# Bilan d'une étude de séroprévalence des Orthoflavivirus West Nile, Usutu et du virus de l'encéphalite à tiques sur un échantillon de la population équine de Gironde en 2023

## Margaux de Mas

► To cite this version:

Margaux de Mas. Bilan d'une étude de séroprévalence des Orthoflavivirus West Nile, Usutu et du virus de l'encéphalite à tiques sur un échantillon de la population équine de Gironde en 2023. Médecine vétérinaire et santé animale. 2025. dumas-05313846

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RÉPUBLIQUE
FRANÇAISE

Liberté
Égalité
Fraternité

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école
néationale
vétérinaire
toulouse

UNIVERSITÉ
DE TOULOUSE

ANNEE 2025 THESE : 2025 - TOU 3 - 4036

# BILAN D'UNE ÉTUDE DE SÉROPREVALENCE DES ORTHOFLAVIVIRUS WEST NILE, USUTU ET DU VIRUS DE L'ENCÉPHALITE À TIQUES SUR UN ÉCHANTILLON DE LA POPULATION ÉQUINE DE GIRONDE EN 2023

## THESE D'EXERCICE
pour obtenir le DIPLOME D'ETAT
de DOCTEUR VETERINAIRE

présentée et soutenue publiquement
devant l'Université de Toulouse
par

## DE MAS Margaux, Arlette, Marie

Directrice de thèse : Mme Elodie LALLEMAND

### JURY

**PRESIDENTE :**

**Mme Séverine BOULLIER** Professeure à l'Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE

**ASSESSEURES :**

**Mme Elodie LALLEMAND** Maître de Conférences à l'Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE
**Mme Aude FERRAN** Maître de Conférences à l'Ecole Nationale Vétérinaire de TOULOUSE

**MEMBRES INVITEES :**

**Mme Marianne DEPECKER** Vétérinaire praticienne et associée de la Clinique Equine de Conques
**Mme Camille MIGNE** Responsable adjointe du Laboratoire National de Référence West Nile de l'ANSES
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Ministère de l'Agriculture et de l'Alimentation
ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE TOULOUSE

Liste des directeurs/assesseurs de thèse de doctorat vétérinaire

Directeur : Professeur Pierre SANS

PROFESSEURS CLASSE EXCEPTIONNELLE

M. BAILLY Jean-Denis, Hygiène et industrie des aliments

M. BERTAGNOLI Stéphane, Pathologie infectieuse

Mme BOURGES-ABELLA Nathalie, Histologie, anatomie pathologique

M. BOUSQUET-MELOU Alain, Pharmacologie, thérapeutique

M. BRUGERE Hubert, Hygiène et industrie des aliments d'origine animale

M. CONCORDET Didier, Mathématiques, statistiques, modélisation

M. DELVERDIER Maxence, Anatomie pathologique

M. FOUCRAS Gilles, Pathologie des ruminants

Mme GAYRARD-TROY Véronique, Physiologie de la reproduction, endocrinologie

M. GUERIN Jean-Luc, Aviculture et pathologie aviaire

Mme HAGEN-PICARD Nicole, Pathologie de la reproduction

M. JACQUIET Philippe, Parasitologie et maladies parasitaires

M. MEYER Gilles, Pathologie des ruminants

M. SCHELCHER François, Pathologie médicale du bétail et des animaux de basse-cour

Mme TRUMEL Catherine, Biologie médicale animale et comparée

PROFESSEURS 1ère CLASSE

Mme CADIERGUES Marie-Christine, Dermatologie vétérinaire

Mme DIQUELOU Armelle, Pathologie médicale des équidés et des carnivores

M. DUCOS Alain, Zootechnie

M. GUERRE Philippe, Pharmacie et toxicologie

Mme LACROUX Caroline, Anatomie pathologique, animaux d'élevage

Mme LETRON-RAYMOND Isabelle, Anatomie pathologique

M. LEFEBVRE Hervé, Physiologie et thérapeutique

M. MAILLARD Renaud, Pathologie des ruminants

Mme MEYNADIER Annabelle, Alimentation animale

M. MOGICATO Giovanni, Anatomie, imagerie médicale

PROFESSEURS 2ème CLASSE

Mme BOULLIER Séverine, Immunologie générale et médicale

Mme CAMUS Christelle, Biologie cellulaire et moléculaire

M. CORBIERE Fabien, Pathologie des ruminants

Mme FERRAN Aude, Physiologie-Thérapeutique

M. MATHON Didier, Pathologie chirurgicale

M. NOUVEL Laurent, Pathologie de la reproduction

Mme PAUL Mathilde, Epidémiologie, gestion de la santé des élevages avicoles

M. VOLMER Romain, Microbiologie et infectiologie
## MAITRES DE CONFERENCES HORS CLASSE

M. **BERGONIER Dominique**, *Pathologie de la reproduction*

Mme **BIBBAL Delphine**, *Hygiène et industrie des denrées alimentaires d'origine animale*

M. **JAEG Jean-Philippe**, *Pharmacie et toxicologie*

Mme **LALLEMAND Elodie**, *Chirurgie des équidés*

M. **LIENARD Emmanuel**, *Parasitologie et maladies parasitaires*

M. **LYAZRHI Faouzi**, *Statistiques biologiques et mathématiques*

Mme **PALIERNE Sophie**, *Chirurgie des animaux de compagnie*

## MAITRES DE CONFERENCES CLASSE NORMALE

M. **ASIMUS Erik**, *Pathologie chirurgicale*

Mme **BRET Lydia**, *Physique et chimie biologiques et médicales*

Mme **BOUHSIRA Emilie**, *Parasitologie, maladies parasitaires*

M. **CARTIAUX Benjamin**, *Anatomie, imagerie médicale*

M. **COMBARROS Daniel**, *Dermatologie vétérinaire*

M. **CONCHOU Fabrice**, *Imagerie médicale*

Mme **DANIELS Hélène**, *Immunologie, bactériologie, pathologie infectieuse*

Mme **DAVID Laure**, *Hygiène et industrie des aliments*

M. **DIDIMO IMAZAKI Pedro**, *Hygiène et industrie des aliments*

M. **DOUET Jean-Yves**, *Ophtalmologie vétérinaire et comparée*

M. **FERCHIOU Ahmed**, *Economie et gestion des entreprises vétérinaires agricoles*

M. **FUSADE-BOYER Maxime**, *Microbiologie et infectiologie*

M. **GAIDE Nicolas**, *Histologie, anatomie pathologique*

Mme **GRANAT Fanny**, *Biologie médicale animale*

Mme **JOURDAN Géraldine**, *Anesthésie, analgésie*

M. **JOUSSERAND Nicolas**, *Médecine interne des animaux de compagnie*

Mme **LAVOUE Rachel**, *Médecine Interne*

M. **LE GRAVERAND Quentin**, *Alimentation animale*

M. **LE LOC'H Guillaume**, *Médecine zoologique et santé de la faune sauvage*

Mme **MEYNAUD-COLLARD Patricia**, *Pathologie chirurgicale*

Mme **MILA Hanna**, *Elevage des carnivores domestiques*

M. **OTAVIANO DO REGO Renato**, *Chirurgie*

Mme **PIERRON Alix**, *Pharmacie-Toxicologie*

M. **TAHIR Zahid Muhammad**, *Reproduction des carnivores*

M. **VERGNE Timothée**, *Santé publique vétérinaire, maladies animales règlementées*

Mme **WARET-SZKUTA Agnès**, *Production et pathologie porcine*

## INGENIEURS DE RECHERCHE

M. **AUMANN Marcel**, *Urgences, soins intensifs*

M. **AUVRAY Frédéric**, *Santé digestive, pathogénie et commensalisme des entérobactéries*

M. **CASSARD Hervé**, *Pathologie des ruminants*

M. **CROVILLE Guillaume**, *Virologie et génomique cliniques*

Mme **DIDIER Caroline**, *Anesthésie, analgésie*

M. **DELPONT Mattias**, *Clinique Aviaire*

Mme **DUPOUY GUIRAUTE Véronique**, *Innovations thérapeutiques et résistances*

Mme **GAILLARD Elodie**, *Urgences, soins intensifs*

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Mme **JEUNESSE Elisabeth**, *Bonnes pratiques de laboratoire*

Mme **LAYSSOL-LAMOUR Catherine**, *Imagerie Médicale*

Mme **POUJADE Agnès**, *Anatomie pathologique Vétérinaire*

Mme **PRESSANTI Charline**, *Dermatologie vétérinaire*

M. **RAMON PORTUGAL Felipe**, *Innovations thérapeutiques et résistances*

M. **REYNOLDS Brice**, *Médecine interne des animaux de compagnie*

Mme **ROUCH BUCK Pétra**, *Médecine préventive*

Mme **SAADA Chloé**, *Gestion intégrée de la santé des ruminants*
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## REMERCIEMENTS

*A mon jury de thèse,*

### A Madame la Professeure Séverine Boullier,

Professeure de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse,
Praticienne hospitalière,
*Immunologie générale et médicale,*

Qui me fait l'honneur de présider mon jury de thèse. Pour ses enseignements et son encadrement bienveillant au cours de ces années d'études,
Sincères remerciements.

### A Madame la Docteure Aude Ferran,

Maître de conférences à l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse,
*Physiologie,*

Qui me fait l'honneur de participer à mon jury de thèse. Pour sa gentillesse et ses enseignements au cours de ces années d'école,
Sincères remerciements.

### A Madame la Docteure Elodie Lallemand,

Maître de conférences à l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse,
Praticienne hospitalière,
*Chirurgie des équidés,*

Qui a accepté d'être la directrice de mes travaux de thèse, et m'a accompagnée au cours de sa réalisation et de sa révision. Pour sa supervision, sa disponibilité et ses conseils avisés,
Reconnaissance et sincères remerciements.

### A Madame la Docteure Marianne Depecker,

Vétérinaire praticienne et associée de la Clinique Equine de Conques,
Membre du Comité scientifique et de la commission Médecine Interne de l'AVEF (Association Vétérinaire Equine Française),
*Spécialiste européenne en Médecine interne des équidés,*
Qui a acceptée la direction de ma thèse et m'a offert l'opportunité de m'intégrer à ce projet de recherche et de participer à l'ensemble des étapes. Pour son engagement, sa bienveillance, sa disponibilité, sa confiance et ses précieux conseils, Gratitude et sincères remerciements.

A Madame la Docteure Camille Migné,

Responsable adjointe du Laboratoire National de Référence West Nile de l'ANSES (Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail),
Chargée de projets en Virologie

Virologie,

Qui a généreusement contribué à l'élaboration de mon manuscrit. Pour son soutien désintéressé, son aide précieuse, sa bienveillance et sa disponibilité constante, Profonde reconnaissance et sincères remerciements.
Je remercie également l'ensemble des personnes ayant contribué à ce travail,

A Madame la Docteure Noémie Chevalier,

Vétérinaire résidente en Médecine interne des équidés à la Clinique Equine de Conques,

*Médecine interne des équidés,*

Pour la réalisation de cet article et pour m'avoir gracieusement intégrée à son projet de
résidence.

A Monsieur le Docteur Benoit Durand,

Chef de l'unité d'Epidémiologie de l'ANSES, (Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail),

*Epidémiologie, biostatistiques*

Pour son aide précieuse dans l'analyse biostatistique des résultats.

A Monsieur le Docteur Clément Bigeard,

Inspecteur de santé publique vétérinaire à l'ANSES, (Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail),

*One Health et épidémiologie,*

Pour son soutien enthousiaste et ses conseils dans la réalisation de mes travaux de thèse.

Au reste de l'équipe de l'enquête de séroprévalence 2023 en Gironde : Gaëlle Gonzalez (ANSES), Agnès Leblond (VetAgro-Sup), tous les vétérinaires référents et traitants impliqués,

Pour leur accueil au sein de l'équipe et la réalisation de ce projet porteur de sens.

A l'équipe de la Clinique Equine de Conques et ses internes de l'année 2023,

Pour leur accueil lors de mon passage en stage et leur partage.

A ma famille, sans laquelle je ne serais pas là aujourd'hui.

Pour votre soutien infaillible et votre confiance inébranlable.
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Table des matières

<table><tr><td>Table des illustrations</td><td>15</td></tr><tr><td>Tableaux :</td><td>16</td></tr><tr><td>Liste des abréviations</td><td>17</td></tr><tr><td>Introduction</td><td>20</td></tr><tr><td>1. Contexte, état des connaissances actuelles et objectifs de l'étude</td><td>21</td></tr><tr><td>1.1. Historique et contexte général en 2023</td><td>21</td></tr><tr><td>1.2. Les orthoflavivirus présents en France</td><td>22</td></tr><tr><td>1.2.1. Vue d'ensemble : Arboviroses et classification</td><td>22</td></tr><tr><td>1.2.2. Les orthoflavivirus : caractéristiques morphologiques et épidémiologiques</td><td>23</td></tr><tr><td>1.2.3. Les orthoflavivirus affectant les équidés</td><td>27</td></tr><tr><td>1.2.4. Les orthoflavivirus capables d'infecter les équidés présents en France métropolitaine au lancement de l'étude épidémiologique au printemps 2023 et leur répartition</td><td>33</td></tr><tr><td>1.3. Pathogénie des orthoflavivirus à l'origine d'encéphalites chez le cheval en France : WNV et TBEV</td><td>36</td></tr><tr><td>1.4. Des outils préventifs et thérapeutiques limités</td><td>39</td></tr><tr><td>1.5. Diagnostic</td><td>40</td></tr><tr><td>1.5.1. Diagnostic clinique</td><td>40</td></tr><tr><td>1.5.2. Diagnostic différentiel</td><td>42</td></tr><tr><td>1.5.3. Diagnostic biologique</td><td>47</td></tr><tr><td>1.5.4. Diagnostic histologique</td><td>51</td></tr><tr><td>1.5.5. Dépistage</td><td>51</td></tr><tr><td>2. Enquête 2023 sur le portage des arbovirus par les équidés en Gironde</td><td>55</td></tr><tr><td>2.1. Enjeux et objectifs de l'enquête</td><td>55</td></tr><tr><td>2.1.1. Des enjeux multiples en santé humaine et animale</td><td>55</td></tr><tr><td>2.1.1.1. Une maladie réglementée à potentiel zoonotique</td><td>55</td></tr></table>
2.1.2. Objectif de l'enquête : une première documentation sur la circulation des orthoflavivirus dans le département de Gironde .................................................. 57

2.2. Matériel et méthodes .................................................................................................................. 57

2.2.1. Conception de l'étude.................................................................................................. 57

2.2.2. Découpage de l'aire géographique de l'étude .......................................................... 58

2.2.3. Méthodes d'échantillonnage et sites de prélèvement ............................................ 62

2.2.4. Critères d'inclusion des animaux prélevés ................................................................ 63

2.2.5. Données additionnelles collectées........................................................................ 64

2.2.6. Prélèvement et traitement des échantillons ................................................................ 64

2.2.7. Analyses sérologiques réalisées par l'ANSES .......................................................... 64

2.2.8. Analyses statistiques.................................................................................................... 68

2.3. Résultats de l'enquête : prévalence des orthoflavivirus chez les équidés en Gironde.................................................................................................................. 68

2.3.1. Résultats de séroprévalence.................................................................................. 69

2.3.2. Analyses statistiques des facteurs de risque ................................................................ 73

3. Discussion des résultats, critiques de l'étude et perspectives pour l'avenir .................... 75

3.1. Contextualisation des résultats de l'enquête épidémiologique de 2023 et limites d'interprétation .................................................................................................................. 75

3.1.1. Circulation des orthoflavivirus en 2023 en Gironde, comparaison avec d'autres publications .................................................................................................................. 75

3.1.2. Adéquation entre les zones de prélèvement et l'emplacement des sites positifs 79

3.1.3. Limite de l'interprétation temporelle des résultats .................................................. 79

3.1.4. Comparaison des facteurs de risques avec d'autres études sérologiques en fonction des conditions du milieu .................................................................................. 80

3.1.5. Les mécanismes expliquant l'émergence et l'expansion de WNV sur un territoire, application à la Gironde .................................................................................. 82

3.2. Critiques et perspectives pour l'avenir ............................................................................ 87

3.2.1. Représentativité de l'échantillon testé........................................................................ 87

3.2.2. Perspectives d'amélioration .................................................................................... 88

3.2.3. Les orthoflavivirus : une maladie ré-émergente méritant une surveillance renforcée 90
<table><tr><td>3.2.3.1. En Gironde et en France : saison 2023 et mesures mises en place depuis notre étude</td><td>90</td></tr><tr><td>3.2.3.2. Enquêtes épidémiologiques et avancées scientifiques en France et à l'international en 2024</td><td>95</td></tr><tr><td>3.2.3.3. Bilan de la saison 2024 en France et en Europe</td><td>98</td></tr><tr><td>3.2.4. Les autres virus à considérer pour le futur en médecine vétérinaire équine</td><td>101</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>108</td></tr><tr><td>Bibliographie</td><td>112</td></tr><tr><td>Annexes</td><td>132</td></tr><tr><td>Annexe 1 : Seroprevalence of West Nile, Usutu and tick-borne encephalitis viruses in equids from south-western France in 2023, N. Chevalier & al., 24 av. 2025</td><td>132</td></tr><tr><td>Annexe 2 : Organigramme de classification des arbovirus (réalisation : Margaux De Mas)</td><td>144</td></tr><tr><td>Annexe 3 : Consentement éclairé utilisé au cours de l'enquête de séroprévalence</td><td>146</td></tr><tr><td>Annexe 4 : Flyer de communication utilisé au cours de l'enquête de séroprévalence</td><td>148</td></tr><tr><td>Annexe 5 : Questionnaire destiné aux détenteurs des équidés ayant participé à l'enquête de séroprévalence</td><td>150</td></tr></table>
Table des illustrations

Figures :

<table><tr><td>Figure 1 : Structure d'un virion du genre Orthoflavivirus (9)</td><td>24</td></tr><tr><td>Figure 2: Structure de la polyprotéine des orthoflavivirus (9)</td><td>25</td></tr><tr><td>Figure 3 : cycle de réplication des orthoflavivirus (11)</td><td>26</td></tr><tr><td>Figure 4 : les cycles de transmission du virus de West Nile (3)</td><td>29</td></tr><tr><td>Figure 5 : Cycle de transmission du virus Usutu et espèces affectées (23)</td><td>31</td></tr><tr><td>Figure 6 : Cycle de transmission du virus de l'encéphalite à tiques (16)</td><td>32</td></tr><tr><td>Figure 7 : Bilan de la répartition des cas d'infection par le WNV en 2022 (34)</td><td>34</td></tr><tr><td>Figure 8 : Bilan de la répartition des cas d'infection par USUV chez les humains, oiseaux, équidés, moustiques et humains entre 2012 et 2021 en Europe, ECDC (35)</td><td>35</td></tr><tr><td>Figure 9 : Bilan européen des cas confirmés d'encéphalite à tiques par pays, 2022, ECDC (1)</td><td>35</td></tr><tr><td>Figure 10: En France hexagonale : cas humains d'infection TBEV entre 2021 et 2023 (33)</td><td>36</td></tr><tr><td>Figure 11 : Schémas explicatifs de la pathogénie de l'infection par le WNV dans le cas de la forme neuroinvasive (36)</td><td>38</td></tr><tr><td>Figure 12 : Graphique de l'évolution dans le temps de la présence du virus ou des marqueurs d'infection virale dans les différents fluides de l'organisme infecté par le WNV (10)</td><td>48</td></tr><tr><td>Figure 13: Schéma de rappel sur les interactions Ac/Ag lors de la réponse immunitaire (40)</td><td>49</td></tr><tr><td>Figure 14 : Principe de la technique d'amplification par PCR (Polymerase chain reaction) (43)</td><td>50</td></tr><tr><td>Figure 15 : Principe de trois méthodes d'ELISA pour la recherche d'anticorps sériques (64)</td><td>53</td></tr><tr><td>Figure 16 : Comparaison des seuils de détection des différentes techniques de détection sérologique usuelles (40)</td><td>55</td></tr><tr><td>Figure 17 : Les territoires de la Gironde (56)</td><td>59</td></tr><tr><td>Figure 18 : Les aires protégées du département de Gironde (59)</td><td>60</td></tr><tr><td>Figure 19 : Les grands axes migratoires à l'échelle mondiale (A) (61) et en France (B) (62)</td><td>61</td></tr><tr><td>Figure 20 : Localisation des écuries réparties sur les trois zones géographiques de l'étude. (63)</td><td>62</td></tr><tr><td>Figure 21 : schéma descriptif du principe du test sérologique ELISA "ID Screen Flavivirus competition" ND (Innovative Diagnostics, Montpellier, France) (Schéma : Margaux De Mas)</td><td>66</td></tr></table>
<table><tr><td>Figure 22 : schéma descriptif du principe du test de séroneutralisation utilisée, décrite dans l'étude de Beck et al. 2020 (69)</td><td>67</td></tr><tr><td>Figure 23 : Distribution des équidés séropositifs au WNV, USUV et/ou au TBEV dans les trois zones d'étude : Confluence, Arcachon et la zone intermédiaire en 2023 (63)</td><td>73</td></tr><tr><td>Figure 24 : Cas équins d'infection West Nile rapportés au cours des saisons de transmission 2022 et 2023 (Crédit : Laboratoire National de Référence, (101))</td><td>92</td></tr><tr><td>Figure 25 : Cas d'infection par le virus Usutu au cours des saisons de transmission 2022 et 2023. (Crédit : Laboratoire National de Référence (61))</td><td>94</td></tr><tr><td>Figure 26 : Cas d'infection par le virus West Nile en 2024 pour les foyers/cas animaux et pour les cas humains dans les pays d'Europe (UE et voisins) (source : bulletins hebdomadaires Plateforme ESA) (124)</td><td>98</td></tr><tr><td>Figure 27 : Cinétique de l'épidémie West Nile en France hexagonale en 2024 chez les équidés et oiseaux basée sur la date de début des symptômes (Données LNR West Nile)</td><td>99</td></tr></table>

## Tableaux :

<table><tr><td>Tableau 1 : Etiologie des affections neurologiques chez les équidés (38)</td><td>43</td></tr><tr><td>Tableau 2 : Résultats de séroprévalence obtenus par test ELISA des chevaux échantillonnés dans les trois zones d'étude : Confluence, Arcachon et la zone intermédiaire.</td><td>70</td></tr><tr><td>Tableau 3 : Résultats de séroprévalence obtenus par séroneutralisation virale dans les trois zones d'étude : Confluence, Arcachon et la zone intermédiaire. (L'effectif "Non caractérisable" regroupe les échantillons positifs ou douteux par ELISA et négatifs par SNT)</td><td>71</td></tr><tr><td>Tableau 4 : Séroprévalence des différentes associations de statuts sérologiques obtenus par SNT pour WNV, USUV et TBEV</td><td>72</td></tr><tr><td>Tableau 5 : Modèle de régression logistique à effets mixtes pour les statuts sérologiques obtenus par VNT concernant le WNV dans la zone de Confluence</td><td>75</td></tr><tr><td>Tableau 6 : Comparaison des résultats de séroprévalence dans différentes régions de France, d'Europe et du monde) (4, 69–80)</td><td>77</td></tr></table>
## Liste des abréviations

AHSV : African horse sickness virus

AIE : Anémie infectieuse équine

ADN : acide désoxyribonucléique

Ag : antigène

ANSES : Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail

APDI : arrêté préfectoral portant déclaration d'infection

ARN : acide ribonucléique

BAGV : Bagaza Virus

BODV-1 : Borna disease virus 1

BVDV : Bovine viral diarrhea virus

CHU : centre hospitalier universitaire

CHVE : centre hospitalier vétérinaire équin

CNR : Centre national de référence

ComERC : Comité d'éthique pour la recherche clinique

COVARS : Comité de Veille et d'Anticipation des Risques Sanitaires

DDPP33 : Direction départementale de la protection des populations de Gironde

DDETSPP : Direction départementale de l'emploi, du travail, des solidarités et de la protection des populations

DENV : Dengue virus

DGAL : Direction générale de l'alimentation

DGV : dépistage du génome viral

DIVA : differentiating infected from vaccinated animals

DMSO : diméthylsulfoxyde

DOM-TOM : départements d'outre-mer et territoires d'outre-mer

ECDC : European Center for Disease Prevention and Control

ECP : effet cytopathique

EEE : Encéphalite équine de l'Est

EEO : Encéphalite équine de l'Ouest

EEV : Encéphalite équine vénézuélienne

EFS : Etablissement français du sang

EHV-1 : Equine herpes virus 1
ELISA : Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay

ENVA : Ecole nationale vétérinaire d'Alfort

FCPR : formation complémentaire par la recherche

HCSP : Haut Conseil de la Santé Publique

HRP : horseradish peroxidase

IC : intervalle de confiance

ICTV : l'International Committee on Taxonomy of Viruses

IgG : immunoglobuline de type G

IgM : immunoglobuline de type M

IM : intramusculaire

ISPV : Inspecteur de santé publique vétérinaire

IV : intraveineux

JEV : Japanese encephalitis virus

LCR : liquide céphalo-rachidien

LIV : Louping Ill virus

LNR : Laboratoire national de référence

MAC ELISA : Immunoglobulin M antibody-capture enzyme-linked immunosorbent assay

MVEV : Murray Valley encephalitis virus

ND : nom déposé

OIE : Office international des épizooties

PACA : Provence-Alpes-Côte d'Azur

RESPE : Réseau d'épidémiosurveillance en pathologie équine

RT-PCR : Reverse-transcription - polymerase chain reaction

SLEV : Saint-Louis encephalitis virus

SNT : seroneutralisation test

TBE-complex : Tick-borne encephalitis complex

TBEV : Tick-borne encephalitis virus

TCID50 : 50% tissue culture infectious dose

USUV : Usutu virus

VIH : Virus de l'immunodéficience humaine

VSB-1 : Variegated Squirrel 1 Bornavirus

WNV : West nile virus

ZIKAV : Zika virus

ZPS : zone de protection spéciale
## Introduction

Les arbovirus sont des virus transmis par des arthropodes comme les moustiques. Parmi les 500 arbovirus identifiés à ce jour, la moitié est transmise par des moustiques, le tiers par des tiques et le reste par des phlébotomes et des moucherons du genre *Culicoïdes* (1). Aujourd'hui, la répartition des arboviroses est mondiale et en expansion, dans le contexte du réchauffement climatique qui modifie les écosystèmes et la biologie des vecteurs. De plus, le caractère très souvent asymptomatique de ces infections, pour l'Homme comme pour l'animal, rend la surveillance délicate.

