1 
 EK-1 
 
 
NUMUNE ALMA METOTLARI  
   
1. GENEL HÜKÜMLER  
 
Yemin resmi kontrolü amacıyla alınacak numuneler aşağıda tarif edilen metotlara göre alınmalıdır. Bu şekilde 
alınan numunelerin, numune alınan kısımları temsil ettiği kabul edilir.  
Temsili numune alınmasının amacı bir partiden küçük bir kısım elde etmek, bunu yaparken de bu kısmın 
özelliğinin partinin söz konusu özelliği bakımından ortalama değere sahip olmasına dikkat etmektir. Partinin 
içerisinden numune alınması partideki farklı noktalardan tekrarlı biçimde birincil numune alınması yoluyla olur. 
Söz konusu birincil numune, temsili bölme yoluyla temsili nihai numunelerin hazırlanacağı toplu bir paçal 
numune oluşturmak üzere karı ştırılarak bir araya getirilir.  
Görsel muayene yoluyla, yemin numune alınacak kısımları nitelik bakımından aynı partideki yemin geri 
kalanından farklılık gösteriyorsa, söz konusu kısımlar yemin geri kalanından ayrılmalı ve ayrı bir alt parti olarak 
değerle ndirilmelidir. Yemin farklı alt partilere ayrılmasının mümkün olmadığı durumda, yem tek bir parti olarak 
değerlendirilmek suretiyle yemden numune alınmalıdır. Bu tür durumlarda, numune alma raporunda bu husus 
belirtilmelidir.  
Bu Yönetmelik hükümleriyle uyu mlu olarak alınan bir yem numunesi , aynı sınıf veya tanımdaki bir yem 
partisinin kısmı ise ve bu numunenin ulusal mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı yönünde değerlendirme 
yapılırsa, söz konusu partideki tüm yemin aynı şekilde etkilendiği varsayılır. Pa rtinin geri kalan kısmının ulusal 
mevzuat gerekliliklerine uyumlu olduğunun detaylı bir değerlendirmeyle ortaya koyulması durumunda 
yukarıdaki varsayım geçerli olmaz.  
Numune, mühür kırılmadan veya uzaklaştırılmadan numuneye erişimi önleyecek şekilde mühürl enmelidir. 
Numunenin mührü açıkça belirlenebilir ve görülebilir olmalıdır. Numune geri dönüşümsüz zarar görmeden 
açılamayacak şekilde kapatılmış bir kap içerisine yerleştirilebilir.  
Numunenin tanımlanması: Numune kalıcı bir şekilde işaretlenmeli ve numune  alma tutanağı ile açıkça bağlantılı 
olarak tanımlanmalıdır.  
Yem işletmelerinde yapılan resmi kontrollerde  kontrol görevlisi tarafından  üç takım numune alınır. Birinci 
takım numunenin muayene ve analizi Bakanlıkça belirlenen laboratuvarda yapılır. İkinci  takım olan şahit 
numune Bakanlık il/ilçe müdürlüğünde muhafaza edilir. Üçüncü takım numune ise işletmeciye bırakılır. 
Mikrobiyolojik incelemeler ve ürün miktarının şahit numunenin analizinin yapılabilmesi için yetersiz olduğu 
durumlarda bir takım numune a lınır.  
 
2.  NUMUNE ALMA ARAÇLARI  
2.1.  Numune alma aracı numune alınacak ürünleri kontamine etmeyecek maddelerden yapılmış olmalıdır. 
Numune alma araçları birden fazla kullanılması gerekiyorsa ise çapraz kontaminasyonun önlenmesi amacıyla 
temizliği kolay olmalıdır.  
2.2.  Katı yemden numune alınması için önerilen araçlar  
2.2.1 .  Manuel numune alma  
2.2.1.1.   Dikey kenarlı düz tabanlı kürek  
2.2.1.2.   Uzun ayrık veya bölümlere sahip numune alma sondası: Numune alma sondasının boyutları numune 
alınan kısmın özellikleri (konteynır derinliği, çuval boyutları, vb.) ve yemin parçacık büyüklüğüne uygun 
olmalıdır.  2 
 Numune alma sondasının birden fazla deliğinin olması durumunda, numune sondası boyunca farklı konumlardan 
alınmasını sağlamak için, delikler bölümlerle a yrılmalı veya sıralı kademeli delikler mevcut bulunmalıdır.  
2.2.2.   Mekanik numune alma  
Akış halindeki yemden numune alınması amacıyla uygun mekanik araçlar kullanılabilir. Burada uygun araçlarla 
ifade edilmek istenen, akış halindeki yemin tümünü temsil ed ecek numune alınması için gerekli araçlardır.  
Hareket halindeki yemden (yüksek akış oranına sahip) numune alınması otomatik numune alma araçlarıyla 
gerçekleştirilebilir.  
2.2.3. Bölme aracı  
Mümkün ve uygun olduğu hallerde, numuneyi yaklaşık olarak eşit parç alara bölme amacıyla tasarlanan 
araçlardır. Azaltılan numunelerin hazırlanması amacıyla kullanılabilir.  
3. BİRİNCİL NUMUNE SAYISINA İLİŞKİN MİKTAR GEREKLİLİKLERİ  
3.1 ve 3.2.’de birincil numune sayısına ilişkin miktar gereklilikleri, maksimum 500 tona kadar  ve temsili numune 
alınmasının  mümkün olacağı büyüklükteki kısımlar için geçerlidir. Tanımlanan numune alma prosedürü, 
belirlenen ve numune alınan maksimum kısım büyüklüğünden daha büyük miktarlar için de geçerlidir. Bunun 
koşulları; aşağıdaki tablolarda belirtilen maksimum birincil numune sayılarının dikkate alınmaması, birincil 
numune sayısının prosedürün uygun kısmında verilen karekök formülüyle belirlenmesi (bkz. 3.3) ve minimum 
Paçal  numune büyüklüğünün oransal olarak artmasıdır. Bu durum büyük bir partinin daha küçük alt partilere 
bölünmesini ve her alt partiden 3.1 ve 3.2.’de tarif edilen prosedüre uygun olarak numune alınmasını önlemez.  
Numune alınan kısmın büyüklüğü, söz konusu kı smın her alt kısmından numune alınabilmesine uygun olmalıdır.  
Çok büyük parti veya alt partiler için (500 ton ’dan büyük) veya bu bölümün 3.1 ve 3.2’sinde belirtilen numune 
alma prosedürüyle uyumlu olarak numunenin alınmasının mümkün olmadığı şekilde taşın an veya saklanan 
partiler için 3.3’te belirtilen numune alma prosedürü uygulanır.  
Yem işletmecisinin mevzuat uyarınca zorunlu bir izleme sistemi kapsamında çerçevesinde bu Yönetmelikle 
uyumlu olarak numune alması gerektiğinde, yem işletmecisinin numune alm a prosedürünün denkliği yanında 
numunenin bütünü temsil edebilme düzeyini yetkili makama ispatlamasından ve yetkili makamın onay 
vermesinden sonra, işlem özelliklerini dikkate almak amacıyla bu bölümdeki miktar gerekliliklerinden sapabilir.  
Kontrol görevli since, p artide oluşacak kabul edilemez ticari hasar dolayısıyla miktar gerekliliklerine ilişkin 
numune alma metodlarının yürütülmesinin mümkün olmadığı istisnai durumlarda (ambalajlama biçimi, taşıma 
araçları, saklama şekli, vb.), mümkün olduğunca temsili olmak ve tam anlamıyla tarif edilmek ve 
belgelendirilmek koşuluyla alternatif bir numune alma metodu uygulanabilir.  
3.1.  Yem içerisinde homojen dağılım gösteren maddelerin veya ürünlerin kontrolü için alınacak birincil 
numuneler hakkında miktar gereklilik leri 
3.1.1.   Dökme katı yem  
 
Numune alınan kısmın büyüklüğü  Alınacak en az birincil numune sayısı  
≤ 2,5 ton  7 
> 2,5 ton  Numune alınan parti miktarının (ton) 20 katının karekökü 
alınarak elde edilen sayı kadar .(*)  
En fazla 40 birincil numune alınır.  
* Elde edilen sayı kesirliyse en yakın üst tam sayıya yuvarlanır.  3 
  
 
 
3.1.2.   Dökme sıvı yem  
 
Numune alınan kısmın büyüklüğü  Alınacak en az birincil numune sayısı  
≤ 2,5 ton veya ≤ 2500 litre  4 (*)  
> 2,5 ton veya > 2500 litre  7 (*)  
(*) Sıvının homojen hale getirilmesinin mümkün olmadığı durumda birincil numune sayısı arttırılmalıdır . 
3.1.3.   Ambalajlı yem   
 
Yem (sıvı ve katı), tabloda birim olarak bahsedilen torba, çuval, teneke, fıçı, vb. içerisinde saklanabilir. Büyük 
birimlerden (≥ 500 kg veya litre) 3.1.1 ve 3.1.2 deki ambalajsız yem için öngörülen hükümlere uygun olarak 
numune alınmalıdır.  
Numune alınan kısmın büyüklüğü  Birincil numune alınması gereken paketlerin minimum sayısı (*)  
1 ila 20 paket  1 Paketten(**)  
21 ila 150 paket  3 Paketten  (**) 
151 ila 400 paket  5 Paketten  (**) 
> 400 paket  Numune alınan partideki paket sayısının karekökünün dörtte biri 
kadar. (*) (***)  
En fazla 40 paketten birincil numune alınır.  
(*) Bir paketin (ör. bozulabilir yaş yemler) açılmasının analizi etkileyebileceği durumlarda açılmayan paket birincil numune olarak kabul 
edilir.  
(**) Miktarı 1 kg veya 1 litreyi geçmeyen paketler için bir orijinal paket miktarı birincil numune olarak kabul edilir.  
(***) Elde edilen sayı kesirliyse en yakın üst tamsayıya yuvarlanır.  
3.1.4. Blok yem ve mineral yalama taşları  
25 üniteden oluşan her parti için bir blok veya bir yalama taşı alınır. En çok dört blok veya yalama taşı alınır. 
Her biri 1 kg’dan az olan blok veya yalama taşları için, bir blok veya bir yalama taşı ağırlığı birinci l numune 
kabul edilir.  
3.1.5.   Kaba yem  
Numune alınan kısmın büyüklüğü  Alınacak en az birincil numune sayısı (*)  
≤ 5 ton  5 
> 5 ton  Numune alınan parti miktarının (ton) 5 katının karekökü alınarak elde 
edilen sayı kadar . (**)  
En fazla 40 birincil numune  alınır.  
 (*) Bazı yemlerden (ör. silajlar), partiye kabul edilemez bir zarar vermeksizin birincil numunelerin alması mümkün olmayabili r. Bu 
durumlarda alternatif numune alma metotları uygulanabilir ve bu tür partilerden numune almak için bir kılavuz hazı rlanabilir.  
(**)Elde edilen sayı kesirliyse en yakın üst tamsayıya yuvarlanır.  4 
 3.2. Yemde içerisinde homojen dağılım göstermeyen bileşen veya maddelerin kontrolüne ilişkin birincil 
numuneler hakkında miktar gereklilikleri  
Birincil numunelere ilişkin miktar  gereklilikleri aşağıdaki durumlarda uygulanır:  
- Yem maddelerinde  aflatoksinler , çavdarmahmuzu, diğer mikotoksinler ve zararlı botanik bulaşıklıkların 
kontrolü;  
- GDO’lu materyaller de dahil olmak üzere, bir bileşen veya maddenin yem maddesinde homojen dağılım 
göstermeyen şekilde çapraz kontaminasyonun kontrolü.  
Kontrol yetkilisinin karma yemdeki bir bileşen veya maddeyle çapraz kontaminasyon durumunda da homojen 
dağılım görülmediğine dair güçlü bir şüphesi varsa, aşağıdaki tabloda verilen miktar gerekli likleri uygulanabilir.  
 
Numune alınan kısmın 
büyüklüğü  Alınacak en az birincil numune sayısı  
< 80 ton  3.1’deki miktar gerekliliklerine bakınız. Alınacak birincil numune sayısı 2,5 
ile çarpılmalıdır.  
≥ 80 ton  100 
 
3.3.  Çok büyük partiler için birincil numunelere ilişkin miktar gereklilikleri  
Numune alınan büyük parti için (numune alınan parti > 500 ton), alınması gereken birincil numune sayısı;  
- Yem içerisinde homojen dağılım gösteren maddelerin veya ürünlerin kontrolü için alınacak birincil 
numune sayıs ı= Numune alınan parti miktarının karekökü alınarak elde edilen sayıya 40 eklenir  
- Yem içerisinde homojen dağılım göstermeyen bileşen veya maddelerin kontrolü için alınacak birincil 
numune sayısı= Numune alınan parti miktarının karekökü alınarak elde edile n sayıya 100 eklenir  
 
4. PAÇAL NUMUNELERDE MİKTAR GEREKLİLİKLERİ  
Numune alınan kısım başına tek bir paçal numune gereklidir.  
 Yemin türü  En az paçal numune miktarı(*),(**)  
4.1. Dökme yem  4 kg 
4.2. Ambalajlı yem  4 kg (***)  
4.3. Sıvı veya yarı sıvı yem  4 lt 
4.4. Blok yem veya mineral yalama taşları  
4.4.1.  1 kg’den fazla olan her yem  4 kg 
4.4.2.  1 kg’den fazla olmayan her yem  Dört blok yem veya yalama taşı ağırlığı  
4.5. Kaba yem  4 kg (****)  
(*) Numune alınan yemin yüksek değerli olması halinde, numune  alma raporunda tanımlanmak ve belgelenmek koşuluyla paçal numune 
daha düşük bir miktarda alınabilir.  
(**) Genetiği değiştirilmiş materyalin varlığının kontrolü için alınacak olan paçal numune en a z 35 000 tohum/dane içermelidir. Buna göre, 
mısır için paça l numune büyüklüğü en az 10,5 kg  soya için ise 7 kg olmalıdır. Arpa, darı, yulaf, pirinç çavdar, buğday ve keten tohumu gibi 
diğer tohum ve daneler için 4 kg’lık paçal numune büyüklüğü 35 000’den daha fazla daneye karşılık gelmektedir.  
(***) Ambalajlı yemd e tekli birimlerin büyüklüğüne bağlı olarak paçal  numune için 4 kg’lık büyüklüğe ulaşmak mümkün olmayabilir.  
(****) Düşük özgül ağırlığa sahip kaba yeme (ör. sap, saman) ilişkin olarak  paçal  numune en az 1 kg büyüklüğe sahip olmalıdır.  5 
 5. NİHAİ NUMUNELERE İLİŞKİN MİKTAR GEREKLİLİKLERİ  
5.1.  Nihai numuneler  
En az bir nihai numunenin analizi gereklidir. Analiz için nihai numunedeki miktar aşağıdakilerden daha az 
olamaz:  
Katı yem  500 g (*) (**) (***)  
Sıvı veya yarı sıvı yem  500 ml (*)  
(*) Genetiği değiştirilmiş materyalin varlığının kontrolü için alınacak numune en az 10 000 tohum/dane içermelidir. Buna göre , mısır için 
nihai numune büyüklüğü en az 3 000 g, soya için ise 2 000 g olmalıdır. Arpa, darı, yulaf, pirinç, çavdar, buğday ve ke ten tohumu gibi diğer 
tohum ve daneler için 500 g’lık nihai numune büyüklüğü 10 000’den fazla daneye karşılık gelmektedir.  
(**) Paçal numunenin 4 kg veya litreden önemli derecede küçük olması halinde, numune alma raporunda tanımlanmak ve belgelenmek 
koşulu yla paçal  numuneden daha düşük bir miktarda alınabilir.  
(***) 15 Ağustos 2011 tarihli ve 28026 sayılı Resmi Gazete’de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Gıdalarda Pestisit Kalıntılarının Resmi 
Kontrolü İçin Numune Alma Tebliği hükümleriyle uyumlu olarak baklagil ler, tahıl daneleri ve ağaç yemişlerinden pestisit kalıntıları 
bakımından numune alınması durumunda, nihai numunenin asgari büyüklüğü 1 kg olacaktır.  
6.  ÇOK BÜYÜK PARTİLER VEYA PARTİ İÇERİSİNDE NUMUNE ALMANIN MÜMKÜN 
OLMAYACAĞI ŞEKİLDE DEPOLANAN VEYA TAŞINAN PARTİLER İÇİN NUMUNE ALMA 
METOT LARI 
6.1. Genel ilkeler  
Bir partinin taşınma veya saklanma biçimi partinin tümünde birincil numune alınmasına olanak sağlamazsa, bu 
tür partilerden numune alınması tercihen partinin akış halinde olduğu sırada yap ılmalıdır.  
Yemlerin depolanmasının amaçlandığı büyük depolarda, işletmeciler in  otomatik numune alma ekipmanın 
depoya kurulması yönünde teşvik edilmelidir. B u sayede saklanan partilerin tümünden (otomatik) numune 
alınmasına olanak sağlanabilir.  
Bu bölümde bahsedilen numune alma prosedürlerinin uygulanması halinde, işletmeci veya temsilcisi numune 
alma prosedürü hakkında bilgilendirilmelidir. Bu numune alma prosedürüne işletmeci veya temsilcisi tarafından 
itiraz edilmesi halinde, masrafları kendileri tarafın dan karşılanmak üzere söz konusu kişiler yetkili makamın tüm 
partiden numune almasına olanak sağlarlar.  
6.2.   Gemiyle taşınan büyük partiler  
6.2.1 Gemiyle taşınan büyük partilerden dinamik (hareket halinde) numune alınması  
Gemilerdeki büyük partilerden n umune alınması tercihen ürünün akış halinde olduğu sırada yapılmalıdır.  
Numune alma işlemi fiziksel olarak ayrılabilen her parti için yapılır. Numune alma işlemi ilk fiziksel ayrım 
kapsamında veya depolama tesislerine aktarımdan sonraki ayrım kapsamında y apılabilir. Fiziksel olarak 
ayrılabilen birimler birbiri ardına boşaltıldığı için depolama tesislerine aktarımdan sonra ilk fiziksel ayrım söz 
konusu olamaz.  
Bir geminin boşaltılması birkaç gün sürebilir. Normalde numune alma işleminin boşaltmanın tümü sır asında 
belirli aralıklarla yapılması gerekir. Ancak resmi bir kontrol görevlisinin tüm boşaltma işlemi boyunca numune 
almak için hazır bulunması mümkün veya uygun olmayabilir. Bu nedenle tüm partinin belirli bir kısmından 
(numune alınan kısım) numune alınm asına izin verilir. Birincil numunelerin sayısı numune alınan kısmın 
büyüklüğü dikkate alınarak belirlenir.  
Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune alındığında ve partinin söz konusu kısmının 
mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı  durumda, o partideki yemin tümü aynı şekilde değerlendirilir.  
Resmi numune otomatik olarak alınsa bile bir denetleyicinin hazır bulunması gereklidir. Bununla birlikte 
otomatik numune alma işleminin önceden belirlenmiş ve numune alma sırasında değiştirile meyen parametrelerle 6 
 yapılması ve birincil numunelerin kapalı bir kapta toplanarak olası bir sahteciliğin önüne geçilmesi söz konusu 
olduğu takdirde, bir denetleyicinin sadece numune alma süreci başında ve sonunda kaplar değiştirilirken hazır 
bulunması ger eklidir.  
6.2.2. Gemiyle taşınan partilerden statik numune alınması  
Numune alınmasının statik olarak yapılması durumunda yukarıdan erişimin mümkün olduğu depolar (silolar) 
için öngörülen prosedürün aynısı uygulanmalıdır (bkz. 6.4.1).  
Numune alma işleminin partinin/fiziksel olarak ayrılabilen biriminin erişilebilir kısmından (üst) yapılması 
gereklidir. Birincil numunelerin sayısı numune alınan kısmın büyüklüğü dikkate alınarak belirlenir. Aynı sınıf 
veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune alın dığında ve partinin söz konusu kısmının mevzuat 
gerekliliklerini karşılamadığı durumda, yemin tümü aynı şekilde değerlendirilir.  
6.3. Depolarda saklanan büyük partilerden numune alma  
Numune, partinin erişilebilir kısmından alınmalıdır. Birincil numunelerin  sayısı numune alınan kısmın 
büyüklüğü dikkate alınarak belirlenir. Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune 
alındığında ve partinin söz konusu bu kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı durumda, yemin tümü 
aynı şekilde değ erlendirilir  
6.4. Saklama tesislerinden (silolar) numune alma  
6.4.1. Yukarıdan kolayca erişilebilen silolardan numune alma  
Numune, partinin erişilebilir kısmından alınmalıdır. Birincil numunelerin sayısı numune alınan kısmın 
büyüklüğü dikkate alınarak beli rlenir. Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune 
alındığı ve partinin söz konusu bu kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı durumda, yemin tümü aynı 
şekilde değerlendirilir.  Bir seri, parti veya sevkiyattaki aynı sınıf veya  çeşit yemin bir bölümünün güvenilir 
olmadığının tespiti  durumunda,  geri kalanı  ile ilgili daha  kapsamlı   yapılan  değerlendirme sonucunda 
güvenilir olduğu ispat edilemez ise, o seri, parti veya sevkiyattaki aynı sınıf veya çeşidin tamamının güvenilir  
olmadığı kabul edilir.  
6.4.2. Yukarıdan erişilemeyen silolardan (kapalı silolar) numune alma  
6.4.2.1 Yukarıdan erişilemeyen (kapalı) silolar (> 100 ton)  
Silolarda saklanan yemlerden statik şekilde numune alınması mümkün değildir. Bu nedenle silodaki yemde n 
numune alınması gerektiği ve sevkiyatın hareket ettirilmesinin mümkün olmadığı durumda, silo boşaltılacağı 
zaman yemin akış halinde olduğu sırada numune alınmasının sağlanması için işletmecinin denetleyici 
bilgilendirmesi gerekir.  
6.4.2.2. Yukarıdan eriş ilemeyen (kapalı) silolar (< 100 ton)  
Numune  alma prosedürü 50 ila 100 kg’lı k miktarın bir kaba alınması ve buradan numune alınmasını kapsar. 
Paçal numune büyüklüğü tüm partiye karşılık gelir ve birincil numunelerin sayısı numune alınması amacıyla bir 
kaba  alınan silonun büyüklüğüyle ilişkilidir. Aynı sınıf veya tanımdaki bir yem partisinin bir kısmından numune 
alındığı ve partinin söz konusu bu kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığı durumda, yemin tümü aynı 
şekilde değerlendirilir. Partinin geri k alan kısmının mevzuat gerekliliklerini karşılamadığına ilişkin veri sunan 
detaylı bir değerlendirme olmaması halinde partinin geri kalan kısmı ayrı değerlendirilir.  
6.5. Büyük kapalı konteynırlardaki dökme yemlerden numune alma  
Bu tür partilerden genellikl e boşaltma işleminin ardından numune alınır. Belirli durumlarda ithalat veya kontrol 
noktasında boşaltma mümkün olmayabilir, bu nedenle numune alma işlemi söz konusu konteynırlar boşaltıldığı 
zaman yapılmalıdır.  7 
 7. NUMUNE ALINMASI, HAZIRLANMASI VE AMBALAJL ANMASINA İLİŞKİN TALİMATLAR  
7.1.  Genel Hükümler  
Numuneler gereksiz gecikmeye meydan vermeden alınmalı ve hazırlanmalıdır. Ayrıca ürünün değiştirilmesi 
veya kontamine olması söz konusu olmayacak şekilde gerekli önlem alınmalıdır. Araçlar ve yüzeyler ile 
numunelerin alınacağı kaplar temiz ve kuru olmalıdır.  
7.2.  Birincil numuneler  
Birincil numuneler numune alınacak kısmı n tamamını  temsil edecek şekilde rastgele alınmalı ve yaklaşık olarak 
aynı büyüklükte olmalıdır.   
Birincil numune büyüklüğü en az 100 gr veya düşük özgül ağırlığa sahip kaba yem için 25 gram olmalıdır.  
6 ncı  maddede belirtilen hükümler kapsamında 40 birincil numuneden daha az numune alınması gerektiğinde 
birincil numunelerin ağırlığı, alınacak paçal n umunenin ağırlığını belirleyen 4 üncü madde ile uyumlu olarak 
belirlenmelidir.  
Miktar gerekliliklerine göre sınırlı sayıda birincil numune alınması gerektiği zaman küçük ambalajlı yem 
partilerinden numune alınması durumunda birincil numunenin miktarı 1 kg veya 1 litreyi geçmeyen bir orijinal 
birim kadar olmalıdır.  
Küçük birimlerden (ör. <250 g) oluşan ambalajlı yemden numune alınması durumunda birincil numunenin 
büyüklüğü ambalajın büyüklüğüne bağlıdır.  
7.2.1.   Dökme yem  
Gerektiğinde numune alınan kısım ha reket ettirilmeden (yükleme veya boşaltma) numune alma işlemi 
yapılabilir.  
7.2.2.  Ambalajlı yem  
3 inci maddede belirtildiği üzere numune alma için gerekli sayıda paketin seçilmesinin ardından her bir paketin 
bir kısmı bir sonda veya kürek kullanılarak alı nabilir. Gerektiğinde numuneler paketlerin ayrı ayrı 
boşaltılmasından sonra alınabilir.  
7.2.3.  Homojen veya homojenize edilebilir sıvı veya yarı sıvı yem  
3 inci maddede belirtildiği üzere numune alma için yeterli sayıda paketin seçilmesinin ardından, içerikler 
karıştırılabilir ve her paketten bir miktar alınabilir.  
İçerikler boşaltıldıktan sonra birincil numuneler alınabilir.  
7.2.4.  Homojenize edilemeyen sıvı veya yarı sıvı yem  
3 üncü  maddede belirtildiği üzere numune alma için gerekli sayıda paketin seçilmesinin ardından numuneler 
farklı düzeylerden alınabilir.  
İçerikler boşaltılırken de numuneler alınabilir fakat bunların ilk kısımları atılır.  
Her iki durumda da alınması gereken toplam hacim 10 litreden az olmamalıdır.  
7.2.5. Blok yemler ve mineral yalama taşları  
3 üncü  maddede belirtildiği üzere, numune alma amacıyla gerekli sayıda blok veya yalama taşının seçilmesinin 
ardından her blok veya yalama taşından bir kısım alınabilir. Homojen olmayan bir blok veya yalama taşının 
bulunma ihtimaline karşı n umune olarak blok veya yalama taşının tümü alınabilir.  8 
 1 kg’da n büyük olmayan blok veya yalama taşları için birincil numune  bir blok veya yalama taşı içeriklerinden 
oluşur.  
7.3. Paçal numunelerin hazırlanması  
Birincil numuneler karıştırılarak tek bir paçal  numune hazırlanmalıdır.  
7.4. Nihai numunelerin hazırlanması  
Paçal numunedeki materyal dikkatle karıştırılmalıdır(1). 
- Her numune uygun bir konteynır/kap içerisine koyulmalıdır. Taşıma veya saklama sırasında numune 
bileşiminde oluşabilecek değişiklik veya k ontaminasyon ya da sahteciliğin önlenmesi amacıyla gereken 
tüm önlemler alınmalıdır.  
- Yemde homojen şekilde dağılmış bileşen veya maddelerin kontrolü amacıyla paçal numune tercihen bir 
mekanik ya da otomatik bölücü yoluyla en az 2,0 kg veya 2,0 litreye tems ili şekilde azaltılabilir 
(azaltılmış numune)(2 ). Baklagiller, tahıl daneleri ve ağaç yemişlerinde pestisit kalıntılarının kontrolü 
amacıyla azaltılmış numunenin asgari büyüklüğü 3 kg olmalıdır. Yemin yapısının bölücü kullanımına 
imkan sağlamaması veya bö lücünün mevcut olmaması durumunda, numune çeyrekleme metot larıyla 
azaltılabilir. Azaltılan numunelerle (Asıl, şahit ve firma numunesi olarak) yaklaşık olarak aynı miktarda 
ve 5 inci maddedeki miktar gerekliliklerine uygun olarak nihai numuneler alınır. Genetiği değiştirilmiş 
materyaller de dahil olmak üzere bileşenlerin kontrolü durumunda, Paçal  numune:  
- Tamamen homojenize edilir ve sonrasında nihai numunelere bölünür ya da  
- Mekanik  veya otomatik bir bölücü kullanılarak en az 2 kg veya 2 litreye(3) azaltılır. Sadece yemin 
yapısının bölücü kullanımına olanak sağlamadığı durumda, gerek duyulması halinde numune 
çeyrekleme meto duyla  azaltılabilir. Genetiği değiştirilmiş materyalin varlığ ının kontrolü amacıyla 
azaltılmış numune en az 10000 tohumun/dane içermelidir (4 üncü maddedeki dipnot (**) ve 7 nci 
madde deki dipnota (*) bakınız).  
7.5.  Numunelerin ambalajlanması  
Resmî kontroller için alınan numuneler, mühürlenir ve etiketlenir. Numunen in konulduğu kap veya ambalajın 
mühürleme işlemi, numune nin güvenliğini temin  etmek  amacıyla mühür bozulmadan paket açılamayacak şekilde 
yapılır.  
7.6.  Numunelerin laboratuvara gönderilmesi  
Numune analizi yapacak kişi için gerekli bilgilerle beraber tayin edilen analiz laboratuvarına gecikme olmaksızın 
gönderilmelidir.  
8. NUMUNE ALMA KAYDI  
Her bir numunenin kaydı tutulmalı, numune alınan her kısmın ve numune büyüklüğünün açıkça tanımlanmasına 
olanak sağlanmalıdır.  
Kayıtta aynı zamanda bu Yönetmelikte sunula n numune alma prosedüründen sapma varsa belirtilmelidir.  
Kayıt altına alınan numune resmi kontrol laboratuvarına gönderilir.  
 
 
 
                                                           
(1) Topaklanmış parçalar ezilir ve karıştırılır.  
(2) Düşük özgül ağırlığa sahip kaba yemler dışında . 
(3) Düşük özgül ağırlığa sahip kaba yemler dışında  9 
 EK-2 
YEM LERİN ANALİZ METOTLARINA İLİŞKİN GENEL HÜKÜMLER  
A. NUMUNELERİN ANALİZ İÇİN HAZIRLANMASI  
1.  Amaç  
Aşağıda belirtilen prosedürler E K-1’de belirtilen hükümlere uygun olarak yapılan numune alma işleminin 
ardından kontrol laboratuvarlarına gönderilen numunelerin analize hazırlanması amacıyla belirlenmiştir.  
Analize alınacak numuneler hazırlanırken tartılan miktarlar analiz m etotları kısmında belirtildiği üzere homojen 
ve nihai numuneleri temsil edecek şekilde hazırlanmalıdır.  
2.  Alınacak tedbirler  
İzlenecek numune hazırlama prosedürü, kullanılacak analiz metotlarına ve kontrol edilecek bileşen ve maddelere 
bağlıdır. Bu neden le aşağıdaki numune hazırlama prosedürü, kullanılan analiz metodu ve kontrol edilecek 
bileşen veya maddeler için uygun olmalıdır.  
Gerekli tüm işlemler, numunenin olası kontaminasyonunu ve numune bileşimindeki değişikliği mümkün 
olduğunca önleyecek şekilde yapılmalıdır. Öğütme, karıştırma ve elekten geçirme işlemleri numunenin hava ve 
ışığa en az düzeyde maruz kalmasına dikkat edilerek gecikme olmaksızın yapılmalıdır. Numune ısısını 
artırabilecek değirmen  ve öğütücüler kullanılmamalıdır.  
Isıya özellikle duya rlı olan yemler için manuel öğütme tavsiye edilmektedir. Bunun dışında kullanılan aparatın 
bir kontaminasyon kaynağı olmamasını sağlamak için özen gösterilmelidir.  
Hazırlama işlemi, numunenin nem düzeyinde önemli değişiklik olmaksızın gerçekleştirilemiyors a, hazırlık 
öncesi ve sonrasında EK-3’ün A Bölümünde belirtilen metoda göre nem düzeyi belirlenmelidir.  
3.  Prosedür  
3.1. Genel prosedür  
Numune, analiz için hazırlanırken uygun ayırma teknikleri kullanılarak analiz ve referans için yeterli alt 
numunelere b ölünür. Alt numunelere bölünürken konileme ve çeyrekleme metotları kullanılmaz.  
3.1.1. Ön işlemsiz öğütülebilen yemler  
Elenen numune karıştırılır, temiz, kuru, hava sızdırmayan uygun bir kaba alınır. Analiz yapılmak üzere numune 
alınacağı zaman, numune tar tılmadan hemen önce homojenizasyon sağlamak amacıyla tekrar karıştırılır.  
3.1.2.  Kurutmanın ardından öğütülebilen yemler  
Analiz metodunda farklı bir şekil belirtilmemişse numune, EK -3’ün A Bölümünün 4.3’ünde belirtilen metottaki 
ön kurutma işlemine uygun olarak, nem içeriği % 8 – 12 aralığına düşünceye kadar kurutulur. Bundan sonraki 
işlemler, 3.1.1’de belirtildiği şekilde yapılır.  
 
3.1.3.  Sıvı veya yarı sıvı yem  
Numune temiz, kuru ve hava sızdırmaya n uygun bir kaba alınır. Analiz yapılmak üzere numune alınacağı zaman, 
numune tartılmadan hemen önce homojenizasyon sağlamak amacıyla karıştırılır.  
 
 10 
 3.1.4.  Diğer yemler  
Yemlerin özelliğine göre, yukarıda belirtilen şekillerde hazırlanması mümkün olmayan  diğer yemlerin 
hazırlanmasında farklı metot lar uygulanabilir. Ancak, analiz için alınan miktar, homojen ve numuneyi temsil 
edecek şekilde olmalıdır.  
- Görsel inceleme veya mikroskopi yoluyla muayene ya da numunenin tümünün homojenize edildiği 
durumlara ilişkin prosedür . 
- Görsel incelemeyle muayene durumunda (mikroskop kullanmaksızın), muayene amacıyla laboratuvar 
numunesinin tümü kullanılır.  
- Mikroskopla muayene durumunda, laboratuvar numuneyi azaltabilir . 
-  Numunenin homojenize olduğu durumda, nihai numune  homojenize olan numuneden alınır.  
 
4.  Numunelerin saklanması  
Numuneler bileşenlerinin değişmeyeceği bir sıcaklıkta saklanmalıdır. Işığa özellikle duyarlı olan vitamin veya 
diğer maddelerin analizi için alınan numuneler, ışıktan olumsuz etkilenmeyecek koş ullarda saklanmalıdır.  
B.  ANALİZLERDE KULLANILAN REAKTİFLER VE APARATLARA İLİŞKİN HÜKÜMLER  
1.  Analiz metodunda farklı bir şekil belirtilmemişse, kullanılan kimyasalların analitik olarak saf olması gerekir. 
Eser miktardaki maddelerin analizinde kullanılan kimyasalların saflığı, kör test ile kontrol edilir. Elde edilen 
sonuçlara göre kimyasalların da ha da saflaştırılması gerekebilir.  
2.  Kullanılan solvent veya dilue ntin yapısı belirtilmeksizin analiz metotlarında belirtilen çözelti hazırlanması, 
seyreltme, durulama veya yıkamayı içeren herhangi bir işlem suyun kullanılmasını gerektirir. Genel bir ku ral 
olarak su demineralize veya distile olmalıdır. Analiz metotlarında belirtilen bazı durumlar dışında bu metot  özel 
saflaştırma prosedürlerine tabi olmalıdır.  
3.  Analiz metotlarında, kontrol laboratuvarlarında normal olarak bulunan ekipmandan, sadece ö zel olan veya 
özel bir kullanım gerektiren araç ve aparatlara atıf yapılmıştır. Özellikle küçük miktarlardaki maddelerin 
belirlenmesi gerektiği zaman bu araç ve aparatlar temiz olmalıdır.  
C.  ANALİZ METOTLARININ UYGULANMASI VE SONUÇLARIN İFADESİ NE İLİŞKİN 
HUSUSLAR  
1.  Ekstraksiyon prosedürü  
Ekstraksiyon işleminde değişik metotlar uygulanabilir. Genel bir kural olarak, metotta atıfta bulunulan prosedür 
dışındaki ekstraksiyon prosedürleri uygulanabilir. Bunun uygulanabilmesi için kullanılan ekstraksiyon 
prose dürünün analiz edilen matriks için metotta belirtilen prosedüre denk bir ekstraksiyon verimine sahip 
olduğunun ortaya konulması gerekir.  
2.  Temizleme prosedürü  
Temizleme prosedürü farklı metotlarla  yapılabilir. Genel bir kural olarak metotta atıfta bulunu lan prosedür 
dışındaki temizleme prosedürleri uygulanabilir. Bunun uygulanabilmesi için, kullanılan prosedürün analiz edilen 
matriks için metotta belirtilen prosedüre denk bir temizleme verimine sahip olduğu ortaya koyulmalıdır.  
3.Tespitlerin sayısı  
İstenm eyen maddeler yönünden analiz yapılıyorsa kalite prosedürlerine uyulmuş olması koşuluyla, çalışılan ilk 
örnekte belirlenen analiz sonucunda elde edilen değer, spesifikasyonda belirtilen değerin yarısından düşükse 
ikinci bir çalışmaya gerek yoktur. Diğer du rumlarda numunenin iç çapraz kontaminasyonu ya da kazara karışma 
olasılığını dışarıda bırakmak için çift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir. Ölçüm belirsizliği göz önüne alınarak 
söz konusu iki tespitin ortalaması, uyumun doğrulaması için kullanılır.  11 
 Bir maddenin içeriğinin veya beyan edilen değerin kontrolünde, kalite prosedürlerine uyulmuş olması koşuluyla, 
çalışılan ilk örnekte belirlenen analiz sonucu, beyan edilen değeri ve içeriği doğruluyor ve kabul edilebilir 
tolerans değerleri (aralığı) bulunuyo rsa ikin ci bir çalışmaya gerek yoktur. Diğer durumlarda numunenin iç çapraz 
kontaminasyonu ya da kazara karışma olasılığını dışarıda bırakmak için çift analiz (ikinci bir tespit) gereklidir. 
Ölçüm belirsizliği göz önüne alınarak söz konusu iki tespitin ort alaması, uyumun doğrulaması için kullanılır.  
Yemin bileşen değeri, etiketinde belirtilen bileşen değerinden farklı bulunduğunda ‘Yemlerin Piyasaya Arzı ve 
Kullanımı Hakkında Yönetmelik’ ve ‘Hayvan Beslemede Kullanılan Yem Katkı Maddeleri Hakkında 
Yönetmel ik’ ile belirlenen tolerans değerleri uygulanır.  
4.  Kullanılan analiz metodunun raporlaması  
Analiz raporunda kullanılan analiz metodu belirtilmelidir.  
5.  Analiz sonucunun raporlaması  
Analiz sonucu, analiz metodunda belirti len basamak sayısı kadar  anlamlı rakamlarla yazılır.  Eğer  gerekli ise 
numune  analize hazırlanmadan önce belirlenen nem içeriğine göre sonuçta düzeltme yapılır.  
6.  İstenmeyen maddelerin analizinde ölçüm belirsizliği ve geri kazanım oranı  
Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebli ğ kapsamındaki istenmeyen maddelerin yemlerde tespiti ve 
değerlendirilmesi, genişletilmiş ölçüm belirsizliği, geri kazanım ve %  12 nem düzeyi düzeltmesi hesaba katılarak 
yapılır. İstenmeyen maddelerin analiz sonucu belirlenen maksimum düzeyi aşıyorsa bu ye m uygun olmayan yem 
olarak değerlendirilir. Geri kazanım ve % 12 nem düzeltmesi yapılmış analiz sonucu genişletilmiş ölçüm 
belirsizliği ile raporlandırılır. Uygunluk değerlendirmesi genişletilmiş ölçüm belirsizliği düşülerek yapılır. Bu 
prosedür sadece ana liz metodunun  ölçüm belirsizliği ve geri kazanım düzeltmesi tahminine olanak sağladığı 
durumlarda geçerlidir. Bu şekildeki değerlendirme mikroskobik analizler için uygun olmadığından yapılmaz. 
Analiz sonucunun raporlanmasında ölçüm belirsizliği ve geri kaz anım oranı aşağıdaki şekilde belirtilir:  
a) Geri kazanım için yapılan düzeltmede, geri kazanım seviyesi belirlenir. Geri kazanım için yapılan düzeltme % 
90 ile % 110 arasında olduğu durumlarda gerekli değildir.  
b) ‘x +/ - U’ eşitliğinde, “x” analiz sonucunu, “U” genişletilmiş ölçüm belirsizliğini ifade eder. Yaklaşık % 95 
güven aralığı için, kapsam faktörü 2 kullanılır.  
Ancak kalite prosedürlerine uyulmuş olması koşuluyla, belirlenen analiz sonucu elde edilen değer, 
spesifikasyonda belirtilen değerin  yarısından düşükse, analiz sonuç raporunda ölçüm belirsizliği ve geri kazanım 
düzeltmesinin belirtilmesine gerek yoktur.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 12 
 EK-3 
YEM MADDELERİ VE KARMA YEMLERİN BİLEŞİMİNİN KONTROL ÜNE YÖNELİK  ANALİZ 
METOTLARI  
A.  NEM TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemdeki nem içeriğinin tayinini mümkün kılar. Yemin organik asitler gibi uçucu maddeler içermesi 
durumunda,  önemli miktarda uçucu maddenin de nem içeriği ile birlikte tayin edilir.  
Bu metot; yem maddeleri olarak kullanılan süt ürünlerinin analizini , mineral maddelerin ve çoğunlukla mineral 
maddelerden oluşan karışımların analizini, hayvansal ve bitkisel yağların analizini ya da yağlı tohumlar ve yağlı 
meyvelerin analizini kapsamaz.  
2.  Prensip  
Numune, yemin yapısına göre değişen, belirlenmiş koşulla r altında kurutulur. Ağırlıktaki kayıp tartılarak tayin 
edilir. Yüksek nem içeriğine sahip katı yem söz konusu olduğunda, birincil kurutma işlemi gereklidir.  
3.  Cihaz  
3.1. Nem absorbe etmeyen materyallerden üretilmiş, öğütme esnasında nem kaybına neden ol acak kadar 
ısınmayan  temizlenmesi kolay hızlı ve homojen ezme işlemine olanak tanıyan, dışarıdaki havayla teması 
olabildiğince önleyen ve 4.1.1. ile 4.1.2.’deki gereklilikleri karşılayan  ezici (örneğin çekiç ya da su soğutmalı 
mikro eziciler, katlanabilir konik değirmenler, yavaş hareket eden ya da dişli eziciler).  
3.2.  Analitik terazi, 1 mg hassaslığında.  
3.3.  Hava sızdırmaz kapaklı, çalışma yüzeyi, test numunesinin yaklaşık 0,3 g/cm2’ye yayılmasını sağlayan 
aşınmaz metal ya da camdan yapılmış kuru kaplar.  
3.4.  Uygun havalandır ma sistemi olan ve  hızlı sıcaklık düzenlemesi sağlayan elektrik ısıtmalı izotermal etüv.  (± 
2°C) (4) 
3.5.   Bir yağ pompası takılmış ve sıcak kurutulmuş havanın girişi için bir mekanizma ya da bir nem çekici 
madde (kalsiyum o ksit gibi) içeren ayarlanabilir elektrik ısıtmalı vakumlu etüv.  
3.6.   Kalın, delikli metal ya da porselen tablalı, uygun bir nem çekici içeren desikatör.  
4.  Metot  
Bu bölümde açıklanan işlemler numune paketleri açıldıktan hemen sonra gerçekleştirilmelidir. Analiz en az iki 
paralel olarak gerçekleştirilmelidir.  
 
4.1.  Hazırlama  
4.1.1.  4.1.2 ve 4.1.3 kapsamı dışındaki yemler  
En az 50 g numune alınır. Gerekiyorsa, nem içeriğinde herhangi bir değişimi  önleyecek şekilde ezilir ya da 
bölünü r. (bakınız 6)  
 
                                                           
(4) Tahıl ve ürünlerinin kurutulması için etüvün termal kapasitesinin 131°C’lik bir ön ayarda olması ve eş zamanlı kurutma için m aksimum 
sayıda test numunesi yerleştirildikten sonra en fazla 45 dakika içinde bu sıcaklığa ulaşacak şekild e olması gerekir. Alabildiği kadar buğday 
numunesi iki saat boyunca kurutulduğunda, dört saatlik kurutmaya göre sonuçlar arasındaki farkın en fazla %  0,15 olacağı şekilde 
havalandırma sağlanmalıdır.  13 
  
4.1.2. Tahıllar ve Ürünleri  
En az 50 g numune alınır. En az %  50’sinin 0,5 mm gözlü bir elekten geçeceği ve en fazla %  10’unun 1 mm 
yuvarlak gözlü elekte kalacağı şekilde öğütülür.  
4.1.3. Sıvı ya da ezme biçimindeki yüksek yoğunlukta yağ içeren  yemler  
Yaklaşık 25 g numune alınır, 10 mg hassasiyetle tartılır, tartılan numuneye uygun miktarda daha önce etüvde 
kurutulmuş kuvars kumu 10 mg hassasiyetle tartılır ve eklenir, homojen bir karışım elde edilene kadar 
karıştırılır.  
4.2.  Kurutma  
4.2.1.   4.2.2 ve 4.2.3 kapsamı dışındaki yemler  
Kapağı ile birlikte bir kap (3.3) 1 mg hassasiyetle tartılır. Tartılan kaba 1 mg hassasiyetle yaklaşık 5 g numune 
tartılır ve eşit olarak yayılır. Kap, kapağı açık olarak önceden 103°C’ye ısıtılmış etüve konulur . 
Etüv sıcaklığının aşırı düşmesini önlemek için kap olabildiğince hızlı yerleştirilir. Etüv sıcaklığının 103°C’ye 
ulaştığı saatten itibaren dört saat boyunca kurumaya bırakılır. Kapak kabın üstüne yerleştirilir, kap etüvden 
çıkartılır, desikatör (3.6) içi nde 30 -45 dakika soğumaya bırakılır 1 mg hassasiyetle tartılır.  
Yağ içeriği yüksek olan yemler, 130°C’de ek olarak 30 dakika daha etüvde kurutulur. İki tartım arasındaki fark 
en fazla, nemin %  0,1’i olmalıdır.  
 
4.2.2. Tahıllar ve ürünleri  
Kapağı ile birlik te bir kap (3.3) 0,5 mg hassasiyetle tartılır. Tartılan kaba 1 mg hassasiyetle yaklaşık 5 g 
öğütülmüş numune tartılır ve eşit olarak yayılır. Kap, kapağı açık olarak önceden 130°C’deki etüve konur . Etüv 
sıcaklığının aşırı düşmesini önlemek için kap olabild iğince hızlı yerleştirilir.  
Etüv sıcaklığının 130°C’ye ulaşmasından itibaren iki saat boyunca kurumaya bırakılır. Kapak kabın üstüne 
yerleştirilir, kap etüvden çıkartılır, desikatör (3.6) içinde 30 – 45 dakika soğumaya bırakılır ve 1 mg hassasiyetle 
tartıl ır. 
4.2.3.   %  4’ten fazla sakkaroz ya da laktoz içeren karma yem: Keçiboynuzu, hidrolize hububat ürünleri, malt 
tohumları, kurutulmuş pancar posası, balık ve şeker çözün ürleri gibi yem materyalleri; kristalleşen suyu da dahil 
% 25’ten fazla mineral tuz iç eren karma yem.  
Kapağı ile birlikte bir kap (3.3) 0,5 mg hassasiyetle tartılır. Tartılan kaba 1 mg hassasiyetle yaklaşık 5 g numune 
tartılır ve eşit olarak yayılır.  Kabı, kapağı açık olarak önceden 80°C - 85°C’ye ısıtılmış vakumlu etüve (3.5) 
konur. Etüv sıcaklığının aşırı düşmesini önlemek için kap olabildiğince hızlı yerleştirilir.  
Basınç 100 Torr’a getirilir ve bu basınçta, sıcak ve kuru bir hava akımında ya da bir nem çekici madde (20 
numune için yaklaşık 300 g) kullanarak dört saat kurumaya bırakılır.  Sonraki işlemde, belirtilen basınca 
erişildiğinde vakum pompası çıkartılır. Etüv sıcaklığının 80°C - 85°C’ye ulaştığı andaki kurutma süresi 
kaydedilir. Etüv dikkatle yeniden atmosfer basıncına getirilir. Etüv açılır, kapağı hemen kabın üstüne 
yerleştirili r, kap etüvden çıkartılır, desikatör (3.6) içinde 30 - 45 dakika soğumaya bırakılır ve 1 mg hassasiyetle 
tartılır. 80°C - 85°C’deki vakumlu etüvde 30 dakika daha kurutulur ve yeniden tartılır. İki tartım arasındaki fark 
en fazla nemin % 0,1’ini aşmamalıdır.  
 
 14 
 4.3. Ön kurutma  
4.3.1.  4.3.2 kapsamı dışındaki yemler  
Parçalama işlemini zorlaştıran, yüksek nem içerikli katı yemler aşağıdaki şekilde ön kurutma işlemine tabi 
tutulmalıdır:  50 g parçalanmamış numune uygun bir kaba (örneğin 20 × 12 cm boyutlarında ve 0,5 cm kenarlı 
alüminyum tepsi )  10 mg hassasiyetle tartılır (gerekiyorsa, sıkıştırılmış ya da yığılmış yem kabaca bölünebilir). 
60°C ile 70°C arasındaki bir etüvde, nem içeriği %  8-% 12’ye azalıncaya kadar kurumaya bırakılır. Etüvden 
çıkartılır, laboratu varda kapaksız olarak bir saat soğumaya bırakılır ve 10 mg hassasiyetle tartılır. Hemen 
4.1.1.’de belirtildiği gibi parçalanır ve yemin yapısına göre 4.2.1 ya da 4.2.3’te belirtildiği gibi kurutulur.  
4.3.2. Tahıllar  
% 17’nin üzerinde nem içeriği olan taneler aşağıdaki şekilde ön kurutma işlemine tabi tutulmalıdır:  
50 g öğütülmemiş tane uygun bir kapta ( ör. 20 × 12 cm boyutlarında ve 0,5 cm kenarlı alüminyum tepsi) 10 mg 
hassasiyetle tartılır. 130°C’deki etüvde 5 -7 dakika kurumaya bırakılır. Etüvden çık artılır, laboratuvar da kapaksız 
olarak iki saat soğumaya bırakılır ve 10 mg hassasiyetle tartılır. Hemen 4.1.2.’de belirtildiği gibi öğütülür ve 
4.2.2.’de belirtildiği gibi kurutulur.  
5. Sonuçların hesaplanması  
Nem içeriği (X), numunenin yüzdesi olarak aşa ğıdaki formülle hesaplanır:  
 
5.1. Ön kurutmasız kurutma  
        
      
Burada;  
m =  Numunenin gram cinsinden ilk ağırlığı,  
m0 = Kuru test numunenin gram cinsinden ağırlığı,  
5.2. Ön kurutmalı kurutma  
  
Burada:  
m = Numunenin gram cinsinden ilk ağırlığı,  
m1 = Ön kurutmadan sonra numunenin gram cinsinden ağırlığı,  
m2 = Kırma ya da öğütmeden sonra numunenin gram cinsinden ağırlığı,  
m0 = Kuru numunenin gram cinsinden ağırlığı.  
5.3. Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark mutlak nem değerinin % 0,2’sini geçmemelidir.  
 
15 
 6. Gözlem  
Kırma işlemi gerekiyorsa ve bu işlem ürünün nem içeriğini değiştirecek gibi görünüyorsa, yem bileşenlerinin 
analiz sonuçları, numunenin ilk durumundaki nem içeriği esas alınarak düzel tilmelidir.  
B.  HAYVANSAL VE BİTKİSEL YAĞLARDA NEM TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; hayvansal ve bitkisel yağlardaki nem ve uçucu madde içeriğinin tayinini mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Numune, 103°C’de sabit ağırlığa ulaşana kadar kurutulur. İki tartım ara sındaki ağırlık kaybı 1 mg’a eşit ya da 
daha az olmalıdır. Ağırlıktaki kayıp tartılarak tayin edilir.  
3.  Cihaz  
3.1. Aşınmaya dirençli malzemeden üretilmiş, 8 - 9 cm çapında ve yaklaşık 3 cm yüksekliğinde düztabanlı 
kurutma kabı.  
3.2. Güçlendirişmiş ampull ü ve üst ucunda genleşme tüpü olan, yaklaşık 80°C ile en az 110°C’ye kadar ölçüm 
yapabilen ve yaklaşık 10 cm uzunluğunda termometre.  
3.3. Kum banyosu ya da elektrikli ısıtıcı tabla.  
3.4. Etkin bir nem çekici içeren desikatör.  
3.5. Analitik terazi.  
4. Metot  
Yaklaşık 20 g homojen numune 1 mg hassasiyetle, termometre (3.2) içeren kuru tartılmış bir kapta (3.1) tartılır. 
Sıcak Kum banyosu ya da elektrikli ısıtıcı tabla  (3.3) üstünde ısıtılır, termometre ile devamlı karıştırılarak 
yaklaşık 7 dakikada sıcak lık 90 °C’ye ulaştırılır.  
Isı düşürülür, kabın tabanından yükselen kabarcıkların sıklığı izlenir. Sıcaklık en fazla 105°C olmalıdır. 
Kabarcıkların oluşması durana kadar, kabın dibini kazıyarak karıştırmaya devam edilir.  
Nemin ortadan kaldırılmasını tamamlamak için birkaç kez 103°C ± 2°C’ye tekrar ısıtılır, ardışık ısıtma arasında 
93°C’ye soğutulur. Ardından desikatörün (3.4) içinde oda sıcaklığında soğumaya bırakılır ve tartılır. Bu işlem iki 
ardışık tartım arasındaki ağırlık kaybı en fazla 2 mg olan a kadar yinelenir.  
Not: Yinelenen ısıtma işleminden sonra numunenin ağırlığındaki bir artış yağın oksitlendiğini gösterir, bu 
durumda sonucun hesaplanmasında, ağırlığın artmaya başlamasından hemen önce gerçekleştirilen tartım 
kullanılır.  
5. Sonuçların hesa planması  
Nem içeriği (X), numunenin yüzdesi olarak aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
m = Numunenin gram cinsinden ağırlığı,  
16 
 m1 = Isıtma öncesinde kabın içindekilerle birlikte gram cinsinden ağırlığı,  
m2 = Isıtma sonrasında kabın içindekilerle birl ikte gram cinsinden ağırlığı,  
% 0,05’in altındaki sonuçlar ‘%  0,05’ten düşük’ olarak kaydedilmelidir.  
6.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki nem farkı mutlak değerin % 0,05’ini geçmemelidir.  
 
C.  HAM PROTEİN İÇERİĞİNİN TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot, Kjeldahl metodu ile tayin edilen azot içeriğine dayanarak yemdeki ham protein içeriğinin tayinini 
mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Numune, bir katalizör varlığında sülfürik asit tarafından parçalanır. Asit çözeltisi,  sodyum hidroksit çözeltisi 
tarafından bazik hale getirilir. Amonyak damıtılır ve miktarı belli olan sülfürik asit içine alınır, geri kalanı 
standart bir sodyum hidroksit çözeltisiyle titre edilir.  
Alternatif olarak, açığa çıkan amonyak daha fazla miktarda  bulunan borik asit çözeltisine damıtılır, ardından 
hidroklorik asit ya da sülfürik asit çözeltisi ile titre edilir.  
3. Ayıraçlar  
3.1. Potasyum sülfat  
3.2. Katalizör: bakır (II) oksit (CuO) ya da bakır (II) sülfat pentahidrat (CuSO 4.5H 2O) 
3.3. Granül çinko  
3.4. Sülfürik asit, ρ20 = 1,84 g/ml  
3.5. Sülfürik asit, standart hacimsel çözelti, c(H 2SO 4) = 0,25 mol/l  
3.6. Sülfürik asit, standart hacimsel çözelti, c( H2SO 4) = 0,10 mol/l  
3.7. Sülfürik asit, standart hacimsel çözelti, c( H2SO 4) = 0,05 mol/l  
3.8. Metil k ırmızısı indikatörü; 300 mg metil kırmızısını 100 ml etanol içinde çözündürülür, σ = %  95-% 96 (v/v)  
3.9. Sodyum hidroksit çözeltisi (Teknik dereceli kullanılabilir) β = 40 g/100 ml (m/v: %  40) 
3.10. Sodyum hidroksit, standart hacimsel çözelti, c(NaOH) = 0,25 mol/l  
3.11. Sodyum hidroksit, standart hacimsel çözelti, c(NaOH) = 0,10 mol/l  
3.12. Granül kaynama taşı, hidroklorik asit içinde yıkanmış ve yakılmış  
3.13. Asetanilid (erime noktası = 114°C, Azot -içeriği= %  10,36)  
3.14. Sakkaroz  (azot içermeyen)  
3.15. Borik asit (H 3BO 3) 17 
 3.16. Metil kırmızısı indikatör çözeltisi: 100 mg metil kırmızısı 100 ml etanol ya da metanol içinde çözdürülür.  
3.17. Bromkrezol yeşili çözeltisi: 100 mg bromkrezol yeşili 100 ml etanol ya da metanol içinde çözdürülür.  
3.18.  Borik a sit çözeltisi (kullanılan cihaza göre 10 g/l - 40 g/l)  
Kolorimetrik olarak dönüm noktası belirleneceği zaman metil kırmızısı ve bromkrezol indikatörleri borik asit 
çözeltisine eklenmelidir. 1 litre borik asit çözeltisi hazırlanırsa, hacmi tamamlanmadan önc e 7 ml metil kırmızısı 
indikatör çözeltisi (3.16) ve 10 ml bromkrezol yeşili çözeltisi (3.17) eklenmelidir.  
Kullanılan suya bağlı olarak borik asit çözeltisinin pH’ sı partiden partiye değişebilir. Genelde küçük hacimde 
alkali içeren bir ayarlama, pozitif k ör elde etmek için gereklidir.  
Not: Yaklaşık 3 ml -4 ml NaOH’nin (3.11) 1 litre 10 g/l borik aside eklenmesi genelde iyi ayarlamalar verir. 
Çözelti oda sıcaklığında depolanır ve depolama süresince ışıktan ve amonyak dumanı kaynağından korunur.  
3.19. Hidrokl orik asit standart hacimsel çözeltisi c  (HCl) = 0,10 mol/l  
Not: Hesaplamalar için düzeltilmişse diğer hacimsel çözelti konsantrasyonları (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 ve 3.19) 
kullanılabilir. Konsantrasyonlar her zaman dört ondalık haneye kadar ifade edilmeli dir. 
4. Cihaz  
Kjeldahl metoduna göre yaş yakma, damıtma ve titrasyona uygun cihaz.  
5. Metot  
5.1. Yaş yakma  
1 g numune 0,001 g hassasiyetle tartılır ve kjeldahl balonuna aktarılır.  15 g potasyum sülfat (3.1), uygun 
miktarda katalizör (3.2) (0,3 - 0,4 g bak ır (II) oksit veya 0,9 -1,2 g bakır (II) sülfat pentahidrat), 25 ml sülfürik 
asit (3.4) ve gerekiyorsa granül kaynama taşı (3.12) eklenir ve karıştırılır.  
Kjeldahl balonu önce yavaşça ısıtılır, kütle karbonize olana ve köpük kaybolana kadar gerekiyorsa ara sıra 
döndürerek karıştırılır, ardından sıvı sürekli kaynayana kadar daha yoğun şekilde ısıtılır. Kaynayan asit cam 
balonun çeperinde yoğunlaşıyorsa ısıtma yeterlidir. Çeperin aşırı ısınması ve organik parçacıkların bunlara 
yapışması önlenir.  
Çözelti berrak  ve açık yeşil olduğunda iki saat daha kaynatmaya devam edilir, ardından soğumaya bırakılır.  
5.2. Damıtma  
Sülfatların tümüyle çözünmesini sağlamak için dikkatle yeterli miktarda su eklenir (yaklaşık 150 -200 ml). 
Soğumaya bırakılır ve ardından gerekiyorsa b irkaç granül çinko (3.3) eklenir. 5.2.1. ya da 5.2.2.’ye göre devam 
edilir.  
5.2.1. Sülfürik aside damıtma  
Damıtma cihazının toplama erlenine varsayılan azot içeriğine göre tam olarak ölçülmüş 25 ml sülfürik asit (3.5 
ya da 3.7) eklenir. Birkaç damla metil kırmızısı indikatörü (3.8) eklenir.  
Kjeldahl Balon damıtma cihazının yoğunlaştırıcısına bağlanır ve yoğunlaştırıcının ucu toplama erleni içindeki 
sıvıya en az 1 cm derinliğinde batırılır. (bakınız 8.3). 100 ml sodyum hidroksit çözeltisi (3.9) yavaşça balon a 
amonyak kaybı olmadan eklenir (bakınız 8.1) Balon amonyak damıtma işlemi tamamlanana kadar ısıtılır.  
 
