II 
(Actes non législatif s) 
DÉCISIONS 
DÉCISION D'EXÉCUTION (UE) 2015/1554 DE LA COMMISSION 
du 11 septembre 2015 
por tant modalités d'application de la directiv e 2006/88/CE en ce qui concer ne les exigences 
relativ es à la surveillance et aux méthodes de diagnost ic 
[notifiée sous le numér o C(2015) 6188] 
(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE) 
LA COMMISSION EUR OPÉENNE, 
vu le traité sur le fonctionnement de l'Union européenne, 
vu la directive 2006/88/CE du Conseil du 24 octobre 2006 relative aux conditions de police sanitaire applicables aux 
animaux et aux produits d'aquaculture, et relative à la prévention de certaines maladies chez les animaux aquatiques et 
aux mesures de lutte contre ces maladies (1), et notamment son article 49, paragraphe 3, son article 50, paragraphe 4, 
son article 57, point b) et son article 61, paragraphe 3, 
considérant ce qui suit: 
(1)  La directive 2006/88/CE établit les mesures préventives minimales pour la surveillance et la détection précoce, 
chez les animaux aquatiques, des maladies énumérées à son annex e IV (ci-après les «maladies réper toriées»), ainsi 
que les mesures de lutte à mettre en œuvre en cas de présence suspectée ou avérée d'un foyer de ces maladies 
réper toriées. Elle définit également les exige nces requises pour l'obtention du statut «indemne de maladie» par des 
États membres ou des zones ou compar timents de ceux-ci. 
(2)  L'éradication des maladies réper toriées et l'obt ention du statut «indemne de maladie» par un État membre, une 
zone ou un compar timent devraient reposer sur des principes et une démarche scientifique identiques dans tout e 
l'Un ion. En conséquence, il est nécessaire de définir au niveau de l'Un ion des exigenc es spécifiques applicables aux 
programmes de surveillance et d'éradication, ainsi que les méthodes d'écha ntillonnage et de diagnostic à utiliser 
par les États membres pour obtenir le statut «indemne de maladie» à l'échelle de l'État membre ou d'une zone ou 
compar timent de celui-ci. 
(3)  Les examens de laboratoire à effectuer en cas de suspicion d'une maladie réper torié e ou pour confir mer la 
présence d'une telle maladie devraient être identiques dans tout e l'Union et respecter les mêmes normes et 
prot ocoles scientifique s. Conf ormément à la directive 2006/88/CE, il est nécessaire d'établir les méthodes et 
procédures de diagnostic spécif iques à utiliser par les laborat oires désignés à cet effet par l'autori té compét ente de 
chaque État membre. 
(4)  Le Code sanitaire pour les animaux aquatiques adopt é par l'Organisation mondiale de la santé animale (OIE) (ci-après 
le «code aquatique») établit des normes pour l'amélioration de la santé des animaux aquatiques et le bien-être des 
poissons d'élevage dans le monde, y compris des normes de sécur ité sanitaire applicables aux écha nges intern a­
tionaux d'animaux aquatiques et des produits qui en sont issus. Un certain nombre de chapitres du code 
aquatique énoncent des recommandations concer nant l'utilisation de certains tests de diagnostic. Ces tests, 
proposés par l'OIE, sont décr its dans le Manuel des tests de diagnostic pour les animaux aquatiques de l'OIE (ci-après 
le «manuel aquatique»). Pour garantir la cohérence entre les normes intern ationales et les exigenc es de l'Union 
relatives aux méthodes de diagnostic des maladies des animaux aquatiques, il convient que les règles énoncées 
dans la présente décision tiennent comp te des normes et recommandations figur ant dans le code aquatique. 23.9.2015 L 247/1 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     
(1)JO L 328 du 24.11.2006, p. 14. (5)  À cet égard, le manuel aquatique énumère, pour un grand nombre des maladies réper toriées, plusieurs tests et 
procédures à utiliser aux fins des examens de laborat oire. Afin d'unif ormiser , à l'échelle de l'Union, la base 
scientifique utilisée pour le diagnostic des maladies réper toriées, il est nécessaire de désigner , parmi les tests et 
procédures de diagnostic recommandés par l'OIE, ceux qui devraient être oblig atoires aux fins des examens de 
laborat oire à réaliser dans le cadre des programmes de surveillance ainsi que pour écar ter une suspicion de 
maladie réper toriée ou conf irmer la présence d'une telle maladie. Comme il sera également nécessaire, dans 
certains cas, de disposer de méthodes et de procédures de substitution, il convient que des descr iptions et des 
explications scientifi ques sur les conditions et les modalités d'application de ces méthodes de substitution soient 
fournies, surtout en ce qui concer ne les procédures de diagnostic détaillées. 
(6)  Aux fins de l'obte ntion de diagnostics précis et reproductibles, il imp orte que les procédures et protocoles 
détaillés à utiliser soient validés conf ormément aux normes de qualité pertinente s visées à l'annexe VI, partie I, de 
la directive 2006/88/CE. Dans un grand nombre des méthodes de diagnostic établies par la présent e décision, 
l'utilisation de kits de diagnostic disponibles dans le commerce est une compo sante nécessaire des protocoles, et 
ces kits de diagnostic ont été validés lors d'essais menés dans le cadre de l'accréditation par les laborat oires de 
référence de l'Un ion pour les différ entes maladies. Pour des raisons de sécur ité juridique, la dénomination 
commerciale des kits de diagnostic qui ont été validés devrait être utilisée dans la présent e décision. 
(7)  Il se peut que certains États membres éprouvent des difficultés à obtenir , pour une ou plusieurs des maladies 
réper toriées, le statut «indemne de maladie» à l'échelle de l'État membre ou pour une zone ou un compar timent 
de celui-ci. En pareille situation, l'État membre peut souhaiter ne pas obtenir ou ne pas retrouver le statut 
«indemne» pour ces maladies réper toriées. Les mesures minimales de lutte à appliquer dans les cas où l'État 
membre concer né ne souhaite pas obte nir ou retrouver le statut «indemne» devraient être identiques dans tout e 
l'Un ion et respecter les mêmes critères. Il est donc nécessaire, conf ormément à la directive 2006/88/CE, de fixer 
des modalités de confinement pour empêcher la propagati on de ces maladies réper torié es, et de définir les 
conditions minimales requises pour la levée de ces mesures de confinement. 
(8)  La décision 2001/183/CE de la Commission (1) fixe les exigenc es relatives aux plans d'échantillon nage et aux 
méthodes de diagnostic pour la détec tion et la confir mation de la nécrose hémat opoïétique infectieuse et de la 
sept icémie hémor ragique virale, qui font partie des maladies réper toriées. La décision 2003/466/CE de la 
Commission (2) fixe les exigenc es relatives aux plans d'échantillon nage et aux méthodes de diagnostic pour la 
détection de l'anémie infectieuse du saumon, ainsi que les critères de zonage et les mesures de surveillance 
officielle à adop ter après suspicion ou conf irmation de la présence de cette maladie. La décision 2002/878/CE de 
la Commission (3) fixe les exige nces relatives aux plans d'échantillonnag e et aux méthodes de diagnostic pour la 
détection et la confir mation de la bonamiose et de la mar teiliose, qui sont des maladies des mollusques. Afin 
d'actualiser ces exigences, ces trois décisions devraient être rem placées par la présente décision. Les décisions 
2001/183/CE, 2002/878/CE et 2003/466/CE devraient dès lors être abrogé es. 
(9)  Certains États membres ayant besoin de temps pour permettre à leurs laboratoires nationaux de référen ce de 
s'adapt er afin de se conf ormer aux exigenc es de la présent e décision, celle-ci devrait être applicable à partir du 
1er avril 2016. 
(10)  Les mesures prévues à la présent e décision sont conf ormes à l'avis du comité permanent des végé taux, des 
animaux, des denrées alimentaires et des aliments pour animaux, 
A ADOPTÉ LA PRÉSENTE DÉCISION: 
Article premier 
Objet 
La présent e décision établit des règles concer nant : 
a)  la surveillance, les zones tam pons, les méthodes d'éch antillonnage et de diagnostic à utiliser par les États membres en 
rappor t avec leur statut sanitaire ou celui de zones ou compar timents de ceux-ci en ce qui concer ne les maladies non 
exotiques des animaux aquatiques énumérées à l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE (ci-après dénommées 
les «maladies réper torié es»); 23.9.2015 L 247/2 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     
(1)Décision 2001/183/CE de la Commission du 22 février 2001 fixant les plans d'échantillonnag e et les méthodes de diagnostic pour la 
détect ion et la confir mation de certaines maladies des poissons et abrogeant la décision 92/532/CEE (JO L 67 du 9.3.2001, p. 65). 
(2)Décision 2003/466/CE de la Commission du 13 juin 2003 établissant les critères de zonage et les mesures de surveillance officielle à 
adopt er après suspicion ou confir mation de la présence de l'anémie infectieuse du saumon (AIS) (JO L 156 du 25.6.2003, p. 61). 
(3)Décision 2002/878/CE de la Commission du 6 novembre 2002 établissant les plans d'échan tillonnage et les méthodes de diagnostic 
pour la détect ion et la confir mation de la présence de deux maladies des mollusques, la bonamiose (Bonamia ostreae) et la mar teiliose 
(Mar teilia refringen s) (JO L 305 du 7.11.2002, p. 57). b)  les méthodes de diagnostic à utiliser pour les examens de laboratoire en cas de suspicion ou de conf irmation de la 
présence de maladies réper torié es et 
c)  les mesures minimales de lutte à mettre en œuvre en cas de présence suspect ée ou confir mée d'une maladie 
réper toriée dans un État membre, une zone ou un compar timent non déclarés indemnes de cette maladie. 
Article 2 
Déf initions 
Aux fins de la présent e décision, on entend par: 
a)  «sep ticémie hémor ragique virale (SHV)», une maladie causée par le virus de la septicémie hémor ragique virale (VSHV), 
également dénommé virus d'Egtved, qui appar tient au genre Novirhabdo virus et à la famille des Rhabdovir idae; 
b)  «nécrose hémat opoïétique infectieuse (NHI)», une maladie causée par le virus de la nécrose hématopoïétique 
infectieuse (VNHI), qui appar tient au genre Novirhabdo virus et à la famille des Rhabdovir idae; 
c)  «her pèsvirose de la carpe koï (HVCK)», une maladie causée par l'her pèsvir us koï (HVK), qui appar tient à la famille des 
Alloher pesvir idae et dont le nom scientifi que est «her pèsvir us cypr in 3» (CyHV -3); 
d)  «anémie infectieuse du saumon (AIS)», une maladie causée par une infection par des variants délét és dans la région 
haute ment polymor phe (RHP) du virus de l'AIS (VAIS), qui appar tient au genre Isavir us et à la famille des Orthomyxo ­
viridae; 
e)  «infect ion à Mar teilia refrin gens», une infection causée par le prot ozoaire Mar teilia refringens, qui appar tient au phylum 
des Param yxea; 
f)  «infect ion à Bonamia ostreae», une infection causée par le protozoaire Bonamia ostreae, qui appar tient au phylum des 
Haplospor idia; 
g)  «maladie des points blancs (MPB)», une maladie causée par le virus du syndrome des points blancs (VSPB), qui est un 
virus à ADN double brin qui appar tient au genre Whispov irus et à la famille des Nimavir idae. 
Article 3 
Exigences minimales relativ es aux prog rammes d'éradication et de surveillance 
Les États membres veillent à ce que les règles relatives aux programmes de surveillance et d'éradication, aux zones 
tampons, aux méthodes d'échantillonnag e et de diagnostic énoncées à l'annexe I, ainsi qu'aux méthodes spécifi ques et 
aux procédures détaillées énoncées à l'annex e II soient respectées en cas d'octroi, de retrait ou de rétablissement, pour 
une ou plusieurs des maladies réper toriées, du statut «indemne de maladie» pour un État membre ou une zone ou 
compar timent de celui-ci. 
Article 4 
Exigences minimales relativ es aux méthodes et aux procédures spécif iques de diagnostic 
Les États membres veillent à ce que les méthodes de lutte figurant à l'annex e I, ainsi que les méthodes spécifiques et 
procédures détaillées de diagnostic énoncées à l'annex e II soient respectées lors des examens de laborat oire réalisés en 
vue de conf irmer ou d'excl ure la présence d'une maladie réper toriée. 
Article 5 
Mesures minimales de lutte contre les maladies réper toriées et exigences minimales pour la levée des mesures 
de conf inement dans des État membres, des zones ou des compar timents non déclarés indemnes de maladies 
réper toriées 
Les États membres veillent à ce que les mesures minimales de lutte et les exige nces minimales pour la levée des mesures 
de confinement énoncées à l'annex e I soient respectées lors de la mise en œuvre de mesures de lutte et de la levée des 
mesures de conf inement à l'égard d'une ou plusieurs maladies réper toriées dans un État membre ou dans une zone ou 
un compar timent non déclarés indemnes de ces maladies. 23.9.2015 L 247/3 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Article 6 
Abrogations 
Les décisions 2001/183/CE, 2002/878/CE et 2003/466/CE sont abrogées. 
Article 7 
Date de mise en application 
La présent e décision est applicable à partir du 1er avril 2016. 
Article 8 
Dest inataires 
Les États membres sont destinataires de la présent e décision. 
Fait à Bruxelles, le 11 sept embre 2015. 
Par la Commission 
Vytenis ANDRIUKAITIS 
Membr e de la Commission  23.9.2015 L 247/4 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     ANNEXE I 
SUR VEILL ANCE ET MÉTHODES DE LUTTE 
I.  Introduction 
La présente annexe établit: 
a)  les exigenc es relatives aux programmes d'éradication et de surveillance prévus à l'article 44 de la directive 
2006/88/CE, ainsi que les méthodes d'échantillonnag e et de diagnostic à utiliser pour déclarer «indemnes de 
maladie» des États membres ou des zones ou compar timents de ceux-ci, conf ormément aux dispositions du 
chapitre VII de ladit e directive; 
b)  les méthodes d'écha ntillonnage et de diagnostic à utiliser pour les examens de laboratoire en cas de suspicion 
d'une ou plusieurs des maladies non exotiques réper torié es à l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE 
(ci-après les «maladies réper toriées») ou pour conf irmer la présence de telles maladies, conf ormément à l'article 28, 
point a), et à l'article 57, point b), de ladit e directive; 
c)  les mesures de confinement à prendre en cas de confir mation de la présence d'une maladie réper toriée, 
conf ormément à l'article 39 de la directive 2006/88/CE, et les mesures à prendre en vue de l'obtentio n d'un statut 
sanitaire de catégo rie III pour un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de 
catégor ie V. 
Les exigenc es établies dans la présente annexe concer nent les maladies réper torié es suivantes: 
1. la septicémie hémor ragique virale (SHV) Partie 1 
2. la nécrose hémat opoïétique infectieuse (NHI) Partie 1 
3. l'her pèsvirose de la carpe koï (HVCK) Partie 2 
4. l'anémie infec tieuse du saumon (AIS) Partie 3 
5. l'infe ction à Mar teilia refringens Partie 4 
6. l'infe ction à Bonamia ostreae Partie 5 
7. la maladie des points blancs (MPB) Partie 6  
II.  Déf initions 
Aux fins des annexes I et II, on entend par:  
a) «compar timent continental»: une ou plusieurs fermes aquacoles situées dans la partie continentale du territoire 
d'un ou de plusieurs États membres, qui relèvent d'un dispositif commun de biosécur ité et abritent une population 
d'animaux aquatiques dotée d'un statut zoosanitaire qui lui est propre au rega rd d'une maladie particulière;  
b) «ferm e aquacole continentale»: une ferme aquacole située dans la partie continentale du territoire d'un État 
membre;  
c) «zone continentale»: un secteur géographique précis situé dans la partie continentale du territoire d'un ou de 
plusieurs États membres, caract érisé par un système hydrographique homogène compr enant des parties de bassin 
hydrographique (depuis la ou les sources jusqu'à une barrière naturelle ou artificiell e empê chant tout e remont ée 
d'animaux aquatiques à partir des parties du bassin situées en aval), un bassin hydrographique entier (depuis la ou 
les sources jusqu'à l'estuaire) ou encore plusieurs bassins hydrographiques, estuaires compr is, en raison du lien 
épidémiologique qui existe entre les bassins hydrographiques au traver s de l'estuaire; 23.9.2015 L 247/5 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     d) «ferm e aquacole officiell ement déclarée infectée »:une ferme aquacole dans laquelle la présence d'une ou de 
plusieurs des maladies réper toriées a été conf irmée par l'aut orité compét ente, conf ormément à l'article 28, 
point a), à l'article 29 et à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE.  
e) «ferm e aquacole en contact»: une ferme aquacole qui, de tout e évidence, a été contaminée par du mat ériel 
infectieux provenant d'une ferme aquacole offici ellement déclarée infectée, ou qui est fortement suspecté e d'av oir 
été ainsi contaminée. 
PARTIE 1 
SUR VEILL ANCE DE LA SEPTICÉMIE HÉMORRA GIQUE VIRALE (SHV) ET DE LA NÉCR OSE HÉMA TOPOÏÉTIQUE 
INFECTIEUSE (NHI) ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE CES MAL ADIES 
I.  Exigences relativ es aux prog rammes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut 
sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne la SHV et la NHI ainsi que des mesures de conf inement destinées 
à lutter contre ces maladies réper toriée s 
I.1.  Exigen ces général es relatives aux inspections sanitaires et à l'échantillonnag e en ce qui concer ne la SHV et la 
NHI: 
a)  les inspections sanitaires et, s'il y a lieu, l'échantillonnag e doivent être effectués pendant la période de l'année 
où la température de l'eau est infér ieure à 14 °C ou à tout moment, lorsque la température de l'eau est 
suscep tible d'atteindre les minima annuels; 
b)  lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvages est requise conf ormément à l'annex e V, partie I, 
point 2, deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, le nombre et la répar tition géographique des 
points de prélèvement doivent être déter minés de façon à obte nir une couver ture raisonnable de l'État 
membre, de la zone ou du compar timent. Les points de prélèvement doivent être représentatifs des différ ents 
écosystèmes abritant des populations sauvage s des espèces sensibles; 
c)  lorsque des fermes aquacoles ou des populations sauvage s doivent, plus d'une fois par an, faire l'objet 
d'inspections sanitaires ou d'éch antillonnages, l'inter valle entre les inspections sanitaires et entre chaque 
prélèvement d'échanti llons doit être d'au moins quatre mois et doit être aussi long que possible comp te tenu 
des conditions de température définie s au point a); 
d)  tout es les unités de production, telles que les étangs, les viviers et les cages en filet doivent faire l'objet 
d'inspections sanitaires destinées à établir la présence de poissons mor ts, faibles ou au compo rtement 
anor mal. Une attention particulière doit être accordée au point d'évacuation des eaux, où les poissons faibles 
ont tendance à s'accumuler en raison du courant ; 
e)  les poissons des espèces sensibles devant faire l'objet d'un échantillon nage sont sélectionnés comme suit: 
i)  si des truites arc-en-ciel sont présentes, seuls des poissons de cette espèce doivent être sélectionnés pour 
l'échantillonna ge, sauf dans les cas où d'autres espèces sensibles présentant des signes typiques de la SHV 
ou de la NHI sont présentes; en l'absence de truites arc-en-ciel, l'échantillon doit être représentatif de 
tout es les autres espèces sensibles présentes; 
ii)  en présence de poissons faibles, au compo rtement anor mal ou qui viennent de mour ir mais ne sont pas 
encore décom posés, ces poissons doivent être sélectionnés; si plus d'une source d'eau est utilisée pour la 
production des poissons, des poissons représentant tout es les sources d'eau doivent être inclus dans 
l'échantillon; 
iii)  les poissons sélectionnés doivent inclure des poissons collect és de telle manière que tout es les parties de 
la ferme aquacole ainsi que tout es les classes d'âg e annuelles soient représent ées propor tionnellement 
dans l'échantillon. 
I.2.  Exigen ces spécifi ques pour l'obt ention du statut sanitaire «indemne de maladie» (catégor ie I) en ce qui concer ne 
la SHV et la NHI 
I.2.1.  Programmes de surveillance: 
a)  un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie III tel que visé à 
l'annex e III, partie B, de la directive 2006/88/CE en ce qui concer ne la SHV ou la NHI, ou les deux, peut 
obte nir le statut sanitaire de catégo rie I pour ces maladies réper torié es à condition que tout es les fermes 
aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de ladite directive dans cet État 
membre, cette zone ou ce compar timent respectent les exige nces fixées à l'annex e V de ladite directive, et que 
tout es ces fermes aquacoles ainsi que, pour autant que les dispositions de l'annexe V, partie I, point 2, 
deuxième paragraphe, de cette directive le requièrent, tous les points de prélèvement dans les populations 
sauvag es sélectionnées conf ormément à cette partie, aient fait l'objet d'un des programmes de surveillance 
suivants: 23.9.2015 L 247/6 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     i)  modèle A — programme de surveillance sur deux ans: 
Les fermes aquacoles ou les points de prélèvement doivent avoir été soumis à des inspections sanitaires et 
fait l'objet d'échanti llonnages pendant une période minimale de deux années consécutives, comme indiqué 
dans le tableau 1.A de la section II. 
Au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échantillons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécif iées au point II.2. doivent s'être révélés négatifs pour la SHV ou la NHI, ou 
pour les deux, et tout e suspicion de SHV ou de NHI doit avoir été écar tée conf ormément aux méthodes 
d'échanti llonnage et de diagnostic établies au point II.3; 
ii)  modèle B — programme de surveillance sur quatre ans avec taille d'échantillon réduite 
Les fermes aquacoles ou les points de prélèvement doivent avoir fait l'objet d'inspections sanitaires et 
d'échanti llonnages pendant une période minimale de quatre années consécutives, comme indiqué dans le 
tableau 1.B de la section II. 
Au cours de cette période de quatre ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échantillons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 doivent s'être révélés négatifs pour la SHV ou la NHI, ou 
pour les deux, et tout e suspicion de SHV ou de NHI, ou des deux maladies, doit avoir été écar tée 
conf ormément aux méthodes d'échantillonnag e et de diagnostic établies au point II.3; 
b)  si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance visé au point a), une infection par la SHV ou 
la NHI, ou par les deux à la fois, est confir mée dans une ferme aquacole incluse dans ce programme de 
surveillance et que, par conséquent, cette ferme a vu son statut sanitaire de caté gorie II lui être retiré, elle 
peut immédiate ment retrouver ce statut sanitaire de catégo rie II et poursuivre la mise en œuvre du 
programme de surveillance en vue de l'obte ntion du statut «indemne de maladie» sans mettre en œuvre un 
programme d'éradication tel qu'établi au point I.2.2, à condition de satisfa ire aux conditions suivantes: 
i)  il s'agit d'une ferme aquacole continentale dont le statut sanitaire en ce qui concer ne la SHV ou la NHI, 
ou les deux, est indépendant du statut zoosanitaire des populations d'animaux aquatiques vivant dans les 
eaux naturelles avoisinante s par rappor t à ces maladies réper toriées conf ormément à l'annex e V, partie II, 
point 3, de la directive 2006/88/CE; 
ii)  elle a été vidée de ses poissons, netto yée, désinfect ée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au 
moins six semaines a été obser vée; 
iii)  elle a été repeuplée avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents 
jouissant d'un statut sanitaire de catégor ie I en ce qui concer ne la SHV ou la NHI, ou les deux. 
I.2.2.  Programmes d'éradication 
I.2.2.1.  Exigen ces générales 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégor ie V en ce qui concer ne la 
SHV ou la NHI, ou les deux, peut obte nir un statut sanitaire de caté gorie I pour ces maladies réper toriées à 
condition que tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II, de la 
directive 2006/88/CE dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent aient fait l'objet d'un programme 
d'éradication conf orme aux points a) à e) suivants: 
a)  les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 4, de la directive 2006/88/CE doivent avoir été 
effectivement appliquées et une zone de conf inement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladit e 
directive, assor tie d'un périmètre de prote ction et d'un périmètre de surveillance, doit avoir été établie aux 
alent ours de la ou des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la SHV ou la NHI, ou par ces 
deux maladies réper torié es. 
La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, comp te tenu des facteurs qui ont une incidence 
sur les risques de propagati on de la maladie réper toriée aux poissons d'élevag e et aux poissons sauvages, à 
savoir la mor talité, le taux de mor talité et la distr ibution de la mor talité dans la ferme aquacole infect ée par 
la SHV ou la NHI, ou par les deux à la fois, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisi nes et 
la densité de ces dernières, la proximit é des abattoirs, les fermes aquacoles en contact, les espèces présent es 
dans les fermes aquacoles, les pratiques d'élevag e appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans 
les fermes aquacoles voisines, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de 
vue épidémiologique. 23.9.2015 L 247/7 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Pour l'établissement des périmètres de protection et de surveillance, les exige nces minimales suivantes 
s'appliquent en ce qui concer ne la délimitation géographique de ces périmètres: 
i)  un périmètre de prot ection doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole officiellement 
déclarée infec tée par la SHV ou la NHI, ou par ces deux maladies réper toriées, et doit correspondre:  
1. dans les zones côtières: à une zone s'éte ndant sur un rayon d'au moins une excursion de marée et, en 
tout état de cause, d'au moins cinq kilomètres autour de la ferme aquacole officiellement déclarée 
infectée par la SHV ou la NHI, ou par les deux, ou à une superf icie équivalent e déterminée selon les 
données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropr iées;  
2. à l'inté rieur des terres: à la tota lité du bassin hydrographique de la ferme aquacole officiellement 
déclarée infec tée par la SHV ou la NHI, ou par les deux à la fois; l'aut orité compét ente peut limiter 
l'ext ension du périmètre à certaines parties du bassin hydrographique ou de la superf icie occupée par 
la ferme aquacole à condition que cela ne remette pas en cause les moyens mis en œuvre pour 
empêcher la propagati on de la SHV ou de la NHI, ou des deux à la fois; 
ii)  l'aut orité compét ente met en place un périmètre de surveillance, qui s'éten d au-delà du périmètre de 
prot ection et qui correspond:  
1. dans les zones côtières: à une zone située autour du périmètre de prot ection et dont la zone 
d'excu rsion de marée chevauche celle du périmètre de protection, à une zone située autour du 
périmètre de prot ection et s'étendant sur un rayon de 10 kilomètres à partir du centre du périmètre de 
prot ection ou à une superf icie équivalent e déter minée selon les données hydrodynamiques ou 
épidémiologiques appropr iées  
2. à l'intér ieur des terres: à une zone étendue qui se situe au-delà du périmètre de protection établi; 
b)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II de la directive 
2006/88/CE, qui se trouvent à l'intér ieur du périmètre de protection et qui ne sont pas officiellement 
déclarées infect ées par la SHV ou la NHI, ou par les deux, doivent faire l'objet d'une enquêt e officielle 
compr enant au moins les éléments suivants: 
i)  un prélèvement d'échantillons en vue de la réalisation de tests sur 10 poissons en cas de signes cliniques 
ou de signes post-mor tem compati bles avec une infection par la SHV ou la NHI, ou par les deux, ou sur 
au moins 30 poissons en l'absence de signes cliniques ou de signes post mor tem; 
ii)  une inspection sanitaire; dans les fermes aquacoles dans lesquelles les tests visés au point i) ont donné 
des résultats négatif s, les inspections sanitaires doivent se poursuivre à raison d'une par mois pendant la 
période durant laquelle la température de l'eau est inférieure à 14 °C, sauf lorsque les étangs ou les 
cages en filet sont couver ts de glace, jusqu'à la levée du périmètre de protection conf ormément au 
point I.2.2.1 c); 
c)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectée s par la SHV ou la NHI, ou par les deux, doivent 
être vidées de leurs poissons, netto yées et désinfect ées et une période de vide sanitaire d'une durée minimale 
de six semaines doit être obser vée. Lorsque tout es les fermes aquacoles officiell ement déclarées infectées à 
l'intérieur d'un même périmètre de protection ont été vidées de leurs poissons, un vide sanitaire synch ronisé 
d'au moins trois semaines doit être respecté . Le présent paragraphe s'applique également aux nouvelles 
fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées pendant la mise en œuvre du programme d'éradication. 
Lors du vide sanitaire des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées, les périmètres de prot ection 
sont convertis en périmètres de surveillance. 
L'autorité compét ente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres 
de prote ction et de surveillance établis soient vidées de leurs poissons, netto yées, désinf ectées et qu'elles 
fassent l'objet d'un vide sanitaire. Pour ces fermes, la durée de la période de vide sanitaire est déterminée par 
l'aut orité compé tent e, sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas; 
d)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la SHV ou la NHI, ou par ces deux maladies 
réper toriées, ainsi que tout es les autres fermes aquacoles soumises à un vide sanitaire situées à l'intér ieur des 
périmètres de protection et de surveillance établis qui sont visées au point c), doivent être repeuplées avec 
des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut sanitaire 
«indemne de maladie» (catégor ie I), en ce qui concer ne la SHV ou la NHI, ou les deux. 23.9.2015 L 247/8 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées 
infectée s ont été évacuées, netto yées et désinfe ctées, puis soumises à une période de vide sanitaire 
conf ormément au point I.2.2.1 c); 
e)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE dans l'État membre, la zone ou le compar timent couver ts par le programme d'éradication, ainsi 
que, lorsqu'une surveillance des populations sauvage s est requise, les points de prélèvement sélectionnés 
conf ormément au point I.1 doivent ensuite faire l'objet du programme de surveillance décr it au point I.2.1. 
I.2.2.2.  Exigen ces à respecte r pour que des compar timents continentaux comprenant une seule ferme aquacole qui ont 
précédemment été déclarés indemnes de la NHI ou de la SHV , ou des deux, puissent retrouver le statut «indemne 
de maladie» 
Un compar timent continental comprenan t une seule ferme aquacole qui a précédemment été déclaré indemne 
de la SHV ou de la NHI, ou de ces deux maladies réper torié es, dont le statut sanitaire en ce qui concer ne ces 
maladies réper torié es est indépendant de celui des eaux naturelles avoisinantes conf ormément à l'annexe V, 
partie II, point 3, de la directive 2006/88/CE, et qui s'est vu retirer le statut sanitaire de catégo rie I 
conf ormément à l'article 53, paragraphe 3, de cette directive, peut retrouver le statut de catégo rie I dès que 
l'aut orité compé tent e a conf irmé que les conditions suivantes sont rem plies: 
a)  la ferme aquacole dont l'infe ction par la SHV ou la NHI, ou par les deux, a été officiellement conf irmée, doit 
avoir été vidée de ses poissons, netto yée et désinfect ée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au 
moins six semaines doit avoir été obser vée; 
b)  la ferme aquacole dont l'infe ction par la NHI ou la SHV , ou par les deux, a été officiellement conf irmée a été 
repeuplée avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut 
sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne la SHV ou la NHI, ou les deux. 
I.3.  Exigen ces spécifiques pour le maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» (catégor ie I) en ce qui concer ne 
la SHV et la NHI, ou les deux 
Lorsqu'une surveillance ciblée est nécessaire pour maintenir le statut sanitaire de catégor ie I conf ormément à 
l'article 52 de la directive 2006/88/CE, tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à 
l'annex e IV, partie II, de cette directive dans l'État membre, la zone ou le compar timent concer nés doivent être 
soumises à une inspection sanitaire et les poissons doivent faire l'objet d'un échantillonnage conf ormément au 
tableau 1.C figurant à la section II de la présent e partie, comp te tenu du risque de contamination de la ferme 
aquacole par la SHV ou la NHI, ou par ces deux maladies réper toriées. 
