# Exposition au MDI dans 19 entreprises françaises - La MDA urinaire comme biomarqueur de l'exposition.

Alain Robert, Philippe Ducos, Jean-Marie Francin, Philippe Marsan

► To cite this version:

Alain Robert, Philippe Ducos, Jean-Marie Francin, Philippe Marsan. Exposition au MDI dans 19 entreprises françaises - La MDA urinaire comme biomarqueur de l'exposition.. Hygiène et Sécurité du Travail, 2007, Hygiène et sécurité du travail - Cahiers de notes documentaires, 208 (ND 2272), pp.7-17. hal-05148845

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# EXPOSITION AU MDI DANS 19 ENTREPRISES FRANÇAISES – LA MDA URINAIRE COMME BIOMARQUEUR DE L'EXPOSITION

Le 4,4'-méthylènediphényl diisocyanate (MDI), utilisé dans un certain nombre de secteurs industriels mettant en œuvre des résines polyuréthannes, est un agent causal bien connu de l'asthme professionnel. Substance irritante et sensibilisante pour les voies respiratoires, sa classification par les instances européennes en catégorie 3 des cancérogènes est également à l'étude.

La surveillance atmosphérique du MDI, isocyanate peu volatil et que l'on retrouve essentiellement sous forme d'aérosols dans les ateliers, est difficile et souvent peu représentative des expositions professionnelles, d'autant plus que les autres voies d'exposition, comme la pénétration percutanée, ne sont pas prises en compte.

De plus, comme il a été montré que des expositions au MDI par voie cutanée pouvaient déclencher chez l'animal des allergies respiratoires, la prise en compte du contact cutané dans l'évaluation de l'exposition est nécessaire.

Le dosage de la 4,4'-méthylènedianiline (MDA) urinaire est considéré comme un moyen fiable d'évaluation indirecte de l'exposition au MDI intégrant la totalité des voies d'exposition.

Cet article présente une étude qui a donc consisté à évaluer les niveaux d'imprégnation de salariés exposés au MDI dans 19 entreprises françaises par la mesure des taux d'excrétion en MDA urinaire.

L'analyse de 424 urines de fin de poste appartenant à 169 salariés met en évidence des expositions professionnelles significativement plus élevées que celles rencontrées chez des personnes non exposées. Les niveaux excrétés en MDA urinaire différent selon le type de procédé de fabrication et surtout le degré d'automatisation du mélange MDI-polyols.

Les opérateurs directement exposés au durcisseur de la résine contenant le MDI monomère excrétent les plus grandes quantités de MDA dans leurs urines de fin de poste et des expositions cutanées avérées au durcisseur ou à la résine en cours de polymérisation entraînent toujours des taux de MDA urinaire significativement plus élevés.

La MDA urinaire s'avère être un outil pertinent pour évaluer les expositions professionnelles au MDI et aider les entreprises à améliorer leur procédé de fabrication et modifier leurs habitudes de travail.

Aujourd'hui, au regard des possibilités techniques et analytiques actuelles des entreprises françaises et des laboratoires de contrôle, une valeur-guide biologique de 7 µg/l (5 µg/g de créatinine) de MDA, à ne pas dépasser dans les urines de fin de poste, pourrait être proposée.

☐ 4,4'-méthylènediphényl diisocyanate (MDI)

☐ Résine polyuréthanne

☐ Exposition professionnelle

☐ Surveillance biologique

☐ Indicateur biologique

► Alain ROBERT, Philippe DUCOS, Jean-Marie FRANCIN, Philippe MARSAN, INRS, département Polluants et santé

## EXPOSURE TO MDI IN 19 FRENCH POLYURETHANE INDUSTRIES – URINARY MDA AS AN EXPOSURE BIOMARKER

Methylenediphenyl diisocyanate (MDI) is used in many polyurethane resin production plants; it is a well-known agent causing occupational asthma. A respiratory tract irritant and sensitizer, European authority classification of MDI in the carcinogenic category 3 is currently pending a final decision.

Atmospheric monitoring of MDI, an aromatic isocyanate with a very low vapour pressure found mainly in workshops in aerosol form, is difficult and poorly representative of occupational exposures, especially since other exposure routes, as skin penetration, are not considered.

Moreover, skin contact consideration is effectively essential in occupational exposure assessment because it has been shown that MDI exposures through skin contact in animals can trigger respiratory allergies.

Biomonitoring of MDI based on its degradation product 4,4'-methylenedianiline (MDA) in urine is a potentially powerful method of estimating personal exposure, when assessing overall exposure to MDI.

This study was designed to evaluate MDI exposure among workers at 19 French factories by measuring urinary MDA excretion levels.

Analysis of 424 post-shift urine samples, collected from 169 workers, show urinary MDA levels in exposed workers, which are significantly higher than from those of the 120 controls.

Type of process and, particularly, level of automation of the mixing operation (polyols-MDI) appear to be determining factors in exposure level values.

Excretion levels of workers directly exposed to hardener containing MDI monomer were significantly higher than those of other workers and skin exposure to MDI hardener or to polyurethane resin, during the curing phase, were invariably associated with significant MDA levels in urine.

Total MDA in post-shift urine samples is a reliable biomarker for assessing occupational exposure to MDI and for assisting companies in improving their manufacturing processes and working practices.

In the light of the current technical and analytical possibilities of French factories and control laboratories, a biological guide value not exceeding 7 µg/l (5 µg/g of creatinine) in the post-shift urine samples could be proposed in France.

☐ 4,4'-methylenediphenyl diisocyanate (MDI)

☐ Polyurethane resin

☐ Occupational exposure

☐ Biological monitoring

☐ Biological indicator
Le 4,4'-méthylènediphényl diisocyanate (CAS n° 101-68-8) est utilisé comme matière première, principalement dans la fabrication de mousses polyuréthannes flexibles et rigides, mais aussi d'élastomères, d'adhésifs, d'enduits de revêtement, de liants, de fibres et de diverses résines thermoplastiques. La capacité de production de l'Union européenne ne cesse de croître. En 2003, elle a été estimée à 2,4 millions de tonnes, faisant du MDI l'isocyanate industriel le plus important devant le diisocyanate de toluylène (TDI). En France, le marché est relativement modeste et représente 220 kilotonnes, soit environ 10 % du marché européen [1].

Le MDI monomère, constitué à 98 % de l'isomère 4,4'-MDI, est très peu utilisé à l'état pur par les industriels. Néanmoins, cette molécule est le composant majoritaire du PMPPI (PolyMéthylène PolyPhényl Isocyanate), produit liquide encore appelé MDI polymérique ou PMDI (CAS n° 9016-87-9), où elle représente environ 50 % du produit, le reste étant des isocyanates de plus haut poids moléculaires (oligomères) formés de deux ou plusieurs molécules de MDI. Pour des applications plus spécifiques nécessitant des exigences particulières (mise en œuvre, propriété du produit final), certains fabricants utilisent du MDI modifié connu sous le nom de prépolymère où la proportion en MDI monomère, plus faible a priori, est très variable.

