식품의약품안전처 공고 제2019-137 호
식품첨가물의 기준 및규격 일부개정고시 (안)
행정예고
2019. 3.19.
식품의약품안전처
- 1 -식품의약품안전처 공고 제2019-137 호
식품첨가물의기준및규격
(식품의약품안전처 고시제2019-1호,
2019.1.9.)을일부개정함에있어국민에게미리알려의견을듣고자
그취지,개정이유및주요내용을
행정절차법
제46조에따라다음과
같이공고합니다.
2019년3월19일
식품의약품안전처장
식품첨가물의 기준 및규격
 일부개정고시 (안)행정예고
1.개정 이유
식품첨가물로허용된아산화질소를직접흡입하는사례가발생함에
따라,아산화질소의오용을방지하기위하여카트리지형태의용기를
사용하지않도록제조기준을신설하고,식용을목적으로하는미생물등
의배양에사용되는식품첨가물의종류등규정을명확히하기위하여
일반사용기준을신설하며,
식품의기준및규격
의식품유형통합개
정사항을반영하여해당사용기준을변경하고,영·유아식에사용가능
한식품첨가물목록및천연향료에사용되는기원물질목록을정비
하는한편,L-글루탐산나트륨등6품목에대한성분규격및기구등의살- 2 -균소독제의살균력시험법을개선하고자
식품첨가물의기준및규격
을
개정하려는것임
2.주요 내용
가.“아산화질소 ”용기에 대한 제조기준 신설
1)아산화질소를직접흡입하는오용을방지하기위한용기제한필요
2)아산화질소를담는용기중카트리지형태를제한하는제조기준
신설(안II.1.5))
3)아산화질소의오용방지로국민건강을확보할수있을것으로기대
나.미생물 등배양시 사용되는 식품첨가물에 대한 일반사용기준 신설
1)미생물등배양시사용하는식품첨가물의종류및사용기준등
규정명확화필요
2)미생물등배양에사용할수있는식품첨가물의범위및사용기준에
대한일반사용기준신설(안II.2.4))
3)미생물등배양시사용할수있는식품첨가물규정명확화로식품
산업활성화및민원이해제고
다.“글루탐산 ”등6품목의 성분규격 개정
1)유해시약을저독성의시약으로대체및성분규격의국제기준과
일치필요
2)“L-글루탐산”등3품목의순도시험중피롤리돈카복실산의 시험법
개선(안Ⅱ.4.가.L-글루탐산,L-글루탐산암모늄,L-글루탐산칼륨)
- 3 -3)“수용성안나토”등3품목의확인시험,순도시험,정량법등시험법
개선(안Ⅱ.4.가.수용성안나토,비타민B12,보존료제제)
4)시험법개선을통한시험자건강보호및국제기준과의조화
라.“천연향료 ”기원물질 명칭 등정비
1)천연향료기원물질의한글명명시등수정필요
2)천연향료기원물질59종에대한명칭,학명수정(안II.4.가.천연
향료)
3)천연향료기원물질에대한정보명확화
마.수산화칼륨 등13품목에 대한 사용기준 개정
1)식품유형개정사항과일치및영·유아식에사용할수있는식품
첨가물에대한사용기준정비필요
2)영·유아용곡류조제식과기타영·유아식이영·유아용이유식으로
통합됨에따라이를반영한글루콘산동등11품목의사용기준개정
(안II.5.가.글루콘산동,글콘산망간,글루콘산아연,글루콘산철,
비타민K1,5’-시티딜산,5’-시티딜산이나트륨 ,5’-아데닐산,5’-우리
딜산이나트륨,황산동,황산아연)
3)영·유아식에사용할수있는식품첨가물의사용기준중수산화칼륨의
사용기준을품목별사용기준과일치시키고,헴철을영양강화목적
으로사용되는식품첨가물목록으로이동(안II.5.다.(1),(2))
4)식품공전과의식품유형일치및식품첨가물사용기준의명확화로
민원이해제고- 4 -바.살균소독력 시험법 개선
1)살균소독력시험법의이해도증진및수행의용이성제고를위하여
개정필요
2)일반시험법중살균소독력시험법 개선(안IV.37.)
3)시험분석편의성제고
사.식품첨가물 신규지정시 안전성 제출자료 규정 개선
1)식품첨가물신규지정시제출하여야하는안전성자료범위규정
명확화필요
2)가공보조제로인정된식품첨가물을그외용도로사용할경우,
기존식품첨가물과동일하게안전성자료추가제출규정신설
(안[별표1])
3)식품첨가물의안전성확보로국민건강증진
3.의견 제출
식품첨가물의기준및규격
일부개정고시(안)에대하여의견이있는
단체또는개인은2019년5월18일까지다음사항을기재한의견서를
식품의약품안전처장 (우편번호:28159,주소:충청북도청주시흥덕구
오송읍오송생명2로187오송보건의료행정타운 식품의약품안전처 ,참조:
첨가물기준과,전화043-719-2502～11,팩스043-719-2500)에게제출
하여주시기바랍니다.
가.예고사항에대한항목별의견(찬·반여부와그사유)
- 5 -나.성명(단체의경우단체명과그대표자명),주소및전화번호
다.기타참고사항- 6 -식품의약품안전처 고시 제2019-000 호
식품위생법
제7조제1항에따른
식품첨가물의기준및규격
(식품
의약품안전처고시제2019-1호,2019.1.9.)을다음과같이개정하고자
합니다.
 2019년월일
식품의약품안전처장
식품첨가물의 기준 및규격
 일부개정고시 (안)
식품첨가물의기준및규격일부를다음과같이개정한다.
II.1.5)를다음과같이신설한다.
5)가스형태의식품첨가물
아산화질소는내용량2.5L이상의고압금속제용기에만충전하여야
한다.
II.2.4)부터5)를5)부터6)으로하고,4)를다음과같이신설한다.
4)식용을목적으로하는미생물등의배양에사용하는식품첨가물은
이고시에서정하고있는품목또는국제식품규격위원 회(Codex
AlimentariusCommission)에서미생물영양원으로등재된것으로
- 7 -최종식품에잔류하여서는아니된다.다만,불가피하게잔류할경우
에는품목별사용기준에적합하여야한다.
II.4.가.L-글루탐산의순도시험중(4)피롤리돈카복실산을 아래와
같이한다.
(4)피롤리돈카복실산:이품목0.5g을달아물100mL에녹인액을
시험용액으로한다.따로,L-글루타민산나트륨 0.5g과피롤리돈카
복실산2.5mg을달아물에녹인액을대조액으로한다.시험용액
및대조액2μL씩을실리카겔박층판에점적한후n-부탄올·빙초
산·물의혼액(2:1:1)을전개용매로하여약10cm전개하고박
층판을상온에서30분간건조시킨다.차아염소산나트륨이3g이
들어있는50mL비이커를전개조안에넣고염소가스를발생시키
기위해염산1mL를천천히가한후뚜껑을닫고30초간방치한
다.이전개조에상기건조된박층판을넣고뚜껑을닫은후20
분간방치한다.박층판을꺼내어상온에서10분간놓아둔후에
탄올을균일하게분무한다.상온에서건조후요오드칼륨전분시
액을균일하게분무한다음자연광하에서발색된반점을관찰할
때,시험용액에서는대조액과같은위치에피로리돈카복실산 반
점이나타나서는아니된다.
요오드칼륨전분시액:전분0.5g을달아물약50mL를가한다
음열을가하면서젤화될때까지젖는다.식힌후요오드칼륨- 8 -0.5g을달아물을가하여100mL로한다.
II.4.가.L-글루탐산암모늄의 순도시험중(3)피롤리돈카복실산을 아
래와같이한다.
(3)피롤리돈카복실산:이품목0.5g을달아물100mL에녹인액을
시험용액으로한다.따로,L-글루타민산나트륨 0.5g과피롤리돈카
복실산2.5mg을달아물에녹인액을대조액으로한다.시험용액
및대조액2μL씩을실리카겔박층판에점적한후n-부탄올·빙초
산·물의혼액(2:1:1)을전개용매로하여약10cm전개하고박
층판을상온에서30분간건조시킨다.차아염소산나트륨이3g이
들어있는50mL비이커를전개조안에넣고염소가스를발생시키
기위해염산1mL를천천히가한후뚜껑을닫고30초간방치한
다.이전개조에상기건조된박층판을넣고뚜껑을닫은후20
분간방치한다.박층판을꺼내어상온에서10분간놓아둔후에
탄올을균일하게분무한다.상온에서건조후요오드칼륨전분시
액을균일하게분무한다음자연광하에서발색된반점을관찰할
때,시험용액에서는대조액과같은위치에피로리돈카복실산 반
점이나타나서는아니된다.
요오드칼륨전분시액:전분0.5g을달아물약50mL를가한다
음열을가하면서젤화될때까지젖는다.식힌후요오드칼륨
0.5g을달아물을가하여100mL로한다.
- 9 -II.4.가.L-글루탐산칼륨의순도시험중(5)피롤리돈카복실산을 아래
와같이한다.
(5)피롤리돈카복실산:이품목0.5g을달아물100mL에녹인액을
시험용액으로한다.따로,L-글루타민산나트륨 0.5g과피롤리돈카
복실산2.5mg을달아물에녹인액을대조액으로한다.시험용액
및대조액2μL씩을실리카겔박층판에점적한후n-부탄올·빙초
산·물의혼액(2:1:1)을전개용매로하여약10cm전개하고박
층판을상온에서30분간건조시킨다.차아염소산나트륨이3g이
들어있는50mL비이커를전개조안에넣고염소가스를발생시키
기위해염산1mL를천천히가한후뚜껑을닫고30초간방치한
다.이전개조에상기건조된박층판을넣고뚜껑을닫은후20
분간방치한다.박층판을꺼내어상온에서10분간놓아둔후에
탄올을균일하게분무한다.상온에서건조후요오드칼륨전분시
액을균일하게분무한다음자연광하에서발색된반점을관찰할
때,시험용액에서는대조액과같은위치에피로리돈카복실산 반
점이나타나서는아니된다.
요오드칼륨전분시액:전분0.5g을달아물약50mL를가한다
음열을가하면서젤화될때까지젖는다.식힌후요오드칼륨
0.5g을달아물을가하여100mL로한다.- 10 -II.4.가.비타민B12의순도시험중“사염화탄소와”를“클로로포름과”
로한다.
II.4.가.수용성안나토의 함량중“380.49”를“380.48”로하고,“100.0
∼125.0%”를“95∼120%”로한다.
II.4.가.수용성안나토의확인시험중(1)을아래와같이한다.
(1)이품목1g을물40mL에녹이고황산(1→20)4mL를넣어흔들어
섞은후여과한다.여지상의잔류물을물40mL씩으로세번씻어
이를시험용액으로하여다음의시험을한다.
(가)잔류물의일부에수산화나트륨용액(1→2,500)을가하여녹인
액은파장452～456nm및480～484nm부근에흡수를확인한다.
(나)잔류물의일부를에탄올10mL에녹이고,그중한방울을여
지상에점적한후바람에말린다음아질산나트륨용액(1→20)
2～3방울을떨어뜨린후계속하여0.5mol/L황산2～3방울을
떨어뜨릴때,여지상의노란색은탈색된다.
II.4.가.수용성안나토의 순도시험중(1)을삭제하고(2)부터(6)을
(1)부터(5)로한다.
II.4.가.수용성안나토의정량법을아래와같이한다.
- 11 -순번 일반명 기원물질명
2Almond,bitter(freefromprussicacid)
(Bitteralmond)장미과벚나무(PrunusamygdalusBatsch.Prunus
armeniacaL.,Prunuspersica(L.)Batsch.)
3Ambergris 향고래과향유고래(PhysetermacrocephalusL.)
8Angelicastem로셀라과로셀라푸시포르미스지의류(Roccella
fuciformisAch)
17Balm(Lemonbalm,Melissa) 꿀풀과레몬밤(MelissaofficinalisL.)
18BalsamofPeru 콩과페루발삼(MyroxylonpereiraeKlotzsch.)
21Bay(Myrciaoil)도금양과서인도베이오일(Pimentaracemosa(Mill.)
J.W.Moore.)
23Bergamot(Bergamotorange)운향과귤(CitrusaurantiumL.subsp.bergamia
WrightetArn.)정량법측정하는흡광도가0.3∼0.7의범위가되도록이품목0.
3～0.5g을정밀히달아,수산화칼륨용액(1→200)을가하여녹인후
정확히100mL로한다.이액1mL를정확하게취한후수산화칼륨
용액(1→200)을넣어정확하게100mL로하여검액으로한다.수산
화칼륨용액(1→200)을대조로파장476∼484nm의극대흡수부에서
흡광도A를측정하여다음식에따라노르빅신의함량을구한다.
함량(%)＝A×100×1002,870검체의채취량(g)
II.4.가.천연향료기원물질목록중“2,3,8,17,18,21,23,25,28,
32,38,39,44,47,69,74,76,81,102,109,119,123,129,130,131,
139,140,147,148,149,150,156,160,161,163,166,170,172,183,
189,194,198,199,209,212,221,227,228,231,232,238,245,249,
250,251,253,254,272,273의일반명및기원물질명을다음과같이
한다.- 12 -25Boisderose 녹나무과브라질장미목(AnibarosaeodoraDucke.)
28Bryoniaroot 박과브리오니아(BryoniaalbaL.,B.diocaJacq)
32Cajeput도금양과흰멜라루카(MelaleucaleucadendronL.,
otherMelaleucaspp.)
38Caraway 산형과캐러웨이(CarumcarviL.)
39Cardamomseed(Cardamon) 생강과소두구(ElettariacardamomumMaton.)
44Cassiabark,Padang또는Batavia녹나무과녹나무(CinnamomumburmanniiBlume.)
47Castoreum비버과유럽비버또는아메리카비버(CastorfiberL.
andC.canadensisKuhl.)
69Civet(Zibeth,Zibet,Zibetum)사향고양이과아프리카사향고양이 또는큰인도사향고
양이(Civetcats:ViverracivettaSchreber,Viverra
zibethaSchreber.)
74Cognacoil,white및green 포도과포도(Ethyloenanthata,so-called)
76Copaiba콩과남미코파이페라속(SouthAmericanspp.of
CopaiferaL.)
81Cumin(Cummin) 산형과쿠민(CuminumcyminumL.)
102Fenugreek 콩과호로파(Trigonellafoenum-graecumL.)
109Genetflowers 콩과스페인빗자루꽃(SpartiumjunceumL.)
119Guaiac남가새과구아이아쿰(GuaiacumofficinaleL.,G.
sanctumL.,BulnesiasarmientiLor.)
123Hemlockneedles및twigs북미산캐나다솔송나무또는북미솔송나무(Tsuga
canadensis(L.)Carr.,T.heterophylla(Raf.)Sarg)
129Hyssop 꿀풀과히숍(HyssopusofficinalisL.)
130Icelandmoss 당초무늬지의과갈퀴지의(CetrariaislandicaAch)
131Immortelle 국화과밀짚꽃(HelichrysumangustifoliumDC.)
139Lavender,spike 꿀풀과라반둘라(LavandulalatifoliaVill.)
140Lavandin꿀풀과라반둘라(HybridsbetweenLavandula
officinalisChaixandLavandulalatifoliaVill.)
147Lindenleaves(146에서flowers)피나무과피나무(Tiliaspp.)
148Locustbean(Carobbean) 콩과캐롭(CeratoniasiliquaL.)
149Lovage 산형과로바지(LevisticumofficinaleKoch)
150Lungmoss(Lungwort)투구지의과갑옷이끼(분말투구지의)(Stictapulmonacea
Ach.)
156Marjoram,sweet꿀풀과오래가눔마조라나(Majoranahortensis
Moench.)
- 13 -160Mimosa(Blackwattle)flowers콩과아카시아(AcaciadecurrensWilld.var.
dealbata)
161Molasses(extract) 화본과사탕수수(SaccharumofficinarumL.)
163Musk(Tonquinmusk)사향노루과시베리아사향노루(Muskdeer,Moschus
moschiferusL.)
166Myrtleleaves 도금양과도금양(MyrtuscommunisL.)
170Olibanum감람과유향속(BoswelliacarteriBirdw.,other
Boswelliaspp.)
172Opopanax(Bisabolmyrrh)산형과오포파낙스치로니쿰(Opopanaxchironium
Koch(trueopopanax)ofCommiphoraerythraea
Engl.var.Glabrescens)
183Parsley 산형과파슬리(Petroselinumcrispum(Mill.)Mansf.)
189Pennyroyal,American꿀풀과북미페니로얄초(Hedeomapulegioides(L.)
Pers)
194Peruvianbalsam 콩과페루발삼(MyroxylonpereiraeKlotzsch.)
198Pimenta(Allspice) 도금양과올스파이스(PimentaofficinalisLindl.)
199Pimentaleaf 도금양과올스파이스(PimentaofficinalisLindl.)
209Quebrachobark협죽도과퀘브라초(Aspidospermaquebracho-blanco
Schlecht,,(Quebrachialorentzii(Griseb))
212Redsaunders(Redsandalwood)콩과자단목(PterocarpussantalinusL.)
221Rosegeranium 쥐손이풀과펠르고니움(PelargoniumgraveolensL'Her.)
227Sage,Spanish 꿀풀과단삼(SalvialavandulifoliaVahl.)
228St.John'sbread 콩과캐롭(CeratoniasiliquaL.)
231Sandarac 측백나무과산다락(Tetraclinisarticulata(Vahl.),Mast)
232Sarsaparilla청미래덩굴과청미래덩굴(Smilaxaristolochiaefolia 
Mill.,(Mexicansarsaparilla),S.regeliiKillipet
Morton(Hondurassarsaparilla),S.febrifuga
Kunth(Ecuadoreansarsaparilla),orundetermined
Smilaxspp.(EcuadorianorCentralAmerical
sarsaparilla).)
238Simarubabark 소태나무과시마루바나무(SimaroubaamaraAubl)
245Tamarind 콩과타마린(TamarindusindicaL.)
249Thistle,blessed(Holythistle)국화과홀리티슬(CnicusbenedictusL.)
250Thyme꿀풀과백리향(ThymusvulgarisL.andThymus
zygisvar.gracilisBoiss.)
251Thyme,white꿀풀과백리향(ThymusvulgarisL.andThymus
zygisvar.gracilisBoiss.)- 14 -253Tuberose 빗자루과튜베로즈(PolianthestuberosaL.)
254Tolu 콩과토루발삼(Myroxylonbalsamum(L.)Harms)
272Mastic 옻나무과유향나무(PistacialentiscusLINNE)
273Paracress 국화과아크멜라(SpilanthesacmellaLinné)
II.4.나.보존료제제의확인시험중“(1)박층크로마토그래피에의한
확인”에대한시험방법을아래와같이한다.
시험용액의조제:정량법1)시험용액의조제에따라얻어진에테
르를날려보낸후잔류물에0.1%아세트아닐라이드아세톤용액대신
에탄올소량(1～2mL)을가하여녹인액을시험용액으로한다.
박층판:박층크로마토그래피용실리카겔(파라옥시안식향산에스테
르류는Silicagel60RP-18F254S또는이와동등한것,안식향산,
데히드로초산,소브산은Silicagel60kieselguhrF254또는이와동
등한것)을사용한다.
