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# APPENDIX

## COMPLETE LIST OF CHARACTER STATE CHANGES

Character state changes in italics are ambiguous optimizations that we chose based on biological considerations. Character state changes in bold are unique to the clade (with no homoplasy outside the clade).

### ANALYSIS 1 (TEN TAXA, ALL EXTANT)

*Synodus* autapomorphy: **33 (1 → 0).**

*Gymnoscopelus* autapomorphies: **3 (0 → 2); 10 (0 → 1); 26 (0 → 1); 31 (0 → 1); 49 (0 → 1); 58 (0 → 1).**

*Acanthomorpha:* **14 (0 → 1); 15 (0 → 1); 16 (0 → 1); 22 (0 → 1); 28 (0 → 2); 42 (0 → 1); 46 (0 → 1); 47 (0 → 1); 56 (0 → 1); 57 (0 → 1).**

*Polymixia* + *Myripristis:* **1 (0 → 1); 23 (0 → 1); 27 (1 → 0); 35 (0 → 1); 66 (0 → 1).**

*Polymixia* autapomorphies: **26 (0 → 1); 48 (0 → 1); 59 (0 → 1); 65 (0 → 1).**

*Myripristis* autapomorphies: **28 (2 → 1); 30 (0 → 1); 31 (0 → 1); 37 (0 → 1); 38 (0 → 1); 51 (0 → 1); 60 (0 → 1); 63 (0 → 1); 64 (0 → 1); 67 (0 → 1).**

*Paracanthopterygii + Lampridiformes:* **3 (0 → 2); 7 (0 → 1); 36 (0 → 1); 37 (0 → 1); 38 (0 → 2); 52 (0 → 1); 53 (0 → 1); 54 (0 → 1); 61 (0 → 1).**

*Aphredoderus + Merluccius* (= extant Paracanthopterygii): **8 (0 → 1); 9 (0 → 1); 10 (0 → 1); 11 (0 → 1); 23 (0 → 1); 30 (0 → 1); 31 (0 → 1); 34 (0 → 1); 35 (0 → 1); 48 (0 → 1); 50 (0 → 1); 59 (0 → 1); 60 (0 → 1); 66 (0 → 1).**

*Aphredoderus* autapomorphies: **19 (0 → 1); 65 (0 → 1).**

*Merluccius* autapomorphies: **1 (0 → 2); 24 (0 → 1); 25 (0 → 1); 32 (0 → 1); 38 (2 → 3); 42 (1 → 0); 46 (1 → 0); 47 (1 → 0); 49 (0 → 1); 51 (0 → 1).**

*Lampridiformes:* **2 (0 → 1); 4 (0 → 1); 6 (0 → 1); 12 (0 → 1); 17 (0 → 1); 20 (0 → 1); 25 (0 → 1); 29 (0 → 1); 39 (0 → 1) 40 (0 → 2); 43 (0 → 1); 58 (0 → 1); 63 (0 → 1); 64 (0 → 1).**

*Metavelifer* autapomorphies: **26 (0 → 1); 27 (1 → 0).**

*Lampris + Trachipterus + Regalecus:* **32 (0 → 1); 42 (1 → 0); 46 (1 → 0); 47 (1 → 0); 50 (0 → 1); 51 (0 → 1); 62 (0 → 1).**

*Lampris* autapomorphy: **24 (0 → 1).**

*Trachipterus + Regalecus* (= Taeniosomi): **16 (1 → 0); 32 (1 → 2); 34 (0 → 1); 38 (2 → 3); 41 (0 → 1); 44 (0 → 1); 45 (0 → 1); 58 (1 → 0); 59 (0 → 1); 66 (0 → 2).**

*Trachipterus* autapomorphies: **48 (0 → 1); 53 (1 → 0).**

*Regalecus* autapomorphies: none.

### ANALYSIS 2 (24 TAXA, EXTANT AND FOSSILS)

*Remark:* The topology presented here is a strict consensus of 12 parsimonious trees, resulting in polytomies. We chose to present ‘hard’ polytomies, where character states are assumed to have appeared independently from other branches in the polytomy. One should remember, however, that this topology does not always reflect the most parsimonious interpretation possible.

*Synodus* autapomorphies: none.

*†Ctenothrissa* autapomorphies: **25 (0 → 1); 27 (1 → 0); 63 (0 → 1).**

*Gymnoscopelus + Acanthomorpha* (= Ctenosquamata): **26 (0 → 1); 33 (0 → 1).**

*Gymnoscopelus* autapomorphies: **3 (0 → 2); 10 (0 → 1); 31 (0 → 1); 49 (0 → 1); 58 (0 → 1).**

*Acanthomorpha:* **14 (0 → 1); 16 (0 → 1); 22 (0 → 1); 28 (0 → 1); 42 (0 → 1); 46 (0 → 1); 47 (0 → 1); 56 (0 → 1); 57 (0 → 1).**

*Euacanthomorpha:* **1 (0 → 1); 15 (0 → 1); 23 (0 → 1); 27 (1 → 0); 35 (0 → 1); 66 (0 → 1).**

*Polymixia* autapomorphies: **28 (1 → 2); 48 (0 → 1); 59 (0 → 1); 65 (0 → 1);**

*Myripristis + Paracanthopterygii:* **26 (1 → 0); 30 (0 → 1); 31 (0 → 1); 37 (0 → 1); 60 (0 → 1).**

*Myripristis* autapomorphies: **38 (0 → 1); 51 (0 → 1); 63 (0 → 1); 64 (0 → 1); 65 (1 → 0); 67 (0 → 1).**

*Paracanthopterygii:* **1 (1 → 2); 3 (0 → 1); 8 (0 → 1); 10 (0 → 1); 11 (0 → 1); 28 (1 → 2); 34 (0 → 1); 38 (0 → 2); 48 (0 → 1); 50 (0 → 1); 59 (0 → 1).**

*†Sphenocephalus* autapomorphies: **19 (0 → 1); 25 (0 → 1); 65 (0 → 1).**

*Aphredoderus + Merluccius:* **3 (1 → 2); 7 (0 → 1); 9 (0 → 1); 27 (0 → 1); 36 (0 → 1); 52 (0 → 1); 53 (0 → 1); 54 (0 → 1); 61 (0 → 1).**

*Aphredoderus* autapomorphies: **1 (2 → 0); 19 (0 → 1); 65 (0 → 1).**

*Merluccius* autapomorphies: **24 (0 → 1); 25 (0 → 1); 32 (0 → 1); 38 (2 → 3); 42 (1 → 0); 46 (1 → 0); 47 (1 → 0); 49 (0 → 1); 51 (0 → 1).**

*Clade A* (= Lampridomorpha): **7 (0 → 1); 8 (0 → 1); 25 (0 → 1); 39 (0 → 1); 40 (0 → 1); 43 (0 → 1); 58 (0 → 1); 63 (0 → 1); 64 (0 → 1).**

*Clade B:* **66 (0 → 2).**

*†Paraipichthys* autapomorphies: none.

*†Pycnosteroides + †Pharmacichthys + †‘Aipichthys’ +*  
*†Freigichthys:* **19 (0 → 1).**

*†Pycnosteroides + †Pharmacichthys:* **27 (1 → 0); 35 (0 → 1); 38 (0 → 1); 40 (1 → 2).**

*†Pycnosteroides* autapomorphies: **37 (0 → 1); 39 (1 → 0); 43 (1 → 0); 48 (0 → 1); 59 (0 → 1); 67 (0 → 1).**
†Pharmacichthys: **5 (0 → 1)**; 8 (1 → 0); 49 (0 → 1); 56 (1 → 0).

†Pharmacichthys venenifer autapomorphy: 40 (2 → 1).

†Pharmacichthys numismalis autapomorphy: **14 (1 → 0).**

†Pharmacichthys judensis autapomorphies: none

†‘Aipichthys’ + †Freigichthys: **3 (0 → 1); 13 (0 → 1); 21 (0 → 1).**

†Aipichthys oblongus autapomorphies: none.

†Aipichthys minor autapomorphies: none.

†Aipichthys velifer + †Freigichthys: **15 (0 → 1).**

†Aipichthys velifer autapomorphies: none.

†Freigichthys autapomorphy: **66 (2 → 1).**

Clade C: **17 (0 → 1); 20 (0 → 1).**

†Zoqueichthys autapomorphies: none.

Clade D: **6 (0 → 1); 51 (0 → 1); 54 (0 → 1).**

†Aipichthyoides autapomorphies: **15 (0 → 1); 18 (0 → 1); 50 (0 → 1); 55 (0 → 1); 66 (0 → 1).**

†Aspesaipichthys autapomorphies: **26 (1 → 0); 33 (1 → 0); 52 (0 → 1); 55 (0 → 1).**

Lampridiformes: **2 (0 → 1); 3 (0 → 2); 4 (0 → 1); 8 (1 → 0); 12 (0 → 1); 28 (1 → 2); 29 (0 → 1); 36 (0 → 1); 37 (0 → 1); 38 (0 → 2); 40 (1 → 2); 52 (0 → 1); 53 (0 → 1); 61 (0 → 1).**

Metavelifer autapomorphies: **27 (1 → 0); 51 (1 → 0).**

Lampris + Trachipterus + Regalecus: **26 (1 → 0); 32 (0 → 1); 42 (1 → 0); 46 (1 → 0); 47 (1 → 0); 50 (0 → 1); 62 (0 → 1).**

Lampris autapomorphy: **24 (0 → 1).**

Trachipterus + Regalecus (= Taeniosomi): **16 (1 → 0); 32 (1 → 2); 34 (0 → 1); 38 (2 → 3); 41 (0 → 1); 44 (0 → 1); 45 (0 → 1); 58 (1 → 0); 59 (0 → 1); 66 (0 → 2).**

Trachipterus autapomorphies: **48 (0 → 1); 53 (1 → 0).**

Regalecus autapomorphies: none.
3.3 : Second jeu de données – base de l'arbre des acanthomorphes

Donald Davesne, Cyril Gallut, Véronique Barriel, Guillaume Lecointre, Philippe Janvier &
Olga Otero

"Reconciling molecular and morphological hypotheses of spiny-rayed teleost
(Acanthomorpha) phylogeny: the impact of taxon sampling"

Manuscrit soumis à *Cladistics*
<figure><img src="image_29.png" /></figure>
## INTRODUCTION

In the quickly evolving field of phylogenetics, studies are based on a growing number of characters and taxa, yet these multiple analyses may still yield significantly different results, hindering the development of a consensual phylogenetic framework. This kind of contradiction is especially common when comparing molecular and morphological results (Patterson, 1987; Patterson *et al.*, 1993). Therefore, seeking a consensus between morphology and molecules should be one of the main objectives of phylogeneticists. This could be achieved by reviewing the coding of morphological characters or looking for new ones, re-evaluating the appropriateness of molecular data and expanding the taxonomic sampling, notably through the inclusion of fossil taxa.

The phylogeny of spiny-rayed teleosts (Acanthomorpha) is a good example of these problems. The interrelationships of this enormous (more than 15.000 species) and morphologically diverse group of vertebrates have been long considered as extremely difficult to resolve, hence its nickname: "bush at the top" (Rosen, 1982; Nelson, 1989). Comparing early cladistic results based on morphology and more recent analyses of molecular data quickly shows major incongruences (see below).

In the late sixties and seventies, pioneer studies of morphological characters began to organize acanthomorph classification with a phylogenetic goal. This was the case of Greenwood *et al*. (1966), Rosen & Patterson (1969), and Rosen (1973) who proposed the clade Acanthomorpha for the first time. Along with subsequent works by Stiassny (1986) and Patterson & Rosen (1989), these successive studies contributed greatly to our present knowledge of acanthomorph evolution, notably by proposing morphological synapomorphies for the major acanthomorph clades.

Computed phylogenetic analyses of acanthomorphs based on a taxon-by-character matrix began to be available in the nineties, with studies by Stiassny & Moore (1992) and Johnson & Patterson (1993) who proposed a comprehensive hypothesis for deep acanthomorph interrelationships including all orders identified at the time (Fig. 3.3.1A).

The results of the latter study have been widely followed subsequently. As an example, the classification adopted in the latest edition of the textbook *Fishes of the World* (Nelson, 2006) still closely follows Johnson & Patterson's one, despite the variety of molecular studies that were already available at the time of its release. This might be due to:

- the combination of the wide range of taxa included and the number of anatomical evidence used by Johnson and Patterson
- the absence of any entirely new study – the only other one was proposed by Wiley *et al.* (2000) but with a morphological dataset closely based on Johnson & Patterson's ; their tree topology based solely on anatomy (Wiley *et al.*, 2000; fig. 8a – and not 8c as stated in the article) does not contradict the original study due to a lack of resolution

- the establishment of a consensual molecular hypothesis that was still at work at the time of the publication.

Subsequent morphological phylogenies were mostly either based on a smaller subset of acanthomorphs, for example Gadiformes (Endo, 2002; Grand *et al.*, 2014), Percopsiformes and other Paracanthopterygii (Murray & Wilson, 1999) and Zeiformes (Tyler *et al.*, 2003; Tyler & Santini, 2005), or were centred on early fossil taxa (Otero *et al.*, 1995; Otero & Gayet, 1996; Alvarado-Ortega & Than-Marchese, 2012; Davesne *et al.*, 2014). Among the few exceptions Springer and Orrell (2004) explored acanthomorph relationships through the gill muscles characters only. Thus, so far no morphological phylogenetic analysis was able to question Johnson & Patterson's topology (Figure 1A).

Ultimately, it is the growing consensus on new relationships proposed by molecular studies (see Fig. 3.3.1B and below) that fundamentally contradicts some main features of Johnson & Patterson's results.

*Recent advances in acanthomorph phylogeny*

[Fig. 3.3.1 about here]

The rapid development of molecular phylogenetic studies since the beginning of the 21st century had a significant impact on acanthomorph phylogeny. Thanks to the accessibility and universality of sequence data, researchers were able to analyse together large datasets including a wider coverage of taxa. The repetition of results from one independent study to another, using different sets of markers, allowed some consensual new relationships to emerge (Fig. 3.3.1B). However, some questions are still unanswered because the different molecular datasets keep contradicting themselves on many key points.

1. *Acanthomorph monophyly*

The taxa nowadays grouped under the name Acanthomorpha were initially treated as three distinct ensembles (Greenwood *et al.*, 1966): Paracanthopterygii (see below), Atherinomorpha (including killifishes, flying fishes, needlefishes, silversides...) and Acanthopterygii (centred on 'perciforms'). The three were later united in Acanthomorpha, on the basis of the presence of true spines in dorsal, anal and sometimes pelvic fins (Rosen, 1973). Subsequent studies
corroborated acanthomorph monophyly by adding morphological synapomorphies for the
group (Rosen, 1985; Stiassny, 1986; Stiassny & Moore, 1992; Johnson & Patterson, 1993).
Molecular data, however, are much more ambiguous regarding acanthomorph monophyly.
While acanthomorph monophyly has been supported by studies based on combined nuclear
and mitochondrial markers (Wiley *et al.*, 2000; Dettaï & Lecointre, 2005; Grande *et al.*,
2013), mitochondrial genomes (Broughton, 2010), and large datasets of multiple nuclear
markers (Near *et al.*, 2012a, 2013; Betancur-R. *et al.*, 2013; Faircloth *et al.*, 2013), it has also
been questioned by studies based on mitochondrial (Colgan *et al.*, 2000; Miya *et al.*, 2001,
2003, 2005, 2007; Poulsen *et al.*, 2013) and combined datasets (Chen *et al.*, 2003, 2014). In
this second case, at least Lampridiformes (opahs, oarfishes and allies; Fig. 3.3.2C) form a
clade with Myctophiformes, the lanternfishes (Fig. 3.3.2B), considered as the extant sister
group to acanthomorphs on the basis of morphology (Rosen, 1973; Stiassny, 1986, 1996;
Johnson, 1992).

This uncertainty about acanthomorph monophyly is probably linked to the uncertainty
about the position of Lampridiformes: they have have been assigned to almost every possible
position within the acanthomorph tree in the successive molecular studies, often in association
with low support values (Davesne *et al.*, 2014).

2. *Unresolved position for Polymixiiformes and Percopsiformes*

Despite the growing number of published studies including an increasing number of markers,
a consensual position is far from being achieved for many key points.

The uncertainty about the position of Lampridiformes has already been mentioned
above, and discussed in details by Davesne *et al.* (2014). However, other acanthomorph
groups also have a very unstable position according to the various studies.

Polymixiiformes (represented today only by the genus *Polymixia*, the beardfish; Fig. 3.3.2D) has been classified in Beryciformes (Greenwood *et al.*, 1966) and possibly Paracanthopterygii (Rosen & Patterson, 1969). However, the latest anatomical studies supported Polymixiiformes as an isolated lineage (Fig. 3.3.1A), sister to all other acanthomorphs except Lampridiformes (Stiassny & Moore, 1992; Johnson & Patterson, 1993). On the other hand, Percopsiformes has been consistently supported as part of Paracanthopterygii (Fig. 3.3.1A) by anatomists (Patterson & Rosen, 1989; Murray & Wilson, 1999).

Mitochondrial data support Percopsiformes and *Polymixia* as closely related to
Gadiformes-Zeiformes, either as sequential sister-groups (Miya *et al.*, 2003; Broughton,
2010), or forming a clade together (Miya *et al.*, 2005, 2007; Dillman *et al.*, 2011). Studies based on either nuclear markers, or a combination of nuclear and mitochondrial markers, have suggested different positions: either sequential sister-groups to Gadiformes-Zeiformes (Dettaï & Lecointre, 2005; Grande *et al.*, 2013; Chen *et al.*, 2014) or to Lampridiformes (Li *et al.*, 2009), sister to Euacanthopterygii for *Polymixia* and to Gadiformes-Zeiformes for Percopsiformes (Betancur-R. *et al.*, 2013), or forming a clade together which itself is sister to all other acanthomorphs (Near *et al.*, 2013). The phylogenetic position of these two taxa is thus far from being settled on the basis of current data (Fig. 3.3.1B).

### 3. Polyphyly of *Paracanthopterygii*

According to its first delimitation (Greenwood *et al.*, 1966), Paracanthopterygii was a series of teleosts sister to Acanthopterygii, and including Percopsiformes (trout-perches and allies; Fig. 3.3.2E, F), Batrachoidiformes (toadfishes; Fig. 3.3.2L), Gobiesociformes (clingfishes), Lophiiformes (anglerfishes), Gadiformes (cods, hakes and allies; Fig. 3.3.2H), Ophidiiformes (cusk-eels and allies; Fig. 3.3.2J) and Zoarcoidei (eelpouts).

Rosen & Patterson (1969) proposed a list of characters supporting Paracanthopterygii, that they reviewed and completed later (Patterson & Rosen, 1989). In their definition, Paracanthopterygii includes only Percopsiformes, Batrachoidiformes, Lophiiformes, Gadiformes and Ophidiiformes (Fig. 3.3.1A).

This assemblage has been controversial since its inception, and most of its constitutive taxa have been excluded from it at one point or another on the basis of their anatomy (Gosline, 1968; Fraser, 1972; Gill, 1996; Chanet *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013). Moreover, molecular data have consistently shown a polyphyly of *Paracanthopterygii sensu* Patterson & Rosen (see below for details).

### 4. *Gadiformes-Zeiformes clade*

Gadiformes have always been part of Paracanthopterygii since the first definition of the group (Greenwood *et al.*, 1966; Rosen & Patterson, 1969; Patterson & Rosen, 1989; Murray & Wilson, 1999).

Zeiformes (dories; Fig. 3.3.2I) were considered close relatives of Tetraodontiformes (triggerfishes, pufferfishes and allies) and Caproidae (boarfishes) in the first phylogenetic study of their position amongst acanthomorphs (Rosen, 1984). Later on, studies including a larger sampling of acanthomorph representatives suggested that Zeiformes lies within Acanthopterygii, but outside of *Percomorpha* (Stiassny & Moore, 1992; Johnson & Patterson,
1993). Subsequent studies (Tyler *et al.*, 2003; Tyler & Santini, 2005) provided arguments for the monophyly and intrarelationships of Zeiformes, while once again proposing a clade uniting them with Tetraodontiformes and Caproidae.

Since their earliest attempts at resolving acanthomorph phylogeny, studies based on molecular datasets have suggested a very different position for both orders (Fig. 3.3.1B) by supporting a Gadiformes-Zeiformes clade (Wiley *et al.*, 2000; Miya *et al.*, 2001, 2003; Chen *et al.*, 2003; Dettaï & Lecointre, 2004, 2005). The subsequent molecular studies have consistently reaffirmed support for this clade (Li *et al.*, 2009; Near *et al.*, 2012a, 2013; Betancur-R. *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013; Chen *et al.*, 2014).

Despite some early claims (Wiley *et al.*, 2000), this grouping (or, at least, an inclusion of Zeiformes within Paracanthopterygii) had been already envisioned by some morphologists before (Gaudant, 1979; Gayet, 1980b; c; Gill, 1996). Indeed, this hypothesis is seemingly supported by numerous morphological characters (Borden *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013), but it has never been formally tested by a comprehensive character analysis.

