มอก. 531 -  25XX  
 
มาตรฐา นผลิตภัณฑ อุตสาหกรรม  
ภาชนะพลาสติกสําหรับบรรจุ ผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเชื้อ  
 
 
1. ขอบขาย  
1.1 มาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้ครอบคลุมเฉพาะภาชนะพลาสติกที่ใชบรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจาก  
เชื้อที่เปนของเหลวสําหรับฉีดเขาสูรางกาย โดยไมรวมถึงอุปกรณประกอบอื่นๆ ซึ่งตอไปในมาตรฐานนี้         
จะเรียกวา “ภาชนะพลาสติก ” 
1.2 มาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้ไมครอบคลุมกระบอกฉีดยาพลาสติกที่บรรจุผลิตภัณฑเภสัชปราศจาก
เชื้อพรอมใช  
 
2. บทนิยาม  
  ความหมายของคําที่ใชในมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้ มีดังตอไปนี้  
2.1 ผลิตภัณฑเภสัชปราศจากเชื้อ ( sterile pharmaceutical products) หมายถึง ของเหลวที่ผานกรรมวิธีการทําให
ปราศจากเชื้อแลว ที่ใช ฉีดเขาสูรางกายเพื่อการวินิจฉัย บําบัด บรรเทา รักษา หรือปองกันโ รคหรือความ
เจ็บปวยของมนุษยและสั ตวหรือเพื่อใหเกิดผลแกสุขภาพ  โครงสราง หรือการกระทําหนาที่ใด  ๆ ของ
รางกายของมนุษยหรือสัตว  
2.2 พลาสติก หลาย ชั้น ( multilayer plastic)  หมายถึง พลาสติกที่ประกอบดวยแผนพลาสติกตั้งแต 2 ชั้นขึ้นไปอัด
ประกบกัน และสวนประกอบแตละชนิดตองไมละลาย เขาดวยกัน  
3. ชนิด  
3.1 ภาชนะพลาสติก แบงเปน  4  ชนิด คือ  
 3.1.1  พอลิเอทิลีน  
 3.1.2  พอลิโพรพิลีน  
 3.1.3   พอลิไวนิลคลอไรด  
 3.1.4  พลาสติก หลาย ชั้น ซึ่งตองไมมีพอลิไวนิลคลอไรดเปนสวนประกอบ  
 
 
-1- มอก. 531 -  25XX  
4. วัสดุ 
4.1  การทดสอบชนิด ของภาชนะพลาสติก ใหใชเครื่องฟูเรียทรานสฟอรมอินฟราเรดสเปกโทรมิเตอร (FTIR)   
  หรือเครื่องมืออื่นที่  เทียบเทา  
4.2  กรณีภาชนะพลาสติกชนิดพลาสติกหลายชั้น ใหทดสอบชนิดเฉพาะชั้นที่สัมผัสกับผลิตภัณฑเทานั้น  
4.3  กรณี ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด      
 4.3.1 ตองประกอบดวยพอลิไวนิลคลอไรดเรซินไมนอยกวา 55% โดยมวล  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.1 
 4.3.2      ตองมีปริมาณได (2-เอทิลเฮกซิล )แทเลต (DEHP) ที่สกัดได  ไมเกิน 40 % โดยมวล  
    การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.2 
 4.3.3  ตองมีปริมาณไวนิลคลอไรดโมโนเมอรไมเกิน 1 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม      
    การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.3 
 
   5. คุณลักษณะที่ตองการ  
5.1  ลักษณะทั่วไป      
 5.1.1 ตองไมมีสี โปรงแสง และมองเห็นผลิตภัณฑเภสัชที่บรรจุอยูภายในไดชัด  
 5.1.2 พื้นผิวภายในของภาชนะพลาสติกตองสะอาด เรียบ ยกเวนตะเข็บที่เกิดจากแบบ (mould) และไมมี 
   ตําหนิซึ่งอาจเปนผลเสียตอการใชงาน 
  การทดสอบใหทําโดยการตรวจพินิจ  
5.2  คุณลักษณะทางฟสิกส  
 5.2.1 รูรั่ว     
   ตองไมมีรูรั่ว 
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.4 
 5.2.2 ความทนตอการตกกระแทก   (ยกเวน ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด )    
   ตองไมรั่วหรือแตก          
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.5 
 5.2.3 ความสม่ําเสมอของความหนา  (เฉพาะ ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด )    
   ผลตางของความหนา คาสูงสุดกับคาต่ําสุด ตองไมเกิน 0.05 mm 
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.6 
 5.2.4 ความทนความดัน (เฉพาะ ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด )    
   ตองไมรั่วซึม  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.7 
-2-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
 5.2.5 ความยืด หยุน  (เฉพาะ ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไว นิลคลอไรด )    
   สารละลายตองไหลออกไดหมดโดยไมมีอากาศไหลเขาไปแทนที่ขณะไหล  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.8 
 5.2.6 การซึมผานของไอน้ํา      
   มวลของน้ําที่หายไปตองไมเกิน 0.20%  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.9 
 5.2.7 ปริมาณกากที่เหลือจากการเผา    
   ตองไมเกิน 0 .10% 
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.10 
 5.2.8 ปริมาณอนุภาคปนเปอน      
   ขนาดเสนผานศูนยกลางตั้งแต 10 µm ตองไมเกิน 25 อนุภาคตอมิลลิลิตร และขนาดเสนผานศูนยกลาง
   ตั้งแต  25 µm ตองไมเกิน 3 อนุภาคตอมิลลิลิตร  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามข อ 8.11 
5.3  คุณลักษณะทางเคมี  
 5.3.1 คุณลักษณะของสารละลายที่สกัดได      
  5.3.1.1 ตองใส ไมมีสี 
  5.3.1.2 ฟองที่เกิดขึ้นตองหายไปภายใน 3 min   
  5.3.1.3 ความเปนกรด -ดาง 
    ผลตาง คาความเปนกรด -ดางของสารละลายที่สกัดได เมื่อเทียบกับ สารละลาย แบลงก  
    ตองไมเกิน 1 .5 
  5.3.1.4 ปริมาตร โพแทสเซียมเพอรแมงกาเนตที่ใชทําปฏิกิริยา  
    ตองไมเกิน 1 .0 ml  
  5.3.1.5 ปริมาณกากที่ไมระเหย  
    ตองไมเกิน 1 .0 mg 
  5.3.1.6 คาการดูดกลืนแสงสูงสุด  
    (1) ตองไมเกิน 0 .08 ที่ชวง ความยาวคลื่น 220 nm  ถึง 240 nm    
    (2) ตองไมเกิน 0 .05 ที่ชวง ความยาวคลื่น 241 nm ถึง 350 nm  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.12 
 5.3.2 ปริมาณโลหะหนัก        
  5.3.2.1 ปริมาณโลหะหนัก (คํานวณเปนตะกั่ว ) ตองไมเกิน 20 µg /g 
  5.3.2.2 ตะกั่ว ตองไมเกิน 10 µg /g 
-3- มอก. 531 -  25XX  
  5.3.2.3 แคดเมียม ตองไมเกิน 1 µg /g 
  5.3.2.4  ดีบุก ตองไมเกิน 5 µg /g 
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.13 
5.4  คุณลักษณะทางชีวภาพ      
 5.4.1 ความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อ เพาะเลี้ยง  
   ตองไมเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.14 
 5.4.2 สารไพโรเจน  
   เมื่อทดสอบตามขอ 8.15 แลว ปริมาณ แบคทีเรียล เอ็นโดท็อกซิน ต องไมเกิน 20.0 หนวยเอ็นโดท็อกซิ น         
   ตอภาชนะพลาสติกตัวอยาง  
 5.4.3 การซึมผานของจุลินทรีย  
   ตองไมมีการซึมผานของจุลินทรีย  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามขอ 8.16 
 5.4.4 การทําลายเม็ดเลือด 
   ตองไมมีการทําลายเม็ดเลือด  
   การทดสอบใหปฏิบัติตามภาคผนวก ก . 
5.5  ความคงทนของเครื่องหมายและฉลาก      
  เมื่อทดสอบตามขอ 8.17 แลว ฉลากตอง ยังคงติดอยูที่ภาชนะพลาสติก ตําแหนงเดิม  และเครื่องหมายหรือ  
  ขอความใดๆ ที่ฉลากหรือที่ภาชนะพลาสติกตองอานไดชัดเจน  
    
 6.  เครื่องหมายและฉลาก  
6.1  ภาชนะพลาสติกที่ทําจากพอลิเอทิลีนหรือพอลิโพรพิลีน หรือทั้งสองอยาง  
  ในเนื้อภาชนะพลาสติกทุกใบ  อยางนอยตองมีเลข อักษร หรือเครื่องหมายแจงรายละเอียดตอไปนี้ใหเห็น  
ไดงาย ชัดเจน ถาวร  
(1) ชนิด  
  (2) ความจุ เปนมิลลิลิตร  พรอมขีดบอกปริมาตร  
(3) ชื่อผูทําหรือโรงงานที่ทํา หรือเครื่องหมายการคาที่จดทะเบียน  
6.2  ภาชนะพลาสติกที่ทําจากพอลิไวนิลคลอไรดหรือพลาสติก หลาย ชั้น 
  ที่ภาชนะพลาสติกทุกใบ  อยางนอยตองมีเลข อักษร หรือเครื่องหมายแจงรายละเอียดตอไปนี้ใหเห็น  ไดงาย 
ชัดเจน  
(1) ชนิด  
-4-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
  (2) ความจุ เปนมิลลิลิตร   
  (3) คําเตือนวาใช DEHP เปนสารเติมแตง  
(4) ชื่อผูทําหรือโรงงานที่ทํา หรือเครื่องหมายการคาที่จดทะเบียน  
6.3  ในกรณีที่ใชภาษาตางประเทศ  ตองมีความหมายตรงกับภาษาไทยที่กําหนดไวขางตน  
7. การชักตัวอยางและเกณฑตัดสิน  
7.1 การชักตัวอยางและเกณฑตัดสินใหเปนไปตามภาคผนวก  ข. 
8.  การทดสอบ  
8.1  ปริมาณพอลิไวนิลคลอไรดเรซิน  
 8.1.1 เครื่องมือ  
   อุปกรณสําหรับวิธีอ อกซิเจนฟลาสกคอมบัสชัน (oxygen flask combustion) ประกอบดวยขวดแกว 
   บอโรซิลิเกต รูปกรวย ขนาดประมาณ 500 ml ปดดวยจุกแกว ที่ยึดกับที่เสียบตัวอยางทําจากลวด 
   แพลทินัมสานเปนตาขาย ขนาดประมาณ 1.5 cm x 2 cm (ดังรูปที่ 1 )  
                                   
  
รูปที่ 1 อุปกรณสําหรับวิธีอ อกซิเจนฟลาสกคอมบัสชัน  
(ขอ 8.1.1) 
 8.1.2 สารเคมี สารละลาย และวิธีเตรียม  
   8.1.2.1 สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 1 M 
   8.1.2.2 ไดบิวทิลแทเลต  
   8.1.2.3 กรดไนทริกเขมขน (ความหนาแนน 1.40 g/ml ) 65%  โดย มวล 
-5- มอก. 531 -  25XX  
   8.1.2.4 สารละลายเฟอรริกแอมโมเนียมซัลเฟต  
     ละลายเฟอรริกแอมโมเนียมซัลเฟต 100 g ในน้ํากลั่น 1 L     
   8.1.2.5 สารละลายซิลเวอร ไนเทรต 0.1 M  
   8.1.2.6  สารละลายแอมโมเนียมไทโอไซยาเนต 0.05 M 
 8.1.3 วิธีวิเคราะห    
  8.1.3.1 เติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด 20 ml ลงในคอมบัสชันฟลาสก  
  8.1.3.2 ชั่งตัวอยาง 50.0 mg หอดวยกระดาษกรองขนาด 30 mm x 40 mm พับใหไดขนาด 10 mm x            
    30 mm สอดหอตัวอยางเขาไปในที่เสียบตัวอยางที่ทําจากลวดแพลทินัม  
  8.1.3.3 เผาหอตัวอยาง แลวใสเขาไปในขวดแกวรูปกรวย ปดจุกแกว  
  8.1.3.4 เมื่อการเผาไหมสมบูรณ แลว แกวงขวดแกว เพื่อใหสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซดดูดซึม ไอของ
    สารประกอบ คลอไรดที่เกิดจากกา รเผาตัวอยาง  
  8.1.3.5 นําจุกแกวและหอตัวอยางออก แลวเติมไดบิวทิลแทเลต 1 ml กรดไนทริก  2.5 ml สารละลายเฟอร
    ริกแอมโมเนียมซัลเฟต  5 ml สารละลายซิลเวอรไนเทรต  10.0 ml ลงในขวด แกวรูปกรวย 
  8.1.3.6 นําสารละลายที่ไดไทเทรตกับสารละลายแอมโมเนียมไทโอไซ ยาเนต จนไดสารละลายสีเหลือง แดง 
    สารละลายซิลเวอรไนเทรต 0.1 M 1 ml สมมูลกับพอลิไวนิลคลอไรด 6 .25 mg 
    หาปริมาณพอลิไวนิลคลอไรดเรซิน  จากสูตร  
 
         ปริมาณพอลิไวนิลคลอไรดเรซิน    =     10 -  �MNH4SCN  x  VNH4SCN
MAgNO 3�     x 6.25 x MAgNO 3
0.1 
                              เปนมิลลิกรัม  
 
     เมื่อ   MNH 4SCN  คือ ความเขมขน ของสารละลายแอมโมเนียมไทโอไซยาเนต เปนโมลาร  
      VNH 4SCN    คือ ปริมาตรของ สารละลายแอมโมเนียมไทโอไซยาเนต เปนมิลลิลิตร  
      MAgNO 3     คือ ความเขมขนของ สารละลายซิลเวอรไนเทรต  เปน โมลาร  
8.2  ปริมาณ DEHP  
 8.2.1 เครื่องมือ  
  8.2.1.1 อุปกรณสําหรับทําทินเลเยอรโครมาโทกราฟ ประกอบดวย แผนแกวที่เคลือบดวยซิลิกาเจลจีเอฟ 
    254 ซึ่งตอไปจะเรียกวา แผนรงคเลข   
  8.2.1.2 ตูโครมาโทกราฟ  
  8.2.1.3  เครื่องใหแสงอัลตราไวโอเลตที่ความยาวคลื่น 254 nm 
  8.2.1.4  เครื่องอังน้ํา  
  8.2.1.5 เครื่องสกัดรีฟลักซคอนเดนเซอร  
-6-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
 8.2.2 สารเคมีและสารละลาย  
  8.2.2.1 โทลูอีน  เปนวัฎภาคเคลื่อนที่ (mobile phase)  
  8.2.2.2  อีเทอร 
  8.2.2.3  สารละลายอางอิง 
    ละลาย DEHP ในโทลูอีน 0.1 mg/ml  
 8.2.3 การเตรียมสารละลายตัวอยาง  
  8.2.3.1 ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางใหไดขนาดไมเกิน 1 cm นําชิ้นตัวอยางมา 2.0 g เติมอีเทอรที่ 
    ปราศจากเพอรออกไซด 200 ml ใหความรอนภายใตรีฟลักซคอนเดนเซอร เปนเวลา 12 h  
  8.2.3.2  แยกกากและสารละลา ยออกจากกัน  
  8.2.3.3 นําสารละลายไประเหยจนแหงโดยการลดความดันดวยเครื่องอังน้ําที่อุณหภูมิ 30 °C          
  8.2.3.4  ละลายกากที่เหลืออยูดวยโทลูอีน 10 ml 
 8.2.4 วิธีวิเคราะห  
  8.2.4.1 หยอดสารละลายตัวอยาง  0.5 ml บนแผนรงคเลขใหไดแถบขนาด 30 mm x 3 mm และหยด 
   สารละลาย อางอิง  5 µl บนแผนรงคเลข ใหแยกออกจากกัน วางในตูโครมาโทกราฟ ที่อิ่มตัว 
   ดวยโทลูอีน ใหโทลูอีนซึมผานสารเคลือบขึ้นไปเหนือเสนที่หยอดสารละลายตัวอยาง (solvent  
   front) เปนระยะ 15 cm   
  8.2.4.2 นําแผนรงคเลขออกจากตูโครมาโทกราฟ ปลอยใหแ หงในอากาศ นําไปตรวจภายใตแสงอัตรา       
    ไวโอเลต ที่ความยาวคลื่น 254 nm ระบุตําแหนงของตัวอย างที่สอดคลองกับสารละลาย อางอิง  
  8.2.4.3  ขูดซิลิกาเจลบริเวณที่สอดคลองกับ สารละลาย อางอิง ไปเขยากับอีเทอร 40 ml เปนเวลา 1 min 
  8.2.4.4  กรอง ลางดวยอีเทอร 10 ml 2 ครั้ง นําอีเทอรที่ไดทั้งหมดไประเหยใหแหง กากที่ไดตองหนักไม 
    เกิน 40 mg 
8.3  ปริมาณไวนิลคลอไรดโมโนเมอร  
 8.3.1 เครื่องมือ  
  8.3.1.1 เฮดสเปซกาซโครมาโทกราฟ  
  8.3.1.2  เครื่องอังน้ํา  ที่ควบคุมอุณหภูมิที่ (60+1) °C 
  8.3.1.3 เครื่องชั่งละเอียด 0.1 mg 
 8.3.2 สารเคมี 
  8.3.2.1 ไดเมทิลอะเซตาไมด  
  8.3.2.2 อีเทอร 
  