 18 
 5.2.2.  Borik aside damıtma  
Damıtık üründeki amonyağın titrasyonu elle yapılıyorsa aşağıda  bahsedilen metot uygulanır.  Damıtma ünitesi  
amonyak içeriğinin titrasyonunu da  kapsayacak şekilde tam  otomatik ise,   cihaz üreticisi firmanın kullanım 
talimatları uygulanır . 
25 ml ila 30 ml borik asit çözeltisi (3.18) içeren bir toplama erleni, iletim borusunun yüksek borik asit 
çözeltisinin yüzey i altında olacağı şekilde yoğunlaştırıcının altına yerleştirilir. Damıtma cihazı 50 ml sodyum 
hidroksit çözeltisini (3.9) dağıtacak şekilde ayarlanır. Damıtma cihazı üreticinin talimatlarına göre kullanılır ve 
sodyum hidroksit çözeltisi eklenmesiyle açığa çıkan amonyak damıtılır. Distilat borik asit toplama çözeltisinde 
toplanır. Distilatın miktarı (buhar damıtma süresi), numunedeki azot miktarına göre değişir. Üreticinin 
talimatlarını izlenir.  
Not:  Yarı otomatik bir damıtma cihazında, yüksek  sodyum hidroks itin eklenmesi ve buhar damıtma işlemi 
otomatik olarak gerçekleştirilir.  
5.3.  Titrasyon  
5.3.1. ya da 5.3.2.’ye göre devam edilir.  
5.3.1.  Sülfürik asit  
Kullanılan sülfrik asidin konsantrasyonuna bağlı olarak, toplama kabı içindeki sülfürik  asidin fazlası, sodyum 
hidroksit çözeltisi ile (3.10 ya da 3.11) dönüm noktasına ulaşılıncaya kadar titre edilir  
5.3.2.  Borik asit  
Toplama şişesinin içeriği bir büret kullanılarak hidroklorik asit standart volumetrik çözeltisi (3.19) ya da sülfürik 
asit standart volumetrik çözeltisi (3.6) ile titre edilir ve kullanılan miktar okunur.  
Dönüm noktasına, içerikte pembe rengin ilk görüldüğü yerde ulaşılır. Büret, en yakın 0,05 ml’ye okuyarak 
tahmin edilir. Aydınlatmalı bir manyetik karıştırma plakası ya da fot ometrik bir detektör dönüm noktasının 
görülmesine yardımcı olabilir. Bu, otomatik titrasyonlu buhar damıtıcı kullanılarak otomatik olarak yapılabilir. 
Özel damıtıcı ya da damıtıcı/titre edicinin kullanımı için üreticinin talimatları izlenir.  
Not: Otomatik titrasyon sistemi kullanıldığında, titrasyon, damıtma işlemi başladıktan hemen sonra başlar ve %  
1 borik asit çözeltisi (3.18) kullanılır.  
Tam otomatik bir damıtma cihazının kullanıldığı yerde, ayrıca amonyağın otomatik titrasyonu da bir 
potansiyometrik pH  sistemi kullanan dönüm noktası tespiti ile yürütülebilir. Bu durumda pH metreli bir otomatik 
titre edici kullanılır. pH metre, normal laboratuvar pH kalibrasyon metotları izlenerek pH 4 ve pH 7 değerlerinde 
düzgün olarak kalibre edilmelidir. Titrasyonun p H dönüm noktasına pH 4,6’da erişilir.  
5.4.  Kör testi  
Ayıraçların azot içermediğini doğrulamak amacıyla numune yerine 1 g sakkaroz (3.14) kullanılarak kör testi (yaş 
yakma, damıtma ve titrasyon) uygulanır.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Hesaplamalar 6.1 ya da  6.2’ye göre gerçekleştirilir.  
6.1.   5.3.1’e göre titrasyon hesabı  
Ağırlıkça yüzde olarak ifade edilen ham protein içeriği, aşağıdaki formülden hesaplanır:  19 
   
Burada;  
V0 = Kör testinde kullanılan NaOH (3.10 ya da 3.11) hacmi (ml)  
V1 = Numune titrasyonunda  kullanılan NaOH (3.10 ya da 3.11) hacmi (ml)  
c =   Sodyum hidroksit (3.10 ya da 3.11) konsantrasyonu (mol/l)  
m = Numunenin ağırlığı (g)  
6.2.    5.3.2’ye göre titrasyon hesabı  
6.2.1. Hidroklorik asitle titrasyon  
Ağırlıkça yüzde olarak ifade edilen ham prot ein içeriği, aşağıdaki formülden hesaplanır:  
  
Burada;  
m = Numunenin ağırlığı (g)  
c =  Standart volumetrik hidroklorik asit (3.19) çözeltisinin konsantrasyonu (mol/l)  
V0 = Kör testinde kullanılan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi  
V1 = Numune için ku llanılan hidroklorik asidin (ml cinsinden) hacmi  
 
6.2.2. Sülfürik asitle titrasyon  
Ağırlıkça yüzde olarak ifade edilen ham protein içeriği, aşağıdaki formülden hesaplanır:  
  
Burada;  
m = Ağırlığı (g)  
c = standart volumetrik sülfürik asit (3.6) çözeltisinin  konsantrasyonu (mol/l)  
V0 = kör testinde kullanılan sülfürik asidin (3.6) (ml cinsinden) hacmi  
V1 = Numune için kullanılan sülfürik asidin (3.6) (ml cinsinden) hacmi  
7. Metodun doğrulanması  
7.1. Tekrar edilebilirlik  
20 
 Aynı numunenin iki paralel tayininin so nuçları arasındaki fark aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
— % 20’den az ham protein içeriği için mutlak değer olarak %  0,2, 
— % 20 ila %  40 ham protein içeriği için bulunan en yüksek değerin %  1,0’i kadar,  
— % 40’tan fazla ham protein içeriği için mutlak değer olarak %  0,4. 
7.2. Doğruluk  
Analiz (yaş yakma, damıtma ve titrasyon) 1 g sakkaroz (3.14) varlığında, 1,5 ila 2,0 g asetanilid (3.13) üzerinde 
gerçekleştirilir. 1 g asetanilid 14,80 ml sülfürik asit (3.5) tüketir. Geri kazanım en az %  99 olmalıdır.  
8.  Gözlemler  
8.1. Cihaz manuel, yarı otomatik ya da otomatik tip olabilir. Yaş yakma ve damıtma adımları arasında makine 
aktarım gerektiriyorsa, bu aktarım kayıpsız gerçekleştirilmelidir. Damıtma cihazının şişesine damlama hunisi 
takılmamışsa, kjeldahl balo nu yoğunlaştırıcıya bağlanmadan hemen önce sodyum hidroksit yavaşça kenardan 
dökülerek eklenir.  
8.2. Yaş yakmaya tabi tutulan madde katılaşırsa, yukarıda belirtilenden daha fazla miktarda sülfürik asit (3.4) 
kullanarak analiz yeniden başlatılır.  
8.3. Düşük  azot içeriği olan ürünler için toplama erlenine koyulacak sülfürik asit (3.7) hacmi gerekiyorsa 10 ya 
da 15 ml’ye azaltılabilir ve su ile 25 ml’ye kadar tamamlanabilir.  
8.4. Rutin analizlerde, ham protein tayini için alternatif analiz metotları uygulanabilir, ancak bu Bölüm C’de 
açıklanan Kjeldahl metodu referans metottur. Alternatif metotla (DUMAS gibi) elde edilen ve referans metot ile 
karşılaştırılan sonuçların eşdeğerliği her matriks için ayrı ayrı gösterilmelidir. Alternatif bir metotla elde  edilen 
sonuçlar, eşdeğerlikleri doğrulanmış olsa bile referans metot ile elde edilen sonuçlardan biraz sapabildiğinden, 
ham protein tayini için kullanılan analiz metodundan analitik raporda bahsedilmesi gereklidir.  
Not: 8.4.’te adı geçen DUMAS metodu, AOÇ ’de yayımlanmış metoda göre yapılabilir.  
 
Ç. ÜRE TAYİNİ  
1. Amaç ve kapsam  
Bu metot, yemdeki üre seviyesinin tayinini mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Numune, berraklaştırma çözeltileriyle su içinde süspansiyon haline getirilir. Süspansiyon süzülür. Süzüntünün 
üre içeriği 4 -dimetilaminobenzaldehid (4 -DMAB) eklendikten sonra 420 nm dalga boyundaki optik yoğunluk 
ölçülerek tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1. 4 -dimetilaminobenzaldehid çözeltisi: 1,6 g 4 -DMAB’yi 100 ml %  96 etanol içinde çözündürülür ve 10 ml 
hidroklorik asit (ρ20 1,19 g/ml) eklenir. Bu ayıraç, en fazla iki hafta kullanılabilir.  
3.2. Carrez çözeltisi I: Su içinde 21,9 g çinko asetat Zn(CH 3COO) 2 2H 2O ve 3 g glasiyal asetik asit 
çözündürülür. Su ile 100 ml’ye tamamlanır.  
3.3. Carrez çözeltisi II: Su içinde 10,6 g potasyum ferrosiyanid K4 Fe (CN) 6 3H 2O çözündürülür. Su ile 100 
ml’ye tamamlanır.  21 
 3.4.  Üre absorbe etmeyen aktif karbon kullanılmalıdır. (Kontrol edilmelidir.)  
3.5.  Üre, %  0,1 çözelti (w/v)  
4. Cihazlar  
4.1.  Karıştırıcı: yaklaşık 35 ila 40 rpm  
4.2. Test tüpleri: 160 × 16 mm, şilifli  
4.3. Spektrofotometre  
5.  Metot  
5.1.  Numunenin analizi  
2 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 1 g aktif karbon (3.4) ile 500 ml’lik balon jojeye konur . 400 ml su ve 5 
ml Carrez I çözeltisi (3.2) eklenir, yaklaşık 30 saniye karıştırılır ve 5 ml Carrez II çözeltisi (3.3) eklenir. 
Karıştırıcıda 30 dakika karıştırılır. Su ile gereken hacme tamamlanır, çalkalanır ve süzülür.  
5 ml şeffaf renksiz filtratı alınır, şilifli test tüplerine ko yulur, 5 ml 4 -DMAB çözeltisi eklenir (3.1) ve karıştırılır. 
Tüpler 20°C’deki (+/ - 4°C) bir su banyosuna konur . 15 dakika sonra, 420 nm’de spektrofotometrede numune 
çözeltisinin optik yoğunluğu ölçülür. Ayıraçlar aynı şekilde kullanılarak numunesiz kör dene me çalışması yapılır 
ve hesaplamalarda dikkate alınır.  
5.2. Kalibrasyon eğrisi  
1, 2, 4, 5 ve 10 ml’lik hacimlerde üre çözeltisi (3.5) alınır, 100 ml balon jojeye konur  ve su ile gereken hacme 
tamamlanır. Her bir çözeltiden 5 ml alınır, bunların her birine 5 ml 4 -DMAB çözeltisi (3.1) eklenir, homojen 
hale getirir, 5 ml 4 -DMAB ve 5 ml üre içermeyen su ihtiva eden bir kontrol çözeltisi ile karşılaştırılarak optik 
yoğunluğu yukarıda gösterildiği gibi ölçülür, kalibrasyon eğrisi çizilir.  
6. Sonuçların hesaplanma sı 
Kalibrasyon eğrisi kullanılarak numunedeki üre miktarı tayin edilir. Sonuçlar numunenin yüzdesi olarak ifade 
edilir. Üre hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılabilir.  
Üre(%): c x f x100  
              m x 1000  
Burada;             
c: Kalibrasyon eğri sinden hesaplanan üre miktarı(mg)  
f: Seyreltme faktörü  
m: Numune miktarı (g)  
7. Gözlemler  
7.1. Üre içeriğinin %  3’ü geçmesi halinde numune 1 g’a azaltılır ya da orijinal çözelti, 500 ml’de en fazla 50 mg 
üre olacak şekilde seyreltilir.  
7.2. Üre içeriğinin düşük olması durumunda, süzüntü şeffaf ve renksiz kalana kadar numune artırılır.  
 
7.3. Numune, amino asitler gibi basit azot bileşikleri içeriyorsa, optik yoğunluk 435 nm’de ölçülmelidir.  22 
 D.  UÇUCU AZOTLU BAZLARIN TAYİNİ  
I. MİKRO DİFÜZYON  METODUYLA    
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemdeki, amonyak olarak ifade edilen uçucu azotlu bazların tayinini mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Numune su ile ekstrakte edilir ve çözelti berraklaştırılıp süzülür. Uçucu azotlu bazlar, bir potasyum karbonat 
çözeltisi kullanılarak mik ro difüzyon yoluyla çıkartılır, borik asit çözeltisinde toplanır ve sülfürik asit ile titre 
edilir.  
3. Ayıraçlar  
3.1. Trikloroasetik asit, %  20 (w/v) çözelti.  
3.2. İndikatör: 33 mg bromokrezol yeşili ve 65 mg metil kırmızısı 100 ml %  95 ila %  96 (v/v) etan ol içinde 
çözündürülür.  
3.3. Borik asit çözeltisi: 1 litrelik balon jojede 10 g borik asit 200 ml %  95 ila %  96 (v/v) etanol ve 700 ml su 
içinde çözündürülür. 10 ml indikatör (3.2) eklenir. Karıştırılır ve gerekiyorsa çözeltinin rengi bir sodyum 
hidroksit çözeltisi ekleyerek açık kırmızıya ayarlanır. Bu çözeltinin 1 ml’si en fazla 300 μg NH 3 bağlayacaktır.  
3.4. Doymuş potasyum karbonat çözeltisi: 100 g potasyum karbonat 100 ml kaynar suda çözündürülür. 
Soğumaya bırakılır.  
3.5. Sülfürik asit 0,01 mol/l  
4. Cihaz  
4.1. Karıştırıcı: yaklaşık 35 ila 40 rpm  
4.2. Cam ya da plastik Conway hücreleri (bakınız şekil)  
4.3. 1/100 ml derecelendirilmiş mikro büretler  
5. Metot  
10 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 100 ml su ile 200 ml’lik balon jojeye konur . 30 dakika boyunca 
karıştırıcıda karıştırılır. 50 ml trikloroasetik asit çözeltisi (3.1) eklenir, su ile gereken hacme tamamlanır, 
kuvvetlice çalkalanır ve katlı bir süzgeç kağıdı ile süzülür.  
Bir pipet kullanarak 1 ml borik asit çözeltisi (3.3) Conway hücresinin ort asına ve 1 ml numune süzüntüsü 
hücrenin başlığına eklenir. Yağlanmış kapakla kısmen kapatılır. 1 ml doymuş potasyum karbonat çözeltisi (3.4) 
hızlı bir şekilde başlığa damlatılır ve kapağı hücrenin hava almayacağı şekilde kapatılır. Hücre, iki ayıracın 
karışacağı şekilde dikkatle yatay bir düzlemde döndürerek çevrilir. Oda sıcaklığında en az dört saat ya da 
40°C’de bir saat inkübe edilmeye bırakılır.  
Bir mikro büret (4.3) kullanılarak uçucu bazları borik asit çözeltisi içinde sülfürik asit (3.5) ile titre e dilir.  
 Analiz edilecek bir numune olmadan aynı metot kullanılarak kör testi gerçekleştirilir.  
6. Sonuçların hesaplanması  
1 ml H2SO 4 0,01 mol/l, 0,34 mg amonyağa karşılık gelir. Sonuçlar numunenin yüzdesi olarak ifade edilir.  23 
 6.1.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki farkı aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
— % 1’den az amonyak içeriği için bağıl değer olarak %  10, 
— % 1 ya da daha fazla amonyak içeriği için mutlak değer olarak %  0,1 
7. Gözlem  
Numunenin amonyak i çeriği %  0,6’dan fazla ise başlangıç süzüntüsü seyreltilir.  
Şekil:   Conway Hücresi  
Ölçek 1/1  
 
 
 
 
 
 
                                                                         
 
 
 
                                                                                               Hücrenin üstten görünümü  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Şilifli cam kapağın üstten görünümü  
Kapağın S  S1 kesiti  
 Kapağın S 2S3 kesiti  
 24 
 II.  DAMITMA METODUYLA  
1.  Amaç ve Kapsam  
 
Bu metot; üre içermeyen balık ununda, amonyak olarak ifade edilen uçucu azotlu bazların tayinini mümkün 
kılar. Bu, yalnızca %  0,25’ten az amonyak içeriği için geçerlidir.  
2.  Prensip  
Numune su ile ekstrakte edilir ve çözelti berraklaştırılıp süzülür. Uçucu azotlu bazlar kaynama noktasında 
magnezyum oksit eklenerek çıkartılır ve belirli miktardaki sülfürik asit içinde toplanır, fazla miktarı sodyum 
hidroksit çözeltisi ile geri titre edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Trikloroasetik asit, %  20 (w/v) çözelti  
3.2.  Magnezyum oksit  
3.3.  Köpürmeyi önleyici emülsiyon (silikon gibi)  
3.4.  Sülfürik asit 0,05 mol/l  
3.5.  Sodyum hidroksit çözeltisi, 0,1 mol/l  
3.6.  % 95 ile %  96 (v/v) etanol içinde %  0,3 metil  kırmızısı çözelti  
4.  Cihaz  
4.1.  Karıştırıcı: yaklaşık 35 ile 40 rpm  
4.2.  Kjeldahl tipi damıtma cihazı  
5.  Metot  
10 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 100 ml su ile 200 ml’lik balon jojeye konur . 30 dakika boyunca 
karıştırıcıda karıştırılır. 50 ml trikloroasetik asit çözeltisi (3.1) eklenir, su ile gereken hacme tamamlanır, 
kuvvetlice çalkalanır ve katlı bir süzgeç kağıdı ile süzülür.  
Varsayılan uçucu azotlu baz içeriği için uygun miktarda berrak süzüntü alınır. (100 ml genelde uygundur) 200 
ml’ye s eyreltilir ve 2 g magnezyum oksit (3.2) ile birkaç damla köpürmeyi önleyici emülsiyonu (3.3) eklenir. 
Çözelti turnusol kağıdına göre alkali olmalıdır, değilse biraz magnezyum oksit (3.2) eklenir. Ham protein 
içeriğinin tayini için analiz metodunun 5.2 ve 5 .3 maddelerine göre devam edilir. (Bakınız Bölüm C).  
Numune olmadan aynı metot kullanarak kör testi gerçekleştirilir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
1 ml H2SO 4 0,05 mol/l, 1,7 mg amonyağa karşılık gelir. Sonuçlar yüzde olarak ifade edilir.  
6.1.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark, bağıl değer olarak en fazla amonyağın %  10’u 
olmalıdır.  
 
 
 25 
 E.  AMİNO ASİTLERİN (TRİPTOFAN HARİÇ) TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot, amino asit analizörü kullanarak yemdeki serbe st (sentetik ve doğal) ve toplam (peptid bağlı ve serbest) 
amino asitlerin tayinini mümkün kılar. Sistein, metiyonin, lizin, treonin, alanin, arjinin, aspartik asit, glutamik 
asit, glisin, histidin, izolöysin, löysin, fenilalanin, prolin, serin, tirozin ve  valin amino asitleri için geçerlidir.  
Metot, amino asit tuzlarını ayırt etmez ve amino asitlerin D ve L formları arasında ayrım yapmaz. Triptofan ya 
da amino asitlerin hidroksi analoglarının tayini için geçerli değildir.  
2.  Prensip  
2.1.  Serbest amino a sitler  
Serbest amino asitler seyreltilmiş hidroklorik asit ile ekstrakte edilir. Beraber ekstrakte edilmiş azotlu makro 
moleküller sülfosalisilik asit ile çökeltilir ve süzülür. Süzüntünün pH’ı 2,20’ye ayarlanır. Amino asitler iyon 
değişim kromatografisi i le ayrılır ve ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm dalga boyunda tespit 
edilir.  
2.2. Toplam amino asitler  
Seçilen metot inceleme altındaki amino asitlere göre değişir. Sistein ve metiyonin hidrolizden önce sırasıyla 
sisteik aside ve metiyo nin sülfona okside edilmelidir. Tirozin, oksitlenmemiş numunelerin hidrolizatlarında tayin 
edilmelidir. Amaç ve kapsamda listelenen diğer tüm amino asitler oksitlenmiş ya da oksitlenmemiş numunede 
tayin edilebilir.  
Oksidasyon 0°C’de performik asit/fenol ka rışımı ile gerçekleştirilir. Oksitlenme ayıracının fazlası sodyum 
disülfit ile ayrıştırılır. Oksitlenmiş ya da oksitlenmemiş numune, hidroklorik asit (3.20) ile 23 saat boyunca 
hidrolize edilir. Hidrolizat pH 2,20’ye ayarlanır. Amino asitler iyon değişim k romatografisi ile ayrılır ve 
ninhidrin ile reaksiyona sokularak fotometrede 570 nm (prolin için 440 nm) dalga boyunda tespit edilir.  
3. Ayıraçlar  
İki kere distile edilmiş su ya da eşdeğer nitelikte su kullanılmalıdır. (iletkenlik < 10 μS).  
3.1.  Hidrojen p eroksit, a (a/a) = %  30  
3.2.  Formik asit, a (a/a) = %  98 - % 100 
3.3.  Fenol.  
3.4.  Sodyum disülfit  
3.5.  Sodyum hidroksit  
3.6.   5-Sülfosalisilik asit dihidrat  
3.7.  Hidroklorik asit, yaklaşık yoğunluğu 1,18 g/ml  
3.8.  Tri-Sodyum sitrat dihidrat  
3.9.  2,2'-Tiyodietanol (tiyodiglikol)  
3.10.  Sodyum klorür  
3.11.  Ninhidrin  26 
 3.12.   Petrol eteri, kaynama aralığı 40 -60°C  
3.13.  Norlöysin ya da başka bir bileşik iç standart olarak kullanılmaya uygundur.  
3.14.  Azot gazı (< 10 ppm oksijen)  
3.15.  1-Oktanol  
3.16.  Amino asitler  
3.16.1. Standard maddeler paragraf 1 altında listelenmiştir. Saf bileşikler kristalizasyon suyu içermezler. 
Kullanmadan önce bir hafta boyunca P 2O5 ya da H 2SO 4 üzerinde vakum altında kurutulur.  
3.16.2.  Sisteik asit  
3.16.3.  Metiyonin sülf at. 
3.17.  Sodyum hidroksit çözeltisi, c = 7,5 mol/l, (300 g NaOH (3.5) su içinde çözündürülür ve 1 litreye 
tamamlanır.)  
3.18. Sodyum hidroksit çözeltisi, c = 1 mol/l, (40 g NaOH (3.5) su içinde çözündürülür ve 1 litreye tamamlanır.)  
3.19.  Formik asit — fenol çözeltisi, (889 g formik asidi (3.2)  111 g su ile karıştırılır ve 4,73 g fenol (3.3) 
eklenir.)  
3.20.  Hidroliz karışımı, c = 6 mol/l HCl (1 g/l fenol içeren), (492 ml HCI (3,7) içine 1 g fenol eklenir ve suyla 1 
litreye tamamlanır)  
3.21.  Ekstraksiyo n karışımı, c = 0,1 mol/l HCl (%  2 tiodiglikol içeren) (8,2 ml HCl (3.7) alınır, yaklaşık 900 ml 
su ile seyreltilir, 20 ml tiodiglikol (3.9) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanır) (3.7 ve 3.9. doğrudan 
karıştırılmaz).  
3.22.  5- Sülfosalisilik asit, ß = %  6, (60 g 5 - sülfosalisilik asidi (3.6) su içinde çözündürülür ve su ile 1 litreye 
tamamlanır.)  
3.23.  Oksidasyon karışımı (Performik asit — fenol) (0,5 ml hidrojen peroksidi (3.1) 4,5 ml formik asit -fenol 
çözeltisi (3.19) ile küçük bir beherde karıştırılır.  Performik asit oluşturmak için 20 -30°C’de 1 saat boyunca 
inkübe edilir. Numuneyi eklemeden önce (15 dakika) buz -su banyosunda soğutulur.)  
Not: Deriyle temasından sakınılır ve koruyucu giysiler kullanılır.  
3.24.  Sitrat tamponu, c = 0,2 mol/l Na+, pH 2,20 (19,61 g sodyum sitrat (3.8), 5 ml tiodiglikol (3.9), 1 g fenol 
(3.3) ve 16,50 ml HCI’yi (3.7) yaklaşık 800 ml su içinde çözündürülür. pH’sı 2,20’ye ayarlanır. Su ile 1 litreye 
tamamlanır.)  
3.25.  Elüsyon tamponları, kullanılan analizör koşullarına göre ha zırlanır (4.9)  
3.26.  Ninhidrin ayıracı, analizör koşullarına göre hazırlanır (4.9)  
3.27.  Amino asitlerin standart çözeltileri. Bu çözeltiler 5°C’de saklanmalıdır.  
3.27.1.  Amino asitlerin stok standart çözeltileri (3.16.1)  
 c = 2,5 μmol/ml (Her birinin hidroklorik asit içindeki çözeltisi. Ticari olarakta bulunur.)  
3.27.2.   Sisteik asit ve metiyonin sülfatın stok standart çözeltileri, c = 1,25 μmol/ml  27 
 0,2115 g sisteik asit (3.16.2) ve 0,2265 g metiyonin sülfatı (3.16.3)1 litrelik balon jojede sitrat tamponu 
içerisinde çözündürülür ve sitrat tamponu ile işaretine kadar tamamlanır. 5°C’nin altında ve en fazla 12 ay 
saklanır. Bu çözelti, stok standart çözeltisi (3.27.1) sisteik asit ve metiyonin sülfat içeriyorsa kullanılmaz.  
3.27.3.  İç standardın stok standart çözeltisi, örneğin norlöysin, c = 20 μmol/ml  0,6560 g norlöysin (3.13) balon 
jojede sitrat tamponu (3.24) içinde çözündürülür ve sitrat tamponu ile 250 ml’ye tamamlanır. 5°C’nin altında en 
fazla 6 ay saklanır.  
3.27.4.  Hidrolizatlar ile kullanılmak üzere standart amino asitlerin kalibrasyon çözeltileri, c = 5 nmol/50 μl, 
sisteik asit ve metiyonin sülfat ve c = 10 nmol/50 μl diğer amino asitler. 2,2 g sodyum klorit (3.10) 100 ml’lik 
beher içinde 30 ml sitrat tamponu (3.2 4)  ile çözündürülür. 4,00 ml amino asit stok standart çözeltisi (3.27.1), 
4,00 ml sisteik asit ve metiyonin sülfatın stok standart çözeltisi (3.27.2) ve eğer kullanılıyorsa 0,50 ml iç 
standardın stok standart çözeltisi (3.27.3) eklenir. Sodyum hidroksit ( 3.18) ile pH’sı 2,20’ye ayarlanır.  
Hazırlanan kısım 50 ml’lik balon jojeye aktarılır ve sitrat tamponu (3.24) ile işarete kadar tamamlayıp karıştırılır. 
5°C’nin altında en fazla 3 ay saklanır. (Bakınız gözlem 9.1.)  
3.27.5.  Hidrolizatlarla kullanılmak üzer e standart amino asitlerin kalibrasyon çözeltileri paragraf 5.3.3.1.’e göre 
ve ekstraktlarla (5.2) birlikte kullanılmak üzere hazırlanır. Kalibrasyon çözeltisi 3.27.4.’e göre hazırlanır ancak 
sodyum klorür ilave edilmez. 5°C’nin altında en fazla 3 ay sakla nır. 
4.  Cihaz  
4.1.  Geri soğutucu  takılmış 100 ila 250 ml’lik yuvarlak tabanlı balon joje  
4.2.  Etüv kullanımı için kauçuk/teflon astarlı vida kapaklı 100 ml’lik borosilikat cam şişe (örneğin Duran, 
Schott)  
4.3.  Havalandırmalı ve ± 2°C’den daha iyi bir hassasiyette sıcaklık düzenleyicili etüv  
4.4.  pH-metre (üç ondalık haneli)  
4.5.  Membran filtre (0,22 μm)  
4.6.  Santrifüj  
4.7.  Rotary vakum evaporatör  
4.8.  Mekanik çalkalayıcı ya da manyetik karıştırıcı  
4.9.  Amino asit analizörü ya da iyon değişimi kol onlu HPLC cihazı, ninhidrin için gereç, kolon sonrası 
türevlendirme ve fotometrik detektör.  
Kolon,  amino asitleri birbirinden ve diğer ninhidrin -pozitif materyallerden ayırabilecek kapasitede sülfonlu 
polistren reçineleri ile doldurul ur. Tampon ve ninhidri n hatlarındaki akış , hem standart kalibrasyon çalışması ve 
hem de numune analizini kapsayan süreç boyunca ± %  0,5 akış stabilitesi olan pompalarla sağlanır.  
Bazı amino asit analizörleri ile birlikte; hidrolizatın c = 0,8 mol/l sodyum konsantrasyonuna sahip  olduğu ve 
oksidasyon basamağından kalan tüm formik asidi içerdiği durumlarda hidroliz metotları kullanılabilir. Hidrolizat 
yüksek  formik asit ve/veya yüksek sodyum iyon konsantrasyonları içerirse, diğerleri belirli amino  asitlerde 
tatmin edici bir ayırım sağlamaz. Bu durumda, asit hacmi hidrolizden sonra ve pH ayarlamasından önce 
buharlaştırma ile yaklaşık 5 ml’ye azaltılır. Buharlaştırma vakum altında en fazla 40°C’de yapılmalıdır.  
 
 28 
 5.  Metot  
5.1.  Numunenin hazırlanmas ı 
Numune 0,5 mm’lik elekten geçecek şekilde öğütülür. Nem oranı yüksek numuneler işlemden önce ya 50°C’yi 
aşmayacak sıcaklıkta hava ile kurutulmalı ya da dondurularak kurutulmalıdır. Yüksek yağ oranlı numuneler 
işlemden önce petrol eteri ile ekstrakte edil melidir (3.12).  
5.2.  Yem ve premikslerde serbest amino asitlerin belirlenmesi  
Hazırlanan numuneden 0,2 mg hassasiyetle uygun bir miktar (1 -5 g) (5.1) erlene tartılır ve ekstraksiyon 
çözeltisinden 100 ml eklenir (3.21). Mekanik bir çalkalayıcı ya da manyet ik bir karıştırıcı kullanarak karışım 60 
dakika boyunca çalkalanır (4.8). Çökeltinin çökmesi beklenir ve 100 ml’lik bir behere süpernatant çözeltiden 10 
ml pipetlenir.  
5,0 ml sülfosalisilik asit çözeltisi (3.22), karıştırılarak eklenir ve manyetik karıştır ıcı yardımı ile 5 dakika 
boyunca karıştırmaya devam edilir. Çökeltiyi ayırmak için süpernatant süzülür ya da santrifüje tabi tutulur. Elde 
edilen çözeltiden 10 ml, 100 ml’lik bir behere alınırak sodyum hidroksit çözeltisi (3.18) eklenir pH’ı 2,20’ye 
ayarla nır, sitrat tamponu (3.24) kullanarak uygun hacimdeki balon jojeye aktarılır ve tampon çözeltisi (3.24) ile 
işarete kadar tamamlanır.  
Bir iç standart kullanılacaksa, her 100 ml nihai çözelti için 1ml iç standart (3.27.3.) eklenir ve tampon çözeltisi 
(3.24 ) ile işarete kadar tamamlanır.  
5.4.’e göre kromatografi işlemine geçilir.  
Ekstraktlar aynı gün incelenmeyecekse 5°C’nin altında saklanır.  
5.3.  Toplam amino asitlerin belirlenmesi  
5.3.1.  Oksidasyon  
Hazırlanan numuneden (5.1 )  0,2 mg hassasiyetle 0,1 ile 1 g’ı,  
- Açık hidroliz (5.3.2.3) için 100 ml’lik yuvarlak tabanlı balon (4.1) içine ya da,  
- Düşük sodyum konsantrasyonu gerekiyorsa (5.3.3.1) 250 ml’lik yuvarlak tabanlı balon (4.1)içine ya da,  
- Kapalı hidroliz (5.3.2.4) için 10 0 ml’lik vidalı kapaklı şişe (4.2) içine tartılır.  
Tartılan numune yaklaşık 10 mg azot içeriğine sahip olmalı ve su miktarı100 mg aşmamalıdır.  
Balon/şişe buz -su banyosu içine yerleştirilir ve 0˚C’ye soğutulur, 5 ml oksidasyon karışımı (3.23) eklenir ve eği k 
uçlu bir cam spatula ile karıştırılır. Balon/şişe spatula ile birlikte hava geçirmez bir filmle kapatılır, buz -su 
banyosu içindeki filmle kapatılmış balon/şişe ile birlikte 0 ˚C’deki buzdolabına yerleştirilir ve 16 saat bekletilir. 
16 saatten sonra buzdo labından çıkarılır ve 0,84 g sodyum disülfür (3.4) ekleyerek fazla oksidasyon ayıracı 
ayrıştırılır.  
 5.3.2.1’e göre işleme devam edilir.  
5.3.2.  Hidroliz  
5.3.2.1.  Oksitlenmiş numunelerin hidrolizi  
5.3.1.’e göre hazırlanmış oksitlenmiş numuneye, 25 ml hidroliz karışımı (3.20) kabın ve spatulanın üzerine 
yapışmış tüm numune kalıntılarını yıkamaya özen göstererek eklenir.  
Kullanılan hidroliz meto duna bağlı olarak, 5.3.2.3 ya da 5.3.2.4.’e göre ilerlen ir. 
5.3.2.2.  Oksitlenmemiş numunelerin hidrolizi  29 
 Hazırlanan numuneden (5.1)  0,2 mg hassasiyetle 0,1 ile 1 g arasında 100 ya da 250 ml’lik yuvarlak tabanlı 
balona (4.1) ya da 100 ml’lik vidalı kapaklı şişeye (4.2) tartılır. Tartılan numune yaklaşık 10 mg’ lık bir azot 
içeriğine sahip olmalıdır. 25 ml hidroliz karışımı (3.20) dikkatlice eklenir ve numuneyle karıştırılır. 5.3.2.3 ya da 
5.3.2.4.’e göre işleme devam edilir.  
5.3.2.3.  Açık hidroliz  
Balondaki karışıma (5.3.2.1 ya da 5.3.2.2’ye göre hazırlanmış) 3  kaynama boncuğu eklenir ve geri soğutucu 
altında 23 saat boyunca sürekli kabartarak kaynatılır. Hidroliz tamamlandığında, yoğunlaştırıcı 5 ml sitrat 
tamponu (3.24) ile yıkanır. Cam balon ayırılır ve buz banyosu içinde soğutulur.  
 5.3.3.’e göre işleme deva m edilir.  
5.3.2.4.  Kapalı hidroliz  
5.3.2.1 ya da 5.3.2.2.’e göre hazırlanmış karışımı içeren şişe 110˚C’deki etüve (4.3)  yerleştirilir. İlk bir saat 
içinde basınç oluşumunu engellemek için (gaz halindeki maddelerin oluşumundan kaynaklanan) ve patlamayı 
önlemek için, şişenin üstüne vidalı kapak yerleştirilir. Şişe kapakla kapatılmamalıdır. Bir saatten sonra şişe 
kapak ile kapatılır ve etüv (4.3) içinde 23 saat boyunca bırakılır. Hidroliz tamamlandığında, şişe etüvden 
çıkarılır, şişenin kapağı dikkatlice aç ılır ve buz -su banyosuna yerleştirilir. Soğumaya bırakılır.  
pH ayarlama metoduna (5.3.3) bağlı olarak, hazırlanan kısım şişenin içeriği 250 ml’lik bir behere ya da 250 
ml’lik yuvarlak tabanlı bir balona sitrat tamponu (3.24) kullanarak aktarılır.   
 5.3.3.’ e göre işleme devam edilir.  
5.3.3. pH’ın ayarlanması  
Amino asit analizörünün (4.9) sodyum toleransına bağlı olarak pH ayarlaması için 5.3.3.1 ya da 5.3.3.2.’ye göre  
işleme devam edilir.  
5.3.3.1.  Düşük sodyum konsantrasyonu gerektiren kromatografik sistemler (4.9) için  
Düşük bir sodyum konsantrasyonu gerektiren amino asit analizörleri kullanıldığında (asit hacmi 
düşürüldüğünde), bir iç stok standardı (3.27.3) kullanılması önerilir.  
Bu durumda buharlaştırmadan önce hidrolizata 2 ml iç stok standardı (3.27.3) eklenir.  
Alınan hidrolizata 5.3.2.3 ya da 5.3.2.4’e göre 2 damla 1 -oktanol (3.15) eklenir.  
Rotary evaporatör (4.7) kullanarak hacim vakum altında 40˚C’de 5 -10 ml’ye düşürülür. Kazayla hacim 5 ml’nin 
altına düşürülürse, hidrolizat atılır ve analiz baştan başlatılır.  
Sodyum hidroksit çözeltisi (3.18) ile pH 2,20’ye ayarlanır ve paragraf 5.3.4’e göre işleme devam edilir.  
5.3.3.2.  Tüm diğer amino asit analizörleri için ( 4.9 )  
5.3.2.3 ya da 5.3.2.4.’e göre elde edilen hidrolizatlar alınır ve 17 ml sod yum hidroksit çözeltisi (3.17) 
karıştırılarak eklenir kısmen nötrleştilir, bu durumda sıcaklık 40˚C’ın altında olmalıdır.  
Oda sıcaklığında sodyum hidroksit çözeltisi (3.17) ve sonra diğer sodyum hidroksit çözeltisi (3.18) ekleyerek pH 
2,20’ye ayarlanır. 5 .3.4’e göre işleme devam edilir.  
5.3.4.  Kromatografi için numuneler  
pH’sı ayarlanmış hidrolizat (5.3.3.1 ya da 5.3.3.2) sitrat tamponu (3.24) ile birlikte 200 ml’lik balon jojeye 
aktarılır ve tamponla (3.24) işarete kadar tamamlanır.  30 
 İç standart henüz ku llanılmadıysa, 2 ml iç standart (3.27.3) eklenir ve sitrat tamponuyla (3.24) işarete kadar 
tamamlanır. İyice karıştırılır.  
Kromatografi basamağına (5.4) geçilir.  
 Numune çözeltileri aynı gün içinde incelenmeyecekse, 5˚C’nin altında saklanmalıdır.  
5.4.  Kromatografi  
Kromatografiden önce ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3.4) oda sıcaklığına getirilir, karışım çalkalanır ve uygun 
bir miktar 0,22 μm membran filtreden (4.5) süzülür. Elde edilen berrak çözelti, amino asit analizörü (4.9) 
kullanılarak iyon deği şim kromatografisine enjekte edilir.  
Enjeksiyon elle ya da otomatik olarak uygulanabilir. Bir iç standart kullanıldığı durumlar dışında standartlar ve 
numunelerin analizi için kolona aynı miktarda ± %  0,5 çözelti eklenmesi önemlidir ve standartlarla numune  
çözeltileri içindeki sodyum/amino asit oranları benzerdir.  
Genel olarak uygulanan kalibrasyon sıklığı ninhidrin ayıracının stabilitesine ve analitik sisteme bağlıdır. 
Numune amino asit pik alanının %  30-200’ü oranında bir standart pik alanı vermesi için standart ya da numune 
sitrat tamponu (3.24) ile seyreltilir.  
Amino asitlerin kromatografisi kullanılan analizör türüne ve kullanılan reçineye göre çok az değişim gösterebilir. 
Kullanılan sistem amino asitleri birbirinden ve diğer ninhidrin -pozitif materyal lerden ayırabilecek kapasitede 
olmalıdır. Çalışma aralığında kromatografik sistem, kolona eklenen amino asitlerin miktarlarındaki değişime 
doğrusal bir tepki vermelidir.  
Kromatografi basamağında; eşmolar bir çözelti (belirlenen aminoasitlerin) analiz edil diğinde aşağıda bahsedilen 
çukur/pik yükseklik oranları uygulanır. Bu eşmolar çözelti amino asit analizör sistemi (4.9) ile hassas bir 
biçimde ölçülebilecek olan her bir amino asidin en azından %  30’unu içermelidir.  
Treonin -serin ayırımı için kromatogramd aki iki çakışan amino asidin daha düşüğünün çukur:pik yüksekliği oranı 
2:10’u geçmemelidir. (Sistein, metiyonin, treonin ve lizin belirlenecekse, birleşik piklerden kaynaklanan yetersiz 
ayırım belirlemeyi olumsuz etkiler). Tüm diğer amino asitlerin ayırımı  1:10’dan daha iyi olmalıdır.  
Sistemde lizinin, lizin benzeri maddelerden ve ornitinden ayrıldığına emin olunmalıdır.  
6.  Sonuçların Hesaplanması  
Numune ve standart pik alanları her bir amino asit için ayrı ayrı ölçülür ve miktar(X), her bir kilograma düşe n 
amino asit miktarı g olarak aşağıdaki gibi hesaplanır:  
  
Bir iç standart kullanılacaksa D/C ile çarpılır.  
A = Pik alanı, hidrolizat ya da ekstrakt  
B = Pik alanı, kalibrasyon standart çözeltisi  
C = Pik alanı, hidrolizat ya da ekstrakt içinde iç standart  
D = Pik alanı, iç standart, kalibrasyon standart çözeltisi  
M = Belirlenen amino asidin mol ağırlığı  
c = μmol/ml cinsinden standardın yoğunluğu  
31 
 m = Numune ağırlığı (g) (kurutulmuşsa ya da yağı ç ıkarılmışsa orijinal ağırlığına göre düzeltilmelidir)  
V = Toplam hidrolizat (5.3.4) ya da ekstraktın ml cinsinden hesaplanan toplam seyrelti hacmi (6.1)  
Hem sistin hem de sistein, oksitlenmiş numunenin hidrolizatlarındaki sisteik asit olarak belirlenir, an cak mol 
ağırlığı M =120,15 g/mol (= 0,5 x 240,30 g/mol) kullanılarak sistin olarak hesaplanır ( (C6H12N2O4S2, M 240,30 
g/mol)  
Oksitlenmiş numunenin hidrolizatlarındaki metiyonin, metiyonin sülfon olarak belirlenir, ancak metiyoninin mol 
ağırlığı M’149,21 g/  kullanılarak metiyonin olarak hesaplanır.  
Metiyonin ekstraksiyonundan sonra ilave edilen  serbest metiyonin belirlenir hesaplanması için aynı mol ağırlık 
kullanılır.  
6.1.  Serbest amino asitlerin (5.2) belirlenmesi için ekstraktların (F) toplam seyrelti h acmi aşağıdaki gibi 
hesaplanır:  
  
V = Nihai ekstraktın hacmi  
7.  Meto dun değerlendirilmesi  
Metot  dört farklı yem ( domuz yemi, etlik piliç  yemi , protein konsantresi,  premix ) kullanılarak 1990 yılında 
uluslar arası düzeyde yapılan döngülü karşılaştırılma  içinde test edilmiştir. Aykırı değerlerin elemesinden sonra; 
sonuçların anlamı ve standart sapma aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
Referans materyal  Amino Asit  
Treonin  Sist(e)in  Metionin  Lisin 
Domuz yemi  6,94 
n = 15  3,01 
n = 17  3,27 
n = 17  9,55 
n = 13  
Etlik Piliç Yemi  9,31 
n = 16  3,92 
n = 18  5,08 
n = 18  13,93  
n = 16  
Protein konsantresi  22,32  
n = 16  5,06 
n = 17  12,01  
n = 17  47,74  
n = 15  
Premiks  58,42  
N = 16  — 90,21  
n = 16  98,03  
n = 16  
n= Katılan laboratuvar  sayısı  
 
7.1.  Tekrar edilebilirlik   
Yukarıda belirtilen döngülü karşılaştırma ile elde edilen laboratuvar  içi  standart sapma için elde edilen sonuçlar 
aşağıdaki tabloda verişlmiştir  
 
32 
 Laboratuvar  İçi Standart Sapma ( Sr) g/kg olarak  
Referans materyal  Amino Asit  
Treonin  Sist(e)in  Metionin  Lisin  
Domuz yemi  0,13 
n = 15  0,10 
n = 17  0,11 
n = 17  0,26 
n = 13  
Etlik Piliç Yemi  0,20 
n = 16  0,11 
n = 18  0,16 
n = 18  0,28 
n = 16  
Protein konsantresi  0,48 
n = 16  0,13 
n = 17  0,27 
n = 17  0,99 
n = 15  
Premiks  1,30 
N = 16  — 2,19 
n = 16  2,06 
n = 16  
n= Katılan laboratuvar  sayısı   
 
Laboratuvar  İçi Standart Sapma ( Sr) için Varyasyon  Katsayısı (%) 
Referans materyal  Amino Asit  
Treonin  Sist(e)in  Metionin  Lisin  
Domuz yemi  1,9 
n = 15  3,3 
n = 17  3,4 
n = 17  2,8 
n = 13  
Etlik Piliç yemi  2,1 
n = 16  2,8 
n = 18 3,1 
n = 18  2,1 
n = 16  
Protein konsantresi  2,7 
n = 16  2,6 
n = 17  2,2 
n = 17  2,4 
n = 15  
Premiks  2,2 
N = 16  — 2,4 
n = 16  2,1 
n = 16  
n= Katılan laboratuvar  sayısı  
 
7.2  Tekrar üretilebilirlik  
Yukarıda belirtilen döngülü karşılaştırma ile elde edilen  laboratuvarlar arası standart sapma için elde edilen 
sonuçlar aşağıdaki tabloda verişlmiştir.  
 Laboratuvarlar arası Standart Sapma (S R) g/kg  33 
 Referans materyal  Amino Asit  
Treonin  Sist(e)in  Metionin  Lisin  
Domuz yemi  0,28 
n = 15  0,30 
n = 17  0,23 
n = 17  0,30 
n = 13  
Etlik Piliç yemi  0,48 
n = 16  0,34 
n = 18  0,55 
n = 18  0,75 
n = 16  
Protein Konsantresi  0,85 
n = 16  0,62 
n = 17  1,57 
n = 17  1,24 
n = 15  
Premi ks 2,49 
n = 16  — 6,20 
n = 16  6,62 
n = 16  
n= Katılan laboratuvar  sayısı  
 
Laboratuvar lar Arası   Standart Sapma  (SR) için Varyasyon Katsayısı (%)  
Referans materyal  Amino Asit  
Treonin  Sist(e)in  Metionin  Lisin  
Domuz yemi  4,1 
n = 15  9,9 
n = 17  7,0 
n = 17  3,2 
n = 13  
Etlik Piliç Yemi  5,2 
n = 16  8,8 
n = 18  10,9 
n = 18  5,4 
n = 16  
Protein konsantresi  3,8 
n = 16  12,3 
n = 17  13,0 
n = 17  3,0 
n = 15  
Premiks  4,3 
N = 16  — 6,9 
n = 16  6,7 
n = 16  
n= Katılan laboratuvar  sayısı  
 
8.  Referans materyallerin kullanımı  
Meto dun doğru uygulanması; erişilebildiği noktalarda onaylı referans materya llerin çoklu öl çümünün 
yapılmasıyla sınanmalıdır. Kalibrasyonun; onaylı amino asit kalibrasyon çözeltisiyle yapılması önerilir.  
9.   Gözlemler  34 
 9.1.  Amino asit analizörleri arasındaki farklardan ötürü; standart amino asitlerin (bakınız 3.27.4 ve 3.27.5) ve 
hidrolizatların  (bakınız 5.3.4) kalibrasyon çözeltilerinin son konsantrasyonları kılavuz olarak alınmalıdır.  
Cihazların lineer tepkilerinin aralığı tüm amino asitler için kontrol edilmelidir.  
Standart çözelti; aralığın ortasındaki tepe alanlarını vermesi için sitrat tamp onu ile seyreltilir.  
9.2. Yüksek performans sıvı kromatografik donanımların hidrolizatların analizinde kullanıldığı yerlerde, 
deneysel koşullar üreticinin önerilerine göre optimize edilmelidir.  
9.3. %  1’den fazla klorit içeren yemlere (konsantre, mineral yemleri, ilave yemler) Meto dun uygulanmasıyla, 
metioninin eksik tahmin edilmesi durumu oluşabilir ve özel uygulama yapılmak zorundadır.  
F.  TRİPTOFAN TAYİNİ   
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot, yemdeki toplam ve serbest triptofan miktarını belirlemek içindir. D - ve L- formları arasında bir ayrım 
yapmaz.  
2.  Prensip  
Toplam triptofan tayini için numune, alkali koşullar altında doymuş baryum hidroksit çözeltisi ile hidrolize edilir 
ve 20 saat boyunca 110°C’ye ısıtılır. Hidrolizden sonra iç standart eklenir.  
 Serbest  triptofan tayini için numune, iç standardın varlığında hafif asidik koşullar altında ekstrakte edilir.  
Hidrolizatın ya da ekstraktın içinde triptofan ve iç standart, HPLC flüoresan dedektör ile tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  İki kere distile edilmiş s u ya da eşdeğer nitelikte su kullanılmalıdır (iletkenlik < 10 μS/cm)  
3.2.  Standard madde: Triptofan (saflık/içerik ≥ %  99) fosfor pentoksit ile vakum altında kurutulmuş  
3.3. İç standart madde: α -metil -triptofan (saflık/içerik ≥ %  99), fosforlu pentoksit ile vakum altında kurutulmuş  
3.4.  Baryum hidroksit okta -hidrat (tayini bozabilecek BaCO 3 oluşumunu önlemek amacıyla havaya yüksek  
Ba(OH) 2 .8H 2O açığa çıkmaması için gerekli önlemler alınacaktır) (bakınız gözlem 9.3)  
3.5.  Sodyum hidroksit  
3.6.  Orto-fosforik asit, w (a/a) = %  85 
3.7.  Hidroklorik asit, ρ 20 1,19 g/ml  
3.8.  Metanol, HPLC kalitesine eşdeğer  
3.9.  Petrol eteri, kaynama aralığı 40 - 60°C  
3.10.  Sodyum hidroksit çözeltisi, c = 1 mol/l,  
40,0 g NaOH (3.5) su içinde çözdürülür ve su ile 1  litreye tamamlanır (3.1)  
3.11.  Hidroklorik asit, c = 6 mol/l, 492 ml HCl (3.7) alınır ve su ile 1 litreye tamamlanır.  
3.12.  Hidroklorik asit, c = 1 mol/l, 82 ml HCl (3.7) alınır ve su ile 1 litreye tamamlanır.  
3.13.  Hidroklorik asit, c = 0,1 mol/l, 8,2  ml HCl (3.7) alınır ve su ile 1 litreye tamamlanır.  35 
 3.14.  Orto-fosforik asit, c = 0,5 mol/l,  
34 ml orto -fosforik asit (3.6) alınır ve su ile 1 litreye tamamlanır. (3.1)  
3.15.  Konsantre triptofan çözeltisi (3.2), c = 2,50 μmol/ml,  
500 ml’lik balon joje de 0,2553 g triptofan (3.2) hidroklorik asit (3.13) içinde çözündürülür ve işarete kadar 
hidroklorik asit (3.13) ile tamamlanır.  
- 18°C’de en fazla 4 hafta saklanır.  
3.16. Konsantre iç standart çözeltisi, c = 2,50 μmol/ml,  
500 ml’lik balon jojede 0,2728 g α-metil -triptofan (3.3) hidroklorik asit (3.13) içinde çözündürülür ve işarete 
kadar hidroklorik asit (3.13) ile tamamlanır. - 18°C’de en fazla 4 hafta saklanır.  
3.17.  Triptofan ve iç standardın kalibrasyon standart çözeltisi,  
2,00 ml konsantre triptof an çözeltisi (3.15) ve 2,00 ml konsantre iç standart (α -metil -triptofan) çözeltisi (3.1 6) 
alınır. Bitmiş hidrolizatta aynı hacimde ve aynı metanol konsantrasyonunda (%  10 - % 30) olacak şekilde eşit 
hacimdeki su (3.1) ve metanol (3.8) ile seyreltilir. Bu ç özelti kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır. 
Hazırlama sırasında doğrudan güneş ışığından korunmalıdır.  
3.18.   Asetik asit  
3.19.  1,1,1 -trikloro -2-metil -2-propanol  
3.20.  Etanolamin w (a/a) > %  98 
3.21.  100 ml metanol (3.8) içinde 1 g 1,1,1 -trikloro -2-metil -2-propanol (3.19) çözeltisi  
3.22.  HPLC için mobil faz: 3,00 g asetik asit (3.18) + 900 ml su (3.1) + metanol (3.8) içinde 50,0 ml 1,1,1 -
trikloro -2-metil -2-propanol (3.19) çözeltisi (3.21) (1g/100ml). Etanolamin (3.20) kullanarak pH’ı 5,00 ’a 
ayarlanır. Su ile 1000 ml’ye tamamlanır (3.1)  
4.  Cihaz  
4.1.  Spektroflorometrik detektörlü HPLC ekipmanı  
4.2.  Sıvı kromatografik kolon, 125 mm x 4 mm, C 18, 3 μm dolgu ya da eşdeğeri  
4.3.  pH metre  
4.4.  Polipropilen erlen, 125 ml kapasiteli, geniş boyunlu ve vidalı kapaklı  
4.5.  Membran filtre, 0,45 μm  
4.6.  Otoklav, 110 (± 2)°C, 1,4 (± 0,1) bar  
4.7.  Mekanik çalkalayıcı ya da manyetik karıştırıcı  
4.8.  Vorteks karıştırıcı  
5.  Metot  
5.1.  Numunelerin hazırlanması  36 
 Numune 0,5 mm elekten geçecek şekild e öğütülür. Nem içeriği yüksek numuneler en fazla 50°C sıcaklıkta hava 
kurutulmalı etüvde ya da öğütülmeden önce dondurularak kurutulmalıdır. Yüksek yağ içerikli numuneler 
öğütülmeden önce petrol eteri (3.9) ile ekstrakte edilecektir.  
5.2.  Serbest triptof an tayini (ekstrakt)  
Hazırlanmış numuneden (5.1) uygun bir miktar (1 -5 g) 1 mg hassasiyetle erlene tartılır. 100,0 ml hidroklorik asit 
(3.13) ve 5,00 ml konsantre iç standart çözelti (3.16) eklenir. Mekanik bir çalkalayıcı ya da manyetik bir 
karıştırıcı (4 .7) kullanarak 60 dakika boyunca çalkalanır ya da karıştırılır. Çökeltinin çökmesi beklenir ve 10,0 
ml’lik süpernatant çözelti pipetle bir behere alınır. 5 ml orto -fosforik asit (3.14) eklenir. Soydum hidroksit (3.10) 
kullanarak pH 3’e ayarlanır. Nihai hac imde %  10 ila %  30 arasında bir metanol konsantrasyonu elde etmek için 
yeteri kadar metanol (3.8) eklenir. Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarılır ve su ile kromatografi için gereken 
bir hacme seyreltilir (Yaklaşık olarak kalibrasyon standart çözeltisiy le (3.17) aynı hacimde).  
HPLC kolonuna enjeksiyondan önce 0,45 μm’lik bir membran filtresinden (4.5) birkaç ml çözelti süzülür. 5.4.’e 
uygun şekilde kromatografi işleme devam edilir.  
Standart çözelti ve ekstraktlar doğrudan güneş ışığından korunur. Ekstrak tların aynı gün analizi mümkün değilse, 
ekstraktlar 5°C’de en fazla 3 gün saklanabilir.  
5.3.  Toplam triptofan tayini (hidrolizat)  
Hazırlanmış numuneden (5.1) 0,1 ila 1 g’ı 0,2 mg hassasiyetle polipropilen malzemeye (4.4) tartılır. Tartılan 
numune kısmında  yaklaşık 10 mg azot içeriği olmalıdır. 8,4 g baryum hidroksit okta -hidrat (3.4) ve 10 ml su 
eklenir. Bir vorteks karıştırıcıda (4.8) ya da mekanik karıştırıcıda (4.7) karıştırılır. Teflon kaplanmış mıknatıs 
karışım içinde bırakılır. Kabın duvarları 4 ml s u ile yıkanır. Vidalı kapağı takılır ve balon joje gevşekçe kapatılır. 
Kaynayan su içeren bir otoklava (4.6) aktarılır ve 30 -60 dakika buhar verilir. Otoklav kapatılır ve 110 (± 2)°C’de 
20 saat boyunca otoklavlanır.  
Otoklavı açmadan önce sıcaklığı 100°C’ni n biraz altına düşürülür. Ba(OH) 2 · 8 H 2O kristalleşmesini önlemek 
için sıcak karışıma oda sıcaklığında 30 ml su eklenir. Yavaşça çalkalanır ya da karıştırılır. 2,00 ml konsantre iç 
standart (α -metil -triptofan) çözeltisi (3.16) eklenir. Kaplar su/buz banyo sunda 15 dakika soğutulur.  
 Ardından 5 ml orto -fosforik asit (3.14) eklenir. Kap soğutucu banyoda tutulur ve HCl (3.11) ile nötrleştirilir, bu 
sırada karıştırılır ve HCl (3.12) kullanılarak pH’ı 3,0’e ayarlanır.  Nihai hacimde %  10 ila %  30 arasında bir 
metanol konsantrasyonu elde etmek için yeteri kadar metanol eklenir. Uygun hacimdeki bir balon jojeye aktarılır 
ve su ile kromatografi için gereken tanımlanmış hacme (örneğin 100 ml) seyreltilir. Metanolün eklenmesi 
çökeltiye neden olmayacaktır.  
HPLC kolonu na enjeksiyondan önce birkaç ml çözelti 0,45 μm’lik bir membran filtresinden (4.5) süzülür. 5.4’e 
uygun şekilde kromatografi adımına geçilir.  
Standart çözelti ve hidrolizatları doğrudan güneş ışığından korunur. Hidrolizatların aynı gün analizi mümkün 
değil se, 5°C’de en fazla 3 gün saklanabilirler.  
 
5.4.  HPLC tayini  
Aşağıdaki izokratik elüsyon koşulları rehber olarak sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla başka 
koşullar da kullanılabilir (bakınız gözlemler 9.1 ve 9.2):  
 
 37 
  
6.  Sonuçların hesaplanması  
100g numune başına g cinsinden triptofan miktarı (X) aşağıdaki gibi hesaplanır:  
X = (A x B x V 1 x c x V 2 x M) / (C x D x V 3 x 10 000 x m)  
A = İç standardın pik alanı, kalibrasyon standardı çözeltisi (3.17)  
B = Triptofan pik alanı, ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3)  
V1 = Kalibrasyon çözeltisine (3.17) eklenen konsantre triptofan çözeltisinin (3.15) ml cins inden hacmi (2 ml)  
c = Kalibrasyon çözeltisine (3.17) eklenen konsantre triptofan çözeltisinin (3.15) μmol/ml cinsinden 
konsantrasyonu (= 2,50)  
V2 = Ekstraksiyonda (= 5,00 ml) (5.2) hacmi ya da hidrolizata (= 2,00 ml) (5.3) eklenen konsantre iç standart 
çözeltisinin (3.16) ml cinsinden  
C = İç standardın pik alanı, ekstrakt (5.2) ya da hidrolizat (5.3)  
D = Triptofanın pik alanı, kalibrasyon standardı çözeltisi (3.17)  
V3 = Kalibrasyon standart çözeltisine (3.17) eklenen konsantre iç standardı çözeltisinin (3 .16) ml cinsinden 
hacmi (= 2,00 ml)  
m = g Cinsinden numune ağırlığı (kurutulmuş ve/veya yağı alınmışsa orijinal ağırlığa göre düzeltilmiş)  
M = Triptofanın mol ağırlığı (= 204,23 g/mol)  
7.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları  arasındaki fark en yüksek sonucun %  10’unu geçmemelidir.  
8. Bir ortak araştırmanın sonuçları  Sıvı kromatografik kolon ( 4.2): 125 mm x 4 mm, C 18, 3 μm dolgu ya da eşdeğeri  
Kolon sıcaklığı:  Oda sıcaklığı  
Mobil faz (3.22):  3,00 g  asetik asit (3.18) + 900 ml su (3.1) + metanol içinde 
(3.8) 50,0 ml 1,1,1 -trikloro -2- metil -2 propanol (3.19) 
çözeltisi (3.21) (1 g/100 ml). Etanolamin (3.20) kullanarak 
pH 5,00’e ayarlanır. Su ile 1000 ml’ye tamamlanır (3.1)  
Akış hızı:  1 ml/dak.  
Toplam  çalışma süresi:  Yaklaşık 34 dak.  
Tespit dalga boyu:  eksitasyon: 280 nm, emisyon: 356 nm.  
Enjeksiyon hacmi:   20 μl  38 
 Hidroliz Meto dunu  onaylamak için 12 kadar laboratuvar  tarafından üç numuneyin analiz edildiği bir Avrupa 
Komisyonu ortak çalışması (4. Döngülü karşılaştırma) organize edilmiştir. Her bir numune üzerinde Eş (5) 
analiz gerçekleştiril miştir.  Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
 Numune  1 
Domuz yemi  Numune  2 
L-Triptofan  ile takviye 
edilmiş  
domuz yemi  Numune  3 
Domuzlar için konsantre yem  
L 
n 
Ortalama [g/kg]  
sr [g/kg]  
r [g/kg]  
CV r [%] 
SR [g/kg]  
R [g/kg]  
CV R [%] 
 12 
50 
2,42 
0,05 
0,14 
1,9 
0,15 
0,42 
6,3 
 12 
55 
3,40 
0,50 
0,14 
1,6 
0,20 
0,56 
6,0 
 12 
50 
4,22 
0,08 
0,22 
1,9 
0,09 
0,25 
2,2 
 
 
L = sonuç  veren laboratuvar   sayısı  
n = aykırı değerleri elimine eden tutulmuş tekil sonuçların sayısı (Cochran, Dixon aykırı sonuç testine göre 
belirlenmiş)  
sr = Tekrar  edilebilirliğin  standart sapması  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
r = Tekrar edilebilirlik  
R = Tekrar üretilebilirlik  
CV r = Tekrar  edilebilirliğin  değişim katsayısı, %  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim katsayısı, %  
Serbest triptofanın özütlenmesini onaylamak için 13 kadar laboratuvar  tarafından iki numune nin analiz edildiği 
başka bir Avrupa Komisyonu ortak çalışması (3. Döngülü karşılaştırma) o rganize edilmiştir. Her bir numune 
üzerinde Eş (5) analiz gerçekleştirildi. Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
 
 39 
  Numune  5 
Buğday ve soya karışımı  Numune  6 
Triptofan  (0,457g/kg1) ilave edilmiş 
buğday ve soya karışımı  
L 
n 
Ortalama [g/kg]  
sr [g/kg]  
r [g/kg]  
CV r [%] 
SR [g/kg]  
R [g/kg]  
CV R [%] 
 12 
59 
0,391  
0,005  
0,014  
1,34 
0,018  
0,050  
4,71 
 12 
60 
0,931  
0,012  
0,034  
1,34 
0,048  
0,134  
5,11 
 
 
L = sonuç  veren laboratuvar  sayısı  
n = aykırı değerleri elimine eden tutulmuş tekil sonuçların sayısı (Cochran, Dixon aykırı sonuç testine göre 
belirlenmiş)  
sr = Tekrar  edilebilirliğin  standart sapması  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
r = Tekrar edilebilirlik  
R = Tekrar üretilebilirlik  
CV r = Tekrar  edilebilirliğin  değişim katsayısı, %  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim katsayısı, %  
Hidroliz için bir triptofan onaylanması amacı ile 7 kadar laboratuvar  tarafından dört numune nin analiz edildiği 
başka bir Avrupa Komisyonu  ortak çalışması (3. Döngülü karşılaştırma) organize edilmiştir. Her bir numune 
üzerinde Eş (5) analiz gerçekleştirildi. Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
 
 
 
 
 
 40 
  Numune  1 
Domuz yemi  
(CRM 117)  Numune  2 
Düşük yağ oranlı 
balık yemi  
(CRM 118)  Numune  3 
Soya fasulyesi  
(CRM 119)   Numune  4 
Yağsız süt tozu  
(CRM 120)  
L 
n 
Ortalama [g/kg]  
sr [g/kg]  
r [g/kg]  
CV r [%] 
SR [g/kg]  
R [g/kg]  
CV R [%] 
 7 
25 
2,064  
0,021  
0,059  
1,04 
0,031  
0,087  
1,48 
 7 
30 
8,801  
0,101  
0,283  
1,15 
0,413  
1,156  
4,69 
 7 
30 
6,882  
0,089  
0,249  
1,30 
0,283  
0,792  
4,11 
 7 
30 
5,236  
0,040  
0,112  
0,76 
0,221  
0,619  
4,22 
 
L = sonuç veren laboratuvar  sayısı  
n = aykırı değerleri elimine eden tutulmuş tekil sonuçların sayısı (Cochran, Dixon aykırı sonuç testine göre 
belirlenmiş)  
sr = Tekrar  edilebilirliğin  standart sapması  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
r = Tekrar edilebilirlik  
R = Tekrar üretilebilirlik  
CV r = Tekrar  edilebilirliğin  değişim katsayısı, %  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin ğin değişim katsayısı, %  
 
9.  Gözlemler  
9.1. Aşağıdaki özel kromatografik koşullar triptofan ile α -metiltriptofan arasında daha iyi bir ayırım sunabilir.  
Gradyan kolonu temizlemesiyle elde edilen izokratik elüsyon:  
 
 
 
 41 
 Sıvı kromatografik kolon:   125 mm x 4 mm, C 18, 5 μm dolgu ya da eşdeğeri  
 
kolon sıcaklığı:  32°C  
Mobil faz:  A: 0,01 mol/l KH 2PO 4/metanol, 95+5 (H+H).  
B:  metanol  
 
Gradyan programı:  0 dak.  % 100 A  % 0 B 
15 dak.  
  % 100 A  % 0 B 
17 dak.  % 60 A   % 40 B  
19 dak  % 60 A  % 40 B  
21 dak.  % 100 A  % 0 B 
33 dak.  % 100 A  % 0 B 
Akış hızı:  1,2 ml/dak.  
Toplam çalışma süresi:  yaklaşık 33 dak.  
 