Le MDI monomère en raison de sa faible pression de vapeur à température ambiante se retrouve essentiellement sous forme d'aérosols dans l'atmosphère des ateliers ou de vapeurs dans les procédés à chaud [2]. L'inhalation de poussières est également possible lorsque le MDI pur, cristallisé à température ambiante, est utilisé [3].

Pour réaliser le suivi des salariés exposés, de nombreuses méthodes de dosage du MDI monomère, mais également des oligomères, ont été publiées et des normes atmosphériques très basses ont été adoptées dans de nombreux pays.

Généralement, les niveaux en MDI atmosphérique mesurés dans les environnements de travail sont très inférieurs à la Valeur limite de moyenne d'exposition (VME) française fixée à 100 µg/m³ sur 8 heures de travail [4, 5].

Des opérations de pulvérisation par pistolage ou des procédés de fabrication à haute température [6, 7, 8, 9] peuvent toutefois entraîner des expositions ponctuelles plus élevées que la valeur limite (TLV : Threshold Limit Value) de l'ACGIH (American Conference of Governmental Industrial Hygienists) de 5 parties par milliard (ppb), soit environ 50 µg/m³ [10].

Cependant, pour réaliser des prélevements atmosphériques fiables et représentatifs, l'hygiéniste du travail doit savoir s'il prélève des vapeurs, des aérosols ou les deux à la fois, voire des poussières, compliquant d'autant les supports de piégeage qu'il doit utiliser [11].

Le MDI, agent causal bien connu de l'asthme professionnel, est également classé comme irritant et sensibilisant des voies respiratoires [12]. Une étude récente montre que le MDI pourrait induire, en milieu professionnel, plus de manifestations asthmatiformes que le TDI [13]. Des cas de pneumopathie d'hypersensibilité ont également été décrites chez des salariés exposés au MDI et deux cas d'asthme ayant entraîné la mort lui ont été attribués [14, 15, 16].

Aujourd'hui, cependant, les manifestations asthmatiformes professionnelles dues aux isocyanates ne semblent pas régresser dans le monde malgré la substitution des isocyanates monomères par des formes moins volatiles dans l'industrie des polyuréthannes [17]. En France, une étude récente de l'Observatoire national des asthmes professionnels (ONAP) attribue aux isocyanates 14 à 17 % des cas d'asthmes professionnels [18].

De plus, des études chez l'animal montrent que des hypersensibilités respiratoires résultent de sensibilisation dermique au MDI [19, 20], nécessitant la prise en compte du contact cutané dans l'évaluation de l'exposition et justifiant son classement "skin notation" dans les listes des valeurs MAK allemandes (Maximale Arbeitsplatz Konzentrationen) et TLV ACGIH [21, 10].

Le MDI, obtenu par phosgénation de l'amine correspondante, en l'occurrence la 4,4'-méthylèndianiline (MDA), est apte, après hydrolyse, à restituer cette amine aromatique in vivo en milieu aqueux. Cette propriété a déjà été mise à profit, dans les cas du TDI et du 1,6-diisocyanate d'hexaméthylène (HDI), pour

rechercher les amines correspondantes [les 2,4- et 2,6-diaminotoluylène (TDAs) et l'hexaméthylènediamine (HDA)] dans les milieux biologiques et, en particulier, dans l'urine [22, 23]. Ce dosage des amines est considéré depuis longtemps comme un moyen fiable d'évaluation biologique indirecte de l'exposition aux isocyanates, intégrant la globalité des voies d'exposition [24].

D'autre part, et indépendamment des risques de sensibilisation cutanée et respiratoire du MDI, la formation de MDA *in vivo* constitue un risque potentiel supplémentaire qui demande à être évalué puisque cette molécule est hépatotoxique et considérée comme un cancérogène potentiel chez l'homme [25]. C'est probablement pour cette raison que l'EPA (Environmental Protection Agency, États-Unis) considère le PMDI/MDI comme une substance suspecte quant à son potentiel cancérogène pour l'homme [26]. La DFG allemande (Deutsche Forschungs Gemeinschaft) a classé le MDI dans la catégorie 3 des substances suspectées d'un potentiel cancérogène pour l'homme, substances pour lesquelles la surveillance médicale des travailleurs doit être intensifiée [21]. Plus récemment, le MDI apparaît au niveau européen dans la troisième liste des substances prioritaires pour lesquelles les effets potentiels sur l'homme ou l'environnement doivent faire l'objet d'une « attention particulière » et son classement en catégorie 3 est à l'étude [27]. Quelques travaux ont tenté d'évaluer le risque cancérogène associé à l'exposition au MDI [28, 29, 30] et éventuent la responsabilité éventuelle de la MDA [28].

Enfin, des résultats récents font état de son caractère génotoxique chez l'homme [31].

Dans la littérature, quelques articles parus depuis 1993 traitent du suivi de salariés exposés au MDI, en utilisant la MDA urinaire comme traceur biologique des expositions [32, 33, 34, 35, 36, 37]. Actuellement, le dosage de la MDA urinaire permet d'identifier clairement des expositions au MDI intégrant la globalité des voies d'exposition. Trois études de terrain récentes montrent que ce dosage met en évidence des expositions professionnelles au MDI, autres qu'atmosphériques [38, 39, 40].

Depuis 1995, de nombreuses techniques analytiques, plus ou moins sophis-
tiquées, ont été décrites pour doser
la MDA urinaire. Beaucoup utilisent,
après dérivation, la chromatographie
gazeuse avec détection de masse (GC/
MS). La chromatographie liquide haute
performance avec des détecteurs plus
conventionnels, ultraviolet (UV) et/ou
électrochimique (EC), reste marginale
[41, 42, 43, 44]. Récemment, une équipe
suédoise a développé une méthode en
chromatographie liquide avec détection
et quantification par spectrométrie de
masse en tandem (LC/MS/MS) [45].