시험조작:박층판의하단에서약1.5cm위치에시험용액및각
보존료표준용액을20μL를약2cm간격으로점적한다음각전
개용매1,2를사용하여전개후건조하고자외선등(254nm)아래
서반점을비교관찰한다.
시액
보존료표준용액:안식향산및데히드로초산표준품은각각10mg
을아세톤1mL씩에녹이고소브산및파라옥시안식향산에스테르
류는각각10mg을아세톤5mL씩에녹인액을각보존료표준용
- 15 -액으로한다.
전개용용매:1.파라옥시안식향산에스테르류:아세톤․물(60:40,v/v)
 2.안식향산,데히드로초산,소브산)자일렌․메탄올․
초산(20:0.5:0.3,v/v/v)
II.5.가.글루콘산동의사용기준중2의“영·유아용곡류조제식,기타
영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.글루콘산망간의 사용기준중9의“영·유아용곡류조제식,기
타영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.글루콘산아연의 사용기준중3의“영·유아용곡류조제식,기
타영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.글루콘산철의사용기준중2의“영·유아용곡류조제식,기타
영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.비타민K1의사용기준중1의“영·유아용곡류조제식,기타
영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.- 16 -II.5.가.5’-시티딜산의사용기준중1의“영·유아용곡류조제식,기타
영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.5’-시티딜산이나트륨의 사용기준중1의“영·유아용곡류조
제식,기타영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.5’-아데닐산의사용기준중1의“영·유아용곡류조제식,기타
영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.5’-우리딜산이나트륨의 사용기준중1의“영·유아용곡류조
제식,기타영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.황산동의사용기준중3의“영·유아용곡류조제식,기타영·
유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.가.황산아연의사용기준중2의“영·유아용곡류조제식,기타
영·유아식”을“영·유아용이유식”으로한다.
II.5.다.의“영·유아용곡류조제식,기타영·유아식”을“영·유아용이
유식”으로한다.
- 17 -II.5.다.(2)수산화칼륨의사용기준을“최종식품완성전에중화또
는제거하여야한다.”로한다.
II.5.다.(2)에서“헴철(HemeIron)”및그사용기준을삭제하고,II.
5.다.(1)의피로인산철나트륨 다음에“헴철(HemeIron)”을추가한다.
IV.37.살균소독력시험법을 아래와같이변경한다.
37. 살균소독력시험법
분석원리:본시험방법은기구등의살균소독제의살균소독력유무를
측정하는방법으로세균현탁액시험법,세균표면시험법,포자현탁액시험
법이있으며,별도의규정이없는한세균현탁액시험법으로측정한다.
살균소독력의정의:기구등의살균소독제에대하여규정된조건에서
규정된시험균의초기균수(cfu/mL)에대한생균수(cfu/mL)감소율(%)
을말한다.
가.세균현탁액시험법
1)시험용액의조제- 18 -시험용액은검체에표시된사용농도보다1.25배높게경수(바.시
액①)로희석하여제조한다.제조된시험용액은바로사용하여야
하며,최대2시간을초과하여사용할수없다.단,희석하지않고
그대로사용하는검체의경우에는원액을그대로사용한다.
2)시험균주
다음의2가지시험균주를표준균주로사용한다.
-EscherichiacoliATCC10536또는EscherichiacoliATCC11229
-StaphylococcusaureusATCC6538
다만,상기표준균주외에다음과같은시험균주를선택하여추가
할수있다.
-BacilluscereusATCC21772
-Vibrioparahaemolyticus ATCC27969
-SalmonellactyphimuriumATCC13311
-ListeriamonocytogenesATCC19111(또는Listeriamonocytogenes
ATCC19115)
3)시험균주의배양
시험균주를TSA배지(마.배지①)에도말하여36±1℃에서18～24
시간배양한다.이를1차배양이라하며,같은방법으로2차배양
을한다.시험에서는2차배양된시험균주를사용한다.다만,추가
시험균주중V.parahaemolyticus 의배양을위해서는염화나트륨
이2%가되도록조정한TSB배지10mL에시험균10μL를접종하
- 19 -여36±1℃에서18～24시간배양한다.1차배양이완료되면2차배
양을염화나트륨이2%가되도록조정한TSB배지100mL에한다.
4)시험균주현탁액의조제및계수
(1)조제
상기3)에따라2차배양된시험균을백금이를사용하여트립톤
생리식염수(바.시약②)10mL와유리비드(라.기구및재료
①)5g이들어간100mL삼각플라스크에옮긴다.이때시험균이
옮겨진백금이를트립톤생리식염수에담그고삼각플라스크의
벽면에문질러완전히균괘가떨어지도록한다음3분간교반
기(라.기구및재료②)를이용하여잘섞는다.이후유리비드
안쪽의현탁액을취하여다른시험관으로옮긴다.트립톤생리식
염수을사용하여생균수를1.5×108～5.0×108cfu/mL로조정하고
20±1℃의항온수조(라.기구및재료③)에방치한후시험균주
현탁액으로사용한다.시험균주현탁액은제조후2시간이내에
사용하여야한다.
다만,추가시험균주중V.parahaemolyticus 의경우에는상기
3)의배양균을멸균된50mL원심분리관에넣고원심분리기(라.
기구및재료④)20℃,5000×g(6,000rpm)에서5분간원심분리
하여상등액을조심스럽게버린후,잔류된균괘에트립톤생리
식염수25mL를첨가하여10초간진탕교반기를이용하여교반
한다.교반이완료되면다시원심분리하여상등액을버린후,- 20 -트립톤생리식염수2mL를첨가하여균괘를현탁시켜둔다.
100mL삼각플라스크에트립톤생리식염수10mL와유리비드5g
을넣고미리준비한균현탁액을첨가하여3분간진탕교반기
를이용하여잘섞은후트립톤생리식염수를사용하여생균수
를1.5～5×108cfu/mL가되도록조정하고20±1℃의항온수조에
서2시간방치한액을시험균주현탁액으로한다.:100mL삼
각플라스크에희석액(TSCS)10mL와유리비드(직경3～4㎜)5g
을넣고백금이를사용하여E.coli활성배양균을옮긴다.이때
백금이를희석액(TSCS)에담그고삼각플라스크의벽면에문질
러완전히균괘가떨어지도록한다음3분간진탕교반기를이
용하여잘섞은후유리비드안쪽의현탁액을취하여다른시
험관으로옮긴다.희석액(TSCS)을사용하여생균수를1.5～
5×108cfu/mL로조정하고20℃의항온수조에서2시간방치한
액을E.coli시험균주현탁액으로한다.
(2)계수
시험균주현탁액을트립톤생리식염수를사용하여10-6과10-7
으로희석하고,이희석액1mL씩을멸균페트리접시(라.기구
및재료⑤)2매에각각넣고45±1℃로유지한TSA배지약
15mL를무균적으로분주하고잘혼합하여응고시킨다.확산집
락의발생을방지하기위하여TSA배지3～5mL를가하여중첩
시킨다.냉각응고된페트리접시를거꾸로하여36±1℃에서
- 21 -48±2시간배양한후다음의계산식에따라시험균주현탁액의
생균수(N)를계수한다.생균수의계산은15～300개의집락을생
성한페트리접시를택하여계산한다.10-6과10-7의희석배수에
서모두유효범위의결과가나오면다음의식에의하여생균수
를산정한다.하지만,한단계의희석배수에서만유효범위의결
과를얻었을경우에는산술평균하고희석배수를곱하여계산한
다.계산된결과는두자리유효숫자를얻을때까지반올림하여
1.0과9.9사이의숫자를10의배수로곱한방식(예,2.7×108
cfu/mL)으로표시한다.
시험균주현탁액의생균수(N,cfu/mL)＝c
(n1+0.1n2)d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n1:10-6희석에서계수된페트리접시의수
n2:10-7희석에서계수된페트리접시의수
d:첫번째희석액의희석배수(10-6)
5)시험균주현탁희석액의조제및계수
(1)조제
상기4)의시험균주현탁액을트립톤생리식염수를사용하여생
균수가3.0×102～1.6×103cfu/mL가되도록희석하여조제한다.
(2)계수
시험균주현탁희석액을트립톤생리식염수로10배희석하고이
희석액1mL씩을멸균페트리접시2매에각각넣어45±1℃로
유지한TSA배지약15mL를무균적으로분주하여냉각응고시- 22 -킨후TSA배지3～5mL를가하여중첩시킨다.냉각응고된페
트리접시를거꾸로하여36±1℃에서48±2시간배양한후생균
수를계수한다.시험균주현탁희석액의생균수(Nv)는다음의계
산식에따라산정한다.이때시험균주현탁희석액의생균수는
3.0×102～1.6×103cfu/mL이어야한다.
시험균주현탁희석액의생균수(Nv,cfu/mL)＝c×10n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
6)시험조작
시험용액,시험균주현탁액,시험균주현탁희석액,시액및물등
은항온수조에서20±1℃로유지시킨다.
(1)본시험
시험관(라.기구및재료⑥)에간섭물질1mL와시험균주현탁
액1mL를첨가하여즉시혼합하고20±1℃의항온수조에서2분
간방치한다.이후시험용액8mL를첨가하여혼합하고20±1℃
의항온수조에서5분간반응시킨다.이반응혼합액1mL를취하
여중화제8mL와증류수1mL가들어있는시험관에넣고20±
1℃의항온수조에서5분간중화시킨다.이중화반응혼합액1mL
씩을멸균페트리접시2매에각각넣고상기가.4)와같이배
양한다.본시험에서의생균수(Na)를상기가.5)(2)의계산식에
따라산정한다.
- 23 -단,원액을사용하는검체는시험용액을9.8mL첨가하고,간섭
물질과시험균주현탁액의농도를상기사용한농도보다10배
높게조제하여각각0.1mL씩첨가하여상기시험조작과동일하
게조작한다.
(2)검증시험
검증시험에는시험조건검증시험,중화제독성검증시험및희
석중화검증시험이있으며,이들검증시험들은상기본시험과
같이수행해야한다.
①시험조건검증시험
시험관에시험균주현탁희석액1mL와간섭물질1mL를첨가
하여즉시혼합하고20±1℃의항온수조에서2분간방치한다.
이후경수8mL를첨가하여혼합한후20±1℃의항온수조에서
5분간반응시킨다.이반응혼합액에서1mL씩을멸균페트리접
시2매에각각넣고상기가.4)(2)와같이배양한다.시험조
건검증법에서의생균수(A)를다음의계산식에따라산정한다.
이때,시험조건검증시험의생균수(A)는시험균주현탁희석액
(Nv)에서산정한생균수의0.05배수이상이어야한다.
시험조건검증시험의생균수(A,cfu/mL)＝c
n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
②중화제독성검증시험- 24 -시험관에시험균주현탁희석액1mL,중화제8mL및증류수
1mL를넣고즉시혼합하고20±1℃의항온수조에서5분간반
응시킨다.이반응혼합액에서1mL씩을멸균페트리접시2매에
각각넣고상기4)(2)와같이배양한다.중화제독성검증시험
의생균수(B)는①시험조건검증시험의계산식에따라산정
한다.이때,중화제독성검증시험에서의생균수(B)는시험균
주현탁희석액에서산정한생균수(Nv)의0.05배수이상이어야
한다.
③희석중화검증시험
시험관에시험용액8mL,간섭물질1mL및트립톤생리식염수
1mL를넣고즉시혼합한후20±1℃의항온수조에서5분간반
응시킨다.이반응혼합액1mL를취하여중화제8mL가담겨져
있는시험관에옮긴후20±1℃의항온수조에서5분간반응시
킨다.이중화반응혼합액에시험균주현탁희석액1mL를첨가
하여혼합하고20±1℃의항온수조에서30분간반응시킨다.이
액1mL씩을멸균페트리접시2매에각각넣고상기가.4)(2)
와같이배양한다.희석중화검증법의생균수(C)는①시험조
건검증시험의계산식에따라산정한다.이때,희석중화검증
시험에서의생균수(C)는중화제독성시험법에서 산정한생균
수(B)의0.5배수이상이어야한다.
7)판정
- 25 -다음계산식에따라시험균의생균수감소율을각각계산하여
생균수감소율이99.999%이상일때적합한것으로본다.
생균수감소율(%)＝N-10Na×100N
N:시험균주현탁액의생균수(cfu/mL)
Na:시험용액의살균소독작용에의한생균수*(cfu/mL)
*본시험에서계수된집락수가15개이하인경우의생균수(Na)는“1.5×102
cfu/mL”를,계수된집락수가300개이상인경우의생균수(Na)는“3.0×103
cfu/mL”를각각적용한다.
나.세균표면시험법
본시험방법은간섭물질이들어있는시험균주현탁액을스테인리
스스틸표면(담체)에도말하여건조시킨후이막위에시험용액
을처리하여20±1℃에서5분간반응시키고즉시검증된중화제를
사용하여반응을억제시키는방법으로각표면의생균수를측정
하여생균수감소율을측정하는방법이다.다만,본시험을할때
에는시험용액대신트립톤생리식염수를사용하여대조시험을실
시하고검증시험을동시에수행하여야한다.
1)시험용액의조제
시험용액은검체에표시된사용농도에맞게경수로희석하여제
조한다.제조된시험용액은바로사용하여야하며,최대2시간을
초과하여사용할수없다.단,희석하지않고그대로사용하는- 26 -검체의경우에는원액을그대로사용한다.
2)시험균주
가.2)의2가지시험균주를사용한다.추가균주는사용하지않는다.
3)시험균주의배양
가.3)에따른다.
4)시험균주현탁액의조제및계수
가.4)에따른다.
5)시험표면접종액의조제
시험관에시험균주현탁액400μL와간섭물질100μL를첨가하여
1분간교반기를이용하여잘섞은후20±1℃의항온수조에서30
분간방치한액을시험표면접종액으로한다.
6)시험표면의조제
시험표면접종액10μL를담체(라.기구및재료⑦)중앙에접종
하여36±1℃로조절된가열판위에서건조시킨것을시험표면으
로한다.
7)시험조작
시험용액,시액,기구등은20±1℃로유지시킨다.담체와유리병
(라.기구및재료⑧)은데시케이터(라.기구및재료⑨)에건
조하여준비한다.
(1)본시험
시험표면을멸균된집게를사용하여시험표면접종액의건조된
- 27 -표면이위로향하게하여유리병에조심스럽게넣는다.유리병
안의시험표면중앙에시험용액50μL를첨가하고20±1℃에서5
분간반응시킨후중화제9.95mL와유리비드2～3g을첨가하여
교반기에서1분간혼합하고막여과장치(라.기구및재료)로
여과한다.여과할때트립톤생리식염수100～150mL를2회또는
3회나누어세척한다.막여과장치로부터여과막을분리하여상기
가.6)(2)①에따라배양한다.상기실험과정을준비된시험표
면으로5회반복한다.본시험의생균수(Nd)를다음계산식에따
라산정한다.
본시험및검증시험의생균수(cfu/carrier)＝c
n×d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
d:희석배수
따로트립톤생리식염수를사용하여대조시험의생균수(Nc)를
산정한다.이때,반응혼합액은트립톤생리식염수로10-2,10-3
및10-4으로희석하여막여과장치로여과하고시험표면반복횟
수는3회로한다.이때대조시험의생균수는상기나.7)(1)의
계산식에따라산정할때1.5×105cfu/carrier이상이어야한다.
(2)검증시험
①중화검증시험
유리병에중화제9.95mL와시험용액50μL를넣고혼합하여- 28 -20±1℃에서5분간정치시킨후시험표면과유리비드2～3g을
첨가한다.교반기에서1분간혼합한후반응혼합액을10-3,10-4
및10-5으로희석하여막여과장치로여과한다.여과할때희석
액100～150mL를2회또는3회나누어세척한다.막여과장치
로부터여과막을분리하여상기가.6)(2)①에따라배양한
다.상기기술된실험과정을따로준비한시험표면으로2회반
복한다.중화검증시험의생균수(A)를상기나.7)①의계산
식에따라산정한다.이때중화검증시험의생균수는1.5×105
cfu/carrier이상이어야한다.
②중화제독성검증시험
유리병에중화제9.95mL와트립톤생리식염수50μL를넣고혼
합하여20±1℃에서5분간정치시킨후시험표면과유리비드
2～3g을첨가한다.교반기에서1분간혼합한후반응혼합액을
10-3,10-4및10-5으로희석하여막여과장치로여과한다.여과
할때희석액100～150mL를2회또는3회나누어세척한다.
막여과장치로부터여과막을분리하여상기가.6)(2)①에따
라배양한다.상기기술된실험과정을따로준비한시험표면으
로2회반복한다.
중화제독성검증시험의생균수(B)를상기나.7)①의계산식
에따라산정한다.이때중화제독성검증시험의생균수는중
화검증시험에서산정한생균수의0.5배수이상～2배수이하이
- 29 -어야한다.
8)판정
다음계산식에따라생균수감소율이99.99%이상일때적합한
것으로본다.
생균수감소율(%)＝Nc-Nd×100Nc
Nc:대조시험의생균수(cfu/carrier)
Nd:시험용액의살균소독작용에의한생균수*(cfu/carrier)
*본시험에서계수된집락수가15개이하인경우의생균수(Nd)는“1.5×10
cfu/carrier”를,계수된집락수가300개이상인경우의생균수(Nd)는“3×102
cfu/carrier”를각각적용한다.
다.포자현탁액시험법
1)시험용액의조제
시험용액은검체에표시된사용농도보다1.25배높게경수로희
석하여제조한다.제조된시험용액은바로사용하며,최대2시간
을초과하여사용할수없다.단,희석하지않고그대로사용하
는검체의경우에는원액을그대로사용한다.
2)시험균주
BacillussubtilisATCC6633
3)포자용액의조제
시험균주를TGB배지(마.배지②)에접종하고30±1℃에서18～- 30 -24시간배양한다.이배양액2～3mL를MYA배지(마.배지③)를
넣어굳힌배양병(라.기구및재료)에접종하여30℃±1℃에
서8～10일간배양한다.멸균한유리비드와증류수를사용하여
포자를집균하고10,000rpm에서20분간원심분리한다.이후상
층액을제거한다음다시멸균증류수에부유시켜세척하는과
정을4회반복하고잔사를멸균증류수에부유시켜75±1℃에서
10분간가열하여포자용액을조제한다.조제된포자용액은냉장
(5±1℃)보관하여사용하되장기보관시에는냉동보관한다.
4)포자현탁액의조제및계수
(1)조제
상기다.3)의포자용액을멸균증류수를사용하여1.5×106～
5×106cfu/mL로조정하고광학현미경(라.기구및재료)을
사용하여영양세포가없는포자임을확인하고,20±1℃의항온수
조에서방치한액을포자현탁액으로한다.이액은제조후2
시간이내에사용하여야한다.
(2)계수
포자현탁액을멸균증류수로10-4～10-5희석하고,1mL씩을멸
균패트리접시2매에각각넣고45±1℃로유지한GYA배지(마.
배지④)약15mL를무균적으로분주하여냉각응고시킨후
GYA배지3～5mL를가하여중첩시킨다.냉각응고된페트리접
시를거꾸로하여30±1℃에서3일간배양한후포자현탁액의
- 31 -포자수(N)를산정한다.이때,포자현탁액의포자수는1.5×106～
5×106cfu/mL이어야한다.