Lors de la détermination de la fréquence des inspections sanitaires pour les compar timents jouissant du statut 
sanitaire de catégor ie I en ce qui concer ne la SHV ou la NHI, ou les deux, qui se trouvent dans des zones 
continentales et dont le statut sanitaire en ce qui concer ne la SHV ou la NHI dépend de la situation sanitaire du 
statut zoosanitaire des populations d'animaux aquatiques dans les eaux naturelles avoisinantes conf ormément à 
l'annex e V, partie II, point 2, de la directive 2006/88/CE, le risque de transmission de la SHV ou de la NHI, ou 
des deux, doit être considéré comme élevé. 
Le statut «indemne de maladie» ne doit être maintenu que tant que tous les échanti llons testés à l'aide des 
méthodes de diagnostic établies au point II.2. se révèlent négat ifs pour la SHV ou la NHI, ou pour ces deux 
maladies réper toriées, et tant que tout e suspicion de SHV ou de NHI, ou des deux, est écar tée conf ormément 
aux méthodes de diagnostic établies au point II.3. 
I.4.  Exigen ces à respecter pour la levée des mesures de conf inement prévues à l'article 39 de la directive 
2006/88/CE, c'est-à-dire pour passer du statut sanitaire de catégo rie V à celui de caté gorie III 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégor ie V en ce qui concer ne la 
SHV ou la NHI, ou les deux, peut obtenir le statut sanitaire de catégo rie III pour ces maladies réper toriées à 
condition que: 
a)les exigenc es définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisf aites. Dans les cas où il n'est techni­
quement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles concer nées doivent faire 
l'objet d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication du virus de la NHI ou 
du virus de la SHV , ou de ces deux agents, de l'env ironnement de la ferme aquacole; 
b)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et tout es les autres fermes aquacoles ayant été 
soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures conf ormément au point a) à l'intér ieur des périmètres de 
prot ection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de 
zones ou de compar timents ayant un statut sanitaire de catégo rie I, II ou III en ce qui concer ne la SHV ou la 
NHI, ou les deux à la fois; 23.9.2015 L 247/9 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     c)  le repeuplement n'ait eu lieu qu'après que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées ont 
été vidées de leurs poissons, netto yées, désinf ectées et soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures 
conf ormément au point a). 
II.  Méthodes d'échantillonnage et de diagnostic 
II.1.  Org anes à prélever 
Les tissus à examiner sont la rate, le rein antérie ur et soit le cœur , soit l'encéphale. Lorsque l'échantillonnag e est 
effectué sur des géniteurs, les ovaires ou le liquide séminal peuvent également être examinés. 
S'il s'agit de jeunes alevins, les poissons entiers de longueur inférieure à 4 cm peuvent être réduits en petits 
fragments à l'aide de ciseaux stéri les ou d'un scalpel après élimination de la partie du corps située à l'arrière de 
l'anus. Si un échantillon est constitué de poissons entiers de longueur compris e entre 4 et 6 cm, les viscères, y 
compris les reins, doivent être prélevés. 
Il est possible de regrouper des fragments d'organes provenant de dix poissons au maximum. 
II.2.  Méthodes de diagnostic pour obteni r et conser ver le statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne la SHV ou 
la NHI, ou les deux 
La méthode de diagnostic conf orme aux méthodes et procédures de diagnostic approuvées indiquées à 
l'annex e II, partie 1, point I, pour obtenir ou conser ver le statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne la 
SHV ou la NHI, ou les deux, est une des deux méthodes suivante s: 
a)  isolement du virus en culture cellulaire, puis identif ication par méthode immuno-enzymatique (ELISA ), test 
d'immunof luorescence indirect e (IFAT), test de neutralisation du virus ou amplification en chaîne par 
polymérase en présence d'une transcr iptase inverse en temps réel (RT-qPCR) ou 
b)  RT-qPCR. 
II.3.  Méthodes d'échantillonnag e et de diagnostic pour excl ure ou conf irmer la présence de la SHV ou de la NHI 
Lorsqu'il est nécessaire de confir mer ou d'écar ter une suspicion de SHV ou de NHI, ou des deux à la fois, 
conf ormément à l'article 28 de la directive 2006/88/CE, les procédures d'inspection, d'échantillonnag e et d'essai 
suivantes doivent être respectées: 
a)  la ferme aquacole suspect e doit faire l'objet d'au moins une inspection sanitaire et d'un échanti llonnage 
portant sur dix poissons en cas de signes cliniques ou de signes post-mor tem compat ibles avec une infection 
par la SHV ou la NHI, ou par les deux, ou sur au moins 30 poissons en l'absence de signes cliniques ou de 
signes post mor tem. Les échanti llons doivent être testés à l'aide d'une ou de plusieurs des méthodes de 
diagnostic indiquées aux points i) et ii), conf ormément aux méthodes de diagnostic et procédures détaillées 
figurant à l'annex e II, partie 1, section II, à savoir: 
i) isolement conven tionnel du virus en culture cellulaire, suivi de son identification par méthode immuno ­
chimique ou moléculaire; 
ii)  détec tion du virus par RT-qPCR; 
iii)  autres techniques de diagnostic d'efficacité similaire avérée telles que le test d'immunof luorescence 
indirecte (IFAT), la méthode immunoenzymatique (ELISA ), la RT-PCR et l'immunohistoc himie (IHC); 
b)  la présence de la SHV est considérée comme confir mée si au moins une de ces méthodes de diagnostic 
donne des résultats positifs pour le virus de la SHV (VSHV) . La présence de la NHI est considérée comme 
confir mée si au moins une de ces méthodes de diagnostic donne des résultats positifs pour le virus de la NHI 
(VNHI). La confir mation du premier cas de SHV ou de NHI dans des États membres, des zones ou des 
compar timents précédemment non infectés doit être obtenu e par isolement conventionnel du virus en 
culture cellulaire ou par RT-qPCR; 
c)  une suspicion de SHV ou de NHI, ou des deux à la fois, peut être écar tée si les résultats de la culture 
cellulaire ou de la RT-qPCR n'appor tent pas d'élément supplémentaire prouvant la présence du virus de la 
SHV ou de la NHI, ou des deux. 23.9.2015 L 247/10 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Tableau 1.A 
Prog ramme de surveillance des zones et compar timents pour la période de deux ans visée au point I.2.1. a) i) 
qui précède l'obtention du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne la SHV ou la NHI 
Type de ferme aquacole Nombre d'inspec ­
tions sanitaires 
par an (sur deux 
ans) Nombre de prélè ­
vements par an 
(sur deux ans) Nombre de poissons par échantillon (1) 
Nombre de poissons en 
développement Nombre de génit eurs (2) 
a)  Fermes aquacoles détenant 
des géniteurs 2 2 50 (première inspec ­
tion) 
75 (deuxième inspec ­
tion) 30 (première ou deu­
xième inspection) 
0 (première ou deu­
xième inspection) 
b)  Fermes aquacoles détenant 
excl usivement des géni teurs 2 1 0 75 (première ou deu­
xième inspection) 
c)Fermes aquacoles ne déte­
nant pas de géniteurs 2 2 75(3) (première et 
deuxième inspections) 0 
Nombre maximal de poissons par regroupement: 10 
(1)  Les échant illons doivent être prélevés au plus tôt trois semaines après le transfer t des poissons de l'eau douce à l'eau de mer . 
(2)  Les ovaires ou le liquide séminal des génit eurs doivent être recueillis au moment de la maturation, à l'occasion de la ponte artificielle 
(stripping). 
(3)  Les échantillons doivent être prélevés sur un nombre de poissons propre à garantir la détection du virus de la SHV ou de la NHI 
avec un niveau de confianc e de 95 % si la prévalence escomp tée est de 5 %.  
Tableau 1.B 
Prog ramme de surveillance avec taille d'échantillon réduite pour la période de quatre ans visée au 
point I.2.1. a) ii) qui précède l'obtention du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne la SHV ou la NHI 
Type de ferme aquacole Nombre d'inspec ­
tions sanitaires 
par an Nombre de prélè ­
vements par an Nombre de poissons par échantillon (1) 
Nombre de poissons en 
développement Nombre de génit eurs (2) 
Deux premières années de la période de surveillance 
a)  Fermes aquacoles détenant 
des géniteurs 2 1 0 (première inspec ­
tion) 
30 (deuxième inspec ­
tion) 0 (première inspec ­
tion) 
0 (deuxième inspec ­
tion) 
b)  Fermes aquacoles détenant 
excl usivement des géni teurs 2 1 0 30 (première ou deu­
xième inspection) 
c)Fermes aquacoles ne déte­
nant pas de géniteurs 2 1 30(3) (première ou 
deuxième inspection) 0 
Deux dernières années de la période de surveillance 
a)  Fermes aquacoles détenant 
des géniteurs 2 2 30 (première inspec ­
tion) 
0 (deuxième inspec ­
tion) 0 (première inspec ­
tion) 
30 (deuxième inspec ­
tion) 23.9.2015 L 247/11 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Type de ferme aquacole Nombre d'inspec ­
tions sanitaires 
par an Nombre de prélè ­
vements par an Nombre de poissons par échantillon (1) 
Nombre de poissons en 
développement Nombre de génit eurs (2) 
b)  Fermes aquacoles détenant 
excl usivement des géni teurs 2 2  30 (première et deu­
xième inspections) 
c)Fermes aquacoles ne déte­
nant pas de géniteurs 2 2 30(3) (première et 
deuxième inspections)  
Nombre maximal de poissons par regroupement: 10 
(1)  Les échant illons doivent être prélevés au plus tôt trois semaines après le transfer t des poissons de l'eau douce à l'eau de mer . 
(2)  Les ovaires ou le liquide séminal des génit eurs doivent être recueillis au moment de la maturation, à l'occasion de la ponte artificielle 
(stripping). 
(3)  Les échantillons doivent être prélevés sur un nombre de poissons propre à garantir la détection du virus de la SHV ou de la NHI 
avec un niveau de confianc e de 95 % si la prévalence escomp tée est de 10 %.  
Tableau 1.C 
Prog rammes de surveillance des zones ou compar timents en vue du maintien du statut «indemne de maladie» 
en ce qui concer ne la SHV ou la NHI visé au point I.3 
Niveau de risque Nombre d'inspections sanitaires Nombre de poissons par échantillon (3) 
Élevé Deux par an 30(1)(2) 
Moyen Une par an 30(1) 
Faible Une tous les deux ans 30(1) 
Nombre maximal de poissons par regroupement: 10 
(1)  Les échant illons doivent être prélevés au plus tôt trois semaines après le transfer t des poissons de l'eau douce à l'eau de mer . 
(2)  Les échantillons doivent être prélevés sur un nombre de poissons propre à garantir la détection du virus de la SHV ou de la NHI 
avec un niveau de confianc e de 95 % si la prévalence escomp tée est de 10 %. 
(3)  Au minimum un échantillon doit être prélevé pour chaque inspection sanitaire.  
PARTIE 2 
SUR VEILL ANCE DE L'HERPÈSVIR OSE DE LA CARPE KOÏ (HV CK) ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE CETTE MAL ADIE 
I.  Exigences relativ es aux prog rammes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut 
sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'HV CK ainsi que des mesures de conf inement destinées à lutter 
contre l'infectio n par l'her pèsvir us koï (HVK) 
I.1.  Exigen ces générales 
Lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvag es est requise conf ormément à l'annexe V, partie I, point 2, 
deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, le nombre et la répar tition géographique des points de 
prélèvement doivent être déterminés de façon à obtenir une couver ture raisonnable de l'État membre, de la zone 
ou du compar timent. Les points de prélèvement doivent aussi être représentatifs des divers écosystèmes abritant 
les populations sauvag es sensibles, à savoir les cours d'eau et les lacs. 23.9.2015 L 247/12 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     La surveillance ciblée doit reposer sur un suivi régulier des sites détenant des espèces sensibles. Les sites doivent 
être contrôlés lorsque la température de l'eau a atteint des niveaux propices au développement de la maladie 
(> 15 °C) et au plus tôt deux semaines après que ces températures ont été atteint es. Tous les poissons malades 
ou présentant un compo rtement anor mal qui sont obser vés sur le site doivent faire l'objet d'un échanti llonnage 
et être testés. 
Dans la mesure du possible, les poissons qui ont été maintenus longtem ps à des températures propices au 
développement du virus, c'est-à-dire entre 15 et 26 °C pendant deux à trois semaines, doivent faire l'objet d'un 
écha ntillonnage. L'approche décr ite ci-après est tout efois accep table: 
a)  recueillir une sous-population au moment du transfer t des étangs d'hiver aux étangs d'été et maint enir les 
poissons dans la même eau que celle des étangs d'été jusqu'à obtention de la température minimale requise, 
ou 
b)  prélever les écha ntillons au moment de la capture ou lors d'autres manipulations des poissons faisant partie 
des pratiques de gestion normales. Dans la mesure du possible, les échantillons doivent être prélevés entre 24 
et 72 heures après ces pratiques de gestion afin d'augmenter les chances de détection de l'her pèsvir us koï. 
Lorsque des fermes aquacoles ou des populations sauvag es doivent, plus d'une fois par an, faire l'objet 
d'inspections sanitaires ou d'échantillonnag es, l'intervalle entre les inspections sanitaires ou entre chaque 
prélèvement d'échanti llons doit être aussi long que possible pendant la saison où la température de l'eau est 
suscep tible d'atteindre les maxima annuels sans pour autant dépasser la limite de 28 °C. 
Toutes les unité s de production, telles que les étangs et les viviers, doivent faire l'objet d'inspections sanitaires 
destinées à établir la présence de poissons mor ts, faibles ou au compo rteme nt anor mal. 
Les poissons de l'espèce Cypr inus carpio et ses hybrides, tels que Cypr inus carpio × Carassius auratus, doivent être 
prélevés lorsqu'ils sont présents dans la ferme aquacole. 
Les poissons à inclure dans les échanti llons sont sélectionnés comme suit: 
i)  en présence de poissons faibles, au compor tement anor mal ou qui viennent de mour ir, mais ne sont pas 
encore décom posés, ces poissons doivent être sélectionnés; 
ii)  si plus d'une source d'eau est utilisée pour la production des poissons, des poissons représentatifs de tout es 
les sources d'eau doivent être inclus dans l'échantillon; 
iii)  les poissons sélectionnés doivent inclure des poissons collect és de telle manière que tout es les parties de la 
ferme aquacole ainsi que tout es les classes d'âge annuelles soient représentées propor tionnellement dans 
l'échantillon. 
I.2.  Exigen ces spécifi ques pour l'obt ention du statut sanitaire «indemne de maladie» (catégor ie I) en ce qui concer ne 
l'HV CK 
I.2.1.  Programmes de surveillance 
a)  Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie III en ce qui concer ne 
l'HV CK peut obteni r un statut sanitaire de catégor ie I lorsque tout es les fermes aquacoles détenant des 
espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet État membre, cette 
zone ou ce compar timent respectent les conditions requises pour l'obtention du statut «indemne de maladie» 
qui sont définies à l'annex e V de ladit e directive, et que tout es ces fermes aquacoles et, pour autant que les 
dispositions de la partie I, point 2, paragraphe 2, de ladite annexe le requièrent, tous les points de 
prélèvement dans les populations sauvages sélectionnées conf ormément à cette partie, ont fait l'objet de l'un 
des programmes de surveillance suivants: 
i)  modèle A — programme de surveillance sur deux ans 
les fermes aquacoles ou les points de prélèvement doivent avoir fait l'objet d'inspections sanitaires et 
d'échanti llonnages pendant une période minimale de deux années consécutives, comme indiqué dans le 
tableau 2.A de la section III. 
Au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échantillons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 doivent s'être révélés néga tifs pour l'HVK et tout e 
suspicion d'HV CK doit avoir été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic indiquées au 
point III.2; 23.9.2015 L 247/13 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     ii)  modèle B — programme de surveillance sur quatre ans avec taille d'échantillon réduite 
Les fermes aquacoles ou les points de prélèvement doivent avoir fait l'objet d'inspections sanitaires et 
d'échanti llonnages pendant une période minimale de quatre années consécutives, comme indiqué dans le 
tableau 2.B de la section III. 
Au cours de cette période de quatre ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échantillons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 doivent s'être révélés néga tifs pour l'HVK et tout e 
suspicion d'HV CK doit avoir été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic indiquées au 
point III.2; 
b)  si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance de quatre ans visé au point a), une infection 
par l'HVK est conf irmée dans une ferme aquacole incluse dans ce programme de surveillance et que, par 
conséquent, cette ferme a vu son statut sanitaire de catégor ie II lui être retiré, elle peut immédiatement 
retrouver ce statut sanitaire de caté gorie II et poursuivre la mise en œuvre du programme de surveillance en 
vue de l'obt ention du statut «indemne de maladie» sans mettre en œuvre le programme d'éradication décr it 
au point I.2.2, à condition de satisf aire aux conditions suivantes: 
i)  il s'agit d'une ferme aquacole continentale dont le statut sanitaire en ce qui concer ne l'HV CK est 
indépendant du statut zoosanitaire des populations d'animaux aquatiques dans les eaux naturelles 
avoisinante s pour cette maladie réper toriée, conf ormément à l'annex e V, partie II, point 3, de la directive 
2006/88/CE; 
ii)  elle a été vidée de ses poissons, netto yée, désinfect ée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au 
moins six semaines a été obser vée; 
iii)  elle a été repeuplée avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents ayant 
un statut sanitaire de caté gorie I en ce qui concer ne l'HV CK. 
I.2.2.  Programmes d'éradication 
I.2.2.1.  Exigen ces générales 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégo rie V en ce qui concer ne 
l'HV CK peut obtenir un statut sanitaire de catégor ie I pour cette maladie réper toriée lorsque tout es les fermes 
aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet 
État membre, cette zone ou ce compar timent ont été soumises au moins au programme d'éradication suivant: 
a)  les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 4, de la directive 2006/88/CE ont effectivement 
été appliquées et une zone de confinement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladit e directive, assor tie 
d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alentours de la ou des fermes 
aquacoles officiellement déclarées infectées par l'HVK. 
La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, comp te tenu des facteurs qui ont une incidence 
sur les risques de propagati on de l'HV CK aux poissons d'élevage et aux poissons sauvage s, à savoir: la 
mor talité, le taux de mor talité et la distr ibution de la mor talité des poissons dans la ferme aquacole infec tée 
par l'HVK; la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisines et la densité de ces dernières, la 
proximité des abattoirs, les fermes aquacoles en contact, les espèces présent es dans les fermes aquacoles, les 
pratiques d'élevage appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, 
les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique. 
Pour l'établissement des périmètres de protection et de surveillance, les exige nces minimales suivantes 
s'appliquent en ce qui concer ne la délimitation géographique de ces périmètres: 
i)  un périmètre de prot ection doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole officiellement 
déclarée infectée par l'HVK et doit correspondre à la totalit é du bassin hydrographique de ladit e ferme 
aquacole; l'autorité compét ente peut limiter l'extension du périmètre à certaines parties du bassin 
hydrographique à condition que cela ne remette pas en cause les moyens mis en œuvre pour empê cher la 
propagati on de l'HV CK; 
ii)  un périmètre de surveillance doit être établi au-delà du périmètre de prot ection et doit correspondre à une 
zone étendue située autour du périmètre de protection établi; 23.9.2015 L 247/14 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     b)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE, qui se trouvent à l'intér ieur du périmètre de protection et qui ne sont pas officiellement 
déclarées infectées par l'HVK doivent faire l'objet d'une enquête offici elle compre nant au moins les éléments 
suivants: 
i)  le prélèvement d'échanti llons en vue de la réalisation de tests sur 10 poissons en cas de signes cliniques 
ou de signes post-mor tem compat ibles avec l'HV CK, ou sur 30 poissons en l'absence de signes cliniques 
ou de signes post mor tem; 
ii)  une inspection sanitaire; dans les fermes aquacoles dans lesquelles les tests visés au point III.2 ont donné 
des résultats négat ifs, les inspections sanitaires doivent se poursuivre à raison d'une fois par mois pendant 
la saison durant laquelle la température de l'eau est suscep tible de dépasser 15 °C, jusqu'à la levée du 
périmètre de prot ection conf ormément au point I.2.2.1 c); 
c)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par l'HVK doivent être vidées de leurs poissons, 
netto yées et désinfe ctées et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines doit être 
obser vée; lorsque tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées à l'intérieur d'un même 
périmètre de protect ion ont été vidées de leurs poissons, un vide sanitaire synchronisé d'au moins trois 
semaines doit être respecté. Le présent paragraphe s'applique également aux nouvelles fermes aquacoles 
officiellement déclarées infectées pendant la mise en œuvre du programme d'éradication. 
Lors du vide sanitaire des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées, les périmètres de prot ection 
sont convertis en périmètres de surveillance. 
L'autorité compét ente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres 
de prote ction et de surveillance établis soient vidées de leurs poissons, netto yées, désinf ectées et qu'elles 
fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déter minée par l'autori té 
compét ente, sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas. 
d)  Toutes les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par l'HVK et tout es les autres fermes aquacoles 
soumises à un vide sanitaire qui se trouvent à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance 
établis doivent être repeuplées: 
i)  avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut 
sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne l'HV CK ou 
ii)  transito irement jusqu'au 31 décembre 2020, avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou 
de compar timents faisant l'objet d'un programme de surveillance de l'HV CK approuvé. 
Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées 
infectée s ont été vidées de leurs poissons, netto yées et désinfe ctées, puis soumises à une période de vide 
sanitaire conf ormément au point I.2.2.1 c); 
e)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE dans l'État membre, la zone ou le compar timent couver ts par le programme d'éradication, ainsi 
que, lorsqu'une surveillance des populations sauvage s est requise, les points de prélèvement sélectionnés 
conf ormément au point I.1 doivent avoir ensuit e été soumis au moins au programme de surveillance décr it 
au point I.2.1. 
I.2.2.2.  Exigen ces à respecter pour que des compar timents continentaux compr enant une seule ferme aquacole ayant 
précédemment été déclarés indemnes de l'HV CK puissent retrouver le statut «indemne de maladie» 
Un compar timent continental comprenan t une seule ferme aquacole jouissant d'un statut sanitaire de catégo rie I 
en ce qui concer ne l'HV CK, dont le statut sanitaire à l'égard de cette maladie est indépendant de celui des eaux 
naturelles avoisinante s conf ormément à l'annexe V, partie II, point 3, de la directive 2006/88/CE, et qui s'est vu 
retirer le statut sanitaire de catégo rie I conf ormément à l'article 53, paragraphe 3, de cette directive, peut 
retrouver le statut de catégo rie I pour l'HV CK dès que l'aut orité compét ente a confir mé que les conditions 
suivantes sont rem plies: 
a)  il a été vidé de ses poissons, netto yé, désinfect é et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six 
semaines a été obser vée; 
b)  il a été repeuplé avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un 
statut sanitaire de caté gorie I ou de compar timents faisant l'objet d'un programme de surveillance de l'HV CK 
approuvé (statut sanitaire de catégor ie II). 23.9.2015 L 247/15 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.3.  Exigen ces spécifiques pour le maintien du statut sanitaire de caté gorie I en ce qui concer ne l'HV CK 
Lorsqu'une surveillance ciblée est nécessaire pour maintenir le statut sanitaire de catégor ie I conf ormément à 
l'article 52 de la directive 2006/88/CE du Conseil, tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles 
énumérées à l'annexe IV, partie II, de cette directive dans l'État membre, la zone ou le compar timent concer nés 
doivent faire l'objet d'inspections sanitaires et d'échantillonnag es conf ormément au tableau 2.B figurant à la 
section III de la présent e partie, comp te tenu du risque de contamination de la ferme aquacole par l'HVK. 
Dans les compar timents jouissant du statut sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne l'HV CK qui se trouvent 
dans des zones continentales et comprennent une ou plusieurs fermes aquacoles dont le statut sanitaire en ce 
qui concer ne l'HV CK dépend de celui des eaux naturelles avoisinantes à l'égar d de cette maladie réper toriée 
conf ormément à l'annexe V, partie II, point 2, de la directive 2006/88/CE, la fréquence des inspections sanitaires 
doit correspondre au nombre indiqué dans le tableau 2.C pour le niveau de risque élevé. 
Dans les États membres, les zones ou les compar timents qui comp tent un nombre limité de fermes aquacoles 
dont la surveillance ciblée ne permet pas d'obten ir suffi samment de données épidémiologiques, les programmes 
de surveillance nécessaires pour maint enir le statut «indemne de maladie» doivent inclure des points de 
prélèvement sélectionnés conf ormément aux exige nces fixées au point I.1. 
50 % de ces points de prélèvement doivent faire l'objet d'inspections et de prélèvements chaque année, par 
rotation. L'échanti llonnage doit être réalisé conf ormément au tableau 2.C de la section III. Les échanti llons 
doivent être sélectionnés, préparés et examinés comme indiqué à la section II et les résultats des examens de 
laborat oire doivent être négatif s en ce qui concer ne la présence de l'agen t de l'HV CK. 
Le statut «indemne de maladie» ne doit être maintenu que tant que tous les échanti llons testés à l'aide des 
méthodes de diagnostic établies au point II.2 se révèlent négatifs pour l'HV CK, et tout e suspicion d'HV CK doit 
être écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic établies au point III.2. 
I.4.  Exigen ces spécifi ques pour la levée des mesures de confinement prévues à l'article 39 de la directive 2006/88/CE 
pour l'obte ntion du statut sanitaire de catégo rie III en ce qui concer ne l'HV CK dans des États membres, des 
zones ou des compar timents ayant un statut sanitaire de catégo rie V 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégo rie V en ce qui concer ne 
l'HV CK peut obte nir le statut sanitaire de caté gorie III pour cette maladie réper toriée à condition que: 
a)Les exigences définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisf aites. Dans les cas où il n'est techni­
quement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles concer nées doivent faire 
l'objet d'une autre mesure offrant des garant ies quasiment identiques pour l'éradication de l'HVK de l'env iron ­
nement de la ferme aquacole; 
b)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et tout es les autres fermes aquacoles ayant été 
soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures conf ormément au point a) qui se trouvent à l'intérieur des 
périmètres de protection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des poissons provenant d'États 
membres, de zones ou de compar timents ayant un statut sanitaire de caté gorie I, II ou III en ce qui concer ne 
l'HV CK; 
c)  le repeuplement n'ait eu lieu qu'après que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées ont 
été vidées de leurs poissons, netto yées, désinf ectées et soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures 
conf ormément au point a). 
II.  Méthodes de diagnostic et d'échantillonnage pour la surveillance visant à l'obtention et au maintien du statut 
«indemne de maladie» en ce qui concer ne l'HV CK 
II.1.  Échantillons 
Les tissus à examiner sont prélevés sur les branchies et les reins. Il est possible de regrouper des fragments 
d'org anes provenant de deux poissons au maximum. 
II.2.  Méthodes de diagnostic pour la surveillance visant à l'obtentio n et au maintien du statut «indemne de maladie» 
en ce qui concer ne l'HV CK 
La méthode de diagnostic pour l'obtention ou le maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne 
l'HV CK est l'am plification en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR), conf ormément aux méthodes et 
procédures de diagnostic détaillées qui figurent à l'annex e II, partie 2, point II. 23.9.2015 L 247/16 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     III.  Méthodes de diagnos tic et d'échantillonnage pour les enquêtes officielles destiné es à conf irmer ou à écar ter une 
suspicion d'HV CK 
III.1.  Échantillons 
Les tissus à examiner sont prélevés sur les branchies et les reins. Il est possible de regrouper des fragments 
d'org anes provenant de deux poissons au maximum. 
III.2.  Méthodes d'enquête officielle et de diagnostic pour exclure ou confir mer la présence d'une infection par l'HVK 
Lorsqu'il est nécessaire de conf irmer ou d'écar ter une suspicion d'HV CK conf ormément à l'article 28 de la 
directive 2006/88/CE, les procédures d'inspection, d'échanti llonnage et d'essai suivante s doivent être respectées: 
a)  l'enquête officielle doit compr endre au moins une inspection sanitaire et un échantillonnag e sur 10 poissons 
en cas de signes cliniques ou de signes post-mor tem compatib les avec une infection par l'HVK, ou sur 
30 poissons en l'absence de signes cliniques ou de signes post mor tem. Les échanti llons doivent être testés à 
l'aide de la méthode de diagnostic indiquée au point b) conf ormément aux méthodes et procédures de 
diagnostic détaillées figurant à l'annex e II, partie 2, point II; 
b)  la présence de l'infe ction par l'HVK doit être considérée comme confir mée si l'HVK est détecté par PCR; 
une suspicion d'HV CK peut être écar tée si les résultats de cet essai n'appor tent aucun élément supplémentaire 
prouvant la présence de l'HVK. 
Tableau 2.A 
Prog ramme de surveillance des zones et compar timents pour la période de deux ans qui précède l'obtention du 
statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'HV CK visée au point I.2.1   
Nombre d'inspec ­
tions cliniques par 
an (sur deux ans) Nombre d'examens 
de laborato ire par 
an (sur deux ans) Nombre de pois ­
sons par échantillon 
Fermes aquacoles/sit es 
de prélèvement Deux premières années de la pé­
riode de surveillance 2 2 75(1)  
Nombre maximal de poissons par regroupement: 2 
(1)  Les échantillons doivent être prélevés sur un nombre de poissons propre à garantir la détection de l'HVK avec un niveau de 
confianc e de 95 % si la prévalence escomp tée est de 5 %.  
Tableau 2.B 
Prog ramme de surveillance des zones et compar timents pour la période de quatre ans qui précède l'obtention 
du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'HV CK visée au point I.2.1   
Nombre d'inspec ­
tions cliniques par 
an Nombre d'examens 
de laborato ire par 
an Nombre de pois ­
sons par échantillon 
Fermes aquacoles/sit es 
de prélèvement Deux premières années de la pé­
riode de surveillance 1 1 30 
Fermes aquacoles/sit es 
de prélèvement Deux dernières années de la pé­
riode de surveillance 2 2 30  
Nombre maximal de poissons par regroupement: 2  23.9.2015 L 247/17 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Tableau 2.C 
Prog rammes de surveillance des zones ou compar timents en vue du maintien du statut «indemne de maladie» 
en ce qui concer ne l'HV CK visé au point I.3 
Niveau de risque Nombre d'inspections sanitaires Nombre de poissons par échant illon 
Élevé Deux par an 30 
Moyen Une par an 30 
Faible Une tous les deux ans 30 
Nombre maximal de poissons par regroupement: 2  
Tableau 2.D 
Prog ramme de surveillance en vue du maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'HV CK 
dans des États membres, zones ou compar timents comptant un nombre limité de fermes aquacoles dont la 
surveillance ciblée ne permet pas d'obtenir suff isamment de données épidémiologiques visé au point I.3  
Nombre d'inspections cliniques 
par an Nombre d'examens de labora ­
toire par an Nombre de poissons par 
écha ntillon 
Points de prélèvement Une tous les deux ans Un tous les deux ans 30 
Nombre maximal de poissons par regroupement: 2  
PARTIE 3 
SUR VEILL ANCE ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE L'ANÉMIE INFECTIEUSE DU SAUMON (AIS) 
I.  Exigences relativ es aux prog rammes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut 
sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'AIS ainsi que des mesures de conf inement destin ées à lutter 
contre l'infectio n par des variants délétés dans la région hautement polymor phe (RHP) du virus de l'AIS (VAIS) 
I.1.  Exigen ces générales 
Lorsque des fermes aquacoles doivent, plus d'une fois par an, faire l'objet d'inspections sanitaires et d'échanti l­
lonnag es conf ormément aux dispositions de l'annex e V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de la directive 
2006/88/CE, l'intervalle entre les inspections sanitaires ou entre chaque prélèvement d'échanti llons doit être 
aussi long que possible. 
Lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvag es est requise conf ormément à l'annexe V, partie I, point 2, 
deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, le nombre et la répar tition géographique des points de 
prélèvement doivent être déterminés de façon à obtenir une couver ture raisonnable de l'État membre, de la zone 
ou du compar timent. Les points de prélèvement doivent aussi être représentatifs des divers écosystèmes abritant 
des populations sauvages sensibles. 
Des inspections sanitaires doivent être effectuées dans tout es les unités de production, telles que les étangs, les 
viviers et les cage s en filet en vue d'établir la présence de poissons mor ts, faibles ou au compo rtement anor mal. 
Une attenti on particulière doit être accordée au point d'évacuation des eaux, où les poissons faibles ont tendance 
à s'accumuler en raison du courant. 23.9.2015 L 247/18 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Les poissons à inclure dans les échanti llons sont sélectionnés comme suit: 
a)  seuls les poissons mor ibonds ou qui viennent de mour ir et ne sont pas encore décom posés doivent être 
sélectionnés; en particulier , les poissons présentant une anémie, des saignements ou d'autres signes cliniques 
évoquant des troubles circulat oires doivent être prélevés en priorité; 
b)  si le saumon de l'Atlantique fait partie des espèces sensibles présent es sur le site, des échanti llons de saumon 
de l'Atlant ique doivent être prélevés en priorité. En l'absence de saumon de l'Atlan tique dans la ferme 
piscicole, d'autres espèces sensibles doivent faire l'objet d'un échantillon nage; 
c)  si plus d'une source d'eau est utilisée pour la production des poissons, des poissons représentatifs de tout es 
les sources d'eau doivent être inclus dans l'écha ntillon. 
d)  les poissons sélectionnés doivent inclure des poissons collectés de telle manière que tout es les unités de 
production, telles que les cage s en filet, les viviers et les étangs, de la ferme aquacole ainsi que tout es les 
classes d'âg e annuelles soient représentées propor tionnellement dans l'éch antillon. 
I.2.  Exigen ces spécifiques pour l'obtention du statut sanitaire de caté gorie I en ce qui concer ne l'AIS 
I.2.1.  Programmes de surveillance 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégor ie III tel que visé à 
l'annex e III, partie B, de la directive 2006/88/CE en ce qui concer ne l'AIS peut obteni r le statut sanitaire de 
catégo rie I pour cette maladie réper toriée lorsque tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles 
énumérées à l'annex e IV, partie II, de ladite directive dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent 
satisf ont aux exigenc es définies à l'annex e V de ladit e directive, et que tout es ces fermes aquacoles et, pour 
autant que les dispositions de l'annex e V, partie I, point 2, deuxième paragraphe de cette directive le requièrent, 
tous les points de prélèvement dans les populations sauvage s sélectionnées conf ormément audit point, ont fait 
l'objet du programme de surveillance suivant: 
a)  les fermes aquacoles ou les points de prélèvement ont fait l'objet d'inspections sanitaires et d'échanti llonnages 
pendant une période minimale de deux années consécutives, comme indiqué dans le tableau 3.A de la 
section II; 
b)  au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échanti llons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 doivent s'être révélés négatif s pour les variants délétés dans la 
RHP du VAIS et tout e suspicion d'AIS doit avoir été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic 
indiquées au point II.3. 
c)  Si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance, l'AIS est conf irmée dans une ferme 
aquacole incluse dans ce programme de surveillance et que, par conséquent, cette ferme a vu son statut 
sanitaire de catégo rie II lui être retiré, un programme d'éradication doit avoir été mis en œuvre 
conf ormément au point I.2.2. 
I.2.2.  Programmes d'éradication 
I.2.2.1.  Exigen ces générales 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégo rie V en ce qui concer ne 
l'ISA peut obtenir un statut sanitaire de catégor ie I pour cette maladie réper toriée lorsque tout es les fermes 
aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet 
État membre, cette zone ou ce compar timent ont fait l'objet d'un programme d'éradication conf orme aux 
points a) à e) suivants: 
a)  les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 3, de la directive 2006/88/CE ont effectivement 
été appliquées et, en particulier , une zone de conf inement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladit e 
directive, assor tie d'un périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alent ours 
de la ou des fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées par des variants délét és dans la RHP du VAIS, 
ou dans lesquelles la présence de l'AIS a été confir mée. 
La zone de confinement doit avoir été définie au cas par cas, comp te tenu des facteurs qui ont une incidence 
sur les risques de transmission de l'AIS aux poissons d'élevag e et aux poissons sauvages , à savoir: la 
mor talité, le taux de mor talité et la distr ibution de la mor talité des poissons dans la ferme aquacole infec tée 
par des variants délétés dans la RHP du VAIS ou dans laquelle la présence de l'AIS a été confir mée, la 
distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisi nes et la densité de ces dernières, la proximité des 
abatt oirs, les fermes aquacoles en contact, les espèces présent es dans les fermes aquacoles, les pratiques 
d'élevag e appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, les 
conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique. 23.9.2015 L 247/19 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Pour l'établissement des périmètres de protection et de surveillance, les exige nces minimales suivantes 
s'appliquent en ce qui concer ne la délimitation géographique de ces périmètres: 
i)  un périmètre de prot ection doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole officiellement 
déclarée infec tée par l'AIS, et doit correspondre:  
1. dans les zones côtières: à une zone s'éte ndant sur un rayon d'au moins une excursion de marée et, en 
tout état de cause, d'au moins cinq kilomètres autour de la ferme aquacole officiellement déclarée 
infectée par l'AIS, ou à une superf icie équivalent e déter minée selon les données hydrodynamiques ou 
épidémiologiques appropr iées;  
2. à l'inté rieur des terres: à la tota lité du bassin hydrographique de la ferme aquacole officiellement 
déclarée infectée par l'AIS; l'aut orité compé tent e peut limiter l'extension du périmètre à certaines 
parties du bassin hydrographique à condition que cela ne remette pas en cause les moyens mis en 
œuvre pour emp êcher la propagation de l'AIS; 
ii)  un périmètre de surveillance doit être établi au-delà du périmètre de prot ection et doit correspondre:  
1. dans les zones côtières: à une zone située autour du périmètre de prot ection et dont la zone 
d'excu rsion de marée chevauche celle du périmètre de protection, à une zone située autour du 
périmètre de prot ection et s'étendant sur un rayon de 10 kilomètres à partir du centre du périmètre de 
prot ection ou à une superf icie équivalent e déter minée selon les données hydrodynamiques ou 
épidémiologiques appropr iées ou  
2. à l'intér ieur des terres: à une zone étendue située au-delà du périmètre de prote ction établi; 
b)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE, qui se trouvent à l'intér ieur du périmètre de protection et qui ne sont pas officiellement 
déclarées infec tées par l'AIS doivent faire l'objet d'une enquête officielle compre nant au moins les éléments 
suivants: 
i)  un prélèvement d'échantillon s en vue de la réalisation de tests sur 10 poissons mor ibonds en cas de signes 
cliniques ou de signes post-mor tem compatib les avec l'AIS, ou sur 30 poissons en l'absence de signes 
cliniques ou de signes post mor tem; 
ii)  une inspection sanitaire; dans les fermes aquacoles dans lesquelles les tests visés au point i) ont donné des 
résultats négat ifs, les inspections sanitaires doivent se poursuivre à raison d'une fois par mois jusqu'à la 
levée du périmètre de prot ection conf ormément au point I.2.2.1 c); 
c)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infect ées par des variants délét és dans la RHP du VAIS ou 
dans lesquelles la présence de l'AIS a été confir mée doivent être vidées de leurs poissons, netto yées et 
désinf ectées et une période de vide sanitaire d'au moins trois mois doit être obser vée. Les périmètres de 
prot ection et de surveillance peuvent être levés lorsque tout es les fermes aquacoles situées à l'intérieur du 
périmètre de protection ont été vidées de leurs poissons, netto yées et désinf ectées et qu'une période de vide 
sanitaire synch ronisé d'au moins six semaines a été respectée. 
Lors du vide sanitaire des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées, les périmètres de prot ection 
sont convertis en périmètres de surveillance. 
L'autorité compét ente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles situées à l'intérieur des périmètres 
de prote ction et de surveillance établis soient vidées de leurs poissons, netto yées, désinf ectées et qu'elles 
fassent l'objet d'un vide sanitaire. Pour ces fermes, la durée de la période de vide sanitaire est déterminée par 
l'aut orité compé tent e, sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas; 
d)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infect ées par des variants délét és dans la RHP du VAIS ou 
dans lesquelles la présence de l'AIS a été conf irmée et tout es les autres fermes aquacoles ayant fait l'objet d'un 
vide sanitaire situées à l'intérieur des périmètres de prote ction et de surveillance établis doivent être 
repeuplées avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut 
sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne l'ISA. 
Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées 
infectée s ont été vidées de leurs poissons, netto yées et désinfe ctées, puis soumises à une période de vide 
sanitaire conf ormément au point I.2.2.1 c); 
e)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE dans l'État membre, la zone ou le compar timent couver t par le programme d'éradication, ainsi 
que, lorsqu'une surveillance des populations sauvage s est requise, les points de prélèvement sélectionnés 
conf ormément au point I.1 doivent ensuite faire l'objet du programme de surveillance décr it au point I.2.1. 23.9.2015 L 247/20 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.2.2.2.  Exigen ces à respecter pour retrouver le statut «indemne de maladie» dans le cas des compar timents continentaux 
comp tant une seule ferme aquacole ayant précédemment bénéficié du statut sanitaire de caté gorie I 
Un compar timent continental comp tant une seule ferme aquacole jouissant d'un statut sanitaire de catégo rie I 
en ce qui concer ne l'AIS, dont le statut sanitaire est indépendant de celui des eaux naturelles avoisinant es 
conf ormément à l'annexe V, partie II, point 3, de la directive 2006/88/CE, et qui s'est vu retirer le statut sanitaire 
de catégor ie I conf ormément à l'article 53, paragraphe 3, de cette directive, peut retrouver ce statut dès que 
l'aut orité compé tent e a conf irmé que les conditions suivantes sont rem plies: 
a)  il a été vidé de ses poissons, netto yé, désinfect é et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six 
semaines a été obser vée; 
b)  il a été repeuplé avec des poissons provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un 
statut sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne l'AIS. 
I.3.  Exigen ces minimales pour le maintien du statut sanitaire de caté gorie I en ce qui concer ne l'AIS 
Lorsqu'une surveillance ciblée est nécessaire pour maintenir le statut sanitaire de catégor ie I conf ormément à 
l'article 52 de la directive 2006/88/CE du Conseil, tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles 
énumérées à l'annexe IV, partie II, de cette directive dans l'État membre, la zone ou le compar timent concer nés 
doivent faire l'objet d'inspections sanitaires et d'échantillon nages conf ormément au tableau 3.B (1) figur ant à la 
section II de la présent e partie, comp te tenu du risque de propagati on de l'AIS à la ferme aquacole. 
Lors de la détermination de la fréquence des inspections sanitaires dans les compar timents jouissant du statut 
sanitaire de caté gorie I en ce qui concer ne l'AIS qui se trouvent dans des zones continentales et dont le statut 
sanitaire en ce qui concer ne l'AIS dépend du statut sanitaire des eaux naturelles avoisinant es abritant le saumon 
de l'Atlan tique (Salmo salar), le risque de transmission de l'AIS doit être considéré comme élevé. 
Le statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'AIS ne doit être maint enu que tant que tous les échantillons 
testés à l'aide des méthodes de diagnostic établies au point II.2 se révèlent négat ifs pour les variants délét és dans 
la RHP du VAIS, et que tout e suspicion d'AIS a été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic établies 
au point II.3. 
I.4.  Exigen ces spécifiques pour l'obtention du statut sanitaire de catégor ie III en ce qui concer ne l'infe ction par des 
variants délét és dans la RHP du VAIS dans des États membres, des zones ou des compar timents ayant un statut 
sanitaire de catégo rie V 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégo rie V en ce qui concer ne 
l'AIS peut obtenir le statut sanitaire de catégor ie III à condition que: 
a)Les exigences définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisf aites. Dans les cas où il n'est techni­
quement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une 
autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication du VAIS de l'environnement de la 
ferme aquacole; 
b)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectée s et tout es les autres fermes aquacoles ayant fait 
l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conf ormément au point a) qui sont situées à l'inté rieur des 
périmètres de protection et de surveillance établis aient été repeuplées avec des poissons provenant d'États 
membres, de zones ou de compar timents ayant un statut sanitaire de caté gorie I, II ou III en ce qui concer ne 
l'AIS; 
c)  le repeuplement n'ait eu lieu qu'après que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées ont 
été vidées de leurs poissons, netto yées, désinf ectées et soumises à un vide sanitaire ou à d'autres mesures 
conf ormément au point a); 
d)  aucune infec tion par des variants délétés dans la RHP du VAIS n'ait pas été confir mée au cours des deux 
années suivant l'exécution des mesures visées aux points a), b) et c), et que tout e suspicion durant cette 
période ait été écar tée conf ormément aux procédures établies au point II.3. 23.9.2015 L 247/21 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     
(1)Ne s'applique pas aux fermes aquacoles qui élèvent uniquement des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ou des truites fario (Salmo 
trutta), ou les deux, dans une eau provenant exclusivement de sources d'eau douce n'abr itant pas le saumon de l'Atlantique (Salmo salar). II.  Méthodes de diagnos tic et enquêtes officielles 
II.1.  Échantillons 
Les tissus à examiner sont: 
a)  histo logie: rein antér ieur, foie, cœur , pancréas, intes tins, rate et branchi es; 
b)  immunohist ochimie: rein médian et cœur , y compris les valves et le bulbe artériel; 
c)  analyse par RT-qPCR: rein médian et cœur ; 
d)  culture du virus: rein médian, cœur , foie et rate. 
Il est possible de regrouper des fragments d'organes provenant de cinq poissons au maximum. 
II.2.  Méthodes de diagnostic pour l'obt ention ou le maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'AIS 
La méthode de diagnostic à utiliser en vue de l'obt ention ou du maintien du statut «indemne de maladie» en ce 
qui concer ne l'AIS conf ormément aux points I.2 et I.3 est l'analyse par RT-qPCR suivie du séquençage des 
écha ntillons positifs conf ormément aux méthodes et procédures détaillées décr ites à l'annex e II, partie 3. 
En cas de résultat positif à l'issue de l'analyse par RT-qPCR, d'autres échantillon s doivent être testés avant la mise 
en œuvre des premières mesures de lutte prévues à l'article 28 de la directive 2006/88/CE. 
Ces échantillons doivent être testés comme suit, conf ormément aux méthodes et procédures détaillées décr ites à 
l'annex e II, partie 3: 
a)  examen des échantillon s par RT-qPCR puis séquençage du gène HE pour vérifier les délétions dans la RHP 
et 
b)  examen sur préparations tissulaires à l'aide d'anticor ps spécifi ques dirigés contre le virus de l'AIS (à savoir 
IHC sur coupes fixées ou test IFAT sur emp reintes tissulaires); ou 
c)  isolement et identif ication du virus de l'AIS dans une culture de cellules provenant d'au moins un échantillon 
prélevé sur n'im porte quel poisson issu de la ferme aquacole. 
II.3.  Méthodes d'enquête officielle et de diagnostic pour exclure ou confir mer la présence de l'AIS 
Lorsqu'il est nécessaire de confir mer ou d'écar ter une suspicion d'AIS conf ormément à l'article 28 de la directive 
2006/88/CE, les procédures d'inspection, d'échantillon nage et d'essai suivantes doivent être respectées: 
a)  l'enquête officielle, qui doit comprendre au moins une inspection sanitaire et un échanti llonnage sur 
10 poissons mor ibonds en cas de signes cliniques ou de signes post mor tem compatibles avec l'AIS. En 
l'absence de signe clinique ou post mor tem compatib le avec l'AIS, l'inspection sanitaire doit être suivie d'un 
écha ntillonnage ciblé sur au moins 30 poissons mor ibonds ou mor ts depuis peu mais de constitution 
normale conf ormément au point I.1. Les échantillons doivent être testés conf ormément aux méthodes de 
diagnostic établies indiquées au point b); 
b)  en cas de résultat positif pour les variants délét és dans la RHP du VAIS à l'issue de l'analyse par RT-qPCR, 
d'autres échantillons doivent être testés avant la mise en œuvre des premières mesures de lutte prévues à 
l'article 28 de la directive 2006/88/CE. Les suspicions d'infection par le VAIS doivent être confir mées 
conf ormément aux critères ci-après, suivant les méthodes et procédures détaillées décr ites à l'annexe II, 
partie 3: 
i)  détection du VAIS par RT-qPCR avec séquençage du gène HE pour vérifier les délétions dans la RHP , et 
détection du VAIS dans des préparations tissulaires à l'aide d'anticor ps spécif iques dirigés contre le VAIS (à 
savoir IHC sur coupes fixées ou test IFAT sur empreint es tissulaires) 
ou 23.9.2015 L 247/22 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     ii)  détection du VAIS par RT-qPCR avec séquençage du gène HE pour vérifier les délétions dans la RHP , et 
isolement et identif ication du VAIS dans une culture de cellules provenant d'au moins un échantillon 
prélevé sur n'im porte quel poisson issu de la ferme aquacole; 
c)  lorsque des modifications cliniques, macropathologiques ou histo pathologiques compati bles avec l'AIS sont 
constat ées, ces constatations doivent être corroborées par la détection du virus par deux méthodes de 
diagnostic reposant sur des principes de détection distincts, telles que la RT-qPCR et l'IHC, conf ormément à 
l'annex e II, partie 3. 
Une suspicion d'AIS peut être écar tée lorsqu'il est établi, à l'issue des tests et inspections réalisés sur une 
période de 12 mois à partir de la date à laquelle est née la suspicion, qu'aucun élément supplémentaire ne 
prouve la présence de l'AIS. 
Tableau 3.A 
Prog ramme de surveillance des zones et compar timents pour la période de deux ans qui précède l'obtention du 
statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'AIS visée au point I.2.1. 
Année de surveillance Nombre d'inspections sani ­
taires par an (sur deux ans) Nombre d'examens de labora ­
toire par an (sur deux ans) Nombre de poissons à échantil ­
lonner par an 
Année 1 6 2(1) 2 * 75(2) 
Année 2 6 2(1) 2 * 75(2) 
(1)Les échantillons doivent être prélevés et stockés puis examinés au cours de deux périodes de tests d'un mois chaque année (au prin­
temps et en automne), ou selon ce qui convient en fonction de considérations d'ordre pratique. 
(2)  Nombre maximal de poissons par regroupement: 5.  
Tableau 3.B 
Prog rammes de surveillance des zones ou compar timents en vue du maintien du statut «indemne de maladie» 
en ce qui concer ne l'AIS visé au point I.3(2) 
Niveau de risque Nombre d'inspections sani ­
taires par an Nombre d'examens de labora ­
toire par an Nombre de poissons à échantil ­
lonner par an 
Élevé 2 2(1) 2 × 30 
Moyen 1 1(1) 30 
Faib le Une tous les deux ans Un tous les deux ans 30 tous les deux ans 
(1)  Les échanti llons doivent être prélevés et examinés au cours de deux périodes de tests d'un mois chaque année (au printem ps et en 
automne), ou selon ce qui convient en fonction de considérations d'ordre pratique. 
(2)  Ne s'applique pas aux fermes aquacoles qui élèvent uniquement des truites arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) ou des truites fario 
(Salmo trutta), ou les deux, dans une eau provenant exclusivement de sources d'eau douce n'abr itant pas le saumon de l'Atlantique 
(Salmo salar).  
PARTIE 4 
SUR VEILL ANCE ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE L'INFECTION À MARTEILIA REFRINGENS 
I.  Exigences relativ es aux prog rammes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut 
sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'infection à Mar teilia refringens 
I.1.  Exigen ces générales 
Des inspections sanitaires et, le cas échéant, le prélèvement d'échanti llons en vue d'examens de laborat oire doivent 
être réalisés pendant la période de l'année où l'on sait que la prévalence du parasite est maximale dans l'État 
membre, la zone ou le compar timent. Si cette information n'est pas disponible, l'échantillonnage doit être réalisé 
juste après que la température de l'eau a dépassé 17 °C. 23.9.2015 L 247/23 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Si les mollusques doivent faire l'objet d'un échantillonnage conf ormément aux exigenc es définies dans la partie 4, 
les critères suivants doivent être respectés: 
a)  si des mollusques des genres Ostrea spp.et Mytilus spp. sont présents dans les unités de production ou l'aire de 
production, ces deux genres doivent être représenté s équitablement dans les écha ntillons. Si un seul de ces 
genres est présent, ce genre doit être inclus dans les échantillon s. Si ni le genre Ostrea ni le genre Mytilus ne 
sont présents, les échantillons doivent être représentatifs de tout es les autres espèces sensibles présent es; 
b)  en présence, dans les unités de production, de mollusques faibles, bâillants ou qui viennent de mour ir mais ne 
sont pas encore décomposés, ces animaux doivent être sélectionnés en priorité. En l'absence de tels mollusques, 
les animaux sains les plus âgés doivent être sélectionnés; 
c)  lorsque les prélèvements sont réalisés dans des fermes conch ylicoles qui utilisent plusieurs sources d'eau pour 
la production des mollusques, des animaux représentant tout es les sources d'eau doivent être inclus dans les 
écha ntillons, de sorte que tout es les parties de la ferme y soient propor tionnellement représenté es; 
d)  lorsque les prélèvements sont réalisés dans des parcs à mollusques, des mollusques provenant d'un nombre 
suffisant de points d'écha ntillonnage doivent être inclus dans les échantillons de sorte que tout es les parties du 
parc à mollusques y soient représent ées propor tionnellement. Les principaux facteurs à prendre en comp te 
pour la sélection de ces points de prélèvements sont les anciens points de prélèvement où Mar teilia refringens a 
été détecté, la densité d'élevag e, les courants, la présence d'espèces sensibles, la présence d'espèces vectr ices, la 
bath ymétr ie et les pratiques de gestion. L'échantillonnag e doit également porter sur les bancs naturels. 
I.2.  Exigen ces spécifiques pour l'obtention du statut sanitaire de caté gorie I en ce qui concer ne Mar teilia refringens 
I.2.1.  Programmes de surveillance 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégor ie III en ce qui concer ne 
l'infect ion à Mar teilia refringens peut obte nir un statut sanitaire de catégo rie I pour cette maladie réper toriée 
lorsque tout es les fermes aquacoles ou parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, 
partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent ont fait l'objet au 
moins du programme de surveillance ci-après compre nant des inspections sanitaires et le prélèvement d'échan ­
tillons en vue de tests: 
Programme de surveillance de deux ans: 
a)les fermes aquacoles ou les parcs à mollusques doivent avoir fait l'objet d'inspections sanitaires et d'échanti l­
lonnag es pendant une période minimale de deux années consécutives, comme indiqué dans le tableau 4.A de la 
section II; 
b)  au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échanti llons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 doivent s'être révélés négat ifs pour Mar teilia refrin gens et tout e 
suspicion d'infection par Mar teilia refringens doit avoir été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic 
indiquées au point II.3; 
c)  lorsque des mollusques des espèces Ostrea edulis, Mytilus edulis ou Mytilus galloprovincialis provenant d'un État 
membre, d'une zone ou d'un compar timent jouissant d'un statut sanitaire de caté gorie I doivent être inclus 
dans les échanti llons, ils doivent avoir été introduits dans la ferme aquacole ou dans le parc à mollusques au 
moins au printem ps précédant immédiatem ent la période d'exé cution du programme de surveillance. 
I.2.2.  Programmes d'éradication 
L'éradication de Mar teilia refringens est considérée comme impossible dans la plupar t des cas, mais lorsque l'État 
membre l'estime faisable, le modèle de programme d'éradication ci-après doit être appliqué. 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie V en ce qui concer ne 
l'infect ion à Mar teilia refringens peut obte nir un statut sanitaire de catégo rie I pour cette maladie réper toriée 
lorsque tout es les fermes aquacoles ou tous les parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à 
l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent ont fait 
l'objet du programme d'éradication suivant au moins: 
a)  les mesures prévues au chapitre V, section 3, de la directive 2006/88/CE ont effectivement été appliquées et, en 
particulier , une zone de conf inement telle que visée à l'article 32, point b), de ladit e directive, assor tie d'un 
périmètre de protection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alent ours de la ou des fermes 
aquacoles ou du ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés par Mar teilia refringens. 23.9.2015 L 247/24 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     La zone de conf inement doit avoir été définie au cas par cas, comp te tenu des facteurs qui ont une incidence 
sur les risques de propagati on de Mar teilia refringens, à savoir: le nombre, l'âge , le taux de mor talité et la 
distr ibution de la mor talité des mollusques dans la ferme aquacole ou le parc à mollusques infecté par Mar teilia 
refringens, y compris chez les mollusques sauvag es, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles ou 
parcs à mollusques voisins et la densité de ceux-ci, y compris les mollusques sauvages , la proximité des établis ­
sements de transf ormation et des fermes aquacoles ou parcs à mollusques en contact, les espèces, en particulier 
les espèces sensibles et les espèces vectr ices, présentes dans les fermes aquacoles ou les parcs à mollusques, les 
pratiques d'élevag e appliquées dans les fermes aquacoles et les parcs à mollusques contaminés et voisins; les 
conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique. 
Pour l'établissement des périmètres de prot ection et de surveillance, les exige nces minimales suivantes doivent 
être satisfait es: 
i)  un périmètre de prot ection doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole ou d'un parc à 
mollusque officiellement déclaré infecté par Mar teilia refringens et doit correspondre à une zone déter minée 
selon des données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropr iées; 
ii)  un périmètre de surveillance doit être établi au-delà du périmètre de prot ection, et doit correspondre à une 
zone située autour du périmètre de protection, déterminée selon des données hydrodynamiques ou 
épidémiologiques appropr iées; 
b)  l'ensemble des fermes aquacoles et des parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à 
l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE situés à l'intérieur du périmètre de prote ction et qui ne sont 
pas officiellement déclarés infect és par Mar teilia refrin gens doit faire l'objet d'une enquêt e officielle compr enant 
au moins un prélèvement d'échantillon s visant à tester 150 mollusques, réalisé après le début de la période de 
transmission de Mar teilia refringens. Lorsque la période de transmission n'est pas connue, l'échantillonnag e doit 
commencer après que la température de l'eau a dépassé 17 °C; 
c)  tout es les fermes aquacoles et tous les parcs à mollusques officiellement déclarés infectés par Mar teilia refrin gens 
sont vidés de leurs mollusques, font l'objet d'un vide sanitaire et sont si possible netto yés et désinfect és. 
La durée de la période de vide sanitaire doit être d'au moins: 
i)  deux mois dans le cas des fermes aquacoles et des parcs à mollusques ayant des liens limités avec les eaux 
avoisinante s telles que celles des écloser ies et des nurser ies; 
ii)  deux mois dans le cas des fermes aquacoles et des parcs à mollusques ayant des liens illimit és avec les eaux 
avoisinante s, à condition que les mollusques infect és des espèces sensibles et les mollusques des espèces 
sensibles ayant des liens épidémiologiques avec la ferme aquacole ou le parc à mollusques infectés aient été 
récoltés ou retirés avant la période de l'année où l'on sait que la prévalence de Mar teilia refringens est 
maximale ou, si cette information n'est pas connue, avant la période où la température de l'eau dépasse 
17 °C; 
iii)  quatorze mois dans le cas des fermes aquacoles et des parcs à mollusques ayant des liens illimit és avec les 
eaux avoisinantes , à condition que les mollusques infect és des espèces sensibles et les mollusques des 
espèces sensibles ayant des liens épidémiologiques avec la ferme aquacole ou le parc à mollusques infectés 
n'aient pas été récolt és ou retirés avant la période de l'année où l'on sait que la prévalence de Mar teilia 
refringens est maximale ou, si cette information n'est pas connue, lorsque les mollusques des espèces 
sensibles n'ont pas été récolté s ou éliminés avant la période où la température de l'eau dépasse 17 °C. 
Lorsque tout es les fermes aquacoles et tous les parcs à mollusques officiellement déclarés infect és sont vidés de 
leurs mollusques, un vide sanitaire synchr onisé d'au moins quatre semaines doit être mis en place. 
L'autorité compét ente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à 
l'intérieur des périmètres de prot ection et de surveillance établis soient vidés de leurs mollusques, netto yés, 
désinf ectés et qu'ils fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déterminée par 
l'aut orité compét ente sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas; 
d)  la totali té des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalit é des 
autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques ayant fait l'objet d'un vide sanitaire situés à l'intér ieur des 
périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées avec des mollusques provenant 
d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut sanitaire de catégo rie I en ce qui 
concer ne Mar teilia refringens. 23.9.2015 L 247/25 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que tout es fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées 
ont été vidées de leurs mollusques, netto yées et désinfect ées, puis soumises à une période de vide sanitaire 
conf ormément au point I.2.2 c); 
e)  tout es les fermes aquacoles et tous les parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à 
l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans l'État membre, la zone ou le compar timent couver t par 
le programme d'éradication doivent ensuite faire l'objet du programme de surveillance décr it au point I.2.1 de 
la présent e partie. 
I.3.  Exigen ces spécifiques pour le maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» (catégor ie I) en ce qui concer ne 
l'infect ion à Mar teilia refringens 
Lorsqu'une surveillance ciblée est requise pour mainte nir le statut sanitaire de catégor ie I conf ormément à 
l'article 52 de la directive 2006/88/CE, la totalit é des fermes aquacoles ou parcs à mollusques détenant des espèces 
sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de cette directive dans l'État membre, la zone ou le compar timent 
concer nés doit faire l'objet d'inspections sanitaires et d'échanti llonnages conf ormément au tableau 4.B de la 
section II, comp te tenu du risque de contamination de la ferme aquacole ou du parc à mollusques par Mar teilia 
refrin gens. 
Le statut «indemne de maladie» ne doit être maint enu que tant que tous les échantillons testés à l'aide des 
méthodes de diagnostic décr ites au point II.2 se révèlent négatifs pour Mar teilia refringens et que tout e suspicion 
d'inf ection à Mar teilia refrin gens est écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic décr ites au point II.3. 
