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# Détermination de sucres dans les végétaux ligneux.
## Utilisation d'un biocapteur

Loic Barthelemy

► To cite this version:

Loic Barthelemy. Détermination de sucres dans les végétaux ligneux. Utilisation d'un biocapteur. Cahier des Techniques de l'INRA, 1998, 40, pp.5-24. hal-04690712

HAL Id: hal-04690712

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# Détermination de sucres dans les végétaux ligneux
UTILISATION D'UN BIOCAPTEUR

Loïc BARTHELEMY

I.N.R.A. - U.R.I.H.
Route des Colles SOPHIA - ANTIPOLIS
06410 BIOT

## A MOTIVATIONS

Ce travail n'a pas la prétention d'être un traité de chimie des Glucides exhaustif sur la question. Il se placera délibérément à l'échelle des préoccupations de l'agronome de serre. Nous suivrons le trajet d'un échantillon, du prélèvement jusqu'à la fin du dosage en soulignant les difficultés rencontrées et les solutions apportées. Cette étude se cantonne à la détermination de sucres solubles (glucose, saccharose) et de l'amidon qui semblent être une forme de réserve commune à tous les ligneux, en particulier le rosier.

Les végétaux ligneux, comme toutes les plantes pérennes, doivent accumuler suffisamment de réserves pendant la saison estivale pour être à même d'assurer leur survie pendant la période où le bilan énergétique est négatif. Ce stockage conduit, entre autres, à l'accumulation de polymères comme l'amidon (KAJJI 1992).

Chez une plante normalement alimentée, la fixation de CO₂, donc de carbone au cours de la photosynthèse, conduit à la formation dans les chloroplastes de trioses P dont la majorité est exportée vers le cytosol en échange de phosphore inorganique.

Dans le cytosol, ces composés servent à la synthèse concomitante et autorégulée de saccharose, forme privilégiée pour le transport de carbone. La capacité de synthèse du saccharose via la sucrose phosphate synthètase (SPS) détermine la disponibilité en Pᵢ cytosolique, régulateur des échanges Pᵢ/trioses-P entre le stroma du chloroplaste et le cytosol, et la disponibilité en trioses-P alloués à la formation d'amidon (Stitt & Heldt, 1981; Stitt et al. 1984; Champigny, 1985; Gerhardt et al. 1987; Rao & Terry 1989; Stitt & Quick, 1989; Geiger & Servaites, 1994). Les autres trioses-P sont en partie retenus dans le chloroplaste et utilisés pour la synthèse de l'amidon, forme privilégiée de mise en réserve du carbone (Stitt & Heldt, 1981; Stitt et al. 1984; Rao & Terry, 1989; Hawker et al. 1991).

Ces 2 voies de biosynthèse cohabitent et s'autorégulent. Au cours du nycthémère, l'excès d'assimilats produit pendant la phase diurne est temporairement
orienté vers la synthèse de l'amidon qui sera ensuite hydrolysé pendant la nuit pour
alimenter la respiration et la synthèse des composés de structure (Ziegler, 1991 ;
Schulze et al. 1991).

(c'est pourquoi tous nos prélèvements seront toujours effectués en début de journée).

Une bonne compréhension du fonctionnement trophique d'un végétal consiste
à suivre le devenir des métabolites carbonées absorbés par la plante. L'hypothèse la
plus couramment admise est que les besoins en minéraux, et dans une moindre
mesure en eau, sont déterminés par le niveau de disponibilité énergétique du
végétal, et plus particulièrement par les quantités de carbohydrates pouvant être
impliqués dans la croissance et le développement. En conséquence, les travaux
portant sur l'évolution saisonnière des pools glucidiques, en relation ou non avec
d'autres métabolismes comme celui de l'azote, se sont multipliés ces dernières
années. (Kajji 1992 ; Schaefer 1986 ; Stassen et al 1981 ; Yoshioka et al 1988).

Ces auteurs ont souligné les importantes difficultés méthodologiques qu' ils ont
rencontrées pour le dosage des sucres.

A l' U.R.I.H. de Sophia Antipolis, où l'on étudie particulièrement, " l'incidence
d'une privation temporaire de nutrition azotée, en culture hors sol, sur la qualité
post-récolte des fleurs" un dosage des réserves carbonées est nécessaire; on dose 3
types de composés glucidiques :

1) **Le glucose** qui est le maillon de base des polymères de la plante.

2) **Le saccharose** il peut représenter 90% des glucides du phloème, c'est la forme de transport des glucides en général, sans oublier le sorbitol (Hansen 1967) ou le mannitol (Kramer et Kozolwski 1979). Le saccharose peut également être considéré comme étant une forme de stockage pendant les épisodes froids. En effet, des concentrations élevées pendant ces périodes contribuent à accroître la résistance de la plante au froid en augmentant la pression de turgescence cellulaire (Siminovitch et al 1953).