### 5. Stylephorus *outside Lampridiformes*

*Stylephorus chordatus* (the tube-eye; Fig. 3.3.2G) is a distinctive mesopelagic acanthomorph with an elongate body, a reduced caudal fin, and extremely modified jaws forming a protrusible tube-like apparatus. Several interpretations have prevailed regarding the position of *Stylephorus* – including possible affinities with 'amphibians' rather than with teleosts according to its original describer in 1791 (Pietsch, 1978) –, but once the discovery of more specimens allowed for further investigations on its morphology, it was united with Lampridiformes (Regan, 1908, 1924; Starks, 1908). *Stylephorus* was classified within the lampridiform suborder Taeniosomi (Fig. 3.3.1A), alongside with *Radiicephalus*, Lophotidae, Trachipteridae and Regalecidae in subsequent works (Oelschläger, 1983; Olney, 1984; Olney *et al.*, 1993).

The first molecular (mitogenomic) phylogenetic analysis to include the species (Miya *et al.*, 2007) proposed a different position for *Stylephorus*, within the Gadiformes-Zeiformes clade (Fig. 3.3.1B). This result has been corroborated subsequently in every other analysis of mitochondrial and nuclear markers (Near *et al.*, 2012a, 2013; Betancur-R. *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013). The new arrangement, implying the creation of a monotypic Stylephoriformes, has been supported by some morphologists (Grande *et al.*, 2013) and opposed by others (Roberts, 2012), but not based on a character analysis.
## 6. *The status of Beryciformes*

Beryciformes has been variably interpreted over time. Initially, it was viewed as a paraphyletic assemblage of anatomically plesiomorphic acanthopterygians, from which arose what we now call percomorphs (Patterson, 1964; Greenwood et al., 1966). Later studies (Johnson & Patterson, 1993; Patterson, 1993a) have supported a definition of Beryciformes as a clade including Berycidae (alfonsinos), Trachichthyidae (roughies; Fig. 3.3.2K), Holocentridae (soldierfishes and squirrelfishes; Fig. 3.3.2M) and other related families. Stephanoberyciformes (deep sea taxa such as ridgeheads, whalefishes and pricklefishes) were either an independent order (Johnson & Patterson, 1993), or included in Beryciformes (Moore, 1993). In these studies Beryciformes were seen as the sister-group to percomorphs within Euacanthopterygii (Fig. 3.3.1A). At least one anatomical study, using characters from the pelvic girdle, challenged the monophyly of Beryciformes by showing holocentrids as closer to percomorphs than to other beryciforms (Stiassny & Moore, 1992).

Molecular studies have supported different statuses for Beryciformes (Fig. 3.3.1B). They have been resolved as either monophyletic with Stephanoberyciformes excluded (Wiley et al., 2000), as a monophyletic assemblage including Stephanoberyciformes (Miya et al., 2001, 2005; Near et al., 2012a, 2013; Grande et al., 2013) or as paraphyletic (Li et al., 2009; Betancur-R. et al., 2013; Chen et al., 2014).

## 7. *Ophidiiformes and Batrachoidiformes in Percomorpha*

The inclusion of Ophidiiformes and Batrachoidiformes in Paracanthopterygii is consistently rejected by molecular studies (Wiley et al., 2000; Miya et al., 2003, 2005; Li et al., 2009; Near et al., 2012a, 2013; Betancur-R. et al., 2013; Chen et al., 2014). In most cases, they are included in Percomorpha, as successive sister-groups to all other percomorphs (Fig. 3.3.1B). In molecular studies, Lophiiformes has been consistently grouped with Tetraodontiformes instead of Batrachoidiformes (Miya et al., 2003; Dettaï & Lecointre, 2005; Yamanoue et al., 2007; Holcroft & Wiley, 2008; Betancur-R. et al., 2013; Near et al., 2013), and at least some anatomical data also support this hypothesis (Chanet et al., 2012, 2013).

### Aims of the study

The discussion above shows that molecular data have proposed a consensual framework for acanthomorph relationships that, although still partly unresolved, challenges some earlier conceptions based on morphology alone. However, all studies based on morphology alone have proposed a different framework which lacks a crucial feature: corroboration by
independent sources of data. As previously explained, the only phylogenetic analysis based on a comprehensive morphological dataset published so far is that by Johnson & Patterson (1993). Subsequent studies are only based on a reduced subset of taxa and/or characters.

In this context, it is time for a reappraisal of morphological data for large-scale acanthomorph phylogeny.

Our main objectives are as follows:

- provide an independent test of the renewed molecular framework, using a different set of data;

- add up morphological synapomorphies for the relevant clades, with insights into early acanthomorph morphological evolution;

- include relevant fossil taxa in the analysis.

We chose not to optimize our characters on an existing molecular topology, as done in previous studies (Borden *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013), because of the irresolution of the molecular "consensus" for key clades (Fig. 3.3.1B). Moreover, this irresolution forbids the usage of a "molecular scaffold" approach (Hermsen & Hendricks, 2008) for the placement of fossil taxa.

Including fossil taxa in a phylogenetic analysis provides several advantages. It sometimes allows detecting instances of homoplasies that mislead phylogenetic reconstruction and it increases our comprehension of the sequence and timing of character acquisition. Moreover, a phylogenetic analysis including fossils provides explicit support for their phylogenetic position, and should be a prerequisite for every analysis of divergence times using fossils as calibration points (Parham *et al.*, 2012; Sauquet, 2013).

Our study will then consist in a comprehensive phylogenetic analysis of the main acanthomorph clades, the first one since 1993 to be based solely on morphological characters, and the first to include fossils.

We have designed our sampling to include every major acanthomorph taxon supported by the most recent molecular phylogenetic frameworks (Figure 1B).

# MATERIAL AND METHODS

## Taxonomic sampling

[Figs. 3.3.2 and 3.3.3 about here]

Our data matrix includes 26 taxa, of which 19 are extant.

*Synodus* and *Gymnoscopelus* represent Aulopiformes (lizardfishes; Fig. 3.3.2A) and Myctophiformes (lanternfishes; Fig. 3.3.2B), respectively. Together they form the two closest
extant sister-groups to acanthomorphs, according to morphological (Rosen, 1985; Stiassny, 1986, 1996; Johnson & Patterson, 1993) and most molecular evidence (Broughton, 2010; Near et al., 2012a, 2013; Betancur-R. et al., 2013; Grande et al., 2013).

Within acanthomorphs, we included representatives from all major taxa, according to the more recent phylogenetic frameworks (Fig. 3.3.1B). *Velifer*, *Lampris* and *Regalecus* represent Lampridiformes; and *Stylephorus* has been added to test its position among other acanthomorphs.

*Polymixia* represents Polymixiiformes. *Aphredoderus* and *Percopsis* (for Percopsiformes), *Merluccius* and *Bregmaceros* (for Gadiformes), *Halobatrachus* (for Batrachoidiformes) and *Brotula* (for Ophidiiformes) allow testing the monophyly of the Paracanthopterygii, as defined by Patterson & Rosen (1989). We did not include Lophiiformes, because molecular data and some anatomical evidence suggest a deeply nested position within *Percomorpha*, which would have necessitated a wide sampling of percomorphs for being efficiently tested; a task well beyond the scope of this study. *Zeus* and *Cyttus* are added to test the Gadiformes+Zeiformes proposed relationship. *Hoplostethus* and *Sargocentron* represent *Beryciformes sensu lato*, while *Dicentrarchus* and *Lates* represent 'generalized' percomorphs.

The seven fossil taxa (Fig. 3.3.3) have been chosen for their potential phylogenetic positions (as suggested by previous studies) that span the entire tree.

†*Ctenothrissa* (Fig. 3.3.3A), a potential acanthomorph outgroup, was described as either a stem-acanthomorph (Patterson, 1964) or a stem-ctenosquamate (Gaudant, 1978c, 1979). The affinities of †*Pycnosteroides* (Fig. 3.3.3C) have been interpreted differently depending on the authors due to its singular character state combination. According to previous phylogenetic analyses, †*Pycnosteroides* is a member of Lampridomorpha (Davesne *et al.*, 2014; Delbarre *et al.*, in press), as well as †'Aipichthys' (Fig. 3.3.3B) and †*Aipichthyoides*. In the present study, the character coding of †'Aipichthys' was based on the species †'A.' *minor* and †'A.' *velifer*, which are phylogenetically distinct from †*A. pretiosus*, the type species of the genus (Delbarre *et al.*, in press).

†*Sphenocephalus* (Fig. 3.3.3D) has been described as a paracanthopterygian, closely related to at least Percopsiformes and Gadiformes (Rosen & Patterson, 1969; Patterson & Rosen, 1989; Murray & Wilson, 1999; Grande *et al.*, 2013; Davesne *et al.*, 2014).

†*Omosomopsis* (Fig. 3.3.3E) has been interpreted as a polymixiiform (Patterson, 1993a; Taverne, 2011), but some of its characters suggest a close relationship to paracanthopterygians (Otero & Gayet, 1996).
†*Stichocentrus* (Fig. 3.3.3F) is a probable beryciform, that has been related to modern holocentrids (Gayet, 1980a, 1982). It has been chosen amongst numerous other closely related coeval taxa because it has been well-described morphologically (Patterson, 1967; Gayet, 1980a) and proposed as a fossil calibration point for divergence time analyses of acanthomorph phylogeny (Benton *et al.*, 2015).

All the fossils in our sampling come from Late Cretaceous deposits, more specifically from the Cenomanian (with the exception of †*Sphenocephalus*, found exclusively in Campanian deposits). This means that they are coeval with the oldest known acanthomorph body fossils (Patterson, 1993a).

Our coding of morphological characters was based either on dissections and dry osteological preparations, or fluid-preserved specimens curated in public collections (Table 3.3.1). When preserved in fluid, the specimens were X-ray tomographed (GE Phoenix v-tome-x L240, microfocus 240kV at the AST-RX platform, Muséum national d'Histoire naturelle) and the skeleton was virtually reconstructed in 3D by means of the *Mimics* software (version 17.0 64-bit). The list of specimens used in the study is provided in Table 3.3.1. We coded the remaining taxa with data from the literature (e.g. Świdnicki, 1991; Otero, 2004).

[Table 3.3.1 about here]

### Phylogenetic analyses

The character matrix was analyzed using PAUP* 4.0 (Swofford, 2001). All characters are unordered.

We performed three phylogenetic analyses. The first one (Fig. 3.3.4) includes all the 26 taxa of our sampling, the second one includes the 19 extant taxa only (Fig. 3.3.5A), and the third one includes the seven fossil taxa only (Fig. 3.3.5B). The second and third analyses are meant to estimate the impact of fossil taxa on the results. Trees were rooted with the outgroup taxon *Synodus* in the first and second analyses, and with †*Ctenothrissa* in the third one. The heuristic search algorithm, with a random stepwise addition sequence (20 replicates), and the "TBR" branch-swapping algorithm was used in all analyses. Character polarity was determined by the outgroup criterion.

Bremer indices were estimated using a PAUP script generated via TreeRot 2 (Sorenson, 1999). We ran a bootstrap analysis with a "heuristic" search option and 1000 replicates, retaining all clades found with a frequency ≥50%.
## RESULTS

### Morphological characters used in the study

The characters that we used were mainly taken from published phylogenetic studies, sometimes recoded, and newly coded if the original study did not use a character matrix.

This list is almost exclusively based on osteological characters (Figs. 3.3.6-9), allowing the matrix to be as complete as possible, even with fossil taxa missing soft tissues.

For four character couples (2-3, 30-31, 34-35 and 63-64), we chose to follow the strategy "C" of Pleijel (2005) that takes into account the hierarchy between the presence of a structure and its shape, while avoiding to duplicate the "absent" character state.

### Jaws and circumorbital series

1. Ascending process of the premaxilla (Fig. 3.3.7A): 0 – shorter than the alveolar process; 1 – equal to or longer than the alveolar process (coded from Olney *et al.* 1993)

2. Postmaxillary process of the premaxilla (Fig. 3.3.7A): 0 – absent; 1 – present (coded from Patterson & Rosen 1989)

3. Postmaxillary process of the premaxilla (Fig. 3.3.7A): 0 – straight posteriorly; 1 – notched posteriorly (coded from Patterson & Rosen 1989)

4. Supramaxillae: 0 – two supramaxillae; 1 – posterior supramaxilla only; 2 – no supramaxillae (from Otero & Gayet, 1996)

5. Supraorbital: 0 – present; 1 – absent (coded from Gaudant, 1979)

6. Antorbital: 0 – present; 1 – absent (from Otero & Gayet, 1996)

### Braincase and skull roof

7. Lateral ethmoid (Fig. 3.3.6C): 0 – not in contact with the vomer; 1 – in direct contact with the vomer (coded from Stiassny, 1986)

8. Mesethmoid (Fig. 3.3.6C): 0 – anterior to the lateral ethmoid; 1 – median or posterior to the lateral ethmoid (coded from Olney *et al.*, 1993)

9. Orbitosphenoid: 0 – present; 1 – absent (from Johnson & Patterson, 1993)

10. Basisphenoid: 0 – present; 1 – absent (from Otero & Gayet, 1996)

11. Intercalar: 0 – small and not containing the foramen for nerve IX; 1 – large and containing the foramen for nerve IX (coded from Patterson & Rosen, 1989)

12. Epioccipital (= epiotic): 0 – not firmly bound to the dorsal limb of the posttemporal; 1 – firmly bound to the dorsal limb of the posttemporal; 2 – epioccipital and posttemporal fused (recoded from Johnson & Patterson, 1993)
13. Frontal: 0 – not forming part of the sagittal crest; 1 – forming part of the sagittal crest (recoded from Otero & Gayet, 1996)

14. Frontal vault or cradle: 0 – absent; 1 – present (coded from Olney *et al.*, 1993)

15. Spina occipitalis: 0 – absent; 1 – present (from Johnson & Patterson, 1993)

Remarks: the spina occipitalis is a ventral expansion of the supraoccipital that separates the exoccipitals and reaches the foramen magnum. When it is absent, the exoccipitals are joined together and exclusively form the dorsal roof of the foramen magnum.

*Suspensorium and hyoid arch*

16. Cranio-hyomandibular articulation (Fig. 3.3.9A): 0 – two-headed; 1 – single-headed (coded from Grande *et al.*, 2013)

17. Metapterygoid: 0 – in contact (or close approximation) with the quadrate; 1 – small and not in contact with the quadrate (recoded from Tyler *et al.*, 2003)

18. Anterior palatine process: 0 – present, palatine articulates with the maxilla; 1 – absent, no palate-maxillary connexion (coded from Olney *et al.*, 1993)

19. Palatine teeth: 0 – present; 1 – absent (from Tyler *et al.*, 2003)

20. Posterior and anterior ceratohyals: 0 – separated with cartilage; 1 – sutured (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

Remark: the posterior ceratohyal is sometimes called 'epihyal', in reference to the epibranchial bones of the branchial arches. However, this structure is probably not homologous with epibranchials (Nelson, 1969a), which led us to prefer the usage of 'posterior ceratohyal'.

21. Articulation between the anterior ceratohyal and the ventral hypohyal (Fig. 3.3.8): 0 – straight; 1 – condylar (new character)

22. Anterior branchiostegals: 0 – subequal in length to the posterior ones; 1 – smaller than the posterior ones (recoded from Otero & Gayet, 1996)

*Vertebral skeleton*

23. Median fusion of neural spines: 0 – at least one paired neural spine; 1 – all neural spines fused medially, unpaired (coded from Gaudant, 1979)

24. Proximal insertion of Baudelot's ligament: 0 – on abdominal vertebrae; 1 – on basioccipital; 2 – on exoccipitals; 3 – split between the first abdominal vertebra and the exoccipitals (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

25. Insertion of epineurals: 0 – all on neural arches or spines; 1 – at least partly below neural arches; 2 – at least partly on ribs (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

26. Epipleurals: 0 – present; 1 – absent (from Johnson & Patterson, 1993)
27. First vertebral centrum: 0 – no facets; 1 – facets articulating with exoccipital condyles (from Johnson & Patterson, 1993)

28. First neural spine (Fig. 3.3.7B): 0 – separated from the neurocranium; 1 – closely associated or sutured with the neurocranium (coded from Patterson & Rosen, 1989)

29. Second vertebral centrum (Fig. 3.3.7B): 0 – subequal in length to the others; 1 – abbreviated in length (coded from Patterson & Rosen, 1989)

*Dorsal and anal fins*

30. Number of supraneurals: 0 – three or more; 1 – two; 2 – one; 3 – none (coded from Patterson & Rosen, 1989; Olney *et al.*, 1993)

31. Position of supraneurals: 0 – at least one posterior to the first neural spine; 1 – all anterior to the first neural spine (from Davesne *et al.*, 2014)

32. Insertion of the first dorsal pterygiophore (Fig. 3.3.6A-B): 0 – posterior to the neural spine 4; 1 – between the neural spines 2 and 4; 2 – between the neural spines 1 and 2; 3 – anterior to the first neural spine (recoded from Johnson & Patterson, 1993; Olney *et al.*, 1993)

33. Distal end of the first dorsal pterygiophore: 0 – oriented posteriorly; 1 – oriented anteriorly (coded from Olney *et al.*, 1993)

34. Dorsal fin spines (Fig. 3.3.6A-B): 0 – absent; 1 – present (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

Remark: a "spine" is here defined as a fin ray which is unpaired (with contralateral halves fused together) and unsegmented distally, in opposition to the so-called "soft" spines, or lepidotrichia.

35. "Chain-link" articulation of dorsal fin spines: 0 – absent; 1 – present; 2 – no distal radials (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

36. Spinous first dorsal fin (Figs. 3.3.2I, L-N; 3.3.6B): 0 – continuous dorsal fin; 1 – dorsal fin subdivised – or deeply notched – with an anterior part entirely spinous; 2 – dorsal fin subdivided with an anterior part composed of soft rays (new character)

37. Elongated and unbranched first soft ray of the dorsal fin: 0 – absent; 1 – present (from Davesne *et al.*, 2014)

38. Adipose fin (Fig. 3.3.2A-B, F): 0 – present; 1 – absent (new character)

39. Anal fin spines (Fig. 3.3.6A-B): 0 – absent; 1 – present (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

40. Soft rays of the unpaired fins: 0 – at least some branched distally; 1 – all unbranched (recoded from Tyler *et al.*, 2003)
*Caudal fin and skeleton*

41. Second ural vertebral centrum: 0 – autogenous; 1 – fused to the upper hypurals but autogenous to the first ural centrum; 2 – fused to the upper hypurals and the first ural centrum+first preural centrum (recoded from Johnson & Patterson, 1993; Grande *et al.*, 2013)

42. Neural spine of the second preural vertebra: 0 – short and leaf-shaped; 1 – long and spine-like (coded from Patterson & Rosen, 1989)

43. First uroneural: 0 – autogenous; 1 – fused to the terminal centrum (coded from Grande *et al.*, 2013)

44. Number of epurals: 0 – three; 1 – two; 2 – one; 3 – none (coded from Patterson & Rosen, 1989)

45. 'Y' bone: 0 – absent; 1 – present (coded from Patterson & Rosen, 1989)

46. Parhypural: 0 – articulated or fused to the first preural centrum; 1 – truncated proximally by the loss of the haemal arch and separated from the first preural centrum (from Johnson & Patterson, 1993)

47. Number of discrete hypurals: 0 – six; 1 – less than six (from Johnson & Patterson, 1993)

48. Overlap of the caudal skeleton by the caudal fin rays: 0 – little to no overlap; 1 – extensive overlap or hypurostegy (from Davesne *et al.*, 2014)

49. Number of principal caudal fin rays: 0 – 19 or more; 1 – 18; 2 – 17 or less (from Johnson & Patterson, 1993)

*Appendicular skeleton and paired fins*

50. Scapular foramen: 0 – in scapula; 1 – between scapula and coracoid (coded from Patterson & Rosen, 1989)

51. Postcleithra: 0 – two or more separated bones; 1 – only one bone (from Otero & Gayet, 1996)

52. Insertion of the pectoral fin: 0 – vertical or oblique; 1 – horizontal (new character)

53. Number of autogenous pectoral radials: 0 – four; 1 – three (coded from Olney *et al.*, 1993)

54. Pectoral fin soft rays: 0 – at least some branched distally; 1 – all unbranched (recoded from Tyler *et al.*, 2003)

55. Anterior tip of the pelvic girdle (Fig. 3.3.6A-B): 0 – posterior to the distal postcleithrum; 1 – anterior to the distal postcleithrum (new character)
56. Contact between pectoral and pelvic girdles (Fig. 3.3.6A-B): 0 – no contact, with pelvic girdle posterior to the pectoral girdle; 1 – contact at the level of the cleithrum; 2 – contact at the level of the coracoid; 3 – pelvic girdle anterior to the pectoral girdle (recoded from Stiassny & Moore, 1992)

57. Antero-median pelvic process: 0 – absent; 1 – present (recoded from Stiassny & Moore, 1992)

58. External dorsal pelvic wing: 0 – shorter than the external ventral wing; 1 – equal in size to the external ventral wing (recoded from Stiassny & Moore, 1992)

59. Internal wings of the pelvic bone: 0 – separated; 1 – joined medially (from Davesne *et al.*, 2014)

60. Median processes of the pelvic bones: 0 – non-overlapping; 1 – overlapping medially (recoded from Stiassny & Moore, 1992)

61. Autogenous pelvic radials: 0 – present; 1 – absent (from Stiassny & Moore, 1992)

62. Number of soft rays of the pelvic fin: 0 – six or more; 1 – five or less (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

63. Pelvic fin spine (Fig. 3.3.9B): 0 – absent; 1 – present (from Stiassny & Moore, 1992)

64. Pelvic fin spine (Fig. 3.3.9B): 0 – symmetrical at the base; 1 – asymmetrical at the base (recoded from Johnson & Patterson, 1993)

[Table 3.3.2 about here]

The resulting data matrix (26 taxa, 64 characters) is available in Table 3.3.2. There is 7.8% of missing data, noted as "?" in the matrix. Most of them are due to incomplete preservation of fossil taxa. 3.8% of the character states were treated as inapplicable. They are noted as "-" in the matrix and are mainly a consequence of the coding strategy used for characters 2-3, 30-31, 34-35 and 63-64. Character 23 is the only one to be uninformative.

