# Dosage du fer et étude de la peroxydation lipidique dans le liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose prise en charge en FIV+/-ICSI AU CHU d'Amiens

Alizée Desruelle

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Alizée Desruelle. Dosage du fer et étude de la peroxydation lipidique dans le liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose prise en charge en FIV+/-ICSI AU CHU d'Amiens. Gynécologie et obstétrique. 2024. dumas-04715714

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UNIVERSITE PICARDIE JULES VERNE

FACULTE DE MEDECINE D'AMIENS

THESE POUR LE DIPLOME D'ETAT DE DOCTEUR EN MEDECINE

Année 2024

Thèse n°2024-57

Spécialité : Gynécologie Médicale

DOSAGE DU FER ET ETUDE DE LA PEROXYDATION LIPIDIQUE
DANS LE LIQUIDE FOLLICULAIRE DE PATIENTES ATTEINTES
D'ENDOMETRIOSE PRISE EN CHARGE EN FIV+/-ICSI
AU CHU D'AMIENS

PRESENTEE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT LE 14 JUIN 2024

PAR

DESRUELLE Alizée

Née le 26 septembre 1995 à Villeneuve d'Ascq

JURY

Président :
Madame le Professeur Rosalie CABRY-GOUBET

Assesseurs :
Monsieur le Professeur Antoine GALMICHE
Monsieur le Professeur Moncef BEN KHALIFA

Directeur de thèse :
Madame le Docteur Albane VANDECANDELAERE
# Remerciements

## A mon président de jury :

Madame le Professeur Rosalie CABRY-GOUBET

Professeur des Universités – Praticien Hospitalier

Histologie et Embryologie

Chef du Service de Médecine et Biologie de la Reproduction et CECOS de Picardie

CHU Amiens Picardie, Centre de Biologie Humaine

C'est un honneur pour moi que vous soyez président de mon jury de thèse.

Merci de juger mon travail et merci pour votre soutien, votre empathie et votre dévotion envers la gynécologie médicale et le service de médecine et de biologie de la reproduction.

Je suis extrêmement fière de faire partie de cette équipe.
A mes juges :

Monsieur le Professeur Antoine GALMICHE

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier
Chef du Laboratoire de Biochimie
Centre de biologie humaine

Je vous remercie d'être présent dans le jury de cette thèse.

Merci d'avoir permis à ce travail de voir le jour ainsi qu'à votre équipe de biochimie pour la
réalisation des dosages.

Merci pour votre disponibilité et votre professionnalisme.
Monsieur le Professeur Moncef BEN KHALIFA

Professeur des Universités – Praticien Hospitalier
Médecine et Biologie de la Reproduction et du Développement

Je vous remercie de faire partie de mon jury de thèse et de juger ce manuscrit.

Merci pour votre implication dans ce travail de recherche « ENDOFIV » ainsi que dans le service de médecine et de biologie de la reproduction.
## A ma directrice de thèse :

Madame le Docteur Albane VANDECANDELAERE

Chef de Clinique des Universités et Assistant des Hôpitaux
Gynécologie Médicale, Médecine et Biologie de la reproduction
CHU Amiens Picardie

Tu as été la meilleure des directrices de thèse que je puisse avoir.

C'est un honneur pour moi que de faire ma thèse en reprenant la suite de ton travail sur
« ENDOFIV ».

Je ne pourrai jamais assez te remercier pour ta patience, ta bienveillance, ton perfectionnisme et ton professionnalisme.

Merci pour tout le temps que tu as passé à relire mes « dernières versions » (et aux siestes de Romane pour avoir permis de te libérer un peu de temps).

Je n'y serai jamais arrivée sans toi.
Je tiens à exprimer ma reconnaissance et mes remerciements à :

Dr BOSQUET Dorian, un immense merci pour avoir réalisé mes analyses statistiques, merci pour ta rapidité et ta disponibilité. En plus d'être un excellent statisticien, tu es un collègue formidable et c'est un plaisir de travailler avec toi.

Mr LOUANDRE Christophe et Mme GODIN Corinne pour m'avoir aidé en réalisant les dosages de cette étude. Merci de m'avoir montré votre laboratoire et la façon de doser les TBARS.
## A ma famille,

Maman, Moon, merci d'être pour moi la meilleure des mamans du monde.
Merci de m'avoir transmis ta détermination, ton immense courage, ta combativité par l'intermédiaire du tennis mais aussi tout l'amour que j'ai reçu dans mon enfance et reçoit encore aujourd'hui. Merci pour ton soutien sans faille pendant mes études, pour m'avoir chouchouté avec tes petits plats, pour avoir su trouver les mots quand ça n'allait pas, pour avoir été un pilier et une épaule sur laquelle se reposer. Tu as participé grandement à ma réussite et je t'en remercie. Je t'aime énormément.

Papa, Poon, merci d'être le merveilleux père que tu es.
Tu m'as transmis ton intelligence, ton humour, ta sociabilité, ton altruisme et ta gentillesse.
Merci d'avoir cru en moi et de m'avoir conseillé de redoubler ma première année de médecine.
Sans toi, je ne serai pas là où je suis aujourd'hui. Merci pour le couple exemplaire que tu formes avec maman, votre amour m'a toujours porté et accompagné dans tout ce que j'entreprends. Je t'aime énormément aussi.

Solène, mimine, ma sœur, ma moitié, mon « mini moi ».
Depuis toute petite nous sommes inséparables, des jumelles, jamais l'une sans l'autre. Je veillais sur toi et je veillerai sur toi toute ma vie. Tu es une boule de joie et de bonne humeur et tu rayonnes partout, tout le temps. Merci d'avoir été à mes côtés pendant toutes ces années de médecine, tu as su me détendre quand il fallait (souvenirs de nos chants et danses dans ma chambre) et me soutenir à chaque étape de mon parcours.
J'aimerai ne jamais être trop loin de toi.
Je serai toujours là et je suis fière de la femme que tu es.

## A mes grands-parents,

A ma Mumbly chérie, merci d'avoir été une incroyable grand-mère.
Merci pour toutes les vacances scolaires que j'ai passé chez toi à Calais, merci pour les bonbons dans mon caddie champion, pour les beignets tunisiens et les vacances à Lacanau.
Merci pour cette complicité que l'on avait et pour tout l'amour que tu m'as donné.
J'espère que de là où tu es, tu es fière de moi. Tu me manques tous les jours.

A mon Papy, merci pour le formidable grand-père que tu as été.
Merci de m'avoir conduit au tennis et de m'avoir donné du chocolat quand j'avais des bons bulletins. Merci pour ces vacances et week-end passés en Vendée avec Chantal.
Je n'oublierai jamais la façon dont tu avais de m'appeler ta « Toubib ».
Je pense à toi tous les jours et tu es avec moi au quotidien.

A Monique et Christophe, merci de faire partie de notre famille, merci d'avoir été présents pour moi et de venir à chacun de mes anniversaires, c'est un réel plaisir d'avoir créé ce lien et de continuer à se voir régulièrement !
Je vous compte parmi mes grands-parents maintenant.
A mes oncles, tantes, cousins et cousines,

A ma marraine Isabelle et mes cousins Lydwine et Geoffroy, merci pour tous ces moments
passés en Auvergne depuis que je suis petite, merci de m'avoir fait aimer votre région, toutes
les baignades dans la Loire, l'Aligot et les spectacles de danse !
Je garde de superbes souvenirs de moments passés avec vous !

A Tata Marion et tonton Pierre-jean, Sacha, Lou, Nine : merci pour tous ces superbes noëls
passés chez vous et j'espère qu'il y en aura encore beaucoup !
Merci pour votre bienveillance, votre gentillesse et votre humour de Desruelle !

A ma belle-famille,

A Fred et Valérie, merci de m'avoir accueillie dans votre famille, nous passons toujours de
superbes moments ensembles, que ce soit pendant les vacances (Mexique et Espagne) ou le
dimanche. Vous êtes de supers beaux-parents et j'ai de la chance de vous avoir.

A mes belles-sœurs adorées, Rosa et Lili, a trois on forme un trio de choc ! Merci pour tous les moments que l'on a partagés et j'espère qu'il y en aura beaucoup d'autres !

A mon beau-frère, Greg, merci pour tous ces moments que l'on a vécus ensemble, tu reviens quand tu veux sur Amiens et on repart quand aux Philippines ?
Un immense merci également d'avoir corrigé mes fautes d'orthographes, tu m'as vraiment aidé !

A mes amis de Lille,

Orel, ma meilleure amie depuis plus de 10 ans déjà !
J'ai tant de merveilleux souvenirs passés avec toi, tu es mon journal intime, celle qui connait toute ma vie ! Merci pour ton soutien pendant toutes ces années de médecine, tu ne m'as jamais laissé tomber et je t'en remercie.

A toutes les années passées ensembles et toutes celles du reste de notre vie !
Merci d'être celle que tu es, et d'être toujours à mes côtés. Je t'aime très fort !

A ma team des championnes, Solène, Camille, Julie et Victoire.
Merci pour ces formidables années passées ensemble, depuis l'intégration chez les BBC, en passant par le voyage au Brésil ainsi que toutes nos années d'externat où l'on s'est soutenues pendant les révisions en média, les pauses en cafet, les examens et jusqu'à l'ECN.
Et maintenant on se retrouve pour passer de superbes moments toutes ensemble,
Vous êtes de vraies amies et je vous aime vraiment beaucoup.

A ma team « Fourfour plus », Camille, Juliette et Clémence.
Merci pour toutes ces incroyables années passées à Supmed, toutes les soirées, salons de l'étudiant, médiweek-end et a tous nos week-end pendant l'internat, nous sommes un petit peu plus éloignées géographiquement mais je sais que l'on continuera à se voir, je vous adore !
A mes binômes de P1, Zoé « Zoui » merci pour les fou-rires en amphithéâtre et d'avoir affronté l'épreuve de Gayant Expo avec moi.

Mathilde et Edouard puis Lorette et Coco, merci pour toutes les fois où l'on a partagé nos doutes, nos joies, nos larmes et notre passage en 2ème année.

A mes amis de longue date, Germain, John et Rose, merci pour toutes ces soirées et nouvel an passés ensemble, je ne garde que de bons souvenirs !

## A mes amies d'Amiens,

Cristina, mon binôme, mon acolyte.

Merci d'être à mes côtés depuis notre premier jour d'internat à Compiègne.

Depuis nous ne nous sommes jamais quittées. Merci pour ta bonne humeur, ta joie de vivre, ta gentillesse et pour tous les moments qu'on a passé ensemble depuis que je suis à Amiens.

Tu es quelqu'un sur qui je peux compter, je serai toujours là pour toi et je tiens énormément à toi !

Anaïs, nous nous sommes connues lors de mon 1er stage à Compiègne, puis on s'est retrouvée en PMA à Amiens et à Senlis, merci pour tous les moments passés à raconter les potins, regarder les sacs à main et rigoler ensemble.

Je te compte vraiment parmi mes amies maintenant et j'espère que l'on gardera toujours contact.

## A mes co-internes,

A mes co-internes de Gynéco Méd : Guillaume, mon co-interne de promo, Camille, Bérénice et Julie, merci pour tous les moments passés en stage ensemble, je ne garde que des bons souvenirs (et surtout à la cafétéria).