3) **L'amidon** : il semble être une forme de réserve commune à tous les ligneux, en particulier le rosier. C'est un polymère du D-glucose formé de chaînes linéaires (l'amylose) et de chaînes ramifiées (l'amylopectine). La proportion en amylose et en amylopectine peut varier selon la provenance botanique de l'amidon. Dans les céréales on trouve de 20 à 25 % d'amylose et 30 % dans les légumineuses. Cette teneur en amylose est à prendre en compte dans le choix de la méthode de dosage : plus l'amidon est riche en amylose, plus il est généralement difficile à hydrolyser. De même, la structure physique de l'échantillon à doser est également un paramètre important à prendre en compte. L'amidon, parfois encapsulé dans un réseau protéique ou dans la cellule végétale, doit être rendu accessible à l'hydrolyse enzymatique.

En cas de privation d'azote, le carbone fixé pendant la photosyntèse est
entièrement orienté vers la voie de synthèse de l'amidon. L'amidon synthétisé le jour
n'est plus complètement dégradé pendant la nuit, ce qui renforce l'engorgement des
chloroplastes (Radin et al. 1986 ; Rufty et al. 1988 ; Van Quy et al. 1991 ; Zombré et al.
1991 ; Schulze et al. 1991). Cette accumulation d'amidon peut provoquer à terme une
désorganisation partielle de la structure du chloroplaste conduisant à la perte de son
intégrité fonctionnelle (Porter, 1962 ; Suniaga Quijada, 1991). C'est pourquoi les racines et la tige florale ont un stock en amidon qui varie peu tandis que la fleur et les feuilles sont des organes où l'accumulation d'amidon est fortement accrue. (Vessey & Layzell, 1987 ; Rufty et al. 1988 ; Paul & Stitt, 1993).

Chez le rosier, il a été démontré que les réserves en carbone de la fleur coupée conditionnent le maintien de sa respiration d'entretien (Coorts, 1973). Or dans un tissu, lorsque les glucides sont épuisés, les protéines et les lipides sont dégradés et servent de substrat au catabolisme respiratoire (Heller, 1989). Dans la fleur, la compétition entre le turn-over protéique et l'élaboration des composés carbonés de structure se traduit par une protéolyse active et la synthèse de précurseurs de la sénescence ou du stress (Borochov & Woodson, 1989). Ceci explique que la longévité des fleurs coupées est toujours augmentée lorsqu'elles sont maintenues en vase dans des solutions contenant des sucres facilement assimilables (Paulin, 1981).

Il est également établi que la durée de vie en vase des tiges florifères est fonction de ses réserves carbonées, seuls ressources énergétiques disponibles pour la respiration et les processus liés à l'épanouissement propre du bouton (Coorts, 1973 ; Buxton & Stoltz, 1977 ; Paulin 1979, 1980, 1981). Selon Slettenhaar (1987), dans un bouton, il faut que la matière sèche des pétales soit composée d'au moins 10 % d'amidon pour que la fleur s'épanouisse correctement. Chez le rosier de serre, il a été dosé jusqu'a 11 % d'amidon dans des pétales, cette accumulation étant corrélée à une augmentation de l'activité amylasique dans les pétales après la coupe (Hammond, 1992 ; Berkholst & Navarro Gonzales, 1989), conduisant à une accumulation de solutés favorables à un influx d'eau nécessaire à l'épanouissement du bouton.

Une alternative serait de suivre au cours de la privation d'azote, l'évolution de la teneur en eau des tiges à fleur coupée par rapport à celle de tiges témoins. Ce critère "teneur en amidon" a donc été suggéré par certains pour juger de la qualité intrinsèque d'une tige florale.

# B Inventaire des techniques de dosage des glucides.

## B1 Dosages des glucides par voie chimique.

Les aldoses ou les cétoses se comportent comme des réducteurs, ils vont donc pouvoir réduire les sels métalliques en solution alcaline.

$$ \mathrm{C_5H_{11}O_5-CHO} + 2 \mathrm{CuO} \text{ (bleu)} \rightarrow \underset{\mathrm{C_5H_{11}O_5-COOH} + \mathrm{Cu_2O} \text{ (rouge)}}{\mathrm{OH}^-} $$

Il en est de même pour le réactif de Tollens Ag₂O ---> Ag avec tous les sucres réducteurs glucose, galactose, mannose, fructose et les dissacharides maltose lactose.

<footnote>* L'oxydation de la fonction aldéhyde du glucose (aldose) en acide gluconique est mise en évidence par la liqueur de Fehling [Cu(OH)₂ <--- CuO + H₂O] avec une solution tampon de tartrate de sodium et potassium [NaO₂C-(CHOH)₂-CO₂K] :</footnote>
* Deux molécules de hydroxybenzhydrazide (PAHBAH) se condensent avec une molécule de glucose pour former un hydroxybenzhydrazone de glucose qui donne une coloration jaune, déterminée par colorimétrie à 415 nm. Les osazones des sucres réducteurs servent à identifier et caractériser ces derniers. (Lever et al 1973)

## B 2 Dosages des glucides par voie enzymatique.

### B 21 Dosage spécifique du glucose.

Les méthodes de dosage les plus utilisées sont les suivantes.