## Phylogenetic results

[Figs. 3.3.4 and 3.3.5 about here]

The analysis of the complete dataset (first analysis) yielded one parsimonious tree, with a length of 193 steps, a consistency index (CI) of 0.42 and a retention index (RI) of 0.69 (Fig. 3.3.4).

It shows †*Ctenothrissa* as a sister to Acanthomorpha, which include three main clades:
- a lampridomorph clade (Lampridomorpha *sensu* Davesne *et al.*, 2014) including
  †'Aipichthys', †Aipichthyoides, *Velifer*, *Lampris* and *Regalecus*, but not
  †*Pycnosteroides*;

- a clade corresponding to the Euacanthopterygii of Johnson & Patterson (1993) that includes beryciforms in paraphyly with a clade Percomorpha (*sensu* Betancur-R. *et al.*, 2014) that itself includes *Dicentrarchus* and *Lates* as sequential sister-groups to Batrachoidiformes (*Halobatrachus*) and Ophidiiformes (*Brotula*);

- a clade that includes †*Pycnosteroides*, *Polymixia*, †*Omosomopsis*, †*Sphenocephalus* and Percopsiformes as sequential sister-groups to a clade bringing together Gadiformes, Zeiformes and *Stylephorus*. We propose to name the Gadiformes + Zeiformes + Percopsiformes clade "Paracanthomorpha", as in Betancur-R. *et al.* (2014).

Euacanthopterygii and *Paracanthomorpha* (*sensu lato*, including *Polymixia* and three fossils) form a clade *Euacanthomorpha*, to the exclusion of *Lampridomorpha*.

The bootstrap values, Bremer indices and the number of synapomorphies are overall consistent; that is, when a node is supported by a higher number of unambiguous synapomorphies its associated support values are higher (Fig. 3.3.4).

The second analysis (reduced dataset, extant taxa only) yielded eight parsimonious trees with a length of 164 steps, a CI of 0.49 and a RI of 0.68 (Fig. 3.3.5A). It shows a largely incongruent topology: Percopsiformes and *Polymixia* are sequential sister-groups to other acanthomorphs, including the Euacanthopterygii of analysis 1 in paraphyly with Zeiformes, Gadiformes and "traditional" Lampridiformes (including *Stylephorus*, sister to the others). Two of the three main acanthomorph clades of analysis 1 are then not recovered by this analysis. The only one to be maintained is *Lampridomorpha* (reduced to extant Lampridiformes), but with different intrarelationships.

The third analysis (reduced dataset, fossil taxa only) yielded one parsimonious tree with a length of 40 steps, a CI of 0.78 and a RI of 0.61 (Fig. 3.3.5B). The topology is compatible with that of the first analysis, with †*Pycnosteroides*, †*Omosomopsis* and †*Sphenocephalus* grouped together and forming a clade with †*Stichocentrus*. The relationships between this clade, †'Aipichthys'+†Aipichthyoides and †*Ctenothrissa* are not resolved.
DISCUSSION

*Acanthomorph monophyly*

[Fig. 3.3.6 about here]

We recovered a clade Acanthomorpha in two of the three analyses (Figs 4, 5A). With the complete dataset, Acanthomorpha is supported by three unambiguous synapomorphies: the presence of unpaired and unsegmented spines (Fig. 3.3.6B) on the dorsal (34¹) and anal fin (39¹), and the contact between the lateral ethmoids and the vomer (7¹; Fig. 3.3.6C). All three characters were already used to define acanthomorphs (Stiassny, 1986; Johnson & Patterson, 1993).

In addition to Acanthomorpha, a larger clade also includes the fossil †*Ctenothrissa* in a position that somehow reflects the ideas of Patterson (1964) but contradicts later studies (Gaudant, 1978c, 1979; Davesne *et al.*, 2014). The four unambiguous synapomorphies of this clade can also be used to define all extant acanthomorphs. These include:

- the loss of the adipose fin (38¹), implying the independent re-acquisition of this attribute in modern Percopsiformes (Fig. 3.3.2F) for the third time in teleost history – a possibility that was ambiguous in the study by Stewart *et al.* (2014), due to a different topology at the base of the acanthomorphs;

- an anterior position of the pelvic girdle (55¹); a "trend" towards an anterior migration of the pelvic fin was already described by Greenwood *et al.* (1966), and later more in details by Stiassny & Moore (1992) and Parenti & Song (1996). More specifically, it is redefined here as the pelvic girdle inserting anteriorly to the ventral tip of the distal postcleithrum (Fig. 3.3.6B);

- two characters that have been previously optimized as synapomorphies of Lampridomorpha (Davesne *et al.*, 2014): the pelvic girdle contacts the pectoral girdle at the level of the coracoids (56²), and the hyomandibula bears only one head at its articulation with the cranium (16¹) – both of these characters undergo numerous reversions within Acanthomorpha.

Finally, two synapomorphies are ambiguous for Acanthomorpha because there is no data regarding their presence in †*Ctenothrissa*. Nonetheless, they are unique to acanthomorphs if only extant taxa are considered. These are the close bonding between the dorsal limb of the posttemporal and the epioccipital (12¹) and the presence of facets on the first vertebral centrum for its articulation with exoccipital condyles (27¹). Both characters were amongst the already published acanthomorph synapomorphies (Rosen, 1985; Stiassny, 1986).
With these nine synapomorphies in total, our study supports the monophyly of Acanthomorpha, in accordance with earlier anatomical works (Stiassny & Moore, 1992; Johnson & Patterson, 1993; Davesne *et al.*, 2014) and in contradistinction with most of the molecular studies using part or the totality of the mitogenome (Miya *et al.*, 2003, 2005; Chen *et al.*, 2014).

*Position of Lampridiformes*

Our complete analysis recovered Lampridomorpha (with lampridiforms as its only extant members) as the sister-group to Euacanthomorpha (all acanthomorphs except Lampridomorpha). The monophyly of Euacanthomorpha is supported by morphology (Johnson & Patterson, 1993; Davesne *et al.*, 2014) but is ambiguous in molecular results. Indeed, the position of Lampridiformes is poorly supported by molecular data, both within datasets (associated support values are often low) and from one study to another. As in our previous writings on the matter (Davesne *et al.*, 2014), this result, coupled with the fact that the partial analysis without fossils yields a very different position for this clade (Fig. 3.3.5A), leads us to suggest that incongruence in the phylogenetic positions of Lampridiformes might be driven by sampling or branch-length artefacts rather than a strong phylogenetic support.

In the present study, two synapomorphies unambiguously support Euacanthomorpha:

- the premaxilla bear a postmaxillary process (2'), which is absent in lampridomorphs and non-acanthomorphs (Fig. 3.3.7A);

- the supraoccipital bears a spina occipitalis (15') that separates exoccipitals medially and reaches the dorsal roof of the foramen magnum. The spina occipitalis is absent in all Lampridiformes, while the state is unknown in fossil lampridomorphs.

*Position and status of Polymixiiformes*

According to our complete analysis, the closest extant relatives of *Polymixia* are Percopsiformes, Gadiformes, *Stylephorus* and Zeiformes; that is, a result similar to those of the molecular analyses that include mitochondrial data (Miya *et al.*, 2003, 2005; Broughton, 2010; Chen *et al.*, 2014). The larger clade that groups together *Polymixia* and its extant relatives also includes †*Omosomopsis* and †*Pycnosteroides* (Fig 4).

The interpretation of †*Pycnosteroides* varies considerably between authors. It has been referred to the Beryciformes (Patterson, 1964; Gayet, 1980a), Polymixiiformes (Taverne, 2011; Murray & Wilson, 2014), Acanthomorpha *incertae sedis* possibly related to Acanthopterygii (Patterson, 1993a) and Lampridomorpha (Davesne *et al.*, 2014; Delbarre *et*
al., in press). The present study contradicts all previous results by showing †*Pycnosteroides* as the earliest branching terminal of the clade "Paracanthomorpha *sensu lato*", defined by two unambiguous synapomorphies: the long neural spine on the second preural vertebra (42¹) and the reduction of the number of principal caudal fin rays to 18 (49¹).

†*Omosomopsis* has been described as a member of Polymixiiformes and Polymixiidae by Patterson (1993) based on its modified anterior branchiostegals (22¹). Our analysis shows that this character state might be a convergence between these two taxa. Indeed, †*Omosomopsis* is found as more closely related to Percopsiformes than to *Polymixia*, like in the analysis by Otero & Gayet (1996). The unambiguous synapomorphies that support this relationship are the losses of the anterior supramaxilla (4¹), of the basisphenoid (10¹) and of one epural (44¹).

It is noteworthy that the characters which group †*Pycnosteroides*, †*Omosomopsis* and *Polymixia* according to some authors (Taverne, 2011; Murray & Wilson, 2014) are the long neural spine on NPU2 and the 18 principal caudal rays, two character states which are shown here to be plesiomorphic for the three taxa. In the light of these results, it appears that a redefinition of the composition and synapomorphies of a putative Polymixiiformes clade (including other early fossil taxa, not analysed here) is much needed.

### Percopsiformes, Gadiformes and Zeiformes clade

[Fig. 3.3.7 about here]

Our analyses did not recover a clade Paracanthopterygii *sensu* Patterson & Rosen, (1989). In the complete analysis, Gadiformes and Percopsiformes form a clade with Zeiformes and *Stylephorus*, instead of Ophidiiformes and Batrachoidiformes, themselves nested within *Percomorpha* (Fig. 3.3.4).

Therefore, we recommend to avoid using "Paracanthopterygii" (and of "paracanthopterygians") as a clade name, and better use "Paracanthomorpha" (and "paracanthomorphs") instead, using the same prefix as in the molecular-based classification of Betancur-R. *et al.* (2014).

†*Sphenocephalus* is recovered here as the sister to modern paracanthomorphs, in accordance with earlier works (Otero & Gayet, 1996; Murray & Wilson, 1999; Grande *et al.*, 2013; Davesne *et al.*, 2014). The characters that support this relationship are the presence of a notch in the postmaxillary process of the premaxilla (3¹) – the so-called "gadoid" notch (Fig. 3.3.7A), and of at most one supraneural bone in front of the dorsal fin (30²).
Percopsiformes is sister to Gadiformes, Zeiformes and *Stylephorus*, in congruence with several mitochondrial and/or nuclear datasets (Dettaï & Lecointre, 2005; Broughton, 2010; Betancur-R. *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013; Chen *et al.*, 2014). The synapomorphies of this clade are the complete loss of supramaxillae (4²), the fusion of the second ural centrum with the upper hypurals while staying autogenous from the first ural centrum (41¹), and the fusion of proximal and distal postcleithra (51¹). All these three characters are convergent with Lampridiformes and Batrachoidiformes. In addition, the monophyly of Percopsiformes is recovered here and supported by three unambiguous synapomorphies; it was also previously recovered with molecular data (Dillman *et al.*, 2011), but ambiguous with morphology (Patterson & Rosen, 1989; Murray & Wilson, 1999).

The Gadiformes-Zeiformes clade (also including *Stylephorus*, see below) contradicts previous morphological studies, but is consistently recovered with molecular data. Here, its monophyly is supported by no less than nine unambiguous synapomorphies, including the loss of palatine teeth (19¹), the shortening of the second vertebral centrum (29¹; Fig. 3.3.7B) – previously used as a synapomorphy of Ophidiiformes + Gadiformes + Batrachoidiformes + Lophiiformes –, and the close association between the first neural spine and the neurocranium (28¹; Fig. 3.3.7B) – previously used as a Gadiformes + Batrachoidiformes + Lophiiformes synapomorphy (Patterson & Rosen, 1989). Another potential synapomorphy (that we did not include in our study because of the lack of fresh material available for dissection) is the presence, in both Gadiformes and Zeiformes, of intrinsic sonic muscles in the anterior end of the swimbladder (Kasumyan, 2008).

*Stylephorus with Gadiformes-Zeiformes*

[Fig. 3.3.8 about here]

The present phylogenetic analysis of morphological characters is the first to include *Stylephorus* alongside not only lampridiforms, but also other acanthomorph representatives. Similarly to molecular studies, this inclusion moves *Stylephorus* within the acanthomorph tree: it is grouped with Gadiformes and Zeiformes, instead of Lampridiformes. However, it is recovered here as sister to Zeiformes (Fig. 3.3.4), whereas all molecular data suggest a closer relationship with Gadiformes (Miya *et al.*, 2007). This *Stylephorus*-Zeiformes relationship is supported by four unambiguous synapomorphies: the ascending processes of the premaxillae are longer than the articular processes (1¹), the soft rays of the unpaired (40¹) and pectoral fins are unbranched (54¹) and there is no contact between the quadrate and the reduced metapterygoid (17¹). The latter two synapomorphies are unique for this clade, and therefore
not found in any lampridiform. In addition, the first vertebra of *Stylephorus* is much reduced and its neural spine is closely associated with the neurocranium (28¹), a Gadiformes-Zeiformes synapomorphy (Fig. 3.3.7B) also absent in Lampridiformes.

Conversely, several synapomorphies that are exclusive to Lampridiformes are absent in *Stylephorus*: it lacks the frontal vault (14¹), the condylar articulation between the anterior ceratohyal and the ventral hypohyal (21¹; Fig. 3.3.8), and its first dorsal pterygiophore is not inserted anteriorly to the first neural spine (32²). It also has four pectoral radials, instead of the three (53¹) that are present in all lampridiforms except for Veliferidae. The presence of exclusive paracanthomorph synapomorphies, combined with the absence of some exclusive lampridiform synapomorphies (all the other ones being either ambiguously present, or convergent in *Stylephorus*) allow us to support the molecular hypothesis of a monotypic order Stylephoriformes, closely related to Gadiformes and Zeiformes.

*The content of Euacanthopterygii: Beryciformes, Ophidiiformes and Batrachoidiformes*
[Fig. 3.3.9 about here]

The monophyly of Euacanthopterygii is supported by numerous synapomorphies. They include the double-headed cranio-hyomandibular articulation (16⁰; Fig. 3.3.9A), the presence of antero-median pelvic processes (57¹), and a Baudelot's ligament inserting proximally on the basioccipital (24¹). A non-homologous insertion of this ligament on the neurocranium rather than on vertebrae is observed in *Zeus* and *Velifer* on the exoccipitals, not on the basioccipital, as is the case in euacanthopterygians. The peculiar, "chain-link" articulation of the dorsal fin spines (35¹), and the asymmetric base of the pelvic spines (64¹, Fig. 3.3.9B) are also unique to euacanthopterygians (Mok & Chang, 1986), but ambiguously optimised at this node because of missing data in fossils. Finally, the pelvic fin spine (63¹; Fig. 3.3.9B), a diagnostic "acanthopterygian" character for Greenwood *et al.* (1966), has an ambiguous position: it could be an euacanthopterygian synapomorphy convergent in †*Pycnosteroides* and Zeiformes, but also a synapomorphy of Euacanthomorpha (with multiple secondary losses).

Within Euacanthopterygii, "beryciforms" are paraphyletic: the holocentrid *Sargocentron* is more closely related to percomorphs than to the trachichthyid *Hoplostethus* (Fig. 3.3.4). *Sargocentron* and percomorphs share a separate, entirely spinous anterior dorsal fin (36¹; Fig. 3.3.2M-N) – with multiple reversions in percomorphs –, the fusion of the ural centra together and with the upper hypurals (41²) and the reduction of the number of hypurals (47¹).
Finally, *Percomorpha* includes the ophidiiform *Brotula* and the batrachoidiform *Halobatrachus* (Fig. 3.3.4), like in every molecular study including these taxa, but in contradistinction with most morphological interpretations. However, it should be kept in mind that we used a limited taxonomic sampling for *Percomorpha*, and that expanding it could have changed the resulting topology.

Batrachoidiformes and Ophidiiformes show euacanthopterygian synapomorphies, such as the two hyomandibular heads (there is only one in paracanthomorphs, see Fig. 3.3.9A), the insertion of the Baudelot's ligament on the basicranium, the asymmetrical pelvic spine base (Fig. 3.3.9B; the pelvic spine is present but extremely reduced in Ophidiiformes) and the spinous anterior dorsal fin (in Batrachoidiformes only; Fig. 3.3.2L). In addition, *Brotula* possesses a supramaxilla, a basisphenoid, supraneurals and palatine teeth, all lost in paracanthomorphs (see above). Our findings parallel those the ones of previous authors (Gosline, 1968; Fraser, 1972; Gill, 1996; Wiley & Johnson, 2010) who viewed these character observations as potential challenges to the monophyly of "Paracanthopterygii".

*Congruence with molecular results*

[Table 3.3.3 about here]

Table 3.3.3 summarizes the topologies found by relevant morphological and molecular phylogenetic analyses. It shows that molecular analyses since 2005 have systematically agreed on a number of points, namely the non-monophyly of a paracanthopterygian clade (consisting of Percopsiformes, Gadiformes, Ophidiiformes and Batrachoidiformes at least), the monophyly of a Gadiformes + Zeiformes clade which also includes *Stylephorus* and the monophyly of Euacanthopterygii which includes Ophidiiformes and Batrachoidiformes along with other percomorphs.

All of these results are also recovered in our complete analysis (Fig. 3.3.4).

Only two minor incongruences remain between our topology and this molecular "consensus":

- *Stylephorus* is sister to Zeiformes, instead of Gadiformes;

- Ophidiiformes and Batrachoidiformes form a clade together, instead of being sequential sister-groups with other percomorphs. However, our percomorph sampling is much reduced compared to the tremendous morphological diversity of this clade.

Therefore, it is not suitable for an efficient test of their interrelationships.

Already well-supported by their repetition from one dataset to another (Chen *et al.*, 2003), clades found in the "molecular consensus" are here corroborated by a diverse set of morphological characters.
On the other hand, some results are still conflicting (Table 3.3.3), like for example: the monophyly of Acanthomorpha and Euacanthomorpha (corroborated by our results), the monophyly of Beryciformes (not corroborated by our results), the grouping of Percopsiformes with Gadiformes + Zeiformes (Paracanthomorpha) and that of Polymixiiformes and paracanthomorphs (both corroborated by our results). However, it should be noted that, for the most part, these conflicting nodes are associated with comparatively low support values (bootstrap indices and/or posterior probabilities). Hence, these clades are neither robust, nor repeated, a combination that should be sufficient to reject them (Chen *et al.*, 2003; Li & Lecointre, 2009). The non-monophyly of acanthomorphs is an example of relationship that is simultaneously robust and not repeated. The Lampridiformes-Myctophiformes clade of Miya *et al.* (2005) has a posterior probability of 0.99 or 1. However, it is never repeated in analyses based on nuclear markers only, nor in another study that used the mitochondrial genome (Broughton, 2010). Assessing in which way gene sampling affects phylogenetic reconstruction in this zone of the tree should be the object of later investigation.

*The critical role of taxonomic sampling*

Taxonomic sampling is an important aspect of phylogenetic studies (Lecointre *et al.*, 1993; Pollock *et al.*, 2002; Zwickl & Hillis, 2002), yet it is too often overlooked when discussing datasets and results.

We can observe its impact on phylogenetic hypotheses when comparing previous analyses based on morphology with the molecular ones. For example, a clade Gadiformes + Zeiformes is always recovered by molecular data (Fig. 3.3.2, Table 3.3.3). Why did the anatomical datasets fail to recover this clade, despite the number of characters available?

Johnson & Patterson (1993) assumed the monophyly of Paracanthopterygii *sensu* Patterson & Rosen (1989), which were represented by the percopsiform *Percopsis*. Two zeiforms were also included, but no gadiform representative. Murray & Wilson (1999) only included, besides outgroups, members of the Paracanthopterygii *sensu* Patterson & Rosen, and no zeiform. These two studies, while using a large character sampling, were unable to challenge the monophyly of Paracanthopterygii, and to propose an alternative Gadiformes + Zeiformes clade because of their taxonomic sampling. Later, Tyler & Santini (2005) did not include any paracanthopterygian *sensu* Patterson & Rosen, but only Zeiformes, Tetraodontiformes, Caproidae and beryciforms as outgroups. With this taxonomic sampling, they couldn't find Gadiformes + Zeiformes either.
In the present study, we mostly used the same characters than earlier authors, with relatively few entirely new morphological data; yet our results differ vastly from the previous ones. We can then emit the hypothesis that all the available anatomical evidence was enough to recover these relationships, while at the same time the lack of a comprehensive taxonomic sampling did not allow it. In this regard, molecular analyses played a critical role in supporting unexpected or overlooked relationships, conducting us to constitute this more comprehensive sampling.

