<table><caption>Tableau 1. Caractéristiques démogénétiques des 16 populations expérimentales de *L. stagnalis*.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Populations</th><th>N<sub>0</sub></th><th rowspan="2">Nombre de lignées</th><th rowspan="2">Effectif efficace initial<sup>a</sup></th></tr><tr><th>Nombre de fondateurs</th></tr></thead><tbody><tr><td>B1 à B4</td><td>80</td><td>80</td><td>80</td></tr><tr><td>B5 à B8</td><td>80</td><td>20</td><td>52.67</td></tr><tr><td>A1 à A4</td><td>8</td><td>8</td><td>8</td></tr><tr><td>A5 à A8</td><td>8</td><td>2</td><td>4.67</td></tr></tbody></table>

Ces populations ont fait l'objet d'une étude :

- démographique : évolution des structures de taille individuelle, mesure de traits d'histoire de vie sur individus isolés au laboratoire ou encagés *in situ*. Ces données ont servi à construire un modèle de dynamique de population. La réduction de fitness et l'augmentation du risque d'extinction attendues quand $Ne_0$ diminue sont testées.

- génétique : évolution spatio-temporelle des fréquences alléliques et génotypiques à des loci microsatellites, estimation de $Ne$, sur la base de 2 ou 3 générations successives. La baisse de variabilité, l'augmentation de la différenciation génétique et la réduction de $Ne$ quand $Ne_0$ diminue sont testées.

- de biologie évolutive : évaluation de l'accumulation du fardeau délétère de mutations par dérive génétique. L'effet d'hétérosis est testé par comparaison des croisements intra- et inter-population. On s'attend à un effet d'autant plus important que $Ne_0$ est petit.

Les attendus relatifs à ces études reposent sur les effets de fondation imposés, et sur la réduction théorique de variabilité génétique neutre et sous sélection qui en résulte.

## Résultats

### Démographie, dynamique des populations

Les caractéristiques démographiques sont hétérogènes sur l'ensemble des populations, mais leur variation n'est pas corrélée à l'effectif efficace initial $Ne_0$.

Les modèles de Leslie construits sur la base des fécondités et probabilités de survie pour 7 classes d'âge (durée = 50 jours) conduisent à des taux d'accroissement très similaires entre types de populations ($N_0$ = 80 individus : $\lambda$ = 1,596, SD = 0,119 ; $N_0$ = 8 individus : $\lambda$ = 1,588, SD = 0,101) (Kruskal-Wallis test KW = 0, df = 1, P = 1). De tels taux prédisent dans tous les cas une explosion démographique rapide, et incompatible avec la réalité observée dans les mésocosmes. Cet écart est probablement lié à une surestimation de la survie à certains stades pré-adultes (survie mesurée au laboratoire, en conditions « douces ») et à l'absence de prise en compte de la densité-dépendance dans les modèles utilisés. L'analyse montre une sensibilité accrue de $\lambda$ à la survie juvénile dans toutes les populations.

Les trajectoires démographiques simulées sur 10 ans et 1000 populations, tenant compte de la variabilité inter-individuelle de fertilité et de survie précoce (logiciel RAMAS [1]) conduisent à des probabilités d'extinction similaires entre les populations initialement grandes ($N_0$ = 80 individus, p = 0,181, SD = 0,119) et petites ($N_0$ = 8 individus : p = 0,153, SD = 0,054) (KW = 0,276, df = 1, P = 0,599). En revanche, les effectifs minimaux attendus au cours des 10 ans de simulation, sont eux logiquement corrélés avec les effectifs initiaux ($N_0$ = 80 individus : $N_{min}$ = 416,3 à 1372 individus ; $N_0$ = 8 individus : $N_{min}$ = 27,2 à 110,8 individus) (KW = 11,294, df = 1, P < 0,001).

### Génétique des populations, effectifs efficaces

L'échantillonnage génotypique aux loci étudiés dans les 3 cohortes successives identifiées sur la période de suivi montre une évolution de la diversité génétique globale sans rapport net avec $Ne_0$ (Fig. 1). La tendance des populations de plus petit

<footnote><sup>a</sup>sous l'hypothèse de fratries de pleins-frères et d'absence de consanguinité initiale. Calcul de $Ne_0$ : 1/(2 · proba de croisement frère-frère · coefficient de parenté).</footnote>
$Ne_0$ (A5 à A8) à montrer une diversité plus faible n'est pas significative. Globalement, la diversité décroît légèrement au fil des générations.

Les estimations de $Ne$ basées sur la variance temporelle des fréquences alléliques (méthode de Wang & Whitlock [2]) ne montrent pas de relation claire avec $Ne_0$.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure 1.** Evolution de la diversité génétique (3 à 5 loci, étude non achevée) dans les cohortes successives étudiées (adultes) en fonction des types de populations. Barres = SE.</figcaption></figure>

La différenciation génétique des populations s'avère significative et les indices les plus élevés (indice θ ; [3]) sont obtenus pour le sous-groupe des populations de plus petit $Ne_0$ (A5 à A8). Ce résultat est en conformité avec les attendus théoriques de l'effet différenciateur de la dérive génétique (inversement proportionnel à $Ne$).

## Fardeau délétère de dérive génétique

Sous l'hypothèse d'accumulation de mutations faiblement délétères par effet de dérive et sous dominance partielle, on s'attend à observer dans les petites populations une fitness de croisement intra-population inférieure à la fitness de croisement inter-population. Cet effet d'hétérosis est significatif pour le taux d'éclosion des pontes des populations de plus petit $Ne_0$ (A5 à A8) alors qu'il ne l'est pas pour les autres types de population.

## Discussion

Les résultats de cette étude ont conduit à la validation de plusieurs hypothèses importantes relatives à la réduction de taille des populations : accumulation du fardeau délétère de dérive génétique, baisse de variabilité génétique et augmentation de la différenciation génétique des populations. Cependant, pour plusieurs indices, on observe une absence de relation entre valeurs mesurées et valeurs attendues d'après la théorie. Cet écart peut être réduit par l'amélioration des techniques (choix de marqueurs microsatellites plus variables que ceux utilisés, d'un modèle biologique plus variable, introduction de densité-dépendance dans les modèles de croissance de population, etc.). Il demeure que l'application directe de ces outils au test d'effet des contaminants sur les populations s'expose à un risque non négligeable d'interprétation biaisée, incluant potentiellement une sous-estimation des effets réels.

## Références bibliographiques

[1] Akçakaya. 2005. *RAMAS GIS: Linking Spatial Data with Population Viability Analysis (version 5.0)*. Applied Biomathematics, Setauket, New York.

[2] Wang & Whitlock, 2003. *Genetics* 163, 429-446.

[3] Weir & Cockerham, 1984. *Evolution* 38, 1358-1370.
Session 4

Altérations de la dynamique
des communautés
<figure><img src="image_47.png" /></figure>
# Sur la piste des β-ketoadipates à la recherche de marqueurs fonctionnels de la qualité microbiologique des sols : la 3,4-protocatechuate dioxygénase et la catechol 1,2-dioxygénase, deux gènes candidats ?

N. El Azhari, N. Rouard et F. Martin-Laurent

INRA, UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon Cedex

Le cycle du carbone dans le sol repose en grande partie sur la biodégradation microbienne de composés phénoliques plus ou moins complexes. Les microorganismes dégradent ces composés principalement selon la voie des β-ketoadipates qui est constituée de deux routes majeures : (i) celle empruntant la voie du protocatechuate et (ii) celle empruntant la voie du catechol reposant sur deux enzymes clefs, la 3,4-protocatechuate dioxygénase et la 1,2-catechol dioxygénase, respectivement. La voie des β-ketoadipates présente le double intérêt d'être dispersée au sein de la microflore du sol et de permettre la dégradation de composés phénoliques naturels de type lignine, mais aussi de composés phénoliques xénobiotiques tel que l'herbicide 2,4-D. Cette voie catabolique subit de nombreuses actions anthropiques dont les pratiques culturales (travail du sol, amendement organique et traitement phytosanitaire). Elle pourrait constituer un marqueur fonctionnel pertinent de la qualité microbiologique du sol, ciblant plus particulièrement des communautés microbiennes impliquées dans le cycle du carbone. Dans ce contexte, nous développons des marqueurs moléculaires et biochimiques permettant de déterminer la densité, la structure, la diversité et l'activité de populations bactériennes du sol possédant la 3,4-protocatechuate dioxygénase et la 1,2-catechol dioxygénase.

Dans le sol la voie des β-ketoadipates est la voie majeure du catabolisme des composés aromatiques naturels [1]. Cette voie joue un rôle important dans la dégradation d'une large gamme de composés phénoliques. Elle est présente dans de nombreuses bactéries éloignées phylogénétiquement. La voie des β-ketoadipates implique la mono- ou di-hydroxylation de composés aromatiques polycycliques ou homocycliques conduisant à la formation d'intermédiaires métaboliques clefs, le catéchol et le protocatechuate [2]. Ces intermédiaires sont par la suite clivés entre deux résidus hydroxyl adjacents par la catéchol 1,2-dioxygénase (1,2-CD) et la protocatechuate 3,4-dioxygénase (3,4-PCD), respectivement. Ces deux enzymes appartiennent à la super-famille des protéines de type dioxygénase C, essentielles pour (i) l'utilisation des composés aromatiques comme source de carbone et d'énergie et (ii) la transformation d'une grande variété de composés aromatiques stables tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et d'autres micropolluants organiques contaminant l'environnement (pesticides) [3]. Par conséquent, il existe un grand intérêt à étudier les communautés bactériennes possédant les gènes codant pour les enzymes clivant les intermédiaires métaboliques de la voie des β-ketoadipates parce qu'elles pourraient constituer des bioindicateurs pertinents de qualité microbiologique du sol.

Jusqu'à présent la plupart des études ont été menées sur des souches modèles ou sur des souches microbiennes cultivables isolées d'échantillons environnementaux et décrivant principalement les mécanismes responsables de l'activité de ces
enzymes [1]. Seules quelques études rapportent la caractérisation moléculaire du gène *pca* codant la protocatechuate 3,4-dioxygénase [4,5]. Dernièrement, deux études concernant la caractérisation de séquences de *pcaH* isolées directement à partir d'échantillons environnementaux ont été rapportées [6,7].

Par conséquent, malgré l'important intérêt des communautés microbiennes *pca* et *cat*, due notamment à leur rôle clef dans le cycle du carbone et dans la biodégradation de composés aromatiques xénobiotiques, l'écologie de cette communauté microbienne fonctionnelle reste peu décrite au sein de l'environnement tellurique. Nous rapportons dans notre communication le développement d'outils moléculaires, basés sur l'extraction directe des acides nucléiques du sol [8] et l'amplification par réaction de polymérisation en chaîne, permettant de déterminer la densité, la structure et la diversité de la communauté *pca* dans le sol [9], qui pourraient être utilisés comme indicateurs de la qualité biologique des sols.

Références bibliographiques

[1] Harwood & Parales, 1996. *Annu. Rev. Microbiol.* 50, 553-590.

[2] Chaudhry & Chapalamadugu, 1991. *Microbiol. Rev.* 55, 59-79.

[3] D'Argenio et al., 1999. *J. Bacteriol.* 181, 6478-6487.

[4] Frazee et al., 1993. *J. Bacteriol.* 175, 6194-6202.

[5] Garcia et al., 2005. *FEMS Microbiol. Ecol.* 54, 97-109.

[6] Buchan et al., 2001. *Appl. Environ. Microbiol.* 67, 5801-5809.

[7] Ni Chadhain et al., 2006. *Appl. Environ. Microbiol.* 72, 4078-4087.

[8] Martin-Laurent et al., 2001. *Appl. Environ. Microbiol.* 67, 2354-2359.

[9] El Azhari et al., 2006. *J. Microbiol. Meth.* En révision.

Les travaux de thèse de Najoi El Azhari sont financés par un contrat de recherche ADEME/Région Bourgogne.
# Comparaison entre descripteurs biologiques et chimiques pour décrire l'impact du cuivre dans un sol

J. Sebastia<fnref n="1" />, D. Lejon<fnref n="2" />, I. Lamy<fnref n="1" /> et L. Ranjard<fnref n="2" />

## Introduction

Le cuivre est un métal toujours utilisé en agriculture en tant que pesticide. Certains horizons de surface de sols, notamment de sols viticoles, présentent des teneurs importantes en cuivre suite à l'utilisation de bouillie bordelaise. La toxicité des éléments traces métalliques comme le cuivre vis-à-vis des organismes vivants du sol a été largement démontrée, et peut se traduire par des effets délétères sur la biocénose du sol. Dans ce cadre, le rôle clé des micro-organismes dans la gestion des flux de matière ainsi que la spécificité et la sensibilité de leur réponse aux stress métalliques en font des indicateurs écotoxicologiques pertinents. Toutefois les effets des métaux et la réponse des micro-organismes sont encore mal compris et donc mal prédits. En effet, l'impact d'un élément trace comme le cuivre va dépendre de façon décisive de sa spéciation. Or les éléments traces métalliques peuvent engager des interactions biotiques et abiotiques avec les différentes composantes du sol, minérale, organique inerte ou organique vivante, qui vont influencer la forme physico-chimique sous laquelle ils se trouvent, et donc leur toxicité. L'affinité du cuivre pour la matière organique, et en particulier la matière organique en solution, est un des paramètres à prendre en compte dans l'évolution de la spéciation du cuivre. Or on ne sait pas prévoir dans quel sens, immobilisation ou transfert, les équilibres vont être modifiés lors d'ajouts de cuivre dans les sols, car les interactions entre les matières organiques, la microflore du sol et les métaux ont été peu étudiées conjointement.

Dans ce travail, nous avons voulu superposer des approches analytiques (teneurs totales en carbone organique et cuivre, spéciation en solution, pH) à des mesures d'écodynamique (évolution de la spéciation du cuivre et du carbone en solution) et d'écotoxicologie (impact sur les communautés de bactéries), pour mettre en place des méthodes permettant de prédire le devenir de cette source de pollution diffuse dans le temps qu'est le cuivre, et de développer des outils qui qualifient son impact sur la biocénose.

## Matériels et méthodes

Notre échantillonnage s'appuie sur un site expérimental en vignoble (Mâcon) dont le sol est limono argileux (pH 6,7) et faiblement contaminé en cuivre (60 ppm). Ce site est organisé en différentes parcelles qui ont reçu des apports répétés de matières organiques, et nous avons utilisé pour cette étude la parcelle témoin sans amendement organique. Les échantillons de sols ont été prélevés à 0-5cm de profondeur, mis à incuber pendant 0, 15 et 35 jours en présence ou en absence de cuivre (microcosmes dopés ou témoins). Après chaque temps d'incubation, la solution du sol a été extraite (rapport sol:eaude 1:2) et un aliquote a été utilisé pour effectuer un fractionnement des matières organiques dissoutes par ultrafiltration afin de les séparer en deux fractions : les petites molécules les plus labiles ($< 500$ Da) et

<footnote n="1">¹INRA, Unité PESSAC, Physico-chimie et Écotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon Cedex</footnote>
les molécules plus grosses (>500 Da). Le cuivre a également été dosé dans chacune de ces fractions. Sur l'autre partie d'aliquote de solution extraite, les éléments traces (Cu total) et majeurs ($C_{org}$, Fe, Ca, Mg, K, Na) ont été dosés afin d'effectuer une modélisation théorique de la spéciation du cuivre en solution (modèle ECOSAT). En parallèle, la densité de la communauté bactérienne totale cultivable hétérotrophe (CH) ainsi que la communauté bactérienne résistante au cuivre (CuR) ont été appréhendées par un dénombrement des colonies formant unité (cfu) sur milieu synthétique YG supplémenté ou non avec du cuivre ($CuCl_2$, 2mM). Les données acquises en présence de cuivre ont été comparées avec des blancs H₂O, des blancs HCl pour mimer l'acidification due à l'ajout de cuivre, et des blancs HCl/$CaCl_2$ pour mimer l'ajout d'un divalent et mieux en comprendre l'effet sur la spéciation du cuivre en relation avec le carbone organique dissous.

## Résultats et discussion

### Descripteurs chimiques de l'impact du cuivre

A $t = 0$, et par rapport aux témoins H₂O, les ajouts de cuivre ont entraîné une diminution du pH et de la teneur en carbone organique en solution. Mais ces diminutions sont aussi observées pour le témoin HCl/$CaCl_2$, mettant en avant l'importance des différences de pH et de force ionique dans la solubilisation de la matière organique des sols. Dans la solution extraite à $t = 0$, on trouve aussi moins de cuivre en solution pour les témoins HCl/$CaCl_2$ que pour les témoins H₂O. Par contre, au cours de l'incubation, les trois types de microcosmes témoins et cuivre montrent les mêmes tendances de diminution avec le temps du carbone et du cuivre dans les solutions extraites, avec cependant des différences d'amplitude suivant les microcosmes. En terme de spéciation, lorsqu'on compare l'évolution des petites (< 500 Da) et des grosses molécules organiques (> 500 Da) en solution (Fig. 1), on voit que la diminution du carbone organique total en solution est attribuable à la diminution significative au cours de l'incubation des petites molécules (< 500 Da) pour le témoin H₂O, mais à celle des grosses molécules pour le témoin HCl/$CaCl_2$. Par contre, l'impact du cuivre se différencie de l'effet de l'acidification et de la présence d'un divalent par une dynamique du carbone différente des deux témoins (Fig. 1). Ces résultats montrent que c'est à 15 jours qu'un effet du cuivre est significativement observable, tandis qu'à 35 jours les effets sont moindres.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 1.** Fractionnement du COT (histogrammes) et du cuivre en solution (courbes superposées) pour les microcosmes témoin H₂O (A), pour les témoins $CaCl_2$ (B) et pour les microcosmes en présence de cuivre (C).</figcaption></figure>

Les calculs de spéciation théorique indiquent que pour le témoin H₂O, très peu de cuivre en solution est sous forme libre, plus de 98 % du cuivre étant sous forme liée à la matière organique en solution pour des pH variant de 7,5 à 7,0 pendant l'incubation. Pour les microcosmes HCl/$CaCl_2$, 90 % du cuivre total est sous forme organique, 8 % sous forme libre, le reste étant attribué à des complexes inorganiques pour des pH de l'ordre de 6,5 variant peu au cours de l'incubation. Pour les microcosmes en présence de cuivre, 55 % du cuivre total en solution est sous
forme libre, et ce pourcentage diminue avec le temps pendant l'incubation à 35 % à 15 jours en faveur d'espèces organiques, pour ré-augmenter à 46 % du cuivre total en solution à 35 jours, avec un pH évoluant parallèlement de 6,4 à 6,8 puis 6,5.

