado de la EMB. 
La repoblación solo se efectuará cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infec tadas por la 
EMB hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbec ho con arreglo al punto I.2.2.1, 
letra c). 
e)  Todas las explotaciones que críen especies sensibles enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 
2006/88/CE dentro del Estado miembro, zona o compar timento cubier tos por el programa de erradicación 
y, cuando se exija la vigilancia de poblaciones salva jes, los punt os de muestreo seleccionados con arreglo a la 
parte I, punto 2, párrafo segundo, del anex o V de dicha Directiva se somete rán posterior mente, al menos, al 
programa establecido en el punt o I.2.1. 
I.2.2.2.  Requisito s para que recuperen la calif icación de libre de EMB los compar timent os continentales que conste n de 
una sola explotación previamente declarada libre de EMB 
Un compar timento continental que consten de una sola explotación con calificación sanitar ia de la cate goría I 
respecto a la EMB, cuya calificación sanitar ia en lo que se refiere a esta enfer medad sea independiente de las 
aguas naturales circundantes con arreglo a la parte II, punt o 3, del anex o V de la Directiva 2006/88/CE y cuya 
calif icación de la catego ría I haya sido retirada con arreglo al artículo 53, apar tado 3, de dicha Directiva podrá 
recuperar la calificación sanitar ia de la catego ría I inmediatament e después de que la autori dad compet ente haya 
conf irmado que se cumplen las siguient es condiciones: 
a)  La explotación con EMB habrá sido vaciada, limpiada, desinf ectada y puesta en barbec ho. La duración del 
barbec ho habrá sido de al menos seis semanas. 
b)  La explotación con EMB habrá sido repoblada con crustáceos procedent es de Estados miembros, zonas o 
compar timent os con una calificación sanitar ia de la categoría I con respecto a la EMB. 
I.3.  Requisito s específicos para manten er la calif icación sanitar ia de libre de EMB (categoría I) 
Cuando sea precisa una vigilancia específica para manten er la calif icación sanitar ia de la catego ría I de 
conf ormidad con el artículo 52 de la Directiva 2006/88/CE, todas las explotaciones que críen especies sensibles 
enumeradas en la parte II del anex o IV de dicha Directiva dentro del Estado miembro, zona o compar timento 
en cuestión serán sometidas a una inspección sanitar ia y se tomarán muestras de conf ormidad con el 
cuadro 6.B de la sección II, teniendo en cuenta el nivel de riesgo de contraer la EMB que present e la 
explotación. 
En los Estados miembros, zonas o compar timent os en los que el número de explotaciones sea limitado y la 
vigilancia específi ca de estas explotaciones no proporcione suficiente s datos epidemiológicos, los programas de 
vigilancia para manten er la calificación de libre de enfermedad incluirán punt os de muestreo seleccionados con 
arreglo a los requisitos establecidos en el punt o I.1. 23.9.2015 L 247/34 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Esos puntos de muestreo serán inspeccionados y muestreados por rotación del 50 % de los puntos de muestreo 
cada año. El muestreo se efectuará de conf ormidad con el cuadro 6.B de la sección II. Las muestras serán 
seleccionadas, preparadas y examinadas de conf ormidad con los métodos de diagnóstico y muestreo 
establecidos en la sección II y los exámenes de laborat orio habrán dado resultado negativo por lo que respecta 
al agente de la EMB. 
La calificación de libre de enfer medad solo se manten drá mientras todas las muestras analizadas utilizando los 
métod os de diagnóstico y muestreo del punt o II.2 den resultados negat ivos por lo que respecta a la EMB y 
cualquier sospecha de EMB haya sido descar tada de conf ormidad con la inve stigación oficial y los métodos de 
diagnóstico del punto II.3. 
I.4.  Requisito s para el levantamient o de las medidas de conf inamient o establecidas en el artículo 39 de la Directiva 
2006/88/CE (cambio de la calif icación sanitar ia de la catego ría V a la catego ría III) con respecto a la EMB 
Un Estado miembro, zona o compar timent o que tenga la calificación sanitar ia de la catego ría V con respecto a 
la EMB podrá obtener la calif icación sanitar ia de la categoría III con respecto a dicha enfer medad de la lista a 
condición de que: 
a)  se cumplan los requisitos establecidos en el punt o I.2.2.1, letras a), b) y c); en caso de que no sea 
técn icamente posible el barbecho, las explotaciones serán sometidas a una medida altern ativa que 
proporcione una garant ía similar de exte rminio del VSMB desde el entorno de la explotación; 
b)  todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por la EMB y todas las demás explotaciones 
puestas en barbec ho o sometidas a medidas alternativas con arreglo a la letra a) dentro de las zonas de 
prote cción y vigilancia establecidas hayan sido repobladas con crustáceos procedent es de Estados miembros, 
zonas o compar timent os con una calif icación sanitar ia de la catego ría I, II o III con respecto a la EMB; 
c)  la repoblación solo se haya efectuado cuando todas las explotaciones oficialmente declaradas infectadas por 
la EMB hayan sido vaciadas, limpiadas, desinfectadas y puestas en barbecho o sometidas a medidas 
alternati vas con arreglo a la letra a); 
d)  no se haya detec tado la EMB durante el período de dos años que sigue a la finalización de las medidas 
mencionadas en las letras a) y b) y las sospechas durante este período hayan sido descar tadas con arreglo a 
los procedimiento s establecidos en el punto II.3. 
II.  Métodos de diagnós tico y muestreo 
II.1.  Muestras 
Las muestras de epider mis tegumentari a, ya sean disecadas o contenidas en pereiópodos, pleópodos, piezas 
bucales o branquias del animal, se fijarán en etanol al 95 % antes de la preparación de muestras para la PCR de 
dos pasos. 
Podrán recogers e otras muestras, fijadas para estudio histo lógico y microscopía electrónica por transmisión, 
para respaldar los datos de diagnóstico resultant es de la PCR. 
II.2.  Métodos de diagnóstico para obte ner o manten er la calif icación de libre de EMB 
El método de diagnóstico que debe utilizarse para obtener o mantener la calificación de libre de EMB con 
arreglo a los métodos y procedimiento s detallados establecidos en la parte 6 del anex o II será la PCR de dos 
pasos. 
En caso de resultado positiv o de la PCR de dos pasos, el resultado será corroborado por la secuenciación del 
amplicón antes de aplicar las medidas de control iniciales cont empladas en el artículo 28 de la Directiva 
2006/88/CE, si es posible, en condiciones prácticas mediante la demostración de signos patognomónicos de 
EMB en los hospedadores sensibles seleccionados, mediante estudio histo lógico y microscopía electrónica por 
transmisión. 
II.3.  Investi gación oficial y métod os de diagnóstico para descar tar o conf irmar la EMB 
Cuando sea preciso confir mar o descar tar la sospech a de EMB de conf ormidad con el artículo 28 de la Directiva 
2006/88/CE, se aplicará el siguient e procedimiento de inspección, muestreo y ensa yo: 
a)  La inve stigación oficial incluirá al menos una inspección sanitar ia y un muestreo de 10 crustáceos cuando se 
obser ven signos clínicos o post mortem compati bles con la EMB, o de 150 crustáceos cuando no se obser ven 
signos clínicos o post mortem. Las muestras se examinarán utilizando el método de diagnóstico establecido en 
el punt o II.2 (PCR de dos pasos). 23.9.2015 L 247/35 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    b)  La EMB se considerará confir mada cuando la PCR de dos pasos, seguida de secuenciación, con arreglo a los 
métod os y procedimiento s detallados establecidos en la present e parte 6 del anex o II, sea positiva al VSMB y 
cuando los hospedadores seleccionados presenten signos patognomónicos de la EMB. 
La sospech a de EMB podrá descar tarse si dichos ensa yos no apor tan ninguna otra prueba de la presencia de 
la EMB. 
Cuadro 6.A 
Sistema de vigilancia de Estados miembros, zonas y compar timentos para el período de control de dos años 
anter ior a la obtención de la calif icación de libre de EMB con arreglo al punto I.2.1  
Número de inspecciones 
clínicas anuales Número de exámenes de 
laborato rio anuales Número de crustáceos de 
la muestra 
Explotaciones o zonas de mues ­
treo 1 1 150  
Cuadr o 6.B 
Sistemas de vigilancia de Estados miembros, zonas o compar timentos para mantener la calif icación de libre 
de EMB con arreglo al punto I.3 
Nivel de riesgo Número de inspecciones 
sanitar ias Número de exámenes 
de laboratorio Número de crustáceos de la 
muestra 
Alto 1 cada año 1 cada dos años 150 
Medio 1 cada dos años 1 cada dos años 150 
Bajo 1 cada dos años 1 cada cuatro años 150   23.9.2015 L 247/36 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    ANEX O II 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTIC O DET ALL ADOS 
I.  Introducción 
En el present e anex o se establecen los procedimiento s detallados de los métodos de diagnóstico que deben 
utilizarse para los exámenes de laborat orio en el marco de los programas de erradicación y vigilancia del 
anex o I de la present e Decisión, y para confir mar o descar tar la sospec ha de las siguiente s enfer medades no 
exóticas enumeradas en la parte II del anex o IV de la Directiva 2006/88/CE (en lo sucesiv o, «las enfe rmedades 
de la lista»), de conf ormidad con el artículo 57, letra b), de esa Directiva: 
1. Septicemia hemor rágica viral (SHV) Parte 1 
2. Necrosis hemat opo yética infec ciosa (NHI) Parte 1 
3. Herpesvirosis de la carpa koi (HCK) Parte 2 
4. Anemia infecciosa del salmón (AIS) Parte 3 
5. Infección por Mar teilia refringens Parte 4 
6. Infección por Bonamia ostreae Parte 5 
7. Enferm edad de las manchas blancas (EMB) Parte 6  
II.  Def iniciones 
A efectos del presente anex o, se entenderá por «medio de transpor te» un medio de cultivo celular con un 10 % 
de suero de terner a y con 200 UI de penicilina, 200 μg de estrept omicina y 200 μg de kanamicina por mililitro, 
o con otros antibióticos de eficacia demostrada. 
PARTE 1 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTICO DET ALL ADOS PARA LA VIGIL ANCIA Y CONFIRMA CIÓN DE LA 
NHI Y LA SHV 
I.  Métodos de diagnós tico y procedimientos para la vigilancia de la SHV y la NHI 
Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laborat orio para obtener o manten er la calif icación 
sanitar ia de libre de NHI o SHV con arreglo a la parte 1, sección I, del anex o I utilizando los métodos de 
diagnóstico que se establecen en los punt os II.1 y II.2 de la parte 1 de dicho anex o se aplicarán los métodos y 
procedimiento s de diagnóstico detallados establecidos en los siguient es puntos I.1 a I.6. 
I.1.  Preparación y envío de las muestras de peces 
I.1.1.  Tejidos para el examen virológico en cultivo celular 
Antes de su embarque o traslado al laborat orio, los trozos de los órganos que vayan a examinarse se retirarán 
del pez con instr umental de disección estér il y se introducirán en tubos de plástico estér iles que conte ngan 
medio de transpor te. 
La cantidad de mat erial de peces idónea para el examen virológico en cultivo celular y mediante RT-qPCR 
depende del tamaño de los peces. Así, los mat eriales muestreados serán alevines enteros cuando la longitud del 
pez sea infer ior a 4 cm; vísceras, incluido el riñón, cuando el pez mida entre 4 y 6 cm o, en el caso de peces de 
mayor tamaño, riñón, bazo, corazón o encéf alo, así como fluido ovárico de reproductores en el moment o del 
deso ve. 
El fluido ovárico o seminal o los trozos de órganos de un máximo de 10 peces podrán ser recogidos en un solo 
tubo estéril que conteng a al menos 4 ml de medio de transpor te y constituirán una muestra conjunta. Los 
tejid os de cada muestra pesarán como mínimo 0,5 g. 
El examen virológico en cultivo celular se iniciará cuanto antes y, a más tardar , 48 horas después de la recogida 
de las muestras. En casos excepcionales, el examen virológico puede empezar a más tardar 72 horas después de 
la recogida, siempre que el mate rial que vaya a examinarse esté prot egido por medio de transpor te y que 
puedan respetarse los requisitos de temperatura durant e el transpor te. 23.9.2015 L 247/37 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.1.2.  Muestras para el análisis por retrotranscr ipción asociada a reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR 
o RT-qPCR) 
Las muestras de peces se tomar án con arreglo al procedimiento descr ito en el punt o I.1.1 utilizando un 
instr umento estéril y se introducirán en un tubo de plástico estéril que conteng a medio de transpor te. Los 
tejid os de diez peces podrán recoge rse en un solo tubo y representarán una muestra conjunta. No obstante, en 
caso de que la cantidad de inóculo sea pequeña, solo podrán utilizarse tejidos de hasta cinco peces. Alter nati­
vament e, las muestras podrán mezclarse en reactivos de estabilización del ARN, a razón de 0,2 g de tejido/ml de 
reactiv o, con arreglo a las recomendaciones de los fabricantes, si bien cada pez será tratado por separado y no 
se mezclará en las muestras, debido a la pequeña cantidad de mat erial que se utilizará para la extracción. 
También podrán enviarse al laboratori o peces enteros. 
I.2.  Envío de muestras de peces 
Los tubos que conteng an tejidos de los peces en medio de transpor te destinados al cultivo celular o los análisis 
de RT-PCR/R T-qPCR se colocarán en recipient es aislados, como cajas de poliestireno de pared gruesa, junto con 
sufic iente hielo u otro medio con efecto refrigerante similar para garantizar que las muestras se manteng an 
refrigeradas durant e el transpor te al laboratori o. No obstante, se evitará la cong elación de las muestras. La 
temperatura de una muestra durant e el transpor te no superará nunca los 10 °C y quedará hielo en la caja de 
transpor te en el momento de la recepción, o bien uno o varios bloques de hielo seguirán parcial o compl e­
tamente congelados. 
Podrán enviarse peces enteros al laborat orio si durant e el transpor te pueden respetarse los requisitos de 
temperatura del párrafo primero. Los peces enteros se envolverán en papel con capacidad absorbent e y se 
enviarán en una bolsa de plástico. También podrán enviarse peces vivos. 
I.3.  Recogida de mater ial de diagnóstico suplementar io 
Cuando lo apruebe el laborat orio de diagnóstico, otros tejidos de peces podrán ser recogidos y preparados para 
exámenes suplementar ios. 
