# Les organoïdes intestinaux des animaux de rente : de nouveaux modèles de culture in vitro pour une meilleure compréhension du fonctionnement de l'intestin

Agnès Wiedemann, Sonia Lacroix-Lamandé

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Agnès Wiedemann, Sonia Lacroix-Lamandé. Les organoïdes intestinaux des animaux de rente : de nouveaux modèles de culture in vitro pour une meilleure compréhension du fonctionnement de l'intestin. INRAE Productions Animales, 2023, 36 (2), pp.7562. 10.20870/productions-animales.2023.36.2.7562. hal-04019991

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# Les organoïdes intestinaux des animaux de rente : de nouveaux modèles de culture *in vitro* pour une meilleure compréhension du fonctionnement de l'intestin

Agnès Wiedemann¹,² et Sonia Lacroix-Lamandé¹

¹ INRAE, Université de Tours, ISP, 37380 Nouzilly, France

² IRSD - Institut de Recherche en Santé Digestive, Université de Toulouse, INSERM, INRAE, ENVT, UPS, Toulouse, France

Courriel : sonia.lamande@inrae.fr

## Résumé

L'intestin est un organe complexe aux fonctions multiples. En effet, il participe à la digestion et l'absorption des nutriments et protège l'individu des agressions par des agents pathogènes intestinaux en assurant un rôle de barrière. L'étude de ce compartiment digestif reste toutefois limitée par l'accès aux tissus que ce soit chez l'Homme ou l'animal.

Dans ce contexte, le développement d'organoïdes intestinaux à partir de cellules souches représente une avancée technologique importante dans l'étude de la physiopathologie intestinale. De plus, cet outil permet de répondre à une demande sociétale visant à réduire l'usage d'animaux modèles pour la recherche et s'inscrit dans la démarche des 3Rs (Remplacement, Réduction et Raffinement).

L'objectif de cette revue est, à partir de rappels de la fonction digestive, de faire un état des lieux sur les différents types d'organoïdes intestinaux existants dérivés d'animaux de rente et de discuter leurs avantages, leurs limites et surtout leur application.

## Abstract

**Intestinal organoids of farm animals: new in vitro models for a better understanding of intestinal functions.**

The intestine is a complex organ with multiple functions. Indeed, it participates in the digestion and absorption of nutrients and protects the host from enteropathogen attack by providing a
barrier function. However, the study of this digestive compartment remains limited due to access to human or animal tissues.

In this context, the development of intestinal organoids derived from stem cells represents an important technological advance in the study of intestinal physiopathology. In addition, this tool makes it possible to respond to a societal demand aiming at reducing the use of animal models in research and is part of the 3R's principle (Replacement, Reduction and Refinement).

The objective of this review is, from reminders of the digestive function, to make an inventory of the different types of existing intestinal organoids derived from farm animals and to discuss their advantages, their limits and especially their application.

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## 49 Chapeau

Les organoïdes intestinaux sont des structures cellulaires tridimensionnelles obtenues in vitro après auto-organisation des cellules souches cultivées avec des facteurs de croissance et de différenciation adéquats. Ces nouveaux modèles cellulaires récapitulent l'architecture et les types cellulaires de l'épithélium intestinal et conservent des fonctions similaires (Hofer and Lutolf 2021). Ils offrent donc un outil intéressant pour la caractérisation de mécanismes impliqués dans la physiopathologie de l'épithélium intestinal et ses interactions avec des pathogènes entériques retrouvés chez les animaux d'élevage<fnref n="1" />.

## 57 Introduction

Ces dernières années, les avancées scientifiques sur les cellules souches et en bio-ingénierie ont permis de révolutionner la culture cellulaire avec un changement de dimensions de 2 (2D) à 3 (3D) pour améliorer la pertinence physiologique des études « *in vitro* ». Ainsi sont nés les « organoïdes », ou mini-organes, qui permettent aujourd'hui de pouvoir reproduire au plus proche de la réalité la physiologie du cerveau, du foie, des intestins etc. de l'Homme. Leur utilisation représente un grand intérêt en recherche pour évaluer l'efficacité et la toxicité de molécules pharmaceutiques, pour étudier les infections, et pour la médecine régénérative/la transplantation d'organes.

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Le développement d'organoïde est initié par la mise en culture de cellules souches ayant des propriétés uniques d'auto-renouvellement et de différenciation. Selon leur origine, on distingue les cellules souches embryonnaires (ESC pour *embryonic stem cell*) pluripotentes, les cellules souches adultes ou tissulaires mulipotentes, et celles obtenues par reprogrammation somatique, dites cellules souches pluripotentes induites (iPSCs pour

<footnote n="1">¹ Cette synthèse a fait l'objet d'une présentation : Lacroix-Lamandé S., Wiedemann, A., 2021. Etude ex vivo des interactions hôte-pathogènes au moyen de cultures d'organoïdes dérivés de cryptes intestinales. 6ème journée thématique de Biotechnocentre « Cellules souches et organoïdes : réalités et perspectives » 25 juin 2021, et d'une publication, Beaumont, M., F. Blanc, C. Cherbuy, G. Egidy, E. Giuffra, S. Lacroix-Lamande, and A. Wiedemann. 2021. 'Intestinal organoids in farm animals', Vet Res, 52: 33.</footnote>
73 *induced pluripotent stem cell*) (Pain 2021). Elles sont cultivées dans des milieux contenant
74 divers facteurs de croissance, inhibiteurs de mort cellulaire et des facteurs de différenciation
75 spécifiques des tissus et dans une matrice cellulaire proche de celle existant in vivo avec des
76 laminines et du collagène leur permettant de s'auto-organiser non pas étalées au fond d'une
77 boîte de Pétri, mais en 3D.

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79 Les organoïdes intestinaux font partie des outils de culture cellulaire 3D les plus développés et étudiés à l'heure actuelle. En effet, l'amélioration des connaissances des voies de signalisation impliquées dans le maintien et la prolifération des cellules souches intestinales qui expriment spécifiquement Lgr5+, un récepteur orphelin à 7 domaines transmembranaire, a permis le développement rapide des organoïdes intestinaux chez la souris et l'homme (Sato et al. 2009; Sato, Stange, et al. 2011). Ils peuvent être générés in vitro à partir des cellules souches des différents segments de l'intestin et conservent ainsi toutes les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles de leurs tissus d'origine. On appellera alors « entéroïdes » les organoïdes intestinaux dérivés de l'intestin grêle et « colonoïdes » ceux dérivés du côlon (Stelzner et al. 2012). Ces structures 3D auto-organisées sont composées d'une monocouche de cellules épithéliales intestinales polarisée qui récapitule in vitro la composition multicellulaire de l'épithélium intestinal et son architecture avec des domaines cryptiques. Ces « mini intestins » reproduisent également leurs principaux rôles tels que l'absorption des nutriments et la fonction barrière (Sato et al. 2009).

