[별표25]<신설2014.12.8><개정2015.7.1.>
사료표준분석방법 (제13조관련)
사료표준 분석방법
2015. 6.< 여 백 >목차
i목 차
제1장 일반성분제1장 일반성분
1. 수분(Moisture) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 1
2. 조단백질(Crude protein)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 5
3. 조섬유(Crude fiber)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 8
4. 조지방(Crude fat, ether extract)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 11
5. 조회분(Crude ash)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 13
6. 가용무질소물 (Nitrogen free extract)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 13
제2장 세포막구성물질 (Cell wall constituents) 제2장 세포막구성물질 (Cell wall constituents)
1. NDF(Neutral detergent fiber)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 14
2. ADF(Acid detergent fiber)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 15
제3장 아미노산 (Amino acid) 제3장 아미노산 (Amino acid)
1. 역상크로마토그래피법 (PITC 유도체화법 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 16
2. 이온교환크로마토그래피법 (Ninhydrin 법)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 17
3. MHA(Methionine Hydroxy Analogue) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 21
제4장 무기물(Minerals) 제4장 무기물(Minerals)
1. 칼슘(Ca)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 23
2. 인(P)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 25
3. 유황(S)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 26
4. 마그네슘(Mg)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 27
5. 칼륨(K)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 28
6. 철(Fe)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 29ii7. 나트륨(Na)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 30
8. 염분(NaCl)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 30
9. 염소(Cl)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 33
10. 망간(Mn)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 33
11. 아연(Zn)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 34
12. 구리(Cu)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 36
13. 코발트(Co)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 37
14. 몰리브덴(Mo)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 38
15. 요오드(I)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 40
16. 산화알루미늄 (Al2O3)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 40
17. 셀레늄(Se)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 43
18. 규산(이산화규소 -SiO2), 규소· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 44
19. ICP 발광분광분석법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 47
제5장 유해 중금속 제5장 유해 중금속
1. 크롬(Cr)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 50
2. 불소(F)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 51
3. 비소(As)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 54
4. 납(Pb)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 56
5. 수은(Hg)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 59
6. 카드뮴(Cd)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 60
7. 주석(Sn)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 61
제6장 비타민제6장 비타민
1. 비타민 A· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 64
2. 프로비타민 A(캐로틴)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 67
3. 비타민 B1· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 68
4. 비타민 B2· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 70
5. 비타민 B6· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 71
6. 비타민 B12· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 73
7. 비타민 C· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 74
8. 비타민 D· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 75목차
iii9. 비타민 E· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 78
10. 비타민 K· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 80
11. 판토텐산 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 83
12. 이노시톨 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 84
13. 염화콜린 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 84
14. 나이아신 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 85
15. 비오틴· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 87
16. 엽 산· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 89
17. L-카르니틴 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 91
18. 주석산수소콜린 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 91
제7장 곰팡이독소제7장 곰팡이독소
1. 아플라톡신 (Aflatoxin B1, B2, G1, G2)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 92
2. 제랄레놀과 제랄레논(Zearalenol, Zearalenone) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 95
3. 오크라톡신 A(Ochratoxin A)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 96
4. 푸사리움 곰팡이독소 (Fusarium Mycotoxins) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 99
5. 푸모니신(Fumonisin B1, B2)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 101
제8장 유해미생물제8장 유해미생물
1. 살모넬라(Salmonella) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 104
제9장 잔류농약제9장 잔류농약
1. 유기인계 및 유기염소계 다성분 분석· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 106
2. 유기인계(Organophosphorus) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 109
3. 유기염소계 (Organochlorine) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 126
4. 카바메이트계 (Carbamate) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 137
5. 유기인계, 유기염소계 및 카바메이트계 다성분 분석법· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 139
6. 다종농약 다성분 분석법(Multi class pesticide multiresidue methods) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 142
7. 기 타· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 148iv
제10장 동물용의약품제10장 동물용의약품
1. 정성분석 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 158
2. 정량분석 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 160
3. 미생물평판법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 187
4. 펜벤다졸(Fenbendazole) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 205
5. 디클라주릴 (Diclazuril) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 207
6. 말라카이트 그린(Malachite Green)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 208
7. 마두라마이신 (Maduramycin) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 211
제11장 생균제(Probiotics) 제11장 생균제(Probiotics)
1. 생균제· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 214
제12장 효소제제12장 효소제
1. α-아밀라아제 (전분호정화력 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 217
2. 말토게닉아밀라아제 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 218
3. β-아밀라아제 (전분당화력시험법 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 220
4. 셀룰라아제 (섬유당화력 시험법)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 220
5. β-글루카나아제 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 223
6. 글루코아밀라아제 (아밀로글루코시다아제 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 225
7. 헤미셀룰라아제 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 229
8. 펙티나아제 (pectinase) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 232
9. 락타아제[펩틴당화력 (lactase) 시험법]· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 233
10. 키시라나제 (키시란당화력 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 234
11. 키토사나아제 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 235
12. 리파아제(지방소화력 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 236
13. 피타아제(피틴산분해력 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 237
14. 산성프로테아제 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 238
15. 중성프로테아제 [단백질소화력 (protease) 시험법]· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 240
16. 식물성프로테아제 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 241
17. 브로멜라인 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 243목차
v
제13장 향미제제13장 향미제
1. 사카린나트륨 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 244
2. 사카린나트륨 및 아스파탐 동시분석법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 246
3. 소르비톨, 자일리톨 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 249
4. 멘 톨· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 250
5. 설탕, 포도당, 맥아당· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 250
6. 네오헤스페리딘디하이드로칼콘 (neohesperidin-dihydrochalcone) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 253
7. 감초추출물 (글리시리진산 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 253
8. 과당· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 254
9. L-글루타민산나트륨 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 256
제14장 보존제제14장 보존제
1. 유기산 정량(액체크로마토그래피법 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 258
2. 소르빈산, 안식향산과 그 염류 정량· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 259
3. 프로피온산 및 그 염류의 정량· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 263
4. 에톡시킨(Ethoxyquin) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 266
5. 부틸히드록시아니졸 (BHA), 디부틸히드록시톨루엔 (BHT) 및 몰식자산프로필 (PG)· · · · · · · · · ·268
6. 케르세틴 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 270
7. 레스베라트롤 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 271
제15장 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법 제15장 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
1. 현미경 검사법· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 272
2. ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) : 효소면역측정검사법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 275
3. PCR(Polymerase Chain Reaction) : 중합효소연쇄반응검사법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 276
4. Multiplex PCR,  Multiplex real-time PCR : 다중중합효소연쇄반응검사법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 282
제16장 올리고당제16장 올리고당
1. 갈락토올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 292
2. 프락토올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 294vi3. 이소말토올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 296
4. 키토올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 301
5. 말토올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 302
6. 자일로올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 304
7. 겐티오올리고당 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 305
제17장 유화제제17장 유화제
1. 프로피렌글리콜 (Propylene glycol)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 308
제18장 완충제제18장 완충제
1. 탄산나트륨 (소다회)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 309
2. 탄산수소나트륨 (중조)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 309
3. 산화마그네슘 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 309
제19장 착색제제19장 착색제
1. 천연착색제 (카로틴, 크산토필 및 카로티노이드 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 310
2. 아스탄키산틴 (Astaxanthin) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 312
3. 칸타산틴(Canthaxanthin) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 313
4. 아포카로텐산 에스테르(Apocarotenoic Ester)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 313
제20장 추출제제20장 추출제
1. 키토산(총글루코사민으로서 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 315
2. 세포벽추출물 (글루칸 혹은 베타글루칸 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 316
3. 포도종자추출물 (프로안토시아닌 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 317
4. 천연비테인 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 318
제21장 기타성분제21장 기타성분
1. 염기성치환용량 (Cation Exchange Capacity) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 320
2. 요소· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 321
3. 휘발성 염기태질소 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 323목차
vii4. 염산불용물질 (토사)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 323
5. 유사단미사료 혼입여부 판정방법 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 324
6. 펩신(Pepsin)소화율· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 324
7. 전 분· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 325
8. 열량(Cal)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 329
9. 협잡물(이물질시험법 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 329
10. 산 가· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 330
11. 우레아제 역가(Urease Activity)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 331
12. HCN(청산)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 332
13. 유리고시폴 (Free Gossypol) · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 333
14. 멜라민· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 336
15. 요오드가 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 343
16. 팽윤도(Swelling volume)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 345
17. 브릭스(Brix)· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 345
18. 비테인염산염 (베타인염산염 )· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 346
19. 불용성불순물 · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 3471장. 일반성분
11장. 일반성분
1. 수분(Moisture)
가. 가열 감량법
1) 기구 
건조기(drying oven),  데시케이터 (desiccator), 알루미늄 칭량병(crucible), 저울 (balance)
2) 가루상태의 시료
미리 건조하여 항량을 구한 알미늄제 칭량병에 시료 2～5g을 정확히 칭량하여 항온건조
기로 135±2 ℃로 정확히 2시간 또는 105～110℃에서 항량이 될 때까지 건조시켜 데시케
이터내에서 30분간 방냉한 다음 무게를 달아 감량을 수분함량으로 한다. 단, 요소제는 
75℃에서 4시간 건조한다. (어즙 흡착사료, 당 흡착사료, 글루텐피드는 105±2 ℃에서 3시
간 건조)
    수분(%)=건조전 중량(칭량병+시료) - 건조후 중량(칭량병+시료)
× 100
시료중량
3) 수분이 높은 시료
미리 항량으로 한 대형 칭량병에 일정량의 시료를 달아 60～80℃의 건조기내에서 48시
간 예비 건조한 다음 실험실내 상온에서 24시간 방치하여 원물(풍건물)의 수분함량을 구
한 후 분쇄하여 다시 이 분쇄된 시료를 (1)항 가루상태의 시료와 동일한 방법으로 수분
을 정량한 후 다음방식에 따라 수분함량을 구한다.
W =  W1 ＋ (100 ― W1) × W2
100
W  : 원물의 수분함량(%)
W1 : 예비건조시의 감량(%)
W2 : 풍건물 공시품의 수분함량(%)
 
칭량
병135±2 ℃에서 2시간 
건조정량
(칭량병
＋시료)135±2 ℃에서 2시간 
건조칭량 →계산
30분간 방냉 30분간 방냉2나. 증류법(톨루엔 증류법)
휘발성 성분이나 지질이 많고 수분이 많아서 건조하면 피막이 생기는 시료에 대한 수분 
정량법이다 .
1) 기구 및 시약
증류식 수분측정장치 , 톨루엔, 해사(건조된 것)
2) 시약조제
톨루엔 또는 톨루엔과 자일렌 혼합액(2:1) 일반품도 사용가능 하나 물을 함유하지 않아
야 하며 미리 무수황산나트륨 소량과 혼합, 진탕하여 탈수시켜 놓는다.
3) 장치 
증류식 수분 정량장치(A.O.A.C.형)
4) 방법
일정량의 시료(수분량이 3～4㎖정도 되게 시료를 취함)를 정확하게 달아 증류식 수분 정
량장치의 증류 플라스크(세척하여 건조시킨 증류 flask)에 넣고(점성시료일 경우는 유산
지나 알미늄박에 싸서 넣어도 좋음), 톨루엔을 시료가 잠길 만큼 부어주고(이때 튀는 것
을 막기 위해 해사를 넣어줌), 환류냉각관과 수분측정관을 연결한다. 냉각관 상부로부터 
톨루엔을 주입하여 수분측정관을 완전히 채운 다음 냉각수를 흐르게 하고 가열을 시작
한다.  
처음에는 1초당 2방울씩 떨어지게 하다가 4방울 정도 떨어지게 가열온도를 조절한다. 냉
각된 유출액은 두 종류의 액으로 분리되며 하층의 물은 눈금관에 모이고 상층의 톨루엔
은 측관에서 플라스크로 되넘어 갔다가 다시 물과 함께 유출되어 넘어온다. 물이 거의 
다 유출되면 유출액은 투명하게 되는데 이 때 점적병의 스포이드를 써서 냉각관 상부에
서부터 톨루엔을 부어넣어 냉각관 내벽에 묻어있는 물방울을 씻어 내린다.  물의 유출이 
끝날 때까지 세정과 증류를 계속하여 15분 간격으로 물의 유출 상태를 조사하여 더 이
상 눈금의 변화가 없으면 물의 유출이 끝난 것으로 간주한다.(수분이 더 이상 유출되지 
않을 때 다시 톨루엔을 냉각관 상부로부터 주입하고 얼마간 더 증류한다)
가열이 끝난 뒤 냉각관 내부나 수분 측정관에 붙어있는 수분을 수분 측정관(눈금부위)으
로 떨어뜨린다 . 물의 유출이 끝나면 눈금관 부분이 따뜻하게 되므로 실온까지 냉각시켜 
분리된 물의 양을 판독하여 아래의 공식에 의거 수분함량을 구한다. 1장. 일반성분
3 수 분(%)  =눈금관의 물의양(㎖)×  100
시료채취량 (g)
다. 칼피셔법
1) 기구
적정장치 ：자동뷰렛 2개, 적정플라스크 , 교반기 및 정전압 전류적정장치로 되어 있다. 칼
피셔시액은 흡수성이 매우 강하므로 장치는 외부로부터 흡수되지 않도록 만들어져야 한
다. 방습제는 실리카겔 또는 염화칼슘(수분측정용 )등을 사용한다.
 