 
-7- มอก. 531 -  25XX  
 8.3.3 การเตรียมสารละลายมาตรฐานภายใน  
   ใชไมโครไซริงค ดูดอีเทอร 10 µl จุมปลายเข็มลงในไดเมทิลอะเซตาไมด 20.0 ml แลวฉีดอีเทอรลงใน
   สารละลาย เจือจางสารละลายดวยไดเมทิลอะเซตาไมดใหเจือจางลง 1 000 เทา ทันทีกอนใช  
 8.3.4 การเตรียมสารละลายทดสอบ  
   ชั่งตัวอยาง 1 .000 g ใสลงในไวแอลขนาด 50 ml เติมสารละลายมาตรฐานภายใน 10.0 ml ปดจุก         
   ไวแอล แกวใหสนิท เขยา หลีกเลี่ยงไมใหของเหลวภายในสัมผั สกับจุกปด วางไวแอล แกวในเครื่องอัง
   น้ําที่อุณหภูมิ (60+1) °C เปนเวลา 2 h 
 8.3.5 การเตรียมสารละลายปฐมภูมิไวนิลคลอไรด  
   ตองเตรียมสารละลายนี้ในตูอากาศไหลเวียน (ventilated hood)  
8.3.5.1 ใชปเปตตดูดไดเมทิลอะเซตาไมด 50.0 ml ใสลงในไวแอล แกวขนาด 50 ml ปดจุกไวแอล แกวให
สนิท แลวชั่งใหมีความละเอียดถึง 0.1 mg  
8.3.5.2 ใชกระบอกฉีดยาที่ทําดวยพอลิเอทิลีนหรือพอลิโพรพิลีนขนาดความจุ 50 ml ดูดกาซไวนิลคลอ
ไรด 50 ml ใหกาซคงอยูในกระบอกฉีดยานานประมาณ 3 min แลวดันกานฉีดไลกาซออก  
8.3.5.3 ดูดกาซไวนิลคลอไรด 50 ml อีกครั้งหนึ่ง ตอเข็มฉีดยาเขากับกระบอกฉีดยา แลวลดปริมาตรกาซ
ในกระบอกฉีดยาจาก 50 ml ลงเหลือ 25 ml  
8.3.5.4 ฉีดกาซไวนิลคลอไรดที่เหลือเขาในไวแอล แกวอยางชาๆ เขยาเบาๆ หลีกเลี่ยงไมใหของเหลว
ภายในสัมผัสกับเข็มฉีดยา  
8.3.5.5 ชั่งมวลไวแอล แกวอีกครั้งหนึ่ง มวลที่เพิ่มขึ้นจะไดประมาณ 60 mg  (สารละลายที่ได 1  µl มี               
ไวนิลคลอไรดประมาณ 1.2 µg) ตั้งไว 2  h เก็บสารละลายนี้ในตูเย็น  
 8.3.6 การเตรียมสารละลายมาตรฐานไวนิลคลอไรด  
   อัตราสวนสารละลายปฐมภูมิไวนิลคลอไรด  : ไดเมทิลอะเซตาไมด เป น 1:3 โดยปริมาตร  
 8.3.7 การเตรียมสารละลายอางอิง  
  8.3.7.1 ใชปเปตตดูดสารละลายมาตรฐานภายใน 10.0 ml ลงในไวแอล แกวขนาด 50 ml จํานวน 6 ขวด  
    ปดจุกไวแอล แกวใหสนิท  
  8.3.7.2 ฉีดสารละลายมาตรฐานไวนิลคลอไรดปริมาตร 1 µl  2 µl  3 µl  5 µl  และ 10 µl ลงในไวแอล แกว 
    5 ขวด  จะไดไวแอล แกวที่มีปริมาณไวนิลคลอไรด ประมาณ  0.3 µg  0 .6 µg  0 .9 µg 1.5 µg  และ                 
    3 µg ตามลําดับ เขยา หลีกเลี่ยงไมใหของเหลวภายในสัมผัสกับจุกปด วางไวแอล แกวในเครื่องอัง
    น้ําที่อุณหภูมิ (60+1) °C เปนเวลา 2 h 
 8.3.8 วิธีวิเคราะห  
   วิเคราะหปริมาณไวนิลคลอไรดในสารละลายทดสอบ โดยใชเฮดสเปซกาซโครมาโทกราฟ ที่มีภาวะ 
   เครื่องดังนี้  
 
-8-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
   1) คอลัมน  
    1.1) ทําดวยเหล็กกลาไรสนิม ขนาดเสนผานศูนยกลาง ภายใน  3 mm ยาว 3 m 
    1.2) วัฏภาคคงที่ (stationary phase)  ประกอบดวยไซเลไนสไดอาโตมาเชียสเอิรธ (silanised  
     diatomaceous earth) ชั้นคุณภาพ โครมาโทกราฟ  ทําให เอิบชุม (impregnate) ดวยสารละลาย
     ผสมของไดเม ทิลสเตียริลเอไมด  5% เศษสวน โดยมวล และมาโครกอล 400 ความเขมขน 5% 
     เศษสวน โดยมวล  
   2) กาซตัวพา : ไนโตรเจน  
   3) อัตราการไหล : 30 ml/min  
   4) อุณหภูมิ :  
    - คอลัมน : 45 ° C 
    - ชองที่ฉีดเขา : 100 °C 
    - ตัวตรวจจับ : 150 ° C 
   5) การตรวจจับ : เฟลมไอออไนเซชัน  
   6) การฉีด : เฮดสเปซ 1 ml 
   หลังจากไดโครมาโตแกรมแลว คํานวณหาปริมาณไวนิลคลอไรดโมโนเมอร  
8.4  รูรั่ว 
 8.4.1  เครื่องมือ  
    เครื่องอัดอากาศที่มีมาตรความดันวัดไดตั้งแต 0 kPa ถึง 5  kPa   
 8.4.2  วิธีทดสอบ  
  8.4.2.1 อัดอากาศเขาไปในภาชนะพลาสติกตัวอยางดวยเครื่องอัดอากาศจนความดันภายในภาชนะ 
  พลาสติกตัวอยางมีคา (1.5+0.15) kPa  
  8.4.2.2 จุมภาชนะพลาสติกตัวอยางที่อัดอากาศแลวลงในน้ํา ใหสวนบนสุดของภาชนะพลาสติก 
  ตัวอยางอยูต่ํากวาระดับผิวน้ํา (20+2) cm เปนเวลา (1.5+0.5) min สังเกตฟองอากาศ หากมี 
  ฟองอากาศปุดขึ้นมาแสดงวาภาชนะพลาสติกตัวอยางมีรูรั่ว  
8.5  ความทนตอการตกกระแทก  (ยกเวน ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด ) 
  ใสน้ําลงในภาชนะพลาสติกตัวอยางเทาความจุที่ระบุไว ปดใหสนิท ปลอยภาชนะพลาสติกตัวอยางจาก 
  ระดับความสูงตามตารางที่ 1 ใหตกอยางอิสร ะลงบนพื้นแข็งเรียบที่อุณหภูมิ 20 °C ถึง 30 ° C แลวตรวจ 
  พินิจภาชนะพลาสติกตัวอยาง  
 
 
 
-9- มอก. 531 -  25XX  
ตารางที่ 1 ความจุระบุของภาชนะพลาสติกตัวอยางและระดับความสูงที่ปลอยภาชนะพลาสติกตัวอยาง  
(ขอ 8.5) 
ความจุระบุ ระดับความสูงที่ปลอย 
 ภาชนะพลาสติกตัวอยาง  
ml m 
นอยกวา  750 1.00 
750   ถึง  1 499  0.75 
               1 500   ถึง  2 499  0.50 
    ตั้งแต  2 500  0.25 
 
8.6  ความสม่ําเสมอของความหนา (เฉพาะ ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด ) 
 8.6.1  เครื่องมือ  
    เครื่องวัดความหนาที่วัดไดละเอียด 0.001 mm 
 8.6.2  วิธีวัด  
    ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยาง แลววัดความหนาของภาชนะพลาสติกที่ตําแหนงตางๆ กัน 5 ตําแหนง 
 (ยกเวนสวนที่เปนตะเข็บหรือรอยนูน ) แตละตําแหนงใหหางกันพอสมควร แลวรายงานผลตาง
 ระหวางความหนาสูงสุดกับความหนาต่ําสุดที่วัดได  
8.7  ความทนความดัน (เฉพาะ ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด ) 
 8.7.1  เครื่องมือ  
    เครื่องอัดความดัน  
 8.7.2  สารละลาย  
    สารละลายฟลูออเรสซีนโซเดียมในน้ํา (1 g ในน้ํา 1 000 ml)  
 8.7.3  วิธีทดสอบ  
    ใสสารละลายฟลูออเรสซีนโซเดียมลงในภาชนะพลาสติกตัวอยางจน เต็ม ปดดวยจุกที่ตอกับเครื่อง อัด
 ความดัน แลวหุมใหทั่วและสนิทดวยกระดาษกรองสีขาว อั ดความดันใสภาชนะพลาสติกตัวอยาง ให
 ได 6.9 N (0.7  kg)/cm2 ที่อุณหภูมิ 20 °C เปนเวลา 10 min  แลวตรวจพินิจ  
8.8  ความยืด หยุน (เฉพาะ ภาชนะพลาสติกชนิด พอลิไวนิลคลอไรด ) 
  แทงเข็มเจาะ (spike needle) เขาทางจุกยางของภาชนะพลาสติกตัวอยาง ที่ผานการทดสอบ ในขอ 8.7 แลว
สังเกตการไหลของสารละลาย  
  หมายเหตุ   เข็มเจาะ หมายถึง เข็มเจาะภาช นะบรรจุขนาดเสนผานศูนยกลางภาย นอก 5.0 mm -  5.3 mm ยาว 
   27 mm -  29 mm ของชุดใหสารละลายทางหลอดเลือดใชครั้งเดียว 
-10-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
8.9  การซึมผานของไอน้ํา 
 8.9.1  เครื่องมือ  
  8.9.1.1 ตูที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่ (25+2) °C ความชื้นสัมพัทธ (65+5)% 
  8.9.1.2 เครื่องชั่งละเอียด 0.1 mg 
 8.9.2  วิธีทดสอบ  
  8.9.2.1 ชั่งภาชนะพลาสติกตัวอยางพรอมฝาปด ใหทราบ มวลแนนอน  เปน m1  
  8.9.2.2 บรรจุน้ํากลั่นลงในภาชนะพลาสติกตัวอยางใหไ ดปริมา ตรเทากับความจุที่ระบุไว  ปดฝาใหสนิท 
  ชั่งมวล เปน m2 
  8.9.2.3 นําไปเก็บในตูที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่ (25+2) °C ความชื้นสัมพัทธ (65+5)% เปนเวลา (336+1) h 
  เมื่อครบตามระยะเวลาที่กําหนด นําไปชั่ง มวล เปน m3 
     คํานวณหาน้ําที่หายไป จากสูตร  
                                     น้ําที่หายไป เปนรอยละ   =𝑚𝑚2– 𝑚𝑚3  
𝑚𝑚2– 𝑚𝑚1 x 100 
       
      เมื่อ   m1  คือ มวลของภาชนะพลาสติกตัวอยางพรอมฝาปด เปนกรัม 
      m2  คือ มวลของภาชนะพลาสติกตัวอยางที่บรรจุน้ํากลั่นกอนทดสอบ เปนกรัม 
      m3  คือ มวลของภาชนะพลาสติกตัวอยางที่บรรจุน้ํากลั่นหลังทดสอบ เปนกรัม  
8.10  ปริมาณกากที่เหลือจากการเผา  
 8.10.1 เครื่องมือ  
   8.10.1 .1 เครื่องชั่งละเอียด 0.1 mg 
   8.10.1 .2 เตาเผาไฟฟาที่ปรับและควบคุมอุณหภูมิไดที่ (550+50) °C  
   8.10.1 .3 ครูซิเบิลแพลทินัม ควอตซ หรือกระเบื้องเคลือบ ที่เผาที่อุณหภูมิ (550+50) °C และชั่ง ที่อุณหภูมิ  
  หองจนได มวลคงที่ เปน m1   
   8.10.1 .4 เดซิกเคเตอร  
 8.10.2 สารเคมี  
    กรดซัลฟวริกเขมขน ความหนาแนน 1.84 g/ml 
 8.10.3 วิธีทดสอบ  
   8.10.3 .1 ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางที่ตําแหนงตางๆ กัน แตละใบใหมีพื้นที่เทาๆ กัน นํามารวมกัน  
  ตัดเปนชิ้นเล็กๆ ผสมรวมกัน แบงมาประมาณ 5 g ชั่งใหทราบมวล แนนอน  เปน m2 ใส           
  ลงในครูซิ เบิล  
    8.10.3 .2 หยดกรดซัลฟวริกเขมขน 2 หยดถึง 3 หยด ลงในครูซิ เบิล เผาดวยไฟออนๆ จนพลาสติก กลาย  
  เปนถาน (carbonize)  ทิ้งไวใหเย็น หยดกรดซัลฟวริกเขมขนลงไปอีกเล็กนอย เผาตอ ดวยไฟ 
-11- มอก. 531 -  25XX  
  ออนๆจนหมดควัน แลวเผาตอในเตา เผาไฟฟาที่อุณหภูมิ (550+50) °C เปนเวลา 1 h นําออกมา
  ใสในเดซิกเคเตอร ปลอยไวใหเย็นที่อุณหภูมิหอง ชั่ง แลวเผาซ้ําครั้งละ 30 min จนได มวลคงที่ 
  เปน m3   
     คํานวณปริมาณกากที่เหลือจากการเผา จากสูตร   
                                              กากที่เหลือจากการเผา  เปนรอยละ   =𝑚𝑚3– 𝑚𝑚1  
𝑚𝑚2 x 100 
              
      เมื่อ   m1  คือ มวลของครูซิเบิล เปนกรัม 
      m2  คือ มวลของภาชนะพลาสติกตัวอยาง เปนกรัม 
      m3  คือ มวลของครูซิเบิลและกากที่เหลือจากการเผา เปนกรัม  
8.11 ปริมาณอนุภาคปนเปอน  
 8.11.1 ภาวะทดสอบ  
   ทําในที่ที่ปราศจากฝุน อุปกรณและเครื่องมือตองสะอาด  
 8.11.2 เครื่องมือ  
   8.11.2.1 เครื่องนับจํานวนอนุภาคที่ทํางานดวยวิธีการกั้นแสง (light blockage method)  
   8.11.2.2 น้ํากลั่นสําหรับ ทํายาฉีด  (water for injection) ที่กรองผานเยื่อกรองที่มีรูพรุนขนาด 0.2 µm แลว 
 8.11.3  วิธีวิเคราะห  
   ใสน้ํากลั่นสําหรับ ทํายาฉีด  ที่กรองผานเยื่อกรองที่มีรูพรุนขนาด 0.2 µm แลว ลงในภาชนะพลาสติก  
   ตัวอยาง เทาความจุที่ระบุไว นําไปผานกระบวนก ารทําใหปราศจากเชื้อ เก็บไวอยา งนอย 12 h นํา สาร  
   ละลายที่ ไดไปนับจํานวนอนุภาค  โดยเปรียบเทียบกับสารละลายแบลงก  
   หมายเหตุ  สารละลายแบลงก คือ น้ํากลั่นสําหรับ ทํายาฉีดที่กรองผานเยื่อกรองที่มีรูพรุนขนาด 0.2 µm  
8.12 คุณลักษณะของสารละลายที่สกัดได  
 8.12.1  การเตรียมตัวอยางรวม  
    ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางทุกใบตรงบริเวณที่มี ความหนา สม่ําเสมอและโคงนอยที่สุด ใหไดชิ้น
 พลาสติก พื้นที่เทาๆ กัน นํามารวมกันใหพื้นที่ผิว ทั้งสองดาน รวมกันได 1 200 cm2 สําหรับพลาสติกที่มี
 ความหนาไมเกิน 0.5 mm และ 600 cm2 สําหรับพลาสติกที่มีความหนาเกิน 0.5 mm  
 8.12.2  การเตรียมสารละลายที่สกัดไดและสารละลายแบลงก  
  8.12.2 .1 เครื่องมือ  
     (1) หมอนึ่งอัด ที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่ (121+2) °C  
     (2) ตูอบ ที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่ (70+2) °C  
     (3) ภาชนะแกวบอโรซิลิเกตขนาด 300 ml  พรอมฝาที่ปดไดสนิท  
 
