(Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
SECRETARIA DE SALUD  
PROYECTO de Norma Oficial Mexicana PROY -NOM -210-SSA1 -2013, Productos y servicios. Métodos de prueba 
microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y 
toxinas microbianas.  
Al marg en un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos. - Secretaría de Salud.  
MIKEL ANDONI ARRIOLA PEÑALOSA, Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de 
Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en los artículos 39, f racción XXI, de la Ley Orgánica de la 
Administración Pública Federal; 4 o., de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3 o., fracciones XXII y 
XXIV, 13, apartado A), fracciones I y II, 17 Bis, 194, fracción I, 195, 197, 199 y 214, de la Ley General d e 
Salud; 38, fracción II, 40, fracciones I, III, VII, XI y XIII, 41, 47, fracción I y 52, de la Ley Federal sobre 
Metrología y Normalización; 28 y 33, del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 4 o., 
15 y Quinto Transitorio, del Regl amento de Control Sanitario de Productos y Servicios; 2 o., Apartado C, 
fracción X y 36, del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud, y 3, fracciones I, literal s) y II, y 10, 
fracciones IV y VIII, del Reglamento de la Comisión Federal para la Protecc ión contra Riesgos Sanitarios; he 
tenido a bien ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación del Proyecto de Norma Oficial 
Mexicana PROY -NOM -210-SSA1 -2013, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. 
Determinación de microorga nismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y  toxinas 
microbianas.  
El presente proyecto se publica a efecto de que los interesados, dentro de los siguientes 60 días naturales, 
contados a partir de la fecha de su publicación, presenten s us comentarios por escrito, en idioma español  y 
con el sustento técnico suficiente ante el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y 
Fomento Sanitario, sito en Oklahoma N o. 14, colonia Nápoles, Delegación Benito Juárez, código postal 
0381 0, México, Distrito Federal, teléfono 5080 5200, extensión 1333, fax 5511 1499, correo electrónico 
rfs@cofepris.gob.mx.  
Durante el plazo mencionado, los documentos que sirvieron de base para la elaboración del proyecto 
estarán a disposición del público par a su consulta en el domicilio del Comité.  
PREFACIO  
En la elaboración de la presente norma participaron las siguientes Instituciones y Organismos.  
SECRETARÍ A DE SALUD.  
Comisión Federal para la Protec ción contra Riesgos Sanitarios.  
RED NACI ONAL DE LABORATORI OS DE SALUD PÚ BLICA.  
Laboratorio de Análisis de Riesgo del Distrito Federal.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública del Estado de Chiapas.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Tamaulipas.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública Coahuila.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Jalisco.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Tlaxcala.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Nayarit.  
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sonora.  
Laboratorio Estat al de Salud Pública de Sinaloa.  
SERVICIOS DE SALUD DEL ESTADO D E PUEBLA.  
Subdirección de Servicios Auxiliares de Diagnóstico y Tratamiento de los Servicios de Salud del Estado  de 
Puebla.  
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.  
Facultad de Química.  
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL.  
Laboratorio de Investigación y Asisten cia Técnica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN.  
Facultad de Ciencias Biológicas.  
CÁMARA NACIONAL DE LA INDUSTRIA DE LA LECHE.  
Organismo Nacional de Normalización de Productos Lácteos, A.C.  
RED DE TERCEROS AUTO RIZADOS.  
Analysis & Research Lab, S.A. de C.V.  
Laboratorio de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.  
Centro de Capacitación en Calidad Sanitaria, S.A. de C.V.  
Centro Estatal de Laboratorios.  
Laboratorios Valdés, S.A. de C.V.  
Grupo Cencon Centro de Con trol, S.A. de C.V.  
Centro de Diagnóstico Microbiológico, S.A. de C.V.  
Microlab Industrial, S.A. de C.V.  
Silliker México, S.A. de C.V. Unidad Querétaro.  
Laboratorio Quibimex, S.A. de C.V.  
Laboratorios de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.  
Labora torio de Control de Calidad de Aguas, Bebidas y Alimentos.  
Laboratorio de Bioquímica y Genética de Microorganismos.  
Laboratorio Bio -Tekax.  
Laboratorios del Sureste Cencon -Baqin, S.A. de C.V.  
Centro de Control Total de Calidades, S.A. de C.V.  
Laboratorio Industrial de Control para Alimentos, S.A. de C.V.  
ÍNDICE  
1. Objetivo y campo de aplicación.  
2. Referencias.  
3. Definiciones.  
4. Símbolos y abreviaturas.  
5. Consideraciones generales.  
6. Equipo.  
7. Medios de cultivo.  
8. Cepas de referencia  
9. Concordancia  con normas internacionales.  
10. Bibliografía.  
11. Vigilancia de la norma.  
12. Vigencia.  
13. Apéndices.  
Apéndice Normativo A.  Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp.  
Apéndice Normativo B.  Método de referencia para la estimación de la c uenta de Staphylococos aureus.  
Apéndice Normativo  C. Método de referencia para el asilamiento Listeria monocitogenes.  
Apéndice Normativo  D. Método aprobado para el recuento de Enterococos en agua.  
Apéndice Normativo E.  Método de referencia “Sustrato fluor ogénico para determinar enterococos en agua”.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Apéndice Normativo F.  Método aprobado para la determinación de Enterococos fecales en agua técnica 
de filtración por membrana.  
Apéndice Normativo G.  Método aprobado para el monitoreo de Enterococos fecales reco mendado para 
el monitoreo de aguas para uso recreativo.  
Apéndice Normativo H.  Método aprobado para la estimación de la densidad de Coliformes Fecales y 
Escherichia coli por la técnica del número más probable presentes en muestras de alimentos para consumo 
humano y agua.  
Apéndice normativo I.  Método aprobado para la estimación de la densidad de Escherichia coli por la 
técnica del número más probable, para productos de la pesca.  
1. Objetivo y campo de aplicación.  
1.1. Esta Norma tiene por objeto establecer lo s métodos generales de prueba y alternativos para la 
determinación de los siguientes indicadores microbianos y patógenos en alimentos y agua para uso y 
consumo humano que no cuentan con una norma específica de producto:  
● Salmonella spp.  
- Apéndice Normativo A.  
● Staphylococus aureus.  
- Apéndice Normativo B.  
● Listeria monocitogenes  
- Apéndice Normativo C.  
● Enterococos.  
- Apéndice Normativo D.  
- Apéndice Normativo E.  
- Apéndice Normativo F.  
- Apéndice Normativo G.  
● Coliformes.  
- Apéndice Normativo H.  
● Escherichia coli.  
- Apéndice Normativo H.  
- Apéndice Normativo I.  
 
