# Mise au point d'une technique de détection de la maladie résiduelle dans le tissu ovarien par RT-qPCR, applicable aux jeunes filles prépubères atteintes de neuroblastome. Étude OVAMAR.

Victoria Grèze, F. Chambon, P. Halle, Andreï Tchirkov, Michel Canis,
Florence Brugnon, Justyna Kanold

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## ► To cite this version:

Victoria Grèze, F. Chambon, P. Halle, Andreï Tchirkov, Michel Canis, et al.. Mise au point d'une technique de détection de la maladie résiduelle dans le tissu ovarien par RT-qPCR, applicable aux jeunes filles prépubères atteintes de neuroblastome. Étude OVAMAR. Forum de la recherche en cancérologie Rhône-Alpes Auvergne, Mar 2016, Lyon, France. hal-05396279

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# Mise au point d'une technique de détection de la maladie résiduelle dans le tissu ovarien par RT-qPCR, applicable aux jeunes filles prépubères atteintes de neuroblastome.
## Étude OVAMAR.

V. Grèze¹, F. Chambon¹, P. Halle², A. Tchirkov³,⁴, M. Canis⁵, F. Brugnon⁶,⁷J. Kanold¹,²,⁸

1. CHU Clermont-Ferrand, Service d'Hématologie-Oncologie Pédiatrique, Hôpital Estaing, Clermont-Ferrand, France

2. CHU Clermont-Ferrand, Centre de Biothérapie d'Auvergne, Hôpital Estaing, Clermont-Ferrand, France

3. CHU Clermont-Ferrand, Service de Cytogénétique, Hôpital Estaing, Clermont-Ferrand, France

Centre Jean Perrin, Équipe de Recherche sur les traitements individualisés des Cancers en Auvergne EA 4677, Clermont-Ferrand, France

5. CHU Clermont-Ferrand, Service de Gynécologie-Obstétrique, Hôpital Estaing, Clermont Ferrand, France

6. CHU Clermont-Ferrand, Service de Biologie de la Reproduction, AMP-CECOS, Hôpital Estaing, Clermont-Ferrand, France

7. CNRS 6293-INSERM 1103, Laboratoire Génétique Reproduction et Développement, Clermont-Ferrand, France

8. INSERM, CIC 1405, Unité CRECHE, Clermont-Ferrand, France

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CONTRE
LE CANCER

LA LIQUE
101
comités

pour la vie

## Introduction

Avec les progrès thérapeutiques en oncologie pédiatrique, la préservation de la fertilité constitue un enjeu majeur. La cryopréservation de tissu ovarien est la seule option envisageable chez la fille prépubère mais comporte un risque de réintroduction de cellules néoplasiques en cas de greffe ultérieure. D'où la nécessité de disposer au préalable de techniques sensibles et spécifiques capables de détecter des micrométastases. Le neuroblastome est la tumeur solide extracrânienne la plus fréquente chez l'enfant et la tumeur solide pédiatrique métastasant le plus fréquemment aux ovaires.

## Objectif

L'objectif de notre étude était de mettre au point une méthode de détection de la maladie résiduelle sensible et spécifique dans les tissus ovariens congelés avec et sans cryoprotecteur par RT-qPCR (Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction), applicable aux filles atteintes de neuroblastome.

## Méthodes

* **Recueil de cortex ovarien** : cortex péri-kystique prélevé lors de l'exérèse de kystes bénins de l'ovaire chez des femmes majeures. Congélation en azote liquide avec (n=10) ou sans (n=10) cryoprotecteur.

* **Culture/entretien de lignées tumorales immortalisées de neuroblastome** : IMR-32 et SK-N-SH.

* **Réalisation de gammes de contamination (n=20)** : pour chaque patiente, cortex découpé en 6 fragments pour contamination avec une lignée

* fragments 1 et 2 contaminés avec 10 cellules

* fragments 3 et 4 contaminés avec 100 cellules

* fragment 5 contaminé avec 1000 cellules

* fragment 6 non contaminé (contrôle).

* **Extraction d'ARN puis détection de la maladie résiduelle par RT-qPCR** : quantification de transcrits de gènes d'intérêt pour le neuroblastome : *TH* (tyrosine hydroxylase), *DCX* (doublecortin) et *PHOX2B* (paired-like homeobox 2B). Expression relative par rapport au transcrit d'un gène de référence : *β2 microglobuline* (β2M).

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<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Fig. 1: Relative quantifications of *TH* (a), *DCX* (b) and *PHOX2B* (c) transcripts for neuroblastoma cell lines IMR-32 (blue) and SK-N-SH (red). Each symbol represents one ovarian fragment (for each tumor cell line, 20 fragments contaminated with 10 and 100 cells, 10 fragments contaminated with 1000 cells and 10 fragments uncontaminated).
ns: non significant; r²: correlation coefficient.</figcaption></figure>

## Résultats

* Les résultats ont été similaires dans les 20 gammes de contamination réalisées.

* Seul le transcrit *PHOX2B* s'est révélé spécifique pour la détection de la maladie résiduelle du neuroblastome dans le tissu ovarien puisqu'il n'est pas exprimé dans le tissu ovarien non contaminé, contrairement à *TH* et *DCX* (Fig. 1).

* L'expression de *PHOX2B* est détectable avec seulement 10 cellules néoplasiques et proportionnelle à la quantité de cellules tumorales utilisées pour la contamination.

## Conclusion

Ces résultats préliminaires nécessitent d'être confirmés sur les tissus ovariens de patientes prises en charge pour un neuroblastome et bénéficiant d'une préservation de leur fertilité mais laissent présager d'une potentielle restauration de la fertilité sans risque carcinologique.