-12-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
  8.12.2 .2 วิธีเตรียม  
     (1) สารละลายที่สกัดได  
      ตัดชิ้นพลาสติกตามขอ 8 .12.1 ออกเปนชิ้นยอย ขนาดกวางประมาณ 0.5 cm  และยาว 
   ประมาณ 1 cm ถึง 5 cm  ลางดวยน้ํากลั่น  ปลอยไวใหแหงที่อุณหภูมิหองในที่สามารถ 
   ปองกันการปนเปอนได แลวใสลงในภาชนะแกวบอโรซิลิเกต เติมน้ํากลั่นลงไป 200.0 
   ml ปดฝาใหสนิท นําไปใสในหมอนึ่งอัดที่อุณหภูมิ (121+2) °C เปนเวลา 1 h ปลอยไว
   ใหเย็นจนถึงอุณหภูมิหอง 
      สําหรับภาชนะพลาสติกที่ทําจากพลาสติก หลาย ชั้น ให เติมน้ํากลั่นลงในภาชนะพลาสติก
   ตัวอยาง ตามความจุที่ระบุไว บันทึกปริมาตรน้ํากลั่นและพื้นที่ภายในภาชนะพลาสติก  
   ตัวอยาง ปดใหสนิท นําไปใสในหมอนึ่งอัดที่อุณหภูมิ (121+2) °C เปนเวลา 1 h  
      ถาภาชนะพลาสติกเปลี่ยนแปลงรูปรางที่อุณหภูมิ (121+2) °C ใหเตรียมสารละลาย 
   ตัวอยางที่อุณหภูมิสูงสุดที่ภาชนะพลาสติกไมเปลี่ยนแปลงรูปรางโดยเลือกใชภาวะใด
   ภาวะหนึ่งตอไปนี้คือ ที่อุณหภูมิ (100+2) °C เปนเวลา (2+0.2) h หรือ ที่อุณหภูมิ( 70+2) °C 
   เปนเวลา (24+2) h หรือที่อุณหภูมิ ( 50+2) °C เปนเวลา (72+2) h หรือที่อุณหภูมิ (37+2) °C 
   เปนเวลา (72+2) h  
     (2) สารละลายแบลงก  
      ใหเตรียมโดยวิธีเดียวกับการเตรียมสารละลายที่สกัดได แตไมตองใสตัวอยาง  
  8.12.2.3 ใหนําสารละลายที่สกัดไดและ สารละลายแบลงก ไปทําการทดสอบตามขอ 8.12.3 ตอไป  
 8.12.3  วิธีทดสอบ  
  8.12.3 .1 ลักษณะสารละลาย  
     ตองใส ไมมีสี จึงจะวิเคราะหรายการอื่นๆ ตอไป  
  8.12.3 .2 การเกิดฟอง  
     ใชปเปตตดูดสารละลายที่สกัดได 5 ml ใสในหลอดแกวขนาดเสนผานศูนยกลางภายใน 15  
  mm ยาว 200 mm  ปดฝาใหสนิท เขยาอยางแรงเปนเวลา 3 min สังเกตฟอง ที่เกิดขึ้น พรอมจับเวลา  
  8.12.3 .3 ความเปนกรด -ดาง 
     (1) ใชปเปตตดูดสารละลายที่สกัดไดและสารละลายแบลงกอยางละ 20 ml ใสในบีกเกอร   
ขนาด 25 ml อยางละใบ  
     (2) เติมสารละลายโพแทสเซียมคลอไรด 1 g/l  ลงในบีกเกอรทั้ง 2 ใบๆ ละ 1 ml วัดคา 
   ความเปน กรด-ดางของสารละลายในบีกเกอรแตละใบดวยเครื่องวัดความเปนกรด -ดาง 
 
 
-13- มอก. 531 -  25XX  
  8.12.3 .4 ปริมาตรโพแทสเซียมเพอรแมงกาเนตที่ใชทําปฏิกิริยา  
     (1) เครื่องมือ  
      ขวดแกวรูปกรวยขนาด 100 ml พรอมจุกแกว จํานวน 2 ใบ  
     (2) สารเคมี สารละลายและวิธีเตรียม  
      (2.1) สารละลายมาตรฐานโพแทสเซียมเพอรแมงกาเนต 0.002 mol/l   
       ละลายโพแทสเซียมเพอรแมงกาเนต 31.6 mg ดวยน้ํากลั่นจํานวนเล็กนอยใน
   ขวดแกวปริมาตรขนาด 100 ml เติมน้ํากลั่นจนถึงขีดปริมาตร เขยาใหเขากัน 
   เก็บสารละลายที่ไดในขวดสีชา 
      (2.2) สารละลายกรดซัลฟวริก 5.7% โดยปริมาตร  
      (2.3) สารละลายโซเดียมไทโอซัลเฟต 0.01 mol/l  
       ละลายโซเดียมไทโอซัลเฟต 2.6 g และโซเดียมคารบอเนต 20 mg  ดวย 
    น้ํากลั่นที่เพิ่งตมเดือดและปลอยไวใหเย็นจํานวนเล็กนอยในขวดแกว 
    ปริมาตรขนาด 1 000 ml เติมน้ําก ลั่นที่เพิ่งตมเดือดและปลอยไวใหเย็นแลว 
    จนถึงขีดปริมาตร เขยาใหเขากัน  
      (2.4) อินดิเคเตอรแปงที่เตรียมใหมๆ  
       ละลายแปง (soluble starch) 1 g ดวยน้ําเย็น 10 ml เทลงในน้ําเดือด 200 ml  
    อยางชาๆ และคนอยางสม่ําเสมอ ตมสารละลายที่ไดใหเดื อดจนกระทั่งมี 
    ลักษณะโปรงใส  
      (2.5) โพแทสเซียมไอโอไดด  
     (3) วิธีวิเคราะห  
      (3.1) ใชปเปตตดูดสารละลายที่สกัดได 20 ml ใสในขวดแกวรูปกรวยใบที่หนึ่ง  
    เติมสารละลายมาตรฐานโพแทสเซียมเพอรแมงกาเนต 20 ml และสาร        
    ละลายกรดซัลฟวริก 1.0 ml แลวตมใหเดือดเปนเวลา 3 min  ปลอยไวให 
    เย็น เติมโพแทสเซียมไอโอไดด 0.10 g ปดจุกใหแนน เขยา ปลอยไวเปน 
    เวลา 10  min เติมอินดิเคเตอรแปง 5 หยด แลวไทเทรตกับสารละลาย 
    โซเดียมไทโอซัลเฟต  
      (3.2) ทดลองตามขอ (3.1) โดยใชสารละลายแบลงก 20 ml แทนสารละลายตัวอยาง 
  8.12.3 .5 ปริมาณกากที่ไมระเหย  
     (1) เครื่องมือ  
      (1.1) เครื่องชั่งละเอียด 0.1 mg  
      (1.2) ตูอบแบบอากาศหมุนเวียนที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่ (105+2) °C  
   (1.3) ครูซิเบิลควอตซหรือกระเบื้องเคลือบ ที่อบจน มวลคงที่แลว 2 ใบ  
-14-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
      (1.4) เครื่องอังไอน้ํา  
      (1.5) เดซิกเคเตอร  
     (2) วิธีวิเคราะห  
      (2.1) ใชปเปตตดูดสารละลายที่สกัดได 20 ml ใสลงในครูซิเบิลใบที่หนึ่ง และ 
    สารละลายแบลงกปริมาตรเทากัน ใสลงในครูซิเบิลใบที่สอง นําไประเหย 
    ใหแหงบนเครื่องอังไอน้ํา  
      (2.2) อบครูซิเบิลทั้ง 2 ใบในตูอบที่อุณหภูมิ (105+2) °C เปนเวลา 1 h นําออกมา 
    ใสในเดซิกเคเตอร ปลอยไวใหเย็นที่อุณหภูมิหอง นําไปชั่งแลวอบซ้ํา 
    เปนเวลาครั้งละ 1 h จนได มวลคงที่ ผลตางของมวลของกากในครูซิเบิล 
    ใบที่หนึ่งและใบที่สองตองไมเกิน 1.0 mg 
  8.12.3 .6 การดูดกลืนแสง  
     (1) เครื่องมือ  
      สเปกโทรโฟโตมิเตอรที่ วัดคาการดูดกลืนแสง ในชวงความยาวคลื่น 220 nm  ถึง 350 nm 
     (2) วิธีวิเคราะห  
      นําสารละลายที่สกัดไดไปวัดคาการดูดกลืนแสงโดยใชสเปกโทรโฟโตมิเตอรในชวง 
   ความยาวคลื่น 220 nm  ถึง 240 nm  และในชวงความยาวคลื่น 241 nm  ถึง 350 nm  
   โดยเปรียบเทียบกับสารละลายแบลงก  
8.13  ปริมาณโลหะหนัก  
 8.13.1    ปริมาณโลหะหนัก  (คํานวณเปนตะกั่ว ) 
   8.13.1 .1 การเตรียมตัวอยาง  
    ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางทุกใบตรงบริเวณที่มี ความหนา สม่ําเสมอและโคงนอยที่สุด ใหไดชิ้น
     พลาสติกพื้นที่เทาๆ กัน นํามารวมกันใหไดมวล ประมาณ 10 g ลางดวยน้ํากลั่น ปลอยไวใหแหงที่
    อุณหภูมิหอง แลวตัดเปนชิ้นเล็กๆ  
  8.13.1 .2 เครื่องมือ  
    (1) เครื่องชั่งละเอียด 0.1 mg 
    (2) ครูซิเบิลควอตซหรือกระเบื้องเคลือบ  พรอมฝาปด  
    (3) เตาเผาไฟฟาที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่ 500 ° C ถึง 600 ° C  
    (4) เครื่องอังน้ํา 
    (5) หลอดเทียบสี ขนาด 50 ml จํานวน 2 หลอด  
  8.13.1 .3 สารเคมี สารละลายแล ะวิธีเตรียม  
    (1) กรดไนทริก  ความหนาแนน 1.42 g/ml  
-15- มอก. 531 -  25XX  
    (2) กรดซัลฟวริก  ความหนาแนน 1.84 g/ml   
    (3) กรดไฮโดรคลอริก  ความหนาแนน 1.18 g/ml  
    (4) สารละลายฟนอลฟทาลีน  
     ละลายฟนอลฟทาลีน 1 g ในเอทานอล 100 ml 
    (5) สารละลายแอมโมเนีย  
     ใชปเปตตดูดสารละลายแอมโมเนีย 0.908 g/ml ปริมาตร 400 ml เติมน้ํากลั่นจนสารละลาย
     มีปริมาตร  1 000 ml  
    (6) สารละลายกรดแอซีติกเจือจาง   
     เจือจางกรดแอซีติก 6 g ดวยน้ํากลั่น แลวเติมน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร  100 ml  
    (7) สารละลายโซเดียมซัลไฟด  
     ละลายโซเดียมซัลไฟด 1 g ในน้ํากลั่น แลวเติมน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร  10 ml  
     เตรียมสารละลายนี้ใหมๆ กอนใช  
  (8) สารละลายกรดไนทริกเจือจาง  
   เจือจางกรดไนทริก (ความหนาแนน 1.42 g/ml) ปริมาตร 10.5 ml ดวยน้ํากลั่น แลวเติมน้ํา
   กลั่นจนสารละลายมีปริมาตร 100 ml  
  (9) สารละลายมาตรฐานตะกั่ว  
      ชั่งตะกั่ว (II) ไนเทรต  159.8 mg ใหทราบมวล แนนอน ละลายในกรดไนทริกเจือจาง 10 ml 
   เจือจางดวยน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปริมาตร เตรียมและ เก็บ
   สารละลายนี้ในภาชนะแกวที่ปราศจากเกลือของตะกั่วที่ละลายได  
       ใชปเปตตดูดสารละลายที่ได 10.0 ml แลวเจือจางดวยน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร  
    100 ml ในขวดแกวปริมาตร สารละลายนี้ 1 ml มีตะกั่ว 0 .01 mg  
       ตองเตรียมสารละลายนี้ ใหมทุกครั้งกอนใช  
 8.13.1 .4  วิธีวิเคราะห 
    (1) การเตรียมสารละลายตัวอยาง 
     (1.1) ชั่งชิ้นตัวอยาง 1.0 กรัม ใสในครูซิเบิลควอตซหรือกระเบื้องเคลือบ  ปดฝาครูซิเบิล 
      ไมตองปดฝาสนิท เผาดวยไฟออนๆ จนเปนถาน ปลอยไวใหเย็น 
     (1.2) เติมกรดไนทริก 2 ml และกรดซัลฟวริก 5 หยด เผาตออยางระมัดระวัง  
     จนกระทั่งควันสีขาวหมดไป แลวเผาตอในเตาเผาไฟฟาที่อุณหภูมิ 500 °C  ถึง  
     600 ° C  จนเปนเถา ปลอยไวใหเย็น  
     (1.3) เติมกรดไฮโดรคลอริก 2 ml ระเหยใหแหงในเครื่องอังน้ํา  
     (1.4) ทําใหชื้นดวยสารละล ายกรดไฮโดรคลอริก 3 หยด เติมน้ํารอน 10 ml อุนเปนเวลา  
2 min  
-16-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
     (1.5) เติมสารละลายฟนอลฟทาลีน 1 หยด แลวเติมสารละลายแอมโมเนียทีละหยด 
จนกระทั่งสารละลายเปลี่ยนสีเปนสีแดงออนๆ  
     (1.6) เติมสารละลายกรดแอซีติกเจือจาง 2 ml กรอง (ถาจําเปน ) ลางดวยน้ํา กลั่น  10 ml   
      ถายสารละลายที่กรองไดและน้ําที่ใชลางลงในหลอดเทียบสี เติมน้ํากลั่นจน
 สารละลายมีปริมาตร 50 ml  
    (2) การเตรียมสารละลายควบคุม  
     (2.1) เติมกรดไนทริก 2 ml กรดซัลฟวริก 5 หยด และกรดไฮโดรคลอริก 2 ml  
      ลงในครูซิเบิลควอตซหรือกระเบื้องเคลือบ ระเหยในเครื่องอังน้ํา  แลวระเหย 
      ใหแหงในอางทราย  
   (2.2) ทําใหชื้นดวยกรดไฮโดรคลอริก 3 หยด เติมน้ํารอน 10 ml อุนเปนเวลา 2 min  
   (2.3) เติมสารละลายฟนอลฟทาลีน 1 หยดแลวเติมสารละลายแอมโมเนีย ทีละหยด  
    จนกร ะทั่งสารละลายเปลี่ยนสีเปนสีแดงออนๆ  
   (2.4) เติมสารละลายกรดแอซีติกเจือจาง 2 ml กรอง (ถาจําเปน ) ลางดวยน้ํากลั่น 10 ml  
    ถายสารละลายที่กรองไดและน้ําที่ใชลางลงในหลอดเทียบสี  
   (2.5) ใชปเปตตดูดสารละลายมาตรฐานตะกั่ว 2.0 ml ใสลงในหลอดเทียบสี แลวเติ มน้ํา
    กลั่นจนสารละลายมีปริมาตร 50 ml  
    (3) เติมสารละลายโซเดียมซัลไฟดลงในหลอดสารละลายตัวอยางและสารละลายควบคุม  
     หลอดละ 1 หยด เขยาใหเขากัน ตั้งไว 5 min เปรียบเทียบสีที่เกิดขึ้น โดยตั้งหลอดเที ยบสีบน
     พื้นขาว แลวมองตรงจากดาน บนลงมา สีของสารละลายตัวอยางตองไมเขมกวาสีของ  
     สารละลายควบคุม  
  8.13.2    ปริมาณตะกั่ว แคดเมียม  และดีบุก 
 8.13.2 .1  การเตรียมตัวอยาง  
  ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางทุกใบใหไดขนาดประมาณกวาง x ยาว เปน 5 mm x 5 mm นํามา
รวมกันใหไดน้ําหนักประมาณ 500 mg  
 8.13.2 .2 เครื่องมือ  
     (1)  เครื่องชั่งละเอียด 0.1 mg 
     (2)  เครื่องยอยสลายสารดวยคลื่นไมโครเวฟพรอมภาชนะใสตัวอยาง  
     (3)  อะตอมิกแอบซอรปชั นสเปกโทรมิเตอรหรือเครื่องมืออื่นที่เทียบเทา  
 8.13.2 .3  สารเคมี สารละลาย  และวิธีเตรียม 
      (1)      กรดไนทริกเขมขน (ความหนาแนน 1.40 g/ml ) 65%  โดย มวล 
     (2)      กรด ไฮโดรคลอริก  (ความหนาแนน 1.18 g/ml ) 37%  โดย มวล 
-17- มอก. 531 -  25XX  
     (3)  กรดไนทริกเจือจาง  
       ละลายกรดไนทริก 1 สวนในน้ํากลั่น 3 สวน 
     (4)  กรดไฮโดรคลอริกเจือจาง  
       ละลายกรดไฮโดรคลอริก 1 สวนในน้ํากลั่น 5 สวน  
      (5)  สารละลายมาตรฐานตะกั่ว  10 µg  /ml 
      ชั่งตะกั่ว (II) ไนเทรต  159.8 mg ใหทราบมวล แนนอน ละลายในกรดไนทริกเจือจาง 10 ml 
   เจือจางดวยน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปริมาตร เตรียมและ เก็บ
   สารละลายนี้ในภาชนะแกวที่ปราศจากเกลือของตะกั่วที่ละลายได  
       ใชปเปตตดูดสารละลายที่ได 10.0 ml แลวเจือจางดวยน้ํากลั่นจนสารละลายมีปริมาตร  
    100 ml ในขวดแกวปริมาตร ตองเตรียมสารละลายนี้ ใหมทุกครั้งกอนใช  
     (6)  สารละลายมาตรฐานแคดเมียม 1 µg /ml 
      ชั่งแคดเมียมบริสุทธิ์  1.000 g ใหทราบมวล แนนอน ละลายในกรดไนทริกเจือจาง 100  
   ml ใหความรอนออนๆ  ทําใหเย็น แลวเจือจางดวยกรดไนทริกเจือจางจนสารละลายมี 
   ปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปริมาตร  
       ใชปเปตตดูดสารละลายที่ได 10 ml แลวเจือจางดวยก รดไนทริกเจือจางจนสารละลายมี  
    ปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปริมาตร ใชปเปตตดูดสารละลายที่ได 10 ml แลวเจือจาง 
    ดวยกรดไนทริกเจือจางจนสารละลายมีปริมาตร 100 ml ในขวดแกวปริมาตร   
                       (7)  สารละลายมาตรฐานดีบุก 5 µg /ml 
      ชั่งดีบุก  0.250 g ใหทราบมวล แนนอน ละลายในกรดซัลฟวริก 10 ml ใหความรอน ทํา 
   ใหเย็น ถายสารละลายนี้กับกรดไฮโดรคลอริกเจือจาง 400 ml ลงในขวดแกวปริมาตร แลว
   เจือจางดวยกรดไฮโดรคลอริกเจือจาง  จนสารละลายมีปริมาตร 500 ml  
       ใชปเปตตดูดสารละลายที่ได 10 ml เจือจางดวย กรดไฮโดรคลอริกเจือจางจนสารละลาย มี
    ปริมาตร 1 000 ml ในขวดแกวปริมาตร      
                       (8)      สารละลายแบลงกของสารละลายมาตรฐาน (Standard blank)    
 8.13.2 .4  วิธีเตรียมสารละลายตัวอยาง  
     (1)  ชั่งตัวอยาง 200 mg ใสภาชนะใสตัวอยาง เติมกรดไนทริก 5 ml ปดฝา แลวใสในเครื่อง 
    ยอยสลายสารด วยคลื่นไมโครเวฟ เตรียมรีเอเจน ตแบลงกโดยไมตองใสตัวอยาง 
     (2)  ยอยตัวอยางตามโปรแกรมที่ตั้งไวตามคูมือของเครื่อง แลวปลอยใหเย็น    
     (3)  ถายสารละลายที่ไดในขวดวัดป ริมาตรขนาด 50 ml เติมน้ําปราศจากไอออนใหถึงขีดวัด  
                                  ปริมาตร  
     (4)  นําสารละลายที่ไดไปวิเคราะห ดวยอะตอมิกแอบซอรปชั นสเปกโทรโฟโตมิเตอร  
    หรือเครื่องมืออื่นที่เทียบเทา  
-18-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
 8.13.2 .5  วิธีวิเคราะห  
     (1)  การเตรียมกราฟมาต รฐานสอบเทียบ  
      (1.1) เตรียมสารละลายมาตรฐานตะกั่ว  สารละลายมาตรฐานแคดเมียม และสารละลาย  
                                            มาตรฐานดีบุก ใหครอบคลุมความเขมขนของสารละลายตัวอยาง  
      (1.2) เตรียมสารละลายแบลงกของสารละลายมาตรฐาน 
      (1.3) วัดคาการดูดกลืนแสง  ของสารละลายมาตรฐานตะกั่ว  สารละลายมาตรฐาน 
    แคดเมียม  และสารละลายมาตรฐานดีบุก แตละความเขมขนเทียบกับสารละลาย  
    แบลงกของสารละลายมาตรฐาน      
                             (1.4) สรางกราฟมาตรฐานสอบเทียบระหวางความเขมขนของสารละลายมาตรฐานของ        
    แตละธาตุกับคาการดูดกลืนแสง  
    (2) การวิเคราะหสารละลายตัวอยาง  
     วัดคาการดูดกลืนแสงของสารละลายรีเ อเจน ตแบลงกและสารละลายตัวอยาง แลวอานคา 
  ความเขมขนของตะกั่ว แคดเมียม และดีบุกจากกราฟมาตรฐานสอบเทียบเปนมิลลิกรัมตอลิตร  
 8.13.2 .6 การคํานวณ  
     ปริมาณตะกั่ว แคดเมียม หรือดีบุก  เปนไมโครกรัมตอกรัม   =𝐴𝐴1– 𝐴𝐴2  
𝑚𝑚 x V 
 