Les objectifs principaux de cette
'étude étaient d'évaluer les niveaux en
MDA urinaire excrétés par les sala-
riés travaillant dans différents secteurs
industriels où sont mis en œuvre des
produits à base de MDI, d'identifier
les procédés de fabrication les plus pol-
luants et les postes de travail les plus
exposés et d'évaluer la pertinence de ce
biomarqueur pour rendre compte des
expositions professionnelles. Une valeur
guide biologique française pour le MDI
est également proposée.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

ENTREPRISES ET EXPOSITIONS

Le choix des entreprises a été effec-
tué avec le concours des médecins du
travail et des Caisses régionales d'assu-
rance maladie (CRAM). Des campagnes
de suivi biologique avec prélèvements
d'urines ont été réalisées dans 19 entre-
prises françaises fabriquant des résines
à base de MDI. Pour chaque entreprise,
après accord de la direction, une visite
préliminaire en présence du médecin
du travail concerné a permis de détermi-
ner les postes de travail à inclure dans
l'étude, de fixer la date et les modalités
d'intervention et d'informer les salariés
volontaires soumis aux prélèvements
urinaires.

Les sites d'intervention étaient très
variés, tant du point de vue de leur taille,
allant de la petite entreprise avec quel-
ques salariés à la moyenne entreprise
avec plusieurs centaines de salariés,
que du type de résine fabriquée, de leur
mode de fabrication et de leur mise en
œuvre.

Très schématiquement, la fabrica-
tion de résines polyuréthannes consiste

généralement à mélanger deux parties
liquides, une partie A composée de
polyols et une partie B contenant l'iso-
cyanate. Le MDI pur, composé à 98 %
d'isomère 4,4'-MDI (MDI monomère),
est un produit solide conditionné sous
forme de poudre ou de pastilles dont
la conservation et la manipulation sont
délicates. Pour ces raisons, et égale-
ment pour permettre un meilleur con-
trôle des réactions de polymérisation,
les industriels préfèrent utiliser du MDI
polymérique (mélange de MDI mono-
mère et d'oligomère (oligoisocyanates)
où le MDI monomère reste majoritaire
et pour des applications plus spécifi-
ques, d'autres mélanges appelés plus
communément MDI prépolymères où
le taux de MDI monomère est réduit à
quelques pour cent.

Par la suite, l'acronyme « MDI »
sera utilisé pour désigner ces différentes
formes de MDI et MDI monomère pour
le 4,4'-MDI, lorsque la distinction sera
nécessaire. La notion de MDI « généri-
que » (CAS n° 26447-40-5) a d'ailleurs
été introduite pour désigner de manière
non spécifique tout isomère de MDI
isolé ou en mélanges d'isomères en pro-
portions quelconques, à l'état monomère
ou d'oligomères.

L'opération de mélange isocyanate-
polyols est plus ou moins mécanisée et
la polymérisation, réalisée à chaud ou
à froid, s'effectue soit dans des moules
hermétiquement clos (procédé fermé),
soit à l'air libre (procédé ouvert) [46].
Le mélange peut ensuite être coulé ou
pulvérisé sur différents supports. Deux
entreprises visitées, fabriquant ou con-
ditionnant des prépolymères à base de
MDI, ne rentrent cependant pas dans
ces classifications.

En bout de chaîne, les pièces de rési-
ne polyuréthanne refroidies sont trans-
férées dans des ateliers de finition, où
elles subissent différentes opérations,
tels l'ébarbage, le ponçage, le polissage...
avant leur conditionnement.

Les résines polyuréthannes sont uti-
lisées dans de nombreuses applications
industrielles et parmi les 19 entreprises
visitées, on peut citer : l'isolation thermi-
que de parois et de tuyaux métalliques,
la literie, les fournitures automobiles,
l'emballage, les pièces techniques, la
sérigraphie, les revêtements de sol, les
adhésifs et la consolidation de galeries
minières.

Cent soixante neuf salariés ont fait
l'objet de prélèvements urinaires. Lorsque
cela était possible, les prélèvements uri-
naires ont été réalisés sur des périodes
de plusieurs jours de travail consécutifs,
pour rendre au mieux compte des condi-
tions de travail habituelles.

Chaque soir, une fiche de poste,
remplie avec l'intéressé, relatait l'activité
de la journée en précisant s'il y avait eu
port ou non de protections individuelles
lors des opérations jugées polluantes.
Les contaminations cutanées visibles ou
avérées étaient également renseignées.

Selon leur activité et leur niveau
d'exposition potentielle au MDI mono-
mère, les salariés ont été classés a priori
comme fortement, moyennement ou fai-
blement exposés. Les opérateurs les plus
exposés (poste de travail I) étaient poten-
tiellement en contact direct avec la partie
« durcisseur » de la résine contenant le
MDI monomère (les mélangeurs, le per-
sonnel de laboratoire, les applicateurs par
pulvérisation). Les opérateurs qui avaient
signalé dans leur questionnaire des con-
tacts cutanés, accidentels ou non, avec
la résine ont également été classés dans
cette catégorie de poste de travail.

Les opérateurs moyennement expo-
sés (poste de travail II) étaient plus spé-
cifiquement exposés à la résine en cours
de polymérisation (les mouleurs, les
applicateurs, les aides au pistolage...).

Enfin, les opérateurs classés comme
faiblement exposés (poste de travail III)
travaillaient sur le produit fini (résine
polymérisée), lors d'opérations de pon-
çage, d'ébarbage, de découpage... Le per-
sonnel d'encadrement amené à séjour-
ner dans les ateliers sans protection
particulière a été également classé dans
cette catégorie.

Les urines de 120 témoins, non pro-
fessionnellement exposés au MDI et/ou
à la MDA (métabolite urinaire du MDI),
ont été recueillies parmi le personnel
INRS mais aussi parmi le personnel
administratif d'autres entreprises.

PRÉLÈVEMENTS URINAIRES

Les salariés, potentiellement expo-
sés au MDI, se soumettaient à un recueil
urinaire quotidien en fin de journée de
travail ; mais également, pour les opé-
rateurs de 13 entreprises visitées, à un
recueil en début de poste avant la repri-
se du travail le lendemain matin. Les échantillons étaient recueillis dans des flacons en polyéthylène haute densité de 100 ml contenant 1 gramme d'acide sulfamique (solide à température ambiante) et congelés sur place (-18°C). La génélation des urines n'est pas obligatoire car la présence d'acide au moment du recueil stabilise la MDA et ses métabolites acétylés, permettant l'envoi des urines à température ambiante au laboratoire d'analyse.

## DOSAGE URINAIRE DE LA MDA TOTALE

Le protocole analytique utilisé, avec cependant quelques modifications, est celui de la méthode mise au point et utilisée par l'INRS pour évaluer les expositions professionnelles à la MDA dans les secteurs industriels où elle est utilisée, comme agent de réticulation pour la mise en œuvre de résines époxydiques et de mousses polyuréthannes rigides, ou comme intermédiaire de synthèse dans la préparation de résines polyamide-imide, polyester-imide et bismaléimide [44].

Les différentes étapes de ce protocole sont résumées dans l'Annexe.