2) 시약 및 시액
가) 칼피셔용 메탄올
메탄올 1 L에 마그네슘가루 5 g을 넣어 염화칼슘관을 붙인 환류냉각관으로 1시간 동
안 환류하고 필요하면 염화제이수은 0.1 g을 넣어 반응을 촉진시킨다 . 가스발생이 멈춘 
다음 습기를 피하면서 메탄올을 증류하여 습기가 들어가지  않도록 보존한다. 이 액 1 
mL중의 수분은 0.5 mg이하이어야 한다.
나) 칼피셔용 피리딘
피리딘에 수산화칼륨 또는 산화바륨을 넣고 마개를 꼭 막고 수일간 방치한 후, 그대로 
습기를 피하면서 증류하여 습기가 들어가지 않도록 저장한다. 이 액 1 mL중의 수분은 
1 mg이하이어야 한다.
다) 칼피셔시액
① 조제
요오드 63 g을 칼피셔용 피리딘 100 mL에 녹이고 방냉한다. 다음에 건조 아황산가스
를 통하여 증가한 양이 32.3 g에 이르렀을 때 아황산가스를 통하는 것을 멈추고 칼피
셔용 메탄올을 넣어 500 mL로 하고 24시간 이상 방치한 다음에 사용한다. 이 시액은 
경과함에 따라 변화하므로 쓸 때마다 표정한다. 차광하여 습기를 피하고 찬 곳에 저장
한다.
② 표정
조작법에 따라 칼피셔용 메탄올 25 mL를 적정플라스크에 취하고 미리 칼피셔시액으로 
종말점까지 적정하여 플라스크안을 무수상태로 한다. 다음에 물 50 mg을 정밀히 달아 
적정 플라스크에 빨리 넣고 세게 흔들어 섞으면서 칼피셔시액으로 종말점까지 적정한
다.
칼피셔시액 1 mL에 해당하는 물(H2O)의  mg수 f를 다음과 같이 구한다.
f＝물(H2O)의 채취량/물(H2O)의 적정에 소비된 칼피셔시액의 양(mL)
라) 물․메탄올 표준액4① 조제
칼피셔용 메탄올 500 mL를 1 L의 건조된 메스플라스크에 취하여 물 2.5 mL를 넣고 
칼피셔용 메탄올을 넣어 1 L로 한다. 이 표준액의 표정을 칼피셔시액의 표정이 끝난 
다음 곧 한다. 이 용액은 차광하여 습기를 피하여 찬곳에 저장한다.
② 표정
조작법에 따라 칼피셔용 메탄올 25 mL를 건조적정 플라스크에 취하고 이것을 미리 칼
피셔시액으로 종말점까지 적정하여 플라스크안을 무수상태로 한다. 다음에 칼피셔시액 
10mL를 정확하게 넣고 조제한 물․메탄올표준액으로 종말점까지 적정한다.
f′＝ f×10/적정에 소비된 물․메탄올표준용액의 양(mL)
3) 시험조작
칼피셔시액에 의한 적정은 습기를 피해야 하며 원칙적으로 이것을 표정했을 때의 온도
와 같은 온도에서 적정하여야 한다. 적정플라스크중의 용액에 2개의 백금전극을 담그고 
가변저항기를 적당히 조절하여 일정한 전류(5～10마이크로암페아 )를 통하여 두고 칼피셔
시액을 적가하면 적정이 진행됨에 따라 회로중의 마이크로암미터의 바늘이 크게 흔들려 
수초내에 다시 원위치로 돌아온다. 적정의 종말점에 이르면 마이크로암미터의 흔들림(5
0～150마이크로암페아 )이 30초간 또는 그 이상 지속된다. 이 상태가 되었을 때를 적정의 
종말점으로 한다.
그러나 역적정일 때에는 칼피셔시액이 과량으로 존재하는 경우 마이크로암미터의 바늘
의 흔들림이 끊기고 종말점에 이르면 급히 원위치로 돌아온다. 마이크로암미터 대신 매
직 아이(Magic eye)가 달린 전원차계를 쓸 수도 있다.
칼피셔시액에 의한 적정은 따로 규정이 없는 한 다음의 어느 방법에 따라도 무방하다. 
적정의 종말점은 보통 역적정을 할 때 명확하게 판별할 수 있다.
가) 직접적정
칼피셔용 메탄올 25 mL를 건조 적정플라스크에 취하여 미리 칼피셔시액으로 종말점까
지 적정하여 플라스크 안을 무수상태로 한다. 다음에 수분 10～50 mg에 해당하는 검체
를 정밀하게 달아 빨리 적정플라스크에 옮겨 넣고 세게 흔들어 섞으면서 칼피셔시액으
로 종말점까지 적정한다.
검체가 용매에 녹지 않을 경우에는 재빨리 가루로 하여 무게를 정밀하게 달아 신속하
게 적정플라스크에 옮겨 습기를 피하면서 30분간 저은 다음 세게 흔들어 섞으면서 적
정한다.
수분(%)＝검체의 적정에 소비된 칼피셔시액의 양(mL)×f×100검체의 양(mg)
f：시약의 역가1장. 일반성분
5나) 역적정
칼피셔용 메탄올 20 mL를 건조적정플라스크에 취하여 미리 칼피셔시액으로 종말점까
지 적정하여 플라스크안을 무수상태로 한다. 다음에 수분 10～50 mg에 해당하는 검체
(S mg)를 정밀하게 달아 빨리 적정플라스크에 넣고 과량의 칼피셔시액 일정량(d mL)을 
넣은 다음 세게 흔들어 섞으면서 물․메탄올표준액으로 종말점까지 적정한다(소비량 e 
mL).
검체가 용매에 녹지 않을 경우에는 재빨리 가루로 하고 무게를 정밀하게 달아 신속하
게 적정플라스크에 옮겨 과량의 칼피셔시액 일정량을 넣고 습기를 피하면서 30분간 저
은 다음 세게 흔들어 섞으면서 적정한다.
수분(%)＝ df-ef ′×100S
f, f′: 시약의 역가
2. 조단백질(Crude protein)
가. 켈달(Kjeldahl) 법
1) 기구
분해 및 증류장치(Kjeldahl nitrogen digestion & distillation apparatus), 켈달 플라스크
(Kjeldahl flask), 메스 실린더, 삼각 플라스크, 저울, 자석 교반기, 피펫
2) 시약의 조제
가) 0.1N 염산용액(HCl) : 농염산(비중 1.18) 8.7㎖를 1000㎖ 메스플라스크에 넣고 증류수로 
표선까지  채우고 혼합하여 만든다.
※ 염산농도가 35.5%, 비중 1.18 인 것으로 1N 염산을 만들려면 아래의 계산식에 의하여 
소요량을 구할 수 있다
     1N 염산용액 =36.465(염산분자량 ) ×100
= 87.05 ㎖/1000 ㎖
35.5(염산%농도)×1.18(염산비중 )
※  0.1N 염산용액의 표정(標定) : 표준 탄산나트륨을 260～270℃에서 약 1시간 가열한 다음 
데시케이터내에서 30분간 방냉한다. 이 중에서 1.5g을 정확히 무게를 단 다음 250㎖ 메
스플라스크의 표선까지 증류수를 가해 혼합한다. 이중 25㎖를 삼각플라스크에 취하여 
메틸오렌지 두 방울을 가하고 0.1N 염산용액으로 적정한다. 황색으로 변하면 담홍색이 
될 때까지 일단 2～3분간 끓이고 냉각한 다음 다시 담홍색이 될 때까지 적정하여 이때 
소비된 0.1N 염산용액의 소비 ㎖로부터 다음과 같이 0.1N 염산용액의 factor를 구한다.6Factor(F)  = 188.67 ×x
b
x : 탄산나트륨의 무게(g)
b : 적정에 사용된 0.1N 염산 용액 소비량(㎖)
나) 분해촉진제 : 황산칼륨(Potassium sulfate) 9g에 황산동(Copper sulfate) 1g의 비율로 유
발(乳鉢)에서 완전히 혼합한다
다) 수산화나트륨 (Sodium hydroxide) 혼합액 : 수산화나트륨 500g과 치오황산나트륨 (Sodium 
thiosulfate) 100g을 증류수 1000㎖에 녹인다
라) 지시약 : 브로모크레졸그린 (Bromocresol green) 0.5g과 메틸레드(Methyl red) 0.1g을 
95%이상의 에탄올(Ethanol) 300㎖에 용해하여 만든다.
마) 4% 붕산(Boric acid)용액 : 붕산 40g을 증류수에 용해하여 1,000㎖로 만든 후 라)의 지
시약 4㎖를 가하여 혼합한다.
3) 시료액의 조제(분해)
시료 0.5～1g을 500㎖ 분해 플라스크에 취하고 분해촉진제 7～8g(10g)을 가하여 잘 혼합
한 후 H2SO4 10㎖를 서서히 가해서 잘 혼합한다. 이를 처음에는 거품이 넘치지 않도록 
서서히 가열하다가 거품이 나지 않으면 투명하게 될 때까지 강하게 가열하여 분해시킨
다.(분해시간 50～90분)
4) 증 류
300㎖ 삼각플라스크에 4%붕산용액 25～75㎖(21～63% 조단백질에 해당)를 취하고 지시약 
2～3방울을 가하여 냉각기의 관 끝이 붕산용액에 잠기도록 받쳐 놓는다. 그 후 냉각된 
분해액에 증류수 200㎖와 아연립(亞鉛粒) 2～3개를 넣고 수산화나트륨 혼합액 45㎖를 가
한 다음 즉시 증류장치에 연결하고 서서히 가열하여 증류하는데 분해액의 양이 약 2/3로 
줄어들거나 증류액이 120～150㎖ 될 때까지 증류한다.
5) 적 정
증류하여 받은 액을 0.1N-염산용액으로 적정하면 종말점(end point)부근에서 무색으로 변
하며 1～2방울 더 가하여 적갈색으로 변할 때의 0.1N 염산용액 소비 ㎖수를 읽는다.
6) 계 산
0.1N 염산용액 1㎖는 질소(N)0.00140067g 에 상당하므로 조단백질 함량은 다음과 같이 계
산한다.
조단백질(%) = 0.00140067 × T × F × 6.25 ×100/W
           T : 0.1N 염산용액 적정치(㎖) - Blank 적정치1장. 일반성분
7           F : 0.1N 염산용액의 Factor
           W : 시료무게(g)
나. 자동분석법 (Kjeltec Method)
1) 기구 및 시약
분해장치, 시료주입 및 증류장치, 화학천평, 자석교반기 , 메스플라스크 , 메스실린더 , 분해
병, 분해병스탠드 , 시약 분주기,  황산(시약 1급)
2) 시약의 조제
0.1N 염산 : 농염산(비중 1.18) 87㎖를 증류수로 희석 10ℓ로 하고 factor를 구하였다. 
*  factor 구하는 방법 : 표준탄산나트륨 (Sodium carbonate) 을 260～270℃에서 약 1시간 동
안 가열한 다음 데시케이터 내에서 30분간 방냉하여 이 중에서 1.5g을 정확히 칭량하
고 증류수로 용해 후 250㎖ 메스 플라스크의 표선을 맟추고 혼합한 후 이 중 25㎖를 
취하여 메틸 오렌지(Methyl orange) 두 방울을 가하고 0.1N 염산을 서서히 떨어뜨려 황
색에서 담홍색이 될 때 일단 2～3분간 끓이고 냉각 후 다시 담홍색이 될 때까지 적정
한다. 이 때 소비된 0.1N 염산용액의 소비㎖로부터 다음과 같이 0.1N 염산용액의 
factor를 구한다.
Factor(F) = 188.67 × χ
b
χ : 탄산나트륨의 중량(g)
b : 적정에 사용된 0.1N HCl 용량(㎖)
가) 분해촉진제 : 황산칼륨(Potassium sulfate : K2SO4) 10g에 황산동(Copper sulfate : CuSO
4․5H2O) 1g의 비율로 유발(乳鉢)에서 완전히 혼합한다.
나) 40% 수산화나트륨용액 : 수산화나트륨 (Sodium hydroxide : NaOH) 4㎏을 증류수에 녹여 
10ℓ로 한다.
다) 1% 붕산용액 : 붕산(Boric acid : H3BO3) 100g을 증류수에 용해하여 10ℓ로 하고 여기
에 브로모크레졸 그린과 메틸레드 용액(Bromocresol green 100㎎과 Methyl red 100㎎을 
각각 Methanol 100㎖에 용해) 각각 100㎖와 70㎖를 가한다.
3) 시료액의 조제(분해)
시료 0.7～1g을 분해병에 취하고 분해촉진제 7～8g을 가하여 잘 혼합한 황산(Sulfuric 
acid, H2SO4) 10㎖를 서서히 가해서 잘 혼합한다. 이를 처음에는 거품이 넘치지 않도록 
서서히 가열하다가 거품이 나지 않으면 투명하게 될 때까지 강하게 가열하여 분해시킨다 .
4) 분석방법(기기 작동방법)  
자동분석기의 작동방법에 따라 측정한다.8다. 자동분석법 (Dumas method)
1) 기구 및 시약
고온 연소장치, 질소수집장치 (측정장치를 갖추고 있어야 하며 기기 장치에 적합한 악세
사리 및 시약), 저울 
2) 시료의 준비
30 sieve체를 통과한 시료로서 뚜껑이 있는 시료병에 보관한다.
3) 방법
가) 기기의 조작법에 따라서 기기를 가동시킨다 .
나) 연소로가 온도평형을 유지한 다음 시작하여 정상가동 여부를 확인한다. 이때 연소로의 
온도는 권장 적정온도 범위(850～1050℃) 이내에 있어야 한다.
다) 연소로 아래 부분에는 stainless steel screen과 glass wool을 삽입한 다음 연소관을 준
비한다.
라) 적정량의 시료를 시료용기(tin foil 또는 boat)에 취한다.
마) 무게를 달 때는 무게변화를 방지하기 위해 가급적 1분 이내에 완료한다.
바) 시료를 취한 시료 용기를 시료 주입장치를 이용하여 기기 분석을 한다.   
사) 표준시약을 이용하여 표준곡선을 구한 다음 시료의 농도를 구한다.
아) 질소 함량에 단백질 환산계수를 곱하여 조단백질 함량을 구한다.
3. 조섬유(Crude fiber)
가. 헨네베르크 ‧ 스토오만 개량법에 의한 정량법
 1) 기 구
정온건조기 , 전기로(Muffle furnace), 톨비이커(tall besker, 200㎖눈금), 유리여과기 (1G2), 
스텐레스금망 (0.044 ㎜), 세척병, 여과대, 진공펌프 또는 수류펌프, 조섬유 자비기, 데시케
이터
 2) 시약의 제조
 가) 5% 황산액(H2SO4, w/v) : 농황산(비중1.84) 27.2㎖를 증류수에 희석하여 1,000㎖로 한다.
 나) 5% 수산화나트륨액 (NaOH, w/v) : 수산화나트륨 50g을 증류수에 용해하여 1,000㎖로 한다.
 3) 정량법
시료 1～2g(지방함량이 많은 것은 탈지하거나 조지방을 정량한 후 남은 찌꺼기 시료 잔1장. 일반성분
9사를 사용)을 500㎖ 톨비이커에 취하고 5% 황산액 50㎖와 증류수 150㎖를 가하고 거품
방지제 2～3방울 떨어뜨린 다음 30분간 끓인 후 스텐레스 금망(0.044 ㎜)으로 여과하여 
잔사(殘渣)를 산성이 완전히 없어질 때까지 뜨거운 증류수로 여러 번 세척한다. 
산 불용해물은 증류수 130～140㎖로 톨비이커에 씻어 넣고 5% 수산화나트륨용액 50㎖를 
가한 다음 200㎖ 표선까지 증류수로 채운다. 다시 30분간 끓이고 No.5A 여과지 또는 유
리여과기 1G2(135 ℃에서 2시간 건조하여 항량을 구한 것)로 여과하는데 알카리성이 없어
질 때까지 뜨거운 증류수로 세척한 다음 다시 95% 에틸알콜로 3회, 에틸에테르로 2회 
세척하고 95～100℃에서 2시간 예비 건조한 다음 135±2 ℃에서 2시간 건조 후 데시케이
터내에서 30분간 방냉한 다음 칭량 후 5A여과지에 사용시에는 자제크루시블 (600℃ 전기
로에서 2시간 태워 항량을 구한 것)에 넣고, 유리여과기의 경우 직접 전기로에 넣어 60
0℃에서 2시간 회화하고 40분간 데시케이터내에서 방냉한 후 무게를 측정한다.
 4) 계 산
조섬유(%)  = d  -  a×  100 s
        * d : 분해후 여과한 잔사의 건조중량(g)
          a : 잔사를 회화한후 남은 회분량(g)
          s : 공시료의 중량(g)
나.자동분석법(여과포분석법)
1)기구
여과포(FilterBag)를사용하는자동조섬유분석장치,건조기(102±2
C),전기회화
로(600
C±15
C),여과포,열밀봉기,방랭파우치
2)시약의제조
가)1.25%황산용액(H₂SO₄)
나)1.25%수산화나트륨액(NaOH)
3)분석방법
가)용제내에서내산성인마커펜을이용하여여과포표면에식별번호를표기한다.
저울천칭의영점을맞추고빈여과포의무게(W1)를재어기록한다.
*주의:여과포를미리건조시키지말것
나)각각의여과포에0.95-1.00g의시료를넣고무게(W2)를측정한다.
다)바탕값보정(C)을위해적어도하나의빈여과포를실험에같이진행한다.
라)열밀봉기를사용하여여과포의윗부분을완벽하게밀봉한다(윗부분에서4-5mm아래부분)
*주의:밀봉한후열밀봉기에서여과포를분리하기전냉각시간을충분히준다.10마)비커(250ml)에여과포를넣고석유에테르(petroleumether)를잠길정도로붓
고30분간탈지한다.면실,대두박,코코넛,애완동물사료같이지방이많은
시료는시료특성에따라1~3시간혹은24시간탈지해서지방을완전히제거
해야한다.
*주의:석유에테르는가연성이크므로정전기발생을피한다.탈지가끝나면용
제를버린후여과포를가볍게눌러용제를최대한많이뺀후그물망에평평하
게겹치지않게놓은후에용제를완전히증발시킨다.완전히마르면여과포를
흔들거나탁탁쳐서여과포안의시료가고르게분산되고뭉치지않도록한다.
바)잘건조된여과포를여과포걸이(suspendertray)에층층이쌓아기계안에넣고기기를
작동한다.
사)조섬유추출과헹굼처리가끝나면뚜껑을열고여과포를꺼낸다.
여과포에서과도한수분을부드럽게눌러짜낸다.여과포를비커에넣은
다음아세톤(또는에테르)을여과포가잠길만큼붓는다.
아)아세톤에서여과포를꺼내철망그물위에놓고아세톤을증발시킨다.아세
톤을증발시킨여과포를102±2
C건조기에서완전히건조시킨다.
*주의:아세톤이완전히증발될때까지건조기에여과포를넣지않도록한다.
자)건조기에서여과포를꺼내어방랭파우치에곧바로넣은다음손으로눌러평평
하게하여공기를빼낸다.실온이될때까지냉각하여여과포의무게를측정한다.
여과포를담을도가니(crucible)의무게를잰후,각각의여과포를도가니에넣고
도가니+여과포의무게(Wa)를계산한다.
차)600±15
C의회화로에서2시간동안회화시킨다.회화가끝나면도가니를어느
정도식힌후(150
C정도까지)데시케이터에넣고실온까지식힌다.충분히
식으면데시케이터에서도가니를하나씩빼내어도가니+회화된여과포의
무게(Wb)를측정해손실된유기물질(lossoforganicmatter,W3)을계산한다.
4)계산
조섬유(%)=100×(W3-(W1×C)) W2
*W1:여과포의자체무게
W2:시료의무게
W3:유기물질무게(여과포와섬유연소로인한무게손실)
W3=Wa–Wb
 Wa=도가니+건조후여과포의무게
 Wb=회화후도가니+여과포의무게
C:빈여과포의회분(ASH)보정값
C=(C2–C3)
 C1
 C1=빈여과포의무게
 C2=도가니+건조후빈여과포의무게
 C3=회화후도가니+빈여과포의무게1장. 일반성분
114. 조지방(Crude fat, ether extract)
가. 에테르 추출법(Ether extract)
1) 기구 및 시약
지방 추출장치(soxhlet extractor), 건조기, 데시케이터 , No. 2 여과지, 에틸에테르
2) 추 출
지방 정량병을 95～100℃에서 2시간정도 건조하고 데시케이터 내에서 30분간 방냉 후 
칭량(秤量)하고 시료 2～3g을 No.2여과지에 싸서 95～100℃ 에서 2시간 건조시킨 다음 
지방추출장치에 넣고 에테르를 부어 80℃로 가열하여 8시간 지방을 추출한 다음 에테르
를 회수하고 지방 정량병을 95～100℃에서 3시간 건조 후 데시케이터 내에서 40분간 방
냉 후 칭량하여 지방 정량병의 중량을 감(減)한 것을 시료량에 대한 백분율을 구하여 조
지방 함량으로 한다.
3) 계 산
      조지방(%)=추출후 지방 정량병중량 - 추출전 지방 정량병중량× 100
시 료 중 량  
나. 산분해 에테르추출법 <팽화사료(extrusion) 및 보호지방의 정량>
1) 기구 및 시약
비이커, 수조, 분액깔대기 ,  데시케이터 , 지방추출장치 (soxhlet extractor), 에틸알콜, 에틸
에테르, 염산
2) 추 출
분석시료 2g을 300㎖ 비이커에 정확히 취하고 에틸알콜 2㎖가하여 혼합하고 염산용액
(4+1) 20㎖를 넣고 시계접시를 덮어 70～80℃ 수욕상(water bath)에서 60분간 가끔 흔들
어주면서 가온한다. 방냉 후 내용물을 250㎖ 분액깔대기에 옮기고 비이커에 에틸알콜 10
㎖, 에틸에테르 25㎖순으로 씻어 분액깔대기에 넣고 다시 에틸에테르 75㎖를 가하여 3분
간 진탕한다. 정치 후 하층(수층)의 액을 다른 분액깔대기에 옮기고 상층의 에테르 층은 
탈지면으로 여과하여 지방병에 받고 에테르를 회수한다. 이와 같이 에테르 추출은 3회 
이상 반복하여 지방을 모은 후 지방병을 95～100℃에서 3시간 동안 건조하고 데시케이
터 내에서 40분간 방냉 후 칭량(秤量)하여 지방병의 중량을 감한 것을 시료량에 대한 백
분율을 구하여 조지방 함량으로 한다.
다. 황혈염 추출법 <유지방(乳脂肪)정량법>121) 기구 및 시약
삼각 플라스크,  수조,  유발, 그 외 에테르 추출법과 동일, 해사(sea sand), 염산용액 (2
＋1), 황혈염용액 (황혈염(Potassium ferrocyanide) 15g을 증류수에 녹여 1,000㎖로 한다), 
초산아연 용액(초산 아연(Zinc acetate) 320g 증류수에 녹여 1,000㎖로 한다)
2) 추 출
시료 5g을 200㎖ 삼각flask 에 취하고 증류수 50㎖를 가한 후 중탕으로 용해 후 염산용
액(2:1) 1㎖를 가하고 15분간 서서히 끓인다. 냉각 후 황혈염 용액 5㎖, 초산아연용액 5㎖
를 넣어 잘 혼합하고 침전물을 Whatman No 2 여과지로 여과 후 증류수로 2～3회 씻어
주고 여과지의 침전물에 해사 5g을 가하여 잘 혼합시켜 98～100℃에서 건조시키고 유발
에 옮겨 균등히 갈아서 분말로 하여 내용물을 원통여과지에 옮기고 유발에 부착된 분말
은 에테르로 축여서 탈지면으로 닦아 원통여과지에 넣고 속시렛 장치에 연결하여 에테
르 추출법과 동일한 방법으로 추출한다.
라. 필터백 분석법 
1) 기구 및 시약
조지방분석기 , 건조기(102± 2℃), 여과포(Filter Bag), 열 밀봉기, 방랭파우치 , 마킹펜(용제
와 산성에 견딜 것), 석유 에테르(Petroleum Ether) 또는 디에틸에테르 (Diethyl Ether)
2) 방 법
가) 마커펜을 이용하여 여과포 표면에 식별번호를 표기한다.
나) 각각의 여과포에 0.95-1.00g 의 시료를 넣고 무게(W1)를 측정한다. 
다) 열 밀봉기를 사용하여 여과포의 윗부분을 완벽하게 밀봉한다.
라) 봉합된 여과포를 102±2 ℃ 건조기에서 2-3시간동안 건조시킨 다음 건조파우치에 넣고 
방냉 후 각각의 여과포 무게(W2)를 잰다.
마) 여과포를 필터백홀더에 꽂은 후 추출용기에 넣고 추출한다.
바) 여과포를 추출용기에서 꺼내어 102±2 ℃ 건조기에서 30분 정도 건조한 다음 건조파우
치에 넣어 방냉 후 무게(W3)를 잰다.
3) 계 산1장. 일반성분
13조지방(%) =W2－W3
 × 100
W1
  W1 : 시료무게
  W2 : 처음 건조 후 시료무게 (시료+필터백), 수분을 제거한 무게
  W3 : 추출 후 건조무게 (시료+필터백), 지방을 제거한 무게
5. 조회분(Crude ash)
가. 기 구
전기로, 자제 크루시블, 데시케이터 , 저울
나. 정량법
600℃ 전기로에서 1～2시간 태운 크루시블을 데시케이터내에서 40분간 방냉 후 칭량한 
다음 시료 2～3g을 취하여 전기곤로 또는 가스버너로 열을 가하여 예비 회화시킨 후 
600℃ 전기로에 넣어 2시간 태운 다음 데시케이터내에서 40분간 방냉 후 칭량하여 이 
중량으로부터 크루시블의 중량을 감(減)한 것을 조회분 함량으로 한다.
다. 계 산
조회분(%) =회화 후 무게(시료＋크루시블 )－크루시블 무게
× 100
시료중량 (g)
6. 가용무질소물 (Nitrogen free extract)
시료를 100으로 하여 여기에서 수분, 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분 함량(%)을 감해서 
구한다. 
NFE = 100－[수분(%)＋조단백질(%)＋조지방(%)＋조섬유(%)＋조회분(%)]
NFE의 주성분은 가용성 당과 전분이고 일부 cellulose와 hemi cellulose 및 lignin이 포함
된다. 특히 조사료 분석시 NFE 중에는 농후사료보다 상당량의 cellulose, hemicellulose 
및 lignin이 포함되어 있다.142장. 세포막구성물질 (Cell wall constituents)
1. NDF(Neutral detergent fiber)
가. 기 구
조섬유자비기 , 건조기, 전기로, 진탕기, 여과병, 초자여과기 (IG2), 진탕배양기
나. 시약의 조제
1) 중성 Detergent 용액 : Sodium Lauryl Sulfate[CH 3(CH2)OSO3Na : 288.38]150g, EDTA 
Disodium Salt [{CH2N(CH2COOH)CH 2COONa} 2․2H2O : 372.25] 93.05g, Sodium Borate 
(Na2B4O․10H2O : 381.37) 34.05g, Sodium Phosphate, dibasic (NaHPO 4․12H2O) 22.8g, 
Ethylene Glycol Monoethyl Ether (C2H5OCH2CH2OH : 90.12) 50㎖를 H2O 5ℓ에 용해 후 
pH가 6.9～7.1 되게 Sodium Carbonate 용액과 묽은 염산을 사용하여 조정한다. 이 액은 
겨울철에는 굳어지므로 가온하여 용해 후 사용한다.
2) 소포제(消泡劑) : Decalin
3) 아세톤 : 시약 1급
4) α-amylase용 인산완충액 : 인산1칼륨(KH2PO4) 60g과 인산2나트륨(Na2HPO4․12H2O) 19.9g을 
H2O에 용해하여 5ℓ로 한다.(pH 5.8)
5) α-amylase용액 : pH 5.8 인산완충액 20㎖에 α-amylase 1㎎의 비율로 용해한다. 이 용액
은 사용직전에 만드는데 현탁액이다 .
6) 무수황산나트륨 : 시약특급
다.  방 법
1) 조사료
풍건사료(風乾飼料) 1g을 500㎖ 톨비이커에 취하고 중성 Detergent 용액 100㎖와 Decalin 
2㎖, Sodium Sulfite 0.5g을 가해 조섬유 정량용 자비기에서 1시간 끓인 다음 유리여과기
(1G2)를 사용하여 흡인여과하고 뜨거운 물과 아세톤으로 씻어주고 풍건 후 105℃ 건조기
내에서 4시간 건조하여 무게를 달고 계산한다.
NDF(%) =(건조후 무게 - 유리여과기 무게)/시료중량×100  
2) 전분을 함유한 시료
시료 0.5～1g을 100㎖ 삼각 후라스크에 취하고 H2O 20㎖를 가한다. 이것을 가열판 위에 
올려놓고 가열하여 전분을 호화(糊化) 시키는데 끓는 상태가 되면 조작을 중지하고 냉각 2장. 세포막구성물질
15후 20㎖의 α-amylase 용액을 가하여 40℃ 진탕 배양기에서 16시간 전분을 가수분해한다 . 
그 후 잔사를 No. 5A 여과지에 여과하고 H2O로 3～4회 세척한 다음에 세척병에 중성 
Detergent 용액을 넣어 여지에 남아 있는 잔사를 500㎖ 톨비커에 씻어 넣고 전체량을 
100㎖로 한 후 Decalin을 3～5방울을 가하고 조섬유 자비기에서 1시간 끓이고 미리 함량
을 구한 유리여과기 (1G2)로 여과하고 H2O로 6～7회 세척하여 잔존 계면활성제를 씻어 
내린 후 Acetone으로 3～4회 세척한다. 그 후 135℃ 건조기에서 2시간 건조하고 냉각 
후 칭량하여 세포막 물질(CW)을 구하고 세포내용물 (CC)의 함량은 100에서 CW의 건물 
중 함량(%)을 제하여 구한다.
2. ADF(Acid detergent fiber)
가. 기 구
조섬유자비기 , 건조기, 여과병, 유리여과기 (1G2)
나. 시약의 조제
1) 산성 Detergent 용액 : Cetyltrimethylammonium Bromide (CETAB) 20g을 1ℓ의 1N H2SO4
에 가열 녹인다. 겨울철에는 보관중에 시약이 굳어지므로 가온 용해하여 사용한다.
2) 소포제 : Decalin
3) Acetone : 시약 1급
다. 방 법
시료 2g을 500㎖ 톨비커에 취하고 100㎖ 산성 Detergent 용액과 2㎖ Decalin을 가해 조
섬유자비기에서 1시간 끓이고 유리여과기 (1G2)로 흡인여과하고 뜨거운 물로 2회 씻어 주
고 남은용액이 무색이 될 때까지 Acetone으로 씻어주고 풍건 후 105℃의 건조기내에서 
4시간 건조 후 무게를 단다. 
ADF(%) =(건조 후 무게 - 유리여과기 무게)/시료중량×100163장. 아미노산(Amino acid)
1. 역상크로마토그래피법 (PITC 유도체화법 )
가. 시약의 조제
1) 6N 염산용액
2) 유도체시약 (PITC, Phenylisothiocyanate)
3) 초산나트륨 , 2-프로판올 : 특급품
4) 트리에틸아민 (TEA) : 원액
5) 아세토니트릴 , 에탄올, 증류수 : HPLC용
6) 인산용액 : 원액사용
7) 재건조시약 : [에탄올 : 증류수 : TEA(2 : 2 : 1, V/V)]
8) 유도체시약 : [에탄올 : 증류수 : TEA : PITC(7 : 1 : 1 : 1, V/V)]
9) 표준용액 : 표준시료 적당량을 취하여 시료액의 조제와 같은 방법으로 처리하여 최종농
도가 2～4μ㏖/㎖가 되도록 한다. 
나. 방법
시료 40～100㎎을 시험관에 취한다. 이 시료를 충분히 가수분해시킬 수 있는 6N 염산을 
가하여 질소가스로 통기시킨 후 마개를 막고 105℃에서 24시간 가수분해시킨다 . 가수분
해된 시액을 냉각시킨 뒤 No. 6 여과지를 사용하여 50㎖ 메스플라스크에 여과한다. 여과
액 중 일정량을 0.45㎛ 여과막으로 여과한 후 시액 일정량(50～100㎕)을 작은 유리시험
관에 취하여 진공 건조시킨다 . 건조된 시료를 다시 재 건조 시약 16～20㎕를 넣고 재 건
조시킨 후 유도체 시약을 25㎕를 넣고 20～25분간 충분히 반응시킨 뒤 다시 진공건조 
시킨 후 액체크로마토그래피의 이동상 A용매로 희석하여 HPLC에 주입 측정한다.
다. 기기조건(HPLC)
1) 이동상 A : 20g 초산나트륨 , 600㎕ TEA를 HPLC용 증류수로 녹여 1ℓ로 한다. 이용액 
940㎖에 아세토니트릴 60㎖를 혼합한 뒤 인산으로 pH 6.30～6.40으로 맞춘 후 0.45㎛ 수
용성 여과지로 여과한다.
2) 이동상 B : 60㎖ 아세토니트릴에 증류수를 채워 1ℓ로 한 후 0.5㎛ 지용성 여과지를 메
탄올로 적셔 활성화시킨 후 여과한다. 
3) 파장 : 254㎚3장. 아미노산
174) 고정상 : C18 Column
5) 칼럼온도 : 45～50℃
6) 이동상의 양 및 조성비(gradient)
Time
Initial Flow       %A       % B         %C
  1.0        100        0            0
10.0
10.5
11.0
14.0
14.5
20.5
21.5  1.0         54        46           0 
  1.0          0       100           0
  1.5          0       100           0
  1.5          0       100           0
  1.5        100         0           0
  1.5        100         0           0
  1.0        100         0           0
라. 계산
시료중의 각 아미노산(%) = A×CB×WD×희석배수×100
               A : 각 아미노산 표준용액의 농도(μ㏖/㎖)
               B : 시료용액의 각 아미노산의 피크면적이나 높이
               C : 표준용액의 각 아미노산 피크면적이나 높이
               D : 각 아미노산의 분자량
               W : 시료의 중량(㎍)
2. 이온교환크로마토그래피법 (Ninhydrin 법)
가. Stable 계열(Lys. 등)
1) 기구 및 시약
아미노산분석기 , 로타리증발기 , 열풍순환식 건조기, 수류펌프, pH메터, oil bath, 분해병, 
메스실린더 , 자석교반기 , 홀피펫, 메스플라스크 , 세척병, 질소가스
2) 시약조제
가) 6N-염산용액 : 농염산(35%, 비중 1.18)과 증류수를 1:1로 혼합한다18나) 아미노산 표준액 : 시판 아미노산 표준원액(2.5μ㏖/㎖)를 정확하게 5㎖ 취하여 25㎖ 메
스플라스크에 넣고 pH 2.2 희석완충액으로 표선을 맞춘다. 
다) 시료희석용 완충액(pH 2.2) : 구연산소다 (Sodium citrate dihydrate) 19.7g을 증류수 400
㎖에 용해하고 여기에 염산(비중 1.18) 16.5㎖와 caprylic acid 0.1㎖, β-Thiodiglycol 20
㎖, Brij35(30% w/v) 2.0㎖ 가한 후 증류수로 1ℓ 되게 한다.
라) 완충액(Buffer) : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
마) 발색제(Ninhydrin 시약) : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
3) 시료액의 조제
시료는 50～300㎎(조단백질로 30㎎ 정도)을 취해서 분해병에 넣은 후 6N-HCl 40㎖를 가
하고 질소가스를 주입한 후 마개를 막고 110℃에서 24시간 가수분해시킨 후 농축증발 
플라스크에 옮기어 로타리 증발기에 연결 50℃에서 염산을 제거시키는데 증발이 다되면 
증류수로 분해병을 씻어 증발 플라스크에 옮기어 다시 증발시키는 것을 3회 반복하여 
증발 건고시키는 데 최종적으로 증발건고 되어 있는 증발플라스크에 시료희석 완충액
(pH 2.2)이나 증류수를 소량씩 가하여 아미노산을 용해시켜 No. 5B 여과지로 여과하여 
50㎖로 만든다.
4) 계산
       아미노산 함량(%) =C ×SA × D ×M× 100ST W
                  C   : 표준아미노산의 농도(㎛/㎖)
                  SA : 시료액의 아미노산 Peak 면적
                  ST  : 표준액의 아미노산 Peak 면적
                  D   : 희석량(㎖)
                  M  : 아미노산의 분자량
                  W  : 시료의 중량(㎍)
나. 황함유계열 (Met. 등)
1) 기구 및 시약
Stable 계열과 동일 
2) 시약조제3장. 아미노산
19가) 6N-염산용액 : 농염산(35%, 비중 1.18)과 증류수를 1:1로 혼합한다
나) 과개미산액 : 85% 개미산(formic acid) 45㎖와 30% 과산화수소 (H2O2) 5㎖를 500㎖ 삼각
플라스크에 취하여 혼합하고 실온에서 1시간 방치하여 과개미산을 생성시킨 다음 얼
음속이나 냉동실에 플라스크를 30분 이상 넣어 생성된 과개미산을 고정시킨다 .
다) Cysteic acid 및 Methionine sulfone 1차 표준액 : Cysteic acid 0.11698g과 Methionine 
sulfone 0.11325g을 정확히 취하여 50㎖ 메스플라스크에 넣고 0.1N 염산 용액으로 용
해하여 표선까지 채운다.
라) 아미노산 표준액 : 시판 아미노산 표준원액(2.5μmol/㎖)를 정확하게 5㎖ 취하여 25㎖ 
메스플라스크에 넣고 pH 2.2 희석완충액으로 표선을 맞춘다. 이때 아미노산은 각각 
0.5μmol/㎖가 된다. 단, 이때 Cysteic acid와 Methionine sulfone 1차 표준액 1㎖씩 미리 
넣은 다음  25㎖를 채운다.
마) 시료희석용 완충액(pH 2.2)
Stable 계열과 동일 
바) 완충액(Buffer) : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
사) 발색제(Ninhydrin 시약) : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
3) 시료액의 조제
Cystine과 Methionine 은 6N-HCl로 가수분해시키면 파괴되므로 산가수분해전에 과개미산 
처리로 일단 안정상태인 Cysteic acid와 Methionine sulfone으로 변화시킨 후 6N-HCl로 
가수분해시킨다 . 분해병에 시료 50～300㎎(조단백질로 30㎎ 정도)을 취하고 과개미산 20
㎖를 가하고 5℃이하의 냉장고에 넣고 이튿날 아침 분해병을 로타리증발기에 연결시켜 
50℃에서 시료 이외의 휘발성물질을 모두 날려보낸 후 6N-HCl(20 ㎎당 5㎖정도)을 가하
고 다른 아미노산 분석시와 같이 110℃에서 24시간 가수분해시킨다 .
4) 계 산
Stable 계열과 동일 
다. 트립토판(Tryptophan)
1) 기 구
Stable 계열과 동일 
2) 시약조제20가) 농염산
나) 0.2N-Sodium Citrate buffer (pH 4.2) : 0.2N의 Sodium citrate와 0.2N의 Citric acid를 혼
합하여 pH를 4.2가 되게 한다.
다) 4.2N-NaOH 용액 : 4.2N-NaOH 10㎖당 0.1㎖의 n-octyl alcohol을 첨가한다.
라) 아미노산표준액 : 시판 트립토판 표준품용을 pH 2.2 희석 완충액 (Hitach 아미노산 분
석기 사용설명서 참조)으로 희석하여 0.1μ㏖/㎖(20.41ng/ ㎖)가 되게 한다. 
마) 표준액 희석액용 완충액(pH 2.2) : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
바) 발색제 : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
사) 아미노산 분석기용 완충액 : 기기조건에 적합한 용액으로 조제하여 사용
3) 시료액의 조제
가) 100㎎의 단백질 함량 정도가 되게 시료를 취해서 분해병에 넣은 후 10㎖의 
4.2N-NaOH 를 가하고 산소를 제거하기 위해 질소가스를 주입한 후 마개를 막고 110℃
에서 20시간 가수분해시킨다 . 가수분해 후 시료를 충분히 냉각시킨 후 50㎖의 메스플
라스크에 가수분해물을 No.5B 여과지로 거르면서 넣고 0.2N- Sodium citrate 
buffer(pH 4.2)로 채운다. 여기서 다시 1～5㎖을 비이커에 취하여 70℃가 되는 항온수
조에서 수분을 증발 시킨다. 건조가 완결된 후 sodium citrate buffer (pH 4.2)와 HCl을 
첨가하여 pH를 4.2로 맞추면서 25㎖이 되게 한다. HCl을 첨가 시 찌꺼기가 형성될 수
도 있으나 트립토판의 회수율에 영향을 미치지는 않는다. 25㎖의 용액을 분석 전에 
여과하여 아미노산 자동 분석기에 200㎕의 시료를 넣어서 분석한다. 
나) 지방이 많이 함유된 시료의 처리 : 시료내 탄수화물, 섬유소 및 회분은 트립토판의 회
수율에 영향을 미치지는 않지만 지방은 회수율을 감소시킨다 . 그래서 지방을 많이 함
유하고 있는 어분, 육분 이나 골분과 같은 시료는 탈지과정이 가수분해 전에 요구된
다. 약 100㎎의 단백질을 포함하고 있는 시료를 5㎖ diethyl ether와 혼합시키고 
2000rpm에서 15분동안 원심분리 후 ether층을 분리시킨다 . 이 과정을 3번 반복한 후 
가수분해 과정을 실행한다. 
다) 가수분해물의 보관 : 가수분해물은 항상 가수분해 과정이 끝난 후 바로 분석을 실행하
는 것이 좋으나 그렇지 못할 경우 pH 4.2의 상태에서 5℃에서 보관하는 것이 가장 안
전하다. 
4) 측 정
일반 아미노산 분석 시와 동일한 조건에서 분석기의 사용설명서에 의하여 측정한다. 3장. 아미노산
215) 계 산
트립토판 함량(%) = SC ×StSa
 × D × WM × 100
SC : 표준 트립토판의 농도 (μM/㎖)
SA : 시료의 트립토판 peak의 면적
ST : 표준 트립토판 peak의 면적
D  : 희석량 (㎖)
M : 트립토판의 분자량
W : 시료의 중량 (㎍)
3. MHA(Methionine Hydroxy Analogue) 의 정량법
가. HPLC법
1) 기 구
HPLC(UV 검출기를 부착한 것), NH2 column(reversed - phased column 4.6*150 ㎜, 5㎛), 
시료분쇄기 , 화학천칭(readability : 0.01㎎), 원심분리기 , 시험관교반기 , ultrasonicator (온
도조절가능 ), hydropilic sylinge filter(0.22 ㎛), Mili-Q, RiOs/Elix water purification 
system(Millipore, Bedford, MA, U.S.A.)
2) 시 약
가) 표준품 : MHA 표준품 Tokyo Kasei Kogro(Japan) 사의 2-hydroxy –4- 
(methylthio)-butanoicacid(MHA,71.6%), 2-hydroxy-4-(methylthio)  butanoic acid calcium 
salt(purity 98.4%)
나) 전처리용 시약 : 85% orthophosphoric acid(analytical reagent grade) (Merck), potassium 
hydroxide(special grade, 85%), ammonium hydroxide (extrapure reagent, 25～28%), 
Acetonitrile(HPLC 급), 증류수 (Mili-Q, RiOs/ Elix water purification system(Millipore, 
Bedford, MA, U.S.A.)에 의해 여과하여 사용함)
다) 추출용매 : 10% acetonitrile (acetonitrile : 증류수 v/v)223) 표준액 조제
MHA 표준품을 전처리시 MHA의 추출용매로 사용되는 10% acetonitrile(90% deionzed 
water)에 녹여 MHA의 농도가  0.2～10㎎/50㎖가 되도록 희석하여 검량선 작성을 위한 
표준액으로 사용한다.
4) 시료에서의 시험용액 추출
가) 사료 시료는 잘 혼합하여 시료분쇄기로 입자의 크기가 600㎛ 정도가 되도록 분쇄한다.
나) 삼각플라스크에 정확히 2g을 칭량한 후 10% acetonitrile  (90% deionzed water) 추출용
액 50 ㎖를 넣고 ultrasonicator (45℃)에서 MHA가 추출되도록 20분간 처리한다.
다) 추출액을 50㎖ conical tube로 옮겨 원심분리기에서 3000rpm으로 20분간 원심분리한 
후 상등액 5㎖을 15㎖ test tube에 피펫팅한다 .
라) 여기에 추출액에 존재하는 미량의 MHA oligomer를 monomer 로 가수분해하기 위해 
50% KOH 100㎕를 넣고 시험관 교반기에서 10초간 교반한다.
마) 기기 분석시 좋은 분리조건을 위해 pH를 4～5로 낮추기 위해 85% phosphoric acid 100
㎕를 가하여 시험관 교반기에서 10초간 교반한다.
바) 전처리액을 0.22㎛ hydrophilic syringe filter로 filtering한 후 기기분석을 위한 시료액으
로 한다.
5) 측 정
동시에 측정한 표준품의 머무름 시간과 일치하는 것을 정성시험의 판정기준으로 하며, 
표준품의 분석농도와 얻어진 피크 면적에 의한 검량선을 작성하여 정량시험에 사용한다.
6) HPLC의 조건
가) Column : NH2 column (reversed-phased column 150 ×4 ㎜ I.D. ODS, particle size 5㎛)
나) Mobile phase : isocratic mode로 acetonitrile 과 NH4OH로 pH를 3.2로 맞춘 0.01M H3PO4
를 23 : 77(%, v/v)
다) Injection volumn : 10㎕
라) Flow rate : 1㎖/min
마) Detector : UV 검출기
바) Detection wavelength : UV 214nm
사) Retention time : 대략 6.7 min
4장. 무기물(Minerals)4장. 무기물
231. 칼슘(Ca)
가. 원자 흡광광도법 (Atomic absorption spectrophotometry)
1) 시약의 조제
가) 5%란타늄 용액 : 산화 란타늄(Lanthanum oxide) 58.65g에 소량의 증류수를 가한 후에 
농염산 250㎖를 서서히 가하면서 용해시키고 냉각한 다음 증류수로 1ℓ 표선까지 채
운다.
나) 칼슘표준용액 : 특급 탄산칼슘(CaCO 3) 0.25g을 염산용액(1:1) 5㎖에 녹이고 증류수로 
100㎖되게 표선까지 채운다.(1,000ppm) 또는 시판 칼슘 표준용액(1,000ppm) 을 희석 사
용한다.
2) 시료액의 조제
가) 유기질시료
시료 2～5g를 자제 크루시블에 취하고 열판에서 예비회화시킨 후 전기로 600℃에서 2
시간 이상(회백색) 회화시킨 뒤 방냉하고 염산용액(1:1) 10㎖를 가하여 하룻밤 방치 용
해시킨 다음 No.6 여과지를 이용 뜨거운 물로 여과하여 일정량으로 맞춰 시료액으로 
한다.
나) 무기질 시료
시료 0.5～1.0g를 취하여 100㎖ 삼각 플라스크에 넣고 염산용액(1:1)10 ㎖를 가하여 시계
접시로 덮은 후 서서히 가온하여 분해액이 반으로 줄어 들었을 때 상기의 여과방법으
로 여과하여 시료액으로 한다.
3) 측 정
시료액 일정량을 50㎖ 메스플라스크에 취하고 5% 란타늄용액 10㎖를 넣고(용액중 란타
늄 함량이 1% 되도록 한다), 다시 염산용액(1:1) 1㎖를 가하고 증류수로 표선을 맞춘다. 
미리 30분간 예열한 원자흡광광도계 파장 422.7㎚에서 흡광도를 측정한다. 이때 칼슘표
준용액을 0, 2, 4, 6, 8, 10ppm이 되도록 50㎖ 메스플라스크에 취한 다음 여기에 란타늄 
용액 10㎖를 각각 넣고 증류수로 표선까지 채운 다음 흡광도를 측정, 표준곡선(검량곡
선)을 작성한다.
4) 계 산24      칼슘(%) = 시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
× 100
시료중량 (g) × 106
나. EDTA적정법(Ethylene Diamine TetraAcetic acid, disodium salt)
1) 시약의 조제
가) 8N-수산화나트륨액 : 특급 수산화나트륨 (NaOH) 320g을 증류수에 녹여 1,000㎖로한다.
나) 10%시안화 칼륨용액 : 시안화칼륨 (KCN) 10g을 증류수에 녹여 100㎖로 한  다.
다) 트리에탄놀아민 (Triethanolamine) 용액(1:1) : 트리에탄놀아민과 증류수를 동량(同量)희
석한다.
라) N, N 지시약 : 순수 N,N 지시약[2-Hydroxy-1-(2-Hydoxy –4-Sulfa -1- Naphthy 
-lazol)-3-Naphtoic Acid〕5g를 황산칼륨(K2SO4) 50g과 잘 혼합(유발 이용)한다.
마) 0.01M-EDTA 용액 : EDTA-2Na(C 10H14N2Na2O8․2H2O) 3.7226g 또는 이의 무수물 3.3622g
을 증류수에 용해하여 1,000㎖로 만든 다음 폴리 에틸렌병에 보관 사용한다.
※  표정 : 0.01M-탄산칼슘 용액을 300㎖ 삼각플라스크에 25㎖를 정확히 취한 후 트리에탄
올아민용액 (1:1) 1㎖를 가하고 증류수 약 50㎖로 플라스크 내벽을 잘 씻으면서 채우고 
N,N지시약 0.1g를 가하고 8N-수산화나트륨용액 5㎖와 10% 시안화칼륨 (KCN)용액 1㎖ 
를 각각 가한 다음 0.01M-EDTA 용액으로 적정하여 몰농도 계수를 계산한다. 적정의 종
점은 미색에서 청색으로 변하는 점인데 이때 EDTA 용액이 떨어지는 순간 그 부위가 
무색으로 보인다.
    Factor(F) = 25/V (V : 0.01M-EDTA 용액 소요 ㎖수)
바) 0.01M-탄산칼슘용액 : 탄산칼슘을 110℃에서 항량이 될 때까지 건조 후 1.0008g을 칭
량하여 염산용액(1:1)으로 탄산가스를 제거하고 가온하여 용해한 후 증류수를 가하여 
1,000㎖로 만든다..
2) 시료액의 조제
원자흡광분광광도법의 시료액 조제와 동일.
3) 측 정4장. 무기물
25시료액 5㎖를 300㎖비커에 정확히 취하고 증류수 10㎖를 가한 후 8N-수산화나트륨용액 
5㎖, 10% KCN용액 1㎖, 트리에탄올아민 (1:1) 1㎖ 를 각각 가한 후 혼합한 다음 0.1g의 
N.N지시약을 넣고 0.01M-EDTA 용액으로 푸른색이 될 때까지 적정하는데 이때 EDTA용
액이 떨어지는 순간 그 부위가 무색으로 보인다.
4) 계 산
칼슘(%) = (0.01M-EDTA 용액소비량 ㎖×0.04008× 희석배수 × F)/시료의 중량(g)
F : 0.01M-EDTA 용액의 factor
2. 인(P)
가. 시약의 조제
1) 몰리브도 바나데이트 (Molybdo vanadate) 발색제
가) 암모늄몰리브데이트 (Ammonium molybdate) 25g을 증류수에 녹여 400㎖로 한다.
나) 암모늄메타바나데이트 (Ammonium metavanadate) 1.25g을 증류수 300㎖에 용해하고 질
산 250㎖를 가한 후 냉각하고 상기 가)와 나)의 두 용액을 합하여 1,000㎖까지 증류수
로 채워 발색제를 만든다.
2) 인(P)표준용액
105℃에서 1시간 건조 후 데시케이터에서 방냉한 제1인산칼륨(Potassium-phosphate, 
monobasic) 2.195g을 1,000㎖의 메스플라스크에 넣고 증류수로 용해하여 이 눈금을 맞춘
다. 이 용액은 500ppm의 표준용액이 된다. 이 표준용액을 10배 희석하여 50ppm의 표준
액을 만든 후 측정시 0, 2, 4, 6, 8, 10 ppm으로 만들어 사용한다.
나. 시료액의 조제
칼슘 정량시와 동일
다. 측 정
25㎖ 메스플라스크에 시료액 1～20㎖(인 함량에 따라)를 취하고 발색제 2.5㎖(용기 의
1/10)를 가한 다음 증류수로 표선을 맞춘 후 혼합하고 15분간 방치 후 파장 470㎚에서 
흡광도를 측정한다. 표준액도 같은 방법으로 실시한다.26라. 계 산
       인 (%) = 시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 × 희석배수
× 100
시료중량(g) × 106
3. 유황(S)
가. 시약의 조제
1) 염산용액(1:1) : 염산과 증류수를 동량부피 혼합한다
2) 10% 염화바륨(Barium chloride)용액 : 염화바륨 10g을 증류수에 용해하여 100㎖로 한다.
나. 시료액의 조제
시료 0.5g을 정확히 취하여 삼각 플라스크에 넣고 염산용액(1:1) 20㎖를 가하여 가열분해
(액량이 1/2될 때까지) 한 후 뜨거운 증류수로 용해하여 No.6 여과지로 여과한 후 전량
을 250㎖로 하여 시료액으로 한다.
다. 방 법
500㎖ 비커에 시료액 100㎖를 취하여 끓을 때까지 가열하면서 10% 염화바륨용액 10㎖를 
피펫으로 한 방울씩 가한다. 침전이 생긴 용액이 맑아질 때까지 끓인 후 약 3시간동안 
수조에서 가열하고 방치한 후 No.6 여과지로 여과하고 뜨거운 증류수로 8～10회 세척한 
뒤 침전물을 여과지와 같이 크루시블에 넣고 건조시킨 다음 800℃ 전기로에서 30분간 
회화하여 데시케이터에서 냉각 후 칭량한다.
라. 계 산
유황(%) =침전물의중량 × 0.1374
×250
×100
시료무게(g) 100
           100 : 시료액중 취한량(㎖)
           0.1374 : 침전 중 유황의 함량
           250 : 시료액의 전량(㎖)
4. 마그네슘(Mg)4장. 무기물
27가. EDTA 적정법(Volumetric 법)
1) 시약의 조제
가) 8N-수산화나트륨 용액 : 수산화나트륨 320g을 증류수에 녹여 1ℓ로 한다.
나) 10% 시안화칼륨용액 : 시안화칼륨 (KCN) 10g을 증류수에 녹여 100㎖로 한다.
다) 암모니아 ․염화암모늄완충액 (pH10.7) ：염화암모늄 (Ammonium chloride) 67.5g을 증류수에 
용해시킨 후 암모니아수 (Ammonium hydroxide) 570㎖를 가한 다음 증류수로 1ℓ를 만
든다.
라) 에리오크롬 블랙 T․염화나트륨 지시약 : 에리오크롬 블랙T(Eriochrome black T) 0.5g과 
염화나트륨 (Sodium chloride) 100g을 고르게 분말형태로 혼합한다.
마) 트리에탄올아민 (Triethanolamine) : 증류수와 동일한 량(1:1) 부피로 혼합
바) N, N지시약 : 칼슘 정량시와 동일
사) 0.05M-EDTA 용액 : EDTA-2Na 18.613g을 증류수에 용해하여 1ℓ로 한 다음 폴리에틸
렌병에 보관 사용한다.
※ 표정은 0.05M 탄산칼슘용액으로 칼슘정량에서와 같이 행한다.
2) 시료액의 조제
칼슘 정량시와 동일
3) 측 정
시료액 25㎖를 비커에 취하고 증류수 50㎖, 암모니아 ․염화암모니움 완충액(pH 10.7) 5㎖
를 넣고 에리오크롬 블랙 T. 염화나트륨지시약 0.04g을 넣은 후 0.05M EDTA 용액으로 
적정한다. 이때 종말점은 용액의 적자색이 청색으로 변한 때로 한다. 다시 시료액 25㎖
를 비커에 취하고 트리에탄올아민 (1: 1) 1㎖를 넣고 칼슘분석과 같은 방법으로 N.N지시
약 0.1g을 넣은 다음 0.01M EDTA 용액으로 적정한다. 
4) 계 산
      마그네슘(%) = (A-B) × 0.0012153 × 희석배수
×  100
시료중량(g)
     A : 에리오크롬블랙 T 지시약사용시 0.05M-EDTA 용액소비량 (㎖)
     B : N.N지시약 사용시 0.01M-EDTA 용액소비량 (㎖)의 1/5값28나. 원자흡광분광광도법
1) 시약 및 시료액의 조제
칼슘 정량시와 동일
2) 측 정
시료액 중 란타늄 함량이 1%되게 희석하여 미리 예열된 원자흡광분광광도계 파장 285㎚
에서 표준액을 측정 검량선을 작성 후 시료액을 측정하여 계산한다.
3) 계 산
      마그네슘(%) = 시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 × 희석배수
× 100
시료중량(g) × 106
5. 칼륨(K)
가. 시약의 조제
1) 칼륨(K)표준원액(1,000ppm) : 특급 염화칼륨(Potassium chloride : KCl)를 500～600℃에서 
40～50분간 가열하고 데시케이터 내에서 방냉 후 0.1907g을 취하여 100㎖ 메스 플라스
크에 넣고 증류수로 용해하여 전량을 100㎖로 한다. 시판 표준원액 사용 가능
2) 1% NaCl 용액
나. 시료액의 조제
칼슘분석법의 시료액의 제조와 동일
다. 측 정
표준용액과 시료액에 Na 농도가 1000～2000ppm이 되도록 첨가한 다음 미리 예열한 원
자흡광분광광도계 파장 766.5㎚에서 측정하는데 먼저 표준원액을 적당히 희석하여 검량
선을 작성 분석한다.4장. 무기물
29라. 계  산
칼륨(%) = 시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
× 100
시료중량(g) × 106
6. 철(Fe)
가. 시약의 조제
철(Fe)표준원액(1,000ppm) : 전해철(99.9%이상) 100㎎을 10㎖ 왕수에 가열 용해하여 증발
건고(蒸發乾固)직전에 가열을 중지하고 증류수로 녹여 100㎖로 만든다. 시판 표준원액 
사용 가능
나. 시료액의 조제
칼슘 분석법의 시료액 조제와 동일
다. 측 정
미리 예열한 원자흡광광도계 파장 248.3㎚에서 측정하는데 먼저 표준원액을 적당히 희석
하여 검량선을 작성 분석한다.
라. 계 산
철(%) =시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
× 100
시료중량(g) × 106
7. 나트륨(Na)30가. 시약의 조제
1) 나트륨(Na) 표준원액(1,000ppm) : 특급염화나트륨 (Sodium chloride: NaCl)을 500～600℃에
서 40～50분간 가열하고 데시케이터내에서 방냉한 후 0.254g을 취하여 증류수로 용해 
전량을 100㎖로 하여 폴리에틸렌병에 보관한다. 시판 표준원액 사용가능
2) 1% 칼륨용액 : 특급 KCl 19.07g을 증류수에 녹여 1000㎖로 만든다.
나. 시료액의 조제
칼슘분석법의 시료액 제조와 동일
다. 측 정
표준용액과 시료액의 나트륨농도가 1000ppm이 되도록하여 원자흡광분광광도계 588.9mm
에서 표준용액으로 검량선을 구한 다음 시료액의 흡광도를 구한다.
라. 계 산
나트륨(%) = 시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
× 100
시료중량(g) × 106
8. 염분(NaCl)
가. 적정법
1) 시약의 조제
가) 활성탄(Activated charcoal)
나) 에틸에테르 (Diethyl ether)
다) 질산(Nitric acid)
라) 황산철 암모늄(Ammonium ferric sulfate) 포화용액
마) Carrez 용액 Ⅰ : 증류수에 2수염의 초산아연(Zinc acetate dihydrate) 21.9g을 녹이고 
여기에 빙초산(Glacial acetic acid) 3㎖를 가하고 증류수로 100㎖까지 희석하여 만든다.
바) Carrez 용액Ⅱ : 황혈염(Potassium ferrocyanide) 10.6g을 증류수에 녹여 100㎖로 만든
다.
사) 0.1N-치오시안산 암모늄용액 (Ammonium thiocyanate) 또는 0.1N-치오시안산칼륨용액4장. 무기물
31(Potassium thiocyanate) (0.1N-용액은 순수한 KSCN 약 9.7g을 증류수에 녹여 1,000㎖로 
만든다)
*  표정: 이미 표정한 0.1N-질산은 용액 20㎖를 삼각플라스크에 취하고 진한 질산 0.5㎖와 
황산철 암모늄(Ammonium ferric sulfate) 포화용액을 1㎖ 가한 다음 뷰렛으로부터 치오
시안칼륨(KSCN) 표준용액을 적하한다. 액이 백색에서 미홍색으로 되는 점에서 적정을 
끝낸다. 적정에 소요된 치오시안산칼륨용액의 ㎖수가 V㎖ 이라면 0.1N-치오시안산 칼
륨용액의 FSCN = 20.0 × FAg / V이다.
아) 0.1N-질산은 용액 : 특급질산은 17.0g을 증류수에 녹여 1,000㎖로 만든다.
*  표정: 특급염화칼륨을 100～120℃에서 2시간 건조하여 데시케이터에서 방냉하여 3.7g을 
정확히 취하여 증류수에 녹여 500㎖로 만든다. 염화칼륨의 양을 a g이라고 하면 0.1N 
- 염화칼륨 용액의 역가는 FCl = a/3.728 이다.
삼각플라스크에 0.1N-염화칼륨 기준용액을 정확히 20㎖ 취하여 1% 옥살산칼륨용액 5
방울을 가하고 뷰렛에서 질산은 표준용액을 적하하여 염화은의 침전을 함유한 황백색
액이 오렌지색으로 되는 점을 종말점으로 한다.
적정에 소요된 표준용액을 a ㎖, 사용한 염화칼륨 기준액을 b ㎖, 그 역가를 FCl로 하
면 0.1N-질산은 표준액의 역가는 FAg = FCl × b/a(여기에서 b = 20이다)
2) 시료액의 조제
가) 유기물이 전혀 없는 시료
10g미만(Cl 함량이 3g미만)의 시료를 500㎖ 메스플라스크에 넣고 증류수(약 20℃) 400
㎖를 가하고 믹서(Mixer)에서 30분간 혼합한 다음 증류수로 표선까지 채우고 혼합한 다
음 여과한다.
나) 유기물이 포함된 시료
① 시료 5g을 250㎖ 메스플라스크에 넣고 활성탄(Activated charcoal) 1g을   넣는다.
② 약 20℃의 증류수 200㎖까지 채우고 여과한다.
③ Carrez용액 Ⅰ 5㎖를 넣어 잘 혼합하고 다시 Carrez용액 Ⅱ 5㎖를 넣는다.
④ 30분간 믹서에서 혼합한 다음 250㎖까지 증류수로 채우고 여과한다.
3) 방  법
가) 앞에서 얻은 용액 25～100㎖(Cl 함량이 150㎎이하)에 질산 (Nitric acid) 5㎖와 포화 황
산철암모늄 (Ammonium ferric sulfate)용액 5㎖를 넣는다.
나) 여기에 과잉의 질산은을 넣는다.
다) 에테르 5㎖를 넣고 침전물이 응고되도록 강하게 흔들어 준다.32라) 남아있는 질산은 용액(10㎖)을 0.1N-치오시안(Thiocyanate) 용액으로 적갈색이 약 1분
간 지속될 때까지 적정한다.
4) 계  산
염분(%) = W/시료무게(g)× 1/1000 × 100
W : 5.844 × (V1 × FAg - V2 × Fscn)
W : 염화나트륨 ㎎ 
V1 : 0.1N - 질산은 용액 ㎖
V2 : 0.1N - 치오시안산 암모늄 용액, 또는 0.1N - 치오시안산 칼륨용액 ㎖
FAg : 0.1N - 질산은 용액의 역가
Fscn : 0.1N - 치오시안산 칼슘 용액의 역가
나. 퀀탑법(Quantab chloride Titrator)
1) 기구 : 삼각 플라스크, 비커
2) 시 약 : 퀀탑
3) 시료액의 조제
시료 5g을 300㎖ 삼각플라스크에 취하고 뜨거운 증류수 45㎖를 가하여 잘 흔들면서 염
분을 용해시킨 후 비커에 No.5A여과지로 여과하여 시료액으로 한다.
4) 측 정
시료액에 퀀탑(No. 1176)을 담그고 가운데의 색이 녹색으로 변하면서 위로 올라가 가로
줄이 완전히 변하면 반응이 끝난 것으로 보고 퀀탑을 꺼내어 황색으로 변한 점의 눈금
을 읽어 계산하는데 염분의 농도가 높으면 시료액을 희석하여 측정한다.
5) 계 산
눈금을 읽은 수치를 표에서 찾아 그때의 함량에 희석배수를 곱한다.
9. 염소(Cl)4장. 무기물
33가. 시약, 시료액의 조제 및 측정법 : 염분정량시와 동일
나.  계 산
염소(%) = W/시료무게(g) × 1/ 1000 ×100
W : 3.545×(V 1×FAg-V2 ×Fscn)
W : 염소(Cl) ㎎ 
V1 : 0.1N-질산은 용액 ㎖
V2 : 0.1N-치오시안산 암모늄용액 또는 0.1N - 치오시안산 칼륨용액 ㎖
FAg : 0.1N-질산은 용액의 역가
Fscn : 0.1N-치오시안산 칼륨 용액의 역가
10. 망간(Mn)
가. 원자흡광분광광도법
1) 시약의 조제
망간(Mn)표준원액 : 금속망간(99.9%) 100㎎을 취하여 왕수(염산 3 : 질산 1) 5㎖를 가하여 
황색연기가 없어질 때까지 가열 용해한 후 방냉하여 증류수로 100㎖가 되게 한다. 시판
표준원액 사용가능
2) 시료액의 조제
칼슘 분석법의 시료액 조제와 동일
3) 측 정
미리 예열한 원자흡광분광광도계 파장 279.5㎚에서 측정하는데 먼저 표준원액을 적당히 
희석하여 검량선을 작성하고 시료액의 흡광도를 구한다.
4) 계 산34망간(%) =시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
× 100
시료중량(g) × 106
나. 분광광도법 (과요오드산 칼륨법)
1) 시료액의 조제 
칼슘정량시와 동일 
2) 방법
가) 전처리한 시료를 100㎖ 비커에 넣고 황산용액(1+1) 10㎖ 넣어 가열 증발시켜 황산의 
흰 연기를 발생시킨다 .
나) 냉각한 다음 물 30㎖와 인산 1㎖를 넣어 가열하면서 녹이고 불용성 물질에 석출되면 
여과하고 침전을 씻어 준 다음 여액과 씻은 액을 합하여 가열 농축하여 약 30㎖로 한
다. 과요오드산 칼륨 0.5g을 넣어 끓는 수욕 중에서 30분간 끓인다.
※  과요오드산칼륨으로 산화할 때 장시간 끓여 주면 생성된 과망간산이 분해되므로 주의
하여야 함
다) 냉각시킨 다음 50㎖용량 플라스크에 옮겨 증류수를 표선까지 채워 흔들어 섞는다. 이 
용액의 일부를 10㎜ 흡수셀에 넣어 분광광도계로 525㎚에서 흡광도를 측정하고, 미리 
작성한 검량선으로부터 망간의 양을 구하고 농도(㎎/ℓ)를 산출한다.
3) 계 산
망간(%) =  시료액흡광도 / 1ppm 기준흡광도 ×희석배수
× 100
시료무게(g) ×  106
11. 아연(Zn)
가. 분광광도법 (진콘법)
1) 시약의 조제
가) 5% 수산화나트륨 용액
나) 1% 시안화칼륨 용액 : 시안화칼륨 10g을 물에 녹여 1,000㎖로 한다. 이 용액을 강염기4장. 무기물
35성 음이온 교환수지인 R-OH형에 유출시키고 수지가 R-CN형으로 변화한 다음의 유출
액을 취한다.
다) 10% 포수클로랄용액 : 포수클로랄 (1수화물) 10g을 물에 녹여 100㎖로 한다.
라) 시료액의 조제 : 칼슘 정량시와 동일
2) 방 법 
가) 시료 적당량을 100㎖ 비커에 취하여 5% 수산화나트륨 용액을 한 방울씩 떨어뜨려 약 
pH 7로 중화한다.
나) 아스코르빈산나트륨 0.5g, 1% 시안화칼륨용액 1㎖를 넣고 잘 흔들어 섞는다. 다음에 
염화칼륨 ․수산화나트륨 완충액(pH 9.0) 5㎖, 진콘용액 3㎖, 10% 포수클로랄 용액 3㎖를 
넣어 흔들어 섞고 2～5분간 방치하여 층장 10㎜ 흡수셀에 옮겨 검액으로 한다. 따로 
아연을 함유하지 않은 물을 취하여 대조액으로 한다.
다) 분광광도계로 620㎚에서 검액의 흡광도를 측정하고 미리 작성한 검량선으로부터 아연
의 양을 구하고 농도(㎎/ℓ)를 산출한다.
3) 계 산
아연(%) =  시료액흡광도 / 1ppm 기준흡광도 × 희석배수
× 100
시료무게(g) ×  106
나. 원자흡광분광광도법
1) 시약의 조제
아연(Zn) 표준원액(1,000ppm) : 금속아연(99.9%이상) 100㎎을 염산용액(1+3) 5㎖로 가열 
용해하여 증류수로 100㎖가 되게 한다. 시판 표준액 사용 가능
2) 시료액의 조제
칼슘분석법의 시료액 조제와 동일
3) 측 정
미리 예열한 원자흡광분광광도계 파장 213.9㎚에서 측정하는데 먼저 표준 원액을 적당히 
희석하여 검량선을 작성하고 시료액의 흡광도를 구한다.364) 계 산
칼슘의 원자 흡광광도법과 동일
아연(%) =  시료액흡광도 / 1ppm 기준흡광도 × 희석배수× 100시료무게(g) ×  106
12. 구리(Cu)
가. 분광광도법 (디에틸디티오카바민산법 )
1) 시약의조제
가) 0.1% 메타크레졸퍼플에틸알콜 용액
나) 구연산 2암모늄 용액, 에틸렌티아민테트라초산나트륨 용액, 초산부틸 : 동시험용
다) 암모니아수 (1:1)
라) 1% 디에틸디티오카바민산나트륨 용액 : 디에틸디티오카바민산나트륨 (3수화물) 1.3g을 
물에 녹여 100㎖로 한다. 착색용기에 보관하여 14일 이내에 사용한다.
마) 시료용액 : 칼슘 정량시와 동일
2) 방 법
가) 전 처리한 시료 적당량을 분액깔대기에 넣어 0.1% 메타크레졸퍼플에틸알콜 용액 2～3
방울 넣고 구연산2암모늄 용액 2㎖, 에틸렌티아민테트라초산나트륨 용액 1㎖를 넣고 
암모니아수로 엷은 자색을 나타낼 때까지 중화하고 물을 넣어 50㎖로 한다.
나) 1% 디에틸디티오카르바민산나트륨 용액 2㎖를 넣고 초산부틸 10㎖를 정확히 넣어 약 
2분간 세게 흔들어 섞고 정치한다.
다) 초산부틸층을 분리하고 건조한 여지로 여과하고 용액의 일부를 층장 10㎜흡수셀에 넣
어 분광광도계로 440㎚에서 흡광도를 측정하고, 미리 작성한 검량선으로 부터 동의 양
을 구하고 농도를 산출한다.
3) 계 산
     구리(%) =  시료액흡광도 / 1ppm 기준흡광도 × 희석배수
× 100시료무게(g) ×  1064장. 무기물
37나. 원자흡광분광광도법
1) 시약의 조제
구리(Cu) 표준원액(1,000ppm) : 금속동(99.9%이상) 100㎎을 질산(1+2) 20㎖를 가하여 가열
용해하고 증발건고(蒸發乾固)하고 냉각 후 증류수를 가하여 용해 전량을 100㎖로 한다. 
시판 표준원액 사용가능
2) 시료액의 조제
칼슘분석법의 시료액 제조와 동일
3) 측 정
미리 예열한 원자흡광광도계 파장 324.7㎚에서 측정하는데 먼저 표준원액을 적당히 희석
하여 검량선을 작성하고 시료액의 흡광도를 구한다.
4) 계 산
구리(%) =  시료액흡광도 / 1ppm 기준흡광도 × 희석배수
× 100시료무게(g) ×  106
13. 코발트(Co)
가. 시약의 조제
1) Co 표준용액(1000ppm) 을 10㎖를 취하여 100㎖ 메스플라스크에 넣고 증류수로 표선까지 
채워 100ppm으로 희석한다.
2) Spekker acid : 85% H3PO4 150㎖＋H2SO4 150㎖＋D.W. 700㎖
3) Nitroso-R salt soln. : C10H4OHNO(SO 3Na)2 2g을 증류수 100㎖에 녹인다.
4) Sodium acetate soln.. : NaOAC ․3H2O(CHCOONa) 500g을 증류수 100㎖에 녹인다.
5) 질산(HNO3) 
나. 방 법38전 처리한 시료 적당량을 100㎖ 메스플라스크에 넣고 1:1 염산 5㎖ 정도를 넣어 용해시
킨 후 100㎖로 정용하여 이 액을 다시 100㎖ 메스플라스크에 1㎖를 뽑아 넣고 코발트 
표준용액을 1, 3, 5ppm 비율로 취하여 Spekker acid를 각각 2㎖씩 뽑아 넣고 Sodium 
acetate 용액을 각각 10㎖씩 넣는다. Nitroso-R salt 용액을 5㎖ 넣은 후 이 액들을 가열
교반기에서 끓기 시작하면서 1～2분 사이에 질산 5㎖을 서서히 넣는다. 이 액들을 방냉 
시킨 후에 100㎖로 표선을 채운 후 2시간 이내에 비색계에서 측정한다. 이 때 파장은 
540㎚이다. 
단 blank는 Spekker acid 2㎖, Sodium acetate soln.. 10㎖만 넣어 100㎖ 메스플라스크에 
표선을 채운다. 시료액도 std.와 같이 최종 희석시킨 후 측정한다.
다. 계 산
코발트(%) =  시료액흡광도 / 1ppm 기준흡광도 × 희석배수
× 100
시료무게(g) × 106
14. 몰리브덴(Mo)
가. 치오시안산나트륨법
1) 시약의 조제
가) 표준몰리브덴액 : 특급3산화몰리브덴 (MoO3. 황산데시케이터중에서 24시간 이상 건조한 
것) 1.5g을 소량의 물로 적시고, NaOH 5g을 가하여 녹인 후, 물을 가하여 정확히 1ℓ
로 하여 표준 Mo 원액을 조제하고 착색병에 저장한다. 사용시 이 원액의 일정량을 물
로 정확히 100배 희석한다.
나) 치오시안산나트륨 : NaSCN 10g을 물에 녹혀 100㎖로 한다.
다) 황산철(Ⅲ) 액 : 황산철(Ⅲ) 5g을 물 및 황산(1:1) 약 10㎖에 녹이고 100㎖로 한다.
라) 염화주석(Ⅱ)액 : 염화주석(Ⅱ) 100g을 염산(1:1) 400㎖를 가해 가온하여 녹인 후 물을 
가하여 1ℓ로 하고 소량의 입상주석을 가하여 착색병에 저장한다. 
2) 공시액의 조제
시료 2～10g을 자제증발접시에 취하고 처음은 열판상에서 가열하여 탄화시키고 , 다음 약 
250℃의 전기로에 넣고 1시간 약 50℃ 전후의 승온온도로 가열하여 약 450℃에서 회화
시킨다. 방냉후 질산 약 5㎖를 가해 열판상에서 가열하여 분해하고 다시 가열을 계속해 4장. 무기물
39산을 거의 증발시켜 방냉한다. 방냉후 온염산(1 : 5) 약 25㎖를 가해 잠시 가열하여 녹이
고 냉각 후 물을 가해 정확히 100㎖로 한 후 즉시 건조 여지로 여과한다.
3) 방 법
공시액의 일정량을 100㎖의 메스플라스크에 정확히 취하고 황산(1:1) 5㎖(황산으로 분해
한 공시액에서는 함유한 황산량 만큼 감한다) 과염소산 5㎖ 및 황산철액 2㎖를 가하여 
혼합하고, 다시 치오시안산나트륨액 16㎖ 및 염화주석(Ⅱ)액 10㎖를 공시액을 진탕하면
서 서서히 차례로 가한 후 눈금까지 물을 가한다. 철에 의한 적색이 없어진 후 용액이 
혼탁한 경우에는(혼탁이 치오시안산동 (1)에 의한 때는 1시간 방치한 후) 원심분리하여 
제거하고 공시험의 액을 대조액으로 파장 460㎚ 부근에서 흡광도를 측정한다. 따로 표준 
Mo을 몇 단계로 정확히 취하고 공시액의 경우와 동일조건에서 조작하여 작성한 검량선
에서 Mo의 량을 구한다.
나. 원자흡광분광광도법
1) 시약의 조제
가) 표준몰리브덴액 : 치오시안산나트륨법에 준한다
나) 8-퀴노리놀액 : 8-퀴노리놀(옥신 : C9H6N․OH) 20g을 비커에 취하고 빙초산 50㎖를 가하
여 수욕상에서 가열하여 녹인 후 물을 가하여 100㎖로 한다.
2) 공시액의 조제
치오시안산나트륨법의 공시액 조제에 준한다.
3) 방 법
공시액의 일정량을 100㎖의 메스플라스크에 정확히 취하고, 1M 염산 10㎖ 8-퀴노리놀 5
㎖ 및 물을 가하여 약 80㎖로 하고 잘 진탕한 후 잠깐 방치한다. 2-heptanone 또는 
4-methyl -2-pentanone 5～10㎖를 가하고 1～2분간 격렬하게 진탕한 후 정치한다. 여기
에 물 약 20㎖를 가하고 상층의 유기용매층에 대해 원자흡광분석기로 파장 313.3㎚에서 
흡광도를 측정한다. 동시에 표준 몰리브덴액을 몇단계로 정확히 취하고 공시액의 경우와 
동일 조건에서 조작하여 작성한 검량선에서 Mo의 량을 구한다.
15. 요오드(I)
가. 대상시료 : 혼합광물질 사료(유기물이 전혀 포함되지 않은 시료)40나. 방 법
200～300㎖의 Ni 접시에 시료 적당량을 칭량하고 약 5g Na2CO3, 1:1 NaOH 5㎖, 알콜 1
㎖를 가하여 시료가 축축히 젖도록 한다. 알콜을 날리기 위해 steam bath에서 가열한다. 
가열 후, 시료가 튀는 것을 방지하기 위해 약 100℃에서 건조한다. (약 30분 정도)  Ni 
접시를 500℃ 전기로에서 15분간 방치한다.(500℃에서 태우는 것은 Br2-H2O에 의해서 산
화되는 가용성 유기물을 탄화시키기 위해 필요하다. 필요하다면 500℃ 이상에서 진행하
여도 된다) 방냉 후 25㎖ 증류수를 가하여 시계접시를 덮고 서서히 10분간 끓인다. 18㎝ 
여과지에 여과하고 끓는 물로 씻는다. (600㎖ 비커에 여과하고 여과액은 약 300㎖가 되
어야 한다) 메틸오렌지를 지시약으로 85% H3PO4를 과잉으로 가하고 5분이상 색이 없어
질 때까지  서서히 끓인다. 약간의 salicylic acid 결정을 가하고 약 20℃로 방냉한다. 
85% H3PO4 1㎖를 가하고 약 0.5g KI를 가한다. 0.005N Na2S2O3로 I2를 적정한다. 유리된 
I2의 색깔이 거의 없어지면 starch 용액을 가한다.
다.  계산 : 1㎖ 0.005N Na2S2O3 = 0.1058㎎ I2
16. 산화알루미늄 (Al2O3)
가. EDTA법(Volumetric 정량법)
1) 기 구  
백금크루시블 (자제 크루시블), 전기로, 비커, 수조(Water bath), 세척병
2) 시약의 조제 
가) 초산암모늄 완충용액 (pH 4.8) : 초산암모늄 (Ammonium acetate) 77g을 증류수 200㎖에 
녹이고 빙초산 57㎖를 넣은 다음 증류수로 1ℓ가 되게 한다.
나) 에리오크롬 블랙 T. 염화나트륨지시약 : 에리오크롬블랙 T(Eriochrome black T) 0.5g과 
염화나트륨 (Sodium chloride) 100g을 분말형태로 고르게 혼합한다. 
다) 0.05M-초산아연 용액 : 초산아연(Zinc acetate) 10.975g을 증류수 1ℓ에 녹인다. 
※ 표정 : 0.05M-EDTA 용액 20㎖를 정확히 비커에 취하여 증류수 50㎖를 가하고 pH10.7 
암모니아, 염화암모늄 완충액 3㎖ 및 에리오크롬 블랙 T. 염화나트륨 지시약 약 40mg
을 넣고 0.05M-초산아연용액으로 적정하여 Mol 농도 계수를 계산한다.
라) 0.05M-EDTA 용액 : EDTA-2Na 18.613g을 증류수 1ℓ에 녹인다. 4장. 무기물
41마) 암모니아. 염화암모늄 완충액(pH 10.7) : 염화암모늄 (Sodium chloride) 67.5g을 증류수에 
용해시킨 후 암모니아수 (Ammonium hydroxide) 570㎖를 가한 다음 증류수로 1ℓ를 만
든다. 
3) 시료액의 조제 
시료 2g을 백금 크루시블(또는 자제 크루시블)에 취하고 탄산나트륨 (Sodium carbonate) 
4g을 넣어 완전히 혼합하고 다시 탄산나트륨 1g으로 표면을 덮고 뚜껑을 덮은 후 온도
를 서서히 올려 850℃ 이상에서 2시간 용융하고(완전히 용융된 것을 육안으로 점검) 방
냉 후 증류수 30㎖로 내용물을 씻어 300㎖ 비커에 넣은 후 다시 농염산 30㎖와 과염소
산(Perchloric acid) 10㎖로 크로시블을 잘 씻어 비커에 넣고 Water bath에서 백색가루가 
될 때까지 증발건고한 후 뜨거운 증류수로 녹여 No.6 여과지로 여과하여 전량을 500㎖
로 하여 시료액으로 한다. 이때 여과지에 남아있는 잔사는 0.5% 염산으로 10~12회 씻어
주고 다시 증류수로 씻어준 후 중량을 구하여 규산으로 한다. 
4) 측 정
시료액 20㎖를 300㎖ 비커에 정확히 취하고 0.05M-EDTA 용액 30㎖를 정확히 넣고 초산
암모늄완충용액 (pH 4.8) 20㎖를 넣은 다음 5분간 끓인 후 실온에서 방냉한다. 이 액에 
에탄올 55㎖를 넣고 암모니아. 염호암모늄지시약 40mg정도 넣고 0.05M-초산아연 용액으
로 적정하는데 , 종말점은 엷은 녹색에서 엷은 적색으로 변할 때로 하고 같은 방법으로 
공시험을 한다. 
5) 계 산 
산화알루미늄 (%) =  0.00254908 × f × 희석배수 × (A-B)× 100시료무게(g)
나. 중량법
1) 기 구  
백금크루시블 (자제크루시블 ), 전기로, 비커, 세척병, Water bath, 건조기, 원자흡광광도계 , 
분광광도계 , 422) 시약의 조제
가) 0.5%(v/v)염산 : 농염산 5㎖를 취하여 증류수 1ℓ 되게 한다. 
나) 암모니아수 용액 (1:3) : 암모니아수와 증류수를 1:3 비율로 희석
다) 2% 염화암모늄 용액 : 염화 암모늄(Ammonium chloride) 20g을 증류수로 용해하여 1ℓ
로 한다. 
3) 시료액의 조제 
Volumetric 방법과 동일
4) 측 정
시료액 중에서 200㎖를 취해서 300㎖ 비커에 넣고 메칠레드 지시약 2～3 방울을 떨어뜨
린 후 서서히 교반하면서 암모니아수 (1:3)를 가하여 연노란색을 띤 은백색의 침전이 생
기면 멈추고 가열하여 탄산가스와 암모니아를 날려보낸 후 No.6 여과지로 여과하여 침
전을 뜨거운 증류수로 충분히 씻어준 후 2% 염화암모늄 용액으로 3회 씻어주고 뜨거운 
증류수로 충분히 씻어준 후 건조하여 크루시블에 넣고 뚜껑을 덮은 후 800℃에서 2시간 
태우고 데시케이터에서 40분간 방냉 후 무게를 측정한다. 이때 시료액에 대하여 산화철
고 5산화인의 함량을 별도로 구한다. 
5) 계 산
산화알미늄 (%) =  잔사중량 - (산화철 + 5산화인)× 100시료무게(g)
시료의 중량(g) : 2g X 250/500
※ 산화철과 5산화인은 상기 시료중량에 대한 함량임4장. 무기물
4317. 셀레늄(Se)
가. 시약의 조제
1) 셀레늄 표준액
셀레늄 0.5g을 정확히 칭량하여 톨비이커에 넣는다. 초산 10㎖를 가해 수욕조에서 가열 
용해한다. 과연소산 2㎖를 가하고 가열하면서 약 2㎖ 정도가 될 때까지 농축하고 염산 5
㎖를 가하여 5분간 가열한다. 방냉 후 증류수로 500㎖ 메스플라스크에 옮겨 담고, 표선
까지 증류수를 가하여 셀레늄 표준원액을 조제한다. 사용시, 표준원액의 일정량을 염산 : 
증류수(1:100)으로 정확히 희석하고 1㎖중에 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1㎍을 함유하는 각 
셀레늄 표준액을 조제한다.
2) 디아미노나프탈렌액
2,3-디아미노나프탈렌 0.1g을 200㎖ 톨비이커에 넣는다. 염산 : 증류수(1:100)을 가하고 
50℃ 수욕조에서 가온하면서 용해한다. 방냉 후 이 액을 분액여두 A에 넣고 시클로핵산 
40㎖를 가하여 진탕한다. 수층(하층)을 분액여두 B에 넣고 시클로헥산 40㎖를 가하여 진
탕하고 수층을 No. 2S여과지로 여과한다.
3) EDTA 용액
에틸렌디아민 4초산2수소나트륨 2수화물 18.6g을 증류수로 용해하여 500㎖로 한다.
나. 시료용액 조제
분석시료 2g을 정확히 칭량하여 200㎖의 톨비이커에 넣는다. 질산 20㎖ 및 과염소산 5㎖
를 가하여 시계접시를 덮고 하룻밤 방치한다. 가열교반기에서 서서히 가열하다 거품이 
사라지면 온도를 높여 건고 직전까지 농축한다. 방냉 후, 염산 5㎖를 가하고 5분간 가열
하여 환원시킨다 . 다시 방냉 후 증류수로 100㎖의 메스플라스크에 옮기고 표선까지 증류
수를 가하여 시료액으로 한다. 시료를 넣지 않고 조제하여 blank로 한다.
다. 방 법
시료액의 일정량을 100㎖의 톨비이커에 정확히 넣는다. EDTA 용액 5㎖를 가하여 pH를 
염산 : 증류수(1:4)로 1.0～1.5로 조정한 다음 염산:증류수(1:100)로 100㎖의 분액여두에 옮
겨 담는다. 시클로헥산 10㎖를 정확히 가하고 5분간 진탕한다. 방치한 후 수층(하층)을 
버리고 잔류액을 염산 : 증류수(1:100) 25㎖씩 2회 진탕 세정한다. 시클로핵산층 (상층)을 
시험관에 옮겨담고, 적당량의 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 후 No.2S여과지로 여과하
여 시료액으로 한다. blank용액 및 각 셀레늄 표준액을 동일하게 조제한다. blank용액을 
대조액으로 하고 시료용액에 대하여 여기파장 378㎚ 및 형광파장 520㎚로 형광광도를 
측정한다.4418. 규산(이산화규소 -SiO2), 규소
가. 중량분석법
1) 정 의
시료를 용융처리하여 수용성으로 만든 것을 증발 건고 한 후 칭량하고 여기에 불산과 
황산을 넣어 가열하여 규소를 희산시켜 전후 차이에 의한 규산을 구하는 방법으로 사료 
중의 규산(SiO2) 성분을 산출하는 방법에 대하여 기술한다.
2) 측정기기 및 원리
규산염에 Na2CO3과 K2CO3을 넣고 가열 용융하면 규산은 Na2SiO3 또는 K2SiO3로 Mg는 
KMgO 또는 MgCO 3로 되고, Al은 KAlO2, NaAlO 2 상태로 되어 수용성이 된다. 규산외의 
물질은 용해, 여과 과정을 거쳐 분리되게 하고 규산 잔사를 측정
3) 시약, 초자기구 및 기기
가) 시 약 
① 용융합제(Na2CO3 : K2CO3  5:7)
② Hydrochloric acid(염산) : 36 %의 반도체용
③ Water : 3차 증류수
나) 초자기구
① Tall beaker(톨 비이커) : 300 mL(Pyrex 재질)
② 백금 도가니 : 50 mL(850 ℃ 이상에서 견딜 수 있어야 한다)
③ Filter paper : Ash free 제품(No. 6)으로 한다.
다) 기 기
① 회화로(Muffle Furnace) : 250 ℃부터 850 ± 10 ℃까지 정확하게 조절 가능한 것이어
야 한다.
② 화학저울(Chemical Balance) : 정확도는 0.0001 g 정도
4) 분석방법
가) 알칼리용융처리4장. 무기물
45① 백금도가니에 용융합제(Na2CO3과 K2CO3을 5:7로 혼합) 2g와 시료0.4g 정도를 넣고 혼
합한 후 용융합제 1g을 덮고 850℃에서 2시간 이상 용융한다. 
② 백금도가니가 식으면 용융상태를 확인하고, tall beaker에 백금도가니를 넣고 염산(1:1)
을 백금도가니에 가한 뒤 방치하여 용해시킨다 . 백금도가니 바닥에 남은 용융물질을 
tall beaker 에 여러번 씻어 넣는다.
③ tall beaker를 물중탕 97℃에서 완전건고 될 때까지 건고하고, 건고위에 진한염산을 
적시고 증발, 건고 시킨다. 이것을 5회 이상 반복한다.
④ tall beaker에 1%HCl을 넣어 건고물질을 녹인 다음 No.6 거름종이에 조용히 붓고 tall 
beaker를 1%HCl로 수차 씻어 넣는다. 1% HCl로 용융물질 거르는 작업을 5회 이상 반
복한다. 다시 온수로 5회 이상 씻어 내린다. 여과지에 남아있는 잔사에 0.5%염산으로 
10회이상 씻고 다시 증류수로 씻어 건조시킨다 .
⑤ 600℃에서 30분간 강열한 후 데시케이터에서 방냉하고 무게를 측정한 백금접시 또는 
자기접시에 거름종이를 넣고 온도를 서서히 올려 600℃에서 2시간 회화 후 같은 
desiccator 에서 방냉한다. 
나) 데이터 분석 및 정리
① 함량을 규산(SiO2)으로 나타낼 경우
함량(％)=(5)의 건조전후의 무게차(g)/시료량(g)×100
② 함량을 규소(Si)로 나타낼 경우
함량(％)=(5)의 건조전후의 무게차(g)/시료량(g)×0.467×100
나. 알칼리 용융처리 후 ICP분석법
1) 측정 및 분석 원리
규산을 알칼리 용융하면 규산은 수용성이 된다. (SiO2+Na2CO3→1000℃용융→Na2SiO2+CO2) 
수용상태의 규소를 고주파유도코일에 의하여 형성된 Ar Plasma에 도입하여 6000～8,000 
oK에서 원자가 여기상태(excited state)로 되었다가 기저상태(ground state)돌아갈 때 방출
하는 발광선 및 발광광도를 측정하여 규산을 분석하여 농도를 산출한다.
2) 기 기
전기로. 백금도가니 . ICP-AES. 열판.
3) 시 약
탄산나트륨 (Na2CO3) 
4) 시료의 전처리46가) 백금도가니에 시료 0.25g정도를 채취하여 탄산나트륨 1g과 충분히 혼합한 다음, 그 위
에 탄산나트륨 1g을 덮는다.
나) 이것을 전기로에 넣고, 1000℃에서 30분간 용융한다.
다) 식힌 다음, 증류수를 도가니의 80%정도 넣어 열판위에서 열을 서서히 가열 녹인다. 이 
과정을 3차례정도 반복하여 flask(PVC)100 ㎖에 넣고, 물로 make- up한 후 filter paper 
(No. 6)로 거른다.
라) 처음 거른 용액은 버리고 거른액 1㎖를 정확히 취하여 flask (PVC)50 ㎖에 넣고 0.4N 
Na2CO3 make-up 한다. 
     ※ 화학천칭을 이용하면 정확한 배수 값을 얻을 수 있다.
5) ICP 기기 분석
가) 검정파장 251.611nm 에서 분석한다. 기기의 warming-up 은 25분 이상 실시한다.
나) Standard는 분석물질 농도가 검량선 중앙에 올 수 있도록 하고 3～4단계의 표준용액을 
조제한다. 표준용액은 실내온도에서 화학천칭을 이용하여 제조하고 matrix는 0.4N 
Na2CO3 한다. 시료의 matrix와 일치 시킨다.
다) 19. ICP 발광분광분석법에 따른다.
6) 데이터 분석 및 정리
가) 함량을 규산(SiO2)로 나타낼 경우
규산함량(％)=분석치(ppm)×희석량(㎖)/시료량(g)×2.139×10,000
나) 함량을 규소(Si)로 나타낼 경우
규소함량(％)=분석치(ppm)×희석량(㎖)/시료량(g)×10,000
7) 분석결과 처리
규산의 측정값은 일반적인 등록치의 1/10의 수치까지 기록하되, Data의 값은 소숫점 이
하 2자리까지로 보며, 소숫점 이하 3자리에서 반올림 한다.4장. 무기물
4719. ICP 발광분광분석법
가. 표준용액의 제조
1) 단일원소표준용액
표준곡선작성을 위해서 표준용액계열을 만드는 보존용액으로서 , 아래와 같이 만들어
(1000㎍/㎖), 적당히 필요한 농도로 희석하여 사용한다.
· Na : NaCl 2.542g을 정밀히 달아 물에 녹여 1ℓ로 한다.
· Mg : Mg(NO 3)2․6H2O 10.550g을 정밀히 달아 물에 녹여 0.1N 질산으로 1ℓ로 한다.
· P : (NH4)2HPO4 4.620g을 정밀히 달아 물에 녹여 1ℓ로 한다.
· K : KCl 1.907g을 정밀히 달아 물에 녹여 1ℓ로 한다.
· Ca : CaCO3 2.497g을 정밀히 달아 소량의 염산을 가하여 녹이고 0.1N 염산으로 1ℓ
되게 한다. 
· Cr : K2Cr2O7 2.829g을 정밀히 달아 물에 녹이고 0.02N 질산으로 1ℓ되게 한다.
· Mn : Mn 1.000g을 정밀히 달아 물에 녹이고 소량의 8N 질산을 가하여 가열하여 녹인 
다음 0.1N 질산으로 1ℓ되게 한다.
· Fe : Fe 1.000g을 정밀히 달아 소량의 8N 질산을 가하여 녹인 다음 0.1N 질산으로 1
ℓ되게 한다.
· Co : Co 1.000g을 정밀히 달아 소량의 8N 질산을 가하여 녹인 다음 0.1N 질산으로 1
ℓ되게 한다.
· Cu : Cu 1.000g을 정밀히 달아 소량의 8N 질산을 가하여 녹인 다음 0.1N 질산으로 1
ℓ되게 한다.
· Zn : Zn 1.000g을 정밀히 달아 소량의 8N 질산을 가하여 녹인 다음 0.1N 질산으로 1
ℓ되게 한다.
· As : As2O3 1.320g을 정밀히 달아 소량의 1N 질산을 가하여 녹인 다음 0.25N 염산으
로 1ℓ되게 한다.
· Se : SeO2 1.405g을 정밀히 달아 소량의 물로 녹이고 0.5N 질산으로 1ℓ 되게 한다.
· Mo : (NH4)6Mo7O24·H2O 1.841g을 정밀히 달아 물에 녹이고 0.5N NH4OH로 1ℓ 되게 
한다.
· Cd : Cd 1.000g을 정밀히 달아 소량의 8N 질산을 가하여 녹인 다음 0.5N NH4OH로 1
ℓ되게 한다.
· Hg : HgCl2 1.354g을 정밀히 달아 물에 녹인 다음 0.5N 질산으로 1ℓ되게 한다.
· Pb : Pb 1.000g을 정밀히 달아 소량의 8N 질산을 가하여 가열하여 녹인 다음 0.1N 질
산으로 1ℓ되게 한다.
· Al : Al 금속 1g을 6N 염산에 녹여 물로 희석하여 1ℓ 되게 한다48· Si : SiO2  2.140g을 백금도가니에 넣고 무수탄산나트륨 2g을 가하여 용융시킨 다음 
물로 녹여 1ℓ가 되게 한다.
2) 혼합표준용액 : 단일원소표준용액을 써서 조제한 다원소분석용 표준곡선 작성을 위한 혼
합표준액으로 한다.
나. 방 법
1) 기기조건
가) 고주파출력 : 수용액시료의 경우 0.8～1.4kW, 유기용매의 경우에도 1.5～2.5kW로 설정.
나) 가스유량의 설정 : 냉각가스, 보조가스, 캐리어가스의 3개의 유로를 지닌 플라즈마 토
취에서 각각의 가스 유량을 10～18ℓ/min, 0～2ℓ/min, 0.5～2ℓ/min의 범위로 설정. S, 
P의 진공자외역의 발광측정으로는 진공분광기 혹은 가스 파- 지분광기를 사용하여 다
시 플라즈마와 분광기간의 광축을 알곤 또는 질소가스로 치환한다.
다) 시험용액 도입량 : 캐리어가스 유량은 1～2ℓ/min일 때 빨아 올리는 양은 1～2㎖/min
이 표준
라) 플라즈마관측높이 : 유도코일상단에서 15～18㎜인 범위로 한다. 다만, 알칼리 원소의 
경우에는 20～25㎜ 범위로 한다.
마) 분석선 : 일반적으로 다음의 최고 감도의 분석파장에 설정한다. 다만, 용액중의 분석대
상원소농도가 높아 스케일아웃하는 경우에는 저감도 분석선을 쓴다. 최고감도의 분석
선 파장에는 분광간섭을 받을 경우에는 분광간섭을 받지 않는 파장을 선택한다.
         As  193.696
 I 206.160
 K 769.896
 Se 196.025
 Ca 393.366
 Mg 279.353
 Mn 257.610 Mo 202.030
 Fe 259.940
 Na 588.995
 Cd 228.802
 Co 228.616
 Cr 205.552
 Cu 324.754 P 213.618
 Pb 220.353
 Zn 213.856
 Hg 194.227
 S 180.6
 Al      396.052
 Si      251.611
2) 표준곡선법
원소농도가 다른 각 혼합표준용액중의 각 원소의 농도를 미리 데이터 처리장치에 기억
시킨 다음 각 혼합표준용액을 플라즈마에 도입하여 각 원소의 스펙트럼선 강도를 측정
하여 표준곡선을 작성한다. 그 다음 시험용액을 플라즈마에 도입하여 스펙트럼선 강도를 
측정하고 다시 백그라운드 보정을 하여 표준곡선으로부터 각 분석대상원소의 농도를 구
한다.4장. 무기물
493) 내부표준법
혼합표준용액과 시료용액의 양쪽에 내부표준원소로서 Y 또는 Co를 10ppm 되도록 첨가
하여 분석대상원소의 발광광도/내부표준원소의 발광광도의 값을 각각에 대하여 측정한
다. 혼합표준용액의 각 분석대상 원소의 발광강도의 값을 써서 내부 표준분석용 표준곡
선을 작성하여, 그의 표준곡선으로부터 시험용액의 발광강도의 값에 상당한 각 분석대상
원소의 농도를 구한다. 표준곡선법과 동일하게 백그라운드 보정을 한다.
4) 표준첨가법
시험용액을 10㎖식 4개의 시험관에 분취하여 그 중의 3개에는 혼합표준용액을 시험용액
중의 분석대상 원소량의 약 0.5, 1.0, 1.5배로 되도록 첨가한다. 각 시험관의 용액에 대해
서 발광강도를 측정하여 4개의 측정점으로 부터 얻은 직선을 외삽하여 각 분석대상원소
의 농도를 산출한다. 표준곡선법과 동일하게 백그라운드 보정을 한다.505장. 유해 중금속
1. 크롬(Cr)
가. 원자흡광분광광도계법 (Atomic absorption spectrophotometry)
1) 기 구
원자흡광분광광도계 , 자제 크루시블, 전기로, 메스 플라스크
2) 시약의 조제
가) 제3인산칼륨(Potassium phosphate tribasic)용액 : 제3인산 칼륨 50g과 수산화칼륨 25g을 
증류수에 용해하여 100㎖로 한다.
나) 크롬 표준용액 : 금속크롬(Chromium 99.9% 이상) 100㎎을 왕수(王水) 5㎖에 녹이고 전
량을 100㎖로 하거나 또는 특급 중크롬산 칼륨을 유발을 이용하여 분말로 하고 100～
110℃에서 3～4시간 건조한 후 방냉하고 0.283g을 증류수에 녹여 1,000㎖로 한다. 이 
때 크롬의 농도는 1000ppm이므로 측정시 희석하여 사용한다.
3) 시료액의 조제
시료 10g을 자제 크루시블에 취하고 제3인산 칼륨 용액 1㎖를 가하여 유리봉으로 완전
히 혼합한 후 유리봉을 탈지면으로 씻어 넣고 예비 회화시킨 후 800℃ 전기로에서 50분
간 태우고 냉각 후 증류수로 크루시블에 남아있는 내용물을 용출하여 250㎖ 메스플라스
크에 넣어 표선까지 맞추고 하룻밤 방치한 후 여과하여 시료액으로 한다.
4) 측 정
원자흡광분광광도계 357.9㎚에서 표준액으로 검량선을 작성한 후 시료액을 측정하여 계
산한다.
5) 계 산
크롬(ppm) =시료액의 흡광도/1ppm당 기준 흡광도×희석배수
시료중량(g)5장. 유해 중금속
51나. 비색법(Diphenyl Carbazide 법)
1) 기 구
분광광도계 , 자제 크루시블, 전기로, 메스 플라스크
2) 시약의 조제
가) 크롬 표준용액 : 원자흡광분광광도계법과 동일
나) 디페닐 카르바지드 (Dipheyl carbazide) 용액 : 디페닐 카르바지드 0.5g을 아세톤 100㎖에 
용해한다.
3) 시료액 조제 : 원자흡광분광광도계법과 동일
4) 측 정
시료액 20～30㎖(크롬으로 50㎍이하)를 50㎖ 메스플라스크에 취하고 황산(1:6) 2㎖, 디페
닐 카르바지드 용액 1㎖를 가하고 표선까지 증류수로 채우고 혼합하여 30분간 방치한 
후 공시험액을 대조액으로 하여 파장 540㎚에서 흡광도를 측정한다. 따로 표준용액을 측
정하여 검량선을 작성 계산한다.
5) 계 산
           크롬(ppm) =시료액의흡광도 / 1ppm 기준 흡광도×희석배수
시료중량(g)
2. 불소(F)
가. 용량법
1) 기 구
삼구플라스크 , 리비히냉각관 , 전압조절기 , 뷰렛, 메스플라스크 , 맨틀히터 또는 알콜램프, 
삼각 플라스크, 자석교반기 , 
2) 시약의 조제52가) 0.04N-질산토리움 (Thorium nitrate)용액 : 12수염의 질산토리움 6.9637g 또는 4수염의 
질산토리움 5.5225g을 증류수에 녹여 1,000㎖로한다.
나) 0.05% 아리자린레드 ․에스(Alizarin red․S)지시약 : 아리자린레드 ․에스 0.1g을 증류수에 용
해시켜 200㎖로 한다.
다) 염산용액 : 농염산 1㎖를 증류수로 희석하여 250㎖로 한다
라) 과염소산
마) 규산
바) 1% 수산화나트륨 용액 : 수산화나트륨 10g을 증류수로 녹여 1,000㎖로 만든다.
3) 증 류
시료 약 2g(불소로서 2～6㎎정도)를 삼구플라스크에 넣고 규산 0.5g과 과염소산 20㎖를 
가하고 직경 3㎜정도의 초자구(硝子球) 5개를 넣은 다음 리비히(Liebig) 냉각기(90㎝)를 
연결하고 135～140℃에서 증류하여 250㎖를 받는다. 단, 유기물이 많은 시료는 10g 정도
를 포화 수산화칼슘 용액으로 충분히 적시고 500℃이하에서 24시간 회화한 후 삼구플라
스크에 옮긴다.
4) 적 정
증류액 중에서 50㎖를 삼각 플라스크에 취하여 아리자린레드 ․에스 지시약 5방울을 넣으
면 황색이 되는데 이때 1% 가성소다 용액을 가하여 적색이 되게 하고 다시 염산 용액을 
가하여 황색으로 변하게 한 후 2㎖를 더 가하고 0.04N-질산토리움용액으로 적정하여 적
색으로 변할 때를 종말점으로 한다. 이때 공시험(Blank test)도 실시한다.
5) 계 산
불소(ppm) =(a-b) ×전체증류액 (㎖)× f × 0.00076 
× 1× 106사용증류액 (㎖) 시료중량(g)
        * a : 0.04N-질산토리움용액 적정치(㎖)
b : 공시험시 0.04N-질산토리움 용액적정치 (㎖)
0.00076 = 0.04N-질산토리움용액 1㎖에 해당하는 불소의 량
(g)(18.9984×0.04×0.001)
f : 0.04N - 질산토륨용액의 역가5장. 유해 중금속
53나. 이온메타(Ion meter)법
1) 기 구
이온메터, 비이커, 자석교반기
2) 시약의 조제
가) 3M-초산소다(Sodium acetate)용액 : 3수염의 초산소다 408g을 정확히 취하여 증류수로 
1,000㎖되게 한다. 단 용액의 pH가 7이 되도록 초산으로 맞춘다.
나) 1.32M-구연산 소다 용액(Sodium citrate) : 2수염의 구연산소다 222g을 정확히 취하여 
250㎖증류수에 녹인 후 과염소산 28㎖를 첨가한 후 1,000㎖로 만든다.
3) 시료액의 조제
가) 200㎖ 비이커에 불소농도가 400㎍정도가 되도록 시료를 정확히 취한다
나) 여기에 1N-염산 20㎖를 넣고 60℃정도로 가온 하면서 자석교반기로 20분간 교반 한다.
다) 200㎖ 메스플라스크에 50㎖ 초산소다용액과 구연산소다용액 50㎖를 가한후 증류수로 
표선까지 취한 용액을 시료액으로 한다.
4) 측  정
가) 이온미터에 불소전극과 비교전극을 장치하고 저 농도의 불소용액(100ppm)에 담근 후 
실온에서 안정시킨다 .
나) 시료액의 불소농도와 비슷한 농도의 표준용액을 100㎖ 비이커에 일정량을 취하여 1N-
염산 10㎖, 초산소다용액 25㎖와 구연산소다 용액 25㎖를 첨가하고 증류수로 일정량
을 만든 후 교반기에서 최저속도로 서서히 저어주면서 전위차를 읽는다.
다) 위와 같은 방법으로 표준용액의 전위값으로 표준방정식을 구한다.
라) 시료액 일정량을 100㎖ 비이커에 취하여 교반기로 서서히 저어 주면서 시료액의 전위
값을 구한다.
5) 계 산
불소(ppm) =기울기값(ppm)×시료액의 전위값 ×희석배수
시료중량(g)543. 비소(As)
가. 시약의 조제
1) 실버디에틸디티오카바메이트 피리딘(Silver Diethyl dithiocarbamate pyridine)용액 : 실버
디에틸디티오카바메이트 1g을 피리딘(pyridine) 200㎖에 용해한 다음 차광하여 냉암소에 
보관한다.
2) 아연 : 20～30메쉬(mesh)의 아연을 1% 황산동 용액에서 검게 될 때까지 침적하였다가 
세척 건조한다.
3) 염화 제1주석(Tin chloride)용액 : 염화 제1주석 4g을 농염산(특급) 250㎖에 녹이고 증류
수 250㎖를 가하여 공전병에 보관한다. 제조후 3개월 이내에 사용한다.
4) 초산납 - Glass wool : 초산납(특급) 9.5g을 증류수 100㎖ 및 초산 한방울을 넣은 용액에 
녹인 다음 glass wool을 약 2～5㎜으로 잘라서 이 용액에 적시고 이것을 꺼내어 증류수
로 세척하고 과량의 액을 제거한 다음 건조한다.
5) 요오드칼륨용액 (Potassium Iodide) : 요오드칼륨 16.5g을 증류수에 녹여 100㎖로 한 다음 
차광하여 보관한다.
6) 비소표준용액 : 3산화비소(Arsenic trioxide)를 유발내에서 미세한 분말로 만들어 데시케
이터에서 건조하고 그중 0.132g을 비이커에 취하여 20% 수산화나트륨 용액 5㎖에 녹이
고 증류수 약 400㎖를 가한 다음 10% 황산으로 중화한다.(리트머스 종이로 확인) 다시 
여기에 10% 황산 10㎖와 증류수를 가하여 1,000㎖로 만들어 보존용액으로 한다.  보존
용액 10㎖를 메스플라스크에 넣고 10% 황산 10㎖를 넣은 뒤에 증류수로 1,000㎖ 되게 
만든다. 이 용액 1㎖는 1㎍의 비소를 함유한다.
7) 질산(Nitric acid) : 원액사용
8) 카프릴알콜 (Caprilalcohol) : 원액사용
9) 과염소산(Perchloric acid) : 원액사용
나. 시료액의 조제
1) 건조시료 10g을 500㎖분해 플라스크에 취한 다음 건조시료에 대하여 수분함량을 80%정
도 되도록 증류수를 가한 다음 질산 20㎖를 가하고 혼합하여 실온에서 15분간 방치한
다. 처음에는 서서히 약하게 가열하다가 심한 반응이 중단되면 냉각한 다음 황산 10㎖
를 가하여 다시 서서히 약하게 가열한다. 이 조작에서 처음에 기포가 심한 경우에는 카
프릴 알콜 2～3방울을 시료에 가한다.
2) 내용물이 암색(검은색)이 되기 시작하면 질산 30㎖씩을 추가하고 과염소산 1㎖를 넣어 5장. 유해 중금속
55가열을 계속한다. 아황산가스의 흰연기가 발생될 때까지 가열하다 내용물이 미황색에서 
무색으로 될 때 분해를 완료 냉각한다.
※ 주의 : 조작도중 질산의 추가가 늦어져서 내용물이 회화되면 비소가 날아가고 분해시간
이 길어진다.
3) 그 다음 증류수 40㎖와 포화수산 암모늄용액 20㎖를 가하여 아황산가스의 흰 연기가 발
생될 때까지 가열한 다음 냉각하여 증류수로 일정량을 만들어 시료액으로 한다.
다. 방 법
1) 시료액 25㎖ 이하(As2O3로서 2～10㎍)를 플라스크 A에 취하고 증류수 25㎖가 되게 한다.
2) 여기에 염산용액(1:1) 5㎖, 요오드칼륨 용액 2㎖ 및 염화 제1석 용액 5㎖를 가하여 실온
에서 15분간 방치한다. 단 Fe+3을 다량 함유한 경우에는 염산 하이드록실아민 0.5g을 가
하여 녹이고 수조상에서 10분간 가열시킨 다음 염산용액(1:1) 5㎖를 가하여 냉각시킨 다
음 요오드칼륨 용액 5㎖ 및 염화 제1석용액 5㎖를 가하여 10분간 방치했다가 수기(受器) 
D에 실버디에틸디티오카바메이트피리딘 용액 3㎖를 넣는다.
3) 플라스크에 아연 3g을 넣고 즉시 흡수관 B 및 유도관 C를 연결한다. 관의 끝을 수기(受
器)의 바닥에 닿게 장치하고 작은 기포가 연속적으로 나오도록 조절한다.
4) 이어서 20～25℃에서 1시간 방치한 다음 장치를 분리한다. 유도관의 내벽에 부착된 용액
은 수기내의 용액과 잘 혼합시킨다 .
5) 이 용액을 액층 1㎝로 하여 파장 525㎚부근에서 30분 이내에 흡광도를 측정한다.  대조
액은 실버 디에틸 디티오카바메이트 피리딘용액을 사용한다. 따로 작성한 검량선으로 
부터 비소의 함량을 계산한다.
6) 검량선의 작성 : 0, 2, 4, 6, 8, 10㎍에 상당하는 비소표준용액을 사용하여 시료액과 동일
하게 조작하고 흡광도를 측정하여 검량선을 작성한다. 이 검량선은 매 시험시마다 작성
하여야 한다. 공시험을 별도로 실시한다.
라. 계 산
비소(ppm) = As(㎍) × 희석배수 / 시료무게(g)564. 납(Pb)
가. 디티죤(Dithizone) 법
1) 기 구
전기로, 분광광도계 , 자제 크루시블, 비이커, 가열판, 시계 접시, 메스플라스크 , 분액 여
두
2) 시약의 조제
가) 구연산 암모니움(Ammonium citrate)용액 : 구연산 암모늄 45g에 증류수 100㎖를 가하
여 용해시킨 뒤 페놀프탈레인 지시약 2～3 방울을 가하여 적색이 될 때까지 암모니아
수를 가한다. 납을 제거하기 위하여 이 용액에 추출용 디티죤 클로르포름 (Dithizone 
chloroform) 용액 20㎖를 넣고 흔들어 디티죤 용액이 고유의 녹색을 유지할 때까지 같
은 방법으로 반복 추출한 후 물층에 클로르포름 50㎖를 넣고 2회 흔들어 섞은 후 물층
을 분획하여 취한다.
나) 아황산 나트륨용액 : 아황산나트륨 (최순품 무수) 15g에 증류수를 가하여 100㎖로 한다.
(사용시에 제조한다) 이 용액에 디티죤 클로르포름용액 20㎖넣고 흔들어 디티죤용액이 
고유의 녹색을 유지할 때까지 같은 방법으로 반복추출 한 후 물층에 클로르포름 50㎖
를 넣고 2회 흔들어 섞은 후 물층을 분액하여 취한다.
다) 10%시안화 칼륨용액 : 시안화칼륨 50g에 증류수를 가해서 100㎖로 한다. 이 용액을 추
출용 디티죤클로르포름 용액 20㎖를 넣고 흔들어 디티죤용액이 고유의 녹색을 유지할 
때까지 같은 방법으로 반복 추출한 후 물층에 클로르포름 50㎖를 넣고 2회 흔들어 섞
은 후 물층을 분액하여 취한다. 단 용액중에 잔존하는 디티존을 제거하기 위하여 이 
물층을 클로르포름으로 10～20회 반복하여 씻는다. 수용액에 증류수를 가하여 5배 희
석하여 사용한다.
라) 묽은 시안화칼륨용액 : 10% - 시안화칼륨 용액 10㎖에 증류수를 가하여 100㎖로 한다. 
(사용시 제조한다)
마) 납(pb)표준용액 : 질산납(Lead nitrate) 0.1598g을 질산(2.5 : 97.5)에 녹여 100㎖로 하여 
보존용액으로 한다. 사용시 이것을 질산(1:99)으로 10배 또는 1,000배로 희석하여 표준
용액으로 한다. 납 표준용액 1㎖ = 10㎍ 또는 1㎍ Pb
바) 추출용 디티죤클로르포름 용액(시약정제용 ) : 디티죤(분말) 0.03g을 취하여 클로르포름 
100㎖에 녹여 여기에 암모니아수 (1:99) 100㎖를 가하여 흔들어 섞은 후 물층을 분취한
다. 다시 클로르포름 층을 암모니아수 (1:99) 100㎖씩으로 2회 동일하게 조작하여 물층
을 합하고 클로르포름 20㎖씩으로 3회 씻는다. 물층에 염산용액(1:1)을 가하여 약 산성5장. 유해 중금속
57으로 한 다음 클로르포름 200㎖씩으로 2회 추출한다. 클로르포름 추출액을 합하고 클
로르포름으로 전량을 1,000㎖로 만들어 차광하여 냉암소에 보존한다
사) 디티죤 벤젠용액(정량용) : 디티죤 분말 0.05g을 벤젠 100㎖에 녹이고 여기에 암모니아
수(1:99) 100㎖를 가하여 잘 흔들어 섞고 물층을 분취한다. 다시 벤젠층을 암모니아수
(1:99) 100㎖씩으로 2회 동일하게 조작하여 물층을 합하고 벤젠 20㎖씩으로 물층을 3
회 씻는다. 또 물층에 염산용액(1:1)을 가하여 약 산성으로 한 뒤 벤젠 200㎖씩으로 2
회 추출한다. 벤젠 추출액을 합하고 벤젠을 가하여 전량을 1,000㎖로 하여 원액으로 
한다. 원액벤젠으로 10배 희석한 용액에 대해서 벤젠을 대조액으로 하여 층장 10㎜에
서 파장 620㎚부근의 흡수 극대 파장에서 흡광도 A를 측정한다. 이때 원액 1,000㎖는 
70.6×A ㎎의 디티죤을 함유하게 된다. 사용시 원액 [20,000/(70.6×A)] ㎖을 취하고 벤젠
을 가하여 1,000㎖로 하여 사용한다. 이 디티죤 벤젠용액 1,000㎖는 디티죤 20㎎을 함
유하게되며 사용시에 제조한다.
3) 시료액 제조 : 건식(회화)법
가) 건조시료 2～10g을 30㎖ 크루시블에 취하여 건조기에서 건조한 후 전기곤로 상에서 
예비 회화한다.
나) 약 250℃로 가열된 전기로에 넣고 온도를 높여 완전히 회화할 때까지 500℃이하로 가
열한다.
다) 24시간 후 아직 회화가 충분히 되지 않은 경우에는 질산용액(1 : 1) 2～5㎖를 가하여 
증발건고 시킨 다음 회화를 계속하여 (경우에 따라 반복) 완전히 회화시킨다 .
라) 방냉 후 크루시블 내의 회분이 튀지 않도록 조심스럽게 증류수로 적신 후 농염산 2～
4㎖을 가하여 수조상 또는 건조기에서 건고 시킨다.
마) 건조시킨 후 농염산 2㎖을 가하고 가온 하여 녹인 후에 불용물이 잔존할 때에는 유리
여과기로 여과한다
바) 유리여과기내의 잔류물에 소량의 염산을 넣은 다음 농염산과 50% 구연산 암모늄용액
을 1:1로 섞은 용액 적당량을 넣고 가열한 후 다시 40% 초산암모늄 용액 0.5～1㎖ 씩
으로 반복하여 씻어 세척액에 합하여 일정량으로 만들어 50～100㎖를 시료액으로 한
다.
4) 측  정
가) 시료액 50㎖을 취하여 구연산암모늄용액 2㎖ 및 메틸레드 지시약 2방울을 가하고 용
액이 황색(pH 8.5～10)을 나타낼 때까지 암모니아수를 떨어뜨려 넣고(滴加) 증류수로 
전량을 100㎖ 정도로 한다.
나) 여기에 10% 시안화칼륨 용액 10㎖와 아황산나트륨 용액 10㎖를 가하여 혼합하고 수조58상에서 10분간 가열한다.
다) 방냉 후 암모니아수 1.5㎖을 가한 다음 분액여두에 옮기고 정량용 디티죤 벤젠용액 10
㎖를 가한다.
라) 분액여두로 1분간 강하게 진탕한 다음 분리된 물층을 제거한 후 벤젠층을 다른 분액
여두로 옮긴다.
마) 다시 1% 시안화칼륨 용액 40㎖을 가하여 30초간 강하게 흔들어 섞은 다음 물층을 버
리고 벤젠층을 받는다.(필요하면 건조 여과지로 여과)
바) 여과액 즉 벤젠 층에 대하여 층장 10㎜에서 파장 525㎚부근의 흡수극대 파장으로 흡
광도 및 공시험의 흡광도를 측정한다.
사) 동시에 납 표준용액 10㎖(Pb 10㎍), 증류수 10㎖에 대하여 동일하게 조작하여 각각 흡
광도를 측정한다.(대조액은 벤젠을 사용한다)
5) 계 산
   납(ppm) =10 ×A-Ab×희석배수 ×   1
w(g) As-Ac 
            ※ 10 : Pb 10㎍
A  : 시료액의 흡광도
As  : 표준용액의 흡광도
Ab  : 공시험의 흡광도
Ac  : 증류수의 흡광도
W   : 시료무게
나. 원자 흡광분광광도계법 (Atomic absorption spectrophotometry)
1) 기 구
원자흡광분광광도계 , 전기로, 자제 크루시블, 톨비커, 가열판, 시계접시, 메스 플라스크, 
세척병, 분액 여두
2) 시약의 조제
가) 납(Pb)표준액 : 원자흡광분광광도계용 납 표준품(1,000ppm) 을 희석하여 2, 4, 6, 8ppm으
로 만든다.
나) 요오드칼륨용액 : 요오드칼륨 (KI) 68.3g을 증류수로 녹여 100㎖로 한다5장. 유해 중금속
59다) 1N-염산 : 농염산(농도 35.39%, 비중 1.18 기준) 87㎖를 증류수로 희석하여 1,000㎖로 
한다
3) 시료액의 조제
시료 10～20g을 50㎖ 자제크루시블에 정확히 취하고 곤로위에서 예비회화시킨 후 500℃ 
전기로에서 48～72시간 회화한 다음 방냉 후 소량의 증류수로 회분을 씻어 200㎖ 톨비
커에 넣고 다시 염산용액(1:1) 30㎖로 크루시블을 씻어 톨비커에 넣은 다음  시계접시를 
덮고 가열판에서 분해액이 무색이 될때까지 가열분해 후 시계접시를 열고 증발건고 시
킨 후 방냉하고 뜨거운 증류수로 씻어 100㎖ 메스플라스크에 넣고 방냉한 다음 표선을 
증류수로 맞추어 시료액으로 한다. 
* 분해시 완전분해가 안되었으면 질산 5㎖와 과염소산 5㎖를 넣어 완전분해가 될 때까지 
분해한다.
무기질 시료의 경우 시료 0.5～2g을 취하여 200㎖ 삼각 플라스크에 넣고 염산용액(1:1) 
30㎖를 가하고 분해액이 1/2로 줄어 들 때까지 가열 용해 후 뜨거운 증류수로 100㎖ 메
스플라스크에 No 6. 여과지를 사용하여 여과한 후 시료액으로 사용한다.
4) 측 정
시료액 일정량(5～30㎖)를 분액여두에 취하고 85%인산 14㎖와 요오드칼륨 용액 5㎖를 
가하고 다시 증류수 50㎖를 넣고 진탕 혼합 후 5분간 방치하고 MIBK(Methyl Isobutyl 
Ketone) 10㎖를 정확히 가하고 3～5분간 진탕, 정치 후 MIBK층(상층)을 원자흡광광도계 
파장 283.3㎚에서 흡광도를 측정한다. 이 때 공시험을 행하여 보정한다.
5) 계 산
납(ppm) =시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
시료중량(g)
5. 수은(Hg)
가. 기 구  
전기로, 직시천칭, 수은자동분석기 , 자제크루시블 , 마이크로피펫
나. 시약의 조제601) 산화알루미늄 : 750℃ 전기로에서 2시간이상 가열 처리한 다음 데시케이터내에서 공기 
중 수은이 오염되지 않도록 하여 방냉시킨다 .
2) 수산화칼슘 , 탄산나트륨시약 (1:1) : 무게비율로 1:1혼합하여 잘 섞고 적당량을 750℃ 전기
로에서 2시간이상 가열 처리한 다음 데시케이터내에서 공기중 수은이 오염되지 않도록 
방냉한다.
3) 완충용액 : 염소(Cl)가 들어가지 않은 pH : 6.86 완충용액을 사용한다.
다. 시료처리
1) 고체시료 : 750℃ 전기로에서 위 시약과 동일 처리한 보트에  ②시약을 깔고 그 위에 배
합사료는 0.1g, 단미사료는 0.05g 취하여 깔고 ②시약으로 덮고 그 위에 ①시약을 깔고 
다시 ②시약으로 덮는다.
2) 액체시료 : 상기와 동일 처리한 보트에 ①시약을 깔고 그 위에 액상시료 100～1000㎕를 
정확히 취한 다음 다시 ①시약을 덮고 그 위를 ②시약으로 덮는다.
라. 방 법
수은전용분석기 (Mercury atomizer) 의 글라스 캡을 열고, 시료 처리보트를 밀어 넣어 캡을 
닫은 다음 작동 스위치를 누르고, 측정량을 ng으로 기록한다.
마. 계 산
수은량(ppm) = 시료 측정량(ng) / 시료량(㎎)
6. 카드뮴(Cd)
가. 원자흡광분광광도계법 (Atomic absorption spectro photometry)
1) 기 구
원자 흡광분광광도계 , 전기로, 자제 크루시블, 톨비커, 가열판, 시계접시, 메스 플라스크, 
분액 여두
2) 시약의 조제
가) 카드뮴(Cd) 표준액 : 원자흡광광도계용 카드뮴 표준원액(1,000ppm) 을 희석하여 사용한
다.5장. 유해 중금속
61나) 요오드화 칼륨용액 : 요드화 칼륨(KI) 68.3g을 증류수로 녹여 100㎖로한다.
다) 1N-염산 : 농염산 87㎖를 증류수로 희석하여 1,000㎖로 한다.
3) 시료액의 조제
시료 10～20g을 50㎖ 자제 크루시블에 정확히 취하고 곤로 위에서 예비회화시킨 후 50
0℃ 전기로에서 하루밤 태우고 방냉 후 소량의 증류수로 회분을 씻어 톨 비커에 넣고 
다시 질산 5㎖와 과염소산 5㎖로 크루시블을 씻어 톨비커에 넣은 후 시계접시를 덮고 
가열판에서 분해액이 무색이 될 때까지 가열분해 후 100㎖ 메스플라스크 시계접시를 열
고 증발 건고시킨 후 방냉하고 1N-염산 10㎖ 가하여 가열용해 후 표선을 증류수로 맞추
어 시료액으로 한다. 무기질시료의 경우 시료 0.5～1g을 취하여 100㎖ 삼각 플라스크에 
넣고 염산(1 : 1) 20㎖를 가하고 분해액이 1/2로 줄어 들 때까지 가열용해 후 뜨거운 증
류수로 여과하여 일정량으로 만들어 시료액으로 한다.
4) 측 정
시료액 일정량(5～30㎖)를 분액여두에 취하고 85%인산 14㎖와 요오드화 칼륨 용액 5㎖
를 가하고 다시 증류수 50㎖를 넣고 진탕 혼합한 후 5분간 방치하고 MIBK(Methyl 
Isobuyl Ketone) 10㎖를 정확히 가하고 3～5분간 진탕 정치 후 MIBK층(상층)을 원자흡광
광도계 파장 228.8㎚에서 흡광도를 측정한다. 이 때 공시험을 행하여 보정한다.
5) 계  산
카드뮴(ppm) =시료액의흡광도 /1ppm기준흡광도 ×희석배수
시료중량(g)
7. 주석(Sn)
가. 시험용액의 조제
1) 습식분해법
가) 황산-질산법
시료(건조물로서 5～20 g에 상당하는 양)를 분해플라스크에 취해 물 50～70 mL, 질산 
10～40 mL를 넣고 혼합하여 방치한다. 다음에 조용히 가열하여 격렬한 반응이 그치면 
식힌 다음 황산 5～20 mL를 넣고 다시 조용히 가열한다. 내용물이 암색이 되기 시작
하면 질산 2～3 mL씩을 추가하면서 가열을 계속하여 내용물이 미황색 ～무색이 되었을 62때 분해가 끝난 것으로 한다. 분해액을 식힌 후 물 30～50 mL, 포화수산암모늄용액 1
0～25 mL를 가해서 황산의 흰 연기가 발생할 때까지 가열하고 식힌 다음 물로 일정량
으로 하여 시험용액으로 한다. 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 
보정한다.
주1) 분해가 용이한 시료의 경우 황산의 사용을 제한한다.
주2) 난분해성 시료의 분석시 황산을 사용하여 유기물 및 휘발성분을 완전 분해 한다.
주3) 난분해성 시료 중 납 분석시 황산을 사용 하되 포화 수산암모늄을 사용하여 회수
한다.
나) 마이크로웨이브법
시료 일정량 (0.1～0.5 g에 한함; 수분함량이 높은 시료의 경우 1～2 g)을 Microwave 
digestion system에 넣고 질산 등으로 처리하여 분해하고 메스플라스크 등에 옮겨 일
정량(시료채취량에 따라 달라짐)으로 한다.
2) 건식회화법
시료(건조물로서 5～20 g에 상당하는 양)를 도가니, 백금접시에 취해 건조하여 탄화시킨 
다음 450℃에서 회화한다. 회화가 잘 되지 않으면 일단 식혀 질산(1+1) 또는 50% 질산마
그네슘용액 또는 질산알루미늄 40 g 및 질산칼륨 20 g을 물 100 mL에 녹인 액 2～5 mL
로 적시고 건조한 다음 회화를 계속한다. 회화가 불충분할 때는 위의 조작을 1회 되풀이
하고 필요하면 마지막으로 질산(1+1) 2～5 mL를 가하여 완전하게 회화를 한다. 회화가 
끝나면 회분을 물로 적시고 염산 2～4 mL를 가하여 수욕상 또는 건조장치에서 건조한 
다음 염산 1～2 mL를 가하여 가온해서 녹이고 불용물이 있으면 석면 또는 유리여과기
로 여과한 다음 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.
주4) 회화보조제는 염산, 산화마그네슘 , 탄산나트륨등을 사용하나 시험조작에 영향이 
없을 때에만 사용하되 공시험용액에 대해서도 같은 조작을 하여 시험용액을 보
정한다.
3) 용매추출법
가) 시 약
① MIBK(Methyl Iso-Buthyl Ketone) 또는 클로로포름
② DDTC(Diethyl dithocatbamic acid), silver를 포함하지 않은 것
나) 시험조작
시험용액 및 공시험용액을 분액깔대기에 각각 10～50 mL 취한 후, 각각에 25% 구연산5장. 유해 중금속
63암모늄용액 2～10 mL 및 브롬티몰블루 (BTB)시액 2방울을 가한 다음 액의 색이 황색에
서 연한 녹색이 될 때까지 암모니아수로 중화하고 이에 40% 황산암모늄시액 2～10 
mL 및 물을 가하여 일정량으로 한다. 여기에 10% DDTC 용액 1～5 mL를 넣고 흔들어 
준 후 MIBK(또는 클로로포름 ) 20 mL를 가하여 심하게 진탕하여 정치하고 MIBK(또는 
클로로포름 )층을 취한다. 다시 MIBK(또는 클로로포름 ) 20 mL로 위의 과정을 되풀이 한 
후 여액을 합한다. 분배액을 열판에서 80℃로 가열하여 용매를 모두 날려버리고 잔류
물에 질한 7 mL, 과산화수소 1 mL를 넣고 다시 열판에서 가열하여 완전히 분해․건조
시킨다. 잔류물은 1 N 질산용액으로 재용해하여 시험용액으로 한다.
주6) 표준용액에 대해서도 같은 조작을 하여 얻는다.
   주7) 주석 분석시 질산에 의한 침전물이 발생할 수 있으므로, 전처리 마지막 단계에 염
산을 수 mL 가하여 침전물 생성을 방지한다.
나. 측 정
1) 원자흡광광도법
이 방법은 시험용액중의 금속원소를 적당한 방법으로 해리시켜 원자증기화하여 생성한 
기저상태의 원자가 그 원자증기를 통과하는 빛으로부터 측정파장의 빛을 흡수하는 현상
을 이용하여 광전측정등에 따라 목적원소의 특정파장에 있어서 흡광도를 측정하고 시험
용액중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 시료를 원자화하는 일반적인 방법은 화염
방식과 무염방식이 있다. 시험용액 및 공시험용액을 그대로, 혹은 희석 또는 농축한 다
음 원자흡광광도계에 주입하여 흡광도를 구하고 따로 표준용액 및 이의 공시험용액에 
대해서도 각각 시험용액의 경우와 같은 조작을 해서 검량선을 작성하여 시험용액의 농
도를 구한다.
2) 유도결합플라즈마법
이 방법은 아르곤 가스에 고주파를 유도결합방법으로 걸어 방전되어 얻어진 아르곤 플
라즈마에 시험용액을 주입하여 목적원소의 원자선 및 이온선의 발광광도를 또는 질량값
을 측정하여 시험용액 중의 목적원소의 농도를 구하는 방법이다. 표준용액과 시험용액 
및 공시험용액을 ICP(유도결합플라즈마 )에 주입하여 시험용액의 농도를 구한다.646장. 비타민
1. 비타민 A
가. 분광광도계법 (Carr Price)
1) 기 구
분광광도계 , 수조(Water bath), 환류냉각장치 , 분액여두, 유리여과기 (G3), 메스실린더 , 
Chromatography tube
2) 시약의 조제
가) 수산화칼륨 용액 : 특급 수산화칼륨 용액(KOH) 50g을 증류수 50㎖에 용해
나) 에틸에테르 : 특급품
다) 에틸 알콜 : HPLC용
라) 무수 황산나트륨 : 특급 무수 황산나트륨 (Na2SO4)
마) 석유에테르 : HPLC용
바) 크로로포름 : HPLC용
사) 3염화안티몬 용액 : 특급 삼염화안티몬 용액(SbCl3) 20g을 크로로포름 100㎖에 용해하
여 하룻밤 방치 후 무수 초산 2㎖를 가하여 콜크마개 또는 폴리에틸렌 마개로 막고 
암소에 보관하는데 이 용액은 흡수성이 강하고 변질되기 쉬우므로 조제 후 1주일 이
내에 사용해야 한다.
3) 시료액의 조제
시료 2～3g을 검화 플라스크에 취하고 수산화칼륨용액 4㎖와 에틸알콜 25㎖를 가하고 
환류냉각기에 연결하여 30분간 가열하여 검화시킨 후 흐르는 물로 냉각한다. 상등액을 
분리하여 분액여두에 넣고 잔사는 유리여과기 (G3)로 흡인 여과하고 다시 검화 플라스크
에 에틸에테르 40㎖로 씻어 유리여과기에 넣어 흡인여과 하여 여과액을 분액여두에 넣
고 초자 여과기에 에틸에테르 10㎖를 넣고 흡인여과 하여 분액여두에 합하고 다시 분액
여두에 증류수 45㎖를 가하여 진탕한 후 수층을 분리하여 다른 분액여두에 분리하고 수
층은 에틸에테르 30㎖씩 2회 추출하여 제1분액 여두의 에틸에테르에 합한다. 
에틸에테르가 들어있는 분액여두에 증류수 30㎖를 넣어 서서히 흔들어 섞은 다음 수층
은 분리하여  제거하고 다시 증류수 40㎖씩 5～6회 씻어 수층을 제거(페놀프탈레인 지시
약의 반응이 없을 때까지)하고 에틸에테르층을 갈색 비커에 옮기고 분액여두는 에틸에테6장. 비타민
65르 10㎖로 2회 씻어 넣는다. 무수 황산나트륨 5g을 가하여 탈수시키고 가지형 플라스크
에 에틸에테르층을 옮기고 무수 황산나트륨은 에틸에테르 10㎖씩 2회 씻어 플라스크에 
넣은 다음 에틸에테르층을 50℃의 수조에서 증발시키고 소량이 되면 불활성가스로 완전
히 증발시킨 후 석유에테르 2～3㎖에 용해시켜 시료액으로 한다. 크로마토그래피용 알루
미나(Alumina) 를 수세(水洗) 후 샤레에 넣고 150℃로 항량이 될때까지 건조시켜 보관한
다. 
그 1g에 대하여 0.15㎖의 증류수를 가해서 잘 흔들어 섞는다. 이 알루미나를 석유에테르
로 섞어서 미리 석유 에테르로 세정(洗靜)한 흡착관(chromatography tube)에 따라 넣고 
0.5×6.0 ㎝의 층을 만든 다음 석유에테르 10㎖를 넣고 흘리는데 알루미나층 위에 석유에
테르층이 1㎝가 되면 시료액을 천천히 넣는다. 액층이 알루미나층위에 1㎝가 되면 갈색 
가지형 플라스크를 받치고 석유에테르 10㎖씩 2회 넣어 카로틴(carotin)을 분리시켜 카로
틴 정량용 검액으로 한다.
