中华人民共和国国家标准
GB××××—××××
食品安全国家标准
食品营养强化剂（6S）-5-甲基四氢叶酸，
氨基葡萄糖盐
（征求意见稿）
××××-××-××发布 ××××-××-××实施
GBXXXX—XXXX
1食品安全国家标准
食品营养强化剂（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐
1范围
本标准适用于以叶酸为原料，经甲基化、盐化、结晶、冻干等工艺制得的食品营养强化剂(6S)-5-
甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐。
2化学名称、分子式、结构式和相对分子质量
2.1化学名称
N-[4-[[[(6S)-2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-5-甲基-4-氧代-6-蝶啶]甲基]氨基]苯甲酰]-L-谷氨基酸，氨基
葡萄糖盐
2.2分子式
C32H51N9O16
2.3结构式
2.4相对分子质量
817.80（无水物）（按2018年国际相对原子质量）
3技术要求
3.1感官要求
感官要求应符合表1的规定。GBXXXX—XXXX
2表1感官要求
项目 要求 检验方法
色泽 乳白色至淡棕色
取适量试样置于洁净、干燥的白瓷盘中，在自然光线下
观察其色泽、状态，嗅其气味状态 粉末，无肉眼可见杂质
气味 无异臭
3.2理化指标
理化指标应符合表2的规定。
表2理化指标
项目 指标 检验方法
（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐
（以干基计），w/%96.0~105.0 附录A中A.4
（6S）-5-甲基四氢叶酸（以干基计），
w/%54.0~59.0 附录A中A.4
氨基葡萄糖（以干基计），w/% 34.0~46.0 附录A中A.5
非对映异构体（（6S）-5-甲基四氢叶
酸），%≥ 99.0 附录A中A.6
水分，w/% ≤ 8.0 GB5009.3卡尔·费休法
灰分，w/% ≤ 0.2 GB5009.4
杂
质总杂质，w/% ≤ 2.5
附录A中A.74-氨基苯甲酰谷氨酸（ABGA），
w/%≤ 0.3
4α-羟基-5-甲基四氢叶酸
（HOMeTHFA），w/%≤ 1.0
（6S）-吡嗪-s-三嗪衍生物
[（6S）-Mefox]，w/%≤ 0.3
5-甲基四氢蝶酸（MeTHPA），
w/%≤ 0.3
总砷（以As计）/（mg/kg） ≤ 2.0 GB5009.11或GB5009.76
铅（Pb）/（mg/kg） ≤ 2.0 GB5009.12或GB5009.75
镉（Cd）/（mg/kg） ≤ 1.0 GB5009.15
总汞（以Hg计）/（mg/kg） ≤ 0.1 GB5009.17GBXXXX—XXXX
3附录A
检验方法
A.1安全提示
本标准中使用的部分试剂具有毒性或腐蚀性，操作时需小心谨慎。若溅到皮肤上应立即用水冲洗，
严重者应立即治疗。在使用挥发酸时，要在通风橱中进行。
A.2一般规定
本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682中规定的三级水。
试验中所用标准溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及其制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601、
GB/T602、GB/T603的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。
A.3鉴别试验
A.3.1红外吸收光谱法
采用溴化钾压片法，按照GB/T32199进行试验，试样的红外光吸收图谱应与对照品的图谱一致（对
照品图谱见图B.1）。
A.4（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐和（6S）-5-甲基四氢叶酸（以干基计）的测定
A.4.1方法提要
试样用水溶解后，采用液相色谱分离，紫外检测器或其他等效检测器检测，标准单点法定量。
A.4.2试剂和材料
A.4.2.1水：GB/T6682规定的一级水。
A.4.2.2乙腈：色谱纯。
A.4.2.3磷酸二氢钾。
A.4.2.4氢氧化钾。
A.4.2.5（6S）-5-甲基四氢叶酸钙标准品：纯度≥98.0%，CAS号：151533-22-1，或经国家认证并授
予标准物质证书的标准品。
A.4.2.6氢氧化钾溶液：20g/100mL。称取20g氢氧化钾，加水溶解，并定容至100mL。
A.4.2.7磷酸二氢钾溶液（pH6.5）：称取约6.80g磷酸二氢钾，精确至0.0001g，加水900mL溶解，
用氢氧化钾溶液调节pH至6.5，加水定容至1000mL。摇匀，过滤并超声后备用。
A.4.2.8磷酸二氢钾-乙腈溶液（pH8.0）：称取约4.08g磷酸二氢钾，精确至0.0001g，加水600mL
溶解，与350mL乙腈混合，用氢氧化钾溶液调节pH至8.0，加水定容至1000mL。摇匀，过滤并超声
后备用。
A.4.3仪器和设备
A.4.3.1高效液相色谱仪：配备紫外吸收检测器，或其他等效的检测器。
A.4.3.2电子天平：感量0.0001g。GBXXXX—XXXX
4A.4.3.3酸度计。
A.4.3.4超声波清洗器。
A.4.4色谱参考条件
A.4.4.1色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，粒径5μm；或其他等效的色谱柱。