**B 211 Dosage spectrophotométrique UV avec l'HK-G6PDH** (Boehhringer 1979)

On phosphorise le glucose en présence de coenzyme ATP (adénoside tri-phosphate) par l'enzyme HK (héxokinase) en glucose-6-phosphate. Celui-ci, en présence de NADP+ (nicotiamide-adénine dinucléotide) est oxydé en acide gluconique par l'enzyme G6P-DH (glucose-6-phosphate déhydrogénase) et le NADP+ est réduit en NADPH que l'on détermine par l'augmentation de l'absorbance dans l'UV, à 340 nm, et qui est proportionnelle à la quantité de glucose initial.

$$ \text{D - glucose} + \text{ATP} \xrightarrow{\text{hexokinase}} \text{glucose - 6 - phosphate} + \text{ADP} $$

$$ \text{glucose-6-phosphate} + \text{NADP}^{+} \xrightarrow{\text{G6-phosphate déhydrogénase}} \text{gluconate-6-phosphate} + \text{NADPH} + \text{H}^{+} $$

**B 212 Méthode à la GOD - POD** (Thivend al 1972 modifiée par Colonna 1981)

Le Glucose hydrolysé en présence d'oxygène avec l'enzyme GOD glucose-oxydase est oxydé en acide gluconique avec apparition de péroxyde d'hydrogène.

$$ \begin{array}{l} C_5H_{11}O_5-CHO + H_2O + O_2 \xrightarrow{\text{GOD}} C_5H_{11}O_5-COOH + HO-OH \\ \text{D - GLUCOSE} \qquad \text{Acide GLUCONIQUE} \end{array} $$

Pour déterminer la concentration en glucose, on peut, quantifier soit l'oxygène consommé, soit le péroxyde d'hydrogène naissant.

La consommation d'oxygène nécessitée par l'oxydation du glucose en acide gluconique, et qui est proportionnelle à la quantité de glucose initial, peut être déterminée à l'aide d'électrodes à oxygène dite de Clark. (BECKMAN).

(voir annexe 1)

La formation de péroxyde d'hydrogène, qui est proportionnelle à la quantité de glucose initial, est déterminée par différentes méthodes :

* **Méthodes colorimétriques :**

- soit en présence de l'enzyme péroxydase POD qui oxyde l'orthotolidine, en utilisant le péroxyde d'hydrogène disponible, en orthodianisidine qui donne une coloration rouge brun que l'on détermine par colorimétrie à 436 nm.

- soit en présence de l'enzyme péroxydase POD qui oxyde le chromogéne (ABTS) en utilisant le péroxyde d'hydrogène disponible.

$$ H_2O_2 + D_2 (\text{ABTS réduit}) \xrightarrow{\text{péroxydase}} 2 H_2O + D (\text{colorant vert}) $$
L'intensité de la coloration formée est mesurée par colorimétrie à 560 ηm.

Mais la péroxydase est susceptible d'oxyder d'autre substances qui entrent en compétition avec le chromogène pour réduire le péroxyde d'hydrogène, conduisant à des résultats par défaut. De même que la coloration des échantillons rend les dosages colorimétrimétriques moins précis.

* Méthode électrochimique :

(Voir Annexe 2)

Le péroxyde d'hydrogène à un pH = 7 et un potentiel de 700 mv (avec une cathode Argent/Ag-Cl) est réducteur; il est oxydé au niveau de l'anode de platine avec apparition d'un courant proportionnel à la quantité de péroxyde d'hydrogène et donc de glucose initial.

$$ \text{Anode } 2\,\text{H}_2\text{O} + \text{HO-OH} \xrightarrow{\text{Pt}} 2\,\text{e}^- + \text{O}_2 + 2\,\text{H}_3\text{O}^+ \quad \text{E} = 0,68 \text{ Volt} $$

$$ \text{Cathode } \text{Ag}^+ + \text{e}^- \xrightarrow{\text{Ag/Ag-Cl}} \text{Ag} \quad \text{E} = 0,80 \text{ Volt} $$

C'est ce mode de détection du péroxyde d'hydrogène que nous utilisons.

## B 2 2 Dosage spécifique du saccharose.

Le saccharose en présence de l'enzyme **saccharase** est hydrolysé en β-D-fructose et α-D-glucose qui par mutarotation donne du β-D-glucose proportionnel au saccharose initial au facteur 0,95 près. (Voir Annexe 1)

(on utilise l'enzyme **mutarotase** pour favoriser le passage de l'α en β)

## B 2 3 Dosage spécifique de l'amidon.

L'amidon est constitué d'amylose (liaison 1-4) et d'amylopectine (liaison 1-6). Cet amidon en présence de l'enzyme **amyloglucosidase** (hydrolyse des liaisons 1-4 et liaisons 1-6) donne des dextrines hydrolisées en maltose qui lui même sera hydrolysé en α-D-glucose, puis par mutarotation donne le β-D-glucose (proportionnel à l'amidon initial, à un facteur près de 0,9) qu'il faut ensuite doser.

# B 3 Autres techniques de dosage des glucides.

## B 3 1 Chromatographie en phase gazeuse.

Les sucres n'étant pas volatils, on utilise pour passer en phase gazeuse des esters de triméthylsilyl [ (CH₃)₃-Si- ]. Cette silanisation des sucres est longue et difficile et le chauffage de la colonne capillaire en silice (210°C) peut entraîner des débuts de dégradation pendant l'analyse. Détecteur utilisé FID.