Le genre *Orthoflavivirus* regroupe un ensemble diversifié d'arbovirus. Certains sont responsables de troubles hémorragiques, et d'autres, comme les virus West Nile (WNV), Usutu (USUV) et de l'encéphalite à tiques (TBEV) ont un tropisme neurologique. L'importance de la forme clinique des maladies causées par ces derniers dépend de l'espèce touchée : ainsi, des symptômes peuvent être observés chez l'Homme suite à l'infection par les trois virus WNV, TBEV, et USUV dans une moindre mesure. En revanche, seules les infections par WNV et TBEV peuvent être symptomatiques chez les équidés.

Le virus du West Nile a été isolé en 1937 en Ouganda chez l'Homme, dans la région du West Nile. Des épidémies régulières chez l'Homme et les chevaux ont depuis été constatées sur les continents européen et africain, puis nord-américain depuis 1999. La France a elle-même connu plusieurs épisodes d'introduction et de (ré)-émergence du virus, notamment en Camargue en 1962 puis en 2000, 2004, dans le Var en 2003, dans le Gard et dans la région d'Argelès-sur-Mer en 2006 (2). Depuis, le virus circule de manière endémique dans le pourtour méditerranéen.

Cependant, aucun cas n'avait été recensé dans les autres régions françaises jusqu'en octobre 2022, où trois infections au WNV ont été signalées sur la côte Atlantique, en Gironde. Les équidés présentaient des symptômes neurologiques, tels qu'une ataxie, une faiblesse et des fasciculations musculaires, ainsi qu'une encéphalite pour un des chevaux. La réalisation de tests sérologiques avait révélé la mise en cause du WNV.

L'apparition d'une épidémie entraîne des conséquences importantes pour les régions touchées : d'une part économique pour la filière équine (mortalité importante, séquelles associées à la maladie) (Jeux Olympiques 2000), d'autre part, pour la santé humaine. En effet, la circulation croissante du virus au sein des populations animales constitue un signal d'alarme pour la santé humaine, plusieurs études ayant montré que l'analyse de la séroprévalence chez les chevaux permettait d'estimer le risque d'infection humaine (3).
Ainsi, l'émergence de maladies zoonotiques, et notamment celles provoquées par des orthoflavivirus dans des régions jusque-là indemnes inquiète, et motive la mise en place d'enquêtes épidémiologiques afin de mieux appréhender l'épidémiologie de ces pathogènes et leur évolution spatiale et temporelle à venir. Dans ce cadre, l'ensemble d'un réseau One Health a été mobilisé dans la région de Nouvelle-Aquitaine en 2023, initiant des études épidémiologiques parmi les populations d'équidés, mais aussi d'oiseaux, et d'insectes. Outre l'intérêt évident de cette étude en médecine vétérinaire, les équidés jouent un rôle efficace de sentinelles et de témoins de la circulation de ces orthoflavivirus zoonotiques, permettant ainsi d'anticiper d'éventuelles flambées épidémiques chez l'homme.

L'enquête de séroprévalence des orthoflavivirus dans la population équine de Gironde présentée dans cette thèse est le fruit de cette démarche. Mettant en jeu l'ensemble des acteurs du réseau One Health français, elle a ainsi pour objectif de caractériser quels orthoflavivirus circulent dans la population équine, ainsi que leur séroprévalence dans les zones à risque de la région bordelaise. Nous tenterons également d'identifier les facteurs de risque qui seraient favorables à l'infection d'un individu.

Après un état des connaissances actuelles concernant les orthoflavivirus, leur épidémiologie et répartition à différentes échelles, nous présenterons l'enquête menée en Gironde en 2023 et ses objectifs. Les résultats obtenus seront ensuite analysés et discutés, puis mis en relation avec le contexte et l'environnement de l'étude. Enfin, nous évoquerons les biais de l'étude et les perspectives de recherche à venir.

# 1. Contexte, état des connaissances actuelles et objectifs de l'étude

## 1.1. Historique et contexte général en 2023

L'existence de maladies virales vectorielles touchant l'Homme n'est pas récente : dès le début du XXème siècle, ces affections sont étudiées à travers les recherches sur la fièvre jaune chez l'Homme. Chez l'animal, la peste équine, virus vectorisé par les moucherons du genre *Culicoides*, a été découverte dès 1901 par MM. Fadyean, Nocard et Theiler. Depuis lors, de nombreux arbovirus, vectorisés par les moustiques mais aussi d'autres arthropodes comme les tiques (comme la maladie de Nairobi du mouton, mise en évidence en 1917 par Montgomery), n'ont cessé d'être découverts au fur et à mesure des recherches et avancées scientifiques permettant leur identification (4).
En effet, beaucoup d'arboviroses sont des zoonoses, c'est-à-dire des "maladies et infections qui se transmettent naturellement des animaux vertébrés à l'Homme et vice-versa" d'après l'Organisation Mondiale de la Santé (1959) (5). Le développement des connaissances à leur sujet constitue donc un enjeu capital pour la protection de la santé humaine, ce qui explique l'avancée rapide des recherches au niveau mondial.

Le cheval, mammifère domestique présent aux côtés de l'homme sur l'ensemble des continents et donc exposé à des vecteurs arthropodes multiples et variés, est sensible à plusieurs arbovirus, qui seront présentés ci-après. L'expression frustre des maladies correspondantes et la faible spécificité des signes cliniques, principalement neurologiques, ont longtemps rendu difficile la mise en cause d'agents viraux. Ainsi, en Camargue dans les années 1960 où circulait le virus du West Nile, on parlait de cas de "lourdiges" en référence à la difficulté à se mouvoir de chevaux ataxiques, avec fréquemment, une parésie postérieure et une démarche ébrieuse (2).

En Europe, des virus appartenant au genre *Orthoflavivirus*, comme WNV et TBEV, sont régulièrement incriminés lors de la déclaration de cas graves d'encéphalites chez les chevaux, et ces infections correspondent fréquemment à l'apparition d'infections humaines concomitantes (6).

En France cependant, seul le virus du West Nile avait été mis en cause jusqu'à ce jour chez les équidés, et ce seulement sur le pourtour méditerranéen (1962 en Camargue, 2003 dans le Var, 2006 dans les Pyrénées-Orientales...) (5). Ainsi, plusieurs enquêtes sérologiques ont été menées en Camargue dans le cadre de cas déclarés d'infection par le virus du West Nile depuis 1963.

## 1.2. Les orthoflavivirus présents en France

### 1.2.1. Vue d'ensemble : Arboviroses et classification

Les arboviroses représentent un ensemble hétérogène de maladies dues à des arbovirus. Venant de l'abréviation de "arthropod-borne virus", ce terme désigne des virus "maintenus dans la nature par un cycle de transmission biologique entre des hôtes vertébrés permissifs et des arthropodes hématophages" (4), les vecteurs principaux étant les moustiques, les tiques, les moucherons du genre *Culicoïdes* et les phlébotomes. Il est important de souligner que dans le cycle des arbovirus, les arthropodes sont des vecteurs biologiques, en opposition au terme de vecteur mécanique (transmission passive par effet de "seringue souillée") : le virus connaît une phase de multiplication dans l'organisme de l'arthropode, sans modification de ses propriétés
(l'arthropode serait alors considéré comme un hôte intermédiaire). Cette définition, basée sur
des critères épidémiologiques et non physico-chimiques, explique la diversité des espèces
d'arbovirus (4).

Les virus de ce groupe hétérogène se caractérisent uniformément par une très faible
résistance aux variations environnementales, ce qui rend obligatoire leur transmission directe
via un arthropode vecteur. De plus, les espèces affectées sont très nombreuses et variées, les
mammifères, reptiles, arthropodes et oiseaux étant tout autant concernés. Un autre critère
nécessaire à l'inclusion d'une souche virale dans l'ensemble des arbovirus est la réussite des
passages intracérébraux sur sourceaux nouveau-nés. La classification séro-immunologique de
Casals et Brown, basée sur le caractère hémagglutinant et hémadsorbant, ainsi que sur le fait
que l'infection par un arbovirus entraîne la synthèse d'anticorps neutralisants persistants
plusieurs années, constitue un critère de classification majeur et précieux pour l'étude
épidémiologique des arbovirus (4).

L'ensemble des arbovirus regroupe des virus appartenant à 10 familles virales
différentes selon la classification taxonomique adoptée par l'International Committee on
Taxonomy of Viruses (ICTV) : les *Asfarviridae*, *Orthomyxoviridae*, *Nairoviridae*,
*Peribunyaviridae*, *Phenuiviridae*, *Nyamiviridae*, *Rhabdoviridae*, *Flaviviridae*, *Reoviridae et
Togaviridae* (4, 6, 7).

Comme le met en lumière le diagramme de l'Annexe 1, la majorité des arbovirus connus
à ce jour pour être responsables d'infection chez les équidés, en France, appartient au genre
*Orthoflavivirus*, et pour l'ensemble, il existe un risque d'infection pour l'Homme. On distingue
dans ce genre différents sérocomplexes au sein desquels les virus sont phylogénétiquement et
antigéniquement très proches les uns des autres, comme le complexe du virus de l'encéphalite
japonaise (JEV) qui regroupe WNV, USUV, JEV, le virus de l'encéphalite de la Murray Valley
(MVEV) et le virus de l'encéphalite de Saint-Louis (SLEV), ou encore le complexe des
encéphalites transmises par les tiques, dans lequel on retrouve TBEV et le virus de Louping Ill
(LIV).

1.2.2. Les orthoflavivirus : caractéristiques morphologiques et épidémiologiques

Le genre *Orthoflavivirus* se classe au sein de la famille *Flaviviridae*. Ces derniers sont des virus enveloppés à ARN simple brin de polarité positive, linéaire, non segmenté. Les virions sont sphériques, d'une taille comprise entre 45 et 60 nm de diamètre, la nucléocapside est à
symétrie icosaédrique et porte plusieurs protéines de surface : les protéines E, prM, C (Figure 1) (4).

Le genre *Orthoflavivirus* plus précisément, anciennement *Flavivirus* renommé par l'ICTV en 2022 (7), compte actuellement 53 représentants. Les orthoflavivirus possèdent un génome d'environ 10 700 nucléotides (5), qui contrairement aux autres virus de la famille *Flaviviridae*, portent une coiffe nucléotide méthylée en son extrémité 5'.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 1 : Structure d'un virion du genre Orthoflavivirus (8)</figcaption></figure>

L'enveloppe des orthoflavivirus est un assemblage complexe des trois protéines virales structurales E, prM, C associées à
des particules provenant de la cellule hôte, intégrés lors du passage et de la maturation du virion dans le système
endomembranaire cellulaire.

La glycoprotéine d'enveloppe E est la plus antigénique des orthoflavivirus, elle est donc
utilisée dans le cadre du diagnostic d'infection aux orthoflavivirus et du développement de
vaccins. Sa structure tertiaire est constituée de trois domaines : DI, DII et DIII. La plupart des
épitopes B localisés sur DI et DIII sont communs aux souches de WNV mais sont distincts des
autres orthoflavivirus. En effet, le DIII présente une séquence moins conservée entre ces virus
et induit des anticorps fortement neutralisants. En revanche, les épitopes reconnus par les
anticorps responsables des réactions croisées entre orthoflavivirus sont localisés au niveau de
DII (9).
Le cycle de réplication des orthoflavivirus, très similaire à celui des hepacivirus, commence par leur entrée dans la cellule cible par endocytose, grâce à la liaison de la glycoprotéine E à des récepteurs cellulaires. Le virus est alors pris en charge dans une vésicule endosomale, dans laquelle le pH acide va provoquer une fusion de la membrane endosomale avec l'enveloppe virale et ainsi un relargage du génome viral dans le cytosol (10). L'ARN viral positif est alors directement traduit en une polyprotéine unique, qui est ensuite scindée en 10 protéines virales fonctionnelles : les protéines structurales E, prM et C et 7 protéines non structurales NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 (Figure 2) (5, 11).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 2: Structure de la polyprotéine des orthoflavivirus (8)</figcaption></figure>

Cette maturation de la polyprotéine virale nécessite l'intervention de protéases cellulaires mais également de protéases codées par le génome viral : chez les orthoflavivirus, il s'agit de la protéase NS3 associée au co-facteur NS2B (12). Les orthoflavivirus codent leur propre ARN-dépendante-ARN-polymérase, qui va alors copier le génome viral en ARN-intermédiaire, matrice pour la réplication de tous les ARN viraux dans le réticulum endoplasmique de la cellule hôte. Les virions immatures formés y sont liés aux proto-protéines prM et E, avant d'être acheminés vers l'appareil de Golgi où des remaniements protéiques vont permettre la maturation finale des virions. Finalement, les virions matures sont transportés par
des vésicules jusqu'à la membrane cytoplasmique où ils sont exocytés dans le milieu extracellulaire, selon un cycle non lytique (Figure 3).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 3 : cycle de réplication des orthoflavivirus (10)</figcaption></figure>

De façon générale, le cycle naturel de transmission des orthoflavivirus est commun avec les autres arbovirus : hôtes réservoirs et/ou amplificateurs, vecteurs arthropodes et hôtes définitifs pouvant être des culs-de-sacs épidémiologiques ou des relais amplificateurs, selon si la virémie est suffisamment élevée à un stade de l'infection pour permettre l'infection d'un vecteur (5).

Le réservoir est l'hôte naturel idéal de l'arbovirus : il est réceptif à l'infection mais ne développe pas de signe clinique. Cependant, le stade de virémie est intense et prolongé, ce qui permet la transmission du virus aux vecteurs. Chez les orthoflavivirus d'importance en santé animale, les espèces réservoirs peuvent être des oiseaux, des rongeurs... Les hôtes définitifs exprimant une virémie élevée peuvent également jouer le rôle d'amplificateurs, ainsi que certains vecteurs capables de transmission ovarienne du virus, comme les tiques. Les vecteurs des orthoflavivirus sont des arthropodes piqueurs hématophages, principalement les moustiques et les tiques (13). Pour un virus donné, on identifie des espèces d'arthropodes dites vecteurs
habituels, et d'autres vecteurs dits accessoires qui interviennent de façon minoritaire, mais qui peuvent expliquer l'extension du spectre d'hôtes à des hôtes accidentels, comme cela sera exposé plus tard. Cette différenciation découle de plusieurs critères : degré de sensibilité et seuil de multiplication du virus permettant sa transmission (compétence vectorielle), longévité, abondance régionale à corréler à la densité d'hôtes dans cette même région, et appétence particulière pour une espèce réservoir ou victime (capacité vectorielle). La transmission est de type biologique, avec une infectiosité prolongée, pouvant être interrompue en diapause hivernale et parfois complétée par une transmission verticale à la descendance chez les tiques (5).

Au contraire de l'espèce hôte, l'espèce hôte définitive, ou victime, est réceptive et sensible à l'infection : la virémie est éphémère et des signes cliniques peuvent être observés. Dans le cas des orthoflavivirus, les hôtes définitifs sont principalement des mammifères (dont l'Homme très souvent), mais le spectre d'hôtes peut s'étendre à de très nombreuses espèces différentes. De fait, on retrouve le virus du West Nile également chez des reptiles et amphibiens (2).

Certains orthoflavivirus ont un tropisme nerveux central (West Nile, TBEV, encéphalite japonaise, encéphalite de Saint Louis, Usutu...), tandis que d'autres ont un tropisme viscéral (Dengue, fièvre jaune). Ainsi, selon le virus, la maladie peut se présenter sous forme de fièvre hémorragique ou de méningo-encéphalite potentiellement mortelle (5, 14).

De façon inhérente à la nature de ce cycle, les maladies dûes aux arbovirus, et donc à notre genre d'intérêt Orthoflavivirus, sont des maladies saisonnières sous la dépendance de la présence des arthropodes vecteurs et donc des conditions environnementales et climatiques favorables à leur développement et à leur rencontre avec les hôtes. Par exemple, en été, la probabilité de rencontre entre les réservoirs oiseaux et les moustiques est renforcée par la concentration des populations autour des rares points d'eau (2).

### 1.2.3. Les orthoflavivirus affectant les équidés

Les équidés sont surtout sensibles à des orthoflavivirus à tropisme nerveux. En Europe, ce sont des infections par les virus du West Nile (WNV), les virus du complexe de l'encéphalite à tiques (TBEV), ainsi que le virus Usutu (USUV), qui sont majoritairement décrites parmi les populations équines d'après le rapport du Collège Européen de Médecine interne équine de 2022 (15–17). D'autres orthoflavivirus circulent également dans le reste du monde, comme le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) en Asie du Sud Est, et le virus de la Murray Valley
(MVEV) en Australie et Nouvelle-Guinée. (Figure 4). Ces derniers virus n'ont pas encore été impliqués des cas humains et équins en Europe, mais ils ont été détectés dans le nord de l'Italie chez des moustiques et oiseaux en 2011 (18).

Le **virus du West Nile (WNV)** d'abord, responsable de symptômes neurologiques sévères autant chez le cheval que chez l'homme, est l'arbovirus responsable d'encéphalite équine le plus largement répandu (16). Il est majoritairement vectorisé par les moustiques du genre *Culex* (*C.pipiens pipiens*, le moustique “commun” et *C. pipiens molestus* sur le territoire métropolitain français), bien que sa spécificité vectorielle soit toute relative : en effet, d'autres vecteurs minoritaires ou opportunistes tels que les moustiques du genre *Aedes* (*Ae. cantans*, *Ae. caspius*), ou des tiques des genres Argas ou Hyalomma pourraient aussi transmettre le virus (4, 19, 20). Le spectre d'hôtes du WNV est extrêmement large : ayant pour réservoir principal les oiseaux, le WNV est aussi capable d'infecter des mammifères, mais également des reptiles et des amphibiens. Cela est lié aux caractéristiques différentes des nombreux vecteurs possibles : si les principaux vecteurs, les moustiques *Culex*, sont surtout ornithophiles en France, le genre *Aedes*, plutôt mammophile non strict, serait à l'origine de la transmission du virus aux mammifères : c'est ce que l'on appelle des “vecteurs-ponts”. Parmi les espèces d'oiseaux, les corvidés sont les plus sensibles, et révèlent ainsi la présence du virus sur un territoire. L'infection d'oiseaux migrateurs explique quant à elle l'expansion transcontinentale du WNV participe sans doute à son émergence dans des aires géographiques jusque-là indemnes. Dans ce cycle, l'Homme et les équidés sont considérés comme des hôtes culs-de-sacs épidémiologiques, ils ne participent pas au cycle naturel de transmission. En effet, ils ne développent pas une virémie suffisante pour être à l'origine de l'infection de moustiques lors de repas sanguins. Dans ce cycle faisant déjà intervenir un grand nombre d'acteurs, des mécanismes considérés plus anecdotiques sont évoqués, tels que la survie du virus pendant l'hiver au sein du vecteur, une transmission verticale possible entre moustiques, ou encore la transmission directe entre oiseaux, par voie oro-fécale (Figure 4) (2). Chez l'Homme, une transmission interhumaine peut s'opérer lors de don de sang et de transplantation d'organes.
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 4 : les cycles de transmission du virus de West Nile (2)</figcaption></figure>

Différentes lignées virales ont été caractérisées : la lignée 1, la plus répandue, est retrouvée notamment en Europe et aux Etats-Unis, mais aussi en Afrique, au Moyen-Orient, en Inde ou en Australie. La lignée 2 n'était trouvée originellement qu'en Afrique subsaharienne ou à Madagascar. Sur les neuf lignées génétiques décrites, les lignées virales 1 et 2 sont celles qui représentent un risque zoonotique le plus important et qui sont incriminées dans les cas symptomatiques chez les hommes, chevaux et oiseaux (4). Il semblerait qu'une importante variabilité de la séquence de la glycoprotéine virale E soit en partie responsable de la neurovirulence et du potentiel invasif du virus du West Nile (16). Le WNV circule en Europe depuis les années 1960, on le trouvait alors en France, au Portugal ou à Chypre. Après une trentaine d'années de silence, la lignée 1A du WNV a refait surface en Afrique du Nord et en Europe, notamment dans la région française de Camargue en 2000. Si aux Etats-Unis, le WNV s'est déclaré sous forme d'épidémie fulgurante et d'une ampleur massive après son introduction à New York en 1999, le scénario européen est différent : depuis une vingtaine d'années, des épidémies imprévisibles, mais limitées dans l'espace et dans le temps, touchent le pourtour méditerranéen et l'Europe de l'Est avec une fréquence néanmoins croissante. Cette allure épidémiologique différente peut être liée aux multiples modalités de transmission du WNV :
une transmission directe entre oiseaux expliquerait la diffusion rapide observée aux Etats-Unis, tandis qu'une épizootie/épidémie plus concentrée et de faible ampleur serait attribuée à une transmission du virus par les vecteurs arthropodes. Plus récemment, l'expansion du WNV a connu un nouvel essor avec l'introduction en Europe du lignage 2, vraisemblablement originaire d'Afrique, qui s'est répandu depuis les pays d'Europe de l'Est (Hongrie, Autriche) vers le reste du continent, notamment en Grèce ou en Italie en 2011, en Espagne en 2017, et même plus récemment en Allemagne et même en France en 2018 (3, 21).

Les humains et les équidés sont les deux espèces de mammifères les plus sensibles à l'infection par le WNV (4). Si dans la majorité des cas, l'infection est asymptomatique chez ces deux espèces, les équidés développent des signes cliniques dans jusqu'à 10% des cas. De même, 1 cas humain sur 140 présente une atteinte neurologique grave (16). Ce sont souvent des patients immunodéprimés, qui ont alors 80% de risque de développer une forme sévère. Cela justifie que la fièvre du West Nile soit classée comme danger sanitaire de catégorie E par la loi de santé animale en Europe, et donc soumise à déclaration et surveillance (règlement (UE) 2016/429, 2021).