A.4.4.2流速：1.0mL/min。
A.4.4.3检测波长：280nm。
A.4.4.4柱温：25℃。
A.4.4.5进样量：10μL。
A.4.4.6流动相：流动相A：磷酸二氢钾溶液（pH6.5）（A.4.2.6）,流动相B：磷酸二氢钾-乙腈溶液（pH8.0）
（A.4.2.7），采用梯度洗脱，梯度洗脱程序如表A.1所示。
表A.1梯度程序
时间（min） 流动相A（%）流动相B（%）
0 100 0
15 60 40
17 30 70
22 30 70
31 100 0
36 100 0
A.4.5分析步骤
A.4.5.1标准溶液的制备
称取0.0433g的（6S）-5-甲基四氢叶酸钙标准品（相当于0.040g（6S）-5-甲基四氢叶酸），精确
至0.0001g，置于100mL容量瓶中，先用少量水溶解，再用水稀释至刻度，摇匀。所得溶液在低于20℃
环境下（在超声浴中放入冰块）超声2min，经0.45μm滤膜过滤后立即进样。
A.4.5.2试样溶液的制备
称取约0.070g试样，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，先用少量水溶解，再用水稀释至刻度，
摇匀。所得溶液在低于20℃环境下（在超声浴中放入冰块）超声2min，经0.45μm滤膜过滤后立即进
样。平行配制两份。
注1：溶液均需现配现用，不得长时间存放。
A.4.5.3系统适用性试验
按照以下步骤执行系统适用性试验。使用带冷却功能的自动进样器，设置温度低于8℃；若使用不
带冷却功能的进样器，进样前需将溶液在2℃~8℃下储存。进行六次标准溶液进样，计算表A.2参数。
表A.2系统适用性试验参数
参数 限值
RSD（峰面积），% ≤ 2.0
RSD（保留时间），%≤ 1.0
拖尾因子 ≤ 2
理论塔板数 ≥ 40000
A.4.5.4测定
在A.4.4色谱条件下，将水（不含溶质）注入，按照上述时间运行色谱仪。然后分别对标准溶液和
试样溶液进行色谱分析。以保留时间定性，以峰面积定量。(6S)-5-甲基四氢叶酸参考色谱图见图C.1，
(6S)-5-甲基四氢叶酸的保留时间(Rt)：约11min。GBXXXX—XXXX
5注2：分析结束后，使用乙腈和水（65∶35）的混合溶液冲洗色谱柱，随后用乙腈和水（65∶35）混合溶液封柱。
A.4.6结果计算
(6S)-5-甲基四氢叶酸（以干基计）的质量分数w1，按公式（A.1）计算：
?1=??1×????1×?%
????1×??1×(100%−?)×100% …………………（A.1）
式中：
Ac1——试样溶液色谱图中(6S)-5-甲基四氢叶酸的峰面积；
mStd1——标准品的质量，单位为克（g）；
T%——(6S)-5-甲基四氢叶酸钙盐标准品中(6S)-5-甲基四氢叶酸的质量分数，%；
AStd1——标准溶液色谱图中(6S)-5-甲基四氢叶酸的峰面积；
mc1——试样的质量，单位为克（g）；
M——试样中水分的质量分数，%。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果
的绝对差值不应超过算术平均值的2%。
(6S)-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐（以干基计）的质量分数w2，按公式（A.2）计算：
?2=?1×?1
?2…………………（A.2）
式中：
w1——(6S)-5-甲基四氢叶酸（以干基计）的质量分数，单位为百分之百（%）；
M1——(6S)-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐的摩尔质量，单位为克/摩尔（g/mol）
（MC32H51N9O16=817.80）；
M2——(6S)-5-甲基四氢叶酸的摩尔质量，单位为克/摩尔（g/mol）（MC20H25N7O6=459.45）。
A.5氨基葡萄糖（以干基计）的测定
A.5.1方法提要
试样用乙腈-水溶液溶解后，采用液相色谱分离，紫外检测器或其他等效检测器检测，标准单点法
定量。
A.5.2试剂和材料
A.5.2.1水：GB/T6682规定的一级水。
A.5.2.2乙腈：色谱纯。
A.5.2.3氢氧化钾。
A.5.2.485%磷酸。
A.5.2.5D-(+)-氨基葡萄糖盐酸盐标准品：摩尔质量MC6H13NO5·HCl=215.63g/mol，纯度≥98.0%，CAS号：
66-84-2，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。
A.5.2.6氢氧化钾溶液：20g/100mL。称取20g氢氧化钾，加水溶解，并定容至100mL。
A.5.2.750%乙腈溶液：量取500mL水和500mL乙腈，混匀。
A.5.2仪器和设备GBXXXX—XXXX
6A.5.2.1高效液相色谱仪：配备紫外吸收检测器，或其他等效的检测器。
A.5.2.2电子天平：感量0.0001g。
A.5.3色谱参考条件
A.5.3.1色谱柱：NH2柱，250mm×4.6mm，粒径5μm；或其他等效的色谱柱。
A.5.3.2流动相：乙腈+水（75+25，体积比）。
A.5.3.3流速：1.0mL/min。
A.5.3.4检测波长：195nm。
A.5.3.5柱温：35℃。
A.5.3.6进样量：10μL。
A.5.4分析步骤
A.5.4.1氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液的制备
称取0.375g氨基葡萄糖盐酸盐标准品，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，加50mL50%乙