I.4.  Preparación de las muestras para examen en cultivo celular y RT-qPCR 
I.4.1.  Conge lación en casos excepci onales 
En caso de que surjan dificultades prácticas que imposibiliten el procesamiento de muestras dentro de las 
48 horas siguientes a la recogida de los tejid os de peces, puede ser acep table que se cong elen las muestras de 
tejid o en medio de transpor te a una temperatura igual o infer ior a – 20 °C y se realice el examen virológico en 
un plazo de 14 días. No obstante , los tejidos de peces solo se cong elarán y descong elarán una vez antes de 
proceder a su examen. Se manten drán registros detallando los motivos de cada cong elación de muestras de 
tejid os de peces. 
I.4.2.  Homogen eización de órganos 
En el laboratorio, los tejidos de peces de los tubos serán completament e homogeneizad os en una licuadora, una 
mezcladora o un mor tero con arena estéril y, post eriormente, suspendidos en el medio de transpor te original. 
Si una muestra consta de un pez entero de menos de 4 cm de longitud, se desmenuzará con unas tijeras o un 
escalpelo estér iles tras eliminar la parte del cuer po posterior a la cloaca. Si una muestra consta de un pez entero 
de una longitud comprendida entre 4 y 6 cm, se recoger án las vísceras, sin descar tar los riñones. Si una muestra 
consta de un pez entero de más de 6 cm de longitud, las muestras de tejidos se obtendrán como se descr ibe en 
el punt o I.1. Las muestras de tejidos se desmenuzarán con unas tijeras o un escalpelo estér iles, se homoge ­
neizarán como se descr ibe en el párrafo primero del presente punto y se suspenderán en medio de transpor te. 
La proporción final entre tejid o y medio de transpor te se ajus tará en el laboratorio a 1:10. 
I.4.3.  Centr ifugación del homogene izado 
El homogeneizado se centr ifugará en una centr ifuga dora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 
y 5 °C a entre 2 000 y 4 000 × g durante 15 minutos; el sobrenadante se recoger á y podrá tratarse con 
antibióticos durant e 4 horas a 15 °C o durante una noche a entre 4 y 8 °C. Si la muestra ha sido enviada en 
medio de transpor te, podrá omitirse el tratamient o del sobrenadant e con antibióticos. 
En caso de que surjan dificultades prácticas, como la rotura de la incubadora o problemas con los cultivo s 
celulares, que impidan inocular las células en las 48 horas siguient es a la recogida de las muestras de tejido de 
peces, el sobrenadante podrá cong elarse a – 80 °C y el examen virológico podrá efectuarse en un plazo de 
14 días. 23.9.2015 L 247/38 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Si el sobrenadant e recogido se almacena a – 80 °C en las 48 horas siguient es al muestreo, podrá reutilizarse 
solo una vez para el examen virológico. 
Antes de la inoculación de las células, el sobrenadante se mezclará con partes iguales de una mezcla adecua ­
damente diluida de antisueros contra los serotipos locales del virus de la necrosis pancreática infec ciosa (VNPI), 
y se incubará durant e como mínimo una hora a 15 °C o como máximo 18 horas a 4 °C. El título del antisuero 
será de al menos 1/2 000 en una prueba de neutralización en placa al 50 %. 
El tratamiento de todos los inóculos con antisuero contra el VNPI tiene por objeto evitar que se desar rolle efecto 
citopát ico (ECP) debido al VNPI en cultivos celulares inoculados. Esto reducirá la duración de los exámenes 
virológicos, así como el número de casos en los que el ECP tendría que considerarse potencialment e indicativo 
del VSHV o del VNHI. 
Cuando las muestras procedan de unidades de producción que se consideran libres de NPI, podrá omitirse el 
tratamiento de los inóculos con antisuero contra el VNPI. 
I.4.4.  Preparación de las muestras para los programas de vigilancia basados en RT-PCR y RT-qPCR 
Si las muestras han sido recogidas en medio de transpor te, se efectuará el procedimiento establecido en los 
puntos I.4.2 y I.4.3. Después del centr ifugado, se recogerá el sobrenadant e y se extraerá el ARN. Si no ha de 
realizarse un nuevo examen directamente después del centr ifugado, las muestras se congelarán inmediatament e 
a una temperatura igual o inferior a – 20 °C. 
Para el análisis de los tejidos de peces conser vados en reactiv o de estabilización del ARN, las tareas posteriores 
se efectuarán dentro de los siguiente s plazos respecto a las muestras almacenadas a distintas temperaturas: 
muestras almacenadas a 37 °C: un día; 
muestras almacenadas a 25 °C: una semana; 
muestras almacenadas a 4 °C: un mes; 
muestras almacenadas a – 20 °C: indef inidamente . 
Las muestras conjuntas en reactiv o de estabilización del ARN se tratarán como muestras individuales en reactivo 
de estabilización del ARN. En lo que respecta a las muestras conjuntas en reactiv o de estabilización del ARN, la 
cantidad de muestra no excede rá de lo recomendado por el fabricante para la extracción con kits de ARN, como 
RNeasy Mini kits (Qiag en) o similares. Si se hacen muestras conjuntas más grandes, los kits o métodos de 
extracción reflejarán este agrupamient o. 
Las muestras recogidas en reactiv os de estabilización del ARN no se utilizarán para el cultivo celular . 
I.4.5.  Obtención de muestras conjuntas para RT-qPCR 
Dado que los prot ocolos de RT-qPCR dados son de sensibilidad igual o mayor que los métodos de cultivo 
celular , podrá utilizarse sobrenadant e obte nido de mate rial de tejid os de peces homogene izado de órganos 
mezclados procedent es de hasta 10 peces en medio de cultivo celular para la PCR. Sin embargo, debido a la 
cantidad much o menor de inóculo utilizada para la PCR en comparación con el cultivo celular , todos los tejidos 
de los peces se homog eneizarán cuidadosament e antes de obtener mate rial para la extracción. 
El mismo principio se aplicará también si las muestras se recogen en reactiv os de estabilización del ARN. No 
obstante, en este caso, suele ser difícil obtener mater ial representativ o de un máximo de 10 peces en un tubo y, 
por tanto , el número de peces por muestra conjunta se reducirá a entre 2 y 5. 
I.5.  Examen virológico en cultivo celular 
I.5.1.  Cultiv os celulares y medios 
Se cultivarán línea celular 2 de alevín de Lepomis macr ochir us (BF-2) o línea celular 2 de gónadas de trucha arco 
iris (RTG-2) y células de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) o de Pimephales promelas (FHM) a entre 20 y 30 °C 
en medio adecuado, a saber , medio esencial mínimo de Eagle (MEM) o variantes de este, con un suplement o del 
10 % de suero bovino fetal y antibióticos en concentraciones habituales. 23.9.2015 L 247/39 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Cuando las células se cultivan en frascos cerrados, el medio se amor tiguará con bicarbonat o. El medio utilizado 
para el cultivo de células en unidades abier tas podrá amor tiguarse con tris(hidro ximetil)aminometano-HCl 
(Tris-HCl) (23 mM) y bicarbonato sódico (6 mM). El pH será de 7,6 ± 0,2. 
Los cultivo s celulares que se utilicen para la inoculación con mate rial de tejid os de peces serán cultivo s 
monocapa jóvenes, normalmente de un día de edad, en la medida de lo posible; no obstante, podrá admitirse 
una franja de entre 4 y 48 horas de edad. Las células estarán en crecimiento activo en el momento de la 
inoculación. 
I.5.2.  Inoculación de los cultivo s celulares 
La suspensión de órganos tratada con antibióticos se inoculará en cultivo s celulares en dos diluciones, a saber , la 
dilución primar ia y, además, una dilución a 1:10, que darán lugar a diluciones finales de mater ial tisular en el 
medio de cultivo celular de 1:100 y 1:1 000, respectivamente , a fin de evitar interfe rencias homólogas . Se 
inocularán al menos dos líneas celulares tal como se indica en el punto I.5.1. La relación entre la cantidad de 
inóculo y el volumen de medio de cultivo celular será apro ximadamente 1:10. 
Para cada dilución y cada línea celular se utilizará al menos un área celular de unos 2 cm2, lo que corresponde a 
un pocillo en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Se utilizarán placas de cultivo celular en la medida de 
lo posible. 
I.5.3.  Incubación de cultivo s celulares 
Los cultivo s celulares inoculados se incubarán a 15 °C durante 7 a 10 días. Si el color del medio de cultivo 
celular pasa de rojo a amar illo, lo que indica una acidif icación del medio, se ajustará el pH con una solución 
estéril de bicarbonat o o sustancias equivalentes para garan tizar la sensibilidad de las células a la infección por el 
virus. 
Al menos cada seis meses, o si se sospec ha que la sensibilidad de las células ha descendido, se efectuará la 
valoración de mat erial cong elado de VSHV y VNHI para comprobar la sensibilidad de los cultivo s celulares a la 
infección. Se utilizará, en la medida de lo posible, el procedimiento establecido en la sección III. 
I.5.4.  Microscopía 
Los cultivo s celulares inoculados se obser varán periódicament e (al menos tres veces por semana) a 
40-150 aumentos para comprobar si se ha producido ECP. Si hay signos evident es de ECP, se iniciarán inmedia ­
tamente los procedimiento s de identif icación del virus de conf ormidad con el punto I.6. 
I.5.5.  Subcultivo 
Si no aparece ECP tras la incubación primar ia de entre 7 y 10 días, se efectuará el subcultivo con cultivo s 
celulares nuevos utilizando un área celular similar a la del cultivo primar io. 
Se reunirán alícuotas del medio (sobrenadant e) de todos los cultivos o pocillos que constituyen el cultivo 
primar io, por líneas celulares, 7 a 10 días después de la inoculación. A continuación, dichas mezclas se 
inocularán en cultivo s celulares homólogos no diluidos y diluidos a 1:10 (obt eniendo diluciones finales de 1:10 
y 1:100, respectivamente, del sobrenadante) según se descr ibe en el punt o I.5.2. Como alternati va, se inocularán 
alícuotas de un 10 % del medio que constituye el cultivo primar io directament e en un pocillo con cultivo 
celular nuevo (subcultivo de pocillo a pocillo). La inoculación puede ir precedida de una preincubación de las 
diluciones con el antisuero contra el VNPI a una dilución adecuada, como se descr ibe en el punto I.4.3. 
A continuación, los cultivo s inoculados se incubarán durant e 7 a 10 días a 15 °C y se inspeccionarán de 
conf ormidad con el punt o I.5.4. 
Si se produce un ECP tóxico en los primeros tres días tras la incubación, puede realizarse un subcultivo en esa 
fase, pero después hay que incubar las células 7 días y realizar otro subcultivo con 7 días más de incubación. Si 
se desar rolla un ECP tóxico pasados tres días, las células se pasarán una vez y se incubarán para lograr el total 
de 14 días desde la inoculación primar ia. En los últimos siete días de incubación no habrá pruebas de toxicidad. 
Si a pesar del tratamient o con antibióticos se produce contaminación bacte riana, el subcultivo irá precedido de 
centr ifugación a 2 000 a 4 000 × g durante 15 a 30 minutos a entre 2 y 5 °C, o filtración del sobrenadante por 
un filtro de 0,45 μm (membrana con baja fijación a las prote ínas). Además, el subcultivo seguirá los mismos 
procedimiento s descr itos para el ECP tóxico en el párrafo cuar to del presente punt o. 
Si no se produce ECP, el ensa yo podrá declararse negat ivo. 23.9.2015 L 247/40 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.6.  Identif icación del virus 
Si se obser va ECP en un cultivo celular , se recoger á medio (sobrenadante) y se analizará mediante una o varias 
de las siguient es técn icas: ensa yo de inmunoadsorción enzimática (ELISA ), inmunof luorescencia (IF), neutrali ­
zación, RT-PCR o RT-qPCR. Si estas pruebas no han permitido una identif icación definit iva del virus en el plazo 
de una semana, el sobrenadante se enviará al laborat orio nacional de referencia o al laboratori o de referencia de 
la UE para las enfe rmedades de los peces a que se refiere el anex o VI de la Directiva 2006/88/CE para su identif i­
cación inmediata. 
I.6.1.  ELISA 
Se efectuará una ELISA tipo sándwich con objeto de identificar la cepa vírica. Las placas de micropocillos se 
recubr irán con 50 µl/pocillo (0,9 pg) de inmunog lobulinas (Ig) de antisueros de conejo contra VNHI o VSHV de 
calidad demostrada, purificadas con proteína A, diluidas en solución amor tiguadora de carbonato (pH 9,6) con 
15 mM de azida de sodio, y se incubarán de 18 horas a 2 semanas a 4 °C. 
En una placa de dilución, cada muestra que cont enga 1 % de Tritón X-100 y los testigos positiv os se diluirá con 
solución amor tiguadora [solución salina fosfatada (PBS)- T-BSA, 1 % BSA] en cuatro grados de dilución: sin 
diluir , 1:4, 1:16 y 1:64. Las placas ELISA se lavarán en PBS que conte nga un 0,05 % de Tween-20 (PBS- T) y 
50 μl de cada dilución se transferirán de la placa de dilución a la placa ELISA lavada y recubier ta. 
A continuación, las placas ELISA se incubarán durante 30 minut os a 37 °C. Luego se lavarán y se incubarán 
durante 30 minutos a 37 °C con anticuer pos monoclonales específicos (AcM IP5B11 para la identificación del 
VSHV y Hyb 136-3, para la del VNHI). Se transfe rirán a la placa ELISA 50μl de anticuer pos antimur inos de 
conejo conjug ados con pero xidasa de rábano, diluidos a 1:1 000 en PBS- T-BSA. 
Por último, después de un nuevo lavado, se desencadenarán las reacciones añadiendo 50 µl/pocillo de ortofeni­
lendiamina (OPD). Las placas ELISA se incubarán durante 20 minutos a temperatura ambient e en la oscur idad, y 
la reacción se detendrá añadiendo 100 µl/pocillo de H2SO4 0,5 M. 
Se controlará la absorbancia a una longitud de onda de 492 y 620 nm en un lector ELISA. Las muestras se 
designarán positivas o negativas tras comparar los resultados de los ensa yos con los valores de absorbancia de 
los testigos positivos y negativ os. En general, las muestras con una absorbancia combinada (A) < 0,5 con 
mater ial no diluido se considerarán negativas, las muestras con valores de A entre 0,5 y 1,0 se considerarán 
sospechosa s y aquellas con A > 1,0 se considerarán positivas. 
Podrán utilizarse otras versiones de ELISA con eficacia similar demostrada en lugar de las cont empladas en este 
punto. 