I.4.  Exigen ces à respecter pour la levée des mesures de conf inement prévues à l'article 39 de la directive 2006/88/CE 
(passag e d'un statut sanitaire de caté gorie V à un statut de catégor ie III) en ce qui concer ne l'infectio n à Mar teilia 
refrin gens 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie V en ce qui concer ne 
l'infect ion à Mar teilia refringens peut obteni r le statut sanitaire de caté gorie III pour cette maladie réper toriée à 
condition que: 
a)Les exige nces définies au paragraphe I.2.2, points a), b) et c) soient satisf aites. Dans les cas où il n'est techni ­
quement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une autre 
mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication de Mar teilia refrin gens de l'env ironnement 
de la ferme aquacole; 
b)  la totali té des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalit é des 
autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à l'intér ieur des périmètres de protection et de 
surveillance établis et ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conf ormément au point a) aient 
été repeuplées avec des mollusques provenant d'États membres, de zones ou de compar timents ayant un statut 
sanitaire de catégo rie I, II ou III en ce qui concer ne l'infect ion à Mar teilia refringens; 
c)le repeuplement n'ait eu lieu qu'après que la totalit é des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiel ­
lement déclarés infect és ont été vidés de leurs mollusques, netto yés, désinfect és et soumis à un vide sanitaire ou 
à d'autres mesures conf ormément au point a); 
d)  aucune infection à Mar teilia refringens n'ait été confir mée au cours des deux années suivant l'exécution des 
mesures visées aux points a), b) et c), et que tout e suspicion au cours de cette période ait été écar tée 
conf ormément aux procédures établies au point II.3. 
II.  Méthodes de diagnos tic et enquêtes officielles 
II.1.  Échantillons 
L'animal entier est présent é au laboratoire pour la réalisation des tests de diagnostic spécifiés aux points II.2 
et II.3. 
II.2.  Méthodes de diagnostic pour l'obt ention ou le maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne 
l'infect ion à Mar teilia refringens 
Les méthodes de diagnostic à utiliser pour l'obt ention ou le maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui 
concer ne l'infe ction à Mar teilia refringens conf ormément aux méthodes et procédures de diagnostic détaillées 
figurant à l'annex e II, partie 4, sont l'examen histo pathologique, les empr eintes tissulaires ou la PCR. 23.9.2015 L 247/26 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     II.3.  Méthodes d'enquête officielle et de diagnostic visant à conf irmer la présence d'une infection à Mar teilia refrin gens 
ou à écar ter une suspicion d'une telle infection 
Lorsqu'il est nécessaire de confir mer ou d'écar ter une suspicion d'inf ection à Mar teilia refringens conf ormément à 
l'article 28 de la directive 2006/88/CE, les procédures d'inspection, d'échanti llonnage et d'essai suivantes doivent 
être respectées: 
a)  l'enquête officielle doit compo rter au moins un échantillonnag e sur 30 mollusques d'espèces sensibles si la 
suspicion est fondée sur un rappor t de mor talité, ou, si tel n'est pas le cas, sur 150 mollusques d'espèces 
sensibles, les prélèvements étant réalisés après le début de la période de transmission de Mar teilia refringens. 
Lorsque la période de transmission n'est pas connue, l'éch antillonnage doit commencer après que la 
température de l'eau a dépassé 17 °C; 
b)  les échantillons doivent être testés à l'aide des méthodes de diagnostic indiquées au point i) conf ormément aux 
méthodes et procédures de diagnostic détaillées figurant à l'annex e II, partie 4, section I: 
i)  la présence de Mar teilia refringens doit être considérée comme confir mée lorsque l'examen histo pathologique, 
les empr eintes tissulaires ou l'hybridation in situ donnent un résultat positif associé à un résultat positif 
obtenu par la PCR compl étée par un séquençage; 
ii)  la suspicion d'inf ection à Mar teilia refrin gens peut être écar tée dans les cas où les tests visés au point i) 
n'appor tent aucun élément supplémentaire prouvant la présence de Mar teilia refrin gens. 
Tableau 4.A 
Prog ramme de surveillance dans les États membres, zones ou compar timents pour la période qui 
précède l'obtention du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'inf ection à Mar teilia refringens visé au 
point I.2.1  
Nombre d'inspections sani ­
taires par an Nombre d'examens de labora ­
toire par an Nombre de mollusques par 
échantillon 
Fermes aquacoles/parcs à 
mollusques 1 1 150  
Tableau 4.B 
Prog rammes de surveillance dans les États membres, zones ou compar timents en vue du maintien du statut 
«indemne de maladie» en ce qui concer ne l'infection à Mar teilia refringens visé au point I.3 
Niveau de risque Nombre d'inspections 
sanitaires Nombre d'examens de 
laboratoire Nombre de mollusques par 
écha ntillon 
Élevé Une par an Un tous les deux ans 150 
Moyen Une tous les deux ans Un tous les deux ans 150 
Faib le Une tous les deux ans Un tous les quatre ans 150  
PARTIE 5 
SUR VEILL ANCE ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE L'INFECTION À BONAMIA OSTREAE 
I.  Exigences relativ es aux prog rammes de surveillance ou d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut 
sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'infection à Bonamia ostr eae 
I.1.  Exigen ces générales 
Des inspections sanitaires et, s'il y a lieu, un échanti llonnage des unité s de production doivent être effectués 
pendant la période de l'année où l'on sait que la prévalence de Bonamia ostreae est maximale dans l'État membre, la 
zone ou le compar timent. Si cette information n'est pas disponible, l'échantillonnage doit être réalisé en hiver ou 
au début du printem ps. 23.9.2015 L 247/27 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Si les mollusques doivent faire l'objet d'un échantillonnage conf ormément aux exigenc es définies dans la partie 5, 
les critères suivants doivent être respectés: 
a)  lorsque des huîtres de l'espèce Ostrea edulis sont présentes, seules des huîtres de cette espèce doivent être 
sélectionnées pour l'éch antillonnage. En l'absence de telles huîtres, l'éch antillon doit être représentatif de tout es 
les autres espèces sensibles présentes; 
b)  en présence de mollusques faibles, bâillants ou qui viennent de mour ir mais ne sont pas encore décomposés, 
ces animaux doivent être sélectionnés en priorité. En l'absence de tels mollusques, les animaux sains les plus 
âgés doivent faire partie des mollusques sélectionnés; 
c)  lorsque les prélèvements sont réalisés dans des fermes aquacoles qui utilisent plusieurs sources d'eau pour la 
production des mollusques, des animaux représentant tout es les sources d'eau doivent être inclus dans les 
écha ntillons, de sorte que tout es les parties de la ferme aquacole y soient propor tionnellement représentées; 
d)  lorsque des échantillon s sont prélevés dans des parcs à mollusques, des animaux provenant d'un nombre 
suffisant de points d'échantillonnag e doivent être inclus dans l'écha ntillon. Les principaux facteurs à prendre en 
comp te pour la sélection de ces points de prélèvements sont les anciens points de prélèvement où Bonamia 
ostreae a été détect é, la densité d'élevag e, les courants, la présence d'espèces sensibles, la présence d'espèces 
vectr ices, la bath ymétr ie et les pratiques de gestion. L'éch antillonnage doit aussi porter sur les bancs naturels se 
trouvant à l'intér ieur des parcs à mollusques ou adjacents à ceux-ci. 
I.2.  Exigen ces spécifiques pour l'obtentio n du statut sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne l'infectio n à Bonamia 
ostreae 
I.2.1.  Programmes de surveillance 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégor ie III en ce qui concer ne 
l'infect ion à Bonamia ostreae peut obtenir un statut sanitaire de caté gorie I pour cette maladie réper toriée lorsque 
tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent ont été soumises au moins au programme de 
surveillance ci-après compre nant des inspections sanitaires et le prélèvement d'échantillons en vue de tests. 
Programme de surveillance de deux ans: 
a)  les fermes aquacoles et les parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II, 
de la directive 2006/88/CE doivent avoir fait l'objet d'inspections sanitaires et d'échantillon nages pendant une 
période minimale de deux années consécutives, comme indiqué dans le tableau 5.A de la présente partie; 
b)  au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échanti llons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 doivent s'être révélés négatifs pour Bonamia ostreae et tout e 
suspicion d'infection par Bonamia ostreae doit avoir été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic 
indiquées au point II.3; 
c)  lorsque des huîtres de l'espèce Ostrea edulis provenant d'un État membre, d'une zone ou d'un compar timent 
jouissant d'un statut sanitaire de catégo rie I doivent être incluses dans l'échantillon, elles doivent avoir été 
introduit es dans la ferme aquacole ou le parc à mollusques au moins à l'automne précédant immédiatement la 
période d'exécution du programme de surveillance. 
I.2.2.  Programmes d'éradication 
L'éradication de Bonamia ostreae est considérée comme impossible dans la plupar t des cas, mais lorsque l'État 
membre l'estime faisable, le modèle de programme d'éradication ci-après doit être appliqué. 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie V en ce qui concer ne 
l'infect ion à Bonamia ostreae peut obtenir un statut sanitaire de caté gorie I pour cette maladie réper toriée lorsque 
tout es les fermes aquacoles ou tous les parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, 
partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent ont fait l'objet du 
programme d'éradication suivant au moins: 
a)  les mesures minimales de lutte prévues au chapit re V, section 3, de la directive 2006/88/CE ont effectivement 
été appliquées et, en particulier , une zone de conf inement telle que visée à l'article 32, point b), de ladit e 
directive, assor tie d'un périmètre de prot ection et d'un périmètre de surveillance, a été établie aux alent ours de 
la ou des fermes aquacoles ou du ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infec tés par Bonamia ostreae. 23.9.2015 L 247/28 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     La zone de conf inement doit avoir été définie au cas par cas, comp te tenu des facteurs qui ont une incidence 
sur les risques de propagat ion de cette maladie réper toriée, à savoir: le nombre, l'âge, le taux de mor talité et la 
distr ibution de la mor talité des mollusques dans la ferme aquacole ou le parc à mollusques infect é par Bonamia 
ostreae, y compris les mollusques sauvage s, l'éloignement et la densité des fermes aquacoles ou parcs à 
mollusques voisins, y compris les mollusques sauvages, la proximité des établissements de transf ormation et 
des fermes aquacoles ou parcs à mollusques en contact, les espèces présentes dans les fermes aquacoles ou les 
parcs à mollusques, en particulier les espèces sensibles et les espèces vectr ices, les pratiques d'élevag e 
appliquées dans les fermes aquacoles ou les parcs à mollusques contaminés et dans les fermes aquacoles ou 
parcs à mollusques voisins, les conditions hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue 
épidémiologique. 
Pour l'établissement des périmètres de prot ection et de surveillance, les exige nces minimales suivantes doivent 
être satisfait es: 
i)  un périmètre de prot ection doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole ou d'un parc à 
mollusques offici ellement déclaré infect é par Bonamia ostreae et doit correspondre à une zone déter minée 
selon des données hydrodynamiques ou épidémiologiques appropr iées; 
ii)  un périmètre de surveillance doit être établi au-delà du périmètre de prot ection, et doit correspondre à une 
zone située autour du périmètre de protection, déterminée selon des données hydrodynamiques ou 
épidémiologiques appropr iées; 
b)  la tota lité des fermes aquacoles et des parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à 
l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE situés à l'intérieur du périmètre de prote ction et qui ne sont 
pas officiellement déclarés infect és par Bonamia ostreae doit faire l'objet d'une enquête officielle compre nant au 
moins un prélèvement d'échantillon s visant à tester 150 mollusques, réalisé après le début de la période de 
transmission de Bonamia ostreae. Lorsque la période de transmission n'est pas connue, l'échantillonnag e doit 
commencer en hiver ou au début du printemps; 
c)  tout es les fermes aquacoles et tous les parcs à mollusques officiell ement déclarés infectés par Bonamia ostreae 
doivent être vidés de leurs mollusques, soumis à un vide sanitaire et si possible netto yés et désinfect és; la durée 
de la période de vide sanitaire doit être d'au moins six semaines. 
Lorsque la totalit é des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infec tés ont été vidés 
de leurs mollusques, un vide sanitaire synchr onisé d'au moins quatre semaines doit être mis en place. 
L'autorité compét ente peut décider d'exiger que d'autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à 
l'intérieur des périmètres de prot ection et de surveillance établis soient vidés de leurs mollusques, netto yés, 
désinf ectés et qu'ils fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est déterminée par 
l'aut orité compét ente sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas; 
d)  la totali té des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalit é des 
fermes aquacoles ou des parcs à mollusques ayant fait l'objet d'un vide sanitaire situés à l'inté rieur des 
périmètres de protection et de surveillance établis doivent être repeuplées avec des mollusques provenant 
d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut sanitaire de catégo rie I en ce qui 
concer ne l'infectio n à Bonamia ostreae. Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que tout es fermes 
aquacoles officiellement déclarées infectée s ont été vidées de leurs mollusques, netto yées et désinfe ctées, puis 
soumises à une période de vide sanitaire conf ormément au point I.2.2 c); 
e)  la tota lité des fermes aquacoles et des parcs à mollusques détenant des espèces sensibles énumérées à 
l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans l'État membre, la zone ou le compar timent couver t par 
le programme d'éradication doit ensuite faire l'objet du programme de surveillance décr it au point I.2. 
I.3.  Exigen ces spécifiques pour le maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» (catégor ie I) en ce qui concer ne 
l'infect ion à Bonamia ostreae 
Lorsqu'une surveillance ciblée est requise pour mainte nir le statut sanitaire de catégor ie I conf ormément à 
l'article 52 de la directive 2006/88/CE, la totalit é des fermes aquacoles ou parcs à mollusques détenant des espèces 
sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II, de cette directive dans l'État membre, la zone ou le compar timent 
concer nés doit faire l'objet d'inspections sanitaires et d'éch antillonnages conf ormément au tableau 5.B figurant à la 
section II de la présent e partie, comp te tenu du risque de contamination de la ferme aquacole ou du parc à 
mollusques par Bonamia ostreae. 
Le statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'infectio n à Bonamia ostreae ne doit être maint enu que tant 
que tous les échantillons testés à l'aide des méthodes de diagnostic établies au point II.2 se révèlent négatifs pour 
Bonamia ostreae, et que tout e suspicion d'inf ection à Bonamia ostreae a été écar tée conf ormément aux méthodes de 
diagnostic établies au point II.3. 23.9.2015 L 247/29 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.4.  Exigen ces à respecter pour la levée des mesures de conf inement prévues à l'article 39 de la directive 2006/88/CE 
(passag e d'un statut sanitaire de caté gorie V à un statut de catégo rie III) en ce qui concer ne l'infe ction à Bonamia 
ostreae. 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie V en ce qui concer ne 
l'infect ion à Bonamia ostreae peut obte nir un statut sanitaire de catégo rie III pour cette maladie réper toriée à 
condition que: 
a)Les exige nces définies au paragraphe I.2.2, points a), b) et c) soient satisf aites. Dans les cas où il n'est techni ­
quement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet d'une autre 
mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication de Bonamia ostreae de l'env ironnement de 
la ferme aquacole; 
b)  la totali té des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiellement déclarés infectés et la totalit é des 
autres fermes aquacoles ou parcs à mollusques situés à l'intér ieur des périmètres de protection et de 
surveillance établis et ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conf ormément au point a) aient 
été repeuplées avec des mollusques provenant d'États membres, de zones ou de compar timents ayant un statut 
sanitaire de catégo rie I, II ou III en ce qui concer ne l'infect ion à Bonamia ostreae; 
c)le repeuplement n'ait eu lieu qu'après que la totalit é des fermes aquacoles ou des parcs à mollusques officiel ­
lement déclarés infect és ont été vidés de leurs mollusques, netto yés, désinfect és et soumis à un vide sanitaire ou 
à d'autres mesures conf ormément au point a); 
d)  aucune infection à Bonamia ostreae n'ait été conf irmée au cours des deux années suivant l'exécution des mesures 
visées aux points a), b) et c), et que tout e suspicion au cours de cette période ait été écar tée conf ormément aux 
procédures établies au point II.3. 
II.  Méthodes et critères de diagnos tic 
II.1.  Échantillons 
L'animal entier est présent é au laboratoire pour la réalisation des tests de diagnostic spécifiés aux points II.2 
et II.3. 
II.2.  Méthodes de diagnostic pour l'obte ntion et le maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne 
l'infect ion à Bonamia ostreae 
Les méthodes de diagnostic à utiliser pour l'obt ention ou le maintien du statut «indemne de maladie» en ce qui 
concer ne les infections à Bonamia ostreae sont l'examen histo pathologique, les empreint es tissulaires ou la PCR. 
Lors de l'application de ces méthodes de diagnostic, les méthodes et procédures détaillées correspondante s décr ites 
à l'annexe II, partie 5, doivent être respectées . 
II.3.  Critères de diagnostic pour conf irmer la présence d'une infec tion à Bonamia ostreae ou écar ter une suspicion d'une 
telle infection 
Lorsqu'il est nécessaire de conf irmer ou d'écar ter une suspicion d'inf ection à Bonamia ostreae conf ormément à 
l'article 28 de la directive 2006/88/CE, les procédures d'inspection, d'échanti llonnage et d'essai suivantes doivent 
être respectées: 
l'enquête officielle doit compo rter au moins un échantillonnag e sur 30 mollusques d'espèces sensibles si la 
suspicion est fondée sur un rappor t de mor talité, ou, si tel n'est pas le cas, sur 150 mollusques d'espèces sensibles, 
les prélèvements étant réalisés après le début de la période de transmission de Bonamia ostreae. Lorsque la période 
de transmission n'est pas connue, l'échantillonna ge doit commencer en hiver ou au début du printem ps. Les 
écha ntillons doivent être testés à l'aide des méthodes de diagnostic indiquées au point i) conf ormément aux 
méthodes et procédures de diagnostic détaillées figurant à l'annex e II, partie 5, section I: 
i)  la présence de Bonamia ostreae doit être considérée comme conf irmée lorsque l'examen histopathologique, les 
empr eintes tissulaires ou l'hybridation in situ donnent un résultat positif associé à un résultat positif obte nu 
par la PCR compl étée par un séquençage , conf ormément aux méthodes et procédures approuvées décr ites à 
l'annex e II, partie 5; 
ii)une suspicion d'infection à Bonamia ostreae doit être écar tée si ces tests n'appor tent pas de preuve supplé ­
mentaire de la présence de Bonamia ostreae. 23.9.2015 L 247/30 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Tableau 5.A 
Prog ramme de surveillance dans les États membres, zones ou compar timents pour la période qui précède 
l'obtention du statut «indemne de maladie» en ce qui concer ne l'infection à Bonamia ostr eae visé au point I.2.1  
Nombre d'inspections sani ­
taires par an Nombre d'examens de labora ­
toire par an Nombre de mollusques par 
échantillon 
Fermes aquacoles/parcs à mol ­
lusques 1 1 150  
Tableau 5.B 
Prog rammes de surveillance dans les États membres, zones ou compar timents en vue du maintien du statut 
«indemne de maladie» en ce qui concer ne l'inf ection à Bonamia ostr eae visé au point I.3 
Niveau de risque Nombre d'inspections 
sanitaires Nombre d'examens de 
laboratoire Nombre de mollusques par 
écha ntillon 
Élevé Une par an Un tous les deux ans 150 
Moyen Une tous les deux ans Un tous les deux ans 150 
Faib le Une tous les deux ans Un tous les quatre ans 150  
PARTIE 6 
SUR VEILL ANCE ET MÉTHODES DE LUTTE CONTRE LA MAL ADIE DES POINTS BLANCS (MPB) 
I.  Exigences relativ es aux prog rammes de surveillance et d'éradication en vue de l'obtention et du maintien du statut 
sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne la MPB ainsi que des mesures de conf inement destinées à lutter 
contre l'infection par le virus du syndrome des points blancs (VSPB) 
I.1.  Exigen ces générales relatives aux inspections et à l'échantillonnage 
L'échanti llonnage des crustacés en vue d'examens de laboratoire doit être effectué chaque fois que la température 
de l'eau est susceptible d'atteindre les maxima annuels. Cette exige nce concer nant la température de l'eau 
s'applique également aux inspections sanitaires lorsque celles-ci sont réalisables et appropr iées. 
Si les crustacés d'élevage doivent faire l'objet d'un échantillonnage conf ormément aux exige nces définies dans la 
présent e partie, les critères suivants doivent être respectés: 
a)  en présence de crustacés faibles ou mor ibonds dans les unité s de production, ces animaux doivent être 
sélectionnés en priorité. En l'absence de tels crustacés, l'échantillonnage doit porter sur des animaux 
appar tenant à différent es cohor tes de taille, à savoir des juvéniles et des adultes des espèces sensibles, qui 
doivent être représentés propor tionnellement dans les échantillons; 
b)  si plus d'une source d'eau est utilisée pour la production des crustacés, des crustacés sensibles représentatifs 
de tout es les sources d'eau doivent être inclus dans les écha ntillons. 
Lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvag es est requise conf ormément à l'annex e V, partie I, point 2, 
deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, le nombre et la répar tition géographique des points de 
prélèvement doivent être déter minés de façon à obtenir une couver ture raisonnable de l'État membre, de la zone 
ou du compar timent. Les points de prélèvement doivent aussi être représentatifs des divers écosystèmes abritant 
des populations sauvag es sensibles, à savoir les eaux mar ines, les estuaires, les cours d'eau et les lacs. 23.9.2015 L 247/31 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Lorsqu'une surveillance ciblée des populations sauvag es est requise conf ormément à l'annex e V, partie I, point 2, 
deuxième paragraphe, de la directive 2006/88/CE, les crustacés à inclure dans l'échantillonnag e doivent être 
sélectionnés comme suit: 
i)  dans les aires mar ines et estuar iennes, une ou plusieurs des espèces suivante s doivent être sélectionnées: 
Carcinus maenas, Cancer pagur us, Eriocheir sinensis, Liocarci nus depur ator, Liocarcinus puber , Crangon crangon, 
Homar us gammar us, Palaemon adspersus ou les crevett es pénéides, notamment Penaeus japonicus, Penaeus 
kerath urus, Penaeus semisulcatus. Si ces espèces ne sont pas présentes, les échantillon s doivent être représen ­
tatifs des autres espèces de décapodes sensibles présent es. Étant donné la grande variété d'hôtes sensibles, il y 
a lieu de choisir des hôte s appar tenant à des genres ou familles de l'ordre des Decapoda dont la sensibilité a 
été démontrée expér imentalement ou dans la nature; 
ii)  dans les cours d'eau et les lacs, une ou plusieurs des espèces suivantes doivent être sélectionnées: Pacifastacus 
leniusculus, Astacus leptodactylus, Austro potamobius pallipes ou Orconectes limosus. Si ces espèces ne sont pas 
présent es, les échanti llons doivent être représentatifs des autres espèces de décapodes sensibles présentes. 
Étant donné la grande variété d'hôte s sensibles, il y a lieu de choisir des hôte s appar tenant à des genres ou 
familles de l'ordre des Decapoda dont la sensibilit é a été démontrée expér imentalement ou dans la nature; 
iii)  en présence de crustacés faibles ou mor ibonds, ces animaux doivent être sélectionnés en priorité. En 
l'absence de tels crustacés, l'échantillonnag e doit porter sur des animaux appar tenant à diffé rentes cohor tes 
de taille, à savoir des juvéniles et des adulte s des espèces sensibles, qui doivent être représentés propor tion ­
nellement dans les échantillons. 
I.2.  Exigen ces spécifiques pour l'obt ention du statut sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne la MPB 
I.2.1.  Programmes de surveillance 
a)  Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de catégor ie III en ce qui concer ne 
la MPB conf ormément à l'annex e III, partie B, de la directive 2006/88/CE peut obtenir le statut sanitaire de 
catégo rie I pour cette maladie réper toriée lorsque tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles 
énumérées à l'annex e IV, partie II, de ladit e directive dans cet État membre, cette zone ou ce compar timent 
rem plissent les conditions fixées à l'annex e V de ladit e directive, et que tout es ces fermes aquacoles et, pour 
autant que les dispositions de l'annexe V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de ladit e directive le 
requièrent, tous les points de prélèvement dans les populations sauvages sélectionnées conf ormément audit 
point, ont fait l'objet du programme de surveillance de deux ans ci-après compre nant des inspections 
sanitaires et le prélèvement d'échanti llons en vue d'essais. 
Les fermes aquacoles ou les points de prélèvement ont fait l'objet d'inspections sanitaires et d'échantil ­
lonnage s pendant une période minimale de deux années consécutives, comme indiqué dans le tableau 6.A de 
la section II. 
Au cours de cette période de deux ans, les tests de dépistage réalisés sur tous les échanti llons à l'aide des 
méthodes de diagnostic spécifi ées au point II.2 se sont révélés négatifs pour la MPB et tout e suspicion de 
MPB a été écar tée conf ormément aux méthodes de diagnostic indiquées au point II.3; 
b)  si, au cours de la mise en œuvre du programme de surveillance visé au point a), une infection par le VSPB 
est confir mée dans une ferme aquacole incluse dans ce programme de surveillance et que, par conséquent, 
cette ferme a vu son statut sanitaire de caté gorie II lui être retiré, elle peut immédiatem ent retrouver ce statut 
sanitaire de catégor ie II et poursuivre la mise en œuvre du programme de surveillance en vue de l'obtention 
du statut «indemne de maladie» sans mettre en œuvre le programme d'éradication décr it au point I.2.2 à 
condition de satisf aire aux conditions suivante s: 
i)  il s'agit d'une ferme aquacole continentale dont le statut sanitaire en ce qui concer ne la MPB est 
indépendant de celui des eaux naturelles avoisinantes pour cette maladie réper torié e, conf ormément à 
l'annex e V, partie II, point 3 de la directive 2006/88/CE; 
ii)  elle a été vidée de ses crustacés, netto yée, désinfect ée et une période de vide sanitaire d'une durée d'au 
moins six semaines a été obser vée; 
iii)  elle a été repeuplée avec des crustacés provenant d'États membres, de zones ou de compar timents ayant 
un statut sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne la MPB. 23.9.2015 L 247/32 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.2.2.  Programmes d'éradication 
I.2.2.1.  Exigen ces générales 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie V en ce qui concer ne la 
MPB peut obtenir un statut sanitaire de catégo rie I pour cette maladie réper toriée lorsque tout es les fermes 
aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II, de la directive 2006/88/CE dans cet 
État membre, cette zone ou ce compar timent ont été soumises au moins au programme d'éradication suivant : 
a)  les mesures minimales de lutte prévues au chapitre V, section 4, de la directive 2006/88/CE ont effectivement 
été appliquées et une zone de confinement, telle que visée à l'article 32, point b), de ladite directive, assor tie 
d'un périmètre de prote ction et d'un périmètre de surveillance, a été établie à proximité de la ou des fermes 
aquacoles officiell ement déclarées infectées par le VSPB. 
La zone de conf inement doit avoir été définie au cas par cas, comp te tenu des facteurs qui ont une incidence 
sur les risques de transmission de la MPB aux crustacés d'élevag e et aux crustacés sauvag es, à savoir: la 
mor talité, le taux de mor talité et la distr ibution de la mor talité des crustacés dans la ferme aquacole infec tée 
par la MPB, la distance à laquelle se trouvent les fermes aquacoles voisines et la densité de ces dernières, les 
fermes aquacoles en contact, les espèces présent es dans les fermes aquacoles, les pratiques d'élevag e 
appliquées dans les fermes aquacoles contaminées et dans les fermes aquacoles voisines, les conditions 
hydrodynamiques et les autres facteurs pertinents d'un point de vue épidémiologique. 
Pour l'établissement des périmètres de prote ction et de surveillance, les exigenc es minimales suivantes 
doivent être satisf aites: 
i)  un périmètre de prote ction doit être établi aux environs immédiats d'une ferme aquacole officiell ement 
déclarée infect ée par la MPB, et doit correspondre:  
1. dans les aires mar ines et estuar iennes: à une zone s'éte ndant sur un rayon d'au moins une excursion de 
marée et, en tout état de cause, d'au moins cinq kilomètres autour de la ferme aquacole officiellement 
déclarée infect ée par la MPB, ou à une superf icie équivalent e déterminée selon les données hydrodyna ­
miques ou épidémiologiques appropr iées; ou  
2. dans les eaux douces: à la totalit é du bassin hydrographique de la ferme aquacole officiellement 
déclarée infectée par la MPB; l'aut orité compét ente peut limiter l'exte nsion du périmètre à certaines 
parties du bassin hydrographique à condition que cela ne remette pas en cause les moyens mis en 
œuvre pour empêc her la propagat ion de la MPB; 
ii)  un périmètre de surveillance doit être établi au-delà du périmètre de protection et doit correspondre:  
1. dans les aires mar ines: à une zone située autour du périmètre de protection et dont la zone 
d'excu rsion de marée chevauc he celle du périmètre de protection, à une zone située autour du 
périmètre de protection et s'étendant sur un rayon de 10 kilomètres à partir du centre du périmètre de 
prote ction ou à une superf icie équivalent e déter minée selon les données hydrodynamiques ou 
épidémiologiques appropr iées ou  
2. dans les eaux douces: à une zone étendue qui se situe au-delà du périmètre de prot ection établi; 
b)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annexe IV, partie II de la directive 
2006/88/CE, qui se trouvent à l'inté rieur du périmètre de prote ction et qui ne sont pas officiell ement 
déclarées infectées par la MPB doivent faire l'objet d'une enquête officiell e compre nant au moins les éléments 
suivants: 
i)  un prélèvement d'échantillons en vue de la réalisation de tests sur 10 crustacés en cas de signes cliniques 
ou de signes post-mor tem compati bles avec la MPB, ou sur 150 crustacés en l'absence de signes cliniques 
ou de signes post mor tem; et 
ii)  une inspection sanitaire; dans les fermes aquacoles où les tests visés au point i) ont donné des résultats 
négatif s, les inspections sanitaires doivent se poursuivre à raison d'une fois par mois pendant la saison 
durant laquelle la température de l'eau est susceptible d'attein dre les maxima annuels, jusqu'à la levée du 
périmètre de protect ion conf ormément au point I.2.2.1 c); 23.9.2015 L 247/33 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     c)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la MPB doivent être vidées de leurs animaux, 
netto yées et désinf ectées et une période de vide sanitaire d'une durée d'au moins six semaines doit être 
obser vée. Lorsque la totali té des fermes aquacoles officiellement déclarées infectées ont été vidées de leurs 
crustacés, un vide sanitaire synchronisé d'au moins trois semaines doit être mis en place. Le présent 
paragraphe s'applique également aux nouvelles fermes aquacoles officiellement déclarées infectées pendant la 
mise en œuvre du programme d'éradication. 
Lors du vide sanitaire des fermes aquacoles offici ellement déclarées infectées, les périmètres de prot ection 
sont conver tis en périmètres de surveillance. 
L'autori té compét ente peut décider d'exige r que d'autres fermes aquacoles situées à l'inté rieur des périmètres 
de protection et de surveillance établis soient vidées de leurs crustacés, netto yées, désinf ectées et qu'elles 
fassent l'objet d'un vide sanitaire. La durée de la période de vide sanitaire est détermi née par l'aut orité 
compét ente sur la base d'une évaluation des risques au cas par cas; 
d)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées et tout es les autres fermes ayant fait l'objet d'un 
vide sanitaire qui se trouvent à l'intérieur des périmètres de protection et de surveillance établis doivent être 
repeuplées: 
i)  avec des crustacés provenant d'États membres, de zones ou de compar timents jouissant d'un statut 
sanitaire de catégor ie I en ce qui concer ne la MPB; ou 
ii)  transito irement jusqu'au 31 décembre 2020, avec des crustacés provenant d'États membres, de zones ou 
de compar timents faisant l'objet d'un programme de surveillance de la MPB approuvé. 