## Descripteurs biologiques de l'impact du cuivre

Les ajouts de cuivre ont induit une diminution du nombre de bactéries cultivables totales à t=15j ainsi qu'un enrichissement en bactéries résistantes au cuivre (Fig. 2) par rapport aux contrôles H₂O. Cependant la différence entre le témoin H₂O et les microcosmes contaminés au cuivre ne se voit plus à 35 jours pour les bactéries cultivables totales, suggérant une atténuation de l'impact du cuivre. Ainsi, l'enrichissement en bactéries résistantes au cuivre observé à 15 jours entre le témoin et les microcosmes contaminés reste le même au bout de 35 jours.

Dans la littérature, un tel résultat d'impact sur les populations microbiennes du cuivre est attribué à la présence d'ions libres en solution. Ici, les calculs théoriques basés sur la composition des solutions montrent que pour les microcosmes Cu, il y a plus de cuivre libre en solution que pour les témoins, cette forme du cuivre étant réputée la plus biodisponible.

Cependant, les données de spéciation des microcosmes H₂O ne peuvent être comparées directement aux spéciations dans les microcosmes cuivre, car les conditions physico-chimiques de pH, force ionique et nature d'ions ne sont pas identiques. Par contre, en comparant avec les spéciations des microcosmes HCl/CaCl₂ on montre bien un impact différencié du cuivre à 15 jours qui peut être relié à l'impact observé sur les populations bactériennes du sol.

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 2.** Dénombrement des populations bactériennes résistantes au cuivre pour les microcosmes témoin H₂O (en noir) et pour les microcosmes en présence de cuivre (en gris).</figcaption></figure>

## Conclusions

Dans nos conditions expérimentales, les résultats montrent qu'il existe bien un lien entre des descripteurs chimiques et biologiques. Ce lien est complexe, car les descripteurs chimiques intègrent les processus biotiques et abiotiques tandis que les descripteurs biologiques sont le résultat d'une biodisponibilité de l'élément métallique introduit. Ainsi il convient, pour pouvoir comparer ces données, de suivre la spéciation des ions et la dynamique des éléments dans des milieux de mêmes conditions physico-chimiques.

Cette étude a été financée en partie par l'INRA et la Région Ile de France (Thèse de J. Sebastia), la région Bourgogne et le BIVB (thèse de D. Lejon) et par le programme national ACI/FNS ECODYN.
# Impact d'un herbicide sur la diversité microbienne aquatique. Une approche expérimentale.

A. Bouchez<fnref n="1" />, A. Villeneuve<fnref n="1" />, C. Leboulanger<fnref n="2" />, J.-F. Humbert<fnref n="1" /> et B. Montuelle<fnref n="3" />

## Introduction

Les communautés périphytiques (principalement algues et bactéries) jouent un rôle important dans le fonctionnement des écosystèmes lotiques en participant aux grands cycles biogéochimiques. Dans les rivières des bassins versants viticoles, ces communautés sont exposées à des concentrations variables de nutriments minéraux et de matière organique, en lien avec les itinéraires techniques suivis dans les parcelles viticoles, et plus particulièrement l'application de produits chimiques. Leur structure et leur dynamique peuvent être affectées par les caractéristiques physico-chimiques et biologiques du milieu et notamment par la présence de pesticides. L'impact relatif des différents facteurs naturels et anthropiques est difficile à estimer *in situ*, du fait des potentielles interactions entre facteurs. Des systèmes expérimentaux (microcosmes, mésocosmes) peuvent permettre de s'affranchir de tels facteurs de confusion et ainsi mieux caractériser les relations entre pression chimique et périphyton.

Des études préliminaires menées dans le Beaujolais, sur la rivière Morcille avec un bassin versant dédié à 80 % à la viticulture, ont permis de constater la présence d'un gradient amont-aval de pesticides. Ce gradient ne s'accompagne pas de modifications notables des nutriments et de la matière organique, mais de changements de la diversité algale et bactérienne. Cependant, le long du cours d'eau, de fortes hétérogénéités au niveau du régime hydrologique et des conditions d'éclairage tant au niveau spatial que temporel empêchent de caractériser le lien entre gradient en pesticides et modifications de diversité microbienne.

Nous avons donc testé en microcosmes lotiques l'effet de faibles concentrations d'herbicide sur la croissance et la diversité des communautés périphytiques, dans des conditions d'éclairement et d'hydrodynamique contrôlées.

## Matériel et méthodes

Des rivières artificielles (90 cm de long sur 35 cm de large) en laboratoire sous éclairage jour/nuit contrôlé, alimentées par l'eau de l'amont de la Morcille renouvelée chaque semaine (15 L d'eau pour chaque rivière), ont permis l'implantation de communautés périphytiques sur des lames de verre dépolies. Différents modes d'exposition à une faible dose (environnementale) d'un herbicide de la viticulture (diuron) ont été mis en œuvre (Fig. 1) afin d'étudier la résistance et la résilience des communautés.

Des échantillons ont été prélevés dès la maturité des biofilms (4 semaines) pour suivre la réaction des communautés aux différents traitements. La diversité a été évaluée par une méthode d'empreinte génétique (PCR-DGGE) pour la communauté

<footnote n="1">¹INRA, UMR CARRTEL, Centre Alpin de Recherche sur les Réseaux Trophiques des Écosystèmes Limniques, 75 avenue de Corzent, BP 511, 74203 Thonon-les-Bains Cedex</footnote>

<footnote n="2">²IRD, Unité CYROCO, Cyanobactéries des milieux aquatiques tropicaux peu profonds: Rôles et Contrôles, 911 avenue Agropolis, 34394 Montpellier Cedex 5</footnote>

<footnote n="3">³Cemagref, Laboratoire Écologie Microbienne des Hydrosystèmes Anthropisés, 3 bis quai Chauveau, 69336 Lyon Cedex</footnote>
eucaryote (gène codant pour l'ARN 18s) et pour la communauté procaryote (gène codant pour l'ARN 16s). Des paramètres en lien avec le fonctionnement des communautés ont également été mesurés (biomasse, production primaire).

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure 1.** Plan expérimental : rivière A : Témoin (sans pesticide) ; rivière B : pollution accidentelle après 4 semaines ; rivière C : pollution permanente ; rivière D : pollution stoppée après 4 semaines.</figcaption></figure>

## Résultats

En premier lieu, on observe un fort lien entre la maturation du biofilm et la composition des communautés. Les populations bactériennes ne semblent pas impactées par les faibles doses de diuron. La pollution accidentelle mimée dans le canal B à 4 semaines de maturité conduit à un changement notable de la composition de la communauté eucaryote et une décroissance de biomasse dès 4 jours d'exposition. Cette tendance est confirmée après 15 jours d'exposition. Dans le scénario de pollution chronique appliquée dès le premier jour de l'expérimentation, après 4 semaines la diversité eucaryote apparaît diminuée (canal D) par rapport au témoin (A). Pour le témoin pollué (C), on observe un changement marqué de diversité ainsi qu'une forte décroissance en termes de production primaire et de biomasse entre T0 et T15 par rapport au témoin en « restauration » (D). Dans ce canal où la pollution a été arrêtée à T0, aucune différence n'est détectée par rapport au témoin non pollué (A) après 15 jours, ce qui suggère une restauration des communautés.

L'exposition au diuron modifie la diversité et la composition des communautés de micro-algues. Cette modification s'accompagne d'une diminution de la biomasse, pour les scénarios mimant une pollution aigue ou chronique. On observe également une résilience des communautés microbiennes : augmentation de biomasse, de production primaire et retour à une diversité proche de celle du témoin. L'impact de la lumière sur ces différents scénarios a également été testé et semble de nature à modifier fortement la réaction des communautés.
Conclusion

A court terme, le diuron en concentration faible tend à diminuer l'activité et la diversité de la communauté périphytique en systèmes expérimentaux. Il semble donc bien susceptible d'impacter le fonctionnement d'un tel écosystème microbien en milieu naturel.

Cet effet est également observé dans le cas d'un scénario de pollution chronique. Cependant l'arrêt de la pollution dans ce cas conduit à observer une résilience de la communauté, tant en terme de fonctionnement qu'en terme de diversité.
Session 4

Altérations de la dynamique des communautés

# Bioindicateurs d'impact du recyclage de produits résiduaires organiques en sols cultivés : lien avec la disponibilité de micropolluants organiques et métalliques

S. Houot<fnref n="1" />, P. Benoit<fnref n="1" />, E. Barriuso<fnref n="1" />, G. Bodineau<fnref n="1" />, V. Etievant<fnref n="1" />, J.-N. Rampon<fnref n="1" />, M. Deschamps<fnref n="1" />, Y. Capowiez<fnref n="2" />, P. Cambier<fnref n="3" />, J.-P. Petraud<fnref n="3" />, A. Jaulin<fnref n="3" />, T. Lebeau<fnref n="4" />, J. Kuntz<fnref n="4" />, C. Leyval<fnref n="5" />, T. Beguiristain<fnref n="5" />, P. Leglize<fnref n="5" />, C. Steinberg<fnref n="6" />, V. Edel-Hermann<fnref n="6" />, N. Gautheron<fnref n="6" />, C. Francou<fnref n="7" />, M. Poitrenaud<fnref n="7" />

Ce projet vise à évaluer les risques d'impacts à long terme du recyclage en agriculture de composts d'origine urbaine sur la composante biologique de sols cultivés, incluant microflore et faune. Les populations testées sont proposées comme bioindicateurs d'impact dont la réponse sera reliée aux effets des composts sur les caractéristiques physico-chimiques d'un sol et à l'état des polluants dans ce sol. Les composts sont vecteurs de polluants organiques (Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques, HAP, étudiés ici) et métalliques (Eléments Traces Métalliques, ETM) en faibles concentrations. Leur application répétée pourrait avoir un effet perturbateur sur le fonctionnement biologique des sols, en raison du cumul de faibles doses de polluants. Mais les composts sont avant tout des matières organiques (MO) dont l'apport répété peut modifier les caractéristiques physico-chimiques du sol comme sa teneur en MO, son pH... Ces 2 composantes devront être prises en compte dans l'interprétation des effets des apports de composts sur la composante biologique du sol.

Les mesures sont réalisées dans un essai de longue durée (collaboration INRA – Centre de Recherches pour l'Environnement, l'Energie et le Déchet, du groupe VEOLIA Environnement) où les apports répétés de composts se font selon des pratiques courantes réelles mises en œuvre chez les agriculteurs.

Les mesures portent sur :

- la taille, la diversité et l'activité de la macrofaune (vers de terre) et de la microflore (communautés bactériennes et fongiques) du sol,

- la qualité chimique des sols soumis aux épanagements et donc soumis d'une part à des apports organiques, d'autre part à l'accumulation de faibles doses d'ETM et de composés trace organique (CTO), polluants dont le comportement sera dépendant de leurs interactions avec les composés organiques.

- la spéciation des ETM et des CTO comme indicateur d'exposition des organismes vivants dans le sol. Cette spéciation est faite dans différentes fractions granulométriques des produits épanus et des sols soumis aux épanagements. En effet, les fractions grossières de la MO ont des turnovers plus

<footnote n="1">¹INRA, UMR EGC, Environnement et Grandes Cultures, 78850 Thiverval-Grignon</footnote>

<footnote n="2">² INRA, UMR Écologie des Invertébrés, Laboratoire de Toxicologie Environnementale, Site Agroparc, 84914 Avignon Cedex 9</footnote>

<footnote n="3">³ INRA, Unité PESSAC, Physico-chimie et Écotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex</footnote>

<footnote n="4">⁴Plate-Forme Technologique Agrosystèmes, Institut Universitaire de Technologie, Université de Haute Alsace, 29 rue d'Herrlisheim, 68008 Colmar</footnote>

<footnote n="5">⁵LIMOS, Laboratoire des Interactions Microorganismes-Minéraux-Matière Organique dans les sols, Faculté des Sciences et Techniques, BP 239, 54506 Vandoeuvre-les-Nancy Cedex</footnote>

<footnote n="6">⁶INRA, UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon Cedex</footnote>

<footnote n="7">⁷Veolia Propreté, 78520 Limay</footnote>
rapides que les MO associées aux fractions fines et sont également plus facilement consommées par la faune du sol.

Les mesures sont faites à différents pas de temps après l'épandage de Septembre 2004. La variation des réponses dans des traitements n'ayant pas reçu d'épandage permettra d'appréhender les variations « naturelles » des indicateurs qui seront comparées à l'intensité des variations dans les traitements soumis à épandage.

Le site «Qualiagro» (Feucherolles, 78) mis en place en 1998, a une superficie de 6 ha. Le sol est de type limoneux lessivé décarbonaté d'une profondeur supérieure à 1,2 m. La teneur en matière organique moyenne initiale est de 1,9 %, valeur proche du seuil critique évalué à 1,5 % dans ce type de sol. Le sol a un pH initial de 6,9. Les teneurs en ETM initiales sont faibles par rapport à la moyenne des sols du même type dans la région, celles en HAP sont faibles également, équivalentes aux valeurs citées dans la bibliographie dans un sol périurbain.

Le dispositif comprend 4 traitements organiques et un témoin. Trois composts sont comparés à un fumier de bovins, amendement organique de référence:

- un compost d'ordures ménagères résiduelles (OMR) après collecte sélective des emballages « propres et secs »

- un compost de boues (DVB) par co-compostage de boues d'épuration urbaines et de déchets verts ou de fragments de palettes

- un compost de fraction fermentescible des ordures ménagères (FFOM) issu de la collecte sélective de cette fraction co-compostée avec des déchets verts

Ces 5 traitements reçoivent ou non une fertilisation azotée (N). Le dispositif comprend 4 blocs de 10 parcelles. Le dispositif est cultivé selon une rotation blé-mais. Les composts et le fumier sont apportés tous les 2 ans, en début d'automne, sur chaume de blé. Seuls les traitements OMR +N et DVB+N sont présentés ici et comparés aux 2 témoins avec et sans N.

Quatre applications de compost ont déjà eu lieu. Les composts OMR ont une biodégradabilité supérieure à celle des composts de DVB avec en moyenne 40 et 10 % du C des composts facilement minéralisable, respectivement pour OMR et DVB. Les teneurs en ETM sont toujours supérieures dans les composts d'OMR où la moyenne des analyses dépasse les teneurs réglementaires pour le Cr et Pb. Les teneurs moyennes en HAP des composts sont très inférieures aux maxima réglementaires.

Les doses de composts sont calculées de façon à apporter environ 4 t C/ha à chaque épandage. Les doses effectivement éwandues sont mesurées. Les flux d'ETM sont conformes à la réglementation pour les DVB, à l'exception des flux de Cu. Pour les composts d'OMR, les flux d'ETM dépassent les flux réglementaires pour Cr, Cu Pb et Zn. Les flux des 3 HAP fluoranthène, benzo-b-fluoranthène et benzo-a-pyrène, sont inférieurs aux flux maxima réglementaires.

L'ensemble de ces apports a modifié les caractéristiques physico-chimiques des sols. Les teneurs en C organique ont augmenté dans les parcelles recevant les composts de DVB et de façon moindre dans les parcelles recevant le compost d'OMR. Les teneurs en N augmentent moins que celles de C, ce qui se traduit par une augmentation du C/N dans tous les traitements. Le pH et le taux de saturation en Ca et Na de la CEC tendent à augmenter dans le traitement OMR et à diminuer dans les autres traitements. Toutes ces variations des caractéristiques physico-chimiques du sol devront être prises en compte pour expliquer les modifications des populations microbiennes, de la faune, de leur activité au même titre que les modifications de teneurs et de spéciation des polluants provenant des apports de composts.

Les évolutions en ETM totaux dans les horizons de surface pour les différents traitements sont cohérentes par rapport aux flux d'ETM apportés par les composts. Seules les teneurs en cuivre augmentent significativement dans les traitements DVB
et OMR. Les teneurs en HAP totaux n'évoluent pas entre 1998 et 2004 et restent en moyenne autour de 200 mg/kg dans tous les traitements.

Les spéciations physique (distribution dans des fractions granulo-densimétriques, FGD) et chimique des ETM et des HAP dans les composts et dans les sols sont utilisées comme indicateurs d'exposition des organismes vivants. Dans les composts, elles montrent l'enrichissement en ETM des fractions légères enrichies en MO et dans la fraction < 50 µm (Fig. 1).

La distribution des ETM dans les FGD des sols sera également présentée. La spéciation chimique des ETM (extraction au Ca₂NO₃ et EDTA) dans les différentes FGD (sol et composts) complétera l'évaluation de la biodisponibilité des ETM.

Enfin, la disponibilité des HAP dans les composts est également évaluée par spéciation. Pour cela des extractions séquentielles à l'eau, puis à l'ASE (*Accelerated Solvent Extractor*) à l'eau subcritique puis à l'aide de solvants organiques sont mises au point. En particulier, une méthode de purification et de concentration des HAP contenus dans les extraits aqueux par absorption sur barreau magnétique (SBSE pour « *Stir Bar Sorptive Extraction* ») a été mise au point.