다음에 수기를 갈아서 10%(V/V)의 에틸에테르를 포함한 석유에테르를 20～30㎖를 유입
하여 비타민 A를 용출시킨다 . 비타민 A용액을 감압 감온하여 용액을 완전히 휘발시키고 
플라스크에 클로르포름 2～3㎖씩 넣어 비타민 A를 용해시켜 메스 플라스크에 받고 클로
르포름으로 표선까지 맞추어 검액으로 한다.
4) 발색과 측정
위에서 얻은 검액 0.3㎖를 분광광도계용 cell에 넣고 3염화안티몬용액 3㎖를 신속히 가하
고 최대흡광도를 알아낸다.  이 때  파장은 620㎚이며 대조액으로는 증류수를 사용한다. 
비타민 A 표준액 5, 10, 15, 20 IU를 만들어 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 
검량선을 작성한다.
5) 계 산
비타민 A(IU/100g) = 시료액의 흡광도 
×V
× 100
 표준액 1IU당 흡광도 W
           V : 검액의 전량
           W : 시료무게(g)
나. HPLC 법
1) 시약의 조제
가) 초산레티놀표준액 : 초산레티놀 100만IU를 100㎖ 갈색메스플라스크에 2-프로판올로 정
확히 희석하여 초산레티놀표준원액을 조제한다.(공기를 질소로 치환하여 보존한다) 사66용시, 표준원액의 일정량을 2-프로판올로 정확히 희석한다. 1㎖중에 5, 10, 15, 20 비
타민 A IU를 함유하는 초산레티놀표준액을 조제함과 동시에 보정계수를 산출한다.
나) 팔미틴산레티놀표준액 : 팔미틴산레티놀 100만 비타민 A IU를 100㎖의 갈색메스플라스
크에 2-프로판올로 정확히 희석하고, 1㎖중에 5, 10, 15, 20 비타민 A IU를 함유하는 
각 팔미틴산레니놀표준액을 제조함과 동시에 보정계수를 산출한다.
다) 보정계수 산출 : 1㎖중에 초산레티놀 또는 팔미틴산레티놀로써 10 비타민 A IU를 함유
하는 표준액에 대하여 10㎜셀을 사용하여, 2-프로판올을 대조액으로 326㎚에서의 흡
광도를 측정한다. 다음식과 같이 초산레티놀 또는 팔미틴산레티놀표준액의 보정계수
를 산출한다.
     f = A × 1.9
     f : 초산레티놀 또는 팔미틴산레티놀표준액의 보정계수
     A : 초산레티놀 또는 팔미틴산레티놀표준액의 326㎚에서의 흡광도
2) 방 법
가) 추출 : 분석시료 1～2g을 정확히 칭량하여 50㎖의 갈색공전삼각플라스크에 넣는다. 디
메틸설폭시드 20㎖를 가하여 15분간 진탕한 후, 에탄올 180㎖로 300㎖의 갈색공전삼각
플라스크에 옮겨 10분간 진탕하여 추출한다. 추출액을 갈색공전원심분리관에 넣고 
3000rpm으로 5분간 원심분리하고 , 상등액을 0.5㎛ 멤브레인필터로 여과한 다음 기기분
석용 시료용액으로 한다.
나) 기기분석예 (HPLC)
검출기 : 자외선흡광광도검출기
파  장 : 326㎚
컬  럼 : C18(4 ㎜ × 200㎜ × 5㎛) 또는 이와 동일한 것
이동상 : 메탄올
유  속 : 1.0㎖/min
다) 계 산
측정된 크로마토그램에서 피크의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중
의 초산레티놀 또는 팔미틴산레티놀량을 산출하여 초산레티놀 및 팔미틴산레티놀의 함
량을 비타민 A 분말 또는 비타민 A류 함량으로 한다.6장. 비타민
672. 프로비타민 A(β-캐로틴)
1) 기 구
속시렛 장치, 분광광도계 , chromatography column, 메스플라스크 , 수조, 환류냉각장치 , 
분액여두, 초자여과기 (G3), 메스 실린더
2) 시약의 조제
가) 아세톤
나) 헥산 : 특급품
다) 아세톤 - 헥산(1:9) 혼합액
라) 아세톤 - 헥산(3:7) 혼합액
마) 무수황산나트륨
바) Magnesia - 규조토(1:1) 혼합물
사) 수산화칼륨용액 : 특급수산화칼륨 (KOH) 50g을 증류수 50㎖에 용해
아) 에틸에테르 : 특급품
자) 에틸알콜 : HPLC용
차) 석유에테르 : HPLC용
카) β-카로틴 표준액 : β-카로틴 10㎎을 아세톤-핵산(1:9) 혼합액으로 용해하여 100㎖로하
여 냉암소에 보관한다.
3) 시료액의 조제
시료 1～4g을 속시렛 장치에 넣어 아세톤-핵산(1:9)혼합액으로 1시간 추출하고 실온까지 
방냉시킨 후 100㎖ 메스플라스크에 옮기고 핵산으로 표선까지 채운다. chromatography 
column(유리여과기가 달린 20×400 ㎜)에 Magnesia- 규조토(1:1) 혼합물로 10㎝ 채우고 그 
위에 무수 황산나트륨을 1㎝ 채운 다음 추출액을 column에 넣어 흡착시키고 아세톤-핵
산(1:9) 혼합액 50㎖를 가하면 색층이 형성되며, 카로틴은 녹고 xanthophll 과 chlorophyll 
등은 column에 남는다. 모든 침출액은 100㎖ 메스 플라스크에 모아서 아세톤-헥산(1:9) 
혼합액으로 100㎖되게 하여 분광광도계 파장 450㎚에서 흡광도를 측정하거나 비타민 A 
분석시 분리된 카로틴의 흡광도를 측정하는데 먼저 β-카로틴 용액을 0, 10, 20, 30, 40, 
50㎍/㎖를 측정하여 검량선을 작성 계산한다 .
4) 계 산
               카로틴(㎍/g)  = C(㎍) × F(㎖)× D시료의 중량68                C: 검량선에 의하여 결정된 카로틴의 양(㎍)
                F: 최후 침출용액의 양(㎖)
                D: 희석율
3. 비타민 B1(Thiochrome 형광법)
1) 원 리
N/10황산으로 시료중의 비타민 B1을 침출하여 Takadiastase 가수분해로 결합태의 비타민 
B1을 유리태로 한 후에 permutit 흡착 column 으로 분리하여 적혈염으로 B1을 산화시키
면 강한 형광(螢光)을 내는 Thiochrome 이 되는데 이것의 형광을 측정하여 B1을 정량한
다.
2) 기 구
형광광도계 , 항온기, 흡착 Column, 비이커, 메스실린더 , 메스피펫, 메스플라스크 , 공전 원
침관
3) 시 약
가) Permutit : 시판품을 체로 쳐서 50～80mesh의 입도를 골라 100g을 500㎖삼각플라스크
에 넣고 물 400㎖를 가해 약 15분간 교반정치 후에 상층은 버리고 상층액이 투명해질 
때까지 반복한 뒤 3% 초산용액 약 400㎖를 넣어 15분간 교반 정치후 상층버림 조작을 
2회 한다. 25% KCl 용액 300㎖를 넣고 boiling water bath 중에서 교반 하되 약 25분후 
수욕에서 꺼내 정치한다. KCl용액을 제거하고 다시 3% 초산 400㎖를 가하여 먼저와 같
이 2회 세정하고 물로 염소 이온 반응이 없을 때까지 세정한다. 대형 샤레에 넣어 10
0℃이하의 oven에서 건조하여 흡착용으로 한다. Vitachange 는 시약 그대로 사용한다.
나) 25% KCl용액 : 특급 KCl 250g을 0.1N HCl로 1ℓ로 한다.
다) 3% 초산용액 : 빙초산 30g을 H2O로 1ℓ로 한다.
라) 1% 적혈염 용액 : K3Fe(CN) 6 3H2O 1g을 H2O로 100㎖로 하여 냉장고 속의 갈색병내에 
보관한다.
마) 30% NaOH용액
바) Isobutyl alcohol : 무형광의 시약
사) 무수 황산나트륨 : 무형광의 시약
아) Diastase용액 : 5% Takadiastase 수용액을 만들어 빙초산 2～3방울을 가하고 다시 산성6장. 비타민
69백토 0.2g을 넣고 3000rpm으로 15분간 원심분리하여 그 상등액을 사용한다.
자) N/10 H2SO4용액
차) 4M NaOAC용액 : 결정초산나트륨 544g을 H2O로 1ℓ로 함
카) Vit B1 표준액 : B1 염산염의 결정 100㎎을 취하여 물에 녹여 빙초산으로 pH 2로 한 
후 1ℓ로 희석한 뒤 용도에 따라 농도를 조절한다.
4) 조 작
가) 침 출 : 시료 1～10g(B1으로서 5-50㎍)을 달고 분쇄를 요하는 것은 N/10 H2SO4 10㎖를 
가하여 유발로 마쇄하고 N/10황산 60㎖ 써서 100㎖ 메스플라스크에 옮겨 잘 흔들어 섞
는다.  4M 초산나트륨 용액을 적하하여 pH4～5로 하고 5% Takadiastase 용액 5㎖를 가
한 다음 Toluene 5～6 방울을 넣고 38～40℃의 incubator 내에 하룻밤 방치한다. 물로 
100㎖ 표선까지 채워 잘 흔들어 섞고 건여과지 (No.2)로 여과한다.
나) 흡착 column준비 : 흡착관에 소량의 물을 유입하고 glass wool을 작고 둥글게 하여 유
리봉으로 흡착관에 밀어 넣고 permutit 1.3～1.5g을 비이커에 넣고 물 20㎖를 가해 교
반 후 기포를 제거하고 H2O와 같이 흡착관에 유입하고 cock를 열어 H2O를 permutit 
상단까지 유출시키고 3% 초산 10㎖를 넣고 3초에 1방울씩 적하시킨다 . 액층이 
permutit 상단까지 오면 다시 물 20㎖를 붓고 똑같이 세정한다.
다) 흡 착 : 흡착관에 침출량 10～25㎖(Vit B1 0.2～4.0mcg)를 정확히 취하여 가만히 주입하
고 cock를 열어 3초에 1방울씩 적하하여 B1을 permutit층에 흡착시킨다 . 침출액이 
column 상단까지 달했을 때 pH 4.5의 산성수(H2O 100㎖ + 10% HCl 3 방울 정도) 5㎖
를 가해 column 내부를 씻는다. 끊는 물을 column 상단 0.5㎝ 정도까지 넣고 1초에 1
방울씩 적하하되 3회 반복하여 B1 이외의 형광물질을 제거하고 cock를 막는다.
라) column 아래 수기를 25㎖ flask로 바꾸고 column이 아직 뜨거울 때 비등 25% KCl 용
액 10㎖를 가해 1초 1방울씩 적하 한다. 비등 KCl 염산용액 8㎖ 다시 7㎖를 주입하고 
용출액의 전량이 거의 25㎖가 되면 cock를 막고 실온까지 방냉하여 물로 정확히 25㎖
로 한다.
마) 산화 : Vol-flask의 액으로부터 정확히 5㎖씩 마개 있는 시험관에 넣어 각각 A, B, C라 
하고 A에는 비타민B1 표준용액(㎍/㎖) 1㎖, B와 C는 물을 1㎖씩 가하여 혼합하고 A와 
B에 1% 적혈염 0.3㎖, C에 물 0.3㎖를 가하고 A, B, C에 30% NaOH 3㎖씩 넣고 30초
간 흔들어 섞는다. Isobutanol 10㎖씩 가해 마개를 막고 세차게 100회 진탕한 다음 무
수황산나트륨 2g을 넣고 다시 100회 진탕한 뒤 정치한다.
5) 측정과 계산
시험관 내의 액이 투명하게 되면 Isobutanol 층을 형광광도계의 Cell에 옮겨 A(첨가 실험
용)를 100%로 하여 B(주검용) C(blank test) 각각의 형광도를 측정한다. (여기파장 365㎚ 70분석광 파장 455㎚)
 V B1(μ/100㎎) = FB - FC×25×100×100
FA - FB 5 a w
              FA : A의 값(보통100)    a : 흡착시킨 검액량
              FB : B의 값             w : 시료채취량 (g)
              FC : C의 값
4. 비타민 B2
1) 원 리
비타민 B2는 alkali 상태에서 광을 조사하면 비타민 B2 자체의 형광보다 훨씬 강한 형광
을 내는 Lumiflavin 으로 변한다. 이 광 분해액을 산성으로 하여 Chloroform 과 진탕하여 
Lumiflavin 을 크로로포름층에 이행시켜 형광을 측정하여 B2를 정량한다. 또한 B2는 산성
에서는 Chloroform 에 불용이므로 미리 산성 Chloroform 처리로서 Chloroform 가용성의 
다른 형광 물질을 제거 가능하며 B2와 Lumiflavin 은 다같이 산성에 대해 저항성이 강하
므로 산성 KMnO 4 용액에 의한 산화로서 기타 형광물질을 제거할 수 있는 점을 이용한 
방법이다.
2) 기 구
형광광도계 , 항온기, 메스 플라스크, 공전 원침관, 메스 실린더, 메스 피펫, 원심분리기 , 
광 분해장치
3) 시약의 조제
가)2N 황산
나)1N NaOH 용액
다)빙초산(glacial acetic acid) 
라)4% KMnO 4 용액
마)3% 과산화수소 : 특급품(30%)를 10배 희석
바)Chlorform(CHCl 3) : 무형광 시판품을 재증류
사)Vit. B2표준용액 : Vit. B2표준품 100㎎을 정취하여 초산성수로 갈색 메스플라스크
에 넣고 온수 중에서 서서히 가온하여 녹이고 실온까지 방냉한다 초산산성수6장. 비타민
71(0.02N)로 1ℓ로 한다 용도에 따라 농도를 조절한다.
4) 조 작
가) 침 출 : 시료의 일정량을 달아(지질이 많으면 미리 ether로 탈지)소량의 물을 가해(Vit. 
B2함량이 50-100 ㎍ 100㎖정도) 80～90℃ 수욕 중에서 교반하여 15～20분간 침출하고 
2N H2SO4를 1/6용 가하여 재차 15분간 침출한다.(전분이 많은 것은 Diastase 가해 3
7～40℃에 하룻밤 방치)  실온까지 방냉하여 물로 일정용량으로 하고 여과하여 침출
액으로 한다 침출액 20～50㎖를 공전원침관에 넣어 Chloroform 20㎖가해 강하게 진탕
한 뒤 300rpm 10분간 원심분리하고 하층의 Chloroform 을 제거하되 이 조작을 3회 
반복한다.
나) 광분해 : 원심분리 후 상층용액으로부터 5㎖씩(Vit. B2로 1m㎍정도) 3개의 마개 있는 
시험관에 취하고 각각 A, B, C로 한다. A(첨가실험용 )에는 Vit. B2 표준용액(1㎍/㎖) 1
㎖를 넣고, B(주검용), C(blank)에는 H2O 1㎖씩 넣어 혼합한다. 3개의 시험관에 1N 
NaOH용액 3㎖씩 넣고 A, B는 1시간 광을 조사하고 (백색 형광등 20㎝ 상방) C는 암
실에 방치한다.
다) 산 화 : A, B, C를 꺼내 빙초산 0.3㎖씩 넣어 산성으로 하고 4% KMNO 4용액을 청색이 
될 때까지 가하고 다음에 3% H2O2를 가하여 과잉의 KMNO 4 환원 탈색한다. 각 시험
관에 클로르포름 10㎖씩 넣고 강하게 2분간 흔들어 섞은 후 정치한다. 잘 분리되지 
않으면 원심침전 후 위의 수층을 제거한다.
5) 측정 및 계산
클로르포름층을 형광광도계 Cell에 옮겨 여기광 365㎚ 분석광에서 A, B, C의 형광도를 
측정 한다.
시료중 B2 함량 = FB - FC×100
×100
FA - FC 5 w
           FA = A의 형광 강도 (보통 100으로 한다)
           FB = B의 형광 강도 (보통 100으로 한다)  
           FC = C의 형광 강도 (보통 100으로 한다)
              a = 침출액량 (㎖)
              w = 시료채취량 (g)
5. 비타민 B672가. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법
1) 시액조제
50mM 인산나트륨용액 : 인산나트륨 6.0g을 증류수에 녹이고 염산으로 pH 2.5로 조절한 
후 전량을 1L가 되게 한다.
2) 표준용액의 조제
가) 피리독신염산염 표준물질 5mg을 정밀히 취해 50mL 부피플라스크에 넣는다. 
나) 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.
3) 시험용액의 조제
가) 시료 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 적당량을 취한다.
나) 테스트튜브에 넣고 증류수 25mL을 넣는다.
다) 30분 동안 초음파 추출 한다.
라) 원심분리후 상등액을 50mL 부피플라스크에 넣는다.
마) 나)～라)의 방법을 1회 반복한다.
바) 증류수를 넣어 표선까지 맞춘다.
사) 이 액을 0.45㎛ 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건(예)
항목 조건
주입량 10μL
칼럼온도 35℃
이동상 50mM 인산나트륨용액 (pH 2.5)
검출기 파장 여기파장 : 290nm , 측정파장 : 396nm
유량 1.0 mL/분
나) 계산식
       비타민B6함량(피리독신,mg/100g)=S×a×b
시료채취량(g)×100
1,000
            S : 시험용액중의 비타민 B6(피리독신)의 농도(μg/mL)6장. 비타민
73            a : 시험용액의 전량(mL)
            b : 시험용액의 희석배수 
6. 비타민 B12
가. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법
1) 시액조제
5mM KH2PO4 : KH2PO4 0.68 g을 증류수에 녹이고 전량을 1 L가 되게 한다.
2) 표준용액의 조제
가) 표준원액 : 비타민 B12(Cyanocobalamin) 을 5mM KH2PO4에 녹여 표준원액(100 μg/mL)을 
조제한다. 
나) 표준용액 : 표준원액을 증류수로 적당히 희석하여 표준용액을 만든다.
3) 시험용액의 조제
가) 검체 적당량을 취하여 마쇄기를 이용하여 잘게 부순 후 5mM 인산완충용액을 가하여 
10분간 초음파 진탕기로 추출한 후 50mL로 맞춘다.
나) 21,000rpm 에서 원심분리한다 . 
다) 분리 후 중간층을 취해서 21,000rpm 에서 다시 원심분리하고 , 중간층을 시험관에 옮겨 
클로르포름 3mL을 첨가하여 지방층을 제거(2,000rpm) 한 물층을 다시 21,000rpm 에서 
10분간 원심분리한다 .
라) 마지막으로 맑은 액층을 0.45μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 
4) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프의 조건(예)
항목 조건
주입량 10μL
칼럼온도 35℃74나) 계산식
        비타민 B12(μg/100g) =S × a×b×100
검체량(g) 1000
          S : 시험용액중의 비타민 B12의 농도(ng/mL)
          a : 시험용액의 전량(mL)
          b : 시험용액의 희석배수
5) 실험 주의사항
주1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것
주2) 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 용량의 홀 피펫과 부
피 프라스크를 사용하여야 한다.
7. 비타민 C
가. 액체크로마토그래피에 의한 정량
1) 장치 액체크로마토그래프 : 자외부검출기를 사용한다.
2) 시약 및 시액
가) 10% 메타인산용액 ：메타인산 10g을 물에 녹여 100mL로 한다. 불용물이 생기는 경우 
여과하여 사용한다. 냉장고에서 일주일까지 보관할 수 있다.
나) 5% 메타인산용액 ：10% 메타인산용액을 물로 2배 희석한다. 사용시 조제한다.
다) 표준용액의 조제 : 아스코르빈산 10.0mg을 정밀히 달아, 5% 메타인산용액에 녹여 
100mL로 한 것을 표준원액(100ppm)으로 한다. 필요한 경우 표준원액에 5% 메타인산
용액을 넣어 원하는 농도로 희석하여 사용한다. 사용시 조제한다.
3) 시험용액의 조제
검체 일정량(비타민 C 함량이 50mg/100g 이상인 경우 2g 정도, 10mg～50mg/ 100g인 경항목 조건
이동상 5mM KH2PO4 / Methanol (80/20)
검출기 파장 550nm
유량 120μL/분6장. 비타민
75우 5～10g 정도를 검체로 한다)을 정확히 달아, 동량의 10% 메탄인산용액을 가하여 10분
간 현탁시킨 후 적당량의 5% 메탄인산을 넣어 균질화한다 . 균질화된 검체를 100mL 메
스플라스크에 옮기고 소량의 5% 메탄인산용액으로 용기를 씻은 후 메스플라스크에 합하
여 100mL로 한다. 그 후 3,000 rpm에서 10～15분간 원심분리를 행하여 상등액을 취하고 
5% 메탄인산용액으로 적당히 희석하여 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 조건
① 칼럼：역상칼럼(Jascopack Fine Sil-NH2, Lichrosorb NH2, 조건을 달리하며, Zipax 
SAX, Vydac SAX. Partisil-10SAX, μ-Bondapak C18, μ- Bondapak/ CN, Pormaphase 
CPS등을 사용할 수 있다)
② 이동상 ：0.05 M KH2PO4/아세토니트릴 (60：40)
③ 유  속：1.0 mL/분
④ 검출기 ： 자외부(UV) 검출기(254 nm)
5) 정량시험 
시험용액 및 표준용액을 각각 10μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 
검량선을 작성한 후 시험용액의 비타민C의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 검체
중 아스코르빈산의 함량(mg/100g) 을 산출한다. L-아스코르빈산 나트륨으로 환산하는 경
우에는 L-아스코르빈산량에 계수 1.125를 곱한다.
               비타민 C 함량(mg/100g) ＝S ×a×b×100
검체채취량 (g)1000
               S：시험용액중의 아스코르빈산의 농도(μg/mL)
               a：시험용액의 전량(mL)
               b：시험용액의 희석배수
8. 비타민 D
가. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법
1) 시 약
가) 무알데히드에탄올 : 에탄올 1L에 50% 수산화칼륨용액 5mL 및 아연분말 5g을 가해 약 762시간 환류 후 증류한다. 단, 처음 및 마지막 증류액 각각 10%는 버린다.
2) 표준용액의 조제
비타민 D2 또는 D3를 무알데히드에탄올에 녹인 후 적절하게 희석하여 표준용액으로 사
용한다.
3) 시험용액의 조제
가) 시료가 고체인 경우에는 초고속마쇄기로 잘게 마쇄한다.
나) 비타민 D2 IU(0.05 μg) 이상 함유한 시료를 증류플라스크에 정밀히 취한다.
다) 피로갈롤 : 에탄올(1→10)용액 40mL를 가하여 약하게 진탕 혼합한다.
라) 90% 수산화칼륨 10mL를 가하고주1) 환류냉각기를 부착하여 수욕중에서 30분간 가열 비
누화주2)한다.
마) 냉각 후 벤젠 100mL를 가하여 15초간 강하게 진탕 혼합한다. 침전이 생기면 이것이 
가라앉을 때까지 방치한다.
바) 250mL 분액깔대기에 옮기고 1N 수산화칼륨 100mL을 가하여 15초간 강하게 진탕 혼
합한다.
사) 방치하여 층분리를 한 후 혼탁한 물층을 버린다.
아) 벤젠 층에 0.5 N 수산화칼륨 40mL를 넣어 진탕 혼합한다.
자) 벤젠 층에 적어도 4회 매회 15초씩 물 40mL로 세척한다. 세척액이 페놀프탈레인시액
으로 알칼리반응을 나타내지 않을 때까지 세척한다.
차) 분액깔대기를 수 분간 방치하여 최후의 물 한방울까지 분리하여 물층을 제거한다.
카) 벤젠용액 80mL를 농축플라스크에 취하여 40℃이하에서 용매를 감압 농축한다.
타) 잔류물에 벤젠 5mL를 가하여 녹이고 이 액 4.5mL를 환저플라스크에 취하여 감압농축
한다.
파) 잔류물에 아세토니트릴 : 메탄올(1：1)용액 500μL를 정확하게 가하여 녹인 것을 시험
용액으로 한다.
4) 정량시험
가) 1단계 분취용 고속액체크로마토그래피 : 시험용액 200μL를 정확히 취해 제1단계 고속
액체크로마토그래피에 주입 하여 분획포집기로 비타민 D 획분을 분취한다(비타민 D 
표준용액의 크로마토그램으로 비타민 D가 검출기에 도달하는 시간을 측정하여 피크가 
검출기에 도달하는 전후 30초 동안 분액을 받을 수 있도록 예비실험으로 분석조건을 
준비한다).
나) 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래피 : 제1단계에서 얻은 비타민 D 획분의 용매를 6장. 비타민
77감압농축하여 잔류물에 0.4% 이소프로판올 ·헥산 200μL를 정확히 가하여 녹인다. 이 
용액 100μL를 정확히 취하여 제2단계 고속액체크로마토그래피에 주입하여 얻어진 크
로마토그램에 나타난 비타민D의 피크의 높이 또는 면적을 측정한다.
5) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건
① 제1단계(분취용) 고속액체크로마토그래프 (예)
            항목 조건
칼럼온도 35℃
이동상 아세토니트릴 : 메탄올 = (1:1)
검출기 파장 254nm
유속 2.0mL/분
② 제2단계(분석용) 고속액체크로마토그래프 (예)
            항목 조건
칼럼온도 35℃
이동상 0.4% 이소프로판올․헥산용액
검출기 파장 254nm
유속 1.6mL/분
나) 계산식
           비타민 D(IU/100g)＝Psa×S × a×100Pst 시료채취량 (g)
        S
Pst
Psa
a: 비타민 D 표준용액의 농도(IU/mL)
: 비타민 D 표준용액의 피크의 높이 또는 면적
: 검체에 대한 피크의 높이 또는 면적
: 시험용액의 전량(mL)
※비타민D의 함량은 비타민 D2 또는 비타민 D3를 구분하여 계산786) 시험 주의사항
주1) 지질함량에 따라 적당히 증감한다. 대개 지질 1g이 수산화칼륨 1g 상당한다.
주2) 비타민 D는 가열 검화시 일부분 가역적으로 열 이성화되어 previtamin D로 전환하는 
것으로 알려져 있다. 이러한 열 이성화 반응은 습도에만 의존하는 가역반응으로 , 습
도가 일정하면 거의 대부분 일정한 비율로 진행한다. 따라서 본법에서는 비타민 D 
표준용액에 대해서도 시료와 동일한 조건하에서 가열 검화한다. 이것에 따라 시료, 
표준품 모두 같은 비율로 previtamin D로 이성화하기 때문에, 피크높이를 비교하는 
것만으로 previtamin D로 이성화된 부분이 상쇄된다.
9. 비타민 E
가. 액체크로마토그래피에 의한 정량
1) 장치 : 액체크로마토그래프 : 형광검출기를 사용한다.
2) 시약 및 시액
가) 에탄올 ：에탄올(특급) 1L에 50% 수산화나트륨용액 5mL 및 아연분말 5g을 가해 약 2시
간 환류후 증류한다.
나) 헥산：스펙트로분석용
다) 무수황산나트륨 ：무수황산나트륨 (시약특급)을 120℃에서 2시간이상 가열시킨 후 데시
케이터(실리카겔)에서 방냉하고 밀전하여 보존한다.
라) α-, β-, γ-, δ-토코페롤 ：d-α-, d-β-, d-γ-,  d-δ-토코페롤 순품
마) 표준용액의 조제
① 토코페롤동족체 표준용액
토코페롤 동족체(α-, β-, γ-, δ-토코페롤)을 각각 100mg씩 정밀히 달아 헥산을 
가해 녹여 100mL로 한 후, 각각의 5mL를 취하여 헥산을 가하여 25.0mL로 한다.
공전 갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존
한다(1개월간 사용할 수 있다).
② 토코페롤표준용액
토코페롤 약 100mg을 정밀히 달아 헥산을 가해 녹인 후 100mL로 한다. 이 5mL
를 취해 헥산을 가해 25.0mL로 한다. 공전 갈색유리병에 넣어 공기를 질소가스
로 치환하여 밀전한 후 냉암소에 보존한다(1개월간 사용할 수 있다).6장. 비타민
793) 시험용액의 조제
가) 일반검체의 경우
토코페롤로서 약 0.2mg을 함유하는 검체를 검화플라스크에 정밀히 달아(Wg) 에탄올 
30mL 및 10% 피로갈롤·에탄올 용액 1mL를 가하고 이에 수산화칼륨용액 (9→10) 3 
mL를 가해 환류냉각관을 부착하여 비등수욕중에서 30분간 비누화한다 . 비누화후 즉시 
냉각하여 실온으로 한 후 물 30mL를 가해 갈색분액여두에 옮긴다. 플라스크는 물 
10mL, 석유에테르 30mL로 씻어 넣고 잘흔들어 혼합하여 방치한 후 석유에테르층을 
분취한다. 물층은 석유에테르 30mL씩으로 2회 추출하고 석유에테르액을 합하여 물 
10mL로 1회, 이어 물 50mL로 페놀프탈레인시액이 분홍색이 되지 않을 때까지 씻는
다. 분액여두중에서 물을 충분히 분리한 후 무수황산나트륨을 가해 탈수한 후 석유에
테르층을 갈색플라스크에 옮긴다. 잔존하는 황산나트륨은 다시 석유에테르 10mL씩으
로 2회 씻고 씻은 액을 플라스크에 모두 합한 다음 전석유에테르추출액을 40～45℃에
서 감압건고한 후 잔류물은 헥산 1.0mL를 가하여 녹여 이를 시험용액으로 한다.
나) 유지검체의 경우
검체가 유지인 경우에는 위의 조작중 비누화조작을 생략하고, 액체크로마토그래프에 
직접 주입할 수 있다. 이 경우에는 유지 약 1g을 정밀히 달아(Wg) n-헥산으로 녹여 
50mL로 한 후, 그 중 일정량(DmL)을 취해 헥산으로 희석한 것을 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 조건
① 칼럼：순상형 칼럼
② 이동상 ：헥산․이소프로판올 (98：2)
③ 유속：0.5mL/분
④ 검출기 ：형광검출기 (여기파장 298nm, 측정파장 325nm)
5) 정량시험
시험용액 1.0mL에 토코페롤표준용액 1.0mL를 가해(S) 이의 10μL를 액체크로마토그래프
용 칼럼에 주입하여 얻은 토코페롤동족체의 피크 넓이 또는 높이(Ptoc) 및 토코페롤의 
피크 넓이 또는 높이(Pint)를 구한다. 또한 토코페롤동족체 각각에 대하여 각 토코페롤 
표준용액 1.0mL를 취해 이에 토코페롤표준용액 1.0mL를 가해 이의 10μL를 액체크로마
토그래프에 주입하여 얻은 각 토코페롤 동족체의 피크 넓이 또는 높이(Pst-toc)와 토코
페롤의 피크 넓이 또는 높이 (Pst-toc)를 구하고, 이들의 중량(mg)에서 토코페롤 동족체
의 토코페롤에 대한 환산계수(F)를 구한다. 검체중 토코페롤 동족체의 함량(mg/ 100 g)은 
다음 계산식에서 구한다.80가) 계산방법
① 일반검체의 경우
  토코페롤동족체의 양(mg/100 g) ＝ S× Ptoc
×F×100
 Pint W
         S：시험용액에 함유된 토코페롤의 함량(mg)
         S＝V×C
         V：검체에 첨가한 토콜표준용액의 양(mL)
         C：검체에 첨가한 토콜표준용액의 농도(mg/mL)
         Ptoc：시험용액중 토코페롤 동족체 피크의 넓이 또는 높이
         Pint：시험용액중 토코페롤 피크의 넓이 또는 높이
         F ：환산계수  
           Fα-δ＝Cst-toc×Pst-int
Cst-int Pst-toc
         Cst-toc：표준용액중 토코페롤 동족체의 농도
         Pst-toc：표준용액중 토코페롤동족체 피크의 높이 또는 넓이
         Cst-int：표준용액중 토코페롤의 농도
         Pst-int：표준용액중 토코페롤 피크의 높이 또는 넓이
② 유지검체의 경우
토코페롤 동족체의 양(mg/100 g)＝S×50 ×Ptoc×F×100
D Pint  W
10. 비타민 K
가. 고속액체크로마토그래프에 의한 정량법
1) 시 약
가) Conditioning 용액 : 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 0.01%가 되게 한다.
나) 용출용매(이동상) : 디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 15%, 0.02%
가 되게 한다.6장. 비타민
81다) 정제칼럼 : 60～200 메쉬 실리카 5.0g (100℃ 오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴 )을 정
제 칼럼(1.0cm id × 30cm, 유리 칼럼)에 충전하고 그 위에 무수황산나트륨 2.0g(100 ℃ 
오븐에서 하룻밤 동안 활성화시킴 )을 가한다.
2) 표준용액의 조제
가) 비타민 K1 표준물질주1) 이소옥탄에 녹여 5μg/mL이 되게 한다.
나) 검량선을 작성할 수 있도록 이소옥탄으로 희석하여 사용한다.
3) 시험용액의 조제
가) 시료 일정량주2)(비타민 K1으로서 3.5 μg함유)을 정확히 취한다.
나) 정밀이 취한 시료를 500mL 분액여두에 넣는다.
다) 암모니아수 4mL를 가한 후 60초간 흔들어 혼합한다.
라) 위의 용액에 메탄올 60mL을 가하여 혼합한 후 디클로로메탄 100mL과 이소옥탄 50 
mL 혼합액을 가하여 잘 흔들어 추출한다.
마) 층 분리 후 하층액을 250mL 증류플라스크에 옮긴다.
바) 라)의 과정을 반복하여 하층액을 마)의 용액과 합한다.
사) 위의 용액을 75℃ 이하에서 감압농축한다 .
아) 증류플라스크를 아세톤 20mL로 씻고 다시 농축시킨다 .
자) 아)의 과정을 3회 반복 후 질소로 충전하여 차광한 채로 밀봉한다.
차) 정제칼럼에 conditioning 용액 20mL를 주입하고 천천히 용출 시킨다.
카) 위의 잔류물에 conditioning 용액 10mL로 녹인 후 칼럼에 통과시켜 비타민 K1을 흡착
시킨다.
타) conditioning 용매를 5mL씩 2회에 걸쳐 증류플라스크를 씻어 정제칼럼에 통과시킨다 .
파) 시료의 지방 함량에 따라 용출용매를 칼럼에 통과시킨다 . 시료의 지방함량이 0.72～
0.80g이면 100 mL의 용매를, 0.72g 이하이면 예비실험을 통해 용출액의 양을 결정한다. 
하) 용출액을 250 mL 증류플라스크에 받아 75℃ 이하로 감압 농축하고, 농축액을 이소옥
탄 1～2mL로 수 회 나누어 씻어 5mL로 한다.
4) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건주3)(예)82항목 조건
주입량 20μL
칼럼온도 35℃
이동상디클로로메탄과 이소프로판올을 이소옥탄에 녹여 각각 
30%, 0.02%가 되게 한다.
검출기 파장 254nm
유속 0.5mL/분
나) 계산식
       비타민 K1 함량(μg/100g) ＝Cstd×F×Hs
Hstd×V
S×100
       Cstd : 표준용액의 농도(μg/mL)
       F   : 비타민K1 표준용액에서 각각의 이성체의 비율
       Hs   : 시료의 비타민K1 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이
       Hstd  : 비타민K1 표준용액 각각의 이성체의 피크 면적 또는 높이
       V   : 시험용액의 희석배수(mL)
       S   : 시료 채취량(g)
              (비타민 K1표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체들을 분리
하여 전체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한다.)
5) 시험 주의사항
주1) 비타민 K1 표준품은 trans와 cis 이성체를 함유하므로 각각의 이성체들을 분리하여 전
체에 대한 cis형과 trans형의 피크 면적 비를 구한다.(불활성형 cis형을 ≤ 20 %정도 함
유함). 암소에서 보관한다.
주2) 지방함량이 적은 시료일 경우 지방을 검화할 필요는 없지만, 지방함량이 많은 시료는 
검화를 하여 검화물질을 제거해야 한다.
주3) column이 이동상에 평형이 되도록 이동상을 column에 흘려 보낸다(보통 column 부피
의 50배). 순상컬럼은 역상에 비해 물질의 머무름시간이 이동상에 함유된 미량의 극성
용매에 의해 변동폭이 크다. 특히 물이나 Methanol이 HPLC용 용매에도 적은양 함유하
고 있는데 이들이 머무름 시간에 미치는 영향은 크므로 항상 같은 용매를 사용해야 하
며, 주기적으로 순상 column은 regeneration 해야 한다. 비슷한 시료를 분획할 때는 시
료간에 peak의 모양이 비슷하므로 분획하는데 큰 어려움이 없으나 시료간에 peak의 
모양이 다를 때는 매번 표준물질을 사용하여 분획한다. 한 시료의 분획이 끝나면 충분
히 이동상으로 column을 세척하여 다음의 시료에 전 시료가 오염되지 않도록 한다.6장. 비타민
8311. 판토텐산
가. 액체크로마토그래피에 의한 정량
1) 장 치  
액체크로마토그래프 : 자외부검출기를 사용한다.
2) 시약 및 시액 
가) 20mM KH2PO4：KH2PO4 2.7 g을 증류수에 녹이고 인산으로 pH 2.1로 조절한 후 전량을 
1 L가 되게 한다. 
나) 표준용액의 조제
판토텐산((D-pantothenic acid, hemicalcium salt)을 20mM KH2PO4에 녹여 표준원액(100 
μg/mL)을 조제하고, 표준원액을 증류수로 적당량 희석하여 표준용액을 만든다. 
3) 시험용액의 조제 
검체 적당량을 취하여 분쇄기를 이용하여 잘게 부순후 적당량의 20mM 인산완충용액을 
가하여 30분간 초음파장치로 추출한 후 50 mL로 맞추고, 3,000 rpm에서 원심분리하여 
상등액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 
4) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 조건
① 칼럼：역상칼럼 (C18 또는 이와 동등한 것, 1.5 mm×250 mm, 5 μm)
② 이동상
A- 20mM potassium phosphate(pH 2.1)
B- 20mM potassium phosphate/ACN(80/20)
A：B(96：4)의 혼합액으로 37분간 흘려보낸 후 B 용액으로 10분간 세척한다.
③ 유속：120 μL/분
④ 검출기 ：자외부(UV) 검출기(200nm)
5) 정량시험       
시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 피
크의 넓이 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하여 시험용액의 판토텐산의 농도(μ
g/mL)를 구하고, 다음의 식에 의하여 검체중 판토텐산의 함량(mg/100 g)을 구한다. 84가) 계산방법
          판토텐산(mg/100 g) =S 
× a×b
×100
검체량(g)1000
       S：시험용액중의 판토텐산의 농도(μg/mL)
       a：시험용액의 전량(mL)
       b：시험용액의 희석배수
12. 이노시톨
이 품목을 105°에서 4시간 건조한 다음 약 0.2g을 정밀히 달아 250ml의 비이커에 넣고 
묽은황산 1ml 및 무수초산 50ml의 혼액 5ml를 가하고 비이커를 시계접시로 덮고 수욕상
에서 20분간 가열한 다음 얼음으로 식히고 물 100ml를 가하여 20분간 끓이고 식힌 다음 
비이커의 내용물을 250ml의 분액깔대기에 옮기고 비이커를 소량의 물로 씻고 씻은 액을 
분액깔대기에 합친다. 다음에 클로로포름 30ml, 25ml, 20ml, 15ml, 10ml 및 5ml의 순서로 
비이커를 씻은 다음 차례로 추출하여 전 클로로포름추출액을 합하여 물 10ml로 씻고 탈
지면으로 여과하여 클로로포름 10ml로 씻고 여액과 씻은 액을 합하여 수욕상에서 증발
건고하고 105°에서 4시간 건조한다. 식힌 다음 무게를 달아 헥사아세틸이노시톨
(C18H24O12)의 양을 구하고 다음 식에 따라 이노시톨의 양을 산출한다. 
 이노시톨(C6H12O6)의 양(mg) ＝ 헥사아세틸이노시톨 (C18H24O12)의 양(mg)×0.4167
13. 염화콜린
가. 효소분석법
1) 시료중의 염화콜린 정량 : 표준품 및 본 품 콜린으로서 약 150～200ppm에 해당하는 양
을 정밀하게 칭량하여 정제수로 1ℓ가 되도록 표정하여 녹인 후 여과하여 측정한다.
2) 사용조건
가) 효소분석기 (생화학분석기 )
나) 표준용액(콜린) : 175ppm(mg/l)6장. 비타민
853) 계산방법
     염화콜린의 
함량(ppm)=측정
치×235ppm
×희석배
수 175ppm
      235ppm : 표준용액 175ppm을 염화콜린으로 환산한 량(ppm)
      175ppm : 표준용액
나. HPLC 분석방법
1) 전처리 : 1.0g에 해당하는 표준품 및 본 품을 정확히 칭량하여 125㎖ 둥근 플라스크에 
넣고 25㎖ H2O + 25㎖ CH3CN을 가하여 10～15분간 Sonication 한 후 여과하여 20㎕ 주
입한다.
2) 분석조건
컬럼 : C18 역상컬럼
Injection Volume : 20㎕
Flow rate : 0.8 ～ 1.0 ㎖/min
검출기 : RI detector
이동상 : H2O 500㎖+CH3CN 500㎖+Sodium Lauryl Sulfate 2.88g+Acetic acid 10㎖
14. 나이아신
가. 분석원리
검체 중에 포함되어 있는 니코틴산(나이아신)을 수용액으로 추출, 정제한 후 액체크로마
토그래피를 이용하여 정성 및 정량분석하는 방법이다.
나. 장 치
액체크로마토그래프 : 자외부검출기를 사용한다.86다. 시약 및 시액
1) 5mM sodium hexanesulfonate 용액 : sodium hexanesulfonate (FW=182.22) 91.11mg을 증
류수에 녹여 100mL로 한다.
2) 용매 : 메탄올, n-헥산 등은 HPLC 급 또는 이와 동등한 것
3) 물 : 3차증류수 또는 이와 동등한 것
4) HLB 카트리지 : N-vinylpyrrolidine 과 divinylbenzene 이 copolymer 의 형태로 결합된 고정
상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(용량 3mL) 또는 이와 동등한 것
5) 표준원액 : 니코틴산 및 니코틴아미드를 각각 증류수에 녹여 100 mg/L로 한다.
6) 표준용액 : 표준원액을 각각 증류수에 녹여 적당한 농도로 희석, 혼합한다.
라. 시험용액의 조제
1) 추 출
검체 일정량(1-10g)을 정밀히 달아 100mL 메스플라스크에 넣고 5mM hexanesulfonate 용
액에 녹여 100mL가 되도록 한다. 이 용액을 30분간 초음파 추출한 후 추출액을 원심분
리기를 사용하여 0℃, 9000rpm에서 30분간 원심분리한다 .  상등액을 취해 membrane 
syringe filter(pore size 0.2 ㎛, 25 mm)로 여과한다.
2) 정 제
여과액의 정제를 위하여 HLB 카트리지를 준비하고 카트리지에 5mL의 메탄올과 5mL의 
증류수를 연속으로 통과시킨 후 카트리지에 여과액 10mL를 통과시켜 니코틴산 및 니코
틴아미드가 카트리지에 흡착되도록 한다. 카트리지는 5mL의 n-헥산으로 세척한 후 80% 
메탄올용액 5mL로 용출한다. 용출액은 10mL 메스플라스크에 모으고 증류수를 가하여 
10mL로 하여 시험용액으로 한다. 
마. 시험조작
1) 크로마토그래프의 측정조건
가) 칼럼 : Capcellpak UG120V(4.6×250 mm, 5 ㎛) 또는 이와 동등한 것
나) 이동상 및 유속 : 1 mL/min
A: 5 mM hexanesulfonate/0.1% acetic acid 
B: 35% 5 mM hexanesulfonate/0.1% acetic acid /65% MeOH 
A:B=100:0(3min hold) → 3%/min → A:B=70:30(7 min hold)
다) 주입량 : 10 μL6장. 비타민
87라) 검출기 및 파장 : 자외부(UV) 검출기(260nm)
마) 칼럼오븐온도 : 40℃
2) 검량선 작성
니코틴산 및 니코틴산아미드 표준용액을 희석하여 일정농도가 되도록 제조한 후 HPLC
에 10μL씩 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상 각 피이크의 넓이를 구하여 검량선을 
작성한다.
표 1. 니코틴산(나이아신)의 검출한계 및 정량한계
분석성분 검출한계 (mg/kg) 정량한계 (mg/kg)
니코틴산 0.2 1.0
니코틴아미드 0.2 1.0
바. 정성시험
시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하여 얻어진 피이
크의 머무름 시간(retention time)을 비교해서 니코틴산의 성분을 확인한다.
사. 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 피이크의 면적 또는 높이를 측정하여 작성한 검량
선으로부터 니코틴산의 함량을 정량한다.
1) 계산방법
① 일반 검체
니코틴산시험용액의농도×시료량시험용액의부피×당 
②특수의료용도 등 검체
니코틴산시험용액의농도×시료량시험용액의부피×회섭취량
* 특수의료용도등식품의 단위는 표시사항에 따라 변동될 수 있음.
15. 비오틴
가. 고속액체크로마토그래피에 의한 정량881) 시약
가) 0.01M 인산이수소칼륨 용액(pH 4.8) : 인산이수소칼륨 1.35g을 증류수에 녹여 1L로 한
다.
2) 표준용액의 조제
가) 비오틴 표준물질주1)을 0.01M 인산이수소칼륨용액에 녹여 1,000mg/L 가 되도록 조제한
다.(4℃ 이하 암소 보관)
나) 상기 표준원액을 0.01M 인산이수소칼륨용액으로 희석주2)하여 표준용액으로 사용한다.
(사용시 제조)
3) 시험용액의 조제
가) 균질화한 시료주3) 일정량(약 5g)을 정밀히 취한다.
나) 위의 시료를 50mL 갈색 부피플라스크에 넣고 0.01M 인산이수소칼륨용액을 넣는다.
다) 30분 동안 초음파 추출한다.
라) 0.01M 인산이수소칼륨용액 넣어 표선까지 맞춘다.
마) 추출액을 원심분리관으로 옮겨 10분간 shaker에서 격렬하게 흔든다.
사) 0℃에서 35,000G로 30분간 원심분리한 후 상층액을 취한다.
아) 이 액을 0.2μm 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프의 조건(예)
            항목 조건
주입량 100μL
칼럼온도 40℃
이동상전처리컬럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액
분석컬럼 : 0.01 M 인산이수소칼륨용액 /메탄올(80:20)
검출기 파장200nm
유속전처리컬럼 : 500μL/분
분석컬럼 : 100μL/분
나) 계산법
비오틴(mg/100g) = C × (a × b) / S × 100 / 1,0006장. 비타민
89C : 시험용액 중의 비오틴의 농도(μg/mL)
a : 시험용액의 전량(mL)
b : 희석배수
S : 시료 채취량(g)
5) 시험 주의사항
주1) USP의 reference standard 또는 이에 준하는 것
주2) 표준원액을 희석하여 표준용액 조제 시 조작오차를 방지하기 위하여 반드시 정해진 
용량의 홀 피펫과 부피 프라스크를 사용하여야 한다.
주3) 시료는 대부분 용기․포장 등에 담겨 있으므로 채취시에는 분석결과에 영향을 미치지 
않는 적절한 기구 및 용기를 준비․사용해야한다 .
16. 엽 산
가. 분석원리
검체에 함유된 엽산을 10mM 인산완충용액 (pH 8.0)으로 추출하고, 역상 분배형 칼럼을 
이용하여 액체크로마토그라프에서 분리하고 UV 280nm에서 측정한다. 
나. 장 치
액체크로마토그래프 /자외부흡광검출기 (UV Detector) 
다. 시약 및 시액
1) 10mM 인산완충용액 (pH 8.0)：10mM 인산수소이나트륨 용액에 10mM 인산이수소나트륨 
용액을 가하여 pH 8.0로 조정하여 제조한다.
2) 표준원액 : 엽산 표준품(99.9%)를 0.1N NaOH 수용액에 녹여 1000mg/L 이 되도록 조제한
다.(4℃이하 암소 보관)
3) 표준용액 : 표준원액을 이동상A로 희석하여 10mg/L로 조제한다.(사용 시 제조)
4) 이동상 A : Tetrabutyl ammonium bromide 1.6120g (5 mM)을 pH 7.2로 조정한 인산완충
용액을 가하여 1L가 되게 한 뒤 0.22㎛ 필터로 여과하여 조제한다.
5) 검량선표준용액 : 표준용액을 이동상A로 희석하여 정량하기에 적합한 농도로 3개 이상 90조제한다.(사용 시 제조)
6) 기타시약 : 잔류농약 시험용 또는 HPLC용
라. 시험용액의 조제
균질화한 검체(약 2g)를 50mL 갈색 플라스크에 정확히 칭량하고, 10mM 인산완충용액
(pH 8.0)을 첨가하여 50mL로 정용하여 10분간 초음파 추출한 후 원심분리관으로 옮겨 
20분간 shaker에서 격렬하게 흔들어 준 다음, 5,000rpm조건에서 10분간 원심분리를 실시
하고, 상징액을 0.22㎛의 membrane filter로 여과한 후 시험용액으로 사용한다.
마. 시험조작
1) 고속액체크로마토그래프의 측정조건
가) 칼럼 : Capcellpak C18 UG120(4.6mm×250mm, 5㎛) 및 이와 동등한 것
나) 칼럼온도 : 40℃
다) 이동상(Isocratic elution)
이동상 A: 아세토니트릴을 8:2로 혼합하여 사용한다.
라) 이동상 유속 : 1.0mL/min
마) 주입량 : 20μL
바) 검출기파장 : 280nm
2) 검량선 작성
검량곡선표준용액을 액체크로마토그래프에 20uL씩 각각 주입하여 얻어진 크로마토그램 
상의 각 피크의 넓이를 구하여 검량선을 작성한다.
바. 정량시험
정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크면적법에 따라 정량한다.
1) 계산방법
엽산 함량(ug/100 kcal) =Y' ×V×100
S 검체 1g 당 kcal
       Y' = 검량곡선에 대입하여 얻은 시험용액의 농도(ug/mL)
       V = 시료 추출에 사용된 용액의 부피(mL)
       S = 추출시료의 무게(g)6장. 비타민
9117. L-카르니틴
가.정량법
1)이품목약0.1g을정밀히달아개미산3mL및빙초산(비수적정용)50mL를
가하여0.1N과염소산으로적정한다(지시약:크리스탈바이올렛․빙초산시액).
종말점은액의자색이청색을지나녹색으로변하는점이다.따로같은방법으
로공시험을한다.
0.1N 과염소산용액 1mL = 16.12mg C7H15NO3
18.주석산수소콜린
가.효소분석법
1)전처리
표준품및본품을콜린으로서약150~200ppm에해당하는양을정밀하게칭량하여정
제수로녹인후여과하여측정한다.
2)사용조건
가)YSI2700효소분석기(생화학분석기)
나)표준용액(콜린):175ppm(mg/l)
3)계산방법
주석산수소콜린
의 함량(ppm)=시료액의 
콜린농도 (mg/l)×253.25×희석배수104.17
235.25:주석산수소콜린의분자량
104.17:콜린의분자량927장. 곰팡이독소
1. 아플라톡신 (Aflatoxin B1, B2, G1, G2)
가. HPLC 법a
1) 기 구
HPLC, 호모게나이저 , 진공펌프, 로타리 증발기, 여과병, 깔대기, 분액 여두, 
Column(22×300 ㎜), 항온 수조, 바이알(vial), 메스플라스크 , 메스 실린더, 홀피펫
2) 시약의 조제
가) 메탄올(Methanol) : 특급품 또는 HPLC등급품 원액을 사용
나) n-핵산(n-Hexane) : 특급품 또는 HPLC등급품 원액을 사용
다) 세라이트(Celite) : 545 또는 이와 동등품
라) 클로르포름 (Chloroform) : 특급품 또는 HPLC 등급품 원액을 사용
마) 무수 황산소다(Sodium Sulfate Anhydro, Na2SO4) : 1시간 건조후 사용
바) 실리카겔(SilicaGel) : Kiesel Gel 60(Merck사제 Art 7734)또는 이와 동등품을 105℃에서 
1시간 건조시킨 후 증류수 1%를 첨가하고 1일 이상 경과 후 사용
사) 클로르포름 메탄올(Chloroform Methanol) 액 : 클로르포름과 메탄올(97 : 3)의 비율로 혼합
아) 아플라톡신 표준품 : 아플라톡신표준품 B1, B2, G1, G2를 벤젠-아세토니트릴 (98 : 2)로 
용해 희석하여 사용한다.
자) 3불화 초산(Trifluoro acetic acid) : 특급품 또는 HPLC 등급품 원액을 사용
차) 증류수(Distilled water) : HPLC 등급품 원액을 사용     
카) 아세토니트릴 (Acetonitrile) : HPLC 등급품 원액을 사용
3) 시료액의 조제
가) 시료 50g을 삼각플라스크에 취하고 메탄올 150㎖와 증류수 100㎖ 및 n-핵산 100㎖를 
가하고 30분간 진탕 추출한다.
나) No.2여과지에 세라이트 545를 넣은 후 흡인하면서 추출액을 여과하고 메탄올과 증류
수가 합쳐진 층(하층) 50㎖를 취하여 250㎖ 분액여두(分液濾斗)에 넣고  n-핵산 100㎖
를 가하여 5분간 진탕 후, 액층을 분리시켜 하층을 다른 분액여두에 옮기고 클로르포
름 50㎖를 가하고 5분간 진탕 후 액을 분리시켜 클로르포름층 (하층)을 취한다.
다) 메탄올과 증류수가 합쳐진 층에 상기의 조작을 2회 더 반복한 후 클로르포름을 합하
여 무수 황산나트륨에 통과시키면서 여과하여 탈수 후 회전식 증발기로 50℃에서 클로
르포름을 증발 건조한다.7장.곰팡이독소
93라) 칼럼(22×300 ㎜)의 하부에 그라스울(glass wool)로 막고 클로르포름을 넣어 기포를 제거
한 후 무수 황산나트륨 5g, 실리카겔(Art, 7734) 10g을 넣은 후 다시 기포를 제거하고 
30분간 방치한 다음 무수 황산나트륨 15g을 넣은 후 클로르포름을 칼럼 상층까지 적하 
한다.
마) 증발건고된 증발 플라스크에 클로르포름 10㎖정도 넣어 용해하여 컬럼에 붓는다. 이와 
같은 방법을 3회 반복한다. 이때 클로르포름 양이 실리카겔층 높이와 비슷하게 하는 
것이 좋다.
바) 추출액을 적하하고 n-핵산 150㎖ 및 에테르 150㎖로 탈지한 후 칼럼 하부에 증발 플
라스크를 받치고 칼럼에 흡착된 아플라톡신을 클로르포름 +메탄올(97+3) 200㎖로 용출
하고 회전식 증발기로 50℃에서 증발 건고한다.
사) 증발건고된 아플라톡신을 클로르포름에 소량씩 3～4회 용해하여 바이알(vial)에 넣고 
50℃ 항온수조에서 N2 gas를 주입시키면서 증발건고 시킨 후 3불화 초산 100㎕를 가하
고 마개를 막은 후 1분 후에 증발건고 시킨다.
아) 바이알에 메탄올 희석량의 1/2정도 넣고 완전히 용해한 후 증류수를 메탄올과 동량 가
하고 혼합시킨 후 0.45㎛여과지로 여과하여 시료액으로 한다.
4) 측 정
고속액체크로마토그래피로 다음 조건에 의하여 측정한다.
Column : Reverse phase C18 Column(4.6m×25 ㎝)
Mobile phase : H2O + Methanol + CH3CN(66+19+25)
Detector : Fluorescence Detector
Excitation Filter 338㎚
Emission Filter 425㎚
Flow rate : 0.96㎖/min 또는 2㎖/min
나. T.L.C법(Thin Layer Chromatography)
HPLC방법 과정에서와 같이 증발건고 시킨 후 벤젠+아세토니트릴 (CH3CN) (98+2)용액 200
㎕로 용해하여 시료액으로 하고 TLC판(Merck Art.5553-7) 에 점적하여(이 때 표준품도 점
적한다) TLC챔버(Chamber) 에 전개용매(展開溶媒)〔클로르포름 (90) : 아세톤(10)〕를 100㎖ 
가하고 TLC판을 넣어 전개 거리가 10㎝ 정도 되면 TLC판을 꺼내 암소(暗所)에서 5분간 
말린 후 UV램프(UV Lamp) 장파장(365㎚) 에서 측정한다.
다. 효소면역 측정방법
AOAC에 등재된 분석방법에 따른다.94라. HPLC 법(Immunoaffinity column 정제)
1) 기 구
HPLC(형광 분광검출기를 부착한 것), KOBRA CELL, 호모지나이저 vacuum system, 아플
라톡신 면역친화칼럼 , 갈색 삼각플라스크 , 깔대기, 갈색 바이얼, 피펫, 여과지(Whatman 
No.4), 클램프 스탠드
2) 시 약
가) 증류수(HPLC급), 메탄올(HPLC급), NaCl
나) 추출용매 : 60% 메탄올(메탄올:증류수 v/v)
3) 표준액 조제
아플라톡신 표준품을 메탄올에 1㎍/㎖의 농도로 녹이고 검량선 작성을 위해 5, 10, 20, 
50ppb로 희석하여 준비한다.
4) 시료에서의 시험용액 추출
가) 분쇄용 시료용기에 시료 50g을 칭량하고 염화나트륨 4g과 60% 메탄올 250 ㎖을 첨가
한 후 2분간 고속으로 추출한다.
나) 추출액에 250㎖의 증류수를 넣어 혼합하고 10분간 방치하여 상등액을 Whatman No. 4 
여과지를 이용하여 갈색플라스크에 여과한다.
다) 아플라톡신 면역칼럼은 사용하기 전에 상온이 되도록 하고, vacuum system에 면역칼
럼을 장착하여 칼럼에 들어 있는 보존용액을 제거한다.
라) 상등액 20㎖(시료1g에 대응하는 량)을 취하여 면역 칼럼에 주입한 후 칼럼에 있는 공
기를 뺀 후 중력하 또는 시료액이 분당 2～3㎖가 칼럼을 통과하도록 압력을 조정한다.
마) 시료액이 면역칼럼을 통과한 후 증류수 20㎖로 분당 5㎖로 칼럼을 통과시켜 면역 칼
럼을 세척하고, 압력을 가하여 가능한 모두 제거한다.
바) 메탄올 1㎖로 칼럼에 결합된 아플라톡신을 용리시키고 , 용출하는 동안 용출용액을 3회 
정도 백플러싱을 하여 아플라톡신를 완전히 용출하여 갈색 바이얼에 담는다.
사) 증류수 1㎖를 가하여 칼럼에 잔존하는 아플라톡신을 용리시키고 , 갈색 바이얼에 담아 
혼합하여 총 부피가 2㎖이 되게 하여 기기분석을 위한 시료용액으로 한다.
5) 측 정7장.곰팡이독소
95동시에 측정한 표준품의 머무름 시간과 일치하는 것을 정성시험의 판정기준으로 하며, 
표준품의 분석농도와 얻어진 피크 면적에 의한 검량선을 작성하여 정량시험에 사용한다.
6) HPLC의 조건
가) Column : C18(4.6 ㎜×150 ㎜, 3.5㎛ 또는 4.6㎜×200 ㎜, 5㎛)
나) Mobile phase : methanol :water (50:50 v/v) with KBr 0.119mg/L, 4M nitric acid 350㎕
다) Injection volumn : 10㎕
라) Flow rate : 1㎖/min
마) Detector : 형광검출기
바) Detection wavelength : EX =338㎚, EM=425 ㎚
2. 제랄레놀과 제랄레논(Zearalenol, Zearalenone)
가. HPLC법
1) 기 구
HPLC, 
HPLC 칼럼 (역상 C18, 10㎛, 칼럼 25㎝×4.6㎜)
검출기 : 형광검출기
분쇄기 : 1/8 inch 스크린 부착
2) 시약의 조제
가) 표준액 : Zearalenol 과 Zearalenone 25㎍/㎖ CH3CN을 함유한 용액 0.1, 0.2, 0.5, 1.0과 
2.0㎖를 바이알에 옮기고, 질소가스로 증발건조 시킨다. 10㎖ 이동상 용매를 각 바이알
에 넣고 완전하게 밀봉한다. 표준용액의 농도는 0.25, 0.50, 1.25, 2.50 과 5.0㎍ 독소/ 
㎖ 이다.
나) 이동상 : MeOH, CH3CN과 H2O(1.0+1.6+2.0) 를 혼합하여 탈기시킨다 .
다) 염화나트륨 포화 용액
라) Sodium hydroxide 용액(2%) : 물 1ℓ에 20g NaOH를 용해시켜 제조
마) Citric acid 용액 : 물 1ℓ에 106g citric acid monohydrate 를 용해시킨 것
바) Diatomaceous earth - Hyflo super-cel
3) 샘플의 준비96시료를 분쇄하여 표준체 No. 20을 통과한 것을 사용한다.
4) 추 출
50g의 샘플을 500㎖의 추출플라스크에 넣고, 25g의 규조토와 20㎖의 물을 넣는다. 얼마
간 혼합하고 250㎖ CHCl3를 넣는다. 완전히 밀봉하고 15분간 교반한다. 필터로 여과하고 
100㎖ 메스실린더로 50㎖를 채취한다. 250㎖의 분액여두로 옮기고 10㎖ NaCl 용액을 넣
고 혼합한다. 2%의 NaOH 용액 50㎖를 넣고, 1분간 충분히 섞는다. 정치하여 완전히 층
을 분리하고, 아래층을 버린다. 두 번째 50㎖ CHCl3를 넣고, 1분 동안 충분히 섞는다. 정
치하여 층을 분리하고, 아래 CHCl3층을 버린다. 50㎖ citric acid 용액을 분액여두에 넣고, 
혼합하며 50㎖ CH2Cl2로 Zearalenol / Zearalenone 을 추출한다.  1분 동안 충분히 혼합하
고 정치하여 층을 분리한다. Glass funnel에 glass wool ball과 2인치(40g) 정도의 무수 
Na2SO4를 넣고 통과시킨다 . 두 번째 50㎖ CH2Cl2로 재추출한다 . 추출액을 Na2SO4에 통과
시키고 Na2SO4를 10～15㎖ CH2Cl2로 세척한다. CH2Cl2 추출액을 감압 증류장치에서 거의 
건조할 정도로 증발시키고 4㎖ 테프론 마개가 달린 바이알에 3～4회 CH2Cl2로 세척하면
서 옮긴 후에 질소가스로 건조시키고 0.5㎖의 이동상에 용해시킨다 .
5) 측  정
이동상을 2.0㎖/min으로 흐르게 하고, 형광 검출기 파장을 236㎚(여기 파장), 418㎚(형광 
파장)로 하여 측정한다.
3. 오크라톡신 A (Ochratoxin A)
가. HPLC법
1) 기 구
HPLC : 형광 분광검출기를 부착한 것
호모게나이저 : 200㎖ 용량
원심분리기 : 250㎖
회전 농축기
진탕기 : 500㎖ 용량의 분액여두를 여러개 진탕할 수 있는 것
칼럼 : C18(내경 10㎜, 길이 200㎜)
2) 시 약
가) 메틸화용 메탄올 : 무수 황산나트륨을 적당량 가하고 잘 섞은 다음 12시간 이상 방치
하여 사용한다. 7장.곰팡이독소
97나) 메탄올-탄산수소나트륨 혼합액 : 메탄올 1 용량에 1% 탄산수소나트륨 용액 1 용량을 
혼합한다.
다) 칼럼용 실리카겔 : Kieselgel 60을 105℃에서 2시간 활성화시킨 후, 물을 15w/w의 비율
로 가하여 잘 혼합한다. 그 밖의 시약류는 전부 특급품을 사용한다.
3) 표준액 조제
오크라톡신 A표준품을 아세토니트릴에 1㎍/㎖의 농도로 녹이고 필요시 희석하여 사용한
다. 표정은 TLC시험법에 따른다. 
4) 시료에서의 시험용액 추출
분쇄한 시료 25g을 칭량하고 메탄올-탄산수소나트륨 혼합액 120㎖을 가하여 5분간 균질
화 시킨다. 마개가 달린 메스 실린더에 옮기고 동일 혼합액을 가하여 200㎖로 한다. 잘 
혼합한 다음 원심분리하고 상층액 150㎖를 분액 여두에 옮긴다. 인산 2㎖를 가해 산성화
시켜 발생한 탄산가스를 잘 빼내고 디에틸에테르 100㎖로 3회 추출한다. 에테르층을 합
치고 에테르를 포화한 물 50㎖로 2회 세척한다. 에테르층을 무수 황산나트륨으로 탈수시
킨 후 감압하면서 농축한다. 잔류물에 1% 암모니아수로 포화한 클로르포름 5㎖를 가하
여 녹이고 클린업 용액으로 한다. 
5) 클린업(정제)
미리 칼럼용 실리카겔 1g을 클로르포름을 사용하여 충전시키고 , 클로르포름 추출액을 가
한다. 칼럼 윗면까지 액을 빼고 클로르포름 40㎖로 씻어 낸 후 벤젠-초산(9:1) 50㎖로 오
크라톡신을 용출한다. 용출액을 물 30㎖로 2회 진동 세척하고 무수 황산나트륨으로 탈수
한다. 글라스 울로 여과한 다음 감압하면서 농축한다. 잔류물에 아세토니트릴 500㎕를 
가하여 녹이고 HPLC용 시험용액으로 한다.  
6) 측 정
동시에 측정한 표준품의 머무름시간과 일치하는 것을 정성시험의 판정기준으로 하며, 표
준품의 분석농도와 얻어진 피크 높이에 의한 검량선을 작성하여 정량시험에 사용한다. 
7) HPLC의 조건 
칼 럼 : C18(입경 10㎛, 내경 4.6㎜, 길이 250㎜)
이동상 : 아세토니트릴 -0.1% 인산(1:1)
유 속 : 0.7㎖/min
측정 파장 : 여기파장(Ex) 327nm, 형광파장(Em) 462nm
주 입 량 : 10㎕98나. HPLC법(Immunoaffinity column 정제)
1) 기 구
HPLC(형광검출기를 부착한 것), 호모게나이저 (200㎖ 용량), 원심분리기 (250㎖), 칼럼 : 
C18(내경 4.6㎜, 길이 150㎜)
2) 시 약
가) 증류수, 초산, 메탄올, phosphate buffered  saline(PBS) pH 7.4
나) 추출용매 : 60% 아세토니트릴 (아세토니트릴 :증류수 v/v)
다) 유출용매 : 초산:메탄올(2:98 v/v)
3) 표준액 조제
오크라톡신 A 표준품을 아세토니트릴에 1㎍/㎖의 농도로 녹이고 필요시 희석하여 사용
한다.
4) 시료에서의 시험용액 추출
가) 시료 50g을 칭량하여 60%아세토니트릴 200㎖를 첨가한 후 2분간 고속으로 혼합 한다 
(과열시키지 말 것).
나) Whatman No. 4 여과지를 이용하여 여과하거나 최소 1,600g에서 원심분리한다 .
다) 상등액 4㎖(시료1g에 대응하는 량)을취하여 44㎖ phosphate buffered saline pH 7.4에 
희석한다(아세토니트릴의 최종농도가 5% (v/v)이 되게 한다).
라) 희석 시료용액에 침전이 생성 되었다면 원심분리를 하거나 재 여과 한다.
마) 유리주사기를 칼럼에 연결하여 어뎁터로 이용한다.
바) 희석 시료용액 전량을 칼럼에 적용시키고 분당 2～3㎖로 칼럼을 통과 시킨다.
사) 20㎖ PBS를 분당 약 5㎖로 칼럼을 통과시켜 세척하되 칼럼에서 모든 액체는 제거한다.
아) 1.5㎖ 용출용액을 중력에 의해 칼럼을 통과 시켜 바이알에 담는다. 용출하는 동안 용
출용액을 3회 정도 backflushing 을 하여 오크라톡신 A를 완전히 용출해 낸다. 공기를 
불어넣어 마지막 방울까지 용출한다.
자) 1.5㎖ 증류수를 칼럼에 통과시켜 용출된 시료액에 혼합하고 최종 3㎖을 만든다.
5) 측 정
동시에 측정한 표준품의 머무름시간과 일치하는 것을 정성시험의 판정기준으로 하며, 표
준품의 분석농도와 얻어진 피크 면적에 의한 검량선을 작성하여 정량시험에 사용한다.7장.곰팡이독소
996) HPLC의 조건 
가) Column : C18 ( 4.6㎜×150 ㎜, 5.0 micron)
나) 이동상 : acetonitrile:water: acetic acid(51:47:2, v/v/v)
다) Flow rate : 1㎖/min 
라) Detector : 형광검출기
마) 검출파장 : EX=333 ㎚, EM=443 ㎚
4. 푸사리움 곰팡이독소 (Fusarium Mycotoxins)
가. 기 구
1) 분쇄기 : 100g 정도의 곡류를 분쇄할 수 있는 것
2) 진탕기 : 300㎖ 용량의 분액여두 여러 개를 걸 수 있는 것
3) 회전 농축기
4) 분액 여두
5) 칼럼 : 초자 밸브가 달린 것(내경 22㎜, 길이 300㎜)
6) 글라스 울
7) 가지형 플라스크 : 300㎖ 용량의 것
8) 테프론 패킹이 된 5㎖ 용량의 병
나. 시 약
1) 아세토니트릴 , n-헥산, 클로르포름 , 에탄올, 메탄올, 사이클로 핵산 등의 유기용매 : 증류
한 것 또는 잔류농약 분석용 시약 특급품, 그 밖의 시약 특급품을 사용한다. 
2) 칼럼용 플로리실 : 플로리실 PR(60 ～80mesh)을 130℃에서 2시간 동안 활성화한 후 데시
케이터에서 식힌 것
3) 추출용매 : 아세토니트릴 -증류수(3:1)
4) 푸사리움 독소 표준액
다. 표준액 조제
1) 곰팡이독소 표준원액(100㎍/㎖)
디옥시니발레놀 (deoxynivalenol), 니발레놀(nivalenol) 표준품 각 10㎎을 달아 각각 메탄올 
10㎖에 완전히 녹인 다음 클로르포름을 가하여 정확히 100㎖를 만든다. 푸살레논
-X(fusalenon-X), 3-아세틸디옥시니발레놀 (3-acetyldeoxy nivalen-ol), 디아세톡시스커페
놀(diacetoxyscirpenol), 네오솔라니올 (neosolaniol), T-2 독소, 제랄레논(zearalenone) 표준100품 각 10㎎을 정확히 달아, 각각 클로르포름으로 완전히 녹인 다음 정확하게 100㎖을 만
든다. 
2) GC용 혼합표준용액
디옥시니발레놀 , 니발레놀, 푸살레논-X, 3-아세틸디옥시니발레놀 표준원액 각 1㎖, 디아
세톡시스커페놀 , 네오솔라니올 , T-2 독소, 제랄레논 표준원액 각 20㎖를 메스 플라스크
에 넣고 클로르포름을 가하여 정확히 100㎖를 만든다. 
라. 추 출
1) 분쇄한 시료 20g를 300㎖ 용량의 분액여두에 넣는다. 추출 용제 200㎖를 가하고 30분간 
가볍게 진탕 혼합한다. 
2) 혼합물을 여지로 여과한다. 여과액 125㎖를 300㎖용량의 분액여두에 넣고 n-핵산 100㎖
를 가하여 10초간 가볍게 진탕한다.  
3) 하층의 아세토니트릴 -증류수층을 300㎖ 용량의 가지형 플스크에 넣고 에탄올 80㎖를 가
하여 회전 농축기로 농축 건고한다. 
4) 잔류물에 메탄올 5㎖를 넣고 독소를 충분히 용해한다. 이어서 클로르포름 45㎖를 가하고 
여지로 여과한다. 여과액 40㎖를 약 10㎖까지 농축하고 추출액으로 한다.
마. 클린업(정제)
1) 칼럼에 소량의 글라스 울을 채우고 칼럼의 약 1/3까지 클로르포름을 넣은 다음, 가만히 
유출시키면서 무수 황산나트륨 약 5g을 칼럼의 하부로 내려보낸다 .  
2) 이어서 클로르포름층을 서서히 내려보내면서 플로리실 10g을 기포가 발생하지 않도록 
조용히 교반하면서 가한다. 매분당 5～10㎖의 속도로 클로르포름을 플로리실 윗면에서 
수㎝ 되는 곳까지 흘려보내 윗면이 편편하게 되도록 한다. 재차 클로르포름을 칼럼의 
거의 상단까지 주입한다. 
3) 코크 밸브를 열고 클로르포름을 흘려보내면서 무수 황산나트륨 약 15g을 플로리실 윗면
에 가만히 부어 넣는다. 쌓은 황산나트륨의 상층에 약간 남을 때까지 클로르포름을 흘
려보낸다. 
4) 이 칼럼에 앞의 추출액을 주입하고 계속하여 클로르포름 -메탄올 용액(9:1) 100㎖를 주입
하고 분당 5～10㎖의 속도로 흘려보낸다 . 300㎖ 용량의 가지형 플라스크에 이동상을 모
은다. 회전 농축기로 농축 건고한다.(45℃)
5) 메탄올을 정확하게 4㎖ 가하고 추출액을 완전히 녹인 다음 시험용액으로 한다. 
바. GC에 의한 정량
1) 장치 : ECD나 FID를 부착한 GC 
2) 시릴화제 : 초산에틸-트리메틸시릴이미다졸 -트리메틸클로로실란 (9 : 1 : 0.2)을 사용 바로 
전에 만든다.  7장.곰팡이독소
101사. 분석조건
1) 칼럼 : 1.5% OV-17/Gas Chrom(60 ～80mesh)을 글라스 칼럼(내경 3㎜, 길이 300㎜)에 충전
시킨다.
2) 칼럼 온도 : 235℃
3) 주입구 및 검출기 온도 : 250℃ 
4) 주입량 : 1～1.5㎕ 
아. 시험 방법
시험용액 1㎖(시료 2.5g에 상당) 및 곰팡이독소 혼합표준용액 1㎖를 각각 테프론 패킹용
기에 넣고, 45℃ 열판에서 질소 가스를 흘려보내면서 건고한다. 시릴화제 0.2㎖ 가하고 
밀봉한 후, 교반하면서 실온에서 20분간 반응시킨다 . 반응 후 3.8㎖ 초산에틸을 가하고 
GC용 시험용액으로 한다.  시릴화한 표준용액의 GC에서의 피크를 면적법이나 높이법으
로 검량선을 작성하고 시험용액의 각 독소 함량을 산출한다. 이 방법의 정량한계는 ECD 
및 FID GC를 사용하는 경우에 디옥시니발레놀 , 니발레놀, 푸살레논-X, 3-아세틸디옥시
니발레놀은 각각 5ng/g, 100ng/g이며, 디아세톡시스커페놀 , 네오솔라니올 , T-2독소, 제랄
레논은 각각 100ng/g, 200ng/g이다. 
5. 푸모니신 (Fumonisin B1, B2)  
가. 분석원리
검체 중의 푸모니신을 메탄올 ․아세토니트릴 ․물(25:25:50, v/v/v) 혼합용액으로 추출, 여과
한 것을 면역친화성컬럼으로 정제시키고 OPA(ο-phthaldialdehyde) 용액으로 유도체화한 
후 형광검출기가 부착된 고성능 액체크로마토그래프로 분석한다.
나. 장치 및 기구
  1) 액체크로마토그래프 : 형광검출기 (Fluorescence detector)를 사용한다.
  2) 정제용 컬럼 : 푸모니신용 면역친화성칼럼 (Immunoaffinity column) (회수율 및 재현성 
등이 검증된 것)
  3) 여과지 ：Whatman No.2(12.0 cm) 또는 이와 동등한 것
  4) 유리섬유여과지 (Glass microfiber filter paper) : Whatman GF/A pore size : 1.6 μm) 또
는 이와 동등한 것
다. 시약 및 용액102  1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
  2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
  3) 푸모니신 혼합표준원액 : 푸모니신 B1및 B2를 아세토니트릴 ․물(50:50, v/v) 혼합용액에 
녹여 각각 200 μg/mL가 되도록 한다.
  4) 푸모니신 혼합표준용액 : 푸모니신 혼합표준용액 1 mL를 정확히 취하여 아세토니트
릴․물(50:50, v/v) 혼합용액으로 정확히 100 mL로 한다.
  5) 추출용액
  메탄올 ․아세토니트릴 ․물(25 : 25 : 50, v/v/v)
  6) OPA(ο-phthaldialdehyde) 용액
  ο-phthaldialdehyde 40 mg을 1 mL 메탄올에 녹인 것을 0.1 M Na2B4O7 용액 5 mL로 
희석하고 메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol) 50 μL를 가하여 혼합한다. 이 용액은 갈
색 바이알에 넣어 어두운 곳에서 1주간 실온보관 가능하다. 
  7) PBS(Phosphate-buffered saline) 용액
  염화나트륨 (NaCl) 8.0 g, 무수 제이인산나트륨 (Na2HPO4) 1.2 g, 제일인산칼륨 (KH2PO4) 
0.2 g 및 염화칼륨(KCl) 0.2 g을 물 990 mL에 녹인 것을 2 M 염산으로 pH 7.0으로 조
정한 후 물로 1 L로 한다.  
  8) 0.1 M 제일인산나트륨 (NaH2PO4 ․2H2O) 용액 : 제일인산나트륨 (NaH2PO4 ․2H2O) 15.6 g를 
물 990 mL에 녹인 것을 인산(H3PO4)을 사용하여 pH 3.3으로 조정한 후 물로 1 L로 
한다.
라. 시험용액의 조제
  1) 추출
  검체를 분쇄하여 균질화 한 시료 20 g을 정밀히 달아 추출용액 100 mL를 넣어 5분간 
고속으로 균질화한 후 이를 여과지로 여과한다. 여액 10 mL를 100 mL 플라스크에 취
하고 PBS 용액 40 mL로 희석시킨다 . 희석액을 흔들어 섞은 후 유리섬유여과지로 여과
한 것을 추출액으로 한다.
  2) 정제
  추출액 10 mL를 인산으로 pH 6.8 ～ 7.2로 조정한 후 정제용 컬럼에 주입하여 초당 
1～2 방울의 속도로 통과시킨다 . 이어서 PBS 용액 10 mL을 같은 유속으로 유출하여 
버린 후 메탄올 ․물(80:20, v/v) 혼합용액 4 mL로 용출시킨다 .
  3) 유도체화
  용출액을 약 60℃에서 질소로 건고시킨 후 잔류물에 아세토니트릴 ․물(50:50, v/v) 혼합
용액 200 μL을 가하여 녹이고 이 중 50 μL를 취하여 30℃ 항온조건에서 OPA용액 200 
μL과 섞고 2 분간 교반한 것을 시험용액으로 한다. 7장.곰팡이독소
103     [주의사항] OPA-푸모니신 유도체는 반응 후 시간이 경과함에 따라 형광성이 떨어
지므로 유도체화한 후 4분 안에 신속하게 액체크로마토그래프에 주입하
여야 한다.
마. 시험조작
 1) 액체크로마토그래프의 측정조건
 가) 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 입자크기 5 μm) 또는 이와 동등한 것
 나) 이동상 : 메탄올 ․0.1 M 제일인산나트륨 (NaH2PO4) 용액(77 : 23, v/v), 인산을 사용하여 
pH 3.3 〜 3.35로 조정한 후 0.45 μm 막 여과기(membrane filter)로 여과하
여 사용
 다) 검출파장
     - 여기파장 : 335 nm
     - 형광파장 : 440 nm
 라) 유속 : 1 mL/분
 마) 주입량 : 5～20 μL
 2) 검량선 작성
 푸모니신 혼합표준용액을 아세토니트릴 ․물(50:50, v/v) 혼합용액으로 희석하여 0.1, 0.5, 
1.0, 2.0 μg/mL가 되도록 하고 각각 1 mL을 취하여 60℃에서 질소로 건고한 후 앞의 
라. 시험용액의 조제 3) 유도체화에 따라 조작하여 검량선을 작성한다.
 3) 정성시험
 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하
여야 한다.
 4) 정량시험
 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 푸모니신의 피
크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다. 이 방법의 정량한계는 푸모니
신 B1은 50 ng/g, 푸모니신 B2은 70 ng/g이며, 검출한계는 푸모니신 B1은 30 
ng/g, 푸모니신 B2은 50 ng/g이다.
바. 계산
 푸모니신의 함량(mg/kg) = (CFB1 + CFB2) × 50/g
 CFB1 : 검량선에서 구한 푸모니신 B1의 농도(μg/mL)
 CFB2 : 검량선에서 구한 푸모니신 B2의 농도(μg/mL)
 50 : 희석배수
 g : 시료 채취량(g)1048장. 유해미생물
1. 살모넬라(Salmonella) 검사방법
가. 항혈청에 의한 검사법
1) 증균 및 분리
가) 시료 10g을 Selenite broth와 BHI(Brain Heart Infusion) broth 100㎖에 각각 접종하고 
37℃에서 18～24시간(BHI는  4～6시간 예비배양 후 배양액 약 1～2㎖를 Tetrathionate 
broth 10㎖에 접종하여 42℃로 18～24시간) 배양한다.
나) 배양액 1～2 백금이를 SS(Salmonella & Shigella)agar 와 MacConkey agar에 도말하여 24
시간 배양하여 살모넬라로 의심되는 집락을 관찰한다. 이때 살모넬라 집락의 특징은 
MacConkey agar에서 작고 무색을 나타내며 SS agar에서는 작고 무색을 나타내거나 
H2S의 생성으로 중앙에 검은점을 형성한다.
다) 살모넬라로 의심되는 집락을 TSI(Triple Sugar Iron)agar( 혹은 KIA)에 천자 및 사면 접종
하여 24시간 배양 후 배양소견이 알칼리(사면)/산성(천자)이거나 알칼리(사면)/산성(천
자), H2S 생성으로 나타난 것을 생화학 검사를 실시한다.
2) 생화학 검사
생화학검사는 우선 Urea 반응검사와 Phenylalanine 반응검사를 실시하여 음성을 나타내
는 균에 대해 진행하며 살모넬라의 일반적인 생화학적 반응은 다음과 같다.
        ※ (±)는 양성 이거나 음성
3) 혈청군(Serogroup) 결정 시험
이상의 생화학 검사결과 살모넬라로 판단되는 균들의 혈청학적 검사를 실시하는데 먼저 
O항원 다가(Polyvalent) 항혈청(Difco 社)으로 슬라이드 응집반응을 실시하여 Polygroup 을 
결정한 후 단일(Single) 항혈청(Difco 社) 슬라이드 응집반응을 통해 혈청군(Serogroup) 을 
결정하여 D group 여부를 확인한다.균
성상Salmonella S. typhosa
TSI agar
(KIA)Glucose
Lactose
Sucrose
gas 형성
H2S 생성+
-
-
+
++
-
-
-
(±)
Indole
Methyl Red
Voges Proskauer
Citrate
Urea
KCN
운동성
Phenylalanine
Gelatin 액화-
+
-
(±)
-
-
+
-
--
+
-
(±)
-
-
+
-
-8장. 유해미생물
105나. 키트(Kit)에 의한 간이 검사법
1) 시약 및 기구
가) 고압멸균기 , 시험관(10㎖, 20㎖용량), Reader기
나) 삼각플라스크
다) 배양기 (2대)
라) 탈지면
마) 멸균기
바) Buffered peptone water 용액 : 시약 20g을 1ℓ증류수나 비이온수에 녹이고 멸균하여 
사용한다.
사) Tetrathionate broth : 시약 4.6g을 증류수 100㎖로 녹이고 끓을 때 까지 가열한다. 서
서히 방냉시켜 60℃이하로 식힌 후 Iodine용액을 2㎖ 넣는다.
아) Selenite broth : Selenite broth 2.3g을 증류수 100㎖에 용해하여 끓을 때 까지 가열한 
후 방냉한다.
자) Iodine용액 : 5g KI를 증류수 20㎖로 녹인 용액에 Iodine Crystal 6g을 넣고 녹인다. 
차) M-broth(혹은 GN broth) : 시약 3.62g을 증류수 100㎖에 넣고 1분간 끓여 멸균 및 용
해시킨다.
2) 시료액의 배양
가) 시료 25g을 칭량하여 멸균한 300㎖ 삼각플라스크에 넣고 멸균한 225㎖ Buffered 
peptone water를 혼합하여 37℃에서 18～24시간 배양한다.
나) 배양액 1㎖씩 분취하여 10㎖의 Selenite cystine broth와 Tetrathionate broth에 각각 혼
합하여 Selenite cystine broth 시험관은 37℃에서 Tetrathionate broth 시험관은 42℃
±0.5에서 18～24시간 배양한다.
다) 각각의 선택배양액 1㎖를 분취하여 멸균한 10㎖의 M-broth와 혼합하여 42℃±0.5에서 
4～6시간 배양한다.
라) 오염이 덜한 시료인 경우에는 ②와 ③의 배양시간을 바꾸어 행한다.
3) 방 법
가) Salmonella kit를 냉장상태에서 실온으로 방치한다.
나) M-broth 배양액을 1㎖씩 시험관에 분취하여 옮겨 멸균하고 실온으로 식힌다.
다) 각각의 Well에 양성음성 기준물 100㎕와 시료 100㎕를 취하여 첨가한 후 시료의 위치
를 기록하고 실온에서 30분간 배양한다.
라) Well buffer로 3회, 증류수로 1회 세척한 후 물기를 제거한다.
마) 각각의 Well working conjugate 100㎕식 첨가한 후 실온에서 30분간 배양한다.
바) 각각의 Well에 TMB Substrate 100㎕씩 첨가한 후 실온암실에서 30분간 배양한다.
사) IN H2SO4 50㎕를 각각의 Well에 첨가한 후 10～15분내에 Reader기로 읽는다.1069장. 잔류농약
1. 유기인계 및 유기염소계 다성분 분석
가. 유기인계 동시분석
파라치온(Parathion), 펜치온(Fenthion), 페니트로치온 (Fenitrothion), 말라치온(Malathion), 
디클로르보스 (Dichlorvos = DDVP), 클로르피리포스메틸 (Chlorpyri fos-methyl), 피리미포스
메틸(Pirimiphos-methyl), 펜토에이트 (Phenthoate), 다이아지논 (Diazinon)
1) 표준용액의 제조
각 표준품을 1000㎍/㎖이 되도록 헥산에 녹여 표준원액으로 하고, 적정농도로 희석하여 
단일표준용액 또는 혼합표준용액을 조제한다.
2) 시약 및 초자
가) 시약
아세톤, 디클로르메탄 , 헥산, 아세토니트릴 (잔류농약분석용 또는 동급), Na2SO4, 무수
(잔류농약분석용 또는 동급), NaCl(잔류농약분석용 또는 동급), 에틸에테르 (잔류농약분
석용 또는 동급) 실리카겔(컬럼크로마토그래피용 ), 규조토,
용출액 A = 아세토니트릴 : 헥산 : 디클로르메탄 = 0.35 : 49.65 : 50
       B = 아세토니트릴 : 헥산 : 디클로르메탄 = 1.5 : 48.5 : 50
       C = 헥산 : 에틸에테르 = 50 : 50
나) 초자
삼각플라스크 (300㎖), 부크너여두 , 농축용플라스크 (125㎖, 250㎖), 분액여두(1000㎖), 메
스실린더(100㎖), 피펫(3㎖, 5㎖), No. 6 여과지, 유리컬럼(테프론 콕 포함, Φ1㎝×50㎝), 
탈지면(아세톤으로 추출한 것), Vial(4 ㎖, 8㎖)
3) 방법
가) 추출
시료 20g을 삼각플라스크에 칭량하고, 증류수 30～40㎖를 넣어 1시간 방치한 후, 아세
톤 100㎖를 첨가하여 2～3시간 진탕 한다. 진탕 후, 부크너여두에 No. 6 여과지와 규조
토(celite 545 또는 Hyflosupercel) 를 깔고, 여두 아래 삼각플라스크를 놓고 흡인여과 
한다. 소량의 아세톤으로 삼각플라스크와 여두내의 잔사를 세척하여 여과액에 합친다.
나) 분배9장. 잔류농약
107시료용액을 1000㎖ 분액여두로 옮기고, 포화식염수 100㎖, 증류수 400㎖, 디클로르메탄 
50㎖를 넣고 약 4분간 진탕시킨다 . 진탕 후, 잠시 정치시켜 아래쪽의 디클로르메탄층을 
Na2SO4((무수)를 통과시켜 수분을 제거한 후, 250㎖ 농축용플라스크에 받는다.(1액) 상
층액에 다시 디클로르메탄 50㎖를 넣고 진탕시켜 디클로르메탄층을 1액과 합친다. 이
를 실온에서 회전증발농축기로 거의 대부분을 농축시킨 다음 질소 가스로 완전히 농축
시킨다. 잔사를 헥산 5㎖로 용해시킨다 .
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
유리컬럼을 아세톤으로 추출한 탈지면으로 막고 실리카겔 5g을 넣은 후, Na2SO4((무수) 
1스푼 정도(높이 1～2㎝)를 넣는다. 이때 컬럼내로 균일하게 들어가도록 한다. 헥산 50
㎖를 흘려버리고 시료액 3㎖를 loading한다. 다시 헥산 50㎖를 흘려버리고 용출액 A, 
B, C을 차례로 흘려 각각 125㎖ 농축용플라스크로 받는다. 실온에서 회전증발농축기로 
거의 대부분을 농축시킨 다음 질소 가스로 완전히 농축시킨다 . 잔사를 헥산 3㎖로 용
해시켜 기기 분석용 시료액으로 한다.
4) 측정조건(Gas chromatograph) 예)
주입부 온도 : 220℃
오븐온도 : 140℃(1분) - 분당 3℃상승 - 210℃(1분)
검출기 : 질소인검출기 (NPD), 온도 - 250℃, H2 - 3.0㎖, Air - 60㎖
Column : Capillary HP-5 또는 이와 동등한 것(5% phenyl methyl siloxane, 
          30.0m×0.32 ㎜×0.25 ㎛)
Carrier gas : N2-2.3㎖/min
주입량 : 1㎕
5) 계산
ppm=검량선(ng)×{최종희석량 (㎖)/주입량(㎕)}×{1/시료무게(g)}
나. 유기염소계 동시분석
비에치씨(BHC), 디디티(DDT : p,p'-DDT, o,p'-DDT), 헵타크롤(Heptachlor), 헵타크롤에폭
사이드(Heptachlor epoxide), 엔드린(Endrin), 알드린(Aldrin), 디엘드린(Dieldrin)
1) 시약의 조제108가) 표준원액
α-비에치씨(BHC), β-비에치씨(BHC), γ-비에치씨(BHC), δ-비에치씨(BHC), 디디티(DDT：
p,p'-DDT, o,p'-DDT), 헵타크롤(Heptachlor), 헵타크롤에폭사이드 (Heptachlor epoxide), 
엔드린(Endrin), 알드린(Aldrin), 디엘드린(Dieldrin)을 각각 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각
각 100㎖의 메스플라스크에 넣고 아세톤 20㎖로 용해 후 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까
지 채워 표준원액을 만든다. 사용할 때 각각의 표준원액을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤
(4+1)로 희석하여 0.1 0.2, 0.3, 0.4ppm 혼합표준액으로 만들어 사용한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 이상 건조한다.
2) 방 법
가) 추출
시료 20g을 삼각플라스크에 칭량하고 아세토니트릴 +증류수(13+7) 150㎖를 첨가하여 진
탕기 250rpm에서 2～3시간 진탕 추출한다. Bell-Jar에 부크너여두를 연결하여 No. 6 여
과지를 깔고 그 위에 규조토를 깔고, 여두 아래 300㎖ 삼각플라스크를 놓고 흡인여과 
한다. 소량의 아세토니트릴로 삼각플라스크와 여두내의 잔사를 세척하여 여과액에 합
친다.
나) 분배
여과액을 1000㎖ 분액여두로 옮기고, 포화식염수 100㎖, 증류수 400㎖, 헥산 50㎖를 넣
고 진탕기에서 약 10분간 진탕시킨다 . 진탕 후, 잠시 정치시켜 헥산층을 분리하고 하층
의 혼합액(증류수+아세토니트릴 )을 다른 분액여두에 옮기고 여기에 다시 헥산 50㎖를 
가하여 진탕추출한다 . 250㎖ 농축플라스크에 깔대기를 놓고 여과지로 막은 후 Na2SO4
를 넣고 헥산층을 여과한다. 40℃이하의 회전증발농축기로 거의 대부분을 농축시킨 다
음 질소 가스로 완전히 농축시킨다 . 잔사를 헥산 5㎖로 용해시킨다 .
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
유리컬럼을 아세톤으로 추출한 탈지면으로 막고 규산마그네슘 5g, 셀룰로스 1g, 
Na2SO4 4g을 각각 헥산으로 현탁시켜 컬럼에 순차적으로 넣고 헥산 40㎖를 가하여 액
층이 충진제의 상면에서 3㎜ 높이가 될 때까지 유출시키고 시료추출액 3㎖를 가하여 
분당 2～3㎖ 속도로 유출시킨다 . 컬럼 밑에 125㎖ 농축플라스크를 놓고 40% 헥산 함유 
벤젠 100㎖로 용출 후 용출액을 40℃이하의 회전증발농축기에서 증발시키고 2,2,4-트리
메틸펜탄+아세톤(4+1) 3㎖로 용해하여 시료분석용 시료로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph) 예)9장. 잔류농약
109주입부 온도 : 235℃
오븐온도 : 150℃(2분) - 분당 5℃상승 - 275℃(5분)
검출기 : 전자포획검출기 (ECD), 온도 - 275℃, Anode purge flow - 6.0㎖/min,    makeup 
flow - 60.0㎖/min
Column : RTX-1701
Carrier gas : He-1.0 ㎖/min
Make-up gas : N2 250mPa
4) 계산
       ppm = 검량선(ng)×{최종희석량 (㎖)/주입량(㎕)}×{1/시료무게(g)}
2. 유기인계(Organophosphorus)
가. 다이아지논 (Diazinon) [C12H21N2O3PS]
1) 시약의 조제
가) 다이아지논 표준액
다이아지논 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖
를 가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄 (iso-octane) 을 가하여 다이아지논 표
준원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 다이아지논 0.2㎎을 함유한다) 사용시 표준원액의 일
정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2
㎍을 함유하는 각 다이아지논 표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin Co.제]
을 130℃에서 16시간 건조한다.
다) L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법
가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴염산염용액 30㎖를 110가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과 한다. 아
세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다. 용기 
및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다.
나) 분 배
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 250㎖ 및 디클로르메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 넣고 5분간 진탕한다. 방치한 후, 디클로르메탄층 (하층)을 삼각플
라스크에 넣는다. 디클로르메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 진탕한 후 방치하고, 디클로
메탄층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고, 
300㎖의 플라스크에 분액여과지로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 디클로르메탄
으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 
감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖로 용해
한다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 아세토니
트릴(하층)을 300㎖ 플라스크에 넣는다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분액여두에 
가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트릴층을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때
까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하여 잔류물을 
용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
컬럼관(내경 15㎜)에 황산나트륨 (무수) 2g, 규산마그네슘 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 
각각 헥산+아세톤(19+1)으로 현탁시킨 것을 순차적으로 주입한다. 액면이 충진제의 상
층에서 3㎜의 높이가 될 때까지 주입시켜서 정제용컬럼을 조제한다. 컬럼의 하층에 
300㎖의 플라스크에 시료용액을 컬럼에 넣고 용기를 헥산+아세톤(19+1) 5㎖로 5회 세
정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 
때까지 유출시켜 다이아지논을 헥산+아세톤(19+1) 70㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸렌
글리콜(99+1) 2～3방울을 가하고, 유출액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까
지 감압농축한 다음, 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확
히 가하여 잔류물을 용해하고, 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 
두께 0.25㎛)
캐리어가스 : He 1.5㎖/min
보조가스 : N2 30㎖/min
수소 : 75㎖/min
공기 : 100㎖/min9장. 잔류농약
111시료도입부 온도 : 230℃
칼럼조 온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
승온 : 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분)
검출기 온도 : 250℃
계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 다이
아지논 함량을 산출한다.
나. 파라치온(Parathion) [C10H14NO5PS]
1) 시약의 조제
가) 파라치온 표준액
파라치온 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖를 
가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 파라치온 표준원액을 조제한
다.(이 액 1㎖는 파라치온 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메
틸펜탄+아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2㎍을 함유하는 각 
파라치온 표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin Co.제]
을 130℃에서 16시간 건조한다.
다) L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법
가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴 염산염용액 30㎖를 
가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과 한다. 아
세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다. 용기 
및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다.
나) 분 배
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 250㎖ 및 디클로로메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 넣고 5분간 진탕한다. 방치한 후, 디클로로메탄 층(하층)을 삼각플112라스크에 넣는다. 디클로로메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕한 후 방치하고, 
디클로로메탄 층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 
탈수하고, 300㎖의 플라스크에 분액여과지로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 디클
로로메탄으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 
때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖
로 용해한다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 
아세토니트릴 (하층)을 300㎖ 플라스크에 넣는다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분
액여두에 가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트릴 층을 40℃이하의 수욕조에서 대부
분 건고될 때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하
여 잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
컬럼관(내경 15㎜)에 황산나트륨 (무수) 2g, 규산마그네슘 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 
각각 헥산+아세톤(19+1)으로 현탁시킨 것을 순차적으로 주입하고, 액면이 충진제의 상
층에서 3㎜의 높이가 될 때까지 주입시켜서 정제용 컬럼을 조제한다.  시료용액을 컬
럼에 넣고 용기를 헥산+아세톤(19+1) 5㎖로 5회 세정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 
가한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시켜 파라치온을 헥산
+아세톤(19+1) 70㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸렌글리콜 (99+1) 2～3방울을 가하고, 유
출액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까지 감압농축한 다음, 질소가스로 건
고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고, 가스
크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
       검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
       칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 
30m, 두께 0.25㎛)
       캐리어가스 : He 1.5㎖/min
       보조가스 : N2 30㎖/min
       수소 : 75㎖/min
       공기 : 100㎖/min
       시료도입부 온도 : 230℃
       칼럼조 온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 : 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분 유지)
       검출기 온도 : 250℃
       계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 파라
치온 함량을 산출한다.9장. 잔류농약
113다. 페니트로치온 (Fenitrothion) [C9H12NO5PS]
1) 시약의 조제
가) 페니트로치온 표준액
페니트로치온 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20
㎖를 가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 페니트로치온 표준 원액
을 조제한다.(이 액 1㎖는 페니트로치온 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량
을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2㎍을 
함유하는 각 페니트로치온표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin Co.제]
을 130℃에서 16시간 건조한다.
다) L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법
가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴 염산염용액 30㎖를 
가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과 한다. 아
세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다. 용기 
및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다.
나) 분 배
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 250㎖ 및 디클로로메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 넣고 5분간 진탕한다. 방치한 후, 디클로로메탄층 (하층)을 삼각플
라스크에 넣는다. 디클로로메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕한 후 방치하고, 
디클로메탄층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈
수하고, 300㎖의 플라스크에 분액여과지로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 디클로
로메탄으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 
때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖
로 용해한다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 
아세토니트릴 (하층)을 300㎖ 플라스크에 넣는다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분114액여두에 가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트릴층을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 
건고될때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하여 
잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
컬럼관(내경 15㎜)에 황산나트륨 (무수) 2g, 규산마그네슘 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 
각각 헥산+아세톤(19+1)으로 현탁시킨 것을 순차적으로 주입하고, 액면이 충진제의 상
층에서 3㎜의 높이가 될 때까지 주입시켜서 정제용컬럼을 조제한다. 컬럼의 하층에 
300㎖의 플라스크에 시료용액을 컬럼에 넣고 용기를 헥산+아세톤(19+1) 5㎖로 5회 세
정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 
때까지 유출시켜 페니트로치온을 헥산+아세톤(19+1) 70㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸
렌글리콜(99+1) 2～3방울을 가하고, 유출액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때
까지 감압농축한 다음, 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정
확히 가하여 잔류물을 용해하고, 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(예)
       검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
       칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 
30m, 두께 0.25㎛)
       캐리어가스 : He 1.5㎖/min
       보조가스 : N2 30㎖/min
       수소 : 75㎖/min
       건조공기 : 100㎖/min
       시료도입부온도 : 230℃
       칼 럼 조 온 도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 : 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분 유지)
       검출기온도 : 250℃
       계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 페니
트로치온 함량을 산출한다.
라. 펜토에이트 (Phenthoate) [C12H17O4PS2]
1) 시약의 조제9장. 잔류농약
115가) 펜토에이트 표준액
펜토에이트 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖
를 가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 펜토에이트 표준 원액을 조
제한다.(이 액 1㎖는 펜토에이트 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-
트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2㎍을 함유하
는 각 펜토에이트표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin Co.제]
을 130℃에서 16시간 건조한다.
다)  L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법
가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴 염산염용액 30㎖를 
가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과 한다. 아
세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다. 용기 
및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다.
나) 분 배
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%, W/V) 250㎖ 및 디클로로메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 넣고 5분간 진탕한다. 방치한 후, 디클로로메탄층 (하층)을 삼각플
라스크에 넣는다. 디클로로메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕한 후 방치하고, 
디클로메탄층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈
수하고, 300㎖의 플라스크에 분액여과지로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 디클로
로메탄으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 
때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖
로 용해한다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 
아세토니트릴 (하층)을 300㎖ 플라스크에 넣는다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분
액여두에 가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트릴층을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 
건고될때까지 감압 농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하여 
잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
컬럼관(내경 15㎜)에 황산나트륨 (무수) 2g, 규산마그네슘 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 
각각 헥산+아세톤(19+1)으로 현탁시킨 것을 순차적으로 주입하고, 액면이 충진제의 상
층에서 3㎜의 높이가 될 때까지 주입시켜서 정제용컬럼을 조제한다. 시료용액을 컬럼116에 넣고 용기를 헥산+아세톤(19+1) 5㎖로 5회 세정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가
한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시켜 펜토에이트를 헥산
+아세톤(19+1) 70㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸렌글리콜 (99+1) 2～3방울을 가하고, 유
출액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압농축한 다음, 질소가스로 건
고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고, 가스
크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
       검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
       칼  럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 
30m, 두께 0.25㎛)
       캐리어가스 : He 1.5㎖/min
       보조가스 : N2 30㎖/min
       수소 : 75㎖/min
       건조공기 : 100㎖/min
       시료도입부온도 : 230℃
       칼 럼 조 온 도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 : 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분)
       검출기온도 : 250℃
       계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 펜토
에이트 함량을 산출한다.
마. 펜치온(Fenthion) [C10H15O3PS2]
1) 시약의 조제
가) 펜치온 표준액
펜치온 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖를 
가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 펜치온 표준 원액을 조제한다.
(이 액 1㎖는 펜치온 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸펜
탄+아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2㎍을 함유하는 각 펜치
온표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘9장. 잔류농약
117합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin Co.제]
을 130℃에서 16시간 건조한다.
다) L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법
가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴 염산염용액 30㎖를 
가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과 한다. 아
세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다. 용기 
및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다.
나) 분 배
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 250㎖ 및 디클로로메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 넣고 5분간 진탕한다. 방치한 후, 디클로로메탄층 (하층)을 삼각플
라스크에 넣는다. 디클로로메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕한 후 방치하고, 
디클로메탄층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈
수하고, 300㎖의 플라스크에 분액여과지로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 디클로
로메탄으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 
때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖
로 용해한다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 
아세토니트릴 (하층)을 300㎖ 플라스크에 넣는다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분
액여두에 가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트릴층을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 
건고될때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하여 
잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
컬럼관(내경 15㎜)에 황산나트륨 (무수) 2g, 규산마그네슘 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 
각각 헥산+아세톤(19+1)으로 현탁시킨 것을 순차적으로 주입하고, 액면이 충진제의 상
층에서 3㎜의 높이가 될 때까지 주입시켜서 정제용컬럼을 조제한다.  시료용액을 컬럼
에 넣고 용기를 헥산+아세톤(19+1) 5㎖로 5회 세정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가
한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시켜 펜치온을 헥산+아
세톤(19+1) 70㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸렌글리콜 (99+1) 2～3방울을 가하고, 유출
액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까지 감압농축한 다음, 질소가스로 건고
한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고, 가스크
로마토그래피용 시료용액으로 한다.1183) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
     칼  럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 
30m, 두께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 30㎖/min
     수소 : 75㎖/min
     건조공기 : 100㎖/min
     시료도입부온도 : 230℃
     칼 럼 조 온 도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
     승온 : 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분 유지)
     검출기온도 : 250℃
     계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 펜치온 
함량을 산출한다.
바. 말라치온(Malathion) [C10H19O6PS2]
1) 시약의 조제
가) 말라치온 표준액
말라치온 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖를 
가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 말라치온 표준 원액을 조제한
다.(이 액 1㎖는 말라치온 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메
틸펜탄+아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2㎍을 함유하는 각 
말라치온 표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin Co.제]
을 130℃에서 16시간 건조한다.
다) L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법9장. 잔류농약
119가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴 염산염용액 30㎖를 
가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과 한다. 아
세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다. 용기 
및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다.
나) 분 배
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 250㎖ 및 디클로로메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 넣고 5분간 진탕한다. 방치한 후, 디클로로메탄층 (하층)을 삼각플
라스크에 넣는다. 디클로로메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕한 후 방치하고, 
디클로메탄층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈
수하고, 300㎖의 플라스크에 분액여과지로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 디클로
로메탄으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 
때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖
로 용해한다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 
아세토니트릴 (하층)을 300㎖ 플라스크에 넣는다. 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분
액여두에 가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트릴층을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 
건고 될 때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하여 
잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
컬럼관(내경 15㎜)에 황산나트륨 (무수) 2g, 규산마그네슘 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 
각각 헥산+아세톤(19+1)으로 현탁시킨 것을 순차적으로 주입하고, 액면이 충진제의 상
층에서 3㎜의 높이가 될 때까지 주입시켜서 정제용컬럼을 조제한다.  시료용액을 컬럼
에 넣고 용기를 헥산+아세톤(19+1) 5㎖로 5회 세정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가
한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시켜 말라치온을 헥산+
아세톤(19+1) 70㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸렌글리콜 (99+1) 2～3방울을 가하고, 유
출액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까지 감압농축한 다음, 질소가스로 건
고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고, 가스
크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
 