However, our partial analysis of extant taxa alone (Fig. 3.3.5A) fails to recover clades that are consistent with molecular (or even with previous morphological) results.

On the other hand, when fossil taxa are analysed alone (Fig. 3.3.5B) they show the same interrelationships than with the complete analysis. The latter is then likely structured by the fossil taxa.

What is shown here is a possible case of "character extinction", where many character state combinations were found in the earliest members of a group, but disappeared since due to extinction of the taxa bearing them, or to extensive subsequent morphological evolution. This is for example the case in Lampridomorpha, whose extant representatives (Lampridiformes) are both relatively less diverse (due to the extinction of many clades at the end of the Cretaceous), and very distinctive anatomically speaking compared with the oldest known members of the clade (Davesne *et al.*, 2014; Delbarre *et al.*, in press).

The combination of parallel rapid morphological innovation in different closely related taxa, and of the loss of ancestral morphotypes due to taxon extinction, creates conflict between morphological characters (homoplasy) if fossils are not included (Huelsenbeck, 1991). Our results show another empirical example in which fossil taxa positively impact a morphological analysis, increasing congruence with molecular topologies (Donoghue *et al.*, 1989; Legg *et al.*, 2013; O'Leary *et al.*, 2013; Schoch & Sues, 2015).

## CONCLUSION AND PERSPECTIVES

In the present study, we provide a morphological dataset of extant and fossil taxa that reconstructs the earliest stages of acanthomorph evolution. The phylogeny we recover is consistent with topologies proposed by the multiple molecular analyses available today. This is a basis for a consensual view of the interrelationships of this important clade.

We expect this kind of analyses to become more common in the future, because of their key role in:
- corroborating the molecular results with independent character sets, which increases the reliability of the repeated clades (Grande, 1994; Miyamoto & Fitch, 1995);

- providing a framework for the evolution of morphological characters;

- integrating taxon and character evolution in the deep time, by explicitly supporting phylogenetic positions for fossil taxa that could be subsequently used for divergence time analyses – directly or as calibration points (Benton & Donoghue, 2007; Parham et al., 2012; Benton et al., 2015).

A more generalized and fruitful dialogue between morphology and molecular data is needed in phylogenetics. Molecular analyses may provide a wide phylogenetic framework, but maintaining a lively research program in morphology is still necessary to understand form and function in an evolutionary context (Giribet, 2015). Paralleling the rapid innovations in the field of sequence acquisition at a now genomic scale, increased usage of new techniques would help building morphological data matrices more efficiently. New generation imagery techniques, but also standardised anatomical descriptions (Deans et al., 2015) will help achieving this goal.
FIGURE CAPTIONS

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 3.3.1:</figcaption></figure>

Consensual phylogenetic hypotheses for Acanthomorpha, based on previously published data.

A: morphological hypothesis (Patterson & Rosen, 1989; Johnson & Patterson, 1993)

B: molecular hypothesis (Miya *et al.*, 2005, 2007; Li *et al.*, 2009; Broughton, 2010; Betancur-R. *et al.*, 2013; Grande *et al.*, 2013; Near *et al.*, 2013; Chen *et al.*, 2014)
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 3.3.2:</figcaption></figure>
Examples of species from the taxa studied.

A: Aulopiformes, *Synodus saurus*, MNHN/SBMC uncatalogued

B: Myctophiformes, *Myctophum punctatum*, MNHN/SBMC uncatalogued

C: Lampridiformes, *Lampris guttatus*, SBMC 2004-0006

D: Polymixiiformes, *Polymixia lowei*, NOAA uncatalogued

E: Percopsiformes, *Aphredoderus sayanus*, reconstruction

F: Percopsiformes, *Percopsis omiscomaycus*, reconstruction

G: *Incertae Sedis, Stylephorus chordatus*, MNHN.IC.2004-1316

H: Gadiformes, *Pollachius pollachius*, MNHN/SBMC uncatalogued

I: Zeiformes, *Zeus faber*, MNHN/SBMC uncatalogued

J: Ophidiiformes, *Cataetyx laticeps*, MNHN/SBMC uncatalogued

K: Beryciformes, *Hoplostethus mediterraneus*, MNHN/SBMC uncatalogued

L: Batrachoidiformes, *Halobatrachus didactylus*, MNHN/SBMC uncatalogued

M: Beryciformes, *Sargocentron hastatum*, MNHN 2013-0848

N: Percomorpha, *Dicentrarchus labrax*, MNHN/SBMC uncatalogued.

Legend: adf = adipose fin; sdf = spinous first dorsal fin. Scale bar equals 10 mm (A-B, D-F), 50 mm (G-N), 100 mm (C). Sizes are based on specimen measurements, or on the "common length" measure given in FishBase (D-F).

Photos D. Davesne (G), courtesy of S. Iglésias (Iglésias, 2014) (A-B, H-N), NOAA (D) and Wikimedia Commons (D-E).
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 3.3.3:</figcaption></figure>

Six of the seven fossil taxa used in the analyses

A: †*Ctenothrissa signifer*, NHMUK PV P47524

B: †'Aipichthys' *velifer*, MNHN.F.HAK57

C: †*Pycnosteroides levispinosus*, MNHN.F.HDJ105

D: †*Sphenocephalus fissicaudus*, NHMUK PV P9059

E: †*Omosomopsis simum*, MNHN.F.DTS222d

F: †*Stichocentrus liratus*, MNHN.F.HDJ97

Scale bar equals 10 mm (A-D, F), 5 mm (E).

Photos by D. Davesne, C. Lemzaouda and P. Loubry.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 3.3.4:</figcaption></figure>

Parsimonious tree obtained from the first analysis (complete analysis, extant and fossil taxa).

Length = 193, CI = 0.42, RI = 0.69.

Support values are above branches: Bremer indexes (bigger font) / bootstrap values (italics).

Unambiguous synapomorphies are below branches.
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 3.3.5:</figcaption></figure>

A: Strict consensus of the eight parsimonious trees obtained from the second analysis (extant taxa only). Length = 164, CI = 0.49, RI = 0.61.

B: Tree obtained from the third analysis (fossil taxa only). Length = 40, CI = 0.78, RI = 0.61.
The clade names on the right correspond to what was found in the first analysis (Fig. 3.3.4).
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 3.3.6:</figcaption></figure>
Examples of acanthomorph synapomorphies

A: Relative positions of the pelvic and pectoral girdle (left), and dorsal fin (right) of a non-acanthomorph, *Myctophum nidulum*, MNHN.IC.1993.2333.

B: Relative positions of the pelvic and pectoral girdle (left), dorsal fins (right) and anal fin (below) of an acanthomorph, *Dicentrarchus labrax*, MNHN uncatalogued.

C: Ethmoid region of an acanthomorph, *Sparus aurata*, MNHN uncatalogued.

Legend: afr = anal fin soft rays, afsp = anal fin spines, apt = anal pterygiophore, cl = cleithrum, co = coracoid, dfr = dorsal fin soft rays, dfsp = dorsal fin spines, dpcl = distal postcleithrum, dpt = dorsal pterygiophores, leth = lateral ethmoid, meth = mesethmoid, pcfr = pectoral fin rays, pcr = pectoral radials, pvg = pelvic girdle, pvfr = pelvic fin rays, sc = scapula, sn = supraneurals, vo = vomer. Scale bar equals 1 mm (A-B), 10 mm (C).

Photos D. Davesne and N. K. Schnell.
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 3.3.7:</figcaption></figure>

Examples of paracanthomorph synapomorphies.

A: Left premaxillae in lateral view of (from top to bottom and left to right) *Synodus scituliceps*, PB-6475; *Dicentrarchus labrax*, MNHN uncatalogued; *Merluccius gayi*, PB-5124; *Zeus faber*, MNHN uncatalogued.

B: Posterior region of the neurocranium and anteriormost vertebrae in lateral view of *Merluccius merluccius*, MNHN uncatalogued; *Zeus faber*, MNHN uncatalogued.

Legend: alp = alveolar process of the premaxilla; asp = ascending process of the premaxilla; boc = basioccipital; eocc = exoccipital condyle; ns1 = neural spine of the first vertebra; pmp = postmaxillary process of the premaxilla; pmpn = posterior notch on the postmaxillary process of the premaxilla; ptt = posttemporal; soc = supraoccipital; vc = vertebral centrum. Scale bar equals 10 mm. Photos D. Davesne and Osteobase (http://osteobase.mnhn.fr/).
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 3.3.8:</figcaption></figure>

A: *Velifer hypselopterus*, MNHN.IC.1982.0025, reconstructed from virtual tomographic data. Ventral portion of the left hyoid arch, in medial view, reversed (anterior faces left).

B: *Stylephorus chordates*, MNHN.IC.2004.1317, reconstructed from virtual tomographic data. Ventral portion of the left hyoid arch, in medial view, reversed (anterior faces left).

Legend: achy = anterior ceratohyal, bhy-hhy = facet of the basihyal-dorsal hypohyal articulation, chy-hhy = condyle of the anterior ceratohyal-ventral hypohyal articulation, dhhy = dorsal hypohyal, ihy = interhyal, pchy = posterior ceratohyal, raphhy = retro-articular process of the ventral hypohyal, vhhy = ventral hypohyal. Scale bar equals 2 mm.
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 3.3.9:</figcaption></figure>

Examples of euacanthopterygian synapomorphies

A: Left hyomandibulae in medial view (anterior faces right) of (from left to right) *Gadus morhua*, PB-A-16; *Zeus faber*, MNHN uncatalogued; *Dicentrarchus labrax*, MNHN uncatalogued; *Batrachoides pacifici*, PB-7005; *Brotula clarkae*, PB-6515. Arrows point to the head(s) of the cranio-hyomandibular articulation.

B: Left pelvic fin spines in anterior view of (from left to right and top to bottom) *Zeus faber*, MNHN uncatalogued; *Batrachoides pacifici*, PB-7005; *Dicentrarchus labrax*, MNHN uncatalogued. Arrows point to the base of the pelvic spine.

Scale bar equals 10 mm.

Photos D. Davesne and Osteobase (http://osteobase.mnhn.fr/).
TABLE CAPTIONS

**Table 3.3.1:**

Specimens used for character coding.

Abbreviations: AMNH = American Museum of Natural History, New York City, USA; AMS = Australian Museum, Sydney, Australia; EY = Hebrew University of Jerusalem, Israel;

MNHN = Muséum national d'Histoire naturelle, Paris, France; NHMUK = Natural History Museum, London, UK; PB = Philippe Béarez research collection, Muséum national d'Histoire naturelle, Paris, France; ZMUC = Zoological Museum, University of Copenhagen, Denmark.

<table><thead><tr><th></th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="3"><strong>Aulopiformes</strong></td></tr><tr><td>Synodus intermedius</td><td>ZMUC P2394016</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Synodus scituliceps</td><td>PB-6475</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td>Synodus synodus</td><td>MNHN.IC.0000-4106</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Myctophiformes</strong></td></tr><tr><td>Gymnoscopelus sp.</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>fresh specimen, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Myctophum nidulum</td><td>MNHN.IC.1993.2333</td><td>cleared and stained specimen</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>†Ctenothrissiformes</strong></td></tr><tr><td>†Ctenothrissa protodorsalis</td><td>MNHN.F.HAK22</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Ctenothrissa signifer</td><td>NHMUK PV P47524</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Ctenothrissa radians</td><td>NHMUK PV P11233</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Ctenothrissa radians</td><td>NHMUK PV P47912</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Ctenothrissa vexillifer</td><td>MNHN.F.HAK39</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Ctenothrissa vexillifer</td><td>MNHN.F.HAK104</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Late Cretaceous acanthomorphs</strong></td></tr><tr><td>†'Aipichthys' minor</td><td>MNHN.F.HAK94</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†'Aipichthys' minor</td><td>MNHN.F.HAK1938</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†'Aipichthys' velifer</td><td>MNHN.F.HAK57</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†'Aipichthys' velifer</td><td>NHMUK PV P4743</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†'Aipichthys' velifer</td><td>NHMUK PV P4744</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Aipichthyoides galeatus</td><td>EY 59a</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Pycnosteroides levispinosus</td><td>MNHN.F.HDJ105</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Pycnosteroides levispinosus</td><td>MNHN.F.HDJ106</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Pycnosteroides levispinosus</td><td>NHMUK PV P13901</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Sphenocephalus fissicaudus</td><td>NHMUK PV P8772</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Sphenocephalus fissicaudus</td><td>NHMUK PV P8774</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Sphenocephalus fissicaudus</td><td>NHMUK PV P9059</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Omosomopsis simum</td><td>MNHN.F.DTS222</td><td>unprepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Stichocentrus liratus</td><td>MNHN.F.HDJ97</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td>†Stichocentrus spinulosus</td><td>MNHN.F.HDJ101</td><td>acid-prepared fossil specimen</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Lampridiformes</strong></td></tr><tr><td>Velifer hypselopterus</td><td>MNHN.IC.1982-0025</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Velifer hypselopterus</td><td>AMS 21840020</td><td>cleared and stained specimen</td></tr><tr><td>Lampris guttatus</td><td>ZMUC 74</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Lampris guttatus</td><td>AMNH 79669 SD</td><td>dry skeleton</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td>Lampris guttatus</td><td>AMNH 21720 SD</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Lampris guttatus</td><td>MNHN.ZA.1883-1795</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Lampris immaculatus</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>dissection of a fresh specimen</td></tr><tr><td>Lampris sp.</td><td>AMNH 21766 SD</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Regalecus glesne</td><td>AMNH 093518 SD</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Order incertae sedis</strong></td></tr><tr><td>Stylephorus chordatus</td><td>MNHN.IC.2004-1316</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Stylephorus chordatus</td><td>MNHN.IC.2004-1317</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Polymixiformes</strong></td></tr><tr><td>Polymixia cf.nobilis</td><td>MNHN.IC.2006-1740</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Polymixia nobilis</td><td>NHMUK 95.5.28.1</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Percopsiformes</strong></td></tr><tr><td>Aphredoderus sayanus</td><td>MNHN.IC.1987-0864</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Percopsis omiscomaycus</td><td>MNHN.IC.1904-0278</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Gadiformes</strong></td></tr><tr><td>Merluccius merluccius</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>dissection of a fresh specimen</td></tr><tr><td>Merluccius merluccius</td><td>ZMUC 215</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Merluccius gayi</td><td>PB-5124</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td>Gadus morhua</td><td>PB-A-16</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Ophidiiformes</strong></td></tr><tr><td>Brotula clarkae</td><td>MNHN.IC.2002-1026</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Brotula multibarbata</td><td>NHMUK 1891.2.9.30</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Brotula clarkae</td><td>PB-6515</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td>Genypterus maculatus</td><td>PB-5232</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Batrachoidiformes</strong></td></tr><tr><td>Halobatrachus didactylus</td><td>MNHN.IC.2005-2431</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Halobatrachus didactylus</td><td>MNHN.ICOS.1979.26</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Halobatrachus didactylus</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>dissection of a fresh specimen</td></tr><tr><td>Batrachoides pacifici</td><td>PB-7005</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Zeiformes</strong></td></tr><tr><td>Cyttus australis</td><td>NHMUK 72.7.1.20</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td>Zeus faber</td><td>ZMUC P42190</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Zeus faber</td><td>MNHN.ICOS.1888-587</td><td>dry skeleton</td></tr><tr><td>Zeus faber</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>dissection of two fresh specimens</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Beryciformes</strong></td></tr><tr><td>Hoplostethus atlanticus</td><td>NHMUK 26.810</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td>Hoplostethus cadenati</td><td>MNHN.IC.1974-0091</td><td>preserved in fluid, X-ray computed tomography</td></tr><tr><td>Sargocentron rubrum</td><td>MNHN.ICOS.00276</td><td>dry isolated bones</td></tr><tr><td>Sargocentron sp.</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>dissection of a fresh specimen</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Percomorpha</strong></td></tr><tr><td>Dicentrarchus labrax</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>cleared and stained specimen</td></tr><tr><td>Dicentrarchus labrax</td><td>MNHN, uncatalogued</td><td>dissection of a fresh specimen</td></tr></tbody></table>
<table><caption>**Table 3.3.2:**
Taxon-by-character matrix used in the phylogenetic analyses.</caption><thead><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th><th>11</th><th>12</th><th>13</th><th>14</th><th>15</th><th>16</th><th>17</th><th>18</th><th>19</th><th>20</th><th>21</th><th>22</th><th>23</th><th>24</th><th>25</th><th>26</th><th>27</th><th>28</th><th>29</th><th>30</th><th>31</th><th>32</th></tr></thead><tbody><tr><td>Synodus</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>Gymnoscopelus</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>†Ctenothrissa</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td></tr><tr><td>†Pycnosteroides</td><td>0</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>2/3</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td></tr><tr><td>†'Aipichthys'</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>1</td><td>2</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td></tr><tr><td>†Aipichthyoides</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>1</td><td>2</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td></tr><tr><td>Velifer</td><td>1</td><td>0</td><td>-</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>3</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>3</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Lampris</td><td>1</td><td>0</td><td>-</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>1</td><td>3</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Regalecus</td><td>1</td><td>0</td><td>-</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>3</td><td>-</td><td>3</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td></tr><tr><td>Stylephorus</td><td>1</td><td>0</td><td>-</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>3</td><td>-</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>Polymixia</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>†Omosomopsis</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td></tr><tr><td>†Sphenocephalus</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>0/1</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td></tr><tr><td>Aphredoderus</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>Percopsis</td><td>0</td><td>0</td><td>-</td><td>2</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>Bregmaceros</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>3</td><td>-</td><td>1/2</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td></tr><tr><td>Merluccius</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>3</td><td>-</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Halobatrachus</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>3</td><td>-</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td></tr><tr><td>Brotula</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td></tr><tr><td>Cyttus</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>-</td><td>2</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Zeus</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>2</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>3</td><td>-</td><td>2</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Hoplostethus</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td></tr><tr><td>Sargocentron</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>1</td></tr><tr><td>†Stichocentrus</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>?</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>?</td><td>0</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>2</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td></tr><tr><td>Dicentrarchus</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>2</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td></tr><tr><td>Lates</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>1</td><td>?</td><td>?</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>0</td><td>1</td></tr></tbody></table>
**Table 3.3.3:**

Summary of the main studies presented in this article, and associated phylogenetic hypotheses.

