식품의약품안전처 공고제2017-289호
- 2 -식품의약품안전처 공고제2017-289호
식품의기준및규격
(식품의약품안전처 고시제2017-57호,2017.6.30.)을
일부개정함에있어국민에게미리알려의견을수렴하고자그취지,
개정이유및주요내용을
행정절차법
제46조에따라다음과같이
공고합니다.
 2017년8월7일
 식품의약품안전처장
식품의기준및규격일부개정고시(안)행정예고
1.개정이유
식품오염물질기준적용원칙을정비하고,중금속규격재평가결과를
바탕으로납또는카드뮴의규격을강화또는신설하고자하며,히스
타민이생성되기쉬운어류중섭취량이많으나기준이설정되어있지
않는‘방어’에히스타민규격을신설함으로써국민에게안전한식품을
공급하고자함.
바이러스에의한식중독발생이지속됨에따라식품용수중식중독
바이러스기준을확대하여식품안전관리를강화하고자함.
참기름과들기름에다른식용유지를혼합할수없도록한규정을
명확히하고새로이규명된발기부전치료제 유사물질을규격에신설
하여식품의건전한유통질서를확립하고자함.식품원료중「야생생- 3 -물보호및관리에관한법률」에서멸종위기종으로 등록된품목중
현재까지양식된사례가없고품목제조보고된 식품중식품원료로사
용된이력이없는어류3종을식품원료목록에서삭제하여멸종위기
종을보호하고자함
국내외에서사용되는농약의잔류허용기준을 신설․개정하여과학
적인식품안전관리를하고자함.
2.주요내용
가.오염물질기준적용원칙정비[안제1.2.4),제2.3.5)]
1)물질별로따로규정되어있던오염물질기준적용원칙을통합
정비
2)농․임․축․수산물의방사능및폴리염화비페닐(PCBs)기준적용
조항신설
3)기준적용여부가명확하지않은가공식품의중금속,곰팡이독소,
패독소등오염물질기준적용원칙문구정비
나.식품용수중식중독바이러스기준설정[안제2.3.4)(2)바,
제5.2.1)(2),제7.4.26∼4.31]
1)바이러스에의한식중독발생이지속됨에따라식품용수중식중독
바이러스기준을확대하여식품미생물안전관리강화
2)노로바이러스외에도A형·E형간염바이러스,로타바이러스등- 4 -식중독바이러스5종의관리기준마련
3)식품용수중바이러스검출에필요한관련시험법신설
다.중금속의규격강화및신설[안제2.3.5)의(2)]
1)식품의중금속기준․규격을재평가한결과,납또는카드뮴의
노출점유가높은식품에납또는카드뮴기준을강화또는신설
2)과일류,갑각류,유지종실류의납규격신설및개정
3)근채류,연체류,해조류의납,카드뮴규격신설및개정
4)우리나라국민이주로섭취하는식품의중금속안전관리강화
라.농약잔류허용기준적용방법개정[안제2.3.7)(1),(3)]
1)식품중잔류농약의효율적안전관리를위해일본,유럽연합등에
서도입중인농약허용물질목록관리제도(PositiveListSystem,
PLS)를국내에도도입필요
2)농약잔류허용기준이설정되지않은경우,일률기준(0.01mg/kg이하)을
적용할수있도록근거조항을신설하고잔류허용기준설정이면제
될수있는근거정비
3)잔류농약안전관리강화로국민건강보호
마.방어의히스타민기준신설[안제2.3.16)의(1)]
1)섭취량이많고알레르기발생이력이높은방어에히스타민규격- 5 -의관리필요성증대
2)수산물의히스타민규격적용어류에‘방어’추가
3)섭취량이높고알레르기발생이력이있는수산물의안전관리강화
바.신규규명된발기부전치료제 유사물질2종및불법의약품성
분5종추가신설[안제2.3.9),제7.10.4,제7.10.7.3∼10.7.6]
1)식품에허용되지않은화학적합성품의관리로식품의건전한유통
질서확립필요
2)신규규명된발기부전치료제유사물질인‘이소프로필노르타다라필 ’과
‘데스카본실데나필 ’을발기부전치료제목록과시험법에추가
3)식품에첨가되어서는아니되는물질로요힘빈,이카린,센노사이드,
카스카로사이드,페놀프탈레인추가
4)불법의약품성분이식품에함유되어유통되는것을방지함으로써안
전한식품이유통될수있는기반마련
사.참기름과들기름의정의및제조․가공기준개정[안제4.7-1,
7-3]
1)가짜참기름,가짜들기름이유통되는것을방지하여식품의건전한
유통질서를확립하기위하여명확한규정필요
2)식물성유지류의제조․가공기준과참기름과들기름,기타식용유지의
정의개정- 6 -3)가짜참(들)기름의유통을사전에차단함으로써식품의건전한유
통질서확립
아.식품에사용할수있는원료목록개정[안별표1]
1)「야생생물보호및관리에관한법률」에멸종위기종으로지정되고
현재까지양식기술이확보되지않은생물의보호필요
2)현행식품원료로인정된것중멸종위기종으로등록된미흑점상어,
비악상어,장완흉상어를식품원료목록에서삭제
3)멸종위기야생생물을식품원료로사용할수없도록금지함으로써
야생생물보호
자.농산물중농약잔류허용기준개정[안별표3중(1)이미녹타딘,(5)
노르플루라존,(9)델타메트린,(11)멥틸디노캅,(12)디디티,(15)
디설포톤,(18)디캄바,(21)디클로르보스,(26)디페노코나졸,(28)
디펜아미드,(29)디플루벤주론,(37)메카밤,(46)메틸브로마이드,
(48)바미도티온,(50)베나락실,(52)벤디오카브,(55)뷰프로페진,
(58)비에치시,(61)비펜트린,(63)세톡시딤,(65)사이로마진,
(68)사이할로트린,(71)아미트라즈,(76)알드린및디엘드린,
(77)알디카브,(83)에티온,(85)에토펜프록스,(88)에트림포스,
(90)엔도설판,(91)엔드린,(101)이미다클로프리드,(106)이피엔,
(107)키노메티오네이트,(108)티오메톤,(110)카두사포스,(112)- 7 -카벤다짐,(113)카보페노티온,(114)카보퓨란,(116)카탑,(117)캡타폴,
(120)퀸토젠,(124)클로로벤질레이트,(125)클로로탈로닐,(129)
클로르펜빈포스,(130)클로르프로팜,(132)클로르피리포스-메틸,
(134)터부트린,(135)터부포스,(149)트리플루미졸,(164)펜발러
레이트,(173)포레이트,(176)포스멧,(180)플루실라졸,(181)
플루발리네이트,(182)플루시트리네이트,(184)프로메트린,
(185)프로사이미돈,(186)프로클로라즈,(188)프로파모카브,
(191)프로폭서,(192)프로피코나졸,(198)피페로닐부톡사이드,
(202)헵타클로르,(207)테부페노자이드,(220)디에토펜카브,
(222)메파니피림,(228)아족시스트로빈,(229)카프로파마이드,
(232)트리사이클라졸,(233)펜사이큐론,(234)펜피록시메이트,
(238)플루디옥소닐,(259)피리메타닐,(291)족사마이드,(294)
터부틸라진,(309)플루톨라닐,(325)사이아조파미드,(327)오리
사스트로빈,(362)트리아자메이트,(370)벤티아발리카브아이소프로필,
(371)디니코나졸,(373)스피로메시펜,(374)알라니카브,(375)오퓨
레이스,(376)트리플루뮤론,(377)티펜설퓨론메틸,(378)페림존,
(379)플루아크리피림,(380)피리달릴,(384)사이플루페나미드,
(386)플로니카미드,(390)시메코나졸,(391)만디프로파미드,
(393)메트알데하이드,(394)비스트리플루론,(395)플루오피콜라이드,
(396)에티클로제이트,(399)사이플루메토펜,(401)디비이디시,
(403)메타플루미존,(404)메트라페논,(405)사이에노피라펜,- 8 -(408)스피네토람,(409)아미설브롬,(410)옥솔린산,(415)크로마
페노자이드,(416)클로란트라닐리프롤,(417)플루벤디아마이드,
(419)프로헥사디온-칼슘,(420)린단]
1)「농약관리법」에신규등록또는수입농산물에농약잔류허용기
준설정신청에따른관련기준개정필요
2)이미녹타딘등농약110종의농약잔류허용기준개정
3)농산물에농약잔류허용기준을 합리적으로개정하여국민에게
안전한식품공급
3.의견제출
「식품의기준및규격」일부개정고시(안)에대하여의견이있는
단체또는개인은2017년10월10일까지다음사항을기재한의견서를
식품의약품안전처장 (우편번호:28159,주소:충청북도청주시흥덕구
오송읍오송생명2로187오송보건의료행정타운 식품의약품안전처 ,
참조:식품기준과,전화043-719-2417,팩스043-719-2400)에게제출하여
주시기바랍니다.
가.예고사항에대한항목별의견(찬․반여부와그이유)
나.성명(단체의경우단체명과그대표자의성명),주소및전화번호
다.기타참고사항- 9 -식품의약품안전처 고시제2017-00호
「식품위생법」제7조제1항에따른「식품의기준및규격」(식품의
약품안전처고시제2017-57호,2017.6.30.)을다음과같이개정고시합
니다.
2017년00월00일
식품의약품안전처장
식품의기준및규격일부개정고시(안)행정예고
식품의기준및규격일부를다음과같이개정한다.
제1.2의4)를삭제하고,5)～12)를각각4)～11)로한다.
제2.3.4)(2)바.를다음과같이한다.
바.식품접객업소등의식중독바이러스기준
식품접객업소,집단급식소,식품제조․가공업소등에서식재료및식기
등의세척,식품의조리및제조․가공,먹는물등으로사용하는물
에서는노로바이러스,A형·E형간염바이러스,로타바이러스,아스트로
바이러스,장관아데노바이러스 ,사포바이러스가검출되어서는아니
된다(단,수돗물및염소등으로소독한식품용수는제외한다).- 10 -제2.3.5)의‘(1)중금속기준’을‘(2)중금속기준’으로하고,(1)를다음
과같이신설한다.
5)오염물질
(1)오염물질의기준적용
①건조과정으로인하여수분함량이변화된건조농․임․
축․수산물의중금속,패독소,폴리염화비페닐(PCBs)기준
은수분함량의변화를고려하여생물기준으로환산
적용한
다.
②그대로섭취하지않는건조농․임․축․수산물의방사능기
준은수분함량의변화를고려하여생물기준으로환산
적용한
다.
③기준이별도로설정되어있지않은가공식품의중금속,곰팡이
독소,패독소등오염물질기준은원료의함량에따라해당
농․임․축․수산물의기준을적용하고,건조등의과정으로
인하여수분함량이변화된경우는수분함량을고려하여적용
한다.
④기준이설정되어있는가공식품중희석하여섭취하는식품
의중금속,방사능,다이옥신,폴리염화비페닐(PCBs)기준은
섭취시의상태(제조사가제시한섭취방법)를반영하여적용
한다.- 11 -제2.3.5)의(2)중금속기준①농산물중유지종실류,과일류,근채류
의납과카드뮴규격을다음과같이한다.
제2.3.5)의(2)중금속기준③수산물중어류,연체류,갑각류,해조
류의규격을다음과같이한다.
제2.3.5)(1)의⑥을삭제하고종전의‘(2)～(7)’을각각‘(3)～(8)’로대상식품 납(mg/ kg) 카드뮴 (mg/ kg)
견과
종실류유지
종실류0.3이하
(참깨 ,들깨에 한한다 )0.2이하
(참깨에 한한다 .)
과일류 0.1이하 0.05이하
근채류0.1이하
(인삼 ,산양삼은 2.0이하 ,
도라지 ,더덕은 0.2이하 )0.1이하
(양파는 0.05이하 ,인삼 ,
산양삼은 0.2이하 )
대상식품 납(mg/ kg) 카드뮴 (mg/ kg) 수은(mg/ kg) 메틸수은 (mg/ kg)
어류 0.5이하0.1이하
(민물 및 회유 
어류에 한한다 )
0.2이하
(해양어류에 한한다 )0.5이하
(심해성 어류,
다랑어류 및 
새치류는 제외한다 )1.0이하
(심해성 어류 ,
다랑어류 및 
새치류에 한한다 )
연체류2.0이하
(내장을 포함한 
낙지는 2.0이하 ,
오징어는 1.0
이하 )2.0이하
(다만 ,내장을 포함한 
낙지는 3.0이하 ,
오징어는 1.5이하 )0.5이하 -
갑각류0.5이하
(다만 ,내장을 
포함한 꽃게류는 
2.0이하 )1.0이하
(다만 ,내장을 포함한 
꽃게류
는 5.0이하 )- -
해조류0.5이하
(미역에 한한다 )0.3이하
[김(조미김 포함 )에 
한한다 ]
0.1이하
(미역에 한한다 )- -- 12 -한다.
제2.3.5)의(8)를(9)로하고③을삭제하며,제2.3.5)의(9)를(10)으
로한다.
제2.3.7)농약의잔류허용기준중(1)을다음과같이한다.
(1)농산물의농약잔류허용기준
①농산물의농약잔류허용기준은 [별표3]과같다.단,개별기준과
그룹기준이있을경우에는개별기준을우선적용한다.
②농산물에잔류한농약에대하여[별표3]에별도로잔류허용기준을
정하지않는경우0.01mg/kg이하를적용한다.
③「농약관리법」상사용․등록된농약및외국에서해당국가의
법률에따라합법적으로사용되는농약에함유된유효성분중
아래의사유에해당되는경우잔류허용기준을면제할수있으며,
면제대상성분은아래표와같다.
㉮독성이현저히낮아인체위해가능성이없는성분
㉯식품에전혀잔류되지않는성분
㉰자연계에존재하여해당식품에포함되어있으므로구분이어
려운성분
㉱안전성이확보된천연식물보호제(미생물등포함)성분
번호 유 효 성 분
1 1-메틸사이클로프로펜 (1-Methylcyclopropene)- 13 -번호 유 효 성 분
2기계유 (Machine oil)
3데실알코올 (Decylalcohol)
4모나크로스포륨타우마슘케이비시 3017( Monacrosporium thaumasium KBC3017)
5바실루스서브틸리스디비비 1501( Bacillus subtilis DBB1501)
6바실루스서브틸리스시제이 -9(Bacillus subtilis CJ-9)
7바실루스서브틸리스엠 27(Bacillus subtilis M27)
8바실루스서브틸리스엠비아이 600(Bacillus subtilis MBI600)
9바실루스서브틸리스와이 1336( Bacillus subtilis Y1336)
10바실루스서브틸리스이더블유 42-1( Bacillus subtilis EW42-1)
11바실루스서브틸리스제이케이케이 238(Bacillus subtilis JKK238)
12바실루스서브틸리스지비 365(Bacillus subtilis GB0365)
13바실루스서브틸리스케이비 401(Bacillus subtilis KB401)
14바실루스서브틸리스케이비시 1010( Bacillus subtilis KBC1010)
15바실루스서브틸리스큐에스티 713(Bacillus subtilis QST713)
16바실루스아밀로리퀴파시엔스케이비시 1121( Bacillus am yloliquefaciens KBC1121)
17바실루스푸밀루스큐에스티 2808( Bacillus pumilus QST2808)
18보르도혼합액 (Bordeaux mixture)
19뷰베리아바시아나지에이치에이 (Beauveria bassiana GHA)
20뷰베리아바시아나티비아이 -1(Beauveria bassiana TBI-1)
21비티아이자와이 (Bacillus thuringiensis subsp. aizawai)
22비티아이자와이엔티 423(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai NT0423)
23비티아이자와이지비 413(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai GB413)
24비티쿠르스타키 (Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki)
25비티쿠르스타키 (Bacillus thuringiensis var. kurstaki)
26석회황 (Calcium polysulfide, lime sulfur)
27스트렙토마이세스고시키엔시스더블유와이이 324(Streptom yces goshikiensis WYE324)
28스트렙토마이세스콜롬비엔시스더블유와이이 20(Streptomyces colom biensis WYE20)
29스프레더스티커 (Spreader sticker)
30폴리에틸렌메틸실록세인 (Polyethylene Methyl Siloxane)
31아이비에이 (IBA, 4-indol-3-ylbutyric acid)
32아이에이에이 (IAA, Indol-3-ylacetic acid)
33알킬설폰화알킬레이트의나트륨염 (Sodium salt ofalkylsulfonated alkylate)
34알킬아릴폴리에톡시레이트 (Alkyl aryl polyethoxylate)
35암펠로마이세스퀴스콸리스에이큐 94013( Ampelomyces quisqualis AQ94013)
36옥시에틸렌메틸실록세인 (Oxyethylene methyl siloxane)
37지베렐린류 (Gibberellin A3,Gibberellin A4+7)
38칼슘카보네이트 (Calcium carbonate)
39코퍼설페이트베이식 (Copper sulfate basic)
40코퍼설페이트트리베이식 (Copper sulfate tribasic)
41코퍼옥시클로라이드 (Copper oxychloride)
42코퍼하이드록사이드 (Copper hydroxide)
43트리코델마하지아늄와이씨 459(Trichoderma harzianum YC 459)- 14 -제2.3.7)(2)를삭제하고,(3)∼(4)를각각(2)∼(3)으로하며,(3)을
다음과같이한다.
(3)가공식품의잔류농약잠정기준적용
가공식품에잔류한농약에대하여[별표3]에별도로잔류허용기준을
정하지않은경우다음을적용한다.
①원료식품의잔류허용기준범위이내에서잔류를허용할수있다.
즉,원료의함량에따라원료농산물및축산물의기준을적용하고,
건조등의과정으로인하여수분함량이변화된경우는수분함량을
고려하여적용한다.[단,건고추(고춧가루및실고추포함)는고추의
7배,녹차추출물은차의6배,건삼및홍삼은수삼의4배,인삼
농축액및홍삼농축액은수삼의8배농약잔류허용기준을 적용한다]번호 유 효 성 분
44패니바실루스폴리믹사에이시 -1(Paenibacillus polymyxa AC-1)
45패실로마이세스퓨모소로세우스디비비 -2032( Paecilomyces fumosoroseus DBB-2032)
46폴리나프틸메탄설폰산디알킬디메틸암모니움염 (Polynaphthyl methane sulfonic aciddialkyl dimethyl amm onium (PM SAADA))
47폴리에테르폴리실록세인 (Polyether modified polysiloxane)
48폴리옥시에틸렌메틸폴리실록세인 (Polyoxyethylene methyl Polysiloxane)
49폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르 (Polyoxyethylene alkylarylether)
50폴리옥시에틸렌지방산에스테르 (Polyoxyethylene fatty acid ester(PFAE))
51황(Sulfur)
52니즈 (polynaphtyl methane sulfonic +polyoxyethylene fatty acid ester)
53소듐리그노설포네이트 (Sodium ligno sulfonate)
54심플리실리움라멜리콜라비씨피 (Simplicillium lamellicola BCP)
55트리코더마아트로비라이드에스케이티 -1(Trichoderma atroviride SKT-1)
56파라핀 ,파라핀오일 (Paraffin, Paraffinic oil)
57펠라르곤산 (Pelargonic acid)
58에틸포메이트 (Ethyl formate)- 15 -제2.3.7)중(5)∼(6)을각각(4)∼(5)로한다.
제2.3.9)의(1)의①중51과52를다음과같이신설한다.
제2.3.9)의(1)의④중7～11을각각다음과같이한다.
④기타의약품성분등
제2.3.16)의(1)중‘물치다래에’를‘물치다래,방어에’로한다.
제4.7.7-11)중‘미강유,참기름,추출참깨유,들기름,추출들깨유,홍
화유’를‘미강유,참기름,들기름,홍화유’로한다.
제4.7.7-1중3)의(4)와(6)을각각다음과같이한다.
(4)참기름과들기름에는다른식용유지를일절혼합하여서는아니
된다.번호 물질명
51이소프로필노르타다라필 (Isopropylnortadalafil)
52데스카본실데나필 (descarbonsildenafil)
번호 물질명
7페놀프탈레인(phenolphthaleine)
8요힘빈(yohimbine)
9이카린(icarine)
10센노사이드(sennoside)
11카스카로사이드(cascaroside)- 16 -(6)향미유제조시참깨,들깨또는이들로부터유래한유지를사
용하여서는아니된다(다만,식품첨가물제외).
제4.7.7-1중4)의(6)과(8)을삭제하고종전의(5)참기름과(7)들
기름을각각다음과같이한다.
(5)참기름
참깨로부터채취한원유를식용에적합하도록처리한것을말
한다.
(6)들기름
들깨로부터채취한원유를식용에적합하도록처리한것을말
한다.
제4.7.7-1중종전의(9)～(16)을각각(7)～(14)로하며종전의(17)
을다음과같이한다.
(15)기타식물성유지
단일식물성원료로부터채취한원료유지를식용에적합하도록
처리한것으로상기의(1)～(14)의식품유형에해당되지않는것을말
한다.
제4.7.7-15)중추출참깨유와추출들깨유의규격을삭제하고,참기
름과들기름의규격을다음과같이한다.- 17 -유형
항목참기름 들기름
(1)산가0.6이하
(압착유는 4.0이하 )0.6이하
(압착유는 5.0이하 )
(2)요오드가 103~118 160~209
(3)산화방지제
(g/kg)-다음에서 정하는 것 이외의 산화방지제가 검출되
어서는 아니 된다 .
부틸히드록시아니솔
디부틸히드록시톨루엔
터셔리부틸히드로퀴논0.2이하
(병용할 때에는 
부틸히드록시아니솔 ,
디부틸히드록시톨루엔 및 
터셔리부틸히드로퀴논 으로
서의 사용량의 합계가 
0.2이하 )
몰식자산프로필 0.1이하
(4)리놀렌산 (%)* 0.5이하 -
(5)에루스산 (%)검출되어서는 아니 된다 . -
*팔미트산(C16:0),스테아르산(C18:0),올레산(C18:1),리놀레산(C18:2),리놀렌
산(C18:3),아라키딘산(C20:0)중리놀렌산함량
제4.7.7-33)의(1)을다음과같이신설한다.
(1)참기름과들기름에는다른식용유지를일절혼합하여서는아니
된다.
제4.7.7-34)의(1)중‘압착한참기름,압착한들기름’을‘참기름,들
기름’으로한다.
제4.7.7-34)의(2)중‘압착참기름,초임계추출참기름,압착들기름,
초임계추출들기름은제외’를‘참기름,들기름은제외’로한다.- 18 -제4.7.7-34)의(8)중‘압착한참기름,압착한들기름은’을‘참기름,
들기름은’으로한다.
제5.2.1)(2)를다음과같이한다.
(2)원료및기구등의세척,식품의조리,먹는물등으로사용되는
물은「먹는물관리법」의수질기준에적합한것이어야하며,노로
바이러스,A형·E형간염바이러스,로타바이러스,아스트로바이러스,
장관아데노바이러스 ,사포바이러스가검출되어서는아니된다(단,
수돗물및염소등으로소독한식품용수는제외한다).
제7.4.26을다음과같이신설한다.
4.26식품용수등의A형간염바이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodiumthiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황산나트륨100g을녹여최종5,000
mL의용액을제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용수채수시검체의pH를조정하는데
사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccatedpowder)용액
1,900mL의증류수에Beefextract분말30g과glycine7.5g(최종- 19 -농도=0.05M)을넣고1MNaOH를이용하여pH9.5로조정한
후최종2L로제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주일간혹은-20℃에서장기간동안보관
할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7수화물(Sodiumphosphate,dibasic,
(Na2HPO47H2O))용액
950mL의증류수에Sodiumphosphate40.2g을넣고1MNaOH
를이용하여pH9.5로조정한후최종1L로제조하고121℃,15분
간고압증기멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의수산화나트륨을넣고최종500mL로
제조하여수산화나트륨용액을준비한다.수산화나트륨용액은상온
에서수개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500∼1,800L을채수하는장치- 20 -구성:용수유입구,단일주입기,유량조절밸브,압력게이지,탈리액
주입구,양전하카트리지필터(positivecartridgefilter),
카트리지하우징(cartridgehousing),탈리액유출구,유
량계,용수유출구
※양전하카트리지필터(positivecartridgefilter):1-MDS,
NanoCeram또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용수의수소이온농도를측정한다.
다)휴대용탁도측정기：식품용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：식품용수의잔류염소농도를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품용수채수후양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)를운반하기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카트리지필터(positivecartridgefilter)
운반시냉장상태유지용으로사용한다.
사)기타：공구상자,2L멸균비커,멸균된알루미늄박,클램프,바
이러스시료검체기록부,멸균장갑,수은온도계,멸균메스실린더,
채수용호스- 21 -
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지ⓔ탈
리액주입구ⓕ감압단추ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카트리지하
우징ⓘ탈리액유출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
 《표준필터장치》
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전하카트리지필터로유입시켜흡착된
바이러스를탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유입구,탈리액유출구,압력게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL용량)
다)0.22μm주사기필터(30mL용량)
다.시험방법- 22 -1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착용하여바이러스가오염되지않게주의
하고오염이될수있는환경요인들을피하여야한다.멸균된장갑이
사람의피부나오염가능성이있는장치,부품에접촉이되었을경우
장갑을바꿔착용한다(예:수도꼭지나다른환경요소표면).
가)채수하려는검체의배출구(수도꼭지등)를2～3분정도열고식품
용수를흘려보낸다.배출구에채수호스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여단단히연결하고탁도가균일할때까
지흘려보낸후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)나불꽃버너를이용하여배출구(수도
꼭지등)를살균또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을제거한후채수할배출구에연결
하고표준필터장치용수유입구(ⓐ)에호스를연결한다.이단계
에서양전하카트리지필터(ⓖ)는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력게이지가200kPa(30PSI)가넘지않
도록배출구를조절하고76L(20gal)의식품용수를흘려보낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후일부를2L멸균비커에받아용
수의탁도,pH,온도,염소농도를각각측정하여검체번호,채수
위치,채수자의이름과함께바이러스검체채수기록부에 기록한다.
pH측정기는사용전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를잠그고검체가다음의조건에해당- 23 -되어부가장치의연결이필요한지의여부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된튜브로단일주입기(ⓑ)와1M염산용
액이담긴메스실린더를연결하고,배출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～7.5가되도록단일주입기를통해1M
염산용액을흘려보낸다.용수유출구(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검체채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위와같이단일주입기를연결하여식품
용수3.8L(1gal)당2%티오황산나트륨용액10mL이주입되
도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당할경우이중주입기를연결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에검체채취일,시작시간,유량계의
초기수치를기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전하카트리지필터를탈리액주입구(ⓔ)
와유출구(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면서카트리지하우징상단의감압단추
(ⓕ,ventbutton)를눌러내부공기가완전히빠지도록한후,수도
꼭지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30PSI)이하로유지되도록유량조절밸
브를조정하고식품용수1,500～1,800L를통과시킨후,용수배
출구(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에검체채취종료일,종료시간,유량- 24 -계의최종수치등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리지하우징(ⓗ)을분리하고양전하카
트리지필터를거꾸로하여남은물을버린후하우징양끝의연
결된개구부를멸균된알루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아이스박스에담고얼음팩등을사용하여
냉장상태(냉동시켜서는아니된다)로유지하여즉시실험실로
운반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는채수시작시간부터24시간내에
실험실에서바이러스탈리시험을실시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간내에탈리시험이불가할경우최대72
시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지하우징을장착한후유량조절밸브를
모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량펌프호스를연결한후연동정량펌프와
1.5%Beefextract용액이채워져있는유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는1L,NanoCeram필터에는0.5L의
1.5%Beefextract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용호스를연결하여1.5%Beefextract용
액이들어있는유리병에넣고탈리액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여양전하카트리지필터하우징안으로- 25 -1.5%Beefextract용액이양전하카트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를통해1.5%Beefextract용액이넘쳐
흘러나오기시작하면감압단추에서손을떼고,연동정량펌프가
동을멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양전하카트리지필터안으로가득채워
질때까지눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동정량펌프를다시가동한후하우징에
채워져있는1.5%Beefextract용액이서서히필터를통과하도록
한다.통과한완충액은1.5%Beefextract용액이들어있던유리
병에수집한다.탈리액을회수할때는거품이없도록주의하여야
한다.
※연동정량펌프대신양압펌프와압력통을사용하여탈리과정을
진행할수도있다.
사)유리병에수집된탈리액은라)～바)의과정을2회반복한다.
아)최종탈리액은1M염산용액으로pH를7.0～7.5사이로조절하고
멸균된메스실린더를사용하여부피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농축시험이가능할경우4℃에서보관
하며,농축시험을즉시시행하기어려울때에는-70℃에서보관
한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서혼합하면서1M염산용액으로pH를- 26 -3.5±0.1로조절한후,실온에서30분간천천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을멸균한원심분리용기에옮겨원심분리
한다(2,500G15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거하고남은침전물에0.15Msodium
phosphate완충액(pH9.0～9.5)을20～30mL넣어완전히부유
시킨후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용액으로pH7.0～7.5로조절한다.
바)미생물오염을방지하기위해30mL주사기를이용하여상등액을
0.22μm주사기필터로여과한다.검체중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기위하여사전에0.22μm주사기필터에
10～20mL의1.5%Beefextract용액(pH7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV,finalconcentratedsamplevolume)을
기록하고검체를24시간이내에분석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는바이러스유전자추출을위한검체로
사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제시
하는적절한실험법에따라실시한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini- 27 -Kits또는동등이상의제품이사용이가능하며,또한자동유전자
추출장치를사용할경우에도바이러스RNA추출키트를사용하여
바이러스유전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시검체와동일한과정으로음성대조군
(negativecontrol)을사용하여유전자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를확인하기위해2개의RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군각280μL에AVL완충액(guanidine
thiocyanate함유)1,120 μL를각각혼합하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분리기를이용하여원심분리(spin-down)
한다.
다)여기에95～100%에탄올1,120 μL을넣어혼합한후가볍게원심
분리(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심(Minispin)컬럼으로옮겨6,000G에서
1분간원심분리하고컬럼을새로운회수용(collection)튜브로옮긴
다음남은혼합액을630μL씩동일한방법으로컬럼에첨가하여
원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을새로운회수용(collection)튜브로
옮겨AW1완충액(guanidinehydrochloride함유)500μL을넣고
6,000G로1분간원심분리후컬럼을새로운회수용(collection)
튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고20,000G로3분간원심분리한후컬- 28 -럼을새로운1.5mL회수용(collection)튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide함유)60μL를넣고6,000G로1분간
원심분리하여다음의RT-PCR(Reversetranscription-Polymerase
chainreaction)을수행하기위한주형(template)으로사용한다.
5)A형간염바이러스유전자PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reversetranscription-PCR)과정에서는A형간염바이러스
를인위적으로조합하여합성한RNA등을PCR양성대조군으로사
용할수있다.
가)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)방법은아래와
같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과같이Mastermix(2X)25μL,Reverse
transcriptase(50unit/μL)1μL,프라이머(HAV1,HAV2)는각
2μL,추출RNA5μL를첨가하여증류수로총50μL로맞추
고반응시킨다.
(2)PCR반응조건은표2와같이48℃에서40분,95℃에서4분
DNA를변성시키고,95℃30초,55℃30초,72℃30초를1회로
하여30회반응시킨후,72℃에서7분간연장반응시킨다.상기
반응종료후PCR생성물에대하여NestedPCR을실시한다.- 29 -Component Volume Primers
Mastermix(2X) 25μL -
Reverse transcriptase (50unit/ μL) 1μL -
D.W. 15μL -
Forward primer(20pmol) 2μL HAV1
Reverse primer(20pmol) 2μL HAV2
Extracted RNA, PCR control 5μL -
Total 50μL -표1.A형간염바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응액조성
온도 시간 Cycle
cDNA합성 (cDNA
synthesis)
초기 변성 (predenaturation)48℃
95℃40min
4min1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)95℃
55℃
72℃30sec
30sec
30sec30cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 7min 1cycle
보관 4℃∞ ∞표2.A형간염바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응조건및온도
나)NestedPCR방법은아래와같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)산물을주형으로
하여표3과같이NestedPCR을실시한다.1차PCR산물5μL,
10x완충액(MgCl2포함)5μL,dNTPs(10mM)4μL,TaqDNA
polymerase(5unit/μL)1μL,프라이머(HAV3,HAV4)는각2μ
L첨가한다음최종증류수로총50μL로맞춘후NestedPCR- 30 -을실시한다.
(2)PCR반응조건은표4와같이95℃에서4분간DNA를변성시키고
95℃30초,55℃30초,72℃30초를1회로하여30회를반응시킨
후72℃에서7분간연장반응시킨다.
Component Volume Primers
dNTPs(10mM) 4μL -
10x Buffer(with MgCl 2) 5μL -
D.W. 31μL -
Forward primer(20 pmol) 2μL HAV3
Reverse primer(20 pmol) 2μL HAV4
TaqDNA polymerase(5 unit/μL) 1μL -
1stPCR Product 5μL -
Total 50μL표3.A형간염바이러스NestedPCR반응액조성
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)95℃ 4min 1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)9 5℃
55℃
72℃30sec
30sec
30sec30cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 7min 1cycle
보관 4℃ ∞∞표4.A형간염바이러스NestedPCR반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR증폭반응액5μL를전기영동완충액
(gelloadingbuffer)1μL와혼합한다음젤(gel)의각홈에검
체를조심스럽게넣고나머지한홈에PCR증폭산물의크기를- 31 -식별하기에적당한표식DNA(markerDNA)7μL를넣는다.
1.5%아가로스젤(agarosegel)상에서100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)염색액(10mg/mL)으로30분간염색한
후증류수로10분간탈색하고자외선조사기(UVtransilluminator)로
조사하여증폭된DNA밴드를관찰한다.
(4)A형간염바이러스유전자증폭에사용하는프라이머는표5와
같다.
Primer Sequence(5'→3') Application PCR Size(bp)
HAV1GCT CCT CTT TAT CAT GCT ATG
GAT One-step
RT-PCR244
HAV2CAG GAA ATG TCT CAG GTA CTT
TCT
HAV3ATG TTA CTA CAC AAG TTG GAG
AT Nested PCR/
Sequencing186
HAV4 GAT CCT CAA TTG TTG TGA TAG CT표5.A형간염바이러스PCR프라이머염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)상에서시료에PCR증폭산물이186
bp(또는244)의밴드가있을경우A형간염바이러스로일차확
인한다.
(2)만일음성대조군(negativecontrol)에서PCR밴드가확인이될경
우등은재시험을실시해야한다(표6참고).
(3)A형간염바이러스가일차확인된경우최종확인을위하여아- 32 -가로스젤(agarosegel)상에서해당부위를절취하여PCR산물을
정제한후염기서열(DNAsequencing)을분석하여최종판정한다.
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표6.A형간염바이러스PCR결과판정(예시)
+:A형간염바이러스PCR밴드확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을위하여다)의(3)에서정제된
DNA1μL를주형으로HAV3과HAV4프라이머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)반응을위한혼합조건은각유전자형
Nested프라이머(primer,1pmol)를독립된각각의튜브에2μL,
dye-terminator2μL,정제DNA2μL를첨가하여증류수로최
종10μL가되도록하고96℃에서1분간DNA를변성시킨후,9
6℃에서10초간,50℃에서5초간,60℃에서4분간을1회로하여
25회반응시킨다음60℃에서10분간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석(DNAsequencing)하되2종이상의- 33 -유전자가혼합되어있는경우에는클로닝염기서열분석
(CloningDNAsequencing)을재실시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의해결정된염기서열은A형간염바이러
스유전자데이터베이스(Referecnesequence및NCBIblast)와
비교하여A형간염바이러스로확인되었을경우검출된것으로
최종확인한다.
제7.4.27을다음과같이신설한다.
4.27식품용수등의E형간염바이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodiumthiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황산나트륨100g을녹여최종5,000
mL의용액을제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용수채수시검체의pH를조정하는데
사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccatedpowder)용액
1,900mL의증류수에Beefextract분말30g과glycine7.5g(최종
농도=0.05M)을넣고1MNaOH를이용하여pH9.5로조정한후
최종2L로제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주일간혹은-20℃에서장기간동안보- 34 -관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7수화물(Sodiumphosphate,dibasic,
(Na2HPO47H2O))용액
950mL의증류수에Sodiumphosphate40.2g을넣고1MNaOH
를이용하여pH9.5로조정한후최종1L로제조하고121℃,15분
간고압증기멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의수산화나트륨을넣고최종500mL로
제조하여수산화나트륨용액을준비한다.수산화나트륨용액은상온
에서수개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주입기,유량조절밸브,압력게이지,탈
리액주입구,양전하카트리지필터(positivecartridge
filter),카트리지하우징(cartridgehousing),탈리액유출구,- 35 -유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터(positivecartridgefilter):1-MDS,
NanoCeram또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용수의수소이온농도를측정한다.
다)휴대용탁도측정기：식품용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：식품용수의잔류염소농도를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품용수채수후양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)를운반하기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카트리지필터(positivecartridgefilter)
운반시냉장상태유지용으로사용한다.
사)기타：공구상자,2L멸균비커,멸균된알루미늄박,클램프,바
이러스시료검체기록부,멸균장갑,수은온도계,멸균메스실린더,
채수용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지ⓔ
탈리액주입구ⓕ감압단추ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카트리지- 36 -하우징ⓘ탈리액유출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
 《표준필터장치》
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전하카트리지필터로유입시켜흡착된
바이러스를탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유입구,탈리액유출구,압력게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL용량)
다)0.22μm주사기필터(30mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착용하여바이러스가오염되지않게
주의하고오염이될수있는환경요인들을피하여야한다.멸균된
장갑이사람의피부나오염가능성이있는장치,부품에접촉이되
었을경우장갑을바꿔착용한다(예:수도꼭지나다른환경요소표면).
가)채수하려는검체의배출구(수도꼭지등)를2～3분정도열고식품
용수를흘려보낸다.배출구에채수호스를장착시누수가되지- 37 -않도록클램프를이용하여단단히연결하고탁도가균일할때
까지흘려보낸후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)나불꽃버너를이용하여배출구(수
도꼭지등)를살균또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을제거한후채수할배출구에연결
하고표준필터장치용수유입구(ⓐ)에호스를연결한다.이단계
에서양전하카트리지필터(ⓖ)는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력게이지가200kPa(30PSI)가넘지
않도록배출구를조절하고76L(20gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후일부를2L멸균비커에받아용
수의탁도,pH,온도,염소농도를각각측정하여검체번호,채수
위치,채수자의이름과함께바이러스검체채수기록부에 기록
한다.pH측정기는사용전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를잠그고검체가다음의조건에해당
되어부가장치의연결이필요한지의여부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된튜브로단일주입기(ⓑ)와1M염산
용액이담긴메스실린더를연결하고,배출구(수도꼭지등)를
다시열어용수의pH가6.5～7.5가되도록단일주입기를통해
1M염산용액을흘려보낸다.용수유출구(ⓚ)로흘러나온용
수의pH를측정해바이러스검체채수기록부에기록한다.- 38 -(2)잔류염소제거를위해위와같이단일주입기를연결하여식품
용수3.8L(1gal)당2%티오황산나트륨용액10mL이주입
되도록한다.
*(1)과(2)번이모두해당할경우이중주입기를연결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에검체채취일,시작시간,유량계의
초기수치를기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전하카트리지필터를탈리액주입구
(ⓔ)와유출구(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면서카트리지하우징상단의감압단추
(ⓕ,ventbutton)를눌러내부공기가완전히빠지도록한후,
수도꼭지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30PSI)이하로유지되도록유량조절밸
브를조정하고식품용수1,500～1,800L를통과시킨후,용수배
출구(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에검체채취종료일,종료시간,유량
계의최종수치등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리지하우징(ⓗ)을분리하고양전하
카트리지필터를거꾸로하여남은물을버린후하우징양끝의
연결된개구부를멸균된알루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아이스박스에담고얼음팩등을사용
하여냉장상태(냉동시켜서는아니된다)로유지하여즉시실험- 39 -실로운반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는채수시작시간부터24시간내에
실험실에서바이러스탈리시험을실시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간내에탈리시험이불가할경우최대
72시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지하우징을장착한후유량조절밸브를
모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량펌프호스를연결한후연동정량펌프와
1.5%Beefextract용액이채워져있는유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는1L,NanoCeram필터에는0.5L의
1.5%Beefextract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용호스를연결하여1.5%Beefextract용
액이들어있는유리병에넣고탈리액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여양전하카트리지필터하우징안으로
1.5%Beefextract용액이양전하카트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를통해1.5%Beefextract용액이넘쳐
흘러나오기시작하면감압단추에서손을떼고,연동정량펌프
가동을멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양전하카트리지필터안으로가득채워질
때까지눌러준다.- 40 -바)탈리액유출구를열고연동정량펌프를다시가동한후하우징에
채워져있는1.5%Beefextract용액이서서히필터를통과하
도록한다.통과한완충액은1.5%Beefextract용액이들어있던
유리병에수집한다.탈리액을회수할때는거품이없도록주의
하여야한다.
※연동정량펌프대신양압펌프와압력통을사용하여탈리과정을
진행할수도있다.
사)유리병에수집된탈리액은라)～바)의과정을2회반복한다.
아)최종탈리액은1M염산용액으로pH를7.0～7.5사이로조절
하고멸균된메스실린더를사용하여부피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농축시험이가능할경우4℃에서보관
하며,농축시험을즉시시행하기어려울때에는-70℃에서보
관한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서혼합하면서1M염산용액으로pH를
3.5±0.1로조절한후,실온에서30분간천천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을멸균한원심분리용기에옮겨원심분리
한다(2,500G15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거하고남은침전물에0.15Msodium
phosphate완충액(pH9.0～9.5)을20～30mL넣어완전히부
유시킨후실온에10분간방치한다.- 41 -라)부유시킨용액을원심분리한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용액으로pH7.0～7.5로조절한다.
바)미생물오염을방지하기위해30mL주사기를이용하여상등액을
0.22μm주사기필터로여과한다.검체중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기위하여사전에0.22μm주사기필터에
10～20mL의1.5%Beefextract용액(pH7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=finalconcentratedsamplevolume)을
기록하고검체를24시간이내에분석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는바이러스유전자추출을위한검
체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제시
하는적절한실험법에따라실시한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품이사용이가능하며,또한자동유전자
추출장치를사용할경우에도바이러스RNA추출키트를사용
하여바이러스유전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시검체와동일한과정으로음성대조군
(negativecontrol)을사용하여유전자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를확인하기위해2개의RNA를추출한다.- 42 -나)검체농축액과음성대조군각280μL에AVL완충액(guanidine
thiocyanate함유)1,120 μL를각각혼합하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올1,120 μL을넣어혼합한후가볍게원심
분리(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심(Minispin)컬럼으로옮겨6,000G
에서1분간원심분리하고컬럼을새로운회수용(collection)튜
브로옮긴다음남은혼합액을630μL씩동일한방법으로컬럼에
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을새로운회수용(collection)튜브로
옮겨AW1완충액(guanidinehydrochloride함유)500μL을넣고
6,000G로1분간원심분리후컬럼을새로운회수용(collection)
튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고20,000G로3분간원심분리한후
컬럼을새로운1.5mL회수용(collection)튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide함유)60μL를넣고6,000G로1분간
원심분리하여다음의RT-PCR(Reversetranscription-Polymerase
chainreaction)을수행하기위한주형(template)으로사용한다.
5)E형간염바이러스유전자PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reversetranscription-PCR)과정에서는E형간염바이러- 43 -스를인위적으로조합하여합성한RNA등을PCR양성대조군으로
사용할수있다.
가)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)방법은아래와
같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과같이Mastermix(2X)25μL,Reverse
transcriptase(50unit/μL)1μL,프라이머(3156N,3157N)는
각1μL,추출RNA5μL를첨가하여증류수로총50μL로
맞추고반응시킨다.
(2)PCR반응조건은표2와같이50℃에서15분,95℃에서2분
DNA를변성시키고,95℃20초,52℃30초,72℃1분을1회로
하여35회반응시킨후,72℃에서5분간연장반응시킨다.상
기반응종료후PCR생성물에대하여NestedPCR을실시
한다.
Component Volume Primer
Mastermix(2X) 25μL -
Reverse transcriptase (50unit/ μL) 1μL -
D.W. 17μL -
Forward primer(20pmol) 1μL 3156N
Reverse primer(20pmol) 1μL 3157N
Extracted RNA, PCR control 5μL -
Total 50μL -표1.E형간염바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응액조성- 44 -온도 시간 Cycle
cDNA합성 (cDNA synthesis)
초기 변성 (predenaturation)50℃
95℃15min
2min1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)95℃
52℃
72℃20sec
30sec
1min35cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 5min 1cycle
보관 4℃∞∞표2.E형간염바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응조건및온도
나)NestedPCR방법은아래와같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)산물을주형
으로하여표3과같이NestedPCR을실시한다.1차PCR산물
2μL,10x완충액(MgCl2포함)2μL,dNTPs(10mM)2μL,
TaqDNApolymerase(1unit/μL)1μL,프라이머(3158N,
3159N)는각1μL첨가한다음최종증류수로총20μL로맞춘
후NestedPCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표4와같이94℃에서5분간DNA를변성시키
고94℃30초,52℃30초,72℃30초를1회로하여35회를반응
시킨후72℃에서10분간연장반응시킨다.- 45 -Component Volume Primer
dNTPs(10mM) 2μL -
10x Buffer(with MgCl 2) 2μL -
D.W. 11μL -
Forward primer(10 pmol) 1μL 3158N
Reverse primer(10 pmol) 1μL 3159N
Taq DNA polymerase(1 unit/μL) 1μL -
1stPCR Product 2μL -
Total 20μL표3.E형간염바이러스NestedPCR반응액조성
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)94℃ 5min 1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)9 4℃
52℃
72℃30sec
30sec
30sec35cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 10min 1cycle
보관 4℃ ∞∞표4.E형간염바이러스NestedPCR반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR증폭반응액5μL를전기영동완충액
(gelloadingbuffer)1μL와혼합한다음젤(gel)의각홈에
검체를조심스럽게넣고나머지한홈에PCR증폭산물의크
기를식별하기에적당한표식DNA(markerDNA)7μL를넣
는다.1.5%아가로스젤(agarosegel)상에서100V로전기영동
한후EthidiumBromide(EtBr)염색액(10mg/mL)으로30분간
염색한후증류수로10분간탈색하고자외선조사기(UV- 46 -transilluminator)로조사하여증폭된DNA밴드를관찰한다.
(4)E형간염바이러스유전자증폭에사용하는프라이머는표5와
같다.
Primer Sequence(5'→3') ApplicationPCR
Size(bp)
3156N AAT TAT GCC CAG TAC CGG GTT GOne-step
RT-PCR7313157N CCC TTA TCC TGC TGA GCA TTC TC
3158N GTT ATG CTT TGC ATA CAT GGC TNested PCR/
Sequencing348
3159N AGC CGA CGA AAT CAA TTC TGT C표5.E형간염바이러스One-stepRT-PCR프라이머염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)상에서시료에증폭산물이348bp
경우E형간염바이러스로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negativecontrol)에서PCR밴드가확이될
경우등은재시험을실시해야한다(표6참고).
(3)E형간염바이러스가 일차확인된경우최종확인을위하여
아가로스젤(agarosegel)상에서해당부위를절취하여PCR
산물을정제한후염기서열(DNAsequencing)을분석하여최종
판정한다.- 47 -추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표6.E형간염바이러스PCR결과판정(예시)
+:E형간염바이러스PCR밴드확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을위하여다)의(3)에서정제된
DNA1μL를주형으로3158N과3159N프라이머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)반응을위한혼합조건은각유전
자형Nested프라이머(primer,1pmol)를독립된각각의튜브
에2μL,dye-terminator2μL,정제DNA2μL를첨가하여
증류수로최종10μL가되도록하고96℃에서1분간DNA를
변성시킨후,96℃에서10초간,50℃에서5초간,60℃에서4분
간을1회로하여25회반응시킨다음60℃에서10분간연장반
응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석(DNAsequencing)하되2종이상의
유전자가혼합되어있는경우에는클로닝염기서열분석
(CloningDNAsequencing)을재실시한다.염기서열분석- 48 -(DNAsequencing)에의해결정된염기서열은E형간염바이
러스유전자데이터베이스(Referecnesequence및NCBIblast)와
비교하여E형간염바이러스로확인되었을경우검출된것으로
최종확인한다.
제7.4.28을다음과같이신설한다.
4.28식품용수등의로타바이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodiumthiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황산나트륨100g을녹여최종5,000
mL의용액을제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용수채수시검체의pH를조정하는데
사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccatedpowder)용액
1,900mL의증류수에Beefextract분말30g과glycine7.5g(최종
농도=0.05M)을넣고1MNaOH를이용하여pH9.5로조정한후
최종2L로제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주일간혹은-20℃에서장기간동안보
관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7수화물(Sodiumphosphate,dibasic,- 49 -(Na2HPO47H2O))용액
950mL의증류수에Sodiumphosphate40.2g을넣고1MNaOH
를이용하여pH9.5로조정한후최종1L로제조하고121℃,15분
간고압증기멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의수산화나트륨을넣고최종500mL로
제조하여수산화나트륨용액을준비한다.수산화나트륨용액은상온
에서수개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치:식품용수1,500∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주입기,유량조절밸브,압력게이지,탈
리액주입구,양전하카트리지필터(positivecartridge
filter),카트리지하우징(cartridgehousing),탈리액유
출구,유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터(positivecartridgefilter):1-MDS,- 50 -NanoCeram또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용수의수소이온농도를측정한다.
다)휴대용탁도측정기：식품용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：식품용수의잔류염소농도를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품용수채수후양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)를운반하기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카트리지필터(positivecartridgefilter)
운반시냉장상태유지용으로사용한다.
사)기타：공구상자,2L멸균비커,멸균된알루미늄박,클램프,바
이러스시료검체기록부,멸균장갑,수은온도계,멸균메스실린더,
채수용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지ⓔ
탈리액주입구ⓕ감압단추ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카트리지
하우징ⓘ탈리액유출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
 《표준필터장치》- 51 -
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전하카트리지필터로유입시켜흡착된
바이러스를탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유입구,탈리액유출구,압력게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL용량)
다)0.22μm주사기필터(30mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착용하여바이러스가오염되지않게
주의하고오염이될수있는환경요인들을피하여야한다.멸균된
장갑이사람의피부나오염가능성이있는장치,부품에접촉이되
었을경우장갑을바꿔착용한다(예：수도꼭지나다른환경요소
표면).
가)채수하려는검체의배출구(수도꼭지등)를2～3분정도열고식품
용수를흘려보낸다.배출구에채수호스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여단단히연결하고탁도가균일할때- 52 -까지흘려보낸후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)나불꽃버너를이용하여배출구(수
도꼭지등)를살균또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을제거한후채수할배출구에연결
하고표준필터장치용수유입구(ⓐ)에호스를연결한다.이단
계에서양전하카트리지필터(ⓖ)는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력게이지가200kPa(30PSI)가넘지
않도록배출구를조절하고76L(20gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후일부를2L멸균비커에받아용
수의탁도,pH,온도,염소농도를각각측정하여검체번호,채수
위치,채수자의이름과함께바이러스검체채수기록부에 기록
한다.pH측정기는사용전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를잠그고검체가다음의조건에해당
되어부가장치의연결이필요한지의여부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된튜브로단일주입기(ⓑ)와1M염산
용액이담긴메스실린더를연결하고,배출구(수도꼭지등)를
다시열어용수의pH가6.5～7.5가되도록단일주입기를통해
1M염산용액을흘려보낸다.용수유출구(ⓚ)로흘러나온용
수의pH를측정해바이러스검체채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위와같이단일주입기를연결하여식품- 53 -용수3.8L(1gal)당2%티오황산나트륨용액10mL이주입
되도록한다.
*(1)과(2)번이모두해당할경우이중주입기를연결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에검체채취일,시작시간,유량계의
초기수치를기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전하카트리지필터를탈리액주입구
(ⓔ)와유출구(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면서카트리지하우징상단의감압단추
(ⓕ,ventbutton)를눌러내부공기가완전히빠지도록한후,수
도꼭지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30PSI)이하로유지되도록유량조절밸
브를조정하고식품용수1,500～1,800L를통과시킨후,용수배
출구(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에검체채취종료일,종료시간,유량
계의최종수치등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리지하우징(ⓗ)을분리하고양전하
카트리지필터를거꾸로하여남은물을버린후하우징양끝의
연결된개구부를멸균된알루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아이스박스에담고얼음팩등을사용
하여냉장상태(냉동시켜서는아니된다)로유지하여즉시실험
실로운반한다.- 54 -2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는채수시작시간부터24시간내에
실험실에서바이러스탈리시험을실시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간내에탈리시험이불가할경우최대
72시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지하우징을장착한후유량조절밸브를
모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량펌프호스를연결한후연동정량펌프와
1.5%Beefextract용액이채워져있는유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는1L,NanoCeram필터에는0.5L의
1.5%Beefextract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용호스를연결하여1.5%Beefextract용
액이들어있는유리병에넣고탈리액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여양전하카트리지필터하우징안으로
1.5%Beefextract용액이양전하카트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를통해1.5%Beefextract용액이넘쳐
흘러나오기시작하면감압단추에서손을떼고,연동정량펌프
가동을멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양전하카트리지필터안으로가득채워
질때까지눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동정량펌프를다시가동한후하우징에- 55 -채워져있는1.5%Beefextract용액이서서히필터를통과하도록
한다.통과한완충액은1.5%Beefextract용액이들어있던유
리병에수집한다.탈리액을회수할때는거품이없도록주의하
여야한다.
※연동정량펌프대신양압펌프와압력통을사용하여탈리과정을
진행할수도있다.
사)유리병에수집된탈리액은라)～바)의과정을2회반복한다.
아)최종탈리액은1M염산용액으로pH를7.0～7.5사이로조절
하고멸균된메스실린더를사용하여부피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농축시험이가능할경우4℃에서보관
하며,농축시험을즉시시행하기어려울때에는-70℃에서보관
한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서혼합하면서1M염산용액으로pH를
3.5±0.1로조절한후,실온에서30분간천천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을멸균한원심분리용기에옮겨원심분리
한다(2,500G15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거하고남은침전물에0.15Msodium
phosphate완충액(pH9.0～9.5)을20～30mL넣어완전히부
유시킨후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리한다(7,000G,10분,4℃).- 56 -마)상등액을취해1M염산용액으로pH7.0～7.5로조절한다.
바)미생물오염을방지하기위해30mL주사기를이용하여상등액을
0.22μm주사기필터로여과한다.검체중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기위하여사전에0.22μm주사기필터에
10～20mL의1.5%Beefextract용액(pH7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=finalconcentratedsamplevolume)을
기록하고검체를24시간이내에분석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는바이러스유전자추출을위한검
체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제시
하는적절한실험법에따라실시한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품이사용이가능하며,또한자동유전자
추출장치를사용할경우에도바이러스RNA추출키트를사용
하여바이러스유전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시검체와동일한과정으로음성대조군
(negativecontrol)을사용하여유전자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를확인하기위해2개의RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군각280μL에AVL완충액(guanidine- 57 -thiocyanate함유)1,120 μL를각각혼합하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올1,120 μL을넣어혼합한후가볍게원심
분리(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심(Minispin)컬럼으로옮겨6,000G
에서1분간원심분리하고컬럼을새로운회수용(collection)튜
브로옮긴다음남은혼합액을630μL씩동일한방법으로컬럼에
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을새로운회수용(collection)튜브로
옮겨AW1완충액(guanidinehydrochloride함유)500μL을넣고
6,000G로1분간원심분리후컬럼을새로운회수용(collection)
튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고20,000G로3분간원심분리한후
컬럼을새로운1.5mL회수용(collection)튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide함유)60μL를넣고6,000G로1분간
원심분리하여다음의RT-PCR(Reversetranscription-Polymerase
chainreaction)을수행하기위한주형(template)으로사용한다.
5)로타바이러스유전자PCR과정및결과판정
로타바이러스 PCR을위한RNA는95℃,5분동안
Pre-denaturation한후4℃에서5분간방치하고사용한다.- 58 -RT-PCR(Reversetranscription-PCR)과정에서는로타바이러스를
인위적으로조합하여합성한RNA등을PCR양성대조군으로사용
할수있다.로타바이러스PCR은VP4와VP7유전자두부위를개
별적으로각각증폭한다.
가)VP4와VP7유전자One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)방법은아래와같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과같이One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)Mastermix13.5 μL,프라이머(VP4:
VP4F-M(20pmol),Con2(20pmol),VP7:Beg-9(20pmol),
End-9(20pmol))은각1μL,추출RNA5μL를첨가하여증
류수로총25μL로맞추고반응시킨다.
(2)VP4PCR반응조건은표2와같이42℃에서40분cDNA를합
성하고,95℃15분동안초기변성후,94℃1분,50℃1분,7
2℃1분을1회로하여35회반응시킨후,72℃에서7분간연
장반응시킨다.VP7PCR반응조건은표3과같이42℃에서
30분cDNA를합성하고,95℃15분동안초기변성후,94℃30
초,42℃30초,72℃1분를1회로하여35회반응시킨후,72℃
에서7분간연장반응시킨다.- 59 -Component VolumePrimers
VP4VP7
2XOne-stepRT-PCRMastermix13.5μL-
D.W. 4.5μL-
Forwardprimer(20pmol) 1μLVP4F-MBeg-9
Reverseprimer(20pmol) 1μLCon2End-9
ExtractedRNA 5μL-
Total 25μL-표1.로타바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응액조성(VP4,VP7개별)
온도 시간 Cycle
cDNA합성(cDNAsynthesis)42℃ 40min1cycle
초기변성(predenaturation)95℃ 15min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
50℃
72℃1min
1min
1min35cycles
최종신장(post-elongation)72℃ 7min1cycle
보관 4℃ ∞ ∞표 2.로타바이러스 VP4부분 O ne-step RT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응조건 및 온도
표3.로타바이러스VP7부분One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응조건및온도
온도 시간 Cycle
cDNA합성(cDNAsynthesis)42℃ 30min1cycle
초기변성(predenaturation)95℃ 15min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
42℃
72℃30sec
30sec
1min35cycles
최종신장(post-elongation)72℃ 7min1cycle
보관 4℃ ∞ ∞- 60 -(3)로타바이러스VP4,VP7One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)에사용하는프라이머는표4와같다.
표4.로타바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
프라이머염기서열
Target Primer Sequence(5' →3') 
VP4VP4F-M TGG CTT CGC TCA TTT ATA GAC A
Con2 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
VP7Beg-9 ATG TAT GGT ATT GAA TAT ACC AC
End-9 AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC
나)VP4,VP7One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)산
물을주형으로하여MultiplexPCR을각각실시한다.
(1)VP4PCR조성조건은표5와같이1차PCR산물2μL,PCR
Premix10μL,프라이머VP4F-M1μL(20pmol),1T-11μ
L(20pmol),2T-11μL(20pmol),3T-11μL(20pmol),4T-1
2μL(20pmol),5T-11μL(20pmol),P[11]1μL(20pmol)
증류수로총25μL로맞춘후MultiplexPCR을실시한다.
PCR반응조건은표6과같이95℃에서5분간DNA를변성시
키고94℃30초,42℃30초,72℃30초를1회로하여25회를
반응시킨후72℃에서7분간연장반응시킨다.
(2)VP7PCR조성조건은표7과같이1차PCR산물2μL,PCR
Premix10μL,프라이머End-91μL(20pmol),aBT11μ
L(20pmol),aCT21μL(20pmol),aET31μL(20pmol),- 61 -aDT41μL(20pmol),aAT81μL(20pmol),aFT91μL(20
pmol),G101μL(20pmol)증류수로총25μL로맞춘후
MultiplexPCR을실시한다.PCR반응조건은표8과같이9
4℃에서2분간DNA를변성시키고94℃1분,48℃2분,68℃1
분을1회로하여30회를반응시킨후68℃에서7분간연장반
응시킨다.
Component VolumePrimerGenotype
PCRPremix 10μL--
D.W. 6μL--
Forwardprimer(20pmol)각1μL1T-1
2T-1
3T-1
4T-1
5T-1
P[11]P1A[8]
P1B[4]
P2A[6]
P3[9]
P4[10]
P[11]
Reverseprimer(20pmol)1μLVP4F-M-
1stPCRProduct 2μL--
Total 25μL--표 5.로타바이러스VP4Multiplex PCR반응액조성
표6.로타바이러스VP4MultiplexPCR반응조건및온도
온도시간Cycle
초기변성(predenaturation)95℃5min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
42℃
72℃30sec
30sec
30sec25cycles
최종신장(post-elongation)72℃7min1cycle
보관 4℃∞∞- 62 -Component VolumePrimerGenotype
PCRPremix 10μL--
D.W. 5μL--
Forwardprimer(20pmol)각1μLaBT1
aCT2
aET3
aDT4
aAT8
aFT9
G10G1
G2
G4
G4
G8
G9
G10
Reverseprimer(10pmol)1μLEnd-9(R)-
1stPCRProduct 2μL--
Total 25μL--표 7.로타바이러스VP7Multiplex PCR반응액조성
표8.로타바이러스VP7MultiplexPCR반응조건및온도
온도시간 Cycle
초기변성(predenaturation)94℃2min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
48℃
68℃1min
2min
1min30cycles
최종신장(post-elongation)68℃7min1cycle
보관 4℃ ∞ ∞
(3)로타바이러스VP4,VP7MultiplexPCR에사용하는프라이머는
표9와같다.
표9.로타바이러스VP4,VP7MultiplexPCR프라이머염기서열- 63 -Target Primer Sequence(5' →3') 
VP4VP4F-M(F)TGGCTTCGCTCATTTATAGACA
1T-1(R)TCTACTGGRTTRACNTGC
2T-1(R)CTATTGTTAGAGGTTAGAGTC
3T-1(R)TGTTGATTAGTTGGATTCAA
4T-1(R)TGAGACATGCAATTGGAC
5T-1(R)ATCATAGTTAGTAGTCGG
P[11](R)GTAAACATCCAGAATGTG
VP7End-9(R)AACTTGCCACCATTTTTTCC
aBT1(F)CAAGTACTCAAATCAATGATGG
aCT2(F)CAATGATATTAACACATTTTCTGTG
aET3(F)ACGAACTCAACACGAGAGG
aDT4(F)CGTTTCTGGTGAGGAGTTG
aAT8(F)GTCACACCATTTGTAAATTCG
aFT9(F)CTTGATGTGACTAYAAATAC
G10(F)ATGTCAGACTACARATACTGG
(4)PCR반응종료후PCR증폭반응액5μL를전기영동완충
액(gelloadingbuffer)1μL와혼합한다음젤(gel)의각홈
에검체를조심스럽게넣고나머지한홈에PCR증폭산물
의크기를식별하기에적당한표식DNA(markerDNA)7μ
L를넣는다.1.5%아가로스젤(agarosegel)상에서100V로
전기영동한후EthidiumBromide(EtBr)염색액(10mg/mL)
으로30분간염색한후증류수로10분간탈색하고자외선
조사기(UVtransilluminator)로조사하여증폭된DNA밴드
를관찰한다.
다)1차결과확인
(1)VP4,VP7PCR증폭반응액을전기영동하여표10과비교하- 64 -여PCR증폭산물의크기가확인되면로타바이러스로일차
확인한다.
표10.VP4,VP7PCR증폭크기
VP4
P-genotype Primer PCR 산물크기(bp)
P1A[8] 1T-1 345
P1B[4] 2T-2 483
P2A[6] 3T-1 267
P3[9] 4T-1 391
P4[10] 5T-1 583
P[11] P[11] 312
VP7
G-genotype Primer PCR 산물크기(bp)
G1 aBT1 618
G2 aCT2 521
G3 aET3 682
G4 aDT4 452
G8 aAT8 754
G9 aFT9 179
G10 G10 266
(2)만일음성대조군(negativecontrol)에서PCR밴드가확인될
경우등은재시험을실시해야한다(표11참고).
(3)로타바이러스가일차확인된경우최종확인을위하여아가로스
젤(agarosegel)상에서해당부위를절취하여PCR산물을정
제한후염기서열(DNAsequencing)을분석하여최종판정
한다.- 65 -추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표11.로타바이러스PCR결과판정(예시)
+:로타바이러스PCR밴드확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을위하여다)의(3)에서정
제된DNA1μL를주형으로VP4이나VP7MultiplexPCR
증폭에사용한프라이머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)반응을위한혼합조건은각유
전자형Multiplex프라이머(primer,1pmol)를독립된각각의
튜브에2μL,dye-terminator2μL,정제DNA2μL를첨가
하여증류수로최종10μL가되도록하고96℃에서1분간
DNA를변성시킨후,96℃에서10초간,50℃에서5초간,6
0℃에서4분간을1회로하여25회반응시킨다음60℃에서10
분간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석(DNAsequencing)하되2종이상
의유전자가혼합되어있는경우에는클로닝염기서열분석
(CloningDNAsequencing)을재실시한다.염기서열분석- 66 -(DNAsequencing)에의해결정된염기서열은로타바이러스
유전자데이터베이스(Referecnesequence및NCBIblast)와
비교하여로타바이러스로 확인되었을경우검출된것으로
최종확인한다.
제7.4.29를다음과같이신설한다.
4.29식품용수등의아스트로바이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodiumthiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황산나트륨100g을녹여최종5,000
mL의용액을제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용수채수시검체의pH를조정하는데
사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccatedpowder)용액
1,900mL의증류수에Beefextract분말30g과glycine7.5g(최종
농도=0.05M)을넣고1MNaOH를이용하여pH9.5로조정한후
최종2L로제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주일간혹은-20℃에서장기간동안보관
할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7수화물(Sodiumphosphate,dibasic,- 67 -(Na2HPO47H2O))용액
950mL의증류수에Sodiumphosphate40.2g을넣고1MNaOH
를이용하여pH9.5로조정한후최종1L로제조하고121℃,15분
간고압증기멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의수산화나트륨을넣고최종500mL로
제조하여수산화나트륨용액을준비한다.수산화나트륨용액은상온
에서수개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNA
MiniKits또는동등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주입기,유량조절밸브,압력게이지,탈
리액주입구,양전하카트리지필터(positivecartridge
filter),카트리지하우징(cartridgehousing),탈리액유출구,