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
     칼  럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 
30m, 두께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min120     보조가스 : N2 30㎖/min
     수소 : 75㎖/min
     건조공기 : 100㎖/min
     시료도입부온도 : 230℃
     칼 럼 조 온 도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
     승온 : 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분 유지)
     검출기온도 : 250℃
     계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 말라치
온 함량을 산출한다.
 
사. 클로르피리포스메틸 (Chlorpyrifos-methyl) [C7H7Cl3NO3PS]
1) 시약의 조제
가) 클로르피리포스메틸 표준액
클로르피리포스메틸 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아
세톤 20㎖를 가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 클로르피리포스메
틸표준 원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 클로르피리포스메틸 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 
표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 
0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 4㎍을 함유하는 각 클로르피리포스메틸표준액을 조제한다.
나) 실리카겔
개봉 후 실리카겔 [입경 63～200㎛ (230～70mesh) : Silica Gel 60 (Merck제)]을 데시케
이타에 보존한다.
다) 응고액 : 염산암모니움 1g을 증류수 1ℓ로 용해하고, 인산 2㎖를 가한다.
라) 규조토 : 규조토(하이프로슈퍼셀 , John-Manville 제)를 온수 및 메탄올로 세정한 후 풍건
한다.
2) 방 법
가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 500㎖의 분액여두에 넣는다. 증류수 60㎖를 가하고, 30분
간 방치한 후, 아세톤 140㎖를 가하여, 30분간 흔들어 섞은 후 추출한다. 톨비이커는 9장. 잔류농약
121부크너여두의 아래에 놓고, 추출액을 No.5여과지로 흡인여과한 후, 용기 및 잔사를 아
세톤+증류수(7+3) 100㎖로 세정하고, 정제용 시료용액으로 한다.
나) 정 제
시료용액을 미리 염화나트륨용액 (5%,W/V) 400㎖ 및 디클로메탄 100㎖를 넣은 1ℓ의 분
액여두에 가한다. 3분간 진탕한 후, 정치하고, 디클로메탄층 (하층)을 삼각플라스크에 넣
는다. 디클로로메탄 100㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 디클로메
탄층을 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고, 500㎖
의 플라스크에 글라스섬유여과지 (GA-100, 동양여과지 )로 여과하고 용기 및 여과지를 
소량의 디클로로메탈으로 세정하여, 여액을 합한다. 여액을 40℃이하의 수욕조에서 대
부분 건고될 때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 아세톤 30㎖를 가하여 잔류
물을 용해하고, 규조토 0.5g 및 응고액 40㎖를 가하여 가볍게 진탕한다. 5분간 방치한 
후, 상등액을 300㎖의 분액여두 A에 글라스섬유여과지 (GA-100, 동양여과지 )로 여과한
다. 아세톤 30㎖를 플라스크에 가하여 진탕하고, 응고액 40㎖를 가하여, 동일하게 조작
한 후, 용기 및 여과지를 소량의 응고액+아세톤(4+3)으로 세정한다. 헥산 50㎖를 분액
여두 A에 가하고, 3분간 진탕한후, 세정한 다음, 수층(하층)을 300㎖의 분액여두 B에 
넣고 헥산층(상층)을 삼각플라스크에 넣는다. 헥산 50㎖를 분액여두 B에 가하고, 동일
하게 조작하여 헥산층(상층)을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)
을 가하여, 탈수하고 300㎖의 플라스크에 글라스섬유여과지로 여과한다. 용기 및 섬유
여과지를 소량의 헥산으로 세정하고, 여액에 합하여, 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 
대부분 건고될 때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 헥산+디에틸에테르 (9+1) 5
㎖를 가하여 잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
황산나트륨 (무수) 5g, 실리카겔 5g 및 황산나트륨 9무수) 5g을 각각 헥산+디에틸에테르
(9+1)에 현탁시켜 컬럼관(내경 15㎜)에 순차적으로 주입한다. 액면이 충진제의 상명에서 
3㎜의 높이가 될 때까지 유출시켜 정제용 컬럼을 조제한다. 200㎖의 플라스크를 컬럼
의 아래에 놓고, 시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 헥산-디에틸에테르 (9+1) 5㎖로 4회 
세정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가한다. 액면이 충진제의 상면으로부터 3㎜의 높
이가 될 때까지 유출시킨 후, 클로르피리포스메틸을 헥산+디에틸에테르 (9+1) 75㎖로 유
출시킨다. 유출액 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압농축한 후, 질소
가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해
시키고, 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 알카리열이온화검출기122     칼  럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 4㎖/min
     보조가스 : N2 26㎖/min
     수소 : 4㎖/min
     건조공기 : 100㎖/min
     시료도입부온도 : 200℃
     칼 럼 조 온 도 : 50℃(1분 유지)
     승   온 : 20℃/min, 180℃(1분), 3℃/min, 200℃
     검출기온도 : 240℃
     계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 클로르
피리포스메틸량을 산출한다.
아. 피리미포스메틸 (Pirimiphos-methyl) [C11H20N3O3PS]
1) 시약의 조제
가) 피리미포스메틸 표준액
피리미포스메틸 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 
20㎖를 가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 피리미포스메틸표준 원
액을 조제한다.(이 액 1㎖는 피리미포스메틸 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일
정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 
2, 4㎍을 함유하는 각 피리미포스메틸표준액을 조제한다.
나) 실리카겔
개봉후 실리카겔 [입경 63～200㎛ (230～70mesh) : Silica Gel 60 (Merck제)]을 데시케이
타에 보존한다.
다) 응고액 : 염산암모니움 1g을  1ℓ로 용해하고, 인산 2㎖를 가한다.
라) 규조토 : 규조토[하이프로슈퍼셀 (John-Manville 제)]를 온수 및 메탄올로 세정한 후 풍건
한다.
2) 방 법
가) 추 출9장. 잔류농약
123시료 10.0～20.0g을 칭량하여 500㎖의 분액여두에 넣는다. 증류수 60㎖를 가하고, 30분
간 방치한 후, 아세톤 140㎖를 가하여, 30분간 흔들어 섞은 후 추출한다. 톨비이커는 
부크너여두의 아래에 놓고, 추출액을 No.5여과지로 흡인여과한 후, 용기 및 잔사를 아
세톤+증류수(7+3) 100㎖로 세정하고, 정제용 시료용액으로 한다.
나) 정 제
시료용액을 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 400㎖ 및 디클로메탄 100㎖를 넣은 1ℓ의 분
액여두에 가한다. 3분간 진탕한 후, 정치하고, 디클로메탄층 (하층)을 삼각플라스크에 넣
는다. 디클로로메탄 100㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 디클로메
탄층을 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고, 500㎖
의 플라스크에 글라스섬유여과지 (GA-100, 동양여과지 )로 여과하고 용기 및 여과지를 
소량의 디클로로메탄으로 세정하여, 여액을 합한다. 여액을 40℃이하의 수욕조에서 대
부분 건고될때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 아세톤 30㎖를 가하여 잔류물
을 용해하고, 규조토 0.5g 및 응고액 40㎖를 가하여 가볍게 진탕한다. 5분간 방치한 후, 
상등액을 300㎖의 분액여두 A에 글라스섬유여과지 (GA-100, 동양여과지 )로 여과한다. 
아세톤 30㎖를 플라스크에 가하여 진탕하고, 응고액 40㎖를 가하여, 동일하게 조작한 
후, 용기 및 여과지를 소량의 응고액+아세톤(4+3)으로 세정한다. 헥산 50㎖를 분액여두 
A에 가하고, 3분간 진탕한후, 세정한 다음, 수층(하층)을 300㎖의 분액여두 B에 넣고 
헥산층(상층)을 삼각플라스크에 넣는다. 헥산 50㎖를 분액여두 B에 넣고 헥산층(상층)
을 삼각플라스크에 넣는다.
헥산 50㎖를 분액여두 B에 가하여 동일하게 조작하고, 헥산층을 삼각플라스크에 가한
다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여, 탈수하고 300㎖의 플라스크에 글라스섬유여
과지(GA-100, 동양여과지 )로 여과한다. 용기 및 섬유여과지를 소량의 헥산으로 세정하
고, 여액에 합하여, 여액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압농축한 
후, 질소가스로 건고한다. 헥산+디에틸에테르 (9+1) 5㎖를 가하여 잔류물을 용해하고, 컬
럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
황산나트륨 (무수) 5g, 실리카겔 5g 및 황산나트륨 (무수) 5g을 각각 헥산+디에틸에테르
(9+1)에 현탁시켜 컬럼관(내경 15㎜)에 순차적으로 주입한다. 액면이 충진제의 상명에서 
3㎜의 높이가 될 때까지 유출시켜 정제용 컬럼을 조제한다. 200㎖의 플라스크를 컬럼
의 아래에 놓고, 시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 헥산-디에틸에테르 (9+1) 5㎖로 4회 
세정하여, 세액을 순차적으로 컬럼에 가한다. 액면이 충진제의 상면으로부터 3㎜의 높
이가 될 때까지 유출시킨 후, 피리미포스메틸을 헥산+디에틸에테르 (9+1) 75㎖로 유출시
킨다. 유출액 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압농축한 후, 질소가스
로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해시키
고, 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.1243) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 알카리열이온화검출기
     칼  럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 4㎖/min
     보조가스 : N2 26㎖/min
     수소 : 4㎖/min
     건조공기 : 100㎖/min
     시료도입부온도 : 200℃
     칼 럼 조 온 도 : 50℃(1분 유지)
     승온 : 20℃/min, 180℃(1분), 3℃/min, 200℃
     검출기온도 : 240℃
     계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 피리미
포스메틸량을 산출한다.
자. 디클로르보스 (Dichlorvos) [C4H7Cl2O4P]
1) 시약의 조제
가) 디클로르보스 표준액
디클로르보스 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20
㎖를 가하여 용해하고 표선까지 2,2,4-트리메틸펜탄을 가하여 디클로르보스 표준 원액
을 조제한다.(이 액 1㎖는 디클로르보스 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량
을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하여 1㎖중에 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2㎍을 
함유하는 각 디클로르보스표준액을 조제한다.
나) 활성탄혼합물
컬럼크로마토그래피용 활성탄 10g 및 미결정컬럼크로마토그래피용 셀룰로스(Merck제) 
90g을 혼합한다.
다) L-시스틴염산용액 : L-시스틴염산염 1수화물 4.2g을 증류수에 용해하여 250㎖로 한다.
2) 방 법9장. 잔류농약
125가) 추 출
시료 10.0～20.0g을 칭량하여 300㎖의 분액여두에 넣는다. L-시스틴 염산염용액 30㎖를 
가하여 30분간 방치한 후, 아세톤 70㎖를 가하고 30분간 진탕한 후 추출한다. 200㎖의 
메스플라스크를 부크너여두 아래에 놓고 추출액을 No.5B 여과지로 흡인여과한 후, 용
기 및 잔사를 아세톤+증류수(7+3) 50㎖로 세정한다. 아세톤+증류수(7+3)를 메스플라스크
의 표선까지 가하여, 정제용 시료용액으로 한다.
나) 정 제
시료용액 100㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%,W/V) 250㎖ 및 디클로로메탄 50㎖를 넣은 
500㎖의 분액여두에 가한다. 5분간 흔들어 혼합하고 정치한 후, 디클로로메탄층 (하층)
을 삼각플라스크에 넣는다. 디클로로메탄 50㎖를 분액여두에 가하여 가볍게 진탕하고 
정치한 후, 디클로메탄층을 위의 삼각플라스크에 가한다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 
가하여 탈수하고, 300㎖ 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 
용기 및 여과지를 소량의 디클로로메탄으로 세정하고, 여액을 합한다. 여액을 40℃ 이
하의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 
200㎖의 분액여두에 헥산 30㎖로 용해하고, 아세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 가하
고, 5분간 진탕하고 정치한 후, 아세토니트릴 (하층)을 300㎖ 농축플라스크에 넣는다. 아
세토니트릴 +증류수(100+1) 30㎖를 분액여두에 가하고, 동일하게 조작한다. 아세토니트
릴층을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까지 감압농축한 후, 질소가스로 건고
한다. 헥산+아세톤(19+1) 5㎖를 가하여 잔류물을 용해하고, 컬럼크로마토그래피용 시료
용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
황산나트륨 (무수) 2g, 활성탄혼합물 5g 및 황산나트륨 (무수) 2g을 각각 아세톤으로 현탁
시켜서 컬럼관(내경 15㎜)에 순차적으로 흘리고 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될 때까지 유출시켜서 정제용컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아
래에 놓고 시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 아세톤 5㎖로 5회 세정하고, 세액을 순차
적으로 컬럼에 가한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시킨후 , 
디클로르보스를  아세톤 20㎖로 유출시킨다 . 아세톤+디에틸렌글리콜 (99+1) 2～3방울을 
가하여, 유출액을 40℃이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까지 감압농축한 후, 질소가
스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하
고, 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 염광광도검출기 (인검출용필터 )
     칼  럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (5% 페닐, 95% 메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 
30m, 두께 0.25㎛)126     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 30㎖/min
     수소 : 75㎖/min
     건조공기 : 100㎖/min
     시료도입부온도 : 230℃
     칼 럼 조 온 도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
     승온 10℃/min, 170℃(21분), 10℃/min, 240℃(12분 유지)
     검출기온도 : 250℃
     계산 : 측정된 크로마토그램에서 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 디클로
르보스량을 산출한다.
3. 유기염소계 (Organochlorine)
가. 비에치씨(BHC) [C6H6Cl6]
1) 시약의 조제
가) BHC표준액
α-BHC, β-BHC, γ-BHC 및 δ-BHC 각각 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각각 100㎖의 메스
플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖를 가하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가
하여 α-BHC, β-BHC, γ-BHC 및 δ-BHC 표준원액을 조제한다.(이액 1㎖는 각각의 BHC 
0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정
확히 희석하고, 1㎖중에 α-BHC, β-BHC, γ-BHC 및 δ-BHC로써 각각 0.05, 0.1, 0.15, 
0.2㎍을 함유하는 각 BHC표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방법
가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖9장. 잔류농약
127를 가한 다음, 30분간 강하게 진탕하여 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No.5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분액
여두A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두B에 
넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 흔들어 혼합하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층
(상층)을 위의 분액여두A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 
수층을 500㎖의 분액여두C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 
진탕하여 정치한 후, 수층을 분액여두C에 가하고, 가볍게 진탕하고 정치한 후, 수층을 
버리고, 헥산층을 위의 삼각플라스크에 넣고, 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈
수한다. 500㎖의 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 
여과지를 소량의 헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도
가 될때까지 감압농축하고 , 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보내고 , 헥산 40㎖를 가한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣어, 용기를 소량의 헥산으로 세정한다. 세액을 컬럼에 가하여 액
면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될때까지 유출시킨후 , BHC를 헥산+디에틸에테
르(17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고 될때까지 
감압 농축하고, 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 3㎖를 정확히 가
하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min
     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
     승온 : 20℃/min, 180℃(1분),  2℃/min, 220℃(1분 유지), 
                1℃/min, 250℃
     검출기온도 : 250℃
     계산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 각 
BHC량을 산출한다.128나. 디디티(DDT) [C14H9Cl5]
1) 시약의 조제
가) DDT표준액
p,p'-DDT 및 o,p'-DDT 각각 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각각 100㎖의 메스플라스크에 
넣는다. 아세톤 20㎖를 가하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가하여 
p,p'-DDT 및 o,p'-DDT 표준원액을 조제한다.(이액 1㎖는 p,p'-DDT 및 o,p'-DDT 0.2㎎
을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 
희석하고, 1㎖중에 p,p'-DDT 및 o,p'-DDT 로써 각각 0.05, 0.1, 0.15, 0.2㎍을 함유하는 
각 DDT혼합표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방 법
가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖
를 가한 다음, 30분간 강하게 진탕하여 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No. 5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%,W/V) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분액
여두A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두B에 
넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 흔들어 혼합하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층
(상층)을 위의 분액여두 A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 흔들고 정치한 후, 
수층을 500㎖의 분액여두 C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 
흔들어 정치한 후, 수층을 분액여두 C에 가하고, 헥산층은 500㎖의 삼각플라스크에 넣
는다. 헥산 100㎖를 분액여두C에 가하고 가볍게 진탕한 후 정치한다. 수층을 버리고, 
헥산층을 위의 삼각플라스크에 넣고, 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수한 다음 
500㎖의 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 여과지를 
소량의 헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도가 될때까
지 감압 농축하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보내고 , 헥산 40㎖를 가한다. 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이9장. 잔류농약
129가 될때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣어, 용기를 소량의 헥산으로 세정한다. 세액을 컬럼에 가하여 액
면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될때까지 유출시킨후 , DDT를 헥산+디에틸에테
르(17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될때까지 
감압농축하고 , 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 3㎖를 정확히 가
하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min
     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
     승온 : 20℃/min, 180℃(1분), 2℃/min, 220℃(1분 유지)
                1℃/min, 250℃
     시료도입부온도 : 250℃
     검출기온도 : 280℃
     계산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 각 
DDT량을 산출한다.
다. 알드린(Aldrin) [C12H8Cl6]
1) 시약의 조제
가) 알드린표준액
알드린 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 100㎖의 메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖를 가
하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가하여 알드린표준원액을 조제한다.(이
액 1㎖는 알드린 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +
아세톤(4+1)으로 정확히 희석하고, 1㎖중에 0.05, 0.1, 0.15, 0.2㎍을 함유하는 각 알드린
표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 130130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방법
가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖
를 가한고, 30분간 강하게 진탕한 다음 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No.5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%,W/V) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분액
여두 A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두 B
에 넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층(상층)
을 위의 분액여두 A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 수
층을 500㎖의 분액여두 C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 
진탕하고 정치한 후, 수층을 분액여두 C에 가하고, 헥산층은 500㎖의 삼각플라스크에 
넣는다. 헥산 100㎖를 분액여두 C에 가하고 가볍게 흔들어 정치한 후 수층을 버리고, 
헥산층을 위의 삼각플라스크에 넣고, 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수한다. 
500㎖의 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 여과지를 
소량의 헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도가 될때까
지 감압 농축하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보낸다 . 헥산 40㎖를 가하여 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 소량의 헥산으로 세정하고 세액을 컬럼에 가하여 
액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될때까지 유출시킨후 , 알드린을 헥산+디에틸
에테르(17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될때
까지 감압 농축하고, 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 3㎖를 정확
히 가하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min9장. 잔류농약
131     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 20℃/min, 180℃(1분 유지)
       승온  2℃/min, 220℃(1분 유지)
       승온  1℃/min, 250℃
     시료도입부온도 : 250℃
     검출기온도 : 280℃
     계    산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중
의 각 알드린량을 산출한다.
라. 디엘드린(Dieldrin) [C12H8Cl6O]
1) 시약의 조제
가) 디엘드린표준액
디엘드린 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각각 100㎖의 메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20
㎖를 가하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가하여 디엘드린표준원액을 조
제한다.(이액 1㎖는 디엘드린 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트
리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하고, 1㎖중에  0.05, 0.1, 0.15, 0.2㎍을 함유하
는 각 디엘드린표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방법
가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖
를 가한 다음, 30분간 강하게 진탕하고 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No.5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5W/V%) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분액
여두A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두B에 
넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층(상층)을 
위의 분액여두A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 수층을 
500㎖의 분액여두 C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 진탕하132고 정치한 후, 수층을 분액여두 C에 가하고, 헥산층은 500㎖의 삼각플라스크에 넣는다. 
헥산 100㎖를 분액여두 C에 가하고 가볍게 흔들어 정치한 후 수층을 버리고, 헥산층을 
위의 삼각플라스크에 넣는다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고 500㎖의 
농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 여과지를 소량의 
헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도가 될때까지 감압
농축하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보낸다 . 헥산 40㎖를 가하여 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 소량의 헥산으로 세정하고 세액을 컬럼에 가하여 
액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될때까지 유출시킨후 , 디엘드린을 헥산+디에
틸에테르(17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될
때까지 감압 농축하고, 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 3㎖를 정
확히 가하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min
     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 20℃/min, 180℃(1분 유지)
       승온  2℃/min, 220℃(1분 유지)
       승온  1℃/min, 250℃
     시료도입부온도 : 250℃
     검출기온도 : 280℃
     계  산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 
각 디엘드린량을 산출한다.
마. 엔드린(Endrin) [C12H8Cl6O]9장. 잔류농약
1331) 시약의 조제
가) 엔드린표준액
엔드린 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각각 100㎖의 메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20㎖
를 가하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가하여 엔드린표준원액을 조제한
다.(이액 1㎖는 엔드린 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸
펜탄+아세톤(4+1)으로 정확히 희석하고, 1㎖중에  0.05, 0.1, 0.15, 0.2㎍을 함유하는 각 
엔드린표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방법
가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖
를 가한 다음, 30분간 강하게 진탕하고 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No.5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%, W/V) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분
액여두 A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두 
B에 넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층(상층)
을 위의 분액여두 A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 수
층을 500㎖의 분액여두 C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 
진탕하고 정치한 후, 수층을 분액여두C에 가하고, 헥산층은 500㎖의 삼각플라스크에 
넣는다. 헥산 100㎖를 분액여두 C에 가하고 가볍게 흔들어 정치한 후 수층을 버리고, 
헥산층을 위의 삼각플라스크에 넣는다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고 
500㎖의 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 여과지를 
소량의 헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도가 될때까
지 감압 농축하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보낸다 . 헥산 40㎖를 가하여 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 소량의 헥산으로 세정하고 세액을 컬럼에 가하여 
액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될때까지 유출시킨후 , 엔드린을 헥산+디에틸
에테르(17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될때134까지 감압농축하고 , 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 3㎖를 정확
히 가하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min
     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 20℃/min, 180℃(1분 유지)
       승온  2℃/min, 220℃(1분 유지)
       승온  1℃/min, 250℃
     시료도입부온도 : 250℃
     검출기온도 : 280℃
     계산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 각 
엔드린량을 산출한다.
바. 헵타크롤(Heptachlor) [C10H5Cl7]
1) 시약의 조제
가) 헵타크롤표준액
헵타크롤 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각각 100㎖의 메스플라스크에 넣는다. 아세톤 20
㎖를 가하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가하여 헵타크롤표준원액을 조
제한다.(이액 1㎖는 헵타크롤 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 2,2,4-트
리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하고, 1㎖중에  0.05, 0.1, 0.15, 0.2㎍을 함유하
는 각 헵타크롤표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방법9장. 잔류농약
135가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖
를 가한 다음, 30분간 강하게 진탕하고 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No.5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%, W/V) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분
액여두 A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두 
B에 넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층(상층)
을 위의 분액여두A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 수층
을 500㎖의 분액여두 C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 진
탕하고 정치한 후, 수층을 분액여두 C에 가하고, 헥산층은 500㎖의 삼각플라스크에 넣
는다. 헥산 100㎖를 분액여두 C에 가하고 가볍게 흔들어 정치한 후 수층을 버리고, 헥
산층을 위의 삼각플라스크에 넣는다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고 
500㎖의 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 여과지를 
소량의 헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도가 될때까
지 감압 농축하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보낸다 . 헥산 40㎖를 가하여 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 소량의 헥산으로 세정하고 세액을 컬럼에 가하여 
액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될때까지 유출시킨후 , 헵타크롤을 헥산+디에
틸에테르(17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대부분 건고될
때까지 감압 농축하고, 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1) 3㎖를 정
확히 가하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min
     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 20℃/min, 180℃(1분 유지)
       승온  2℃/min, 220℃(1분 유지)136       승온  1℃/min, 250℃
     시료도입부온도 : 250℃
     검출기온도 : 280℃
     계산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 각 
헵타크롤량을 산출한다.
사. 헵타크롤에폭사이드 (Heptachlor Epoxide) [C10H5Cl7O]
1) 시약의 조제
가) 헵타크롤에폭사이드표준액
헵타크롤에폭사이드 20㎎씩을 정확히 칭량하여, 각각 100㎖의 메스플라스크에 넣는다. 
아세톤 20㎖를 가하여 용해하고, 2,2,4-트리메틸펜탄을 표선까지 가하여 헵타크롤에폭
사이드표준원액을 조제한다.(이액 1㎖는 헵타크롤에폭사이드 0.2㎎을 함유한다) 사용시, 
표준원액의 일정량을 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤(4+1)으로 정확히 희석하고, 1㎖중에  
0.05, 0.1, 0.15, 0.2㎍을 함유하는 각 헵타크롤에폭사이드표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [(입경 149～250㎛(100～60mesh) : 플로리실PR 미국의 Floridin제]을 
130℃에서 5시간 건조한다.
2) 방법
가) 추출
시료 10.0～50.0g을 칭량하여 500㎖ 분액여두에 넣고, 아세토니트릴 +증류수(13+7) 300㎖
를 가한 다음, 30분간 강하게 진탕하고 추출한다. 비이커를 부크너여두의 아래에 놓고, 
추출액을 No.5B 여과지로 흡인 여과하여 추출액으로 한다.
나) 정제
추출액 150㎖를 미리 염화나트륨용액 (5%, W/V) 600㎖ 및 헥산 100㎖를 넣은 1ℓ의 분
액여두 A에 가하고, 5분간 강하게 진탕한다. 정치한 후, 수층(하층)을 1ℓ의 분액여두 
B에 넣고, 헥산 50㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한다. 수층을 버리고, 헥산층(상층)
을 위의 분액여두 A에 가하고 증류수 100㎖를 가하여 가볍게 진탕하고 정치한 후, 수
층을 500㎖의 분액여두 C에 넣는다. 그리고 증류수 100㎖를 헥산층에 가하여 가볍게 
진탕하고 정치한 후, 수층을 분액여두 C에 가하고, 헥산층은 500㎖의 삼각플라스크에 
넣는다. 헥산 100㎖를 분액여두 C에 가하고 가볍게 흔들어 정치한 후 수층을 버리고, 
헥산층을 위의 삼각플라스크에 넣는다. 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 탈수하고 9장. 잔류농약
137500㎖의 농축플라스크에 No.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과한 후, 용기 및 여과지를 
소량의 헥산으로 세정한다. 여액에 합하여 40℃ 이하의 수욕조에서 5㎖정도가 될때까
지 감압 농축하고, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
다) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 9g, 황산나트륨 (무수) 3g을 각각 헥산으로 현탁시켜서 컬럼관(내경 15㎜)
에 순차적으로 흘려보낸다 . 헥산 40㎖를 가하여 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이
가 될 때까지 유출시켜 컬럼을 조제한다. 300㎖의 농축플라스크를 컬럼의 아래에 놓고, 
시료용액을 컬럼에 넣는다. 용기를 소량의 헥산으로 세정하고 세액을 컬럼에 가하여 
액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시킨 후, 헵타크롤에폭사이드
을 헥산+디에틸에테르 (17+3) 150㎖로 용출시킨다 . 용출액을 40℃ 이하의 수욕조에서 대
부분 건고될 때까지 감압농축하고 , 질소가스로 건고한다. 2,2,4-트리메틸펜탄 +아세톤
(4+1) 3㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고 가스크로마토그래피용 시료용액으로 한
다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
     검출기 : 전자포획검출기
     칼럼 : 용융석영제 캐필러리컬럼 (시아노프로필메틸실리콘코팅 , 내경 0.32㎜, 길이 30m, 두
께 0.25㎛)
     캐리어가스 : He 1.5㎖/min
     보조가스 : N2 60㎖/min
     칼럼조온도 : 초기온도 60℃(1분 유지)
       승온 20℃/min, 180℃(1분 유지)
       승온  2℃/min, 220℃(1분 유지)
       승온  1℃/min, 250℃
     시료도입부온도 : 250℃
     검출기온도 : 280℃
     계산 : 측정된 크로마토그램의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 각 
헵타크롤에폭사이드량을 산출한다.
4. 카바메이트계 (Carbamate)
가. 카바릴(Carbaryl) [C12H11NO2]1381) 표준용액의 제조
표준품을 1000㎍/㎖이 되도록 메탄올에 녹여 표준원액으로 하고, 적정농도로 희석하여 
사용한다.
2) 시약 및 초자
가) 시약
메탄올, 아세토니트릴 - HPLC등급
디클로로메탄 , 헥산 - 잔류농약분석용 또는 동급
Na2SO4(,(무수), NaCl, ο-phthaldialdehyde, NaOH, Sodium tetraborate decahydrate,
2-mercaptoethanol - 특급 이상
Florisil - 60～100mesh, 규조토,
용출액 - 헥산 : 아세톤 = 60:40
나) 초자
삼각플라스크 (300㎖), 부크너여두 , 농축용플라스크 (125㎖, 250㎖), 분액여두(1000㎖), 메
스실린더(100㎖), 피펫(3㎖, 5㎖), No. 6 여과지, 유리컬럼(테프론콕 포함, Φ1㎝×50㎝), 
탈지면(아세톤으로 추출한 것), vial(4㎖, 8㎖), 멤브레인필터 (pore size : 0.45㎛)
3) 방법
가) 추출
시료 20g을 삼각플라스크에 칭량하고, 증류수 30～40㎖를 넣어 1시간 방치한 후, 메탄
올 100㎖를 첨가하여 12～14시간(over night) 진탕한다. 진탕 후, 부크너여두에 No. 6 
여과지와 규조토를 깔고, 여두 아래 삼각플라스크를 놓고 흡인여과한다 . 소량의 메탄올
로 삼각플라스크와 여두내의 잔사를 세척하여 여과액에 합친다.
나) 분배
시료용액을 1000㎖ 분액여두로 옮기고, 포화식염수 100㎖, 증류수 400㎖, 디클로로메탄 
100㎖를 넣고 약 4분간 진탕시킨다 . 진탕 후, 잠시 정치시켜 아래쪽의 디클로로메탄층
을 Na2SO4를 통과시켜 수분을 제거한 후, 250㎖ 농축용플라스크에 받는다.(1액), 상층액
에 다시 디클로로메탄 100㎖를 넣고 진탕시켜 디클로로메탄층을 1액과 합친다. 이를 
실온에서 회전증발농축기로 거의 대부분을 농축시킨 다음 질소가스로 완전히 농축시킨
다. 잔사를 헥산 5㎖로 용해시킨다 .
다) 정제(컬럼크로마토그래피 )
유리컬럼을 아세톤으로 추출한 탈지면으로 막고 Florisil 5g을 넣은 후, Na2SO4((무수) 19장. 잔류농약
139스푼 정도 (높이 1～2㎝)를 넣는다. 이때 컬럼내로 균일하게 들어가도록 한다. 헥산 50
㎖를 흘려버리고 시료액 3㎖를 loading한다. 다시 헥산 50㎖를 흘려버리고 용출액 50㎖
를 흘려 125㎖ 농축용플라스크로 받는다. 실온에서 회전증발농축기로 거의 대부분을 
농축시킨 다음 질소 가스로 완전히 농축시킨다 . 잔사를 메탄올 3㎖로 용해시키고 멤브
레인필터(poresize 0.45㎛)로 여과하여 기기분석용 시료액으로 한다.
      ※ 후컬럼 시약
  ① 0.05N NaOH : 1g NaOH를 3차증류수 또는 HPLC용 증류수로 500㎖ 정용. 진공 필
터법에 의해 여과하고 갈색병에 보관.
  ② OPA/ME
   ㉮ 저장용 버퍼(0.05M sodium borate) : 19.1g sodium tetraborate decahydrate 를 1ℓ의 
3차증류수나 HPLC용 증류수로 녹인다. 밀봉하여 보관.
   ㉯ OPA 시약 : 50㎎의 OPA를 500㎖ 플라스크에 넣고 5㎖ 메탄올을 가하여 녹인 후 
0.05M borate 버퍼로 정용한다. 진공필터법으로 여과하고 25㎕ 2-mercaptoethanol
을 첨가한다. 2-mercaptoethanol 첨가 후 탈기나 degas 단계를 실시하지 않는다. 
갈색병에 밀봉 보관.
4) 측정조건(High Performance liquid chromatograph)
     Column - carbarmate analysis column(Waters co.)
     검출기 - 형광검출기
     이동상 : H2O : 메탄올 : 아세토니트릴 = 50 : 45 : 5
     Flow rate - 1.0㎖/min
     PCRS : OPA - 0.5㎖/min, NaOH - 0.5㎖/min
     주입량 : 10㎕
5) 계산
ppm = 검량선(ng)×{최종희석량 (㎖)/주입량(㎕)}×{1/시료무게(g)}
5. 유기인계, 유기염소계 및 카바메이트계 다성분 분석법
가. 분석성분
다이아지논 (Diazinon), 파라치온(Parathion), 페니트로치온 (Fenitrothion), 펜치온(Fenthion), 
카바릴(Carbaryl), 말라치온(Malathion), 펜토에이트 (Phenthoate), 클로르피리포스메칠140(Chlorphyrifos-methyl), 피리미포스메칠 (Pirimiphos-methyl), 비에이치시 (BHC), 디디티
(DDT), 디엘드린(알드린포함 ; Dieldrin and Aldrin), 엔드린(Endrin), 헵타크롤(헵타크롤에
폭사이드포함 ; Heptachlor and Heptachlor epoxide), 치아벤다졸 (Thiabendazole), EPN, 베
노밀(Benomyl), 퍼메쓰린(Permethrin), 에치온(Ethion), 클로르피리포스 (Chlorpyrifos), 페노
브카브(Fenobucarb), 이소프로카브 (Isoprocarb), 펜발러레이트 (Fenvalerate), 에디펜포스
(Edifenphos), 이소펜포스 (Isofenphos)
1) 표준용액의 조제
유기인계 및 유기염소계 20성분은 원제(분말)를 Acetone : Hexane (1 : 9)용액, 카바메이
트계등 5성분은 메탄올이나 아세토니트릴를 이용하여 각각 1000ppm으로 만든 후 각각
의 성분을 그룹별(유기인계, 유기염소계 , 카바메이트계등 )로 100㎖ mass flask에 1㎖씩 넣
고 표선을 맞추어 10ppm의 work solution을 제조하여 아세톤이나 아세토니트릴로 각각 
0.1, 0.5, 1.0ppm으로 희석하여 표준물질로 사용한다.
2) 시약 및 초자
가) 시약
아세톤, 디클로로메탄 , 헥산, 아세토니트릴 , 1,2-프로판디올 , NaCl(잔류농약분석용 또는 
동급)
나) 초자
폴리에틸렌병 (250㎖), 메스실린더 (100㎖), 피펫(1㎖, 5㎖), vial(2㎖) 또는 Microvolume 
insert(0.2 ㎖)  
3) 방법
가) 추출
마쇄된 시료 5g을 폴리에틸렌병에 칭량하고, 증류수 20㎖를 넣어 1시간 방치한 후, 아
세토니트릴 50㎖와 NaCl 10g을 첨가하여 1시간 진탕 한다. 진탕 후 3000rpm에서 3분
간 원심분리 시킨다.
나) 정제
디클로로메탄 7㎖와 아세토니트릴 7㎖로 활성화 된 아민 카트리지(NH2-2g)에 원심분리 
된 상층부(아세토니트릴층 )에서 3㎖를 취하여 loading하여 버린다. 이어서 아세토니트릴 
4㎖로 용출하고 용출액은 질소가스 또는 공기를 사용하여 용매를 날려 버리고 잔류물
을 아세톤 일정량에 녹여 시험용액으로 한다(다만, 카바메이트계 등 5성분은 용출액 4
㎖에 Keeper제〔1,2-프로판디올 (20) : 아세토니트릴 (80) = 부피비 〕1㎖첨가한 후 농축한
다. 농축 후 Tube에 0.2㎖ 1,2-프로판디올이 남아 있으므로 이를 고려하여 아세토니트9장. 잔류농약
141릴 일정량에 녹여 시험용액으로 한다)
4) 측정조건
가) 유기인계(Gas chromatograph/NPD)
주입부온도 : 250℃, 1㎕ splitless
오븐온도 : 130℃(1분) →분당 7℃ →200℃ →분당 2℃ →220℃(4분) →분당 10℃→300℃
(6분)
검출기 : 질소인검출기 (NPD), 온도 - 320℃, H2 : 3.1㎖/min, Air : 60㎖/min
Column : DB-5 Capillary Column (30m x 0.25mm x 0.25㎛)또는 이와 동등한 것
Make up gas(N2) : 10㎖/min
주입량 : 1㎕
나) 유기염소계 (Gas chromatograph/ECD)
주입부온도 : 250℃, 1㎕ split ratio 60 : 1
오븐온도 : 130℃(1분) →분당 7℃ →200℃ →분당 2℃ →220℃(4분) →분당 10℃ →30
0℃(6분)
검출기 : 전자포획검출기 (ECD), 온도 - 320℃
Column : DB-5 Capillary Column (30m x 0.25mm x 0.25㎛)또는 이와 동등한 것
Make up gas(N2) : 60㎖/min
주입량 : 1㎕
다) 카바메이트계 (High Performance liquid chromatograph/UV/FLD)
     측정기기 : HP-1100 series
     검출기 : UV : 254, 275nm, 
              FLD : Excitation - 330nm, Emission - 446nm 
     Column : Phenomenox Luna (25㎝, particle size 5㎛, C18)
     Post-Column Derivatizer : OPA - 0.25㎖/min, NaOH - 0.25㎖/min 
     이동상 : H2O : 아세토니트릴 = 70 : 30, 1.0㎖/min (0-5min)
             H2O : 아세토니트릴 = 15 : 85, 1.2㎖/min (5-25min)
             H2O : 아세토니트릴 = 15 : 85, 1.2㎖/min (25-40min)
     주입량 : 10㎕1425) 계산
     ppm = 검량선(ng) x〔최종희석량 (㎖)/주입량(㎕)〕x〔1/시료무게(g)〕
6. 다종농약 다성분 분석법 (Multi class pesticide multiresidue methods)
가. 다종농약다성분 동시분석
○ 기체크로마토그래프 분석 대상
1 Acrinathrin 2 Aldrin 3 Allidochlor
4 Ametryn 5 Anilofos 6 Asulam
7 Atraine 8 Azaconazole 9 Azinphos-ethyl
10 Azinphos-methyl 11 BHC 12 Bifenthrin
13 Binapacryl 14 Bromacil 15 Bromobutide
16 Bromophos-methyl 17 Bromopropylate 18 Bromoxynil
19 Bupirimate 20 Butafenacil 21 Cadusafos
22 Captafol 23 Captan 24 Carbophenothion
25 Chinomethionat 26 Chlordane 27 Chlorfenapyr
28 Chloridazon 29 Chlorobenzilate 30 Chlorothalonil
31 Chlorpyrifos 32Chlorpyrifos-methyl 33 Chlorthal-dimethyl
34 Cinmethylin 35 Clomeprop 36 Cyanazine
37 Cyanophos 38 Cycloate 39 Cycloprothrin
40 Cyflufenamid 41 Cyfluthrin 42 Cyhalothrin
43 Cypermethrin 44 Cyproconazole 45 Cyprodinil
46 DDT 47 Deltamethrin 48 Diallate
49 Diazinon 50 Dichlofluanid 51 Dichlorvos
52 Dicloran 53 Dicofol 54 Dicrotophos
55 Dieldrin 56 Diethofencarb 57 Diflufenican
58 Dimepiperate 59 Dimethachlor 60 Dimethenamid
61 Dimethoate 62 Dimethylvinphos 63 Diniconazole
64 Diphenamid 65 Diphenylamine 66 Dithiopyr
67 Edifenphos 68 Endosulfan 69 Endrin
70 EPN 71 Esprocarb 72 Ethion
73 Ethoprophos 74 Etoxazole 75 Etrimfos
76 Fenamidone 77 Fenarimol 78 Fenazaquin
79 Fenbuconazole 80 Fenitrothion 81 Fenobucarb
82 Fenothiocarb 83 Fenoxanil 84 Fenoxycarb
85 Fenpropathrin 86 Fenthion 87 Fenvalerate
88 Fipronil 89 Flonicamid 90 Fluazinam
91 Fludioxonil 92 Flumiclorac-pentyl 93 Flupyrazofos
94 Flusilazole 95 Flusulfamide 96 Fluthiacet-methyl
97 Flutolanil 98 Fluvalinate 99 Folpet
100 Fonofos 101 Fosthiazate 102 Fthalide
103 Furathiocarb 104 Heptachlor  epoxide 105 Heptachlor
106 Hexachlorobenzene 107 Imazalil 108 Indanofan9장. 잔류농약
143 
○ 액체크로마토그래프 분석 대상
1 Acetamiprid 2 Aldicarb 3 Amisulbrom
4 Azafenidin 5 Azamethiphos 6 Azoxystrobin
Bendiocarb 8 Bensulide 9 Benzoximate 7
10 Boscalid 11 Butocarboxim 12 Carbaryl
13 Carbofuran 14 Chlorantraniliprole 15 Chlorimuron-ethyl
16Chlorobenzuron 17 Chlorotoluron 18 Chromafenozide
19 Cinosulfuron 20 Clothianidin 21 Cyazofamid
22Cyhalofop-butyl 23 Cymoxanil 24 Dimethomorph
25 Ethaboxam 26 Ethametsulfuron-methyl 27 Ethiofencarb
28 Fenhexamid 29 Fenpyroximate 30 Ferimzone
31 Fluacrypyrim 32 Flubendiamide 33 Flufenacet
34 Flufenoxuron 35 Flumioxazine 36 Fluquinconazole
37 Fluridone 38 Forchlorfenuron 39 Hexaflumuron
40 Imazamox 41 Imazapic 42 Imazaquin109 Indoxacarb 110 Iprobenfos 111 Iprodione
112 Iprovalicarb 113 Isazofos 114 Isazophos
115 Isofenphos 116 Isofenphos-methyl 117 Isoprothiolane
118 Isoxathion 119 Kresoxim-methyl 120 Lactofen
121 Malathion 122 Mecarbam 123 Mefenacet
124 Mefenpyr-diethyl 125 Mepronil 126 Metconazole
127 Methidathion 128 Methoxychlor 129 Metrafenone
130 Molinate 131 Myclobutanil 132 Nitrapyrin
133 Nitrothal-isopropyl 134 Nonachlor 135 Nuarimol
136 Ofurace 137 Oxadixyl 138 Oxydemeton-methyl
139 Paclobutrazol 140 Parathion 141 Parathion-methyl
142 Pebulate 143 Penconazole 144 Pendimethalin
145 Permethrin 146 Phenthoate 147 Phosalone
148 Phosmet 149 Phosphamidone 150 Picolinafen
151 Picoxystrobin 152 Piperophos 153 Pirimicarb
154 Pirimiphos-ethyl 155 Pirimiphos-methyl 156 Probenazole
157 Prochloraz 158 Procymidone 159 Profenofos
160 Propachlor 161 Propazine 162 Propham
163 Propisochlor 164 Propyzamide 165 Prothiofos
166 Pyraclofos 167 Pyrazophos 168 Pyridaben
169 Pyridalyl 170 Pyrifenox 171 Pyrimidifen
172 Pyriminobac-methyl 173 Quinalphos 174 Quintozene
175 Simeconazole 176 Sulprofos 177 TCMTB
178 Tebufenpyrad 179 Tebupirimfos 180 Tefluthrin
181 Terbufos 182 Terbutylazine 183 Tetrachlorvinphos
184 Tetradifon 185 Thiazopyr 186 Thifluzamide
187 Thiometon 188 Tolclofos-methyl 189 Tolfenpyrad
190 Tolylfluanid 191 Tralomethrin 192 Triadimefon
193 Triazophos 194 Tribuphos 195 Triflumizole
196 Triflumuron 197 Triticonazole 198 Uniconazole
199 Vernolate 200 Vinclozoline 201 Zoxamide1441) 표준용액의 제조
각 표준품을 1000㎍/㎖이 되도록 유기용매에 녹여 표준원액으로 하고, 적정농도로 희석
하여 단일표준용액 또는 혼합표준용액을 조제한다. 
2) 시약 및 초자
가) 시약
① 용매：잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것
② 일회용 카트리지 ：플로리실(500 mg) 및 아미노-프로필(1 g) 등의 고정상이 충전되어 
있는 일회용 카트리지 
③ 기타 시약：특급 또는 이와 동등한 것
나) 초자
삼각플라스크 (300㎖), 부크너여두 , 농축용플라스크 (125㎖, 250㎖), 분액여두(1000㎖), 메
스실린더(100㎖), 피펫(3㎖, 5㎖), No. 6 여과지, 유리컬럼(테프론 콕 포함, Φ1㎝×50㎝), 
탈지면(아세톤으로 추출한 것), vial(4㎖, 8㎖)
3) 방법
가) 추출 
○ 아세토니트릴 추출법
시료 5 g을 정밀히 달아 혼합추출분쇄기 (Omni mixer)병에 넣고(물 30 mL를 넣어 1시간 
방치) 아세토니트릴 100 mL를 넣은 후 혼합추출분쇄기로 2～3분간 균질화한다 . 이를 43 Imazethapyr 44 Imibenconazole 45 Isoprocarb
46 Isoproturon 47 Lufenuron 48 Mepanipyrim
49 Metamifop 50 Methabenzthiazuron 51 Methiocarb
52 Methomyl 53 Methoxyfenozide 54 Metolcarb
55 Nitenpyram 56 Novaluron 57 Oxamyl
58 Oxaziclomefon 59 Pentoxazone 60 Phenmedipham
61 Promecarb 62 Propoxur 63 Pyraclostrobin
64 Pyrazolate 65 Pyribenzoxim 66 Pyributicarb
67 Pyridate 68 Pyrimethanil 69 Pyriproxyfen
70 Pyroquilon 71 Quinoclamine 72 Rimsulfuron
73 Spirodiclofen 74 Tebufenozide 75 Teflubenzuron
76 Thenychlor 77 Thiacloprid 78 Thiamethoxam
79 Thiodicarb 80 Tiadinil 81 Tribenuron-methyl
82 Tricyclazole 83 Trifloxystrobin 84 Trimethacarb9장. 잔류농약
145여지가 깔려있는 부흐너깔때기로 감압여과한다 . 여액을 염화나트륨 10～15 g이 들어있
는 500 mL 분액깔때기에 옮기고 마개(Teflon-lined) 를 막은 후 심하게 흔들어 층이 완
전히 분리될 때까지 정치한다. 아세토니트릴층을 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수한 
후 별도의 아세토니트릴을 가하여 최종 부피가 100 mL가 되게 한다. 아세토니트릴층 
20 mL를 각각 취하고 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축하여 용매를 날려버린다 . ★ 잔
류물을 기체크로마토그래프 분석 대상 농약의 경우 20% 아세톤 함유 헥산 4 mL로 용
해하고, 액체크로마토그래프 분석 대상 농약은 1% 메탄올 함유 디클로로메탄 4 mL로 
용해한다.
○ 아세톤 추출법
시료 5 g을 정밀히 달아 혼합추출분쇄기 (Omni mixer)병에 넣고(물 30 mL를 넣어 1시간 
방치) 아세톤 100 mL를 넣은 후 혼합추출분쇄기로 2～3분간 균질화한다 . 이를 여지가 
깔려있는 부흐너깔때기로 감압여과한다 . 이를 여과지가 깔려있는 부흐너깔때기로 감압
여과한다. 여과액을 1 L 분액깔때기로 옮기고 포화염화나트륨 용액 50 mL, 물 100 mL 
및 디클로로메탄 50 mL를 가하고 마개(Teflon-lined) 를 막은 후 심하게 흔들어 층이 완
전히 분리될 때까지 정치하고 디클로로메탄층을 취한다. 다시 디클로로메탄 50 mL로 
상기의 과정을 되풀이 하여 여액을 합하고 무수황산나트륨에 통과시켜 탈수한 후 별도
의 디클로로메탄을 가하여 최종 부피가 100 mL가 되게 한다. 디클로로메탄층 20 mL를 
각각 취하고 40℃ 이하 수욕상에서 감압농축하여 용매를 날려버린다 . ★ 잔류물을 기
체크로마토그래프 분석 대상 농약의 경우 20% 아세톤 함유 헥산 4 mL에 녹이고, 액체
크로마토그래프 분석 대상 농약은 1% 메탄올 함유 디클로로메탄 4 mL로 용해한다.
※ 추출은 상기 1) 또는 2) 중 선택하여 사용함.
나) 정제
○ 기체크로마토그래프 측정 농약
미리 플로리실 카트리지에 헥산 5 mL를 2～3 방울/초의 속도로 유출하여 버린다. 이 
카트리지에 20% 아세톤 함유 헥산 5 mL를 위와 같은 방법으로 유출하여 버린다. 이어
서 20% 아세톤 함유 헥산 4 mL에 녹인 액을 카트리지 상단에 넣고 초당 1～2방울 정
도의 속도로 용출시켜 시험관에 받는다. 다시 카트리지가 용매에 젖어 있는 상태에서 
20% 아세톤 함유 헥산 5 mL를 용출하여 동일 시험관에 모은다. 용출액은 40℃ 이하 
수욕상에서 질소 또는 공기를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 날려 보낸 후 20% 
아세톤 함유 헥산에 녹여서 일정량으로 한 후 맴브레인 필터(PTFE 0.45 μm)로 여과하
여 시험용액으로 한다.
※ 정제과정 중에는 모든 카트리지의 충전제가 마르지 않도록 주의한다.
※ 기체크로마토그래프 측정 농약을 전처리할 때 항상 감압농축하기 전에 2% 에틸렌글
리콜(Diethylene glycol) 함유 아세톤 0.2 mL를 첨가한다.146○ 액체크로마토그래프 측정 농약
미리 아미노-프로필 카트리지에 디클로로메탄 5 mL를 2～3 방울/초의 속도로 유출하
여 버린다. 이어서 1% 메탄올 함유 디클로로메탄 4 mL에 녹인 액을 카트리지 상단에 
넣고 1～2 방울/초의 속도로 용출시켜 시험관에 받는다. 다시 카트리지가 용매에 젖어 
있는 상태에서 1% 메탄올 함유 디클로로메탄 7 mL를 유출하여 동일 시험관에 합친다. 
유출액은 40℃ 이하 수욕상에서 질소 또는 공기를 낮은 유속으로 통과시키면서 용매를 
날려 보낸 후 아세토니트릴에 녹여 일정량으로 한 후 맴브레인 필터(PTFE 0.45 μm)로 
여과하여 시험용액으로 한다.
4) 시험조작
가) 기체크로마토그래프의 측정조건
○ GC-ECD
칼럼：DB-5(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 및 DB-17(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 
이와 동등한 것
캐리어가스 및 유량：N2, 1.0 mL/min
칼럼오븐온도 ：80℃에서 시험용액을 주입하고 2분간 유지한 후 7℃/min의 비율로 25
0℃까지 온도를 상승시키고 5℃/min의 비율로 280℃까지 상승시켜 20분 이상 유
지한다.
주입부 ：split mode(20 : 1)
검출기온도 ：280℃
○ GC-NPD
칼럼：DB-5(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 및 DB-17(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 
이와 동등한 것
이동상가스 및 유량：N2, 1.0 mL/min
오븐 온도：80℃에서 시험용액을 주입하고 2분간 유지한 후 7℃/min의 비율로 250℃까
지 온도를 상승시키고 5℃/min의 비율로 280℃까지 상승시켜 20분 이상 유지한
다.
주입부 ：splitless mode
검출기온도 ：280℃
○ GC-FPD
칼럼：DB-5(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 및 DB-17(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 9장. 잔류농약
147이와 동등한 것
이동상가스 및 유량：N2, 1.0 mL/min
오븐 온도：80℃에서 시험용액을 주입하고 2분간 유지한 후 7℃/min의 비율로 250℃까지 
온도를 상승시키고 5℃/min의 비율로 280℃까지 상승시켜 20분 이상 유지한다.
주입부 ：splitless mode
검출기온도 ：230℃
○ GC-MS
칼럼：DB-5ms(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상가스 및 유량：He, 0.8 mL/min
오븐 온도：70℃에서 시험용액을 주입하고 3분간 유지한 후 20℃/min의 비율로 180℃
까지 온도를 상승시키고 5℃/min의 비율로 300℃까지 상승시켜 7분 이상 유지한
다.
주입부 ：splitless mode
인터페이스 온도：280℃
Solvent delay time：4 min
나) 액체크로마토그래프의 측정조건
○ HPLC-FLD(Post-derivatization 포함)
칼럼：C18(3.9 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
검출기 ：Excitation 340 nm, Emission 455 nm
이동상 ：물 및 메탄올
  - 메탄올 ：물(3：7)의 혼합액에서 메탄올 ：물(7：3)의 혼합액으로 23분간 농도균배한 
후 5분 이상 흘려보낸다 .
이동상 유량：0.8 mL/min
Post Reaction Pump 유량：0.5 mL/min(NaOH 0.25 mL/min, OPA 0.25 mL/min) 또는 기
타 최적조건
○ HPLC-UVD
칼럼：C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 등등한 것
검출기 ：자외부흡광검출기 (254 nm)
이동상 ：물 및 아세토니트릴
  - 아세토니트릴 /물 혼합액(20/80, v/v)에서 (80/20, v/v)의 혼합액으로 40분간 농도 균
배한 후 10분 이상 흘려보낸다 .148  - 메탄올/물(35/65, v/v)에서 (90/10, v/v)의 혼합액으로 40분간 농도균배한 후 10분 이
상 흘려보낸다 .
  ※ 이동상의 조건은 상기 두 가지 중 선택하여 사용함
이동상 유량：1.0 mL/min
○ LC-MS
칼럼：C18(100 mm × 2 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상 ：A(물 + 0.1% 포름산, 2 mM 아세트산암모늄 ), B(99% 아세토니트릴 + 0.1% 포름
산, 2 mM 아세트산암모늄 )
  - A/B(90/10, v/v)에서 (10/90, v/v)의 혼합액으로 20분간 농도균배한 후 10분 이상 흘려
보낸다.
이동상 유량 : 0.2 mL/min
칼럼 온도 : 40℃
주입량 : 2 μL
이온화 : ESI positive 또는 negative-ion mode
5) 정성시험
위의 조건에서 시험할 때 시험결과는 어느 측정조건에서도 표준품과 일치하여야 한다.
  ※ GC-MS 및 LC-MS 상의 머무름 시간 및 질량분석 스펙트럼으로 각 농약의 성분을 
확인할 수 있다.
 
6) 정량시험
정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크 높이 또는 피크 면적에 따라 
정량한다.
     ※ 정량시험은 단일 표준품으로 표준용액을 일정농도로 제조한 후 얻어진 크로마토그램
상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
     ※ 이 시험법을 이용하여 사료에서 검출될 경우 정량분석은 사료공정서나 식품공전의 단
성분 분석법에 따른다.
7. 기타
가. 에틸렌디브로마이드 (EDB) [C2H4Br2]9장. 잔류농약
149○ 정성법 
1) 표준용액 조제
표준품을 아세톤으로 1000㎍/㎖ 되게 녹인 후, 적정 농도로 희석하여 사용한다.
2) 시약 및 초자
가) 시약 : 아세톤, CaCl2 - 특급이상
나) 초자 : 원심분리용 cornical tube(50 ㎖)
3) 방법
Conical tube에 분쇄시료 10g을 칭량한다. 아세톤 30㎖을 첨가하여 진탕기를 이용하여 
2～3시간 동안 진탕시킨다 .(진탕기 사용이 어려울 경우, 때때로 격렬히 흔들어 주면서 
방치한다) 진탕 후, CaCl2 1～2 스푼을 넣어 격렬히 흔들어 준다. CaCl2가 다 용해되었을 
경우 1스푼 정도 더 첨가하고 혼합한다. tube를 10분간 원심 분리하거나 , 30분간 정치시
켜 상층액으로 기기분석을 실시한다.
4) 측정조건(Gas Chromatograph)
       주입부 온도 : 220℃
       오븐 온도 : 120℃(1분) - 분당 3℃상승 - 190℃(1분)
       검출기 : 전자포획검출기 (ECD), 온도 - 250℃,
                Anode purge flow - N2 6.0㎖/min, 
                makeup flow - N2 54.0㎖/min
       Column : capillary HP-FFAP(30.0m×0.53 ㎛×1.0㎛)
       Carrier gas : N2 - 6.0㎖/min
       주입량 : 1㎕
○ 정량법
1) 시약의 조제
가) 에틸렌디브로마이드 표준액
에틸렌디브로마이드 0.1g을 정확히 칭량하여 100㎖의 메스플라스크에 넣는다. 아세톤을 
가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 에틸렌디브로마이드표준원액으로 조제한
다.(이액 1㎖는 에틸렌디브로마이드 1㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 헥
산으로 정확히 희석하고, 1㎖중에 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.1, 0.2㎍을 함유하는 각 에틸150렌디브로마이드표준액을 조제한다.
나) 규산마그네슘
합성규산마그네슘 [입경 149～250㎛ (100～60mesh) : 플로리실 PR. 미국의 Floridin제]
2) 방법
가) 추출
시료 50g을 칭량하여 1ℓ의 Dean-Stark 증류장치용 플라스크에 넣는다. 증류수 400㎖, 
헥산 15㎖ 및 실리콘유 1방울을 가한 후, 플라스크를 증류장치에 연결하고, 맨틀히터로 
1시간 가열하여 추출한다. 방냉한 후, 증류장치의 트랩내의 물을 제거하고, 헥산층을 
No. 2S 분액여과지 (동양여과지 )로 20㎖의 메스플라스크에 여과한다. 여과지를 소량의 
헥산으로 세정하고, 헥산을 표선까지 가하여, 컬럼크로마토그래피용 시료용액으로 한
다.
나) 컬럼크로마토그래피
규산마그네슘 2g을 컬럼관(내경 10㎜)에 건식 충진하고, 정제용 컬럼을 조제한다. 시료
용액을 컬럼에 넣은 다음, 처음의 유출액 5㎖를 버리고, 유출액을 가스크로마토그래피
용 시료용액으로 한다.
3) 측정조건(Gas chromatograph)
검출기 : 전자포획검출기
컬럼용관 : 글라스제 내경 3㎜, 길이 2m
컬럼충진제 : FFAP(10%)/ 가스크롬 Q[입경 177～200㎛(80～60mesh)]
캐리어가스 : N2 40㎖/min
컬럼조온도 : 80℃
시료도입부온도 : 150℃
검출기온도 : 250℃
계산 : 측정된 크로마토그램의 피크면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료중의 에틸렌
디브로마이드량을 산출한다.
나. 치아벤다졸 (Thiabendazole) [C10H7N3S]
1) 시약의 조제
가) 치아벤다졸 표준액 : 치아벤다졸 20㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 9장. 잔류농약
151넣고 메탄올을 가하여 용해하고 동용매를 표선까지 가하여 표준원액조제 (이액 1㎖는 
치아벤다졸 0.2㎎ 함유) 사용할 때 표준원액을 메탄올로 희석하여 1㎖중 0.05, 0.1, 
0.25, 0.5㎍ 함유되게 조제하여 사용한다.
나) Ethyl Acetate : 시약특급
다) Sodium Acetate 완충액 : Sodium Acetate anhyd. (CH3COONa) 33g을 증류수에 1ℓ에 
녹인후 염산으로 pH 4.5로 조정하고 NaCl 150g을 가하여 녹인다.
라) 5N NaOH용액 : 가성 소다 200g을 증류수에 녹여 1ℓ로 한다.
마) 0.1N HCl 용액 : 농염산 (비중 1.18) 8.7㎖를 증류수로 희석하여 1ℓ로 한다.
바) Dichloromethane : 시약특급
사) Methanol : HPLC용
아) 0.01M KH2PO4 용액
2) 추출
시료 50g을 300㎖ 삼각플라스크에 정확히 취하고 Ethyl Acetate 100㎖와 Sodium Acetate 
완충액 50㎖를 가하여 진탕기 250rpm에서 1시간 진탕 추출후 Bell-Jar에 Buchner funnel
을 연결하여 No. 6 여과지를 깔고 그 위에 Hyflo Super Cel 1 spoon으로 덮은 후 300㎖ 
삼각플라스크에 흡인여과하고 Ethyl Acetate로 삼각플라스크와 깔대기의 잔사를 씻어준
다.
분액 깔대기에 시료액을 넣고, 5N-NaOH 10㎖를 가하고 1분간 진탕 후 물층(하층)은 버
리고 Ethyl Acetate층은 증류수 100㎖를 가하여 진탕하고 하층을 버린 다음 0.1N-HCl 50
㎖로 2회 추출한다.
0.1N HCl층을 Dichlomethane 50㎖로 씻어주고 5N-NaOH 용액으로 pH 8 이상 조절한 다
음 Ethyl Acetate 50㎖로 2회 추출한 후 Ethyl Acetate층을 Na2SO4로 탈수한 후 회전식
증발기에서 증발 건고한 후 Methanol 4㎖로 용해하여 검액으로 한다.
3) 측정(예)
      측정기기 : HPLC
      Column : C18 NOVA-PAK 또는 이와 동등한 것(4.6㎜×15㎝)
      Mobile phase : 0.136% KH2PO4 : Methanol(4:6)
                     ※ H3PO4로 pH 2.5 조정
      Detector : Fluorescence Detector
                - Excitation Filter 300㎚152                - Emission Filter 355㎚
      Flow rate : 1.0㎖/min
4) 계산
측정된 크로마토그램의 면적을 구하여 검량선을 작성하고 시료중의 치아벤다졸의 함량
을 산출한다. 
다. 프로피코나졸 (Propiconazole) [C15H17Cl2N3O2]
1) 표준용액의 제조
프로피코나졸을 헥산에 녹여 100 mg/kg이 되게 하고, 표준원액을 각각 헥산에 녹여 적당
한 농도로 혼합, 희석한다.
2) 시약
용매：잔류농약 시험용
물：증류수 또는 이와 동등한 물
기타시약 ：잔류농약 시험용 또는 특급
3) 방법
가) 추출
균질화한 시료 10 g을 달아 물 20 mL를 넣고 2시간 방치한다. 이를 균질기에 넣고 아
세톤 100 mL를 넣어 3분간 균질화한 후 여과보조제를 깔은 흡인여과기로 여과한다. 
잔류물은 균질기에 다시 넣고 아세톤 100 mL를 넣고 3분간 균질화한 후 위와같이 되
풀이하여 여과한다. 여액을 합쳐 40℃이하의 수욕상에서 감압하에 50 mL로 농축한다. 
위의 농축액에 인산 1 mL 및 5% 초산아연용액 100 mL를 넣고 때때로 흔들어 섞으면
서 15분간 방치한 후 여과보조제를 깔은 흡인여과기로 여과하고 여지상의 잔류물을 물 
10 mL로 씻고 여과한다. 
나) 분배
여액을 합쳐 1N 수산화나트륨 10 g 및 디클로로메탄 100 mL를 넣고 진탕기로 5분간 
심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 디클로로메탄층을 삼각플라스크에 취한다. 물층에 디
클로로메탄 100 mL를 넣어 위와 같이 되풀이하여 디클로로메탄층을 위의 삼각플라스
크에 합친다. 이에 적당량의 무수황산나트륨을 넣고 때때로 흔들어 섞으면서 1시간 방9장. 잔류농약
153치한 후 여과한다. 다시 디클로로메탄 40 mL로 삼각플라스크를 씻고 이 씻은 액으로 
여지상의 잔류물을 씻고 여과한다. 여액을 합쳐 40℃이하의 수욕상에서 감압하에 날려
보낸다. 잔사를 에틸아세테이트에 녹여 정확히 5 mL로 하여 시험용액으로 한다. 
4) 측정조건
캐필러리 칼럼：0.25 mm의 안지름을 가지는 30 m의 모세관 유리 칼럼에 50% Phenyl 
50% Methyl siloxane을 0.25 μm의 두께로 화학결합 또는 Crosslink 코팅
한 것 또는 이와 동등한 것(4. 식품중 잔류농약 분석법, 4.1.2.1의 6) 시
험조작중 ｢사용이 가능한 동등한 칼럼｣ 참조)
주입부 및 검출기온도 ：모두 280℃
칼럼오븐온도 ：60℃에서 2분간 유지하고 10℃/분으로 온도를 상승시켜 270℃에서 7분간 
유지한다.
캐리어가스 및 유량：헬륨(트리아디메놀이 약 22분에서 유출하는 유속으로 조정하고 공
기 및 수소의 유량을 최적조건으로 조정한다)
검량선의 작성 : 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입한
다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선
을 작성한다.
5) 정성시험
위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액 피크의 머
무름시간과 일치하여야 한다.
6) 정량시험
정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 결과에 의해 피크높이법 또는 피크면적법에 따라 
정량한다.
7) 질량분석법에 의한 확인시험
정성시험과 똑같은 조건으로 기체크로마토그래피 질량분석을 하였을 때 시험결과는 표준
품과 일치하여야 한다. 또한 필요하면 피크높이법 또는 피크면적법에 따라 정량한다.
라. 에토펜프록스 (Etofenprox) [C25H28O3]1541) 표준용액의 조제
에토펜프록스를 헥산에 녹여 100 mg/kg이 되게 하고, 표준원액 1 mL를 취하여 플라스
크에 넣고 실온에서 질소를 통과하면서 증발건고 시킨 후 시험용액의 조제 방법 중 유
도체화에 따라 실험하고 헥산으로 적절한 농도로 희석하여 사용한다.
2) 시약 및 시액
용매∶잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것
물∶증류수 또는 이와 동등한 것
다공성 Chromosorb 칼럼∶SPE용 또는 이와 동등한 것
실리카 카트리지 ∶SPE용 또는 이와 동등한 것
후로리실 카트리지 ∶SPE용 또는 이와 동등한 것
유도체화 시약∶idotrimethylsilane(ITMS)
기타 시약∶잔류농약 시험용 또는 특급
3) 방법
가) 추출
시료를 잘게 썰거나 갈은 후 20 g을 달아 용기에 넣고 아세톤 100 mL를 넣어 5분간 고
속으로 균질화하고 이를 부흐너깔때기로 감압여과한다 . 그 잔사를 아세톤 50 mL로 씻
고 씻은 액은 위의 여액에 합하여 40℃이하의 수욕중에서 감압농축하여 용매를 대부분 
날려 버리고 잔류물에 물을 넣어 15 mL로 한다. 이를 다공성 Chromosorb 칼럼에 넣고 
10분간 방치후 헥산 40 mL로 용출하고 용출액은 40℃이하의 수욕중에서 감압농축하여 
헥산 3 mL로 용해한다.
나) 정제(1차)
미리 헥산 5 mL를 유출시켜 활성화한 실리카 카트리지에 위의 헥산 3 mL를 넣고 유출
하여 유출액은 버리고 이어서 아세톤 ∶헥산(5∶95) 혼합액 8 mL로 용출하고 용출액을 
질소가스 또는 공기를 사용하여 용매를 완전히 날려 버리고 잔류물을 클로로포름 1 mL
에 녹인다.
다) 유도체화
위의 클로로포름 1 mL에 iodotrimethylsilane(ITMS) 0.1 mL를 넣어 90분간 실온에서 방치 
후 0.03% 티오황산나트륨용액 30 mL를 넣고 분액깔때기로 옮겨 잘 흔들어 섞는다. 이
에 헥산 50 mL를 넣어 3분간 심하게 흔들어 섞은 후 방치하여 층을 분리하여 헥산층을 
감압 농축기용 플라스크에 옮긴다. 다시 물층에 헥산 30 mL를 넣어 위와 같이 되풀이
한 후 헥산층을 위의 플라스크에 합하여 무수황산나트륨으로 탈수, 여과한 후 40℃이하
의 수욕중에서 감압 농축하여 3 mL로 한다.9장. 잔류농약
155라) 정제(2차)
위의 헥산 3 mL를 미리 헥산 5 mL로 활성화한 후로리실 카트리지에 넣고 유출하여 버
리고 다시 헥산 3 mL씩으로 2회 유출시킨 후 이어서 에틸에테르 ∶헥산(2∶98) 혼합액 
10 mL로 용출하고 용출액을 질소가스 또는 공기를 사용하여 용매를 날려 버리고 잔류
물을 헥산 일정량에 녹여 시험용액으로 한다.
 
4) 시험조작
가) 기체크로마토그래프의 측정조건
충전칼럼
고정상담체 ∶기체크로마토그래프용 크로모솔브 W(AW-DMCS), 크로모솔브 G(AW-DMCS) 
및 가스크롬 Q 또는 이와 동등한 것
고정상액체 ∶기체크로마토그래프용 5% OV-17(50% 페닐메틸실리콘 )
칼럼∶안지름 2.6 mm, 길이 1 m의 유리관 또는 위와 동등한 캘필러리 칼럼
주입구 및 검출기의 온도∶280℃
칼럼온도 ∶240℃(항온, 필요에 따라 적절히 조절한다)
캐리어가스 및 유량∶질소를 적절하게 조절한다.
검량선의 작성 : 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프에 각각 주입
한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
5) 정성시험
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액피크의 
머무름시간과 일치하여야 한다.
6) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크높이법 또는 피크면적법에 따
라 정량한다.
마. 포레이트(Phorate)
1) 표준용액의 조제
포레이트[phorate 모화합물, phorate의  oxygen analog(phoratoxon, phoratoxon sulfoxide, 
phoratoxon sulfone), phorate sulfoxide, phorate sulfone]를 아세토니트릴에 녹여 100 156mg/kg이 되게 하고, 표준원액을 적절한 농도로 희석하여 표준용액으로 사용한다.
2) 시약 및 시액
용매∶잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것
물∶증류수 또는 이와 동등한 것
기타 시약∶잔류농약 시험용 또는 특급
   
3) 방법
가) 추출
볏짚 시료를 균질화한 후 10 g을 정확히 칭량하여 50 mL 원심분리관에 넣고 아세토니
트릴 20 mL를 넣은 후 shaker에서 1분간 진탕한다. 여기에 4 g MgSO4, 1 g NaCl, 1 g 
trisodiumcitrate dihydrate 를 첨가한 후 다시 1분간 강하게 진탕한다. 원심분리기를 이용
하여 3,000 rpm으로 5분간 원심분리한다 . 여과액 500 μL에 메탄올 500 μL를 넣고 
voltexing하여 기기분석을 실시한다.    
 
4) 시험조작
가) 액체크로마토그래프 질량분석기 (LC-MS/MS) 의 측정조건
칼럼∶C18 3 μm, 안지름 2.0 mm, 길이 1 m의 캐필러리 칼럼
칼럼온도 :40℃
주입량 : 2 μL
검량선의 작성 : 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프 질량분석기
(LC-MS/MS) 에 각각 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구
하여 검량선을 작성한다.
이동상 : A - 5 mM ammonium formate, 0.1% in Water
         B - 5 mM ammonium formate, 0.1% in 90% Acetonitrile
Time 유속(mL/min) A (%) B (%)
Intial 0.4 90 10
0.5 0.4 90 10
6.0 0.4 10 90
8.0 0.4 10 90
15.0 0.4 90 10
5) 정성시험
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피크는 어느 측정조건에서도 표준용액피크의 
머무름시간과 일치하여야 한다.9장. 잔류농약
1576) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피크높이법 또는 피크면적법에 따
라 정량한다.15810장. 동물용의약품
1. 정성분석
가. Charm Ⅱ 분석법
1) 추출용액 및 시약조제
가) 정제시약 : 정제시약은 -15℃이하에서 저장, 6개월 정도 보관이 가능하다. 사용할 때 
25℃에서 12시간 유효하다.
나) 추출용액 : 추출용액은 buffer와 유기용매를 아래와 같이 혼합하여 만든다.
     항생물질계열 buffer 용매 혼합비율
 베타-락탐(β-lactam) 1% KH2PO4(pH 6.0) 메탄올 1 : 1
 마크로라이드 (Macrolide) 1% KH2PO4(pH 8.0) 메탄올 1 : 1
 설폰아미드 (Sulfonamide) 0.1M HCl 메탄올 1 : 1
 아미노글리코시드 (Aminoglycoside) 18% NaCl or  20mM CaCl₂H2O 1 : 1
 테트라싸이클린 (Tetracycline) 0.1M HCl 메탄올 1 : 1
다) Buffer M : Dried buffer는 4℃에서 저장하며 라벨에 표시된 대로 40℃의 물 100㎖를 
넣어 덩어리지지 않도록 녹인다. 사용 전에 4℃로 냉장시킨다 . buffer는 얼음 또는 4℃
로 유지하면 3일간 유효하며 -15℃로 냉동시키면 3주간 저장할 수 있다.
라) MSU Multi-antimicrobial Standard (stock) : Dried standard는 4℃에서 저장한다. 10㎖의 
증류수를 넣고 잘 혼합하여 15분간 정치시킨 후 사용하고 얼음 또는 4℃에서 24시간 
이내에 사용하여야 한다.
2) 표준용액 조제
가) Negative Control standard(음성대조) : 임의 조제한 무첨가 사료추출액으로 한다. 음성 
대조시료액은 3개 준비한다.
나) Positive Control standard(양성대조)
Multi-antimicrobial standard를 지시된 대로 복원시킨 후 적당한 농도로 희석한다. 임의 10장. 동물용의약품
159조제한 무첨가 사료에 첨가하여 추출한 시료액을 사용한다. 이 과정을 6회 반복하여 
양성대조 시료액 6개를 준비한다.
3) 추출방법
가) 위에서 지시된 대로 추출용액을 조제한다.
나) 시료를 고운 가루에 가깝게 갈아준 뒤 10g을 칭량하여 50㎖ conical tube에 넣는다.
다) 추출용액 20㎖를 가하고 뚜껑을 씌워 잘 흔들어 준 후 15분간 sonication 시켜 추출한
다.
라) 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 No 5A 여과지로 여과한다.
마) 여액을 Charm test로 분석한다.
4) 각 계열별 분석방법
계    열 분    석    법
① 베타-락탐 
 (β-lactam)공시험관에 green시약 첨가→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→5㎖ buffer M 첨가
→시료추출액 200㎕첨가, 10초간 혼합→55℃ 2분간 반응→yellow시약 첨가, 10
초간 혼합→55℃ 2분간 반응→3분간 원심분리 →상층액 제거→DW 300㎕첨가, 
10초간 혼합→측정액 3㎖첨가→뚜껑덮고 10초간 혼합→측정
② 마이크로라이드
  (Macrolide)공시험관에 white시약 첨가→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→5㎖ buffer M첨가→
시료추출액 200㎕첨가, 10초간 혼합→55℃ 2분간반응 →green시약 첨가, 10초간 
혼합→55℃ 2분간 반응→3분간 원심분리 →상층액 제거→DW 300㎕첨가, 10초간 
혼합→측정액 3㎖첨가→뚜껑 덮고 10초간 혼합→측정
③ 설폰아미드
  (Sulfonamide)공시험관에 white시약 첨가→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→5㎖ buffer M 첨가
→시료추출액 200㎕첨가, 15초간 혼합→pink시약 첨가, 15초간 혼합→85℃ 3분
간반응 →3분간 원심분리 →상층액 제거→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→측정액 3
㎖첨가→뚜떵 덮고 10초간 혼합→측정
④ 아미노글리코시 드
(Aminoglycoside)공시험관에 white시약 첨가→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→5㎖ buffer M 첨가
→시료추출액 200㎕첨가, 10초간 혼합→35℃ 2분간 반응→green시약 첨가, 10
초간 혼합→35℃ 2분간 반응→3분간 원심분리 →상층액 제거→DW 300㎕첨가, 
10초간 혼합→측정액 3㎖첨가→뚜껑 덮고 10초간 혼합→측정
⑤ 테트라싸이클린
  (Tetracycline)공시험관에 white시약 첨가→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→5㎖ buffer M 첨가
→시료추출액 200㎕첨가→orange시약 첨가, 15초간 혼합→35℃ 3분간 반응→5
분간 원심분리 →상층액 제거→DW 300㎕첨가, 10초간 혼합→측정액 3㎖첨가→
뚜껑 덮고 10초간 혼합→측정
5) Control point와 양성의 결정 : control point는 양성과 음성을 결정하는 표준이 되는 수치
이다.160가) 6개의 양성대조 시료액으로 부터 평균 CPM을 구한다.
나) 3개의 음성대조 시료액으로 부터 평균 CPM을 구한다.(이 값은 control point계산에는 
영향을 주지 않으나 양성평균 CPM과 비교할 수 있다)
다) 평균양성 CPM에 15%를 더한 값이 control point이다.
라) 만일 시료의 CPM이 control point보다 높다면 그 시료는 음성이다. 시료의 CPM이 
control point보다 낮거나 같을 경우는 양성으로 판정하고, 각 계열 성분을 개별 정량분
석법으로 재분석한다 .
나. 분석 가능한 항생물질 계열
항생물질 계 열 성        분
베타-락탐(β-lactam)  페니실린 (penicillin)
마크로라이드
(Macrolide) 타이로신 (tylosin),
 스피라마이신 (spiramycin ),
 린코마이신 (lincomycin ),
 에리스로마이신 (erythromycin )
설폰아미드
(Sulfonamide) 설파디메톡신 (sulfadimethoxine ),
 설파메타진 (sulfamethazine ),
 설파퀴녹살린 (sulfaquinoxaline ),
 설파치아졸 (sulfathiazole )
아미노글리코시드 (Aminoglycoside)  네오마이신 (neomycin)
테트라싸이클린 (Tetracycline) 클로르테트라싸이클린 (chlortetracycline )
 옥시테트라싸이클린 (oxytetracycline )
 테트라싸이클린 (tetracycline)
2. 정량분석
가. 베타-락탐계열
1) 페니실린 지(Penicillin G)
가) 시 약
① B-6 buffer : 인산2수소칼륨 (KH2PO4) 7.0g / 500㎖ 증류수 + 인산수소나트륨
(Na2HPO4) 6.0g / 500㎖ 증류수(pH : 6.0±0.1)
② STD조제 : 페니실린지 (Penicillin G) 표준품을 메탄올(HPLC용)에 용해하여 사용
③ 이동상 조제 : 0.01M 인산2수소칼륨 : 아세토니트릴 : 메탄올 = 70 : 19 : 11, pH 7.110장. 동물용의약품
161나) 방 법
50㎖ conical tube에 사료 1～5g을 취하여 매회 메탄올 25㎖, 10㎖씩 넣고 각각 20분씩 
초음파처리 한 다음 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 합한다. 상등액을 125㎖ 농축용
플라스크에 옮기고 n-부틸알콜 2㎖, 에탄올 20㎖를 넣고 35～40℃수욕조에서 농축한다. 
잔여물에 B-6 완충액 10㎖를 넣고 다시 20분간 sonication 한다. 0.45㎛ 수용성 멤브레인 
필터로 여과하여 HPLC로 측정한다.
다) HPLC 조건 (예)
          Column - C18
          파  장 - 225㎚
          유  속 - 1.0㎖/min
          이동상 - 0.01M 인산2수소칼륨(KH2PO4) : 아세토니트릴 : 메탄올 = 70 : 19 : 11, pH 
7.1
나. 테트라싸이클린 계열
클로르테트라싸이클린 -염산(CTC-HCl), 옥시테트라싸이클린 -염산(OTC- HCl), 옥시테트라
싸이클린-4급암모늄(OTC-NH 4)
1) HPLC법
○ 방법 A
가) 시약제조
① 추출용매 - 염산 : 아세톤 : 증류수 = 9 : 40 : 51
② 표준액 - 2.0ppm, 4.0ppm, 6.0ppm
③ 이동상 - 증류수+메탄올(55+45) 1ℓ에 PICB-6 시약 1병을 혼합한 후 인산으로 pH를 
2.5로 조정
나) 방  법
사료 5g을 갈색공전삼각플라스크에 정확히 넣는다. 추출용매 100㎖를 가한 후, 교반기
로 30분간 용해시킨다 . No. 5A 여과지로 여과(혹은 원심분리기 3000rpm에서 10분간 원
심분리)한 후 여액을 0.45㎛ 멤브레인필터로 재여과하여 기기분석용 시료액으로 한다.162다) 기기분석 예(HPLC)
Column : C18(4.6 ㎜×250 ㎜, 5㎛)
파장 : 369㎚
유속 : 1.0㎖/min
이동상 : 상동
   
○  방법 B
가) 시약조제
① 0.01M 옥살산용액 : 옥살산 1.26g을 물 1ℓ에 녹인다.
② 핵산, 벤젠 : 특급 이상
③ 메탄올성 옥살산 용액 : 0.01M이 되게 옥살산을 메탄올에 녹인다.
④ 표준액 조제 : TC, OTC, CTC 표준품을 메탄올에 용해한 후 다시 메탄올로 희석해서 
사용
나) 방  법
주사기의 아래를 filter paper disk 2장으로 막고 탈지면으로 다시 막은 후, 분쇄시료 
0.5～1.0g을 채우고 그 위에 다시 탈지면으로 막는다. C18 sep-pak cartridge를 연결하
고 C18 sep-pak cartridge의 하단부를 막는다. 상부에 핵산 10㎖를 넣고 20분간 
sonication 한 후 흘려준다. 벤젠 10㎖을 넣고 똑같이 조작하여 용출시킨다 . 벤젠 용출
액을 증발 농축시킨 후, 여기에 메탄올성 옥살산 용액 10㎖를 넣는다. 다시 증발 건조
시켜 이동상 1㎖로 용해하여 HPLC 분석용 시료로 한다. 
다) HPLC 조건예
Column - C18(4.6 ㎜×250 ㎜, 5㎛) 
파장 - 360㎚
이동상 - 0.01M 옥살산용액 : 아세토니트릴 : 메탄올 = 7 : 2 : 1
2) GC-MSD법(CTC, OTC, Penicillin G)
가) 시약
① 0.01M EDTA 2Na-Mcilvaine buffer(pH 4.0) : 0.1M citric acid 272.5㎖+0.2M Na2HPO4 10장. 동물용의약품
163227.5㎖를 잘 혼합하여 EDTA 73.2g을 녹인다. 이 액을 1ℓ 메스실린더로 옮겨 10% 
수산화나트륨이나 1M 염산을 사용하여 pH 4.0으로 조정한 후 증류수로 1ℓ 눈금을 
맞춘다.
② 핵산, 메탄올
③ 0.01M 메탄올성 옥살산 : HPLC법 참조
④ 유도체 시약 : 에리스로마이신 (Eythromycin), 스피라마이신 (Spiramycin) 법 참조
나) 방 법
① 추 출 
사료 1～5g을 칭량하여 0.01M EDTA 2Na-Mcilvaine buffer 20㎖를 넣고 20분간씩 초음
파처리 및 흔들어주기를 반복한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 플라
스크에 넣는다. 다시 10㎖를 넣고 똑같이 조작한 후 플라스크에 합하여 No.5A 여과지
로 여과한다.
② 정  제
메탄올 10㎖, 물 20㎖로 conditioning 시켜 놓은 sep-pak C18 cartridge에 여액을 흘려
준다. 여기에 0.01M 메탄올성 옥살산 용액 1㎖로 5회 용출시킨 후 용출액을 합해 완전
히 증발 건조시킨다 .
③ 유도체화
완전히 건조된 잔사에 MSHFB : TMS-Cl : TMS-imidazole(100 : 5 : 2, V : V : V) 혼합
용액 50㎕를 넣고 80℃에서 15분간 가열시킨다 .
다) 기기 조건(GC-MSD) (예)
Column : Fused silica capillary(cross-linked 5% phenylmethyl silicone, 17m×0.2 ㎜×0.33
㎛)
주입부 온도 : 280℃
Transfer line 온도 : 300℃
Ion source 온도 : 200℃
Injection mode : splitless
Carrier gas : He (0.7㎖/min)
Electron energy : 70eV
Oven 온도 : 150℃ - 20℃/min - 270℃(3min) - 5℃/min - 300℃(6min)
※ 내부표준물질은 cholesteryl isobutyrate 500ppm 100㎕를 사용164다. 설폰아미드계 (Sulfonamides)
1) 설파메타진 (Sulfamethazine), 설파디메톡신 (Sulfadimethoxine), 설파퀴녹사린
(Sulfaquinoxaline)
가) 시약의 조제
① 표준원액 : 설파메타진 , 설파디메톡신 , 설파퀴녹살린 각 10.0㎎을 메스플라스크에 달
아 메탄올을 넣어 100㎖로 한다.(냉장보관)
② 표준원액을 이동상 용매로 희석하여 적절한 농도로 혼합, 희석한다.
③ n-Hexane : HPLC용
④ Dichloromethane : HPLC용
나) 추  출
① 10㎖ 유리주사기속에 탈지면을 깔고 분석시료(오염방지를 위하여 유발에서 마쇄함) 
0.5g을 취한 후, 탈지면으로 시료위를 덮은 후 주사기아래에 Sep-pak C18을 끼우고 
다시 Sep-pak 아래에 주사바늘을 끼우고 용액이 흐르지 않게 주사바늘을 고무마개에 
끼운다.
② 핵산 8㎖를 가하여 초음파세척기에서 10분간 Sonication 후 핵산을 서서히 유출시키고 
다시 디클로로메탄 8㎖를 가하여 10분간 Sonication 후 250㎖ 증발플라스크에 용출시
키고 다시 디클로로메탄 4㎖를 가하여 씻어주고 30～40℃ 회전식증발기에서 증발건고 
후 이동상용매 5㎖를 넣고 초음파세척기에서 시료액으로 한다.
다) 측정
측정기기 : 고속액체크로마토그래프
칼 럼  : Nova-pak C18  또는 이와 동등한 것
칼럼 : 3.9㎜×15㎝
이동상용매 - 아세트니트릴 : 0.1% 인산이수소칼륨 (16:84)의 혼합액을 인산용액으로 
pH 3.55되게 조절한다.
검출기파장 : 268㎚
유      속 : 1.0㎖/min
주  입  량 : 10㎕
라) 계  산10장. 동물용의약품
165측정된 크로마토그람의 피이크 높이 또는 피이크 면적을 구하고 검량선을 작성하여 계
산한다.
2) 설파치아졸 (Sulfathazole)
가) 시약의 조제
① 표준원액 : 설파치아졸 10.0㎎을 메스플라스크에 달아 메탄올을 넣어 100㎖로 한다.
(냉장보관)
② 표준원액을 이동상 용매로 희석하여 적절한 농도로 혼합, 희석한다.
③ n-Hexane : HPLC용
④ Dichloromethane : HPLC용
나) 추  출
Sulfa계열 동물의약품 동시분석법과 동일
다) 측  정
측 정 기 기 : 고속액체크로마토그래프
칼       럼 :  C18 (3.9㎜×15㎝)
이동상용매 : 아세트니트릴 : 0.1% 인산2수소칼륨 (16:84)의 혼합액을 인산용액으로 pH 
3.55되게 조절한다.
검출기파장 : 287㎚
유      속 : 1.0㎖/min
주  입  량 : 10㎕
라) 계  산
측정된 크로마토그람의 피이크 높이 또는 피이크 면적을 구하고 검량선을 작성하여 계
산한다.
라. 설폰아미드계 (Sulfonamides), 니트로퓨란계 (Nitrofuranes), 에토파베이트
    (Ethopabate) 동시분석1661) 설폰아미드계 (Sulfonamides) : 설파메라진 (Sulfamerazine), 설파메타진 (Sulfamethazine), 설
파치아졸(Sulfathiazole), 설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline), 설파디메톡신 (Sulfadimethoxine), 
설파다이아진 (Sulfadiazine)
니트로퓨란 (Nitrofuranes) : 퓨라졸리돈 (Furazolidone), 나이카바진 (Nicarbagine)
가) 시약 조제
① 0.01N 초산암모늄 조제
② 산화알루미늄 - activated basic, 70～230mesh, 200g을 증류수 1ℓ에 교반하여 감압여
과 하면서 메탄올 100㎖씩 3회 세척한 후 100℃에서 건조한다. 건조된 Al2O3을 증류
수에 섞어서 사용한다.
③ 설파메타진 , 설파치아졸 , 설파퀴녹살린 , 설파디메톡신 , 에토파베이트 , 설파다이아진 
1000ppm이 되도록 메탄올에 녹여 적정 농도로 희석하여 사용
④ 설파메라진 표준품을 아세톤으로 1000ppm으로 녹여 희석하여 사용
⑤ 퓨라졸리돈 , 나이카바진을 1000ppm되게 디메틸포름아미드로 녹여 적정 농도로 희석
하여 사용
나) 방 법
① 추출
사료 1～5g을 달아 아세톤 15㎖와 아세토니트릴 10㎖ 넣고 20분간 초음파로 처리하는 
동안 4～5회 흔들어 준다. 2500rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취하고 아세톤 
15㎖와 아세토니트릴 10㎖를 똑같이 조작하여 합한다. Whatman No.42 여과지로 여과
한다. 이때 1-프로판올 15㎖를 더하고 아세톤 20㎖로 씻어준다. 이 액이 수욕조 45℃에
서 약 15㎖정도 남을 때까지 농축한다. 잔여액에 아세톤 20㎖, 핵산 30㎖, 3% NaCl 30
㎖를 더하여 10분간 진탕한다. 5분간 정치 후, 핵산층을 제거하고, 클로르포름 : 아세토
니트릴(1:1)용액 30㎖씩 넣어 3회 추출한 다음 수욕조 45℃에서 농축한다. 이 잔액에 
아세토니트릴 2㎖를 녹인 후 정제용 시액으로 한다.
② 정  제
산화 알루미늄 column을 충전하고(1.5㎝) 95% 아세토니트릴 , 클로르포름 각 20㎖로 씻
어주고 시액을 흘려준다. 아세토니트릴 20㎖, 95% 아세토니트릴 20㎖, 85% 아세토니트
릴 20㎖, 1% NaOH 30㎖를 순차적으로 흘려주고 합한다. 최종적으로 클로르포름 10㎖
를 흘려주어 더한다. 합한 용출액에 0.8㎖ 인산을 넣고 30㎖의 클로르포름으로 3회 추
출하고, 디클로로메탄 30㎖로 3회 추출하여 합한다. 무수황산나트륨 5g으로 탈수시켜 
수욕조 45℃에서 농축 후, 아세토니트릴 100㎕에 녹여 HPLC 시액으로 한다.10장. 동물용의약품
167다) HPLC 조건(예)
Column : C18(4.6 ㎜×250 ㎜, 5㎛) 
Column 온도 : 40℃
유    속 : 0.8㎖/min → 1.0㎖/min(15min)
이동상 : A-0.01M 초산암모늄 , 0.0005M 헥산설포닉산 용액, 
        B-아세토니트릴
파    장 : 247㎚, 269㎚, 350㎚
주 입 량 : 10㎕
Gradient : A 90%  15분 70%  20분 20%
           B 10% → 30% → 80%
마. 마크로라이드 계열
1) 에리스로마이신 (Erythromycin), 스피라마이신 (Spiramycin)
가) 시  약
① 메탄올 : HPLC용
② n-핵산 : 잔류농약 분석용
③ 수산화나트륨 (Sodiumhydroxide, NaOH),
④ 클로르포름 (Chloroform), 이산수소나트륨 (Na2HPO4), 염산 - 특급
⑤ 유도체시약 : [MSHFBA:TMS-Cl:TMS-imidazole(100:5:2, V:V:V)]
               MSHFBA : N-Methyl-N-trimethylSiylHeptaFluoroButyrAmide - 특급
               TMS - Cl(=TMCS) : TriMethylChloroSilane - 특급
               TMS-imidazole(=TMSI) : TriMethylSilylImidazole - 특급
나) 방  법
① 추  출
사료 1～5g을 칭량하여 20㎖ 메탄올을 첨가하여 30분간 초음파처리 혹은 진탕한다. 
2500～3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 취해 n-헥산 20㎖를 첨가한 후 잘 
흔들어 정치시켜 메탄올층을 취한다. 1N-수산화나트륨 2㎖와 클로르포름 30㎖를 넣고 
약 5분간 흔들어 준다. 클로르포름층을 취한 후 농축시킨 다음 다시 클로르포름 5㎖에 
녹여 정제용 시액으로 한다.168② 정  제
클로르포름 30㎖를 흘려준 sep-pak silicagel column에 시료액을 흘려주고 클로르포름 ＋
메탄올(2＋1)로 10㎖씩 3번 용출시킨다 . 용출액을 농축시킨 후 0.3N 염산 15㎖를 첨가
시켜 50℃에서 1시간동안 산가수분해한다 . 다시 냉각시켜 5N 수산화나트륨을 가하여 
염기성으로 만들고 20㎖ 클로르포름으로 추출한 후, 클로르포름층을 모아 완전히 농축
시킨다.
③ 유도체화
증발건조시킨 후 유도체시약 50㎕를 넣고 80℃에서 15분간 가열시킨다 .
다) 기기분석 예(GC-MSD)
Column : Fused silica capillary
          (cross-linked 5% phenylmethyl silicone, 17m×0.2 ㎜×0.33 ㎛)
주입부 온도 : 280℃
Transfer line 온도 : 300℃
Ion source 온도 : 200℃
Injection mode : auto sampler
Carrier gas : He(0.7 ㎖/min)
Electron energy : 70eV
Oven 온도 : 200℃-10℃/min-300 ℃(3min)
※ 내부표준물질은 cholesteryl isobutyrate m/z 368 ion을 사용
바. 폴리에텔계열
1) 라살로시드 나트륨
가) 시약 및 시액
① 표준원액 : 상용표준 라살로시드 나트륨 10mg을 정확히 칭량하여 100㎖ 메스플라스
크에 넣어서 메탄올을 가해서 용해, 표선을 맞추어 라살로시드 나트륨 표준용액을 제
조한다. 사용할 때 메탄올로 희석하여 사용한다.
② 인산완충액 : 인산칼륨 2.72g을 물에 녹여 1l로 하고, 인산으로 pH를 3으로 조정한다.
③ 기타시약 : HPLC 급
나) 추출10장. 동물용의약품
169시료 2-10g을 측량해서 100㎖ 삼각플라스크에 넣고, 메탄올 100㎖를 첨가, 진탕 추출하
고, 3000rpm에서 10분간 원심분리한다 . 상층액을 0.22㎛ 멤브레인 필터로 여과하고 그 
여과액을 시료액으로 한다.
다) 측정
측정기기 : 고속액체크로마토그래피 (Agilent 1100 series)
검출기 : 형광검출기 (FLD, 여기파장: 310nm, 형광파장:420nm)
컬 럼 : C18(150 ㎜×4.6㎜. 5㎛)
이동상 : 메탄올-0.02M 인산완충액 (pH3)=9-1
유  속 : 1.0㎖/min
칼럼온도 : 40℃
2) 나라신, 살리노마이신 , 모넨신나트륨 , 샘두라마이신
가) 시약 및 시액
① 표준원액 : 각각의 상용표준품 10mg을 정확히 칭량하여 100㎖ 메스플라스크에 넣어
서 메탄올을 가해서 용해, 표선을 맞추어 표준용액으로 한다.. 사용할 때 메탄
올:dw(9:1)로 희석하여 사용한다.
② 반응액 : 황산 10㎖를 메탄올 475㎖에 저으면서 조금씩 첨가한 후, 바닐린 15g을 첨
가해 녹인다.
③ 기타시약 : HPLC 급
나) 추출
시료 10g을 측량해서 100㎖ 삼각플라스크에 넣고, 메탄올:dw(9:1) 100㎖를 첨가, 20분간 
진탕 추출하고, 3000rpm에서 10분간 원심분리한다 . 상층액을 0.22㎛ 멤브레인 필터로 
여과하고 그 여과액을 시료액으로 한다.
다) 기기분석 조건(예)
측정기기 : 고속액체크로마토그래피 (Agilent 1100 series)
포스트칼럼유도체화기 (Pickering520X system)
검출기 : 자외가시흡광광도 검출기(DAD, 520nm)
컬  럼 : C18(150 ㎜×4.6㎜. 5㎛)170이동상 : 메탄올-DW-초산 = 940-60-1
반응액 : 메탄올-황산-바닐린 = 950-20-30
반응조 온도 : 95℃
유  속 : 이동상-0.6㎖/min, 반응액-0.6㎖/min
칼럼온도 : 40℃
사. 기 타
1) 카바독스(Carbadox)
가) 시  약
① 아세토니트릴 , 메탄올 : HPLC용, 헥산 : 잔류농약분석용
② 무수탄산칼륨 , 디메틸포름아미드 : 특급
③ 표준액 조제 : 100㎎ 표준품을 소량 디메틸포름아미드에 녹인 후 메탄올을 가해 100
㎖로 한다. 이액 적당량을 취하여 메탄올로 희석하여 사용한다.
나) 방  법
사료 10g을 취하여 아세토니트릴 100㎖를 가하여 20분간 가끔 흔들어 주면서 초음파처
리 한다. 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 플라스크에 상등액을 취한다. 다시 50㎖ 
아세토니트릴을 똑같이 조작하여 플라스크에 합한다. 여기에 무수탄산칼륨 20g을 가하
여 흔들어 섞은 다음 1분간 정치 후 유리여과기 (11G4)로 여과하여 분액여두에 받는다. 
헥산 100㎖를 가하여 5분간 진탕한 후 정치하여 아세토니트릴층을 농축용 플라스크에 
취해 수욕조 40℃에서 증발농축시킨다 . 잔류물을 메탄올 2㎖에 녹여 0.45㎛ 멤브레인필
터로 여과 후 HPLC 시액으로 한다.
다) HPLC 조건 (예)
Column : Nucleosil 10 C18(4.6×250 ㎜) 혹은 이와 동등한 것
이동상 : [메탄올 : 물(50 : 50)]
파  장 : 380㎚
유  속 : 1.0㎖/min10장. 동물용의약품
1712) 암프로리움 (Amprolium)
○ 흡광광도법
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 메탄올+증류수(2+1)
② 암프로리움표준액 : 암프로리움 25㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 
넣는다. 추출용매를 가하여 용해하고 동용매를 표선까지 가하여 암프로리움 표준용액
을 조제한다.(이 액 1㎖는 암프로리움 0.25㎎을 함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량
을 추출용매로 정확히 희석하고, 1㎖중에 25㎍을 함유하는 암프로리움 표준액을 조제
한다.
③ 염기성알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 염기성 알루미나[입경 63～200㎛(230～
70mesh) Aluminiumoxide active basic Art. 1076(Merck 제)]를 100℃에서 3시간 건조한
다.
④ 수산화나트륨 +메탄올액 : 수산화나트륨 용액(1.1W/V%) 15㎖에 메탄올을 가하여 200㎖
로 한다.
⑤ 나프탈린디올메탄올액 : 2.7-나프탈린디올 25㎎을 메탄올에 용해하여 1ℓ로 한다.
⑥ 발색시액 : 나프탈린디올메탄올액 90㎖를 250㎖의 메스플라스크에 넣고 페리시안화칼
륨용액(0.2%, W/V) 5㎖를 가하여 진탕하고, 시안화칼륨용액 (1%, W/V) 5㎖를 가하여 진
탕한 후, 30분간 정치하고, 수산화나트륨 +메탄올액 100㎖를 가하여 진탕 후, 글라스 
필터(G2)로 여과한다. 이 발색시액은 , 사용시 조제하여, 75분 이내에 사용한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 15.0g이하 (암프로리움 1.5～2.5㎎ 상당량)을 칭량하여 250㎖의 분액
여두에 넣고, 추출용매 100㎖를 가하여 1시간동안 진탕하고 추출하여 정치한 후, 
No.5A 여과지로 여과하여 칼럼크로마토그래프용 시료용액으로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 염기성 알루미나 5g을 칼럼관(내경 10㎜)에 건식충진하여 , 정제
용 칼럼을 조제한다. 시료용액 25㎖를 칼럼에 넣고, 처음의 유출액 5㎖를 버린 후의 
유출액은 측정용 시료용액으로 한다.
② 측 정 : 시료용액 4㎖를 공전원심침전관에 정확히 넣고, 발색시액 10㎖를 가하여 진
탕하고, 20분간 정치한 후, 2,000rpm에서 3분간 원심분리하고 , 즉시 상등액을 셀에 넣
고 뚜껑을 씌워 공시험용액 (추출용매 4㎖에 대하여 시료용액과 동일하게 조작한 액)을 
대조액으로 하여 파장 530㎚에서 흡광도를 측정한다. 동시에, 암프로리움 표준액 4㎖
를 공전원심침전관에 정확히 넣고, 시료원액의 경우와 동일한 조건에서 흡광도를 측
정한다.
③ 계산 : 측정된 흡광도로 시료중의 암프로리움량을 계산한다.172  
○ 고속액체크로마토그래피법 (1)
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(2＋1)
② 암프로리움 표준액 : 암프로리움 25㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크
에 넣는다. 추출용매를 가하여 용해하고 동용매를 표선까지 가하여 암프로리움 표준
용액을 조제한다.(이 액 1㎖는 암프로리움 0.25㎎을 함유) 사용시에 표준원액의 일정
량을 추출용매로 정확히 희석하고, 1㎖중에 2, 4, 6, 8, 10㎍을 함유하는 암프로리움 
표준액을 조제한다.
③ 중성알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 중성알루미나 [입경 63～200㎛(230～70mesh) : 
Aluminumoxide 90 active neutral Art.1077(Merck 제)] 100℃에서 2시간 건조한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 3～10g(암프로리움 0.4～0.8㎎상당량)을 정확히 칭량하여 200㎖의 갈
색공전삼각플라스크에 넣고, 추출용매 100㎖를 가하여 30분간 흔들면서 추출한다. 추
출액을 공전원심침전관에 넣고, 2,000rpm에서 10분간 원심분리하고 , 상등액을 칼럼크
로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 중성알루미나 10g을 칼럼관(내경 10㎜)에 건식충진하고 , 정제용 
칼럼을 조제한다. 시료용액을 칼럼에 넣고, 처음의 유출액 5㎖를 버린 후, 유출액을 
멤브레인필터 (공경 0.5㎛ 이하)로 여과하고, 고속액체크로마토그래피용 시료용액으로 
한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 암프로리움 표준액 각 20㎕를 고속액체크로
마토그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건 (HPLC)
검출기 : 자외흡광광도검출기 (측정파장 : 242㎚)
칼  럼 : μ Bondapak C18(내경 3.9㎜, 길이 300㎜, 입경 10㎛) 또는 이와 동응한 것
이동상 : HPLC용 아세토니트릴 +구연산완충액 ＊ (11＋9)
유  속 : 1.0㎖/min
＊구연산1수화물 19.2g을 증류수에 용해하여 1ℓ로 하고, 수산화나트륨용액 (40%, W/V) 
으로 pH를 3.5로 조정한 후, 도데실황산나트륨 22.2g을 가하여 용해한다.
라) 계  산 : 측정된 크로마토그램의 피크의 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고,  10장. 동물용의약품
173시료중의 암프로리움량을 계산한다.
○ 고속액체크로마토그래프법 (2)
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(2＋1)
② 암프로리움표준액 : 암프로리움 25㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 
넣는다. 추출용매를 가하여 용해하고 동용매를 표선까지 가하여 암프로리움 용액을 
조제한다.(이 액 1㎖는 암프로리움 0.25㎎을 함유) 사용시, 표준원액의 일정량을 추출
용매로 정확히 희석하고, 1㎖중에 0.1, 0.25, 0.5, 1.2㎍을 함유하는 암프로리움 표준액
을 조제한다.
③ 2-메틸-1-프로판올포화수 : 증류수 100㎖에 2-메틸-1-프로판올(형광분석용시약 ) 10㎖
를 가하여 진탕하고, 하룻밤 방치한 후, 수층을 분리한다.
④ 중성알루미나 : 칼럼크로마토용 중성알루미나 [입경 63～200㎛(230～70mesh) : 
Aluminiumoxide 90 active neutral Art. 1077 (Merck제)] 120℃에서 2시간 건조한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 20.0g을 칭량하여 200㎖의 갈색공전삼각플라스크에 넣는다. 추출용
매 100㎖를 가하여, 30분간 진탕하고 추출한다. 추출액을 갈색공전원심침전관에 넣고, 
3,000rpm으로 5분간 원심분리하고 , 상등액을 칼럼크로마토그래피에 제공할 시료용액
으로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 중성알루미나 10g을 칼럼관(내경 10㎜)에 건식충전하고 , 정제용
칼럼을 조제한다. 시료용액을 칼럼에 넣고, 처음의 용출액 5㎖를 버린 후, 유출액을 
형광화용 시료용액으로 한다.
② 형광화 : 시료용액 10㎖를 50㎖의 플라스크에 정확히 넣는다. 40～60℃의 수욕조에서 
약 1㎖까지 감압 농축한 후, 질소가스로 건고한다. 잔류물을 10㎖의 눈금부착 공전 원
심침전관에 증류수로 세척하면서 , 증류수를 가하여 5㎖로 한 후, 메탄올 0.5㎖를 정확
히 가한다. 그리고, 수산화나트륨용액 (30%, W/V) 1㎖ 및 페리시안화칼륨용액 (2%, W/V) 
0.5㎖를 가하여 혼합하고, 10분간 방치한다. 그 다음, 형광분석용 2-메틸-1-프로판올 1
㎖를 가하여 5분간 흔든 후, 3,000rpm에서 3분간 원심분리하고 , 2-메틸-1-프로판올층
(상층)을 별개의 공전원심 침전관 넣고, 2-메틸-1-프로판올포화수 1㎖를 정확히 가하
여, 약 5분간 진탕한 후, 3000rpm에서 5분간 원심분리한다 . 2-메틸-1-프로판올층을 고
속액체크로마토그래피용 시료 용액으로 한다. 동시에 각 암프로리움 표준액 1㎖를 각
각 10㎖의 눈금 부착 공전원심 침전관에 넣고, 증류수를 가하여 5㎖로 한후, 시료용액174과 동일하게 조작하고, 고속액체크로마토그래피용 각 암프로리움 표준액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 암프로리움 표준액 각 20㎕를 고속액체크로
마토그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건(HPLC)
검출기 : 형광검출기 (여기파장 : 400㎚, 형광파장 : 440㎚)
칼  럼 : YMC A-312(내경 6㎜, 길이 150㎜, 입경 5㎛) 또는 이것과 동등한 것.
이동상 : HPLC용 인산완충액 ＊＋증류수 ＋아세트니트릴 (3＋2＋1), 인산(1＋1,000)으로 
pH를 4.0으로 조정한다.
유  속 : 0.7㎖/min
칼럼온도 : 40℃
＊ 인산2수소나트륨용액 (인산2수소나트륨 2수화물 7.8g을 증류수에 용해하여 1ℓ로 한다)
 인산2수소칼륨용액 (인산2수소칼륨 6.8g을 증류수에 용해하여 1ℓ로 한다) (2＋1)
라) 계 산 : 측정된 크로마토그람의 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시
료중의 암프로리움량을 산출한다.
3) 오라퀸독스 (Olaquindox)
○ 고속액체크로마토그래프법 (1)
가) 시액의 조제
① 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(7＋3)
② 오라퀸독스 표준액 : 오라퀸독스 50㎎을 정확히 칭량하여 250㎖ 갈색메스플라스크에 
넣는다. 추출용매를 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 오라퀸독스 표준액
을 조제한다.(이 액 1㎖는 오라퀸독스 0.2㎎을 함유한다)
* 사용시, 표준원액의 일정량을 추출용매로 정확히 희석하고, 1㎖중에 1, 2, 4, 6㎍을 함
유하는 각 오라퀸독스 표준액을 조제한다.
③ 중성알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 중성알루미나 [입경 63～200㎛(230～70 mesh) : 
Aluminiumoxide 90 active neutral Art. 1077(Merck 제)]를 100℃에서 2시간 건조한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 10.0～20.0g을 칭량하여 200㎖의 갈색공전삼각플라스크에 넣는다. 10장. 동물용의약품
175추출용매 100㎖를 가하여 30분간 진탕하고 추출한다. 추출액을 갈색공전원심침전관에 
넣고, 2,000rpm에서 5분간 원심분리하고 , 상등액을 칼럼크로마토그래피용 시료용액으
로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 중성알루미나 5g을 칼럼관(내경 10㎜)에 건식충진 하고, 정제용 
칼럼을 조제한다. 시료용액을 칼럼에 넣고, 처음의 유출액 3㎖를 버린 후, 유출액을 
멤브레인필터 (공경 0.5㎛이하)로 여과하고, 고속액체크로마토그래피용 시료용액으로 한
다.
* 고속액체크로마토그래프 : 시료용액 및 오라퀸독스표준액 각 20㎕를 고속액체크로마토
그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건(예)
검출기 : 자외선흡광광도검출기 (측정파장 : 380㎚)
칼  럼 : Shodex ODS pak F-411(내경 4㎜, 길이 150㎜, 입경 5㎛) 또는 이것과 동등한 
것
용리액 : HPLC용 증류수 ＋HPLC용 메탄올(7＋3)
유  속 : 0.7㎖/min
라) 계  산 : 측정된크로마토그램의 피크높이 또는 면적을 구하는 검량선을 작성하고, 시
료중의 오라퀸독스량을 산출한다.
○ 고속액체크로마토그래프법 (2)
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(7＋3)
② 오라퀸독스 표준액 : 오라퀸독 50㎎을 정확히 칭량하여 250㎖ 갈색메스플라스크에 넣
고, 용출용매를 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 오라퀸독스 표준원액을 
조제한다.(이 액 1㎖는 오라퀸독스 0.2㎎을 함유) 사용시, 표준원액의 일정량을 추출용
매로 정확히 희석하고, 1㎖중에 0.05, 0.1, 0.2, 0.4㎍을 함유하는 각 오라퀸 표준액을 
조제한다.
③ 중성알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 중성알루미나 [입경 63～200㎛(230～70 mesh) : 
Aluminiumoxide 90 active neutral Art. 1077]를 100℃로 2시간 건조한다.
나) 정  량176① 추출 : 분석시료 10～20g을 칭량하여 200㎖의 갈색삼각공전플라스크에 넣는다. 추출
용매 100㎖를 가하여 30분간 진탕하고 추출한다. 갈색공전원심침전관에 넣고, 
2000rpm에서 5분간 원심분리하고 상등액을 칼럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 중성알루미나 5g을 칼럼관(내경 10㎜)에 건식충진하고 , 정제용칼
럼을 조제한다. 시료용액을 칼럼에 넣고, 처음의 유출액 3㎖를 버린 후, 유출액 2㎖를 
멤브레인필터 (공경 0.5㎜이하)로 여과하고, 고속액체크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 오라퀸독스표준액 각 20㎕를 고속액체크로마토
그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건 (예)
검출기 : 자외흡광광도검출기 (측정파장 : 380㎚)
칼  럼 : Shodex ODS pak F-411(내경 4㎜, 길이 150㎜, 입경 5㎛)또는 이것과 동등한 
것.
용리액 : HPLC용 증류수 ＋메탄올(7＋3)
유  속 : 0.7㎖/min
계  산 : 측정된 크로마토그람의 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시
료중의 오라퀸독스량을 산출한다.
4) 크로피돌(Clopidol)
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 메탄올+암모니아수 (24+1)
② 크로피돌 표준액 : 크로피돌 0.1g을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라스크에 넣
는다. 추출용매를 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 크로피돌 표준원액을 
조제한다.(이 액 1㎖는 크로피돌 1㎎을 함유한다) 사용시 표준원액의 일정량을 메탄올
로 정확히 희석하고, 1㎖ 중에 10, 15, 20, 25㎍을 함유하는 각 크로피돌 표준액을 조
제한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 10.0～20.0g(크로피돌 1.6～2.5㎎상당량)을 칭량하여 200㎖의 갈색공
전삼각플라스크에 넣는다. 추출용매 100㎖를 가하여 10분간 진탕하고 추출한다. 상등
액을 공전원심침전관에 넣고 3,000rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 다시 멤브
레인필터(공경 0.5㎛이하)로 여과하여 고속액체크로마토그래프용 시료용액으로 한다.10장. 동물용의약품
177* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 크로피돌 표준액 각 20㎕를 고속액체크로마토
그래프에 주입하고 크로마토그람을 측정한다.
다) 측정조건(예)
검출기 : 자외선흡광광도검출기 (측정파장 : 260㎚)
칼  럼 : Lichrosorb NH2(내경 4㎜, 길이 150㎜, 입경 10㎛)
이동상 : HPLC용 아세토니트릴 +증류수(49+1)
유  량 : 2㎖/min
계  산 : 측정된 크로마토그램의 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시료
중의 크로피돌량을 산출한다.
    