1.2. Esta Norma es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas físicas o morales 
que se dedican a efectuar los métodos a que  se refiere el numeral anterior en alimentos para consumo 
nacional o de importación.  
2. Referencias.  
2.1. Norma Oficial Mexicana NOM -008-SCFI -2002.  Sistema General de Unidades de Medida.  
2.2. Norma Mexicana NMX -EC-17025 -IMNC -2006.  Requisitos generales par a la competencia de los 
laboratorios de ensayo y de calibración.  
3. Definiciones.  
Para fines de esta Norma se entiende por:  
3.1. Clostridium botulinum:  al bacilo Gram positivo, anaerobio y formador de esporas, productor de una 
potente neurotoxina. Según la  especificidad antigénica de la toxina producida por cada cepa, se conocen siete 
tipos diferentes: A, B, C, D, E, F y G.  
3.2. Coliformes:  a los bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que a 
32-35°C fermentan la lactosa co n formación de ácido y gas en un tiempo no mayor a 48 h.  
3.3. Coliformes fecales:  a los bacilos cortos Gram negativos, anaerobios facultativos, que fermentan la 
lactosa con producción  de ácido y de  gas a 45,5 ± 0,2°C en 24 a 48 h.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
3.4. Escherichia  coli: al microorganismo que  está presente en el intestino del hombre y animales de 
sangre caliente, por lo que su presencia en una muestra de alimento no es deseable. Este microorganismo es 
miembro de la familia Enterobacteriaceae  que incluye diferentes géneros d e interés sanitario ( Salmonella , 
Shigella  y Yersinia , entre otras). La mayoría de los aislamientos de E. coli  no son considerados como 
patógenos aunque pueden causar severas infecciones en personas inmunocomprometidas, en niños 
pequeños y ancianos. Ciertas  cepas al ser  ingeridas, pueden causar enfermedades gastrointestinales en 
individuos sanos.  Produce ácido en agar que contenga 5 -bromo -4-cloro -3-indol --D glucuronido y es  -
glucuronidasa positivo incubado a 44±1°C por 22 ±1°C.  
3.5. Enterococos intestinal es: al subgrupo de los Streptococcus que incluye Enterococcus faecalis , E. 
faecium , Enterococcus durans  y Enterococcus hirae . Son cadenas cortas o en pares de cocos Gram positivos, 
anaerobios facultativos, inmóviles, catalasa negativos. Al desarrollarse en  los medios adecuados son capaces 
de reducir el 2, 3, 5 – trifeniltetrazolio e hidrolizar la esculina a 44°C.  
3.6. Colonias:  al agrupamiento de células en forma de masas visibles, en un medio sólido que provienen 
teóricamente de una sola célula.  
3.7. Diluci ón primaria:  a la solución, suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una 
cantidad del producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.  
3.8. Diluciones decimales adicionales:  a las suspensiones o so luciones obtenidas al mezclar un 
determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repetición 
de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas 
para la in oculación de medios de cultivo.  
3.9. Hemólisis:  a la zona transparente alrededor de la colonia debida a la lisis total del eritrocito.  
3.10. Levaduras:  a los microorganismos cuya forma dominante de crecimiento es unicelular, no suelen 
formar filamentos. Po seen un núcleo definido y se multiplican por reproducción sexual o asexual, por 
gemación o por fisión transversal. La reproducción sexual cuando ocurre, es por medio de ascosporas 
contenidas en un saco o asca. Típicamente exhiben forma oval y algunas espec ies son cromógenas.  
3.11.  Listeria monocytogenes:  al bacilo corto, Gram positivo, no esporulado, móvil, aerobio facultativos, 
ß-hemolítico, catalasa positivo, oxidasa negativo, capaz de crecer en condiciones de microaerofília.  
3.12. Métodos de referencia:  a los métodos utilizados en casos de controversia nacional o internacional y 
en ausencia de un método aprobado.  
3.13.  Métodos aprobados:  a los métodos que pueden emplearse para fines de control, inspección, 
reglamentación o por un programa específico y pa ra decisiones para la protección contra riesgos sanitarios.  
3.14.  Métodos alternativos aprobados: a los métodos que se encuentran referidos en las referencias 
internacionales como AOAC Internacional, AFNOR, ISO, FDA, CODEX, entre otras y que cuentan con 
validación internacional y verificación  en el laboratorio de prueba, só lo pueden ser usados en el análisis del 
producto para el cual fue validado.  
3.15.  Mesofílico aerobio:  al microorganismo capaz de crecer en presencia de oxígeno y cuya temperatura 
óptima de crecimiento se encuentra entre los 20 y 37ºC.  
3.16.  Mohos:  al grupo de hongos microscópicos; organismos pertenecientes al reino Fungí , que se 
caracterizan por estar formados de una estructura filamentosa con ramificaciones que se conocen con el 
nombre d e hifas, el conjunto de hifas constituye el micelio, carecen de clorofila, se alimentan por absorción 
pudiendo propagarse por esporas o no, las paredes celulares pueden ser de queratina, celulosa o manana. 
Crecen formando colonias en un medio selectivo a 2 5-28°C.  
3.17.  Micrococus: al género de bacterias Gram -positivas con células esféricas de diámetro comprendido 
entre 0,5 y 3 micrómetros que típicamente aparecen en tétradas. Micrococcus tiene una gruesa pared celular 
que puede abarcar tanto como el 50% del  materia celular. Su genoma es rico en guanina y citosina (GC), 
típicamente en porcentaje del 65 al 75% de contenido Guanin -Citocina.  
3.18.  Muestra:  al número de unidades tomadas de un lote, que han sido seleccionadas en forma aleatoria 
y cuyas caracterís ticas son lo más similar posible a las del lote que procede.  
3.19.  Patógeno:  al microorganismo capaz de producir una enfermedad.  
3.20.  Psicrofílico:  al microorganismo que exhibe una temperatura óptima de crecimiento a 5 -7ºC como 
máximo. Tiene la capacidad de crecer a 0ºC.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
3.21.  Psicrotrófico:  al microorganismo que exhibe una temperatura óptima de crecimiento inferior a 20ºC, 
pero que puede desarrollarse a temperaturas de refrigeración.  
3.22.  Salmonella spp:  al bacilo Gram negativo, aerobio o anaerobio facul tativo, no esporulado, 
generalmente lactosa negativo y móviles. Es una bacteria patógena para el hombre y algunos animales.  
3.23.  Staphylococcus aureus:  a los cocos de 0,8 a 1,2µm, Gram positivo, anaerobio facultativo, no 
esporulado, inmóvil, catalasa posi tivo, capaz de producir toxinas y otras enzimas relacionadas con su 
patogenicidad.  
3.24.  Temperatura Ambiental:  a la que oscila entre 18°C y 27°C.  
3.25.  Termofílico aerobio:  al microorganismo capaz de crecer en presencia de oxígeno y cuya 
temperatura óptim a de crecimiento se encuentra por encima de los 50ºC.  
3.26.  Toxina:  a la sustancia productora de efectos tóxicos secretada por las bacterias patógenas.  
3.27.  Unidades Formadoras de Colonias:  al término que se utiliza para reportar la cuenta de colonias en 
placa, presuponiendo que cada colonia proviene de un solo microorganismo.  
3.28.  Vibrio cholerae:  al bacilo Gram negativo, curvo, móvil, no esporulado, anaerobio facultativo,  oxidasa 
positivo.  
4. Símbolos y abreviaturas.  
Cuando en esta Norma se haga referen cia a los siguientes símbolos y abreviaturas se entiende por:  
ABE Agar Bilis Esculina.  
ADN  Ácido desoxirribonucleico.  
ASB Agar Sulfito de Bismuto.  
ASPE  Agar Selectivo para Enterococos Pfizer.  
AST Agar Soya Tripticasa.  
ATCC  Por sus siglas en inglés Am erican Type Culture Collection.  
AOAC Internacional  Por sus siglas en inglés Association of Analytical Communities.  
AFNOR  Por sus siglas en francés Association Française de Normalisation.  
ß Beta.  
BHI  Caldo Infusión Cerebro Corazón.  
Caldo A -1 Caldo de pre enriquecimiento para coliformes.  
Caldo fraser  Caldo pre -enriquecimiento selectivo secundario.  
Caldo freser medio  Caldo pre -enriquecimiento selectivo primario.  
CCAyAC  Comisión de Control Analítico y Ampliación de Cobertura.  
CENAM  Centro Nacional de  Metrología.  
cm centímetro.  
CIP Por sus siglas en inglés Culture International Production.  
CODEX  Por sus siglas en inglés Codex Alimentarius, Internacional Food 
Standards.  
COFEPRIS  Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios.  
CST Caldo Soya Tripticaseina.  
CTSYE  Caldo Triptona Soya con Extracto de Levadura.  
°C grados Celsius.  
° grados.  
EC Caldo E. coli.  
E. coli  Escherichia coli.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
E. faecalis  Enterococcus faecalis.  
E. faecium  Enterococcus fecalis.  
EH Agar Entérico de Hektoen.  
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético  
EMB -L Agar Azul de Metileno de Levin.  
FDA Por sus siglas en inglés Foods and Drugs Administration.  
g gramos  
GUD  beta-glucuronidasa.  
h hora.  
ISO Por sus siglas en inglés International Organization for 
Standardization . 
ICMSF  Por sus siglas en inglés International Commission on 
Microbiological Specifications for Foods.  
IMViC  Indol, Rojo de metilo, voges Proskauer, citrato.  
1/d Inverso de la dilución.  
KOH  Hidróxido de Potasio.  
L Litro.  
± más menos.  
> mayor.  
< Menor. 
LIA Agar hierro y lisina.  
L. monocytogenes  Listeria monocytogenes.   
L. innocua  Listeria innocua.  
L. ivanovii  Listeria ivanovii.  
µm micrómetro.  
mL mililitro.  
mm milímetro.  
min minuto.  
MKTTn  Caldo de Muller -Kauffmann tetrationato novobiocina.  
M molar.  
MMGB  Caldo Glutamato con Minerales Modificado.  
MUG  4-metilumbelliferyl -beta-D-glucurónido.  
MU 4-metilumbelliferona.  
NaCl  Cloruro de Sodio.  
Nm nanómetro.  
NCTC  Por sus siglas en inglés National Culture Type Collection.  
N Normal.  
NMP  Número Má s Probable.  
ONPG  O-Nitrofenil ß -D-galactopiranosido.  
PALCAM  Medio PALCAM para determinar Listeria.  
PBS Solución Salina fosfatada amortiguda.  
RM Rojo metilo.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
TBGA  Agar bilis glucuronido.  
TSI Agar triple azúcar y Hierro.  
TSYA  Agar triptona soya con e xtracto de levadura.  
/ por. 
% por ciento.  
pH potencial de Hidrógeno.  
R. Equi  Rhodococus equi.  
Rpm  Revoluciones por minuto.  
RVS Medio de Rappaport -Vassiliadis con soya.  
S. auresus  Staphylococcus aureus.  
S. epidermidis  Staphylococcus epidermidis.  
seg segundo.  
spp especies plurales.  
X signo de multiplicación.  
XLD Agar Xilosa Lisina Desoxicolato.  
UFC Unidades Formadoras de Colonias.  
UV Ultravioleta.  
VP Voges – Proskauer.  
5. Consideraciones Generales.  
5.1. Los laboratorios de prueba que realicen  estas determinaciones o análisis deberán cumplir con los 
requisitos establecidos en la NMX -EC-17025 -IMNC -2006 o su versión vigente.  
5.2. Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto significativos, es de suma importancia seguir 
fielmente y contro lar cuidadosamente las condiciones en que se llevan a cabo estos métodos.  
5.3. Para aquellos casos en los que las personas físicas o morales que soliciten la aprobación de los 
métodos que utilicen para fines de control, inspección o programa específico, la  COFEPRIS, emitirá la 
autorización correspondiente en términos de las disposiciones jurídicas aplicables y conforme a lo dispuesto 
en las “Guías para la aprobación de métodos alternativos”,  disponibles para su consulta en el portal de 
internet http://www.c ofepris.gob.mx.  
6. Equipos.  
6.1. Todos los equipos deberán estar incluidos en un programa de calibración, verificación mantenimiento, 
de acuerdo a las características del equipo.  
6.2. Los potenciómetros deben tener una precisión de verificación mínima de ±  0,1 pH a 20°C – 25°C. 
Deben verificarse el día de uso con soluciones Buffer trazables al CENAM.  
6.3. Las balanzas deberán ser verificadas el día de uso utilizando un marco de pesas calibrado  o 
verificado.  
6.4. Los equipos para incubación tales como incuba doras y baños de agua, deberán demostrar que 
pueden trabajar a los intervalos de temperatura indicados en los métodos, mediante un estudio de 
distribución, muestreando diferentes puntos de la cámara, durante un tiempo determinado, que asegure las 
condicion es de incubación de la prueba.  
6.5. Cuando se i ndique el uso de un termómetro é ste deberá estar dentro de un programa de calibración y 
verificación vigente.  
6.6. Las autoclaves y hornos, que se utilicen para la esterilización de material y medios de culti vo, deberán 
contar con instrumentos de medición calibrados. Cada ciclo de esterilización debe estar controlado 
paramétricamente (temperatura y presión) y con indicadores biológicos o contar con un programa de 
monitoreo con indicadores biológicos, considera ndo la frecuencia de uso y las condiciones de mantenimiento. 
Como con indicadores biológicos. Es recomendable que el laboratorio cuente con ciclos de esterilización 
validados, con el propósito de demostrar la distribución y la penetración del calor.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
6.7. Los equipos de incubación deberán contar con termómetros calibrados con división mínima de la 
mitad de la variación permitida al equipo, por ejemplo cuando se indique un variación de +/ - 1ºC, el 
termómetro deberá tener un división mínima de 0.5ºC.  
6.8. La calibración de los equipos deberá ser trazable a un patrón nacional (CENAM).  
7. Medios de Cultivo.  
7.1. Todos los medios de cultivo deberán usarse hasta haber aprobado el control de calidad adecuado 
para su uso, con excepción de los medios de cultivo que t engan como restricción el tiempo de uso, en esos 
casos los resultados del análisis no podrán ser emitidos hasta haber completado el control de calidad de los 
medios de cultivo.  
7.2. Pueden utilizarse medios de cultivo preparados en el laboratorio por ingre diente, medios de cultivo 
preparados en polvo o l istos para su uso, siempre que é stos cumplan con la Formulación descrita en  el 
método.  
7.3. Debe realizarse control de calidad lote a lote de preparación. Como referencia para el control de 
calidad de los m edios de cultivo pueden utilizarse las normas internacionales ISO 11133 -1 e ISO 11133 -2, los 
procedimientos recomendados por el fabricante o conforme a lo dispuesto en las “Guías para la evaluación de 
medios de cultivo para análisis microbiológicos”,  dispo nibles para su consulta en el portal de Internet 
http://www.cofepris.gob.mx. Para los medios de cultivo preparados el control de calidad debe realizarse por 
cada remisión entregada.  
7.4. Los reactivos a emplear en el método objeto de esta Norma deben ser grado analítico.  
8. Cepas de referencia.  
8.1. Las cepas control utilizadas deberán demostrar trazabilidad a una colección de microorganismos 
reconocida y deberá demostrar la pureza y viabilidad de las mismas.  
9. Concordancia con normas internacionales.  
Esta Norma es totalmente equivalente con las siguientes normas internacionales.  
9.1. International Standard ISO 16649 -3. Microbiological of food and animal feeding stuffs. Horizontal 
method for the enumation of  –glucuronidasa Escherichia coli  positive. Part  3 number technique using  5-
bromo -4-choloro -3-indolyl –-Dglucuronido. First edition (2005).  
9.2. International Standard ISO 7899 -2 Water quality. Detection and enumeration of intestinal enterococci. 
Part 2: Membrane filtration method. (04 -2000).  
9.3. International Standard ISO 8199 Water quality. General guidance on the enumeration of  micro -
organisms by cultura. (06 -2005).  
9.4. International Standard ISO 11290 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method 
for the detection and enum eration of Listeria monocytogenes . Part 1: Detection method. 1th Edition (1996).  
9.5. International Standard ISO 6888. Microbiology – General guidance for enumeration of Staphylococcus 
aureus  – colony count technique, 1th edition (05 -1983).  
9.6. Internatio nal Standard ISO 6579 Microbiology of food and animal feeding stuffs – horizontal method for 
the detection of Salmonella  spp. 4th edition (2002).  
10. Bibliografía.  
10.1.  American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and 
Wastewater. 21th edition. Washington DC. (2005).  
10.2. Peter Feng, Stephen D. Weagant, Michael A. Grant. Bacteriological Analytical Manual, Chapter 4, 
Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria, marzo 2012. 
http://www.fda.gov/Food/FoodScienc eResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/  
default.htm.  
10.3. American Public Health Association. Compendium of methods for the microbiological examination of 
foods. 4th edition Washington DC. (2001).  
10.4. American Public Health Assoc iation. Recommended Procedures for the Examination of Seawater and 
shellfish. 4th edition. Washington DC. (1970).  
10.5. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 16th 
edition. Washington DC. (1992).       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
10.6. American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and 
Wastewater. 20th edition. Washington DC. (1998).  
10.7. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Manual of Food Quality Control 
Microbiological Analysis. 4 revisions (1992).  
10.8. AOAC Official Methods of Analysis. Microbiological Methods. Capítulo 17. 18 ° Edición, (1995).  
10.9. AOAC Official Methods of Analysis. Microbiological Methods. Capítulo 17. 18 ° Edición, (2007).  
10.10. MacFadin. Pruebas bioquímicas  para la identificación de bacterias de importancia clínica. Editorial 
Panamericana (2002).  
10.11. American Public Health Association Standard Methods For the examination Of Water & Wastewater, 
Membrane Filter  Techniques. 21th edition. Washington DC. (2005 ). 
10.12.  Directiva Europea relativa a la calidad de las aguas destinadas al consumo humano. 98/83/CE.  
10.13.  World Health Organization. Guidelines for Drinking -water Quality. Vol. 1, 3th Edition.  
10.14.  ASTM International Standard Test Method for Enteroc occi in water using Enterolert. D6503 -99 
(2009).  
10.15.  EPA US Method 1600: Enterococci in Water by Membrane Filtration Using membrane -Enterococcus 
Indoxyl -ß-D-Glucoside Agar (mEI) (September 2002).  
10.16.  FDA U.S. Food and Drug Administration. National Sh ellfish Sanitation Program. Guide for the 
control of Molluscan Shellfish. Charpenter II. Growing Areas. Section IV. (2007).  
10.17. FSIS USDA MLG 8.08 Isolation and identification of Listeria monocytogenes  from red meat, poultry 
and egg products, and enviro nmental samples.  
10.18.  Wallace H. Andrews, Andrew Jacobson, and Thomas Hammack Bacteriological Analytical Manual. 
Capítulo 5 Salmonella  8th revisión, (Noviembre 2011) http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/  
Laboratory Methods/BacteriologicalAnalytical ManualBAM/default.htm.  
10.19.  NMX -EC-17025 -IMNC -2006 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de 
ensayo y calibración”.  
10.20. International Standar  ISO/TS 11133 -1:2009 Microbiology of food and animal feeding stuffs -- 
Guidelines on pr eparation and production of culture media -- Part 1: General guidelines on quality assurance 
for the preparation of culture media in the laboratory. (2009).  
10.21.  International Standar ISO/TS 11133 -2:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs -- 
Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines on performance 
testing of culture media.  
11. Vigilancia de la norma.  
La vigilancia del cumplimiento de esta Norma corresponde a la Secretaría de Salud, a través de l a 
Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y a los gobiernos de las Entidades 
Federativas, en el ámbito de sus respectivas competencias.  
12. Vigencia.  
Esta Norma entrará en vigor a los 180 días naturales contados a partir del día sigui ente de su publicación 
en el Diario Oficial de la Federación.  
TRANSITORIOS  
PRIMERO. - La entrada en vigor de la presente Norma deja sin efectos la Norma Oficial Mexicana  NOM -
143-SSA1 -1995, Bienes y servicios. Método de prueba microbiológico para alimentos.  Determinación de 
Listeria monocytogenes , publicada en el Diario Oficial de la Federación el 19 de noviembre de 1997.  
SEGUNDO. - La entrada en vigor de la presente Norma deja sin efectos el Proyecto de Norma Oficial 
Mexicana PROY -NOM -210-SSA1 -2002, Producto s y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. 
Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas 
microbianas, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 10 de septiembre de 2003.  
Sufragio Efectivo . No Reelección.  
México, D.F., a 23 de abril de 2013. - El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios 
y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, Mikel 
Andoni Arriola Peñalosa .- Rúbri ca. Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
13. Apéndices.  
Apéndice Normativo A.  
Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp . 
Este método es aplicable para la detección de Salmonella spp en productos para consumo humano , así 
como de áreas de producción y manejo de alimentos especi almente en productos donde las condiciones 
ambientales permiten la contaminación de estos productos por microorganismos de la familia 
Enterobacteriaceae .  
A.1. INTRODUCCIÓN . 
Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos cuando s e encuentran 
presentes en los alimentos. El control de este microorganismo depende en cierta medida del método analítico 
utilizado para su detección.  
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para 
estos casos se adaptaron posteriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos 
consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas 
presentes en un alimento debido al proceso a que está  sujeto (por ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) 
y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.  
La determinación de la presencia o ausencia de Salmonella spp , en cierta cantidad de masa o volumen 
espec ífico de produ cto, se lleva a cabo acorde a lo descrito en el presente método, requiriendo 4 etapas 
sucesivas. Las cuales son:  
- Etapa de pre -enriquecimiento,  
- Enriquecimiento selectivo,  
- Aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales; y  
- Identificac ión bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.  
Nota:  Salmonella  puede presentarse en pequeños números y en algunas ocasiones ir acompañada de una 
gran carga microbiana de otras enterobacterias u otras familias. Es por lo que se hace nece sario el  pre-
enriquecimiento para permitir la detección de un número bajo y/o células estresadas de Salmonella spp .  
A.2. EQUIPO . 
A.2.1.  Aparato de esterilización de calor húmedo y calor seco.  
A.2.2.  Incubadora capaz de operar a 37°C ± 1°C.  
A.2.3.  Baño de  agua capaz de operar a 41,5°C ± 1°C o incubadora capaz de trabajar a 41,5°C ± 1°C.  
A.2.4.  Baño de agua capaz de operar a 45°C ± 2°C.  
A.2.5.  Baño de agua capaz de operar a 37°C ± 1°C.  
A.2.6.  Potenciómetro.  
A.2.7.  Balanza granataria con sensibilidad de 0,1g  verificada el día de uso.  
A.2.8.  Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con 
vasos esterilizables (vidrio o aluminio).  
A.3. MATERIALES . 
A.3.1.  Asa de platino o níquel de aprox. 3mm de diámetro o 10 l.  
A.3.2.  Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL, graduadas 
respectivamente en divisiones de 0.5mL y 0.1mL protegidas con tapón de algodón.  
A.3.3.  Pipetas de 1mL, con graduaciones de 0.1mL o micropipetas calibradas y ver ificadas.  
A.3.4.  Matraces Erlenmeyer de 500mL y/o capacidad apropiada.  
A.3.5.  Cajas Petri estériles de vidrio o desechables de diámetro 15mm x 100mm y/o de un diámetro mayor 
140mm.  
A.3.6.  Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas.  
A.3.7.  Tubos de ensaye de 1 6 x 150mm y de 20 x 100mm o de capacidades adecuadas.  
A.3.8.  Gradillas para tubos de ensaye.  
A.3.9.  Mecheros Bunsen o Fisher.  
Nota: El material desechable puede utilizarse como alternativa aceptable a la cristalería reutilizable si 
cumple las especificacio nes adecuadas.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.4. MEDIOS DE CULTIVO . 
A.4.1. Agua Peptonada amortiguada.  
A.4.2. RVS.  
A.4.3. MKTTn.  
A.4.4. XLD.  
A.4.5. EH. 
A.4.6. ASB.  
A.4.7. Agar Verde Brillante.  
A.4.8. Agar nutritivo.  
A.4.9. TSI. 
A.4.10. LIA. 
A.4.11. Agar Urea de Christensen.  
A.4.12. Medio L -Lisina descarboxisolato.  
A.4.13. Solución salina fisiológica.  
A.4.14. Medio Triptófano/Triptona.  
A.5. REA CTIVOS . 
A.5.1. Reactivos para la reacción VP.  
A.5.2. Reactivos para la reacción de indol.  
A.5.3. Antisuero somático (O) polivalente de Salmonell a. 
A.5.4. Tolueno.  
A.5.5. -naftol.  
A.5.6. Solución de creatina.  
A.5.7. KOH.  
A.5.8. Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium).  
A.5.9. Salmonella diarizonae  ATCC 12325. ( S. diarizonae ) 
A.5.10.  Salmonella abortus equi  ATCC 9842. ( S. abortus equi ) 
A.5.11. ONPG . 
A.5.12. Novobiocina (sal sódica).  
A.5.13. Yodo.  
A.5.14. Yoduro de Potasio.  
A.5.15. Alcohol etílico 96%4 -Dimetilaminobenzaldehído.  
A.5.16. Ácido hidroclórico,  = 1.18g/mL a 1.19g/mL.  
A.5.17. 2-metilbutan -2-ol. 
A.5.18. Cloruro de sodio.  
A.5.19. Monohidrat o de creatinina.  
A.6. CONDICIONES DE PRUEBA . 
A.6.1.  Muestreo . 
Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no haya tenido 
daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento.  
El muestreo no es parte del méto do especificado aquí, es recomendable que las partes involucradas en 
este punto lleguen a un acuerdo al respecto, pueden utilizarse diversos estándares internacionales tales como 
los planes de muestreo del CODEX alimentarios o las guías del ICMSF.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
A.6.2.  Preparación de la muestra de ensayo.  
Lineamientos generales para la preparación de las muestras.  
A.6.2.1.  General. Bibliografía 10.23  
La preparación de la suspensión inicial requiere 25g de la muestra en una cantidad suficiente del medio de 
pre-enriquecimi ento, para obtener una dilución 1:10.  
En una situación atípica y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g, se 
deberá utilizar la cantidad necesaria de medio de pre -enriquecimiento para obtener una dilución 1:10.  
En cas os excepcionales, cuando es necesario analizar más de una porción de 25g de un lote espec ífico 
de alimento y teniendo evidencia de que si hay mezcla de tales porciones no afecta el resultado, las muestras 
pueden ser compuestas; es decir, si 10 muestras de 25g serán examinadas, combinar las 10 porciones para 
obtener 250g y adicionar 2,25L del caldo de pre -enriquecimiento precalentado a 37°C +/ -1°C. 
Sin embargo, se debe tomar en cuenta que para inocular el caldo selectivo RVS y MKTTn aumentarán las 
porciones de 10mL a 100mL teniendo que inocular 1mL y 10mL respectivamente. Continuar como se indica 
en A.7.  
A.6.2.2.  Productos que contienen cacao. Bibliografía 10.23 
Agregar al agua peptonada amortiguada 50g/L de caseína (no usar caseína ácida) o 100g/L de leche 
descremada en polvo, si el alimento tiene alta probabilidad de estar contaminado con microorganismos Gram 
positivos, incubar a 37°C ±  1°C por 2h, añadir 0.018g/L de verde brillante. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.3.  Productos ácidos y acidificantes. Bibliografía 10.23 
Asegurarse de que el pH no se encuentre por debajo de 4.5 durante el pre –enriquecimiento, puede 
utilizarse agua peptonada amortiguada a doble concentración. En caso de que se requiera subir el pH a más 
de 4.5 utilizando NaOH 1N, registr ar esta cantidad. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.4.  Preparación de la muestra para moluscos en concha. Bibliografía 10.24 
En general, deben tomarse un mínimo de 10 a 12 moluscos bivalvos, a fin de obtener una muestra 
representativa y permitir la se lección de animales completos disponibles para su desconche. Con la mayoría 
de las especies, esto permite una adecuada selección y se obtendrán aproximadamente 200g de licor y carne. 
Por otro lado 10 a 12 piezas de ciertas especies pequeñas de moluscos biv alvos, pueden producir mucho 
menos que 100g de licor y carne por lo que se deben usar de 20 a 30 piezas de estas especies para obtener 
el peso adecuado.  
Limpieza de la concha. Lavarse las manos con agua potable y jabón antes de comenzar. Enjuagar el 
exces o de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril bajo el chorro de agua potable poniendo 
particular atención en las hendiduras de las conchas. Colocar las conchas limpias en toallas de papel 
absorbente o gasas limpias. Desechar los moluscos q ue tengan las conchas dañadas o con las valvas 
abiertas.  
Remoción del contenido. Lavarse las manos con agua, jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. Se puede 
utilizar guantes para evitar lesionarse. Sostener el molusco en la mano sobre una gasa dirigiendo l a unión de 
las valvas o bisagra hacia el analista apoyándose sobre la mesa. Con un cuchillo desconchador estéril, 
insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el músculo abductor. Drenar el licor de la concha 
dentro de un recipiente estér il. Cortar el músculo abductor de las conchas y vaciar el cuerpo del animal dentro 
del mismo recipiente. Continuar como A.6.2.5  
A.6.2.5.  Procedimiento para moluscos, desconchados y congelados. Bibliografía 10.24  
Pesar el total de la muestra, máximo 200g ( carne y licor) y adicionar igual cantidad de agua peptonada 
amortiguada para obtener una dilución 1:2. Licuar por 2 min. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.6.  Yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo, huevo en polvo, leche fluida, leche 
descrema da, leche con 2% de grasa, entera y suero de leche. Mezclas preparadas en polvo (Harinas 
para pastel, galletas, donas, bisquets y pan) Fórmulas infantiles y alimentos para administración por 
cánula u oral, que contengan huevo. De preferencia, no descongela r las muestras antes de su análisis. Si 
están congeladas, atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar tan rápido como sea 
posible para disminuir el incremento en el número de microorganismos competentes o para reducir el daño 
potencial sobre las células de Salmonella. Descongelar en un baño de agua con temperatura controlada a 
45°C, durante 15 min y con agitación constante, o descongelar manteniendo la muestra a 2 -5ºC durante 18h. 
Pesar 25g de la muestra en condiciones asépticas, c olocar en un frasco de boca ancha y tapa de rosca de 
500mL. Si las muestras no están en polvo, agregar 225mL de agua peptonada amortiguada. Si el producto es 
un polvo, agregar aproximadamente 15mL de agua peptonada y agitar con una varilla de vidrio, cucha ra o 
abate lenguas. hasta obtener una suspensión homogénea. Agregar tres porciones más de 10, 10, y 190mL 
para un total de 225mL. Agitar suficientemente hasta que la suspensión no contenga grumos. Tapar el frasco 
y dejar en reposo durante 60 ± 5 min a temp eratura del laboratorio. Mezclar por agitación Aflojar la tapa a un 
1/4 de vuelta, e incubar a 37°C 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.6.2.7.  Huevos.  
A.6.2.7.1.  Huevo en cascarón.  Eliminar cualquier material ajeno adherido a la superficie del cas carón. 
Desinfección del cascarón: Preparar la solución desinfectante (1:3) que consiste en adicionar 3 partes de una 
solución de etanol o isopropanol al 70% a una parte de solución de yodo/yoduro de potasio. Preparar una 
solución de alcohol al 70% diluyend o 700mL de etanol al 100% hasta completar un volumen final de 1000mL 
de agua destilada estéril o bien diluir 700mL de alcohol al 95% con agua destilada estéril hasta completar un 
volumen final de 950mL. La solución de yodo/yoduro de potasio se prepara como  sigue: Pesar 100g de 
yoduro de potasio y disolver en 200 -300mL de agua destilada estéril. Adicionar 50g de yodo y calentar 
suavemente con agitación constante hasta disolver el yodo. Disolver esta solución hasta completar un 
volumen final de 1000mL de agua  destilada estéril y almacenar en una botella ámbar con tapón de vidrio en la 
oscuridad. Sumergir los huevos en esta solución por al menos 10 seg, sacarlos y dejar secar al aire. Cada 
muestra consiste de 20 huevos, en un total de 50 muestras por cada galli nero. Abrir los huevos en 
condiciones asépticas con guantes estériles y pasar a un recipiente estéril, cambiar guantes entre cada 
muestra. Evitar que fragmentos del casarón caigan en el contenedor. Mezclar completamente las yemas y 
claras con una cuchara o  cualquier otro instrumento estéril. Mantener las muestras a temperatura ambiente 
(20-24°C) por 96 ± 2h. Después de este tiempo, tomar 25mL o 25g de la mezcla anterior y 25mL de un CST 
de prueba (testigo) en un contenedor de 500mL y agregar 225mL de CST su plementado con sulfato ferroso. 
(35mg de sulfato ferroso a 1000mL de CST. Mezclar bien por agitación. Dejar en reposo durante 60 ± 5min a 
temperatura ambiente. Mezclar nuevamente por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH, 
si es neces ario, a 6.8 ± 0.2. Incubar 24 ± 2h a 35°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.7.2.  Huevo entero líquido (homogeneizado).  Combinar 15 porciones de 25mL cada una para dar 
una muestra combinada de 375mL en un matraz Erlenmeyer de 6L. Mantener esta mezcla a temperatura 
ambiente (20 -25°C) por 96 ± 2h. Después de este tiempo, adicionar 3375mL de CST suplementado con 
sulfato ferroso. Mezclar bien por agitación. Dejar en reposo durante 60 ± 5 min a temperatura ambiente. 
Mezclar nuevamente por agitación y determ inar pH con papel indicador. Ajustar el  pH, si es necesario, a 6.8 ± 
0.2. Incubar 24 ± 2h a 35°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.7.3.  Huevo cocido  (de pollo, pato u otros, hervidos).  Si el cascarón del huevo se encuentra 
intacto, desinfectar como s e describe en el inciso 9.1.2 a) y separar en condiciones asépticas el cascarón. 
Pulverizar la yema y la clara y pesar 25g en un matraz Erlenmeyer de 500mL u otro recipiente apropiado. 
Agregar  225mL CST (sin sulfato ferroso). Mezclar bien por agitación y c ontinuar como se describe en para 
huevo en cascaron.  
A.6.2.8.  Leche descremada en polvo y Caseína. Adicionar el agua peptonada amortiguada 
preferiblemente 50g/l de caseína (a excepción de caseína acida) o 100g/L de leche descremada en polvo y 
adicionar des pués de 2h de incubación, 0.018g/L de verde brillante si el alimento tiene alta probabilidad de 
estar contaminado con microbiota Gram Positivo. Incubar a 37°C ±2h. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.9.  Productos que contienen huevo (pastas, rollos  de h uevo, macarrones, espaguet i), quesos, 
ensaladas preparadas a base de: jamón, huevo, pollo, atún, pavo; frutas y verduras frescas 
congeladas o secas; frutas secas, carne, crustáceos (camarones, cangrejo, cangrejo de río, langosta,  
langostinos) y pescado.  De preferencia, no descongelar muestras congeladas, antes de someterlas al 
análisis. Si está congelada, para obtener la porción por analizar debe dejarse atemperar, descongelando 
cerca de 45°C durante <15 min, en un baño de agua con temperatura controlada y flujo continuo o 
preferentemente mantener durante 18h a 2 -5°C. Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra en un vaso 
de licuadora. Agregar  225mL de agua peptonada amortiguada y licuar por 2 min. Pasar a un frasco estéril de 
boca ancha y tapa de rosca d e 500mL. Mezclar por agitación, aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 
18 ± 2h a 37°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.10.  Levadura seca (levadura activa e inactiva).  Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra, 
en un frasco estéril de  boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Agregar 225mL de CST. Mezclar bien hasta 
formar una suspensión homogénea. Dejar en reposo, a la temperatura del laboratorio, durante 60 ± 5 min, con 
la tapa bien cerrada. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es 
necesario, a 6.8 ± 0.2. Mezclar bien antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar 
durante 24 ± 2h a 35°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.11.  Mezclas para repostería o cremas pasteleras . Pesar en condiciones asépticas, 25g de 
muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL. Agregar 225mL de caldo nutritivo y 
mezclar bien. Dejar en reposo a la temperatura del laboratorio, durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada.  
Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2 mezclar bien, antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de 
vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35°C. Continuar como se indica en A.7.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
A.6.2.12.  Especias . 
A.6.2.12.1.  Pimienta negra, pimienta blanca, semi llas de apio en hojuelas, chile en polvo, cominos, 
páprika, hojuelas de perejil, romero, semilla de ajonjolí, tomillo y yerbas en hojuelas. Pesar en 
condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Agregar  
225mL de CST. Mezclar bien. Dejar en reposo con la tapa bien cerrada, durante 60 ± 5min a temperatura de 
laboratorio. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario, a 
6.8 ± 0.2. Mezclar bien, antes de ajusta r el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h  a 
35°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.12.2.  Cebolla en hojuelas, cebolla en polvo, ajo en hojuelas. Pesar en condiciones asépticas, 
25g de muestra, en un frasco estéril de bo ca ancha y tapa de rosca, de 500mL. Pre -enriquecer la muestra en 
CST adicionado con K 2SO 3 (5 g K 2SO 3 por 1000mL de CST, resultando una concentración final de 0.5% de 
K2SO 3). Agregar el K 2SO 3 al caldo antes de esterilizar, distribuir en volúmenes de 225mL e n matraces 
Erlemeyer de 500mL esterilizar a 121°C por 15 min. Después de esterilizar, determinar el pH asépticamente, 
si es necesario, ajustar el volumen final a 225mL. Agregar 225mL de CST adicionado con K 2SO 3, a los 25g de 
muestra y mezclar bien. Continu ar como se indica en  el punto anterior.  
A.6.2.12.3.  Pimienta de jamaica, canela, clavo y orégano. Hasta ahora, no se conocen métodos para 
neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Lo que se recomienda para su análisis, es diluirlas más allá 
de su nivel tóxico. En el caso de la pimienta de jamaica, canela y orégano; preparar diluciones con una 
relación 1:100 muestra/caldo; y para el clavo, una relación 1:1000. En el caso de condimentos en hojas secas, 
preparar diluciones cuya relación sea mayor a 1: 10, debido a las dificultades que se han encontrado para que 
el caldo se absorba en productos deshidratados. Analizar estas especias como se describe en para la 
pimienta negra, manteniendo las relaciones muestra/caldo, recomendadas.  
A.6.2.13.  Dulce, cubier ta de dulce (incluyendo chocolate).  Pesar en condiciones asépticas, 25g de 
muestra en un vaso de licuadora. Agregar 225mL de leche descremada, reconstituida, estéril y licuar por 2 
min. Pasar la mezcla homogeneizada a un frasco de boca ancha, con tapón de rosca de 500mL y dejar en 
reposo durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada, a temperatura del laboratorio. Mezclar bien por agitación 
y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario a  6.8 ± 0.2. Agregar 0.45mL de solución 
acuosa de ve rde brillante al 1% y mezclar bien. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 
35°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.14.  Coco.  Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y 
tapa de rosca, de 5 00mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agregar 225mL de caldo lactosado estéril. 
Agitar bien y dejar en reposo a la temperatura del laboratorio durante 60 ± 5 min, con la tapa bien cerrada. 
Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador . Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2. 
Agregar hasta 2.25mL de Tergitol /Aniónico (pasado por vapor fluente durante 15 min) y mezclar bien. 
Alternativamente se puede usar Triton X -100 (pasado por vapor fluente durante 15 min). Limitar el uso de 
estos surfactantes a la cantidad mínima necesaria para iniciar la espuma. En el caso de Triton X -100, con 2 a 
3 gotas es suficiente. Aflojar la tapa a un a l/4 de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 35°C. Continuar como se 
indica A.7.  
A.6.2.15.  Colorantes y sub stancias coloridas para alimentos.  En el caso de colorantes con pH mayor a 
6.0 (suspensiones acuosas al 10%), aplicar el método descrito para huevo entero desecado.  
A.6.2.16.  Colorante (lacas) o colorantes con pH abajo 6.0 , pesar en condiciones asépticas, 25 g de 
muestra en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. 
Agregar 225mL de caldo tetrationato (CTT) sin verde brillante. Mezclar bien por agitación y determinar pH con 
papel indicador. Ajustar el pH. Agitar bien y dejar en reposo a la temperatura del laboratorio durante 60 ± 5 
min, con la tapa bien cerrada. Ajustar el pH a 6.8 ± 0.2 con un potenciómetro y agregar 2.25mL de solución al 
0.1% de verde brillante mezclar completamente, por agitación. Afloja r la tapa a un l/4 de vuelta e incubar 
durante 24 ± 2h a 35°C. Continuar como se indica en A.7.3  
A.6.2.17.  Gelatina.  Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y 
tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agregar 225mL de agua peptonada 
amortiguada estéril, agregar 5mL de solución acuosa de papaína al 5% y mezclar bien. Colocar la tapa bien 
cerrada e incubar a 37°C por 60 ± 5 min. Mezclar bien y aflojar la tapa a un 1/4 de vuelta e incubar durante   18 
± 2h a 35°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.18.  Carnes, substitutos de carne, productos cárnicos, sustancias de origen animal, glándulas 
y otros alimentos (pescado, carne y hueso).  Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un vaso 
de licuadora. Agregar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. Aflojar la tapa a un l/4 
de vuelta e incubar durante 24 ± 2h a 37°C. Continuar como se indica en A.7.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.6.2.19.  Ancas de rana.  Colocar 15 pares de ancas de rana en una bols a de plástico estéril y cubrirlas 
con agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 muestra/caldo (g/mL). Si se estima que un solo par 
de ancas, pesa un promedio de 25g o más, analizar un solo par, por cada 15 pares. Colocar la bolsa en un 
vaso de plást ico grande o cualquier otro recipiente. Incubar a 37°C por 18 ± 2h. Continuar el análisis, como se 
indica en A.7.  
A.6.2.20.  Conejo en canal.  Introducir el conejo en una bolsa de plástico estéril y colocarlo en un vaso u 
otro contenedor adecuado. Adicionar agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 De muestra/caldo 
(g/mL) para cubrir la muestra. Mezclar bien con agitación Incubar a 37°C por 18 ± 2h. Continuar el análisis 
como se indica en A.7.  
A.6.2.21.  Jugo de naranja (pasteurizado y sin pasteurizar),  jugo de manzana (pasteurizado y sin 
pasteurizar),  En condiciones asépticas, agregar 25mL de la muestra y 225mL de agua peptonada 
amortiguada, en un frasco de boca ancha estéril, con tapa de rosca de 500mL u otro recipiente apropiado. 
Agitar para mezclar c ompletamente. Incubar con la tapa suelta por 18 ± 2h a 35°C. Continuar como se indica 
en A.9. (alimento de carga microbiana baja).  
A.6.2.22.  Orejas de puerco.  Colocar en un bolsa de plástico  una pieza (de 2 a 3 piezas si é stas son 
pequeñas) por cada unidad  analítica. Introducir la bolsa en un vaso o en un contenedor adecuado. Adicionar 
agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 de muestra/caldo (g/mL) para cubrir las piezas. Mezclar 
bien con agitación e incubar a 37°C por 18 ± 2h. Continuar como se in dica en 9.2.  
A.6.2.23.  Melones.  Preferentemente no descongelar las muestras antes del análisis. Si la muestra está 
congelada atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar en un baño de agua con 
temperatura controlada con termostato,  a 45°C durante 15 min y con agitación constante, o descongelar 
manteniendo la muestra a 2 -5ºC durante 18h. Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones 
asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. 
Pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro 
recipiente adecuado. Aflojar la tapa e incubar a 37°C por 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.24.  Para melones enteros  no enju agarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos 
como estén. Colocar los melones en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada 
amortiguada que permita que el melón flote. El volumen del agua peptonada amortiguada puede ser una y 
media veces el peso del melón. Por ejemplo los melones pesan 1500g probablemente se necesitará un 
volumen de aproximadamente 2250mL de agua peptonada amortiguada. Adicionar más agua peptonada 
amortiguada si es necesario. Colocar la bolsa de plást ico con los melones y el agua en un vaso u otro 
contenedor adecuado. Doblar el extremo de la bolsa de plástico de forma segura pero no apretada para que 
permita el paso de aire durante la incubación. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 37°C por 18 ± 2 h. 
Continuar como A.7.  
A.6.2.25.  Mangos . De preferencia, no descongelar las muestras antes de su análisis. Si están congeladas, 
atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar en un baño de agua con temperatura 
controlada y termostato , a 45°C durante 15 min y con agitación constante, o descongelar manteniendo la 
muestra a 2 -5ºC durante 18h. Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones asépticas en un vaso 
de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y  licuar por 2 min. En condiciones 
asépticas, pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier 
otro recipiente adecuado. Aflojar la tapa 1/4 de vuelta e incubar a 37°C por 18 ± 2h. Continuar como se indica 
en A. 7.  
A.6.2.26.  Para mangos enteros  no enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos 
como estén. Colocar el mango en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada 
amortiguada que permita que el mango flote. El volumen  del agua peptonada amortiguada puede ser una vez 
el peso los mangos. Por ejemplo los mangos pesan 500g, probablemente se necesitará un volumen de 
aproximadamente 500mL de agua peptonada amortiguada para que floten. Adicionar más agua peptonada 
amortiguada  si es necesario. Colocar la bolsa de plástico con los mangos y el agua peptonada amortiguada 
en un vaso u otro contenedor de 5 L. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 37°C por 18 ± 2 h. Continuar 
como A.7.  
A.6.2.27.  Tomates (tomates rojos o jitomates) . Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones 
asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. 
En condiciones asépticas, pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tap a de rosca, de 
500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Aflojar la tapa a l/4 de vuelta e incubar durante 18 ± 2h a 37°C. 
Continuar como se indica en A.7.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
A.6.2.28.  Para tomates enteros  no enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizar los 
como estén. Colocar los tomates en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada 
amortiguada que permita que los tomates floten. El volumen del caldo universal puede ser una vez el peso  de 
los tomates. Por ejemplo los tomates pesan 300g probablemente se necesitará un volumen de 
aproximadamente 300mL de agua peptonada amortiguada. Adicionar más agua pepetonada amortiguada si 
es necesario. Colocar la bolsa de plástico con los tomates y el caldo en un vaso u otro contenedor adecuado. 
Doblar el extremo de la bolsa de plástico de forma segura pero no apretada para que permita el paso de aire 
durante la incubación. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 37°C por 18 ± 2h. Continuar como A.7.  
A.6.2.29.  Muestras ambientales.  Muestrear superfi cies ambientales con hisopos o esponjas estériles. 
Colocarlos en una bolsa estéril que contenga suficiente caldo Dey -Engly o solución de fosfatos para cubrir los 
hisopos o esponja. Transportar las muestras protegidas en un contenedor con paquetes de gel co ngelado 
para mantener las muestras frías, pero no congeladas. Si las muestras no pueden ser procesadas 
inmediatamente, refrigerarlas a 4 ± 2°C. Analizar las muestras dentro de las siguientes 48 ± 2h después de 
haber sido muestreadas, agregar a la bolsa o c ontenedor que contiene los hisopos o esponjas 225mL de agua 
peptonada amortiguada estéril. Agitar bien el contenido. Mezclar, por agitación, aflojar la tapa o la boca de la 
bolsa e incubar durante 18 ± 2h a 37°C. Continuar como se indica en A.7.  
A.6.2.30.  Semillas de alfalfa y frijoles.  En condiciones asépticas pesar 25g de semillas de alfalfa y 
frijoles en un matraz Erlenmeyer. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada agitar el matraz. Cubrir la 
boca del matraz con papel aluminio estéril. Incubar a 37 °C durante 18 ± 2h. Continuar como se indica en A.7.2 
(tratarla como un alimento con carga microbiana alta).  
A.6.2.31.  Agua para consumo humano.  Debido a que el agua para consumo humano pasa por procesos 
de potabilización y purificación, los niveles de mic roorganismos viables son bajos, por lo que es necesario 
utilizar métodos de concentración.  
A.6.2.31.1.  Filtración por membrana.  Este método es recomendable para aguas con baja turbiedad. 
Filtrar 1L o más de la muestra de agua. Retirar la membrana y coloca rla en 50mL de agua pepetonada 
amortiguada Incubar a 37°C por 18 ± 2h. Continuar como se describe en A.7.  
Nota : Para porciones grandes de agua peptonada amortiguada precalentar a 37°C ± 1°C antes de la 
inoculación de la muestra a analizar.  
A.7. PROCEDIMIEN TO ANALÍTICO.  
A.7.1.  Pre-enriquecimiento.  
En general  incubar la dilución inicial a 37°C ± 1°C por 18h ± 2h.  
Para moluscos en concha, desconchados y congelados , inocular a temperatura ambiente 50g del 
homogenizado (dilución 1:2) a 200mL de agua peptonada am ortiguada e incubar a 37°C ± 1°C por 18h ± 2h.  
A.7.2.  Enriquecimiento selectivo.  
Transferir 0.1mL del cultivo de pre -enriquecimiento a un tubo del 10mL de caldo RVS y 1mL a un tubo 
conteniendo 10mL de caldo MKTTn.  
Incubar el caldo RVS a 41.5°C ± 1°C por 24 h ± 3h y el caldo MKTTn a 37°C ±1°C por 24h ± 3h.  
A.7.3.  Aislamiento e identificación.  
Para el aislamiento, inocular a partir de los cultivos obtenidos en el punto anterior, tres medios selectivos 
en placa como sigue:  
Agar XLD y cualquier otro medio selec tivo sólido complementario al agar XLD y especialmente apropiado 
para el aislamiento de Salmonella  lactosa positiva, Salmonella Typhi  y Salmonella  Paratyphi ; el laboratorio 
puede seleccionar que medio utilizar. Por ejemplo, se pueden elegir el  ASB, EH, Aga r Verde Brillante,  entre 
otros.  
El agar XLD se incuba a 37°C ± 1°C durante 24h ± 3h, el segundo y tercero agar selectivo incubar de 
acuerdo a las recomendaciones contenidas en los manuales de medios de cultivo de los fabricantes.  
A.7.3.1.  Morfología Coloni al Típica de Salmonella.  
Seleccionar 2 o más colonias de Salmonella  de acuerdo con las características siguientes, en cada agar 
selectivo:  
A.7.3.1.1.  XLD. Colonias rosas con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella  pueden producir 
colonias con un  centro negro muy grande o completamente negras.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.7.3.1.2.  EH. Colonias azul -verde o azules, con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella  
pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras.  
A.7.3.1.3.  ASB . Colonias caf és, grises o negras; algunas veces pueden presentar brillo metálico y el 
medio circundante a la colonia generalmente es café al principio y a medida que se prolonga el tiempo de 
incubación, pueden aparecer de color negro.  
Si se presentan colonias típicas e n ASB después de 24 ± 2h de incubación, seleccionar 2 o más colonias. 
Si por el contrario, no se observan colonias típicas a las 24 ± 2h, re -incubar las placas de ASB, otras 24 ± 2h. 
Después de 48 ± 2h de incubación, seleccionar si están presentes, 2 o más  colonias típicas. Si las colonias 
seleccionadas, no dan reacciones típicas en TSI y LIA, el cultivo se considera como negativo a Salmonella . 
A.7.3.2.  Morfología Colonial Atípica de  Salmonella.  
En ausencia de colonias típicas sospechosas de Salmonella , bus car colonias atípicas con las 
características siguientes:  
A.7.3.2.1. Agares EH y XLD. Muy pocos cultivos atípicos de Salmonella  producen colonias amarillas con 
o sin centro negro. En ausencia de colonias típicas, en EH y XLD, seleccionar 2 o más colonias a típicas.  
Nota: Algunas cepas variables de Salmonella  como: H 2S negativo (ej. S. Paratyphi A) crece en XLD como 
colonias rosas con el centro de un color rosa obscuro. Salmonella  Lactosa – positiva crece en XLD  como 
colonias amarillas con o sin el centro ne gro. 
A.7.3.2.2. ASB.  Algunos cultivos producen colonias verdes con un halo oscuro muy pequeño. Si después 
de 48h de incubación (como se explicó anteriormente), no hay colonias típicas sospechosas en ASB, 
seleccionar 2 o más colonias atípicas.  
A.7.3.3.  Cultivos Control Sugeridos.  
Además de los cultivos control positivos ( Salmonella Typhimurium  ATCC14028), deben usarse controles 
adicionales para ayudar a la selección de colonias atípicas, se recomiendan: S. diarizonae (ATCC 12325) 
lactosa positivo, H 2S positi vo y S. abortus equi  (ATCC 9842), lactosa -negativo, H 2S-negativo; o S. diarizonae  
(ATCC 29934) lactosa -positivo, H 2S-negativo.  
A.7.3.4.  Selección de colonias para su confirmación.  
Para la confirmación, tomar de cada medio selectivo al menos dos colonias co nsideradas como típicas o 4 
colonias sospechosas si no existe la primera posibilidad.  
En casos epidemiológicos identificar al menos 5 colonias típicas y 5 atípicas, si en una placa se encuentran 
menos de 5 colonias típicas o sospechosas, confirmar todas la s colonias que se encuentren en el medio.  
Estriar cada colonia seleccionada en agar nutritivo, preferiblemente sin agua de condensación, de tal 
manera que permita el aislamiento de colonias. Incubar las placas inoculadas a 37°C ± 1°C durante 24h ± 3h.  
Utilizar cultivos puros para la confirmación por pruebas bioquímicas y serología.  
A.7.3.5.  Confirmación Bioquímica.  
A partir del agar nutritivo, con un asa recta, estéril tocar ligeramente el centro de la colonia seleccionada e 
inocular en tubos de agar inclin ado de TSI y LIA. Sembrar por picadura en el fondo y estría en la superficie 
inclinada. Debido a que la reacción de descarboxilación de la lisina, es estrictamente anaerobia, el fondo del 
medio de LIA, debe medir 4cm. Mantener las placas de agares selectiv os a 5 -8ºC. 
Incubar los tubos de TSI y LIA a 37°C ± 1°C por 24 ± 3h. Dejar los tapones flojos de los tubos para 
mantener condiciones de aerobiosis mientras se incuban evitando excesiva producción de H 2S. Interpretar los 
cambios de color como se describe a continuación:  
TSI: Fondo del medio;  
● Amarillo, glucosa positiva.  
● Rojo o sin cambio de color, glucosa negativa.  
● Negro, formación de sulfuro de hidrógeno.  
● Burbujas o grietas en el medio, formación de gas debido a la utilización de la glucosa.  
TSI: Su perficie inclinada.  
● Amarillo, lactosa y/o sacarosa positivos.  
● Rojo o sin cambio de color, lactosa y/o sacarosa negativa.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Las colonias típicas de Salmonella , producen alcalinidad (color rojo) en la parte inclinada del medio y ácido 
(color amarillo) en e l fondo; con producción de gas y cerca del 90% de las casos producen H 2S 
(ennegrecimiento del agar). Cuando alguna Salmonella  lactosa positiva es aislada, el agar de TSI se torna 
completamente amarillo.  
En LIA, Salmonella  produce reacción alcalina (color púrpura) Considerar como negativos los cultivos que 
produzcan claramente un color amarillo en el fondo del tubo. La mayoría de los cultivos de Salmonella  
producen H 2S en LIA. Algunos cultivos que no son de Salmonella , producen un color rojo ladrillo en la parte 
inclinada del LIA.  
Todos los cultivos que den reacción alcalina en el fondo del medio de LIA, independientemente de la 
reacción que hayan dado en TSI, deben retenerse como aislamientos presuntivos de Salmonella,  para 
someterlos a pruebas bioquímicas adicionales y pruebas serológicas.  
Para los cultivos de TSI que se consideran presuntivos para Salmonella , continuar como se indica en 
Identificación de Salmonella para determinar la especie, incluyendo Salmonella arizonae.  
a) Prueba de ureasa (convenciona l). Con un asa estéril inocular tubos de agar urea de Christensen. 
Debido a que algunas veces los tubos de agar urea de Christensen sin inocular, pueden virar a rojo púrpura 
(prueba positiva), debe incluirse, un tubo de este agar sin inocular como control.  Una prueba positiva está 
dada por el uso de la urea generando amoniaco produciendo un cambio en la coloración del medio a color rojo 
rosado, una prueba negativa no se produce cambio en la coloración (amarillo anaranjado). Incubar 24 ± 2h a 
37°C ± 1°C.  
b) Caldo L -lisina descarboxilasa.  
Si la prueba de LIA fue satisfactoria, no es necesario repetirla. Si la reacción de LIA fue dudosa, utilizar 
caldo lisina descarboxilasa para la determinación final de lisina descarboxilasa. Inocular el caldo con pequeña 
cantidad de cultivo. Cerrar la tapa fuertemente e incubar durante a 37°C ± 1°C por 24  ± 3h. Las especies de 
Salmonella  dan reacción alcalina (color púrpura del medio). La prueba negativa se interpreta por un color 
amarillo del medio. Si el medio aparece desco lorido (ni púrpura, ni amarillo), agregar unas gotas de colorante 
púrpura de bromocresol al 0.2% y leer nuevamente la reacción.  
c) Detección de -galactosidasa.  
Colocar la colonia seleccionada en un tubo conteniendo 0.25mL de solución salina, agitar para o btener 
una suspensión homogénea. Adicionar 1 gota de tolueno y agitar. Colocar el tubo en un baño de agua a 37°C 
± 1°C dejar reposar por aproximadamente 5 min. Adicionar 0.25mL del agente de detección de la  -
galactosidasa y mezclar. Colocar nuevamente el  tubo en el baño de agua a 37°C ± 1°C y dejar por 24h ± 3h. 
Examinar el tubo a intervalos de tiempo. Un color amarillo es indicativo de reacción positiva, la cual se hace 
evidente en aproximadamente 20 min.  
Si se utilizan discos comerciales, seguir las ins trucciones del fabricante.  
d) Prueba de Indol.  
Inocular un tubo conteniendo 5mL del medio triptófano/triptona con una suspensión homogénea de la 
colonia sospechosa.  
Incubar a 37°C ± 1°C por 24 ± 3h después de la incubación adicionar 1mL de reactivo de Kova cs. 
La formación de un anillo de color rojo indica una reacción positiva. Un anillo de color amarillo indica una 
reacción negativa.  
e) Prueba de VP.  
Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estéril conteniendo 3mL del medio VP. 
Incubar 37°C ± 1°C por 24± 3h.  
Después de la incubación adicionar 2 gotas de solución de creatinina, 3 gotas de solución 1 -naftol y al final 
2 gotas de solución de KOH, agitar después de cada reactivo.  
La formación de un color rosa a rojo brillante en menos de 15 min indica una reacción positiva.  
f) Identificación presuntiva del género Salmonella.  
Alternativamente se pueden utilizar pruebas bioquímicas miniaturizadas o métodos de biología molecular 
disponibles en el mercado para la identificación presuntiva de géne ro Salmonella , se deberá utilizar un 
sistema adecuado basado en el sistema bioquímico descrito en esta sección. Estos sistemas bioquímicos 
deberán contar con validación y no deben ser usados como sustitutos de las pruebas serológicas. Inocular e 
incubar es tos sistemas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.7.3.5.1.  Interpretación de las pruebas bioquímicas.  
Tabla A.1. Interpretación de pruebas bioquímicas.  
 