유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터(positivecartridgefilter):1-MDS,- 68 -NanoCeram또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용수의수소이온농도를측정한다.
다)휴대용탁도측정기：식품용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：식품용수의잔류염소농도를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품용수채수후양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)를운반하기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카트리지필터(positivecartridgefilter)
운반시냉장상태유지용으로사용한다.
사)기타：공구상자,2L멸균비커,멸균된알루미늄박,클램프,바
이러스시료검체기록부,멸균장갑,수은온도계,멸균메스실린더,
채수용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지ⓔ
탈리액주입구ⓕ감압단추ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카트리지
하우징ⓘ탈리액유출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
 《표준필터장치》- 69 -
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전하카트리지필터로유입시켜흡착된
바이러스를탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유입구,탈리액유출구,압력게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL용량)
다)0.22μm주사기필터(30mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착용하여바이러스가오염되지않게
주의하고오염이될수있는환경요인들을피하여야한다.멸균된
장갑이사람의피부나오염가능성이있는장치,부품에접촉이되
었을경우장갑을바꿔착용한다(예：수도꼭지나다른환경요소
표면).
가)채수하려는검체의배출구(수도꼭지등)를2～3분정도열고식품
용수를흘려보낸다.배출구에채수호스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여단단히연결하고탁도가균일할때- 70 -까지흘려보낸후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)나불꽃버너를이용하여배출구(수
도꼭지등)를살균또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을제거한후채수할배출구에연결
하고표준필터장치용수유입구(ⓐ)에호스를연결한다.이단
계에서양전하카트리지필터(ⓖ)는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력게이지가200kPa(30PSI)가넘지
않도록배출구를조절하고76L(20gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후일부를2L멸균비커에받아용
수의탁도,pH,온도,염소농도를각각측정하여검체번호,채수
위치,채수자의이름과함께바이러스검체채수기록부에 기록
한다.pH측정기는사용전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를잠그고검체가다음의조건에해당
되어부가장치의연결이필요한지의여부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된튜브로단일주입기(ⓑ)와1M염산
용액이담긴메스실린더를연결하고,배출구(수도꼭지등)를
다시열어용수의pH가6.5～7.5가되도록단일주입기를통해
1M염산용액을흘려보낸다.용수유출구(ⓚ)로흘러나온용
수의pH를측정해바이러스검체채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위와같이단일주입기를연결하여식품- 71 -용수3.8L(1gal)당2%티오황산나트륨용액10mL이주입
되도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당할경우이중주입기를연결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에검체채취일,시작시간,유량계의
초기수치를기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전하카트리지필터를탈리액주입구
(ⓔ)와유출구(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면서카트리지하우징상단의감압단추
(ⓕ,ventbutton)를눌러내부공기가완전히빠지도록한후,수
도꼭지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30PSI)이하로유지되도록유량조절밸
브를조정하고식품용수1,500～1,800L를통과시킨후,용수배
출구(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에검체채취종료일,종료시간,유량
계의최종수치등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리지하우징(ⓗ)을분리하고양전하
카트리지필터를거꾸로하여남은물을버린후하우징양끝의
연결된개구부를멸균된알루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아이스박스에담고얼음팩등을사용
하여냉장상태(냉동시켜서는아니된다)로유지하여즉시실험
실로운반한다.- 72 -2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는채수시작시간부터24시간내에
실험실에서바이러스탈리시험을실시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간내에탈리시험이불가할경우최대
72시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지하우징을장착한후유량조절밸브를
모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량펌프호스를연결한후연동정량펌프와
1.5%Beefextract용액이채워져있는유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는1L,NanoCeram필터에는0.5L의
1.5%Beefextract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용호스를연결하여1.5%Beefextract용
액이들어있는유리병에넣고탈리액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여양전하카트리지필터하우징안으로
1.5%Beefextract용액이양전하카트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를통해1.5%Beefextract용액이넘쳐
흘러나오기시작하면감압단추에서손을떼고,연동정량펌프
가동을멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양전하카트리지필터안으로가득채워
질때까지눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동정량펌프를다시가동한후하우징에- 73 -채워져있는1.5%Beefextract용액이서서히필터를통과하
도록한다.통과한완충액은1.5%Beefextract용액이들어있던
유리병에수집한다.탈리액을회수할때는거품이없도록주의
하여야한다.
※연동정량펌프대신양압펌프와압력통을사용하여탈리과정을
진행할수도있다.
사)유리병에수집된탈리액은라)～바)의과정을2회반복한다.
아)최종탈리액은1M염산용액으로pH를7.0～7.5사이로조절
하고멸균된메스실린더를사용하여부피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농축시험이가능할경우4℃에서보관
하며,농축시험을즉시시행하기어려울때에는-70℃에서보관
한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서혼합하면서1M염산용액으로pH를
3.5±0.1로조절한후,실온에서30분간천천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을멸균한원심분리용기에옮겨원심분리
한다(2,500G15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거하고남은침전물에0.15Msodium
phosphate완충액(pH9.0～9.5)을20～30mL넣어완전히부유
시킨후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리한다(7,000G,10분,4℃).- 74 -마)상등액을취해1M염산용액으로pH7.0～7.5로조절한다.
바)미생물오염을방지하기위해30mL주사기를이용하여상등액을
0.22μm주사기필터로여과한다.검체중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기위하여사전에0.22μm주사기필터에
10～20mL의1.5%Beefextract용액(pH7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=finalconcentratedsamplevolume)을
기록하고검체를24시간이내에분석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는바이러스유전자추출을위한검
체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제시
하는적절한실험법에따라실시한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품이사용이가능하며,또한자동유전자
추출장치를사용할경우에도바이러스RNA추출키트를사용
하여바이러스유전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시검체와동일한과정으로음성대조군
(negativecontrol)을사용하여유전자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를확인하기위해2개의RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군각280μL에AVL완충액(guanidine- 75 -thiocyanate함유)1,120 μL를각각혼합하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올1,120 μL을넣어혼합한후가볍게원심
분리(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심(Minispin)컬럼으로옮겨6,000G
에서1분간원심분리하고컬럼을새로운회수용(collection)튜
브로옮긴다음남은혼합액을630μL씩동일한방법으로컬럼에
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을새로운회수용(collection)튜브로
옮겨AW1완충액(guanidinehydrochloride함유)500μL을넣고
6,000G로1분간원심분리후컬럼을새로운회수용(collection)
튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고20,000G로3분간원심분리한후컬
럼을새로운1.5mL회수용(collection)튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide함유)60μL를넣고6,000G로1분간
원심분리하여다음의RT-PCR(Reversetranscription-Polymerase
chainreaction)을수행하기위한주형(template)으로사용한다.
5)아스트로바이러스유전자PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reversetranscription-PCR)과정에서는아스트로바이러
스를인위적으로조합하여합성한RNA등을PCR양성대조군으로- 76 -사용할수있다.
가)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)방법은아래와
같이수행한다.
(1)PCR조성조건은Mastermix(2X)12.5μL,Reversetranscriptase
(50unit/μL)0.5μL,프라이머(Mon269,Mon270)는각2
μL,추출RNA2μL를첨가하여증류수로총25μL로맞
추고반응시킨다.
(2)PCR반응조건은48℃에서40분,94℃에서3분DNA를변성
시키고,94℃30초,52℃30초,72℃1분30초를1회로하여
35회반응시킨후,68℃에서5분간연장반응시킨다.- 77 -온도 시간 cycle
cDNA합성 (cDNA synthesis)
초기 변성 (predenaturation)48℃
94℃40min
3min1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)94℃
52℃
72℃30sec
30sec
1min 30sec35cycles
최종신장 (post-elongation) 68℃ 5min 1cycle
보관 4℃∞∞표2.아스트로바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응조건및온도
표3.아스트로바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
프라이머염기서열
primer Sequence(5'→3') ApplicationPCR
Size(bp)
Mon 269CAA CTC AGG AAA CAG GGT
GTOne-step RT-
PCR/Sequen
cing449
Mon 270TCA GAT GCA TTG TCA TTG
GT
나)1차결과확인Component Volume Primer
Mastermix(2X) 12.5μL -
Reverse transcriptase (50unit/ μL) 0.5μL -
D.W. 6μL -
Forward primer(10 pmol) 2μL Mon 269
Reverse primer(10 pmol) 2μL Mon 270
Extracted RNA 2μL -
Total 25μL표1.아스트로바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응액조성- 78 -(1)아가로스젤(agarosegel)상에서시료에증폭산물이449bp
경우아스트로바이러스로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negativecontrol)에서PCR밴드가확이될
경우등은재시험을실시해야한다(표4참고).
(3)아스트로바이러스가일차확인된경우최종확인을위하여아
가로스젤(agarosegel)상에서해당부위를절취하여PCR산물
을정제한후염기서열(DNAsequencing)을분석하여최종판
정한다.
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표4.아스트로바이러스PCR결과판정(예시)
+:아스트로바이러스PCR밴드확인됨,-:밴드가확인되지않음
다)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을위하여다)의(3)에서정
제된DNA1μL를주형으로바이러스유전형및진행방향에
따라Mon269및Mon270의프라이머를사용한다.- 79 -(2)염기서열분석(sequencing)반응을위한혼합조건은각프라
이머(primer,1pmol)를독립된각각의튜브에2μL,
dye-terminator2μL,정제DNA2μL를첨가하여증류수로
최종10μL가되도록하고96℃에서1분간DNA를변성시킨
후,96℃에서10초간,50℃에서5초간,60℃에서4분간을1회로
하여25회반응시킨다음60℃에서10분간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석(DNAsequencing)하되2종이상의
유전자가혼합되어있는경우에는클로닝염기서열분석
(CloningDNAsequencing)을재실시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의해결정된염기서열은아스트로바이러
스유전자데이터베이스(Referecnesequence및NCBIblast)
와비교하여아스트로바이러스로확인되었을경우검출된것
으로최종확인한다.
제7.4.30을다음과같이신설한다.
4.30식품용수등의장관아데노바이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodiumthiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황산나트륨100g을녹여최종5,000
mL의용액을제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.
2)1M염산(HCl)용액- 80 -1M염산(HCl)용액은식품용수채수시검체의pH를조정하는데
사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccatedpowder)용액
1,900mL의증류수에Beefextract분말30g과glycine7.5g(최종
농도=0.05M)을넣고1MNaOH를이용하여pH9.5로조정한후
최종2L로제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주일간혹은-20℃에서장기간동안보관
할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7수화물(Sodiumphosphate,dibasic,
(Na2HPO47H2O))용액
950mL의증류수에Sodiumphosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로조정한후최종1L로제조하고12
1℃,15분간고압증기멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의수산화나트륨을넣고최종500mL로
제조하여수산화나트륨용액을준비한다.수산화나트륨용액은상온
에서수개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트
시판되는바이러스DNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제
시하는적절한실험법에따라실시한다.
※또한자동유전자추출장치를사용할경우에도바이러스추출키- 81 -트를사용하여바이러스유전자를추출할수있다.
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주입기,유량조절밸브,압력게이지,탈
리액주입구,양전하카트리지필터(positivecartridge
filter),카트리지하우징(cartridgehousing),탈리액유출구,
유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터(positivecartridgefilter):1-MDS,
NanoCeram또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용수의수소이온농도를측정한다.
다)휴대용탁도측정기：식품용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：식품용수의잔류염소농도를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품용수채수후양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)를운반하기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카트리지필터(positivecartridgefilter)
운반시냉장상태유지용으로사용한다.
사)기타：공구상자,2L멸균비커,멸균된알루미늄박,클램프,바
이러스시료검체기록부,멸균장갑,수은온도계,멸균메스실린더,
채수용호스- 82 -
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지ⓔ
탈리액주입구ⓕ감압단추ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카트리지
하우징ⓘ탈리액유출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
 《표준필터장치》
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전하카트리지필터로유입시켜흡착된
바이러스를탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유입구,탈리액유출구,압력게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL용량)
다)0.22μm주사기필터(30mL용량)- 83 -
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착용하여바이러스가오염되지않게
주의하고오염이될수있는환경요인들을피하여야한다.멸균된
장갑이사람의피부나오염가능성이있는장치,부품에접촉이되
었을경우장갑을바꿔착용한다(예：수도꼭지나다른환경요소
표면).
가)채수하려는검체의배출구(수도꼭지등)를2～3분정도열고식품
용수를흘려보낸다.배출구에채수호스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여단단히연결하고탁도가균일할때
까지흘려보낸후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)나불꽃버너를이용하여배출구(수
도꼭지등)를살균또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을제거한후채수할배출구에연결
하고표준필터장치용수유입구(ⓐ)에호스를연결한다.이단계
에서양전하카트리지필터(ⓖ)는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력게이지가200kPa(30PSI)가넘지
않도록배출구를조절하고76L(20gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후일부를2L멸균비커에받아용- 84 -수의탁도,pH,온도,염소농도를각각측정하여검체번호,채수
위치,채수자의이름과함께바이러스검체채수기록부에 기록
한다.pH측정기는사용전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를잠그고검체가다음의조건에해당
되어부가장치의연결이필요한지의여부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된튜브로단일주입기(ⓑ)와1M염산
용액이담긴메스실린더를연결하고,배출구(수도꼭지등)를
다시열어용수의pH가6.5～7.5가되도록단일주입기를통해
1M염산용액을흘려보낸다.용수유출구(ⓚ)로흘러나온용
수의pH를측정해바이러스검체채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위와같이단일주입기를연결하여식품
용수3.8L(1gal)당2%티오황산나트륨용액10mL이주입
되도록한다.
*(1)과(2)번이모두해당할경우이중주입기를연결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에검체채취일,시작시간,유량계의
초기수치를기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전하카트리지필터를탈리액주입구
(ⓔ)와유출구(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면서카트리지하우징상단의감압단추
(ⓕ,ventbutton)를눌러내부공기가완전히빠지도록한후,
수도꼭지를완전히열어준다.- 85 -차)압력게이지가200kPa(30PSI)이하로유지되도록유량조절밸
브를조정하고식품용수1,500～1,800L를통과시킨후,용수배
출구(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에검체채취종료일,종료시간,유량
계의최종수치등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리지하우징(ⓗ)을분리하고양전하
카트리지필터를거꾸로하여남은물을버린후하우징양끝의
연결된개구부를멸균된알루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아이스박스에담고얼음팩등을사용
하여냉장상태(냉동시켜서는아니된다)로유지하여즉시실험
실로운반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는채수시작시간부터24시간내에
실험실에서바이러스탈리시험을실시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간내에탈리시험이불가할경우최대
72시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지하우징을장착한후유량조절밸브를
모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량펌프호스를연결한후연동정량펌프와
1.5%Beefextract용액이채워져있는유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는1L,NanoCeram필터에는0.5L의- 86 -1.5%Beefextract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용호스를연결하여1.5%Beefextract용
액이들어있는유리병에넣고탈리액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여양전하카트리지필터하우징안으로
1.5%Beefextract용액이양전하카트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를통해1.5%Beefextract용액이넘쳐
흘러나오기시작하면감압단추에서손을떼고,연동정량펌프
가동을멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양전하카트리지필터안으로가득채워
질때까지눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동정량펌프를다시가동한후하우징에
채워져있는1.5%Beefextract용액이서서히필터를통과하
도록한다.통과한완충액은1.5%Beefextract용액이들어있던
유리병에수집한다.탈리액을회수할때는거품이없도록주의
하여야한다.
※연동정량펌프대신양압펌프와압력통을사용하여탈리과정을
진행할수도있다.
사)유리병에수집된탈리액은라)～바)의과정을2회반복한다.
아)최종탈리액은1M염산용액으로pH를7.0～7.5사이로조절
하고멸균된메스실린더를사용하여부피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농축시험이가능할경우4℃에서보관- 87 -하며,농축시험을즉시시행하기어려울때에는-70℃에서보관
한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서혼합하면서1M염산용액으로pH를
3.5±0.1로조절한후,실온에서30분간천천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을멸균한원심분리용기에옮겨원심분리
한다(2,500G15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거하고남은침전물에0.15Msodium
phosphate완충액(pH9.0～9.5)을20～30mL넣어완전히부유
시킨후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용액으로pH7.0～7.5로조절한다.
바)미생물오염을방지하기위해30mL주사기를이용하여상등액을
0.22μm주사기필터로여과한다.검체중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기위하여사전에0.22μm주사기필터에
10～20mL의1.5%Beefextract용액(pH7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=finalconcentratedsamplevolume)을
기록하고검체를24시간이내에분석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는바이러스유전자추출을위한검
체로사용한다.- 88 -4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스DNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제
시하는적절한실험법에따라실시한다.
※또한자동유전자추출장치를사용할경우에도바이러스추출키
트를사용하여바이러스유전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시검체와동일한과정으로음성대조군
(negativecontrol)을사용하여유전자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를확인하기위해2개의DNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군각300μL에Lysis-Bindingsolution
buffer600μL를넣어혼합하고가볍게원심분리한후실온에서
5분동안방치한다.
다)여기에Magneticbead를40μL를넣어혼합한후상온에서10
분간방치한다.
라)Magnetictrapper에튜브를장착한후상층액을모두제거한다.
마)Magnetictrapper에서튜브를꺼내Washing1solution600μL를
넣고세척한후다시trapper에장착하여상층액을모두제거한다.
바)Trapper에서튜브를꺼내어Washing2solution600μL를첨가
하여세척하고다시trapper에장착하여상층액을모두제거한다.
사)Trapper에서튜브를꺼내어Washing3solution600μL를첨가
하여세척하고다시trapper에장착하여상층액을모두제거한다.
아)Elutionbuffer160μL를넣고5분간실온방치한다.- 89 -자)Trapper에서튜브를꺼내어60℃에서10분간방치한후다시
trapper에장착하여상층액을취하며PCR을수행하기위한주
형(template)으로사용한다.
5)장관아데노바이러스 유전자PCR과정및결과판정
PCR(Polymerasechainreaction)과정에서는장관아데노바이러스를 인
위적으로조합하여합성한DNA등을PCR양성대조군으로사용할
수있다.
가)PCR방법은아래와같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과같이추출DNA5μL,10x완충액
(MgCl2포함)5μL,dNTPs(10mM)4μL,TaqDNA
polymerase1μL,프라이머(AD1,AD2)는각1μL첨가한다
음최종증류수로총50μL로맞춘후PCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표2와같이94℃에서3분간DNA를변성시키고
94℃30초,50℃30초,72℃1분을1회로하여35회를반응시
킨후72℃에서5분간연장반응시킨다.- 90 -Component Volume Primer
dNTPs(10mM) 4μL -
10x Buffer(with MgCl 2) 5μL -
D.W. 33μL -
Forward primer(10 pmol) 1μL AD1
Reverse primer(10 pmol) 1μL AD2
Taq DNA polymerase 1μL -
DNA 5μL -
Total 50μL표1.장관아데노바이러스 PCR반응액조성 
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)94℃ 3min 1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)9 4℃
50℃
72℃30sec
30sec
1m in35cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 5min 1cycle
보관 4℃ ∞∞표2.장관아데노바이러스 PCR반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR증폭반응액5μL를전기영동완충액
(gelloadingbuffer)1μL와혼합한다음젤(gel)의각홈에
검체를조심스럽게넣고나머지한홈에PCR증폭산물의크
기를식별하기에적당한표식DNA(markerDNA)7μL를넣
는다.1.5%아가로스젤(agarosegel)상에서100V로전기영
동한후EthidiumBromide(EtBr)염색액(10mg/mL)으로30
분간염색한후증류수로10분간탈색하고자외선조사기- 91 -(UVtransilluminator)로조사하여증폭된DNA밴드를관찰
한다.
(4)장관아데노바이러스 유전자증폭에사용하는프라이머는표
3와같다.
Primer Sequence(5'→3') Application PCR Size(bp)
AD1 TTC CCC ATG GCI CAY AAC AC
PCR/sequencing 482
AD2 CCC TGG TAK CCR TRT TGT A표3.장관아데노바이러스 PCR프라이머염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)상에서시료에PCR밴드의크기가
482bp로확인될경우장관아데노바이러스로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negativecontrol)에서PCR밴드가확이될
경우등은재시험을실시해야한다(표4참고).
(3)장관아데노바이러스가 일차확인된경우최종확인을위하여
아가로스젤(agarosegel)상에서해당부위를절취하여PCR
산물을정제한후염기서열(DNAsequencing)을분석하여최종
판정한다.- 92 -추출 DNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표4.장관아데노바이러스 PCR결과판정(예시)
+:장관아데노바이러스 PCR밴드확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을위하여다)의(3)에서정
제된DNA1μL를주형으로AD1과AD2프라이머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)반응을위한혼합조건은각유전
자형Semi-nested프라이머(primer,1pmol)를독립된각각의
튜브에2μL,dye-terminator2μL,정제DNA2μL를첨가
하여증류수로최종10μL가되도록하고96℃에서1분간
DNA를변성시킨후,96℃에서10초간,50℃에서5초간,60℃
에서4분간을1회로하여25회반응시킨다음60℃에서10분간
연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석(DNAsequencing)하되2종이상
의유전자가혼합되어있는경우에는클로닝염기서열분석
(CloningDNAsequencing)을재실시한다.염기서열분석- 93 -(DNAsequencing)에의해결정된염기서열은장관아데노바
이러스유전자데이터베이스(Referecnesequence및NCBIblast)
와비교하여장관아데노바이러스로 확인되었을경우검출된
것으로최종확인한다.
제7.4.31을다음과같이신설한다.
4.31식품용수등의사포바이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodiumthiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황산나트륨100g을녹여최종5,000
mL의용액을제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용수채수시검체의pH를조정하는데
사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccatedpowder)용액
1,900mL의증류수에Beefextract분말30g과glycine7.5g(최종
농도=0.05M)을넣고1MNaOH를이용하여pH9.5로조정한후
최종2L로제조하고121℃,15분간고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주일간혹은-20℃에서장기간동안보관
할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7수화물(Sodiumphosphate,dibasic,- 94 -(Na2HPO47H2O))용액
950mL의증류수에Sodiumphosphate40.2g을넣고1MNaOH
를이용하여pH9.5로조정한후최종1L로제조하고121℃,15분
간고압증기멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의수산화나트륨을넣고최종500mL로
제조하여수산화나트륨용액을준비한다.수산화나트륨용액은상온
에서수개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주입기,유량조절밸브,압력게이지,탈
리액주입구,양전하카트리지필터(positivecartridge
filter),카트리지하우징(cartridgehousing),탈리액유출구,
유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터(positivecartridgefilter):1-MDS,- 95 -NanoCeram또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용수의수소이온농도를측정한다.
다)휴대용탁도측정기：식품용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：식품용수의잔류염소농도를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품용수채수후양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)를운반하기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카트리지필터(positivecartridgefilter)
운반시냉장상태유지용으로사용한다.
사)기타：공구상자,2L멸균비커,멸균된알루미늄박,클램프,바
이러스시료검체기록부,멸균장갑,수은온도계,멸균메스실린더,
채수용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지ⓔ
탈리액주입구ⓕ감압단추ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카트리지
하우징ⓘ탈리액유출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
《표준필터장치》- 96 -
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전하카트리지필터로유입시켜흡착된
바이러스를탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유입구,탈리액유출구,압력게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL용량)
다)0.22μm주사기필터(30mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착용하여바이러스가오염되지않게
주의하고오염이될수있는환경요인들을피하여야한다.멸균된
장갑이사람의피부나오염가능성이있는장치,부품에접촉이되
었을경우장갑을바꿔착용한다(예：수도꼭지나다른환경요소
표면).
가)채수하려는검체의배출구(수도꼭지등)를2～3분정도열고식품
용수를흘려보낸다.배출구에채수호스를장착시누수가되지- 97 -않도록클램프를이용하여단단히연결하고탁도가균일할때
까지흘려보낸후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)나불꽃버너를이용하여배출구(수
도꼭지등)를살균또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을제거한후채수할배출구에연결
하고표준필터장치용수유입구(ⓐ)에호스를연결한다.이단계
에서양전하카트리지필터(ⓖ)는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력게이지가200kPa(30PSI)가넘지
않도록배출구를조절하고76L(20gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후일부를2L멸균비커에받아용
수의탁도,pH,온도,염소농도를각각측정하여검체번호,채수
위치,채수자의이름과함께바이러스검체채수기록부에 기록
한다.pH측정기는사용전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를잠그고검체가다음의조건에해당
되어부가장치의연결이필요한지의여부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된튜브로단일주입기(ⓑ)와1M염산
용액이담긴메스실린더를연결하고,배출구(수도꼭지등)를
다시열어용수의pH가6.5～7.5가되도록단일주입기를통해
1M염산용액을흘려보낸다.용수유출구(ⓚ)로흘러나온용
수의pH를측정해바이러스검체채수기록부에기록한다.- 98 -(2)잔류염소제거를위해위와같이단일주입기를연결하여식품
용수3.8L(1gal)당2%티오황산나트륨용액10mL이주입
되도록한다.
*(1)과(2)번이모두해당할경우이중주입기를연결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에검체채취일,시작시간,유량계의
초기수치를기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전하카트리지필터를탈리액주입구
(ⓔ)와유출구(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면서카트리지하우징상단의감압단추
(ⓕ,ventbutton)를눌러내부공기가완전히빠지도록한후,수
도꼭지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30PSI)이하로유지되도록유량조절밸
브를조정하고식품용수1,500～1,800L를통과시킨후,용수배
출구(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에검체채취종료일,종료시간,유량
계의최종수치등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리지하우징(ⓗ)을분리하고양전하
카트리지필터를거꾸로하여남은물을버린후하우징양끝의
연결된개구부를멸균된알루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아이스박스에담고얼음팩등을사용
하여냉장상태(냉동시켜서는아니된다)로유지하여즉시실험- 99 -실로운반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는채수시작시간부터24시간내에
실험실에서바이러스탈리시험을실시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간내에탈리시험이불가할경우최대
72시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지하우징을장착한후유량조절밸브를
모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량펌프호스를연결한후연동정량펌프와
1.5%Beefextract용액이채워져있는유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는1L,NanoCeram필터에는0.5L의
1.5%Beefextract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용호스를연결하여1.5%Beefextract용
액이들어있는유리병에넣고탈리액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여양전하카트리지필터하우징안으로
1.5%Beefextract용액이양전하카트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를통해1.5%Beefextract용액이넘쳐
흘러나오기시작하면감압단추에서손을떼고,연동정량펌프
가동을멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양전하카트리지필터안으로가득채워
질때까지눌러준다.- 100 -바)탈리액유출구를열고연동정량펌프를다시가동한후하우징에
채워져있는1.5%Beefextract용액이서서히필터를통과하
도록한다.통과한완충액은1.5%Beefextract용액이들어있던
유리병에수집한다.탈리액을회수할때는거품이없도록주의
하여야한다.
※연동정량펌프대신양압펌프와압력통을사용하여탈리과정을
진행할수도있다.
사)유리병에수집된탈리액은라)～바)의과정을2회반복한다.
아)최종탈리액은1M염산용액으로pH를7.0～7.5사이로조절
하고멸균된메스실린더를사용하여부피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농축시험이가능할경우4℃에서보관
하며,농축시험을즉시시행하기어려울때에는-70℃에서보관
한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서혼합하면서1M염산용액으로pH를
3.5±0.1로조절한후,실온에서30분간천천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을멸균한원심분리용기에옮겨원심분리
한다(2,500G15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거하고남은침전물에0.15Msodium
phosphate완충액(pH9.0～9.5)을20～30mL넣어완전히부유
시킨후실온에10분간방치한다.- 101 -라)부유시킨용액을원심분리한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용액으로pH7.0～7.5로조절한다.
바)미생물오염을방지하기위해30mL주사기를이용하여상등액을
0.22μm주사기필터로여과한다.검체중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기위하여사전에0.22μm주사기필터에
10～20mL의1.5%Beefextract용액(pH7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=finalconcentratedsamplevolume)을
기록하고검체를24시간이내에분석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는바이러스유전자추출을위한검
체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출키트(kit)를사용하며,제조사가제시
하는적절한실험법에따라실시한다.
※재현성및검출효율등을고려하여QIAGEN-ViralRNAMini
Kits또는동등이상의제품이사용이가능하며,또한자동유전자
추출장치를사용할경우에도바이러스RNA추출키트를사용
하여바이러스유전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시검체와동일한과정으로음성대조군
(negativecontrol)을사용하여유전자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를확인하기위해2개의RNA를추출한다.- 102 -나)검체농축액과음성대조군각280μL에AVL완충액(guanidine
thiocyanate함유)1,120 μL를각각혼합하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올1,120 μL을넣어혼합한후가볍게원심
분리(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심(Minispin)컬럼으로옮겨6,000G
에서1분간원심분리하고컬럼을새로운회수용(collection)튜
브로옮긴다음남은혼합액을630μL씩동일한방법으로컬럼에
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을새로운회수용(collection)튜브로
옮겨AW1완충액(guanidinehydrochloride함유)500μL을넣고
6,000G로1분간원심분리후컬럼을새로운회수용(collection)
튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고20,000G로3분간원심분리한후
컬럼을새로운1.5mL회수용(collection)튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide함유)60μL를넣고6,000G로1분간
원심분리하여다음의RT-PCR(Reversetranscription-Polymerase
chainreaction)을수행하기위한주형(template)으로사용한다.
5)사포바이러스유전자PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reversetranscription-PCR)과정에서는사포바이러스를- 103 -인위적으로조합하여합성한RNA등을PCR양성대조군으로사용
할수있다.
가)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)방법은아래와
같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)조성조건은표
1과같이Mastermix(2X)9.5μL,Reversetranscriptase(50unit/
μL)0.5μL,프라이머(SV-F11,SV-R1)는각2μL,추출RNA
5μL를첨가하여증류수로총25μL로맞추고반응시킨다.
(2)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)반응조건은
표2와같이45℃에서30분,94℃에서5분변성시키고,94℃30
초,55℃30초,72℃1분30초를1회로하여35회반응시킨후,
72℃에서7분간연장반응시킨다.상기반응종료후PCR생성
물에대하여NestedPCR을실시한다.
Component Volume Primers
Mastermix(2X) 9.5μL -
Reversetranscriptase(50unit/μL) 0.5μL -
D.W. 6μL -
Forwardprimer(20pmol) 2μL SV-F11
Reverseprimer(20pmol) 2μL SV-R1
ExtractedRNA,PCRcontrol 5μL -
Total 25μL -표1.사포바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응액조성 - 104 -나)NestedPCR방법은아래와같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)산물을주형으로
하여표3과같이NestedPCR을실시한다.1차PCR산물2μL,
10x완충액(MgCl2포함)5μL,dNTPs(10mM)4μL,Taq
DNApolymerase(5unit/μL)1μL,프라이머(SV-F21,SV-R2)
는각2.5μL첨가한다음최종증류수로총50μL로맞춘후
NestedPCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표4와같이94℃에서5분간DNA를변성시키
고94℃30초,55℃30초,72℃1분30초를1회로하여25회를
반응시킨후72℃에서7분간연장반응시킨다.온도 시간 Cycle
cDNA합성 (cDNA synthesis)
초기 변성 (predenaturation)45℃
94℃30min
5min1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)94℃
55℃
72℃30sec
30sec
1min 30sec35cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 7min 1cycle
보관 4℃ ∞ ∞표2.사포바이러스One-stepRT-PCR(Reversetranscription-PCR)
반응조건및온도- 105 -Component Volume Primers
dNTPs(10mM) 4μL -
10xBuffer(withMgCl2) 5μL -
D.W. 33μL -
Forwardprimer(20pmol)2.5μL SV-F21
Reverseprimer(20pmol)2.5μL SV-R2
TaqDNApolymerase(5unit/μL)1μL -
1stPCRProduct 2μL -
Total 50μL표3.사포바이러스NestedPCR반응액조성
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)94℃ 5 min 1 cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃ 
55℃
72℃30 sec
30 sec 
1 min 30 sec30 cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 7 min 1 cycle
보관 4℃ ∞ ∞표4.사포바이러스NestedPCR반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR증폭반응액5μL를전기영동완충액
(gelloadingbuffer)1μL와혼합한다음젤(gel)의각홈에검
체를조심스럽게넣고나머지한홈에PCR증폭산물의크기를
식별하기에적당한표식DNA(markerDNA)7μL를넣는다.
1.5%아가로스젤(agarosegel)상에서100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)염색액(10mg/mL)으로30분간염색
한후증류수로10분간탈색하고자외선조사기(UV- 106 -transilluminator)로조사하여증폭된DNA밴드를관찰한다.
(4)사포바이러스유전자증폭에사용하는프라이머는표5와같다.
Primer Sequence(5'→3') Application PCR Size(bp)
SV-F11 GCY TGG TTY ATA GGT GGT AC
One-step
RT-PCR781
SV-R1 CWG GTG AMA CMC CAT TKT CCA T
SV-F21 ANT AGT GTT TGA RAT GGA GGG
Nested PCR/
Sequencing415
SV-R2 GWG GGR TCA ACM CCW GGT GG표5.사포바이러스PCR프라이머염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)상에서시료에PCR증폭산물이415bp의
밴드가있을경우사포바이러스로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negativecontrol)에서PCR밴드가확이될경우
등은재시험을실시해야한다(표6참고).
(3)사포바이러스가일차확인된경우최종확인을위하여아가로스젤
(agarosegel)상에서해당부위를절취하여PCR산물을정제한후
염기서열(DNAsequencing)을분석하여최종판정한다.- 107 -추출 RNA(시료 ) 음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표6.사포바이러스PCR결과판정(예시)
+:사포바이러스PCR밴드확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을위하여다)의(3)에서정제
된DNA1μL를주형으로SV-F21과SV-R2프라이머를사용
한다.
(2)염기서열분석(sequencing)반응을위한혼합조건은각유전자형
Nested프라이머(primer,1pmol)를독립된각각의튜브에2μL,
dye-terminator2μL,정제DNA2μL를첨가하여증류수로최종
10μL가되도록하고96℃에서1분간DNA를변성시킨후,96℃
에서10초간,50℃에서5초간,60℃에서4분간을1회로하여25회
반응시킨다음60℃에서10분간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석(DNAsequencing)하되2종이상의
유전자가혼합되어있는경우에는클로닝염기서열분석
(CloningDNAsequencing)을재실시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의해결정된염기서열은사포바이러스유전- 108 -자데이터베이스(Referecnesequence및NCBIblast)와비교하
여사포바이러스로확인되었을경우검출된것으로최종확인
한다.
제7.10중10.4를다음과같이한다.
10.4발기부전치료제및그유사물질
가.시험법적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-액추출하고액체크로마토그래프/
자외부흡광검출기(UVphotometricdetector),PDA검출기로
분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UVphotometric
detector),PDA검출기(LC/PDA),액체크로마토그래프/질량분
석기(LC/MS)를사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
3)표준원액:호모실데나필(homosildenafil),홍데나필
(hongdenafil),하이드록시호모실데나필(hydroxyhomosildenafil),- 109 -아미노타다라필(aminotadalafil), 슈도바데나필
(pseudovardenafil),하이드록시홍데나필(hydroxyhongdenafil),
디메틸실데나필(dimethylsildenafil), 잔소안트라필
(xanthoanthrafil),하이드록시바데나필 (hydroxyvardenafil),노르
네오실데나필(norneosildenafil), 데메틸홍데나필
(demethylhongdenafil), 피페리디노홍데나필
(piperidinohongdenafil),카보데나필(carbodenafil),치오실데나
필,(thiosildenafil)디메틸치오실데나필(dimethylthiosildenafil),
아세틸바데나필(acetylvardenafil), 벤질실데나필
(benzylsildenafil),노르네오바데나필(norneovardenafil),옥소홍
데나필(oxohongdenafil),클로로데나필(chlorodenafil),신나밀데
나필(cinnamyldenafil),치오호모실데나필(thiohomosildenafil),
데설포바데나필(desulfovardenafil),니트로데나필(nitrodenafil),
싸이클로펜티나필(cyclopenpentynafil),옥틸노르타다라필
(octylnortadalafil),치오퀴나피페리필(thioquinapiperifil),클로로
프레타다라필(chloropretadalafil),하이드록시치오호 모실데나필
(hydroxythiohomosildenafil),하이드록시클로로데나필
(hydroxychlorodenafil),디클로로데나필(dichlorodenafil),데메칠
타다라필(demethyltadalafil),아세트아미노타다라필
(acetaminotadalafil), 메틸하이드록시호모실데나필
(methylhydroxyhomosildenafil),프로폭시페닐치오호모실데나필- 110 -(propoxyphenylthiosildenafil),프로폭시페닐치오하이드 록시호모
실데나필(propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil),프로폭시페
닐치오호모실데나필(propoxyphenylthiohomosildenafil),프로폭
시페닐치오아일데나필 (propoxyphenylthioaildenafil),호모타다라
필(Homotadalafil),아세틸산(acetylacid),겐데나필(gendenafil),
이미다조사가트리아지논(imidazosagatriazinone),cis-사이클로
펜틸타다라필(cis-cyclopentyltadalafil),trans-사이클로펜틸타다
라필(trans-cyclopentyltadalafil),이소프로필노르타다라필
(Isopropylnortadalafil),데스카본실데나필 (descarbonsildenafil),
실데나필(sildenafil),타다라필(tadalafil),바데나필(vardenafil),
유데나필(udenafil),미로데나필(mirodenafil),아바나필(avanafil)
각각의표준품을메탄올에녹여각각1,000mg/L이되게한다.
4)표준용액:표준원액을각각메탄올에녹여1～100mg/L의
범위가되도록적당한농도로희석한다.
5)sodium-1-hexanesulfonate:이온쌍크로마토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히달아50mL용량의메스플라스크에
넣고물15mL를가하여습윤화한다.메스플라스크에메탄올25
mL를가하여10분간초음파추출한후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여과하여시험용액으로사용한다.단,- 111 -시험용액의농도가검량곡선의농도범위를벗어날경우농도
범위내로희석하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측정조건
가)칼럼:C18(4.6mm×250mm,5㎛)또는이와동등한것
나)칼럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mMsodium-1-hexanesulfonate를
함유한0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세토니트릴
시간 (분) 이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:200～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정량취하여액체크로마토그래프에각각- 112 -주입한다.얻어진크로마토그램상의각피크높이또는면적을
구하여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램
- 113 -
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로마토그램상의피크는동일한- 114 -측정조건에서표준용액피크의머무름시간과일치하여야하며
PDA검출기에서표준용액과시험용액이동일한스펙트럼을
보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서얻어진시험결과를피크높이법또는
피크면적법에따라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준물질의피크높이또는피크면적을
Y축으로하고표준물질의농도를X축으로하여검량곡선을
작성하고시험용액의높이또는면적을Y축에대입하여
발기부전치료제유사물질의농도를계산한다.
발기부전치료제 및 유사물질의 함량(mg/g) =C×V×DS
C:검량곡선에서계산된각각의발기부전치료제 유사물질의
농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래프/질량분석기로분석하였을때시험용액중- 115 -표준물질의m/z값은표준용액중표준물질의m/z값과
일치하여야한다.
1)액체크로마토그래프/질량분석기의측정조건
가)칼럼:C18(2.0mm×100mm,3㎛)또는이와동등한것
나)칼럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%formicacid를함유한아세토니트릴
시간 (분) 이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
20 20 80
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
차.발기부전치료제유사물질의분자량및화학구조식
①호모실데나필 (Homosildenafil)
 (C23H32N6O4S,488.61 )②홍데나필 (Hongdenafil)
 (C25H34N6O3,466.59 )- 116 -ONHNO
NN
S
NOO
N
ONHNO
NNO
NN
③하이드록시호모실데나필
 (Hydroxyhomosildenafil)
 (C23H32N6O5S,504.61 )
ONHNO
NN
S
NOO
N
HO④아미노타다라필 (Aminotadalafil)
 (C21H18N4O4,390.40 )
NN
HN
OOOO
NH2
⑤슈도바데나필 (Pseudovardenafil)
 (C22H29N5O4S,459.57 )
ONNHNO
NSNOO⑥하이드록시홍데나필 (Hydroxyhongdenafil)
 (C25H34N6O4,482.59 )
ONHNO
NNO
NNHO
⑦디메틸실데나필 (Dimethylsildenafil)
 (C23H32N6O4S,488.61 )
ONHNO
NN
S
NOO
HN⑧잔소안트라필 (Xanthoanthrafil)
 (C19H23N3O6,389.41 )
HNO
NH
OCH3OCH3OH
NO2
⑨하이드록시바데나필 (Hydroxyvardenafil)
 (C23H32N6O5S,504.61 )
ONNHNO
NSN
NHOOO⑩노르네오실데나필 (Norneosildenafil)
 (C22H29N5O4S,459.57 )
⑪데메틸홍데나필 (Demethylhongdenafil)
 (C24H32N6O3,452.55 )⑫ 피페리디노홍데나필
(Piperidinohongdenafil)
 (C24H31N5O3,437.55 )- 117 -ONHNO
NNO
NN
ONHNO
NNO
N
⑬카보데나필 (Carbodenafil)
 (C24H32N6O3,452.56 )
ONHNO
NN
N
NO⑭치오실데나필 (Thiosildenfil)
 (C22H30N6O3S2,490.64 )
ONHNS
NN
S
NOO
N
⑮디메틸치오실데 나필(Dimethylthiosildenafil)
 (C23H32N6O3S2,504)
ONHNS
NN
SNOO
HN⑯아세틸바데나필 (Acetylvardenafil)
 (C25H34N6O3,466.59 )
ONNHNO
N
NN O
⑰벤질실데나필 (Benzylsildenafil)
 (C28H34N6O4S,550.68 )
ONHNO
NN
SNOO
N⑱노르네오바데나필 (Norneovardenafil)
 (C18H20N4O4,356.38 )
ONNHNO
N
HOO
⑲옥소홍데나필 (Oxohongdenafil)
 (C25H32N6O4,480.57 )
ONHNO
NNO
NN
O치오호모실데나필 (Thiohomosildenafil)
 (C23H32N6O3S2,504.68 )
ONHNS
NN
SNOO
N
데설포바데나필 (Desulfovardenafil)
 (C17H20N4O2,312.37 )
ONNHNO
N니트로데나필 (Nitrodenafil)
(C17H19N5O4,357.37)
ONHNO
NN
O2N- 118 -싸이클로펜티나필 (Cyclopentynafil)
(C26H36N6O4S,528.68)
ONHNO
NN
SNOO
N옥틸노르타다라필 (N-Octylnortadalafil )
(C29H33N3O4,487.60)
NNHN
OOOO
클로로데나필 (Chlorodenafil)
(C19H21ClN 4O3,388.86)
ONHNO
NNO
Cl신나밀데나필 (Cinnamyldenafil)
(C32H38N6O3,554)
ONHNO
NNO
NN
치오퀴나피페리필 (Thioquinapiperifil)
(C24H28N6OS, 448.59)
N
NNH
N
SNHN
HO하이드록시치오호모실데나필
 (Hydroxythiohomosildenafil)
(C23H32N6O4S2,520.68)
ONHNS
NN
S
NOO
N
HO
클로로프레타다라필 (Chloropretadalafil)
(C22H19ClN 2O5,426.86)
NN
HO
OOOO
Cl㉚ 하이드록시클로로데나필
(Hydroxychlorodenafil)
(C19H23ClN 4O3,390.87 )
ONHNO
NNOH
Cl
Hydroxychlorodenafil(C19H23ClN4O3,390)
㉛ 디클로로데나필 (Dichlorodenafil)
 (C19H20Cl2N4O2,407.30 )
ONHNO
NNCl
Cl
H데메칠타다라필 (Demethyltadalafil)
 (C21H17N3O4,375.38 )
- 119 -아세트아미노타다라필 (Acetaminotadalafil)
 (C23H20N4O5,432.43 )
NN
N
H
OOO
OH
N
O㉞ 메틸하이드록시호모실데나필         
 (Methylhydroxyhomosildenafil)
 (C24H34N6O5S,518.00 )
㉟ 프로폭시페닐치오호모실데나필
 (Propoxyphenylthiohomosildenafil)
 (C24H34N6O3S2,518.70 )
㊱ 프로폭시페닐치오하이드록시호모실데나필  
(Propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil)
 (C24H34N6O4S2,534.69 )
프로폭시페닐치오실데나필
(Propoxyphenylhiosildenaifl)
(C24H32N6O3S2,504.67 )
S
ONHNS
NN
NN
O
O프로폭시페닐치오아일데나필
(Propoxyphenylhioaildenaifl)
(C24H34N6O3S2,518.70 )
SO
ONHNS
NN
ONHN
㊴ 호모타다라필 (Homotadalafil)
(C23H21N3O4,403.43)
아세틸산 (Acetyl acid)
(C18H20N4O4,356.38)
OHO
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3
겐데나필 (Gendenafil)
(C19H22N4O3,354.41)
CH3O
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3이미다조사가트리아지논 (Imidazosagatriazinone)
(C17H20N4O2,312.37)
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3- 120 -
제7.10중10.7.3∼10.7.6을다음과같이신설한다.
10.7.3페놀프탈레인(phenolphthalein)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-액추출하고액체크로마토그래프/자외
부흡광검출기(UVphotometricdetector),PDA검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UVphotometricdetector),
PDA검출기(LC/PDA),액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를
사용한다.
라.시약및시액cis-사이클로펜틸타다라필 (cis-Cyclopentyltadalafil) 
(C26H25N3O4,443)
trans-사이클로펜틸타다라필 (trans-Cyclopentyltadalafil)
(C26H25N3O4,443)
데스카본실데나필 (Descarbonsildenafil)
(C21H30N6O4S,462.57)
이소프로필노르타다라필 (Isopropylnortadalafil)
(C24H23N3O4,417.47)
- 121 -1)유기용매:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
3)표준원액:페놀프탈레인(phenolphthalein)표준품을메탄올에
녹여1,000mg/L이되게한다.
4)표준용액:표준원액을메탄올에녹여1～100mg/L의범위가
되도록적당한농도로희석한다.
5)sodium-1-hexanesulfonate:이온쌍크로마토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히달아50mL용량의메스플라스크에
넣고물15mL를가하여습윤화한다.메스플라스크에메탄올25
mL를가하여10분간초음파추출한후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여과하여시험용액으로사용한다.단,시
험용액의농도가검량곡선의농도범위를벗어날경우농도범위
내로희석하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측정조건
가)컬럼:C18(4.6mm×250mm,5㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mMsodium-1-hexanesulfonate를함유한- 122 -0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세토니트릴
시간 (분) 이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:200～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정량취하여액체크로마토그래프에각
각주입한다.얻어진크로마토그램상의각피크높이또는면적
을구하여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및스펙트럼- 123 -
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로마토그램상의피크는동일한측정조건
에서표준용액피크의머무름시간과일치하여야하며PDA검출
기에서표준용액과시험용액이동일한스펙트럼을보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서얻어진시험결과를피크높이법또- 124 -는피크면적법에따라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준물질의피크높이또는피크면적을Y
축으로하고표준물질의농도를X축으로하여검량곡선을작성
하고시험용액의높이또는면적을Y축에대입하여페놀프탈레
인의농도를계산한다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된페놀프탈레인의농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래프/질량분석기로분석하였을때시험용액중표
준물질의m/z값은표준용액중표준물질의m/z값과일치하여
야한다.
1)액체크로마토그래프/질량분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×100mm,3㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상- 125 -(1)이동상A:0.1%formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%formicacid를함유한아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition
물질 분자량 Ion modePrecursor
ion
(m/z)Fragment
ion
(m/z)
페놀프탈레인
(C20H14O4)318.32 Positive 319 225, 197
10.7.4요힘빈(yohimbine)및이카린(icariin)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-액추출하고액체크로마토그래프/자외- 126 -부흡광검출기(UVphotometricdetector),PDA검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UVphotometricdetector),
PDA검출기(LC/PDA),액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를
사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
3)표준원액:요힘빈(yohimbine)및이카린(icariin)표준품을메
탄올에녹여각각1,000mg/L이되게한다.
4)표준용액:표준원액을각각메탄올에녹여1～100mg/L의범
위가되도록적당한농도로희석한다.
5)sodium-1-hexanesulfonate:ionpare크로마토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히달아50mL용량의메스플라스크에
넣고물15mL를가하여습윤화한다.메스플라스크에메탄올25
mL를가하여10분간초음파추출한후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여과하여시험용액으로사용한다.단,시
험용액의농도가검량곡선의농도범위를벗어날경우농도범위
내로희석하여사용한다.- 127 -바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측정조건
가)컬럼:C18(4.6mm×250mm,5㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mMsodium-1-hexanesulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:200～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정량취하여액체크로마토그래프에각
각주입한다.얻어진크로마토그램상의각피크높이또는면적
을구하여검량선을작성한다.- 128 -3)표준품의크로마토그램및스펙트럼
(a)요힘빈및이카린의크로마토그램
(b)요힘빈의스펙트럼- 129 -
(c)이카린의스펙트럼
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로마토그램상의피크는동일한측정조
건에서표준용액피크의머무름시간과일치하여야하며PDA
검출기에서표준용액과시험용액이동일한스펙트럼을보여야
한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서얻어진시험결과를피크높이법또
는피크면적법에따라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준물질의피이크높이또는피이크면적
을Y축으로하고표준물질의농도를X축으로하여검량곡선을
작성하고시험용액의높이또는면적을Y축에대입하여요힘빈- 130 -및이카린의농도를계산한다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된요힘빈,이카린각각의농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래피-질량분석기로분석하였을때시험용액중
표준물질의m/z값은표준용액중표준물질의m/z값과일치하
여야한다.
1)액체크로마토그래프/질량분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×100mm,3㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%formicacid를함유한아세토니트릴- 131 -시간 (분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition
물질 분자량 Ion modePrecursor
ion
(m/z)Fragment
ion
(m/z)
요힘빈 (C21H26N2O3) 354.4 Positive 355 144, 212
이카린 (C9H13N) 676.7 Negative 677 367, 513
10.7.5카스카로사이드(CascarosideA,B,C,D)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-액추출하고액체크로마토그래프/자외
부흡광검출기(UVphotometricdetector),PDA검출기로분석한다.- 132 -다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UVphotometricdetector),
PDA검출기(LC/PDA),액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를
사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
3)표준원액:카스카로사이드 A(cascarosideA),카스카로사이드
B(cascarosideB),카스카로사이드 C(cascarosideC),카스카로
사이드D(cascarosideD)표준품을각각메탄올에녹여1,000
mg/L이되게한다.
4)표준용액:표준원액을메탄올에녹여1～100mg/L의범위가
되도록적당한농도로희석한다.
5)sodium-1-hexanesulfonate:이온쌍크로마토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히달아50mL용량의메스플라스크에
넣고물15mL를가하여습윤화한다.메스플라스크에메탄올25
mL를가하여10분간초음파추출한후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여과하여시험용액으로사용한다.단,시
험용액의농도가검량곡선의농도범위를벗어날경우농도범위- 133 -내로희석하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측정조건
가)컬럼:C18(4.6mm×250mm,5㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mMsodium-1-hexanesulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:200～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정량취하여액체크로마토그래프에각각
주입한다.얻어진크로마토그램상의각피크높이또는면적을- 134 -구하여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및스펙트럼
(a)카스카로사이드A,B,C,D의크로마토그램
(b)카스카로사이드A,B의스펙트럼- 135 -
(C)카스카로사이드C,D의스펙트럼
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로마토그램상의피크는동일한측정조건
에서표준용액피크의머무름시간과일치하여야하며PDA검출
기에서표준용액과시험용액이동일한스펙트럼을보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서얻어진시험결과를피크높이법또
는피크면적법에따라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준물질의피크높이또는피크면적을Y
축으로하고표준물질의농도를X축으로하여검량곡선을작성
하고시험용액의높이또는면적을Y축에대입하여카스카로사
이드의농도를계산한다.- 136 -시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된카스카로사이드의 농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래프/질량분석기로분석하였을때시험용액중표
준물질의m/z값은표준용액중표준물질의m/z값과일치하여
야한다.
1)액체크로마토그래프/질량분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×100mm,3㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%formicacid를함유한아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5- 137 -라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition
물질분자량IonmodePrecursor
ion
(m/z)Fragment
ion
(m/z)
카스카로사이드 A
(C27H32O14)580.1Negative579297,459
카스카로사이드 B
(C27H32O14)580.1Negative579297,459
카스카로사이드 C
(C27H32O13)563.8Negative563281,443
카스카로사이드 D
(C27H32O13)563.8Negative563281,443
10.7.6센노사이드(sennosideA,B)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-액추출하고액체크로마토그래프/자외
부흡광검출기(UVphotometricdetector),PDA검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부흡광검출기(LC/UVphotometricdetector),- 138 -PDA검출기(LC/PDA),액체크로마토그래프/질량분석기(LC/MS)를
사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피용또는이와동등한것
3)표준원액:센노사이드A(sennodiseA),센노사이드B(sennodise
B)각각의표준품을아세토나이트릴/물혼합액(80/20,v/v)에
녹여각각1,000mg/L이되게한다.
4)표준용액:표준원액을각각메탄올에녹여1～100mg/L이되
도록적당한농도로희석한다.
5)sodium-1-hexanesulfonate:이온쌍크로마토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히달아50mL용량의메스플라스크에
넣고물15mL를가하여습윤화한다.메스플라스크에메탄올25
mL를가하여10분간초음파추출한후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여과하여시험용액으로사용한다.단,시
험용액의농도가검량곡선의농도범위를벗어날경우농도범위
내로희석하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측정조건- 139 -가)컬럼:C18(4.6mm×250mm,5㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mMsodium-1-hexanesulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%) 이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:220nm
바)PDA검출기파장:200～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정량취하여액체크로마토그래프에각각
주입한다.얻어진크로마토그램상의각피크높이또는면적을
구하여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및스펙트럼- 140 -
(a)센노사이드A,B의크로마토그램
(b)센노사이드A의스펙트럼
(b)센노사이드B의스펙트럼- 141 -4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로마토그램상의피크는동일한측정조건
에서표준용액피크의머무름시간과일치하여야하며PDA검출
기에서표준용액과시험용액이동일한스펙트럼을보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서얻어진시험결과를피크높이법또
는피크면적법에따라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준물질의피크높이또는피크면적을Y
축으로하고표준물질의농도를X축으로하여검량곡선을작성
하고시험용액의높이또는면적을Y축에대입하여센노사이드
A및B의농도를계산한다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된센노사이드A및B의농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험- 142 -액체크로마토그래프/질량분석기로분석하였을때시험용액중표
준물질의m/z값은표준용액중표준물질의m/z값과일치하여
야한다.
1)액체크로마토그래프/질량분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×100mm,3㎛)또는이와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%formicacid를함유한아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition- 143 -물질분자량IonmodePrecursor
ion
(m/z)Fragment
ion
(m/z)
센노사이드A
(C42H38O20)862.7Negative861224,386,699
센노사이드B
(C42H38O20)862.7Negative861224,386,699
[별표1]2.중377을삭제하고기존의378∼491을각각377∼490으로,
492를삭제하고기존의493∼660을각각491∼658로하며,661을삭제
하고기존의662∼952를각각659∼949로한다.
[별표3],(1)이미녹타딘(Iminoctadine)중“기타농산물0.05”를삭제하고,
“마늘0.5”를“마늘0.1”로하며,“파1.0”을“파0.5”로한다.
[별표3],(5)노르플루라존(Norflurazon)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(9)델타메트린(Deltamethrin)중“기타농산물0.01”을삭제
한다.
[별표3],(11)멥틸디노캅(Meptyldinocap)중“기타농산물0.05”를
삭제하고,“감0.5”를“감0.3”으로하며,“오이1.0”을“오이0.7”로
한다.- 144 -[별표3],(12)디디티(DDT)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(15)디설포톤(Disulfoton)중“기타농산물0.02”를삭제한다.
[별표3],(18)디캄바(Dicamba)중“수수3.0”을“수수0.1”로한다.
[별표3],(21)디클로르보스(Dichlorvos)중“기타농산물0.05”를삭제
하고,“사과2.0”을“사과0.05”로하며,“오이1.0”을“오이0.1”로
하고,“파0.5”를“파0.1”로한다.
[별표3],(26)디페노코나졸(Difenoconazole)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(28)디펜아미드(Diphenamid)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(29)디플루벤주론(Diflubenzuron)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(37)메카밤(Mecarbam)중“기타농산물0.05”를삭제한다.- 145 -[별표3],(46)메틸브로마이드(Methylbromide)중“기타농산물20”을
삭제한다.
[별표3],(48)바미도티온(Vamidothion)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(50)베나락실(Benalaxyl)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(52)벤디오카브(Bendiocarb)중“기타농산물0.02”를삭제
한다.
[별표3],(55)뷰프로페진(Buprofezin)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(58)비에치시(BHC)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(61)비펜트린(Bifenthrin)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(63)세톡시딤(Sethoxydim)중“아몬드1.0”,“피칸1.0”을
삭제하고,“견과류1.0”을“견과류0.05†”로하며,“면실5.0”을- 146 -“면실0.05†”로하며,“아보카도1.0”을“아보카도0.04†”로하고,
“해바라기씨7.0”을“해바라기씨0.05†”로한다.
[별표3],(65)사이로마진(Cyromazine)중“기타농산물0.05”를삭제하고,
“느타리버섯5.0”을“느타리버섯3.0”으로하며,“수박0.3”을“수박
0.1”로한다.
[별표3],(68)사이할로트린(Cyhalothrin)중“복숭아0.5”를“복숭아
0.2”로한다.