     เมื่อ   A1  คือ ความเขมขนของตะกั่ว แคดเมียม หรือดีบุกในสารละลายตัวอยาง เปนมิลลิกรัมตอลิตร 
     A2  คือ ความเขมขนของตะกั่ ว แคดเมียม หรือดีบุกในรีเอเจน ตแบลงก เปนมิลลิกรัมตอลิตร  
     V   คือ ปริมาตรของสารละลายตัวอยาง เปนมิลลิลิตร  
     m  คือ มวลของตัวอยาง เปนกรัม  
8.14 ความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง  
8.14.1  เครื่องมือและอุปกรณ  
8.14.1.1  เครื่องมือและอุปกรณที่จําเปนสําหรับเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ  ไดแก  ตูลามินารแอรโฟลว  ตูอบเพาะเชื้อ
ชนิดคารบอนไดออกไซดที่สามารถควบคุมปริมาณกาซคารบอนไดออกไซดที่  (5+1)%    กลอง
จุลทรรศน  ชนิดอินเวอเตด  (inverted microscope)  
8.14.1.2  อุปกรณฆาเชื้อ  ไดแก  หมอนึ่งอัด  ตูอบรอน  (hot air oven)  
8.14.1.3  ถาดเลี้ยงเซลลขนาด  6 หลุม  
8.14.1.4  ขวดแกวฝาเกลียวสําหรับเตรียมตัวอยาง  
8.14.1.5  ขวดเพาะเลี้ยงเซลลเนื้อเยื่อ  (tissue culture flask) ขนาดพื้นที่  75 cm2 
  