## B 3 2 Chromatographie liquide HPLC

Sur colonne remplie de silice greffée en NH₂ (MERCK Lichrosorb), avec une phase mobile constituée par un mélange acétonitrile-eau (80/20) [ CH₃-CN ] dégazé en continu par un barbotage d'hélium, un débit de 1 ml/mm, une pression de 50 à
60 bars et à température ambiante, on sépare les différents sucres qui seront mis en évidence par un détecteur réfractomètre différentiel ou en absorption dans les UV.

## B 3 3 Chromatographie ionique HPAE

On utilise, à un pH élevé (12-14), l' ionisation partielle des sucres neutres qui se comportant comme des acides faibles avec des pKa entre 12 et 13, et qui vont être séparés par échange d'anions sur colonne (Carbopac), remplie de résines constituées de billes de polystyrène-divinyl-benzène (5 à 10 µm) sur les quelles sont greffées des micro-particules de latex (0,1 µm) qui servent aux échanges pelliculaires d'ions, avec comme phase mobile de la soude [ NaOH, 100 mM/1 ]. La détection se fait par l'utilisation d'un détecteur ampérométrique pulsé.

La méthode de détection est basée sur l'aptitude des sucres à s'oxyder à des potentiels spécifiques. (Par ex. : + 0,05 V pour les alcools secondaires ou + 0,02 V pour les alcools primaires).

## B 3 4 Electrophorèse capillaire .

On fixe sur les sucres un marqueur fluorescent.

- Soit de l'APTS 1 amino-pyrène 3,6,8 trisulfonate de sodium en mélange à volume égal avec du [ CH3-B=N ] cyanoborohydride de sodium et de l'acide acétique [ CH3-COOH ] à 15 %. Na Le tampon utilisé est à pH = 4,75 (solution molaire de tetrahydrofuran (THF) [ ∏ O ]). Cette fixation est effectuée soit pendant 16 h à 37°C soit 2 h à 55°C.

- Soit de l'ANTS : 8 amino-naphtaléne 1,3,6 trisulfonate de sodium dans le même mélange que précédemment. Le tampon utilisé cette fois ci, étant à pH = 4,5 (solution molaire d'un solvant aprotique, le méthylsulfoxide (DMSO) [ CH3-S-CH3 ]), cette fixation étant effectuée comme précédemment.

Puis les sucres-APTS ou ANTS sont injectés dans l'électrolyte spécifique adapté aux caractéristiques spectrales, à la cathode d'une électrophorèse capillaire. Ces échantillons vont migrer différemment sous l'effet du champ électrique vers l'anode. A l'anode, après avoir été excités à la longueur d'onde $λ = 488$ ηm, ils sont quantifiés par un détecteur de fluorescence induit au laser (10 à $10^4$ plus sensible que le détecteur UV) sous atmosphère d'argon, à la longueur d'onde $λ = 520$ ηm.

## C Dosage de l'amidon, du glucose et du saccharose appliqué au rosier à l'URIH .

On utilise la méthode de THIVEND et al. 1972

**Principe** : On extrait les sucres solubles à l'éthanol à 80% (*), et sur la matière végétale insoluble on fait gonfler et éclater l'amidon par un traitement hydrothermique à 135°C. Cet amidon est hydrolysé ensuite en glucose par l'action de l'amyloglucosidase. On évapore l'éthanol des sucres solubles avant de faire les dosages de glucose et de saccharose, par **biocapteurs** à enzymes immobilisés (YSI).

* Les Galactanes ne sont pas hydrolysés.
C1 Préparation et conservation de l'échantillon.

Le dosage est rarement sur le matériel frais, compte tenu de la difficulté à broyer de façon satisfaisante du végétal humide. Smith (1973) a comparé les techniques de séchage les plus utilisées : lyophilisation et dessication à l'air libre où à l'étuve réglée à 60, 70 et 100°C. Il en conclut que la lyophilisation dégrade peu les échantillons, augmente la porosité du matériel végétal et donc facilite l'extraction (Raguse et Smith 1965).

En général les échantillons frais sont conservés au congélateur, après éventuellement un passage dans l'azote liquide au moment du prélèvement pour les stabiliser. Par ailleurs, la rupture des parois cellulaires provoquée par ce traitement entraîne, à la décongélation, une dégradation rapide (Hendrix et Peelen 1987) et le phénomène s'accompagne d'une hydrolyse conjointe des polymères de réserve. Il est donc très important de traiter les échantillons dès leur sortie du congélateur avant qu'ils ne reviennent à la température ambiante.

Pour notre part, l'échantillon végétal, après avoir été pesé en frais, est fractionné en fines lamelles et desséché :

- soit par lyophilisation (congélation de l'eau et élimination par sublimation)

- soit par séchage à l'étuve à 80°C, pendant 8 heures afin de limiter la température qui peut dégrader les sucres (jusqu'à un poids constant).