Le repeuplement ne doit avoir lieu qu'une fois que tout es les fermes aquacoles offici ellement déclarées 
infectées par la MPB ont été vidées de leurs animaux, netto yées et désinfect ées, puis soumises à une période 
de vide sanitaire conf ormément au point I.2.2.1. c); 
e)  tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles énumérées à l'annex e IV, partie II, de la directive 
2006/88/CE dans l'État membre, la zone ou le compar timent couver ts par le programme d'éradication, ainsi 
que, lorsqu'une surveillance des populations sauvag es est requise, les points de prélèvement sélectionnés 
conf ormément à l'annex e V, partie I, point 2, deuxième paragraphe, de ladite directive doivent avoir ensuite 
été soumises au moins au programme de surveillance décr it au point I.2.1. 
I.2.2.2.  Exigen ces à respecte r pour que des compar timents continentaux compre nant une seule ferme aquacole 
précédemment déclarés indemnes de la MPB puissent retrouver le statut «indemne de maladie» 
Un compar timent continental comprenan t une seule ferme aquacole ayant un statut sanitaire de caté gorie I en 
ce qui concer ne la MPB, dont le statut sanitaire à l'égar d de cette maladie réper toriée est indépendant de celui 
des eaux naturelles avoisinant es, conf ormément à l'annex e V, partie II, point 3, de la directive 2006/88/CE, et 
qui s'est vu retirer ce statut sanitaire de catégo rie I conf ormément à l'article 53, paragraphe 3, de ladit e directive, 
peut retrouver ce statut de caté gorie I dès que l'autorité compét ente a conf irmé que les conditions suivantes sont 
rem plies: 
a)  la ferme aquacole infect ée par la MPB a été vidée de ses animaux, netto yée, désinfe ctée et une période de vide 
sanitaire d'une durée d'au moins six semaines a été obser vée; 
b)la ferme infectée a été repeuplée avec des crustacés provenant d'États membres, de zones ou de compar ­
timents jouissant d'un statut sanitaire de catégo rie I en ce qui concer ne la MPB. 
I.3.  Exigen ces spécifi ques pour le maintien du statut sanitaire «indemne de maladie» (catégor ie I) en ce qui concer ne 
la MPB 
Lorsqu'une surveillance ciblée est nécessaire pour mainte nir le statut sanitaire de caté gorie I conf ormément à 
l'article 52 de la directive 2006/88/CE du Conseil, tout es les fermes aquacoles détenant des espèces sensibles 
énumérées à l'annexe IV, partie II, de cette directive dans l'État membre, la zone ou le compar timent concer nés 
doivent faire l'objet d'une inspection sanitaire et d'échantillonnag es conf ormément au tableau 6.B de la section 
II, comp te tenu du risque de contamination de la ferme aquacole par la MPB. 
Dans les États membres, les zones ou les compar timents comp tant un nombre limité de fermes aquacoles et où 
la surveillance ciblée de ces établissements ne fournit pas suffi samment de données épidémiologiques, les 
programmes de surveillance nécessaires pour maintenir le statut «indemne de maladie» doivent inclure des 
points de prélèvement sélectionnés conf ormément aux exigences fixées au point I.1. 23.9.2015 L 247/34 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     50 % de ces points de prélèvement doivent faire l'objet d'inspections et de prélèvements chaque année, par 
rotation. L'échantillonnag e doit être réalisé conf ormément au tableau 6.B de la section II. Les échantillons 
doivent être sélectionnés, préparés et analysés conf ormément aux méthodes d'échantillonnag e et de diagnostic 
décr ites à la section II et les examens de laborat oire doivent avoir fourni des résultats négat ifs en ce qui 
concer ne l'age nt de la MPB. 
Le statut «indemne de maladie» ne doit être maintenu que tant que tous les échantillons testés à l'aide des 
méthodes de diagnostic établies au point II.2 se révèlent négat ifs pour la MPB et que tout e suspicion de MPB est 
écar tée conf ormément aux méthodes d'enquêt e officielle et de diagnostic établies au point II.3. 
I.4.  Exigen ces à respecte r pour la levée des mesures de conf inement prévues à l'article 39 de la directive 2006/88/CE 
(passag e d'un statut sanitaire de catégor ie V à un statut de catégo rie III) en ce qui concer ne la MPB 
Un État membre, une zone ou un compar timent ayant un statut sanitaire de caté gorie V en ce qui concer ne la 
MPB peut obtenir le statut sanitaire de catégor ie III pour cette maladie réper toriée à condition que: 
a)  Les exigenc es définies au paragraphe I.2.2.1, points a), b) et c) soient satisf aites. Dans les cas où il n'est 
techniquement pas possible de mettre en place un vide sanitaire, les fermes aquacoles doivent faire l'objet 
d'une autre mesure offrant des garanties quasiment identiques pour l'éradication du VSPB de l'env ironnement 
de la ferme aquacole; 
b)  tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infectées par la MPB et tout es les autres fermes aquacoles 
ayant fait l'objet d'un vide sanitaire ou d'autres mesures conf ormément au point a) situées à l'intér ieur des 
périmètres de protect ion et de surveillance établis aient été repeuplées avec des crustacés provenant d'États 
membres, de zones ou de compar timents ayant un statut sanitaire de catégo rie I, II ou III en ce qui concer ne 
la MPB; 
c)  le repeuplement n'ait eu lieu qu'après que tout es les fermes aquacoles officiellement déclarées infec tées par la 
MPB ont été vidées de leurs animaux, netto yées, désinfe ctées et soumises à un vide sanitaire ou à d'autres 
mesures conf ormément au point a); 
d)  la MPB n'ait pas été détectée au cours des deux années suivant l'exécution des mesures visées aux points a), 
b) et c), et que tout e suspicion au cours de cette période ait été écar tée conf ormément aux procédures 
établies au point II.3. 
II.  Méthodes d'échantillonnage et de diagnostic 
II.1.  Échantillons 
Des échanti llons d'épider me tégumentaire, soit disséqué, soit présent dans les patt es locomotr ices, les pléopodes, 
les pièces buccales ou les branchies de l'animal d'expér ience sont fixés dans de l'éthanol à 95 % avant la 
préparation des échantillons pour la PCR en deux étapes. 
D'autres échantillons, fixés pour l'examen histologique et l'examen en microscopie électronique à transmission 
peuvent être prélevés pour corroborer les données de diagnostic obtenu es par PCR. 
II.2.  Méthodes de diagnostic pour l'obte ntion ou le maintien du statut «indemne de la MPB» 
La méthode de diagnostic à utiliser pour l'obt ention ou le maintien du statut «indemne de la MPB» 
conf ormément aux méthodes et procédures de diagnostic détaillées figur ant à l'annexe II, partie 6, est la PCR en 
deux étapes. 
Si la PCR en deux étapes donne un résultat positif, celui-ci doit être corroboré par le séquençage du produit 
d'amplification avant la mise en place des premières mesures de lutte prévues à l'article 28 de la directive 
2006/88/CE, si possible, concrètem ent, par la mise en évidence, par examen histologique et microscopie 
électronique à transmission, de signes pathognomoniques de la MPB chez les hôtes sensibles sélectionnés. 
II.3.  Méthodes d'enquêt e officielle et de diagnostic pour écar ter une suspicion de MPB ou pour conf irmer la présence 
de la maladie 
Lorsqu'il est nécessaire de confir mer ou d'écar ter une suspicion de MPB conf ormément à l'article 28 de la 
directive 2006/88/CE, la procédure d'inspection, d'éch antillonnage et d'essai suivante doit être respecté e: 
a)  l'enquête officiell e doit compr endre au moins une inspection sanitaire et un échanti llonnage sur 10 crustacés 
en cas de signes cliniques ou de signes post-mor tem compatibles avec une infection par le SVPB, ou sur 
150 crustacés en l'absence de signes cliniques ou de signes post mor tem. Les échantillon s doivent être testés 
conf ormément à la méthode de diagnostic indiquée au point II.2 (PCR en deux étapes); 23.9.2015 L 247/35 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     b)  la présence de la MPB doit être considérée comme confir mée lorsque la PCR en deux étapes suivie d'un 
séquençage, réalisée selon les méthodes et procédures détaillées indiquées à l'annexe II, partie 6, se révèle 
positive pour le VSPB et que des signes pathognomoniques de la MPB sont obser vés chez les hôtes 
sélectionnés. 
Une suspicion de MPB peut être écar tée si les résultats de ces tests n'appor tent aucun élément supplémentaire 
prouvant la présence de la MPB. 
Tableau 6.A 
Prog ramme de surveillance dans les États membres, zones et compar timents pour la période de deux ans qui 
précède l'obtention du statut «indemne de la MPB» visée au point I.2.1  
Nombre d'inspections clini ­
ques par an Nombre d'examens de labora ­
toire par an Nombre de crustacés par 
échantillon 
Fermes aquacoles/sit es de prélè ­
vement 1 1 150  
Tableau 6.B 
Prog rammes de surveillance dans les États membres, zones ou compar timents en vue du maintien du statut 
«indemne de la MPB» visé au point I.3 
Niveau de risque Nombre d'inspections 
sanitaires Nombre d'examens de 
laboratoire Nombre de crustacés par 
écha ntillon 
Élevé Une par an Un tous les deux ans 150 
Moyen Une tous les deux ans Un tous les deux ans 150 
Faib le Une tous les deux ans Un tous les quatre ans 150   23.9.2015 L 247/36 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     ANNEXE II 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES 
I.  Introduction 
La présente annexe établit les procédures détaillées des méthodes de diagnostic à appliquer lors des examens de 
laboratoire prévus par les programmes d'éradication et de surveillance décr its à l'annex e I de la présent e 
décision, et afin de conf irmer ou d'écar ter les suspicions des maladies non exotiques ci-après qui sont énumérées 
à l'annexe IV, partie II de la directive 2006/88/CE (ci-après les «maladies réper toriées»), conf ormément à 
l'article 57, point b), de cette directive: 
1. la septicémie hémor ragique virale (SHV) Partie 1 
2. la nécrose hématopoïétique infectieuse (NHI) Partie 1 
3. l'her pèsvirose de la carpe koï (HV CK) Partie 2 
4. l'anémie infectieuse du saumon (AIS) Partie 3 
5. l'infection à Mar teilia refrin gens Partie 4 
6. l'infection à Bonamia ostreae Partie 5 
7. la maladie des points blancs (MPB) Partie 6  
II.  Déf initions 
Aux fins de la présente annexe, on entend par «milieu de transpor t», un milieu de culture cellulaire conte nant 
10 % de sérum de veau, 200 UI de pénicilline, 200 μg de strept omycine et 200 μg de kanam ycine par millilitre 
ou d'autres antibiotiques d'effi cacit é avérée. 
PARTIE 1 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES POUR LA SUR VEILL ANCE ET LA CONFIRMA TION DE LA 
NHI ET DE LA SHV 
I.  Méthodes et procédures de diagnos tic pour la surveillance de la SHV et de la NHI 
Lorsque des prélèvements et des examens de laborat oire sont réalisés en vue de l'obt ention ou du maintien du 
statut sanitaire «indemne de maladie» en ce qui concer ne la NHI ou la SHV visé à l'annex e I, partie 1, section I, à 
l'aide des méthodes de diagnostic indiquées dans la partie 1, points II.1 et II.2, de ladit e annexe, les méthodes et 
procédures de diagnostic détaillées décr ites aux points I.1 à I.6 doivent être appliquées. 
I.1.  Préparation et expédition des échantillons de poissons 
I.1.1.  Tissus destinés à un examen virologique sur culture cellulaire 
Avant d'être expédiés ou transfér és vers le laboratoire, les morceaux d'orga nes à examiner doivent être prélevés 
sur le poisson à l'aide d'instr uments de dissection stéri les et placés dans des tubes en plastique stériles conte nant 
le milieu de transpor t. 
La quantité de tissus de poisson nécessaire pour un examen virologique sur culture cellulaire et par RT-qPCR 
dépend de la taille des poissons. On prélèvera donc l'alevin entier (si longueur du corps < 4 cm), les viscères, y 
compris les reins (si 4 cm < longueur du corps < 6 cm) ou, dans le cas des poissons de plus grande taille, les 
reins, la rate, le cœur et/ou l'encéphale, ainsi que le liquide ovarien des reproductr ices au moment du frai. 
Du liquide ovarien ou séminal ou des morceaux d'org anes provenant de dix poissons au maximum peuvent être 
regroupés dans un tube stérile conte nant au moins 4 ml de milieu de transpor t; ils constituent un échantillon 
global. Le poids minimal de tissus conte nus dans chaque échanti llon doit être de 0,5 gramme (g). 
L'examen virologique sur culture cellulaire doit commencer dès que possible et au plus tard 48 heures après le 
prélèvement des échantillon s. Dans des cas excep tionnels, l'examen virologique peut commencer au plus tard 
72 heures après la collecte du matér iel à examiner à condition que celui-ci soit conser vé dans le milieu de 
transpor t et que les conditions de température requises pendant le transpor t aient pu être respectées. 23.9.2015 L 247/37 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.1.2.  Échantillons destinés à l'analyse par amplification en chaîne par polymérase en présence de transcr iptase inve rse 
(RT-PCR ou RT-qPCR) 
Les échantillons doivent être prélevés sur le poisson conf ormément à la procédure décr ite au point I.1.1 à l'aide 
d'un instr ument stéril e, puis transférés dans des tubes en plastique stériles conte nant le milieu de transpor t. Les 
tissus de 10 poissons peuvent être rassemblés dans un tube pour constituer un échanti llon global. Toutef ois, si 
la quantité d'inoculum est faible, on regroupera les tissus provenant de cinq poissons au maximum. Il est aussi 
possible de regrouper les échantillons dans des réactifs de stabilisation de l'ARN, à raison de 0,2 g de tissu/ml de 
réactif selon les recommandations des fabr icants, mais chaque poisson devra être traité séparément et ne devra 
pas être regroupé avec d'autres dans les échanti llons en raison de la faible quantité de matér iel à utiliser pour 
l'extraction. 
Des poissons entiers peuvent aussi être envoyés au laboratoire. 
I.2.  Expédition des échantillons de poissons 
Les tubes contenant les tissus des poissons dans le milieu de transpor t qui sont destinés à la culture cellulaire ou 
à l'analyse par RT-qPCR doivent être placés dans des conte neurs isolés, tels que des boît es en polystyrène à 
parois épaisses, avec une quantité suffi sante de glace ou d'un autre agent réfrigérant ayant le même effet afin de 
garant ir la réfrigération des échanti llons pendant le transpor t vers le laboratoire . Il y a tout efois lieu d'évite r la 
cong élation des échantillons. La température d'un échantillon pendant son transpor t ne doit jamais dépasser 
10 °C et le récipient de transpor t doit encore contenir de la glace lors de sa récep tion, ou un ou plusieurs blocs 
réfrigérants doivent encore être partiellement ou totalement cong elés. 
Des poissons entiers peuvent être envoyés au laborat oire si les conditions de température pendant le transpor t 
visées au premier paragraphe peuvent être respecté es. Le cas éché ant, les poissons entiers, éventuellement 
enveloppés dans du papier absorbant, doivent être placés dans un sac en plastique pour l'expédition. Des 
poissons vivants peuvent également être expédiés. 
I.3.  Collecte de matér iel de diagnostic supplémentaire 
Si le laborat oire de diagnostic y consent, d'autres tissus de poissons peuvent aussi être collect és et préparés en 
vue d'examens supplémentaires. 
I.4.  Préparation des échantillons destinés à la culture cellulaire et à l'analyse par RT-qPCR 
I.4.1.  Congé lation dans des cas excep tionnels 
En cas de difficulté s pratiques empê chant le trait ement des échantillon s dans les 48 heures suivant la collecte des 
tissus de poisson, il est possible de congeler les spécimens de tissus dans le milieu de transpor t à – 20 °C ou à 
une température inférieure et de procéder à l'examen virologique dans les 14 jours suivants. Toutef ois, les tissus 
ne doivent être cong elés et décongelés qu'une seule fois avant examen. Les motifs précis de chaque cong élation 
d'échantillon s de tissus de poisson doivent être consignés. 
I.4.2.  Homogén éisation des organes 
Au laborat oire, les tissus de poisson contenus dans les tubes doivent être compl ètement homog énéisés (à l'aide 
d'un malaxe ur d'échantillon s, d'un mélang eur ou d'un ensemble pilon-mor tier avec sable stéri le) et mis ensuit e 
en suspension dans le milieu de transpor t d'or igine. 
Si un échantillon est constitué d'un poisson entier de longueur infér ieure à 4 cm, celui-ci doit être réduit en 
petits fragments à l'aide de ciseaux stériles ou d'un scalpel, après élimination de la partie du corps située à 
l'arrière de l'anus. Si un échantillon est constitué d'un poisson entier de longueur compris e entre 4 et 6 cm, il y 
a lieu de prélever les viscères, y compris les reins. Si un échantillon est constitué d'un poisson entier de longueur 
supér ieure à 6 cm, les spécimens de tissus doivent être prélevés comme décr it au point I.1. Les spécimens de 
tissus doivent être réduits en petits fragments à l'aide de ciseaux stériles ou d'un scalpel et homog énéisés comme 
décr it au premier paragraphe, puis mis en suspension dans le milieu de transpor t. 
Le rappor t final entre les tissus et le milieu de transpor t doit être ajust é à 1:10 au laborat oire. 
I.4.3.  Centr ifugation de l'homogé nat 
L'homog énat doit être centr ifugé entre 2 000 et 4 000 g dans une centr ifugeuse réfrigéré e à une température 
compris e entre 2 et 5 °C pendant 15 minute s et le surnageant doit être recueilli; celui-ci peut ensuite être traité 
avec des antibiotiques, soit pendant 4 heures à 15 °C, soit pendant une nuit entre 4 et 8 °C. Si l'échantillon a été 
expédié dans un milieu de transpor t, le traitement du surnagea nt par des antibiotiques n'est pas nécessaire. 
En cas de difficulté s pratiques, telles qu'une panne d'incubate ur ou des problèmes de cultures cellulaires, 
empêc hant l'inoculation des cellules dans les 48 heures qui suivent la collect e des échantillons de tissus, le 
surnageant peut être cong elé à – 80 °C et l'examen virologique réalisé dans les quatorze jours. 23.9.2015 L 247/38 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Si le surnage ant recueilli est conser vé à – 80 °C au cours des 48 heures suivant l'écha ntillonnage, il ne peut être 
réutilisé qu'une seule fois pour l'examen virologique. 
Avant d'inoculer les cellules, le surnage ant doit être mélangé à parts égales avec un lot de sérums anti-sérotypes 
indigènes du virus de la nécrose pancréatique infectieuse (NPI), dilués de façon appropr iée, et doit être incubé 
ainsi pendant au minimum une heure à 15 °C ou pendant au maximum 18 heures à 4 °C. Le titre de 
l'antisér um doit être d'au moins 1/2 000 dans un test de neutralisation sur plaque à 50 %. 
Le traitement de tous les inoculums par le sérum anti-vir us de la NPI vise à empêc her l'effet cytopathogène 
(ECP) dû au virus de la NPI de se manifes ter dans les cultures cellulaires inoculées. Cela permet de réduire la 
durée des examens virologiques ainsi que le nombre de cas où l'appar ition d'un ECP devrait être considérée 
comme une manifestation possible du virus de la SHV ou de la NHI. 
Lorsque les échanti llons proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de la NPI, le 
traitem ent des inoculums par le sérum antivir us de la NPI peut être omis. 
I.4.4.  Préparation des échantillons pour les programmes de surveillance faisant appel à la RT-PCR et à la RT-qPCR 
Si les échantillon s ont été placés dans le milieu de transpor t, la procédure décr ite aux points I.4.2 et I.4.3 doit 
être suivie. Après centr ifuga tion, le surnage ant doit être recueilli et l'ARN extrait. Si aucun autre examen ne doit 
être réalisé directement après la centr ifugation, les échantillon s doivent être immédiatement congelés à – 20 °C 
ou à une température inférieure. 
Pour l'analyse des tissus de poisson conser vés dans du réactif de stabilisation de l'ARN, d'autres opérations 
doivent être réalisées dans les délais précisés ci-après sur les échanti llons stoc kés à différ entes températures: 
échantillon s stoc kés à 37 °C: dans un délai d'un jour; 
échantillon s stoc kés à 25 °C: dans un délai d'une semaine 
échantillon s stoc kés à 4 °C: dans un délai d'un mois; 
échantillon s stoc kés à – 20 °C: délai indétermi né. 
Les échanti llons globaux conser vés dans le réactif de stabilisation de l'ARN doivent être traités de la même 
manière que les échantillon s simples dans du réactif de stabilisation de l'ARN. Dans le cas d'écha ntillons globaux 
dans du réactif de stabilisation de l'ARN, le volume de l'éch antillon ne doit dépasser le volume recommandé par 
le fabricant pour l'extraction de l'ARN à l'aide de kits tels que RNeasy Minikit (Qiag en) ou similaires. En cas de 
regroupement d'échantillons plus grands, les kits ou les méthodes d'extraction doivent être adapt és en 
conséquence. 
Les échantillons recueillis dans des réactifs de stabilisation de l'ARN ne doivent pas être utilisés pour les cultures 
cellulaires. 
I.4.5.  Regroupement d'échantillons pour la RT-qPCR 
Étant donné que les protocoles de RT-qPCR sont d'une sensibilité identique ou supér ieure à celle des méthodes 
de culture cellulaire, il est dans certains cas acceptable d'utiliser pour la PCR le surnagea nt des tissus 
homog énéisés d'org anes prélevés sur 10 poissons au maximum et regroupés dans le milieu de culture cellulaire. 
Toutef ois, en raison de la quantité netteme nt réduite d'inoculum utilisée pour la PCR par rappor t à la culture 
cellulaire, tous les tissus de poissons doivent être soigneusement homog énéisés avant le regroupement du 
matér iel pour l'extraction. 
Le même principe s'applique lorsque les échantillons sont recueillis dans des réactifs de stabilisation de l'ARN. 
Toutef ois, dans ce cas, il est souvent difficile de regrouper dans un même tube du maté riel pouvant provenir de 
10 poissons, et il faut donc réduire le nombre de poissons par échanti llon global et le ramener à un chiffre 
compris entre 2 et 5. 
I.5.  Examen virologique sur culture cellulaire 
I.5.1.  Cultures cellulaires et milieux 
Des cellules de la lignée cellulaire 2 d'alevins de crapet arlequin (Bluegill fry) (BF-2) ou de la lignée cellulaire 2 de 
gonades de truite arc-en-ciel (Rainbow trout gonad) (RTG-2) et des cellules de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) 
ou de poisson tête de boule (Fathead minnow) (FHM) sont cultivées à une température comprise entre 20 et 
30 °C dans un milieu appropr ié, en l'occur rence le milieu essentiel minimal de Eagle (MEM) ou une variante de 
celui-ci, additionné de sérum fœtal bovin à 10 % et d'antibiotiques à une concentration standard. 23.9.2015 L 247/39 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Lorsque les cellules sont cultivées dans des flacons fermés, le milieu doit être tamponné à l'aide de bicarbonat e. 
Le milieu utilisé pour la culture cellulaire en unité s ouver tes peut être tamponn é à l'aide de tris(hydro xyméthyl ) 
aminométhane-HCl (Tris-HCl) (23 mM) et de bicarbonat e de sodium (6 mM). Le pH doit être égal à 7,6 ± 0,2. 
Pour l'inoculation des cultures par du matér iel tissulaire de poisson, il convient d'utiliser des cultures cellulaires 
jeunes, âgées normalement d'un jour et monocouches si possible; néanmoins, les cultures d'âg e compr is entre 4 
et 48 heures sont acceptables . Les cellules doivent être en phase de croissance active au moment de l'inocu ­
lation. 
I.5.2.  Inoculation des cultures cellulaires 
Une suspension d'orga nes traitée aux antibiotiques doit être inoculée aux cultures cellulaires en deux dilutions 
distinctes , à savoir la dilution initiale et, en outre, une dilution au 1:10 de celle-ci (soit des dilutions finales 
respectives des tissus dans le milieu de culture de 1:100 et 1:1 000), de manière à évite r les interfé rences 
homologues. Deux lignées cellulaires au moins doivent être inoculées comme indiqué au point I.5.1. Le rappor t 
entre la quantité d'inoculum et le volume du milieu de culture cellulaire doit être de 1:10 environ. 
Pour chaque dilution et chaque lignée cellulaire, il y a lieu d'utiliser une surface de culture minimale d'en viron 
2 cm2, ce qui correspond à un puits sur une plaque de culture cellulaire à 24 puits. Des plaques de culture 
cellulaire doivent être utilisées dans la mesure du possible. 
I.5.3.  Incubation des cultures cellulaires 
Les cultures cellulaires inoculées doivent être incubées à 15 °C pendant sept à dix jours. Si la couleur du milieu 
de culture vire du roug e au jaune, indiquant une acidification du milieu, il y a lieu d'ajus ter le pH à l'aide d'une 
solution stéril e de bicarbonat e ou à l'aide de substances équivalent es pour garantir la sensibilité des cellules à 
l'infectio n virale. 
Tous les six mois au moins, ou lorsqu'on suspect e une diminution de la sensibilit é cellulaire, il y a lieu de 
procéder au titrage des préparations mères cong elées de VSHV et VNHI, afin de vérifier la sensibilit é des cultures 
cellulaires à l'infection. La procédure décr ite à la section III doit être appliquée, si possible. 
I.5.4.  Microscopie 
Les cultures cellulaires inoculées doivent être examinées régulièrement (au moins trois fois par semaine) au 
microscope à un grossissement compris entre × 40 et × 150 pour recherc her un ECP. Si un ECP net est obser vé, 
les procédures d'identification du virus décr ites au point I.6 doivent être mises en œuvre immédiate ment. 
I.5.5.  Repiquag e 
Si aucun ECP ne s'est manifest é après une première incubation de sept à dix jours, il convient de procéder à un 
repiquage sur des cultures cellulaires fraîches en utilisant une surface de culture identique à celle de la culture 
primaire. 
Des parties aliquotes du milieu (surnage ant) de tout es les cultures ou de tous les puits constituant la culture 
primaire sont regroupées en pools par lignée cellulaire sept à dix jours après l'inoculation. Les pools non dilués 
et dilués au 1:10 (ce qui donne respectivement des dilutions finales du surnageant au 1:10 et au 1:100) 
sont ensuite inoculés chacun à des cultures cellulaires homologues, comme décr it au point I.5.2. Une autre 
possibilit é consiste à inoculer directe ment des parties aliquotes de 10 % du milieu constituant la culture 
primaire dans un puits contenant une culture cellulaire fraîc he (repiquage de puits à puits). L'inoculation peut 
être précédée d'une préincubation des dilutions avec le sérum antivir us de la NPI à la dilution appropr iée, 
comme décr it au point I.4.3. 
Les cultures inoculées doivent ensuite être incubées à 15 °C pendant sept à dix jours, puis examinées comme 
indiqué au point I.5.4. 
Si un ECP toxique se manifest e au cours des trois premiers jours d'incubation, un repiquag e doit être effectué à 
ce stade, mais les cellules doivent alors être incubées pendant sept jours puis repiquées à nouveau et soumises à 
une nouvelle période d'incubation de sept jours. Lorsqu'un ECP toxique se manife ste après trois jours, les 
cellules doivent être repiquées une fois puis incubées jusqu'à ce que se soient écoulés au total quatorze jours à 
partir de l'inoculation primaire. Aucun signe de toxicité ne doit se manifest er au cours des sept derniers jours 
d'incubation. 
Si une contamination bacté rienne se produit malgré le traitement antibiotique, le repiquage doit être précédé 
d'une centr ifugation à 2 000-4 000 g pendant 15 à 30 minutes à une température comprise entre 2 et 5 °C, ou 
d'une filtration du surnageant à travers un filtre de 0,45 μm, ou bien des deux à la fois (membrane à faible 
capacité de liaison des prot éines). En outre, le repiquage doit être réalisé suivant les mêmes procédures que celles 
décr ites pour l'appar ition d'un ECP toxique au quatr ième alinéa du présent point. 
Si aucun ECP ne se manifes te, le test est réputé négatif . 23.9.2015 L 247/40 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.6.  Identif ication du virus 
Si un ECP a été obser vé dans une culture cellulaire, le milieu (surnageant) doit être recueilli et examiné par une 
ou plusieurs des techniques suivantes: méthode immunoenzymatique (ELISA ), test d'immunof luorescence (IF), 
neutralisation, RT-PCR ou RT-qPCR. Si ces méthodes n'ont pas permis d'identif ier le virus de façon certaine dans 
un délai d'une semaine, le surnageant doit être envoyé au laboratoire de référence national ou au laboratoire de 
référen ce de l'Un ion pour les maladies des poissons visé à l'annexe VI de la directive 2006/88/CE en vue d'une 
identif ication immédiate . 
I.6.1.  ELISA 
Un test ELISA en double sandwich doit être réalisé pour identifier l'isolat de virus. Les plaques de micropuits 
sont enduit es à raison de 50 µl/puits (0,9 pg) d'une solution d'immunog lobulines (Ig) de sérums anti-NHI ou 
anti-SHV de lapin purifiées à la proté ine A, de qualité reconnue, diluées dans un tam pon de carbonate (pH 9,6) 
conte nant 15 mM d'azoture de sodium, puis incubées à 4 °C pour une durée compris e entre 18 heures et 
2 semaines. 
Sur une plaque de dilution, chaque échantillon cont enant 1 % de Triton X-100 et les témoins positifs doit être 
dilué à l'aide de la solution tampon [à savoir une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)- T-BSA, 1 % 
BSA] dans un rappor t de dilution de 4 (1:4, 1:16, 1:64). Les plaques ELISA doivent être lavées dans du PBS 
conte nant 0,05 % de Tween 20 (PBS- T) et 50 μl de chaque dilution doivent être transfér és de la plaque de 
dilution vers la plaque ELISA lavée et enduit e. 
Les plaques ELISA doivent ensuite être incubées pendant 30 minut es à 37 °C, avant d'être lavées et incubées 
30 minutes à 37 °C en présence d'anticor ps monoclonaux (AcM) spécifi ques (à savoir IP5B11 pour l'identifi ­
cation du virus de la SHV et HYB-136-3 pour celle du virus de la NHI). 50 μl d'anticor ps anti-sour is de lapin 
conjugués à de la pero xydase de raifort (HRP) dilués au 1:1 000 dans du PBS- T-BSA doivent être transfér és sur 
la plaque ELISA. 
Enfin, après nouveau lavage, les réactions sont déclenchées par addition de 50 µl d'or thophényl ènediamine 
(OPD) dans chaque puits. Les plaques ELISA doivent être incubées pendant 20 minutes à température ambiant e 
dans l'obscur ité, et la réaction doit être arrêtée par addition de 100 μl de H2SO4 0,5 M par puits. 
L'absorbance doit être contrôlée à la longueur d'onde de 492 puis de 620 nm dans un lecteur ELISA. Les 
échantillon s sont déclarés positifs ou néga tifs après compar aison des résultats aux valeurs d'absorbance des 
témoins positifs et négatifs. En règle générale, les échanti llons présentant une absorbance totale (A) < 0,5 pour 
du matér iel non dilué sont considérés comme étant négat ifs; les échantillons dont les valeurs A sont compr ises 
entre 0,5 et 1,0 sont considérés comme suspects et les échantillons avec valeurs A > 1,0 sont considérés comme 
positifs. 
D'autres versions de la technique ELIS A d'une efficacit é similaire avérée peuvent être utilisées en lieu et place de 
celles mentionnées au présent point. 