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94 Chez les animaux de rente, quatre revues internationales récentes ont décrit tous les travaux réalisés à partir d'organoïdes intestinaux de différents animaux de ferme et les particularités des milieux de culture de chaque modèle cellulaire (Seeger 2020; Beaumont et al. 2021; Lacroix-Lamandé S., Wiedemann, A, 2021; Kar et al. 2021; Holthaus et al. 2020). Dans cette revue, nous décrirons la composition de l'épithélium intestinal pour mieux comprendre comment la technologie des organoïdes intestinaux a pu se développer. Un état des lieux des différents modèles d'organoïdes intestinaux des animaux de rente fera l'objet d'une autre partie de cette revue pour finir sur quelques applications actuelles et futures de ces outils innovants (Tableau 1). Ils ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la recherche animale et répondent à une demande sociétale de limiter l'utilisation des animaux en recherche. C'est pourquoi, un collectif de scientifiques, chercheurs et ingénieurs de INRAE, s'approprient actuellement ces nouvelles méthodologies et ont constitué un groupe de travail (GT Organoïde INRAE) pour échanger et progresser plus efficacement sur cette technologie.

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<table><thead><tr><th>Espèce</th><th>Segment</th><th>Application</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">Porc</td><td>Duodenum</td><td>Stimulation avec du LPS<br/>Edition de génome</td><td>(Koltes and Gabler 2016)<br/>(Engevik et al. 2020)</td></tr><tr><td rowspan="3">Jejunum</td><td>Identification des types cellulaires<br/>Culture 2D et transcriptomique</td><td>(Gonzalez et al. 2013)<br/>(van der Hee et al. 2018; van der Hee et al. 2020; Hoffmann et al. 2021)</td></tr><tr><td>Stimulation avec des Mycotoxines, Stress thermique<br/>Infection par le Swine enteric virus, S. Typhimurium and T. gondii<br/>Supplémentation en cuivre</td><td>(Li, Zhu, et al. 2019; Zhou et al. 2020)<br/>(Li et al. 2020; Derricott et al. 2019)<br/>(Yin et al. 2021)</td></tr><tr><td>Modèle de développement de l'intestin<br/>Supplémentation en Vitamine A<br/>Infection par Lawsonia intracellularis</td><td>(Powell and Behnke 2017; Ferrandis Vila et al. 2018)<br/>(Wang et al. 2020)<br/>(Resende et al. 2020)</td></tr><tr><td>Duodenum, Jejunum, Ileum, Colon</td><td>Infection par le virus Porcine epidemic diarrhea virus</td><td>(Li, Fu, et al. 2019)</td></tr><tr><td rowspan="3">Poulet</td><td>Caecum, jejunum</td><td>Modèle de développement de l'intestin</td><td>(Powell and Behnke 2017; Li et al. 2018)</td></tr><tr><td>Intestin grêle</td><td>Traitements Chimiques</td><td>(Acharya et al. 2020)</td></tr><tr><td>Intestin grêle, embryon</td><td>Modèle de développement de l'intestin, Stimulation par des agonistes de TLR et Lactobacillus acidophilus, Infection par Eimeria, Salmonella et Influenza</td><td>(Panek, Grabacka, and Pierzchalska 2018; Pierzchalska et al. 2017; Pierzchalska et al. 2012; Pierzchalska et al. 2019; Nash et al. 2021; Orr et al. 2021)</td></tr><tr><td rowspan="3">Bovin</td><td>Jejunum</td><td>Infection par S. Typhimurium and T. gondii<br/>Modèle de développement de l'intestin</td><td>(Derricott et al. 2019)<br/>(Lee et al. 2021)</td></tr><tr><td rowspan="2">Ileum</td><td>Modèle de développement de l'intestin</td><td>(Hamilton et al. 2018; Powell and Behnke 2017)</td></tr><tr><td>Infection par E. coli, Rotavirus</td><td>(Fitzgerald et al. 2019; Alfajaro et al. 2019)</td></tr><tr><td>Colon</td><td>Culture 2D, cryoconservation</td><td>(Topfer et al. 2019)</td></tr><tr><td>Mouton</td><td>Ileum</td><td>Modèle de développement de l'intestin</td><td>(Powell and Behnke 2017)</td></tr><tr><td>Cheval</td><td>Ileum, jejunum</td><td>Modèle de développement de l'intestin</td><td>(Powell and Behnke 2017; Stewart, Freund, and Gonzalez 2018)</td></tr><tr><td>Lapin</td><td>Caecum</td><td>Modèle de développement de l'intestin et 2D</td><td>(Mussard et al. 2020; Kardia et al. 2021)</td></tr></tbody></table>

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Tableau 1. Etat des lieux des organoïdes intestinaux des animaux de rente.

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Tableau adapté de Beaumont et al., 2021.

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127 1. Le tractus gastro-intestinal

128 1.1. Structure et fonctions du tube digestif

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130 Différents compartiments constituent le tractus intestinal depuis la bouche jusqu'à l'anus :
131 l'œsophage, l'estomac, l'intestin grêle lui-même subdivisé en 3 compartiments (duodénum,
132 jéjunum et iléon), le caecum, le côlon et le rectum. Le duodénum reçoit le chyme alimentaire,
133 le suc biliaire et les sécrétions pancréatiques pour compléter la digestion chimique. Le jéjunum
134 est le site principal d'absorption des nutriments tandis que l'iléon absorbe les nutriments
135 résiduels, les vitamines et les acides biliaires conjugués. Le gros intestin est composé du caecum
136 et du côlon, dont les fonctions principales sont d'absorber l'eau, les électrolytes et les produits
de fermentation microbienne.
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138 Tous ces organes ont la même origine embryonnaire mais exercent des fonctions spécifiques à
139 leur localisation pour permettre la digestion des aliments, la fonction première attribuée à
140 l'intestin. L'intestin joue également un rôle de barrière en permettant le passage spécifique des
141 nutriments lors de la digestion et en prévenant celui de pathogènes. Il est constitué de 4 couches
142 successives permettant d'assurer l'ensemble de ses fonctions (Figure 1). La couche la plus
143 externe du tube est appelée la séreuse, elle est accolée à la musculeuse qui est composée de
144 muscles lisses longitudinaux et circulaires et d'un système nerveux entérique (SNE) essentiel à
145 la fonction de motricité intestinale pour l'élimination du bol alimentaire. La 3ème couche
146 correspond à la sous-muqueuse. Elle est constituée de tissu conjonctif lâche contenant des
147 vaisseaux sanguins et lymphatiques ainsi que les neurones et cellules gliales du SNE. La
148 dernière couche appelée muqueuse est constituée d'un épithélium en contact direct avec la
149 lumière digestive et d'un système immunitaire appelé GALT pour Gut associated lymphoid
150 tissue. L'épithélium constitue une barrière physique entre l'organisme et le milieu extérieur. A
151 cette interface se localise le microbiote intestinal jouant également un rôle important dans la
152 digestion et dans la protection de l'hôte.
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

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154 Figure 1. Coupe Histologique représentant la paroi de l'intestin grêle.