포자현탁액의포자수(N,cfu/mL)＝c
(n1+0.1n2)d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n1:첫번째희석에서계수된페트리접시의수
n2:두번째희석에서계수된페트리접시의수
d:첫번째희석액의희석배수
5)포자현탁희석액의조제및계수
(1)조제
상기다.4)의포자현탁액을포자의수가6×102～3×103cfu/mL
가되도록멸균증류수로희석하여조제한액을포자현탁희석
액으로한다.
(2)계수
포자현탁희석액을멸균증류수로10배희석하고,1mL씩취하여
2매의멸균페트리접시에각각넣고45±1℃로유지한GYA배
지를가하여상기다.4)(2)와같이배양한다.포자현탁희석액
의포자수(Nv)는다음의계산식에따라산정한다.이때,포자
현탁희석액의포자수(Nv)는6×102～3×103cfu/mL이어야한다.
포자현탁액의포자수(Nv,cfu/mL)＝c×10n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수- 32 -6)시험조작
(1)본시험
시험관에간섭물질1mL와포자현탁액1mL를첨가하여즉시
혼합하고20±1℃의항온수조에서2분간방치한후시험용액
8mL를첨가하여혼합한다음20±1℃의항온수조에서60분간
반응시킨다.이반응혼합액1mL를취하여중화제8mL와멸균
증류수1mL가들어있는시험관에넣고20±1℃의항온수조에
서5분간중화시킨다.이중화반응혼합액1mL씩을멸균페트
리접시2매에각각넣고상기다.4)(2)와같이GYA배지를
가하여배양한다.본시험의포자수(Na)를상기다.5)(2)의계
산식에따라산정한다.
단,원액을사용하는검체는시험용액을9.8mL첨가하고,간섭
물질및포자현탁액의농도를상기사용한농도보다10배높
게조제하여각각0.1mL씩첨가하여상기시험조작과동일하
게조작한다.
(2)검증시험
검증시험에는시험조건검증시험,중화제독성검증시험및희
석중화검증시험이있으며,이들검증시험들은상기본시험과
같이수행해야한다.
①시험조건검증시험
시험관에간섭물질1mL와포자현탁희석액1mL를첨가하여
- 33 -즉시혼합하고20±1℃의항온수조에서2분간방치하고경수
8mL를첨가하여혼합한후20±1℃의항온수조에서60분간반
응시킨다.이반응혼합액에서1mL씩을멸균페트리접시2매에
각각넣고상기다.4)(2)와같이GYA배지를가하여배양한
다.시험조건검증시험에서의포자수(A)를다음의계산식에따
라산정한다.이때,시험조건검증시험의포자수(A)는포자
현탁희석액포자수(Nv)의0.05배수이상이어야한다.
시험조건검증시험의포자수(A,cfu/mL)＝c
n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
②중화제독성검증시험
시험관에중화제8mL,물1mL및포자현탁희석액1mL를넣
고수초간혼합한후20±1℃의항온수조에서5분간반응시킨
다.이반응혼합액에서1mL씩을멸균페트리접시2매에각각
넣고상기다.4)(2)와같이GYA배지를가하여배양한다.중
화제독성검증법의포자수(B)를상기다.6)(2)①시험조건
검증시험의계산식에따라산정한다.이때,중화제독성검증
시험의포자수(B)는포자현탁희석액포자수(Nv)의0.05배수
이상이어야한다.
③희석중화검증시험
시험관에간섭물질1mL,물1mL및시험용액8mL를넣고수- 34 -초간혼합한후20±1℃의항온수조에서60분간반응시킨다.이
반응혼합액1mL를취하여중화제8mL가담겨져있는시험관
에옮긴후20±1℃의항온수조에서5분간반응시킨다.이중화
반응혼합액에포자현탁희석액1mL를첨가하여혼합하고
20±1℃의항온수조에서30분간반응킨후1mL씩취하여2매
의멸균페트리접시에각각넣고상기다.4)(2)와같이GYA
배지를가하여배양한다.희석중화검증법의포자수(C)를다.
6)(2)①시험조건검증시험의계산식에따라산정한다.이
때,희석중화검증시험의포자수(C)는포자현탁희석액포자수
(Nv)의0.05배수이상이어야한다.
7)판정
다음계산식에따라포자수감소율(%)을계산하여포자수감소
율이99.9%이상일때적합한것으로본다.
포자수감소율(%)＝N-10Na×100N
N:포자현탁액의포자수(cfu/mL)
Na:본시험의포자수*(cfu/mL)
*본시험에서계수된집락수가15개이하인경우의생균수(Na)는“1.5×102
cfu/mL”를,계수된집락수가300개이상인경우의생균수(Nd)는“3.0×103
cfu/mL”를각각적용한다.
라.기구 및재료
- 35 -①유리비드(glassbead,직경3～4mm)
②교반기(Stirrer),기계식교반기(Mixer)
③항온수조(WaterBath,자동온도조절기능함유,20±1℃)
④원심분리기(Centrifuger)
⑤페트리접시(Petridish)
⑥시험관(TestTube,18×170mm등)
⑦담체(carrier,ø1cm×0.07cm스테인리스스틸디스크ANSI3042B)
⑧유리병(바닥지름2～3cm,용량15～20mL)
⑨데시케이터(Desicator)
막여과장치(여과막지름:47～50mmporesize:0.45㎛,최소
50mL의용액을담을수있어야함,진공사용시균일한여과
율로세척액100mL가20～40초사이에여과될수있도록설계
된장치사용)
배양병(Rouxbottle,500mL)
광학현미경(Opticalmicroscope)
무균대(Cleanbench)
고압멸균기(Autoclave)
건조기(DryOven)
배양기(Incubator,36±1℃와30±1℃)
냉동및냉장고(-70℃Freezer포함)
초순수제조장치(UltraPureWaterSystem)- 36 -집락계산기(ColonyCounter)
수소이온농도측정기(pHmeter)
피펫(1mL,5mL,10mL등)
슬라이드/커버글라스
알콜램프,백금이,백금선등
마.배지
본실험을위한배지조제시이미상품화된배지의사용이가능
하며,사용할각제조사별조제법을따를수있다.
①TSA배지(TryptoneSoyaAgar)
Tryptone,pancreaticdigestofcasein 15.0g
Soyapeptone,papaicdigestofsoybeanmeal5.0g
NaCl 5.0g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL에녹여pH7.2±0.2로조정한후
121℃에서15분간멸균한다.
②TGB배지(TryptoneGlucoseBroth)
YeastExtract 2.5g
Tryptone 5.0g
Glucose 1.0g
- 37 -위의성분을증류수1,000mL에녹여pH7.2±0.2로조정한후
121℃에서15분간멸균한다.
③MYA배지(YeastExtractAgar)
MeatExtract 10.0g
YeastExtract 2.0g
MnSO4·H2O 0.04g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL에녹여pH7.0±0.2로조정한후
121℃에서15분간멸균한다.
④GYA배지(GlucoseYeastExtractAgar)
AminoAcids,acidhydrolysisofcasein 1.0g
SolubleStarch 1.0g
Glucose 2.5g
YeastExtract 2.5g
FeSO4 0.1g
MnSO4·H2O 0.0001g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL에녹여pH6.8±0.2로조정한후
121℃에서15분간멸균한다.
바.시액- 38 -①트립톤생리식염수(TryptoneSodiumChlorideSolution)
Tryptone,pancreaticdigestofcasein 1.0g
NaCl 8.5g
위의성분을증류수1,000mL에녹여pH7.2±0.2로조정한후
121℃에서15분간멸균한다.
②경수(Hardwater)
-용액A:19.84g의염화마그네슘(MgCl2)과46.24g의염화칼슘
(CaCl2)을증류수에용해하여1L로맞춘다.이용액은냉장보관
하여최대1개월간사용할수있다.
-용액B:35.02g의탄산수소나트륨(NaHCO3)을증류수로용해
하여1,000mL로맞춘다.이용액은냉장보관하여최대1주일
간사용할수있다.
1,000mL의메스플라스크에용액A3.0mL를넣고최소600mL
의증류수를가해주고,용액B8.0mL를가해준후증류수를가
하여1,000mL로한다.용액의pH를7.0±0.2로조정하고여과
멸균한다.이혼합용액은12시간이내에사용하여야한다.
③간섭물질(Interferingsubstance)
0.3g의알부민(bovinealbuminfractionV)을증류수100mL에
녹이고여과멸균한다.본간섭물질이시험용액과반응하여침전
이발생할경우에는적절한다른간섭물질을사용하여실험할
수있으며,이때사용한간섭물질은본간섭물질과동일한간섭
- 39 -효과를가져야한다.
④중화제(Neutralizer)
레시틴(lecithin) 3g
폴리소르베이트80(polysorbate80) 30g
치오설페이트염(sodiumthiosulfate) 5g
히스티딘(L-histidine) 1g
사포닌(saponine) 30g
위의성분을트립톤생리식염수를가하여1,000mL로하고pH
7.2±0.2로조정한후121℃에서15분간멸균한다.본중화제이
외에검증시험에서유효성이검증된다른중화제를사용할수
도있다.
[별표1]제5.6.라.를아래와같이신설한다.
라.가공보조제로지정받은식품첨가물을가공보조제이외의용도로
신청하고자하는경우에는기존에제출하지않았던독성시험에
관한자료(생식
발생독성시험,면역독성시험,만성
발암성시험자
료),체내동태에관한자료,1일섭취량에관한자료를제출하여야
한다.- 40 -부칙 <제2019- 호,2019. .>
제1조(시행일)①이고시는고시한날부터시행한다.
②제1조제1항에도불구하고다음각호의구분에따른개정규정은
다음각호에서정한날부터시행한다.
1.II.1.5)의아산화질소제조기준:고시한날부터1년후
2.II.5.가.및다.의영·유아용이유식관련사항:2020년1월1일
제2조(검사중인사항에관한경과조치)①이고시시행당시종전의
고시에따라검사가진행중인식품첨가물,식품,건강기능식품또는
축산물(이하“식품첨가물등”이라한다)에대하여는종전의규정에
따른다.
②제1항에도불구하고2.II.1.5)의개정규정은이고시시행당시
검사가진행중인사항에대하여도적용한다.
제3조(이미제조된식품첨가물등에관한경과조치)이고시시행당시
종전의규정에따라이미제조·가공·소분·수입(선적일기준)한식품
첨가물등은이고시시행이후에도(유통기한이있는경우에는그
유통기한까지한함)판매할수있으며,위식품첨가물등을 이용하여
제조·가공한식품첨가물등에대하여도해당제품의유통기한까지판
매할수있다.다만,2.II.1.5)의개정규정을적용하는아산화질소의
경우에는그러하지아니한다.
- 41 -현 행 개정(안)
II.식품첨가물 및혼합제제류
1.제조기준
1)∼4)(생략)
<신설>II.식품첨가물 및혼합제제류
1.제조기준
1)∼4)(현행과같음)
5)가스형태의식품첨가물
아산화질소는내용량2.5L이상의
고압금속제용기에만충전하여야
한다.
2.일반사용기준
1)∼3)(생략)
<신설>
4)∼5)(생략)2.일반사용기준
1)∼3)(현행과같음)
4)식용을목적으로하는미생물
등의배양에사용하는식품첨가
물은이고시에정하고있는품
목또는국제식품규격위원 회
(CodexAlimentarius
Commission)에서미생물영양
원으로등재된것으로최종식품
에잔류하여서는아니된다.다
만,불가피하게잔류할경우에는
품목별사용기준에적합하여야
한다.
5)∼6)(현행4)～5)와같음)
- 42 -현 행 개정(안)
4.품목별 성분규격
가.식품첨가물
L-글루탐산
L-Glutamic Acid
함 량(생략)
성 상(생략)
확인시험(생략)
순도시험(1)∼(3)(생략)
(4)피롤리돈카복실산 :이품목
1g을달아물100mL에녹인액
을시험용액으로한다.따로,피
롤리돈카복실산 (pyrrolidone
carboxylicacid)1g을달아물
에녹인액을대조액으로한다.
시험용액및대조액1μL씩을
미리박층크로마토그래피용실
리카겔을사용하여조제한박층
판에점적한후n-부탄올․빙초
산․물의혼액(2:1:1)을전개
용매로하여약10cm전개하고
박층판을80℃에서30분간건조
시킨다.이에발색시액을분무하4.품목별 성분규격
가.식품첨가물
L-글루탐산
L-Glutamic Acid
함 량(현행과같음)
성 상(현행과같음)
확인시험(현행과같음)
순도시험(1)∼(3)(현행과같음)
(4)피롤리돈카복실산 :이품목
0.5g을달아물100mL에녹인
액을시험용액으로한다.따로,
L-글루타민산나트륨 0.5g과피
롤리돈카복실산 2.5mg을달아
물에녹인액을대조액으로한
다.시험용액및대조액2μL씩
을실리카겔박층판에점적한
후n-부탄올·빙초산·물의혼액(2
:1:1)을전개용매로하여약
10cm전개하고박층판을상온에
서30분간건조시킨다.차아염소
산나트륨이3g이들어있는
50mL비이커를전개조안에넣
- 43 -현 행 개정(안)
고80℃에서10분간가열하여
발색된반점을관찰할때,시험
용액에서는대조액과같은위치
에피롤리돈카복실산 반점이나
타나서는아니된다.
발색시액:닌히드린1g및초산
3mL에n-부탄올을가하여
100mL로한다.
건조감량(생략)
강열잔류물(생략)
정량법(생략)고염소가스를발생시키기위해
염산1mL를천천히가한후뚜
껑을닫고30초간방치한다.이
전개조에상기건조된박층판을
넣고뚜껑을닫은후20분간방
치한다.박층판을꺼내어상온에
서10분간놓아둔후에탄올을
균일하게분무한다.상온에서건
조후요오드칼륨전분시액을균
일하게분무한다음자연광하
에서발색된반점을관찰할때,
시험용액에서는대조액과같은
위치에피로리돈카복실산 반점
이나타나서는아니된다.
요오드칼륨전분시액:전분0.5g
을달아물약50mL를가한다
음열을가하면서젤화될때까
지젖는다.식힌후요오드칼륨
0.5g을달아물을가하여100mL
로한다.
건조감량(현행과같음)
강열잔류물(현행과같음)
정량법(현행과같음)
L-글루탐산암모늄 L-글루탐산암모늄- 44 -현 행 개정(안)
Monoammonium L-Glutamate
함 량(생략)
성 상(생략)
확인시험(생략)
순도시험(1)∼(2)(생략)
(3)피롤리돈카복실산 :이품목
1g을달아물100mL에녹인액
을시험용액으로한다.따로,피
롤리돈카복실산 (pyrrolidone
carboxylicacid)1g을달아물
에녹인액을대조액으로한다.
시험용액및대조액1μL씩을
미리박층크로마토그래피용실
리카겔을사용하여조제한박층
판에점적한후n-부탄올․빙초
산․물의혼액(2:1:1)을전개
용매로하여약10cm전개하고
박층판을80℃에서30분간건조
시킨다.이에발색시액을분무하
고80℃에서10분간가열하여
발색된반점을관찰할때,시험
용액에서는대조액과같은위치
에피롤리돈카복실산 반점이나
타나서는아니된다.
발색시액:닌히드린1g및초산Monoammonium L-Glutamate
함 량(현행과같음)
성 상(현행과같음)
확인시험(현행과같음)
순도시험(1)∼(2)(현행과같음)
(3)피롤리돈카복실산 :이품목
0.5g을달아물100mL에녹인
액을시험용액으로한다.따로,
L-글루타민산나트륨 0.5g과피
롤리돈카복실산 2.5mg을달아
물에녹인액을대조액으로한
다.시험용액및대조액2μL씩
을실리카겔박층판에점적한
후n-부탄올·빙초산·물의혼액(2
:1:1)을전개용매로하여약
10cm전개하고박층판을상온에
서30분간건조시킨다.차아염소
산나트륨이3g이들어있는
50mL비이커를전개조안에넣
고염소가스를발생시키기위해
염산1mL를천천히가한후뚜
껑을닫고30초간방치한다.이
전개조에상기건조된박층판을
넣고뚜껑을닫은후20분간방
치한다.박층판을꺼내어상온에
- 45 -현 행 개정(안)
3mL에n-부탄올을가하여
100mL로한다.
건조감량(생략)
강열잔류물(생략)
정량법(생략)서10분간놓아둔후에탄올을
균일하게분무한다.상온에서건
조후요오드칼륨전분시액을균
일하게분무한다음자연광하
에서발색된반점을관찰할때,
시험용액에서는대조액과같은
위치에피로리돈카복실산 반점
이나타나서는아니된다.
요오드칼륨전분시액:전분0.5g
을달아물약50mL를가한다
음열을가하면서젤화될때까
지젖는다.식힌후요오드칼륨
0.5g을달아물을가하여100mL
로한다.
건조감량(현행과같음)
강열잔류물(현행과같음)
정량법(현행과같음)
L-글루탐산칼륨
Monopotassium L-Glutamate
함 량(생략)
성 상(생략)
확인시험(생략)
순도시험(1)∼(4)(생략)L-글루탐산칼륨
Monopotassium L-Glutamate
함 량(현행과같음)
성 상(현행과같음)
확인시험(현행과같음)
순도시험(1)∼(4)(현행과같음)- 46 -현 행 개정(안)
(5)피롤리돈카복실산 :이품목
1g을달아물100mL에녹인액
을시험용액으로한다.따로,피
롤리돈카복실산 (pyrrolidone
carboxylicacid)1g을달아물
에녹인액을대조액으로한다.
시험용액및대조액1μL씩을
미리박층크로마토그래피용실
리카겔을사용하여조제한박층
판에점적한후n-부탄올․빙초
산․물의혼액(2:1:1)을전개
용매로하여약10cm전개하고
박층판을80℃에서30분간건조
시킨다.이에발색시액을분무하
고80℃에서10분간가열하여
발색된반점을관찰할때,시험
용액에서는대조액과같은위치
에피롤리돈카복실산 반점이나
타나서는아니된다.
발색시액:닌히드린1g및초산
3mL에n-부탄올을가하여
100mL로한다.(5)피롤리돈카복실산 :이품목
0.5g을달아물100mL에녹인
액을시험용액으로한다.따로,
L-글루타민산나트륨 0.5g과피
롤리돈카복실산 2.5mg을달아
물에녹인액을대조액으로한
다.시험용액및대조액2μL씩
을실리카겔박층판에점적한
후n-부탄올·빙초산·물의혼액(2
:1:1)을전개용매로하여약
10cm전개하고박층판을상온에
서30분간건조시킨다.차아염소
산나트륨이3g이들어있는
50mL비이커를전개조안에넣
고염소가스를발생시키기위해
염산1mL를천천히가한후뚜
껑을닫고30초간방치한다.이
전개조에상기건조된박층판을
넣고뚜껑을닫은후20분간방
치한다.박층판을꺼내어상온에
서10분간놓아둔후에탄올을
균일하게분무한다.상온에서건
조후요오드칼륨전분시액을균
일하게분무한다음자연광하
에서발색된반점을관찰할때,
시험용액에서는대조액과같은
- 47 -현 행 개정(안)
건조감량(생략)
강열잔류물(생략)
정량법(생략)위치에피로리돈카복실산 반점
이나타나서는아니된다.
요오드칼륨전분시액:전분0.5g
을달아물약50mL를가한다
음열을가하면서젤화될때까
지젖는다.식힌후요오드칼륨
0.5g을달아물을가하여100mL
로한다.