[별표3],(71)아미트라즈(Amitraz)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(76)알드린및디엘드린(Aldrin&Dieldrin)중“기타농산물
0.01”을삭제한다.
[별표3],(77)알디카브(Aldicarb)중“기타농산물0.02”를삭제한다.
[별표3],(83)에티온(Ethion)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(85)에토펜프록스(Etofenprox)중“기타농산물0.01”을
삭제한다.- 147 -[별표3],(88)에트림포스(Etrimfos)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(90)엔도설판(Endosulfan)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(91)엔드린(Endrin)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(101)이미다클로프리드(Imidacloprid)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(106)이피엔(EPN)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(107)키노메티오네이트(Chinomethionat)중“기타농산물
0.05”를삭제한다.
[별표3],(108)티오메톤(Thiometon)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(110)카두사포스(Cadusafos)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(112)카벤다짐(Carbendazim)중“기타농산물0.01”을삭제한다.- 148 -[별표3],(113)카보페노티온(Carbophenothion)중“기타농산물0.02”를삭제
한다.
[별표3],(114)카보퓨란(Carbofuran)중“바나나0.1”을“바나나0.01†”로
한다.
[별표3],(116)카탑(Cartap)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(117)캡타폴(Captafol)중“기타농산물0.02”를삭제한다.
[별표3],(120)퀸토젠(Quintozene)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(124)클로로벤질레이트(Chlorobenzilate)중“기타농산물0.02”를
삭제한다.
[별표3],(125)클로로탈로닐(Chlorothalonil)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(129)클로르펜빈포스(Chlorfenvinphos)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.- 149 -[별표3],(130)클로르프로팜(Chlorpropham)중“감자50.0”을“감자
20”으로한다.
[별표3],(132)클로르피리포스-메틸(Chlorpyrifos-methyl)중“기타농산물
0.05”를삭제한다.
[별표3],(134)터부트린(Terbutryn)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(135)터부포스(Terbufos)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(149)트리플루미졸(Triflumizole)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(164)펜발러레이트(Fenvalerate)중“아몬드0.2”,“호두0.2”를
삭제하고,다음항목을신설한다.
견과류 0.15†
[별표3],(173)포레이트(Phorate)중“감자0.2”를“감자0.05”로하고,
“마늘0.1”을“마늘0.05”로한다.
[별표3],(176)포스멧(Phosmet,PMP)중“기타농산물0.05”를삭제- 150 -한다.
[별표3],(180)플루실라졸(Flusilazole)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(181)플루발리네이트(Fluvalinate)중“기타농산물0.01”을삭제
한다.
[별표3],(182)플루시트리네이트(Flucythrinate)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(184)프로메트린(Prometryn)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(185)프로사이미돈(Procymidone)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(186)프로클로라즈(Prochloraz)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(188)프로파모카브(Propamocarb)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.- 151 -[별표3],(191)프로폭서(Propoxur)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(192)프로피코나졸(Propiconazole)중“옥수수1.0”을“옥수수
0.05”로한다.
[별표3],(198)피페로닐부톡사이드(Piperonylbutoxide)중“기타농산물
0.05”를삭제한다.
[별표3],(202)헵타클로르(Heptachlor)중“기타농산물0.01”을삭제한다.
[별표3],(207)테부페노자이드(Tebufenozide)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(220)디에토펜카브(Diethofencarb)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(222)메파니피림(Mepanipyrim)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(228)아족시스트로빈(Azoxystrobin)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.- 152 -[별표3],(229)카프로파마이드(Carpropamide)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(232)트리사이클라졸(Tricyclazole)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(233)펜사이큐론(Pencycuron)중“기타농산물0.1”를삭제한다.
[별표3],(234)펜피록시메이트(Fenpyroximate)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(238)플루디옥소닐(Fludioxonil)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(259)피리메타닐(Pyrimethanil)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(291)족사마이드(Zoxamide)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(294)터부틸라진(Terbuthylazine)중“기타농산물0.05”를삭제- 153 -한다.
[별표3],(309)플루톨라닐(Flutolanil)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(325)사이아조파미드(Cyazofamid)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(327)오리사스트로빈(Orysastrobin)중“기타농산물0.07”을삭제
한다.
[별표3],(362)트리아자메이트(Triazamate)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(370)벤티아발리카브아이소프로필(Benthiavalicarb-isopropyl)중
“기타농산물0.07”을삭제한다.
[별표3],(371)디니코나졸(Diniconazole)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(373)스피로메시펜(Spiromesifen)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.- 154 -[별표3],(374)알라니카브(Alanycarb)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(375)오퓨레이스(Ofurace)중“기타농산물0.02”를삭제한다.
[별표3],(376)트리플루뮤론(Triflumuron)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(377)티펜설퓨론메틸(Thifensulfuron-methyl)중“기타농산물
0.05”를삭제한다.
[별표3],(378)페림존(Ferimzone)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(379)플루아크리피림(Fluacrypyrim)중“기타농산물0.1”을
삭제한다.
[별표3],(380)피리달릴(Pyridalyl)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(384)사이플루페나미드(Cyflufenamid)중“기타농산물0.1”을
삭제한다.- 155 -[별표3],(386)플로니카미드(Flonicamid)중“기타농산물0.1”을삭제
한다.
[별표3],(390)시메코나졸(Simeconazole)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(391)만디프로파미드(Mandipropamid)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(393)메트알데하이드(Metaldehyde)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(394)비스트리플루론(Bistrifluron)중“기타농산물0.2”를
삭제한다.
[별표3],(395)플루오피콜라이드(Fluopicolide)중“기타농산물0.1”을
삭제한다.
[별표3],(396)에티클로제이트(Ethychlozate)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.- 156 -[별표3],(399)사이플루메토펜(Cyflumetofen)중“기타농산물0.07”을
삭제한다.
[별표3],(401)디비이디시(DBEDC)중“기타농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(403)메타플루미존(Metaflumizone)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(404)메트라페논(Metrafenone)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(405)사이에노피라펜(Cyenopyrafen)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(408)스피네토람(Spinetoram)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(409)아미설브롬(Amisulbrom)중“기타농산물0.05”를삭제
한다.
[별표3],(410)옥솔린산(Oxolinicacid)중“기타농산물0.05”를삭제- 157 -한다.
[별표3],(415)크로마페노자이드(Chromafenozide)중“기타농산물0.05”를
삭제한다.
[별표3],(416)클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole)중“기타농산물
0.05”를삭제한다.
[별표3],(417)플루벤디아마이드(Flubendiamide)중“기타농산물
0.05”를삭제한다.
[별표3],(419)프로헥사디온-칼슘(Prohexadione-calcium)중“기타
농산물0.05”를삭제한다.
[별표3],(420)린단(Lindane,γ-BHC)중“기타농산물0.01”을삭제
한다.- 158 -부칙
제1조(시행일)①이고시는고시한날부터시행한다.
②제1조제1항에도불구하고다음각호의구분에따른개정규정
은다음각호에서정한날부터시행한다.
1.시행일:고시후2개월이경과한날
가.별표3(다만,기타농산물의개정규정제외)
2.시행일:고시후6개월이경과한날
가.제2.3.5)(2)중금속
나.제2.3.16)(1)히스타민
3.시행일:고시후1년이경과한날
가.제4.7.식용유지류
4.시행일:2019년1월1일
가.제2.3.4)(2)바
나.제5.2.1)(2)
다.제7.4.26∼4.31
라.제2.3.7)
마.별표3중“기타농산물”개정규정
제2조(적용례)이고시는이고시시행이후최초로제조·가공또는
수입한식품(선적일기준)부터적용한다.
제3조(경과조치)이고시는이고시시행당시제조․가공․판매또는
수입되어검사가진행중인사항에대하여는종전의규정에따른다.- 159 -
현행 개정(안)
제1.총칙
1.(생략)
2.기준및규격의적용
1)～3)(생략)
4)가공식품에대한중금속,곰
팡이독소,패독소등오염물질
기준은원료식품의기준범위
내에서적용할수있다.즉,
원료의함량에따라원료농․
임․축․수산물의기준을적용
하고,건조등의과정으로인
하여수분함량이변화된경우
는수분함량을고려하여적용
한다.
5)～12)(생략)
제2.식품일반에대한공통기준및규격
1.∼2.(생략)
3.식품일반의기준및규격
1)∼3)(생략)
4)위생지표균및식중독균
(1)(생략)
(2)식중독균
가.∼마.(생략)제1.총칙
1.(현행과같음)
2.기준및규격의적용
1)～3)(현행과같음)
<삭제>
4)～11)(현행과같음)
제2.식품일반에대한공통기준및규격
1.∼2.(현행과같음)
3.식품일반의기준및규격
1)∼3)(현행과같음)
4)위생지표균및식중독균
(1)(현행과같음)
(2)식중독균
가.∼마.(현행과같음)- 160 -현행 개정(안)
바.식품접객업소등의노로
바이러스기준
식품접객업소,집단급식소,
식품제조․가공업소등에서
식재료및식기등의세척,
식품의조리및제조․가공,
먹는물등으로사용하는물
:불검출(다만,식품접객업소,
집단급식소등에서먹는물로
제공되는수돗물은먹는물
관리법에서규정하고있는
먹는물수질기준에의한다)
5)오염물질
<신설>바.-------------- 식중독
바이러스-----
----------------------
----------------------
----------------------
----------------------
---------------------
물에서는노로바이러스,A형·E형
간염바이러스,로타바이러스,
아스트로바이러스,장관아데
노바이러스,사포바이러스가
검출되어서는아니된다(단,
수돗물및염소등으로소독한
식품용수는제외한다).
5)오염물질
(1)오염물질기준적용
①건조과정으로인하여수분함
량이변화된건조농․임․축․
수산물의중금속,패독소,폴리
염화비페닐(PCBs)기준은수분
함량의변화를고려하여생물
기준으로환산
적용한다.
②그대로섭취하지않는건조농․
임․축․수산물의방사능기준은
수분함량의변화를고려하여생물
기준으로환산
적용한다.- 161 -현행 개정(안)
(1)중금속기준
①농산물
대상식품납
(㎎/㎏)카드뮴
(㎎/㎏)무기비소
(㎎/㎏)
곡류(현미 
제외)(생략) (생략) (생략)
서류 (생략) (생략) -
콩류 (생략) (생략) -
견과
종실
류땅콩 
또는 
견과
류(생략) (생략) -
유지
종실
류0.3 이하
(참깨에 한한다 )(생략) -③기준이별도로설정되어있
지않은가공식품의중금속,
곰팡이독소,패독소등오염물
질기준은원료의함량에따라
해당농․임․축․수산물의기
준을적용하고,건조등의과정
으로인하여수분함량이변화된
경우는수분함량을고려하여
적용한다.
④기준이설정되어있는가공
식품중희석하여섭취하는
식품의중금속,방사능,다이옥
신,폴리염화비페닐(PCBs)기준
은섭취시의상태(제조사가제
시한섭취방법)를반영하여적
용한다.
(2)중금속기준
①농산물
대상식품납
(㎎/㎏)카드뮴
(㎎/㎏)무기비소
(㎎/㎏)
곡류(현미 
제외)(현행과 같음)(현행과 같음)(현행과 
같음)
서류 (현행과 같음)(현행과 같음) -
콩류 (현행과 같음)(현행과 같음) -
견과
종실
류땅콩 
또는 
견과
류(현행과 같음)(현행과 같음) -
유지
종실
류0.3 이하
(참깨, 들깨에 
한한다 )(현행과 같음) -- 162 -현행 개정(안)
②(생략)
③수산물과일류0.1 이하
(사과, 귤, 
장과류는 0.2 
이하)(생략) -
엽채류 (결
구 엽채류 
포함)(생략) (생략) -
엽경채류 (생략) (생략) -
근채류0.1 이하
(인삼, 산양삼 , 
도라지 , 더덕 
2.0 이하)0.1 이하
(양파 0.05 
이하, 인삼, 
산양삼 , 도라지 , 
더덕 0.2 이하)-
과채류 (생략) (생략) -
버섯류 (생략) (생략) -
*(생  략)
대상
식품납(mg/kg) 카 드 뮴(m g/kg) 수은(mg/kg) 메 틸 수 은(m g /k g )
어류 (생략)0.1 이하
(민물 및 
회유 어류에 
해당된다 )
0.2 이하
(해양어류에 
해당된다 )(생략)1.0 이하
(심해성 
어류, 
다랑어류 
및 
새치류에 
해당된다 )
연체
류2.0 이하
(다 만, 내 장 을 
포함한 
낙지는 2.0 
이하)2.0 이하
(다 만, 내 장 을  
포함한 
낙지는 3.0 
이하)(생략) -
갑각
류1.0 이하
[다 만, 내 장 을 
포 함 한 
꽃 게 류
(꽃 게 과 에 
속 하 는  꽃 게 
종)는  2.0 
이 하]1.0 이하
[다 만, 내 장 을 
포 함 한 
꽃 게 류
(꽃 게 과 에 
속 하 는  꽃 게 
종)는 5.0 
이 하]- -
해조
류<신  설>0.3 이하
[김(조미 김 을 
포함하며 , 
생물 기준 
적용)에 
해당된다 ]- -②(현행과같음)
③수산물과일류 0.1 이하 (현행과 같음) -
엽채류 (결
구 엽채류 
포함)(현행과 같음)(현행과 같음) -
엽경채류 (현행과 같음)(현행과 같음) -
근채류0.1 이하
(인삼, 산양삼은 
2.0 이하, 
도라지 , 더덕은 
0.2 이하)0.1 이하
(양파는 0.05 
이하, 인삼, 
산양삼은 0.2 
이하)-
과채류 (현행과 같음)(현행과 같음) -
버섯류(현행과같음)(현행과같음) -
*(현행과같음)
대상
식품납(mg/kg) 카 드 뮴(m g/kg) 수은(mg/kg) 메 틸 수 은(m g /k g )
어류 (현 행 과  같 음)0.1 이하
(민물 및 
회유 어류에 
한한다 )
0.2 이하
(해양어류에 
한한다 )(현 행 과  같 음)1.0 이하
(심해성 
어류, 
다랑어류 
및 
새치류에 
한한다 )
연체
류2.0 이하
(다 만, 내 장 을 
포함한 
낙지는 2.0 
이하, 
오징어는 
1.0 이하)2.0 이하
(다 만, 내 장 을  
포함한 
낙지는 3.0 
이하, 
오징어는 
1.5 이하)(현 행 과  같 음) -
갑각
류0.5 이하
(다 만, 내 장 을  
포함한 
꽃게류는  
2.0 이하)1.0 이하
(다 만, 내 장 을  
포함한 
꽃게류는  
5.0 이하)- -
해조
류0.5 이하 
(미역에  
한한다 )0.3 이하
[김(조미 김  
포함)에 
한한다 ] 
0.1 이하 
(미역에  
한한다 )- -- 163 -현행 개정(안)
④～⑤(생략)
⑥건조농․임․축․수산물등
의중금속기준은건조과정
으로인하여수분함량이변
화된경우에는수분함량을
고려하여적용하여야한다.
(2)～(7)(생략)
(8)패독소기준
①～②(생략)
③건조수산물의패독소잠정
기준적용
건조과정으로인하여수분
함량이변화된경우는수분
함량을고려하여적용한다.
(9)(생략)
6)(생략)
7)농약의잔류허용기준
(1)농산물의잔류농약기준적용대상
식품납(mg/kg) 카 드 뮴(m g/kg) 수은(mg/kg) 메 틸 수 은(m g /k g )
냉동
식용
어류
머리(생략) (생략) (생략) (생략)
냉동
식용
어류
내장(생략) (생략) (생략) (생략)
④～⑤(현행과같음)
<삭제>
(3)～(8)
(9)패독소기준
①～②(현행과같음)
<삭제>
(10)(현행과같음)
6)(현행과같음)
7)농약의잔류허용기준
(1)농산물의농약잔류허용기준대상
식품납(mg/kg) 카 드 뮴(m g/kg) 수은(mg/kg) 메 틸 수 은(m g /k g )
냉동
식용
어류
머리(현 행 과  같 음)(현 행 과  같 음)(현 행 과  같 음)(현 행 과  같 음)
냉동
식용
어류
내장(현 행 과  같 음)(현 행 과  같 음)(현 행 과  같 음)(현 행 과  같 음)- 164 -현행 개정(안)
①농산물에잔류한농약에
대하여「식품의기준및
규격」에별도로잔류허용
기준을정하지않은경우
다음각항의기준을순차적
으로적용한다.(단,제1.4.1)
식물성원료의분류에서견과
종실류및과일류중열대
과일류의경우에는제외)
㉮당해농산물(개별농산물
그자체를의미하며그룹
으로설정된농산물은제외)에
대한CODEX기준
㉯[별표3]농산물의농약
잔류허용기준의 그농약
기준중당해농산물과제1.4.1)
식물성원료의분류에서
정한동일대분류군(단,
소분류가있을경우소분류를
우선적용)에속한농산물의
최저기준
②제1.4.1)식물성원료의
분류에서견과종실류및과일류
중열대과일류에잔류한농약에
대하여「식품의기준및규격」에
별도로잔류허용기준을정하지①농산물의농약잔류허용
기준은[별표3]과같다.단,
개별기준과그룹기준이
있을경우에는개별기준을
우선적용한다.
②농산물에잔류한농약에대하
여[별표3]에별도로잔류허
용기준을정하지않는경우
0.01mg/kg이하를적용한다.
③「농약관리법」상사용․
등록된농약및외국에서
해당국가의법률에따라
합법적으로사용되는농약에
함유된유효성분중아래의
사유에해당되는경우잔류
허용기준을면제할수있으
며,면제대상성분은아래
표와같다.
㉮독성이현저히낮아인체
위해가능성이없는성분
㉯식품에전혀잔류되지않는
성분
㉰자연계에존재하여해당
식품에포함되어있으므로
구분이어려운성분
㉱안전성이확보된천연식물- 165 -현행 개정(안)
않은경우0.01mg/kg을적용
한다.
③상기“①”의규정에해당
되지않은농약의경우에는
[별표3]농산물의농약잔류
허용기준의그농약기준
중최저기준을적용한다(단,
해당농약의기준중기타
농산물의기준이있을경우
에는기타농산물의기준을
우선적으로적용한다.)보호제(미생물등포함)성분
번
호유효성분
11-메틸사이클로프로펜(1-Methylcyclopropene)
2기계유(Machineoil)
3데실알코올(Decylalcohol)
4모나크로 스포 륨타 우 마슘케이 비 시
3017(MonacrosporiumthaumasiumKBC3017)
5바실루스서브틸리스디비비1501(BacillussubtilisDBB1501)
6바실루스서브틸리스시제이-9(BacillussubtilisCJ-9)
7바실루스서브틸리스엠27(BacillussubtilisM27)
8바실루스서브틸리스엠비아이600(BacillussubtilisMBI600)
9바실루스서브틸리스와이1336(BacillussubtilisY1336)
10바실루스서브틸리스이더블유42-1(BacillussubtilisEW42-1)
11바실루스서브틸리스제이케이케이238(BacillussubtilisJKK238)
12바실루스서브틸리스지비365(BacillussubtilisGB0365)
13바실루스서브틸리스케이비401(BacillussubtilisKB401)
14바실루스서브틸리스케이비시1010(BacillussubtilisKBC1010)
15바실루스서브틸리스큐에스티713(BacillussubtilisQST713)
16바실루스아밀로리퀴파시엔스케이비시1121(Bacillus
amyloliquefaciensKBC1121)
17바실루스푸밀루스큐에스티2808(BacilluspumilusQST2808)
18보르도혼합액(Bordeauxmixture)
19뷰베리아바시아나지에이치에이 (Beauveria
bassianaGHA)
20뷰베리아바시아나티비아이-1(BeauveriabassianaTBI-1)
21비티아이자와이(Bacillusthuringiensissubsp.aizawai)
22비티아이자와이엔티423(Bacillusthuringiensis
subsp.aizawaiNT0423)
23비티아이자와이지비413(Bacillusthuringiensis
subsp.aizawaiGB413)
24비티쿠르스타키(Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki)
25비티쿠르스타키(Bacillusthuringiensisvar.kurstaki)
26석회황(Calciumpolysulfide,limesulfur)
27스트렙토마이세스고시키엔시스더블유와이이
324(StreptomycesgoshikiensisWYE324)
28스트렙토마이세스콜롬비엔시스더블유와이이
20(StreptomycescolombiensisWYE20)
29스프레더스티커(Spreadersticker)
30폴리에틸렌메틸실록세인(PolyethyleneMethylSiloxane)
31아이비에이(IBA,4-indol-3-ylbutyricacid)
32아이에이에이(IAA,Indol-3-ylaceticacid)
33알킬설폰화알킬레이트의나트륨염(Sodiumsaltof
alkylsulfonatedalkylate)- 166 -현행 개정(안)
(2)농산물의농약잔류허용기준
①농산물의농약잔류허용기
준은[별표3]과같다.단,
개별기준과그룹기준이있<삭제>34알킬아릴폴리에톡시레이트(Alkylarylpolyethoxylate)
35암펠로마이세스퀴스콸리스에이큐94013(Ampelomyces
quisqualisAQ94013)
36옥시에틸렌메틸실록세인(Oxyethylenemethylsiloxane)
37지베렐린류(GibberellinA3,GibberellinA4+7)
38칼슘카보네이트(Calciumcarbonate)
39코퍼설페이트베이식(Coppersulfatebasic)
40코퍼설페이트트리베이식(Coppersulfatetribasic)
41코퍼옥시클로라이드(Copperoxychloride)
42코퍼하이드록사이드(Copperhydroxide)
43트리코델마하지아늄와이씨459(Trichodermaharzianum
YC459)
44패니바실루스폴리믹사에이시-1(Paenibacillus
polymyxaAC-1)
45패실로마이세스퓨모소로세우스디비비
-2032(PaecilomycesfumosoroseusDBB-2032)
46폴리나프틸메탄설폰산디알킬디메틸암모니움염
(Polynaphthylmethanesulfonicaciddialkyl
dimethylammonium(PMSAADA))
47폴리에테르폴리실록세인(Polyethermodifiedpolysiloxane)
48폴리옥시에틸렌메틸폴리실록세인(Polyoxyethylene
methylPolysiloxane)
49폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르(Polyoxyethylene
alkylarylether)
50폴리옥시에틸렌지방산에스테르(Polyoxyethylene
fattyacidester(PFAE))
51황(Sulfur)
52니즈(polynaphtylmethanesulfonic+polyoxyethylene
fattyacidester)
53소듐리그노설포네이트(Sodiumlignosulfonate)
54심플리실리움라멜리콜라비씨피(Simplicillium
lamellicolaBCP)
55트리코더마아트로비라이드에스케이티-1(Trichoderma
atrovirideSKT-1)
56파라핀,파라핀오일(Paraffin,Paraffinicoil)
57펠라르곤산(Pelargonicacid)
58에틸포메이트(Ethylformate)- 167 -현행 개정(안)
을경우에는개별기준을우
선적용한다.
②「농약관리법」상사용․
등록된농약및외국에서
해당국가의법률에따라
합법적으로사용되는농약에
함유된유효성분중아래의
성분에대하여는잔류허용기준
설정을면제한다.
번
호유효성분
11-메틸사이클로프로펜(1-Methylcyclopropene)
2기계유(Machineoil)
3데실알코올(Decylalcohol)
4모나크로 스포 륨타 우 마슘케이 비 시
3017(MonacrosporiumthaumasiumKBC3017)
5바실루스서브틸리스디비비1501(BacillussubtilisDBB1501)
6바실루스서브틸리스시제이-9(BacillussubtilisCJ-9)
7바실루스서브틸리스엠27(BacillussubtilisM27)
8바실루스서브틸리스엠비아이600(BacillussubtilisMBI600)
9바실루스서브틸리스와이1336(BacillussubtilisY1336)
10바실루스서브틸리스이더블유42-1(BacillussubtilisEW42-1)
11바실루스서브틸리스제이케이케이238(BacillussubtilisJKK238)
12바실루스서브틸리스지비365(BacillussubtilisGB0365)
13바실루스서브틸리스케이비401(BacillussubtilisKB401)
14바실루스서브틸리스케이비시1010(BacillussubtilisKBC1010)
15바실루스서브틸리스큐에스티713(BacillussubtilisQST713)
16바실루스아밀로리퀴파시엔스케이비시1121(Bacillus
amyloliquefaciensKBC1121)
17바실루스푸밀루스큐에스티2808(BacilluspumilusQST2808)
18보르도혼합액(Bordeauxmixture)
19뷰베리아바시아나지에이치에이 (Beauveria
bassianaGHA)
20뷰베리아바시아나티비아이-1(BeauveriabassianaTBI-1)
21비티아이자와이(Bacillusthuringiensissubsp.aizawai)
22비티아이자와이엔티423(Bacillusthuringiensis
subsp.aizawaiNT0423)- 168 -현행 개정(안)
23비티아이자와이지비413(Bacillusthuringiensis
subsp.aizawaiGB413)
24비티쿠르스타키(Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki)
25비티쿠르스타키(Bacillusthuringiensisvar.kurstaki)
26석회황(Calciumpolysulfide,limesulfur)
27스트렙토마이세스고시키엔시스더블유와이이
324(StreptomycesgoshikiensisWYE324)
28스트렙토마이세스콜롬비엔시스더블유와이이
20(StreptomycescolombiensisWYE20)
29스프레더스티커(Spreadersticker)
30폴리에틸렌메틸실록세인(PolyethyleneMethylSiloxane)
31아이비에이(IBA,4-indol-3-ylbutyricacid)
32아이에이에이(IAA,Indol-3-ylaceticacid)
33알킬설폰화알킬레이트의나트륨염(Sodiumsaltof
alkylsulfonatedalkylate)
34알킬아릴폴리에톡시레이트(Alkylarylpolyethoxylate)
35암펠로마이세스퀴스콸리스에이큐94013(Ampelomyces
quisqualisAQ94013)
36옥시에틸렌메틸실록세인(Oxyethylenemethylsiloxane)
37지베렐린류(GibberellinA3,GibberellinA4+7)
38칼슘카보네이트(Calciumcarbonate)
39코퍼설페이트베이식(Coppersulfatebasic)
40코퍼설페이트트리베이식(Coppersulfatetribasic)
41코퍼옥시클로라이드(Copperoxychloride)
42코퍼하이드록사이드(Copperhydroxide)
43트리코델마하지아늄와이씨459(Trichodermaharzianum
YC459)
44패니바실루스폴리믹사에이시-1(Paenibacillus
polymyxaAC-1)
45패실로마이세스퓨모소로세우스디비비
-2032(PaecilomycesfumosoroseusDBB-2032)
46폴리나프틸메탄설폰산디알킬디메틸암모니움염
(Polynaphthylmethanesulfonicaciddialkyl
dimethylammonium(PMSAADA))
47폴리에테르폴리실록세인(Polyethermodifiedpolysiloxane)
48폴리옥시에틸렌메틸폴리실록세인(Polyoxyethylene
methylPolysiloxane)
49폴리옥시에틸렌알킬아릴에테르(Polyoxyethylene
alkylarylether)
50폴리옥시에틸렌지방산에스테르(Polyoxyethylene
fattyacidester(PFAE))
51황(Sulfur)
52니즈(polynaphtylmethanesulfonic+polyoxyethylene
fattyacidester)
53소듐리그노설포네이트(Sodiumlignosulfonate)
54심플리실리움라멜리콜라비씨피(Simplicillium
lamellicolaBCP)- 169 -현행 개정(안)
(3)(생략)
(4)가공식품의잔류농약잠정기준적용
가공식품에잔류한농약에
대하여「식품의기준및규격」에
별도로잔류허용기준을정하지
않은경우다음각항의기준을
순차적으로적용한다.
①CODEX기준을우선적용
②(생략)
(5)∼(6)(생략)
8)(생략)
9)부정물질
(1)(생략)
①발기부전치료제및그유사
물질
②～③(생략)55트리코더마아트로비라이드에스케이티-1(Trichoderma
atrovirideSKT-1)
56파라핀,파라핀오일(Paraffin,Paraffinicoil)
57펠라르곤산(Pelargonicacid)
58에틸포메이트(Ethylformate)
번호 물질명
1～50(생략)
<신설>
<신설>(2)(현행과같음)
(3)가공식품의잔류농약잠정기준적용
가공식품에잔류한농약에
대하여[별표3]에별도로잔
류허용기준을정하지않은경
우다음을적용한다.
<삭제>
①(현행과같음)
(4)∼(5)(현행과같음)
8)(현행과같음)
9)부정물질
(1)(현행과같음)
①발기부전치료제및그유사
물질
②～③(현행과같음)번호 물질명
1～50(현행과같음)
51이소프로필노르타다라필
(Isopropylnortadalafil)
52데스카본실데나필
(descarbonsildenafil)- 170 -현행 개정(안)
④기타의약품성분
10)～15)(생략)
16)수산물에대한규격
(1)히스타민:냉동어류,염장어류,
통조림,건조또는절단등단
순처리한것(어육,필렛,건멸
치등):200mg/kg이하(고등
어,다랑어류,연어,꽁치,청어,
멸치,삼치,정어리,몽치다래,
물치다래에한한다)
(2)～(3)(생략)
17)(생략)
4.(생략)
제3.장기보존식품의기준및규격
(생략)번호 물질명
1리오치로닌(T3)
2레보치록신(T4)
3에페드린(ephedrine)
4플루옥세틴(fluoxetine)
5펜플루라민(fenfluramine)
6N-니트로소펜플루라민
(N-nitrosofenfluramine)
<신설>
<신설>
<신설>
<신설>
<신설>④기타의약품성분
10)～15)(현행과같음)
16)수산물에대한규격
(1)히스타민:------------
--------------------
----------------------
--------------------
----------------------
------------- 몽치다래,
물치다래,방어에한한다)
(2)～(3)(현행과같음)
17)(현행과같음)
4.(현행과같음)
제3.장기보존식품의기준및규격
(현행과같음)번호 물질명
1리오치로닌(T3)
2레보치록신(T4)
3에페드린(ephedrine)
4플루옥세틴(fluoxetine)
5펜플루라민(fenfluramine)
6N-니트로소펜플루라민
(N-nitrosofenfluramine)
7페놀프탈레인(phenolphthaleine)
8요힘빈(yohimbine)
9이카린(icarine)
10센노사이드(sennoside)
11카스카로사이드(cascaroside)
제4.식품별기준및규격
1.～6.(생략)제4.식품별기준및규격
1.～6.(현행과같음)- 171 -현행 개정(안)
7.식용유지류
(생략)
7-1식물성유지류
1)정의
식물성유지류라함은유지를함유
한식물(파쇄분포함)로부터얻은
원료유지를식용에적합하게처리
한것이거나이를원료로하여제
조․가공한것으로콩기름,옥수
수기름,채종유,미강유,참기름,
추출참깨유,들기름,추출들깨
유,홍화유,해바라기유,목화씨
기름,땅콩기름,올리브유,팜유
류,야자유,고추씨기름등을말
한다.
2)(생략)
3)제조․가공기준
(1)～(3)(생략)
(4)압착또는이산화탄소(초임계
추출)로얻어진참기름과들기
름에는다른식용유지를일절
혼합하여서는아니된다.
(5)(생략)
<신설>7.식용유지류
(현행과같음)
7-1식물성유지류
1)정의
---------------------------
---------------------------
---------------------------
---------------------------
---------------------------
--------------- 미강유,참기름,
들기름,홍화유,------------
-------------------------
-------------------------
-------------------------
---.
2)(현행과같음)
3)제조․가공기준
(1)～(3)(현행과같음)
(4)참기름과들기름에는다른
식용유지를일절혼합하여서
는아니된다.
(5)(현행과같음)
(6)향미유제조시참깨,들깨또는
이들로부터유래한유지를사
용하여서는아니된다(다만,- 172 -현행 개정(안)
4)식품유형
(1)～(4)(생략)
(5)참기름
참깨를압착하여얻은압착
참기름또는이산화탄소(초임
계추출)로추출한초임계추출
참기름을말한다.
(6)추출참깨유
참깨로부터추출한원료유
지를정제한것을말한다.
(7)들기름
들깨를압착하여얻은압착
들기름또는이산화탄소(초임
계추출)로추출한초임계추출
들기름을말한다.
(8)추출들깨유
들깨로부터추출한원료유
지를정제한것을말한다.
(9)～(16)(생략)
(17)기타식물성유지
단일식물성원료로부터채
취한원료유지를식용에적합
하도록처리한것또는압착
방법으로착유하고남은박
으로부터채취한원료유지를식품첨가물제외).
4)식품유형
(1)～(4)(현행과같음)
(5)참기름
참깨로부터채취한원유를
식용에적합하도록처리한것
을말한다.
<삭제>
(6)들기름
들깨로부터채취한원유를
식용에적합하도록처리한것
을말한다.
<삭제>
(7)～(14)(현행과같음)
(15)기타식물성유지
단일식물성원료로부터
채취한원료유지를식용에
적합하도록처리한것으로
상기의(1)～(14)의식품유
형에해당되지않는것을말- 173 -현행 개정(안)
식용에적합하도록정제처리
한것을말한다.다만,다른
기준및규격이정하여져있
는것은그기준․규격에의
한다.
5)규격
(생략)
*팔미트산(C16:0),스테아르산
(C18:0),올레산(C18:1),리놀레산
(C18:2),리놀렌산(C18:3),아라키딘
산(C20:0)중리놀렌산함량
(생략)
6)(생략)
7-2(생략)
7-3식용유지가공품유형
항목참기름추출참깨유 들기름 추출들깨유
(1)산가 4.0이하 0.6이하 5.0이하 0.6이하
(2)요오드가 103~118 103~118 160~209 160~209
(3)산 화 방 지 제
(g/kg)- -다음에서 정하는 것 이외의 산화방지
제가 검출되어서는 아니 된다.
부틸히드록
시아니솔
디부틸히드
록시톨루엔
터셔리부틸
히드로퀴논0.2이하(병용할 때
에는 부틸히드록시
아니솔 ,디부틸히드
록시톨루엔 및 터셔
리부틸히드로퀴논으
로서의 사용량의 합
계가 0.2이하)
몰식자산
프로필0.1이하
(4)리놀렌산
(%)*0.5이하 - - -
(5)에루스산
(%)검 출 되 어 서 는 
아니 된다.- - -한다.
5)규격
(현행과같음)
*-------------------------
--------------------------
--------------------------
------------------
(현행과같음)
6)(현행과같음)
7-2(현행과같음)
7-3식용유지가공품유형
항목참기름 들기름
(1)산가0.6이하
(압착유는 4.0이하)0.6이하
(압착유는 5.0이하)
(2)요오드가 103~118 160~209
(3)산 화 방 지 제
(g/kg)-다음에서 정하는 것 이외의 산화방지
제가 검출되어서는 아니 된다.
부틸히드록시
아니솔
디부틸히드록
시톨루엔
터셔리부틸히
드로퀴논0.2이하(병용
할 때에는 부
틸히드록시아
니솔,디부틸히
드록시톨루엔 
및 터셔리부틸
히드로퀴논으
로서의 사용량
의 합계가 0.2
이하)
몰식자산프
로필0.1이하
(4)리놀렌산
(%)*0.5이하 -
(5)에루스산
(%)검출되어서는 아니 
된다.-- 174 -현행 개정(안)
1)∼2)(생략)
3)제조․가공기준
<신설>
4)식품유형
(1)혼합식용유
이고시에서제품유형이정
하여진2종이상의식용유지
(다만,압착한참기름,압착한
들기름,향미유제외)를단순
히혼합한것을말한다.
(2)향미유
식용유지(다만,압착참기름,
초임계추출참기름,압착들기
름,초임계추출들기름은제외)
에향신료,향료,천연추출물,
조미료등을혼합한것(식용
유지50%이상)으로서,조리
또는가공시식품에풍미를
부여하기위하여사용하는것
을말한다.
(3)～(7)(생략)
(8)기타식용유지가공품
식물성유지또는동물성유지
를주원료(다만,압착한참기1)∼2)(현행과같음)
3)제조․가공기준
(1)참기름과들기름에는다른
식용유지를일절혼합하여서
는아니된다.
4)식품유형
(1)혼합식용유
이고시에서제품유형이정
하여진2종이상의식용유지
(다만,참기름,들기름,향미유는
제외)를단순히혼합한것을
말한다.
(2)향미유
식용유지(다만,참기름,들기
름은제외)에향신료,향료,
천연추출물,조미료등을혼합
한것(식용유지50%이상)으
로서,조리또는가공시식품
에풍미를부여하기위하여사
용하는것을말한다.
(3)～(7)(현행과같음)
(8)기타식용유지가공품
식물성유지또는동물성유지
를주원료(다만,참기름,들기- 175 -현행 개정(안)
름,압착한들기름은제외한다)
로하여가공한것을말한다.
5)～6)(생략)
8.～23.(생략)
제3.∼제4.(생략)름은제외)로하여가공한것
을말한다.
5)～6)(현행과같음)
8.～23.(현행과같음)
제3.∼제4.(현행과같음)
제5.식품접객업소(집단급식소포함)의
조리식품등에대한기준및규격
1.(생략)
2.원료기준
1)원료의구비요건
(1)(생략)
(2)원료및기구등의세척,
식품의조리,먹는물등으로
사용되는물은「먹는물관
리법」의수질기준에적합한
것이어야하며,노로바이
러스가검출되어서는아니
된다(수돗물은제외).
(3)∼(4)(생략)
2)(생략)
3.∼5.(생략)제5.식품접객업소(집단급식소포함)의
조리식품등에대한기준및규격
1.(현행과같음)
2.원료기준
1)원료의구비요건
(1)(현행과같음)
(2)---------------------
---------------------
---------------------
---------------------
-------------- 노로바이
러스,A형·E형간염바이러
스,로타바이러스,아스트로
바이러스,장관아데노바이러
스,사포바이러스가검출되어
서는아니된다(단,수돗물
및염소등으로소독한식
품용수는제외한다).
(3)∼(4)(현행과같음)
2)(현행과같음)
3.∼5.(현행과같음)- 176 -현행 개정(안)
제6.(생략)
제7.일반시험법
1.∼3.(생략)
4.미생물시험법
4.1∼4.25(생략)
<신설>제6.(현행과같음)
제7.일반시험법
1.∼3.(현행과같음)
4.미생물시험법
4.1∼4.25(현행과같음)
4.26식품용수등의A형간염바이
러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodium
thiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황
산나트륨100g을녹여최종
5,000mL의용액을제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품
용수채수시검체의pH를
조정하는데사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccated
powder)용액
1,900mL의증류수에Beef
extract분말30g과glycine
7.5g(최종농도=0.05M)을
넣고1MNaOH를이용하여- 177 -현행 개정(안)
pH9.5로조정한후최종2
L로제조하고121℃,15분간
고압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주
일간혹은-20℃에서장기간
동안보관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7
수화물(Sodiumphosphate,
dibasic,(Na2HPO47H2O))
용액
950mL의증류수에Sodium
phosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로
조정한후최종1L로제조
하고121℃,15분간고압증기
멸균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의
수산화나트륨을넣고최종
500mL로제조하여수산화나
트륨용액을준비한다.수산
화나트륨용액은상온에서수
개월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트
(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추- 178 -현행 개정(안)
출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동
등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500
∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주
입기,유량조절밸브,압력게
이지,탈리액주입구,양전하
카트리지필터(positive
cartridgefilter),카트리지
하우징(cartridgehousing),
탈리액유출구,유량계,용
수유출구
※양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)
:1-MDS,NanoCeram
또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용
수의수소이온농도를측정
한다.
다)휴대용탁도측정기：식품- 179 -현행 개정(안)
용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：
식품용수의잔류염소농도
를측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품
용수채수후양전하카트리
지필터(positivecartridge
filter)를운반하기위해사용
한다.
바)상업용얼음팩：양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter)운반시
냉장상태유지용으로사용
한다.
사)기타：공구상자,2L멸균
비커,멸균된알루미늄박,
클램프,바이러스시료검
체기록부,멸균장갑,수은
온도계,멸균메스실린더,
채수용호스
- 180 -현행 개정(안)
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기
ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지
ⓔ탈리액주입구ⓕ감압단추
ⓖ양전하카트리지필터ⓗ카
트리지하우징ⓘ탈리액유출구
ⓙ유량계ⓚ용수유출구
《표준필터장치》
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전
하카트리지필터로유입
시켜흡착된바이러스를탈
리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용
호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유
입구,탈리액유출구,압력
게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼
10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL
용량)
다)0.22μm주사기필터(30- 181 -현행 개정(안)
mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착
용하여바이러스가오염되지
않게주의하고오염이될수
있는환경요인들을피하여야
한다.멸균된장갑이사람의
피부나오염가능성이있는장
치,부품에접촉이되었을경우
장갑을바꿔착용한다(예:수
도꼭지나다른환경요소표
면).
가)채수하려는검체의배출구
(수도꼭지등)를2～3분정
도열고식품용수를흘려보
낸다.배출구에채수호스를
장착시누수가되지않도
록클램프를이용하여단단
히연결하고탁도가균일할
때까지흘려보낸후배출
구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)
나불꽃버너를이용하여
배출구(수도꼭지등)를살
균또는가열한다.- 182 -현행 개정(안)
다)채수용호스의알루미늄박을
제거한후채수할배출구에
연결하고표준필터장치용
수유입구(ⓐ)에호스를연
결한다.이단계에서양전
하카트리지필터(ⓖ)는연
결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압력
게이지가200kPa(30PSI)가
넘지않도록배출구를조절하고
76L(20gal)의식품용수를
흘려보낸다.
마)식품용수76L를흘려보
낸후일부를2L멸균비
커에받아용수의탁도,pH,
온도,염소농도를각각측
정하여검체번호,채수위치,
채수자의이름과함께바이
러스검체채수기록부에 기
록한다.pH측정기는사용
전보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)를
잠그고검체가다음의조건
에해당되어부가장치의연
결이필요한지의여부를결
정하여연결한다.- 183 -현행 개정(안)
(1)pH8이상일경우멸균된
튜브로단일주입기(ⓑ)와
1M염산용액이담긴메
스실린더를연결하고,배
출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～
7.5가되도록단일주입기
를통해1M염산용액을
흘려보낸다.용수유출구
(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검체
채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위와
같이단일주입기를연결하여
식품용수3.8L(1gal)당
2%티오황산나트륨용액
10mL이주입되도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당할
경우이중주입기를연결하여
사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에
검체채취일,시작시간,
유량계의초기수치를기
록한다.
아)알루미늄박을제거한양전
하카트리지필터를탈리액- 184 -현행 개정(안)
주입구(ⓔ)와유출구(ⓘ)
사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면
서카트리지하우징상단의
감압단추(ⓕ,ventbutton)
를눌러내부공기가완전히
빠지도록한후,수도꼭지
를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30
PSI)이하로유지되도록유
량조절밸브를조정하고식
품용수1,500～1,800L를
통과시킨후,용수배출구
(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에
검체채취종료일,종료시
간,유량계의최종수치등
을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리
지하우징(ⓗ)을분리하고
양전하카트리지필터를
거꾸로하여남은물을버린
후하우징양끝의연결된
개구부를멸균된알루미늄
박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를아- 185 -현행 개정(안)
이스박스에담고얼음팩등을
사용하여냉장상태(냉동시
켜서는아니된다)로유지
하여즉시실험실로운반
한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터
는채수시작시간부터24
시간내에실험실에서바
이러스탈리시험을실시하
여야한다.다만,부득이한
경우로인해24시간내에
탈리시험이불가할경우
최대72시간이넘지않도
록한다.
나)탈리용거치대에카트리지
하우징을장착한후유량
조절밸브를모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량
펌프호스를연결한후연
동정량펌프와1.5%Beef
extract용액이채워져있는
유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는
1L,NanoCeram필터에는
0.5L의1.5%Beefextract- 186 -현행 개정(안)
용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용
호스를연결하여1.5%
Beefextract용액이들어
있는유리병에넣고탈리
액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여
양전하카트리지필터하
우징안으로1.5%Beef
extract용액이양전하카
트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를
통해1.5%Beefextract
용액이넘쳐흘러나오기
시작하면감압단추에서손을
떼고,연동정량펌프가동을
멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양
전하카트리지필터안으로
가득채워질때까지눌러
준다.
바)탈리액유출구를열고연동
정량펌프를다시가동한후
하우징에채워져있는1.5%
Beefextract용액이서서히
필터를통과하도록한다.통- 187 -현행 개정(안)
과한완충액은1.5%Beef
extract용액이들어있던
유리병에수집한다.탈리액
을회수할때는거품이없도
록주의하여야한다.
※연동정량펌프대신양압
펌프와압력통을사용하
여탈리과정을진행할수
도있다.
사)유리병에수집된탈리액은
라)～바)의과정을2회반복
한다.
아)최종탈리액은1M염산용액
으로pH를7.0～7.5사이로
조절하고멸균된메스실린
더를사용하여부피를기
록한다.
자)탈리액은24시간이내에농
축시험이가능할경우4℃에
서보관하며,농축시험을
즉시시행하기어려울때에
는-70℃에서보관한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서
혼합하면서1M염산용액
으로pH를3.5±0.1로조절한- 188 -현행 개정(안)
후,실온에서30분간천천
히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을
멸균한원심분리용기에옮겨
원심분리한다(2,500G15분,
4℃).
다)원심분리후,상등액을제거
하고남은침전물에0.15
Msodiumphosphate완충액
(pH9.0～9.5)을20～30
mL넣어완전히부유시킨
후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리
한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용
액으로pH7.0～7.5로조절
한다.
바)미생물오염을방지하기위해
30mL주사기를이용하여
상등액을0.22μm주사기
필터로여과한다.검체중의
바이러스가필터에흡착되
는것을방지하기위하여사
전에0.22μm주사기필터
에10～20mL의1.5%Beef
extract용액(pH7.0～7.5)- 189 -현행 개정(안)
을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=final
concentratedsample
volume)을기록하고검체를
24시간이내에분석할경우는
4℃에보관하고나머지는
분석전까지-70℃에보관
한다.
아)최종농축검체20～30mL
는바이러스유전자추출을
위한검체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출
키트(kit)를사용하며,제조사
가제시하는적절한실험법에
따라실시한다.
※재현성및검출효율등을고려
하여QIAGEN-ViralRNA
MiniKits또는동등이상의
제품이사용이가능하며,또한
자동유전자추출장치를사용
할경우에도바이러스RNA
추출키트를사용하여바이
러스유전자를추출할수
있다.
가)바이러스유전자추출시- 190 -현행 개정(안)
검체와동일한과정으로
음성대조군(negative
control)을사용하여유전
자를추출하며검체의경우
시험진행중오염여부를
확인하기위해2개의RNA
를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군
각280μL에AVL완충액
(guanidinethiocyanate함
유)1,120 μL를각각혼합
하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분
리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올
1,120 μL을넣어혼합한후
가볍게원심분리
(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심
(Minispin)컬럼으로옮겨
6,000G에서1분간원심분리
하고컬럼을새로운회수용
(collection)튜브로옮긴다음
남은혼합액을630μL씩
동일한방법으로컬럼에- 191 -현행 개정(안)
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을
새로운회수용(collection)
튜브로옮겨AW1완충액
(guanidinehydrochloride
함유)500μL을넣고6,000
G로1분간원심분리후컬
럼을새로운회수용
(collection)튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고
20,000G로3분간원심분리
한후컬럼을새로운1.5
mL회수용(collection)튜
브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide
함유)60μL를넣고6,000
G로1분간원심분리하여
다음의RT-PCR(Reverse
transcription-Polymerase
chainreaction)을수행하기
위한주형(template)으로
사용한다.
5)A형간염바이러스유전자
PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reversetranscription
-PCR)과정에서는A형간염바- 192 -현행 개정(안)
이러스를인위적으로조합하여
합성한RNA등을PCR양성대
조군으로사용할수있다.
가)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)방법은
아래와같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과
같이Mastermix(2X)25μ
L,Reversetranscriptase
(50unit/μL)1μL,프라이
머(HAV1,HAV2)는각
2μL,추출RNA5μL를
첨가하여증류수로총50
μL로맞추고반응시킨다.
(2)PCR반응조건은표2와
같이48℃에서40분,95℃
에서4분DNA를변성시
키고,95℃30초,55℃30
초,72℃30초를1회로하
여30회반응시킨후,7
2℃에서7분간연장반응
시킨다.상기반응종료
후PCR생성물에대하여
NestedPCR을실시한다.- 193 -현행 개정(안)
Component Volume Primers
Mastermix(2X) 25μL -
Reverse transcriptase (50unit/ μL) 1μL -
D.W. 15μL -
Forward primer(20pmol) 2μL HAV1
Reverse primer(20pmol) 2μL HAV2
Extracted RNA, PCR control 5μL -
Total 50μL -표1.A형간염바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응액
조성
온도 시간 Cycle
cDNA합성 (cDNA synthesis)
초기 변성 (predenaturation)48℃
95℃40min
4min1
cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)95℃
55℃
72℃30sec
30sec
30sec30
cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 7min1
cycle
보관 4℃∞∞표2.A형간염바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응조건
및온도
나)NestedPCR방법은아래
와같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)산물을
주형으로하여표3과같이- 194 -현행 개정(안)
NestedPCR을실시한다.
1차PCR산물5μL,10x
완충액(MgCl2포함)5μL,
dNTPs(10mM)4μL,
TaqDNApolymerase(5
unit/μL)1μL,프라이머
(HAV3,HAV4)는각2μ
L첨가한다음최종증류
수로총50μL로맞춘후
NestedPCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표4와
같이95℃에서4분간
DNA를변성시키고95℃
30초,55℃30초,72℃30
초를1회로하여30회를
반응시킨후72℃에서7분
간연장반응시킨다.
Component Volume primers
dNTPs(10mM) 4μL -
10x Buffer(with MgCl 2) 5μL -
D.W. 31μL -
Forward primer(20 pmol) 2μL HAV3
Reverse primer(20 pmol) 2μL HAV4
Taq DNA polymerase(5
unit/μL)1μL -
1stPCR Product 5μL -
Total 50μL표3.A형간염바이러스NestedPCR
반응액조성- 195 -현행 개정(안)
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)95℃ 4min1
cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)9 5℃
55℃
72℃30sec
30sec
30sec30
cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 7min1
cycle
보관 4℃∞∞표4.A형간염바이러스Nested
PCR반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR
증폭반응액5μL를전기
영동완충액(gelloading
buffer)1μL와혼합한다음
젤(gel)의각홈에검체를
조심스럽게넣고나머지
한홈에PCR증폭산물의
크기를식별하기에적당
한표식DNA(marker
DNA)7μL를넣는다.
1.5%아가로스젤
(agarosegel)상에서
100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)
염색액(10mg/mL)으로
30분간염색한후증류수로- 196 -현행 개정(안)
10분간탈색하고자외선조
사기(UVtransilluminator)
로조사하여증폭된DNA
밴드를관찰한다.
(4)A형간염바이러스유전자
증폭에사용하는프라이
머는표5와같다.
Primer Sequence(5'→3') ApplicationPCR
Size(bp)
HAV1GCT CCT CTT TAT CAT
GCT ATG GATOne-step
RT-PCR
244
HAV2CAG GAA ATG TCT
CAG GTA CTT TCTOne-step
RT-PCR
HAV3ATG TTA CTA CAC
AAG TTG GAG ATNested
PCR/
Sequencing186
HAV4GAT CCT CAA TTG
TTG TGA TAG CTNested
PCR/
Sequencing표5.A형간염바이러스PCR프라
이머염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)
상에서시료에PCR증폭
산물이186bp(또는244
bp)의밴드가있을경우A
형간염바이러스로일차
확인한다.
(2)만일음성대조군(negative
control)에서PCR밴드가
확인될경우등은재시험- 197 -현행 개정(안)
을실시해야한다(표6참
고).
(3)A형간염바이러스가일차
확인된경우최종확인을
위하여아가로스젤
(agarosegel)상에서해당
부위를절취하여PCR산
물을정제한후염기서열
(DNAsequencing)을분석
하여최종판정한다.
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+
- PCR검출
+
2+
- PCR검출
-
3+
+ 재 실험
+
4-
- PCR불검출
-표6.A형간염바이러스PCR결과
판정(예시)
+:A형간염바이러스PCR밴드
확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)을- 198 -현행 개정(안)
위하여다)의(3)에서정제된
DNA1μL를주형으로
HAV3과HAV4프라이머를
사용한다.
(2)염기서열분석
(sequencing)반응을위한
혼합조건은각유전자형
Nested프라이머(primer,1
pmol)를독립된각각의튜
브에2μL,dye-terminator
2μL,정제DNA2μL를
첨가하여증류수로최종10
μL가되도록하고96℃에서
1분간DNA를변성시킨후,
96℃에서10초간,50℃에
서5초간,60℃에서4분간
을1회로하여25회반응
시킨다음60℃에서10분
간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분
석(DNAsequencing)하되2
종이상의유전자가혼합
되어있는경우에는클로
닝염기서열분석(Cloning
DNAsequencing)을재실
시한다.염기서열분석- 199 -현행 개정(안)
<신설>(DNAsequencing)에의
해결정된염기서열은A형
간염바이러스유전자데이
터베이스(Referecne
sequence및NCBIblast)와
비교하여A형간염바이러
스로확인되었을경우검
출된것으로최종확인한다.
4.27식품용수등의E형간염바이
러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodium
thiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황
산나트륨100g을녹여최종
5,000mL의용액을제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품
용수채수시검체의pH를
조정하는데사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccated
powder)용액
1,900mL의증류수에Beef- 200 -현행 개정(안)
extract분말30g과glycine
7.5g(최종농도=0.05M)을
넣고1MNaOH를이용하여
pH9.5로조정한후최종2L
로제조하고121℃,15분간고
압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주
일간혹은-20℃에서장기간
동안보관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7
수화물(Sodiumphosphate,
dibasic,(Na2HPO47H2O))
용액
950mL의증류수에Sodium
phosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로
조정한후최종1L로제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의
수산화나트륨을넣고최종
500mL로제조하여수산화나
트륨용액을준비한다.수산화
나트륨용액은상온에서수개
월동안보관할수있다.- 201 -현행 개정(안)
6)바이러스유전자추출키트
(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추
출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동
등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수
1,500∼1,800L을채수하는
장치
구성:용수유입구,단일주
입기,유량조절밸브,압력게
이지,탈리액주입구,양전
하카트리지필터(positive
cartridgefilter),카트리지
하우징(cartridgehousing),
탈리액유출구,유량계,용수
유출구
※양전하카트리지필터(positive
cartridgefilter):1-MDS,
NanoCeram또는이와동등
한것- 202 -현행 개정(안)
나)휴대용pH측정기：식품용
수의수소이온농도를측정
한다.
다)휴대용탁도측정기：식품
용수의혼탁도를측정한
다.
라)휴대용염소농도측정기：
식품용수의잔류염소농도를
측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품
용수채수후양전하카트
리지필터(positive
cartridgefilter)를운반하
기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter)운반시
냉장상태유지용으로사용
한다.
사)기타：공구상자,2L멸균
비커,멸균된알루미늄박,
클램프,바이러스시료검체
기록부,멸균장갑,수은온도계,
멸균메스실린더,채수용
호스- 203 -현행 개정(안)
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기
ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지
ⓔ탈리액주입구ⓕ감압단추
ⓖ양전하카트리지필터ⓗ
카트리지하우징ⓘ탈리액유출
구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
《표준필터장치》
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전
하카트리지필터로유입시
켜흡착된바이러스를탈리
하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용
호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유
입구,탈리액유출구,압력
게이지
3)바이러스농축과정
- 204 -현행 개정(안)
가)원심분리기(4℃,2,500∼
10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL
용량)
다)0.22μm주사기필터(30
mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을
착용하여바이러스가오염되
지않게주의하고오염이될
수있는환경요인들을피하여
야한다.멸균된장갑이사람
의피부나오염가능성이있
는장치,부품에접촉이되었
을경우장갑을바꿔착용한다
(예:수도꼭지나다른환경요소
표면).
가)채수하려는검체의배출구
(수도꼭지등)를2～3분정도
열고식품용수를흘려보낸
다.배출구에채수호스를
장착시누수가되지않도
록클램프를이용하여단
단히연결하고탁도가균
일할때까지흘려보낸후- 205 -현행 개정(안)
배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)
나불꽃버너를이용하여
배출구(수도꼭지등)를살균
또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을
제거한후채수할배출구에
연결하고표준필터장치용
수유입구(ⓐ)에호스를연
결한다.이단계에서양전
하카트리지필터(ⓖ)는연
결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압
력게이지가200kPa(30
PSI)가넘지않도록배출
구를조절하고76L(20gal)
의식품용수를흘려보낸다.
마)식품용수76L를흘려보
낸후일부를2L멸균비
커에받아용수의탁도,pH,
온도,염소농도를각각측
정하여검체번호,채수위치,
채수자의이름과함께바이
러스검체채수기록부에 기
록한다.pH측정기는사용
전보정(calibration)한다.- 206 -현행 개정(안)
바)용수배출구(수도꼭지등)
를잠그고검체가다음의조
건에해당되어부가장치의
연결이필요한지의여부를
결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된
튜브로단일주입기(ⓑ)와
1M염산용액이담긴메
스실린더를연결하고,배
출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～
7.5가되도록단일주입기
를통해1M염산용액을
흘려보낸다.용수유출구
(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검체
채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위와
같이단일주입기를연결하여
식품용수3.8L(1gal)당
2%티오황산나트륨용액
10mL이주입되도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당할
경우이중주입기를연결하여
사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에- 207 -현행 개정(안)
검체채취일,시작시간,유
량계의초기수치를기록
한다.
아)알루미늄박을제거한양전
하카트리지필터를탈리
액주입구(ⓔ)와유출구
(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면
서카트리지하우징상단의
감압단추(ⓕ,ventbutton)
를눌러내부공기가완전
히빠지도록한후,수도꼭
지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30
PSI)이하로유지되도록유
량조절밸브를조정하고식
품용수1,500～1,800L를
통과시킨후,용수배출구
(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부에
검체채취종료일,종료시간,
유량계의최종수치등을
기록한다.
타)표준필터장치로부터카트리
지하우징(ⓗ)을분리하고
양전하카트리지필터를거- 208 -현행 개정(안)
꾸로하여남은물을버린
후하우징양끝의연결된
개구부를멸균된알루미늄
박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를
아이스박스에담고얼음팩
등을사용하여냉장상태(냉
동시켜서는아니된다)로
유지하여즉시실험실로운
반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터
는채수시작시간부터24
시간내에실험실에서바
이러스탈리시험을실시하
여야한다.다만,부득이한
경우로인해24시간내에
탈리시험이불가할경우
최대72시간이넘지않도
록한다.
나)탈리용거치대에카트리지
하우징을장착한후유량조
절밸브를모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량
펌프호스를연결한후연
동정량펌프와1.5%Beef- 209 -현행 개정(안)
extract용액이채워져있는
유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는
1L,NanoCeram필터에는
0.5L의1.5%Beefextract
용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용
호스를연결하여1.5%
Beefextract용액이들어
있는유리병에넣고탈리
액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여
양전하카트리지필터하
우징안으로1.5%Beef
extract용액이양전하카
트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를
통해1.5%Beefextract
용액이넘쳐흘러나오기
시작하면감압단추에서
손을떼고,연동정량펌프
가동을멈춘후5분간정
치한다.
※감압단추는탈리액이양
전하카트리지필터안으
로가득채워질때까지- 210 -현행 개정(안)
눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동
정량펌프를다시가동한후
하우징에채워져있는
1.5%Beefextract용액이
서서히필터를통과하도록
한다.통과한완충액은
1.5%Beefextract용액이
들어있던유리병에수집한다.
탈리액을회수할때는거품이
없도록주의하여야한다.
※연동정량펌프대신양압
펌프와압력통을사용하
여탈리과정을진행할수
도있다.
사)유리병에수집된탈리액은
라)～바)의과정을2회반
복한다.
아)최종탈리액은1M염산
용액으로pH를7.0～7.5
사이로조절하고멸균된
메스실린더를사용하여부
피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농
축시험이가능할경우4℃에
서보관하며,농축시험을- 211 -현행 개정(안)
즉시시행하기어려울때에
는-70℃에서보관한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서
혼합하면서1M염산용액
으로pH를3.5±0.1로조절
한후,실온에서30분간천
천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을
멸균한원심분리용기에옮겨
원심분리한다(2,500G15
분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제거
하고남은침전물에0.15M
sodiumphosphate완충액
(pH9.0～9.5)을20～30
mL넣어완전히부유시킨
후실온에10분간방치한
다.
라)부유시킨용액을원심분리
한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용
액으로pH7.0～7.5로조절
한다.
바)미생물오염을방지하기위해
30mL주사기를이용하여- 212 -현행 개정(안)
상등액을0.22μm주사기
필터로여과한다.검체중
의바이러스가필터에흡착
되는것을방지하기위하
여사전에0.22μm주사기
필터에10～20mL의1.5%
Beefextract용액(pH7.0～
7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량
(FCSV=finalconcentrated
samplevolume)을기록하
고검체를24시간이내에분
석할경우는4℃에보관하고
나머지는분석전까지-7
0℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는
바이러스유전자추출을
위한검체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출
키트(kit)를사용하며,제조사가
제시하는적절한실험법에따라
실시한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동등- 213 -현행 개정(안)
이상의제품이사용이가능
하며,또한자동유전자추
출장치를사용할경우에도
바이러스RNA추출키트를
사용하여바이러스유전자
를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시
검체와동일한과정으로
음성대조군(negative
control)을사용하여유전
자를추출하며검체의경
우시험진행중오염여부
를확인하기위해2개의
RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군
각280μL에AVL완충액
(guanidinethiocyanate함
유)1,120 μL를각각혼합
하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분
리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올
1,120 μL을넣어혼합한후
가볍게원심분리
(spin-down)한다.- 214 -현행 개정(안)
라)혼합액630μL을소량원심
(Minispin)컬럼으로옮겨
6,000G에서1분간원심분
리하고컬럼을새로운회수
용(collection)튜브로옮긴
다음남은혼합액을630μL
씩동일한방법으로컬럼에
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을
새로운회수용(collection)
튜브로옮겨AW1완충액
(guanidinehydrochloride
함유)500μL을넣고6,000
G로1분간원심분리후컬
럼을새로운회수용
(collection)튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣고
20,000G로3분간원심분
리한후컬럼을새로운1.5
mL회수용(collection)튜
브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide
함유)60μL를넣고6,000
G로1분간원심분리하여
다음의RT-PCR(Reverse
transcription-Polymerase- 215 -현행 개정(안)
chainreaction)을수행하기
위한주형(template)으로
사용한다.
5)E형간염바이러스유전자
PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)과정에서
는E형간염바이러스를인위
적으로조합하여합성한
RNA등을PCR양성대조군으
로사용할수있다.
가) One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)방법은
아래와같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과같
이Mastermix(2X)25μL,
Reversetranscriptase(50
unit/μL)1μL,프라이머
(3156N,3157N)는각1μ
L,추출RNA5μL를첨가
하여증류수로총50μL로
반응시킨다.
(2)PCR반응조건은표2와
같이50℃에서15분,95℃
에서2분DNA를변성시키- 216 -현행 개정(안)
고,95℃20초,52℃30초,
72℃1분을1회로하여35
회반응시킨후,72℃에서
5분간연장반응시킨다.상
기반응종료후PCR생
성물에대하여Nested
PCR을실시한다.
Component Volume Primer
Mastermix(2X) 25μL -
Reverse transcriptase (50unit/ μL) 1μL -
D.W. 17μL -
Forward primer(20pmol) 1μL 3156N
Reverse primer(20pmol) 1μL 3157N
Extracted RNA, PCR control 5μL -
Total 50μL -표1.E형간염바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응액
조성
온도 시간 Cycle
cDNA합성 (cDNA synthesis)
초기 변성 (predenaturation)50℃
95℃15min
2min1cycle표2.E형간염바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응조
건및온도- 217 -현행 개정(안)
나)NestedPCR방법은아래와
같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)산물을
주형으로하여표3과같
이NestedPCR을실시한
다.1차PCR산물2μL,
10x완충액(MgCl2포함)2
μL,dNTPs(10mM)2μL,
TaqDNApolymerase(1
unit/μL)1μL,프라이머
(3158N,3159N)는각1μL
첨가한다음최종증류수로
총20μL로맞춘후
NestedPCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표4와
같이94℃에서5분간
DNA를변성시키고94℃
30초,52℃30초,72℃30
초를1회로하여35회를
반응시킨후72℃에서10변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)95℃
52℃
72℃20sec
30sec
1min35
cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 5min 1cycle
보관 4℃∞∞- 218 -현행 개정(안)
분간연장반응시킨다.
Component Volume Primer
dNTPs(10mM) 2μL -
10x Buffer(with MgCl 2) 2μL -
D.W. 11μL -
Forward primer(10 pmol) 1μL 3158N
Reverse primer(10 pmol) 1μL 3159N
Taq DNA polymerase(1
unit/μL)1μL -
1stPCR Product 2μL -
Total 20μL표3.E형간염바이러스NestedPCR
반응액조성
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)94℃ 5min 1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)9 4℃
52℃
72℃30sec
30sec
30sec35
cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 10min 1cycle
보관 4℃∞∞표4.E형간염바이러스Nested
PCR반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR
증폭반응액5μL를전기
영동완충액(gelloading
buffer)1μL와혼합한다
음젤(gel)의각홈에검- 219 -현행 개정(안)
체를조심스럽게넣고나
머지한홈에PCR증폭
산물의크기를식별하기에
적당한표식DNA(marker
DNA)7μL를넣는다.
1.5%아가로스젤
(agarosegel)상에서
100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)
염색액(10mg/mL)으로
30분간염색한후증류수
로10분간탈색하고자외
선조사기(UV
transilluminator)로조사하
여증폭된DNA밴드를
관찰한다.
(4)E형간염바이러스유전자
증폭에사용하는프라이머
는표5와같다.- 220 -현행 개정(안)
Primer Sequence(5'→3')Applicati
onPCR Size(bp)
3156NAAT TAT GCC CAG TAC
CGG GTT GOne-step
RT-PCR
731
3157NCCC TTA TCC TGC TGA
GCA TTC TCOne-step
RT-PCR
3158NGTT ATG CTT TGC ATA
CAT GGC TNested
PCR/
Sequencin
g348
3159NAGC CGA CGA AAT CAA
TTC TGT CNested
PCR/
Sequencin
g표5.E형간염바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)프라이머
염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)
상에서시료에증폭산물이
348bp경우E형간염바이
러스로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negative
control)에서PCR밴드가
확인될경우등은재시험을
실시해야한다(표6참고).
(3)E형간염바이러스가일차
확인된경우최종확인을
위하여아가로스젤
(agarosegel)상에서해당
부위를절취하여PCR산
물을정제한후염기서열- 221 -현행 개정(안)
(DNAsequencing)을분석
하여최종판정한다.
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+
- PCR검출
+
2+
- PCR검출
-
3+
+ 재 실험
+
4-
- PCR불검출
-표6.E형간염바이러스PCR결과
판정(예시)
+:E형간염바이러스PCR밴드
확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)
을위하여다)의(3)에서정
제된DNA1μL를주형으
로3158N과3159N프라이
머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)
반응을위한혼합조건은
각유전자형Nested프라
이머(primer,1pmol)를
독립된각각의튜브에2μL,
dye-terminator2μL,정
제DNA2μL를첨가하여- 222 -현행 개정(안)
<신설>증류수로최종10μL가되
도록하고96℃에서1분간
DNA를변성시킨후,96℃
에서10초간,50℃에서5
초간,60℃에서4분간을1
회로하여25회반응시킨
다음60℃에서10분간연장
반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분
석(DNAsequencing)하되2
종이상의유전자가혼합
되어있는경우에는클로
닝염기서열분석(Cloning
DNAsequencing)을재실
시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의
해결정된염기서열은E
형간염바이러스유전자
데이터베이스(Referecne
sequence및NCBIblast)와
비교하여E형간염바이러
스로확인되었을경우검
출된것으로최종확인한다.
4.28식품용수등의로타바이러스
가.시약및시액- 223 -현행 개정(안)
1)2%티오황산나트륨(Sodium
thiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황
산나트륨100g을녹여최종
5,000mL의용액을제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용
수채수시검체의pH를조정
하는데사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccated
powder)용액
1,900mL의증류수에Beef
extract분말30g과glycine
7.5g(최종농도=0.05M)을
넣고1MNaOH를이용하여
pH9.5로조정한후최종2L
로제조하고121℃,15분간고
압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주
일간혹은-20℃에서장기간
동안보관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7
수화물(Sodiumphosphate,
dibasic,(Na2HPO47H2O))- 224 -현행 개정(안)
용액
950mL의증류수에Sodium
phosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로
조정한후최종1L로제조하
고121℃,15분간고압증기멸
균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의
수산화나트륨을넣고최종
500mL로제조하여수산화나
트륨용액을준비한다.수산화
나트륨용액은상온에서수개
월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트
(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추
출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동
등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치:식품용수- 225 -현행 개정(안)
1,500∼1,800L을채수하
는장치
구성:용수유입구,단일주
입기,유량조절밸브,압력게
이지,탈리액주입구,양전하
카트리지필터(positive
cartridgefilter),카트리지
하우징(cartridgehousing),
탈리액유출구,유량계,용수
유출구
※양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)
:1-MDS,NanoCeram
또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용
수의수소이온농도를측정
한다.
다)휴대용탁도측정기：식품