9.2.  Kromatografi HPLC türüne ve kullanılan kolon dolgu materyaline göre değişecektir .Seçilen sistem, 
triptofan ile iç standart arasındaki kromatografik ayrım verebilmelidir. Ayrıca parçalanma ürünlerinin  triptofan 
ve iç standardından iyi ayrılması da önemlidir. Safsızlıklar için iç standart altında temel çizgiyi denetlemek 
amacıyla iç standart içermeyen hidrolizatlar çalıştırılacaktır. Çalışma süresinin, tüm parçalanma ürünlerinin 
elüsyonu için yeterince uzun olması önemlidir, aksi halde geç elüsyon pikleri sonraki kromatografik 
çalıştırmaları etkileyebilir.  
İşlem süresince kromatografik sistem doğrusal bir yanıt verecektir. Doğrusal yanıt sabit (normal) bir iç standart 
konsantrasyonu ve değişen triptofan konsantrasyonları ile ölçülecektir. Hem triptofan hem de iç standart 
piklerinin boyutlarının, HPLC/flüoresans sisteminin doğrusal aralığı aralığında olması önemlidir. Triptofan 
ve/veya iç standart pik(ler)i çok küçük ya da çok büyükse analiz başka bir numu ne boyutu ve/veya değiştirilmiş 
bir nihai hacim ile yinelenecektir.  
9.3.  Baryum hidroksit  
Zamanla baryum hidroksitin çözünmesi zorlaşır. Bu durum HPLC tayini için, düşük triptofan sonuçları 
üretebilecek bulanık bir çözeltiye yol açar.  
G.  HAM KATI VE SIVI  YAĞLARIN BELİRLENMESİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yem içindeki ham katı ve sıvı yağların belirlenmesi için kullanılır. Bu; yağlı tohumların ve yağlı 
meyvelerin analizlerini kapsamaz. Aşağıda tanımlanmış olan iki metot; yemin doğasına ve bileşimine ve yap ılan 
analizinin yapılış nedenine bağlıdır.  42 
 1.1.    Metot A — Doğrudan ekstrakte edilebilen ham katı ve sıvı yağlar  
Bu metot; Metot B kapsamında olanlar hariç bitki kökenli yem maddeleri için uygulanabilir.  
1.2.  Metot B — Toplam  ham katı ve sıvı yağlar  
Bu metot; hayvansal kökenli yem maddeleri ve tüm karma yemler için uygulanabilir. Bu metot; ön bir hidroliz 
yapılmadan sıvı ve katı yağları ekstrakte edilemeyen tüm yemler için kullanılır (örneğin glutenler, maya, patates 
proteinleri ve ekstrüzyon, ezme ve ıs ıtma gibi işlemlerden geçirilmiş ürünler).  
1.3.  Sonuçların yorumlanması  
Metot B’ nin Metot A’ dan daha yüksek sonuç verdiği tüm durumlarda, Metot B’ den elde edilen sonuç doğru 
değer olarak kabul edilmelidir.  
2.  Prensip  
2.1.  Metot A  
Numune petrol eteri ile ekstrakte edilir. Çözücü damıtılır, kalıntı kurutulur ve tartılır.  
2.2.  Metot B  
Numune; hidroklorik asitle ısı altında işlem görür. Karışım soğutulur ve süzülür. Kalıntı yıkanır ve kurutulur ve  
Metot A’ ya göre işleme devam edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Petrol eteri, kaynama aralığı: 40 - 60°C. Brom değeri 1’ den düşük olmalı ve buharlaşmadaki kalıntı 2 
mg/100 ml’den az olmalıdır.  
3.2.  Sodyum sülfat, susuz  
3.3.  Hidroklorik asit, c = 3 mol/l  
3.4.  Filtrasyon yardımcı malzemesi, örneğin Kieselguhr, Hyfl o-supercel  
4.  Cihazlar  
4.1. Ekstraksiyon cihazı. Eğer Ekstraksiyon cihazı sifonluysa (Soxhlet cihazı), geri akış oranı; saatte yaklaşık 10 
dönüş oluşturacak kadar olmalıdır; eğer sifonsuz tipse, dakikada yaklaşık 10 ml geri akım oluşturacak kadar 
olmalıdır.  
4.2.  Ekstraksiyon, kartuşu, petrol eteri içinde çözülebilen madde içermeyen ve madde 4.1’de belirtilen gözenekli 
sahip  
4.3.  Etüv, ya 75 ± 3°C’de vakum etüv seti ya da 100 ± 3°C’de hava etüvü  
5.  Metot  
5.1.  Metot A (bakınız madde 8.1)  
5 g örnek, 1 mg hassasiyetle tartılıp bir Ekstraksiyon kartuşuna (4.2) aktarılır ve yağsız bir hidrofil pamuk ile 
kapatılır.  43 
 Kartuş bir ekstraktöre yerleştirilir (4.1) ve 6 saat boyunca petrol eteri ile ekstrakte edilir (3.1). Petrol eteri 
ekstraktı; kuru, tar tılmış ve sünger taşı parçaları içeren bir balona toplanır.(5 ) Çözücü damıtılır. Balon ve içinde 
kalanlar  bir buçuk saat boyunca etüvde tutarak kurutulur (4.3).  Bir desikatörün içinde soğumaya bırakılır ve 
tartılır. Ölçülen Katı ve sıvı yağların ağırlığı sabitlenene kadar 30 dakika boyunca tekrar tekrar kurutulur 
(birbirini izleyen bu iki tartım arasındaki fark 1mg’dan az ya da 1 mg’ a eşit olmalıdır).   
5.2.  Metot B  
2,5 g örnek, 1 mg hassasiyetle tartılıp (bakınız madde 8.2), 400ml’lik bir behere ya da 30 0 ml’lik bir konik cam 
balona yerleştirilir ve 100 ml hidroklorik asit (3.3) ve sünger taşı parçaları eklenir. Beher bir saat camı ile 
kapatılır ya da konik cam balonu bir geri -soğutucuya yerleştirilir. Karışım düşük ateş ya da ısıtıcı üzerinde 
yavaşça kay namaya getirilir ve bir saat boyunca orda tutulur. Ürünün; kabın duvarlarına yapışmasına izin 
verilmemelidir.  
Soğutulur ve süzme sırasında hiç katı ya da sıvı yağ kaybı olmamasına yetecek kadar süzme desteği eklenir  
(3.4). Nemlendirilmiş, yağsız iki katlı süzgeç kâğıdı ile süzülür. Kalanlar; nötr bir süzüntü elde edene kadar 
soğuk su ile yıkanır. Süzüntünün herhangi bir katı ya da sıvı yağ içermediği kontrol edilir. Katı ya da sıvı 
yağların varlığı; hidrolizden önce örneğin Metot A kullanılarak petrol eter  ile ekstrakte edilmesi gerektiğini 
gösterir.  
Kalıntıları içeren iki katlı süzgeç kağıdını bir saat camı üzerine yerleştirilir ve hava üflemeli etüvde (4.3) bir 
buçuk saat boyunca 100 ± 3°C’ de kurutulur.  
Kalıntıları içeren iki katlı süzgeç kağıdı bir Ekstr aksiyon kartuşuna (4.2) yerleştirilir ve yağsız bir hidrofil 
pamuğu ile kapatılır. Kartuş ekstraksiyon ünitesinin (4.1) içine yerleştirilir ve madde 5.1’ in ikinci ve üçüncü 
paragraflarında belirtildiği şekilde ilerlenir.  
6.  Sonuçların gösterilmesi  
Kalınt ının ağırlığı numunenin yüzdesi olarak gösterilir.  
7.  Tekrar edilebilirlik  
Analizi yapan aynı kişi ve aynı numune üzerinde yapılan 2 paralel ölçümünün sonuçları arasındaki fark:  
- % 5’ ten az ham katı ya da sıvı yağ içeriği olanlar için mutlak değerde %  0,2’ den,  
- İçerikleri %  5 ile %  10 arasındaki için en yüksek sonuçlara göre bağıl olarak %  4,0’ dan,  
- İçerikleri %  10’dan fazla olanlar için mutlak değer olarak %  0,4’ ten fazla olmamalıdır . 
 
8.  Gözlemler  
8.1.  Parçalaması zor olan ya da homojen bir numuney e dönüştürülmesi zor olan yüksek katı ve sıvı yağ içeriğine 
sahip olan ürünler için aşağıdaki gibi ilerlenir.  
20 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır ve 10 g ya da daha fazla anhidre (susuz) sodyum sülfat (3.2) ile 
karıştırılır. Madde 5.1’de belirtildiği gi bi petrol eteri (3.1) ile ekstrakte edilir. Elde edilen ekstrakt petrol eteri 
(3.1) ile 500 ml’ ye tamamlanır ve karıştırılır. 50 ml çözelti alınır ve kurutulmuş tartılmış ve süngertaşı parçaları 
içeren cam balona yerleştirilir. Çözücü damıtılıp, kurutulur  ve madde 5.1’in son paragrafında belirtildiği gibi 
ilerlenir.  
Kartuş içinde kalan kalıntılardan çözücü ayırılır, kalıntılar 1 mm’lik incelikte parçalanıp, tekrar kartuşun içine 
alınır (sodyum sülfat eklenmez) madde 5.1’ in ikinci ve üçüncü paragraflarında  belirtildiği şekilde ilerlenir.  
Aşağıdaki formülü kullanarak katı ve sıvı yağ içeriğinin numunedeki yüzdesini hesaplanır:  
                                                           
(5) Katı ve sıvı yağların kalite testine girmesi gerektiğ i durumlarda, süngertaşı parçaları yerine cam boncuklar kullanılır.  44 
 (10m 1 + m 2) × 5  
m1 = İlk ekstraksiyondan sonraki kalıntının gram cinsinden ağırlığı (ekstraktın sıvı kısmı),  
m2 = İkinci ekstraktraks iyondan sonraki kalıntının gram cinsinden ağırlığı.  
8.2.   Katı ve sıvı yağ oranı düşük ürünlerde test numunelerinin ağırlığı 5 g’a çıkarılabilir.  
8.3.  Yüksek miktarda su içeren pet hayvan yemlerinin; her bir Metot B’de hidroliz ve ekstraktsiyon işleminde n 
önce susuz sodyum sülfat ile karıştırılması gerekebilir.  
8.4.   Paragraf 5.2’de; süzdükten sonra soğuk su yerine sıcak su ile yıkama yapmak daha etkili olabilir.  
8.5.  Bazı yemler için kurutma süresi olan 1,5 saatin uzatılması gerekebilir. Düşük sonuçlara sebep olmamak için 
aşırı kurutmadan kaçınılmalıdır. Mikrodalga etüv de kullanılabilir.  
8.6.   Eğer ham katı ya da sıvı yağ oranı %  15’ten yüksek ise; Metot A için ön -ekstraksiyon ve Metot B için 
tekrar -ekstraksiyon önerilir. Bu durum yemdeki katı/sıvı yağın yapısına ve yemin bileşimine bağlıdır.  
Ğ.  HAM SELÜLOZ TAYİNİ    
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemlerde ham selüloz miktarının belirlenmesini mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Gerekli ise yağı alınmış numune, belirli yoğunluktaki sülfürik asit ve pot asyum hidroksit çözeltileriyle ile arka 
arkaya kaynatılır. Kalıntı; sinterlenmiş cam filtre üzerinde süzülerek ayrılır, yıkanır, kurutulur, tartılır ve 475 ile 
500°C aralığında yakılır. Yanma sonunda oluşan ağırlık kaybı, numunedeki ham selüloz miktarına k arşılık gelir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Sülfürik asit, c = 0,13 mol/l  
3.2.  Köpük engelleyici madde (örneğin, n -oktanol)  
3.3.  Filtre yardımcı malzemesi (Celite 545 ya da eşdeğeri) dört saat boyunca 500°C’de yakılmış, (8.6)  
3.4.  Aseton  
3.5.  Petrol eteri, kayn ama aralığı 40 ile 60°C olan  
3.6.  Hidroklorik asit, c = 0,5 mol/l  
3.7.  Potasyum hidroksit çözeltisi, c = 0,23 mol/l  
4.  Cihazlar  
4.1. Sülfürik asit ve potasyum hidroksitle parçalama işlemi için , süzme krozesi (4.2) desteği olan ve tapalı sıvı 
çıkış borusu ve mümkünse hava basınçlı vakumla donatılmış Isıtma ünitesi . Her kullanımdan  önce ünite 
kaynayan su ile 5 dakikada boyunca ön ısıtmaya tabi tutulur.  
 
4.2.  Gözenek boyutu 40 -90 μm olan sinterle nmiş cam süzgeç plakalı kroze (nuçe krozesi). İlk kullanımdan önce 
birkaç dakika boyunca 500°C’ ye ısıtılır ve soğutulur (8.6)  
4.3.  Kaynamaya uygun, geri soğutuculu en azından 270 ml kapasiteli silindir  45 
 4.4. Termostatlı kurutma etüvü  
4.5. Termostatlı kül fırını  
4.6. Ekstraksiyon ünitesi, süzgeç krozesi (4,2) için destek plakasından oluşan ve vakum için kapaklı boşaltım 
borusu ve sıvı çıkışı olan  
4.7. Birleştirme halkaları, ısıtma ünitesi (4.1), kroze (4.2) ve silindiri (4.3) monte etmek ve soğuk ekstraksiy on 
ünitesi (4.6) ve krozeyi birbirine bağlamak için  
5.  Metot  
1 g numune, 1 mg hassasiyetle  kroze içerisine tartılır ve (bakınız gözlem 8.1, 8.2 ve 8.3) ve 1 g filtreleme 
desteği filtre yardımcı malzemesi eklenir (3.3).  
Isıtma ünitesi (4.1) ve filtre kroz esi (4.2) monte edilir daha sonra silindir (4.3) krozeye bağlanır. 150 ml 
kaynayan sülfürik asit (3.1) bağlanmış silindir ve krozeye dökülür ve eğer gerekli ise birkaç damla köpük 
önleyici madde (3.2) eklenir.  
Sıvı 5 ±  2 dakika içinde kaynama durumuna get irilir ve aktif bir biçimde tam olarak 30 dakika boyunca 
kaynatılır.  
Boşaltım borusunun kapağı açılır (4.1) ve vakum altında sülfürik asit filtre krozeden geçirilir ve kalıntılar ardı 
ardına üç defa 30 ml kaynayan suyla yıkanır, her yıkamadan sonra süzülen edilen kalıntının kuru olduğundan 
emin olunmalıdır.  
Çıkış kapağı kapatılır ve 150 ml kaynayan potasyum hidroksit çözeltisi (3.7) bağlanmış silindir ve krozeye 
dökülür ve birkaç damla köpük önleyici madde (3.2) eklenir. Sıvı 5 ± 2 dakika içinde kayn ama durumuna 
getirilir ve aktif bir biçimde tam olarak 30 dakika boyunca kaynatılır. Süzülür ve sülfürik asit için uygulanan 
yıkama işlemi tekrarlanır.  
 Son yıkama ve kurutma adımından sonra krozenin ve parçalarının bağlantısı ayrılır ve kroze tekrar soğuk  
ekstraksiyon ünitesine (4.6) bağlanır. Vakum uygulanır ve kroze içindeki kalıntılar ardı ardına üç defa 25 ml 
aseton (3.4) ile yıkanır, her yıkamadan sonra süzülen kalıntının kuru olduğundan emin olunmalıdır.  
Kroze 130°C’ de etüvde sabit ağırlığa gelene kadar kurutulur. Kurutmadan sonra desikatörde soğutulur ve hemen 
tartılır. Kroze kül fırınına yerleştirilir ve sabit ağırlığa kadar 475 ile 500°C aralığında en azından 30 dakika 
boyunca yakılır (birbirini izleyen bu iki tartım arasında ki fark 2 mg’dan az y a da 2 mg’ a eşit olmalıdır).  
 Her yakmadan sonra önce fırın içinde daha sonra desikatörde soğutulur tartılır.  
Numune içermeyen kör bir test uygulanır. Yakma sonucu oluşan ağırlık kaybı 4 mg’ı aşmamalıdır.  
6. Sonuçların hesaplanması  
Ham selüloz içeriğinin n umunedeki yüzdesi şöyle ifade edilir:  
 
 m = Numune ağırlığı,  g   
m0 = Yaktıktan sonraki ağırlık kaybı, g   
m1 = Numune içermeyen kör testin yaktıktan sonraki ağırlık kaybı, g  
7.  Tekrar edilebilirlik  
46 
 Aynı numune için iki paraleller arasındaki fark:  
- % 10’dan daha az ham selüloz kapsayan numunelerde mutlak değer olarak % 0.6’dan   
- % 10 ve daha fazla ham selüloz kapsayan numunelerde en yüksek sonucun % 6’sından fazla 
olmamalıdır.  
 
8. Gözlemler  
8.1.  % 10’dan fazla ham yağ içeriği olan yemlerin analizden ön ce petrol eteri (3.5) ile yağı alınmalıdır. süzme 
krozesi (4.2) ve parçaları soğuk ekstraksiyon ünitesine (4.6) bağlanır, Vakum uygulanır ve kroze içindeki 
kalıntılar ardı ardına üç defa 30 ml petrol eteri ile yıkanır, kalıntının kuru olduğundan emin olunm alıdır. Kroze 
ve parçaları ısıtma ünitesine (4.1) ve 5.1’e göre  işleme devam edilir.  
8.2.  Petrol eteri (3.5) ile yağı alınamayan yemlerin yağı 8.1’de gösterildiği gibi alınmalı ve daha sonra kaynayan 
asit ile bir kez daha yağları alınmalıdır. Asitle kayn atılmasından sonra yıkama aşamasından sonra kroze ve 
parçaları soğuk Ekstraksiyon ünitesine (4.6) bağlanır ve üç defa 30 ml asetonla yıkamayı takiben üç defa 30 ml 
petrol eteri ile yıkanır. Vakum altında kuruyana kadar filtre edilir ve potasyum hidroksit i şlemi ile başlayan 5’i 
işleme devam edilir.  
8.3 Eğer yem % 5’ten fazla karbonat (kalsiyum karbonat olarak) içeriyorsa ,tartılmış numune ,içeren  , kroze 
(4.2) ısıtma ünitesine (4.1) takılır., numune üç defa 30 ml hidroklorik asitle (3.6) yıkanır. Her bir e klemeden 
sonra numune süzülmeden  önce bir dakika boyunca bekletilir,30 ml su ile bir defa yıkanır ve 5.’e göre işleme 
devam edilir.  
8.4. Stand şeklinde bir cihaz kullanılıyorsa (birçok kroze aynı ısıtma ünitesine bağlanmıştır) aynı numunenin iki 
paraleli aynı seri içinde analiz edilemeyebilir.  
8.5. Eğer kaynatmadan sonra asidik ve bazik çözeltileri süzmek zor ise ısıtma ünitesinin boşaltım borusundan 
basınçlı hava kullanılır ve süzmeye devam edilir.  
8.6. Yakma işlemi için sıcaklık; cam filtre krozelerinin  ömrünü uzatmak için 500°C’den daha yüksek 
olmamalıdır. Isıtma soğutma döngüleri sırasında yüksek  termal şokun  engellenmesi için dikkat edilmelidir.  
H. ŞEKER TAYİNİ  
1. Amaç ve kapsam  
Bu metot; indirgen şeker ve inversiyondan sonra toplam şeker miktarını glukoz olarak veya gerekirse 0,95 
faktörü ile çarpılarak sakkaroz olarak belirlemeyi mümkün kılar. Karma yemlere uygulanabilir. Diğer yemler 
için özel metotlar bulunmaktadır. Gerektiği noktada laktoz ayrı olarak ölçülür ve sonuçlar hesaplanırken dikkate 
alınır. 
2. Prensip  
Şekerler seyreltilmiş etanol ile ekstrakte edilir; Carrez I ve II çözeltileri ile berraklaştırılır. Etanolun 
ayrılmasından sonra, inversiyondan önceki ve sonraki miktarlar Luff -Schoorl metodu ile belirlenir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Etanol çöze ltisi %  40 (v/v) 20°C’de yoğunluk: 0,948 g/ml, fenolftalein ile nötrleştirilmiş.  
3.2. Carrez I çözeltisi: 21,9 g çinko asetat Zn (CH 3COO) 2 2H 2O ve 3 g glasiyel asetik asit su içinde 
çözündürülür. Su ile 100 ml’ye tamamlanır.  
3.3.  Carrez II çözeltisi: 10,6  g Potasyum ferro siyanür K 4Fe (CN) 6 3H 2O su içinde çözündürülür. Su ile 100 
ml’ye tamamlanır.  47 
 3.4.  Metil oranj, % 0,1 (w/v)  
3.5.  Hidroklorik asit 4 mol/l  
3.6.  Hidroklorik asit 0,1 mol/l  
3.7.  Sodyum hidroksit çözeltisi 0,1 mol/l  
3.8. Luff -Schoorli ayı racı: Dikkatlice karıştırarak sodyum karbonat çözeltisinin (3.8.3) içine sitrik asit çözeltisi 
(3.8.2) dökülür. Bakır sülfat çözeltisi (3.8.1) eklenir ve su ile 1 litreye tamamlanır. Çökmesi için gece boyunca 
bekletilir ve süzülür.  
Elde edilen ayıracın (C u 0,05 mol/litre; Na 2CO 3 1 mol/l) konsantrasyonu kontrol edilir, (bakınız (5.4) son 
paragraf) Çözeltinin pH değeri yaklaşık olarak 9,4 olmalıdır.  
3.8.1. Bakır sülfat çözeltisi: 25 g bakır sülfat (demir içermeyen), CuSO 4 5H 2O, 100 ml su içinde çözündürülür.  
3.8.2.  Sitrik asit çözeltisi: 50 g sitrik asit C 6H8O7 H2O 50 ml su içinde çözündürülür.  
3.8.3. Sodyum karbonat çözeltisi: 143,8 g susuz sodyum karbonat yaklaşık 300 ml ılık su içinde çözündürülür. 
Soğumaya bırakılır.  
3.9.  Sodyumtiyosülfat çözeltisi 0,1 mol/l  
3.10. Nişasta çözeltisi: 5 g nişasta 30 ml  su içinde çözülürlerek karışım 1 litre kaynayan suya eklenir. 3 dakika 
kaynatılır ve soğumaya bırakılır, gerekli ise 10 mg cıva iki iyodürü koruyucu olarak eklenir.  
3.11.  Sülfürik asit 3 mol/l  
3.12.  Potas yum iyodür, çözelti %  30 (w/v)  
3.13.  Granül sünger taşı, hidroklorik asit içinde kaynatılmış, su ile yıkanmış ve kurutulmuş;  
3.14.  3-metilbütan -l-ol 
4.  Cihazlar  
Çalkalayıcı: yaklaşık 35 ile 40 rpm  
5.  Metot  
5.1.  Numune ekstraksiyonu  
2,5 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır (numunenin yapısına göre numune miktarı arttırılabilir.) ve 250 ml’lik 
balon jojeye konur . 200 ml etanol (3.1) eklenir ve çalkalayıcıda bir saat karıştırılır. 5 ml Carrez I çözeltisi (3.2) 
eklenir ve yaklaşık 30 saniye karıştırılır. 5  ml Carrez II çözeltisi (3.3) eklenir ve tekrar bir dakika karıştırılır. 
Etanol (3.1) ile hacme tamamlanır, homojenize edilir ve süzülür. 200 ml süzüntü alınır ve etanolun çoğunu 
,elimine etmek  için yaklaşık , hacmin yarısına kadar buharlaştırılır.  Buharl aşma kalıntısı 200 ml’lik balon jojeye 
ılık su kullanarak aktarılır, soğutulur, su ile hacmine tamamlanır , homojenize edilir ve eğer gerekiyorsa süzülür. 
Bu çözelti indirgen şekerlerin miktarını ve inversiyondan sonra ki toplam şeker miktarını belirlemekte  kullanılır.  
5.2.  İndirgen şekerlerin belirlenmesi  
Bir pipet kullanarak; glikoz olarak adlandırılan indirgen şekerlerden en fazla 60 mg içeren çözeltiden 25 ml’den 
fazla olmayacak şekilde alınır. Eğer gerekiyorsa saf su ile hacmi 25 ml’ye tamamlanır ve indirgen şekerin içeriği 
Luff-Schoorl metodu ile belirlenir. Sonuç numune içindeki glikoz içeriğinin yüzde olarak ifadesidir.  
5.3.  İnversiyondan sonra toplam şekerin belirlenmesi  48 
 Bir pipet kullanarak çözeltiden 50 ml alınır ve 100 ml’lik balon jojeye akta rılır. Birkaç damla metil oranj 
çözeltisi (3.4) eklenir daha sonra dikkatlice ve sürekli karıştırarak sıvı belirgin bir kırmızıya dönene kadar 
hidroklorik asit (3.5) eklenir. 15 ml hidroklorik asit (3.6) eklenir ve balon joje hızlı kaynayan su banyosuna 
daldırılır ve burada 30 dakika tutulur. Hızlıca 20°C’ye soğutulur ve 15 ml sodyum hidroksit çözeltisi (3.7) 
eklenir. Saf su ekleyerek 100 ml’ye tamamlanır ve homojenize edilir. İndirgen şekerden 60 mg’dan az olacak 
şekilde, 25 ml’ye kadar alınır 25 ml’den az  alınmışsa saf su ile hacmi 25 ml’ye tamamlanır ve indirgen şekerin 
içeriği Luff -Schoorl metodu ile belirlenir. Sonuç numune içindeki glikoz içeriğinin ya da uygun olan yerde 0,95 
çarpım faktörü ile sakaroz içeriğinin yüzde olarak ifadesidir.  
5.4.  Luff-Schoorl metodu ile titrasyon  
Bir pipet kullanarak 25 ml Luff -Schoorli ayıracı (3.8) alınır ve 300 ml erlene aktarılır; tam olarak 25 ml berrak 
şeker çözeltisi eklenir. 2 granül süngertaşı (3.13) eklenir, kontrollü bir ateş üzerinde elle karıştırarak ısıtılır  ve 
sıvı yaklaşık iki dakika içinde kaynama noktasına getirilir. Erlen üzerinde yaklaşık 6 cm çapında bir delik 
bulunan ve altında ateş yakılmış olan asbest kaplı tel örgü üzerine hemen alınır. Alev sadece Erlenin merkezinin 
ısıtılacağı bir biçimde ayarlan malıdır. Erlen bir geri soğutucuya bağlanır. Tam olarak 10 dk boyunca kaynatılır. 
Hemen soğuk su içinde soğutulur ve 5 dakika sonra aşağıdaki şekilde titre edilir:  
10 ml potasyum iyodür çözelitisi (3.12) eklenir ve hemen arkasından 25 ml sülfürik asit (3.1 1) eklenir. (çok 
köpüklenme riskine karşı dikkat edilmelidir), Tiyosülfat çözeltisi (3.9) ile donuk bir sarı renk oluşana kadar titre 
edilir, nişasta indikatörü (3.10) eklenir ve titrasyon tamamlanır.  
Kör deneme: Aynı titrasyon tam olarak ölçülen 25 ml Luf f-Schoorl ayıracı (3.8) ve 25 ml su karışımında 10 ml 
potasyum iyodür çözeltisi (3.12) ve 25 ml sülfürik asit (3.11) eklendikten sonra kaynatmadan tekrar edilir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Tablo kullanılarak iki titrasyon değerleri arasındaki (0,1 mol/lit re konsantrasyondaki sodyum tiyosülfat 
düzeyleri) farka karşılık gelen glikoz miktarının mg cinsinden bulunur. Sonuç numunenin yüzdesi olarak ifade 
edilir.  
7.  Özel Metotlar  
7.1.  Yemin melas bakımından zengin olduğu ya da yemin özellikle homojen olmadığı durumlarda, 20 g tartılır 
ve 500 ml saf su ile 1 litrelik balon jojeye aktarılır. Çalkalayıcıda bir saat boyunca karıştırılır. Carrez I (3.2) ve II 
(3.3) ayıraçları kullanılarak 5.1’e göre berraklaştırılır, ancak bu sefer her bir ayıracın dört katı kullanı lır. %  
80’lik etanol (v/v) ile hacmine tamamlanır .  
Homojenize edilir ve süzülür. 5.1’e göre etanol ayrılır . Eğer hiç dekstrin ize nişasta bulunmuyor ise, saf  su ile 
hacme getirilir.  
7.2.  Analiz yapılacak numunenin şeker bakımından zengin ve nişasta içerme yen (keçi boynuzu, kurutmuş şeker 
pancarı posası gibi) yem maddeleri ve melas olması durumunda, 5 g tartılır ve 250 ml’lik balon jojeye aktarılır, 
200 ml saf su ilave edilir ve çalkalayıcıda bir saat, gerekirse daha fazla karıştırılır. Carrez I (3.2) ve II  (3.3) 
ayıraçları kullanılarak 5.1’de anlatıldığı şekilde berraklaştırılır. Soğuk saf su ile hacmine tamamlanır, 
homojenize edilir ve süzülür. Toplam şeker miktarlarını belirlemek için 5.3’de anlatıldığı şekilde devam edilir.  
8.  Gözlemler  
8.1. Köpüklenmey i önlemek için Luff -Schoorl ayıracı ile kaynatmadan önce (hacme bakılmaksızın) yaklaşık 1 
ml 3-metilbütan -l-ol (3.14) eklenmesi önerilir.  
8.2.  İnversiyondan sonraki glikoz olarak belirtilen toplam şeker içeriği ile glikoz olarak belirtilen indirgen şeker 
miktarı arasındaki fark 0,95 ile çarpıldığında sakaroz içeriğinin yüzdesini verir.  
8.3.  Laktoz dışında, indirgen şeker içeriğinin belirlenmesi için iki metot uygulanabilir:  49 
 8.3.1. Yaklaşık bir hesaplama için, farklı bir analiz metodu ile bulunmuş laktoz i çeriği 0,675 ile çarpılır ve elde 
edilen sonuç indirgen şeker içeriğinden çıkarılır.  
8.3.2. Laktoz dışındaki indirgen şeker lerin doğru bir şekilde hesaplanması için aynı numune iki son  tespit  için 
kullanılmadır. Analizlerden biri 5.1’de ifade edilen çözel ti kullanılarak, diğeri; bu amaç için belirlenmiş metotla 
(diğer tür şekerler fermente edilerek ve berraklaştırılarak) laktoz belirlenmesi sırasında elde edilen çözelti 
kullanılarak gerçekleştirilir.  
Her iki durumda da var olan şeker miktarı Luff -Schoorl metodu ile belirlenir ve mg glikoz olarak hesaplanır. Bu 
değerlerden biri diğerinden çıkarılır ve fark numunenin yüzdesi olarak belirtilir.  
Örnek:  
Her bir belirleme için alınan iki hacim 250 mg’lık numuneye karşılık gelir. Bu ilk durumda 17 ml sodyum 
tiyos ülfat çözeltisi (0,1 mol/l’lik) kullanılan 44,2 mg glikoza; ikincisinde 11 ml’si; 27,6 mg glikoza karşılık 
gelmektedir. Aradaki fark 16,6 mg glikozdur.  
Glikoz olarak hesaplanan indirgen şeker içeriği (laktoz hariç) şöyledir:  
  
 
25 ml Luff -Schoorl ayıracı için değerler tablosu  
ml Na 2 S2 O3 0,1 mol/l, iki dakika ısıtma, 10 dakika kaynatma  
Na2 S2O3 
0,1 mol/l  
 Glikoz, fruktoz  
invert şekerler  
C6 H12 O6 Laktoz  
C12 H22 O11 
 Maltoz  
C12 H22 O11 
 Na2 S2 O3 
0,1 mol/l  
ml mg Fark mg Fark mg Fark ml 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 2,4 
4,8 
7,2 
9,7 
12,2 
14,7 
17,2 
19,8 
22,4 
25,0 2,4 
2,4 
2,5 
2,5 
2,5 
2,5 
2,6 
2,6 
2,6 
2,6 3,6  
7,3 
11,0 
14,7 
18,4 
22,1 
25,8 
29,5 
33,2 
37,0 3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,8 
3,8 3,9 
7,8 
11,7 
15,6 
19,6 
23,5 
27,5 
31,5 
35,5 
39,5 3,9 
3,9 
3,9 
4,0 
3,9 
4,0 
4,0 
4,0 
4,0 
4,0 1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
50 
 11 
12 
13 
14 
15 
16 
17 
18 
19 
20 
21 
22 
23 27,6 
30,3 
33,0 
35,7 
38,5 
41,3 
44,2 
47,1 
50,0 
53,0 
56,0 
59,1 
62,2 2,7 
2,7 
2,7 
2,8 
2,8 
2,9 
2,9 
2,9 
3,0 
3,0 
3,1 
3,1 40,8 
44,6 
48,4 
52,2 
56,0 
59,9 
63,8 
67,7 
71,7 
75,7 
79,8 
83,9 
88,0 3,8 
3,8 
3,8 
3,8 
3,9 
3,9 
3,9 
4,0 
4,0 
4,1 
4,1 
4,1 
 43,5 
47,5 
51,6 
55,7 
59,8 
63,9 
68,0 
72,2 
76,5 
80,9 
85,4 
90,0 
94,6 4,0 
4,1 
4,1 
4,1 
4,1 
4,1 
4,2 
4,3 
4,4 
4,5 
4,6 
4,6 11 
12 
13 
14 
15 
16 
17 
18 
19 
20 
21 
22 
23 
 
I-  LAKTOZ TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; % 0,5’ten fazla laktoz içeren yemlerdeki laktoz seviyesini belirmeyi mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Şekerler su içinde çözülür. Çözelti; laktozu parçalanmadan koruyan Saccharomyces cerevisiae mayası ile 
fermantasyona tabi tutulur. Berraklaştırma ve süzme işleminden sonra ; süzüntüdeki laktoz içeriği Luff -Schoorl 
metodu ile belirlenir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1. Saccharomyces cerevisiae süspansiyonu: 25 g taze maya 100 ml saf su içinde süspanse edilir. Süspansiyon 
buzdolabı içinde en fazla bir hafta süre ile saklanmalıdır.  
3.2.  Carrez I çözeltisi : 21,9 g çinko asetat Zn (CH 3COO) 2 2H 2O ve 3 g glasiyal asetik asidi saf su içinde 
çözündürülür. Saf su ile 100 ml’ye tamamlanır.  
3.3.  Carrez çözeltisi II: 10,6 g potasyum demir siyanür K 4Fe (CN) 6 3H 2O saf su içinde çözündürülür. Saf su i le 
100 ml’ye tamamlanır.  
3.4.  Luff-Schoorl ayıracı:  
Sodyum karbonat çözeltisinin (3.4.3) içine dikkatlice karıştırılarak sitrik asit çözeltisi (3.4.2) dökülür. Bakır 
sülfat çözeltisi (3.4.1) eklenir ve saf su ile 1 litreye tamamlanır. Çökmesi için gece bo yunca bekletilir ve süzülür. 
Elde edilen  ayıracın (Cu 0,05 mol/litre; Na 2 CO 3  1 mol/litre) konsantrasyonu kontrol edilir. Çözeltinin pH 
değeri yaklaşık 9,4 olmalıdır.  
3.4.1. Bakır sülfat çözeltisi: 25 g bakır sülfatı, Cu SO4 5  H2O (demir içermeyen), 100 ml su içinde çözündürülür.  51 
 3.4.2.  Sitrik asit çözeltisi: 50 g sitrik asit C 6H8O7·H2O 50 ml su içinde çözündürülür.  
3.4.3. Sodyum karbonat çözeltisi: 143,8 g susuz sodyum karbonat yaklaşık 300 ml ılık su içinde çözündürülür. 
Soğumaya bırakılır.  
3.5.  Granül sünger taşı, hidroklorik asit içinde kaynatılmış, su içinde yıkanmış ve kurutulmuş.  
3.6.  Potasyum iyodür, %  30’luk çözelti  (w/v)  
3.7.  Sülfürik asit, 3 mol/l  
3.8.  Sodyumtiyosülfat çözeltisi 0,1 mol/l  
3.9.  Nişasta çözeltisi: 5 g nişasta 30 ml saf  su içinde çözdürülür,  karışım 1 litre kaynayan suya eklenir. Üç 
dakika kaynatılır ve soğumaya bırakılır, gerekli ise 10 mg cıva iki iyodürü koruyucu olarak eklenir.  
4.  Cihazlar  
Su banyosu, 38 - 40 ˚C’ye ayarlanmış termostatlı  
5.  Metot  
1 g numune 1 mg h assasiyetle tartılır ve 100 ml’lik balon jojeye aktarılır. 25 - 30 ml saf su eklenir. Balon joje 30 
dakika kaynayan su banyosunda bekletilir ve sonra yaklaşık 35 ˚C’ye soğutulur. 5 ml maya süspansiyonu (3.1) 
eklenir ve homojenize edilir. Balon joje 38 - 40˚C’deki su banyosunda iki saat süreyle bırakılır. Yaklaşık 
20˚C’ye soğutulur.  
2,5 ml Carrez I çözeltisi (3.2) eklenir ve yaklaşık 30 saniye karıştırılır, daha sonra 2,5 ml Carrez II çözeltisi (3.3) 
eklenir ve tekrar 30 saniye karıştırılır. Saf su ile 100 m l hacme tamamlanır, karıştırılır ve süzülür. Bir pipet 
kullanılarak; tercihen süzüntüden 40 ila 80 mg laktoz içerebilecek ve süzüntüden 25 ml’den fazla olmayacak 
şekilde bir miktar alınır ve 300 ml hacminde bir Erlene aktarılır. Eğer gerekiyorsa su ile hac mi 25 ml’ye 
tamamlanır (Alınan hacim 25 ml’den az ise).  
5 ml maya süspansiyonu (3.1) ile aynı şekilde bir kör test gerçekleştirilir. Laktoz içeriğini Luff -Schoorl’a göre şu 
şekilde belirlenir: tam olarak 25 ml Luff -Schoorl ayıracı (3.4) iki granül süngerta şı (3.5) eklenir. Orta 
yükseklikteki bir serbest ateş üzerinde elle karıştırılarak ısıtılır ve sıvı yaklaşık iki dakika içinde kaynama 
seviyesine getirilir. Erlen, üzerinde yaklaşık 6 cm çapında bir delik bulunan ve altında ateş yakılmış olan asbest 
kaplı tel örgü üzerine hemen alınır. Alev sadece Erlenin merkezinin ısıtılacağı bir biçimde ayarlanmalıdır. Bir 
geri soğutucu Erlen balonuna takılır. Tam olarak 10 dk boyunca kaynatılır.  
 Hemen soğuk su içinde soğutulur ve daha sonra 5 dakikalık titrasyon aşağıd aki şekilde yapılır; 10 ml potasyum 
iyodür çözelitisi (3.6) eklenir ve hemen arkasından 25 ml sülfürik asit (3.7)eklenir. (çok köpüklenme riskine 
karşı dikkatli olunmalıdır),  Tiyosülfat çözeltisi (3.8) ile donuk bir sarı renk oluşana kadar titre edilir, n işasta 
ayıracı (3.9) eklenir ve titrasyon tamamlanır.  
Kör deneme: Aynı titrasyon tam olarak ölçülen 25 ml Luff -Schoorl ayıracı (3.8) ve 25 ml su karışımında 10 ml 
potasyum iyodür çözeltisi (3.12) ve 25 ml sülfürik asit (3.11) eklendikten sonra kaynatmadan tekrar edilir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Tablo kullanılarak; mg olarak sodyum tiyosülfat 0,1 mol/litre ifade edilen, iki titrasyon değerleri arasındaki farka 
karşılık gelen laktoz miktarının mg cinsinden değeri oluşturulur.  
Susuz laktozun sonucu, örneğin yüzdesi değerinden ifade edilir.  
 52 
 7.  Gözlemler  
% 40’tan daha fazla fermente edilebilir şeker içeren ürünler için 5 ml’den daha fazla maya süspansiyonu (3.1) 
kullanılır.  
25 ml Luff -Schoorl ayıracı için değerler tablosu  
ml Na 2 S2 O3 0,1 mol/litre, i ki dakika ısıtma, 10 dakika kaynatma  
 
Na2S2 O3 
0,1 mol/l  
 Glikoz, fruktoz  
invert şekerler  
C6 H12 O6 Laktoz  
C12 H22 O11 
 Maltoz  
C12 H22 O11 
 Na2S2 O3 
0,1 mol/l  
 
ml mg Fark mg Fark mg Fark ml 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
12 
13 
14 
15 
16 
17 
18 
19 
20 2,4 
4,8 
7,2 
9,7 
12,2 
14,7 
17,2 
19,8 
22,4 
25,0 
27,6 
30,3 
33,0 
35,7 
38,5 
41,3 
44,2 
47,1 
50,0 
53,0 2,4 
2,4 
2,5 
2,5 
2,5 
2,5 
2,6 
2,6 
2,6 
2,6 
2,7 
2,7 
2,7 
2,8 
2,8 
2,9 
2,9 
2,9 
3,0 
3,0 3,6 
7,3 
11,0 
14,7 
18,4 
22,1 
25,8 
29,5 
33,2 
37,0 
40,8 
44,6 
48,4 
52,2 
56,0 
59,9 
63,8 
67,7 
71,7 
75,7 3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,7 
3,8 
3,8 
3,8 
3,8 
3,8 
3,8 
3,9 
3,9 
3,9 
4,0 
4,0 
4,1 3,9 
7,8 
11,7 
15,6 
19,6 
23,5 
27,5 
31,5 
35,5 
39,5 
43,5 
47,5 
51,6 
55,7 
59,8 
63,9 
68,0 
72,2 
76,5 
80,9 3,9 
3,9 
3,9 
4,0 
3,9 
4,0 
4,0 
4,0 
4,0 
4,0 
4,0 
4,1 
4,1 
4,1 
4,1 
4,1 
4,2 
4,3 
4,4 
4,5 1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
11 
12 
13 
14 
15 
16 
17 
18 
19 
20 53 
  
İ.  NİŞASTA TAYİNİ  
 
POLARİMETRİK METOT  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; beyan edilen enerji değerlerine (EK -7 içindeki hükümler) uygunluğunu kontrol etmek için, yemlerde 
nişasta ve yüksek molekül ağırlıklı nişasta parçalanma ürünlerinin seviyelerini belirlemede kullanılır.  
2.  Prensip  
Bu metot; iki aşamayı kapsamaktadır. İlkin de; numune seyreltilmiş hidroklorik asit ile işleme tabi tutulur. 
Berraklaştırma ve filtrelemeden sonra çözeltinin optik sapması polarimetre ile ölçülür.  
İkincisinde, numune % 40 etanol ile ekstrakte edilir. Süzüntü hidroklorik asit ile asitleştirilmesind en sonra, 
berraklaştırma ve filtreleme ile çözeltinin optik rotasyonu ilkindeki gibi belirlenir.  
Bilinen bir faktörle çarpılan iki ölçüm arasındaki fark örneğin nişasta içeriğini verir.  
3.  Ayıracılar  
3.1.  Hidroklorik asit, çözeltisi %  25 (w/w) yoğunluk:  1,126 g/ml  
3.2.  Hidroklorik asit, çözeltisi %  1,13 (w/v)  
Yoğunluk; %  94 (v/v) etanol içindeki %  0,1 (w/v) metil kırmızı varlığı ile 0,1 mol/l sodyum hidroksit çözeltisi 
kullanılarak titrasyon ile kontrol edilmelidir. 10 ml’nin nötrleştirilmesi için 30,94  ml NaOH 0,1 mol/l 
gerekmektedir.  
3.3. Carrez I çözeltisi: 21,9 g çinko asetat Zn (CH 3COO) 2 2H 2O ve 3 g saf asetik asit su içinde çözündürülür.  Su 
ile 100 ml’ye tamamlanır.  
3.4.  Carrez II çözeltisi: 10,6 g demir siyanür K 4Fe (CN) 6 3H 2O su içinde çözündürülür. Su ile 100 ml’ye 
tamamlanır.  
3.5.  Etanol, çözelti % 40 (v/v), 20˚C’de yoğunluk: 0,948 g/ml  
4.  Cihazlar  
4.1.  Geri soğutucu ve 250 ml şilifli Erlen  
4.2.  Polarimetre ya da sakarimetre  
5.  Metot  
5.1.  Örneğin hazırlanması  
Örnek 0,5 mm yuvarla k delikli elekten geçebilecek inceliğe gelene kadar öğütülür.  
5.2.  Toplam optik sapma belirlenmesi (P ya da S) (bakınız gözlem 7.1)  21 
22 
23 56,0  
59,1 
62,2 3,1 
3,1 
 79,8 
83,9 
88,0 4,1 
4,1 
 85,4 
90,0 
94,6 4,6 
4,6 21 
22 
23 54 
 1 mg hassasiyetle 2,5 g öğütülmüş örnek tartılır ve bu numune 100 ml’lik bir balon jojeye yerleştirilir. 25 ml 
hidroklorik asit (3.2) eklenir, test örneğinin homojen dağılımı sağlanana kadar çalkalanır ve bir 25 ml daha 
hidroklorik asit (3.2) eklenir. Balon kuvvetlice çalkalanarak kaynayan suyun içine daldırılır ve ilk üç dakika 
boyunca topaklanma oluşumunu önlemek için devam edilir. Su banyosundaki su miktarı balonun içine 
daldırıldığında kaynamanın devam etmesine yeterli olmalıdır. Çalkalanması sırasında balon; banyodan 
çıkarılmamalıdır. Tam olarak 15 dakika sonra, banyodan çıkarılır, 30 ml soğuk su eklenir ve hemen 20 ˚C’ye 
soğutulur.  
5 ml Carrez I çözeltisi (3.3) eklenir ve yaklaşık 30 saniye boyunca çalkalanır. Daha sonra, 5 ml Carrez IIçözeltisi 
(3.4) eklenir ve tekrar 30 saniye boyunca çalkalanır. Su ekleyerek hacme getrilir, karıştırılır ve filtre edilir. Eğer 
filtrat t am olarak berrak değilse (nadir bir durumdur) belirlemeyi, daha fazla miktar Carrez çözeltisi I ve II 
kullanarak tekrarlanır, (örneğin10 ml).  
Çözeltinin optik sapması 200 mm'lik tüpte polarimetre ya da sakarimetre ile ölçülür.  
5.3.   % 40 etanol içinde çö zülebilen maddelerin optik sapmasının  (P' ya da S')belirlenmesi  
1mg hassasiyetle 5 g örnek tartılır. 100 ml lik balon joje içine alınır ve yaklaşık 80 ml etanol (3.5) eklenir. 
(bakınız gözlem (7.2)) Balon 1 saat boyunca oda sıcaklığında bırakılır; bu süre  esnasında, altı kez daha 
kuvvetlice çalkalanır, böylece test örneği etanol ile iyice karışması sağlanır. Etanol (3.5) ekleyerek hacme 
getirilir, karıştırılır ve filtre edilir.  
Bir pipet kullanarak 50 ml filtrat (2,5 g örneğe karşılık gelir) 250 ml erlene  alınır. 2,1 ml hidroklorik asit (3.1) 
eklenir ve kuvvetlice çalkalanır. Geri soğutucu erlene bağlanır ve kaynayan su banyosuna daldırılır. Tam olarak 
15 dakika sonra erlen banyodan çıkarılır. İçerik, 100 ml'lik balon jojeye bir parça soğuk su ile çalkalay arak 
aktarılır ve 20 ˚C’ye soğutulur.  
Carrez çözeltileri I (3.3) ve II (3.4) kullanarak berraklaştırılır, su ekleyerek hacme tamamlanır, karıştırılır, filtre 
edilir ve 5.2’nin ikinci ve üçüncü paragraflarında belirtildiği gibi optik sapmasını ölçülür.  
6.   Sonuçların hesaplanması  
Nişasta içeriği (%) aşağıdaki gibi hesaplanır:  
6.1.  Polarimetre ile hesaplanma:  
Nişasta içeriği       
 
P = Derece cinsinden toplam optik sapma  
P' = %  40 etanol ( v/v) içinde çözülebilen maddelerin derece cinsinden toplam optik sa pma  
      Saf nişastanın özgül optik sapması Bu faktör için konvansiyonel olarak kabul edilen değerler 
aşağıdaki gibidir:  
+ 185,9o: Pirinç nişastası   
+ 185,7o: Patates nişastası  
+ 184,6o: Mısır nişastası  
+ 182,7o: Buğday nişastası  
55 
 + 181,5o: Arpa nişastası  
+ 181,3o: Yulaf nişastası  
+ 184,0o: Diğer tür nişastalar ve karma yemlerdeki nişasta karışımları  
6.2.  Sakarimetre ile hesaplama  
 
 
S = Sakarimetre derecelerinde toplam optik sapma  
S' = %  40 etanol (v/v) içinde çözülebilen maddelerin sakarimetre derecelerinde toplam optik sapması  
N = 200 mm tüp kullanarak ölçüm yapıldığında 100 sakarimetre derecelik bir optik sapma yaratan 100 ml su 
içindeki sakaroz ağırlığı (g)  
Fransız sakarimetreleri için 16,29 g  
Alman sakarimetreleri için 26,00 g  
Karışık sakarimetreler için 20,00 g.  
      = Saf nişastanın özgül optik sapması (bakınız 6.1)  
6.3.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numune üzerinden elde edilen iki paralel ölçümün sonuçları arasındaki fark nişasta içeriği %  40’tan az 
olanlar için mutlak değer olarak 0,4’ü ve nişasta içeriği %  40’a eşit ya da daha fazla olanlar için göreceli değer 
olarak %  1’i aşmamalıdır.  
7.  Gözlemler  
7.1.  Eğer numune % 6’dan fazla karbonat içeriyorsa, kalsiyum karbonat olarak hesaplanmalı.  Toplam optik 
sapma hesaplanmadan önce karbonatlar uygun miktarda seyreltilmiş sülfürik asitle işlenerek parçalanmalıdır.  
7.2.  Süt tozu serumu ya da yağı alınmış süt tozu gibi laktoz içeriği yüksek ürünler için, 80 ml etanol (3.5) 
ekledikten sonra aşağıda ki gibi ilerlenir. Geri soğutucu balona tutturulur ve 30 dakika boyunca 50˚C’deki su 
banyosuna daldırılır. Soğumaya bırakılır ve 5.3’te belirtildiği gibi analiz edilir.  
7.3.  Yem içinde aşağıda belirtilen materyaller önemli miktarda olduğu zaman nişastanın  polarimetrik metot ile 
belirlenmesi sırasında etkileşim yaratmaları ile bilinirler bu da yanlış sonuçlar ortaya çıkmasına sebep olabilir.  
— Şeker pancarı pulpu, melası, şırası, şekeri gibi ş eker pancarı ürünleri — Pancar şırası, (pancar) şekeri gibi  
(şeke r) pancar ürünleri  
— Turunçgil posası,  
— Keten tohumu; keten tohumu ekspeller küspesi; keten tohumu ekstraksiyon küspesi,  
— Kolza tohumu; kolza tohumu ekspeller küspesi; kolza tohumu ekstraksiyon küspesi; kolza tohumu kabukları,  
 
Nişasta içeriği            
 56 
 — Ayçiçeği tohumu; ayçiçeği  tohumu ekspeller küspesi; kısmen kabuğu soyulmuş ayçiçeği tohumu ekstraksiyon 
küspesi,  
— Kopra (Hindistan Cevizi içi) ekspeller küspesi; kopra (Hindistan Cevizi içi) ekstraksiyon küspesi,  
— Patates posası,  
— Kurutulmuş maya,  
— İnulin açısından zengin ürün ler (yerelması talaşı ve unu gibi),  
— Don yağı tortusu.  
J.  HAM KÜL TAYİNİ  
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot; yemdeki ham kül içeriğinin tayinini mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Numune 550°C’de yakılarak kül haline getirilir ; kalıntı tartılır.  
3.  Ayıraçlar  
Amonyum nitrat, %  20 (w/v) çözelti  
4.  Cihaz  
4.1.  Isıtıcı plaka  
4.2.  Elektrikli, termostatlı kül fırını  
4.3.  Yakma  için dikdörtgen (yaklaşık 60 × 40 × 25 mm) ya da dairesel (çap: 60 ila 75 mm, yükseklik: 20 ila 40 
mm) formda silis, porselen ya da platin kroze.  
5.  Metot  
Yaklaşık 5 g numune (şişme eğilimi olan ürünlerde 2,5 g) yaklaşık olarak 1 mg hassasiyetinde 550°C’de 
ısıtılmış, soğutulmuş ve darası alınmış bir kül krozesine tartılır. Kroze sıcak plakaya konur ve madde karbonize 
olana kadar dereceli olarak ısı tılır 5.1 ya da 5.2’ye göre yakılır . 
5.1.  Kroze, 550°C’ye ayarlanmış ve kalibre edilmiş kül fırınına konur. Bu sıcaklık, görünürde karbonlu 
partiküller içermeyen beyaz, açık gri ya da kırmızımsı bir kül elde edilene kadar tutulur. Kroze bir desikatöre 
yerleştirilir, soğumaya bırakılır ve hemen tartılır.  
5.2.  Kroze, kalibre edilmiş 550°C’deki kül fırınına konur. 3 saat boyunca küllendirilir. Kroze bir desikatöre 
yerleştirilir, soğumaya bırakılır ve hemen tartılır. Kül ağırlığının sabit olduğundan emin olma k için 30 dakika 
daha küllendirilir (iki ardışık tartım arasındaki ağırlık kaybı 1 mg’a eşit ya da daha az olmalıdır).  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Darayı düşerek kalıntının ağırlığı hesaplanır. Sonuçları numunenin yüzdesi olarak ifade edilir.  
7.  Gözlemler  
7.1. Kül haline gelmesi zor maddeler en az üç saat boyunca bir ilk yakma  işlemine tabi tutulmalı, soğutulmalı ve 
ardından birkaç damla % 20 amonyum nitrat çözeltisi ya da su eklenmelidir . (Bu işlem, külün dağılmasını ya da 57 
 yumru oluşmasını önlemek için dikkatle yapılmalıdır .)  Etüvde kuruttuktan sonra yakma işlemine devam edilir. 
Küllenme tamamlanana kadar işlem gereken sayıda yinelenir.  
7.2.   7.1. maddesinde anlatılan işleme dirençli maddeler olması halinde aşağıdaki işlemler yapılır: Üç saat  
yakıldıkt an sonra, kül sıcak suya konur ve külsüz süzgeç kağıdı ndan süzülür . Filtre ve orijinal krozedeki içerik 
küllenir. Süzüntü soğutulmuş darası alınmış bir krozeye konur, kuruyana kadar buharlaştırılır, küllendirilir ve 
tartılır . 
7.3 Katı ve sıvı yağlarda çalı şılıyorsa 25 g numune uygun boyutlu bir krozeye tartılır. Kül süz süzgeç kağıdı 
şeridi ile kömürleştirilir.  Yanma sonrasında, olabildiğince az su ile nemlendirilir. Kurutulur ve madde 5’te 
anlatılan şekilde küllenir.  
K.  HİDROKLORİK ASİTTE ÇÖZÜNMEYEN KÜL TAYİNİ  
1. Amaç ve Kapsam  
Bu metot yemde yer alan, hidroklorik asit içinde çözünmeyen mineral maddelerin tayinini mümkün kılar. 
Numunenin doğasına göre iki metot kullanılabilir.  
1.1.  Metot A: Organik yem ham maddeleri ve çoğu karma yem için geçerlidir.  
1.2.  Metot B: Mineral bileşikler ve karışımların yanı sıra Metot A ile tayin edilen hidroklorik asit içinde 
çözünmeyen madde içeriği %  1’den büyük olan karma yemler için geçerlidir.  
2.  Prensip  
2.1. Metot A: Numune kül haline getirilir , kül hidroklorik asit içinde kaynatılır ve çözünmeyen kalıntı filtrelenip, 
kurutulup, yakılıp tartılır.  
2.2. Metot B: Hidroklorik asitle işlem görmüş numune. Çözelti filtre edilir, kalıntı küllenir ve bu sayede Metot 
A’ya uygun şekilde işlem görmüş kül elde edilir.  
3.  Ayıraçla r 
3.1.  Hidroklorik asit 3 mol/l  
3.2.  Trikloroasetik asit, %  20 (w/v) çözelti  
3.3.  Trikloroasetik asit, %  1 (w/v) çözelti  
4.  Cihaz  
4.1.  Isıtıcı plaka  
4.2.  Elektrikli, termostatlı kül fırını  
4.3.  Küllendirme için dikdörtgen (yaklaşık 60 × 40 × 25 mm) ya da dairesel (çap: 60 ile 75 mm, yükseklik: 20 
ile 40 mm) formda silis, porselen ya da platinden üretilen krozeler  
5.  Metot  
5.1.  Metot A:  
Numune ham kül tayini için anlatılan metot kullanarak kül haline getirilir . Ayrıca bu analizden elde edilen kül de  
kullanılabilir.  
Kül, 75 ml hidroklorik asit (3.1) kullanarak 250 ila 400 ml’lik bir behere konur. Yavaş yavaş kaynama noktasına 
getirilir ve 15 dakika hafifçe kaynatılır. Sıcak çözelti kül içermeyen bir filtre kâğıdıyla süzülür ve kalıntı, asit 58 
 reaksiyonu  görünmez hale gelene kadar sıcak su ile yıkanır. Kalıntı içeren filtre kurutulur ve darası alınmış bir 
kroze içinde en az 550°C ve en fazla 700°C sıcaklıkta 30 dakika küllenir. Bir desikatörde kurutulur ve tartılır.  
5.2.  Metot B:  
5 g numune yaklaşık 1 mg  hassasiyetle tartılır ve 250 ila 400 ml’lik bir behere konur. 25 ml su ve 25 ml 
hidroklorik asid (3.1) art arda eklenir, karıştırılır ve köpürmenin durması beklenir. 50 ml daha hidroklorik asit 
(3.1) eklenir. Tüm gazların açığa çıkışının durmasını bekleni r ardından beheri kaynayan su banyosuna 
yerleştirilir ve olası tüm nişastanın hidrolize olması için en az 30 dakika ya da daha uzun süre bekletilir. 
Sıcakken kül içermeyen bir filtreden süzülür ve filtre 50 ml sıcak su ile yıkanır (bakınız gözlem 7). Kalın tı içeren 
filtre bir küllendirme krozesine konur, kurutulur  ve en az 550°C ve en fazla 700°C sıcaklıkta 3 saat küllendirilir. 
Kül, 75 ml hidroklorik asit (3.1) kullanılarak 250 ila 400 ml’lik bir behere konur; 5.1 maddesinin ikinci alt 
paragrafından anlat ılan şekilde devam edilir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Dara düşülerek kalıntının ağırlığı hesaplanır. Sonuçlar numunenin yüzdesi olarak ifade edilir.  
7.  Gözlem  
Filtrasyon işlemi zorsa, yeni bir analiz numunesi hazırlanarak 50 ml hidroklorik asit (3.1) yer ine 50 ml %  20 
trikloroasetik asit (3.2) ile değiştirerek ve filtreyi sıcak bir %  1 trikloroasetik asit (3.3) çözeltisi ile yıkayarak 
analiz yeniden başlanır.  
L.  KARBONATLARIN TAYİNİ  
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot, çoğu yemde genelde kalsiyum karbonat olarak  ifade edilen karbonatların tayinini mümkün kılar. 
Ancak belirli durumlarda (örneğin demir karbonatla) özel bir metot kullanılmalıdır.  
2.  Prensip  
Karbonatlar hidroklorik asitte parçalanır ; açığa çıkan karbon dioksit derecelendirilmiş bir tüpte toplanır ve  
hacmi, aynı koşullar altında açığa çıkan bilinen miktardaki kalsiyum karbonat ile karşılaştırılır.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Hidroklorik asit, 1,10 g/ml yoğunluğunda  
3.2.  Kalsiyum karbonat  
3.3. Sülfürik asit, yaklaşık 0,05 mol/litre, metil kırmızısı ile renkle ndirilmiş  
4.  Cihaz  
Scheibler -Dietrich cihazı (bkz. diyagram) ya da eşdeğeri bir cihaz  
5.  Metot  
Numunenin karbonat içeriğine göre numune aşağıda gösterildiği gibi tartılır:  
— % 50 ila %  100 kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat içeren ürünlerde 0 ,5 g, 
— % 40 ila %  50 kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat içeren ürünlerde 1 g,  
— diğer ürünlerde 2 ila 3 g.  59 
 Tartılan numune, içinde 10 ml hidroklorik asit (3.1) içeren kırılmaz bir tüp bulunan özel balona (4) konur ve 
balon joje cihaza bağlanır. Üç yönlü musluk (5) , tüpü (1) dışarıya bağla yacak şekilde çevirilir.  Renklendirilmiş 
sülfürik asit doldurulmuş (3.3) ve derecelendirilmiş tüpe (1) bağlanmış hareketli tüp (2) kullan ılarak  sıvı 
seviyesi , sıfır işaretine kadar getirilir. Musluk  (5), (1) ve (3) tüpleri bağlayacak şekilde çevirilir ve seviyenin 
sıfırda olduğu kontrol edilir.  
Balon joje (4) eğilerek hidroklorik asid (3.1) yavaşça numuneye akıtılır. Tüp (2) alçaltılark basınç eşitlenir. 
Karbon dioksitin açığa çıkması tamamen durana kad ar balon joje (4) çalkalanır.  
Sıvı (1) ve (2) tüpleride aynı seviyeye getirilerek yeniden basınç oluşturulur. Birkaç dakika sonra, gaz hacmi 
sabit olduğunda değeri okunur.  
Aynı koşullarda 0,5 g kalsiyum karbonat (3.2) ile bir kontrol testi yapılır.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat içeriği aşağıdaki formülle hesaplanır:  
  
burada:  
X = Numune içinde kalsiyum karbonat olarak ifade edilen karbonat %’si (w/w)  
V = Numuneden açığa çıkan CO 2’nin ml cinsinden hacmi  
V1 = 0,5 g CaCO 3’ten açığa çıkan CO 2’nin ml cinsinden hacmi  
m = Numunenin gram cinsinden ağırlığı  
ifade eder.  
 