Les principales modifications sont les suivantes :

- la durée de l'hydrolyse basique de l'échantillon urinaire, qui permet de libérer tous les métabolites de la MDA (acétylés, glucuroconjugés et autres) pour aboutir à la MDA urinaire totale, passe de 1 heure à 24 heures ;

- avec les nouvelles colonnes Extrelut® NT20, le volume de diéthyl éther passe de 50 à 40 ml ;

- l'utilisation d'un four colonne permet de stabiliser le temps de rétention de la MDA mais aussi d'améliorer sa séparation vis-à-vis d'interférents potentiels présents dans l'urine.

Les valeurs de MDA urinaire totale sont exprimées en microgrammes par litre (µg/l).

## DOSAGE DE LA CRÉATININE

Les déterminations ont été effectuées selon la méthode de Jaffé [47]. Les valeurs de MDA totale sont aussi exprimées après correction par la créatinine, pour tenir compte de la diurèse mais, également, par souci de comparaison avec d'autres travaux publiés.

## ANALYSES STATISTIQUES

La distribution des concentrations de MDA mesurées dans les urines des salariés ne suivant pas une loi normale, les différences entre les populations ont été mises en évidence par les tests non paramétriques de Mann-Whitney et de Kruskal-Wallis (logiciel Statgraphics®) pour comparer respectivement deux ou plusieurs groupes d'exposition.

Les données provenant d'un même individu pendant la semaine de travail sont considérées comme indépendantes en raison de la variabilité des expositions plus déterminante que le facteur individuel.

Les valeurs de MDA urinaire inférieures à la limite de détection (0,10 µg/l) ont été prises en compte pour le traitement statistique en divisant cette limite par deux [48, 49] et les différences considérées comme significatives au niveau de confiance de 95 % (P < 0,05).

# RÉSULTATS ET DISCUSSION

Les taux de MDI monomère (4,4'-MDI) utilisées par les entreprises suives, dans leurs différentes formes commerciales, ont été évalués à l'INRS et variaient de 1 à 70 %, avec une valeur moyenne de l'ordre de 40 %. Seules quatre entreprises manipulaient des durcisseurs avec des taux de MDI monomère inférieurs à 30 % et une entreprise utilisait du MDI pur (98 % de 4,4'-MDI).

Les résultats, sont consignés dans les tableaux. 822 analyses urinaires de MDA ont été réalisées (169 opérateurs potentiellement exposés et 120 témoins), avec pour les exposés, respectivement 278 et 424 analyses de début et fin de poste (cf. Tableau I).

Dans les 13 entreprises visitées, où des recueils urinaires ont pu être réalisés en début et fin de poste, les niveaux en MDA excrétés en fin de poste étaient significativement plus élevés que ceux mesurés dans les urines de début de poste (P < 0,01). En conséquence, les résultats présentés selon le type de procédé de fabrication, le taux d'automatisation du procédé et les catégories

de postes de travail ont été obtenus uniquement avec les analyses des urines de fin de poste (cf. Tableaux II, III et IV).

Cependant, l'analyse des urines en début de poste suivant (soit après 16 heures sans exposition professionnelle) peut s'avérer informative et attester d'expositions significatives, la veille, en toute fin de poste. Ainsi, dans 20 % des analyses de début de poste, les niveaux excrétés sont plus élevés que ceux mesurés dans les urines de fin de poste correspondant. Avec une moyenne arithmétique de 0,70 µg/l, ils se distinguent également significativement de ceux mesurés chez les témoins (P < 0,05), où le bruit de fond environnemental moyen est de l'ordre de 0,14 µg/l. La présence de MDA dans la miction de ces opérateurs avant la prise du poste suivant peut également attester d'une vitesse d'élimination plus lente chez ces derniers. Cependant, nous n'avons pas observé d'accumulation de MDA en fin de semaine, pas plus que chez deux opérateurs que nous avions suivi sur deux jours de travail consécutifs avec recueil de toutes leurs mictions sur 48 heures [50].

La correction par la créatinine n'apporte pas d'information supplémentaire sur les résultats, dans le sens où les classements par type de population ne changent pas, les tests statistiques appliqués gardant leur même niveau de significativité. En conséquence et par souci de simplification, les valeurs corrigées ne sont mentionnées que dans les tableaux et, exceptionnellement, dans le texte, si la comparaison avec d'autres résultats déjà publiés l'exige.

## LES EXPOSITIONS PROFESSIONNELLES AU MDI SONT SIGNIFICATIVES

L'analyse des 424 urines montre que les excrétions en MDA urinaire de fin de poste des salariés, tous postes de travail confondus, sont significativement plus élevées (P < 0,01) que celles mesurées chez les témoins, avec des médianes respectives de 0,39 et 0,05 µg/l (cf. Tableau I). La MDA urinaire était détectable dans 73 % des échantillons recueillis, avec 30 % de valeurs supérieures à 1 µg/l. Chez les témoins, les proportions correspondantes étaient respectivement de 32 et 0 %.
## TABLEAU I

### MDA urinaire chez les travailleurs et les témoins
Urinary MDA in workers and controls

<table><thead><tr><th rowspan="3"></th><th colspan="3">MDA urinaire µg/l (µg/g creatinine)</th></tr><tr><th colspan="2">Exposés</th><th rowspan="2">Témoins</th></tr><tr><th>Début de poste</th><th>Fin de poste</th></tr></thead><tbody><tr><th>Nombre d'analyses</th><td>278</td><td>424</td><td>120</td></tr><tr><th>Moyenne arithmétique</th><td>0,70 (0,55)</td><td>1,25 (1,16)</td><td>0,14 (0,11)</td></tr><tr><th>Médiane</th><td>0,30* (0,26)*</td><td>0,39** (0,34)**</td><td>0,05 (0,05)</td></tr><tr><th>Étendue</th><td>&lt; 0,10 - 13,30<br>(&lt; 0,10 - 12,00)</td><td>&lt; 0,10 - 23,60<br>(&lt; 0,10 - 33,70)</td><td>&lt; 0,10 - 0,87<br>(&lt; 0,10 - 0,88)</td></tr></tbody></table>

## TABLEAU III

### Résultats selon le degré d'automatisation du mélange polyols-MDI
Results according to automation level of mixing operation (polyols-MDI)

<table><thead><tr><th rowspan="2">Automatisation du mélange</th><th colspan="2">MDA urinaire µg/l (µg/g creatinine)</th></tr><tr><th>Haute</th><th>Faible</th></tr></thead><tbody><tr><th>Nombre d'entreprises</th><td>5</td><td>14</td></tr><tr><th>Nombre d'opérateurs</th><td>16</td><td>45</td></tr><tr><th>Nombre d'analyses</th><td>105</td><td>114</td></tr><tr><th>Moyenne arithmétique</th><td>0,57 (0,57)</td><td>3,60 (3,22)</td></tr><tr><th>Médiane</th><td>0,20 (0,29)</td><td>1,38*(1,20)*</td></tr><tr><th>Étendue</th><td>&lt; 0,10 - 8,70<br>(&lt; 0,10 - 8,88)</td><td>&lt; 0,10 - 23,60<br>(&lt; 0,10 - 33,71)</td></tr></tbody></table>

L'augmentation, en fin de poste, des concentrations en MDA urinaire, à des niveaux significativement plus élevés que ceux mesurés dans la population générale, atteste d'une exposition avérée au MDI chez les salariés des entreprises fabriquant des résines polyuréthannes.