La synthèse des résultats obtenus concernant l'évaluation de la spéciation des ETM et HAP sera présentée dans l'exposé.

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure 1.** Distribution des ETM dans les fractions granulo-densimétriques du compost DVB. Les tailles des fractions sont en µm ; M : fraction minérale, V : fraction « végétale » ou légère.</figcaption></figure>

Les effets des traitements sur la microflore du sol sont abordés *via* l'évolution de la structure des communautés microbiennes, bactériennes et fongiques, incluant les champignons mycorhiziens en utilisant deux techniques d'analyse de l'ADN extrait des sols : la PCR-TTGE et la PCR-T-RFLP. Ces 2 méthodes ont nécessité des mises au point techniques. Par ailleurs, l'intervention de trois laboratoires différents a mis en évidence la nécessité d'une intercalibration. Les premiers résultats montrent que la structure des communautés fongiques estimée par TTGE est modifiée par l'apport d'OMR dès le premier prélèvement après épandage alors que le compost DVB n'a aucune incidence.

L'épandage du compost OMR exerce des effets positifs plus importants et durables sur la taille des communautés lombriciennes que le DVB (Fig 2), sans modifier leur structure. A certaines dates, on a pu déceler des effets attractifs et répulsifs du sol ayant reçu des composts d'OMR et de DVB respectivement, qui pourraient contribuer aux évolutions d'abondance observées.
<figure><img src="image_52.png" /></figure>

**Figure 2.** Évolution temporelle de l'abondance des vers de terre (+ ES) dans chaque traitement. A une date donnée, les points portant des lettres différentes sont significativement différents au seuil de 5 %.

En résumé, les épandages des 2 composts dans les conditions expérimentales du site n'ont aucun effet délétère sur les communautés de vers de terre ; ils modifient la structure des communautés microbiennes sans que cela puisse être attribué à une exposition plus importante à des composés toxiques.
# Organisation des communautés végétales et distribution des traits fonctionnels d'espèces d'intérêt pour révéler la phytotoxicité des sols sur un site de traitement du bois

M. Mench, M. Aulen et C. Bes

INRA, UMR BIOGECO, Biodiversité, Gènes et Écosystèmes, 1, avenue des Facultés, 33405 Talence

Créosote, CuSO₄ et CCA ont été successivement utilisés dans les formulations pour traiter du bois sur un site. Fuites de fluides de traitement, lixiviats de bois traités, dépôts de déchets, envols et entraînement particulaire ont disséminé les produits chimiques et contaminé les sols. Ils contiennent en surface de 65 à 2600 mg Cu kg⁻¹ et certains ont montré une forte écotoxicité lors de tests en microcosmes vis-à-vis de végétaux et d'invertébrés [1]. Que la contamination du sol et leur phytotoxicité s'accompagnent d'une diminution de la biodiversité et de la couverture végétale, d'un éclairement accru et d'un manque de nutriments ou d'eau est un postulat que l'on souhaite vérifier sur ce site au niveau des communautés [2,3]. L'objectif est d'examiner l'organisation de la biodiversité des communautés végétales sur une série de stations du site, ayant le même type de sol mais une contamination croissante (i.e. Cu, As, HAPs). On souhaite aussi identifier les plantes à fréquence élevée et à fort recouvrement dans les zones fortement contaminées afin de sélectionner des espèces d'intérêt pour la phytoremédiation.

## Matériels et Méthodes

Le site a une activité d'imprégnation du bois depuis le 19ème siècle. Plusieurs secteurs abandonnés montrent des sols nus ou des bosquets nains, tandis que d'autres s'auto-organisent autour de peupliers et saules. Après prospection du site, de fosses pédologiques et des communautés végétales en place, 5 stations d'échantillonnage (A, B, C, D et E) ont été choisies. D'après les analyses du sol en surface (Tab. 1), la contamination en Cu serait comme suit : D>C>E>B>A.

<table><caption>Tableau 1. Caractéristiques des sols (horizon 0-0,25 m)</caption><thead><tr><th>Stations</th><th>P1</th><th>P4</th><th>B</th><th>D</th><th>E</th><th>P10</th></tr></thead><tbody><tr><td>C org (g/kg)</td><td>9,2</td><td>10,1</td><td>11,6</td><td>15,7</td><td>9,4</td><td>19,6</td></tr><tr><td>N total (g/kg)</td><td>0,53</td><td>0,70</td><td>0,83</td><td>0,62</td><td>0,43</td><td>1,04</td></tr><tr><td>C/N</td><td>17,2</td><td>14,4</td><td>13,9</td><td>25,1</td><td>21,9</td><td>18,9</td></tr><tr><td>MO (g/kg)</td><td>15,9</td><td>17,4</td><td>20</td><td>27,2</td><td>16,2</td><td>33,9</td></tr><tr><td>CEC cmol⁺/kg</td><td>3,5</td><td>5,3</td><td>5,0</td><td>1,9</td><td>4,5</td><td>6,0</td></tr><tr><td>Cr (mg/kg)</td><td>23</td><td>24</td><td>26</td><td>31</td><td>87</td><td>28</td></tr><tr><td>Cu (mg/kg)</td><td>1460</td><td>260</td><td>65</td><td>2600</td><td>185</td><td>118</td></tr><tr><td>Zn (mg/kg)</td><td>46</td><td>59,7</td><td>31,8</td><td>57,7</td><td>37,8</td><td>67,8</td></tr><tr><td>As (mg/kg)</td><td>9,8</td><td>12,1</td><td>20,2</td><td>26,3</td><td>52,8</td><td>11,6</td></tr><tr><td>Σ7 PCB (mg/kg)</td><td colspan="6">&lt;0,035</td></tr><tr><td>Benzo[a]pyrène (mg/kg)</td><td colspan="6">0,64</td></tr></tbody></table>

Les stations (~150 m² chacune) ont été divisées en quadrats de 4 m de côté. Les espèces végétales ont été systématiquement inventoriées, photographiées et mises sous herbier. Le nombre d'espèces végétales, les indices de recouvrement et les
biomasses spécifiques ont été mesurés en octobre 2005 et mai 2006 (indice : + : quelques individus, puis recouvrement croissant de 1, faible à 5, total).

L'indice H de Shannon ($H = -\sum p_i \ln p_i$ , où $p_i$ est la proportion de l'espèce i dans la communauté à S espèces) est calculé pour chaque station.

## Résultats - Discussion

Les communautés végétales des zones contaminées (e.g., D) sont réduites, peu diversifiées et souvent en patch. La biodiversité en octobre sur la station A (faible contamination) est similaire à celle quantifiée sur la globalité des stations (89 espèces identifiées) et plus élevée que celle de la station D (p<0,05), la plus contaminée (Fig. 1).

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 1.** Indices de Shannon : Moyennes des indices des quadrats de toutes les stations, de la station A (peu contaminée) et de la station D (fortement contaminée). T-test entre la station A et les autres stations (* : P<0,05 ; ** : P<0,01 ; ns : non significatif).</figcaption></figure>

En mai, la diversité végétale est similaire à octobre quelles que soient les stations (T-test non significatif). La station A devient plus diversifiée que la moyenne de l'ensemble des stations (p<0,05). La station D reste moins diversifiée que A (p<0,01). L'indice de Shannon est le plus souvent compris entre 0,5 (communautés à diversité très faible ou dominance d'une espèce) et 4,5 (communautés complexes, riches en espèces ayant des abondances similaires) [4]. La diversité végétale diminue avec l'augmentation de la contamination des sols des stations et leur écotoxicité testée au préalable, mais reste faible sur l'échelle de l'indice, même aux stations peu contaminées. La couverture globale des quadrats varie entre 0 (pas de couverture végétale) et 5 (couverture maximum). La moyenne toutes parcelles confondues est de 3,3. Dans les zones à forte contamination, elle est de 2,8. Elle vaut 4,7 dans les zones à faible contamination. Hutchinson & Symington [5] et Zvereva & Kozlov [3] montrent le même sens de variation. La composition de la communauté végétale A diffère de celle de la D et ne correspond pas à la composition floristique moyenne sur l'ensemble des stations (Tab. 2). Ce sont les zones peu contaminées (e.g., A) qui contribuent le plus à la diversité végétale en octobre et mai, cependant une dynamique des communautés végétales existe entre l'automne et le printemps. Les espèces dominantes pour la station D contaminée sont des herbacées plutôt que des ligneuses. Pour les herbacées, les pérennes sont toujours plus abondantes que les annuelles, quelle que soit la zone considérée. Les Poacées et Astéracées sont fréquentes dans les zones à forte contamination ; aux faibles contaminations, ce sont les Poacées, Fabacées et Rosacées (Fig. 2a et b), confirmant les données de Wang *et al.* [6]. En zones contaminées, des plantes pionnières et tolérantes aux métaux s'installent en premier [5,7]. Parmi les plantes les plus abondantes de la station A, il y a des espèces connues pour leurs traits fonctionnels lorsqu'elles sont exposées aux métaux dont Cu. Agrostis stolonifera est tolérant aux métaux [8]. A. capillaris [9] et Rumex acetosella [7] sont tolérants au Cu. Populus nigra est un accumulateur de Zn [10] qui serait tolérant aux métaux grâce à des mécanismes de détoxication comme les métallothionéines [11]. L'écologie des espèces de la station D et de l'ensemble
des stations correspond au type de sol sableux, sec, légèrement acide, présent sur la majorité du site (e.g. *Rumex acetosella*, *Agrostis capillaris*, *Geranium molle*, *Trifolium campestre*, *Vicia sativa*, *Ulex europaeus*, *Tuveraria gutata*) (J. Laporte-Cru, com. pers.). D'autres sont plus rudérales (*Sporobolus tenacissimus*, *Hypericum perforatum*, *Rubus fruticosus*, *Galium aparine*). Les espèces sur la station A sont caractéristiques de milieux mésophiles (plus humide, lisières de bois) comme *Stellaria holostea*, *Teucrium scorodonia*, *Hedera helix*, *Geranium robertianum*. La station A est effectivement plus ombragée, moins contaminée et en lisière de chênaie (*Quercus robur*, mésophile).

<table><caption>Tableau 2. 10 plus fortes abondances spécifiques (% de recouvrement) en mai.</caption><thead><tr><th colspan="3">Toutes stations confondues</th><th colspan="3">Station A (faible contamination)</th><th colspan="3">Station D (forte contamination)</th></tr><tr><th>rang</th><th>Genre</th><th>espèce</th><th>%</th><th>Genre</th><th>espèce</th><th>%</th><th>Genre</th><th>Espèce</th><th>%</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Agrostis</td><td>capillaris</td><td>43.6</td><td>Hedera</td><td>helix</td><td>31.4</td><td>Agrostis</td><td>capillaris</td><td>50.8</td></tr><tr><td>2</td><td>Rumex</td><td>acetosella</td><td>29.8</td><td>Agrostis</td><td>stolonifera</td><td>22.9</td><td>Rumex</td><td>acetosella</td><td>28.3</td></tr><tr><td>3</td><td>Agrostis</td><td>stolonifera</td><td>14.1</td><td>Cytisus</td><td>scoparius</td><td>22.9</td><td>Trifolium</td><td>campestre</td><td>10.8</td></tr><tr><td>4</td><td>Trifolium</td><td>campestre</td><td>12.9</td><td>Agrostis</td><td>capillaris</td><td>20.0</td><td>Hypericum</td><td>perforatum</td><td>22.5</td></tr><tr><td>5</td><td>Sporobolus</td><td>tenacissimus</td><td>8.5</td><td>Galium</td><td>aparine</td><td>20.0</td><td>Agrostis</td><td>stolonifera</td><td>11.7</td></tr><tr><td>6</td><td>Rubus</td><td>fruticosus</td><td>9.9</td><td>Quercus</td><td>robur</td><td>17.1</td><td>Populus</td><td>nigra</td><td>10.8</td></tr><tr><td>7</td><td>Geranium</td><td>molle</td><td>9.6</td><td>Rubus</td><td>fruticosus</td><td>17.1</td><td>Lotus</td><td>corniculatus</td><td>6.7</td></tr><tr><td>8</td><td>Cerastium</td><td>glomeratum</td><td>8.8</td><td>Vicia</td><td>hirsuta</td><td>14.3</td><td>Cerastium</td><td>glomeratum</td><td>6.7</td></tr><tr><td>9</td><td>Hypericum</td><td>perforatum</td><td>6.0</td><td>Vicia</td><td>sativa</td><td>11.4</td><td>Rubus</td><td>fruticosus</td><td>3.3</td></tr><tr><td>10</td><td>Vicia</td><td>sativa</td><td>5.7</td><td>Trifolium</td><td>campestre</td><td>8.6</td><td>Sporobolus</td><td>tenacissimus</td><td>3.3</td></tr></tbody></table>

Forte contamination

Faible contamination

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 2. Fréquence des familles en zones de forte et faible contamination.</figcaption></figure>

En conclusion, la contamination de l'horizon de surface des sols, notamment en Cu, leur écotoxicité et leur texture sableuse forment des zones sur le site où un stress fort s'exerce sur les espèces végétales. La contamination du sol et de sa solution affecte la biodiversité et la composition des communautés végétales. Les espèces présentes dans les zones les plus contaminées sont des candidats d'intérêt pour la phytoremédiation. L'effet de la contamination sur la banque de graines n'est pas connu, mais sera étudié.

Références bibliographiques

[1] Mench & Bes, 2006. 3ème Séminaire d'Ecotoxicologie de l'INRA, Dinard, 17-19 Septembre 2006.

[2] Freitas et al., 2004. *Environ. Int.* 30, 65-72.

[3] Zvereva & Kozlov, 2004. *J. Ecol.* 92, 288-296.

[4] http://www.ifn.fr/spip/IMG/pdf/if_3_biodiv.pdf

[5] Hutchinson & Symington, 1997. *J. Geochem. Explor.* 58, 323-330.

[6] Wang et al., 2004. *Acta Botanica Sinica* 46, 780-787.

[7] Bagatto & Shorthouse, 1999. *Can. J. Bot.* 77, 410-425.

[8] Siedlecka et al. 2001. In Prasad (ed.), *Metals in the Environment. Analysis by Biodiversity*, Marcel Dekker, NY, 171-217.

[9] Lepp et al., 1997. *Environ. Pollut.* 95, 363-369.

[10] Di Baccio et al., 2003. *New Phytologist* 159, 443-452.

[11] Kohler et al., 2004. *New Phytologist* 164, 83-93.

Les auteurs remercient l'Ademe, Département sites et sols pollués, Angers.
# Caractéristiques des modèles d'écosystèmes aquatiques et conséquences pour l'évaluation des risques écotoxicologiques

S. Sourisseau<fnref n="1" />, A. Bassères<fnref n="2" />, F. Périé<fnref n="2" /> et T. Caquet<fnref n="1" />

## Introduction

Divers outils numériques destinés à simuler le devenir des polluants dans l'environnement et leurs impacts sur les écosystèmes ont été développés [1]. Leur mise en œuvre implique le plus souvent l'élaboration d'une représentation théorique, ou modèle conceptuel, de l'écosystème étudié, généralement présentée sous la forme d'un modèle à compartiments. Schématiquement, les modèles se répartissent en deux grands types : des modèles détaillés comportant de nombreuses variables, et des modèles agrégés, qui ne comportent que quelques variables (Fig. 1). Pour un même écosystème, le passage d'un type de modèle à l'autre se fait *vía* une agrégation de variables. Selon les cas, l'agrégation peut être envisagée d'un point de vue taxonomique, fonctionnel (regroupement selon des traits écologiques et/ou biologiques) ou encore en fonction de la sensibilité au toxique considéré. Il est toutefois essentiel d'évaluer jusqu'à quel point cette agrégation peut être réalisée sans que cela remette en cause la pertinence du modèle. Inversement, il convient de déterminer le meilleur compromis entre la pertinence du modèle et la difficulté de l'acquisition des informations nécessaires à son établissement (Fig. 1).

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>**Figure 1.** Exemples d'agrégation appliquée à un modèle conceptuel de réseau trophique aquatique et conséquences pratiques associées.</figcaption></figure>

<footnote n="1">¹INRA, UMR EQHC, Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint Brieuc, 35042 Rennes Cedex</footnote>

<footnote n="2">²TOTAL Petrochemicals, Pôle de Recherches et Développement de Mont-Lacq, Service Environnement, BP 47, 64170 Lacq.</footnote>
## Matériel et Méthodes

Le cas retenu est celui de la contamination ponctuelle d'un écosystème aquatique par un insecticide, la deltaméthrine. Les données utilisées ont été obtenues lors d'expérimentations réalisées dans des mésocosmes lentiques (U3E, INRA, Rennes) et lotiques (Total Petrochemicals, Lacq). Les modèles conceptuels ont été définis en fonction des groupes taxonomiques présents et des connaissances disponibles sur leur écologie. Ils ont été agrégés selon la sensibilité à la deltaméthrine des compartiments planctoniques (agrégation moyenne), ou en fonction des caractéristiques trophiques et fonctionnelles des groupes (agrégation forte).

Les simulations ont été réalisées à l'aide du logiciel AQUATOX [2]. Cet outil fournit des sorties (dynamiques temporelles des paramètres physico-chimiques et des biomasses des différents compartiments) dans deux types de conditions : normales (systèmes témoins) et perturbées (systèmes contaminés). Il est alors possible de calculer un pourcentage d'effet simulé associé à la contamination en comparant les évolutions des biomasses de chaque compartiment en conditions normales et perturbées à différentes dates t après le traitement :

$$ \% \text{effet,t} = \frac{(\text{Biomasse}_{\text{Contaminé,t}} - \text{Biomasse}_{\text{Témoin,t}})}{\text{Biomasse}_{\text{Témoin,t}}} \times 100 $$

Les données réelles ont été utilisées pour calculer de la même façon un pourcentage d'effet observé. Les deux types de résultats ont ensuite été comparés qualitativement (sens de l'effet) et quantitativement (intensité de l'effet).