Le matériel végétal sec est broyé à l'aide d'un broyeur à billes ou d'un broyeur ultracentrifuge, jusqu'à une taille de poudre inférieure à 0,2 mm sans refus, et ce pour obtenir un échantillon homogène qui sera réprésenté par une aliquote au moment du dosage. Il convient de veiller à ce que les frottements sur les grilles ou les billes n'induisent pas d'échauffement susceptible de provoquer une caramélisation des sucres. Le broyage a pour but d'obtenir une poudre suffisamment fine et homogène pour que toutes les substances spécifiques au liquide d'extraction puissent être solubilisées par diffusion. Mais les poudres végétales ainsi obtenues ne sont pas totalement inertes. En effet, Smith (1973) à montré, sur broyats de feuilles lyophilisées conservés en flacons scellés à température ambiante pendant 1 an, que les concentrations en glucose, saccharose et fructose varient et peuvent même doubler en 6 mois pour le fructose. Il montre que ceci est dû à une hydrolyse de l'amidon, qui baisse de 25% au profit du saccharose et des sucres réducteurs qui augmentent conjointement de façon compensatoire.

L'échantillon doit être également finement broyé, afin d'optimiser le processus de dispersion de l'amidon, ce qui conditionne une bonne efficacité pour l'hydrolyse par l'amyloglucosidase.

Les poudres végétales sont également fortement hydrophiles. Gary et Vandame (1993) notent que des échantillons conservés en flacons plastiques, scellés à température ambiante pendant 1 an, avaient repris entre 4 et 6% d'humidité pour les feuilles et les tiges et même 11% pour les fruits. Une correction compensatoire peut être envisagées en déterminant, sur une aliquote étuvée à 70°C (72 h) ou 100°C (48 h) (Gurakan et al 1990).

Pour notre part, on **stocke** l'échantillon sec, broyé à température ambiante, dans un dessicateur (silicagel) à l'abri de l'humidité et de la lumière (les échantillons
lyophilisés conservent leurs diastases qui n'ont pas été détruites par la chaleur et l'action de la lumière ou de l'humidité peut dégrader la matière organique et les sucres).

## C2 Séparation de l'amidon des sucres solubles.

Les modes de dispersion de l'amidon les plus utilisés sont :

- Solubilisations de l'amidon, soit dans du diméthysulfoxyde (DMSO) de 80 à 95 % et à des températures de 60 à 120°C (Holtz 1977 ; Cuber 1982) ou du DMSO-HCl 8M (Gutmann 1970), soit dans des alcalis (NaOH) (Dekker et Richards 1971) suivie d'une hydrolyse avec une amylase thermorésistante (Karkalas 1985).

- Gélatinisation et solubilisation dans la potasse (KOH) 2M (Englyst 1972).

L'extraction a pour but la séparation des sucres solubles des polymères insolubles (amidon) en les précipitant. Le solvant utilisé est l' éthanol 80 GL à 80°C (Cheneyard 1988), bien que le méthanol à température ambiante donne également de bon résultats (Dickson et Larson 1975 ; Dickson 1978). Ce protocole, en effet, n'altère pas les chaînes d'amidon et de cellulose et solubilise plus de 98% des oligosides de PM < 2000 (Mercier et Tollier 1984), soit ceux dont le degré de polymérisation est inférieur à 12 hexoses (chaînes courts à l'exception des dextranes). Sa répétabilité est de 5% (Dickson 1978). Avec les attaques acides ($CH_3COOH + HCl$ : Gaines 1973 ; ou $H_2SO_4$ : Mith 1969,) il y a risque non négligeable d'hydrolyse des celluloses. C'est souvent dès cette étape que sont éliminés les pigments lipidiques dont la coloration peut interférer avec le dosage.

Le dosage se fait sur des séries de 30 échantillons.

On pèse exactement environ 50 mg ou 25 mg de poudre sèche de végétal, remis à sécher 2 h à l'étuve (80°C), dans des petits tubes (à centrifuger) de 5 ml, en PSF (polysulfone) qui résistent à des températures de 150°C, et que l'on a tarés à 2 ml.

**1er Extraction** : on ajoute 2 ml d' **éthanol 80 %** (*) aux tubes qui sont ensuite bouchés à l'aide de bouchons de matière plastique. On les met au bain marie thermostaté 70°C pendant 5 mn. Puis à l'aide d'un agitateur Vortex, et pendant une minute, on agite l'échantillon. Par groupes de 10 tubes, on centrifuge (9000 trs/mn) pendant 5 mn et l'on recueille le surnageant dans un tube bouché (10 ml).

**2ème Extraction** : on ajoute 2 ml d' éthanol 80 % dans les tubes contenant le culot puis on agite intimement à nouveau pendant une minute chaque échantillon, enfin comme précédemment, on centrifuge et on rassemble les surnageants.

**3ème Extraction** : idem, le surnageant (6 ml) contenant les sucres solubles est stocké à 4°C, pendant quelques jours au maximum pour les dosages ultérieurs. Et le culot dans les tubes bouchés est conservé à 4°C (réfrigérateur) pour la détermination de l'amidon.

Cet alcool à 80 % est le compromis qui permet de solubiliser les sucres sans hydroliser l'amidon (seuls quelques morceaux de la chaîne d'amidon peuvent se dissoudre, morceaux inférieurs à 9 molécules).