건조감량(현행과같음)
강열잔류물(현행과같음)
정량법(현행과같음)
비타민 B12
Cyanocobalamin
정 의(생략)
함 량(생략)
성 상(생략)
확인시험(생략)
순도시험 유사비타민B12:이품
목1mg을물20mL에녹여작은
분액깔대기에옮기고사염화탄소
와m-크레솔의같은양의혼액
4mL를넣어약1분간잘흔들어
섞고조용히방치한다음아랫층을비타민 B12
Cyanocobalamin
정 의(현행과같음)
함 량(현행과같음)
성 상(현행과같음)
확인시험(현행과같음)
순도시험 -------------------
---------------------------
------------------- 클로로포
름과----------------------
---------------------------
---------------------------- 48 -현 행 개정(안)
다른분액깔대기에옮겨황산(1→
7)5mL를가하여심하게흔들어
섞고필요하면원심분리하여두
액층으로분리할때분리된윗층
은색이없거나또는0.1N과망간
산칼륨용액0.15mL와물250mL의
혼액의색보다진하여서는아니
된다.
건조감량 (생략)
정량법(생략)---------------------------
---------------------------
---------------------------
---------------------------
---------------------------
---------------------------
---------------------------
---.
건조감량 (현행과같음)
정량법(현행과같음)
수용성안나토
Annatto, Water-Soluble
정 의(생략)
함 량이품목은노르빅신
(C24H28O4＝380.49)으로서,표시
량의100.0～125.0%를함유한다.
성 상(생략)
확인시험(1)이품목을0.1N수
산화나트륨용액으로희석하여그
농도를증크롬산칼륨용액(1→1,000)
의색깔과거의같은정도로조정
하고그50mL를취하여묽은황산
2mL를가하여섞은다음벤젠수용성안나토
Annatto, Water-Soluble
정 의(현행과같음)
함 량이품목은노르빅신
(C24H28O4＝380.48)으로서,표시
량의95～120%를함유한다.
성 상(현행과같음)
확인시험(1)이품목1g을물
40mL에녹이고황산(1→20)4mL
를넣어흔들어섞은후여과한다.
여지상의잔류물을물40mL씩으로
세번씻어이를시험용액으로하
여다음의시험을한다.
- 49 -현 행 개정(안)
10mL를가하여강하게흔들어섞
어추출한다.이벤젠추출액을물
5mL씩으로세번씻어이를시험
용액으로하여다음의시험을한
다.
(가)시험용액5mL를취하여
0.01N수산화나트륨용액5mL씩
을사용하여0.01N수산화나트륨
용액이착색하지아니할때까지
추출한다.그추출된용액을모
두합하고이에0.01N수산화나
트륨용액을가하여50mL로한
다.이액은파장454±2nm및
482±2nm에극대흡수부가있다.
(나)벤젠에현탁한비타민A측
정용알루미나를 높이약5cm의
알루미나층으로하고알루미나층
이항상벤젠10mL에잠겨있
도록흡착관을만든다.이알루
미나층의상부에여과지의소편
을끼우고이에벤젠10mL를
넣어벤젠이1분간에약30방울
을떨어지는속도로조정하고
벤젠의액면이알루미나층의상
면으로부터약1cm가되었을
때,시험용액3mL를흡착관에(가)잔류물의일부에수산화나
트륨용액(1→2,500)을가하여
녹인액은파장452～456nm및
480～484nm부근에흡수를확인
한다.
(나)잔류물의일부를에탄올
10mL에녹이고,그중한방울
을여지상에점적한후바람에
말린다음아질산나트륨용액(1
→20)2～3방울을떨어뜨린후
계속하여0.5mol/L황산2～3
방울을떨어뜨릴때,여지상의
노란색은탈색된다.- 50 -현 행 개정(안)
넣는다.시험용액의액면이알
루미나층의상부에약간남아
있는동안에클로로포름5mL를
가한다.다시같은조작으로클
로로포름5mL씩을2회가한다.
이어삼염화안티몬시액2mL를
가할때,알루미나층의상부의
흡착대의황등색은천천히청록
색으로변한다.
(2)(생략)
순도시험
(1)흡광비:확인시험의(1)의
(가)와같은방법으로조작하여
482±2nm에서의흡광도와
454±2nm에서의흡광도를측정
할때,그비는1.18±0.07이어야
한다.
(2)∼(6)(생략)
정량법이품목0.1～1g을정
밀히달아0.01N수산화나트륨용
액을가하여100mL로하여잘섞
는다.그1mL를분액깔대기에취
하고,염화나트륨용액(1→10)
10mL를가하여다시물을가하여
50mL로한다음,묽은황산2mL
를가하여잘섞는다.이어서벤(2)(현행과같음)
순도시험
<삭제>
(1)∼(5)(현행(2)∼(6)과같음)
정량법측정하는흡광도가0.3
∼0.7의범위가되도록이품목
0.3～0.5g을정밀히달아,수산화칼
륨용액(1→200)을가하여녹인후
정확히100mL로한다.이액1mL
를정확하게취한후수산화칼륨
용액(1→200)을넣어정확하게
100mL로하여검액으로한다.수
- 51 -현 행 개정(안)
젠10mL씩을사용하여벤젠추출
액이착색하지아니할때까지계
속하여추출한다.벤젠추출액을합
하여이를물5mL씩으로3회씻고
잠시정치하여물층을완전히제거
한다음벤젠추출액을다른분액
깔대기에옮기고먼저의분액깔대
기는벤젠2mL씩으로3회씻어
씻은액을벤젠추출액에합친다.
이벤젠추출액에같은양의석유
벤진을가하여섞은다음0.01N
수산화나트륨용액5mL씩으로
0.01N수산화나트륨용액이착색하
지아니할때까지계속추출하여
추출액을합치고0.01N수산화나
트륨용액을가하여100mL로한
다.이액의파장454nm에서의
흡광도A를측정하고,다음계산
식에따라노르빅신의함량을구
한다.
함량(%)＝A
×100,000
×100
3,473검체의채취량(mg)산화칼륨용액(1→200)을대조로
파장476∼484nm의극대흡수부에
서흡광도A를측정하여다음식
에따라노르빅신의함량을구한
다.
함량(%)＝A
×100
×100
2,870검체의채취량(g)
천연향료
Synthetic Flavoring Substances천연향료
Natural Flavoring Substances- 52 -현 행 개정(안)
순
번일반명 기원물질명
2(생략)장미과벚나무(Prunus
amygdalusBatsch.,
PrunusarmeniacaL.,or
Prunuspersica(L.)Batsch.)
3(생략)PhysetermacrocephalusL.
8(생략)RoccellafuciformisAch
17(생략)MelissaofficinalisL.
18(생략)Myroxylonpereirae
Klotzsch.
21(생략)Pimentaracemosa(Mill.)J.
W.Moore.
23(생략)운향과귤(Citrusaurantium
L.subsp.beramiaWright
etArn.)
25(생략)AnibarosaeodoraDucke.
28(생략)박과브리오니아(Bryonia
albaL.,orB.diociaJacq)
32(생략)MelaleucaleucadendronL.
andotherMelaleucaspp.
38(생략)CarumcarviL.
39(생략)Elettariacardamomum
Maton.
44(생략)녹나무과녹나무
(Cinnamomumburmanni
Blume.)
47(생략)CastorfiberL.andC.
canadensisKuhl.
69(생략)Civetcats,Viverracivetta
SchreberandViverra정 의(생략)
순도시험(생략)
순
번일반명 기원물질명
2(현행과같음)장미과벚나무(Prunus
amygdalusBatsch.,Prunus
armeniacaL.,Prunus
persica(L.)Batsch.)
3(현행과같음)향고래과향유고래(Physeter
macrocephalusL.)
8(현행과같음)로셀라과로셀라
푸시포르미스지의류(Roccella
fuciformisAch)
17(현행과같음)꿀풀과레몬밤(Melissa
officinalisL.)
18(현행과같음)콩과페루발삼(Myroxylon
pereiraeKlotzsch.)
21(현행과같음)도금양과서인도베이오일
(Pimentaracemosa(Mill.)
J.W.Moore.)
23(현행과같음)운향과귤(Citrusaurantium
L.subsp.bergamiaWright
etArn.)
25(현행과같음)녹나무과브라질장미목
(AnibarosaeodoraDucke.)
28(현행과같음)박과브리오니아(Bryonia
albaL.,B.diocaJacq)
32(현행과같음)도금양과
흰멜라루카(Melaleuca
leucadendronL.,other
Melaleucaspp.)
38(현행과같음)산형과캐러웨이(Carum
carviL.)
39(현행과같음)생강과소두구(Elettaria
cardamomumMaton.)
44(현행과같음)녹나무과녹나무
(Cinnamomumburmannii
Blume.)
47(현행과같음)비버과유럽비버또는아
메리카비버(Castorfiber
L.,C.canadensisKuhl.)
69(현행과같음)사향고양이과
아프리카사향고양이 또는정 의(현행과같음)
순도시험(현행과같음)
- 53 -현 행 개정(안)
zibethaSchreber.
74(생략)Ethyloenanthata,so-called.
76(생략)SouthAmericanspp.of
CopaiferaL.
81(생략)CuminumcyminumL.
102(생략)Trigonellafoenum-graecum
L.
109(생략)SpartiumjunceumL.
119(생략)남가새과구아이아쿰
(GuaiacumofficinaleL.,G.
santumL.,Bulnesia
sarmientiLor.)
123(생략)Tsugacanadensis(L.)Carr.
orT.heterophylla(Raf.)
Sarg
129(생략)HyssopusofficinalisL.
130(생략)CetrariaislandicaAch
131(생략)국화과밀짚꽃(Helichrysum
augustifoliumDC.)
139Laverder,spike(생략)
140(생략)꿀풀과라반둘라(Hybrids
betweenLavandula
officinalisChaixand
LavandulalatifolinVill.)
147(생략)피나무과피나무(Tilliaspp.)
148(생략)CeratoniasiliquaL.
149(생략)LevisticumofficinaleKoch
150(생략)StictapulmonaceaAch.
156(생략)MajoranahortensisMoench.
160(생략)콩과아카시아(Acadia
decurrensWilld.var.
dealbata)큰인도사향고양이(Civet
cats:Viverracivetta
Schreber,Viverrazibetha
Schreber.)
74(현행과같음)포도과포도(Ethyl
oenanthata,so-called)
76(현행과같음)콩과남미코파이페라속
(SouthAmericanspp.of
CopaiferaL.)
81(현행과같음)산형과쿠민(Cuminum
cyminumL.)
102(현행과같음)콩과호로파(Trigonella
foenum-graecumL.)
109(현행과같음)콩과스페인빗자루꽃
(SpartiumjunceumL.)
119(현행과같음)남가새과구아이아쿰
(GuaiacumofficinaleL.,G.
sanctumL.,Bulnesia
sarmientiLor.)
123(현행과같음)북미산캐나다솔송나무또
는북미솔송나무(Tsuga
canadensis(L.)Carr.,T.
heterophylla(Raf.)Sarg)
129(현행과같음)꿀풀과히숍(Hyssopus
officinalisL.)
130(현행과같음)당초무늬지의과갈퀴지의
(CetrariaislandicaAch)
131(현행과같음)국화과밀짚꽃(Helichrysum
angustifoliumDC.)
139Lavender,spike(현행과같음)
140(현행과같음)꿀풀과라반둘라(Hybrids
betweenLavandula
officinalisChaixand
LavandulalatifoliaVill.)
147(현행과같음)피나무과피나무(Tiliaspp.)
148(현행과같음)콩과캐롭(Ceratonia
siliquaL.)
149(현행과같음)산형과로바지(Levisticum
officinaleKoch)
150(현행과같음)투구지의과
갑옷이끼(분말투구지의)(Sti
ctapulmonaceaAch.)
156(현행과같음)꿀풀과오래가눔마조라나
(Majoranahortensis
Moench.)
160(현행과같음)콩과아카시아(Acacia
decurrensWilld.var.
dealbata)- 54 -현 행 개정(안)
161(생략)SaccarumofficinarumL
163(생략)Muskdeer,Moschus
moschiferusL.
166(생략)MyrtuscommunisL.
170(생략)BoswelliacarteriBirdw.
andotherBoswelliaspp.
172(생략)OpopanaxchironiumKoch
(trueopopanax)of
Commiphoraerythraea
Engl.var.Llabrescens
183(생략)Petroselinumcrispum(Mill.)
Mansf.
189(생략)Hedeomapulegioides(L.)
Pers
194(생략)Myroxylonpereirae
klotzsch.
198(생략)PimentaofficinalisLindl.
199(생략)PimentaofficinalisLindl.
209(생략)Aspidosperma
quebracho-blanco
Schlecht,or(Quebrachia
lorentzii(Griseb)).
212(생략)PterocarpussanalinusL.
221(생략)쥐손이풀과펠르고니움
(Pelargoniumgraveolens
L'Hdr.)
227(생략)꿀풀과단삼(Salvia
lavandulaefoliaVahl.)
228(생략)CeratoniasiliquaL.
231(생략)Tetraclinisarticulata(Vahl.),
Mast
232(생략)청미래덩굴과
청미래덩굴(Smilax161(현행과같음)화본과
사탕수수(Saccharum
officinarumL.)
163(현행과같음)사향노루과
시베리아사향노루(Muskdeer,
MoschusmoschiferusL.)
166(현행과같음)도금양과도금양(Myrtus
communisL.)
170(현행과같음)감람과유향속(Boswellia
carteriBirdw.,other
Boswelliaspp.)
172(현행과같음)산형과오포파낙스치로니
쿰(Opopanaxchironium
Koch(trueopopanax)of
Commiphoraerythraea
Engl.var.Glabrescens)
183(현행과같음)산형과
파슬리(Petroselinum
crispum(Mill.)Mansf.)
189(현행과같음)꿀풀과
북미페니로얄초(Hedeoma
pulegioides(L.)Pers)
194(현행과같음)콩과페루발삼(Myroxylon
pereiraeKlotzsch.)
198(현행과같음)도금양과
올스파이스(Pimenta
officinalisLindl.)
199(현행과같음)도금양과
올스파이스(Pimenta
officinalisLindl.)
209(현행과같음)협죽도과
퀘브라초(Aspidosperma
quebracho-blanco
Schlecht,Quebrachia
lorentzii(Griseb))
212(현행과같음)콩과자단목(Pterocarpus
santalinusL.)
221(현행과같음)쥐손이풀과펠르고니움
(Pelargoniumgraveolens
L'Her.)
227(현행과같음)꿀풀과단삼(Salvia
lavandulifoliaVahl.)
228(현행과같음)콩과캐롭(Ceratonia
siliquaL.)
231(현행과같음)측백나무과
산다락(Tetraclinis
articulata(Vahl.),Mast)
232(현행과같음)청미래덩굴과
청미래덩굴(Smilax
- 55 -현 행 개정(안)
aristolochiaefoliaMill.,
(Mexicansarsaparilla),S.
regeliiKillipet
Morton(Honduras
sarsaparilla),S.febrifuga
Kunth(Ecuadorean
sarsaparilla),or
undeterminedSmilax
spp.(EcuadoreanorCentral
Americalsarsaparilla).)
238(생략)SimarubaamaraAubl
245(생략)TamarindusindicaL.
249(생략)OnicusbenedictusL.
250(생략)꿀풀과백리향(Thymus
vulgarisL.andThymus
zygisvar.gracilsBoiss.)
251(생략)꿀풀과백리향(Thymus
vulgarisL.andThymus
zygisvar.gracilsBoiss.)
253(생략)PolianthestuberosaL.
254(생략)Myroxylonbalsamum(L.)
Harms
272(생략)PistacialentiscusLINNE
273(생략)SpilanthesacnellaLinnéaristolochiaefoliaMill.,
(Mexicansarsaparilla),S.
regeliiKillipet
Morton(Honduras
sarsaparilla),S.febrifuga
Kunth(Ecuadorean
sarsaparilla),undetermined
Smilaxspp.(Ecuadorianor
CentralAmerical
sarsaparilla).)
238(현행과같음)소태나무과시마루바나무
(SimaroubaamaraAubl)
245(현행과같음)콩과타마린(Tamarindus
indicaL.)
249(현행과같음)국화과홀리티슬(Cnicus
benedictusL.)
250(현행과같음)꿀풀과백리향(Thymus
vulgarisL.,Thymus
zygisvar.gracilisBoiss.)
251(현행과같음)꿀풀과백리향(Thymus
vulgarisL.,Thymus
zygisvar.gracilisBoiss.)
253(현행과같음)빗자루과튜베로즈(Polianthes
tuberosaL.)
254(현행과같음)콩과토루발삼(Myroxylon
balsamum(L.)Harms)
272(현행과같음)옻나무과
유향나무(Pistacia
lentiscusLINNE)
273(현행과같음)국화과아크멜라(Spilanthes
acmellaLinné)
가.혼합제제류
보존료제제
정 의(생략)
함 량(생략)
확인시험(생략)가.혼합제제류
보존료제제
정 의(현행과같음)
함 량(현행과같음)
확인시험(현행과같음)- 56 -현 행 개정(안)
1)안식향산,데히드로초산,소브산
및파라옥시안식향산에스테르류
(1)박층크로마토그래피에의한확인
시험용액의조제:정량법1)
시험용액의조제에따라얻어
진에테르를날려보낸후잔류
물에0.1%아세트아닐라이드아
세톤용액대신에탄올소량(1～
2mL)을가하여녹인액을시험
용액으로한다.
박층판의조제:폴리아미드(박
층크로마토그래피용)에이소프
로필알콜(20:75)을가하여잘
흔들어호상으로하여0.25mm
두께로박층을만들어이를풍
건하여60～70℃에서30분간
건조한것을사용한다.
시험조작:박층판의하단에서
약1cm위치에시험용액및각
보존료표준용액을0.2～1μL를
약2cm간격으로점적한다음
전개용용매1～3을사용하여
전개후풍건하여자외선등
(2,533°의조사선)아래서반점
을관찰하거나발색시액1～3
을선택하여분무한후발색된1)안식향산,데히드로초산,소브산
및파라옥시안식향산에스테르류
(1)박층크로마토그래피에의한확인
시험용액의조제:정량법1)시
험용액의조제에따라얻어진
에테르를날려보낸후잔류물에
0.1%아세트아닐라이드아세톤용
액대신에탄올소량(1～2mL)을
가하여녹인액을시험용액으로
한다.
박층판:박층크로마토그래피용
실리카겔(파라옥시안식향산에스
테르류는Silicagel60RP-18
F254S또는이와동등한것,안
식향산,데히드로초산,소브산은
Silicagel60kieselguhrF254또
는이와동등한것)을사용한다.
시험조작:박층판의하단에서
약1.5cm위치에시험용액및
각보존료표준용액을20μL를
약2cm간격으로점적한다음
각전개용매1,2를사용하여
전개후건조하고자외선등
(254nm)아래서반점을비교관
찰한다.
시액
- 57 -현 행 개정(안)
반점을비교관찰하여확인한
다.발색시액3을사용한경우
에는10%수산화나트륨용액을
분무하여정색시켜비교한다.
시액
보존료표준용액:안식향산및
데히드로초산표준품은각각
10mg을아세톤1mL씩에녹
이고소브산및파라옥시안식
향산에스테르류는각각10mg
을아세톤5mL씩에녹인액
을각보존료표준용액으로한
다.