D'autre part, un logiciel d'évaluation du risque (TerraSys) a été utilisé pour déterminer des indices de risque (IR) pour chacun des compartiments. Ces indices sont déduits du rapport entre l'exposition estimée à la deltaméthrine et un niveau présumé sécuritaire pour le compartiment considéré. Une valeur inférieure à 1 indique une absence de risque tandis qu'un indice égal ou supérieur à 1 met en évidence la possibilité d'effets écotoxicologiques.

## Résultats-Discussion

**Mésocosmes lentiques** - D'un point de vue qualitatif, les trois modèles prédisent bien l'évolution des biomasses à la suite de la contamination, sauf en ce qui concerne les microprédateurs pélagiques (Tab. 1). D'un point de vue quantitatif, le modèle détaillé permet une bonne estimation des effets sur les différents compartiments. Le modèle moyennement agrégé prédit relativement bien la réponse des compartiments planctoniques, mais il sous-estime fortement les effets sur les macroinvertébrés. Le modèle très agrégé simule assez bien l'évolution des compartiments benthiques mais il suretime fortement les effets sur les compartiments planctoniques.

<table><caption>**Tableau 1.** Pourcentages d'effet observés et simulés, 21 jours après la contamination, en mésocosmes lentiques et indices de risque (IR) calculés avec TerraSys (Ag. : agrégation).</caption><thead><tr><th>Variable</th><th>Effet observé</th><th>Ag. forte</th><th>Ag. moyenne</th><th>Ag. faible</th><th>IR</th></tr></thead><tbody><tr><td>Phytoplancton</td><td>+43,5 %</td><td>+225,7 %</td><td>+37,4 %</td><td>+6,8 %</td><td>0,012</td></tr><tr><td>Zooplancton herbivore</td><td>-18,7 %</td><td>-100%</td><td></td><td></td><td>6,25</td></tr><tr><td>Rotifères</td><td>+6,2 %</td><td></td><td>+45,9 %</td><td>+40,7 %</td><td>6,25</td></tr><tr><td>Microcrustacés</td><td>-39,9 %</td><td></td><td>-100 %</td><td>-100 %</td><td>6,25</td></tr><tr><td>Microprédateurs pélagiques</td><td>+210,2 %</td><td>-92,8 %</td><td>-83,0 %</td><td>-93,6 %</td><td>6,25</td></tr><tr><td>Herbivores brouteurs</td><td>+429,8 %</td><td>+0,5 %</td><td>+0,2 %</td><td>+927,9 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Baetidae</td><td>-95,2 %</td><td></td><td></td><td>-100 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Lymnaeidae</td><td>+225,6 %</td><td></td><td></td><td>+119 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Détritivores</td><td>-92,7 %</td><td>-100 %</td><td>-0,1 %</td><td></td><td>0,51</td></tr><tr><td>Chironomidae</td><td>-92,7 %</td><td></td><td></td><td>-88,1 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Macroinvertébrés prédateurs</td><td>-65,5 %</td><td>-60,5 %</td><td>-17 %</td><td></td><td>0,51</td></tr></tbody></table>
**Mésocosmes lotiques** – D'un point de vue qualitatif, les différents modèles ne permettent pas une bonne simulation de l'évolution des biomasses à la suite de la contamination de l'écosystème (Tab. 2). D'un point de vue quantitatif, les deux types de modèles surestiment fortement l'impact de la deltaméthrine sur les compartiments planctoniques. Cet écart découle vraisemblablement d'une insuffisance des données disponibles pour les organismes concernés.

<table><caption>**Tableau 2.** Pourcentages d'effet observés et simulés, 21 jours après la contamination, en mésocosmes lotiques et indices de risque (IR) calculés avec TerraSys (Ag. : agrégation).</caption><thead><tr><th>Variable</th><th>Effet observé</th><th>Ag. forte</th><th>Ag. faible</th><th>IR</th></tr></thead><tbody><tr><td>Herbivores filtreurs</td><td>24,6 %</td><td>-100 %</td><td></td><td>6,25</td></tr><tr><td>Herbivores brouteurs</td><td>-66,9 %</td><td>0,14 %</td><td></td><td>0,51</td></tr><tr><td>Baetidae</td><td>-75,5 %</td><td></td><td>-93,7 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Elmidae</td><td>-62,6 %</td><td></td><td>-100 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Ephemerellidae</td><td>-100 %</td><td></td><td>-27,7 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Microprédateurs pélagiques</td><td>119 %</td><td>-100 %</td><td></td><td>6,25</td></tr><tr><td>Microprédateurs benthiques</td><td>49 %</td><td>-100 %</td><td></td><td>0,51</td></tr><tr><td>Ceratopogonidae</td><td>-15,8 %</td><td></td><td>-94,2 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Polycelis sp.</td><td>-82,5 %</td><td></td><td>-100 %</td><td>0,51</td></tr><tr><td>Détritivores</td><td>22 %</td><td>-100 %</td><td></td><td>0,51</td></tr><tr><td>Macroprédateurs</td><td>0,02 %</td><td>-100 %</td><td></td><td>0,51</td></tr></tbody></table>

**Comparaison des deux logiciels** – Dans le cas des mésocosmes lentiques, les valeurs de IR reflètent relativement bien les pourcentages d'effets observés en mésocosmes et estimés avec AQUATOX lors de la simulation à partir d'une représentation agrégée. Cependant, TerraSys ne permet pas de prendre en compte les effets positifs (indirects) sur certains groupes.

La modélisation du fonctionnement des différents compartiments nécessite de définir précisément un grand nombre de caractéristiques (éco)physiologiques et écologiques dont certaines ont une influence importante sur la sortie des modèles (taux maximal de photosynthèse et taux de sédimentation du phytoplancton par exemple). L'absence de mesures expérimentales propres ou de données bibliographiques pour ces paramètres semblent être les sources principales des écarts entre les valeurs observées et les valeurs simulées.

L'évaluation des risques écotoxicologiques au niveau des communautés implique notamment de prendre en compte les différences inter-spécifiques de sensibilité aux toxiques et les éventuels effets indirects découlant par exemple de l'altération de relations de compétition ou de prédation. En théorie, une représentation agrégée permet une estimation plus fiable de l'évolution de la biomasse des groupes fonctionnels [3] mais elle ne permet pas de mettre en évidence certains phénomènes comme des effets indirects par exemple. Une agrégation faible permet une meilleure analyse de la réponse de chacun des compartiments à la contamination mais il semble extrêmement difficile de pouvoir disposer de données fiables pour tous les compartiments. En fin de compte, le choix du modèle et du niveau d'agrégation dépendront avant tout de la question posée et de la quantité (et de la qualité) des données disponibles.

## Références bibliographiques

[1] Pastorok R.A. et al. (Eds), 2002. *Ecological Modeling in Risk Assessment: Chemical effects on Populations, Ecosystems, and Landscapes*. Lewis Publishers, Boca Raton, FL, USA. 302 p.

[2] Park R.A. & Clough J.S., 2004. *AQUATOX (RELEASE 2). Modeling environmental fate and ecological effects in aquatic ecosystems. Volume 2: Technical documentation*. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water, Office of Science and Technology, Washington DC. 210p.

[3] Brinkman et al., 1994. *Vie Milieu* 44, 29-37.
Session 5

Stress toxique et
stress environnementaux
<figure><img src="image_56.png" /></figure>
# Application des isotopes stables à l'étude des conséquences des perturbations environnementales en milieu aquatique

T. Caquet, J.-M. Roussel, J. Haury et M. Roucaute

INRA, UMR EQHC, Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex

## Introduction

La mesure des teneurs en isotopes stables de certains éléments par spectrométrie de masse est de plus en plus employée pour l'étude des réseaux trophiques aquatiques [1]. Les mesures les plus utilisées sont l'enrichissement relatif en ¹³C et en ¹⁵N (exprimé en ‰) des organismes, respectivement désignés par δ¹³C et δ¹⁵N et définis de la façon suivante (les standards sont la bélemnite de Pee Dee pour le carbone et l'azote de l'air pour le second élément) :

$$ \delta^{13}C = \left[ \frac{(^{13}C/^{12}C)\text{organisme}}{(^{13}C/^{12}C)\text{standard}} - 1 \right] \times 1000 \quad \text{et} \quad \delta^{15}N = \left[ \frac{(^{15}N/^{14}N)\text{organisme}}{(^{15}N/^{14}N)\text{standard}} - 1 \right] \times 1000 $$

La mesure de l'enrichissement en isotope stable de certains éléments permet en théorie de reconstituer le flux d'énergie depuis les producteurs primaires jusqu'aux consommateurs secondaires, d'identifier les ressources alimentaires utilisées par un consommateur (phytoplancton, macrophytes, proies présentes localement ou apports exogènes, etc.) et le niveau trophique auquel il appartient, les isotopes les plus légers étant préférentiellement éliminés par les consommateurs. L'analyse de la signature isotopique peut ainsi permettre la mise en évidence d'une modification de la longueur des réseaux trophiques (diminution de δ¹⁵N pour les organismes situés au plus haut niveau du réseau si celui-ci est plus court) ou bien d'identifier des modifications de leur architecture générale suite à une perturbation.

Les travaux présentés ici portent sur la caractérisation, à l'aide de la mesure du δ¹³C et du δ¹⁵N, de la réponse de communautés d'invertébrés aquatiques à deux types de perturbations (contamination par un pesticide et par des nutriments issus d'activités d'élevage), dans deux contextes environnementaux différents (mésocosmes lentiques et cours d'eau, respectivement).

## 1. Effets d'un herbicide et d'un mélange herbicide-adjuvant de pulvérisation sur des réseaux trophiques aquatiques expérimentaux

Les études en mésocosmes, soutenues dans le cadre du programme 'Pesticides' du Ministère de l'Écologie et du Développement Durable et par l'ACI Écologie Quantitative, ont été réalisées sur la plate-forme expérimentale de l'Unité Expérimentale Écologie et Écotoxicologie Aquatique (U3E) de l'INRA de Rennes. Le dispositif comprenait 12 mésocosmes rectangulaires d'un volume utile de 18 m³. Le scénario retenu était celui correspondant à la contamination non-intentionnelle d'un écosystème lentique par un herbicide, le fomesafen, appliqué à la dose moyenne d'emploi au champ, seul ou en mélange avec un adjuvant de pulvérisation, l'Agral 90, en respectant le rapport des concentrations préconisé par le fabricant de l'herbicide. Les concentrations nominales correspondantes étaient de 40 µg/L pour le fomesafen et de 90 µg/L pour l'Agral 90.
L'analyse de larves de notonecte, des insectes prédateurs, a permis de mettre en évidence des modifications significatives de signature isotopique (et donc vraisemblablement de régime alimentaire) entre les différents stades larvaires d'une part, et entre mésocosmes témoins et traités d'autre part (Fig. 1). La contamination par le mélange a entraîné une diminution de la valeur de $\delta^{15}$N et de $\delta^{13}$C par rapport aux témoins. La contamination par l'herbicide seul a uniquement entraîné une diminution de la valeur de $\delta^{13}$C par rapport aux témoins [2].

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure 1.** Valeurs moyennes (± erreur standard) de l'enrichissement en isotopes stables du carbone ($\delta^{13}$C) et de l'azote ($\delta^{15}$N) pour les différents stades larvaires de Notonectidae prélevés dans les mésocosmes témoins, contaminés par le fomesafen seul et par le mélange fomesafen + Agral 90.</figcaption></figure>

Les deux traitements ont eu des effets directs et indirects sur la structure du phytoplancton [3] qui ont pu avoir des conséquences sur la valeur de $\delta^{13}$C. L'herbicide seul n'a pas eu d'effet sur le zooplancton, alors que le mélange a entraîné une diminution de l'abondance des Calanides, accompagnée d'une augmentation de celle de leurs compétiteurs (rotifères, nauplii de Cycloporidés). La baisse de la valeur de $\delta^{15}$N chez les notonectes dans les mésocosmes contaminés par le mélange pourrait découler d'une augmentation de la contribution des rotifères, qui présentent souvent une valeur de $\delta^{15}$N inférieure à celle des Crustacés, au régime alimentaire des notonectes ou à celui de leurs proies (adultes de Cycloporidés par exemple).

## 2. Mise en évidence de l'incorporation d'azote d'origine anthropique dans des réseaux trophiques lotiques

Une étude, financée dans le cadre des projets fléchés du Département Hydrobiologie et Faune Sauvage, a été réalisée en 2002 sur un affluent du Scorff (Morbihan), le ruisseau de Pont-Houarn, dont le bassin versant est classé en Zone d'Excédent Structurel (ZES ; plus de 170 kg de N organique épendable/ha/an). L'étude avait pour objectif de mettre en évidence l'existence d'apports éventuels d'azote d'origine animale et leurs conséquences sur les réseaux trophiques (producteurs primaires, macro-invertébrés, poissons) du ruisseau et du Scorff, grâce à la mesure du $\delta^{15}$N pour des organismes appartenant à différents niveaux trophiques (producteurs primaires, macro-invertébrés, poissons). Les déjections animales, et notamment le lisier de porc, présentent en effet une valeur de $\delta^{15}$N plus élevée que celle des sources naturelles d'azote [4]. Des stations réparties le long du ruisseau (d'amont en aval : stations AA, A, C et E) et sur le Scorff après la confluence des deux cours d'eau (station F) ont été échantillonnées en mai et septembre. Seuls les résultats obtenus pour les macro-invertébrés sont présentés ici.

Les valeurs de $\delta^{15}$N sont élevées dans toutes les stations, y compris pour des organismes herbivores (larves de Baetidae), ce qui indiquerait une contamination générale des réseaux trophiques par des apports d'azote liés à des épandages.
Lorsque les résultats obtenus sont regroupés par station, il est possible de mettre en évidence un gradient de δ¹⁵N entre l'amont et l'aval du ruisseau en mai (Fig. 2). En septembre, le gradient est inversé (la station A est celle où la valeur de δ¹⁵N est maximale). Des épandages ont sans doute été réalisés dans la partie amont du bassin versant entre les deux dates. Dans ces conditions, la station située la plus en amont (AA) constituerait la meilleure référence, même si est, elle-aussi, contaminée.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 2.** Valeurs moyennes (± erreur standard) de l'enrichissement en isotopes stables du carbone (δ¹³C) et de l'azote (δ¹⁵N) mesurés sur les macro-invertébrés benthiques échantillonnés dans les différentes stations en mai (symboles pleins) et en septembre 2002 (symboles ouverts).</figcaption></figure>

L'analyse détaillée des données a montré que l'enrichissement en azote d'origine anthropique était particulièrement important pour les larves d'Éphéméroptères herbivores (Baetidae et Heptageniidae) et de Trichoptères suspensivores (Hydropsychidae). Une partie de l'azote est vraisemblablement incorporée dans les biofilms dont se nourrissent les larves d'Éphéméroptères. Une fraction significative pourrait aussi parvenir au ruisseau en étant associée à des particules, lesquelles seraient captées par les larves d'Hydropsychidae. Aucun enrichissement n'a été observé en revanche pour les Gammaridae qui se nourrissent essentiellement à partir des apports de litière en provenance des berges.

## Conclusion

Ces résultats soulignent l'intérêt de l'utilisation de la mesure du degré d'enrichissement en isotopes stables du carbone et de l'azote pour l'étude des réponses des communautés de macro-invertébrés et des réseaux trophiques vis-à-vis de perturbations variées :

- En mésocosme, les effets de xénobiotiques sur la structure des communautés planctoniques se traduisent par des modifications des ressources alimentaires disponibles pour certains macro-invertébrés. Les prédateurs tels que les notonectes semblent constituer de bons organismes modèles pour ce genre d'étude. Toutefois, des travaux complémentaires sont encore nécessaires avant de pouvoir conclure sur la pertinence de cet outil en écotoxicologie.

- En milieu naturel, les apports d'azote par épandage de déchets d'élevage sont essentiellement mis en évidence par une augmentation du δ¹⁵N des consommateurs primaires qui se nourrissent de biofilms. Le caractère fortement anthropisé du système étudié rend toutefois difficile l'utilisation de l'outil isotopique dans ce type d'écosystème, la contamination étant importante depuis la tête du bassin versant.

## Références bibliographiques

[1] Van der Zanden & Rasmussen, 2001. *Limnol. Oceanogr.* 46, 2061-2066.

[2] Caquet T., 2006. *Environ. Pollut.* 141, 54-59.

[3] Caquet T. et al., 2005. *Environ. Toxicol. Chem.* 24, 1116-1124.

[4] Karr et al., 2003. *Agr. Ecosyst. Environ.* 95, 103-110.
# Élaboration et validation d'un indice d'état biologique des sols

S. Barray<fnref n="1" />, K. Laval<fnref n="2" />, M. Legras<fnref n="2" />, C. Mougin<fnref n="3" />, S. Taibi<fnref n="4" /> et D. Tessier<fnref n="3" />

## Contexte

L'analyse de l'influence respective des facteurs anthropiques (pratiques agricoles) et environnementaux (apports de contaminants) sur l'état du sol et son fonctionnement biologique, passe dans les agrosystèmes par une étape de modélisation. Cette dernière implique la connaissance de la structure des sols (composition, richesse, abondance relative des populations) et des facteurs biotiques (compétition entre espèces, prédation...) ou abiotiques (nutriments biodisponibles, oxygénation, température, pH, pollutions...) qui les régulent.