용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：
식품용수의잔류염소농도를
측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품
용수채수후양전하카트
리지필터(positive
cartridgefilter)를운반하- 226 -현행 개정(안)
기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter)운반시
냉장상태유지용으로사용
한다.
사)기타：공구상자,2L멸균
비커,멸균된알루미늄박,
클램프,바이러스시료검체
기록부,멸균장갑,수은온
도계,멸균메스실린더,채
수용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기
ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지
ⓔ탈리액주입구ⓕ감압단추
ⓖ양전하카트리지필터ⓗ
카트리지하우징ⓘ탈리액유
출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
《표준필터장치》
- 227 -현행 개정(안)
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전
하카트리지필터로유입
시켜흡착된바이러스를
탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용
호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유
입구,탈리액유출구,압력
게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼
10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL
용량)
다)0.22μm주사기필터(30
mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을
착용하여바이러스가오염되
지않게주의하고오염이될
수있는환경요인들을피하여
야한다.멸균된장갑이사람
의피부나오염가능성이있- 228 -현행 개정(안)
는장치,부품에접촉이되었
을경우장갑을바꿔착용한
다(예：수도꼭지나다른환경
요소표면).
가)채수하려는검체의배출구
(수도꼭지등)를2～3분정도
열고식품용수를흘려보낸
다.배출구에채수호스를
장착시누수가되지않도
록클램프를이용하여단
단히연결하고탁도가균
일할때까지흘려보낸후
배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)
나불꽃버너를이용하여
배출구(수도꼭지등)를살균
또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박을
제거한후채수할배출구에
연결하고표준필터장치용
수유입구(ⓐ)에호스를연
결한다.이단계에서양전
하카트리지필터(ⓖ)는연
결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압
력게이지가200kPa(30- 229 -현행 개정(안)
PSI)가넘지않도록배출
구를조절하고76L(20
gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보낸후
일부를2L멸균비커에받
아용수의탁도,pH,온도,
염소농도를각각측정하여
검체번호,채수위치,채수자
의이름과함께바이러스
검체채수기록부에 기록한
다.pH측정기는사용전
보정(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)
를잠그고검체가다음의
조건에해당되어부가장치
의연결이필요한지의여
부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된
튜브로단일주입기(ⓑ)와
1M염산용액이담긴메
스실린더를연결하고,배
출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～
7.5가되도록단일주입기
를통해1M염산용액을- 230 -현행 개정(안)
흘려보낸다.용수유출구
(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검
체채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위
와같이단일주입기를연
결하여식품용수3.8L(1
gal)당2%티오황산나트
륨용액10mL이주입되
도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당
할경우이중주입기를연
결하여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에
검체채취일,시작시간,유
량계의초기수치를기록
한다.
아)알루미늄박을제거한양전하
카트리지필터를탈리액
주입구(ⓔ)와유출구(ⓘ)
사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면
서카트리지하우징상단의
감압단추(ⓕ,ventbutton)
를눌러내부공기가완전히
빠지도록한후,수도꼭지를- 231 -현행 개정(안)
완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30
PSI)이하로유지되도록유
량조절밸브를조정하고식
품용수1,500～1,800L를
통과시킨후,용수배출구
(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부
에검체채취종료일,종료
시간,유량계의최종수치
등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트
리지하우징(ⓗ)을분리하고
양전하카트리지필터를
거꾸로하여남은물을버
린후하우징양끝의연결
된개구부를멸균된알루
미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를
아이스박스에담고얼음팩
등을사용하여냉장상태
(냉동시켜서는아니된다)
로유지하여즉시실험실로
운반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터는- 232 -현행 개정(안)
채수시작시간부터24시간
내에실험실에서바이러스
탈리시험을실시하여야한
다.다만,부득이한경우로
인해24시간내에탈리시험
이불가할경우최대72시
간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지
하우징을장착한후유량
조절밸브를모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량
펌프호스를연결한후연
동정량펌프와1.5%Beef
extract용액이채워져있는
유리병에호스를차례로
연결하되,1-MDS필터는
1L,NanoCeram필터에는
0.5L의1.5%Beefextract
용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용
호스를연결하여1.5%
Beefextract용액이들어
있는유리병에넣고탈리
액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여
양전하카트리지필터하- 233 -현행 개정(안)
우징안으로1.5%Beef
extract용액이양전하카
트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를
통해1.5%Beefextract
용액이넘쳐흘러나오기
시작하면감압단추에서손을
떼고,연동정량펌프가동을
멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양
전하카트리지필터안으로
가득채워질때까지눌러
준다.
바)탈리액유출구를열고연동
정량펌프를다시가동한후
하우징에채워져있는1.5%
Beefextract용액이서서히
필터를통과하도록한다.통
과한완충액은1.5%Beef
extract용액이들어있던
유리병에수집한다.탈리액
을회수할때는거품이없
도록주의하여야한다.
※연동정량펌프대신양압
펌프와압력통을사용하
여탈리과정을진행할수- 234 -현행 개정(안)
도있다.
사)유리병에수집된탈리액은
라)～바)의과정을2회반
복한다.
아)최종탈리액은1M염산
용액으로pH를7.0～7.5
사이로조절하고멸균된
메스실린더를사용하여부
피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에
농축시험이가능할경우
4℃에서보관하며,농축시
험을즉시시행하기어려
울때에는-70℃에서보관
한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서
혼합하면서1M염산용액
으로pH를3.5±0.1로조절
한후,실온에서30분간천
천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을
멸균한원심분리용기에옮
겨원심분리한다(2,500G
15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제- 235 -현행 개정(안)
거하고남은침전물에0.15
Msodiumphosphate완충액
(pH9.0～9.5)을20～30
mL넣어완전히부유시킨
후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리
한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용
액으로pH7.0～7.5로조절
한다.
바)미생물오염을방지하기위
해30mL주사기를이용하
여상등액을0.22μm주사
기필터로여과한다.검체
중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기
위하여사전에0.22μm주
사기필터에10～20mL의
1.5%Beefextract용액(pH
7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량(FCSV=final
concentratedsample
volume)을기록하고검체
를24시간이내에분석할
경우는4℃에보관하고나
머지는분석전까지-70℃- 236 -현행 개정(안)
에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL
는바이러스유전자추출을
위한검체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추
출키트(kit)를사용하며,제조
사가제시하는적절한실험법
에따라실시한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동등
이상의제품이사용이가
능하며,또한자동유전자
추출장치를사용할경우
에도바이러스RNA추
출키트를사용하여바이
러스유전자를추출할수
있다.
가)바이러스유전자추출시
검체와동일한과정으로
음성대조군(negative
control)을사용하여유전
자를추출하며검체의경
우시험진행중오염여부
를확인하기위해2개의- 237 -현행 개정(안)
RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군
각280μL에AVL완충액
(guanidinethiocyanate함
유)1,120 μL를각각혼합
하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분
리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올
1,120 μL을넣어혼합한후
가볍게원심분리
(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원
심(Minispin)컬럼으로옮
겨6,000G에서1분간원
심분리하고컬럼을새로운
회수용(collection)튜브로
옮긴다음남은혼합액을
630μL씩동일한방법으로
컬럼에첨가하여원심분리
한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을
새로운회수용(collection)
튜브로옮겨AW1완충액
(guanidinehydrochloride- 238 -현행 개정(안)
함유)500μL을넣고6,000
G로1분간원심분리후컬
럼을새로운회수용
(collection)튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣
고20,000G로3분간원심
분리한후컬럼을새로운
1.5mL회수용(collection)
튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide
함유)60μL를넣고6,000
G로1분간원심분리하여
다음의RT-PCR(Reverse
transcription-Polymerase
chainreaction)을수행하기
위한주형(template)으로
사용한다.
5)로타바이러스유전자PCR
과정및결과판정
로타바이러스PCR을위한
RNA는95℃,5분동안
Pre-denaturation한후4℃에서
5분간방치하고사용한다.
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)과정에서는
로타바이러스를인위적으로- 239 -현행 개정(안)
조합하여합성한RNA등을
PCR양성대조군으로사용할수
있다.로타바이러스PCR은
VP4와VP7유전자두부위를
개별적으로각각증폭한다.
가)VP4와VP7유전자One
-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)방법
은아래와같이수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과같
이One-stepRT
P CR(Re v ers e
transcription-PCR)
Mastermix13.5μL,프라
이머(VP4:VP4F-M(20
pmol),Con2(20pmol),
VP7:Beg-9(20pmol),
End-9(20pmol))은각1
μL,추출RNA5μL를첨
가하여증류수로총25μL
로맞추고반응시킨다.
(2)VP4PCR반응조건은표
2와같이42℃에서40분
cDNA를합성하고,95℃
15분동안초기변성후,
94℃1분,50℃1분,72℃1- 240 -현행 개정(안)
분을1회로하여35회반응
시킨후,72℃에서7분간
연장반응시킨다.VP7
PCR반응조건은표3과
같이42℃에서30분
cDNA를합성하고,95℃
15분동안초기변성후,
94℃30초,42℃30초,7
2℃1분를1회로하여35회
반응시킨후,72℃에서7
분간연장반응시킨다.
ComponentVolumePrimers
VP4VP7
2XOne-stepRT-PCR
Mastermix13.5μL-
D.W.4.5μL-
Forwardprimer(20pmol)1μLVP4F-
MBeg-9
Reverseprimer(20pmol)1μLCon2End-9
ExtractedRNA5μL-
Total25μL-표1.로타바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반
응액조성(VP4,VP7개별)- 241 -현행 개정(안)
온도시간Cycle
cDNA합성(cDNA
synthesis)42℃40min1cycle
초기변성(predenaturation)95℃15min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
50℃
72℃1min
1min
1min35
cycles
최종신장(post-elongation)72℃7min1cycle
보관 4℃∞∞표2.로타바이러스VP4부분
O ne - s t ep
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응
조건및온도
표3.로타바이러스VP7부분
One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응조
건및온도
온도시간Cycle
cDNA합성(cDNAsynthesis)42℃30min1cycle
초기변성(predenaturation)95℃15min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
42℃
72℃30sec
30sec
1min35
cycles
최종신장(post-elongation)72℃7min1cycle
보관 4℃∞∞
(3)로타바이러스VP4,VP7
One-stepRT-PCR(Reverse- 242 -현행 개정(안)
transcription-PCR)에사
용하는프라이머는표4와
같다.
표4.로타바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)프
라이머염기서열
Target Primer Sequence(5' →3') 
VP4VP4F-MTGG CTT CGC TCA TTT ATA 
GAC A
Con2 ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
VP7Beg-9ATG TAT GGT ATT GAA TAT 
ACC AC
End-9 AAC TTG CCA CCA TTT TTT CC
나)VP4,VP7One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)산
물을주형으로하여
MultiplexPCR을실시한다.
(1)VP4PCR조성조건은
표5와같이1차PCR산
물2μL,PCRPremix10
μL,프라이머VP4F-M1μ
L(20pmol),1T-11μ
L(20pmol),2T-11μ
L(20pmol),3T-11μ
L(20pmol),4T-12μ- 243 -현행 개정(안)
L(20pmol),5T-11μ
L(20pmol),P[11]1μ
L(20pmol)증류수로
총25μL로맞춘후
MultiplexPCR을실시
한다.PCR반응조건은
표6과같이95℃에서5
분간DNA를변성시키
고94℃30초,42℃30
초,72℃30초를1회로
하여25회를반응시킨
후72℃에서7분간연
장반응시킨다.
(2)VP7PCR조성조건은
표7과같이1차PCR산
물2μL,PCRpremix
10 μL,프라이머
End-91μL(20pmol),
aBT111μL(20
pmol),aCT21μL(20
pmol),aET31μL(20
pmol),aDT41μL(20
pmol),aAT81μL(20
pmol),aFT91μL(20
pmol),G101μL(20- 244 -현행 개정(안)
pmol)증류수로총25
μL로맞춘후Multiplex
PCR을실시한다.PCR
반응조건은표8과같이
94℃에서2분간DNA를
변성시키고94℃1분,4
8℃2분,68℃1분을1
회로하여30회를반응
시킨후68℃에서7분
간연장반응시킨다.
ComponentVolumePrimerGenotype
PCRPremix10μL--
D.W.6μL--
Forwardprimer(20pmol)각1μL1T-1
2T-1
3T-1
4T-1
5T-1
P[11]P1A[8]
P1B[4]
P2A[6]
P3[9]
P4[10]
P[11]
Reverseprimer(20pmol)1μLVP4F-
M-
1stPCRProduct2μL--
Total25μL--표5.로타바이러스VP4Multiplex
PCR반응액조성
표6.로타바이러스VP4Multiplex
PCR반응조건및온도- 245 -현행 개정(안)
온도시간Cycle
초기변성(predenaturation)95℃5min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
42℃
72℃30sec
30sec
30sec25
cycles
최종신장(post-elongation)72℃7min1cycle
보관 4℃∞∞
표7.로타바이러스VP7Multiplex
PCR반응액조성
표8.로타바이러스VP7Multiplex
PCR반응조건및온도ComponentVolumePrimerGenotype
PCRPremix10μL--
D.W.5μL--
Forward
primer(20pmol)각1μLaBT1
aCT2
aET3
aDT4
aAT8
aFT9
G10G1
G2
G4
G4
G8
G9
G10
Reverse
primer(10pmol)1μLEnd-9(R)-
1stPCRProduct2μL--
Total25μL--
온도시간Cycle
초기변성(predenaturation)94℃2min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
48℃
68℃1min
2min
1min30cycles
최종신장(post-elongation)68℃7min1cycle
보관 4℃∞∞- 246 -현행 개정(안)
(3)로타바이러스VP4,VP7
MultiplexPCR에사용하는
프라이머는표9와같다.
표9.로타바이러스VP4,VP7
MultiplexPCR프라이머
염기서열
(4)PCR반응종료후PCR
증폭반응액5μL를전
기영동완충액(gel
loadingbuffer)1μL와
혼합한다음젤(gel)의Target Primer Sequence(5' →3') 
VP4VP4F-M(F)TGGCTTCGCTCATTTATA
GACA
1T-1(R)TCTACTGGRTTRACN
TGC
2T-1(R)CTATTGTTAGAGGTT
AGAGTC
3T-1(R)TGTTGATTAGTTGGA
TTCAA
4T-1(R)TGAGACATGCAATTG
GAC
5T-1(R)ATCATAGTTAGTAGT
CGG
P[11](R)GTAAACATCCAGAAT
GTG
VP7End-9(R)AACTTGCCACCATTTTTT
CC
aBT1(F)CAAGTACTCAAATCA
ATGATGG
aCT2(F)CAATGATATTAACACATT
TTCTGTG
aET3(F)ACGAACTCAACACGA
GAGG
aDT4(F)CGTTTCTGGTGAGGA
GTTG
aAT8(F)GTCACACCATTTGTA
AATTCG
aFT9(F)CTTGATGTGACTAYA
AATAC
G10(F)ATGTCAGACTACARA
TACTGG- 247 -현행 개정(안)
각홈에검체를조심스
럽게넣고나머지한홈
에PCR증폭산물의크
기를식별하기에적당
한표식DNA(marker
DNA)7μL를넣는다.
1.5%아가로스젤
(agarosegel)상에서
100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)
염색액(10mg/mL)으로
30분간염색한후증류수
로10분간탈색하고자외
선조사기(UV
transilluminator)로조
사하여증폭된DNA밴
드를관찰한다.
다)1차결과확인
(1)VP4,VP7PCR증폭반
응액을전기영동하여표
10과비교하여PCR증폭
산물의크기가확인되면로
타바이러스로일차확인한다.
표10.VP4,VP7PCR증폭크기
VP4
P-genotype Primer PCR 산물크기(bp)- 248 -현행 개정(안)
(2)만일음성대조군(negative
control)에서PCR밴드가
확인될경우등은재시험을
실시해야한다(표11참고).
(3)로타바이러스가일차확인
된경우최종확인을위하여
아가로스젤(agarosegel)
상에서해당부위를절취
하여PCR산물을정제한
후염기서열(DNA
sequencing)을분석하여최
종판정한다.P1A[8] 1T-1 345
P1B[4] 2T-2 483
P2A[6] 3T-1 267
P3[9] 4T-1 391
P4[10] 5T-1 583
P[11] P[11] 312
VP7
G-genotype Primer PCR 산물크기(bp)
G1 aBT1 618
G2 aCT2 521
G3 aET3 682
G4 aDT4 452
G8 aAT8 754
G9 aFT9 179
G10 G10 266- 249 -현행 개정(안)
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+
- PCR검출
+
2+
- PCR검출
-
3+
+ 재 실험
+
4-
- PCR불검출
-표11.로타바이러스PCR결과판정
(예시)
+:로타바이러스PCR밴드확인됨,
-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNAsequencing)
을위하여다)의(3)에서정
제된DNA1μL를주형으로
VP4이나VP7Multiplex
PCR증폭에사용한프라
이머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)
반응을위한혼합조건은
각유전자형Multiplex프
라이머(primer,1pmol)를
독립된각각의튜브에2μ
L,dye-terminator2μL,
정제DNA2μL를첨가하
여증류수로최종10μL- 250 -현행 개정(안)
<신설>가되도록하고96℃에서
1분간DNA를변성시킨
후,96℃에서10초간,5
0℃에서5초간,60℃에서
4분간을1회로하여25회반
응시킨다음60℃에서10
분간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분석
(DNAsequencing)하되2
종이상의유전자가혼합
되어있는경우에는클로
닝염기서열분석(Cloning
DNAsequencing)을재실시
한다.염기서열분석(DNA
sequencing)에의해결정
된염기서열은로타바이
러스유전자데이터베이
스(Referecnesequence및
NCBIblast)와비교하여로
타바이러스로확인되었을
경우검출된것으로최종
확인한다.
4.29식품용수등의아스트로바이
러스
가.시약및시액- 251 -현행 개정(안)
1)2%티오황산나트륨(Sodium
thiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황
산나트륨100g을녹여최종
5,000mL의용액을제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용
수채수시검체의pH를조정
하는데사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccated
powder)용액
1,900mL의증류수에Beef
extract분말30g과glycine
7.5g(최종농도=0.05M)을
넣고1MNaOH를이용하여
pH9.5로조정한후최종2L
로제조하고121℃,15분간고
압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주
일간혹은-20℃에서장기간
동안보관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7
수화물(Sodiumphosphate,
dibasic,(Na2HPO47H2O))- 252 -현행 개정(안)
용액
950mL의증류수에Sodium
phosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로
조정한후최종1L로제조하
고121℃,15분간고압증기멸
균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의
수산화나트륨을넣고최종
500mL로제조하여수산화나
트륨용액을준비한다.수산화
나트륨용액은상온에서수개
월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트
(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추
출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동
등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수- 253 -현행 개정(안)
1,500∼1,800L을채수하
는장치
구성:용수유입구,단일주입
기,유량조절밸브,압력게이
지,탈리액주입구,양전하카
트리지필터(positivecartridge
filter),카트리지하우징
(cartridgehousing),탈리액유
출구,유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)
:1-MDS,NanoCeram
또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용
수의수소이온농도를측정
한다.
다)휴대용탁도측정기：식품
용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：
식품용수의잔류염소농도를
측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품
용수채수후양전하카트
리지필터(positive
cartridgefilter)를운반하
기위해사용한다.- 254 -현행 개정(안)
바)상업용얼음팩：양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter)운반시
냉장상태유지용으로사용
한다.
사)기타：공구상자,2L멸균
비커,멸균된알루미늄박,
클램프,바이러스시료검체
기록부,멸균장갑,수은온도
계,멸균메스실린더,채수
용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기
ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이
지ⓔ탈리액주입구ⓕ감압
단추ⓖ양전하카트리지필터
ⓗ카트리지하우징ⓘ탈리액
유출구ⓙ유량계ⓚ용수유
출구
《표준필터장치》
- 255 -현행 개정(안)
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전
하카트리지필터로유입
시켜흡착된바이러스를
탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용
호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유
입구,탈리액유출구,압력
게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼
10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL
용량)
다)0.22μm주사기필터(30
mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을
착용하여바이러스가오염되
지않게주의하고오염이될
수있는환경요인들을피하여
야한다.멸균된장갑이사람
의피부나오염가능성이있- 256 -현행 개정(안)
는장치,부품에접촉이되었
을경우장갑을바꿔착용한
다(예：수도꼭지나다른환경
요소표면).
가)채수하려는검체의배출구
(수도꼭지등)를2～3분정
도열고식품용수를흘려
보낸다.배출구에채수호
스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여
단단히연결하고탁도가
균일할때까지흘려보낸
후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)
나불꽃버너를이용하여
배출구(수도꼭지등)를살균
또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박
을제거한후채수할배출
구에연결하고표준필터장
치용수유입구(ⓐ)에호스
를연결한다.이단계에서
양전하카트리지필터(ⓖ)
는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압
력게이지가200kPa(30- 257 -현행 개정(안)
PSI)가넘지않도록배출
구를조절하고76L(20
gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보
낸후일부를2L멸균비
커에받아용수의탁도,
pH,온도,염소농도를각
각측정하여검체번호,채
수위치,채수자의이름과
함께바이러스검체채수기
록부에기록한다.pH측정
기는사용전보정
(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)
를잠그고검체가다음의
조건에해당되어부가장치
의연결이필요한지의여
부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된
튜브로단일주입기(ⓑ)와
1M염산용액이담긴메
스실린더를연결하고,배
출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～
7.5가되도록단일주입기- 258 -현행 개정(안)
를통해1M염산용액을
흘려보낸다.용수유출구
(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검체
채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위
와같이단일주입기를연
결하여식품용수3.8L(1
gal)당2%티오황산나트
륨용액10mL이주입되
도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당할
경우이중주입기를연결하
여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부
에검체채취일,시작시
간,유량계의초기수치를
기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전
하카트리지필터를탈리
액주입구(ⓔ)와유출구
(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면
서카트리지하우징상단의
감압단추(ⓕ,ventbutton)
를눌러내부공기가완전히- 259 -현행 개정(안)
빠지도록한후,수도꼭지를
완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30
PSI)이하로유지되도록
유량조절밸브를조정하고
식품용수1,500～1,800L를
통과시킨후,용수배출구
(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부
에검체채취종료일,종료
시간,유량계의최종수치
등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트
리지하우징(ⓗ)을분리하
고양전하카트리지필터
를거꾸로하여남은물을
버린후하우징양끝의연
결된개구부를멸균된알
루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를
아이스박스에담고얼음팩
등을사용하여냉장상태
(냉동시켜서는아니된다)
로유지하여즉시실험실
로운반한다.
2)바이러스탈리과정- 260 -현행 개정(안)
가)냉장보관하여운반한필
터는채수시작시간부터
24시간내에실험실에서
바이러스탈리시험을실
시하여야한다.다만,부득
이한경우로인해24시간
내에탈리시험이불가할
경우최대72시간이넘지
않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지
하우징을장착한후유량
조절밸브를모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량
펌프호스를연결한후연
동정량펌프와1.5%Beef
extract용액이채워져있
는유리병에호스를차례
로연결하되,1-MDS필터
는1L,NanoCeram필터
에는0.5L의1.5%Beef
extract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용
호스를연결하여1.5%
Beefextract용액이들어
있는유리병에넣고탈리
액유출구를닫는다.- 261 -현행 개정(안)
마)연동정량펌프를가동하여
양전하카트리지필터하
우징안으로1.5%Beef
extract용액이양전하카
트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를
통해1.5%Beefextract용
액이넘쳐흘러나오기시
작하면감압단추에서손을
떼고,연동정량펌프가동을
멈춘후5분간정치한다.
※감압단추는탈리액이양
전하카트리지필터안으
로가득채워질때까지
눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동
정량펌프를다시가동한
후하우징에채워져있는
1.5%Beefextract용액이
서서히필터를통과하도록
한다.통과한완충액은
1.5%Beefextract용액이
들어있던유리병에수집한
다.탈리액을회수할때는
거품이없도록주의하여야
한다.- 262 -현행 개정(안)
※연동정량펌프대신양압
펌프와압력통을사용하
여탈리과정을진행할수
도있다.
사)유리병에수집된탈리액은
라)～바)의과정을2회반
복한다.
아)최종탈리액은1M염산
용액으로pH를7.0～7.5
사이로조절하고멸균된
메스실린더를사용하여부
피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에농
축시험이가능할경우4℃
에서보관하며,농축시험을
즉시시행하기어려울때에
는-70℃에서보관한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서
혼합하면서1M염산용액
으로pH를3.5±0.1로조절
한후,실온에서30분간천
천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을
멸균한원심분리용기에옮
겨원심분리한다(2,500G- 263 -현행 개정(안)
15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제
거하고남은침전물에0.15
Msodiumphosphate완충
액(pH9.0～9.5)을20～30
mL넣어완전히부유시킨
후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리
한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용
액으로pH7.0～7.5로조절
한다.
바)미생물오염을방지하기위
해30mL주사기를이용하
여상등액을0.22μm주사
기필터로여과한다.검체
중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기
위하여사전에0.22μm주
사기필터에10～20mL의
1.5%Beefextract용액(pH
7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량
(FCSV=finalconcentrated
samplevolume)을기록하
고검체를24시간이내에- 264 -현행 개정(안)
분석할경우는4℃에보관
하고나머지는분석전까
지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL
는바이러스유전자추출
을위한검체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출
키트(kit)를사용하며,제조사
가제시하는적절한실험법에
따라실시한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동등
이상의제품이사용이가능
하며,또한자동유전자추
출장치를사용할경우에도
바이러스RNA추출키트
를사용하여바이러스유
전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시
검체와동일한과정으로
음성대조군(negative
control)을사용하여유전
자를추출하며검체의경
우시험진행중오염여부- 265 -현행 개정(안)
를확인하기위해2개의
RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군
각280μL에AVL완충액
(guanidinethiocyanate함
유)1,120 μL를각각혼합
하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분
리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올
1,120 μL을넣어혼합한후
가볍게원심분리
(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심
(Minispin)컬럼으로옮겨
6,000G에서1분간원심분
리하고컬럼을새로운회수
용(collection)튜브로옮긴
다음남은혼합액을630μL
씩동일한방법으로컬럼에
첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을
새로운회수용(collection)
튜브로옮겨AW1완충액
(guanidinehydrochloride- 266 -현행 개정(안)
함유)500μL을넣고6,000
G로1분간원심분리후컬
럼을새로운회수용
(collection)튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣
고20,000G로3분간원심
분리한후컬럼을새로운
1.5mL회수용(collection)
튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide
함유)60μL를넣고6,000
G로1분간원심분리하여
다음의RT-PCR(Reverse
transcription-Polymerase
chainreaction)을수행하
기위한주형(template)으
로사용한다.
5)아스트로바이러스유전자
PCR과정및결과판정
RT-PCR(Reversetranscription
-PCR)과정에서는아스트로
바이러스를인위적으로조합
하여합성한RNA등을PCR
양성대조군으로사용할수
있다.
가)One-stepRT-PCR(Reverse- 267 -현행 개정(안)
transcription-PCR)방법은
아래와같이수행한다.
(1)PCR조성조건은
Mastermix(2X)12.5 μL,
Re v ers e
transcriptase(50unit/μL)
0.5μL,프라이머(Mon269,
Mon270)는각2μL,추출
RNA2μL를첨가하여
증류수로총25μL로맞
추고반응시킨다.
(2)PCR반응조건은48℃에
서40분,94℃에서3분
DNA를변성시키고,94℃
30초,52℃30초,72℃1분
30초를1회로하여35회
반응시킨후,68℃에서5
분간연장반응시킨다.- 268 -현행 개정(안)
Component Volume Primer
Mastermix(2X) 12.5μL -
Reverse transcriptase (50unit/ μL) 0.5μL -
D.W. 6μL -
Forward primer(10 pmol) 2μL Mon 269
Reverse primer(10 pmol) 2μL Mon 270
Extracted RNA 2μL -
Total 25μL표1.아스트로바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응액
조성
온도 시간 cycle
cDNA합성 (cDNA synthesis)
초기 변성 (predenaturation)48℃
94℃40min
3min1cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)94℃
52℃
72℃30sec
30sec
1min
30sec35
cycles
최종신장 (post-elongation) 68℃ 5min 1cycle
보관 4℃∞∞표2.아스트로바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응조건
및온도
표3.아스트로바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)프라이
머염기서열
primer Sequence(5'→3') ApplicationPCR
Size(bP)
Mon 269CAA CTC AGG
AAA CAG GGT GTOne-step RT-
PCR/Sequen449- 269 -현행 개정(안)
나)1차결과확인
(1)아가로스젤(agarosegel)
상에서시료에증폭산물이
449bp경우아스트로바
이러스로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negative
control)에서PCR밴드가
확인될경우등은재시험을
실시해야한다(표4참고).
(3)아스트로바이러스가일차
확인된경우최종확인을
위하여아가로스젤
(agarosegel)상에서해
당부위를절취하여PCR
산물을정제한후염기서
열(DNAsequencing)을분
석하여최종판정한다.
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+- PCR검출+
2+- PCR검출-
3++ 재 실험+
4-- PCR불검출-표4.아스트로바이러스PCR결과
판정(예시)
+:아스트로바이러스PCR밴드cing
Mon 270TCA GAT GCA TTG
TCA TTG GTOne-step RT-
PCR/Sequen
cing- 270 -현행 개정(안)
확인됨,-:밴드가확인되지않음
다)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNA
sequencing)을위하여다)
의(3)에서정제된DNA1
μL를주형으로바이러스
유전형및진행방향에따라
Mon269및Mon270의프
라이머를사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)
반응을위한혼합조건은
각프라이머(primer,1
pmol)를독립된각각의튜
브에2 μL,
dye-terminator2μL,정
제DNA2μL를첨가하여
증류수로최종10μL가되
도록하고96℃에서1분간
DNA를변성시킨후,96℃
에서10초간,50℃에서5초
간,60℃에서4분간을1회
로하여25회반응시킨다
음60℃에서10분간연장
반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분- 271 -현행 개정(안)
<신설>석(DNAsequencing)하되
2종이상의유전자가혼합
되어있는경우에는클로
닝염기서열분석(Cloning
DNAsequencing)을재실
시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의
해결정된염기서열은아
스트로바이러스유전자데
이터베이스(Referecne
sequence및NCBIblast)와
비교하여아스트로바이러
스로확인되었을경우검
출된것으로최종확인한다.
4.30식품용수등의장관아데노바
이러스
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodium
thiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황
산나트륨100g을녹여최종
5,000mL의용액을제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
2)1M염산(HCl)용액- 272 -현행 개정(안)
1M염산(HCl)용액은식품용
수채수시검체의pH를조정
하는데사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccated
powder)용액
1,900mL의증류수에Beef
extract분말30g과glycine
7.5g(최종농도=0.05M)을
넣고1MNaOH를이용하여
pH9.5로조정한후최종2L
로제조하고121℃,15분간고
압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주
일간혹은-20℃에서장기간
동안보관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7
수화물(Sodiumphosphate,
dibasic,(Na2HPO47H2O))
용액
950mL의증류수에Sodium
phosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로
조정한후최종1L로제조하
고121℃,15분간고압증기멸
균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액- 273 -현행 개정(안)
400mL의증류수에20g의
수산화나트륨을넣고최종
500mL로제조하여수산화나
트륨용액을준비한다.수산화
나트륨용액은상온에서수개
월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트
시판되는바이러스DNA추
출키트(kit)를사용하며,제조
사가제시하는적절한실험법
에따라실시한다.
※또한자동유전자추출장치를
사용할경우에도바이러스
추출키트를사용하여바
이러스유전자를추출할
수있다.
나.장치및기구
1)검체채수과정
가)표준필터장치：식품용수1,500
∼1,800L을채수하는장치
구성:용수유입구,단일주입
기,유량조절밸브,압력게이
지,탈리액주입구,양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter),카트리지하- 274 -현행 개정(안)
우징(cartridgehousing),탈리
액유출구,유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)
:1-MDS,NanoCeram
또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용
수의수소이온농도를측정
한다.
다)휴대용탁도측정기：식품
용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：
식품용수의잔류염소농도를
측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품
용수채수후양전하카트
리지필터(positive
cartridgefilter)를운반하
기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter)운반시
냉장상태유지용으로사용
한다.
사)기타：공구상자,2L멸균
비커,멸균된알루미늄박,- 275 -현행 개정(안)
클램프,바이러스시료검체
기록부,멸균장갑,수은온
도계,멸균메스실린더,채
수용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기
ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지
ⓔ탈리액주입구ⓕ감압단추
ⓖ양전하카트리지필터ⓗ
카트리지하우징ⓘ탈리액유
출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
《표준필터장치》
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전
하카트리지필터로유입
시켜흡착된바이러스를
탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용
호스,탈리액유출용호스
- 276 -현행 개정(안)
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유
입구,탈리액유출구,압력
게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼
10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL
용량)
다)0.22μm주사기필터(30
mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을
착용하여바이러스가오염되지
않게주의하고오염이될수
있는환경요인들을피하여야
한다.멸균된장갑이사람의
피부나오염가능성이있는
장치,부품에접촉이되었을
경우장갑을바꿔착용한다
(예：수도꼭지나다른환경요
소표면).
가)채수하려는검체의배출구
(수도꼭지등)를2～3분정- 277 -현행 개정(안)
도열고식품용수를흘려
보낸다.배출구에채수호
스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여
단단히연결하고탁도가
균일할때까지흘려보낸
후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)
나불꽃버너를이용하여
배출구(수도꼭지등)를살균
또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박
을제거한후채수할배출
구에연결하고표준필터장
치용수유입구(ⓐ)에호스
를연결한다.이단계에서
양전하카트리지필터(ⓖ)
는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압
력게이지가200kPa(30
PSI)가넘지않도록배출
구를조절하고76L(20
gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보
낸후일부를2L멸균비- 278 -현행 개정(안)
커에받아용수의탁도,
pH,온도,염소농도를각
각측정하여검체번호,채
수위치,채수자의이름과
함께바이러스검체채수기
록부에기록한다.pH측정
기는사용전보정
(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)
를잠그고검체가다음의
조건에해당되어부가장치
의연결이필요한지의여
부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된
튜브로단일주입기(ⓑ)와
1M염산용액이담긴메
스실린더를연결하고,배
출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～
7.5가되도록단일주입기
를통해1M염산용액을
흘려보낸다.용수유출구
(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검체
채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위- 279 -현행 개정(안)
와같이단일주입기를연
결하여식품용수3.8L(1
gal)당2%티오황산나트
륨용액10mL이주입되
도록한다.
*(1)와(2)번이모두해당할
경우이중주입기를연결하여
사용한다.
사)바이러스검체채수기록부에
검체채취일,시작시간,유
량계의초기수치를기록
한다.
아)알루미늄박을제거한양전
하카트리지필터를탈리
액주입구(ⓔ)와유출구
(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면
서카트리지하우징상단의
감압단추(ⓕ,ventbutton)
를눌러내부공기가완전
히빠지도록한후,수도꼭
지를완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30
PSI)이하로유지되도록
유량조절밸브를조정하고
식품용수1,500～1,800L를- 280 -현행 개정(안)
통과시킨후,용수배출구
(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부
에검체채취종료일,종료
시간,유량계의최종수치
등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트
리지하우징(ⓗ)을분리하
고양전하카트리지필터
를거꾸로하여남은물을
버린후하우징양끝의연
결된개구부를멸균된알
루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를
아이스박스에담고얼음팩
등을사용하여냉장상태(냉
동시켜서는아니된다)로
유지하여즉시실험실로운
반한다.
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필
터는채수시작시간부터
24시간내에실험실에서
바이러스탈리시험을실시
하여야한다.다만,부득이한
경우로인해24시간내에- 281 -현행 개정(안)
탈리시험이불가할경우
최대72시간이넘지않도
록한다.
나)탈리용거치대에카트리지
하우징을장착한후유량
조절밸브를모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량
펌프호스를연결한후연
동정량펌프와1.5%Beef
extract용액이채워져있
는유리병에호스를차례
로연결하되,1-MDS필터
는1L,NanoCeram필터
에는0.5L의1.5%Beef
extract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용
호스를연결하여1.5%
Beefextract용액이들어
있는유리병에넣고탈리
액유출구를닫는다.
마)연동정량펌프를가동하여
양전하카트리지필터하
우징안으로1.5%Beef
extract용액이양전하카
트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를- 282 -현행 개정(안)
통해1.5%Beefextract
용액이넘쳐흘러나오기
시작하면감압단추에서손을
떼고,연동정량펌프가동
을멈춘후5분간정치한
다.
※감압단추는탈리액이양
전하카트리지필터안으
로가득채워질때까지
눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동
정량펌프를다시가동한후
하우징에채워져있는
1.5%Beefextract용액이
서서히필터를통과하도록
한다.통과한완충액은
1.5%Beefextract용액이
들어있던유리병에수집한
다.탈리액을회수할때는
거품이없도록주의하여야
한다.
※연동정량펌프대신양압
펌프와압력통을사용하
여탈리과정을진행할수
도있다.
사)유리병에수집된탈리액은- 283 -현행 개정(안)
라)～바)의과정을2회반
복한다.
아)최종탈리액은1M염산
용액으로pH를7.0～7.5사
이로조절하고멸균된메
스실린더를사용하여부피
를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에
농축시험이가능할경우
4℃에서보관하며,농축시
험을즉시시행하기어려울
때에는-70℃에서보관한
다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서
혼합하면서1M염산용액
으로pH를3.5±0.1로조절
한후,실온에서30분간천
천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을
멸균한원심분리용기에옮
겨원심분리한다(2,500G
15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제
거하고남은침전물에0.15
Msodiumphosphate완충- 284 -현행 개정(안)
액(pH9.0～9.5)을20～30
mL넣어완전히부유시킨
후실온에10분간방치한다.
라)부유시킨용액을원심분리
한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용
액으로pH7.0～7.5로조절
한다.
바)미생물오염을방지하기위
해30mL주사기를이용하
여상등액을0.22μm주사
기필터로여과한다.검체
중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기
위하여사전에0.22μm주
사기필터에10～20mL의
1.5%Beefextract용액(pH
7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량
(FCSV=finalconcentrated
samplevolume)을기록하
고검체를24시간이내에
분석할경우는4℃에보관
하고나머지는분석전까
지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL- 285 -현행 개정(안)
는바이러스유전자추출
을위한검체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스DNA추
출키트(kit)를사용하며,제조
사가제시하는적절한실험법
에따라실시한다.
※또한자동유전자추출장치
를사용할경우에도바이
러스추출키트를사용하
여바이러스유전자를추
출할수있다.
가)바이러스유전자추출시
검체와동일한과정으로
음성대조군(negative
control)을사용하여유전
자를추출하며검체의경
우시험진행중오염여부
를확인하기위해2개의
DNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군
각300 μL에
Lysis-Bindingsolution
buffer600μL를넣어혼합
하고가볍게원심분리한
후실온에서5분동안방- 286 -현행 개정(안)
치한다.
다)여기에Magneticbead를
40μL를넣어혼합한후
상온에서10분간방치한다.
라)Magnetictrapper에튜브
를장착한후상층액을모
두제거한다.
마)Magnetictrapper에서튜
브를꺼내Washing1
solution600μL를넣고
세척한후다시trapper에
장착하여상층액을모두
제거한다.
바)Trapper에서튜브를꺼내
어Washing2solution
600μL를첨가하여세척하
고다시trapper에장착하여
상층액을모두제거한다.
사)Trapper에서튜브를꺼내
어Washing3solution
600μL를첨가하여세척
하고다시trapper에장착
하여상층액을모두제거
한다.
아)Elutionbuffer160μL를
넣고5분간실온방치한다.- 287 -현행 개정(안)
자)Trapper에서튜브를꺼내
어60℃에서10분간방치
한후다시trapper에장착
하여상층액을취하며
PCR을수행하기위한주
형(template)으로사용한다.
5)장관아데노바이러스 유전자
PCR과정및결과판정
PCR(Polymerasechain
reaction)과정에서는장관아데노
바이러스를인위적으로조합하여
합성한DNA등을PCR양성대
조군으로사용할수있다.
가)PCR방법은아래와같이
수행한다.
(1)PCR조성조건은표1과
같이추출DNA5μL,
10x완충액(MgCl2포함)
5μL,dNTPs(10mM)4
μL,TaqDNA
polymerase1μL,프라이
머(AD1,AD2)는각1μL
첨가한다음최종증류수
로총50μL로맞춘후
PCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표2와같- 288 -현행 개정(안)
이94℃에서3분간DNA를
변성시키고94℃30초,5
0℃30초,72℃1분을1회
로하여35회를반응시킨
후72℃에서5분간연장
반응시킨다.
Component Volume Primer
dNTPs(10mM) 4μL -
10x Buffer(with MgCl 2) 5μL -
D.W. 33μL -
Forward primer(10 pmol) 1μL AD1
Reverse primer(10 pmol) 1μL AD2
Taq DNA polymerase 1μL -
DNA 5μL -
Total 50μL표1.장관아데노바이러스 PCR
반응액조성
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)94℃ 3min1
cycle
변성 (denaturation)
결합 (annealing)
확장 (extension)9 4℃
50℃
72℃30sec
30sec
1m in35
cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃ 5min1
cycle
보관 4℃∞∞표2.장관아데노바이러스 PCR반
응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR- 289 -현행 개정(안)
증폭반응액5μL를전기
영동완충액(gelloading
buffer)1μL와혼합한다
음젤(gel)의각홈에검
체를조심스럽게넣고나
머지한홈에PCR증폭
산물의크기를식별하기
에적당한표식
DNA(markerDNA)7μL
를넣는다.1.5%아가로
스젤(agarosegel)상에
서100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)
염색액(10mg/mL)으로
30분간염색한후증류수로
10분간탈색하고자외선
조사기(UVtransilluminator)
로조사하여증폭된DNA
밴드를관찰한다.
(4)장관아데노바이러스 유전
자증폭에사용하는프라
이머는표3과같다.- 290 -현행 개정(안)
PrimerSequence(5'→3')ApplicationPCR
Size(bP)
AD1TTCCCCATGGCICAY
AACACPCR/sequenc
ing
482
AD2CCCTGGTAKCCR
TRTTGTAPCR/sequenc
ing표3.장관아데노바이러스 PCR프
라이머염기서열
다)1차결과확인
(1)아가로즈젤(agarosegel)
상에서시료에PCR밴드의
크기가482bp로확인될
경우장관아데노바이러스
로일차확인한다.
(2)만일음성대조군(negative
control)에서PCR밴드가
확인될경우등은재시험을
실시해야한다(표4참고).
(3)장관아데노바이러스가 일
차확인된경우최종확인
을위하여아가로스젤
(agarosegel)상에서해당
부위를절취하여PCR산
물을정제한후염기서열
(DNAsequencing)을분석
하여최종판정한다.- 291 -현행 개정(안)
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+
- PCR검출
+
2+
- PCR검출
-
3+
+ 재 실험
+
4-
- PCR불검출
-표4.장관아데노바이러스 PCR결
과판정(예시)
+:장관아데노바이러스 PCR
밴드확인됨,-:밴드가확인되지
않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNA
sequencing)을위하여
다)의(3)에서정제된
DNA1μL를주형으로
AD1과AD2프라이머를
사용한다.
(2)염기서열분석(sequencing)
반응을위한혼합조건은
각유전자형Semi-nested
프라이머(primer,1pmol)
를독립된각각의튜브에
2μL,dye-terminator2μ- 292 -현행 개정(안)
<신설>L,정제DNA2μL를첨
가하여증류수로최종10
μL가되도록하고96℃에서
1분간DNA를변성시킨
후,96℃에서10초간,50℃
에서5초간,60℃에서4분
간을1회로하여25회반
응시킨다음60℃에서10
분간연장반응을시킨다.
(3)PCR산물은염기서열분
석(DNAsequencing)하되2
종이상의유전자가혼합
되어있는경우에는클로
닝염기서열분석(Cloning
DNAsequencing)을재실
시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의
해결정된염기서열은장
관아데노바이러스 유전자
데이터베이스(Referecne
sequence및NCBIblast)와
비교하여장관아데노바이
러스로확인되었을경우검
출된것으로최종확인한다.
4.31식품용수등의사포바이러스- 293 -현행 개정(안)
가.시약및시액
1)2%티오황산나트륨(Sodium
thiosulfate:Na2S2O3)용액
4,800mL의증류수에티오황
산나트륨100g을녹여최종
5,000mL의용액을제조하고
121℃,15분간고압증기멸균
한다.
2)1M염산(HCl)용액
1M염산(HCl)용액은식품용
수채수시검체의pH를조정
하는데사용한다.
3)1.5%Beefextract(desiccated
powder)용액
1,900mL의증류수에Beef
extract분말30g과glycine
7.5g(최종농도=0.05M)을
넣고1MNaOH를이용하여
pH9.5로조정한후최종2L
로제조하고121℃,15분간고
압증기멸균한다.Beef
extract용액은4℃에서일주
일간혹은-20℃에서장기간
동안보관할수있다.
4)0.15M인산일수소나트륨,7
수화물(Sodiumphosphate,- 294 -현행 개정(안)
dibasic,(Na2HPO47H2O))
용액
950mL의증류수에Sodium
phosphate40.2g을넣고1M
NaOH를이용하여pH9.5로
조정한후최종1L로제조하
고121℃,15분간고압증기멸
균한다.
5)1M수산화나트륨(NaOH)용액
400mL의증류수에20g의
수산화나트륨을넣고최종
500mL로제조하여수산화나
트륨용액을준비한다.수산화
나트륨용액은상온에서수개
월동안보관할수있다.
6)바이러스유전자추출키트
(ViralRNAMiniKits)
시판되는바이러스RNA추
출키트(kit)를사용한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동
등이상의제품사용가능
나.장치및기구
1)검체채수과정- 295 -현행 개정(안)
가)표준필터장치：식품용수
1,500∼1,800L을채수하
는장치
구성:용수유입구,단일주입
기,유량조절밸브,압력게이
지,탈리액주입구,양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter),카트리지하
우징(cartridgehousing),탈리액
유출구,유량계,용수유출구
※양전하카트리지필터
(positivecartridgefilter)
:1-MDS,NanoCeram
또는이와동등한것
나)휴대용pH측정기：식품용
수의수소이온농도를측정
한다.
다)휴대용탁도측정기：식품
용수의혼탁도를측정한다.
라)휴대용염소농도측정기：
식품용수의잔류염소농도를
측정한다.
마)휴대용아이스박스：식품
용수채수후양전하카트
리지필터(positive
cartridgefilter)를운반하- 296 -현행 개정(안)
기위해사용한다.
바)상업용얼음팩：양전하카
트리지필터(positive
cartridgefilter)운반시
냉장상태유지용으로사용
한다.
사)기타：공구상자,2L멸균
비커,멸균된알루미늄박,
클램프,바이러스시료검체
기록부,멸균장갑,수은온도
계,멸균메스실린더,채수
용호스
ⓐ용수유입구ⓑ단일주입기
ⓒ유량조절밸브ⓓ압력게이지
ⓔ탈리액주입구ⓕ감압단추
ⓖ양전하카트리지필터ⓗ
카트리지하우징ⓘ탈리액유
출구ⓙ유량계ⓚ용수유출구
《표준필터장치》
- 297 -현행 개정(안)
2)바이러스탈리과정
가)연동정량펌프：1.5%양전
하카트리지필터로유입
시켜흡착된바이러스를
탈리하기위한장치
나)연동정량펌프탈리액유입용
호스,탈리액유출용호스
다)자석교반기및자석교반막대
라)하우징거치대,탈리액유
입구,탈리액유출구,압력
게이지
3)바이러스농축과정
가)원심분리기(4℃,2,500∼
10,000G)
나)원심분리용기(50∼500mL
용량)
다)0.22μm주사기필터(30
mL용량)
다.시험방법
1)식품용수채수
채수할때는멸균된장갑을착
용하여바이러스가오염되지
않게주의하고오염이될수
있는환경요인들을피하여야- 298 -현행 개정(안)
한다.멸균된장갑이사람의피
부나오염가능성이있는장치,
부품에접촉이되었을경우장
갑을바꿔착용한다(예：수도
꼭지나다른환경요소표면).
가)채수하려는검체의배출구
(수도꼭지등)를2～3분정
도열고식품용수를흘려
보낸다.배출구에채수호
스를장착시누수가되지
않도록클램프를이용하여
단단히연결하고탁도가
균일할때까지흘려보낸
후배출구를잠근다.
나)염소계소독제(예,HOCl등)
나불꽃버너를이용하여
배출구(수도꼭지등)를살균
또는가열한다.
다)채수용호스의알루미늄박
을제거한후채수할배출
구에연결하고표준필터장
치용수유입구(ⓐ)에호스
를연결한다.이단계에서
양전하카트리지필터(ⓖ)
는연결하지않는다.
라)천천히배출구를열어압- 299 -현행 개정(안)
력게이지가200kPa(30
PSI)가넘지않도록배출
구를조절하고76L(20
gal)의식품용수를흘려보
낸다.
마)식품용수76L를흘려보
낸후일부를2L멸균비
커에받아용수의탁도,
pH,온도,염소농도를각
각측정하여검체번호,채
수위치,채수자의이름과
함께바이러스검체채수기
록부에기록한다.pH측정
기는사용전보정
(calibration)한다.
바)용수배출구(수도꼭지등)
를잠그고검체가다음의
조건에해당되어부가장치
의연결이필요한지의여
부를결정하여연결한다.
(1)pH8이상일경우멸균된
튜브로단일주입기(ⓑ)와
1M염산용액이담긴메
스실린더를연결하고,배
출구(수도꼭지등)를다시
열어용수의pH가6.5～- 300 -현행 개정(안)
7.5가되도록단일주입기
를통해1M염산용액을
흘려보낸다.용수유출구
(ⓚ)로흘러나온용수의
pH를측정해바이러스검체
채수기록부에기록한다.
(2)잔류염소제거를위해위
와같이단일주입기를연
결하여식품용수3.8L(1
gal)당2%티오황산나트
륨용액10mL이주입되
도록한다.
*(1)과(2)번이모두해당할
경우이중주입기를연결하
여사용한다.
사)바이러스검체채수기록부
에검체채취일,시작시
간,유량계의초기수치를
기록한다.
아)알루미늄박을제거한양전
하카트리지필터를탈리
액주입구(ⓔ)와유출구
(ⓘ)사이에연결한다.
자)용수를천천히흐르게하면
서카트리지하우징상단의
감압단추(ⓕ,ventbutton)- 301 -현행 개정(안)
를눌러내부공기가완전히
빠지도록한후,수도꼭지를
완전히열어준다.
차)압력게이지가200kPa(30
PSI)이하로유지되도록
유량조절밸브를조정하고
식품용수1,500～1,800L를
통과시킨후,용수배출구
(수도꼭지등)를잠근다.
카)바이러스검체채수기록부
에검체채취종료일,종료
시간,유량계의최종수치
등을기록한다.
타)표준필터장치로부터카트
리지하우징(ⓗ)을분리하
고양전하카트리지필터
를거꾸로하여남은물을
버린후하우징양끝의연
결된개구부를멸균된알
루미늄박으로싼다.
파)양전하카트리지필터를
아이스박스에담고얼음
팩등을사용하여냉장상
태(냉동시켜서는아니된
다)로유지하여즉시실험
실로운반한다.- 302 -현행 개정(안)
2)바이러스탈리과정
가)냉장보관하여운반한필터
는채수시작시간부터24
시간내에실험실에서바이
러스탈리시험을실시하여
야한다.다만,부득이한경
우로인해24시간내에탈
리시험이불가할경우최대
72시간이넘지않도록한다.
나)탈리용거치대에카트리지
하우징을장착한후유량
조절밸브를모두닫는다.
다)탈리액주입구에연동정량
펌프호스를연결한후연
동정량펌프와1.5%Beef
extract용액이채워져있
는유리병에호스를차례
로연결하되,1-MDS필터
는1L,NanoCeram필터
에는0.5L의1.5%Beef
extract용액을사용한다.
라)탈리액유출구에유출용
호스를연결하여1.5%
Beefextract용액이들어
있는유리병에넣고탈리
액유출구를닫는다.- 303 -현행 개정(안)
마)연동정량펌프를가동하여
양전하카트리지필터하
우징안으로1.5%Beef
extract용액이양전하카
트리지필터내에완전히
차도록한후감압단추를
통해1.5%Beefextract
용액이넘쳐흘러나오기
시작하면감압단추에서손
을떼고,연동정량펌프가
동을멈춘후5분간정치
한다.
※감압단추는탈리액이양
전하카트리지필터안으
로가득채워질때까지
눌러준다.
바)탈리액유출구를열고연동
정량펌프를다시가동한후
하우징에채워져있는
1.5%Beefextract용액이
서서히필터를통과하도록
한다.통과한완충액은
1.5%Beefextract용액이
들어있던유리병에수집한
다.탈리액을회수할때는
거품이없도록주의하여야- 304 -현행 개정(안)
한다.
※연동정량펌프대신양압
펌프와압력통을사용하
여탈리과정을진행할수
도있다.
사)유리병에수집된탈리액은
라)～바)의과정을2회반
복한다.
아)최종탈리액은1M염산
용액으로pH를7.0～7.5
사이로조절하고멸균된
메스실린더를사용하여부
피를기록한다.
자)탈리액은24시간이내에
농축시험이가능할경우
4℃에서보관하며,농축시
험을즉시시행하기어려울
때에는-70℃에서보관한다.
3)바이러스농축과정
가)최종탈리액을교반기에서
혼합하면서1M염산용액
으로pH를3.5±0.1로조절
한후,실온에서30분간천
천히섞는다.
나)침전물이생기면탈리액을
멸균한원심분리용기에옮- 305 -현행 개정(안)
겨원심분리한다(2,500G
15분,4℃).
다)원심분리후,상등액을제
거하고남은침전물에0.15
Msodiumphosphate완충
액(pH9.0～9.5)을20～30
mL넣어완전히부유시
킨후실온에10분간방치
한다.
라)부유시킨용액을원심분리
한다(7,000G,10분,4℃).
마)상등액을취해1M염산용
액으로pH7.0～7.5로조절
한다.
바)미생물오염을방지하기위
해30mL주사기를이용하
여상등액을0.22μm주사
기필터로여과한다.검체
중의바이러스가필터에
흡착되는것을방지하기
위하여사전에0.22μm주
사기필터에10～20mL의
1.5%Beefextract용액(pH
7.0～7.5)을통과시킨다.
사)최종농축검체량
(FCSV=finalconcentrated- 306 -현행 개정(안)
samplevolume)을기록하
고검체를24시간이내에
분석할경우는4℃에보관
하고나머지는분석전까
지-70℃에보관한다.
아)최종농축검체20～30mL는
바이러스유전자추출을
위한검체로사용한다.
4)바이러스유전자추출과정
시판되는바이러스RNA추출
키트(kit)를사용하며,제조사가
제시하는적절한실험법에따
라실시한다.
※재현성및검출효율등을
고려하여QIAGEN-Viral
RNAMiniKits또는동등
이상의제품이사용이가능
하며,또한자동유전자추
출장치를사용할경우에도
바이러스RNA추출키트
를사용하여바이러스유
전자를추출할수있다.
가)바이러스유전자추출시
검체와동일한과정으로
음성대조군(negative
control)을사용하여유전- 307 -현행 개정(안)
자를추출하며검체의경
우시험진행중오염여부
를확인하기위해2개의
RNA를추출한다.
나)검체농축액과음성대조군
각280μL에AVL완충액
(guanidinethiocyanate함
유)1,120 μL를각각혼합
하여실온에서10분동안
방치한후가볍게원심분
리기를이용하여원심분리
(spin-down)한다.
다)여기에95～100%에탄올
1,120 μL을넣어혼합한후
가볍게원심분리
(spin-down)한다.
라)혼합액630μL을소량원심
(Minispin)컬럼으로옮겨
6,000G에서1분간원심분
리하고컬럼을새로운회
수용(collection)튜브로옮
긴다음남은혼합액을630
μL씩동일한방법으로컬럼
에첨가하여원심분리한다.
마)소량원심(Minispin)컬럼을
새로운회수용(collection)- 308 -현행 개정(안)
튜브로옮겨AW1완충액
(guanidinehydrochloride함
유)500μL을넣고6,000G
로1분간원심분리후컬럼을
새로운회수용(collection)
튜브로옮긴다.
바)AW2완충액500μL을넣
고20,000G로3분간원심
분리한후컬럼을새로운
1.5mL회수용(collection)
튜브로옮긴다.
사)AVE완충액(sodiumazide
함유)60μL를넣고6,000
G로1분간원심분리하여
다음의RT-PCR(Reverse
transcription-Polymerase
chainreaction)을수행하기
위한주형(template)으로
사용한다.
5)사포바이러스유전자PCR과
정및결과판정
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)과정에서는
사포바이러스를인위적으로조
합하여합성한RNA등을
PCR양성대조군으로사용할- 309 -현행 개정(안)
수있다.
가)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)방법은
아래와같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)조성
조건은표1과같이
Mastermix(2X)9.5μL,
Reversetranscriptase
(50unit/μL)0.5μL,프라
이머(SV-F11,SV-R1)는
각2μL,추출RNA5μL를
첨가하여증류수로총25
μL로맞추고반응시킨다
(2)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반응
조건은표2와같이45℃
에서30분,94℃에서5분
변성시키고,94℃30초,5
5℃30초,72℃1분30초를
1회로하여35회반응시킨
후,72℃에서7분간연장반
응시킨다.상기반응종료
후PCR생성물에대하여
NestedPCR을실시한다.- 310 -현행 개정(안)
ComponentVolumePrimers
Mastermix(2X)9.5μL-
Reversetranscriptase(50unit/μL)0.5μL-
D.W. 6μL-
Forwardprimer(20pmol)2μLSV-F11
Reverseprimer(20pmol)2μLSV-R1
ExtractedRNA,PCRcontrol5μL-
Total 25μL-표1.사포바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반
응액조성 
나)NestedPCR방법은아래
와같이수행한다.
(1)One-stepRT-PCR(Reverse
transcription-PCR)산물을온도시간Cycle
cDNA합성(cDNAsynthesis)
초기변성(predenaturation)45℃
94℃30min
5min1cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃
55℃
72℃30sec
30sec
1min30
sec35
cycles
최종신장(post-elongation)72℃7min1cycle
보관 4℃∞∞표2.사포바이러스One-step
RT-PCR(Reverse
transcription-PCR)반
응조건및온도- 311 -현행 개정(안)
주형으로하여표3과같이
NestedPCR을실시한다.1
차PCR산물2μL,10x완
충액(MgCl2포함)5μL,
dNTPs(10mM)4μL,
TaqDNApolymerase(5
unit/μL)1μL,프라이머
(SV-F21,SV-R2)는각
2.5μL첨가한다음최종
증류수로총50μL로맞춘
후NestedPCR을실시한다.
(2)PCR반응조건은표4와
같이94℃에서5분간
DNA를변성시키고94℃
30초,55℃30초,72℃1
분30초를1회로하여25
회를반응시킨후72℃에서
7분간연장반응시킨다.- 312 -현행 개정(안)
ComponentVolumePrimers
dNTPs(10mM)4μL-
10xBuffer(withMgCl2)5μL-
D.W. 33μL-
Forwardprimer(20pmol)2.5μLSV-F21
Reverseprimer(20pmol)2.5μLSV-R2
TaqDNApolymerase(5unit/μL)1μL-
1stPCRProduct2μL-
Total 50μL표3.사포바이러스NestedPCR
반응액조성
온도 시간 cycle
초기 변성
(predenaturation)94℃5 min 1 cycle
변성(denaturation)
결합(annealing)
확장(extension)94℃ 
55℃
72℃30 sec
30 sec 
1 min 30 
sec30 cycles
최종신장 (post-elongation) 72℃7 min 1 cycle
보관 4℃ ∞ ∞표4.사포바이러스NestedPCR
반응조건및온도
(3)PCR반응종료후PCR
증폭반응액5μL를전기
영동완충액(gelloading
buffer)1μL와혼합한다음
젤(gel)의각홈에검체를
조심스럽게넣고나머지
한홈에PCR증폭산물의- 313 -현행 개정(안)
크기를식별하기에적당
한표식DNA(marker
DNA)7μL를넣는다.
1.5%아가로스젤
(agarosegel)상에서
100V로전기영동한후
EthidiumBromide(EtBr)
염색액(10mg/mL)으로
30분간염색한후증류수
로10분간탈색하고자외선
조사기(UVtransilluminator)
로조사하여증폭된DNA
밴드를관찰한다.
(4)사포바이러스유전자증폭
에사용하는프라이머는
표5와같다.
PrimerSequence(5'→3')ApplicationPCR
Size(bp)
SV-F11GCYTGGTTYATA
GGTGGTACOne-step
RT-PCR
781
SV-R1CWGGTGAMACMC
CATTKTCCATOne-step
RT-PCR/
SV-F21ANTAGTGTTTGA
RATGGAGGGNested
PCR/
Sequencing415
SV-R2GWGGGRTCAACM
CCWGGTGGNested
PCR/
Sequencing표5.사포바이러스PCR프라이머
염기서열
다)1차결과확인- 314 -현행 개정(안)
(1)아가로즈젤(agarosegel)상
에서시료에PCR증폭산물
이415bp의밴드가있을
경우사포바이러스로일차
확인한다.
(2)만일음성대조군(negative
control)에서PCR밴드가
확인될경우등은재시험을
실시해야한다(표6참고).
(3)사포바이러스가일차확인
된경우최종확인을위하
여아가로스젤(agarose
gel)상에서해당부위를절
취하여PCR산물을정제
한후염기서열(DNA
sequencing)을분석하여
최종판정한다.
추출 RNA(시료 )음성대조군 1차 판정
1+
- PCR검출
+
2+
- PCR검출
-
3+
+ 재 실험
+
4-
- PCR불검출
-표6.사포바이러스PCR결과판정
(예시)
- 315 -현행 개정(안)
+:사포바이러스PCR밴드
확인됨,-:밴드가확인되지않음
라)최종검출판정
(1)염기서열분석(DNA
sequencing)을위하여다)
의(3)에서정제된DNA1
μL를주형으로SV-F21
과SV-R2프라이머를사
용한다.
(2)염기서열분석
(sequencing)반응을위한
혼합조건은각유전자형
Nested프라이머(primer,
1pmol)를독립된각각의
튜브에2 μL,
dye-terminator2μL,정제
DNA2μL를첨가하여증
류수로최종10μL가되도
록하고96℃에서1분간
DNA를변성시킨후,96℃
에서10초간,50℃에서5초
간,60℃에서4분간을1회
로하여25회반응시킨다
음60℃에서10분간연장
반응을시킨다.- 316 -현행 개정(안)
5.～9.(생략)
10.식품중유해물질
10.1～10.3(생략)
10.4발기부전치료제및그유사물질
가.～다.(생략)
라.시약및시액
1)～2)(생략)
3)표준원액:호모실데나필
(homosildenafil),홍데나필(3)PCR산물은염기서열분
석(DNAsequencing)하되2
종이상의유전자가혼합
되어있는경우에는클로
닝염기서열분석(Cloning
DNAsequencing)을재실
시한다.염기서열분석
(DNAsequencing)에의해
결정된염기서열은사포바
이러스유전자데이터베이
스(Referecnesequence및
NCBIblast)와비교하여사
포바이러스로확인되었을
경우검출된것으로최종
확인한다.
5.～9.(현행과같음)
10.식품중유해물질
10.1～10.3(현행과같음)
10.4발기부전치료제및그유사물질
가.～다.(현행과같음)
라.시약및시액
1)～2)(현행과같음)
3)표준원액:호모실데나필
(homosildenafil),홍데나필- 317 -현행 개정(안)
(hongdenafil),하이드록시호모실데
나필(hydroxyhomosildenafil),아
미노타다라필(aminotadalafil),슈
도바데나필(pseudovardenafil),하
이 드 록 시 홍데 나 필
(hydroxyhongdenafil),디메틸실
데나필(dimethylsildenafil),잔소
안트라필(xanthoanthrafil),하이
드 록 시 바 데 나 필
(hydroxyvardenafil),노르네오실
데나필(norneosildenafil),데메틸
홍데나필(demethylhongdenafil),
피페 리디노홍데 나 필
(piperidinohongdenafil),카보데나
필(carbodenafil),치오실데나필
(thiosildenafil),디메틸치오실데
나필(dimethylthiosildenafil),아
세틸바데나필(acetylvardenafil),
벤질실데나필(benzylsildenafil),
노 르네오 바 데 나 필
(norneovardenafil),옥소홍데나필
(oxohongdenafil),치오호모실데
나필(thiohomosildenafil),데설포
바데나필(desulfovardenafil),니
트로데나필(nitrodenafil),싸이클
로펜티나필(cyclopenpentynafil),(hongdenafil),하이드록시호모실데
나필(hydroxyhomosildenafil),아
미노타다라필(aminotadalafil),슈
도바데나필(pseudovardenafil),하
이 드 록 시 홍데 나 필
(hydroxyhongdenafil),디메틸실
데나필(dimethylsildenafil),잔소
안트라필(xanthoanthrafil),하이
드 록 시 바 데 나 필
(hydroxyvardenafil),노르네오실
데나필(norneosildenafil),데메틸
홍데나필(demethylhongdenafil),
피페 리디노홍데 나 필
(piperidinohongdenafil),카보데나
필(carbodenafil),치오실데나필
(thiosildenafil),디메틸치오실데
나필(dimethylthiosildenafil),아
세틸바데나필(acetylvardenafil),
벤질실데나필(benzylsildenafil),
노 르네오 바 데 나 필
(norneovardenafil),옥소홍데나필
(oxohongdenafil),치오호모실데
나필(thiohomosildenafil),데설포
바데나필(desulfovardenafil),니
트로데나필(nitrodenafil),싸이클
로펜티나필(cyclopenpentynafil),- 318 -현행 개정(안)
옥 틸노 르 타 다 라 필
(octylnortadalafil),클로로데나필
(chlorodenafil),신나밀데나필
(cinnamyldenafil),치오퀴나피페
리필(thioquinapiperifil),하이드
록 시 치 오 호 모실 데 나 필
(hydroxythiohomosildenafil),클
로 로 프 레 타 다 라 필
(chloropretadalafil),하이드록시
클로 로 데 나 필
(hydroxychlorodenafil),디클로로
데나필(dichlorodenafil),데메칠
타다라필(demethyltadalafil),아
세 트아 미 노 타 다 라 필
(acetaminotadalafil),메틸하이드
록 시 호모실 데 나 필
(methylhydroxyhomosildenafil),
프로폭시페닐치오호모실데나필
(propoxyphenylthiosildenafil),프
로폭시페닐치오하이드록시호 모실데
나 필
(propoxyphenylthiohydroxyhomosil
denafil),프로폭시페닐치오실데나
필(propoxyphenylthiosildenafil),
프폭시페닐치오아일데나필
(Propoxyphenylthioaildenafil),호옥 틸노 르 타 다 라 필
(octylnortadalafil),클로로데나필
(chlorodenafil),신나밀데나필
(cinnamyldenafil),치오퀴나피페
리필(thioquinapiperifil),하이드
록 시 치 오 호 모실 데 나 필
(hydroxythiohomosildenafil),클
로 로 프 레 타 다 라 필
(chloropretadalafil),하이드록시
클로 로 데 나 필
(hydroxychlorodenafil),디클로로
데나필(dichlorodenafil),데메칠
타다라필(demethyltadalafil),아
세 트아 미 노 타 다 라 필
(acetaminotadalafil),메틸하이드
록 시 호모실 데 나 필
(methylhydroxyhomosildenafil),
프로폭시페닐치오호모실데나필
(propoxyphenylthiosildenafil),프
로폭시페닐치오하이드록시호 모실데
나 필
(propoxyphenylthiohydroxyhomosil
denafil),프로폭시페닐치오실데나
필(propoxyphenylthiosildenafil),
프로폭시페닐치오아일데나필
(Propoxyphenylthioaildenafil),호- 319 -현행 개정(안)
모타다라필(Homotadalafil),아세
틸산(acetylacid),겐데나필
(gendenafil),이미다조사가트리
아지논(imidazosagatriazinone),
cis-사이클로펜틸타다라필
(cis-cyclopentyltadalafil),trans-
사 이클로펜 틸타 다 라 필
(trans-cyclopentyltadalafil),실
데나필(sildenafil),타다라필
(tadalafil),바데나필(vardenafil),
유데나필(udenafil),미로데나필
(mirodenafil),아바나필(avanafil)
각각의표준품을메탄올에녹여
각각1,000mg/L이되게한다.
4)∼6)(생략)
마.∼아.(생략)
자.확인시험
(생략)
1)액체크로마토그래프/질량
분석기의측정조건
가)칼럼:C18(2.0mm×
150mm,5μm)또는이
와동등한것모타다라필(Homotadalafil),아세
틸산(acetylacid),겐데나필
(gendenafil),이미다조사가트리
아지논(imidazosagatriazinone),
cis-사이클로펜틸타다라필
(cis-cyclopentyltadalafil),trans-
사 이클로펜 틸타 다 라 필
(trans-cyclopentyltadalafil),이
소 프 로 필 노 르 타 다 라 필
(Isopropylnortadalafil),데스카본
실데나필(descarbonsildenafil),
실데나필(sildenafil),타다라필
(tadalafil),바데나필(vardenafil),
유데나필(udenafil),미로데나필
(mirodenafil),아바나필(avanafil)
각각의표준품을메탄올에녹여
각각1,000mg/L이되게한다.
4)∼6)(현행과같음)
마.∼아.(현행과같음)
자.확인시험
(현행과같음)
1)액체크로마토그래프/질량
분석기의측정조건
가)칼럼:C18(2.0mm×
100mm,3μm)또는이
와동등한것- 320 -현행 개정(안)
나)(생략)
다)이동상
(1)이동상A:0.1%formic
acid
(2)(생략)
라)∼사)(생략)
차.발기부전치료제 유사물질
의분자량및화학구조식
 ① 호모실데나필
(Homosildenafil)
    (C23H32N6O4S, 488)
NNS
ONHN
NN
OOO② 홍데나필 (Hongdenafil)
    (C25H34N6O3, 466)
ONHN
NNO
NN O
 ③ 하이드록시호모실데나필
    (Hydroxy homosildenafil)
    (C23H32N6O5S, 504)
NNS
ONHN
NN
OO
HOO ④ 아미노타다라필 (Amino 
tadalafil) 
    (C21H18N4O4, 390)
 ⑤ 슈도바데나필
(Pseudo-vardenafil)
    (C22H29N5O4S, 459)
NS
ONH
NO
O O
NN ⑥ 하이드록시홍데나필 (Hydroxy 
hongdenafil)
    (C25H34N6O4, 482)
   