전개용용매:1.헥산․초산(20:0.7)
2.벤젠․초산(20:0.5)
3.벤젠․메탄올․초산(20：
0.2：0.5)또는(20：0.
5：0.3)
발색시액：1.2%황산제이철용액
2.0.1%브로모크레솔
그린에탄올용액
3.디아조화설파닐산용액
:설파닐산1g에염산
3mL를가하고가열
하여용해시킨후물
100mL를가한다.여보존료표준용액:안식향산및
데히드로초산표준품은각각
10mg을아세톤1mL씩에녹
이고소브산및파라옥시안식
향산에스테르류는각각10mg
을아세톤5mL씩에녹인액
을각보존료표준용액으로한
다.
전개용용매:
1.파라옥시안식향산에스테르류:
아세톤․물(60:40,v/v)
2.안식향산,데히드로초산,소브산
:자일렌․메탄올․초산(20:0.5:
0.3,v/v/v)- 58 -현 행 개정(안)
기에동량의0.7%아
질산나트륨용액을가
한다.
품목명 사용기준 주용도
글루콘
산동글루콘산동은아래의식품
에한하여사용하여야한다.
1.(생략)
2.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식
3.∼5.(생략)(생략)
글루콘
산망간글루콘산망간은아래의식품
에한하여사용하여야한다.
1.∼8.(생략)
9.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식,유단
백알레르기영
유아용
조제식품,영·유아용특
수조제식품
10.(생략)(생략)
글루콘
산아연글루콘산아연은아래의식품
에한하여사용하여야한다.
1.∼2.(생략)
3.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식(생략)5.품목별 사용기준
가.식품첨가물
아래의식품첨가물은해당품목별
사용기준에따라사용하여야한다.
다만,따로사용량이정하여지지
아니한것은이고시의II.2.1)의
규정에따라사용하여야한다.
품목명 사용기준 주용도
글루콘
산동---------------------
---------------------
1.(현행과같음)
2.------------------
------------------
영․유아용이유식
3.∼5.(현행과같음)(현행과
같음)
글루콘
산망간---------------------
---------------------
1.∼8.(현행과같음)
9.------------------
------------------
영․유아용이유식,--
------------------
------------------
-----------------
10.(현행과같음)(현행과
같음)
글루콘
산아연---------------------
---------------------
1.∼2.(현행과같음)
3.------------------
------------------
영․유아용이유식(현행과
같음)5.품목별 사용기준
가.식품첨가물
-----------------------
-------------------------
-------------------------
-------------------------
------------------------.
- 59 -현 행 개정(안)
품목명 사용기준 주용도
4.∼6.(생략)
글루콘
산철글루콘산철은아래의식품에
한하여사용하여야한다.다
만,올리브가공품에한하여
글루콘산철의사용량은철
로서
1.(생략)
2.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식,유단
백알레르기영
유아용
조제식품,영·유아용특
수조제식품
3.(생략)(생략)
비타민
K1비타민K1은아래의식품에
한하여사용하여야한다.
1.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식
2.∼3.(생략)(생략)
수산화
칼륨수산화칼륨은최종식품완
성전에제거하여야한다.(생략)
5'-시티
딜산5'-시티딜산은아래의식품
에한하여사용하여야한다.
5'-시티딜산의사용량은
1.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식,유단
백알레르기영
유아용
조제식품,영·유아용특
수조제식품:0.125g/kg
이하(생략)
5'-시티
딜산이
나트륨5'-시티딜산이나트륨은 아
래의식품에한하여사용
하여야한다.5'-시티딜산
이나트륨의사용량은
1.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식,유단
백알레르기영
유아용
조제식품,영·유아용특
수조제식품:0.142g/kg(생략)품목명 사용기준 주용도
4.∼6.(현행과같음)
글루콘
산철---------------------
---------------------
---------------------
---------------------
---
1.(현행과같음)
2.------------------
------------------
영․유아용이유식,--
------------------
------------------
-----------------
3.(현행과같음)(현행과
같음)
비타민
K1----------------------
-------------------.
1.------------------
------------------
영․유아용이유식
2.∼3.(현행과같음)(현행과
같음)
수산화
칼륨---------------------
-------중화또는제거
하여야--.(현행과
같음)
5'-시티
딜산---------------------
---------------------
------------------
1.------------------
------------------
영․유아용이유식,
------------------
------------------
-------:-------(현행과
같음)
5'-시티
딜산이
나트륨---------------------
---------------------
---------------------
-------------
1.------------------
------------------
영․유아용이유식,
------------------
------------------
-------:-------(현행과
같음)- 60 -현 행 개정(안)
품목명 사용기준 주용도
이하
5'-아데
닐산5'-아데닐산은아래의식품
에한하여사용하여야한다.
5'-아데닐산의사용량은
1.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식,유단
백알레르기영
유아용
조제식품,영·유아용특
수조제식품:0.075g/kg
이하(생략)
5'-우리
딜산이
나트륨5'-우리딜산이나트륨은 아래
의식품에한하여사용하여
야한다.5'-우리딜산이나트
륨의사용량은
1.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식,유단
백알레르기영
유아용
조제식품,영·유아용특
수조제식품:0.099g/kg
이하
2.(생략)(생략)
황산동황산동은아래의식품에
한하여사용하여야한다.
다만,포도주의경우황산
동의사용량은동으로서
아래의기준이상남지아
니하도록사용하여야한다.
1.∼2.(생략)
3.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식
4.∼6.(생략)(생략)
황산아
연황산아연은아래의식품에
한하여사용하여야한다.
1.(생략)
2.조제유류,영아용조제
식,성장기용조제식,
영․유아용곡류조제식,
기타영․유아식
3.∼5.(생략)(생략)품목명 사용기준 주용도
5'-아데
닐산---------------------
---------------------
------------------
1.------------------
------------------
영․유아용이유식,
------------------
------------------
-------:-------(현행과
같음)
5'-우리
딜산이
나트륨---------------------
---------------------
---------------------
---------
1.------------------
------------------
영․유아용이유식,
------------------
------------------
-------:-------
2.(현행과같음)(현행과
같음)
황산동---------------------
---------------------
---------------------
---------------------
---------------------
-----------------.
1.∼2.(현행과같음)
3.------------------
------------------
영․유아용이유식
4.∼6.(현행과같음)(현행과
같음)
황산아
연---------------------
-------------------.
1.(현행과같음)
2.------------------
------------------
영․유아용이유식
3.∼5.(현행과같음)(현행과
같음)
- 61 -현 행 개정(안)
주영양소 식품첨가물명 (영문명 )
철(Fe)구연산철(FerricCitrate)
구연산철암모늄
(FerricAmmoniumCitrate)
글루콘산철(FerrousGluconate)
인산철(FerricPhosphate)*
전해철(Iron,Electrolytic)나.혼합제제류
(생략)
다.조제유류 ,영아용 조제식 ,성장
기용 조제식 ,영․유아용 곡류
조제식 ,기타 영․유아 식,유단
백알레르기 영
유아용 조제식
품,영․유아용 특수조제식품
상기II.5.가.의사용기준에서
따로사용대상식품이정하여지
지아니한품목일지라도조제유
류,영아용조제식,성장기용조
제식,영․유아용곡류조제식,기
타영․유아식,유단백알레르기
영
유아용조제식품,영․유아용
특수조제식품(이하“조제유류
등”이라한다)에는다음각호의
식품첨가물에한하여사용하여
야한다.
(1)(생략)
주영양소 식품첨가물명 (영문명 )
철(Fe)구연산철(FerricCitrate)
구연산철암모늄
(FerricAmmoniumCitrate)
글루콘산철(FerrousGluconate)
인산철(FerricPhosphate)*
전해철(Iron,Electrolytic)나.혼합제제류
(현행과같음)
다.----------------------
--------- 영․유아용 이유
식,---------------------
------------------------
--------------
--------------------------
--------------------------
--------------------------
--------------------------
--영․유아용이유식,-------
--------------------------
--------------------------
--------------------------
--------------------------
------------------
(1)(현행과같음)- 62 -현 행 개정(안)
주영양소 식품첨가물명 (영문명 )
젖산철(FerrousLactate)
푸마르산제일철
(FerrousFumarate)
피로인산제이철
(FerricPyrophosphate)*
피로인산철나트륨
(SodiumFerricPyrophosphate)*
<신설>
환원철(Iron,Reduced)
황산제일철(FerrousSulfate)
식품첨가물명 (영문명 )사용기준
(희석하여
섭취하는제품에
있어서는희석한
것으로서
적용한다)
구아검∼변성전분(생락)
수산화칼륨
(PotassiumHydroxide)II.2.1)의규정에따라
사용하여야한다.
수산화칼슘
∼프로테아제(식물성)(생락)
헴철
(HemeIron)II.2.1)의규정에따라
사용하여야한다.(2)(생략)주영양소 식품첨가물명 (영문명 )
젖산철(FerrousLactate)
푸마르산제일철
(FerrousFumarate)
피로인산제이철
(FerricPyrophosphate)*
피로인산철나트륨
(SodiumFerricPyrophosphate)*
헴철(HemeIron)
환원철(Iron,Reduced)
황산제일철(FerrousSulfate)
식품첨가물명 (영문명 )사용기준
(희석하여
섭취하는제품에
있어서는희석한
것으로서
적용한다)
구아검∼변성전분(현행과같음)
수산화칼륨
(PotassiumHydroxide)최종식품완성전에중
화또는제거하여야한
다.
수산화칼슘
∼프로테아제(식물성)(현행과같음)
<삭제><삭제>(2)(현행과같음)
IV. 일반시험법
37.살균소독력시험법
분석원리:본시험방법은기구등
의살균소독제의살균소독력유무
를측정하는방법으로제1법인세IV. 일반시험법
37.살균소독력시험법
분석원리:본시험방법은기구등
의살균소독제의살균소독력유무
를측정하는방법으로세균현탁액
- 63 -현 행 개정(안)
균현탁액시험법과제2법인세균표
면시험법및제3법인포자현탁액시
험법이있으며,별도의규정이없는
한제1법인세균현탁액시험법으로
측정한다.
살균소독력의정의:기구등의살균
소독제에대하여규정된조건에서
규정된시험균의초기균수(cfu/mL)
에대한생균수(cfu/mL)감소율(%)
을말한다.
제1법세균현탁액시험법
본시험방법에는희석중화시험법
과막여과법이있다.희석중화시
험법은간섭물질이들어있는시
험균주현탁액을시험용액에첨가
하여20℃에서5분간반응시킨후
미리검증해둔적합한중화제를
즉시사용하여반응을억제시키고
각시료중의생균수를측정하여
생균수감소율을측정하는방법이
다.막여과법은중화제대신에여
과막을사용하여반응을억제시키
는방법으로적합한중화제가없
는경우사용할수있다.
또한,본시험을할때에는검증시험법,세균표면시험법,포자현탁
액시험법이있으며,별도의규정이
없는한세균현탁액시험법으로측
정한다.
살균소독력의정의:기구등의살
균소독제에대하여규정된조건에
서규정된시험균의초기균수
(cfu/mL)에대한생균수(cfu/mL)
감소율(%)을말한다.
가.세균현탁액시험법
1)시험용액의조제
시험용액은검체에표시된사
용농도보다1.25배높게경수
(바.시액①)로희석하여제조
한다.제조된시험용액은바로
사용하여야하며,최대2시간
을초과하여사용할수없다.
단,희석하지않고그대로사
용하는검체의경우에는원액
을그대로사용한다.
2)시험균주
다음의2가지시험균주를표준
균주로사용한다.
-EscherichiacoliATCC- 64 -현 행 개정(안)
시험을동시에수행하여야한다.
1)시험용액의조제
시험용액은검체일정량을취하
여경수를사용하여다음과같이
각각다른3가지농도로조제한
다.또한이들시험용액은시험
60분전에제조된것을사용하여
야한다.
-제1액:제품에표시된사용농
도보다1.25배높게희석한
액.단,원액을희석하지않고
그대로사용하는경우에는원
액을제1액으로한다.
-제2액및제3액:제1액을2배
및4배희석한액
2)시험균주
다음의2가지시험균주를표준균
주로사용한다.
-EscherichiacoliATCC10536
또는EscherichiacoliATCC
11229
-StaphylococcusaureusATCC
6538
다만,상기표준균주외에다음과
같은시험균주를선택하여추가
할수있다.10536또는Escherichia
coliATCC11229
-Staphylococcusaureus
ATCC6538
다만,상기표준균주외에다
음과같은시험균주를선택하
여추가할수있다.
-BacilluscereusATCC
21772
-Vibrioparahaemolyticus 
ATCC27969
-Salmonellactyphimurium
ATCC13311
-Listeriamonocytogenes
ATCC19111(또는
Listeriamonocytogenes
ATCC19115)
3)시험균주의배양
시험균주를TSA배지(마.배지
①)에도말하여36±1℃에서1
8～24시간배양한다.이를1차
배양이라하며,같은방법으로
2차배양을한다.시험에서는2
차배양된시험균주를사용한
다.다만,추가시험균주중V.
parahaemolyticus 의배양을위
- 65 -현 행 개정(안)
-BacilluscereusATCC21772
-VibrioparahaemolyticusATCC
27969
-SalmonellactyphimuriumATCC
13311
-ListeriamonocytogenesATCC
19111(또는Listeria
monocytogenesATCC19115)
3)시험균주의활성배양
시험균주를TSA배지에도말하여
36℃에서18～24시간배양한다.
같은방법으로2차배양을하고
다시3차배양을하며,2차배양
균또는3차배양균을활성배양
균으로한다.다만,추가시험균
주중V.parahaemolyticus 의활
성배양을위해서는염화나트륨이
2%가되도록조정한TSB배지
10mL에시험균10μL를접종하여
36℃에서18～24시간배양한다.1
차배양이완료되면2차배양및
3차배양은염화나트륨이2%가
되도록조정한TSB배지100mL
에한다.
4)시험균주현탁액의조제및
계수해서는염화나트륨이2%가되
도록조정한TSB배지10mL에
시험균10μL를접종하여36±
1℃에서18～24시간배양한다.
1차배양이완료되면2차배양
을염화나트륨이2%가되도록
조정한TSB배지100mL에한
다.
4)시험균주현탁액의조제및
계수
(1)조제
상기3)에따라2차배양된
시험균을백금이를사용하
여트립톤생리식염수(바.시
약②)10mL와유리비드
(라.기구및재료①)5g이
들어간100mL삼각플라스
크에옮긴다.이때시험균이
옮겨진백금이를트립톤생
리식염수에담그고삼각플
라스크의벽면에문질러완
전히균괘가떨어지도록한
다음3분간교반기(라.기구
및재료②)를이용하여잘
섞는다.이후유리비드안쪽
의현탁액을취하여다른- 66 -현 행 개정(안)
(1)조제:100mL삼각플라스크
에희석액(TSCS)10mL와유리
비드(직경3～4㎜)5g을넣고백
금이를사용하여E.coli활성배
양균을옮긴다.이때백금이를
희석액(TSCS)에담그고삼각플
라스크의벽면에문질러완전히
균괘가떨어지도록한다음3분
간진탕교반기를이용하여잘
섞은후유리비드안쪽의현탁
액을취하여다른시험관으로
옮긴다.희석액(TSCS)을사용하
여생균수를1.5～5×108cfu/mL로
조정하고20℃의항온수조에서2
시간방치한액을E.coli시험
균주현탁액으로한다.
따로S.aureus활성배양균을
상기시험조작과동일하게조작
하여S.aureus시험균주현탁
액을조제한다.다만,추가시험
균주중V.parahaemolyticus 의
경우에는상기3)의활성배양균
을멸균된50mL원심분리관에
넣고20℃,5000×g(6,000rpm)에
서5분간원심분리하여상등액
을조심스럽게버린후,잔류된시험관으로옮긴다.트립톤
생리식염수을사용하여생
균수를1.5×108～5.0×108
cfu/mL로조정하고20±1℃
의항온수조(라.기구및재
료③)에방치한후시험균
주현탁액으로사용한다.시
험균주현탁액은제조후2
시간이내에사용하여야한
다.
다만,추가시험균주중V.
parahaemolyticus 의경우에
는상기3)의배양균을멸균
된50mL원심분리관에넣
고원심분리기(라.기구및
재료④)20℃,5000×g
(6,000rpm)에서5분간원심
분리하여상등액을조심스
럽게버린후,잔류된균괘
에트립톤생리식염수25mL
를첨가하여10초간진탕교
반기를이용하여교반한다.
교반이완료되면다시원심
분리하여상등액을버린후,
트립톤생리식염수2mL를
첨가하여균괘를현탁시켜
- 67 -현 행 개정(안)
균괘에희석액(TSCS)25mL를
첨가하여10초간진탕교반기를
이용하여교반한다.교반이완료
되면다시원심분리하여상등액
을버린후,희석액(TSCS)2mL
를첨가하여균괘를현탁시켜
둔다.100mL삼각플라스크에희
석액(TSCS)10mL와유리비드
5g을넣고미리준비한균현탁
액을첨가하여3분간진탕교반기
를이용하여잘섞은후희석액
(TSCS)을사용하여생균수를
1.5～5×108cfu/mL가되도록조
정하고20℃의항온수조에서2
시간방치한액을시험균주현
탁액으로한다.
(2)계수:희석액(TSCS)을사
용하여E.coli시험균주현탁액
을10-6～10-7으로희석한후이
액1mL씩2매의페트리접시에
각각넣고45℃로유지한TSA
배지약15mL를무균적으로분
주하여냉각응고시킨후TSA
배지3～5mL를가하여중첩시
킨다.냉각응고된페트리접시를
거꾸로하여36℃에서24시간둔다.100mL삼각플라스크
에트립톤생리식염수10mL
와유리비드5g을넣고미
리준비한균현탁액을첨
가하여3분간진탕교반기를
이용하여잘섞은후트립
톤생리식염수를사용하여
생균수를 1.5～5×108
cfu/mL가되도록조정하고
20±1℃의항온수조에서2시
간방치한액을시험균주
현탁액으로한다.:100mL
삼각플라스크에희석액
(TSCS)10mL와유리비드
(직경3～4㎜)5g을넣고백
금이를사용하여E.coli활
성배양균을옮긴다.이때백
금이를희석액(TSCS)에담
그고삼각플라스크의벽면
에문질러완전히균괘가
떨어지도록한다음3분간
진탕교반기를이용하여잘
섞은후유리비드안쪽의
현탁액을취하여다른시험
관으로옮긴다.희석액
(TSCS)을사용하여생균수- 68 -현 행 개정(안)
배양한다.페트리접시에서집락
수를세고페트리접시를24시간
추가배양한다.잘분리된집락
이추가로보이지않을때,페트
리접시의최대집락수를세어
E.coli시험균주현탁액의생균
수(N)를다음계산식에따라산
정한다.
시험균주현탁액의
생균수*(cfu/mL)＝c
(n1+0.1n2)d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n1:첫번째희석에서계수된페트리접시의수
n2:두번째희석에서계수된페트리접시의수
d:첫번째희석액의희석배수
*생균수의계산은페트리접시
당15～300개의집락을생성
한페트리접시를택하여계
산한다.결과의신뢰성을위
하여적어도2개이상의페
트리접시를사용하여야한다.