I.6.2.  Immunof luorescence (IF) 
L'identif ication des agents pathogènes réper toriés que sont les virus de la SHV et de la NHI doit être réalisée en 
infectant des cellules dans des plaques 96 puits «Blac k» ou des plaques 24 puits classiques, ou sur lamelles dans 
des plaques 24 puits. Si l'identifi cation du virus de la NHI ou de la SHV , ou des deux, s'effectue par infection de 
cellules sur des lamelles, le prot ocole suivant doit être appliqué: 
a)  les lamelles doivent être ensemencées lorsque les cellules sont entre 60 et 90 % de conf luence après 
24 heures de culture. On utilisera de préf érence des cellules EPC en raison de leur forte adhérence aux 
surfaces de verre, mais d'autres lignées cellulaires, telles que BF-2, RTG- 2 ou FHM, peuvent également être 
utilisées. On inoculera 150 µl de surnage ant de culture cellulaire à deux dilutions différent es (1:10 
et 1:1 000) en deux exem plaires à des cultures monocouch es âgées d'un jour qui sont ensuite incubées à 
15 °C pendant 24 heures; 
b)  le milieu de culture cellulaire est ensuite éliminé, et les monocouche s de cellules infectée s sont fixées avec 
0,5 ml d'une solution aqueuse d'acétone glacée (80 % v/v). La fixation doit avoir lieu sous hott e pendant 
15 minut es à la température ambiant e, puis la solution d'acétone doit être éliminée et les lamelles séch ées à 
l'air pendant au moins 30 minutes . À ce stade, les plaques doivent être traitées immédiatem ent ou bien 
stoc kées à une température de – 20 °C en vue d'une utilisation ultérieure; 
c)  les anticor ps monoclonaux spécifiques (à savoir IP5B11 pour le virus de la SHV et HYB-136-3 pour le virus 
de la NHI) doivent être dilués dans du PBST 0,01 M, à pH 7,2, à la dilution recommandée par le fournisseur 
des AcM; ils doivent ensuite être ajout és aux cultures monocouches fixées, à raison de 50 à 100 µl/puits, et 
les plaques doivent ensuite être incubées pendant une heure à 37 °C dans une étuve humide; 23.9.2015 L 247/41 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     d)  les lamelles doivent être rincées en douceur trois fois dans du PBS cont enant 0,05 % de Tween 20 (PBS- T), et 
le tam pon doit être totalem ent éliminé après le dernier rinçage. Les cellules doivent ensuit e être incubées 
pendant une heure à 37 °C avec des anticor ps anti-immunog lobulines de sour is conjugués à de l'isothio ­
cyanate de fluorescéine (FITC) ou du tétraméthylrhodamine-5-(et 6-)isothiocyanate (TRITC), utilisés comme 
anticor ps primaires, dilués conf ormément aux instr uctions du fournisseur , avant nouveau rinçag e au PBS- T 
puis séchage. Les cultures colorées doivent être montées sur lames de verre à l'aide d'une solution saline de 
glycérol puis examinées en lumière ultraviolett e incident e. Utiliser des oculaires 10 × ou 12 × et des lentilles 
d'objectif × 25 ou × 40, dont les ouver tures numér iques sont respectivement > 0,7 et > 1,3. 
Il est aussi possible de recour ir à d'autres techniques d'IF (pour ce qui est des cultures cellulaires, de la fixation et 
des anticor ps de référence) d'effi cacit é équivalent e avérée. 
I.6.3.  Neutralisation 
Les cellules présentes dans le surnagea nt recueilli doivent être éliminées par centr ifugation (entre 2 000 
et 4 000 g) ou par filtration sur membrane (0,45 μm) à l'aide d'une membrane à faible capacit é de liaison des 
protéin es, puis le surnageant doit être dilué au 1:100 et au 1:10 000 dans le milieu de culture. 
Des parties aliquotes d'au moins deux dilutions du surnageant doivent être mélangé es et incubées séparément 
pendant 60 minutes à 15 °C avec des parties égales des réactifs suivants: 
a)  du sérum cont enant l'anticor ps spécifique de groupe contre le virus de la SHV , à une dilution de 1:50 (v:v), 
b)  du sérum cont enant l'anticor ps spécifique de groupe contre le virus de la NHI, à une dilution de 1:50 (v:v), 
c)  un lot d'antisér ums anti-sérotypes indigènes du virus de la NPI, à une dilution de 1:50 (v:v), 
d)  le milieu seul (témoin positif). 
Au moins deux cultures cellulaires doivent être inoculées à l'aide de 50 µl du mélang e surnage ant-sér um de 
chaque virus, puis incubées à 15 °C. L'appar ition de l'ECP doit être vérifiée comme indiqué au point I.5.4. 
Les souc hes et les isolats du virus de la SHV qui ne réagissent pas dans les tests de neutralisation doivent être 
identif iés par les techniques IF ou ELISA. 
D'autres tests de neutralisation présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisés. 
I.6.4.  RT-PCR/RT -qPCR 
I.6.4.1.  Préparation de l'ARN viral 
Toutes les manipulations sur l'ARN doivent être réalisées sur de la glace, et des gants doivent être utilisés. 
L'ARN doit être extrait par la méthode phénol/chlo roforme ou par chromatographie d'aff inité sur colonnes, 
selon les instr uctions du fabricant. Il est possible d'utiliser les kits d'extraction de l'ARN disponibles dans le 
commerce, qui permettent d'obtenir un ARN de qualité utilisable dans les protocoles de RT-PCR détaillés 
ci-après. 
L'ARN doit être remis en suspension dans de l'eau distillée exem pte d'ARNase (c.-à-d. de l'eau traitée avec du 
pyrocarbonate de diéthyle à 0,1 %) ou un tampon d'élution appropr ié. 
I.6.4.2.  RT-PCR 
Les amorces suivante s doivent être utilisées pour la détection du VNHI: 
amorce sens 5′-A GA-GA T-CCC- TAC-A CC-A GA-GA C-3′; 
amorce antisens 5′-GGT -GGT -GTT -GTT -TCC-GTG-CAA-3′. 
Les cycles suivants doivent être utilisés (RT-PCR en une seule étape): 1 cycle: 50 °C pendant 30 minute s; 1 cycle: 
95 °C pendant 2 minutes ; 30 cycles: 95 °C pendant 30 secondes, 50 °C pendant 30 secondes, 72 °C pendant 
60 secondes; 1 cycle: 72 °C pendant 7 minutes et trempag e à 4 °C. 
Les amorces suivante s doivent être utilisées pour la détection du VSHV : 
VN For 5′-A TG-GAA-GGA-GGA-A TT-CGT -GAA-GCG-3′; 
VN Rev 5′-GCG-GTG-AA G-TGC- TGC-A GT-TCC-C-3′. 23.9.2015 L 247/42 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Les cycles suivants doivent être utilisés (RT-PCR en une seule étape): 50 °C pendant 30 minutes, 95 °C pendant 
15 minute s, 35 cycles de 94 °C pendant 30 secondes, 55 °C pendant 30 secondes et 68 °C pendant 
60 secondes. La réaction doit être ensuit e mainte nue à une température de 68 °C pendant 7 minutes . 
La quantité et la spécifi cité des réactions de RT-PCR doivent être évaluées par électrophorèse sur gel d'ag arose à 
1,5 % à l'aide de bromure d'éthidium, et les produits des réactions doivent être obser vés en lumière UV. Un 
amplicon de PCR de 693 paires de bases (pb) peut être obser vé pour le VNHI. Pour le VSHV , la taille de 
l'amp licon peut atteindre 505 pb. 
Les résultats de la PCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à- 
dire qu'une optimisation des prot ocoles ther miques pour rait s'avérer nécessaire en fonction du ther mocy cleur 
utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hy bridation des amorces ou d'une 
contamination au laboratoire. Afin de dissiper tout doute, il convient de prévoi r des témoins positifs et négat ifs 
et des amplicons de séquences appropr iés. En ce qui concer ne les amorces du VSHV , l'utilisation de cellules BF-2 
nécessite une attention particulière, car les amorces peuvent réagir avec l'ADN/l'ARN de la lignée cellulaire et 
produire des faux-positifs de même taille. Si le test est réalisé sur du surnageant provenant de cellules BF-2, tous 
les fragments amplifiés par PCR doivent être séquencés. 
I.6.4.3.  RT-qPCR pour le VSHV 
Pour le VSHV , l'am plification doit être réalisée à l'aide de la sonde et des amorces suivantes: 
amorce sens: 5′-AAA-CTC-GCA -GGA- TGT -GTG-CGT -CC-3′; 
amorce antisens: 5′-TCT -GCG-A TC-TCA-GTC-A GG-A TG-AA-3′; 
et sonde: 5′-F AM- TAG-A GG-GCC- TTG-GTG-A TC-TTC- TG-BHQ1. 
RT-qPCR en une étape: 
À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus sur la plaque. Succession de 
cycles: 50 °C pendant 30 minutes, 95 °C pendant 15 minutes , 40 cycles de 94 °C pendant 15 secondes, 60 °C 
pendant 40 secondes et 72 °C pendant 20 secondes, à adapt er si nécessaire. D'autres versions de RT-PCR ou de 
RT-qPCR présentant une efficacit é similaire avérée peuvent aussi être utilisées. 
I.6.4.4.  RT-qPCR pour le VNHI 
Pour le VNHI, l'amplification doit être réalisée à l'aide de la sonde et des amorces suivantes : 
amorce sens: 5′-A GA-GCC-AA G-GCA-CTG- TGC-G-3′; 
amorce antisens: 5′-TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′; 
et sonde: 5′ 6FAM- TGA GACTGA GCGGGA CA-NFQ/MGB. 
RT-qPCR en deux étapes: 
L'analyse reposant sur une ampli fication en deux étapes, des précautions doivent être prises lors de la 
manuten tion des tubes entre les réactions, afin d'évite r tout e contamination. 
Succession de cycles (après l'étape de la transcr iption inverse): 50 °C pendant 2 minutes, 95 °C pendant 
10 minutes, puis 40 cycles de 95 °C pendant 15 secondes et 60 °C pendant 1 minute , à adapt er si nécessaire. 
D'autres versions de RT-PCR ou de RT-qPCR présentant une efficacit é similaire avérée peuvent aussi être 
utilisées. 
II.  Méthodes et procédures de diagnostic détaillées pour écar ter une suspicion de SHV ou de NHI ou des deux maladies, 
ou pour conf irmer la présence d'une de ces maladies ou des deux 
Lorsqu'un examen de laborat oire est requis pour conf irmer ou exclure la présence de la NHI ou de la SHV , ou 
de ces deux maladies à la fois, conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, à l'aide des 
méthodes de diagnostic établies à l'annex e I, partie 1, point II.3, les méthodes et procédures de diagnostic 
détaillées suivantes doivent être appliquées: 
a)  isolement classique du virus suivi d'une identification de celui-ci par séroneutralisation ou par technique 
immunochimi que ou moléculaire; 
b)  détection du virus par RT-PCR ou RT-qPCR; 
c)  autres techniques de diagnostic, telles que IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC. 23.9.2015 L 247/43 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     II.1.  Isolement classique du virus suivi de son identification 
II.1.1.  Sélection des échantillon s 
Au moins dix poissons présentant des signes typiques de NHI ou de SHV doivent être sélectionnés pour un 
examen. 
II.1.2.  Préparation et expédition des échantillons de poissons 
La préparation et l'expédition aux fins de l'isolement classique du virus doivent être effectuées selon les 
méthodes et procédures indiquées au point I.2. 
II.1.3.  Collecte de matér iel de diagnostic supplémentaire 
La collect e de matér iel supplémentaire aux fins de l'isolement classique du virus doit être réalisée selon les 
méthodes et procédures indiquées au point I.3. 
II.1.4.  Préparation des échantillons en vue de l'examen de cultures cellulaires 
La préparation des échanti llons en vue de l'examen de cultures cellulaires aux fins de l'isolement classique du 
virus doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.4. 
II.1.5.  Examen virologique sur culture cellulaire 
L'examen virologique aux fins de l'isolement classique du virus doit être effectué selon les méthodes et 
procédures indiquées au point I.5. 
II.1.6.  Identif ication du virus 
L'identif ication du virus aux fins de son isolement classique doit être effectuée selon les méthodes et procédures 
indiquées au point I.6. 
II.2.  Détection du virus par RT-qPCR 
II.2.1.  Sélection des échantillon s 
La sélection des échantillon s aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doit être effectuée selon les 
méthodes et procédures indiquées au point I.1.2. 
II.2.2.  Préparation et expédition des échantillons de poisson 
La préparation et l'expédition des échantillons aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doivent être 
réalisées selon les méthodes et procédures indiquées au point I.2. 
II.2.3.  Collecte de matér iel de diagnostic supplémentaire 
La collect e de matér iel de diagnostic supplémentaire aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doit être 
effectuée selon les méthodes et procédures indiquées au point I.3. 
II.2.4.  Préparation des échantillons pour la RT-qPCR 
La préparation des échantillons aux fins de la détection du virus par RT-qPCR doit être réalisée selon les 
méthodes et procédures indiquées au point I.6.4.1. 
II.2.5.  RT-qPCR 
La détec tion du virus par RT-qPCR doit être effectuée selon les méthodes et procédures indiquées aux 
points I.6.4.1, I.6.4.3 et I.6.4.4. 
II.3.  Autres techniques de diagnostic 
Le surnageant préparé comme indiqué au point I.4.3 peut être soumis à un test ELISA, à un test d'immunof luo­
rescence indirecte (IFAT) ou à une analyse par RT-PCR conf ormément aux instr uctions figurant respectivement 
aux points I.6.1, I.6.2 ou I.6.4. Les tissus peuvent être soumis à d'autres techniques de diagnostic telles que 
l'IFAT sur coupes congelées ou l'analyse immunohistoc himique sur tissus fixés au formol. Ces techniques rapides 
doivent être compl étées par un examen virologique conf ormément au point II a) ou au point II b), dans les 
48 heures suivant l'échantillonnag e: 
a)  si un résultat négatif a été obtenu ou 
b)  si un résultat positif a été obtenu avec un matér iel représentant le premier cas de NHI ou SHV . 23.9.2015 L 247/44 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     III.  Titrage destiné à vérifier la sensibilité des cultures cellulaires à l'infection 
Lors du titrage destiné à vérifier la sensibilit é des cultures cellulaires à l'infectio n visé au point I.5.3, les 
procédures décr ites ci-après doivent être respectées. 
Il convie nt d'utiliser au moins deux isolats de VSHV et un isolat de VNHI. Ces isolats doivent être représentatifs 
des principaux groupes de virus dans l'Un ion européenne, à savoir, en ce qui concer ne le VSHV , un isolat 
pathogène issu de truite arc-en-ciel évoluant en eau douce et un isolat pathogène de turbot évoluant en eau de 
mer et, en ce qui concer ne le VNHI, une souc he pathogène de truite arc-en-ciel provenant de l'Un ion 
européenne. Il convie nt d'utiliser des isolats bien définis provenant des États membres. Des lots de virus ayant 
subi un petit nombre de passages sont propagés, dans des flacons de culture cellulaire, sur des cellules BF-2 ou 
RTG- 2 dans le cas du VSHV , et sur des cellules EPC ou FHM dans le cas du VNHI. Il convient d'utiliser un milieu 
de culture contenant au moins 10 % de sérum. Pour l'inoculation, la multiplicit é d'inf ection doit être faible (< 1). 
Lorsque l'ECP est total, le virus est récolté par centr ifugation du surnage ant de la culture cellulaire à 2 000 g 
pendant quinze minutes , stéril isé et filtré à traver s une membrane de 0,45 µm, puis répar ti dans des cryotubes 
étiquet és. Le virus doit être conser vé à – 80 °C. 
Une semaine après la cong élation, trois fioles de chaque virus sont décongelé es sous eau froide et titrées sur 
leurs lignées cellulaires respectives. Chaque isolat de virus doit être décongelé et titré tous les six mois au moins, 
ou dès que l'on suspect e une diminution de la sensibilité d'une lignée cellulaire. 
Les procédures de titrag e doivent être décr ites en détail et la même procédure doit être appliquée à chaque fois. 
Le titrage par dilution limite doit comprendre au moins six réplicats de chaque série de dilutions. Les titres 
doivent être compar és à ceux obtenus antérieurement. Si le titre d'un des trois isolats viraux baisse d'un 
facteur 100 ou plus par rappor t au titre initial, la lignée cellulaire ne doit plus être utilisée à des fins de 
surveillance. 
Si différ entes lignées cellulaires sont conser vées au laboratoire, chaque lignée doit être examinée séparément. 
Des registres sont conser vés pendant dix ans au moins. 
PARTIE 2 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES POUR LA SUR VEILL ANCE ET LA CONFIRMA TION DE 
L'HERPÈSVIR OSE DE LA CARPE KOÏ (HV CK) 
I.  Méthodes et procédures de diagnos tic détaillées pour écar ter une suspicion d'HV CK ou conf irmer la présence de 
cette maladie 
Lorsqu'un examen de laboratoire est requis pour conf irmer la présence de l'HV CK ou pour écar ter une suspicion 
de cette maladie, conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, à l'aide des méthodes de 
diagnostic établies à l'annex e I, partie 2, section III, les méthodes et procédures de diagnostic détaillées indiquées 
aux points I.1 à I.2 de la présente partie doivent être appliquées. 
I.1.  Préparation des échantillons de poissons 
À des fins de diagnostic, il est possible d'utiliser des poissons (expédiés vivants ou mor ts et emballés séparément 
dans des conteneur s aseptiques hermétiques) ou bien des organes ou des morceaux d'org anes congelés conser vés 
dans de l'éthanol de concentration comprise entre 80 % et la concentration de l'éthanol absolu, ou dans un 
milieu de transpor t viral (en vue d'un traitement dans les 48 heures suivant le prélèvement) pour procéder aux 
essais par des méthodes fondées sur la PCR classique ou la qPCR. 
Pour la détec tion de l'HVK, les branchi es et les reins doivent être prélevés; en outre, la rate, l'encéphale et les 
intest ins peuvent être inclus dans un échantillon supplémentaire distinct. En cas d'infection aiguë, il est possible 
de regrouper des tissus provenant de cinq poissons au maximum. 
De surcroît, des écha ntillons non létaux tels que du sang, des frottis et des biopsies de branchi es et des 
prélèvements de mucus peuvent être utilisés dans certains cas (c'est-à-dire que des poissons de grande valeur 
peuvent être utilisés lorsque l'on suspecte la présence de l'HVK). 
I.1.1.  Extraction de l'ADN 
L'ADN doit être extrait conf ormément aux procédures standard. 
Il est possible d'utiliser les kits d'extraction de l'ADN disponibles dans le commerce, qui permett ent d'obte nir un 
ADN de qualité utilisable dans les protocoles de PCR décr its au point I.2. 23.9.2015 L 247/45 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.2.  Détection et identif ication de l'agent infec tieux par des méthodes basées sur l'am plification en chaîne par 
polymérase (PCR) 
I.2.1.  qPCR pour la détection de l'HVK 
Pour la détection de l'HVK par qPCR, le prot ocole suivant doit être appliqué: 
amorce sens (KHV -86f): 5′-GA CGCCGGA GACCTTGTG-3′; 
amorce antisens (KHV -163r): 5′-CGGGTTCTT ATTTTTGTCCTTGTT -3′ 
et sonde (KHV -109p): 5′-F AM-CTTCCTCTGCTCGGCGA GCACG-3′. 
Succession de cycles: un cycle de 95 °C pendant 15 minutes, suivi de 40 cycles de 94 °C pendant 15 secondes 
et 60 °C pendant 60 secondes. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus 
sur la plaque. Cependant, d'autres versions de qPCR présentant une efficacit é similaire avérée peuvent aussi être 
utilisées. 
I.2.2.  PCR classique pour la détection de l'HVK 
Le prot ocole décr it au présent point, qui cible le gène codant pour la thymine kinase (TK) de l'HVK, doit être 
utilisé. Toutef ois, d'autres protocoles de PCR dont la sensibilité et la spécificité sont, de tout e évidence, similaires 
à celles du prot ocole décr it peuvent être utilisés à la place de ce dernier. 
Amorce sens (KHV -TKf): 5′-GGGTT ACCTGT AC GAG-3′; 
amorce antisens (KHV -TKr): 5′-CA CCCA GTAGATTA TGC-3′. 
Succession de cycles: un cycle de 95 °C pendant 5 minut es, suivi de 35 cycles de 95 °C pendant 30 secondes, 
52 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant une minute et d'un cycle de 72 °C pendant 10 minutes. La taille 
du produit doit être de 409 bp. 
Les résultats de la PCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à- 
dire qu'une optimisation des prot ocoles ther miques pour rait s'avérer nécessaire en fonction du ther mocy cleur 
utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hy bridation des amorces ou d'une 
contamination. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négatif s doivent être inclus sur la plaque. 
Cependant, d'autres versions de qPCR présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi être utilisées. 
La première détection du virus dans une zone doit être conf irmée par séquençage ou par envoi d'éch antillons à 
un laboratoire de référen ce national ou au laborat oire de référence de l'Un ion pour les maladies des poissons 
visé à l'annex e VI de la directive 2006/88/CE en vue d'une identif ication immédiate. 
II.  Méthodes et procédures de diagnos tic détai llées pour la surveillance de l'HV CK 
Lorsque des prélèvements et des examens de laborat oire sont réalisés en vue de l'obt ention ou du maintien d'un 
statut sanitaire donné en ce qui concer ne l'HV CK comme indiqué à l'annex e I, partie 2, section I, à l'aide des 
méthodes de diagnostic décr ites dans la partie 2, sections II ou III, de ladit e annexe, les méthodes et procédures 
de diagnostic figurant aux points II.1 et II.2 de la présente partie doivent être appliquées. 
II.1.  Préparation des échantillons de poisson 
Dans la mesure du possible, les poissons qui ont été maintenus longtem ps à des températures propices au 
développement du virus (c'est-à-dire entre 15 et 26 °C pendant deux à trois semaines) doivent faire l'objet d'un 
échantillon nage. Si possible, les échantillon s doivent être prélevés au minimum 24 heures et au maximum 
72 heures après des pratiques de gestion susceptibles de réactiver le virus dans les poissons vect eurs, telles que 
la capture en filet ou le transpor t, afin d'augmenter les chances de détection de l'HVK. 
Aux fins de la surveillance de l'HV CK, les poissons peuvent être expédiés vivants ou mor ts et emballés 
séparément dans des cont eneurs asept iques hermétiques; sinon, il est aussi possible d'utiliser des organes ou des 
morceaux d'organes cong elés conser vés dans de l'alcool de concentration compris e entre 80 % et 100 % ou 
dans un milieu de transpor t viral (en vue d'un traite ment dans les 48 heures suivant le prélèvement) pour des 
tests par des méthodes fondées sur la PCR. Pour la surveillance de l'HV CK, les branchies et les reins doivent être 
prélevés. 
Le regroupement de tissus de plusieurs poissons doit être évité dans la mesure du possible. Si ce regroupement 
est nécessaire, il ne portera que sur deux poissons au maximum. Les échanti llons de plus grande taille doivent 
être homogénéisés au moyen d'un ensemble mor tier-pilon ou d'un malaxeur , et des sous-échanti llons devront 
être prélevés avant la clarification en vue de l'extraction de l'ADN. Une autre solution consist e à prélever des 
sous-échanti llons de chaque tissu présent dans l'échantillon et à les placer dans des tubes de lyse. 23.9.2015 L 247/46 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     II.1.1.  Extraction de l'ADN 
L'ADN doit être extrait conf ormément aux procédures standard. Il est possible d'utiliser les kits d'extraction de 
l'ADN disponibles dans le commerce, qui permett ent d'obten ir un ADN de qualité utilisable dans les protocoles 
de PCR décr its au point II.2. 
Le rappor t accept able entre les tissus et le milieu est de 1:9 p/v. Les essais doivent porter sur 20 à 25 mg de 
tissus. 
II.2.  Surveillance de l'HV CK par méthodes fondées sur la PCR 
Pour la surveillance de l'HV CK, il y a lieu de recour ir à la qPCR. Si des échantillons positifs apparaissent dans 
une zone qui n'a pas été préalablement confir mée positive, les résultats de l'essai doivent être confir més: 
a)  par séquençage d'un produit de PCR ou de PCR niché e («nested PCR») obtenu à partir des échantillon s. 
La séquence consensus obtenu e doit coïncider (à 98 % au moins) avec les séquences de référen ce; 
b)  ou par envoi des échantillons à un laboratoire national de référence. 
II.2.1.  qPCR pour la détection de l'HVK 
Le protocole de qPCR décr it ci-dessous doit être appliqué: 
amorce sens (KHV -86f): 5′-GA CGCCGGA GACCTTGTG-3′; 
amorce antisens (KHV -163r): 5′-CGGGTTCTT ATTTTTGTCCTTGTT -3′ 
et sonde (KHV -109p): 5′-F AM-CTTCCTCTGCTCGGCGA GCACG-3′. 
Succession de cycles: un cycle de 95 °C pendant 15 minutes, suivi de 50 cycles de 94 °C pendant 15 secondes 
et 60 °C pendant 60 secondes. 
Les résultats de la qPCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est- 
à-dire qu'une optimisation des prot ocoles ther miques pour rait s'avérer nécessaire en fonction du ther mocy cleur 
utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hy bridation des amorces ou d'une 
contamination au laboratoire. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négat ifs doivent être inclus 
sur la plaque. Cependant, d'autres versions de qPCR présentant une efficacit é similaire avérée peuvent aussi être 
utilisées. 
II.2.2.  PCR classique pour conf irmer la détection de l'HVK 
Pour confir mer la présence d'une infection par l'HVK, le protocole génér ique de PCR niché e décr it dans le 
tableau 2.1 ci-dessous doit être utilisé, suivi d'un séquençag e du produit d'ampli fication. 
Tableau 2.1 
Amorces et conditions pour le prot ocole de PCR nichée ciblant tous les herpèsvir us des cypr inidés 
(CyHV -1, CyHV -2 et CyHV -3) 
Nom de l'amorce Séquence Succession de cycles Taille du 
produit 
CyHVpol-sens 5′-CC AGCAACATGTGCGA CGG-3′ Première phase de PCR 
1 cycle: 
95 °C pendant 2 minutes 
40 cycles: 
95 °C pendant 30 secondes 
55 °C pendant 30 secondes 
72 °C pendant 45 secondes 
1 cycle: 
72 °C pendant 10 minutes. 362 pb 
CyHVpol-antisens 5′-CCGT ARTGA GAGTTGGCGCA -3′ 23.9.2015 L 247/47 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Nom de l'amorce Séquence Succession de cycles Taille du 
produit 
CyHVpol-inter ne 
sens 5′-CGA CGGV GGY ATCAGCCC-3′ Deuxième phase de PCR 
1 cycle: 
95 °C pendant 2 minutes 
40 cycles: 
95 °C pendant 30 secondes 
55 °C pendant 30 secondes 
72 °C pendant 45 secondes 
1 cycle: 
72 °C pendant 10 minutes. 339 pb 
CyHVpol-inter ne 
antisens 5′-GA GTTGGCGCA YACYTTC ATC-3′  
Les résultats de la PCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à- 
dire qu'une optimisation des prot ocoles ther miques pour rait s'avérer nécessaire en fonction du ther mocy cleur 
utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hy bridation des amorces ou d'une 
contamination au laboratoire. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négat ifs doivent être inclus 
sur la plaque. D'autres versions de PCR présentant une efficacit é similaire avérée peuvent aussi être utilisées. 
Le séquençage peut être effectué par le laboratoire ou conf ié à des sociét és exté rieures spécialisées. Les résultats 
du séquençage doivent être analysés en compar ant les séquences aux séquences de référence connues de l'HVK 
(numéros d'accès à GenBank AP008984, DQ657948 et DQ177346). La séquence consensus obtenu e doit 
coïncider à 98 % au moins avec ces séquences de référen ce. 
PARTIE 3 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES POUR LA SUR VEILL ANCE ET LA CONFIRMA TION DE 
L'ANÉMIE INFECTIEUSE DU SAUMON (AIS) 
I.  Procédures d'échantillonnage pour la surveillance de l'AIS et la lutte contre cette maladie 
Lors du prélèvement d'échantillons et des examens de laborat oire réalisés aux fins des programmes de 
surveillance ou d'éradication décr its à l'annex e I, partie 3, ou en vue de confir mer la présence de l'AIS ou 
d'écar ter une suspicion d'AIS conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, les méthodes et 
procédures détaillées établies aux points I.1, I.2 et I.3 de la présente section doivent être appliquées. 
I.1.  Préparation des échantillons de poisson 
Aux fins des examens de laboratoire visant à détecter un foyer d'AIS, les échantillons de poisson ne doivent pas 
être regroupés, dans la mesure du possible. Toutef ois, aux fins de la surveillance de l'AIS, le regroupement de 2 
à 5 poissons est acceptable. 
Des échantillon s destinés à l'analyse par amplification en chaîne par polymérase en présence d'une transcr iptase 
inve rse (RT-PCR) doivent être prélevés sur tous les poissons présents dans l'échantillon. Un morceau de rein 
médian doit être prélevé sur chaque poisson à l'aide d'un instr ument stérile et transféré dans un microtube de 
centr ifugation conte nant 1 ml de solution de conser vation de l'ARN d'efficacité avérée. Les tissus de cinq 
poissons au maximum peuvent être regroupés dans un tube de solution de transpor t pour constituer un 
échantillon global. Le poids de tissu d'un échantillon doit être de 0,5 g. Quand les poissons sont trop petits 
pour constituer un échanti llon pesant le poids requis, il est possible d'ajout er, par ordre de préférence, des 
morceaux de rein, de cœur , de rate, de foie ou de cæcum pylor ique pour atteindre 0,5 g. 
Les tissus destinés à l'examen histologique doivent être prélevés uniquement sur des poissons fraîchement 
sacr ifiés de constitution normale, sur des poissons présentant des signes cliniques compat ibles avec l'AIS ou sur 
des poissons ayant fait l'objet de constatations post-mor tem compati bles avec la présence de l'AIS. Toute lésion 
externe ou interne constatée doit donner lieu au prélèvement de l'individu concer né, et dans tous les cas, des 
échantillon s de rein médian, de cœur , de foie, de pancréas, d'intestin, de branchi es et de rate doivent être 
prélevés sur chaque poisson à l'aide d'un scalpel et transférés dans une solution saline tamponnée de formol à 
8-10 % (v/v). Le rappor t entre le fixateur et les tissus doit être d'au moins 20:1 pour garantir une conser vation 
satisf aisante des tissus. En vue d'une analyse immunohistoc himique (IHC), des échanti llons de rein médian et de 
cœur doivent être prélevés. 23.9.2015 L 247/48 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Les tissus destinés à l'examen virologique sur culture cellulaire doivent être prélevés sur tous les poissons 
présents dans les échantillons. Des morceaux de foie, de rein antérieur ou médian, de cœur et de rate doivent 
être prélevés sur les poissons à l'aide d'un instr ument stérile et transfé rés dans des tubes en plastique cont enant 
9 ml de milieu de transpor t. Des tissus prélevés sur cinq poissons au maximum peuvent être rassemblés dans 
un tube conte nant une solution de transpor t pour constituer un échantillon global. Le poids de tissu d'un 
échantillon doit être de 1,0 ± 0,5 g. 