-19- มอก. 531 -  25XX  
8.14.2  สารละลายและวิธีเตรียม  
8.14.2.1  สารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอรที่ปราศจากเชื้อ  
 ละลายโพแทสเซียมคลอไรด  0.2 g โพแทสเซียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต  0.2 g โซเดียมคลอไรด                  
8.0 g และไดโซเดียมไฮโดรเจนฟอสเฟตแอนไฮดรัส  1.15 g ในน้ํากลั่น  เติมน้ํากลั่นจนปริมาตรเปน  
1 000 ml ทําใหปราศจากเชื้อโดยการนึ่งฆาเชื้อในหม อนึ่งอัดที่อุณหภูมิ  (121 +  2) ºC  เปนเวลา  15 
min หรือกรองผานแผนกรองขนาด  0.22 µm  
8.14.2.2  สารละลายโซเดียมไบคารบอเนต  100 g/l ที่ปราศจากเชื้อ  
8.14.2.3  สารละลายทริปซิน  (trypsin) 0.5 g/l ถึง 5.0 g/l ที่ปราศจากเชื้อ   
8.14.2.4  สารละลายกลูทามีน  (glutamine) 29.2 g/l ที่ปราศจากเชื้อ  
8.14.2.5  อาหารเลี้ยงเซลลอีเกิลลเอ็มอีเอ็ม  (Eagle's MEM)  
8.14.2.6  อาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญเติบโต  และอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับสกัดตัวอยาง  
 เติมสารละลายกลูทามีน  1 ml สารละลายโซเดียมไบคารบอเนต  1.2 ml  และเซรุมฟทัล โบไวน                     
(fetal bovine serum) 5 ml ลงในอาหารเลี้ยงเซลลอีเกิลลเอ็มอีเอ็ม  100 ml โดยวิธีปราศจากเชื้อ  เก็บ
ไวในขวดแกวฝาเกลียวที่อุณหภูมิ  2 ºC ถึง 8 ºC  เก็บไวไดไมเกิน  1 สัปดาห  
8.14.2.7  สารละลายฟอรมาลิน -คริสทัลไวโอเลต  (formalin -crystal  violet)  
 ละลายคริสทัลไวโอเลต  500 mg ดวยสารละลายฟอรมาลดีไฮด  10 ml และสารละลายฟอสเฟต
บัฟเฟอร  90 ml เก็บไวที่อุณหภูมิหอง  
8.14.2.8  สียอมทริปแพนบลู  (trypan blue stain) 4.0 g/l  
 เตรียมโดย ละลาย ทริปแพนบลู ในสารละลายโซเดียมคลอไรด  0.9%  
8.14.2.9  การควบคุมเชิงบวก  
 วัสดุควบคุมเชิงบวก  (positive material control) เชน แผนพอลิไวนิลคลอไรดที่มีซิงกไดเอทิลไดไท
โอคารบาเมต  0.1%  หรือแผนยูเอสพีโพสิทีฟไบโอรีแอกชั่นอารเอส  (USP Positive Bioreaction RS)  
8.14.2.10 การควบคุมเชิงลบ   
 วัสดุควบคุมเชิงลบ  (negative material control) เชน แผนพลาสติกมาตรฐานพอลิเอทิลีนความ
หนาแนนสูง  (USP high density polyethylene RS)  
8.14.3  การเตรียมเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง  
8.14.3.1  การเตรียมสารแขวนลอยของเซลลเนื้อเยื่อ  (cell suspension)  
 นําเซลลเนื้อเยื่อ  L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC clone 929) ที่เพาะเลี้ยงไวในขวดเพาะเลี้ยง
เซลลขนาดพื้นที่ 75 cm2 มาลางดวยสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร เติมสารละลายทริปซิน  1 ml และ
อบในตูอบเพาะเชื้อชนิดคารบอนไดออกไซดที่อุณหภูมิ  (37 +  1) °C เปนเวลา  3 min ถึง 5 min เคาะ
ขวดเบาๆ จนเซลลหลุดรอนจากพื้นผิวขวด  แลวจึงเติมอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญเติบโต  5 
ml ลงในขวด  เขยาขวดใหไดสารแขวนลอยของเซลลเปนเนื้อเดียวกัน  นําสารแขวนลอยที่ไดนี้ไป
-20-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
วัดความเขมขนของเซลล  โดยดูดสารแขวนลอยของเซลล  0.1 ml มาผสมกับสียอมทริปแพนบลู  0.1 ml  
ทิ้งไว 1 min แลวนับจํานวนเซลลที่มีชีวิตพรอมทั้งคํานวณความเขมขนของเซลลในสารแขวนลอย
โดยใชเครื่องนับเม็ดเลือด เจือจางสารแขวนลอยของเซลลนี้ดวยอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการ
เจริญเติบโตใหไดความเขมขน  2×105 เซลลตอ 1 ml  
8.14.3.2  นําเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงที่มีความเขมขน 2×105 เซลลตอ 1 ml เติมลงในถาดเลี้ยงเซลลขนาด  6 
หลุม  หลุมละ  3 ml แลวนําไปอบในตูอบเพาะเชื้อชนิดคารบอนไดออกไซดที่อุณหภูมิ  (37 + 1) ºC 
เปนเวลาไมนอยกวา  1 วัน จนเซลลโตเปนชั้นเดี่ยว  (monolayer) อยางนอย  80%  ของพื้นที่เลี้ยงเซลล  
8.14.4  วิธีทดสอบ  
 (1) การเตรียมชิ้นพลาสติกตัวอยางและวัสดุควบคุม  
  (1.1)  การเตรียมชิ้นพลาสติกตัวอยาง  
   ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางอยางนอย  2 ชิ้น  ใหมีพื้นที่ผิวชิ้นละไมนอยกวา  100 mm2 
  ใสลงในขวดแกวฝาเกลียว ลางและนึ่งฆาเชื้อในหมอนึ่งอัด  หรือโดยวิธีอื่นที่ไมทําให   
  ตัวอยางเสียสภาพ  
 (1.2)  การเตรียมวัสดุควบคุม  
   เตรียมวัสดุควบคุมเชิงบวกและวัสดุควบคุมเชิงลบ  ตามวิธีในขอ  8.14.4 (1.1)  
 (2) ดูดอาหารเลี้ยงเซลลในถาดเลี้ยงเซลลแตละหลุมออก  
 (3) เติมอาหารเลี้ยงเ ซลลสําหรับการเจริญเติบโต  หลุมละ  0.8 ml  
  (3.1)  วางชิ้นตัวอยางทดสอบ  2 หลุมๆ  ละ 1 ชิ้น  
  (3.2)  วางวัสดุควบคุมเชิงบวก  2 หลุมๆ  ละ 1 ชิ้น  
  (3.3)  วางวัสดุควบคุมเชิงลบ  1 หลุมๆ  ละ 1 ชิ้น  
  (3.4)  เติมอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับการเจริญเติบโตเพื่อใชเปนแบลงก  1 หลุม  
 (4) นําถาดเลี้ยงเซลลไปอบในตูอบเพาะเชื้อชนิดคารบอนไดออกไซดที่อุณหภูมิ  (37 + 1) °C เมื่อครบ  
 ระยะเวลา  24 h ใหประเมินผลตามวิธีในขอ  8.14.5  
8.14.5  การประเมินผล  
 หลังจากปลอยใหเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงในถาดเลี้ยงเซลลสัมผัสกับชิ้นพลาสติกตัวอยาง  ชิ้นวัสดุควบคุม  
และแบลงก  เปนเวลา  24 h ดูความเปนพิษที่เกิดกับเซลล  การเปลี่ยนแปลงรูปราง  (morphological 
change) และความหนาแนนของเซลลที่มีชีวิต  (cell density) ดวยกลองจุลทรรศนชนิดอินเวอเตด  บันทึก
การตายของเซลลโดยดูลักษณะของเซลลและวงที่เกิดขึ้นจากปฏิกิ ริยา แลวประเมินผลตามตารางที่  2 
หลังจากบันทึกผลที่  24 h แลว ถาตองการเก็บเซลลบนถาดเลี้ยงเซลลไวเปนเวลานาน  ใหยึด  (fix) และ
ยอมสีเซลลติดบนถาดเลี้ยงเซลล  ดวยสารละลายฟอรมาลิน -คริสทัลไวโอเลต  เพื่อเก็บไวเปนหลักฐาน
สําหรับการตรวจสอบ  
-21- มอก. 531 -  25XX  
    ตารางที่  2 การปร ะเมินระดับความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง  
(ขอ 8.14.5)  
ระดับ ปฏิกิริยา  ลักษณะของวงที่เกิดขึ้นจากปฏิกิริยา 
(grade)  (reactivity)  (description of reactivity zone)  
0 ไมมีพิษ  ไมพบวงรอบๆ หรือภายใตชิ้นพลาสติกตัวอยาง  
 (none)   
1 เปนพิษนอยมาก  พบเซลลมีรูปรางผิดปกติภายใตชิ้นพลาสติกตัวอยาง  
 (slight)   
2 เปนพิษนอย  มีเซลลตายเปนวงจํากัดอยูในพื้นที่ใตชิ้นพลาสติกตัวอยาง  
 (mild)   
3 เปนพิษปานกลาง  มีเซลลตายเปนวงแผขยายออกจากชิ้นพลาสติกตัวอยาง  
 (moderate)  ไมเกิน 1.0 cm 
4 เปนพิษรุนแรง  มีเซลลตายเปนวงแผขยายออกจากชิ้นพลาสติกตัวอยาง  
 (severe)  มากกวา 1.0 cm 
8.14.6  การแปลผล  
 (1) การทดสอบจะมีผลเชื่อถือไดตอเมื่อ  
  (1.1)  แบลงกและวัสดุควบคุมเชิงลบ ไมเปนพิษตอเซลล  (ความเปนพิษระดับ  0) 
 (1.2)  วัสดุควบคุมเชิงบวก  มีความเปนพิษตอเซลลระดับ  3 ขึ้นไป  
 (2) เกณฑการตัดสิน  
  ผลการทดสอบจะถือวาตัวอยางไมเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงเมื่อชิ้นพลาสติกตัวอยาง มี
 ความเปนพิษตอเซลลไมมากกวาระดับ  2 
  8.14.7  กรณีไมสามารถทดสอบโดยวิธีขางตนได ใหทําการทดสอบโดยวิธีตอไป นี้ 
  8.14.7 .1 วิธีทดสอบ  
    (1) การเตรียมสารละลายทดสอบ  
     (1.1) ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละหนวยตรงบริเวณที่มี ความหนา สม่ําเสมอและโคง  
      นอยที่สุดใหได ชิ้นพลาสติกพื้นที่เทาๆ กัน นํามารวมกันใหพื้นที่ผิว ทั้งสองดาน 
      รวมกันได 120 cm2 สําหรับภาชนะพลาสติกหนานอยกวา 0.5 mm หรือ 60 cm2 
      สําหรับภาชนะพลาสติก หนาเทากับหรือมากกวา 0.5 mm แลวนํามาตัดออกเปนชิ้น  
      ยอยขนาดกวางประมาณ 0.1 cm ถึง 0.3 cm และยาวประมาณ 1 cm ถึง 5 cm ใสใน  
-22-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
      ขวดแก วฝาเกลียวสําหรับสกัดตัวอยาง ลางและนึ่งฆา เชื้อในหมอนึ่งอัดความดันหรือ
      โดยวิธีอื่นที่ไมทําใหตัวอยางเสียสภาพ  
    (1.2) เติมอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับสกัดตัวอยาง ปริมาตร 20 ml แลวนําไปบ มในตูอบ เพาะ
      เชื้อชนิดคารบอนไดออกไ ซด ที่ (37+1) °C เปนเวลา (24+1) h เขยาขวดเปนระยะ  
   (2) การเตรียมสารละลายควบคุม (เลือกขอใดขอหนึ่ง ) 
    (2.1) เตรียมสารละลายวัสดุควบคุมเชิงบวกและสารละลายวัสดุควบคุมเชิงลบ โดยสกัด  
      วัสดุควบคุมเชิงบวกและวัสดุควบคุมเชิงลบ ตามวิธีในขอ (1.1) 
    (2.2) เตรียมสารเคมีควบคุมเชิงบวกและสารเคมีควบคุมเชิงลบ โดยเตรียม สารละลายซิงก  
      แอซิเทตในอาหารเลี้ยงเซลลสําหรับสกัดตัวอยางที่ความเขมขน 8 mg/l และ 2 mg/l   
      ตามลําดั บ 
   (3) ดูดอาหารเลี้ยงเซลลในถาดเลี้ยงเซลลแตละหลุมออก  
   (4) เติมสารละลายทดสอบและสารละลายควบคุมดังตอไปนี้ลงสัมผัสกับเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง  
    หลุมละ 3 ml 
    (4.1) สารละลายทดสอบ โดยเติม 2 หลุม  
    (4.2) สารละลายวัสดุควบคุมเ ชิงบวก และ /หรือสารละลายซิงกแอซี เทต 8 mg/l โดยเติม         
      2 หลุม  
    (4.3) สารละลายวัสดุควบคุมเชิงลบ และ /หรือสารละลายซิงกแอซี เทต 2 mg/l โดยเติม            
      1 หลุม  
    (4.4) อาหารเลี้ยงเซลลสําหรับสกัดตัวอยางเพื่อใชเปนแบลงก  โดยเติม 1 หลุม  
   (5) นําถาดเลี้ยงเซ ลลไปอบในตูอบ เพาะเชื้อชนิดคารบอนไดออกไ ซดที่อุณหภูมิ (37+1) °C เมื่อ 
  ครบระยะเวลา 48 h ใหประเมินผลตามวิธีในขอ (6) 
   (6) การประเมินผล  
    หลังจากปลอยใหเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงในถาดเลี้ยงเซลลสัมผัสกับสารละลายทดสอบ  
    สารละลาย ควบคุมและแบลงก เปนเวลา 48 h แลว ดูความเปนพิษที่เกิดกับเซลล โดยดู  
    ลักษณะของเซลลดวยกลองจุลทรรศน บันทึกการตายของเซลล การเปลี่ยนแปลงรูปราง  
    (morphological change) และความหนาแนนของเซลลที่มีชีวิต (cell density) แลวประเมินผล
    ตามตารางที่ 3 หลังจากบันทึกผลที่ 48 h แลวและตองการเก็บเซลลบนถาดเลี้ยงเซลลไวเปน  
    เวลานาน ใหยึด (fix) และยอมสีเซลลใหติดบนถาดเลี้ยงเซลลดวยสารละลายฟอรมาลิน -  
    คริสทัลไวโอเลต  
   (7) การแปลผล  
    (7.1) การทดสอบจะมีผลเชื่อถือไดตอเมื่อ  
-23- มอก. 531 -  25XX  
     (7.1.1) แบลงก สารละลายซิงกแอซี เทตความเขมขน 2 mg/l  หรือสารละลายวัสดุ
      ควบคุมเชิงลบ ไม เปนพิษตอเซลล (ความเปนพิษระดับ 0) 
     (7.1.2) สารละลายซิงกแอซี เทตความเขมขน 8 mg/l  หรือสารละลายวัสดุควบคุม 
      เชิงบวก มีความเปนพิษตอเซลลระดับ 3 ขึ้นไป  
    (7.2) เกณฑตัดสิน  
     ผลการทดสอบจะถือวาตัวอยางไมเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยงเมื่อสารละลาย  
     ทดสอบมี ความเปนพิษตอเซลลไมมากกวาระดับ 2 
ตาราง ที่ 3 การประเมินระดับความเปนพิษตอเซลลเนื้อเยื่อเพาะเลี้ยง  
(ขอ 8.14.7 .1(6)) 
ระดับ ปฏิกิริยา  สภาพของเซลลเนื้อเยื่อ  
(grade)  (reactivity)  (conditions of cell cultures)  
0 ไมเปนพิษ  
(none)  พบเซลลแผเปนชั้นเดี่ยว มีเม็ดอินทราไซโตพลาสมิก 
(intracytoplasmic granule) กระจายอยูในเซลลตามปกติ  ไมพบ
การแตกทําลายของเซลล 
1 เปนพิษนอยมาก  
(slight)  พบเซลลมีลักษณะกลมใกลหลุดออกจากพื้นผิวไมเกิน 20% 
อาจพบการแตกทําลายของเซลลไดบาง 
2 เปนพิษนอย  
(mild)  พบเซลลมีลักษณะกลมไมเกิน 50% อาจพบการแตกทําลายของ
เซลลแตไมรุนแรง และไมพบชองวางระหวางเซลลชั้นเดี่ยว 
3 เปนพิษปานกลาง  
(moderate)  พบเซลลมีลักษณะกลม หรือพบการแตกทําลายของเซลลไมเกิน 
70% 
4 เปนพิษรุนแรง  (severe)  พบการทําลายของเซลลชั้นเดี่ยวเกือบทั้งหมดหรือทั้งหมด 
 
8.15 สารไพโรเจน  
 ใหใชวิธีทดสอบที่กําหนดตอไปนี้  ซึ่งปฏิบัติตามหลักการใน  USP35  หัวขอ  Bacterial Endotoxins Test โดยมี
วิธีการทดสอบ  2 วิธี คือ เจลคล็อตเทคนิค  (gel-clot technique) และโฟโตเมทริกเทคนิค  (photometric technique)  
สามารถเลือกทดสอบดวยวิธีใดวิธีหนึ่ง  
8.15.1  เครื่องมือและอุปกรณ  
 เครื่องมือและอุปกรณทุกชนิดตองปราศจากสารไพโรเจน  สําหรับอุปกรณที่ทนความรอนใหทําลาย  สาร
ไพโรเจนดวยความรอนแหง  (dry heat sterilization) ในกรณีอุปกรณที่ใชเปนพลาสติกหรือไมสามารถ
ทนความรอนสูงได  ตองเลือกใชเฉพาะผลิตภัณฑที่ปราศจากสารไพโรเจน  
 
-24-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
8.15.1.1  ตูอบ เพาะเชื้อ ควบคุมอุณหภูมิไดที่  (37 + 1) °C  
8.15.1.2 ลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต (Limulus Amebocyte Lysate (LAL) reagent)  
8.15.1.3  สารมาตรฐานเอ็นโดท็อกซิน  
8.15.1.4  แอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร  (LAL reagent water) เอ็นโดท็อกซินไมเกิน  0.005 หนวยเอ็นโดท็อก               
ซินตอมิลลิลิตรหรือน อยกวาความไวของแอลเอแอลรีเอเจน ตที่ใช 
8.15.1.5  น้ํากลั่นสําหรับ ทํายาฉีดที่ไดผานการตรวจ แบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซิน แลว 
8.15.1.6  หลอดแกวขนาด  10 mm x 75 mm เปนหลอดทําปฏิกิริยา  (reaction tube) สําหรับเจลคล็อตเทคนิค  
8.15.1.7 หลอดแกวขนาด  16 mm x 125 mm หรือ 13 mm x 100 mm เปนหลอดสําหรับเจือจาง  (dilution 
tube)  
8.15.1.8  ถาดเลี้ยงเซลลขนาด  96 หลุม  ชนิดพอลิสไตรีนปราศจากเชื้อ  และสารไพโรเจนสําหรับโฟโทเม ตริก
เทคนิค   
8.15.1.9  ไมโครปเปตตและทิป   
8.15.1.10  เครื่องผสม  (vortex mixer)  
8.15.1.11  นาฬิกาจับเวลา 
8.15.1.12  เตาหลุมไฟฟา หรืออางน้ํารอน สําหรับเจลคล็อตเทคนิค   
8.15.1.13  เครื่องอานผลวิเคราะหถาดเลี้ยงเซลล  (microplate reader) ที่สามารถควบคุมอุณหภูมิที่  (37+1) °C 
พรอมโ ปรแกรมตรว จหาสารเอ็นโดท็อกซินสําหรับโฟโทเม ตริกเทคนิค   
8.15.2  การเตรียมสารละลายทดสอบ  
 ใชภาชนะพลาสติกตัวอยางจํานวน  3 ใบ ถึง 10 ใบ สําหรับการทดสอบในแตละครั้ง  ลางภายในภาชนะ
พลาสติกตัวอยางดวยน้ํากลั่นสําหรับ ทํายา ฉีดจํานวนไมนอยกวา  20%  ของความจุ เขยาใหน้ํากลั่นสัมผัส
ผิวภายในจนทั่ว แลวเททิ้ง  ทําซ้ําอีกครั้ง  แลวเติมน้ํากลั่นสําหรับ ทํายา ฉีดจํานวนเทากับความจุของ
ภาชนะพลาสติกตัวอยาง  นําไปอบในตูอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ  (37+1) °C เปนเวลาไมนอยกวา  1 h นํา
สารละลายสกัดจากภาชนะพลาสติกตัวอยางทั้งหมดมาผสมรวมกันสําหรับการทดสอบ 
8.15.3  การคํานวณคาการเจือจางใชไดสูงสุด  (maximum valid dilution, MVD)  
 (1) คํานวณปริมาณขีดจํากัดเอ็นโดท็อกซิน   
            ปริมาณขีดจํากัดเอ็นโดท็อกซินของสารละลายทดสอบ   =𝐾𝐾×𝑁𝑁  
𝑉𝑉  
   
             เมื่อ    K คือ  ปริมาณขีดจํากัดเอ็นโดท็อกซินของอุปกรณการแพทยตามมาตรฐาน  USP เทากับ  
         20 หนวยเอ็นโดท็อกซินตออุปกรณ  
   N  คือ  จํานวนชิ้นตัวอยางที่ใชในการทดสอบ  
   V  คือ  ปริมาตรรวมของสารสะลายทดสอบ  
-25- มอก. 531 -  25XX  
 (2) คํานวณคาการเจือจางใชไดสูงสุด  (MVD)  
         MVD   =    ปริมาณขีดจํากัดเอ็นโดท็อกซิน  (จากขอ  8.15.3(1))
λ     
    