7.  Gözlemler  
7.1. Numune 2 g’dan fazla tartıldığında, önce 15 ml damıtılmış su cam malzemeye (4) konur ve teste 
başlamadan önce karıştırılır. Kontrol testi için aynı hacimde su kullanılır.  
7.2. Kullanılana cihazın Scheibler -Dietrich cihazından farklı bir hacmi varsa, numuneden ve kontrol 
maddesinden alınan miktarlar ile sonuçların hesaplanması, uygun şekilde ayarlanmalıdır.  
 
 
 
 
 
 
 
 
60 
 SCHEIBER -DEITRICH CO 2 TAYİN CİHAZI  
 
(ölçüler mm cinsinden verilmiştir)  
 
 
 
 
M. TOPLAM FOSFOR TAYİNİ  
FOTOMETRİK METOT  
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot, yemdeki toplam fosfor içeriğinin tayinini mümkün kılar. Özellikle fosfor içeriği düşük ürünlerin 
analizi için uygundur. Belirli durumlarda (fosfor açısından zengin ürünler), gravimetrik bir metot da 
kullanılabilir.  
61 
 2.  Prensip  
Numune, kuru yanma (organik yem se) ya da asitle parçalama (mineral bileşikler ve sıvı yemde) yoluyla 
mineralleştirilir ve bir asit çözeltisinin içinde ko nur. Çözelti, molibdovanadat reaktifi ile işleme tabi tutulur. Bu 
şekilde oluşan sarı çözeltinin optik yoğunluğu 430 nm’de spektrofotometre ile ölçülür.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Kalsiyum karbonat.  
3.2.  Hidroklorik asit, ρ 20 = 1,10 g/ml (yaklaşık 6 mol/l)  
3.3.  Nitrik asit, ρ 20 = 1,045 g/ml  
3.4.  Nitrik asit, ρ 20 = 1,38 ila 1,42 g/ml  
3.5.  Sülfürik asit, ρ 20 = 1,84 g/ml  
3.6. Molibdovanadat ayıracı: 200 ml amonyum heptamolibdat çözeltisi (3.6.1), 200 ml amonyum monovanadat 
çözeltisi (3.6.2) ve 134 ml nitrik asid (3.4 ) 1 litrelik balon jojede karıştırılır. Su ile gereken hacme tamamlanır.  
3.6.1. Amonyum heptamolibdat çözeltisi: Sıcak su içinde 100 g amonyum heptamolibdat (NH 4) 6Mo 7O24·4H 2O 
çözündürülür. 10 ml amonyak (0,91 g/ml yoğunluğunda) eklenir ve su ile 1 litreye  tamamlanır.  
3.6.2. Amonyum monovanadat çözeltisi: 2,35 g amonyum monovanadat NH 4VO 3, 400 ml sıcak suda 
çözündürülür. Sürekli karıştırılırken, yavaşça 20 ml seyreltik nitrik asit (7 ml HNO 3 (3.4) + 13 ml H 2O) eklenir 
ve su ile 1 litreye tamamlanır.  
3.7.   1 mg/ml fosfor standart çözeltisi: 4,387 g potasyum dihidrojen fosfat KH 2PO 4 suda çözündürülür. Su ile 1 
litreye tamamlanır.  
4.  Cihaz  
4.1.  Silis, porselen ya da platin küllendirme krozeleri  
4.2.  Elektrikli, 550°C’ye ayarlanmış termostatlı kül fırını  
4.3.  250 ml’lik Kjeldahl şişesi  
4.4.  Balon joje ve hassas pipetler  
4.5.  Spektrofotometre  
4.6.  Yaklaşık 16 mm çapında, 14,5 mm çapında tapalı ve 25 ila 30 ml kapasiteli test tüpleri  
5.  Metot  
5.1.  Çözeltinin hazırlanması  
Numunenin doğasına göre 5.1.1 ya d a 5.1.2’de anlatılan şekilde bir çözelti hazırlanır.  
5.1.1. Genel Metot  
1 g ya da daha fazla numune 1 mg hassasiyetle tartılır. Test numunesi bir Kjeldahl şişesine konur, 20 ml sülfürik 
asit (3.5) eklenir, madde tamamen asitle ıslatmak ve şişenin yanlarına yapışmasını önlemek için çalkalanır, 
ısıtılır ve 10 dakika boyunca kayn ama noktasında tutulur. Biraz soğumaya bırakılır, 2 ml nitrik asit (3.4) eklenir, 
hafifçe ısıtılır, biraz soğumaya bırakılır, biraz daha nitrik asit (3.4) eklenir ve yeniden kaynama noktasına 
getirilir. Renksiz bir çözelti elde edilene kadar bu metot yinel enir. Soğutulur, biraz su ekleyip, sıvı 500 ml’lik 62 
 balon jojeye aktarılır, Kjeldahl şişesi sıcak su ile çalkalanır. Soğumaya bırakılır, su ile gereken hacme 
tamamlanır, homojenleştirilir ve filtre edilir.  
5.1.2.  Organik maddeler içeren, kalsiyum ve magnez yum dihidrojen fosfatları içermeyen numuneler:  
2,5 g numune en yakın 1 mg hassasiyetle bir küllendirme krozesine konur. Test numunesi, tamamen karışana 
kadar 1 g kalsiyum karbonat (3.1) ile karıştırılır. Beyaz ya da gri kül elde edilene kadar 550°C fırında  
küllendirilir (bir miktar kömür sorun oluşturmaz). Kül, 250 ml’lik bir behere aktarılır. Köpürme durana kadar 20 
ml su ve hidroklorik asit (3.2) eklenir. 10 ml daha hidroklorik asit (3,2) eklenir. Beher bir kum banyosuna konur 
ve çözünmeyen silika oluştur arak kuruyana kadar buharlaştırılır. Kalıntı 10 ml nitrik asitte (3.3) yeniden 
çözündürülür ve kum banyosunda ya da ısıtıcı plakada 5 dakika boyunca kuruyana kadar buharlaştırmadan 
kaynatılır. Sıvı 500 ml’lik balon jojeye boşaltılır, beher birkaç kez sıcak  su ile durulanır. Soğumaya bırakılır, su 
ile gereken hacme tamamlanır, homojenleştirilir ve filtrelenir.  
5.2.  Renk oluşumu ve optik yoğunluğun ölçümü  
5.1.1 ya da 5.1.2 ile elde edilen filtratın temsili bir miktarı, en fazla 40 μg/ml’lik bir fosfor konsantrasyonu elde 
etmek için seyreltilir. Bu çözeltinin 10 ml’si bir test tüpüne (4.6) konur ve 10 ml molibdovanadat ayıracı (3.6) 
eklenir. Homojenleştirilir ve 20°C’de en az 10 dakika boyunca bekletilir. 10 ml suya 10 ml molibdovanadat 
ayıracı (3.6) ekl enerek elde edilen bir çözeltiye karşılık 430 nm’de bir spektrofotometre ile optik yoğunluk 
ölçülür.  
5.3.  Kalibrasyon eğrisi  
Standart çözeltiden (3.7), sırasıyla 5, 10, 20, 30 ve 40 μg/ml fosfor içeren çözeltiler hazırlanır. Bu çözeltilerin her 
birinden 1 0 ml alınır ve ilaveten 10 ml molibdovanadat ayıracı (3.6) eklenir. Homojenleştirilir ve 20°C’de en az 
10 dakika boyunca bekletilir. Optik yoğunluk 5.2’de belirtildiği gibi ölçülür. Karşılık gelen fosfor miktarlarına 
göre optik yoğunlukları çizerek kalibra syon eğrisi çizilir. 0 ile 40 μg/ml arasındaki konsantrasyonlarda eğri 
doğrusal olacaktır.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalibrasyon eğrisini kullanılarak test numunesindeki fosfor miktarını tayin edilir. Sonuçları numunenin yüzdesi 
olarak ifade edilir.  
6.1.Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki farkı aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
— % 5’ten az fosfor içeriği için daha yüksek sonuca bağıl %  3  
— % 5 ve daha fazla fosfor içeriği için mutlak değer olarak %  0,15.  
N.  SU DA ÇÖZÜNEBİLEN KLORÜR İÇERİĞİNİN TAYİNİ  
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot; yemlerde sodyum klorür olarak suda çözünebilen klorür tayinini mümkün kılar. Tüm yemler için 
geçerlidir.  
2.  Prensip  
Klorürler suda çözünür. Ürün organik madde içeriyorsa berraklaştırılır . Çözelti nitrik asitle biraz asitleştirilir ve 
klorürler, gümüş nitrat çözeltisi ile gümüş klorür formunda çöktürülür. Gümüş nitratın fazlası amonyum 
tiyosiyanat çözeltisi ile Volhard metoduna göre titre edilir.  
3.  Ayıraçlar  63 
 3.1.  0,1 mol/l’lik amonyum t iyosiyanat çözeltisi  
3.2.  0,1 mol/l’lik gümüş nitrat çözeltisi  
3.3.  Doymuş amonyum demir sülfat (NH 4)Fe(SO 4)2 çözeltisi  
3.4.  Nitrik asit, yoğunluk: 1,38 g/ml  
3.5.  Dietil eter  
3.6.  Aseton  
3.7.  Carrez I çözeltisi: Su içinde 21,9 g çinko asetat Zn(CH 3COO) 2 2H 2O ve 3 g glasiyal asetik asit 
çözündürülür. Su ile 100 ml’ye tamamlanır.  
3.8.  Carrez II çözeltisi: Su içinde 10,6 g potasyum ferrosiyanid K 4Fe(CN) 6 3H 2O çözündürülür. Su ile 100 ml’ye 
tamamlanır.  
3.9.  Aktif karbon (klorür içermeyen ve klorürleri  absorbe etmeyen).  
4.  Cihaz  
Karıştırıcı (çalkalayıcı): yaklaşık 35 ila 40 rpm  
5.  Metot  
5.1.  Çözeltinin hazırlanması  
Numunenin yapısına göre 5.1.1, 5.1.2 ya da 5.1.3’te gösterilen şekilde bir çözelti hazırlanır.  
 Aynı zamanda analiz edilecek numuneyi içe rmeyen bir kör testi gerçekleştirilir.  
5.1.1.  Organik madde içermeyen numuneler  
En fazla 10 g ağırlığında ve klorür formunda en fazla 3 g klor içeren numune 1 mg hassasiyetle tartılır. Yaklaşık 
20°C’deki 400 ml su ile birlikte 500 ml’lik bir balon jojeye konur. Karıştırıcıda 30 dakika karıştırılır, hacmine 
tamamlanır, homojenleştirilir ve süzülür.  
5.1.2.     5.1.3’te listelenenler dışındaki organik maddeleri içeren numuneler  
Yaklaşık 5 g numune 1 mg hassasiyetle tartılır  ve 1 g aktif karbon (3.4) ile 500 ml’lik balon jojeye konur. 
Yaklaşık 20°C’deki 400 ml su ve 5 ml Carrez I çözeltisi (3.7) eklenip, 30 saniye karıştırılır, ardından 5 ml Carrez 
II çözeltisi (3.8) eklenir. Karıştırıcıda 30 dakika karıştırılır, hacmine tamamlanıp, homojenleştirilir ve süzülü r. 
5.1.3.  Pişirilmiş yem, keten tohumu küspesi ve unu, keten tohumu unu açısından zengin ürünler ve müsilaj ya da 
kolloidal maddeler açısından zengin ürünler (örneğin; dekstrine edilmiş nişasta):  
Çözelti 5.1.2’de anlatılan şekilde hazırlanır ancak süzülme z. Gerekiyorsa santrifüjlenir, 100 ml süpernatant sıvı 
alınır ve 200 ml’lik bir balon jojeye aktarılır. Aseton (3.6) ile karıştırılır ve bu çözücü ile hacmine tamamlanıp, 
homojenleştirilir ve süzülür.  
5.2.  Titrasyon  
Bir pipet ile 5.1.1, 5.1.2 ya da 5.1.3’ te açıklanan şekilde elde edilen 25 ml -100 ml süzüntü (varsayılan klorür 
içeriğine göre) bir erlene aktarılır. Alınan çözelti en fazla 150 mg klorür (Cl) içermelidir. Gerekiyorsa en az 50 
ml su ile seyreltilir, 5 ml nitrik asit (3.4), 20 ml doymuş amonyum demir sülfat çözeltisi (3.3) ve sıfır işaretine 
kadar doldurulmuş bir büretle aktarılan iki damla amonyum tiyosiyanat çözeltisi (3.1) eklenir. Bir büret 
kullanarak gümüş nitrat çözeltisi (3.2) 5 ml’lik bir fazlalık elde edecek şekilde aktarılır. 5 ml dieti l eter (3.5) 64 
 eklenir ve çökelti oluşturmak için sertçe çalkalanır. Gümüş nitratın fazlası amonyum tiyosiyanat çözeltisi (3.1) 
ile kırmızımsı kahverengi ton oluşup  bir dakika boyunca  kaybolmadan  devem edene kadar titre edilir.   
6.  Sonuçların hesaplanması  
Klorür miktarı % sodyum klorür olarak (X) aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:  
  
burada:  
V1 = Eklenen 0,1 mol/l gümüş nitrat çözeltisinin miktarı, ml  
V2 = Titrasyon için kullanılan 0,1 mol/l amonyum tiyosiyanat çözeltisinin miktarı, ml  
m = Numunenin ağırlığı.  
Kör testi için 0,1 mol/l gümüş nitrat çözeltisi tüketiliyorsa, bu değer hacimden düşülür (V1 − V2).  
7.  Gözlemler  
7.1.  Ayrıca titrasyon potansiyometre ile de gerçekleştirilebilir.  
7.2.  Sıvı ya da katı yağlar açısından çok zengin ürünlerde, önce  dietil eter ya da petrol eteri ile yağ alınır.  
7.3.  Balık ununda, titrasyon Mohr metodu ile yürütülebilir.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
65 
 EK-4 
YEMLERDE KULLANIMINA İZİN VERİLEN YEM KATKI MADDELERİNİN DÜZEYLERİNİN 
KONTROLÜNE YÖNELİK  ANALİZ METOTLARI  
A.  VİTAMİN A TAYİNİ  
 
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot; yemlerdeki ve premikslerdeki A vitamini (retinol) seviyesinin tayinini mümkün kılar. A vitamini all -
trans -retinil alkol ve bunun cis -izomerlerini içerir; bu bileşenler bu metot ile tayin edilir. A vitamininin içeriği kg  
başına Uluslararası Birim (IU) cinsinden ifade edilir. Bir IU, 0,300 μg all -trans -vitamin A alkol ya da 0,344 μg 
all-trans -vitamin A asetat veya 0,550 μg all -trans -vitamin A palmitat etkinliğine karşılık gelir. Ölçüm limiti 
2.000 IU/kg vitamin A’dır.  
2.  Prensip  
Numune etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile hidrolize edilir ve vitamin A petrol eter içinde ekstrakte edilir. 
Çözücü buharlaştırılarak uzaklaştırılır ve kalıntı metanol içinde çözündürülür ve gerekiyorsa gereken 
konsantrasyona seyreltilir. Vi tamin A miktarı UV veya florasans dedektör kullanılarak ters fazlı yüksek 
performans sıvı kromatografisi (RP -HPLC) ile belirlenir.  Kromatografik parametreler all -trans -vitamin A alkolü 
ile cis izomerleri arasında ayrım olmayacak şekilde seçilir.  
3.  Ayıra çlar 
3.1.  Etanol, σ = %  96 
3.2.  Petrol eteri, kaynama aralığı 40 -60°C  
3.3.  Metanol  
3.4.  Potasyum hidroksit çözeltisi, c = 50 g/100 ml  
3.5.  Sodyum askorbat çözeltisi, c = 10 g/100 ml (bakınız 7.7)  
3.6.  Sodyum sülfit, Na 2S · x H 2O (x = 7 -9) 
3.6.1.  Sodyum sülfit çözeltisi, gliserol içinde c = 0,5 mol/l, ß = 120 g/l (x = 9 için) (bakınız 7.8)  
3.7.  Fenolftalein çözeltisi, etanol (3.1) içinde c = 2 g/100 ml  
3.8.  2-Propanol  
3.9. HPLC için mobil faz: metanol (3.3) ve su karışımı, örn. 980 + 20 (v + v)  Tam oran kullanılan kolon 
özellikleri ile belirlenebilir.  
3.10.  Azot, oksijen içermeyen  
3.11.   All-trans -vitamin A asetat, ekstra saf, onaylanan etkinlikte, (örneğin 2,80 x 106 IU/g)  
3.11.1.   All-trans -vitamin A asetat stok çözeltisi: 50 mg vitamin A asetatı (3.11) 0,1 mg hassasiyetle 100 ml’lik 
balon jojeye tartılır. 2 -propanol (3.8) içinde çözündürülür ve aynı çözücü ile hacmine tamamlanır. Bu çözeltinin 
nominal konsantrasyonu 1 400 IU/ml vi tamin A’dır. Tam içerik 5.6.3.1’e göre tayin edilir.  
3.12.  All-trans -vitamin A palmitat, ekstra saf, onaylanan aktivitede, örn. 1,80 x 106 IU/g 66 
 3.12.1.  All-trans -vitamin A palmitatın stok çözeltisi: 80 mg vitamin A palmitatı (3,12) 0,1 mg hassasiyetle 10 0 
ml’lik balon jojeye tartılır. 2 -propanol (3.8) içinde çözündürülür ve aynı çözücü ile hacmine tamamlanır. Bu 
çözeltinin nominal konsantrasyonu 1 400 IU/ml vitamin A’dır. Tam içerik 5.6.3.2’ye göre tayin edilir.  
3.13.  2,6-Di-tert-butil-4-metilfenol (BHT)  (bakınız 7.5)  
4.  Cihazlar  
4.1.  Vakumlu döner buharlaştırıcı (rotary evaporator)  
4.2.  Amber renkli cam malzemeler  
4.2.1.  500 ml’lik, şilif cam soketli, düztabanlı ya da konik şişe.  
4.2.2.  Şilif tapalı, dar ağızlı, 10, 25, 100 ve 500 ml’lik balon jojel er 
4.2.3.  1000 ml’lik, şilif cam tapalı, konik, ayırma hunileri  
4.2.4.  250 ml’lik, buzlu cam soketli, armut şekilli balon  
4.3.  Allihn yoğunlaştırıcı, ceket uzunluğu 300 mm, rodajlı bağlantılı, gaz besleme borusu için adaptör  
4.4.  Faz ayrımı için, 185 mm çapında katlı filtre kağıdı (örn. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)  
4.5.  Enjeksiyon sistemli HPLC cihazı  
4.5.1. Sıvı kromatografik kolon, 250 mm x 4 mm, C 18, 5 ya da 10 μm dolgu ya da eşdeğeri (performans kriteri: 
HPLC koşulları altında tüm retinol izom erleri için yalnızca tek bir pik)  
4.5.2.  UV ya da flüoresans detektörü, değişken dalga boyu ayarlı  
4.6.  10 mm kuvars hücreli spektrofotometre  
4.7.  Manyetik karıştırıcılı su banyosu  
4.8.  Aşağıdakilerden oluşan ekstraksiyon cihazı (bakınız şekil 1):  
4.8.1.  1 litre kapasiteli, şilifli camdan bir boyun ve tıpa takılmış cam silindir  
4.8.2.  Bir yan kol ve merkezden geçen ayarlanabilir bir tüp takılmış şilifli cam ek. Ayarlanabilir tüpün, 
silindirdeki üst sıvı katmanının ayırıcı bir huniye aktarılabileceği şekilde U şekilli bir alt ucu ve karşı uçta bir jeti 
olmalıdır.  
5.  Metot  
Not: Vitamin A (UV) ışığa ve oksitlenmeye duyarlıdır. Tüm işlemler ışık (amber cam malzemeler ya da 
alüminyum folyo ile korunan cam malzemeler kullanılarak) ve oksijenden korunmalı (azot akımında) bir 
ortamda gerçekleştirilmelidir. Ekstraksiyon sırasında sıvı ü zerindeki hava azotla yer değiştirmelidir (ara sıra tıpa 
gevşetilerek yüksek  basınç oluşması engellenmelidir).  
5.1.  Numunenin hazırlanması  
Numune 1 mm gözenekli elekten geçecek şekilde öğütülür, ısı oluşumunun önlenmesine dikkat edilir. Öğütme 
işlemi tart ım ve sabunlaştırmanın hemen öncesinde gerçekleştirilmelidir, aksi halde vitamin A kaybı olabilir.  
5.2.  Sabunlaştırma  67 
 Vitamin A içeriğine bağlı olarak 2 g - 25 g numune 1 mg hassasiyetle 500 ml’lik bir düztabanlı ya da konik cam 
balona  (4.2.1) konur . Karıştırarak sırasıyla 130 ml etanol (3.1), yaklaşık 100 mg BHT (3.13), 2 ml sodyum 
askorbat çözeltisi (3.5) ve 2 ml sodyum sülfit çözeltisi (3.6) eklenir. Cam malzemeye bir yoğunlaştırıcı (4.3) 
takılır ve balon joje manyetik karıştırıcılı bir su banyosuna  (4.7) daldırılır. Kaynama noktasına ısıtılır ve 5 dakika 
boyunca geri soğutucuda tutulur. Ardından 25 ml potasyum hidroksit çözeltisi (3.4) yoğunlaştırıcı (4.3) içinden 
eklenir ve yavaş bir azot akımı altında karıştırılarak 25 dakika daha geri soğutucuda tutulur. Ardından 
yoğunlaştırıcı yaklaşık 20 ml su ile durulanır ve şişenin içeriği oda sıcaklığına soğutulur.  
5.3.  Ekstraksiyon  
Sabunlaştırma çözeltisi toplam hacmi 250 ml olan su ile durulayarak nicel olarak 1000 ml’lik bir ayırma 
hunisine (4.2.3) ya da  ekstraksiyon cihazına (4.8) süzerek aktarılır. Sabunlaştırma şişesi sırasıyla 25 ml etanol 
(3.1) ve 100 ml petrol eteri (3.2) ile durulanır ve durulama çözeltileri ayırma hunisine ya da ekstraksiyon 
cihazına aktarılır. Birleştirilmiş çözeltilerdeki su ve etanol oranı yaklaşık 2:1 olmalıdır. 2 dakika boyunca 
kuvvetlice çalkalanır ve 2 dakika durulması beklenir.  
5.3.1.  Bir ayırma hunisi (4.2.3) kullanarak ekstraksiyon  
Fazlar  ayrıldığında (bakınız 7.3) petrol eteri fazı başka bir ayırma hunisine (4.2.3) akta rılır. Bu ekstraksiyon 
işlemi 100 ml petrol eteri ile (3.2) iki kez ve 50 ml petrol eteri ile (3.2) iki kez yinelenir.  
Ayırma hunisindeki birleştirilmiş ekstraktları, 100 ml’lik su ile hafifçe karıştırarak (emülsiyon oluşumunu 
önlemek için) ve ardından fen olftalein çözeltisi (3.7) eklendiğinde su renksiz kalana kadar 100 ml’lik su ile 
yeniden çalkalayarak (dört kez yıkamak genelde yeterlidir) yıkanır. Yıkanmış ekstrakt, süspansiyon halindeki 
suyu çıkartmak amacıyla faz ayrımı (4.4) için bir kuru katmanlı fi ltreden 500 ml’lik balon jojeye (4.2.2) süzülür. 
Ayırma hunisi ve filtre 50 ml petrol eteri ile (3.2) durulanır, petrol eteri ile (3.2) işarete kadar tamamlanır ve 
iyice karıştırılır.  
5.3.2.  Ekstraksiyon cihazı (4.8) kullanarak ekstraksiyon  
Fazlar  ayrıldı ğında (bakınız 7.3) cam silindirin tıpası (4.8.1) şilifli cam ek (4.8.2) ile değiştirilir ve ayarlanabilir 
tüpün U şekilli alt ucu, birleşme yüzeyi seviyesinin hemen üzerinde olacak şekilde yerleştirilir. Azot hattından 
yan kola basınç uygulayarak üstteki petrol eteri 1000 ml’lik bir ayırma hunisine (4.2.3) aktarılır. 100 ml petrol 
eteri (3.2) cam silindire eklenir, ağzı kapatılır ve iyice çalkalanır. Fazların ayrılmasına izin verilir ve üstteki 
katmanı önceki gibi ayırma hunisine aktarılır. Ekstraksiyon iş lemi 100 ml petrol eteri ile (3.2), ardından iki kez 
50 ml’lik petrol eteri ile (3.2) yinelenir ve petrol eteri fazları  ayırma hunisine eklenir.  
Birleştirilmiş petrol eteri ekstraktları 5.3.1’de anlatıldığı gibi yıkanır ve devam edilir.  
5.4.  HPLC için nu mune çözeltisinin hazırlanması  
Belirli miktarda petrol eteri çözeltisi (5.3.1 ya da 5.3.2’den elde edilen) 250 ml’lik armut şekilli balona (4.2.4) 
pipetle alınır. En fazla 40°C’lik bir su banyosunda azaltılan basınçla döner buharlaştırıcıda (rotary evapora tor) 
(4.1) çözücü neredeyse kuruyana kadar buharlaştırılır. Azot (3.10) içeri alınarak atmosferik basınç yeniden 
sağlanır ve balon joje döner buharlaştırıcıdan (rotary evaporator) çıkartılır. Kalan çözücü bir azot (3.10) buharı 
ile çıkartılır ve kalıntı he men bilinen hacimdeki (10 -100 ml) metanol (3.3) (vitamin A konsantrasyonu 5 IU/ml 
ile 30 IU/ml arasında olmalıdır) içinde çözündürülür.  
5.5.  HPLC ile tayin  
Vitamin A, bir C 18 ters faz kolonunda (4.5.1) ayrılır ve konsantrasyon bir UV detektörü (325 nm) ya  da bir 
flüoresans detektörü ile ölçülür. (eksitasyon: 325 nm, emisyon: 475 nm) (4.5.2)  
5.4’te elde edilen metanolik çözeltiden belirli miktarda (örneğin 20 μl) enjekte edilir ve mobil faz (3.9) ile elüe 
edilir. Aynı numune çözeltisinin çeşitli enjeksiyonl arının ortalama pik yüksekliği (alan) ve kalibrasyon 
çözeltilerinin (5.6.2) çeşitli enjeksiyonlarının ortalama pik yükseklikleri (alanlar) hesaplanır.  68 
 HPLC koşulları  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğ er koşullar da 
kullanılabilir.  
 
5.6.  Kalibrasyon  
5.6.1.  Çalışma standard çözeltilerinin hazırlanması  
20 ml vitamin A asetat stok çözeltisi (3.11.1) ya da 20 ml vitamin A palmitat stok çözeltisi (3.12.1) 500 ml’lik 
düz tabanlı ya da konik cam balona (4.2.1) pipet ile alınır ve BHT eklenmeden 5.2’de anlatıldığı gibi hidrolize 
edilir. Ardından p etrol eteri ile (3.2) 5.3’e göre ekstrakte edilir ve petrol eteri ile (3.2) 500 ml’ye tamamlanır. Bu 
ekstraktın 100 ml’si döner buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (bakınız 5.4) neredeyse kuruyana kadar 
buharlaştırılır, kalan çözücü bir azot (3.10) buharı  ile çıkartılır ve kalıntı 10,0 ml metanol (3.3) içinde yeniden 
çözündürülür. Bu çözeltinin nominal konsantrasyonu 560 IU/ml vitamin A’dır. Tam içerik 5.6.3.3’e göre tayin 
edilir. Çalışma standardı çözeltisi, kullanılmadan önce taze hazırlanmalıdır.  
 Bu ça lışma standardı çözeltisinin 2,0 ml’sini 20 ml’lik balon jojeye pipetlenir, metanol (3.3) ile işarete kadar 
tamamlanır ve karıştırılır. Bu seyreltilmiş çalışma standardının nominal konsantrasyonu 56 IU/ml vitamin A’dır.  
5.6.2.  Kalibrasyon çözeltilerinin v e kalibrasyon grafiğinin hazırlanması  
1,0- 2,0- 5,0 ve 10,0 ml seyreltilmiş çalışma standardı çözeltisi bir dizi 20 ml’lik balon jojeye aktarılır, metanol 
(3.3) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltilerin nominal konsantrasyonları 2,8 - 5,6- 14,0 ve 28,0 
IU/ml vitamin A’dır.  
Her bir kalibrasyon çözeltisinin 20 μl’si birkaç kez enjekte edilir ve ortalama pik yükseklikleri (alanlar) tayin 
edilir. Ortalama pik yükseklikleri (alanlar) ve UV kontrolünün (5.6.3.3) sonuçları göz önünde bulundurula rak bir 
kalibrasyon grafiği çizilir.  
5.6.3.  Standart çözeltilerinin UV standardizasyonu  
5.6.3.1.   Vitamin A asetat stok çözeltisi  
2,0 ml vitamin A asetat stok çözeltisi (3.11.1) 50 ml’lik bir balon jojeye (4.2.2) pipet ile alınır ve 2 -propanol 
(3.8) ile i şaretine kadar tamamlanır. Bu çözeltinin nominal konsantrasyonu 56 IU/ml vitamin A’dır. Bu 
seyreltilmiş vitamin A asetat çözeltisinin 3,0 ml’si 25 ml’lik balon jojeye pipet ile alınır ve 2 -propanol (3.8) ile 
işaretine kadar tamamlanır. Bu çözeltinin nomina l konsantrasyonu 6,72 IU/ml vitamin A’dır. Bu çözeltinin UV 
spektrumu  2 -propanole (3.8) göre, 300 nm ile 400 nm arasında spektrofotometrede (4.6) ölçülür. Ekstinksiyon 
maksimumu 325 nm ile 327 nm arasında olmalıdır.  
Vitamin A içeriğinin hesabı  
IU vitamin A/ml = E 326 × 19,0  Sıvı kromatografik kolon (4.5.1):  250 mm × 4 mm, C 18, 5 ya da 10 μm dolgu ya da 
eşdeğeri  
Mobil faz (3.9)                          Metanol (3.3) ve su karışımı, örn. 980 + 20 ( v+v). 
Akış hızı                                       1-2 ml/dak.  
Dedektör (4.5.2)                             UV detektörü (325 nm) ya da floresans detektörü 
(eksitasyon: 325 nm/emisyon: 475 nm).  69 
 Vitamin A asetat için (      = 326 nm’de 2 -propanol içinde 1530)  
5.6.3.2.  Vitamin A palmitat stok çözeltisi  
2,0 ml vitamin A palmitat stok çözeltisi (3.12.1) 50 ml’lik (3.8) ile işaretine kadar tamamlanır. Bu çözeltinin 
nominal konsantrasyonu 56 IU/ml vitamin A’dır.  
Bu seyreltilmiş vitamin A palmitat çözeltisinin 3,0 ml’si 25 ml’lik bir balon jojeye pipetlenir ve 2 -propanol (3.8) 
ile işarete kadar tamamlanır. Bu çözeltinin nominal konsantrasyonu 6,72 IU/ml vitamin A’dır. Bu çözel tinin UV 
spektrumu 2 -propanole (3.8) göre, 300 nm ile 400 nm arasında spektrofotometrede (4.6) ölçülür.  Ekstinksiyon 
maksimumu 325 nm ile 327 nm arasında olmalıdır.  
Vitamin A içeriğinin hesabı:  
IU vitamin A/ml = E 326 × 19,0  
Vitamin A palmitat için (        =326 nm’de 2 -propanol içinde 957)  
5.6.3.3.  Vitamin A çalışma standardı çözeltisi  
5.6.1’e göre hazırlanan seyreltil memiş vitamin A çalışma standard çözeltisinin 3,0 ml’si 50 ml’lik bir balon 
jojeye (4.2.2) pipetle alınır ve 2 -propanol (3.8) ile işaret ine kadar tamamlanır. Bu çözeltinin 5,0 ml’si 25 ml’lik 
bir balon jojeye pipetle alınır ve 2 -propanol (3.8) ile işaretine kadar tamamlanır. Bu çözeltinin nominal 
konsantrasyonu 6,72 IU/ml vitamin A’dır. Bu çözeltinin UV spektrumu 2 -propanole (3.8) göre, 30 0 nm ile 400 
nm arasında spektrofotometrede (4.6) ölçülür. Ekstinksiyon maksimumu 325 nm ile 327 nm arasında olmalıdır.  
Vitamin A içeriğinin hesabı:  
IU vitamin A/ml = E 325 × 18,3  
Vitamin A alkol için (       = 325 nm’de 2 -propanol içinde 1821)  
6.  Sonuçl arın hesaplanması  
Kalibrasyon grafiğini (5.6.2) referans alarak, çözeltinin vitamin A piklerinin ortalama yüksekliğinden (alan), 
aynı çözeltisinin konsantrasyonu IU/ml cinsinden tayin edilir.  
Numunenin IU/kg cinsinden vitamin A içeriği “w” aşağıdaki formül le elde edilir:  
  
burada:  
c = Numune çözeltisinin (5.4) vitamin A konsantrasyonu, IU/ml  
V1 = Numune çözeltisinin (5.4) hacmi, ml  
V2 = 5.4’te alınan temsili miktarının hacmi, ml  
m = Test numunesinin ağırlığı, g  
7.  Gözlemler  
7.1.  Düşük vitamin A konsantrasyonu olan numunelerde iki sabunlaştırma yükünün (tartılan miktar: 25 g) petrol 
eteri ekstraktlarının HPLC tayini için bir numune çözeltisinde birleştirilmesi yararlı olabilir.  
7.2.  Analiz için alınan numunenin ağırlığı 2 g’dan fazla yağ içermeme lidir.  
70 
 7.3.  Faz ayrımı oluşmazsa emülsiyonu kırmak için yaklaşık 10 ml etanol (3.1) eklenir.  
7.4.  Balık yağı ve diğer saf yağlarla sabunlaştırma süresi 45 -60 dakikaya kadar uzatılabilir.  
7.5. BHT yerine hidrokinon kullanılabilir.  
7.6.  Bir n ormal faz kolonu kullanılarak retinol izomerlerinin ayrımı mümkündür. Ancak bu durumda tüm cis ve 
trans izomer piklerinin yükseklikleri (alanlar) hesaplar için toplanmalıdır.  
7.7.  Sodyum askorbat çözeltisi yerine yaklaşık 150 mg askorbik asit kullanılabilir.  
7.8.  Sodyum sülfit çözeltisi yerine yaklaşık 50 mg EDTA kullanılabilir.  
7.9.  Süt ikame yemlerindeki vitamin A’nın analizinde, aşağıdakilere özellikle dikkat edilmelidir  
— sabunlaştırmada (5.2): Numunede mevcut yağ miktarı nedeniyle potasyum hidroksit çözeltisi  (3.4) miktarının 
artırılması gerekebilir,  
— ekstraksiyonda (5.3): emülsiyonların varlığı nedeniyle, su/etanol 2:1 oranının adaptasyonu gerekebilir.  
Uygulanan analiz metodunun bu spesifik matrikste (süt ikame yemi) güvenilir sonuçlar verip vermediğini 
kontrol etmek için, ilave test numunesinde  bir geri kazanım testi uygulanmalıdır. Geri kazanım oranı %  80’den 
düşükse analitik sonucun geri kazanım için düzeltilmesi gerekir.  
8.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki f ark daha yüksek sonuca bağıl %  15’i geçmemelidir.  
9.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
 Premiks  Premiks -yem Mineral 
konsantresi  Protein yemi  Domuz 
yavrusu  
L  13 12 13 12 13 
n  48 45 47 46 49 
ortalama 
[IU/kg]  17,02 x 106 1,21 x 106 537.100  151.800  18.070  
sr [IU/kg]  0,51 x 106 0,039 x 106 22.080  12.280  682 
r [IU/kg]  1,43 x 106 0,109 x 106 61.824  34.384  1.910  
CV r [%] 3,0 3,5 4,1 8,1 3,8 
SR [IU/kg]  1,36 x 106 0,069 x 106 46.300  23.060  3.614  
R [IU/kg]  3,81 x 106 0,193 x 106 129.640  64.568  10.119  
CV R [%] 8,0 6,2 8,6 15 20 71 
 L = Laboratuvarların sayısı  
n= Tekil değerlerin sayısı  
sr = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
r = Tekrar edilebilirlik  
R = Tekrar üretilebilirlik  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı.  
 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 72 
 
Ektraksiyon Cihazları  
 
 
şilifli cam ek (4.8.2) (yaklaşık 
uzunluk  45 cm)  
  
Cam silindir (4.8.1) (yaklaşık yükseklik 48 cm   
 
 
 
 
 
Ayarlanabilir tüp  
 
 
 
 
 
                  Petrol eteri fazı 
 
 
 
 
 
 Sulu katman + sabunlaştırılmış yem  
 
 
 
 
 
 73 
 B.  VİTAMİN E TAYİNİ  
 
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot; yemdeki ve premikslerdeki E vitamini seviyesinin tayinini mümkün kılar. Vitamin E içeriği mg/kg 
DL-α-tokoferol asetat olarak ifade edilir. 1 mg DL -α-tokoferol asetat 0,91 mg DL -α-tokoferole (vitamin E) 
karşılık gelir.  
Ölçüm limiti 2 mg/kg vitamin E’dir. Bu ölçüm limiti yalnızca floresans detektörüyle geçerlidir. Bir UV 
detektöründe ölçüm limiti 10 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Numune etanollü potasyum hidroksit çözeltisi ile hidrolize edilir ve vitamin E petrol eteri ile ekstrakte edilir. 
Çözücü buharlaştırılarak uzaklaştırılır ve kalıntı metanol içinde çözündürülür ve gerekiyorsa gereken 
konsantrasyona seyreltilir. Vitamin E içe riği, bir UV ya da floresans detektörü kullanılarak ters fazlı yüksek 
performans sıvı kromatografisi (RP -HPLC) ile tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Etanol, σ = %  96. 
3.2.  Petrol eteri, kaynama aralığı 40 -60°C.  
3.3.  Metanol.  
3.4.  Potasyum hidroksit çöze ltisi, c = 50 g/100 ml.  
3.5.  Sodyum askorbat çözeltisi, c = 10 g/100 ml (bakınız 7.7 ).  
3.6.  Sodyum sülfit, Na 2S · x H 2O (x = 7 -9). 
3.6.1.  Sodyum sülfit çözeltisi, gliserol içinde c = 0,5 mol/l, ß = 120 g/l (x = 9 için) (bakınız 7.8 )  
3.7.  Fenolftalein  çözeltisi, etanol (3.1) içinde c = 2 g/100 ml.  
3.8.  HPLC için mobil faz: metanol (3.3) ve su karışımı, örn. 980 + 20 (h + h). Tam oran, kullanılan kolon 
özellikleri ile tayin edilecektir.  
3.9.  Azot, oksijen içermemeli.  
3.10.  DL-α-tokoferol asetat, ekst ra saf, onaylanan aktivitede.  
3.10.1.  DL-α-tokoferol asetatın stok çözeltisi: 100 mg DL -α-tokoferol asetat (3.10) 0,1 mg hassasiyetle 100 
ml’lik balon jojeye tartılır. Etanol (3.1) içinde çözündürülür ve aynı çözücü ile işaret çizgisine kadar tamamlanır. 
Bu çözeltinin 1 ml’si 1 mg DL -α-tokoferol asetat içerir (UV kontrolü için bakınız 5.6.1.3; stabilizasyon için 
bakınız 7.4 ).  
3.11.  DL-α-tokoferol, ekstra saf, onaylanan aktivitede.  
3.11.1.  DL-α-tokoferol stok çözeltisi: 100 mg DL -α-tokoferol (3.10) 0,1 m g hassasiyetle 100 ml’lik balon jojeye 
tartılır. Etanol (3.1) içinde çözündürülür ve aynı çözücü ile işaret çizgisine kadar tamamlanır. Bu çözeltinin 1 
ml’si 1 mg DL -α-tokoferol içerir. (UV kontrolü için bakınız 5.6.2.3; stabilizasyon için bakınız 7.4 ).  
3.12. 2,   6-Di-tert-bütil-4-metilfenol (BHT) (bakınız 7.5 ).  
4.  Cihazlar  74 
 4.1.  Döner buharlaştırıcı (Rotary evaporator).  
4.2.  Amber renkli cam malzemeler.  
4.2.1.  500 ml’lik, şilifli, düz tabanlı ya da konik şişe.  
4.2.2.  Şilifli , dar ağızlı, 10, 25, 100  ve 500 ml’lik balon jojeler.  
4.2.3.  1000 ml’lik, şilifli, konik, ayırma hunileri.  
4.2.4.  250 ml’lik, şilifli , armut şekilli balon joje.  
4.3.  Allihn yoğunlaştırıcı, ceket uzunluğu 300 mm, şilifli cam ekleme, gaz besleme borusu için adaptör.  
4.4.  Faz ayrımı için, 185 mm çapında katlı filtre kağıdı (örn. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).  
4.5.  Enjeksiyon sistemli HPLC cihazı  
4.5.1.  Sıvı kromatografik kolon, 250 mm × 4 mm, C 18, 5 ya da 10 μm dolgu ya da eşdeğeri.  
4.5.2.   UV ya da flüoresans detektörü, de ğişken dalga boyu ayarlı.  
4.6.  10 mm kuvars hücreli spektrofotometre.  
4.7.  Manyetik karıştırıcılı su banyosu.  
4.8.  Aşağıdakilerden oluşan ekstraksiyon cihazı (bakınız şekil 1)  
4.8.1.   1 litre kapasiteli, şilifli camdan bir boyun ve tıpa takılmış cam si lindir.  
4.8.2.  Bir yan kol ve merkezden geçen ayarlanabilir bir tüp takılmış şilifli cam ek. Ayarlanabilir tüpün, 
silindirdeki üst sıvı katmanının ayırıcı bir huniye aktarılabileceği şekilde U şekilli bir alt ucu ve karşı uçta bir jeti 
olmalıdır.  
5.  Meto t 
Not: Vitamin E (UV -) ışığa ve oksitlenmeye duyarlıdır. Tüm işlemler ışık (amber cam malzemeler ya da 
alüminyum folyo ile korunan cam malzemeler kullanılarak) ve oksijen (azot ile yıkama) korunmalı bir ortamda 
gerçekleştirilmelidir. Ekstraksiyon sırasında  sıvı üzerindeki hava, azotla değiştirilmelidir (ara sıra tıpayı 
gevşeterek yüksek  basınç oluşması engellenmelidir).  
5.1.  Numunenin hazırlanması  
Numune 1 mm gözenekli elekten geçecek şekilde öğütülür, ısı oluşumunun önlemesine dikkat edilir. Öğütme 
işlemi  tartım ve sabunlaştırmanın hemen öncesinde gerçekleştirilmelidir, aksi halde vitamin E kaybı olabilir.  
5.2.  Sabunlaştırma  
Vitamin E içeriğine  bağlı olarak 2 g - 25 g numune 0,01 g hassasiyetle 500 ml’lik bir düz tabanlı ya da konik 
cam balona (4.2.1) tartılır. Karıştırarak sırasıyla  130 ml etanol (3.1), yaklaşık 100 mg BHT (3,12), 2 ml sodyum 
askorbat çözeltisi (3.5) ve 2 ml sodyum sülfit çözeltisi (3.6) eklenir. Cam malzemeye yoğunlaştırıcı (4.3) takılır 
ve balon manyetik karıştırıcılı bir su banyosuna ( 4.7) daldırılır. 5 dakika boyunca geri soğutucuda tutulur . 
Ardından 25 ml potasyum hidroksit çözeltisi (3.4) yoğunlaştırıcı (4.3) içinden eklenir ve yavaş bir azot akımı 
altında karıştırılarak 25 dakika daha geri soğutucuda bırakılır. Ardından yoğunlaştırıcı yaklaşık  20 ml su ile 
durulanır ve balonun içeriği oda sıcaklığına soğutulur.  
5.3.  Ekstraksiyon  75 
 Sabunlaştırma çözeltisi, toplam hacmi 250 ml olan su ile durulanarak nicel olarak 1000 ml’lik bir ayırma 
hunisine (4.2.3) ya da ekstraksiyon cih azına (4.8) süzülerek  aktarılır. Sabunlaştırma şişesi sırasıyla 25 ml etanol 
(3.1) ve 100 ml petrol eteri (3.2) ile durulanır ve durulama suyu ayırma hunisine ya da ekstraksiyon cihazına 
aktarılır. Birleştirilmiş çözeltilerdeki su ve etanol oranı yaklaşık 2:1 olmalıdır. 2 dakika boyunca kuvvetlice 
çalkalanır ve 2 dakika çökmesi için (faz ayrımı için) beklenir.  
5.3.1.  Ayırma hunisi (4.2.3) kullanarak ekstraksiyon  
Fazlar  ayrıldığında (bakınız 7.3) petrol eteri Fazı başka bir ayırma hunisine (4.2.3) aktarılır . Bu ekstraksiyon 
işlemi 100 ml petrol  eteri ile  (3.2) iki kez ve 50 ml petrol  eteri ile  (3.2) iki kez yinelenir.  
Ayırma hunisindeki birleştirilmiş ekstraktlara, 100 ml’lik su ekleyip hafifçe karıştırarak (emülsiyon oluşumunu 
önlemek için) ve ardından fen olftalein çözeltisi (3.7) eklenerek su renksiz kalana kadar 100 ml’lik su ile yeniden 
çalkalayarak (dört kez yıkamak genelde yeterlidir) iki kez yıkanır. Yıkanmış ekstrakt, süspansiyon halindeki 
suyu ayırmak amacıyla faz ayrımı (4.4) için bir kuru katmanlı  filtreden 500 ml’lik balon jojeye (4.2.2) süzülür. 
Ayırma hunisi ve filtre 50 ml petrol eteri ile (3.2) durulanır, petrol eteri ile (3.2) işaretine kadar tamamlanır ve 
iyice karıştırılır.  
5.3.2.  Ekstraksiyon cihazı (4.8) kullanarak ekstraksiyon  
Fazlar  ayrıldığında (bakınız 7.3) cam silindirin tıpası (4.8.1) silifli cam ek (4.8.2) ile değiştirilir ve ayarlanabilir 
tüpün U şekilli alt ucu, birleşme yüzeyi seviyesinin hemen üzerinde olacak şekilde yerleştirilir. Azot hattından 
yan kola basınç uygulayarak üstteki hafif petrol 1000 ml’lik bir ayırma hunisine (4.2.3) aktarılır. 100 ml petrol 
eteri (3.2) cam silindire eklenir, ağzı kapatılır ve iyice çalkalanır. Katmanların ayrılmasına izin verilir ve üstteki 
katman  önceki gibi ayırma hunisine aktarılır. Ekstr aksiyon işlemini 100 ml petrol eteri ile (3.2), ardından iki kez 
50 ml’lik petrol eteri ile (3.2) yinelenir ve hafif petrol eteri fazı ayırma hunisine eklenir.  
 Birleştirilmiş petrol eteri ile ekstraktları 5.3.1’de anlatıldığı gibi yıkanır ve devam edilir.  
5.4.  HPLC için numune çözeltisinin hazırlanması  
Belli bir miktarda petrol eteri çözeltisi (5.3.1 ya da 5.3.2’den elde edilen) 250 ml’lik armut şekilli balona (4.2.4) 
pipetle alınır. En fazla 40°C’lik bir su banyosunda azaltılan basınçla döner buharlaştır ıcıda (rotary evaporator) 
(4.1) çözücü neredeyse kuruyana kadar buharlaştırılır. Azot (3.9) içeri alınarak atmosferik basınç yeniden 
sağlanır ve balon joje döner buharlaştırıcıdan (rotary evaporator) çıkartılır. Kalan çözücü bir azot (3.9) buharı ile 
çıkar tılır ve kalıntı hemen bilinen hacimdeki (10 -100 ml) metanol (3.3) (DL -α-tokoferol konsantrasyonu 5 μg/ml 
ile 30 μg/ml arasında olmalıdır) içinde çözündürülür.  
5.5.  HPLC ile tayin  
Vitamin E, bir C 18 ters faz kolonunda (4.5.1) ayrılır ve konsantrasyon bir floresans detektörü (eksitasyon: 295 
nm, emisyon: 330 nm) ya da UV detektörü (292 nm) (4.2.1) kullanılarak ölçülür.  
5.4’te elde edilen metanollü çözeltiden belli miktarda (örn. 20 μl) enjekte edilir ve mobil faz (3.8) ile elüe edilir. 
Aynı numune çözeltisi nin çeşitli enjeksiyonlarının ortalama pik yükseklikleri (alanlar) ve kalibrasyon 
çözeltilerinin (5.6.2) çeşitli enjeksiyonlarının ortalama pik yükseklikleri (alanlar) hesaplanır.  
HPLC koşulları  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir.  
 76 
  
5.6.  Kalibrasyon (DL -α-tokoferol asetat ya da DL -α-tokoferol)  
5.6.1.  DL-α- tokoferol asetat standardı  
5.6.1.1.  Çalışma standard çözeltisinin hazırlanması  
25 ml DL -α-tokoferol asetat stok çözeltisi (3.10.1) 500 ml’lik düz tabanlı ya da konik erlene (4.2.1) pipetle 
aktarılır ve 5.2’de anlatıldığı gibi hidrolize edilir. Ardından petrol eteri ile (3.2) 5.3’e göre ekstrakte edilir ve 
petrol eteri ile 500 ml’ye tama mlanır. Bu ekstraktın 25 ml’si döner buharlaştırıcıda (rotary evaporator)  (bakınız 
5.4) neredeyse kuruyana kadar buharlaştırılır, kalan çözücü azot (3.9) buharı ile çıkartılır ve kalıntı 25,0 ml 
metanol (3.3) içinde yeniden çözündürülür. Bu çözeltinin nom inal konsantrasyonu, 50 μg/ml DL -α-tokoferol 
asetata eşdeğer 45,5 μg/ml DL -α-tokoferoldür. Çalışma standard çözeltisi, kullanılmadan önce taze 
hazırlanmalıdır.  
5.6.1.2.  Kalibrasyon çözeltilerinin ve kalibrasyon grafiğinin hazırlanması  
1,0- 2,0- 4,0 ve 10, 0 ml çalışma standardı çözeltisi bir dizi 20 ml’lik balon jojeye aktarılır, metanol (3.3) ile 
işaretine kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltilerin nominal konsantrasyonları 2,5 - 5,0- 10,0 ve 25,0 μg/ml 
DL-α-tokoferol asetattır ya da 2,28 - 4,55- 9,10 μg/ml ve 22,8 μg/ml DL -α-tokoferoldür.  
Her bir kalibrasyon çözeltisinin 20 μl’si birkaç kez enjekte edilir ve ortalama pik yükseklikleri (alanlar) tayin 
edilir. Ortalama pik yükseklikleriyle (alanlar), bir kalibrasyon grafiği çizilir.  
5.6.1.3.  DL-α-tokoferol asetat stok çözeltisinin UV standardizasyonu (3.10.1)  
5,0 ml DL -α-tokoferol asetat stok çözeltisi (3.10.1) etanol ile 25,0 ml’ye seyreltilir ve bu çözeltinin UV 
spektrumu etanole (3.1) göre, 250 nm ile 320 nm arasında spektrofotometrede (4.6) ölçülür . 
Absorpsiyon maksimumu 284 nm’de olmalıdır:  
       = 284 nm’de etanol içinde 43,6  
Bu seyreltmede 0,84 ila 0,88 arasında bir ekstinksiyon değeri elde edilmelidir.  
5.6.2.  DL-α- tokoferol standardı  
5.6.2.1.  Çalışma standard çözeltisinin hazırlanması  
2 m l DL -α-tokoferol stok çözeltisi (3.11.1) 50 ml’lik balon jojeye pipetle alınır, metanol (3.3) içinde 
çözündürülür ve metanol ile işarete kadar tamamlanır. Bu çözeltinin nominal konsantrasyonu, 44,0 μg/ml DL -α-
tokoferol asetata eşdeğer 40 μg/ml DL -α-tokofer oldür. Çalışma standardı çözeltisi, kullanılmadan önce taze 
hazırlanmalıdır.  Sıvı kromatografik kolon (4.5.1):  250 mm × 4 mm, C 18, 5 ya da 10 μm dolgu ya da 
eşdeğeri  
Mobil faz (3.8):  Metanol (3.3) ve su karışımı, örn. 980 + 20 v+v). 
Akış hızı:  1-2 ml/dak.  
Detektör (4.5.2)  Floresans detektörü  
(eksitasyon: 295 nm/emisyon: 330 nm) ya da UV 
detektörü (292 nm)   77 
 5.6.2.2.  Kalibrasyon çözeltilerinin ve kalibrasyon grafiğinin hazırlanması  
1,0- 2,0- 4,0 ve 10,0 ml çalışma standardı çözeltisi bir dizi 20 ml’lik balon jojeye aktarılır, metanol  (3.3) ile 
işaretine kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltilerin nominal konsantrasyonları 2,0 - 4,0- 8,0 ve 20,0 μg/ml 
DL-α-tokoferol ya da 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml ve 22,0 μg/ml DL -α-tokoferol asetattır.  
Her bir kalibrasyon çözeltisinin 20 μl’si birka ç kez enjekte edilir ve ortalama pik yükseklikleri (alanlar) tayin 
edilir. Ortalama pik yükseklikleriyle (alanlar), bir kalibrasyon grafiği çizilir.  
5.6.2.3.  DL-α-tokoferol stok çözeltisinin UV standardizasyonu (3.11.1)  
2,0 ml DL -α-tokoferol stok çözeltis i (3.11.1) etanol ile 25,0 ml’ye seyreltilir ve bu çözeltinin UV spektrumu 
etanole (3.1) göre, 250 nm ile 320 nm arasında spektrofotometrede (4.6) ölçülür. Absorpsiyon maksimumu 292 
nm’de olmalıdır:  
 
      = 292 nm’de etanol içinde 75,8  
Bu seyreltmede ekstinksiyon değeri 0,6 elde edilmelidir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalibrasyon grafiğini (5.6.1.2 ya da 5.6.2.2) referans alarak, numune çözeltisinin vitamin E piklerinin ortalama 
yüksekliği (alan), aynı çözeltinin konsantrasyonu μg/ml (α -tokoferol aset at olarak hesaplanan)cinsinden tayin 
edilir.  
Numunenin mg/kg cinsinden vitamin E içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
c = Numune çözeltisinin (5.4) vitamin E konsantrasyonu (α -tokoferol asetat olarak), μg/ml  
V1 = Numune çözeltisinin (5.4) hacmi, ml 
V2 = 5.4’te alınan belirli miktarın hacmi, ml  
m = Numunenin ağırlığı, g  
7. Gözlemler  
7.1.  Düşük vitamin E konsantrasyonu olan numunelerde iki sabunlaştırma yükünün (tartılan miktar: 25 g) petrol 
eteri ekstraktlarının HPLC tayini için bir numune çözelti sinde birleştirilmesi yararlı olabilir.  
7.2.  Analiz için alınan numunenin ağırlığı 2 g’dan fazla yağ içermemelidir.  
7.3.  Faz ayrımı oluşmazsa emülsiyonu kırmak için yaklaşık 10 ml etanol (3.1) eklenir.  
7.4. DL -α-tokoferol asetat ya da DL -α-tokoferol çöze ltisinin sırasıyla 5.6.1.3 ya da 5.6.2.3’e göre 
spektrofotometrik ölçümlerden sonra yaklaşık 10 mg BHT’yi (3.12) çözeltiye (3.10.1 ya da 3.10.2) eklenir ve 
çözelti bir buzdolabında tutulur (saklama ömrü en fazla 4 haftadır).  
7.5.  BHT yerine hidrokinon kul lanılabilir.  
7.6.  Bir n ormal faz kolonu kullanılarak α -, β-, γ- ve δ-tokoferol ayrımı mümkündür.  
7.7.  Sodyum askorbat çözeltisi yerine yaklaşık 150 mg askorbik asit kullanılabilir.  
78 
 7.8.  Sodyum sülfit çözeltisi yerine yaklaşık 50 mg EDTA kullanılabilir.  
7.9.  Vitamin E asetat, alkali koşullar altında son derece hızlı hidrolize olur ve bu nedenle özellikle demir ve 
bakır gibi iz elementlerin varlığında oksitlenmeye çok duyarlıdır. 5000 mg/kg’dan yüksek seviyelerdeki 
premikslerd e vitamin E tayini yapılırken , bir vitamin E parçalanması oluşabilir. Bu nedenle onay için, alkalin 
sabunlaştırma adımı olmayan vitamin E formülasyonu enzimatik parçalanmasını içeren bir HPLC metodu 
önerilir.  
8.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları aras ındaki fark daha yüksek sonuca bağıl %  15’i geçmemelidir.  
9.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
 Premiks  Premiks yem  Mineral 
konsantresi  Protein yemi  Domuz 
yavrusu  
L 12 12 12 12 12 
n  48 48 48 48 48 
ortalama [mg/kg]  17.380  1.187  926 315 61,3 
sr [mg/kg]  384 45,3 25,2 13,0 2,3 
r [mg/kg]  1.075  126,8  70,6 36,4 6,4 
CVr [%]  2,2 3,8 2,7 4,1 3,8 
SR [mg/kg]  830 65,0 55,5 18,9 7,8 
R [mg/kg]  2.324  182,0  155,4  52,9 21,8 
CV R [%]  4,8 5,5 6,0 6,0 12,7 
L   = Laboratuvar ların sayısı  
N   = Tekil değerlerin sayısı  
sr    = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
SR   = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
r     = Tekrar edilebilirlik  
R    = Tekrar üretilebilirlik  
CV r   = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı  
 
 
 
 79 
 
 
 
Şekil 1: Ekstraksiyon cihazı (4.8)  
 
 
Buzlu cam ek (4.8.2.(yaklaşık 
uzunluk  45 cm)  
                   Cam silindir (4.8.1.)  
              (Yaklaşık yükseklik 48 cm)  
 
 
 
          
          Ayarlanabilir tüp  
 
 
   
 
Petrol eteri fazı 
 
 
 
Sulu katman +sabunlaştırılmış yem    
 
 
 
 
 
 
 
 
 80 
 C.  DEMİR, BAKIR, MANGAN VE ÇİNKO İZ ELEMENTLERİNİN TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemdeki iz miktardaki demir, bakır, mangan ve çinko elementlerinin tayinini mümkün kılar. Miktar 
tayini sınırları şunlardır:  
— demir (Fe): 20 mg/kg  
— bakır (Cu): 10 mg/kg  
— mangan (Mn): 20 mg/kg  
— çinko (Zn): 20 mg/kg.  
 