S. diarizonae (ATCC 12325) lactosa positivos, H 2S positivo y S. abortus equi  (ATCC 9842) , lactosa -
negativo, H 2S-negativo; o S. diarizonae  (ATCC 29934) lactosa -positivo, H 2S-negativo.  
A.7.3.5.2.  Pruebas Serológicas.  
A.7.3.5.3.  General.  
La aglutinación con el antisuero polivalente Poly A -I & Vi, puede usarse como resultado confirmatorio de la 
presencia de Salmonella  para las cepas probadas por TSI y LIA, existen cepas que no aglutinan con el 
polivalente, pa ra éstos es necesario confirma usando la batería completa de bioquímicas.  
A.7.3.5.4.  Eliminación de las cepas autoaglutinables.  
Deposite una  gota de solución salina, en una lámina de vidrio perfectamente limpia. Disperse con un asa, 
parte de la colonia a probar en la gota, de manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia. Rote 
suavemente la lámina por 30 a 60seg. Observe el resultado  sobre un fondo oscuro, preferiblemente con la 
ayuda de una lupa. Si las bacterias se agrupan en unidades más o menos distintas, la cepa se considera 
como autoaglutinable y no debe someterse a las siguientes pruebas, porque la detección de los antígenos  no 
es factible.  
NOTA: También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua, y luego mezclar 
esta solución con una gota de la solución salina.  
A.7.3.5.5.  Detección de los antígenos Poly A -I & Vi.  
Empleando una colonia pura no autoa glutinable, proceda, empleando una gota del antisuero O en lugar de 
la solución salina. Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Para fines de vigilancia sanitaria, enviar el cultivo al laboratorio de referencia de la COFEPRIS (CCAYAC ) 
para su identificación serológica o molecular.  
A.8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.  
a) Los cultivos determinados como presuntivos con las pruebas bioquímicas o confirmados por la 
serología, informar como:  
Salmonella spp en 25g:  PRESENCIA.  
b) Descartar los cultivos con resultados atípicos a partir de las pruebas bioquímicas miniaturizadas 
clasificadas como no Salmonella , informar:  
Salmonella spp  en 25g:  AUSENCIA.  
c) Placas con agar XLD, ASB y EH sin desarrollo y/o colonias atípicas, informar:  
Salmonella spp en 25g:  AUSENCIA.  
d) En caso de que la cantidad sea menor a 25g se debe reportar la presencia o ausencia de Salmonella  en 
la porción de ensayo (g o mL) de producto utilizado.  
A.9. AYUDA VISUAL.  
      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.10. FORMULACIONES Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.  
Alternativamente pueden utilizarse medios comerciales a menos que se indique otra cosa.  
La caducidad de los medios de cultivo una vez preparado deberá ser demostrada en el laboratorio bajo las 
condiciones de almacenamiento particulares, a menos que se ind ique otra cosa.  
A.10.1.  Agua peptonada amortiguada.  
A.10.1.1.  Fórmula.  
Digerido enzimático de caseína  
NaCl  
Na2HPO 4.12H 2O 
KH2PO 4 
Agua  10.0g  
5.0g 
9.0g 
1.5g 
1 000mL  
 
A.10.1.2.  Preparación: Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Ajust ar el pH, de tal 
manera que después de la esterilización sea 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir el medio en frascos de capacidad 
necesaria para obtener las porciones de prueba. Esterilizar en autoclave 15 min a 121°C.  
A.10.2.  Caldo RVS.  
A.10.2.1.  Solución A.  
A.10.2.1.1.  Fórmula.  
Digerido enzimático de soya  
NaCl  
KH2PO 4 
K2HPO 4 
Agua  5.0g 
8.0g 
1.4g 
0.2g 
1000mL  
 
A.10.2.1.2.  Preparación: Preparar por ingredientes y disolverlos en el agua, es necesario calentar 
aproximadamente a 70°C. La solución debe prepararse el día  de la preparación del medio de RVS completo.  
A.10.2.2.  Solución B.  
A.10.2.2.1.  Fórmula.  
MgCl 2.6H 2O 
Agua  400.0g  
1000mL  
 
A.10.2.2.2.  Preparación: Disolver el cloruro de magnesio en el agua. Como esta sal es muy higroscópica, 
es aconsejable disolver el cont enido completo de un frasco nuevo de MgCl 2.6H 2O de acuerdo a la fórmula. 
Por ejemplo, agregando 250g de MgCl 2.6H 2O a 625mL de agua, dará un volumen total de solución de 788mL 
y una concentración de 31.7g por cada 100mL de MgCl 2.6H 2 aproximadamente.  
La solu ción puede almacenarse en un frasco ámbar con tapa hermética a temperatura ambiente por 2 años.  
A.10.2.3.  Solución C.  
A.10.2.3.1.  Fórmula.  
Oxalato de verde malaquita  
Agua  0.4g 
100mL  
 
A.10.2.3.2.  Preparación: Disolver el oxalato de verde malaquita en el ag ua. La solución puede 
almacenarse en frasco ámbar a temperatura ambiente por 8 meses.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
A.10.2.4.  Medio Completo.  
A.10.2.4.1.  Fórmula.  
Solución A  
Solución B  
Solución C  1000mL  
100mL  
10mL  
 
A.10.2.4.2. Preparación: Agregar 1000mL de la solución A, 100mL de la  solución B y 10mL de la solución 
C. Ajustar el pH, si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5.2 ± 0.2. Antes de su 
uso, distribuir porciones de 10mL a cada tubo. Esterilizar a 115°C por 15 min. Almacenar el medio preparado 
a 3°C ± 2°C, utilizar el medio el mismo día de su preparación.  
Nota: La composición final del medio completo será de: Digerido enzimático de soya, 4.5g/L; NaCl, 7.2g/L; 
KH2PO 4 + K 2HPO 4, 1.44g/L; MgCl2, 13.4g/L o MgCl 2.6H 2O, 28.6g/L; oxalato de verde malaquit a, 0.036g/L.  
A.10.3.  Caldo MKTTn.  
A.10.3.1.  Medio Base.  
A.10.3.1.1.  Fórmula.  
Extracto de carne  
Digerido enzimático de caseína  
NaCl  
CaCO 3 
Na2S2O3.5H 2O 
Ox sales biliares uso bacteriológico  
Verde brillante  
Agua  4.3g 
8.6g 
2.6g 
38.7g  
47.8g  
4.78g  
0.0096g  
1000mL  
 
A.10.3.1.2. Preparación:  Disolver los ingredientes deshidratados básicos de la fórmula o el medio 
completo deshidratado en el agua, hervir por 5 min. Ajustar el pH, si es necesario, a 8.2 ± 0.2 a 25°C. El 
medio base puede almacenarse por 4 semanas a 3°C ± 2°C.  
A.10.3.2.  Solución de Yodo –Yoduro  
A.10.3.2.1.  Fórmula.  
Yodo  
Yoduro de potasio (KI)  
Agua  20.0g  
25.0g  
100.0mL  
 
A.10.3.2.2. Preparación: Disolver completamente el yoduro de potasio en 10mL de agua, agregar el yodo 
y diluir a 100mL con agua estéril. No  calentar.  
Almacenar la solución en la oscuridad a temperatura ambiente en un frasco bien cerrado.  
A.10.3.3.  Solución de Novobiocina.  
A.10.3.3.1.  Fórmula.  
Novobiocina (sal sódica)  
Agua  0.04g  
5.0mL  
 
A.10.3.3.2. Preparación: Disolver la novobiocina (sal sód ica) en el agua y esterilizar por filtración. Puede 
almacenar la solución por no más de 4 semanas a 3°C ± 2°C.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.10.3.4.  Medio Completo.  
A.10.3.4.1.  Fórmula.  
Medio base  
Solución de yodo -yoduro  
Solución de novobiocina  1000mL  
20mL  
5mL 
 
A.10.3.4.2.  Prepar ación: Agregar asépticamente 5mL de solución de novobiocina a 1000mL de medio 
base. Mezclar, después agregar 20mL de la solución de yodo -yoduro. Mezclar bien. Distribuir el medio 
asépticamente en recipientes estériles de suficiente capacidad para contener las porciones necesarias de 
prueba. El medio completo deberá utilizarse el mismo día de la preparación.  
A.10.4.  Agar XLD.  
A.10.4.1.  Medio Base.  
A.10.4.1.1.  Fórmula.  
Extracto de levadura en polvo  
NaCl  
Xilosa  
Lactosa  
Sacarosa  
L-Lisina  
Tiosulfato de sodio  
Citrato férrico  amónico  
Rojo de fenol  
Desoxicolato de sodio  
Agar  
Agua  3.0g 
5.0g 
3.75g  
7.5g 
7.5g 
5.0g 
6.8g 
0.8g 
0.08g  
2.5g 
15.0g  
1000mL  
 
A.10.4.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes básicos deshidratados de la fórmula o el medio 
completo deshidratado en  el agua por calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio comience a 
hervir. Evitar el sobrecalentamiento. Ajustar el pH, si es necesario, a 7.4 ± 0.2 a 25°C.  
A.10.4.1.3. Preparación de las placas de agar: Transferir el medio inmediatamente a  un baño de agua a 
44°C – 47°C y esperar a que el medio se atempere, agitar y vaciar en las placas, dejar solidificar. Antes de su 
uso las placas deberán estar completamente secas, se recomienda secar las placas en horno entre 37°C y 
55°C con las tapas par cialmente abiertas o en campana de flujo laminar hasta que la superficie del agar este 
seca. El medio se puede almacenar por no más de 5 días a 3°C ± 2°C.  
A.10.5.  Agar nutritivo.  
A.10.5.1.  Fórmula.  
Extracto de carne  
Peptona  
Agar  
Agua  3.0g 
5.0g 
15.0g  
1000mL  
 
A.10.5.2.  Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado en el agua, por 
calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 6.8 ± 
0.2 a 25°C. Transferir el medio de cultivo a tu bos o botellas de capacidad apropiada. Esterilizar por 15min  a 
121°C.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
A.10.5.2.1. Preparación de las placas de agar nutritivo: Transferir el medio inmediatamente a un baño 
de agua a 44°C – 47°C y esperar a que el medio se atempere, agitar y vaciar 15mL de l medio fundido a 
placas estériles, dejar solidificar. La superficies de las placas debe estar completamente seca antes de su uso, 
se recomienda secar las placas en un horno entre 37°C y 55°C con las tapas parcialmente abiertas o en 
campana de flujo lamina r hasta que la superficie del agar este seca.  
A.10.6.  Agar TSI.  
A.10.6.1.  Fórmula.  
Extracto de carne  
Extracto de levadura  
Peptona  
NaCl  
Lactosa  
Sacarosa  
Glucosa  
Citrato de fierro (III)  
Tiosulfato de sodio  
Rojo de fenol  
Agar  
Agua  3.0g 
3.0g 
20.0g  
5.0g 
10.0g  
10.0g 
1.0g 
0.3g 
0.3g 
0.3g 
15.0g  
1000mL  
 
A.10.6.2. Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado en el agua por 
calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 7.4 ± 
0.2 a 25°C.  Distribuir 10mL del medio en tubos de ensaye. Esterilizar por 15 min a 121°C. Dejar solidificar en 
posición inclinada para obtener un bisel de 2.5cm – 5cm.  
A.10.7.  Agar Urea de Christensen.  
A.10.7.1.  Medio Base.  
A.10.7.1.1.  Fórmula.  
Peptona  
Glucosa  
NaCl  
Fosfato dihidrogenado de potasio (KH 2PO 4) 
Rojo de fenol  
Agar  1.0g 
1.0g 
5.0g 
2.0g 
0.012g  
15.0g  
 
A.10.7.1.2.  Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado por calentamiento. Si 
es necesario, ajustar el pH de tal manera que después d e la esterilización quede en 6.8 ± 0.2 a 25°C. 
Esterilizar por 15 min a 121°C.  
A.10.7.2.  Solución de urea.  
A.10.7.2.1.  Fórmula.  
Urea  
Agua, para un volumen final de  400g  
1000mL       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.10.7.2.2.  Preparación: Disolver la urea en el agua. Esterilizar por filtració n. 
A.10.7.3.  Medio Completo.  
A.10.7.3.1.  Fórmula.  
Medio base  
Solución de Urea  950mL  
50mL  
 
A.10.7.3.2.  Preparación: Agregar bajo condiciones asépticas, la solución de urea al medio base, 
previamente fundido y mantenido de 44°C – 47°C en el baño de agua. Distribuir 10mL del medio completo a 
tubos de ensaye.  
A.10.8.  Reactivo de ß -Galactosidasa.  
A.10.8.1.  Solución amortiguadora.  
A.10.8.1.1.  Fórmula.  
NaH 2PO 4 
NaOH, 10mol/L solución   
Agua, para un volumen final de   6.9g 
~ 3mL 
50mL  
 
A.10.8.1.2.  Preparación: Disolver el fosfato dihidrogenado de sodio en ~ 45mL de agua en un matraz 
volumétrico. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C con la solución de hidróxido de sodio. Agregar agua para un 
volumen final de 50mL.  
A.10.8.2.  Solución de ONPG.  
A.10.8.2.1.  Fórmula.  
ONPG  
Agua 0.08g  
15mL  
 
A.10.8.2.2. Preparación: Disolver el ONPG en el agua a aproximadamente 50°C. Enfriar la solución.  
A.10.8.3.  Reactivo Completo.  
A.10.8.3.1.  Fórmula.  
Solución amortiguadora  
Solución de ONPG  5mL 
15mL  
 
A.10.8.3.2.  Preparación: Agregar la sol ución amortiguadora a la solución de ONPG.  
A.10.9.  Reactivos para la prueba VP.  
A.10.9.1.  Medio de VP.  
A.10.9.1.1.  Fórmula.  
Peptona  
Glucosa  
K2HPO 4 
Agua  7.0g 
5.0g 
5.0g 
1000mL  
 
A.10.9.1.2.  Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentar si es neces ario. Ajustar el pH de tal 
forma que después de la esterilización quede a 6.9 ± 0.2 a 25°C. Transferir 3mL de volumen a tubos de 
ensaye y esterilizar por 15min a 121°C.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
A.10.9.2.  Solución de creatinina (N -amidinosarcosina).  
A.10.9.2.1.  Fórmula.  
Monohidrato  de creatinina  
Agua  0.5g 
100mL  
 
A.10.9.2.2.  Preparación: Disolver el monohidrato de creatinina en el agua.  
A.10.9.3.  1-naftol, solución etanólica  
A.10.9.3.1.  Fórmula  
1-Naftol  
Etanol al 96%  6g 
100mL  
 
A.10.9.3.2.  Preparación: Disolver el 1 -naftol en el agu a. 
A.10.9.4.  Solución de KOH.  
A.10.9.4.1.  Fórmula.  
KOH  
Agua  40g 
100mL  
 
A.10.9.4.2.  Preparación: Disolver el KOH en el agua.  
A.10.10.  Reactivos para la reacción de Indol.  
A.10.10.1.  Medio Triptona/triptófano.  
A.10.10.1.1.Fórmula.  
Triptona  
NaCl  
DL-Triptófan o 
Agua  10g 
5g 
1g 
1000mL  
 
A.10.10.1.2. Preparación: Disolver los ingredientes en el agua hirviendo. En caso necesario, ajustar el pH 
a 7.5 ± 0.2 a 25°C. Distribuir volúmenes de 5mL del medio a tubos de ensaye. Esterilizar 15 min a 121°C.  
A.10.11.  Reactivo de Kovacs.  
A.10.11.1. Fórmula.  
4-Dimetilaminobenzaldehido  
Ácido hidroclórico,  = 1.18 g/mL a 1.19 g/mL  
2-metilbutan -ol 5g 
25mL  
75mL  
 
A.10.11.2.  Preparación: Mezclar los componentes.  
A.10.12.  Solución Salina Fisiológica.  
A.10.12.1.  Fórmula.  
NaCl  
Agua  8.5g 
1000mL       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
A.10.12.2.  Preparación: Disolver el cloruro de sodio en el agua. Si es necesario, ajustar el pH de tal 
manera que después de la esterilización quede en 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir volúmenes de la solución  tal 
que después de la esterilización que den entre 90mL a 100mL. Esterilizar 15 min a 121°C.  
A.10.13.  Agar EH.  
A.10.13.1.  Fórmula.  
Peptona  12g 
Extracto de levadura  3g 
Sales biliares No. 3  9g 
Lactosa  12g 
Sacarosa  12g 
Salicina  2g 
NaCl  5g 
Tiosulfato de sodio  5g 
Citrato férrico amónico  1.5g 
Azul de bromotimol  0.065g  
Fucsina ácida  0.1g 
Agar  14.0g  
Agua destilada   1L 
pH final 7.5 ± 0.2  
 
A.10.13.2.  Preparación: Calentar a ebullición con agitación frecuente para disolver los ingredientes  por no 
más de 1 min. No sobrecalentar. Enfriar a 45 -50°C. Distribuir en porciones de 20mL en cajas Petri de 15 x 
100mm. Dejar secar por 2h con las tapas parcialmente abiertas. Almacenar hasta 30 días en refrigeración (4  ± 
2°C).  
A.10.14.  Agar ASB.  
A.10.14.1.  Fórmula.  
Polipeptona (o peptona)  10g 
Extracto de ca rne 5g 
Dextrosa  5g 
Na2HPO 4 (anhi dro) 4g 
FeSO 4 (anhi dro) 0.3g 
Sulfito de bismuto (indicador)  8g 
Verde brillante  0.025g  
Agar  20g 
Agua destilada  
pH, 7.7 ± 0.2   1L 
 
