Nouvelle stratégie
pour la conception
d'expérimentations animales
robustes et reproductibles

Christophe Audebert<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Gaël Even<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Nicolas Vandenabeele<fnref n="3" />,<fnref n="4" />,
Anthony Mouray<fnref n="3" />,<fnref n="4" />, Magali Chabé<fnref n="5" />

> Lors du recours aux expérimentations animales, le protocole expérimental est d'une importance cruciale, tant d'un point de vue scientifique pour garantir fiabilité et reproductibilité des analyses, que du point de vue éthique. En effet, améliorer la reproductibilité des expériences animales est une condition fondamentale pour respecter les recommandations relatives au remplacement, à la réduction et au raffinement (règle des 3R), cela afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d'affiner les procédures mises en œuvre dans le but de minimiser la douleur et la détresse des animaux [1]. En particulier, concernant la réduction du nombre d'animaux, une conception adéquate des groupes expérimentaux est essentielle pour garantir des résultats robustes et reproductibles, tout en maximisant les informations collectées sur chaque animal afin d'éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires, et en minimisant les animaux écartés car associés à des valeurs aberrantes [1].

Nombreuses peuvent être les raisons
expliquant la faible reproductibilité des
résultats des expérimentations ani-
males, telles qu'un design d'expérience
inadapté ou l'utilisation de méthodes
statistiques inadéquates. De mul-
tiples facteurs génétiques ou environ-
nementaux, dont certains sont incon-
trôlables, sont susceptibles d'influer
sur les observations recueillies lors des
expérimentations [2]. Parmi ces fac-
teurs de confusion, les différences de

microbiote intestinal entre les groupes
expérimentaux ont longtemps été igno-
rées, bien qu'elles contribuent à cette
faible reproductibilité [3]. L'influence
du microbiote intestinal sur la phy-
siologie, le développement du système
immunitaire et des muqueuses de son
hôte, humain ou animal, est aujourd'hui
admise [3]. En outre, l'utilisation de
modèles animaux, tels que le modèle
murin classique *Mus musculus*, joue un
rôle primordial dans le défi consistant à
dépasser les études de corrélation pour
établir les liens de causalité dans les
relations hôte-microbiote [4].

Compte tenu de ces éléments, il semble
rationnel que le microbiote intestinal
soit pris en considération lors de la
conception et de l'interprétation des
expériences utilisant des modèles ani-
maux, que le sujet d'étude porte ou pas
sur le microbiote.

Dans les faits, malgré les efforts de
standardisation des procédures d'éle-
vage et d'expérimentation, malgré les
efforts afin d'offrir un cadre contrôlé
pour étudier l'association entre patri-
moine génétique de l'hôte, facteurs
environnementaux et composition du
microbiote, les modèles murins ne sont
pas exempts de variabilité du micro-
biote intestinal. La constitution des
groupes d'animaux à comparer lors
d'une expérimentation est actuelle-
ment une étape retenant peu l'at-
tention de l'expérimentateur, qui s'en
remet généralement au hasard. Il s'agit
cependant d'une source de biais, par-

fois majeurs, établis avant même que
l'expérimentation ne débute réelle-
ment, et pouvant conduire à écarter
par la suite des valeurs jugées aber-
rantes. La probabilité d'être confronté
à des groupes dissimilaires en termes
de microbiote intestinal lors d'une
répartition aléatoire des animaux est
assez forte (plus de 10 % des designs
expérimentaux, selon notre expérience,
sont soumis à des biais initiaux) et
les solutions ne visant qu'à atténuer
ce risque peuvent être insuffisamment
efficaces. Aussi proposons nous une
nouvelle stratégie qui prend en consi-
dération la réalité des différences
d'empreintes de microbiote entre les
animaux, à partir des données issues
d'analyses métagénomiques 16S, et
qui utilise ces différences pour guider
la répartition de ces animaux dans les
différents groupes d'une étude expé-
rimentale. Cette stratégie permet de
constituer des groupes similaires quant
à leur profil de microbiote fécal avant
le début de l'expérience [5].