 ⑦ 디메칠실데나필
(Dimethylsildenafil)
    (C23H32N6O4S, 488)
⑧ 잔소안트라필
(Xanthoanthrafil)
    (C19H23N3O6, 389)
⑨ 하이드록시바데나필
(Hydroxyvardenafil)
     (C23H32N6O5S, 504)
  
⑩ 노르네오실데나필
(Norneosildenafil)
    (C22H29N5O4S, 459)
나)(현행과같음)
다)이동상
(1)이동상A:0.1%formic
acid를함유한물
(2)(현행과같음)
라)∼사)(현행과같음)
차.발기부전치료제 유사물질
의분자량및화학구조식
 ① 호모실데나필
(Homosildenafil)
    (C23H32N6O4S, 488.61)
NNS
ONHN
NN
OOO② 홍데나필 (Hongdenafil)
    (C25H34N6O3, 466.59)
ONHN
NNO
NN O
 ③ 하이드록시호모실데나필
    (Hydroxy homosildenafil)
    (C23H32N6O5S, 504.61)
NNS
ONHN
NN
OO
HOO ④ 아미노타다라필 (Amino 
tadalafil) 
    (C21H18N4O4, 390.40)
 ⑤ 슈도바데나필
(Pseudo-vardenafil)
    (C22H29N5O4S, 459.57)
NS
ONH
NO
O O
NN ⑥ 하이드록시홍데나필 (Hydroxy 
hongdenafil)
    (C25H34N6O4, 482.59)
   