2.  Prensip  
Numune, organik maddeler hidroklorik asit içinde parçalandıktan sonra çözelti haline getirilir. Demir, bakır, 
mangan ve çinko elementleri, uygun bir se yreltmeden sonra atomik absorpsiyon spektrometresi  ya da diğer 
cihazlar  ile tayin edilir.  
3.  Malzemeler ve Çözeltiler   
Tanıtıcı yorumlar  
 Analizde kullanılan sarf malzemelerin ve çözeltilerin hazırlanmasında tayin edilecek maddeleri içermeyen ultra 
saf su kullanılır . 
Analizde kullanılan kimyasallar en azından analitik saflıkta olmalıdır. Tayin edilecek elementlerin var olmadığı, 
bir kör deneyle kontrol edilmelidir. Gerekiyorsa, ayıraçlar daha da saflaştırılmalıdır.  
Aşağıda açıklanan standart çözeltiler y erine, garantili olmaları ve kullanmadan önce kontrol edilmeleri kaydıyla 
ticari standart çözeltiler de kullanılabilir.  
Aşağıda açıklanan kimyasallar ve elementlere ait standart çözeltiler  
3.1.  Hidroklorik asit (d:1,19 g/ml).  
3.2.  Hidroklorik asit (6 mol /litre).  
3.3.  Hidroklorik asit (0,5 mol/litre).  
3.4.  En fazla 1 mg/litre demir (Fe) içeriği olan ve buharlaştırmadan sonra en fazla 10 mg (sülfat olarak)/litre 
kalıntı bırakan hidroflorik asit, %  38 - % 40’lık (v/v).  
3.5.  Sülfürik asit (d: 1,84 g/ml).  
3.6.  Hidrojen peroksit (yaklaşık 100 hacim oksijen (ağırlıkça %  30)).  
3.7.  Aşağıdaki gibi hazırlanan standart demir çözeltisi (1000 μg Fe/ml) ya da ticari olarak satın alınabilir 
eşdeğer bir çözelti: 1 g demir teli 200 ml 6 mol/litre hidroklorik asitte (3.2) çözündürülür, 16 ml hidrojen 
peroksit (3.6) eklenir ve suyla bir litrey e tamamlanır.  
3.7.1.  Çalışma standardı demir çözeltisi (100 μg Fe/ml), standart çözeltinin bir kısmının (3.7) 9 kısım suyla 
seyreltilmesiyle hazırlanmaktadır.  
3.8.  Aşağıdaki gibi hazırlanan standart bakır çözeltisi (1000 μg Cu/ml) ya da ticari olarak sa tın alınabilir eşdeğer 
bir çözelti:  81 
 –– 1 g toz formundaki bakır 25 ml 6 mol/litre hidroklorik asitte (3.2) çözündürülür, 5 ml hidrojen peroksit (3.6) 
eklenir ve suyla bir litreye tamamlanır.  
3.8.1.  Çalışma standardı bakır çözeltisi (10 μg Cu/ml), standart  çözeltinin 1 kısmının (3.8) 9 kısım suyla 
seyreltilmesiyle ve ardından ortaya çıkan çözeltinin 1:9 suyla seyreltilmesiyle hazırlanır  
3.9.  Aşağıdaki gibi hazırlanan standart mangan çözeltisi (1000 μg Mn/ml) ya da ticari olarak satın alınabilir 
eşdeğer bi r çözelti:  
–– 1 g toz formundaki bakır 25 ml 6 mol/litre hidroklorik asitte (3.2) çözündürülür ve suyla bir litreye 
tamamlanır.  
3.9.1.  Çalışma standardı mangan çözeltisi (10 μg Mn/ml), standart çözeltinin bir kısmının (3.9) 9 kısım suyla 
seyreltilmesiyle ve ardından ortaya çıkan çözeltinin 1:9 suyla seyreltilmesiyle hazırlanır.  
3.10.  Aşağıdaki gibi hazırlanan standart çinko çözeltisi (1000 μg Zn/ml) ya da ticari olarak satın alınabilir 
eşdeğer bir çözelti:  
–– 1 g şerit ya da yaprak formundaki çinko 25 ml  6 mol/litre hidroklorik asitte (3.2) çözündürülür ve suyla bir 
litreye tamamlanır.  
3.10.1.  Çalışma standardı çinko çözeltisi (10 μg Zn/ml), standart çözeltinin bir kısmının (3.10) 9 kısım suyla 
seyreltilmesiyle ve ardından ortaya çıkan çözeltinin 1:9 suy la seyreltilmesiyle hazırlanır.  
3.11.  Lantan klorür çözeltisi: 12 g lantan oksit 150 ml suda çözündürülür, 100 ml 6 mol/litre hidroklorik asit 
(3.2) eklenir ve suyla bir litreye tamamlanır.  
4.  Cihazlar  
4.1.  Sıcaklık düzenlemesi ve tercihen kaydedicisi o lan kül fırını.  
4.2.  Cam malzemeler dayanıklı borosilikat tipi olmalıdır ve özellikle eser element tayini için kullanıma ayrılmış 
cihaz kullanılması önerilir.  
4.3. Gerekli aralıktaki hassasiyet ve kesinlik açısından metodun gerekliliklerini karşılayan ato mik absorpsiyon 
spektrofotometresi.  
5.  Metot (6 ) 
5.1.  Organik madde içeren numuneler  
5.1.1.  Yakma ve analiz için çözeltinin hazırlanması (7) 
5.1.1.1.  5 ila 10 g numune 0,2 mg hassasiyetle tartılarak kuvars ya da platin krozeye (bakınız Not (b)) 
yerleştirilir, 105°C’deki bir etüvde kurutulur ve kroze soğuk kül fırınına (4.1) alınır. Fırın kapatılır (bakınız Not 
(c)) ve sıcaklığı, yaklaşık 90 dakika içind e kademeli olarak 450 ila 475°C’ye yükseltilir. Karbonlu materyali 
ortadan kaldırmak için bu sıcaklık 4 ila 16 saat (örneğin gece boyunca) sürdürülür, ardından fırın açılır ve 
soğumaya bırakılır (bakınız Not (d)).  
                                                           
(6) Aynı sonuçları vermeleri kaydıyla diğer parçalama metotları (mikrodalga basınçlı parçalama) de kullanılabilir.  
(7) Yeşil kaba yem (taze ya da kuru), eser elementleri tutabilecek çok miktarda bitkisel silis içerme eğilimindedir ve ortamdan 
uzaklaştırılmalıdır. Bu nedenle bu yemlerin numunelerinde aşağıdaki değiştirilmiş metod izlenmelidir. Süzme işlemine kadar 5. 1.1.1 i şlemini 
uygulanır. Çözünmeyen kalıntıyı içeren süzgeç kağıdı iki kez kaynar suyla yıkanır ve kuvars ya da platin bir kroze içine koyu lur. Kül 
fırınında (4.1) 550°C’nin altında bir sıcaklıkta tüm karbonlu materyaller tümüyle yanana kadar yakılır. Soğumaya b ırakılır, birkaç damla su 
ve ardından 10 ile 15 ml hidroflorik asit (3.4) eklenir ve yaklaşık 150°C’de kuruyana kadar buharlaştırılır. Kalıntıda herhan gi bir silis içeriği 
kalırsa, birkaç  ml hidroflorik asit (3.4) içinde yeniden çözündürülür ve kuruyana k adar buharlaştırılır. Beş damla sülfürik asit (3.5) eklenir 
ve beyaz duman çıkmayana kadar ısıtılır. 5 ml 6 mol/litre hidroklorik asit (3.2) ve yaklaşık 30 ml su ekledikten sonra, ısıtı lır, çözelti 250 
ml’lik balon jojeye filtrelenir ve su ile işaretine ka dar tamamlanır (HCl konsantrasyonu yaklaşık 0,5 mol/l). Tayin işlemine madde 5.1.2’den 
devam edilir.  82 
 Küller su ile nemlendirilir ve bunlar 250 ml’lik bir behere aktarılır. Kroze toplamda yaklaşık 5 ml hidroklorik 
asit (3.1) ile yıkanır ve hidroklorik asit yavaşça ve dikkatle behere eklenir (CO 2 oluşumu nedeniyle şiddetli bir 
reaksiyon olabilir).   Tüm köpürme durana kadar damla damla hidroklorik a sit (3.1) eklenir. Kuruyana kadar 
buharlaştırılır, ara sıra cam bir çubukla karıştırılır.  
Sonra kalıntıya 15 ml 6 mol/l hidroklorik asit (3.2) ve ardından yaklaşık 120 ml su eklenir. Cam çubuk ile 
karıştırılır (çubuk beherin içinde bırakılmalıdır) ve beher  bir saat camı ile örtülür. Yavaşca kaynama noktasına 
getirilir ve çözünecek kül kalmayana kadar kaynama noktasında tutulur. Kül içermeyen süzgeç kağıdından 
süzülür ve süzüntü 250 ml’lik bir balon jojeye alınır. Beher ve süzgeç kağıdı 5 ml sıcak 6 mol/litr e hidroklorik 
asitle (3.2) ve iki kez kaynar suyla yıkanır. Balon joje işaretine kadar suyla doldurulur (HCl konsantrasyonu 
yaklaşık 0,5 mol/l).  
5.1.1.2.  Süzgeçteki kalıntı siyah (karbon) görünüyorsa, yeniden fırına konur  ve yeniden 450 ile 475°C’de 
yakıl ır. Bu yakma (yalnızca üç ila beş saat yeterlidir) işlemi, kül beyaz ya da beyaza yakın göründüğünde 
tamamlanır. Kalıntı yaklaşık 2 ml hidroklorik asit (3.1) ile çözündürülür, kuruyana kadar buharlaştırılır ve 5 ml 6 
mol/litre hidroklorik asit (3.2) ekleni r. Isıtılır, çözelti balon joje içerisine süzülür ve su ile işarete kadar 
tamamlanır (HCl konsantrasyonu yaklaşık 0,5 mol/l).  
Notlar:  
(a) İz elementlerin tayininde özellikle çinko, bakır ve demir kaynaklı kontaminasyon risklerine karşı dikkatli 
olmak önemlidir. Bu nedenle numunelerin hazırlanmasında kullanılan ekipman bu metalleri içermemelidir.  
Genel kontaminasyon riskini azaltmak için tozsuz bir ortamda, dikkatlice temiz ekipmanla ve iyice yıkanmış 
cam malzemelerle çalışılır. Çinko tayini özellikle c am malzeme, reaktifler, toz vb. birçok kontaminasyon türüne 
duyarlıdır.  
(b) Yakılacak numunenin ağırlığı, kullanılan spektrofotometre duyarlılığına uygun olarak yemdeki yaklaşık iz 
element içeriğinden hesaplanır. İz element içeriği düşük belirli yemlerde 1 0 ila 20 g numune ile başlamak ve son 
çözeltiyi yalnızca 100 ml’ye tamamlamak gerekebilir.  
(c) Yakma işlemi, hava ya da oksijen girmeyen kapalı bir kül fırınında gerçekleştirilmelidir.  
(ç) Pirometre ile gösterilen sıcaklık en fazla 475°C olmalıdır.  
5.1.2.  Spektrofotometrik tayin  
5.1.2.1.  Kalibrasyon çözeltilerinin hazırlanması  
Tayin edilecek her element için madde 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 ve 3.10.1’de verilen çalışma standardı çözeltisinden bir 
dizi kalibrasyon çözeltisi hazırlanır, her bir kalibrasyon çözelti si yaklaşık 0,5 mol/litrelik bir HCl konsantrasyonu 
demir, mangan ve çinko söz konusu olduğunda %  0,1 Lantanyuma (a/h) eşdeğer bir lantan klorür 
konsantrasyonu içermelidir.  
Seçilen iz element konsantrasyonları kullanılan spektrofotometrenin hassaslık sınır ı aralığında olmalıdır. 
Aşağıdaki tablolarda kalibrasyon çözeltilerinin bileşim aralıkları gösterilmektedir; bununla birlikte kullanılan 
spektrofotometrenin türüne ve duyarlılığına göre başka konsantrasyonlar seçmek gerekebilir.  
 
 
 
 
 83 
 Demir  
μg Fe/ml  0 0,5 1 2 3 4 5 
çalışma standardı çözeltisi (3.7.1) 
(1 ml = 100 μg Fe), ml  0 0,5 1 2 3 4 5 
HCl (3.2), ml  7 7 7 7 7 7 7 
10 ml of lantan klorür çözeltisi (3.11) eklenir ve suyla 100 ml’ye tamamlanır  
 
Bakır  
μg Cu/ml  0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 
Çalışma standardı  çözeltisi (3.8.1) 
(1 ml = 10 μg Cu), ml  0 1 2 4 6 8 10 
HCl (3.2), ml  8 8 8 8 8 8 8 
 
Mangan  
μg Mn/ml  0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 
Çalışma standardı çözeltisi (3.9.1) 
(1 ml = 10 μg Mn), ml  0 1 2 4 6 8 10 
HCl (3.2), ml  7 7 7 7 7 7 7 
10 ml of lantan klorür çözeltisi (3.11) eklenir ve suyla 100 ml’ye tamamlanır  
 
Çinko  
μg Zn/ml  0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 
Çalışma standardı çözeltisi (3.10.1) 
(1 ml = 10 μg Zn), ml  0 0,5 1 2 4 6 8 
HCl (3.2), ml  7 7 7 7 7 7 7 
10 ml of lantan klorür çözeltisi (3.11) eklenir ve suyla 100 ml’ye tamamlanır  
 
5.1.2.2.  Analiz için çözeltinin hazırlanması  
Bakır tayini için madde 5.1.1’den hazırlanan çözelti normalde doğrudan kullanılabilir. Konsantrasyonunu 
kalibrasyon çözeltilerinin sınırına çekmek gerekiyorsa, belli bir miktarı 100 ml’lik bir balon jojeye pipetle alınır 
ve 0,5 mol/litre hidroklorik asit (3.3) ile işarete kadar tamamlanabilir.  84 
 Demir, mangan ve çinko tayini için madde 5.1.1’den hazırlanan çözeltiden belli bir miktar 100 ml’lik balon 
jojeye pipetle alınır, 10 ml lantan klorür çözeltisi (3.11) eklenir ve 0,5 mol/litre hidroklorik asit (3.3) ile işaretine 
kadar tamamlanır (ayrıca bkz. madde 8 ‘Gözlem’).  
5.1.2.3.  Kör deney  
Kör deney metodun belirtilen tüm adımlarını içermeli, ancak numune materyali göz ardı ed ilmelidir. Kalibrasyon 
çözeltisi ‘0’, kör olarak kullanılmamalıdır.  
5.1.2.4.  Atomik absorpsiyon ölçümü  
Kalibrasyon çözeltilerinin ve analiz edilecek çözeltinin atomik absorpsiyonu, oksitlendirici bir hava -asetilen 
alevi kullanarak aşağıdaki dalga boyların da ölçülür:  
Fe: 248,3 nm  
Cu: 324,8 nm  
Mn: 279,5 nm  
Zn: 213,8 nm  
Her ölçüm dört kez gerçekleştirilir.  
5.2.  Mineral yem  
Numune organik madde içermiyorsa, önceden yakmak gerekli değildir. Madde 5.1.1.1’de belirtilen şekilde ve 
ikinci paragraftan başlatılarak  devam edilir. Hidroflorik asidin buharlaştırılması göz ardı edilebilir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Bir kalibrasyon eğrisi kullanarak, analiz edilecek çözeltideki iz element konsantrasyonunu hesaplanır ve sonuçlar 
bir kg numunede bulunan iz element miktar ı, mg şeklinde (ppm) ifade edilir.  
7.  Tekrar Edilebilirlik  
Aynı numunenin, aynı analist ile gerçekleştirilen iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark aşağıdaki 
değerleri geçmemelidir:  
— en fazla 50 mg/kg’a kadar iz element içeriği için mutlak değer  olarak 5 mg/kg,  
— 50 ila 100 mg/kg’a kadar iz element içeriği için daha yüksek sonucun %  10’u,  
— 100 ila 200 mg/kg’a kadar iz element içeriği için mutlak değer olarak 10 mg/kg,  
— 200 mg/kg’dan fazla iz element içeriği için daha yüksek sonucun %  5’i, 
8.  Gözlem  
Çok miktarda fosfat varlığı demir, mangan ve çinko tayinini etkileyebilir. Bu etkileşim lantanyum klorür 
çözeltisi (3.11) eklenerek düzeltilmelidir. Ancak numunedeki ağırlık oranı Ca + Mg/P = > 2 ise, analiz 
çözeltisine ve kalibrasyon çözeltilerine l antanyum klorür çözeltisi (3.11) eklenmesi göz ardı edilebilir.  
Ç.  HALOFUGİNON TAYİNİ  
DL-trans -7-bromo -6-kloro -3- [3-(3-hidroksi -2-piperidil)asetonil] -kuinazolin -4-(3H) -bir hidrobromür  
1.  Amaç ve kapsam  85 
 Metot, yemdeki halofuginon seviyesinin tayinini mümkün kılar. Miktar tayinlerinin sınırı 1 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Sıcak su ile işleme tabi tuttuktan sonra, halofuginon serbest baz olarak etil asetata ekstrakte edilir ve ardından 
hidroklorür olarak sulu asit çözeltisine ayrıştırılır. Ekstrakt iyon değişi m kromatografisi ile saflaştırılır. 
Halofuginon içeriği, bir UV detektörü kullanılarak ters fazlı yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile 
tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Asetonitril, HPLC kullanım saflığında  
3.2.  Amberlit XAD -2 reçinesi.  
3.3.  Amonyum asetat.  
3.4.  Etil asetat.  
3.5.  Asetik asit, Glasiyal.  
3.6. Halofuginon standart maddesi DL -trans -7-bromo -6-kloro -3- [3-(3-hidroksi -2-piperidil)asetonil] - 
(quinazoline) -4-(3H) -bir hidrobromür, E 764).  
3.6.1.  Halofuginon stok standart çözeltisi, 100 μg/ml  
50 mg halofuginon (3.6) 0,1 mg hassasiyetle 500 ml’lik balon jojeye tartılır, amonyum asetat tampon 
çözeltisinde (3.18) çözündürülür, tampon çözeltiyle işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözelti, karanlıkta 
5°C’de saklanırsa üç hafta bo yunca stabildir.  
3.6.2.  Kalibrasyon çözeltileri  
Bir dizi 100 ml’lik balon jojeye 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ve 6,0 ml stok standart çözelti (3.6.1) aktarılır. Mobil faz (3.21) 
ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltiler sırasıyla 1,0, 2,0, 3,0, 4, 0 ve 6,0 μg/ml halofuginon 
konsantrasyonlarına sahiptir. Bu çözeltiler kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.7.  Hidroklorik asit (ρ20 yaklaşık 1,16 g/ml).  
3.8.  Metanol.  
3.9.  Gümüş nitrat.  
3.10.  Sodyum askorbat.  
3.11.  Sodyum karbonat.  
3.12.   Sodyum klorür.  
3.13.  EDTA (etilenediamintetraasetik asit, disodyum tuzu).  
3.14.   Su, HPLC kullanım saflığında  
3.15.  Sodyum karbonat çözeltisi, c = 10 g/100 ml.  
3.16.  Sodyum klorürce doymuş sodyum karbonat çözeltisi, c = 5 g/100 ml.  
50 g sodyum karbonat (3 .11) suda çözündürülür, 1 litreye seyreltilir ve çözelti doymuş hale gelene kadar sodyum 
klorür (3.12) eklenir.  86 
 3.17.  Hidroklorik asit, yaklaşık 0,1 mol/l.  
10 ml HCI (3.7) suyla 1 litreye seyreltilir.  
3.18.  Amonyum asetat tampon çözeltisi, yaklaşık 0,25 mol/l.  
19,3 g amonyum asetat (3.3) ve 30 ml asetik asid (3.5) suda çözündürülür (3.14) ve 1 litreye seyreltilir.  
3.19.  Amberlit XAD -2 reçinesi hazırlama.  
Uygun miktarda Amberliti (3.2) tüm klorür iyonları giderilene kadar suyla yıkanır; bu, atılmış sulu f az üstünde 
gerçekleştirilen bir gümüş nitrat (3.20) testi ile belirlenebilir. Ardından reçine 50 ml metanol (3.8) ile yıkanır, 
metanolü atılır ve reçine taze metanol altında saklanır.  
3.20.  Gümüş nitrat çözeltisi, yaklaşık 0,1 mol/l.  
0,17 g gümüş nitratı (3.9) 10 ml suda çözündürülür.  
3.21.  HPLC Mobil faz  
500 ml asetonitril (3.1) 300 ml amonyum asetat tampon çözeltisi (3.18) ve 1200 ml su (3.14) ile karıştırılır. 
Asetik asit (3.5) kullanarak pH’ı 4,3’e ayarlanır. 0,22 μm filtreden (4.8) süzülür ve çözelti  gazdan arındırılır (örn. 
10 dakika ultrason ses dalgaları uygulayarak). Bu çözelti, kapalı bir kapta ve karanlıkta saklanırsa bir ay boyunca 
stabildir.  
4.  Cihazlar  
4.1.  Ultrasonik banyo  
4.2.  Döner buharlaştırıcı (Rotary evaporator)  
4.3.  Santrifüj  
4.4.  HPLC cihazı, değişken dalga boyu mor ötesi detektörlü (UV Dedektör) ya da Diode Array detektörlü  
4.4.1.  Sıvı kromatografik kolon, 300 mm × 4 mm, C 18, 10 μm dolgu ya da eşdeğeri bir kolon.  
4.5.  Sinterlenmiş bir cam filtre ve bir musluk takılmış cam kolo n (300 mm x 10 mm)  
4.6.  Fiberglas filtreler, 150 mm çapında  
4.7.  Membran filtreler, 0,45 μm  
4.8.  Membran filtreler, 0,22 μm  
5.  Metot  
Not: Halofuginon serbest baz olduğundan, alkali ya da etil asetat çözeltilerinde stabil değildir. Etil asetat içinde 
en fazla 30 dakika kalır.  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Halofuginon ya da etkileyen maddelerin olmadığını kontrol etmek için bir kör yem testi yapılmalıdır.  
5.1.2.  Numunedeki varlığına yakın miktarda halofuginon eklenerek zenginleştirilen kör yem analiz edilerek bir 
geri kazanım testi yürütülmelidir. 3 mg/kg düzeyine ulaştırmak için 300 μl stok standart çözelti (3.6.1) 10 g kör 
yeme eklenir, karıştırılır ve ekstraksiyon basamağından (5.2) önce 10 dakika bekletilir.  87 
 Not: Bu metodun amacı doğrultusunda, kör yem, numuned ekine benzer olmalı ve analizde halofuginon tespit 
edilmemelidir.  
 
5.2.  Ekstraksiyon  
10 g hazırlanmış numune 0,1 mg hassasiyetle 200 ml’lik santrifüj tüpüne tartılır, 0,5 g sodyum askorbat (3.10), 
0,5 g EDTA (3.13) ve 20 ml su eklenip karıştırılır. Tüp 5 dakika süreyle bir su banyosuna (80°C) konulur. Oda 
sıcaklığına soğuttuktan sonra 20 ml soydum karbonat çözeltisi (3.15) eklenir ve karıştırılır. Hemen 100 ml etil 
asetat (3.4) eklenir ve elle 15 saniye boyunca şiddetle çalkalanır. Ardından tüp üç dakika u ltrasonik banyoya 
(4.1) konulur ve tapası gevşetilir. İki dakika santrifüje tabi tutulur ve etil asetat fazı boşaltılır fiberglas bir 
filtreden (4.6) 500 ml’lik ayırma hunisine boşaltılır. Numunenin ekstraksiyonu 100 ml’lik ikinci bir etil asetat ile 
yinel enir. Birleştirilen ekstraktlar bir dakika boyunca 50 ml sodyum karbonat bakımından doymuş sodyum 
klorür çözeltisiyle (3.16) yıkanır ve sulu katman atılır.  
Organik katman 1 dakika boyunca 50 ml hidroklorik asitle (3.17) ekstrakte edilir. Alttaki asit katma nı 250 ml’lik 
ayırma hunisine akıtılır. Organik katman 1,5 dakika boyunca 50 ml’lik ilave hidroklorik asit ile yeniden 
ekstrakte edilir ve ilk ekstrakt ile birleştirilir. Birleştirilmiş asit ekstraktları yaklaşık 10 saniye 10 ml etil asetatla 
(3.4) karıştı rılarak yıkanır.  
Sulu katman nicel olarak 250 ml’lik yuvarlak tabanlı cam balona aktarılır ve organik faz atılır. Kalan tüm etil 
asetat, bir döner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (4.2) kullanılarak asit çözeltisinden buharlaştırılır. Su 
banyosunun sıcak lığı en fazla 40°C olmalıdır. Tüm etil asetat kalıntısı, yaklaşık 25 mbar’lık bir vakum altında, 
38°C’de 5 dakika içinde ayrılır.  
5.3.  Temizleme  
5.3.1.  Amberlit Kolonunun Hazırlanması  
Her numune ekstraktı için bir XAD -2 kolunu hazırlanır. 10 g hazırlanmı ş amberliti (3.19), metanol (3.8) ile cam 
kolona (4.5) aktarılır. Reçine yatağının üstüne cam yününden küçük bir tıpa eklenir. Metanol kolondan tahliye 
edilir ve reçine 100 ml suyla yıkanır, sıvı reçine yatağının üstüne ulaştığında akışı durdurulur. Kullan madan önce 
kolonun dengeye ulaşması için 10 dakika beklenilir. Kesinlikle kolonun kurumasına izin verilmemelidir.  
5.3.2.  Numune Temizleme  
Ekstrakt (5.2), nicel olarak, hazırlanmış Amberlit kolonunun (5.3.1) üstüne aktarılır ve elüe edilir, elüatı atılır. 
Elüasyon hızı en fazla 20 ml/dakika olmalıdır. Yuvarlak tabanlı balon joje 20 ml hidroklorik asitle (3.17) yıkanır 
ve bu reçine kolonunu yıkamak için kullanılır. Kalan asit çözeltisi hava üfleyerek giderilir. Yıkama suları atılır. 
100 ml metanol (3.8) kolo na eklenir ve 5 ila 10 ml’sinin elüe olmasına izin verilir, elüatı 250 ml’lik yuvarlak 
tabanlı bir balona alınır. Kalan metanolün reçine ile dengelenmesi için 10 dakika beklenir ve elüasyon işlemine 
en fazla 20 ml/dakika hızda devam edilir, elüatı aynı yuv arlak tabanlı cam balona alınır. Metanol döner 
buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (4.2) buharlaştırılır, su banyosunun sıcaklığı en fazla 40°C olmalıdır. Kalıntı, 
mobil faz (3.21) kullanarak ve nicel olarak 10 ml’lik kalibre edilmiş balon jojeye aktarılı r. Mobil faz ile işarete 
kadar tamamlanır ve karıştırılır. Sulu kısım bir membran filtreden (4.7) süzülür. Bu çözelti HPLC tayini (5.4) 
için saklanır.  
5.4.  HPLC Tayini  
5.4.1.   Parametreler  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçla r vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir.  
Sıvı kromatografik kolon (4.4.1)  88 
 HPLC Mobil faz (3.21)  
Akış hızı: 1,5 - 2 ml/dak.  
Dalga boyu: 243 nm  
Enjeksiyon hacmi: 40 ila 100 μl.  
3,0 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisi (3.6.2), tutarlı pik yüksekl ikleri (alanlar) ve alıkonma süreleri elde edilene 
kadar birkaç kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.4.2.   Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.6.2) birkaç kez enjekte edilir ve her bir konsantrasyonun p ik yükseklikleri 
(alanları) ölçülür.  
Kalibrasyon çözeltilerinin apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlarına ordinatlarda denk gelen ortalama pik 
yükseklikleri ya da alanları kullanılarak bir kalibrasyon grafiği çizilir.  
5.4.3.  Numune çözeltisi  
Kalibrasy on çözeltileri için alınanla aynı hacmi kullanarak numune ekstraktı (5.3.2) birkaç kez enjekte edilir ve 
halofuginon piklerinin ortalama pik yüksekliği (alan) belirlenir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Numune çözeltisinin konsantrasyonunu, kalibrasyon grafiği ni (5.4.2) referans alarak numune çözeltisinin 
halofuginon piklerinin ortalama yüksekliğinden (alan) ve μg/ml cinsinden belirlenir.  
Numunenin mg/kg cinsinden halofuginon içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
         
  
Burada;  
c = Numune çözeltis inin μg/ml cinsinden halofuginon konsantrasyonu,  
m = Test numunesinin gram cinsinden ağırlığı.  
7. Sonuçların Validasyonu  
7.1.  Tanım lama 
Analitin tanıması ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının ve 6,0 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisinin 
(3.6.2)  spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array detektörü kullanılarak onaylanabilir.  
7.1.1.  Ortak kromatografi  
Bir numune ekstraktı, uygun miktarda kalibrasyon çözeltisi (3.6.2) eklenerek zenginleştirilir. Eklenen 
halofuginon miktarı numune ekstraktı nda bulunan tahmini halofuginon miktarına benzer olmalıdır.  
Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca halofuginon pikinin yüksekliği 
geliştirilmelidir. Maksimum yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal geni şliğin ±  % 10 aralığında 
olmalıdır.  
7.1.2.  Diode Array ile Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir:  89 
 (a) numunenin ve standart spektrumlarının, kromatogramın pik apeksinde kaydedilen maksimum absorpsiyon 
dalga boyu, tespit sisteminin çözüleme gücüyle tayin edilen bir marj aralığında aynı olmalıdır. Diode Array 
tespit için bu tipik olarak ± 2 nm’dir;  
(b) 225 ile 300 nm arasında, kromatogramın pik apeksinde kaydedilen numune ve standart spektrumlar, 
spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorb ans aralığındaki bölümleri için farklı olmamalıdır. Bu kriter aynı 
maksimum piki olduğunda ve gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sapma, standart analizin 
absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır;  
(c) 225 ile 300 nm arasında, aynı ekstrakt tarafından üretilen pikin yukarı eğim, apeks ve aşağı eğim 
spektrumları, spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı 
olmamalıdır. Bu kriter, aynı maksimum piki olduğunda ve gözlenen tüm noktalarda spekt rumlar arasındaki 
sapma, apeks spektrumunun absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır.  
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır.  
7.2.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark, hal ofuginon içeriği için 3 mg/kg’a kadar 0,5 
mg/kg’ı geçmemelidir.  
7.3.  Geri kazanım  
Zenginleştirilmiş kör numune için geri kazanım en az %  80 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
Üç numunenin 8 laboratuvarda analiz edilmesi için bir çalışma düzenle nmiştir.  
Sonuçlar  
 Numune A (kör):  
Alındığında  Numune B (Öğutülmüş 
halde   İnce yem):  Numune C (Pelet halde yem):  
  Alındığında  İki ay sonra  Alındığında  İki ay sonra  
Ortalama 
[mg/kg]  ND 2,80 2,42 2,89 2,45 
SR [mg/kg]  — 0,45 0,43 0,40 0,42 
 CV R [%]  — 16 18 14 17 
Rec. [%]   86 74 88 75 
 
ND = Tespit edilmedi  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı (%)  
Rec. = Geri kazanım (%)  
 90 
 D.  ROBENİDİN TAYİNİ  
1,3-bis [(4 -klorobenziliden)amino]guanidin — hidroklorür  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemdeki robenidin seviyelerinin tayinini mümkün kılar. Miktar tayinlerinin sınırı 5 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Numune asitleştirilmiş metanol ile ekstrakte edilir. Ekstrakt kurutulur ve temsili bir miktarı bir alüminyum  oksit 
kolonunda temizlemeye tabi tutulur. Robenidin, metanol ile kolondan elüe edilir, konsantre edilir ve mobil faz 
ile uygun hacme tamamlanır. Robenidin içeriği, bir UV detektörü kullanılarak ters fazlı yüksek performans sıvı 
kromatografisi (HPLC) ile t ayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Metanol.  
3.2.  Asitleştirilmiş metanol.  
4,0 ml hidroklorik asidi (ρ 20 = 1,18 g/ml) 500 ml’lik balon jojeye aktarılır, metanol (3.1) ile işarete kadar 
tamamlanılır ve karıştırılır. Bu çözelti kullanılmadan önce taze olarak h azırlanılmalıdır.  
3.3.  Asetonitril, HPLC kullanım saflığında  
3.4.  Moleküler süzgeç . 
Tip 3A, 8 ila 12 gözlü boncuk  (1,6-2,5 mm’lik boncuk , kristalimsi alüminyum silikat, 0,3 mm’lik gözenek çapı).  
3.5.  Kolon kromatografisi için alüminyum oksit asidik etkinlik sınıfı I.  
100 g alüminyum oksidi uygun bir kaba aktarılır ve 2,0 ml su eklenir. Kapatılır ve yaklaşık 20 dakika çalkalanır. 
İyi kapatılmış bir kapta saklanılır.  
3.6.  Potasyum dihidrojen fosfat çözeltisi, c = 0,025 mol/l.  
3,40 g potasyum dihidroje n fosfatı 1000 ml’lik balon jojede suda (HPLC kullanım saflığında) çözündürülür, 
işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır.  
3.7.  Disodyum hidrojen fosfat çözeltisi, c = 0,025 mol/l.  
3,55 g susuz (ya da 4,45 g dihidrat ya da 8,95 g dodesahidrat) di -sodyum h idrojen fosfatı 1 litrelik balon jojede 
su (HPLC kullanım saflığında) içinde çözündürülür, işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır.  
3.8.  HPLC mobil faz.  
Aşağıdaki reaktiflerle birlikte karıştırılır:  
650 ml asetonitril (3.3),  
250 ml su (HPLC kullanım safl ığında),  
50 ml potasyum di -hidrojen fosfat çözeltisi (3.6),  
50 ml di -sodyum hidrojen fosfat çözeltisi (3.7).  
0,22 μm filtreden (4,6) süzülür ve çözelti gazdan arındırılır (örn. 10 dakika ultrason ses dalgaları uygulayarak).  91 
 3.9.  Standard madde.  
Saf robeni din: 1,3 -bis [(4 -klorobenziliden)amino]guanidin — hidroklorür  
3.9.1.  Robenidin stok standart çözeltisi: 300 μg/ml  
30 mg robenidin standart maddesi (3.9) 0,1 mg hassasiyetle tartılır. Asitleştirilmiş metanol (3.2) içinde 100 
ml’lik balon jojede çözündürülü r, aynı çözücüyle işarete kadar tamamlanılır ve karıştırılır. Balon joje alüminyum 
folyo ile sarılır ve karanlık bir yerde saklanılır.  
3.9.2.  Robenidin ara standart çözeltisi: 12 μg/ml  
10,0 ml stok standart çözeltisi (3.9.1) 250 ml’lik balon jojeye aktarı lır, mobil fazla (3.8) işarete kadar tamamlanır 
ve karıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ve karanlık bir yerde saklanır.  
3.9.3.  Kalibrasyon çözeltileri  
Bir dizi 50 ml’lik kalibre edilmiş balon jojeye 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 ve 25,0 ml ara sta ndart çözeltisi (3.6.1) 
aktarılır. Mobil faz (3.8) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltiler sırasıyla 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 ve 6,0 
μg/ml robenidine karşılık gelir. Bu çözeltiler kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.10.   Su, HPLC kullanım saflığında  
4.  Cihazlar  
4.1.  Cam kolon.  
Amber camdan üretilmiş, musluk ve yaklaşık 150 ml kapasiteli bir hazne takılmış, iç çapı 10 – 15 mm, uzunluğu 
250 mm.  
4.2.  Mekanik çalkalayıcı ya da manyetik karıştırıcı.  
4.3.  Döner buharlaştırıcı (Rotary  evaporator).  
4.4.  HPLC cihazı, değişken dalga boyu mor ötesi detektörlü (ultraviolet detector) ya da 250 – 400 nm aralığında 
çalışan Diode Array detektörlü.  
4.4.1.   Sıvı kromatografik kolon: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 μm dolgu ya da eşdeğeri.  
4.5.  Fiberglas  süzgeç kağıdı (Whatman GF/A ya da eşdeğeri).  
4.6.  Membran filtreler, 0,22 μm.  
4.7.  Membran filtreler, 0,45 μm.  
 
5.  Metot  
Not: Robenidin ışığa duyarlıdır. Tüm işlemlerde amber renkli cam malzeme kullanılmalıdır.  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Robenidin ya da etkil eyen maddelerin olmadığını kontrol etmek için bir kör yem analiz edilmelidir.  
5.1.2.  Numunedeki varlığına yakın miktarda robenidin eklenen kör yem (5.1.1) analiz edilerek bir geri kazanım 
testi yürütülmelidir. 60 mg/kg seviyesine ulaştırmak için 3,0 ml st ok standart çözeltisi (3.9.1) 250 ml’lik erlene 
aktarılır. Çözelti, bir azot akışında yaklaşık 0,5 ml’ye buharlaştırılır. 15 g kör yem eklenir, karıştırılır ve 
ekstraksiyon aşamasına (5.2) devam etmeden önce 10 dakika bekleyin.  92 
 Not: Bu metodun amacı doğrul tusunda, kör yem numunedekine benzer olmalı ve analizde robenidin tespit 
edilmemelidir.  
5.2.  Ekstraksiyon  
Yaklaşık 15 g hazırlanmış numune 0,01 g hassasiyetle tartılır. 250 ml’lik bir konik cam balona aktarılır ve 100,0 
ml asitleştirilmiş metanol (3.2) ek lenilir, kapatılır ve çalkalayıcı (4.2) ile bir saat çalkalanılır. Çözelti fiberglas 
süzgeç kağıdından (4.5) süzülür ve süzüntünün tümü 150 ml’lik konik cam balona alınır. 7, 5 g moleküler süzgeç  
(3.4) eklenir, kapatılır ve beş dakika çalkalanılır. Hemen fi berglas süzgeç kağıdından süzülür. Bu çözelti 
saflaştırma adımı (5.3) için tutulur  
5.3.  Saflaştırma  
5.3.1.  Alüminyum oksit kolonunun hazırlanması  
Bir cam kolonunun (4.1) alt ucuna cam yününden küçük bir tıpa sokulur ve bir cam çubuk kullanılarak 
sıkıştır ılır.11,0 g hazırlanmış alüminyum oksit (3.5) tartılır ve kolona aktarılır. Bu aşamada havayla temasın en 
az düzeyde olmasına dikkat edinilmelidir. Yüklenen kolona alt ucundan nazikçe vurarak alüminyum oksidin 
çökmesi sağlanılır.  
5.3.2.  Numune saflaştırma  
Pipetle kolona (5.2) maddesinde hazırlanan 5,0 ml numune ekstraktı aktarılır. Pipetin ucu kolon duvarına yakın 
tutulur ve çözeltinin alüminyum okside absorbe edilmesi beklenilir. 100 ml metanol (3.1) kullanılarak, 2 - 3 
ml/dakikalık bir hızla robenidini k olondan elüe edilir ve elüatı 250 ml’lik yuvarlak tabanlı bir balona alınır. 
Metanol çözeltisi, azaltılmış basınç altında, 40°C’de, bir döner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (4.3) ile 
kuruyana kadar buharlaştırılır. Kalıntı 3 - 4 ml mobil faz (3.8) için de yeniden çözündürülür ve nicel olarak 10 
ml’lik balon jojeye aktarılır. Balon birkaç kez 1 ila 2 ml’lik mobil faz ile durulanır ve bu durulama suları balon 
jojeye aktarılır. Aynı çözücü ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Temsili bir miktar, 0, 45 μm’lik bir 
membran filtreden (4.7) süzülür. Bu çözelti HPLC tayini (5.4) için saklanır.  
5.4.  HPLC tayini  
5.4.1.  Parametreler  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilinir:  
Sıvı kromatografik kolon (4.4.1),  
HPLC Mobil faz (3.8),  
Akış hızı: 1,5 - 2 ml/dakika,  
Detektör dalga boyu: 317 nm,  
Enjeksiyon hacmi: 20 ila 50 μl.  
3,6 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisini (3.9.3), tutarlı pik yükseklikleri ve alıkonma süreleri elde edene kadar 
birkaç kez enjekte ederek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.4.2.  Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.9.3) birkaç kez enjekte edilir.  Her bir kon santrasyonun pik yükseklikleri  
(alanları) ölçülür.  Kalibrasyon çözel tilerinin apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlarına ordinatlarda denk 
gelen ortalama pik yükseklikleri ya da alanları  kullan ılarak bi r kalibrasyon eğrisi çizilir.  93 
 5.4.3.  Numune çözeltisi  
Kalibrasyon çözeltileri için alınanla aynı hacmi kullanarak numune ekstraktı (5.3.2) birkaç kez enjekte edilir ve 
robenidin piklerinin ortalama pik yüksekliği (alan) belirlenir.  
6.   Sonuçların Hesaplanması  
Kalibrasyon grafiğini (5.4.2) referans alarak, aynı çözeltinin robenidin piklerinin ortalama yüksekliğinden ( alan), 
numune çözeltisinin konsantrasyonunu μg/ml cinsinden tayin edilir.  
Numunedeki mg/kg cinsinden robenidin içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
         
  
Burada;  
c = Numune çözeltisinin μg/ml cinsinden robenidin konsantrasyonu,  
m = Test numunesinin  gram cinsinden ağırlığı.  
7.   Sonuçların Validasyonu  
7.1.  Tanım lama 
Analitin tanıması ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının ve 6 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisinin 
(3.9.3) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektör ü kullanılarak onaylanabilir.  
7.1.1.    Ortak kromatografi  
Bir numune ekstraktı, uygun miktarda kalibrasyon çözeltisi (3.9.3) eklenerek güçlendirilir. Eklenen robenidin 
miktarı numune ekstraktında bulunan tahmini robenidin miktarına benzer olmalıdır.  
Hem ek lenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca robenidin pikinin yüksekliği 
geliştirilmelidir. Maksimum yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği orijinal genişliğin yaklaşık %  10’u 
aralığında olmalıdır.  
7.1.2.   Diode Array Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir:  
(a) numunenin ve standart spektrumlarının, kromatogramın pik apeksinde kaydedilen maksimum absorpsiyon 
dalga boyu, tespit sisteminin çözüleme gücüyle tayin edilen bir marj aralığında aynı olmalı dır. Diode Array ile 
tespit için bu tipik olarak yaklaşık 2 nm’dir;  
(b) 250 ile 400 nm arasında, kromatogramın pik apeksinde kaydedilen numune ve standart spektrumlar, 
spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için farklı olmamalıdır . Bu kriter aynı 
maksimum piki olduğunda ve gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sapma, standart analizin 
absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır;  
(c) 250 ile 400 nm arasında, aynı ekstrakt tarafından üretilen pikin yukarı eğim, ap eks ve aşağı eğim 
spektrumları, spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorbans  aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı 
olmamalıdır. Bu kriter, aynı maksimum piki olduğunda ve gözlenen tüm noktalarda spektrumlar arasındaki 
sapma, apeks spektrumunun absor bansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır.  
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır.  
 94 
 7.2.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunede gerçekleştirilen iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark, 15 mg/kg’den yüksek robenidin 
içeriği için daha yüksek sonucun %  10’unu geçmemelidir.  
7.3.  Geri kazanım  
Güçlendirilmiş bir kör numune için geri kazanım en az %  85 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
Bir EC ortak çalışması düzenlenmiş, bu çalışmada 12 laboratuvar  tarafından toz Öğütülmüş ya da pelet 
formunda dört kanatlı ve tavşan yemi numunesi analiz edilmiştir. Her numunede analizler paralel olarak 
gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
 Kanatlı  Tavşan  
 Öğütülmüş toz ince 
formda  Pelet for mda Öğütülmüş toz ince 
formda  Pelet formda  
Ortalama [mg/kg]  27,00  27,99  43,6 40,1 
 sr [mg/kg]  1,46 1,26 1,44 1,66 
CV r [%]  5,4 4,5 3,3 4,1 
SR [mg/kg]  4,36 3,36 4,61 3,91 
CV R [%]  16,1 12,0 10,6 9,7 
Geri kazanım [%]  90,0 93,3 87,2 80,2 
 
sr = Tekrar  edilebilirliğin  standart sapması,  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı, %  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması,  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı. %  
E.  DİKLAZURİL TAYİNİ  
(+)-4-klorfenil [2,6-dikloro -4-(2,3,4,5 -tetrahidro -3,5-diokso -1,2,4 -triazin -2-il)fenil] asetonitril  
1.  Amaç ve kapsam  
Metot, yemdeki ve premikslerdeki diklazuril seviyesinin tayinini mümkün kılar. Tespit limiti 0,1 mg/kg, ölçüm 
limiti 0,5 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Bir iç st andart ekledikten sonra, numune asitleştirilmiş metanol ile ekstrakte edilir. Yem için temsili bir miktar 
ekstrakt, bir C 18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşunda saflaştırılır. Diklazuril, asitleştirilmiş metanol ve su karışımı 
ile kartuştan elüe edilir. Buha rlaştırmadan sonra kalıntı DMF/su içinde çözündürülür. Premiksler için ekstrakt 
buharlaştırılır ve kalıntı, DMF/su içinde çözündürülür. Diklazuril içeriği, bir UV dedektörü kullanılarak gradyan 
ters fazlı yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile ta yin edilir.  95 
 3.  Ayıraçlar  
3.1.  Su, HPLC kullanım saflığında  
3.2.  Amonyum asetat.  
3.3. Tetrabutilamonyum hidrojen sülfat (TBHS)  
3.4. Asetonitril, HPLC kullanım saflığında  
3.5. Metanol, HPLC kullanım saflığında.  
3.6. N, N -dimetilformamid (DMF)  
3.7. Hidroklorik asit, ρ 20 = 1,19 g/ml.  
3.8. Standard madde: diklazuril II -24: (+) -4-klorfenil [2,6 -dikloro -4-(2,3,4,5 -tetrahidro -3,5-diokso -1,2,4 -triazin -
2-il)fenil] asetonitril, garantili saflıkta,  
3.8.1.  Diklazuril stok standart çözeltisi, 500 μg/ml  
25 mg d iklazuril standart maddesi (3.8) 0,1 mg hassasiyetle 50 ml’lik balon jojeye tartılır. DMF (3.6) içinde 
çözündürülür ve DMF (3.6) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ya 
da amber renkli cam malzeme kullanılır ve buzdolabında saklanılır. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle 
stabildir.  
3.8.2.  Diklazuril standart çözeltisi, 50 μg/ml  
5,00 ml stok standart çözeltisi (3.8.1) 50 ml’lik balon jojeye aktarılır, DMF (3.6) ile işarete kadar tamamlanır ve 
karıştır ılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ya da amber renkli cam malzeme kullanılır ve buzdolabında 
saklanır. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle stabildir.  
3.9. İç standart maddesi: 2,6 dikloro -α-(4-klorofenil) -4-(4,5 dihidro -3,5-diokso -1,2,4 -triazine -2 (3H) —il) α -
metilbenzen -asetonitril  
3.9.1.  İç stok standart çözeltisi, 500 μg/ml  
25 mg iç standart maddesini (3.9) 0,1 mg hassasiyetle 50 ml’lik balon jojeye tartın. DMF (3.6) içinde 
çözündürülür ve DMF (3.6) ile işarete kadar tamamlanır ve kar ıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ya 
da amber renkli balon joje kullanılır ve buzdolabında saklanır. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle 
stabildir.  
3.9.2.   İç standart çözeltisi, 50 μg/ml  
5,00 ml iç stok standart çözeltisi (3.9.1) 50 ml’lik balon jojeye aktarılır, DMF (3.6) ile işarete kadar tamamlanır 
ve karıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ya da amber renkli balon joje kullanılır ve bir buzdolabında 
saklanır. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle stabildir.  
3.9.3.  Premiksler için iç standart çözeltisi, p/1000 mg/ml  
(p = premiksdeki diklazuril’in nominal içeriği, mg/kg)  
p/10 mg iç standart maddesi 0,1 mg hassasiyetle 100 ml’lik balon jojeye tartılır, DMF (3.6) içinde, ultrasonik 
banyoda (4.6) çözündürülür, DM F ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile 
sarılır ya da amber renkli cam malzeme kullanılır ve bir buzdolabında saklanılırr. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 
1 ay süreyle stabildir.  
3.10.  Kalibrasyon çözeltisi, 2 μg/ml.  96 
 2,00 ml diklazuril standart çözeltisi (3.8.2) ve 2,00 ml iç standart çözeltisi (3.9.2) 50 ml’lik balon jojeye pipetle 
alınır. 16 ml DMF (3.6) eklenir, DMF (3.6) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözelti kullanmadan 
önce taze olarak hazırlan malıdır.  
3.11.  C18 katı fazlı ekstraksiyon kartuşu, örn. Bond Elut, boyut: 1 cc, sorban ağırlığı: 100 mg.  
3.12.  Ekstraksiyon çözücüsü: asitleştirilmiş metanol.  
5,0 ml hidroklorik asit (3.7) pipetle alınarak 1000 ml metanol (3.5) içerisine konur  ve karıştırılır.  
3.13.  HPLC için mobil faz  
3.13.1.  Elüent A: amonyum asetat — tetrabutilamonyum hidrojen sülfat çözeltisi.  
5 g amonyum asetat (3.2) ve 3,4 g TBHS (3.3) 1000 ml suda (3.1) çözündürülür ve karıştırılır.  
3.13.2.  Elüent B: asetonitril (3.4) . 
3.13.3.  Elüent C: metanol (3.5).  
4.  Cihaz  
4.1.  Mekanik çalkalayıcı  
4.2.  Üçlü gradyan HPLC cihazı  
4.2.1.  Sıvı kromatografik kolon, Hipersil ODS, 3 μm dolgu, 100 mm x 4,6 mm, ya da eşdeğeri.  
4.2.2.  Değişken dalga boyu ayarlı UV detektörü ya da Diode Array dedektörü  
4.3.  Döner buharlaştırıcı (Rotary evaporator)  
4.4.  Membran filtre, 0,45 μm.  
4.5.  Vakumlu manifold  
4.6.  Ultrasonik banyo  
5.  Metot  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Kör yem  
Diklazuril ya da etkileşime giren maddelerin olmadığını kontrol etmek için bir  kör yem analiz edilmelidir. Kör 
yem numunedekine benzer türde olmalı ve analizde, diklazuril ya da etkileyen maddeler tespit edilmemelidir.  
5.1.2.  Geri kazanım testi  
Numunedeki varlığına yakın miktarda diklazuril eklenen kör yem analiz edilerek bir geri kazanım testi 
yürütülmelidir. 1 mg/kg düzeyine ulaştırmak için 0,1 ml stok standart çözeltisi (3.8.1) 50 g’lık kör yeme 
eklenilir, iyice karıştırılır ve 10 dakika dinlendirilir. (5.2) maddesine geçmeden önce birkaç kez yeniden 
karıştırılır.  
Alternatif olar ak, numune ile benzer türde bir kör yem mümkün değilse (bkz. 5.1.1), standart ekleme metodu 
yoluyla bir geri kazanım testi gerçekleştirilebilir. Bu durumda analiz edilecek numune, zaten numune içinde 
mevcut olana benzer bir miktar diklazuril ile zenginleşt irilir. Bu numune zenginleştirilmemiş numune ile birlikte 
analiz edilir ve çıkartma yoluyla geri kazanım hesaplanabilir.  97 
 5.2.  Ekstraksiyon  
5.2.1.  Yem  
Yaklaşık 50 g numune 0,01 g hassasiyetle tartılır. 500 ml’lik bir erlene aktarılır, 1,00 ml iç standart çözeltisi 
(3.2), 200 ml ekstraksiyon çözücüsü (3.12) eklenilir ve balon joje kapatılır. Karışım çalkalayıcıda (4.1) gece 
boyunca çalkalanır.  Çökmesi için 10 dakika dinlendirilir. 20 ml temsili miktarda süpernatant uygun bir cam 
kaba aktarılır ve 20 ml su ile seyreltilir. Bu çözelti bir ekstraksiyon kartuşuna (3.11) aktarılır ve vakum (4.5) 
uygulayarak geçirilir. Kartuş 25 ml ekstraksiyon çözücü karışımı (3.12) ve suyla [65 + 35 (V + V)] yıkanır. 
Toplanan fraksiyonlar atılır ve bileşikler 25 ml ekstraksiyon  çözücü karışımı (3.12) ve suyla [80 + 20 (V + V)] 
elüe edilir. Bu fraksiyonu, döner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (4.3) ile 60°C’de kuruyana kadar 
buharlaştırılır. Kalıntı 1,0 ml DMF (3.6) içinde çözündürülür, 1,5 ml su (3.1) eklenir ve karıştırılır.  Bir membran 
filtreden (4.4) süzülür. HPLC tayinine (5.3) geçilir.  
5.2.2.  Premiksler  
Yaklaşık 1 g numune 0,001 g hassasiyetle tartılır. 500 ml’lik konik erlene aktarılır, 1,00 ml iç standart çözeltisi 
(3.9.2), 200 ml ekstraksiyon çözücüsü (3.12) eklenir v e erlenin ağzı kapatılır. Karışım çalkalayıcıda (4.1) gece 
boyunca çalkalanır. Çökmesi için 10 dakika dinlendirilir. 10.000/p ml’lik (p = premiksdeki diklazuril’in nominal 
içeriği, mg/kg ) temsili miktarda süpernatant uygun boyuttaki yuvarlak tabanlı bir b alona aktarılır. Azaltılan 
basınç altında, 60°C’de, döner buharlaştırıcı (rotary evaporator) (4.3) ile kuruyana kadar buharlaştırılır. Kalıntı 
10,0 ml DMF (3.6) içinde yeniden çözündürülür, 15,0 ml su (3.1) eklenir ve karıştırılır. HPLC tayinine (5.3) 
geçilir. 
5.3.  HPLC tayini  
5.3.1.  Parametreler  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir.  
Sıvı kromatografik kolon (4.2.1):  100 mm x 4,6 mm, Hipersil 
ODS, 3 μm dolgu ya da eşdeğeri   
Mobil faz:  Elüent A (3.13.1):  Sulu amonyum asetat ve tetrabutil -
amonyum hidrojen sülfat çözeltisi.  
 Elüent B (3.13.2):  asetonitril  
 Elüent C (3.13.3):  metanol  
Elüsyon modu  — doğrusal gradyan  
— başlangıç koşulları  
A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)  
— 10 dakika gradyan elüsyonundan sonraki 30 dakika boyunca hedef: A 
+ B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)  
10 dakika boyunca B ile yıkanır.  
Akış hızı  1,5-2 ml/dak.  Enjeksiyon hacmi: 20 μl  
Detektör dalga boyu  280 nm.   98 
  
2 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisini  (3.10), tutarlı pik yükseklikleri ve alıkonma süreleri elde edene kadar 
birkaç kez enjekte ederek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.3.2.  Kalibrasyon çözeltisi  
20 μl kalibrasyon çözeltisi (3.10) birkaç kez enjekte edilir ve diklazuril o rtalama pik yüksekliği (alan) ile iç 
standart pikleri tayin edilir.  
5.3.3.  Numune çözeltisi  
20 μl numune çözeltisi (5.2.1 ya da 5.2.2) birkaç kez enjekte edilir ve diklazuril ortalama pik ile iç standart 
piklerinin yüksekliği (alan) tayin edilir.  
6.  Sonu çların hesaplanması  
6.1. Yemler  
Numunedeki mg/kg cinsinden diklazuril içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
hd,s = Diklazurilin numune çözeltisindeki (5.2.1) pik yüksekliği (alan)  
hi,s = İç standardın numune çözeltisindeki (5.2.1) pik yüksekliği (alan)  
hd,c = Diklazurilin kalibrasyon çözeltisindeki (3.10) pik yüksekliği (alan)  
hi,c = İç standardın kalibrasyon çözeltisindeki (3.10) pik yüksekliği (alan)  
cd,c = Kalibrasyon çözeltisindeki diklazuril konsantrasyonu (3.10), μg/ml  
m = Test numunesinin  ağırlığı, g  
V = Numune ekstraktının 5.2.1’e göre hacmi (örneğin 2,5 ml)  
6.2. Premiksler  
Numunedeki mg/kg cinsinden diklazuril içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
hd,c = Diklazurilin kalibrasyon çözeltisindeki (3.10) pik yüksekl iği (alan)  
hi,c = İç standardın kalibrasyon çözeltisindeki (3.10) pik yüksekliği (alan)  
hd,s = Diklazurilin numune çözeltisindeki (5.2.2) pik yüksekliği (alan)  
hi,s = İç standardın numune çözeltisindeki (5.2.2) pik yüksekliği (alan)  
99 
 cd,c = Kalibrasyon çöze ltisindeki diklazuril konsantrasyonu (3.10), μg/ml  
m = Test numunesinin  ağırlığı, g  
V = Numune ekstraktının 5.2.2’ye göre hacmi (örneğin 25 ml)  
p = Premiksdeki diklazuril’in nominal içeriği, mg/kg  
7.  Sonuçların validasyonu  
7.1.  Tanım lama 
Analitin tanımas ı ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının (5.2.1 ya da 5.2.2) ve kalibrasyon çözeltisinin 
(3.10) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektörü kullanılarak onaylanabilir.  
7.1.1.  Ortak kromatografi  
Bir numune ekstraktı (5.2.1 ya da 5.2.2), uygun miktarda kalibrasyon çözeltisi (3.10) eklenerek zenginleştirilir. 
Eklenen diklazuril miktarı numune ekstraktında bulunan diklazuril miktarına benzer olmalıdır.  
Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katıldıktan sonra yalnız ca diklazuril piki ve iç 
standart pikinin yüksekliği geliştirilmelidir. Yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği, orijinal diklazuril 
piki genişliğinin ya da zenginleştirilmemiş numune ekstraktının iç standart piki ±  % 10 aralığında olmalıdır.  
7.1.2.   Diode Array Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir:  
(a) Numunenin ve standart spektrumlarının, kromatogramın pik apeksinde kaydedilen maksimum absorpsiyon 
dalga boyu, tespit sisteminin çözüleme gücüyle tayin edilen bir marj aralığında aynı olmalıdır. Diode Array 
metodu için bu tipik olarak ± 2 nm’dir.  
(b) 230 - 320 nm arasında, kromatogramın pik apeksinde kaydedilen numune ve standart spektrumlar, 
spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için farklı ol mamalıdır. Bu kriter aynı 
maksimum piki olduğunda ve gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sapma, standart analizin 
absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır.  
(c) 230 - 320 nm arasında, aynı ekstrakt tarafından üretilen pikin yukarı eğim, apeks ve aşağı eğim spektrumları, 
spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı olmamalıdır. Bu kriter, 
aynı maksimum piki olduğunda ve gözlenen tüm noktalarda spektrumlar arasındaki sapma, pik apeksi 
spektr umunun absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır.  
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır.  
7.2.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki farkı aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
— 0,5 mg/kg ila 2,5 mg/kg diklazuril içeriği için daha yüksek değere bağıl %  30, 
— 2,5 mg/kg ile 5 mg/kg arasındaki diklazuril içeriği için 0,75 mg/kg,  
— 5 mg/kg’dan fazla diklazuril içeriği için daha yüksek değere bağıl %  15, 
7.3. Geri kazanım  
Zenginleştirilmiş  bir (kör) numune için geri kazanım en az %  80 olmalıdır.  100 
 8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
Bir EC ortak çalışması düzenlenmiş, bu çalışmada 11 laboratuvar  tarafından 5 numune analiz edilmiştir. Bu 
numuneler iki premiksden oluşmaktadır; biri organik bir m atris (O 100) ile ve diğeri inorganik bir matris (A 100) 
ile karıştırılmıştır. Teorik içerik 100 mg/kg diklazurildir. 3 farklı üreticiden (NL) (L1/Z1/K1) üç kanatlı  karma 
yemi oluşturulmuştur. Teorik içerik 1 mg/kg diklazurildir. Laboratuvar lara numuneleri n her birini bir kez ya da 
iki kez analiz etme talimatı verilmiştir. (Bu ortak çalışma hakkında daha ayrıntılı bilgi için bkz. Journal of 
AOAC International, Volume 77, No 6, 1994, p. 1359 -1361). Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir.  
 Numune 1  
A 100  Num une 2  
O 100  Numune 3  
L1 Numune 4  
Z1 Numune 5  
K1 
L  11 11 11 11 6 
n  19 18 19 19 12 
Ortalama  100,8  103,5  0,89 1,15 0,89 
sr (mg/kg)  5,88 7,64 0,15 0,02 0,03 
CV r (%)  5,83 7,38 17,32  1,92 3,34 
SR (mg/kg)  7,59 7,64 0,17 0,11 0,12 
CV R (%)  7,53 7,38 18,61  9,67 13,65  
Nominal içerik (mg/kg)  100 100 1 1 1 
 
L = Laboratuvar ların sayısı  
n = Tekil değerlerin sayısı  
sr = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı  
 