I.6.2.  Inmunof luorescencia (IF) 
La identificación de los patóg enos VSHV y VNHI se efectuará infectando células en placas «Black» de 96 pocillos, 
placas conven cionales de 24 pocillos o cubreobjetos en placas de 24 pocillos. Cuando se identifique el VNHI, 
el VSHV o ambos infectando células en cubreobjet os, se aplicará el siguiente protocolo : 
a)  los cubreobjet os se sembrarán con células a una densidad que lleve a una conf luencia de entre 60 % y 90 % 
después de 24 horas de cultivo . Para esto se utilizarán células de EPC, en la medida de lo posible, debido a su 
fuer te adherencia a las superf icies de vidr io, aunque también pueden usarse otras líneas celulares, como BF-2, 
RTG- 2 o FHM. Se inocularán 150 µl de sobrenadante del cultivo celular en dos diluciones diferentes (1:10 
y 1:1 000) por duplicado en monocapas de un día, y se incubará a 15 °C durant e 24 horas. 
b)  Poste riormente, el medio de cultivo celular se retirará y las monocapas de células infectadas se fijarán con 
0,5 ml de solución acuosa de acet ona helada (80 % v/v). La fijación se efectuará en campana extract ora 
durante 15 minutos a temperatura ambiente; a continuación se retirará la solución de aceton a y se dejarán 
secar al aire los cubreobjet os durant e al menos 30 minutos. En esta fase, las placas se procesarán inmedia ­
tamente o se almacenarán a – 20 °C para su uso ulterior. 
c)  Los anticuer pos monoclonales específi cos (AcM IP5B11 para la identif icación del VSHV y Hyb 136-3, para la 
del VNHI) se diluirán en de PBS- T 0,01 M (pH 7,2) en la dilución recomendada por el proveedor de los 
anticuer pos monoclonales. Se añadirán de 50 a 100 µl/pocillo a las monocapas fijadas, y las placas se 
incubarán durant e una hora a 37 °C en una cámara húmeda. 23.9.2015 L 247/41 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    d)  Los cubreobjetos se lavarán suav emente tres veces con una PBS que cont enga un 0,05 % de Tween-20 
(PBS- T), y la solución amor tiguadora se eliminará compl etament e después del último enjuague. A 
continuación, las células se incubarán durante una hora a 37 °C con anticuer pos contra las inmunog lobulinas 
de ratón conjuga dos con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o isotiocianat o de tetrametilrodamina-5-(y 6) 
(TRITC), utilizados como anticuer po primar io, diluidos de acuerdo con las instr ucciones del proveedor , se 
lavarán de nuev o con PBS- T y se secarán. Los cultivo s teñidos se montarán en portaobjetos utilizando 
solución salina de glicerol y se examinarán con luz ultravioleta (UV) incidente, utilizando oculares de 10 o 
12 aumentos y un objetivo de 25 o 40 aumentos con aper turas numér icas > 0,7 y > 1,3, respectivamente. 
Podrán utilizarse, en su lugar , otras técn icas de IF con eficacia similar demostrada por lo que se refiere a los 
cultivo s celulares, la fijación y los anticuer pos de calidad de referencia. 
I.6.3.  Neutralización 
Las células se retirarán del sobrenadante mediante centr ifugado (2 000 a 4 000 × g) o filtración por membrana 
(0,45 μm) de baja fijación con proteínas, y el sobrenadant e se diluirá a 1:100 y 1:10 000 en medio de cultivo 
celular . 
Se mezclarán alícuotas de un mínimo de dos diluciones de sobrenadant e y se incubarán durante 60 minut os a 
15 °C con partes iguales de los reactivos siguientes, por separado: 
a)  suero que conteng a un anticuer po específico del grupo contra el VSHV a una dilución de 1:50 (v/v); 
b)  suero que conteng a un anticuer po específico del grupo contra el VNHI a una dilución de 1:50 (v/v); 
c)  grupo de antisueros contra los serotipos locales del VNPI a una dilución de 1:50 (v/v); 
d)  únicamente medio (testigo positiv o). 
De cada mezcla de sobrenadant e y suero de cada virus, al menos dos cultivos celulares se inocularán con 50 µl 
cada uno y, a continuación, se incubarán a 15 °C. Se obser vará si se produce ECP según lo descr ito en el 
punto I.5.4. 
Las cepas y aislados de VSHV que no reaccionen en pruebas de neutralización se identif icarán mediante IF 
o ELISA. 
Podrán utilizarse, en su lugar , otras pruebas de neutralización con eficacia similar demostrada. 
I.6.4.  RT-PCR/RT -qPCR 
I.6.4.1.  Preparación de ARN vírico 
Todos los trabajos con ARN se realizarán en hielo, utilizando guantes. 
El ARN se extraerá utilizando el método del fenol-clorof ormo o por columnas de afinidad, de acuerdo con las 
instr ucciones del fabricante. Pueden utilizarse los kits de extracción del ARN disponibles en el comercio, que 
permiten obtener ARN de alta calidad adecuado para su uso con los protocolos de RT-PCR detallados en los 
puntos siguiente s. 
El ARN se volverá a suspender en agua destilada libre de ribonucleasa (es decir , agua tratada con pirocarbonato 
de dietilo al 0,1 %) o un amor tiguador de elución apropiado. 
I.6.4.2.  RT-PCR 
Se utilizarán los siguient es cebadores para la detección del VNHI: 
cebador direct o 5′-A GA-GA T-CCC- TAC-A CC-A GA-GA C-3′; 
cebador inverso 5′-GGT -GGT -GTT -GTT -TCC-GTG-CA A-3′. 
Se efectuarán los siguiente s ciclos (RT-PCR de un paso): 1 ciclo a 50 °C durant e 30 minutos; 1 ciclo a 95 °C 
durante 2 minutos; 30 ciclos a 95 °C durant e 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos, 72 °C durant e 
60 segundos; 1 ciclo a 72 °C durante 7 minut os e inmersión a 4 °C. 
Se utilizarán los siguient es cebadores para la detección del VSHV : 
VN For 5′-A TG-GAA-GGA-GGA-A TT-CGT -GAA-GCG-3′; 
VN Rev 5′-GCG-GTG-AA G-TGC- TGC-A GT-TCC-C-3′. 23.9.2015 L 247/42 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Se efectuarán los siguient es ciclos (RT-PCR de un paso): 50 °C durant e 30 minutos, 95 °C durant e 15 minut os, 
35 ciclos a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durant e 30 segundos, y 68 °C durante 60 segundos. A 
continuación, la reacción se mantendrá a 68 °C durante 7 minutos . 
La cantidad y la especific idad de las reacciones RT-PCR se evaluarán mediante electrof oresis en gel de agarosa al 
1,5 % con bromuro de etidio, y se obser varán por transiluminación UV. Un amplicón de PCR de 693 bp podrá 
obser varse con respecto al VNHI. En el caso del VSHV , el tamaño será de 505 bp. 
Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir , puede que 
sea necesar io optimizar los protocolo s térm icos, dependiendo del term ociclador que se use. Por otra parte, 
pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibr idación del cebador o una contaminación en el 
laboratorio. Por tanto , se incluirán testigos positiv os y negativ os adecuados y ampli cones de secuencia positiva y 
negativ a, para evitar cualquier duda. En lo que respecta a los cebadores del VSHV , se prestará especial atención 
al utilizar células de BF-2, ya que dichos cebadores puedan reaccionar con la línea celular de ADN/ARN 
produciendo falsos positiv os de tamaño similar . Al realizar pruebas con sobrenadant e de células de BF-2, todos 
los fragment os ampli ficados por PCR serán secuenciados. 
I.6.4.3.  RT-qPCR para el VSHV 
En relación con el VSHV , la amplificación se efectuará utilizando los siguientes cebadores y sonda: 
cebador direct o: 5′-AAA-CTC-GCA-GG A-TGT -GTG-CGT -CC-3′; 
cebador inverso: 5′-TCT -GCG-A TC-TCA-GTC-A GG-A TG-AA-3′; 
sonda: 5′-F AM- TAG-A GG-GCC- TTG-GTG-A TC-TTC- TG-BHQ1. 
RT-qPCR de un paso: 
En cada serie de placas se incluirán testigos negativos y positiv os. Sucesión de ciclos: 50 °C durante 30 minut os, 
95 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 94 °C durant e 15 segundos, 60 °C durante 40 segundos, 72 °C durante 
20 segundos; ajustar en caso necesar io. Podrán utilizarse, en su lugar , otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con 
eficacia similar demostrada. 
I.6.4.4.  RT-qPCR para el VNHI 
En relación con el VNHI, la amplificación se efectuará utilizando los siguient es cebadores y sonda: 
cebador direct o: 5′- AGA-GCC-AA G-GCA-CT G-TGC-G-3′; 
cebador inverso: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′; 
sonda: 5′ 6FAM- TGA GACTGA GCGGGA CA-NFQ/MGB. 
RT-qPCR de dos pasos: 
Dado que el siguiente ensa yo depende de una amplificación en dos pasos, se pondrá especial cuidado al 
manipular los tubos de una reacción a otra, con el fin de evitar la contaminación. 
Sucesión de ciclos (después del paso RT): 50 °C durant e 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos, seguidos de 
40 ciclos a 95 °C durant e 15 segundos, y 60 °C durante 1 segundos; se efectuarán ajustes en caso necesar io. 
Podrán utilizarse, en su lugar , otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con eficacia similar demostrada. 
II.  Métodos y procedimientos de diagnós tico detallados para conf irmar o descar tar la sospecha de SHV , NHI o ambas 
en brotes sospechosos 
Cuando se precise un examen de laborat orio para conf irmar o descar tar la NHI, la SHV o ambas de 
conf ormidad con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE utilizando los métod os de diagnóstico que 
se establecen en la parte 1, punt o II.3, del anex o I de la presente Decisión, se aplicarán los siguient es métod os y 
procedimiento s de diagnóstico detallados: 
a)  aislamiento convencional del virus seguido de seroneutralización e identif icación inmunoquímica o 
molecular del virus; 
b)  detección del virus por RT-PCR o RT-qPCR; 
c)  otras técn icas de diagnóstico como IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC. 23.9.2015 L 247/43 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    II.1.  Aislamient o convencional del virus con posterior identif icación del virus 
II.1.1.  Selección de las muestras 
Se seleccionarán para las pruebas al menos diez peces que present en signos típicos de NHI o SHV . 
II.1.2.  Preparación y envío de las muestras de peces 
La preparación y el envío a efect os del aislamiento convencional del virus seguirán los métod os y procedi ­
mientos establecidos en el punt o I.2. 
II.1.3.  Recogida de mater ial de diagnóstico suplementar io 
La recogida de mater ial suplementar io a efect os del aislamient o conven cional del virus seguirá los métod os y 
procedimiento s establecidos en el punt o I.3. 
II.1.4.  Preparación de muestras para el examen en cultivo celular 
La preparación de las muestras para el examen en cultivo celular a efectos del aislamiento conven cional del 
virus seguirá los métodos y procedimientos establecidos en el punt o I.4. 
II.1.5.  Examen virológico en cultivo celular 
El examen virológico a efect os del aislamient o convencional del virus seguirá los métodos y procedimiento s 
establecidos en el punt o I.5. 
II.1.6.  Identif icación del virus 
La identificación del virus a efectos del aislamiento conven cional del virus seguirá los métodos y procedimiento s 
establecidos en el punt o I.6. 
II.2.  Detección del virus por RT-qPCR 
II.2.1.  Selección de las muestras 
La selección de las muestras a efect os de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirá los métod os y procedi ­
mientos establecidos en el punt o I.1.2. 
II.2.2.  Preparación y envío de las muestras de peces 
La preparación y el enví o a efectos de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirán los métodos y procedi ­
mientos establecidos en el punt o I.2. 
II.2.3.  Recogida de mater ial de diagnóstico suplementar io 
La recogida de mat erial de diagnóstico suplementar io a efectos de la detección del virus mediante RT-qPCR 
seguirá los métodos y procedimiento s establecidos en el punto I.3. 
II.2.4.  Preparación de las muestras para RT-qPCR 
La preparación de las muestras a efect os de la detección del virus mediante RT-qPCR seguirá los métod os y 
procedimiento s establecidos en el punt o I.6.4.1. 
II.2.5.  RT-qPCR 
La detec ción de virus por RT-qPCR seguirá los métod os y procedimiento s establecidos en los punt os I.6.4.1, 
I.6.4.3 y I.6.4.4. 
II.3.  Otras técn icas de diagnóstico 
El sobrenadant e preparado como se descr ibe en el punto I.4.3 podrá somet erse a una ELISA, una prueba de 
inmunof luorescencia indirecta (IFAT) o una RT-PCR, de conf ormidad con los punt os I.6.1, I.6.2 o I.6.4, respecti ­
vament e. El mate rial tisular podrá somet erse a otras técn icas de diagnóstico, como IFAT en cortes congelados o 
pruebas inmunohist oquímicas con mate rial tisular fijado en formol. Estas técnicas rápidas se compl etarán con 
un examen virológico con arreglo al punto II, letras a) o b), en el plazo de 48 horas después del muestreo, si: 
a)  se obtiene un resultado negativ o; o bien 
b)  se obtiene un resultado positiv o con un mate rial que represente el primer caso de NHI o SHV . 23.9.2015 L 247/44 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    III.  Procedimiento de valoración para verificar la sensibilidad de los cultiv os celulares a la infección 
Cuando se realice una valoración para verificar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infección como se 
indica en el punt o I.5.3, se seguirán los procedimiento s establecidos en los siguientes apar tados del present e 
punto. 
Se utilizarán al menos dos cepas aisladas del VSHV y una del VNHI. Las cepas representarán el mayor grupo de 
virus dentro de la Unión Europea, es decir , para el VSHV , una cepa patóg ena procedent e de trucha arco iris en 
agua dulce y una cepa patóg ena mar ina de rodaballo y, para el VNHI, una cepa patóg ena de trucha arco iris de 
la Unión Europea. Se utilizarán cepas aisladas bien definidas procedent es de los Estados miembros. Los lotes de 
virus de un número bajo de pasadas en cultivo celular se propagarán en tubos de cultivo celular con células 
BF-2 o RTG-2, en el caso del VSHV , y con células de EPC o FHM, en el del VNHI. Se utilizará medio de cultivo 
celular con al menos un 10 % de suero. En la inoculación se utilizará una MOI baja (< 1). 
En el momento del ECP total, se recoger á el virus mediante centr ifugado del sobrenadant e del cultivo celular a 
2 000 × g durant e 15 minutos, se ester ilizará pasándolo por un filtro de membrana de 0,45 µm y se distr ibuirá 
en criotubos etiquetados. El virus se mantendrá a – 80 °C. 