D'autre part, le **virus Usutu** (USUV), jamais décrit comme étant à l'origine de signes cliniques chez le cheval, a été isolé dans des cas de symptômes neurologiques chez l'Homme. Isolé en 1959 en Afrique sub-saharienne, il a été introduit en Europe en 1996, où il fait l'objet de programmes de surveillance renforcés. Le virus USUV se caractérise par ailleurs par une grande diversité génétique : on dénombre à ce jour 5 lignées européennes et 3 lignées africaines. Le cycle de transmission naturelle du virus Usutu implique les moustiques (Culex spp.) comme vecteurs biologiques, et les oiseaux comme hôtes amplificateurs et réservoirs, notamment les passereaux. De même que pour le WNV, l'homme et d'autres espèces de mammifères constituent des hôtes culs-de-sacs épidémiologiques (Figure 6). Certaines espèces de mammifères, comme le chien et le cheval, ne développent que de façon exceptionnelle des symptômes et l'historique d'un contact avec le virus n'est visible que sérologiquement. Cependant, USUV est responsable de forte mortalité chez certaines espèces aviaires comme les merles et les chouettes lapones. Chez l'Homme, le neurotropisme du virus engendre des signes neurologiques graves et explique la considération et l'inquiétude en regard du USUV, d'autant plus que la co-circulation de plusieurs lignées virales sur un même espace et le caractère asymptomatique de l'infection chez plusieurs espèces compliquent la surveillance et le contrôle (22).
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 5 : Cycle de transmission du virus Usutu et espèces affectées (22)</figcaption></figure>

Le virus Usutu a été isolé chez les espèces en noir, tandis que des individus sérologiquement positifs ont été mis en évidence chez les espèces en bleu.

Le **virus de l'encéphalite à tiques** (TBEV : tick-borne encephalitis virus) est également un orthoflavivirus capable d'infecter les équidés. Il est inclus plus largement dans le sérocomplexe TBE, tout comme le virus Louping Ill (LIV), responsable de l'encéphalomyélite ovine et capable d'affecter de façon plus anecdotique d'autres mammifères, dont l'homme, le cheval, les bovins, certains rongeurs... Contrairement au WNV et au USUV, le TBEV est transmis par des tiques dures : *Ixodes ricinus* est le principal vecteur en Europe de l'Ouest, mais 14 espèces de tiques peuvent être infectées (*I. persulcatus* en Europe du Nord et de l'Est) (15). Les petits rongeurs constituent le principal réservoir du virus. Les tiques constituent également un réservoir du virus. Lorsqu'une tique au stade larvaire se gorge sur un rongeur virémique, elle restera infectée tout au long de sa vie. Le virus est maintenu lors des différentes mues (transmission trans-stadiale), et une transmission transovarienne a été décrite (de la tique adulte femelle à sa descendance). Les virus du TBE-complex ont aussi été isolés dans le lait de mammifères infectés : la consommation de lait ou de produits laitiers non pasteurisés est également une voie de contamination (Figure 7). Divisé en cinq souches virales différentes, le TBEV est largement distribué sur l'ensemble des territoires eurasiatiques, où on recense plus de 10 000 cas humains par an (23). Tout comme la fièvre West Nile, l'infection des humains et des équidés par le TBEV est généralement asymptomatique, mais dans une minorité de cas, la maladie peut évoluer vers un état fébrile et des symptômes neurologiques sévères (4). Ainsi, une étude rétrospective menée en Suisse entre 2011 et 2019 a mis en évidence l'implication du
TBEV chez 6 chevaux atteints de symptômes neurologiques aigus, dont une ataxie et des déficits proprioceptifs (24). D'autres publications rapportent l'existence de cas cliniques équins dans les régions endémiques du virus, comme en Autriche ou en Allemagne (25, 26).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 6 : Cycle de transmission du virus de l'encéphalite à tiques (15)</figcaption></figure>

Le virus de l'encéphalite de la vallée de Murray (MVEV) a été isolé pour la première fois en 1951 dans la vallée de Murray, en Australie. Responsable d'épidémies mortelles chez l'homme associées à des symptômes sévères (fièvre, vomissements, diarrhée, céphalées, encéphalite voire mort), le virus infecte également les animaux domestiques par la piqûre de moustiques des genre *Culex*, *Anopheles* et *Aedes*. Cependant, seul le cheval présente des signes cliniques. Dans ce cas encore, les oiseaux sauvages, et surtout les oiseaux d'eau, sont les principaux hôtes réservoirs du virus, mais le porc, le lapin et le kangourou peuvent également jouer ce rôle (4).
Le **virus de l'encéphalite japonaise (JEV)**, comme le West Nile, est classé comme danger sanitaire de catégorie E en Europe, soumis à déclaration et surveillance. C'est en effet une zoonose grave responsable de pertes économiques importantes en élevage porcin. Il existe 5 génotypes, les plus répandues étant les génotypes I et III en Asie du Sud-Est, région où il est décrit pour circuler. En 2022, de manière inattendue, le génotype IV a été introduit en Australie où des cas porcins et chez des alpagas ont été rapportés (27). Également transmis par les moustiques du genres *Culex*, JEV possède un cycle épidémiologique très proche de celui du virus du West Nile, à ceci près qu'il infecte également les porcs, et que ceux-ci sont des hôtes amplificateurs pouvant être à l'origine de l'infection de nouveaux moustiques. L'encéphalite japonaise est majoritairement asymptomatique dans l'espèce porcine même si elle peut causer des avortements chez les truies gestantes. En revanche, elle provoque des signes cliniques similaires au West Nile chez les humains et les équidés infectés. Il est à noter qu'un vaccin contre cette maladie existe et est disponible dans les régions d'Asie où le virus circule (5).

Si dans le contexte actuel du réchauffement climatique et du chamboulement global des conditions climatiques et environnementales mondiales, il faut s'attendre à des émergences virales inattendues sur des territoires à ce jour indemnes, les connaissances actuelles et les études menées jusqu'à maintenant permettent de donner une idée de la distribution géographique des différentes espèces d'orthoflavivirus dans le monde, et plus spécifiquement des souches virales circulant en France hexagonale.

### 1.2.4. Les orthoflavivirus capables d'infecter les équidés présents en France métropolitaine au lancement de l'étude épidémiologique au printemps 2023 et leur répartition

Pour résumer, les orthoflavivirus WNV, USUV ainsi que le TBEV ont été identifiés en Europe et plus précisément en France hexagonale chez les populations d'équidés. Avant le signalement de trois cas de West Nile chez des chevaux en Gironde en octobre 2022, la lignée 1a du WNV mais aussi la lignée 2, ne concernait que le bassin méditerranéen (Camargue, Hérault, Bouches-du-Rhône, Var, Pyrénées Orientales) (Figure 7) (28). Quant au USUV, sa présence n'avait pas été reportée en France jusqu'en 2015 dans les régions du Rhône et du Haut-Rhin, où une importante mortalité parmi les populations d'oiseaux a révélé sa présence sur le territoire. En 2016, le premier cas humain a été recensé en Camargue. D'après les enquêtes épidémiologiques réalisées depuis, les lignées Africa 2 et 3 et Europa 3 circulent sur une large
portion du territoire français, avec un record de circulation dans l'avifaune en 2018 où plus d'une centaines de cas aviaires répartis sur 47 départements ont été rapportés (22, 29). En octobre 2022, un cas humain a été confirmé en Nouvelle-Aquitaine pour la première fois (30). Concernant l'infection des chevaux par le virus Usutu, les enquêtes sérologiques menées dans le Bassin Méditerranéen sur le virus du West Nile ont révélé une co-circulation du virus Usutu, sans déclaration de cas cliniques (Figure 8). Le virus TBEV est endémique chez les équidés dans plusieurs pays d'Europe, tels que la Lituanie, l'Allemagne, l'Autriche la Suisse où des séroprévalences inattendues ont été trouvées (entre 20 et 30%) (31). En France, des cas humains pour la plupart autochtones, recensés entre 2021 et 2023 en Haute-Savoie, Alsace, et Auvergne-Rhône-Alpes témoignent de la circulation active du virus sur le territoire français (Figure 9, Figure 10) (32). Cependant, le TBEV n'a pas encore été détecté chez les chevaux, son absence a même été objectivée lors de l'enquête épidémiologique sur la présence des virus WNV et USUV menée en 2022 dans le Sud-Est de la France (28).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 7 : Bilan de la répartition des cas d'infection par le WNV en 2022 (33)</figcaption></figure>
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 8 :** Bilan de la répartition des cas d'infection par USUV chez les humains, oiseaux, équidés, moustiques et humains entre 2012 et 2021 en Europe, ECDC (34)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 9 :** Bilan européen des cas confirmés d'encéphalite à tiques par pays, 2022, ECDC (35)</figcaption></figure>
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 10: En France hexagonale : cas humains d'infection TBEV entre 2021 et 2023 (32)</figcaption></figure>

Nous verrons par ailleurs que certaines enquêtes épidémiologiques menées à ce jour, dont celle sur laquelle porte ce travail, révèlent la circulation possible chez les chevaux de nouveaux orthoflavivirus encore non caractérisés sur le territoire français (28).

## 1.3. Pathogénie des orthoflavivirus à l'origine d'encéphalites chez le cheval en France : WNV et TBEV

La pathogénie de ces orthoflavivirus est similaire et est caractérisée par une réplication initiale extra-neuronale, puis par une invasion du système nerveux central via la barrière hémato-méningée (36). De nombreuses zones d'ombre persistent, mais les recherches avancent et donnent de plus en plus de précisions sur les mécanismes d'action du virus. Dans la suite de ce paragraphe, le mode d'action du WNV est développé et pris comme exemple. Suite à la piqûre du moustique infecté, le virus se réplique localement dans les kératinocytes et les cellules de Langerhans de l'épiderme au niveau du site d'injection. Cette réplication locale est favorisée par l'effet immunomodulateur de la salive du moustique, qui perturbe le signalement et le recrutement des premiers acteurs de l'immunité innée par les cytokines (interleukine 2, interféron Gamma) (Figure 11). Les cellules de Langerhans infectées migrent ensuite jusqu'aux
nœuds lymphatiques drainant la zone correspondante, où le virus poursuit sa multiplication. Là, l'immunité innée joue son rôle de lutte contre l'infection par phagocytose des cellules infectées et des particules virales libres, ou via la sécrétion de chimiokines. Cependant, le virus continue de se répliquer dans les cellules dendritiques du nœud lymphatique simultanément à l'action de lutte des macrophages. Depuis le système lymphatique, le virus se répand ensuite par voie hématogène dans le reste de l'organisme. De cette infection généralisée découlent ensuite les différentes formes cliniques observables : la forme neuroinvasive rapportée chez beaucoup d'espèces hôtes, mais aussi des formes gastro-intestinales, hépatiques, pancréatiques, cardiovasculaires ou cutanées chez l'humain notamment.

Concernant la forme neuroinvasive, plusieurs scénarios sont avancés pour expliquer les voies d'infection du tissu nerveux par le virus. La première hypothèse avancée est la voie hématogène, avec un transfert passif du virus à travers la barrière hémato-méningée favorisé par le contexte inflammatoire et la perméabilité vasculaire plus importante associée. Le mécanisme du “Cheval de Troie” est également évoqué par certaines études : il fait référence à un mécanisme décrit dans l'infection par le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV). Le virus atteindrait alors le cerveau par le recrutement de leucocytes périphériques infectés dans le système vasculaire cérébral. Finalement, l'autre scénario recevant le plus de considération est la voie trans neuronale : le virus migrerait depuis son point d'entrée - les nerfs somatiques périphériques ou les nerfs sensitifs - via les nerfs moteurs et sensitifs par transport axonal, jusqu'au système nerveux central. La parésie postérieure observée chez les chevaux infectés résulterait des dommages causés au cours de cette migration trans neuronale à travers la moelle épinière de la région lombo sacrée (L5-S1).

Il est à noter que la forme rénale est également observée chez les équidés, le plus souvent en association avec la forme neuroinvasive, sans que les mécanismes associés ne soient encore clairs.

Les séquelles régulièrement signalées après la guérison peuvent en partie s'expliquer par une surexpression continue et un dérèglement de la régulation des gènes codant pour les cytokines inflammatoires, qui ont pour conséquences des processus inflammatoires incontrôlables parfois mortels, mais qui sont aussi propices au développement d'immunopathologies (Figure 11) (37).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 4.** Pathogenesis of WNV infection. (1) *Culex quinquefasciatus* transmitting WNV during a blood meal on susceptible host and releasing its infectious saliva, (2) immunomodulation by mosquito's saliva followed by infection of keratinocytes and Langerhans cells, (3) migration of infected cells to nearby draining lymph nodes, (4) viremia followed by migration of infected macrophage from the lymph nodes, and (5) spleen from which the virus spread to other organs of tropism. Source: Adapted from Petersen et al. [1].</figcaption></figure>

Pathogénie de l'infection par le WNV. (1) *Culex quinquefasciatus* transmettant le WNV par sa salive infectante à un hôte sensible, durant un repas de sang, (2) Immunomodulation par la salive du moustique, favorisant l'infection des kératinocytes et des cellules de Langherans, (3) migration des cellules infectées jusqu'au nœud lymphatique régional, (4) virémie suivie de la migration des macrophages infectés depuis les nœuds lymphatiques et (5) la rate vers les autres organes.

Source : adapté de Petersen et al.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 5.** WNV neuroinvasive mechanisms. (a) Passive migration of free virus particles across the disrupted blood-brain barrier (BBB) through a "transudative" mechanism following increased vascular permeability, (b) "Trojan horse" mechanism through migration of infected macrophages into brain parenchyma, (c) direct infection of endothelial cell. (d) retrograde axonal transport of WNV, (e) WNV migration into spinal cord, (f) WNV migration from spinal cord to brain and vice versa. (g) neuroinvasive mechanism by transneural mechanism via olfactory nerve, (1) astrocyte, (2) microglia, (3) WNV particles, (4) transmigrating macrophage, (5) motor neuron, (6) blood-brain barrier (BBB) tight junction. Source: Adapted from Petersen et al. [1].</figcaption></figure>

Mécanismes de neuroinvasion par le WNV. (a) Migration passive de particules virales libres par « transsudation » à travers la barrière hémato-encéphalique rendue plus perméable par l'infection, (b) Mécanisme du « Cheval de Troie » : migration de macrophages infectés dans le parenchyme encéphalique, (c) Infection directe des cellules endothéliales, (d) transport axonal rétrograde du WNV, (e) migration du WNV dans la moelle épinière, (f) migration du WNV depuis la moelle épinière vers le cerveau et vice-versa, (g) neuroinvasion par mécanisme transneuronal via les nerfs olfactifs, (1) astrocyte, (2) microglie, (3) Particules virales de WNV, (4) macrophage infecté, (5) motoneurone, (6) jonctions serrées de la barrière hémato-méningée.

Source : adapté de Petersen et al.

<caption>**Figure 11 :** Schémas explicatifs de la pathogénie de l'infection par le WNV dans le cas de la forme neuroinvasive (37)</caption>
1.4. Des outils préventifs et thérapeutiques limités

Outre les conséquences économiques évidentes pour la filière équine, l'impact des infections par les orthoflavivirus sur la santé animale est dramatique. Les orthoflavivirus atteignent les chevaux de tous âges sans distinction, l'évolution clinique est brutale et peut être très grave, voire mortelle. Même en cas de guérison, les séquelles ne sont pas rares et la prise en charge de la maladie implique des frais de soin et d'hospitalisation conséquents.

En effet, pour les infections au WNV comme pour le TBEV, il n'existe pas de traitement spécifique de la maladie, la prise en charge est essentiellement symptomatique. L'équidé est sédaté et placé dans un local calme, semi-éclairé et désinsectisé. Le nursing constitue une part essentielle de la prise en charge chez ces animaux hyperesthésiques parfois incapables de se tenir debout : changement régulier de décubitus, aide à l'alimentation, litière confortable... Le traitement médical consiste en l'administration d'anti-inflammatoires non stéroïdiens (comme la flunixine méglumine IV (1,1 mg/kg q12h)), et de dexaméthasone IV/IM (0,05 à 0,1 mg/kg q24h), ainsi qu'en une complémentation vitaminique (vitamines C, B1, E). Une fluidothérapie de Ringer Lactate est mise en place si le cheval présente des troubles de l'encéphale et une déshydratation, et peut être complétée avec du DMSO pour lutter contre l'œdème cérébral.

Le pronostic des encéphalites à orthoflavivirus est réservé : pour la fièvre du West Nile,
on enregistre 22% de mortalité en 2004 (Zeller et al. 2004a), et jusqu'à 80% en cas de décubitus.
Lors de l'épidémie de 2023 en Gironde, le Centre Hospitalier Vétérinaire de Conques a rapporté
un taux de mortalité de 10 à 15%. La prise en charge efficace des signes cliniques peut donc
dans les cas favorables conduire à la guérison spontanée du patient, même si des séquelles sont
à déplorer dans 20% des cas : perte de poids, ataxie, faiblesse, atteinte des nerfs crâniens.

Concernant les moyens de prévention à disposition, si des vaccins existent en humaine,
comme Ticovac® ou Encepur® (38) aucun vaccin n'est disponible pour protéger contre les
encéphalites à tiques chez les équidés. En revanche, l'existence de vaccins contre la fièvre du
West Nile utilisables uniquement chez les chevaux mais interdits chez les humains, permet une
prophylaxie efficace dans les zones atteintes. Ainsi, la première campagne de vaccination de
grande ampleur a été réalisée aux Etats-Unis en 2003 et a permis la stabilisation des cas équins
(39). La vaccination assure une bonne protection contre l'infection et empêche la virémie ou
diminue les signes cliniques en cas d'atteinte. En France, un vaccin est disponible sur le marché
: Proteq West Nile® de Boehringer Ingelheim (40). Il s'agit d'un vaccin recombinant utilisant
un virus canarypox exprimant les protéines E et M du WNV. Deux autres vaccins sont
disponibles dans d'autres pays européens : vaccin inactivé (Zoetis) et un vaccin recombinant
utilisant le virus de fièvre jaune exprimant les protéines E et M du WNV (Intervet). La
glycoprotéine d'enveloppe E est la protéine la plus immunogène des orthoflavivirus et figure
parmi les protéines les plus conservées chez les orthoflavivirus. Ainsi, il a été montré que le
vaccin protège aussi bien contre les lignages 1 et 2 de West Nile. (41)

Le protocole de vaccination pour le Proteq WN®, chez les individus séronégatifs d'au moins 5 mois d'âge, consiste en deux injections de primovaccination à un mois d'intervalle, puis un rappel annuel est nécessaire (42) idéalement avant la saison de transmission permettant d'avoir un taux en anticorps neutralisants suffisant lors de la saison à risque (43). En effet, la protection vaccinale, corrélée au taux d'anticorps, s'avère plus efficace après le booster annuel, et la différence est surtout significative après le premier rappel annuel suivant la primovaccination (44).

Outre la prophylaxie vaccinale, qui n'est disponible que pour le WNV et mise en place
dans les zones que l'on sait déjà atteintes, des mesures d'hygiène et environnementales sont
également à mettre en place et permettent une prise en charge d'autant plus précoce : le contact
avec les vecteurs doit être limité au maximum, par l'assèchement des eaux stagnantes, la
désinsectisation des animaux et des locaux, l'hébergement en intérieur à l'aube et au crépuscule,
où les moustiques du genre *Culex* sont les plus actifs. Une prise de température rectale régulière
permet également une détection précoce d'épisode fébrile (6).

1.5. Diagnostic

1.5.1. Diagnostic clinique

Les signes cliniques observés chez les chevaux infectés par le virus du West Nile,
lorsqu'ils sont présents, s'inscrivent de façon globale dans le tableau clinique des encéphalites
équines, et ce peu importe la souche du virus responsable. Comme nous l'avons déjà précisé,
80% des cas d'infection passent inaperçues car elles sont asymptomatiques. Dans 20% des cas,
les équidés peuvent présenter des symptômes très frustres : après une période d'incubation de
3 à 15 jours, un état fébrile plus ou moins marqué avec une baisse de l'état général et des
performances, voire de l'anorexie, de la fièvre, des coliques ou des douleurs
musculosquelettiques peuvent être observés. En l'absence d'évolution vers une forme
neurologique, la guérison a lieu en 20 à 30 jours (2). Dans 1 à 10% des cas présentant un
syndrome fébrile, le virus atteint le tissu nerveux par la voie hématogène, et des symptômes
neurologiques se développent : des signes de myélite tout d'abord avec une ataxie ou incoordination des mouvements de grade 2 à 4 et progressive, une parésie remarquable surtout et d'abord des membres postérieurs, sur les mouvements de reculer. De l'hypermétrie peut être observée, c'est-à-dire une exagération de l'amplitude des mouvements lorsque le cheval se déplace. Des signes d'atteinte encéphalique et des nerfs crâniens sont également observables parfois, avec une paralysie faciale et une dysphagie associée, une amaurose ou encore un syndrôme vestibulaire. Des tremblements musculaires, aussi appelés "tremblements encéphalitiques", sont plus spécifiquement présents dans le cas d'une infection par le WNV, au niveau des muscles du tronc, de l'encolure, des épaules, de la tête... avec également des mâchonnements intermittents évocateurs. Les troubles de la vigilance apparaissent de façon plus anecdotique dans le tableau clinique. Enfin, une atteinte corticale peut mener à des troubles du comportement, tels que des chevaux qui poussent au mur, tournent en rond ou présentent une démarche ébrieuse. Dans la forme neurologique, la fièvre n'est pas systématique. Les symptômes évoluent parfois jusqu'au coma et à la mort, avec un taux de létalité pouvant atteindre 50% des cas neurologiques décrits (2).

Concernant les autres espèces d'équidés, tels que les ânes et les mules, la réceptivité au WNV et le développement d'un tableau clinique est encore peu documentée à l'heure actuelle, bien que des enquêtes de séroprévalence menées en Espagne, Bulgarie ou encore au Nigeria révèlent l'existence d'individus séropositifs sans jamais avoir déclaré de signes cliniques. De rares cas ont déjà été décrits comme en France en 2023 pour un âne ayant présentant un tableau clinique sévère (Données Laboratoire National de Référence pour le virus West Nile). Ainsi, il semblerait que les mules et les ânes soient plus résistants au développement de formes cliniques, même si l'infection et le développement de signes cliniques apparaissent donc possible.

Pour ce qui est de l'encéphalite à tiques due au TBEV, aucun cas clinique n'a encore été recensé en France, cependant le TBEV est bien à l'origine de symptômes neurologiques chez les équidés, avec des cas rapportés dans les pays européens voisins : Autriche, Allemagne, Lituanie, Suisse... D'après ces rapports, qui demeurent encore rares, les signes cliniques sont globalement similaires et peu spécifiques, avec cependant une prédominance de signes d'atteinte encéphalique suivant une phase fébrile plus ou moins marquée (25) : marche compulsive, amaurose, poussée au mur. On retrouve également une atteinte des nerfs crâniaux, une sensibilité cutanée excarimbée et des trémulations musculaires, une hypersthésie, de l'ataxie et de l'hypermétrie, une paralysie des muscles du cou et des épaules, voire des convulsions (24, 25).
A titre de rappel, le virus Usutu n'est pas à l'origine de signes cliniques chez les équidés. Il est responsable de signes cliniques chez certaines espèces d'oiseaux tels que les merles noirs et chouettes lapones. Ces deux espèces sont très sensibles et présentent un fort taux de mortalité à la suite d'une infection USUV. Les signes développés sont : plumage ébouriffé, anorexie, tremblement, port de tête anormal, incapacité de voler,... (45).

Comme on peut le voir, le tableau clinique regroupe un grand nombre de symptômes neurologiques peu spécifiques, et tout trouble nerveux peut et doit faire penser à une infection par le West Nile Virus, voire par le TBEV selon le contexte épidémiologique.