       เมื่อ     λ      คือ ความไวของแอลเอแอลรีเอเจน ต  
8.15.4  สารละลายและวิธีเตรียม  
 สารละลายที่เตรียมตอไปนี้  ตองทําการเตรียมในวันที่ทําการทดสอบ  และไมควรนําสารละลายที่เหลือ
หลังจากเสร็จสิ้นการทดสอบแลวกลับมาใชอีก  ยกเวนสารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซิน  สามารถเก็บไว
ในตูเย็นที่อุณหภูมิ  2 °C ถึง 8 °C ไดไมเกิน  4 สัปดาห  
8.15.4.1  สารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซิน  
 ปเปตตแอลเอแอลรีเอเจนท ตวอเตอร  ตามปริมาตรที่ ระบุโดยผูทํา  ลงในผงแหงของสารมาตรฐาน  
เอ็นโดท็อกซิน  และผสมโดยใชเครื่องผสม  เปนเวลา  30 min หรือตามที่ผูทําระบุ  จะไดสารละลาย
เอ็นโดท็อกซิน  มีความแรงตามที่ระบุในใบรับรองของผูทํา  
8.15.5  วิธีทดสอบ  
 สารละลายทดสอบตองผานการทดสอบฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุนการเกิดปฏิกิริยา  (test for interfering 
factors หรือ inhibition/enhancement  test) ตามหลักการที่ระบุใน  USP ถาพบวาสารละลายทดสอบมี
ฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุนการเกิดปฏิกิริยา  ใหเจือจางสารละลายทดสอบดวยแอลเอแอล รีเอเจนต วอเตอร   
กอนนํามาทําการทดสอบโดยคาการเจือจาง  ตองไมเกินคา  MVD  
 8.15.5.1  วิธีเจลคล็อตเทคนิค 
 (1) การทดสอบยืนยันความไวของสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต  
  เปนการทดสอบเพื่อยืนยันความไวของของสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต 
  ตามที่ ระบุไวในฉลาก  ซึ่งตองทําการทดสอบทุกครั้งเมื่อมีการเปลี่ยนรุนการผลิต  
(1.1) นําสารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซินที่เตรียมตาม 8.15.4.1 มาทํากา รเจือจางตอดวย
แอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง
ครอบคลุมความไวของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต  (Lysate s ensitivity) ที่ 2λ 1λ 
0.5λ และ 0.25λ  หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือจาง 
ตองนําสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยางนอย 1 min  
กอนนําไปทําการเจือจางตอไป 
(1.2) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติม
สารละลายแตละชนิด ปริมาตร 100 µl  ตอหลอด ชนิดละ 4 หลอด  
(1.2.1) สารละลายควบคุมเชิงลบ (negative control) ใหเติมแอลเอแอลรีเอเจน ต 
วอเตอร  
-26-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
(1.2.2) สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 2λ 1λ 0.5λ และ 
0.25λ  หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร  
(1.3) นําหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดไปอุนในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนที่อุณหภูมิ             
(37 ± 1) °C  เปนเวลาประมาณ 10 min 
(1.4) เติมแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอรลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไ ลเสต                   
รีเอเจนต ตามปริมาตรที่ระบุบน ฉลากหรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุดน้ํายา ผสม
เบาๆจนผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตละลายหมด  
 (1.5) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 µl ลงในหลอดทําปฏิกิริยา
  แตละหลอด แกวงหลอดเบาๆ ระวังอยาใหเกิดฟอง เริ่มทําการจับเวลาตั้งแตเติม 
  สารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตลงในหลอดทําปฏิกิริยาหลอดแรกเสร็จ  
(1.6) บมหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนที่อุณหภูมิ                  
(37± 1) °C เปนเวลา (60 ± 2) min หลีกเลี่ยงการวางในบริเวณที่สั่นสะเทือน  
(1.7) ดูผลการเกิดเจลในหลอดทําปฏิกิริยา โดยคว่ําหลอด 180๐  ถาเจลที่เกิดขึ้นคงสภาพ
โดยไมไหลลงมาจากกนหลอด ใหบันทึกเปนผลบวก  แตถาไมเกิดเจล  หรือเจลเสีย
สภาพไหลลงมา ใหบันทึกเปนผลลบ การยกหลอดขึ้นดูผลตองทําดวยความ
ระมัดระวัง เพราะเจลที่เกิดขึ้นคอนขางเปราะและแตกงาย  
 (1.8) การประเมินผล  
  (1.8.1) บันทึกคาจุดยุติ  (endpoint) คือ ความเขมขนต่ําสุดของสารละลายเอ็นโด           
   ท็อกซินที่ใหผลบวก  
(1.8.2) คํานวณคามัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติ (geometric mean endpoint) โดย
แปลงคาจุดยุติแตละคาเปน log10 endpoint แลวหาคาเฉลี่ย  คาแอนตี้ล็อก 
(antilog) ของคาเฉลี่ย คือคามัชฌิมเรข าคณิตของจุดยุติ   
(1.8.3) ความไวของน้ํายาลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตนํามาใชได ถาคามัชฌิม
เรขาคณิตของจุดยุติ อยูในชวง 0.5 λ ถึง 2λ 
 (2)  การทดสอบฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุนการเกิดปฏิกิริยาของสารละลายทดสอบ  
(2.1) เตรียมตัวอยางโดยการเจือจางใหไดความเขมขนที่จะทดสอบ แตตองไมเ กิน MVD  
(2.2) นําสารละลายเขมขนเอ็นโดท็อกซินที่เตรียมตาม 8.15.4.1 มาเจือจางตอดวย
สารละลายตัวอยางที่เตรียมในขอ (2.1) ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่มีความ
แรง 2λ 1λ 0.5λ และ 0.25λ  หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับ
การเจือจาง ตองนําสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยาง
นอย 1 min  กอนนําไปทําการเจือจางตอไป 
-27- มอก. 531 -  25XX  
(2.3) นําสารละลายเขมขนแบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซินที่เตรียมตาม 8.15.4.1 มาทํากา รเจือ
จางตอดวยแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร  ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่มีความ
แรง 2λ 1λ 0.5λ และ 0.25λ  หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับ
การเจือจาง ตองนําสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยาง
นอย 1 min  กอนนําไปทําการเจือจางตอไป 
(2.4) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลอ ดทําปฏิกิริยาโดยเติม
สารละลายแตละชนิด ปริมาตร 100 µl  ตอหลอด ชนิดละ 2 หลอด  
   (2.4.1) สารละลายควบคุมเชิงลบ (negative control) ใหเติมแอลเอ แอล                 
   รีเอเจน ตวอเตอร  
(2.4.2)   สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่เจือจางดวยดว ยแอลเอแอล             
 รีเอเจน ตวอเตอรที่มีความแรง 2λ 1λ 0.5λ และ 0.25λ  หนวยเอ็นโด 
 ท็อกซินตอมิลลิลิตร  
(2.5) เติมสารละลายตอไปนี้ลงในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติมสารละลายแตละชนิด 
ปริมาตร 100 µl ตอหลอด ชนิดละ 4 หลอด  
(2.5.1)   สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่เจือจางดวยดวยสารละลาย
 ตัวอยางที่มีความแรง 2λ 1λ 0.5λ และ 0.25λ  หนวยเอ็นโดท็อก              
 ซินตอมิลลิลิตร  
(2.5.2)  สารละลายตัวอยาง 
(2.6) นําหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดไปอุนในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนที่อุณหภูมิ            
(37 ± 1) °C  เปนเวลาประมาณ  10 min 
(2.7) เติมแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอรลงในผงแหงขอ งลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต
ตามปริมาตรที่ระบุบนฉลากหรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุดน้ํายา ผสมเบาๆจนผง
แหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตละลายหมด  
(2.8) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 µl ลงในหลอดทําปฏิกิริยา
แตละหลอด แกวงหลอดเบาๆ ระวังอยาใหเกิดฟอง เริ่ มทําการจับเวลาตั้งแตเติม
สารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตลงในหลอดทําปฏิกิริยาหลอดแรกเสร็จ  
(2.9) บมหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนที่อุณหภูมิ                 
(37 ± 1) °C เปนเวลา (60 ± 2) min หลีกเลี่ยงการวางในบริเวณที่สั่นสะเทือน  
(2.10) ดูผลการเกิดเจลใ นหลอดทําปฏิกิริยา โดยคว่ําหลอด 180๐  ถาเจลที่เกิดขึ้นคงสภาพ
โดยไมไหลลงมาจากกนหลอด ใหบันทึกเปนผลบวก  แตถาไมเกิดเจลหรือเจลเสีย
-28-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
สภาพไหลลงมา ใหบันทึกเปนผลลบ การยกหลอดขึ้นดูผลตองทําดวยความ
ระมัดระวัง เพราะเจลที่เกิดขึ้นคอนขางเปราะและแตกงาย  
(2.11) การประเมินผล  
(2.11.1 )      บันทึกคาจุดยุติ  คือ ความเขมขนต่ําสุดของสารละลายเอ็นโดท็อก
 ซินที่ใหผลบวก  
(2.11.2 )      คํานวณคามัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติ โดยแปลงคาจุดยุติแตละคาเปน 
 log10 endpoint แลวหาคาเฉลี่ย  คาแอนตี้ล็อกของคาเฉลี่ย คือ คา
 มัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติ  
(2.11.3 )      ตัวอยางที่ ความเขมขนที่ทดสอบ ไมมีฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุนปฏิกิริยา  
 (interfering factor ) ถาคามัชฌิมเรขาคณิตของจุดยุติของสารละลาย
 เอ็นโดท็อกซินที่เจือจางดวยดวยสารละลายตัวอยางอยูในชวง 0.5 λ  ถึง 
 2λ หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร  
  (2.11.4 ) ตัวอยางที่ความเขมขนที่ทดสอบ มีฤทธิ์ยับยั้งปฏิกิริยา ถาคามัชฌิม 
  เรขาคณิตของจุดยุติของเอ็นโดทอกซินในตัวอยางมากกวา 2λ หนวย
  เอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร  
  (2.11.5 ) ตัวอยางที่ความเขมขนที่ทดสอบ มีฤทธิ์กระตุนปฏิกิริยา ถาคามัชฌิม 
  เรขาคณิตของจุดยุติ ของเอ็นโดท็อกซินในตัวอยางต่ํากวา 0.5λ หนวย 
  เอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร  
 (3)  การทดสอบหาการปนเ ปอนของแบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซินของสารละลายทดสอบ  
(3.1) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลอดทําปฏิกิริยาโดยเติม
สารละลายแตละชนิด ปริมาตร 100 µl ตอหลอด ชนิดละ 2 หลอด  
(3.1.1)      สารละลายควบคุ มเชิงลบ ใหเติมแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร  
(3.1.2)      สารละลายควบคุมเชิงบวก (positive control) ใหเติมสารละลาย
 มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 2λ หนวยเอ็นโดท็อกซินตอ
 มิลลิลิตร  
(3.1.3)     สารละลายทดสอบ (sample tested)  ใหเติมสารละลายทดสอบหรือ
 สารละลายทดสอบที่เจือจาง 
(3.1.4)      สารละลายทดสอบเชิงบวก (positive product control) ใหเติม
 สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 2λ หนวยเอ็นโด          
 ท็อกซินตอมิลลิลิตร ซึ่งเตรียมโดยการเจือจางในสารละลายทดสอบ
 หรือสารละลายทดสอบที่เจือจาง 
-29- มอก. 531 -  25XX  
(3.2) นําหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดไปอุนในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนที่อุณหภูมิ             
(37 ± 1) °C  เปนเวลาประมาณ  10 min 
(3.3) เติมแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอรลงในผงแหงของลิมูลัสอะมีโ บไซตไลเสต             
รีเอเจน ตตามปริมาตรที่ระบุบนฉลากหรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุดน้ํา ยา ผสม
เบาๆจนผงแหงของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตละลายหมด  
(3.4) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 µl ลงในหลอดทําปฏิกิริยา
แตละหลอด แกวงหลอดเบาๆ ระวังอยาใหเกิดฟอง เริ่มทําการจับเวลาตั้งแตเติม
สารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตลงในหลอดทําปฏิกิริยาหลอดแรกเสร็จ  
(3.5) บมหลอดทําปฏิกิริยาทั้งหมดในเตาหลุมไฟฟาหรืออางน้ํารอนที่อุณหภูมิ                     
(37 ± 1) °C เปนเวลา (60 ± 2) min หลีกเลี่ยงการวางในบริเวณที่สั่นสะเทือน  
(3.6) ดูผลการเกิดเจลในหลอดทําปฏิกิริยา โดยคว่ําหลอด 180๐  ถาเจลที่เกิดขึ้น คงสภาพ
โดยไมไหลลงมาจากกนหลอ ด ใหบันทึกเปนผลบวก  แตถาไมเกิดเจล  หรือเจลเสีย
สภาพไหลลงมา ใหบันทึกเปนผลลบ การยกหลอดขึ้นดูผลตองทําดวยความระมัดระวัง เพราะเจลที่เกิดขึ้นคอนขางเปราะและแตกงาย  
(3.7) การประเมินผล  
  ผลการทดสอบจะมีผลเชื่อถือไดเมื่อ  
 (3.7.1) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชิงลบได ผลลบ  
 (3.7.2) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชิงบวกไดผลบวก  
(3.7.3)  ผลการทดสอบของสารละลายทดสอบเชิงบวกไดผลบวก  
  (4) เกณฑการตัดสิน  
  ผลการทดสอบจะถือวาตัวอยางเปนไปตามมาตรฐาน ถามีปริมาณสารเอ็นโดท็อกซินนอย  
  กวาปริมาณขีดจํากัดเอ็นโดท็อกซิน 
 8.15.5.2   วิธีโฟโตเมทริกเทคนิค 
 ประกอบดวยวิธีเทอบิไดเมตริก (Turbidimetric) และโครโมเจนิค (Chromogenic)  ซึ่งน้ํายาที่ใช 
 ในการทดสอบจะมีรายละเอียดบางสวนของวิธีการทดสอบที่แตกตางกันไปตามบริษัทผูทํา 
 กําหนด ผูวิเคราะหสามารถปรับขั้นตอนการทดสอบบางสวนใหไดตามความเหมาะ สมกับน้ํายาที่
 ใชวิธีทดสอบที่กําหนดตอไปนี้ เปนไปตามขั้นตอนพื้นฐานที่ระบุใน USP  
(1)     การทดสอบยืนยันความไวของสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต 
  เปนการทดสอบเพื่อยืนยันความไวของของสารละลาย ลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต 
  ตามที่ระบุไวในฉลาก  ซึ่งตองทําการทดสอบทุกครั้งเมื่อมีการเปลี่ยนรุนการผลิต  
-30-
                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
(1.1) ปอนขอมูลน้ํายาที่ใชในการทดสอบ และกําหนดตําแหนงของสารละลายควบคุม
และสารละลายเอ็นโดท็อกซินในแผนแบบถาดเลี้ยงเซลล (microplate template) ลง
ในโปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดท็อกซิน  
(1.2) นําสารละลายเขมขน แบคทีเรียล เอ็นโ ดท็อกซินที่เตรียมตาม 8.15.4.1 มาทํากา รเจือ
จางตอดวยแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่มีความ
แรงครอบคลุมความไวของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต  (Lysate sensitivity) ที่ 1λ 
10λ 100λ  และ 1000λ หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือ
จาง ตองนําสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยางนอย                  
1 min  กอนนําไปทําการเจือจางตอไป 
(1.3) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไปนี้ลงในหลุมของถาดเลี้ยงเซลล โดยเติม
สารละลายแตละชนิด ปริ มาตร 100 µl ตอหลุม ชนิดละ 3 หลุม  ตามตําแหนงที่
กําหนดในแผนแบบถาดเลี้ยงเซลล  
(1.3.1)  สารละลายควบคุมเชิงลบ (negative control) ใหเติมแอลเอแอล                    
 รีเอเจน ตวอเตอร  
(1.3.2)   สารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 1λ 10λ  100λ  และ      
1 000λ  หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร  
(1.4) นําถาดเลี้ยงเซลลไปอุนในเครื่องอานผลวิเคราะหถาดเลี้ยงเซลลที่อุณหภูมิ                 
(37± 1 ) °C เปนเวลาประมาณ  10 min 
(1.5) เติมแอลเอแอลรีคอนสติติวชั่นบัฟเฟอร (LAL Reconstitution Buffer) หรือตัวทํา
ละลายที่ผูทํากําหนด ตามปริมาตรที่ ระบุบนฉลาก หรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุด
น้ํายา ลงในผงแหงขอ งลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต ผสมเบาๆจนผงแหงขอ ง
ลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ตละลายหมด   
(1.6) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 µl ลงในหลุมทําปฏิกิริยาทุก
หลุมจนครบ  แลวเริ่มการทํางานของโปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดท็อกซิน  
(1.7) เมื่อสิ้นสุดการทดสอบ โปรแกรมจะทํา การสรางกราฟมาตรฐานและคํานวณ
คาพารามิเตอร ตางๆใหโดยอัตโนมัติ 
(1.8) การประเมินผล  
(1.8.1)   คาสัมบูรณ ( absolute value) ของคาสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ 
 (Correlation Coefficient, r) ของกราฟมาตรฐานตองมากกวาหรือ
 เทากับ 0.980 
-31- มอก. 531 -  25XX  
(1.8.2)   คาของเวลาที่ทําปฏิกิริยา  (reaction time) ที่วัดไดจากสารละลาย
 มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินแตละความเขมขน ตองมี   % CV นอยกวา  10% 
(2) การทดสอบหาการปนเปอนของแบคทีเรียลเอ็นโดท็อกซิน ของสารละลายทดสอบ  
(2.1) ปอนขอมูลน้ํายาที่ใชในการทดสอบ และกําหนดตําแหนงของสารละลายควบคุม 
สารละลายทดสอบและสารละลายเอ็นโ ดท็อกซินในแผนแบบถาดเลี้ยงเซลล ลงใน
โปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดท็อกซิน  
(2.2) นําสารละลายเขมขน แบคทีเรียล เอ็นโดท็อกซินที่เตรียมตาม 8.15.4.1 มาทํากา รเจือ
จางตอดวยแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร ใหไดสารละลายเอ็นโดท็อกซินที่มีความ
แรงครอบคลุมความไวของลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตที่ 1λ 10λ  100λ  และ1 000λ 
หนวยเอ็นโดท็อกซินตอมิลลิลิตร โดยแตละระดับการเจือจาง ตองนําสารละลาย
มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินไปปนบนเครื่องผสมอยางนอย 1 min  กอนนําไปทําการ
เจือจางตอไป  
(2.3) เตรียมตัวอยางโดยการเจือจางใหไดความเขมขนที่จะทดสอบ แตตองไมเกิน MVD 
(2.4) เติมสารละลายควบคุมและสารละลายตอไ ปนี้ลงในหลุมของถาดเลี้ยงเซลล โดยเติม
สารละลายแตละชนิด ปริมาตร 100 µl ตอหลุม ชนิดละ 3 หลุม  ตามตําแหนงที่
กําหนดในแผนแบบถาดเลี้ยงเซลล  
(2.4.1)  สารละลายควบคุมเชิงลบ ใหเติมแอลเอแอลรีเอเจน ตวอเตอร  
(2.4.2)  สารละลายควบคุมเชิงบวก เติมสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มี
 ความแรง 1λ 10λ 100λ  และ 1 000λ หนวยเอ็นโดท็อกซินตอ
 มิลลิลิตร  เพื่อใชสรางกราฟมาตรฐาน  
(2.4.3)   สารละลายทดสอบ (sample tested)  ใหเติมสารละลายทดสอบหรือ
 สารละลายทดสอบที่เจือจาง 
(2.4.4)   สารละลายทดสอบเชิงบวก (positive product control) ใหเติม  สารละลาย
 มาตรฐานเอ็นโดท็อกซินที่มีความแรง 100λ  หนวยเอ็นโ ดท็อกซินตอ
 มิลลิลิตร ปริมาตร 11 µl ลงในกนหลุมของถาดเลี้ยงเซลล แลวเติมสาร  
 ละลายทดสอบหรือสารละลายทดสอบที่เจือจาง  ปริมาตร 100 µl ลงใน
 หลุมเดียวกัน  
(2.5) เมื่อเติมสารละลายขางตนครบตามแผนแบบถาดเลี้ยงเซลลแลว ให นําถาดเลี้ยงเซลล
ไปอุนในเครื่องอานผลวิเคราะหถาดเลี้ยงเซลลที่อุณหภูมิ (37 ± 1) °C เปนเวลา
ประมาณ  10 min 
-32-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
(2.6) เติมแอลเอแอลรีคอนสติติวชั่นบัฟเฟอร (LAL Reconstitution Buffer) หรือตัวทํา
ละลายที่ผูทํากําหนด ตามปริมาตรที่ระบุบนฉลาก หรือใบรับรองที่มาพรอมกับชุด
น้ํายา  ลงในผงแหงของลิมูลั สอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจน ต ผสมเบาๆจนผงแหงของ
ลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสตรีเอเจนทละลายหมด   
(2.7) เติมสารละลายลิมูลัสอะมีโบไซตไลเสต ปริมาตร 100 µl ลงในหลุมทําปฏิกิริยาทุก
หลุมจนครบ  แลวเริ่มการทํางานของโปรแกรมตรวจหาสารเอ็นโดท็อกซิน  
(2.8) เมื่อสิ้นสุดการทดส อบ โปรแกรมจะทําการสรางกราฟมาตรฐานและคํานวณคา 
พารามิเตอร ตางๆใหโดยอัตโนมัติ 
(2.9) การประเมินผล  
(2.9.1) ผลการทดสอบจะมีผลเชื่อถือไดเมื่อ  
 (2.9.1.1) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชิงลบไดผลลบ 
 (2.9.1.2) ผลการทดสอบของสารละลายควบคุมเชิงบวกไดผลบวก  
(2.9.2)   คาสัมบูรณ ของคา สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ ของกราฟมาตรฐานตอง
 มากกวาหรือเทากับ 0.980 
(2.9.3) คาของเวลาที่ทําปฏิกิริยา ที่วัดไดจากสารละลายมาตรฐานเอ็นโดท็อ กซิน 
แตละความเขมขน ตองมี  % CV นอยกวา 10% 
(2.9.4)   ตัวอยางที่ความเขมขนที่ทดสอบ ไมมีฤทธิ์ยับยั้งหรือกระตุนปฏิกิริยา  
 ถา % PPC Recovery ของสารละลายทดสอบเชิงบวกอยูในชวง   50% ถึง 
 200% 
8.16 การซึมผานของจุลินทรีย  
8.16.1  จุลินทรียที่ใชทดสอบ  
 ใชเชื้อ บาซิลลัส  ซับทิลิส  ATCC 6633 ( Bacillus subtilis  ATCC 6633) และเชื้อ ซาลโมเนลลา  คอเลอเรซูอิส  
ATCC 10708 ( Salmonella Choleraesuis  ATCC 10708 )  
8.16.2  อาหารเลี้ยงเชื้อ  
 อาจเตรียมจากอาหารเลี้ยงเชื้อสําเร็จรูปหรือเตรียมตามวิธีตอไปนี้  
 (1) ฟลูอิดไทโอไกลโคเลตมีเดียม  
  แอล-ซีสทีน  0.5 g 
  โซเดียมคลอไรด  2.5 g 
  เดกซโทรส  5.5 g 
  อะการ  0.75 g 
-33- มอก. 531 -  25XX  
  ยีสตเอกซแทรกต    5.0 g  
 เคซีนที่ถูกยอยดวยเอนไซมจากตับออน  (pancreatic digest of casein)  15.0  g 
  โซเดียมไทโอไกลโคเลต  (หรือกรดไทโอไกลโคลิก  0.3 ml)  0.5 g 
  สารละลายเรซาซูรินโซเดียม  (resazurin sodium solution)  
   0.1%  โดยปริมาตรที่เตรียมขึ้นใหม  1.0 ml 
  น้ํากลั่น  1 L 
  นําแอล -ซีสทีน  โซเดียมคลอไรด  เดกซโทรส  อะการ  ยีสตเอกซแทรกต  และเคซีนที่ถูกยอยดวย    
 เอนไซมจากตับออน  มาผสมรวมกันในโกรงและบดใหเขากัน  เติมน้ํากลั่นลงไปเล็กนอย  คนให  
 เขากันแลวเทสารละลายที่ไดใสในบีกเกอร  ลางโกรงดวยน้ํากลั่นจํานวนที่เหลือ   เทรวมกันใน   
 บีกเกอรนําไปทําใหรอน  เติมโซเดียมไทโอไกลโคเลตหรือกรดไทโอไกลโคลิกลงไป  ปรับความ
 เปนกรด -ดางใหมีคา  (7.1+0.2) ดวยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด  1 mol/l ( ถาจําเปนตองกรอง
 ใหนําสารละลายที่ไดมาทําใหรอนแตไมใหเดือด  แลวกรองในขณะรอนผานกระดาษกรองที่เปยก
 ชื้น)  
  เติมสารละลายเรซาซูรินโซเดียม  ผสมใหเขากันแลวฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดที่อุณหภูมิ  121 °C ความ
 ดัน 15 ปอนดตอตารางนิ้ว   เปนเวลา  15 min  
 (2) ซอยบีนเคซีนไดเจสตมีเดียม  
  เคซีนที่ถูกยอยดวยเอนไซมจากตับออน     17.0 g 
  ซอยบีนมีลที่ถูกยอยดวยเอนไซมปาเปน  
  (papaic digest soybean meal)         3.0 g 
  โซเดียมคลอไรด          5.0 g 
  ไดเบสิกโพแทสเซียมฟอสเฟต        2.5 g 
  เดกซโทรส          2.5 g 
   น้ํากลั่น           1 L 
  ผสมสวนผสมทั้งหมดเขาดวยกัน  ตมใหละลาย  แลวปลอยไวใหเย็นลงจนถึงอุณหภูมิหอง        
 ปรับความเปนกรด -ดางใหเปน  (7.3+0.2) ดวยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด  1 mol/l กรอง      
 แลวฆาเชื้อในหมอนึ่งอัดที่อุณหภูมิ  121 °C ความดัน  15 ปอนดตอตารางนิ้ว เปนเวลา  15 min  
8.16.3  การเตรียมเชื้อเผื่อใช  (stock culture)  
 (1) การเตรียมเชื้อ บาซิลลัส  ซับทิลิส  
  ใหเพาะลงบนอะการผิวเอียงของซอยบีนเ คซีนไดเจสตอะการ  นําไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ  30 °C 
 ถึง 35 ° C เปนเวลา  24 h แลวเก็บไวที่อุณหภูมิ  2 °C ถึง 8 °C 
 