Una semana después de la congelación, se desconge larán en agua fría tres frascos replicados con cada virus, y se 
valorarán frente a sus líneas celulares respectivas. Cada cepa de virus será desconge lada y valorada al menos 
cada seis meses, o cuando se sospec he que la sensibilidad de una línea celular ha disminuido. 
Los procedimiento s de valoración se descr ibirán detalladamente y se seguirá el mismo procedimiento cada vez. 
La valoración por dilución hasta el límite incluirá al menos seis réplicas en cada fase de dilución. Los valores se 
compararán con valores obtenidos con anterior idad. Si la valoración de alguna de las tres cepas víricas decrece 
en un factor igual o super ior a 2 unidades logarítmicas en compar ación con la valoración inicial, la línea celular 
ya no podrá ser utilizada con fines de vigilancia. 
Si se guardan en el laborat orio distintas líneas celulares, cada línea se examinará por separado. 
Se mantendrán registros durante al menos 10 años. 
PARTE 2 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTICO DET ALL ADOS PARA LA VIGIL ANCIA Y CONFIRMA CIÓN DE LA 
HERPESVIR OSIS DE LA CARP A KOI (HCK) 
I.  Métodos y procedimientos de diagnóstico para conf irmar o descar tar la sospecha de HCK 
Cuando se precise un examen de laborat orio para conf irmar o descar tar la sospech a de HCK de conf ormidad 
con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE, utilizando los métodos de diagnóstico que se establecen 
en la parte 2, sección III, del anex o I, se aplicarán los métodos y procedimientos de diagnóstico detallados 
establecidos en los punt os I.1 y I.2 de la presente parte. 
I.1.  Preparación de las muestras de peces 
Con fines de diagnóstico, para los ensa yos con métodos basados en la PCR convencional o la qPCR podrán 
utilizarse peces (que se enviarán vivos o muer tos y embalados por separado en recipient es asépticos precintados) 
o, alternativament e, órganos o trozos de órganos cong elados conser vados en etanol del 80 % a absoluto o en 
medio de transpor te vírico (que serán procesados en las 48 horas siguientes a su recogida). 
Para la detección del HVK se recoger án muestras de branquias y riñón; en una muestra separada adicional 
podrán incluirse bazo, encéf alo e intestinos. En caso de infección aguda, podrá mezclarse mat erial tisular de 
hasta cinco peces. 
Además, en deter minados casos podrán utilizarse muestras no letales, como sangre, frotis o biopsias de las 
branquias o muestras de mucosidad (por tanto, en caso de sospec ha de la infec ción por el HVK pueden usarse 
ejemplares muy valiosos). 
I.1.1.  Extracción del ADN 
El ADN se extraerá con arreglo a procedimiento s normalizados. 
Pueden utilizarse los kits de extracción del ADN disponibles en el comercio, que permiten obtener ADN de alta 
calidad adecuado para su uso con los protocolo s de PCR contem plados en el punt o I.2. 23.9.2015 L 247/45 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.2.  Detección e identificación del agente mediante métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
I.2.1.  qPCR para la detección del HVK 
Para la detección del HVK se efectuará la siguient e prueba de qPCR: 
Cebador directo (KHV -86f): 5′- GACGCCGGA GACCTTGTG -3′; 
Cebador inverso (KHV -163r): 5′- CGGGTTCTT ATTTTTGTCCTTGTT -3′; 
Sonda (KHV -109p): 5′-F AM- CTTCCTCTGCTCGGCGA GCA CG -3′. 
Sucesión de ciclos: un ciclo a 95 °C en 15 minutos, seguido de 40 ciclos a 94 °C en 15 segundos y 60 °C 
durante 60 segundos. En cada serie de placas se incluirán testigos nega tivos y positiv os. No obstante, podrán 
utilizarse, en su lugar , otras versiones de qPCR con eficacia similar demostrada. 
I.2.2.  PCR convencional para la detección del HVK 
Se utilizará la prueba descr ita en el present e punto, que tiene por objeto el gen de la timina cinasa (TK) del 
HVK. Sin embargo, en su lugar podrán emple arse otras pruebas de PCR con sensibilidad y especificidad 
similares a la de la prueba descr ita. 
Cebador directo (KHV -TKf): 5′-GGGTT ACCTGT AC GAG-3′. 
Cebador inverso (KHV -TKr): 5′-CA CCCA GTAGATTA TGC-3′. 
Sucesión de ciclos: Un ciclo a 95 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 °C durante 30 segundos, 
52 °C durante 30 segundos, 72 °C durante un minuto y un ciclo a 72 °C durante 10 minutos. El product o debe 
ser de 409 bp. 
Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir , puede que 
sea necesar io optimizar los protocolo s térm icos, dependiendo del term ociclador que se use. Por otra parte, 
pueden darse falsos positiv os, debidos a un error de hibr idación del cebador o una contaminación. En cada serie 
de placas se incluirán testigos negativ os y positivos. No obstante , podrán utilizarse, en su lugar , otras versiones 
de PCR con eficacia similar demostrada. 
La primera detección en una zona se conf irmará mediante secuenciación o se envi ará para su identificación 
inmediata a un laboratori o nacional de referencia o al laboratorio de referen cia de la UE para las enfer medades 
de los peces indicado en el anex o VI de la Directiva 2006/88/CE. 
II.  Métodos de diagnós tico y procedimientos detallados para la vigilancia de la HCK 
Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratori o para obtener o mantener determinadas califi ­
caciones sanitar ias con respecto a la HCK con arreglo a la parte 2, sección I, del anex o I utilizando los métodos 
de diagnóstico que se establecen en la parte 2, secciones II o III, de dicho anex o se aplicarán los métod os y 
procedimiento s de diagnóstico detallados establecidos en los siguient es puntos II.1 y II.2 de la present e parte. 
II.1.  Preparación de las muestras de peces 
Si es posible, serán sometidos a muestreo los peces que se hayan mantenido durant e un tiempo prolongado (de 
dos a tres semanas) en el inter valo de temperaturas que permite el desar rollo del virus, es decir , entre 15 
y 26 °C. Si es posible, las muestras se recoger án una vez transcur ridas 24 horas y a más tardar 72 horas 
después de prácticas de gestión que puedan reactivar el virus en peces vectores, como la captur a en redes o el 
transpor te, al fin de aumentar las posibilidades de detección del HVK. 
Para la vigilancia de la HCK con métodos basados en la PCR podrán enviarse peces vivos o muer tos y 
embalados por separado en recipientes asépticos precintados o, alternativamente, órganos o trozos de órganos 
cong elados conser vados en alcohol al 80-100 % o medio de transpor te vírico (que serán procesados en las 
48 horas siguiente s a su recogida). Para la vigilancia de la HCK se recoger án muestras tisulares de branquias y 
riñón. 
Para esta vigilancia se evitará mezclar muestras en la medida de lo posible. En caso de que sea necesar io, podrá 
mezclarse mate rial tisular de un máximo de dos peces. Las muestras más grandes se homogeneizarán en 
mor tero o en licuadora, y se obtendr án submuestras para la extracción de ADN antes de la aclaración. Alternati­
vament e, podrán obteners e submuestras de cada tejido incluido en la muestra y colocarse en tubos de lisis. 23.9.2015 L 247/46 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    II.1.1.  Extracción del ADN 
El ADN se extraerá con arreglo a procedimiento s normalizados. Pueden utilizarse los kits de extracción del ADN 
disponibles en el comercio, que permiten obtener ADN de alta calidad adecuado para su uso con los protocolo s 
de RT-PCR conte mplados en el punto II.2. 
La proporción aceptable entre tejido y medio será de 1:9 p/v. En los ensa yos se incluirán entre 20 y 25 mg de 
mater ial tisular . 
II.2.  Vigilancia de la HCK con métodos basados en la PCR 
Para la vigilancia del HVK se utilizará la qPCR. Si aparecen muestras positivas en una zona sin resultados 
positiv os conf irmados previamente, los resultados de los ensa yos se conf irmarán mediante uno de los siguient es 
procedimiento s: 
a)  Secuenciación de un product o de PCR o de PCR con cebadores internos obtenid o a partir de las muestras. 
La secuencia de consenso clara obtenida debe coincidir (al menos en un 98 %) con las secuencias de 
referen cia. 
b)  Alte rnativament e, las muestras pueden enviarse a un laboratorio nacional de referencia para conf irmación. 
II.2.1.  qPCR para la detección del HVK 
Se utilizará la siguiente qPCR: 
Cebador directo (KHV -86f): 5′- GACGCCGGA GACCTTGTG -3′; 
Cebador inverso (KHV -163r): 5′- CGGGTTCTT ATTTTTGTCCTTGTT -3′; 
Sonda (KHV -109p): 5′-F AM- CTTCCTCTGCTCGGCGA GCA CG -3′. 
Sucesión de ciclos: un ciclo a 95 °C en 15 minutos, seguido de 50 ciclos a 94 °C en 15 segundos y 60 °C 
durante 60 segundos. 
Los resultados de la qPCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir , puede que 
sea necesar io optimizar los protocolo s térm icos, dependiendo del term ociclador que se use. Por otra parte, 
pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibr idación del cebador o una contaminación en el 
laboratorio. En cada serie de placas se incluirán testigos negativ os y positivos. No obstante , podrán utilizarse, en 
su luga r, otras versiones de la qPCR con eficacia similar demostrada. 
II.2.2.  PCR convencional para la confir mación del HVK 
Para confir mar una infección por el HVK se empleará el prot ocolo genérico de PCR con cebadores internos 
descr ito en el cuadro 2.1, seguido de la secuenciación del product o amplificado. 
Cuadro 2.1 
Cebadores y condiciones de la PCR con cebadores inter nos para todos los herpesvir us de los ciprínidos 
(CyHV -1, CyHV -2 y CyHV -3) 
Nombre del 
cebador Secuencia Sucesión de ciclos Tamaño del 
producto 
CyHVpol-direct o 5′-CC AGCAACATGTGCGA CGG-3′ Primera serie de PCR 
1 ciclo: 
95 °C durante 2 minut os 
40 ciclos: 
95 °C durante 30 segundos 
55 °C durante 30 segundos 
72 °C durante 45 segundos 
1 ciclo: 
72 °C durante 10 minutos 362 bp 
CyHVpol-inv erso 5′-CCGT ARTGA GAGTTGGCGCA -3′ 23.9.2015 L 247/47 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Nombre del 
cebador Secuencia Sucesión de ciclos Tamaño del 
producto 
CyHVpol-direct o 
interno 5′-CGA CGGV GGY ATCAGCCC-3′ Segunda serie de RCP 
1 ciclo: 
95 °C durante 2 minut os 
40 ciclos: 
95 °C durante 30 segundos 
55 °C durante 30 segundos 
72 °C durante 45 segundos 
1 ciclo: 
72 °C durante 10 minutos 339 bp 
CyHVpol-inv erso 
interno 5′-GA GTTGGCGCA YACYTTC ATC-3′  
Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir , puede que 
sea necesar io optimizar los protocolo s térm icos, dependiendo del term ociclador que se use. Por otra parte, 
pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibr idación del cebador o una contaminación en el 
laboratorio. En cada serie de placas se incluirán testigos nega tivos y positiv os. Podrán utilizarse, en su lugar , 
versiones de PCR con eficacia similar demostrada. 
La secuenciación podrá ser realizada por el laboratorio o en empresas exte rnas especializadas. Los resultados de 
la secuenciación serán analizados compar ando las secuencias con las secuencias de referencia conocidas del HVK 
(números de acceso a Gen Bank AP008984, DQ657948 y DQ177346). La secuencia de consenso clara 
obtenid a debe coincidir al menos en un 98 % con dichas secuencias de referencia. 
PARTE 3 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTICO DET ALL ADOS PARA LA VIGIL ANCIA Y CONFIRMA CIÓN DE LA 
ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN (AIS) 
I.  Procedimientos de mues treo para la vigilancia y el control de la AIS 
Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laborat orio a los efectos de los programas de vigilancia o 
erradicación establecidos en la parte 3 del anex o I o a fin de confir mar o descar tar la AIS con arreglo al 
artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE, se aplicarán los métodos y procedimientos detallados 
establecidos en los punt os I.1, I.2 y I.3 de la presente sección. 
I.1.  Preparación de las muestras de peces 
A efectos de los exámenes de laboratorio para detectar la AIS, se evitará mezclar muestras de peces en la 
medida de lo posible. Sin embargo, para la vigilancia de la AIS se acep tará la mezcla de entre dos y cinco peces. 
Se tomar án muestras para pruebas de retrotranscr ipción asociada a PCR (RT-PCR) de todos los peces 
muestreados. Un trozo de riñón medio del pez se retirará utilizando un instr umento estér il y se introducirá en 
un tubo de microcentr ifugado que conteng a 1 ml de solución conser vant e del ARN de eficacia demostrada. 
Podrán recogerse tejidos de hasta cinco peces en un solo tubo de solución de transpor te y representarán una 
muestra conjunta. El peso del tejid o de una muestra será de 0,5 g. Cuando los peces sean demasiado pequeños 
para obtener una muestra del peso requer ido, podrán tomars e trozos de riñón, corazón, bazo, hígado o ciegos 
pilór icos, en este orden de preferencia, para obtener 0,5 g. 
Los tejid os para el estudio histo lógico solo se tomarán de peces recién sacr ificados con una constitución 
normal, que present en signos clínicos o post mortem compati bles con la AIS. Se tomarán con un escalpelo 
muestras de todas las lesiones externas o internas y, en todo caso, del riñón medio, el corazón, el hígado, el 
páncreas, el intest ino, las branquias y el bazo, y se introducirán en una solución salina amor tiguada con formol 
al 8-10 % (v/v). La proporción entre fijador y tejido será al menos de 20:1, para asegurar una conser vación 
satisf actor ia de los tejid os. Para la inmunohist oquímica (IHC) se tomarán muestras de riñón medio y corazón. 23.9.2015 L 247/48 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Se obtendrán tejidos para el examen virológico en cultivo celular de todos los peces muestreados. Se retirarán 
trozos de hígado, riñón anterior o medio, corazón y bazo utilizando un instr umento estéril y se introducirán en 
tubos de plástico que conte ngan 9 ml de medio de transpor te. Podrán recogerse tejidos de hasta cinco peces en 
un solo tubo con solución de transpor te y representarán una muestra conjunta. El peso del tejido de una 
muestra será de 1,0 ± 0,5 g. 
I.2.  Envío de las muestras de peces 
Podrán transpor tarse al laboratori o peces enteros si durante el transpor te pueden cumplir se los requisitos de 
temperatura del apar tado 3 del present e punt o. Los peces enteros se envolverán en papel absorbent e y se 
enviarán en una bolsa de plástico, refrigerados como se descr ibe en dicho apar tado. 