9.  Gözlemler  
Diklazuril yanıtının ölçülen konsantrasyon dizisinde doğrusal olduğu önceden gösterilmiş olmalıdır.  
F.  LASALOSİD SODYUM TAYİNİ  
Streptomyces lasaliensis ile üretilen bir polieter monokarboksi lik asidin sodyum tuzu  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemlerdeki ve premikslerdeki lasalosid sodyum seviyesinin tayinini mümkün kılar. Tespit limiti 5 
mg/kg, Ölçüm limiti 10 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Lasalosid sodyum numuneden asitleştirilmiş metanolle ekstrakte edilir ve spektroflorometrik bir detektör 
kullanılarak ters fazlı yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Potasyum dihidrojen fosfat (KH 2PO 4) 
3.2.  Ortofosforik asit, w (w/w) = %  85 101 
 3.3.  Ortofosforik asit çözeltisi, c = %  20,  23,5 ml ortofosforik asit (3.2) suyla 100 ml’ye seyreltilir.  
3.4.  6-Metil -2-heptilamin (1,5 -dimetilheksilamin), w (w/w) = %  99 
3.5.  Metanol, HPLC kullanım saflığında   
3.6.  Hidroklorik asit, yoğunluk = 1,19 g/ml  
3.7.  Fosfat ta mpon çözeltisi, c = 0,01 mol/l, 1,36 g KH 2PO 4 (3.1) 500 ml suda (3.11) çözündürülür, 3,5 ml 
ortofosforik asit (3.2) ve 10,0 ml 6 -metil -2-heptilamin (3.4) eklenir. Ortofosforik asit çözeltisiyle (3.3) pH 4,0’e 
ayarlanır ve su ile (3.11) 1000 ml’ye tamamlanı r. 
3.8.  Asitleştirilmiş metanol, 5,0 ml hidroklorik asit (3.6) 1000 ml’lik balon jojeye aktarılır, metanol (3.5) ile 
işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözelti kullanılmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.9.  HPLC mobil fazı, fosfat tampon metanol çözeltisi 5 + 95 (V + V), 5 ml fosfat tampon çözeltisi (3.7) 95 ml 
metanol (3.5) ile karıştırılır.  
3.10. Garantili saflıkta lasalosid sodyum standart maddesi, C 34H53O8Na (Streptomyces lasaliensis  ile üretilen bir 
polieter monokarboksilik asidin sod yum tuzu), E763  
3.10.1. Lasalosid sodyum stok standart çözeltisi, 500 μg/ml, 50 mg lasalosid sodyum (3.10) 0,1 mg hassasiyetle 
100 ml’lik balon jojeye tartılır, asitleştirilmiş metanolde (3.8) çözündürülür, aynı çözücü ile işarete kadar 
tamamlanır ve karış tırılır. Bu çözelti, kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.10.2.  Lasalosid sodyum ara standart çözeltisi, 50 μg/ml, 10,0 ml stok standart çözeltisi (3.10.1) 100 ml’lik 
balon jojeye pipetlenir, asitleştirilmiş metanol (3.8) ile işarete kadar tama mlanır ve karıştırılır. Bu çözelti, 
kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.10.3.  Kalibrasyon çözeltileri  
Bir dizi 50 ml’lik balon jojeye 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ve 10,0 ml ara standart çözeltisi (3.10.2) aktarılır. Asitleştirilmiş 
metanol (3.8) ile iş arete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltiler sırasıyla 1,0, 2,0, 4,0, 5,0 ve 10,0 μg/ml 
lasalosid sodyuma karşılık gelir. Bu çözeltiler kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.11.   Su, HPLC kullanım saflığında  
4.  Cihazlar  
4.1.  Sıcaklık kontrollü ultrasonik banyo (ya da çalkalanan su banyosu).  
4.2.  Membran filtreler, 0,45 μm.  
4.3.  20 μl’lik hacimleri enjekte etmeye uygun enjeksiyon sistemli HPLC cihazı.  
4.3.1.  Sıvı kromatografik kolon, 125 mm x 4 mm, ters fazlı C 18, 5 μm dolgu ya da e şdeğeri.  
4.3.2.  Eksitasyon ve emisyon dalga boyları için değişken dalga boyu ayarlı spektroflorometre  
5.  Metot  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Kör yem  
Geri kazanım testinin (5.1.2) performansında, lasalosid sodyum ya da etkileşime giren maddelerin olmadığını 
kontrol  etmek için bir kör yem analiz edilmelidir. Kör yem numunedekine benzer türde olmalı ve analizde, 
lasalosid sodyum ya da etkileyen maddeler tespit edilmemelidir.  102 
 5.1.2.  Geri kazanım   testi 
Numunedeki varlığına yakın miktarda lasalosid sodyum eklenen kör y em analiz edilerek bir geri kazanım testi 
yürütülmelidir. Lasalosid sodyumu 100 mg/kg düzeyine ulaştırmak için 10,0 ml stok standardı (3.10.1) 250 
ml’lik erlene aktarılır ve çözelti yaklaşık 0,5 ml’ye buharlaştırılır. 50 g kör yem eklenir, iyice karıştırıl ır, 10 
dakika dinlendirilir, ekstraksiyon aşamasına (5.2) devam etmeden önce birkaç kez yeniden karıştırılır.  
Alternatif olarak, numune ile benzer türde bir kör yem mümkün değilse (bakınız 5.1.1), standart ekleme metodu 
yoluyla bir geri kazanım testi gerçe kleştirilebilir. Bu durumda analiz edilecek numune, zaten numune içinde 
mevcut olana benzer bir miktar lasalosid sodyum ile zenginleştirilir. Bu numune zenginleştirilmemiş numune ile 
birlikte analiz edilir ve çıkartma yoluyla geri kazanım hesaplanır.  
5.2.  Ekstraksiyon  
5.2.1.  Yem   
5 g ile 10 g numune 0,01 g hassasiyetle 250 ml’lik tapalı bir konik cam erlene tartılır. 100,0 ml asitleştirilmiş 
metanol (3.8) pipetle eklenir. Gevşekçe kapatılır ve içeriğin dağılması için karıştırılır. Erlen yaklaşık 40°C’deki  
bir ultrasonik banyoya (4.1) 20 dakika konulur, ardından banyodan alınır ve oda sıcaklığına soğutulur. 
Süspansiyon halindeki madde oturana kadar yaklaşık bir saat dinlendirilir, ardından temsili bir miktar 0,45 
μm’lik bir membran filtreden (4.2) uygun bir  kaba süzülür. HPLC tayinine (5.3) geçilir.  
5.2.2.  Premiksler  
Yaklaşık 2 g öğütülmemiş premiks 0,001 g hassasiyetle 250 ml’lik balon jojeye tartılır. 100,0 ml asitleştirilmiş 
metanol (3.8) eklenir ve içeriğin dağılması için karıştırılır. Balon joje ve içi ndekiler yaklaşık 40°C’deki bir 
ultrasonik banyoya (4.1) 20 dakika süreyle konur , ardından banyodan alınır ve oda sıcaklığına soğutulur. 
Asitleştirilmiş metanol (3.8) ile işarete kadar tamamlanır ve iyice karıştırılır. Süspansiyon halindeki madde 
oturana k adar bir saat dinlendirilir, ardından temsili bir miktar 0,45 μm’lik bir membran filtreden (4.2) süzülür. 
Yaklaşık 4 μg/ml lasalosid sodyum içeren nihai test çözeltisi üretmek için uygun hacimdeki berrak filtrat 
asitleştirilmiş metanol (3.8) ile seyreltili r. HPLC tayinine (5.3) geçilir.  
5.3.  HPLC tayini  
5.3.1.  Parametreler  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur, eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir:  
 Sıvı kromatografik kolon (4.3.1):  125 mm x 4 mm, ters fazlı C 18, 5 μm dolgu ya da 
eşdeğeri.  
Mobil faz (3.9):  Fosfat tampon çözeltisi (3.7) ve metanol (3.5) 
karışımı, 5 + 95 (V+V)  
Akış hızı:  1,2 ml/dak.  
Tespit dalga boyları:   
Eksitasyon:  310 nm  
Emisyon:  419 nm  
Enjeksiyon hacmi:  20 μl  103 
 4,0 μg/ml içeren kalibrasyon  çözeltisi (3.10.3), tutarlı pik yükseklikleri (alanlar) ve alıkonma süreleri elde edene 
kadar birkaç kez enjekte ederek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.3.2.  Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.10.3) birkaç kez enjekt e edilir ve her bir konsantrasyonun ortalama pik 
yükseklikleri (alanları) tayin edilir. Apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlara ordinatlarda denk gelen 
ortalama pik yükseklikleri ya da alanları kullanarak bir kalibrasyon grafiği çizilir.  
5.3.3.  Numune  çözeltisi  
Kalibrasyon çözeltileri için alınanla aynı hacim kullanılarak 5.2.1 ya da 5.2.2’deki numune ekstraktları birkaç 
kez enjekte edilir ve lasalosid sodyum piklerinin ortalama pik yüksekliği (alanlar) belirlenir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalibrasyon grafiği referans alınarak, aynı çözeltinin (5.3.3) enjeksiyonu ile üretilen ortalama pik yüksekliğinden 
(alan) lasalosid sodyum çözeltisinin konsantrasyonu (μg/ml) tayin edilir.  
6.1.  Yemler  
Numunedeki mg/kg cinsinden lasalosid sodyum içeriği “ w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
c = Numune çözeltisinin lasalosid sodyum konsantrasyonu, μg/ml  
V1 = Numune ekstraktının 5.2.1’e göre hacmi, ml (örneğin 100)  
m = Test kısmının ağırlığı, g  
6.2.  Premiksler  
Numunedeki mg/kg cinsinden lasalosid sodyum içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
c = Numune çözeltisinin (5.2.2.) lasalosid sodyum konsantrasyonu, μg/ml  
V2 = Numune ekstraktının 5.2.2’ye göre hacmi, ml (örn. 250)  
f = 5.2.2’ye göre seyreltme faktörü  
m = Test kısmının ağırlığı , g 
7.  Sonuçların validasyonu  
7.1.  Tanım lama 
Spektroflorometriye dayanan metotlar, UV tespitinin kullanıldığı metotlara göre etkilenmeye daha az duyarlıdır. 
Analitin tanıması ortak kromatografi ile doğrulanabilir.  
104 
 7.1.1.  Ortak kromatografi  
Bir numune ek straktına (5.2.1 ya da 5.2.2), uygun miktarda kalibrasyon çözeltisi (3.10.3) eklenir. Eklenen 
lasalosid sodyum miktarı numune ekstraktında bulunan lasalosid sodyum miktarına benzer olmalıdır. Hem 
eklenen lasalosid sodyum miktarı hem de ekstraktın seyreltil mesi hesaba katılarak yalnızca lasalosid sodyum 
pikinin yüksekliği geliştirilmelidir. Yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği, zenginleştirilmemiş numune 
ekstraktı ile üretilen orijinal pik genişliğinin ±  % 10 aralığında olmalıdır.  
7.2.  Tekrar edil ebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki farkı aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
— 30 mg/kg ile 100 mg/kg lasalosid sodyum içeriği için daha yüksek değere bağıl %  15, 
— 100 mg/kg ile 200 mg/kg arasındaki lasalosid sodyum içeriği için 15 mg/kg,  
— 200 mg/kg’dan fazla lasalosid sodyum içeriği için daha yüksek değere bağıl %  7,5. 
7.3.  Geri kazanım  
Zenginleştirilmiş (kör) numune için geri kazanım en az %  80 olmalıdır. Güçlendirilmiş premiks numuneleri için 
geri kazanım en az %  90 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
Bir EC ortak çalışması düzenlenmiş, bu çalışmada 12 laboratuvar  tarafından 2 premiks numunesi (numuneler 1 
ve 2) ile 5 yem (numuneler 3 -7) analiz edilmiştir. Her numunede analizler paralel olarak gerçekleştirilmiştir. 
Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
 Numune 1  
Tavuk 
premiksi  Numune  2 
Hindi 
premiksi  Numune 3 
Hindi 
yemi, Pelet 
formunda  Numune 4 
Tavuk yemi 
ince-toz 
formunda  Numune 
5 Hindi 
Yemi  Numune 6 
Tavuk Yemi 
A Numune 7 
Tavuk Yemi 
B 
L 12 12 12 12 12 12 12 
n  23 23 23 23 23 23 23 
Ortalama 
[mg/kg]  5050  16200  76,5 78,4 92,9 48,3 32,6 
sr [mg/kg]  107 408 1,71 2,23 2,27 1,93 1,75 
CV r [%]  2,12 2,52 2,24 2,84 2,44 4,00 5,37 
sR [mg/kg]  286 883 3,85 7,32 5,29 3,47 3,49 
CV R [%]  5,66 5,45 5,03 9,34 5,69 7,18 10,70  
Nominal 
içerik 
[mg/kg]  5 000 (*)  16 000 (*)  80 (*)  105 (*)  120 (*)  50 (**)  35 (**)  
 
 105 
 (*) Üretici tarafından beyan edilen içerik  
(**) Laboratuvar da hazırlanan yem  
L = Laboratuvar ların sayısı  
n = Tekil sonuçların sayısı  
sr = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı, %  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı, %  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 106 
 EK-5 
YEM LERDE İSTENMEYEN MADDELERİNİN KONTROLÜ NE YÖNELİK ANALİZ METOTLARI  
A. SERBEST VE TOPLAM GOSİPOL TAYİNİ  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot, 20 mg/kg’dan fazla serbest gosipol, toplam gosipol ve kimyasal olarak bu maddelerle ilgili maddeleri 
içeren pamuk tohumu, pamuk tohumu küspesinde ve bu yem materyallerini içeren karma yemlerde serbest 
gosipol, toplam gosipol ve kimyasal olarak bu maddelerle ilgili maddelerin tayinin i mümkün kılar.  
2.  Prensip  
Gosipol, 3 -aminopropan -1-ol varlığında serbest gosipol tayini için bir propan -2-ol ve hekzan karışımı ile ya da 
toplam gosipol tayini için dimetilformamid ile ekstrakte edilir. Gosipol, anilin ile, optik yoğunluğu 440 nm’de 
ölçülen gosipol -dianiline dönüştürülür.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Propan -2-ol- hekzan karışımı: hacmen 60 birim propan -2-ol ile hacmen 40 birim n - hekzan karıştırılır.  
3.2. Çözücü A: 1 litrelik balon jojeye yaklaşık 500 ml propan -2-ol- hekzan karışımı (3.1), 2 ml 3 - aminopropan -
1-ol, 8 ml glasiyal asetik asit ve 50 ml su konur . Propan -2-ol- hekzan karşımı (3.1) ile hacmine tamamlanır. Bu 
ayıraç bir hafta stabildir.  
3.3. Çözücü B: 2 ml 3 -aminopropan -1-ol ile 10 ml glasiyal asetik asit 100 ml’lik balon jojeye pipetleni r. Oda 
sıcaklığına soğutulur ve N, N -dimetilformamid ile gereken hacme tamamlanır. Bu ayıraç bir hafta stabildir.  
3.4.  Anilin: Kör testinin optik yoğunluğu 0,022’yi geçerse, anilin çinko tozu üstünde damıtılır, distilatın ilk ve 
son %  10’luk fraksiyonları  atılır. Kahverengi, kapalı bir şişede, soğutulup saklanırsa, bu ayıraç birkaç ay 
saklanacak . 
3.5.  Standart gosipol çözeltisi A: 27,9 mg gosipol asetat 250 ml’lik balon jojeye konur . Çözündürülür ve çözücü 
A (3.2) ile hacmine tamamlanır. Bu çözeltinin 50 ml’si 250 ml’lik balon jojeye pipetlenir ve çözücü A ile 
hacmine kadar tamamlanır. Bu çözeltideki gosipol konsantrasyonu 0,02 mg/ml’dir. Kullanmadan önce oda 
sıcaklığında bir saat dinlenmeye bırakılır.  
3.6.  Standart gosipol çözeltisi B : 27,9 mg gosipol a setat 50 ml’lik balon jojeye konur , çözündürülür ve çözücü 
B (3.3) ile hacmine kadar tamamlanır. Bu çözeltideki gosipol konsantrasyonu 0,5 mg/ml’dir.  
 Standart gosipol çözeltileri A ve B, ışıktan korunduklarında 24 saat stabildir.  
4.  Cihaz  
4.1.  Karıştırıcı : yaklaşık 35 rpm  
4.2.  Spektrofotometre  
5.  Metot  
5.1.  Test numunesi  
Kullanılan test numunesi miktarı numunenin varsayılan gosipol içeriğine göre değişir. Tercihen az miktarda test 
numunesi ve bağıl olarak daha fazla temsili miktarda filtrat ile çalışılır, bu sayede hassas fotometrik ölçüm 
yapılabilmesi için yeterli gosipol elde edilir. Pamuk ve pamuk tohumu küspesinde serbest gosipol tayini için, test 
numunesi 1 g’ı geçmemelidir, karma yemlerde en fazla 5 g olabilir. 10 ml’lik temsili miktard a filtrat çoğu 107 
 durumda uygundur, 50 ile 100 μg gosipol içermelidir. Toplam gosipol tayini için test numunesi 0,5 ile 5 g 
arasında olmalıdır, bu durumda 2 ml temlisi miktarda filtrat 40 ile 200 μg gosipol içerecektir.  
Analiz yaklaşık 20°C’deki oda sıcaklığ ında gerçekleştirilmelidir.  
5.2.  Serbest gosipol tayini  
Numune yuvarlak boyunlu, dibi ezilmiş camla kaplanmış 250 ml’lik bir cam balona konur . Bir pipet kullanılarak 
50 ml çözücü A (3.2) eklenir, balon joje kapatılır ve bir karıştırıcıda bir saat karıştır ılır. Kuru bir süzgeç 
kağıdından süzülür ve süzüntü küçük, yuvarlak boyunlu bir cam balona alınır. Süzme sırasında huni bir saat 
camı ile örtülür.  
50 ile 100 μg gosipol içeren benzer temsili miktarda süzüntü, 25 ml’lik balon jojelerin (A ve B) her birine 
pipetlenir. Gerekiyorsa hacmi çözücü A (3.2) ile 10 ml’ye tamamlanır. Ardından şişedeki (A) içeriği propan -2-
ol- hekzan karşımı (3.1) ile hacmine tamamlanır. Bu çözelti, numune çözeltisinin ölçümünde referans çözelti 
olarak kullanılacaktır.  
10 ml çözücü A (3.2) diğer 25 ml’lik balon jojelerden (C ve D) her birine pipetlenir. Şişedeki (C) içeriği propan -
2-ol- hekzan karşımı (3.1) ile hacmine tamamlanır. Bu çözelti, kör test çözeltisinin ölçümünde referans çözelti 
olarak kullanılacaktır.  
2 ml anilin (3.4) şiş elerden (D ve B) her birine eklenir. Renk geliştirmek için kaynar su banyosunda 30 dakika 
ısıtılır. Oda sıcaklığına soğutulur, propan -2-ol- hekzan karşımı (3.1) ile hacmine tamamlanır, homojenleştirilir ve 
bir saat dinlendirilir.  
1 cm cam hücreler kullanıl arak 440 nm’deki spektrofotometrede, kör testin (D) optik yoğunluğu referans çözelti 
(C) ile karşılaştırılarak ve numune çözeltisinin (B) optik yoğunluğu referans çözeltisi (A) ile karşılaştırılarak 
tayin edilir.  
Kör testin optik yoğunluğu numune çözeltisi nin optik yoğunluğundan çıkartılır (=düzeltilmiş optik yoğunluk). 
Bu değerden, serbest gosipol içeriği madde 6’da belirtilen şekilde hesaplanır.  
5.3.  Toplam gosipol tayini  
1 - 5 mg gosipol içeren bir test numunesi 50 ml’lik balon jojeye konur  ve 10 ml çöz ücü B (3.3) eklenir. Aynı 
zamanda, 10 ml çözücü B (3.3) başka bir 50 ml’lik balon jojeye koyularak bir kör test hazırlanır. İki balon joje 
30 dakika kaynar su banyosunda ısıtılır. Oda sıcaklığına soğutulur ve her bir şişedeki içerik propan -2-ol-hekzan 
karşımı (3.1) ile hacmine tamamlanır. Homojenleştirilir ve 10 ile 15 dakika çökmesi beklenir, ardından süzülür 
ve süzüntüler yuvarlak boyunlu erlenlere alınır.  
2 ml numune filtratı iki 25 ml’lik balon jojelerden her birine ve 2 ml kör test filtratı diğer iki 25 ml’lik şişelerden 
her birine pipetlenir. Her seriden bir şişenin içeriğini propan -2-ol-hekzan karşımı (3.1) ile 25 ml’ye tamamlanır. 
Bu çözeltiler referans çözeltiler olarak kullanılacaktır.  
2 ml anilin (3.4) diğer iki şişeden her birine eklenir. Renk g eliştirmek için kaynar su banyosunda 30 dakika 
ısıtılır. Oda sıcaklığına soğutulur, propan -2-ol-hekzan karşımı (3.1) ile 25 ml’ye tamamlanır, homojenleştirilir ve 
bir saat dinlendirilir.  
Optik yoğunluğu, serbest gosipol için 5.2’de belirtildiği gibi ölçülü r. Bu değerden, toplam gosipol içeriği madde 
6’da belirtilen şekilde hesaplanır.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Sonuçlar spesifik optik yoğunluktan (6.1) ya da bir kalibrasyon eğrisini (6.2) referans alarak hesaplanabilir.  
6.1.  Spesifik optik yoğunluk ile  108 
 Belirtilen koşullar altındaki spesifik optik yoğunluklar aşağıdaki gibidir:  
                       =625  
                     =600  
       Numunenin serbest ya da toplam gosipol içeriği aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır:  
%  gosipol :   
 
Burada;  
E = Düzeltilmiş optik yoğunluk, madde 5.2’de belirtilen şekilde tayin edilmiş,  
p = Test numunesi, g  
a = Filtratın temsili miktarı, ml  
6.2. Kalibrasyon eğrisi ile  
6.2.1. Serbest gosipol  
2 seri beş adet 25 ml’lik balon joje hazırlanır. 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 ve 10, 0 ml’lik standart gosipol çözeltisi A (3.5) 
temsili miktarları her bir balon joje serisine pipetlenir. Çözücü A (3.2) ile 10 ml’ye tamamlanır. Her seri yalnızca 
10 ml çözücü A (3.2) içeren 25 ml’lik balon jojeyle tamamlanır (kör test).  
İlk serideki balon jojelerin hacmi (kör testinin şişesi de dahil) propan -2-ol-hekzan karışımı (3.1) ile 25 ml’ye 
tamamlanır (referans serisi).  
İkinci serideki her bir balon jojeye (kör testinin balon jojesi de dahil) 2 ml anilin (3.4) eklenir. Renk geliştirmek 
için kaynar su  banyosunda 30 dakika ısıtılır. Oda sıcaklığına soğutulur, propan -2-ol-hekzan karşımı (3.1) ile 
hacmine tamamlanır, homojenleştirilir ve bir saat dinlendirilir (standart serisi).  
5.2’de belirtilen şekilde, standart serisindeki çözeltilerin optik yoğunluğu,  referans serisindeki çözeltilerle 
karşılaştırarak tayin edilir. Gosipol (μg) miktarlarına göre optik yoğunlukları yazılarak kalibrasyon eğrisi çizilir.  
6.2.2.  Toplam gosipol  
Altı adet 50 ml’lik balon joje hazırlanır. Birinci cam malzemeye 10 ml çözücü B (3.3) ve diğerlerine sırasıyla 
2,0, 4,0, 6,0, 8,0 ve 10,0 ml’lik standart gosipol çözeltisi B (3.6) konur . Her balon jojedeki içerik çözücü B (3.3) 
ile 10 ml’ye tamamlanır. 30 dakika kaynar su banyosunda ısıtılır. Oda sıcaklığına soğutulur, propan -2-ol-hekzan 
karşımı (3.1) ile hacmine tamamlanır ve homojenleştirilir.  
Bu çözeltilerin 2,0 ml’si altı adet 25 ml’lik balon jojelerin iki serisinden her birine konur . İlk serideki balon 
jojelerin içeriği propan -2-ol-hekzan karışımı (3.1) ile 25 ml’ye tamamlanır (re ferans serisi).  
2 ml anilin (3.4) ikinci serideki her bir balon jojeye eklenir. 30 dakika kaynar su banyosunda ısıtılır. Oda 
sıcaklığına soğutulur, propan -2-ol-hekzan karşımı (3.1) ile gerekli hacme tamamlanır, homojenleştirilir ve bir 
saat dinlendirilir ( standart serisi).  
5.2’de belirtilen şekilde, standart serisindeki çözeltilerin optik yoğunluğu, referans serisindeki çözeltilerle 
karşılaştırarak tayin edilir. Gosipol (μg) miktarlarına göre optik yoğunlukları yazılarak kalibrasyon eğrisi çizilir.  
6.3.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
109 
 — 500 ppm’den az gosipol içeriği için daha yüksek değere bağıl %  15 
— 500 ppm ile 750 ppm arasındaki gosipol içeriği için mutlak değer olarak 75 ppm  
— 750 ppm’den fazla gosipol içeriği için daha yüksek değere bağıl %  10 
 
B.  DİOKSİN (PCDD/PCDF) VE DİOKSİN BENZERİ PCB SEVİYELERİNİN TAYİNİ  
BÖLÜM 1  
Numune alma metotları ve ana liz sonuçlarının yorumlanması  
1.  Amaç ve Kapsam  
Poliklorlu dibenzo -p-dioksinler (PCDD’ler), poliklorlu dibenzofuranlar (PCDF’ler), dioksin benzeri poliklorlu 
bifeniller (PCB’ler) (8) ve dioksin benzeri olmayan PCB’lerin yemdeki düzeylerine ilişkin resmi k ontroller 
amacıyla alınacak numuneler Yönetmeliğin  E K-1’indeki hükümleriyle uyumlu olarak alınmalıdır. Yemde 
homojen olarak dağılmış madde veya ürünlerin kontrolüyle ilişkili nicel gereklilikler EK -1’in 3.1 inci 
maddesinde belirtildiği gibi uygulanacaktır. Bu şekilde alınan paçal numunelerin alındıkları parti veya alt partiyi 
temsil ettikleri kabul edilmektedir. Yemlerde İstenmeyen Maddeler Hakkında Tebliğ’deki maksimum düzeylerle 
laboratuvar numune lerinde belirlenen düzeyler temelinde uyum sağlanacaktır.  
                                                           
(8)Dioksinler, furanlar ve dioksin benzeri PCB’ler için TEF (toksik ekivalans faktörleri) tablosu  
Dünya Sağlık Örgütü tarafından Haziran 2005’te, Cenevre’d e düzenlenen ‘Kimyasal Güvenilirlik Uluslararası Programı (IPCS)’nda (Martin 
Van den Berg ve ark., ‘Dioksin ve Dioksin Benzeri Bileşiklerin İnsanlar ve Memeliler İçin Toksik Eşdeğerlik Faktörlerinin 200 5 Dünya 
Sağlık Örgütü Yeniden Değerlendirmesi’) kabul edilen, dioksin ve dioksin benzeri bileşiklerin insanlar için tehlike değerlerini gösteren 
Toksik Eşdeğerlik Faktörleri (WHO -TEF, 2005) [Toxicological Sciences 93(2), 223 -241 (2006)]  
Türdeş bileşen  TEF değeri  Türdeş bileşen  TEF değeri  
Dibenzo -p-dioksinler  (‘PCDD’ler)  Dioksin benzeri PCB’ler: Non -orto PCB’ler ve 
Mono -orto PCB’ler  
2,3,7,8 -TCDD  1 
Non-orto PCB’ler  1,2,3,7,8 -PeCDD  1 
1,2,3,4,7,8 -HxCDD  0,1 PCB 77  0,0001  
1,2,3,6,7,8 -HxCDD  0,1 PCB 81  0,0003  
1,2,3,7,8,9 -HxCDD  0,1 PCB 126  0,1 
1,2,3,4,6,7,8 -HpCDD  0,01 PCB 169  0,03 
OCDD  0,0003    
Dibenzofuranlar (‘PCDF’ler)  Mono -orto PCB’ler  
2,3,7,8 - TCDF  0,1 PCB 105  0,00003  
1,2,3,7,8 -PeCDF  0,03 PCB 114  0,00003  
2,3,4,7,8 -PeCDF  0,3 PCB 118  0,00003  
1,2,3,4,7,8 -HxCDF  0,1 PCB 123  0,00003  
1,2,3,6,7,8 -HxCDF  0,1 PCB 156  0,00003  
1,2,3,7,8,9 -HxCDF  0,1 PCB 157  0,00003  
2,3,4,6,7,8 -HxCDF  0,1 PCB 167  0,00003  
1,2,3,4,6,7,8 -HpCDF  0,01 PCB 189  0,00003  
1,2,3,4,7,8,9 -HpCDF  0,01   
OCDF  0,0003    
Kısaltmalar: T; Tetra/Dört, Pe; Penta/Beş, Hx;Hekza/Altı, Hp;Hepta/Yedi,  O;Octa/Sekiz, CDD; Klorodibenzodioksin, CDF; 
Klorodibenzofuran, CB; Klorobifenil   
 110 
 Bölüm B’deki amaçlara yönelik olarak “Analiz Metot larının  Uygulanması ve Sonuçların Yorumlanmasına 
İlişkin 96/23/EC sayılı Konsey Direktifini uygulayan 12 Ağustos 2002 tarihli ve 2002/657/EC (9) sayılı 
Komisyon Kararı” Ek I’inde belirtilen tanımlar geçerli olacaktır.   
 “Tarama metotları ” maksimum düzeyleri veya müdahale eşiklerini geçen PCDD/F ve dioksin benzeri PCB 
düzeylerine sahip numunelerin seçimi için kullanılan metotlardır. Bunlar maliyet açısından etkin ve yüksek bir 
numune analiz hacmine olanak sağlar ve yüksek maruziyet ve tüke ticiler açısından sağlık riski teşkil eden yeni 
olayların tespit olasılığını arttırır. Tarama metotları biyoanalitik veya GC -MS metotlarına dayanacaktır. 
Maksimum düzeyle uyumun kontrolü için eşik değerini aşan numunelere ait sonuçlar, orijinal numunede 
doğrulayıcı bir metotla  yapılacak tam kapsamlı yeni bir analizle doğrulanacaktır.  
“Doğrulayıcı metotlar ” PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin maksimum düzeyde veya ihtiyaç duyulduğu 
takdirde müdahale eşiğinde kesin biçimde belirlenmesi ve miktarının ölçül mesine olanak sağlayan tam veya 
tamamlayıcı bilgileri sağlayan metotlardır. Söz konusu metotlar gaz kromatografi/yüksek çözünürlüklü kütle 
spektrometreden (GC -HRMS) veya gaz kromatografi/tandem kütle spektrometreden (GC -MS/MS) faydalanır.  
2.  Parti veya a lt partinin maksimum düzeyle uyumu  
2.1.  Dioksin benzeri olmayan PCB’ler için  
Analiz sonucunun Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliği’nde dioksin benzeri olmayan PCB’lerin maksimum 
düzeyi aşmaması durumunda, söz konusu parti ölçüm belirsizliği göz önüne alın arak maksimum düzeyle uyumlu 
kabul edilir.  
Üst sınır (10) analiz sonucunun tekrarlı analizle (11) doğrulandığı nda  Yemlerde İstenmeyen Maddeler 
Tebliği’ndeki maksimum düzeyi aşması durumunda, söz konusu parti ölçüm belirsizliği göz önüne alınarak 
maksimum dü zeyle uyumsuz kabul edilir. İki tespitin ortalaması, ölçüm belirsizliği göz önüne alınarak uyumun 
doğrulanması amacıyla kullanılır.  
Ölçüm belirsizliği aşağıdaki yaklaşımların birisine göre dikkate alınacaktır:  
- Yaklaşık % 95 güven aralığı veren kapsam faktö rünün 2 (k=2) olarak alınmasıyla genişletilmiş 
belirsizlik hesaplanır. “Ölçülen değer eksi U” maksimum düzeyin üzerindeyse bir parti veya alt parti 
uyumsuz olarak kabul edilir.  
- Karar sınırı (CCα) tesis edilerek ölçülen değer CCα’ya eşit ya da daha yüksekse  numune alınan kısım 
ile uyumlu değildir . 
Mevcut yorum kuralları, resmî kontrol amacıyla numunede elde edilen analitik sonuçlar için geçerlidir.  
2.2.  PCDD/F ve dioksin benzeri PCB’ler için  
Parti aşağıdaki koşullarda maksimum düzeylerle uyumlu kabul edilir:  
- Yanlış uyumluluk oranı % 5’in altında olan bir tarama metoduyla gerçekleştirilen tek bir analizin 
sonucuna göre söz konusu düzeyin Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliği’ndeki maksimum 
PCDD/PCDF düzeyi ve PCDD/PCDF’ler ile dioksin benzeri PCB’lerin t oplamın ı geçmemesi.  
                                                           
(9) Analitik metotların yürütülmesi ve sonuçların yorumlanmasına ilişkin 96/23/EC sayılı Konsey Direktifi’ni uygulayan 14 Ağust os 2002 
tarihli ve 2002/657/EC sayılı Komisyon Kararı  
(10) “üst sınır” kavramı miktarı belirlenmemiş her türdeşin katkısı için miktar tayin limitinin kullanılmasını gerektirir. “alt sınır” miktarı 
belirlenmemiş her türdeşin katkısı için sıfır kullanılmasını gerektirir. “orta sınır” miktarı beli rlenmemiş her türdeşin katkısını hesaplamak için 
miktar tayin limitinin yarısını kullanmayı gerektirir.  
(11) Genel olarak, EK-2, Bölüm C’nin 3’üncü maddesinde tekrarlı analizlere ilişkin gereklilikler geçerli olur.  Bununla birlikte, ilgili analitler 
için 13C etiketli iç standardın kullanımıyla birlikte yürütülen doğrulama metotları için, tekrarlı analiz sadece söz konusu doğrulama 
metotlarını uygulayan ilk tespitin sonucunun uyumsuz olması halinde gereklidir. Tekrarlı analiz iç çapraz bulaşma veya numune lerin kazara 
karışması olasılığını ortadan kaldırmak için gereklidir. Analizin bulaşma hadisesi çerçevesinde yürütülmesi durumunda, analiz  için seçilen 
numunelerin izlenebilirlik yoluyla bulaşma hadisesiyle bağlantılandırılması ve düzeyin maksimum seviyenin ö nemli ölçüde üstünde olması 
halinde tekrarlı analiz yoluyla doğrulama yapılabilir.  111 
 - Doğrulayıcı metotla gerçekleştirilen tek bir analizin sonucuna göre söz konusu düzeyin ölçüm 
belirsizliği göz önüne alınarak Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliği’ndeki maksimum PCDD/PCDF 
düzeyi ve PCDD/PCDF’ler ile dioksin benzeri PCB’l erin toplamını geçmemesi.  
 
Tarama tayinleri için maksimum PCDD/PCDF düzeyi veya PCDD/PCDF’ler ile dioksin benzeri PCB’lerin 
toplamı için numune uyumuna ilişkin kararlara yönelik olarak bir eşik değeri belirlenir.  
Doğrulayıcı metotla elde edilen ve tekrarlı  analizle doğrulanan üst sınır (12) analiz sonucunun Yemlerde 
İstenmeyen Maddeler Tebliği’ndeki maksimum düzeyi aşması durumunda, söz konusu parti ölçüm 
belirsizliği (13) göz önüne alınarak maksimum düzeyle uyumsuz kabul edilir. İki tespitin ortalaması, ölçüm  
belirsizliği göz önüne alınarak uyumun doğrulanması amacıyla kullanılır.  
Ölçüm belirsizliği aşağıdaki yaklaşımların birisine göre dikkate alınacaktır:  
- Yaklaşık % 95 güven aralığı veren kapsam faktörünün 2 (k=2)  olarak alınmasıyla genişletilmiş 
belirsizli k hesaplanır. “Ölçülen değer eksi U” maksimum düzeyin üzerindeyse bir parti veya alt parti 
uyumsuz olarak kabul edilir. PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin ayrı tayini durumunda, 
PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin ayrı analiz sonuçlarının ta hmini genişletilmiş belirsizlik 
toplamı PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin toplamı için kullanılacaktır.  
- Karar sınırı (CCα) tesis edilerek ölçülen değer CCα’ya eşit ya da daha yüksekse numune alınan kısım 
ile uyumlu değildir.  
 
Mevcut yorum kuralları, resmî kontrol amacıyla numunede elde edilen analitik sonuçlar için geçerlidir.  
3.  Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliği’nin Ek 2’sindeki müdahale eşiklerini aşan sonuçlar  
Müdahale eşikleri, bulaşma kaynağı belirlenmesi ve bunları azaltacak ya da ortadan kaldıracak önlemler 
alınmasının gerekli olduğu durumlarda numune seçimine yönelik bir araç görevi görür. Tarama metotlarıyla söz 
konusu numunelerin seçimi için uygun eşik de ğerleri belirlenir. Bir kaynak belirlenmesi ve bulaşmanın 
azaltılması veya ortadan kaldırılması için önemli çabalara ihtiyaç duyulması durumunda, bir doğrulama metodu 
kullanarak ve ölçüm belirsizliğini dikkate alarak tekrarlı analiz yoluyla müdahale eşiklerinin aşıldığının 
doğrulanması uygun olabilir (14). 
BÖLÜM  2 
Yemde dioksin (PCDD/PCDF) ve dioksin benzeri PCB düzeylerinin resmi kontrolünde kullanılan analiz 
metotları için numune hazırlama ve gereklilikler  
1.  Uygulama Alanı 
Bu Bölümde belirlenen gereklilikler, poliklorlu dibenzo -p-dioksinler ve poliklorlu dibenz ofuranlar (PCDD/F’ler) 
ve dioksin benzeri poliklorlu bifenillerin (dioksin benzeri PCB’ler) resmi kontrolü ve diğer yasal amaçlarla 
yemin analiz edildiği durumlarda geçerli olur.  
PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin yemdeki varlığının izlenmesi iki tür analiz metoduyla birlikte 
gerçekleştirilebilir:  
                                                           
(12)  Üst sınır” kavramı miktarı belirlenmemiş her türdeşin Toksik Ekivalana (TEQ) katkısının miktar sınırını kullanmayı gerektirir . “Alt 
sınır” kavramı miktarı belirlenmemiş  her türdeşin TEQ’ye katkısı için sıfır değerinin kullanılmasını gerektirir. “Orta sınır” kavramı miktarı 
belirlenmemiş her türdeşin TEQ’ye katkısını hesaplamada miktar tayin limitinin yarısının kullanılmasını gerektirir.  
(13)Genel olarak, EK-2, Bölüm C’nin 3’üncü maddesinde tekrarlı analizlere ilişkin gereklilikler geçerli olur.  Bununla birlikte, ilgili analitler 
için 13C etiketli iç standartın kullanımıyla birlikte yürütülen doğrulama metotları için, tekrarlı analiz sadece söz konusu doğrulam a 
metotlarını uygulayan ilk tespitin sonucunun uyumsuz olması halinde gereklidir. Tekrarlı analiz iç çapraz bulaşma veya numune lerin kazara 
karışması olasılığını ortadan kaldırmak için gereklidir. Analizin bulaşma hadisesi çerçevesinde yürütülmesi durumund a, analiz için seçilen 
numunelerin izlenebilirlik yoluyla bulaşma hadisesiyle bağlantılandırılması ve düzeyin maksimum seviyenin önemli ölçüde üstün de olması 
halinde tekrarlı analiz yoluyla doğrulama çıkarılabilir.  
(14) Maksimum düzeyler için 5 nolu dipnotta olduğu gibi müdahale eşiklerinin kontrolü için tekrarlı analize ilişkin aynı açıklama ve 
gereklilikler.  112 
 a) Tarama metotları  
Tarama metotlarının amacı maksimum düzeyleri veya müdahale eşiklerini geçen PCDD/F ve dioksin benzeri 
PCB düzeylerine sahip numuneleri seçmektir. Tarama metotları maliyet açısından etkin ve yüksek bir numune 
analiz hacmine olanak sağlar ve yüksek maruziyet ve tüketiciler açısından sağlık riski teşkil eden yeni olayların 
tespit olasılığını arttırır.  Bunların uygulanması yanlış uyumlu sonuçların önlenmesini hedeflemelidir. Tarama 
metotları biy oanalitik veya GC -MS metotlarını kapsayabilir.  
Tarama metotları analiz sonucunu eşik noktasıyla karşılaştırır ve maksimum düzey veya müdahale eşiğinin 
muhtemel aşımına yönelik evet/hayır şeklinde karar verilmesini sağlar. Maksimum düzeyle uyumsuz olmasında n 
şüphelenilen numunelerde PCDD/F’lerin konsantrasyonu ve PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin toplamı 
bir doğrulama metoduyla tespit edilmeli/doğrulanmalıdır.  
İlave olarak, tarama metotları numunede mevcut olan PCDD/F ve dioksin benzeri PCB’lerin düzey lerinin 
belirlenmesini sağlayabilir. Biyoanalitik tarama metotlarının uygulanması durumunda, sonuç Biyoanalitik 
Ekivalanlar (BEQ) olarak ifade edilirken, fizikokimyasal GC -MS metotlarının uygulanması durumunda sonuç 
Toksik Ekivalanlar (TEQ) olarak ifade ed ilmektedir. Tarama metotlarının sayısal olarak belirtilen sonuçları, 
uyumu, uyumsuzluk şüphesini veya müdahale eşiklerinin aşılmasını göstermek için uygundur ve do ğrulayıcı 
metotlarla takip durumunda düzeylerin aralığını belirtir. Düşük zemin seviyelerinin  belirlenmesi, maruziyet 
seviyelerinin zamana bağlı olarak değişiminin izlenmesi veya müdahale seviyesi ve maksimum limitlerin 
yeniden değerlendirilmesi gibi durumlar için tarama metotları uygun değildir.  
b) Doğrulama metotları  
Numunedeki mevcut PCDD/F ve di oksin benzeri PCB’lerin kesin bir şekilde hesaplanması ve tanımlanmasını ve 
türdeş bileşen bazında da tam bilgiye ulaşılmasını sağlar.  
Bu nedenle bu metotlar tarama metotları ile elde edilen sonuçların doğrulanması da olmak üzere maksimum limit 
ve müdahale  seviyelerinin kontrolünü sağlar. Buna ilave olarak bu metotlar; yem izlemede düşük zemin 
seviyelerinin tespiti, zamana bağlı olarak de ğişimlerin izlenmesi, popülasyonun maruziyet değerlendirmesi ve 
müdahale seviyesi ve maksimum limitlerin olası yeniden de ğerlendirilmesi için veri tabanının oluşturulması gibi 
farklı amaçlar için de kullanılabilir. Doğrulama metotları aynı zamanda muhtemel bulaşı kaynağını ortaya 
çıkarmak üzere türdeş bileşen dağılımlarının belirlenmesi hususunda da önemlidirler. Bu metotlar  GC-HRMS 
kullanırlar. Maksimum limit lere uygunluk ve ya uygunsuzlu ğun kontrolünde   aynı zamanda GC -MS/MS de 
kullanılabilir.  
2.  Arka plan  
Toksik Ekivalan (TEQ) konsantrasyonlarının hesaplanması için, belirli bir numunede maddelerin tek başına 
konsantrasyonları kendilerine ait Toksik Ekivalans Faktörleriyle (TEF) çarpılacak (bkz. Bölüm 1’deki dipnot ( 8) 
ve sonrasında TEQ cinsinden ifade edilen dioksin benzeri bileşiklerin toplam konsantrasyonlarını ortaya koymak 
için toplanacaktır.  
Söz konusu Bö lüm B’ye yönelik olarak, tek bir türdeşin kabul edilen spesifik miktar tayini limiti, bir analitin en 
düşük miktarının makul istatistiksel belirlilikle ölçülebileceği ve uluslararası düzeyde tanınan standartlarda 
belirtilen teşhis kriterlerini (örneğin EN 16215:2012 (Hayvan yemi — Dioksin ve dioksin benzeri PCB’lerin 
GC-HRMS ile belirlenmesi, indikatör PCB’lerin GCHRMS ile belirlenmesi) ve/veya revize edilen EPA 1613 ve 
1668 metotları.) yerine getireceği anlamına gelir.  
Tekli bir türdeşin miktar tayin limit i aşağıdaki şekilde belirlenebilir:  
a) Daha düşük yoğunluktaki ham veri sinyali için 3:1’lik S/N (sinyal/gürültü) oranıyla izlenmesi gereken iki 
farklı iyonda instrumental yanıt (response) üreten bir numune ekstraktında analitin konsantrasyonu veya  
b) Teknik gerekçeler dolayısıyla, sinyal/gürültü hesaplamasında güvenilir sonuçlar elde edilemezse, her numune 
serisinde kalibrasyon eğrisindeki tüm noktalar için hesaplanan ortalama bağıl yanıt faktöründen kabul 
edilebilir (≤  % 30) ve tutarlı (analitik numune seris inin en azından başında ve sonunda ölçülen) sapma. LOQ 
iç standartların geri kazanımı ve numune alımı dikkate alınarak en düşük konsantrasyondan hesaplanır  
 113 
 Biyoanalitik tarama metotları türdeş düzeyinde sonuç vermez fakat sadece TEQ düzeyinin Biyoanalitik  
Ekivalanlar (BEQ) cinsinden ifade edilen bir göstergesidir (15) ve testte yanıt meydana getiren bir numune 
ekstraktındaki tüm bileşiklerin TEQ prensibinin t üm gerekliliklerine uymayabileceğini gösterir.  
Tarama ve doğrulama metotları, müdahale eşiği veya maksimum düzeyde seviyeleri güvenilir şekilde tespit 
etmek için yeterli düzeyde duyarlı olmaları halinde sadece belirli bir matriksin kontrolü için uygulanabilirler.  
3. Kalite güvence gereklilikleri  
a)   Numune alma ve analiz prosedürünün her bir basamağın da çapraz bulaşmayı önleyecek tedbirler alınmalıdır.  
b)   Numuneler, numunelerdeki PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin seviyeleri üzerine etki etmeyecek 
şekilde saklamaya uygun cam, alüminyum, polipropilen veya polietilen kaplarda muhafaza edilmeli ve 
taşınmalıdır. Eser miktarda olsa dahi kağıt tozlarının kalıntıları numune kabından uzaklaştırılmalıdır.  
c)  Numuneler, bütünlüğü korunarak özellikleri değişmeyecek koşullarda muhafaza edilmeli ve taşınmalıdır.  
ç)  Her bir laboratuvar numunesi mümkün olduğ u kadar, tam homojenizasyonu sağlamak üzere, iyice öğütülmeli 
(örneğin 1 mm’lik elekten geçecek şekilde) ve iyice karıştırılmalıdır. Numuneler, rutubet içeriği çok yüksek ise, 
öğütülmeden önce kurutulmalıdır.  
d)   Kimyasallar, cam malzemeler ve ekipmanları n, TEQ veya BEQ’e dayalı sonuçları etkilememesi için kontrol 
edilmiş olması çok önemlidir.  
e)   Numune hariç tutularak, tüm analitik prosedürün uygulanması ile kör analiz gerçekleştirilmelidir.  
f)  Biyoanalitik metotlar için, analizde kullanılan tüm cam ma lzeme ve çözücülerin çalışma aralığı içerisinde 
hedef bileşiklerin tespitinde girişim yapan bileşikler içermediğinin kontrol edilmiş olması oldukça önemlidir. 
Cam malzemeler, PCDD/F’ler, dioksin benzeri PCB’ler ve girişim yapan bileşiklerin kalıntılarını u zaklaştırmak 
için uygun sıcaklıklarda ısıtılmalı ve/veya çözücüler ile çalkalanmalıdır.  
g) Ekstraksiyon için kullanılan numune miktarı, müdahale seviyesi veya maksimum limit konsantrasyonunu 
içeren yeterince düşük çalışma aralığındaki gereklilikleri karşıl amalıdır.  
ğ)  Analiz edilecek ürünler için kullanılan özel numune hazırlama prosedürleri, uluslararası kabul edilen 
talimatlara uygun olmalıdır.  
4.  Laboratuvarların gereklilikleri  
4.1 Laboratuvarlar, Gıda ve Yemin Resmi Kontrollerine Dair Yönetmeli kte laboratuvarlar için belirtilen 
hükümlere uymak zorundadır . 
4.2.  İlgili yem matrisleri ve konsantrasyon aralıklarında PCDD/PCDF ve dioksin benzeri PCB’lerin tespiti için 
laboratuvarlar arası çalışmalara devamlı olarak başarılı şekilde katılım yoluyla labor atuvar yeterliliği 
kanıtlanacaktır.  
4.3. Numunelerin rutin kontrolü için tarama metotları uygulayan laboratuvarlar, doğrulama metodunu uygulayan 
laboratuvarlarla kalite kontrol ve şüpheli numunelerin analiz sonucunun doğrulanması bakımından yakın bir 
işbirliği oluşturacaklardır.  
5.  Dioksinler (PCDD/PCDF’ler) ve dioksin benzeri PCB’lerin analiz prosedürünün karşılaması gereken temel 
gereklilikler   
5.1.  Düşük çalışma aralığı ve miktar tayin limitleri  
                                                           
(15) Biyoanalitik metotlar TEF programına dahil edilen türdeşlere özgü değildir. Yapısal olarak ilişkili diğer AhR -aktif bileşikler genel yanıta  
katkı yapan numune ekstraktında mevcut olabilir. Bu nedenle biyoanalitik sonuçlar numunedeki TEQ düzeyinin bir tahmini değil fakat bir 
göstergesi olabilir.  114 
 PCDD/F’ler için, bu bileşiklerin bazılarının yüksek  toksisiteleri nedeniyle tespit edilebilir miktarlar 
femtogram(10-15g) düzeyinde olmalıdır. Çoğu PCB türdeş bileşeni için nanogram (10-9g) düzeyinde ölçüm limiti 
yeterlidir. Ancak, daha toksik dioksin benzeri PCB türdeş bileşenlerinin (özellikle non -orto tü rdeş bileşenlerin) 
ölçümü için, çalışma aralığı pikogram (10-12g) seviyelerine inmelidir.  
5.2.  Yüksek seçicilik (spesifiklik)  
5.2.1. PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’leri, ilgili analitlerden birkaç kat fazla konsantrasyonlarda mevcut 
olan, ilgili analitlerle birlikte ekstrakte edilen ve girişim yapması muhtemel bileşiklerden ayırt etmek gereklidir. 
Gaz kromatografisi/kütle spektrometresi (GC -MS) metotlarında, toksik bileşikler (17 adet PCDD/F’ler ve 12 
adet dioksin benzeri PCB’ler) ve diğer türdeş bileşenlerin ayrımı gereklidir.  
5.2.2. Biyoanalitik metotlar, PCDD/F’ler ve/veya dioksin benzeri PCB’lerin toplamı olarak, hedef bileşikleri 
tespit edebilir olmalıdır. Clean -up işlemi “hatalı -uygunsuz” sonuçlara sebep olan bileşikleri ya da hatalı -uygun 
sonuçlara sebep olan yanıtı düşürecek bileşikleri uzaklaştıracak şekilde olmalıdır.  
5.3.  Yüksek doğruluk ( gerçeklik ve kesinlik, biyoanaliz görünür geri kazanımı)  
5.3.1. GC -MS metotları ile tespit; numunedeki gerçek konsantrasyon için geçerli bir değerlend irme sağlamalıdır. 
Yüksek doğruluk (Ölçüm doğruluğu: Analite ilişkin gerçek veya atfedilen değer ile ölçülen sonucun birbirine 
yakınlığı), hesaplanan TEQ seviyesinin zayıf güvenilirliği sebebiyle analiz sonucunun reddinden kaçınmak için 
gereklidir. Doğrulu k, gerçeklik ve kesinlik olarak ifade edilir. Gerçeklik, sertifikalı materyal içindeki analit için 
ölçülen ortalama değer ve onun sertifikalanmış değeri arasındaki farktır ve bu farkın sertifikalanmış değere göre 
yüzdesi olarak ifade edilir. Kesinlik ise t ekrar üretilebilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan 
bağıl standart sapmadır (RSDR).  
5.3.2. Biyoanalitik metotlar için biyoanaliz görünür geri kazanımı belirlenir. Biyoanaliz görünür geri kazanımı, 
kör tayin için düzeltilmiş TCDD veya  PCB 126 kalibrasyon eğrisinden hesaplanan ve sonrasında doğrulama 
metoduyla belirlenmiş TEQ düzeyine bölünen BEQ düzeyidir. Ekstraksiyon ve temizleme aşamalarında 
PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri bileşiklerin kaybı, yanıtı arttıran veya azaltan (agonistik  ve antagonistik 
etkiler) ve birlikte ekstrakte edilen bileşikler, veya Toksik Ekivalans Faktörü (TEF) ve Bağıl Güç (REP) 
değerleri arasındaki farklar gibi faktörlerin düzeltilmesini hedefler. Biyoanaliz görünür geri kazanımı ilgi düzeyi 
çevresinde temsili  türdeş bileşenlerine sahip uygun referans numunelerinden hesaplanmaktadır.  
5.4.  Maksimum düzey aralığı ve genel kalite kontrol önlemlerinin validasyonu  
5.4.1.  Laboratuvarlar,  geçerli kılma işleminde ve/veya rutin analizlerde maksimum limitin 0.5, 1 ve 2 katı gibi 
maksimum limit aralığında tekrarlanan analizlerde kabul edilebilir bir varyasyon katsayısı sağlanacak şekilde, 
metodun performansını göstermelidir.  
5.4.2.  Kontrol numunelerinin düzenli kör kontrolleri ve eklenmiş denemeler veya analiz (tercihe n mevcut olması 
halinde sertifikalı referans materyali) iç kalite kontrol tedbirleri olarak yürütülür. Analizin gerekliliklere uygun 
olarak yürütülmesinin teyidi için kontrol numunelerinin kör kontrolleri, eklenmiş denemeleri veya analizleri 
kaydedilmeli v e kontrol edilmelidir.  
5.5.  Ölçüm Limiti (LOQ)  
5.5.1.  Biyoanalitik tarama metotları için, ölçüm limitinin belirlenmesi zorunlu bir gereklilik değildir ancak bu 
metodun eşik değeri ve kör değerini birbirinden ayırt edebildiğini kanıtlaması gerekmektedir. Bir BEQ düzeyi 
verildiği zaman, bu seviyenin altında yanıt veren numuneleri ele almak için bir raporlama limiti belirlenmelidir. 
Raporlama limitinin, çalışma aralığı altında kalmak kaydıyla, “prosedür kör numunelerinden” en az 3 kat fazla 
olabileceği göste rilmelidir. Bu sebeple, bu limit, bir deneme köründen ya da S/N oranından değil;  istenen 
minimum seviye civarındaki hedef bileşenleri içeren numunelerden hesaplanmalıdır.  
5.5.2.  Bir doğrulama metodu için; ölçüm limiti, maksimum limitin ortalama 1/5’i olm alıdır.  115 
 5.6.  Analiz kriterleri  
Doğrulama veya tarama metotlarından güvenilir sonuçlar elde etmek amacıyla; maksimum limit veya müdahale 
seviyesi aralığında, gerek toplam TEQ değeri olarak hesaplanan (PCDD/F ve dioksin benzeri PCB’lerin toplamı) 
ve gerekse  PCDD/F ve dioksin benzeri PCB’ler olarak ayrı ayrı hesaplanan TEQ değeri ve BEQ değeri için 
Tablo - 5’teki kriterler karşılanmalıdır.  
  Tablo yukarıda belirtildiği üzere no:5 e tekabül ediyorsa numaralandırılmalıdır.  
5.7.   Tarama metotları için özel gereklilikler  
5.7.1.  Tarama için GC -MS analiz metotları ve biyoanalitik metotlar kullanılabilir. GC -MS metotları için   6 ncı 
maddede verilen hükümler kullanılmalıdır. Hücre temelli biyoanalitik metotlar için özel hükümler 7  nci madde de 
açıklanmıştır.  
5.7.2.   Numunelerin rutin kontrolü için tarama metotları uygulayan laboratuvarlar doğrulama     metodu 
uygulayan laboratuvarlarla yakın işbirliği kurmalıdır.  
5.7.3.   Rutin analizler sırasında, tarama metodunun performans doğrulaması, analitik kalite kontro l ve devam 
eden metot geçerli kılma işlemleriyle yapılmalıdır. Uygun sonuçların kontrolü için, sürekli bir program 
olmalıdır.  
5.7.4.  Hücre yanıtının olası baskılanmasının ve sitotoksisitenin kontrolü:  
 Hücre yanıtının olası baskılanmasının ve sitotoksisite nin kontrolü: Rutin taramalarda, numune ekstraktında 
girişim yapan bileşikler tarafından yanıtın olası baskılanmasını kontrol etmek için numune ekstraktlarının % 
20’si;  maksimum limit veya müdahale seviyesine karşılık gelen miktarda 2,3,7,8 -TCDD eklenerek  ve 
eklenmeksizin ölçülmelidir. Standart eklenmiş numunenin ölçülen konsantrasyonu; standart eklenmemiş ekstrakt 
konsantrasyonu ve eklenen standardın konsantrasyonunun toplamı ile karşılaştırılır. Bu ölçülen konsantrasyon, 
hesaplanan (toplam) konsantrasyon dan % 25’ten daha fazla oranda düşükse; bu potansiyel sinyal baskılamasının 
göstergesidir ve ilgili numune, GC -HRMS doğrulama analizi için gönderilmelidir. Sonuçlar, kalite kontrol 
grafiklerinde izlenmelidir.  
5.7.5.  Uygun numunelerin kalite kontrolü:  
Uygu n numunelerin kalite kontrolü: Numune matriksi ve laboratuvar tecrübesine bağlı olarak, uygun 
numunelerin yaklaşık % 2 -10’u GC -HRMS tarafından doğrulanmalıdır  
5.7.6.  Kalite kontrol verilerinden yanlış uyumlu oranların belirlenmesi:  
Maksimum düzey veya müd ahale eşiğinin altında veya üstündeki numunelerin tarama sonuçlarında elde edilen 
yanlış uygun sonuçların oranları belirlenmelidir. Yanlış uygun sonuç ların oranı %  5’in altında olmalıdır. Uyumlu  Biyoanalitik veya 
fizikokimyasal metotlarla 
tarama  Doğrulama metotları  
Yanlış uyumlu oran( *) < % 5  
Geçerlilik   - % 20 ila + %  20 
Tekrar edilebilirlik  (RSD r) < % 20  
Laboratuvarda tekrar  üretilebilirlik ( RSD R) < % 25 < % 15 
(*)Maksimum düzeylere istinaden  
 116 
 numunelerin kalite kontrolünde matris/matris grubu başına en az 20 adet doğrulanmış sonucun mevcut olması 
halinde, yanlış uyumlu orana dayanan sonuçlar bu veritabanından çekilmelidir. Ring denemeleri veya bulaşmalar 
sırasında analiz edilen ve örneğin maksimum düzeyin (ML) 2 katına kadar konsantrasyon aralığını kapsa yan 
numunelere ait sonuçlar yanlış uyumlu sonuç oranının değerlendirilmesi için en az 20 sonuca ilave edilebilir. 
Numuneler çeşitli kaynakları temsil eden en sık türdeş bileşenlerini kapsamalıdır.  
Tarama analizleri tercihen müdahale eşiğini geçen numuneler in tespitini hedeflemelidir, ancak yanlış uyumlu 
sonuç oranlarının belirlenmesindeki kriter maksimum düzey olup doğrulama metodunun ölçüm belirsizliğini 
dikkate almalıdır.  
5.7.7.   Tarama metodundan elde edilen potansiyel uygunsuz sonuçlar, orijinal numunen in doğrulama metodu ile 
komple yeniden analizi ile doğrulanmalıdır. Bu numuneler, hatalı -uygunsuz sonuçların oranının 
değerlendirilmesi için de kullanılabilir. Tarama metotları için, hatalı uygunsuz sonuçların oranı, daha önce 
tarama esnasında uygunsuz old uğundan şüpheli olarak deklare edilen numunenin doğrulama analizi ile 
uygunluğu doğrulanmış sonuçlarına olan oranıdır. Bununla beraber, tarama metotlarının avantajlı olup 
olmadıklarının değerlendirilmesi, hatalı uygunsuz numunelerin, toplamda kontrol edile n numune sayısı ile 
kıyaslanmasına dayanır. Tarama metodunun avantajlı olarak değerlendirilebilmesi için bu oran yeterince düşük 
olmalıdır.  
5.7.8 .   En azından geçerli kılma koşulları altında; biyoanalitik metotlar, BEQ olarak hesaplanan ve ifade edilen 
TEQ limitinin geçerli bir göstergesini sağlamalıdır. Ayrıca tekrar edilebilirlik koşulları altında yürütülen 
biyoanalitik metotlar için, laboratuvar içi RSD r, tekrar üretilebilirlik RSD R’den genellikle daha küçük olmalıdır.  
6.  GC -MS metotlarının tarama veya  doğrulama amaçlarıyla taşıması gereken özel şartlar  
6.1.  WHO -TEQ seviyeleri üst -sınır ve alt -sınır arasındaki kabul edilebilir farklılıklar  
Maksimum limit aşımının doğrulanması veya müdahale seviyelerine ihtiyaç olduğu durumda üst -sınır ve alt -sınır 
değerleri arasındaki fark % 20’yi geçmemelidir.  
6.2.  Geri kazanımların kontrolü  
6.2.1.   2,3,7,8 pozisyonlarında klor içeren 13C -işaretlenmiş PCDD/F iç standartları ve 13C -işaretlenmiş dioksin 
benzeri PCB iç standartları analitik metodun en başında (örnek olarak metodun geçerli kılınması için 
ekstraksiyon öncesi) eklenmelidir. 4’den 8’e kadar klor ihtiva eden her bir PCDD/F’ler homolog grubu ve her bir 
dioksin benzeri PCB h omolog grubu için en az bir işaretli bileşik eklenmelidir (alternatif olarak, kütle 
spektrometresinde PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin taranmasında kullanılan seçici iyon kaydedici 
fonksiyonların her biri için en az bir işaretli bileşik). Doğrulama metotları söz konusu olduğunda, 17 adet 2,3,7,8 
pozisyonlarında klor içeren 13C -işaretlenmiş PCDD/F iç standartlarının tümü ve 12 tane 13C -işaretlenmiş 
dioksin benzeri PCB iç standartlarının tümü kullanılmalıdır.  
6.2.2.  13C-işaretlenmiş analoğu eklenmem iş her bir türdeş için de uygun kalibrasyon çözeltileri kullanılarak 
bağıl tepki faktörü (RRF) belirlenmelidir.  
6.2.3.   Bitkisel veya hayvansal menşeli olup %  10’dan daha düşük oranda yağ içeren yemler için, iç 
standartların ilavesi ekstraksiyon öncesinde  zorunlu olmalıdır. Hayvansal menşeli olup %  10’dan fazla yağ 
içeren yemler için, iç standartlar yağ ekstraksiyonundan önce veya sonra ilave edilmelidir. İç standartların 
uygulandığı aşama ve sonuçların ürün veya yağ bazlı bildirimine bağlı olarak ekstraks iyon etkinliğinin 
validasyonu uygun şekilde yapılmalıdır.  
6.2.4.   GC-MS analizi öncesinde, 1 veya 2 geri kazanım standardı/standartları (kimyasal yapısı ekstrakte edilen 
bileşenlere benzeyen) eklenmelidir.  
6.2.5.  Geri kazanım kontrolü gereklidir. Doğrulam a metotları için, her bir iç standardın geri kazanımı % 60 -120 
aralığında olmalıdır. Herhangi bir bileşiğin, özellikle bazı 7 ve 8 klorlu dibenzo -p-dioksinler ve 
dibenzofuranların, toplam TEQ değerine katkısı, toplam TEQ değerinin (PCDD/F ve dioksin benzer i PCB’lerin 117 
 toplamı) % 10’unu geçmemesi durumunda,  daha düşük veya daha yüksek geri kazanımlar kabul edilebilir. GC -
MS tarama metotları için, geri kazanım % 30 -140 aralığında olmalıdır.    
6.3.   Girişim (interferans) yapan maddelerin uzaklaştırılması  
 
- Dioksin benzeri olmayan PCB’ler ve klorlanmış difenil eterler gibi girişim yapan klorlanmış 
bileşiklerden PCDD/F’lerin ayrımı uygun kromatografik tekniklerle, tercihen florisil, alümina ve/veya 
karbon kolonu ile gerçekleştirilmelidir.  
- İzomerlerin gaz kromato grafisi ile ayrımı yeterli olmalıdır (1,2,3,4,7,8 -HxCDF ve 1,2,3,6,7,8 -HxCDF 
arasındaki pikten pike ayrım %  25’ten küçük olmalıdır).  
 