A mes co-internes du 1er semestre de Compiègne : Valoche, Claire, Lionel, Sophie, Morgane et Isma, merci toutes ces folles soirées passées ensemble à l'internat !

A mes co-internes du 1er semestre au CHU : Célia, Yann et Xavier, on s'est serrés les coudes et on a passé de superbes moments ensembles, entre les tonus, les pots de thèse et les cafés, merci pour ces moments que je n'oublierai jamais !

## A mes chefs de gynéco méd,

Merci à Claire, Camille, Océane, Maryam et Caroline pour tous ce que vous m'avez appris, vous avez toujours été très pédagogues et disponibles quand j'en avais besoin !

A Dr Cabry : merci pour votre accompagnement, votre bienveillance et l'encadrement que vous faites auprès des internes, je me suis toujours sentie accueillie et épaulée.

A Dr Lourdel : merci de m'avoir appris à ponctionner le jeudi matin et merci pour toutes les connaissances que vous m'avez transmises !
Au service d'AMP,

A la biologiste Elodie Lefranc, merci pour ta gentillesse et ta pédagogie, tu as toujours été très sympa avec moi !

Aux techniciens du labo : Amandine, Séverine, Audrey, Elodie, Benoit : vous avez toujours été très agréables et gentils avec moi, j'adore travailler avec vous !

A mes trois secrétaires préférées : Béné, Laurette et Audrey : merci pour votre bonne humeur et votre joie de vivre, c'est un réel plaisir de travailler avec vous !

Merci à toutes les personnes du CH de Compiègne, les gynécologues-obstétriciens, sage-femmes, infirmières, aides-soignantes mais aussi l'équipe du CH de Senlis, gynécologues, biologistes et secrétaires et à toutes les personnes qui ont croisé mon chemin durant cet internat.

Et pour terminer (le meilleur pour la fin),

A mon Bidou, l'amour de ma vie, mon confident, mon meilleur ami, mon âme sœur.

Merci de partager ma vie au quotidien, merci de m'écouter parler pendant des heures et de répondre à toutes mes questions.

Merci pour ton soutien sans failles dans toutes les épreuves de la vie, merci pour ton immense courage et ta détermination, merci pour la complicité que nous avons.

Je veux continuer à rigoler à tes côtés tous les jours de ma vie.

A nous, et au merveilleux avenir qui nous attend.

Je t'aime
# Abréviations

**FIV** Fécondation in vitro

**ICSI** Intra Cytoplasmic Sperm Injection

**CHU** Centre Hospitalo-Universitaire

**ATP** Adénosine TriPhosphate

**ROS** Espèces Réactives de l'Oxygène

**MIV** Maturation In Vitro

**8OHdG** 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine

**TNF** Tumor Necrosis Factor

**MDA** Malondialdéhyde

**TBARS** Thiobarbituric Acid Reactive Substances

**TDA** Tryptophane désaminase

**GPX4** Glutathion peroxydase 4

**NCOA4** Nuclear receptor coactivator 4

**mRNA** Messenger Ribonucleic acid

**AMH** Hormone Anti-Mullérienne

**IRM** Imagerie par Résonnance Magnétique

**FSH** Hormone Folliculo-stimulante

**LH** Hormone Lutéinisante

**IMC** Indice de Masse Corporelle

**E2** Estradiol

**EDTA** EthylèneDiamineTétracétique

**BHT** ButylHydroxyToluène

**CCO** Compexe Cumulo-Ovocytaire
# Sommaire

## Table des matières

<table><tr><td>Remerciements</td><td>3</td></tr><tr><td>Abréviations</td><td>17</td></tr><tr><td>Sommaire</td><td>18</td></tr><tr><td>I. Introduction</td><td>20</td></tr><tr><td>1.1 Endométriose : généralités et hypothèses sur les mécanismes de l'infertilité</td><td>20</td></tr><tr><td>1.2 Stress oxydant médié par le fer</td><td>24</td></tr><tr><td>1.3 Impact du stress oxydant médié par le fer dans l'infertilité</td><td>26</td></tr><tr><td>II. Matériels et Méthodes</td><td>29</td></tr><tr><td>1.1 Population étudiée</td><td>29</td></tr><tr><td>1.2 Stimulation ovarienne</td><td>30</td></tr><tr><td>1.3 Prélèvement folliculaire</td><td>30</td></tr><tr><td>1.4 Dosage de fer</td><td>31</td></tr><tr><td>1.5 Dosage de TBARS par la méthode de YAGI</td><td>31</td></tr><tr><td>1.6 Taux de maturité nucléaire ovocytaire, de fécondation, qualité embryonnaire et résultats cliniques</td><td>33</td></tr><tr><td>1.7 Analyse statistique</td><td>34</td></tr><tr><td>III. Résultats</td><td>35</td></tr><tr><td>1.1 Caractéristiques de la population</td><td>35</td></tr><tr><td>1.2 Résultats sur le critère de jugement principal</td><td>37</td></tr><tr><td>1.3 Impact de l'endométriose, du fer et de la peroxydation lipidique sur les résultats de FIV.</td><td>37</td></tr><tr><td>IV. Discussion</td><td>42</td></tr><tr><td>1.1 Résultats des analyses dans le liquide folliculaire</td><td>42</td></tr><tr><td>V. Conclusion</td><td>48</td></tr></table>
<table><tr><td>Liste des figures</td><td>49</td></tr><tr><td>Liste des tableaux</td><td>50</td></tr><tr><td>Références</td><td>51</td></tr><tr><td>Annexe 1</td><td>56</td></tr><tr><td>Résumé / abstract</td><td>57</td></tr></table>
# I. Introduction

## 1.1 Endométriose : généralités et hypothèses sur les mécanismes de l'infertilité

L'endométriose est une maladie inflammatoire chronique bénigne, définie par la présence de tissus endométrial en dehors de l'utérus.

Elle touche 6 à 10 % des femmes en âge de procréer, et les symptômes principaux sont : les dysménorrhées, les dyspareunies, les douleurs pelviennes chroniques et l'infertilité (1).

On distingue trois formes principales d'endométriose : endométriose superficielle et endométriose profonde avec ou sans endométriose (2). Les formes ovariennes pures sont rares (1%).

Environ 25 % des patientes atteintes d'endométriose présenteront une infertilité (3). Ces patientes, quand elles sont prises en charge en FIV, présentent 15% de chances en moins d'obtenir une grossesse par rapport aux causes d'infertilité tubaire (4).

Les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent cette infertilité ne sont pas encore parfaitement connus. Il semble déjà admis que l'inflammation péritonéale chronique, propre à cette pathologie, altère le processus de fécondation des gamètes et que les adhérences pelviennes diminuent la fonctionnalité des trompes (4).

Il se pose également la question d'une altération de la qualité ovocytaire et d'un défaut de réceptivité endométriale (5).

L'objet de cette étude est de mettre en évidence des biomarqueurs de la qualité ovocytaire chez des patientes atteintes d'endométriose avec une réserve ovarienne normale.

Il faut revenir sur la physiopathologie du développement de l'endométriose pour comprendre cette hypothèse. La physiopathologie de l'endométriose est éminemment complexe et plusieurs hypothèses co-existent : la métaplasie müllérienne, les embolies lympho-vasculaires des cellules endométriales, la prolifération de cellules souches endométriales et enfin, la plus répandue celle du reflux menstruel (2).

Lors du reflux menstruel, des cellules endométriales traversent les trompes de Fallope jusqu'à la cavité péritonéale. Ce phénomène concerne 80% des femmes en âge de procréer (3).
L'endométriose se développe quand les cellules endométriales persistent et s'implantent au sein du péritoine. Ce mécanisme est probablement en lien avec un échappement à la clairance immunitaire et à une neuro-vascularisation qui sont spécifiques de cette pathologie (1)(2).

Il existe par ailleurs un excès de fer au sein du liquide péritonéal de ces patientes (6)(7).

Ces données font sens avec la théorie du reflux via la lyse des érythrocytes menstruels au sein de la cavité péritonéale et le relargage de fer (8). Il semble, de plus, y avoir une corrélation entre les concentrations péritonéales en fer et la gravité de la maladie (9).

Enfin, il est également déjà connu que les endométriomes sont des kystes particulièrement riches en fer avec des modifications histologiques de la corticale à proximité (10).

Concernant le fer dans le liquide folliculaire :

Singh et al ont déjà montré que le taux de fer dans le liquide folliculaire des femmes atteintes d'endométriose pelvienne profonde (avec ou sans endométriomes) était plus élevé que celui des femmes souffrant d'infertilité tubaire prise en charge en FIV (11), Sanchez et al, ont démontré de plus que la teneur en fer dépendait de la distance du follicule par rapport à l'endométriope (12).

A contrario, Benaglia et al n'ont pas retrouvé de différence significative sur le dosage du fer dans le liquide folliculaire issu d'un ovaire porteur d'un endométriope par rapport à l'ovaire controlatéral (13). Ils avaient par contre retrouvé un augmentation significative de la ferritine au sein du liquide folliculaire de l'ovaire porteur d'endométriope.

Ces données soulèvent la question d'un éventuel impact du fer sur le microenvironnement folliculaire, la communication ovocyte/cumulus et sur l'infertilité médiée par l'endométriose (14).

En parallèle, il est déjà bien établi que les lésions d'endométriose sont vecteurs de stress oxydant et de phénomènes inflammatoires qui participent au développement lésionnel (15)(16).

Le stress oxydant est un état de stress biologique caractérisé par un excès d'espèces réactives de l'oxygène. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont des radicaux libres issus de molécules d'O2 qui ont perdu un ou plusieurs électrons et deviennent des réactifs pro-oxydants.

Une des sources physiologiques de réactifs de l'oxygène est la chaîne respiratoire de la mitochondrie lors de la production d'ATP. Ils peuvent aussi émaner de réactions avec des molécules à potentiel oxydatif comme le fer ou le nitrogène par exemple.
A l'état d'équilibre, ces radicaux libres ont un rôle physiologique dans la folliculogenèse. Les cellules folliculaires produisent elle-même des ROS et celles-ci sont indispensables à la reprise de la méiose ainsi qu'à l'ovulation.

Cependant, en excès, les espèces réactives de l'oxygène peuvent altérer les composants cellulaires notamment les lipides membranaires, les protéines et les acides nucléiques (cassure de l'ADN). Ils peuvent être responsables à l'extrême de la survenue de mort cellulaire (17).

Plusieurs types de morts cellulaires induites par le stress oxydant sont décrites. L'une d'elles est particulièrement liée à l'action oxydante du fer : la ferroptose.

Celle-ci implique un défaut de régulation des espèces réactives de l'oxygène de la cellule en limitant l'action du glutathion et des espèces antioxydantes et induisant une peroxydation lipidique importante (18).

Enfin, dans cette étude, les auteurs s'intéressent tout particulièrement au micro-environnement ovocytaire : le liquide folliculaire.