5) 데콕퀴네이트 (Decoquinate)
○ 형광광도법
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 염화칼슘 10g을 메탄올에 용해하여 1ℓ로 한다.
② 데콕퀴네이트 표준액 : 데콕퀴네이트 30㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라
스크에 넣는다. 추출용매를 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 데콕퀴네이트 
표준원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 데콕퀴네이트 0.3㎎을 함유) 사용시, 표준원액의 일
정량을 추출용매로 정확히 희석하고 1㎖중에 6㎍을 함유하는 데콕퀴네이트 표준액을 
조제한다.
③ 규산마그네슘 : 합성규산마그네슘 [입경 74～149㎛(200～100 mesh)]을 120℃에서 3시간 
건조한다.
나) 정  량
① 추출 : 분석시료 10.0g을 칭량하여 100㎖의 공전삼각플라스크에 넣는다. 추출용매 50
㎖를 가하여, 20분간 진탕하고 추출한 후, 공전원심침전관에 넣고 2,000rpm에서 5분간 
원심분리하고 , 상등액을 추출액으로 한다. 추출액 10㎖ 및 클로르포름 10㎖를 각각 
200㎖의 분액여두에 정확히 넣는다. 염산(1+9) 100㎖를 가하여 진탕한 후, 15분간 정
치한 후 클로르포름 (하층)을 공전시험관에 넣고, 적당량의 황산나트륨 (무수)을 가하여 
탈수하고, 칼럼크로마토그래프용 시료용액으로 한다. 동시에 데콕퀴네이트 표준액 10
㎖를 200㎖의 분액여두에 정확히 넣고, 추출액의 경우와 동일하게 조작하여 칼럼크로
마토그래피용 표준액으로 한다.178* 칼럼크로마토그래피 : 규산마그네슘 각 0.5g을 3본의 칼럼관(내경 7㎜)에 각각 건식충
진하고 황산나트륨 (무수) 각 0.2g을 충진하여 칼럼을 조제한다. 시료용액 5㎖를 제 1
의 칼럼에 정확히 넣고, 표준액 5㎖를 제 2의 칼럼에 정확히 넣은 후 클로르포름 5㎖
를 제 3의 칼럼에 넣는다. 칼럼의 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 
유출시킨 후 각각의 칼럼에 메탄올 각 10㎖를 가하여 동일하게 유출시킨다 . 20㎖의 
시험관을 칼럼의 아래에 두고 제1 및 제2의 칼럼에 추출용매 각 15㎖를 가하여 데콕
퀴네이트를 용출시켜 측정용 시료용액 및 표준액으로 한다. 동시에 제3의 칼럼에 대
하여 동일하게  조작하여 공시험 액으로 한다.
② 측정 : 시료용액, 표준액 및 공시험액에 대해서 여기파장 330㎚ 및 형광파장 390㎚에
서 형광광도를 측정한다.
③ 계산 : 측정된 형광광도에서 시료중의 데콕퀴네이트량을 산출한다.
○ 고속액체크로마토그래프법 (1)
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 메탄올 + 클로르포름 (9+1)
② 데콕퀴네이트 표준액 : 데콕퀴네이트 30㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라
스크에 넣는다. 추출용매를 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 데콕퀴네이트 
표준원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 데콕퀴네이트 0.3㎎을 함유) 사용시 표준원액의 일
정량을 추출용매로 정확히 희석하고 1㎖에 1, 2, 4, 6㎍을 함유하는 데콕퀴네이트 표
준액을 조제한다.
나) 정  량 
① 추 출 : 분석시료 5.0～20.0g(데콕퀴네이트 0.2～0.8㎎상당량)을 칭량하여 200㎖의 공전
삼각플라스크에 넣는다. 추출용매 100㎖를 가한다. 40분간 진탕하고 추출한 후 공전원
심침전관에 넣고 3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 , 상등액을 멤브레인필터 (공경 0.5
㎛이하)로 여과하여, 고속액체크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 데콕퀴네이트 표준액 각 20㎕를 고속액체크
로마토그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건 (예)
검출기 : 형광검출기 (여기파장: 326㎚, 형광파장 : 384㎚)
칼  럼 :  C18 (내경 3.9㎜, 길이 300㎜, 입경 10㎛)
이동상 : HPLC용 염화칼슘 0.1g을 메탄올+증류수(9+1)에 용해하여 1ℓ로 한다.
유  량 : 1.0㎖/min10장. 동물용의약품
179계  산 : 측정된 크로마토그람의 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고 시
료 중의 데콕퀴네이트량을 산출한다.
○ 고속액체크로마토그래프법 (2)
가) 시약의 조제
① 염화칼슘+메탄올액 : 염화칼슘 10g을 메탄올에 용해하여 1ℓ로 한다.
② 데콕퀴네이트 표준액 : 데콕퀴네이트 40㎎을 정확히 칭량하여 100㎖의 갈색메스플라
스크에 넣는다. 염화칼슘 ＋메탄올액을 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 데
콕퀴네이트 표준원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 데콕퀴네이트 0.4㎎을 함유한다) 사용
시 표준원액의 일정량을 메탄올로 정확히 희석하고 1㎖중에 0.025, 0.05, 0.2, 0.3, 0.4
㎍을 함유하는 각 데콕퀴네이트 표준액을 조제한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 50g을 칭량하여 300㎖ 공전삼각플라스크에 넣는다. 클로르포름 200
㎖를 가하여 20분간 진탕하고 추출한다. 추출액을 적당량의 황산나트륨 (무수)을 넣은 
NO.2S 분액여과지 (동양여과지 )로 여과하고 카트리지칼럼크로마토그래피용 시료용액으
로 한다.
* 카트리지칼럼크로마토그래피 : 실리카겔카트리지 [SEP-PAK silica cartridge (Waters제)]
를 주사기에 연결하고 클로르포름 10㎖로 세정한다. 시료용액 10㎖를 주사기에 정확
히 넣고 유속 2～5㎖/min로 압주하여 유출시킨다 . 용기를 클로르포름 10㎖로 세정하
고, 동일하게 조작한다. 10㎖의 갈색메스플라스크를 실리카겔카트리지의 아래에 두고, 
데콕퀴네이트를 메탄올 8㎖로 유속 2～5㎖/min로 압주하여 용출시킨다 . 메탄올을 갈
색메스플라스크의 표선까지 가하고 멤브레인필터 (공경 0.5㎛이하)로 여과하여 고속액
체크로마토그래프용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 데콕퀴네이트 표준액 각 20㎕를 고속액체크
로마토그래프에 주입하고 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건 (예)
검출기 : 형광검출기 (여기파장 : 326㎚, 형광파장 : 384㎚)
칼  럼 : Wakpsil 5 C18 Hg(내경 4.6㎜, 길이 250㎜, 입경 5㎛)또는 이것과 동등한 것.
용리액 : HPLC용 염화칼슘 1.0g을 메탄올 ＋증류수(4＋1)에 용해하여 1ℓ로 한다.
유  속 : 1.0㎖/min
칼럼조 온도 : 40℃180계  산 : 측정된 크로마토그램의 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고, 시
료중의 데콕퀴네이트량을 산출한다.
6) 염산로베니딘 (Robenidine)
가) 시약의 조제
① 추출용매 : 염산 8.3㎖에 아세톤을 가하여 1ℓ로 한다.(사용시 조제한다)
② 염산로베니딘표준액 : 염산로베니딘 0.1g을 정확히 칭량하여 250㎖의 갈색 메스플라
스크에 넣는다. 적당량의 메탄올을 가하여, 50℃의 수욕조에서 가열하면서 용해하여, 
방냉한 후, 동용매를 표선까지 가하여 염산로베니딘 표준원액을 조제한다.(이 액 1㎖
는 염산로베니딘 0.4㎎을 함유) 사용시 표준원액의 일정량을 추출용매로 정확히 희석
하여 1㎖에 2, 4, 8, 16㎍을 함유하는 각 염산로베니딘 표준액을 조제한다.
③ 세정용매 : 2-메톡시에탄올 100㎖에 아세토니트릴을 가하여 1ℓ로 한다.
④ 용출용매 : 암모니아수 40㎖에 세정용매를 가하여 1ℓ로 한다.
⑤ 트리클로로초산용액 : 트리클로로초산 2g에 세정용매 4㎖를 가하여 진탕한다.
⑥ 수산화칼륨시액 : 수산화칼륨 3g에 에탄올 100㎖를 가하여 진탕하고 상등액을 사용한
다.
⑦ 염기성알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 염기성알루미나 [입경 53～210㎛(270～
65mesh): Alumina Welm B Art. 1. 2069(Welm parma제)]를 105℃에서 3시간 건조한다. 
사용시 조제한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 50g을 칭량하여 1ℓ의 분액여두에 넣는다. 추출용매 400㎖를 가하
여, 1시간 진탕하여 추출하고, 5분간 정치한 후, NO.5A 여과지로 여과하고, 칼럼크로
마토그래프용 시료용액으로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 염기성 알루미나 13g을 칼럼관(내경 13㎜)에 건식충진하고 칼럼
을 조제한다. 시료용액 5㎖를 칼럼에 넣고 액면이 충진제의 상면에서 3㎜높이가 될 
때까지 유출시킨 후, 세정용매 10㎖ 및 5㎖를 순차적으로 칼럼에 가하여 동일하게 유
출시킨다. 50㎖의 갈색메스플라스크를 칼럼의 아래에 놓고 용출용매 20㎖를 칼럼에 
정확히 가하여, 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이에 도달할 때까지 유출시킨 후, 
용출용매 10㎖를 칼럼에 정확히 가하여 염산로베니딘을 용출시켜 시료용액으로 한다.
② 측  정 : 시료용액을 진탕한 후, 수산화칼륨시액 1㎖를 가하여 진탕하고, 즉시 이 액
을 셀에 넣고 뚜껑을 씌워, 용출용매를 대조액으로 하여 파장 440㎚ 및 550㎚의 흡광
도를 측정하고, 440㎚의 흡광도에서 550㎚의 흡광도를 빼서 흡광도(A)를 구한다. 다음
에 이 셀에 트리클로로초산용액 3방울을 가하여 뚜껑을 씌워서 흔들어 퇴색시킨 후 10장. 동물용의약품
181동일하게 조작하여 흡광도(B)를 구하고, 흡광도(A)에서 흡광도(B)를 빼서 흡광도(C)를 
구한다. 동시에 각 염산로베니딘 표중액 5㎖를 정확히 추출액의 경우와 동일한 조건
에서 조작하여 흡광도(D)를 구한다.
다) 계 산
측정된 흡광도(D)에서 검량선을 작성하고 시료중의 염산로베니딘 량을 산출한다.
7) 구연산모란텔 (Morantelcitrate)
○ 고속액체크로마토그래피법 (1)
가) 시약의 조제
① 구연산모란텔 표준액 : 구연산모란텔 25㎎을 정확히 칭량하여 250㎖의 갈색메스플라
스크에 넣는다. 메탄올을 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 구연산모란텔 
표준원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 구연산모란텔 0.1㎎을 함유한다) 사용시 표준원액
의 일정량을 메탄올로 정확히 희석하고, 1㎖중에 0.05, 0.1, 0.25, 0.5㎍을 함유하는 각 
구연산 모란텔 표준액을 조제한다.
②염기성 알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 염기성 알루미나[입경 63～200㎛(230～
70mesh) : Aluminiumoxide 90 active basic Art. 1076 (Merck제)]를 130℃에서 2시간 건
조한다.
나) 정량
① 추 출 : 분석시료 10.0g을 칭량하여 200㎖의 갈색공전플라스크에 넣는다. 메탄올 100
㎖를 가하여 30분간 진탕하고 추출한다. 추출액을 갈색공전원심침전관에 넣고, 
3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 , 상등액을 칼럼크로마토그래피용 시료용액으로 한
다.
* 칼럼크로마토그래피 : 염기성알루미나 5g을 칼럼관(내경 100㎜)에 건식충진하고 정제용 
칼럼을 조제한다. 시료용액을 칼럼에 넣고, 처음의 유출액 5㎖를 버린 후, 유출액 5㎖
를 구연산모란텔의 흡착성이 없는 멤브레인필터 (공경 0.5㎛이하)로 여과하고, 고속액
체크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 구연산모란텔 표준액 각 20㎕를 고속액체크
로마토그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건 (예)182검출기 : 자외선흡광광도검출기 (측정파장 : 300㎚)
칼 럼 : Shodex C18-5B(내경 4.6㎜, 길이 250㎜, 입경 5㎛)또는 이것과 동등한 것.
용리액 : HPLC용 인산완충액 ＋아세토니트릴 (4＋1)
유  속 : 1.0㎖/min
칼럼조 온도 : 40℃
계  산 : 측정된 크로마토그램의 피크면적을 구해 검량선을 작성하고, 시료중의 구연산
모란텔량을 산출한다.
○ 고속액체크로마토그래프법 (2)
가) 시약의 조제
① 구연산모란텔표준액 : 구연산모란텔 25㎎을 정확히 칭량하여 250㎖의 갈색메스플라스
크에 넣는다. 메탄올을 가하여 용해하고, 동용매를 표선까지 가하여 구연산모란텔
표준원액을 조제한다.(이 액 1㎖는 구연산모란텔 0.1㎎을 함유) 사용시, 표준원액의 일
정량을 메탄올로 정확히 희석하고 1㎖중에 0.05, 0.1, 0.25, 0.5㎍을 함유하는 각 구연
산 모란텔표준액을 조제한다.
② 염기성 알루미나 : 칼럼크로마토그래프용 염기성알루미나 [입경 63～200㎛(230～
70mesh): Aluminiumoxide 90 active basic Art. 1076(Merck 제)]를 130℃에서 2시간 건조
한다.
③ 탄산완충액 : 탄산수소나트륨 7.6g 및 탄산나트륨 0.5g을 증류수에 용해하여 1ℓ로 하
고 수산화나트륨 용액(4.2%, W/V)으로 pH를 9.0으로 조정한다.
나) 정  량
① 추출 : 분석시료 10.0g을 칭량하여 200㎖의 갈색공전삼각플라스크에 넣는다. 메탄올 
100㎖를 가하여 30분간 진탕하고 추출한다. 추출액을 갈색공전원심침전관에 넣고, 
3,000rpm에서 5분간 원심분리하고 , 상등액을 칼럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 칼럼크로마토그래피 : 염기성알루미나 5g을 칼럼관(내경 10㎜)에 건식 충진하고 정제용 
칼럼을 조제한다. 시료용액을 칼럼에 넣고 처음의 5㎖를 버린 후 유출액 10㎖를 50㎖
의 증발플라스크에 정확히 넣고 50℃의 수욕조에서 감압 건고한다. 잔류물을 메탄올 ＋
탄산완충액 (1＋1) 5㎖에 용해하고, 카트리지칼럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 카트리지칼럼크로마토그래피 : C18 카트리지[SEP-PAK C18 CARTRIDGE (Waters제)]를 
주사통에 연결하고 메탄올 10㎖, 증류수 10㎖ 및 탄산완충액 10㎖로 순차적으로 세정
한다. 시료용액을 주사통에 넣고 유속 약 2㎖/min로 압주하여 유출시킨 후 용기를 메
탄올+탄산완충액 (1+1) 5㎖로 세정하고, 동일하게 조작한다. 50㎖의 증발플라스크를 C18 
카트리지의 아래에 놓고 구연산모란텔을 메탄올 ＋초산(200＋1) 10㎖를 유속 약 2㎖/min10장. 동물용의약품
183로 압주하여 용출시킨다 . 용출액을 50℃의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압농축
한 후 질소가스로 건고한다. 메탄올 2㎖를 증발플라스크에 정확히 가하여 잔류물을 용
해한 후 구연산모란텔의 흡착성이 없는 멤브레인필터 (공경 0.5㎛이하)로 여과하여 고속
액체크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 구연산모란텔 표준액 각 20㎕를 액체크로마
토그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
② 계산 : 측정된 크로마토그램의 피크면적을 구해 검량선을 작성하고, 시료중의 구연산
모란텔량을 산출한다.
8) 할로푸지논 (Halofuginone)
○ 고속액체크로마토그래프법 (1)
가) 시약의 조제
① 취화수소산할로푸지논 표준액 : 취화수소산할로푸지논 20㎎을 정확히 칭량하여 200㎖
의 메스플라스크에 넣는다. 염산(1＋100)을 가하여 용해하고 표선까지 동액을 가하여 
취화수소산할로푸지논 표준액을 조제한다.(이 액 1㎖는 취화수소산할로푸지논으로써 
0.1㎎을 함유한다) 사용시 표준원액의 일정량을 염산(1＋100)으로 정확히 희석하여 1
㎖중에 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2㎍을 함유하는 각 취화수소산할로푸지논 표준액을 조제한다.
나) 정  량
① 추 출 : 분석시료 5g을 칭량하여 50㎖의 공전원심침전관에 넣는다. 초산에틸 20㎖ 및 
탄산나트륨 (1%, W/V)용액 10㎖를 가하여 15분간 진탕한 후 3,000rpm에서 10분간 원심
분리하고 초산에틸층 (상층)을 300㎖의 분액여두에 넣는다. 잔류물에 초산에틸 20㎖를 
가하여 동일한 조작을 하고 초산에틸층을 그 분액여두에 가한다. 그리고 이 조작을 4
회 반복하여 초산에틸층을 그 분액여두에 가하여 정제용 시료용액으로 한다.
② 정 제 : 시료용액에 염산(1＋100) 10㎖를 가하여 5분간 진탕하고 정치한 후 염산층(하
층)을 200㎖의 플라스크에 넣는다. 잔류액에 염산(1+100) 10㎖를 가하여 동일하게 조
작하고, 염산층을 증발플라스크에 가하여 50℃의 수욕조에서 5㎖가 될 때까지 감압 
농축한 후, 20㎖의 메스플라스크에 넣고 소량의 염산(1+100)으로 용기를 세정하고, 세
정액을 그 메스플라스크에 가하여 표선까지 동액을 가하고 멤브레인필터 (공경 0.5㎛이
하)로 여과하고 고속액체크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 취화수소산할로푸지논 표준액 각 20㎕를 고184속액체크로마토그래프에 주입하고, 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건 (예)
검출기 : 자외선흡광광도검출기 (측정파장 : 243㎚)
칼 럼 : Wakosil 5 C18-200(내경 4.6㎜, 길이 250㎜, 입경 5㎛) 또는 이것과 동등한  것. 
칼럼온도 : 40℃
용 리 액 : HPLC용 초산완충액 + 메탄올(11+9)
유    속 : 1.0㎖/min
라) 계   산 : 측정된 크로마토그램의 피크높이 또는 면적을 구하고 다음 식으로 시료 중
의 할로푸지논폴리스틸렌설폰산칼슘량을 산출한다.
* 시료중의 할로푸지논폴리스틸렌설폰산칼슘량 (g/t)= A×20/8.5
A : 검량선에서 구한 취화수소산할로푸지논의 중량(ng)
○ 고속액체크로마토그래프법 (2)
가) 시약의 조제
① 취화수소산할로푸지논 표준액 : 취화수소산할로푸지논 20㎎을 정확히 칭량하여 200㎖ 
메스플라스크에 넣는다. 염산(1＋100)을 가하여 용해하고, 표선까지 동액을 가하여, 취
화수소산할로푸지논 표준액을 조제한다.(이 액 1㎖는 취화수소산할로푸지논 0.1㎎을 
함유한다) 사용시, 표준원액의 일정량을 염산(1＋100)으로 정확히 희석하고 1㎖중에 
0.1, 0.2, 0.4, 0.8㎍을 함유하는 각 취화수소산할로푸지논 표준액을 조제한다.
② 초산완충액 : 초산암모니움 4.9g 및 초산 7.5㎖를 증류수로 용해하여 1ℓ로 하고, 초
산으로 pH를 4.3으로 조정한다.
나) 정  량
① 추출 : 분석시료 5g을 정확히 칭량하여 50㎖의 공전원심침전관에 넣는다. 초산에틸 
20㎖ 및 탄산나트륨 (1%, W/V)용액 10㎖를 가하여 15분간 진탕 후, 3,000rpm에서 10분
간 원심분리하고 초산에틸층 (상층)을 300㎖의 분액여두에 넣는다. 잔류물에 초산에틸 
20㎖를 가하여 동일한 조작을 하고 초산에틸층을 그 분액여두에 가한다. 그리고 이 
조작을 4회 반복하여 초산에틸층을 분액여두에 가하여 정제용 시료용액으로 한다.
② 정제 : 시료용액을 넣은 분액여두에 염산용액(1＋100) 10㎖를 가하고, 5분간 진탕하고 
정치한 후 수층(하층)을 100㎖ 증발플라스크에 넣는다. 염산용액(1＋100) 10㎖를 분액
여두에 가하고 동일하게 조작한다. 수층을 50℃의 수욕조에서 5㎖정도가 될 때까지 10장. 동물용의약품
185감압 농축하고 카트리지 칼럼크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 카트리지칼럼크로마토그래피 : C18 카트리지[메가본드엘드 C18카트리지, 충진량 1g, 리
자바 용량 6㎖(Varian Associates 제)]를 메탄올 10㎖ 및 증류수 10㎖로 순차적으로 세
정한다. 시료용액을 칼럼에 넣고, 액면이 충진제의 상면에서 1㎜의 높이가 될 때까지 
유출시킨 후, 증류수 5㎖로 용기를 2회 세정하고 동일하게 조작한다. 칼럼을 증류수 5
㎖로 1회, 메탄올 ＋증류수(3＋2) 각 5㎖로 2회 및 염산(1＋100) 각 5㎖로 4회 세정한
다. 50㎖의 증발플라스크를 칼럼의 아래에 두고, 할로푸지논을 메탄올 ＋클로르포름 (9
＋1) 10㎖로 용출시킨다 . 용출액을 50℃의 수욕조에서 대부분 건고될 때까지 감압 농
축한 후 질소가스로 건고한다. 증류수 ＋아세토니트릴 ＋초산완충액 (62＋23＋15) 1㎖를 
증발플라스크에 정확히 가하여, 잔류물을 용해한 후 멤브레인필터 (공경 0.5㎛이하)로 
여과하고, 고속액체크로마토그래피용 시료용액으로 한다.
* 고속액체크로마토그래피 : 시료용액 및 각 취화수소산할로푸지논표준액 각 20㎕를 고
속액체크로마토그래프에 주입하고 크로마토그램을 측정한다.
다) 측정조건(예)
검출기 : 자외흡광광도검출기 (측정파장 : 243㎚)
칼 럼 : μBondapak C18 (내경 3.9㎜, 길이 300㎜, 입경 10㎛)또는 이것과 동등한 것.
용리액 : 증류수+아세토니트릴 +초산완충액 (62+23+15)
유  량 : 1.0㎖/min
칼럼조온도 : 40℃
계   산 : 측정된 크로마토그람의 피크높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성하고 다
음식으로 시료중의 할로푸지논폴리스틸렌설폰산칼슘량을 산출한다.  
      * 시료중의 할로푸지논폴리스틸렌설폰산칼슘량 (g/t)
                 = A × 1/ 8.5
       A : 검량선에서 구한 취화수소산할로푸지논의 중량 (ng) 
9) 죠렌(Zoalene), 디니톨마이드 (Dinitolmide)
가) 시  약
① 아세토니트릴 , n-핵산, 아세톤, 클로르포름 (Chloroform), 무수황산나트륨 (Sodium 
sulfate, anhydrous) : 이상 특급
② 5% 염화나트륨 용액
③ Florisil column : 140℃에서 12시간 활성시킨 10g을 아세톤 30㎖와 잘 혼합시킨다 . 이186것을 내경 1.5～2.0㎝의 관에 충진한다.
④ 표준품 : 표준품 100㎎을 칭량하여 아세톤에 녹여 100㎖로 하고 다시 아세톤으로 적
절히 희석하여 사용한다. 
나) 방 법
사료 10g을 칭량하여 아세토니트릴 50㎖를 가하고 잘 혼합시켜 sonication, vortexing 을 
각 5분씩 한다. 3000rpm에서 10분간 원심분리 상등액을 취한다. 이 조작 2회 반복하여 
모두 합한다. 핵산 20㎖로 세정한다. 아세토니트릴층을 45℃ 수욕조에서 약 10㎖ 되게 
농축한다. 농축물을 5% 염화나트륨 용액 100㎖로 수회 씻으면서 분액여두에 넣고, 클
로르포름 50㎖씩 2회 진탕하여 추출한다. 클로르포름층을 무수황산나트륨으로 탈수한 
후 농축시킨다 . 농축물을 아세톤 10㎖에 녹여 florisil column에 흘려 넣는다. 클로르포
름 150㎖로 세정한 후 아세톤 100㎖로 용출한다. 이 용출액을 재농축하고 아세톤 2㎖
에 녹여 기기분석용 시료액으로 한다.
다) 기기조건(GC) (예)
검 출 기 : ECD
Column : 액상 OV-17을 1.5% chromosob W에 흡착시켜 2m의 유리컬럼관에 충진
컬 럼 온 도 : 270℃
검출기 온도 : 300℃
10) 오르메토프림 (Ormethoprim)
가) 시  약
① 초산에틸, 메탄올, 염화칼륨, 염화나트륨 , 과염소산, 수산화나트륨 , 탄산나트륨 , 붕산, 
무수황산나트륨 , 황산, 클로르포름 이상 특급시약
② Buffer(pH 11) : 0.1M 탄산나트륨 96.5㎖와 붕산-염화칼륨 용액(붕산 6.2g+염화칼륨 
7.45g/1 ℓ 증류수) 3.5㎖를 혼합하여 조제한다.
③ 표준액 조제 : 메탄올(HPLC용)에 희석하여 조제
④ 이동상 : 0.5% 과염소산 ＋메탄올(7＋3)
나) 방법
사료 5～10g을 conical tube에 취하여 0.2N 황산 20㎖ 및 클로르포름 15㎖를 가하여 5
분씩 초음파 처리한 후 강하게 흔들어준다 . 2500～3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 10장. 동물용의약품
187상등액을 분액여두에 취하고 잔류물은 다시 0.2N 황산 15㎖를 넣고 똑같이 조작하여 
상등액을 분액여두에 합한다. 1N 수산화나트륨용액을 가하여 pH 12가 되도록 조정한 
후 염화나트륨 5g 초산에틸 100㎖를 가하여 10분간 진탕 추출한다. 정치하여 두 층이 
분리하면 상층을 취하고 하층은 초산에틸 50㎖를 가하여 똑같이 조작한 후 앞의 상층
과 합한다. 초산에틸층을 무수황산나트륨 5g으로 탈수시켜 농축용 플라스크에 받는다. 
이 액을 농축하여 0.5% 과염소산 ＋메탄올(7＋3)용액 1㎖에 녹여 HPLC 시액으로 한다.
다) 기기분석(HPLC) (예)
Column : Nucleosil 10 C18(250×4.6 ㎜) 혹은 이와 동등한 것.
파  장 : 230㎚
이동상 : 0.5% 과염소산+메탄올(7+3)
3. 미생물평판법
가. 아연바시트라신 (Bacitracin-Zinc)[C 66H103N17O16S-Zn]
1) 시약의 조제
가) 완 충 액
3호 완충액.(pH 6.0) 인산2수소칼륨 7g과 인산수소2나트륨12수 6g을 칭량하여 증류수 
750㎖로 용해하고 pH를 5.9～6.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 1000㎖로 한다. 
나) 바시트라신 표준액
상용표준 바시트라신 적당량을 60℃, 5㎜Hg이하의 감압 조건에서 3시간 건조한 후, 40
㎎ 이상을 정확히 칭량한다. 3호 완충액을 정확히 가하고 용해하여 100IU/ ㎖의 표준원
액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 3호 완충액 ＋메탄올(3＋1)로 정확히 희석하여 
0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025IU/ ㎖의 각 표준액을 조제하여 사용한다.
다) 배지 : F-1호 배지.
펩톤 10g, 육즙 5g, 염화나트륨 2.5g, 한천 13～20g에 증류수 1000㎖를 넣는다. 121℃에
서 15분간 멸균 후, 염산(1＋11) 또는 수산화나트륨 (4.2%, W/V)으로 pH를 6.4～6.6으로 
조정한다.188라) 균액 및 첨가량
시험균 Micrococcus luteus ATCC 10240으로 10배 희석한 균액을 적당량 (배지 100㎖당 
0.1㎖정도) 첨가한다.
마) 한천평판
균액을 일단 용해하여 49～51℃로 보온한 배지에 가하여 충분히 혼합한다. 20㎖를 배
양접시(내경 90㎜, 높이 20㎜의 합성수지제 또는 경질유리제 )에 일시에 번지도록 분주
한 후 수평으로 정치하여 응고시킨다 . 평판에서 반경 25㎜의 원주상에 인접하도록 각
각 90도 간격이 되는 위치에 직경 7.9～8.1㎜의 원통컵을 올려놓는다 .
바) 추출용매 : 증류수 ＋메탄올 ＋염산(75＋77＋2)
2) 시료액의 조제
분석시료의 일정량(아연바시트라신으로써 20 IU 상당량)을 칭량한다. 200㎖의 삼각플라
스크에 넣고, 추출용매 100㎖를 가하여 20분간 진탕후 추출한다. 추출액을 100㎖의 원
심분리관에 넣고, 3000rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상등액을 No.5A 여과지로 여과한
다. 여액 25㎖를 50㎖의 비이커에 정확히 넣고, 암모니아수 ＋증류수(2＋3)로 pH 5.9～
6.1로 조정한다. 용액전량을 50㎖의 메스플라스크에 옮겨 넣고, 3호 완충액을 표선까지 
가한다. NO.5A 여과지로 여과하고, 0.1 IU/㎖의 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 표준곡선법
나. 황산콜리스틴 (Colistin-sulfate)[C 53H100N16O13-H2SO4]
1) 시약의 조제
가) 완충액 : 5호 완충액(pH 6.0)
인산2수소칼륨 80g, 인산수소2칼륨 20g을 칭량하여 증류수 750㎖로 용해하고, pH를 5.
9～6.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 1000㎖로 한다.
나) 희석용매 
① 황산콜리스틴이 10g(역가)/t이상의 경우 : 5호 완충액 - 아세톤 ＋피리딘(91＋8＋1)10장. 동물용의약품
189② 황산콜리스틴이 10g(역가)/t미만의 경우 : 5호 완충액 - 아세톤 ＋피리딘(83＋15＋2)
다) 콜리스틴 표준액
상용표준 콜리스틴 적당량을 60℃, 5㎜Hg 이하의 감압조건에서 3시간 건조한 후, 40㎎ 
이상을 정확히 칭량한다. 5호 완충액을 정확히 가하여 용해하고, 1㎎(역가)/㎖의 콜리스
틴 표준원액을 조제한다. 사용 할 때, 표준원액을 희석용매로 정확히 희석하고, 0.8, 
0.4, 0.2, 0.1, 0.05㎍(역가)/㎖의 각 표준액을 조제한다.
라) 배지 : F-9호 배지
췌소화카제인 17g, 파파인소화대두 3g, 포도당 2.5g, 염화나트륨 5g, 인산2수소칼륨 
2.5g, 계면활성제 (폴리솔베이트 80) 10g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000㎖
를 조제한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산(1+11) 또는 수산화나트륨 (4.2%, 
W/V)으로 pH를 7.2～7.4로 조정한다.
마) 균액 및 첨가량
시험균, Bordetella bronchiseptica ATCC 4617로 100배 희석한 균액을 배지 100㎖당 0.1
㎖ 정도 가한다.
바) 한천평판 : 아연바시트라신과 동일
사) 추출용매 : 증류수 ＋아세톤 ＋염산(51＋40＋9)
2) 시료액의 조제
가) 황산콜리스틴이 10g/t 이상인 경우
분석시료의 일정량(콜리스틴으로써 0.1㎎역가 상당량)을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스
크에 넣는다. 피리딘 5㎖ 및 핵산 5㎖를 가하여 2～3분간 진탕한다.
추출용매 95㎖를 가하고 20분간 진탕하여 추출한다. 추출액을 100㎖의 원심분리관에 
넣고, 3000rpm으로 5분간 원심분리한 후 증류수 ＋아세톤층(하층)을 No. 5A 여과지로 
여과한다. 여액 20㎖를 50㎖의 비이커에 정확히 넣고, 암모니아수로 pH를 5.9～6.1로 
조정한다. 용액전량을 100㎖ 메스플라스크에 옮겨 담고, 5호 완충액을 표선까지 가한 
후 No. 5A여과지로 여과하여 0.2㎍역가/㎖의 시료액을 조제한다.190나) 황산콜리스틴이 10g/t미만인 경우
분석시료의 일정량(콜리스틴으로써 50㎍역가상당량 )을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스크
에 넣는다. 피리딘 5㎖ 및 핵산 5㎖를 가하여 2～3분간 진탕한다. 추출용매 95㎖를 가
하고 20분간 진탕하여 추출한다. 추출액을 100㎖의 원심분리관에 넣고, 3000rpm으로 5
분간 원심분리한 후 증류수 + 아세톤층(하층)을 No.5A 여과지로 여과한다. 여액 20㎖를 
50㎖의 비이커에 정확히 넣고, 암모니아수로 pH를 5.9～6.1로 조정한다. 용액전량을 50
㎖ 메스플라스크에 옮겨담고 표선까지 5호 완충액을 가한 후 No.5A 여과지로 여과하
여 0.2㎍역가/㎖의 시료액을 조제한다.
3) 정량 : 표준곡선법
다. 버지니아 마이신(Virginiamycin) [M Type : C28H35N3O7, S Type : C43H49N7O10]
1) 시약의 조제
가) 완충액 : 2호 완충액(pH 6.0)
인산2수소칼륨 3.5g, 인산수소2나트륨12수 6g을 칭량하여 증류수 750㎖로 용해하고, pH 
5.9～6.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 1000㎖로 한다.
나) 버지니아마이신 표준액
상용표준 버지니아마이신 40㎎ 이상을 정확히 칭량한다. 메탄올로 용해하여 1㎎역가/㎖
의 버지니아마이신 표준원액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 2호 완충액 ＋메탄올(7
＋3)으로 정확히 희석하고, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2㎍역가/㎖의 각 표준원액을 조제한다.
다) 배지 : F-4호 배지
펩톤 6g, 육즙 1.5g, 효모 3g, 포도당 1g, 한천 13～20g 증류수 적당량으로 배지 1000㎖
를 조제한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산＋증류수(1＋1) 또는 수산화나
트륨(4.2%, W/V)으로 pH를 5.9～6.1로 조정한다.
라) 균액 및 첨가량
시험균 Micrococcus luteus ATCC 9341로 100배 희석한 균액을 배지 100㎖당 0.2㎖ 정
도 가한다.10장. 동물용의약품
191마) 한천평판 : 천공법
2) 시료액의 조제
가) 버지니아마이신이 10g역가/t이상인 경우
분석시료의 일정량(버지니아마이신으로써 0.16㎎역가 상당량)을 칭량하여 200㎖의 삼각
플라스크에 넣는다. 핵산 20㎖를 가하여 10분간 방치한다. 메탄올 ＋2호 완충액(1＋1) 
100㎖를 가하여 20분간 진탕하여 추출한다. 추출액을 100㎖의 원심분리관에 넣는다. 
3000rpm으로 5분간 원심분리한 후 증류수 ＋메탄올층(하층)을 No.6A 여과지로 여과한
다. 여액의 일정량을 2호 완충액 ＋메탄올(9＋1)로 정확히 희석하고, 0.8㎍역가/㎖의 시
료액을 조제한다.
나) 버지니아마이신이 10g역가/t미만인 경우
분석시료의 일정량(버지니아마이신으로써 40㎍역가 상당량)을 칭량하여 200㎖의 삼각
플라스크에 넣는다. 메탄올 100㎖를 가하여 20분간 진탕하고 추출한다. 추출액을 
No.6A여과지로 여과한다. 여액 20㎖를 50㎖ 농축플라스크에 정확히 넣고 50℃의 수욕
조에서 감압농축하고 핵산 5㎖를 가하여 진탕한다. 메탄올 3㎖를 정확히 가하여 잔류
물을 용해한다. 2호 완충액 7㎖를 정확히 가하여 진탕한다. 용액을 50㎖의 원심분리관
에 넣고 3000rpm으로 5분간 원심분리하고 , 증류수 ＋메탄올(하층)을 0.8㎍역가/㎖의 시
료액으로 한다.
  
3) 정  량 : 표준곡선법
라. 타이로신(Tylosin) [C46H77NO17]
1) 시약의 조제
가) 4호 완충액(pH 8.0)
인산 2수소칼륨 13.3g을 칭량하여 증류수 750㎖로 용해한다. 수산화칼륨용액 (6.6%, 
W/V) 100㎖정도를 가하여 pH를 7.9～8.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 1000㎖한다.192나) 타이로신 표준액
상용표준타이로신 적당량을 5㎜Hg, 60℃에서 3시간 건조한 후 40㎎이상을 정확히 칭량
한다. 메탄올 소량을 가하여 용해하고, 4호 완충액을 정확히 가하여 1㎎역가/㎖의 타이
로신표준액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 4호 완충액 ＋메탄올(4＋1)로 정확히 희
석하고, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2㎍역가/㎖의 각 표준액을 조제한다.
다) 배지 : F-7호 배지
펩톤 6g, 육즙 1.5g, 효모 3g, 포도당 1g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000
㎖를 조제한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산용액(1+11) 또는 염화나트륨
(4.2%, W/V)으로 pH를 7.9～8.1로 조정한다.
라) 균액 및 첨가량 
시험균, Micrococcus luteus ATCC 9341로 100배 희석한 균액을 배지 100㎖당 0.1㎖정도 
가한다.
마) 한천평판 : 아연바시트라신과 동일
2) 시료액의 조제
가) 타이로신이 40g(역가)/t이상인 경우
분석시료 일정량[타이로신으로써 0.4㎎(역가)상당량]을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스크
에 넣는다. 증류수 50㎖를 가하여 20분간 진탕한다. 메탄올 50㎖를 가하여 20분간 진탕
추출한 후, No. 5A여과지로 여과한다. 여액의 일정량을 4호 완충액 ＋메탄올(7＋1)로 정
확히 희석하고, 0.8㎍역가/㎖의 시료액을 조제한다.
나) 타이로신이 10g역가/t이상에서 40g(역가)/t미만인 경우
분석시료 일정량(타이로신으로써 0.2㎎ 역가상당량 )을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스크
에 넣는다. 증류수 50㎖를 가하여 20분간 진탕한다. 메탄올 50㎖를 가하여 20분간 진탕 
추출한 후, No. 5A 여과지로 여과한다. 여액의 일정량을 4호 완충액으로 정확히 희석
하고, 0.8㎍역가/㎖의 시료액을 조제한다.
다) 타이로신이 10g(역가)/t이하인 경우
분석시료 일정량[타이로신으로써 80㎍(역가)상당량]을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스크
에 넣는다. 증류수 50㎖를 가하여 20분간 진탕한다. 메탄올 50㎖를 가하여 20분간 진탕 10장. 동물용의약품
193추출한 후 No. 5A 여과지로 여과한다. 여액 20㎖를 50㎖ 증발플라스크에 정확히 넣는
다. 50℃ 수욕조에서 감압농축 한 후, 증류수 8㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고 
4호 완충액 + 메탄올(2+1) 12㎖를 정확히 가하여 진탕하고 0.8㎍(역가)/㎖의 시료액을 
조제한다.
3) 정  량 : 표준곡선법
마. 스피라마이신 (Spiramycin) [C43H74N2O14]
1) 시약의 조제
가) 완충액 : 4호 완충액(pH 8.0)
인산2수소칼륨 13.3g을 칭량하여 증류수 750㎖로 용해한다. 수산화칼륨용액 (6.6%, W/V) 
100㎖를 가하여 pH를 7.9～8.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 1000㎖한다.
나) 희석용매 : 4호 완충액 ＋메탄올(7＋3)
다) 스피라마이신 표준액 
상용표준 스피라마이신 40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올 소량을 가하여 용해하고, 
4호 완충액을 정확히 가하여 1㎍역가/㎖의 스피라마이신 표준원액을 조제한다. 사용할 
때. 표준액을 희석용매로 정확히 희석하고, 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1㎍/㎖의 각 표준액을 
조제한다.
라) 배지 : F-7호 배지
펩톤 6g, 육즙 1.5g, 효모 3g, 포도당 1g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000
㎖를 조제한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산＋증류수(1＋11) 또는 수산화
나트륨(4.2W/V%) 으로 pH를 5.9～6.1로 조정한다.
마) 균액 및 첨가량
시험균, Micrococcus luteus ATCC 9341로 10배 희석한 균액을 배지 100㎖당 0.2㎖정도 
가한다.
바) 한천평판 : 천공법
2) 시료액의 조제
가) 스피라마이신이 20g역가/t이상으로 모넨신나트륨을 포함하지 않는 경우194분석시료의 일정량[스피라마이신이 50g역가/t이상의 경우에는 스피라마이신으로써 0.5
㎎역가 상당량, 20g역가/t이상, 50g역가/t미만의 경우에는 0.2㎎ 역가 상당량, 20g역가/t
미만의 경우에는 50㎍역가 상당량]을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스크에 넣고, 아세톤 
100㎖를 가하여 20분간 진탕하여 추출한 후, No.6A여과지로 여과한다. 여액 24㎖를 50
㎖ 증발플라스크에 넣고 40℃의 수욕조에서 감압농축하고 희석용매 15㎖를 정확히 가
하여 잔류물을 용해한다. 핵산 5㎖를 가하여 진탕한 후 100㎖의 원심분리관에 넣고 
3000rpm에서 5분간 원심분리 한 후 증류수 ＋메탄올층(하층)의 일정량을 희석용매로 정
확히 희석하고 0.4㎍역가/㎖의 시료액을 조제한다.
나) 스피라마이신이 20g역가/t이상으로 모넨신나트륨을 포함한 경우
분석시료의 일정량[스피라마이신이 50g역가/t이상의 경우에는 스피라마이신으로써 0.5
㎎ 역가상당량 , 20g역가/t이상 50g역가/t미만의 경우에는 0.2㎎역가 상당량]을 칭량하여 
200㎖의 삼각플라스크에 넣는다. 아세톤 100㎖를 가하여 20분간 진탕하여 추출하고 
No. 6A 여과지로 여과한다. 여액 24㎖를 50㎖증발플라스크에 정확히 넣고, 40℃의 수
욕조에서 감압농축하고 희석용매 15㎖를 가하여 잔류물을 용해한다. 핵산 5㎖를 가하
여 진탕한 후, 100㎖의 공전원심분리관에 넣고 3000rpm에서 5분간 원심분리 한다. 증
류수＋메탄올층(하층) 10㎖를 20㎖의 비이커에 정확히 넣고, 염산으로 pH를 1.0이하로 
조정하여 1시간 방치한 후, 암모니아로 pH를 7.9～8.1로 조정한다. 용액전량을 50㎖의 
메스플라스크에 옮겨담고 희석용매를 표선까지 가한다. No. 5A 여과지로 여과한 후, 
여액의 일정량을 희석용매로 정확히 희석하고 0.4㎍역가/㎖의 시료액을 조제한다.
다) 스피라마이신이 20g(역가)/t미만이고 모넨신나트륨을 포함할 경우
분석시료의 일정량(스피라마이신으로써 50㎍역가 상당량)을 칭량하여 200㎖ 삼각플라
스크에 넣는다. 아세톤 100㎖를 가하고 20분간 진탕 추출하고 No. 6A 여과지로 여과한
다. 여액 24㎖를 50㎖ 증발플라스크에 정확히 넣는다. 40℃ 수욕조에서 감압농축한 후, 
희석용매 15㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해한다. 핵산 5㎖를 가하여 진탕한 후, 100
㎖의 원심분리관에 넣고 3000rpm에서 5분간 원심분리한다 . 증류수 ＋메탄올(하층) 10㎖
를 20㎖의 비이커에 적당히 넣는다. 염산으로 pH를 1.0이하로 조정한다. 1시간 방치한 
후, 암모니아수로 pH를 7.9～8.1로 조정한다. 용액전량을 20㎖의 메스플라스크에 옮긴
다. 표선까지 희석용매를 가하여 진탕한 후 No. 5A 여과지로 여과하고 0.4㎍(역가)/㎖
의 시료액을 조제한다.
3) 정  량: 표준곡선법
바. 살리노마이신 나트륨(Salinomycin) [C42H70O11]10장. 동물용의약품
195○ 적용범위 : 닭사료
1) 시약의 조제
가) 희석용매 : 증류수 ＋메탄올(7＋3)
나) 살리노마이신 표준액
상용표준 살리노마이신 적당량을 60℃, 5㎜Hg이하의 감압조건하에서 3시간 건조한 후, 
40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올을 가하여 용해하고, 1㎎역가/㎖의 살리노마이신 
표준원액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 희석용매로 정확히 희석하고, 3㎍(역가)/
㎖의 고농도표준액 및 0.75㎍(역가)/㎖의 저 농도표준액의 각 표준원액을 조제한다.
다) 배지 : F-16호 배지
펩톤 2.0g, 효모 2.5g, 포도당 1.0g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000㎖를 조
제한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산＋증류수(1＋11) 또는 수산화나트륨
(4.2%, W/V)으로 pH를 5.9～6.1로 조정한다.
라) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.1㎖정
도 가한다.
마) 한천평판 : 원통법
바) 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(9＋1)
2) 시료액의 조제
분석시료 일정량[살리노마이신나트륨 0.5㎎(역가) 상당량]을 칭량하여 100㎖의 삼각플라
스크에 넣는다. 추출용매 50㎖를 가하고, 20분간 진탕하고 추출한 후 No. 5A 여과지로 
여과한다. 여액을 칼럼관(내경 14㎜)에 칼럼크로마토그래피용 염기성알루미나 [입경 74～
177㎛, 200～80mesh, F-20(Alcoa 또는 Merck제)] 12g을 건식으로 충진하고 처음 유출액 
5㎖를 버린다. 그 다음 유출액의 일정량을 증류수+메탄올(24+1)로 정확히 희석하여 3㎍
(역가)/㎖의 고농도 시료액을 조제하고 희석용매로 정확히 희석하여 0.75㎍(역가)/㎖의 저
농도 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 2-2 용량법
○ 적용범위 : 소사료1961) 시약의 조제
가) 희석용매 : 증류수 ＋메탄올(7＋3)
나) 살리노마이신 표준액
상용표준 살리노마이신 적당량을 60℃, 5㎜Hg이하의 감압조건하에서 3시간 건조한 후, 
40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올을 가하여 용해하고, 1㎎역가/㎖의 살리노마이신 
표준원액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 희석용매로 정확히 희석하고, 1.2㎍(역가)/
㎖의 고농도표준액 , 0.3㎍(역가)/㎖의 저농도표준액의 각 표준원액을 조제한다.
다) 배지 : F-22호 배지
효모 2.5g, 포도당 1.0g, 황산나트륨 50g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000
㎖를 조성한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산(1＋11) 또는 수산화나트륨
(4.2%, W/V)으로 pH를 5.9～6.1로 조정한다.
라) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.5㎖정도로 가
한다.
마) 한천평판 : 원통법
바) 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(9＋1)
2) 시료액의 조제
분석시료 일정량(살리노마이신나트륨으로써 0.2㎎(역가) 상당량)을 칭량하여 100㎖의 삼
각플라스크에 넣는다. 추출용매 50㎖를 가하고, 20분간 진탕하고 추출한 후 No. 5A 여과
지로 여과한다. 여액을 칼럼관(내경 14㎜)에 칼럼크로마토그래피용 염기성알루미나 [입경 
74～177㎛, 200～80mesh, F-20(Alcoa 또는 Merk제)] 12g을 건식으로 충진하고 처음 유출
액 5㎖를 버린다. 그 후 유출액의 일정량을 증류수 ＋메탄올(24＋1)로 정확히 희석하고 
1.2(역가)/㎖의 고농도 시료액을 조제하고, 희석용매로 정확히 희석하여 0.8㎍(역가)/㎖의 
저농도 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 2-2 용량법
사. 모넨신나트륨 (Monensin-Na)[C 36H62O11-Na]10장. 동물용의약품
197○ 적용범위 : 닭사료
1) 시약의 조제
가) 모넨신나트륨 표준액
상용표준 모넨신나트륨 40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올을 가하여 용해하고 1㎎역
가/㎖의 모넨신나트륨 표준원액을 조제한다. 사용할 때 표준원액을 증류수 ＋메탄올(7＋
3)로 정확히 희석하고, 4㎍역가/㎖의 고농도 표준액 및 1㎍역가/㎖의 저농도 표준액을 
조제한다.
나) 배지 : F-16호 배지
펩톤 2g, 효모 2.5g, 포도당 1g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000㎖를 조제
한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산(1＋11) 또는 수산화나트륨 (4.2%, W/V)
으로 pH를 5.9～6.1로 조정한다.
다) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.1㎖ 정
도 가한다.
라) 한천평판 : 원통법
마) 추출용매 : 메탄올 + 증류수 (9+1)
2) 시료액의 조제
분석시료의 일정량 모넨신나트륨으로써 0.5㎎(역가상당량 )을 칭량하여 100㎖의 삼각플라
스크에 넣는다. 추출용매 50㎖를 가하여 20분간 진탕하고, 추출한 후, No. 5A 여과지로 
여과한다. 여액을 칼럼(칼럼관내경 14㎜)에 칼럼크로마토그래피용 염기성알루미나 [입경 
74～177㎛, 200～80 mesh, F-20(Alcoa 제 또는 Merck제) 12g을 건식으로 충진한 것]에 넣
고 처음의 추출액 5㎖는 버린다. 그 다음 유출액의 일정량을 증류수 ＋메탄올(9＋1)로 정
확히 희석하고 4㎍역가/㎖의 고농도시료액을 조제한다. 이것을 증류수 ＋메탄올(7＋3)로 
정확히 희석하고 1㎍역가/㎖의 저농도 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 2 - 2 용량법
○ 적용범위 : 소사료1981) 시약의 조제
가) 모넨신나트륨 표준액
상용표준 모넨신나트륨 40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올을 가하여 용해하고 1㎎역
가/㎖의 모넨신나트륨 표준원액을 조제한다. 사용할 때 표준원액을 증류수 ＋메탄올(7＋
3)로 정확히 희석하고, 2㎍역가/㎖의 고농도 표준액 및 0.5㎍역가/㎖의 저농도 표준액을 
조제한다.
나) 배지 : F-22호 배지
효모 2.5g, 포도당 10g, 황산나트륨 50g, 한천 18～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000㎖
를 조제한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균 후, 염산 ＋증류수(1＋11)또는 수산화나
트륨(4.2%, W/V)으로 pH를 5.9～6.1로 조정한다.
       
다) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.5㎖ 
정도 가한다.
라) 한천평판 : 원통법
마) 추출용매 : 메탄올 ＋증류수(9＋1)
2) 시료액의 조제
분석시료의 일정량 모넨신나트륨으로써 0.3㎎(역가 상당량)을 칭량하여 100㎖의 삼각플
라스크에 넣는다. 추출용매 50㎖를 가하여 20분간 진탕하고 추출한 후, No. 5A 여과지로 
여과한다. 여액을 칼럼(칼럼관 내경 14㎜)에 칼럼크로마토그래피용 염기성 알루미나[입경 
74～177㎛, 200～80 mesh, F-20(Alcoa 제 또는 Merck제) 12g을 건식으로 충진한 것]에 넣
고 처음 추출액 5㎖는 버린다. 그 다음 추출액의 일정량을 증류수로 정확히 희석하고 2
㎍역가/㎖의 고농도시료액을 조제하고 이것을 증류수 ＋메탄올(7＋3)로 정확히 희석하여 
0.5㎍역가/㎖의 저농도시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 2 - 2 용량법10장. 동물용의약품
199아. 라살로시드나트륨 (Lasalocid-Na) [C34H53NaO8]
○ 적용범위 : 닭사료
1) 시약의 조제
가) 라살로씨드나트륨 표준액
상용표준 라살로씨드 40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올을 정확히 가하여 용해하고, 
1㎎(역가)/㎖의 라살로씨드 표준원액을 조제한다. 사용할 때 표준원액을 증류수 ＋메탄
올(3＋1)로 정확히 희석하고, 1㎍(역가)/㎖의 고농도 표준액과 0.5㎍(역가)/㎖의 저농도 
표준액을 조제한다.
나) 배지 : F-18호 배지
효모즙 2.5g, 포도당 10g, 염화마그네슘 10g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 
1000㎖를 조성한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균한다.
다) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.4㎖정
도 가한다.
라) 한천평판 : 천공법
마) 실리카겔
칼럼크로마토그래피용 실리카겔[입경 62～210㎛(250～65mesh) Kieselgel 40 Art 10180 
E.Merck제]을 110℃에서 2시간 건조한다.
2) 시료액의 조제
가) 추 출 : 분석시료의 일정량[라살로씨드나트륨으로써 1㎎(역가) 상당량]을 칭량하여 200
㎖의 삼각플라스크에 넣는다. 클로르포름 100㎖를 가하여 20분간 진탕추출한 후, No. 
5A여과지로 여과한다. 여액 25㎖를 실험관에 넣고, 무수황산나트륨을 가하여 탈수한 
후, No. 5A 여과지로 여과한 다음 칼럼크로마토그래피용 시료액으로 한다.
나) 칼럼크로마토그래피 : 칼럼관(내경 10㎜)에 실리카겔 2.5g을 메탄올로 현탁시켜 흘려 
보낸다. 메탄올 20㎖ 및 클로르포름 50㎖를 순차적으로 세정하여, 칼럼을 조제한다. 시200료액 5㎖를 칼럼에 정확히 넣고, 액면이 충진제의 상면에서 3㎜ 높이가 될 때가지 유
속 2～3㎖/min으로 유출시키고 , 클로르포름 30㎖를 가하여, 동일하게 유출시킨다 . 50㎖ 
증발플라스크를 칼럼아래에 두고, 메탄올 15㎖를 칼럼에 가하여 라살로씨드나트륨을 
용출시켜 50℃의 농축기에서 감압 농축한 후, 메탄올 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 
용해한다. 용액의 일정량을 증류수+메탄올(5+1)로 정확히 희석하고, 1㎍(역가)/㎖의 고농
도 시료액을 조제한다. 그 다음 증류수 ＋메탄올(3＋1)로 정확히 희석하고 0.5㎍(역가)/㎖
의 저농도 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 2 - 2 용량법
○ 적용범위 : 소사료
1) 시약의 조제
가) 라살로씨드나트륨 표준액
상용표준 라살로씨드나트륨 40㎎이상을 정확히 칭량한다. 메탄올을 정확히 가하여 용
해하고, 1㎎(역가)/㎖의 라살로씨드나트륨 표준원액을 조제한다. 사용할 때 표준원액을 
증류수 ＋메탄올(3＋1)로 정확히 희석하고, 2㎍(역가)/㎖의 고농도 표준액과 1㎍(역가)/㎖
의 저농도 표준액을 조제한다.
나) 배지 : F-18호 배지
효모즙 2.5g, 포도당 10g, 염화마그네슘 10g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 
1000㎖를 조성한다. 121℃에서 15분간 고압증기 멸균한다.
다) 포자액 및 첨가량 : 시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 
배지 100㎖당 0.4㎖정도 가한다.
라) 한천평판 : 아연바시트라신과 동일
마) 효소용액 : 효소제 4g을 증류수로 용해하여 100㎖로 한다.
2) 시료액의 조제
가) 추출 : 분석시료 18.2g을 칭량하여 200㎖의 삼각플라스크에 넣는다.10장. 동물용의약품
201효소용액 15㎖를 가하여 진탕한 후, 10～20분간 실온에 방치한다. 아세토니트릴 85㎖를 
가하여 30분간 진탕 추출한다. 그 후 No. 5A여과지로 여과하여 정제용 시료액으로 한
다.
나) 정제 : 시료액 25㎖를 200㎖ 분액여두에 정확히 넣는다. 증류수 25㎖를 가하여 핵산 
50㎖를 가하여 10분간 진탕한다. 방치한 후, 핵산층(상층)을 200㎖ 농축플라스크에 넣
는다. 그리고 분액여두에 핵산 50㎖를 가하여 1분간 진탕하고 핵산층을 그 농축플라스
크에 넣는다. 동일한 조작을 반복하고, 핵산층을 합하여, 50℃ 농축기에서 감압 농축한
다. 핵산 10㎖를 가하여 잔류물을 용해하고, 카트리지칼럼크로마토그래피용 시료액으로 
한다.
다) 카트리지칼럼크로마토그래피 : 실리카겔카트리지 (Sep-pak Silica Cartridge, Waters제)를 
연결한 주사기에 핵산 10㎖를 넣고 세정한다. 시료액을 주사기에 넣고, 1㎖이하까지 자
연 유하시킨다 . 그 후, 농축플라스크를 핵산 10㎖로 세정하고, 세액을 주사기에 넣고, 
동일한 조작을 2회 반복한다. 그리고, 핵산 20㎖ 및 클로르포름 20㎖를 주사기에 넣고 
실리카겔카트리지를 순차적으로 세정한다. 50㎖ 농축플라스크를 실리카겔카트리지 아
래에 두고, 클로르포름 ＋메탄올(4＋1) 30㎖를 주사기에 넣고 라살로씨드나트륨을 용출
시킨다. 용출액을 50℃ 농축기에서 감압 농축한 후, 메탄올 10㎖를 정확히 가하여 잔류
물을 용해하고 여과한다. 여액의 일정량을 증류수 + 메탄올(45+7)로 정확히 희석하고 2
㎍(역가)/㎖의 고농도 시료액을 조제하고, 그것을 증류수 ＋메탄올(3＋1)로 정확히 희석
하여 1㎍(역가)/㎖의 저농도 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 2 - 2 용량법
자. 하이그로마이신 B (Hygromycin-B)[C 20H37N3O13]
1) 시약의 조제
가) 완충액 : 4호 완충액(pH 8.0)
인산2수소칼륨 13.3g을 칭량하여 증류수 750㎖로 용해한다. 수산화칼륨 용액(6.6%, 
W/V) 100㎖를 가하여 pH 7.9～8.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 100㎖로 한다.
나) 희석용매202에틸렌디아민 4초간 2수소 2나트륨 2수화물 1g을 칭량하여, 4호 완충액으로 용해하여 
1000㎖로 한다.
다) 하이그로마인 B 표준액
상용표준 하이그로마이신 B 적당량을 5㎜Hg이하의 감압하에서 60℃로 3시간 건조한다. 
4㎎이상을 정확히 칭량하고, 4호 완충액을 정확히 가하여 용해하고, 1000단위/㎖의 하
이그로마이신 B 표준원액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 희석용매로 정확히 희석
하고 5, 10, 20, 40, 80단위/㎖의 각 표준액을 조제한다.
라) 배지 : F-3호 배지
펩톤 5g, 육즙 3g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000㎖를 조성한다. 121℃에
서 15분간 고압증기 멸균한다. 멸균 후, 염산(1＋1) 또는 염화나트륨용액 (4.2%, W/V)으
로 pH를 7.9～8.1로 조성한다.
마) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.2㎖ 
비율로 가한다.
바) 한천평판 : 아연바시트라신과 동일
사) 칼럼크로마토그래피용 충진제
① 합성흡착제 : 합성흡착제 (스틸렌디비닐벤젠중합체 , Ambereit XAD - 2, Rohm & Haas
제) 100g을 칭량하여 1ℓ용 비이커에 넣는다. 메탄올 500㎖로 세정한 후, 세액을 버리
고, 메탄올 500㎖를 가하고 하룻밤 방치한다. 그 다음 증류수로 충분히 세정하고 수중
에서 보존한다.
② 이온교환수지 : 이온교환수지 (약산성카치온교환 , Ambereit CG-50 Type-1, Rohm & 
Haas제) 100g을 칭량하여, 1ℓ용 비이커에 넣는다. 암모니아 ＋증류수(2＋23) 500㎖로 
세정한다. 세액을 버리고 암모니아 ＋ 증류수(2＋23) 500㎖를 가하여 하룻밤 방치한다. 
그 다음 증류수로 충분히 세정하여 NH+4 type 수지를 조제한다. 별도로, 이온교환수
지 100g을 칭량하여 1ℓ용 비이커에 넣는다. 염산＋증류수(1＋11) 500㎖로 세정한 다
음, 세액을 버리고 염산＋증류수(1＋11) 500㎖를 가하여 하룻밤 방치한다. 그 다음 증
류수로 충분히 세정하고 H+type 수지를 조제한다. NH+4 type 수지 70㎖로 H+ type 
수지 30㎖를 가하여 충분히 진탕하고, 수중에서 보존한다.10장. 동물용의약품
2032) 시료액의 조제
가) 추  출
분석시료의 일정량(하이그로마이신 B로써 200단위 상당량)을 칭량하여 300㎖ 삼각플라
스크에 넣는다. 황산수소칼륨용액 (1%, W/V) 200㎖를 가하여, 20분간 진탕하고 추출한
다. 추출액을 200㎖ 원심분리관에 넣고, 3000rpm에서 10분간 원심분리하고 , 상등액 150
㎖를 200㎖ 비이커에 넣고, 수산화나트륨 용액(40%, W/V)으로 pH를 7.9～8.1로 조정한
다. 그리고 200㎖ 원심분리관에 넣고, 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 
No. 5A여과지로 여과하고, 칼럼크로마토그래피용 시료액으로 한다.
나) 칼럼크로마토그래피
제1칼럼관(내경 10㎜)에 합성흡착제를 증류수로 현탁시킨 것을 10㎝ 높이까지 흘리고, 
제2칼럼관(내경 10㎜)에 이온교환수지를 증류수로 현탁시킨 것을 6cm 높이까지 흘린
다. 각각의 칼럼관을 탈지면으로 가볍게 막은 후, 증류수 20㎖를 가하여 액면이 충진제
의 상면에서 3㎜ 높이가 될 때까지 유출시켜 칼럼을 조제한다. 그 다음 제1칼럼의 하
단과 제 2칼럼의 상단을 공기가 새지 않도록 연결한다. 시료액 100㎖를 제1의 칼럼에 
넣는다. 제1의 칼럼의 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유속 2㎖
/min로 제2의 칼럼으로 유출시킨 후, 제1의 칼럼에 증류수 40㎖를 가하여, 제2의 칼럼
의 액면이 충진제의 상면에서 3㎜의 높이가 될 때까지 유출시킨다 . 제1의 칼럼을 분리
하고, 제2의 칼럼 하부에 100㎖용 농축플라스크를 두고 암모니아 ＋증류수(1＋24) 25㎖
를 제2의 칼럼에 가하여 하이그로마이신 B를 용출시킨다 . 용출액을 70℃의 수욕조에서 
감압농축한 후, 희석용매를 5㎖를 정확히 가하여 잔류물을 용해하고, 20단위/㎖의 시료
액을 조제한다.
3) 정  량 : 표준곡선법
차. 데스토마이신 A(Destomycin-A)[C 20H37N3O13]
○ 적용범위 : OTC를 포함하지 않은 사료
1) 시약의 조제
가) 완충액 : 4호 완충액(pH 8.0)204인산2수소칼륨 13.3g을 칭량하여 증류수 750㎖로 용해하고, 수산화칼륨용액 (6.6%, W/V) 
100㎖를 가하여 pH 7.9～8.1로 조정한 후, 증류수를 가하여 1000㎖로 한다.
나) 희석용매
에틸렌디아민 4초산 2수소 나트륨 2수화물 1g을 칭량하여, 4호 완충액에 희석하여 
1000㎖로 한다.
다) 데이토마이신 A 표준액
상용표준 데이토마이신 A 적당량을 5㎜Hg이하의 감압하에서 60℃에서 3시간 건조한 후 
40㎎이상을 정확히 칭량한다. 4호 완충액을 정확히 가하여 용해하고, 1㎎(역가)/㎖의 데
이토마이신 A 표준액을 조제한다. 사용할 때, 표준원액을 희석용매로 정확히 희석하고, 
10, 20, 40, 80㎍(역가)/㎖의 각 표준액을 조제한다.
라) 배  지 - F-3호 배지
펩톤 5g, 육즙 3g, 한천 13～20g, 증류수 적당량으로 배지 1000㎖를 조성한다. 121℃에
서 15분간 고압증기 멸균한다. 멸균 후, 염산＋증류수(1＋1) 또는 염화나트륨용액 (4.2%, 
W/V)으로 pH를 7.9～8.1로 조정한다.
마) 포자액 및 첨가량
시험균, Bacillus subtilis ATCC 6633으로 1×107개/㎖의 포자액을 배지 100㎖당 0.2㎖비
율로 가한다.
바) 한천평판 : 아연바시트라신과 동일
사) 이온교환수지
이온교환수지 [약산성카치온교환 , Ambereit CG-50 Type-1, Rohm & Haas제] 100g을 칭
량하여 1ℓ용 비이커에 넣고, 암모니아수 ＋증류수(2＋23) 500㎖로 세정한다. 세액을 버
리고 암모니아수 ＋증류수(2＋23) 500㎖를 가한 다음 하룻밤 방치한다. 그 다음 증류수
로 충분히 세정하고 NH+4 type 수지를 조제한다. 별도로 이온교환수지 100g을 칭량하
여 1ℓ용 비이커에 넣고 염산＋증류수(1＋11) 500㎖로 세정한다. 세액을 버리고, 염산
＋증류수(1＋11) 500㎖를 가한 다음 방치한다. 그 다음 증류수로 충분히 세정하고 
H+type 수지를 조제한다. NH+4type 수지 70㎖로 H+type 수지 30㎖를 가한다. 충분히 
진탕한 후 수중에 보존한다.10장. 동물용의약품
2052) 시료액의 조제
가) 추  출
분석시료의 일정량[데스토마이신으로써 0.2㎍(역가)상당량]을 칭량하여 300㎖ 삼각플라
스크에 넣는다. 황산수소칼륨용액 (1%,W/V) 200㎖를 가하고, 20분간 진탕 추출한다. 추
출액을 200㎖ 원심분리관에 넣고, 3000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 150㎖를 
200㎖ 비이커에 정확히 넣고, 암모니아수로 pH를 7.9～8.1로 조정한다. 200㎖ 원심분리
관에 넣고 3000rpm에서 10분간 원심분리한 다음, 상등액을 No. 5A여과지로 여과하여, 
칼럼크로마토그래피용 시료액으로 한다.
나) 칼럼크로마토그래피
이온교환수지를 증류수에 현탁시킨 것을 내경 10㎜ 칼럼관에 높이 6㎝까지 흘리고 상
부에 탈지면을 가볍게 채운다. 증류수 20㎖를 가하여 액면이 충진제의 상면에서 3㎜가 
될 때까지 유출시켜 칼럼을 조제한다. 시료액 100㎖를 칼럼에 넣고, 칼럼의 액면이 충
진제의 상면에서 3㎜가 될 때까지 유속 2㎖/min로 유출시킨다 . 칼럼에 증류수 40㎖를 
가하고 칼럼의 액면이 충진제의 상면에서 3㎜가 될 때까지 유출시킨다 . 100㎖ 농축플
라스크를 칼럼 아래에 두고, 암모니아수 + 증류수(1+49) 25㎖를 칼럼에 가하여 데스토
마이신A를 용출시킨다 . 70℃의 수욕조에서 감압농축한 후, 희석용매 5㎖를 정확히 가
하여 잔류물을 용해시키고 , 20㎍(역가)/㎖의 시료액을 조제한다.
3) 정  량 : 표준곡선법
4. 펜벤다졸(Fenbendazole)
가. 분석원리
사료 시료 중의 펜벤다졸을 에틸아세테이트 , 헥산, 에탄올, 0.2 N 염산으로 추출한 후 양
이온교환 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프 /질량분석기로 분석한다.
나. 측정기기
액체크로마토그래프 /질량분석기
다. 시약 및 시액
1) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것2062) 표준원액 : 펜벤다졸 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L로 한다. 조제된 표
준원액은 냉동보관 한다.
3) 표준용액 : 표준원액을 메탄올로 희석하여 펜벤다졸은 0.15, 0.3, 0.45, 0.6 및 0.75 mg/L
가 되게 한다. 조제된 표준용액은 냉장보관한다 .
4) 양이온교환 카트리지 : MCX (Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지(60 mg) 또는 이와 
동등한 것
라. 시험용액의 제조
균질화 한 검체 3 g을 달아 15 mL 원심관에 넣고 에틸아세테이트 8 mL를 가하여 흔들
어 섞는다. 이 용액을 3,000 G에서 5분간 원심분리한다 . 상층액을 취하고, 잔류물에 에틸
아세테이트 8 mL를 가하여 위와 동일하게 원심분리하여 상층액을 모은다. 상층액을 모
은 액은 40℃ 수욕조상에서 감압농축 한다. 잔류물에 헥산 5 mL을 가하여 30초 동안 균
질화한 후 에탄올:0.2 N 염산(2:1) 혼합용액 1 mL를 가하여 30초 동안 균질화하고 아래
층을 취하여 45℃ 수욕조상에서 감압농축 한다. 잔류물에 5% 개미산 메탄올 용액 3 mL
를 가하여 녹인다. 미리 아세토니트릴 :초산(95:5) 1 mL와 5% 개미산 메탄올 용액 2 mL
로 활성화시킨 양이온교환 카트리지에 위의 5% 개미산 메탄올 용액 3 mL에 녹인 잔류
물을 흡착시키고 50% 메탄올 용액 2 mL로 세척한다. 25% 수산화암모늄 :아세토니트릴
(1:4) 혼합용액 3 mL로 용출시켜 40℃이하의 수욕상에서 질소농축하고 잔류물을 0.1% 개
미산 용액:메탄올(1:1) 혼합용액 1 mL로 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으
로 한다.
마. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 조건
칼럼 : C18(2.0 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
칼럼온도 : 40℃
이동상
- 이동상 A : 0.1% 개미산 용액
- 이동상 B : 0.1% 개미산 메탄올 용액
          시간(분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0.0 20 80
1.5 20 80
6.0 95 5
8.0 95 5
9.0 20 80
10.0 20 8010장. 동물용의약품
207유속 : 0.3 mL/분
주입량 : 2 μL
질량분석기 조건
Ionization : ESI(positive)
Capillary Temperature : 450℃
Collision gas : 질소(N2)
바. 정량시험
1) 시험용액 및 표준용액을 각각 질량분석기에 주입하여 아래표의 특이이온을 확인한다. 이
후 각각에서 얻은 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고, 펜벤다졸은 m/z 268
에 대한 면적으로 각각 검량선을 작성하여 시험용액 중 각각의 함량을 구한다.
         물질Precursor ion 
(m/z)Fragment ion (m/z)
펜벤다졸 300 268, 159, 131
2) 정량한계 : 각각 0.001 mg/kg
5. 디클라주릴 (Diclazuril)
가. 분석원리
검체에 존재하는 디클라주릴을 에틸아세테이트로 추출하고 추출액을 농축하여 헥산:아세
토니트릴 분배로 정제하여 액체크로마토그래프 / 자외부흡광검출기로 정량한다.
나. 장 치
액체크로마토그래프 /자외부흡광검출기
다. 시약 및 시액
1) 표준원액 ：디클라주릴을 메탄올 ：디메틸포름아미드 (90：10)에 녹여 100 ppm으로 제조하
여 사용한다. 
2) 표준용액 ：표준원액 일정량을 취하여 메탄올로 희석하여 사용한다.2083) 기타시약 ：특급 
라. 시험용액의 조제 
검체 일정량을 취하여 물을 4배 부피로 가하고 균질화한다 . 균질액 2.5 mL를 취하여 에
틸아세테이트 3 mL씩으로 2회 반복추출한다 . 유기용매층을 모아 60℃에서 증발건조시킨 
후 잔류물을 50% 아세토니트릴 용액 2 mL에 재용해한다 . 헥산 3 mL로 2회 세척한 다음 
에틸아세테이트 3 mL로 추출하여 증발건조시킨다 . 잔류물을 이동상용액 120 μL로 재용
해하여 시험용액으로 한다.
마. 시험조작 
1) 측정조건 
칼럼：ODS-Hypersil(4.6 × 100 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상 ：0.1 M 초산암모늄 (Ammonium acetate):테트라하이드로퓨란 (tetrahydrofuran) 
(69:31)
유속：3 mL/분
파장：UV 278 nm
바. 정량시험
시험용액 및 표준용액 35 μL를 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어
진 각 피크의 머무름시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검
체 중 디클라주릴의 농도를 구한다.
6. 말라카이트 그린(Malachite Green)
가. 분석원리
검체를 아세토니트릴과 디클로로메탄으로 추출하고 감압농축한 후, 2,3-디클로로-5,6-디
시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)을 이용하여 류코말라카이트 그린을 말라카이트 그린으로 산
화시키고 SPE(Solid Phase Extraction) 칼럼으로 정제하여 액체크로마토그래프 /가시부흡광
검출기로 분석한다.
나. 장 치
액체크로마토그래프 /가시부흡광검출기10장. 동물용의약품
209다. 시약 및 시액
1) 용매：액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
2) 물：3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 ：말라카이트 그린 및 크리스탈 바이올렛 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 
100 μg/mL로 하고 갈색유리병에 보관한다.
4) 표준용액 ：표준원액을 이동상 A에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.
5) 1 mM 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzo- 
quinone, DDQ) 용액：2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논 0.227 g을 100 mL 메스플
라스크에 취하고 아세토니트릴로 녹여 표시선까지 채워 10 mM DDQ 용액을 만들어 냉
장 보관한다. 사용직전에 10 mM DDQ 용액을 아세토니트릴로 10배 희석하여 사용한다.
6) 25% 염산수산화아민 용액(Hydroxylamine hydrochloride, HAH)：염산수산화아민 25 g을 
100 mL 메스플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채운다.
7) 1 M p-톨루엔설폰산 (p-Toluene sulfonic acid, p-TSA) 용액：p-톨루엔설폰산 9.5 g을 50 
mL 메스플라스크에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채운다.
8) 5 mM p-톨루엔설폰산 /0.1 M 초산암모늄완충용액 ：7.7 g 초산암모늄을 1 L 메스플라스크
에 취하고 물로 녹여 표시선까지 채운다. 초산 8 mL와 1 M p-톨루엔설폰산 5 mL를 넣
어 pH 4.5로 조정한다. 이 액은 이동상 A 용액 조제 시 사용한다.
9) 알루미나(충진제 Alumina, 중성) 카트리지 또는 이와 동등한 것
10) 프로필설폰산 (충진제 Propylsulfonic acid, PRS) 카트리지 또는 이와 동등한 것 
11) 기타시약 ：특급
라. 시험용액의 조제
균질화한 검체 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 5 mM p-톨루엔설폰산 /0.1 M 초산암
모늄완충용액 5 mL, 25% 염산수산화아민 (HAH) 용액 1 mL, 1 M p-톨루엔설폰산 (p-TSA) 
용액 100 μL를 넣어 30초간 강하게 균질화한다 . 여기에 아세토니트릴 25 mL를 넣어 30
초간 강하게 진탕하고 다시 알루미나(80~200메쉬) 10 g을 넣어 15초간 강하게 진탕한 후 
0℃, 2,000 G에서 5분간 원심분리하고 상등액은 미리 물 50 mL와 디에틸렌글리콜 2 mL
를 넣은 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 다시 아세토니트릴 25 mL를 넣어 1분간 강하게 
진탕하고 0℃, 2,000 G에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 앞의 액과 합한다. 디클로로
메탄 25 mL를 넣고 분액깔때기를 30초간 흔들어 섞은 후 정치하여 디클로로메탄층 (아래
층)을 취한다. 다시 디클로로메탄 25 mL를 넣어 이 과정을 한 번 반복하고 40℃ 수욕 
중에서 감압농축한 후 잔류물을 아세토니트릴 3 mL에 녹이고 1 mM 2,3-디클로로-5,6-
디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ) 용액 3 mL를 넣어 30분간 반응시킨다 . 알루미나 카트리지210(충진제 1 g) 및 프로필설폰산 (Propylsulfonic acid, PRS) 카트리지(충진제 500 mg)를 미리 
메탄올 5 mL와 아세토니트릴 5 mL로 활성화시키고 , 프로필설폰산 카트리지에 아세토니
트릴 5 mL를 넣은 후 알루미나 카트리지를 그 위에 연결한다. 검체를 추출한 액과 추출
액이 담겨 있던 플라스크를 아세토니트릴 5 mL로 2회 세척한 액을 알루미나 카트리지
에 흡착시키고 감압하여 분당 4 mL로 용출하고 알루미나 카트리지를 제거한다. 프로필
설폰산 카트리지를 아세토니트릴 5 mL로 세척하고 감압하여 건조시킨 후 15 mL 원심분
리관에 이동상 A 용액 4 mL로 용출한 액을 받아 이동상 A 용액으로 5 mL 눈금에 맞춘 
후 0.2 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
마. 시험조작
1) 측정조건
칼럼：C18(4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상 
  - 이동상 A(95%) ：5 mM p-톨루엔설폰산 /0.1 M 초산암모늄완충용액 ：아세토니트릴
(50:50)
  - 이동상 B(5%) ：아세토니트릴
유속：1.0 mL/분
측정파장 ：618 nm 
바. 정량시험
1) 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 
피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 
말라카이트 그린의 함량을 구한다.
2) 정량한계 ：2 μg/kg
사. 확인시험
액체크로마토그래프 /질량분석기로 정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 
피크 높이법 또는 피크 면적법에 따라 확인한다.
1) 액체크로마토그래프 조건
칼럼：C18(2.0 × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상 
- 이동상 A：0.1% 개미산 수용액10장. 동물용의약품
211- 이동상 B：0.1% 개미산 메탄올용액
시간(분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0.0 80 20
1.5 80 20
6.0 0 100
8.0 0 100
8.5 80 20
10.0 80 20
유속：0.3 mL/분
2) 질량분석기 조건
Ionization ：ESI(positive)
Capillary Temperature ：450℃
Collision gas：질소
CompoundPrecursor 
Ion (m/z)Fragment 
Ion (m/z)Collision 
Energy (V)
Malachite green329 313 51
329 208 51
329 165 91
7. 마두라마이신 (Maduramycin)
가. 시험법 적용범위
사료 등에 적용한다.
나. 분석원리
검체 중 마두라마이신 , 샘두라마이신 및 티아물린을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid 
Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프 /질량분석기로 분석한다.
다. 장치
액체크로마토그래프 /질량분석기
라. 시약 및 시액2121) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
2) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
3) 표준원액 : 마두라마이신 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 μg/mL로 한다.
4) 표준용액 : 표준원액을 이동상에 적당한 농도로 희석하여 사용한다.
5) 후로리실 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것
6) 기타시약 : 특급
마. 시험용액의 조제
균질화한 검체 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 강하게 진탕한 후 1,000 G에서 5분간 
원심분리한다 . -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃에서 
질소 농축시킨 후 헥산 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 헥산 5 mL
로 활성화시킨 후로리실 카트리지에 추출액을 흡착시키고 헥산 5 mL로 4회 세척한 후, 
메탄올 6 mL로 용출한다. 용출액은 40℃에서 질소 농축시키고 잔류물은 이동상 0.1 mL
에 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.
바. 시험조작
1)　액체크로마토그래프 조건
칼럼：C18(2.1 × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것
이동상  - 이동상 A : 0.1% 개미산, 5% 아세토니트릴 수용액
        - 이동상 B : 0.1% 개미산, 95% 아세토니트릴 수용액
시간(분) A (%) B (%)
0.0 80  20
15.0  0 100
17.0  0 100
18.0 80  20
25.0 80  20
유속 : 0.2 mL/min
２）질량분석기 조건
칼럼　Ionization : ESI(positive)
Spray voltage : 5 kV
Capillary temperature : 210℃
Sheath gas : 질소(N2)(10 psi)10장. 동물용의약품
213Auxiliary gas : 질소(N2)(10 psi)
SIM ion : m/z 934
사. 확인시험
1) 시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머
무름시간을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 검체 중 마두라마이신의 함량
을 구한다.
2) 정량한계 : 0.002 mg/kg21411장. 생균제(Probiotics)
1. 분석원리
생균제란 숙주에 유익한 작용을 갖는 미생물제제 또는 미생물의 성분으로 적정 농도로 
희석한 시료 일정량을 취하여 균에 적합한 선택배지에 도말하여 균 생장에 적합한 온도
로 일정시간 배양하여 발생한 집락수를 계수하여 시료 중에 존재하는 균수를 측정한다.
2. 분석방법
가. 대상균주
Lactobacillus  sp.락토바실러스 락티스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 불가리쿠스 , 
락토바실러스 브레비스 , 락토바실러스 살리바리우스 , 락토바실러스 애
시도필러스 , 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 커바투스 , 락토바실러
스 퍼멘텀, 락토바실러스 프란타럼 , 락토바실러스 헬베티쿠스 , 락토바
실러스 페롤렌스 , 락토바실러스 파라카제 , 락토바실러스 크리스파투스
Bacillus sp.바실러스 렌투스, 바실러스 리체니포미스 , 바실러스 서브틸리스 , 바실러
스 세레우스 (도요이에 한함), 바실러스 코아글란스 , 바실러스  폴리프멘
티쿠스, 바실러스 푸밀루스
효모
(Saccharomyces  sp.)맥주효모 , 토룰라효모 , 제빵효모 , 양조효모 , 조사건조효모 , 효모배양물, 
잔토필로마이세스 덴드로하우스 , 피키아 파리노사
Bifidobacterium sp.비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 서모필
럼, 비피도박테리움 인판티스 , 비피도박테리움 슈도롱검
Enterococcus  sp. 엔테로코커스 락티스, 엔테로코커스 써모필러스 , 엔테로코커스 훼시엄
Pediococcus  sp.페디오코커스 세레비지아 , 페디오코커스 애시디락티시 , 페디오코커스 펜토
사세우스  
Aspergillus  sp. 아스퍼질러스 니이거, 아스퍼질러스 오리제
Monascus sp. 모나스커스 퍼퓨리어스
Clostridium butyricum 클로스트리듐 브티리컴
나. 기구 및 시약 등
1) 기 구
크린벤치, 고압멸균기 , 균질기, 광학현미경 , 배양기, 교반기, 초순수제조장치 
2) 시 약
NaCl, L-cystein, KH2PO4, Na2HPO4, tween 80, BPB(Bromophenol blue), TTA(Tartaric acid)11장. 생균제
2153) 배 지
① DeMan-Rogosa-Sharpe(MRS) ② Nutrient Agar(NA) 
③ KF Streptococcus ④ Potato Dextrose Agar(PDA)
⑤ Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar(YEGC) 
⑥ Bifidobacterium Selective Agar(BS) ⑦ Salmonella Shigella Agar(SS) 
⑧ Xylose Lysine Desoxycholate(XLD) ⑨ Clostridium Difficile Agar Base 
다. 용액 제조
1) 시료추출용액 : 0.85% 생리식염수
가) 비이커에 NaCl을 넣고 증류수를 가하여 완전히 녹인다.
나) 250ml 사각광구병에 90ml, 25ml 시험관에 9ml씩 분주한다.
다) 마개를 막고 121℃에서 15분간 고압 멸균하여 방냉한다.
2) 다당류코팅제거 완충액 : 시료에 코팅이 되어있어 시료추출용액 (생리식염수 )  으로 균이 
추출되지 않을 경우 완충액을 사용한다. 
라. 배지 및 배양조건 
 균종배지종류
배양조건 배양온도 배양시간
Lactobacillus  sp.MRS Agar + 0.002% Bromophenol blue
혐기 30～37℃ 48～72시간
Bacillus sp.Nutrient Agar 또는 Nutrient broth + Agar
호기 35℃ 18～20시간
효모
(Saccharomyces  sp.)Yeast Extract Glucose Chloramphenicol Agar
호기 25℃ 5～7일
Bifidobacterium sp.Bifidobacterium Selective Agar
혐기 36±1 ℃ 24～48시간No. 시약 중량 방 법
➀L-cystein 0.5g ➀～➂번까지 섞은 후 증류수를 부어 호일로 덮고 
온도를 약간 높여서 섞음(시약량은 증류수 3L제
조 기준)➁KH2PO4 2.37g 
➂Na2HPO4 2.12g
➃ pH 7.7로 조절 NaOH, HCl 1N시약으로 pH 조절
➄tween 80 0.05% 온도를 약간 높여 완전히 녹여서 섞음 216 Enterococcus  sp.KF streptococcus Agar
호기 36±1 ℃ 48시간
Pediococcus  sp.MRS Agar + 0.002% Bromophenol blue  
혐기 36±1 ℃ 48시간
Aspergillus  sp.
Monascus  sp.Potato Dextrose Agar + 10% 주석산 
호기 22～25℃ 5일
Clostridium butyricumClostridium Difficile Agar Base 
혐기 36±1 ℃ 24～48시간
   