腈溶液溶解后，再用50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤后立即进样。
A.5.4.2试样溶液的制备
称取0.350g试样，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，加50mL50%乙腈溶液溶解后，再用
50%乙腈溶液定容至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤后立即进样。
注3：溶液均需现配现用，不得长时间存放。
A.5.4.3系统适用性试验
氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液进样6次，确定峰面积相对标准差（RSD）、拖尾因子和理论塔板数。
合格标准：RSD≤2.0%，拖尾因子≤2.0，理论塔板数≥1500。
A.5.4.4测定
在A.5.3色谱条件下，先注入氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液，根据上述时长进行色谱测定，记录色谱
图，另取试样溶液，同法测定。氨基葡萄糖标准溶液的参考色谱图见图C.2。氨基葡萄糖的保留时间(Rt)：
约6.2min。
A.5.5结果计算
氨基葡萄糖盐（以干基计）的质量分数w3，按公式（A.3）计算：
?3=??2×????2×?%
????2×??2×(100%−?)×100%…………………………(A.3)
式中：
Ac2——试样溶液色谱图中氨基葡萄糖盐的峰面积；
mStd2——标准品的质量，单位为克（g）；
T%——D-氨基葡萄糖盐酸盐标准品中D-氨基葡萄糖的质量分数，%；
AStd2——标准溶液色谱图中氨基葡萄糖的峰面积；
mc2——试样的质量，单位为克（g）；
M——试样中水分的质量分数，%。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差
值不应超过算术平均值的2%。
A.6非对映异构体（（6S）-5-甲基四氢叶酸）的测定GBXXXX—XXXX
7A.6.1方法提要
试样用水溶解后，采用液相色谱分离，紫外检测器或其他等效检测器检测，标准单点法定量。
A.6.2试剂和材料
A.6.2.1水：GB/T6682规定的一级水。
A.6.2.2异丙醇：色谱纯。
A.6.2.3磷酸二氢钠。
A.6.2.4氢氧化钠。
A.6.2.5(6R,S)-5-甲基四氢叶酸钙标准品：纯度≥98.0%，CAS号：26560-38-3，或经国家认证并授予
标准物质证书的标准品。
A.6.2.6氢氧化钠溶液：10g/100mL。称取10g氢氧化钠，加水溶解，并定容至100mL。
A.6.2.7100mmol/L磷酸钠缓冲溶液：精确称取12.0g磷酸二氢钠溶于水，用氢氧化钠溶液将pH
准确调至7.0，加水定容至1000mL，过滤并超声。
A.6.3仪器和设备
A.6.3.1高效液相色谱仪：配备紫外吸收检测器，或其他等效的检测器。
A.6.3.2电子天平：感量0.1mg。
A.6.3.3pH计。
A.6.3.4超声波清洗器。
A.6.4色谱参考条件
A.6.4.1色谱柱：HSA手性柱，100mm×4.0mm，粒径5μm；或其他等效的色谱柱。
A.6.4.2流动相：异丙醇+100mmol/L磷酸钠缓冲溶液（6+94，体积比）。
A.6.4.3流速：0.7mL/min，调整流速，使(6S)-5-甲基四氢叶酸保留时间约为4.0min。
A.6.4.4检测波长：225nm。
A.6.4.5柱温：30℃。
A.6.4.6进样量：5μL。
A.6.4.7时间：20min。
A.6.5分析步骤
A.6.5.1标准溶液的制备
称取约0.025g(6R,S)-5-甲基四氢叶酸钙标准品，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，用90mL
水溶解，20°C超声1min，用水定容至刻度。移取5mL该溶液至10mL容量瓶中，用流动相定容，经
0.45μm滤膜过滤后立即进样。
A.6.5.2试样溶液的制备
称取约0.035g试样，精确至0.0001g，置于100mL容量瓶中，用90mL水溶解。20°C超声1min，
用水定容至刻度。移取5mL该溶液至10mL容量瓶中，用流动相定容，经0.45µm滤膜过滤后立即进
样。
注4：溶液均需现配现用，不得长时间存放。
A.6.5.3测定
在A.6.4色谱条件下，先注入标准溶液，检查系统适用性。(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢
叶酸的分离度应不小于2。另取试样溶液，同法测定。(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢叶酸标准
溶液的参考色谱图见图C.3。(6S)-5-甲基四氢叶酸保留时间(Rt)：约4.0min。(6R)-5-甲基四氢叶酸保留时GBXXXX—XXXX
8间(Rt)：约7.4min。分离度R，按式（A.4）计算：
?=1.18×(?2−?1)
?1+?2…………………………(A.4)
式中：
T2——相邻两色谱峰中后一峰的保留时间，单位为分钟（min）；
T1——相邻两色谱峰中前一峰的保留时间，单位为分钟（min）；
W1——相邻两色谱峰中前一峰的半高峰宽；
W2——相邻两色谱峰中后一峰的半高峰宽；
1.18——分离度系数。
A.6.5结果计算
非对映异构体(6S)-5-甲基四氢叶酸的含量w4，按公式（A.5）计算：
?4=??