A.10.14.2.  Preparación: Mezclar los ingredientes con calentamiento y agitación constant e a ebullición por 
1min hasta obtener una suspensión uniforme (el precipitado no se disuelve). Enfriar a 45 -50ºC. Suspender el 
precipitado con agitación suave y distribuir volúmenes de 20mL en cajas Petri estériles de 15 X 100mm. 
Permitir que seque el agar  por 2h con las tapas parcialmente abiertas y después cerrarlas.  
PRECAUCIÓN: No esterilizar. Preparar el medio un día antes de su uso y almacenar en oscuridad. El 
medio pierde selectividad después de 48h.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Apéndice Normativo B.  
Método de referencia para la estimación de la cuenta de Staphylococcus aureus.  
Se establece el método microbiológico para determinar la cuenta de S. aureus presente en alimentos para 
consumo humano nacionales o de importación.  
B.1. INTRO DUCCIÓN.  
B.2. S. aureus  es una bacteria altament e vulnerable a tratamientos térmicos y a varios agentes 
sanitizantes. La presencia de esta bacteria en los alimentos procesados o en los equipos donde se procesan, 
es generalmente un indicador de sanitización inadecuada. S. aureus  produce enterotoxinas que  al ingerirse 
pueden causar intoxicaciones alimentarias. Es actualmente responsable de un alto porcentaje de los brotes de 
intoxicación alimentaria a nivel mundial.  
Para el propósito del presente método, la confirmación de S. aureus  está basado en una fuer te reacción 
de coagulasa, pero se reconoce que hay algunas cepas de S. aureus  que producen una reacción débil. Estas 
últimas cepas se pueden confundir con otras bacterias, pero se pueden distinguir por medio del uso de 
pruebas adicionales, como son la term onucleasa y producción de ácido a partir del manitol, entre otras.  
Este método permite hacer una estimación del contenido de S. aureus en los productos de consumo, se 
efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confir mación mediante las 
pruebas de coagulasa como determinante y pruebas auxiliares cuando la determinación de la coagulasa  es 
débil.  
B.3. EQUIPO.  
B.3.1  Horno para esterilizar que alcance 180°C.  
B.3.2  Autoclave.  
B.3.3  Balanza con capacidad no mayor de 2,500g y sensibilidad de 0.1g.  
B.3.4  Incubadora a capaz de operar a 35°C ± 1ºC.  
B.3.5  Homogeneizador peristáltico tipo Stomacher.  
B.3.6  Baño de agua  capaz de operar a 35°C ± 1ºC.  
B.4. MATERIALES.  
B.4.1  Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas.  
B.4.2  Tubos de cultivo de 16mm x 150mm o frascos de 125 a 250mL de capacidad.  
B.4.3  Tubos de cultivo de 10mm x 75mm.  
B.4.4  Cajas Petri de 90 a 100mm de diámetro.  
B.4.5  Pipetas bacteriológicas de 1mL y 10mL de capacidad graduadas en 0.1mL y 1mL respectivamente y 
diámet ro de 2 a 3mm.  
B.4.6  Pipetas Pasteur.  
B.4.7  Probetas.  
B.4.8  Varillas de vidrio de 3.5mm de diámetro aproximadamente y 20cm de largo dobladas en ángulo recto 
u equivalente.  
B.4.9  Matraz Erlenmeyer.  
B.4.10  Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cu al se coloca una varilla de vidrio en forma de 
"V" rodeada de algodón humedecido con agua.  
B.5. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.  
B.5.1  Agar Baird Parker.  
B.5.2  Solución de telurito de potasio.  
B.5.3  Emulsión de yema de huevo (puede usarse comercialmente prep arada).  
B.5.4  BHI.      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
B.5.5  Solución reguladora de fosfatos.  
B.5.6  Agua peptonada.  
B.5.7  Solución Salina 0.85%.  
B.5.8  Agar Azul de Toluidina -ADN.  
B.5.9  Plasma de Conejo con EDTA.  
B.5.10  Agar Soja Tripticaseina . 
B.5.11  Peróxido de hidrógeno al 3%.  
B.5.12  AST.  
B.5.13  Reactivos para la tinción de Gram . 
B.5.14  Caldo rojo de fenol (glucosa y manitol).  
B.5.15  Solución de Piruvato de Sodio.  
B.5.16  Aceite de parafina o mineral estéril.  
B.5.17  S. aureus.  
B.5.18  S. epidermidis . 
B.5.19  Solución trazable para calibración de potenciómetro (CENAM).  
B.6. CONDICIONES DE PRUEBA.  
B.6.1  Preparación de la muestra.  
Tomar diferentes porciones del alimento, transferir 25g o mL a frascos de dilución con 225mL de solución 
reguladora de fosfatos, para preparar una dilución 1:10.  
En una  situación atípica y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g, se 
deberá utilizar la cantidad necesaria de solución reguladora de fosfatos, para obtener una dilución 1:10.  
Homogeneizar por 1 o 2 min en licuadora o Stom acher dependiendo del tipo de alimento.  
B.6.2  Preparación de la muestra para Moluscos en concha  
Como se indica en A.6.2.4.  
B.6.3  Procedimiento para Moluscos, desconchados y congelados.  
Como se indica en A.6.2.5  
B.6.4  Productos de la pesca.  
Pesar 200g del alimento en 200mL de regulador de fosfatos (dilución 1:2) y homogeneizar por 2 min en 
vaso de licuadora u homogeneizador peristáltico, el volumen total en el vaso debe cubrir totalmente las aspas. 
Las muestras congeladas deben descongelarse en refrigeració n (2ºC - 5ºC) un máximo de 18h antes de  su 
análisis.  
B.7. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.  
B.7.1  Transferir por medio de una pipeta estéril, 0.1mL de la muestra directa si es líquida, o 0.1mL de la 
suspensión inicial (dilución 10-1) en el caso de otros productos,  por duplicado a cajas de agar Baird Parker. 
Repetir el procedimiento para las diluciones siguientes si son necesarias 10-2, 10-3. 
Nota: Si se sospecha que el alimento contiene bajas cuentas de S.aureus,  se deberá aumentar el límite de 
detección, en un fac tor igual a 10 inoculand o 1mL de la muestra directa si é sta es líquida, o de cada dilución 
distribuida en 3 placas como sigue: 0.4, 0.3 y 0.3mL sobre la superficie de las placas de agar Baird -Parker, 
por duplicado. En ambos casos evitar usar cajas húmedas.  
B.7.2  Cuidadosamente distribuir el inóculo tan pronto como sea posible, sobre la superficie del agar con 
varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada placa y dilución.  
B.7.3  Mantener las placas con las tapas hacia arriba hasta q ue el inóculo sea absorbido totalmente por el agar.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
B.7.4  Invertir las placas e incubar por 24 a 35ºC ± 1ºC, marcar las colonias típicas observadas. Morfología 
colonial típica colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1 a 2mm  y muestran una 
zona opaca, húmedas y con un halo claro (de proteólis is) alrededor de la colonia. Re incubar las placas a 35ºC 
± 1ºC, por otras 22 a 24h y marcar las nuevas colonias típicas.  
NOTA: En algunas ocasiones cepas que han sido aisladas de product os congelados o deshidratados que 
han sido almacenados por periodos largos de tiempo, frecuentemente desarrollan colonias menos negras  con 
apariencia rugosa y textura seca. Las colonias atípicas son similares en apariencia pero sin halo claro 
alrededor.  
B.7.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S. aureus ; si no es 
posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias. 
Seleccionar de cada placa 5 colonias típicas y 5 co lonias atípicas, para su confirmación.  
B.7.6  Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas se debe agregar la nota de "valor estimado" 
al reporte de los resultados.  
B.7.7  Si fue inocu lado 1.0mL en 3 placas, tratar é stas como una sola y seguir los p rocedimientos  de 
confirmación.  
B.7.8  Confirmación: Prueba de Coagulasa.  
B.7.8.1  Seleccionar y sembrar cada colonia típica en tubos con 0.5mL de BHI y en tubos con AST. Utilizar 
simultáneamente un control positivo de S. aureus  y un control negativo de S. epidermidis . Incubar a 35ºC ± 
1ºC en baño de agua, durante 20 a 24h. Mantener los cultivos en AST a no más de 27ºC ± 1ºC para pruebas 
posteriores. Agregar a 0.1mL del cultivo anterior a 0.3mL de plasma de conejo con EDTA (a menos que el 
fabricante indique ot ras cantidades). Incubar a 35°C ± 1ºC en baño de agua y observar periódicamente a 
intervalos de 1h durante las primeras 4 a 6h; si no hay formación de coá gulo, observar hasta las 24h. 
Considerar la prueba positiva cuando el coágulo se forma completamente y  es firme al invertir el tubo. En otro 
caso se deberán realizar las pruebas auxiliares.  
B.7.8.2  Nota: Para cada reactivo nuevo se deberá realizar la prueba de coagulabilidad del plasma de 
conejo añadiendo una gota de calcio al 5% a 0.5mL de plasma reconsti tuido, formándose un coágulo en 10 -15 seg.  
B.7.9  Pruebas auxiliares.  
B.7.9.1  Realizar una tinción de Gram  a cada cultivo observar al microscopio y observar la presencia de 
cocos Gram positivos.  
B.7.9.2  Si se dispone de un sistema  de bioquímicas miniaturiza do, é ste puede ser utilizado como 
alternativa de las siguientes pruebas, con excepción de la termonucleasa y la tinción de Gram.  
B.7.9.3  Prueba de catalasa.  A partir de un cultivo en AST realizar la prueba de la catalasa en un 
portaobjetos, emulsificar una  porción del cultivo con 1 gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Observar la 
producción de burbujas de gas.  
B.7.9.4  Utilización anaeróbica del manitol . Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado 
de manitol al (0.5%), con un inóculo abundante . Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite 
mineral de al menos 25mm. Incubar hasta 5 días a 37°C ± 1ºC. Un cambio en la coloración del indicador 
indica la utilización anaeróbica del manitol y la presencia S. aureus . Incluir los controles  positivos y negativos.  
B.7.9.5  Utilización anaeróbica de la glucosa . Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado 
de glucosa al (0.5%), con un inóculo abundante. Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite 
mineral de al menos  25mm. Incubar hasta 5 días a 37°C ± 1ºC. Un cambio en la coloración del indicador 
indica la utilización anaeróbica de la glucosa y la presencia S. aureus . Incluir los controles positivos  y 
negativos.  
B.7.9.6  Prueba de termonucleasa. Preparar portaobjetos  con 3mL de agar azul de toluidina -ADN. Con 
ayuda de una pipeta Pasteur hacer orificios equidistantes en el agar. En un baño de agua hirviendo calentar 
durante 15 min, 0.3 mL de cultivo en BHI. Utilizando un a pipeta Pasteur transferir una gota del cultivo a un 
orificio del medio, repetir para cada cepa incluyendo testigos positivo y negativo.  Incubar a 35ºC ± 2°C en 
cámara húmeda de 4 a 24h. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1mm alrededor de 
la perforación se califica como positiv a la prueba.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Tabla B.1. Características de S. aureus, S. epidermidis y Micrococcus . 
 
 
B.8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.  
B.8.1.  Si al menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas fueron coagulasa positiva, tomar el 
número total de las colonias c ontadas como presuntivas de S.aureus.  
B.8.2.  En otros casos, calcular el número de colonias presuntivas de S. aureus a partir del porcentaje 
obtenido de colonias coagulasa positivas confirmadas.  
B.8.3.  Promediar los resultados de los duplicados.  
B.8.4.  Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (típicas o 
atípicas) calcular el número de S. aureus  para cada dilución como se especifica en los puntos anteriores, 
calcular la cuenta de S. aureus considerando el factor de d ilución, calcular el logaritmo en base diez de cada 
dilución  y realizar la resta de é stos, si la diferencia entre los logaritmos de las dos diluciones es menor a 0.3, 
reportar el promedio de las dos diluciones. Si por el contrario la diferencia entre los l ogaritmos es mayor  a 0.3; 
reportar el valor más bajo.  
B.8.5.  Cuando no se tenga crecimiento reportar como:  
 
 
B.8.6.  Ejemplo para el cálculo de S. aureus.  
Por ejemplo, el 0.1mL del inó culo de la dilución 10-2 de la muestra da como resultado 65 y 85 colon ias 
típicas por placa.  
Ninguna colonia atípica fue identificada en las placas.  
Todas las 5 colonias seleccionadas de la placa conteniendo 65 colonias fueron coagulasa positiva por  lo 
que las 65 colonias fueron consideradas como S. aureus.  
3 de las 5 colon ias seleccionadas de la placa que contiene 85 colonias fueron coagulasa positiva por lo 
que el 60%, es decir, 51 colonias son consideradas como S. aureus . 
La cuenta promedio es:  
65+51 / 2 = 58 S. aureus.  
58 por el inverso del factor de dilución (1/10-2) es 5800 UFC.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Si se considera que el inóculo fue de 0.1mL habrá que multiplicar por 10 para obtener 58000UFC/mL.  
B.8.7.  Precisión de la cuenta.  
Para razones estadísticas, los intervalos de confianza de este método varía n en un 95% de los casos, 
desde un ±16% a ±52%. En la práctica, una mayor variación se puede encontrar, especialmente entre los 
resultados obtenidos por diferentes analistas.  
B.9. Ayuda Visual.  
 
 
B.10. Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos.  
B.10.1  Agar Baird Parker.  
B.10.1. 1. Medio base.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
B.10.1.2.  Fórmula.  
Triptona  1g 
Extracto de carne  5g 
Extracto de levadura  1g 
Piruvato de sodio  1g 
Glicina  1g 
Cloruro de litio .6H2O  5g 
Agar  20g 
Agua destilada  
pH final 7.0 ± 0.2.  1L 
B.10.1.3.  Preparación: Disolver los ingredientes e n 950mL de agua destilada con agitación constante y 
calentamiento. Esterilizar 15 min a 121°C. Si se utiliza inmediatamente, mantenerlo fundido a 48 -50ºC antes 
de adicionar los ingredientes de enriquecimiento o almacenar el medio solidificado a 4 ± 1°C has ta 1 mes. 
Fundir el medio antes de su uso.  
Ingredientes de enriquecimiento: telurito y yema de huevo.  
Adicionar asépticamente 5mL de yema de huevo -telurito de potasio a temperatura ambiente, a 95mL de la 
base fundida. Mezclar bien evitando hacer burbujas y vaciar porciones de 15 -18mL en cajas Petri  15 x 
100mm. El medio debe ser densamente opaco. Secar las placas antes de su uso. Guard ar las placas 
preparadas 20 -25ºC hasta 5 días.  
B.10.2  Emulsión de yema de huevo.  
B.10.2.1  Preparación.  (Sólo si una present ación comercial no está disponible)  
Utilizar huevos frescos, separar la yema de la clara.  
Mezclar las yemas con 4 veces el volumen de agua, calentar la mezcla en un baño de agua, controlando 
la temperatura a 45 ± 0.5°C por 2h y dejar reposar por de 18 a 24 h de 0 a +5°C, dejar precipitar.  
Decantar el sobrenadante líquido y esterilizarlo por filtración, a menos que se haya llevado la separación 
asépticamente. La emulsión puede ser almacenada de 2 a 8°C por no más de 72h.  
B.10.3  Solución de Telurito de potasio . 
B.10.3.1  Fórmula.  
Telurito de potasio (trioxotelurito dipotásico)  
Agua  1.0g 
100mL  
B.10.3.2  Preparación: Disolver el telurito de potasio en agua con un mínimo calentamiento.  
Esterilizar por filtración.  
La solución puede ser conservada de 2 a 8°C por sei s meses.  
B.10.4  BHI. 
B.10.4.1  Fórmula.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Peptona  
Infusión cerebro de ternero deshidratado  
Infusión corazón de res deshidratado  
Glucosa  
Cloruro de sodio  
Fosfato disódico Na2HPO4  
Agua  1.0g 
100mL  
5.0g 
2.0g 
5.0g 
2.5g 
1000mL  
B.10.4.2  Preparación: Disolver los componentes o el medio completo comercial en agua hirviendo, ajustar 
el pH para que después de la esterilización se encuentre entre en 7.4 a 25°C.  
Transferir el contenido a tubos o botellas en cantidades iguales a 10mL. Esterilizar el medio por 20 min  a 
121°C.  
El medio puede ser almacenado por 6 meses en condiciones de refrigeración de 0 a 5°C.  
B.10.5  Plasma de Conejo.  
B.10.5.1.  Preparación: Utilizar el plasma de conejo que esté disponible comercialmente y rehidratar de 
acuerdo a las instrucciones del fabr icante. Adicionar el EDTA, en el plasma hidratado.  
Si no encuentra plasma de conejo deshidratado comercial diluir plasma de conejo fresco en una 
proporción 1:3 con agua estéril.  
Antes de su uso probar cada lote de plasma de conejo con cepas positivas, cepa s ligeramente positivas de 
S. aureus  y con cepas negativas.  
B.10.6  Agar Azul de Toluidina.  
B.10.6.1  Fórmula.  
ADN de timo de carnero  0.3g 
Agar  10g 
CaCl2 (anhi dro) 1.1mg  
NaCl  10g 
Azul de toluidina O  0.083g  
Tris (hidroximetil aminometano)  6.1g 
Agua dest ilada  
pH 9.0 final  1L 
B.10.6.2.  Preparación: Disolver el Tris (hidroximetil aminometano) en 1L de agua destilada. Ajustar el pH 
a 9.0 adicionar los ingredientes restantes a excepción del azul de toluidina. Calentar a ebullición para disolver 
el azul de t oluidina en el medio. Distribuir en matraces o tubos de ensaye con tapa de rosca. No es necesario 
esterilizar si se usa inmediatamente. El medio estéril es estable a temperatura ambiente por 4 meses y es 
satisfactorio después de varios ciclos de fusión.  
Este medio se prepara por ingredientes.  
B.10.7  Solución Reguladora de Fosfatos.  
B.10.7.1.  Fórmula.  
Fosfato monopotásico  34.0g  
Agua destilada  
pH final 7.2   0.2 1L 
B.10.7.2.  Preparación: Disolver el fosfato en 500mL de agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con solución 
de hidróxido de sodio 1N. Llevar a un L con agua destilada. Esterilizar durante 15 min a 121°C   1°C. 
Para diluciones.  
Añadir 1.25mL de solución concentrada de reguladora de fosfat os a un L de agua destilada y ajustar el pH 
a 7.2 distribuir en frascos de dilución en volúmenes de 97mL. Esterilizar a 121°C   1°C durante 15 min.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
B.10.8  AST.  
B.10.8.1.  Fórmula.  
Tripticasa peptona  15g 
Fitona peptona  5g 
NaCl 5g 
Agar  15g 
Agua destilada  
pH 7.3 ± 0.2  1L 
B.10.8.2.  Preparación: Suspender los ingredientes en un L de agua destilada. Dejar reposar de 5 a 10 
min. Calentar con agitación constante para disolver el agar. Hervir por 1 min. Distribuir en tubos, cajas  o 
matraces. Esterilizar a 121ºC por 15 min.  
Cepas control: E. coli y S. aureus . 
B.10.9  Caldo Rojo de Fenol (para fermentación de carbohidratos).  
B.10.9.1.  Fórmula.  
Tripticasa o proteona peptona No. 3  10g 
NaCl  5g 
Extracto de carne (opcional)  1g 
Rojo de f enol (7.2 mL de solución de rojo de fenol al 0.25%)  0.018g  
Agua destilada  
pH 7.4 ± 0.2.  1L 
Carbohidrato*  
B.10.9.2.  Preparación: Disolver los ingredientes sin el carbohidrato, en 800mL de agua destilada con 
calentamiento y agitación ocasional. Distribuir  en volúmenes de 2mL en tubos de 13 X 100mm con campana 
de Durham. Esterilizar a 121ºC por 15min y dejar enfriar. Disolver 20g del carbohidrato en 200mL de agua 
destilada y esterilizar por filtro de membrana, adicionar asépticamente 0.5mL del filtrado a ca da tubo con 
medio esterilizado y enfriado a menos de 45ºC, agitar suavemente para mezclar.  
B.10.10  Aceite de parafina estéril.  
Puede esterilizar por filtración en membrana de 0.22 µm   
Se recomienda el uso de Unidad de filtración estéril Millex 33mm con mem brana MF -Millipore Cat álogo 
SLGS033SS (0.22 µm) o equivalente . 
Apéndice Normativo C.  
Método de referencia para el aislamiento de L. monocytogenes.  
Establece el método microbiológico para determinar la presencia de L. monocytogenes a partir de 
alimentos par a consumo humano nacionales o de importación.  
C.1. INTRODUCCIÓN.  
El método para detectar la presencia de L. monocytogenes  se basa en el aislamiento y la diferenciación de 
especies de Listeria spp,  principalmente por la fermentación de carbohidratos y la ac tividad hemolítica de los 
miembros de este género.  
L. monocytogenes  es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de Listeriosis. Es uno 
de los patógenos más virulentos causante de infecciones alimentarias, con una tasa de mortalidad e ntre un 20 
a 30%, más alta que casi todas las restantes tóxico infecciones alimentarias. L. monocytogenes  es un bacilo 
corto Gram positivo, que presenta diploformas dispuestas en “V” y anaerobio facultativo capaz de proliferar en 
un amplio intervalo de tem peraturas ( 1° a 45°C). Es catalasa positiva  y no presenta cápsula ni espora. Tiene Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
flagelos perítricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30°C o menos, pero es inmóvil a 37°C, 
temperatura a la cual sus flagelos se inactivan.  
Este método permite hac er una estimación del contenido de L. monocytogenes en los productos de 
consumo, se efectúa por medio de un pre -enriquecimiento selectivo y después su aislamiento en  placas  de 
medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante pruebas bioquímicas y fisiológicas.  
C.2. EQUIPO.  
C.2.1.  Equipos de esterilización de calor húmedo y calor seco.  
C.2.2.  Balanza con capacidad no mayor de 2,500g y sensibilidad de 0.1g.  
C.2.3.  Incubadoras a las diferentes temperaturas: 25°C ± 1°C, 30°C ± 1°C y 35°C ±1°C o 37°C ± 1°C. 
Baño de agua con una temperatura controlada de 47°C ± 2°C.  
C.2.4.  Potenciómetro.  
C.2.5.  Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con 
vasos esterilizables (vidrio o aluminio).  
C.3. MATE RIALES.  
C.3.1.  Asa de platino o níquel de Aprox . 3mm de diámetro o 10 l. 
C.3.2.  Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL, con divisiones de 
0.5mL y 0.1mL respectivamente  protegidas con tapón de algodón.  
C.3.3.  Pipetas de  1mL, con graduaciones de 0.1mL.  
C.3.4.  Matraces Erlenmeyer de 500mL y/o capacidad apropiada.  
C.3.5.  Cajas Petri de vidrio o desechables; diámetro 15mm  x 100mm y/o de un diámetro mayor 140mm.  
C.3.6.  Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas.  
C.3.7.  Tubos de ensaye de 16mm x 150mm y de 20mm x 100mm.  
C.3.8.  Tubos para serología de 10mm x 75mm o de 13mm x 100mm.  
C.3.9.  Gradillas para tubos de ensaye.  
C.3.10.  Mecheros Bunsen o Fisher.  
C.3.11.  Todo el material que tenga contacto con las muestras bajo estudio debe esterilizarse mediante: 
Horno, durante 2h a 170 -175ºC o autoclave, durante 15 min como mínimo a 121ºC ± 1ºC.  
C.4. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.  
C.4.1.  Caldo Fraser medio, con reducción de la concentración de agentes selectivos.  
C.4.2.  Caldo Fraser, con co mpleta concentración de agentes selectivos.  
C.4.3.  Agar Oxford.  
C.4.4.  Agar PALCAM.  
C.4.5.  TSYA.  
C.4.6.  CTSYE.  
C.4.7.  Agar sangre de cordero.  
C.4.8.  Caldo carbohidrato (ramnosa y xilosa).  
C.4.9.  Agar movilidad.  
C.4.10.  Solución de Peróxido de hidrógeno.  
C.4.11.  PBS.  
C.5. CEPAS.  
C.5.1.  S. aureus  ATCC 49444, ATCC 25923, CIP 5710.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
C.5.2.  R. equi  ATCC 6939, NCTC 1621.  
C.5.3.  L. monocytogenes ATCC 19115.  
C.5.4.  L. innocua ATCC 33090.  
C.5.5.  L. ivanovii.  
C.6. CONDICIONES DE PRUEBA.  
C.6.1.  Muestreo.  
Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no haya tenido 
daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento.  
El muestreo no es parte del método especificado en el presente método, es recomendable que las partes 
involu cradas en este punto lleguen a un acuerdo al respecto.  
C.6.2.  Preparación de la muestra.  
En general, al preparar la suspensión inicial, tomar diferentes porciones del alimento, transferirlo al  Caldo 
Fraser medio, a fin de obtener una relación 1:10. Pesar 2 5g o mL a frascos de dilución con 225mL  del Caldo 
Fraser medio, para obtener una dilución 1:10 (masa -volumen o volumen -volumen).  
Homogeneizar por 1 o 2 min en licuadora o homogeneizador peristáltico dependiendo del tipo de alimento.  
C.7. PROCEDIMIENTO ANAL ÍTICO.  
C.7.1.  Enriquecimiento Primario:  
Incubar la suspensión inicial (C.6.2) a 30°C ± 1ºC por 24h ± 2h.  
Nota: una coloración obscura puede aparecer, durante la incubación.  
C.7.2.  Enriquecimiento Secundario:  
Transferir  0.1mL del enriquecimiento primario, después de la incubación inicial por 24h ± 2h, a un tubo 
conteniendo 10mL del Caldo Fraser.  
Incubar el medio inoculado por un total de 48h ± 2h a 37°C ± 1°C.  
C.7.3.  Siembra en medios Selectivos e Identificación.  
Después de la incubación, examine el Caldo F raser para detectar la presencia de L. monocytogenes  
mediante la observación visual de la hidrólisis de la esculina que al ser positiva obscurece el caldo. Si se tiene 
cualquier grado de obscurecimiento.  
Del primer enriquecimiento selectivo, después de las  24h ± 2h de incubación, inocular 2 placas de agar 
Oxford y 2 placas de PALCAM por estría cruzada.  
Del segundo enriquecimiento incubado a 37°C ± 1°C por 48 ± 2h,  inocular 2 placas con agar Oxford y 2 
placas con PALCAM por estría cruzada.  
Invertir las placa s e incubar el agar Oxford y PALCAM a 30°C ± 1°C y a 37 ± 1°C.  
NOTA: Las placas con agar PALCAM se pueden incubar en condiciones de microaerofilia  (CO 2 5% -12% 
O2 5%-15%).  
C.7.4.  Después de la incubación por 24h; si se observa un crecimiento pobre o si n o se observan colonias; 
volver a incubar por 18h a 24h. Observar las placas para detectar la presencia de colonias presuntivas de 
Listeria spp . 
C.7.5.  Colonias Típicas de Listeria spp , en agar Oxford; por lo general crecen a las 24h se observan 
pequeñas (1 mm) grisáceas, rodeadas por un halo oscuro. Después de las 48h de incubación, las colonias se 
tornan obscuras con posible brillo verdoso con aproximadamente 2mm de diámetro, con halos negros y 
centros hundidos.  
C.7.6. Colonias típicas de Listeria spp  en ag ar PALCAM; para placas incubadas en anaerobiosis dejarlas 
expuestas las placas al aire por 1h, para que recuperen su color de rosa a púrpura. Después de 24h se 
observa a Listeria spp . como colonias muy pequeñas grisáceas o un verde olivo de aproximadamente  1.5 a 
2mm de diámetro, a veces con centros negros, pero siempre con halos oscuros. Después de 48h las colonias Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
de Listeria spp  se observan de color verde de aproximadamente 1.5 a 2mm de diámetro, con el centro 
hundido y rodeadas de un halo negro.  
C.7.7.  Pruebas Auxiliares Confirmatorias de Listeria spp . 
C.7.7.1.  Selección de Colonias para su confirmación:  Tomar de cada placa de agares selectivos,  5 
colonias sospechosas de Listeria spp.  Si se tiene que alguna de las placas tiene menos de 5 colonias 
presunt ivas, tomar para su confirmación todas las colonias que hayan crecido.  
C.7.7.2.  Aislamiento:  Inocular por estría cruzada, para obtener colonias aisladas en cajas con TSYEA. 
Incubar estas placas en una incubadora a 37°C ± 2°C por 18h a 24h o hasta que el c recimiento sea 
satisfactorio (no más de 72h).  
Las colonias típicas se observan de 1mm a 2mm de diámetro, convexas, incoloras y opacas con borde 
entero. Si no se obtiene un buen aislamiento, proceder a sembrar nuevamente otra colonia sospechosa de los 
medio s selectivos.  
C.7.7.3.  Luz de Henry: Esta prueba tiene carácter informativo examinar las placas para TSYEA con 
colonias típicas, con el sistema óptico Henry se trata de hacer incidir luz transmitida oblicuamente con una 
lámpara de luz blanca lo suficientem ente potente como para iluminar la placa y en un ángulo de 45°. Las 
colonias aparecen de color azul -gris a azul. El uso de las colonias de control positivo y negativo es 
recomendado. La placa puede ser observando a simple vista pero el uso de un microscopi o de disección o 
lupa es preferible.  
Nota: La luz de Henry puede ser mejor percibida si el TSYEA es delgado aproximadamente 15mL/placa.  
 