155 L'intestin est un tube creux constitué de quatre couches: la muqueuse, la sous muqueuse, la

156 musculeuse et la séreuse. L : lumière intestinale ; C : crypte

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## 1.2. Composition de l'épithélium intestinal

161 L'épithélium intestinal est composé de villosités et de cryptes (Figure 1 et 2). Il est formé d'une monocouche de cellules épithéliales différenciées ou prolifératrices situées à l'interface entre 162 milieu extérieur (lumière intestinale) et l'hôte. Les cellules épithéliales différenciées assurent 163 des fonctions de digestion et de défenses physique, en formant une barrière, et immunologique 164 en produisant des agents anti-microbiens et des cytokines ou chimiokines. Les cellules épithéliales en prolifération assurent le renouvellement de l'épithélium qui se produit tous les 165 3 à 5 jours. La balance entre la prolifération et la différenciation doit être maintenue et finement 166 régulée pour assurer l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Cet équilibre est contrôlé par des 167 gradients d'activations spécifiques des grandes voies de signalisation (Wnt, Notch, Bmp) 168 Figure 2. 169

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174 Figure 2. Composition de l'épithélium intestinal.

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L'intestin est un tube recouvert de villosités elles-mêmes recouvertes d'un épithélium monocouche. Différents types de cellules épithéliales composent cet épithélium. Dans les cryptes intestinales, se trouvent les cellules souches Lgr5+ qui prolifèrent et migrent le long de l'axe crypto-villositaire pour se différencier en cellules absorbantes que sont les entérocytes ou en cellules sécrétrices telles que les cellules caliciformes, les cellules entéroendocrines et les cellules Tuft. Les cellules de Paneth sont elles aussi des cellules différenciées mais ne migrent pas, elles restent localisées dans les cryptes et constituent une niche pour les cellules souches. La prolifération des cellules ou leur différenciation implique une régulation fine des voies de signalisation. Ainsi, la voie Wnt est fortement active dans les cryptes et favorise la prolifération et le maintien des cellules prolifératives. La voie Bmp est active dans les villosités et permet la différenciation des cellules. La voie Notch est active dans les cryptes au niveau des cellules progénitrices absorbantes et des cellules souches et permet notamment le choix du lignage de différenciation (cellules absorbante ou sécrétrice) et le maintien de la prolifération.

a. Les villosités

Les cellules spécialisées ou différenciées, recouvrent les villosités dans l'intestin grêle, et se positionnent dans le tiers supérieur des cryptes dans le côlon. Il existe 5 types de cellules différenciées dans l'intestin appartenant à deux grands lignages cellulaires dans cet épithélium: le type absorbant, représenté par les entérocytes, et le type sécrétoire, auquel correspondent les cellules de Paneth, les cellules caliciformes, les cellules entéro-endocrines et les cellules Tuft ou « touffues ». Les entérocytes représentent 80% des cellules de l'épithélium et ont un rôle dans l'absorption des nutriments. Les cellules entéro-endocrines sont moins nombreuses (1%) et sont spécialisées dans la sécrétion de peptides et d'hormones (telles que la sérotonine, les catécholamines, l'adrénaline, l'enteroglucagon, du peptide YY et bien d'autres...) pour agir sur la mobilité intestinale et les fonctions digestives. Elles sont stimulées par les produits de digestions (glucose, acides-aminés...) et les produits de de fermentation du microbiote tels que
202 les acides gras à chaine courte (de l'anglais SCFA (short-Chain Fatty Acids). De par leur fonction, elles sont plus nombreuses en partie proximale de l'intestin grêle et les peptides et les hormones qu'elles produisent sont différentes selon leur localisation (Gribble and Reimann 2019). La fonction de protection est principalement assurée par les cellules de Paneth qui sécrètent des peptides antimicrobiens et les cellules caliciformes qui représentent 5% des cellules épithéliales spécialisées dans la sécrétion du mucus. Les cellules « touffues » appelées ainsi de par leur aspect en microscopie électronique à balayage, ont plus récemment été décrites et participent à l'immunité antiparasitaire (Figure 2). Tous ces types de cellules épithéliales intestinales différenciées dérivent des cellules souches épithéliales intestinales situées à la base des cryptes épithéliales. Ils acquièrent leur spécificité en se différenciant le long de l'axe crypto-villositaire (Gehart and Clevers 2019). En revanche, les cellules de Paneth restent au fond des cryptes et participent également au maintien de la niche des cellules progénitrices et des cellules souches Lgr5⁺ (Sato, van Es, et al. 2011). La distribution des types de cellules épithéliales diffère également le long de l'intestin, ce qui reflète la spécialisation fonctionnelle des segments digestifs (Middendorp et al. 2014).

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## b. Les cryptes ou niches des cellules souches

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220 Dans les cryptes intestinales, les cellules souches sont appelées les CBC pour crypt base columnar cell et expriment le récepteur Lgr5. Ces cellules prolifèrent activement et possèdent les caractéristiques typiques des cellules souches dans un environnement privilégié appelé « niche ». À chaque division, elles engendrent des cellules progénitrices qui s'amplifient, puis se différencient dans les différents types cellulaires de l'épithélium intestinal (Seishima and Barker 2019).

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227 La signalisation Wnt/β-caténine participe au contrôle de la prolifération, au maintien des cellules souches, et au renouvellement de l'épithélium intestinal (van der Hee et al. 2020; Randall, Turton, and Foster 2011). Si les cellules souches génèrent leur propre niche qui leur assure, par un effet paracrine, un rôle protecteur et instructeur, les cellules avoisinantes telles que les cellules épithéliales adjacentes (cellules de Paneth), les myofibroblastes, les neurones entériques, les cellules endothéliales, les lymphocytes intraépithéliaux et les macrophages participent également à cette « niche ». Dans cette niche sont sécrétés des facteurs activant la voie Wnt tels que Wnt3a, de l'EGF (epidermal growth factor), des ligands des récepteurs Notch pour favoriser la prolifération, et du TGF-α (transforming growth factor-α) (Sato, van Es, et al. 2011).