**Remarque** : On utilise l' éthanol à 40 % pour la séparation de l'amidon des dextrines.

<footnote>* **Ethanol 80 %** : 800 ml éthanol distillé à 96° Gay Lussac ($C_2H_5OH$) (PM : 46,07 d : 0,79 Eb. : 78°C) et 200 ml d'eau permutée</footnote>
# C3 Dosage de l'amidon.

## C31 Gonflement et éclatement de l'amidon.

Smith en 1973 conclut que les traitements thermiques provoquent à la fois une hydrolyse de l'amidon inversement proportionnelle à la température appliquée (de 0% à 100°C à 50% à 25°C) et une perte constante des sucres solubles par caramélisation ou hydrolyse.

Pour notre part, on ajoute au culot, qui est dans le tube, 1ml d'eau permutée. Et à l'aide de capuchons (non étanches) en papier aluminium ou coton de verre, on couvre les 30 tubes que l'on met dans un panier métallique. Ce panier est mis dans l'autoclave (7 l) après avoir versé un litre d'eau permutée. On ferme le couvercle robinet ouvert. On régle la soupape de sécurité à 3,5 bars de pression. La plaque chauffante est réglée au maximum pendant 5 mn (début du frémissement de l'eau) puis à thermostat (7). On laisse 5 mn (*) avant de fermer le robinet en laissant une légère fuite pour stabiliser la montée en température et en pression. Au bout de 15 mn on vérifie que la température a atteint 135°C et donc une pression de 3 Bars. On laisse 1 heure, puis on arrête le chauffage afin de refroidir et retour à la pression atmosphérique (environ 30 mn). Les échantillons sont prêts pour l'hydrolyse.

## C32 Hydrolyse de l'amidon en glucose par l'amyloglucosidase.

C'est l'action d'enzymes spécifiques qui hydrolysent les liaisons α (1-4) (amylose) et les liaisons α (1-6) (amylopectine). Cet enzyme est une **amyloglucosidase** d'origine fongique Aspergillus niger qui hydrolyse l'amidon en glucose suivant des conditions précises. (Thivend et al 1965 1972) préconisent une hydrolyse de 2h à une température de 60°C (bain thermostatée) avec un pH de 4,6 et une concentration d'amyloglucosidase de 50 mg/ml.

### C321 Préparation des réactifs.

- Le milieu tampon est une solution contenant, pour un Litre :

-> 16,4 g acétate de sodium anhydre [CH3-COONa], PM : 82,03;

-> 12 ml acide acétique [CH3-COOH], PM : 60,05, d : 1,05

soit une solution de 0,2 M en acétate de sodium et 0,2 M en acide acétique qui a un pouvoir tampon de pH : 4,55.

- Diastase sélective qui **hydrolyse** l'amidon en glucose :

10 mg d'amyloglucosidase dans 25 ml de solution tampon acétoacétique.

L'amyloglucosidase lyophilisée 100 U/mg (Usage BioChimique MERCK) a un effet optimum à 60°C et à pH : 4,55, elle est stockée (4°C).

### C322 Hydrolyse.

On ajoute à chaque tube (taré à 2 ml) contenant 1 ml d'eau dans lequel l'amidon a éclaté : -> 0,9 ml de tampon acétoacétique 0,2 M

-> 0,1 ml d'amyloglucosidase

<footnote>* L'eau permet aux molécules d'amidon de gonfler pendant 5 mn à la pression atmosphérique, puis l'augmentation de pression (3 Bars) et de température (135°C) permet aux grains d'amidon d'éclater.</footnote>
On agite, on bouche à l'aide de bouchons de matière plastique et on laisse 2 h au bain marie thermostaté à 60°C avec agitation. Puis on laisse refroidir, on ajuste à 2 ml avec de l'eau permutée et on homogénéise. On centrifuge par groupes de 10, à 9000 trs/mn pendant 5 mn. Puis on dose le glucose provenant de l'hydrolyse de l'amidon.

Faire un test préalable sur 3 échantillons d'amidon soluble [ $C_6H_{10}O_5 ]_n$ de 10 mg environ desséché sous vide à 35°C avec traitement à l'autoclave et hydrolyse à 60° C.

## C 4 Dosage du glucose et du saccharose.

### Sucres solubles dans l' éthanol à 80 %.

On transvase la solution alcoolique d'extraction (6 ml) contenant les sucres solubles dans un ballon de 50 ml pour rotavapor, afin d'éliminer l' éthanol.
Le ballon est alors plongé dans un bain Marie thermostaté à 35°C. La rotation du ballon étant réduite après le début de l' ébullition de l'alcool, on concentre à sec (*).
L' évaporation terminée, on rince le balon 4 à 8 fois à l'eau permutée par fractions de 250 à 500 microlitres.

### Dosage du glucose et du saccharose.

Dans les tubes contenant les échantillons soit d'amidon hydrolysé en glucose (C3), soit de sucres solubles (C4), l'aiguille de l'analyseur biochimique, prélève 25 µl qu'elle injecte dans une chambre d'échantillonnage, où l'échantillon à mesurer est comparé directement à un étalon, soit de glucose, soit de saccharose.

Le principe de l'analyseur biochimique YSI 2700D® est l'utilisation de **biocapteurs** constitués par 2 sondes spécifiques de glucose et de saccharose, en liaison avec une chambre d'échantillonnage contenant un tampon à pH : 7, qui déterminent par une mesure de courant, la teneur de l'échantillon à mesurer.