### 1.5.2. Diagnostic différentiel

Le WNV et le TBEV ne sont pas les seuls agents pouvant être à l'origine de signes neurologiques chez les équidés, il convient donc de prendre en compte la situation dans sa globalité et l'ensemble des hypothèses diagnostiques. Ainsi, une catégorisation des signes neurologiques observés permet déjà de préciser la zone du tissu nerveux atteinte : une ataxie comme unique symptôme signe plutôt une atteinte médullaire seule, qui peut être causée par un traumatisme, une myélopathie cervicale compressive (syndrome de Wobbler), ou encore une infection par le virus de l'herpès équin de type 1 (EHV1). Quant aux signes d'encéphalites, qui sont des troubles du comportement, de la conscience, de la proprioception ou encore des signes d'atteinte des nerfs crâniens, la liste des causes possibles est extrêmement vaste, et présenté dans le *Tableau 1* ci-dessous : (46)
<table><caption>Tableau 1 : Etiologie des affections neurologiques chez les équidés</caption><thead><tr><th>Catégorie</th><th>Affection</th><th>Symptômes et caractéristiques spécifiques (outre les signes neurologiques communs aux encéphalites)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Encéphalites virales (première cause d'encéphalite équine)</td><td>Herpèsvirose équine de type 1 (EHV1)</td><td><ul><li>Epizooties (contagiosité élevée)</li><li>Sujets âgés, gestation, densité élevée, hygiène médiocre</li><li>Période d'incubation de 48h</li><li>Parésie postérieure</li><li>Démarche hésitante, pédalage, atonie vésicale et de la queue, œdèmes sous-cutanés</li></ul></td></tr><tr><td>Fièvre ou maladie de West Nile (WNV)</td><td><ul><li>Caractère saisonnier : cas clinique entre juillet et novembre en France</li><li>Première phase fébrile (passant souvent inaperçue)</li><li>Prédominance des syndromes myélitiques et encéphalitiques → ataxie, tremblements de la tête et du tronc assez pathognomoniques</li></ul></td></tr><tr><td>Maladie de Borna</td><td><ul><li>Absente en France à ce jour (Allemagne, Etats-Unis, Japon...)</li><li>Infection saisonnière : printemps et début de l'été</li><li>Période d'incubation de deux semaines à plusieurs mois</li><li>Contamination directe par les sécrétions nasales</li></ul></td></tr><tr><td>Rage</td><td><ul><li>Absente en France à ce jour</li><li>Réservoir : chiroptères</li><li>Inquiétude, agressivité</li></ul></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>Encéphalite à tiques (TBEV)</td><td><ul><li>Non décrite en France à ce jour</li><li>Prédominance des signes encéphalitiques : troubles du comportement</li></ul></td></tr><tr><td rowspan="2">Encéphalites bactériennes</td><td>Encéphalites bactériennes non spécifiques</td><td><ul><li>Poulains : septicémie</li><li>Adultes : infection des voies respiratoires supérieures, traumatisme...</li></ul></td></tr><tr><td>Lyme</td><td><ul><li>Présence en France</li><li>Arthrite, œdème des membres</li><li>Diagnostic ante-mortem difficile</li></ul></td></tr><tr><td rowspan="2">Encéphalites parasitaires</td><td>Larves d'helminthes ou de mouches</td><td><ul><li>Modification du liquide céphalorachidien</li><li>Atteinte cérébrale ou spinale d'évolution aigue</li></ul></td></tr><tr><td>Méningoencéphalite à protozoaires : Neospora</td><td><ul><li>Absente en France : chevaux importés des Etats-Unis</li><li>Ataxie, troubles des nerfs crâniens, asymétrie</li></ul></td></tr><tr><td rowspan="2">Encéphalites toxiques</td><td>Botulisme</td><td><ul><li>Apyrétique</li><li>Période d'incubation d'1 ou 2 jours</li><li>Paralysie flasque (absence de tonus lingual)</li><li>Conscience et sensibilité non altérées</li></ul></td></tr><tr><td>Tétanos</td><td><ul><li>Paralysie spastique : tétanie localisée ou généralisée (raideur, procidence de la membrane nictitante)</li></ul></td></tr></table>
<table><tr><td></td><td>Toxiques chimiques (mercure, organophosphorés, métaldéhyde, monensin)</td><td><ul><li>Contexte et risque d'exposition</li></ul></td></tr><tr><td></td><td>Végétaux (Solanacés, ombellifères, acacia)</td><td><ul><li>Contexte et risque d'exposition</li></ul></td></tr><tr><td>Encéphalites fongiques</td><td>Fusarium</td><td><ul><li>Alimentation par des fourrages ensemencés</li></ul></td></tr><tr><td>Malformations congénitales</td><td></td><td><ul><li>Sujets plutôt jeunes</li></ul></td></tr><tr><td>Origine traumatique</td><td></td><td><ul><li>Contexte</li></ul></td></tr><tr><td>Origine métabolique</td><td>Hypoglycémie, hypoxie, trouble de la natrémie, encéphalose hépatique, hyperammoniémie d'origine digestive</td><td><ul><li>Analyses sanguines anormales</li></ul></td></tr><tr><td>Origine dégénérative</td><td>Dystrophie neuroaxonale ou myéloencéphalopathie dégénérative</td><td><ul><li>Non différentiable cliniquement d'une myélopathie compressive (syndrome de Wobbler)</li><li>Forme juvénile ou retardée</li></ul></td></tr><tr><td>Encéphalite idiopathique</td><td>Epilepsie, narcolepsie</td><td>/</td></tr><tr><td>Origine vasculaire</td><td>Thromboembolie</td><td>/</td></tr></table>
Un examen clinique rigoureux et complet associé à une démarche diagnostique hiérarchisée sont donc essentiels pour réaliser le diagnostic clinique de la maladie de West Nile. Une synthèse de la démarche diagnostique clinique est proposée dans la thèse de M. Hesse, basé sur des points essentiels : (46)

## Recueil de l'anamnèse et commémoratifs :

* Âge : les poulains sont davantage sujets aux encéphalites bactériennes, tandis que l'on retrouve plus fréquemment une forme nerveuse de la rhino pneumonie chez les animaux âgés.

* Zone géographique : il est intéressant de connaître les caractéristiques de la région (climat, humidité) ainsi que la prévalence des espèces vectrices propres aux différentes maladies (tiques, moustiques...) pour orienter les hypothèses diagnostiques.

* Saisonnalité : la distribution temporelle des maladies vectorielles dépend du cycle biologique des vecteurs

* Mode de vie : en effet, l'exposition aux vecteurs est différente selon l'habitat des chevaux, s'ils vivent au pré ou au box...

* Statut vaccinal et parasitaire

## Examen clinique général et plus spécifique, consistant en un examen neurologique approfondi d'avant en arrière :

* Examen à distance : modification du comportement, posture

* Examen rapproché : réponses aux stimuli, état de vigilance

* Examen dynamique : démarche et coordination

* Tests neurologiques des nerfs crâniens

* Examen du tronc, encolure, membres et queue : recherche d'amyotrophie ou d'une asymétrie de la musculature, sensibilité cutanée, réactions posturales

Malgré ces connaissances, des subtilités de chaque virus, pour tous ces virus, les symptômes sont donc assez similaires et la clinique ne permet pas un diagnostic discriminant de façon certaine les différentes espèces virales. Les techniques de diagnostic biologique (identification du matériel génétique viral par (RT-)PCR) et des tests immunologiques basés sur les caractéristiques communes des orthoflavivirus (hémagglutination, test de
séroneutralisation, ELISA...) sont alors nécessaires pour identifier l'étiologie exacte responsable des signes cliniques observés.

### 1.5.3. Diagnostic biologique

Les examens biologiques, non spécifiques, ne sont pas d'un grand intérêt dans la conduite diagnostique d'une encéphalite virale. En effet, des marqueurs généraux d'inflammation et d'infection sont observables sur les analyses hématologiques, tels qu'une leucocytose ou leucopénie, ou une augmentation de la concentration en fibrinogène. Les examens hématologiques et biochimiques permettent tout au plus d'exclure d'autres causes métaboliques de troubles nerveux observés, comme une encéphalose hépatique. De même, l'analyse du liquide céphalo-rachidien (LCR) ne permet pas de conforter le diagnostic d'une infection au WNV : elle permet à la rigueur une évaluation de la perméabilité de la barrière hémato méningée par comparaison de l'albuminémie sanguine et de l'albuminémie dans le LCR. A titre d'information, l'analyse du LCR a davantage d'intérêt lors d'une suspicion d'infection à un herpès virus, où on observe une élévation disproportionnée de la concentration en protéines dans le LCR par rapport au nombre de cellules observées. De même, le type cellulaire dominant dans le LCR permet d'orienter le diagnostic dans le cas d'une infection bactérienne, parasitaire ou d'une encéphalite à protozoaires, de l'Ouest ou de l'Est (47).

Les méthodes de diagnostic biologique spécifiques les plus pertinentes dans le cas d'une maladie donnée dépendent de la pathogénie de l'agent et du profil de la réaction immunitaire développée par l'hôte. Dans le cas d'une infection par le WNV mais également par les autres orthoflavivirus d'intérêt de cette étude, la virémie est faible et de courte durée. Il semblerait néanmoins que le virus soit détectable plus longtemps dans les urines que dans le plasma, le sérum ou le liquide cérébrospinal dû à un potentiel portage rénal. De même, le WNV est capable d'adhérer aux hématies, cela expliquant que la maladie soit transmissible par transfusion sanguine de sang total. Une réaction immunitaire humorale se met en place ensuite : les IgM sont détectables dès 4 jours post-infection, et jusqu'à deux mois plus tard. Les IgG sont détectables dès 8 jours après l'infection, et sont encore présents plusieurs années après (Figure 12) (9).
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 12 : Graphique de l'évolution dans le temps de la présence du virus ou des marqueurs d'infection virale dans les différents fluides de l'organisme infecté par le WNV (9)</figcaption></figure>

Les caractéristiques de l'infection aux orthoflavivirus impliquent ainsi qu'aujourd'hui,
le diagnostic biologique de la fièvre du West Nile consiste principalement en un diagnostic
sérologique, c'est-à-dire en une recherche dans le sérum des anticorps de type IgM spécifiques
au virus, voire en une mise en évidence de la séroconversion des IgG par deux titrages
sérologiques espacés de 10 à 15 jours (4). Cependant, il est important de considérer les
inconvénients de ces méthodes de dépistage basées sur la détection d'anticorps spécifiques de
l'infection : des résultats faussement négatifs peuvent être dus au profil temporel de la réaction
immunitaire et notamment à la latence de la séroconversion, d'où l'importance du paragraphe
précédent. Des faux positifs sont également possibles, chez les individus vaccinés, de même
que chez les très jeunes qui sont encore sous la protection des anticorps d'origine maternelle.
D'autre part, l'affinité des anticorps utilisés pour la révélation des IgG spécifiques n'est pas
toujours totale, et des réactions croisées peuvent également conduire à un diagnostic faussement
positif. En effet, la fiabilité d'un test est liée aux caractéristiques de l'interaction Ag/Ac (Figure
13) :

* La spécificité diagnostique (= nombre de négatifs trouvés/(nombre de vrais positifs + nombre de faux négatifs)) dépend de la capacité de l'Ac à reconnaître un seul déterminant antigénique (épitope)

* La sensibilité diagnostique (= nombre de positifs trouvés/(nombre de vrais positifs + nombre de faux négatifs)) dépend de la capacité d'un sérum/anticorps à détecter de faibles quantités d'antigènes
* L'affinité est fonction de la force de l'interaction épitope/paratope

* L'avidité désigne la stabilité du complexe Ag/Ac

* On parle de réaction croisée quand deux antigènes différents partagent un même épitope, ou lorsque deux épitopes apparentés reconnus par le même anticorps.

Un antigène peut présenter un seul ou plusieurs épitopes reconnus par différents anticorps : reconnaissance monoclonale (anticorps monospécifiques en grande quantité) ou polyclonale (anticorps polyclonaux, haute affinité, sérum hétérogène).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 13: Schéma de rappel sur les interactions Ac/Ag lors de la réponse immunitaire (48)</figcaption></figure>

Ainsi, des souches virales différentes présentant des antigènes très proches peuvent être reconnues par un même anticorps, en fonction de la spécificité de celui-ci et du type de reconnaissance Ac/Ag. C'est le cas pour le genre des orthoflavivirus, qui partagent des antigènes communs (notamment le domaine DII de la protéine E) à l'origine de la synthèse d'anticorps ainsi capables de réagir avec plusieurs virus. Au sein de ce genre plusieurs sérocomplexes sont décrits, notamment celui de l'encéphalite japonaise dans lequel WNV et USUV appartiennent. De ce fait, le diagnostic sérologique n'est pas spécifique d'un virus, mais d'un groupe antigénique correspondant à de nombreux virus (9, 49). En raison de ce manque de spécificité des tests sérologiques, le diagnostic sérologique chez les équidés nécessite la combinaison d'au moins deux tests.
Outre ce diagnostic biologique indirect par détection des anticorps marqueurs de l'infection, et malgré une phase virémique initiale limitée, il est tout de même possible de diagnostiquer une infection au WNV par isolement et identification du virus dans les trois premiers jours de la maladie : c'est une mise en évidence directe qui ne dépend pas de la cinétique de la réaction immunitaire et des possibles biais associés au diagnostic indirect. La principale limite de cette technique, outre la nécessaire précocité de la suspicion clinique, est de prélever un fluide contenant suffisamment de matériel viral pour permettre sa détection. Pour le virus du West Nile, l'isolement est possible sur un prélèvement *post-mortem* à partir de tissu cérébral. L'expédition du prélèvement sanguin se fait ensuite sous couvert de froid vers le Laboratoire National de Référence pour le virus West Nile. La présence de virus est d'abord testée par **RT-PCR** (Reverse-transcription - polymerase chain reaction) (4), dont le principe est une amplification *in vitro* encadrée par des amorces d'un segment d'ADN à partir d'un génome complet ou d'un mélange de séquences après une étape de transcription inverse (passage de l'ARN vers ADN sous l'action d'une reverse transcriptase après extraction des ARN totaux) (Figure 14). Pour éviter la réactivité croisée et garantir la fiabilité du résultat, la séquence cible choisie doit être spécifique du virus recherché. Pour cela, des alignements de séquences virales issues de différents orthoflavivirus permettent de mettre en évidence des zones conservées entre espèces virales (37). Ces zones conservées sont ciblées et utilisées pour le design des amorces. Au LNR West Nile, la cible utilisée est la protéine de la capside pour la détection du WNV par RT-PCR (50).

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 14 : Principe de la technique d'amplification par PCR (Polymerase chain reaction) (51)</figcaption></figure>

Pour la RT-PCR, une étape de transcription de l'ARN viral en ADN par l'enzyme transcriptase inverse précède les étapes de ce schéma.
#### 1.5.4. Diagnostic histologique

L'étude des lésions tissulaires, et de leur localisation, permet dans une certaine mesure de dégager un tableau lésionnel assez caractéristique de différentes encéphalomyélites équines. Dans le cas d'une encéphalite à West Nile, la topographie des lésions s'inverse par rapport aux autres encéphalites puisque les lésions les plus intenses sont observées dans la partie postérieure du cerveau et de la moelle épinière. Les lésions en question se définissent par une poliomyélite avec atteinte des cornes ventrales, motrices de la moelle épinière. En revanche, le cerveau présente des lésions plus discrètes, caractérisées par de l'œdème en région méningée et sous-méningée, ou une péri vascularite lymphocytaire (4).

#### 1.5.5. Dépistage

Dans le cadre de notre étude, on s'intéresse davantage aux différentes méthodes de dépistage des maladies causées par les orthoflavivirus, plutôt que de diagnostic. Autrement dit, dans un objectif d'étude de la séroprévalence d'un agent pathogène dans une région et une population donnée, on recherche les traces d'une infection présente ou passée chez des individus asymptomatiques. D'après la cinétique de la production des immunoglobulines présentée précédemment, on recherchera donc dans ce cas plutôt la présence des IgG. Il est nécessaire cependant de prendre en considération le statut vaccinal de l'animal testé : en effet, la vaccination interfère avec le diagnostic sérologique.

*La technique ELISA*

La technique de mise en évidence des anticorps la plus utilisée à ce jour pour le dépistage d'une infection aiguë ou antérieure au West Nile chez les équidés, utilisée par le LNR West Nile et les laboratoires agréés pour le diagnostic sérologique, est la **technique ELISA, ou Enzyme linked immunosorbent assay**. C'est en effet une technique très sensible (ng), qualitative ou quantitative, et automatisable. La technique ELISA peut être utilisée pour détecter la présence d'anticorps dans un sérum à tester, ou d'antigènes d'un agent pathogène. Le principe reste le même : on utilise un anticorps conjugué de l'anticorps ou de l'antigène recherché, et lié à une enzyme catalysant la transformation d'un substrat chromogène en un produit de couleur différente. La lecture du résultat se fait alors au spectrophotomètre en fonction de l'intensité de la coloration (9, 6).
Pour confirmer une primo-infection à WNV chez un équidé, la détection des IgM et IgG permette de poser le diagnostic. En cas d'un résultat douteux pour un des deux tests, un second prélèvement est nécessaire. De plus d'autres tests sont réalisés en parallèle, comme la séroneutralisation qui est détaillée plus bas. Dans un contexte de dépistage comme dans notre étude, c'est la recherche d'anticorps spécifiques des orthoflavivirus évoqués, plus précisément de type IgG qui présente un intérêt. Pour se faire, il existe différents types de tests ELISA :

- **ELISA indirect** : ce test permet de révéler seulement les IgG sériques. Ceux-ci reconnaissent l'antigène viral fixé sur la plaque du test, et sont révélés avec un anticorps anti-espèce lié à une enzyme (Figure 15). Cela implique qu'un test ELISA indirect soit spécifique d'une espèce donnée. Étant donnée la grande variété d'hôtes potentiels au WNV et aux autres orthoflavivirus, l'ELISA indirect est aujourd'hui de moins en moins utilisé dans la détection de ceux-ci, au profit de l'ELISA de compétition.

- **ELISA de compétition** : cette technique cible tous les isotypes d'anticorps, et permet à priori de tester toutes les espèces concernées avec un même conjugué. En effet, l'anticorps conjugué fourni avec le test cible l'antigène propre au virus coaté sur la plaque du test, au même titre que les anticorps sériques que l'on cherche à mettre en évidence. L'anticorps conjugué monoclonal spécifique de l'antigène viral entre ainsi en compétition avec les anticorps sériques pour la fixation au site antigénique. (Figure 15) C'est la technique la plus sensible de tous les tests ELISA présentés ici. Cependant, elle est moins spécifique que la technique MAC ELISA.

- **MAC ELISA (IgM Antibody-Capture ELISA)** : cette technique met en évidence les IgM dirigés contre un agent pathogène donné, et permet ainsi la détection d'une infection aigue ou récente (Figure 13). Ici, ce sont les IgM sériques qui sont capturés sur la plaque recouverte d'anticorps anti-IgM spécifiques à une espèce. Ces IgM capturés vont eux-mêmes se lier à l'antigène viral ensuite ajouté, et retenir indirectement l'anticorps conjugué spécifique de cet antigène (Figure 15). Cette technique présente moins de risque de réaction croisée que les deux autres techniques.
<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 15 : Principe de trois méthodes d'ELISA pour la recherche d'anticorps sériques (64)</figcaption></figure>

Ainsi, si le dépistage par les techniques ELISA de routine (de compétition ou indirect) est très sensible et permet la mise en évidence d'une infection passée ou présente par un orthoflavivirus, il n'est à ce jour pas assez spécifique pour discriminer les différentes souches virales et aboutir à une identification complète lorsque seuls les anticorps de type IgG sont détectés par test ELISA. La mise en place de d'autres tests plus spécifiques est nécessaire.

- Le test de séroneutralisation

Pour cela, on utilise un deuxième test sérologique sur les échantillons trouvés positifs avec le test ELISA pour la détection des anticorps de type IgG : le **test de séroneutralisation (SNT)**. (4, 52) Cette méthode permet la détection et la quantification d'anticorps neutralisants spécifiques pour un virus dans un échantillon de sérum : les anticorps spécifiques contenus dans un sérum à tester neutralisent le virus et empêche ce dernier d'infecter des cellules. L'observation au microscope de la présence d'effet cytopathique (ECP) permet l'évaluation de la présence d'anticorps. En effet, un tapis cellulaire présentant des ECP signifie qu'il n'y avait pas d'anticorps présents dans le sérum. A l'inverse, l'absence d'ECP coïncide avec la présence d'anticorps neutralisants. Les sérums étant dilués en cascade, la quantification des anticorps est possible et est inversement proportionnelle à la dilution du sérum. Le déroulement de la technique est le suivant :

1) Dilution en série du sérum et ajout d'une dose viral égale à 100 TCID50

2) Incubation pendant 1h30 à 37°C, 5% CO₂
3) Ajout des cellules cibles sensibles à l'infection virale Les cellules utilisées pour les SNT sont généralement des cellules VERO (cellule épithéliale de reins du singe vert d'Afrique).

3) Quantification par observation ou non de l'effet cytopathogène ou par technique immuno-réactive après 3 jours d'incubation pour WNV, 4 jours pour USUV et 5 jours pour TBEV.

Cette technique est plus spécifique que le test ELISA pour la détection des anticorps IgG. Elle permet l'obtention d'un résultat quantitatif, utile en cas de réactivité croisée comme c'est le cas pour les orthoflavivirus recherché chez les équidés. Cependant, il s'agit d'une technique qui est chronophage et nécessite la manipulation des virus dans un laboratoire de biosécurité de niveau 3.

D'autres tests sérologiques existent pour le dépistage de la fièvre du West Nile d'après la littérature (4), mais sont en réalité de moins en moins utilisés aujourd'hui car caduques et peu sensibles. On pourra citer la technique d'inhibition de l'hémagglutination, ou la technique de fixation du complément.

Pour résumer, plusieurs techniques sont envisageables pour la détection d'une affection virale. Le choix de la technique la plus adaptée dépend des caractéristiques et objectifs de l'étude et de la maladie. Dans notre cas, l'enjeu est le dépistage d'une circulation virale, et non le diagnostic d'une affection dans un contexte de suspicion clinique : on se tourne donc vers un protocole d'une très bonne sensibilité (on veut minimiser la quantité de faux négatifs). Cette caractéristique va de pair avec un seuil de positivité le plus faible possible : d'après les données présentées dans la *Figure 16*, les test ELISA et de séroneutralisation virale sont parmi ceux qui offrent des limites inférieures de détection les plus basses. D'ailleurs, la technique de séroneutralisation virale est considérée comme le gold standard en virologie : un résultat négatif peut être considéré comme indubitable. (48) D'autre part, nous sommes ici dans le cadre d'une étude à grande échelle avec plusieurs centaines d'échantillons testés, les facteurs économiques, de reproductibilité et de facilité de mise en œuvre sont donc également essentiels à prendre en compte. C'est pourquoi, il est justifié de ne pas se tourner vers la technique de dosage radio-immunologique, certes très sensible mais qui entraîne des risques d'exposition aux radiations et des problèmes de gestion des déchets radioactifs.
## Limites inférieures de détection des épreuves sérologiques usuelles
(plus petite concentration détectable)

<table><caption>Figure 16 : Comparaison des seuils de détection des différentes techniques de détection sérologique usuelles (48)</caption><thead><tr><th>Tests</th><th>µg/mL (protéines)</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Réactions primaires</strong></td><td></td></tr><tr><td>Radio-immuno essai compétitif</td><td>0,00005</td></tr><tr><td>ELISA</td><td>0,0005</td></tr><tr><td><strong>Réactions secondaires</strong></td><td></td></tr><tr><td>Neutralisation virale</td><td>0,00005</td></tr><tr><td>Inhibition de l'hémagglutination</td><td>0,005</td></tr><tr><td>Neutralisation des toxines</td><td>0,005</td></tr><tr><td>Fixation du complément</td><td>0,05</td></tr><tr><td>Agglutination directe</td><td>0,01 à 1</td></tr><tr><td>Test de l'anneau</td><td>2 à 15</td></tr><tr><td>Précipitation en gélose</td><td>0,5 à 30</td></tr><tr><td><strong>Réactions tertiaires</strong></td><td></td></tr><tr><td>Anaphylaxie cutanée induite/IDR</td><td>0,08 à 32</td></tr></tbody></table>

## 2. Enquête 2023 sur le portage des arbovirus par les équidés en Gironde

### 2.1. Enjeux et objectifs de l'enquête

#### 2.1.1. Des enjeux multiples en santé humaine et animale

##### 2.1.1.1. Une maladie réglementée à potentiel zoonotique

La fièvre du West Nile est responsable de symptômes neurologiques graves chez l'humain. C'est pourquoi elle est classée en catégorie E par la loi européenne de santé animale datant de 2021, avec obligation de déclaration et de surveillance. Plus précisément, la déclaration de cas à la Commission Européenne est obligatoire pour l'avifaune depuis 2021, mais les cas équins et humains sont concernés par cette réglementation depuis 2009 (53). Ainsi, en cas de suspicion d'une infection par le virus du West Nile, des prélèvements sont réalisés par le vétérinaire sanitaire à visée diagnostique, et si la suspicion s'avère vérifiée, le cas sera immédiatement déclaré.