만약2단계의희석배수에서
모두유효범위의결과가나오
면상기식에의하여생균수
를산정한다.단,한단계의
희석배수에서유효범위의결
과를얻었을경우생균수는
산술평균으로계산한다.계산를1.5～5×108cfu/mL로조
정하고20℃의항온수조에
서2시간방치한액을E.
coli시험균주현탁액으로
한다.
(2)계수
시험균주현탁액을트립톤
생리식염수를사용하여
10-6과10-7으로희석하고,
이희석액1mL씩을멸균
페트리접시(라.기구및재
료⑤)2매에각각넣고
45±1℃로유지한TSA배지
약15mL를무균적으로분
주하고잘혼합하여응고시
킨다.확산집락의발생을방
지하기위하여TSA배지
3～5mL를가하여중첩시킨
다.냉각응고된페트리접시
를거꾸로하여36±1℃에서
48±2시간배양한후다음의
계산식에따라시험균주현
탁액의생균수(N)를계수한
다.생균수의계산은15～
300개의집락을생성한페
트리접시를택하여계산한
- 69 -현 행 개정(안)
된결과는두자리유효숫자
를얻을때까지반올림한다.
마지막숫자가5미만인경우,
앞자리숫자는조정되지않는
다.마지막숫자가5이상인
경우,앞자리숫자에1을더
한다.마지막숫자가5일경
우는인접한자리수가홀수일
때는위로반올림하고,짝수
일경우는0으로처리한다.
두자리의유효숫자를얻을
때까지이과정을반복한다.
생균수는1.0과9.9사이의숫
자를10의배수로곱한방식
으로계산한다.
따로S.aureus시험균주현탁
액을상기시험조작과동일하게
조작하여S.aureus시험균주
현탁액의생균수를산정한다.이
때,각시험균주현탁액의생균
수는1.5×108cfu/mL～5×108
cfu/mL이어야한다.
5)시험균주현탁희석액의조제
및계수
(1)조제:E.coli의생균수가
6×102～3×103cfu/mL가되도록다.10-6과10-7의희석배수
에서모두유효범위의결과
가나오면다음의식에의
하여생균수를산정한다.하
지만,한단계의희석배수에
서만유효범위의결과를얻
었을경우에는산술평균하
고희석배수를곱하여계산
한다.계산된결과는두자
리유효숫자를얻을때까지
반올림하여1.0과9.9사이의
숫자를10의배수로곱한
방식(예,2.7×108cfu/mL)으
로표시한다.
시험균주현탁액의생균수(N,
cfu/mL)＝c
(n1+0.1n2)d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n1:10-6희석에서계수된페트리접시의수
n2:10-7희석에서계수된페트리접시의수
d:첫번째희석액의희석배수(10-6)
5)시험균주현탁희석액의조제
및계수
(1)조제
상기4)의시험균주현탁액
을트립톤생리식염수를사
용하여생균수가3.0×102～
1.6×103cfu/mL가되도록- 70 -현 행 개정(안)
E.coli시험균주현탁액을희석
액(TSCS)으로희석하여조제한
액을E.coli시험균주현탁희석
액으로한다.
따로S.aureus시험균주현탁액
을상기시험조작과동일하게조
작하여S.aureus현탁희석액을
조제한다.
(2)계수:E.coli시험균주현
탁희석액을희석액(TSCS)으로
10배희석하고이액1mL씩2
매의페트리접시에각각넣어
상기4)(2)와같이배양한다.
페트리접시에서최대집락수를
세고E.coli시험균주현탁희석
액의생균수(Nv)를다음계산
식에따라산정한다.
본시험및검증시험의
생균수*(cfu/mL)＝c
n×d×V
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
d:희석배수(희석중화시험법과 시험균주현탁
희석액의경우에는10-1)
V:샘플의부피(희석중화시험법과그검증시험
및시험균주현탁희석액의경우에는1.0mL,
막여과법과그검증시험의경우에는
0.1mL)
따로S.aureus현탁희석액을
상기시험조작과동일하게조희석하여조제한다.
(2)계수
시험균주현탁희석액을트
립톤생리식염수로10배희
석하고이희석액1mL씩을
멸균페트리접시2매에각
각넣어45±1℃로유지한
TSA배지약15mL를무균
적으로분주하여냉각응고
시킨후TSA배지3～5mL
를가하여중첩시킨다.냉각
응고된페트리접시를거꾸
로하여36±1℃에서48±2시
간배양한후생균수를계
수한다.시험균주현탁희석
액의생균수(Nv)는다음의
계산식에따라산정한다.이
때시험균주현탁희석액의
생균수는3.0×102～1.6×103
cfu/mL이어야한다.
시험균주현탁희석액의
생균수(Nv,cfu/mL)＝c
×10
n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
6)시험조작
시험용액,시험균주현탁액,
- 71 -현 행 개정(안)
작하여S.aureus시험균주현
탁희석액의생균수를산정한다.
이때,각시험균주현탁희석액
의생균수는6×102cfu/mL～
3×103cfu/mL이어야한다.
6)시험조작
시험용액,시험균주현탁액,시험
균주현탁희석액,시액및물등
은항온수조에서20℃로유지시킨
다.
(1)희석중화시험법
①본시험
시험관에간섭물질1mL및E.
coli시험균주현탁액1mL를첨
가하여즉시혼합하고20℃항온
수조에서2분간방치한후시험
용액(제1액)8mL를첨가하여혼
합한다음20℃항온수조에서5
분간반응시킨다.이반응혼합액
1mL를취하여중화제8mL와
물1mL가들어있는시험관에
넣고20℃항온수조에서5분간
중화시킨다.중화완료후중화
반응액1mL씩2매의페트리접
시에각각넣고상기4)(2)와
같이TSA배지를가하여배양시험균주현탁희석액,시액및
물등은항온수조에서20±1℃
로유지시킨다.
(1)본시험
시험관(라.기구및재료
⑥)에간섭물질1mL와시험
균주현탁액1mL를첨가하
여즉시혼합하고20±1℃의
항온수조에서2분간방치한
다.이후시험용액8mL를
첨가하여혼합하고20±1℃
의항온수조에서5분간반
응시킨다.이반응혼합액
1mL를취하여중화제8mL
와증류수1mL가들어있는
시험관에넣고20±1℃의항
온수조에서5분간중화시킨
다.이중화반응혼합액1mL
씩을멸균페트리접시2매
에각각넣고상기가.4)와
같이배양한다.본시험에서
의생균수(Na)를상기가.
5)(2)의계산식에따라산
정한다.
단,원액을사용하는검체는
시험용액을9.8mL첨가하- 72 -현 행 개정(안)
한다.페트리접시에서최대집락
수를세고시험용액의살균소독
작용에의한생균수(Na)를상기
5)(2)의계산식에따라산정한
다.
따로S.aureus시험균주현탁
액및나머지시험용액(제2액
및제3액)에대해서도상기시
험조작과동일하게조작하여시
험용액의살균소독작용에의한
생균수를산정한다.단,원액을
사용하는검체는시험용액(제1
액)을9.8mL첨가하고,간섭물질
및시험균주현탁액의농도를상
기사용한농도보다10배높게
조제하여각각0.1mL씩첨가하여
상기시험조작과동일하게조작
한다.
②검증시험
Ⓐ시험조건검증법
시험관에간섭물질1mL와E.
coli시험균주현탁희석액1mL
를넣고수초간혼합하여2
0℃항온수조에서2분간방치하
고경수8mL를첨가하여혼합
한후20℃항온수조에서5분간고,간섭물질과시험균주현
탁액의농도를상기사용한
농도보다10배높게조제하
여각각0.1mL씩첨가하여
상기시험조작과동일하게
조작한다.
(2)검증시험
검증시험에는시험조건검
증시험,중화제독성검증시
험및희석중화검증시험이
있으며,이들검증시험들은
상기본시험과같이수행해
야한다.
①시험조건검증시험
시험관에시험균주현탁희
석액1mL와간섭물질
1mL를첨가하여즉시혼
합하고20±1℃의항온수조
에서2분간방치한다.이후
경수8mL를첨가하여혼
합한후20±1℃의항온수
조에서5분간반응시킨다.
이반응혼합액에서1mL씩
을멸균페트리접시2매에
각각넣고상기가.4)(2)
와같이배양한다.시험조
- 73 -현 행 개정(안)
반응시킨다.이반응혼합액에서
1mL씩취하여2매의페트리접
시에각각넣고상기4)(2)와
같이배양한다.페트리접시의
최대집락수를세고시험조건
검증법에서의생균수(A)를상
기5)(2)의계산식에따라산
정한다.
따로S.aureus시험균주현탁
희석액에대해서도상기시험조
작과동일하게조작하여생균수
를산정한다.이때,각시험균
주의생균수는시험균주현탁희
석액생균수의0.05배수이상이
어야한다.
Ⓑ중화제독성검증법
시험관에중화제8mL,물1mL
및E.coli시험균주현탁희석
액1mL를넣고수초간혼합한
후20℃항온수조에서5분간반
응시킨다.이반응혼합액에서
1mL씩취하여2매의페트리접
시에각각넣고상기4)(2)와
같이TSA배지를가하여배양
한다.페트리접시의최대집락
수를세고중화제독성검증법건검증법에서의생균수
(A)를다음의계산식에따
라산정한다.이때,시험
조건검증시험의생균수
(A)는시험균주현탁희석
액(Nv)에서산정한생균수
의0.05배수이상이어야한
다.
시험조건검증시험의
생균수(A,cfu/mL)＝c
n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
②중화제독성검증시험
시험관에시험균주현탁희
석액1mL,중화제8mL및
증류수1mL를넣고즉시
혼합하고20±1℃의항온수
조에서5분간반응시킨다.
이반응혼합액에서1mL씩
을멸균페트리접시2매에
각각넣고상기4)(2)와
같이배양한다.중화제독
성검증시험의생균수(B)
는①시험조건검증시험
의계산식에따라산정한
다.이때,중화제독성검- 74 -현 행 개정(안)
의생균수(B)를상기5)(2)의
계산식에따라산정한다.
따로S.aureus시험균주현탁
희석액에대해서도상기시험조
작과동일하게조작하여생균수
를산정한다.이때,각시험균
주의생균수는시험균주현탁희
석액생균수의0.05배수이상이
어야한다.
Ⓒ희석중화검증법
시험관에간섭물질1mL,희석
액(TSCS)1mL및시험용액(제
1액)8mL를넣고수초간혼합
한후20℃항온수조에서5분간
반응시킨다.이반응혼합액
1mL를취하여중화제8mL가
담겨져있는시험관에옮긴후
20℃항온수조에서5분간반응
시킨다.이액에E.coli시험균
주현탁희석액1mL를첨가하여
혼합하고20℃항온수조에서30
분간반응시킨다.반응혼합액에
서1mL씩취하여2매의페트리
접시에각각넣고상기4)(2)
와같이TSA배지를가하여
배양한다.페트리접시의최대증시험에서의생균수(B)는
시험균주현탁희석액에서
산정한생균수(Nv)의0.05
배수이상이어야한다.
③희석중화검증시험
시험관에시험용액8mL,
간섭물질1mL및트립톤
생리식염수1mL를넣고
즉시혼합한후20±1℃의
항온수조에서5분간반응
시킨다.이반응혼합액
1mL를취하여중화제
8mL가담겨져있는시험
관에옮긴후20±1℃의항
온수조에서5분간반응시
킨다.이중화반응혼합액에
시험균주현탁희석액1mL
를첨가하여혼합하고
20±1℃의항온수조에서30
분간반응시킨다.이액
1mL씩을멸균페트리접시
2매에각각넣고상기가.
4)(2)와같이배양한다.희
석중화검증법의생균수
(C)는①시험조건검증시
험의계산식에따라산정
- 75 -현 행 개정(안)
집락수를세고희석중화검증법
의생균수(C)를상기5)(2)의
계산식에따라산정한다.
따로S.aureus시험균주현탁
희석액에대해서도상기시험조
작과동일하게조작하여생균수
를산정한다.이때,각시험균
주의생균수는중화제독성시험
법에서산정한생균수의0.5배
수이상이어야한다.
(2)막여과법
시험용액,시험균주현탁액,시
액및물등은항온수조에서2
0℃로유지시킨다.
①본시험
시험관에간섭물질1mL및E.
coli시험균주현탁액1mL를첨
가하여즉시혼합하고20℃항온
수조에서2분간방치한후시험
용액(제1액)8mL를첨가하여혼
합한다음20℃항온수조에서5
분간반응시킨다.이반응혼합액
0.1mL씩취하여세척액50mL씩
과함께2대의막여과장치에각
각옮기고즉시여과한다.여과
시간은1분을초과하지않도록한다.이때,희석중화검
증시험에서의생균수(C)는
중화제독성시험법에서 산
정한생균수(B)의0.5배수
이상이어야한다.
7)판정
다음계산식에따라시험균
의생균수감소율을각각계
산하여생균수감소율이
99.999%이상일때적합한것
으로본다.
생균수감소율(%)＝N-10Na
×100
N
N:시험균주현탁액의생균수(cfu/mL)
Na:시험용액의살균소독작용에의한생균수
*(cfu/mL)
*본시험에서계수된집락수가15
개이하인경우의생균수(Na)는
“1.5×102cfu/mL”를,계수된집
락수가300개이상인경우의생
균수(Na)는“3.0×103cfu/mL”를
각각적용한다.
나.세균표면시험법
본시험방법은간섭물질이들
어있는시험균주현탁액을스
테인리스스틸표면(담체)에
도말하여건조시킨후이막위- 76 -현 행 개정(안)
한다.각막여과장치에세척액
150～500mL씩첨가하여여과하
고추가로물50mL씩첨가하여
여과한다.여과막은여과한쪽을
위로향하게하여TSA배지표
면에밀착시켜36℃에서24시간
배양한다.이때,여과막과배지
표면사이에공기가들어가지
않도록주의한다.페트리접시에
서집락수를세고페트리접시를
24시간추가배양한다.잘분리
된집락이추가로보이지않을
때,페트리접시에서최대집락수
를세고시험용액의살균소독
작용에의한생균수(Na)를상기
5)(2)의계산식에따라산정한다.
따로S.aureus시험균주현탁
액및나머지시험용액(제2액
및제3액)에대해서도상기시
험조작과동일하게조작하여시
험용액의살균소독작용에의한
생균수를산정한다.단,원액을
사용하는검체는시험용액(제1
액)을9.8mL첨가하고,간섭물질
및시험균주현탁액의농도를
상기사용한농도보다10배높에시험용액을처리하여20±
1℃에서5분간반응시키고즉
시검증된중화제를사용하여
반응을억제시키는방법으로
각표면의생균수를측정하여
생균수감소율을측정하는방
법이다.다만,본시험을할때
에는시험용액대신트립톤생
리식염수를사용하여대조시험
을실시하고검증시험을동시
에수행하여야한다.
1)시험용액의조제
시험용액은검체에표시된
사용농도에맞게경수로희
석하여제조한다.제조된시
험용액은바로사용하여야
하며,최대2시간을초과하여
사용할수없다.단,희석하
지않고그대로사용하는검
체의경우에는원액을그대
로사용한다.
2)시험균주
가.2)의2가지시험균주를사
용한다.추가균주는사용하지
않는다.
3)시험균주의배양
- 77 -현 행 개정(안)
게조제하여각각0.1mL씩첨가
하여상기시험조작과동일하게
조작한다.
②검증시험
Ⓐ시험조건검증법
상기6)(2)①의E.coli시험
균주현탁액1mL대신에E.
coli시험균주현탁희석액1mL
를,시험용액(제1액)8mL대신
에경수8mL를,반응혼합액
0.1mL대신에반응혼합액1mL
를,세척액150～500mL대신
에물50mL를사용하여상기
시험과동일하게조작한다.각
페트리접시의최대집락수를
세고시험조건검증의생균수
(A)를상기5)(2)의계산식에
따라산정한다.
따로S.aureus시험균주현탁
희석액에대해서도상기시험
조작과동일하게조작하여시
험조건검증의생균수를산정
한다.이때,각시험균주의생
균수는시험균주현탁희석액
생균수의0.05배수이상이어야
한다.가.3)에따른다.
4)시험균주현탁액의조제및
계수
가.4)에따른다.
5)시험표면접종액의조제
시험관에시험균주현탁액
400μL와간섭물질100μL를
첨가하여1분간교반기를이
용하여잘섞은후20±1℃의
항온수조에서30분간방치한
액을시험표면접종액으로
한다.
6)시험표면의조제
시험표면접종액10μL를담
체(라.기구및재료⑦)중
앙에접종하여36±1℃로조
절된가열판위에서건조시
킨것을시험표면으로한다.
7)시험조작
시험용액,시액,기구등은
20±1℃로유지시킨다.담체와
유리병(라.기구및재료⑧)
은데시케이터(라.기구및
재료⑨)에건조하여준비한
다.
(1)본시험- 78 -현 행 개정(안)
Ⓑ여과과정검증법
E.coli시험균주현탁희석액
0.1mL씩취하여세척액50mL
씩과함께2대의막여과장치
에각각옮기고즉시여과한
다.각여과장치에물50mL씩
첨가하여여과한후여과지를
상기6)(2)①과같이배양한
다.페트리접시의최대집락
수를세고여과과정검증의
생균수(B)를상기5)(2)의계
산식에따라산정한다.
따로S.aureus시험균주현
탁희석액에대해서도상기시
험조작과동일하게조작하여
여과과정검증의생균수를산
정한다.이때,각시험균주의
생균수는시험균주현탁희석
액생균수의0.05배수이상이
어야한다.
Ⓒ여과방법검증법
시험관에간섭물질1mL,희석
액(TSCS)1mL및시험용액
(제1액)8mL를첨가하여혼합
한후20℃항온수조에서5분간
반응시킨다.이반응혼합물에시험표면을멸균된집게를
사용하여시험표면접종액의
건조된표면이위로향하게
하여유리병에조심스럽게
넣는다.유리병안의시험표
면중앙에시험용액50μL를
첨가하고20±1℃에서5분간
반응시킨후중화제9.95mL
와유리비드2～3g을첨가
하여교반기에서1분간혼합
하고막여과장치(라.기구
및재료)로여과한다.여
과할때트립톤생리식염수
100～150mL를2회또는3회
나누어세척한다.막여과장
치로부터여과막을분리하여
상기가.6)(2)①에따라
배양한다.상기실험과정을
준비된시험표면으로5회반
복한다.본시험의생균수
(Nd)를다음계산식에따라
산정한다.
본시험및검증시험의
생균수(cfu/carrier)＝c
n×d
- 79 -현 행 개정(안)
서0.1mL씩취하여세척액
50mL씩과함께2대의막여과
장치에각각옮겨여과하고물
150mL～500mL씩첨가하여여
과한다.각여과장치에세척액
50mL및E.coli시험균주현
탁희석액0.1mL씩첨가하여여
과한후물50mL를추가로가
하여여과한다음여과지를상
기6)(2)①과같이배양한다.
페트리접시의최대집락수를
세고여과방법검증의생균수
(C)를상기5)(2)의계산식에
따라산정한다.
따로S.aureus시험균주현탁
희석액에대해서도상기시험
조작과동일하게조작하여여
과방법검증의생균수를산정
한다.이때,각시험균주의생
균수는여과과정검증법에서
산정한생균수의0.5배수이상
이어야한다.