??+??×100%…………………………(A.5)
式中：
AS——试样溶液色谱图中(6S)-5-甲基四氢叶酸的峰面积；
AR——试样溶液色谱图中(6R)-5-甲基四氢叶酸的峰面积；
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差
值不应超过算术平均值的2%。
A.7杂质的测定
A.7.1方法提要、试剂和材料、仪器和设备、色谱参考条件及分析步骤同A.4.1，A.4.2，A.4.3，A.4.4，
A.4.5。相关物质参考色谱图见图C.4。
A.7.2单个杂质的参考保留时间见表A.3。
表A.3单个杂质的参考保留时间
相关物质名称 参考相对保留时间（min）
4-氨基苯甲酰谷氨酸（ABGA） 3.31
4α-羟基-5-甲基四氢叶酸（HOMeTHFA） 4.23
(6S)-吡嗪-s-三嗪衍生物[(6S)-Mefox] 6.18
5-甲基四氢叶酸（5－MTHF） 10.98
5-甲基四氢碟酸（MeTHPA） 12.30
A.7.3结果计算
利用试样溶液色谱图计算所有单个杂质的质量分数Xi，范围包括除主峰以外的所有色谱峰，并忽
略试样溶液（0.1%）色谱图中峰面积为主峰面积0.05倍的所有峰。
单个杂质的质量分数Xi，按式（A.6）计算：GBXXXX—XXXX
9??=??×????3×?%×(??)?
????3×??3……………………（A.6）
式中：
Ai——试样溶液色谱图中单个杂质的峰面积；
mstd3——标准品的质量，单位为克（g）；
T%——(6S)-5-甲基四氢叶酸钙盐标准品中(6S)-5-甲基四氢叶酸的质量分数（%）；
(RF)i——单个杂质的响应因子；
AStd3——标准溶液色谱图中(6S)5甲基四氢叶酸的峰面积；
mc3——试样的质量，单位为克（g）；
注5：5-甲基四氢碟酸的RF为0.68，其他单个杂质的RF均为1.00。
总杂质为单个杂质的质量分数相加，总杂质的质量分数w5，按式（A.7）计算：
w5=Xi …………………………………………………（A.7）
式中：
Xi——单个杂质的质量分数（%）。
试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差
值不应超过算术平均值的2%。GBXXXX—XXXX
10附录B
（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐的参考红外光谱图
B.1（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐的参考红外光谱图
（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐的参考红外光谱图见图B.1。
图B.1（6S）-5-甲基四氢叶酸，氨基葡萄糖盐参考红外光谱图GBXXXX—XXXX
11附录C
参考液相色谱图
C.1（6S）-5-甲基四氢叶酸的参考液相色谱图
（6S）-5-甲基四氢叶酸的参考液相色谱图见图C.1。
图C.1（6S）-5-甲基四氢叶酸参考液相色谱图
C.2氨基葡萄糖盐酸盐的参考液相色谱图
氨基葡萄糖盐酸盐的参考液相色谱图见图C.2。
图C.2氨基葡萄糖盐酸盐参考液相色谱图GBXXXX—XXXX
12C.3(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢叶酸的参考液相色谱图
(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢叶酸的参考液相色谱图见图C.3。
图C.3(6S)-5-甲基四氢叶酸和(6R)-5-甲基四氢叶酸参考液相色谱图
C.4相关物质的参考液相色谱图
相关物质的参考液相色谱图见图C.4。
图C.4相关物质参考液相色谱图