 ⑦ 디메칠실데나필
(Dimethylsildenafil)
    (C23H32N6O4S, 488.61)
⑧ 잔소안트라필
(Xanthoanthrafil)
    (C19H23N3O6, 389.41)
⑨ 하이드록시바데나필
(Hydroxyvardenafil)
     (C23H32N6O5S, 504.61)
  
⑩ 노르네오실데나필
(Norneosildenafil)
    (C22H29N5O4S, 459.57)
- 321 -현행 개정(안)
 ⑪ 데메틸홍데나필
(demethylhongdenafil)
    (C24H32N6O3, 452)
HN
NNN
OO
NNO ⑫ 피페리디노홍데나필
(piperidinohongdenafil)
    (C24H31N5O3, 437)
 ⑬ 카보데나필 (carbodenafil)
    (C24H32N6O3, 452)
 ⑭ 치오실데나필 (thiosildenfil)
    (C20H30N6O3S2, 490)
 ⑮ 디메틸치오실데 나필 
(dimethylthiosildenafil)
    (C23H32N6O3S2, 504)
 ⑯ 아세틸바데나필
(acetylvardenafil)
    (C25H34N6O3, 466)
 ⑰ 벤질실데나필
(benzylsildenafil)
    (C28H34N6O4S, 550)
 ⑱ 노르네오바데나필
(norneovardenafil)
    (C18H20N4O4, 356)
 ⑲ 옥소홍데나필
(oxohongdenafil)
    (C25H32N6O4, 480)
  