También podrán enviarse peces vivos, pero únicamente bajo la super visión del laborat orio nacional de referencia 
para las enfermedades de los peces y teniendo en cuenta los aspectos suplementar ios de desinfe cción y 
biosegur idad aplicables cuando se transpor tan peces vivos . 
Las muestras de sangre y los tubos que conteng an tejidos de peces para examen virológico o pruebas de RT-PCR 
se colocarán en recipient es aislados, como cajas de poliestireno de pared gruesa, junto con suficiente hielo o 
bloques de cong elación para garant izar que las muestras se mante ngan refrigeradas durant e el transpor te al 
laboratorio. Se evitará la cong elación, y quedará hielo en la caja de transpor te en el momento de la recepción, o 
bien uno o varios de los bloques de congelación deben seguir parcial o compl etamente cong elados. En circuns ­
tancias excepcionales, las muestras para RT-PCR y las muestras para examen virológico podrán ser congeladas y 
transpor tarse al laboratorio a – 20 °C o menor temperatura. 
Para el análisis por RT-PCR de los tejid os conser vados en reactiv o de estabilización del ARN, la extracción del 
ARN se efectuará dentro de los siguiente s plazos en función de la temperatura a la que se almacenen las 
muestras: 
muestras almacenadas a 37 °C: un día; 
muestras almacenadas a 25 °C: una semana; 
muestras almacenadas a 4 °C: un mes; 
muestras almacenadas a – 20 °C: indef inidamente . 
Si se transpor tan tejid os de peces en fijador para el estudio histológico, serán enviados en tubos a prueba de 
fugas dentro de recipient es resist entes a los golpes. Se evitará la cong elación de estas muestras. 
El examen virológico en cultivo celular se iniciará cuanto antes y, a más tardar , 48 horas después de la recogida 
de las muestras. En casos excepcionales, el examen virológico puede empezar a más tardar 72 horas después de 
la recogida, siempre que el mate rial que vaya a examinarse esté prot egido por medio de transpor te y que 
puedan respetarse los requisitos de temperatura durant e el transpor te. 
I.3.  Recogida de mater ial de diagnóstico suplementar io 
A reser va de la aprobación del laborat orio de diagnóstico, podrán extraerse y prepararse para un examen 
suplementar io tejid os de peces distintos de los mencionados en el punt o I.1. 
II.  Métodos y procedimientos de diagnóstico detallados para la vigilancia y para conf irmar o descar tar la sospecha 
de AIS 
Cuando se efectúe un examen de laboratori o con el fin de obtener o mantener un deter minado estatus sanitar io 
con respecto a la AIS con arreglo a la parte 3, sección I, del anex o I o para conf irmar o descar tar una sospecha 
de AIS de conf ormidad con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE utilizando los métodos de 
diagnóstico establecidos en la parte 3, sección II, del anex o I, se aplicarán los métodos y procedimiento s 
detallados establecidos en los siguient es puntos II.1 a II.5. 
II.1.  Examen de muestras por RT-PCR 
El métod o de diagnóstico que debe utilizarse para el cribado del VAIS será la RT-qPCR. Dado que los resultados 
de la RT-qPCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúa, se incluirán testigos y 
amplicones positiv os y negativos adecuados para evitar cualquier duda. 
II.1.1.  Extracción del ARN total 
Todos los trabajos con ARN se realizarán en hielo, utilizando guantes. 23.9.2015 L 247/49 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    El ARN total se extraerá utilizando el método del fenol-clorof ormo o columnas de afinidad, de acuerdo con las 
instr ucciones del fabricante. 
El ARN purificado se volverá a suspender en agua destilada libre de ribonucleasa (es decir , agua tratada con 
pirocarbonato de dietilo al 0,1 %). 
La concentración y la pureza del ARN extraído se estimarán midiendo la densidad óptica a 260 nm y a 280 nm. 
Un enfoque altern ativo podría ser incluir testig os internos dirigidos al genoma del virus, como se indica en el 
punto II.1.3. 
II.1.2.  RT-PCR para la detección del VAIS 
Para la amplificación del genoma del VAIS pueden utilizarse varios métodos de RT-PCR. Puede realizarse una 
prueba de RT-PCR en dos pasos en la que las reacciones RT y PCR se efectúen en dos tubos separados. Sin 
embargo, también podrá hacerse una reacción en un solo paso, con ambas reacciones en un tubo. Se empleará, 
siempre que sea posible, el método en un solo paso, ya que el ensa yo con un solo tubo minimiza el riesgo de 
contaminación cruzada, pues no precisa de ningún traslado de contenido y se considera tan sensible como el 
métod o en dos pasos. 
Se utilizarán los cebadores y el ensa yo descr itos en el present e punt o, a saber , la pareja de cebadores ILA1 
o ILA2, dirigidos al segmento 8 y que se han considerado adecuados para detectar el VAIS en brotes y en peces 
vect ores. El cebador inverso ILA2 no se une a cepas procedentes de Amér ica del Nor te y en estos casos se 
utilizará un par de cebadores altern ativo. 
Cebador directo (ILA1): 5′-GGCT ATCT ACCATGAA CGAA TC-3′. 
Cebador inverso (ILA2): 5′-GCCAA GTGT AAGTAGCA CTCC-3′. 
Sucesión de ciclos: Un ciclo a 50 °C durante 30 minutos, un ciclo a 94 °C durante 15 minutos, 40 ciclos 
a 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos; un ciclo a 72 °C durant e 
5 minutos. Tamaño del producto: 155 bp. 
Los resultados de la PCR pueden variar en función de las condiciones en las que se efectúe, es decir , puede que 
sea necesar io optimizar los protocolo s térm icos, dependiendo del term ociclador que se use. Por otra parte, 
pueden darse falsos positivos, debidos a un error de hibr idación del cebador o una contaminación en el 
laboratorio. En cada serie de placas se incluirán testigos negativ os y positivos. No obstante , podrán utilizarse, en 
su luga r, otras versiones de RT-PCR con eficacia similar demostrada. 
II.1.3.  RT-qPCR para la detec ción del VAIS 
El uso de la RT-qPCR puede aumentar la especificidad y probablement e también la sensibilidad. El método 
puede hacerse más rápidamente , ya que la fase de electrof oresis en gel no es necesar ia, y reduce el riesgo de 
contaminación cruzada, pues es posible estimar la cantidad de ARN del genoma del virus dentro del tubo de 
muestra. Una desventaja del ensa yo de RT-qPCR es que a menudo no es posible secuenciar product os 
amplificados. No obstante, en caso de duda sobre la especificidad del product o amp lificado, se realizará otro 
ensa yo específic o para el VAIS a fin de verificar el resultado. 
Se utilizará el ensa yo descr ito en el present e punto, dirigido al segmento 8. Este ensa yo será válido para las 
cepas procedent es de la Unión Europea, de países de la Asociación Europea de Libre Comercio y de Amér ica del 
Nor te. Se emp leará, siempre que sea posible, el método en un solo paso, ya que el ensa yo con un solo tubo 
minimiza el riesgo de contaminación cruzada. 
Cebador directo: 5′- CTACACAGCAGGA TGCA GATGT -3′. 
Cebador inverso: 5′- CAGGA TGCCGGAA GTCGA T -3′. 
Sonda: 5′-F AM- CATCGTCGCTGCA GTTC — MGBNFQ-3′. 
En cada serie de placas se incluirán testigos negativ os y positiv os. Sucesión de ciclos: Un ciclo a 50 °C durant e 
30 minutos, un ciclo a 95 °C durante 15 minut os, 40 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 
60 segundos. Se ajus tará en caso necesar io. Podrán utilizarse, en su lugar, otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR 
con eficacia similar demostrada. 23.9.2015 L 247/50 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    II.1.4.  Secuenciación de los productos de PCR amplificados 
Cebador directo (ILAs6-3F): 5′-A TGA GGGA GGT AGCA TTGCA -3′. 
Cebador inverso (ILAs6-2R): 5′-CA TGCTTTCC AACCTGCT AGGA -3′. 
En cada serie de placas se incluirán testig os negativ os y positivos. Sucesión de ciclos (RT-PCR de dos pasos): 
un ciclo a 50 °C durante 30 minutos, un ciclo a 94 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 94 °C durante 
30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 60 segundos, un ciclo a 72 °C durant e 5 minutos; se 
ajus tará en caso necesar io. Podrán utilizarse, en su luga r, otras versiones de RT-PCR o RT-qPCR con eficacia 
similar demostrada. 
Como altern ativa, podrá utilizarse el siguient e métod o para secuenciar la HPR en el segmento 6: 
Cebador directo: 5′-GA C-CAG-A CA- AGC- TTA-GGT -AA C-A CA-GA-3′. 
Cebador inverso: 5′-GA T-GGT -GGA-A TT-CTA-CCT -CTA-GA C-TTG- TA-3′. 
Tamaño del product o: 304 nt si HPR0. 
También podrán utilizarse ensa yos RT-PCR con sensibilidades y especificidades similares a los ensa yos descr itos 
en el present e punt o. 
La pureza del producto de la RT-PCR amp lificado se comprobará mediante electrof oresis en gel antes de la 
secuenciación. Si aparece solo un fragmento puro, se purificará directamente a partir de la PCR. Si están 
present es múltiples fragmentos amplificados, el fragment o de interés se purificará mediante electrof oresis en gel. 
La purificación de los fragmentos amplificados a partir de soluciones o geles de agarosa se efectuará utilizando 
columnas de afinidad para fragment os de PCR, de acuerdo con las instr ucciones del fabr icante . 
La secuenciación se realizará utilizando cebadores de ampli ficación en emp resas exte rnas especializadas. Los 
resultados se analizarán mediante la herramienta de búsqueda BLAST u las secuencias se compar arán a otras 
secuencias conocidas de la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biot écnica de los 
Estados Unidos (NCBI). 
La secuenciación eliminará cualquier duda sobre la especificidad de un producto amplificado de RT-PCR. 
II.2.  Aislamient o del VAIS en cultivo s celulares 
II.2.1.  Preparación de las muestras 
Los tejid os podrán manten erse a – 80 °C. Solo podrán cong elarse y descongelarse una vez antes de su examen. 
Con fines de vigilancia y control, el examen se llevará a cabo con la mayor rapidez posible. 
Cada muestra conjunta de tejidos en solución de transpor te será compl etamente homogeneizada con un 
homog eneizador validado y se centr ifugará a entre 2 000 y 4 000 × g durant e 15 minutos a 0-6 °C; el 
sobrenadante se filtrará (0,45 μm) y se incubará en un volumen igual de una mezcla adecuadamente diluida de 
antisueros contra los serotipos locales del VNPI. El valor del antisuero será de al menos 1:2 000 en una prueba 
de neutralización en placa al 50 %. La mezcla se incubará durant e una hora a 15 °C. Esto representará el 
inóculo. 
El tratamiento de todos los inóculos con antisuero contra el VNPI (que en algunas partes de Europa se 
encuentra en un 50 % de las muestras de peces) tiene por objeto evitar que el VNPI produzca ECP en los 
cultivo s celulares inoculados. Este tratamiento puede realizarse para reducir la duración de los exámenes 
virológicos, así como el número de casos en los que el ECP tendría que considerarse potencialment e indicativo 
del VAIS. Cuando las muestras procedan de unidades de producción que se consideran libres de NPI, podrá 
omitirse el tratamiento de los inóculos con antisuero contra el VNPI. 
II.2.2.  Inoculación en cultivo s celulares 
Para el aislamient o primar io del VAIS se utilizarán células de riñón de salmón del Atlántico (ASK). Podrán 
utilizarse otras líneas celulares de eficacia y sensibilidad demostradas para aislar el VAIS, teniendo en cuenta la 
variabilidad de las cepas y su capacidad de replicarse en distintas líneas celulares. Las células de ASK parecen 
sopor tar el aislamiento y el crecimiento de las cepas de virus conocidas hasta la fecha, en la medida en que se 
utilice un número poco elevado de pasadas. En las células de ASK puede aparecer un ECP más claro que en 
otras líneas celulares sensibles, como SHK -1 (riñón anterior de salmón-1). 23.9.2015 L 247/51 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Las células de ASK (65 pasadas o menos) se cultivarán en un medio L-15 que conteng a 10 % de suero bovino 
fetal, 2 % (v/v) de L-glutamina 200 mM y 0,08 % (v/v) de 2-mercap toetanol 50 mM, en placas con múltiples 
pocillos. Se inoculará la suspensión de órganos tratada con antisuero en cultivos celulares jóvenes en 
crecimiento activo hasta obte ner una dilución final del mater ial tisular en el medio de cultivo de 1:1 000. Para 
cada órgano, 40 μl de la suspensión de inóculo se añadirán a un pocillo que cont enga 2 ml de medio de cultivo . 
Para minimizar el riesgo de contaminación cruzada, se utilizarán placas separadas de doce o veinticuatro 
pocillos para las muestras procedent es de distint os lugar es de las explotaciones piscícolas. 
Se dejará una placa sin inocular como testigo negativ o. Otra placa se inoculará con una cepa de referen cia del 
VAIS como testigo positivo, conf orme al siguiente procedimiento . Se inoculará en el primer pocillo 100 μl de 
una preparación madre de VAIS (valor mínimo 107 dosis infecciosas del 50 % del cultivo tisular [DICT50 ml– 1]) 
y se mezclará. Un volume n de este mater ial se trasladará del primer pocillo al segundo para hacer una dilución 
a 1:10 y se mezclará. Esto se repetirá en toda la placa para hacer seis diluciones a 1:10. La preparación madre 
de VAIS puede almacenarse a – 80 °C durant e al menos dos años, pero una vez descong elada deberá utilizarse 
en un plazo de tres días. Se tom arán precauciones para evitar la contaminación cruzada de las placas de ensa yo 
con mater ial testigo positiv o. Para impedir este riesgo, los testigos positiv os se prepararán y manipularán por 
separado de las placas de ensa yo. En lugar de incluir un testigo positiv o en cada inoculación, puede optarse por 
hacer cada seis meses una prueba de sensibilidad de las células de ASK frente al VAIS. 
Las muestras se incubarán a 15 ± 2 °C durante un máximo de 15 días. Para obser var si se ha producido ECP, los 
cultivo s celulares se examinarán al microscopio en dos ocasiones, entre 5 y 7 días y entre 12 y 14 días después 
de la inoculación. Si alguna muestra conjunta presenta ECP, se iniciarán inmediatament e los procedimiento s de 
identif icación del virus de conf ormidad con el punt o II.2.4. Si no se obser va ECP hasta el día 14, se efectuará 
una prueba de inmunof luorescencia indirecta (IFAT), una hemadsorción o una prueba de RT-PCR. 