I.2.  Expédition des échantillons de poissons 
Des poissons entiers peuvent être envoyés au laborat oire si les conditions de température pendant le transpor t 
qui sont décr ites au paragraphe 3 du présent point peuvent être respectée s. Les poissons entiers doivent être 
enveloppés dans du papier absorbant et expédiés dans un sac en plastique, réfrigéré comme indiqué dans ledit 
paragraphe. 
Des poissons vivants peuvent également être expédiés, mais uniquement sous la super vision du laboratoire de 
référen ce national pour les maladies des poissons et comp te tenu des règles supplémentaires de désinf ection et 
de biosécur ité applicables lors du transpor t de poissons vivants. 
Les échanti llons de sang et les tubes cont enant les tissus de poisson destinés à l'examen virologique ou à 
l'analyse par RT-PCR doivent être placés dans des récipients isolés, tels que des boîte s en polystyrène à parois 
épaisses, cont enant une quantité suffi sante de glace ou de blocs réfrigérants pour garantir la réfrigération des 
échantillon s pendant le transpor t vers le laborat oire. La cong élation doit être évitée et le récipient de transpor t 
doit encore cont enir de la glace lors de sa réception, ou bien un ou plusieurs des blocs réfrigéra nts doivent être 
encore partiellement ou totalement congelés. Excep tionnellement, les échanti llons destinés à l'analyse par RT- 
PCR et ceux destinés à l'examen virologique peuvent être surgelés et transpor tés vers le laboratoire à une 
température inférieure ou égale à – 20 °C. 
Pour l'analyse l'ulté rieure par RT-PCR de tissus conser vés dans du réactif de stabilisation de l'ARN (RNAlater), 
l'extraction de l'ARN doit être réalisée dans les délais indiqués ci-dessous, en fonction de la température de 
stoc kage des échantillons: 
échantillon s stoc kés à 37 °C: dans un délai d'un jour; 
échantillon s stoc kés à 25 °C: dans un délai d'une semaine; 
échantillon s stoc kés à 4 °C: dans un délai d'un mois; 
échantillon s stoc kés à – 20 °C: délai indétermi né. 
Si les tissus de poisson sont transpor tés dans du fixate ur pour examen histologique, ils doivent être expédiés 
dans des tubes étanches placés dans des récipients résistant aux chocs. Il y a tout efois lieu d'éviter la cong élation 
de ces échantillons. 
L'examen virologique sur culture cellulaire doit commencer dès que possible et au plus tard 48 heures après le 
prélèvement des échantillon s. Dans des cas excep tionnels, l'examen virologique peut commencer au plus tard 
72 heures après la collecte du matér iel à examiner à condition que celui-ci soit conser vé dans le milieu de 
transpor t et que les conditions de température requises pendant le transpor t aient pu être respectées. 
I.3.  Collecte de matér iel de diagnostic supplémentaire 
Sous réser ve de l'approbation du laborat oire de diagnostic, des tissus de poisson autres que ceux visés au 
point I.1 peuvent être collectés et préparés en vue d'un examen supplémentaire. 
II.  Méthodes et procédures de diagnostic détai llées pour la surveillance de l'AIS et pour conf irmer la présence de l'AIS 
ou écar ter une suspicion de cette maladie 
Lorsque des examens de laborat oire sont réalisés en vue de l'obtention ou de la conser vation d'un certain statut 
sanitaire en ce qui concer ne l'AIS comme indiqué à l'annex e I, partie 3, section I, ou afin de conf irmer la 
présence de l'AIS ou d'écar ter une suspicion d'AIS conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 
2006/88/CE à l'aide des méthodes de diagnostic énoncées à l'annexe I, partie 3, section II, les méthodes et 
procédures détaillées figurant aux points II.1 à II.5 ci-après doivent être appliquées. 
II.1.  Examen des écha ntillons par RT-PCR 
La méthode de diagnostic à utiliser pour la détection du VAIS est la RT-qPCR. Étant donné que les résultats de la 
RT-pPCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, il y a lieu de prévoi r 
des témoins positifs et négatif s et des amplicons adéquats afin de dissiper tout doute. 
II.1.1.  Extraction de l'ARN total 
Toutes les manipulations sur l'ARN doivent être réalisées sur de la glace, et des gants doivent être utilisés. 23.9.2015 L 247/49 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     L'ARN total doit être extrait par la méthode phénol/chlorof orme ou par chromat ographie d'affi nité sur colonnes, 
selon les instr uctions du fabr icant. 
L'ARN purifié doit être remis en suspension dans de l'eau distillée exem pte d'ARNase (c.-à-d. de l'eau traitée avec 
du pyrocarbonate de diéth yle à 0,1 %). 
La concentration et la pureté de l'ARN extrait doivent être évaluées en mesurant la densité optique à 260 nm et 
à 280 nm. Il est également possible d'inclure des témoins internes ciblés contre le génome viral comme indiqué 
au point II.1.3. 
II.1.2.  RT-PCR pour la détection du VAIS 
Plusieurs méthodes de RT-PCR peuvent être utilisées pour l'am plification du génome du VAIS. Il est possible de 
procéder à une RT-PCR en deux étapes en réalisant les réactions de RT et de PCR dans deux tubes distincts. 
Toutef ois, une réaction en une seule étape, dans laquelle les deux réactions sont réalisées dans un seul tube, est 
également possible. La méthode en une étape doit être privilégiée dans la mesure du possible car le tube unique 
réduit au minimum le risque de contamination croisée, puisque tout transfer t de contenu est évité; de surcroît, 
cette méthode est considérée comme étant aussi sensible que la méthode en deux étapes. 
Il y a lieu d'utiliser les amorces et le protocole décr it dans le présent point, à savoir la paire d'amorces ILA1 ou 
ILA2 qui ciblent le segment 8 et qui ont été jugées adéquate s pour la détection du VAIS dans des foyers 
d'infec tion ainsi que dans les poissons vect eurs. L'amorce antisens ILA2 ne convient pas pour les isolats 
provenant d'Amér ique du Nord et une autre série d'amorces doit être utilisée dans ces cas. 
Amorce sens (ILA1): 5′-GGCT ATCT ACCA TGAA CGAA TC-3′; 
amorce antisens (ILA2): 5′-GCCAA GTGT AAGTAGCACTCC-3′. 
Succession de cycles: un cycle de 50 °C pendant 30 minutes, 1 cycle de 94 °C pendant 15 minut es, 40 cycles de 
94 °C pendant 30 secondes, 55 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant 60 secondes; un cycle de 72 °C 
pendant 5 minute s. Taille du produit: 155 pb. 
Les résultats de la PCR peuvent varier en fonction des conditions dans lesquelles la technique est réalisée, c'est-à- 
dire qu'une optimisation des prot ocoles ther miques pour rait s'avérer nécessaire en fonction du ther mocy cleur 
utilisé. Par ailleurs, des faux-positifs sont possibles à la suite d'erreurs d'hy bridation des amorces ou d'une 
contamination au laboratoire. À chaque «run» de RT-qPCR, des témoins positifs et négat ifs doivent être inclus 
sur la plaque. Cependant, d'autres versions de RT-PCR présentant une efficacité similaire avérée peuvent aussi 
être utilisées. 
II.1.3.  RT-qPCR pour la détection du VAIS 
Le recours à la RT-qPCR peut accroître la spécificité et sans doute aussi la sensibilit é. La méthode peut être 
réalisée plus rapidement car il n'y a pas d'étape d'électrophorèse sur gel, et le risque de contamination croisée 
est réduit puisqu'il est possible d'estimer la quantité d'ARN génomique viral dans le tube à essai. Un des inconvé ­
nients de l'essai par RT-qPCR est qu'il n'est souvent pas possible de séquencer les produits d'amp lification. 
Toutef ois, en cas de doute sur la spécifi cité du produit d'ampli fication, un autre essai spécifi que du VAIS doit 
être effectué pour vérifier le résultat. 
Il y a lieu de recour ir à l'essai décr it au présent point, qui cible le segment 8. Cet essai doit être valable pour les 
isolats provenant de pays de l'Union européenne, de l'Association européenne de libre-échang e et d'Amér ique du 
Nord. La méthode en une étape doit être utilisée dans la mesure du possible car l'essai réalisé dans un seul tube 
réduit le risque de contamination croisée. 
Amorce sens: 5′-CT ACACAGCAGGA TGCA GATGT -3′; 
amorce antisens: 5′-CA GGA TGCCGGAA GTCGA T-3′ 
et sonde: 5′-F AM-C ATCGTCGCTGCA GTTC–MGBNFQ-3′. 
À chaque série d'épreuves de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus sur la plaque. 
Succession de cycles: un cycle de 50 °C pendant 30 minute s, un cycle de 95 °C pendant 15 minute s, 40 cycles 
de 94 °C pendant 15 secondes et 60 °C pendant 60 secondes, à adapt er si nécessaire. D'autres versions de RT- 
PCR ou de RT-qPCR présentant une effic acité similaire avérée peuvent aussi être utilisées. 23.9.2015 L 247/50 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     II.1.4.  Séquençage des produits d'ampli fication de la PCR 
Amorce sens (ILAs6-3F): 5′-A TGA GGGA GGT AGCATTGCA -3′; 
amorce antisens (ILAs6-2R): 5′-CA TGCTTTCCAA CCTGCT AGGA-3′. 
À chaque série d'épreuves de RT-qPCR, des témoins positifs et négatifs doivent être inclus sur la plaque. 
Succession de cycles (RT-PCR en une étape): un cycle de 50 °C pendant 30 minutes, un cycle de 94 °C pendant 
15 minute s, 40 cycles de 94 °C pendant 30 secondes, 55 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant 
60 secondes, un cycle de 72 °C pendant 5 minut es; à adapt er si nécessaire. D'autres versions de RT-PCR ou de 
RT-qPCR présentant une efficacit é similaire avérée peuvent aussi être utilisées. 
La méthode ci-après peut aussi être utilisée pour le séquençage de la RHP dans le segment 6: 
Amorce sens: 5′-GA C-CA G-A CA-A GC- TTA-GGT -AA C-A CA-GA-3′; 
amorce antisens: 5′-GA T-GGT -GGA-A TT-CTA-CCT -CTA-GA C-TTG- TA-3′; 
taille du produit: 304 nt si HPR0. 
Il est aussi possible de recour ir à des essais par RT-PCR de sensibilit é et de spécificité similaires à celles des essais 
décr its dans le présent point. 
La pureté du produit d'amplification par RT-PCR doit être vérifiée par électrophorèse sur gel avant le 
séquençage. Si un seul fragment pur apparaît, il doit être purifié direct ement à partir de la réaction de PCR. Si 
plusieurs fragments amplifiés sont présents, le fragment d'intér êt doit être purifié par électrophorèse sur gel. La 
purification des fragments ampli fiés à partir de solutions ou de gels d'ag arose doit être réalisée à l'aide de 
colonnes de chromat ographie d'affi nité pour fragments de PCR conf ormément aux instr uctions du fabricant. 
Le séquençage doit être réalisé à l'aide des amorces d'amplification par des sociét és de séquençage spécialisées 
extérieur es. Les résultats du séquençage doivent être analysés à l'aide de l'outil de recherche BLAST , et les 
séquences compar ées à d'autres séquences connues se trouvant dans la base de données des nucléotides du 
Centre national d'inf ormations biot echn ologiques des États-Un is (NCBI). 
Le séquençage doit permettre de dissiper tout doute quant à la spécifi cité d'un produit amplifié par RT-PCR. 
II.2.  Isolement du VAIS en culture cellulaire 
II.2.1.  Préparation des échantillons 
Les tissus peuvent être conser vés à – 80 °C. Ils ne doivent être congelés et décong elés qu'une fois avant examen. 
Aux fins de la surveillance et des mesures de lutte , l'examen doit être entrepr is aussi rapidement que possible. 
Chacun des échantillons (regroupement de tissus dans une solution de transpor t) doit être compl ètement 
homog énéisé à l'aide d'un homog énéisateur validé, puis centr ifugé entre 2 000 et 4 000 g pendant 15 minut es 
à une température comprise entre 0 et 6 °C, et le surnageant doit être filtré (0,45 μm) et incubé avec un volume 
égal d'un ensemble de sérums anti-sérotypes indigènes du virus de la NPI dûment dilués. Le titre de l'antisér um 
doit être d'au moins 1:2 000 dans un test de neutralisation sur plaque à 50 %. Le mélange doit être incubé 
pendant une heure à 15 °C; il constitue l'inoculum. 
Le trait ement de tous les inoculums par un sérum antivir us de la nécrose pancréatique infectieuse (virus qui, 
dans certaines régions d'Europe, est présent dans 50 % des échantillons de poissons) vise à empê cher 
l'appar ition d'un effet cytopathogène (ECP) dû au virus NPI dans les cultures cellulaires inoculées. Ce trait ement 
peut être effectué pour réduire la durée des examens virologiques ainsi que le nombre de cas où l'appar ition 
d'un ECP devrait être considérée comme une manifestation possible du VAIS. Lorsque les écha ntillons 
proviennent d'unités de production considérées comme indemnes de la NPI, le traitement des inoculums par le 
sérum antivir us de la NPI peut être omis. 
II.2.2.  Inoculation des cultures cellulaires 
Des cellules de rein de saumon de l'Atlantique (ASK) doivent être utilisées pour l'isolement primaire du VAIS. 
D'autres lignées cellulaires dont l'efficacité et la sensibilit é sont avérées pour l'isolement du VAIS peuvent être 
utilisées, comp te tenu de la variabilit é de la souc he et de la capacité des différentes souc hes de se multiplier dans 
différ entes lignées cellulaires. Les cellules ASK semblent suppor ter l'isolement et la croissance des isolats de virus 
connus à ce jour , tant que le nombre de passages est faible. Un effet cytopathogène (ECP) peut se manifest er 
plus distinctement dans les cellules ASK que dans d'autres lignées cellulaires sensibles telles que SHK -1 (cellules 
de rein antér ieur de saumon-1). 23.9.2015 L 247/51 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Des cellules ASK (65 passage s au maximum) doivent être cultivées dans un milieu L-15 cont enant du sérum 
fœtal bovin à 10 %, 200 mM de L-glutamine à 2 % (v/v) et 50 mM de 2-mercapt oéthanol à 0,08 % (v/v) dans 
des plaques multipuits. Une suspension d'organes traité e par antisér um est inoculée à de jeunes cultures 
cellulaires en phase de croissance active de manière à obte nir une dilution finale du matér iel tissulaire dans le 
milieu de culture de 1:1 000. Pour chaque organe, 40 μl de la suspension d'inoculum sont ajoutés dans un puits 
conte nant 2 ml de milieu de culture. Afin de minimiser le risque de contamination croisée, on utilisera des 
plaques à 12 ou 24 puits distincte s pour les échantillon s provenant de diffé rentes exploitations piscicoles. 
Il convient de conser ver une plaque non inoculée qui servira de témoin négatif . Une autre plaque doit être 
inoculée avec un isolat de référen ce du VAIS, qui servira de témoin positif, comme suit: inoculer 100 µl d'une 
préparation mère du VAIS [titre minimal 107 Dose infectant 50 % de la culture tissulaire (DICT50 ml– 1)] dans le 
premier puits et mélanger . Transf érer une fraction de ce matér iel du premier puits dans le deuxième afin 
d'obten ir une dilution au 1:10, puis mélanger . Répét er l'opération sur tout e la plaque pour obtenir six dilutions 
au 1:10. La préparation mère du VAIS peut être conser vée à – 80 °C pendant au moins deux ans, mais une fois 
déconge lée, elle doit être utilisée dans les trois jours. Des précautions doivent être prises pour éviter la contami ­
nation croisée des plaques d'essai par le témoin positif. Pour éviter ce risque, les témoins positifs doivent être 
constitués et traités séparément des plaques d'essai. Plutôt que de prév oir un témoin positif à chaque 
inoculation, il est possible de réaliser tous les six mois un essai de sensibilit é des cellules d'ASK au VAIS. 
Les échantillons doivent être incubés à 15 ± 2 °C pendant une durée maximale de 15 jours. Les cellules doivent 
être examinées au microscope deux fois pour détecter un ECP, d'abord entre le cinquième et le septième jour , 
puis entre le douzième et le quat orzième jour après inoculation. Si un ECP est détecté, les procédures d'identif i­
cation du virus doivent être mises en œuvre immédiatement conf ormément au point II.2.4. Si aucun ECP n'est 
obser vé au quatorzième jour , il y a lieu de procéder à un test d'immunof luorescence indirect e (IFAT), à un test 
d'hémadsor ption ou à une RT-PCR. 
II.2.3.  Repiquag e 
Le repiquage doit être effectué entre le treizième et le quinzième jour . Du surnageant de culture doit être ajout é 
dans les puits de plaques multipuits conte nant des cellules fraîc hes en phase de croissance active, à la dilution 
appropr iée (1/10), et les plaques doivent ensuite être incubées à 14 ± 2 °C pendant une durée maximale de 18 
jours. Les cultures cellulaires doivent être examinées deux fois au microscope pour rech ercher un ECP, d'abord 
entre le cinquième et le septième jour puis entre le quat orzième et le dix-huitième jour après inoculation. Si un 
ECP est détect é, les procédures d'identification du virus doivent être mises en œuvre immédiat ement 
conf ormément au point II.2.4. Si aucun ECP n'est obser vé entre le quatorziè me et le dix-huitième jour , il faut 
procéder à un test d'hémadsor ption ou à une RT-PCR. 
Si un effet cytotoxique est obser vé au cours des sept premiers jours suivant l'incubation, il faut procéder à ce 
stade à un repiquage et incuber les cellules pendant quat orze à dix-huit jours, puis réaliser un nouveau 
repiquage suivi d'une nouvelle période d'incubation de quatorze à dix-huit jours. Si l'effet cytot oxique apparaît 
au bout de sept jours, le repiquage n'est effectué qu'une fois et les cellules sont incubées de manière à parvenir à 
un total de vingt-huit à trent e-six jours d'incubation à partir de l'inoculation primaire. 
En cas de contamination bacté rienne de la culture primaire, le test doit être recommencé avec l'homogénat de 
tissus conser vé à – 80 °C. Avant inoculation, l'homogé nat de tissus doit être centr ifugé à 4 000 g pendant 15 à 
30 minut es à une température comprise entre 0 et 6 °C et le surnage ant doit être filtré à 0,22 µm. Si la contami ­
nation bactéri enne survient pendant l'étape de repiquag e, le surnageant doit être filtré à 0,22 µm, puis inoculé à 
des cellules fraîc hes qui seront ensuit e incubées pendant une nouvelle période de quat orze à dix-huit jours. 
II.2.4.  Tests d'identif ication du virus 
Si un ECP est obser vé à quelque stade que ce soit, ou si le test d'hémadsor ption est positif, il faut procéder à 
l'identifi cation du virus. Les méthodes de prédilection pour l'identifi cation du VAIS sont la RT-PCR 
conf ormément au point II.1 et l'immunof luorescence (IF) conf ormément au point II.2.6. Si l'on soupçonne la 
présence d'autres virus, des tests supplémentaires d'identification du virus doivent être effectués. Si ces tests 
n'ont pas permis d'identif ier le virus de façon certaine dans un délai d'une semaine, le surnageant doit être 
envoyé en vue d'une identif ication immédiate : 
a)  au laborat oire de référence de l'Organisation mondiale de la santé animale (OIE) pour l'AIS ou 
b)  à un laboratoire national de référence ou au laboratoire de référence de l'Union européenne pour les 
maladies des poissons visé à l'annexe VI de la directive 2006/88/CE. 
II.2.5.  Hémadsor ption 
Comme la réplication du VAIS dans des cultures cellulaires n'entraîne pas touj ours l'appar ition d'un ECP, chaque 
puits doit être soumis à une épreuve de RT-PCR ou à un test d'hémadsor ption conf ormément au présent point, 
ou bien à un test IF conf ormément au point II.2.6. 23.9.2015 L 247/52 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Du milieu de culture cellulaire doit être prélevé dans chacun des puits, y compr is ceux des témoins positifs et 
négatif s, et placé dans des tubes stéril es étiquetés. Ajouter dans chaque puits 500 µl d'une suspension à 0,2 % 
(v/v) d'hématies de cheval ou de lapin lavées ou d'une suspension à 0,05 % (v/v) d'hématies de truite arc-en-ciel 
ou de saumon de l'Atlan tique lavées, puis incuber à température ambiante pendant 45 minutes . Éliminer les 
hématies et rincer chaque puits deux fois avec du milieu L-15. Chaque puits doit être examiné au microscope. 
La présence d'amas d'érythrocyte s adhérant à la surface des cellules d'ASK est révélatr ice d'une possible infection 
par un orthom yxovirus. Si le test d'hémadsor ption est positif, un test d'identif ication du virus doit être réalisé 
immédiatem ent conf ormément au point II.2.4. 
II.2.6.  Immunof luorescence (IF) 
Des cellules ASK (65 passages au maximum) doivent être cultivées dans du milieu L-15 contenant du sérum 
fœtal bovin à 10 %, 200 mM de L-glutamine à 2 % (v/v) et 50 mM de 2-mercapt oéthanol à 0,08 % (v/v) dans 
des plaques multipuits, et doivent être utilisées à plus de 50 % de conf luence. Il est également possible d'utiliser 
d'autres lignées cellulaires ou un autre milieu de culture d'effi cacit é avérée. Ajoute r respectivement 225 μl de 
surnageant de culture infec tée par le virus présumé dans deux puits, mélanger puis transférer 225 μl de chaque 
puits dans deux autres puits, de façon à obte nir une dilution au 1:5. Deux autres puits non inoculés serviront de 
témoins. Les échanti llons provenant de chaque site d'une ferme piscicole doivent être traité s sur des plaques 
distinctes , de même que les témoins. Un témoin viral doit être constitué à l'aide d'un isolat de référen ce du VAIS. 
Les plaques doivent être incubées à 14 ± 2 °C et examinées au microscope sept jours durant au maximum. Si 
un ECP précoce est obser vé ou si aucun ECP n'est obser vé dans un délai de sept jours, l'étape suivante est la 
fixation. Les puits doivent être lavés à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixés par 
incubation avec de l'acétone à 80 % pendant 20 minutes à température ambiant e. Les plaques doivent être 
séché es à l'air puis immédiate ment colorées ou bien conser vées entre 0 et 6 °C pendant au maximum 24 heures 
avant coloration. 
Les puits répliques doivent être colorés à l'aide d'un mélange d'anticor ps monoclonaux (AcM) 3H6F8 et 1OC9F5 
anti- VAIS, ou d'autres AcM d'efficacité et de spécificité avérées, dilués dans du PBS, et les plaques doivent être 
incubées à 37 ± 4 °C pendant 30 minutes. Après élimination des AcM, les plaques doivent être lavées trois fois 
au Tween 20 à 0,05 % dans du PBS. Des anti-IgG de sour is conjuguées à de l'isothiocyanat e de fluorescéine 
(FITC) diluées dans du PBS doivent être ajoutées dans chaque puits et les plaques doivent être incubées à 
37 ± 4 °C pendant 30 minutes . Les dilutions des différents lots de conjugués d'AcM et de FITC doivent être 
optimisées dans chaque laborat oire. Après élimination des anticor ps, les plaques doivent être lavées trois fois au 
Tween 20 à 0,05 % dans du PBS. 
Les puits doivent être examinés immédiate ment au microscope inve rsé équipé pour la fluorescence avec un filtre 
adapt é pour exci ter le FITC. Le test est considéré comme positif si des cellules fluorescentes sont obser vées. Pour 
que le test soit valable, les témoins positifs doivent donner un résultat positif et les témoins négatifs, un résultat 
négatif . 
II.3.  Examen d'autres tissus 
La technique visée au point II.2.6 peut être appliquée à d'autres tissus de poisson tels que le foie, la rate et le 
cœur , à condition qu'une quantité suffisante de cellules endothéliales, de leucocytes ou de lymph ocytes puisse 
être déposée sur la lame. Si la procédure de marquag e est la même pour tous les tissus, il peut être préfé rable 
pour certains de renoncer à la coloration à l'iodure de propidium et de recour ir à l'éclairage en contraste de 
phase pour identif ier les types de cellules présents sur l'em preinte. 
II.4.  Analyse histo logique 
Des coupes de 5 µm d'épaisseur doivent être réalisées à partir des tissus inclus en paraff ine, puis colorées à 
l'hémato xyline et à l'éosine. 
Les modifi cations histo logiques obser vables chez le saumon de l'Atlantique présentant des signes cliniques de la 
maladie sont variables, mais elles peuvent inclure les éléments suivants: 
a)  nombreux érythrocytes dans le sinus veineux central et dans les capillaires lamellaires des branchies, où ces 
érythrocytes peuvent également former des thrombus; 
b)  pétéc hies multif ocales à conf luentes ou nécrose des hépatocyt es, ou les deux, à une certaine distance des plus 
gros vaisseaux du foie; accumulation multif ocale d'érythrocytes dans des sinusoïdes hépatiques dilat és; 23.9.2015 L 247/53 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     c)  accumulation d'érythrocytes dans les vaisseaux sanguins de la lamina propria intestinale, pouvant aboutir à 
une hémor ragie de celle-ci; 
d)  distension du stroma splénique due à l'accumulation d'érythrocytes ; 
e)  légère hémor ragie inter stitielle diffuse multif ocale à généralisée avec nécrose tubulaire dans les zones 
hémor ragiques, accumulation d'érythrocytes dans les glomér ules rénaux; 
f)  érythrophagocyt ose dans la rate et hémor ragies secondaires dans le foie et les reins. 
II.5.  Analyse immunohist ochimique (IHC) 
Des anticor ps poly clonaux anti-nucléoprotéi nes du VAIS doivent être utilisés sur des coupes de tissus fixés au 
formol et inclus en paraff ine. Les organes à examiner sont le rein médian et le cœur (zone de transition, y 
compris les trois chambres et les valves). Les cas suspects en raison de signes pathologiques doivent être 
conf irmés par un examen IHC positif. Les coupes histologiques doivent être préparées conf ormément aux 
méthodes standard.  
1. Préparation des coupes de tissus 
Les tissus doivent être fixés à l'aide d'une solution neutre de formol à 10 % tamponné e au phosphat e 
pendant au moins un jour , puis déshy dratés dans une série de bains d'éthanol de concentration croissante, 
rincés au xylène et inclus en paraffine, conf ormément aux protocoles standard. Des coupes d'en viron 5 µm 
d'épaisseur (pour IHC sur lames traitées à la poly-L-l ysine) doivent être chauffées à une température compr ise 
entre 56 et 58 °C (60 °C au maximum) pendant 20 minutes, déparaffinées au xylène, réhydratées dans une 
série de bains d'éthanol de concentration décroissant e, et colorées à l'hémato xyline et à l'éosine en vue d'une 
analyse pathomor phologique et immunohistoc himique conf ormément au point 2.  
2. Procédure de coloration pour l'IHC 
Toutes les incubations doivent être réalisées à la température ambiant e sur un agitat eur à bascule, sauf 
disposition contraire prévue dans la présent e décision: 
a)  la récupération des antigènes doit être réalisée en faisant bouillir les coupes dans un tampon au citrate 
0,1 M à pH 6 pendant 2 × 6 minutes , puis en procédant à l'étape de blocage avec 5 % d'extrait sec 
dégraissé de lait et 2 % de sérum de chèvre dans 50 mM de TBS (TBS; 50 mM de Tris/HCl, 150 mM de 
NaCl, pH 7,6) pendant 20 minutes ; 
b)les coupes doivent ensuite être incubées pendant la nuit avec l'anticor ps primaire (anticor ps monospé ­
cifique de lapin anti-nucléoprotéi nes de VAIS) dilué dans du TBS additionné de 1 % d'extrait sec dégraissé 
de lait, puis lavées trois fois dans du TBS conte nant du Tween 20 à 0,1 %; 
c)  pour la détection des anticor ps liés, les coupes doivent être incubées pendant 60 minut es avec des 
anticor ps anti IgG de lapin conjugués à la phosphatase alcaline. Après un dernier rinçage , on ajout e du 
roug e neutre (1 mg ml– 1) et du Naphtol AS-MX phosphat e (0,2 mg ml– 1) avec 1 mM de lévamisole dans 
0,1 M de TBS (pH 8,2) et on laisse développer pendant 20 minut es. Les coupes doivent ensuite être lavées 
à l'eau du robinet avant contre-coloration à l'hémato xyline de Harris puis montage dans un milieu de 
montage aqueux. Des coupes de tissus positifs et négatifs au VAIS doivent être incluses en tant que 
témoins à chaque étape.  
3. Interp rétation des résultats de l'IHC 
Les résultats du test IHC doivent être interprétés comme indiqué aux points a) et b): 
a)  les coupes témoins doivent être considérées comme positives lorsqu'on obser ve une coloration rouge 
clairement visible du cytoplasme et de l'inté rieur du noyau des cellules endothéliales des vaisseaux 
sanguins de l'endocarde. Une coupe d'échantillon d'essai ne doit être considérée comme positive que si 
l'on obser ve cette coloration roug e marquée à l'intérieur du noyau des cellules endothéliales; 
b)  les coupes témoins doivent être considérées comme négatives si elles ne présent ent aucune réaction de 
coloration particulière. 
Étant donné que la localisation intranucléaire est spécifique des nucléoprot éines de l'orthom yxovirus pendant 
une étape de la réplication du virus, mais qu'une coloration cytoplasmique concomitant e prédomine souvent, 
des zones de coloration cytoplasmiques et autres sans localisation intranucléaire doivent être considérées 
comme étant non spécif iques ou non concluant es. 23.9.2015 L 247/54 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Les plus fortes réactions positives de coloration sont général ement obte nues sur les cellules endothéliales 
cardiaques et rénales. Il se peut que la coloration des cellules endothéliales soit faible ou inexistante au niveau 
de lésions hémor ragiques très étendue s, sans doute en raison de la lyse des cellules endothéliales infectées. 
PARTIE 4 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES POUR LA SUR VEILL ANCE ET LA CONFIRMA TION DE 
L'INFECTION À MARTEILIA REFRINGENS 
I.  Méthodes et procédures de diagnos tic détai llées pour le diagnos tic de l'infectio n à Mar teilia refringens 
Lorsque des prélèvements et des examens de laboratoire sont réalisés en vue de l'obt ention ou de la 
conser vation d'un certain statut sanitaire en ce qui concer ne l'infectio n à Mar teilia refringens comme indiqué à 
l'annex e I, partie 4, section I, ou afin de conf irmer la présence de cette maladie réper toriée ou d'écar ter une 
suspicion de cette maladie conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE à l'aide des 
méthodes de diagnostic décr ites à l'annex e I, partie 4, section II, les méthodes et procédures détaillées de 
diagnostic figurant aux points I.1, I.2 et I.3 de la présente partie doivent être appliquées. 
I.1.  Procédure d'échantillonnag e 
Les mollusques bâillants ou qui viennent de mour ir doivent être prélevés en priorité afin d'accroître les chances 
de trouver des animaux infectés. 
Une fois prélevées, les huîtres ou les moules doivent être maintenues à 4 °C ou réfrigéré es sur de la glace 
pendant 24 heures au maximum si les échantillon s compre nnent des mollusques bâillants et pendant 72 heures 
tout au plus dans le cas contraire, dans un sac en plastique muni d'une étiquett e sur laquelle figuren t des 
informations relatives à la nature et à l'origine des huîtres ou des moules. Les mollusques bâillants ou qui 
viennent de mour ir doivent être séparés des autres mollusques. 