 
C.7.7.4.  Reacción de Catalasa: Tomar una colonia aislada y suspenderla en una gota de solución de 
peróxido de hidróge no. La inmediata formación de burbujas indica una reacción positiva.  
Precaución: la agitación del reactivo con la suspensión del microorganismo debe h acerse con un  asa  de 
plástico o palillo de madera estéril, evitando el contacto del metal con el reactiv o.  
C.7.7.5.  Tinción de Gram: Realizar la tinción de Gram a una colonia aislada obtenida en TSYA, se 
deberán observar bacilos cortos Gram Positivos.  
C.7.7.6.  Prueba de Movilidad: Tomar una colonia aislada de TSYA, y suspenderla en un tubo 
conteniendo CST c on extracto de levadura. Incubar a 25°C ± 1ºC por 8h a 24h o hasta que se observe  el 
medio turbio. Depositar una gota de este cultivo entre un portaobjetos y cubreobjetos y examinar en el 
microscopio. Listeria spp . se observan como bacilos cortos con un m ovimiento giratorio (trumbling). Cultivos 
incubados a la temperatura de 25°C  ± 1ºC pueden ser falsos positivos al exhibir dicho movimiento: se 
recomienda siempre comparar el cultivo de prueba con cepas conocidas de cocos, bacilos largos o cortos con 
una mo vilidad rápida de nado y que no es característico de Listeria spp .  
C.7.7.6.1.  Prueba alternativa de movilidad:  utilizando un  asa recta, inocular el agar de movilidad picando 
una colonia obtenida en TSYEA. Incubar por 48h a 25°C ± 1ºC. Examinar el crecimie nto alrededor de la 
picadura. Debido al típico movimiento de Listeria spp.  da como resultado un crecimiento característico en      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
forma de sombrilla. Si el crecimiento no es suficiente, incubar por 5 días adicionales y observar la picadura al 
término de ese ti empo.  
C.7.8.  Confirmación de L. monocytogenes   
C.7.8.1.  Prueba de hemólisis: Si las características morfológicas y fisiológicas, así como la catalasa son 
indicativos de Listeria spp,  inocular una placa con agar sangre de carnero al 5% para determinar la ac tividad 
hemolítica. Las placas de agar sangre no deben presentar agua de condensación en la superficie del medio. 
Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el anverso de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Tomar 
una colonia aislada obtenida en TS YA e inocular por picadura un cuadro por cada cultivo a probar. 
Simultáneamente utilizar cepas control positiva ( L. monocytogenes ) y negativas ( L. innocua ). Después de la 
incubación a 35°C ± 2°C por 24h ± 2h, examinar las cepas de prueba y los controles. L. monocytogenes  
produce una zona ligeramente clara alrededor del punto de la picadura ( -hemólisis); L. innocua no muestra 
una zona clara alrededor de la picadura. L. ivanovii  usualmente se observa una zona ancha, clara y delimitada 
de -hemólisis. Examina r las placas con una luz brillante para poder comparar las cepas de prueba con  los 
controles.  
C.7.8.2.  Utilización de Carbohidratos (ramnosa y xilosa): Utilizando una asa bacteriológica, inocular 
cada uno de los caldos de carbohidratos a probar usando col onias aisladas en TSYA. Incubar a 35°C ± 2°C 
por 5 días. Una reacción positiva se caracteriza por la producción de ácido y cambio de color a amarillo que 
ocurre dentro de las primeras 24 a 48h, si después de 48h de incubación no se observa una reacción pos itiva 
clara, dejar incubar hasta 5 días  (alternativamente pueden utilizarse sistemas de bioquímicas miniaturizadas o 
métodos de biología molecular).  
C.7.8.3.  Prueba de CAMP: En una placa de agar sangre de carnero sembrar una estría de la cepa de  S. 
aureus  y otra línea paralela de R. equi , separada s lo suficiente para que entre é stas pueda estriarse la cepa 
sospechosa de Listeria , sin que lleguen a tocars e entre sí  (Ver figura C.1). Simultáneamente probar cepas 
control: L. monocytogenes , L. innocua  y/o L. ivanovii . Incubar las placas a 35°C ± 2°C por 12 a 18h. Observar 
el sinergismo entre las hemólisis de S. aureus , R. equi  y Listeria  que se manifiesta como una zona hemolítica 
intensa. La figura C.1. Muestra la disposición de las estrías de los cultivos en u na placa de la prueba de 
CAMP. La hemólisis de L. monocytogenes  y Listeria seeligeri  se incrementa cerca de la estría de S. aureus  y 
la hemólisis de L. ivanovii  se aumenta cerca de la estría de R. equi . Las especies restantes de Listeria no son 
hemolíticas  en esta prueba.  
Figura C.1. Inoculación e Interpretación de la prueba de CAMP.  
 
C.8. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.  
C.8.1.  Interpretación de las propiedades morfológicas y fisiológicas de las reacciones Bioquímicas.  
Todos las especies de Listeria spp  son colonias pequeñas, bacilos Gram positivos con movilidad rotativa y 
catalasa positiva. L. monocytogenes  se distingue de otras especies por las características enlistadas en la 
tabla C.1.   
Para fines de vigilancia sanitaria, los aislamientos que sean con siderados como L. monocytogenes  deben 
ser enviados al laboratorio de referencia de la COFEPRIS (CCAyAC) para realizar tipificación.  
Tabla C.1. Pruebas para la identificación de Listeria spp.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
C.8.2.  Cultivos Control.  
C.8.3.  Con el fin de comprobar la habi lidad del pre -enriquecimiento y la identificación de Listeria spp ,  se 
recomienda analizar junto con la prueba cepas control negativo como S. aureus  y positivo como  L. 
monocytogenes . 
C.8.4.  Expresión de Resultados.  
C.8.5.  De acuerdo con la interpretación  de los resultados, informar la presencia o ausencia de  L. 
monocytogenes  en la muestra de ensayo, especificando la masa en g o el volumen en mL de la muestra 
ensayada.  
C.9. Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos.  
C.9.1.  Caldo Fraser M edio.  
C.9.1.1.  Medio Base.  
C.9.1.1.1.  Fórmula.  
Peptona de Carne  
Triptona  
Extracto de Carne de Res  
Extracto de Levadura  
Cloruro de Sodio  
Fosfato de sodio monobásico di hidratado  
Fosfato de Potasio di básico  
Esculina  
Agua  5.0g 
5.0g 
5.0g 
5.0g 
20.0g  
 12.0g  
1.35g 
1.0g 
1000mL  
C.9.1.1.2.  Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, calentando si es necesario. Ajustar 
el pH, si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25°C. 
Dispensar la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba. Esterilizar por 15 min en la autoclave 
a 121°C.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Nota: Se deberá adicionar la solución de cloruro de litio y la solución de ácido nalidíxico después de la 
esterilización del medio base.  
C.9.1.2.  Solución de Cloruro de  litio. 
C.9.1.2.1.  Fórmula.  
Cloruro de litio  
Agua  3.0g 
100mL  
C.9.1.2.2.  Preparación: Adicionar el cloruro de litio al agua.  Esterilizar por filtración.  
C.9.1.3.  Solución de ácido nalidíxico.  
C.9.1.3.1.  Fórmula.  
Sales de ácido nalidí xico sódico  
Solución de Hidróxido de sodio. 0,05 mol/L  0.1g 
10mL  
C.9.1.3.2.  Preparación: Disolver las sales de ácido nalidí xico en la solución de hidróxido de sodio . 
Esterilizar por filtración.  
C.9.1.4.  Solución de clorhidrato de acriflavina.  
C.9.1.4.1.  Fórmula.  
Clorhidrato  de acriflavina  
Agua  0.25g  
100mL  
C.9.1.4.2.  Preparación: Disolver el clorhidrato de acriflavina en una porción de agua.  Esterilizar  por 
filtración.  
C.9.1.5.  Solución de citrato, amonio hierro III.  
C.9.1.5.1.  Fórmula.  
Citrato de amonio hierro III  
Agua  5.0g 
100mL  
C.9.1.5.2.  Preparación: Disolver el Citrato de amonio hierro III en el agua.  Esterilizar por filtración.  
C.9.1.6.  Medio Completo.  
C.9.1.6.1.  Fórmula.  
Medio Base  
Solución de Cloruro de Litio  
Solución de ácido nalidí xico 
Solución de clorhidrato d e acriflavina  
Solución de citrato, amonio hierro III  100mL  
1.0mL  
0.1mL  
0.5mL  
1.0mL  
C.9.1.6.2.  Preparación: Agregar las cuatro soluciones por cada porción de 100mL de base 
inmediatamente antes de usar.  
C.9.2.  Caldo Fraser.  
C.9.2.1.  Medio Base.  
C.9.2.1.1.  Fórmula  
Peptona de Carne  
Triptona  
Extracto de Carne de Res  
Extracto de Levadura  
Cloruro de Sodio  
Fosfato de sodio monobásico dihidratado  5.0g 
5.0g 
5.0g 
5.0g 
20.0g  
12.0g Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Fosfato de Potasio dibásico  
Esculina  
Cloruro de litio  
Sal de sodio o ácido nalid íxico 
Agua  1.35g  
1.0g 
3.0g 
0.02g  
1000mL  
C.9.2.1.2.  Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, puede usarse calentamiento. 
Ajustar el pH, cuando se requiera para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 
25°C. Dispensar la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba.  Esterilizar por 15 min en la 
autoclave a 121°C.  
C.9.2.2.  Solución de clorhidrato de acriflavina.  
C.9.2.2.1.  Fórmula.  
Clorhidrato de acriflavina  
Agua  0.25g  
100mL  
C.9.2.2.2.  Preparación: Disolver el clorhidrato de acriflavina en una porción de agua.  Esterilizar  por 
filtración  
C.9.2.3.  Solución de citrato, amonio hierro III.  
C.9.2.3.1.  Fórmula.  
Citrato de amonio hierro III  
Agua  5.0g 
100mL  
C.9.2.3.2.  Preparación: Disolver el Citrato de amonio hier ro III en el agua.  Esterilizar por filtración.  
C.9.2.4.  Medio Completo.  
C.9.2.4.1.  Preparación: Antes de usar añadir a cada tubo con 10mL del medio base 0.1mL de las 
soluciones de Clorhidrato de acriflavina y solución de citrato de amonio hierro III. Mezcl ar vigorosamente.  
C.9.3.  Agar Oxford.  
C.9.3.1.  Agar Base.  
C.9.3.1.1.  Fórmula.  
Peptonas  
Almidón  
Cloruro de sodio  
Extracto de Levadura  
Agar  
D-glucosa  
D-manitol  
Esculina  
Citrato de amonio, hierro III  
Rojo de Fenol  
Cloruro de Litio  
Agua  23.0g  
1.0g 
5.0g 
3.0g 
De 9 a 18g(1) 
0.5g 
10.0g  
0.8g 
0.5g 
0.08g  
15.0g  
960mL  
(1) Dependiendo de la fuerza gel del agar.  
C.9.3.1.2.  Preparación: Disuelva los componentes o el medio deshidratado completo en agua hirviendo. 
Ajuste el pH si es necesario para que después de la este rilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25°C. 
Esterilizar por 15 min en la autoclave a 121°C.  
C.9.3.2.  Suplemento para 1000mL del Agar Oxford.  
C.9.3.2.1.  Fórmula.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Cicloheximida  
Sulfato de Colistina  
Clorhidrato de Acriflavina  
Cefotetá n 
Fosfomicina  
Etanol  
Agua  400mg  
20mg  
5.0mg  
2.0mg  
10mg  
5.0mL  
5.0mL  
C.9.3.2.2.  Preparación: Disuelva los componentes o el medio deshidratado completo en una mezcla de 
etanol -agua. Esterilizar por filtración.  
C.9.3.3.  Medio completo.  
C.9.3.3.1.  Preparación: Enfriar la bas e a aproximadamente 47°C y agregue el suplemento asépticamente. 
Vierta el med io en cajas Petri, en aproximadamente 15mL. Almacene el medio en oscuridad, evite el contacto 
con la luz.  
C.9.4.  Agar PALCAM.  
C.9.4.1.  Agar Base.  
C.9.4.1.1.  Fórmula.  
Peptona de C arne  
Triptona  
Extracto de Carne de Res  
Extracto de Levadura  
Cloruro de Sodio  
Fosfato de sodio monobásico dihidratado  
Fosfato de Potasio dibásico  
Esculina  
Cloruro de litio  
Sal de sodio o ácido nalidí xico 
Agua  5.0g 
5.0g 
5.0g 
5.0g 
20.0g  
12.0g  
1.35g  
1.0g 
3.0g 
0.02g  
1000mL  
C.9.4.1.2.  Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, calentando si es necesario. Ajustar 
el pH, si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25°C. 
Dispensar la base en matraces co n capacidad apropiada para la prueba.  Esterilizar por 15 min en la autoclave 
a 121°C.  
C.9.4.2.  Solución de Sulfato de Polimixina B.  
C.9.4.2.1.  Fórmula.  
Sulfato de Polimixima B (100, 000 UI)  
Agua  0.1g 
100mL  
C.9.4.2.2.  Preparación: Disolver el Sulfato de P olimixina B en agua.  Esterilizar por filtración.  
C.9.4.3.  Solución de Clorhidrato de Acriflavina.  
C.9.4.3.1.  Fórmula.  
Clorhidrato de Acriflavina  
Agua  0.05g  
100mL  
C.9.4.3.2.  Preparación: Disolver el Clorhidrato de Acriflavina en agua.  Esterilizar por filt ración.  
C.9.4.4.  Solución de Ceftazidima Sódica Pentahidratada.  
C.9.4.4.1.  Fórmula.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Ceftazidima sódica Pentahidratada  
Agua  0.116g  
100mL  
C.9.4.4.2.  Preparación: Disuelva la ceftazidima sódica Pentahidratada en agua. Esterilice por filtración.  
C.9.4.5.  Medio completo.  
C.9.4.5.1.  Fórmula.  
Base Agar PALCAM  
Solución de sulfato de polimixina B  
Solución de Clorhidrato de Acriflavina  
Solución de Ceftazidima sódica pentahidratada  960mL  
10mL  
10mL  
2 mL  
C.9.4.5.2.  Preparación: A la base de agar fundida a 45°C agreg ar las 3 soluciones, mencionadas en la 
fórmula, mezclar vigorosamente entre cada adición. Para la preparación en placa añadir al número apropiado 
de cajas Petri aproximadamente 15mL del medio completo recién preparado, permita solidificar. Almacene el 
medi o lejos de la luz.  
C.9.5.  Agar TSYE.  
C.9.5.1.  Fórmula.  
Caldo triptona soya (1) 
Extracto de levadura  
Agar   
Agua  30g 
6.0g 
de 9 a 18g(2) 
1000mL  
Triptona  
Peptona de Soya  
Cloruro de sodio  
Fosfato de potasio  
Glucosa  
Dependiendo de la fuerza del agar  17.0g  
3.0g 
5.0g 
2.5g 
2.5g 
C.9.5.2.  Preparación: Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua hirviendo. 
Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25°C. vierta el medio 
en tubos de capacidad apropia da, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121°C. Colocar los 
tubos en una posición inclinada. Dispensar en cajas Petri aproximadamente 15mL y dejar solidificar.  
C.9.6.  CTSYE.  
C.9.6.1.  Fórmula.  
Caldo triptona soya (1) 
Extracto de levadura  
Agua 30g 
6.0g 
1000mL  
Triptona  
Peptona de Soya  
Cloruro de sodio  
Fosfato de potasio  
Glucosa  17.0g  
3.0g 
5.0g 
2.5g 
2.5g 
C.9.6.2.  Preparación: Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua hirviendo. 
Ajustar el pH si es necesario a modo que  después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Vierta el medio 
en matraces, frascos o tubos de capacidad apropiada para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 
121°C.  
C.9.7.  Agar Sangre de cordero.  
C.9.7.1.  Fórmula.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Peptona de carne  
Digerido de hígado  
Extracto de levadura  
Cloruro de sodio  
Agar  
Agua  
Sangre de Cordero Desfibrada  15g 
2.5g 
5g 
5g 
de 9 a 18g(1) 
1000mL  
100mL  
(1) Dependiendo de la fuerza del agar   
C.9.7.2.  Preparación: Disuelva los componentes en agua hirviendo con excepción d e la sangre. Ajustar el 
pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25°C vierta el medio en 
matraces de capacidad apropiada, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121°C. Agregar la 
sangre desfibrinada a la  base previamente atemperada a 47°C, mezclar bien. Vierta el medio en cajas Petri en 
proporciones adecuadas para las pruebas, permita solidificar.  
C.9.8.  Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa).  
C.9.8.1.  Medio Base.  
C.9.8.1.1.  Fórmula.  
Proteasa de Peptona  
Extracto de Carne  
Cloruro de sodio  
Purpura de Bromocresol  
Agua  10g 
1g 
5g 
0.02g  
1000mL  
C.9.8.1.2.  Preparación: Disuelva los componentes en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH a 
modo que después de la esterilización sea de 6.8 ± 0.2 a 25°C. Vierta el medio en tubos de capacidad 
apropiada, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121°C.  
C.9.8.2.  Solución de Carbohidrato.  
C.9.8.2.1.  Fórmula.  
Carbohidrato (L -Ramnosa o D -Xilosa)  
Agua   5g 
100mL  
C.9.8.2.2.  Preparación: Disuelva por separad o cada carbohidrato en 100mL de agua, esterilizar  por 
filtración.  
C.9.8.3.  Medio Completo.  
C.9.8.3.1.  Preparación: En condiciones asépticas para cada carbohidrato agregue xmL de solución del 
carbohidrato a 9xmL de la base.  
C.9.9.  Agar de Movilidad.  
C.9.9 .1. Fórmula.  
Peptona de Caseína  
Peptona de Carne  
Agar  
Agua  20.0g  
6.1g 
3.5g  
1000mL  
C.9.9.2.  Preparación: Disuelva los componentes en agua hirviendo. Ajustar el pH si es necesario a modo 
que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Vierta el m edio en tubos en cantidades de 5mL y 
esterilice por 15 min en autoclave a 121°C.  
C.9.10.  Solución de Peróxido de Hidrógeno.  
C.9.10.1.  Preparación: Utilizar 10 volúmenes de solución al 3% masa / masa  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
C.9.11.  PBS.  
C.9.11.1.  Fórmula.  
Fosfato de Sodio monobá sico Dihidratado  
Fosfato de sodio Dibásico  
Cloruro de Sodio  
Agua  8.98g  
2.71g  
8.5g  
1000mL  
C.9.11.2.  Preparación: Disuelva los componentes en agua. Ajustar el pH si es necesario a modo que 
después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar p or 15 min en autoclave a 121°C.  
Apéndice Normativo D.  
Método alternativo para el recuento de Enterococos en agua.  
D.1. INTRODUCCIÓN.  
Este grupo fue separado del resto de los estreptococos fecales debido a que son relativamente específicos 
para la contamin ación fecal. Sin embargo, algunos enterococos intestinales aislados de agua, pueden 
ocasionalmente tener un origen de otr as fuentes, incluyendo suelos au n en ausencia de contaminación fecal. 
El grupo enterococo intestinal puede ser usado como un índice de contaminación fecal.  
Los enterococos intestinales son relativamente tolerantes al cloruro de sodio y pH alcalino. La mayoría de 
las especies no se multiplican en agua. La ventaja de este grupo es su tendencia a sobrevivir en medios 
acuáticos más que E. col i, son más resistentes a la desecación y a la clorinación.  
La presencia de enterococos intestinales evidencia una contaminación fecal reciente, así como la 
necesidad de llevar a cabo acciones en aquellas fuentes de abastecimiento con un inadecuado tratamie nto de 
potabilización.  
En la presente norma se describen tres técnicas para cuantificar y estimar la presencia de enterococos en 
agua para uso y consumo humano, agua envasada y hielo, agua de uso recreativo (dulce y salobre):  1. 
Técnica de filtración por membrana, 2. Técnica del número más probable y 3. Técnica del sustrato 
cromogénico definido.  
Es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una muestra, basada en 
la dilución de la misma y sembrada en réplicas de tubos con caldo selectivo (caldo azida dextrosa), en los 
cuales después de un período de incubación de 24h  - 48h a 35° C ± 0.5°C, se observa la presencia de 
turbiedad en cada tubo.  
La prueba confirmativa consiste en sembrar cada uno de los tubos que presenten turbie dad, en medio 
selectivo para enterococos de Pfizer. Después de un periodo de incubación, las colonias de color café a negro 
y un halo café debido a la hidrólisis de la esculina, son sembradas en caldo BHI con 6.5% de NaCl  e 
incubadas a 45°C ± 0.5°C. El des arrollo en este medio confirma la presencia de enterococos.   
D.2. MATERIALES.  
D.2.1.  Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de polipropileno.  
D.2.2.  Pipetas serológicas de 10mL.  
D.2.3.  Pipetas serológicas de 1mL.  
D.2.4.  Asas bacteriológ icas. 
D.2.5.  Tubos de ensaye de 16 x 150mm con tapón de rosca.  
D.2.6.  Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 100 X 150mm.  
D.2.7.  Propipeta.  
D.2.8.  Gradillas.  
D.3. APARATOS E INSTRUMENTOS.  
D.3.1.  Incubadora que evite variaciones mayor es de ± 0.5ºC con termómetro calibrado o verificado.  
D.3.2.  Autoclave.  
D.3.3.  Balanza granataria con sensibilidad de al menos 0.1g.  
D.4. MEDIOS DE CULTIVO.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
D.4.1.  Caldo Azida Dextrosa.  
D.4.2.  ASPE  
D.4.3.  BHI 
D.5. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.  
D.5.1.  MEDIDAS DE  SEGURIDAD.  
Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.  
D.5.2.  MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD.  
El laboratorio debe tener implementado un sistema de control de calidad para asegurar que los material es, 
equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.  
D.5.3.  ÍNDICES DE REPRODUCIBILIDAD Y REPETIBILIDAD.  
Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados analíticos deben 
estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.*  
La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%*.  
*Fuente: Manual of food quality control12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory. 
Food and Agriculture Organi zation. FAO.  
D.5.4.  RECOMENDACIONES GENERALES PREVIAS AL ANÁLISIS DE LA MUESTRA.  
Homogeneización de la muestra. - Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5cm), 
pueden homogeneizarse por inversión rápida 25 veces. Las muestras en frascos que tengan de ⅔ a ¾ de 
lleno, deberán agitarse 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30cm completados en un tiempo de 
7seg, para asegurar una unidad analítica representativa.  
D.5.5.  CONDICIONES DE PRUEBA.  
Trabajar en condiciones asépticas en un área limpia y desc ontaminada. Todo el material que esté en 
contacto con la muestra debe estar estéril.  
D.5.6.  PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.  
Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%. Realizar 
diluciones decimales cuando se esti me que la carga de enterococos es alta.  
D.5.7.  Prueba presuntiva.  
D.5.7.1.  El tamaño de la porción de muestra analizada dependerá de su tipo (agua para uso y consumo 
humano, agua envasada y hielo). Utilizar 5 porciones de 20mL o 10 porciones de 10mL inocul ados a tubos 
con caldo azida dextrosa (consultar la sección de medios de cultivo para las concentraciones). Incubar a 35°C 
± 0.5°C por 24h a 48h. La presencia de turbiedad en los tubos debida al desarrollo microbiano, se considera 
como prueba presuntiva po sitiva.  
D.5.8.  Prueba confirmativa.  
D.5.8.1.  A partir de los tubos con turbiedad, transferir una asada a placas de ASPE. Incubar las placas 
invertidas a 35°C ± 0,5°C por 24h. El desarrollo de colonias de color café oscuro a negro con halos cafés, 
confirma n la presencia de estreptococos fecales. Transferir las colonias características a tubos con caldo BHI 
con 6,5% de NaCl. Incubar a 45°C ± 0.5°C. El crecimiento en este medio confirma la presencia de 
enterococos.  
D.5.9.  Cálculos.  
D.5.9.1.  Calcular la densid ad de Enterococos por el número más probable en 100mL con el número de 
tubos confir mados consultando las tablas 1 o  2. Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
Referencia: American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and 
Wastewater. 21th edition 2005. Washin gton DC.  
 