La composante microbiologique assure en grande partie les fonctions biologiques d'un sol. La mise au point de bioindicateurs microbiens nécessite tout particulièrement une démarche méthodologique pluridisciplinaire et l'établissement de référentiels permettant de valider ces outils à des fins prédictives et/ou rétrospectives, et donc de pallier les biais méthodologiques relatifs à chacune des méthodes. En effet, la problématique de développement de bioindicateurs est confrontée à deux niveaux de régulation : (1) variabilité, sensibilité, robustesse du bioindicateur lui-même (organisme ou communautés d'organismes), mais aussi (2) validité de la variable descriptive de cet indicateur (méthode et méthodologie). Ainsi, le compartiment microbien peut être décrit par des variables dont les réponses suivent des fonctions mathématiques spécifiques de chaque bioindicateur mais aussi de la méthodologie employée pour déterminer la variable descriptive correspondante.

## Objectifs

Les objectifs généraux du projet consistent en :

- L'établissement d'un indice d'état biologique du sol qui devrait permettre a minima une classification hiérarchique de l'impact relatif des pratiques agricoles (de l'impact du travail du sol à l'impact des intrants phytosanitaires et autres polluants) selon un modèle comparable à un indice de qualité de l'air.

- Une analyse critique des différentes variables descriptives au travers d'une analyse comparative et intégrative des approches permettant d'accroître les connaissances fondamentales concernant les relations structure/fonctions.

- La mise au point et/ou la validation de nouvelles technologies pour l'évaluation des communautés microbiennes telluriques.

- La mise en perspective des résultats au regard des propriétés des sols d'ordre physique, chimique et physico-chimique, révélatrices de contextes pédoclimatiques, et par delà de fonctionnement des sols sous différents modes de gestion. Ceci devrait permettre de donner aux indices précédents une portée générale.

<footnote n="1">¹Laboratoire de Microbiologie du Froid, Université de Rouen, 76281 Mont-Saint-Aignan Cedex</footnote>

<footnote n="2">²Laboratoire BioSol, ESITPA, 13 rue du Nord, 76000 Rouen</footnote>

<footnote n="3">³INRA, Unité PESSAC Physico-chimie et Écotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex</footnote>

<footnote n="4">⁴LAMSAD, ESITPA, 13 rue du Nord, 76000 Rouen</footnote>
## Matériels et méthodes

Dans un premier temps, nous mesurons 45 variables physico-chimiques et biologiques sur des échantillons provenant de 2 sites (incluant prairies et grandes cultures) afin de tester la variabilité des descripteurs au champ, en fonction de l'usage du sol et du climat. Dans un second temps, les sols (provenant d'un des deux sites) sont mis en cosmes sans déstructuration, puis incubés en extérieur à l'INRA de Versailles en présence de polluants. Les variables descriptives sont mesurées au cours du temps (1 semaine ; 5 semaines ; 2 mois) dans les cosmes mais également dans les parcelles de référence. La mise en relation mathématique de l'ensemble des résultats est en cours.

## Résultats

### Expérimentations au champ

Les premières analyses statistiques intégrant l'ensemble des paramètres ont permis de mettre en évidence que la variabilité intra-parcellaire est plus élevée en sols de prairie qu'en sols de grande culture. Elle est plus élevée sur le site de Saint George que sur le site d'Yvetot, mais demeure modérée à l'échelle mesurée. Pour la majorité des variables, l'effet "pratique culturale" domine sur les effets "date (climat)" et "site", ce qui permet d'envisager l'élaboration d'un indice d'état biologique des sols sensible aux activités anthropiques et indépendant de l'évolution naturelle des sols (applicable dans le cadre de sols limoneux du Nord Ouest de la France).

Ces premiers résultats ont donc permis d'établir des valeurs caractéristiques en sols de référence : prairies / grandes cultures. Les variables biologiques en sols de prairie étant en moyenne trois fois supérieures à celles observées en grande culture, l'impact écotoxicologique d'un apport de polluants devra être évalué en considérant la nature différente de ces situations.

Cette approche multidisciplinaire permet d'établir les relations entre les différentes variables. Ainsi les régressions multiples donnent accès à l'estimation d'une variable par une combinaison mathématique des autres variables mesurées (première étape de réflexion dans une démarche de modélisation), les corrélations relient les activités enzymatiques exprimées aux différents compartiments microbiens.

### Expérimentations en cosmes

L'impact des polluants est évalué en maintenant la quantification de l'ensemble des variables descriptives, dans des cosmes prenant en compte les deux pratiques culturales de référence (prairie permanente et grande culture) pour le site d'Yvetot où la conduite des prairies est plus représentative des pratiques actuelles. Les cosmes ont été traités par le sulfate de cuivre à deux concentrations, représentatives pour l'une d'un usage en culture légumière (2 ppm) et pour l'autre d'une utilisation en viticulture (200 ppm).

Des effets contrastés sont observés en fonction des paramètres par rapports aux mêmes sols non traités servant de témoins, cependant l'amplitude des variations reste toujours inférieure à la variabilité notée au champ ou encore à l'évolution propre de l'échantillon en cosme et/ou au champ.

## Conclusion

Actuellement, nos résultats suggèrent que des effets écotoxiques dans les sols sont moins marqués que des effets liés aux pratiques (labour...). Dans des systèmes non déstructurés, une éventuelle toxicité de polluants s'exprimerait peu, alors qu'elle serait plus forte après un stress physique du sol entrainant une forte activité microbienne.

Les résultats présentés ont été acquis dans le cadre du programme « Bioindicateurs » soutenu par l'ADEME. Les auteurs remercient tous les personnels qui se sont impliqués dans ces travaux.
# Caractérisation de l'écotoxicité des sols d'un site de traitement de bois avant leur phytoremédiation

M. Mench et C. Bes

INRA, UMR BIOGECO, Biodiversité, Gènes et Écosystèmes, 1 avenue des Facultés, 33405 Talence

En Aquitaine, l'industrie du bois est fort développée et compte plus de 150 entreprises, dont des sites de traitement du bois [1]. Certains sont historiquement contaminés par des produits de traitement. Caractériser l'écotoxicité de leurs sols est une étape complémentaire de l'analyse physico-chimique et un préalable avant leur éventuel assainissement par différentes techniques dont celles de phytoremédiation. Une série de sols a été collectée sur un site dont l'activité remonte au 19ème siècle. La créosote, le CuSO4 et le CCA ont été successivement utilisés dans les formulations en tant que fongicides et/ou insecticides. Fuites de fluides de traitement, lixiviats de bois traités, déchets et poussières ont disséminé les produits et sont les sources de contamination des sols. L'étude rapporte la composition des sols et les réponses de bioindicateurs terrestres exposés en microcosmes: laitue, radis, vers de terre (Dendrobaena octaedra) et limace (Arion rufus).

## Matériels et Méthodes

Les stations ont été sélectionnées à partir d'une prospection des communautés végétales en place, de photos d'archives et de témoignages d'employés. A l'aide de photos aériennes, des bâtiments détruits ont été localisés, ainsi que les infrastructures actuelles et les zones sans végétation. Les stations 1 à 4 se situent dans une ancienne zone de stockage du bois traité (les stations 1 à 3 explorées pour évaluer la variabilité spatiale ont été ensuite regroupées en une station, la 3), la 5 dans une zone en friche, la 6 près d'un stockage de poteaux, la 7 sur l'emplacement de l'ancienne usine de traitement. La station 8 correspond à une zone de stockage de piquets. La 9 est au droit d'un chemin correspondant à une ancienne voie ferrée et la 10 est un jardin potager adjacent.
Pour chaque sol, 3 kg de terre ont été prélevés dans l'horizon 0-0,25 m (Afnor AF X31-100). Les paramètres des végétaux étaient la germination (NFX 31-201) et les biomasses (ISO 11269-2) des feuilles et racines [2,3]. On a étudié d'une part, l'évitement et la mortalité des vers de terre et d'autre part, l'herbivorie et la mortalité des limaces, en microcosme et exposition chronique [2]. Les réponses des bioindicateurs ont été normalisées et traduites en classes d'écotoxicité (1 non écotoxique à 4 forte écotoxicité) par rapport à des sols témoins négatifs de même type (Arenic Udifluvent) à texture sableuse.

## Résultats - Discussion

Les sols sont sableux, avec une faible CEC à leur pH respectif qui varie de 5,5 (P10) à 8,2 (P8) (Tab. 1). Le sol P10 n'a reçu que des retombées atmosphériques. Des empierrements calcaires ont été réalisés pour faciliter le transport du bois aux P8 et P9. Des sols (e.g. P3, P4, et P6) ont une teneur moindre en matière organique. Les diagnostics de danger et de contamination, par rapport au fonds pédogochimique des sols sableux français [4] établissent Cu comme contaminant majeur, parmi les composés inorganiques recherchés, dans tous les horizons de sol de surface. Sa concentration dans P3 et P7 excède 456 et 813 fois la valeur
médiane des sols sableux français. Le Cu migre souvent peu vers les horizons profonds [5]. La valeur seuil d'investigation de Baize [4], i.e. 35 mg Cu kg⁻¹, est dépassée. La contamination en surface reflète plus les formulations au CuSO₄. Le chrome et As (sauf au P8) sont au niveau du fonds pédogéochimique. Cr(VI) et As(V) ont pu migrer en profondeur. Selon l'équation de Sauvé [6], pCu²⁺ varierait entre 7,1 (P6) et 11 (P8). La solution du sol serait une source d'exposition des racines au Cu. Les concentrations prédites sans effet négatif (PNEC) sont également dépassées pour le pyrène et le benzo[a]pyrène au P3.

<table><caption>**Tableau 1.** Caractéristiques physico-chimiques des sols.</caption><thead><tr><th>Sols</th><th>P3</th><th>P4</th><th>P5</th><th>P6</th><th>P7</th><th>P8</th><th>P9</th><th>P10</th></tr></thead><tbody><tr><td>C org (g/kg)</td><td>9,2</td><td>10,1</td><td>11,6</td><td>9,6</td><td>15,7</td><td>9,4</td><td>17,6</td><td>19,6</td></tr><tr><td>N total (g/kg)</td><td>0,53</td><td>0,70</td><td>0,83</td><td>0,41</td><td>0,62</td><td>0,43</td><td>0,56</td><td>1,04</td></tr><tr><td>C/N</td><td>17,2</td><td>14,4</td><td>13,9</td><td>23,5</td><td>25,1</td><td>21,9</td><td>31,5</td><td>18,9</td></tr><tr><td>MO (g/kg)</td><td>15,9</td><td>17,4</td><td>20</td><td>16,7</td><td>27,2</td><td>16,2</td><td>30,4</td><td>33,9</td></tr><tr><td>CEC (cmol⁺/kg)</td><td>3,5</td><td>5,2</td><td>5,0</td><td>2,1</td><td>1,9</td><td>4,5</td><td>3,4</td><td>6,0</td></tr><tr><td>pH</td><td>7,0</td><td>7,7</td><td>6,7</td><td>6,1</td><td>7,0</td><td>8,2</td><td>7,9</td><td>5,5</td></tr><tr><td>As (mg/kg)</td><td>9,8</td><td>12,1</td><td>20,2</td><td>14,4</td><td>26,3</td><td>52,8</td><td>12,6</td><td>11,6</td></tr><tr><td>Cr (mg/kg)</td><td>23</td><td>24</td><td>26</td><td>22</td><td>31</td><td>87</td><td>20</td><td>28</td></tr><tr><td>Cu (mg/kg)</td><td><strong>1460</strong></td><td><strong>260</strong></td><td><strong>65</strong></td><td><strong>536</strong></td><td><strong>2600</strong></td><td><strong>185</strong></td><td><strong>2390</strong></td><td><strong>118</strong></td></tr><tr><td>Ni (mg/kg)</td><td>5</td><td>5,58</td><td>5,18</td><td>5,7</td><td>7,11</td><td>6,81</td><td>12,3</td><td>7,02</td></tr><tr><td>Zn (mg/kg)</td><td>46</td><td>59,7</td><td>31,8</td><td>21,4</td><td>57,7</td><td>37,8</td><td>65,5</td><td>67,8</td></tr><tr><td>Co (mg/kg)</td><td>2</td><td>2,09</td><td>2</td><td>1,73</td><td>2,46</td><td>2,44</td><td>4,39</td><td>2,95</td></tr><tr><td>Σ7 PCB (mg/kg)</td><td>&lt;0,035</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B[a]P (mg/kg)</td><td>0,64</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCu²⁺ (µM)</td><td>7,6</td><td>10,1</td><td>9,7</td><td>7,1</td><td>7,2</td><td>11,1</td><td>8,6</td><td>7,5</td></tr></tbody></table>

La teneur en Cu du sol n'influe pas significativement sur le temps de résidence des limaces sur le sol ou leur mortalité, mais affecte leur comportement alimentaire (p=0,009) (Fig. 1). Le taux d'herbivorie est réduit pour les sols 6, 3 et 7 ayant les faibles pCu²⁺ (Fig. 1a, Tab. 1). Le sol 7 occasionne la mortalité la plus rapide des limaces. Des tests sur limaces montrent que Cu agit comme un repoussant et est létal pour elles [7].

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Figure 1.** Pourcentage de laitue consommée (a) par les limaces et mortalité (b) en fonction de la station (EC50: nombre de jours pour obtenir 50 % de mortalité des limaces)</figcaption></figure>

La contamination en Cu affecte (p<0,001) le comportement des lombrics. Ils se localisent toujours dans les sols les moins contaminés et évitent le contact dermal et/ou d'ingérer les sols à faible pCu²⁺ (P3, P6, et P7) (Fig. 2). Les vers de terre éviteraient les sols avec des apports anthropiques de Cu même aux faibles concentrations (4 mg Cu kg⁻¹ sol) ; aux concentrations supérieures à 600 mg Cu kg⁻¹ sol, l'évitement atteint 100 % [8].

La germination des laitues (p=0,02), les biomasses (MS) des feuilles de radis (p<0,001, Fig. 3a) et des racines de radis (p<0,01, Fig. 3b) diffèrent selon les sols, mais pas la germination des radis, ni la biomasse des feuilles de laitues. Les sols 7, 6 et 3 sont les plus phytotoxiques.
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**Figure 2.** Nombre moyen de lombrics présents selon les sols (3 réplications). Les histogrammes surmontés de lettres différentes sont significativement différents.</figcaption></figure>

<table><caption>**Tableau 2.** Moyenne des classes d'écotoxicité des sols.</caption><thead><tr><td>Station</td><td>Moyenne des classes</td><td>Rang</td></tr></thead><tbody><tr><td>10</td><td>1.85</td><td>1</td></tr><tr><td>8</td><td>2.00</td><td>2</td></tr><tr><td>4</td><td>2.40</td><td>3</td></tr><tr><td>5</td><td>2.50</td><td>4</td></tr><tr><td>1</td><td>2.57</td><td>5</td></tr><tr><td>2</td><td>2.57</td><td>5</td></tr><tr><td>9</td><td>2.57</td><td>5</td></tr><tr><td>3</td><td>3.00</td><td>8</td></tr><tr><td>6</td><td>3.20</td><td>9</td></tr><tr><td>7</td><td>3.80</td><td>10</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>**Figure 3.** Biomasse de matière sèche (MS) des feuilles (a) et des racines (b) des radis selon les sols.</figcaption></figure>

Le sol 8, assez écotoxique pour les 2 invertébrés, est moins phytotoxique pour les radis et les laitues. Schultz *et al.* [9] rapportent une moindre germination des laitues à 2330 mg Cu kg⁻¹ sol et Chen *et al.* [10], l'inhibition de la biomasse du radis par des sols contaminés mais pas celle de leur germination.

La moyenne des valeurs des classes d'écotoxicité relatives aux variables des tests ordonne les sols selon leur écotoxicité (Tab. 2). Le sol 7 est le plus écotoxique. Si l'on excepte ce dernier, une corrélation linéaire (r² = 0,72) existe entre pCu²⁺ calculé (Tab. 1) et l'écotoxicité de chaque sol (Tab. 2). Celle-ci est moins reliée à la teneur totale en Cu du sol. L'organisation des communautés végétales sur le site montre une richesse spécifique plus faible pour les stations 7 et 3, et conforte les tests de phytotoxicité. La restauration de la croissance de haricots sur le sol phytotoxique P7, après un amendement alcalin et/ou de matière organique, suggère le pH et les teneurs en matière organique et Cu comme des facteurs contrôlant l'exposition des racines au Cu²⁺ via la solution de sol et l'écotoxicité des sols étudiés.

Références bibliographiques

[1] www.industrie.gouv.fr/sessi/index.htm.

[2] Bes, 2005. Phytostabilisation assistée d'un site contaminé au CCA: Caractérisation de l'écotoxicité du site, choix des amendements et implantation d'espèces végétales tolérantes. Mastère II Modélisation et fonctionnement des écosystèmes terrestres, Université Bordeaux I, UFR des Sciences Biologiques. 39 p.

[3] Mench *et al.*, 2005 1st Scientific Workshop and Management Committee Meeting, Phytotechnologies to promote sustainable land use and improve food safety, Cost 859, 14-16 June 2005, CNR Research Campus, Pisa, Italy.

[4] Baize, 1997. Un point sur les teneurs totales des éléments traces métalliques dans les sols (France), Paris.

[5] Lepp *et al.*, 1997. *Environ. Pollut.* 95, 363-369.

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[8] Zwieten *et al.*, 2004. Review of impacts on soil biota caused by copper residues from fungicide application. p 8 *In Sydney* (ed.), Supersoil 2004, Sydney, Australia.

[9] Schultz *et al.*, 2004. *Sci. Total Environ* 326, 71-84.