바. 분석절차 
1) 시료 10g을 취하여 생리식염수 90ml에 넣고 35℃에서 20분간 진탕하여 균질화 한다.
2) 희석액을 제조한다.
가) 9ml 생리식염수 시험관에 시료 1ml를 취하여 첫 번째 시험관에 넣고 잘 혼합 한다. 
나) 혼합액 1ml를 취하여 시험관에 10배 단계희석한다 .
3) 혼합액 100㎕를 취하여 배지에 주입하여 물기가 없어질 때까지 도말한다. 
     농도 당 3반복 이상으로 한다.
사. 균 확인시험 
1) API Kit 
API kit는 Biochemical test, Assimilation test, Fermentation test를 이용한 동정법으로 
Biochemical test는 saline용액에 시험균을 현탁하여 대사유무를 색의 변화로써 판정한다. 
Assimilation test는 현탁한 시험균을 접종 배양한 후 탁도 변화로 판정한다. 
Fermentation test는 당으로부터 산을 생산하여 pH의 변화로 판정한다. 
2) 기기분석  
초미량의 각종 건조 배지 및 생화학적 반응물이 들어 있는 마이크로웰이 있는 플라스틱 
카드를 사용한다. 카드의 마이크로웰 내부에서 균의 증식 및 대사가 이루어지고 , 이러한 
화학반응의 변화를 매 15분마다 Transmittance/Colorimetry Optics으로 측정하여 프로그
램상에서 분석 되어진 후 결과를 자동으로 출력한다. 12장. 효소제
217제12장 효소제
1. α-아밀라아제 (전분호정화력 )
가. 전분호정화력 제1법
1) 원 리
아밀라아제 (amylase, 전분분해효소 )는 전분의 가수분해에 관여하는 효소로 그 종류도 많
고 각기 분해생성물도 다르며 성질의 차이에 따라 여러 가지 분류법이 있다. 아밀라아제
에 의한 전분의 분해에는 액화, 호화, 당화의 3단계가 행해지며, 특히 액화, 호화력이 강
한 것을 액화형 amylase( α-amylase) 라 하고, 당화력이 강한 것을 당화형 amylase( β
-amylase) 라고 한다. 전분이 amylase의 작용을 받아 호정화되어 가면 전분의 요오드정색
이 변화한다. 이것에 의하여 amylase의 호정화력을 측정하는 방법이다. 
2) 시약의 조제
가) 1% 가용성 전분(soluble starch)용액
나) 0.01N-요오드용액
① KI 약 50g을 소량의 증류수로 용해시키고 , 요오드 12.69g을 가하여 완전히 용해한다.
② 이것을 1ℓ로 하여 0.1N의 용액을 조제하고 다시 10배로 희석한다. 
다) 0.1M- 초산염완충용액
① 0.1M 초산(acetic acid)용액과 0.1초산나트륨 (sodium acetate)용액을 적당량 혼합해서 
그 효소의 최적 pH로 한다.
② 0.1M 초산용액을 적당량 혼합해서 그 효소의 최적 pH로 한다.
③ 0.1M 초산용액은 acetic acid 6.005㎖을 정밀하게 청량하여 증류수에 용해시켜 1ℓ로 
하고, 
④ 0.1M 초산나트륨 (sodium acetate) 용액은 sodium acetate(CH 3COONa ․3H2O) 13.61g을 정
밀하게 칭량하여 증류수에 용해시켜 1ℓ로 하여 각각 조제한다.
라) 2N 초산(acetic acid)용액
마) 1/300M-NaCl 용액
바) 1/300M 초산칼슘(calcium acetate)용액
3) 측정218가) 효소액의 조제
시료를 1/300M NaCl, 1/300M 초산칼슘(calcium acetate) 혼합액에 용해시켜 적당한 농
도로 한다. 
나) 활성도의 측정
① 마개가 있는 시험관 여러 개를 준비하고, 
② 효소액을 1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, ․․․․․, 0.1㎖씩 취한다.
③ 여기에 0.1M 초산염완충용액 1㎖씩을 가하여 흔든다. 
④ 각 시험관에는 미리 40℃로 가열된 1% 가용성 전분 용액을 5㎖씩 가하여 즉시 
흔들고
⑤ 40℃의 항온수조 내에 넣어 30분간 반응시킨다
⑥ 반응정지 즉시 2N 초산용액 2㎖씩을 가하여 흔들어 반응을 정지시킨다
⑦ 0.01N요오드용액을 1㎖씩 넣어서 발색시킨다 .
4) 계 산
아밀라아제 (amylase) 활성도 단위는 반응시킨 시험관 안에서 엷은 자색을 나타내는 시험
관을 취하여 여기에 첨가한 희석한 효소액의 양으로부터 효소액 1㎖에 의하여 분해된 
1% 가용성 전분의 ㎖수로서 표시한다. 이 효소의 전분 호정화력은 다음과 같이 표시한
다.
효소활성도 (D40℃30＇)= 5 X (1/E) X F
       E : 시험관에 가한 희석한 효소액량(㎖)
       F : 효소액의 희석배수
       D40℃30＇: D는 diastase의 머리글이며 , 숫자는 40℃에서 30분간 반응시켰음을 나
타낸다.
2. 말토게닉아밀라아제
가. 적용 및 원리 : 본 시험방법은 Bacillus subtilis 및 그 변종에서 얻어진 효소제의 말토게
닉아밀라아제 역가를 측정하는 방법이다. 역가시험은 온도 37°에서 말토트리오스기질의 
가수분해에 근거를 두고 있다. 생성된 포도당은 Glucose dehydrogenase 및 NAD가 함유된 
혼합액을 사용하여 측정한다.
나. 시험용액의 조제 : 검체 일정량을 취하여 1㎖당 0.015～0.075 MANU를 함유하도록 물로 
희석한다. 다만, 최종희석액은 1%의 1M 염화나트륨용액을 함유하도록 조제한다.12장. 효소제
219다. 시험조작 : 기질용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 37±1°의 수욕조에서 항온시킨다 . 시험용액 
0.5㎖를 정확히 가하고 흔들어 혼합한 후 수욕조에 방치한다. 정확히 30분후 시험관을 수
욕조에서 꺼내어 0.06N 수산화나트륨용액 1㎖를 가하여 반응을 중지시킨 다음 이액에 
GluDH용액 3㎖를 가하여 잘 혼합하고 상온에서 정확히 30분간 유지시킨다 . 기질용액 0.5
㎖, 0.06N, 수산화나트륨용액 1㎖, 시험용액 0.5㎖의 순으로 가해주고 GluDH용액 3㎖를 
가해준 다음 상온에서 30분간 유지시킨 액을 효소공시험용으로 한다. 효소공시험용액을 
대조액으로 하여 액층 1cm, 파장 340nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선에서 포도당표
준용액의 농도(μ㏖/l)를 구한다.
라. 표준곡선 : 포도당 1.6g을 정밀히 달아 물을 가하여 1,000㎖로 한다. 이 액을 사용하여 
각각 88.8μmol/l, 177.6μmol/l, 266.4μmol/l, 355.2μmol/l, 444.0μmol/l, 532.9μmol/l의 포도당
을 함유하도록 포도당 표준용액을 조제한다. 각 표준용액 2㎖를 각각의 시험관에 넣고 
GluDH용액 3㎖를 가해준 다음 상온에서 30분간 방치한다. 이들 용액에 대해 물을 대조
액으로 하여 액층 1cm, 파장 340nm에서 흡광도를 각각 측정하고 포도당표준용액의 농
도(μmol/l)에 대한 표준곡선을 작성한다. 
    다음의 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.
MANU/g=A×4×F
30×W×1,000
 A : 표준곡선에서 얻은 시험용액의 포도당표준용액의 농도(μ㏖/l)
 F : 희석배수
 4 : 시험에 사용된 시험용액의 약 0.5㎖와 포도당표준용액의 양 2㎖의 비
 30 : 반응시간(분)
 W : 검체의 채취량(g)
 1,000 : l를 ㎖로 전화시키는 계수
마. 역가의 정의 : 1 Maltogenic Amylase Nove Unit(MANU) 는 상기시험조건하에서 분당 1μ
㏖/l의 말토트리오스를 분해하는 효소의 양이다.
바. 시 액
1) 구연산완충액 : 구연산 0.225g에 물 20㎖를 가하여 녹인 다음 4N 또는 1N 수산화나트륨
용액을 가하여 pH 5.0으로 조절한 다음 물을 가하여 250㎖로 한다.
2) 기질용액 ; 말토트리오스 (Maltotriose)1g 을 구연산완충액에 녹여 50㎖로 한다.
3) 1M 염화나트륨용액 : 염화나트륨 29.22g에 물을 가하여 500㎖로 한다.
4) 0.06N 수한화나트륨용액 : 1N 수산화나트륨용액 30㎖를 취한 다음 물을 가하여 500㎖로 
한다.
5) GluDH용액 : 글루코오스디하이드로게나아제 (Glucose dehydrogenase) 를 함유한 혼합시액
(Merck No. 14853)을 사용한다.2203. β-아밀라아제 (전분당화력시험법 )
가. 전분당화력시험 제1법
1) 기질용액의조제
미리 감자전분 약 1g을 정확히 칭량하여 105℃에서 2시간 건조하여 그 감량을 측정한다. 
그 건조물 1g에 대응하는 감자전분을 정확히 측정하여 삼각플라스크에 넣어 물 20㎖를 
넣고 잘 교반하면서 서서히 2N 수산화나트륨 시액 5㎖를 넣어 죽상태로 만들고 수욕상
에서 교반하면서 3분간 가열한 후, 물 25㎖를 넣어 냉각 후 2N 염산시약으로 정확히 중
화하여 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 1M 초산, 초산나트륨 완충액 10㎖
를 넣고 여기에 물을 추가하여 정확히 100㎖를 만든다.
2) 방 법
시료 적당량을 정밀하게 측정하여 1㎖당의 농도가 0.4～0.8 전분당화력단위로 되도록 물 
또는 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 0.1M 황산염  완충액을 넣어 녹인
후, 시료용액으로 한다. 시료가 완전히 녹지 않는 경우에는 이따금씩 교반 하면서 1시간 
방치한 후 원심분리하여 그 상등액을 시료 용액으로 한다. 기질 용액 10㎖를 정확히 칭
량하여 직경 30mm의 시험관에 넣어 37±0.5 ℃에서 10분간 방치한 후, 시료 용액 1㎖를 
정확히 측정하여 넣은 후 즉시 교반하여 37±0.5 ℃에서 정확히 10분간 방치한다. 다음에 
페린용액의 동(銅)액 2㎖를 넣어 시험관 입구에 깔때기를 끼우고 수조속에서 정확히 15
분간 가열하여 냉각시킨다 . 여기에 짙은 염화칼륨 시약 2㎖ 및 묽은 황산(1→6) 2㎖를 
넣고, 유리한 요오드를 즉시 0.05N 티오황산나트륨액으로 적정한다.(지시약 용성전분시약 
1～2방울) 이 경우에 적정 종점은 액의 청색이 없어진  때로 하며 그 적정량을 A㎖로 
한다. 별도로 기질용액 10㎖ 대신 물 10㎖를 취하여 이하 같은 방법으로 조작하여 그 적
정량을 B㎖로 한다.
     1g중의 전분당화력 단위 =(B-A) × 1.6 × 1
10×1
W
        W : 시료용액 1㎖중의 시료량(g)
4. 셀룰라아제 (섬유당화력 시험법)
가. 섬유당화력 시험법 제1법12장. 효소제
2211) 기질용액의 조제
미리 카르복시메틸셀룰로스나트륨 약 1g을 정확히 칭량하고, 105℃에서 4시간 건조하여 
그 감량을 측정한다. 그 건조물 0.625g에 대응하는 카르복시메틸셀룰로스나트륨을 정확
히 취하여 물 50㎖에 휘저어 섞으면서 조금씩 넣은 후 60～70℃에서 가끔씩 저으면서 
20분간 가열하여 녹이고 냉각한 후 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 1M 
초산, 초산나트륨 완충액 10㎖를 넣어 여기에 물을 넣어 정확히 100㎖로 만든다.
2) 방 법
가) 시료 적당량을 정밀하게 측정하여 1㎖당의 농도가 0.02～0.08 섬유당화력단위로 되도
록 물 또는 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 0.1M 초산, 초산나트륨완충
액을 넣어 녹인 후, 시료용액으로 한다. 시료가 완전히 녹지 않는 경우에는 이따금씩 
교반하면서 1시간 방치한 후 원심분리하여 그 상등액을 시료 용액으로 한다. 기질 용
액 4㎖를 정확히 칭량하여 25㎖의 메스플라스크에 넣어 37±0.5 ℃에서 10분간 방치한 
후, 시료 용액 1㎖를 정확히 측정하여 넣은 후 즉시 흔들어 섞고 37±0.5 ℃에서 정확히 
30분간 방치한다. 다음에 알칼리성 동銅 시약 B 2㎖를 넣어 흔들어 섞고 메스플라스크
에 뚜껑을 하고 수조속에서 30분간 가열하여 냉각시킨다 . 여기에 비소리브틴산 시약 2
㎖를 넣어 잘 흔든 후, 0.5N 수산화나트륨 시약 3㎖를 넣어 흔든 후 침전을 녹여 20분
간 방치한 후 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 1M 초산, 초산나트륨 완
충액을 넣어 정확히 25㎖로 한다. 이 용액 1㎖를 정확히 칭량하여 시료의 최대효소활
성을 나타내는 pH에 조제한 1M 초산, 초산나트륨 완충액 9㎖를 넣어 잘 섞은 후 파장 
750nm에서의 흡광도 AT를 측정한다. 별도로 시료 용액 1㎖를 정확히 칭량하고 25㎖의 
메스플라스크에 넣어 알칼리성 동銅 시약 B 2㎖를 넣어 흔들고 기질 용액 4㎖를 정확
히 칭량하여 넣고 교반하여 메스플라스크에 뚜껑을 막고 수조속에서 30분간 가열하여 
냉각시킨다 . 이하 같은 방법으로 조작하여 흡광도 AT'를 측정한다. AT 및 AT'에 대응
하는 포도당의 양(㎎)을 검량선에서 구하여 각각 GT 및 GT'로 한다. 
      1g중의 섬유당화력 단위 = GT-GT'
30×1
0.18×1
W
         W : 시료 용액 1㎖ 중의 시료의 량(g)
나) 검량선의 작성
미리 포도당 약 1g을 정밀하게 칭량하여 105℃에서 6시간 건조 후 그 감량을 측정한
다. 그 건조물 1g에 대응하는 포도당을 정확하게 칭량하여 물을 넣어 녹인 후 정확히 
1000㎖로 한다. 이 액을 1, 2, 3, 4 및 5㎖를 정확히 측정하여 각각에 물을 넣어 정확
히 10㎖로 한다. 각각의 액 1㎖ 기질용액 4㎖ 및 알칼리성 동銅용액 B 2㎖를 정확히 
칭량하고 25㎖의 메스플라스크에 넣어 잘 섞은 후 메스플라스크에 뚜껑을 막고 수욕상222에서 30분간 가열하여 냉각시킨다 . 비소몰리브덴산 시약 2㎖를 넣어 잘 섞고, 여기에 
0.5N 수산화나트륨시약 3㎖를 넣어 잘 섞어 침전을 녹여 20분간 방치한 후 시료의 최
대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 1M 초산, 초산나트륨 완충액을 넣어 각각 정확히 
25㎖로 한다. 이들 용액을 파장 750nm에서의 흡광도 A1, A2, A3, A4 및 A5를 측정한
다. 별도로 물 1㎖, 기질용액 4㎖ 및 알칼리성 동銅용액 B 2㎖를 정확히 칭량하여 이
하 같은 방법으로 조작하여 흡광도 A0를 측정한다. 흡광도 차이 (A1-A0), (A2-A0), 
(A3-A0), (A4-A0) 및 (A5-A0)를 종축으로 포도당의 양(㎎)을 횡축으로하여 검량선을 작
성한다.
나. 섬유당화력 시험법 제2법
1) 원 리 
셀룰라아제 (cellulase, 섬유소분해효소 )는 glucose의 β-1,4 결합에 의하여 축합된 셀룰로오
스(cellulose, 섬유소)의 가수분해에 관여하는 효소이다. 변성 섬유소인 carboxymethyl 
cellulase(CMC) 를 기질로 하여 효소를 작용시켜 기질이 분해되어 생성되는 환원당을 정
량하여 cellulase의 활성도를 측정한다.
2) 시약의 조제 
가) 0.1M 초산염완충용액 (pH 5.5) : 0.1M초산(acetic acid)과 0.1M초산나트륨 (sodium acetate)
을 14.8:35.2의 비율로  혼합한다.
나) 1N-NaOH 용액 
다) 2%(w/v)-CMC 용액
라) DNS(dinitrosalicylic acid) 용액
3) 측정 
가) 효소액의 조제
시료를 증류수에 용해시켜 적당한 농도로 사용한다. 최종의 희석액에는 0.1M 초산염완
충용액(pH 5.0)을 사용한다.
나) 활성도의 측정
2%(w/v) CMC 용액 1㎖를 시험관에 취하고, 여기에 0.1M 초산염완충용액 (acetate 
buffer, pH 5.5) 1㎖를 가하여 흔든다. 45℃의 항온수조에서 3분간 예열한 후 효소액(적
당하게 희석된 것, 희석배율 F) 0.2㎖를 넣어서 흔든다. 
45℃의 항온수조내에서 60분간 진탕 반응시킨다 . 반응직후에 1 N-NaOH 용액 1㎖를 가12장. 효소제
223하여 반응을 정지시킨다 . 100℃의 끓는 물에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켜도 된
다. 반응 상층액 0.2㎖를 취해서 DNS(dinitrosalicylic acid) 용액 0.6㎖씩 넣고  100℃의 
끓는 물에서 5분간 반응시킨다 . 그리고 증류수로 5㎖되게 희석시킨다 . 550nm에서 OD
값을 측정하여 CMC로부터 유리된 환원당(glucose)의 양을 환산한다. 환원당의 정량은 
Somogyi법이나 Bertrand법을 이용해도 무방하다. 측정된 환원당의 양을 G ug이라 한
다.
대조로서 2% CMC액 1㎖, 0.1M 초산염완충용액 1㎖, 1N-NaOH 용액 1㎖를 가하여 흔들
고, 다시 효소액 1㎖를 가한 혼합액 1㎖의 환원당을 정량하여 glucose로서 표시한다. 
이것을 B㎎으로 한다. 
4) 계 산 
셀룰라제 활성도 단위는 45℃에서 60분간에 생성되는 환원당(glucose)의 ㎎수로서 표시한
다. 
셀룰라제 활성도 = (G - B)×10×F  (F는 효소액의 희석배수)
5. β-글루카나아제
가. 제1법
1) 적용 및 원리 : 본 시험 방법은 Aspergillus niger 및 그 변종, Bacillus subtilis 및 그 변종
에서 얻어진 효소제의 β-글루카나아제 역가를 측정하는 방법이다. 역가시험은 pH 6.5, 
온도 40℃에서 리케닌(Lichenin) 기질의 15분간 가수분해에 근거를 두고 있다. 발생된 환
원물질에 따른 환원력의 증가는 Neocuproine 법으로 측정된다.
2) 시험용액조제 : 최종희석액 1㎖가 0.01～0.02 β-Glucanase units를 함유하도록 시험 용액
을 조제한다. 검체 일정량을 취하여 적당한 메스플라스크에 취하여 인산염완충액으로 
녹이고 인산염완충액으로 채운다.
3) 시험조작 : 25㎖ 메스플라스크 4개에 기질용액 2㎖씩을 넣고 40℃ 수욕조에서 10～15분
간 항온시킨다 . 시험관 1에는 인산염완충액 1㎖, 시험관 2(포도당표준품용 )에는 포도당표
준용액 1㎖, 시험관 3(효소공시험용 )에는 네오쿠프로인용액 A 4㎖와 시험용액 1㎖를 가하
고 시험관 4(효소시험용 )에는 시험용액 1㎖를 넣는다. 인산염완충액공시험용으로 제5의 
시험관을 준비하여 인산완충액 3㎖를 넣는다. 40℃에서 정확히 15분간 항온시키고 시험
관 1, 2, 4, 5에 네오쿠프로인용액 A 4㎖씩을 가하고 시험관 모두에 네오쿠푸로인용액 B 
4㎖씩을 가하여 유리마개를 한다.(고무마개는 사용하지 말 것) 수욕조에서 12분 동안 격
렬히 가열시켜 발색시키고 냉수에서 상온으로 식힌 다음 물을 가하여 전량을 25㎖로 한
다. 파라필름으로 마개를 하던가 또는 적당한 마개를 하여 수회 거꾸로 하여 내용물을 224혼합한 후 시험관 5의 인산염완충액공시험관을 대조액으로 하여 액층 1cm, 파장 450nm
에서 각 용액의 흡광도를 측정한다.
BGU=(A4-A3)×36×106×F
(A2-A1)×180×15×S
A4  : 효소시험용 (시험관 4)의 흡광도
A3  : 효소공시험용 (시험관 3)의 흡광도
A2  : 포도당표준품용 (시험관 2)의 흡광도
A1  : 기질공시험용 (시험관 1)의 흡광도
F   : 시험용액의 희석배수
S   : 검체의 채취량(㎍)
36  : 포도당표준용액에 함유된 포도당의 ㎍수
106  : ㎍을 g으로 환산하는 변환계수
180 : 포도당 1μ㏖의 무게
15  : 반응시간(분)
4) 역가의 정의 : 1 β-Glucanase unit(BGU) 는 상기시험조건하에서 1분간에 환원당으로서 포
도당 1μ㏖을 생성하는 효소의 양이다.
5) 시 액
가) 인산염완충액 : 인산칼륨 13.6g을 물 1,900㎖에 녹이고 70% 수산화나트륨용액을 가하
여 pH를 6.5±0.05로 조절하고 전량을 물로 채워 2000㎖로 한다.
나) 네오쿠프로인 (Neocuproine) 용액 A : 탄산나트륨 (무수) 40g, 글리신 16g 및 황산동(5수화
물) 450mg를 물 약 600㎖에 녹여 물을 가하여 1,000㎖로 한다.
다) 네오쿠프로인 (Neocuproine) 용액 B : 네오쿠프로인염산염 (Neocuproine  hydro- chloride) 
600㎎을 물 400㎖에 녹여 물을 가하여 500㎖로 한다. 황색이 나타나면 버린다. 
라) 기질용액 : 리케닌(Lichenin) 150mg을 유발에 갈아 미세분말로 하여 약 85℃의  물 50
㎖에 녹인다. 완전히 녹으면(20～30분 걸림) 수소화붕산나트륨 (Sodium borohydride) 90
㎎을 넣고 비점하에서 1시간 계속 가열한다. Amberlite MB-8 (또는 이와 동등한 이온 
교환수지) 15g을 가하고 30분간 계속 저어준다. Buchner 깔때기와 왓트만 No.1 또는 
동종의 여지를 사용하여 진공여과하고 물 20㎖로 씻는다. 여액에 인산일칼륨 680mg을 
가하고 0.22㎛ 밀리포아여과기 (또는 이와 동등한 것)를 사용하여 다시 여과한다. 여과
기를 물 10㎖로 씻고 1N 수산화나트륨용액 또는 1N 염산으로 pH를 6.5±0.05로 조절
한 다음 물을 가하여 100㎖로 한다. 2～4℃에서 보관하고 3일이내에 사용하여야 한다.
마) 포도당표준용액 : 포도당(무수) 36.0mg을 인산염완충액 50㎖에 녹여 물을 가하여 1.000
㎖로 한다.12장. 효소제
2256. 글루코아밀라아제 (아밀로글루코시다아제 )
1) 적용 및 원리:
본 시험방법은 Aspergillus niger 및 그 변종에서 얻어진 효소제의 글루코아밀라아제 역
가를 측정하는 방법이다. Aspergillus oryzae 및 그 변종에서 얻어진 효소제의 역가측정
에서도 변형되어 사용될 수 있다. 역가시험은 일정시간, 온도, pH 및 농도 조건하에서 
옥수수전분 가수분해용액이 분해되어 생성된 환원당으로서 측정한다. 
2) 시험용액조제 :
하기 실험은 글루코아밀라아제 역가 0.1～0.2unit를 함유하는 검체의 사용에 기초를 두고 
있다. 이 검체의 양은 동 시험조건하에서 환원당 0.2 ～ 0.4g을 생성하는 양이 되며 이 
범위에서 가장 적합한 값이 얻어진다. 액체검체, 고체검체 및 액체농축물은 다음 도표에 
따라 조제되고 표시된 일정량이 사용되어야 한다.
가) 액체검체
검체중의 효소(단위/㎖)희석배율 (㎖)취하는 양(㎖)희석배수 (F)
0.05이하 - 5.0 0.2
0.06～0.1 - 2.0 0.5
0.11～0.25 - 0.80 1.25
0.3～0.5 - 0.40 2.5
0.6～1.0 - 0.20 5
1.1～2.0 - 0.10 10
2.1～4.0 5.0→100 1.00 20
4.1～5.0 4.0→100 1.00 25
5.1～7.0 3.0→100 1.00 33.3
7.1～10.0 2.0→100 1.00 50
나) 고체검체 및 액체농축액226검체중의 효소(단위/㎖)검체무게 (g)*희석되는 양(㎖)취하는 양(㎖)
4이하 10 1,000 5.0
5～10 4 1,000 5.0
11～25 1.6 1,000 5.0
26～50 1.4 1,000 3.0
51～75 1.25 1,000 2.0
76～100 1.00 1,000 2.0
101～150 1.25 1,000 1.0
151～200 1.00 1,000 1.0
201～250 1.50 2,000 1.0
251～300 1.00 2,000 1.0
※ 검체를 정밀히 달아 1,000㎖ 메스플라스크에 넣고 물로 2/3정도 채우고 상온에서 30분
간 방치한다. 방치하는 동안 격렬히 흔들어 주는 조작을 5회 이상 실시한 다음 물로 
채운다. 이 용액을 왓트만 No.12 또는 동종의 여지를 사용하여 여과한 여액을 시험용
액으로 하여 지시된 일정량을 취한다. 
3) 시험조작:
가) 환원당의 생성 : 전분가수분해물의용액 50㎖와 초산염완충액 5㎖를 100㎖ 메스플라스
크에 넣어 시험용액용 플라스크로 한다. 대조용으로 다른 메스플라스크를 준비하여 
시험용액 대신 물을 취하여 시험용액의 경우와 동일하게 취급한다. 플라스크를 60℃
수욕조에 넣어 10분간 방치한다.(Aspergillus oryzae와 Rhizopus oryzae에 의해 생산된 
효소는 55℃에서 실시한다) 해당량의 시험용액용 플라스크에 가하고 동시에 시간을 
측정한다.(여러개의 검체를 분석할 경우는 120분간의 반응시간 후 각각 중화시키는 
시간을 고려하여 시험용액을 취하는 시간에 간격을 둔다) 내용물을 흔들어 완벽하게 
혼합하고 수욕조에서  120분간 방치한다. 반응 시간이 115～118분 지났을 경우 페놀
프탈레인시액 3방울을 가하고 정확히 120분이 되면 플라스크를 수욕조에서 꺼내어 빨
리 뷰렛을 사용하여 2％ 수산화나트륨용액으로 중화(약 3～7㎖가 소요됨)한 다음 흐
르는 물로 상온으로 식히고 물을 가하여 100㎖로 한다. 이 액 10㎖와 대조액 10㎖를 
취하여 다음과 같이 환원당량을 측정한다.
나) 환원당의 측정(Schoorl Method) : (주: 본 시험방법은 단백질을 함유하지 않는 용해성물
질에서 환원당을 측정하는데 적합한 방법이다. 다만 상당량의 단백질을 함유하는 검
체는 단백질 침전제로 처리한 후 실험한다) 펠링시액 A, B 각 10㎖씩을 취하여 250㎖ 
삼각플라스크에 넣고 위의 환원당 생성에 따라 얻은 용액 10㎖를 정확히 가한다. 대
조액도 동일하게 처리한다.(주: 여러개의 검체를 분석 할 경우 시험용액을 일련의 플
라스크에 취하여 물을 가하여 30㎖로 희석하여 펠링시액 A를 가하고 펠링시액 B는 12장. 효소제
227가열하기 직전에 가한다) 물을 가하여 50㎖로 하고 조용히 흔들어 내용물을 혼합한다. 
유리구 2개를 넣고 조그만 깔때기로 마개를 하고 가열하여 3분이내에 끓도록 하여 2
분간 계속 가열한다. 이어 얼음욕이나 흐르는 냉수에 빨리 식힌 다음 소량의 물로 깔
때기를 씻어내린다 . 이에 30％ 요오드칼륨 10㎖, 28％ 황산 10㎖를 가하고 요오드의 
색이 거의 없어질 때까지 0.1N 치오황산나트륨용액으로 재빨리 적정한 다음, 다시 전
분시액 1㎖를 가하여 0.1N 치오황산나트륨용액의 소비 ㎖수를 S로 하고 대조액에 소
비된 ㎖수를 C로 한다. 검체에 대해 물 30㎖로 대체하여 시약공시험을 두 개 행한다. 
그 소비 ㎖수의 평균치를 B로 한다. B에서 S를 빼서 검체에 대해 0.1N 치오황산나트
륨용액 소비㎖수로서 표시하여 적정차값을 구하여 Ts로 한다. B에서 C를 빼서 대조
액에 대한 적정값을 구하고 이를 Tc로 한다. 
적정차값의 환원당량 환산표 ⓐ
적정차
(㎖)0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
환원당량 (포도당으로 ) (㎎)
0.00.00.30.71.01.31.61.92.22.52.8
1.03.23.53.84.14.44.75.05.35.65.9
2.06.46.66 6.97.27.57.88.18.58.89.1
3.09.49.810.110.410.711.011.411.712.012.3
4.012.613.013.313.610.014.314.615.015.315.6
5.015.916.316.616.917.217.617.918.218.518.9
6.019.219.519.820.120.520.821.121.421.822.1
7.022.422.723.023.323.724.024.324.624.925.2
8.025.625.926.226.626.927.327.628.028.328.6
9.028.929.319.630.030.330.631.031.331.631.9
10.032.332.733.033.333.734.034.334.635.035.3
11.035.736.036.336.737.037.337.638.038.338.7
12.039.039.339.640.040.340.641.041.341.742.0
13.042.442.843.143.443.744.144.444.845.245.5
14.045.846.246.546.947.247.647.348.348.648.9
15.049.349.649.950.350.751.151.451.752.152.4
16.052.853.253.553.954.254.554.955.355.656.0
17.056.356.757.057.357.758.158.458.859.159.5
18.059.860.160.560.961.261.561.962.362.663.0
19.063.363.664.064.364.765.065.465.866.166.5
20.066.967.267.668.068.468.869.169.569.970.3
21.070.771.171.571.972.272.673.073.473.774.1
22.074.574.975.375.776.176.576.977.377.778.1
23.078.578.979.379.780.180.580.981.381.782.1
24.082.683.083.483.884.284.685.085.485.886.2
25.086.687.087.487.888.288.689.089.489.890.2228※ 위의 도표의 사용은 분석자가 자료가 얻어지는 조건하에 2회의 실험값이 동일하여야 
함을 전제로 한다. 오차의 위험은 이미 알고 있는 순수한 포도당의 양(10～70mg범위의 
5개 검체)으로 세심한 중복의 표준화에 의해 피할 수 있다. 포도당mg에 대한 적정차값
의 검량선은 원점을 통과하여 약간 굽은 일직선이 된다. 만약 표준화 곡선이 채택될 
경우 치오황산나트륨용액은 표정을 구하지 않아도 된다. 0.065N 치오황산나트륨용액을 
사용하므로 공시험적정값을 44～45㎖로 증가시켜 더 정확한 결과를 얻을 수 있다. 
다) 환원당 함량 : 적정값의 환원당량 환산표를 참고로 하여 검체에 대한 적정차값(Ts)에 
해당하는 환원당량(mg)을 찾아 그 값을 Ws라 한다. 동일한 방법으로 대조액에 대한 적
정차값(Tc)에 대한 환원당량(mg)을 찾아 그 값을 Wc라 한다. 시험용액 취한 량에 의해 
생성된 총환원당(포도당)량은 다음 계산식에 따라 구한다. 
Ds/g=WS×100
1,000×10
대조액에 의해 생성된 총환원당(포도당)량은 다음 식에 따라 구한다.
Dc/g=WC×100
1,000×10
     ․액체효소역가의 계산 
       다음 계산식에서 따라 분석한 액체효소제의 역가를 구한다.
Glucoamylase,units/㎖=(Ds-Dc)×F
2h
F: 희석배수
       다음 계산식에 따라 분석한 액체효소제의 역가를 구한다. 
               Glucoamylase,units/㎖=(DS-DC)×V
(G×A×2h)=
V:  희 석 용 량 (㎖)
A:  시험에 사용된 시험용액의 양
            (시험용액조제에서 고체검체에 및 액체농축물에 대한 표를 참조할 것)
G:  검체의 채취량(g)
4) 역가의 정의 :
1 Glucoamylase unit(GAU) 는 상기 시험조건하에서 1시간에 환원당으로서 포도당 1g을 생
성하는 효소의 양이다. 적정차
(㎖)0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9
26.090.791.191.591.992.392.793.193.593.994.3
27.094.812장. 효소제
2295) 시 액
가) 전분가수분해물용액 (4%) : 포도당 당량(Dextrose equivalent, DE)이 15～20인 옥수수시
럽 고형물을 건조물로 40g에 상당하는 양을 달아 녹여 1000㎖로 한다. 이 용액은 매
일 새로 조제하여 사용한다. 
나) 초산염완충액 : 빙초산 60g을 달아 물을 가하여 1,000㎖로 한 다음, 초산나트륨
(NaC2H3O2․3H2O) 136g을 녹여 1,000㎖로 한 액으로 pH 4.2로 조절한다.(Aspergillus 
oryzae, Rhizopus oryzae에 의해 생산된 효소제는 pH 5.0으로 한다)
다) 펠링시액 A : 황산동(CuSO 4․5H2O) 34.66g을 달아 물을 가하여 500㎖로 한다. 이 용액은 
적은 용기에 보관하고 마개를 꼭하여 보존한다. 
라) 펠링시액 B : 주석산칼륨나트륨 (KNaC 4H4O6․4H2O) 173g을 물 일정량에 녹이고 수산화나
트륨 50g을 가하여 녹인 후 물을 가하여 500㎖로 한다. 이 용액은 적은 용기에 보관
하고 마개를 꼭하여 보존한다. 사용시에는 A액과 B액 동량을 혼합한다. 이론적 공시
험적정치는 27.8㎖이나 적정치가 27.5～29.5㎖이면 적당하다. 
7. 헤미셀룰라아제
1) 적용 및 원리
본 시험방법은 Aspergillus niger 그 변종에서 얻어진 효소제의 헤미셀룰라아제역가를 측
정하는 방법이다. 역가시험은 pH 4.5, 온도 40℃에서 로커스트콩검기질의 내부 Glycosidic
결합의 효소적 가수분해에 근거를 두고 있다. 기질의 점도에 있어서 해당되는 감소는 눈
금보정이 된 점도계를 사용하여 측정한다.
2) 시험용액조제
최종희석액 1㎖가 본 시험방법의 제시된 조건하에 5분안에 0.18～0.22사이의 상대유동성 
변화를 생성하도록 물로 희석하여 시험용액을 조제한다. 검체 일정량을 유리분쇄기에 취
하고 물을 넣어 둔다. 이를 적당한 용량의 메스플라스크에 옮겨 물로 일정량으로 희석하
고 사용전에 왓트만 No.1 또는 동종의 여지로 여과한다.
3) 시험조작
눈금보정된 점도계를 미리 충분한 양의 세제에 담근 다음 물을 사용하여 깨끗이 닦은 
다음 40±0.1 ℃의 유리 수욕조에 정확하게 수직으로 장치한다. 기질용액 20㎖와 초산염
완충액 4㎖를 50㎖ 공전삼각플라스크에 취하고 1 검체당효소시험용 2개, 기질공시험용 1230개를 준비한다. 효소시험용 플라스크에 마개를 하고 수욕조에서 15분간 방치하여 온도를 
평형시킨 다음 이에 시험용액 1㎖를 정확히 취하여 가해주고 시간을 측정하기 시작하며 
용액을 잘 혼합한다. 즉시 이 혼액 10㎖를 취하여 점도계의 큰가지에 가하고 반응용액을 
점도계의 가느다란 가지입구에 고무관을 부착하여 상부눈금위까지 빨아올린다 . 용액이 
상부눈금에 도달할 때까지의 시간(분)을 측정하고 이를 TR이라고 하고, 다시 상부눈금을 
통과하여 하부눈금을 통과하는 시간(초)을 측정하여 이를 TT라 한다. 다시 반응용액을 
상부눈금위로 빨아 올리고 액의 표면이 상부의 눈금에 도달 할때까지의 시간(분)을 즉시 
측정하여 반응시간 TR로 하고 상부눈금에서 하부눈금까지 도달하는 시간(초)을 측정하
여 이를 TT로 한다. 15분 이내에서 반응시간(TR)에 대하여 “다시 반응용액을 상부눈금
위로 빨아”이하의 조작을 총 4회 반복한다. 기질공시험용에는 기질용액 20㎖와 초산염
완충액 4㎖의 혼액에 물 1㎖를 가하여 혼합하고 이 혼액 10㎖를 즉시 취하여 점도계의 
큰가지에 넣은 다음 액을 상부눈금에서 하부눈금까지 도달하는 시간 TS(초)를 5회 반복
하여 평균한 값을 TS로 한다. 물공시험용에는 미리 40±0.1 ℃로 평형시킨 물 10㎖를 취
하여 점도계의 큰 가지에 넣고 두 눈금사이에 도달하는 시간 TW(초)를 5회 반복 측정하
여 평균 한 값을 TW로 한다. 
4) 다음 식에 따라 4회의 유출시간(TT)과 반응시간(TR) 각각에 대하여 상대유동성 (FR)과 TN
값을 구한다. 
FR=TS-TW
TT-TW
TN=1
2(TT/60초/분)+TR=TT
120+TR
FR: 각 반응시간에 대한 상대유동성
TS: 기질공시험에 대한 평균 유출시간(초)
TW: 물공시험에 대한 평균 유출시간(초)
TT: 효소반응용액의 유출시간(초)
TR: 반응의 경과시간(분) (시험용액을 가한 시간에서 유출시간(TT) 측정시작 시간
까지)
TN: 반응시간(TR)(분)+ 시험용액 유출시간(TT)(분)의 1/2
4개의 반응시간(TN)에 대한 4개의 상대유동성 (FR)을 사용하여 표준곡선을 작성한다. 이
때 하나의 직선이 그려져야 한다. 선의 기울기는 분당 상대유동성변화에 대응하며 효소
의 양에 비례한다. 일련의 시험점을 통과하는 최선의 선의 기울기는 단독의 상대유동성 
값보다는 좋은 효소역가의 기준이 된다. 표준곡선으로부터 10분과 5분에서 FR값을 측정
한다. 유동성의 차이는 0.18～0.22이어야 한다. 12장. 효소제
2315) 다음 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.
HCU/g=1,000(FR10-FR5)
W
FR10 : 반응시간 10분에서 상대유동성
FR5 : 반응시간 5분에서 상대유동성
1,000 : g을 mg으로 환산
W : 시험용액 1㎖에 함유된 검체의 양(mg)
6) 역가의정의
1 Hemicellulase unit(HCU) 는 상기시험조건하에서 로커스트콩검기질에서 5분동안에 1 상
대유동성변화를 생성하는 역가이다.
7) 장  치
가) 점도계: 싸이즈-100의 눈금보정이 된 캐논-펜스케형 점도계(Cannon- Fenske Type 
Viscometer) 를 사용하거나 이와 동등한 것을 사용하다.
나) 유리수욕조 : 40±0.1 ℃의 유리항온수욕조를 사용한다.
8) 시약 및 시액
가) 초산염완충액 (pH 4.5) : 0.2N 초산나트륨용액을 0.2N 초산 400㎖에 계속 저으며 가하며 
pH를 4.5±0.05로 조절한다.
나) 로커스트콩검 : 분말형 로커스트콩검이 기질성분 Lot에 따라 품질이 다르기 때문에 
Lot가 바뀔 때는 서로 동질의 것인가를 확인하여야 한다. 서로간의 점도차이가 ±5% 
이상이면 동일시험에 적용할 수 없다.
다) 기질용액 : 혼합기그릇에 0.2N염산 12.5㎖와 더운 물(70～75℃) 250㎖를 가하고 혼합기
를 저속에 맞춘다. 건조물로서 2g의 로커스트콩검을 용액 용기내에서 튀어 나오지 않
게 하여 천천히 그릇 내에서 분산시킨다 . 고무 폴리스만을 사용하여 더운물로 그릇기
벽을 씻어 내린 다음 그릇에 뚜껑을 하고 고속에서 5분간 혼합한다. 이를 1,000㎖ 비
이커에 옮겨 상온으로 냉각시킨 후 0.2N 수산화나트륨용액으로 pH 6.0으로 조절한다. 
이를 1,000㎖ 메스플라스크에 옮겨 물을 가하며 1,000㎖로 하고 사용전에 거즈로 여과
하여 사용한다.2328. 펙티나아제 (pectinase)
가. 적용 및 원리 
본 시험 방법은 Aspergillus niger에서 얻어진 효소제의 펙티나아제 역가를 측정하는 방
법이다. 역가시험은 pH 5.0 온도 40℃에서 얻어진 Pecticacid 의 가수분해로 생성된 
Galacturonic acid의 환원당을 측정하는데 근거를 두고 있다.
나. 시험용액의 조제
최종 희석액 1㎖가 20～40 Pectinase units를 함유하도록 물로 희석하여 시험용액을 조제
한다.
다. 시험조작
기질용액 20㎖를 100㎖ 삼각플라스크에 넣고 40℃의 수욕조에서 미리 10분간 항온시킨
다. 항온시킨 기질용액에 시험용액 2㎖를 넣고 60분간 작용시킨다 . 별도의 삼각플라스크
에 1M 탄산나트륨용액 2.5㎖를 가해주고, 이에 위의 반응액 10㎖를 가하여 반응을 중지
시킨 다음 0.1N 요오드용액 5㎖를 가해주고 밀전하여 암소에 20분간 방치한 후 2M 황산 
5㎖, 전분시액 4～5방울을 가하여 0.01N 치오황산나트륨용액으로 적정한다. 여기에 소비
된 양(㎖)을 S라 한다. 따로 공시험용으로 시험용액 대신 10분간 수욕조에서 가열실활시
킨 시험용액 2㎖를 사용하여 위의 시험조작에 따라 시험하여 0.01N 치오황산나트륨의 
소비 ㎖수를 B라 한다.
  다음 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.
 펙티나아제역가(U/g)=(B-S)×f×3.35×22
2×10×W
 3.35 : 0.01N 치오황산나트륨용액 1㎖에 상당하는 galacturonic acid의 μ㏖수
    f : 0.01N 치오황산나트륨용액의 factor
   22 : 최종반응액의 양(㎖)
    2 : 사용된 시험용액의 양(㎖)
   10 : 사용된 반응액의 양(㎖)
       W : 시험용액 1㎖에 함유된 검체의 양(g)
라. 역가의 정의
1 Pectinase units는 상기시험조건 하에서 1μ㏖의 galacturonic acid를 생성하는 효소의 
양이다.12장. 효소제
233마. 시 액
1) 기질용액: 펙틴산(Fluka Co.)을 무수물로서 1g에 상당하는 양을 취한 다음 이에 0.5M 초
산완충액 40～50㎖를 가하여 가열용해하고 0.5N 초산완충액을 가하여 100㎖로 한다.
2) 0.50M 초산완충용액 (pH 5.0)
A액 : 초산 60g을 물에 녹여 1000㎖로 한다.
B액 : 무수초산나트륨 82g을 물에 녹여 1000㎖로 한다.
A액 148㎖와 B액 352㎖를 혼합하고 A액 또는 B액을 사용하여 pH 5.0으로 조절하여 물
을 가하여 전량을 1000㎖로 한다. 
9. 락타아제[펩틴당화력 (lactase) 시험법]
가. 기질용액의 조제
o-니트로페닐 -β-D-가락토피라노시드 0.172g을 칭량하여 시료의 최대효소활성을 나타내
는 pH로 조제한 마키르베인완충액을 녹여 정확히 100㎖로 한다. 
나. 방 법
시료 적당량을 칭량하여 1㎖당 농도가 0.05～0.08 락타아제 단위가 되도록 물을 넣어 녹
여 시료용액으로 한다. 시료가 완전히 녹지 않은 경우에는 가끔씩 교반하면서 1시간 방
치한 후, 원심분리하여 그 상등액을 시료용액으로 한다. 기질용액 3.5㎖를 정확히 칭량하
여 30℃에서 가온하여 시료용액 0.5㎖를 정확히 넣어 30℃에서 정확히 10분간 방치한 후 
탄산나트륨시약 1㎖를 정확히 넣어 교반한 후 이 액으로 파장 420nm에서 흡광도 AT를 
측정한다. 별도로 기질용액 3.5㎖를 정확히 칭량하여 30℃로 가열하여 탄산나트륨 시약 
1㎖를 정확히 넣어 교반한 후 여기에 시료용액 0.5㎖를 정확히 넣어 30℃에서 정확히 10
분간 방치하여 이 액으로 같은 방법으로 흡광도 AT'를 측정한다.
다. 계 산
   1g중의 락타제 단위 = AT-AT'
0.90×1
10×2
W
        W : 시료용액 1㎖중의 시료량(g)23410. 키시라나제 (키시란당화력 )
1) 기질용액의 조제
키시란 4.0g을 정확히 취하여 수산화나트륨 시액 50㎖에 서서히 가열하면서 격렬하게 흔
들어 녹이고, 페놀프탈레인 시약 2방울을 넣어, 1N 염산시약으로 중화시킨 후, 시료의 
최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 0.1M 초산, 초산나트륨 완충액 100㎖를 넣고 여
기에 물을 넣어 정확히 200㎖를 만든다.
2) 방 법
가) 시료적당량을 정밀하게 취하여 1㎖당의 농도가 0.1～0.2 키시란당화력단위로 되도록 
물 또는 시료의 최대 효소 활성을 나타내는 pH에 조제한 0.01M 초산, 초산나트륨 완충
액을 넣어 녹인 후 시료용액으로 한다. 시료가 완전히 녹지 않는 경우에는 가끔씩 섞
으면서 1시간 방치한 후, 원심분리하여 그 상층액을 시료용액으로 한다. 기질 용액 2㎖
를 정확히 취해 25×200mm 의 시험관에 넣고 40±0.2 ℃의 수조 속에 5분간 방치한 후 
시료용액 1㎖를 정확히 넣어 잘 섞은 후 즉시 40±0.2 ℃의 수조 속에 30분간 방치한다. 
다음에 묽은 황산((6→100) 0.5㎖를 넣고 잘 흔든 후 10분간 방치한 다음 페놀프타레인 
시약 1방울을 넣고 수산화나트륨 시약으로 중화한다. 
여기에 물을 넣어 5㎖를 만들고 알칼리성 동시에 A 5㎖를 정확히 넣어 시험관 입구를 
알루미늄 호일로 가볍게 덮고 가끔씩 흔들면서 20분간 수조속에서 가열한 후 20～30℃
로 냉각한다. 냉각 후 염화칼륨용액 (1→40) 2㎖를 넣고 여기에 묽은 황산(6→100) 1.5㎖
를 넣어 즉시 강하게 흔들어 섞는다. 액이 투명하게된 후, 0.005N 티오황산나트륨액으
로 적정한다.(전분지시약 1㎖) 이 경우, 적정의 종점은 액의 청색이 없어진 시기로 하
고 그 적정량을 A㎖로 한다. 
별도로 기질용액 2㎖를 정확히 취하여  25×200mm 의 시험관에 넣어 묽은 황산(6→
100) 0.5㎖를 넣어 잘 흔든 후, 시료용액 1㎖를 정확히 넣어 잘 흔들어 섞는다. 다음에 
페놀프타레인 시약 1방울을 넣어 이하 같은 방법으로 조작하여 그 적정량을 B㎖로 한
다. 0.005N 티오황산나트륨액의 소비량 차이(B-A)㎖에 대응하는 키시로스의 양(g)을 검
량선에서 구해 K라 한다. 
       1g중의 키시란당화력 단위 = K
150.13×10-6×30×1
W
          W : 시료 용액 1㎖ 중의 시료의 량(g)
나) 검량선의 작성
키시로스를 105℃에서 3시간 건조하여 그 0.5g을 정확히 취해 물을 넣어 녹여 정확히 
100㎖를 만든다. 이 액을 1㎖, 2㎖, 3㎖ 및 4㎖를 정확히 칭량하여 각각에 물을 넣어 
정확히 100㎖를 만든다. 각각의 액 5㎖를 정확히 칭량하여 각각을 25×200mm 의 시험12장. 효소제
235관에 넣어 알칼리성 동(銅) 시약 A 5㎖를 정확히 넣어, 이하 시료와 같은 방법으로 조
작하여 그 적정량을 B'㎖로 한다. 0.005N 티오황산나트륨액의 소비량 차이 (B'-S1), 
(B'-S2), (B'-S3) 및 (B'-S4)를 종축으로 각각에 대응하는 키시로스의 양(g)을 횡축으로하
여 검량선을 작성한다.
11. 키토사나아제
가. 적용 및 원리
본 시험 방법은 Aeromonas 속 및 Bacillus 속의 배양물에서 얻어진 효소제의 키토사나아
제 역가를 측정하는 방법이다. 역가시험은 pH 5.0 온도 48℃에서 Chitosan 기질의 가수
분해에 근거를 두고 있다. 가수분해에 의하여 생성된 환원당인 글루코사민을 알칼리성 
페리시아나이드 시액과 반응시켜 흡광도측정법으로 측정한다.
나. 시험용액조제
시험조건하에서 최종희석액 1㎖가 효소공시험용액과 흡광도차이가 0.1～0.5의 범위가 되
도록 일정량을 취한 다음 0.05M 초산염완충용액에 녹여 시험용액을 조제한다. 
다. 시험조작
기질용액 2㎖를 시험관에 넣고 이에 미리 48℃의 수욕조에서 5분간 항온시킨시험용액 1
㎖를 정확히 가해주고 흔들어 혼합한 후 수욕조에 방치한다. 정확히 5분후 시험관을 끓
는 수욕조에서 3분간 가열하여 효소반응을 중지시킨 다음 상온으로 식혀준다. 따로 효소
공시험용으로 시험용액대신 미리 수욕조에서 3분간 가열실활시킨 시험용액 1㎖를 사용
한다. 별도로 2개의 시험관에 물 1.4㎖를 각각 넣고 이에 위의 효소반응액 0.1㎖와 효소
공시험반응액 0.1㎖를 각각 가해준 다음 알칼리성페리시아나이드시액 2㎖씩을 가해 주고 
끓는 수욕조에서 15분간 가열하고 상온으로 식힌 다음 액층 1cm, 파장 420nm에서 효소
시험용액과 효소공시험용액의 흡광도를 각각 측정하여 표준곡선에서 D-글루코사민의 농
도(μ㏖/㎖)를 구한다.
라. 표준곡선
미리 건조 항량시킨 D-글루코사민 염산염 215.6mg을 정밀히 달아 물을 가하여 100㎖로 
한다. 이 액을 사용하여 1㎖당 D-글루코사민을 2.0, 4.0, 6.0, 10.0μ㏖/㎖을 함유하도록 글
루코사민표준용액을 각각 조제한다. 각 표준용액 1㎖와 물 2㎖를 각 시험관에 넣고 시험
관 모두를 끓는 수욕조에서 3분간 끓여주고 상온으로 식힌 다음 시험조작의 「별도로 2
개의 시험관에 」이하와 동일조작을 행한다. 따로, 표준용액 1㎖ 대신에 물 1㎖를 사용하236여 시험한 것을 대조액으로 하여 액층 1cm, 파장 420nm에서 각각의 흡광도를 측정하고 
글루코사민표준용액의 농도(μ㏖/㎖)에 대한 표준곡선을 작성한다.
    다음의 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.
      CU/㎖=A
5×W
 A : 표준곡선에서 얻은 시험용액의 D-글루코사민 표준용액의 농도(μ㏖/㎖)
 5 : 반응시간(분)
 W : 시험용액 1㎖에 함유된 검체의 양(㎖)
마. 역가의 정의
1 Chitosanase Unit(CU)는 상기시험조건하에서 분당 1μ㏖의 D-글루코사민에 상당하는 환
원당을 유리시키는 효소의 양이다.
바. 시  액
1) 0.05M 초산염완충액 : 0.1M 초산 14.8㎖와 0.1M 초산나트륨용액 35.2㎖를 혼합하고 물을 
가하여 100㎖로 한다. 이 용액의 pH는 5.0이어야 한다.
2) 기질용액 : 키토산(Sigma Co.) 0.2g을 물 40㎖에 현탁시키고 1.0M 초산 10㎖를 가하여 교
반 용해시킨 후 1.0M 초산나트륨용액을 가하여 pH를 5.0으로 조절한 다음 0.05M 초산염
완충액을 가하여 100㎖로 한다. 이 용액은 냉장고에 보관한다. 
3) 알칼리성페리시아나이드시액 : 페리시안화칼륨 (K3Fe(CN) 6) 0.5g을 0.5M 탄산나트륨용액 
1,000㎖에 녹인다. 이 액은 갈색병에 넣어 밀봉하여 보존한다.
12. 리파아제(지방소화력 )
가. 기질용액의 조제
폴리비닐알콜 시약, 올리브유혼합액 (3:1) 200～300㎖를 취하여 유화기 500㎖ 용기에 넣어 
10℃ 이하에서 냉각하면서 매분 12,000 ～16,000 회전으로 10분간 유화하여 시원한 곳에
서 1시간 방치한 후, 유층이 분리되지 않은 것을 확인한 후 사용한다.
나. 방 법12장. 효소제
237시료적당량을 정밀하게 취하여 1㎖당의 농도가 1.0, 5.0 지방소화력 단위가 되도록 차가
운 물에 넣어 녹인 후 시료용액으로 한다. 여과 또는 원심분리를 한다. 기질용액 5㎖ 및 
시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 0.1M 인산염완충액 4㎖를 정확히 칭량하
여 잘 혼합하고 37±0.5 ℃에서 정확히 20분간 방치한다. 다음에 아세톤, 에탄올 혼합액
(1:1) 10㎖를 넣어 잘 흔들어 섞어 0.05N 수산화나트륨 시약 10㎖를 정확히 추가하고 
0.05N염산으로 적정한다.(지시약 페놀프탈레인 시약 2～3방울) 이 경우에 적정의 마지막 
점은 액의 적색이 없어지는 때로 하고 그 적정량을 A㎖로 한다. 별도로 기질 용액 5㎖ 
및 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조제한 0.1M 인산염완충액 4㎖를 정확히 칭량
하여 잘 혼합 후, 37±0.5 ℃에서 30분간 방치한다. 다음에 아세톤, 에탄올 혼합액(1:1) 10
㎖를 정확히 넣어 섞고 이하는 같은 방법으로 조작하여 그 적정량을 B㎖로 한다.
   1g중의 지방소화력 단위 = 50×(B-A)×1
20×1
W
      W : 시료 용액 1㎖ 중의 시료의 량(g)
13. 피타아제(피틴산분해력 )
1) 시약의 조제
가) 기질용액의 조제
미리 피틴산나트륨을 데시케이터 (실리카겔)중에서 24시간 이상 건조하여 0.271g을 정확
히 칭량하여 시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조정한 0.2M 초산, 초산나트륨완충
액 50㎖를 넣고 용해하여 0.2N 초산시약을 넣고 pH 5.5로 조정 후, 동 완충액으로 정
확히 100㎖로 만든다.
나) 반응정지 발색액의 조제
0.01M 몰리브덴산 암모늄 시약 1용량에 5N 황산시약 1용량과 아세톤 2용량을 넣어 잘 
흔든 후 즉시 수중에서 냉각한다. 반응정지 발색액은 사용할 때마다 조제한다.
2) 방  법
가) 시료 적당량을 정확히 칭량하여 1㎖당 농도가 0.04～0.06 피틴산분해력 단위로 되도록 
시료의 최대효소활성을 나타내는 pH에 조정한 0.005M 초산, 초산나트륨 완충액을 넣어 
녹인 후 필요하다면 여과하여 시료용액으로 한다. 기질용액 0.5㎖를 정확히 칭량하여 
10㎖의 둥근바닥 원심관 또는 시험관에 넣어 37±0.5 ℃로 가온한다. 이 기질용액에 별
도로 37±0.5 ℃로 가온한 시료용액 0.5㎖를 정확히 넣어 즉시 교반하여 37±0.5 ℃에서 
정확히 10분간 방치한다. 그 후 얼음속에서 냉각한 반응정지발색액 2㎖를 정확히 넣어 
잘 혼합하여 여기에 1M 구연산시약 0.1㎖를 정확히 첨가하여 교반한다. 이 액을 5분이238내에 물을 대조액으로하여 파장 380nm에서 흡광도 ODT를 측정한다. 별도로 시료용액 
0.5㎖를 정확히 측정하여 수중에서 냉각한 반응정지 발색액 2㎖, 기질용액 0.5㎖, 1M 
구연산 시약 0.1㎖를 정확히 넣은 후 잘 혼합시킨다 . 이하 같은 방법으로 조작하여 흡
광도 ODTB를 측정한다. 
   1g중의 피틴산분해력 단위 =(ODT-ODTB)×F× 2 × 1
10×1
W× Z
   W : 량선에서 구한 흡광도차 1에 대응하는 인산이온 농도(μmol/㎖)
      시료용액 1㎖중의 시료량(g)
    F : 검  Z : 희석배율
나) 검량선의 작성
인산이수소칼륨을 데시케이터 (실리카겔)중에서 24시간이상 건조하여 0.680g을 칭량하여 
물을 넣고 녹여 1000㎖로 한다. 이 액 1, 2, 3 및 4㎖를 정확히 칭량하여 각각에 물을 
넣어 정확히 50㎖로 한다. 각각의 액 1㎖를 얼음 중에서 냉각한 반응정지 발색액 2㎖
를 넣어 교반하여 여기에 1M 구연산 시약 0.1㎖를 넣고 교반시킨다 . 물을 대조액으로
하여 파장 380nm에서 흡광도 ODS1, ODS2, ODS3, ODS4를 측정한다. 별도로 물 1㎖를 취
하여 얼음속에서 냉각한 반응정지 발색액 2㎖를 넣고 교반하여 여기에 1M 구연산시약 
0.1㎖를 넣어 교반한다. 물을 대조액으로하여 파장 380nm에서의 흡광도 ODSB를 측정
한다. 인산이온농도를 횡축으로 흡광도차 (ODS1-ODSB), (ODS2-ODSB), (ODS3-ODSB), 
(ODS4-ODSB)를 종축으로하여 검량선을 작성한다.
14. 산성프로테아제
1) 역가의 정의 
산성프로테아제 활성도의 역가(unit)는 (기질인 casein으로부터) 1분간에 1ug의 tyrosine을 
생성하는 효소의 양으로 표시한다.
2) 기구 및 장치
가) 항온수조
나) 시험관 ; Cap test tube (20×150mm) 
다) 분광광도계 ; 660nm  
3) 시약제조12장. 효소제
239가) 0.44M-Trichloroacetic acid 용액 : 
   Trichloroacetic acid 7.1892g을 물에 녹이고  100ml로 정용한다.
나) 0.1N-NaOH 용액 : 수산화나트륨 4g을 증류수 100ml로 용해한다.
다) 0.55M-탄산나트륨용액 : 무수 탄산나트륨 5.83g을 물 100㎖로 용해 한다.
라) Folin-Ciocalteu's Phenol Reagent, 2N (Sigma F9252) : 이 발색시약을 사용시 3배(시약1 
+ 물2)로 희석하여 사용한다. → 엷은 포린용액 
마) (기질용액) 0.6 % casein 용액 : 
Casein 0.6g을 정밀하게 칭량한 다음 0.1M lactic acid 60ml를 가하고 끓는 수욕 중에서 
용해시켜 즉시 냉각 시킨 다음, 0.1N-NaOH 와 0.1N lactic acid로 pH 2.6으로 조절한 후 
0.1M 유산염완충용액 (pH 2.6) 20ml를 넣고 다시 물을 가하여 100ml로 정용한다.
바) 0.1M 유산염 완충용액 (pH 2.6) : 
0.1M 유산(lactic acid) 과 0.1M 유산나트륨 (sodium lactate)용액을 16 : 1의 비율로 혼합
한다.(0.1M 유산은 유산 9.008g을 정밀하게 칭량하여 물에 용해시켜 1L로 하고, 0.1M 
유산나트륨은 유산나트륨 11.206g을 정밀하게 칭량하고 물에 용해시켜 1L로 하여 각각 
조제한다.)
4) 측정방법
가) 시료를 적정량 취하여 물로 추출한다. 최종의 희석액은 0.1M-유산염완충용액 (pH 2.6)을 
사용한다.
나) 효소액 1ml를 시험관에 취하고 미리 30℃로 예열시킨 0.6% Casein 용액 5ml를 가하여 
잘 흔든 후 정확히 10분간 항온수조 내에서 반응시킨다 .
다) 10분간 경과 즉시 0.44M-TCA 용액 5ml를 넣고 교반하여 반응을 중지시킨다 . 30℃에서 
30분간 방치한 후, 정량용 여과지로 여과한다.
라) 시험관에 여액 2ml를 취해 0.55M 탄산나트륨용액 5ml 및 엷은 포린용액(1→3) 1ml를 
넣어 잘 교반시켜 30℃에 30분간 방치한 다음 이 용액을 파장 660nm에서 흡광도(AT)
를 측정한다.
마) 공시험은 별도로 시료용액 1.0㎖를 캡시험관에 취하고 TCA용액 5㎖를 가한 다음 기질
용액 5㎖를 정확히 넣고 30± 0.5℃에 30분간 방치한다. 
이하 같은 방법으로 위 4)와 같이 조작하여 흡광도 Ab를 측정한다.
5) 검량선 작성(tyrosine standard calibration)
가) 티로신 표준품을 105℃에서 3시간 건조하여 0.1g을 정확히 칭량하고 0.2N 염산 용액으
로 용해하여 100ml로 한다. (100mg/100ml → 1000ppm)240나) 이 액  1, 2, 3, 4 및 5ml를 정확히 취하여 각각 0.2N 염산용액을 넣어 정확히 100ml로 
한다.  → 10, 20, 30, 40 및 50ppm(ug/ml) 용액
다) 각각의 액 2ml를 정확히 취하여 0.55M 탄산나트륨용액 5ml 및 엷은 포린용액 (1→3) 
1ml를 넣어 잘 교반 시켜 30℃에 30분간 방치한 후 이 용액을 파장 600nm에서 흡광도 
A1, A2, A3, A4, A5를 측정 한다. 
라) 별도로 0.2N 염산용액 2ml를 취해 이하 같은 방법으로 조작하여 흡광도 A0를 측정한
다.
마) 흡광도 값 {A1-A0, A2-A0, A3-A0 및 A4-A0}를 횡(X)축으로 하고 티로신의 양(ug)을 종
축(Y)으로 하여 검량선(회귀방정식 )을 작성한다.
6) 계 산
   산성프로테아제 활성도(U/g) = (AT - Ab') × F 11/2 × 1/10 × 1/W
     여기서 F : 검량선에서 구한 흡수광도 1에 대응하는 티로신의 양(㎍)
            W: 시료용액 1ml중의 시료의 양(g)
15. 중성프로테아제 [단백질소화력 (protease) 시험법]
가. 기질용액의 조제
미리 우유로 만든 카제인 약 1g을 정확히 측정하여 105℃에서 2시간 건조하여 그 감량
을 측정한다. 그 건조물 1.20g에 대응하는 우유로 만든 카제인을 정확히 측정하여 0.05M 
인산-수소나트륨 시약 160㎖를 넣어 수욕상에서 가온하여 녹인다. 이 액을 흐르는 물에
서 냉각시킨 후 1N 염산시약 또는 수산화나트륨 시약을 첨가하여 시료의 최대효소활성
을 나타내는 pH에 조제한 후, 물을 넣어 정확히 200㎖를 만든다.
나. 방  법
1) 시료 적당량을 정밀하게 측정하여 1㎖당의 농도가 10～30 단백질소화력단위로 되도록 
물 또는 0.02M 인산염 완충액을 넣어 녹인 후, 시료용액으로 한다. 시료가 완전히 녹지 
않는 경우에는 이따금씩 교반 하면서 1시간 방치한 후 원심분리하여 그 상등액을 시료 
용액으로 한다. 기질 용액 5㎖를 정확히 칭량하여 25㎖의 메스플라스크에 넣어 37±0.
5℃에서 10분간 방치한 후, 시료 용액 1㎖를 정확히 측정하여 넣은 후 즉시 교반하여 
37±0.5 ℃에서 정확히 10분간 방치한다. 다음에 트리클로로초산시약 B 5㎖를 넣어 교반12장. 효소제
241하여  37±0.5 ℃에서 30분간 방치한다. 여과지에 이 액을 여과시켜 침전물을 완전히 제
거한 후, 이 용액 2㎖를 정확히 칭량하여 0.55M 탄산나트륨시약 5㎖ 및 엷은 포린시약(1
→3) 1㎖를 넣어 잘 교반시켜  37±0.5 ℃에서 30분간 방치한 후 이 액을 파장 660nm에
서 흡광도 AT를 측정한다. 별도로 시료 용액 1㎖를 정확히 칭량하고 25㎖의 메스플라스
크에 넣어 트리클로로초산시약 B 2㎖를 교반하고 기질 용액 5㎖를 정확히 넣어 37±0.
5℃에서 30분간 방치한다. 이하 같은 방법으로 조작하여 흡광도 AT'를 측정한다. 
   1g중의 단백질소화력 단위 = (AT-AT')×F×11
2×1
10×1
W
     W : 시료 용액 1㎖ 중의 시료의 량(g)
     F : 검량선에 구한 흡수광도 1에 대응하는 티로신의 양(㎍)
2) 검량선의 작성
티로신 표준품을 105℃에서 3시간 건조하여 0.5g을 정확히 칭량하고 0.2N 염산시약을 넣
어 용해하여 정확히 500㎖로 한다. 이 액을 1, 2, 3, 4 및 5㎖를 정확히 취하여 각각 
0.2N 염산시약을 넣어 정확히 100㎖로 한다. 각각의 액 2㎖를 정확히 취하여 0.55M 탄산
나트륨시약 5㎖ 및 묽은 포린시약(1→3) 1㎖를 넣어 잘 교반시켜  37±0.5 ℃에서 30분간 
방치한 후 이 액을 파장 660nm에서 흡광도 A1, A2, A3, A4를 측정한다. 별도로 0.2N염
산시약 2㎖를 정확히 칭량하여 이하 같은 방법으로 조작하여 흡광도 A0를 측정한다. 흡
광도 차이 (A1-A0), (A2-A0), (A3-A0), (A4-A0) 및 (AS-A0)를 종축으로 티로신의 양(㎎)을 
횡축으로하여 검량선을 작성한다. 
16. 식물성프로테아제
가. 정의
파파인, 피신, 브로멜라인 등 식물에서 얻어진 효소제이다 .
나. 분석원리
본 역가시험은 pH 6.0, 온도 40℃에서 60분간 카제인 기질의 단백질가수분해에 근거를 
두고 있다. 가수분해 되지 않은 기질은 삼염화초산으로 침전하여 여과에 의해 제거되고 
용해된 카제인을 흡광도 측정법으로 측정한다.
다. 시험용액의 조제
최종희석액 2mL의  흡광도가 0.2～0.5의 범위가 되도록 검체를 정밀히 달아 유발에 취242하고 인산염-시스테인-이.디.티.에이.완충액을 가하여 분쇄시킨 다음 이를 메스플라스크
에 옮겨 인산염-시스테인-이.디.티.에이.완충액으로 채운다.
라. 시험조작
25×150mm 시험관 3개는 효소시험용으로 , 6개는 파파인검량선용으로 하여 이들 각각에 
카제인기질용액 5mL씩을 넣는다. 이를 40±0.1 ℃의 수욕조에서 15분간 항온 시킨 후 시
험용액 2mL, 표준용액 2mL를 각각 가하여 흔들어 섞고 마개를 하여 다시 수욕조에서 
60분간 항온시킨 후 각각의 시험관에 삼염화초산용액 3mL씩을 가하여 흔들어 섞는다. 
별도로 효소공시험용 시험관 9개에는 기질용액 5mL, 삼염화초산용액 3mL를 가하여 흔
들어 섞고, 이에 시험용액, 해당 표준용액 2mL를 정확히 취하여 각각 가한다. 시험관 모
두를 다시 수욕조에서 30분간 항온하여 침전된 단백질을 완전히 응고시킨 다음 왓트만 
No. 42 또는 동종의 여지를 사용하여 여과한다. 초류액 3mL는 버리고 완전히 투명한 여
액을 사용하여 각각의 공시험용액을 대조액으로 하여 액층 1cm, 파장 280nm에서 흡광
도를 측정한다. 표준용액농도 (mg/mL)에 대하여 여액의 흡광도로 검량선을 작성한다. 검
량선으로부터 시험용액에서 얻은 여액의 농도를 구한다.
    다음 계산식에 따라 효소제의 역가를 구한다.
역가(PU/mg) =A × C ×10
W
  A : USP 파파인표준품의 역가(PU/mg)
  C : 검량선에서 구한 효소시험용액에 대응하는 표준품의 농도(mg/mL)
  W : 시험용액 2mL에 함유된 검체의 양(mg)
마. 역가의 정의
1 Papain unit(PU)는 상기시험조건 하에서 1시간 동안에 Tyrosine 1μg 상당량을 유리시키
는 효소의 양이다.
바. 시액
1) 인산나트륨용액 (0.05M) : 인산이나트륨 (무수) 7.1g을 500mL의 물에 녹이고 물을 가하여 
1,000mL로 한다. 이에 보존료로서 톨루엔 한방울을 가한다.
2) 구연산용액 (0.05M) : 구연산(1수화물) 10.5g을 500mL의 물에 녹이고 물을 가하여 1,000mL
로 한다. 이에 보존료로서 톨루엔 한방울을 가한다.
3) 인산염-시스테인-이.디.티.에이.완충액 : 인산이나트륨 7.1g을 약 800mL의 물에 녹이고 
이에 이.디.티.에이.이나트륨(2수화물) 14.0g과 시스테인염산염 (1수화물) 6.1g을 녹인다. 
1N 염산 또는 1N 수산화나트륨용액으로 pH 6.0±0.1로 맞추고 물을 가하여 1,000mL로 
한다.12장. 효소제
2434) 삼염화초산용액 : 삼염화초산 30g을 물에 녹여 100mL로 한다.
5) 기질용액 : 카제인(Hammarsten) 1g(건조물로서 )을 인산나트륨용액 50mL에 녹이고 끓는 
수욕조에서 30분간 때때로 흔들어 주면서 가열시킨다 . 이를 냉각시켜 계속 흔들어 주며 
구연산용액으로 pH 6.0±0.1로 맞춘다(※주 : 계속 빨리 흔들어주면 침전이 생기지 않는
다). 이에 물을 가하여 정확히 100mL로 한다.
6) 표준원액 : USP파파인표준품 100.0mg을 인산염-시스테인-이.디.티.에이.완충액에 녹여 
100mL로 한다.
7) 표준용액 : 표준원액 2, 3, 4, 5, 6 및 7mL를 100mL 메스플라스크에 각각 취하고 이에 
인산염-시스테인-이.디.티.에이.완충액으로 용량을 맞춘다.
17. 브로멜라인
가. 시약 및 제조방법
이 품목 약 0.1g을 정밀하게 달아 유발에 넣고 효소희석액 적당량을 넣어 저어 섞은 다
음 100ml 용량플라스크에 옮긴다. 유발은 효소희석액 약 50ml를 써서 잘 씻고, 씻은 액
은 용량플라스크에 합치고 다시 효소희석액을 넣어 100ml 로 한다. 이 액을 원심분리하
여 얻은 상징액을 다시 효소희석액으로 희석하여 1ml중에 30～50브로멜라인 단위를 함
유하는 액을 만들어 검액으로 한다. 검액 1ml를 정확하게 취하여 시험관에 넣고 37±0.
5℃로 5분간 유지한다. 따로 37±0.5 ℃로 미리 가온한 기질액 5ml를 시험관중의 검액에 
빨리 넣고 효소반응을 시킨다. 
정확하게 10분후에 침전시약 5ml를 넣어 잘 흔들어 섞고 37±1 ℃에서 40분간 방치한 다
음 정량용여지를 써서 여과한다. 처음 여액 3ml를 버리고 다음 여액을 가지고 2시간 이
내에 물을 대조로 하여 파장 275nm에서 흡광도 A를 측정한다. 따로 검액 1ml를 정확하
게 취하여 침전시약 5ml를 넣어 잘 흔들어 섞은 다음 기질액 5ml를 넣고 이하 같은 방
법으로 조작하여 흡광도 A0를 구한다. 
따로 티로신 표준품을 정밀하게 달아 0.1mol/L 염산시액에 녹여 그 1ml 중에 티로신 
50.0㎍을 함유하는 액을 만들어 이 액을 가지고 물을 대조로 하여 파장 275nm에서 흡광
도 As를 측정한다.
이품목1mg중의단위수=A-A0
As×50×11
10×1
검액1ml중의검체량(mg)
나. 역가의 정의
1 브로멜라인 단위는 위의 반응조건에서 1분간에 티로신 1㎍에 해당하는 반응물을 생성
시키는 효소량으로 한다.24413장 향미제
1. 사카린나트륨
가. 액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량
1) 분석원리
검체 중의 사카린나트륨을 반투막을 이용하여 투석한 후, 투석외액을 역상계 및 강음이
온교환형 카트리지로 정제한 다음 액체크로마토그래프로 정성 및 정량분석하는 방법이
다.
2) 장 치
가) 정제용 카트리지
① 역상계 카트리지 ：Sep-pak C18 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 
mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).
② 강음이온교환형 카트리지 ：Sep-pak QMA 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 
및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).
3) 시약 및 시액
가) 투석내액 ：염화나트륨 100 g 및 인산 7 mL를 물에 녹여 1,000 mL로 한다.
나) 투석외액 ：인산 7 mL를 물에 녹여 1,000 mL로 한다.
다) 0.1M TPA-Br용액：TPA-Br(Tetrapropylammonium bromide) 2.66 g을 물에 녹여서 100 
mL로 한다.
라) 표준용액 ：사카린나트륨을 120에서 4시간 건조시킨 후 100 mg을 정밀히 달아 물에 녹
여 100 mL로 한다. 사용시 이 용액 1～10 mL를 취하고 물을 가하여 100 mL로 한 것
을 표준용액으로 한다.
4) 시험용액의 조제
가) 투석
액체검체는 10～20 g을 취하고, 고체 또는 반고체검체는 균질화하거나 잘게 썰어 잘 
섞은 후 10～20 g 취한 다음 투석내액 약 20 mL를 가하여 혼합한다. 이 혼합액을 투
석용 튜브(분자량 12,000 ～14,000)에 넣고 튜브의 끝을 밀봉한다. 미리 투석외액 약 150 
mL를 넣은 눈금이 있는 용기에 튜브를 넣고 투석외액을 가하여 전량을 약 200 mL로 13장. 향미제
245한다. 때때로 흔들어 주면서 실온에서 24～48시간 방치하여 투석한 후 투석용 튜브를 
제거하고 투석외액을 가해 200 mL로 하여 투석액으로 한다.
나) 정 제
투석액 20 mL를 25 mL 메스플라스크에 넣고 0.1M TPA-Br용액 2 mL를 가한 다음 물
을 가하여 25 mL로 한다. 이 액 5 mL를 역상계 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 
떨어뜨리고 물 10 mL로 세척한 후 메탄올 ：물 (40：60) 혼합액 10 mL로 용출시킨다 . 
용출액 전량을 강음이온교환형 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 0.1% 
인산 5 mL와 물 5 mL를 사용하여 세척한 후 0.3N 염산 5 mL로 용출시킨 액을 시험
용액으로 한다.
5) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
① 검출기 :자외부흡광검출기 (UV), 210 nm
② 칼럼：Nova-Pak C18 또는 이와 동등한 것
③ 이동상 ：10% TPA-OH(Tetrapropylammonium hydroxide) 20.3 mL를 메탄올 ：물(30：70)
의 혼합액 약 900 mL에 녹이고 인산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 메탄올 ：물(30：
70) 혼합액으로 전량을 1,000 mL로 한다.
④ 이동상유량 ：1.0 mL/min
⑤ 주입량 : 10～20 μL
6) 정성시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크
로마토그램상의 사카린나트륨의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 
머무름시간이 일치하여야 한다.
7) 정량시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 피
크의 높이 또는 면적으로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중의 사카린나트륨의 
함량을 산출한다.2462. 사카린나트륨 및 아스파탐 동시분석법
가. 분석원리
검체 중의 사카린나트륨 및 아스파탐을 물로 추출후 여과하거나 반투막을 이용하여 분석
한 후, 투석외액을 사카린나트륨은 역상계 및 강음이온교환형 카트리지, 아스파탐은 강양
이온교환형 카트리지로 각각 정제한 다음 액체크로마토그래프로 정성 및 정량분석하는 
방법이다.
나. 장 치
1) 정제용 카트리지
가) 역상계 카트리지 ：Sep-pak C18 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 및 물 5 
mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).
나) 강음이온교환형 카트리지 ：Sep-pak QMA 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 
및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).
다) 강양이온교환형 카트리지 ：Bond Elut SCX 또는 이와 동등한 것(사용전에 메탄올 5 mL 
및 물 5 mL를 차례로 흘려 보낸 후 사용한다).
다. 시약 및 시액
1) 투석내액 ：염화나트륨 100 g 및 85% 인산 11.8g을 물에 녹여 1,000 mL로 한다.
2) 투석외액 ：85% 인산 11.8 g을 물에 녹여 1,000 mL로 한다.
3) 0.1M TPA-Br용액：TPA-Br(Tetrapropylammonium bromide) 2.66 g을 물에 녹여 100 mL
로 한다.
4) 혼합표준용액 ：사카린나트륨을 120℃에서 4시간 건조시킨 후, 아스파탐은 그대로 각각 
100 mg을 정밀히 달아 물에 녹여 100 mL로 한다. 사용시 이 용액 1～10 mL를 취하고 
물을 가하여 100 mL로 한 것을 표준용액으로 한다.
5) 카레스(Carrez)침전제 : 제1액 15%페로시안화칼륨용액 , 제2액 30%황산아연용액
라. 시험용액의 조제
1) 제1법
가) 액상검체 
검체 약 5 g을 취하고 물을 가해 50 mL로 하여 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 
시험용액으로 한다. 다만, 탄산가스가 있는 경우에는 10분간 초음파 처리하여 탄산가스13장. 향미제
247를 제거하며 알코올을 함유한 경우는 70°의 수욕상에서 15분간 가온하여 알코올을 증
발시켜 검체를 취한다.
나) 고체 또는 반고체검체 
검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5g을 취하여 물 10～20 mL를 
가한 다음 10～20분간 흔들어 완전히 용해시키거나 10분간 초음파 추출한다. 이 액에 
물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 다음 
0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 시험용액으로 한다. 
다) 단백질 함량이 많은 검체
검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5 g을 취하여 물 10～20 mL를 
가한다. 이 액에 카레스(Carrez) 침전제 제1액 2 mL를 가해 흔들어 섞은 다음 다시 카
레스(Carrez) 침전제 제1액 2 mL를 가해 2분간 흔들어 섞는다. 발생한 거품은 초음파 
처리하여 제거한 후 물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상
등액을 취한 다음 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 시험용액으로 한다.
라) 지방 함량이 많은 검체 
검체를 미리 균질화하거나 잘게 썰어 잘 섞은 후 약 2～5g을 취하여 물 10～20 mL를 
가한 다음 10～20분간 흔들어 완전히 용해시키거나 10분간 초음파 추출한다. 이 액에 
물을 가해 50 mL로 하고 5,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 분액
깔때기에 옮겨 디에틸에테르 50 mL를 가한 다음 흔들어 정치하고 물층을 취한다. 이 
조작을 2회 반복하여 지방성분을 제거한 다음 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 
시험용액으로 한다. 다만, 상기 가)～라)의 조작후에도 정제가 필요한 경우는 2) 제2법 
나) 정제에 따라 시험한다.
2) 제2법
가) 투석
액체검체는 10～20 g을 취하고, 고체 또는 반고체검체는 균질화하거나 잘게 썰어 잘 
섞은 후 10～20 g 취한 다음 투석내액 약 20 mL를 가하여 혼합한다. 이 혼합액을 투
석용 튜브(분자량 12,000 ～14,000, 미리 수세한 다음에 사용한다)에 넣고 튜브의 끝을 
밀봉한다. 미리 투석외액 약 150 mL를 넣은 눈금이 있는 용기에 튜브를 넣고 투석외
액을 가하여 전량을 약 200 mL로 한다. 때때로 흔들어 주면서 실온에서 15～48시간 
방치하여 투석한 후 투석용 튜브를 제거하고 투석외액을 가해 200 mL로 하여 투석액
으로 한다.
나) 정제
① 사카린나트륨248투석액 20 mL를 25 mL 메스플라스크에 넣고 0.1M TPA-Br용액 2 mL를 가한 다음 물
을 가하여 25 mL로 한다. 이 액 5 mL를 역상계 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 
떨어뜨리고 물 10 mL로 세척한 후 메탄올 ：물 (40：60) 혼합액 10 mL로 용출시킨다 . 
용출액 전량을 강음이온교환형 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 0.5% 
인산 5 mL와 물 5 mL를 사용하여 세척한 후 0.3N 염산 약 5 mL로 분당 3～4 mL의 
속도로 용출시켜 전량을 5 mL로 한 액을 시험용액으로 한다.
② 아스파탐
투석액 5 mL를 강양이온교환형 카트리지에 분당 3～4 mL의 속도로 떨어뜨리고 물 10 
mL를 사용하여 세척한 후 15% 염화나트륨용액 : 메탄올(50:50) 혼합액 5 mL로 분당 
3～4 mL의 속도로 용출시켜 전량을 5mL로 한 액을 시험용액으로 한다.
마. 시험조작
1) 액체크로마토그래프의 측정조건
가) 검출기 : 자외부흡광검출기 (UV), 210 nm
나) 칼럼：Nova-Pak C18 또는 이와 동등한 것
다) 칼럼온도 : 25～40℃의 일정온도
라) 이동상 ：10% TPA-OH(Tetrapropyl ammonium hydroxide) 20.3 mL를 메탄올 ：물(20：
80)의 혼합액 약 900 mL에 녹이고 인산으로 pH를 4.0으로 조정한 다음 메탄올 ：물(2
0：80) 혼합액으로 전량을 1,000 mL로 한다.
마) 이동상유량 ：1.0 mL/min
바) 주입량 : 10～20 μL
사. 정성시험
시험용액 및 혼합표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 
크로마토그램상의 사카린나트륨 및 아스파탐의 피크는 어느 측정조건에서도 혼합표준용
액과 시험용액의 머무름시간이 일치하여야 한다.
아. 정량시험
시험용액 및 혼합표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 
피크의 높이 또는 면적으로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중의 사카린나트륨 
및 아스파탐의 함량을 산출한다.13장. 향미제
2493. 소르비톨, 자일리톨
가. 가스크로마토그래피법
1) 분석방법
검체 5g을 정밀히 달아 물에 녹여 100mL로 한 것을 시험원액으로 한다. 따로 자일리톨
표준품 4.9g, 소르비톨 표준품을 25mg 정밀히 달아 100mL 메스플라스크에 넣고 이에 물
을 가하여 100mL로 한것을 표준원액으로 한다. 시험원액 1mL 및 표준원액 1mL를 
100mL 환저플라스크에 각각 취한 후 각 플라스크에 내부표준용액 (에리스리톨 500mg을 
취하여 물을 가하여 25mL로 한 액) 1mL를 가해주고 감압농축기를 사용하여 60℃의 수
욕에서 증발건고시킨 다음 각 건조물에 피리딘 1mL 및 무수초산 1mL를 가해주고 환류
냉각기를 부착시켜 수욕상에서 1시간 동안 끓여 완전히 아세틸화 한 액을 각각 시험용
액 및 표준용액으로 한다. 시험용액 1μL 및 표준용액 1μL를 각각 가스크로마토그래피에 
주입하고 다음 계산식에 따라 함량(%)을 구한다.
함량(%) =100×Ws × Ru
Wu × Rs
Ws : 표준품의 무게(mg)
Wu : 검체의 무게(mg)(무수물로서 )
Ru : 시험용액중의 에리스리톨유도체 피크면적에 대한 자일리톨유도체 피크면적
비
Rs : 표준용액중의 에리스리톨유도체 피크면적에 대한 자일리톨유도체 피크면적비
2) 조작조건
칼      럼 : 내경 2mm, 길이 2m의 유리판 또는 스테인레스관
칼럼충전제 : 크로모소브 W—HP에 3% OV—225를 입힌 것
검  출  기 : 수소염이온화검출기 (FID)
주입구온도 : 250℃
칼럼온도 : 200℃
검출기온도 : 250℃
캐리어가스 및 유량 : 질소, 30mL/min
유지시간(Retention time) : 내부표준물질 에리스리톨의 유지시간은 약 3.3분이며, 에리스
리톨의 유지시간을 1.0으로 하였을 때, 각 성분들의 상대적인 유지시간은 자일리톨 약 
3.90, 소르비톨 약 8.43이다.2504. 멘 톨
가. 기체크로마토그래피법
1) 분석방법
검체 5 g을 정밀하게 달아 에탄올에 녹여 정확하게 20 mL로 한다. 이 액 10 mL를 정확
하게 취하여 내부표준액 10 mL를 정확하게 넣어 검액으로 한다. 따로 l-멘톨표준품 약 
10 g을 정밀하게 달아 에탄올에 녹여 정확하게 100 mL로 한다. 이 액 10 mL를 정확하
게 취하여 내부표준액 10 mL를 정확하게 넣어 표준액으로 한다. 검액 및 표준액 1 μL씩
을 가지고 다음 조건으로 기체크로마토그래프법에 따라 시험하여 내부표준물질의 피크
면적에 대한 멘톨의 피크면적비 QT 및 QS를 구한다.
ST
QQl ´(mg)  양  표준품의멘톨- = (mg)  양  O)의H(C 멘톨2010
내부표준액  n-카프릴산에틸의 에탄올용액 (1 → 25)
2) 조작조건
검출기 : 불꽃이온화검출기
칼  럼 : 안지름 약 3 mm, 길이 약 2 m인 관에 기체크로마토그래프용폴리에틸렌글리콜 
6000을 산처리한 180 ~ 250 μm의 기체크로마토그래프용규조토에 25 %의 비
율로 피복한 것을 충전한다.
칼럼온도 : 150 ℃ 부근의 일정 온도
운반기체 : 질소
유  량 : 내부표준물질의 유지시간이 약 10 분이 되도록 조정한다.
칼럼의 선정 : 표준액 1 μL를 가지고 위의 조건으로 조작할 때 내부표준물질 , l-멘톨의 
순서로 유출하고 분리도가 5 이상이다.
5. 설탕, 포도당, 맥아당
가. 시험법 적용범위
사료의 전반에 적용이 가능하다.
나. 장 치13장. 향미제
251액체크로마토그래프 -시차굴절계검출기 (RI)
다. 시약 및 시액
1) 당류 혼합 표준용액
각각의 당류 표준품(과당, 포도당, 설탕, 맥아당, 유당)을 60℃ 진공오븐에서 12시간 건조
하여 각각을 증류수에 녹여 혼합 조제한다. 이때 검량선용 표준용액의 농도는 시험용액
의 피크면적이 각 당류 표준물질의 직선성을 만족할 수 있도록 조정하여 조제한다.
2) 이동상
아세토니트릴과 증류수를 80:20의 부피비율로 혼합하여 조제한다. 이때 이동상은 유리섬
유필터(Whatman GF/F 0.7um 또는 이와 동등한 것) 또는 나일론 66필터(Pall 0.45um 또
는 이와 동등한 것)로 여과한 후, 사용 전에 초음파 처리하여 가스를 제거하고 사용한다.
※ 아세토니트릴 및 증류수를 테프론과 셀룰로오즈 에스테르 멤브레인 필터로 각각 여과
하여 사용할 수 있다.
라. 시험용액의 조제
1) 시료 중 지방 제거
시료를 균질화한 후, 50 mL 원심분리관에 균질화된 검체 5 g을 정밀히 달아 넣고 25 
mL 석유에테르로 분산시킨다 . 이를 2,000 rpm에서 약 10분간 원심분리한 후, 고형분이 
제거되지 않도록 조심스럽게 석유에테르를 제거한다. 이를 반복하고 질소를 이용하여 석
유에테르를 완전히 증발시킨다 . 이때, 지방이 없는 것으로 확인된 시료의 경우 시료 중 
지방 제거과정을 생략한다. 
2) 당류의 추출
지방이 제거된 시료에 증류수 25 mL 혹은 50% 에탄올 용액을  가하여 무게를 확인한
다. 이를 85℃ 수조에서 25분간 가온하여 당류를 추출하고 실온으로 냉각하여 최초 기록
한 추출용매의 무게가 될 수 있도록 추출용매를 첨가한다. 이를 0.45 μm의 나일론 멤브
레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다. 이때, 시험용액이 혼탁할 경우, 2,000 rpm에서 
10분간 원심분리하여 여과한다.
마. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 조건
※ 다)이동상 및 라)유속의 조건은 가)컬럼의 용량요인과 분해능을 만족하는 범위에서 조정
할 수 있다.
가) 칼럼：길이 300 mm, 안지름 4 mm, μ-Bondapak Carbohydrate 칼럼 또는 이와 동등한 
것252※ 칼럼은 다음의 용량요인과 분해능을 만족해야 한다.
   - 과당에 대한 용량요인(Capacity factor, K') = (tR-t0)/t0 ≥ 5
   ․tR : 주입 후 과당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간
   ․t0 : 주입 후 용매의 최대 피크높이까지의 머무름 시간
   - 과당과 포도당의 분해능(Resolution, Rs) = (t2-t1)/0.5(tw1+tw2) ≥ 1
   ․t1 : 주입 후 과당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간
   ․t2 : 주입 후 포도당의 최대 피크높이까지의 머무름 시간
   ․tw1 : 과당의 베이스라인에서의 피크넓이(Width)
   ․tw2 : 포도당의 베이스라인에서의 피크넓이(Width)    
나) 검출기 ：시차굴절계검출기 (RI)
다) 이동상 : 아세토니트릴 :증류수(80:20, w/w) 
라) 유속：1.0 mL/분
마) 칼럼온도 ：실온
바. 정량시험
시험용액 및 표준용액을 각각 10 μL씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 
검량선을 작성한 후 시험용액의 각각의 당류의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음 식에 의해 
검체 중 당류의 함량(mg/100 g)을 산출한다. 이때 표준용액 검량선의 농도범위는 시험용
액 중 각각의 당류의 농도에 대한 직선성이 만족될 수 있도록 조정한다. 
1) 계산방법
             당함량(mg/100 g)＝S×a×b×100
검체채취량 (g) 1,000
                S：시험용액중의 당질의 농도(μg/mL)
                a：시험용액의 전량(mL)
                b：희석배수13장. 향미제
2536. 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 (Neohesperidine Dihydrochalcone)
가. 아래와 같은 조건을 이용하여 액체크로마토그래피법을 이용하여 적량한다.
1) 기구 및 실험조건
Nova Pack RP C18 4㎛처리된 3.9mm ID × 150mm 길이의 컬럼을 사용하며 이동상으
로 아세토니트릴 /초산 0.5%(20:80 V/V)을 이용하여 분당 1㎖의 속도로 실험한다. 컬럼
의 온도는 30℃를 유지하여 282nm의 자외선에서 측정한다.
2) 실험과정
50㎖의 DMSO에 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘 표준품을 40㎎, 45㎎, 50㎎, 60㎎씩 각
각 녹여 플라스크에 담고 위의 실험조건 하에서 실험하여 표준곡선을 얻는다. 본 품 
50㎎을 50㎖의 DMSO에 녹여 플라스크에 담고 위의 실험조건 하에서 3차례 실험한 뒤 
그 결과를 표준곡선과 비교한다.
실험결과로 산출된 네오헤스페리딘 디하이드로칼콘의 양을 건조감량된 수분의 양을 고
려하여 최종의 함량으로 산출하여 준다.
7.감초추출물(글리시리진산)
가.정량법
1)이품목을글리실리진산으로서 약20mg에상당하는양을정밀히달아50%
에탄올을가하여100mL로한액을시험용액으로한다.따로,글리실리진산표준
품약20mg을정밀히달아50%에탄올을가하여100mL로한액을표준용액으
로한다.표준용액및시험용액각각20μL씩을다음의조작조건으로액체크로
마토그래피에주입하고,다음계산식에따라감초추출물의함량을구한다.
글리시리진산 (%)  ＝ TG × Ws×100 SG × W
SG:표준용액의피크면적
TG:시험용액의피크면적
Ws:표준품의채취량(mg)(무수물로환산)
W:검체의채취량(mg)(무수물로환산)
2)조작조건254가)검출기:UV254nm
나)칼럼:μ-BondapakC18(내경4～6mm,길이15～30cm)또는이와
 동등한것
다)칼럼온도:40℃
라)이동상:2%초산․아세토니트릴의혼액(20:11)
마)유속:글리실리진산의유지시간이약10분이되도록조정한다.
8.과당
가.기기분석법에의한당류의정량
1)장치
가)액체크로마토그래프-시차굴절계검출기(RI)
2)시약및시액
가)당류혼합표준용액
각각의당류표준품(과당,포도당,설탕,맥아당,유당)을60℃진공오븐에서12
시간건조하여각각을증류수에녹여혼합조제한다.이때검량선용표준용액
의농도는시험용액의피크면적이각당류표준물질의직선성을만족할수있
도록조정하여조제한다.
나)이동상
아세토니트릴과증류수를80:20의부피비율로혼합하여조제한다.이때이동상
은유리섬유필터(WhatmanGF/F0.7um또는이와동등한것)또는나일론66
필터(Pall0.45um또는이와동등한것)로여과한후,사용전에초음파처리하
여가스를제거하고사용한다.
※아세토니트릴및증류수를테프론과셀룰로오즈에스테르멤브레인필터로
각각여과하여사용할수있다.
3)시험용액의조제
가)시료중지방제거
시료를균질화한후,50mL원심분리관에균질화된검체5g을정밀히달아넣13장. 향미제
255고25mL석유에테르로분산시킨다.이를2,000rpm에서약10분간원심분리한
후,고형분이제거되지않도록조심스럽게석유에테르를제거한다.이를반복하
고질소를이용하여석유에테르를완전히증발시킨다.이때,지방이없는것으
로확인된시료의경우시료중지방제거과정을생략한다.
나)당류의추출
지방이제거된시료에증류수25mL혹은50%에탄올용액을가하여무게를
확인한다.이를85℃수조에서25분간가온하여당류를추출하고실온으로냉각
하여최초기록한추출용매의무게가될수있도록추출용매를첨가한다.이를
0.45μm의나일론멤브레인필터로여과하여시험용액으로한다.이때,시험용
액이혼탁할경우,2,000rpm에서10분간원심분리하여여과한다.
4)시험조작
가)액체크로마토그래프조건
※③이동상및④유속의조건은①컬럼의용량요인과분해능을만족하는
범위에서조정할수있다.
①칼럼：길이300mm,안지름4mm,μ-BondapakCarbohydrate칼럼또는
이와동등한것
※칼럼은다음의용량요인과분해능을만족해야한다.
과당에대한용량요인(Capacityfactor,K')=(tR-t0)/t0≥5
․tR:주입후과당의최대피크높이까지의머무름시간
․t0:주입후용매의최대피크높이까지의머무름시간
과당과포도당의분해능(Resolution,Rs)=(t2-t1)/0.5(tw1+tw2)≥1
․t1:주입후과당의최대피크높이까지의머무름시간
․t2:주입후포도당의최대피크높이까지의머무름시간
․tw1:과당의베이스라인에서의피크넓이(Width)
․tw2:포도당의베이스라인에서의피크넓이(Width)
②검출기：시차굴절계검출기(RI)
③이동상:아세토니트릴:증류수(80:20,w/w)
④유속：1.0mL/분
⑤칼럼온도：실온
5)정량시험
시험용액및표준용액을각각10μL씩주입하여얻은피크의넓이또는높이를구
하여검량선을작성한후시험용액의각각의당류의농도(μg/mL)를구하고,다음식256에의해검체중당류의함량(mg/100g)을산출한다.이때표준용액검량선의농도
범위는시험용액중각각의당류의농도에대한직선성이만족될수있도록조정한다.
가)계산방법
당함량(mg/100g)＝S×a×b×100
검체채취량(g) 1,000
S：시험용액중의당질의농도(μg/mL)
a：시험용액의전량(mL)
b：희석배수
9.L-글루타민산나트륨
가.정량법
1)장치
아미노산분석기또는이와동등한것
2)시험용액의조제:검체0.2g을정확히취하여구연산리튬완충액(Lithiumcitrate
buffer,pH2.2)을가해100mL로정용한후이중1mL를취하여50mL로한
액을시험용액으로한다.다음의조작조건에따라시험한다.
3)조작조건
가)아미노산분석기의측정조건
①칼럼:HRNacolumn(4.6mm×200mm)또는이와동등한것
②칼럼온도:78℃
③검출기및파장:흡광검출기(570nm)
④이동상및이동상유량
㉮완충액:구연산리튬완충액(Lithiumcitratebuffer,pH2.8)을20mL/h의유
속으로흘려줌
㉯반응액:닌히드린(ninhydrin)시액을25mL/h의유속으로흘려줌
㉰반응기온도:135℃13장. 향미제
257㉱시료주입량:40μL
4)시액
가)완충액:구연산리튬완충액(Lithiumcitratebuffer,pH2.8)
나)닌히드린시액:닌히드린(ninhydrin)18g과히드린단틴(hydrindantin) 0.7g
을정밀히달아디메틸설폭시드675mL에녹인다.이액에초산리튬시액(pH
5.2)225mL을가한다.
다)표준원액:L-글루타민산나트륨표준품0.2g을취하고구연산리튬완충액
(Lithiumcitratebuffer,pH2.2)를가하여100mL로한액을표준원액으로한
다.
라)표준용액:표준원액을1mL를취하여구연산리튬완충액(Lithiumcitratebuffer,
pH2.2)를가하여50mL로한액을표준용액으로한다.25814장. 보존제
1. 유기산 다성분 분석법(액체크로마토그래피법 )
본 방법은 보조사료로 성분등록된 구연산, 젖산, 사과산, 낙산, 초산, 주석산, 호박산, 
개미산, 푸말산, 프로피온산 및 염화물에 적용한다.
가. 시료액의 조제
보조사료 약 0.05∼0.1g을 칭량하여 50ml 용량병에 취하고 0.4% 염산용액 20ml를 가한 
후 20분간 초음파 수조에서 용해시킨다 . 0.4% 염산용액으로 정용하고 균질하게 혼합한 
후 상등액을 원심분리(3000rpm, 10분)하거나 또는 여과한 후 0.45um membrane filter로 
여과하여 시험용액으로 사용한다. 유기산 표준물질을 위와 동일하게 처리하여 표준용액
으로 한다.
나. HPLC 분석조건
LC Pump : Isocratic pump
Mobile Phase : 5~20mM H2SO4
Column : Organic acid analysis colum (유기분석용 칼럼 또는 이와 동등한 것) 예) ①
Aminex HPX-87H Ion Exclusion colum (300mm x 738mm, Bio-Rad) 또는 ②
RSpak KC-811(300mmx 7.8mm, Shodex)
검출조건 : UV 210nm (또는 RI detector)
유속 : 0.7~1.0ml/min
주입량 : 20ul
Column Oven : Ambient 또는 40℃
다. 계산방법
유기산(%)= (시료의 피크면적/표준물질의 피크면적) x 표준물질의 농도(g/50ml)/ 시료무게
(g) x 100
라. 칼슘, 나트륨 등 무기물 염의 정량
무기물의 분석방법 중 AAS 또는 ICP법을 따른다.14장. 보존제
2592. 소르빈산, 안식향산과 그 염류 정량
본 방법은 보조사료 중 소르빈산, 안식향산 및 그 염류에 적용 한다.
가. 기체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량
1) 장치
기체크로마토그래프 : 불꽃이온화검출기 (FID)를 사용한다.
2) 시약 및 시액
가) 내부표준물질용액 ：0.1% 아세트아닐라이드의 아세톤용액
나) 표준용액 ：소르빈산, 안식향산을 내부표준물질 용액에 녹여 0.5～1.0 mg/mL의 용액을 
만든다.
3) 시험용액의 조제
가) 제1법
○ 액체검체 ：보존료의 함량에 따라 검체 30～100 g을 비커에 취하여 10% 수산화나트륨
용액 또는 10% 염산으로 중화하고 이를 500 mL～1 L의 둥근바닥플라스크에 옮기고 
이에 15% 주석산용액 5 mL, 염화나트륨 약 80 g 및 실리콘수지 한방울을 가한 후, 
전량을 물로 150～200 mL로 한다. 이를 수증기 증류기에 연결하여 증류하고 유액은 
매분 약 10 mL의 속도로 하여 500 mL를 취한다. 수증기 증류한 유액 일정량(각 보존
료 5～10 mg 함량)을 분액깔때기에 넣고 염화나트륨 10 g, 10% 염산 5 mL를 가하여 
에테르 40, 30 및 30 mL씩으로 3회 추출한다. 에테르추출액을 합하여 소량의 물로 씻
고 에테르층을 분취한다. 무수황산나트륨을 사용하여 수분을 제거하고 쿠데르나다니
쉬 농축기 또는 감압농축기를 이용하여 농축한 후 잔류물에 내부표준물질이 1 mL 중
에 1.0 mg을 함유하도록 첨가하여 아세톤으로 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.
○ 고체검체 ：검체를 잘게 썰거나 갈아서 보존료의 함량에 따라 30～100 g을 취하여 물 
50～100 mL를 가하여 잘 섞은 후 이하 액체검체와 동일하게 처리하여 시험용액으로 
한다.260나) 제2법
수증기 증류기를 이용
○ 액체검체 : 증류방법은 가) 제1법과 동일하며, 다만 15% 주석산용액은 10 mL를 가하
고, 증류액을 받는 수기끝은 1% 수산화나트륨용액 20 mL에 잠기도록 하여 증류한다. 
○ 고체검체 : 검체를 잘게 썰거나 갈아서 보존료의 함량에 따라 검체 30～100 g을 취하
여 물 50～100 mL를 가하고 잘 섞은 후 이하 액체검체와 동일하게 처리하여 시험용
액으로 한다.
수증기 자동증류기를 이용
○ 액체검체 : 보존료의 함량에 따라 검체 30～100 g을 비이커에 취하여 10% 수산화나
트륨용액 또는 10% 염산으로 중화하고 이를 500 mL～1 L의 플라스크에 옮기고 이에 
15% 주석산용액 10 mL, 염화나트륨 약 80 g 및 실리콘수지 한 방울을 가한 후, 적정
량의 물을 추가한다. 이를 수증기 자동증류기에 연결하고 증류액을 받는 수기끝을 1% 
수산화나트륨용액 20 mL에 잠기도록 하여 증류하고 유액은 매분 10 mL의 속도로 하
여 500 mL를  취한다. 수증기 증류한 유액 일정량(각 보존료 5～10 mg 함량)을 분액
깔때기에 넣고 염화나트륨 10 g, 10% 염산 5 mL를 가하여 에테르 40, 30 및 30 mL씩
으로 3회 추출한다. 에테르추출액을 합하여 소량의 물로 씻고 에테르층을 분취한다. 
무수황산나트륨을 사용하여 수분을 제거하고 쿠데르나다니쉬 농축기 또는 감압농축기
를 이용하여 농축한 후 잔류물에 내부표준물질이 1 mL 중에 1.0 mg을 함유되도록 첨
가하고 아세톤으로 일정량으로 하여 시험용액으로 한다.
○ 고체검체 : 검체를 잘게 썰거나 갈아서 보존료의 함량에 따라 검체 10～100 g을 취하
여 물 50～100 mL를 가하고 잘 섞은 후 이하 액체검체와 동일하게 처리하여 시험용
액으로 한다.
5) 시험조작
가) 기체크로마토그래프의 측정조건
칼럼 : HP-5(30m×0.32mm×0.25um) 또는 이와 동등한 것 (5%-phenyl- methyl 
-polysiloxane)
검출기: FID(불꽃이온화 검출기)
주입부 온도 : 210～230℃
검출기 온도 : 230～250℃
칼럼오븐온도 : 140～200℃
캐리어가스 및 유량 : N2 1.0 mL/min(split)14장. 보존제
2616) 정성시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로
마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름시간이 일치
하여야 한다.
7) 정량시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 표준
용액의 피크의 높이 또는 면적으로부터 작성한 검량선을 이용하여 시험용액 중의 각 보
존료의 함량을 산출한다.
나. 액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량
1) 분석원리
사료 중의 보존료를 수증기증류한 후, 얻은 유액을 액체크로마토그래프로 정성 및 정량
분석하는 방법이다.
2) 장치
액체크로마토그래프 : 자외부흡광검출기를 사용한다.
3) 시약 및 시액
가) 이동상
0.1% TBA-OH(0.1% 인산) 용액 : 40% TBA-OH(Tetrabutylammonium hydroxide) 2.5g과 
85% 인산 1.2g을 증류수로 희석하여 1L로 한 후 용매여과장치로 여과한다.
나) 보존료 표준용액 ：각 보존료 표준품(데히드로초산 , 소르빈산, 안식향산 및 각각의 파라
옥시안식향산에스테르류 ) 0.1g을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mL씩으로 한 액을 각 
표준원액으로 한다. 각 표준원액을 취하여 10~50 mg/L가 되도록 희석한 액을 표준용액
으로 한다.
4) 시험용액의 조제
기체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량시험 4) 시험용액의 조제에 따라 수증기 증류한 
유액을 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과한 액을 시험용액으로 한다.2625) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
검출기 : 자외부흡광검출기 (UV Detector), 217 nm
칼럼：Capcell pak MF-C8(4.5 μm, 4.6 ×150mm) 또는 이와 동등한 것
이동상
  - 이동상 A : 0.1% TBA-OH(0.1% 인산) 용액
  - 이동상 B : 아세토니트릴
시간(분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0.0 75 25
2.5 75 25
7.0 65 35
12.0 60 40
15.0 70 30
이동상유량：1 mL/분
주입량 : 10 μL
나) 표준용액의 크로마토그램
데히드로초산 (2.8분), 소르빈산(3.5분), 안식향산(4.6분), 파라옥시안식
향산메틸(5.1분), 파라옥시안식향산에틸 (6.9분)
다) 정량한계
데히드로초산 (0.6 mg/kg), 소르빈산(1.5 mg/kg), 안식향산(1.0 mg/kg), 파라옥시안식향산
메틸(1.0 mg/kg), 파라옥시안식향산에틸 (1.0 mg/kg)
6) 정성시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로
마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름시간이 일치
하여야 한다.14장. 보존제
2637) 정량시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 피크
의 높이 또는 면적으로부터 다음 식에 따라 검체중의 각 보존료의 함량을 산출한다.
보존료(g/kg) ＝각 표준용액의 농도(mg/L) ×PA×500×1
PS SA 1,000
  PS
  PA
  SA:표준용액의 높이 또는 면적
:시험용액의 높이 또는 면적
:검체의 채취량(g)
3. 프로피온산 및 그 염류의 정량
가. 기체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량
1) 분석원리
사료 중의 프로피온산 및 그 염류를 수증기증류한 후, 얻은 유액을 용매추출 등을 통하
여 정제한 다음, 기체크로마토그래프로 정성 및 정량분석하는 방법이다.
2) 장 치
기체크로마토그래프 : 불꽃이온화검출기 (FID)를 사용한다.
가) 충전칼럼(Packed column)
고정상담체 ：기체크로마토그패프용 크로모솔브 101(80 ～100메쉬) 또는 이와 동등한 것
나) 캐필라리칼럼
① 고정상액체 ：Polyethylene glycol-terephthalic acid 또는 이와 동등한 것
② 칼럼：0.2～0.32 또는 0.53 mm의 안지름을 가지는 30 m의 모세관 유리칼럼에 적합한 
고정상액을 화학적결합시키거나 또는 Cross link 코팅한 것 (HP-FFAP 또는 이와 동등
한 것)
다) 이온교환수지칼럼 ：유리관(10 mm×10 ～15 cm)에 높이 25～30 mm로 강산성 이온교환
수지를 충전한다.2643) 시약 및 시액
가) 강산성 이온교환수지 ：100～200메쉬의 도웩스(Dowex) 50X8 또는 암버라이트
(Amberlite) CG120을 H형으로 하고 물로 씻는다.
나) 내부표준물질용액 : 트란스크로톤산 0.1 g을 정밀히 달아 물에 녹이고 100 mL로 한 액
을 내부표준물질용액으로 한다(사용시 조제).
다) 프로피온산표준용액 ：프로피온산 0.1 g을 정밀히 달아 아세톤에 녹이고 100 mL로 한 
액을  표준원액으로 한다. 프로피온산표준원액 1 mL 및 내부표준용액 1 mL를 취하고 
아세톤으로 희석하여 10 mL로 한다(사용시 조제).
프로피온산 1 mL = 100 μg C3H6O2
4) 시험용액의 조제
가) 제1법
잘게 썰은 검체 30～50 g(프로피온산으로서 100～200 mg)을 1 L 증류플라스크에 넣고 
물 200 mL, 염화나트륨 80 g, 10%인산용액 10 mL 및 실리콘수지 한 방울을 가한 다음 
수증기 증류를 하여 유액 500 mL를 받는다. 이 때 플라스크는 1% NaOH 20 mL를 가
해 냉각기 끝이 잠기도록 한다. 유액 25 mL를 정확히 취하여 감압하에서 농축건조한 
다음 잔류물을 물 1 mL로 녹여 미리 강산성 이온교환수지를 채워둔 이온교환수지칼럼
의 상부에 넣고 유출액은 내부표준물질용액 1.0 mL를 넣은 10 mL메스플라스크에 받는
다. 물 1 mL씩으로 잔류물을 녹여서 이 조작을 되풀이 하여 유출액의 전량을 10 mL로 
한 다음 인산 1 mL, 에틸에테르 5 mL를 가하여 흔들어 섞어 추출한다. 다시 물층을 
에틸에테르로 1～2회 추출하고 에테르추출액을 합한 다음, 무수황산나트륨을 사용하여 
수분을 제거하고 쿠데르나다니쉬 농축기 또는 감압농축기를 이용하여 농축한 후 일정
량의 아세톤을 가하여 시험용액으로 한다.
나) 제2법
소르빈산, 안식향산 및 그 염류 가.기체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량시험 4) 시
험용액의 조제 가) 제1법에 따라 얻어진 수증기 증류한 유액 100 mL를 정확히 취하여 
분액깔때기에 넣고 염화나트륨 10g, 인산 1 mL 및 내부표준용액 1 mL를 가하여 에테
르 50 mL 씩으로 2회 추출하여 에테르층을 모은 뒤, 무수황산나트륨을 사용하여 수분
을 제거하고 쿠데르나다니쉬 농축기 또는 감압농축기를 이용하여 농축한 후, 아세톤을 
가하여 최종 부피가 10 mL가 되도록 하여 시험용액으로 한다.14장. 보존제
2655) 시험조작
가) 기체크로마토그래프의 측정조건
칼럼 : 충전칼럼 또는 캐필라리칼럼
주입부 온도 : 200～240℃
검출기 온도 : 200～250℃
칼럼오븐온도 : 120～200℃
캐리어가스 및 유량 : 질소 또는 헬륨을 적절하게 조절한다.
검출기의 가스유량 ：수소와 공기를 적절히 조절한다.
나) 표준용액의 크로마토그램
프로피온산 (3.4분), 트란스크로톤산 (6.9분)
다) 정량한계
프로피온산 (1.0 mg/kg)
6) 정성시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로
마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름시간이 일치
하여야 한다.
7) 정량시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 피크266의 높이 또는 면적으로부터 다음 식에 따라 검체중의 프로피온산의 함량을 산출한다.
프로피온산 (g/kg) = 표준용액의 농도(mg/L)× PA × PSis×500×1×1
PS × PAisSACR1,000
PS
PA
PSis
PAis
SA
CR:표준용액중 프로피온산의 피크 높이 또는 면적
:시험용액중 프로피온산의 피크 높이 또는 면적
:표준용액중 내부표준물질의 피크 높이 또는 면적
:시험용액중 내부표준물질의 피크 높이 또는 면적
:검체의 채취량(g)
: 농축배수 (= 취한 유액의 량(mL)/최종 시험용액의 량(mL))
4. 에톡시킨(Ethoxyquin)
1) 시험법 적용범위
사료에 적용한다.
2) 분석원리
검체를 탄산나트륨용액 및 헥산으로 추출한 후 액액분배하여 액체크로마토그래프로 측
정한다.
3) 장치
액체크로마토그래프 ∶형광검출기 (Fluorescence Detector) 를 사용한다.
4) 시약 및 시액
용매：잔류농약 시험용 또는 이와 동등한 것
물：증류수 또는 이와 동등한 것
실리카(silica) ：옥타데실시릴기를 화학결합시킨 실리카(5 μm)
표준원액 ：에톡시퀸을 헥산에 녹여 100 mg/kg이 되게 한다.
표준용액 ：표준원액을 헥산에 녹여 적당한 농도로 희석한다.
기타시약 ：잔류농약 시험용 또는 특급14장. 보존제
2675) 시험용액의 조제
수분이 많은 시료는 약 1 kg을 정밀히 달아 필요하면 적당량의 물을 달아 넣고 균질화
한 후 그 20 g에 상당하는 양을 달아 삼각플라스크에 옮긴다. 이에 10% 탄산나트륨용액 
20 mL 및 헥산 100 mL를 넣고 진탕기로 30분간 심하게 흔들어 섞은 후 3,000 rpm에서 
약 5분간 원심분리하여 헥산층을 취한다. 헥산층 50 mL를 분액깔때기 (Ⅰ)에 취하여 이에 
1N 염산 15 mL를 넣고 진탕기로 5분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 물층을 분액깔
때기(Ⅱ)에 옮긴다. 헥산층에 1N 염산 15 mL를 넣고 위와 같이 되풀이하여 물층을 분액
깔때기(Ⅱ)에 합친다. 물층에 헥산 10 mL를 넣고 진탕기로 5분간 심하게 흔들어 섞은 후 
정치하여 헥산층을 버리고 5N 수산화나트륨용액 10 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 이에 
헥산 30 mL를 넣고 진탕기로 30분간 심하게 흔들어 섞은 후 정치하여 헥산층을 삼각플
라스크에 옮긴다. 
물층에 헥산 30 mL를 넣고 위와 같이 되풀이하여 헥산층을 위의 삼각플라스크에 합친
다. 헥산층에 적당량의 무수황산나트륨을 넣고 때때로 흔들어 섞으면서 1시간 방치한 후 
여과한다. 다시 헥산 15 mL로 삼각플라스크를 씻고 이 씻은 액으로 여지상의 잔류물을 
씻고 여과한다. 여액을 합쳐 40℃ 이하의 수욕상에서 감압하에 거의 날려보내고 다시 실
온에서 질소가스를 통하면서 건고시킨다 . 잔사를 아세토니트릴에 녹여서 일정량으로 하
여 시험용액으로 한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
칼럼충전제：옥타데실시릴화한 실리카
칼럼：안지름 4.5 mm, 길이 250 mm의 스테인리스관
칼럼온도：40℃
이동상：디부칠히드록시톨루엔 50 mg을 아세토니트릴：물(3：1)을 혼합액 1,000 mL에 
녹인 것을 사용한다.
검출기파장 여기파장 360nm, 형광파장 435nm
유속：에톡시퀸이 약 9분에서 유출하는 유속으로 조정한다.
나) 검량선의 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입한다. 얻어진 크
로마토그램상의 각 피이크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.
다) 정량한계
0.05 mg/kg2687) 정성시험
위의 조건에서 시험할 때 시험결과는 표준품과 일치하여야 한다.
8) 정량시험
정성시험과 똑같은 조건에서 얻어진 시험결과에 의해 피이크높이법 또는 피이크면적법
에 따라 정량한다.
5. 부틸히드록시아니졸 (BHA), 디부틸히드록시톨루엔 (BHT) 및 몰식자산프로필 (PG)
가. 액체크로마토그래피에 의한 정성 및 정량
1) 적용범위
유지, 수산동물유래 등 사료에 적용한다.
2) 분석원리
사료 중의 BHA, BHT 및 PG를 헥산으로 용해․추출하고, 용매추출을 통하여 정제한 다음, 
액체크로마토그래프로 정성 및 정량분석하는 방법이다.
3) 장 치
액체크로마토그래프 : 자외부흡광검출기 (UV Detecter) 를 사용한다.
4) 시약 및 시액
가) 0.01M TBA-OH용액：40% TBA-OH(Tetrabutylammonium hydroxide) 용액 6.5 mL에 물 
900 mL를 가하고 초산으로 pH 3.0로 조정한 다음 물을 가하여 1,000 mL로 한다.
나) 0.01M 염화제이철용액 ：염화제이철 (FeCl3․6H2O) 0.27 g을 0.01N 염산에 녹여 100 mL로 
한다.
다) 표준용액 : BHA, 50 mg과 PG 25 mg, BHT 100 mg을 이소프로판올 및 아세토니트릴혼
액 (1：1)에 녹여 50 mL로 한다. 사용시 이액 10 mL를 취하고 이동상으로 희석하여 
100 mL로 한다.14장. 보존제
2695) 시험용액의 조제
가) 유지류
균질화한 검체 5 g을 비커에 달아, 5 mL 헥산이 들어 있는 125 mL분액깔때기에 옮기
고, 헥산 15 mL로 여러번 나누어서 비커를 씻어 분액깔때기에 합친다. 여기에 헥산포
화아세토니트릴 50 mL 씩으로 3회 추출하고(만약 유탁형태가 일어나면 뜨거운 물에 
분액깔때기를 5～10초 동안 담구어서 분리한다), 추출액을 250 mL 분액깔때기에 합한
다. 이 액을 농축플라스크에 서서히 옮겨 40℃이하의 수욕에서 감압농축기를 사용하여 
3～4 mL로 농축하여 눈금이 있는 용기에 옮기고 씻어 전량을 5 mL로 한후, 이소프로
판올 5 mL로 플라스크를 씻어 전량을 10 mL로 하여 시험용액으로 한다.
나) 수산동물유래 사료 등
잘게 썰은 검체 5～20 g을 달아 브랜더캡(Blender Cap)에 옮기고 무수황산나트륨 약 
15 g, 헥산 100 mL를 가하여 약 2분간 균일하게 섞은 다음 여과한다. 잔사에 헥산 100 
mL를 가하여 추출을 되풀이하고 , 여액을 합친다. 여액을 농축하여 약 20 mL로 한다. 
이하 가) 유지에 따라 조작한다.
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
검출기 : 자외부흡광검출기 (UV Detector), 280nm
칼럼：μ-Bondapak C18 또는 Lichrosorb RP-18
이동상：물：아세토니트릴：초산 (35：60：5)
이동상유량：1.0～1.5 mL/분
주입량 : 10～20 μL
감도：0.05 AUFS
7) 정성시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 크로
마토그램상의 피이크는 어느 측정조건에서도 표준용액과 시험용액의 머무름시간이 일치
하여야 한다.
8) 정량시험
시험용액 및 표준용액을 앞의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입하고, 얻어진 피크
의 높이 또는 면적으로부터 다음 식에 따라 검체 중의 BHA, BHT, PG의 양을 산출한다.270산화방지제 (mg/kg) ＝각 표준용액의 농도(mg/L)×PA×10
PSSA
PS：표준용액의 높이 또는 면적
PA：시험용액의 높이 또는 면적
SA：검체의 채취량(g)
6.케르세틴
가.시료액의조제
시료약50mg을정밀히달아메탄올을가하여50mL로한다음0.5㎛밀리포아여과기로
여과한액을시험용액으로한다.따로,케르세틴표준품(C15H10O7․2H2O)을케르세틴으
로서50mg함유하도록정밀히달아메탄올을가하여50mL로한다음0.5㎛밀리포아여
과기로여과한액을표준용액으로한다.표준용액및시험용액각각10μL씩을다음의
조작조건으로고속액체크로마토그래피에주입하고다음계산식에따라케르세틴의함량
을구한다.
나.측정
검출기:UV375nm
칼럼:μ-BondapakC18(3.9mm×300mm)또는이와동등한것
칼럼온도:실온
이동상:메탄올․물․초산의혼액(15:3:1)
유속:1.0mL/min
다.계산
함  량(%) =표준품(케르세틴으로서 )의 채취량(mg)
×시험용액의 피크면적 × 
100건조물로 환산한 검체의 채취량(mg) 표준용액의 피크면적14장. 보존제
2717.레스베라트롤
가.시료액의조제
시료약1.0g을정밀하게달아둥근바닥플라스크에넣고30mL물에녹인다.여
기에초산에칠30mL를넣은다음5분동안세게교반한다.분별깔때기에넣어
초산에칠층을분리해내고물층을초산에칠30mL를5분동안2번더세게교반
한다음초산에칠층을분리한다음초산에칠층을모두모아감압건조하고잔류
물에5mL메탄올을넣어다시감압건조한다.잔류물에50%아세토니트릴5mL
를넣어여과한것을검액으로한다.따로레스베라트롤(C14H12O3)표준품6mg
을정밀하게달아50%아세토니트릴10mL로녹인다.이액5mL를정확하게취
하여50%아세토니트릴을넣어100mL로하여표준액으로한다.검액및표준액
20μL를가지고상기조건에서액체크로마토그래프법에따라시험하고검액및
표준액의피크면적AT및AS를구한다.
나.측정
검출기:자외부흡광광도계(측정파장306)
칼럼:안지름약4.6mm,길이약25cm인스테인레스관에5μm옥타데실릴릴
화한실리카겔을충전한다.
이동상:아세토니트릴과0.1%오르토인산용액의혼합액(20:80)
유속:1.0mL/분
다.계산
레스베라트롤
(C14H12O3)의양(mg)=레스베라트롤표준품의양(mg)×At×1
As40
At:표준용액중레스베라트롤의피크면적
As:시험용액중레스베라트롤의피크면적27215장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
1. 현미경 검사법
가. 비중에 의한 현미경 검사법
1) 시료채취 방법
반추동물 배합사료 또는 동물성사료의 최종제품에 대한 시료채취는 사료검사요령 (농림부
고시)의 규정에 따라 실시한다.
2) 감정방법
시료를 1㎜체로 통과할 수 있도록 분쇄한 후, 분쇄한 시료 1g을 미리 제조한 비중액에 
넣어 비중분리용 여과용기에 넣고, 가는 유리봉을 이용하여 혼합하고, 약 20분간 방치한 
다음 시료중의 각 원료를 비중 분리한다.
하층에 분리된 사료원료(육골분 등이 부분적으로 분리) 및 클로로포름을 여지(No 5A)로 
여과하고 여지에 부착된 사료원료를 에탄올로 세척하고 여지에 모은다. 여지를 건조한 
후 여지에 있는 사료를 100㎖의 톨비이커에 옮겨 5% 수산화나트륨용액 200㎖을 가한 후 
30분간 끓이고, 비이커의 상부 까지 물을 채워서 정치하고 상등액을 흡입 제거한다.
물층이 투명하게 될 때까지 세정조작을 반복한다. 비이커내 침점물 전량을  소형 샤레에 
옮겨 광학현미경 (배율 50～100배) 및 실체현미경 (20～30배)에서 각 시료중의 육골분 유래
조직단편의 유무를 확인한다.
나. 염색에 의한 현미경 검사법
동물유래물질은 샘플을 체로 치고 침전물도에 따라 구분, 시료(10g 이상)을 분쇄하여 2
개의 대표샘플로 나누어서 하나는 5g을 체로 치고, 2g은 침전시켜, 염색시약에 의해 색
깔로 확인, 동물유래물질의 현미경 확인은 특수 염색시약을 이용하여 조사가 가능
1) 시 약
Chloral hydrate, gelatin, Paraffin oil, Bradford reagent Iodine/potassium iodide solution, 
Millon reagent, Cystin reagent
2) 방 법
가) 체로 동물유래물질 분리 확인15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
273① 5g의 샘플을 체를 통하여 분리 
② 0.5㎜이상의 샘플은 실체현미경을 이용하여 다양한 배율에서 조사시 동물유래물질은 
체계적으로 나타남
③ 0.5㎜ 동물유래물질을 여러 배율의 복합현미경으로 현경
나) 동물유래물질의 현미경 확인은 특수 염색시약을 이용하여 조사가 가능
① Chloral hydrate : 조심스럽게 가열처리하면 세포구조가 분명하게 보임
   (전분이 젤라틴화되기 때문, 세포내용물이 제거되어짐 )
② gelatin : collagen이 구성 단백질(가열과정에서 tryptophane 파괴)
③ Paraffin oil : 골격성분 물질은 대부분이 lacunae(뼈소강, 뼈기질내 공간, 열공)내  
공기가 차있고, 5～15㎛정도의 검은 구멍이 있어 확인되어짐
④ Bradford reagent : 단백질 검출시 이용(전형적인 푸른 색깔)
⑤ Iodine/potassium iodide solution : 전분 검출시 사용(blue-violet colour), 
단백질(yellow-orange colour).     
⑥ Millon reagent : By carefully heating, 골격 성분원소는 분홍색으로 됨
⑦ Cystin reagent : By carefully heating, cystin-containing 성분 원소들은 (머리카락, 
깃털들, 등등) black-brown 으로 됨
* 견과 양모는 같은 단백질 섬유로 비슷한 염색거동을 갖는다. 그러나 견섬유는 양모와 
달리 Cystin을 함유하지 않으므로 Disulfide(S-S) 에 의한 가교결합이 없다. 
다) 침전물로부터 동물유래물질 분리확인
①  플 2g(0.001g 까지 정확하게)를 시험관이나 분액여두에 넣고 15㎖의 4염화에틸렌으로 
처리 
② 혼합 후 정치(1～3분)하여 침전물을 분류
③ 침전물을 건조한 후 무게를 칭량(0.001g에 까지)하여, 골은 건조침전물에서 실체현미
경 복합현미경으로 조사
3) 계산과 평가
동물유래물질의 정량평가로 골이 함유된 동물성유래물질이라면 계산이 가능하다. 육상 
온혈동물(포유류, 조류)의 골 파편내 골소강을 조사하며, 샘플내 동물유래물질은 침전물
내 골로 평가된 부분(무게), 동물유래 물질내 골의 비율(무게)을 고려하여 평가한다. 평가
시 3개의 슬라이드와 슬라이드 당 5개의 위치를 조사하여야 한다. 혼합 사료내 침전물은 
육상동물의 골과 어골뿐만 아니라 고 중량의 물질이 혼합되어 있다(미네랄, 모래, 목지
화된 식물체).   274가) 골격파편 비율의 평가치
% 육상동물 골분 파편 ＝ (S×c)/W
% 어골과 비늘 파편  ＝ (S×d)/W
 ※ S = 침전물무게 (㎎),
    c = 침전물내 육상동물 골의 평가를 위한 보정인자(%)
    d = 침전물내 어골과 비늘의 평가를 위한 보정인자(%)
    W = 침전되어진 샘플의 무게(㎎)
나) 동물유래물질의 평가치
동물생산물의 골격의 비율은 크게 변화할 수 있으며, 골분의 경우에 골의 비율은 50～
60%, 육분의 경우 20～30%가 골이며, 어골분과 비늘에 경우에도 어분이 10～20% 함유
되어있다. 만일 샘플내 육분의 종류가 알려지면, 함량의 추정이 가능하다.
① 육상동물 생산물 유래물질의 함량 추정 = (S×c)/(W×f) × 100
② 물고기 생산물 유래물질의 함량 추정 = (S×d)/(W×f) × 100
   ※ S = 침전물무게 (㎎),
      c = 침전물내 육상동물 골의 평가를 위한 보정인자(%)
      d = 침전물내 어골과 비늘의 평가를 위한 보정인자(%)
      f = 조사 샘플내 동물유래 물질의 골 부분을 위한 보정인자(%)
      W = 침전되어진 샘플의 무게(㎎)
4) 조사결과의 표현
가) 현미경으로 관찰시 동물유래물질이 조사샘플에서 발견되지 않음
    현미경으로 관찰시 동물유래물질이 조사샘플에서 발견
나) 이런 경우는 조사결과 보고서는 상세하게 기술
다) 현미경으로 조사결과 조사샘플에서 동물유래물질 소량 발견
라) 조사의 경험에 의존
① 어느 한쪽 현미경으로 관찰 시 조사샘플에서 동물유래물질 소량 발견, 골 파편 내용
물(물고기/육상동물-육상동물의 골 파편의 경우, 특히 가금류와 포유류로부터 유래된 
골 파편)은 동물유래 생산물내(= f 보정인자 사용) 골(%)에 근거하여 계산했을 때 크
기순서에 따라 큰 것(%), 동등한 것(%)
② 현미경으로 관찰 시 조사샘플에서 측정할 수 있는 양의 동물유래물질 발견
③ 육상동물유래 골 성분이 확인, 보고서에는 추가기술
- 상기 물질은 포유동물로부터 유래되어진 가능성 있음, 이것은 육상동물로부터 골 파편
이 가금류와 포유류로부터 특이성을 가진다면 필요한 사항이 아님15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
2752. ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) : 효소면역측정검사법 
가. 시약
1) 사용 kits [Ruminant Kit for Meat&Bone Meals and animal feeds kits] 
2) kit 내용
가) Antibody Coated Microwell Module
나) Biotinylated anti-species antibody
다) Avidin-peroxidase conjugate
라) TMB substrate solution
마) Stop solution
바) 양성 control 액 / Positive species control
사) 음성 control 액 / Positive species control
아) Wash solution concentrate
자) Extraction additive concentrate
나. 시약의 조제
1) Positive controls, Anti-species botinylates, Avidiin peroxidase conjugate 는 buffer조제 공
급시약 이용
2) ABTs Concentrate 와 Peroxide Citrate buffer를 1:24의 비율로 희석하여 working ABTs 
용액으로 제조하여 사용(희석후 즉시 사용)
3) Wash solution는 1:9의 비율로 증류수와 혼합하여 사용
다. 시료추출방법
1) 측정시료를 막자사발 또는 분쇄기를 이용하여 분쇄한다.
2) 시료 5g을 250㎖삼각플라스크에 취한다.
3) 추출용매(0.5M NaCl, 10mMEDTA) 50㎖을 첨가하여 15～30분간 방치한다.
4) 방치 후, 항온수조에서 95～100℃로 15분간 가열한다.
5) 상온에서 냉각시킨 후 여과지(Whatman 4)를 이용하여 여과하여 시료용액으로 사용 한
다.276라. 측정방법
1) 측정 kit와 시료추출액은 분석 전 실온에서 측정한다.
2) 정밀한 마이크로피펫을 이용하여 시료액, 양성 control액, 음성 control액 각 100㎕를 well
속에 첨가한다. 또 음성 control 액은 그 외의 축종의 음성 control 액을 2종 이상 사용
한다.
3) 서서히 손으로 혼합한 후 well을 덮은 후 실온에서 20분 정치 배양시킨다 .
4) 배양 후 well 속의 내용물을 버리고, 흡착지를 이용해 두드려가면서 잔여물을 제거한 후 
wash solution 300㎕를 각각의 well에 채우고, 동일한 방법으로 내용물을 버린다(2회 세
정을 반복).
5) Biotinylated anti-species antibody 50㎕을 각각의 well에 넣고, 덮어서 실온에서  20분 정
치 배양시킨다 . 배양 후 well의 내용물을 버리고 세정을 3회 반복한다.
6) Avidin-peroxidase conjugate 50㎕ 을 각각의 well에 넣은 후 덮고 실온에서 20분간 정치
배양시킨다 . Well의 내용물을 버리고, 6번 세정을 반복한다.
7) TMB substrate solution 50㎕를 각각의 well에 넣고, 차광 실온에서 20분 정치배양 시킨
다.
8) 배양후 stop solution 50㎕을 각각의 well에 넣고 발색을 정지시킨다 .
9) 15분 이내에 plate reader (450㎚파장)에서 흡광도를 측정한다.
3. PCR(Polymerase Chain Reaction) : 중합효소연쇄반응검사법
배합사료, 육골분 및 분쇄중의 포유동물 유래조직, 반추동물유래 조직 및 소, 닭․돼지 등
의 각종 동물유래 조직의 유무를 조직중에 함유되어 있는 미토콘트리아 DNA의 각 동물
특이적 배열을 PCR법으로 검출함에 의해 확인한다.
가. 시료 및 검출대상
1) 대상시료 : 배합사료, 육골분 및 어분 등의 사료원료를 대상으로 한다.
2) 검출대상 동물종 : 포유동물, 반추동물, 소, 닭, 양, 산양 등 아래표에 각종 프라이마에 
의해 검출 가능한 동물치를 나타낸다.
3) 검출처리 : 본법에 의한 사료중의 소유래 육골분의 검출감도(원물함량 %로서)는 다음과 
같다.
가) 포유동물 검출 프라이마 -- 육골분으로서 0.1～0.01%15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
277나) 반추동물 검출 프라이마 -- 육골분으로서 0.1～0.01%
다) 소검출 프라이마 -------- 육골분으로서 0.1～0.01%
육골분의 검출감도는 육골분 원료동물의 사용비율, 제조방법(가열처리조건 ) 및 골 성분
의 함유비율 등에 의해 다른 경우가 있다. 또한 본 법은 동물유래 DNA를 검출하는 것
이기 때문에 육골분에 한하지 않고 탈지분유, 혈장단백질 등의 동물유래 DNA를 포함
하는 원료에서도 검출된다.
나. 시료의 채취 및 분쇄
1) 시료의 채취
원칙적으로 시료는 공장내 보관시 등에 다른 원료 혹은 환경에서 오염물질이 오염되는 
가능성이 없는 제조품에서 채취한다. 수거방법은 미생물채취법에 준해 대상시료 이외의 
물질의 오염이 없도록 신중히 채취한다. 채취시는 플라스틱제 장갑을 끼고 멸균된 스푼
을 사용하여 약 500g을 멸균된 채취봉지에 채취한다.
2) 분쇄 등
육골분, 어분은 원칙적으로 분쇄를 하지 않는다(분쇄시 오염의 위험성이 크므로) 입자가 
거친 박류 등 큰 육편 등이 포함되는 경우에는 깨끗한 망(1㎜)으로 통과물을 채취한다. 
배합사료에서는 1㎜의 망을 통과할 때 까지 분쇄한다. 이 때 시료간의 오염을 방지하기 
위하여 시료마다 분쇄반을 세정하거나 교환한다.
3) 시료의 보존
시료는 냉장 보관한다. 또한 미분쇄후의 시료를 장기(1주일 이상)보존하는 경우에는 냉
동고(-20℃)에서 보존한다.
다. 시험방법
1) 시약의 조제
물은 특별한 경우를 제외하고 이온교환수 또는 증류수를 사용한다. PCR반응액의 조제에 
사용하는 물 및 추출 DNA의 희석에 사용하는 물 및 아래에 특별히 기술한 경우에는 고
압증기처리 (121℃, 15분간)한 초순수(역삼투압으로 정제한 RO수 또는 증류수를 MIlli-Q 
등으로 비저항치 17M/㎝까지 정제한 것)을 사용한다.
가) 조직․세포용 미토콘드리아 DNA 추출킷트
mtDNA 엑스트라-CT 킷트(화광순약) 또는 이것과 같은 것을 사용한다.278나) 0.5M EDTA 용액
에틸렌티아민 4초산-나트륨-수화물 18.6g을 초순수 80㎖에 넣고 수산화나 트륨(가루형
태) 약 2g을 더하여 녹이고, pH 8.0에 용해시킨 후 초순수를 가하여 100㎖을 만들고 
121℃에서 15분간 고압증기멸균한다 .
다) 1M 토리스 염산완충액
토리스히드록시메틸아미노메탄 12.1g을 초순수 80㎖에 넣고 염산약 4.2㎖을 넣고 녹이
고, pH8.0에 조정한 후 초순수를 넣어 100㎖로 하고 121℃에서 15분간 고압증기멸균한
다.
라) 전기영동용 완충액(TAE완충액)
토리스히드록시메틸아미노메탄 4.84g, 초산 1.14㎖ 및 0.5M EDTA용액 2㎖을 물에 녹여 
1000㎖로 한다.
마) TE 완충액
1M 토리스염산완충액 1㎖ 및 0.5M EDTA용액 0.2㎖을 물에 녹여 100㎖로 하고 121℃
에서 15분간 고압증기멸균한다 .
바) 아가로스 겔
고순도 아가로스(전기영동용 ) 또는 이것과 동등의 것 2.5g을 전기영동용 완충액 100㎖
을 넣고 가열하고 녹인후 50～60℃에서 냉각시킨후 겔의 두께가 3-4㎜가 되도록 겔형 
성형에 넣고, 겔과 고무의 사이에 기포가 들어가지 않도록 신중하게 고무를 넣고 실온
에서 방치하여 고체화시킨다 .
사) 영동용 색소용액
프로모페놀블루 25㎎, 키실렌시아놀 25㎎ 및 글리세린 3g을 초순수에 녹여 10㎖로 하
고 121℃에서 15분간 고압증기멸균한다 .
아) DNA 사이즈마커 (50-1000bp)   (FMC, 보주조 등)
자) 취화에치지움 용액
취화에치디움 10mg을 초순수 500㎕에 녹여 취화에치지움 원액을 조제하고 사용시에는 
이 원액 25㎖을 전기영동용 완충액 1000㎖에 녹인다.(사용할 때 조제) 또한 취화에치지
움 용액은 광분해성이 있으므로 차광 냉장보관한다 . 또한 취하에치지움은 독가스가 생
기므로 취급시에는 반드시 장갑을 사용하고 시험종료후 흡착제가 들어간 필터 등을 사
용하여 처리한 후 폐기한다. 취화에치지움 염색한 아가로스 겔은 5% 차아염산나트륨 
용액에 침적후 직사 일광하에 방치하여 광분해시킨후 폐기한다.
차) 지루코르아비스 (직경 1.5㎜)
YTZ볼(닛카토) 또는 이것과 같은 동등의 것을 121℃에서 15분간 고압증기멸균한다 .
카) 프라이마
․ 포유동물 검출 프라이마 : 검출반도싸이즈 176bp
․ 반추동물 검출 프라이마 : 104bp15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
279․ 소 검출 프라이마 : 120bp
․ 소 검출 프라이마 : 271bp
․ 닭 검출 프라이마 : 227bp
․ 양, 산양검출 프라이마 : 331bp
․ 돼지검출 프라이마 : 126bp
타) PCR 반응용 효소
Ampli Taq Gold(applied Biocyateme)
파) PCR 완충액
PCR buffer II, PCR Gold buffer 또는 이것과 동등의 물질
하) 2mM dNTPmix
갸) 양성 콘트롤
소 미토콘드리아 DNA, 닭 미토콘드리아 DNA, 양 미토콘드리아 DNA 등 소고기 등에
서 “(다)”항에 의해 추출한 DNA를 사용한다.
2) 장치 및 기구
가) 사말사이크라
PE9600, PE9700, PCR Thermal Cycler MP 또는 이것과 동등의 물질
나) 크린벤치
다) 비즈파쇄장치
2000rpm 정도의 회전수에, 2㎖ 튜브에 대응하는 것. BC-20(센트랄과학기구 ), 마치비즈
숀카, Fast Prop, FP120(nskzhtl), Mixer Mill MM300(Qlagen) 또는 이것과 동등의 물질
라) Autoclave
마) 전기영동장치 : Mupid-2(코스모바이오 ) 또는 이것과 동등의 물질
바) 폴라로이드 카메라
사) UV 트랜스일루미네이터
아) 고속냉각원심기
    1.5㎖ 및 0.2㎖ 튜브대응, 4℃냉각, 12000 × g의 원심분리가 가능한 것
자) 마이크로피펫트 (1000, 200, 200, 20 및 2㎕용 디지털가변형 )
차) 그외 2㎖, 1.5㎖ 및 0.2㎖ 의 각종 플라스틱제 튜브 및 각종 마이크로피펫형 팁등(살균
된 것)2803) DNA 추출
시판 조직, 세포용 미토콘드리라 DNA 추출킷트 (mtDNA 엑스트라쿠타 -CT킷트)을 사용한 
DNA의 추출법에 대하여 설명한다.
또한 육골분의 DNA 추출방법으로서는 그밖에 페놀크로르포름법 , 케아니진치오시아네트 
완충액을 사용하는 방법, 키렉스 수지를 사용하는 방법이 있다.
가) 시료 100mg을 2㎖  플라스틱제 나사형 튜브에 채취하고, 질유니아 비즈를 1.5g 정도 
넣고 추출용완충액 (mtDNA 추출킷트에 첨부)를 1㎖ 넣고 비즈파쇄장치 )에 셋트하여 
2000rpm으로 1분간 진동한다. 1분간 정치한 후 다시 2000rpm으로 1분간 진동하고 수
냉 후 1000×g으로 2분간 원심분리(4℃)한다.
 ※ 주) 통상 호모지나이즈 추출로도 좋으나, 시료간의 오염에 주의를 요한다.
나) 상층부를 1.5㎖  플라스틱제튜브에 채취하여 10000 × g으로 10분간 원심분리(4℃) 한 
후 상층을 제거한다.
다) DNA 추출용액(킷트 첨부) 50㎕ dmf 가하여 피펫팅에 의해 현탁시키고 여기에 DNA 추
출용액 II(킷트에 첨부) 100㎕을 가하여 혼합후 5분간 수냉한다.
라) 여기에 미리 수냉해 놓은 DNA 추출용액(킷트에 첨부) 75㎕을 가하여 물루틴스미키사
로 혼합후 즉시 수냉한다.     
마) 12000 × g으로 5분간 원심분리(4℃)한 후 상층액 200㎕을 채취하고 새로 1.5㎖ 튜브에 
옮긴다.
바) 여기에 요화나트륨액 (킷트에 첨부) 300㎕을 가하여 혼합후 여기에 500㎕의 이소프로바
놀을 가하여 혼합한다. 
사) 12000 × g으로 5분간 원심분리(실온화)한 후 상층을 제거한다.
아) 1㎖의 70% 에탄올을 가하여 혼합후 12000 × g으로 5분간 원심분리하고 상층을 제거
한다. 다시 1㎖의 70% 에탄올을 가하고 혼합후 12000 × g으로 5분간 원심분리하고 상
층을 제거하여 20㎕의 TE 완충액을 가하여 DNA를 용해한다. 이 DNA용액은 냉동 보존
한다.
4) PCR 반응
일반적인 PCR법의 조작에 준한다. 포유동물 유래 DNA의 검출에 플라이마셋트 anicon5, 
anicon3, 반추동물유래 DNA의 추출에는 rumicon 52, rumicon 32, 소유래 DNA의 검출에
는 cow52, cow31 또는 I8129, H8357을 사용하여도 좋다.
각 플라스마를 사용할 때의 PCR의 반응조건은 별지 1 (PCR반응조건)에 나타났다. 이하
의 조작법은 개략적으로 나타냈다.
가) 200㎕의 플라스틱제 튜브에 PCR 반응액 18㎕ 및 추출 DNA용액의 10배 희석액 2uL을 
가한 것을 PCR반응용의 시약액으로 한다.15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
281나) 같은 방법으로 PCR 반응액 18㎕ 및 소유래 DNA용액의 10배 희석액 2㎕ 가한 것을 양
성 콘트롤액, PCR 반응액 18㎕ 및 물 2㎕을 가한 것을 음성 콘트롤액으로 한다.
다) 시료액, 양성콘트롤액 및 음성콘트롤액을 사마루사이쿠라에 넣고, 별지1의 반응조건에
서 PCR반응을 실시한다.
5) 전기영동
가) 아가로스겔을 전기영동용 완충액을 넣은 영동조에 넣고 10분간 100V의 정전압을 넣어 
예비 영동한다. 
나) DNA 사이즈마커 5㎕에 약 1㎕의 영동용색소용액을 가하고 혼합하여 그 전량을 아가
로스겔의 스롯트에 주입한다.
다) PCR 반응이 종료한 시료액, 양성콘트롤 및 음성콘트롤 각각 5㎕에 약 1㎕의 영동용색
소용액을 가하고 혼합하여 그 전량을 아가로스겔의 스롯트에 주입한다.
라) 100V 정전압을 걸고 부로모페놀프레가스롯트에서 3-4cm 이동할때까지 전기영동을 실
시한다.
마) 전기영동이 종료한 아가로스겔을 취화에치지움 용액에 약 30분간 적시고 염색한다.
바) 아가로스겔을 UV트랜스일루미네이터에 넣어, 365㎚의 자외선을 조사하고 시료액으로 
검출한 DNA밴드위치를 사이즈마카의 밴드위치와 비교하여 DNA단편사이즈를 구한다. 
흑백필름을 사용하여 폴라로이드 사진을 활용한다.
6) 판정방법
가) 양성콘트롤로 검출 사이즈의 밴드가 검출되고, 음성 콘트롤로 밴드가 검출되지 않는 
경우에서 또한 시료에 있어 양성콘트롤과 동동일 사이즈의 밴드가 검출되지 않는 경우
를 양성으로 한다.
나) 양성콘트롤으로 밴드가 검출되지 않는 경우, 및 음성콘트롤으로 밴드가 검출되지 않는 
경우에는 PCR반응이 정상적으로 행해지지 않을 가능성이 있기 때문에 재시험이 필요
하다.
라. 검사할 때의 주의사항 등
1) 시험조작상 주의사항
PCR법은 검출감도가 높고 극미량의 DNA에서도 검출되기 때문에 분석시험중은 목적외
의 DNA의 혼입방지에 세심한 주의를 기울일 필요가 있다.
또한 DNA는 미생물이나 사람의 피부 등에 존재하는 DNA 분해효소에 의해 분해되기 떄282문에 이 효소의 혼입을 방지하기 위하여 멸균등의 적절한 조작을 할 필요가 있다.
가) 마이크로피펫용 칩은 멸균된 것을 사용하고 조작시마다 매회 새로운 것으로 바꾼다. 
필터가 붙은 칩을 사용하는 것도 바람직하다 .
나) 분석 조작중은 플라스틱제 장갑을 사용하고 장갑위를 알콜로 소독한다.
다) 샘플링 및 분쇄를 실시하는 경우 PCR조작을 실시하는 장소 및 전기 영동을 실시하는 
경우는 분리하는 것이 바람직하다 . PCR반응액의 조제는 깨끗한 장소에서 실시한다.
2) 검사 정확도 확보상의 주의사항
가) 한 검사체의 시료에서 DNA의 추출은 2점 병행으로 실시하고, 2점의 추출 DNA에 대해 
PCR반응을 각각 2점 병행으로 실시한다.
나) PCR반응을 실시하는 돼지에는 반드시 양성 콘트롤과 양성콘트롤을 동시에 반응시킨
다.
다) 더블첵크를 위하여 프라이마는 2종류 이상을 사용하는 것이 바람직하다 . 예를들면 소, 
양 등의 동물종을 감별하는 경우에는 포유동물 검출 플라이마 및 각종 동물검출 플라
이마를 사용해도 좋다.
3) 시험결과의 취급
1 검체당 2점의 추출 DNA중 2점 모두 양성의 결과가 나타난 경우에만 양성으로 판정한
다.
4. Multiplex PCR,  Multiplex real-time PCR :다중중합효소연쇄반응검사법
가. Multiplex PCR에 의한 검사법
사료에 척추동물, 갑각류, 연체동물이 포함되어 있는지의 여부를 온도와 압력에 비교적 
안정한 미토콘드리아 DNA에 기초한 멀티플렉스 PCR법을 이용하여 동물성 성분을 동시
에 검사할 수 있다.
    