L'analyse du liquide folliculaire comme outil d'évaluation de la qualité ovocytaire est particulièrement intéressant tant l'évaluation morphologique des ovocytes est encore difficile, non standardisée et opérateur dépendant (description d'un espace périvitellin augmenté, un ovocyte granuleux, une zone pellucide vide, un réticulum endoplasmique lisse...) (19). Il n'existe pas, à l'heure actuelle, de critères validés pour déterminer morphologiquement la qualité ovocytaire.

Le liquide folliculaire est un composé spécifique de la folliculogenèse terminale, il apparaît à partir du stade « antral » du développement folliculaire. Il est le fruit de la communication fine entre l'ovocyte et les cellules de la granulosa, cellules indispensables à l'ovogenèse et à la stéroïdogenèse.

Les cellules de la granulosa sont à l'origine de son apparition en sécrétant de larges molécules de haut poids moléculaire (protéoglycanes), créant ainsi un gradient osmotique et permettant la diffusion du plasma issu des capillaires de la thèque vers l'antrum (20)(21).

Le liquide folliculaire est composé de nombreux électrolytes, substrats énergétiques, métabolites, facteurs de croissance ainsi que d'hormones (21). Il est donc le reflet de la communication ovocyte/cellules de la granulosa, indispensable à la maturation et à l'obtention des compétences ovocytaires qui permettront le développement embryonnaire.
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1 : représentation schématique d'un follicule antral (22)**</figcaption></figure>

Certaines études ont déjà tenté d'évaluer la qualité ovocytaire dans l'endométriose indépendamment de la réserve ovarienne :

L'étude de Orazov et al. ont comparé des patientes atteintes d'endométriose (avec endométriose réséqué ou non) à un groupe contrôle avec une réserve ovarienne comparable, ils ont retrouvé une diminution significative sur le nombre d'ovocytes matures ainsi qu'une moins bonne réponse à la MIV (Maturation In Vitro) en cas d'endométriose (5). Ces critères restent malheureusement très indirects pour évaluer la qualité ovocytaire.

Kasapoglu et al. ont montré sur une population infertile prise en charge en FIV-ICSI une différence significative sur le nombre d'ovocytes morphologiquement anormaux dans l'endométriose par rapport à un groupe contrôle avec notamment un cytoplasme foncé, une zone pellucide anormale ou un globule polaire anormal mais sans avoir recherché de corrélation sur les chances de grossesse (23).

Enfin, certaines études animales semblent également montrer des dommages méiotiques après exposition des ovocytes à un fluide péritonéal endométriosque. Ces effets étaient d'ailleurs diminués par l'ajout d'antioxydants (24).

L'altération de la qualité ovocytaire reste difficile à appréhender et il manque des critères biologiques objectifs pour l'évaluer.

En parallèle, et comme dit précédemment, il y a fort à penser que le stress oxydant folliculaire puisse altérer la communication entre les cellules de la granulosa et l'ovocyte et ainsi diminuer sa compétence (25)(26). Or, ce stress oxydant est facilement mesurable en faisant des analyses dans le liquide folliculaire.
Dans l'endométriose, différents marqueurs du stress oxydant ont déjà été évalués.

Le 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8OHdG), la 2,7-dichlorofluorescéine, ainsi que les marqueurs d'inflammation (TNF alpha) ont été retrouvés en excès dans le liquide folliculaire et peuvent être associés à des blocages du cycle cellulaire (27) ainsi qu'à de moins bons résultats en FIV (taux de fécondation, qualité embryonnaire, taux de grossesse) (28)(29)(30)(31).

Cependant toutes ces études ne sont pas concordantes et l'étude préliminaire de ce travail n'avait d'ailleurs pas retrouvé de différence significative sur le dosage de la 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine chez des patientes atteintes d'endométriose prise en charge en FIV +/- ICSI, elle avait par contre retrouvé une corrélation entre le taux de la 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine et le taux de fécondation ainsi qu'avec la qualité embryonnaire au stade blastocyste (32)(33).

Le but de cette étude est donc de rechercher un stress oxydant médié par le fer au sein du liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose profonde avec ou sans endométriome. Il sera également recherché une éventuelle corrélation entre ces marqueurs du micro-environnement folliculaire et la compétence ovocytaire via l'évaluation du développement embryonnaire et les résultats cliniques (34)(35).

## 1.2 Stress oxydant médié par le fer

Le fer est une molécule biologique présente dans l'organisme à l'état ferreux (Fe 2+) ou ferrique (Fe 3+), libre ou inclus dans des complexes hétéroprotéiniques.

Il existe plusieurs formes de circulation du fer assurée par des protéines spécifiques notamment la ferritine, la transferrine et avec une régulation par l'hepcidine.

Le fer est véhiculé dans le plasma associé à la transferrine et est internalisé dans les cellules par interaction avec des récepteurs membranaires spécifiques. Le fer intracellulaire se répartit entre le compartiment de réserve, associé à la ferritine, et la mitochondrie où il participe à la synthèse de l'hème. Le transport et la distribution du fer dans tout l'organisme se fait principalement par la transferrine. En situation physiologique, la transferrine est saturée à environ 30%, laissant peu de fer circulant non lié à la protéine.

En effet, le fer libre est particulièrement néfaste de par sa capacité à développer des radicaux libres, il doit donc toujours être associé à des protéines spécifiques, tant pour son transport dans le plasma par la transferrine que pour son stockage intracellulaire par la ferritine.
La ferritine a ainsi une fonction de réserve et de détoxication du fer.

Lors d'une réduction des apports en fer, sa biodisponibilité est utilisée par la dégradation de la ferritine dans le lysosome et sa libération (36). Ce processus appelé « ferritinophagie » peut donc également jouer un rôle important dans la modulation du stress oxydatif au niveau de l'organisme (37).

Le fer libre est donc un grand pourvoyeur d'espèces réactives de l'oxygène. Ce stress oxydant est médié par la production de radicaux hydroxyles via la réaction de Fenton (38) qui ensuite, conduit à une peroxydation lipidique (9).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2 : réaction de Fenton (39)**</figcaption></figure>

Il existe de nombreux marqueurs des espèces réactives de l'oxygène ciblant notamment les produits issus de l'oxydation de l'ADN, des protéines et des lipides.

Le malondialdéhyde (MDA), le 4-hydroxynonenal (HNE), le F2-isoprostane, et les prostaglandines F2α sont les produits lipidiques les mieux étudiés pour la peroxydation (40).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3 : schéma simplifié concernant la formation de produits de la peroxydation lipidique à partir des espèces réactives de l'oxygène (ROS) (40).**</figcaption></figure>
Une des méthodes décrites pour détecter le stress oxydatif dans des échantillons biologiques consiste à mesurer les substances réactives à l'acide thiobarbiturique (TBARS) par spectrophotométrie. Ces substances qui réagissent aux TBARS sont majoritairement représentées par le MDA qui est une chaîne carbonée avec fonction aldéhyde, produit dérivé de la peroxydation lipidique (17)(41).

Jackson et al, ont dosé les TBARS associés au dosage du 8-F2-isoprostane (produit final de lipides oxydés dérivés de l'acide arachidonique) dans le sang des patientes devant bénéficier d'une chirurgie pour suspicion d'endométriose. Dans cette étude, 80% des femmes atteintes d'endométriose avaient une augmentation significative de TBARS par rapport aux témoins (de l'ordre de 0,5 nmol/ml) (41).

Cette technique a d'ailleurs déjà été utilisée pour évaluer le stress oxydant folliculaire chez des patientes âgées prise en charge en FIV (42).

A noter que le dosage du TBARS doit tout de même être interprété avec prudence (43). En effet, une réponse positive au test à l'acide thiobarbiturique (TBA) indique uniquement la présence de TBARS dans l'échantillon et ne donne en soi aucune information quantitative ou chimique sur la source ou la nature des TBARS.

## 1.3 Impact du stress oxydant médié par le fer dans l'endométriose

Plusieurs auteurs se sont déjà intéressés à l'impact du fer sur le développement embryonnaire notamment sur des modèles murins.

Li et al, ont montré l'impact de la surcharge en fer dans le liquide folliculaire issu de patientes atteintes d'endométriose sur les embryons de souris.

Ces auteurs ont mis en évidence une diminution de l'expression de GPX4 à l'origine d'une peroxydation lipidique qui avait perturbé la formation des blastocystes murins (44).

Ce stress oxydant à l'origine d'une accumulation de lipides peroxydés peut induire de la ferroptose. Cette mort cellulaire peut atteindre les cellules de la granulosa, comme l'ont montré Zhexin et al. En effet, cette équipe a travaillé sur une cohorte de 1712 patientes.

Ils ont tout d'abord mis en évidence de moins bon résultats de prise en charge en FIV-ICSI chez les patientes atteintes d'endométriose ovarienne ou pelvienne par rapport au groupe contrôle (taux de maturité ovocytaire, qualité embryonnaire et grossesses cliniques).
Pour étayer l'origine ovocytaire de ces résultats, ils ont mis en lumière l'impact de l'exposition au liquide folliculaire de ces patientes atteintes d'endométriose (ovariennes et/ou pelviennes) sur des cellules de granulosa issues de culture cellulaire ou murine.

Le taux de fer total et d'hepcidine était plus élevé dans le groupe endométriose. L'activité GPX4 et le dosage du malondialdéhyde, reflet de la peroxydation lipidique étaient également significativement augmentés dans le groupe endométriose.

La viabilité cellulaire était diminuée avec mise en évidence de deux voies : la ferroptose et la voie p53. L'expression de gènes impliqués dans la ferropotose (notamment une augmentation de la ferritinophagie (récepteur NCOA4)) était augmentée.

Sur les cellules de la granulosa murines, ils ont mis en évidence un excès de Fe2+ et de ROS au sein des cellules exposées au liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose, ils ont également mis en évidence un effet inhibiteur de la mort cellulaire en les exposant à des chélateurs du fer ce qui n'était pas le cas en cas d'exposition aux inhibiteurs de l'apoptose et de la nécrose.

Cette augmentation de la ferropotose passerait par des modifications d'ordre épigénétique avec la modification des mRNA issus des exosomes cellulaires.

Au final, cette étude semble mettre en évidence, in vitro, que l'excès de fer folliculaire dans l'endométriose modifierait l'expression de gènes impliqués dans la ferroptose induisant la mort des cellules de la granulosa. Celle-ci, pourrait avoir un rôle dans un défaut de maturation ovocytaire, l'induction de la méiose et la qualité ovocytaire (45).

Li et al, sur une cohorte de 72 patientes ont retrouvé un excès de fer et de ferritine dans le liquide péritonéal des patientes atteintes d'endométriose tous stades confondus. L'exposition d'embryons murins à ce liquide induit à nouveau une diminution de l'expression GPX4 des cellules embryonnaires ainsi qu'une augmentation de la peroxydation lipidique (évalué par le BODIPY 581/591 C11 oxydé).

Le taux de blastulation était plus bas en cas d'exposition au liquide péritonéal de patientes atteintes d'endométriose mais ce taux était rattrapé en cas d'exposition à un inhibiteur de ferroptose. Enfin, pour ces auteurs, la ferroptose était associée à une dysfonction mitochondriale secondaire à l'expression d'un gène impliqué dans la régulation oxydante (HMOX1) (44).