[10] Chen *et al.*, 2002. *Plant Physiol. Biochem.* 40, 439-444.
Session 6

Bioremédiation
et bioprocédés
<figure><img src="image_62.png" /></figure>
# Phytotoxicité d'un sol contaminé par des produits de traitement du bois après un amendement pour stabiliser des contaminants

C. Bes et M. Mench

INRA, UMR BIOGECO, Biodiversité, Gènes et Écosystèmes, 1 avenue des Facultés, 33405 Talence

Des concentrations élevées en Cu, atteignant jusqu'à 2 600 mg Cu kg⁻¹, se sont accumulées dans les horizons de surface des sols d'un site de traitement du bois par imprégnation, exploité depuis le 19ème siècle. De la créosote, du CuSO₄ et du CCA (arséniate de cuivre chromé) ont été successivement utilisés dans les formulations. Fuites de fluides de traitement, lixiviats de bois traités, déchets et poussières ont disséminé les produits et sont les sources de contamination des sols. La remédiation des sols les plus contaminés et écotoxiques de ce site par la technique de phytostabilisation aidée comprend une première étape de stabilisation des contaminants par un amendement. L'hypothèse est de rendre les contaminants moins solubles en favorisant dans le sol des réactions d'adsorption, d'échange d'ions et/ou de sorption avec des oxydes et hydroxydes (Fe, Mn, Al) [1,2]. Plusieurs mécanismes sont possibles pour immobiliser le Cu de la solution du sol. Sous sa forme soluble, Cu²⁺ a une affinité pour l'oxygène et donc se lie avec les oxydes, hydroxydes de la matière organique [3], avec les phosphates [4], avec les oxydes de Fe et de Mn [5]. La concentration en Cu dans la solution du sol et donc l'exposition des racines passe par un minimum lorsque le pH croît, puis réaugmente sous l'effet de la solubilité des complexes organiques [6]. Ces mécanismes n'ayant pas la même efficacité selon les sols, nous les avons testés en vases de végétation. L'efficacité de la stabilisation peut être évaluée par différents bioindicateurs dont des récepteurs végétaux tels que le haricot qui est sensible à la contamination. On présente l'évolution de la phytotoxicité d'un sol contaminé par des composés issus du traitement du bois (Cu, As, HAP) après l'apport d'amendements susceptibles d'immobiliser Cu et As et/ou de faciliter la biodégradation des HAPs.

## Matériels et Méthodes

Le sol P7, contaminé en Cu, est un sol sableux de Graves (Arenic Udifluvent) issu d'un site girondin d'imprégnation du bois (Tab. 1). Un sol de jardin non contaminé est utilisé comme contrôle négatif. Les amendements utilisés sont (en % par rapport au sol séché à l'air) : grenailles d'acier (ZVIG) (1 %), compost (C, 5 %), tourbe (5 %), beringite (B) (5 %), sépiolite (SEP, 5 %), silicates de Fe:Mn (0,25 et 0,5 %), MgSO₄, MnSO₄ et oxyde de calcium (CaO) (0,05, 0,1, et 0,3 %). Ces amendements sont apportés seuls ou en combinaison avec 1 % ZVIG. Après mélange par rotation, les sols sont placés en pots plastiques de 1 kg, réhydratés à 50 % de la capacité de rétention avec de l'eau distillée et placés en chambre climatique. Pour les traitements combinés avec 1 % ZVIG, l'apport du second amendement est effectué au bout de 2 semaines. Enfin après 2 autres semaines, chaque pot reçoit 20 mL d'une solution rhizosphérique (obtenue par agitation de la même quantité d'eau distillée et de sol rhizosphérique, issu du secouage de racines de trèfle blanc cultivé sur une parcelle de référence, et récupération du surnageant). La phytotoxicité est déterminée par le test PlantTox avec Phaseolus vulgaris L, cv. vroege Limburgs [7]. Les haricots sont cultivés en pots placés en chambre climatique avec les conditions suivantes: 14 h jour/8 h nuit, 150 µmol m⁻² s⁻¹, 25°C/22°C, 65 % d'humidité relative. Le développement des plantes a été quotidiennement noté avec un indice. Des paramètres biométriques (indice de croissance,
biomasses des organes: parties aériennes, feuilles primaires et racines, nombre de nodules sur racines), biochimiques (densités de chlorophylles et caroténoïdes, activité gaiacolperoxydase des feuilles comme indicateur de stress oxydant) et les concentrations des éléments majeurs et traces dans les feuilles primaires sont déterminés au bout de 2 semaines.

<table><caption>Tableau 1. Caractéristiques des sols utilisés.</caption><thead><tr><th></th><th>Pierroton</th><th>P7</th><th>Fonds pédogéochimique<br>sols sableux français [8]</th></tr></thead><tbody><tr><td>sables (%)</td><td>93</td><td>86</td><td></td></tr><tr><td>C/N</td><td>25,9</td><td>25,1</td><td></td></tr><tr><td>Matière organique (g/kg)</td><td>33,7</td><td>27,0</td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>6,8</td><td>6,4</td><td></td></tr><tr><td>CEC (cmol/kg)</td><td>5,9</td><td>1,9</td><td></td></tr><tr><td>As (mg/kg)</td><td></td><td>26,3</td><td>1,0 - 25</td></tr><tr><td>Cr total HF (mg/kg)</td><td>6,7</td><td>31</td><td>14,1 - 40,2</td></tr><tr><td>Cu total HF (mg/kg)</td><td>3,5</td><td>2600</td><td>3,2 - 8,4</td></tr><tr><td>Fe total HF (mg/kg)</td><td>1090</td><td>9060</td><td>6000 - 14300</td></tr><tr><td>Zn total HF (mg/kg)</td><td>10,3</td><td>58,0</td><td>17 - 48</td></tr></tbody></table>

## Résultats – Discussion

Les modifications de pH (Tab. 2), les réactions de sorption induites et/ou les phases porteuses, introduites ou développées dans le sol, aboutissent à former une série de sols avec un gradient de $pCu^{2+}$ en solution et de nutriments. D'après le pH et le Cu total, $pCu^{2+}$ devrait varier entre 6 et 9,2 µM, avec une solubilité de Cu plus élevée pour ZVIG combiné avec la tourbe et plus faible pour ZVIG combiné avec CaO.

<table><caption>Tableau 2. pH mesuré et $pCu^{2+}$ calculé selon Sauvé [6] pour les sols amendés</caption><thead><tr><th>Amendement</th><th>pH</th><th>$pCu^{2+}$ (µM)</th></tr></thead><tbody><tr><td>ZVIG (1%)+tourbe (5%)</td><td>6.03</td><td>6.06</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+MnSO<sub>4</sub></td><td>6.74</td><td>7.05</td></tr><tr><td>ZVIG (2%)</td><td>6.83</td><td>7.18</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+MgSO<sub>4</sub></td><td>6.96</td><td>7.36</td></tr><tr><td>non traité</td><td>7.01</td><td>7.43</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)</td><td>7.06</td><td>7.49</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+ZVIG (1%)</td><td>7.2</td><td>7.69</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+FeMn (0,5%)</td><td>7.38</td><td>7.94</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+FeMn (0,25%)</td><td>7.61</td><td>8.27</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+SEP (5%)</td><td>7.79</td><td>8.52</td></tr><tr><td>Contrôle</td><td>7.84</td><td>8.59</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+B (5%)</td><td>8.14</td><td>9.01</td></tr><tr><td>ZVIG (1%)+CaO (0,1%)</td><td>8.27</td><td>9.19</td></tr></tbody></table>

La contamination du sol non traité abaisse de 77 % la biomasse des parties aériennes du haricot par rapport au sol contrôle (Fig. 1). L'apport d'amendement et la diminution de Cu dans la solution du sol permettent de restaurer la biomasse des parties aériennes sauf pour les traitements ZVIG+tourbe, ZVIG+FeMn 0,25 et ZVIG (2 %). Les 3 traitements les plus bénéfiques à la biomasse des parties aériennes sont les combinaisons de ZVIG avec la béringite, MgSO$_4$ et la sépiolite. L'effet n'est pas seulement dû au pH si l'on compare avec CaO. Le fractionnement de l'apport de grenailles accroît leur efficacité. L'effet des matières organiques diffère selon leur nature. L'apport de tourbe combiné à ZVIG a la moindre efficacité, tandis que l'apport d'un compost de fumier de cheval, combiné à ZVIG (1 %) ou ZVIG (1 %+ 1 %), rétablit la croissance au niveau du sol contrôle (i.e. g MF/ plante, C+ZVIG 2,67 ± 0,67, C+ZVIG (1 %+1 %) 3,33 ± 0,36, contrôle 3,22 ± 0,34). Les résultats sont similaires pour les racines. Les concentrations en Cu des feuilles primaires varient de 8 à 324 mg kg$^{-1}$ MS et excèdent les seuils de phytotoxicité dans les feuilles du haricot (15-30 mg Cu kg$^{-1}$ MS [9]) dans 7 des sols. L'activité GuPx des feuilles primaires s'inscrit dans
l'intervalle 0,9 – 1,45 fois par rapport au sol contrôle, sans relation dose-effet avec l'imprégnation en Cu. Elle augmente pour le traitement silicates de Fe:Mn avec l'accumulation de Mn dans les feuilles primaires (Fig. 2a) et indique un stress oxydant. L'inhibition de l'allongement des cellules par Cu fait croître la densité de chlorophylle totale (Fig. 2b) et des caroténoïdes totaux (« bronzing »).

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>**Figure 1.** Biomasse des parties aériennes des haricots et $pCu^{2+}$ calculé [6].</figcaption></figure>

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>**Figure 2.** Activité GuPx (a) et densité de chlorophylle (b) dans les feuilles primaires.</figcaption></figure>

La concentration en P des feuilles primaires varie de 1,6 à 6,8 mg g⁻¹ MS. Les modifications des teneurs en Ca, Fe, Mn et Zn des feuilles ne sont pas corrélées avec leur imprégnation en Cu. Elles reflètent l'évolution de biomasse et la nature des amendements. Les mécanismes de sorption de Cu par la bêringite, la sépiolite ou le compost combiné à ZVIG permettent de restaurer la croissance du haricot mais leur persistance et effets sur d'autres récepteurs biotiques et abiotiques sont à étudier en parcelles sur le long terme.

Références bibliographiques

[1] Williford *et al.*, 2001. Physical separation of metal- contaminated soils. pp. 121-166 in I.K. Iskandar (ed.), Environmental restoration of metal-contaminated soils. Lewis publishers.

[2] Mench *et al.*, 2005. Phytostabilisation of metal-contaminated sites. pp. 109-190, in Phytoremediation of metal-contaminated soils, Morel J.L. et al (Eds.), Springer, The Netherlands.

[3] Garrido *et al.*, 2005. *Appl. Géochimie*. 20, 397-408.

[4] Maenpaa *et al.*, 2002. *Arch. Environ. Contam. Toxicol*. 43, 389-398

[5] Kumpiene *et al.*, 2006. *Environ. Pollut*. 144 (in press).

[6] Sauvé, S., 2003. Modelling trace element exposure and effects on plants. pp. 69-70. *In* Risk assessment and sustainable land management using plants in trace element-contaminated soils, M Mench, B Mocquot (Eds.), Cost Action 837, 4th WG2 Workshop, Bordeaux'2002, INRA, Centre Bordeaux-Aquitaine, Villenave d'Ornon, France.

[7] Ruttens *et al.*, 2006. *Environ. Pollut.* (in press).

[8] Baize, D. 1997. Un point sur les teneurs totales des éléments traces métalliques dans les sols (France), Paris.

[9] MacNicol & Beckett, 1985. *Plant Soil* 85, 107-129.

Les auteurs remercient l'Ademe, Département sites et sols pollués, Angers et le Conseil Régional d'Aquitaine.
# Traits fonctionnels d'espèces d'intérêt (Sporobolus tenacissimus, Carex praecox, Amorpha fruticosa, et Agrostis capillaris), pour phytoremédier des sols contaminés sur un site de traitement du bois

M. Mench<fnref n="1" />, H. Gasté<fnref n="1" />, J. Taberly<fnref n="1" />, M. Aulen<fnref n="1" /> et S. Gawronski<fnref n="2" />

Les sols de sites contaminés sont des sources d'exposition aux contaminants qui peuvent être assainies par des techniques de génie civil, de la physico-chimie ou des sciences de la vie. Les biotechnologies basées sur les plantes et micro-organismes associés, i.e. phytoremédiation, relèvent de la dernière catégorie. Leur efficacité s'affirme pour décontaminer des sols (phytoextraction, phytodégradation) ou diminuer une source d'exposition comme la solution du sol (phytostabilisation) [1]. Cependant des domaines d'investigation restent ouverts tels le choix et l'amélioration du matériel végétal, notamment des plantes natives de sites contaminés. Dans cette étude, de la créosote, du CuSO₄ et du CCA (arséniate de cuivre chromé) ont été successivement utilisés pour traiter du bois sur un site. Fuites de fluides de traitement, lixiviats de bois traités, déchets et poussières ont disséminé les produits et contaminé les sols en surface jusqu'à 2600 µg Cu g⁻<fnref n="1" />. L'objectif est de connaître l'aptitude de 4 espèces végétales à phytostabiliser les contaminants et à faciliter la revégétalisation. Les traits fonctionnels en réponse à l'exposition au Cu sont étudiés sur des espèces herbacées natives, *Sporobolus tenacissimus*, *Carex praecox* et *Agrostis capillaris*, et un ligneux, *Amorpha fruticosa*, en comparant des biotypes d'origine métallicoles et non-métallicoles. Ces espèces d'intérêt sont cultivées en pots sur une série de sols à l'exposition en Cu croissante.

## Matériels et Méthodes

Le sol non contaminé est un podzol sableux de lande forestière humide (INRA Pierroton, Cestas), cultivée et régulièrement chaulé (Tab. 1). Le sol P7, contaminé en Cu, est un sol sableux de Graves (*Arenic Udifluvent*) issu d'un site girondin d'imprégnation du bois.

<table><caption>**Tableau 1.** Caractéristiques des sols utilisés.</caption><thead><tr><th></th><th>Pierroton</th><th>P7</th><th>Fonds pédogéochimique<br>sols sableux français [2]</th></tr></thead><tbody><tr><td>sables (%)</td><td>93</td><td>86</td><td></td></tr><tr><td>C/N</td><td>25,9</td><td>25,1</td><td></td></tr><tr><td>Matière organique (g/kg)</td><td>33,7</td><td>27,0</td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>6,8</td><td>6,4</td><td></td></tr><tr><td>CEC (cmol/kg)</td><td>5,9</td><td>1,9</td><td></td></tr><tr><td>As (mg/kg)</td><td></td><td>26,3</td><td>1,0 - 25</td></tr><tr><td>Cr total HF (mg/kg)</td><td>6,7</td><td>31</td><td>14,1 - 40,2</td></tr><tr><td>Cu total HF (mg/kg)</td><td>3,5</td><td>2600</td><td>3,2 - 8,4</td></tr><tr><td>Fe total HF (mg/kg)</td><td>1090</td><td>9060</td><td>6000 - 14300</td></tr><tr><td>Zn total HF (mg/kg)</td><td>10,3</td><td>58,0</td><td>17 - 48</td></tr></tbody></table>

Chacune des espèces végétales a été cultivée (3 réplications) sur une série de sols formant

<footnote n="1">¹INRA, UMR BIOGECO, Biodiversité, Gènes et Écosystèmes, 1 avenue des Facultés, 33405 Talence</footnote>

<footnote n="2">²Dept. Pomology and Basic Natural Sciences in Horticulture, Faculty of Horticulture and Landscape Architecture, Ul. Nowoursynowska 159, PL 02776, Warsaw, Pologne</footnote>
un gradient de contamination en Cu, obtenu par mélange de 0, 250, 500, 750 et 1000 g de sol contaminé (P7) complété à 1000 g avec le sol non contaminé. Le pH des sols est mesuré selon la norme Afnor X31-103 (Hanna Instruments pH210, électrode Ag/AgCl). Les concentrations en Cu dans chaque solution du sol, recueillie par un Rhizon MOM, ont été déterminées par ICP-AES radiale. Des plants métallicoles d'A. fruticosa de 1 an, issus d'un semis de graines provenant d'un site contaminé en Cu en Pologne [3] ont été utilisés. Agrostis capillaris, C. praecox et S. tenacissimus ont été prélevés sur le site contaminé (métallicole, M) et dans des sites non contaminés (non métallicole, NM) - Route forestière (Belin Beliet), friche à Martillac (33), bois à Gradignan (33). A. capillaris (30 mg de graines par pot), S. tenacissimus et C. praecox (3 transplants/pot), et A. fruticosa (1 transplant/pot) ont été placés 14 semaines (février - mi-mai) sous serre non chauffée à humidité régulée, en pot de 1 kg et arrosés (eau déminéralisée) tous les 1-2 jours jusqu'à 70 % de la capacité de rétention en eau. Les hauteurs des plus hauts brins, le nombre et la longueur des feuilles, le nombre de rejets ont été mesurés. Les parties aériennes ont été coupées puis pesées avant et après séchage en étuve ventilée (65°C).

## Résultats – Discussion

Le Cu total croît sur la série de sols de 3,5 à 2600 µg g⁻¹ mais le pH décroît seulement de 0,4 unité (Tab. 2). L'équation de Sauvé [4] sous-estime le Cu soluble dans la solution du sol (Tab. 2) qui varie de <0,3 à 12 µM.