##### 2.1.1.2. Les équidés, marqueurs sentinels de la circulation des orthoflavivirus et enjeu One Health

Le contrôle et le suivi de la circulation des orthoflavivirus est un enjeu actuel d'importance majeure, d'autant que la plupart des infections sont asymptomatiques, rendant la surveillance passive, telle qu'elle est faite en France, difficile, et donc la détection tardive. Pourtant, leur présence à bas bruit dans un territoire sans mesure préventive associée représente un danger important pour la santé publique : en effet, la protection contre les arthropodes vecteurs ne suffit pas, car il existe des moyens de transmission non vectorisés du virus : les secteurs hospitaliers doivent également prendre des précautions en termes de transfusions
sanguines, dons d'organes qui sont une source potentielle de contamination. Une infection lors d'activités professionnelles est également possible par voie conjonctivale, percutanée lors de manipulations de tissus infectés ou de matières fécales d'animaux infectés voire même peut-être par aérosols. Cela concerne donc notamment les vétérinaires lors d'autopsies, les techniciens de laboratoire ou les éleveurs avicoles (2).

Des programmes de surveillance épidémiologique basés sur plusieurs facteurs aident ainsi les autorités compétentes à prendre les mesures nécessaires pour protéger la santé humaine et animale. Ces programmes sont fondés sur la surveillance des oiseaux sauvages, notamment de certaines espèces sentinelles comme les corvidés, et des populations humaines et équines. Dans beaucoup de pays européens, les équidés constituent l'espèce animale sentinelle de choix dans le système One Health, et sont ainsi utilisés dans plusieurs études de surveillance épidémiologique récentes en France, Allemagne ou Belgique : une étude de séroprévalence du WNV et des orthoflavivirus associés que sont le TBEV et l'USUV menée en Allemagne en 2023, précise que cette surveillance chez les chevaux non vaccinés constituerait le marqueur d'alerte le plus précoce d'un risque d'infection humaine. De même, pour le TBEV, le dépistage sérologique des équidés représente un outil efficace d'estimation de la prévalence du virus sur un territoire, ajouté à la détection du TBEV chez les tiques et au signalement des cas humains (49).

En effet, leur mode de vie à la fois proche de l'Homme et en extérieur en fait de bons marqueurs d'exposition aux vecteurs d'orthoflavivirus. On pourra par ailleurs noter que ces caractéristiques, partagées avec les chiens de bergers ou d'élevage, en font également de bons marqueurs sentinelles de la circulation du WNV et de l'USUV dans un écosystème, d'après une étude menée en France en 2023 (28). De plus, contrairement aux oiseaux sauvages ou aux arthropodes, les chevaux sont faciles à approcher et à prélever. En outre, les équidés sont particulièrement sensibles à l'infection par le WNV, le TBEV ou l'USUV, et développent une réponse immunitaire facilement identifiable par analyse sérologique, avec la production massive de deux types d'immunoglobulines : les IgM et IgG, ces dernières étant détectables au moins 15 mois post-infection (Ostlund et al. 2001) voire à vie d'après certains auteurs (2). Pour WNV comme TBEV, un autre avantage d'utiliser les chevaux comme sentinelles est la possibilité de mettre en évidence des microfoci d'infection et d'obtenir une cartographie précise de la séroprévalence, à une moindre échelle (49). D'autre part, dans les régions où beaucoup de chevaux sont vaccinés contre le virus du West Nile, il peut être intéressant de considérer les autres espèces d'équidés (ânes, mules) comme espèces sentinelles tout aussi efficaces (54).
Dans le contexte actuel, les arboviroses comme celles causées par les orthoflavivirus émergent dans des territoires toujours plus étendus. Au vu de leurs conséquences pour la santé humaine et animale, et des moyens de lutte très limités à existants, il est essentiel d'anticiper ces mouvements et d'améliorer les moyens de détection précoces d'émergence pour en gérer l'impact.

### 2.1.2. Objectif de l'enquête : une première documentation sur la circulation des orthoflavivirus dans le département de Gironde

Dans le contexte d'émergence du virus du West Nile dans le Sud-Ouest de la France hexagonale, une première enquête épidémiologique a été menée au cours de l'année 2023 dans le département de Gironde afin d'évaluer l'intensité de la circulation du WNV sur ce territoire nouvellement atteint en 2022, et de dégager les facteurs de risques d'infection. L'objectif était également de fournir une première base de données concernant la prévalence des orthoflavivirus chez les équidés dans cette région.

## 2.2. Matériel et méthodes

### 2.2.1. Conception de l'étude

Suite à la confirmation de trois cas autochtones d'infection par le virus du West Nile dans la population équine de Gironde en octobre 2022, la première enquête de séroprévalence de la région a été initiée parmi les équidés vivant dans les structures proches des cas déclarés, dans l'objectif d'apporter des données concrètes sur la circulation du WNV, mais aussi USUV et TBEV dans ce territoire nouvellement touché.

De nombreux acteurs ont travaillé ensemble au cours de cette étude, à savoir : la Clinique Équine de Conques, le RESPE (Réseau d'épidémiosurveillance en pathologie équine), l'ANSES (Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail), la DDPP 33 (Direction départementale de la protection des populations de Gironde), et les vétérinaires traitants de Gironde.

L'enquête de séroprévalence a été menée du 15 avril au 31 mai 2023, afin de refléter au mieux l'exposition des équidés aux virus au cours de l'été problématique 2022. Cette période d'échantillonnage s'est voulue achevée avant le début de la saison d'activité estivale des moustiques en 2023, pour ne prendre en compte que les chevaux infectés au cours de la saison estivale de 2022. En effet, d'après les connaissances actuelles sur les caractéristiques des vecteurs principaux du WNV en France hexagonale, le moustique *Culex pipiens pipiens*, la
femelle de cette espèce de moustique est capable de survivre toute l'année grâce à la stratégie de diapause hivernale, se réfugiant dans les caves, les salles de chaudière... (55). Cependant, l'activité piqueuse mais aussi la compétence vectorielle de ces moustiques, c'est-à-dire leur capacité à transmettre le virus à l'hôte piqué, dépend de la température extérieure. Ainsi, en Europe, la transmission du WNV par le moustique *Culex* lors d'un repas sanguin serait significativement plus élevée pour une température extérieure supérieure à 18°C (56). D'ailleurs, on observe de façon empirique en France, et plus précisément en Gironde, une augmentation de la nuisance causée par les moustiques surtout durant les mois de juillet et d'août. D'autre part, les cas cliniques humains et équins déclarés présentent tous des symptômes en été ou à l'automne, correspondant à une infection au plus tôt en fin de printemps, si l'on se base sur la période d'incubation du WNV qui est de 5 à 15 jours.

Le recrutement des équidés échantillonnés a été réalisé au sein de la clientèle du Centre Hospitalier Vétérinaire Equin de Conques (Saint Aubin de Branne, Gironde) par courrier électronique pour les structures localisées dans la zone d'étude, et également à travers les réseaux sociaux, à l'aide d'un flyer informatif expliquant le principe de l'étude (Annexe 2). Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique pour la recherche clinique (ComERC) de l'École vétérinaire d'Alfort (EnVA) (numéro d'accord : 2023-06-23). Les prélèvements ont été anonymes et gratuits pour les détenteurs de chevaux, et un consentement éclairé a été signé avant toute collecte de données ou d'échantillon sanguin (Annexe 3). Ils ont été réalisés par le Dr Noémie Chevalier (résidente en médecine interne à la Clinique Equine de Conques), assistée par Clément Bigeard, vétérinaire et ISPV stagiaire alors en stage à la DDPP 33 et au LNR West Nile et instigateur du projet. Dr Marianne Depecker (vétérinaire associée à la Clinique Equine de Conques) et moi-même, alors étudiante en 3ème année à l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, ainsi que les vétérinaires exerçant dans la région, avons également participé à la collecte des échantillons sanguins et des données épidémiologiques. De plus, un recueil de données par cheval a été effectué dans le but de déterminer des facteurs de risque d'infection, cela est détaillé plus loin.

### 2.2.2. Découpage de l'aire géographique de l'étude

L'étude a été menée dans le département de Gironde, dans le Sud-Ouest de la France, un département situé sur le littoral océanique, au paysage contrasté, abritant vallées, terres de polyculture, forêts et vignes (Figure 17). Néanmoins, 75% de la population humaine y est citadine, notamment avec la présence de son chef-lieu, la métropole de Bordeaux. Ce
département de la région Nouvelle-Aquitaine doit son nom à l'estuaire de la Gironde, le plus
large d'Europe, où se rejoignent les fleuves de la Garonne et de la Dordogne. Entre ces deux
fleuves se trouve le plateau calcaire de l'Entre-Deux-Mers (57, 58). Le littoral est marqué par
son occupation urbaine intense et saisonnière, notamment autour du bassin d'Arcachon.
L'estuaire quant à lui, présente des dynamiques géographiques spécifiques : fortement soumis
aux marées, l'accumulation d'alluvions en fait une terre viticole humide, riche et marécageuse.
Le climat girondin est tempéré, de type océanique : les hivers y sont relativement doux et les
étés chauds. C'est un département ensoleillé et humide, avec des précipitations bien réparties
sur les saisons.

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 17 : Les territoires de la Gironde (59)</figcaption></figure>

Les chevaux et les sports équestres ont une place importante dans la région. La métropole bordelaise abrite ainsi le pôle équestre du Bouscat, qui accueille notamment chaque
année le célèbre Jumping de Bordeaux. Les courses hippiques, l'élevage, les centres d'entraînement et surtout les structures équestres font aussi la dynamique de la filière équine en Gironde. En tout, la Gironde génère 20% du chiffre d'affaire régional de la filière équine en Nouvelle-Aquitaine, et abrite près de 17 000 équidés, en grande majorité des chevaux de selle (60, 61).

Le département de Gironde est également une réserve de biodiversité précieuse et protégée. Une partie importante du territoire est classée comme réserve naturelle, favorisant la préservation des espèces animales et végétales et la protection des écosystèmes (Figure 18).

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 18 : Les aires protégées du département de Gironde (62)</figcaption></figure>

(Légende : les repères circulaires rouges représentent les réserves naturelles nationales, et les étoiles orange indiquent les réserves nationales régionales. Le cercle rouge montre le département de Gironde)

Des actions sont en particulier menées en faveur de la protection des espèces sauvages migratrices. En effet, l'estuaire est situé sur un des axes les plus empruntés par les oiseaux au cours de leur migration : la voie Est-Atlantique (Figure 19), et les zones humides de la zone sont également des sites de nidation et d'hivernage privilégiés (63).
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 19 : Les grands axes migratoires à l'échelle mondiale (A) (61) et en France (B) (64)</figcaption></figure>

L'aire d'étude a ainsi été divisée en trois zones selon des critères géographiques épidémiologiques (Figure 20) :

La première, **Confluence**, correspond à la zone où les cas de 2022 ont été signalés. Confluence se situe à la jonction entre les deux cours d'eau que sont la Garonne et la Dordogne, en faisant un territoire humide potentiellement propice au développement des populations de moustiques.

Le **bassin d'Arcachon**, deuxième zone de l'étude, se trouve à l'aplomb la voie de migration Est-Atlantique, un des huit axes de migration d'oiseaux les plus importants de la planète. Aucun cas d'infection au virus du West Nile n'a été rapporté dans cette zone. Tout comme Confluence, le bassin d'Arcachon constitue ainsi un habitat humide et protégé propice à l'installation d'oiseaux autochtones ou à la halte d'oiseaux migrateurs au cours de leur voyage. Ainsi, la situation est particulièrement favorable aux interactions entre les moustiques
vecteurs et les hôtes aviaires compétents, et donc à la mise en place du cycle de transmission des virus Usutu et du West Nile.

La troisième et dernière zone couvre le territoire intermédiaire entre Confluence et le bassin d'Arcachon.

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 20 : Localisation des écuries réparties sur les trois zones géographiques de l'étude. (65)</figcaption></figure>

(Légende : les points noirs représentent les structures où les chevaux ont été échantillonnés. Les cercles rouges correspondent aux écuries où les cas cliniques ont été signalés en 2022. Les zones vertes matérialisent les aires de protection des oiseaux sauvages).

### 2.2.3. Méthodes d'échantillonnage et sites de prélèvement

Pour cette enquête, des échantillons sériques d'une population de 494 chevaux, poneys et ânes adultes (âgés de plus de deux ans), ont été prélevés, dans 39 structures équestres différentes réparties sur les trois zones d'étude, et plus précisément :

- 306 équidés provenant de 25 écuries dans la zone Confluence
- 77 équidés résidant dans 5 structures dans la zone d'Arcachon

- 111 équidés venant de 9 établissements situés dans la zone intermédiaire

Le nombre d'équidés échantillonnés par structure était proportionnel à la taille de cette dernière, selon le modèle suivant :

* Structures de moins de 10 individus : prélèvement de l'ensemble des animaux

* Structures de 10 à 15 individus : prélèvement de 10 équidés

* Structures de plus de 15 individus : prélèvement de 15 équidés

L'objectif était d'allier à la fois des considérations pratiques, en limitant le nombre d'exploitations visitées et les coûts, et d'optimiser la représentativité des échantillons à l'échelle de chaque structure, afin de limiter le risque de biais de classification avec des structures qui sortiraient faussement négatives de l'étude.

Les trois cas confirmés d'infection par le WNV n'ont pas été inclus dans la cohorte d'étude, cependant deux des trois structures équestres concernées y sont représentées (Figure 20).

### 2.2.4. Critères d'inclusion des animaux prélevés

L'ensemble des animaux testés avait vécu dans l'aire d'étude au cours de l'année 2022, et était âgé d'au moins 2 ans. En effet, au-delà de considérations pratiques et de sécurité au moment du prélèvement, l'objectif était d'avoir des indications sur la circulation virale en 2022, donc les jeunes de quelques mois d'âge n'étaient pas intéressants à inclure dans notre étude. Au moment de l'enquête, aucun des équidés choisis n'était vacciné contre le virus du West Nile, et n'avait voyagé vers la côte Méditerranéenne sur les 6 dernières années. En effet, même si très peu de données sont disponibles dans la littérature sur la persistance des IgG chez le cheval, certaines études estiment qu'elles seraient décelables 5,5 ans en moyenne chez les chevaux en condition d'infection naturelle (enquêtes sérologiques menées en Camargue entre les années 2000 et 2003 (66)), et jusqu'à 6 ans après la vaccination (67). Tous les animaux étaient asymptomatiques au moment de la campagne de prélèvement.
### 2.2.5. Données additionnelles collectées

En complément des prélèvements sériques effectués, l'étude a été complétée par la collecte de données sur les caractéristiques individuelles des individus testés, ainsi que sur la gestion et le mode de vie des animaux dans les différents établissements. Ainsi, à l'échelle individuelle ont été recueillis l'âge, le sexe, la robe, l'activité et les antécédents médicaux de chaque équidé. Pour les structures, le type d'hébergement, l'utilisation ou non de méthodes de lutte contre les insectes (répulsifs chimiques, couvertures...), ou encore le ressenti des détenteurs d'équidés concernant la nuisance causée par les moustiques pour les humains et les animaux ont été documentés. De plus, la distance par rapport au plus proche plan d'eau et aux zones protégées (ZPS : zones de protection spéciale) ont également été recensés (Annexe 4). Les surfaces d'eau sont considérées comme un indicateur des zones d'habitat des moustiques vecteurs, et les ZPS comme un indicateur des zones où la biodiversité aviaire est plus élevée. En effet, les ZPS ont été créées pour la protection des espèces d'oiseaux sauvages répertoriées dans l'annexe 1 de la directive européenne sur les oiseaux (Directive 79/409/CEE), ou qui servent de zones de reproduction, de mue, d'hivernage, ou de halte pour les oiseaux migrateurs. Cinq ZPS ont été définies dans la zone d'étude autour des zones humides (Figure 20).

### 2.2.6. Prélèvement et traitement des échantillons

Afin d'obtenir les sérumes nécessaires à l'enquête de séroprévalence, une prise de sang a été réalisée sur chaque équidé de la cohorte d'étude, à la veine jugulaire, à l'aide de tubes secs sous-vide. Les échantillons ont ensuite été centrifugés dans les 24h suivant le prélèvement, à 5000 rpm durant 5 minutes. Les séra ont été séparés et stockés à 4°C avant d'être envoyés au Laboratoire National de Référence (LNR) pour le virus du West Nile : l'ANSES (Maisons-Alfort, France), où ils ont été analysés.

### 2.2.7. Analyses sérologiques réalisées par l'ANSES

#### Test ELISA : (9, 68-70)

Dans un premier temps, les IgG spécifiques des principaux orthoflavivirus circulant en France : USUV, WNV et TBEV ont été recherchés dans les séra par l'intermédiaire du test ELISA Pan-Flavivirus "ID Screen Flavivirus competition" ND (Innovative Diagnostics,
Montpellier, France), selon le protocole préconisé par le concepteur (Figure 21). Ce test est positivé par la présence d'anticorps spécifiques à l'un ou plusieurs de ces trois virus, sans qu'il ne permette pour autant de les distinguer les uns des autres. Les résultats de ce test ont été exprimés en %S/N :

- Résultat inférieur ou égal à 40% : positif.

- Résultat strictement supérieur à 50% : négatif.

- Valeurs intermédiaires, entre 40% et 50% : douteuses.

En outre, il est important de garder à l'esprit que le test "ID Screen Flavivirus competition" ND permet, d'après son concepteur, la détection d'anticorps dirigés contre WNV, TBEV et USUV, mais également contre JEV, ZIKAV, et DENV, et ce chez de nombreuses espèces : humain, chevaux, oiseaux.
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 21 : schéma descriptif du principe du test sérologique ELISA "ID Screen Flavivirus competition" ND (Innovative Diagnostics, Montpellier, France) (Schéma : Margaux De Mas)</figcaption></figure>
## Test de séroneutralisation virale (SNT) :

Les échantillons ressortis positifs ou douteux du premier test ELISA ont ensuite été testés par séroneutralisation, afin de distinguer les anticorps dirigés contre le WNV, USUV ou le TBEV spécifiquement. Ce test a été réalisé en plaque 96 puits, selon le principe décrit précédemment, et tel que décrit dans l'étude menée par Beck et al. 2020 (Figure 22) (71):

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 22 : schéma descriptif du principe du test de séroneutralisation utilisée, décrite dans l'étude de Beck et al. 2020 (71)</figcaption></figure>

La dernière dilution sérique montrant une absence d'ECP ou une proportion d'ECP inférieure à un quart du puits a été notée comme étant celle où il existe encore une protection contre le virus, le titre conservé comme résultat correspond donc à l'inverse de cette dilution.
Le seuil de positivité des tests de neutralisation virale a été fixé à un titre de 20. Les séra neutralisant plus d'un virus ont été considérés positifs pour le virus neutralisé à une dilution
quadruplement supérieure aux autres virus. Si cet écart n'était pas atteint, le sérum est considéré
non différentiable en raison des réactions croisées qui peut être observées. Quant aux séra testés
positifs par ELISA compétitive et négatifs par neutralisation virale, ils ont été notés négatifs
pour les virus testés, le test de séroneutralisation étant considéré comme le Gold Standard.

2.2.8. Analyses statistiques

Les données ont été analysées à l'aide de modèles de régression logistique à effets
mixtes, en utilisant l'écurie comme effet aléatoire. La variable à expliquer était le statut
sérologique des animaux, obtenus par le test de séroneutralisation. Les effets fixes étaient l'âge
des animaux (en années), le sexe (mâle ou femelle), la robe (claire ou foncée), le type
d'hébergement (pâturage exclusif, ou à la fois au pâturage et en intérieur), la distance jusqu'à la
surface d'eau la plus proche (qu'elle soit intermittente ou permanente, et de tout type : rivière,
canal, estuaire, lac, marais, réservoir...), et la distance jusqu'à la zone de protection spéciale
(ZPS) la plus proche. En partant du modèle avec tous les effets fixes, le modèle le plus
parcimonieux a été sélectionné en utilisant le test du rapport de vraisemblance : celui-ci est basé
sur une sélection du modèle montrant le meilleur équilibre entre les observations faites et le
nombre de paramètres, par élimination progressive des variables. Malheureusement, certaines
variables n'ont pu être intégrées dans l'analyse statistique car nous ne disposions pas des
informations pour l'ensemble des individus considérés : c'est le cas des critères "utilisation de
moyens de lutte contre les moustiques", et "présence d'autres animaux sur la structure". Afin
de documenter l'association entre les résultats SNT positifs contre le WNV, l'USUV et le TBEV
(c'est-à-dire le nombre d'équidés positifs pour un, deux ou trois de ces virus), une approche non
paramétrique, en l'occurrence celle proposée par Vaumourin et al., (2014) a permis de tester si
les résultats obtenus différaient significativement de la distribution attendue sous l'hypothèse
nulle de résultats positifs indépendants. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide
de R 4.3.3 (R Core Team 2024).