Ces études, certes sur ovocytes murins, semblent montrer un impact de la surcharge en fer au sein du micro-environnement folliculaire sur la qualité ovocytaire via l'évaluation de la mort cellulaire folliculaire et le développement embryonnaire.
A ce jour dans l'endométriose, aucun marqueur du stress oxydatif n'a fait la preuve de sa supériorité en termes de facteur pronostique des prises en charge en FIV.

Cette étude a donc pour but d'évaluer, au sein d'une cohorte de patientes atteintes d'endométriose pelvienne profonde, la présence du fer et de peroxydation lipidique au sein du liquide folliculaire ainsi que son éventuel impact sur les résultats de prise en charge en FIV +/- ICSI. Le dosage de TBARS, marqueur de la peroxydation lipidique, a été choisi comme marqueur du stress oxydant médié par le fer.
# II. Matériels et Méthodes

Il s'agit d'une étude de cohorte rétrospective monocentrique. Les analyses réalisées dans cette étude ont été faites sur des prélèvements issus d'une étude de cohorte prospective antérieure nommée « ENDOFIV » réalisée au CHU d'Amiens dans le service de Médecine et Biologie de la Reproduction et dont les inclusions se sont étendues de juillet 2020 à août 2023.

Il s'agit donc ici du protocole « ENDOFIV 2 » validé par le Comité de Protection des Personnes qui a été obtenu en date du 09/02/2024 (Numéro DRCI : PI2024_843_0024).

## 1.1 Population étudiée

La population était constituée de femmes de 18 à 40 ans prise en charge en FIV +/- ICSI avec ou sans don de spermatozoïdes dans le service de médecine de la reproduction du CHU d'Amiens.

Les patientes souffrant d'une obésité, d'une baisse de réserve ovarienne (définie par une AMH < 1,5 ng/ml), d'un syndrome des ovaires polykystiques (défini selon les critères de Rotterdam), d'une hyperprolactinémie, d'une prise en charge en risque viral, souffrant d'une maladie pelvienne inflammatoire autre que l'endométriose ou d'une infection génitale haute récente (< 6 mois) ou d'une infection à la Covid 19 au moment de la stimulation étaient exclues.

Les patientes dont le conjoint présente une numération spermatique inférieure à 5 millions/ml étaient également exclues.

L'endométriose pelvienne était diagnostiquée sur une échographie pelvienne ou une IRM pelvienne.

Tous les stades d'endométriose étaient inclus ; étaient distinguées les endométrioses superficielles et profondes et au sein des endométrioses profondes, les patientes avec ou sans atteinte ovarienne objectivée. L'antécédent de chirurgie d'endométriose était spécifié. Il était également recherché, au moment de la ponction, la présence ou non d'un endométriose sur l'ovaire dont le follicule analysé était issu.

Les patientes donnaient leur consentement oral au moment de la remise d'ordonnance de stimulation ovarienne en vue d'un protocole de FIV.

Il leur était remis une lettre d'information (Annexe 1). Elles présentaient toutes un identifiant anonymisé. La participation des patientes leur imposait la récupération du liquide folliculaire issu d'un follicule mature pour analyses.
## 1.2 Stimulation ovarienne

Toutes les patientes incluses bénéficiaient d'un protocole de stimulation ovarienne contrôlée en vue d'une FIV avec ou sans ICSI. Les patientes étaient stimulées par de la FSH seule ou une association de FSH+LH et selon un protocole agoniste long ou antagoniste.

L'agoniste de la GnRH utilisé était le Décapeptyl® 0,1 mg et les antagonistes étaient le Fyrémadel® ou l'Orgalutran®.

Les patientes bénéficiaient d'un monitorage par échographie pelvienne et bilan sanguin. Le déclenchement de l'ovulation était décidé par l'équipe de cliniciens dès qu'au moins 3 ou 5 follicules (en fonction de l'âge de la patiente) avaient atteint une taille mature. Le déclenchement de l'ovulation était réalisé par Ovitrelle® (1 ampoule de 250ug) ou Decapetyl® (3 ampoules de 0,1 mg).

La ponction était réalisée sous anesthésie générale ou rachi-anesthésie avec un échoguidage par voie transvaginale 36h après l'induction de l'ovulation.

## 1.3 Prélèvement folliculaire

Le liquide folliculaire prélevé était issu d'un seul et unique follicule mature d'entre 18 et 20 mm le jour de la ponction ovocytaire. La seringue le contenant était numérotée et la présence d'un endométrioide du côté du liquide prélevé était précisée. Le liquide était ensuite acheminé jusqu'au laboratoire à 37°C. Le liquide folliculaire était récupéré après le tri habituel des cumulus oophorus.

Le prélèvement folliculaire était centrifugé dans les 48h afin de limiter la contamination cellulaire. Le prélèvement était centrifugé une première fois à 1600g pendant 10 min à 4°C en évitant l'exposition à la lumière puis à 3200g pendant 20min à 4°C en évitant l'exposition à la lumière. Après chaque centrifugation, seul le surnageant était récupéré. Le surnageant final était ensuite congelé à -80°C sur un tube anonymisé en attendant la réalisation des analyses.

A noter que pour cette étude, les prélèvements ont été décongelés deux fois avant d'être analysés en raison d'analyses précédentes sur cette cohorte de patientes.
## 1.4 Dosage de fer

Le dosage du fer au sein du follicule a été réalisé par le test Atellica CH Iron_2 (46). C'est le fer à l'état ferreux Fe 2+ qui est dosé.

Le fer est dissocié de la transferrine en milieu acide puis réduit à l'état ferreux pour se combiner avec un chromogène : la ferrozine. Une mesure colorimétrique peut alors être effectuée à 571/658 nm. Cette procédure permet de mesurer le fer directement sans passer par une étape de précipitation protéique et sans risque d'interférence avec le cuivre endogène.

Le dosage du Fer a été effectué sur les analyseurs Atellica CH SIEMENS situés au laboratoire de biochimie au centre de biologie humaine du CHU.

Le système a effectué une pré-dilution de l'échantillon dans une cuvette de pré-dilution : 50 µl de plasma + 200 µl de l'Atellica CH diluent. Une fraction de 25 µl de l'échantillon dilué a ensuite été transférée dans la cuvette réactionnelle.

La durée du test était de 10 minutes.

## 1.5 Dosage de TBARS par la méthode de YAGI

Le principe de cette méthode repose sur le fait que dans des conditions acides et à chaud (90-100°C), une molécule de MDA réagit avec deux molécules de TBA pour former un produit d'addition de condensation TBA-MDA mesurable par spectrophotométrie (λmax, 532nm) ou par fluorométrie (excitation : λ, 515nm ; émission : λ, 553nm).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4 : schéma de la réaction d'addition MDA/TBA (47)**</figcaption></figure>

Il s'agit d'une réaction d'addition de type Michael dans laquelle le centre nucléophile est le cycle aromatique du TBA (40).

Afin d'obtenir les réactifs, le TBA (acide thiobarbiturique) à 0,67% a été dissous dans l'eau distillée à 50°C. L'acide acétique Glacial était prêt à l'emploi.
Pour préparer le volume de réactif nécessaire aux dosages de la série d'échantillons et de la gamme d'étalonnage, 1 volume de TBA à 0,67% a été ajouté à 1 volume d'acide acétique glacial (préparer 500µl par tube à doser).

Une gamme d'étalonnage en 8 points (0 ; 61 ; 122 ; 183 ; 244 ; 305 ; 610 et 1220 pmoles) a été réalisé à partir d'une solution de MDA (poids moléculaire = 164g) à 1mg/ml (6.1 nanomoles/µl) conservée à – 20°C. Une dilution au 1/1000e avec de l'eau distillée a été réalisée afin d'obtenir une solution à 6,1 pmoles/µl de MDA.

Dans des tubes en verre ont été mis :

<table><tr><td>0 µl de la dilution......... : soit</td><td>0 pmoles</td></tr><tr><td>10 µl.................... : soit</td><td>61 pmoles</td></tr><tr><td>20 µl.................... : soit</td><td>122 pmoles</td></tr><tr><td>30 µl.................... : soit</td><td>183 pmoles</td></tr><tr><td>40 µl.................... : soit</td><td>244 pmoles</td></tr><tr><td>50 µl.................... : soit</td><td>305 pmoles</td></tr><tr><td>100 µl.................... : soit</td><td>610 pmoles</td></tr><tr><td>200 µl.................... : soit</td><td>1220 pmoles</td></tr></table>

Lors de la préparation des échantillons afin d'éviter la formation artéfactuelle de MDA durant la procédure, de l'EDTA (0,04% final) et du BHT (5X10-6M final) sont ajoutés aux 100 µL d'échantillon à tester dans des tubes en verre. Les volumes sont ensuite ajustés à 2000 µL avec de l'eau distillée.

Afin de réaliser le dosage des TBARS, 500 µL de mélange TBA 0,67% / Acide acétique préparé précédemment ont été ajoutés dans chaque tube (gamme et échantillons).

Une incubation à 95°C pendant une heure a été réalisée.

Après refroidissement à température ambiante, la lecture a été effectuée sur le fluorimètre RF-5301 PC SHIMADZU, à 515 nm d'excitation et 553 nm d'émission.

La lecture de la gamme d'étalonnage est réalisée dans un premier temps afin de déterminer une courbe d'étalonnage qui servira à déterminer la concentration des échantillons qui seront lus dans un second temps : on obtient ainsi directement les concentrations en pmoles de MDA par tube.

Dans cette étude, la prise d'essai pour les dosages était de 100 µL d'échantillon, il a été tenu compte de ce volume pour l'expression des résultats : ils ont été multipliés par 10 afin d'obtenir des résultats en pmoles/ml.

Un dosage de protéines a également été réalisé sur Atellica® afin de pouvoir analyser le rapport TBARS/protéines en pmoles/g. Il s'agit d'un résultat normalisé.
Dans la suite de cette étude, les résultats décrits concernant le dosage de TBARS sont toujours
des résultats rapportés aux taux de protéines.

La méthode Atellica®CH Protéine II Totale (TP) est basée sur la méthode de Weichslbaum qui utilise le réactif du Biuret (sulfate de cuivre en milieu alcalin). Les liaisons peptidiques des protéines interagissent avec les ions cuivre pour former un complexe cuproprotéique de couleur violette dont l'intensité est mesurée au point de virage de la réaction à 545 nm.

1.6 Taux de maturité nucléaire ovocytaire, taux de fécondation, qualité embryonnaire et résultats cliniques

Le taux de maturité nucléaire ovocytaire était défini par le nombre d'ovocytes ayant expulsé un globule polaire le jour de la ponction sur le nombre total de cumulus ovocytaires récupérés. Le taux de lyse ovocytaire correspondait au nombre d'ovocytes lysés objectivés après décoronisation sur le nombre de cumulus ovocytaires. Le taux d'ovocytes de morphologie anormale, en ICSI seulement, correspondait aux ovocytes dont une anomalie morphologique était précisée (cytoplasme granuleux, zone pellucide fine, espace périvitellin large, réticulum endoplasmique lisse ou des corps réticulés) sur le nombre d'ovocytes matures. Le taux de fécondation correspondait au nombre de zygotes à 2 globules polaires (associés à soit 2 pronuclei, soit 0 pronuclei (syngamie) ou 3 pronuclei) sur le nombre d'ovocytes à un globule polaire.