7)판정
각시험균과시험용액별로다음
계산식에따라생균수감소율을
각각계산하여제1액의생균수감c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
d:희석배수
따로트립톤생리식염수를
사용하여대조시험의생균
수(Nc)를산정한다.이때,
반응혼합액은트립톤생리식
염수로10-2,10-3및10-4으
로희석하여막여과장치로
여과하고시험표면반복횟
수는3회로한다.이때대조
시험의생균수는상기나.
7)(1)의계산식에따라산
정할때1.5×105cfu/carrier
이상이어야한다.
(2)검증시험
①중화검증시험
유리병에중화제9.95mL와
시험용액50μL를넣고혼
합하여20±1℃에서5분간
정치시킨후시험표면과
유리비드2～3g을첨가한
다.교반기에서1분간혼합
한후반응혼합액을10-3,
10-4및10-5으로희석하여
막여과장치로여과한다.여- 80 -현 행 개정(안)
소율이99.999%이상일때적합한
것으로본다.
생균수감소율(%)＝N-10Na×100
N
Na:시험용액의살균소독작용에의한
생균수*(cfu/mL)
*본시험에서계수된집락수가
15개이하인경우의생균수
(Na)는“1.5×102cfu/mL”를,
계수된집락수가300개이상인
경우의생균수(Na)는“3×103
cfu/mL”를각각적용한다.
제2법세균표면시험법
본시험방법은간섭물질이들어있
는시험균주현탁액을스테인리스
스틸표면에도말하여건조시킨후
이막위에시험용액을처리하여2
0℃에서5분간반응시키고즉시검
증된적합한중화제를사용하여반
응을억제시키는방법으로각표
면의생균수를측정하여생균수감
소율을측정하는방법이다.다만,
본시험을할때에는시험용액대
신희석액을사용하여대조시험을
실시하고검증시험을동시에수행과할때희석액100～
150mL를2회또는3회나
누어세척한다.막여과장치
로부터여과막을분리하여
상기가.6)(2)①에따라
배양한다.상기기술된실
험과정을따로준비한시
험표면으로2회반복한다.
중화검증시험의생균수
(A)를상기나.7)①의계
산식에따라산정한다.이
때중화검증시험의생균
수는1.5×105cfu/carrier이
상이어야한다.
②중화제독성검증시험
유리병에중화제9.95mL와
트립톤생리식염수50μL를
넣고혼합하여20±1℃에서
5분간정치시킨후시험표
면과유리비드2～3g을첨
가한다.교반기에서1분간
혼합한후반응혼합액을
10-3,10-4및10-5으로희석
하여막여과장치로여과한
다.여과할때희석액10
0～150mL를2회또는3회
- 81 -현 행 개정(안)
하여야한다.
1)시험용액의조제
시험용액은검체일정량을취하여
경수를사용하여다음과같이각
각다른3가지농도로조제한다.
또한이들시험용액은시험60분
전에제조된것을사용하여야한
다.
제1액:제품에표시된사용농도
로희석한액.단,원액을희석
하지않고그대로사용하는경
우에는원액을제1액으로한다.
제2액및제3액:제1액을2배
및4배희석한액
2)시험균주
제1법2)의2가지시험균주를표
준균주로사용하되,추가균주는사
용하지않는다.
3)시험균주의활성배양
제1법3)에따른다.
4)시험균주현탁액의조제및계수
제1법4)에따른다.
5)시험표면접종액의조제
소형시험관에E.coli시험균주현
탁액400μL와간섭물질100μL를
첨가하여1분간진탕교반기를이나누어세척한다.막여과장
치로부터여과막을분리하
여상기가.6)(2)①에따
라배양한다.상기기술된
실험과정을따로준비한
시험표면으로2회반복한
다.
중화제독성검증시험의
생균수(B)를상기나.7)
①의계산식에따라산정
한다.이때중화제독성검
증시험의생균수는중화
검증시험에서산정한생균
수의0.5배수이상～2배수
이하이어야한다.
8)판정
다음계산식에따라생균수
감소율이99.99%이상일때
적합한것으로본다.
생균수감소율(%)＝Nc-Nd×100
Nc
Nc:대조시험의생균수(cfu/carrier)
Nd:시험용액의살균소독작용에의한생균수
*(cfu/carrier)
*본시험에서계수된집락수가15
개이하인경우의생균수(Nd)는
“1.5×10cfu/carrier”를,계수된- 82 -현 행 개정(안)
용하여잘섞은후20℃항온수조
에서30분간방치한액을E.coli
시험표면접종액으로한다.
따로S.aureus시험균주현탁액
에대해서도상기시험조작과같
이S.aureus시험표면접종액을
조제한다.
6)시험표면의조제
E.coli시험표면접종액10μL를
담체(carrier,ø1㎝×0.07㎝스테인
리스스틸디스크ANSI3042B)
중앙에접종하여36℃로조절된
가열판위에서건조시킨것을E.
coli시험표면으로한다.따로S.
aureus시험표면접종액에대해서
도상기시험조작과같이S.
aureus시험표면을조제한다.
7)시험조작
시험용액,시액,기구등은20℃로
유지시킨다.담체와유리병은데
시케이터에건조하여준비한다.
①본시험
E.coli시험표면을멸균된집게
를사용하여E.coli시험표면접
종액의건조된표면이위로향하
게하여유리병(바닥지름2～3집락수가300개이상인경우의
생균수(Nd)는“3×102
cfu/carrier”를각각적용한다.
다.포자현탁액시험법
1)시험용액의조제
시험용액은검체에표시된
사용농도보다1.25배높게경
수로희석하여제조한다.제
조된시험용액은바로사용
하며,최대2시간을초과하여
사용할수없다.단,희석하
지않고그대로사용하는검
체의경우에는원액을그대
로사용한다.
2)시험균주
BacillussubtilisATCC
6633
3)포자용액의조제
시험균주를TGB배지(마.배
지②)에접종하고30±1℃에
서18～24시간배양한다.이
배양액2～3mL를MYA배지
(마.배지③)를넣어굳힌
배양병(라.기구및재료)
에접종하여30℃±1℃에서
- 83 -현 행 개정(안)
㎝,용량15～20mL)에조심스럽
게넣는다.유리병안의E.coli시
험표면중앙에시험용액(제1액)
50μL를첨가하고20℃에서5분간
반응시킨후중화제9.95mL와유
리비드2～3g을첨가하여진탕교
반기에서1분간혼합하고막여과
장치로여과한다.여과할때희석
액(TSCS)100～150mL를2회또
는3회나누어세척한다.막여과
장치로부터여과막을분리하여
제1법(2)①에따라배양한다.
상기실험과정을준비된E.coli
시험표면으로5회반복한다.각각
페트리접시의최대집락수를세
고시험용액의살균소독작용에
의한생균수(Nd)를다음계산식
에따라산정한다.
본시험및검증시험의
생균수(cfu/carrier)＝c
n×d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
d:희석배수
따로희석액(TSCS)을사용하여
대조시험의생균수(Nc)를산정한
다.이때,반응혼합액은희석액8～10일간배양한다.멸균한
유리비드와증류수를사용하
여포자를집균하고
10,000rpm에서20분간원심
분리한다.이후상층액을제
거한다음다시멸균증류수
에부유시켜세척하는과정
을4회반복하고잔사를멸
균증류수에부유시켜75±
1℃에서10분간가열하여포
자용액을조제한다.조제된
포자용액은냉장(5±1℃)보관
하여사용하되장기보관시에
는냉동보관한다.
4)포자현탁액의조제및계수
(1)조제
상기다.3)의포자용액을
멸균증류수를사용하여
1.5×106～5×106cfu/mL로
조정하고광학현미경(라.기
구및재료)을사용하여
영양세포가없는포자임을
확인하고,20±1℃의항온수
조에서방치한액을포자
현탁액으로한다.이액은
제조후2시간이내에사용- 84 -현 행 개정(안)
(TSCS)으로10-2,10-3및10-4으
로희석하여막여과장치로여과
하고시험표면반복횟수는3회로
한다.
S.aureus시험표면과나머지시
험용액(제2액및제3액)에대해서
도상기시험조작과동일하게조
작하여시험용액의살균소독작용
에의한생균수를산정한다.각
시험균의대조시험생균수는상
기식에따라산정할때1.5×105
cfu/carrier이상이어야한다.
②검증시험
Ⓐ중화검증법
유리병에중화제9.95mL와시험
용액(제1액)50μL를넣고혼합하
여20℃에서5분간정치시킨후
E.coli시험표면과유리비드
2～3g을첨가한다.진탕교반기에
서1분간혼합한후반응혼합액
을10-3,10-4및10-5으로희석하
여막여과장치로여과한다.여과
할때희석액100～150mL를2회
또는3회나누어세척한다.막여
과장치로부터여과막을분리하
여제1법(2)①에따라배양한하여야한다.
(2)계수
포자현탁액을멸균증류수
로10-4～10-5희석하고,
1mL씩을멸균패트리접시
2매에각각넣고45±1℃로
유지한GYA배지(마.배지
④)약15mL를무균적으로
분주하여냉각응고시킨후
GYA배지3～5mL를가하여
중첩시킨다.냉각응고된페
트리접시를거꾸로하여
30±1℃에서3일간배양한
후포자현탁액의포자수(N)
를산정한다.이때,포자현
탁액의포자수는1.5×106～
5×106cfu/mL이어야한다.
포자현탁액의
포자수(N,cfu/mL)＝c
(n1+0.1n2)d
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n1:첫번째희석에서계수된페트리접시의수
n2:두번째희석에서계수된페트리접시의수
d:첫번째희석액의희석배수
5)포자현탁희석액의조제및
계수
(1)조제
상기다.4)의포자현탁액
- 85 -현 행 개정(안)
다.상기기술된실험과정을따
로준비한E.coli시험표면으로
2회반복한다.각각페트리접시
의최대집락수를세고중화검
증법시험의생균수(B)를상기
7)①의계산식에따라산정한
다.
따로S.aureus시험표면에대해
서도상기시험조작과동일하게
조작하여중화검증법시험의생
균수를산정한다.각시험균주의
생균수는1.5×105cfu/carrier이상
이어야한다.
Ⓑ중화제독성검증법
상기7)②Ⓐ의시험용액(제1
액)대신희석액(TSCS)을사용
하여상기중화검증법에따라
시험한다.각각페트리접시의최
대집락수를세고중화제독성
검증법시험의생균수(A)를상
기7)①의계산식에따라산정
한다.
따로S.aureus시험표면에대해
서도상기시험조작과동일하게
조작하여중화제독성검증법시
험의생균수를산정한다.각시을포자의수가6×102～
3×103cfu/mL가되도록멸
균증류수로희석하여조제
한액을포자현탁희석액으
로한다.
(2)계수
포자현탁희석액을멸균증
류수로10배희석하고,1mL
씩취하여2매의멸균페트
리접시에각각넣고45±1℃
로유지한GYA배지를가하
여상기다.4)(2)와같이
배양한다.포자현탁희석액
의포자수(Nv)는다음의계
산식에따라산정한다.이
때,포자현탁희석액의포자
수(Nv)는6×102～3×103
cfu/mL이어야한다.
포자현탁액의
포자수(Nv,cfu/mL)＝c
×10
n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
6)시험조작
(1)본시험
시험관에간섭물질1mL와
포자현탁액1mL를첨가- 86 -현 행 개정(안)
험균주의생균수는중화검증법
에서산정한생균수의0.5배수
이상～2배수이하이어야한다.
8)판정
각시험균과시험용액별로다음계
산식에따라생균수감소율을각각
계산하여제1액의생균수감소율이
99.99%이상일때적합한것으로본
다.
생균수감소율(%)＝Nc-Nd×100
Nc
Nc:대조시험의생균수(cfu/carrier)
Nd:시험용액의살균소독작용에의한생균
수*(cfu/carrier)
*본시험에서계수된집락수가
15개이하인경우의생균수
(Nd)는“1.5×10cfu/carrier”
를,계수된집락수가300개이
상인경우의생균수(Nd)는
“3×102cfu/carrier”를각각적
용한다.
제3법포자현탁액시험법
본시험방법에는희석중화시험법
과막여과법이있다.희석중화시험
법은간섭물질이들어있는포자현하여즉시혼합하고20±
1℃의항온수조에서2분간
방치한후시험용액8mL
를첨가하여혼합한다음
20±1℃의항온수조에서60
분간반응시킨다.이반응
혼합액1mL를취하여중
화제8mL와멸균증류수
1mL가들어있는시험관에
넣고20±1℃의항온수조에
서5분간중화시킨다.이
중화반응혼합액1mL씩을
멸균페트리접시2매에각
각넣고상기다.4)(2)와
같이GYA배지를가하여
배양한다.본시험의포자수
(Na)를상기다.5)(2)의
계산식에따라산정한다.
단,원액을사용하는검체
는시험용액을9.8mL첨가
하고,간섭물질및포자현
탁액의농도를상기사용
한농도보다10배높게조
제하여각각0.1mL씩첨가
하여상기시험조작과동
일하게조작한다.
- 87 -현 행 개정(안)
탁액을시험용액에첨가하여20℃
에서60분간반응시킨후미리검
증해둔적합한중화제를즉시사
용하여반응을억제시키고각시료
중의포자수를측정하여그감소율
을측정하는방법이다.막여과법은
중화제대신에여과막을사용하여
반응을억제시키는방법으로적합
한중화제가없는경우사용할수
있다.
또한,본시험을할때에는검증시
험을동시에수행하여야한다.
1)시험용액의조제
시험용액은검체일정량을취하
여경수를사용하여다음과같이
각각다른3가지농도로조제한
다.또한이들시험용액은시험60
분전에제조된것을사용하여야
한다.
제1액:제품에표시된사용농
도보다1.25배높게희석한액.
단,원액을희석하지않고그대
로사용하는경우에는원액을제
1액으로한다.
제2액및제3액:제1액을2배
및4배희석한액(2)검증시험
검증시험에는시험조건검
증시험,중화제독성검증
시험및희석중화검증시
험이있으며,이들검증시
험들은상기본시험과같
이수행해야한다.
①시험조건검증시험
시험관에간섭물질1mL와
포자현탁희석액1mL를
첨가하여즉시혼합하고
20±1℃의항온수조에서2
분간방치하고경수8mL
를첨가하여혼합한후
20±1℃의항온수조에서60
분간반응시킨다.이반응
혼합액에서1mL씩을멸균
페트리접시2매에각각넣
고상기다.4)(2)와같이
GYA배지를가하여배양한
다.시험조건검증시험에서
의포자수(A)를다음의계
산식에따라산정한다.이
때,시험조건검증시험의
포자수(A)는포자현탁희
석액포자수(Nv)의0.05배- 88 -현 행 개정(안)
2)시험균주
BacillussubtilisATCC6633을
사용한다.
3)포자용액의조제
약106개의포자를보통배지에접
종하고30℃에서18～24시간배양
한다.이배양액2～3mL를황산
망간첨가한천배지를넣어굳힌
배양병(Rouxbottle)에접종하여
30℃에서14일간배양한다.멸균
유리구슬과물로집균하여
10,000rpm에서20분간원심분리하
고상층액을제거한다음다시물
에부유시켜세척하는과정을3회
반복하고잔사를물에부유시켜
75℃에서10분간가열한다.이포
자용액은냉장보관하여사용하되
장기보관시에는냉동보관한다.
4)포자현탁액의조제및계수
(1)조제:포자액을물을사용하
여1.5～5×106cfu/mL로조정하
고20℃항온수조에서방치한액
을포자현탁액으로한다.이액은
제조후2시간이내에사용하여
야한다.
(2)계수:물을사용하여포자현수이상이어야한다.
시험조건검증시험의
포자수(A,cfu/mL)＝c
n
c:페트리접시에서계수된집락수의합
n:계수된페트리접시의수
②중화제독성검증시험
시험관에중화제8mL,물
1mL및포자현탁희석액
1mL를넣고수초간혼합
한후20±1℃의항온수조
에서5분간반응시킨다.이
반응혼합액에서1mL씩을
멸균페트리접시2매에각
각넣고상기다.4)(2)와
같이GYA배지를가하여
배양한다.중화제독성검
증법의포자수(B)를상기
다.6)(2)①시험조건검
증시험의계산식에따라
산정한다.이때,중화제
독성검증시험의포자수
(B)는포자현탁희석액포
자수(Nv)의0.05배수이상
이어야한다.
③희석중화검증시험
시험관에간섭물질1mL,
- 89 -현 행 개정(안)
탁액을10-4～10-5으로희석한후
이액1mL씩2매의페트리접시
에각각넣고45℃로유지한보
통한천배지를가하여제1법4)
(2)에따라배양하고포자현탁액
의포자수(N)를산정한다.이때,
포자현탁액의포자수는1.5～
5×106cfu/mL이어야한다.
5)포자현탁희석액의조제및계수
(1)조제:포자의수가6×102～
3×103cfu/mL가되도록포자현
탁액을물로희석하여조제한액
을포자현탁희석액으로한다.
(2)계수:포자현탁희석액을물
로10배희석하고이액1mL씩
취하여2매의페트리접시에각각
넣고45℃로유지한보통한천배
지를가하여제1법4)(2)와같이
배양한다.페트리접시에서최대
집락수를세고포자현탁희석액의
포자수(Nv)를제1법5)(2)의계
산식에따라산정한다.이때,포
자현탁희석액의포자수는6×102
cfu/mL～3×103cfu/mL이어야한
다.
6)시험조작물1mL및시험용액8mL
를넣고수초간혼합한
후20±1℃의항온수조에서
60분간반응시킨다.이반
응혼합액1mL를취하여
중화제8mL가담겨져있
는시험관에옮긴후20±
1℃의항온수조에서5분간
반응시킨다.이중화반응혼
합액에포자현탁희석액
1mL를첨가하여혼합하고
20±1℃의항온수조에서30
분간반응킨후1mL씩취
하여2매의멸균페트리접
시에각각넣고상기다.
4)(2)와같이GYA배지를
가하여배양한다.희석중화
검증법의포자수(C)를다.
6)(2)①시험조건검증시
험의계산식에따라산정
한다.이때,희석중화검
증시험의포자수(C)는포
자현탁희석액포자수(Nv)
의0.05배수이상이어야한
다.
7)판정- 90 -현 행 개정(안)
다음의접촉온도(θ)및접촉시간
(t)을사용한다.
-접촉온도(θ):20℃
-접촉시간(t):60분
다만,상기조건외에다음과같은
조건을선택하여추가할수있다.
-접촉온도(θ):4℃,10℃,40℃
또는75℃등
-접촉시간(t):5분,15분또는
30분등
시험전모든시약은다음의온도
에서유지되어야한다.
-접촉온도(θ)가40℃이하인경
우:시험용액,포자현탁액,간
섭물질은항온수조에서 θ℃로,
중화제및물은20℃로유지시
킨다.
-접촉온도(θ)가40℃를초과하
는경우:시험용액은θ℃로,
중화제,포자현탁액,간섭물질,
물은20℃로유지시킨다.
(1)희석중화시험법
①본시험
시험관에간섭물질1mL및포
자현탁액1mL를첨가하여즉시
혼합하고θ℃항온수조에서2분다음계산식에따라포자수
감소율(%)을계산하여포자
수감소율이99.9%이상일때
적합한것으로본다.
포자수감소율(%)＝N-10Na×100
N
N:포자현탁액의포자수(cfu/mL)
Na:본시험의포자수*(cfu/mL)
*본시험에서계수된집락수가15
개이하인경우의생균수(Na)는
“1.5×102cfu/mL”를,계수된집
락수가300개이상인경우의생
균수(Nd)는“3.0×103cfu/mL”를
각각적용한다.