6.4.  Standart eğriyle kalibrasyon  
Kalibrasyon eğrisinin aralığı, maksimum limit veya müdahale seviyesini kapsamalıdır.  
6.5.  Doğrulama metotları için spesifik kriterler  
- GC-HRMS için:  
HRMS’de, çözünürlük % 10’luk vadideki parçalanmamış (bütün) kütle aralığı için tipik olarak 10000 den büyük 
veya eşit olmalıdır  
Uluslararası kabul görmüş standartlarda tanımlanan ileri tanım lama ve doğrulama kriterlerinin yerine getirilmesi, 
örneğin EN 16215:2012 standardı (Hayvansal yemlerde dioksinler ve dioksin benzeri PCB ler ve indikatör PCB 
lerin GC -HRMS ile tespit edilmesi) ve/veya  EPA metotları 1613 ve revize edilmiş 1668 de tanımlan dığı şekilde 
yapılır.  
- GC-MS/MS için  
Analiz kapsamındaki bütün işaretlenmiş ve işaretlenmemiş analitler en az 2 spesifik öncü(precursor) iyon ve 
öncü iyonların her birisi de kendine karşılık gelen bir adet spesifik geçiş ürün iyonu (transition product ion s) ile 
izlenmelidir.  
Tipik MS/MS şartlarına uygulanan, özellikle analitin her geçişi için çarpışma (collision) enerjisi ve çarpışma gaz 
basıncı, hesaplanmış veya ölçülmüş değerlere kıyasla (kalibrasyon standartlarından elde edilen ortalama değer) 
seçilmiş geçiş ürün iyonları i çin relatif iyon yoğunluklarının maksimum müsaade edilen toleransı ±15 % dir.  
İlgilenilen analitleri etkileyebilecek muhtemel girişimleri minimize etmek üzere her kuadropol için çözünürlük 
birim kütle çözünürlüğe eşit veya daha iyi olacak şekilde ayarlanmalıdır (birim kütle çözünürlük: iki pikin bir 
kütle birimi ayrı olacak şekilde ayırabilmek için yeterli çözünürlük).  
Uluslararası kabul görmüş standartlarda tanımlanan ileri düzeydeki kriterlerin yerine getirilmesi, örneğin 
standart EN 16215:2012 (hayvansal yemlerde dioksinler ve dioksin benzeri PCB ler ve indikatör PCB lerin GC -
HRMS ile tespit edilmesi) ve EPA metotları 1613 ve revize edilmiş 1668 de tanımlandığı üzere (GC -HRMS in 
kullanılmasının zorunlu tutulması haricinde) yapılır.  
7.   Biyoanalitik metotlar için özel gereklilikler  
Biyoanalitik metotlar, hücre temelli, reseptör ya da immuno analizler gibi biyolojik prensiplere dayalı 
metotlardır. Bu kısım, genel olarak biyoanalitik metotlar için gereklilikleri vermektedir.  
Bir taram a metodu prensip olarak numuneyi uygun ya da “uygunsuz olmasından şüphe edilen/şüpheli” olarak 
sınıflandırır. Bunun için, hesaplanan BEQ düzeyi eşik değeri ile karşılaştırılır (Bkz: Madde 7.3). Eşik değerinin 
altındaki numuneler uygun olarak beyan edilir, eşik değerine eşit veya bu değerin üzerindeki numuneler şüpheli 
olarak beyan edilir ve bir doğrulama metodu ile analiz edilmesi gerekir. Pratikte, maksimum limitin 2/3’üne 
karşılık gelen bir BEQ değeri, hatalı -uygunsuz sonuçlar için kabul edilebilir bir or an olup hatalı -uygun sonuçlar 
için % 5’in altında bir oran sağlayan en uygun eşik değerini verebilir. PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’ler 
toplamı ve PCDD/F’ler için ayrı maksimum limitler olduğu durumda, fraksiyonlarına ayrılmamış numunelerin 118 
 uygunluk ko ntrolü, PCDD/F’ler için uygun biyoanaliz eşik değerlerinin tespit edilmesini gerektirir. Müdahale 
seviyesini aşan numunelerin kontrolü için, müdahale seviyenin uygun bir yüzdesi, eşik değeri olarak kullanılır.  
Ayrıca, belirli biyoanalitik metotlar olması h alinde; raporlama limitini aşan ve çalışma aralığındaki numuneler 
için BEQ olarak ifade edilen bir gösterge seviyesi verilebilir. (bkz. 7.1.1 ve 7.1.6).  
7.1.  Test yanıtının değerlendirilmesi  
7.1.1.  Genel gereklilikler  
- Bir TCDD kalibrasyon eğrisinden kons antrasyonlar hesaplanacağı zaman, eğrinin en alt ve en üst 
uçlarındaki değerler, yüksek bir varyasyon katsayısı (CV) gösterecektir. Çalışma aralığı, bu CV’nin %  
15’ten düşük olduğu alandır. Çalışma aralığının en alt ucu (raporlama limiti), prosedür körleri nin en az 
üç kat üzerinde belirlenmiş olmalıdır. Çalışma aralığının en üst ucu, genellikle EC 70 değeri (maksimum 
etkin konsantrasyonun % 70’i) ile gösterilir, ancak CV bu aralıkta % 15’ten daha yüksek ise, çalışma 
aralığının en üst ucu daha düşük olur. Çal ışma aralığı, geçerli kılma esnasında belirlenmelidir. Eşik 
değerleri [Madde 7.3], çalışma aralığı içinde olmalıdır.  
- Standart çözeltiler ve numune ekstraktları, en az iki tekrar olarak analiz edilmelidir. Tekrarlar 
kullanılacağı zaman, bölünmüş tabaka üzer inde 4 -6 gözde test edilen bir standart çözelti ya da kontrol 
ekstraktı, %  15’ten daha düşük CV’ye sahip bir yanıt ya da konsantrasyon (sadece çalışma aralığında) 
üretmelidir.  
 
7.1.2.       Kalibrasyon   
7.1.2.1.    Standart eğriyle kalibrasyon  
- Ekstrakttaki ve akabinde numunedeki BEQ düzeyini hesaplamak için; analiz yanıtı TCDD kalibrasyon 
eğrisiyle (ya da PCB 126 ya da bir PCDD/F/dioksin benzeri PCB standart karışımı)  karşılaştırılarak 
numunedeki seviyeler belirlenebilir.  
- Kalibrasyon eğrileri, çalışma aralığının en alt ucunda yeterli konsantrasyonlar içermek kaydıyla, 8 -12 
konsantrasyon (en az iki tekrar) içermelidir. Çalışma aralığında, kalibrasyon eğrisine uygunluk 
kalitesine özellikle dikkat gösterilmelidir. R2 değeri, doğrusal olmayan regresyon için de uygunluk 
derecesinin tahmininde ya çok az fikir verir ya da hiç vermez. Daha iyi bir uygunluğa, eğrinin çalışma 
aralığında gözlenen ve hesaplanan düzeyler arasındaki farkı minimize ederek ulaşılabilir (örneğin 
farkların karelerinin toplamını minimize ed erek).  
- Numune ekstraktında belirlenen seviye, bir matriks/çözelti kör numunesi için (kullanılan çözeltiler ve 
kimyasallardan gelen safsızlıkları hesaba katmak için) hesaplanan BEQ düzeyine ve geri kazanıma 
(maksimum limit veya müdahale seviyesi civarında b enzer türdeş bileşen dağılımına sahip uygun 
referans numunelerin BEQ düzeyinden hesaplanan) göre düzeltilir. Bir geri kazanım düzeltmesi 
yapmak için, geri kazanım her zaman istenen aralık içinde olmalıdır [Bkz: Madde 7.1.4]. Geri kazanım 
düzeltmesi için ku llanılan referans numuneler, Madde 7.2’de verilen gerekliliklere uymak zorundadır.  
7.1.2.2.  Referans numunelerle kalibrasyon  
Alternatif olarak, kör ve geri kazanım düzeltmesi gerekliliğini elimine ederek; ilgilenilen seviye civarında en az 
4 referans numu neden [Bkz: Madde 7.2.4: bir matriks kör + maksimum limit veya müdahale seviyesinin 0.5, 1 
ve 2 katı seviyesinde 3 referans numune] hazırlanan bir kalibrasyon eğrisi kullanılabilir. Bu durumda, 
maksimum limitin 2/3’üne karşılık gelen [Bkz: Madde 7.3] anali z yanıtı, direkt olarak bu numunelerden 
hesaplanabilir ve eşik değeri olarak kullanılabilir. Müdahale seviyesini aşan numunelerin kontrolü için, bu 
müdahale seviyelerinin uygun bir yüzdesi eşik değeri olarak kullanılır.  
7.1.3.   PCDD/PCDF’ler ve dioksin ben zeri PCB’lerin ayrı belirlenmesi  
Ekstraktlar, PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin TEQ değerlerinin (BEQ olarak) ayrı ayrı gösterilmesine 
olanak tanıyan, PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’leri içeren fraksiyonlara ayrılabilir. Dioksin benzeri 
PCB’leri i çeren fraksiyona ilişkin sonuçlar ı değerlendirmek için tercihen PCB 126 standart kalibrasyon eğrisi 
kullanılmalıdır.  
 119 
  
7.1.4.   Biyoanaliz görünür geri kazanımları  
Biyoanaliz görünür geri kazanımı, maksimum limit veya müdahale seviyesi civarında benzer türd eş bileşen 
dağılımına sahip uygun referans numunelerden hesaplanmalı ve TEQ düzeyi ile karşılaştırılan BEQ düzeyinin 
yüzdesi olarak açıklanmalıdır. Deney tipine ve kullanılan TEF’lere (16)bağlı olarak; dioksin benzeri PCB’ler için 
TEF ve REP faktörleri aras ındaki farklılıklar, PCDD/F’lere kıyasla dioksin benzeri PCB’ler için daha düşük geri 
kazanımlara sebep olabilir. Bu yüzden, PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin ayrı ayrı belirlemesi yapılacak 
ise; biyoanaliz görünür geri kazanımı, dioksin benzeri PCB’ ler için %  20-60, PCDD/F’ler için % 50 -130 
(Oranlar, TCDD kalibrasyon eğrisi içindir) olmalıdır. Farklı matriksler ve numunelerde, PCDD/F’lerin ve 
dioksin benzeri PCB’lerin toplamına dioksin benzeri PCB’lerin katkısı değişebileceğinden, toplam parametre 
için biyoanaliz görünür geri kazanımı, bu oranları yansıtacak şekilde % 30 -130 arasında olmalıdır. 
PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin için TEF değerlerinin uygulanmasında bu aralıkların gözden 
geçirilmesi gereklidir.  
7.1.5.   Clean -up aşamasında geri kazanımların kontrolü  
Geçerli kılma işleminde, clean -up aşamasında bileşenlerin kaybı kontrol edilmelidir. Farklı türdeş bileşenler 
içeren karışım eklenmiş bir kör numunede clean -up yapılmalı (en az n=3); geri kazanım ve değişkenlik bir 
doğrulama metodu il e kontrol edilmelidir. Geri kazanım, çeşitli karışımlarda, özellikle TEQ düzeyine %  10’dan 
daha fazla katkı sağlayan türdeş bileşenler için, % 60 -120 arasında olmalıdır.  
7.1.6.   Raporlama limiti  
BEQ değerleri raporlanırken, eğrinin alt aralığındaki düşük kesinlik sebebiyle, standartların kalibrasyon 
eğrisinden değil; tipik türdeş bileşen dağılımı içeren ilgili matriks numunelerinden bir raporlama limiti 
belirlenmelidir. Ekstraksiyon ve clean -up işleminin etkileri hesaba katılmalıdır. Raporlama limiti, pros edür 
körlerinin en az üç kat üzerinde belirlenmiş olmalıdır.  
7.2.   Referans numunelerinin kullanımı  
 
7.2.1.  Referans numuneler, numune matriksi,  türdeş bileşen dağılımı ve maksimum limit veya müdahale 
seviyesi civarında PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB ’ler için konsantrasyon aralıklarını temsil etmelidir.  
7.2.2 .  Her analiz serisinde, bir prosedür körü, ya da tercihen bir matriks körü ve maksimum limit veya müdahale 
seviyesinde bir referans numune dahil edilmelidir. Bu numuneler, aynı koşullar altında a ynı zamanda ekstrakte 
edilmeli ve analiz edilmelidir. Referans numune, kör numune ile karşılaştırıldığında belirgin yüksek bir yanıt 
göstermeli ve böylece analizin uygunluğunu temin etmelidir. Bu numuneler, kör ve geri kazanım düzeltmeleri 
için kullanılabi lir. 
7.2.3.   Bir geri kazanım düzeltmesi yapmak için seçilen referans numuneler, analiz numunesini temsil etmelidir, 
yani türdeş bileşen dağılımı, seviyenin eksik bulunmasına sebep olmamalıdır.  
7.2.4.   Maksimum limit veya müdahale seviyesinin kontrolünde; ilgi aralığında analizin performansının 
uygunluğunu göstermek için, maksimum limit veya müdahale seviyesinin 0.5 ve 2 katı konsantrasyonuna sahip 
olan ekstra referans numuneler dâhil edilebilir. Bu numuneler, analiz numunelerinde BEQ düzeylerinin 
hesaplanm ası için kullanılabilir [Madde 7.1.2.2].  
7.3.  Eşik değerlerinin belirlenmesi  
BEQ olarak ifade edilen biyoanalitik sonuçlar ve TEQ olarak ifade edilen doğrulama metotları sonuçları arasında 
ilişki kurulmalıdır (örneğin her seviyede 6 tekrar yapılarak maksi mum limitin 0,  0.5, 1 ve 2 katlarında (n=24) 
                                                           
(16) Mevcut gereklilikler M. Van den Berg et al, Toxicol Sci 93 (2), 223 -241 (2006) künye bilgisine sahip kaynakta yayımlanan TEF’lere 
dayanmaktadır  120 
 standart eklenmiş referans numuneleri içeren matriks etkili kalibrasyon denemeleri). Düzeltme faktörleri (kör ve 
geri kazanım) bu ilişkiden tahmin edilebilir ancak her analiz serisine prosedür/matriks körleri v e geri kazanım 
numuneleri dahil edilerek kontrol edilmelidir(7.2.2).  
Eşik değerleri, müdahale seviyesinin kontrolü ya da numunenin maksimum limitlerle (eğer istenirse, ya 
PCDD/F’ler ve dioksin benzeri PCB’ler için ayrı ayrı ya da dioksin benzeri PCB’ler ve  PCDD/F’ler toplamı için 
karşılık gelen maksimum limit veya müdahale seviyesiyle) uyumuna karar vermek için belirlenmelidir.  %  5’in 
altında bir hatalı -uygun oranı gösteren ve % 25’in altında RSD R’de, %  95 güven aralığına dayalı bir doğrulama 
metodu karar limitine karşılık gelen biyoanalitik sonuçların (kör ve geri kazanım için düzeltilmiş) dağılımının en 
alt uç noktası eşik değerler olarak ifade edilir. Doğrulama metodu karar limiti, ölçüm belirsizliğinin hesaba 
katıldığı maksimum limittir.  
BEQ cinsinden k esim değeri 7.3.1, 7.3.2 ve 7.3.3’teki yaklaşımlarla uyumlu olarak hesaplanmalıdır (bkz. Şekil 
1). 
7.3.1 .  Doğrulama metodu karar limitinde % 95 tahmin aralığının en düşük bandının kullanımı:  
Eşik değeri:   
Burada:  
BEQ DL: Ölçüm belirsizliğinin hesaba katıldığı maksimum limit olan doğrulama metodu karar limitine karşılık 
gelen BEQ,        
sy,x: Fark standart sapması  
tα,f = m-2: “t” testi faktörü (α  = % 5, f = serbestlik derecesi, tek yönlü),  
m: Kalibrasyon noktalarının toplam sayısı (j indeksi),  
n: Her seviyedeki tekrarların sayısı,  
xi: Doğrulama metodu ile belirlenen kalibrasyon noktası i’ye karşılık gelen numune konsantrasyonu (TEQ olarak 
ifade edilen),  
x: Tüm kalibrasyon numunelerinin konsantrasyonlarının ortalaması ( TEQ olarak ifade edilen),  
 : Kareler toplamı parametresi,  
i=Kalibrasyon noktası i için indekstir.  
7.3.2.   Ortalama BEQ değerine karşılık gelen veri dağılımının en alt uç noktası olarak; doğrulama metodu karar 
limiti düzeyinde bulaşan numunelerin çoklu an alizlerinin (n ≥ 6) biyoanalitik sonuçlarından (kör ve geri kazanım 
için düzeltilmiş) hesaplama:  
Eşik değeri= BEQ DL-1,64 x SD R 
       Burada:  
       SD R: Laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik koşulları altında ölçülen BEQ DL’de biyoanaliz sonuçlarının 
standart sapmasıdır.  
7.3.3. Ortalama BEQ değerinin, maksimum limit veya müdahale seviyesinin 2/3’ü düzeyinde bulaşı seviyesine 
sahip numunelerin çoklu analizlerinin (n ≥ 6) biyoanalitik sonuçlarından (kör ve geri kazanım için düzeltilmiş) 
xx2
i  2-mfα, xy, DL /Q)x (x 1/m 1/n t*s BEQ  

m
ji xx x x Q
12) (121 
 hesaplanması. Bu hesa plama, bu seviyenin Madde 7.3.1 ve Madde 7.3.2’de hesaplanan eşik değeri civarında 
olacağı gözlemine dayanmaktadır.  
  
Şekil 1 % 5’in altında bir yanlış -uyumlu oranı gösteren ve % 25’in altında RSD R’de,% 95 güven aralığına sahip 
eşik değerleri:  
1.  Doğrulama metodu karar limitinde % 95 tahmin aralığının en düşük bandından,  
2.  Ortalama BEQ değerine karşılık gelen veri dağılımının (şekilde çan eğrisi ile temsil edilen) en alt uç noktası 
olarak, doğrulama metodu karar limiti düzeyinde bulaşıya sahip nu munelerin çoklu analizlerinden (n ≥ 6) 
hesaplanır.  
7.3.4.  Eşik değerlerine kısıtlamalar  
Farklı matriks/türdeş bileşen dağılımına sahip az sayıda numune kullanılarak yapılan geçerli kılmadaki 
RSD R’den hesaplanan BEQ’e dayalı eşik değerleri, rutinde muhteme l türdeş bileşen dağılımının bilinmeyen 
spektrumunun analizinden elde edilenden daha iyi bir kesinliğe sahip olduğundan dolayı TEQ’e dayalı 
maksimum limit veya müdahale seviyesinden daha yüksek olabilir. Bu durumlarda, eşik değerleri RSD R = % 
25’ten hesapl anmalı ya da maksimum limit veya müdahale seviyesinin 2/3’ü tercih edilmelidir.  
7.4.  Performans özellikleri  
7.4.1. Biyoanalitik metotlarda iç standart kullanılmadığından; analiz serileri arasında ve analiz serileri içinde 
standart sapma hakkında bilgi edi nmek amacıyla, tekrar edilebilirlik analizleri yapılmalıdır. Tekrar edilebilirlik  
122 
 % 20’nin ve laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik  % 25’in altında olmalıdır. Bu, kör ve geri kazanım 
düzeltmesinden sonra hesaplanan BEQ olarak ifade edilen seviyelere day andırılmalıdır.  
7.4.2. Geçerli kılma işleminin bir parçası olarak, analize karşılık gelen eşik değerinin üstündeki numunelerin 
tanımlanmasına olanak sağlamak üzere;  eşik değerindeki bir seviye ile bir kör numuneyi ayırt edebileceği 
gösterilmelidir. [Madde  7.1.2].  
7.4.3. Hedef bileşikler, olası girişim yapan bileşikler ve maksimum tolere edilebilir kör seviyeler 
tanımlanmalıdır.  
7.4.4.  Numune ekstraktının üçlü tekerrür analizinde elde edilen yanıtların (sadece çalışma aralığında) veya 
yanıtlardan hesaplana n konsantrasyonların standart sapma yüzdesi  % 15’in üzerinde olmamalıdır.  
7.4.5.  BEQ (kör ve maksimum limit veya müdahale seviyesi) olarak ifade edilen referans numune(lerin)nin 
düzeltilmemiş sonuçları, belirli bir zaman aralığında biyoanalitik metodun p erformansının değerlendirilmesi için 
kullanılmalıdır.  
7.4.6. Her tip referans numune ve prosedür körleri için kalite kontrol (QC) grafikleri, analitik performansın 
gerekliliklerini karşıladığından emin olmak için (özellikle prosedür körleri için çalışma ar alığının en düşük 
seviyesi ile istenilen minimum fark açısından ve referans numuneler için laboratuvar içi tekrar üretilebilirlik 
açısından) kayıt ve kontrol edilmelidir. Hesaplamada çıkarıldığında, hatalı -uygun sonuçları önlemek için 
prosedür körleri çok iyi kontrol edilmelidir.  
7.4.7. Uygun numunelerin % 2 -10’undan elde edilen sonuçlar (her matriks için en az 20 numune) ve şüpheli 
numunelerin doğrulama metotlarından elde edilen sonuçlar toplanmalı; tarama metotlarının performansını ve 
BEQ ile TEQ arasındaki ilişkiyi hesaplamak için kullanılmalıdır. Bu veri tabanı, geçerli kılınmış matrikslerde 
rutin numunelere uygulanabilir eşik değerlerinin yeniden hesaplanması için kullanılabilir.  
7.4.8.  Başarılı metot performansı, ring deneylerine katılımla gös terilmiş de olabilir. Eğer bir laboratuvar ring 
deneylerinde başarı performansını gösterebilirse; maksimum limitin iki katına kadar ulaştığı bir konsantrasyonu 
kapsayan numunelerden elde edilen analiz sonuçları, yanlış -uyumlu oranının değerlendirilmesine d e dahil 
edilebilir. Numuneler, değişik kaynakları temsil eden en sık türdeş bileşen dağılımını kapsamalıdır.  
7.4.9.  Olaylar sırasında eşik değerleri söz konusu olayın spesifik matriks ve türdeş bileşenlerini yansıtacak 
şekilde yeniden değerlendirilebilir  
8.   Sonuçların raporlanması  
8.1.  Doğrulama metotları  
8.1.1.  Kullanılan analitik prosedür elverdiği ölçüde, sonuçların raporlanmasında maksimum bilgiyi içermesi ve 
dolayısıyla özel hükümlere göre sonuçların yorumlanabilmesine imkan sağlamak için analitik  sonuçlar her bir 
PCDD/F, dioksin benzeri PCB türdeş bileşenlerinin seviyelerini içermeli; alt -sınır, üst -sınır ve orta -sınır olarak 
rapor edilmelidir.  
8.1.2.  Raporda PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri PCB’lerin ekstraksiyonu için kullanılan metot yer almal ıdır. 
8.1.3.  Her bir iç standardın geri kazanımı; geri kazanımlar Madde 6.2.5’de bahsedilen aralık dışında olduğunda, 
maksimum limit aşıldığında (bu durumda, iki analizin biri için geri kazanımlar) ve başka durumlarda talep 
edilmesi halinde belirtilmelidi r. 
8.1.4.  Numunenin uygunluğu hakkında karar verileceği zaman ölçüm belirsizliği dikkate alınacağı için, bu 
parametre de belirtilmelidir. Dolayısıyla, analitik sonuçlar x+/ -U şeklinde raporlanmalıdır. Burada (x) analitik 
sonuç ve (U) ise kapsama faktörü o larak yaklaşık %  95’lik güven aralığını veren “2” katsayısının kullanıldığı 
genişletilmiş ölçüm belirsizliğini ifade eder. PCDD/F’lerin ve dioksin benzeri PCB’lerin ayrı ayrı tespit edilmesi 123 
 durumunda; PCDD/F’lerin ve dioksin benzeri PCB’lerin ayrı ayrı an alitik sonu çlarından hesaplanan 
genişletilmiş ölçüm belirsizliği toplamı PCDD/F’lerin ve dioksin benzeri PCB’lerin toplamı için kullanılmalıdır.  
8.1.5.   Ölçüm belirsizliği CCα karar limiti uygulanarak [Kısım B’nin Bölüm I’inin 2.2’sinde tanımlandığı üzere ] 
hesaplanırsa, bu parametre raporlanmalıdır.  
8.1.6.   Sonuçlar, Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliği’nde belirtilen maksimum limitlerin birimi ile aynı 
birimlerde ve aynı ondalık basamağında ifade edilmelidir  
8.2.  Biyoanalitik tarama metotları  
8.2.1.  Tarama sonuçları uygun ya da uygunsuz olmasından şüphe edilen (şüpheli) olarak açıklanmalıdır.  
8.2.2.  İlave olarak PCDD/PCDF’ler ve/veya dioksin benzeri PCB’ler için BEQ cinsinden ifade edilen (ve TEQ 
cinsinden ifade edilmeyen) bir sonuç verilebilir  
8.2.3 .  Raporlama limitinin altında bir yanıt veren numuneler, raporlama limitinden daha düşük olarak 
açıklanmalıdır .  
8.2.4.  Her bir numune matriksi için; rapor, değerlendirmenin esas tutulduğu maksimum limit veya müdahale 
seviyesini belirtmelidir  
8.2.5.  Rapor uygulanan analiz tipi, temel analiz prensibi ve kalibrasyon çeşidinden bahsetmelidir .  
8.2.6. Raporda PCDD/PCDF’ler ve dioksin benzeri PCB’ler için kullanılan ekstraksiyon metodu belirtilmelidir .  
8.2.7.  Uygunsuz olduğundan şüphelenilen numuneler için , yapılması gereken işlem her ne ise raporda yer 
almalıdır. Yüksek seviyelere sahip numunelerdeki PCDD/F ler ve PCDD/F ler ile dioksin benzeri PCB lerin 
konsantrasyonları doğrulama metodu ile tespit edilmeli ve doğrulanmalıdır.  
BÖLÜM III  
Dioksin Benzeri Ol mayan PCB’lerin (PCB 28, 52, 101, 138, 153, 180) Seviyesinin Kontrolünde Kullanılan 
Analiz Metotları İçin Gereklilikler ve Numune Hazırlama Usul ve Esasları  
1. Uygulama alanı  
Bu Bölümde belirtilen gereklilikler, yemin dioksin benzeri olmayan PCB’lerin res mi kontrolü ve diğer yasal 
amaçlarla analiz edildiği durumlarda geçerli olacaktır.  
2.  Uygulanabilir tespit metotları  
Gaz kromatografi/Elektron Yakalayıcı Dedektör (GC -ECD), GC -LRMS, GC -MS/MS, GC -HRMS veya denk 
metotlar.  
3.  Aranan analitlerin teşhis ve do ğrulaması  
3.1.  İç standartlar veya referans standartlara göre olarak bağıl alıkonulma zamanı (+/ - % 0,25 kabul edilebilir 
sapmayla).  
3.2. Numunelerin seviyeleri yasal limitler aralığında olduğunda veya uygunsuz olup olmadığı doğrulanacaksa, 
toplam altı ad et indikatör PCB’lerin tamamı (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 ve PCB 180) 
girişim yapan bileşiklerden özellikle de birbirlerinden ayrılmadan gelen PCB’lerden gaz kromatografik ayrımı        
(Birbirlerinden ayrılmadan gelen türdeş bileşenler, gen ellikle, PCB 28/31, PCB 52/69 ve PCB 138/163/164 
olarak bulunur. GC -MS için yüksek klorlu türdeş bileşenlerin fragmentlerinden gelebilecek muhtemel girişimler 
de göz önünde bulundurulmalıdır.).  
3.3.   GC-MS teknikleri için  
En az aşağıdakilerin izlenmesi:  124 
 a) HRMS için iki spesifik iyon;  
b) LRMS için m/z >200’iki spesifik iyon veya m/z >100 üç spesifik iyon  
c) MS-MS için 1 öncü ve 2 ürün iyonu.  
Seçilmiş kütle parçalarının mevcudiyet oranları için izin verilen maksimum toleranslar:  
Seçilmiş kütle fragmentlerinin mevcu diyet oranının teorik mevcudiyetten bağıl sapması veya hedef iyon (izlenen 
iyonlardan en çok bulunan) ve niteleyici iyon(lar) için kalibrasyon standardı:  
Hedef iyonla karşılaştırılan niteleyici 
iyonun/iyonların bağıl yoğunluğu  GC-EI-MS 
(bağıl sapma)  GC-CI-MS, GC -MSn 
(bağıl sapma)  
> % 50 ± % 10  ± % 20  
> % 20 ila %  50 ± % 15  ± % 25  
> % 10 ila %  20 ± % 20  ± % 30  
≤ % 10 ± % 50( *) ± % 50( *) 
(*)Bağıl yoğunluğu % 10’dan yüksek olan kütle fragmentlerinin yeterli sayısı. Bu nedenle hedef iyon ile karşılaştırılan % 10’dan daha 
düşük bağıl yoğunluğa sahip niteleyici iyonların kullanılması önerilmemektedir.  
 
3.4.   GC-ECD tekniklerine ilişkin gereklilikler  
Tolerans düzeyini aşan sonuçlar farklı polariteye sahip iki sabit fazlı GC kolonu  kullanılarak  doğrulanmalıdır.  
4.  Metot performansının gösterilmesi  
Metodun yürütülmesi maksimum limit aralığında (maksimum düzeyin 0,5 ila 2 katı) tekrarlanan analiz için kabul 
edilebilir bir varyasyon katsayısıyla geçerli kılınmalıdır (orta seviyede kesinlik için ge reklilikler için 9’a 
bakınız).  
5.  Ölçüm Limiti  
Kör değerler maksimum limite karşılık gelen bulaşan seviyesinin %  30’undan daha yüksek olmamalıdır (17). 
6.  Kalite kontrol  
Düzenli kör kontroller, standart eklenmiş numunelerin analizi, kalite kontrol numune leri, ilgili matrislere ilişkin 
laboratuvarlar arası çalışmalara katılım.  
7.   Geri kazanımların kontrolü  
7.1. Aranılan analitlerle karşılaştırılabilen fizikokimyasal özelliklerle birlikte uygun iç standartlar 
kullanılmalıdır.  
7.2.  İç standartların eklenm esi: 
Ürünlere ekleme (ekstraksiyon ve clean -up işleminden önce).  
7.3.  Altı adet izotop etiketli indikatör PCB türdeş bileşenleri kullanan metotlara ilişkin gereklilikler:  
a) İç standartların geri kazanımlarına göre sonuçlar düzeltilmelidir.  
                                                           
(17). Numunedeki bir bulaşanın seviyesine kimyasal kör seviyesinin katılımının olabildiğince düşük olması önerilir. Özellikle de kör 
seviyelerinin çıkarıldığı durumlarda, kör seviyelerindeki varyasyonun kontr olü, laboratuvarın sorumluluğundadır.  125 
 b) izotop etiketli iç standartların geri kazanımları %  50 ila %  120 arasında olmalıdır.  
c) Altı adet indikatör PCB’lerin toplamına % 10’dan az katkı sağlayan her bir türdeş bileşen için daha düşük 
veya daha  yüksek geri kazanımlar kabul edilebilir.  
7.4.  Altı adet i zotop -işaretlenmiş iç standartların hepsini kullanmayan veya başka iç standartlar kullanan 
metotlar için gereklilikler:  
a) İç standart(lar)ın geri kazanımı her numune için kontrol edilmelidir,  
b) İç standart(lar)ın geri kazanımı %  60 ila %  120 arasında olm alıdır,  
c) İç standartların geri kazanımları için sonuçlar düzeltilmelidir.  
7.5.  İşaretlenmemiş türdeş bileşenlerin geri kazanımları, maksimum limit aralığındaki konsantrasyonlara sahip 
kalite kontrol numuneleri ya da standart eklenmiş numunelerle kontrol  edilmelidir. Bu türdeş bileşenler için 
kabul edilebilir geri kazanımlar %  70-120 arasındadır.  
8.  Laboratuvarlara ilişkin gereklilikler  
 Laboratuvarlar, Gıda ve Yemin Resmi Kontrollerine Dair Yönetmeliğinde laboratuvarlar için belirtilen 
hükümlere uymak zorundadır .  
9.  Performans karakteristikleri: İlgilenilen seviyedeki altı adet indikatör PCB’ler toplamı için kriter  
10.   Sonuçların raporlanması  
10.1.   Kullanılan analitik prosedür elverdiği ölçüde, sonuçların raporlanmasında maksimum bilgiyi içermesi ve 
dolayısıyla özel hükümlere göre sonuçların yorumlanabilmesine imkan sağlamak için analitik sonuçlar her bir 
PCB türdeş bileşenlerinin seviyelerini içermeli; alt -sınır, üst -sınır ve orta -sınır olarak rapor edilmelidir.  
10.2.   Rapor, PCB’lerin ve yağları n ekstraksiyonu için kullanılan metodu da içermelidir.  
10.3.  Geri kazanımların 7’de bahsedilen aralık dışında olması durumunda, maksimum limitin aşılması 
durumunda ve isteğe bağlı diğer bütün durumlarda her bir iç standardın geri kazanımı belirtilmelidir.  
10.4.  Numunenin uygunluğuna karar verirken ölçüm belirsizliği dikkate alındığı için, bu parametre de 
belirtilmelidir. Bu nedenle,  analitik sonuçlar x+/ -U olarak raporlanır.  Burada x analitik sonucu, U ise kapsama 
faktörü olarak yaklaşık  %  95’lik bir g üven aralığını veren “2” katsayısının kullanıldığı, genişletilmiş ölçüm 
belirsizliğini ifade eder.  
10.5. Eğer ölçüm belirsizliği karar limiti (CCα) uygulayarak [Kısım B’nin Bölüm I’inin 2.1’inde tanımlandığı 
üzere] hesaba katılıyorsa, bu parametre rapor ed ilmelidir.  
10.6.  Sonuçlar, Yemlerde İstenmeyen Maddeler Tebliği’nde belirtilen maksimum limitlerin birimi ile aynı 
birimlerde ve aynı ondalık basamağında ifade edilmelidir.  
 
 
 Gerçeklik  – % 30 ila + %  30  
Orta seviyede kesinlik (% RSD)  ≤ % 20  
Üst ve alt sınır hesaplaması arasındaki fark  ≤ %20  126 
 EK-6 
YEMLER DE HAYVAN SAL  BİLEŞENLERİN  TESPİTİNE YÖNELİK ANALİZ METODLARI  
1. HEDEF VE KAPSAM  
Hayvan orijinli birleşenlerin tespit edilmesi, ışık mikroskopi veya polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile bu 
Ek’te yer alan hükümlere uygun olarak yapılacaktır.  
Bu iki metot, yem maddeleri ve karma yemlerde, hayva nsal orijinli birleşenlerin varlığını tespit etmeyi amaçlar. 
Ancak bu metotlar la, yem maddeleri ve karma yemlerde bu tür birleşenlerin miktarı hesap lanamaz. Her iki 
metodun da tespit limiti %  0,1(w/w)’in alt ındadır.  
PCR meto du, yem maddeleri ve karma yemlerde bulunan hayvan orijinli birleşenlerin taksonomik grubunu 
tanımlamayı sağlar.  
Bu metotlar, 24/12/2011 tarih ve 28152 sayılı Resmi Gazetede yayımlanan İnsan Tüketimi Amacıyla 
Kullanılmayan Hayvansal Yan Ürünler Yönetmeliğinin 8 inci maddesi ve 24/11/2011 tarih ve 28152 sayılı 
Resmi Gazetede yayımlanan Yemlerin Piyasaya Arzı ve Kullan imi Hakkında Yönetmeliğin EK-2’sinde yer alan 
yasaklamaların kontrolünde uygulanacaktır.  
Analiz edilen yem çeşidine  bağlı olarak bir tek operasyonel protokol içerisinde, yem maddelerindeki hayvansal 
proteinlere yönelik AB referans laboratu varınca (EURL -AP) oluşturulan ve sitesinde yayı mlanan standart 
çalışma prosedürleri (SOP)’ne uygun olarak, kendi başına veya kombine olarak bu metotlar kullanılabilir.(18) 
2.  METOTLAR  
2.1.  Işık Mikroskopi  
2.1.1   Prensip  
Analiz için gönderilen, yem maddeleri ve karma yemlerde mevcut olan hayvansal orijinli birleşenleri, kas lifleri 
ve diğer et parçaları, kıkırdak, kemik, boynuz, tüy, kıl, kan, kanat, yumurta kabuğu, balık kılçığı ve iskeleti gibi 
tipik ve mikroskobik olarak ayırt edilebilen özelliklere göre tanımlanır.  
2.1.2.   Reaktifler ve Ekipman  
2.1.2.1.  Reaktifler  
2.1.2.1.1.   Konsantre Edici Ajanlar  
2.1.2.1.1.1.   Tetrakloroetilen (özgül ağırlık1,62)  
2.1.2.1.2.    Boya Reaktifleri  
2.1.2.1.2.1.   Alizarin Kırmızı (Red) Çözelti (2,5 ml 1M hidrolik asit, 100 ml su ile  seyreltilir ve bu çözeltiye 200 
mg Alizarin (Red) Kırmızı eklenir.)  
 
2.1.2.1.3.   Kapatma ortamı  
2.1.2.1.3.1.  Lye (NaOH 2,5 % w/v or KOH 2,5 % w/v)  
2.1.2.1.3.2.   Gliserol (seyreltilmemiş, viskozite  1 490 cP)  
                                                           
(18)  http://eurl.craw.eu / 127 
 2.1.2.1.3.3.  Norland ® Optik Yapıştırıcı 65  (viskozite: 1 200 cP) veya kalıcı preparat hazırlamak için muadili bir 
reçine  
2.1.2.1.4.  Boyama özelliği olan Kapatma ortamı  
2.1.2.1.4.1. Lugol solüsyon (2 gr. potasyum iodide 100 ml su ile  çözülür ve sürekli  çalkalayarak 1 gr. iodine 
eklenir.)  
2.1.2. 1.4.2.  Sistin reaktif (10 gr NaOH,  100 ml su ile çözülür, çözeltiye 2 gr kurşun asetat eklenir)  
2.1.2.1.4.3.  Fehling reaktifi (A ve B’ stok çözeltilerinden 1/1 oranında kullanım öncesi hazırlanır. Çözelti A: 
100 ml suda 6,9 gr. demir (II) sulfat pentahi drat çözülür. Çözelti B: 34,6 g potasyum sodium tartarat tetrahidrat 
ve 12 gr. NaOH 100 ml suda ç özülür.).  
2.1.2.1.4.4.  Tetrametilbenzidin/Hidrojen peroksit. (1 gr. 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidin (TMB) 100 ml buzlu glacial 
asetik asit ve 150 ml suda çözülür . Kullanım öncesi, 4 kısım TMB çözeltisi,  1 kısım %  3 hidrojen peroksit 
çözeltisi ile karıştırılır.)  
2.1.2.1.5.  Yıkama reaktifi  
2.1.2.1.5.1.   Etanol > 96 % (teknik derecede)  
2.1.2.1.5.2.  Aseton (teknik derecede)  
2.1.2.1.6.   Ağartıcı reaktif  
2.1.2.1.6.1.  Ticari sodyum hipoklorit solüsyon (% 9 - 14 aktif klorin)  
2.1.2.2.  Ekipman  
2.1.2.2.1.  0,001 gr. Hassasiyette analitik terazi  
2.1.2.2.2.  Öğütücü ekipman: havan -değirmen  
2.1.2.2.3.  0,25 mm ve 1 mm’lik kare gözenekli elek  
2.1.2.2.4.  Yuvarla k cam valfli, 250 ml Teflon içerikli, konik cam ayırma hunisi. Valfin açılma çapı ≥ 4mm.  
Tespit düzeylerinin konik cam ayırma hunisi kullanılarak elde edilen düzeylere denk olduğunun laboratuvarca 
ortaya konulması şartıyla konik tabanlı çöktürme beheri  de kullanılabilir.  
Ayırma hunisi  
 
128 
 2.1.2.2.5.   En az 6,5X -  40X nihai büyütme oranına sahip stereomikroskop  
2.1.2.2.6.   En az 100X - 400X nihai büyütme oranına sahip bright field mikroskobu. Polarize ışık ve farklı 
girişim kontrastlığı ayrıca eklenebil ir.  
2.1.2.2.7.   Standart laboratuvar  cam malzemeleri  
2.1.2.2.8.  Preparat hazırlığı için ekipman: klasik mikroskop lamı, çukur lamlar, lamel (20 × 20 mm), pensler, 
ince spatul  
2.1.3.   Numune alımı ve hazırlanması  
2.1.3.1.   Numune alımı  
EK-1’de belirtil en metoda göre alınan numune kullanılmalıdır.  
2.1.3.2.  Alınması gereken önlemler  
Laboratuvarda çapraz kontaminasyondan kaçınmak amacıyla, yeniden kullanılabilir tüm ekipman, kullanım 
öncesi dikkatlice temizlenmelidir. Ayırma hunisi parçaları ve cam malzeme ler elle yıkanmalı ve sonrasında 
bulaşık makinesinde yıkanmalıdır. Elekler, sert sentetik kıllı fırçalar yardımıyla temizlenmelidir. Eleklerin nihai 
olarak temizlenmesi, asetonla yapılmalıdır ve balık ununa benzer yağlı materyallerin elekten geçirilmesi so nrası, 
sıkıştırılmış hava ile temizlenmesi tavsiye edilir.  
2.1.3.3.  Yağlar dışında numune hazırlığı  
2.1.3.3.1. Numune Kurutma: nem içeriği > % 14’ten fazla olan numuneler işleme başlamadan önce 
kurutulmalıdır.   
2.1.3.3.2.  Numunenin elekten geçirilmesi: P elet ve taneli yemlerin 1 mm. lik elekle ön eleme yapılması ve elek 
altı ile elek üstü kısımların ayrı ayrı çalışılması tavsiye edilir.  
2.1.3.3.3.  Alt-numune ve öğütme: Analiz için en az 50 gr. alt -numune alınmalı ve sonrasında öğütülmelidir.  
2.1.3.3.4.   Ekstraksiyon ve sediment hazırlığı: Öğütülmüş alt -numunesinin 10±0,01 gr’lık kısmı ayırma hunisine 
alınır ve 50 ml tetrakloroetilen eklen. Huniye alınan miktar, balık unu veya %  10’dan fazla sediment oluşturan 
mineral katkıları veya premiksler di ğer saf hayvan ürünleri olması durumunda 3 gr. ile sınırlı olmalıdır. Karışım, 
kuvvetli bir şekilde en az 30 sn. kadar çalkalanmalıdır. Çalkalama esnasında huninin iç yüzeyine yapışan 
paracıklar, sonradan eklenecek en az 50 ml. daha tetrakloroetilen ile sıvı içine  indirilir. Karışım, sediment 
ayrılması için tıpa açılmadan en az 5 dakika beklemeye bırakılmalıdır.  
Sediment kurutulmalı ve sonrasında tartılmalıdır (0,001 gr hassasiyetle) Sedimentin % 5’inden fazlası > 0,50 
mm parçacıklardan oluşuyor ise, 0,25 mm elenm eli ve iki sonuç fraksiyonu incelenmelidir.  
2.1.3.3.5. Ekstraksiyon ve flotat hazırlığı: Sediment, yukarıda belirtilen metotlara tabi olduktan sonra, ayırım 
hunisinde iki faz kalmalıdır: tetrakloroetilden oluşan sıvı olan faz ve flotat materyalden oluşan k atı olan faz.  Bu 
katı faz flotattır ve tıpanın açılmasıyla huniden gelen tetrakloroetilin tamamıyla temizlenmesiyle yerine 
getirilmelidir. Ayırma hunisini ters -yüz ederek, flotat parça geniş bir Petri kabına alınır ve buhar yolu ile hava 
kurutması yapılır . Eğer flotat parçanın %  5’i > 0,50 mm’den daha fazla ise, 0,25 mm’de elenmeli ve sonuç veren 
iki fraksiyon incelenmelidir.  
2.1.3.3.6. Ham materialin hazırlanması: Öğütülmüş alt -numunesinin en az 5 gr.’ının parçası hazırlanmalıdır. 
Eğer numenin %  5’i > 0,50 mm parçalardan oluşuyor ise, 0,25 mm’de elenmelidir ve oluşan iki fraksiyon tetkik 
edilmelidir.  
2.1.3.4.   Yağlardan oluşan numunelerin hazırlanması  
Yağlardan oluşan numunelerin hazırlanması için aşağıdaki protokol takip edilmelidir:  129 
 - Eğer yağ katı is e, sıvılaştırıncaya kadar ısıtılmalıdır.  
- Bir pipet kullanarak, 40 ml.’lik yağ, numunenin dibinden bir santrifüj tüpüne aktarılmalıdır.  
- 4 000 r.p.m.’de 10 dakika boyunca santrifüj edilmelidir.  
- eğer yağ santrifüj sonrası katı ise, sıvılaştırıncaya kadar ıs ıtılmalıdır.  
- 4 000 r.p.m.’de 5 dakika boyunca santrifüjü tekrarlayınız.  
- Küçük bir kaşık veya spatula kullanarak, çökeltinin yarısı lamlara tetkik için alınmalıdır; Kapatıcı ortam 
olarak gliserol kullanılması tavsiye edilmektedir.  
- Kalan çökeltide,  2.1.3.3 . bendinde belirtildiği şekilde sedimentin hazırlanması için kullanılmalıdır.  
 
2.1.3.5.   Boyama reaktifleri  
Analist, hayvansal orijinli doğru tanımlamaları kolaylaştırmak amacıyla, numunelerin hazırlanması esnasında 
boyama reaktiflerini EURL -AP tarafından  onaylanan ve sitesinde yayınlanan rehbere uygun olarak kullanabilir.  
Alizarin Red çözeltisi, sediment renklendirmesi için kullanılması durumunda aşağıdaki protokol uygulanacaktır:  
- Kurutulmuş sediment cam bir test tüpüne aktarılmalı ve yıkama işlemi yakla şık 5 ml etanol ile 2 kez 
tekrarlanmalıdır. (Her seferinde 30 saniyelik vorteks kullanılmalı; solventin 1,5 dakika durulması 
beklenmeli ve boşaltılmalıdır.)  
- Sediment, en az 1 ml. sodium hipoklorit solüsyon ekleyerek ağartılmalıdır. Reaksiyonun gerçekleşmes i 
için 10 dakika beklenmelidir. Test tüpü, su ile doldurulmalı, sediment 2 -3 dakika su ile bekletilmeli, su 
ve yüzen parçacıklar nazikçe dökülerek boşaltılmalıdır.  
- Sediment, 10 ml. su ile en az iki kere daha yıkanmalıdır. (En az 30 sn vortekslenmeli, çökme si 
beklenmeli, yıkama suyu boşaltılmalıdır.  
- 2 ile 10 damla arasında Alizarin Red çözeltisi eklenmeli ve karışım vorteksxlenmelidir. Reaksiyonun 
oluşması için 30 saniye beklenmeli ve boyanmış sediment, yaklaşık 5 ml. etanol ile iki kere yıkanmalı, 
daha son ra bir defa aseton ile yıkanmalıdır. En az 30 sn vortekslenmeli, 1 dakika beklenmeli, solvent 
boşaltılmalıdır.  
- Boyanmış sediment kurutulmalıdır.  
2.1.4.   Mikroskopik  
2.1.4.1.   Preparat Hazırlığı  
Mikroskobik Preparatlar, sedimentten hazırlanmalı ve  anal istin tercihine göre  flotat veya ham materyal halinde 
olmalıdır. Numune hazırlanmasında eleme yapıldığında elek altı ve elek üstü fraksiyonlardan ayrı ayrı 
hazırlanmalıdır. Preparatlar üzerine yayılan fraksiyonların test parçaları, tüm fraksiyonu temsil e tmelidir. 2.1.4.2. 
bendinde yer alan  tüm inceleme prosedürünün yerine getirildiğinden emin olmaya yetecek kadar preparat 
hazırlanmalıdır.  
Preparatlar, EURL -AP tarafından oluşturulan ve sitesinde yayınlanan SOP’e uygun kapatıcı ortam kullanılarak 
lamelle kapatılmalıdır.  
2.1.4.2.   Karma yem ve yem maddelerinde hayvansal orjinli bileşenlerin tetkiki için gözlem protokolleri  
Hazırlanan Preparatlar, karma yem ve yem maddelerinde (balık unu hariç) Şekil -1’de ve balık unu için ise Şekil -
2’de verilen gözlem prot okollerine uygun olarak incelenmelidir.  
Mikroskobik incelenmeler compound mikroskop kullanılarak analistin ihtiyacına göre sediment, flotat veya ham 
materyalden yapılabilir. Büyük fraksiyonlar için Stereomikroskop, compound mikroskoba ilaveten kullanılabi lir. 
Her preparat, farklı büyütme oranlar ında taranmalıdır.  
Tüm fraksiyon materyalleri, şart koşulan preparat sayısına ulaşmaya yeterli değilse gözlem protokolerinin her bir 
basamağında minimum sayıda preparat zorunlu olarak incelenmelidir. Tanımlama için  en fazla 6 preparat 
incelenmelidir.  
Analist, parçacıkların tabiatı ve orijininin tanımlanmasını kolaylaştırmak amacıyla, karar destek sistemi,  doku 
kütüphanesi ve referans örnek gibi destek araçlarını kullanabilir.  
 
 130 
  
 
Şekil- 1 Balık unu hariç, karma yem ve yem materyallerinde hayvansal orjinli bileşenlerin saptanmasına yönelik 
gözlem protokolü  
 
  
Numunenin öğütme prosesi, 
parçaların %95’inin ≤0,50 mm 
olduğunu temin etmektedir.HAYIR 0,25 mm . Gözenekli elekten 
eleyin  
3 preparat <0,25 mm sediment
+
1 preparat
<0,25 mm flotat veya ham materyalden
Aynı tabiatta 
hayvan 
parçasından >5 
saptandı mı?
1 preparat >0,25 mm  
sediment
HAYIRAynı tabiat ta 
hayvan 
parçasından 
>5 saptandı 
mı?
1 preparat. >0,25 mm  flotat
veya ham materyaldenHAYIR
Hayvan 
parçaları 
saptandı 
mı?EVETEVETSedimentten 3 preparat 
+
Flotat veya ham materyal 1 
preparat
Aynı tabiat 
hayvan 
parçasından >5 
saptandı mı?
sedimentten 1 
preparatHAYIR
>5 aynı türde 
hayvan 
parçası 
saptandı mı?
flotat veya ham 
materyalden 1 preparat.
HAYIRhayvan 
parçaları 
saptandı mı?
Madde 2.1.5.1. gereğince 
bildirilen numuneEVETHAYIRBALIKLARA 
yönelik Madde 
2.1.5.3 gereğince 
bildirilen 
numuneMadde 
2.1.4.3 
gereğince 
analizin 
tekrarı
Balık 
parçalarının 
sayısı
Hayvan 
parçalarının 
tabiatı
Kara hayvanları 
sayısı
KARA 
HAYVANLARINA 
yönelik madde 
2.1.5.3. 
gereğince 
bildirilen numuneMadde 2.1.4.3. 
gereğince analiz 
tekrarı
HAYIR>5 ≤5
>5 ≤5BALIK
KARA HAYVANLARIEVETEVET
EVETEVET
 
 
 
 
 
 
 131 
  
 
Şekil- 2 Balık unundaki hayvansal bileşenlerin saptanmasına yönelik gözlem protokolü  
3 preparat 
<0.25 mm sedimentten
Hayvan 
parçasından 
>5 saptandı 
mı?
2 preparat
>0.25 mm sedimentten
Hayvan 
parçasından 
>5 saptandı 
mı?
1 preparat < 0.25 mm  flotat
veya ham materyalden
Kara 
hayvanları 
saptandı 
mı?Hayvan 
parçasından 
>5 saptandı 
mı?
sedimentten
2 preparat.
Hayvan 
parçasından 
>5 saptandı 
mı?
Flotat veya ham materyalden 1 
preparat.
hayvan 
parçaları 
saptandı 
mı?EVETSedimentten
3 preparat Numunenin öğütme prosesi, parçaların 
%95’inin ≤ 0,50 mm olduğunu temin 
etmektedir.0.25 mm 
gözenekli elekten 
eleyin.
KARA HAYVANLARINA yönelik
Madde 2.1.5.1. gereğince bildirilen numuneMadde 2.1.4.3. gereğince analizin 
tekrarıKARA HAYVANLARINA yönelik, 
Madde 2.1.5.3. gereğince bildirilen 
numune
Kara 
hayvanları 
parçalarının 
sayısı?
EVETEVETEVET
EVETEVETEVET
HAYIRHAYIR
HAYIR HAYIRHAYIRHAYIRHAYIR
≤5>5
 
 
  
2.1.4.3.  Tespit Sayısı  
Şekil-1 ve Şekil -2’de belirtilen gözlem protokollerine göre yapılan ilk tespiti müteakip Belirli bir yapıda hayvan 
parçacığı tespit edilmez ise (örn. Kara hayvanları veya balık), ek çalışmaya gerek yoktur ve analiz sonuçları, 
2.1.5.1. bendinde yer alan terminoloji kullanılarak raporlandırılmalıdır.  
Şekil-1 ve Şekil -2’de belirtilen gözlem protokollerine uygun ya pılan ilk tespiti müteakip belirli bir yapıda 
hayvan parçacığı (örn. kara hayvanları veya balık), 1’den 5’e kadar derecelerde tespit edilirse; ikinci tespit yeni 
bir 50 gr. alt numunesinden başlayarak yapılmalıdır. Eğer bu ikinci tespit sonrası belirli bir yapıda hayvan 
parçaları, 0’dan 5’ kadar derecelerde tespit edilirse; analiz sonuçları 2.1.5.2 bendinde yer alan terminoloji 
kullanılarak raporlandırılır; bunun dışında üçüncü tespit yeni bir 50 gr.lık alt -numuneden yapılmalıdır. Ancak 
yine de, ilk ve ikinc i tespit sonrası iki tespit üzerinden belirli bir yapıda parçaların toplamı 15’ten fazla ise, ilave 
bir tespit gerekmez ve analiz  sonucu  2.1.5.3.bendinde belirtilen terminoloji kullanılarak direkt 
raporlandırılmalıdır. Üçüncü tespit sonrası belirli bir yapıda hayvan parçacıklarının toplamı 15’ten fazla ise; 
analiz sonuçları 2.1.5.3. bendinde yer alan terminoloji kullanılarak raporlandırılmalıdır.Aksi takdirde, analiz 
sonuçları 2.1.5.2.bendinde belirtilen terminoloji kullanılarak raporlandırılm alıdır.  
Şekil 1 - Şekil 2 deki gözlem protokolüne göre ilk determinasyonda 5 ten fazla hayvan parçacığı (kara hayvanı 
veya balık) tespit edilmişse analiz sonuları 2.1.5.3 teki terminoloji kullanılarak raporlandırılırır.  132 
 2.1.5.   Sonuçların Açıklanması  
Sonu çlar raporlandırılırken, laboratuvar , hangi  çeşit materyal üzerinde (sediment, flotat veya ham materyal) 
analizlerin gerçekleştirilmiş olduğunu ve kaç adet determinasyonun yapılmış olduğunu belirtmelidir.  
Laboratuvar  raporu, en azından kara hayvanları veya  balıktan elde edilen tamamlayıcıların mevcutluğu ile ilgili 
bilgi vermelidir.  
Farklı durumlar, aşağıdaki yollarda raporlandırılmalıdır:  
2.1.5.1 .  Belirli bir yapıda hayvan parçaları tespit edilememiş ise:   
- Analiz edilen numunede, ışık mikroskobu kullanarak gözle görülebildiği kadarıyla kara hayvanlarına 
ait bileşen tespit edilememiştir.  
- Analiz edilen numunede, ışık mikroskobu kullanarak gözle görülebildiği kadarıyla balıklara ait bileşen 
tespit edilememiş tir. 
2.1.5.2  Belirli bir yapıda hayvansal orjinli bileşen sayısı 1 ile 5 arasında tespit edilmiş ise:   
 - Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak gözle görülebildiği kadarıyla kara hayvanlarından, 
her determinasyon için ortalama  5 parçadan daha fazla p arça tespit edilememiştir. Parçalar şu şekilde 
tanımlanır (kemik, kıkırdak, kas, saç, boynuz…vb.) Bu düşük seviyenin varlığı, mikroskobik metotta 
tespit limitinin altında olması, yanlış pozitif sonuç riskinin olabileceği göz ardı edilmemelidir.  
veya, yukar ıdaki gibi,  
- Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak gözle görülebildiği kadarıyla balıklardan, her 
determinasyon için ortalama 5 parçadan daha fazla parça tespit edilememiştir. Parçalar şu şekilde 
tanımlanır. (Balık kılçığı, balık iskeleti, kıkırdak, k as, otolit, solungaç) Bu düşük seviyenin varlığı, 
mikroskobik metotta tespit limitinin altında olması, yanlış pozitif sonuç riskinin olabileceği göz ardı 
edilmemelidir.  
- Yalnızca elenerek yapılan fraksiyonda hayvan parçalarının tespiti çevresel kontaminasyo nlarla işareti 
olabileceğinden, ön -eleme durumunda, laboratuvar  raporu, hangi fraksiyonda (elenen fraksiyon, taneli 
fraksiyon) hayvan parçalarının tespit edilmiş olduğunu belirtmelidir.  
 
2.1.5.3.  Belirli bir yapıda  ortalama 5 hayvan parçasından daha fazlası tespit edilmiştir:  
- Işık mikroskop kullanarak gözle görüldüğü üzere; kara hayvanlarından, verilen numunede her 
determinasyon için ortalama 5 parçadan daha fazla parça elde edilir. Bu parçalar şu şekilde 
tanımlanmı ştır: [kemik, kıkırdak, kas, saç, boynuz…]  
Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak gözle görülebildiği kadarıyla kara hayvanlarından, her 
determinasyon için ortalama 5 parçadan daha fazla parça tespit edilmiştir. Parçalar şu şekilde tanımlanır (kemik, 
kıkırdak, kas, saç, boynuz…vb.)  
veya, yukarıdaki gibi  
- Verilen numunede ışık mikroskobu kullanarak gözle görülebildiği kadarıyla balıklardan, her 
determinasyon için ortalama 5 parçadan daha fazla parça tespit edilmiştir. Parçalar şu şekilde tanımlanır 
(balık kılçığı, balık iskeleti, kıkırdak, kas, otolit, solungaç.) .  
Yalnızca elenerek yapılan fraksiyonda hayvan parçalarının tespiti çevresel kontaminasyonların işareti 
olabileceğinden, ön -eleme durumunda, laboratuvar  raporu, şimdiye kadar hangi fraksiyonda (e lenen fraksiyon, 
taneli veya çekirdek içi fraksiyon) hayvan parçalarının tespit edilmiş olduğunu belirtmelidir.  
2.2.  PCR  
2.2.1.  Prensip  133 
 Yem maddeleri ve karma yemlerdeki hayvan orijinli Deoksiribonukleik asit (DNA) fragmanlarındaki hedeflenen 
türe özgü s pesifik DNA sekanslarının, PCR tekniği ile çoğaltılarak tespit edilmesidir.  
PCR metodunda ilk olarak DNA ekstraksiyon basamağına gerek vardır. Elde edilen DNA ekstraktına analizde  
hedeflenen hayvan türlerini tetkik etmek amacıyla çoğaltma basamağı uygula nmalıdır  
2.2.2. Reaktifler ve Ekipmanlar  
2.2.2.1.  Reaktifler  
2.2.2.1.1.  DNA ekstraksiyon basamağı için reaktifler  
Yalnızca EURL -AP tarafından onaylanan ve internet sitesinde yayınlanmış olan reaktifler kullanılmalıdır.  
2.2.2.1.2.  DNA çoğaltma basamakları için reaktifler  
2.2.2.1.2.1.  Primer ve Problar 
Yalnızca EURL -AP tarafından valide edilen oligonükleotid dizilime sahip Primer ve Problar kullanılmalıdır. (19 )  
2.2.2.1.2.2.  Master Miks  
Yalnızca hayvansal DNA varlığından dolayı yanlış sonuçlara neden olabilecek reaktifleri içermeyen master 
miksler kullanılmalıdır.(20 )  
2.2.2.1.2.3.  Dekontaminasyon reaktifleri  
2.2.2.1.2.3.1.  Hidroklorik asit çözeltisi (0,1 N)  
2.2.2.1.2.3.2.  Ağartıcı (%  0,15 aktif klor  içeren sodyum hipoklorit çözeltisi)  
2.2.2.1.2.3.3.  Analitik teraz iler gibi pahalı cihazları n dekontaminasyonu için aşındırıcı olmayan reaktifler (örn. 
MP Biomedi cals marka DNA EraseTM) 
2.2.2.2.  Ekipman  
2.2.2.2.1 .  0,001 gr. doğruluktaki analitik terazi  
2.2.2.2. 2.  Öğütücü  
2.2.2.2.3.  Real-time PCR    
2.2.2.2.4.  Mikrosantrifüj  
2.2.2.2.5.  1 - 1 000 μl hacimli mikropipet seti  
2.2.2.2.6.  Standart moleküler biyoloji sarf malzemeleri ; mikrofüj tüpleri, filtreli mikro pipet ucları, real time 
PCR plakaları  
2.2.2.2 .7.  Numune ve reaktifleri depolama  amaçlı dondurucular  
2.2.3.   Numune alma ve Numunenin Hazırlanması  
2.2.3.1.  Numune alma  
                                                           
(19) Analiz de hedeflenen, her hayvan türü için primerlerin ve probların listesi EURL -AP websitesinde bulun maktadır. . 
 