(voir annexe 3)

**Sonde glucose** qui se compose d'une membrane de polycarbonate (0,03 µm) non poreuse aux macromolécules et particules en suspension et d'une deuxième membrane imprégnée de l'enzyme GOD **glucose-oxydase**, où le glucose, en présence d'oxygène, est hydrolysé et oxydé en acide gluconique avec production de péroxyde d'hydrogène.

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<footnote>* Pour le dosage des sucres solubles, où l'on utilise une méthode à enzymes immobilisés, il faut éliminer totalement l'alcool qui est destructeur de ces enzymes.</footnote>
**Sonde saccharose** qui se compose aussi d'une membrane de polycarbonate (0,03 µm) non poreuse aux macromolécules et particules en suspension, et d'une deuxième membrane imprégnée de 3 enzymes, la saccharase, la mutarotase et la glucose-oxydase. Le saccharose en présence de l'enzyme **saccharase** est hydrolysé en β-D-Fructose et α-D-glucose qui par mutarotation, donne le β-D-glucose proportionnellement au saccharose initial à un facteur 0,95 près.

(la mutarotase favorise le passage du glucose de la forme α à la forme β)

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Pour la sonde glucose ou saccharose, il y a une troisième membrane d'acétate de cellulose 0,6 ηm, derrière laquelle le péroxyde d'hydrogène est oxydé au niveau de l'anode de platine (soumis a un potentiel de 700 mv avec une cathode argent/Ag-Cl) avec apparition d'un courant proportionnel à la quantité de péroxyde d'hydrogène et donc de glucose initial.

(voir annexe 1)

$$ \text{Anode} \quad 2 \text{H}_2\text{O} + \text{HO-OH} \xrightarrow{\text{Pt}} 2 \text{e}^- + \text{O}_2 + 2 \text{H}_3\text{O}^+ \quad \text{E} = 0,68 \text{ Volt} $$

$$ \text{Cathode} \quad \text{Ag}^+ + \text{e}^- \xrightarrow{\text{Ag/Ag-Cl}} \text{Ag} \quad \text{E} = 0,80 \text{ Volt} $$

l'enzyme **catalase** oxyde le péroxyde d'hydrogène et, pour inhiber cette catalase on utilise l'azide de sodium [NaN₃] à 5 mgl⁻¹ dans le tampon.

**Remarque** : Les matières organiques en suspension [polyphénol des racines ; anthocyane (rouge) ; flavone (brun jaune) des fleurs et chlorophylle des feuilles] donnent des colorations qui, en principe, n'interfèrent pas sur le dosage.

S'il y a pollution des membranes, on peut, sur la phase aqueuse de l'échantillon et avant le dosage, procéder à l'une des opérations suivantes :

- Faire une défécation (2 corps solubles qui, en mélange, précipitent en entraînant les grosses molécules) pour précipiter les matières protéiques et pectiques extraites par l'éthanol à 80 % avec les sucres solubles.
-> Dans le tube contenant les 2 ml de l'échantillon, on ajoute 0,5 ml d'une solution de sulfate de zinc contenant 50 g/l [SO₄Zn, 7 H₂O ; PM = 287,54 g soit 0,17 M]. Puis après avoir mélangé intimement, on ajoute 0,5 ml d'une solution de baryte contenant 47 g/l [Ba(OH)₂, 8 H₂O ; PM = 315,48 g soit 0,15 M]. On agite à nouveau énergiquement et on centrifuge pendant 5 mn à 9000 trs/mn.

- Faire une dépigmentation et délipidation par une extraction à l' éther de pétrole.

-> Dans le tube contenant les 2 ml d'échantillon, on ajoute 2 ml d' éther de pétrole (d = 0,65), que l'on mélange intimement, puis, après un repos de 5 mn, on centrifuge pendant 5 mn à 9000 trs/mn et on élimine la phase organique contenant l' éther de pétrole et les pigments à l'aide d'une micro-pipette.

- Le dosage étant effectué dans le 1er cas sur 3 ml, et dans le 2ème sur les 2 ml initiaux.

## C 5 Calculs.

L'analyseur biochimique YSI 2700D® nous donne directement la concentration en glucose et en saccharose en mg/l.

Calculs pour le glucose ou le saccharose :

$$ \begin{array}{l} \text{GLUCOSE} = \frac{\text{concentration lue (mg/l)} \times 2 \text{ ml (prise d'essai)} \times 1000 (\text{par g})}{\text{mg g}^{-1} \text{ de M.S}} \end{array} $$

$$ \begin{array}{l} \text{SACCHAROSE} = \frac{\text{concentration lue (mg/l)} \times 2 \text{ ml (prise d'essai)} \times 1000 (\text{par g})}{\text{mg g}^{-1} \text{ de M.S}} \end{array} $$

Calculs pour l'amidon :

$$ \text{AMIDON} \text{ mg g}^{-1} \text{ de M.S} = \text{GLUCOSE mg g}^{-1} \text{ de M.S} \times 0,9 \text{ (coefficient d' hydrolyse )} $$