Pour cela, nous avons élaboré un nou-
vel algorithme, que nous avons nommé
« Bact-to-Batch » [5]. L'algorithme
se fonde sur les mesures d'indices de
diversité alpha et bêta des micro-
biotes intestinaux de tous les ani-
maux destinés à l'étude expérimentale,
pour proposer un ensemble de designs
d'assignation des animaux consi-
dérés comme optimaux, grâce à une
méthode permettant de maximiser les
distances intra-groupe tout en mini-

<footnote n="1">¹GD Biotech-Gènes Diffusion, Lille, France</footnote>

<footnote n="2">² PEGASE-Biosciences,
Institut Pasteur de Lille, Lille, France</footnote>

<footnote n="3">³ Plateforme d'expérimentations
et de hautes technologies animales,
Institut Pasteur de Lille, Lille, France</footnote>

<footnote n="4">⁴ Institut Pasteur de Lille, US 41-UAR 2014-
PLBS, Université Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille,
Lille, France</footnote>

<footnote n="5">⁵ Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille,
Institut Pasteur de Lille, U1019 - UMR 9017
- Centre d'infection et d'immunité de Lille
(CIIL), Lille, France
magali.chabe@univ-lille.fr</footnote>
<figure><img src="image_1.png" /></figure>

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

DESIGNS
High-Risk Design
Optimal Design
Sub-Optimal Design
Suggested Design

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Axis1 Axis2, PERMANOVA p-value = 0,004

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

Chao1, p-value = 0,034

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Axis1 Axis2, PERMANOVA p-value = 0,4

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Shannon, p-value = 1

**Figure 1.** Scores de similarité, en termes de microbiote intestinal, de toutes les combinaisons de répartition possibles de 20 souris en deux lots de 10 animaux, et différences de diversité du microbiote intestinal entre les deux groupes du modèle de répartition le plus optimal et de celui le moins favorable, grâce à l'algorithme Bact-to-Batch. (A) Diagramme des scores de similarité des microbiotes intestinaux des deux groupes d'animaux pour les 92 378 combinaisons de répartition possibles. Les scores de couleur verte, orange et rouge désignent respectivement les modèles optimaux, sous-optimaux et à risque de répartition des animaux. La ligne en trait pointillé correspond au résultat optimal fourni par l'algorithme. Pour le modèle le moins favorable : (B) analyse en coordonnées principales mettant en évidence deux groupes distincts en termes de composition du microbiote intestinal ; (C) « boîtes à moustaches » mettant en évidence les différences de deux indices d'alpha-diversité du microbiote entre les deux groupes d'animaux. Pour le modèle le plus favorable : (D) analyse en coordonnées principales montrant deux groupes similaires en termes de composition du microbiote intestinal ; (E) « boîtes à moustaches » montrant des indices d'alpha-diversité semblables (figure d'après [5]).

misant les distances inter-groupes. Cette méthode a été mise au point sur un total de 20 souris, que nous souhaitions répartir en deux lots similaires en termes de microbiote. Après analyse métagénomique classique du microbiote bactérien de ces souris et obtention des indices de diversité alpha et bêta pour chaque animal, nous avons utilisé l'algorithmme Bact-to-Batch pour obtenir un design optimal d'assignation des animaux en deux groupes. Afin de situer la qualité de ce design par rapport à l'exhaustivité des designs possibles, nous avons évalué les scores de similarité sur les plus de 90 000 possibilités de combinaisons de répartition des 20 souris en deux lots de 10 souris (Figure 1). Les cinq premiers centiles des scores de classement étaient considérés comme des « modèles optimaux », et les scores de classement supérieurs au 95e centile comme « modèles à haut risque ».

Les modèles se situant entre le 5e et le 95e centile étaient considérés comme des « modèles sous-optimaux ». L'algorithme Bact-to-Batch a systématiquement proposé des designs dans les cinq premiers centiles (Figure 1).

Dans cette étude, le temps de calcul de l'exhaustivité des combinaisons était de 55 minutes, alors que l'algorithmme Bact-to-Batch proposait une solution optimale en 13 secondes. Si le calcul exhaustif et la sélection de la solution « exacte » étaient possibles dans ce cas, le nombre de modèles possibles dans d'autres études expérimentales (x animaux répartis en y groupes) et le temps nécessaire pour calculer les scores de similarité et leur classement peuvent rapidement devenir un verrou. Par exemple, si l'on souhaite évaluer exhaustivement la répartition de 20 animaux en quatre groupes, il faudrait plus de 30 ans avec un ordinateur de configuration classique.