 
-34-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
 (2) การเตรียมเชื้อ ซาลโมเนลลา  คอเลอเรซูอิส  
  ใหเพาะลงบนอะการผิวเอียงของซอยบีนเคซีนไดเจสตอะการนําไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ  30 °C
 ถึง  35 ° C เปนเวลา  24 h แลวเก็บไวที่อุณหภูมิ  2 °C ถึง 8 °C 
 (3) การเตรียมเชื้อเผื่อใชอาจเตรียมโดยวิธีการอื่นที่เหมาะสม  
8.16.4  การเตรียมเชื้อทดสอบ  (inoculum)  
 (1) ถายเชื้อ บาซิลลัส  ซับทิลิส  จากเชื้อเผื่อใช  (ขอ 8.16.3) ลงในขวด หรือหลอด ที่มีฟลูอิดไทโอไกล  
 โคเลตมีเดียม  
 (2) ถายเชื้อ ซาลโมเนลลา  คอเลอเรซูอิส  จากเชื้อเผื่อใช  (ขอ 8.16.3)  ลงในขวด หรือหลอด ที่มีซอยบีน  
 เคซีนไดเจสตมีเดียม   
 (3) นําขวด หรือหลอด ในขอ  (1) และข อ (2) ไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ  30 ° C ถึง 35 °C เปนเวลา  24 h 
8.16.5  วิธีวิเคราะห  
 (1) ใสฟลูอิดไทโอไกลโคเลตมีเดียมและซอยบีนเคซีนไดเจสตมีเดียม  ลงในภาชนะพลาสติกตัวอยาง  
 ตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่  4 สดมภที่  2 ใหไดปริมาณเทากับความจุที่ระบุไวของภาชนะ  
 พลาสติกตัวอยางนั้น  แลวปดใหสนิท  
 (2) วางภาชนะพลาสติกตัวอยางตามขอ  (1) ลงในภาชนะที่เหมาะสม   (เชน บีกเกอรขนาดใหญ   
  อางแกว ) ที่บรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเดียวกันกับที่มีอยูในภาชนะพลาสติกตัวอยางโดยใหพื้นที่  
  ผิวภายนอกของภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละใบ จมอยูใตผิวหนาของอาหารเลี้ยงเชื้อไมนอยกวา  
  60%  
 (3) เติมเชื้อ บาซิลลัส  ซับทิลิส  ที่ใชทดสอบ  ลงในบีกเกอรขนาดใหญที่บรรจุฟลูอิดไทโอไกลโครเลต
 มีเดียม  20 ml  ตออาหารเลี้ยงเชื้อ  1 L ผสมใหเขากันแลวปดปากภาชนะดวยกระจก  
 (4) เติมเชื้อ ซาลโมเนลลา  คอเลอเรซูอิส  ที่ใชทดสอบ  ลงในบีกเกอรขนาดใหญที่บรรจุซอยบีนเคซีน  
 ไดเจสตมีเดียม  20 ml ตออาหารเลี้ยงเชื้อ  1 L  ผสมใหเขากันแลวปดปากภาชนะดวยกระจก  
 (5) นําภาชนะในขอ  (3) และขอ  (4) ไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ  30 ° C ถึง 35 ° C เปนเวลา  7 วัน 
 (6) เมื่อครบตามเวลาที่กําหนด  ทําความสะอาดภาชนะดานบนที่อยูเหนืออาหารเลี้ยงเชื้อโดยการลาง
 ดวยสารละลายโพรพานอล 60% โดยปริมาตร เปนเวลา 120 s และลางดวยน้ําที่ปราศจาก
 เชื้ออีกครั้ง  
 (7) ใชแทงแกวรอนแดง  ขนาดเสนผานศูนยกลางประมาณ  5 mm เจาะผนังภาชนะพลาสติกตัว อยาง  
 (ขอ(6)) บริเวณเหนือผิวหนาของอาหารเลี้ยงเชื้อที่อยูภายในทันทีแลวใชกระบอกฉีดยาพรอมเข็ม
 ฉีดยาที่ปราศจากเชื้อดูดอาหารเลี้ยงเชื้อจากภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละใบตามปริมาณที่
 กําหนดในตารางที่  4 สดมภที่ 4  
-35- มอก. 531 -  25XX  
 (8) แบงอาหารเลี้ยงเชื้อที่ดูดเอาไวจากภาชนะพล าสติกตัวอยางแตละใบ (ขอ(7))ใสลงในขวด เพาะ
 เชื้อซึ่งบรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดเดียวกันขวดละ  10.0 ml ตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่  4 
 สดมภที่  5 นําขวดเพาะเชื้อทั้งหมดไปอบเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ  30 °C ถึง 35 °C เปนเวลา  10 วัน  
 เมื่อครบตามเวลาที่กําหนด  สังเกตดูวามีการเจริญของจุลินทรียในขวดเพาะเชื้อแตละใบหรือไม 
8.16.6 การประเมินผล  
 ใหถือวาภาชนะพลาสติกตัวอยางไมมีการซึมผานของจุลินทรียเมื่อขวดเพาะเชื้อทุกใบไมมีการเจริญของ
จุลินทรีย  
ตารางที่  4 การทดสอบการซึมผานของจุลินทรีย  
(ขอ 8.16.5)  
ความจุของภาชนะ จํานวนภาชนะพลาสติก  ปริมาณอาหารเลี้ยงเชื้อ  จํานวนขวดเพาะเชื้อ  
พลาสติกตัวอยาง  ตัวอยางที่ใชทดสอบ ที่ดูดจากภาชนะพลาสติก  ที่ใชทดสอบ ตอ 
 อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดละ  รวม ตัวอยางแตละใบ  ภาชนะพลาสติก ตัวอยาง  
ml ใบ ใบ  ใบ 
ไมเกิน  100 5 10 1 % โดยปริมาตรของ ความจุ  1 
   แตตองไมนอยกวา 0.1 ml   
101  ถึง  500 3 6 1 % โดยปริมาตรของ ความจุ  2 
              เกิน 500 1 2 1 % โดยปริมาตรของ ความจุ  5 
   แตไมเกิน 25 ml  
 
8.17 ความคงทนของเครื่องหมายและฉลาก  
 8.17.1 เครื่องมือ  
   เครื่องอังน้ําที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่  20°C ถึง 30°C 
 8.17.2  วิธีทดสอบ  
   นําภาชนะพลาสติกตัวอยางที่บรรจุน้ํากลั่นจนถึงปริมาตรบรรจุและปดผนึกเรียบรอย แชในน้ํา  
   อุณหภูมิ 20 °C ถึง 30 °C เปนเวลา 24 h แลวตรวจพินิจสภาพของเครื่องหมายและฉลากบนภาชนะ  
   พลาสติกตัวอยาง แลว ตองไมหลุด  
   
 
  