1) 시료 및 검출대상
가) 대상시료 : 반추동물용 배합사료, 반추동물용 섬유질배합사료 등을 대상으로 한다.
나) 검출대상 동물 종 : 척추동물, 갑각류, 연체동물 
다) 검출처리 : 본법에 의한 사료 중의 모든 동물성단백질의 검출감도(원물함량 %로서)는 15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
283다음과 같다.
라) 모든 동물성단백질 검출 Primer : 육골분으로서 0.1~0.01% 육골분의 검출감도는 육골
분 원료동물의 사용비율, 제조방법(가열처리조건 ) 및 골성분의 함유비율 등에 의해 다
른 경우가 있다. 또한 본 법은 동물성 성분을 검사할 수 있는 것이기 때문에 육골분에 
한하지 않고 어분, 혈분 등의 동물유래 DNA를 포함하는 원료에서도 검출된다.
   
2) 시료의 채취 및 분쇄
가) 시료의 채취
원칙적으로 시료는 공장내 보관 시 다른 원료 혹은 환경에서 오염물질이 오염되는 가
능성이 없는 제조품에서 채취한다. 수거방법은 미생물 채취법에 준해 대상시료 이외의 
물질의 오염이 없도록 신중히 채취한다. 채취시는 플라스틱제 장갑을 끼고 멸균된 스
푼을 사용하여 약 500g을 멸균된 채취봉지에 채취한다.
나) 분 쇄
시료는 입자가 거친 박류 등 큰 육편 등이 포함되는 경우에는 깨끗한 망(1㎜)으로 통
과물을 채취한다. 배합사료에서는 1㎜의 망을 통과할때 까지 분쇄한다. 이 때 시료간의 
오염을 방지하기 위하여 시료마다 분쇄반을 세정하거나 교환한다.
다) 시료의 보존
시료는 냉장 보관한다. 또한 미분쇄 후의 시료를 장기(1주일 이상)보존하는 경우에는 
냉동고(-20℃)에서 보존한다.
   
3) 시험방법
가) 시약
① DNA 추출용 Kit [PowerPrepTM, DNA Extraction from Food and Feed Kit]
② DNA 추출용 Kit 내용
Lysis Buffer A
Lysis Buffer B
Binding Buffer
DNA Binding Column 이와 동등의 추출 Kit 내용 사용
③ All animal PCR Kit [PowercheckTM, All animal PCR Kit]
④ All animal PCR Kit 내용
All animal Detection PCR Primer mix
5×Reaction Buffer
DNA loading dye
Taq. DNA Polymerase284DNA size marker
Control DNA 이와 동등의 모든 동물성단백질 PCR Kit내용 사용
⑤ 전기영동용 완충액(1×TAE완충액)
50×TAE완충액 20ml를 증류수 980ml에 희석하여 1000ml로 한다
⑥ TE 완충액
1M 트리스염산완충액 1㎖ 및 0.5M EDTA용액 0.2㎖을 물에 녹여 100㎖로 하고 121℃
에서 15분간 고압증기 멸균한다. 
⑦ 아가로스 겔
아가로스(전기영동용 ) 2.0g을 전기영동용 완충액(1×TAE Buffer) 100㎖을 넣고 중불에
서 끓인 후 50~60 ℃에서 냉각 시킨 후 약간 식힌 후 EtBr 3㎕를 넣어 준 후 겔의 두
께가 3~4㎜가 되도록 겔형 성형에 넣고, 겔과 고무의 사이에 기포가 들어가지 않도록 
신중하게 고무를 넣고 실온에서 방치하여 고체화시킨다 .
⑧ DNA 사이즈마커 (100-1000bp)  
⑨ Ethidium bromide 용액
Ethidium bromide 10mg을 초순수 500㎕에 녹여 ethidium bromide 원액을 조제하고 사
용 시에는 이 원액 25㎖을 전기영동용 완충액 1000㎖에 녹인다.(사용할 때 조제) 또한 
ethidium bromide 용액은 광분해성이 있으므로 차광 냉장 보관한다. 또한 ethidium 
bromide는 독가스가 생기므로 취급 시에는 반드시 장갑을 사용하고 실험이 끝난 후 
흡착제가 들어간 필터 등을 사용하여 처리한 다음 폐기한다. ethidium bromide로 염색
한 아가로스 겔은 5% 차아염산나트륨 용액에 침적 후 직사일광 하에 방치하여 광분
해 시킨 후 폐기한다.
(아가로즈 젤을 제조할 때 ethidium bromide 용액을 사용하지 않고 직접 ethidium 
bromide를 넣어 제조하는 경우도 가능하다) 
⑩ Primer
모든 동물성 성분 검출 프라이머 : 200～210bp   
나) 장치 및 기구      
① PCR장치
Gene Amp PCR system 9700 또는 이것과 동등의 장치
② 크린벤치
③ 비즈파쇄장치
2000rpm 정도의 회전수에, 2㎖ 튜브에 대응하는 것. BC-20(센트랄과학기구 ), 마치비즈
숀카, Fast Prop, FP120(nskzhtl), Mixer Mill MM300(Qlagen) 또는 이것과 동등의 장치
④ Autoclave
⑤ 전기영동장치
Mupid-2plus( 코스모바이오 ) 또는 이것과 동등의 장치15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
285⑥ Gel Doc XR System(전기영동리더기 ) 또는 이것과 동등의 장치
⑦ 고속냉각원심기
1.5㎖ 및 2㎖ 튜브대응, 4℃냉각, 12000rpm 원심분리가 가능한 것
⑧ 마이크로피펫 (1000, 200, 100, 20 및 10㎕용 디지털가변형 )
⑨ 멸균된 1000㎕, 300㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕ 마이크로피펫형 팁   
다) DNA 추출
PowerPrepTM DNA Extraction from Food and Feed Kit를 사용하여 Kit 내 매뉴얼 또는 
아래와 같은 추출법으로 사료에서 DNA를 추출한다.
① Sample을 곱게 분쇄한 후 50ml tube에 0.5~2g 정량하여 담는다.
② Lysis A buffer 4ml, Lysis B buffer 400㎕을 첨가하고, vortex한 후, water bath(65 ℃)
에서 1시간 반응시킨다 .
(Lysis buffer양은 sample에 따라 증가 또는 감소시킨다 .)
③ Chloroform 을 4ml 넣고 vortex 후, 3,000rpm 15min 원심분리 한다.
④ 2ml tube에 ③번 용액의 1ml, Chloroform 1ml을 넣고 vortex후, 12,000rpm 에 10min 원
심분리 한다.
⑤ 2ml tube에 ④번 용액의 상층액 500㎕, Binding buffer와 Iso-propanol 을 500㎕씩 넣어
준다. (Iso-propanol 은 Kit 안에 포함되어 있지 않다.)
⑥ ⑤번 용액을 DNA binding column tube에 750㎕을 넣고, 12,000rpm 에서 2min 원심분
리 한다.
⑦ DNA binding column tube를 통과한 여과액을 버린 후 동일한 DNA binding column 
tube에 남은 나머지 ⑤번 용액 750㎕을 넣고 12,000rpm 에서 2min 원심분리 한다. 
⑧ 75% Ethanol 600㎕넣고 12,000rpm 에서 2min 원심분리 한다.
(두번 반복하며, Ethanol은 Kit 안에 포함되어 있지 않다.)
⑨ 빈 DNA binding column tube를 12,000rpm 에서 2min 원심분리하여 Ethanol을 완전히 
제거한다.
⑩ DNA binding column tube를 1.5ml tube로 옮긴 후 멸균된 증류수 100㎕ 넣고 1min 
동안 상온에 방치한다.
(추출된 DNA를 오래 보관할 경우 멸균된 증류수 대신 TE 완충액을 사용한다.)
⑪ 8,000rpm에서 3min 원심분리 하여 DNA를 얻는다.
⑫ 이 DNA용액은 냉동 보존한다.    
라) PCR 반응
일반적인 PCR법의 조작에 준한다. PCR 반응은 DNA polymerase, dNTPs, Reaction 
buffer 및 Primer 등 PCR 수행에 필요한 구성 성분을 다음과 같은 비율로 혼합하여 286PCR 반응액으로 사용하고, DNA를 첨가하여 mixing한 후 PCR 장비에서 반응시킨다 .
① 200㎕의 플라스틱제 튜브에 PCR Primer mix 4㎕, 멸균된 증류수 10㎕, 5×Reaction 
Buffer 5㎕, DNA Polymerase 1㎕을 혼합한 20㎕는 PCR 반응액으로 PCR tube에 분주
한 후 여기에 추출된 DNA 용액 5㎕을 가한 것을 시료액으로 한다.
② 같은 방법으로 PCR 반응액 20㎕에 Control DNA용액 5㎕ 가한 것을 양성 콘트롤액, 
PCR 반응액 20㎕에 멸균된 물 5㎕을 가한 것을 음성 콘트롤액으로 한다.
③ 시료액, 양성콘트롤액 및 음성콘트롤액을 PCR에 넣고, 아래와 같은 반응조건에서 
PCR반응을 실시한다.
    Step Temp( ℃)Time Cycle 
Pre-Denaturation 94 12min 1
Amplification94  20sec
32 58 10sec
72 30sec
Final Extension 72 2min 1
마) 전기영동
① 아가로스겔은 전기영동용 완충액을 넣은 영동조에서 10분간 100V의 정전압을 넣어 
예비 영동한다. 
② 전원을 끈 후 DNA 사이즈마커 100bp 6㎕를 아가로스겔의 스롯트에 주입한다.
③ PCR 반응이 종료한 시료액, 양성콘트롤 및 음성콘트롤 각각 5㎕에 DNA loading 
dye(6x) 1㎕를 가하여 혼합한 후 그 전량을 아가로스겔의 스롯트에 차례대로 주입한
다. 
④ 100V 정전압을 걸고 부로모페놀프레가 스롯트에서 3-4cm 이동할 때까지 전기영동을 
실시한다.
⑤ 전기영동이 종료한 아가로스겔을 전기영동기에 넣어 UV 365㎚의 자외선을 조사하고 
시료액으로 검출한 DNA밴드위치를 사이즈마카의 밴드위치와 비교하여 DNA 단편사이
즈를 구한다. 
⑥ 판정방법
㉮양성콘트롤의 검출 사이즈 밴드가 검출되고, 음성 콘트롤의 밴드가 검출되지 않는 
경우, 시료에 있어서 양성콘트롤과 동일 사이즈의 밴드가 검출되는 경우를 양성으
로 한다.
㉯ 양성콘트롤으로 밴드가 검출되지 않는 경우나 음성콘트롤으로 밴드가 검출될 경우
에는 PCR반응이 정상적으로 행해지지 않을 가능성이 있기 때문에 재시험이 필요하
다.
4) 검사할 때의 주의사항 등
가) 시험조작상 주의사항15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
287PCR법은 검출감도가 높고 극미량의 DNA에서도 검출되기 때문에 분석과정 중 오염에 
세심한 주의를 기울일 필요가 있다.
또한 DNA는 미생물이나 사람의 피부 등에 존재하는 DNA 분해효소에 의해 분해되기 
때문에 이 효소의 혼입을 방지하기 위하여 멸균 등의 적절한 조작을 할 필요가 있다.
① 마이크로피펫용 팁은 멸균된 것을 사용하고 조작 시마다 매회 새로운 것으로 바꾼다. 
필터가 붙은 팁을 사용하는 것도 바람직하다 .
② 분석 조작 중은 플라스틱제 장갑을 사용하고 장갑 위를 70％ 알콜로 소독한다.
③ 샘플링을 하거나 시료 분쇄를 할 경우 PCR실이나 전기영동실과는 분리하는 것이 바
람직하다. PCR 반응액의 조제는 크린벤치에서 실시한다.
나) 시험결과의 취급
1검체당 2점의 추출 DNA중 2점 모두 양성의 결과가 나타난 경우에만 양성으로 판정한
다.
나. Multiplex Real-time PCR에 의한 검사법
사료에 척추동물, 갑각류, 연체동물이 포함되어 있는지의 여부를 온도와 압력에 비교적 
안정한 미토콘드리아 DNA에 기초한 멀티플렉스 Real-time PCR법을 이용하여 동물성 성
분을 동시에 검사할 수 있다.
   
1) 시료 및 검출대상
가) 대상시료 : 반추동물용 배합사료, 반추동물용 섬유질배합사료 등을 대상으로 한다.
나) 검출대상 동물 종 : 척추동물, 갑각류, 연체동물 
다) 검출처리 : 본법에 의한 사료중의 모든 동물성단백질의 검출감도(원물함량 %로서)는 
다음과 같다.
라) 모든 동물성단백질 검출 Primer : 육골분으로서 0.1~0.01% 육골분의 검출감도는 육골
분 원료동물의 사용비율, 제조방법(가열처리조건 ) 및 골성분의 함유비율 등에 의해 다
른 경우가 있다. 
또한 본 법은 동물성 성분을 검사할 수 있는 것이기 때문에 육골분에 한하지 않고 어
분, 혈분 등의 동물유래 DNA를 포함하는 원료에서도 검출된다.
   
2) 시료의 채취 및 분쇄
가) 시료의 채취
원칙적으로 시료는 공장내 보관 시 다른 원료 혹은 환경에서 오염물질이 오염되는 가
능성이 없는 제조품에서 채취한다. 수거방법은 미생물 채취법에 준해 대상시료 이외의 288물질의 오염이 없도록 신중히 채취한다. 채취 시는 플라스틱제 장갑을 끼고 멸균된 스
푼을 사용하여 약 500g 을 멸균된 채취봉지에 채취한다.
나) 분 쇄
시료는 입자가 거친 박류 등 큰 육편 등이 포함되는 경우에는 깨끗한 망(1㎜)으로 통
과물을 채취한다. 배합사료에서는 1㎜의 망을 통과할때 까지 분쇄한다. 이 때 시료간의 
오염을 방지하기 위하여 시료마다 분쇄반을 세정하거나 교환한다.
다) 시료의 보존
시료는 냉장 보관한다. 또한 미분쇄 후의 시료를 장기(1주일 이상)보존하는 경우에는 
냉동고(-20℃)에서 보존한다.
   
3) 시험방법
가) 시약
물은 특별한 경우를 제외하고 이온교환수 또는 증류수를 사용한다.
PCR 반응액의 조제에 사용하는 물이나 추출 DNA의 희석에 사용하는 물 및 아래에 특
별히 기술한 경우에는 고압증기처리 (121℃, 15분간)한 초순수(역삼투압으로 정제한 RO
수 또는 증류수를 MIlli-Q 등으로 비저항치 17M/㎝까지 정제한 것)을 사용한다.
① DNA 추출용 Kit [PowerPrepTM DNA Extraction from Food and Feed]
② DNA 추출용 Kit 내용
Lysis Buffer A
Lysis Buffer B
Binding Buffer
DNA Binding Column 이와 동등의 추출 Kit 내용 사용
③All animal Real-time PCR Kit [PowercheckTM All animal Real-time PCR Kit]
④ All animal Real-time PCR Kit 내용
All animal Primer/Probe Mix
2×Real-time Master Mix
Control DNA 이와 동등의 All animal PCR Kit 내용 사용
⑤ Primer/Probe
Fluorescence dye : FAM
⑥ TE 완충액
1M 트리스염산완충액 1㎖ 및 0.5M EDTA용액 0.2㎖을 물에 녹여 100㎖로 하고 121℃
에서 15분간 고압증기 멸균한다. 
나) 장치 및 기구     15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
289① Real-time PCR장치
7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems) 또는 이것과 동등의 장치
② 크린벤치
③ 비즈파쇄장치
2000rpm 정도의 회전수에, 2㎖ 튜브에 대응하는 것. BC-20(센트랄과학기구 ), 마치비즈
숀카, Fast Prop, FP120(nskzhtl), Mixer Mill MM300(Qlagen) 또는 이것과 동등의 장치
④ Autoclave
⑤ 고속냉각원심기
1.5㎖ 및 2㎖ 튜브대응, 4℃냉각, 12000rpm 의 원심분리 가능한 것
⑥ 마이크로피펫 (1000, 200, 100, 20 및 10㎕용 디지털가변형 )
⑦ 멸균된 1000㎕, 300㎕, 100㎕, 20㎕, 10㎕ 마이크로피펫형 팁 
다) DNA 추출
PowerPrepTM DNA Extraction from Food and Feed Kit를 사용하여 Kit 내 매뉴얼 또는 
아래와 같은 추출법으로 사료에서 DNA를 추출한다.     
① Sample을 곱게 분쇄한 후 50ml tube에 1~2g 정량하여 담는다.
② Lysis A buffer 4ml, Lysis B buffer 400㎕을 첨가하고, vortex한 후, water bath(65 ℃)
에서 1시간 반응시킨다 .
    (Lysis buffer양은 sample에 따라 증가 또는 감소시킨다 .)
③ chloroform 을 4ml 넣고 vortex후, 3,000rpm 15min 원심분리 한다.
④ 2ml tube에 ③번 용액의 1ml, Chloroform 1ml을 넣고 vortex후,    12,000rpm 에 10min 
원심분리 한다.
⑤ 2ml tube에 ④번 용액의 상층액 500㎕, Binding buffer와 ISO-propanol 을 500㎕씩 넣
어준다.
   (ISO-propanol 은 Kit 안에 포함되어 있지 않다)
⑥ ⑤번 용액을 DNA binding column tube에 750㎕을 넣고, 12,000rpm 에서 2min 원심분
리 한다.
⑦ DNA binding column tube를 통과한 여과액을 버린 후 동일한 DNA binding column 
tube에 남은 나머지 ⑤번 용액 750㎕을 넣고 12,000rpm 에서 2min 원심분리 한다. 
⑧ 75% Ethanol 600㎕넣고 12,000rpm 에서 2min 원심분리 한다.
(두번 반복하며, Ethanol은 kit 안에 포함되어 있지 않다)
⑨ 빈 DNA binding column tube를 12,000rpm 에서 2min 원심 분리하여 Ethanol을 완전히 
제거한다.
⑩ DNA binding column tube를 1.5ml tube로 옮긴 후 멸균된 증류수 100㎕ 넣고 1min 
동안 상온에 방치한다.290(추출된 DNA를 오래 보관할 경우 멸균된 증류수 대신 TE 완충액을 사용한다.)
⑪ 8,000rpm에서 3min 원심분리 하여 DNA를 얻는다.
⑫ 이 DNA용액은 냉동 보존한다.
라) Real-time PCR 반응
일반적인 Real-time PCR법의 조작에 준한다. PCR 반응은 Control DNA, All animal 
Primer/Probe Mix 및 2×Real-time Master Mix 등 Real-time PCR 수행에 필요한 구성 
성분을 다음과 같은 비율로 혼합하여 Real-time PCR 반응액으로 사용하고, DNA를 첨
가하여 mixing한 후 Real-time PCR 장비에서 반응시킨다 .     
① 200㎕의 플라스틱제 튜브에 All animal Primer/Probe Mix 4㎕, 2×Real-time Master 
Mix 10㎕을 혼합한 14㎕는 PCR 반응액으로 PCR tube에 분주한 후 여기에 추출된 
DNA용액 6㎕을 가한 것을 시료액으로 한다.
② 같은 방법으로 PCR 반응액 14㎕에 Control DNA용액 6㎕ 가한 것을 양성 콘트롤액, 
PCR 반응액 14㎕에 멸균된 물 6㎕을 가한 것을 음성콘트롤액으로 한다.
③ 시료액, 양성콘트롤액 및 음성콘트롤액을 Real-time PCR에 넣고, 아래와 같은 반응조
건에서 Real-time PCR반응을 실시한다.
 Temp( ℃)Time Cycle 
50 2min 1
95   10min 1
95 15sec
35
60 1min
마) 판정방법
① Real time PCR 결과는 확인하고자 하는 Maker을 선택하여 증폭 곡선을 확인한다. 만
약 시료에서 15~33 Ct 사이에 PCR 증폭이 일어날 경우 양성으로 판정하고, Ct값이 너
무 낮거나 (15＞Ct), 너무 높은 경우(33＜Ct)에는 재시험이 요구된다.
  