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# 2. Les modèles in vitro pour étudier l'intestin des animaux de rente

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240 Etudier les fonctions de l'épithélium intestinal chez les espèces animales a des implications majeures en recherche que ce soit pour l'amélioration de l'efficacité alimentaire des animaux, pour la santé vétérinaire en décryptant les interactions entre l'intestin des animaux et les agents pathogènes entériques ou encore pour la recherche biomédicale avec l'utilisation des animaux

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en tant que modèle de maladies humaines. Les modèles couramment utilisés pour étudier l'épithélium intestinal des animaux sont les lignées cellulaires de cellules épithéliales immortalisées. Ces lignées sont disponibles chez le porc (IPEC-J2, dérivées du jéjunum ou PoCo83-3 dérivé du colon) mais n'existent pas pour d'autres espèces animales comme le poulet et le bovin. De plus, elles présentent l'inconvénient majeur de ne pas représenter l'hétérogénéité cellulaire de l'épithélium et par conséquent ne reproduisent pas entièrement la fonctionnalité des tissus (Vergauwen 2015; van der Hee et al. 2020). La culture *ex vivo* d'explants intestinaux ou de cellules épithéliales intestinales primaires récapitule les principales caractéristiques du tissu *in vivo*, mais elle ne convient pas aux expériences de longue durée en raison de la viabilité limitée à environ 24 ou 48h (Randall, Turton, and Foster 2011). Le développement récent des organoïdes intestinaux des animaux de rente résout la plupart de ces limitations. Une revue récente décrit les progrès réalisés pour les études *in vitro* de l'intestin chez l'Homme depuis l'utilisation des lignées cellulaires jusqu'aux organoïdes cultivés sur puce (décrits à la fin de la revue) (Rahman et al. 2021).

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# 3. Les organoïdes intestinaux des animaux de rente

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## 3.1. Les cellules souches pour cultiver des organoïdes pluripotentes

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Les organoïdes sont cultivés à partir de cellules souches ayant des propriétés d'auto-renouvèlement et de différenciation leur permettant de générer l'ensemble des cellules de l'organisme. Trois types de cellules souches sont généralement utilisées pour dériver des organoïdes : les cellules souches à pluripotence induite (iPSC) (des cellules somatiques reprogrammées génétiquement pour les rendre pluripotentes) ou les cellules souches embryonnaires (ESC) ou encore les cellules souches multipotentes isolées de tissus. Malgré les progrès récents pour le développement de cellules iPSC des animaux domestiques (Bogliotti et al. 2018; Sato and Clevers 2013), à notre connaissance, tous les modèles organoïdes intestinaux d'espèces animales ont été développés avec les cellules souches isolées de tissus.

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## 3.2. Culture des organoïdes intestinaux

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La culture d'organoïde intestinal est basée sur la reproduction de la niche des cellules souches *in vitro*. Ainsi, le milieu de culture des organoïdes contient des facteurs permettant de stimuler la voie Wnt (Wnt3a et R-Spondin), de l'EGF important pour la prolifération des cellules souches et du Noggin pour inhiber la signalisation Bmp. Grâce à ces facteurs, les organoïdes croissent et forment au bout de quelques jours des mini-intestins regroupant toutes les cellules différenciées de l'épithélium intestinal. Lorsque des cellules souches d'intestin grêle sont cultivées, des bourgeons contenant des cellules souches ainsi que des cellules de Paneth se forment et reproduisent l'architecture des cryptes (Figure 3). Les cellules différenciées se retrouvent hors des cryptes dans des domaines récapitulant l'organisation des villosités. Pour obtenir la structure 3D des organoïdes, les cellules souches épithéliales intestinales sont
284 généralement ensemencées dans du Matrigel™, un gel de protéines de la matrice extracellulaire contenant des facteurs de croissance.

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287 Les organoïdes intestinaux humains et murins sont dérivés des cellules souches isolées de tissus intestinaux ou de cellules souches pluripotentes induites ou de cellules souches embryonnaires (Gao et al. 2019). Ces méthodes ont récemment été adaptées à de nombreuses espèces agronomiques, notamment le porc, le lapin, le bovin, le mouton, le cheval et le poulet (Figure 4 et Tableau 1) (Panek, Grabacka, and Pierzchalska 2018). Les modèles organoïdes intestinaux n'ont pas encore été développés pour les poissons. Des organoïdes intestinaux d'animaux de ferme ont été obtenus avec succès à partir de plusieurs segments digestifs (duodénum, jéjunum, iléon, caecum et côlon).

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298 Figure 3. Génération et culture d'organoïdes intestinaux.

299 Les organoïdes intestinaux sont générés à partir des cellules souches intestinales. Que ce soit pour l'Homme ou l'animal, celles-ci peuvent être purifiées à partir de cryptes isolées de fragments d'intestin ou de biopsies. Elles sont ensuite mises en culture avec des facteurs de croissance adaptés et dans une matrice leur permettant une croissance en 3D. (A) Schéma de protocole expérimental pour obtenir des organoïdes intestinaux en culture. (B) Images de microscopie optique illustrant le développement au cours du temps des organoïdes intestinaux en culture à partir d'ensemencement de cellules de cryptes intestinales.

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308 a. Isolement des cellules souches intestinales

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310 La première étape de la culture d'organoïdes intestinaux des animaux de rente consiste à isoler les cryptes intestinales contenant les cellules souches avec des protocoles proches de ceux utilisés pour l'Homme et la souris. A partir du prélèvement d'intestin du segment désiré, des étapes d'incubation et d'agitation avec des tampons de dissociation généralement à base d'acide

313
314 éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et du dithiothréitol (DTT) sont réalisées. Selon les
315 espèces et les segments digestifs, la concentration en EDTA varie énormément de même que le
316 temps et la température d'incubation. Dans certains cas, un inhibiteur de la mort des cellules
317 épithéliales, le Y27632, est ajouté lors de la purification. Les cryptes isolées sont ensuite
318 ensemencées dans du Matrigel™ et le milieu de croissance est ajouté.

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320 b. Mise en Culture des cryptes intestinales

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322 Face à la diversité des facteurs nécessaires à la culture des organoïdes, la difficulté à obtenir
323 des molécules recombinantes spécifiques de chacune des espèces animales étudiées aurait pu
324 constituer un frein au développement de ces nouveaux modèles de culture. Toutefois, la
325 conservation évolutive élevée des séquences en acides aminés des facteurs de croissances entre
326 les espèces animales a rendu possible la culture d'organoïdes intestinaux à partir de facteurs
327 humains ou murins (Panek, Grabacka, and Pierzchalska 2018; Mussard et al. 2020). Ainsi, de
328 très nombreuses études rapportent l'utilisation du milieu conditionné de cellules L-WRN
329 (lignée cellulaire L de souris sécrétant Wnt3a, R-spondin et Noggin, ATCC® CRL-3276TM)
330 pour cultiver des organoïdes intestinaux de plusieurs espèces comme le poulet et le lapin
331 (Panek, Grabacka, and Pierzchalska 2018; Mussard et al. 2020). Comme décrit précédemment,
332 le développement des organoïdes intestinaux à partir des cellules souches est possible en
333 inhibant la signalisation de la voie Bmp par le Noggin, en stimulant la prolifération des cellules
334 souches épithéliales par la R-Spondin et la protéine Wnt3a, cette dernière participant également
335 à la différenciation des cellules épithéliales. Pour faciliter la croissance des organoïdes
336 intestinaux, le milieu peut également contenir de l'EGF, ou des suppléments de culture cellulaire
337 tels que des vitamines ou des mélanges complexes commercialisés tels que les suppléments N2
338 et B27.