2.3. Résultats de l'enquête : prévalence des orthoflavivirus chez les équidés en Gironde

Comme cela a été précisé plus haut, le recrutement des équidés participant à l'enquête a été fait
surtout selon des critères géographiques et pratiques, dépendant de la motivation des
propriétaires contactés au sein de la clientèle du CHVE de Conques. Ce faisant, les différentes catégories d'animaux choisies pour l'étude (sexe, couleur de robe, mode de vie, activité...) ont été plus ou moins représentées dans notre échantillon. Ainsi, l'enquête a concerné 494 équidés adultes que l'on peut classer :

* Par espèce : 334 chevaux (68%), 151 poneys (30%) et 9 ânes (2%)

* Par sexe : 271 mâles (55%) et 223 femelles (45%)

* Par activité : 412 équidés actifs (83%) (club, loisirs, sport, élevage, débourrage) et 82 équidés non actifs (17%) (sans activité, retraité)

* Par type d'hébergement : 328 animaux en pâture exclusive (66%), et 166 animaux en logement mixte (34%) (écurie et pâture)

* Par couleur de robe : 331 animaux de robe foncée (67%) (alezan, bai, chocolat, noir), et 163 animaux de robe claire (33%) (pie, appaloosa, aubère, blanc, crème, gris, isabelle, palomino, perlino, souris, rouan)

### 2.3.1. Résultats de séroprévalence

Les résultats de l'enquête ont mis en évidence la présence des trois orthoflavivirus d'intérêt dans la zone d'étude, à différents niveaux (Tableau 2). Parmi les 494 équidés testés, 70 ont eu un résultat ELISA positif (les résultats ELISA douteux n'ont pas été comptabilisés comme étant positifs). La grande majorité des cas positifs (64 chevaux) se situaient dans la zone de Confluence, où l'on trouvait alors une prévalence de 21% (IC 95% : 16% - 26%). En comparaison, on n'a retrouvé que 5% de séroprévalence dans la zone intermédiaire (IC 95% : 2% - 10%), et un seul cheval est ressorti positif dans la zone d'Arcachon (1%, IC 95% : 0% - 7%). Ces résultats mettent en évidence un effet zone entre Confluence et les autres territoires étudiés. D'ailleurs, une large distribution des cas positifs détectés était observée parmi les structures de Confluence, avec 80% des établissements visités touchés, alors que dans la zone intermédiaire et celle d'Arcachon, les cas positifs étaient plus localisés, dans un nombre moins important de structures, avec 44% des structures touchées dans la zone intermédiaire, et une seule structure parmi 5 dans la région d'Arcachon.
<table><caption>Tableau 2 : Résultats de séroprévalence obtenus par test ELISA des chevaux échantillonnés dans les trois zones d'étude : Confluence, Arcachon et la zone intermédiaire.</caption><thead><tr><th></th><th>Nombre de chevaux testés/nombre de structures</th><th>ELISA +</th><th>Prévalence (IC 95%)</th><th>Proportion des structures testées touchées</th></tr></thead><tbody><tr><td>Confluence</td><td>306/25</td><td>64</td><td>0,21 (0,16 - 0,26)</td><td>20/25 = 80%</td></tr><tr><td>Arcachon</td><td>77/5</td><td>1</td><td>0,01 (0,00 - 0,07)</td><td>1/5 = 20%</td></tr><tr><td>Zone intermédiaire</td><td>111/9</td><td>5</td><td>0,05 (0,02 - 0,10)</td><td>4/9 = 44%</td></tr><tr><td>Total zones d'étude</td><td>494/39</td><td>70</td><td>0,14 (0,11 - 0,18)</td><td>25/39 = 64%</td></tr></tbody></table>

Dans un second temps, les tests de séroneutralisation (SNT) des échantillons positifs et douteux en ELISA (81 séra au total) ont permis de caractériser l'espèce virale à l'origine de la séropositivité détectée. Les résultats ont été reportés dans le Tableau 3 : c'est dans la zone d'étude de Confluence qu'ont été retrouvés la majorité des cas séropositifs à l'un ou plusieurs des orthoflavivirus recherchés, avec 9% (IC 95% : 6% - 13%) de cas positifs au WNV, 5% (IC 95% : 3% - 8%) de cas positifs au USUV et 2% (IC 95% : 1% - 4%) d'équidés séropositifs au TBEV. Dans la zone intermédiaire, 3 cas positifs au WNV ont été détectés (3%, IC 95% : 1% - 8%), ainsi qu'un équidé positif à l'USUV (1%, IC 95% : 0% - 5%) et un cas positif au TBEV (1%, IC 95% : 0% - 5%). Enfin dans la zone d'Arcachon, seul un cas séropositif pour le WNV a été trouvé (1%, IC 95% : 0% - 7%). Il est intéressant de constater que pour 35 échantillons testés par séroneutralisation virale, soit 43% d'entre eux, aucun des trois orthoflavivirus d'intérêt n'a été mis en évidence, nous y reviendrons plus loin.
<table><caption>Tableau 3 : Résultats de séroprévalence obtenus par séroneutralisation virale dans les trois zones d'étude : Confluence, Arcachon et la zone intermédiaire. (L'effectif "Non caractérisable" regroupe les échantillons positifs ou douteux par ELISA et négatifs par SNT)</caption><thead><tr><th></th><th>WNV +<br>Prévalence<br>WNV<br>(IC 95%)</th><th>USUV +<br>Prévalence USUV<br>(IC 95%)</th><th>TBEV +<br>Prévalence<br>TBEV<br>(IC 95%)</th><th>Non<br>caractérisable</th></tr></thead><tbody><tr><td>Confluence</td><td>27<br>0,09 (0,06 -<br>0,13)</td><td>14<br>0,05 (0,03 - 0,08)</td><td>6<br>0,02 (0,01 -<br>0,04)</td><td rowspan="3">35</td></tr><tr><td>Arcachon</td><td>1<br>0,01 (0,00 -<br>0,07)</td><td>0<br>0,00 (0,00 - 0,05)</td><td>0<br>0,00 (0,00 -<br>0,05)</td></tr><tr><td>Zone intermédiaire</td><td>3<br>0,03 (0,01 -<br>0,08)</td><td>1<br>0,01 (0,00 - 0,05)</td><td>1<br>0,01 (0,00 -<br>0,05)</td></tr></tbody></table>

Il est également intéressant de remarquer que la séropositivité à plusieurs orthoflavivirus chez un même cheval est possible et non anecdotique d'après nos résultats par SNT (Tableau 4). Ainsi, 5 chevaux étaient positifs à la fois pour WNV et USUV, correspondant à de la réaction croisée en raison de leur appartenance au même sérocomplexe. Dans ce cas, il n'a pas été possible de les différencier. Deux chevaux étaient positifs pour WNV et TBEV et un autre pour USUV et TBEV. En revanche, il n'a été mis en évidence aucun cas de séropositivité aux trois orthoflavivirus simultanément.
<table><caption>Tableau 4 : Séroprévalence des différentes associations de statuts sérologiques obtenus par SNT pour WNV, USUV et TBEV</caption><thead><tr><th>WNV</th><th>USUV</th><th>TBEV</th><th>Nombre d'animaux</th></tr></thead><tbody><tr><td>Positif</td><td>Positif</td><td>Positif</td><td>0</td></tr><tr><td>Positif</td><td>Positif</td><td>Négatif</td><td>5</td></tr><tr><td>Positif</td><td>Négatif</td><td>Positif</td><td>2</td></tr><tr><td><strong>Positif</strong></td><td>Négatif</td><td>Négatif</td><td>24</td></tr><tr><td>Négatif</td><td>Positif</td><td>Positif</td><td>1</td></tr><tr><td>Négatif</td><td><strong>Positif</strong></td><td>Négatif</td><td>9</td></tr><tr><td>Négatif</td><td>Négatif</td><td><strong>Positif</strong></td><td>4</td></tr><tr><td>Négatif</td><td>Négatif</td><td>Négatif</td><td>449</td></tr><tr><td></td><td></td><td>TOTAL</td><td>494</td></tr></tbody></table>

Si l'on s'intéresse à la distribution géographique des cas, la *Figure 23* met en évidence une circulation des orthoflavivirus relativement généralisée dans la zone de Confluence, où la séroprévalence s'est avérée être la plus élevée. Cependant, on peut tout de même relever deux zones où la concentration semble supérieure au sein même de cette zone, d'après nos données : au niveau de la limite Sud de la ZPS colorée en vert sur la carte, ainsi que sur le plateau de l'Entre-Deux Mers, entre les bras de la Dordogne et de la Garonne, juste avant que celles-ci se rejoignent. En effet, dans ces deux zones, on trouve les structures équestres où les résultats ELISA positifs ont été les plus nombreux en regard du nombre de chevaux échantillonnés : jusqu'à 73% de chevaux séropositifs par ELISA dans une écurie. Les gérants des structures où l'on retrouve ces prévalences les plus élevées signalent tous des scores de nuisance due aux moustiques de 5/5. Cette corrélation n'est cependant pas réciproque : d'autres écuries annonçant des scores de nuisance maximum s'avèrent indemnes d'orthoflavivirus. Quant aux deux écuries incluses dans l'étude où les premiers cas cliniques de Gironde avaient été signalés en 2022, il n'a pas été mis en évidence une séroprévalence significativement supérieure par rapport aux autres structures visitées durant l'enquête. Dans la première (*repère* (1), *Figure 20*), un cas a été positif au WNV par SNT sur 9 chevaux testés, tandis que dans la deuxième (*repère* (3), *Figure 20*), les résultats par SNT ont révélé un cas positif pour le WNV ainsi qu'un cas positif pour le TBEV, sur 12 individus prélevés.
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 23 : Distribution des équidés séropositifs au WNV, USUV et/ou au TBEV dans les trois zones d'étude : Confluence, Arcachon et la zone intermédiaire en 2023 (65)</figcaption></figure>

Les cercles représentent les structures équestres visitées, leur diamètre étant proportionnel au nombre de chevaux échantillonnés dans chacune. L'intensité de la couleur des cercles augmente avec le nombre de cas séropositifs détectés.

### 2.3.2. Analyses statistiques des facteurs de risque

Pour l'analyse statistique des facteurs de risque deux échelles ont été considérées : à l'échelle individuelle, nous disposions des facteurs : sexe, espèce, activité, couleur de robe, âge. A l'échelle des structures, nous avions récoltés des informations concernant le type d'hébergement, les mesures répulsives mises en place, le score de nuisance causée par les moustiques, la présence d'autres animaux sur l'exploitation, notamment les poules ou les bovins, et la proximité avec une ZPS ou une zone humide. Dans un premier temps, les analyses statistiques ont été réalisées en s'affranchissant du facteur « zone », c'est-à-dire en considérant le nombre total de cas sur le département. Pour l'ensemble des facteurs cités, individuels comme collectifs, aucune influence significative n'a pu être mise en évidence par le test du Khi², pour aucun des trois orthoflavivirus. Cependant, des données concernant le score de
nuisance et la présence d'autres animaux sur la structure n'avaient pas été fournies par un quart des établissements équestres participants. Concernant le score de nuisance, il est tout de même intéressant de souligner que 80% des structures hébergeant des chevaux séropositifs pour au moins un des trois orthoflavivirus recherchés rapportaient un score de nuisance de 4 ou 5 sur l'échelle de 5 fournie.

Pour une analyse statistique plus poussée et mettant en relation les différents facteurs de risque par régression logistique à effets mixtes, seuls les statuts sérologiques pour le WNV et USUV étaient exploitables, étant donné la prévalence très faible trouvée pour le TBEV, et il a été décidé de concentrer l'analyse des facteurs de risque sur la zone de Confluence, où la majorité des cas séropositifs au WNV et USUV ont été enregistrés au cours de l'enquête. De plus, seuls les facteurs pour lesquels nous disposions de données pour l'ensemble des chevaux et structures inclus dans l'étude ont été retenus. Ainsi, l'analyse logistique multivariée des facteurs de risque a inclus d'une part à l'échelle individuelle, les facteurs : espèce, âge, espèce, activité principale, couleur de robe. A l'échelle des structures équestres d'autre part, ont été pris en compte les facteurs : proximité avec une ZPS, proximité avec une zone humide, type d'hébergement.

L'analyse statistique par sélection de modèle a montré qu'aucun des facteurs individuels n'était significativement associé à un risque plus élevé de séropositivité au WNV. En revanche, le type d'hébergement s'est révélé être associé à un risque d'infection beaucoup plus important dans le cas d'un hébergement en pâture uniquement (Odds-ratio de 4,99 (IC 95% : 1,83 - 17,47)). De même dans le modèle choisi, le risque qu'un animal soit séropositif au WNV augmentait de façon significative à mesure que l'on se rapprochait d'une ZPS (Odds-ratio de 0,85 (0,78 - 0,93)), mettant en évidence le caractère protecteur d'un éloignement par rapport à ces zones protégées (Tableau 5). Pour l'USUV, aucun des facteurs de risque n'a pu être retenu comme significatif.

Par ailleurs, l'analyse non-paramétrique de l'association entre les résultats de SNT positifs aux différents orthoflavivirus a révélé que des statuts sérologiques positifs à la fois pour WNV et USUV chez un même individu serait significativement associé (p=0,006), le nombre d'équidés séropositifs pour les deux virus (5 animaux) étant significativement plus élevé qu'attendu dans l'hypothèse nulle (IC 95 : 0 à 4 animaux).
<table><caption>Tableau 5: Modèle de régression logistique à effets mixtes pour les statuts sérologiques obtenus par VNT concernant le WNV dans la zone de Confluence</caption><thead><tr><th>Variable</th><th>Valeurs</th><th>Odds-ratio (IC 95%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Intercept (risque résiduel)</td><td></td><td>0.10 (0.03-0.27)</td></tr><tr><td rowspan="2">Type d'hébergement</td><td>Pâture stricte</td><td>Référence</td></tr><tr><td>Intérieur et pâture</td><td>4,99 (1,83 - 17,47)</td></tr><tr><td>Distance à la ZPS la plus proche</td><td>Implémentation par kilomètre</td><td>0,85 (0,78 - 0,93)</td></tr></tbody></table>

# 3. Discussion des résultats, critiques de l'étude et perspectives pour l'avenir

## 3.1. Contextualisation des résultats de l'enquête épidémiologique de 2023 et limites d'interprétation

### 3.1.1. Circulation des orthoflavivirus en 2023 en Gironde, comparaison avec d'autres publications

Les orthoflavivirus West Nile, Usutu et le virus de l'encéphalite à tiques sont des virus émergents difficiles à appréhender, notamment en raison du caractère asymptomatique très majoritaire des cas infectés. L'enquête sérologique menée en 2023 dans trois zones particulièrement à risque du département de la Gironde, où les trois premiers cas équins avaient été signalés quelques mois plus tôt, ont révélé une circulation virale active dans la région, jusqu'alors insoupçonnée. Ainsi pour le WNV, les tests sérologiques ont dévoilé des séroprévalences allant de 1% dans la zone d'Arcachon, jusqu'à 9% dans la zone de Confluence, résultant en une séroprévalence moyenne de 6% sur les trois zones à risque étudiées ici. Quant au virus Usutu, il circulait également même si dans une moindre mesure, allant de 0% de séroprévalence dans la zone d'Arcachon à 5% dans la zone de Confluence, soit une séroprévalence moyenne globale de 3%. Si pour le WNV, ces résultats ne sont pas anodins, ils restent tout de même bien inférieurs aux 13,19% de séroprévalence obtenus lors d'une enquête menée entre 2016 et 2020 (92) en Camargue, où le virus du West Nile est endémique depuis plusieurs décennies. Concernant le virus Usutu, les prévalences sont comparables, avec une estimation de 3,83% en Camargue d'après cette même étude. Ainsi, les virus du West Nile et Usutu ont circulé de façon active au sein de la population équine au cours de l'année 2022,
notamment dans la zone de Confluence, qui s'avère être un « hot spot » de circulation des orthoflavivirus vectorisés par les moustiques du genre *Culex* en 2022.

Concernant le TBEV, transmis par différentes espèces de tiques, la séroprévalence moyenne sur les trois zones concernées était de 1,4% avec des chiffres allant de 0% dans le Bassin d'Arcachon à 2% dans la zone de Confluence. Au vu de ces faibles séroprévalences, il est difficile de conclure quant à la circulation ou non du TBEV dans le Sud-Ouest de la France, même s'il elle semble bel et bien exister, d'autant plus que la sélection de la population échantillonnée pour notre étude n'était pas réellement adaptée à l'étude de la circulation du TBEV dans la région spécifiquement. En effet, le TBEV est connu pour circuler dans le Nord-Est de la France, notamment dans le Jura. Or, les chevaux ayant voyagé dans cette région au cours des dernières années n'étaient pas exclus de notre échantillonnage (contrairement au pourtour méditerranéen, en considération de l'habitat des moustiques vecteurs du WNV et USUV). Cependant, au vu du faible nombre de cas séropositifs au TBEV révélés par notre enquête, il nous a été possible de nous renseigner au cas par cas des déplacements des chevaux concernés, et un seul s'est avéré avoir voyagé dans l'Est de la France par le passé. Il est donc possible d'affirmer qu'excepté un doute sur ce cheval en question, les cas séropositifs révélés lors de notre enquête sont des cas autochtones d'infection à un virus appartenant au sérocomplexe du TBEV. Des études plus ciblées et approfondies sur ce virus et sa présence chez les vecteurs (tiques) et réservoirs (rongeurs) seront nécessaires afin de caractériser et affirmer la présence et la circulation du TBEV en Gironde.

Le tableau 6 rassemble les résultats de séroprévalence obtenus dans différentes régions d'Europe et du monde concernés par la circulation des orthoflavivirus.
<table><caption>Tableau 6 : Comparaison des résultats de séroprévalence dans différentes régions de France, d'Europe et du monde) (3, 72–83) Le signe « - » signifie que le virus n'a pas été recherché dans les études citées.</caption><thead><tr><th>Résultats de séroprévalence</th><th>WNV</th><th>USUV</th><th>TBEV</th></tr></thead><tbody><tr><td>Gironde (trois zones confondues), 2023</td><td>6%</td><td>3%</td><td>1%</td></tr><tr><td>Camargue, 2016-2020</td><td>13%</td><td>4%</td><td>-</td></tr><tr><td>Serbie, 2011</td><td>12%</td><td>0,3%</td><td>-</td></tr><tr><td>Croatie, 2012</td><td>3%</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Grèce, 2013</td><td>4%</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Ukraine, 2013</td><td>14,5%</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Albanie, 2013</td><td>22%</td><td>-</td><td>1%</td></tr><tr><td>Corse, 2017</td><td>9%</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pologne, 2018</td><td>15%</td><td>28%</td><td>-</td></tr><tr><td>Égypte, 2018</td><td>16,8%</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Catalogne, Espagne, 2010-2019</td><td>5%</td><td>0,6%</td><td>0,2%</td></tr><tr><td>Kosovo, 2018-2019</td><td>3%</td><td>0%</td><td>-</td></tr><tr><td>Autriche, 2021</td><td>5%</td><td>0%</td><td>15%</td></tr><tr><td>Espagne du Sud-Ouest, 2021</td><td>20%</td><td>1%</td><td>-</td></tr><tr><td>Allemagne centrale et de l'Est, 2023</td><td>3%</td><td>0,4%</td><td>6%</td></tr></tbody></table>

Ainsi, les chiffres de séroprévalence pour le virus West Nile obtenus en Gironde sont comparables avec d'autres régions telles que la Catalogne, l'Autriche... Il est assez alarmant de constater que le virus circule aux frontières de la France hexagonale : il est présent en Corse, mais en Espagne, pays frontalier de la France, avec jusqu'à 20% de la population équine séropositive dans le Sud-Ouest espagnol. Les résultats obtenus en Pologne, Albanie, Ukraine, Serbie, allant de 14,5% à 22% de séropositivité, prouvent une fois de plus que le virus du West
Nile pose un enjeu sanitaire d'importance majeure qu'il est nécessaire d'appréhender à l'échelle internationale. De plus, si les résultats en Gironde sont pour l'heure inférieurs à ceux obtenus dans les études menées en Camargue et ailleurs dans le monde, il apparaît essentiel de poursuivre les recherches afin d'anticiper l'évolution de la circulation du WNV et des autres orthoflavivirus dans cette région nouvellement atteinte. Ainsi, il est intéressant de rappeler qu'une étude menée en Camargue en 2003 (72) faisait à cette époque état d'une séroprévalence de 8,1% pour le WNV (contre 13% en 2020), ce qui est comparable aux chiffres estimés dans la zone de Confluence dans notre étude de 2023. Le Sud-Ouest pourrait donc connaître la même évolution que le pourtour méditerranéen avec une éventuelle endémisation du WNV.

Concernant le **virus Usutu**, la France semble particulièrement touchée, contrairement aux autres pays où il a été recherché, exceptée la Pologne où des anticorps spécifiques du virus ont été trouvés dans presque un tiers de la population équine (7). L'enquête réalisée en Camargue entre 2016 et 2020 a révélé qu'une plus forte prévalence d'USUV était retrouvée chez les humains, chiens, moustiques et oiseaux plutôt que chez les chevaux, qui présentaient par contre davantage d'anticorps contre le WNV par rapport aux autres espèces (84). Cette différence de séroprévalence observée, entre le WNV et l'USUV qui sont pourtant vectorisés par les mêmes familles d'arthropodes, pourrait être en partie liée aux caractéristiques immunitaires des différentes espèces touchées.

Enfin, on dispose de beaucoup moins de données épidémiologiques sur la distribution du TBEV, qui circule cependant très activement dans certains pays, avec des séroprévalences de 15% en Autriche, et de 6% en Allemagne du Sud et de l'Est ((3, 83)). Cela concorde avec la répartition du TBEV en France, pour l'heure détecté seulement chez les humains dans le Nord-Est de la France et les Alpes, avec 71 cas notifiés entre mai 2021 et mai 2023 d'après les bilans les plus récents (32).

Par ailleurs, une part conséquente des tests de séroneutralisation pour le WNV, USUV et TBEV dans notre étude sont sortis négatifs (7%), alors qu'ils étaient positifs en ELISA. Comme cela a déjà été précisé, le test ELISA utilisé ressort positif en présence de WNV, USUV et TBEV, mais également de JEV, Louping LIV, DENV. D'autre part, la réactivité croisée entre les orthoflavivirus est connue et il n'est pas exclu qu'un autre orthoflavivirus encore, ou une nouvelle souche d'un orthoflavivirus connu, non caractérisés à ce jour, soit à l'origine de tests ELISA positifs. L'orthoflavivirus Bagaza (BAGV) est ainsi évoqué dans certaines études (28). Ces résultats peuvent suggérer la circulation possible de souches virales inconnues et potentiellement pathogènes en Gironde, et confirment la nécessité de poursuivre les recherches
et enquêtes épidémiologiques sur les orthoflavivirus présents en France. Enfin, les tests utilisés ne mettent pas exactement en évidence les mêmes anticorps. En effet, le ELISA permet la détection de tous les types d'anticorps IgG tandis que la SNT permet uniquement la détection des anticorps neutralisants pour lesquels la durée de persistance dans un organisme n'est à ce jour pas connue. De ce fait, les résultats positifs en ELISA et négatifs en SNT pourrait résulter soit d'une infection antérieure par WNV et/ou USUV et/ou TBEV ou bien par un orthoflavivirus non caractérisé.

### 3.1.2. Adéquation entre les zones de prélèvement et l'emplacement des sites positifs

Considérant le fait que cette enquête menée en 2023 était la première dans la région, la détermination des zones de prélèvement a été majoritairement centrée sur les endroits où les cas positifs avaient été déclarés en 2022, et dépendante de la motivation des écuries contactées, sans pouvoir se baser sur une étude précédente. Les résultats ont néanmoins montré que l'adéquation entre les zones d'étude et les sites positifs était relativement bonne, notamment avec la mise en évidence d'un foyer de circulation active dans la zone de Confluence, où la majorité des prélèvements ont été faits (306/494 équidés). De même, la zone de transition dans notre étude s'est révélée être également celle où la séroprévalence était intermédiaire entre Confluence et le bassin d'Arcachon, même si le nombre de chevaux prélevés a été bien moindre que dans la zone de Confluence. Cette étude permettra pour les enquêtes futures d'orienter de façon plus précise les zones d'échantillonnage, en se concentrant par exemple sur la zone de Confluence tout en s'élargissant vers la zone intermédiaire, et en y recrutant le plus d'écuries possible.

### 3.1.3. Limite de l'interprétation temporelle des résultats

Les tests immunologiques utilisés sont basés sur la réaction immunitaire de l'hôte en réponse à l'infection par les virus recherchés. Ils dépendent donc des caractéristiques de cette réaction, et les résultats doivent être interprétés à la lumière de ceux-ci. Ainsi, le test ELISA utilisé détecte la présence d'IgG dans le sérum de l'individu testé : ces IgG peuvent être présents suite à un contact avec le virus, mais également suite à la mise en place de la réponse vaccinale si le cheval a été vacciné. Dans notre étude, l'échantillonnage a permis d'écarter cet écueil. Cependant, une autre limite persiste. L'objectif de notre étude était d'obtenir des informations
sur la circulation du virus West Nile, ainsi que de l'USUV et du TBEV, dans les zones à risques de Gironde au cours de l'année 2022. Or, du fait de la persistance des IgG dans le sérum plusieurs années après la rencontre avec les virus (jusqu'à 5,5 ans d'après certaines études (66)), nous ne pouvons affirmer que l'ensemble des cas positifs échantillonnés au printemps 2023 aient été infectés au cours de l'année 2022. Cependant, les caractéristiques choisies pour la sélection de la cohorte échantillonnée, notamment l'absence de voyage en zone endémique sur les 6 dernières années, permettent au moins d'affirmer que les chevaux séropositifs aient été infectés sur le territoire français, où le virus n'avait pas été détecté, et plus vraisemblablement en Gironde, alors la seule région où des cas cliniques ont été recensés en dehors du Sud-Est. En effet, le premier cas symptomatique de Gironde ayant été signalé en automne 2022, on peut raisonnablement supposer que le virus du West Nile circule depuis relativement peu de saisons dans la région, et donc que les résultats de séroprévalence obtenus illustrent l'incidence de la maladie au cours de la saison 2022. En outre, l'âge des équidés n'a pas montré d'impact significatif sur les résultats obtenus au cours de notre étude, ce qui laisse supposer que la circulation du WNV dans cette zone est récente. Contrairement aux zones où le virus est présent depuis plusieurs années, il est admis que les équidés âgés présentent plus d'anticorps dirigés contre le virus que les équidés jeunes (72).