<table><thead><tr><th></th><th>Stiassny &<br>Moore, 1992</th><th>Johnson &<br>Patterson,<br>1993</th><th>Patterson &<br>Rosen, 1989</th><th>Miya et al.,<br>2005/2007</th><th>Broughton,<br>2010</th></tr></thead><tbody><tr><td>Clades tested</td><td>morphology<br>(pelvic girdle<br>only)</td><td>morphology</td><td>morphology</td><td>complete<br>mitogenomes</td><td>protein-coding<br>mitochondrial<br>genes</td></tr><tr><td>Acanthomorpha</td><td>yes</td><td>yes</td><td>outgroups<br>absent</td><td>no</td><td>yes</td></tr><tr><td>Euacanthomorpha</td><td>ambiguous</td><td>yes</td><td>Lampri. absent</td><td>yes (Lampri.<br>outside<br>Acantho.)</td><td>yes</td></tr><tr><td>Lampri. +<br>Paracanthomorpha</td><td>no</td><td>no</td><td>Lampri. absent</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Lampri. +<br>Euacanthopterygii</td><td>ambiguous</td><td>no</td><td>Lampri. absent</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Polymixia +<br>Paracanthomorpha</td><td>ambiguous</td><td>no</td><td>no</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Polymixia + Percops.</td><td>ambiguous</td><td>no</td><td>no</td><td>yes</td><td>no</td></tr><tr><td>Percops.+ Gadi. + Zei<br>(Paracanthomorpha)</td><td>no - Gadiformes<br>absent</td><td>no -<br>Gadiformes<br>absent</td><td>Zeiformes<br>absent</td><td>no</td><td>yes</td></tr><tr><td>Percops. + Gadi. +<br>Ophii. + Batra.</td><td>assumed yes</td><td>assumed yes</td><td>yes</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Gadiformes +<br>Zeiformes</td><td>Gadiformes<br>absent</td><td>Gadiformes<br>absent</td><td>Zeiformes<br>absent</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Stylephorus in<br>Gadi.+Zei.</td><td>Stylephorus and<br>Gadi. absent</td><td>Stylephorus<br>and Gadi.<br>absent</td><td>Stylephorus<br>and Zei. absent</td><td>yes (2007 only)</td><td>Stylephorus<br>absent</td></tr><tr><td>Euacanthopterygii</td><td>no</td><td>yes</td><td>assumed yes</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Ze. +<br>Euacanthopterygii</td><td>yes</td><td>yes</td><td>assumed yes</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Beryciformes</td><td>no</td><td>yes</td><td>absent</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Ophidiiformes in<br>Percomorpha</td><td>assumed no</td><td>assumed no</td><td>no</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Batracho. in<br>Percomorpha</td><td>assumed no</td><td>assumed no</td><td>no</td><td>yes</td><td>Batracho.<br>absent</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th></th><th>Li et al., 2009</th><th>Grande et al., 2013</th><th>Near et al., 2013</th><th>Betancur-R. et al., 2013</th><th>Chen et al., 2014</th></tr></thead><tbody><tr><td>Clades tested</td><td>4 nuclear markers</td><td>4 nuclear/3 mitochondrial markers</td><td>10 nuclear markers</td><td>20 nuclear markers</td><td>6 nuclear/3 mitochondrial markers</td></tr><tr><td>Acanthomorpha</td><td>ambiguous</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>no with RY-coding / yes without</td></tr><tr><td>Euacanthomorpha</td><td>no</td><td>yes (using parsimony)</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Lampri. + Paracanthomorpha</td><td>yes + Polymixia</td><td>no</td><td>no</td><td>yes</td><td>no with RY-coding / yes without</td></tr><tr><td>Lampri. + Euacanthopterygii</td><td>no</td><td>yes (using likelihood)</td><td>yes</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Polymixia + Paracanthomorpha</td><td>yes + Lampri.</td><td>yes</td><td>no</td><td>no</td><td>yes</td></tr><tr><td>Polymixia + Percops.</td><td>no</td><td>no</td><td>yes</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Percops. + Gadi. + Zei (Paracanthomorpha)</td><td>no</td><td>yes</td><td>no</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Percops. + Gadi. + Ophii. + Batra.</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Gadiformes+Zeiformes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Stylephorus in Gadi. + Zei.</td><td>Stylephorus absent</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>Stylephorus absent</td></tr><tr><td>Euacanthopterygii</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Zei. + Euacanthopterygii</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Beryciformes</td><td>no</td><td>yes</td><td>yes</td><td>no</td><td>no</td></tr><tr><td>Ophidiiformes in Percomorpha</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td></tr><tr><td>Batracho. in Percomorpha</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td><td>yes</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th></th><th>Molecular<br>"consensus"</th><th>Present analysis -<br>complete</th><th>Present analysis - no<br>fossils</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Clades tested</strong></td><td></td><td>morphology</td><td>morphology</td></tr><tr><td>Acanthomorpha</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>yes</td></tr><tr><td>Euacanthomorpha</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Lampri.+Paracanthomorpha</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>no</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Lampri.+Euacanthopterygii</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>no</strong></td><td>no</td></tr><tr><td><em>Polymixia</em>+Paracanthomorpha</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr><tr><td><em>Polymixia</em>+Percops.</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>no</strong></td><td>ambiguous</td></tr><tr><td>Percops.+Gadi.+Zei<br>(Paracanthomorpha)</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Percops.+Gadi.+Ophii.+Batra.</td><td><strong>no</strong></td><td><strong>no</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Gadiformes+Zeiformes</td><td><strong>yes</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>ambiguous</td></tr><tr><td><em>Stylephorus</em> in Gadi.+Zei.</td><td><strong>yes</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Euacanthopterygii</td><td><strong>yes</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Zei. + Euacanthopterygii</td><td><strong>no</strong></td><td><strong>no</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Beryciformes</td><td><strong>ambiguous</strong></td><td><strong>no</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Ophidiiformes in Percomorpha</td><td><strong>yes</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr><tr><td>Batracho. in Percomorpha</td><td><strong>yes</strong></td><td><strong>yes</strong></td><td>no</td></tr></tbody></table>
**3.4 : Apport des résultats en morphologie**

L'analyse des deux jeux de données morphologiques (3.2 et 3.3) a fourni des résultats significatifs pour la phylogénie de la base de l'arbre des acanthomorphes :

- la position phylogénétique de certains groupes est soutenue par de nouveaux arguments ;

- les résultats majeurs répétés des analyses moléculaires sont corroborés par la morphologie ;

- le positionnement des taxons fossiles dans l'arbre permet de mieux caler dans le temps l'évolution des acanthomorphes et de leurs caractères ;

- le rôle de l'échantillonnage dans la résolution de la phylogénie et la congruence des résultats est discuté.

**3.4.1 Position des clades énigmatiques**

La position phylogénétique des Lampridiformes, Polymixiiformes et Percopsiformes est peu soutenue par les données moléculaires, qui peinent à retrouver une position similaire d'une étude à l'autre.

Grâce à un jeu de données spécifiquement conçu pour répondre à cette question (3.2) mes résultats soutiennent l'hypothèse que les Lampridiformes constituent le groupe-frère de tous les autres acanthomorphes actuels (Euacanthomorpha). Cette hypothèse reprend des résultats précédents en morphologie (Johnson & Patterson, 1993; Olney *et al.*, 1993) et a été retrouvée également avec le second jeu de données (3.3).

L'analyse de ce dernier (3.3) a quant à elle permis de soutenir une position pour les Percopsiformes et les Polymixiiformes. Les Percopsiformes sont ainsi groupe-frère des Gadiformes-Zeiformes, formant le clade Paracanthomorpha. Les Polymixiiformes sont quant à eux groupe-frère des Paracanthomorpha. Cette position relative des deux taxons n'est pas congruente avec les précédentes hypothèses morphologiques ; d'autre part elle n'est congruente qu'avec une partie des topologies issues des analyses moléculaires (Broughton, 2010; Grande *et al.*, 2013; Chen *et al.*, 2014).

La monophylie des Beryciformes, ambiguë avec la morphologie (Stiassny & Moore, 1992; Johnson & Patterson, 1993; Moore, 1993) aussi bien qu'avec le moléculaire (Betancur-R. *et al.*, 2013; Near *et al.*, 2013), n'est pas soutenue par ce jeu de données : les Holocentridae sont plus proches des Percomorpha que des Trachichthyidae.
### 3.4.2 Corroboration de clades répétés par le moléculaire

Certains résultats systématiquement retrouvés par les analyses des données moléculaires sont également soutenus par mon analyse des données morphologiques **(3.3)**. Les "Paracanthopterygii" de Rosen & Patterson (1969; 1989) sont éclatés pour la première fois par la morphologie :

- les Percopsiformes et les Gadiformes restent ensemble dans le nouveau clade des Paracanthomorpha;

- en revanche les Gadiformes sont plus proches des Zeiformes que des Percopsiformes;

- les Ophidiiformes et les Batrachoidiformes sont des Euacanthopterygii Percomorpha.

La position de *Stylephorus*, hors des Lampridiformes mais groupé avec les Gadiformes-Zeiformes, est un autre résultat moléculaire répété que l'on retrouve ici.

C'est enfin également le cas de la monophylie des Euacanthopterygii, seul clade systématiquement répété aussi bien par les précédentes études morphologiques que moléculaires.

### 3.4.3 Cas complexes

Pour certains cas, mes résultats sont confrontés à des cas de figure plus complexes.

Par exemple, la monophylie des acanthomorphes est soutenue par la plupart des jeux de données moléculaires à l'exception de certains, basés sur les marqueurs mitochondriaux. Dans ces derniers cas, la non-monophylie est très bien soutenue par les données (indices de soutien optimaux). Il s'agit donc d'un cas douteux dans le cadre de la répétabilité comme critère de fiabilité (Chen *et al.*, 2003), qui sera discuté plus dans le détail à l'issue de l'analyse des données moléculaires **(4.3)**.

Certains résultats de mon analyse contredisent des résultats répétés et robustes en moléculaire. Il s'agit de la position relative des Ophidiiformes et Batrachoidiformes (en groupes-frères) ; et de la position de *Stylephorus* en groupe-frère des Zeiformes, plutôt que des Gadiformes. Dans le premier cas, l'échantillonnage très réduit au niveau des Percomorpha ne permet pas d'accorder beaucoup de crédit à mon résultat – la contradiction est donc faible. La deuxième, en revanche, est soutenue par de nombreux caractères morphologiques. Cela suggère qu'une révision de l'anatomie de *Stylephorus* (qui reste très mal connue) serait pertinente, en s'inscrivant dans le cadre de sa nouvelle position phylogénétique. Elle pourrait permettre de lever l'ambiguïté en décelant des caractères supplémentaires.
### 3.4.4 Position des taxons fossiles

L'impact de mes résultats sur le registre fossile ancien des acanthomorphes sera discuté plus dans le détail après avoir intégré l'ensemble des données (5.3).

Quelques résultats nouveaux ont néanmoins été apportés par l'inclusion des fossiles dans les jeux de données.

Le groupement des †Pharmacichthyidae et des †"Aipichthyoidea" avec les Lampridiformes actuels, retrouvé dans les deux analyses (3.2, 3.3) m'a poussé à proposer pour cet ensemble le nom Lampridomorpha. Au sein des Lampridomorpha, j'ai également mis en évidence la paraphylie des †"Aipichthyoidea". Ces changements taxonomiques ont été autorisés par la mise en commun des taxons fossiles et actuels dans un même jeu de données. La position des †Pycnosteroididae est ambiguë car les deux jeux de données proposent des solutions différentes : avec les Lampridomorpha pour le premier (3.2), ou avec les Paracanthomorpha et les Polymixiiformes pour le second (3.3).

†*Stichocentrus* a été conforté comme un "béryciforme" et †*Sphenocephalus* et †*Omosomopsis* comme des paracanthomorphes, à l'instar de ce que suggéraient des analyses antérieures.

### 3.4.5 Impact de l'échantillonnage

Au-delà des résultats concernant la topologie de l'arbre, l'analyse de mes jeux de données a permis de mettre en évidence l'impact de l'échantillonnage taxonomique sur les résultats.

J'ai utilisé majoritairement des caractères issus de jeux de données antérieurs (Patterson & Rosen, 1989; Stiassny & Moore, 1992; Johnson & Patterson, 1993; Olney et al., 1993; Otero & Gayet, 1996). Mes résultats suggèrent donc que les données anatomiques à disposition de ces auteurs étaient suffisantes pour résoudre les relations phylogénétiques de la base des acanthomorphes tout en produisant des topologies congruentes avec celles des analyses moléculaires ultérieures. En revanche, leur échantillonnage taxonomique incomplet ne le permettait pas. En dotant les jeux de données d'une couverture taxonomique qui tend à se rapprocher de celle des analyses moléculaires, j'ai retrouvé une topologie congruente avec ces dernières. Par exemple, le clade Gadiformes + Zeiformes est retrouvé pour la première fois – mais la présence de ces deux taxons ensemble dans un même jeu de données était également une première. Il est envisageable que sans l'apport des phylogénies moléculaires, les anatomistes n'auraient pas pu retrouver ce clade – une étroite parenté entre les deux taxons n'étant tout simplement pas envisagée !
D'autre part, la partition de mes analyses selon le type de taxons (actuels/fossiles) a mis en évidence le rôle prépondérant des fossiles dans un échantillonnage en morphologie. En effet, sans les fossiles, les topologies obtenues ne sont pas congruentes avec les résultats morphologiques (3.2, 3.3) ou moléculaires (3.3) antérieurs. En revanche, quand le second jeu de données est analysé avec les fossiles uniquement (3.3) la topologie est compatible avec celle de l'analyse totale, suggérant que ce sont les fossiles – et non les actuels – qui structurent la topologie à grande échelle.

La présence chez les taxons fossiles de combinaisons d'états de caractères éteintes dans la nature actuelle, combinée à la grande quantité d'homoplasie constatée chez les taxons actuels d'acanthomorphes est probablement à l'origine de ce phénomène.

Les résultats morphologiques du présent chapitre seront confrontés aux résultats moléculaires présentés ci-après **(chapitre 4)**. Par la suite, l'intégration ainsi obtenue permettra de dégager les noeuds consensuels de la phylogénie basale des acanthomorphes et les points qui nécessitent une révision plus poussée (5.1). Enfin, mes résultats nouveaux seront replacés dans le cadre temporel des débuts de l'évolution des acanthomorphes (5.3).
# Chapitre 4

## Analyses des jeux de données moléculaires

*Pourquoi faire simple quand on peut faire compliqué ? –*

vielle devise Shadock
## 4.1 Etat des lieux et approche nouvelle

La phylogénie de la base des acanthomorphes a été fortement remise en question avec l'arrivée des données moléculaires. Des clades contredisant la morphologie ont été retrouvés de façon répétée d'une étude à l'autre mais aussi, au sein de certaines études, d'un marqueur à l'autre (Chen et al., 2003; Dettaï & Lecointre, 2005; Li et al., 2009).

Cependant, hormis ces quelques clades répétés et donc fiables (Gadiformes – Zeiformes, Percomorpha incluant les Ophidiiformes et Batrachoidiformes), peu de clades à la base des acanthomorphes ont été répétés d'une étude à l'autre, laissant notamment irrésolues les relations de parenté profondes des acanthomorphes.

Différents facteurs peuvent être invoqués pour expliquer ces résultats peu répétés.

- Des différences dans les marqueurs utilisés :

Les diverses études n'utilisent que partiellement les mêmes marqueurs. Parmi les principales ayant couvert la base des acanthomorphes, on peut identifier des équipes utilisant largement les mêmes séries de marqueurs : celle de Masaki Miya et Mutsumi Nishida (Chiba et Tokyo, Japon) utilise le génome mitochondrial (Miya et al., 2001, 2003, 2005, 2007; Simmons & Miya, 2004; Broughton, 2010), celle de Guillaume Lecointre (Paris) utilise un ensemble de marqueurs nucléaires (Chen et al., 2003; Dettaï & Lecointre, 2005, 2008; Li et al., 2009) et celle de Guillermo Ortí (Washington) utilisent un autre ensemble de marqueurs nucléaires (Li et al., 2007, 2008; Roa-Varón & Ortí, 2009; Betancur-R. et al., 2013), une partie de ces marqueurs étant repris pas l'équipe de Thomas Near à Yale (Near et al., 2012a, 2013).

Ces équipes n'utilisent généralement pas les marqueurs des autres (Tableau 4.1.1), aboutissant à des résultats soutenus très majoritairement par des données différentes. Cette indépendance des jeux de données a un avantage : elle accentue la fiabilité des clades répétés d'une étude à l'autre, puisqu'ils sont produits avec des marqueurs différents. En revanche, chaque jeu de données peut présenter des biais spécifiques qui influencent la reconstruction de l'arbre : il va alors soutenir une topologie différente des autres à la base des acanthomorphes. Une stratégie potentielle serait de combiner l'ensemble de ces marqueurs qui se sont montrés efficaces pour résoudre les relations phylogénétiques : ainsi leurs éventuels biais pourraient se compenser, faisant émerger un signal commun.
- Un échantillonnage limité à la base des acanthomorphes :

Le peu de répétabilité des résultats à la base de l'arbre peut provenir d'un échantillonnage ne couvrant pas suffisamment la diversité phylogénétique de cette zone. En effet, aucune des principales études évoquées plus haut n'était spécifiquement centrée sur la base de l'arbre des acanthomorphes. Il en résulte un échantillonnage couvrant les grands clades, mais peu représentatif au sein de ces grands clades. Pour reprendre l'exemple des Lampridiformes, aucun jeu de données publié n'inclut de représentant de la famille des Veliferidae, pourtant le groupe-frère potentiel des autres membres du groupe. C'est ainsi un large pan de la diversité phylogénétique du groupe qui est ignoré, entraînant de possibles artefacts d'échantillonnage qui peuvent à leur tour influencer la position phylogénétique du groupe (Bergsten, 2005).

- Un grand nombre de données manquantes :

Des marqueurs de plus en plus nombreux ont été analysés en combinaison dans les études successives (Tableau 4.1.1). Cette augmentation a un effet favorable sur la fiabilité des résultats, mais entraîne des difficultés croissantes d'acquisition des données. Ainsi, en se penchant sur les listes de séquences publiées (ou, à défaut, sur les matrices employées pour les analyses) on constate que certains marqueurs ne couvrent que partiellement l'échantillonnage. C'est le cas, par exemple, du marqueur RNF213 chez Li *et al.* (2009) pour les taxons de la base des acanthomorphes, ou encore des marqueurs RAG2, SIDKEY ou SVEP1 chez Betancur-R. *et al.* (2013).

Les données manquantes qui en résultent dans l'alignement concaténé de l'ensemble des marqueurs peuvent avoir un effet sur la reconstruction phylogénétique, qui seront alors plus sensibles aux artefacts phylogénétiques (Roure *et al.*, 2013), même si cet effet se réduit avec une taille croissante du jeu de données (Wiens & Moen, 2008).

Ces facteurs limitant la résolution des relations profondes des acanthomorphes doivent donc être réduits dans les futures analyses, tandis que la quantité considérable de données déjà acquises doit pouvoir être intégrée et valorisée. J'ai mis en place un protocole d'acquisition de nouvelles séquences permettant d'obtenir un jeu de données dont les caractéristiques réduiront au maximum ces effets indésirables (4.2). Parallèlement et en attendant d'obtenir de nouvelles séquences, je propose d'analyser l'ensemble des données déjà produites et analysées séparément par les différentes équipes (4.3).
<table><caption>**Tableau 4.1.1** : Récapitulatif des marqueurs utilisés dans les études publiées couvrant la base de l'arbre des acanthomorphes. <sup>(1)</sup> Marqueur inclus dans le mitogénome ; <sup>(2)</sup> gènes codants uniquement ; <sup>(3)</sup> en synthèse avec le NGS uniquement.</caption><thead><tr><th>Marqueurs</th><th>Wiley et al., 2000</th><th>Miya et al., 2001, 2003, 2005</th><th>Chen et al., 2003</th><th>Dettaï & Lecointre, 2005</th><th>Miya et al., 2007</th><th>C. Li et al., 2008</th><th>B. Li et al., 2009</th><th>Broughton, 2010</th><th>Near et al., 2012, 2013</th><th>Grande et al., 2013</th><th>Betancur-R. et al., 2013</th><th>Présente thèse</th></tr></thead><tbody><tr><td>12S</td><td>x</td><td>x<sup>(1)</sup></td><td>x</td><td>x</td><td>x<sup>(1)</sup></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>16S</td><td></td><td>x<sup>(1)</sup></td><td>x</td><td>x</td><td>x<sup>(1)</sup></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>tRNA-Val</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COI</td><td></td><td>x<sup>(1)</sup></td><td></td><td></td><td>x<sup>(1)</sup></td><td></td><td></td><td>x<sup>(1)</sup></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>Mitogénome</td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x<sup>(2)</sup></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>28S</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>rhodo</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>MLL4</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>MLL2</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>IRBP</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>RNF213</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>RAG1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>RAG2</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>ENC1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>Glyt</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>MYH6</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>PLAGL2</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>PTR</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>RYR3</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>SH3PX3</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>SREB2</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>TBR1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>ZIC1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>FICD</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>HOXC6A</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>KIAA1239</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>PANX2</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>RIPK4</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>SIDKEY</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>SVEP1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>VCPIP</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>Histone H3</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGR1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x<sup>(3)</sup></td></tr><tr><td>EGR2B</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x<sup>(3)</sup></td></tr><tr><td>EGR3</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x<sup>(3)</sup></td></tr><tr><td>MC1R</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>PKD1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>KIAA2022</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>PCDH19</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>ZFHX4</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>Total</td><td>2</td><td>1</td><td>4</td><td>7</td><td>2</td><td>10</td><td>4</td><td>1</td><td>10</td><td>7</td><td>21</td><td>9</td><td>33</td></tr></tbody></table>
## 4.2 Acquisition de nouvelles données

Dans mon jeu de données :

- les marqueurs des différentes équipes sont intégrés et mis en commun, permettant leur interaction pour résoudre la topologie (Tableau 4.2.1) ;

- l'échantillonnage taxonomique est conçu afin de couvrir efficacement la diversité intra- et inter-clades et de permettre la comparaison des résultats avec ceux de la morphologie ;

- les données manquantes sont réduites au maximum.

### 4.2.1 Marqueurs utilisés

Les marqueurs utilisés pour ce travail ont déjà été utilisés, avec succès, pour résoudre la phylogénie à grande échelle des acanthomorphes – à l'exception de trois nouveaux marqueurs.

- Marqueurs mitochondriaux :

Des marqueurs issus du génome mitochondrial ont été utilisé très tôt pour la phylogénie moléculaire des acanthomorphes, notamment les ARN ribosomiques 12S et 16S qui sont faciles à amplifier par PCR (Wiley et al., 1998, 2000; Chen et al., 2003; Dettaï & Lecointre, 2005). Ils sont encore couramment utilisés aujourd'hui (Betancur-R. et al., 2013; Grande et al., 2013; Chen et al., 2014) et leurs séquences sont présentes dans les bases de données pour une grande quantité de taxons. C'est également le cas pour la 1ère sous-unité de la cytochrome C oxydase (COI), le gène du Barcode (Hebert et al., 2003; Ivanova et al., 2007).

Néanmoins, les plus importantes contributions des gènes mitochondriaux à la phylogénie profonde proviennent des études de l'équipe de Masaki Miya et Mutsumi Nishida au Japon, qui utilisent un jeu d'une trentaine d'amorces pour séquencer le génome mitochondrial complet. Leurs travaux ont permis d'obtenir les mitogénomes de plus d'une centaine d'espèces d'acanthomorphes, qui ont été analysés en phylogénie, découvrant pour la première fois certaines relations de parentés inattendues (Miya & Nishida, 2014). La plupart de ces mitogénomes sont déposés sur la base de données spécifique MitoFish (Iwasaki et al., 2013).

Le génome mitochondrial des vertébrés est composé de deux ARN ribosomiques (12S, 16S), de 22 ARN de transfert, d'une région de contrôle (d-loop) et de 13 gènes codant pour des protéines (dont le COI). Ces différents marqueurs ont des performances phylogénétiques
variables (Zardoya & Meyer, 1996; Miya & Nishida, 2000; Mueller, 2006; Havird & Santos,
2014).