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340

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<figure><img src="image_5.png" /></figure>

342

<caption>343 Figure 4: Organoïdes intestinaux dérivés de cryptes jéjunales de poulet cultivés en milieu L-</caption>

344 WRN.

345 (A) Image de microscopie optique d'organoïde mature en culture. (B-C) Caractérisation du modèle
346 organoïde intestinal aviaire par microscopie électronique à transmission. La face luminale (L) de
347 l'organoïde est apparente dont la surface est décorée d'une bordure en brosse (visualisée avec un
348 astérisque). M indique une cellule à mucus qui fait face à la lumière et la flèche indique les jonctions
349 intercellulaires caractéristiques de l'organisation polarisée des cellules.
350

351
351 En absence de molécules recombinantes spécifiques d'espèce, une autre approche a été de 352 cultiver des organoïdes intestinaux de porc et de bovin avec du milieu de croissance commercial 353 optimisé par STEMCELL Technologies (Vancouver, Canada) pour la souris et les organoïdes 354 humains (Li, Zhu, et al. 2019; Derricott et al. 2019; Li, Fu, et al. 2019).

355 Enfin, l'utilisation d'inhibiteurs ou d'activateurs synthétiques des voies de signalisation 356 essentielles à la physiologie intestinale est également un moyen de s'affranchir de la 357 disponibilité des molécules recombinantes. Ainsi l'inhibiteur CHIR99021 peut être utilisé pour 358 inhiber la glycogène synthase kinase 3 et ainsi activer la voie Wnt dans la culture d'organoïdes 359 intestinaux de porc, bovin, cheval et lapin (Zhou et al. 2020; Derricott et al. 2019; Stewart, 360 Freund, and Gonzalez 2018; Mussard et al. 2020). Dans plusieurs études, la prolifération 361 épithéliale et l'inhibition de la différenciation ont été facilitées par les inhibiteurs du récepteur 362 TGFβ (LY2157299, A8301, SB43542) et l'inhibiteur de p38 MAPK SB202190 (Holmberg et 363 al. 2017). Enfin, il est possible de remplacer le Noggin par l'inhibiteur de la voie Bmp 364 LDN193189 comme cela a été décrit pour la culture d'organoïdes de caecum de lapin (Mussard 365 et al. 2020). Un autre inhibiteur est classiquement utilisé pour la culture d'organoïdes 366 intestinaux pour empêcher la mort des cellules épithéliales isolées, l'inhibiteur ROCK, Y27632 367 (Li, Zhu, et al. 2019).

368 Pour améliorer la culture et plus précisément la différenciation des organoïdes intestinaux, il 369 est possible de moduler les concentrations des facteurs de niche tels que Wnt3a ou Noggin 370 comme cela a été décrit les organoïdes du caecum de lapin (Mussard et al. 2020) et les 371 entéroïdes bovins (Hamilton et al. 2018; Topfer et al. 2019).

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### c. Culture dans le temps des organoïdes intestinaux

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375 Dans tous les épithélia, la cellule épithéliale est dite « polarisée ». En effet, elle repose sur une 376 membrane basale ce qui permet de lui définir un pôle basal, en contact avec la membrane basale 377 et un pôle apical exposé au milieu « extérieur ». Cultivés en 3D dans une matrice, classiquement 378 dans du Matrigel™, l'épithélium des organoïdes intestinaux acquiert cette caractéristique de 379 polarisation avec la partie apicale vers l'intérieur de l'organoïde. Cette orientation de 380 l'épithélium intestinal peut présenter des inconvénients à l'utilisation de ce modèle *in vitro*. Le 381 premier est directement relié aux caractéristiques intrinsèques de l'épithélium intestinal réputé 382 pour sa vitesse de renouvellement, qui est la plus élevée de l'organisme et qui entraîne une 383 quantité importante de cellules mortes s'accumulant dans la lumière des organoïdes classiques. 384 Cette accumulation excessive au cœur de l'organoïde de cellules mortes, par le phénomène 385 d'anoïkose, nécessite de les dissocier en moyenne chaque semaine pour les maintenir dans une 386 culture viable. L'autre inconvénient dépend de la question scientifique pour laquelle l'outil va 387 être utilisé. En effet, pour des études des interactions microbiote-épithélium, ou pathogènes- 388 épithélium ou encore pour étudier le devenir de nutriments, l'accès au pôle apical de 389 l'épithélium est indispensable. La technique de micro-injection est un moyen d'accéder à la 390 lumière de l'organoïde, cependant, elle nécessite un appareillage et une technicité complexe qui 391 ne sont pas adaptées à tous les questionnements scientifiques et notamment aux applications à 392 haut débit (Puschhof et al. 2021).

393
Pour pallier cet inconvénient majeur, d'autres façons de cultiver les organoïdes intestinaux ont été décrits à partir de ce qui a été réalisé chez l'homme et la souris. Les organoïdes peuvent être dissociés en plus petits fragments ou cellules isolées mécaniquement ou par digestion enzymatique. Les fragments peuvent ainsi être exposés aux pathogènes ou à des nutriments puis re-ensemencés en Matrigel™ pour se réorganiser et se transformer de nouveau en organoïdes. L'inconvénient de cette méthode est la perte probable de polarité de l'épithélium une fois dissocié, ce qui signifie que son exposition aux pathogènes ou à des nutriments n'est pas très représentatif de la situation in vivo. Une autre approche consiste à ensemencer les cellules isolées dans une configuration monocouche 2D sur une membrane de type Transwell. Elle a été décrite pour les organoïdes intestinaux de poulet (Orr et al. 2021), de cheval (Hellman, 2021), de lapin (Kardia E et al., 2021, Mussard E et al., 2020) et de porc (Hoffmann et al. 2021). Les cellules sont alors capables de former une barrière avec un épithélium polarisé donnant un accès facilité au pôle apical. Enfin, plus récemment, il a été décrit que les organoïdes intestinaux peuvent être maintenus en culture en suspension induisant une inversion de la polarité des cellules épithéliales de sorte que la membrane apicale soit tournée vers l'extérieur (Co et al. 2019; Co et al. 2021). Cette culture en suspension a été décrite avec des cryptes isolées du côlon et du jéjunum porcins et de caeca de poulet (Li et al. 2020; Nash et al. 2021). La figure 5 illustre une gamme de différentes méthodes utilisées pour avoir accès au pôle apical des cellules épithéliales de l'organoïde intestinal.