<table><caption>Tableau 2. Série de sols utilisée pour le gradient d'exposition au Cu en vases de végétation</caption><thead><tr><th></th><th></th><th></th><th></th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>Sol non contaminé</td><td>100%</td><td>75%</td><td>50%</td><td>25%</td><td>0%</td></tr><tr><td>Sol contaminé (P7)</td><td>0%</td><td>25%</td><td>50%</td><td>75%</td><td>100%</td></tr><tr><td>pH du sol</td><td>6,83 ± 0,06</td><td>6,50 ± 0,08</td><td>6,40 ± 0,04</td><td>6,44 ± 0,10</td><td>6,40 ± 0,05</td></tr><tr><td>Cuivre total (µg Cu g⁻¹)</td><td>3,5</td><td>652</td><td>1301</td><td>1951</td><td>2600</td></tr><tr><td>pCu²⁺ (µM) [4]</td><td>0</td><td>0,02</td><td>0,13</td><td>0,24</td><td>0,48</td></tr><tr><td>Cu en solution du sol (µM)</td><td>&lt;0,3</td><td>3,46</td><td>4,19</td><td>12,05</td><td>10,57</td></tr></tbody></table>

**A. capillaris.** En termes de productivité, les EC 50 des biotypes NM et M sont respectivement 940 et 2275 µg Cu g⁻¹ (Fig. 1A). La densité d'individus est plus importante chez le biotype NM jusqu'à 1951 µg Cu g⁻¹. La croissance des plants M est plus performante aux fortes contaminations (> 652 µg Cu g⁻¹). La sélection sur le site contaminé conserverait des individus tolérants.

**S. tenacissimus.** La productivité des transplants NM décroît à partir de 1302 µg Cu g⁻¹ (Fig. 1B). Les transplants M présentent un optimum de croissance entre 653 et 1302 µg Cu g⁻¹. Les transplants M et NM arborent respectivement des feuilles chlorosées à partir de 1302 et 1951µg Cu g⁻¹. Le nombre moyen de brins par transplant M décline à partir de 1302 µg Cu g⁻¹ puis reste constant à 2600 µg Cu g⁻¹. Pour les NM, une baisse significative n'est observée qu'à 1951 µg Cu g⁻¹. Le nombre de rejets reste constant pour les M jusqu'à 1302 µg Cu g⁻¹ puis s'annule au-delà. Pour les NM, une diminution forte est constatée dès 1302 µg Cu g⁻¹. La hauteur du plus haut brin par transplant des M est faiblement supérieure à celle des NM pour les concentrations de 3 et 653 µg Cu g⁻¹ sol. Au-delà les deux biotypes présentent une même réponse avec une diminution à partir de 1951 µg Cu g⁻¹ sol.

**C. praecox.** Les transplants M sont moins productifs sur tout le gradient (Fig. 1C), le nombre de nouveaux rejets diminue d'un facteur 3, et la densité de chlorophylle foliaire baisse à partir de 1951 µg Cu g⁻¹. Les plantes NM sont les seules à fleurir. Le nombre d'inflorescences augmente jusqu'à 1302 µg Cu g⁻¹ puis chute. La biomasse des nouveaux rejets des NM est maximale à 1951 µg Cu g⁻¹. Cependant les biomasses initiales sont plus importantes chez les NM (2,3 fois celles des M) avec probablement des nutriments en réserves et des systèmes racinaires n'ayant pas encore accumulé de Cu.

**A. fruticosa.** La longueur et la taille des feuilles ne sont pas affectées par l'exposition croissante au Cu. Ces deux paramètres ont une forte variabilité entre les individus. Le nombre de feuilles ne varie pas par rapport au témoin pour les traitements 653, 1302 et 1951 µg Cu g⁻¹ (Fig. 1D). Il chute de 50 % pour 2600 µg Cu g⁻¹. Aucun des plants ne présente de
chlorose foliaire, ni d'épinastie. La biomasse des plantes souvent décroît à 10 µM Cu [5] et
donc *A. fruticosa* montre une bonne résistance au Cu.

Chez *A. fruticosa* exposé à Pb, la concentration en acide citrique augmente dans les racines et de l'acide malique est exsudé [6]. Ces acides organiques sont des ligands pour les métaux et auraient un rôle dans la tolérance et la détoxication [7].

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>**Figure 1.** Productivité (mg MS j⁻¹ pot⁻¹) et nombre d'individus (pointillés) par pot pour *A. capillaris* (A), productivité de *S. tenacissimus* (B) et *C. praecox* (C), et nombre de feuilles d'A. fruticosa (D).</figcaption></figure>

Des herbacées testées, la population NM de *C. praecox* a la meilleure productivité aux fortes expositions en Cu. Pour les populations métallicoles d'A. capillaris et de S. tenacissimus, la sélection irait vers des individus plus tolérants à l'exposition au Cu. A. fruticosa est un ligneux d'intérêt pour la phytostabilisation qui tolère un niveau faible de nutriments et une exposition en Cu dans la solution du sol qui devrait induire un stress oxydant. Il pourrait être une espèce pionnière servant d'abri aux autres espèces contre l'ensoleillement et fixant de l'azote, mais son caractère invasif et son potentiel allopathe sont à étudier.

Références bibliographiques

[1] Mench et al., 2005. Phytostabilisation of metal-contaminated sites. pp. 109-190, in Phytoremediation of metal-contaminated soils, Morel J.L. et al (Eds.), Springer, The Netherlands.

[2] Baize, 1997. Un point sur les teneurs totales des éléments traces métalliques dans les sols (France), Paris.

[3] Gawronski & Raczka, 2004. Lead uptake and PAHs capture by plants cultivated in urban area. p. 30. *In* Integration and application of phytotechnologies. COST 859 WG 4 Meeting, Leipzig, Allemagne.

[4] Sauvé, 2003. Modelling trace element exposure and effects on plants. pp. 69-70. *In* Risk assessment and sustainable land management using plants in trace element-contaminated soils, Mench & Mocquot (Eds.), Cost Action 837, 4th WG2 Workshop, Bordeaux'2002, INRA, Centre Bordeaux-Aquitaine, Villenave d'Ornon.

[5] Mocquot et al., 1996. *Plant Soil* 182, 287-300.

[6] Raczka et al., 2004. Heavy metals uptake and accumulation in various organs by legumes and *Arabidopsis thaliana* L. plants. p. 44. *In* Phytotechnologies to promote sustainable land use management and improve food safety. COST 859 WG 1 Meeting, Varsovie, Pologne.

[7] Clemens, 2000. *Planta* 212, 475-486.
# Mécanismes physico-chimiques d'action de l'immobilisation in situ des éléments traces dans les sols

V. Sappin-Didier et L. Denaix

INRA, UMR TCEM, Transfert Sol-Plante et Cycle des Éléments Minéraux dans les Écosystèmes Cultivés, 71 avenue E. Bourleaux, BP 81, 33883 Villenave-d'Ornon Cedex

## Introduction

Les activités anthropiques liées aux industries, mais également aux pratiques agricoles, peuvent induire une contamination des sols en éléments traces métalliques (ETM). Dans les deux cas, il convient de diminuer la quantité d'élément susceptible d'être dispersée dans l'environnement (sol, eau de surface et eaux profondes) et transférée vers les organismes vivants.

Différentes techniques peuvent être proposées pour diminuer l'exposition des organismes vivants aux ETM. Ces techniques sont classées en 3 catégories : méthodes physiques, méthodes biologiques et méthodes chimiques. Ces techniques peuvent être pratiquées *in situ* ou *ex-situ*. Les méthodes physiques sont généralement considérées comme des méthodes "dures", altérant fortement la structure physique du sol (excavation du sol, lavage sous pression, solidification) [1]. Dans les sols fortement pollués, notamment les sites industriels et aux alentours proches, ce type de méthode est applicable. Par contre dans les sols agricoles, des méthodes dites "douces" sont préférables. Ces méthodes sont destinées à éliminer les risques liés à la présence d'ETM sans détruire le sol, c'est-à-dire sans bouleverser l'activité biologique, les propriétés chimiques et la structure physique du sol. Il existe ainsi des méthodes biologiques de phytoextraction, basées sur le principe de l'utilisation de plantes capables d'accumuler des concentrations très élevées en ETM [2]. Cette technique permet ainsi de diminuer dans le sol le stock d'ETM disponible par la suite pour les plantes. Des méthodes chimiques sont également utilisées. Elles sont basées principalement sur la prise en compte du fonctionnement pédo-géochimique et la réactivité du sol. Ainsi, la technique d'immobilisation *in situ* peut être appliquée afin de diminuer le transfert sol-plante et la lixiviation des éléments traces [3-5]. Le principe de cette méthode est d'immobiliser les ETM dans le sol en modifiant leur spéciation dans le sol et la solution du sol. L'objectif de cette méthode n'est pas de décontaminer le sol mais de diminuer la quantité d'ETM dans la solution du sol, milieu où les organismes vivants du sol et notamment les végétaux prélèvent les éléments nutritifs.

Le travail présenté a pour objectif de décrire les différents mécanismes physico-chimiques pouvant être utilisé afin de modifier la spéciation et immobiliser les ETM dans le sol en fonction des types de sol et de leurs propriétés minéralogiques et chimiques.

## Immobilisation in situ

Cette méthode est basée sur la modification de la spéciation des ETM dans le sol afin de diminuer leur transfert du sol à la solution du sol. La disponibilité des ETM est déterminée par des échanges sol - solution du sol, le système sol étant en déséquilibre. L'immobilisation *in situ* consiste donc à insolubiliser les ETM dans le sol en augmentant leur rétention dans le sol. Les différents mécanismes de rétention d'ETM dans un sol sont définit sous le terme de sorption. Ce terme englobe principalement trois processus : adsorption, précipitation et fixation [6].
## Mécanismes de sorption dans le sol :

### - Adsorption

L'adsorption est une accumulation bidimensionnelle de matière à l'interface de solide/eau [7]. Concernant l'adsorption des ETM dans les sols, deux mécanismes sont généralement identifiés : l'adsorption spécifique, correspondant principalement à des liaisons chimiques fortes et irréversibles entre ETM et des matières organiques ou des minéraux à charges variables (complexe de sphère interne), et l'adsorption non spécifique (ou échange ionique), correspondant à des liaisons faibles et réversibles de type électrostatique entre un cation en solution et un autre cation sur une surface (complexe de sphère externe).

### - Précipitation

La précipitation est caractérisée par la croissance d'une nouvelle phase solide, formant un nouveau réseau à trois dimensions [7]. Les ETM peuvent précipiter sous forme d'oxyde, d'hydroxyde, de carbonates, de sulfate et de phosphate dans le sol. Ces réactions sont fonction du pH et de la quantité de cation et d'anion présent en solution.

### - Fixation (ou absorption)

La fixation est un mécanisme de sorption qui correspond à la diffusion des espèces aqueuses métallique dans une phase solide [8]. Les ETM qui sont spécifiquement adsorbés sur les minerais argileux et les oxydes peuvent diffuser dans le réseau cristallin de ces minerais. L'élément est alors fixé dans la structure minérale. Seule la dissolution du minéral permettra la libération de l'ETM.

L'adsorption est un des mécanismes chimiques les plus importants dans les sols.

## Paramètres influençant l'immobilisation des ETM dans le sol

Les échanges sol-solution des ETM sont dépendants de différents facteurs du sol comme la composition minéralogique et organique, le pH, le type et la spéciation des ions ETM impliqués. La compréhension de ces différents mécanismes et paramètres permet ainsi de dégager les solutions pour augmenter la capacité de sorption et d'immobiliser les ETM dans le sol. En agissant sur ces paramètres, il est ainsi possible de modifier la disponibilité des ETM dans le sol.

La technique généralement employée pour immobiliser les ETM dans un sol pollué est l'apport de certains amendements dans le sol afin de modifier soit la composition minéralogique et organique du sol, soit les conditions physico-chimiques du milieu.

**Apport de phase minérale ou organique :** Cette technique permet d'agir directement sur le mode de sorption. Ainsi, l'apport de minéraux ou composés organiques augmentent soit la capacité d'adsorption (minéraux argileux, oxyde et hydroxyde de fer ou de manganèse, matière organique) [9,10], soit permet la précipitation des ETM (chaulage, minéraux phosphatés comme l'hydroxyapatite) [11].

**Modification du pH :** Le pH est le paramètre qui influence le plus la solubilité des ETM dans le sol. Il joue en rôle la quantité de charges sur les composés à charges variables, sur réactions de précipitations [6].

**Rôle des ions métalliques :** la concentration ionique détermine l'intensité de la compétition entre les cations pour les sites de surface des phases solide du sol, et la présence des ligands solubles qui pourraient complexe le métal libre.

## Conclusion

Pour diminuer la concentration en ETM dans la solution du sol par la méthode d'immobilisation in situ, il est nécessaire d'avoir des informations sur le type de sol et ces propriétés pédogéochimiques, et identifier le ou les ETM responsables de la pollution. Compte tenu de ces informations, il faut ensuite choisir quel paramètre pédo-géochimique
sera modifié. Ce choix est fonction notamment de l'élément(s) que l'on souhaite immobiliser (ex : pour Pb, les traitements phosphatés sont privilégiés ; pour Cd, les traitements modifiant le pH ou d'adsorption sont souhaités ; pour Cu, les amendements organiques sont choisis). La pollution d'un sol n'est généralement pas monométallique. Il faut donc également dans les cas polymétalliques, immobiliser plusieurs ETM. Mais le choix d'un ou des amendement(s) ne doit pas seulement être raisonné en fonction de l'ETM incriminé, car il est important d'éviter de diminuer la solubilité des éléments essentiels aux végétaux [12].

Par ailleurs, même si nous avons une connaissance théorique des mécanismes de sorption des différents composés, dans un système complexe qu'est le sol, et compte tenu des interactions entre éléments et/ou les phases solides du sol, les réactions d'immobilisation des ETM dans le sol restent souvent inconnues ou difficilement prévisibles. Ainsi, certains amendements permettront de diminuer l'exposition en ETM dans certains sols, mais ceci ne sera pas le cas pour un autre type de sol.

Enfin, il y a également la question de la pérennité de l'immobilisation. Ceci peut être dû à des variations géochimiques (pH), climatiques (température, teneur en eau,...), ces variations étant liées, mais également aux réactions de sorption plus ou moins rapide et réversible. Ainsi par exemple, si l'ETM est immobilisé dans le réseau cristallin du minéral nouvellement formé après un apport, seule la dissolution du minéral permettra la libération de l'ETM.

Références bibliographiques

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# Utilisation de plantes agronomiques pour la phyto-dépollution des sols contaminés par des explosifs

M. Vila, S. Pascal-Lorber et F. Laurent

INRA, UMR Xénobiotiques, 180 chemin de Tournefeuille, BP 3, 31931 Toulouse Cedex 9

La phyto-dépollution est une technologie émergente qui consiste à utiliser les plantes pour absorber, accumuler, dégrader ou détoxiquer des polluants de diverses natures (polluants organiques ou minéraux). De par leur immobilité, les plantes sont sans cesse soumises à des contraintes environnementales qui constituent des facteurs importants dans leur adaptation et leur évolution. Beaucoup de plantes ont développé des systèmes biochimiques pour la détoxication et le contrôle des conditions géochimiques locales. S'appuyant sur ces caractéristiques, la phyto-dépollution met en œuvre divers mécanismes qui n'aboutissent pas au même traitement de la pollution (Fig. 1). La phyto-dépollution permet d'éviter l'usage de méthodes invasives et chères comme l'incinération totale des sols après excavation.

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>**Figure 1.** Représentation schématique des différents mécanismes impliqués dans la phyto-dépollution.</figcaption></figure>

La phyto-dépollution est une méthode envisagée pour la dépollution de sols contaminés par des explosifs nitrés. En effet, la pollution résultant de la production, du stockage et de l'utilisation de l'hexahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazine (RDX) et du 2,4,6-trinitrotoluène (TNT) représente un problème environnemental important. Ces composés toxiques se retrouvent
dans les sols à des teneurs très élevées. Auparavant, au cours de la production d'explosifs, les eaux usées étaient rejetées dans des bassins de décantation pour permettre la sédimentation des polluants. L'eau après cette dépollution était orientée vers les rivières avoisinantes. Il en résulte aujourd'hui des lagunes hautement contaminées par les explosifs mais aussi d'autres produits intervenants dans leur synthèse. Sur les autres sites pollués, la pollution est plus diffuse mais tout aussi préoccupante. L'utilisation de plantes agronomiques a été envisagée pour cette dépollution car elles ont une croissance rapide et peuvent produire une biomasse importante.

Des expérimentations utilisant des molécules marquées au carbone 14 ont été mises en place pour étudier les capacités des plantes agronomiques à absorber les explosifs. Des études ont aussi été menées pour connaître le devenir de ces explosifs une fois absorbés par les plantes. Les plantes testées sont le blé, le maïs, le soja et le riz. Ce dernier a été envisagé pour son adaptation à des cas de pollution sur des sites lagunaires. Les plantes ont été semées sur des sols contaminés avec 138 mg/kg avec chacun des explosifs séparément ainsi que son équivalent radiomarqué. Les pots ont été disposés dans une chambre de culture avec une alternance jour nuit de 16 h et une température de 25°C le jour et de 20°C la nuit. Après 42 jours de culture, les plantes sont récoltées, lyophilisées, broyées puis analysées pour déterminer la quantité de radioactivité dans les parties racinaires et aériennes. Une analyse en radio-CLHP (Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à la détection de la radioactivité) a permis d'étudier les transformations de chacun des explosifs après pénétration dans les plantes.

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>**Figure 2.** Principaux résultats obtenus lors de l'étude de l'absorption et du devenir du RDX (à gauche) et du TNT (à droite) dans quatre espèces végétales.</figcaption></figure>

Les quatre plantes se sont révélées capables d'absorber le RDX et le TNT (Fig. 2). Toutefois, les quantités, la répartition et le devenir de chaque explosif après absorption sont totalement différents. Le RDX est absorbé en grande quantité et plus de 80 % de la radioactivité est transférée vers les parties aériennes. Le RDX est très peu dégradé puisqu'il
représente plus de 95 % de la radioactivité absorbée. Le TNT, quant à lui, est absorbé en quantité 20 fois plus faible. Le TNT est totalement dégradé en composés plus polaires (principalement des conjugués à des sucres) qui sont ensuite stockés dans les vacuoles ou liés à la paroi au niveau des racines (plus de 60 % de la radioactivité est non extractible). Après pénétration dans la plante, le TNT est donc bloqué dans les parties racinaires et seulement 20 % de la radioactivité est transférée vers les parties aériennes.