Une coupe de tissus incluant les branchi es et du tissu cardiaque, de 3 à 5 mm d'épaisseur , doit être utilisée pour 
le diagnostic histo logique de Mar teilia refringens. Un morceau de la glande digestive doit être utilisé pour certains 
tests , y compr is pour les emp reintes et la réaction en chaîne par polymérase (PCR). 
I.2.  Techn iques microscopiques 
I.2.1.  Cytologie (cytologie sur empreint e) 
Après séchag e des tissus de glande dige stive sur du papier absorbant, plusieurs empr eintes doivent être réalisées 
sur une lame de verre. Les lames doivent être séch ées à l'air, fixées au méthanol ou à l'éthanol absolu et colorées 
à l'aide d'un kit de coloration disponible dans le commerce tel que tel que Diff-Quic k®/Hemacolor® 
conf ormément aux instr uctions du fabricant. Après rinçage à l'eau du robinet et séchag e, les lames doivent être 
mont ées avec une lamelle couvre-objet à l'aide d'une résine synthétique appropr iée. Les lames doivent être 
obser vées dans un premier temps à un grossissement de × 200, puis en immersion dans l'huile, à un grossis ­
sement de × 1 000. 
Un résultat positif consist e en l'obser vation de cellules de taille compris e entre 30 et 40 µm. Leur cytoplasme est 
basophile, tandis que leur noyau est éosinophile. On obser ve des auréoles pâles autour de gros granules 
(réfr inge nts) fortement colorés et, sur les cellules de plus grande taille, une organisation du type emboîteme nt de 
cellules. 
La technique n'est pas spécif ique de l'espèce parasit e. 
I.2.2.  Analyse histo logique 
Des fragments de tissus incluant branchies, glande diges tive, manteau et gonades doivent être fixés pendant au 
moins 24 heures dans du fixateur de Davidson, puis préparés normalement pour un examen histo logique après 
inclusion en paraff ine et coloration, par exemple à l'hémato xyline et à l'éosine. Les obser vations doivent être 
effectuées à un grossissement maximal de × 1 000. 
Un résultat positif consist e en l'obser vation de cellules de taille compris e entre 4 et 40 µm. Les premiers stades 
sont des cellules multinuclées, de forme sphér ique à allongée. Ces cellules proviennent principalement de 
l'épithélium de l'œsophage et de l'esto mac et parfoi s des palpes labiaux. La spor ulation se traduit par la division 
de cellules à l'intérieur des cellules et se déroule dans les tubules et conduits de la glande diges tive. Des granules 
réfringents apparaissent au cours de la spor ulation, mais ne sont pas obser vés dans les premiers stades. Dans les 
dernières phases de l'infectio n, des sporang es libres sont obser vés dans la lumière du tube digestif. Leur 
cytoplas me est basophile, tandis que leur noyau est éosinophile. La couleur des granules peut aller de l'orang e 
foncé au roug e foncé. 
La technique n'est pas spécif ique de l'espèce parasit e. 23.9.2015 L 247/55 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.3.  Techn iques moléculaires 
I.3.1.  Extraction de l'ADN 
L'ADN doit être extrait conf ormément aux procédures standard. 
Il est possible d'utiliser des kits d'extraction de l'ADN disponibles dans le commerce, qui produisent 
généralement de l'ADN de haute qualité utilisable pour les protocoles de PCR, comme indiqué au point I.3.2. 
I.3.2.  Amplif ication en chaîne par la polymér ase (PCR) 
Plusieurs prot ocoles de PCR ont été élaborés et publiés. 
Il y a lieu d'utiliser des amorces PCR ciblant la région de l'espaceur transcr it interne (ITS1), car elles sont 
capables d'amplifier uniquement M. refringens. 
La PCR doit être réalisée dans un volume de 50 µl. Les mélange s pour PCR doivent conteni r du tampon 
[500 mM de KCL, 100 mM de Tris/HCl (pH 9,0 à 25 °C) et 1 % de Triton® X-100], 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM 
de mélang e dNTP , 1 µM d'amorces sens et antisens, 0,02 unité s µl– 1 d'ADN Taq polymérase, et 10 à 100 ng 
d'ADN extrait. Après dénaturation de l'ADN à 94 °C pendant 5 minute s, 30 cycles doivent être effectués, 
comme suit: dénaturation à 94 °C pendant une minute, hybridation à 55 °C pendant une minute, et élongati on 
à 72 °C pendant une minute par kilopaire de bases. Une étape d'élongat ion finale de 10 minutes à 72 °C doit 
être effectuée. Pour la détection de M. refringens, la PCR doit être réalisée avec des amorces qui ciblent la région 
ITS1 (5′-CCG-CA C-A CG- TTC- TTC-A CT-CC-3′ et 5′-CTC-GCG-A GT-TTC-GA C-A GA-CG-3′). 
Les témoins positifs doivent consister en ADN génomique d'un hôte très infecté ou en ADN plasmidique 
incluant la région cible. 
Les témoins négatif s doivent consister en ADN génomique d'hôtes non infect és et en réactifs de PCR exem pts 
d'ADN cible. 
Un résultat positif consiste en un produit d'amplification positif de la taille escomp tée (412 pb), tandis que tous 
les témoins négat ifs sont néga tifs et que tous les témoins positifs sont positifs. 
I.3.3.  Hybr idation in situ 
Plusieurs prot ocoles d'hyb ridation in situ ont été élaborés et publiés. 
Il faut utiliser une sonde ciblant la petite sous-unité du complex e de gènes de l'ARNr car elle a été validée par 
rappor t à l'hist ologie. 
Des fragments de tissus incluant branchi es et glande digestive doivent être fixés pendant au moins 24 heures 
dans du fixateur de Davidson, puis préparés normalement pour un examen histo logique après inclusion en 
paraff ine. Des coupes de 5 µm d'épaisseur doivent être réalisées et placées sur des lames recouver tes d'aminoal ­
kylsilane, puis incubées pendant une nuit dans une étuve à 40 °C. Les coupes doivent être déparaffi nées par 
immersion dans du xylène pendant 10 minutes . Cette étape doit être répétée une fois, puis le solvant doit être 
éliminé par immersion dans deux bains successifs d'éthanol absolu de 10 minute s chacun. Les coupes doivent 
ensuite être déshydrat ées par immersion dans une série de bains d'éthanol de concentration croissant e. Elles 
doivent ensuit e être traitées à la protéinase K (100 µg ml– 1) dans un tampon TE [Tris (50 mM), EDT A (10 mM)], 
à une température de 37 °C pendant 30 minute s. Les lames doivent être déshy dratées par immersion dans une 
série de bains d'éthanol de concentration croissant e puis séchées à l'air. Les coupes doivent être incubées avec 
100 µl de tampon d'hybr idation [4 × SSC (solution saline de citrate), formamide à 50 %, 1 × solution de 
Denhardt, 250 µg ml– 1 d'ARNt de levure, sulfat e de dextrane à 10 %] cont enant 10 ng (1 µl des réactifs de la 
PCR préparés comme décr it au point I.3.2 à l'aide des amorces CCG-GTG-CCA-GGT -ATA-TCT -CG et TTC-GGG- 
TGG- TCT -TGA-AA G-GC) de la sonde marquée à la digo xigénine. Les coupes doivent être recouver tes de lamelles 
couvre-objet en plastique pour hybridation in situ et placées sur un bloc chauff ant à 95 °C pendant 5 minutes . 
Les lames doivent ensuite être refroidies sur de la glace pendant une minute avant l'hybridation à une 
température de 42 °C pendant une nuit dans une étuve humide. Les coupes doivent être lavées deux fois 
pendant cinq minut es dans 2 × SSC à température ambiant e, et une fois pendant 10 minutes dans 0,4 × SSC à 
42 °C. Les étapes de détection doivent être réalisées selon les instr uctions du fabr icant. Les lames doivent ensuit e 
être rincées dans de l'eau distillée stéri le (dH2O). Les coupes doivent être contre-colorées au brun Bismarck Y et 
rincées dans dH2O avant l'application de lamelles couvre-objet à l'aide d'un milieu de montag e aqueux. 
Des coupes provenant d'hôtes infectés et non infectés connus servent respectivement de témoins positifs et 
négatif s. 23.9.2015 L 247/56 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Un résultat positif doit être établi par la coloration violet-noire des cellules de M. refrin gens dans les tissus des 
organes cibles connus, tandis que tous les témoins négatif s sont négatifs et tous les témoins positifs sont 
positifs. 
I.3.4.  Séquençage 
Le séquençage est une des dernières étapes requises pour confir mer le diagnostic. Les régions ciblées sont la 
petite sous-unité de l'ARNr et ITS1. 
II.  Méthodes et procédures de diagnos tic détai llées pour la surveillance et la conf irmation de l'infection à Mar teilia 
refringens 
Aux fins des programmes de surveillance et afin de conf irmer la présence d'une infection à Mar teilia refrin gens 
ou d'écar ter une suspicion de cette maladie réper torié e, conf ormément aux exige nces fixées à l'annex e I, 
partie 4, section II, les méthodes de diagnostic et les procédures correspondantes à utiliser doivent être 
conf ormes aux lignes directr ices fournies dans le tableau 4.1 ci-dessous: 
Tableau 4.1 
Lignes directr ices concer nant les méthodes de diagnost ic à appliquer aux fins des prog rammes de 
surveillance et pour conf irmer une infection à Mar teilia refringens ou écar ter une suspicion de cette 
maladie 
Méthode Surveillance ciblée Diagnostic de 
présomp tion Diagnostic confir matif 
Empre intes de glande digestive X X X, ou 
Histopath ologie X  X, ou 
Hybr idation in situ   X, et 
PCR X X X, et 
Séquençage   X  
PARTIE 5 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES POUR LA SUR VEILL ANCE ET LA CONFIRMA TION DE 
L'INFECTION À BONAMIA OSTREAE 
I.  Procédures pour le diagnostic de l'inf ection à Bonamia ostr eae 
Lorsque des prélèvements et des examens de laboratoire sont réalisés en vue de l'obt ention ou de la 
conser vation d'un certain statut sanitaire en ce qui concer ne les infections à Bonamia ostreae comme indiqué à 
l'annex e I, partie 5, section I, ou afin de conf irmer la présence de cette maladie réper toriée ou d'écar ter une 
suspicion de cette maladie conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, à l'aide des 
méthodes de diagnostic énoncées à l'annexe I, partie 5, section II, les méthodes et procédures détaillées figur ant 
aux points I.1, I.2 et I.3 ci-après doivent être appliquées. 
I.1.  Procédure d'échantillonnag e 
Les mollusques bâillants ou qui viennent de mour ir doivent être prélevés en priorité afin d'accroître les chances 
de trouver des animaux infectés. 
Une fois prélevées, les huîtres doivent être maintenues à 4 °C ou réfrigérées sur de la glace pendant 24 heures 
au maximum si les échantillons compre nnent des mollusques bâillants et pendant 72 heures dans le cas 
contraire, dans un sac en plastique muni d'une étiquette sur laquelle figurent des informations relatives à la 
nature et à l'origine des huîtres. Les mollusques bâillants ou qui viennent de mour ir doivent être séparés des 
autres mollusques. 
Une coupe de tissus incluant les branchi es et du tissu cardiaque, de 3 à 5 mm d'épaisseur , doit être utilisée pour 
le diagnostic histo logique de Bonamia ostreae. Un morceau de la glande digestive doit être utilisé pour certains 
tests , y compr is pour les emp reintes et la réaction en chaîne par polymérase (PCR). 23.9.2015 L 247/57 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     I.2.  Techn iques microscopiques 
I.2.1.  Cytologie (cytologie sur empreint e) 
Après sécha ge des tissus branchi aux ou cardiaques sur du papier absorbant, plusieurs empr eintes doivent être 
réalisées sur une lame de verre. Les lames doivent être séch ées à l'air, fixées au méthanol ou à l'éthanol absolu et 
colorées à l'aide d'un kit de coloration disponible dans le commerce (tel que Diff-Quic k®/Hemacolor®) 
conf ormément aux instr uctions du fabricant. Après rinçage à l'eau du robinet et séchag e, les lames doivent être 
mont ées avec une lamelle couvre-objet à l'aide d'une résine synthétique appropr iée. Les lames doivent être 
obser vées dans un premier temps à un grossissement de × 200, puis en immersion dans l'huile, à un grossis ­
sement de × 1 000. 
Un résultat positif doit être constat é en présence de petits organismes sphér iques ou ovoïdes (2 à 5 µm de large) 
à l'intérieur des hémocytes . Toutef ois, le parasite peut également être présent à l'extér ieur des cellules. Ces 
organismes ont un cytoplasme basophile et un noyau éosinophile (les couleurs peuvent varier en fonction du 
colorant utilisé) et, comme ils s'étalent sur la lame, ils peuvent paraître plus grands sur les empreintes qu'à 
l'examen histo logique. Des cellules multinuclées peuvent être obser vées. La technique n'est pas spécifi que de 
l'espèce parasit e. 
I.2.2.  Analyse histo logique 
Des fragments de tissus incluant les branchi es et la glande digestive doivent être fixés pendant au moins 
24 heures dans du fixateur de Davidson, puis préparés normalement pour un examen histo logique après 
inclusion en paraff ine et coloration, par exemple à l'hémato xyline et à l'éosine. Les obser vations doivent être 
effectuées à des grossissements croissants, jusqu'à × 1 000. 
Un résultat positif doit être établi en présence de parasit es sous la forme de très petites cellules de 2 à 5 µm de 
large à l'intérieur des hémocyte s ou libres dans le tissu conjonctif ou les sinus de l'épithélium des branchi es, du 
tube dige stif et du manteau, souvent associés à une réaction inflammatoire intense. Pour dissiper tout doute, le 
parasite doit être obser vé à l'inté rieur de l'hémocyte afin de mettre en évidence un diagnostic positif. La 
technique n'est pas spécifi que de l'espèce parasit e. 
I.3.  Techn iques moléculaires 
I.3.1.  Extraction de l'ADN 
L'ADN doit être extrait conf ormément aux procédures standard. 
Il est possible d'utiliser des kits d'extraction de l'ADN disponibles dans le commerce, qui produisent 
généralement de l'ADN de haute qualité utilisable pour les protocoles de PCR, comme indiqué ci-après. 
I.3.2.  Amplification en chaîne par polymérase (PCR) 
Plusieurs prot ocoles de PCR ont été élaborés et publiés. 
Deux protocoles de PCR ciblant la petite sous-unité de l'ADNr peuvent être utilisés: 
a)  le premier est un protocole de PCR classique permettant d'amplifier plusieurs membres du phylum des 
Haplospor idia, dont Bonamia spp. Les amorces, dénommées Bo et Boas, sont respectivement 5′-CA T-TTA- 
ATT-GGT -CGG-GCC-GC-3′ et 5′-CTG-A TC-GTC- TTC-GA T-CCC-CC-3′, et elles amplifient un produit de 
300 pb. Les mélange s pour PCR contiennent du tampon [500 mM de KCL, 100 mM de Tris/HCl (pH 9,0 à 
25 °C) et 1 % de Triton® X-100], 2,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de mélange dNTP , 1 µM d'amorces sens et 
antisens, 0,02 unité s µl– 1 d'ADN Taq polymérase, et 0,2 ng µl– 1 de la matr ice d'ADN dans un volume total 
de 50 µl. Les échanti llons doivent être dénaturés dans un ther mocy cleur pendant cinq minutes à 94 °C avant 
d'être soumis à 30 cycles (94 °C pendant une minute, 55 °C pendant une minute, 72 °C pendant une 
minute), suivis d'une étape finale d'élongat ion à 72 °C pendant 10 minutes . 
Les témoins positifs doivent consister en ADN génomique d'un hôte très infecté ou en ADN plasmidique 
incluant la région cible. 
Les témoins négatif s doivent consister en ADN génomique d'hôtes non infectés et en réactifs de PCR exem pts 
d'ADN cible. 
Un résultat positif consiste en un produit d'ampli fication positif de la taille escomp tée (c.-à-d. 300 pb), tandis 
que tous les témoins négatifs sont négatifs et que tous les témoins positifs sont positifs; 23.9.2015 L 247/58 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     b)  le second protocole de PCR est une PCR en temps réel au SYBR®Green. Elle permet la détec tion spécifi que 
de B. ostreae (décr ite ci-après) et peut être couplée à une PCR en temps réel au SYBR®Green permettant la 
détection spécifi que de B. exitiosa (Ram ilo et al., 2013). 
Les amorces BOSTRE-F (5′-TTACGTCCCTGCCCTTTGT A-3′) et BOSTRE-R (5′-TCGCGGTTGAA TTTT ATCGT - 
3′) amp lifient un produit de 208 pb. Les mélange s pour PCR contiennent un mélange SYBR® Green Maste r 
Mix (1X), 0,3 µM d'amorces sens et antisens et 200 ng d'ADN extrait. Les échantillon s doivent être dénaturés 
dans un système de détection en temps réel pendant 10 minutes à 95 °C avant d'être soumis à 35 cycles 
(95 °C pendant 30 secondes, 55 °C pendant 45 secondes et 72 °C pendant une minute). L'analyse de la 
courbe de fusion est réalisée en augmentant la température de 55 à 95 °C par paliers de 0,5 °C/s et en 
mesurant l'inte nsité de fluorescence à chaque change ment de température. 
Les témoins positifs doivent consister en ADN génomique d'un hôte très infecté ou en ADN plasmidique 
incluant la région cible. 
Les témoins négatif s doivent consister en ADN génomique d'hôtes non infectés et en réactifs de PCR exem pts 
d'ADN cible. 
Un résultat positif consiste en un produit d'amplification positif avec un seul pic de température de fusion 
(78,25 ± 0,25 °C dans les conditions publiées par Ramilo et al. en 2013), tandis que tous les témoins 
négatif s sont négat ifs et que tous les témoins positifs sont positifs. 
I.3.3.  Hybr idation in situ 
Plusieurs prot ocoles d'hyb ridation in situ ont été élaborés et publiés. 
Une sonde ciblant la petite sous-unité du compl exe de gènes de l'ADNr doit être utilisée, même s'il a été 
démontré qu'elle pouvait interagir avec certains autres membres du phylum des Haplospor idia. 
Des fragments de tissus incluant branchi es et glande digestive doivent être fixés pendant au moins 24 heures 
dans du fixateur de Davidson, puis préparés normalement pour un examen histo logique après inclusion en 
paraff ine. Des coupes de 5 µm d'épaisseur doivent être réalisées et placées sur des lames recouver tes d'aminoal ­
kylsilane, puis incubées pendant une nuit dans une étuve à 40 °C. Les coupes doivent être déparaffi nées par 
immersion dans du xylène pendant 10 minutes . Cette étape doit être répétée une fois, puis le solvant doit être 
éliminé par immersion dans deux bains successifs d'éthanol absolu de 10 minute s chacun. Les coupes doivent 
ensuite être déshydrat ées par immersion dans une série de bains d'éthanol de concentration croissant e. Elles 
doivent ensuit e être traitées à la protéinase K (100 µg ml– 1) dans un tampon TE [Tris (50 mM), EDT A (10 mM)], 
à une température de 37 °C pendant 30 minute s. Les lames doivent être déshy dratées par immersion dans une 
série de bains d'éthanol de concentration croissant e puis séchées à l'air. Les coupes doivent être incubées avec 
100 µl de tampon d'hybr idation [4 × SSC (solution saline de citrate ), 50 % de formamide, 1 × solution de 
Denhardt, 250 µg ml– 1 d'ARNt de levure, 10 % de sulfate de dextrane] cont enant 20 ng (2 µl de la réaction de 
PCR préparés comme décr it au point I.3.2 à l'aide des amorces Bo et Boas) de la sonde marquée à la 
digo xigénine. Les coupes doivent être recouver tes de lamelles couvre-objet en plastique pour hybr idation in situ 
et placées sur un bloc chauffant à 95 °C pendant 5 minutes. Les lames doivent ensuit e être refroidies sur de la 
glace pendant une minute avant l'hybridation à une température de 42 °C pendant une nuit dans une étuve 
humide. Les coupes doivent être lavées deux fois pendant cinq minute s dans 2 × SSC à température ambiant e, et 
une fois pendant 10 minutes dans 0,4 × SSC à 42 °C. Les étapes de détection doivent être réalisées selon les 
instr uctions du fabricant. Les lames doivent ensuite être rincées dans de l'eau distillée stérile (dH2O). Les coupes 
doivent être contre-colorées au brun Bismarck Y et rincées dans dH2O avant l'application de lamelles couvre- 
objet à l'aide d'un milieu de montage aqueux. 
Des coupes provenant d'hôtes infectés et non infectés connus servent respectivement de témoins positifs et 
négatif s. 
Un résultat positif consiste en parasit es marqués à l'intér ieur des hémocyte s, tandis que tous les témoins néga tifs 
sont négatif s et que tous les témoins positifs sont positifs. 
I.3.4.  Séquençage 
Le séquençage est une des dernières étapes requises pour confir mer le diagnostic. Les régions ciblées sont la 
petite sous-unité de l'ARNr et ITS1. 23.9.2015 L 247/59 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     II.  Procédures de surveillance et de conf irmation de l'infection à Bonamia ostr eae 
Aux fins de la surveillance des infections à Bonamia ostreae et pour conf irmer la présence d'une telle infection ou 
écar ter une suspicion de cette maladie conf ormément aux exigenc es fixées à l'annex e I, partie 5, section II, les 
méthodes de diagnostic et les procédures correspondantes à utiliser doivent être conf ormes aux lignes directr ices 
fournies dans le tableau 5.1 ci-dessous: 
Tableau 5.1 
Lignes directr ices concer nant les méthodes de diagnost ic à appliquer aux fins des prog rammes de 
surveillance et pour conf irmer une infection à Bonamia ostr eae ou écar ter une suspicion de cette 
maladie 
Méthode Surveillance ciblée Diagnostic de 
présomp tion Diagnostic confir matif 
Empre intes de cœur ou de branchi es X X X, ou 
Histopath ologie X  X, ou 
Hybr idation in situ   X, et 
PCR X X X, et 
Séquençage   X  
PARTIE 6 
MÉTHODES ET PROCÉDURES DE DIA GNOSTIC DÉT AILLÉES POUR LA SUR VEILL ANCE ET LA CONFIRMA TION DE LA 
MAL ADIE DES POINTS BLANCS (MPB) 
1.  Procédures de diagnos tic pour la détection du virus du syndrome des points blancs (VSPB) 
Lorsque des prélèvements et des examens de laboratoire sont réalisés aux fins des programmes de surveillance et 
d'éradication décr its à l'annex e I, partie 6, section I, et pour conf irmer la présence du VSP B ou écar ter une 
suspicion d'inf ection par ce virus conf ormément à l'article 57, point b), de la directive 2006/88/CE, à l'aide des 
méthodes de diagnostic énoncées à l'annexe I, partie 6, section II, les méthodes et procédures détaillées figur ant 
aux points 2 à 7 de la présent e partie doivent être appliquées. 
Les méthodes et procédures décr ites dans la présent e partie de l'annexe II ont été adap tées d'après l'essai 
préconisé par les laborat oires accrédité s selon la norme ISO 17025 réalisé au laboratoire de référence de l'Union 
européenne pour les maladies des crustacés. Il est possible de recour ir à d'autres méthodes utilisant des 
conditions équivalent es ou des kits produits par d'autres fabricants, mais dont la sensibilit é et la spécific ité sont 
équivalent es à celles décr ites dans la présent e partie. Dans tous les cas, le produit ampli fié par PCR doit être 
séquencé pour conf irmer qu'il s'agit bien du virus du syndrome des points blancs (VSPB). 
2.  Procédure d'échantillonnage 
Les tissus (pléopodes et branch ies) de crustacés abritant le VSPB doivent être stoc kés dans de l'éthanol ou dans 
un réactif de stabilisation de l'ARN (RNAlater), ou surgelés à – 80 °C. Les étapes nécessaires à l'identifi cation du 
VSP B à partir d'échantillons de tissus sont les suivantes: homogénéisation des tissus, extraction de l'ADN, 
amplification spécifi que de l'ADN du VSPB par PCR, visualisation du produit ampli fié sur un gel, purification de 
l'ADN et séquençage pour confir mer l'identit é de l'agen t pathogène. 
3.  Homogénéisation des tissus 
Le broyage des tissus et la préparation d'un homogénat dans un tampon appropr ié doivent être réalisés à l'aide 
du broyeur Fast Prep et de tubes Lysing matr ix A (MP Biomedicals). Les tissus doivent être pesés, placés dans des 
tubes Lysing Matr ix A, dilués au 1:10 m/v ou selon les instr uctions du fabricant dans un tampon appropr ié [G2 
et 10 µl de prot éinase K à utiliser avec le kit d'extraction de l'ADN de tissus DNA Tissue kit (Qiag en)] et 
homog énéisés à l'aide de l'homogé néisateur Fast Prep24 pendant deux minutes. Les échantillons homog énéisés 
doivent être incubés à 56 °C pendant au minimum quatre heures ou pendant une nuit. Les échanti llons doivent 
ensuite être passés au vortex, centr ifugés à 9 000 tr/min pendant deux minut es, puis 50 µl de surnageant ou un 
volume équivalant à 5 mg de tissus (poids de tissu optimal pour le kit d'extraction) doivent être ajout és dans un 
tube échantillon pour extraction d'ADN et le volume doit être compl été à 200 µl à l'aide de tam pon G2. 23.9.2015 L 247/60 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     4.  Extraction de l'ADN 
L'ADN tota l doit être extrait à l'aide d'un kit d'extraction de l'ADN de tissus et du Biorobot EZ1 Advanced XL 
(Qiag en) suivant les instr uctions des fabricants. Un témoin d'extraction (ADN de thymus de veau) et un témoin 
négatif (tampon G2) doivent accompag ner chaque lot d'échantillons. L'ADN doit être élué dans un volume de 
50 µl. Pour s'assurer que l'extraction a réussi, la concentration d'ADN de tous les échantillons et de tous les 
témoins doit être déterminée à l'aide d'un NanoDrop. L'ADN extrait doit être cong elé à – 20 °C s'il ne doit pas 
être utilisé immédiatement. 
5.  Amplif ication du VSPB par réaction en chaîne par polymérase (PCR) 
La méthode à utiliser pour la détection du VSPB est le protocole de détection du VSPB par PCR niché e décr it 
dans les paragraphes ci-après, qui permet d'obtenir respectivement lors de la première et de la deuxième phase 
de PCR un ampli con de 1 447 pb et un amplicon de 848 pb du gène codant pour l'ARNr 18S. 
La réaction de la première phase de PCR est mise en œuvre dans un volume de 50 µl contenant, en concen ­
tration finale, 1 × GoTaq Buffer (Promega), 5 mM de MgCl2, 1 pmol/µl d'amorce VSPB 146 F1, 1 pmol/µl 
d'amorce VSPB 146 R1 (tableau 1), 0,25 mM de dNTP , 1,25 U de Taq polymérase et 2,5 µl d'ADN. Chaque 
échantillon est dupliqué et associé à un témoin d'extraction négat if, un témoin PCR négat if (ajout de 2,5 µl de 
H2O au lieu d'ADN) et un témoin positif. Le témoin positif doit être constitué de plasmide de VSPB dilué 
préparé et validé pour une utilisation en intern e (disponible auprès du laborat oire de référence de l'Union 
européenne). 
La réaction de la 2e phase de PCR doit être mise en œuvre comme la première, mais en utilisant le jeu 
d'amorces VSPB 146 F2/R2 et un deuxième témoin positif pour vérifier que cette étape de la PCR a réussi. 
Amorce Séquence 
WSSV 146 F1 ACTACTAACTTCA GCCT ATCT AG 
WSSV 146 R1 TAATGCGGGTGT AATGTTCTT ACGA 
WSSV 146 F2 GTAACTGCCCCTTCC ATCTCC A 
WSSV 146 R2 TACGGC AGCTGCTGCA CCTTGT  
La première comme la seconde phase de la PCR sont mises en œuvre en appliquant la succession de cycles ci- 
après à l'aide d'un ther mocy cleur DNA Engine Tetrad 2 Peltier (ou équivalent): une étape initiale de dénaturation 
à 94 °C pendant 2 minutes, suivie d'une étape à 94 °C pendant 30 secondes, puis 62 °C pendant 30 secondes et 
72 °C pendant 30 secondes, répétée pendant 30 cycles, une étape d'élongati on à 72 °C pendant deux minutes et 
maintien à 4 °C. 
6.  Électrophorèse sur gel 
Les produits amp lifiés résultant de la première comme de la deuxième phase de la PCR doivent être visualisés 
sur des gels d'agaro se à 2 % préparés à l'aide de tampon TAE. 15 µl de chaque échantillon doivent être soumis à 
une tension de 120 volts pendant environ 20 minutes, puis examinés en lumière ultra violette. Les échantillons 
positifs produiront une bande de 1 447 pb lors de la première phase de PCR et de 848 pb lors de la seconde. 
Les échanti llons de cette taille doivent être découpés et placés dans un microtube de centr ifugation de 1,5 ml. 
L'ADN contenu dans les tranches de gel doit être purifié à l'aide du kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up 
System de Promega conf ormément aux instr uctions du fabricant. La concentration de l'ADN doit être estimée à 
l'aide d'un NanoDrop. L'ADN purifié doit être congelé à – 20 °C s'il n'est pas utilisé immédiat ement. 
7.  Séquençage des produits de PCR 
L'ADN doit être séquencé à l'aide du kit Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosyst ems). Le volume total de 
chaque réaction est de 20 µl, les concentrations finales étant 1 × Big Dye Terminator , 1 × tam pon de 
séquençage, 10 pmol/µl d'amorce sens ou antisens et 10 µl d'ADN purifié (dilué à envi ron 10 ng/µl), et la 
succession de cycles suivante est appliquée à l'aide d'un ther mocy cleur DNA Engine Tetrad 2 Peltier (ou 
équivalent): 94 °C pendant 30 secondes, suivi de 96 °C pendant 10 secondes, 50 °C pendant 10 secondes et à 
60 °C pendant quatre minutes, les trois dernières étapes étant reproduites 30 fois. 23.9.2015 L 247/61 Jour nal officiel de l'Union européenne FR     Les produits de PCR doivent être précipités par une méthode à base d'acétate de sodium, dans le cadre de 
laquelle on ajout e 20 µl d'ADN à 10 µl de NaA c, 70 µl de H2O et 250 µl d'éthanol; le tout est passé au vortex et 
centr ifugé à 13 000 tr/min pendant 20 minutes, puis le surnagea nt est éliminé et le culot est lavé avec 200 µl 
d'éthanol absolu et centr ifugé à 13 000 tr/min pendant cinq minutes. Le culot doit être séché à 37 °C pendant 
cinq minut es. 25 µl de Hi-Di formamide doivent être ajout és aux culots que l'on chauffe ensuite à 95 °C 
pendant deux minutes avant de mélang er avec soin au vortex. Les échanti llons doivent être séquencés à l'aide de 
l'analyseur ABI 3130xl Avant Genetic conf ormément aux instr uctions du fabricant. Les résultats du séquençage 
doivent être analysés à l'aide du logiciel Sequenc her et les séquences rapproc hées de celles qui se trouvent dans 
la base de données du NCBI, à l'aide de la fonction BLAST .  23.9.2015 L 247/62 Jour nal officiel de l'Union européenne FR