414

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

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416 Figure 5. Méthodes de culture pour accéder au pôle apical des cellules épithéliales.

417 Les cellules épithéliales sont dites « orientées » avec un pôle apical (A), exposé à l'environnement extérieur, et un pôle basal (B). La majorité des agents pathogènes à porte d'entrée intestinale envahit l'hôte par le pôle apical des cellules. L'inconvénient majeur de la culture des organoïdes en 3D est la difficulté d'accéder au pôle apical des cellules qui se trouve à l'intérieur de l'organoïde. Pour cela, 4 méthodes ont été décrites afin d'étudier par exemple les interactions hôtes-micro-organismes (pathogènes ou commensaux).

423
424

4. Les applications des modèles d'organoïdes intestinaux chez les animaux de rente
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426

4.1. Etude de la barrière intestinale

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429 Une fonction cruciale de l'épithélium intestinal est de former une barrière physique et immunologique pour empêcher l'entrée dans l'organisme de composants luminaux nocifs.

431 Parmi les mécanismes de « barrière » de l'épithélium, le renouvellement constant tous les 3 à 5 jours des cellules épithéliales intestinales est un mécanisme permettant de maintenir l'intégrité épithéliale. Il génère la mort des cellules épithéliales intestinales par un mécanisme de mort cellulaire appelé « Anoïkose » qui est reproduit *in vitro* dans la culture d'organoïdes et est visualisé microscopiquement par l'apparition d'un « cœur » noir au centre de l'organoïde après plusieurs jours de culture. L'expression des marqueurs de prolifération tels que LGR5, SOX9, KI67 et PCNA dans les organoïdes atteste également de ce renouvellement continue des cellules épithéliales intestinales. Ils sont exprimés dans des organoïdes de porc, de lapin, de cheval, de poulet et de bovin, ce qui indique que la prolifération épithéliale est maintenue *in vitro* (In et al. 2016; Panek, Grabacka, and Pierzchalska 2018; Mussard et al. 2020; Li, Zhu, et al. 2019; van der Hee et al. 2018; Li, Fu, et al. 2019; Hamilton et al. 2018; Alfajaro et al. 2019; Zhou et al. 2020; Engevik et al. 2020; Luo et al. 2020; Gonzalez et al. 2013).

443 Le maintien de la perméabilité épithéliale constitue un autre mécanisme de « barrière » de l'épithélium.
444

445 Il est contrôlé par les protéines des jonctions serrées comme les claudines (CLAU), l'occludine (OCLN), les JAM, les protéines de la Zonula Occludens 1 à 3 (ZO1 à 3) (...), et celles des jonctions adhérentes impliquant les Cadherines (CDH)...). Tous les gènes de ces protéines sont exprimés dans les organoïdes intestinaux de porc, de lapin, de poulet et de bovin (van der Hee et al. 2020; Mussard et al. 2020; Li, Fu, et al. 2019; Hamilton et al. 2018; Li et al. 2018). Plusieurs méthodes permettent d'évaluer la perméabilité de l'épithélium. L'incubation des organoïdes intestinaux avec des sondes fluorescentes (FITC (isothiocyanate de fluorescéine)-Dextran 4kDa ou LY (*Lucifer Yellow*)) et la non pénétration de ces produits à l'intérieur de l'organoïde cultivé en 3D attestent de la perméabilité intacte de l'épithélium (Bardenbacher et al. 2020). La mesure de résistance transépitheliale (TEER) et l'analyse du transport apical-basal des sondes fluorescentes sont également un moyen d'étudier la perméabilité épithéliale para et trans-cellulaire d'une monocouche 2D de cellules d'organoïdes comme cela a été décrit pour le porc, le lapin, le bovin et plus récemment le poulet (Mussard et al. 2020; van der Hee et al. 2018; Hamilton et al. 2018; Orr et al. 2021).
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Enfin, la production de molécules à activité antimicrobienne ou ayant la particularité de piéger ou bloquer l'accès à la cellule d'un microorganisme par les cellules épithéliales intestinales est un mécanisme de protection de l'hôte. Par exemple, la production de mucine 2 (MUC-2), principale mucine gélifiante sécrétée par les cellules caliciformes, est exprimée par les organoïdes intestinaux du porc, du lapin, du cheval et du bovin (Mussard et al. 2020; Li, Zhu, et al. 2019; van der Hee et al. 2018; Derricott et al. 2019; Li, Fu, et al. 2019; Hamilton et al. 2018; Alfajaro et al. 2019; Zhou et al. 2020; Pierzchalska et al. 2012). De plus, l'expression de peptides antimicrobiens (REG3G, le lyzozyme) a également été détectée dans des organoïdes de porc, de cheval, de bovin et de lapin (Mussard et al. 2020; van der Hee et al. 2018; Li, Fu, et al. 2019; Alfajaro et al. 2019; Engevik et al. 2020).

## 4.2. Etude de la fonction d'absorption des nutriments de l'épithélium

L'étude à l'échelle cellulaire des fonctions de digestion de l'épithélium des animaux de rente, sans accès au tissus intestinal, est à présent rendue possible avec les organoïdes intestinaux. En effet, outre son rôle de barrière, l'épithélium intestinal contribue également à la digestion des aliments, à l'absorption des nutriments et à la régulation hormonale. Les entérocytes sont les cellules absorbantes et expriment des marqueurs spécifiques tels que la villine-1 (VIL1), la phosphatase alkaline (ALPI), et la kératine 20 (KRT20). Elles produisent également des enzymes digestives (sucrase-isomaltase) et des transporteurs d'ions/nutriments (exemples : transporteur de monocarboxylate (MCT1), co-transporteur de sodium-glucose-1 (SGLT1), échangeur sodium-hydrogène-3 (NHE3)), comme cela a été décrit dans les organoïdes de porc, de lapin, de poulet et de bovin (In et al. 2016; Mussard et al. 2020; Li, Zhu, et al. 2019; van der Hee et al. 2018; Derricott et al. 2019; d'Aldebert et al. 2020; Engevik et al. 2020; Gonzalez et al. 2013). Les cellules entéro-endocrines sont impliquées dans la sécrétion d'hormones digestives telles que le peptide YY (PYY) et la chromogranine A (CHGA), leur présence a été décrite dans les organoïdes de porc, de lapin, de poulet et de bovin (Nash et al. 2021; Mussard et al. 2020; Li, Zhu, et al. 2019; van der Hee et al. 2018; Derricott et al. 2019; Hamilton et al. 2018; Zhou et al. 2020; Engevik et al. 2020).