Le taux de blastulation correspondait au nombre de blastocystes obtenus après 5 ou 6 jours de culture sur le nombre d'embryons mis en culture prolongée. Le taux d'embryons utilisables correspondait au nombre d'embryons de qualité suffisante pour être transférés ou congelés sur le nombre de zygotes. La qualité embryonnaire était définie selon la classification BLEFCO pour les embryons de 2 ou 3 jours et la classification GARDNER et SHOOLCRAFT pour les blastocystes.

Les embryons de qualité suffisante pour transfert ou congélation sont :

- des embryons de 2 jours avec 3 à 5 cellules et < 10% de fragmentation

- des embryons de 3 jours avec 6 à 10 cellules et < 10% de fragmentation

- les blastocystes classés B3 ou B4 avec une classification du bouton embryonnaire et du trophoblaste classée A ou B.

La grossesse clinique correspondait aux grossesses objectivées par la présence d'un sac
gestationnel en échographie.
## 1.7 Analyse statistique

Le calcul d'effectif était basé sur une taille d'effet attendue classée comme moyenne selon la classification de Cohen.

Un test T non paramétrique (Mann-Whitney) était réalisé pour le critère de jugement principal (comparaison de deux moyennes non appariées).

Les corrélations entre le dosage du fer, le dosage des TBARS et les paramètres de stimulations étaient calculées selon des corrélations de Pearson.

Les corrélations entre le dosage du fer, le dosage des TBARS et la présence d'une grossesse clinique à l'issue de la tentative étaient calculées avec une analyse en régression logistique binaire.
# III. Résultats

## 1.1 Caractéristiques de la population

115 patientes ont été incluses dans l'étude ENDOFIV 2 (Numéro ID-RCB : PI2024_843_0024).
Parmi celles-ci, 64 patientes ont eu un dosage de fer, de TBARS et de protéines.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5 : Flow chart des patientes analysées pour le dosage de fer, TBARS et protéines.</figcaption></figure>

Les patientes sont comparables sur l'âge, l'IMC, l'AMH, le taux de FSH en début de cycle et
le taux d'estradiolémie en début de cycle. Il y avait une différence significative sur la durée
d'infertilité avec un nombre d'années d'infertilité supérieur dans le groupe témoin (4,4 années)
par rapport au groupe endométriose (3,28 années) (p=0,04) (Tableau 1).
Il y avait 13 % de fumeuses dans le groupe endométriose contre 25 % dans le groupe sans endométriose mais cette différence n'était pas significative.

Il n'y avait pas non plus de différence significative sur les paramètres spermatiques des conjoints dans les deux groupes (objectivés sur la numération, la mobilité a+b et le spermocytogramme).

Les patientes incluses sans endométriose présentaient une infertilité d'origine tubaire, idiopathique ou masculine légère.

Les patientes incluses dans le groupe endométriose présentaient toutes une endométriose profonde, 93% d'entre elles présentaient une atteinte ovarienne. Parmi ces patientes, 30,7% avaient bénéficié d'une chirurgie complète d'endométriose et 23% avaient bénéficié, lors de cette chirurgie, d'un geste ovarien.

Les ovocytes issus des follicules, quand ils étaient retrouvés, étaient tous matures. Seulement chez 31% des patientes, l'ovocyte issu du follicule n'avait pas été retrouvé dans la seringue analysée. En effet, il n'y avait parfois pas d'ovocyte retrouvé dans le follicule, celui-ci restant souvent dans l'aiguille de ponction et se retrouvait au sein du liquide folliculaire suivant. Un retrait d'aiguille pour rinçage suivi d'un nouveau piquage de la patiente ne paraissait pas éthique. Il ne peut donc pas être affirmé avec certitude, pour ces cas, que l'ovocyte issu du follicule était mature.

<table><caption>Tableau 1 : Caractéristiques générales de la population</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th>Sans Endométriose<br>(n=35)</th><th>Avec Endométriose<br>(n=29)</th><th rowspan="2">p-value</th></tr><tr><th>Moyenne ± écart type</th><th>Moyenne ± écart type</th></tr></thead><tbody><tr><td>Age (années)</td><td>32,38 ± 1,96</td><td>32,90 ± 1,50</td><td>0,23</td></tr><tr><td>IMC</td><td>23,92 ± 4,13</td><td>23,06 ± 4,12</td><td>0,43</td></tr><tr><td>FSH J3 (mUi/L)</td><td>7,25 ± 2,18</td><td>7,96 ± 2,83</td><td>0,31</td></tr><tr><td>E2 J3 (pg/ml)</td><td>41,95 ± 19,23</td><td>55,84 ± 61,9</td><td>0,26</td></tr><tr><td>AMH (ng/ml)</td><td>3,28 ± 1,76</td><td>3,11 ± 1,33</td><td>0,66</td></tr><tr><td>Durée de l'infertilité (années)</td><td>4,40 ± 1,98</td><td>3,28 ± 2,00</td><td><strong>0,04</strong></td></tr><tr><td>Numération spermatique du<br>conjoint (millions/ml)</td><td>71,53 ± 73,8</td><td>66,40 ± 67,80</td><td>0,79</td></tr><tr><td>Mobilité a+b (%)</td><td>41,45 ± 15,81</td><td>42,68 ± 17,97</td><td>0,78</td></tr></tbody></table>
## 1.2 Résultats sur le critère de jugement principal

Le dosage du fer est de 11,03 µmol/L chez les patientes atteintes d'endométriose contre 10,44 µmol/L chez les patientes sans endométriose. Cette différence n'est pas significative (p = 0,51) (Tableau 2).

Le dosage de TBARS (rapporté aux protéines) n'était pas non plus significativement différent en fonction de la présence d'une endométriose (30,33pmoles/g) ou non (27,09 pmoles/g) (p = 0,40).

Ces analyses ont également été réalisées chez les patientes atteintes d'endométriose et dont le follicule avait été ponctionné du côté d'un endométriose (n=15) comparativement aux patientes sans endométriose, il n'a pas été retrouvé de différence significative.

<table><caption>Tableau 2 : Comparaison du fer folliculaire et du ratio TBARS/protéines folliculaire chez les patientes atteintes ou non d'endométriose.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th>Sans Endométriose<br>(n=35)</th><th>Avec Endométriose<br>(n=29)</th><th rowspan="2">p-value</th></tr><tr><th>Moyenne ± écart type</th><th>Moyenne ± écart type</th></tr></thead><tbody><tr><td>Fer (µmol/L)</td><td>10,44 ± 3,43</td><td>11,03 ± 3,76</td><td>0,51</td></tr><tr><td>TBARS (pmoles/g)</td><td>27.09 ± 7,11</td><td>30,33 ± 19,43</td><td>0,40</td></tr></tbody></table>

## 1.3 Impact de l'endométriose, du fer et de la peroxydation lipidique sur les résultats de FIV.

La stimulation ovarienne des deux groupes était comparable en termes de dose totale d'unités de FSH administrée, de nombre d'ovocytes obtenus après la ponction, de taux de maturité.

Le taux d'ovocytes morphologiquement anormaux n'était pas significativement différent en fonction de la présence ou non d'une endométriose.

A noter, une baisse du taux de fécondation chez les patientes atteintes d'endométriose (65%) par rapport au groupe sans endométriose (77%) sans que cette différence n'atteigne la significativité (p = 0,08) (Tableau 3).

Concernant les résultats sur la culture embryonnaire, les patientes atteintes d'endométriose présentaient un taux de développement embryonnaire à J2 significativement plus bas (75%) par rapport aux patientes sans endométriose (91%) (p=0,04). Le taux de blastulation était significativement abaissé chez les patientes atteintes d'endométriose (42%) par rapport aux patientes sans endométriose (63%) (p= 0,03).

Il en va de même pour le taux de blastocystes de bonne qualité, qui était significativement plus bas chez les patientes avec endométriose (37% vs 20%) (p=0,03).
Le nombre d'embryons utilisables en fin de stimulation était en moyenne de 1,41 en cas d'endométriose et de 2,20 en l'absence d'endométriose sans que cette différence n'atteigne la significativité (p=0,08) (Tableau 3).

Enfin, en ce qui concerne le taux de grossesse clinique, les résultats correspondaient aux taux de grossesses obtenues sur le transfert du ou des embryons issus de la tentative étudiée. Seuls les résultats de 86% des patientes ont pu être analysés car certaines patientes sont encore en attente de transfert d'embryon ou alors il y a eu un arrêt de prise en charge. Il y a 37% de grossesses chez les patientes sans endométriose contre 21,4% de grossesses chez les patientes atteintes d'endométriose. Cette différence n'était pas significative (p=0,24) (Tableau 3).

<table><caption>Tableau 3 : Comparaison des résultats de la stimulation ovarienne en fonction de la présence d'endométriose.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th>Sans Endométriose<br>(n=35)</th><th>Avec Endométriose<br>(n=29)</th><th rowspan="2">p-value</th></tr><tr><th>Moyenne ± écart<br>type</th><th>Moyenne ± écart<br>type</th></tr></thead><tbody><tr><td>Oestradiolémie au déclenchement<br>(pg/ml)</td><td>2566,61 ± 1339,92</td><td>2162,31 ± 807,15</td><td>0,14</td></tr><tr><td>Dose totale d'unités de FSH (UI)</td><td>2095,58 ± 806,42</td><td>2480,35 ± 1280,45</td><td>0,17</td></tr><tr><td>Nombre d'ovocytes matures à la<br>ponction</td><td>7,51 ± 3,42</td><td>7,44 ± 4,12</td><td>0,94</td></tr><tr><td>Taux de maturité %</td><td>68 ± 23</td><td>73 ± 21</td><td>0,33</td></tr><tr><td>Taux d'ovocytes anormaux %</td><td>44 ± 37</td><td>45 ± 34</td><td>0,92</td></tr><tr><td>Taux de fécondation %</td><td>77 ± 20</td><td>65 ± 31</td><td>0,08</td></tr><tr><td>Taux de blastulation %</td><td>63 ± 31</td><td>42 ± 40</td><td><strong>0,03</strong></td></tr><tr><td>Taux de développement embryonnaire<br>à J2 %</td><td>91 ± 11</td><td>75 ± 32</td><td><strong>0,04</strong></td></tr><tr><td>Taux de blastocystes de bonne qualité<br>%</td><td>37 ± 34</td><td>20 ± 28</td><td><strong>0,03</strong></td></tr><tr><td>Nb d'embryons utilisables en fin de<br>stimulation</td><td>2,20 ± 1,71</td><td>1,41 ± 1,80</td><td>0,08</td></tr><tr><td>Taux de grossesse (%)</td><td>37</td><td>21</td><td>0,24</td></tr></tbody></table>
Concernant, les résultats de corrélation entre le critère de jugement principal et les résultats de prise en charge en FIV.