치오호모실데나필 (thiohomosildena
fil)      
    (C23H32N6O3S2, 504)
  
데설포바데나필 (desulfovardena
fil) 
    (C17H20N4O2, 312)
  니트로데나필 (nitrodenafil)
  
싸이클로펜티나필 (cyclopentyna
fil)
  
옥틸노르타다라필 (octylnortadala
fil)
  클로로데나필 (chlorodenafil)     ⑪ 데메틸홍데나필
(Demethylhongdenafil)
    (C24H32N6O3, 452.55)
HN
NNN
OO
NNO ⑫ 피페리디노홍데나필
(Piperidinohongdenafil)
    (C24H31N5O3, 437.55)
 ⑬ 카보데나필 (Carbodenafil)
    (C24H32N6O3, 452.56)
 ⑭ 치오실데나필 (Thiosildenfil)
    (C20H30N6O3S2, 490.64)
 ⑮ 디메틸치오실데 나필 
(Dimethylthiosildenafil)
    (C23H32N6O3S2, 504)
 ⑯ 아세틸바데나필
(Acetylvardenafil)
    (C25H34N6O3, 466.59)
 ⑰ 벤질실데나필
(Benzylsildenafil)
    (C28H34N6O4S, 550.68)
 ⑱ 노르네오바데나필
(Norneovardenafil)
    (C18H20N4O4, 356.38)
 ⑲ 옥소홍데나필
(Oxohongdenafil)
    (C25H32N6O4, 480.57)
  
치오호모실데나필 (Thiohomosilden
afil)      
    (C23H32N6O3S2, 504.68)
  
데설포바데나필 (Desulfovardena
fil) 
    (C17H20N4O2, 312.37)
  니트로데나필 (Nitrodenafil)
    (C17H19N5O4, 357.37)
  
싸이클로펜티나필 (Cyclopentyna
fil)
    (C26H36N6O4S, 528.68)
  
옥틸노르타다라필 (N-Octylnorta
dalafil)
    (C29H33N3O4, 487.60)
     - 322 -현행 개정(안)
    (C19H21ClN4O3, 388) 신나밀데나필 (cinnamyldenafil)
     (C32H38N6O3, 554)
  
  
치오퀴나피페리필 (Thioquinapip
erifil)
    (C24H28N6OS, 448)
N
NNH
N
SNHN
HO  
하이드록시치오호모실데나필  
(hydroxythiohomosildenafil)
     (C23H32N6O4S2, 520)
  
ONHNS
NN
S
NOO
N
HO
  
클로로프레타다라필 (Chloropret
adalafil)
 (C22H19ClN2O5, 426)
NNHO
OOOO
Cl  
하이드록시클로로데나필 (Hydroxych
lorodenafil)
    (C19H23ClN 4O3, 390)
ONHNO
NNOH
Cl
Hydroxychlorodenafil(C19H23ClN4O3,390)
  
디클로로데나필 (Dichlorodenafil)
    (C19H21Cl2N4O2, 406)
ONHNO
NNCl
Cl
H데 메 칠 타 다 라 필
(Demethyltadalafil)
  (C21H17N3O4, 375)
아 세 트 아 미 노 타 다 라 필
(Acetaminotadalafil)
  (C23H20N4O5, 432.43)
NN
NH
OOO
OHN
O㉞메틸하이드록시호모실데나필 (
Methylhydroxyhomosildenafil)  
(C24H34N6O5S, 518)
㉟ 프로폭시페닐 치오호모실데나필
( P r o p o x y p h e n y l 
thiohomosildenafil)
(C24H34N6O3S2,518.70)
㊱ 프로폭시페닐 치오하이드록시호
모실데나필
   ( P r o p o x y p h e n y l 
thiohydroxyhomosildenafil)      
(C24H34N6O4S2, 534.69)
 ㊲ 프로폭시페닐치오실데나필   
(Propoxyphenylthiosildenafil) 
    (C23H32N6O3S2, 504.67)
HN
NNN
SNO
ON
OS  프로폭시페닐치오아일데나필   
 (Propoxyphenylthioaildenafil) 
    (C24H34N6O3S2, 518.70)
클로로데나필 (Chlorodenafil)
  (C19H21ClN 4O3, 388.86)신나밀데나필 (Cinnamyldenafil)
    (C32H38N6O3, 554)
  
  
치오퀴나피페리필 (Thioquinapip
erifil)
    (C24H28N6OS, 448.59)
N
NNH
N
SNHN
HO  
하이드록시치오호모실데나필 (Hy
droxythiohomosildenafil)
     (C23H32N6O4S2, 520.68)
  
ONHNS
NN
S
NOO
N
HO
  
클로로프레타다라필 (Chloropret
adalafil)
  (C22H19ClN 2O5, 426.86)
NNHO
OOOO
Cl  
하이드록시클로로데나필 (Hydrox
ychlorodenafil)
    (C19H23ClN 4O3, 390.87)
ONHNO
NNOH
Cl
Hydroxychlorodenafil(C19H23ClN4O3,390)
  
디클로로데나필 (Dichlorodenafil)
    (C19H21Cl2N4O2, 407.30)
ONHNO
NNCl
Cl
H데 메 칠 타 다 라 필
(Demethyltadalafil)
  (C21H17N3O4, 375.38)
아 세 트 아 미 노 타 다 라 필
(Acetaminotadalafil)
  (C23H20N4O5, 432.43)
NN
NH
OOO
OHN
O㉞메틸하이드록시호모실데나필 (
Methylhydroxyhomosildenafil)  
(C24H34N6O5S, 518.00)
㉟ 프로폭시페닐 치오호모실데나필
( P r o p o x y p h e n y l 
thiohomosildenafil)
(C24H34N6O3S2,518.70)
㊱ 프로폭시페닐 치오하이드록시호
모실데나필
   ( P r o p o x y p h e n y l 
thiohydroxyhomosildenafil)      
(C24H34N6O4S2, 534.69)
 ㊲ 프로폭시페닐치오실데나필   
(Propoxyphenylthiosildenafil) 
    (C23H32N6O3S2, 504.67) 프로폭시페닐치오아일데나필 
(Propoxyphenylthioaildenafil) 
    (C24H34N6O3S2, 518.70)- 323 -현행 개정(안)
10.5～10.6(생략)
  
호모타다라필 (Homotadalafil) 
    (C23H21N3O4, 403.43)
㊵ 아세틸산 (Acetyl acid)
    (C18H20N4O4, 356)
OHO
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3
 ㊶ 겐데나필(Gendenafil)
(C19H22N4O3,354)
CH3O
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3㊷ 이미다조사가트리아지논
(Imidazosagatriazinone)
(C17H20N4O2,312)
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3
 ㊸
cis-사이클로펜틸타다라필(cis-Cyclopenty
ltadalafil)
(C26H25N3O4,443)
㊹ 
trans-사이클로펜틸타다라필(trans-Cyclopen
tyltadalafil)
(C26H25N3O4,443)
<신설>
10.5～10.6(현행과같음)HN
NNN
SNO
ON
OS
  