4) 검사할 때의 주의사항 등
가) 시험조작상 주의사항
PCR법은 검출감도가 높고 극미량의 DNA에서도 검출되기 때문에 분석과정 중 오염에 
세심한 주의를 기울일 필요가 있다.
또한 DNA는 미생물이나 사람의 피부 등에 존재하는 DNA 분해효소에 의해 분해되기 
때문에 이 효소의 혼입을 방지하기 위하여 멸균 등의 적절한 조작을 할 필요가 있다.
①마이크로피펫용 팁은 멸균된 것을 사용하고 조작 시마다 매회 새로운 것으로 바꾼다. 15장. 사료중 동물성 유래 단백질 혼입검사법
291필터가 있는 팁을 사용하는 것도 바람직하다 .
② 분석 조작 중은 플라스틱제 장갑을 사용하고 장갑 위를 70％ 알콜로 소독한다.
③ 플링을 하거나 시료 분쇄를 할 경우 PCR실이나 전기영동실과는 분리하는 것이 바람
직하다. PCR 반응액의 조제는 크린벤치에서 실시한다.
나) 시험결과의 취급
1 검체당 2점의 추출 DNA중 2점 모두 양성의 결과가 나타난 경우에만 양성으로 판정
한다.29216장. 올리고당
1. 갈락토올리고당
정의 : 당질원료를 이용하여 효소를 작용시켜 얻은 전이갈락토올리고당액 또는 사탕무, 
대두 등에서 추출한 라피노스, 스타치오스의 당액을 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말
상의 것을 말한다.
가. 갈락토올리고당 (전이갈락토올리고당 )
1) 장 치
고속액체크로마토그래프
2) 시 약
가) 20%(w/v) 설포살리실린산용액 (Sulfosalicylic acid)∶시약특급의 설포살리실린산 20 g에 
물을 넣어 용해시켜 100 mL로 한다.
나) Ribose ∶시약특급
다) Arabinose ∶시약특급
3) 표준용액의 조제
갈락토올리고당 2 g을 정확히 달아 물에 녹여 50 mL로 한다.
4) 시험용액 조제
갈락토올리고당이 약 0.1~1 g 포함되도록 검체 적당량을 정확히 달아 물을 가해 용해시
킨 후 50 mL로 한다. 이 용액을 0.45 μm의 필터로 여과시켜 이를 시험용액으로 한다.
(주1) 단백질 제거 조작이 필요한 시료에 대해서는 설포살리실린산을 여러 방울 첨가하
여 생긴 불용성 단백질을 원심분리로 제거하든가 Sep pak C18 cartridge를 통과시키든가 
한다. 이들의 제작을 요하는 경우에는 내부표준으로서 Ribose 또는 Arabinose 를 사용한
다.
(주2) 유지를 많이 함유한 시료의 경우 시료의 전처리는 프락토올리고당의 분석법의 전
처리방법에 준한다.
(주3) 시료중에 갈락토올리고당 이외의 3 ~ 6당류인 올리고당이 존재할 경우에는 해당하
는 올리고당 분해효소에 의해 단당류, 2당류로 분해하고 나서 분석한다. 그러나 이성화당, 16장. 올리고당
293설탕이나 다당류의 존재는 갈락토올리고당의 분석을 방해하지 않는다.
5) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프 조건
칼럼∶Shodex Ionpak KS-802 상당품 및 역상 amino column
칼럼온도 ∶80℃
이동상 ∶물
유  속∶0.4 mL/min
검출기 ∶시차굴절계 (RI)
나) 정량시험
갈락토올리고당 표준용액을 2, 4, 6, 8 및 10 mL를 20 mL용 메스플라스크에 정확하게 
취하여 물로 눈금을 맞춘 다음, 각각 10 μL씩 고속액체크로마토그래프에 주입시켜 피
크의 면적 또는 높이를 읽어내어 검량선을 작성한다. 검체중의 갈락토올리고당의 함량
(%)은 다음 식으로 구한다.
갈락토올리고당 (%) ＝B mg/mL ×50mL
Ag×100
1000
A∶시료채취량 (g)
B∶검량선에서 구한 갈락토올리고당의 농도(mg/mL)
나. 갈락토올리고당 (라피노스, 스타치오스 ) 
1) 시 약
가) 설포살리실린산 (Sulfosalicylic acid)
나) 갈락토올리고당 (Raffinose, Stachyose) 표준용액
   각 갈락토올리고당을 각각 0.6 g씩 정확하게 취하여 물에 넣고 용해시켜 20mL로 한다.
2) 시험용액 조제
가) 유지를 거의 함유하지 않은 시료인 경우
검체 적당량(각 갈락토올리고당 0.07~0.7 g 함유한 양)을 정확히 달아 물을 가하여 용
해 혹은 추출하여 50 mL로 한다. 이 용액을 0.45 μm의 필터로 여과한다.294나) 유지를 많이 함유한 시료인 경우
검체가 액체인 경우에는 그 적당량(위의 가)와 같음)을 정확히 재고, 필요하다면 중화
한다. 여기에 규조토를 넣고 잘 혼합한다. 60±2 ℃에서 2～4시간 감압 건조한다. 건조
후 전량을 원통여과지에 옮겨 넣고 석유에테르를 사용하여 속시렛 지방 추출기로 8~16
시간 탈지한다. 탈지 후 원통여과지안의 전량을 꺼내서 이하 상기 가)와 같이 조작한
다. 시료가 분말상태인 경우에는 규조토를 넣지 않고 직접 원통여과지에 넣어 이하 똑
같이 조작한다.
(주1) 시료에 단백질이 함유된 경우 0.2 g/mL 설포살리실린산 수용액을 수방울 가해 단
백질을 제거한다. 또한 덱스트린이 검체중에 혼재하는 경우는 글루코아밀라제
(Glucoamylase) 로 분해한다.
3) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래피 조건
       칼럼∶Shodex Ionpak KS-802 상당품
       칼럼온도 ∶70℃
       이동상 ∶물
       유속∶1.0 mL/min
       검출기 ∶시차굴절계 (RI)
나) 정량시험
갈락토올리고당 표준용액을 1, 2, 3, 4 및 5 mL를 10 mL용 메스플라스크에 정확하게 
취하여 물로 눈금을 맞춘 다음, 각각 10 μL씩 고속액체크로마토그래프에 주입시켜 피
크의 높이 또는 면적을 읽어내어 검량선을 작성한다. 검체중의 갈락토올리고당의 함량
(%)은 다음 식으로 구한다.
        갈락토올리고당 (%) ＝ (A＋B) ×50
C×100
1000
        A∶ 갈락토올리고당의 농도(mg/mL)  
        B∶ 시험용액중의 갈락토올리고당의 농도(mg/mL) 
        C∶ 시료 채취량(g)
2. 프락토올리고당
정의 : 당질원료를 이용하여 1개 이상의 과당분자가 결합되도록 효소를 작용시켜 얻은 
당액이나 당질원료를 효소를 이용하여 얻은 당액을 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말상
의 것을 말한다.16장. 올리고당
295가. 장치 : 고속액체크로마토그래프
나. 시 약
1) 아세토니트릴 ∶HPLC용
2) 글리세롤 ∶특급
3) 에탄올 ∶특급(99.5%)
4) 규조토 ∶여과조제용 (정제품)
5) 80% 에탄올 ∶99.5% 에탄올과 물을 80∶20(v/v)으로 혼합한다.
6) 5% 글리세롤 ∶글리세롤 5 g을 취하여 100 mL 메스플라스크에 넣고 에탄올 50 mL를 넣
어 용해시킨 후 물로 표선까지 채워 내부표준물질로 사용한다(글리세롤외에 아라비노스
도 내부표준물질로서 사용할 수 있다).
다. 표준용액의 조제
1-케스토즈(GF2), 니스토즈(GF3), 1-F 프락토퓨라노실니스토즈 (GF4)를 0.4 g씩 달아 각각 
20 mL의 메스플라스크에 넣고 약 10 mL의 물을 넣어 용해시킨 후 증류수로 표선까지 
채운 것을 표준원액으로 한다. 표준원액 1, 2, 3, 4, 및 5 mL를 정확히 취하여 각각 10 
mL용 메스플라스크에 옮겨 넣고, 이에 5% 글리세롤 1 mL를 넣은 뒤 물로 표선까지 채
운 것을 표준용액으로 한다.
라. 시험용액 조제
프락토올리고당으로서 0.2g∼2g이 함유되도록 적당량의 시료를 정밀하게 달아 100mL의 
용량플라스크에 넣고 이에 물 20mL를 가하여 용해 또는 추출한다(산성인 채로 실험을 
진행할 경우 가수분해의 우려가 있으므로 필요하면 중화하고, 가열하면서 혼합하든지 초
음파처리를 한다).
용해되지 않는 물질이 거의 없을 때에는 내부표준용액 20mL를 넣은 후 증류수로 표선
까지 채운다. 필요하면 여과(No.5B 또는 10,000 Da cut off 원심분리필터 )하여 사용한다. 
얻어진 여과액에 동량의 에탄올을 첨가하여 희석한다. 침전 또는 탁한 것이 생겼을 경우
에는 여과하고 여과액을 시험용액으로 한다. 
(주1) 용해되지 않는 물질이 많을 때에는 추출액을 여과(No. 5B)하면서 100 mL 메스플라
스크에 전가용물을 옮겨 넣고 이하 똑같이 처리한다.
마. 시험조작2961) 고속액체크로마토그래피의 측정 조건
    칼럼∶당분석칼럼 또는 이와 동등 이상인 것
    이동상 ∶아세토니트릴 ∶물(65∶35)
    검출기 ∶시차굴절계 (RI)
    유속∶1.0 mL/min
   (주1) 이동상은 칼럼의 종류나 상태에 따라 조성을 달리 할 수 있다. 아세토니트릴과 
물의 비율을 65∶35에서 70∶30정도의 차이로 조정한다. 소량의 에틸알코올을 넣어 조
정할 수도 있다.
2) 정량시험
표준용액과 시험용액을 각각 10μL씩 주입하여 앞의 조건에서 시험한다. 표준용액 중 각 
프락토올리고당과 내부표준물질의 피크의 면적 또는 높이에 의해 구한 검량선을 사용하
여 시험용액 중 각 프락토올리고당의 농도(mg/mL)를 구하고, 다음 식에 의하여 시료 중 
프락토올리고당 (GF2＋GF3＋GF4)의 함량(%)을 구한다.
바. 계 산
    프락토올리고당함량(%)=(A+B+C)×100×b
시료채취량(g)×100
1,000
       A : 시험용액 중 GF2의 농도(mg/mL)
       B : 시험용액 중 GF3의 농도(mg/mL) 
       C : 시험용액 중 GF4의 농도(mg/mL) 
       b : 희석배수  
3. 이소말토올리고당
정의 : 당질원료를 포도당분자가 분지결합의 기본구조를 갖도록 효소를 작용시켜 얻은 
당액을 여과, 정제, 농축한 액상 또는 분말상의 것을 말한다.
가. 장 치
고속액체크로마토그래프
나. 시 약16장. 올리고당
2971) 50% 알코올
2) 활성탄 ∶청주용 또는 당액 탈색용
3) 이온교환수지 ∶강 산성형(H형) 및 강 알칼리형(OH형)
4) 퍼라이트(Perlite)
5) 아세토니트릴 ∶HPLC용
6) 표준당
     단당류 —Glucose, Fructose
     이당류 —Maltose, *Isomaltose, Sucrose, *Kojibiose, *Nigerose
     삼당류 —Maltotriose, *Pannose, *Isomaltotriose
     사당류 —Maltotetraose, *Isomaltotetraose
     오당류 —Maltopentaose, *Isomaltopentaose
     육당류 —Maltohexaose, *Isomaltohexaose
     칠당류 —Maltoheptaose, *Isomaltoheptaose 
            (*는 이소말토올리고당의 분기당성분 )
다. 표준용제의 조제
1) 배제형 이온교환계 ∶각 중합도의 직쇄당을 정확하게 50 mg씩 달아 탈기한 증류수 50 
mL에 녹이고, 용해되기 어려울 때는 가온하여 녹이고 냉각 후 증류수 100 mL로 채워 
표준용액으로 한다.
2) 역상분배계 ∶각 분기당의 표준액 100 mg을 증류수 1 mL에 용해한 것을 표준용액으로 
한다. 
라. 시험용액 조제
1) 유지를 거의 함유하지 않은 검체인 경우 이소말토올리고당이 약 500 mg이 되도록 시료
를 적당량(0.5～5 g)을 정확히 달아 여기에 물 또는 50% 알코올(단백질을 함유한 경우)
을 30 mL 넣어서 가열하여 용해, 혹은 추출한다. 추출액은 약 0.5 g의 활성탄과 이온교
환수지(양이온 및 음이온을 1∶2로 혼합한 것 약 1.5 g)을 사용하여 정제하고, 전량을 
500 mL로 하여 시험용액으로 한다.
2) 유지를 많이 함유한 검체인 경우
이소말토올리고당 적당량(0.5～5 g)을 정확히 달아 분말인 경우에는 그대로 추출기에 넣298고, 시료가 액체인 경우에는 필요하다면 (pH 4~10 이외) 중화한 후 퍼라이트를 부석부석
하게 될 때까지 넣어서 잘 분산시켜 8~16시간 탈지한다. 탈지 후 원통여과지 안의 전량
을 꺼내어 위의 Ⓐ와 같이 추출 이후의 조작을 한다.
   (주1) 중합도 2～5와 거의 같은 분자량인 설탕, 유당, 프락토올리고당 , Coupling sugar 및 
갈락토올리고당이 혼재할 경우에는 각각의 측정법으로 따로 분석한다. 그러나 이성화당, 
포도당, 물엿 등의 전분당이 혼재할 경우에는 이소말토올리고당의 분석을 방해하지 않
는다.
마. 시험조작
1) 고속액체크로마토그래피 조건
가) 배제형 이온교환계
        칼럼∶∮8 mm × 200 mm MCI GEL CKO  4S 상당품
        가드칼럼 ∶∮8 mm × 50 mm MCI GEL CKO 8S 상당품
        칼럼온도 ∶65℃
        이동상 ∶물
        유속∶0.4mL/min
        검출기 ∶시차굴절계 (RI)
나) 역상분배계
        칼럼∶∮4.6 mm×250 mm TSK GEL NH2 -60 상당품
        칼럼온도 ∶35℃
        이동상 ∶아세토니트릴 ∶물(63∶37)
        유속∶0.8m mL/min
        검출기 ∶시차굴절(Refractive Index)계
2) 정량시험
가) 검량선의 작성∶표준용액을 5, 10, 15, 20, 25 mL씩을 넣고 증류수로 각각 50 mL로(이 
농도는 25, 50, 75, 100, 125 mg/50mL가 된다) 한 다음 10 μL씩 주입한 후 상당하는 직
쇄상의 피크에 따라서 면적 또는 높이를 읽어내어 검량선을 작성한다. 
나) 계산
① 배제형 이온교환계에서 분석한 피크의 면적 또는 높이에 의해 구해진 각 중합도의 검
량선에서 각각의 중합도의 함량이 구해지며 그 결과는 다음과 같다.
    중합도 DP1(단당류)∶A16장. 올리고당
299    중합도 DP2(이당류)∶B
    중합도 DP3(삼당류)∶C
    중합도 DP4(사당류)∶D
    중합도 DP5(오당류)∶E
    중합도 DP6(오당류)∶F
    중합도 DP7(오당류)∶G
다) 역상분배계에서 시료를 분석한 Data의 각 당분함유율 (%)은 다음과 같다.
    DP1 Fructose A1
    DP1 Glucose A2
    DP2 Maltose B1
    DP2 Sucrose B2
    DP2 Isomaltose B3
    DP2 Nigerose B4
    DP2 Gojibiose B5
    DP3 Maltotriose C1
    DP3 Pannose C2
    DP3 Isomaltotriose C3
    DP3 불명(분기당) C4
    DP4 Maltotetraose D1
    DP4 Isomaltotetraose D2
    DP5 Maltopentaose E1
    DP5 Isomaltopentaose E2
    DP6 이상 F
    DP6 Isomaltohexaose F2
    DP7 Maltoheptaose G1
    DP7 Isomaltoheptaose G2
    DP8 이상 H
  (주∶이소말토올리고당에는 DP4이상의 직쇄당 및 DP8 이상의 성분을 포함하지 않는다)
바. 계 산300    DP1 Fructose        A mg×A1
A1＋A2 ＝ a1 mg
    DP1 Glucose        A mg×A2
A1＋A2 ＝ a2 mg
    DP2 Maltose        B mg×B1
B1＋B2＋B3＋B4＋B5＝  b1 mg
    DP2 Sucrose        B mg×B2
B1＋B2＋B3＋B4＋B5 ＝ b2 mg
    DP2 Isomaltose      B mg×B3
B1＋B2＋B3＋B4＋B5 ＝ b3 mg※
    DP2 Negerose       B mg×B4
B1＋B2＋B3＋B4＋B5 ＝ b4 mg※
    DP2 Kojibiose       B mg×B5
B1＋B2＋B3＋B4＋B5 ＝ b5 mg※
    DP3 Maltotriose     C mg ×C1
C1＋C2＋C3＋C4 ＝ c1 mg
    DP3 Pannose        C mg ×C2
C1＋C2＋C3＋C4 ＝ c2 mg※
    DP3 Isomaltotriose   C mg ×C3
C1＋C2＋C3＋C4 ＝ c3 mg※
    DP3 불명(분기당)    C mg ×C4
C1＋C2＋C3＋C4 ＝ c4 mg※
    DP4 Maltotetraose    D mg ×D1
D1＋D2＝ d1 mg
    DP4 Isomaltotetraose  D mg ×D2
D1＋D2 ＝ d2 mg※
    DP5 Maltopentaose    E mg ×E1
E1＋E2 ＝ e1 mg
    DP5 Isomaltopentaose  E mg ×E2
E1＋E2 ＝ e2 mg※
    DP6 이 상   F mg ＝ f mg
    DP6 Maltohexaose      F mg ×F1
F1＋F2＝ f1 mg
    DP6 Isomaltohexaose    F mg ×F2
F1＋F2 ＝ f2 mg※
    DP7 Maltoheptaose     G mg ×G1
G1＋G2 ＝ g1 mg16장. 올리고당
301    DP7 Isomaltoheptaose   G mg ×G2
G1＋G2 ＝ g2 mg※
    DP8 이상           H mg ＝ h mg
    결국 시료채취량을 I mg으로 하고 희석배수를 Ｌ로 하면, 위의 ※은 모두 분기당이므
로 분기당함량 (%) ＝ (b3＋b4＋b5＋c2＋c3＋c4＋d2＋e2＋f2＋g2) ×L÷I×100 으로 한다.
4. 키토올리고당
가. 총 글루코사민
시료 0.04g(글루코사민으로 )을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물에 녹여 액성이 
산성인 중화(pH 7.0)시켜 물을 가하여 100mL로 하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 
후 상층액을 검액으로 한다. 제21장 추출제 1. 키토산(총글루코사민으로서 ) 다. 시험조작
에 따라 시험한다. 
나. 유리 D-글루코사민
1) 표준용액의 조제
D-글루코사민 표준품 0.5g을 100mL용 메스플라스크에 정밀히 달아 물 50mL를 가하여 
녹인 후 아세토니트릴로 100mL까지 채운다.
2) 시험용액의 조제
시료 약 5g을 메스플라스크에 정밀히 달아 물 25mL를 가하여 녹인 후 아세토니트릴로 
50mL까지 채운다. 이를 0.45μm의 멤브레인 필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.
3) 시험조작
가) 고속액체크로마토그래프의 측정 조건
칼럼 : 길이 250mm, 안지름 4.6mm의 NH2-60칼럼 또는 이와 동등한 것
이동상 물 : 아세토니트릴 (25:75)
검출기 : 시차굴절계 (RI)
칼럼온도 : 40℃
유속 : 0.8mL/min302나) 정량시험
시험용액 및 표준용액을 각각 10μL 씩 주입하여 얻은 피크의 넓이 또는 높이를 구하여 
검량선을 작성한 후 시험용액의 글루코사민의 농도(μg/mL)를 구하고, 다음의 식에 의해 
시료 중 글루코사민의 함량(g/100g)을 산출한다.
다) 계산
     S : 시험용액중의 당질의 농도(μg/mL)
     a : 시험용액의 전량(mL)
     b : 희석배수
다. 키토올리고당
  키토올리고당 = 총 글루코사민 함량 - 유리 D-글루코사민 함량
5.말토올리고당
가.장치
고속액체크로마토그래프
나.시약
1)50%알코올
2)활성탄∶청주용또는당액탈색용
3)이온교환수지∶강산성형(H형)및강알칼리형(OH형)
4)퍼라이트(Perlite)
5)물∶HPLC용
6)표준당
삼당류(DP3)—Maltotriose
사당류(DP4)—Maltotetraose
오당류(DP5)—Maltopentaose
육당류(DP6)—Maltohexaose
칠당류(DP7)—Maltoheptaose16장. 올리고당
303다.표준용액의제조
각중합도의직쇄당을정확하게50mg씩달아탈기한증류수50mL에녹이고,용해
되기어려울때는가온하여녹이고냉각후증류수로100mL로채워표준용액으로
한다.
라.시험용액조제
1)유지를거의함유하지않은검체의경우
시료4g을정확히달아여기에물또는50%알코올(단백질을함유한경우)을30
mL넣어서가열하여용해,혹은추출한다.추출액은약0.5g의활성탄과이온교환
수지(양이온및음이온을1∶2로혼합한것약1.5g)을사용하여정제하고,전량을
100mL로하여시험용액으로한다.
2)유지를많이함유한검체인경우
시료4g을정확히달아분말인경우에는그대로추출기에넣고,시료가액체인
경우에는필요하다면(pH4~10이외)중화하고나서퍼라이트를부석부석하게될때까
지넣어서잘분산시켜8~16시간탈지한다.탈지후원통여과지안의전량을꺼내어
위의1)과같이추출이후의조작을한다.
주1.중합도2~5와거의같은분자량인설탕,유당,프락토올리고당,Coupling
sugar및갈락토올리고당이혼재할경우에는각각의측정법으로따로분석한다.그
러나이성화당,포도당,물엿등의전분당이혼재할경우에는말토올리고당의분석을
방해하지않는다.
마.시험조작
1)고속액체크로마토그래피조건
—칼럼∶AminexHP×42A(BioRad)또는이에상응하는배제형이온교환계
—칼럼온도∶85℃
—이동상∶물
—유속∶0.6mL/min
—검출기∶시차굴절계(RI)
2)검량선작성
각농도의표준용액을10μL씩주입하여분석한뒤횡축이말토올리고당량(mg),
종축에크로마토그램의면적을취하여검량선을작성한다.
3)계산304시료의말토올리고당의면적을읽어검량선으로부터시료의말토올리고당함량을
구한다.
말토올리고당함량(%)＝(A＋B＋C＋D＋E)mɡ
시료채취량(mɡ)×희석배수
DP3MaltotrioseAmg
DP4MaltotetraoseBmg
DP5MaltopentaoseCmg
DP6MaltohexaoseDmg
DP7MaltoheptaoseEmg
6.자일로올리고당
가.장치
고속액체크로마토그래프
나.시약
1)물:HPLC용
2)아세토니트릴:HPLC용
3)퍼라이트(Perlite)
4)표준당
이당류-xylobiose
삼당류-xylotriose
사당류-xylotetraose
오당류-xylopentaose
육당류-xylohexaose
다.표준용액의제조
각중합도의자일로올리고당이약50~100mg포함되도록검체적당량을정확히달
아탈기한물50mL에녹이고이용액을0.45μm의필터로여과시켜이를표준용액
으로한다.
라.시험용액의제조
1)유지를거의함유하지않은시료의경우
시료3g을정확히담아물을가해용해하여30mL가되게한다.이용액을0.4516장. 올리고당
305μm의필터로여과시켜이를시험용액으로한다.
2)유지를많이함유한시료의경우
시료3g을정확히달아분말인경우에는그대로추출기에넣고,시료가액체인
경우에는필요하다면중화후퍼라이트를부석부석할때까지넣고분산시켜8~16시
간동안탈지한다.탈지후원통여과지내의전량을회수하여Ⓐ와같이이하똑같이
조작한다.
마.시험조작
1)고속액체크로마토그래피조건
—칼럼:Carbohydratecolumn4.6×250mm또는이에상응하는칼럼
—칼럼온도:상온
—이동상:아세토니트릴:물(75：25)
 (칼럼의종류나상태에따라조성을달리할수있다)
—유속:1.2mL/min
—검출기:시차굴절계(RIdetector)
2)정량시험
각농도의표준용액을10μL씩주입하여분석한후검량선의횡축은자일로올리
고당(mg),종축은크로마토그램피크의면적을읽어검량선을작성한다.시료중의자
일로올리고당의함량(%)은다음식으로구한다.
자일로올리고당함량(%)=(A＋B＋C＋D＋E)mɡ
시료채취량(mɡ)×희석배수×100
xylobioseAmg
xylotrioseBmg
xylotetraoseCmg
xylopentaoseDmg
xylohexaoseEmg
7.겐티오올리고당
가.장치
고속액체크로마토그래프
나.시약3061)물:HPLC용
2)SodiumHydroxide
3)Sodiumacetate
4)퍼라이트(Perlite)
5)표준당
이당류Gentiobiose,Cellobiose
다.표준용액의조제
Gentiobiose와Cellobiose가약50~100mg포함되도록검체적당량을정확히달아
탈기한물1L에녹이고이용액을0.45㎛의필터로여과시켜이를표준용액으로한다.
라.시험용액의조제
1)유지를거의함유하지않은검체인경우
시료100mg을정확히담아물을가해용해하여1L가되게한다.이용액을
0.45㎛의필터로여과시켜이를시험용액으로한다.
2)유지를많이함유한검체인경우
시료100mg을정확히달아분말인경우에는그대로추출기에넣고시료가액체
인경우에는필요하다면중화후퍼라이트를부석부석할때까지넣고8~16시간동안
탈지한다.탈지후원통여과지내의전량을회수하여1)과같이이하똑같이조작한다.
마.시험조작
1)고속액체크로마토그래피조건(1)
—칼럼:PA-1Column4.6×250mm또는이에상응하는칼럼
—칼럼온도:상온
—이동상:
A:150mMSodiumHydroxide
B:150mMSodiumHydroxise+600mMSodiumAcetate
—유속:1.0mL/min
—검출기:PulsedAmperometricDetecter
2)고속액체크로마토그래피조건(2)
—칼럼:AminexHPX-42AColumn7.8×300mm또는이에상응하는배제형
 이온교환계
—칼럼온도:85℃
—이동상:물
—유속:0.6mL/min16장. 올리고당
307—검출기:시차굴절계(RI)
3)정량시험
가)검량선작성
각농도의표준용액을10μL씩주입하여분석한후검량선의횡축은겐티오올리
고당(mg),종축은크로마토그램피크의면적을읽어검량선을작성한다.
나)계산
배제형이온교환계에서분석한피크의면적또는높이에의해구해진각중합도
의검량선에서각각의중합도의함유량이구해지며그결과는다음과같다.
중합도DP1(단당류):A
중합도DP2(이당류):B
중합도DP3이상(3당류이상):C
PA-1칼럼에서시료를분석한Data의각당분함유율(%)은다음과같다.
DP1Fructose A₁
DP1Glucose A₂
DP2Maltose B₁
DP2Gentiobiose B₂
DP2Cellobiose B₃
DP3이상 C
<계산>
DP1FructoseAmg×A1
A1＋A2=a₁mg
DP1GlucoseAmg×A2
A1＋A2=a₂mg
DP2MaltoseBmg×B1
B1＋B2＋B3=b₁mg
DP2GentiobioseBmg×B2
B1＋B2＋B3=b₂mg
DP2CellobioseBmg×B3
B1＋B2＋B3=b₃mg
겐티오올리고당의함량(%)=(b₂+b₃)mg÷시료채취량mg×희석배수×10030817장. 유화제
1. 프로피렌글리콜 (Propylene glycol)
가. 적정법
본 품 약 1g을 정밀히 칭량하여, 물을 넣어 정확히 250㎖로 하고 그 중 10㎖를 취하여 
공전 플라스크에 넣는다. 여기에 과요오드산나트륨 시액 10㎖를 정확히 넣고 이어 황산
(1→2) 4㎖를 넣고 잘 흔들어 섞어 40분간 방치한다. 여기에 요오드화칼륨 5g을 넣고 즉
시 밀봉하여 잘 흔들어 섞은 후, 어두운 곳에 5분간 방치하여 0.1N 티오황산나트륨액으
로 적정한다.(지시약 전분시약 1㎖) 별도로 같은 방법으로 공시험한다 .
 0.1N 티오황산나트륨액 1㎖ = 3.805㎎ C3H8O218장. 완충제
30918장. 완충제
1. 탄산나트륨 (소다회)
가. 분석방법(기기 분석법)
본 품목을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 나트륨(Na) 
함량을 분석하고 탄산나트륨 (Na2CO3)의 함량으로서 계산한다.
2. 탄산수소나트륨 (중조)
가. 중화적정법
본 품을 데시케이터 (실리카겔)에서 4시간 건조 후 그 중 약 2.0g을 정밀히 칭량하여 물 
25㎖를 가하여 녹이고, 1N황산으로 적정하여 액의 청색이 황녹색으로 변할 때 주의하여 
끓이고 냉각 후 녹황색을 띌 때까지 적정한다.(지시약 브롬크레졸그린 시액 2방울) 같은 
방법으로 공시험을 실시하여 보정한다.
1N 황산 1㎖ = 84.01㎎ NaHCO 3
나. 기기 분석법
본 품목을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 나트륨(Na) 
함량을 분석하고 탄산수소나트륨 (NaHCO 3)의 함량으로서 계산한다.
3. 산화마그네슘
가. 분석방법(기기 분석법)
본 품목을 취하여 원자흡광광도법 또는 유도결합플라즈마발광광도법에 따라 마그네슘
(Mg) 함량을 분석하고 산화마그네슘 (MgO)의 함량으로서 계산한다.31019장. 착색제
1. 천연착색제 (카로틴, 크산토필 및 카로티노이드 )
가. 장치 및 시약
1) 장치
가) 코크달린 유리관 컬럼 : 직경 12.5mm x 높이 300mm (with stopper)
나) Reflux Condenser( 속실렛 검화장치)
다) UV/Vis Spectrophotometer ; 카로틴 λ=436nm, 크산토필 λ=474nm
2) 시약
가) 추출용액 : Hexane + Acetone + Abs.EtOH + Toluene = 10 + 7 + 6 + 7 
나) 40% Methanolic KOH 
다) 10% Na2SO4 용액
라) Florisil (60-100 mesh)
마) 카로틴 용출액(carotene eluent) : Hexane +Acetone = 96 + 4 
바) 크산토필 용출액 : Hexane +Acetone + MeOH = 8 + 1 + 1
나. 시료의 전처리 방법
1) 추 출
시료를 색소 함량에 따라 0.5~4g 칭량하여 100㎖ 농축 플라스크에 취한다. 색소추출용매 
30㎖ 정확히 가해 1분간 흔든 뒤, 40% methanolic KOH용액 2㎖ 첨가한다. (배합사료는 
4㎖) 수분이 낮은 시료는 증류수를 1㎖/2g 가한다. 56℃의 검화장치에서 30분간 검화 후 
냉각시킨 다음, 어두운 곳에서 1시간 방치한다. Hexane 30㎖를 정확히 가하여 1분간 흔
들어주고, 10% Na2SO4 용액 50㎖를 가하고 1분간 세게 흔들어 준다. 칼럼크로마토그라
피를 하기 전까지 냉암소에 방치한다.(상층부는 50㎖이다)19장. 착색제
3112) 칼럼크로마토그라피 준비
유리관 컬럼에 탈지면을 깔고 Florisil 5g을 충진하고 상부에 무수Na2SO4를 2cm정도가 
되도록 넣고 콜크를 유리막대에 꽂아 눌러준다.
3) Carotene 과 Xanthophyll 의 분리․정량
조제된 시료의 상등액 중 5㎖를 취해(낮은 농도인 경우 10㎖) 관컬럼을 넣고 초당 2∼3
방울 떨어지게 조절한다. Eluent가 마지막으로 adsorbent 의 상부에 닿기 전에 먼저 카로
틴 용출액(carotene eluent)를 가해주되 carotene band가 25㎖ 플라스크에 모아질 때까지 
계속한다. 추출 후 carotene eluent로 정용한다 크산토필 용출액(xanthophyll eluent)를 10
㎖씩 2회 가하고 25㎖ 플라스크에 용출액을 모으고 xanthophyll eluent로 정용한다.
    주1) adsorbent 는 항상 용매(eluent용액)로 채워져 있어야 한다. 
    주2) carotene성분이 추출된 후 xanthophyll 은 column에 남아 있다. 
다. 흡광도 측정
각각의 용출액(eluent)를 공시험 용액으로 하여 카로틴 추출액은 436nm에서 크산토필 추
출액은 474nm에서 흡광도를 측정한다.
    주1) 흡광도값은 0.25 ~ 0.75 사이에 들도록 한다.
    주2) 크산토필 추출액은 캡산틴의 LC 정량에 사용할 수 있다.
3) 계산방법 
  다음의 방정식을 사용하여 측정된 수치를 가지고 농도를 계산한다.
   : trans- β-carotene 과 trans-lutein 의 경우에는 a가 각각 196과 236이다.
가) 카 로 틴 (mg/kg) = [흡광도(at 436nm) x 454 x f] / (a)196 x d x 0.4536)
나) 크산토필 (mg/kg) = [흡광도(at 474nm) x 454 x f] / (a)236 x d x 0.4536)
다) (총)카로티노이드의 함량은 1)  + 2) 
    여기서 
      f : 기계의 deviation factor 
                a) 카 로 틴 ; 0.460 / A436
                b) 크산토필 ; 0.561 / A474
      d : 희석비율 : 시료채취량 g × column에 주입한량 ㎖) / (50㎖ 상등액 × 최종희석액
㎖3122. 아스타키산틴 (Astaxanthin)
가. 비색법
본 품 약 0.035g을 정밀하게 칭량하여 클로르포름을 가하고 녹여 정확히 200㎖로 한다. 
이 액 5㎖를 정확하게 취하여 클로르포름을 가하여 정확하게 50㎖로 한다. 여기에 이 액 
5㎖를 정확히 취하여 클로르포름을 가하여 정확히 50㎖로 하여 시료용액으로 한다. 이 
액으로 클로르포름을 대조로 하여 파장 489nm 부근의 최대파장에서의 흡광도 A를 측정
한다.
아스타키산틴 (C40H52O4)의 양(㎎) = A
1,975×200,000
나. HPLC법(역상LC법)
1) 장치 및 시약
  진탕항온수조
  무수알콜
  클로로포름 : HPLC grade 
  메탄올 : HPLC grade 
2) 시험방법
시료를 일정량을 평량하여 50ml 메스플라스크에 넣고 증류수 10㎖를 가해 60℃ 수욕조
에서 1시간 방치하여 완전히 용해시킨다 . 방냉 후 클로로포름 4ml를 가하고 무수알콜로 
희석하여 혼합한다. 이 용액을 실린지필터 (0.45um)로 여과 후 시험용액으로 사용한다. 
Astaxanthin 표준물질을 적정량 취하여 시료용액과 동일하게 처리한다.
3) HPLC 분석조건
 이동상 : Methanol 100%
 칼  럼 : Novapak C18 3.9 × 150mm 또는 Phenomenex C18 4.6mm x 250mm 
 검출기 : UV 470nm (trans & Cis isomer ; 2 peak)
 유  속 : 0.8ml/min 
4) 계 산  19장. 착색제
313     Astaxantin (%) = Sample area / Std area x 표준품의 농도(mg/ml)
                        x 희석량(ml) x 100 / 시료무게(mg) 
3. 칸타산틴(Canthaxanthin)
가. HPLC법
1) 시험방법
본 품 약 1.0g을 증류수 80㎖, 암모니아수 (20～30%) 1㎖, 트립신/펩신(1 : 1) 100mg을 가
하여 50℃ 초음파 수욕상에서 30분간 방치 한 후, 상온으로 냉각하고 증류수를 가하여 
100㎖ 되도록 한다. 혼합액 10g에 에탄올 100㎖를 가하여 흔든 뒤 에틸에테르로 250㎖가 
되게 한다. n-헥산에 담겨있는 비활성 산화알루미늄을 채운 컬럼에 추출액 25㎖를 넣고 
n-헥산 : 에테르(1 : 1) 50～100㎖로 흘려 용리액을 수집하여 용매를 날린 뒤, 건조된 잔
류물을 n-헥산 : 아세톤(95 : 5) 5㎖로 용해하여  시료액으로 하고 아래의 조건에서 분석
한다. 칸타산틴 함량은 그것과 이성체 피크들의 합으로 계산한다.
2) 고속액체크로마토그라피 분석조건 (예)
컬럼 : 실리카겔 충진 컬럼
이동상 : n-헥산 : 아세톤 (93 : 7)
유속 : 1.5㎖/min
시료주입량 : 10～50㎕
검출기 : 가시광선자외선 검출기, 466nm
4. 아포카로텐산 에스테르(Apocarotenoic Ester)
가. HPLC법
1) 시험방법
본 품 약 1.0g을 증류수 80㎖, 암모니아수 (20～30%) 1㎖, 트립신/펩신(1 : 1) 100mg을 가
하여 50℃ 초음파 수욕상에서 30분간 방치 한 후, 상온으로 냉각하고 증류수를 가하여 
100㎖ 되도록 한다. 혼합액 10g에 에탄올 100㎖를 가하여 흔든 뒤 에틸에테르로 250㎖가 
되게 한다. n-헥산에 담겨있는 비활성 산화알루미늄을 채운 컬럼에 추출액 25㎖를 넣고  314n-헥산 : 에테르(1 : 1) 50～100㎖로 흘려 용리액을 수집하여 용매를 날린 뒤, 건조된 잔
류물을 n-헥산 : 아세톤(95 : 5) 5㎖로 용해하여  시료액으로 하고 아래의 조건에서 분석
한다. 아포카로텐산 에스테르의 함량은 그것과 이성체 피크들의 합으로 계산한다.
2) 고속액체크로마토그라피 분석조건 (예)
컬럼 : 실리카겔 충진 컬럼
이동상 : n-헥산 : 아세톤 (93 : 7)
유속 : 1.5㎖/min
시료주입량 : 10～50㎕
검출기 : 가시광선자외선 검출기, 466nm20장. 추출제
315제20장. 추출제
1. 키토산(총글루코사민으로서 )
가. 시액 조제
1) 아세틸아세톤용액 : 증류 정제한 무색 아세틸아세톤 (BP 138～140℃) 1.5mL에 1.2N 탄산
나트륨용액을 가하여 50mL로 한다.
2) p-디메틸아미노벤즈알데히드 (p-Dimethylaminobenzaldehyde) 시액 : p-디메틸아미노벤즈알
데히드 1.6g에 염산 30mL를 가하여 녹이고 96%(v/v) 에탄올 30mL를 가하여 혼합한다.
나. 시험용액의 조제
시료 0.04g(글루코사민으로 )을 정밀히 취하여 필요한 경우 탈지하고 물에 녹여 액성이 
산성인 경우 중화(pH7.0)시켜 물을 가하여 100mL로 하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리
한 후 상층액을 검액으로 한다.
다. 시험조작
1) 검액 10mL를 취하여 염산 7mL 및 물을 가하여 20mL로 하고, 이 액 5mL를 시험관에 취
하고 탈기 밀봉하여 105℃에서 24시간 분해한 후 뚜껑을 열어 감압하에 염산 및 물을 
제거한 다음 잔류물을 물 5mL로 녹이고 불용물이 있으면 여과한다. 이 여액 1mL를 마
개 있는 시험관에 취하고 아세틸 아세톤시액 2mL 를 가하여 혼합한 후 96℃에서 1시간 
가열한 후 흐르는 물에서 냉각시키고 이에 96%(v/v) 에탄올 20mL를 가하고 p-디메틸아
미노벤즈알데히드시액 2mL를 가하여 혼합하고 실온에서 2시간 방치 후 파장 530nm에서 
흡광도를 측정한다.
2) 따로, D-글루코사민 또는 N-아세틸 D-글루코사민을 100~500 μg(D-글루코사민으로 )/mL 함
유한 용액 10mL를 취하여 앞의 (1)이하에 따라 동일하게 조작하여 다음과 같이 총글루
코사민의 함량을 구한다.
라. 계 산
     총글루코사민 (%) =316        Sa : 검액의 흡광도
        St : 표준용액의 흡광도
2. 세포벽추출물 (글루칸 혹은 베타글루칸 )
가. 시약 및 시액조제
1) 에탄올용액
2) 내열성 α-아밀라아제용액 : Sigma사 Cat. No. A3306 또는 Termamyl 300L, Novo Cat, 
No. 361-6282 또는 이와 동등한 것
3) 셀룰라아제 : Sigma사 Cat. No. C8546 또는 이와 동등한 것
4) 프로테아제 : Sigma사 Cat. No. P3910 또는 이와 동등한 것(냉장 (0～5℃)보존) MES/TRIS 
완충액으로 50mg/mL되게 조제한다. 사용 시 조제한다.
5) 아밀로글루코시다제 용액 : Sigma사 Cat. No. AMG A9913 또는 이와 동등한 것(냉장 
(0～5℃)보존)
6) 0.1N 수산화나트륨용액
7) 0.1N 염산용액
8) 5% 페놀용액 : 페놀 5g을 취하여 물을 가하여 100mL로 한다.
나. 시료의 전처리 및 시험용액의 조제 
1) 시험은 두개의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다.
2) 시료(지방이 10%이상인 경우 탈지하고, 당을 많이 함유한 경우 85% 에탄올용액으로 시
료 1g당 10mL씩으로 세척한다) 약2～10g을 정밀히 달아 삼각플라스크에 취하고 물 
100mL을 가한다. 여기에 아밀라아제 (20unit) 약 40～200mg을 취하여 넣고 0.1N NaOH로 
pH 6.9로 한 후 20℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 이에 0.1N HCl로 pH 5.0
으로 하고 셀룰라아제 (50unit)를 넣고 37℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시키고, 프
로테아제(10unit) 약 15～80mg을 넣고 0.1N NaOH로 pH 7.5로 한 후 37℃에서 2시간동안 
진탕하여 효소분해 시킨다. 이에 아밀로글루코시다제 (70unit) 약 20～100mg을 넣고 0.1N 표준용액의농도(글루코사민으로,μg/10㎖)×Sa
St×10
검체의채취량(g)×100
10620장. 추출제
317HCl로 pH 4.8로 한 후 60℃에서 2시간동안 진탕하여 효소분해 시킨다. 효소분해물에 
95% 에탄올 400mL을 가하여 4℃에서 12시간 동안 침전시킨 후, 원심분리(10,000rpm, 10
분)하여 시료의 침전물을 취하고, 다시 80% 에탄올 500mL을 침전물에 가하여 4℃에서 1
시간 동안 침전시킨 후, 원심분리(10,000rpm, 10분)를 한다. 원심분리된 침전물에 물 
20mL를 가한 후 침전물을 호모게나이저를 이용하여 균질화하고 물로 100mL가 되도록 
한다. 이를 적정농도가 되도록 희석한 것을 시험용액으로 한다.
다. 표준용액의 조제
글루코오스표준품을 증류수에 녹여 표준원액을 만들고(1mg/mL) 표준원액을 증류수로 희
석하여 글루코오스 표준용액 0, 25, 50, 75, 100(μg/mL)농도별 표준용액을 만든다.
라. 시험조작 
각각의 25mL 시험관에 5% 페놀용액 1mL를 넣고 농도별 표준용액은 각각 1mL를 가하
고, 시험용액은 0.1mL와 증류수 0.9mL을 가한 후 10초간 잘 흔들어 섞어 황산 5mL씩을 
가하여 혼합하고 20분 동안 실온 반응시켜 470nm에서 측정한다.
마. 계산
    베타글루칸함량(mg/g)=S×a
시료채취량×10
1,000×0.9
             S ：시험용액중의 글루코오스 농도(μg/mL)
             a ：시험용액의 전량(mL)
             0.9 : 베타글루칸 전환계수(162/180)
3. 포도종자추출물 (프로안토시아니딘 )
가. 정의
이 품목은 포도과 포도(Vitis labrusca LINNE, Vitis vinifera LINNE)의 종자로부터 얻어지
는 것으로서 주성분은 프로안토시아니딘이다 .
나. 함량
이 품목은 프로안토시아니딘으로서 표시량의 90～130%이어야 한다.
다. 정량법(측정방법)318이 품목을 프로안토시아니딘으로서 농도가 10～50mg 되도록 정밀히 달아 메탄올을 가하
여 100mL로 한 것을 시험용액으로 한다. 시험용액 0.5mL를 갈색시험관에 취하고 바닐린
-메탄올용액 (4→100) 3.0mL를 가해준 다음 뚜껑을 덮고 10초간 교반한 후 염산 1.5mL를 
정확하게 가해주고 즉시 뚜껑을 덮고 18～22℃에서 15분간 방치한 다음 물을 대조액으
로 하여 500nm에서 흡광도를 측정하고 검량선으로 부터 시험용액의 (＋)카테킨 상당량
을 구한 다음 이를 프로안토시아니딘으로 한다. 따로, 검체 중에 존재하는 안토시아니딘
을 보정하기 위한 보정시험으로 바닐린-메탄올용액 3mL 대신에 메탄올 3mL를 사용하여 
이하 시험용액의 시험조작과 동일하게 조작하여 물을 대조액으로 하여 500nm에서 흡광
도를 측정한다. 
따로, 검체 중에 존재하는 안토시아니딘을 보정하기 위한 보정시험으로 바닐린-메탄올용
액 3mL 대신에 메탄올 3mL를 사용하여 이하 시험용액의 시험조작과 동일하게 조작하여 
물을 대조액으로 하여 500nm에서 흡광도를 측정한 값을 시험용액의 흡광도에서 빼준다. 
이 때 얻은 흡광도에서 검량선으로 부터 시험용액의 (＋)카테킨 상당량을 구한 다음 이
를 프로안토시아니딘으로 한다.
라. 검량선의 작성
(＋)카테킨표준품 100mg을 정밀히 달아 메탄올을 가하여 100mL로 하고 이 액 1, 2, 3, 
5mL를 각각 취한 다음 이에 메탄올을 가하여 10mL씩으로 한 것을 각 표준용액으로 한
다. 각 표준용액 0.5mL를 갈색시험관에 각각 취하고 바닐린:메탄올 용액(4→100) 3mL를 
가해준 다음 뚜껑을 덮고 10초간 교반한 후 염산 1.5mL를 정확하게 가해주고 즉시 뚜껑
을 덮고 18～22℃에서 15분간 방치한 다음 물을 대조액으로 하여 500nm에서 각각의 흡
광도를 측정하여 표준용액의 농도(mg/mL)에 대한 흡광도로 검량선을 작성한다. 따로, 공
시험은 카테킨표준용액 대신에 물 0.5mL를 갈색시험관에 취하고 이하 표준용액의 시험
방법과 동일하게 조작한다.
    다음의 계산식에 따라 프로안토시아니딘의 함량을 구한다.
마. 계산
   프로안토시아니딘 (%) = A ×희석배수× 100/검체의 채취량(mg)
         A : 검량선에서 얻어진 시험용액의 (＋)카테킨의 상당량(mg)
4. 천연비테인
 
가. 시 약  
1) Water : LC grade 20장. 추출제
3192) 질산칼슘[Ca(NO 3)2․4H2O]
3) Betaine (mw 117.15, Sigma B2629, 99%, 냉장보관) 
나. 분석방법
예상함량에 따라 시료와 표준물질을 적당량 칭량하여 50ml Vol. flask에 취하고 40ml 정
도의 물을 가한다. 때때로 흔들어 주면서 30분정도 sonication 하고 물로 정용한 다음 고
루 흔들어준다 . 이 용액을 0.45 μm 실린지필터로 여과시켜 그 여액을 시험용액으로 사
용한다. 
다. HPLC 분석조건
칼럼 : Sugar-pak (6.5 x 300mm) 
이동상 : 0.004M Ca(NO 3)2․4H2O (사용시 제조)
검출기 : RID (reflective index detector)
칼럼오븐 : 80℃
유속 : 1.0 mL/min
라. 계 산
 비테인(%) = 시험용액의 피크면적 ÷ 표준용액의 피크면적 
× 표준용액의 농도(mg/ml) × 50ml ÷ 시료무게(mg) × 10032021장. 기타성분
1. 염기성치환용량 (Cation Exchange Capacity)
가. 시 약
1) 1N-초산 암모늄 용액 : 암모니아수 68㎖와 초산(Acetic acid) 57㎖를 혼합하고 증류수로 
1,000㎖가 되게 만든다. (pH 7로 조정)
2) 80% 에탄올(Ethanol)
3) 4% 붕산용액(Boric acid) : 조단백질 정량과 동일
4) 산화마그네슘 (Magnesium Oxide)
5) 0.1N-염산용액
나. 방 법
먼저 칼럼(Column)하부를 탈지면으로 막고 No. 5A 여과지(작게 자른 것)를 1㎝ 정도 깔
고 1N-초산암모늄 용액을 가하여 기포를 제거한 다음 시료 2g을 넣고 1N-초산암모늄 
용액 150㎖가 6～12시간에 유출되도록 마개를 조정한다.
이 액의 유출이 끝나면 80% 에탄올 150㎖를 가하고 위와 같은 방법으로 유출시키면서 
초산암모늄을 제거하고 시료와 여과지를 증류 플라스크에 씻어 넣은 다음 산화마그네슘 
5g과 증류수 300㎖를 가하고 수기(受器)에 4% 붕산용액 50㎖를 넣고 조단백질 때와 같
은 방법으로 증류한 다음 0.1N-염산용액으로 적정한다. 동시에 공시험도 행한다.
     
다. 계 산
염기성치환용량 (meq/100g) = (T-B)/S×N×F×100
T : 시료 0.1N - 염산 적정치(㎖)
B : 공시험에 대한 0.1N - 염산 적정치(㎖)
N : 염산의 규정농도
F : 0.1N - 염산의 factor
S : 시료무게(g)21장. 기타성분
3212. 요소
가. 증 류 법
1) 시약의 조제 : 조단백질과 동일
2) 시료액의 조제
시료(배합사료) 20g을 250㎖ 메스플라스크에 취하고 0.1N-염산용액 200㎖를 가하여 30분
간 진탕한 다음 0.1N-염산용액으로 표준선을 맞추고 건조 여과지로 여과한다.
3) 방 법
시료액 25㎖를 증류플라스크에 취하여 메틸레드 지시약 2～3방울을 가한 다음 0.5% 가
성소다 용액으로 중화(pH 5.6～5.8)시키고 우레아제(Urease) 0.1g을 가하여 마개를 막은 
다음 40～50℃ 항온수조에서 1시간 작용시키고 냉각한 다음 산화마그네슘 3g과 액체 파
라핀 2㎖를 가하고 조단백질 정량법과 같이 증류 및 적정한다. 별도로 공시험을 행한다.
4) 계 산
조단백질 분석법에 준하여 질소(N) 함량을 구하고 계수로써 2.14를 곱하여 요소의 양을 
산출한다.
요소(%) =[(0.1N염산적정량 -공시험적정량 )×F×0.140067×2.14×10]/ 시료무게(g)
F  : 0.1N - 염산의 factor
10 : 희석배수
나. 비 색 법
1) 시약의 조제
가) 파라디메틸아미노벤즈알데히드 (P-Dimethylaminobenzaldehyde) 용액 : DMAB 16.0g을 에
탄올 1,000㎖에 용해한 다음 염산 100㎖를 가한다. 약 1개월 동안 안정하며 새로운 용
액을 이용할 때는 새로운 표준곡선을 작성한다.
나) 초산아연 용액 : 초산아연 22.0g을 증류수에 녹인 다음 초산 3㎖를 가하고 100㎖로 희
석하여 만든다.
다) 황혈염(Potassium ferroyanide) 용액 : 황혈염 10.6g을 증류수에 용해하고 100㎖로 희석
하여 만든다.
라) 식물성 활성탄(Vegetable charcoal)
마) 인산 완충액(Phosphate buffer solution) : 무수 제1인산칼륨 3.403g과 무수 제2인산칼륨 
4.355g을 증류수 100㎖에 각각 용해한 다음 각 용액을 서로 혼합하고 1,000㎖로 희석하
여 만든다.(pH 7.0)322바) 요소표준액
① 저장액 - 5㎎/㎖ : 요소 5.000±0.001g 을 증류수에 녹이고 1,000㎖ 희석하여 만든다.
② 검정액 - 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 및 2.0㎎의 요소가 5㎖에 함유 되도
록 다음과 같이 준비한다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 20㎖의 저장액을 250㎖의 
메스플라스크에 넣고 인산완충액으로 표선까지 희석하여 만든다.
③ 표준액 : 1.0㎎요소/5㎖를 함유하는 용액을 표준으로 사용 24℃이하에서 저장해야 하
며 1주일간 안정한다.
2) 표준곡선 작성
가) 검정액 5㎖를 25㎖의 시험관에 넣고 각각 DMAB액 5㎖를 넣는다.
나) 여기에 완충액 5㎖와 DMAB액 5㎖를 넣은 공시험액을 만든다.
다) 25℃에서 10분간 방치한 다음 파장 420㎚에서 요소농도에 따른 흡광도를 측정한다. 요
소농도에 따라서 흡광도는 직선이 얻어져야 하며 그렇지 않은 경우는 새로운 DMAB액
을 이용하며 되풀이한다 .
3) 방법
가) 500㎖ 메스플라스크에 분쇄한 시료 0.1g과 활성탄 1g, 증류수 250㎖, 초산아연용액 5㎖ 
및 황혈용액 5㎖를 넣는다.
나) 30분간 흔든 다음 증류수로 표선까지 채우고 침전이 생길 때까지 정치한다.
다) Whatman No. 40 여과하고 여액 5㎖에 DMAB 5㎖를 넣어 잘 흔든다.
라) 25℃에서 10분간 방치한 다음 420㎚에서 흡광도를 읽는다.
4) 계 산
요소(%) = (1.0×시료의 흡광도×100)/표준액의 흡광도×시료의 무게(㎎)×100
    ※ 1.0 = 표준액 중 요소 ㎎수
100(분자) = 희석배수21장. 기타성분
3233. 휘발성 염기태질소
가. 시약의 조제 : 조단백질과 동일
나. 시료액의 조제
시료 5～10g을 250㎖ 메스플라스크에 정확히 취하고 증류수 200㎖를 가하여 30분간 진
탕후 표준선까지 증류수로 채우고 No. 5A 여과지로 여과한다. 여과가 잘 안되면 
3000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 시료액으로 한다.
다. 방  법
시료액 50㎖를 분해플라스크에 정확히 취하여 산화마그네슘 2g, 액체파라핀 0.5g 및 증
류수 50㎖를 가하고 조단백질 정량법에 준하여 증류 및 적정을 행하여 질소량을 산출한
다.
라. 계  산
휘발성염기태질소 (%) =(0.140067×A×5×F)/ 시료무게(g)
※ A : 0.1N - 염산용액의 소모량(㎖)
   F : 0.1N - 염산용액의 factor
   5 : 희석배수
4. 염산불용물질 (토사)
600℃에서 2시간 회화후 잔류회분을 250～400ml 비이커에 옮겨 3N의 염산 75ml 가하여 
최소 1시간 이상 지속적으로 열을 가하여 완전하게 건고시킨다 . 
방냉한 후 3N 염산 75ml를 넣어 서서히 약 15분간 끓여준 다음 여과지(No. 6 Ashless)를 
이용하여 여과하되 산기가 완전히 없어지도록 뜨거운 물로 반복하여 씻어준다. 건조 후 
항량을 구한 크루시블에 옮겨 600℃에서 2시간 태우고 난 다음 무게를 측정한다.
염산불용물질 (%)=(태운 후 중량 - 크루시불 함량)/시료무게(g)×1003245. 유사단미사료 혼입여부 판정방법
가. 어분 중 우모분 혼입여부 판정방법
시료 일정량(1～2g)에 1% NaOH용액 150㎖를 가하고 1분간 끓인 다음 2～3회 물로 씻어
주고 방치한 다음 상층에 떠있는 부유물을 슬라이드글라스에 취하고 현미경 100～150배
로 관찰하면 우모분은 분해되어 투명하고 교질 상태의 매듭을 갖는 모양을 나타낸다.
나. 어분 중 식물성 단백질 사료 혼합여부 판정방법
시료 일정량(2～3g)에 5% NaOH용액 150㎖를 가하고 거품 방지제 2～3방울 떨어뜨려 30
분간 자비한 다음 3～5회 물로 씻어주고 방치한 후 침전물을 슬라이드글라스에 취하여 
커버글라스를 덮은 후 현미경 150배 이상으로 관찰하면 식물성단백질사료는 세포막이 
벌집모양의 그물 구조를 선명하게 나타낸다.
6. 펩신(Pepsin)소화율
가. 시약의 조제
1) 0.2% 펩신염산액 : 농염산용액 (HCl) 6.1㎖를 증류수 1,000㎖로 희석하여 0.075N 염산용액
을 만들어 여기에 2g의 펩신을 녹여 만든다.
2) 0.1N - 염산용액(HCl) : 조단백질 정량방법과 동일
3) 분해촉진제 : 조단백질 정량방법과 동일
4) 가성소다(Sodium Hydroxide) 혼합액 : 조단백질 정량방법과 동일
5) 지시약 : 조단백질 정량방법과 동일
나. 방 법
시료 1g을 정확히 취하여 탈지한 다음 200㎖ 삼각플라스크에 넣고 42～45℃로 미리 가
열한 0.2% 펩신염산용액 150㎖를 가하고 45℃ 항온수조에서 흔들어 주면서 16시간 소화
시킨 다음 No. 2A 여과지로 여과한다.
불소화물을 온수로 세척하고 불소화물과 여과지를 분해플라스크에 넣고 조단백질 정량
법에 준하여 분해, 증류, 적정하여 불소화물의 조단백질 함량을 구한다. 별도로 시료에 21장. 기타성분
325대한 조단백질의 함량도 구한다.
다. 계 산
펩신소화율 (%) =(A-B)/A× 100
※ A : 사료중 조단백질 함량(%)
   B : 불소화물중 조단백질 함량(%)
7. 전 분
가. 편광계법
1) 원 리
가) 표준화된 조건하에서 약산으로 사료를 가수분해한 후 여과시킨 용액의 광학적 회전도
를 편광기를 이용하여 측정하는 방법이다.
나) 40% 에탄올에 가용성인 물질(수크로스)도 광학적으로 활성을 띄기 때문에 이 물질의 
함량을 제외한 순수한 전분(40% 에탄올에 불용성임)에 의한 광학적 회전도를 측정한
다.
다) 비트펄프 등과 같이 이눌린을 함유한 물질은 산가수분해 또는 효소적 방법에 의한 측
정을 하여야 한다.
2) 기 구
가) 100㎖ 메스후라이크 
나) 여과지(Whatman No.2)
다) 깔대기
라) 항온수조
마) 20㎖ 시험관
바) 편광계
3) 시약의 조제
가) 40% 에탄올 (V/V) 조제
나) 메틸레드 지시약 : 1.0g의 메틸레드를 96% 에탄올에 녹여 1ℓ용액을 만든다.326다) 0.31N(1.13%) 염산 : 24.8㎖의 12.5N염산을 증류수에 녹여 1ℓ 용액을 만든다. 0.31N 염
산 10㎖은 메틸레드반응에서 0.1N 가성소다 30㎖를 이용하여야 한다. (Strength check)
라) Carrez시약Ⅰ: 106g의 Potassim ferrocyanide(K4Fe(CN)6 ․3H2O)를 증류수에 녹여 1ℓ용액
(0.25Molar) 을 만든다.
마) Carrez시약 Ⅱ : 220g의 Zinc acetate(ZnC2H3O22H2O) 와 30g의 빙초산을 증류수에 녹
여 1ℓ 용액(Zinc acetate 1Molar)을 만든다. 
4) 측정방법
가) 제 1단계
① 시료는 0.5㎜체를 완전히 통과하여야 한다.
② 메스후라스크에 2.5g 시료와 0.31N 염산 25㎖를 넣고 혼합시킨 후 다시 0.31N 염산 
25㎖를 넣은 즉시 100℃ 항온수조에 정확히 15분 동안 두고(플라스크 투입 30초 이내 
다시 100℃로 끓여야함) 처음 3분간은 플라스크를 항온수조 내에서 잘 흔들어 준다.
③ 항온수조에서 끄집어낸 후 즉시 30㎖의 증류수를 주입하고 빠른시간 내 상온으로 식
힌다.
④ 식혀진 플라스크에 Carrez시약 Ⅰ 5㎖을 넣고 1분간 혼합한 후 Carrez시약 Ⅱ 5㎖을 
넣은 후 다시 혼합한다.
⑤ 증류수로 100㎖ 표선을 맞추고 혼합한 후 No. 2 여과지로 여과한다.
⑥ 처음 여과액은 버리고 맑은 여과액을 20㎜길이의 편광기 튜브속에 넣고 광학적 회전
도를 측정한다.
나) 제 2 단계
① 시료 5g을 100㎖의 메스후라이크에 취한다.
② 40% 에탄올 70～80㎖을 넣어 시료와 잘 혼합시킨 후 1시간동안 상온에서 방치한다. 
이때 10분 간격으로 가볍게 흔들어 준다.
③ 40% 에탄올을 가지고 100㎖로 맞춘 후 혼합한 다음 여과지로 여과한다.
④ 여과액 중 50㎖을 취하여 새로운 100㎖ 메스후라이크에 담고 25% 염산용액 2.1㎖를 
넣은 후 잘 혼합한다.
⑤ 100℃ 항온수조에서 정확히 15분간 흔들지 않고 놓아둔다.
⑥ 항온수조에서 끄집어 낸 후 빠른 시간 내 상온으로 식힌다.
⑦ 제 1 단계의 ④ ⑤ ⑥ 과정을 거쳐 광학적 회전도를 측정한다.
5) 계산방법21장. 기타성분
327전분함량(%) ={5000×( 제1단계 회전도- 제2단계 회전도)}/α×시료중량
α값 :옥수수전분 = 184.6
보리전분 = 181.5
 감자전분 = 185.7
 밀전분 = 182.7
 쌀전분 = 185.9
* 대부분의 원료사료는 제 2 단계과정을 생략하고 제 2 단계 회전도 대신 증류수에 의
한 블랭크 회전도를 측정하면 됨
** 여과액의 농도가 맑지 않을 때는 Carrez시약의 양을 배가한다.
나. 비색법
1) 기구
가) 100㎖ 메스후라이크
나) Voltex
다) 여과지(Whatman No.2)
라) 깔대기
마) 원심분리기
바) 50㎖ 원심분리관
사) 항온수조
아) 20㎖ 시험관
자) 비색계
2) 시약의 조제
가) 80% 에탄올
나) 52% Perchloric acid : 100㎖ 증류수에 270㎖의 72% Percholic acid 첨가
다) 황산 용액 : 농황산 760㎖을 증류수(약 330㎖)에 녹여 1ℓ 용액을 만든다.
라) Anthrone 용액 : 황산용액 100㎖에 시약 0.1g을 녹임(0.1% 용액제조)당일 분석용으로 
준비, 갈색병으로 4℃에 보관하면 48시간동안 사용가능 
마) D-glucose 표준액 : D-glucose 1g을 증류수 1ℓ에 녹여 1000㎍/㎖ 농도를 만든 후  25, 
50, 100, 200㎍/㎖로 희석하여 사용한다.3283) 분석 방법
가) 시료 0.2g(＜0.5㎜)을 칭량 후 50㎖ 원심분리관에 넣는다.
나) 80% 에탄올 2방울을 떨어뜨려 시료를 적신 다음 증류수 5㎖을 넣고 voltex를 이용하여 
완전히 혼합한다.
다) 75℃ 80% 에탄올 25㎖을 첨가하여 완전히 혼합한 후 5분간 방치한 다음 3000rpm에서 
원심분리 한다. 
라) 상등액은 버리고 원심분리관에는 다시 75℃ 80%에탄올 30㎖을 넣고 2차 원심분리한
다.
마) 상등액은 버리고 잔사는 에탄올을 날리기 위해 약 40℃에서 1시간동안 건조한다.
바) 잔사에 증류수 5㎖을 넣고 흔들어 준 후 52% Percholic acid 6.5㎖을 첨가한 후 20분 
동안 매 5분마다 흔들어 준다.
사) 증류수 20㎖을 넣고 3000rpm에서 원심분리한다 .
아) 상등액을 100㎖ 메스후라스크에 담고 ㈓, ㈔ 과정을 반복하여 2차 상등액을 1차 상등
액이 들어 있는 flask에 담는다.
자) 아)의 1, 2차 상등액과 2차 원심분리후 남은 잔사를 새로운 100㎖ 메스후라스크에 여
과하면서 옮겨 100㎖로 정용한다.
차) 포도당 농도가 약 100㎍/㎖가 되게끔 희석하여 분석에 임한다.
카) 유리시험관에 희석용액 1㎖을 넣은 즉시 anthrone용액 5㎖을 첨가한다.
타) 마개를 막은 후 내용물을 잘 혼합하여 100℃의 수조에 정확히 12분간 가열한 다음 얼
음 또는 흐르는 물에 급속히 상온으로 냉각시킨다 .
파) 용액의 흡광도를 630㎚에서 측정한다.
4) 계산방법
전분(%)=0.9×(M/10)×(100/V 1)×(100/V 0)×(100/E)×(100/MS)
M  = 표준곡선에서의 포도당 농도, ㎍/㎖
V1 = 희석용 채취량, ㎖(원액사용시 V1 = 100)
V0 = 분석용액 채취량, ㎖
E  = 시료무게, g
MS = 시료의 건물함량, %21장. 기타성분
3298. 열량(Cal)
가. 기구 및 시약
1) 열량측정기 (Parr 1261)
2) Balance
3) 공기 순환식 건조기
4) 안피지(5×5㎝)
5) 닉켈선
6) 산소
7) 핀세트
8) 안식향산
나. 시료의 조제 및 측정
안피지 무게를 측정 후 시료(사료 1g, 동물성단백질 사료 0.8g, 유지 0.4g)를 취한 다음 
시료를 안피지로 싼다. 시료가 들어있는 안피지를 bomb에 연결한 다음 산소를 bomb에 
충진한 후 열량을 측정한다.
    
9. 협잡물(이물질시험법 )
가. 정 의
시료를 규정의 방법에 준하여 석유에테르 용해시킬 경우의 불용해 잔분의 백분율을 말
한다.
나. 장 치
항온건조기 (100±1 ℃로 온도조절이 가능한 것)
다. 시 약
석유에테르 (시약 일급)330라. 방 법
① 시료 약 20g을 beaker에 정확히 정량한 후 석유에테르 200㎖ 가해 완전히 용해시킨
다.
② 미리 건조시켜 항량으로 한 whatman No2 여과지에 여과한 후 석유에테르를 사용해
서 완전히 추출 세정한다.
③ 잔분의 여지는 100±1 ℃의 항온 건조기에서 건조한 후 30분간 방냉하여 칭량한다.(건
조에 의한 중량변화가 0.3mg이하가 되면 항량으로 간주한다)
마. 계산
협잡물(%) = 잔분중량(g)
시료무게(g)×100
10. 산 가
가. 원 리
산가는 유지 1g중에 들어있는 유리지방산을 중화하는데 필요한 KOH의 양을 측정하여 
유지의 성상을 판단한다.
나. 시약
0.1N KOH-Ethanol,  ether-ethanol(1 : 1) 혼합액, 
1% Phenolphthalein 지시약
1) 0.1N KOH-Ethanol 용액
6.58g(순도85% 기준)의 KOH를 소량의 증류수에 녹이고 Ethanol로 1ℓ까지 희석하여 2～
3일간 방치한 후 여과하여 역가를 표정한다.
※ 0.1N KOH-Ethanol 용액 역가 표정법
가) Benzoic acid를 100～105℃ 2시간 건조시킨다 .
나) 데시케이터에서 30분간 방냉한다
다) 삼각플라스크에 benzoic acid를 0.2～0.3g 정도 취한다.
라) ether -ethanol 혼합액 10㎖에 용해시킨다 .
마) 1% Phenolphtalein 지시약 2～3방울을 가하고 0.1N KOH-Ethanol 용액으로 적정한다.21장. 기타성분
331Factor=Benzoicacid양(g)×1000
122×적정치(㎖)×10
* Ether-Ethanol 혼합액 : Ethyl Ether : Ethanol을 1 : 1로 한다
* 1% Phenolphtalein 지시약 : Phenolphtalein 특급 1g을 ethanol 100㎖에 녹인다.
다. 분 석
시료 2g을 에테르 : 에탄올(1 : 1) 혼합액 100㎖에 녹이고 여기에 알콜에 녹인 1% 
Phenolphthalein 지시약을 2～3방울 가하고, 30초간 지속하는 담홍색을 띨 때까지 0.1N 
KOH-Ethanol 용액으로 적정한다. 동시에 공시험도 행한다.
라. 계 산
산가=(T1-T0)×5.611×F
S
※ T1 : 시료 0.1N KOH-Ethanol 적정치(㎖)
   T0 : 공시험에 대한 0.1N KOH-Ethanol 적정치(㎖)
   F  : 0.1N KOH-Ethanol 의 factor
   S  : 시료무게(g)
   5.611 : KOH분자량 × 농도(0.1N)
11. 우레아제 역가(Urease Activity)
가. 원 리
대두부산물 1g을 요소용액과 혼합하였을 때 30℃에서 1분간 발생하는 암모니아태 질소
의 양으로 urease activity를 측정한다
나. 기 구
1) 30℃±0.5℃ 유지할 수 있는 진탕수조
2) 정확한 pH meter(pH 0.02까지 측정 가능한 것)
3) 시험관(20×150mm 고무마개)332다. 시 약
1) phosphate buffer soln. 0.05M : 3.403g의 KH2PO4와 4.355g의 K2HPO4를 각각 100㎖의 신
선한 증류수에 녹인 다음 두 가지를 섞어 1ℓ로 한다. 사용전에 강산 또는 강염기로 pH
를 7로 조절한다
2) urea-buffer soln : 15g의 urea를 500㎖ phosphate buffer용액에 녹인 다음, toluene 5㎖
를 넣고 pH 7로 맞춘다.
라. 방 법
1) 시료를 열 발생 없이 가능한 미세하게 간다.(0.2mm체 통과)
2) 0.2g의 준비된 시료를 시험관에 넣고 10㎖의 urea-buffer 액을 가한 후, 뚜껑을 닫고 잘 
흔들어 30℃ 진탕수조에 넣어 왕복 진탕시킨다 . 시간을 기록(test)
3) 0.2g의 분비된 시료를 시험관에 넣어 blank를 준비한다. 10㎖의 phosphate buffer를 가하
고 뚜껑을 한 후, 잘 흔들어 30℃ 진탕수조에 넣어 왕복진탕 시킨다. 시간을 기록(blank)
4) test blank를 준비하는 사이의 시간은 5분간의 차이를 둔다.
5) 30분간 왕복진탕 시킨 후 시험관을 꺼내 상등액의 pH를 잰다.
6) 진탕수조에서 시험관을 꺼낸 후 정확히 5분이 되었을 때 pH를 읽는다.
마. 계 산
test와 blank의 pH차이는 pH증가 또는 urease activity로 표시한다.
12. HCN(청산)
가. 적용범위 : 타피오카
나. 측정원리
타피오카 중의 HCN을 증류수로 추출하고 수증기 증류장치를 이용하여 증류 포집한 후 
0.01N AgNO3로 적정하여 계산한다.
다. 시약의 조제
1) 0.01N AgNO321장. 기타성분
33317g의 AgNO3을 갈색 flask에 넣고 증류수로 1ℓ가 되게 한다. NaCl로 표정하여 Factor를 
구한 후 10배 희석하여 사용한다.
* (표정)
NaCl (500℃～600℃에서 50분 가열한 후 황산데시케이터에서 방냉) 1.461g을 증류수에 
녹여 250㎖로 한다. 정확히 25㎖를 취하고 약 25㎖의 증류수를 넣고 Dextrin 5㎖, 
Fluorescien Na 수 방울을 첨가한 후 0.1N AgNO3로 적정한다.
(황록색(형광) 미적색)
2) Dextrin액 : Dextrin 2g을 증류수 100㎖에 용해한다.
3) Fluorescein  Na액 : Fluorescein Na(C20H10O5Na2) 0.2g을 증류수 100㎖에 용해한다
4) p-Dimethylaminobenzalrhodanine(CH 3)2NC6H4CH:CCONHSCS=DMABR) : 0.02g을 acetone 
100㎖ 에 용해한다
라. 측정방법
시료 20g을 500㎖ round botton flask에 취하고 증류수 200㎖ 첨가한 후 밀봉해서 25～
30℃에서 2시간 이상 방치한다. 증류장치에 연결시키고 5%  NaOH 20㎖를 넣은 수기로 
200㎖이상 될 때까지 받는다.(HCN의 boiling point는 약 26℃) 증류액에 
p-dimethylaminobenzalrhodanine 0.5㎖를 넣고 0.01N AgNO3로 적정한다. (황녹색(형광) 
미적색)
HCN(ppm)=v×f×0.54
w×1,000
v : 0.01N AgNO3 소요 ㎖
f : 0.01N AgNO3 factor
w : 시료중량(g)
13. 유리고시폴 (Free Gossypol)
고시폴은 면실박 중 색소로서 유리된 형태로 있을 때 가축에게 독성을 나타내는 유독성 
물질이다.
가. 정 의334유리고시폴은 aqueous acetone에 녹을 수 있는 gossypol과 gossypol 유도체를 말한다.
나. 적용범위 : 면실박, 면실
다. 시약 및 제조
1) aqueous acetone
700㎖ acetone + 300㎖ 증류수
2) aqueous iso-propanol
800㎖ iso-propanol + 200㎖ 증류수
3) Thiourea sol.
10g thiourea/100 ㎖ 증류수
4) 1.2N HCl
106㎖ HCl(35 ～37%)/1 ℓ
5) Anilline(Benzeamine)
anilline(ACS reagent)에 zinc powder를 넣고 냉각기에 연결 증류하여 용액의 처음과 마지
막 10%를 버린 용액(reagent blank의 흡광도가 0.022를 넘으면 재증류해야 한다. 냉암소 
보관 유리마개를 한다)
6) Gossypol 또는 Gossypol acetate 표준용액
◦ 순도결정 실험 : 2mg의 gossypol 또는 gossypol acetate를 100㎖ 정량플라스크에 넣고 
40㎖ cyclo-hexane 을 첨가한다. 더운물에서 녹이고 cyclo-hexane 으로 100㎖까지 채운 
후 358nm에서 흡광도를 측정한다.
Absorptivity = A/C × l
A : absorbance
C : concentration, g/l
l : light path, 1cm
* 순수표준 gossypol의 absorptivity 는 39.9±0.2
순수표준 gossypolacetate 의 absorptivity 는 35.8±0.2
◦ 표준용액 조제 : 25mg gossypol 또는 27.9mg의 gossypol acetate를 acetone 100㎖에 녹
이고 1㎖의 glacial acetic acid와 75㎖의 증류수를 첨가하고 아세톤으로 250㎖로 맞춘
다. 50㎖를 취하여 60㎖ 증류수를 가하고 acetone으로 200㎖로 맞춘다.( 0.025mg/ ㎖ ) 
24시간 안정하며 차광해야 한다.21장. 기타성분
335라. 시 료
1mm의 screen을 통과하게 분쇄
마. 시료량
gossypol의 기대치에 따라 취한다.
바. 실험방법
1) 시료를 상기 표에 따라 무게를 달고 초자구를 깔은 공전 삼각플라스크 250㎖ 에 넣는다.
2) 50㎖ aqueous acetone을 넣고 shaker 또는 자석교반기로 1시간 진탕한다.
3) 건조여지로 여과(whatman No 2), 처음 약 5㎖는 버리고 작은 부피의 flask에 담는다. 용
매의 휘발방지를 위해 여과기를 유리접시로 덮는다.
4) 2개의 25㎖ 정량플라스크에 표의 aliquot size에 따라 (A, B)액을 취한다
5) A에 10% thiourea 2방울 (0.10㎖), 1.2N HCl 1방울(0.05㎖)을 넣고 aqueous iso-propanol 로 
표선까지 채운다.(25㎖)
6) B에 10% thiourea 2방울, 1.2N HCl 1방울을 넣고 2㎖ anilline을 즉시 넣는다.
7) Reagent blank : 시료와 동량의 aqueous acetone에 2방울의 thiourea와 2㎖의 anilline을 
첨가한다.
8) B와 Blank를 100℃ 수조에서 30분간 가열한다
9) 수조에서 꺼내 aqueous iso-propanol 를 약 10㎖ 첨가하고 water bath에서 실온으로 냉각
한 후 aqueous iso-propanol 로 표선까지 채운다.(25㎖)
10) 440nm에서 A용액의 흡광도를 측정한다.(Blank는 aqueous iso-propanol)
11) reagent의 흡광도 측정(Blank는 aqueous iso-propanol)
12) B용액의 흡광도 측정(Blank는 reagent blank)기대치(%) 시료무게 (g) aliquot size(㎖)
0.2 ~ 0.4 0.5 2
0.1 ~ 0.2 1.0 2
0.05 ~ 0.1 1.0 5
0.02 ~ 0.05 1.0 10
0.01 ~ 0.02 2.0 10
below 0.01 5.0 1033613) Corrected Absorbance( = B용액의 흡광도 - A용액의 흡광도)
14) 0.025mg ～ 0.25mg 범위의 검량선을 상기 방법으로 작성하여 gossypol mg을 계산한다.
Gossypol(mg) = Corrected Absorbance × factor
사. 계 산    
  Freegossypol(%)=gossypol(mg)×희석배수
sample(mg)×100
14. 멜라민
가. 액체크로마토그래피 /질량분석기 /질량분석기에 의한 시험
1) 시험법의 적용범위
불검출 기준 적용대상 식품
2) 분석원리
검체 중의 멜라민을 아세토니트릴 ․물(50:50, v/v) 용액으로 추출, 여과하고 이를 양이온교
환수지를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프 /질량분석기 /질량분석기로 분석한다.
3) 장 치
가) 액체크로마토그래프 /질량분석기 /질량분석기 (LC/MS/MS)
나) 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 
Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것
4) 시약 및 시액 
가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것
나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액 : 멜라민 표준품 10 mg을 취하여 0.1% 개미산 ․아세토니트릴
(5:95, v/v) 혼합용액으로 녹여 정확히 100 mL로 한다.21장. 기타성분
337라) 표준용액 : 표준원액을 0.01, 0.02, 0.05, 0.10 및 0.20 μg/mL 농도가 되도록 0.1% 개미
산․아세토니트릴 (5:95, v/v) 혼합용액으로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 
한다(사용 시 조제한다).
마) 0.1% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 0.1 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.
바) 4% 개미산용액 : 개미산 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.
사) 0.1% 개미산 ․아세토니트릴 (5:95, v/v) 혼합용액 : 0.1% 개미산 용액 5mL에 아세토니트릴 
95 mL를 가하여 100 mL로 한다.
아) 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 (Diethylamine) 0.2 mL에 아세토
니트릴을 가하여 100 mL로 한다.
자) 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴 용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 
100 mL로 한다.
차) 20 mM 개미산암모늄 용액 : 개미산암모늄 (Ammonium formate) 1.26 g을 물에 녹여 
1,000 mL로 한다.
카) 기타시약 : 특급
5) 시험용액의 조제
가) 추 출
검체를 분쇄한 후 시료 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 
물 5 mL를 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL를 가하여 심하게 흔들어 섞
고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 
μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 
서로 혼화시킨 후 여과한다).
나) 정 제
미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카
트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하
여 유출시킨다 . 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 
mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 
2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다 . 카트리지 내에 남아있는 
용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다. 용출액 1 mL를 4 mL 
바이알에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 0.1% 개미산 ․아세토니트릴 (5:95, 
v/v) 혼합용액 1 mL를 가하여 녹인 것을 시험용액으로 한다. 
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건338① 칼럼 : HILIC Silica(2.1 × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것  
② 이동상은 A 및 B 용액의 농도 구배조건에 따라 사용한다.
   이동상 A : 0.1% 개미산 ․아세토니트릴 (5:95, v/v)
   이동상 B : 20 mM 개미산암모늄 ․아세토니트릴 (50:50, v/v)
③ 유속 : 0.25 mL/분
④ 주입량 : 10 μL 
⑤ 칼럼온도 : 35℃
나) 질량분석기 /질량분석기의 조건
① Ionization : ESI (Positive) 
② Source voltage : 4.8 kV
③ Capillary Temp. : 350℃
④ Auxiliary gas : 질소
⑤ Collision gas : 아르곤 또는 질소
⑥ Source collision energy : 15～30 V
다) 검량선 작성
표준용액을 액체크로마토그래프 /질량분석기 /질량분석기에 주입한 후 얻어진 크로마토
그램 상의 m/z 85 이온의 피크 높이 또는 면적을 이용하여 검량선을 작성한다.
라) 정량한계 : 0.15 mg/kg
7) 정성시험
위의 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하
여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하고 표준
용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 85 이온에 대한 m/z 68 이온의 백분율, 
response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다. 시간(분)이동상 A이동상 B
0.0 100 0
5.0 100 0
10.0 25 75
11.0 25 75
13.0 100 0
15.0 100 021장. 기타성분
339 물  질Precursor ion(m/z) Fragment ion(m/z)
멜 라 민 12785
68
8) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 m/z 85 이온의 
피크높이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
가) 계산
       멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D
          C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL) 
          V : 시험용액의 최종 부피 (mL)
          S : 시료 채취량 (g)
          D : 시험용액의 희석배수
나. 액체크로마토그래피에 의한 시험
1) 시험법의 적용범위
     불검출 기준 적용대상 이외의 식품
2) 분석원리
검체 중의 멜라민을 아세토니트릴 ․물(50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온교환수지
를 사용하여 정제한 후 액체크로마토그래프로 분석한다.
3) 장 치
가) 액체크로마토그래프 : 자외부흡수검출기 (UV detector)를 사용한다.
나) 정제용 카트리지 : 설폰산기(-SO3H)를 갖는 강산성 양이온교환수지 카트리지로서 
Oasis MCX(150 mg 함유, 6 mL용) 또는 이와 동등한 것
4) 시약 및 시액
가) 용매 : 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것340나) 물 : 3차 증류수 또는 이와 동등한 것
다) 표준원액 : 멜라민 표준품 100 mg을 취하여 물에 녹여 정확히 200 mL로 한다.
라) 표준용액 : 표준원액을 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 및 5.0 μg/mL의 농도가 되도록      물에 녹
여  희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 한다. 
마) 4% 개미산용액 : 개미산(Formic acid) 4 mL에 물을 가하여 100 mL로 한다.
바) 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 (Diethylamine) 0.2 mL에 아세토
니트릴을 가하여 100 mL로 한다.
사) 2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 : 디에틸아민 2 mL에 아세토니트릴을 가하여 
100 mL로 한다.
아) 기타시약 : 특급
5) 시험용액의 조제
가) 추 출
검체를 분쇄한 후 시료 1 g을 정밀히 달아 폴리프로필렌 원심분리관에 넣는다. 여기에 
물 5 mL을 넣어 검체를 습윤시킨 후 아세토니트릴 5 mL을 가하여 심하게 흔들어 섞
고 30분간 초음파 진탕한 다음 원심분리(2,600 × G, 10분)한다. 상등액을 취하여 0.45 
μm 멤브레인필터로 여과한 것을 추출액으로 한다(상등액의 층이 분리되어 있을 경우 
서로 혼화시킨 후 여과한다).
주1) 동물의 근육이나 조직을 분석할 경우에는 검체를 분쇄한 후 시료 5 g을 정밀히 
취한 후 물 10 mL를 가하여 습윤시키고 아세토니트릴 10 mL를 가한 후 상기와 같이 
초음파 진탕, 원심분리 및 여과한다.
나) 정제
미리 아세토니트릴 5 mL, 4% 개미산용액 5 mL를 차례로 흘려 활성화시킨 정제용 카
트리지에 4% 개미산용액 3 mL 및 추출액 2 mL를 함께 주입하고 이를 중력을 이용하
여 유출시킨다 . 이어서 아세토니트릴 5 mL, 0.2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 5 
mL를 차례로 흘린 후 카트리지 내에 남아있는 용액을 감압펌프를 이용하여 제거하고 
2% 디에틸아민 함유 아세토니트릴용액 4 mL로 용출시킨다 . 카트리지 내에 남아있는 
용액은 감압펌프를 이용하여 완전히 용출시켜 용출액에 합한다*. 용출액 2 mL를 4 mL 
바이알에 취하여 50℃에서 질소로 건고한 후 잔류물에 물 1 mL를 가하여 녹인 것을 
시험용액으로 한다. 
6) 시험조작
가) 액체크로마토그래프의 측정조건
① 칼럼 : C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것21장. 기타성분
341② 이동상 : 완충용액 ․아세토니트릴 (85:15, v/v)
   완충용액 : 무수구연산 1.92 g과 옥탄설폰산나트륨 [C8H17O3SNa] 2.16 g을 950 mL의 
물에 녹이고 1 M 수산화나트륨을 사용하여 pH 3.0으로 한 후 물을 가하여 전량을 1 
L로 한다. 
③ 검출파장 : 240 nm
④ 유속 : 1.0 mL/분
⑤ 주입량 : 10 μL
나) 검량선 작성
표준용액을 액체크로마토그래프에 주입한 후 얻어진 크로마토그램상의 피크 높이 또는 
면적을 이용하여 검량선을 작성한다.
7) 정성시험
위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치하
여야 한다.
8) 정량시험
정성시험과 동일한 조건에서 얻어진 시험용액의 크로마토그램으로부터 멜라민의 피크높
이 또는 피크면적을 검량선에 대입하여 정량한다.
가) 계산
멜라민의 함량(mg/kg) = C × V/S × D
C : 검량선에서 구한 멜라민의 농도 (μg/mL) 
V : 시험용액의 최종 부피(mL)
S : 시료 채취량(g)
D : 시험용액의 희석배수
9) 확인시험
“액체크로마토그래피 /질량분석기 /질량분석기에 의한 멜라민 시험법”의 정성시험 또는 
“기체크로마토그래피 /질량분석기 ”의 정성시험에 따라 시험할 때 멜라민이 확인되어야 
한다.
다. 기체크로마토그래피 /질량분석기에 의한 확인시험3421) 시험법 적용범위
     불검출 기준 적용대상 이외의 식품
2) 분석원리
검체 중의 멜라민을 아세토니트릴 ․물(50:50, v/v) 용액으로 추출하고 이를 양이온교환수지
를 사용하여 정제한 후 유도체화시켜 기체크로마토그래프 /질량분석기로 분석한다.
3) 장치
가) 기체크로마토그래프 /질량분석기 (GC/MS)
4) 시약 및 시액
가) 표준용액
액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법의 시약 및 시액 중 표준용액을 사용한다.
나) 피리딘 : 특급을 사용한다.
다) 유도체시약 (BSTFA)
N,O-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (1% trimethyl-chlorosilane 함유)를 사용한다.
5) 시험용액의 조제
가) 추출 및 정제
액체크로마토그래피에 의한 멜라민 시험법 5) 시험용액의 조제 가) 추출 및 나) 정제에 
따라 *까지 시험하여 용출액으로 사용한다.
나) 유도체화
표준용액 및 위의 용출액 200 μL를 각각 바이알에 넣은 다음 70℃에서 질소로 건고한
다. 잔류물에 피리딘 200 μL와 유도체시약 (BSTFA) 200 μL를 넣고 마개를 닫은 후 7
0℃에서 30분간 방치한 것을 확인시험용 표준용액 및 시험용액으로 한다. 
6) 시험조작
가) 기체크로마토그래프 /질량분석기의 측정조건
① 칼럼 : DB-5MS(0.25 mm × 30 m, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것
② 주입부 온도 : 250℃21장. 기타성분
343③ 검출기 온도 : 250℃ 
④ 오븐온도 : 초기 온도 75℃에서 1분간 유지하고 15℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 
상승시켜 2분간 유지한다.
⑤ 캐리어가스 및 유량 : 헬륨 (1.0 mL/분)
⑥ 주입방법 : splitless
⑦ 주입량 : 1 μL 
⑧ 이온화 방법 : EI mode
⑨ 이온화 전압 : 70 V
7) 정성시험
위 조건으로 얻어진 시험용액 크로마토그램상의 피크는 표준용액 피크의 머무름 시간과 
비교하여 일치 여부를 확인한다. 시험용액의 특성이온이 아래 표와 같이 확인되어야 하
고 표준용액과 시험용액 이온간 반응세기의 비(m/z 327 이온에 대한 각 이온의 백분율, 
response ratio)를 비교하여 그 비가 ± 10% 이내에서 일치하여야 한다. 
물  질 이  온
멜 라 민342
343
344
327(M)
(M+1)
(M+2)
(M-15)
15. 요오드가
요오드가라 함은 일정한 측정법으로 측정한 지질 100 g에 흡수되는 할로겐의 양을 요오
드의 g수로 나타낸 것이다.
가. 하누스법
1) 시액 및 시약
가) 브롬요오드시액 ：요오드 13.2 g을 초산 1,000 mL에 가온하여 녹이고 이것을 25℃로 식
힌 다음 20.0 mL를 취하여 0.1 N 티오황산나트륨액으로 적정한다. 요오드용액의 나머
지에 그중에 함유되는 요오드의 양과 당량의 브롬(약 3 mL)을 가한다. 이 액은 차광한 
마개달린병에 보존한다.
2) 시험조작344검체의 요오드가를 감안하여 다음 표에 따라 0.1～0.8 g을 작은 유리용기에 정밀히 달고 
250 mL의 마개달린 삼각플라스크 중에 유리용기과 같이 넣는다.
클로로포름 10 mL를 가하여 녹이고 여기에 브롬요오드시액 25 mL를 정확히 가하고 밀
전하여 잘 섞고 차광하여 30분간(요오드가가 100이상의 것은 1시간) 방치한다. 다음에 1 
N 요오드화칼륨액 30 mL를 가하여 흔들어 섞고 다시 물 100 mL를 가하여 유리한 요오
드를 0.1 N 티오황산나트륨액으로 적정한다(지시약 전분시액 1 mL). 따로 검체를 사용하
지 않고 같은 방법으로 공시험을 한다.
요오드가 ：1.269×(b-a)×f/S
a：본시험에 있어서의 0.1 N 티오황산나트륨액의 소비량(mL)
b：공시험에 있어서의 0.1 N 티오황산나트륨액의 소비량(mL)
S：검체의 채취량(g)
f：0.1 N 티오황산나트륨액의 역가
이 시험에서 만약 브롬요오드시액의 반량 이상이 소비되었을 때에는 검체를 감량하여 
그 측정을 되풀이 한다.
요오드가 검체채취량 (g)
120이상
60～120
60이하0.1～0.2
0.2～0.4
0.4～0.8  
나. 위이스법 
1) 시액 및 시약
가) 일염화요오드시액 : 재승화시킨 요오드 13 g을 초산 1,000 mL에 녹이고 그 일부에 대
하여 티오황산나트륨액으로 적정하여 놓고, 이에 씻은 건조염소를 통하여 다시 일부에 
대하여 티오황산나트륨액으로 적정하여 그 양이 최초의 적정량의 2배가 되도록 한다. 
요오드는 약간 과잉의 정도로 한다. 이 시액은 마개달린갈색유리병에 넣어 파라핀으로 
봉하고 사용직전에 연다. 30일 이상 지난 시액은 사용하면 아니된다.
2) 시험조작
검체의 요오드를 감안하여 적당량의 검체를 250 mL의 마개달린 삼각플라스크에 취하고 
사염화탄소 또는 클로로포름 15～20 mL를 가하고 일염화요오드시액 25 mL를 피펫으로 
일정한 속도로 적가한다. 다음에 암소에 30분간(요오드가가 100이상의 것은 1시간) 방치
한 다음 1 N 요오드화칼륨액 20 mL 및 물 100 mL를 가하여 흔들어 섞은 다음 유리한 
요오드를 0.1 N 티오황산나트륨액으로 적정한다(지시약 전분시액1 mL). 같은 방법으로 21장. 기타성분
345공시험을 한다. 계산은 하누스법에 따라 한다.
16. 팽윤도
가. 적용범위
본 시험은 Bentonite 의 수중에서의 팽윤능력을 실온에서 측정하는 방법이다.
나. 분석방법 
1) 메스실린더에 증류수를 100㎖ 표선까지 채운다.
2) 건조된 벤토나이트 분말 2g을 칭량하여 상온에서 2시간에 걸쳐 소량씩 메스실린더에 투
입 한다 . 이 때 먼저 넣은 것이 일단 침착한 다음에 다음 것을 넣는다.
3) 24시간 방치하고 벤토나이트 수화물의 팽창된 부피를 벤토나이트의 팽윤도로 한다(㎖
/2g). 24시간 방치할 때 그릇 바닥의 덩어리가 팽윤한 용적은 10ml의 눈금 이상이어야 
한다.
다. 데이터 분석 및 정리
1) 팽윤도(ml/2g)= 메스실린더 바닥에서 시료가 팽윤한 부피 값.
17. 브릭스(Brix)
가. 기구
아베 굴절계 : Abbe Reflectometer, 온도계
나. 분석방법
1) 추출
시료 5 g 을 100 ml 비이커에 칭량하고, 당밀과 동량의 증류수를 비이커에 넣고 잘 혼합
한다.
2) 측 정
가) 당굴절계의 grinding glass, prism상의 수분을 잘 닦아낸다. 또 굴절계의 보정은 증류수346를 검액으로 하여 눈금상의 명암의 경계선이 영점에 오도록 영점조정 나사를 움직여 
바르게 보정한다.
나) Grinding glass 위에 시료 1-2방울을 취하여 프리즘위에 합친다.
다) 광선이 채광공으로 들어오게 기우려 주고 접안경으로 관측하면 눈금위에는 명암의 경
계선이 나타난다.
라) 접안경을 움직여 초점을 맞추고 경계선상의 눈금의 숫자를 읽  는다. 온도보정은 온도 
보정표에 따라 한다.
다. 분석결과 처리 : 눈금을 읽은 수치에 희석배수를 곱한다
 
18. 비테인염산염 (베타인염산염 )
가. 시험용액의 조제
시료를 예상함량에 따라 (0.1g～1g) 적당량을 칭량하여 100mL 정량플라스크 (Vol. flask)에 
취하고 80mL 정도의 물을 가한다. 완전히 용해하면서 30분간 초음파(Sonication in ultra 
sonic bath) 처리하고 물로 정용한다. 0.45μm 필터로 여과한 액을 액체크로마토그래피 
시험용액으로 사용한다.
나. 표준용액의 조제 
Betaine-HCl( 분자량 153.61) 또는 Betaine(분자량 117.15)을 일정량 칭량하여 100mL 정량
플라스크(Vol. flask)에 취하고 용해하여 사용한다.
다. 시 약
1) Water : LC grade 
2) 질산칼슘[Ca(NO 3)2·4H2O]
3) Betaine-HCl (mw 153.61)
4) Betaine (mw 117.15)
라. 분석방법
1) 분쇄된 시료를 예상함량에 따라 (0.1g ~ 1g) 적당량을 칭량하여 100mL Vol. flask에 취하21장. 기타성분
347고 80mL 정도의 물을 가한다.
2) 완전히 용해하면서 30분 sonication 하고 물로 정용한다.
3) syrindge filter (0.45um)로 여과하여 LC시험용액으로 사용한다.
마. 액체크로마토그래프 분석조건
1) 친수성상호작용계
칼럼 : HILIC 칼럼 또는 이와 동등한 것
이동상 : acetonitrile + 30mM ammonium acetate (8:2, 사용 시 제조)
검출기 : 증기화 광산란 검출기(ELSD) 또는 시차굴절계 (RID)
칼럼온도 : 실온
유속 : 0.8 mL/min
2) 배제형 이온교환계
칼럼 : Sugar-pak 칼럼 또는 이와 동등한 것
이동상 : 0.004M Ca(NO3)2-4H2O (사용 시 제조)
검출기 : 증기화 광산란 검출기(ELSD) 또는 시차굴절계 (RID)
칼럼온도 : 80 ℃
유속 : 0.6 mL/min
바. 계 산
1) Betaine 또는 Betaine-HCl (mg/kg) = (시료용액의 피크면적/표준용액의 피크면적) × 표준
용액의 농도(mg/mL) × 총 희석량(mL) × 희석배수 / 시료무게 (g)
2) Betaine HCl 함량= Betaine 함량 × 153.61 / 117.15
19. 불용성불순물
가. 분석개요
1) 반추위 사료에 사용되는 동물성유지의 불순물을 측정하는 방법으로 시료에 석유에테르
를 첨가하여 유지를 녹인 후 유리여과기 (G3)로 여과하고 유리여과기에 잔류하는 물질을 
불순물로 하며 불순물은 유지가 아닌 단백질과 그 외 뼈 등이 될 수 있다. 반추위 사료
에 사용하는 유지는 불순물이 0.15% 이내로 규정하고 있다. 3482) 축우용(생후 3개월령 이내의 소)대용유용 배합사료는 동물성 유지(식용의 고기에서 채취
한 지방만을 원료로 한 것)의 불용성 불순물의 함량은 0.02%이하여야 한다. 
나. 적용범위
식물성유지 , 동물성유지 , 혼합성유지
다. 분석원리
석유에테르를 이용하여 유지류를 용해하여 여과한 후 유지를 생산할때 함유된 단백질 
조직, 섬유질, 녹 등의 기타 잡물의 함량을 백분율로 환산한 방법
라. 분석기기 및 시약
1) 분석기기 및 초자 : 250㎖ 비이커, 유리여과기 (G3), 열풍건조기 , 삼각플라스크 500㎖ 이
상  
2) 시약 : Petroleum ether(석유에테르 , 특급)
마. 분석방법
1) 시료 전처리
가) 시료 약 20g을 250㎖ 비이커에 정확히 칭량한 후 석유에테르 200㎖을 가해 완전히 용
해시킨다. 이때 분말 또는 과립으로 된 시료는 항온수조에서 충분히 용해시킨 후 시료
로 사용한다. 
나) 건조기를 이용하여 105℃ 1시간 건조하여 중량을 측정한 유리여과기 (G3)로 용해된 시
료를 여과하고 여과기 위의 잔류물을 특급 석유에테르 200㎖로 충분히 세정한다. 
다) 잔류물이 들어 있는 유리여과기를 105±1 ℃에서 1시간 건조하고, 데시케이터에서 30분
간 방냉한 후 중량을 측정한다.  
2) 결과 정리
불용성불순물 (%) = [여과 후 유리여과기 중량(g) - 여과 전 유리여과기 중량(g)/시료채취
량(g)]×100