Des méthodes visant à collecter facilement des mitogénomes pour une variété de
taxons simultanément ont été développées au sein de l'équipe dans laquelle j'ai effectué ma
thèse (Dettaï et al., 2012). Cependant, je n'ai pas inclus les mitogénomes dans mon
échantillonnage pour plusieurs raisons : récupérer les marqueurs nucléaires et mitochondriaux
en utilisant des techniques différentes aurait constitué un travail trop lourd ; l'obtention de
mitogénomes nécessite des ADN très peu dégradés, auxquels je n'avais pas accès pour
beaucoup de spécimens ; enfin, les marqueurs mitochondriaux ont des séquences trop
divergentes à grande échelle pour fonctionner qu'un protocole d'enrichissement par capture
ciblée (voir plus bas) soit efficace. Néanmoins, il n'est pas exclu d'ajouter a posteriori
quelques marqueurs mitochondriaux à l'échantillonnage : par exemple COI, disponible dans
les bases de données pour une large variété de taxons en raison de son utilisation en
barcoding.

- Marqueurs de l'équipe Lecointre :

J'ai repris les différents marqueurs utilisés pour des études à grande échelle des
acanthomorphes par mon équipe d'accueil. Les marqueurs concernés sont le rétrogène de la
rhodopsine – le premier marqueur développé par l'équipe (Chen et al., 2003), deux des gènes
*Mixed-Lineage Leukemia-Like* – MLL4 (autrefois appelé MLL1) et MLL2 (Dettaï &
Lecointre, 2005), IRBP (Dettaï & Lecointre, 2008) et RNF213 (Li et al., 2009). J'ai également
inclus deux marqueurs développés à plus petite échelle (clade des Serraniformes, ou
Perciformes *sensu stricto*) mais qui s'amplifient bien pour les taxons d'intérêt : MC1R et
PKD1 (Lautrédou et al., 2013).

A cela s'ajoutent trois marqueurs nouveaux, spécifiquement développés au sein de l'équipe
(dans le cadre du stage de Mathilde Belli, encadrée par Cyril Gallut) pour la phylogénie
profonde des acanthomorphes. Ils furent sélectionnés en suivant une procédure informatisée
ciblant les exons à copie unique partagés entre quatre génomes complets d'acanthomorphes et
un non-acanthomorphe (*Danio rerio*) disponibles dans la base de données ENSEMBL. Cette
procédure a permis d'identifier environ 150 marqueurs potentiels. J'en ai conservé trois
(KIAA2022, PCDH19 et ZFHX4), qui donnaient des résultats satisfaisants en PCR.
- Autres marqueurs :

J'ai également inclus dans mon échantillonnage les marqueurs RAG1 et RAG2, largement
utilisés en phylogénie des acanthomorphes (Holcroft, 2004; Miya et al., 2007; Near et al.,
2012a, 2013; Betancur-R. et al., 2013; Grande et al., 2013; Chen et al., 2014), ainsi que trois
*Early Growth Factors* (EGR1, 2B et 3), récemment utilisés dans un jeu de données centré sur
la base des acanthomorphes (Chen et al., 2014).

Le reste de mon échantillonnage provient d'un ensemble de marqueurs identifiés par
Chenhong Li et ses collaborateurs avec une procédure informatisée basée sur la recherche de
marqueurs à copie unique partagés entre les génomes de *Danio rerio* et de l'acanthomorphe
*Takifugu rubripes*. Cette approche a d'abord fourni 10 marqueurs (Li *et al.*, 2007), puis
d'autres ont été testés à diverses échelles par la suite (Li *et al.*, 2010a, 2011; Betancur-R. *et
al.*, 2013).

Au total, j'ai donc inclus 33 marqueurs nucléaires dans mon échantillonnage (Tableau
4.2.1). Tous sont à copie unique et tous sont codants sauf l'intron HOXC6A. Cet
échantillonnage combine la plupart des marqueurs déjà publiés pour la phylogénie profonde
des acanthomorphes, y compris les marqueurs du projet *Euteleost Tree of Life*
(http://www.fishtree.org/).
<table><caption>**Tableau 4.2.1** : Liste des 33 marqueurs nucléaires utilisés pour la constitution du nouveau jeu de données moléculaire.</caption><thead><tr><th colspan="3">Equipe Lecointre</th></tr></thead><tbody><tr><td>Rhodo</td><td>Rhodopsin retrogen</td><td>Chen et al., 2003</td></tr><tr><td>MLL2</td><td>Mixed lineage leukemia-like protein 2</td><td>Dettaï & Lecointre, 2005</td></tr><tr><td>MLL4</td><td>Mixed lineage leukemia-like protein 4</td><td>Dettaï & Lecointre, 2005</td></tr><tr><td>IRBP</td><td>Interphotoreceptor retinoid binding protein</td><td>Dettaï & Lecointre, 2008</td></tr><tr><td>RNF213</td><td>Ring finger protein 213</td><td>Li et al., 2009</td></tr><tr><td>PKD1</td><td>Polycystic kidney disease 1</td><td>Lautrédou et al., 2010</td></tr><tr><td>MC1R</td><td>Melanocortin type 1 receptor</td><td>Lautrédou et al., 2013</td></tr><tr><td>KIAA2022</td><td>XLMR-related protein, neurite extension</td><td>nouveau</td></tr><tr><td>PCDH19</td><td>Protocadherin 19</td><td>nouveau</td></tr><tr><td>ZFHX4</td><td>Zinc finger homeobox protein 4</td><td>nouveau</td></tr><tr><th colspan="3">Equipe Ortí</th></tr><tr><td>RAG1</td><td>Recombination activating gene 1</td><td>López et al., 2004</td></tr><tr><td>ENC1</td><td>Ectodermal-neural cortex</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>Glyt - GTDC2</td><td>Glycosyltransferase</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>MYH6</td><td>Cardiac myosin heavy chain 6 alpha</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>PLAGL2</td><td>Pleiomorphic adenoma protein-like 2</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>PTR - PTCHD4</td><td>Patched domain containing 4</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>RYR3</td><td>Ryanodine receptor 3</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>SH3PX3 - SNX33</td><td>Sorting nexin 33</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>SREB2 - GPR85</td><td>G protein-coupled receptor 85</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>TBR1b</td><td>T-box brain 1b</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>ZIC1</td><td>Zic family member 1</td><td>Li et al., 2007</td></tr><tr><td>SIDKEY</td><td>si:dkey-174m14.3</td><td>Li et al., 2010a</td></tr><tr><td>FICD</td><td>FIC domain-containing protein</td><td>Li et al., 2011</td></tr><tr><td>KIAA1239 - NWD2</td><td>NACHT and WD repeat domain containing 2</td><td>Li et al., 2011</td></tr><tr><td>RIPK4</td><td>Receptor-interacting serine-threonine kinase 4</td><td>Li et al., 2011</td></tr><tr><td>HOXC6A</td><td>intron</td><td>Betancur-R. et al., 2013</td></tr><tr><td>PANX2</td><td>Pannexin 2</td><td>Betancur-R. et al., 2013</td></tr><tr><td>SVEP1</td><td>Sushi, von Willebrand factor type A, EGF and pentraxin domain containing 1</td><td>Betancur-R. et al., 2013</td></tr><tr><td>VCPIP</td><td>Valosin-containing protein / p47 complex interacting protein 1</td><td>Betancur-R. et al., 2013</td></tr><tr><th colspan="3">Autres</th></tr><tr><td>RAG2</td><td>Recombination activating gene 2</td><td>Lovejoy & Collette, 2001</td></tr><tr><td>EGR1</td><td>Early growth response gene 1</td><td>Chen et al., 2008</td></tr><tr><td>EGR2B</td><td>Early growth response gene 2B</td><td>Chen et al., 2008</td></tr><tr><td>EGR3</td><td>Early growth response gene 3</td><td>Chen et al., 2008</td></tr></tbody></table>
4.2.2 Constitution de l'échantillonnage taxonomique

L'échantillonnage taxonomique de cette étude s'est constitué en plusieurs étapes.

Il a été basé au départ sur la collection de recherche de l'équipe d'accueil, au MNHN (tissus conservés au frais et en alcool à 75°), comprenant un large échantillonnage constitué notamment pour les travaux de l'équipe et notablement enrichi par des missions de collecte en Atlantique Nord-Est (campagnes EVOHE) et dans l'Océan Austral (campagnes POKER aux Îles Kerguelen). Cette collection ne présentait cependant pas la couverture recherchée, notamment pour les taxons provenant d'autres régions du monde, mais aussi car les études précédemment menées dans l'équipe n'étaient pas spécifiquement centrées sur la base des acanthomorphes.

J'ai donc complété l'échantillonnage par des dons de tissus provenant d'autres collections :

- la collection de l'Université du Kansas, Etats-Unis (KU),

- la collection du Musée National de la Nature et des Sciences, Tokyo, Japon (NSMT),

- la collection de recherche de Samuel Iglésias (Station de Biologie Marine de Concarneau, MNHN), tendant à l'exhaustivité pour les taxons de l'Atlantique Nord-Est et de la Méditerranée (Iglésias, 2014).

En plus de ces échantillons préservés en alcool, des spécimens "frais" ont été collectés : *in situ* dans la région de Bayeux (Normandie), à Concarneau (Bretagne) et en Méditerranée occidentale (campagne MEDIT). Enfin, j'ai complété mon échantillonnage en récupérant des tissus provenant de spécimens historiques des collections d'ichtyologie du MNHN. Pour ces spécimens parfois récoltés il y a plusieurs siècles, le fluide utilisé pour la conservation a un impact sur la quantité et la qualité de l'ADN extrait. C'est pourquoi j'ai recherché en priorité les plus anciens spécimens, ce qui peut paraître paradoxal : ils ont moins de chances d'avoir été conservés dans le formol, qui dégrade considérablement le matériel génétique (notamment par cassure des brins).

Aussi bien pour la collection du MNHN que pour les autres collections, chaque échantillon de tissu utilisé correspond à un spécimen conservé par ailleurs en collection, le *voucher*. L'identification de l'espèce peut donc être confirmée si besoin. L'échantillonnage actuel est présenté dans le tableau 4.2.2. Il couvre 45 des 47 familles à la base des acanthomorphes (percomorphes exclus), soit 96% (ce chiffre descend à 75% si on ne tient pas compte des spécimens historiques). Si l'objectif de séquencer l'ensemble de ces taxons avec les 33 marqueurs nucléaires est atteint, cet échantillonnage sera le plus large jamais constitué pour la base des acanthomorphes.
<table><thead><tr><th></th><th></th><th>Taxonomie</th><th>Identifiant</th><th>Origine</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Argentiniformes</td><td>Argentinidae</td><td>Argentina sphyraena</td><td>BPS-1102</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Bathylagidae</td><td>Bathylagus tenuis</td><td>9311, 9297</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Osmeriformes</td><td>Osmeridae</td><td>Osmerus eperlanus</td><td>BPS-1033</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="2">Salmoniformes</td><td>Salmonidae</td><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>BPS-1028/1029</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Salmonidae</td><td>Salmo trutta</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Esociformes</td><td>Esocidae</td><td>Esox cf. lucius</td><td>-</td><td>don G. Denys</td></tr><tr><td rowspan="12">Stomiiformes</td><td>Diplophidae</td><td>Diplophos rebainsi</td><td>9537</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Gonostomatidae</td><td>Cyclothone braueri</td><td>BPS-1564</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Gonostoma elongatum</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Phosichthyidae</td><td>Polymetme thaeocoryla</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="5">Sternoptychidae</td><td>Argyropelecus hemigymnus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Maurolicus muelleri</td><td>BPS-1690</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Astronesthes psychrolutes</td><td>9536</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Borostomias antarcticus</td><td>BPS-1981</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Chauliodus sloani</td><td>9314</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="5">Stomiidae</td><td>Idiacanthus atlanticus</td><td>9367, 9434</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Leptostomias longibarba</td><td>BPS-0636</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Malacosteus niger</td><td>9497</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Stomias boa</td><td>9365, 9315</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="3">Ateleopodiformes</td><td rowspan="3">Ateleopodidae</td><td>Ateleopus japonicus</td><td>2005-1329</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Guentherus altivelis</td><td>1987-1569</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Ijimaia loppei</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="20">Aulopiformes</td><td rowspan="2">Alepisauridae</td><td>Alepisaurus brevirostris</td><td>1154</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Alepisaurus ferox</td><td>BPS-0152</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Anotopteridae</td><td>Anotopterus pharao</td><td>1938-0008</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Aulopidae</td><td>Aulopus filamentosus</td><td>BPS-1928</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Bathysauridae</td><td>Bathysaurus ferox</td><td>1885-0149</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Bathysauroididae</td><td>Bathysauroides gigas</td><td>2005-0968</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Chlorophthalmidae</td><td>Chlorophthalmus agassizi</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Evermannellidae</td><td>Evermannella balbo</td><td>BPS-1972</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Giganturidae</td><td>Gigantura chuni</td><td>1992-0007</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Ipnopidae</td><td>Bathypterois dubius</td><td>BPS-1019</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Bathysauropsis gracilis</td><td>2004-2138</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Notosudidae</td><td>Luciosudis normani</td><td>9351</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Omosudidae</td><td>Omosudis lowii</td><td>1992-1233</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Paralepididae</td><td>Arctozenus risso</td><td>9202</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Notolepis coatsi</td><td>9333</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Paraulopidae</td><td>Paraulopus legandi</td><td>1978-0468</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Scopelarchidae</td><td>Benthalbella elongata</td><td>1160</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="3">Synodontidae</td><td>Synodus saurus</td><td>BPS-1419, 0483</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Synodus synodus</td><td>0000-4106</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Trachinocephalus myops</td><td>913</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td rowspan="24">Myctophiformes</td><td rowspan="12">Myctophidae</td><td>Benthosema glaciale</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Diaphus cf.rafinesquii</td><td>BPS-1979</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Electrona antarctica</td><td>9477</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Electrona carlsbergi</td><td>EC 342</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Ceratoscopelus maderensis</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Gymnoscopelus bolini</td><td>9300</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gymnoscopelus braueri</td><td>9301, 9350</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gymnoscopelus fraseri</td><td>9340</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gymnoscopelus hintonoides</td><td>9295, 9293, 9292</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gymnoscopelus microlampas</td><td>9348</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Krefftichthys anderssoni</td><td>9335</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lampadena atlantica</td><td>BPS-1961</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Lampanyctus crocodilus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Lampanyctus crocodilus</td><td>72</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Myctophum punctatum</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Nannobrachium achirus</td><td>9337</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Notolychnus valdiviae</td><td>-</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Notoscopelus cf.kroeyeri</td><td>71</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Notoscopelus elongatus</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Protomyctophum sp.</td><td>9538</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Symbolophorus veranyi</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="2">Neoscopelidae</td><td>Neoscopelus microchir</td><td>BPS-0608</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Scopelengys tristis</td><td>BPS-2002</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="12">Lampridiformes</td><td rowspan="2">Lamprididae</td><td>Lampris guttatus</td><td>NSMT-P 78933, BPS-0288</td><td>don Tokyo Nat. Sci. Mus., don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Lampris immaculatus</td><td>-</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Lophotidae</td><td>Lophotus capellei</td><td>NSMT-P 79586</td><td>don Tokyo Nat. Sci. Mus.</td></tr><tr><td>Lophotus lacepede</td><td>-</td><td>don Kansas University</td></tr><tr><td rowspan="2">Regalecidae</td><td>Regalecus glesne</td><td>BPS-1766, I1693</td><td>don S. Iglésias, coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Regalecus russelii</td><td>NSMT-P 63945, ICTI 341</td><td>Tokyo Nat. Sci. Mus., coll. tissus MNHN</td></tr><tr><td rowspan="6">Trachipteridae</td><td>Desmodema polystictum</td><td>NSMT-P 65206</td><td>don Tokyo Nat. Sci. Mus.</td></tr><tr><td>Trachipterus altivelis</td><td>0000-2821</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Trachipterus arcticus</td><td>1687</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Trachipterus trachypterus</td><td>NSMT-P 76996</td><td>don Tokyo Nat. Sci. Mus.</td></tr><tr><td>Zu cristatus</td><td>NSMT-P 63974</td><td>don Tokyo Nat. Sci. Mus.</td></tr><tr><td>Zu elongatus</td><td>2001-0743</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Veliferidae</td><td>Metavelifer multiradiatus</td><td>2003-1897</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Velifer hypselopterus</td><td>1982-0025</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td>incertae sedis</td><td>Stylephoridae</td><td>Stylephorus chordatus</td><td>2004-1316, 2004-1317</td><td>coll. ichtyo.MNHN, don Kansas University</td></tr><tr><td rowspan="3">Polymixiiformes</td><td rowspan="3">Polymixiidae</td><td>Polymixia berndti</td><td>1988-1581</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Polymixia japonica</td><td>1998-0859</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Polymixia nobilis</td><td>692</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="5">Percopsiformes</td><td>Aphredoderidae</td><td>Aphredoderus sayanus</td><td>-</td><td>don Kansas University</td></tr><tr><td rowspan="2">Amblyopsidae</td><td>Amblyopsis spelaea</td><td>0000-4184</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Chologaster cornuta</td><td>1889-0407</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Percopsidae</td><td>Percopsis omiscomaycus</td><td>1904-0278</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Percopsis transmontana</td><td>-</td><td>don Kansas University</td></tr><tr><td rowspan="2">Bregmacerotidae</td><td>Bregmaceros japonicus</td><td>1992-0329</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Euclichthyidae</td><td>Euclichthys polynemus</td><td>1995-1001</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="15">Gadiformes</td><td rowspan="10">Gadidae</td><td>Gadiculus argenteus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Gadus morhua</td><td>CE 9503</td><td>récolte Concarneau</td></tr><tr><td>Melanogrammus aeglefinus</td><td>784</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Merlangius merlangus</td><td>217</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Micromesistius poutassou</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Pollachius virens</td><td>BPS-1724</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Pollachius pollachius</td><td>787</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Trisopterus luscus</td><td>224</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Trisopterus minutus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Raniceps raninus</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="10">Lotidae</td><td>Brosme brosme</td><td>BPS-0823</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Ciliata mustela</td><td>CE 6013</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td>Enchelyopus cimbrius</td><td>-</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Gaidropsarus mediterraneus</td><td>BPS-1192</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Gaidropsarus novaezelandiae</td><td>1300</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gaidropsarus vulgaris</td><td>220</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Molva dypterygia</td><td>218</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Molva macrophthalma</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Molva molva</td><td>785</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="10">Macrouridae</td><td>Bathygadus melanobranchus</td><td>BPS-0616</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Coelorinchus labiatus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Coryphaenoides armatus</td><td>1157</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Cynomacrurus piriei</td><td>9366</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Hymenocephalus italicus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Macrourus carinatus</td><td>1141</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Malacocephalus laevis</td><td>120</td><td>EVOHE</td></tr><tr><td>Nezumia sclerorhynchus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Trachyrincus scabrus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td rowspan="2">Melanonidae</td><td>Melanonus zugmayeri</td><td>BPS-0614/1994</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Melanonus gracilis</td><td>955</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td rowspan="10">Ophidiiformes</td><td rowspan="2">Merlucciidae</td><td>Macruronus magellanicus</td><td>1990-0981</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Merluccius merluccius</td><td>CE 9501</td><td>récolte Concarneau 2014</td></tr><tr><td rowspan="6">Moridae</td><td>Antimora rostrata</td><td>1147, 9182</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gadella maraldi</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Guttigadus kongi</td><td>9399</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Halargyreus johnsonii</td><td>9181</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lepidion ensiferus</td><td>9193</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lepidion lepidion</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td rowspan="2">Muraenolepididae</td><td>Mora moro</td><td>222</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Muraenolepis microps</td><td>1288</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Phycidae</td><td>Muraenolepis marmorata</td><td>1121</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Phycis blennoides</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td rowspan="10">Batrachoidiformes</td><td rowspan="2">Aphyonidae</td><td>Phycis phycis</td><td>BPS-0122</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Aphyonus gelatinosus</td><td>1973-0032</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Bythitidae</td><td>Cataetyx laticeps</td><td>BPS-0388/0631</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Grammonus ater</td><td>BPS-1799</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="5">Carapidae</td><td>Carapus acus</td><td>BPS-1532</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Echiodon dentatus</td><td>BPS-2225</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Echiodon cryomargarites</td><td>942, 9185</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Encheliophis boraborensis</td><td>1614</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Encheliophis homei</td><td>1613</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="5">Ophidiidae</td><td>Brotula clarkae</td><td>2002-1026</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Brotulotaenia crassa</td><td>BPS-0131/0155</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Lamprogrammus shcherbachevi</td><td>BPS-0510</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Holcomycteronus brucei</td><td>1304</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Ophidion barbatum</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td>Parabrotulidae</td><td>Parabrotula plagiophthalma</td><td>BPS-1989</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="5">Zeiformes</td><td rowspan="2">Cyttidae</td><td>Batrachoides surinamensis</td><td>A-4733</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Halobatrachus didactylus</td><td>229, 796</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="3">Grammicolepididae</td><td>Halophryne diemensis</td><td>1890-0286</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Opsanus tau</td><td>0000-9958</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Porichthys porosissimus</td><td>1965-0627</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="5">Oreosomatidae</td><td>Cyttus traversi</td><td>1996-0229</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Grammicolepis brachiusculus</td><td>1686, BPS-0220</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Xenolepidichthys dalgleishi</td><td>1135</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Allocyttus verrucosus</td><td>1137</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Neocyttus helgae</td><td>1130</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Parazenidae</td><td>Pseudocyttus maculatus</td><td>BPS-1956</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Cyttopsis rosea</td><td>1138, BPS-0645</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td></td><td>Zeidae</td><td>Zenopsis conchifer</td><td>813, 1132, 1019</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Zeus faber</td><td>CE 9502</td><td>récolte Concarneau 2014</td></tr><tr><td></td><td>Zenionidae</td><td>Zenion japonicus</td><td>1131, 1001</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="12">Beryciformes</td><td>Anomalopidae</td><td>Photoblepharon palpebratus</td><td>760</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Anoplogastridae</td><td>Anoplogaster cornuta</td><td>BPS-0635</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Barbourisiidae</td><td>Barbourisia rufa</td><td>1000, BPS-0132</td><td>coll. recherche MNHN, don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="2">Berycidae</td><td>Beryx decadactylus</td><td>BPS-1171</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Beryx splendens</td><td>1031</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="3">Cetomimidae</td><td>Cetomimus sp.</td><td>1991-0832</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Diretmoides sp.</td><td>998</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Diretmus argenteus</td><td>BPS-0623</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Hispidoberycidae</td><td>Hispidoberyx ambagiosus</td><td>1996-1501</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td rowspan="2">Holocentridae</td><td>Myripristis jacobus</td><td>BPS-2514</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Sargocentron hastatum</td><td>BPS-2521</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td rowspan="2">Melamphaidae</td><td>Melamphaes suborbitalis</td><td>BPS-0613</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Poromitra crassiceps</td><td>9296, 9190</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Monocentridae</td><td>Monocentris japonica</td><td>1996-0968</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Rondeletiidae</td><td>Rondeletia sp.</td><td>999</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="4">Stephanoberycidae</td><td>Stephanoberyx monae</td><td>1896-0195</td><td>coll. ichtyo. MNHN</td></tr><tr><td>Hoplostethus atlanticus</td><td>413</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Hoplostethus cadenati</td><td>BPS-0052</td><td>don S. Iglésias</td></tr><tr><td>Hoplostethus mediterraneus</td><td>-</td><td>MEDIT 2014</td></tr><tr><td rowspan="12">autres Percomorpha</td><td rowspan="4">Gobiaria</td><td>Apogon quadrifasciatus</td><td>1657</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gobius niger</td><td>194</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Pomatoschistus microps</td><td>CE 6016</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td>Ptereleotris zebra</td><td>1105</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="6">Pelagiaria</td><td>Aphanopus carbo</td><td>694, 698</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Centrolophus niger</td><td>357</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Kali macrura</td><td>202</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Pampus argenteus</td><td>865</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Scomber scombrus</td><td>1692</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Thunnus albacares</td><td>1178</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="5">Syngnatharia</td><td>Callionymus lyra</td><td>348, 360</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Dactylopterus volitans</td><td>907, 908</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Hippocampus ramulosus</td><td>200</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Mullus surmuletus</td><td>1644</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Nerophis lumbricoides</td><td>CE 6012</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td rowspan="4">Anabantaria</td><td>Betta splendens</td><td>422</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Indostomus paradoxus</td><td>1063</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Mastacembelus erythrotaenia</td><td>1646</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Monopterus albus</td><td>1650</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr></tbody></table>
<table><caption>**Tableau 4.2.2** : Taxons actuellement disponibles. Les taxons en gris sont uniquement obtenus à partir de spécimens de la collection d'ichtyologie du MNHN (le préfixe MNHN.IC. est à ajouter au numéro de spécimen). CE = numéros de collecte ; BPS = collection de recherche de S. Iglésias ; ICTI = collection de tissus du MNHN ; NSMT = Natural Sciences Museum Tokyo.</caption><tbody><tr><td rowspan="8">Carangaria</td><td>Bothus podas</td><td>890, 891</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Citharus linguatula</td><td>871</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Coryphaena equiselis</td><td>814</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Cynoglossus canariensis</td><td>872</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lates calcarifer</td><td>1603</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Psettodes belcheri</td><td>992</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Selene bidorsalis</td><td>869, 870</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Sphyraena sphyraena</td><td>905</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td rowspan="10">Ovalentaria</td><td>Trachurus trachurus</td><td>416</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Atherina presbyter</td><td>280</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Belone belone</td><td>748</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Cheilopogon heterurus</td><td>1685</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Chelon labrosus</td><td>16</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Dascyllus trimaculatus</td><td>66</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Hemichromis fasciatus</td><td>485, 487</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lepadogaster lepadogaster</td><td>705</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lipophrys pholis</td><td>CE 6017</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td>Liza ramada</td><td>CE 6011</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td rowspan="13">Eupercaria</td><td>Tripterygion delaisi</td><td>1675</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Acanthurus nigricans</td><td>1204</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Antennarius striatus</td><td>373</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Capros asper</td><td>16</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Chaetodipterus faber</td><td>1060</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Channichthys rhinoceratus</td><td>9329</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Cyclopterus lumpus</td><td>337</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Dicentrarchus labrax</td><td>131</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Diplodus sargus</td><td>1601, 1602</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Epinephelus clippertonensis</td><td>1163, 1171</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Gasterosteus aculeatus</td><td>325</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lepomis gibbosus</td><td>1628</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Lophius budegassa</td><td>419</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Mola mola</td><td>-</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Pungitius pungitius</td><td>-</td><td>récolte Bayeux 2014</td></tr><tr><td>Perca fluviatilis</td><td>-</td><td>don G. Denys</td></tr><tr><td>Prionotus rubio</td><td>691</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Rhinecanthus aculeatus</td><td>732</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr><tr><td>Symphodus melops</td><td>CE 6020</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td>Taurulus bubalis</td><td>CE 6018</td><td>récolte Bayeux 2013</td></tr><tr><td>Trachinus draco</td><td>14</td><td>coll. recherche MNHN</td></tr></tbody></table>
### 4.2.3 Extraction de l'ADN