(20) Fonksiyonel olan m aster miks örnekleri EURL -AP websitesinden bulunmaktadır..  134 
 Yemlerin Resmî Kontrolü İçin Numune Alma Ve Analiz Metotlarına Dair Yönetmeliğin E K-1’de belirtilen 
metoda göre alınan numune kullanılmalıdır.  
2.2.3.2.   Numune nin hazırlanması  
 
DNA ektsraksiyonuna kadar laboratuvar  numunelerinin hazırlanması, E K-2’de yer alan şartlara uygun olmalıdır. 
Analiz için en az 50 gr. alt numune alınarak öğütülür.  
Numune hazırlığı, ISO 24276 da belirtildiği gibi PCR hazırlık odası ve DNA ekstraksiyon odalarından farklı bir 
odada yapılmalıdır.  
Her numune en az 100 mg lık iki paralel olarak hazırlanmalıdır.  
 
2.2.4.   DNA ekstraksiyonu  
 
DNA ekstraksiyonu, EURL -AP tara fından oluşturulan ve internet sitelerinde yayınlanan SOP’ler (Standart 
çalışma prosedürleri -SÇP) kullanılarak gerçekleştirilmelidir.  
ISO 24276 da belirtildiği gibi, her eskraksiyon serisi  için iki ekstraksiyon kontrolü hazırlanmalıdır.  
- Ekstraksiyon nega tif kontrol,  
- Ekstraksiyon pozitif kontrol  
 
2.2.5.  Genetik amplifikasyon  
Genetik çoğaltma, tanımlanması gereken her tür için valide edilmiş metotlar kullanarak gerçekleştirilmelidir. Bu 
metotlar, EURL -AP tarafından oluşturulan ve internet sitesinde yayınlanan SOP’lerde belirtilmiştir. Her DNA 
ekstraktı, inhibisyonun kontrolü  amacıyla en az iki farklı dilüsyonda analiz edilmelidir.  
Hedeflenen her tür için, ISO 24276 da belirtildiği gibi, iki çoğaltma kontrolü hazırlanmalıdır.  
- Her bir plaka veya PCR analiz serisi için bir p ozitif hedef  DNA kontrolü kullanılmalıdır.  
- Her bir plaka  veya PCR analiz serisi için ç oğaltma reaktifi kontrolü (hedef DNA yı içermeyen kontrol 
olarakta adlandırılır), her plate için kullanılmalıdır.  
2.2.6.   Sonuçların değerlendirilmesi ve ifadesi  
Laboratuvar  sonuçları raporlandırırken, en azından, kullanılan numelerin ağırlığını, kullanılan ekstraksiyon 
tekniğini, tespit edilen bulguların sayısını ve metodun tespit limitini göstermelidir.  
Çoğaltma reaktif kontrolü negatif iken  pozitif DNA ekstraksiyon kontrolü ve pozitif DNA hedef kontrol leri 
analiz edilen hedef için pozitif sonuçlar  vermez ise sonuçlar değerlendirilmemeli ve raporlandırılmamalıdır.  
Numuneye ait iki paralelin sonuçlarının uyumsuz olması durumunda, en azından PCR aşaması tekrarlanmalıdır. 
Laboratuvar , DNA ekstraklarının uyumsuzluğun sebebi ola bileceğinden şüpheleniyorsa, sonuçlar 
yorumlanmadan önce yeni bir DNA ekstraksiyonunu ve bunu takiben PCR aşaması yapılmalıdır.  
Sonuçların nihai yorumlanmasında EURL -AP tarafından oluşturulan ve internet sitesinde yayınlananan SOP ‘ye 
dayanarak paralel num unelerinin sonuçlarının integyonuna ve yorumlanmasına dayanmaktadır.  
2.2.6.1.  Negatif sonuç  
Negatif bir sonuç aşağıdaki gibi raporlandırıl malıdır :  
Analiz edilen numunede X’e ait DNA tespit edilmedi. (X: hedeflenen hayvan türü veya grubu)  
2.2.6.2.   Pozit if sonuç  
Pozitif bir sonuç aşağıdaki gibi raporlandırılmalıdır:  
Analiz edilen numunede X’e ait DNA tespit edildi. (X: hedeflenen hayvan türü veya grubu)  
 135 
 EK-7 
KANATLI KARMA YEM LERİNDE  ENERJİ DEĞERİNİN HESAPLANMASI NA YÖNELİK ANALİZ 
METODU  
1.  HESAPLAMA METODU VE ENERJİ DEĞERİNİN İFADESİ  
Kanatlı karma yemindeki enerji değeri, yemin belirli analitik bileşenlerinin yüzdesi temelinde aşağıda belirtilen 
formüle göre hesaplanmalıdır. Bu değer, karma yemin azota göre düzeltilmiş metabolize olabilir enerji (ME) 
değerini MJ/kg cinsinden ifade eder:  
MJ/kg ME = 0,1551 × % ham protein + 0,3431 × % ham yağ + 0,1669 × % nişasta + 0,1301 × % toplam şeker 
(sakkaroz olarak).  
2.  BEYAN EDİLEN DEĞERLER İÇİN GEÇERLİ TOLERANSLAR  
Resmî muayenede, muayene sonuçları ile beyan ed ilen enerji değeri arasında bir farklılık (artan ya da azalan 
yem enerji değeri) ortaya çıkarsa, en az 0,4 MJ/kg ME’lik bir toleransa izin verilmelidir.  
3.  SONUCUN İFADE EDİLMESİ  
Yukarıdaki formül uygulandıktan sonra, elde edilen sonuçlar bir ondalık hane  ile verilmelidir.  
4.  NUMUNE ALMA VE ANALİZ METOTLARI  
Karma yemden numune alma ve hesaplama metodunda belirtilen analitik bileşenlerin içeriğinin tayini, resmî 
yem kontrolü için sırasıyla numune alma metotlarına ve analiz metotlarına göre gerçekleştirilme lidir.  
Aşağıdakiler geçerlidir:  
-  ham yağ içeriğinin tayini için: EK -3, Bölüm H’de açıklanan, ham sıvı yağ ve katı yağ tayini metodu, 
metot B.  
-  nişasta içeriğinin tayini için: EK -3, Bölüm L’de belirtilen polarimetrik metot.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 136 
 EK-8 
YEMLERDE KULLANIMI YASAKLANAN YEM KATKI MADDELERİNİN KONTROLÜNE 
YÖNELİK ANALİZ METOTLARI  
Bu ekte belirtilen analiz metotlarından daha hassas analiz metotları, yemde izin verilmeyen katkı maddelerini 
saptamada kullanılabilir.  
A.  METİL BENZOKUAT TAYİNİ  
7-benziloski -6-butil-3-metoksikarbonil -4-kinolin  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemdeki metil benzokuat seviyesinin tayinini mümkün kılar. Tespit limiti (LOQ)  1 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Metil benzokuat, numuneden metanollü metansülfonik asit çözeltisi ile ekst rakte edilir. Ekstrakt, diklorometan, 
iyon değişim kromatografisi ve sonra yeniden diklorometan ile saflaştırılır. Metil benzokuat içeriği, UV 
dedektörlü ters faz yüksek performans sıvı kromatografi (HPLC) tespit edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Diklorometan  
3.2.  Metanol, HPLC saflı kta 
3.3.  HPLC mobil faz  
Metanol (3.2) ve su (HPLC  saflıta ) karışım 75 + 25 (v+v), 0,22 μm filtreden (4,5) geçirilir ve çözelti gazdan 
arındırılır (örneğin 10 dakika  ultrasonik su banyosunda tutularak ). 
 
3.4. Metanosülfonik asit çözeltisi, c = %  2,  20,0 ml metansülfonik asit, metanol (3.2) ile 1000 ml’ye tamamlanır.  
3.5. Hidroklorik asit çözeltisi, c = %  10, 100 ml hidroklorik asit (ρ20 1,18 g/ml), su ile 1000 ml’ye tamamlanır.  
3.6.  Amberlit katyon değişim  reçinesi CG -120 (Na),  100 ila 200 göz açıklığında  
Reçine kullanımdan önce ön işleme tabi tutulur. 100 g reçine 500 ml hidroklorik asit çözeltisi (3.5) ile karıştırılır 
ve sıcak plakada sürekli karıştırarak kaynayana kadar ısıtılır. Soğuması beklenir ve asit boşaltılır. Vakum a ltında 
bir filtre kağıdından geçirilir. Reçine iki kez 500 ml’lik su ile ve ardından 250 ml’lik metanolle  (3.2) ile yıkanır. 
Reçine yeniden 250 ml’lik metanol ile durulanır ve Yıkama ortamındaki katı madde (reçine)  hava geçirerek 
kurutulur. Kuruyan reçin e kapalı bir şişede saklanır . 
3.7.  Standard madde: Saf metil benzokuat (7 -benziloski -6-butil-3-metoksikarbonil -4-kinolin)  
3.7.1. Metil benzokuat stok standart çözeltisi, 500 μg/ml,  
50 mg standart madde (3.7) 0,1 mg hassasiyetle tartılır,  metansülfonik a sit çözeltisi ile (3.4) çözdürülür, hacmi 
balon jojede 100 ml ’ye tamamlanır ve karıştırılır . 
3.7.2.  Metil benzokuat ara standart çözeltisi, 50 μg/ml,   
5,0 ml metil benzokuat stok standart çözeltisi (3.7.1) 50 ml’lik balon jojeye metanolle (3.2) hacmi tam amlanır ve 
karıştırılır.  137 
 3.7.3.  Kalibrasyon çözeltileri  
25 ml’lik balon jojelere 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ve 5,0 ml metil benzokuat ara standart çözelti hazırlamak için (3.7.2) 
aktarılır. Mobil faz (3.3) ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltiler sırasıyla 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 ve 10,0 
μg/ml metil benzokuat konsantrasyonlarına sahiptir. Bu çözeltiler kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
4.  Cihaz  
4.1.  Laboratuvar  tipi  çalkalayıcı  
4.2.  Döner buharlaştırıcı (Rotary evaporator)  
4.3.  Yaklaşı k 200 ml kapasite hazneli ve bir musluk  takılmış cam kolon (250 mm x 15 mm)  
4.4.  Değişken dalga boylu UV yada DAD dedektörlü HPLC cihazı  
4.4.1.  HPLC kolonu: 300 mm x 4 mm, C18, 10 μm dolgu ya da eşdeğeri.  
4.5.  Membran filtreler, 0,22 μm  
4.6.  Membran filtreler, 0,45 μm  
5.  Metot  
5.1.  Genel  
5.1.1.   
Bir kör yem numunesi, metil benzokuat ya da girişim yapan maddelerin olup olmadığını kontrol etmek için 
analiz edilmelidir.  
5.1.2.  Numunedeki varlığına yakın miktarda metil benzokuat eklenen kör yem numune si analiz edilerek geri 
alma yapılmalıdır.  . 15 mg/kg geri alma için 20 g kör yeme 600 μl stok standart çözeltisi (3.7.1) eklenir, 
karıştırılır ve ekstraksiyondan (5.2) önce 10 dakika beklenir.  
Bu metodun amacı doğrultusunda, kör yem numunesi analiz edil ecek örnek tipine  benzer olmalı ve metil 
benzokuat içermemelidir.  
5.2.  Ekstraksiyon  
Hazırlanmış numunden 0,01 g hassasiyetle yaklaşık 20 gr tartılır ve 250 ml’lik erlene aktarılır. 100,0 ml 
metansülfonik asit çözeltisi (3.4) eklenir ve 30 dakika boyunca mekanik olarak (4.1) çalkalanır. Çözelti bir 
süzgeç kağıdından süzülür ve filtrat sıvı -sıvı ayırma aşaması (5.3) için saklanır.  
5.3.  Sıvı -sıvı ayırma  
Elde edilen (5.2) filtratın 25,0 ml’si, 100 ml hidroklorik asit çözeltisi (3.5) içeren 500 ml’lik bir ayı rma hunisine 
aktarılır. Ayırma hunisine 100 ml diklorometan (3.1) eklenir ve bir dakika çalkalanır. Faz ayrımı beklenir ve 
alttaki (diklorometan) katman 500 ml’lik yuvarlak tabanlı bir balona akıtılır. Sulu fazın ekstraksiyon işlemi 40 
ml’lik diklorometan ile iki kez daha yapılır ve bunlar yuvarlak tabanlı balon jojede ilk ekstrakt ile birleştirilir. 
Diklorometan ekstraktı, düşük basınç altında 40°C’de döner buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (4.2) kuruyana 
kadar buharlaştırılır. Kalıntı 20 ila 25 ml meta nolde (3.2) çözdürülür, balon joje kapatılır ve tüm ekstrakt iyon 
değişim kromatografisi (5.4) için saklanır.  
5.4.  İyon değişimi kromatografisi  
5.4.1.  İyon değişimi kolonunun hazırlanması  138 
 Bir cam kolonunun (4.3) alt kısmına cam yününden küçük bir tıkaç y apılır. 50 ml hidroklorik asit (3.5) ile 
işlenmiş 5,0 g katyon değişim reçinesi karışımı(3.6) hazırlanır, cam kolona dökülür ve çökmesi beklenir.  
Reçine yüzeyinin hemen üstündeki fazla asit akıtılır ve dışarı akış turnusol kağıdında nötr görünene kadar kol on 
su ile yıkanır. 50 ml metanol (3.2) kolona aktarılır ve reçine yüzeyine tahliye olması beklenir.  
5.4.2.  Kolon kromatografisi  
Bir pipetle, (5.3)’te elde edilen ekstrakt dikkatle kolona aktarılır. Yuvarlak tabanlı balon joje 5 ile 10 ml’lik  
metanolle (3 .2)  2 defa yıkanır ve bu yıkama  solventleri kolona aktarılır. Ekstrakt reçine yüzeyine akıtılır ve 
kolon 50 ml metanol ile yıkanır, akış hızının en fazla 5 ml/dakika dolduğundan emin olunur. Atık kısım atılır. 
150 ml metansülfonik asit çözeltisi (3.4) ku llanarak metil benzokuat kolondan elüe edilir ve kolondaki elüat 250 
ml’lik bir konik cam erlene alınır.  
5.5.  Sıvı -sıvı ayırma  
(5.4.2)’de elde edilen elüat 1 litrelik ayırma hunisine alınır. Konik balon joje 5 ile 10 ml metanol (3.2) ile yıkanır 
bu yıkama  suları ayırma hunisinin içeriği ile birleştirilir. 300 ml hidroklorik asit çözeltisi (3.5) ve 130 ml 
diklorometan (3.1) eklenir. 1 dakika çalkalanır ve fazın ayrılması beklenir. Alt (diklorometan) faz 500 ml’lik 
yuvarlak tabanlı bir balona akıtılır. Sıvı fazın ekstraksiyon işlemi 70 ml’lik diklorometan ile iki kez daha yapılır 
ve bunlar yuvarlak tabanlı balon jojede ilk ekstrakt ile birleştirilir.  
Diklorometan ekstraktı, düşük basınç altında 40°C’de döner buharlaştırıcıda (rotary evaporator) (4.2) kuruyana  
kadar buharlaştırılır. Şişedeki kalıntı yaklaşık 5 ml metanol (3.2) içinde çözündürülür ve bu çözelti 10 ml’lik 
dereceli balon jojeye aktarılır. Yuvarlak tabanlı balon joje iki defa 1 ile 2 ml’lik  metanol ile durulanır ve bunlar 
balon jojeye aktarılır. M etanol ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır.  Numune membran filtreden (4.6) süzülür ve 
HPLC tayini (5.6) için saklanır.  
5.6.  HPLC tayini  
5.6.1.  Parametreler  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koş ullar da 
kullanılabilir:  
— sıvı kromatografik kolon (4.4.1)  
— HPLC mobil faz: Metanol -su karışımı (3.3)  
— akış hızı: 1 - 1,5 ml/dakika  
— tespit dalga boyu: 265 nm  
— enjeksiyon hacmi: 20 ila 50 μl  
4 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisi (3.7.3), tutarlı pik yü kseklikleri (alanlar) ve alıkonma süreleri elde edene 
kadar birkaç kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.6.2.  Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.7.3) birkaç kez enjekte edilir ve her bir konsantrasyonu n pik yükseklikleri 
(alanları) ölçülür.  
Kalibrasyon çözeltilerinin apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlarına ordinatlarda denk gelen ortalama pik 
yükseklikleri ya da alanları kullanarak bir kalibrasyon grafiği çizilir.  
5.6.3.  Numune çözeltisi  139 
 Kalibras yon çözeltileri için alınanlaaynı enjeksiyon hacmi kullanarak numune ekstraktı (5.5) birkaç kez enjekte 
edilir ve metil benzokuat piklerinin ortalama pik yüksekliği (alan) belirlenir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Numune çözeltisinin konsantrasyonu, kalibras yon grafiği (5.6.2) referans alınarak numune çözeltisinin metil 
benzokuat piklerinin ortalama yüksekliğinden (alan) μg/ml olarak belirlenir.  
Numunenin mg/kg cinsinden metil benzokuat içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
   
Burada;  
c = Numune çözeltisinin metil benzokuat konsantrasyonu, μg/ml  
m =      g olarak numunenin ağırlığı  
7. Sonuçların validasyonu  
7.1.  Tanımlama  
Analitin tanımlanması  ortakkromatografi yöntemi ile ya da numune ekstraktının ve 10 μg/ml içeren kalibrasyon 
çözeltisinin (3. 7.3) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array detektörü (DAD)kullanılarak yapılabilir.  
7.1.1.  Ortak kromatografi (co -chromatography)  
Bir numune ekstraktına, uygun miktarda ara standart çözeltisi (3.7.2) eklenir. Eklenen metil benzokuat miktarı 
numune ekstraktındaki tahmini metil benzokuat miktarına benzer olmalıdır.  
Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca metil benzokuat pikinin yüksekliği 
artırılmalıdır. Maksimum yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliğ i orijinal genişliğin yaklaşık % 10’u 
aralığında olmalıdır.  
7.1.2.  Diode Array Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir:  
(a) Numunedeki maksimum absobsiyon ve standart spectranın tepe noktasındaki dalga boyu diode array 
sisteminin limitleri içinde olmalıdır.  Diode Array ile tespit için bu tipik olarak yaklaşık 2 nm’dir;  
(b) 220 - 350 nm arasında, kromatogramdaki pik tepe noktasında kaydedilen numune ve standart spektrumları, 
spektrumun % 10 ila % 100 bağıl absorbans aralığından far klı olmamalıdır. Bu kriter aynı maksimum pik 
olduğunda ve gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sapma, standart analizin absorbansının % 
15’ini geçmediğinde karşılanır;  
(c) 220 - 350 nm arasında, aynı ekstrakta  ait pikin yukarı eğim, tepe  noktası ve aşağı eğim spektrumları, 
spektrumun % 10 ila % 100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı olmamalıdır. Bu kriter, 
aynı maksimum pik olduğunda ve gözlenen hiçbir noktada spektrumlar arasındaki sapma,  tepe noktası 
spektru munun absorbansının % 15’ini geçmediğinde karşılanır.  
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır.  
 
 
140 
 7.2.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunedekiiki paralel sonuçları arasındaki fark aşağıdaki değerleri geçmemelidir: 4 ile 20 mg/kg 
arasındaki metil benzokuat içeriği için daha yüksek sonuca bağıl % 10.  
7.3.  Geri kazanım  
Standart eklenmiş bir kör numune için geri kazanım en az % 90 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
10 laboratuvar da beş numune analiz edilmiştir. Her numunede  analizler paralel olarak gerçekleştirilmiştir.  
 Kör Toz yem 1  Pelet yem 1  Toz yem 2  Pelet yem 2  
Ortalama [mg/kg]  ND  4,50  4,50  8,90  8,70 
sr [mg/kg]  —  0,30  0,20  0,60  0,50 
CV r [%]  —  6,70  4,40  6,70  5,70 
sR[mg/kg]  —  0,40  0,50  0,90  1,00 
CV R [%]  —  8,90  11,10  10,10  11,50  
Geri kazanım [%]  —  92,00  93,00  92,00  89,00  
  
ND = Tespit Edilmedi  
sr = Tekrar edilebilirliğin  Standart Sapması  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  Değişim  Katsayısı , % 
SR = Tekrar Üretilebilirliğin  Standart Sapması  
CV R = Tekrar Üretilebilirli ğin Değişim  Katsayısı , %. 
 
B. OLAQUİNDOX TAYİNİ  
2-[N-2'-(hidroksietil)karbamoil] -3-metilkinoksalin -N1,N4-dioksit  
1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot; yemdeki olaquindox seviyesinin tayinini mümkün kılar. Miktar tayinlerinin sınırı 5 mg/kg’d ır. 
2.  Prensip  
Numune su -metanol karışımı ile ekstrakte edilir. Olaquindox içeriği, bir UV detektörü kullanılarak ters fazlı 
yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir.  141 
 3.  Ayıraçlar  
3.1.  Metanol  
3.2.  Metanol, HPLC saflıkta 
3.3.  Su, HPLC saflıkta  
3.4. HPLC için mobil faz  
Su (3.3) -metanol (3.2) karışımı, 900 +100 (V + V).  
3.5. Standard madde: Saf olaquindox 2 -[N-2'-(hidroksietil)karbamoil] -3-metilkinoksalin -N1,N4 -dioksit, E851.  
3.5.1.  Olaquindox stok standart çözeltisi, 250 μg/ml  
50 mg olaquindox’u (3.5) 0,1 mg hassasiyetle 200 ml’lik balon jojeye tartılır ve yaklaşık 190 ml su eklenir. 
Ardından balon joje 20 dakika ultrasonik banyoya (4.1) konulur. Ultrasonik işlemden sonra çözelti oda 
sıcaklığına getirilir, su ile hacmi tamamlanı r ve karıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ve 
buzdolabında saklanır. Bu çözelti her ay taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.5.2.  Olaquindox ara standart çözeltisi, 25 μg/ml  
10,0 ml stok standart çözeltisi (3.5.1) 100 ml’lik balon jojeye aktarılır , mobil fazla (3,4) hacmi tamamlanır ve 
karıştırılır. Balon joje alüminyum folyo ile sarılır ve buzdolabında saklanır. Bu çözelti her gün taze olarak 
hazırlanmalıdır.  
3.5.3.  Kalibrasyon çözeltileri  
50 ml’lik balon jojelere 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 ve 20, 0 ml ara standart çözeltisi (3.5.2) aktarılır. Mobil faz (3,4) 
ile hacmi tamamlanır ve karıştırılır. Cam malzeme alüminyum folyo ile sarılır.  
   Bu çözeltiler sırasıyla 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5 ve 10,0 μg/ml olaquindox içerirBu çözeltiler her gün taze olara k 
hazırlanmalıdır.  
4. Cihaz  
4.1.  Ultrasonik banyo  
4.2.  Mekanik çalkalayıcı  
4.3.  HPLC cihazı, değişken dalga boyu UV detektörlü ya da Diode Array (DAD)dedektörlü  
4.3.1.  Sıvı kromatografik kolon, 250 mm × 4 mm, C18, 10 μm dolgu ya da eşdeğeri  
4.4.  Memb ran filtreler, 0,45 μm  
5.  Metot  
Not: Olaquindox ışığa duyarlıdır. Tüm metotlar hafif ışık altında ya da amber renkli cam malzeme kullanarak 
gerçekleştirilmelidir.  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Olaquindox ya da girişim yapan maddelerin olup olmadığını kontrol etmek  için bir kör yem analiz 
edilmelidir.  142 
 5.1.2.  Numunedeki varlığına yakın miktarda olaquindox eklenenkör yem analiz edilerek bir geri 
kazanımçalışması yapılmalıdır. 50 mg/kg düzeyinde geri alma için  10,0 ml stok standardı çözeltisi (3.5.1) 250 
ml’lik erlen e alınır ve çözelti yaklaşık 0,5 ml’ye buharlaştırılır. 50 g kör yem eklenir, iyice karıştırılır 10 dakika 
dinlendirilir, ekstraksiyona (5.2) başlamadan önce birkaç kez yeniden karıştırılır.  
Not: Bu metodun amacı doğrultusunda , kör yem numunesi analiz edi lecek örneğe benzer olmalı ve 
olaquindoxiçermemelidir.  
5.2.  Ekstraksiyon  
Yaklaşık 50 g numune 0,01 g hassasiyetle tartılır. 1000 ml’lik bir konik cam erlene aktarılır ve 100 ml metanol 
(3.1) eklenir ve balon joje 5 dakika boyunca ultrasonik banyoda (4.1)  tutulur.. 410 ml su eklenir ve ultrasonik 
banyoda 15 dakika daha bırakılır. Balon joje ultrasonik banyodan alınır, 30 dakika çalkalayıcıda (4.2) çalkalanır 
ve katlanmış bir filtreden süzülür. 10,0 ml filtrat 20 ml’lik balon jojeye aktarılır, su ile işaret e kadar tamamlanır 
ve karıştırılır.  Numune bir membran filtreden (4,4) süzülür. (bakınız 9) HPLC tayini (5.3) adımına geçilir.  
5.3.  HPLC tayini  
5.3.1.  Parametreler:  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir.  
Analitik kolon (4.3.1):  
Analitik kolon (4.3.1):    
Mobil faz (3.4):  Su (3.3) -metanol (3.2) karışımı, 900 100 (V + V).  
Akış hızı:  1,5-2 ml/dak.  
Tespit dalga boyu:  380 nm  
Enjeksiyon hacmi:  20 μl –100 μl  
 
2,5 μg/ml içeren  kalibrasyon çözeltisini (3.5.3), tutarlı pik yükseklikleri ve alıkonma süreleri elde edilene kadar 
birkaç kez enjekte ederek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.3.2.  Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.5.3) birkaç kez en jekte edilir ve her bir konsantrasyonun ortalama pik 
yükseklikleri (alanları) tayin edilir. Kalibrasyon çözeltilerinin apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlarına 
ordinatlarda denk gelen ortalama pik yükseklikleri (alanlar) kullanılarak bir kalibrasyon g rafiği çizilir.  
5.3.3.  Numune çözeltisi  
Kalibrasyon çözeltileri için alınanla aynı  enjeksiyon  hacmi kullanarak numune ekstraktı (5.2) birkaç kez enjekte 
edilir ve olaquindox piklerinin ortalama pik yüksekliği (alan) belirlenir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalibrasyon grafiği (5.3.2) referans alınarak, numune  çözelti sinin olaquindox pikinin ortalama yüksekliğinden 
(alan), numune çözeltisinin konsantrasyonu μg/ml cinsinden tayin edilir.  
Numunenin mg/kg cinsinden olaquindox içeriği “w” aşağıdaki f ormülle elde edilir:  143 
   
c = Numune ekstraktının olaquindox konsantrasyonu, μg/ml  
m = Test numunesinin ağırlığı (5.2), g  
7.  Sonuçların validasyonu  
7.1.  Tanımlama 
Analitin tanı mlan ması ortak kromatografi  yöntemi  ile ya da numune ekstraktının (5.2) ve 5,0 μg/ml içeren 
kalibrasyon çözeltisinin (3.5.3) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektörü  (DAD)  kullanılarak 
onaylanabilir.  
7.1.1.  Ortak kromatografi  
Bir numune ekstraktına (5.2), uygun miktarda  kalibrasyon çözeltisi (3.5.3) eklenir. Eklenen olaquindox miktarı 
numune ekstraktında bulunan olaquindox miktarına benzer olmalıdır.  
Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca olaquindox pikinin 
yüksekliği artırılmalıdır. . Yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği, kirletilmemiş numune ekstraktının 
orijinal olaquindox piki genişliğinin ±  % 10 aralı ğında olmalıdır.  
7.1.2.  Diode Array Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir:,  
(a). Numunedeki maksimu m absobsiyon ve standart spectranın tepe noktasındaki dalga boyu diode array 
sisteminin limitleri içinde olmalıdır.   
 Diode Array saptama için bu tipik olarak ± 2 nm’dir.  
(b) 220 ile 400 nm arasında, kromatogramın pik tepe noktasında  kaydedilen numune ve standart spektrumlar, 
spektrumun %  10 ila %  100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için farklı olmamalıdır. Bu kriter aynı 
maksimum pik olduğunda ve gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sapma, standart analizin 
absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır.  
(c) 220 ile 400 nm arasında, aynı ekstrakt a ait pikin yukarı eğim, apeks ve aşağı eğim spektrumları, spektrumun 
% 10 ila %  100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı olmamalıdır. Bu kriter, aynı 
maksimum pik i olduğunda ve gözlenen tüm noktalarda spektrumlar arasındaki sapma, pik tepe noktası  
spektrumunun absorbansının %  15’ini geçmediğinde karşılanır.  
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır.  
7.2.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunen in iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark, 10 ila 200 mg/kg arasındaki olaquindox içeriği 
için  aynı ürün üzerinde yapılan 2 parelel arasındaki fark yüksek sonucakıyasla  % 15’i geçmemelidir.  
7.3.  Geri kazanım  
Standart eklenmiş bir kör numune için geri kazanım en az %  90 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
144 
 Bir EC ortak çalışması düzenlenmiş, bu çalışmada 13 laboratuvar  tarafından bir kör yem de dahil dört domuz 
yavrusu yemi numunesi analiz edilmiştir. Sonuçlar aşağıda verilmiştir:  
 Numune 1  Numune 2  Numune 3  Numune 4  
L  13 10 11 11 
n  40 40 44 44 
ortalama [mg/kg]  — 14,6 48,0 95,4 
sr [mg/kg]  — 0,82 2,05 6,36 
SR [mg/kg]  — 1,62 4,28 8,42 
CV r [%]  — 5,6 4,3 6,7 
CV R [%]  — 11,1 8,9 8,8 
Nominal içerik [mg/kg]  — 15 50 100 
geri kazanım %  — 97,3 96,0 95,4 
 
L = Laboratuvar ların sayısı  
n= Tekil değerlerin sayısı  
sr = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı.  
9.  Gözlem  
Metot, 100 mg/kg’dan fazla olaquindox içeren yemler için valide edilmemiş olsa da, daha az numune ağırlığı 
alarak ve/veya ekstraktı (5.2) kalibrasyon grafiğinin (5.3.2) aralığı aralığında ki bir konsantrasyon a erişecek 
şekilde seyrelterek tatmin edici sonu çlar almak mümkündür.  
C.  AMPROLİUM TAYİNİ  
1-[(4-amino -2-propilpirimidin -5-il)metil] -2-metil -piridinyum klorür hidroklorür  
1.  Amaç ve Kapsam  
Bu metot, yemdeki ve premikslerdeki amprolium seviyesinin tayinini  mümkün kılar. Tespit limiti 1 mg/kg, 
ölçüm limiti 5 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  145 
 Numune su -metanol karışımı ile ekstrakte edilir. Mobil faz ile seyreltilip membran ile süzüldükten sonra, 
amprolium içeriği, bir UV detektörü kullanan katyon değişimi yüksek perfor manslı sıvı kromatografisi (HPLC) 
ile tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Metanol.  
3.2.  Asetonitril, HPLC saflıkta . 
3.3.  Su, HPLC saflıkta . 
3.4.  Sodyum dihidrojen fosfat çözeltisi, c = 0,1 mol/l.  
13,80 g sodyum dihidrojen fosfat monohidrat 1000 ml’lik balon jojede su (3.3) içinde çözündürülür, suyla (3.3) 
hacmi tamamlanır ve karıştırılır.  
3.5.  Sodyum perklorat çözeltisi, c = 1,6 mol/l.  
224,74 g sodyum perklorat monohidrat 1000 ml’lik balon jojede su (3.3) içinde çözündürülür, suyla (3.3) hacmi 
tamamlanır ve karıştırılır.  
3.6.  HPLC için mobil faz (bakınız 9.1)  
Asetonitril (3.2), sodyum dihidrojen fosfat çözeltisi (3.4) ve sodyum perklorat çözeltisi (3.5) karışımı, 
450+450+100 (v+v+v). Kullanmadan ö nce 0,22 μm’lik bir membran filtreden (4.3) süzülür ve çözelti gazdan 
arındırılır (örn. Ultrasonik banyoda (4.4) en az 15 dakika).  
3.7. Standard madde: saf amprolium, 1 -[(4-amino -2-propilpirimidin -5-il)metil] -2-metil -piridinyum klorür 
hidroklorür, E 750 (b akınız 9.2).  
3.7.1.  Amprolium stok standart çözeltisi, 500 μg/ml  
50 mg amprolium (3.7) en  az 0,1 mg hassasiyetle 100 ml’lik balon jojeye tartılır, 80 ml metanol (3.1) içinde 
çözündürülür ve balon joje 10 dakika ultrasonik banyoya (4.4) konur . Ultrasonik işlemden sonra çözelti oda 
sıcaklığına getirilir, su ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle 
stabildir.  
3.7.2.  Amprolium ara standart çözeltisi, 50 μg/ml  
5,0 ml stok standart çözeltisi (3.7.1) 50 ml’lik b alon jojeye alınır , ekstraksiyon çözücüsüyle (3.8) işarete kadar 
tamamlanır ve karıştırılır. En fazla 4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle stabildir.  
3.7.3.  Kalibrasyon çözeltileri  
Bir dizi 50 ml’lik balon jojeye 0,5, 1,0 ve 2,0 ml ara standart çözeltisi ( 3.7.2) aktarılır.  
Mobil faz (3,6) ile işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Bu çözeltiler sırasıyla 0,5, 1,0 ve 2,0 μg/ml amprolium  
içerir . Bu çözeltiler kullanmadan önce taze olarak hazırlanmalıdır.  
3.8. Ekstraksiyon çözücüsü.  
Metanol (3.1) -su karışı mı 2+1 (v+v).  
4.  Cihaz  
4.1. 100 μl’lik hacimleri enjekte etmeye uygun enjeksiyon sistemli HPLC cihazı.  146 
 4.1.1.  Sıvı kromatografik kolon, 125 mm × 4 mm, katyon değişimi Nucleosil 10 SA, 5 ya da 10 μm dolgu ya da 
eşdeğeri.  
4.1.2.  Değişken dalga boyu ayarl ı UV detektörü ya da Diode Array dedektörü. (DAD)  
4.2.  Membran filtre, PTFE materyali, 0,45 μm.  
4.3.  Membran filtre, 0,22 μm.  
4.4.  Ultrasonik banyo.  
4.5. Mekanik çalkalayıcı ya da manyetik karıştırıcı.  
5.  Metot  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Kör yem  
Geri kazanım testinin (5.1.2) performansında, amprolium ya da girişim yapan maddeleri içermeyen  bir kör yem 
analiz edilmelidir. Kör yem numunedekine benzer türde olmalı ve analizde, amprolium ya da etkileyen maddeler 
tespit edilmemelidir.  
5.1.2.  Geri kazanım testi  
Numunedeki varlığına yakın miktarda amprolium eklenen kör yem analiz edilerek bir geri kazanım testi 
yapılmalıdır. 100 mg/kg düzeyinde geri kazanım  için 10,0 ml stok standardı çözeltisi (3.7.1) 250 ml’lik erlene 
aktarılır ve çözelti yaklaşık 0,5 ml’ye buhar laştırılır.  
50 g kör yem eklenir, iyice karıştırılır 10 dakika dinlendirilir, ekstraksiyona (5.2) geçilmeden önce birkaç kez 
yeniden karıştırılır.  
Alternatif olarak, numune ile benzer türde bir kör yem mümkün değilse (bakınız 5.1.1), standart ekleme metodu  
yoluyla bir geri kazanım testi gerçekleştirilebilir. Bu durumda analiz edilecek numune, zaten numune içinde 
mevcut olana benzer bir miktar amprolium eklenir. Bu numune standart eklenmiş numune ile birlikte analiz 
edilir ve  standart ekleme yöntemi ilegeri  kazanım hesaplanabilir . 
5.2.  Ekstraksiyon  
5.2.1.  Premiksler (içerik < %  1 amprolium) ve yem  
Amprolium içeriğine göre 5 -40 g numune 0,01 g hassasiyetle 500 ml’lik bir konik cam malzemeye tartılır ve 200 
ml ekstraksiyon çözücüsü (3.8) eklenir. Balon joje ultrasonik banyoya (4.4) konur  ve 15 dakika bırakılır. Balon 
joje ultrasonik banyodan alınır ve 1 saat  çalkalayıcıda çalkalanır ya da manyetik karıştırıcıda (4.5) karıştırılır. 
Ekstrakttan temsili bir miktarı mobil faz (3.6) ile 0,5 -2 μg/ml amprolium içer iğine seyreltilir ve karıştırılır 
(bakınız 9.3). Bu seyreltilmiş çözeltiden 5 -10 ml bir membran filtrede (4.2) süzülür. HPLC tayinine (5.3) geçilir.  
5.2.2.  Premiksler (içerik ≥ %  1 amprolium)  
Amprolium içeriğine göre 1 -4 g premiki 0,001 g hassasiyetle 500  ml’lik bir konik cam malzemeye tartılır ve 200 
ml ekstraksiyon çözücüsü (3.8) eklenir. Balon joje ultrasonik banyoya (4.4) konur  ve 15 dakika bırakılır. Balon 
joje ultrasonik banyodan alınır ve 1 saat çalkalayıcıda çalkalanır ya da manyetik karıştırıcıda (4.5) karıştırılır. 
Ekstrakttan temsili bir miktarı mobil faz (3.6) ile 0,5 -2 μg/ml amprolium içeriğine seyreltilir ve karıştırılır. Bu 
seyreltilmiş çözeltiden 5 -10 ml’si bir membran filtrede (4.2) süzülür. HPLC tayinine (5.3) geçilir.  
 147 
 5.3.  HPLC tayini  
5.3.1.  Parametreler:  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir.  
Sıvı kromatografik   
kolon (4.1.1):   125 mm × 4 mm, katyon değişimi Nucleosil 10 SA, 5 
ya da 10 μm dolgu ya da eşdeğeri.  
 
Mobil faz (3,6):  Asetonitril (3.2), sodyum dihidrojen fosfat çözeltisi 
(3.4) ve sodyum perklorat çözeltisi (3.5) karışımı, 
450+450+100 (v+v+v).  
Akış hızı:  0,7-1 ml/dak  
Tespit dalga boyu:  264 nm  
Enjeksiyon hacmi:  100 μl  
 
1,0 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisi (3.7.3), tutarlı pik yükseklikleri ve alıkonma süreleri elde edene kadar 
birkaç kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.3.2.  Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.7.3) birkaç kez enjek te edilir ve her bir konsantrasyonun ortalama pik 
yükseklikleri (alanları) tayin edilir. Kalibrasyon çözeltilerinin apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlarına 
ordinatlarda denk gelen ortalama pik yüksekliklerini (alanlar) kullanarak bir kalibrasyon graf iği çizilir.  
5.3.3.  Numune çözeltisi  
Kalibrasyon çözeltileri için alınanla aynı hacmi kullanarak numune ekstraktı (5.2) birkaç kez enjekte edilir ve 
amprolium piklerinin ortalama pik yüksekliği (alan) belirlenir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalibrasyon gr afiğini (5.3.2) referans alınarak, aynı çözeltinin amprolium piklerinin ortalama yüksekliğinden 
(alan), numune çözeltisinin konsantrasyonu μg/ml cinsinden tayin edilir.  
Numunenin mg/kg cinsinden amprolium içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
V = Ekstraksiyon çözücüsünün (3.8) 5.2’e göre hacmi, ml (örneğin 200 ml)  
c = Numune ekstraktının amprolium konsantrasyonu, μg/ml  
f = 5.2’ye göre seyreltme faktörü  
m = Analize alınan numune ağırlığı, g   
 
148 
 7.  Sonuçların validasyonu  
7.1.  Tanım lama  
Analitin tanımlanması ortak kromatografi ile ya da numune ekstraktının (5.2) ve 2,0 μg/ml içeren kalibrasyon 
çözeltisinin (3.7.3) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektörü kullanılarak tanımlanır.  
7.1.1.  Ortak kromatografi (co -chromatog raphy)  
Bir numune ekstraktına (5.2), uygun miktarda kalibrasyon çözeltisi (3.7.3) eklenir. Eklenen amprolium miktarı 
numune ekstraktında bulunan amprolium miktarına benzer olmalıdır.  
Hem eklenen miktar hem de ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnı zca amprolium pikinin yüksekliği 
artırılmalıdır. Yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliği, kirletilmemiş numune ekstraktının orijinal 
amprolium piki genişliğinin ± % 10 aralığında olmalıdır.  
7.1.2.  Diode Array Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere  göre değerlendirilir:  
(a) Numunedeki maksimum absobsiyon ve standart spectranın tepe noktasındaki dalga boyu diode array 
sisteminin limitleri içinde olmalıdır.   
Diode Array saptama için bu tipik olarak ± 2 nm’dir.  
(b) 210 ile 320 nm arasında, kromatogram ın pik tepe noktasında kaydedilen numune ve standart spektrumlar, 
spektrumun % 10 ila % 100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için farklı olmamalıdır. Bu kriter aynı 
maksimum piki olduğunda ve gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sap ma, standart analizin 
absorbansının % 15’ini geçmediğinde karşılanır.  
 c) 210 ile 320 nm arasında, aynı ekstraktına ait  pikin yukarı eğim, apeks ve aşağı eğim spektrumları, 
spektrumun % 10 ila % 100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı olmamalıdır. Bu kriter, 
aynı maksimum piki olduğunda ve gözlenen tüm noktalarda spektrumlar arasındaki sapma, pik tepe noktası 
spektrumunun absorbansının % 15’ini geçmediğinde karşılanır.  
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanm amıştır.  
7.2.  Tekrar edilebilirlik  
Aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki farkı aşağıdaki değerleri geçmemelidir:  
— 25 mg/kg ila 500 mg/kg amprolium içeriği için daha yüksek değere bağıl % 15,  
— 500 mg/kg ile 1.000 mg/kg arasındaki ampr olium içeriği için 75 mg/kg,  
— 1000 mg/kg’dan fazla amprolium içeriği için fark  yüksek değere kıyasla  % 7,5 İ geçmemelidir.  
7.3.  Geri kazanım  
Standart eklenmiş bir (kör) numune için geri kazanım en az % 90 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
Bir ortak çalışma düzenlenmiş, bu çalışmada üç kanatlı  yemi (numune 1 -3), bir mineral yem (numune 4) ve bir 
premiks (numune 5) analiz edilmiştir. Sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir:  
 149 
  
 Numune 1  
(kör yem)  Numune 2  Numune 3  Numune 4  Numune 5  
L  14 14 14 14 15 
n  56 56 56 56 60 
ortalama [mg/kg]  — 45,5 188 5129  25140  
sr [mg/kg]  — 2,26 3,57 178 550 
CV r [%]  — 4,95 1,90 3,46 2,20 
sR [mg/kg]  — 2,95 11,8 266 760 
CV R [%]  — 6,47 6,27 5,19 3,00 
nominal içerik [mg/kg]  — 50 200 5000  25000  
 
L = Laboratuvar ların sayısı  
n= Tekil değerlerin sayısı  
sr = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  değişim  katsayısı.  
9. Gözlemler  
9.1.  Numune tiamin içeriyorsa, tiamin piki kromatogramda amprolium pikinden biraz önce görünür. Bu metodu 
uygularken  amprolium ve tiamin ayrılmalıdır. Numunedeki Amprolium ve tiamin bu metotda kullanılan kol on 
(4.1.1) tarafından ayrılmazsa, mobil fazın %  50 asetonitril kısmı (3.6) metanol ile değiştirilir.  
9.2.  İngiliz Farmakopesine göre bir amprolium çözeltisinin (c = 0,02 mol/l) hidroklorik asit (c = 0,1 mol/l) 
içindeki spektrumu 246 nm ve 262 nm’de maksimum pikler gösterir. Absorbans 246 nm’de 0,84 ve 262 nm’de 
0,80 olmalıdır.  
9.3.  Ekstrakt her zaman mobil fazla seyreltilmelidir, çünkü amprolium pikinin  alıkonma süresi iyonik güçteki 
değişime bağlı olarak önemli oranda kayabilir.  
Ç.  CARBADOX  TAYİNİ  
Methil 3 -(2-kinoksalinilmetilen) carbazate N1,N4 -dioksit 150 
 1.  Amaç ve kapsam  
Bu metot, yemlerdeki, premikslerdeki ve preparatlardaki carbadox seviyesinin tayinini mümkün kılar. Tespit 
limiti 1 mg/kg, ölçüm limiti 5 mg/kg’dır.  
2.  Prensip  
Numune su ile dengelenir ve metanol -asetonitril ile ekstrakte edilir. Filtrelenmiş yem ekstraktındantan temsili bir 
miktar, alüminyum oksit kolonunda temizlemeye tabi tutulur. Premiksler ve preparatlar için filtrelenmiş 
ekstrakttan bir miktar, su, metanol ve asetonitril ile uygun konsantrasyona seyreltilir. Carbadox içeriği,  bir UV 
detektörü kullanılarak ters fazlı yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) ile tayin edilir.  
3.  Ayıraçlar  
3.1.  Metanol  
3.2.  Asetonitril, HPLC kullanım saflığında  
3.3.  Asetik asit, w = %  100 
3.4.  Alüminyum oksit: nötr, etkinlik derecesi I  
3.5.  Metanol -asetonitril 1+1 (v+v), 500 ml metanol (3.1) 500 ml asetonitril (3.2) ile karıştırılır.  
3.6.  Asetik asit, σ = %  10,  10 ml asetik asit (3.3) suyla 100 ml’ye seyreltilir.  
3.7.  Sodyum asetat.  
3.8.  Su, HPLC saflıkta  
3.9.  Asetat tampon çözelti si, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0,  0,82 g sodyum asetat (3.7) 700 ml su (3.8) içinde 
çözündürülür ve asetik asitle (3.6) pH’ı 6,0’a ayarlanır. 1000 ml’lik balon jojeye aktarılır, su (3.8) ile işarete 
kadar tamamlanır ve karıştırılır.  
3.10.  HPLC için mobil faz , 825 ml asetat tampon çözeltisi (3.9) 175 ml asetonitril (3.2) ile karıştırılır. 0,22 μm 
filtreden (4,5) süzülür ve çözelti gazdan arındırılır (örneğin 10 dakika ultrason su banyosu ile ). 
3.11.  Standard madde, Saf carbadox: Methil 3 -(2-kinoksalinilmetile n) carbazate N1,N4-dioksit, E 850.  
3.11.1. Carbadox stok standart çözeltisi, 100 μg/ml (bakınız 5. Metot Not), 25 mg carbadox standart maddesi 
(3.11) 0,1 mg hassasiyetle 250 ml’lik balon jojeye tartılır.  
Metanol -asetonitril (3.5) içinde ultrason su banyosu  ile (4.7) çözündürülür. Ultrasonik işlemden sonra çözelti oda 
sıcaklığına getirilir, metanol asetonitril (3.5) ile hacmi işarete kadar tamamlanır ve karıştırılır. Balon joje 
alüminyum folyo ile sarılır ya da amber renkli cam malzeme kullanılır ve bir buzd olabında saklanır. En fazla 
4°C sıcaklıkta çözelti 1 ay süreyle stabildir.  
3.11.2.  Kalibrasyon çözeltileri  
Bir dizi 100 ml’lik balon jojeye 2,0, 5,0, 10,0 ve 20,0 ml stok standart çözeltisi (3.11.1) aktarılır. 30 ml su 
eklenir, metanol -asetonitril (3.5) i le hacmi tamamlanır ve karıştırılır. Balon jojeler alüminyum folyo ile sarılır. 
Bu çözeltiler sırasıyla 2,0, 5,0, 10,0 ve 20,0 μg/ml carbadox’içerir. Kalibrasyon çözeltileri kullanılmadan önce 
taze olarak hazırlanmalıdır . 
Not: 10 mg/kg’dan az içeren yemler de carbadox tayini için, konsantrasyonu 2,0 μg/ml altındaki kalibrasyon 
çözeltileri hazırlanmalıdır.  151 
 3.12.  Su-[metanol -asetonitril] (3.5) karışımı, 300 + 700 (v + v), 300 ml suyla 700 ml metanol -asetonitril 
karışımı (3.5) karıştırılır.  
4.  Cihaz  
4.1.  Laboratuvar  çalkalayıcısı ya da manyetik karıştırıcı  
4.2.  Fiberglas filtre kağıdı (Whatman GF/A ya da eşdeğeri)  
4.3.  Sinterlenmiş cam lı ve sıvı geçirme valflı cam kolon (300 ila 400 mm uzunluk yaklaşık 10 mm iç çap)  
Not: Ayrıca musluk takılı bir cam kolon ya da konik uçlu bir cam kolon da kullanılabilir; bu durumda cam 
yününden küçük bir tapa alt uca sokulur ve bir cam çubuk kullanılarak sıkıştırılır.  
4.4.  20 μl’lik hacimleri enjekte etmeye uygun enjeksiyon sistemli HPLC ekipmanı  
4.4.1.  Sıvı kromatografi k kolon: 300 mm x 4 mm, C 18, 10 μm dolgu ya da eşdeğeri  
4.4.2. Değişken dalga boyu ayarlı UV detektörü ya da 225 – 400 nm aralığında çalışan Diode Array detektörü  
4.5.  Membran filtre, 0,22 μm  
4.6.  Membran filtre, 0,45 μm  
4.7.  Ultrasonik banyo  
5.  Metot  
Not: Carbadox ışığa duyarlıdır. Tüm metotlar hafif ışık altında ya da amber renkli cam malzeme ya da 
alüminyum folyo sarılmış cam malzeme kullanarak gerçekleştirilir.  
5.1.  Genel  
5.1.1.  Kör yem  
Geri kazanım testinin (5.1.2) performansında, carbadox ya da girişim yapan  maddelerin olmadığını kontrol 
etmek için bir kör yem analiz edilmelidir. Kör yem numunedekine benzer türde olmalı ve analizde, carbadox ya 
da etkileyen maddeler tespit edilmemelidir . 
5.1.2.  Geri kazanım testi  
Numunedeki varlığına yakın mikta rda carbadox eklenerek kirletilen kör yem (5.1.1) analiz edilerek bir geri 
kazanım testi yürütülmelidir. 50 mg/kg düzeyinde kirletmek için 5,0 ml stok standart çözeltisi (3.11.1) 200 
ml’lik erlene aktarılır. Çözelti, bir azot akışında yaklaşık 0,5 ml’ye bu harlaştırılır. 10 g kör yem eklenir, 
karıştırılır ve ekstraksiyon adımıyla (5.2) devam etmeden önce 10 dakika beklenir.  
Alternatif olarak, numune ile benzer türde bir kör yem mümkün değilse (bakınız 5.1.1), standart ekleme metodu 
yoluyla bir geri kazanım t esti gerçekleştirilebilir. Bu durumda numune, zaten numune içinde mevcut olana 
benzer bir miktar carbadox ile zenginleştirilir. Bu numune zenginleştirilmemiş numune ile birlikte analiz edilir 
ve standart ekleme metodu yoluyla geri kazanım hesaplanabilir . 
5.2.  Ekstraksiyon  
5.2.1.  Yem  
10 g numune 0,01 g hassasiyetle tartılır ve 200 ml’lik erlene aktarılır. 15,0 ml su eklenir, karıştırılır ve 5 dakika 
bekletilir. 35,0 ml metanol -asetonitril (3.5) eklenir, kapatılır ve 30 dakika çalkalayıcıda çalkalanır ya da  152 
 manyetik karıştırıcıda (4.1) karıştırılır. Çözelti fiberglas süzgeç kağıdından (4.2) süzülür. Bu çözelti saflaştırma 
adımı (5.3) için tutulur . 
5.2.2.  Premiksler (%  0,1 ile %  2,0) 
1 g öğütülmemiş numune 0,001 g hassasiyetle tartılır ve 200 ml’lik erlene aktarılır. 15,0 ml su eklenir, karıştırılır 
ve 5 dakika dengelenir. 35,0 ml metanol -asetonitril (3.5) eklenir, kapatılır ve 30 dakika çalkalayıcıda çalkalanır 
ya da manyetik karıştır ıcıda (4.1) karıştırılır. Çözelti fiberglas süzgeç kağıdından (4.2) süzülü r. 
Temsili miktarda filtrat 50 ml’lik balon jojeye pipetlenir. 15,0 ml su eklenir, metanol -asetonitril (3.5) ile işarete 
kadar tamamlanır ve karıştırılır. Nihai çözeltideki carbadox konsantrasyonu yaklaşık 10 μg/ml olmalıdır. Temsili 
bir miktar, 0,45 μm’li k bir filtreden (4,6) süzülür. HPLC tayinine (5,4) geçilir.  
5.2.3.  Preparatlar ( > %  2) 
0,2 g öğütülmemiş numune 0,001 g hassasiyetle  tartılır ve 250 ml’lik erlene aktarılır. 45,0 ml su eklenir, 
karıştırılır ve 5 dakika bekletilir. 105,0 ml metanol -aseto nitril (3.5) eklenir, kapatılır ve homojenleştirilir.  
Numune 15 dakika ultrasonik su banyosunda  (4.7) t tutulur, ardından 15 dakika çalkalanır ya da karıştırılır (4.1). 
Çözelti fiberglas süzgeç kağıdından (4.2) süzülür . 
Temsili miktarda filtrat su -metanol -asetonitril (3.12) karışımı ile 10 -15 μg/ml’lik nihai bir carbadox 
konsantrasyonuna (%  10’luk bir preparat için seyreltme faktörü 10’dur) seyreltilir. Temsili bir miktar, 0,45 
μm’lik bir filtreden (4,6) süzülür. HPLC tayinine (5,4) geçilir.  
5.3.  Saflaştı rma 
5.3.1.  Alüminyum oksit kolonunun hazırlanması  
4 g alüminyum oksit (3.4) tartılır ve cam kolona (4.3) aktarılır.  
5.3.2.  Numune saflaştırma  
15 ml filtrelenmiş ekstrakt (5.2.1) alüminyum oksit kolonuna uygulanır ve ilk 2 ml’lik ekstrakt  atılır. Sonraki 5 
ml’lik ekstrakte edilen kısım alınır ve temsili bir miktarı 0,45 μm’lik bir filtreden (4.6) süzülür. HPLC tayinine 
(5,4) geçilir . 
5.4.  HPLC tayini  
5.4.1.  Parametreler  
Aşağıdaki koşullar rehberlik amacıyla sunulmuştur; eşdeğer sonuçlar vermeleri kaydıyla diğer koşullar da 
kullanılabilir:  
Sıvı kromatografik   
kolon (4.4.1):  300 mm x 4 mm, C 18, 10 μm dolgu ya da eşdeğeri  
Mobil faz (3,10):  Asetat tampon çözeltisi (3.9) ve asetonitril (3.2) karışımı, 
825 + 175 (v+v).  
Akış hızı:  1,5-2 ml/dak.  
Tespit  dalga boyu:  365 nm  
Enjeksiyon hacmi:  20 μl  153 
  
5,0 μg/ml içeren kalibrasyon çözeltisi (3.11.2), tutarlı pik yükseklikleri (alanlar) ve alıkonma süreleri elde 
edilene kadar birkaç kez enjekte edilerek kromatografik sistemin stabilitesi kontrol edilir.  
5.4.2.  Kalibrasyon grafiği  
Her bir kalibrasyon çözeltisi (3.11.2) birkaç kez enjekte edilir ve her bir konsantrasyonun pik yükseklikleri 
(alanları) ölçülür. Kalibrasyon çözeltilerinin apsisteki μg/ml cinsinden konsantrasyonlarına ordinatlarda denk 
gelen o rtalama pik yükseklikleri ya da alanları kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi çizilir.  
5.4.3.  Numune çözeltisi  
Numune ekstraktı (yem için (5.3.2), Premiksler için (5.2.2) ve preparatlar için (5.2.3)) birkaç kez enjekte edilir 
ve carbadox piklerinin ortalam a pik yüksekliği (alan) belirlenir.  
6.  Sonuçların hesaplanması  
Kalibrasyon grafiği (5.4.2) referans alınarak, aynı çözeltinin carbadox piklerinin ortalama yüksekliğinden (alan), 
numune çözeltisinin carbadox konsantrasyonu μg/ml cinsinden tayin edilir.  
6.1.  Yemler  
Numunedeki mg/kg cinsinden carbadox içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
c = Numune ekstraktının (5.3.2) carbadox konsantrasyonu, μg/ml  
V1 = Ekstraksiyon hacmi, ml (örneğin 50)  
m = Test kısmının ağırlığı, g  
6.2. Premiksler  ve preparatlar  
Numunedeki mg/kg cinsinden carbadox içeriği “w” aşağıdaki formülle elde edilir:  
  
Burada;  
c = Numune ekstraktının (5.2.2 ya da 5.2.3) carbadox konsantrasyonu, μg/ml  
V2 = Ekstraksiyon hacmi, ml (örneğin premiksler  için 50, preparatlar için 150) 
f = 5.2.2’ye (Premiksler) ya da 5.2.3'e (preparatlar) göre seyreltme faktörü  
m = Test kısmının ağırlığı, g  
7.  Sonuçların validasyonu  
7.1 Tanımlama   
154 
 Analitin tanıması co-kromatografi  ile ya da numune ekstraktının ve 10,0 μg/ml içeren kalibrasyon çözel tisinin 
(3.11.2) spektrumlarının karşılaştırılacağı bir Diode Array dedektörü kullanılarak onaylanabilir.  
7.1.1.  Ortak kromatografi ( co -chromatography)  
Bir numune ekstraktına, uygun miktarda kalibrasyon çözeltisi (3.11.2) eklenir. Eklenen carbadox miktarı 
numune ekstraktında bulunan tahmini carbadox miktarına benzer olmalıdır. Hem eklenen miktar hem de 
ekstraktın seyreltilmesi hesaba katılarak yalnızca carbadox pikinin yüksekliği artırılmalıdır. Maksimum 
yüksekliğinin yarısı boyutundaki pik genişliğ i orijinal genişliğin yaklaşık % 10’u aralığında olmalıdır . 
7.1.2.  Diode Array Tanımlama  
Sonuçlar aşağıdaki kriterlere göre değerlendirilir:  
(a) Numunedeki maksimum absobsiyon ve standart spectranın tepe noktasındaki dalga boyu diode array 
sisteminin limi tleri içinde olmalıdır.  
(b) 225 ile 400 nm arasında, kromatogramın pik tepe noktasıkaydedilen numune ve standart spektrumlar, 
spektrumun % 10 ila % 100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için farklı olmamalıdır. Bu kriter aynı 
maksimum piki olduğunda v e gözlenen noktaların hiçbirinde iki spektrum arasındaki sapma, standart analizin 
absorbansının % 15’ini geçmediğinde karşılanır . 
 c) 225 ile 400 nm arasında, aynı ekstrakt tarafından üretilen pikin yukarı eğim, tepe noktası ve aşağı eğim 
spektrumları, spe ktrumun % 10 ila % 100 bağıl absorbans aralığındaki bölümleri için birbirinden farklı 
olmamalıdır. Bu kriter, aynı maksimum piki olduğunda ve gözlenen tüm noktalarda spektrumlar arasındaki 
sapma, tepe noktası spektrumunun absorbansının % 15’ini geçmediğind e karşılanır . 
Bu kriterlerden biri karşılanmazsa analitin varlığı doğrulanmamıştır.  
7.2.  Tekrar edilebilirlik  
10 mg/kg ya da yüksek içerik için, aynı numunenin iki paralel tayininin sonuçları arasındaki fark daha yüksek 
sonuc un % 15’ini geçmemelidir.  
7.3.  Geri kazanım  
Zenginleştirilmiş bir (kör) numune için geri kazanım en az %  90 olmalıdır.  
8.  Ortak bir çalışmanın sonuçları  
Bir ortak çalışma düzenlenmiş, bu çalışmada 8 laboratuvar  tarafından 6 yem, 4 premiks ve 3 preparat numunesi 
analiz edilmiştir. Her numunede analizler paralel olarak gerçekleştirilmiştir. (Bu ortak çalışma hakkında daha 
ayrıntılı bilgi için bkz. Journal of the AOAC, Volume 71, 1988, p. 484 -490). Sonuçlar (atılan lar dışında) aşağıda 
verilmiştir:  
Tablo 1  
Yem için ortak çalışmanın sonuçları  
 Numune 1  Numune 2  Numune 3  Numune 4  Numune 5  Numune 6  
L  8 8 8 8 8 8 
n  15 14 15 15 15 15 155 
 Ortalama (mg/kg)  50,0 47,6 48,2 49,7 46,9 49,7 
sr (mg/kg)  2,90 2,69 1,38 1,55 1,52 2,12 
CV r (%)  5,8 5,6 2,9 3,1 3,2 4,3 
SR (mg/kg)  3,92 4,13 2,23 2,58 2,26 2,44 
CV R (%)  7,8 8,7 4,6 5,2 4,8 4,9 
Nominal içerik (mg/kg)  50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 
 
Tablo 2  
Premiksler ve preparatlar için ortak çalışmanın sonuçları  
 Premiksler  Preparatlar  
 A B C D A B C 
L  7 7 7 7 8 8 8 
n  14 14 14 14 16 16 16 
Ortalama (g/kg)  8,89 9,29 9,21 8,76 94,6 98,1 104 
sr (g/kg)  0,37 0,28 0,28 0,44 4,1 5,1 7,7 
CV r (%)  4,2 3,0 3,0 5,0 4,3 5,2 7,4 
SR (g/kg)  0,37 0,28 0,40 0,55 5,4 6,4 7,7 
CV R (%)  4,2 3,0 4,3 6,3 5,7 6,5 7,4 
Nominal içerik (g/kg)  10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100 
L = Laboratuvar ların sayısı  
n= Tekil değerlerin sayısı  
sr = Tekrar edilebilirliğin  standart sapması  
CV r = Tekrar edilebilirliğin  değişim  katsayısı  
SR = Tekrar üretilebilirliğin  standart sapması  
CV R = Tekrar üretilebilirliğin  vacvrryasyon katsayısı