라.기구 및재료
①유리비드(glassbead,직경
3～4mm)
②교반기(Stirrer),기계식교반
기(Mixer)
③항온수조(WaterBath,자동
온도조절기능함유,20±1℃)
④원심분리기(Centrifuger)
⑤페트리접시(Petridish)
⑥시험관(TestTube,
18×170mm등)
⑦담체(carrier,ø1cm×0.07cm스
- 91 -현 행 개정(안)
간방치한후시험용액(제1액)
8mL를첨가하여혼합한다음
θ℃항온수조에서t분간반응시
킨다.이반응혼합액1mL를취
하여중화제8mL와물1mL가
들어있는시험관에넣고20℃항
온수조에서5분간중화시킨다.
중화완료후중화반응액1mL씩
2매의페트리접시에각각넣고
보통한천배지를가하여제1법4)
(2)와같이배양한다.페트리접
시에서최대집락수를세고시
험용액의멸균작용에의한포
자수(Na)를제1법5)(2)의계산
식에따라산정한다.
따로나머지시험용액(제2액및
제3액)에대해서도상기시험조
작과동일하게조작하여시험용
액의멸균작용에의한포자수
를산정한다.단,원액을사용하
는검체는시험용액(제1액)을
9.8mL첨가하고,간섭물질및
포자현탁액의농도를상기사
용한농도보다10배높게조제
하여각각0.1mL씩첨가하여상
기시험조작과동일하게조작한테인리스스틸디스크ANSI
3042B)
⑧유리병(바닥지름2～3cm,
용량15～20mL)
⑨데시케이터(Desicator)
막여과장치(여과막지름:4
7～50mmporesize:0.45㎛,
최소50mL의용액을담을
수있어야함,진공사용시
균일한여과율로세척액
100mL가20～40초사이에
여과될수있도록설계된장
치사용)
배양병(Rouxbottle,500mL)
광학현미경(Opticalmicroscope)
무균대(Cleanbench)
고압멸균기(Autoclave)
건조기(DryOven)
배양기(Incubator,36±1℃와
30±1℃)
냉동및냉장고(-70℃Freezer
포함)
초순수제조장치(UltraPure
WaterSystem)
집락계산기(ColonyCounter)
수소이온농도측정기(pHmeter)- 92 -현 행 개정(안)
다.
②검증시험
Ⓐ시험조건검증법
시험관에간섭물질1mL와포자
현탁희석액1mL를넣고수초
간혼합하여θ℃항온수조에서2
분간방치하고경수8mL를첨
가하여혼합한후θ℃항온수조
에서t분간반응시킨다.이반응
혼합액에서1mL씩취하여2매
의페트리접시에각각넣고제1
법4)(2)와같이배양한다.페
트리접시의최대집락수를세고
시험조건검증법에서의포자수
(A)를제1법5)(2)의계산식에
따라산정한다.이때,포자수는
포자현탁희석액포자수의0.05배
수이상이어야한다.
Ⓑ중화제독성검증법
시험관에중화제8mL,물1mL
및포자현탁희석액1mL를넣고
수초간혼합한후20℃항온수조
에서5분간반응시킨다.이반응
혼합액에서1mL씩취하여2매의
페트리접시에각각넣고제1법
4)(2)와같이보통한천배지를피펫(1mL,5mL,10mL등)
슬라이드/커버글라스
알콜램프,백금이,백금선등
마.배지
본실험을위한배지조제시
이미상품화된배지의사용이
가능하며,사용할각제조사별
조제법을따를수있다.
①TSA배지(TryptoneSoya
Agar)
Tryptone,pancreaticdigestofcasein15.0g
Soyapeptone,papaicdigestofsoybeanmeal5.0g
NaCl 5.0g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL
에녹여pH7.2±0.2로조정
한후121℃에서15분간멸
균한다.
②TGB배지(TryptoneGlucose
Broth)
YeastExtract 2.5g
Tryptone 5.0g
Glucose 1.0g
- 93 -현 행 개정(안)
가하여배양한다.페트리접시의
최대집락수를세고중화제독성
검증법의포자수(B)를제1법5)
(2)의계산식에따라산정한다.
이때,포자수는포자현탁희석액
포자수의0.05배수이상이어야
한다.
Ⓒ희석중화검증법
시험관에간섭물질1mL,물
1mL및시험용액(제1액)8mL를
넣고수초간혼합한후θ℃항온
수조에서t분간반응시킨다.이
반응혼합액1mL를취하여중화
제8mL가담겨져있는시험관에
옮긴후20℃항온수조에서5분간
반응시킨다.이액에포자현탁희
석액1mL를첨가하여혼합하고
20℃항온수조에서30분간반응시
킨다.반응혼합액에서1mL씩취
하여2매의페트리접시에각각
넣고제1법4)(2)와같이보통한
천배지를가하여배양한다.페트
리접시의최대집락수를세고희
석중화검증법의포자수(C)를상
기제1법5)(2)의계산식에따라
산정한다.이때,포자수는중화위의성분을증류수1,000mL
에녹여pH7.2±0.2로조정
한후121℃에서15분간멸
균한다.
③MYA배지(YeastExtractAgar)
MeatExtract 10.0g
YeastExtract 2.0g
MnSO4·H2O 0.04g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL
에녹여pH7.0±0.2로조정
한후121℃에서15분간멸
균한다.
④GYA배지(GlucoseYeast
ExtractAgar)
AminoAcids,acidhydrolysisofcasein1.0g
SolubleStarch 1.0g
Glucose 2.5g
YeastExtract 2.5g
FeSO4 0.1g
MnSO4·H2O 0.0001g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL
에녹여pH6.8±0.2로조정- 94 -현 행 개정(안)
제독성시험법에서 산정한포자
수의0.5배수이상이어야한다.
(2)막여과법
①본시험
시험관에간섭물질1mL및포
자현탁액1mL를첨가하여즉시
혼합하고θ℃항온수조에서2분
간방치한후시험용액(제1액)
8mL를첨가하여혼합한다음
θ℃항온수조에서t분간반응시
킨다.이반응혼합액0.1mL씩
취하여세척액50mL씩과함께
2대의막여과장치에각각옮기
고즉시여과한다.여과시간은
1분을초과하지않도록한다.
각막여과장치에세척액150～
500mL씩첨가하여여과하고추
가로물50mL씩첨가하여여과
한다.여과막은여과한쪽을위
로향하게하여보통한천배지
표면에밀착시켜36℃에서24시
간배양한다.이때,여과막과
배지표면사이에공기가들어
가지않도록주의한다.페트리
접시에서집락수를세고페트리
접시를24시간추가배양한다.한후121℃에서15분간멸
균한다.
바.시액
①트립톤생리식염수(Tryptone
SodiumChlorideSolution)
Tryptone,pancreaticdigestofcasein1.0g
NaCl 8.5g
위의성분을증류수1,000mL
에녹여pH7.2±0.2로조정
한후121℃에서15분간멸
균한다.
②경수(Hardwater)
-용액A:19.84g의염화마
그네슘(MgCl2)과46.24g의
염화칼슘(CaCl2)을증류수
에용해하여1L로맞춘다.
이용액은냉장보관하여최
대1개월간사용할수있
다.
-용액B:35.02g의탄산수소
나트륨(NaHCO3)을증류수
로용해하여1,000mL로맞
춘다.이용액은냉장보관
하여최대1주일간사용할
- 95 -현 행 개정(안)
잘분리된집락이추가로보이
지않을때,페트리접시에서최
대집락수를세고시험용액의
멸균작용에의한포자수(Na)를
제1법5)(2)의계산식에따라
산정한다.단,원액을사용하는
검체는시험용액(제1액)을
9.8mL첨가하고,간섭물질및
포자현탁액의농도를상기사용
한농도보다10배높게조제하
여각각0.1mL씩첨가하여상
기시험조작과동일하게조작한
다.
②검증시험
Ⓐ시험조건검증법
상기6)(2)①의포자현탁액
1mL대신에포자현탁희석액
1mL를,시험용액(제1액)8mL
대신에경수8mL를,반응혼합
액0.1mL대신에반응혼합액
1mL를,세척액150～500mL대
신에물50mL를사용하여상기
시험과동일하게조작한다.각
페트리접시의최대집락수를
세고시험조건검증의포자수
(A)를제1법5)(2)의계산식에수있다.
1,000mL의메스플라스크에
용액A3.0mL를넣고최소
600mL의증류수를가해주
고,용액B8.0mL를가해준
후증류수를가하여
1,000mL로한다.용액의pH
를7.0±0.2로조정하고여과
멸균한다.이혼합용액은
12시간이내에사용하여야
한다.
③간섭물질(Interferingsubstance)
0.3g의알부민(bovinealbumin
fractionV)을증류수100mL
에녹이고여과멸균한다.본
간섭물질이시험용액과반응
하여침전이발생할경우에
는적절한다른간섭물질을
사용하여실험할수있으며,
이때사용한간섭물질은본
간섭물질과동일한간섭효과
를가져야한다.
④중화제(Neutralizer)- 96 -현 행 개정(안)
따라산정한다.이때,포자수는
포자현탁희석액포자수의0.05
배수이상이어야한다.
Ⓑ여과과정검증법
포자현탁희석액0.1mL씩취하여
세척액50mL씩과함께2대의
막여과장치에각각옮기고즉시
여과한다.각여과장치에물
50mL씩첨가하여여과한후여
과지를제1법6)(2)①과같이
배양한다.페트리접시의최대집
락수를세고여과과정검증의
포자수(B)를제1법5)(2)의계
산식에따라산정한다.이때,
포자수는포자현탁희석액포자
수의0.05배수이상이어야한다.
Ⓒ여과방법검증법
시험관에간섭물질1mL,물
1mL및시험용액(제1액)8mL를
첨가하여혼합한후θ℃항온수
조에서t분간반응시킨다.이반
응혼합물에서0.1mL씩취하여
세척액50mL씩과함께2대의
막여과장치에각각옮겨여과하
고물150mL～500mL씩첨가하
여여과한다.각여과장치에세레시틴(lecithin) 3g
폴리소르베이트80(polysorbate80)30g
치오설페이트염(sodiumthiosulfate)5g
히스티딘(L-histidine)1g
사포닌(saponine) 30g
위의성분을트립톤생리식
염수를가하여1,000mL로
하고pH7.2±0.2로조정한
후121℃에서15분간멸균
한다.본중화제이외에검
증시험에서유효성이검증
된다른중화제를사용할
수도있다.
- 97 -현 행 개정(안)
척액50mL및포자현탁희석액
0.1mL씩첨가하여여과한후물
50mL를추가로가하여여과한
다음여과지를제1법6)(2)①
과같이배양한다.페트리접시의
최대집락수를세고여과방법
검증의포자수(C)를제1법5)
(2)의계산식에따라산정한다.
이때,포자수는여과과정검증
법에서산정한포자수의0.5배수
이상이어야한다.
7)판정
시험용액별로다음계산식에따라
포자수감소율을각각계산하여제
1액의포자수감소율이99.9%이상
일때적합한것으로본다.
포자수감소율(%)＝N-10Na×100
N
Na:시험용액의멸균작용에의한포자
수*(cfu/mL)
*본시험에서계수된집락수가
15개이하인경우의생균수
(Na)는“1.5×102cfu/mL”를,
계수된집락수가300개이상인
경우의생균수(Na)는“3×103
cfu/mL”를각각적용한다.- 98 -현 행 개정(안)
장 치
막여과장치:최소한50mL의
용액을담을수있어야하고적
합한여과막(지름:47～50㎜,
poresize:0.45㎛)을사용하여
야한다.진공을사용하는경우
균일한여과율을보여미생물이
여과막전면에균일하게분포될
수있어야하며지나치게장시
간여과를하지않도록세척액
100mL가20～40초사이에여과될
수있도록설계되어야한다.
배 지
1)TSA배지(TryptoneSoya
Agar)
Tryptone,pancreaticdigestof
casein 15.0g
Soyapeptone,papaicdigestof
soybeanmeal 5.0g
NaCl 5.0g
Agar 15.0g
위의성분을증류수1,000mL에
녹여pH7.2로조정한후121℃
에서15분간멸균한다.
- 99 -현 행 개정(안)
2)TSB배지(TryptoneSoya
Broth)
Tryptone,pancreaticdigestof
casein 15.0g
Soyapeptone,papaicdigestof
soybeanmeal 5.0g
NaCl 5.0g
위의성분을증류수1,000mL에
녹여pH7.2로조정한후121℃
에서15분간멸균한다.
3)보통배지(NutrientBroth)
Peptone 10.0g
BeefExtract 3.0g
위의성분을증류수1,000mL에
녹여pH7.2로조정한후121℃
에서15분간멸균한다.
4)보통한천배지(NutrientAgar)
보통배지1,000mL에정제한천
15.0g을가하여가열용해하고
증류수양을보정한다.pH6.8
로조정한후121℃에서15분간
멸균한다.
5)황산망간첨가 한천배지
(AmendedNutrientAgar)
보통한천배지에 황산망간(MnSO
4․H2O)을5㎍/mL가되도록가
하고121℃에서15분간멸균한다.- 100 -현 행 개정(안)
시 액
1)멸균인산완충용액
무수인산이수소칼륨 34g을증류
수500mL에용해하고1N수산화
나트륨175mL를가해pH7.2로
조정하고여기에증류수를가하
여1,000mL로하여인산완충액으
로한다.이것을121℃에서20분
간멸균한후이액1mL를멸균
증류수800mL에가하여희석한
액을멸균인산완충용액으로한다.
2)물
유해한물질이나미생물의성장
을방해하는물질이없어야한다.
증류된물을사용하되탈염된물
을사용하여서는안된다.121℃
에서15분간멸균한다.
3)희석액(TSCS)
TryptoneSodiumChloride
Solution:
Tryptone,pancreaticdigestof
casein 1.0g
NaCl 8.5g
위의성분을증류수1,000mL에녹
여pH7.2로조정한후121℃에
- 101 -현 행 개정(안)
서15분간멸균한다.
4)중화제
다음의중화제중에서적절한것
을선택하여멸균된것을사용하
고검증시험에서유효성이검증
되어야한다.
(1)기본중화혼합제
레시틴(lecithin) 3g
폴리소르베이트80(polysorbate80)30g
치오설페이트염(sodiumthiosulfate)
5g
히스티딘(L-histidine)1g
사포닌(saponine)30g
위의성분을1%멸균인산완충
용액또는희석액을가하여
1,000mL로한다.
(2)멸균인산완충용액
인산이수소칼륨(KH2PO4)34g을
물500mL에용해하고1N수산
화나트륨액을이용하여pH7.2
로조정한다음이액에물을
가하여1,000mL로한다.
(3)5%또는0.5%(V/V)난황
용액
살균된난황액(난황에동량의
멸균생리식염수를가한것)을- 102 -현 행 개정(안)
10mL또는1mL에물을첨가하
여100mL로한다.
(4)3%(V/V)폴리소르베이트80,
4g/L라우릴설페이트염(sodium
laurylsulfate)과3g/L레시틴을
함유한용액
(5)5%(V/V)난황과4%(V/V)
폴리소르베이트80를함유한용
액
(6)7%(V/V)ethyleneoxide
condensateoffattyalcohol,
20g/L레시틴과4%(V/V)폴리
소르베이트80을함유한용액
(7)4%(V/V)ethyleneoxide
condensateoffattyalcohol와
4g/L레시틴을함유한용액
(8)3%(V/V)폴리소르베이트80,
3g/L레시틴과1g/L히스티딘을
함유한용액
(9)글라이신(glycine)
(10)3%(V/V)폴리소르베이트
80과3g/L레시틴을함유한용
액
(11)50㎎/mL인지질유화제와
4g/L레시틴을함유한용액
(12)0.05g/L또는0.5g/L치오
- 103 -현 행 개정(안)
글리콜레이트염용액
(13)0.8g/L또는1.5g/L시스테
인용액
(14)0.5g/L치오설페이트염용액
상기에서열거한중화제이외에
적절한다른중화제를사용할수
있다.
5)세척액
세척액은멸균된것을사용하고
막을통하여여과될수있어야
한다.다음의세척액중한가지를
사용할수있다.
(1)물
(2)희석액(TSCS)
(3)0.1%(V/V)폴리소르베이트
80용액
(4)0.5%(V/V)폴리소르베이트
80용액
(5)0.5%(V/V)폴리소르베이트
80과레시틴(0.7g/L)을함유한
용액
(6)중화제
(7)멸균인산완충용액
상기에서열거한용액이외에
적절한다른용액을사용할수
있다.- 104 -현 행 개정(안)
6)경수
검체의희석에사용되는경수는
다음과같이조제한다.
-용액A:19.84g의무수염화
마그네슘과46.24g의무수염화칼
슘을물에용해하여1L로맞춘
다.
-용액B:35.02g의탄산수소나
트륨을물로용해하여1,000mL로
맞춘다.
1,000mL의메스플라스크에용액
A3.0mL를넣고최소600mL의
물을가해주고,용액B8.0mL를
가해준후물을가하여1,000mL
로한다.용액의pH를7.0으로조
정하고최대poresize가0.45㎛
이하인여과막에통과시켜제균
한다.용액은4～8℃에서최대1
개월간보관할수있다.
7)세균현탁액시험법또는포자현
탁액시험법의간섭물질
간섭물질로는알부민용액(청정조
건또는오염조건)을사용하여야
하나간섭물질이시험용액과반응
하여침전이발생할경우다음의
적절한간섭물질을선택하여실험
- 105 -현 행 개정(안)
할수있다.
(1)알부민용액(Bovinealbumin
solutions)
시험에사용되는알부민용액의
조제는다음과같다.
-청정조건을위한조제
0.3g의알부민(Dubosmedium
을위한CohnfractionV)을
물100mL에녹이고막여과를
통하여제균한다.
-오염조건을위한조제
3g의알부민(Dubosmedium
을위한CohnfractionV)을
물100mL에녹여서막여과를
통하여제균한다.
(2)우유
항생제나어떠한첨가제도들어
있지않은분말우유100g을물
1l로용해한후10%(V/V)용액
으로제조하여105℃에서30분
(또는121℃에서5분)간멸균한
다.
(3)효모추출물
미생물용건조효모추출물을물
에100g/L이되도록용해하고,
NaOH를이용하여pH를7.0±0.2- 106 -현 행 개정(안)
로조정한후121℃에서15분간
멸균한다.
(4)서당
서당을물에100g/L이되도록용
해하고여과막을이용하여제균
한다.
(5)pH5와pH9의완충용액
(6)라우릴설페이트염(Sodium
laurylsulfate)
라우릴설페이트염을물에50g/L
이되도록용해하고121℃에서
15분간멸균한다.
8)세균표면시험법의간섭물질
실제사용조건을반영하기위하여
사용되는간섭물질은알부민용액
과트립톤용액을혼합하여제조한
것으로다음의제조방법에따라
제조하여보관한다.
-알부민용액:멸균인산완충용액
10mL에알부민0.3g을첨가하
고여과제균한다.
-트립톤용액:멸균인산완충용액
10mL에트팁톤0.1g을첨가하
고여과제균한다.
각여과제균한용액을사용하기
직전에50μL씩동량혼합하고2
- 107 -현 행 개정(안)
0℃에보관한다.