L'ADN était déjà extrait pour une partie des spécimens de la collection de tissus du MNHN, mais j'ai dû réaliser de nouvelles extractions pour les spécimens obtenus par dons, collectes ou provenant des collections historiques. Les extractions sont effectuées à partir d'un fragment de tissu dans une solution de détergent CTAB, de β-mercaptoéthanol et de protéinase K, incubée à 60°C. L'extrait d'ADN est ensuite nettoyé au chloroforme et à l'isopropanol, avant d'être repris dans le tampon TRIS. Les extraits sont ensuite conservés au congélateur à environ -20°C. L'ADN dilué dans les extraits a été quantifié par des PCR en temps réel utilisant un réactif fluorescent (SYBR).

### 4.2.4 Séquençage de l'ADN

#### 4.2.4.a Séquençage en Sanger

Dans un premier temps, pour obtenir les séquences voulues, j'ai adopté l'approche "classique" d'amplification marqueur par marqueur et taxon par taxon, suivie d'un séquençage en Sanger, qui avait été adoptée pour la plupart des études précédentes.

Cette approche se base sur des *Polymerase Chain Reactions*, ou PCR, un protocole qui repose sur la multiplication cyclique d'un fragment d'ADN bien précis grâce à une ADN polymérase spéciale (Taq polymérase) fonctionnant à température donnée. La zone à amplifier est délimitée et donc définie par des fragments conservés d'ADN déterminés au préalable, les amorces, sur lesquelles se fixe la polymérase. Les amorces testées sont présentées dans le Tableau 4.2.3.

Pour le séquençage (externalisé au Génoscope, à Evry), j'ai utilisé la méthode Sanger. Avec cette méthode, chaque produit de PCR est mélangé avec des amorces, des ADN polymérides, des désoxyribonucléotides isolés et des didésoxyribonucléotides, qui agissent comme des terminateurs de la réplication de l'ADN. Ainsi, on obtient des fragments de différentes longueurs, ce qui permet (après tri des fragments par taille sur gel de polyacrylamide et révélation de la nature du dernier nucléotide synthétisé par des traceurs fluorescents spécifiques) de reconstituer la séquence.

La méthode Sanger a pour inconvénient principal de nécessiter un échantillon pur pour pouvoir fonctionner (sinon, la séquence sera illisible). Il faut donc impérativement séparer les réactions de PCR pour chaque taxon et pour chaque marqueur. Avec plus de 200 taxons et une trentaine de marqueurs, le temps de manipulation en laboratoire pour tout séquencer en Sanger et le coût total de ces manipulations est donc très important.
Après une première série de manipulations, basées sur un nombre restreint de marqueurs (Tableau 4.2.3) et une partie des taxons (uniquement les spécimens de la collection de tissus du MNHN), il s'est avéré qu'il serait impossible de couvrir l'échantillonnage entier avec cette approche pour différentes raisons :

- le temps nécessaire pour produire ces données ;

- le coût associé qui augmente proportionnellement à la taille de l'échantillonnage ;

- le faible taux obtenu de réussite des PCR (Tableau 4.2.3), qui, de fait, augmente encore plus le temps et le coût nécessaires pour obtenir tout l'échantillonnage.

Ce faible taux de réussite peut être expliqué par plusieurs facteurs :

- la faible qualité de préservation de l'ADN de certains spécimens, conservés en alcool depuis plus de 10 ans pour certains, alors que les PCR nécessitent une séquence continue de la région d'intérêt pour fonctionner ;

- le manque de spécificité des amorces pour certains taxons : la plupart de ces amorces ont été conçues à partir des premiers génomes complets d'acanthomorphes séquencés, c'est-à-dire le poisson-coffre *Takifugu rubripes* et l'épinoche *Gasterosteus aculeatus*. Ce sont des Percomorpha Eupercaria et l'efficacité des amorces diminue à mesure que le clade d'intérêt s'élargit. Elle devient donc faible à l'échelle des acanthomorphes. De nouvelles amorces, plus adaptées à l'ensemble de l'échantillonnage, ont été testées pour IRBP mais améliorent peu le taux de réussite, diminuant l'intérêt d'en produire de nombreuses autres pour l'ensemble des marqueurs.

La faible efficacité et le coût de cette méthode de séquençage m'ont donc poussé à adopter une approche différente pour obtenir le reste de mon échantillonnage après ces premiers tests.
<table><thead><tr><th>Gène</th><th>Amorce Forward</th><th>Amorce Reverse</th><th>T° optimale</th><th>Taux de réussite de l'amplification</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="5" style="text-align: center;">1ère série</td></tr><tr><td rowspan="2">Glyt</td><td>F559</td><td>R1562</td><td>55°C</td><td>15%</td></tr><tr><td>F577</td><td>R1464</td><td>62°C</td><td>50%</td></tr><tr><td rowspan="4">IRBP</td><td>F110</td><td>R936</td><td>52°C</td><td>30%</td></tr><tr><td>F44*</td><td>R723*</td><td>45°C</td><td>20%</td></tr><tr><td>F46*</td><td>R723*</td><td>45°C</td><td>12%</td></tr><tr><td>F147</td><td>R2300</td><td>52°C</td><td>12%</td></tr><tr><td>KIAA2022</td><td>F2018*</td><td>R2632*</td><td>52°C</td><td>60%</td></tr><tr><td rowspan="2">MC1R</td><td>F113</td><td>R841</td><td>58°C</td><td>22%</td></tr><tr><td>F51</td><td>R832</td><td>60°C</td><td>25%</td></tr><tr><td rowspan="2">MLL 4</td><td>U1570</td><td>L2080</td><td>50°C</td><td>30%</td></tr><tr><td>F1499</td><td>R2158</td><td>50°C</td><td>11%</td></tr><tr><td>PCDH19</td><td>F475*</td><td>R1174*</td><td>62°C</td><td>60%</td></tr><tr><td rowspan="2">PKD1</td><td>F62</td><td>R952</td><td>52°C</td><td>30%</td></tr><tr><td>F63</td><td>R737</td><td>54°C</td><td>10%</td></tr><tr><td>PTR</td><td>F463</td><td>R1242</td><td>62°C</td><td>60%</td></tr><tr><td>Rhodo</td><td>F193</td><td>R1039</td><td>52°C</td><td>6%</td></tr><tr><td rowspan="2">RIPK4</td><td>F57</td><td>R880</td><td>55°C</td><td>40%</td></tr><tr><td>F65</td><td>R766</td><td>56°C</td><td>2%</td></tr><tr><td>RNF213</td><td>F114</td><td>R828</td><td>52°C</td><td>40%</td></tr><tr><td rowspan="2">SREB2</td><td>F10</td><td>R1094</td><td>55°C</td><td>45%</td></tr><tr><td>F27</td><td>R1082</td><td>62°C</td><td>22%</td></tr><tr><td rowspan="2">SIDKEY</td><td>F116</td><td>R1360</td><td>62°C</td><td>17%</td></tr><tr><td>F247</td><td>R1355</td><td>58°C</td><td>12%</td></tr><tr><td>TBR1b</td><td>F86</td><td>R811</td><td>62°C</td><td>25%</td></tr><tr><td rowspan="2">ZFHX4</td><td>F1187*</td><td>R1882*</td><td>57°C</td><td>22%</td></tr><tr><td>F1451*</td><td>R1882*</td><td>58°C</td><td>20%</td></tr><tr><td colspan="5" style="text-align: center;">2e série</td></tr><tr><td>ENC1</td><td>F85</td><td>R982</td><td>55°C</td><td>50%</td></tr><tr><td>FICD</td><td>F166</td><td>R965</td><td>58°C</td><td>25%</td></tr><tr><td>HOXC6A</td><td>F215</td><td>R1129</td><td>58°C</td><td>62%</td></tr><tr><td>KIAA1239</td><td>F273</td><td>R2079</td><td>58°C</td><td>45%</td></tr><tr><td>MLL2</td><td>F100</td><td>R930</td><td>58°C</td><td>25%</td></tr><tr><td>MYH6</td><td>F459</td><td>R1325</td><td>55°C</td><td>87%</td></tr><tr><td>PLAGL2</td><td>F9</td><td>R930</td><td>55°C</td><td>50%</td></tr><tr><td>RAG1</td><td>F2533</td><td>R4090</td><td>52°C</td><td>37%</td></tr><tr><td>RAG2</td><td>F2</td><td>R1453</td><td>52°C</td><td>25%</td></tr><tr><td>RYR3</td><td>F22</td><td>R931</td><td>62°C</td><td>75%</td></tr><tr><td>SH3PX3</td><td>F461</td><td>R1303</td><td>55°C</td><td>50%</td></tr><tr><td>SSRP</td><td>F34</td><td>R600</td><td>55°C</td><td>12%</td></tr><tr><td>SVEP1</td><td>F7960</td><td>R8889</td><td>52°C</td><td>12%</td></tr><tr><td>VCPIP</td><td>F84</td><td>R946</td><td>52°C</td><td>50%</td></tr><tr><td>ZIC1</td><td>F9</td><td>R967</td><td>58°C</td><td>25%</td></tr></tbody></table>

Tableau 4.2.3 :

Couples d'amorces utilisés pour couvrir tout l'échantillonnage avec l'approche de Sanger (1ère série) et pour obtenir les sondes avec l'approche NGS (1ère et 2e série). Les amorces marquées d'une étoile sont nouvelles.
4.2.4.b Séquençage en NGS

Avec la popularisation du séquençage de matériel génétique dans tous les domaines de la
biologie, la demande s'est faite de plus en plus forte pour le développement de méthodes
permettant de séquencer de larges quantités de matériel simultanément, ce que les méthodes
comme le Sanger ne permettent pas. Cet ensemble de méthodes de séquençage massif sont
regroupées sous le nom de "séquençage de nouvelle-génération" (Next-Generation
Sequencing, NGS). L'application du NGS à la reconstruction phylogénétique en est encore à
ses débuts (McCormack et al., 2013) mais connaît actuellement un développement rapide.
Pour suivre ces développements technologiques prometteurs, le Service de Systématique
Moléculaire (SSM) du Muséum national d'Histoire naturelle s'est doté d'un séquenceur
nouvelle-génération de type IonTorrent, qui a été mis en service fin 2013, soit pendant le
déroulement de cette thèse.

En séquençant simultanément tous les échantillons, le NGS permet de réduire
drastiquement le nombre de manipulations à effectuer, et donc le coût par échantillon. De
plus, la présence de ce séquenceur dans les locaux du Muséum permet d'effectuer sur place
toutes les étapes de l'extraction au séquençage.

Quatre types d'approches sont couramment employés en NGS pour réduire la quantité de matériel génomique tout en enrichissant l'échantillon en un produit recherché :

- le multiplexage PCR ( *amplicon sequencing* ) se base sur le séquençage simultané de multiples produits de PCR, produites pour chaque taxon et chaque marqueur ;

- le RAD-seq se base sur la réduction du génome par des enzymes de restriction, permettant de récupérer de multiples fragments découpés au même endroit d'un taxon à l'autre sans aucune connaissance préalable du génome ;

- le transcriptome, où seuls les ARN transcrits (et donc, les portions codantes du génome) vont être séquencés ;

- l'enrichissement par capture ciblée (target enrichment) se base sur la capture, au sein d'un extrait génomique, de fragments d'ADN correspondant à des séquences choisies (Albert et al., 2007).

C'est cette dernière méthode que j'ai adopté pour obtenir mon échantillonnage. Afin de pouvoir intégrer les données existantes dans l'échantillonnage, j'ai ciblé les mêmes marqueurs que pour le séquençage en Sanger. Ces marqueurs sont tout d'abord amplifiés pour un petit nombre de taxons couvrant l'échantillonnage, produisant des fragments d'ADN de référence : les "sondes". Ces sondes vont ensuite être mélangées avec des extraits génomiques de tous les taxons de l'échantillonnage simultanément, regroupés en banques génomiques. Les sondes
vont alors capturer les séquences qui leur sont très similaires au sein des extraits génomiques, permettant d'enrichir l'ensemble de l'échantillonnage en une seule fois pour l'ensemble des marqueurs tout en évitant l'étape PCR pour chaque taxon et chaque marqueur. Les gains en coût et en temps sont donc importants.

Pour constituer mon échantillonnage en enrichissement ciblé, j'ai suivi le protocole suivant :

- Sélection des sondes :

Les sondes de référence doivent être produites pour tous les marqueurs recherchés et couvrir l'échantillonnage de sorte que les divergences entre les taxons ne soient pas trop importantes (ce qui pourrait empêcher l'hybridation). J'ai ainsi sélectionné huit taxons, pour lesquels j'ai amplifié trente de mes marqueurs par PCR : *Notolychnus valdiviae* (Myctophiformes), *Lampris immaculatus* (Lampridiformes), *Polymixia nobilis* (Polymixiiformes), *Gadus morhua*, *Merluccius merluccius* et *Ciliata mustela* (Gadiformes), *Zeus faber* (Zeiformes) et *Gasterosteus aculeatus* (Gasterosteiformes). Ces taxons ont été choisis pour leur couverture de l'échantillonnage et pour la qualité des échantillons dont je disposais. Deux d'entre eux (*Gadus* et *Gasterosteus*) sont séquencés pour le génome complet, permettant d'avoir une idée très précise de la structure de leur génome et de leur séquence pour les marqueurs d'intérêt.

- Préparation des sondes :

Les produits de PCR des taxons-sondes sont alors fragmentés par exposition à des ultrasons (sonication), dénaturés en simple-brin en élevant la température, puis biotinylés (on associe de la biotine aux fragments d'ADN par liaison covalente).

- Conception des banques d'ADN génomique :

Les NGS permettent de séquencer simultanément de nombreux fragments d'ADN génomiques. Néanmoins, au sein de ce mélange il n'est pas possible de reconnaître à quel taxon appartient chaque fragment. L'approche que j'ai adoptée consiste à ne mettre en commun que des espèces suffisamment éloignées phylogénétiquement. Les espèces de l'échantillonnage sont réparties par grand clade, chacun correspondant à un ou plusieurs taxons-sondes. Au sein d'un grand clade, chaque extrait d'ADN génomique va être attribué à une banque génomique distincte, afin de s'assurer que les taxons trop proches ne seront pas dans la même banque. C'est suivant l'affinité avec les séquences déjà connues (notamment celles des taxons-sondes) que l'on peut déterminer, après le séquençage, à quel grand clade (et donc à quelle espèce) appartient chaque séquence de chaque banque. Au sein d'une banque, il est important que les échantillons soient équimolaires. Une quantité plus ou moins importante d'extrait va donc être incluse dans la banque selon la richesse en ADN de l'échantillon.
- Préparation des banques :

L'ADN génomique contenu dans les banques va d'abord être fragmenté par sonication. Puis, les extrémités vont être réparées (end repair) afin d'y permettre la ligation des adaptateurs. Les adaptateurs sont des fragments courts d'ADN dont la séquence est connue. Un couple d'adaptateur est lié à chaque fragment génomique : un adaptateur universel qui permet l'amplification de la banque totale grâce à des amorces complémentaires, et un adaptateur spécifique à chaque banque. Ces adaptateurs spécifiques permettent de séparer (démultiplexer) les différentes banques après le séquençage, car l'étape suivante implique de mettre en commun les banques et d'amplifier l'ensemble de l'ADN génomique simultanément par PCR quantitative.