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>**Figure 3.** Effets de l'accumulation de RDX dans les parties aériennes du blé et du soja.</figcaption></figure>

Chez le soja, le riz et le blé, la forte accumulation de RDX dans les parties aériennes provoque l'apparition de nécroses précédée d'un jaunissement des tissus aériens (Fig. 3). Ces nécroses conduisent à la chute des feuilles de soja. Ce phénomène pourrait conduire à la dispersion du polluant et à une impossibilité d'utilisation pour la phyto-dépollution du RDX. Par contre, ce phénomène est moins marqué chez les graminées qui pourraient donc être utilisées pour la phyto-dépollution. Après phyto-accumulation du RDX dans les parties aériennes, les plantes devront être récoltées puis incinérées ou compostées. Il faudra donc privilégier l'utilisation de monocotylédones pour éviter la chute des feuilles ayant accumulé le RDX. Parmi les plantes testées, le blé semble être la plus efficace.

La séquestration du TNT dans les parties racinaires ne permet pas l'usage des plantes dans un processus de phyto-accumulation suffisamment efficace pour dépolluer des sols. Toutefois, elle conduit à une phyto-stabilisation du polluant évitant sa dispersion vers les nappes phréatiques. De plus, certains micro-organismes capables de dégrader la lignine, probable site de fixation des résidus du TNT dans la paroi, pourront dégrader le polluant dans le sol après la mort du végétal.
# Devenir des composés disrupteurs endocriniens et de l'activité œstrogénique au sein d'une station d'épuration des eaux urbaines

M. Muller<fnref n="1" />, F. Rabenoelina<fnref n="2" />, N. Delgènes<fnref n="1" />, D. Patureau<fnref n="1" />, P. Balaguer<fnref n="2" /> et G. Hernandez-Raquet<fnref n="1" />

Des perturbations endocriniennes, tels que la féminisation de certaines populations de poissons, ont été observées dans l'environnement [1]. Ces perturbations ont été attribuées à la présence, dans les milieux naturels, de micropolluants organiques à caractère disrupteur endocrinien. Les composés disrupteurs endocriniens (CDE) interférent avec le système endocrinien des organismes vivants induisant des dysfonctionnements et des malformations du système reproducteur [2,3]. Dans cette étude, nous nous focalisons sur deux types de CDE : les xéno-œstrogènes du type alkylphénol, de par les gros volumes introduits dans l'environnement, et les composés stéroïdiens naturels et synthétiques, de par leur pouvoir œstrogène élevé.

Les êtres humains et, plus généralement, les animaux excrètent naturellement des œstrogènes. Les hormones synthétiques sont quant à elles utilisées dans le cadre de la contraception orale et des thérapies de remplacement hormonal. Ces molécules rejoignent les eaux usées par l'intermédiaire des urines et, dans une moindre mesure, des fèces. Les NPE sont issues de la dégradation de tensioactifs non ioniques, largement utilisés dans le secteur industriel et domestique en tant que détergent, constituant de peinture, agent de traitement des surfaces, etc. [4]. Les NPE et les œstrogènes ont été décelés dans les eaux de surface, en particulier, à proximité des sites de rejet des effluents de STEP [5,6]. Il a en effet été montré, dans de nombreux cas, que les STEP n'éliminaient pas complètement les CDE des eaux usées [7]. Les effluents de STEP constituent donc la principale voie de transfert de ces molécules vers les milieux aquatiques [8].

L'objectif de cette étude est de mieux comprendre le devenir des œstrogènes et des NPE au cours du traitement d'eau résiduaire urbaine au sein d'une STEP moderne. De plus, une attention particulière a été portée à l'aspect écotoxicologique en déterminant le rôle de ces deux composés dans l'activité œstrogénique globale des effluents de la STEP étudiée.

## Matériels et méthodes

Le site étudié est la STEP de Narbonne-Ville (Aude) qui assure un traitement biologique à boue activée comprenant des étapes de nitrification, dénitrification et déphosphoration des effluents. Elle offre une capacité épuratoire de 120 000 équivalent-habitants. Des échantillons d'eau, moyens sur 24 h et proportionnels au flux entrant, ont été prélevés en différents points de la STEP (Fig. 1). Ces prélèvements ont été réalisés de manière hebdomadaire, durant trois semaines, lors de deux campagnes effectuées à des saisons différentes (octobre 2005 et avril 2006).

<footnote n="1">¹INRA, Laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement, Avenue des Étangs, 11100 Narbonne</footnote>

<footnote n="2">²INSERM, Laboratoire d'Endocrinologie Moléculaire et Cellulaire des Cancers, 60 rue de Navacelles, 34090 Montpellier</footnote>
<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>**Figure 1.** Schéma de la STEP de Narbonne-Ville avec les différents points de prélèvement (ERU = eau usée, EGU = eau pré-traitée, BL = boue liquide, C = centrat, ET = eau traitée)</figcaption></figure>

Les composés d'intérêt ont été extraits en phase solide (SPE) et analysés en GC-MS [9] et HPLC-FLD [10], respectivement, pour les œstrogènes et les NPE. Les œstrogènes mesurés sont les composés naturels œstrone (E1), 17β-œstradiol (E2), œstriol (E3) et synthétiques 17α-éthinylœstradiol (EE2) et mestranol (MeEE2), ainsi que leurs formes conjuguées sulfates et glucuronides. Le nonylphénol (NP) et les nonylphénols mono et diéthoxylés (NP1EO et NP2EO) sont les molécules dosées pour la famille des alkylphénols. L'activité œstrogénique (capacité à activer les récepteurs aux œstrogènes) a été évaluée en utilisant des cellules cancéreuses humaines modifiées (test MELN). Ces cellules expriment les récepteurs aux œstrogènes humains et émettent une bioluminescence proportionnelle au degré d'activation de ces derniers [11]. L'activité œstrogénique d'un produit est exprimée par rapport à l'activité de E2 (ng E2eq/L).

## Résultats

Les résultats des analyses effectuées aux différentes étapes de traitement montrent des concentrations en œstrogènes dans les ERU de l'ordre de 230 à 450 ng/L avec une proportion relative des formes libres et conjuguées quasiment équivalente. Les formes libres, les plus actives, présentent des teneurs de 120 à 270 ng/L avec pour hormones majoritaires E1 et E3. Les NPE sont détectés dans les ERU à des teneurs de l'ordre de 9 à 15 µg/L ; la molécule majoritaire étant le NP (Fig. 2).

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>**Figure 2.** Concentration globale des NPE et de chacune des molécules aux différents points de prélèvement (avril 2006)</figcaption></figure>

L'élimination des œstrogènes conjugués par la STEP est presque totale (>99 %) et les formes libres sont éliminées avec plus de 90 % d'efficacité. E2 et son produit d'oxydation E1 sont les œstrogènes prédominants dans les ET. Les NPE restent très présents dans les ET, avec un abattement de leurs concentrations de 80 à 92 % au cours du traitement. Le NP est
le nonylphénol majoritaire dans les ET (fig. 2). Ainsi, les concentrations d'œstrogènes dans les ET varient entre 6 et 9 ng/L, tandis que les teneurs en NPE sont de l'ordre de 1 à 3 µg/L. La détermination de l'activité œstrogénique a mis en évidence un pouvoir œstrogène des ERU allant de 20 à 100 ng E2eq/L contre moins de 5 ng E2eq/L pour les ET. En considérant un effet additif du pouvoir œstrogène de chacune des hormones, l'activité œstrogénique estimée à partir des concentrations en œstrogène (EP théorique) est très proche de l'activité œstrogénique mesurée à l'aide du test in vitro MELN (EP réel) en entrée et sortie de STEP (Fig. 3).

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>**Figure 3.** Concentration globale en œstrogènes libres et activité œstrogénique aux différents points de prélèvement (avril 2006)</figcaption></figure>

## Conclusions

Les œstrogènes sont 50 à 200 fois moins concentrés que les NPE dans les eaux brutes et traitées. Cependant, les NPE ont un pouvoir œstrogène $10^4$ à $10^5$ fois plus faible que les hormones. Par conséquent, les concentrations en hormones détectées dans la STEP permettent d'expliquer la quasi-totalité de l'activité œstrogénique mesurée aux différentes étapes du traitement. Dans le cas particulier du site étudié, le facteur de dilution des effluents dans les eaux réceptrices est de 10 à 20 ×. Ainsi, l'activité œstrogénique résultante dans le milieu naturel est, probablement, légèrement supérieure aux seuils capables d'induire un effet chez certains organismes [2]. La dilution des effluents dans le milieu récepteur joue donc un rôle important sur l'impact écotoxicologique des CDE. Par ailleurs, les effets sur les organismes d'une exposition chronique à de faibles concentrations d'œstrogènes, ainsi que les effets des mélanges de polluants sont encore mal connus. Or, d'autres polluants, tels le cadmium et des pesticides, molécules œstrogènes, sont fréquemment détectés à proximité du site d'étude [12].

## Références bibliographiques

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[11] Balaguer *et al.*, 1999. *Sci. Tot. Environ.* 233, 47-56.

[12] Données issues de la surveillance du site par le Centre Permanent d'Initiatives pour l'Environnement des Pays Narbonnais (http://www.languedoc-roussillon.ecologie.gouv.fr/loadPge.php?file=eau/fogem/fogem.file).
# Impact écotoxicologique des composés organiques présents dans les boues d'épuration valorisées par épandage sur les sols agricoles

A. Ghanem<fnref n="1" />, J. Einhorn<fnref n="2" />, F. Laurent<fnref n="3" />, F. de Alencastro<fnref n="4" />, Y. Levi<fnref n="5" />, C. Jolivalt<fnref n="6" />, D. Patureau<fnref n="7" /> et C. Mougin<fnref n="1" />

## Contexte

La valorisation des boues d'épuration par épandage sur les sols agricoles constitue une pratique de plus en plus répandue qui contribue à améliorer la qualité des sols sur le plan physique et chimique, et fournit des éléments nutritifs aux micro-organismes et végétaux. Toutefois, les boues peuvent contenir de nombreux contaminants chimiques et biologiques potentiellement bioactifs, et présenter de ce fait des risques écotoxicologiques et sanitaires. Depuis plusieurs décennies, l'épandage des boues est soumis à réglementation. Un projet de directive européenne va proposer de nouvelles valeurs limites pour sept métaux lourds dans les boues, ainsi que pour six familles de polluants organiques et un phtalate. Si la situation semble relativement contrôlée concernant les contaminants métalliques (faible nombre d'éléments) et biologiques (procédés d'hygiénisation des boues), les risques liés aux contaminants organiques restent peu connus.

## Objectifs

Dans ce contexte, nos objectifs sont de déterminer les impacts écotoxicologiques sur l'écosystème sol, de composés connus comme ou suspectés d'être des perturbateurs endocriniens et apportés *via* les boues d'épuration contaminées. Nous développons des systèmes sol-plante-eau (cosmes) permettant d'explicitier le devenir (transformation et transfert vers les eaux de lixiviation et les végétaux) et de réaliser des tests écotoxicologiques sur des organismes du sol appartenant à différents niveaux écologiques (micro-organismes, végétaux, invertébrés) [1-3].

## Matériels et méthodes

Différentes conditions de traitement du sol sont comparées. Pour les études concernant le devenir des contaminants organiques, apportés sous la forme de radiotraceurs, le sol seul traité par pulvérisation de polluants est considéré comme référence ; le sol amendé par les boues contaminées à des doses équivalentes à 6 ou 30 T MS/ha représente soit une situation agronomique, soit une situation de pire cas. Pour l'évaluation des impacts écotoxicologiques, le sol n'ayant reçu aucun traitement est considéré comme référence. Les cosmes sont incubés au laboratoire pendant 90 jours sous conditions de température, de lumière et d'humidité contrôlées. Des graines de blé et de radis sont semées dans tous les

<footnote n="1">¹INRA, Unité PESSAC Physico-chimie et Écotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex</footnote>

<footnote n="2">²INRA, Unité Phytopharmacie et Médiateurs Chimiques, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex</footnote>

<footnote n="3">³INRA, UMR Xénobiotiques, 180 chemin de Tournefeuille, BP 3, 31931 Toulouse Cedex 9</footnote>

<footnote n="4">⁴Institut des Sciences et Technologies de l'Environnement, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, CH-1015, Lausanne, Suisse</footnote>

<footnote n="5">⁵Santé Publique et Environnement, Université Paris-Sud, Faculté de Pharmacie, 5 rue J.-B. Clément, 92290 Châtenay-Malabry</footnote>

<footnote n="6">⁶Laboratoire de Synthèse sélective organique et produits naturels, École Nationale Supérieure de Chimie de Paris, 11 rue Pierre et Marie Curie, 75231 Paris Cedex 05</footnote>

<footnote n="7">⁷INRA, Laboratoire de Biotechnologie de l'Environnement, Avenue des Étangs, 11100 Narbonne</footnote>
cosmes. Des échantillons de sol sont prélevés pour les tests collemboles. L'estrogénicité des lixiviats est mesurée après leur obtention lors de la simulation d'un épisode pluvieux.

## Résultats

### Contamination des boues par les composés organiques

Nos campagnes de suivi ont révélé la présence du glyphosate et de l'AMPA, son métabolite majeur, à des doses de l'ordre de la ppm dans tous les échantillons de boues provenant de stations urbaines, ainsi que celle du diuron au niveau de la ppb. Le nonylphénol est quant à lui présent à des doses supérieures à celles préconisées dans la future norme (50 ppm). Les données de la littérature font état d'une contamination en hormones stéroïdiennes (naturelles ou de synthèse), en phtalates et HAPs de l'ordre de la ppb, et de la ppm.

Les teneurs en herbicides, notamment glyphosate et AMPA, sont les plus élevées dans les boues issues de STEP raccordées à des réseaux séparatifs. D'autre part, il n'a pas été possible de relier les teneurs des boues en herbicides à d'éventuelles périodes de traitement herbicide.

### Devenir des polluants organiques dans les systèmes sol/boues

D'une façon générale, la minéralisation des contaminants organiques étudiés est ralentie lorsque ces composés sont apportés au sol *via* les boues, avec parfois apparition d'une phase de latence de la dégradation selon le type de boue (chaulée). Ceci peut être du à d'éventuels effets toxiques des composés déjà présents dans les boues, ou à l'apport excessif d'éléments nutritifs qui détournent l'activité des micro-organismes. Dans ces conditions, les extraits organiques de sol contiennent de fortes teneurs en composés chimiques non transformés. A l'inverse, l'apport par la boue stimule la minéralisation du 17$\beta$-œstradiol, ce qui serait dû à la présence dans la boue d'une microflore déjà adaptée à la biotransformation des hormones.

Nos résultats démontrent également que les composés organiques contenus dans les boues sont mobiles, et sont partiellement transférés dans les eaux de lixiviation et les végétaux.

### Effet des boues sur les organismes et l'activité biologique du sol

Les boues, en l'absence de tout traitement par les composes organiques, stimulent ou sont sans effet sur l'activité de transformation de matière organique du sol (secs de litière). Les boues à forte dose sont légèrement inhibitrices, en raison de l'apport important de matière organique qui est une source de substrat. En présence des herbicides et nonylphénol, l'activité biologique est légèrement inférieure ou égale à celle du sol témoin. Le type de boue (brute, digérée...) influe sur l'activité biologique du sol.

L'analyse des profils d'acides gras phospholipidiques du sol montre souvent un développement fongique supérieur à celui des populations bactériennes. Nous n'avons pas observé d'effet toxique direct des contaminants ajoutés aux boues.

### Effet des boues sur les performances de croissance des végétaux

Les résultats les plus significatifs ont été obtenus avec le blé. Des effets inhibiteurs sont notés sur la germination, effets qui dépendent du type de boue et de la présence de contaminants organiques, qui semblent exercer en mélange une certaine phytotoxicité. Toutefois, la croissance des plantules reste globalement stimulée par l'apport de boue. La boue séchée à forte dose conduit dans certains cas à une prolifération de filaments fongiques à la surface du sol.
## Effet des boues sur les collemboles

La reproduction et la survie de *Folsomia candida* ne sont pas affectées par l'ajout des boues non contaminées, à faible dose. A l'inverse, la mortalité des collemboles augmente et le nombre de juvéniles diminue fortement à la forte dose de boues, en raison de la prolifération fongique (boue séchée) ou de l'alcalinité du milieu (boue chaulée). La présence des herbicides et du nonylphénol a un effet négatif sur la reproduction et la survie uniquement dans le cas de la boue séchée, aux deux doses d'application.

## Estrogénicité des percolats

L'estrogénicité des percolats récoltés après 15 jours d'incubation des mélanges sols/boues a été mesurée sur des lignées cellulaires MELN. Seuls les percolats issus des cosmes incubés en présence de la boue séchée à forte dose ont révélé des effets oestrogéniques, et ce avec et sans ajout de polluants.

## Conclusion

Dans ces différents programmes, nous avons montré que les boues renferment des polluants organiques préoccupants à des concentrations non négligeables. Leur persistance est réelle dans le sol, comme leur mobilité vers les eaux et les végétaux. Toutefois, l'écotoxicité des boues contaminées n'a pas pu être mise en évidence.

## Références bibliographiques

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Les résultats présentés ont été acquis dans le cadre de plusieurs programmes soutenus par l'ADEME, l'INSU et la CEE. Les auteurs remercient tous les personnels qui se sont impliqués dans ces travaux.