Dans le groupe endométriose comme dans la cohorte entière, il a été retrouvé une corrélation négative significative entre le taux de fécondation et le dosage du fer (coefficient de corrélation à -0,39) (p=0,04) dans le groupe endométriose et coefficient de corrélation à -0,28 (p=0,02) dans la cohorte entière)). Par contre, cette corrélation n'a pas été retrouvée avec le dosage de TBARS.

Dans la population avec endométriose, il a été retrouvé une corrélation négative entre le nombre total de CCO obtenus et le dosage de TBARS (coefficient de corrélation à -0,47) avec p significatif < 0,01. On retrouvait également une corrélation négative de manière significative entre le dosage de TBARS et le nombre d'ovocytes matures (coefficient de corrélation à -0,39) (p= 0,04)) (Tableau 4).

Ces deux corrélations sont également retrouvées dans la cohorte entière mais avec des coefficients de corrélation moins importants (Tableau 4).

L'analyse statistique n'a pas retrouvé de corrélation significative entre le dosage du fer ou des TBARS avec le taux de maturité, le taux d'ovocytes anormaux, le taux de blastulation, le nombre d'embryons utilisables en fin de stimulation, ni sur les chances de grossesses.

Il a été retrouvé un coefficient de corrélation négatif entre le taux de grossesses cliniques et le dosage de fer (coefficient à -1,24) mais sans que ce résultat ne soit significatif (p=0,7).

De même que pour le taux de grossesses cliniques et le dosage de TBARS (coefficient de corrélation à -0,54 avec un p=0,57) (Tableau 4).
<table><caption>Tableau 4 : Coefficient de corrélation entre le dosage de fer, le ratio TBARS/protéines et les résultats en FIV (cohorte entière n=64 et groupe endométriose n=29)</caption><thead><tr><th></th><th>Fer (µmol/l) (cohorte entière)</th><th>P-value</th><th>Fer (µmol/l) (Endomé-triose)</th><th>P-value</th><th>TBARS (pmoles/g) (cohorte entière)</th><th>P-value</th><th>TBARS (pmoles/g) (endomé-triose)</th><th>P-value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Nombre de CCO</td><td>-0,03</td><td>0,76</td><td>0,21</td><td>0,28</td><td>-0,34</td><td><strong>0,005</strong></td><td>-0,47</td><td><strong>0,01</strong></td></tr><tr><td>Nombre d'ovocytes matures à la ponction</td><td>0,02</td><td>0,82</td><td>0,17</td><td>0,39</td><td>-0,25</td><td><strong>0,04</strong></td><td>-0,39</td><td><strong>0,04</strong></td></tr><tr><td>Taux de maturité %</td><td>0,09</td><td>0,71</td><td>0,04</td><td>0,83</td><td>0,05</td><td>0,66</td><td>0,24</td><td>0,22</td></tr><tr><td>Taux d'ovocytes anormaux %</td><td>0,04</td><td>0,79</td><td>0,02</td><td>0,92</td><td>0,12</td><td>0,48</td><td>0,34</td><td>0,24</td></tr><tr><td>Taux de fécondation %</td><td>-0,28</td><td><strong>0,02</strong></td><td>-0,39</td><td><strong>0,04</strong></td><td>-0,07</td><td>0,57</td><td>-0,17</td><td>0,37</td></tr><tr><td>Taux de blastulation %</td><td>-0,03</td><td>0,68</td><td>-0,12</td><td>0,56</td><td>-0,03</td><td>0,81</td><td>-0,06</td><td>0,76</td></tr><tr><td>Nombre d'embryon utilisable en fin de stimulation</td><td>-0,09</td><td>0,45</td><td>-0,16</td><td>0,40</td><td>-0,08</td><td>0,50</td><td>-0,15</td><td>0,44</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 6 : Corrélation négative significative entre le dosage du fer et le taux de fécondation dans le liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose**</figcaption></figure>
# IV. **Discussion**

## 1.1 Résultats des analyses dans le liquide folliculaire

L'impact de l'endométriose sur la fertilité est indéniable, 30 à 40% des patientes atteintes d'endométriose consulteront pour une infertilité. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent cette infertilité sont encore mal compris.

La récente revue de la littérature de Vercellini et al, a d'ailleurs retrouvé, sur 29 études incluses, une baisse de 15% des chances de grossesse à l'issue d'une FIV-ICSI chez les patientes atteintes d'endométriose (4). Il semble d'ailleurs y avoir une corrélation négative entre la sévérité de l'endométriose et les résultats en FIV (48)(49)(5).

Notre étude a analysé un groupe de patientes homogènes en termes d'âge, de réserve ovarienne et de réponse à la stimulation ovarienne en vue d'une FIV+/ICSI. Et il a été retrouvé, dans ce groupe, une baisse significative du taux de développement embryonnaire, du taux de blastulation ainsi qu'une qualité embryonnaire significativement abaissée en cas d'endométriose pelvienne profonde.

Ces résultats sont concordants avec l'étude de Esmaeilzadeh et al, qui a montré également que les patientes atteintes d'endométriose sévère (stade III et IV) présentaient significativement moins d'embryons (J2-J3) par rapport au groupe témoin alors même qu'il n'y avait pas de différence significative sur le taux de fécondation (50).

Certains auteurs retrouvent au contraire des taux de fécondation abaissés en cas d'endométriose, c'est le cas de l'étude de Shelb et al, pour lesquels l'inflammation péritonéale serait en cause dans l'interaction entre les gamètes avec une aggravation en fonction du stade d'endométriose (stade III-IV vs I-II). La FIV avec ICSI permettrait alors de rattraper ce taux de fécondation (49). L'étude de Kuivasaari et al retrouvait des résultats similaires, cependant le taux de fécondation était calculé sur l'ensemble de la cohorte ovocytaire dont les ovocytes immatures ce qui peut biaiser le résultat à notre sens (45).
Certaines études imputent l'infertilité à la présence d'endométriope(s) plus spécifiquement comme dans la cohorte rétrospective de Yilmaz et al qui retrouve un nombre d'ovocytes matures significativement plus faible chez les femmes infertiles atteintes d'endométriose avec endométriope(s) uni ou bilatéral. Ce résultat n'impactait pas les chances de grossesses cliniques ni de naissances vivantes qui étaient comparables aux témoins (51). Cependant, ces résultats restent critiquables car les groupes n'étaient pas comparables en termes de réserve ovarienne avec un compte des follicules antraux significativement plus bas dans le groupe endométriose.

Un des points forts de notre étude est donc d'avoir une cohorte de patientes comparables en termes de réserve ovarienne et de facteurs influençant la réponse à la stimulation tel que le poids et l'âge. Les résultats sur le développement embryonnaire ne peuvent donc être imputables à une éventuelle baisse de réserve ovarienne qui peut être retrouvée en cas d'endométriose.

En effet, les populations atteintes d'endométriose ont souvent bénéficié d'une prise en charge chirurgicale notamment ovarienne dont il est bien connu l'impact sur la réserve folliculaire.

Non prise en compte, la réserve ovarienne peut être un biais important dans l'interprétation des résultats de prise en charge en FIV (52).

Concernant le critère de jugement principal : cette étude n'a pas mis en évidence de différence significative sur les dosages folliculaires de fer et de TBARS (ratio TBARS/protéines) dans les follicules matures de patientes prise en charge en FIV +/- ICSI en fonction de la présence ou non d'une endométriose.

Ce n'est pas la première étude à s'intéresser au dosage fer au sein du liquide folliculaire :

L'étude de Benaglia et al avait évalué un pool de liquide folliculaire de 37 patientes atteintes d'endométriose en comparant un ovaire siège d'endométriope par rapport à l'ovaire controlatéral. Cette équipe n'avait pas retrouvé de différence significative sur le dosage de fer.

Cependant, l'ovaire controlatéral n'est probablement pas un parfait « témoin » puisqu'il se situe au sein d'un péritoine inflammatoire impacté par le stress oxydant. Ils retrouvaient par contre une augmentation significative de la ferritine dans le groupe endométriose. La ferritine est une forme de stockage du fer dont l'interprétation reste difficile sans connaître l'état de déplétion ferrique systémique etc..(13).
Dans l'étude de Sanchez et al, il a été montré que le taux de fer total était plus élevé dans les follicules à proximité de l'endométriope que dans les follicules plus à distance ainsi que par rapport aux follicules de l'ovaire sain. La technique de dosage est identique à celle utilisée dans notre étude (dosage colorimétrique sans déprotéinisation). Cette étude avait été réalisée sur 145 follicules évalués individuellement mais issus de seulement 13 patientes. La distinction faite entre follicules proximaux et distaux dépendait d'un éventuel contact direct avec l'endométriope ou non.

Dans notre étude, l'analyse du sous-groupe de patiente dont le liquide folliculaire avait été ponctionné du côté de l'endométriope n'a pas permis de mettre en évidence de différence significative par rapport aux patientes sans endométriose. A noter que le nombre de patientes ayant eu le liquide folliculaire ponctionné du côté de l'endométriope n'était que de 15 ce qui peut être une limite de notre étude (12).

Enfin, l'équipe de Zhexin et al avait bien mis en évidence, sur une cohorte de 1712 patientes, un excès de fer folliculaire par méthode colorimétrique chez les patientes atteintes d'endométriose (tous stades confondus) qui était d'ailleurs associé à de moins bons résultats de prise en charge en FIV-ICSI (qualité embryonnaire et grossesse clinique) (45).

L'excès de fer au sein du liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose profonde avec ou sans endométriope semble toujours plausible au vu de cette étude et a probablement simplement manqué de puissance pour pouvoir le mettre en évidence.

Concernant l'évaluation du stress oxydant folliculaire comme facteur prédictif des résultats de prise en charge en FIV : il s'agit d'une question d'un grand intérêt dans l'endométriose tant le caractère inflammatoire et pro-oxydant de ces lésions est reconnu (53).

Notre équipe s'est intéressée à la peroxydation lipidique, mécanisme oxydatif médié par le fer en utilisant la technique de dosage par les TBARS.

Celle-ci a déjà été étudiée quelques fois dans le liquide folliculaire :

L'équipe de Nasiri et al, l'a déjà étudié de façon concomitante dans le sérum et le liquide folliculaire de 63 patientes prise en charge en FIV. Il avait d'ailleurs été retrouvé une concentration de MDA plus élevée chez les patientes atteintes d'endométriose par rapport au groupe témoin (infertilité tubaire).

L'équipe retrouvait également une diminution des marqueurs antioxydants chez ces mêmes patientes par rapport au groupe sans endométriose (54).
La peroxydation lipidique est un, parmi de nombreux, marqueur du stress oxydant. La littérature en est riche et la multiplicité des techniques de dosages complexifient les comparaisons. Il est cependant important d'essayer d'identifier des biomarqueurs qui pourraient être prédictifs des résultats de prise en charge en FIV.

Notre étude a retrouvé une corrélation négative significative entre le dosage des TBARS et le nombre d'ovocytes matures obtenus à la ponction que ce soit sur la cohorte entière comme dans le groupe endométriose. Et ce, alors même que le nombre d'ovocytes matures n'était pas significativement différent en fonction de la présence ou non d'une endométriose. De plus, il a été retrouvé une corrélation négative significative entre le taux de fer et le taux de fécondation sur la cohorte comme dans le groupe endométriose. A nouveau, le taux de fécondation n'était pas significativement différent en fonction de la présence ou non d'une endométriose.