II.2.3.  Subcultivo 
El subcultivo se llevará a cabo entre los días 13 y 15. Se añadirá sobrenadant e de cultivo en los pocillos que 
conte ngan células frescas en crecimient o activo en una dilución adecuada (1:10) en placas con múltiples pocillos 
y se incubará a 14 ± 2 °C durante un máximo de 18 días. Para obser var si se ha producido ECP, los cultivo s 
celulares se examinarán al microscopio en dos ocasiones, entre 5 y 7 días y entre 14 y 18 días después de la 
inoculación. Si alguna muestra conjunta presenta ECP, se iniciarán inmediatamente los procedimiento s de identi ­
ficación del virus de conf ormidad con el punt o II.2.4. Si no se obser va ECP entre los días 14 y 18, se efectuará 
una hemadsorción o una prueba de RT-PCR. 
Si la citot oxicidad se produce en los primeros siete días de incubación, se realizará un subcultivo en esa fase, y 
las células se incubarán entre 14 y 18 días y volverán a subcultivarse durante otra período de entre 14 
y 18 días. Si la citot oxicidad se produce después de siete días, se realizará un solo subcultivo y las células se 
incubarán hasta alcanzar el período total de 28 a 36 días de incubación de la inoculación primar ia. 
Si se produce contaminación bacte riana del cultivo primar io, se repetirá la prueba utilizando el homog eneizado 
de tejid os almacenado a – 80 °C. Antes de la inoculación, el homog eneizado de tejid os se centr ifugará a 
4 000 × g durante 15 a 30 minutos a entre 0 y 6 °C, y el sobrenadante se filtrará a 0,22 μm. Si se produce 
contaminación bact eriana durante la fase de subcultivo, el sobrenadante se filtrará a 0,22 μm, se inoculará en 
células frescas y se incubará durante otros 14 a 18 días. 
II.2.4.  Pruebas de identificación del virus 
Si se obser va ECP en cualquier fase o si la prueba de hemadsorción es positiva, se llevará a cabo la identificación 
del virus. Los métod os prefe ribles para la identif icación del VAIS serán la de RT-PCR de conf ormidad con el 
punto II.1 y la inmunof luorescencia (IF) de conf ormidad con el punto II.2.6. Si se considera que puede haber 
otros virus, se realizarán pruebas suplementar ias de identif icación de virus. En caso de que tales pruebas no 
proporcionen una identif icación definitiva del virus en el plazo de una semana, el sobrenadant e se enviará para 
su identificación inmediata: 
a)  al laborat orio de referencia para la AIS de la Org anización Mundial de Sanidad Animal (OIE), o 
b)  a un laborat orio nacional de referencia o al laboratori o de referencia de la UE para las enfermedades de los 
peces al que se refiere el anex o VI de la Directiva 2006/88/CE. 
II.2.5.  Hemadsorción 
Como la replicación del VAIS en cultivos celulares no siempr e produce ECP, cada pocillo se somet erá a una 
prueba de RT-PCR o de hemadsorción de conf ormidad con el presente punt o, o a una prueba IF con arreglo al 
punto II.2.6. 23.9.2015 L 247/52 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    El medio de cultivo celular se retirará de cada pocillo, incluidos los testigos positivos y nega tivos, y se 
introducirá en tubos estér iles. En cada pocillo se añadirán 500 μl de una suspensión al 0,2 % (v/v) de eritrocitos 
lavados de conejo o de caballo, o de una suspensión a 0,05 % (v/v) de eritrocitos lavados de trucha arco iris o 
de salmón del Atlántico, y se incubarán a temperatura ambient e durant e 45 minutos. Se retirarán los eritrocitos 
y los pocillos se lavarán dos veces con medio L-15. Se examinará cada pocillo al microscopio. 
La presencia de aglomerados de eritrocit os adher idos a la superf icie de las células de ASK se considerará un 
indicio de presunta infección por un ortomix ovirus. Si la prueba de hemadsorción es positiva, se realizará 
inmediatament e una prueba de identificación del virus de conf ormidad con el punto II.2.4. 
II.2.6.  Inmunof luorescencia (IF) 
Las células de ASK (65 pasadas o menos) se cultivarán en un medio L-15 que conteng a 10 % de suero bovino 
fetal, 2 % (v/v) de L-glutamina 200 mM y 0,08 % (v/v) de 2-mercap toetanol 50 mM en placas con múltiples 
pocillos y se utilizarán a más del 50 % de conf luencia. También podrán utilizarse otras líneas celulares o medio 
de cultivo de eficacia demostrada. En cada uno de dos pocillos se añadirán 225 μl de sobrenadant e de cultivo 
presuntament e infectado con el virus, se mezclará y se transferirán 225 μl a otros dos pocillos, alcanzando una 
dilución de 1:5. Otros dos pocillos se dejarán sin inocular como testigos. Las muestras de peces de cada 
explotación se manipularán en placas separadas, así como el testig o del virus. Se establecerá un testigo 
utilizando una cepa de referencia del VAIS. 
Las placas se incubarán a 14 ± 2 °C y se examinarán al microscopio durante un máximo de 7 días. Cuando el 
ECP aparezca tempranamente, o si no se obser va en 7 días, el próximo paso será la fijación. Los pocillos se 
lavarán con PBS y se fijarán mediante incubación con un 80 % de acet ona durante 20 minutos a temperatura 
ambient e. Las placas se secarán al aire y se teñirán inmediatament e o se almacenarán a 0-6 °C durante no más 
de 24 horas antes de realizar la tinción. 
Los pocillos replicados se teñirán con una mezcla de anticuer pos monoclonales (AcM) 3H6F8 y 1OC9F5 contra 
el VAIS, u otros AcM de eficacia y especificidad demostradas, diluidos en PBS, y se incubarán a 37 ± 4 °C 
durante 30 minutos. Los AcM se retirarán y las placas se lavarán tres veces con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Se 
añadirá en cada pocillo FITC conjugado con anti-IgG de ratón, diluido en PBS, y se incubará a 37 ± 4 °C 
durante 30 minutos. Las diluciones de diferentes lotes de AcM y conjugado FITC se optimizarán en cada 
laboratorio. El anticuer po se retirará y las placas se lavarán tres veces con 0,05 % de Tween 20 en PBS. 
Los pocillos se examinarán inmediatament e con un microscopio invertido equipado para microscopía de 
fluorescencia con un filtro adecuado para la excitación del FITC. La prueba se considerará positiva si se 
obser van células fluorescentes . Para que la prueba sea válida, los testig os positivos deberán dar resultados 
positiv os y los testigos negativ os, resultados negativos. 
II.3.  Examen de otros tejid os 
La técn ica del punt o II.2.6 podrá aplicarse a otros tejidos de peces como el hígado, el bazo y el corazón, 
siempre que una cantidad razonable de células endoteliales, leucocitos o linfocitos pueda depositarse en el 
portaobjetos. El procedimiento de tinción será el mismo para cada tejido, aunque para algunos puede ser 
prefer ible omitir la tinción con yoduro de propidio y limitarse a la iluminación en fase para identificar los tipos 
de células present es en la impronta. 
II.4.  Estudio histo lógico 
Se harán cortes incluidos en paraf ina de 5 μm y se teñirán con hemato xilina y eosina. 
Los cambios histo lógicos en salmón del Atlántico clínicament e enfe rmo son variables: 
a)  numerosos eritrocitos en el seno venoso central y en los capilares laminares de las branquias, donde también 
pueden formarse trombos de eritrocitos ; 
b)  petequia s multif ocales a conf luyent es, necrosis de hepatocit os o ambas a cierta distancia de los vasos más 
grandes del hígad o; acumulación multif ocal de eritrocit os en sinusoides hepáticos dilatados; 23.9.2015 L 247/53 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    c)  acumulación de eritrocitos en los vasos sanguíneos de la lámina propia intest inal y, a la larga, hemor ragia en 
la lámina propia; 
d)  estroma del bazo distendido por acumulación de eritrocitos; 
e)  hemor ragia inter sticial de ligera y multif ocal a extensa y difusa, con necrosis tubular en las zonas 
hemor rágicas y acumulación de eritrocitos en los glomér ulos renales; 
f)  eritrof agocitosis esplénica y hemor ragias secundar ias en hígado y riñón. 
II.5.  Inmunohist oquímica (IHC) 
Se utilizarán anticuer pos policlonales contra la nucleoprot eína del VAIS en cortes de tejid os incluidos en 
parafina y fijados en formol. Los órganos examinados serán el riñón medio y el corazón (zona de transición, 
incluidas las tres cámaras y las válvulas). Los casos sospech osos debido a signos patoló gicos se verificarán con 
una IHC positiva. Los cortes histo lógicos se prepararán conf orme a métodos normalizados.  
1) Preparación de los cortes de tejidos 
Los tejidos se fijarán en formol neutro al 10 % con solución amor tiguadora de fosfato durante al menos un 
día, se deshidratarán en series de etanol escalonadas, se aclararán en xileno y se incluirán en paraf ina de 
acuerdo con protocolo s normalizados. Los cortes de apro ximadamente 5 µm de espesor (colocados para la 
IHC en portaobjetos cubier tos de poli-L-lisina) se calentarán a 56-58 °C (máximo 60 °C) durante 20 minutos 
y serán desparaf inados en xileno, rehidratados en series de etanol escalonadas y teñidos con hemat oxilina y 
eosina para el estudio anat omopatoló gico y la IHC con arreglo al punto 2.  
2) Procedimiento de tinción para IHC 
Todas las incubaciones se llevarán a cabo a temperatura ambient e sobre una plataf orma oscilante, a no ser 
que se indique lo contrar io. 
a)  La recuperación del antíg eno se hará hirviendo cortes en amor tiguador de citrato 0,1 M (pH 6,0) durant e 
2 × 6 minutos y bloqueándolos a continuación con un 5 % de leche en polvo desnatada y un 2 % de 
suero de cabra en TBS 50 mM (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6) durante 20 minutos. 
b)  A continuación, los cortes se incubarán durant e una noche con anticuer po primar io (anticuer po de 
conejo monoespecífico contra la nucleoprot eína del VAIS) diluido en TBS con un 1 % de leche en polvo 
desnatada, y se lavarán tres veces con TBS con Tween 20 al 0,1 %. 
c)  Para la detección de anticuer pos unidos, los cortes se incubarán con anticuer pos anti IgG de 
conejo conjug ados con fosfatasa alcalina durante 60 minutos. Tras un lavado final, se añadirá Fast Red 
(1 mg/ml– 1) y Naphtol AS-MX fosfato (0,2 mg/ml– 1) con levamisol 1 mM en TBS 0,1 M (pH 8,2) para el 
revelado durant e 20 minutos. Después, los cortes se lavarán en agua del grifo antes de aplicar la tinción 
de contraste con hemat oxilina de Harris, y se montarán en medio de monta je acuoso. Se incluirán cortes 
de tejido positiv os y negat ivos al VAIS como testigos en cada realización.  
3) Interp retación del resultado de la IHC 
La interpr etación del resultado de la IHC será la que se establece en las letras a) y b): 
a)  Los cortes testigo se considerarán positiv os si presentan una coloración citoplasmática e intranuclear roja 
o rojiza claramente visible de las células endotelia les de los vasos sanguíneos o el endocardio. Un corte de 
muestra de ensa yo solo se considerará positivo si se obser va esa clara coloración roja intranuclear de las 
células endoteli ales. 
b)  Los cortes testigo se considerarán negativ os si no presentan ninguna reacción de color importante. 
Dado que la localización intranuclear es propia de la nucleoprot eína del ortomix ovirus durante la fase de 
replicación del virus, pero a menudo domina una tinción citoplasmática simultánea, las tinciones citoplas ­
máticas y otros patrones de tinción sin localización intranuclear se considerarán inespecífi cos o inconclu ­
yent es. 23.9.2015 L 247/54 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Las reacciones de tinción positivas más fuer tes se suelen obtener en células endoteli ales del corazón y el 
riñón. Las reacciones de tinción endoteli al en el interi or de lesiones hemor rágicas muy extensas pueden ser 
ligeras o estar ausentes, posiblemente por lisis de las células endoteliales infec tadas. 
PARTE 4 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTICO DET ALL ADOS PARA LA VIGIL ANCIA Y CONFIRMA CIÓN DE LA 
INFECCIÓN POR MARTEILIA REFRINGENS 
I.  Métodos y procedimientos detallados para el diagnóstico de la infecci ón por Mar teilia refringens 
Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratori o con el fin de obtener o manten er una 
calif icación sanitar ia con respecto a la infec ción por Mar teilia refringens con arreglo a la parte 4, sección I, del 
anex o I o para conf irmar o descar tar esta enfe rmedad de la lista de conf ormidad con el artículo 57, letra b), de 
la Directiva 2006/88/CE utilizando los métod os de diagnóstico establecidos en la parte 4, sección II, del anex o I, 
se aplicarán los métod os y procedimientos de diagnóstico detallados establecidos en los puntos I.1, I.2 y I.3 de 
la present e parte. 
I.1.  Procedimient o de muestreo 
Se tomar án prioritariament e muestras de moluscos mor ibundos o recién muer tos, a fin de aumentar las posibi ­
lidades de hallar animales infectados. 
Las muestras de ostras o mejillones se mantendrán a 4 °C o en hielo refrigerado durant e no más de 24 horas si 
contienen moluscos mor ibundos, y no más de 72 horas si no, en una bolsa de plástico etiquetada con datos 
sobre la naturaleza y el origen de las ostras o mejillones. Los moluscos mor ibundos o recién muer tos se 
manten drán separados de otros moluscos. 
Para el diagnóstico de Mar teilia refringens por estudio histológico se utilizará un corte de entre 3 y 5 mm de 
espesor de tejidos que incluya branquias y tejido cardíaco. Para algunas pruebas, incluidas las improntas y 
la PCR, se utilizará un fragmento de la glándula digestiva. 
I.2.  Técnicas de microscopía 
I.2.1.  Citodiagnóstico (por impronta) 
Tras el secado de los tejid os de glándula digestiva en papel absorbent e, se realizarán varias improntas sobre un 
portaobjetos de vidr io. Las preparaciones se secarán al aire, se fijarán en metanol o en etanol absoluto y se 
teñirán utilizando un kit de tinción sanguínea disponible en el comercio, como Diff-Quik® o Hemacolor®, de 
acuerdo con las instr ucciones del fabricante. Tras un lavado con agua del grifo y un secado, se montarán los 
portaobjetos con un cubreobjet os utilizando una resina sintét ica apropiada. El examen de los portaobjetos se 
realizará primero a 200 aumentos, y luego con microscopía de inmersión en aceit e a 1 000 aument os. 