La MDA urinaire n'étant pas un traceur spécifique de l'exposition au MDI, les concentrations urinaires mesurés chez les témoins peuvent s'expliquer par des expositions au MDI et/ou à la MDA lors de l'utilisation domestique de mousses, de laques, de vernis... contenant des traces de ces deux substances.

L'exposition *via* des aliments ou des boissons qui ont été en contact avec ces substances ne doit pas être exclue.

Pour les salariés exposés, les niveaux mesurés sont plus spécifiquement le reflet d'une exposition au seul MDI pendant les 8 heures de travail (pas d'utilisation concomitante de MDA dans les entreprises visitées), surtout en fin de poste où la part du bruit de fond environnemental est, *a priori*, négligeable.

Globalement, les résultats de cette étude sont en accord avec ceux publiées dans la littérature et, en particulier avec ceux de Rosenberg et coll. [39] qui, sur 69 analyses urinaires provenant de 21 opérateurs travaillant dans 5 entreprises différentes, obtiennent une valeur moyenne en MDA urinaire de 1,0 µg/l.

En revanche, les concentrations urinaires maximales mentionnées dans les autres études de terrain publiées s'échelonnent de 2,00 à 9,40 µg/l, valeurs assez éloignées de celle mesurée à 23,60 µg/l dans notre étude.

## TABLEAU II

### Résultats selon le procédé de fabrication
Results according to type of process

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">MDA urinaire µg/l (µg/g creatinine)</th></tr><tr><th>Fermé</th><th>Ouvert</th><th>Autre</th></tr></thead><tbody><tr><th>Nombre d'entreprises</th><td>6</td><td>11</td><td>2</td></tr><tr><th>Nombre d'analyses</th><td>177</td><td>187</td><td>60</td></tr><tr><th>Moyenne arithmétique</th><td>1,55 (1,40)</td><td>1,10 (1,07)</td><td>0,83 (0,71)</td></tr><tr><th>Médiane</th><td>0,50* (0,43)*</td><td>0,36 (0,24)</td><td>0,28 (0,32)</td></tr><tr><th>Étendue</th><td>&lt; 0,10 - 23,60<br>(&lt; 0,10 - 33,70)</td><td>&lt; 0,10 - 15,60<br>(&lt; 0,10 - 25,40)</td><td>&lt; 0,10 - 9,75<br>(&lt; 0,10 - 8,80)</td></tr></tbody></table>

## TABLEAU IV

### Résultats selon le poste de travail
Results according to job category

<table><thead><tr><th rowspan="2">Poste de travail</th><th colspan="3">MDA urinaire µg/l (µg/g creatinine)</th></tr><tr><th>I</th><th>II</th><th>III</th></tr></thead><tbody><tr><th>Nombre d'opérateurs</th><td>61</td><td>51</td><td>57</td></tr><tr><th>Nombre d'analyses</th><td>140</td><td>125</td><td>159</td></tr><tr><th>Moyenne arithmétique</th><td>2,64 (2,55)</td><td>0,71 (0,63)</td><td>0,45 (0,34)</td></tr><tr><th>Médiane</th><td>0,70*° (0,64)*°</td><td>0,46* (0,35)*</td><td>0,18 (0,16)</td></tr><tr><th>Étendue</th><td>&lt; 0,10 - 23,60<br>(&lt; 0,10 - 33,70)</td><td>&lt; 0,10 - 4,40<br>(&lt; 0,10 - 8,80)</td><td>&lt; 0,10 - 5,60<br>(&lt; 0,10 - 2,70)</td></tr><tr><th>90ème Quantile</th><td>6,80 (4,70)</td><td>1,60 (1,30)</td><td>1,20 (0,90)</td></tr></tbody></table>

<footnote>* et ** différences significatives entre exposés et témoins
(*P < 0,05 ; **P < 0,01).</footnote>

<footnote>* différence significative entre haut et faible degré d'automatisation
(P < 0,01)</footnote>

<footnote>* différence significative entre procédé fermé et ouvert (P = 0,02).</footnote>

<footnote>* différence significative entre le poste de travail III et les deux autres
(P < 0,01)</footnote>

<footnote>° différence significative entre I et II (P < 0,01)</footnote>
La stabilisation ou non de la MDA et de ses métabolites au moment de recueil urinaire par l'ajout d'acide, mais également le type d'acide utilisé contribuent probablement à expliquer ces différences [51]. A noter, cependant, qu'une étude de terrain récente [40] fait état, chez un fondeur, d'une excrétion urinaire en MDA de 12,64 µmol/mol de créatinine, soit environ 32,40 µg/l, valeur plus proche de celle que nous avons mesurée dans notre étude. Des valeurs maximales à 38 et 78 µg/l ont également été observées dans des entreprises suédoises [52].

## LES SALARIÉS SONT DIFFÉREMMENT EXPOSÉS AU MDI SELON LE TYPE DE PROCÉDÉ DE FABRICATION

Sur le terrain, le nombre d'échantillons urinaires recueillis sur un ou plusieurs jours de travail dans une entreprise donnée est un paramètre difficile à maîtriser. Il dépend de la taille de l'entreprise et de ses exigences, du nombre de salariés désireux de participer à la campagne et des désistements ou empêchements de dernière heure. Ainsi, le nombre de recueils urinaires par entreprise est très hétérogène, allant pour cette étude de 6 à 52 analyses. En conséquence, la présentation sous forme d'histogrammes des résultats par entreprise n'est pas très informative, d'autant que les matières premières (% de MDI monomère dans le durcisseur), la mise en œuvre des résines et les pratiques de travail se révèlent également très variées.