- Hybridation :

Les extraits d'ADN génomique sont d'abord dénaturés puis mis en commun avec les sondes biotinylées. En abaissant la température, sondes et extraits vont s'hybrider selon leur affinité. On obtient alors des dimères extraits-sondes biotinylées.

- Enrichissement des banques :

L'ADN génomique va être définitivement enrichi en capturant les fragments d'intérêt et en éliminant le reste. Des billes paramagnétiques de streptavidine sont ajoutées à la solution et se fixent par affinité forte à la biotine des sondes, elles mêmes hybridées avec les fragments génomiques recherchés. Le mélange est alors passé dans un banc magnétique, qui va attirer l'ensemble streptavidine-sonde biotinylée-extraits génomiques. Le reste de la solution, incluant tout le reste des ADN génomiques est ensuite élué par rinçages successifs, il ne reste donc plus dans le mélange que les fragments génomiques correspondant aux marqueurs d'intérêt.

- Obtention d'ADN double-brin :

Afin d'obtenir de l'ADN double-brin pour ces fragments, il convient de procéder à une étape de *strand displacement*: une ADN-polymérase spéciale (sans fonction exonucléase) va se fixer sur une amorce complémentaire à l'adaptateur universel, puis polymériser le brin complémentaire en "poussant" le complexe sonde biotinylée-streptavidine jusqu'à ce qu'il se décroche et puisse être élué.

- Séquençage :

A cette étape, la banque totale d'ADN génomique est enrichie et contient uniquement les fragments correspondant aux marqueurs choisis. Elle doit encore être amplifiée une nouvelle fois par PCR, selon un protocole impliquant une émulsion de l'extrait avec un mélange lipidique. Cette PCR à émulsion permet de lier l'ADN amplifié avec des microbilles : chaque
bulle microscopique formée lors de l'émulsion va abriter une bille et un petit nombre de
fragments qui s'amplifient à proximité, ce qui va favoriser l'homogénéité des fragments
d'ADN liés à chaque bille. Chacune d'entre elle, avec ses fragments d'ADN, va être insérée
dans un puits dans la puce de séquençage.

Le séquençage à proprement parler peut alors débuter. Avec les machines de type IonTorrent, les puits vont être arrosés séquentiellement et cycliquement par chaque type d'oligonucléotide pendant que des polymérides répliquent l'ADN fixé dans les puits. Si le type d'oligonucléotide correspond à celui qui vient dans la séquence, il va être incorporé et des ions H+ vont être libérés pendant la réaction. Ce sont ces ions hydrogène qui sont détectés par le séquenceur, qui va alors déterminer quel type d'oligonucléotide était fourni durant ce cycle et donc, de proche en proche, la séquence. Quand plusieurs nucléotides identiques se suivent ils vont être incorporés durant le même cycle : c'est alors l'intensité de l'émission en ions H+ qui va permettre à la machine de déterminer combien de nucléotides ont été insérés.

Cette méthode permet de séquencer l'ensemble de la puce en quelques heures. Une fois les reads (fragments d'ADN lus par la machine) récupérés informatiquement, ils peuvent être assemblés in silico pour reconstituer à quel marqueur chacun correspond et de quelle banque de départ il provient. En disposant de la banque de départ de l'échantillon et en comparant le read avec les séquences de référence dont l'on dispose, il est possible de remonter à l'identité du taxon ayant produit l'extrait. Le nombre de reads chevauchants à un locus donné donne une idée de la couverture du séquençage. Plus cette couverture est importante, plus la séquence sera fiable car répétée de nombreuses fois.

4.2.5 Résultats de séquençage

4.2.5.a Résultats du séquençage en Sanger

L'approche d'amplification en PCR taxon par taxon et marqueur par marqueur a été relativement peu efficace, avec des taux de réussite des PCR globalement bas (Tableau 4.2.3). La première série d'échantillons était constituée principalement de morceaux de tissus de la collection d'étude de l'équipe MNHN (Tableau 4.2.2) : elle ne couvrait qu'une partie de la diversité phylogénétique, une petite proportion du total des échantillons obtenus au cours de la thèse et la moitié des marqueurs. Avec cette approche pour cette première série d'échantillon, j'ai obtenu 120 séquences nouvelles en Sanger.
### 4.2.5.b Résultats du séquençage NGS

Une première session de séquençage a été effectuée avec une partie seulement de l'échantillonnage taxonomique car les spécimens issus des collections historiques n'avaient pas été extraits, nécessitant un protocole spécifique (Tableau 4.2.2). Les résultats ne furent pas concluants, aucun *read* obtenu n'ayant pu être identifié de façon sûre.

L'origine du problème est difficile à déterminer en raison du grand nombre d'étapes impliquées dans un tel séquençage. Il semblerait que les sondes produites par PCR soient en grande partie en cause : elles n'étaient pas assez riches en ADN et les échantillons n'étaient pas assez purs. L'hybridation, et donc l'enrichissement, ont donc dû avoir une efficacité limitée, réduisant le matériel disponible pour séquençage.

Pour tenter de remédier à ce problème, une deuxième session de séquençage a été lancée. Cette fois-ci, les sondes ont été directement synthétisées (en faisant appel à un prestataire extérieur) à partir des séquences publiées et des génomes complets : ainsi, les sondes sont pures et présentes en grande quantité. Elles seront testées avec l'ensemble des taxons retenus pour l'étude, y compris les spécimens historiques, et trois marqueurs supplémentaires (EGR1, 2B et 3). La phase de préparation des banques débutera en septembre 2015.

### 4.2.6 Intérêts et limites de l'approche d'enrichissement ciblé

Parmi toutes les approches disponibles pour le séquençage en NGS, l'enrichissement par capture ciblée semble particulièrement adapté pour le type d'étude de la thèse : la phylogénie à grande échelle incluant un grand nombre de marqueurs (McCormack et al., 2013). En effet, quand le nombre de marqueurs et de taxons augmentent le coût des manipulations de PCR (et pas uniquement du séquençage) devient prohibitif, ce qui rend l'approche de multiplexage de PCR peu attrayante. L'enrichissement par capture est ainsi l'une des méthodes les plus rapides et intéressantes financièrement dont on dispose actuellement (Mamanova et al., 2010; Lemmon & Lemmon, 2013).

Cette méthode permet également de choisir au préalable les zones enrichies, ce que n'autorise pas le RAD-seq, qui va couper aléatoirement le génome selon les sites de restriction disponibles. Pouvoir cibler des marqueurs d'intérêt permet de se limiter aux gènes codants, ou aux orthologues (comme ici) et de manière générale garantit d'obtenir des séquences homologues à des échelles bien plus importantes (une divergence trop importante entre les séquences peut modifier les sites de restriction et rendre problématique l'approche de RAD-
seq). Une approche qui a été appliquée avec succès pour la phylogénie des téléostéens (pour l'instant, avec un échantillonnage taxonomique limité) consiste à cibler et enrichir des éléments ultra-conservés (UCE) d'un génome à l'autre, à grande échelle phylogénétique. Des centaines de marqueurs peuvent ainsi être utilisés simultanément (Faircloth et al., 2012, 2013). Cette approche est prometteuse, mais pose la question de l'identification et de l'homologie de ces régions, qui peuvent correspondre à des éléments répétés ou paralogues. De plus, elle ne permet pas une comparaison avec les résultats précédents puisqu'elle n'utilise pas les mêmes marqueurs.

Un autre avantage de la méthode d'enrichissement ciblé est qu'elle permet d'obtenir des résultats avec des échantillons dont l'ADN est très dégradé (Templeton et al., 2013). En effet, la capture par hybridation peut fonctionner même avec de petits fragments, qui peuvent ensuite être assemblés pour reconstituer la séquence complète. En théorie, les résultats sur ce matériel seront donc meilleurs qu'avec une amplification par PCR, qui nécessite de disposer d'ADN matrice non fragmenté pour le marqueur ciblé.

Cette approche présente néanmoins des limites. Si l'ensemble des taxons et des marqueurs sont mis en commun et séquencés simultanément à l'inverse de la méthode Sanger, l'ensemble du processus comporte beaucoup plus d'étapes. Chacune de ces étapes est cruciale pour obtenir des résultats concluants et il peut donc être nécessaire de tout recommencer, ce qui est arrivé lors de ma première tentative. La multiplication des étapes peut également rendre l'origine du problème difficile à identifier. Cette méthode est néanmoins encore en développement ; il ne fait pas de doute que les protocoles vont encore être améliorés ce qui réduira ces difficultés.

Au moment où le projet de séquençage en NGS a été lancé dans le cadre de ma thèse, il s'agissait de la première étude de ce type chez les acanthomorphes. Depuis, des travaux sur les UCE ont été publiés (Faircloth et al., 2013; Eytan et al., 2015). Un virage méthodologique est en train de s'amorcer dans la communauté des systématiciens moléculaires entre les méthodes "classiques", comme le Sanger, et les NGS. La prise de ce virage permettra aux systématiciens de répondre aux difficultés posées par la diversité considérable des acanthomorphes en couvrant plus efficacement l'échantillonnage et de mettre en lien les travaux des différentes équipes en travaillant sur l'ensemble des marqueurs déjà utilisés. Les spécimens de collections anciennes pourront également être valorisés grâce à l'efficacité de méthodes comme la capture ciblée par hybridation pour obtenir des séquences d'ADN ancien et dégradé. Une autre conséquence du développement des NGS est l'explosion de la quantité de génomes complets qui seront disponibles dans les années à venir. Cette disponibilité des
données génomiques pour de nombreux taxons d'acanthomorphes (Bernardi *et al.*, 2012) rendra de nouvelles données accessibles pour la phylogénie : des séquences plus nombreuses et couvrant toutes les vitesses d'évolution, ainsi que des données plus qualitatives comme la position des gènes dans les chromosomes.

Malgré l'absence de résultats probants à l'heure où ces lignes sont rédigées, lancer ce projet de séquençage en NGS était donc pertinent et nous saurons rapidement si une autre approche doit être imaginée ou si c'est bien l'approche par enrichissement ciblé qui convient aux contraites de notre étude : taille de l'échantillon, rareté des spécimens, nombre de marqueurs exploités par les différentes équipes.
## 4.3 Analyse des données existantes

### 4.3.1 Objectifs

Disposer d'une topologie bien soutenue par les données moléculaires est indispensable pour permettre une discussion avec les résultats issus de la morphologie (chapitre 3). Les topologies déjà publiées se contredisent pour les relations à la base des acanthomorphes : une topologie unique n'est donc pas disponible avec les données actuelles.

Les incongruences entre les différents jeux de données peuvent être dues à la nature différente des marqueurs employés, ou à un échantillonnage incomplet et couvrant insuffisamment la base des acanthomorphes (4.1). Afin de répondre à ces problèmes potentiels, je propose ici une analyse simultanée des données existantes.

Dans cette analyse simultanée, je vais donc :

- combiner les données issues des différents marqueurs nucléaires d'une part (simulant ainsi partiellement mon jeu de données optimal), ainsi que des marqueurs nucléaires et mitochondriaux d'autre part ;

- apporter un éclairage sur l'impact des différents types de marqueurs sur la reconstruction phylogénétique ;

- combler au maximum les trous dans l'échantillonnage en mettant en commun les données disponibles ;

- élaborer un échantillonnage ciblant la zone phylogénétique d'intérêt : la base des acanthomorphes.

Pour constituer le jeu de données, je me suis basé sur les matrices des trois plus récentes analyses comprenant un large échantillonnage qui couvre à la fois la base des acanthomorphes, la diversité intra-percomorphes et les extra-groupes :

- B13 : la matrice de Betancur-R. et al. (2013) qui contient 20 gènes nucléaires ;

- N13 : la matrice de Near et al. (2013) qui contient 10 gènes nucléaires (tous présents également dans B13) ;

- M07 : la matrice de Miya et al. (2007) qui utilise les mitogénomes presque complets ; la région de contrôle n'est pas incluse, ni non plus le gène codant ND6 considéré comme peu adapté pour la reconstruction phylogénétique (Zardoya & Meyer, 1996; Miya & Nishida, 2000).
Les auteurs des trois études ont été contactés et ont fourni leurs matrices – les deux matrices basées sur les marqueurs nucléaires étaient par ailleurs disponibles sur la base de données Dryad (http://datadryad.org/).

Je n'ai pas utilisé la matrice de Li *et al.* (2009) qui aurait pu ajouter des marqueurs nucléaires supplémentaires, car elle couvrait mal la base des acanthomorphes et les extra-groupes.

### 4.3.2 Echantillonnage

Pour obtenir un échantillonnage comparable d'un jeu de données à l'autre et réduire au maximum les données manquantes des analyses combinées, j'ai conservé préférentiellement les taxons qui étaient communs aux trois jeux de données (Tableau 4.3.1). La taille de l'échantillonnage taxonomique de N13 et surtout B13 surpassant largement celle de M07, quasiment tous les taxons de ce dernier jeu de données sont inclus. Certains taxons n'étaient pas partagés au niveau spécifique, mais au niveau du genre. J'ai donc constitué dans certains cas des chimères de plusieurs espèces d'un même genre (ou de la même famille dans cinq cas). Les divergences potentielles entre les espèces concernées ont peu de chances d'affecter la reconstruction phylogénétique à l'échelle profonde couverte par cet échantillonnage.

Pour certains taxons (notamment au niveau des extra-groupes), le mitogénome n'était pas inclus dans M07, mais était disponible en ligne dans la base de données MitoFish (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/). J'ai alors inclus certains de ces mitogénomes pour compléter l'échantillonnage.

L'échantillonnage obtenu inclut 98 taxons. Il couvre tous les "grands clades" répétés de la base des acanthomorphes (voir chapitre 2) et les sept clades répétés de percomorphes.

Les marqueurs nucléaires inclus sont au nombre de 19, tous présents dans B13. Dix de ces marqueurs sont inclus dans N13. Ainsi, j'ai pu combler certaines lacunes de l'échantillonnage de B13 par des séquences de N13 pour ces dix marqueurs. Le marqueur RAG2 de B13 (absent de N13) n'a pas été inclus, car il ne couvrait aucun taxon de la base des acanthomorphes et n'était donc pas informatif dans le cadre de cette étude.

Malgré la combinaison des données de B13 et N13, il restait de nombreuses lacunes dans l'échantillonnage pour certains marqueurs (en particulier pour les gènes propres à B13 qui ne pouvaient bénéficier de l'appui de N13). Dans le cas de six d'entre eux (FICD, HOXC6A, Rhodo, SIDKEY, SVEP1 et VCPIP) ce manque d'information concernait tout particulièrement les taxons situés à la base des acanthomorphes. Une matrice nucléaire qui
n'incluait pas ces marqueurs a donc été constituée, pour contourner les potentiels effets négatifs des données manquantes.

Pour les mitogénomes, les marqueurs non-codants (les ARN-t, les ARN-r 12S et 16S) étaient très complexes à aligner avec les nouvelles données provenant de MitoFish, en raison de l'absence de cadre de lecture, mais aussi parce que les auteurs de la publication originale n'ont utilisé que certaines régions non-contiguës de ces marqueurs, sans spécifier précisément lesquelles (Miya et al., 2007). Face à cette difficulté d'alignement et de présomptions concernant le manque d'information à grande échelle de ces marqueurs (Meyer, 1993; Mueller, 2006), j'ai décidé de ne pas les inclure. La publication originale (Miya et al., 2007) proposait quatre analyses différentes (avec et sans les troisièmes positions de codons, avec et sans le codage des troisièmes positions en RY – c'est-à-dire en purines-pyrimidines, et avec et sans les insertions-délétions). J'ai conservé la matrice contenant le plus d'informations (troisièmes positions incluses sans RY et avec les insertions-délétions).

Les séquences provenant de M07, B13, N13 et MitoFish ont été segmentées par marqueurs sous Geneious v.7.1.7 (Drummond et al., 2011), alignées sous MEGA v.6.06 (alignement automatique avec Muscle, suivi d'une vérification visuelle) et re-concaténées sous Geneious.

La matrice complète concaténée comporte 28082 paires de bases, avec 29,6 % de données manquantes et 49,2 % de sites informatifs. Elle inclut le jeu de données nucléaires complet (16947 pb, 47,7 % de données manquantes, 41,4 % de sites informatifs) et le jeu de données mitochondriales (11135 pb, 2,27 % de données manquantes, 61 % de sites informatifs). Le jeu de données nucléaires partiel, qui exclut les marqueurs les plus incomplets, comporte 11413 paires de bases dont 35,4 % de données manquantes.

### 4.3.3 Méthodes d'analyse

Au total, quatre analyses ont été effectuées :

- une analyse du jeu de données nucléaires complet (19 marqueurs);

- une analyse du jeu de données nucléaires partiel (les six marqueurs les moins informatifs à la base de l'arbre en sont exclus);

- une analyse du jeu de données mitochondriales;

- une analyse combinée des jeux de données nucléaires complet et du jeu de données mitochondriales.
Les analyses séparées des données nucléaires et mitochondriales permettent de comprendre comment chaque type de données influe sur la topologie. Elles permettent également de déterminer quels clades sont fiables car répétés, ces deux jeux de données étant indépendants. Il aurait été intéressant d'analyser chaque jeu de données marqueur par marqueur, ce qui aurait autorisé une discussion plus fine sur les performances des différents marqueurs et sur la répétabilité des clades. Je n'ai pas été en mesure d'effectuer ces analyses séparées par manque de temps au vu de la durée des analyses (environ 72 heures en moyenne) et de l'impossibilité de paralléliser trop d'analyses en même temps.

Les quatre jeux de données ont été analysés avec BEAST v.1.8.2 (Drummond & Rambaut, 2007), un programme de phylogénie utilisant l'inférence Bayésienne. Cette méthode de reconstruction est celle qui permet de comparer directement les résultats avec ceux des études originelles : M07 avait été analysé en inférence Bayésienne avec le programme MrBayes ; B13 et N13 avaient été analysés en maximum de vraisemblance avec RaxML, mais dans les deux cas, une estimation des temps de divergence avait été produite avec BEAST, obtenant une topologie identique (Miya et al., 2007; Betancur-R. et al., 2013; Near et al., 2013). En outre, les jeux de données destinés à être analysés par BEAST peuvent être formatés à l'aide du programme BEAUti v.1.8.2 (Drummond et al., 2012), rendant intuitive et simple la préparation des fichiers et permettant de revoir et modifier en un coup d'œil l'ensemble des paramètres de l'analyse.

BEAST est couramment utilisé pour estimer les temps de divergence entre les taxons et les paramètres à spécifier avant l'analyse incluent les modèles d'horloge moléculaire. J'ai tenu compte de ces paramètres pour ne pas fausser la reconstruction phylogénétique, mais n'ai pas inclus d'âge minimaux pour les clades car :

- cela aurait encore augmenté le temps de calcul ;

- les marqueurs utilisés peuvent ne pas être adaptés pour estimer les temps de divergence – c'est notamment le cas pour les marqueurs mitochondriaux (Dornburg et al., 2014).

Je n'ai donc pas tenu compte de l'estimation des temps de divergence (faussés sans la spécification d'âges minimaux) pour cette étude.

Les quatre jeux de données ont été partitionnés gène par gène pour préciser l'estimation des paramètres. Les trois positions de codons ont été également séparées (sauf pour l'intron non-codant HOXC6A). Le modèle de substitution le plus approprié a été estimé avec jModelTest2, et le modèle GTR+I+Γ a été utilisé pour toutes les partitions. Le modèle d'horloge moléculaire utilisé était le log-normal non-corrélé, ou UCLN (Drummond et al.,
2006). Le modèle de spéciation choisi était "speciation birth-death with incomplete
sampling", en raison de l'échelle phylogénétique de l'étude (plus de spéciations que de
coalescences) et de l'incomplétude du jeu de données due à l'échantillonnage et aux
extinctions (Stadler, 2010). La longueur des chaînes de Markov-Monte Carlo (MCMC) a été
définie à 20 millions, avec un échantillonnage tous les 10 000 arbres.

Les analyses ont été effectuées sur les serveurs dédiés aux analyses phylogénétiques
Cipres (https://www.phylo.org/), en lançant quatre réplicats de chaque analyse en parallèle (ce
qui permet de réduire le temps de calcul). Les fichiers de sortie ont été analysés avec
TRACER v.1.6 (Drummond et al., 2012), un programme inclus dans le package de BEAST,
qui permet de vérifier la solidité des analyses produites : visualisation (et élimination) du
"burn-in", calcul des tailles effectives d'échantillons (ESS) pour chaque paramètre (si elles
sont supérieures à 200, les paramètres ne sont pas corrélés entre eux) et convergence des
paramètres estimés entre les quatre réplicats. Les quatre réplicats étaient toujours convergents
(sauf pour un des réplicats de l'analyse du jeu de données mitochondrial) et leurs paramètres
de sortie ont pu être combinés (une fois les burn-in éliminés) avec LogCombiner v.1.8.2
(Drummond et al., 2012). Les ESS étaient largement supérieures à 200 pour tous les
paramètres une fois les réplicats combinés. Ensuite, avec TreeAnnotator v.1.8.2 (Drummond
et al., 2012), les fichiers de sortie combinés pour chaque analyse ont été résumés, l'arbre
optimal a été extrait et les valeurs de probabilités postérieures pour tous les clades ont été
calculées.