Car en hydrolysant l'amidon en glucose, on fixe des molécules d'eau et donc la masse du glucose déterminée est supérieure à celle de l'amidon
(180 g de glucose correspond 162 g d'amidon)

## D Remarques.

Lors de l'échantillonage, il est primordial de standardiser le prélèvement des différents organes de la plante (l'ordre et l'heure) de façon à avoir des organes végétaux à un stade précis pour ce qui concerne le métabolisme glucidique.
De plus les échantillons doivent être rapidement stabilisés, l'activité enzymatique, qui perdure jusqu'à stabilisation de l'échantillon par le froid ou le séchage, peut entraîner des pertes de glucose par respiration et une hydrolyse compensatoire de l'amidon. Cette lourdeur de moyens à mettre en oeuvre limite également le nombre de répétitions par traitement (Kajji 1992 ; Yoshioka et al 1988).

Notons enfin que les faibles effectifs ne permetent pas, dans la plupart des cas, d'utiliser les méthodes statistiques courantes pour l'analyse des résultats.

On a été amené à rechercher une méthode globale, moins longue et moins coûteuse que les techniques plus spécifiques comme la chromatographie en phase gazeuse ou l'HPLC (Birch 1973 ; Masson et Slover 1971 ; Sweeley 1965) ou les méthodes enzymatiques traditionnelles (Bergmeyer et al 1983 ; Leroux 1981).
Les feuilles semblent à priori avoir des teneurs en sucres qui évoluent très vite puisqu'elles sont le siège de nombreuses réactions enzymatiques.

Divers auteurs ont montré qu'il est préférable d'exprimer les résultats sous forme de concentration, en mg de sucre par g de matière sèche. Cependant, dans certain cas (suivi des pools glucidiques durant un cycle végétatif), il est plus judicieux de raisonner en quantité, donc de pondérer les concentrations précédentes, par le poids de l'organe considéré (Kajji 1992) ou même par son importance relative dans la biomasse totale de la plante.

Il est bon de rappeler que, compte tenu de la diversité des fonctions de la plupart des sucres, et de la rapidité des interconversions, notamment glucose -amidon, ces dosages ne donnent en général qu'une partie des éléments indispensables à la compréhension des processus métaboliques de base et à leur formalisation en règles simples.

Annexe 1

## Anomères α et β dus à la forme cyclique (pyranose)

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

On constate que la forme hémiacétalique du glucose est plus stable (forme cyclique) que celle aldéhydique (0,024 mole pour cent), mais avec apparition de deux **anomères**. Par définition, sur le carbone n° 1, l'anomère α, a le groupement OH au -dessous du cycle et l'anomère β au-dessus. Ces deux anomères sont stables à l'état cristallisé, mais mis en solution il s'établit un équilibre à 36,25 % en anomère α et 63,75 % en anomère β (ce dernier plus stable car tous les groupements OH sont en position équatoriale).

Ce phénomène, appelé mutarotation, peut être mis en évidence en mesurant les pouvoirs de rotation de la lumière du glucose en solution ; on constate la décroissance de l'anomère α (+ 112,2 °) et la croissance de l'anomère β (+ 18,7 °) jusqu' à la valeur d'équilibre (+ 52,7 °) à 20°C.
## Le biocapteur.

Le biocapteur est une électrode à enzymes immobilisés. Il est constitué de matériel biologique (tissus, bactéries, d'enzymes ou anticorps) et d'électrodes qui mesurent un potentiel ou un courant proportionnel à l'élément à doser.

Ce biocapteur est isolé du milieu extérieur par une membrane perméable à la substance que l'on veut doser.

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

### Exemples

**Electrode de Clark** : mesure la consommation d'oxygène pour estimer la quantité de glucose initial.

**Electrode de YSI** : mesure la production d'eau oxygénée pour estimer la quantité de glucose initial.

### Interférences

La catalase réduit l'eau oxygénée et la présence d'acide ascorbique (car l'anode de platine y est sensible).

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

## Propriétés oxydo-réductrices de l'eau oxygénée en solution.

**L'eau oxygénée et les potentiels normaux à pH = 0 qui leurs sont associés :**

L' Eau Oxygénée est soluble dans l'eau en toutes proportions, mais dans un état métastable et sa dismutation en H₂O et O₂ se produit suivant des conditions extérieurs bien définies.

( Catalyseur, pH, potentiel )

Car l'eau oxygénée peut avoir, tour à tour, les propriétés oxydantes et réductrices.

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Pour le dosage de l'eau oxygénée qui intervient lors de la détermination de la teneur en glucose, on utilise sa propriété **réductrice**. Pour cela, on travaille avec un pH de 7 (solution tampon) et à un potentiel de 700 mV. Il y a un blocage cinétique de cette dismutation que l'on peut contourner par l'utilisation de catalyseur en platine. On oxyde donc l'eau oxygénée à l'anode de platine ayant une différence de potentiel de 700 mV avec la cathode d'argent recouvert AgCl. Cette oxydation produit un dégagement d'oxygène suivant la réaction :

$$ HO-OH \rightarrow O_2 + 2e^- + 2H^+ $$

E = 0,68 Volt
Annexe 3

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

Courant proportionnel à la quantité de HO-OH
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