En revanche, l'examen statistique des résultats relatifs aux trois grandes catégories de procédés de fabrication permet de différencier les entreprises qui travaillent en système clos (procédé fermé) de celles qui travaillent en système ouvert (procédé ouvert), avec cependant une différence peu marquée, même si elle est significative (test de Mann-Whitney, p = 0,02). Curieusement, les niveaux excrétés en MDA urinaire chez les salariés des 6 entreprises travaillant en système clos sont plus élevés que ceux observés chez les salariés des 11 entreprises travaillant en système ouvert, avec des médianes respectives de 0,50 et 0,36 µg/l. Ce résultat, également observé dans une étude récente [40], peut s'expliquer par le fait que les entreprises qui travaillent en système « fermé » manipulent souvent des quantités de MDI beaucoup plus importantes. Une impression de sécurité pourrait également rendre les opérateurs moins vigilants sur les règles à respecter.

La représentation graphique (cf. Figure 1) des logarithmes des moyennes des concentrations en MDA urinaire pour chaque entreprise, encadrées par leurs barres d'erreur à 95 % indiquant la différence minimale significative (test de Fisher LSD, Least Significant Difference), permet de visualiser, dans chaque catégorie (Tableau II), les entreprises qui diffèrent significativement des autres. L'utilisation de l'échelle logarithmique est nécessaire en raison d'une distribution des données proche d'une loi log-normale.

Ainsi, exceptées les entreprises B et D pour les procédés fermés et les entreprises H, M et O pour les procédés ouverts, les moyennes globales respectives passent à 0,58 et 1,16 µg/l, valeurs plus conformes au ressenti sur le terrain.

Tous procédés confondus, trois entreprises se différencient des autres par des niveaux d'excration moyens plus élevés (B, D et H) et constituent des cas à part.

La fonderie visitée fait partie de ces entreprises, puisque la température élevée (160°C) atteinte par les moules de sable lié par de la résine polyuréthanne augmente le risque d'inhalation de MDI sous forme de vapeurs ou d'aérosols, mais aussi de MDA, produit de dégration à chaud de la résine [40]. Pour les deux autres entreprises, les niveaux moyens excrétés, plus élevés, s'expliquent, soit par des contacts cutanés répétés avec la résine MDI chez les opérateurs suivis, soit par des expositions ponctuelles élevées lors d'opérations spécifiques.

## L'AUTOMATISATION DU MÉLANGE ISOCYANATE-POLYOLS CONTRIBUE À FAIRE BAISSER LES EXPOSITIONS

Dans les entreprises suivies, l'opération potentiellement exposante, qui consiste à mélanger la partie « isocyanate » avec la partie « polyols », permet de distinguer deux grandes catégories d'entreprises en fonction de l'automatisation ou non de cette opération.

### FIGURE I

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Représentations graphiques des différences d'exposition en fonction des entreprises

Graphical representations of exposure differences according to factory</figcaption></figure>
Une analyse de la variance fait appa-
raître que les entreprises qui n'ont pas
automatisé le mélange isocyanate-poly-
ols différent très significativement des
autres, avec sur l'ensemble des postes de
travail suivis un niveau moyen des excré-
tions en MDA urinaire de 3,60 µg/l, soit
environ 6 fois supérieur à la moyenne
arithmétique obtenue dans les entrepri-
ses automatisées (cf. Tableau III).

L'automatisation du mélange per-
met de limiter au maximum les expo-
sitions avec le prépolymère contenant
le MDI monomère et, plus particulière-
ment, les contacts cutanés, le mélange
étant le plus souvent réalisé à des tem-
pératures relativement basses pour ne
pas générer de vapeurs et/ou d'aérosols
de MDI.

L'analyse par entreprise montre éga-
lement que ce sont les plus grandes d'en-
tre elles avec des volumes de production
élevés et souvent une meilleure prise
en charge et gestion du risque chimi-
que, qui ont automatisé leur procédé
de fabrication. De plus, le mélange iso-
cyanate-polyols est généralement réalisé
par un seul opérateur pour alimenter
plusieurs machines de coulée et, sou-
vent, dans une partie de l'atelier éloi-
gnée des opérations de moulage. Cette
organisation du travail, en limitant le
nombre d'opérateurs sur les postes de
travail potentiellement à risque, peut
egalement expliquer un niveau global
d'exposition au MDI plus faible.

LES SALARIÉS SONT DIFFÉREMMENT
EXPOSÉS AU MDI SELON LEUR POSTE
DE TRAVAIL

L'examen des résultats relatifs aux
trois grandes catégories de poste de
travail (comme définies précédemment)
confirme que les plus fortes excrétions
en MDA urinaire sont mesurées chez
les salariés a priori les plus exposés au
MDI monomère, c'est-à-dire les salariés
qui préparent le mélange isocyanate-
polyols. Avec une moyenne arithmé-
tique de 2,64 µg/l, cette catégorie se
différencie statistiquement des catégo-
ries de poste II et III, avec des moyennes
respectives de 0,71 µg/l et 0,45 µg/l.

Les postes de travail classés en caté-
gorie II, qui concernent principalement
des opérateurs potentiellement exposés
à la résine en cours de polymérisation,
sont également significativement plus
exposés que les opérateurs appartenant

à la catégorie III, exposés au produit
fini, c'est-à-dire à la résine polymérisée
(cf. Tableau IV).

Pour les opérateurs de la catégorie
III, si le niveau moyen excrété en fin de
poste est faible, il est cependant signifi-
cativement plus élevé que celui mesuré
dans une population de personnes non
professionnellement exposées et tradui-
sant le bruit de fond environnemental
(p < 0,05 ; test de Mann-Whitney). Cela
confirme que le protocole de traitement
et d'analyse des urines mis au point
est suffisamment sensible pour évaluer
toutes les expositions professionnelles
au MDI. Des opérations de ponçage ou
de découpe à chaud de pièces de résine
fraîchement polymérisée réalisées, sans
système d'aspiration des poussières ou
des aérosols, pourraient expliquer les
niveaux mesurés chez certains opéra-
teurs de la catégorie III. Cependant,
pour la majorité d'entre eux, le risque
d'exposition au MDI est essentiellement
de type cutané ; lors de la manipulation
du produit fini sans protection, le port
de gants n'étant pas jugé nécessaire.

À noter, que les différences statisti-
ques entre les trois catégories de poste
de travail pour l'ensemble des entrepri-
ses sont également observées au niveau
de chacune d'entre elles.

LA PÉNÉTRATION CUTANÉE EST-ELLE
PRÉPONDÉRANTE ?

Le MDI étant un isocyanate peu
volatil, il est donc peu probable de le
retrouver sous forme de vapeur dans les
environnements professionnels visités
sauf, éventuellement, dans les fonderies
où les moules de résine et de sable sont
portés à 160°C. Si le MDI est présent
dans l'atmosphère, il ne peut donc l'être
que sous forme d'aérosols [2], dont la
composition évolue plus ou moins rapi-
dement dans le temps jusqu'à polyméri-
sation complète.