Referencia: American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and 
Wastewater. 21th edition 2005. Washington DC.  
D.5.9.2.  Considerar en el resultado final la(s) dilución(es) realizadas, cuando proceda.  
 D.5.9.3.  Para el caso de agua para uso recreativo utilizar 5 tubos con caldo azida dextrosa por cada 
porción de 10mL, 1mL y 0,1mL de muestra. Para inóculos de 10mL de agua, preparar el medio a doble 
concentración y para volúmenes de 1mL y 0.1mL a concentración senci lla. Hacer diluciones decimales de la 
muestra cuando se considere necesario con solución reguladora de fosfatos o agua peptonada. Incubar a 
35°C ± 0.5°C por 24h a 48h. La presencia de turbiedad en los tubos debida al desarrollo microbiano, se 
considera com o prueba presuntiva positiva. Continuar como se indica para la prueba confirmativa.  
 D.5.9.4.  Calcular la densidad de Enterococos por el número más probable en 100mL con el número de 
tubos confirmados consultando la tabla D.3.  
Tabla No. D.3 NMP para 100mL de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de 3 
diluciones con series geométricas.  
No. de Tubos Positivos  No. de Tubos Positivos  No. de Tubos Positivos  No. de Tubos Positivos  No. de Tubos Positivos  No. de Tubos Positivos  
10mL  1 mL  0.1mL  NMP  10mL  1 mL 0.1mL  NMP  10mL  1 mL  0.1mL  NMP  10mL  1 mL  0.1mL  NMP  10mL  1 mL  0.1mL  NMP  10mL  1 mL  0.1mL  NMP  
0 0 0 <1,8 1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23 
0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31 
0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43 
0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58 
0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76 
0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33 
0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46 
0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64 
0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84 
0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110 
0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130 
0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49 
0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70 
0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95 
0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120 
0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150 
0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180 
0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79 
0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110 
0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140 
0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180 
0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210 
0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250 
0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130 
0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170 
0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220 
0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280 
0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350 
0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430 
0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240 
0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350 
0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540 
0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920 
0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600  
0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81 5 5 5 >1600  
Referencia: AOAC 18 ° Edición. Revisión 2, 2007.  
D.5.10.  Interpretación de resultados.  
El crecimiento en caldo BHI con 6.5% de NaCl incubado a 45°C ± 1ºC confirma la presencia  de 
enterococos.  
D.6. Criterios de validez de la prueba.  
Esta prueba tiene validez cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de 
la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga enteroc ocos o 
cuando se trate de un cultivo control inoculado con 100 UFC.  
D.7. Informe de prueba.  
Informar como: Enterococos NMP/100mL.  
D.8. MEDIOS DE CULTIVO.  
D.8.1.  Caldo Azida Dextrosa.  
D.8.1.1.  Fórmula.  
 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
D.8.1.2.  Preparación: Disolver los ingredientes en un  L de agua. Esterilizar a 121°C durante 15min. El pH 
después de la esterilización debe ser de 7,2 ± 0,2 a 25°C.   
D.8.9.  ASPE.  
D.8.2.1.  Fórmula.  
Ingredientes  Cantidad  
Peptona C  17,0g  
Peptona B  3,0g 
Extracto de Levadura  5,0g 
Bilis bacteriológica  10,0g  
Cloru ro de Sodio  5.0g 
Citrato de Sodi  1,0g 
Esculina  1,0g 
Citrato Férrico amónico  0,5g 
Azida de Sodio,  NaN3  0,25g  
Aga 15,0g  
Agua  1,0L 
D.8.2.2.  Preparación: Disolver los ingredientes en un L de agua. Esterilizar a 121°C durante 15min. El pH 
después de la esterili zación debe ser de 7,1 ± 0,2 a 25°C. Dejar enfriar y mantener el medio no más de 4h 
antes de vaciarlo a una temperatura de 45°C a 50°C.  
D.8.10.  BHI con 6.5% de NaCI.  
D.8.3.1.  Fórmula.  
Ingredientes  Cantidad  
Infusión de cerebro de ternera  200,0g  
Infusión de  corazón de res  250,0g  
Proteosa peptona  10,0g  
Glucosa  2,0g 
Cloruro de sodio NaCl  65,0g  
Fosfato disódico hidrogenado Na2HPO4  2,5g 
Agua  1L 
D.8.3.2.  Preparación: Disolver los ingredientes en un L de agua. Distribuir en tubos de ensaye. Esterilizar 
a 121°C dur ante 15 min. E l pH después de la esteri lización debe ser de 7,4 ± 0.2.  
Apéndice Normativo E.  
Método de referencia “Sustrato fluorogénico para determinar enterococos en agua”.  
E.1. INTRODUCCIÓN.  
Este método de prueba se basa en la detección de enterococos, tales como E. faecium , E. faecalis  en 
agua potable, fuentes de abastecimiento, agua de uso recreativo (dulce y salobre), agua envasada y hielo. 
Cuando el reactivo (comercialmente disponible) es adicionado a la muestra e incubado a 41°C ± 0.5°C por 
24h. Est a prueba detecta a los enterococos en 1UFC/100mL. La fluorescencia se produce cuando los 
enterococos metabolizan el indicador nutritivo. El medio puede utilizarse como presencia/ausencia o por 
cuantificación de: 5 tubos, 10 tubos, series de 15 tubos o el s istema de charolas de cuantificación 
(comercialmente disponibles).  
E.2. MATERIALES.  
E.2.1.  Vasos estériles no fluorescentes.  
E.2.2.  Charolas con 51 celdas de un solo tamaño.  
E.2.3.  Charolas con 48 celdas pequeñas y 48 celdas grandes.  
E.2.4.  Tubos de ensay e de 20 x 150mm.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
E.2.5.  Tubos de ensaye de 16 x 150mm.  
E.3. APARATOS E INSTRUMENTOS.  
E.3.1.  Selladora de charolas de cuantificación (comercialmente disponibles)  
E.3.2.  Lámpara de luz UV de 6 watts con una longitud de onda de 366 nm.  
E.3.3.  Incubadora a 41° C ± 0.5°C de aire o baño de agua.  
E.3.4.  Termómetro con variaciones de ± 0.5°C con un intervalo de 10°C a 50°C calibrado y/o verificado.  
E.4. PROCEDIMIENTO.  
E.4.1.  Interferencia:  La presencia de Bacillus puede interferir con la prueba en muestras de agua 
(salobres) con una conductividad por arriba de 20,000 µSiemens/cm a 25°C. Por lo que es necesario hacer 
una dilución 1:10 con agua estéril (deionizada o destilada).  
E.4.2.  Presencia/Ausencia.  
E.4.2.1.  Las muestras deben alcanzar una temperatura ambiente (18 °C a 30°C). Separar cuidadosamente 
un paquete (que contiene el reactivo) de la tira. Golpear el paquete para asegurarse que todo el polvo se vaya 
al fondo. Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la parte expuesta de la 
misma. Agregar el reactivo a 100mL de una muestra de agua, la cual está en un recipiente estéril, 
transparente y no fluorescente o comercialmente disponible. Cubrir y sellar asépticamente el recipiente. Agitar 
hasta disolución del polvo. Incubar por 24h a 41°C ± 0.5°C. Observar la fluorescencia a las 24h con la lámpara 
de UV de 6 watts y 366 -nm de longitud onda en un cuarto oscuro. Asegurarse que la luz se encuentre alejada 
de sus ojos y dirigida hacia la muestra. Si se observa fluorescencia, se confirma en tonces la presencia de 
enterococos.  
E.4.2.2.  Si la muestra se incuba por más de 28h, aplicar lo siguiente: Si no hay fluorescencia después de 
28h, se considera una prueba negativa válida. Si hay fluorescencia después de 28h, se considera como un 
resultado inválido.  
E.4.3.  NMP Procedimiento de enumeración para 100mL de muestra.  
E.4.3.1.  Las muestras deben alcanzar una temperatura ambiente (18°C a 30°C). Separar cuidadosamente 
un paquete (que contiene el reactivo) de la tira. Golpear el paquete para asegurars e que todo el polvo se vaya 
al fondo. Abrir el paquete rompiendo la parte superior de la línea punteada. No tocar la parte expuesta de la 
misma. Agregar el reactivo a 100mL de una muestra de agua, la cual está en un recipiente estéril, 
transparente y no fl uorescente o comercialmente disponible. Cubrir y sellar asépticamente el recipiente. Agitar 
hasta disolución del polvo. Vaciar la muestra con el reactivo dentro de la charola de cuantificación, evitar el 
contacto con la hoja de la charola y el sello (consu ltar el instructivo del reactivo). Incubar 24h a 41°C ± 0.5°C. 
Observar la fluorescencia a las 24h con la lámpara de UV de 6 watts y 366 -nm de longitud onda en un cuarto 
oscuro. Asegurarse que la luz se encuentre alejada de sus ojos y dirigida hacia la mue stra. Si se observa 
fluorescencia, se confirma entonces la presencia de enterococos. Contar el número de celdas positivas 
(fluorescencia). Interpolar en las tablas ver tabla E.1 y tabla E.2, proporcionada por el fabricante para 
determinar el NMP/100mL. El NMP en 100mL de muestra equivale, en un 95% de confianza a las unidades 
formadoras de colonias presentes en 100mL.  
E.4.4.  Cálculos.  
Para determinar presencia/ausencia no hay cálculos que realizar. Para la cuantificación referirse a las 
tablas de NMP corres pondientes. Considerar en los cálculos la dilución cuando proceda.  
Tabla E.1 de NMP para charolas de 51 celdas.  
No. de celdas positivas  NMP/100mL de muestra  Límite del 95 % de confianza  
Bajo  Alto 
0 < 1 0,0 3,7 
1 1,0 0,3 5,6 
2 2,0 0,6 7,3 
3 3,1 1,1 9,0 
4 4,2 1,7 10,7 
5 5,3 2,3 12,3 
6 6,4 3,0 13,9 
7 7,5 3,7 15,5 
8 8,7 4,5 17,1 
9 9,9 5,3 18,8 
10 11,1 6,1 20,5 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
11 12,4 7,0 22,1 
12 13,7 7,9 23,9 
13 15,0 8,8 25,7 
14 16,4 9,8 27,5 
15 17,8 10,8 29,4 
16 19,2 11,9 31,3 
17 20,7 13,0 33,3 
18 22,2 14,1 35,2 
19 23,8 15,3 37,3 
20 25,4 16,5 39,4 
21 27,1 17,7 41,6 
22 28,8 19,0 43,9 
23 30,6 20,4 46,3 
24 32,4 21,8 48,7 
25 34,4 23,3 51,2 
26 36,4 24,7 53,9 
27 38,4 26,4 56,6 
28 40,6 28,0 59,5 
29 42,9 29,7 62,5 
30 45,3 31,5 65,6 
31 47,8 33,4 69,0 
32 50,4 35,4 72,5 
33 53,1 37,5 76,2 
34 56,0 39,7 80,1 
35 59,1 42,0 84,4 
36 62,4 44,6 88,8 
37 65,9 47,2 93,7 
38 69,7 50,0 99,0 
39 73,8 53,1 104,8  
40 78,2 56,4 111,2  
41 83,1 59,9 118,3  
42 88,5 63,9 126,2  
43 94,5 68,2 135,4  
44 101,3  73,1 146,0  
45 109,1  78,6 158,7  
46 118,4  85,0 174,5  
47 129,8  92,7 195,0  
48 144,5  102,3  224,1  
49 165,2  115,2  272,2  
50 200,5  135,8  387,6  
51 > 200,5  146,1  Infinito  
 
 
Tabla No. E.2 de NMP (UFC/100mL) para charolas de 48 celda s pequeñas y 48 celdas grandes.  
 
      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
 
 
 
Tabla E.2 de NMP (Continuación).  
 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
E.4.5.  Interpretación de resultados.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Si se observa fluorescencia en los frascos, tubos o charolas, se confirma entonces la presencia de 
Enterococos.  
E.4.6.  Criterios de validez de la prueba.  
E.4.6.1.  Revisar y registrar las  temperaturas de las incubadoras diariamente, a  fin de asegurarse que se 
encuentran dentro de los límites establecidos.  
E.4.6.2.  Deberá llevarse a cabo un control de calidad en cada nuevo lote de reactivo, el cual consiste del 
siguiente protocolo:  
E.4.6.2. 1. Para cada tipo de cepa ATCC enlistadas más adelante, estriar en AST o a placas de agar 
sangre e incubar a 35° C por 18h a 24h.  
E.4.6.2.2.  De cada cepa bacteriana, tomar una asada de 1µl de cada colonia e inocular un tubo de ensaye 
con 5mL de agua deioniz ada estéril. Cerrar y agitar completamente.  
E.4.6.2.3.  A continuación tomar una asada de 1µl del tubo de ensayo  y usar para inocular un frasco con 
100mL de agua deionizada o destilada estéril debidamente etiquetado. Seguir los pasos del inciso E.4.2 de 
presencia/ausencia, señalados anteriormente.  
E.4.6.2.4.  Comparar los resultados de esta prueba con los resultados esperados de la siguiente tabla:  
Control  ATCC  Resultados esperados  
E. faecium  335667  Fluorescencia  
Serratia marcescens (Gram -) 43862  No fluor escencia  
Aerococcus viridians (Gram +)  10400  No fluorescencia  
E.4.7.  Informe de prueba.  
Informar como presencia, ausencia o el resultado basado en el cálculo de la densidad de enterococos 
determinado en la tabla de NMP E.1. y E.2.  
E.5. MEDIOS DE CULTIVO . 
E.5.1.  Medio que contiene el sustrato fluorogénico definido (comercialmente disponible).  
Apéndice Normativo F.  
Método aprobado para la determinación de Enterococos fecales en agua técnica de filtración por 
membrana.  
F.1. INTRODUCCIÓN.  
El recuento de ente rococos intestinales se basa en la filtración de un volumen determinado de una 
muestra de agua, a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro suficiente para retener las 
bacterias (0.45µm). La membrana es colocada en un medio selectivo sólido que  contiene azida de sodio, la 
cual inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas. El cloruro de 2, 3, 5 – trifeniltetrazolio es un 
compuesto incoloro, que por la acción de los enterococos intestinales, se reduce a formazán de color rojo.  
Las colonias tí picas de enterococos intestinales, son elevadas de color rojo, marrón o rosa.  
Confirmación: si se observan colonias típicas, la prueba de confirmación es necesaria y la  membrana se 
transfiere a una caja con agar bilis esculina azida, precalentada a 44°C. L os enterococos intestinales 
hidrolizan la esculina, dando como producto final la 6, 7 -dihidroxicumarina, que al combinarse con los iones 
Fe3+, forman un compuesto colorido que va desde marrón a negro que se difunde en el agar.  
F.2. MEDIOS DE CULTIVO.  
PRECA UCIÓ N. La azida de sodio es un polvo fino altamente tóxico y mutagénico. Durante su preparación, 
debe emplearse guantes, cubrebocas especiales para polvos, lentes de protección y lavarse las manos 
inmediatamente después de su preparación.  
Los medios que c ontienen azida no deben mezclarse con ácidos minerales fuertes, ya que puede 
producirse azida de hidrógeno que es tóxica. Las soluciones que contienen azida pueden formar también 
compuestos explosivos por contacto con tuberías metálicas, por ejemplo, en lo s desagües.  
Las azidas pueden descomponerse de forma segura, por adición de un exceso de solución saturada de nitrito.  
F.3. MATERIALES.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
F.3.1.  Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de poli -propileno.  
F.3.2.  Pipetas serológicas de 10mL.  
F.3.3.  Pipetas serológicas de 1mL.  
F.3.4.  Pinzas estériles para membrana.  
F.3.5.  Matraces Kitazato de 1000 mL.  
F.3.6.  Filtros de membranas estériles de tamaño de poro de 0.45 µm.  
F.3.7. Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60 X 15 mm o 50 X 9mm u otro tamaño 
apropiado.  
F.3.8.  Propipeta.  
F.3.9.  Manguera de hule para equipo de filtración.  
F.4. APARATOS E INSTRUMENTOS.  
F.4.1.  Autoclave, capaz de mantener una temperatura de 121°C ± 1°C con termómetro calibrado y/o 
verificado.  
F.4.2.  Potenciómetro con sens ibilidad de 0,1 de unidad de pH . 
F.4.3.  Equipo de filtración con trampa.  
F.4.4.  Bomba de vacío.  
F.4.5.  Cuenta colonias.  
F.4.6.  Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 36°C ± 2° C con termómetro verificado  y/o 
calibrado.  
F.4.7.  Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 44°C ± 0.5°C con termómetro verificado  y/o 
calibrado.  
F.4.8.  PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.  
F.4.8.1.  Filtración e incubación: Conectar el equipo de filtración a la bomba de vacío. Utilizando pinzas 
estériles, coloca r la membrana con la cuadrícula hacia arriba sobre el portafiltro. Colocar cuidadosamente el 
embudo sobre el receptáculo y asegurarlo en su lugar. Abrir la llave de paso  y filtrar a través de la membrana, 
100mL de muestra aplicando suficiente vacío, (aprox imadamente 70 kPa). Cerrar la llave de paso tan pronto 
como la muestra haya sido filtrada. Es aconsejable enjuagar el embudo mediante la filtración de una a tres 
porciones de 10 a 30mL de diluyente estéril, mientras la membrana permanezca en su lugar. Inme diatamente 
después cerrar la llave de paso. Retirar el embudo para dejar expuesta la membrana de filtración. Colocar la 
membrana con pinzas estériles en el agar Slanetz & Bartley. Evitar la formación de burbujas entre  la 
membrana y la superficie del agar.  Incubar  las placas invertidas a 36°C ± 2°C durante 44h ± 4h.  
F.4.8.2.  Confirmación y Recuento. Las colonias típicas de enterococcos son elevadas, de color rojo, 
marrón o rosado. Si hay colonias típicas, transferir la membrana con pinzas estériles a una p laca con agar bilis 
esculina azida. Incubar a 44°C ± 0.5°C durante 2h. Leer la placa inmediatamente después de la incubación. 
Las colonias típicas de enterococos intestinales presentan un color marrón a negro alrededor de la colonia. 
Con ayuda de un cuenta  colonias, seleccionar cajas que contengan entre 20 y 80 colonias típicas y contar el 
número de UFC.   
Nota: Una distribución desigual de las colonias o la presencia de microbiota competitiva, puede interferir 
con la diferenciación de colonias positivas deb ido a la difusión del color a las colonias adyacentes.  
F.4.9.  Cálculos.  
Aplicar la siguiente fórmula para determinar la cantidad de enterococos:  
Fórmula 1   
CS = _Z_ x Vs 
 Vtot 
Donde:       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
CS es el número estimado de UFC en un volumen de referencia de la muestra  (100mL)  
Z es la suma de colonias contadas en las membranas provenientes de diferentes diluciones d 1, d2….d i o 
de volúmenes separados de muestras filtradas.  
VS el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de enterococos en la muestr a. 
Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución.  
Fórmula 2  
Vtot = (n 1V1d1) + (n2V2d2) +………….. (n iVidi) 
Donde:  
n1, n2, ......n i es el número  de membranas filtradas por dilución d 1, d2….d i 
V1, V2, ......V i es el volumen a nalizado en la dilución d 1, d2….d i o porción de muestra  
d1, d2….d i es la dilución utilizada por cada porción de volumen analizado V 1, V2, ......V i (d = 1 para la 
muestra sin diluir, d = 0.1 para una dilución 1:10, etc.)  
Ejemplo:  
Volumen probado  Cuentas  
100 mL  82 colonias  
10 mL  11 colonias  
Z = 82 + 11 = 93  
Vtot = (1 x 100 x 1) + (1 x 10 x 1) = 110  
y si V S es por 100 mL:  
Cs = 93 x 100 = 84 UFC/100mL  
 110 
F.4.10.  Interpretación de resultados.  
La presencia de colonias color marrón a negro alrededor de la col onia en agar bilis esculina azida, 
incubado a 44°C ± 0.5°C durante 2h, se considera una prueba confirmativa de enterococos.  
F.4.11.  Criterios de validez de la prueba.  
Esta prueba tiene validez si se obtienen cajas que contengan entre 20 a 80 UFC.  
Una dist ribución desigual de las colonias o la presencia de microbiota competitiva, puede interferir con la 
diferenciación de colonias positivas debido a la difusión del color a las colonias adyacentes.  
F.5. Informe de prueba.  
F.5.1.  Informar como: Enterococos int estinales  UFC / 100mL.  
F.5.2.  Si se observan menos de 20 colonias, aplicar la fórmula 1 e informar como valor estimado.  
F.5.3.  Placas sin colonias, informar como  < 1 / V tot UFC / 100mL e informar como valor estimado.  
Donde:  Vtot es la suma del volumen tota l de las porciones probadas de muestra o dilución (ver inciso 2.6).  
También se puede informar como “Cero” u “organismos no detectables” indicando el volumen de muestra 
analizada.  
F.5.4.  En caso que se tengan placas con más de 80 colonias, informar como > d e 80 UFC/100mL.  
F.6. MEDIOS DE CULTIVO.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
F.6.1.  Medio Slanetz y Bartley.  
F.6.1.1.  Medio base.  
Ingredientes  Cantidad  
Triptosa  20,0g  
Extracto de Levadura  5,0g 
Glucosa  2,0g 
Fosfato dipotásico, K2HPO4  4,0g 
Azida de Sodio NaN3  0.4g 
Agar  8 a 18g*  (* La can tidad de agar depende de la   
gelificación del agar)  
Agua  1L 
Disolver los ingredientes en un L de agua hirviendo. Calentar durante 5 min más. Enfriar entre 50°C y 
60°C.  
F.6.1.2.  Solución de TTC 0.1%.  
Ingredientes  Cantidad  
Cloruro de 2,3,5 -trifeniltetrazo lio TTC  1,0g 
Agua  100mL  
Disolver el indicador en 100mL de agua, agitando constantemente. Esterilizar por filtración (0,2µm de 
poro). Proteger la solución de la luz. Descartar cuando aparezca una coloración rosa.  
F.6.1.3.  Medio Completo.  
Ingredientes  Cant idad 
Medio Base   1L 
Solución de TTC  10mL  
Adicionar la solución de TTC sobre el medio base enfriado a una temperatura de 50°C a 60°C. El pH  
después de la esterilización debe ser de 7,2 ± 0,1 a 25°C. Distribuir en placas de Petri. Dejar solidificar sobre 
una superficie horizontal fría. Conservar en la oscuridad por 2 semanas a 5°C ± 3°C.  
F.6.2.  Agar bilis esculina azida.  
Ingredientes  Cantidad  
Triptona  17,0g  
Peptona  3,0g 
Extracto de Levadura  5,0g 
Bilis de buey deshidratada   10,0g  
Cloruro de Sodio  5,0g 
Esculina  1,0g 
Citrato de Hierro III y amonio  0,5g 
Azida de Sodio NaN3  0,15g  
Agar  de 8 a 18g* ( * Dependiendo de la gelificación del agar)  
Agua  1L 
Disolver los ingredientes en un L de agua y hervir. Esterilizar a 121°C ± 2°C. El pH después de la 
esteri lización debe ser de 7,1 ± 0,1 a 25°C. Enfriar entre 50°C y 60°C. Distribuir en placas Petri para obtener 
un espesor de 3mm a 5mm. Dejar solidificar en una superficie horizontal. Conservar hasta 2 semanas  a 5°C ± 
3°C. 
Apéndice Normativo G.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Método aprobado para el monitoreo de Enterococos fecales recomendado para el monitoreo de 
aguas para uso recreativo.  
G.1. INTRODUCCIÓN:  
Se basa en la filtración de un volumen determinado de una muestra de agua, a través de un filtro de 
membrana con un tamaño de poro sufi ciente para retener las bacterias (0.45µm). La membrana es colocada 
en agar mEI el cual contiene entre otros ingredientes, el comógeno indoxil –ß– D- glucosido, que debido a la 
acción de la enzima ß –D–glucosidasa sintetizada por los enterococos, producen un  compuesto azul índigo 
alrededor de la colonia que se difunde en el medio.  
G.2. MATERIALES.  
G.2.1.  Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de poli -propileno.  
G.2.2.  Pipetas serológicas de 10mL.  
G.2.3.  Pipetas serológicas de 1mL.  
G.2.4.  Pinzas estériles para membrana.  
G.2.5.  Matraces Kitazato de 1000 mL.  
G.2.6.  Filtros de membranas estériles de tamaño de poro de 0.45µm.  
G.2.7.  Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60 X 15mm o 50 X 9mm u otro tamaño 
apropiado.  
G.2.8 . Propipeta.  
G.2.9.  Manguera de hule para equipo de filtración.  
G.3. APARATOS E INSTRUMENTOS.  
G.3.1.  Potenciómetro con sensibilidad de 0,1 de unidad de pH.  
G.3.2.  Equipo de filtración con trampa.  
G.3.3.  Bomba de vacío.  
G.3.4.  Cuenta colonias.  
G.3.5.  Incuba dora, capaz de mantener una temperatura de 36°C ± 2°C con termómetro verificado y/o 
calibrado.  
G.3.6.  Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 41°C ± 0.5°C con termómetro verificado y/o 
calibrado.  
G.4. MEDIOS DE CULTIVO.  
G.4.1.  BHI. 
G.4.2.  BHI con 6.5% NaCl.  
G.4.3.  Agar infusión cerebro corazón.  
G.4.4.  ABE.  
G.4.5.  Agar mEI.  
G.5. PROCEDIMIENTO.  
G.5.1.  Consultar el inciso 2.5 y colocar la membrana en la superficie del agar mEI e incubar a 41°C ± 
0.5°C por 24 h. Seleccionar cajas que contengan entre 20  y 60 colonias que  independientemente de su color 
tengan un halo azul correspondiente a enterococos. Las colonias con halo azul se pueden verificar.  
G.5.2.  La verificación de las colonias puede ser necesaria para evidenciar cúmulos y también para control 
de calidad al implementar la prueba, cambios en los sitios de muestreo, lotes de medio comercial o preparado 
por ingredientes. Transferir al menos 10 colonias típicas aisladas a caldo BHI y agar infusión cerebro corazón 
inclinado. Incubar los caldos por 24 h y los agares por  48h a 35°C ±0.5°C. Después de 24h de incubación 
transferir una asada de los tubos de BHI a agar bilis esculina y a BHI y BHI con 6.5% de NaCl.  
G.5.2.1.  Incubar el agar bilis esculina y el BHI con 6.5% de NaCl a 35°C± 0.5°C por 48h.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
G.5.2 .2. Incubar el caldo BHI a 45°C ± 0.5°C por 48h.  
G.5.3.  Observar crecimiento.  
G.5.3.1.  Después de las 48h de incubación, hacer una tinción de Gram al crecimiento de los agares de BHI.  
G.5.3.2.  Los cocos Gram positivos que crecen e hidrolizan la esculina en  agar bilis esculina (producción un 
precipitado negro o café) y crecen en caldo BHI a 45°C ± 0.5°C y caldo BHI con 6.5% de NaCl a 35°C ± 0.5°C 
son confirmados como enterococos.  
G.6. Cálculos  
Aplicar la siguiente fórmula para determinar la cantidad de enter ococos:  
Fórmula 1.   
CS = _Z_ x Vs 
 Vtot  
Donde:  
CS es el número estimado de UFC en un volumen de referencia de la muestra (100mL)  
Z es la suma de colonias contadas en las membranas provenientes de diferentes diluciones d 1, d2….d i o 
de volúmenes separados d e muestras filtradas.  
VS el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de enterococos en la muestra.  
Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución.  
Fórmula 2.  
Vtot = (n 1V1d1) + (n2V2d2) +………….. (n iVidi) 
Donde:  
n1, n2, ......n i es el número  de membranas filtradas por dilución d 1, d2….d i 
V1, V2, ......V i es el volumen analizado en la dilución d 1, d2….d i o porción de muestra  
d1, d2….d i es la dilución utilizada por cada porción de volumen analizado V 1, V2, ......V i (d = 1 para la 
muestra sin diluir, d = 0.1 para una dilución 1:10, etc.).  
Ejemplo:  
Volumen probado  Cuentas  
100 mL  82 colonias  
10 mL  11 colonias  
Z = 82 + 11 = 93  
Vtot = (1 x 100 x 1) + (1 x 10 x 1) = 110  
y si V S es por 100mL:  
Cs = 93 x 100 =  84 UFC/100mL  
110 
G.6.1.  Interpretación de resultados.  
La presencia de colonias que independientemente de su color presenten un halo azul en agar mEI, 
incubado a 41°C ± 0.5°C por 24 h, se considera una prueba confirmativa  de enterococos.  
G.6.2.  Criterios d e validez de la prueba.  
Esta prueba tiene validez si se obtienen cajas que contengan entre 20 a 80 UFC.  
Una distribución desigual de las colonias o la presencia de microbiota competitiva, puede interferir con la 
diferenciación de colonias positivas debido  a la difusión del color a las colonias adyacentes.  
G.6.3.  Informe de prueba.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Informar como: Enterococos intestinales  UFC / 100mL.  
Si se observan menos de 20 colonias, aplicar la fórmula 1 e informar como valor estimado.  
Placas sin colonias, informar como  < 1 / V tot UFC / 100mL e informar como valor estimado.  
Donde:  Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución (ver inciso 2.6).  
También se puede informar como “Cero” u “organismos no detectables” indicando el volumen de mu estra 
analizada.  
En caso que se tengan placas con más de 80 colonias,  informar como > de 80 UFC/100mL.  
G.7. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.  
G.7.1. BHI.  
G.7.1.1.  Fórmula.  
Infusión de cerebro de ternera  200.0g  
Infusión de corazón de res  250.0g  
Proteosa peptona  10.0g  
Cloruro de sodio  5.0g 
Fosfato disódico  2.5g 
Dextrosa  2.0g 
Agua destilada  1.0L 
G.7.1.2.  Preparación: Disolver los ingredientes o 37.0g del medio deshidratado en un matraz con 1L de 
agua destilada, distribuir volúmenes de 10mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave 
a 121°C por 15 min. El pH final del medio deberá ser de 7.4 ± 0.2.  
G.7.2. BHI con 6.5% de NaCl.  
G.7.2.1.  Fórmula: BHI con 6.5% de NaCI seguir las instrucciones que en BHI antes descrito, pero 
agregando N aCl. 
G.7.2.2. Preparación: Agregar 60.0g de NaCl por cada L de medio. Dado que la presentación comercial 
deshidratada contiene 5g de NaCl, esta cantidad deberá restarse de los 65g necesarios por L para obtener 
una concentración final de 6.5% de NaCl.  
G.7.3 . Agar infusión cerebro corazón  
G.7.3.1.  Fórmula:  El agar BHI contiene los mismo ingredientes que el BHI pero adicionando 5.0g de agar 
por cada L de medio.  
G.7.3.2. Preparación:  Suspender los ingredientes o 52g del medio agar BHI deshidratado en 1L de agua  
destilada. Calentar a ebullición hasta disolver los ingredientes. Distribuir 10mL del medio en tubos con tapón 
de rosca y esterilizar a 121°C por 15 min. Después de la esterilización, solidificar inclinado, pH final 7.4 ± 0.2.  
G.7.4. BEA.  
G.7.4.1.  Fórmula . 
Extracto de carne  3.0g 
Peptona  5.0g 
Sales biliares  40.0g  
Esculina  1.0L 
Citrato férrico  0.5g 
Agar  15.0g  
Agua destilada  1.0L Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
G.7.4.2. Preparación: Disolver los ingredientes o 64.0g del medio deshidratado en un 1L de agua 
destilada, calentar a ebulli ción hasta la disolución de los ingredientes.  
Distribuir volúmenes de 10mL a tubos con tapón de rosca o frascos. Esterilizar en autoclave a 121°C por 
15 min, Después de esterilizar, solidificar los tubos inclinados o dejar enfriar a 50°C en baño de agua y  
distribuir en cajas Petri, dejar solidificar. El pH final del medio es 6.6 ± 0.2. Almacenar en refrigeración.  
G.7.5. Agar mEI  
G.7.5.1. Fórmula.  
Peptona  10.0g  
Cloruro de sodio  15.0g  
Extracto de levadura  30.0g  
Esculina  1.0g 
Actidiona (Cicloheximida)  0.05g 
Azida de sodio  0.15g  
Agar  15.0g  
Agua destilada  1.0L 
G.7.5.2. Preparación: Agregar a un matraz, los ingredientes o 71.2g del medio comercial deshidratado 
más 0.75g de indoxyl -ß-D-glucósido a 1L de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución. 
Esterilizar a 121°C durante 15 min y enfriar en baño de agua a 50°C.   
Reactivos que se agregan después de esteriliza r: Mezclar 0.24g de ácido nalidí xico en 5mL de agua 
destilada, agregar unas gotas de NaOH 0.1N hasta disolución y agregar al med io mEI y mezclar. Agregar 
0.02g de cloruro de trifenil tetrazolium (TTC) al mEI y mezclar.  
Alternativamente se pueden agregar las siguientes soluciones:  
a) Ácido nalidí xico. Agregar 0.48g de ácido nalidí xico y 0.4mL de NaOH 10N a 10mL de agua destilada y 
mezclar. Esterilizar la solución por filtración y adicione 5.2mL por cada L de medio.  
b) Cloruro de trifeniltetrazolium (TTC): Agregar 0.1g de TTC a 10mL de agua destilada y calentar para 
disolver. Esterilizar la solución por filtración y adicione 2mL por c ada L de medio.  
c) Vaciar en cajas de 9 X 50mm y de 4 a  mm de espesor (aproximadamente de 4 a 6mL) y dejar solidificar. 
El pH final del medio deberá estar entre 7.1 ± 0.2. Conservar en refrigeración.  
Apéndice Normativo H.  
Método aprobado para la estimación  de la densidad de Coliformes Fecales y E. coli por la técnica 
del número más probable presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua.  
Este método es aplicable para la estimación de la densidad de Coliformes Fecales y E. coli por la técnica 
del número más probable presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua.  
Este método es aplicable para la detección de coliformes fecales y  E. coli , especialmente en productos 
que se encuentran en bajas concentraciones de microrganismos y par a aquellos alimentos cuyas 
características particulares puedan interferir en la exactitud de la cuenta de UFC.  
H.1. INTRODUCCIÓN.  
Actualmente se utilizan tres grupos de indicadores microbianos con diferentes aplicaciones. La detección 
de bacterias coliform es se usa como indicador de la calidad sanitaria del agua o como indicador de las 
condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos. Los coliformes fecales y E. coli  continúan siendo el 
indicador de elección que manifiesta contaminación fecal recient e o condiciones higiénicas inadecuadas. El 
método del número más probable consiste de una prueba presuntiva y confirmativa. El uso de las series de 3, 
5 y 10 tubos va a depender de la contaminación esperada y el grado de exactitud deseada.  
El principio de  la técnica se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los 
tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor sean negativos. El resultado 
positivo se demuestra por la presencia de gas y/o crecimiento microbiano propiedad de los microrganismos 
coliformes para producir gas a partir de la fermentación de lactosa dentro de las 48h de incubación a 45,5± 
0,2°C (coliformes fecales y E. coli ).      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Para obtener el NMP en los resultados se aplica la teor ía de la probabilidad, lo cual tiene como condición 
lo siguiente:  
- Una distribución aleatoria de las bacterias que existen en la muestra.  
- Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas.  
- Los microorganismos presentes en la muestra crecerán en el medio cuando son incubados y se 
mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo.  
Alrededor del 96% de las cepas de E. coli  incluso las cepas anaerogénicas  producen la enzima  beta-
glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4 -metilumbelliferyl -beta-D-glucurónido (MUG) en 4 -
metilumbelliferona (MU), que al ser expuesto a una fuente de luz UV de onda larga (365nm) produce una 
fluorescencia azul, fácil de observar cuando el MUG es incorporado al caldo EC o al caldo lauril.  
Una excepció n es la E.coli  enterohemorrágica serotipo O157:H7, que es GUD negativa; por lo que es 
común que esta prueba se utilice para diferenciar este serotipo de las demás E. coli . 
La producción de GUD por otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae  es rara. A lgunas Shigellas  (44-
58%) y Salmonellae  (20-29%) son GUD positivas, sin embargo no se considera una desventaja de esta 
prueba para su uso en salud pública.  
Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las 
condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un 
inóculo en series de tubos. A medida que el número de tubos inoculados para cada dilución aumenta, se 
reducen los límites de confianza.  
H.2. EQUIPO.  
H.2.1  Baño de agua con: recirculación continua, tapa de dos aguas y termostato que evite variaciones 
mayores a 0.1°C.  
H.2.2  Lámpara de luz UV de 365nm longitud de onda.  
H.2.3  Incubadora de 35ºC ± 0.5ºC.  
H.2.4  Balanza con capacidad adecuada y sensibilidad de 0,1g.  
H.2.5 Motor de licuadora u homogenizador peristáltico.  
H.2.6  Potenciómetro con sensibilidad de 0,1 de unidad de pH.   
H.2.7  Mecheros Bunsen.  
H.2.8  Autoclave que alcance una temperatura de 121°C con termómetro y previamente evaluada con 
esporas de Bacillus st earothermophilus.   
H.3. MATERIALES.  
H.3.1  Tubos de cultivo de 18 x 150mm, 18 x 200, 16 x 150mm, 16 x 160mm, 22 x 175mm con tapón de rosca.  
H.3.2  Campanas de fermentación de 5cm de largo por 5mm de diámetro (campanas de Durham).  
H.3.3  Gradillas de plástico y metal.  
H.3.4  Asas bacteriológicas de 3 a 3.5mm de diámetro con porta asa.  
H.3.5  Lentes protectores.  
H.3.6  Termómetros de inmersión parcial con división mínima de 0.5ºC para incubadora calibrado y/o verificado.  
H.3.7  Termómetro de máximas para autoclave c on división mínima de 0.5°C calibrado.  
H.3.8  Termómetro de inmersión total de 1 - 55ºC de aproximadamente 55mm de longitud con 
subdivisiones de 0.1ºC, calibrado.  
H.3.9  Cinta testigo para procesos de esterilización por calor húmedo.  
H.3.10  Vasos de licuador a estériles o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico.  
H.3.11  Pipetas graduadas bacteriológicas de 1, 2, 5 y 10mL.  
H.3.12  Probetas de 100, 500 y 1000mL.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
H.3.13  Botellas de dilución de vidrio de borosilicato con tapa de rosca.  
H.3.14  Frascos con c apacidad 500mL con tapa de rosca.  
H.3.15  Espátulas, cucharas, cuchillos, pinzas.  
H.4. MEDIOS DE CULTIVO.  
H.4.1  Caldo A -1. 
H.4.2  Caldo lauril Triptosa.  
H.4.3  Caldo EC.  
H.4.4  EMB -L. 
H.4.5  Caldo triptona al 1%.  
H.4.6  Caldo RM – VP. 
H.4.7  Caldo Citrato de Kos er. 
H.4.8  Citrato de Simmons.  
H.5. REACTIVOS.  
H.5.1  Regulador de fosfatos solución concentrada.  
H.5.2  Diluyente de peptona al 0.1%.  
H.5.3  Reactivo de Kovacs.  
H.5.4  Reactivo de VP.  
H.5.5  Indicador rojo de metilo.  
H.5.6  Reactivos para la coloración de Gram.  
H.5.7  Caldo EC – MUG.  
H.6. PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.  
H.6.1  Procedimiento para determinar Coliformes Fecales y E. coli  en agua y hielo.  
H.6.1.1  Prueba presuntiva. Agitar la muestra vigorosamente, la cantidad necesaria para el análisis 
deberá ser de 100mL com o mínimo.  
H.6.1.1.1  Agua para uso y consumo humano y envasada , transferir 5 porciones de 20mL, 10mL o una 
porción de 100mL. Consultar las tablas H.7.2.2, H.7.2.3 y H.7.2.4 para seleccionar las diferentes 
concentraciones de caldo lauril de acuerdo a los dif erentes volúmenes de muestra a inocular.  
H.6.1.1.2  Agua para uso recreativo.  Utilizar 5 tubos de caldo lauril por cada porción de 10, 1 y 0.1mL, 
hacer diluciones decimales cuando se espere una densidad microbiana alta.  
H.6.1.1.3  Hielo . Fundir el hielo a 45 °C y realizar el análisis como agua para uso y consumo humano. 
Incubar los tubos de caldo lauril inoculados a 35 ± 0.5°C. Examinar los tubos a las 24h y observar si hay 
formación de gas. Anotar los resultados. Si la formación de gas no se observa, incubar 24h más y anotar los 
resultados.  
H.6.1.2  Prueba confirmativa. De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar 
en un número igual de tubos con el medio indicado para la prueba confirmativa; para bacterias coliformes 
totales, utilizar el  caldo verde brillante lactosa bilis y para coliformes fecales utilizar EC. Inocular en tubos de 
EC un control positivo de E. coli  y un control negativo de Enterobacter aerogenes  e incubar con las muestras.  
H.6.1.3  Incubar los tubos para prueba de colifor mes totales a 35 ± 0.5°C por 48 ± 2h y para la prueba de 
coliformes fecales a 45.5 ± 0.2°C en baño de agua con recirculación continua durante 24h, observar si hay 
formación de gas, registrar la lectura, en caso de no haber formación de gas, incubar 24h más . Utilizar estos 
resultados para calcular el NMP de coliformes totales y coliformes fecales respetivamente. Consultar la 
sección de cálculos.  
Nota: Para todos los alimentos que se les determine coliformes fecales, la incubación debe ser a  45.5°C ± 
0.2°C por 24 a 48h, excepto para muestras de agua que deberán incubarse a 44.5 ± 0.2°C  durante 24h.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
H.6.1.4  Prueba complementaria.  
H.6.1.4.1  Esta es una prueba optativa de calidad para todas las muestras de agua que tiene como objetivo 
confirmar el 10% de los tubos positivos de coliformes totales en caldo verde brillante. Tomar una asada de 
cada uno de los tubos positivos de caldo verde brillante y sembrar por estría cruzada en agar Mc Conkey. 
Incubar a 35°C ± 0.5°C por 24h ± 2h. Observar las colonias típicas f ermentadoras de color rojo que pueden 
estar rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales biliares.  
H.6.1.4.2  Seleccionar 1 o más colonias aisladas con las características anteriores o lo más parecido a esta 
descripción e inocular igual número de tub os de fermentación con caldo lauril triptosa y a tubos con agar 
nutritivo inclinado; Incubar a 35°C ± 0.5°C examinar los tubos a las 24h y observar si hay formación de gas. 
Anotar los resultados. Si la formación de gas no se observa, incubar 24h más y anot ar los resultados.  
H.6.1.4.3  Realizar tinción de Gram a partir del crecimiento en el agar nutritivo para observación de la 
morfología microscópica de las colonias.  
H.6.1.4.4  La formación de gas en los tubos de caldo lauril sulfato dentro de las 48h ± 3h y  la observación 
de bacterias Gram negativas, en forma de bacilos no esporulados constituyen una prueba positiva a la 
presencia del grupo coliforme.  
H.6.1.5  Prueba confirmativa para E. coli  (por identificación bioquímica).  
H.6.1.5.1  Prueba presuntiva.  
H.6.1.5.1.1  Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría cruzada 
en agar EMB -L para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35°C por 18 -24h. Seleccionar dos colonias 
de cada plaza con la morfología colonial típic a: colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico y 
sembrarlas en agar cuenta estándar (placa o agar inclinado), para realizar las pruebas de morfología 
microscópica y pruebas bioquímicas. Incubar las placas o tubos a 35°C por 18 a 24h.  
H.6.1. 5.1.2  Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido a E. coli  
de cada placa. Realizar un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos 
Gram  negativos.  
H.6.1.5.1.3  Pruebas bioquímicas : Indol, Rojo de metilo, VP, citrato.  
H.6.1.5.1.4  Producción de indol . Inocular un tubo con caldo triptona e incubarlo a 35 ± 0.5°C por 24 ± 2h. 
Adicionar 0.2 – 0.3mL de reactivo de Kovacs. La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se 
considera una prueba positiva.  
H.6.1.5.1.5  VP. Inocular un tubo con caldo MR -VP e incubar a 35 ± 0.5°C por 48 ± 2h. Transferir 1mL a un 
tubo de 13 x 100mm. Adicionar 0.6mL de solución alfa naftol y 0.2mL de KOH al 40% y agitar. Se considera 
una prueba posit iva cuando se desarrolla un color rojo rosado de 15 a 30 min.  
H.6.1.5.1.6  Rojo de metilo. Inocular un tubo adicional con caldo MR -VP e incubar a 35°C ± 0.5°C por  48 
± 2h. Adicionar 5 gotas de solución de solución de rojo de metilo. Se considera una prueba  positiva cuando se 
desarrolla un color rojo. Un color amarillo definido es una prueba negativa.  
H.6.1.5.1.7  Citrato. Sembrar con inó culo ligero un tubo con caldo citrato de Koser, evitar turbiedad en el 
tubo. Incubar a 35°C ± 0.5°C por 96h. Una reacción p ositiva se observa mediante el desarrollo de turbiedad 
detectable. Se puede utilizar como alternativa citrato de Simmons el cual se debe inocular por estría. Incubar 
35°C ± 0.5°C por 48h. Una prueba positiva se observa mediante crecimiento y un cambio a co loración azul; la 
ausencia de crecimiento se considera una prueba negativa.  
H.6.1.5.1.8  Interpretación de resultados de las pruebas bioquímicas.  
H.6.1.5.1.9  Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48h a 35°C, 
sean ba cilos o bacilos cortos Gram negativos no esporulados y se obtengan las siguientes combinaciones 
para el IMViC:  
Pruebas  Biotipo 1*  Biotipo 2*  
Indol  + - 
RM + + 
VP - - 
Citrato  - - 
 * Son consideradas como E. coli . Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
H.6.1.5.1.10  Calcular el NMP de E. coli  basada en la proporción de los tubos positivos de caldo EC 
confirmados. Consultar el H.7 Cálculos.  
H.6.2  Prueba para detectar E. coli  en alimentos refrigerados o congelados.  
H.6.2.1  Prueba Presuntiva. Seguir lo indicado en el punto Procedimiento para Alime ntos.  Utilizando 
caldo lauril con MUG en vez de caldo lauril. Inocular un tubo con una cepa de E. coli GUD  positiva como 
control (ATCC 25922). Además inocular otro tubo con una cepa de Enterobacter aerogenes  (ATCC13048) 
como control negativo, para facilita r la diferenciación entre los tubos que presenten solo crecimiento  y 
crecimiento con fluorescencia. Inocular los tubos por 24 a 48 ± 2h a 35°C. Examinar cada tubo con 
crecimiento (turbiedad y gas), después, observar los tubos en la oscuridad con una lámpa ra de luz UV. Una 
prueba positiva para E. coli  es la presencia de fluorescencia en el tubo. La lectura a las 24h de incubación, 
identifica a E. coli  en un 83 -95%, mientras que a las 48h de incubación la identifica en un 96 -100%.  
H.6.2.2  Prueba confirmativa . Confirmar todos los tubos positivos estriando en una placa de agar L -EMB, 
incubar a 35°C por 24h y continuar como en el punto.  
H.6.2.2.1.  Prueba confirmativa para E. coli  (por identificación bioquímica). Calcular el NMP de E. coli  
basada en la confirmaci ón de tubos en las 3 diluciones consecutivas.  
H.6.3  Procedimiento para Alimentos.  
H.6.3.1  Prueba Presuntiva. Pesar 25g o 50g del alimento en 225 o 450mL de regulador de fosfatos y 
moler por 2 min en vaso de licuadora u homogeneizador peristáltico, el volum en total en el vaso debe cubrir 
totalmente las aspas. Las muestras congeladas deben mantenerse en refrigeración (2 -5°C) un máximo de 18h 
antes de su análisis, sin llegar a la descongelación. En caso de que la cantidad de muestra disponible sea 
menor a 25g y el análisis necesite ser efectuado (por denuncia o queja ante la autoridad), utilizar una cantidad 
de muestra que represente una proporción 1:10.  
H.6.3.2  Preparar diluciones decimales con regulador de fosfatos. La cantidad de diluciones dependerá de 
la densidad de coliformes esperada. Agitar las diluciones 25 veces en un arco de 30cm por 7 seg transferir 
volúmenes de 1mL a 3 tubos con 10mL de caldo lauril sulfato de sodio por cada dilución por lo menos tres 
diluciones consecutivas (el volumen que se trans fiera nunca debe ser menor del 10% de la capacidad total de 
la pipeta). Mantener la pipeta en ángulo de tal manera que descanse sobre el borde del tubo. El tiempo entre 
la homogeneización de la muestra y la inoculación de los tubos no debe exceder de 15 a 20 min.  
H.6.3.3  Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa, una vez inoculados incubar a  35 ± 
0.5°C. Examinar los tubos a las 24h y observar si hay formación de gas. Anotar los resultados. Si la formación 
de gas no se observa, incubar 24 h más y anotar los resultados.  
H.6.3.4  Prueba Confirmativa. Continuar como en el H.6.1.2. Prueba Confirmatoria,  considerando que si 
la formación de gas no se observa, continuar la incubación 24h más.  
H.7. CALCULOS.  
H.7.1  Con frecuencia es necesario calcul ar el NMP con cantidades de muestra diferentes de los enlistados 
en las tablas H.7.4 desde el primer número de la combinación encontrada. Si la cantidad de muestra es mayor 
que 0,01g multiplicar el NMP enlistado en la tabla por 10.  
H.7.2  Una determinación  de 5 tubos que dé 3 tubos positivos en 0.01g; 2 tubos positivos en 0.001g y  1 
tubo positivo en 0.0001g (3 -2-1) el resultado obtenido al leer en la tabla 7.4.1, es 17, multiplicar por 10 para 
así obtener 170 como el NMP final por gramo de muestra. De igua l forma si la cantidad más grande utilizada 
para la tabla de referencia es 1g en lugar de 0.1g, dividir el NMP derivado de la tabla entre 10. Por ejemplo el 
resultado de la determinación del NMP en 3 tubos para Salmonella spp que de 3 tubos positivos en 1g ; 1 tubo 
positivo en 0.1g y ningún positivo en 0,01g (3 - 1 - 0) el resultado obtenido al leer en la tabla H.7.4.2 es 43 y 
dividir entre 10, lo que da 4,3 como el NMP presuntivo por gramo de muestra.  
H.7.3  Un método alternativo para obtener el número más p robable es usando la siguiente fórmula:  
(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de en medio = NMP/g.  
Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
H.7.4  Tablas.  
H.7.4.1  Tabla 1. NMP para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones de 0.1; 0.01  y 
0.001g.  
 