Un resultado positivo será la obser vación de células de un tamaño de hasta 30-40 μm. El citoplasma adquiere 
una tinción basóf ila, mientras que la tinción del núcleo es eosinóf ila. Se obser van halos pálidos alrededor de 
gránulos grandes, intensamente teñidos (refr ingent es) y, en las células más grandes, disposiciones de células 
dentro de células. 
La técn ica no es específi ca para esta especie de parásito. 
I.2.2.  Estudio histo lógico 
Los cortes de tejid o, que incluirán branquias, glándula digestiva, manto y gónadas, se fijarán durante al menos 
24 horas en fijador de Davidson, tras lo cual se realizará el tratamient o normal para estudio histo lógico en 
parafina y la tinción, por ejemp lo con hemat oxilina y eosina. Las obser vaciones se efectuarán a aumentos 
crecient es hasta × 1 000. 
Un resultado positivo será la obser vación de células de un tamaño que va de 4 a 40 μm. Las fases iniciales 
consisten en células multinucleadas, esféric as a alargadas. Estas se encuentran principalmente en el epitelio del 
esófago o el estómago y, a veces, en los palpos labiales. La espor ulación compor ta la división de células dentro 
de células y tiene lugar en los túbulos y conduct os de la glándula dige stiva. Aparecen gránulos refringent es en el 
curso de la espor ulación, pero no se obser van en las fases iniciales. En las fases avanzadas de la infección se 
obser van esporangios libres en la luz del tubo dige stivo. El citoplasma adquiere una tinción basóf ila, mientras 
que la tinción del núcleo es eosinófila. Los gránulos pueden adquir ir una coloración entre naranja oscuro y rojo 
oscuro. 
La técn ica no es específi ca para esta especie de parásito. 23.9.2015 L 247/55 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.3.  Técnicas moleculares 
I.3.1.  Extracción del ADN 
El ADN se extraerá con arreglo a procedimiento s normalizados. 
Pueden utilizarse kits de extracción del ADN, que están disponibles en el comercio y suelen producir ADN de 
alta calidad adecuado para su uso con los prot ocolos de PCR conte mplados en el punto I.3.2. 
I.3.2.  Reacción en cadena de la polimer asa (PCR) 
Se han elaborado y publicado varios prot ocolos de PCR. 
Se utilizarán los cebadores de PCR dirigidos a la región del ITS1 (espaciador transcr ito intern o), por su 
capacidad de amplificar únicamente la especie M. refringens. 
La PCR se realizará en un volumen de 50 µl. Las mezclas de PCR cont endrán solución amor tiguadora 
(KCl 500 mM, Tris/HCl 100 mM [pH 9,0 a 25 °C] y un 1 % de Triton® X-100), MgCl2 2,5 mM, mezcla de 
dNTP 0,2 mM, cebadores direct o e inve rso 1 μΜ, 0,02 unidades μl– 1 de Taq ADN polimerasa y 10 a 100 ng de 
ADN extraído. Tras la desnaturalización del ADN a 94 °C durante 5 minutos, se realizan 30 ciclos como sigue: 
desnaturalización a 94 °C durante 1 minuto, hibr idación a 55 °C durante 1 minuto y elongaci ón a 72 °C 
durante 1 minuto por cada par de kilobases. Se realiza un paso final de elongaci ón de 10 minutos a 72 °C. Para 
la detec ción de M. refringens, se realiza una PCR con cebadores dirigidos a la región del ITS1 (5′-CCG-C AC- 
ACG- TTC- TTC-A CT-CC-3′ y 5′-CTC-GCG-A GT-TTC-GA C-A GA-CG-3′). 
Los testigos positiv os consistirán en ADN genómico procedent e de un hospedador con una infec ción intensa 
o ADN plasmídico que contiene la región objetivo. 
Los testig os negativ os consistirán en ADN genómico procedente de hospedadores no infectados y reactiv os de la 
PCR sin ADN objetivo. 
Un resultado positiv o será una amplificación de PCR positiva de la magnitud esperada (412 bp), al tiempo que 
todos los testigos negativ os producen resultados negativ os y todos los testigos positivos dan resultados 
positiv os. 
I.3.3.  Hibr idación in situ 
Se han elaborado y publicado varios prot ocolos de hibr idación in situ. 
Se utilizará una sonda dirigida a la subunidad pequeña (SSU) del complejo génico del ARNr , ya que ha sido 
validada frente al estudio histo lógico. 
Los cortes de tejido, que incluirán branquias y glándula diges tiva, se fijarán durante al menos 24 horas en 
fijador de Davidson, tras lo cual se realizará el tratamient o normal para estudio histo lógico en parafina. Los 
cortes de 5 µm de espesor se colocarán sobre portaobjet os con recubr imiento de aminoalquilsilano, que se 
hornearán durante una noch e a 40 °C. Los cortes se desparaf inarán mediante inmersión en xileno durante 
10 minutos. Este paso se repetirá una vez y luego se eliminará el disolvente mediante inmersión en dos baños 
sucesivos de etanol absoluto de 10 minutos cada uno. Luego se deshidratarán los cortes mediante inmersión en 
series de etanol escalonadas. Los cortes se tratarán con prot einasa K (100 μg ml– 1) en amor tiguador TE (Tris 
[50 mM], EDT A [10 mM]), a 37 °C durante 30 minutos. Los portaobjetos se deshidratarán mediante inmersión 
en series de etanol escalonadas y luego se secarán al aire. Los cortes se incubarán con 100 μl de amor tiguador 
de hibr idación (4 × SSC [citrato salino estándar], 50 % de formamida, 1 × solución de Denhardt, 250 µg ml– 1 
de ARNt de levadura, 10 % de sulfat o de dextrano) que conte ngan 10 ng (1 µl del reactant e PCR preparado 
como se descr ibe en el punt o I.3.2 y utilizando los cebadores CCG-GTG-CC A-GGT -ATA-TCT -CG y TTC-GGG- 
TGG- TCT -TGA-AA G-GC) de la sonda marcada con digo xigenina. Los cortes se cubr irán con cubreobjetos de 
plástico in situ y se colocarán en un bloque de calentamiento a 95 °C durante 5 minutos. A continuación se 
enfr iarán los portaobjetos en hielo durante 1 minuto antes de una hibr idación durant e una noch e a 42 °C en 
cámara húmeda. Los cortes se lavarán dos veces durante 5 minutos en 2 × SSC a temperatura ambient e y una 
vez durante 10 minutos en 0,4 × SSC a 42 °C. Los pasos de detección se realizarán de acuerdo con las instr uc­
ciones del fabr icante. Luego se enjuagarán los portaobjet os en agua destilada (dH2O) estér il. Se aplicará una 
tinción de contraste a los cortes con Bismarck Brown Yellow; los cortes se enjuagar án en dH2O y se aplicarán 
cubreobjetos utilizando un medio de monta je acuoso. 
Los testigos positivos y negat ivos serán cortes de hospedadores de los que se sepa, respectivamente , que están 
infectados y que no están infectados. 23.9.2015 L 247/56 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Un resultado positivo se mostrará en un marcado de color violeta-negro de las células de M. refringens dentro de 
los tejidos objetivo conocidos, al tiempo que todos los testigos negat ivos producen resultados negativ os y todos 
los testigos positiv os dan resultados positiv os. 
I.3.4.  Secuenciación 
La secuenciación se llevará a cabo como uno de los pasos finales para el diagnóstico de conf irmación. Las 
regiones objetivo serán la SSU del ADNr y el ITS1. 
II.  Métodos y procedimientos detallados para la vigilancia y conf irmación de la infección por Mar teilia refringens 
A los efect os de los programas de vigilancia y para confir mar una infección por Mar teilia refringens o descar tar 
una sospec ha de dicha enfer medad de la lista de conf ormidad con los requisitos de la parte 4, sección II, del 
anex o I, los métodos de diagnóstico y procedimiento s correspondiente s se ajus tarán a las directr ices del 
cuadro 4.1. 
Cuadro 4.1 
Directr ices para el uso de los métodos de diagnóstico en los prog ramas de vigilancia y para descar tar o 
conf irmar la infección por Mar teilia refringens 
Méto do Vigilancia específica Diagnóstico de 
presunción Diagnóstico de 
confir mación 
Imp rontas de glándula diges tiva X X X, o 
Histopat ología X  X, o 
Hibr idación in situ   X, y 
PCR X X X, y 
Secuenciación   X  
PARTE 5 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTICO DET ALL ADOS PARA LA VIGIL ANCIA Y CONFIRMA CIÓN DE LA 
INFECCIÓN POR BONAMIA OSTREAE 
I.  Procedimientos de diagnós tico de la infección por Bonamia ostr eae 
Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratori o con el fin de obtener o manten er una 
calif icación sanitar ia con respecto a la infección por Bonamia ostreae con arreglo a la parte 5, sección I, del 
anex o I o para conf irmar o descar tar esta enfe rmedad de la lista de conf ormidad con el artículo 57, letra b), de 
la Directiva 2006/88/CE utilizando los métod os de diagnóstico establecidos en la parte 5, sección II, del anex o I, 
se aplicarán los métodos y procedimientos de diagnóstico detallados establecidos en los siguient es punt os I.1, 
I.2 y I.3. 
I.1.  Proceso de muestreo 
Se tomar án prioritariament e muestras de moluscos mor ibundos o recién muer tos, a fin de aumentar las posibi ­
lidades de hallar animales infectados. 
Las muestras de ostras se manten drán a 4 °C o en hielo refrigerado durant e no más de 24 horas si contienen 
moluscos mor ibundos, y 72 horas si no, en una bolsa de plástico etiquetada con datos sobre la naturaleza y el 
origen de las ostras. Los moluscos mor ibundos o recién muer tos se manten drán separados de otros moluscos. 
Para el diagnóstico de Bonamia ostreae por estudio histo lógico se utilizará un corte de entre 3 y 5 mm de espesor 
de tejid os que incluya branquias y tejido cardíaco. Para algunas pruebas, incluidas las improntas y la PCR, se 
utilizará un fragmento de la glándula digestiva. 23.9.2015 L 247/57 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    I.2.  Técnicas de microscopía 
I.2.1.  Citodiagnóstico (por impronta) 
Tras el secado de las branquias o el tejido cardíaco en papel absorbente, se realizarán varias improntas sobre un 
portaobjetos de vidr io. Los portaobjetos se secarán al aire, se fijarán en metanol o en etanol absoluto y se 
teñirán utilizando un kit de tinción sanguínea disponible en el comercio, como Diff-Quik® o Hemacolor®, de 
acuerdo con las instr ucciones del fabricante. Tras un lavado con agua del grifo y un secado, se montarán los 
portaobjetos con un cubreobjet os utilizando una resina sintét ica apropiada. El examen de los portaobjetos se 
realizará primero a 200 aumentos, y luego con microscopía de inmersión en aceit e a 1 000 aument os. 
Un resultado positiv o será la presencia de pequeños cuer pos esférico s u orga nismos ovoides (2-5 μm de 
anch ura) dentro de los hemocitos. No obstante, el parásito también puede ser exterior a las células. Estos 
organismos muestran un citoplasma basófilo y un núcleo eosinóf ilo (los colores pueden variar en función de la 
tinción usada) y, dado que se extienden sobre el portaobjetos, pueden parecer más anchos en las improntas que 
en el examen histo lógico. Podrán obser varse células multinucleadas. La técnica no es específi ca para esta especie 
de parásito. 
I.2.2.  Estudio histo lógico 
Los cortes de tejido, que incluirán branquias y glándula diges tiva, se fijarán durante al menos 24 horas en 
fijador de Davidson, tras lo cual se realizará el tratamiento normal para estudio histológico en paraf ina 
y la tinción, por ejemplo con hemato xilina y eosina. Las obser vaciones se efectuarán a aumentos crecient es 
hasta × 1 000. 
Un resultado positivo será la presencia de parásitos como células muy pequeñas de 2 a 5 µm de anchura dentro 
de los hemocitos o libres en el tejid o conjuntiv o o los senos de las branquias, el intest ino y el epitelio del 
manto , a menudo asociados con una intensa reacción inflamatori a. Para evitar posibles dudas, el diagnóstico 
será positiv o solo si el parásit o se obser va dentro del hemocito. La técn ica no es específica para esta especie de 
parásito. 
I.3.  Técnicas moleculares 
I.3.1.  Extracción del ADN 
El ADN se extraerá con arreglo a procedimiento s normalizados. 
Pueden utilizarse kits de extracción del ADN, que están disponibles en el comercio y suelen producir ADN de 
alta calidad adecuado para su uso con los prot ocolos de PCR que más abajo se detallan. 
I.3.2.  Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
Se han elaborado y publicado varios prot ocolos de PCR. 
Podrán utilizarse dos protocolo s de PCR dirigidos a la SSU del ADNr: 
a)  El primero consiste en una PCR convencional que amplifica varios miembros del filo Haplospor idia, 
incluida Bonamia spp.Los cebadores designados Bo-Boas serán 5′-CA T-TTA-A TT-GGT -CGG-GCC-GC-3′ 
y 5′-CTG-A TC-GTC- TTC-GA T-CCC-CC-3′ respectivamente , y amplificarán un producto de 300 bp. Las 
mezclas de PCR cont endrán solución amor tiguadora (KCl 500 mM, Tris/HCl 100 mM [pH 9,0 a 25 °C] y 
un 1 % de Triton® X-100), MgCl2 2,5 mM, mezcla de dNTP 0,2 mM, cebadores directo e inverso 1 μΜ, 
0,02 unidades μl– 1 de Taq ADN polimerasa y 0,2 ng µl– 1 del molde de ADN en un volumen tota l de 50 µl. 
Las muestras serán desnaturalizadas en un term ociclador durante 5 minutos a 94 °C antes de ser sometidas a 
30 ciclos (94 °C durant e 1 minuto, 55 °C durant e 1 minuto, 72 °C durante un minut o), seguidos de una 
extensi ón final de 10 minutos a 72 °C. 
Los testigos positivos consistirán en ADN genómico procedent e de un hospedador con una infección intensa 
o ADN plasmídico que contiene la región objetivo. 
Los testigos nega tivos consistirán en ADN genómico procedente de hospedadores no infectados y reactiv os 
de la PCR sin ADN objetivo. 