Ainsi, les organoïdes intestinaux des animaux de rente possèdent les types cellulaires et potentiellement toutes les caractéristiques physiologiques et fonctionnelles pour étudier le transport des nutriments et la production d'hormones intestinales, comme cela a déjà été réalisé chez la souris ou les entéroïdes humains (Pierzchalska et al. 2017; Ferrandis Vila et al. 2018). Des études fonctionnelles réalisées chez le porc ont démontré que les cellules épithéliales d'organoïdes intestinaux étaient capables de transporter des nutriments tels que des acides aminés et des vitamines du côté apical au côté basolatéral comme l'épithélium in vivo (van der Hee et al. 2020).

D'autres questionnements scientifiques visant à étudier l'impact de nutriments sur l'homéostasie épithéliale peuvent également être abordés à l'aide de ces outils. Par exemple, il a été montré que le traitement des organoïdes de porcelets avec de la vitamine A alimentaire freine la différenciation des cellules épithéliales et favorise la prolifération, alors que le traitement d'organoïdes de porc avec du glutamate augmente la prolifération épithéliale (Zietek et al. 2015; Wang et al. 2020). De même une supplémentation dans l'alimentation en cuivre
502 favorise la croissance de l'épithélium intestinal des jeunes porcelets au sevrage et le modèle
503 organoïde a permis de démontrer le mode d'action du Cuivre qui favorise la prolifération des
504 cellules souches et la maturation de l'épithélium intestinal (Yin et al. 2021). Une étude récente
505 a démontré qu'un déficit en méthionine impacte négativement le développement de l'organoïde
506 intestinal du poulet suggérant qu'une déficience dans son alimentation pourrait empêcher toute
507 régénération de l'épithélium intestinal en cas de lésions (Wang et al. 2022). Ces études illustrent
508 bien l'intérêt de tels outils pour mieux comprendre l'importance de la nutrition animale dans le
509 maintien de la santé digestive.
510

510

## 4.3. Etude des Interactions hôtes – micro-organismes

511

512

Les modèles organoïdes intestinaux peuvent être utilisés pour modéliser les infections
513 entériques et ainsi mieux élucider les mécanismes d'entrée dans les cellules des agents
514 pathogènes, les mécanismes de réplication et de propagation intracellulaire mais aussi de sortie
515 des agents pathogènes. Par ailleurs, ils représentent le seul modèle permettant d'étudier *in vitro*
516 le rôle respectif des types cellulaires spécifiques dans ces processus infectieux et dans
517 l'induction des réponses immunitaires.
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A l'heure actuelle, de nombreuses études d'infections d'organoïdes intestinaux dérivés
519 d'animaux de rente par des agents pathogènes à tropisme intestinal d'importance économique
520 majeure dans les élevages, ont permis de valider l'utilisation de cet outil pour modéliser les
521 infections.
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### a. Les agents infectieux étudiés

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Ainsi, des organoïdes intestinaux bovin ont été infectés avec succès par une variété
525 d'agents pathogènes entériques, tels que *Salmonella Typhimurium*, *Toxoplasma gondii* et des
526 rotavirus du groupe A (Derricott et al. 2019; Topfer et al. 2019). De même, les organoïdes
527 intestinaux de porc ont été infectés par plusieurs coronavirus porcins (virus de la diarrhée
528 épidémique porcine (PEDV), virus de la gastro-entérite transmissible (TGEV) et
529 deltacoronavirus porcin (PDCoV)) (Li, Zhu, et al. 2019; Tsai et al. 2018; Co et al. 2019;
530 Resende et al. 2020), également par les bactéries *Salmonella Typhimurium* (Derricott et al.
531 2019) et *Lawsonia intracellularis* (Li et al. 2020) et par le parasite protozoaire *Toxoplasma
gondii* (Derricott et al. 2019). Enfin, les organoïdes intestinaux aviaires ont également été
532 utilisés pour modéliser les infections à *Salmonella*, au parasite *Eimeria* et au virus Influenza A
533 (Nash et al. 2021). Voir Tableau 1.
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### b. Les modèles d'infection

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Pour ces différents modèles infectieux, les différentes approches décrites dans la figure
539 5 ont été utilisées afin de reproduire au mieux la voie physiologique d'entrée du pathogène
540 entérique. Le modèle d'infection d'organoïdes dissociés mécaniquement lors du passage a été
541 utilisé pour modéliser les infections des cellules épithéliales intestinales de porc et de bovin par
542 *Toxoplasma gondii* ou par *Salmonella Typhimurium* (Derricott et al. 2019). Les cellules
543 d'organoïdes cultivées en 2D sur une membrane ont permis les infections des cellules de porc
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strictement par le pôle apical par des coronavirus porcins ou *Lawsonia intracellularis* (Li, Zhu, et al. 2019; Tsai et al. 2018; Co et al. 2019; Li et al. 2020; Resende et al. 2020) ou ont permis d'étudier l'impact d'endotoxines de *Salmonella Typhimurium* ou de *Bacillus subtilis* sur les cellules épithéliales intestinales de poulet (Orr et al. 2021). La microinjection des organoïdes par des agents pathogènes a été décrite pour modéliser l'infection par le parasite *Cryptosporidium parvum* mais avec des organoïdes de souris (Dutta, Heo, and O'Connor 2019; Heo et al. 2018). A l'heure actuelle, cette technologie nécessitant une expertise en microinjection n'a pas été utilisée pour modéliser des infections d'animaux de ferme. Enfin, la mise au point récente de la culture d'organoïde sans matrice permettant une exposition externe du pôle apical des cellules de l'organoïde a permis de réaliser des infections par *Salmonella*, le virus *Influenza* et le parasite *Eimeria tenella* du côté apical des cellules épithéliales intestinales de poulet (Nash et al. 2021).

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### c. Etude des cellules cibles des infections

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L'avantage de la composition multicellulaire des organoïdes intestinaux est l'identification des types de cellules épithéliales ciblées par les pathogènes entériques. Ainsi, des expériences de double immunomarquage en fluorescence sur des entéroïdes de porc ont démontré que les virus PEDV et le PDCoV infectaient principalement les entérocytes, les cellules souches et les cellules caliciformes (Li, Zhu, et al. 2019; Tsai et al. 2018; Resende et al. 2020). Ces études permettent donc de reproduire *in vitro* l'infection de l'épithélium intestinal dans un environnement plus physiologique.

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Les organoïdes intestinaux peuvent également être utilisés pour mieux comprendre le tropisme du segment digestif des agents pathogènes entériques. En effet, les organoïdes intestinaux conservent *in vitro* le phénotype de leur segment digestif d'origine, comme discuté ci-dessus.

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La susceptibilité à l'infection par PEDV et PDCoV était plus élevée chez les organoïdes de porc de l'intestin grêle que chez les organoïdes du côlon, reflétant les observations *in vivo* (Li, Zhu, et al. 2019; Tsai et al. 2018). Des études plus approfondies ont démontré que le tropisme préférentiel du jéjunum du PDCoV était associé à une expression plus élevée du récepteur d'entrée aminopeptidase N dans les entéroïdes du jéjunum par rapport aux organoïdes dérivés d'autres segments digestifs (Tsai et al. 2018).