L'enquête épidémiologique de 2023 en Gironde, la toute première dans ce département, ne permet en outre pas de conclure quant à l'évolution de la circulation des orthoflavivirus dans le futur : une endémisation est-elle à prévoir, comme sur le pourtour méditerranéen, ou plutôt des épisodes épizootiques/épidémiques plus ou moins récurrents ? Si des hypothèses peuvent déjà être avancées, et développées plus loin, seule une étude de l'évolution de la séroprévalence sur plusieurs saisons de transmission permettra de corroborer un scénario plutôt qu'un autre. En effet, certaines études utilisent la répartition de la séroprévalence selon les classes d'âges des animaux touchés pour orienter les hypothèses : si les chevaux plus âgés sont davantage touchés, une allure endémique de longue date serait plus probable (72). Mais une fois encore, l'absence de connaissances précises sur la persistance des IgG spécifiques aux orthoflavivirus d'intérêt chez les chevaux est une limite à ces conclusions. Enfin, notre enquête de séroprévalence est une enquête épidémiologique transversale : les données de séroprévalence ont été collectées simultanément aux données d'exposition aux facteurs de risque.

3.1.4. Comparaison des facteurs de risques avec d'autres études sérologiques en fonction des conditions du milieu
Les résultats de notre étude concernant les facteurs potentiellement associés à une probabilité plus élevée de séropositivité pour le WNV dans la zone de Confluence ont montré que seuls des facteurs liés à l'environnement et au mode de vie des équidés, tels que le logement en pâturage exclusif et la proximité avec des zones spéciales protégées, augmentaient significativement le risque. Cela est cohérent avec les connaissances actuelles sur le cycle biologique du virus et de ses vecteurs, et les études publiées : les chevaux n'étant pas rentrés aux heures où les moustiques *Culex* sont les plus actifs, classiquement au crépuscule et jusqu'à l'aube (101, 102), sont logiquement davantage exposés à leurs piqûres. De même, les ZPS sont des aires où la biodiversité est riche et propice à la rencontre des différents acteurs et à la réalisation du cycle de transmission, d'autant plus que la concentration de cette diversité biologique dans des espaces restreints favorise l'infection d'hôtes culs-de-sac (2).

De manière surprenante, l'étude statistique n'a pas révélé de corrélation significative entre le statut sérologique des équidés aux virus West Nile et Usutu vectorisés par les moustiques et le degré de nuisance lié à ceux-ci, renseigné par les propriétaires dans le questionnaire. Cependant, ce résultat est difficilement interprétable, considérant le caractère subjectif et très individu-dépendant de cette donnée, et les renseignements très lacunaires dont nous dispositions, 10 des 39 structures sollicitées n'ayant pas fourni d'informations à ce sujet.

En revanche, dans notre étude, aucune caractéristique individuelle n'a été significativement associée à l'infection par le WNV. Ce résultat est compatible avec des études menées en Camargue (72), en Allemagne (3), ou encore en Autriche (83). Néanmoins, d'autres enquêtes ont retenu l'âge et la robe comme significativement associés à un risque de séropositivité au WNV accrue : les chevaux adultes et ceux de couleur claire seraient davantage à risque d'après une étude menée dans le Sud-Ouest de l'Espagne (73). D'autres résultats obtenus au sein de la population équine en Israël entre 1997 et 2013, révèlent que l'espèce et la race seraient également des facteurs prédisposants à la piqûre par les moustiques vecteurs du virus du West Nile : les Quarter horse et chevaux Arabes étant davantage exposés, et les pur-sangs et poneys moins à risque. Cette étude conclut également à un risque plus élevé pour les chevaux de robe claire par rapport à ceux de robe foncée (85). Cependant, les auteurs restent prudents quant à ces conclusions, contredites par d'autres résultats qui montrent au contraire une séroprévalence pour le WNV plus élevée chez les chevaux de couleur foncée (86). De même pour l'influence de la race, qui peut être liée à une différence d'utilisation et de mode de vie des chevaux : les pur-sangs et autres chevaux de sport sont ainsi communément davantage protégés contre les moustiques que des chevaux de loisirs vivant en extérieur.
Concernant le virus Usutu, peu d'études se sont intéressées à l'influence des différents facteurs de risques potentiels, cependant, les chevaux « pure race » seraient plus à risque d'après l'étude menée en Espagne du Sud-Ouest citée plus haut (73). Dans notre étude en Gironde, aucun facteur de risque n'a pu être mis en évidence, mais le facteur "pure race" n'a pas été analysé.

Ainsi, les résultats des différentes études sur les facteurs de risque favorisant l'infection par le WNV et USUV ne se rejoignent pas toujours et se contredisent même parfois. Il est difficile dans l'état des connaissances actuelles de tirer des conclusions consensuelles et certaines de ces enquêtes. Cela met en lumière le manque de connaissances qui demeure aujourd'hui vis-à-vis de la biologie des orthoflavivirus et de leurs vecteurs, et la nécessité urgente d'en apprendre plus sur leur fonctionnement et modes d'expansion.

### 3.1.5. Les mécanismes expliquant l'émergence et l'expansion de WNV sur un territoire, application à la Gironde

L'émergence inattendue du virus du West Nile dans ce nouveau territoire français, mise en évidence par notre étude en 2023 et l'apparition de plusieurs cas cliniques équins en 2022, soulève des interrogations sur les facteurs ayant favorisé son introduction.

#### Introduction du virus dans un nouveau territoire :

L'hypothèse principale implique les oiseaux migrateurs. En effet, la Gironde est à l'aplomb d'une des principales routes migratoires de la planète, ainsi qu'une région de halte et de nichage importante pour de nombreuses espèces de passereaux et de rapaces, deux groupes majoritairement concernés dans le cycle de transmission du WNV (87). Des programmes d'étude ciblés sont maintenant nécessaires afin d'identifier les espèces d'oiseaux présentes en Gironde jouant le rôle d'hôtes réservoirs et amplificateurs dans cette nouvelle région touchée. Par ailleurs, les incendies dévastateurs survenus en Gironde en juillet 2022 ont été à l'origine d'une désorganisation dramatique des écosystèmes sur près de 30 000 hectares de forêts. En modifiant les interactions complexes et l'équilibre entre les organismes, ces feux de forêts ont pu favoriser l'implantation du virus et sa transmission au sein d'un écosystème fragilisé. D'autre part, les incendies jouent un rôle moteur mésestimé dans le maintien de la biodiversité et le renouvellement de la richesse interspécifique, elle-même favorable à de nouvelles interactions entre le virus et ses hôtes (88).
Plus généralement, pour comprendre l'émergence et les tendances de circulation des virus dans un territoire, il faut non seulement étudier les phénomènes d'introduction, mais également les mécanismes d'amplification, de transmission et de persistance dans le temps.

## Amplification et transmission du virus du West Nile :

L'implantation du virus sur le territoire tient en premier lieu à la présence d'espèces d'oiseaux sauvages réservoir/amplificatrices et d'espèces arthropodes vectrices, les moustiques, permettant la réalisation de son cycle biologique. Cette présence dépend essentiellement des caractéristiques environnementales et climatiques des écosystèmes, en termes de températures, précipitations, fréquence des épisodes d'inondations et présence de zones humides permanentes qui favorisent à la fois la halte migratoire des oiseaux et le développement des populations de moustiques. L'année la plus propice à l'explosion de l'abondance du vecteur moustique comporte un hiver doux, un printemps sec, un été avec de longues vagues de chaleurs, suivi d'un automne orageux (2, 89). Ainsi, de façon surprenante, un printemps très sec augmenterait les risques d'occurrence d'une épidémie chez l'homme (85). En outre, l'importance de l'amplification du virus au sein d'un écosystème donné dépend de la réceptivité des espèces hôtes et vectrices présentes, ainsi que de leur résistance à l'infection et de leur potentiel d'amplification : toutes les espèces d'oiseaux, même si elles sont susceptibles d'être infectées par le virus, ne sont pas d' aussi bons hôtes réservoirs et/ou amplificateurs, cela dépendant de facteurs génétiques et d'interactions biologiques complexes (4). D'autre part, le milieu doit offrir des facteurs favorisant le contact entre les différents acteurs du cycle. La densité vecteur/hôte est déterminante, et elle-même influencée par les caractères environnementaux : la sécheresse entraîne ainsi un contact plus rapproché entre les vecteurs et les hôtes réservoirs aviaires autour des rares points d'eau. Par ailleurs, les couloirs végétaux facilitent le déplacement des moustiques sur de plus grandes distances par rapport aux espaces ouverts (2). Tous ces aspects font partie de la **capacité vectorielle**. Au sein de la capacité vectorielle, des caractéristiques inhérentes aux vecteurs permettent également d'expliquer l'amplification et les mécanismes de transmission du virus. Parmi elles, la **compétence vectorielle** désigne l'aptitude à acquérir un agent infectieux au cours d'un repas sanguin, de l'amplifier et de le retransmettre au cours d'un nouveau repas sanguin. Tous les arthropodes ne peuvent pas assurer la transmission biologique de n'importe quel agent pathogène, cette réceptivité résulte notamment de facteurs génétiques et de l'évolution adaptative entre le virus et le vecteur (2). Ainsi certains vecteurs seront hôtes préférentiels, ou accessoires s'ils interviennent seulement de façon minoritaire en raison de leur moins bonne réceptivité. La
compétence vectorielle est estimée en laboratoire, et dépend notamment de la capacité d'amplification du virus au sein de l'organisme de l'insecte et de la concentration des particules virales infectantes dans les sécrétions de celui-ci, transmissibles lors du repas sanguin. Le potentiel d'amplification, ou capacité réplicative virale (fitness), est également une caractéristique déterminante dans l'amplification et la transmission du virus. Elle tient compte de la sensibilité à l'infection du moustique et de la capacité du virus à se répliquer au sein du moustique et à franchir des barrières biologiques telles qu'intestinale et salivaire. Ce dernier critère varie en fonction de nombreux facteurs, parmi lesquels la température joue un rôle primordial : la réplication virale s'intensifie à température plus élevée. Ainsi, un étude a démontré qu'à 30°C, 90% des moustiques transmettent le virus West Nile au cours du repas, alors qu'à 18°C seulement 30% des *Culex* le transmettent (90). La température et l'humidité influenceraient également la croissance des populations de moustiques vecteurs ainsi que leur agressivité (4, 85, 90, 91). Finalement, les préférences trophiques du vecteur, c'est-à-dire les préférences alimentaires manifestées par le moustique pour un type d'hôte déterminé, définissent le spectre d'hôtes potentiellement impliqués dans le cycle d'infection du West Nile. En effet, en fonction de l'espèce, les moustiques sont préférentiellement ornithophiles, mammophiles ou alors peu sélectifs. Par exemple, d'après une étude réalisée dans le Sud-Ouest de l'Espagne, les espèces *Culex perexiguus*, *Cx. modestus* et *Cx. pipiens*, préférentiellement ornithophiles, permettent le maintien du cycle enzootique oiseaux-moustique dans la région, tandis que *Cx. theileri* serait impliqué seulement dans la transmission aux humains (91).

Ainsi, l'installation du cycle de transmission du virus West Nile en Gironde serait le résultat de l'existence de plusieurs facteurs concomitants : arrivée ou présence d'espèces actrices du cycle biologique viral, augmentation du potentiel de rencontre de ces espèces, évolution des paramètres climatiques favorisant le développement des vecteurs et leur capacité à transmettre le virus...

## Persistance du virus du West Nile :

La situation épidémiologique en France oriente davantage vers l'hypothèse d'une persistance du virus d'une année sur l'autre plutôt que d'une réémergence annuelle. En effet, les épizooties successives sur un même territoire, comme en Camargue, et la grande proximité des souches virales mises en cause d'un épisode à l'autre (Lignage 1 du WNV détecté chez les moustiques et les chevaux depuis 2000, et la souche USUV Africa 3 depuis 2015 chez *C. pipiens* d'après une étude menée en Camargue entre 2016 et 2020) (84) supportent le scénario d'endémisation pour ces virus dans la zone d'étude.
Les hypothèses expliquant la persistance du virus West Nile sur les territoires où il circule sont diverses et plus ou moins controversées, même si plusieurs mécanismes coexistent vraisemblablement. L'infection chronique des oiseaux, avec une persistance du virus notamment dans le tissu rénal, a été mis en évidence (92) et pourrait expliquer la circulation du WNV sur plusieurs années. De même, la transmission verticale chez les moustiques, ou encore la capacité des femelles infectées à entrer en diapause hivernale sont autant d'idées avancées. La transmission vectorielle continue, sans pause d'activité hivernale, est un autre mode de persistance possible, originellement surtout dans les régions plus chaudes où les températures descendent peu, mais plus seulement aujourd'hui, avec le réchauffement climatique qui favorise le gommage des saisons et des hivers moins rigoureux à des latitudes de plus en plus hautes (92). Enfin, une biodiversité riche, ainsi que des paysages hétérogènes multiplient les interactions écologiques complexes et diversifiées, permettant l'entretien et le développement pérenne du virus (2).

## Infection des hôtes culs-de-sac épidémiologiques et apparition de cas cliniques :

La circulation enzootique du virus peut être importante alors même que le risque de transmission aux chevaux et aux humains est plus faible, car cette transmission à des hôtes accidentels dépend de facteurs supplémentaires. Par exemple, les moustiques ne se nourrissent pas forcément sur l'hôte le plus abondant, en fonction de leurs préférences trophiques : une étude menée en Italie du Nord met en évidence le caractère protecteur de la présence de poules vis-à-vis de l'infection des humains et chevaux par le West Nile. De façon corrélée, il est observé qu'une diminution saisonnière de la population d'oiseaux préférée par les vecteurs augmente le risque d'infection des hôtes accidentels (93). Ainsi, le risque pour les humains et les chevaux d'être infectés par le WNV dépend des vecteurs présents sur le territoire. C'est pourquoi l'étude entomologique des espèces de moustiques présentes en Gironde et de leurs préférences trophiques est essentielle à l'appréciation du risque dans la région. Outre des critères d'espèces, la préférence des moustiques pour un individu donné au sein d'une population semble dépendre de divers critères : le choix de l'hôte se fait de façon générale grâce aux fonctions sensorielles de l'insecte, capable de percevoir des émissions tels que l'acide lactique, l'acétone ou les composés phénoliques excrétés dans la sueur des animaux cibles, de même que les variations de gaz carbonique expiré (90). Les couleurs foncées exercent également un pouvoir attractif sur le moustique. Cela corrobore les conclusions d'études montrant une séroprévalence positive pour le WNV plus élevée chez les chevaux de robe foncée, même si l'infection semble davantage mortelle chez les chevaux de robe claire d'après
cette même étude (86). Cette sensibilité accrue des chevaux de robes claires vis-à-vis du développement de signes cliniques suite à l'infection par le virus du West Nile pourrait être expliquée par un lien génétique existant entre la couleur de robe et la réponse immunitaire de l'hôte. Rappelons cependant qu'une autre étude menée en Israël citée plus haut montre une séroprévalence plus importante chez les chevaux de robe claire, même si cette conclusion pourrait être biaisée par le lien entre la robe et la race des chevaux inclus dans l'étude (85). L'influence de la robe sur les risques de piqûre est donc sujet à débat, et ne peut être étudiée comme facteur isolé expliquant les préférences trophiques des moustiques et les risques d'infection liés. Par ailleurs, la femelle moustique utilise ses pièces buccales pour le repérage thermique des capillaires sanguins, les zones à peau fine et glabres ou à poils courts sont donc préférées. Ce constat concorde bien avec la séroprévalence pour le WNV inférieure chez les poneys trouvée par la même étude menée en Israël (85).

Le risque est également lié aux probabilités de contact et de rencontre entre les vecteurs et les hôtes accidentels. L'activité des chevaux et leur mode de vie est ainsi un facteur prédisposant ou non à la rencontre avec les moustiques infectés. Cette probabilité de contact peut également connaître des variations, ce qui explique alors l'observation d'une saisonnalité dans le spectre d'hôtes touchés : l'infection et la déclaration des cas humains se concentrent par exemple en été, époque à laquelle non seulement les moustiques sont les plus actifs, mais où nous passons aussi davantage de temps en extérieur et proches des points d'eau, donc davantage au contact des vecteurs. Des facteurs génétiques propres aux espèces hôtes culs-de-sac sembleraient également jouer un rôle dans les différences de réceptivité et de sévérité de la maladie contractée. Ainsi, les chevaux de race Camargue, soumis au contact du virus du West Nile depuis des décennies, paraîtraient plus résistants au développement de la maladie, même si des cas mortels ont tout de même été recensés en 2024 (94). Des recherches complémentaires sont cependant nécessaires pour vérifier ces constats. En revanche, il est intéressant de constater que l'infection des hôtes culs-de-sac, incapable de poursuivre le cycle de transmission du virus, provoque un effet de dilution : l'impact positif ou négatif de la diversité biologique dépend de la compétence des espèces présentes : s'il y a davantage d'espèces compétentes pour transmettre le virus, cela favorise son maintien et son développement, par contre, si beaucoup d'espèces sont non compétentes, le nombre de repas des moustiques pris sur des hôtes incapables d'amplifier le virus va en conséquence diminuer le taux d'infection dans la population de moustiques, et donc le risque d'infection diminue (2).

Enfin, l'expansion rapide du virus à de nouveaux territoires et à de nouvelles espèces peut s'expliquer par l'émergence de souches plus virulentes, capables de se développer dans
l'organisme d'autres espèces, ou encore par l'apparition de mutations améliorant l'efficacité de
réplication du virus chez l'hôte (95). Cela a notamment été le cas en Israël entre 1997 et 1999,
ou encore lors de l'expansion fulgurante vers l'Ouest des Etats-Unis en 1999 (2). C'est d'autant
plus le cas du virus Usutu, dont la virulence est très lignage-dépendante. Cette plasticité
génétique propre aux virus à ARN rend ces événements mutationnels encore plus inquiétants
par leur fréquence et leur imprévisibilité (96).

Enfin, avec l'évolution climatique globale et la remontée de l'aire de répartition des vecteurs, une explosion de l'ampleur des épizooties et épidémies est par ailleurs à craindre car le virus pourra atteindre des populations naïves complètement dépourvues d'immunité. Ainsi, une enquête sérologique menée au Royaume-Uni en 2019 a révélé l'absence de cas de WNV autochtones sur le territoire, les seuls équidés séropositifs ayant vraisemblablement été vaccinés. Les pays du nord de l'Europe s'intéressent ainsi de façon croissante à la situation européenne concernant la circulation du West Nile, car leurs populations non immunisées sont d'autant plus à risque. En revanche, l'étude de l'évolution de la séroprévalence au sein de ces populations totalement naïves présente un intérêt certain car elle permettra de connaître précocement l'introduction et l'expansion du WNV et d'en suivre les limites, afin de prendre des mesures préventives en conséquence (97).

## 3.2. Critiques et perspectives pour l'avenir

Les résultats obtenus par notre étude offrent des perspectives intéressantes et inédites quant à la situation sanitaire en France concernant le virus West Nile. Cependant, il est essentiel d’en évaluer les limites et les implications, afin d’ouvrir la voie à des recherches futures plus approfondies.

### 3.2.1. Représentativité de l'échantillon testé

Comme cela a été décrit plus haut, les critères de sélection des équidés inclus dans l'étude ont été choisis en fonction des objectifs de celle-ci, à savoir déterminer l'état de la circulation des orthoflavvirus WNV et USUV au cours de l'année 2022, dans les zones considérées comme les plus à risque en Gironde. Nous avons également profité de cette enquête pour étudier l'éventuelle circulation du TBEV jusqu'alors jamais décrite dans cette région. Fondamentalement, cette assertion comporte déjà un biais car ces "zones à risques" ont été
déterminées en fonction de la localisation des premiers cas cliniques de 2022, sans étude préliminaire d'orientation accessible. D'autre part, cet échantillonnage s'est évidemment heurté à des considérations pratiques qui ont limité sa réalisation : notre capacité à joindre les différentes structures, la motivation et la disponibilité des gérants de ces mêmes structures, le caractère manipulable des chevaux... Autant de facteurs qui créent inévitablement un biais d'échantillonnage, celui-ci n'étant de fait pas véritablement aléatoire. Quant à la représentativité de la cohorte étudiée, il faut prendre en compte les objectifs de l'étude : si l'on se place à l'échelle du département, la cohorte échantillonnée ne représente que près de 2% de la population équine de Gironde (494/23300 (60)). Cependant, à l'échelle des 39 structures visitées, on compte au total environ 1100 équidés : la population échantillonnée représente alors 45% de l'effectif total de ces structures (494/1100). Ainsi, notre cohorte d'étude peut, par sa taille, être considérée comme représentative des zones ciblées dans cette première enquête comme étant les plus à risque. Cela correspond bien aux fins de cette enquête 2023, qui rappelons-le, n'avait pas pour ambition de balayer l'ensemble de la Gironde, mais d'étudier l'étendue et l'intensité de circulation du WNV en 2022 à la suite des premiers cas équins autochtones en Gironde dans la zone Confluence. Il s'agissait d'une étude pilote financée sur fonds propres de chaque partenaire de l'étude (Clinique de Conques, DDPP33, LNR West Nile).

Outre les considérations sur la taille de l'échantillon, et pour des raisons pratiques également, notre cohorte n'est pas forcément représentative de la population équine de Gironde, en termes d'abondance relative des différentes espèces (seulement 3 ânes inclus dans l'étude), de couleurs de robe... Cela a également eu pour conséquence que certains facteurs de risques n'ont pu être pris en compte dans l'analyse statistique car ils n'étaient pas assez représentés au sein de notre échantillon.

### 3.2.2. Perspectives d'amélioration

Cette première enquête menée en 2023 constitue en fait une étude pilote qui permettra l'optimisation des protocoles et des modalités de réalisation pour le futur. Tout d'abord, le questionnaire envoyé aux propriétaires pourrait être complété afin d'en exploiter les réponses au mieux : il serait intéressant, pour les chevaux qui sont rentrés le soir en box, de savoir à quelle heure ils le sont, et surtout s'ils sont déjà en intérieur au moment du crépuscule, où les moustiques du genre *Culex* sont les plus actifs. D'autre part, concernant les informations sur l'utilisation principale des chevaux de sport, dont on peut supposer qu'ils sont davantage
déplacés pour participer aux compétitions, des informations sur ces déplacements, tels que leur
distance par rapport au domicile, leurs destinations, permettraient par exemple d'explorer leur
impact sur le risque d'infection en fonction des régions visitées. Par ailleurs, le score de
nuisance renseigné par les propriétaires s'est avéré peu exploitable dans notre étude à cause du
caractère très subjectif de ce critère. Afin de palier à cela, il serait intéressant de fournir une
grille de score avec des critères précis, permettant aux participants de se situer selon des critères
plus objectifs et donc comparables d'une structure à l'autre. Il serait par ailleurs pertinent de
savoir à quel moment de la journée ou de la nuit les équidés sont le plus gênés par les
moustiques. En outre, on pourrait envisager de caractériser précisément quels moustiques sont
responsables de la nuisance rapportée : en effet en journée, les moustiques du genre *Aedes*,
vecteurs du virus de la dengue, peuvent par exemple être davantage impliqués que les
moustiques du genre *Culex*. Cela permettrait de mutualiser les données pour la surveillance des
multiples agents pathogènes d'importance en santé humaine. La variabilité inter-enquêteur et
la façon de poser les questions est aussi un biais à prendre en considération que l'on pourrait
rectifier, par exemple, par la formation homogénéisée des intervenants de terrain. Si l'on veut
également explorer de façon plus précise l'impact de la couleur de robe sur l'attirance des
moustiques vecteurs, il s'agira d'être plus rigoureux sur la caractérisation des robes, notamment
pour les robes pies, pour lesquelles la quantité de blanc sur le pelage peut énormément varier
d'un cheval pie à l'autre. Finalement, un des principaux enjeux pour les prochaines études sur
la circulation autochtone des orthoflavivirus en Gironde sera de sélectionner les équidés n'ayant
pu s'infecter sur d'autres territoires. En effet dans notre étude, les critères ont été établis
uniquement pour le WNV, seuls la vaccination WNV et un séjour en zone de circulation
endémique (pourtour méditerranéen ou Espagne) au cours des 6 dernières années étaient des
critères d'exclusion. Concernant le virus TBEV, les tiques dures *I. ricinus* sont retrouvées sur
quasiment tout le territoire français à l'exception du sud-est de la France où il fait trop sec. Un
échantillonnage adapté spécifiquement à l'étude de ce virus serait nécessaire afin d'évaluer
correctement l'état de sa circulation dans le Sud-Ouest de la France, notamment en incluant des
équidés ayant vécu uniquement en Gironde. De plus, dans certaines études, il a été montré que
les bovins étaient de très bonnes sentinelles pour la circulation du TBEV (98). Il serait d'abord
nécessaire de valider le fait que les équidés peuvent être utilisés comme sentinelles pour ce
virus.