Refer encia: Official Methods of Analysis of AOAC Internat ional, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5  
H.7.4.2  Tabla 2. NMP para 100mL de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de 3 
diluciones con series geométricas.  
 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
 
H.7.4.6 Tabla 6. NMP por gramo de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando 5 tubos 
con 0.1, 0.01 y 0.001 g de muestra.  
 
 
 
 
 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
 
 
H.7.4.7  Tabla 7. NMP por gramo de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando 5 tubos 
con 0.1, 0.01 y 0.001 g de muestra.  
 
 
 
      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
 
 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
 
 
 
      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
 
H.7.5  ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TÉCNICA DE NMP. Uso de tablas de 
NMP con 95% de límite de confianza.  
H.7.5.1  Las tablas H.7.4.5, H.7.4.6, H.7.4.7 presentan la estimación estadística de los valores del NMP 
que corresponden al 95% de límite de confianza cuando se utilizan 3, 5 y 10 tubos. Otras combinaciones de 
resultados positivos y negativos no encontrados en estas tablas, tienen muy baja probabilidad de que se 
presenten. Si los resultados no están incluidos  en las tablas, se deberá repetir la prueba a partir de la muestra 
original. Si no es posible, el NMP se puede obtener aplicando una ecuación ( véase Cálculo aproximado del 
NMP y el 95% de Límite de Confianza ) para tener el NMP aproximado (para las combinac iones de 3 y  5 
tubos).  
H.7.5.2  El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el analista supone que el número 
real de microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces. 
El valor del NMP tab ulado representa un intervalo y no un valor absoluto.   
H.7.5.3  Cuando se preparan más de 3 diluciones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir de 
los resultados de tres diluciones consecutivas. Primero, para todas las diluciones que tengan todos  los tubos 
positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar las 2 siguientes diluciones mayores (A y B en los 
ejemplos H.7.5.3.1 y H.7.5.3.2). Cuando en ninguna de las diluciones probadas hubiera crecimiento en todos 
los tubos, seleccionar (si es pos ible) las primeras tres diluciones consecutivas para que la dilución media 
contenga resultados positivos (C de los ejemplos H.7.5.3.1 y H.7.5.3.2). Cuando se presenta un resultado 
positivo en la di lución más alta no seleccionada  (menor cantidad de muestra) , sumar el número de tubos 
positivos a la dilución más alta seleccionada (D de los ejemplos H.7.5.3.1 y H.7.5.3.2). Cuando todos los tubos 
de todas las diluciones son positivos seleccionar las tres diluciones más altas. (E de los ejemplos H.7.5.3.1 y 
H.7.5 .3.2).  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
aNumerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.  
bMultiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).  
H.8. CÁLCULO APROXIMADO DEL NMP Y EL 95% DE LÍMITE DE CONFIANZA.  
H.8.1  Debido  a la inherente complejidad para calcular los límites de confianza del NMP lo más común es el 
uso de tablas. Generalmente estas tablas están limitadas al uso de 3, 5 y 10 tubos por dilución, incluso 
usando un método aceptado, pueden presentarse datos irreg ulares o accidentes de laboratorio que causan 
pérdida de 1 o más tubos de dilución. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5, 4, 4 puede dar 
una lectura de 5 - 2 - 0. Para estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no correspo nde 
exactamente con los resultados obtenidos teóricamente; sin embargo, las desviaciones generalmente son 
pequeñas, esta fórmula no debe ser aplicada para fines de regulación. La fórmula no restringe el número de 
tubos o las diluciones y puede aplicarse pa ra todo tipo de pruebas. El cálculo aproximado de Thomas está 
dado por la siguiente ecuación:  
NMP/g = P/(N T)1/2 
Donde: P es el número de tubos positivos, N es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos 
negativos y T es la cantidad total de muestr a (g) en todos los tubos.  
Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble:  
MUESTRA 
(g) No. DE 
TUBOS  No. DE 
TUBOS 
POSITIVOS  
8 
4 
2 
1 
0,5 5 
5 
5 
5 
5 5 
4 
2 
0 
1      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
0,25 5 0 
El número de tubos positivos es:  
P = (5 + 4 + 2+ 1) = 12;  
N = (8x0)  + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0,5x4) + (0,25x5) = 18,25; y  
T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75  
NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g.  
Los límites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la 
siguiente ecuació n: 
log (NMP/g) ±1,078 [(log a)/n ]1/2 
Log (NMP/g) ± (1,96) (0,55)  
Donde:  a es el radio de dilución 2 y  
 n es el número de tubos por dilución.  
Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un límite de confianza aproximado de 95% será el siguiente:  
log 0,32 ± (1,078)[(log a)/n ]1/2 
= -0,495 ±  0,265  
Entonces el límite inferior es el antilogaritmo ( -0,76) = 0,17/g o 17/100 g y el límite superior es el 
antilogaritmo ( -0,23) = 0,59/g o 59/100 g. Cuando se compara con las tablas el NMP podría ser 0,31/g con 
límite s de confianza de 0,16/g y 0,57/g.  
H.9. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.  
H.9.1  Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100mL para agua.  
H.9.2  Cuando se obtienen resultados negativos (ausencia de gas en los tubos), informar el límite de 
detección que c orresponde a menos de una vez el valor más bajo del NMP de la tabla utilizada. Excepto  en 
los casos de agua para uso y consumo humano que por acuerdo internacional se informa como  “No 
detectable” o “ND”.  
H.10.  MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD.  
H.10.1  Verifica r la funcionalidad del procedimiento analítico mediante cultivos control con cepas de E. coli 
y E. aerogens para coliformes fecales y E. coli y K. pneumoniae  para la determinación de E. coli  con caldo 
EC-MUG.  
H.10.2  Cuando el ingreso de muestras para esta determinación sea frecuente, analizar un duplicado cada 
mes; si el ingreso no es frecuente, realizar un duplicado cada 10 muestras.   
H.10.3  Registrar las temperaturas de incubación con termómetros verificados.  
H.10.4  Pesar la muestra en balanza calibrada y  verificada.  
H.10.5  Verificar el ciclo de esterilización de autoclaves con indicador biológico y termómetro de máximas 
calibrado o verificado.  
H.10.6  Verificar el ciclo de esterilización de hornos con indicador biológico.  
H.10.7  Realizar control de medios  de cultivo con cepas tipo (evaluación biológica) y evaluación física.  
H.10.8  Realizar control ambiental por el método de sedimentación.  
H.11.  VALIDEZ DE LA PRUEBA.  
H.11.1  Si el crecimiento de los controles no es característico la prueba se invalida.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
H.11. 2 Cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor 
sean negativos o la combinación de ambos.  
H.12.  Diagrama de Flujo.  
 