L'approche heuristique proposée avec l'algorithmme Bact-to-Batch permet au contraire d'obtenir une solution optimale (toujours proche de la solution exacte) en quelques secondes, et ce, quel que soit le nombre de modèles possibles. L'algorithmme Bact-to-Batch a également été appliqué à des résultats publiés précédemment avec un modèle murin de lupus [6], en utilisant les données métagénomiques disponibles pour les 28 souris au début de cette étude. Le classement de l'allocation des souris en trois groupes homogènes proposé par notre algorithme était le 6e/90 000 combinaisons<fnref n="1" /> (top 0,007 %). Selon Bact-to-Batch, la répartition des souris en trois lots qui a été sélectionnée par les auteurs, vraisemblablement fondée sur

<footnote n="1">1. Pour des raisons de temps de calcul, nous avons échantillonné 90 000 combinaisons possibles pour cette validation et non l'exhaustivité des combinaisons. Ainsi, pour 90 000 combinaisons, le temps de calcul de l'algorithmme était d'environ une heure.</footnote>
la randomisation, a obtenu un score
de similarité au-dessus du 95e centile,
considéré comme la limite de la catégo-
rie de conception à haut risque de biais.
Ainsi, sans remettre en cause les résul-
tats de cette étude, nous pouvons souli-
gner le fait que, selon notre algorithme,
la répartition des souris en trois groupes
expérimentaux n'était pas optimale pour
ce qui concerne la similarité des micro-
biotes intestinaux.

En conclusion, le microbiote intestinal pouvant avoir une influence globale sur les résultats de certaines expéri- mentations animales (qu'elles soient fondées ou non sur une étude métagé- nomique), nous proposons d'utiliser ce nouvel algorithme « Bact-to-Batch » pour constituer les groupes d'animaux à comparer. Cette stratégie s'appuie sur une image métagénomique du microbiote fécal, qui peut être obtenue selon diverses modalités : en utili- sant un séquenceur d'ADN haut-débit de deuxième génération (comme dans cette étude pilote) ou en utilisant un séquenceur de haut-débit portatif de troisième génération, ce qui facilite la mise en œuvre de cette stratégie tout

en minimisant les délais de restitution
des analyses.

La sécurisation de l'étape d'assigna-
tion des animaux aux différents groupes
expérimentaux, qui permet de dispo-
ser de groupes similaires en termes de
microbiote intestinal, devrait permettre,
en limitant les biais expérimentaux, de
favoriser la reproductibilité expérimen-
tale, tout en minimisant le nombre de
valeurs aberrantes, donc en réduisant le
nombre d'animaux non contributifs à la
démarche expérimentale.

Dans un contexte où l'emploi d'ani-
maux dans les expérimentations doit
être mûrement réfléchi, il convient de
mettre en œuvre des procédures garan-
tissant l'utilité de tous les animaux
contributeurs. Les quelques contraintes
de cette nouvelle stratégie de réparti-
tion des animaux dans les groupes expé-
rimentaux (expertise nécessaire, coût
financier, etc.) s'effacent derrière les
gains de robustesse et de reproductibi-
lité des résultats expérimentaux qu'elle
permet. Cela ne fait aucun doute dès
lors que le design expérimental inclut
des analyses du microbiote dans les
différents groupes constitués, mais cela

semble valoir aussi pour les autres cas,
tant le microbiote intestinal influe sur
l'immunité et bien d'autres fonctions
physiologiques de l'animal. ◊

A novel strategy taking gut microbiota fingerprints into account for robust and reproducible animal experiments

LIENS D'INTÉRÊT

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article.

RÉFÉRENCES

1. Prescott MJ, Lidster K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. *Lab Anim* 2017; 46: 152-6.

2. Kortzfleisch VT von, Karp NA, Palme R, et al. Improving reproducibility in animal research by splitting the study population into several 'mini-experiments'. *Sci Rep* 2020; 10: 16579.

3. Debelius J, Song SJ, Vazquez-Baeza Y, et al. Tiny microbes, enormous impacts: what matters in gut microbiome studies? *Genome Biol* 2016; 17: 217.

4. Org E, Lusis AJ. Using the natural variation of mouse populations to understand host-gut microbiome interactions. *Drug Discov Today Dis Models* 2018; 28: 61-71.

5. Even G, Mouray A, Vandenabeele N, et al. Bact-to-Batch: A microbiota-based tool to determine optimal animal allocation in experimental designs. *Int J Mol Sci* 2023; 24: 7912.

6. Neuman H, Mor H, Bashi T, et al. Helminth-based product and the microbiome of mice with lupus. *mSystems* 2019; 4:e00160-18.

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