Singh et coll., sur une analyse de 200 liquides folliculaires avaient retrouvé des niveaux plus élevés d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) (chimioluminescence) chez les patientes atteintes d'endométriose avec une corrélation négative sur les résultats de prise charge en FIV (taux d'immaturité et qualité embryonnaire) (11). Das et al, avaient également mis en évidence une corrélation négative et significative entre le dosage des ROS folliculaire et la qualité embryonnaire (31).

Kumar et al, ont étudié différents marqueurs de stress oxydant dans le sang et le liquide folliculaire de 176 femmes ayant bénéficiés d'un transfert d'embryons après une prise en charge en FIV. Il en ressortait des niveaux plus élevés de MDA (technique des TBARS) chez des patientes toutes causes d'infertilité confondues dans le liquide folliculaire avec un impact négatif sur les chances de grossesses cliniques en FIV (55).

Liu et al, ont également évalué différents marqueurs du stress oxydatif sur le liquide folliculaire de 51 patientes prise en charge en FIV. Les patientes qui n'étaient pas enceintes présentaient un taux de MDA significativement plus élevé, une incidence plus élevée d'apoptose dans les cellules de la granulosa avec un taux d'embryons de bonne qualité inférieure par rapport aux patientes qui étaient enceintes (56).

A contrario, Nakagawa et al, eux, ont évalué le stress oxydatif et le pouvoir antioxydant à l'aide du BAP-test (Biological Antioxidant Potential : mesure du pouvoir réducteur antioxydant physiologique du fer) et du dROM-test (Reactive Oxygene Metabolites : mesure des formes réactives de l'oxygène) sur liquide folliculaire de patientes présentant un endométriose unilatéral (ponction d'un seul follicule du côté de l'endométriose).
Ils n'ont pas mis en évidence de différence significative par rapport à un groupe témoin (patientes sans endométrienes) (51).

Dans l'étude préliminaire à cette étude, il n'avait pas été retrouvé d'augmentation de la mort cellulaire folliculaire ni d'augmentation de la 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, marqueur du stress oxydant sur l'ADN circulant en cas d'endométriose. Il y avait par contre une corrélation entre ces marqueurs et le taux de fécondation ainsi qu'avec la qualité embryonnaire au stade blastocyste chez les patientes atteintes d'endométriose (32).

Enfin, dans notre étude, il n'avait pas été retrouvé de différence significative sur les taux de grossesses entre les patientes atteintes d'endométriose et les patientes témoins, ni de coefficient de corrélation significatif entre le dosage de fer et de TBARS et les taux de grossesses. Cela remet peut-être en cause la question de l'altération de la qualité ovocytaire dans l'endométriose.

La littérature reste donc très controversée mais il semblerait néanmoins y avoir un lien entre stress oxydant (et notamment peroxydation lipidique folliculaire), endométriose, et résultats de prise en charge en FIV. A l'heure actuelle, aucun marqueur du stress oxydant n'a révélé sa supériorité aux autres en termes de spécificité et de pouvoir prédictif. La recherche doit encore être poursuivie avant une éventuelle application en routine.

Concernant les limites de cette étude :

Il a été retrouvé, sur la cohorte entière comme en cas d'endométriose, une corrélation entre le fer, la peroxydation lipidique et résultats de prise en charge en FIV. Ces corrélations étaient retrouvées sur le taux de fécondation et la maturité ovocytaire. Ceci questionne donc la compétence ovocytaire et pourrait être le témoin d'une altération dans la communication entre l'ovocyte et les cellules folliculaires lors de la folliculogenèse terminale.

Ces corrélations sont objectivées alors même que les résultats ne différaient pas entre les deux groupes. Ceci soulève la question du choix des patientes « témoins » ; elles restent des patientes infertiles, parfois pour des causes idiopathiques dont l'étiologie n'a pas (encore) été retrouvée. Présentaient-elles un certain degré de stress oxydant non suspecté ? Le stress oxydant ne serait-il pas à dépister de façon plus large indépendamment de la présence d'une pathologie inflammatoire ?
Un autre résultat étonnant est que la corrélation entre le dosage de fer et des TBARS n’était pas significative. Ceci soulève la question du choix du TBARS comme marqueur de l’évaluation du stress oxydant médié par le fer (18). Est-ce le dosage le plus adapté au liquide folliculaire ?

Enfin, il a été volontairement choisi d'analyser un seul follicule par patiente et non le pool
folliculaire mélangé. Ceci dans le but de ne pas surestimer des marqueurs oxydatifs
potentiellement augmentés en cas de follicule immature ponctionné (57). Il pourrait être critiqué
d'avoir comparé le résultat de ce seul follicule aux résultats de la culture de l'ensemble des
ovocytes issus de la ponction.
# V. Conclusion

Cette étude n'a pas retrouvé d'augmentation significative concernant le dosage de fer et de TBARS comme marqueur de la peroxydation lipidique chez les patientes atteintes d'endométriose pelvienne profonde et au vu de la littérature la question d'un défaut de la qualité ovocytaire dans l'endométriose reste ouverte.

Il est possible que nos résultats soient limités par la faible puissance de cette étude. De plus, bien que le stress oxydatif médié par le fer concerne l'ensemble du péritoine des patientes, peut-être que l'impact de celui-ci n'intervient qu'à proximité des lésions de type endométriose ? Cette étude n'a pas été conçue en ce sens.

Enfin, ces marqueurs se sont révélés être, sur une cohorte de patiente homogène en termes de réserve ovarienne et de réponse à la stimulation ovarienne, prédictifs du nombre de CCO, du nombre d'ovocytes matures à la ponction et du taux de fécondation. Ceci soulève donc la question de l'impact du fer sur la communication ovocyte/cumulus et la capacité du follicule, quand il est exposé au stress oxydant à maturer correctement l'ovocyte qu'il contient.

Ces résultats nécessiteraient donc d'être conforté par des études de plus grande puissance avec une discrimination particulière en cas d'endométriose à proximité du follicule étudié.
## Liste des figures

<table><tr><td>Figure 1 : représentation schématique d'un follicule antral (22)</td><td>23</td></tr><tr><td>Figure 2 : réaction de Fenton (39)</td><td>25</td></tr><tr><td>Figure 3 : schéma simplifié concernant la formation de produits de la peroxydation lipidique à partir des espèces réactives de l'oxygène (ROS) (40).</td><td>25</td></tr><tr><td>Figure 4 : schéma de la réaction d'addition MDA/TBA (47)</td><td>31</td></tr><tr><td>Figure 5 : Flow chart des patientes analysées pour le dosage de fer, TBARS et protéines.</td><td>35</td></tr><tr><td>Figure 6 : Corrélation négative significative entre le dosage du fer et le taux de fécondation dans le liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose.</td><td>41</td></tr></table>
# Liste des tableaux

Tableau 1 : Caractéristiques générales de la population .................................... 36

Tableau 2 : Comparaison du fer folliculaire et du ratio TBARS/protéines folliculaire chez les patientes atteintes ou non d'endométriose. ................................. 37

Tableau 3 : Comparaison des résultats de la stimulation ovarienne en fonction de la présence d'endométriose................................................................................ 38

Tableau 4 : Coefficient de corrélation entre le dosage de fer, le ratio TBARS/protéines et les résultats en FIV (cohorte entière n=64 et groupe endométriose n=29).................................................................................... 40
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# Annexe 1 : lettre d'information aux patientes

Ref CH: P12019_843_0087

LI et CE -v2.0 du 16/12/2021

N° IDRCB: 2019-A02858-49

## LLETTER D'INFORMATION DE LA PATIENTE POUR LA PARTICIPATION A UNE RECHERCHE IMPLIQUANT LA PERSONNE HUMAINE DE TYPE 2

### Dosage de l'ADN libre circulant dans le plasma et le liquide folliculaire chez des patientes atteintes d'endométrie prise en charge en FIV+/ICSI

**Promoteur :** CHU Amiens-Picardie
80054 Amiens Cedex 1

**Investigateur Principal :**

Dr Cabry Rosalie
Biologie et médecin de la reproduction
CHU Amiens Picardie
80054 Amiens
Tél : 03 22 08 73 68

Madame, Monsieur,

Dans le cadre de votre suivi pour Assistance Médicale à la Procédure(AMP), le docteur vous propose de participer à une recherche impliquant la personne humaine à risques et contraintes minimales dont le CHU Amiens-Picardie est le promoteur.

Il nous parait intéressant de mener cette étude auprès de personnes orientées pour une prise en charge de protocole FIV+/ICSI pour améliorer nos connaissances sur les problèmes d'infertilité chez les patientes atteintes d'endométrie.

Avant de prendre une décision, il est important que vous lisez attentivement ces pages qui vous apporteront les informations nécessaires concernant les différents aspects de cette recherche. N'hésitez pas lui à poser toutes les questions que vous jugerez utiles.

Votre décision de participer à l'étude est entièrement volontaire. **Vous pouvez vous retirer de cette étude à n'importe quel moment.** Si de nouvelles informations, pouvant influencer votre décision de poursuivre votre participation, devenant disponibles pendant l'étude, vous en seriez aussi informé.

Afin de vous aider dans vos décisions, vous pourrez être accompagné(e) de la personne de confiance que vous aurez désignée.

### 1. Pourquoi cette recherche ?

Cette étude a pour but d'améliorer les connaissances sur la qualité des ovocytes chez les patientes prises en charge en AMP et notamment dans la pathologie de l'endométrie. Pour l'instant, nous évaluerons la qualité ovocytaire sur des critères morphologiques lors de l'observation au microscope.

L'objectif será, a terms, a identificar un markeur biologique à doser dans le liquide folliculaire ou dans le sang qui serait utilisé comme un facteur prédictif de la qualité ovocytaire et de la réussite de la prise en charge d'aide médicale à la procédure.

### 2. Quel est l'objectif de cette recherche ?

L'objectif de cette recherche est de comparer la quantité d'ADN circulant (d'matériel génétique) dans le sang et dans le liquide folliculaire des patientes atteintes d'endométrie et prises en charge en FIV+/ICSI par rapport aux autres patientes non atteintes d'endométrie prise en charge en FIV+/ICSI.

Ce dosage a pour but de rechercher une apoptose accrue des cellules de la granulosa probablement en lien avec un stress oxydant accrue dans cette pathologie.

Nous souhaitons aussi comparer cette quantité d'ADN circulant avec les critères habituels de qualité ovocytaire: le nombre d'ovocytes matures recueillis, le nombre d'embryons de bonne qualité obtenus, le nombre d'embryons ayant donné une grossese.

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Ref CH: P12019_843_0087

LI et CE -v2.0 du 16/12/2021

N° IDRCB: 2019-A02858-49

Conformément au Règlement Européen 2016/679 du 27 avril 2016 (Règlement Général sur la Protection des Données Personnelles ou « RGDP », entré en vigueur le 25 mai 2018) et aux dispositions de la loi relative à l'Informatique, aux fichiers et aux libertés, vous disposez d'un droit d'accès, de portabilité, de rectification, d'effacement et de limitation des données vous concernant. Vous disposez également d'un droit d'opposition à la transmission des données couvertes par le secret professionnel susceptibles d'être utilisées dans le cadre de cette recherche et d'être traitées. L'exercice de de droit d'opposition à l'utilisation de vos données entraine l'arrêt de votre participation à l'étude.