Aujourd'hui, le fait qu'aucune étude
de terrain ne mette en évidence de lien
fort entre MDI atmosphérique et MDA
urinaire excrétée [23, 38, 52, 53], plaide
en faveur d'une exposition profession-
nelle par voie cutanée significative, voire
prépondérante.

Sur le terrain, à la lecture du ques-
tionnaire associé à chaque recueil uri-
naire, le signalement de contacts cuta-
nés avec le prépolymère MDI ou la

résine en cours de polymérisation (suite
à des manipulations sans gants ou des
incidents de fabrication) ont toujours
entraîné, en fin de poste, des excrétions
en MDA urinaire sensiblement plus
élevées. Creely et coll. [40] montrent que
des contaminations dermiques entraî-
nent chez les opérateurs concernés des
excrétions urinaires plus de deux fois
plus élevées que celles mesurées chez
les opérateurs qui ne s'estimaient pas
sujets à de telles contaminations.

Dans l'entreprise visitée (H), nous
avons pu suivre 7 salariés qui devaient
régulièrement tester, sans gant pour des
raisons d'efficacité, le degré de polymé-
risation de la résine fabriquée. Ces expo-
sitions cutanées répétées ont entraîné
chez ces salariés des excrétions en MDA
urinaire relativement élevées, avec une
moyenne globale de 8,18 µg/l statis-
tiquement très différente des autres
entreprises visitées (cf. Figure 1).

De plus, l'excration urinaire maxi-
male, mesurée à 23,60 µg/l en fin de
poste, chez un laborantin travaillant
avec des solutions de MDI, peut s'ex-
pliquer par l'utilisation de chlorure de
méthylène lors d'opérations de nettoya-
ge sans protection adéquate. Ce dernier
facilite très certainement la pénétration
du MDI dans l'organisme.

Une équipe allemande [54] a mon-
tré que des volontaires, exposés à des
concentrations de MDI atmosphérique
de 3,9 µg/m³, excrétaient en moyenne
1,1 µg/l de MDA dans leurs urines. Par
extrapolation de ces données, l'excration
en MDA urinaire maximale mesurée à
23,60 µg/l correspondrait à une expo-
sition au MDI atmosphérique de l'ordre
de 85 µg/m³, valeur proche de la VME
française à 100 µg/m³ et improbable
pour le poste concerné.

Les niveaux excrétés par deux opé-
rateurs, appliquant par pulvérisation
une résine polyuréthanne sur le sol
d'un entrepôt industriel, attestent d'ex-
positions cutanées prépondérantes. En
effet, malgré le port de combinaisons à
capuche, de gants et d'appareils respira-
toires, des excrétions en MDA urinaire
de l'ordre de 8,74 µg/l ont été mesurées
en fin de poste chez l'opérateur qui
utilisait le pistolet, attestant d'exposi-
tions au MDI significatives. Dans le
cas présent, comme l'appareil respira-
toire utilisé était adapté à la situation
rendant l'inhalation et/ou l'ingestion
d'aérosols de MDI impossible, seules
des contaminations par voie cutanée peuvent expliquer de telles excrétions. Lors des pauses, le relâchement de la vigilance et le non-respect des règles de sécurité au moment de retirer les protections souillées par la résine peuvent expliquer ces expositions.

## PROPOSITION D'UNE VALEUR-GUIDE BIOLOGIQUE FRANÇAISE

Actuellement, il existe deux valeurs-guides biologiques basées sur l'analyse de MDA totale obtenue sur des urines de fin de poste hydrolysées :

- ☐ celle de la Technische Regeln für Gefahrstoffe (TRGS) 903 allemande, fixée à 10 µg de MDA par gramme de créatinine et obtenue, après extrapolation, chez des volontaires exposés à des concentrations contrôlées de MDI atmosphérique. Récemment pour le MDI, un nouveau concept de valeur-guide biologique BGW (Biologische Grenzwerte) a été introduit avec une valeur fixée à 10 µg/l [21] ;

- ☐ celle, plus récente, proposée par le Working group on Action To control CChemicals britannique (WATCH) et fixée à 1 µmol/mol de créatinine, soit approximativement 2,60 µg/l [55].

Dans ce contexte, et avec les données que nous avons collectées, il nous apparaît important et nécessaire de proposer aujourd'hui une valeur guide biologique française :

- ☐ pour faciliter la tâche des hygiénistes du travail dans l'interprétation des résultats de leurs analyses urinaires ;

- ☐ pour aider les entreprises à améliorer leurs procédés de fabrication et changer, si nécessaire, leur organisation et leurs habitudes de travail.

Une valeur-guide biologique fixée à 7 µg/l (5 µg/g de créatinine), basée sur l'analyse des urines de fin de poste selon la procédure décrite en Annexe, nous paraît raisonnable et technique-ment possible à atteindre pour toutes les entreprises visitées et, tout particulièrement, pour les opérateurs les plus exposés (catégorie I). Cette valeur arbi-traire représente le 90ème percentile des 140 analyses réalisées chez les 61 opérateurs les plus exposés

Sur l'ensemble des analyses urinaires effectuées (n = 424), tous postes confondus, 4 % des excrétions en MDA

urinaire sont supérieures à cette valeur-guide de 7 µg/l. Cette proposition passe à 12 % pour les opérateurs de la seule catégorie I.

## CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS

Le suivi biologique des salariés réalisé dans 19 entreprises françaises mettant en œuvre des résines polyuréthanes à base de MDI permet de mettre clairement en évidence des expositions professionnelles à cet isocyanate, confirmant la pertinence du dosage de la MDA urinaire comme indicateur d'exposition.

### Les résultats

- ☐ montrent des excrétions de MDA plus importantes en fin de poste qu'en début de poste et significativement plus élevées que celles mesurées chez des témoins,

- ☐ permettent de différencier les entreprises qui, dans leur procédé de fabrication, ont automatisé le mélange isocyanate-polyols,

- ☐ permettent de distinguer trois grandes catégories de poste de travail en fonction du risque d'exposition potentiel au MDI monomère,

- ☐ confirment l'hypothèse d'une contamination prioritairement par voie cutanée, les excrétions les plus élevées étant mesurées dans les urines de fin de poste des opérateurs soumis, accidentellement ou non, à des contacts cutanés avec la résine.

Dans la mesure où la MDA est un cancérogène potentiel chez l'homme, tous les efforts doivent être faits pour aboutir aux concentrations urinaires les plus faibles possibles. Compte tenu des méthodes analytiques, mais aussi des capacités techniques actuelles, la valeur-guide de 7 µg/l de MDA, à ne pas dépasser dans les urines de fin de poste, nous paraît applicable sans trop de difficultés dans toutes les entreprises françaises mettant en œuvre des résines polyuréthanes à base de MDI.