-36-
                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
ภาคผนวก ก . 
การทําลายเม็ดเลือด  
(ขอ 5.4.4) 
ก.1 การทําลายเม็ดเลือด  
ก.1.1 เครื่องมือ  
 (1) ตูอบที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่  (70 + 2) °C 
 (2) สเปกโทรโฟโตมิเตอรที่มีความยาวคลื่น  540 nm  
 (3) เครื่องหมุนเหวี่ยง  
 (4) หมอนึ่งอัด  
 (5) ตูอบเพาะเชื้อ  (incubator) ที่ควบคุมอุณหภูมิไดที่  (37 + 1) °C 
ก.1.2 สารเคมี  สารละลาย  และวิธีเตรียม  
 (1) สารละลายโซเดียมคลอไรด  0.9%  โดย มวล ที่ปราศจากเชื้อ  
 (2) สารมาตรฐานอางอิงฮีโมโกลบิน  (hemoglobin reference standard) 6 mg/ml  
 (3) สารละลายแดรบคิน  (Drabkin's solution)  
  ละลายโซเดียมไบคารบอเนต  1 g โพแทสเซียมไซยาไนด  0.05 g และโพแทสเซียมเฟอริ ไซยา  
 ไนด 0.2 g ในน้ํากลั่น  และเติมน้ํากลั่นจนปริมาตรเปน  1 000 ml  
 (4) การควบคุมเชิงบวก (positive control) เชน น้ํากลั่นสําหรับ ทํายาฉีด  
 (5) การควบคุมเชิงลบ (negative control) เชน แผนพลาสติกมาตรฐานพอลิเอทิลีนความหนาแนนสูง  
ก.1.3 การเตรียมเลือดกระตาย  
 เจาะเลือดกระตายอยางนอย  3 ตัว ผสมกับสารปองกันการแข็งตัวของเลือด  เชน น้ํายาเอซีดี  
(anticoagulant  citrate dextrose solution, ACD) น้ํายาซีพีดี  (anticoagulant c itrate phosphate dextrose 
solution, CPD) ถาไมนํามาใชทันที  ใหแยกเก็บในภาชนะเก็บเลือดของกระตายแตละตัวที่อุณหภูมิ  
(4+2) °C แตตองนํามาใชทําการทดสอบภายในเวลา 96 h 
ก.1.4 การเตรียมสารละลายทดสอบ  
 (1) ตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางแตละหนวยตรงบริเวณที่มี ความหนา สม่ําเสมอและโคงนอยที่สุดใหได
 ชิ้นพลาสติกพื้นที่เทาๆกัน  นํามารวมกันใหพื้นที่ผิว สองดาน รวมกันได  120 cm2 สําหรับภาชนะ  
 พลาสติกหนานอยกวา  0.5 mm และ  60 cm2 สําหรับภาชนะพลาสติกที่หนาเทากับหรือ มากกวา 
 0.5 mm แลวนํามาตัดออกเปนชิ้นยอยขนาดกวางประมาณ  0.1 cm ถึง 0.3 cm และยาวประมาณ            
 1 cm ถึง 5 cm ในกรณีที่ไมสามารถตัดภาชนะพลาสติกตัวอยางใหไดขนาดดังกลาว ใหตัดตัวอยาง
 เปนชิ้นเล็กๆ แลวชั่งน้ําหนัก 4 g จากนั้นนําตัวอยางที่เตรียมไว ใสลงในขวดแกวฝา เกลีย วสําหรับ  
 สกัดตัวอยาง  
-37- มอก. 531 -  25XX  
 (2) ลางภาชนะพลาสติกตั วอยางดวยน้ํากลั่นสําหรับ ทํายาฉีดอยางนอย 2 ครั้ง ปลอยใหแหงที่อุณหภูมิ  
 หอง 
 (3) สกัดชิ้นพลาสติกตัวอยางดวยสารละลายโซเดียมคลอไรด  0.9% โดยมวลที่ปราศจากเชื้อ
 ปริมาตร  20 ml  
  เตรียมแผนพลาสติกที่ใชสําหรับการควบคุมเชิงลบเชนเดีย วกับพลาสติกตัวอยาง สวนน้ํากลั่น
 สําหรับ ทํายาฉีดที่ใชสําหรับการควบคุมเชิงบวก  และสารละลายโซเดียมคลอไรด  0.9% โดยมวลที่
 ปราศจากเชื้อใชเปนแบลงก  ใหใสลงในขวดแกวฝาเกลียว แลวปดฝาใหสนิท  
 (4) นําภาชนะสําหรับสกัด ทั้งหมดจากขอ (3) ใสในหมอนึ่งอัดที่อุณหภูมิ  (121 + 2) °C เปนเวลา  1 h 
 หรือใสในตูอบที่อุณหภูมิ  (70 + 2) °C เปนเวลา  24 h หรือที่อุณหภูมิ (50 + 2) °C เปนเวลา  72 h 
 แลวนําออกมาปลอยไวใหเย็นที่อุณหภูมิหอง  (20 °C ถึง 30 °C)  เขยาอยางแรง  แลวเทสารละลาย
 สกัดที่ไดลงในภาชนะที่สะอาด  แหง และปราศจากเชื้ อทันทีนําไปเก็บไวในที่ซึ่งมีอุณหภูมิ  20 °C 
 ถึง 30 ° C และตองนําไปทดสอบตอไปภายในเวลา   24 h หลังจากที่เตรียมได  
ก.1.5 วิธีทดสอบ  
 (1) การเตรียมกราฟสอบเทียบ  
  (1.1)  เตรียมสารละลายสอบเทียบ  โดยใชปเปตตดูดสารละลายมาตรฐานอางอิงฮีโมโกลบิน     
   10 ml 5 ml 2 ml 1 ml และ 0.5 ml ใสลงในขวดแกวปริมาตรขนาด  100 ml จํานวน  5 ใบ 
  ตามลําดับ เจือจางดวยสารละลายแดรบคินจนถึงขีดปริมาตร  สารละลายที่ไดจะมีความ 
  เขมขน  0.6 mg/ml 0.3 mg/ml 0.12 mg/ml 0.06 mg/ml และ 0.03 mg/ml ตามลําดับ 
  ตั้งไว 5 min 
  (1.2)  วัดคาการดูดกลืนแสงของสารละลาย สอบเทียบ แตละความเขมขน ที่ความยาวคลื่น           
  540 nm โดยใชสารละลายแดรบคินเปนแบลงก  
  (1.3)  สรางกราฟ สอบเทียบ ระหวางความเขมขนของฮีโมโกลบินมาตรฐานเปนมิลลิกรัมตอ  
  มิลลิลิตรกับคาการดูดกลืนแสง  
 (2) การตรวจหาระดับพลาสมาฮีโ มโกลบินในเลือด  
  (2.1)  นําเลือดกระตายแตละภาชนะบรรจุตามขอ  ก.1.3 ปริมาตร  1 ml ใสลงในหลอดหมุน 
  เหวี่ยง  และนําไปหมุนเหวี่ยงในแนวระดับดวยอัตราเร็ว  700 G  ถึง 800 G  นาน 15 min 
  (2.2)  ดูดสวนใสดานบน   (พลาสมา ) 100 µl  เติมลงในสารละลายแดรบคิน  5.0 ml  ตั้งทิ้งไว   
  15 min แลวนําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น  540 nm โดยใชสารละลาย                
  แดรบคินเปนแบลงก  
  (2.3)  นําคาการดูดกลืนแสงที่ไดไปเทียบกับกราฟ สอบเทียบ  หาปริมาณฮีโมโกลบินใน 
  พลาสมาของเลือดกระตายแตละตัว   เปนมิลลิกรัมตอมิลลิลิตร  
-38-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
  (2.4)  ถาเลือดกระตายตัวใดมีปริมาณฮีโมโกลบินในพลาสมาเกิน  1.0 mg/ml จะไมนําเลือด   
  กระตายตัวนั้นมาใชในการทดสอบตอไป  และตองใชเลือดกระตาย  3 ตัวในการทดสอบ   
 (3) การเจือจางเลือด  
  (3.1)  นําเลือดกระตายแตละตัวที่ผานการทดสอบหาปริมาณฮีโมโกลบินในพลาสมาแลว               
  20 µl เติมลงในสารละลายแดรบคิน  5.0 ml ตั้งทิ้งไว 15 min 
  (3.2)  นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น  540 nm  โดยใชสารละลายแดรบคินเปน            
  แบลงก  นําคาการดูดกลืนแสงที่ไดไปเทียบกับกราฟ สอบเทียบ  หาปริมาณฮีโมโกลบิน   
  ในเลือด  
   (3.3)  เจือจางเลือดกระตายแตละตัวดวยสารละลายโซเดียมคลอไรด  0.9% โดยมวล ที่ 
   ปราศจากเชื้อให มีปริมาณ  ฮีโมโกลบินอยูในชวง  (25.0 +  2.5) mg/ml  เปนคา  
   ฮีโมโกลบินปรากฎ  (hemoglobin present)  
 (4) การทดสอบตัวอยาง  
  (4.1)  นําเลือด ที่ไดจากขอ ก .1.5 (3.3) มาตัวละ 5.0 ml เติมสารละลายทดสอบ 4.0 ml นําไปบม
  ในตูอบที่อุณหภูมิ (37 +  1) °C เปนเวลา  4 h   
  (4.2)  เมื่อครบเวลา นําไป หมุนเหวี่ยงในแนวระดับดวยอัตราเร็ว 100 G ถึง 200 G เปนเวลา 15 
 min 
  (4.3)  ดูดสวนใสดานบนใสในหลอดหมุนเหวี่ยงหลอดใหม แลว นําไป หมุนเหวี่ยงดวย  
  อัตราเร็ว 700 G ถึง 800 G เปนเวลา 5 min  ดูดสวนใสดานบนใสในหลอดแกวใหม แลว
  นําไปหาคาดัชนีการแตกตัวของเม็ดเลือด  
 (5) การหาคาดัชนีการแตกตัวของเม็ด เลือด  
  (5.1)  นําสวนใสจากขอ ก .1.5 (4.3) มา 1.0 ml เติมลงในสารละลายแดรบคิน  3.0 ml ตั้งทิ้งไว  
  15 min  
  (5.2)  นําไปวัดคาการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น  540 nm โดยใชสารละลายแดรบคินเปน            
  แบลงก  นําคาการดูดกลืนแสงที่ไดไปเทียบกับกราฟ สอบเทียบ  หาปริมาณฮีโมโกลบิน   
  เปนคา ฮีโมโกลบิน ปลดปลอย (hemoglob in released)  
   (5.3) คํานวณ คาดัชนีการแตกตัวของเม็ด เลือด จากสูตร  
    ดัชนีการแตกตัวของเม็ด เลือด       =         ฮีโมโกลบิน ปลดปลอย     
ฮีโมโกลบินปรากฏ x 100 
          (5.4) คํานวณคาเฉลี่ยของดัชนีการแตกตัวของเม็ด เลือด  แลวเทียบหาระดับการแตกตัวของเม็ด
   เลือดตามตารางที่ 5 
 
 
-39- มอก. 531 -  25XX  
 
ตารางที่ 5 ระดับการแตกตัวของเม็ดเลือด  
(ขอ ก .1.5(5.4)) 
 
ดัชนีการแตกตัวของเม็ดเลือด  ระดับการแตกตัวของเม็ดเลือด  
0 ถึง นอยกวา 2 ไมมีการแตกตัว  
2 ถึง นอยกวา 10 มีการแตกตัวเล็กนอย  
10 ถึง นอยกวา 20 มีการแตกตัวปานกลาง  
20 ถึง นอยกวา 40 มีการแตกตัวอยางเห็นไดชัด  
40 ขึ้นไป  มีการแตกตัวอยางรุนแรง  
 
             
 
 
 
  
 
 
 
 
  
 
  
 
 
 
  
 
-40-
                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
ภาคผนวก  ข. 
การชักตัวอยางและเกณฑตัดสิน  
(ขอ 7.1) 
ข.1  รุน ในที่นี้  หมายถึง ภาชนะพลาสติกชนิดเดียวกัน  ที่ทําโดยกรรมวิธีเดียวกันและในคราวเดียวกัน  หรือที่ทํา
หรือสงมอบหรือซื้อขายในระยะเวลาเดียวกัน  
ข.2  การชักตัวอยางและการยอมรับ  ใหเปนไปตามแผนการชักตัวอยางที่กําหนดตอไปนี้  หรืออาจใชแผนการชัก  
ตัวอยางอื่นที่เทียบเทากันทางวิชาการกับแผนที่กําหนดไว  
ข.2.1  การชักตัวอยางและการยอมรับสําหรับการทดสอบลักษณะทั่วไป  ความสม่ําเสมอของความหนา ความ
ยืดหยุน  และเครื่องหมายและฉลาก  
ข.2.1.1  ใหชักตัวอยางโดยวิธีสุมจากรุนเดียวกันตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่  ข.1 
ข.2.1.2  จํานวนตัวอยางที่ไมเปนไปตามขอ  5.1 ขอ 5.2.3 ขอ 5.2.5 และขอ  6. ตองไมเกินเลขจํานวนที่
ยอมรับที่กําหนดในตารางที่  ข.1 จึงจะถือวาภาชนะพลาสติกรุนนั้นเปนไปตามเกณฑที่กําหนด  
 
ตารางที่  ข.1 แผนการชักตัวอยางสําหรับการทดสอบลักษณะทั่วไป  ความสม่ําเสมอของความหนา  
ความ ยืดหยุน  และเครื่องหมายและฉลาก  
                                                        ( ขอ ข.2.1)  
 
ขนาดรุน  ขนาดตัวอยาง  เลขจํานวนที่ยอมรับ  
ใบ ใบ  
       ไมเกิน   1 200  20 2 
1 201   ถึง  10 000  32 3 
           เกิน 10 000  50 5 
 
ข.2.2  การชักตัวอยางและการยอมรับสําหรับการทดสอบรูรั่ว   ความทนตอการตกกระแทก ความทนความดัน 
และปริมาณ อนุภาคปนเปอน  
ข.2.2.1  ใหชักตัวอยางโดยวิธีสุมจากรุนเดียวกันจํานวน  20 ใบ  
ข.2.2.2  ตัวอยางทุกตัวอยางตองเปนไปตามขอ  5.2.1 ขอ 5.2.2 ขอ 5.2.4 และขอ 5.2.8 จึงจะถือวาภาชนะ
พลาสติกรุนนั้นเปนไปตามเกณฑที่กําหนด  
 
-41- มอก. 531 -  25XX  
 
ข.2.3  การชักตัวอยางและการยอมรับสําหรับการทดสอบ พอลิไวนิลคลอไรดเรซิน ได (2-เอทิลเฮกซิล )แทเลต 
ไวนิลคลอไรดโมโนเมอร  ปริมาณกากที่เหลือจากการเผา  คุณลักษณะของสารละลายที่สกัดได   และ
ปริมาณโลหะหนัก   
ข.2.3.1  ใหชักตัวอยางโดยวิธีสุมจากรุนเดียวกันตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่  ข.2 
ข.2.3.2  ตัวอยางตองเปนไปตาม ขอ 4.3.1 ขอ 4.3.2 ขอ 4.3.3 ขอ 5.2.7 ขอ 5.3.1 และขอ 5.3.2  จึงจะถือวา
ภาชนะพลาสติกรุนนั้นเปนไปตามเกณฑที่กําหนด  
ตารางที่  ข.2  แผนการชักตัวอยางสําหรับการทดสอบ พอลิไวนิลคลอไรดเรซิน   ได( 2-เอทิลเฮกซิล )แทเลต ไวนิลคลอ
ไรดโมโนเมอร  ปริมาณกากที่เหลือจากการเผา  คุณลักษณะของสารละลายที่สกัดได   และ ปริมาณโลหะหนัก  
                                                                             ( ขอ ข.2.3)  
ขนาดรุน  ขนาดตัวอยาง  
ใบ ใบ 
       ไมเกิน   1 200  20 
1 201   ถึง  10 000  32 
           เกิน 10 000  50 
 
ข.2.4  การชักตัวอยางและการยอมรับสําหรับการทดสอบการซึมผานของไอน้ํา  และความคงทนของ
เครื่องหมายและฉลาก  
ข.2.4.1  ใหชักตัวอยางโดยวิธีสุมจากรุนเดียวกันตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่  ข.3 
ข.2.4.2  จํานวนตัวอยางที่ไมเปนไปตามขอ  5.2.6 และขอ 5.5 ตองไมเกินเลขจํานวนที่ยอมรับที่กําหนดใน
ตารางที่  ข.3 จึงจะถือวาภาชนะพลาสติกรุนนั้นเปนไปตามเกณฑที่กําหนด  
ตารางที่  ข.3 แผนการชัก ตัวอยางสําหรับการทดสอบการซึมผานของไอน้ํา   
และความคงทนของเครื่องหมายและฉลาก  
(ขอ ข.2.4)  
ขนาดรุน  ขนาดตัวอยาง  เลขจํานวนที่ยอมรับ  
ใบ ใบ  
       ไมเกิน   1 200  13 1 
1 201   ถึง  10 000  20 2 
           เกิน 10 000  32 3 
-42-                                                                         มอก. 531 -  25XX  
 
 
ข.2.5  การชักตัวอยางและการยอมรับสําหรับการทดสอบ คุณลักษณะทางชีวภาพ  
ข.2.5.1  ใหชักตัวอยางโดยวิธีสุมจากรุนเดียวกันตามจํานวนที่กําหนดในตารางที่  ข.4 
ข.2.5.2   จํานวนตัวอยาง ตองเปนไปตามขอ  5.4  จึงจะถือวาภาชนะพลาสติกรุนนั้นเปนไปตามเกณฑ  
 ที่กําหนด  
 
ตารางที่  ข. 4 แผนการชักตัวอยางสําหรับการทดสอบ คุณลักษณะทางชีวภาพ  
(ขอ ข.2.5 ) 
ขนาดความจุภาชนะพลาสติก  
ml ขนาดตัวอยาง  
ใบ 
นอยกวา   100 80 
100   ถึง   499 60 
ตั้งแต   500 40 
 
ข.3 เกณฑตัดสิน  
 ตัวอยางภาชนะพลาสติกตองเปนไปตามขอ  ข.2.1.2 ขอ ข.2.2.2 ขอ ข.2.3.2 ขอ ข .2.4.2 และขอ  ข.2.5 .2           
ทุกขอ  จึงจะถือวาภาชนะพลาสติกรุนนั้นเปนไปตามมาตรฐานผลิตภัณฑอุตสาหกรรมนี้  
 
 
 
 
 
_________________________ 
 
 
 
  
  
-43-