호모타다라필 (Homotadalafil) 
    (C23H21N3O4, 403.43)
㊵ 아세틸산 (Acetyl acid)
    (C18H20N4O4, 356.38)
OHO
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3
 ㊶ 겐데나필(Gendenafil)
(C19H22N4O3,354.41)
CH3O
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3㊷ 이미다조사가트리아지논
(Imidazosagatriazinone)
(C17H20N4O2,312.37)
OCH3NNHO
NH
NHCH3
CH3
 ㊸
cis-사이클로펜틸타다라필(cis-C
yclopentyltadalafil)
(C26H25N3O4,443)
㊹ 
trans-사이클로펜틸타다라필(tran
s-Cyclopentyltadalafil)
(C26H25N3O4,443)
 ㊺ 
데스카본실데나필 (Descarbonsildenafil
)
  (C21H30N6O4S, 462.57)
 ㊻ 
이소프로필노르타다라필 (Isopropylnor
tadalafil)
  (C24H23N3O4, 417.47)
 
10.7기타의약품성분
10.7.1∼10.7.2(생략)
<신설>10.7기타의약품성분
10.7.1∼10.7.2(현행과같음)
10.7.3페놀프탈레인(phenolphthalein)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리- 324 -현행 개정(안)
균질화한검체를취하여액-
액추출하고액체크로마토그
래프/자외부흡광검출기(UV
photometricdetector),PDA
검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부
흡광검출기(LC/UV
photometricdetector),PDA
검출기(LC/PDA),액체크로마
토그래프/질량분석기(LC/MS)
를사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토
그래피용또는이와동등한
것
2)물:액체크로마토그래피
용또는이와동등한것
3)표준원액:페놀프탈레인
(phenolphthalein)표준품을
메탄올에녹여1,000mg/L
이되게한다.
4)표준용액:표준원액을메
탄올에녹여1～100mg/L
의범위가되도록적당한
농도로희석한다.- 325 -현행 개정(안)
5)sodium-1-hexane
sulfonate:이온쌍크로마
토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험
용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히
달아50mL용량의메스플
라스크에넣고물15mL를
가하여습윤화한다.메스플라
스크에메탄올25mL를가
하여10분간초음파추출한
후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여
과하여시험용액으로사용한
다.단,시험용액의농도가
검량곡선의농도범위를벗어
날경우농도범위내로희석
하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측정
조건
가)컬럼:C18(4.6mm×
250mm,5㎛)또는이와
동등한것
나)컬럼온도:40℃- 326 -현행 개정(안)
다)이동상
(1)이동상A:0.5mM
sodium-1-hexane
sulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세
토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:200～
400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정
량취하여액체크로마토그래
프에각각주입한다.얻어진
크로마토그램상의각피크
높이또는면적을구하여검
량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및- 327 -현행 개정(안)
스펙트럼
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로
마토그램상의피크는동일한
측정조건에서표준용액피크
의머무름시간과일치하여
야하며PDA검출기에서표
준용액과시험용액이동일한
스펙트럼을보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서
얻어진시험결과를피크높
이법또는피크면적법에따
라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준- 328 -현행 개정(안)
물질의피크높이또는피
크면적을Y축으로하고표
준물질의농도를X축으로
하여검량곡선을작성하고
시험용액의높이또는면적
을Y축에대입하여페놀프
탈레인의농도를계산한다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된페놀
프탈레인의농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래프/질량분석
기로분석하였을때시험용액
중표준물질의m/z값은표준
용액중표준물질의m/z값과
일치하여야한다.
1)액체크로마토그래프/질량
분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×
100mm,3㎛)또는이
와동등한것- 329 -현행 개정(안)
<신설>나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%
formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%
formicacid를함유한
아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition
물질 분자량Ion
modePrecurs
orion
(m/z)Fragme
ntion
(m/z)
페놀프탈
레인
(C20H14O4)318.32 Positive 319 225, 197
10.7.4요힘빈(yohimbine)및이
카린(icariin)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.- 330 -현행 개정(안)
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-
액추출하고액체크로마토그
래프/자외부흡광검출기(UV
photometricdetector),PDA
검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부
흡광검출기(LC/UV
photometricdetector),PDA
검출기(LC/PDA),액체크로마
토그래프/질량분석기(LC/MS)
를사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토
그래피용또는이와동등한
것
2)물:액체크로마토그래피
용또는이와동등한것
3)표준원액:요힘빈
(yohimbine)및이카린
(icariin)표준품을메탄올에
녹여각각1,000mg/L이
되게한다.
4)표준용액:표준원액을각
각메탄올에녹여1～100- 331 -현행 개정(안)
mg/L의범위가되도록적
당한농도로희석한다.
5)sodium-1-hexanesulfonate
:ionpare크로마토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험
용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히
달아50mL용량의메스플
라스크에넣고물15mL를
가하여습윤화한다.메스플라
스크에메탄올25mL를가
하여10분간초음파추출한
후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여
과하여시험용액으로사용한
다.단,시험용액의농도가
검량곡선의농도범위를벗어
날경우농도범위내로희석
하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측
정조건
가)컬럼:C18(4.6mm×
250mm,5㎛)또는이
와동등한것- 332 -현행 개정(안)
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mM
sodium-1-hexane
sulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세
토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:20
0～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정
량취하여액체크로마토그
래프에각각주입한다.얻
어진크로마토그램상의각
피크높이또는면적을구
하여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및- 333 -현행 개정(안)
스펙트럼
(a)요힘빈및이카린의
크로마토그램
(b)요힘빈의스펙트럼
(c)이카린의스펙트럼
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로
마토그램상의피크는동일
한측정조건에서표준용액
피크의머무름시간과일치- 334 -현행 개정(안)
하여야하며PDA검출기에
서표준용액과시험용액이
동일한스펙트럼을보여야
한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에
서얻어진시험결과를피크
높이법또는피크면적법에
따라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준
물질의피이크높이또는
피이크면적을Y축으로하
고표준물질의농도를X축
으로하여검량곡선을작
성하고시험용액의높이
또는면적을Y축에대입하
여요힘빈및이카린의농
도를계산한다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된요
힘빈,이카린각각의농
도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)- 335 -현행 개정(안)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래피-질량분
석기로분석하였을때시험
용액중표준물질의m/z값
은표준용액중표준물질의
m/z값과일치하여야한다.
1)액체크로마토그래프/질량
분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×
100mm,3㎛)또는이
와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%
formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%
formicacid를함유한
아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min- 336 -현행 개정(안)
<신설>마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition
물질분자
량Ion
modePrecu
rsor
ion
(m/z)Frag
ment
ion
(m/z)
요힘빈 (C21H26N2O3)354.4Positi
ve355144,
212
이카린 (C9H13N) 676.7Negat
ive677367,
513
10.7.5카스카로사이드(Cascaroside
A,B,C,D)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-
액추출하고액체크로마토그
래프/자외부흡광검출기(UV
photometricdetector),PDA
검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부
흡광검출기(LC/UV
photometricdetector),PDA
검출기(LC/PDA),액체크로- 337 -현행 개정(안)
마토그래프/질량분석기
(LC/MS)를사용한다.
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토그
래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피
용또는이와동등한것
3)표준원액:카스카로사이
드A(cascarosideA),카스
카로사이드B(cascaroside
B),카스카로사이드
C(cascarosideC),카스카로
사이드D(cascarosideD)
표준품을각각메탄올에녹
여1,000mg/L이되게한
다.
4)표준용액:표준원액을메
탄올에녹여1～100mg/L
의범위가되도록적당한
농도로희석한다.
5)sodium-1-hexane
sulfonate:이온쌍크로마
토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험
용또는이와동등한것
마.시험용액의조제- 338 -현행 개정(안)
균질화한검체1g을정확히
달아50mL용량의메스플
라스크에넣고물15mL를
가하여습윤화한다.메스플라
스크에메탄올25mL를가
하여10분간초음파추출한
후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여
과하여시험용액으로사용한
다.단,시험용액의농도가
검량곡선의농도범위를벗어
날경우농도범위내로희석
하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측
정조건
가)컬럼:C18(4.6mm×
250mm,5㎛)또는이
와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mM
sodium-1-hexane
sulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세- 339 -현행 개정(안)
토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:291nm
바)PDA검출기파장:20
0～400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정
량취하여액체크로마토그
래프에각각주입한다.얻어
진크로마토그램상의각피
크높이또는면적을구하
여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및
스펙트럼
(a)카스카로사이드A,B,C,D의- 340 -현행 개정(안)
크로마토그램
(b)카스카로사이드A,B의
스펙트럼
(C)카스카로사이드C,D의
스펙트럼
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로
마토그램상의피크는동일한
측정조건에서표준용액피크
의머무름시간과일치하여
야하며PDA검출기에서표
준용액과시험용액이동일한
스펙트럼을보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서- 341 -현행 개정(안)
얻어진시험결과를피크높
이법또는피크면적법에따
라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준
물질의피크높이또는피
크면적을Y축으로하고표
준물질의농도를X축으로
하여검량곡선을작성하고
시험용액의높이또는면적
을Y축에대입하여카스카
로사이드의농도를계산한
다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된카스
카로사이드의농도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래프/질량분석
기로분석하였을때시험용
액중표준물질의m/z값은
표준용액중표준물질의m/z- 342 -현행 개정(안)
값과일치하여야한다.
1)액체크로마토그래프/질량
분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×
100mm,3㎛)또는이
와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%
formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%
formicacid를함유한
아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition- 343 -현행 개정(안)
<신설>물질분자량Ion
modePrecu
rsor
ion
(m/z)Frag
ment
ion
(m/z)
카스카로사이드 A
(C27H32O14)580.1Negati
ve579297,
459
카스카로사이드 B
(C27H32O14)580.1Negati
ve579297,
459
카스카로사이드 C
(C27H32O13)563.8Negati
ve563281,
443
카스카로사이드 D
(C27H32O13)563.8Negati
ve563281,
443
10.7.6센노사이드(sennosideA,B)
가.시험법의적용범위
모든식품에적용한다.
나.분석원리
균질화한검체를취하여액-
액추출하고액체크로마토그
래프/자외부흡광검출기(UV
photometricdetector),PDA
검출기로분석한다.
다.장치
1)액체크로마토그래프/자외부
흡광검출기(LC/UV
photometricdetector),PDA
검출기(LC/PDA),액체크로마
토그래프/질량분석기(LC/MS)
를사용한다.- 344 -현행 개정(안)
라.시약및시액
1)유기용매:액체크로마토그
래피용또는이와동등한것
2)물:액체크로마토그래피
용또는이와동등한것
3)표준원액:센노사이드
A(sennodiseA),센노사이
드B(sennodiseB)각각의
표준품을아세토나이트릴/물
혼합액(80/20,v/v)에녹여
각각1,000mg/L이되게한
다.
4)표준용액:표준원액을각
각메탄올에녹여1～100
mg/L이되도록적당한농
도로희석한다.
5)sodium-1-hexane
sulfonate:이온쌍크로마
토그래피용
6)기타시약:잔류농약시험
용또는이와동등한것
마.시험용액의조제
균질화한검체1g을정확히
달아50mL용량의메스플
라스크에넣고물15mL를
가하여습윤화한다.메스플라- 345 -현행 개정(안)
스크에메탄올25mL를가
하여10분간초음파추출한
후메탄올로눈금을채우고
0.45㎛멤브레인필터로여
과하여시험용액으로사용한
다.단,시험용액의농도가
검량곡선의농도범위를벗어
날경우농도범위내로희석
하여사용한다.
바.시험조작
1)액체크로마토그래프의측
정조건
가)컬럼:C18(4.6mm×
250mm,5㎛)또는이
와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.5mM
sodium-1-hexane
sulfonate를함유한
0.1%인산용액
(2)이동상B:95%아세
토니트릴- 346 -현행 개정(안)
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 85 15
6 85 15
15 70 30
30 60 40
32 60 40
42 0 100
50 0 100
52 85 15
60 85 15
라)이동상유량:1.2mL/min
마)UV검출기파장:220nm
바)PDA검출기파장:200～
400nm
2)검량선의작성
표준용액을농도별로일정
량취하여액체크로마토그
래프에각각주입한다.얻어
진크로마토그램상의각피
크높이또는면적을구하
여검량선을작성한다.
3)표준품의크로마토그램및
스펙트럼
(a)센노사이드A,B의
크로마토그램- 347 -현행 개정(안)
(b)센노사이드A의스펙트럼
(b)센노사이드B의스펙트럼
4)정량한계:25mg/kg
사.정성시험
위의조건에서얻어진크로
마토그램상의피크는동일한
측정조건에서표준용액피크
의머무름시간과일치하여
야하며PDA검출기에서표
준용액과시험용액이동일한
스펙트럼을보여야한다.
아.정량시험
정성시험과동일한조건에서
얻어진시험결과를피크높
이법또는피크면적법에따
라정량한다.
1)계산방법
검량곡선에서얻어진표준- 348 -현행 개정(안)
물질의피크높이또는피
크면적을Y축으로하고표
준물질의농도를X축으로
하여검량곡선을작성하고
시험용액의높이또는면적
을Y축에대입하여센노사
이드A및B의농도를계
산한다.
시료중함량(mg/g)=C×V×DS
C:검량곡선에서계산된센
노사이드A및B의농
도(mg/L)
V:시험용액의최종부피(L)
S:검체채취량(g)
D:희석배수
자.확인시험
액체크로마토그래프/질량분석
기로분석하였을때시험용
액중표준물질의m/z값은
표준용액중표준물질의m/z
값과일치하여야한다.
1)액체크로마토그래프/질량
분석기의측정조건
가)컬럼:C18(2.0mm×- 349 -현행 개정(안)
10.8～10.13(생략)
11.～13.(생략)100mm,3㎛)또는이
와동등한것
나)컬럼온도:40℃
다)이동상
(1)이동상A:0.1%
formicacid를함유한물
(2)이동상B:0.1%
formicacid를함유한
아세토니트릴
시간 (분)이동상 A(%)이동상 B(%)
0 95 5
3 95 5
18 20 80
18.1 0 100
20.9 0 100
21 95 5
25 95 5
라)이동상유량:0.3mL/min
마)이온화방법:ESI
바)capillarytemperature:340℃
사)sprayvoltage:4.0kV
아)MRMtransition
물질분자량Ion
modePrecur
sorion
(m/z)Fragm
ention
(m/z)
센노사이드A
(C42H38O20)862.7Negati
ve861224,
386,
699
센노사이드B
(C42H38O20)862.7Negati
ve861224,
386,
699- 350 -현행 개정(안)
10.8～10.13(현행과같음)
11.～13.(현행과같음)
[별표1]“식품에사용할수있는원료”의
목록
1.(생략)
2.동물성
3.～4.(생략)
[별표2](생략)품목명이명 
또는 
영명학명 또는 
특성사용
부위
1
∼
376(생  략)
377미흑
점상
어 Silky
shark　Carcharhinu
sfalciformis-
378
∼
491(생  략)
492비악
상어P o rb e a g le ,
Beaum
aris
shark,
P o rb eag leLamna
nasus-
493
∼
660(생  략)
661장완
흉상
어Oceanic
whitetip 
sharkCarcharhinu
s
longimanus-
662
∼
952(생  략)
(생  략)[별표1]“식품에사용할수있는원료”의
목록
1.(현행과같음)
2.동물성
3.～4.(현행과같음)
[별표2](현행과같음)품목명이명 
또는 
영명학명 또는 
특성사용
부위
1
∼
376(현행과 같음)
<삭  제>
377
∼
490(현행 378∼491과 같음)
<삭  제>
491
∼
658(현행 493∼660과 같음)
<삭  제>
659
∼
949(현행 662∼952와 같음)
(현행과 같음)- 351 -현행 개정(안)
[별표3]농산물의농약잔류허용기준
(1)이미녹타딘(Iminoctadine)
(생략)
마늘0.5
파1.0
기타농산물 0.05
(2)∼(4)(생략)
(5)노르플루라존(Norflurazon)
(생략)
기타농산물 0.05
(6)∼(8)(생략)
(9)델타메트린(Deltamethrin)
(생략)
기타농산물 0.01
(10)(생략)
(11)멥틸디노캅(Meptyldinocap)
(생략)
감0.5
오이 1.0[별표3]농산물의농약잔류허용기준
(1)이미녹타딘(Iminoctadine)
(현행과같음)
마늘0.1
파0.5
<삭제>
(2)∼(4)(현행과같음)
(5)노르플루라존(Norflurazon)
(현행과같음)
<삭제>
(6)∼(8)(현행과같음)
(9)델타메트린(Deltamethrin)
(현행과같음)
<삭제>
(10)(현행과같음)
(11)멥틸디노캅(Meptyldinocap)
(현행과같음)
감0.3
오이 0.7- 352 -현행 개정(안)
기타농산물 0.05
(12)디디티(DDT)
(생략)
기타농산물 0.05
(13)∼(14)(생략)
(15)디설포톤(Disulfoton)
(생략)
기타농산물 0.02
(16)∼(17)(생략)
(18)디캄바(Dicamba)
(생략)
수수 3.0
(19)∼(20)(생략)
(21)디클로르보스(Dichlorvos)
(생략)
사과 2.0
오이 1.0
파 0.5
기타농산물 0.05<삭제>
(12)디디티(DDT)
(현행과같음)
<삭제>
(13)∼(14)(현행과같음)
(15)디설포톤(Disulfoton)
(현행과같음)
<삭제>
(16)∼(17)(현행과같음)
(18)디캄바(Dicamba)
(현행과같음)
수수 0.1
(19)∼(20)(현행과같음)
(21)디클로르보스(Dichlorvos)
(현행과같음)
사과 0.05
오이 0.1
파 0.1
<삭제>- 353 -현행 개정(안)
(22)∼(25)(생략)
(26)디페노코나졸(Difenoconazole)
(생략)
기타농산물 0.05
(27)(생략)
(28)디펜아미드(Diphenamid)
(생략)
기타농산물 0.05
(29)디플루벤주론(Diflubenzuron)
(생략)
기타농산물 0.05
(30)∼(36)(생략)
(37)메카밤(Mecarbam)
(생략)
기타농산물 0.05
(38)∼(45)(생략)
(46)메틸브로마이드(Methylbromide)(22)∼(25)(현행과같음)
(26)디페노코나졸(Difenoconazole)
(현행과같음)
<삭제>
(27)(현행과같음)
(28)디펜아미드(Diphenamid)
(현행과같음)
<삭제>
(29)디플루벤주론(Diflubenzuron)
(현행과같음)
<삭제>
(30)∼(36)(현행과같음)
(37)메카밤(Mecarbam)
(현행과같음)
<삭제>
(38)∼(45)(현행과같음)
(46)메틸브로마이드(Methylbromide)- 354 -현행 개정(안)
(생략)
기타농산물 20
(47)(생략)
(48)바미도티온(Vamidothion)
(생략)
기타농산물 0.05
(49)(생략)
(50)베나락실(Benalaxyl)
(생략)
기타농산물 0.05
(51)(생략)
(52)벤디오카브(Bendiocarb)
(생략)
기타농산물 0.02
(53)∼(54)(생략)
(55)뷰프로페진(Buprofezin)
(생략)
기타농산물 0.05(현행과같음)
<삭제>
(47)(현행과같음)
(48)바미도티온(Vamidothion)
(현행과같음)
<삭제>
(49)(현행과같음)
(50)베나락실(Benalaxyl)
(현행과같음)
<삭제>
(51)(현행과같음)
(52)벤디오카브(Bendiocarb)
(현행과같음)
<삭제>
(53)∼(54)(현행과같음)
(55)뷰프로페진(Buprofezin)
(현행과같음)
<삭제>- 355 -현행 개정(안)
(56)∼(57)(생략)
(58)비에치시(BHC)
(생략)
기타농산물 0.01
(59)∼(60)(생략)
(61)비펜트린(Bifenthrin)
(생략)
기타농산물 0.05
(62)(생략)
(63)세톡시딤(Sethoxydim)
(생략)
아몬드1.0
피칸1.0
견과류 1.0
면실 5.0
아보카도 1.0
해바라기씨7.0
(64)(생략)(56)∼(57)(현행과같음)
(58)비에치시(BHC)
(현행과같음)
<삭제>
(59)∼(60)(현행과같음)
(61)비펜트린(Bifenthrin)
(현행과같음)
<삭제>
(62)(현행과같음)
(63)세톡시딤(Sethoxydim)
(현행과같음)
<삭제>
<삭제>
견과류 0.05†
면실 0.05†
아보카도 0.04†
해바라기씨0.05†
(64)(현행과같음)- 356 -현행 개정(안)
(65)사이로마진(Cyromazine)
(생략)
느타리버섯5.0
수박0.3
기타농산물 0.05
(66)∼(67)(생략)
(68)사이할로트린(Cyhalothrin)
(생략)
복숭아0.5
(69)∼(70)(생략)
(71)아미트라즈(Amitraz)
(생략)
기타농산물 0.05
(72)∼(75)(생략)
(76)알드린및디엘드린(Aldrin&
Dieldrin)
(생략)
기타농산물 0.01
(77)알디카브(Aldicarb)(65)사이로마진(Cyromazine)
(현행과같음)
느타리버섯3.0
수박0.1
<삭제>
(66)∼(67)(현행과같음)
(68)사이할로트린(Cyhalothrin)
(현행과같음)
복숭아0.2
(69)∼(70)(현행과같음)
(71)아미트라즈(Amitraz)
(현행과같음)
<삭제>
(72)∼(75)(현행과같음)
(76)알드린및디엘드린(Aldrin&
Dieldrin)
(현행과같음)
<삭제>
(77)알디카브(Aldicarb)- 357 -현행 개정(안)
(생략)
기타농산물 0.02
(78)∼(82)(생략)
(83)에티온(Ethion)
(생략)
기타농산물 0.01
(84)(생략)
(85)에토펜프록스(Etofenprox)
(생략)
기타농산물 0.01
(86)∼(87)(생략)
(88)에트림포스(Etrimfos)
(생략)
기타농산물 0.01
(89)(생략)
(90)엔도설판(Endosulfan)
(생략)
기타농산물 0.05(현행과같음)
<삭제>
(78)∼(82)(현행과같음)
(83)에티온(Ethion)
(현행과같음)
<삭제>
(84)(현행과같음)
(85)에토펜프록스(Etofenprox)
(현행과같음)
<삭제>
(86)∼(87)(현행과같음)
(88)에트림포스(Etrimfos)
(현행과같음)
<삭제>
(89)(현행과같음)
(90)엔도설판(Endosulfan)
(현행과같음)
<삭제>- 358 -현행 개정(안)
(91)엔드린(Endrin)
(생략)
기타농산물 0.01
(92)∼(100)(생략)
(101)이미다클로프리드(Imidacloprid)
(생략)
기타농산물 0.05
(102)∼(105)(생략)
(106)이피엔(EPN)
(생략)
기타농산물 0.05
(107)키노메티오네이트
(Chinomethionat)
(생략)
기타농산물 0.05
(108)티오메톤(Thiometon)
(생략)
기타농산물 0.05(91)엔드린(Endrin)
(현행과같음)
<삭제>
(92)∼(100)(현행과같음)
(101)이미다클로프리드(Imidacloprid)
(현행과같음)
<삭제>
(102)∼(105)(현행과같음)
(106)이피엔(EPN)
(현행과같음)
<삭제>
(107)키노메티오네이트
(Chinomethionat)
(현행과같음)
<삭제>
(108)티오메톤(Thiometon)
(현행과같음)
<삭제>- 359 -현행 개정(안)
(109)(생략)
(110)카두사포스(Cadusafos)
(생략)
기타농산물 0.01
(111)(생략)
(112)카벤다짐(Carbendazim)
(생략)
기타농산물 0.01
(113)카보페노티온(Carbophenothion)
(생략)
기타농산물 0.02
(114)카보퓨란(Carbofuran)
(생략)
바나나 0.1
(115)(생략)
(116)카탑(Cartap)
(생략)
기타농산물 0.05(109)(현행과같음)
(110)카두사포스(Cadusafos)
(현행과같음)
<삭제>
(111)(현행과같음)
(112)카벤다짐(Carbendazim)
(현행과같음)
<삭제>
(113)카보페노티온(Carbophenothion)
(현행과같음)
<삭제>
(114)카보퓨란(Carbofuran)
(현행과같음)
바나나 0.01†
(115)(현행과같음)
(116)카탑(Cartap)
(현행과같음)
<삭제>- 360 -현행 개정(안)
(117)캡타폴(Captafol)
(생략)
기타농산물 0.02
(118)∼(119)(생략)
(120)퀸토젠(Quintozene)
(생략)
기타농산물 0.01
(121)∼(123)(생략)
(124)클로로벤질레이트(Chlorobenzilate)
(생략)
기타농산물 0.02
(125)클로로탈로닐(Chlorothalonil)
(생략)
기타농산물 0.05
(126)∼(128)(생략)
(129)클로르펜빈포스(Chlorfenvinphos)
(생략)
기타농산물 0.05(117)캡타폴(Captafol)
(현행과같음)
<삭제>
(118)∼(119)(현행과같음)
(120)퀸토젠(Quintozene)
(현행과같음)
<삭제>
(121)∼(123)(현행과같음)
(124)클로로벤질레이트(Chlorobenzilate)
(현행과같음)
<삭제>
(125)클로로탈로닐(Chlorothalonil)
(현행과같음)
<삭제>
(126)∼(128)(현행과같음)
(129)클로르펜빈포스(Chlorfenvinphos)
(현행과같음)
<삭제>- 361 -현행 개정(안)
(130)클로르프로팜(Chlorpropham)
(생략)
감자50.0
(131)(생략)
(132)클로르피리포스-메틸(Chlorpyrifos
-methyl)
(생략)
기타농산물 0.05
(133)(생략)
(134)터부트린(Terbutryn)
(생략)
기타농산물 0.05
(135)터부포스(Terbufos)
(생략)
기타농산물 0.01
(136)∼(148)(생략)
(149)트리플루미졸(Triflumizole)
(생략)
기타농산물 0.05(130)클로르프로팜(Chlorpropham)
(현행과같음)
감자20
(131)(현행과같음)
(132)클로르피리포스-메틸(Chlorpyrifos
-methyl)
(현행과같음)
<삭제>
(133)(현행과같음)
(134)터부트린(Terbutryn)
(현행과같음)
<삭제>
(135)터부포스(Terbufos)
(현행과같음)
<삭제>
(136)∼(148)(현행과같음)
(149)트리플루미졸(Triflumizole)
(현행과같음)
<삭제>- 362 -현행 개정(안)
(150)∼(163)(생략)
(164)펜발러레이트(Fenvalerate)
(생략)
아몬드0.2
호두0.2
<신설>
(165)∼(172)(생략)
(173)포레이트(Phorate)
(생략)
감자0.2
마늘0.1
(174)∼(175)(생략)
(176)포스멧(Phosmet,PMP)
(생략)
기타농산물 0.05
(177)∼(179)(생략)
(180)플루실라졸(Flusilazole)
(생략)(150)∼(163)(현행과같음)
(164)펜발러레이트(Fenvalerate)
(현행과같음)
<삭제>
<삭제>
견과류 0.15†
(165)∼(172)(현행과같음)
(173)포레이트(Phorate)
(현행과같음)
감자0.05
마늘0.05
(174)∼(175)(현행과같음)
(176)포스멧(Phosmet,PMP)
(현행과같음)
<삭제>
(177)∼(179)(현행과같음)
(180)플루실라졸(Flusilazole)
(현행과같음)- 363 -현행 개정(안)
기타농산물 0.05
(181)플루발리네이트(Fluvalinate)
(생략)
기타농산물 0.01
(182)플루시트리네이트(Flucythrinate)
(생략)
기타농산물 0.05
(183)(생략)
(184)프로메트린(Prometryn)
(생략)
기타농산물 0.05
(185)프로사이미돈(Procymidone)
(생략)
기타농산물 0.05
(186)프로클로라즈(Prochloraz)
(생략)
기타농산물 0.05
(187)(생략)<삭제>
(181)플루발리네이트(Fluvalinate)
(현행과같음)
<삭제>
(182)플루시트리네이트(Flucythrinate)
(현행과같음)
<삭제>
(183)(현행과같음)
(184)프로메트린(Prometryn)
(현행과같음)
<삭제>
(185)프로사이미돈(Procymidone)
(현행과같음)
<삭제>
(186)프로클로라즈(Prochloraz)
(현행과같음)
<삭제>
(187)(현행과같음)- 364 -현행 개정(안)
(188)프로파모카브(Propamocarb)
(생략)
기타농산물 0.05
(189)∼(190)(생략)
(191)프로폭서(Propoxur)
(생략)
기타농산물 0.05
(192)프로피코나졸(Propiconazole)
(생략)
옥수수1.0
(193)∼(197)(생략)
(198)피페로닐부톡사이드(Piperonyl
butoxide)
(생략)
기타농산물 0.05
(199)∼(201)(생략)
(202)헵타클로르(Heptachlor)
(생략)
기타농산물 0.01(188)프로파모카브(Propamocarb)
(현행과같음)
<삭제>
(189)∼(190)(현행과같음)
(191)프로폭서(Propoxur)
(현행과같음)
<삭제>
(192)프로피코나졸(Propiconazole)
(현행과같음)
옥수수0.05
(193)∼(197)(현행과같음)
(198)피페로닐부톡사이드(Piperonyl
butoxide)
(현행과같음)
<삭제>
(199)∼(201)(현행과같음)
(202)헵타클로르(Heptachlor)
(현행과같음)
<삭제>- 365 -현행 개정(안)
(203)∼(206)(생략)
(207)테부페노자이드(Tebufenozide)
(생략)
기타농산물 0.05
(208)∼(219)(생략)
(220)디에토펜카브(Diethofencarb)
(생략)
기타농산물 0.05
(221)(생략)
(222)메파니피림(Mepanipyrim)
(생략)
기타농산물 0.05
(223)∼(227)(생략)
(228)아족시스트로빈(Azoxystrobin)
(생략)
기타농산물 0.05
(229)카프로파마이드(Carpropamide)(203)∼(206)(현행과같음)
(207)테부페노자이드(Tebufenozide)
(현행과같음)
<삭제>
(208)∼(219)(현행과같음)
(220)디에토펜카브(Diethofencarb)
(현행과같음)
<삭제>
(221)(현행과같음)
(222)메파니피림(Mepanipyrim)
(현행과같음)
<삭제>
(223)∼(227)(현행과같음)
(228)아족시스트로빈(Azoxystrobin)
(현행과같음)
<삭제>
(229)카프로파마이드(Carpropamide)- 366 -현행 개정(안)
(생략)
기타농산물 0.05
(230)∼(231)(생략)
(232)트리사이클라졸(Tricyclazole)
(생략)
기타농산물 0.05
(233)펜사이큐론(Pencycuron)
(생략)
기타농산물 0.1
(234)펜피록시메이트(Fenpyroximate)
(생략)
기타농산물 0.05
(235)∼(237)(생략)
(238)플루디옥소닐(Fludioxonil)
(생략)
기타농산물 0.05
(239)∼(258)(생략)
(259)피리메타닐(Pyrimethanil)(현행과같음)
<삭제>
(230)∼(231)(현행과같음)
(232)트리사이클라졸(Tricyclazole)
(현행과같음)
<삭제>
(233)펜사이큐론(Pencycuron)
(현행과같음)
<삭제>
(234)펜피록시메이트(Fenpyroximate)
(현행과같음)
<삭제>
(235)∼(237)(현행과같음)
(238)플루디옥소닐(Fludioxonil)
(현행과같음)
<삭제>
(239)∼(258)(현행과같음)
(259)피리메타닐(Pyrimethanil)- 367 -현행 개정(안)
(생략)
기타농산물 0.05
(260)∼(290)(생략)
(291)족사마이드(Zoxamide)
(생략)
기타농산물 0.05
(292)∼(293)(생략)
(294)터부틸라진(Terbuthylazine)
(생략)
기타농산물 0.05
(295)∼(308)(생략)
(309)플루톨라닐(Flutolanil)
(생략)
기타농산물 0.05
(310)∼(324)(생략)
(325)사이아조파미드(Cyazofamid)
(생략)
기타농산물 0.05(현행과같음)
<삭제>
(260)∼(290)(현행과같음)
(291)족사마이드(Zoxamide)
(현행과같음)
<삭제>
(292)∼(293)(현행과같음)
(294)터부틸라진(Terbuthylazine)
(현행과같음)
<삭제>
(295)∼(308)(현행과같음)
(309)플루톨라닐(Flutolanil)
(현행과같음)
<삭제>
(310)∼(324)(현행과같음)
(325)사이아조파미드(Cyazofamid)
(현행과같음)
<삭제>- 368 -현행 개정(안)
(326)(생략)
(327)오리사스트로빈(Orysastrobin)
(생략)
기타농산물 0.07
(328)∼(361)(생략)
(362)트리아자메이트(Triazamate)
(생략)
기타농산물 0.05
(363)∼(369)(생략)
(370)벤티아발리카브아이소프로필
(Benthiavalicarb-isopropyl)
(생략)
기타농산물 0.07
(371)디니코나졸(Diniconazole)
(생략)
기타농산물 0.05
(372)(생략)(326)(현행과같음)
(327)오리사스트로빈(Orysastrobin)
(현행과같음)
<삭제>
(328)∼(361)(현행과같음)
(362)트리아자메이트(Triazamate)
(현행과같음)
<삭제>
(363)∼(369)(현행과같음)
(370)벤티아발리카브아이소프로필
(Benthiavalicarb-isopropyl)
(현행과같음)
<삭제>
(371)디니코나졸(Diniconazole)
(현행과같음)
<삭제>
(372)(현행과같음)- 369 -현행 개정(안)
(373)스피로메시펜(Spiromesifen)
(생략)
기타농산물 0.05
(374)알라니카브(Alanycarb)
(생략)
기타농산물 0.05
(375)오퓨레이스(Ofurace)
(생략)
기타농산물 0.02
(376)트리플루뮤론(Triflumuron)
(생략)
기타농산물 0.05
(377)티펜설퓨론메틸(Thifensulfuron
-methyl)
(생략)
기타농산물 0.05
(378)페림존(Ferimzone)
(생략)
기타농산물 0.05
(379)플루아크리피림(Fluacrypyrim)(373)스피로메시펜(Spiromesifen)
(현행과같음)
<삭제>
(374)알라니카브(Alanycarb)
(현행과같음)
<삭제>
(375)오퓨레이스(Ofurace)
(현행과같음)
<삭제>
(376)트리플루뮤론(Triflumuron)
(현행과같음)
<삭제>
(377)티펜설퓨론메틸(Thifensulfuron
-methyl)
(현행과같음)
<삭제>
(378)페림존(Ferimzone)
(현행과같음)
<삭제>
(379)플루아크리피림(Fluacrypyrim)- 370 -현행 개정(안)
(생략)
기타농산물 0.1
(380)피리달릴(Pyridalyl)
(생략)
기타농산물 0.05
(381)∼(383)(생략)
(384)사이플루페나미드(Cyflufenamid)
(생략)
기타농산물 0.1
(385)(생략)
(386)플로니카미드(Flonicamid)
(생략)
기타농산물 0.1
(387)∼(389)(생략)
(390)시메코나졸(Simeconazole)
(생략)
기타농산물 0.05
(391)만디프로파미드(Mandipropamid)(현행과같음)
<삭제>
(380)피리달릴(Pyridalyl)
(현행과같음)
<삭제>
(381)∼(383)(현행과같음)
(384)사이플루페나미드(Cyflufenamid)
(현행과같음)
<삭제>
(385)(현행과같음)
(386)플로니카미드(Flonicamid)
(현행과같음)
<삭제>
(387)∼(389)(현행과같음)
(390)시메코나졸(Simeconazole)
(현행과같음)
<삭제>
(391)만디프로파미드(Mandipropamid)- 371 -현행 개정(안)
(생략)
기타농산물 0.05
(392)(생략)
(393)메트알데하이드(Metaldehyde)
(생략)
기타농산물 0.05
(394)비스트리플루론(Bistrifluron)
(생략)
기타농산물 0.2
(395)플루오피콜라이드(Fluopicolide)
(생략)
기타농산물 0.1
(396)에티클로제이트(Ethychlozate)
(생략)
기타농산물 0.05
(397)∼(398)(생략)
(399)사이플루메토펜(Cyflumetofen)
(생략)
기타농산물 0.07(현행과같음)
<삭제>
(392)(현행과같음)
(393)메트알데하이드(Metaldehyde)
(현행과같음)
<삭제>
(394)비스트리플루론(Bistrifluron)
(현행과같음)
<삭제>
(395)플루오피콜라이드(Fluopicolide)
(현행과같음)
<삭제>
(396)에티클로제이트(Ethychlozate)
(현행과같음)
<삭제>
(397)∼(398)(현행과같음)
(399)사이플루메토펜(Cyflumetofen)
(현행과같음)
<삭제>- 372 -현행 개정(안)
(400)(생략)
(401)디비이디시(DBEDC)
(생략)
기타농산물 0.05
(402)(생략)
(403)메타플루미존(Metaflumizone)
(생략)
기타농산물 0.05
(404)메트라페논(Metrafenone)
(생략)
기타농산물 0.05
(405)사이에노피라펜(Cyenopyrafen)
(생략)
기타농산물 0.05
(406)∼(407)(생략)
(408)스피네토람(Spinetoram)
(생략)
기타농산물 0.05(400)(현행과같음)
(401)디비이디시(DBEDC)
(현행과같음)
<삭제>
(402)(현행과같음)
(403)메타플루미존(Metaflumizone)
(현행과같음)
<삭제>
(404)메트라페논(Metrafenone)
(현행과같음)
<삭제>
(405)사이에노피라펜(Cyenopyrafen)
(현행과같음)
<삭제>
(406)∼(407)(현행과같음)
(408)스피네토람(Spinetoram)
(현행과같음)
<삭제>- 373 -현행 개정(안)
(409)아미설브롬(Amisulbrom)
(생략)
기타농산물 0.05
(410)옥솔린산(Oxolinicacid)
(생략)
기타농산물 0.05
(411)∼(414)(생략)
(415)크로마페노자이드(Chromafenozide)
(생략)
기타농산물 0.05
(416)클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole)
(생략)
기타농산물 0.05
(417)플루벤디아마이드(Flubendiamide)
(생략)
기타농산물 0.05
(418)(생략)
(419)프로헥사디온-칼슘(Prohexadione(409)아미설브롬(Amisulbrom)
(현행과같음)
<삭제>
(410)옥솔린산(Oxolinicacid)
(현행과같음)
<삭제>
(411)∼(414)(현행과같음)
(415)크로마페노자이드(Chromafenozide)
(현행과같음)
<삭제>
(416)클로란트라닐리프롤(Chlorantraniliprole)
(현행과같음)
<삭제>
(417)플루벤디아마이드(Flubendiamide)
(현행과같음)
<삭제>
(418)(현행과같음)
(419)프로헥사디온-칼슘(Prohexadione- 374 -현행 개정(안)
-calcium)
(생략)
기타농산물 0.05
(420)린단(Lindane,γ-BHC)
(생략)
기타농산물 0.01
(421)∼(462)(생략)
[별표4]～[별표6](생략)-calcium)
(현행과같음)
<삭제>
(420)린단(Lindane,γ-BHC)
(현행과같음)
<삭제>
(421)∼(462)(현행과같음)
[별표4]～[별표6](현행과같음)