Dans le cas où vous vous retirez explicitement de l'étude, aucune donnée supplémentaire ne sera recueillie à l'exclusion des données de suivi. Les données d'ores et d'ajours collectées seront conservées afin de préserver l'intérêt de l'étude.

Vous pouvez également accorder directement ou par l'intermédiaire du médecin de votre choix à l'ensemble de vos données médicales en application des dispositions de l'article L1111-7 du code de la santé publique. Ces droits s'exercent auprès de l'investigateur qui vous suit dans le cadre de cette recherche et qui connait votre identité ou du délégué à la protection des données, désigné par le responsable de ce traitement au sens du Règlement Européen 2016/679 et promoteur de cette étude le CHU Amiens-Picardie, joignable à l'adresse mail suivante : dp0@chu-amiens.fr.

En cas de litigation, vous disposez de tous les droits d'introduire une réclamation, prévis par la loi, auprès de la Commission Nationale de l'Informatique et des libertés (CNIL), 3 Place de Fontenoy - TSA 80715 - 75334 PARIS ou sur https://www.cnil.fr/webform/adresser-un-plaite.

Vos données seront conservées pour un maximum de 2 ans après la dernière publication scientifique liée à ce projet de recherche. Elles seront enregistrées, avec un accès très restreint, pour un maximum de 15 ans.

### 7. Aspects légaux

Cette étude est une recherche interventionnelle à risques et contraintes minimales pour laquelle le comité de protection des personnes Ile de France XI a émis un avis favorable le XX.

Le CHU Amiens-Picardie qui organise cette recherche impliquant la personne humaine de type 2 (recherche interventionnelle qui ne comporte que des risques et des contraintes minimales) en qualité de promoteur, a contracté une assurance conformément aux dispositions législatives, garantissant sa responsabilité civile et celle de tout intervenant auprès de la compagnie SHAM (Société Hospitalière d'Assurances Mutuelles) - 18 rue Edouard Rochet - 69372 Lyon cédex 08, via le Contrat de Responsabilité Civile Promoteur de Recherches impliquant la personne humaine n° 147-73. Elle répond aux critères de garantie définis pour la protection de patients participant à une recherche clinique. Le contrat d'assurance peut être consulté auprès de la Direction de la Recherche Clinique, si vous le souhaitez (CHU Amiens-Picardie 80 0054 AMIENS Cedex 1. Tél: 03.32.08.80.51).

Lorsque cette recherche sera terminée, vous serez tenu informé personnellement des résultats globaux par l'investigateur des que ceux-ci seront disponibles, si vous en faites la demande.

L'investigateur qui vous suit dans le cadre de cette recherche doit vous fournir toutes les explications nécessaires concernant cette recherche. Vous pouvez vous retirer à tout moment de l'étude sans subir le moindre préjudice, quel que soit le motif et sans avoir à vous justifier. Vous continuera à bénéficier du suivi médical optimal et cela n'aflectera en rien votre surveillance future.

Le/Docteur Rosalie Cabry est à votre disposition pour vous expliquer en détail le déroulement de l'étude et pour toute information complémentaire. Vous pouvez la joindre au 03 22 08 73 68.

Nous vous remettions par avance pour votre participation.

A :

Date :

Signature de l'investigateur :

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N° IDRCB: 2019-A02858-49

Nous doserons également au sein du liquide folliculaire un marqueur plus spécifique du stress oxydant créant des dommages sur l'ADN : la 8-hydroxy-déoxyguanosine et un marqueur de la communication entre l'ovocyte et les cellules de la granulosa : l'F1G1.

### 3. Comment va se dérouler cette recherche ?

Si vous acceptez de participer à l'étude, après avoir signé le consentement de participation, il vous sera demandé deux prises de sang supplémentaires pour le dosage de l'ADN plasmatique. Le médecin prendra également connaissance d'informations utiles à cette étude dans votre carnet de grossesse et dans votre dossier médical.

Vous aurez une première prise de sang (10 ml) pour dosage de l'ADN circulant plasmatique et de la 8-hydroxy-2-déoxyguanosine, réalisée à la centrale de prélèvement, au moment de la remise d'ordonnance le jour de la consultation. Cette prise de sang (10 ml) sera renouvelée le jour de la ponction, dans le service de chirurgie ambulatoire.

Un dosage d'ADN circulant ainsi que la 8-hydroxy-2-déoxyguanosine sera également réalisé sur le liquide folliculaire issu de la ponction, habituellement non utilisé et considéré comme déchet biologique. En cela, ce dosage dans le liquide folliculaire n'implique aucun geste invasif supplémentaire.

### 4. Qui peut participer ?

Toutes les patientes entre 18 et 43 ans prises en charges dans un protocole de FIV+/ICSI qui ne sont pas solvues pour une insuffisance ovienne prématurée, ni pour une pathologie inflammatoire et qui n'ont pas eu une infection pelvienne récente.

### 5. Quels sont les bénéfices et inconvénients possibles ?

Le bénéfice est d'aider les équipes médicales à développer un marqueur biologique non invasif de qualité ovocytaire qui pourrait ensuite être utilisé comme un marqueur pronostique de la prise en charge en FIV. L'autre bénéfice est d'aider les équipes médicales à mieux comprendre l'endométrie. Notamment en essuyant de prouver que dans cette maladie, il y a un lien entre la qualité ovocytaire et les difficultés de prises en charge, que la baisse de qualité ovocytaire est probablement due à une apoptose accrue des cellules de la granulosa en lien avec l'état inflammatoire du pelvis des patientes et l'exécès de stress oxydant au niveau cellulaire. Si ce marqueur d'apoptose, montre des résultats significatifs, il pourrait devenir un argument pour l'introduction d'un traitement anti oxydant et le développement de ces voies médicamentuses La seule contrainte est le fait de devoir subir deux prises de sang.

Les risques sont ceux liés à la réalisation d'une prise de sang (hématome ou infection cutanée au point de prélèvement).

### 6. Traitement des données et droit d'accès

Les informations nécessaires à l'étude seront recueillies sur des cahiers d'observation.

Les données collectées resteront strictement confidentielles et seront traitées selon les règles du secret médical dans une finale de intérêt public. Elles seront codées, identifiées par un N° et vos initials sans votre nom et analyses par informatique. Nous n'autorisons leur consultation que par des personnes qui collaborent à l'étude, dûment mandataires par le promoteur, et eventuellement par des représentants des autorités administratives ou des autorités de santé s'ils en font sur la demande.

Vos données pourront être utilisées pour des recherches ultérieures ou des analyses complémentaires à la présente recherche en collaboration avec des partenaires privés ou publics, en France ou à l'étranger, dans des conditions assurant leur confidentialité et le même niveau de protection que la législation européenne.

Vous pouvez retirer à tout moment votre consentement à l'utilisation ultérieure de vos données auprès de l'investigateur qui vous suit dans le cadre de cette recherche.

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# Résumé / abstract

## THESE N°2024-57

**Introduction** : L'endométriose est une pathologie bénigne de la femme en âge de procréer responsable d'infertilité dont les mécanismes physiopathologiques sont encore mal connus. La qualité ovocytaire, paramètre difficile à évaluer, pourrait être impliqué. L'objectif de ce travail est d'évaluer deux paramètres du micro-environnement ovocytaire dans le liquide folliculaire, le fer et la peroxydation lipidique, comme potentiels marqueurs indirects de la qualité ovocytaire dans cette pathologie.

**Matériel et méthode** : il s'agit d'une étude de cohorte de 64 patientes prise en charge en FIV+/-ICSI. 29 d'entre elles présentaient une endométriose pelvienne profonde. Les patientes obèses, avec une BRO ou une SOPK étaient exclues. Le fer a été dosé par colorimétrie et la peroxydation lipidique par le dosage de TBARS au sein d'un follicule mature. Ces analyses étaient ensuite corrélées aux résultats de la FIV +/- ICSI.

**Résultats** : Il n'a pas été mis en évidence d'augmentation significative du dosage du fer et de TBARS dans le liquide folliculaire de patientes atteintes d'endométriose. Cependant, le dosage du fer était négativement corrélé au taux de fécondation et le dosage des TBARS aux nombres d'ovocytes matures, avec un coefficient de corrélation plus fort en cas d'endométriose.

**Discussion** : La littérature reste assez controversée mais il semblerait que le stress oxydant via la peroxydation lipidique induite par un excès de fer au sein du follicule puisse impacter la fertilité et les résultats de prise en charge en FIV des patientes atteintes d'endométriose. Cette étude a probablement manqué de puissance pour pouvoir le mettre en évidence.

**Conclusion** : Cette étude n'a pas retrouvé d'augmentation significative concernant le dosage de fer et la peroxydation lipidique chez les patientes atteintes d'endométrioses pelviennes profondes. Il a cependant été retrouvé une corrélation entre ces marqueurs et la maturité ovocytaire comme le taux de fécondation. Ces marqueurs sont de potentiels témoins de l'altération de la qualité ovocytaire et d'autres études, plus puissantes seraient nécessaires pour étayer ces résultats. La question d'un éventuel défaut de la qualité ovocytaire dans l'endométriose reste toujours et encore débattue.

**Mots clés** : endométriose, stress oxydant, fer, peroxydation lipidique, TBARS, qualité ovocytaire.

**Introduction:** Endometriosis is a benign pathology of women of childbearing age responsible for infertility, the pathophysiological mechanisms of which are still poorly understood. Oocyte quality, a parameter which is difficult to assess, may be involved. The aim of this study was to evaluate two parameters of the oocyte microenvironment in follicular fluid, iron and lipid peroxidation, as potential indirect markers of oocyte quality in this pathology.

**Material and methods:** This is a cohort study of 64 IVF+/-ICSI patients. Of these, 29 had deep pelvic endometriosis. Patients with obesity, BRO or PCOS were excluded. Iron was measured colorimetrically and lipid peroxidation by TBARS in a mature follicle. These analyses were then correlated with the results of IVF +/- ICSI.

**Results:** There was no significant increase in iron or TBARS levels in the follicular fluid of patients with endometriosis. However, iron levels were negatively correlated with fertilization rates and TBARS levels with numbers of mature oocytes, with a stronger correlation coefficient in cases of endometriosis.

**Discussion:** The literature is still rather controversial, but it would appear that oxidative stress via lipid peroxidation induced by excess iron within the follicle may impact fertility and IVF management outcomes in patients with endometriosis. This study probably lacked the power to demonstrate this.

**Conclusion:** This study found no significant increase in iron levels or lipid peroxidation in patients with deep pelvic endometriosis. However, these markers were correlated with oocyte maturity and fertilization rate. These markers are potential indicators of altered oocyte quality, and further, more powerful studies are needed to substantiate these findings. The question of a possible oocyte quality defect in endometriosis is still being debated.

**Key words:** endometriosis, oxidative stress, iron, lipid peroxidation, TBARS, oocyte quality.