Il a d'autre part été envisagé pour notre enquête, mais non réalisable dans un premier
temps, de déterminer le groupe sanguin de tous les équidés échantillonnés, afin d'évaluer si,
comme chez les humains, les moustiques *Culex* piquaient préférentiellement un groupe sanguin en particulier (99). Cela pourrait être intéressant à étudier pour les futures investigations.

Par ailleurs, il serait intéressant de poursuivre les investigations sur les interactions existant entre WNV et USUV. En effet, il a été mis en évidence que chez *C. pipiens*, une pré-infection par USUV réduit la transmission de WNV, tandis qu'une co-infection simultanée réduit la transmission d'USUV uniquement (100). Chez les hôtes aviaires, des études réalisées chez des pies ont montré qu'une infection USUV protégeait partiellement contre une infection WNV (101). Cependant, il a déjà été trouvé dans la nature des cas mortels aviaires où les deux virus étaient présents au sein des organes. C'est le cas en 2023, où un pigeon ramier en Charente-Maritime et une grive musicienne en Gironde étaient co-infectés (Données LNR West Nile). Enfin, USUV étant asymptomatique chez les équidés, il serait intéressant de savoir si une infection à USUV pouvait fournir une protection contre une infection à WNV.

Pour aller plus loin dans l'approfondissement des connaissances sur les orthoflavivirus,
il serait indispensable de mener des enquêtes conjointes sur leurs circulations chez les
arthropodes, par des campagnes de capture, les oiseaux, les autres espèces de mammifères, et
notamment de caractériser avec précision les espèces de vecteurs présentes en Gironde, comme
cela a été fait en Camargue. En effet, cela est déterminant pour prévoir l'évolution enzootique
ou épizootique dans la région, le potentiel d'expansion et le risque d'infection pour l'homme et
les différentes espèces hôtes potentielles. Cet apport de connaissances, associé à une étude
précise des biotopes, des flux migratoires et des écosystèmes, pourra permettre de cibler de
nouvelles zones potentiellement à risque et d'adapter les mesures de prévention.

3.2.3. Les orthoflavivirus : une maladie ré-émergente méritant une surveillance renforcée

3.2.3.1. *En Gironde et en France : saison 2023 et mesures mises en place depuis notre étude*

Cette première enquête de séroprévalence menée en 2023, en amont de la saison de transmission 2023, dans la population équine de Gironde proche des lieux de confirmation des premiers cas infectés dans la zone, a permis de mettre en évidence la circulation active du WNV et USUV dans des zones précises. Dans le domaine de la recherche, ces résultats préliminaires ont permis d'installer sans tarder, mi-juillet 2023, des pièges à moustiques dans la région de
Confluence afin de poursuivre les investigations sur la circulation du WNV et USUV chez les autres espèces dans cette zone à haut risque (102). L'enquête de 2023 apparaît comme une étude pilote, fournissant les premiers résultats et permettant de dessiner les prochaines pistes de recherches opérationnelles pour appréhender et contrôler au mieux l'émergence du WNV dans cette région jusqu'alors indemne. Elle met également en évidence la nécessité, mais aussi la faisabilité d'une prise en compte intégrée et globale de l'enjeu dans une logique One Health, où la coopération entre les acteurs de la santé publique humaine, animale, environnementale et des organismes de recherche et administratifs, est essentielle pour gérer au mieux ce danger nouveau dans les territoires du Sud-Ouest de la France.

D'autre part, cette enquête a contribué au lancement de mesures préventives nécessaires pour garantir la santé publique en Gironde et Charente Maritime, notamment par le renforcement des précautions prises en milieu hospitalier pour les dons du sang et dons d'organes (100). En effet, pour la première fois, les données en santé animale et environnementale ont été prise en compte pour la sécurisation des produits labiles sanguins. Jusqu'à aujourd'hui, seule la détection du premier cas humain dans un département donné déclenche les mesures de diagnostic génomique viral (DGV, recherche du génome WNV au sein des poches de sang et organes des donneurs) pour le département. En 2023, à la suite du diagnostic du premier cas humain dans la métropole de Bordeaux, le Haut Conseil de la Santé Publique (HCSP) a réuni tous les acteurs de la surveillance régalienne du WNV, réunissant l'EFS, le Centre National de Référence (CNR) des arbovirus, le LNR West Nile,... dans le but d'établir la zone où le DGV allait être mis en place. Dans un premier temps, il était prévu de restreindre le DGV à la métropole bordelaise. Cependant, les données recueillies via l'étude des pièges à moustique précisément placés dans les écuries à forte circulation en 2022 que notre étude avait mis en évidence, ont révélé la circulation active du WNV au nord de la Gironde. De plus, grâce aux acteurs de terrain et notamment aux vétérinaires sensibilisés, des suspicions cliniques équines dans le sud de la Charente-Maritime ont été remontées. De ce fait, le DGV a été étendu à tout le département de la Gironde mais également à la Charente-Maritime par anticipation (103). Quant à la filière équine, les propriétaires et gérants de structures équestres sont depuis d'autant plus vivement encouragés à vacciner leurs animaux contre le WNV, surtout dans le secteur de Confluence où le risque apparaît a priori comme étant plus élevé.

A l'échelle de la France, selon le bilan de la saison 2022 publié par l'ANSES (Figure 24), ainsi que d'après les données de Santé publique France, 6 cas humains auront été recensés en Provence-Alpes-Côte d'Azur (PACA), et 9 cas équins, dont 6 localisés sur le pourtour méditerranéen, en Corse, et pour la première fois 3 en Gironde. Cette "conquête de l'Ouest"
insidieuse est confirmée par notre étude de séroprévalence, qui a révélé la circulation active jusqu'alors silencieuse, du virus West Nile dans le département girondin. D'ailleurs, le bilan de la saison suivante 2023 en est l'image : les cas rapportés ont explosé en nombre, et l'aire de répartition s'est encore élargie vers l'Ouest, avec la déclaration d'un premier cas dans le département du Gers, et l'expansion de la circulation en Gironde aux départements de Charente et Charente-Maritime. Ainsi, au cours de la saison de transmission 2023, 49 cas humains ont été recensés en Nouvelle-Aquitaine, PACA et Corse, 49 cas équins ont été diagnostiqués en Nouvelle-Aquitaine, sur le pourtour méditerranéen et dans le Gers, ainsi que 7 cas aviaires en Nouvelle-Aquitaine.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 24 : Cas équins d'infection West Nile rapportés au cours des saisons de transmission 2022 et 2023 (Crédit : Laboratoire National de Référence, (104))</figcaption></figure>

Si les enquêtes de séroprévalence s'avèrent ainsi être de bons indicateurs prédictifs de l'évolution du virus et de son expansion, une telle explosion du nombre de cas détectés entre 2022 et 2023 peut également en partie être expliquée par la sensibilisation accrue des professionnels et des détenteurs d'équidés quant à la détection de la maladie, permettant la déclaration de davantage de cas qui seraient auparavant passés inaperçus (100, 104). Ainsi, en cas de suspicion d'un cas d'infection aiguë par le WNV, le vétérinaire doit envoyer un échantillon de sérum à un laboratoire départemental agréé par la DGAL via sa participation à des essais inter-laboratoires organisés par le LNR West Nile, pour le diagnostic sérologique chez les équidés, où seront effectués des tests sérologiques ELISA IgG et IgM. Les délais d'obtention des résultats sont environ de 4h pour les IgG et de un jour pour les IgM. Si le résultat est positif ou douteux, ou s'il y a une forte suspicion clinique malgré un test ELISA négatif, les échantillons sont ensuite transférés à l'ANSES, au LNR West Nile pour confirmation et déclaration du cas auprès de la DGAL. Un test de séroneutralisation, réalisé au
LNR, est nécessaire lorsqu'un des deux tests ressort « douteux ». Une amplification génique par RT-PCR peut théoriquement également être réalisée sur urine (le matériel viral y serait plus longtemps détectable en raison du portage rénal du virus WNV notamment) (41). En *post-mortem*, le prélèvement d'échantillons de tissu nerveux (encéphale, moelle épinière) permet l'isolement et le séquençage de l'agent pathogène infectant, et d'en caractériser ainsi la souche.

Aujourd'hui, l'absence de tests à la fois spécifiques et sensibles, directement utilisables sur le terrain motive le développement de nouveaux tests sérologiques rapides, spécifiques et utilisant du matériel non contagieux. Une méthode de diagnostic sérologique multiplexe des infections à orthoflavivirus chez les équidés utilisant la technologie Luminex® (Biorad) a été développée par le LNR West Nile en 2016 en collaboration avec l'Institut Pasteur et montre des résultats encourageants. Fondée sur le principe de la cytométrie en flux, cette technique allie l'utilisation de microsphères magnétiques recouvertes d'antigènes (protéines virales) différentiables et une double lecture après excitation par deux lasers. La technique Luminex® a beaucoup d'avantages : le volume de sérum nécessaire est limité, ce qui est un atout notamment lors des tests réalisés chez les oiseaux. De plus, les résultats sont disponibles en 24h et pour plusieurs virus grâce à sa forme multiplex, contrairement à la séroneutralisation qui requiert plusieurs jours et la manipulation des virus en laboratoire confiné de niveau 3. Cependant, si cette méthode est prometteuse, il reste toujours difficile de discriminer les orthoflavivirus du même sérocomplexe JEV (WNV, USUV, JEV) (105). Des travaux de recherche sont en cours pour tenter d'améliorer la spécificité de ce test.

Cette volonté d'améliorer la détection du virus et de documenter sa circulation de façon plus rigoureuse et compréhensive s'est également étendue au virus Usutu, sa surveillance étant adossée à celle du WNV et réalisé par le LNR WNV. L'année 2023 a été marquée par une circulation exceptionnelle du virus parmi les populations d'oiseaux sur une large partie du territoire métropolitain français, après 5 ans de faible circulation continue (pour rappel, en 2018 une très forte épizootie due à USUV a été observée en France où plus d'une centaine de cas aviaires répartis sur 47 départements ont été diagnostiqués – LNR WNV) (Figure 25). Le virus a également été détecté chez l'homme en Gironde en 2022.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 25 : Cas d'infection par le virus Usutu au cours des saisons de transmission 2022 et 2023. (Crédit : Laboratoire National de Référence (100))</figcaption></figure>

Face à la flambée de cette circulation virale et à son extension marquée engendrant un risque sanitaire accru en santé humaine et animale, le Comité de Veille et d'Anticipation des Risques Sanitaires (COVARS) a émis le 20 octobre 2023 une note, elle-même mise à jour le 18 juin 2024, faisant un état des lieux de la situation et établissant de nouvelles recommandations pour lutter contre les risques liés aux virus WN et Usutu. Le COVARS y insiste à nouveau sur la nécessité d'une action concertée des différents acteurs nationaux dans un cadre One Health, et d'une action territorialisée, ainsi que d'une approche globale comprenant le renforcement des mesures de surveillance humaine, animale et environnementale, et des moyens d'information et de sensibilisation, la lutte anti-vectorielle, l'optimisation de la prise en charge médicale et la poursuite des recherches sur les arboviroses (106).

Les bilans des saisons de transmission du WNV, chez les équidés mais aussi les oiseaux et les humains, établis par le Laboratoire national de Référence pour le WNV et Santé Publique France durant l'année 2023, suggèrent que l'on se dirige vers une dynamique endémique du virus dans la région. La comparaison avec la situation dans les régions historiquement touchées par le WNV est également intéressante pour anticiper l'évolution possible de la circulation virale dans les zones nouvellement touchées : ainsi, le virus West Nile est endémique en Camargue depuis des décennies, cependant son allure épidémiologique n'est pas régulière, et a notamment été marquée par une période de silence entre 2004 et 2015, année marquée par une explosion de cas cliniques. La question se pose donc ici d'un phénomène de réintroduction ou plutôt d'une période de persistance à bas bruit qui aurait accompagné une diminution de l'immunité chez les populations d'hôte. Cela suivi d'une année plus propice au développement
et à la transmission du virus expliquerait ensuite la réémergence massive de la maladie. Ce phénomène ne semble pas isolé puisqu'il a également été observé en Israël en 2000 et en 2005 (85). Plusieurs scénarios sont donc envisageables quant à l'évolution de la circulation du virus du West Nile en Gironde et seule la poursuite et l'élargissement des recherches sur les années à venir permettra d'y voir plus clair.

Par ailleurs, une poursuite de l'expansion de son aire de circulation, vers le nord notamment, est également à craindre dans le futur proche, compte tenu des dynamiques actuelles, de l'évolution climatique et de la géographie/topologie. De nouvelles études sont cependant nécessaires pour anticiper plus précisément l'évolution épidémiologique de ce virus : il faudrait pour cela multiplier les années d'études, approfondir les recherches sur les phénomènes migratoires, les mécanismes de persistance des vecteurs et l'impact du réchauffement climatique sur leur répartition géographique (72).

### 3.2.3.2. Enquêtes épidémiologiques et avancées scientifiques en France et à l'international en 2024

Notre étude de séroprévalence en 2023 s'inscrit dans une dynamique actuelle globale de recherche active autour de des orthoflavivirus émergents, à toutes les échelles. En Nouvelle-Aquitaine d'une part, une enquête sérologique semblable à celle menée en Gironde a suivi en Charente-Maritime en 2024, suite à la déclaration de 6 cas équins dont le premier le 11 août 2023. Le LNR WNV a également lancé d'autres opérations de recherche sur le terrain, comme une analyse de la sérothèque du zoo de la Palmyre (2015-2023), où le WNV a été incriminé dans la perte d'une quarantaine d'oiseaux de la collection, afin de tenter de dater l'introduction du virus en Charente-Maritime. A l'échelle nationale, des enquêtes sérologiques ont été menées à travers tout le territoire chez les espèces aviaires de 18 parcs zoologiques sur 2023 et 2024 (Données LNR West Nile). D'autres enquêtes chez les équidés, oiseaux, bovins sont en cours de réalisation dans d'autres départements de la Nouvelle Aquitaine (Thèse FCPR de Clément Bigeard – Encadrement CHU Bordeaux et LNR West Nile).

Dans le monde entier, depuis l'année 2023, des centaines d'études ont été publiées sur le **virus West Nile** : des enquêtes de séroprévalence similaires à la nôtre révèlent la circulation du virus dans de nouveaux territoires, comme en Libye où le virus a été détecté pour la première fois chez les animaux (107), ou en Espagne dans la communauté de Madrid, parmi les populations d'oiseaux sauvages (108). Face à la montée en latitude de l'aire de distribution du WNV, les pays plus au nord s'intéressent également de plus en plus aux orthoflavivirus : une
enquête de séroprévalence menée aux Pays-Bas sur le WNV, USUV et TBEV permet un premier état des lieux de la situation épidémiologique dans le pays où un cas humain a été déclaré en 2020 (109). Elle révèle néanmoins de très faibles séroprévalences chez les chiens et les chevaux (110). Le virus du West Nile réémerge également dans des zones où il était resté silencieux pendant plusieurs années, comme en Italie où les lignages 1 et 2 ont récemment été responsables d'épizooties massives et inattendues (111, 112). La connaissance plus approfondie des facteurs de pathogénicité, des mécanismes de transmission et de persistance et des modes d'interactions entre le virus et ses hôtes est primordiale pour la mise en place de moyens de lutte efficaces contre le virus. C'est ainsi que la caractérisation plus poussée du génome du virus permet l'identification de gènes intervenant dans sa virulence et la compétence vectorielle des vecteurs (113). Par ailleurs, l'intervention de bactéries symbiotiques appartenant au microbiote du moustique *Culex* jouerait un rôle favorisant dans le développement du WNV au sein de l'organisme de ce dernier (114). Les recherches sur le développement d'outils de détection et des méthodes de surveillance sont également de plus en plus nombreuses : une étude menée au Pays-Bas démontre l'intérêt de l'utilisation d'oiseaux de basse-cour comme sentinelles de la circulation du WNV et USUV (115), tandis que de nouveaux tests de dépistage sont proposés pour simplifier et optimiser la détection précoce des infections sur le terrain et dans des régions plus reculées ou disposant de peu de moyens, comme le test sérologique multiplexe développé par l'ANSES précédemment cité, ou encore un test immunologique par micropuce à flux latéral indépendant de l'espèce, développé par une équipe néerlandaise (116).

Outre la nécessité d'améliorer nos performances diagnostiques, il apparaît également nécessaire de développer le volet préventif dans le contrôle de la maladie. La vaccination contre la fièvre de West Nile est une mesure essentielle à promouvoir dans les territoires où le virus circule. Vient alors la question de la population concernée par la vaccination : au vu de la prévalence de cas asymptomatiques séropositifs, est-il pertinent de vacciner les individus déjà séropositifs, ou sont-ils protégés à vie contre la maladie ? Si oui, combien de temps ? La littérature manque de données concernant l'espèce équine sur la persistance des défenses immunitaires contre le WNV. D'après les résultats d'une nouvelle étude menée à l'Université de Médecine vétérinaire de Budapest, les chevaux ayant développé des signes cliniques à la suite d'une infection par le WNV conservent une quantité protectrice d'anticorps neutralisants au moins 4 ans après l'infection (117). En revanche, d'après ces mêmes travaux, les chevaux séropositifs n'ayant jamais déclaré la maladie voient leur taux d'anticorps diminuer rapidement dès les premières années post-infection, il n'est donc pas possible d'assurer qu'ils seront protégés contre une potentielle réinfection. En considération de ces récentes découvertes, et
bien que l'on manque encore de recul, il paraît donc judicieux de conseiller la vaccination de
tous les chevaux n'ayant jamais montré de symptômes de la fièvre de West Nile dans les régions
touchées par le virus (pourtour méditerranéen en Occitanie et PACA, Corse, Nouvelle-
Aquitaine), en accord avec les recommandations actuelles du RESPE ou de réaliser des
dépistages annuels au LNR West Nile afin de s'assurer la présence d'anicorps neutralisants
dirigés spécifiquement contre le WNV (118). La primo-vaccination consiste en deux injections
à 4-6 semaines d'intervalle, avec un rappel annuel plus judicieusement au printemps. Le
protocole de vaccination peut être initié dès 5 mois d'âge, et une vaccination des poulinières
avant le poulinage garantit un transfert colostral des anticorps au poulain. Concernant les
chevaux qui ont déjà été infectés et cliniques de la maladie, un suivi sérologique peut être
envisagé afin d'évaluer l'évolution du statut immunologique et la nécessité de vacciner (119).

Il est intéressant de se placer à l'échelle internationale pour envisager les perspectives
de la situation épidémiologique européenne. En effet, le WNV est aujourd'hui présent à travers
l'entièreté du territoire nord-américain. Mais grâce à des politiques de vaccination de grande
envergure, le nombre de cas équins déclarés est passé de 15 257 en 2002 à 116 en 2022 (120).
Cela prouve qu'une mobilisation coordonnée des différents acteurs en santé publique, animale
et des autorités gouvernementales, ainsi que la mise en place de stratégies basées sur la
prévention vaccinale sont nécessaires et efficaces dans la prise en charge de cette nouvelle
menace.

La recherche d'un vaccin humain efficace est également un enjeu majeur au vu de
l'explosion des cas cliniques, et des pistes sur l'utilisation de moustiques transgéniques
semblent prometteuses (121). En outre, la vaccination n'est pas la seule solution de contrôle
envisagée et des outils thérapeutiques sous la forme de molécules antivirales sont également en
cours d'étude (122).

Les recherches épidémiologiques sur le **virus Usutu** sont souvent menées conjointement à celles étudiant le WNV, en parallèle de recherches poussées sur la séquence génétique du virus, afin de mieux en appréhender les dynamiques d'évolution et de transmission (123).

Concernant le **virus de l'encéphalite à tiques**, le recensement des études menées au cours des derniers mois montre également un intérêt accru pour ce virus et ces mécanismes. De même que le WNV, le TBEV conquiert continuellement de nouveaux territoires, comme en Allemagne du Nord où de nouveaux foci ont été découverts récemment grâce à des études de séroprévalence parmi les animaux sauvages et domestiques (124), ou encore en Croatie (125). La communauté vétérinaire ne dispose cependant toujours pas de vaccin contre le TBEV chez
les chevaux, mais des résultats sont parus sur la performance du vaccin humain chez le cheval, sans pouvoir encore en démontrer l'efficacité (126).

### 3.2.3.3. Bilan de la saison 2024 en France et en Europe

En 2024, la France hexagonale a fait face à la plus forte saison de transmission depuis son arrivée sur le territoire, surtout chez les équidés, causant 89 cas dont 11 décès. (Données LNR West Nile et Santé Publique France). La majorité des cas étaient localisés sur le pourtour méditerranéen. Cependant, la saison a surtout été marquée par une extension spectaculaire de l'aire de répartition du virus, notamment en Nouvelle-Aquitaine, avec la notification d'un premier cas équin en Vendée et des cas aviaires dans le département de la Vienne (Figure 26).

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 26 : Cas d'infection par le virus West Nile en 2024 pour les foyers/cas animaux et pour les cas humains dans les pays d'Europe (UE et voisins) (source : bulletins hebdomadaires Plateforme ESA) (127)</figcaption></figure>

La Corse a également signalé 3 cas équins, et les DOM-TOM n'ont pas été épargnés puisque des cas équins symptomatiques ont été diagnostiqués en Guadeloupe en août 2024, et le virus a été décrit pour la première fois en Martinique en décembre. Les populations animales
n'étaient pas les seules concernées par cette expansion : le Gard, l'Hérault, le Var les Pyrénées-
Atlantiques ont dû déplorer des cas humains dont un décès. La saison s'est étendue du 15 juillet
2024, avec les premiers cas équins symptomatiques dans le Var et Bouche-du-Rhône, jusqu'à
fin octobre. (Figure 27)

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 27 : Cinétique de l'épidémie West Nile en France hexagonale en 2024 chez les équidés et oiseaux basée sur la date de début des symptômes (Données LNR West Nile)</figcaption></figure>

Des recherches sur les souches circulant au cours de la saison 2024 ont permis de conclure que deux souches de la lignée 2, apparentées à celle de 2023 en Gironde et celle circulant en Italie ont circulé de façon active sur le territoire cette année-là. Ces données démontrent pour la première fois la circulation du WNV lignée 2 en Camargue où seule la lignée 1 avait été décrite. De plus, les analyses phylogénétiques des souches retrouvés en Charente-Maritime et Vienne démontrent que ces dernières découlent de la souche circulante de 2023 (Données LNR West Nile).

En Gironde, un seul cas de maladie de West Nile chez les équidés a été déclaré au cours
de la saison, tardivement (Figure 27). Cela pourrait peut-être s'expliquer en partie par
l'ensemble des mesures mises en place suite aux résultats de l'enquête sérologique de 2023, et
au travail de communication et de sensibilisation qui ont accompagné cette dernière. En effet,
le WNV n'était pas même connu de beaucoup de propriétaires et acteurs de la filière équine
dans cette région jusque-là épargnée. De même, la prise de conscience a également concerné
les professionnels vétérinaires. Maintenant conscient de la menace, ceux-ci sont en mesure de
promouvoir la vaccination, mesure de lutte essentielle, ainsi que de conseiller les détenteurs de