Cette valeur-guide technique devrait surtout être respectée pour les opérateurs occupant les postes de travail les plus exposés (catégorie I).

Elle pourrait être abaissée pour le suivi des autres postes de travail. Ainsi, la valeur-guide à 2,60 µg/l préconisée par le Health and Safety Executive pourrait être, à terme, le critère de référence pour toutes les catégories de personnel. A noter que cette norme britannique correspond exactement au 90ème percentile des 424 valeurs de MDA mesurées dans les urines de fin de poste des 169 opérateurs suivis dans cette étude, tous postes confondus.

Reçu le : 15/03/2007

Accepté le : 27/07/2007

### Les auteurs remercient :

- les entreprises et les salariés qui ont collaboré à cette étude, ainsi que la Médecine du travail et les Caisses régionales d'assurance maladie concernées ;

- les laboratoires Chimie analytique et organique et Surveillance biologique de l'exposition aux substances inorganiques de l'INRS pour, respectivement, les dosages du taux de MDI monomère dans les produits commerciaux et de la créatinine.
# ANNEXE

## DÉTERMINATION DE LA 4,4'-MÉTHYLÈNEDIANILINE (MDA) URINAIRE.

Cette méthode a été décrite plus succinctement dans le cadre de la surveillance biologique de salariés exposés à la MDA [44]. Après quelques modifications, elle peut être utilisée pour effectuer le suivi de salariés exposés au MDI, moyennant une étape d'hydrolyse plus longue (24 heures au lieu d'une heure) et l'utilisation de la détection électrochimique (EC). La détection ultra-violette (UV) qui peut être mise en série, en amont de la détection EC, n'est pas assez sensible (limite de détection de 1,0 µg/l) pour distinguer les expositions professionnelles, mesurées aujourd'hui dans ces filières industrielles, du bruit de fond environnemental.

### Hydrolyse de l'urine

Elle est réalisée sur une partie aliquote du recueil urinaire (20 ml), préalablement décongelée et placée dans un tube de culture à col fileté en verre borosilicaté de 40 ml avec bouchon et joint caoutchouc/PTFE, en milieu forte-ment basique par l'ajout de 4 grammes de NaOH en pastilles et portée, après dissolution complète de la soude sur un agitateur vortex, à 80°C au bain-marie pendant 24 heures.

### Extraction urinaire

Elle est réalisée par deux extractions solide-liquide successives : la première sur colonne Extrelut® NT20 (Merck) et la seconde sur colonne d'extraction en phase solide (SPE) de chez Baker, échangeuse de cations faible, BAKERBOND Carboxylic Acid (CBA) de 500 mg.

### Extraction sur colonne Extrelut®

Après 24 heures d'hydrolyse et remise à température ambiante, les 20 ml d'urine sont déposés sur la colonne Extrelut® et 15 à 20 minutes sont nécessaires pour imprégner la quasi-totalité de la phase de la colonne. L'élution est réalisée avec 40 ml de diéthyl éther Normapur (Prolabo) et l'éléat organique, environ 30 ml, est recueilli dans un tube à essai de verre borosilicaté (20 x 150 mm). Le tube à essai est alors placé dans un évaporateur à effet vortex Turbovap LV (Zymark) pour une

évaporation à sec de la phase éthérée sous flux d'azote. Avec une température du bain-marie réglée à 30°C, cette opération dure environ 30 minutes.

### Extraction sur colonne échangeuse de cations faible

Le résidu sec est repris avec 15 ml d'eau déionisée MilliQ® (Millipore) et déposé sur la colonne à l'aide d'un résevoir adapté. La colonne est préalablement conditionnée avec 3 ml de méthanol (environ 1 volume de la colonne) suivis de 3 ml d'eau déionisée. Le dépôt est réalisé sous vide sur une unité d'extraction permettant de traiter 20 extraits urinaires simultanément. Pour une bonne reproductibilité, la phase de la colonne ne doit pas sécher et la percolation doit se faire au goutte à goutte (environ 1 goutte à la seconde).

La colonne chargée est alors lavée avec 3 ml de méthanol, suivis de 3 ml d'eau déionisée.

1 ml d'un mélange acide chlorhydrique 0,02 M / méthanol (50/50) permet de décrocher la MDA fixée sur la phase CBA et l'éluat est recueilli dans une fiole jaugée de 2 ml complété avec de l'eau déionisée (ce qui correspond à une concentration par 10 de l'échantillon urinaire de départ).

L'extrait aqueux est alors transféré dans un flacon ambré de 4 ml serti avec un bouchon muni d'un septum silicone/PTFE et conservé à 4°C jusqu'à l'analyse.

### Analyse par CLHP (Chromatographie Liquide Haute performance)

Le dosage de la MDA est réalisé par CLHP avec le matériel suivant :

* une pompe haute pression Shimadzu LC-10AS®,

* un four colonne Shimadzu CTO-10AS® réglé à 40°C,

* un passeur d'échantillons automatique Waters Wisp 717+®,

* un détecteur électrochimique Waters 460®, utilisé en mode oxydation à 0,9 V avec une électrode de référence Ag/AgCl,

* une station d'acquisition et de traitement équipée du logiciel Millennium 32® (Waters).

L'analyse est réalisée en mode isocratique avec les conditions opératoires suivantes :

* volume injecté : 20 µl,

* durée d'analyse : 20 min,

* colonne analytique : Merck®, Lichrocart 250 x 4 mm, Lichrospher®, 5 µm, 60 RP Select B C8,

* éluant : mélange binaire d'acétonitrile et d'eau déionisée (30/70 en volume), additionnée à 0,4 %, d'une solution aqueuse d'acétate de sodium ajustée à pH 4,6 avec de l'acide acétique,

* débit : 1 ml/min,

* détection EC, potentiel d'oxydation à 0,90 V, électrode de référence Ag/AgCl.

Les déterminations de concentration sont effectuées par étalonnage externe. La gamme d'étalonnage est réalisée avec des urines de personnes non exposées au MDI et/ou à la MDA, surchargées avec de la MDA pour obtenir une gamme urinaire allant de 5 à 500 µg/l et soumises au protocole d'extraction et de concentration décrit ci-dessus. Pour être dans les mêmes conditions que les urines recueillies en entreprise, l'urine servant à construire la gamme est, préalablement aux ajouts de MDA, acidifiée à 10 g/l avec de l'acide sulfamique.

La méthode est linéaire dans la gamme de concentration étudiée, avec un rendement d'extraction (par rapport à une gamme d'étalonnage aqueuse non soumise à la procédure d'extraction) de l'ordre de 80 % et une limite de détection de 0,10 µg/l dans la matrice urinaire.
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