Un resultado positivo será una ampli ficación de PCR positiva de la magnitud esperada (300 bp), al tiempo 
que todos los testigos negat ivos producen resultados negativos y todos los testigos positiv os dan resultados 
positiv os. 23.9.2015 L 247/58 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    b)  El segundo protocolo de PCR es un ensa yo en tiempo real con SYBR® Green. Permite la detección específi ca 
de B. ostreae (descr ita abajo) y puede combinarse con un ensa yo de PCR en tiempo real con SYBR® Green, 
que permite la detección específica de B. exitiosa (Ram ilo et al. 2013). 
Los cebadores BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGT A-3′) y BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAA TTT ­
TATCGT -3′) ampli fican un product o de 208 bp. Las mezclas de PCR cont endrán SYBR® Green Maste r Mix 
(1X), 0,3 µm de cebadores direct o e inverso y 200 ng de ADN extraído. Las muestras se desnaturalizarán en 
un sistema de detección en tiempo real durante 10 minutos a 95 °C antes de ser sometidas a 35 ciclos 
(95 °C durant e 30 segundos, 55 °C durante 45 segundos y 72 °C durant e 1 minuto). El análisis de la curva 
de temperatura de fusión se llevará a cabo con incrementos de temperatura de 0,5 °C/s, emp ezando a 55 °C 
y finalizando a 95 °C, y registrando la fluorescencia en cada cambio de temperatura. 
Los testigos positivos consistirán en ADN genómico procedent e de un hospedador con una infección intensa 
o ADN plasmídico que cont enga la región objetivo. 
Los testigos nega tivos consistirán en ADN genómico procedente de hospedadores no infectados y reactiv os 
de la PCR sin ADN objetivo. 
Un resultado positivo será una amplificación de PCR con un pico único de temperatura de fusión 
(78,25 ± 0,25 °C en las condiciones publicadas por Ramilo et al. 2013), al tiempo que todos los testigos 
negativ os producen resultados negativ os y todos los testig os positiv os dan resultados positivos. 
I.3.3.  Hibr idación in situ 
Se han elaborado y publicado varios prot ocolos de hibr idación in situ. 
Se utilizará una sonda dirigida a la SSU del compl ejo génico del ADNr , si bien se ha demostrado que da lugar a 
reacciones cruzadas con otros haplospor idios. 
Los cortes de tejido, que incluirán branquias y glándula diges tiva, se fijarán durante al menos 24 horas en 
fijador de Davidson, tras lo cual se realizará el tratamient o normal para estudio histo lógico en parafina. Los 
cortes de 5 µm de espesor se colocarán sobre portaobjet os con recubr imiento de aminoalquilsilano, que se 
hornearán durante una noch e a 40 °C. Los cortes se desparaf inarán mediante inmersión en xileno durante 
10 minutos. Este paso se repetirá una vez y luego se eliminará el disolvente mediante inmersión en dos baños 
sucesivos de etanol absoluto de 10 minutos cada uno. Luego se deshidratarán los cortes mediante inmersión en 
series de etanol escalonadas. Los cortes se tratarán con prot einasa K (100 μg ml– 1) en amor tiguador TE (Tris 
[50 mM], EDT A [10 mM]), a 37 °C durante 30 minutos. Los portaobjetos se deshidratarán mediante inmersión 
en series de etanol escalonadas y luego se secarán al aire. Los cortes se incubarán con 100 μl de amor tiguador 
de hibr idación (4 × SSC [citrato salino estándar], 50 % de formamida, 1 × solución de Denhardt, 250 µg ml– 1 
de ARNt de levadura, 10 % de sulfato de dextrano) que conte ngan 20 ng (2 µl de la PCR preparada como se 
descr ibe en el punt o I.3.2 utilizando los cebadores Bo y Boas) de la sonda marcada con digo xigenina. Los cortes 
se cubr irán con cubreobjet os de plástico in situ y se colocarán en un bloque de calentamiento a 95 °C durante 
5 minutos. A continuación se enfr iarán los portaobjetos en hielo durante 1 minuto antes de una hibr idación 
durante una noche a 42 °C en cámara húmeda. Los cortes se lavarán dos veces durant e 5 minutos en 2 × SSC a 
temperatura ambient e y una vez durant e 10 minutos en 0,4 × SSC a 42 °C. Los pasos de detección se realizarán 
de acuerdo con las instr ucciones del fabricante . Luego se enjuagar án los portaobjet os en agua destilada (dH2O) 
estéril. Se aplicará una tinción de contrast e a los cortes con Bismarck Brown Yellow; los cortes se enjuagarán en 
dH2O y se aplicarán cubreobjet os utilizando un medio de montaje acuoso. 
Los testigos positivos y negat ivos serán cortes de hospedadores de los que se sepa, respectivamente , que están 
infectados y que no están infectados. 
Un resultado positiv o corresponderá a parásit os marcados dentro de los hemocitos, al tiempo que todos los 
testig os negativ os dan un resultado negativ o y todos los positiv os, un resultado positiv o. 
I.3.4.  Secuenciación 
La secuenciación se llevará a cabo como uno de los pasos finales para el diagnóstico de conf irmación. Las 
regiones objetivo serán la SSU del ADNr y el ITS1. 23.9.2015 L 247/59 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    II.  Procedimientos de vigilancia y conf irmación de la infección por Bonamia ostr eae 
A los efectos de la vigilancia y para conf irmar o descar tar la sospech a de una infección por Bonamia ostreae, de 
conf ormidad con los requisitos de la parte 5, sección II, del anex o I, los métodos de diagnóstico y procedi ­
mientos correspondiente s se ajustarán a las directr ices del cuadro 5.1. 
Cuadro 5.1 
Directr ices para el uso de los métodos de diagnóstico en los prog ramas de vigilancia y para descar tar o 
conf irmar la infección por Bonamia ostr eae 
Méto do Vigilancia específica Diagnóstico de 
presunción Diagnóstico de 
confir mación 
Imp rontas de corazón o branquias X X X, o 
Histopat ología X  X, o 
Hibr idación in situ   X, y 
PCR X X X, y 
Secuenciación   X  
PARTE 6 
MÉTODOS Y PROCEDIMIENTOS DE DIA GNÓSTICO DET ALL ADOS PARA LA VIGIL ANCIA Y CONFIRMA CIÓN DE LA 
ENFERMED AD DE LAS MANCHAS BLANC AS (EMB) 
1.  Procedimientos de diagnós tico para la detección del VSMB 
Cuando se tomen muestras y se efectúen exámenes de laboratori o a los efectos de los programas de vigilancia y 
erradicación establecidos en la parte 6, sección I, del anex o I y para conf irmar o descar tar una sospech a de 
infección por el VSMB de conf ormidad con el artículo 57, letra b), de la Directiva 2006/88/CE, utilizando los 
métod os de diagnóstico que se establecen en la parte 6, sección II, del anex o I, se aplicarán los métod os y 
procedimiento s de diagnóstico detallados establecidos en los punt os 2 a 7 de la presente parte. 
Los métod os y procedimiento s que se descr iben en la presente parte del anex o II se han adapta do partir de los 
ensa yos acreditados conf orme a ISO 17025 en el laboratori o de referencia de la Unión Europea para las 
enfe rmedades de los crustáceos. Podrán aplicarse enfoques alternativ os en condiciones equivalent es o con kits 
producidos por distintos fabr icantes , si bien deben ofrecer una sensibilidad y especifi cidad equivalentes a los 
descr itos en la present e parte. En todos los casos, los productos de PCR ampli ficados serán secuenciados para 
conf irmar su identidad como virus del síndrome de las manc has blancas (VSMB). 
2.  Proceso de muestreo 
Los tejidos de crustáceos (pleópodos y branquias) que conte ngan el VSMB podrán almacenarse en etanol o 
reactiv o de estabilización del ARN, o cong elarse a – 80 °C. Las fases necesar ias para la identif icación del VSMB a 
partir de muestras tisulares serán las siguientes: homog eneización del tejid o, extracción del ADN, ampli ficación 
específica por PCR del ADN del virus, visualización del producto amp lificado en un gel, purificación del ADN y 
secuenciación para confir mar la identidad del agente patóg eno. 
3.  Homogeneización de tejidos 
La molturación de los tejidos y la preparación de un homog eneizado en una solución amor tiguadora adecuada 
se efectuarán utilizando el molino FastPrep y tubos Lysing matr ix A (MP Biomedicals). Los tejidos se pesarán, se 
introducirán en tubos Lysing matr ix A, se diluirán 1 a 10 p/v (o de acuerdo con las instr ucciones del fabr icante) 
en una solución amor tiguadora adecuada (G2 y 10 µl de proteina sa K para uso con DNA Tissue Kit [Qiag en]) y 
se homogeneizarán con el homog eneizador FastPr ep 24 durante dos minutos. Las muestras homogeneizadas se 
incubarán a 56 °C durante un mínimo de cuatro horas o durante una noch e. Las muestras se mezclarán en 
vórtex y se centr ifugarán a 9 000 rpm durante dos minutos, y 50 µl del sobrenadant e o un volumen 
equivalent e a 5 mg de tejid os (peso de tejido óptimo para el kit de extracción) se añadirán a un tubo de muestra 
para la extracción de ADN; se rellenará hasta 200 µl con solución amor tiguadora G2. 23.9.2015 L 247/60 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    4.  Extracción del ADN 
El ADN total se extraerá utilizando un kit de extracción del ADN de tejidos y el aparat o EZ1 Advanced XL 
BioR obot (Qiagen), siguiendo las instr ucciones del fabricante. Se incluirán un testig o de extracción (ADN de 
timo de ternera) y un testigo negativ o (amor tiguador G2) en cada lote de muestras. El ADN se eluirá en 50 µl de 
volume n. Para garantizar que la extracción ha tenido éxito, la concentración de ADN para todas las muestras y 
testig os se determinará utilizando una máquina NanoDrop. El ADN extraído se cong elará a – 20 °C si no se 
necesita inmediatament e. 
5.  PCR para la detección del VSMB 
El métod o que se utilizará para la detección del VSMB será el protocolo de PCR con cebadores internos que se 
establece en los siguient es apar tados, que amplifica, respectivament e en la primera serie de PCR y en la segunda, 
un amplicón de 1 447 bp y un ampli cón de 848 bp del gen 18s del ARNr . 
La primera serie de PCR se efectuará con un volumen de 50 µl que cont endrá concentraciones finale s de 
1 × GoTaq Buff er (Promega), MgCl2 5 mM, 1 pmol/µl de cebador VSMB 146 F1, 1 pmol/µl de cebador 
VSMB 146 R1 (cuadro 1), dNTP 0,25 mM, 1,25 U de Taq polimerasa y 2,5 µl de ADN. Cada muestra se 
manipulará por duplicado junto a un testig o de extracción nega tivo, un testigo negativo de la PCR (con 2,5 µl 
de H2O añadido en lugar de ADN) y un testigo positiv o. El testigo positiv o será plásmido diluido del VSMB 
preparado y validado para uso propio (disponible en el laborat orio de referencia de la UE). 
La segunda serie de PCR para el VSMB se efectuará igual que la primera, aunque se utilizará el par de cebadores 
VSMB 146 F2/R2 y un segundo testigo positiv o, para comprobar que esta fase de la PCR ha funcionado. 
Cebador Secuencia 
WSSV 146 F1 ACTACTAACTTCA GCCT ATCT AG 
WSSV 146 R1 TAATGCGGGTGT AATGTTCTT ACGA 
WSSV 146 F2 GTAACTGCCCCTTCC ATCTCC A 
WSSV 146 R2 TACGGC AGCTGCTGCA CCTTGT  
Ambas series de la PCR se realizarán conf orme a la siguient e sucesión de ciclos en un term ociclador DNA 
Engine Tetrad 2 Peltier (o equivalente). Un paso inicial de desnaturalización a 94 °C durant e dos minutos, 
seguido de 94 °C durante 30 segundos, 62 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos, que se repite 
en 30 ciclos, una exte nsión a 72 °C durante dos minutos , y serán mantenidos a 4 °C. 
6.  Electroforesis en gel 
Los product os amplificados de las series primera y segunda de PCR se visualizarán en geles de agarosa al 2 % 
utilizando un amor tiguador TAE. Se pasarán 15 µl de cada muestra a 120 voltios durante 20 minutos apro xima ­
damente , y se obser varán con luz ultraviolet a. Las muestras positivas producirán una banda de 1 447 bp en la 
primera serie de PCR y de 848 bp, en la segunda. Las muestras de este tamaño se cortarán y se introducirán en 
un tubo de microcentr ifugado de 1,5 ml. El ADN contenido en los cortes de gel se purificará con el kit 
Wizard® SV Gel and PCR clean-Up System de Promega con arreglo a las instr ucciones del fabr icante. La concen ­
tración del ADN se estimará utilizando una máquina NanoDrop. El ADN purificado se cong elará a – 20 °C si 
no se utiliza inmediatament e. 
7.  Secuenciación de los productos de PCR amplif icados 
El ADN será secuenciado con Big Dye Terminator Kit v3,1 (Applied Biosyste ms). El volumen total de cada 
reacción es 20 µl, y las concentraciones finales son 1 × Big Dye Terminat or, 1 × amor tiguador de secuenciación, 
10 pmol/µl de cebador directo o inverso y 10 µl de ADN purificad o (diluido a apro ximadamente 10 ng/µl); 
pasar la siguient e sucesión de ciclos en un term ociclador DNA Engine Tetrad 2 Peltier (o equivalent e): 94 °C 
durante 30 segundos, seguido de 96 °C durante 10 segundos, 50 °C durante 10 segundos y 60 °C durante 
4 minutos, repitiendo los últimos tres pasos 30 veces. 23.9.2015 L 247/61 Diar io Oficial de la Unión Europea ES    Los product os de PCR se precipitarán con un métod o a base de acetat o de sodio, en el cual se añaden 20 µl 
de ADN a 10 µl de NaA c, 70 µl de H2O y 250 µl de etanol, se mezclan en vórtex y se centr ifugan a 
13 000 rpm durante 20 minutos; el sobrenadante se eliminará y el sedimento se lavará con 200 µl de etanol 
absoluto, y se centr ifugará a 13 000 rpm durante 5 minutos. El sediment o se secará durante cinco minutos 
a 37 °C. Se le añadirán 25 µl de formamida Hi-Di, se calentará a 95 °C durant e dos minutos y se mezclará bien 
en vórtex. Las muestras se secuenciarán utilizando el analizador ABI3130xl Avant Genetic de acuerdo con las 
instr ucciones del fabricante. Los resultados de la secuenciación se analizarán mediante el programa informático 
Sequench er y las secuencias se cotejarán con las de la base de datos del NCBI utilizando la función BLAST .  23.9.2015 L 247/62 Diar io Oficial de la Unión Europea ES