 
H.13.  Preparación de Medios de Cultivo.  
H.13.1  Caldo A -1. 
H.13.1.1. Fórmula.  
Este medi o se debe preparar a partir de ingredientes:  
Lactosa  5,0g 
Triptona  20,0g  
Cloruro de sodio  5,0g 
Salicina  0,5g 
Eter p-isoctilfenil polietilen glicol (Tritón X -100) 1,0mL  
Agua destilada  1000mL  
 
H.13.1.2. Preparación: Calentar los ingredientes hasta su d isolución, agregar 1mL del  Tritón X -100 y 
ajustar el pH a 6,9 ± 0,1. Para alícuotas de 10mL preparar y utilizar el medio a doble concentración. Para 
lograr aproximadament e el mismo nivel del medio e inó culo en todos los tubos, distribuir porciones de 10mL 
del caldo en tubos de 18 x 150mm. Los tubos deben contener campanas de Durham; usar tubos de  22 x 
175mm para el caldo a doble concentración. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 10 min y guardar el medio a      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
temperatura ambiente en un lugar oscuro por no má s de 7 días. La formación de precipitado particularmente 
en los tubos de doble concentración, no afecta el desempeño.  
Nota: Debido a que  las diferencias geográficas pueden afectar el desempeño del método medio A -1, antes 
de empezar a utilizarlo determinar  su comparabilidad con el método de tubos lauril Sulfato – Caldo EC. Más 
aun, el medio A -1 debe prepararse a partir de sus ingredientes individuales.   
H.13.2  Caldo lauril Triptosa.  
H.13.2.1. Fórmula.  
Bacto triptosa  20,0g  
Bacto lactosa  5,0g 
Fosfato potási co dibásico  2,75g  
Fosfato potásico monobásico  2,75g  
Cloruro de sodio  5,0g 
Lauril sulfato de sodio  0,1g 
Agua destilada  1000,0mL  
pH final: 6,8 ± 0,2 a 25°C.   
H.13.2.2. Preparación: Disolver los ingredientes en un L de agua destilada, ajustar el pH si e s necesario y 
distribuir en tubos de ensaye 16 X 150mm con campanas de Durham de 5 x 45mm. Adicionar el volumen de 
medio de acuerdo con la siguiente tabla cuando se prepare a partir de medio completo deshidratado. 
Esterilizar en autoclave durante 15 min a 121ºC.  
Preparación de caldo lauril triptosa.  
Cantidad de medio por tubo (mL)  Volumen de medio más inóculo 
(mL)  Caldo lauril Triptosa 
requerido g/l  
10 o más  11 o más  35,6 
10 20 71,2 
20 30 53,4 
10 30 106,8  
50 150 106,8  
35 135 137,1  
20 120 213,6  
H.13. 3 Caldo EC.  
H.13.3.1. Fórmula.  
Bacto triptosa o tripticasa  20,0g  
Bacto lactosa  5,0g 
Bacto sales biliares No. 3  1,5g 
Fosfato dipotásico  4,0g 
Fosfato monopotásico  1,5g 
Cloruro de sodio  5,0g 
Agua destilada  1000,0mL  
pH final: 6,9 ± 0,2 a 25°C.   
H.13.3. 2. Preparación: Disolver los ingredientes en un L de agua destilada, dejar en reposo durante 5 a 
10 min, mezclar bien hasta que se disuelva por completo. Ajustar el pH si es necesario. Distribuir en porciones 
de 10mL en tubos de ensaye de 16 x 150 mm con c ampanas de Durham de 5 x 50mm y esterilizar en 
autoclave durante 15 min a 121°C.  
H.13.4  EMB -L 
H.13.4.1. Fórmula.  
Peptona  10,0g  
Lactosa  10,0g  
K2HPO4  2,0g Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
Eosina Y  0,4g 
Azul de metileno  0,065g  
Agar  15,0g  
Agua destilada  1000mL  
pH final: 7,1 ± 0,2   
H.13.4.2. Preparación: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un L de agua, calentar hasta ebullición 
para la disolución completa, distribuir en porciones de 100 o 200mL y esterilizar a no más de 121°C por 15 min.  
Fundir antes de su uso y adicionar a c ada porción de 100mL; lo siguiente:  
a) 5mL de solución de lactosa al 20% estéril.  
b) 2mL de solución acuosa de eosina y al 2%.  
c) 4,3mL de solución acuosa de azul de metileno al 0,15%.  
Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes  de acuerdo con las instrucciones 
del fabricante.  
H.13.5  Caldo triptona al 1 %.  
H.13.5.1. Fórmula.  
Triptona o tripticasa  10g 
Agua destilada  1000mL  
pH final: 6,9 ± 0,2   
H.13.5.2. Preparación: Disolver los ingredientes, distribuir en porciones de 5mL en t ubos de ensaye de  16 
x 125 o 16 x 150mm y esterilizar a 121°C por 15 min.  
H.13.6 Caldo MR – VP. 
H.13.6.1. Fórmula.  
Peptona tamponada  7g 
Glucosa  5g 
K2HPO 4 5g 
Agua destilada  1000mL  
pH final: 6,9 ± 0,2   
o 
Digerido Pancreático de caseína  
Digerido péptico de tejido animal  3.5g 
3.5g 
Dextrosa  5g 
Fosfato de potasio  5g 
Agua destilada  1000mL  
pH 6.9 ± 0.2   
o 
Peptona  5g 
Glucosa  5g 
Regulador de Fosfatos  5g 
Agua destilada  
pH 7.5 ± 0.2  1000mL  
H.13.6.2. Preparación: Disolver los ingredientes con calentamiento  suave si es necesario, distribuir en 
volúmenes de 10mL en tubos de ensaye de 16 x 150mm y esterilizar a 121°C por 15 min.  
H.13.7  Caldo Citrato de Koser.  
H.13.7.1. Fórmula.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
NaNH 4HPO 4 •4H2O  1,5g 
KH2PO 4 (monobásico)  1,0g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2g 
Citrato de  97ódio •2H 2O 3,0g 
Agua destil ada 1000mL  
H.13.7.2. Preparación: Distribuir 5mL del caldo preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca y 
esterilizar a 121°C por 15 min.  
Esta formulación se recomienda en los métodos de análisis oficial de AOAC y en los M étodos Estándares 
para el Análisis de A gua y Aguas de Desecho (APHA). É ste difiere de la composición del medio deshidratado 
disponible comercialmente y es recomendable su uso.  
H.13.8  Citrato de Simmons.  
H.13.8.1. Fórmula.  
NaNH 4HPO 4 •4H 2O 1,5g 
KH2PO 4 (mono básico)  1,0g 
MgSO 4 •7H 2O 0,2g 
Citrato de 98ódio •2H 2O 3,0g 
NaCl  5,0g 
Agar  5g 
Azul de bromotimol  0,08g  
Agua destilada  1000mL  
H.13.8.2. Preparación: Disolver los ingredientes y calentar a ebullición por 1 min. Distribuir en porciones 
de 5mL, en tubos  con tapón de rosca, esterilizar por 15 min a 121ºC y dejar solidificar en una superficie lo 
suficientemente inclinada para tener una profundidad de 3 cm.  
H.13.9  Regulador de fosfatos solución concentrada.  
H.13.9.1. Fórmula.  
KH 2PO 4 34g 
Agua destilada  500m L 
H.13.9.2. Preparación: Solución concentrada: Disolver el fosfato en 500mL de agua y ajustar el pH a 7,2 
con solución de hidróxido de sodio 1,0N, llevar a un L con agua y esterilizar durante 15 min a 121°C. 
Conservar en refrigeración.  
Solución de trabaj o: Tomar 1,25mL de la solución concentrada y llevar a un L con agua. Distribuir en 
porciones de 99, 90 y 9mL según se requiera. Esterilizar a 121°C durante 15 min. Después de la 
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberá n ser iguales a los iniciales.  
H.13.10. Diluyente de peptona al 0.1 %.  
H.13.10.1. Fórmula.  
Peptona  1g 
Agua destilada  1000mL  
pH: 7,0 ± 0,2   
H.13.10.2. Preparación: Disolver la peptona en el agua destilada y esterilizar a 121°C por 15 min.  
H.13.11. Reacti vo de Kovacs.  
H.13.11.1 Fórmula.  
p-dimetilaminobenzaldehído  5g 
Alcohol amílico (normal)  75mL  
HCI concentrado  25mL  
H.13.11.2. Preparación: Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal, adicionar 
lentamente el HCl. Almacenar a 4°C.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
H.13.12 . Reactivo de VP.  
H.13.12.1. Fórmula.  
Solución 1.  
alfa-naftol  5g 
Alcohol Absoluto  100mL  
Solución 2.  
KOH  40g 
Agua destilada  Para llevar a 100mL  
H.13.13  . Indicador rojo de metilo.  
H.13.13.1.Fórmula.  
Rojo de metilo  0,10g  
Etanol al 95%  300mL  
Agua d estilada  Para completar 500mL  
H.13.13.2. Preparación: Disolver el rojo de metilo en 300mL de etanol y aforar a 500mL con agua destilada.  
H.13.14. Reactivos para la coloración de Gram.  
H.13.14.1  Cristal Violeta.  
H.13.14.1.1. Fórmula.  
Solución A.  
Cristal v ioleta (colorante 90%)  2g 
Etanol 95%  20mL  
Solución B.  
Oxalato de amonio  0,8g 
Agua destilada  80mL  
H.13.14.1.2. Preparación:  Mezclar la solución A y B y filtrar a través de un papel filtro. Almacenar por 24h.  
H.13.14.2  lodo.  
H.13.14.2.1. Fórmula  
Iodo 1g 
Ioduro de potasio (KI)  2g 
Agua Destilada  300mL  
H.13.14.2.2. Preparación:  Colocar el Kl en un mortero, adicionar el iodo, triturar con el pistilo por 5 a 10 
seg, adicionar 1mL de agua y triturar. Adicionar 5mL de agua y triturar. Adicionar 10mL de agua y triturar. 
Vaciar esta solución en una botella de reactivo, enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua 
necesaria para completar 300mL.  
H.13.14.3  Colorante de contraste (solución concentrada).  
H.13.14.3.1. Fórmula.  
Safranina  2,5g 
Etanol al  95% 100mL  
H.13.14.3.2. Preparación:  Solución de trabajo: Adicionar 10mL de la solución concentrada a 90mL de 
agua destilada.  
H.13.14.4  Caldo EC – MUG  
H.13.14.4.1. Preparación: Preparar el caldo EC y adicionar 50mg de 4 -metilumbelliferyl -beta-D-glucuróni do 
(MUG) por L antes de esterilizar (121°C por 15 min). El caldo EC -MUG está comercialmente disponible.  
Apéndice normativo I.       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Método aprobado para la estimación de la densidad de E. coli  por la técnica del NMP, para 
productos de la pesca.  
Este método es ap licable para pescados y productos de la pesca como: pescados crudos, enteros o filetes 
sin piel y cabeza, pescado salado, seco, ahumado, cefalópodo entero o en rebanada, crustáceos entero como 
langostas, cangrejo, gasterópodos, bivalvos, caracoles, procesa dos pescados y crustáceos moluscos como: 
secos, ahumados, marinados, troceado, horneado, pescado entero o filetes con o sin piel cocidos, surimi, 
crustáceos enteros y moluscos en su concha, congelados, pescado, entero, filetes y piezas, cangrejo, 
cefalópod os, moluscos en concha cocidos y caracoles en concha.  
I.1. INTRODUCCIÓN.  
Este método consta de dos etapas. La primera es un enriquecimiento mediante la inoculación de la 
muestra previamente homogeneizada y diluida en 5 tubos por dilución, en caldo glutamat o con minerales 
modificado e incubado a 37±1°C por 24h. La segunda es la confirmación de la presencia de E.coli  mediante la 
resiembra de tubos en los que se observe producción de ácido en agar que contenga 5 -bromo -4-cloro -3-indol -
β-D glucuronido y detectar la actividad de β-glucuronidasa incubado a 44±1°C por 22 ±1°C.  
I.2. EQUIPO.  
I.2.1 Emplear el equipo e instrumentos de laboratorio habituales incluyendo.  
I.2.2 Homogeneizador peristáltico y bolsas.  
I.2.3 Motor homogeneizador rota torio) y vasos de licuadora.  
I.2.4 Gabinete de flujo laminar (clase II).  
I.2.5 Refrigerador a 3°C ± 2°C.  
I.2.6 Material de vidrio estéril.  
I.2.7 Cuchillos desconchadores, tijeras, pinzas, espátulas estériles.  
I.2.8 Mechero Bunsen . 
I.2.9 Guantes de lá tex. 
I.2.10  Incubadora a 37°C ±1°C y a 44°C ± 1°C.  
I.2.11  Asas bacteriológicas.  
I.2.12  Pipetas de 1mL, 2mL y 10mL.  
I.3. MATERIALES.  
I.3.1 Cajas Petri desechables 15mm x 100mm.  
I.3.2 Tubos de ensaye 18mm x 200mm y de 16mm x160mm con tapón de rosca.  
I.3.3 Botellas  de dilución de vidrio de borosilicato con tapa de rosca.  
I.3.4 Botellas de 500mL esterilizables.  
I.4. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO.  
I.4.1 Etanol.  
I.4.2 Agua peptonada al 0.1% (concentración simple).  
I.4.3 MMGB medio selectivo de enriquecimiento.  
I.4.4 TBGA  
I.5. CULTIVOS DE REFERENCIA.  
I.5.1 E. coli ATCC  25922 o ATCC 8739.  
I.5.2 E. faecalis  ATCC 29212 o ATCC 19433.  
I.6. PREPARACIÓ N DE LAS MUESTRAS.  
I.6.1 Procedimientos generales. Todas las preparaciones de la muestras deben llevarse a cabo en 
condiciones asépticas con materiales estériles y evitar contaminaciones de fuentes externas.  Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
I.6.2 Productos congelados. Los productos congelados deben permitir que obtengan una consistencia 
adecuada para  ser muestreados en el laboratorio, almacenados de 18 a 27° (tem peratura del laboratorio) por 
máximo de 3h o a 2°C ±  2°C por  de 24h. Las muestras deben ser analizadas tan rápido como sea posible 
después de este paso. Si el producto todavía está congelado, tomar una porción del diluyent e a temperatura 
del laboratorio  y adicionar para facilitar la descongelación.  
I.6.3 Productos secos y duros. No homogeneizar  en un homogeneizador rotatorio por más de 2.5 min.  
Para productos secos y duros  heterogéneos, puede ser necesario picarlos o moler la muestra por no más 
de 2.5 min p ara evitar el aumento de temperatura.  
I.6.4 Productos líquidos no viscosos. Antes de analizar la muestra agitar con la manos 25 veces en un 
arco de 25cm o por medios mecánicos para asegurar la distribución homogénea de los microorganismos.  
I.6.5 Productos heterogéneos. Para las muestras que contienen diferentes piezas de alimentos, 
muestrear varias alícuotas representativas de la s diferentes porciones del producto. También se puede 
homogeneizar toda la muestra del recibida en el laboratorio y tomar una porc ión analítica de este 
homogeneizado. Para lo cual puede ser necesario picar o moler por más de 1 min para evitar 
sobrecalentamiento de la muestra.  
I.6.6 Productos ácidos. Cuando se analicen productos ácidos es necesario llevar el pH a la neutralidad. 
El uso de un diluyente con un indicador de pH puede evitar el uso de tiras de reactivas de pH. Para lo cual es 
necesario adicionar NaOH (0.1 M) y ajustar cuando el indicador cambie de coloración.  
I.6.7 Alimentos altos en grasa.  (aproximadamente sobre el 20% de  grasa). Usar diluyente con Tween 80 
entre 1 y 10mg/l de acuerdo al contenido de grasa mejora la emulsificación de la suspensión.  
I.6.8 Pescado fresco entero. Las áreas de las branquias, el intestino y el año deben ser cubiertas con 
algodón estéril empapad o de alcohol al 70%. Tomar porciones cúbicas del músculo dorsal y moler con el diluyente.  
I.6.9 Rebanadas y filete de pescado.  Tomar una porción representativa de la muestra y diluir 1 + 9  de 
diluyente.  
I.6.10  Cefalópodos enteros y en rebanadas. Remover la  piel y las ventosas con pinzas y bisturí. Tomar 
porciones cúbicas del músculo dorsal y porciones de los tentáculos. Adicionar diluyente necesario para tener 
una dilución 1:10. La carne de los cefalópodos es relativamente firme, moler con el diluyente con 
homogeneizador rotatorio o cortar en piezas finas.  
I.6.11  Crustáceos enteros como cangrejos. Utilizar martillo, pinzas y pinzas para romper la concha y 
tenazas para extraer la cantidad máxima de carne para el análisis. Adicionar el diluyente y moler con 
homogeneizador rotatorio. Alternativamente se puede cortar en piezas finas y colocarlo en doble bolsa  de 
homogeneizador peristáltico para evitar derrames durante la homogeneización.  
I.6.12  Carne de crustáceo en concha. Tomar una porción necesaria para tener  una suspensión 1:10  y 
homogeneizar.  
I.6.13  Crustáceos como gambas, langostinos y langostas. Remover la cabeza y la cola antes del 
análisis de la carne del cuerpo. Excepto para animales pequeños cortar la carne en piezas. Homogeneizar en 
licuadora. Adicio nar la cantidad necesaria de diluyente para tener una dilución 1:10.  
I.6.14  Moluscos bivalvos, gasterópodos y otros. Las muestras en el laboratorio deben ser almacenadas 
a 4 ±2°C. Los moluscos deben estar vivos. Desechar los moluscos con las conchas abier tas o dañadas. Una 
muestra representativa debe contener al menos 6 conchas individuales que deberán ser aproximadamente  75 
a 100g (25g para animales pequeños). La muestra de bivalvos debe contener carne y líquido intervalvar 
(licor). Abrir la cantidad nece saria de moluscos para tener la cantidad suficiente de muestra para el método.  
I.6.14.1  Bivalvos. Lavar y cepillar cada concha con agua potable corriente, especialmente del m úsculo 
abductor o bisagra. Colocar los bivalvos en una charola con un papel absorb ente. Con un cuchillo 
desconchador estéril, insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el músculo abductor y abrir 
la concha. Penetrar sobre la concha superior y  drenar el licor y la carne en un vaso de precipitados estéril. 
Adicionar u na parte de carne y licor (agua intervalvar) y 2 partes de diluyente y homogeneizar en 
homogeneizador rotatorio por 30 seg a 2 min. De esta manera se obtiene una suspensión 1:2 de diluyente, 
puede adicionarse la cantidad necesaria para obtener una dilución  1:9.      (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
I.6.14.2  Gasterópodos. Lavar y cepillar cada concha, lavarlas con al alcohol al 70%, romper la concha 
con un martillo para extraer el animal. Preparar una dilución 1:2 en diluyente y posteriormente completar el 
volumen a una dilución 1:10.  
I.6.14.3  Erizos de mar. Lavar 6 piezas individualmente con agua potable corriente y colocarlos en una 
charola estéril. Sostener los animales con unas pinzas y con un guante apropiado cortar una pieza del lado 
ventral con unas tijeras afiladas. Colectar la carne y e n fluido en un contenedor estéril para homogeneizarlo. 
Preparar una dilución 1:2  con diluyente y despué s una cantidad necesaria para tener una dilución 1 + 9 con el 
mismo diluyente.  
I.6.15  Productos salados y encurtidos. Tomar tiras del producto para obten er el homogeneizado. En 
caso de que sea muy salado es necesario diluir más de 1:10.  
I.6.16  Pescado seco. Con unas tijeras cortar piezas de cuerpo del pescado incluyendo la piel. Preparar 
una suspensión 1:2 con el diluyente y homogeneizar un  motor de licua dora, adicionar la cantidad suficiente 
para tener una dilución 1:10 usando el mismo diluyente.  
I.6.17  Pescado seco y salado. Prepara la muestra igual que para el pescado seco. Si es necesario 
rehidratar la muestra con agitación por 60 min de 18 a 27°C.  
I.6.18 Pescado ahumado entero. Si el pescado se come entero, incluir en la muestra la piel, si no se 
come entero excluir la piel.  
I.6.19  Pescado ahumado en filetes o rebanadas con o sin piel. Tomas porciones en cubo de la muestra 
retirando la piel.  
I.6.20  Productos marinados . Para productos acidificados bajar el pH.  
I.6.21  Pescados empanizados, surimi, crustáceos y moluscos delicatesen . Tomar porciones 
representativas de la muestra y diluir 1:10.  
I.6.22  Platillos con pescado, crustáceos y moluscos cocidos. Tomar una porción de cada 
componente.  Homogeneizar toda la muestra para tomar una muestra analítica.  
I.6.23  Gasterópodos cocidos. Tomar una porción del cuerpo del animal con pinzas y diluir 1:10.  
I.6.24  Langostinos en concha congelados en bloque. Descongelar poco a poco por 1 h a 18 - 27°C 
(temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, extraer los langostinos con pinzas estériles. 
Mezclar las piezas con un homogeneizador peristáltico.  
I.6.25  Bloques congelados de carne de cangrejo en hojuelas. Desco ngelar poco a poco por 1 h a  18- 
27°C (temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, extraer trozos con pinzas estériles. 
Mezclar con el diluyente con un homogeneizador rotario.  
I.6.26  Cefalópodos enteros congelados en bloque. Descon gelar poco  a poco por 1 h a 18 -27°C 
(temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, extraer con pinzas o tijeras estériles. Mezclar las 
piezas con un homogeneizados rotario.  
I.6.27  Filetes de pescado congelado en bloques. Tomar una muestra perforando el b loque o permitir 
que se descongele de 18 a 27°C por 1 h y tomar porciones con pinzas estériles o dejar que se descógele lo 
suficiente por no más de 3h para tomar porciones con pinzas estériles.  
I.6.28  Piezas grandes de pescado congelado en bloques. Descong elar poco a poco por 1 h a 18 - 27°C 
(temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, rebanadas con cuchillo bien afilado estéril por la 
mitad del bloque.  
I.6.29  Porciones pequeñas de pescado congeladas individuales . Descongelar poco a poco por 1  hora 
a 18- 27°C (temperatura ambiente). Tratar la muestra como un producto fresco.  
I.6.30  Atún entero congelado. Si el atún es descongelado tomar una pieza del músculo debajo de la piel 
usando un cuchillo estéril. Si el atún no se descongela usar un perfo rador. Pescado congelado y piezas de 
pescado congelado. Descongelar poco a poco por no más de 3h a 18 -27°C (temperatura ambiente) o 
descongelar en el refrigerador de 0°C a 4°C por máximo de 48h o tomar piezas con un perforador evitando los 
huesos si es pos ible. Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
I.6.31  Preparación de diluciones decimales . Transferir 1mL de la suspensión inicial a un tubo con 9mL 
de diluyente estéril.  
NOTA: Si es necesario tener un volumen más grande de la suspensión inicial (más de 1mL) adicionar 9 
partes del diluyente emple ado. Introducir la pipeta no más de 1cm de profundidad. Utilizar una pipeta para 
cada dilución. Mezclar perfectamente entre cada dilución preferentemente usando un agitador mecánico para 
obtener una dilución 10-2. Si es necesario repetir la operación con u na pipeta nueva diferente para obtener  10-
3, 10-4 etc. hasta obtener la dilución apropiada y obtener la cantidad de microorganismos necesaria. Se 
deberán suficientes diluciones decimales para obtener resultados negativos.  
I.6.32  Duración del proceso. El tiempo inicial entre la preparación de la suspensión y el momento final 
cuando el inó culo entre en contacto con el medios no debe ser mayor a 45 min, mientras que el límite de 
tiempo entre la preparación de la suspensión inicial y el comienzo de las dilucio nes de las diluciones 
decimales siguientes no debe ser mayor a 30 min a menos que se especifique otra cosa.  
I.7. MEDIOS DE CULTIVO.  
I.7.1 Agua peptonada al 0.1% (concentración simple).  
I.7.2 Caldo glutamato con minerales modificado (MMGB medio selectivo d e enriquecimiento).  
I.7.3 Agar bilis glucuronido (TBGA segundo medio selectivo).  
I.8. PROCEDIMIENTO, INOCULACIÓN DEL ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO.  
I.8.1 En caso general inocular 3 tubos por cada dilución. Para moluscos vivos, u otros productos 
especiales y/o cuando sea necesario obtener resultados más exactos es necesario inocular series de 5 tubos 
por dilución. Tomar 3 tubos de medios de enriquecimiento selectivo. Con una pipeta estéril transferir 10mL de 
la muestra líquida o 10mL de la suspensión original en  caso de otros productos. Tomar 3 tubos de 
concentración simple de medios de enriquecimiento selectivo, usando otra pipeta estéril, transferir a cada uno 
de estos tubos 1mL de la muestra líquida o 1mL de la suspensión en caso de otros productos. Realizar 
diluciones decimales y repetir los puntos anteriores para cada dilució n. Mezclar cuidadosamente el inó culo y  
el medio.  
I.8.2 Incubar a 37°C ± 1°C  por 24h ± 2h.  
I.8.3 Para cada tubo inoculado que muestre presencia col oración amarilla estriar con un  asa a u na placa 
de agar triptona bilis glucuronido para obtener colonias aisladas.  
I.8.4 Incubar las placas a 44°C ± 1°C por 24h ± 2h 14.  
I.8.5 Después del periodo de incubación, observar la presencia de colonias de cualquier tono azul 
(obscuro o pálido), indican  la presencia de -glucuronidasa positivo de E. coli.  
I.9. INTERPRETACIÓN.  
I.9.1 Considerar como positivo cada tubo del cual se obtengan colonias azules a azules -verdes en la palca 
del medio selectivo. Contar por cada dilución el número de tubos positivos  en el medio.  
I.10. EXPRESIÓN DE RESULTADOS.  
I.10.1  Calcular el número más probable a partir del número de tubos positivos por cada dilución 
consultando las tablas I.1 o I.2 dependiendo de la serie de tubos que se utilice. Considerar la cantidad de 
gramos  de muestra en cada dilución e informar por 100g de molusco o por gramo para productos de la pesca 
en general.  
I.11. PRECISIÓN.  
I.11.1  La técnica del NMP tiene amplias variaciones en los resultados en series de 3 tubos por dilución. 
Por lo que los resultad os obtenidos deben ser usados con precaución. Cuando se use las series de 5 tubos, 
se debe de reportar con la precisión obtenida la cual es comparable con los métodos de cuenta de colonias. 
Los límites de confianza se encuentran en se encuentran en las tab las. 
Ejemplo:       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
Para una muestra sólida, en el 95% de los casos los límite de confianza varían de 13 a 200 E.coli  β 
glucuronidasa positiva 7.4 X 10 1NMP por gramo y de 4 a 99 E.coli  β glucuronidasa positiva en NMP  2.4 X101 
por gramo.  
I.12. INFORME DE PRUEBA.  
I.12.1  El informe debe especificar:  
I.12.1.1  Toda la información necesaria y completa para la identificación de  la muestra.  
I.12.1.2  El método de muestreo usado, si se conoce.  
I.12.1.3  El método de prueba usado.  
I.12.1.4  Todos los detalles no especificado en la técnica.  
I.12.1.5  Los resultados obtenidos y/o si la repetitividad se ha realizado.  
 
 Lunes 6 de mayo d e 2013  DIARIO OFICIAL  (Segunda Sección)       
 
I.13. MEDIOS DE  CULTIVO.  
I.13.1  Agua peptonada al 0.1% (concentración simple).  
Peptona babterioló gica (Oxoid LPP37)  1.0±0.1g  
Agua deionizada  1L 
pH  
I.13.2  Caldo glutamato con minerales modificado (MMGB medio selectivo de enriquecimiento).  
Ingredientes  Doble concentrac ión Concentración simple  
Glutamato de sodio (Oxoid L124)  12.7g  6.35g  
Lactosa  20.0g  10.0g  
Formato de sodio  0.5g 0.25g  
L-Cisteí na 0.04g  0.02g       (Segunda Sección)  DIARIO OFICIAL  Lunes 6 de mayo de 2013  
L(-) Acido aspártico  0.048g  0.024g  
L(+) - Arginina  0.04g  0.02g  
Tiamina  0.002g  0.001g  
Ácido nic otínico 0.002g  0.001g  
Ácido pantogénico  0.002g  0.001g  
Sulfato de magnesio septahidratado  0.2g 0.1g 
Citrato de fierro III  0.02g  0.01g  
Cloruro de calcio dihidratado  0.02g  0.01g  
Fosfato dipotásico  1.8g 0.9g 
Púrpura de bromocresol  0.02g  0.01g  
Cloruro de amonio  5.0g 2.5g 
Agua destilada  1000mL  1000mL  
 
I.13.2.1. Preparación:  Disolver el cloruro de amonio en agua. Adicionar el resto de los componentes hasta 
su completa disolución y calentar si es necesario. Para mejorara la estabilidad del almacenamiento  del medio. 
Adicionar el glutamato de sodio por separado. Ajustar el pH si es necesario, así como después de la 
esterilización el cual debe de ser de 6.7 ± 0.1 a 25°C. Distribuir el medio en volúmenes de 10mL en caso de 
concentración simple y tubos de  22mm X 175mm para e l caso de concentración doble de medio. Esterilizar en 
autoclave a 116°C Alternativamente calentar a 100°C por 30 min en 3 días sucesivos.  
I.13.3  Agar bilis glucuronido (TBGA segundo medio selectivo).  
Digerido enzimático de caseína   20.0g  
Sales biliares N o.3 1.5g 
5-Bromo -4-cloro -3-Indol -β-D- glucuronido  ácido (BCIG)  144 µ mola 
Dimetil sulfoxido (DMSO) b 3mL 
Agar  9 a 18gc 
Agua  1000mL  
a Por ejemplo 0.075g de  
b Dimetil sulfoxido es peligroso al inhalarlo y al contacto. Se recomienda el uso de cubrebocas  para humos 
y equipo de protecció n apropiado para manejar este reactivo.  
c Depende de la concentración del gel el agar.  
 
I.13.3.1. Preparación:  Disolver el medio anterior en el dimetil sulfoxido. Disolver todos los componentes 
en aguas calentando a ebullición. Ajustar el pH si es necesar io, así como después de la esterilización el cual 
debe de ser de 7.2 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar el medio a 121°C por 15 min. Vaciar de 12 a 15mL en placas Petri 
estériles y dejar secar. Las placas pueden ser almacenadas a 5 3°C hasta 5 días. El agar debe es tar lo 
suficientemente seco pasa permitir que el exceso de humedad desaparezca dentro de los 1 5 min después de 
extender el inó culo.   
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