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### d. Etude des réponses aux infections

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Après contact avec les agents pathogènes, les organoïdes intestinaux sont également capables d'initier des réponses immunitaires innées. Les organoïdes de porc infectés par des coronavirus porcins (PEDV, PDCoV et TGEV) augmentent l'expression des gènes des interférons de type I et des cytokines inflammatoires (Li, Zhu, et al. 2019; Tsai et al. 2018; Resende et al. 2020).

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Les cellules épithéliales intestinales d'organoïdes peuvent également répondre à des stimulations par des endotoxines bactériennes de *Salmonella Typhimurium* et de *Bacillus subtilis* en produisant de l'IL6 et de l'IL8 comme cela a été décrit dans le modèle aviaire (Orr et al. 2021). C'est également le cas lors d'interactions de ligands bactériens et viraux avec des entéroïdes de chevaux, qui répondent en produisant des cytokines inflammatoires telles que du
588 TNF-α (Tumor necrosis factor-α), du TGFβ, de l'IL33 et de l'IFNβ (Interferon-β) (Hellman 2021).

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## e. Etude des interactions des cellules épithéliales avec des bactéries commensales

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593 Si les connaissances scientifiques du dialogue entre les pathogènes et l'intestin vont continuer de s'accroître grâce à l'utilisation des modèles des organoïdes intestinaux des animaux de rente, ces derniers sont également d'une grande utilité pour aider à évaluer l'impact des bactéries commensales dans le maintien de l'épithélium intestinal, dans sa maturation ou régénération lors de processus de cicatrisation (Rubert et al. 2020; Min, Kim, and Cho 2020) et dans ses fonctions digestives. En effet, *in vivo*, l'épithélium intestinal est en contact permanent avec des microorganismes commensaux constituant le microbiote intestinal. Actuellement, la plupart des études co-cultivant les organoïdes intestinaux avec des bactéries commensales ont été réalisées avec des organoïdes murins ou humains. Par exemple, des études utilisant des organoïdes intestinaux murins ont révélé un lien entre le microbiote intestinal et la régénération épithéliale. En effet, les cellules souches répondent fortement au peptidoglycane des bactéries du microbiote qui stimule la survie des cellule souches (Nigro et al. 2014). Dans une autre étude, la coculture des organoïdes iléaux de souris avec une bactérie intestinale commensale *Akkermansia muciniphila* a permis de démontrer le rôle de bactéries du microbiote et de leur production en métabolites dans le renouvellement de l'épithélium intestinal (Lukovac et al. 2014). Un effet réparateur a également pu être illustré après stimulation des organoïdes de l'intestin grêle de souris préalablement traité au TNFα par le probiotique *Lactobacillus reuteri* (Hou et al. 2018). Le microbiote intestinal joue donc un rôle essentiel dans l'homéostasie et la réparation de l'épithélium, toutefois il représente un immensément complexe écosystème. En effet, les microbes intestinaux interagissent les uns avec les autres en partageant les ressources et les réseaux métaboliques, conduisant ainsi à des comportements compétitifs, mutualistes ou symbiotiques (Stubbendieck, Vargas-Bautista, and Straight 2016). Les modèles d'étude évaluant les effets d'un seul microbe peuvent facilement exagérer l'impact du microbiote intestinal individuel, soulignant l'avantage de complexifier les modèles de culture organoïdes intestinaux *in vitro* par de nouvelles approches introduisant de la fluidique et des échanges gazeux contrôlés (voir paragraphe suivant).

619

## 5. Complexification des modèles d'organoïdes intestinaux des animaux de rente dans le futur...

622

623 Des avancées récentes ont montré qu'il était possible de complexifier encore plus les modèles de culture d'organoïdes intestinaux, essentiellement humains et murins, pour obtenir un modèle *in vitro* le plus physiologique possible. Pour cela, des composantes du système nerveux entérique, des cellules immunitaires, des contraintes mécaniques reproduisant le péristaltisme, ou encore une exposition à du microbiote peuvent être ajoutés à la culture *in vitro* pour reproduire au mieux la complexité de l'environnement intestinal.

629
630 a. Co-culture avec des cellules immunitaires

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632 Les organoïdes intestinaux ne comportent pas de cellules immunitaires dont l'origine cellulaire
633 est différente. Environ 60-70 % des cellules immunitaires (macrophages, cellules dendritiques,
634 cellules lymphoïdes, lymphocytes T et B) sont retrouvées au niveau de l'intestin. Il existe une
635 coopération entre l'épithélium intestinal et le système immunitaire afin de renforcer la barrière
636 intestinale, protéger l'organisme contre les agressions extérieures et permettre la tolérance des
637 aliments. Pour récapituler cet environnement cellulaire, différentes cellules du système
638 immunitaire telles que des lymphocytes T et des macrophages ont été co-cultivés avec des
639 organoïdes intestinaux humains (Staab et al. 2020; Schreurs et al. 2021). Le modèle
640 d'organoïdes intestinaux humains en 2D cultivés avec des macrophages du côté basolatéral a
641 permis de reproduire le phénomène d'extension de dendrites à travers la monocouche de
642 cellules épithéliales servant à capter des particules étrangères comme des bactéries pathogènes
643 du côté apical (Noel et al. 2017). La co-culture avec des lymphocytes a permis de décrire l'effet
644 positif de l'IL-2, une cytokine produite par les cellules lymphoïdes en prolifération sur la
645 maturation des organoïdes humain dérivés d'iPSC, visualisée microscopiquement par
646 l'augmentation du nombre de bourgeons (cryptes) par organoïde. Dans ce système, les cellules
647 épithéliales de l'organoïde augmentent leur expression de facteurs de transcription de
648 l'épithélium digestif tels que CDX2, SOX9 et ISX et des marqueurs spécifiques des types
649 cellulaires (entérocytes, cellules entéroendocrines, cellules de Paneth et caliciformes) attestant
650 l'effet de cette cytokine sur l'épithélium intestinal (Jung et al. 2018).

651 Dans l'intestin et plus particulièrement dans les plaques de Peyer, une cellule épithéliale
652 particulière est présente, il s'agit des cellules M (M pour Microvillosité ou *Microfold*). Les
653 cellules M sont dépourvues de microvillosités mais, comme d'autres cellules épithéliales, elles
654 se caractérisent par des jonctions intercellulaires puissantes. Ces cellules sont connues pour
655 initier des réponses du système immunitaire au niveau des muqueuses et permettre le transport
656 de microbes et de particules à travers la paroi intestinale, les captant dans la lumière intestinale
657 pour les mener jusqu'à la lamina propria où des interactions avec les cellules immunitaires
658 peuvent avoir lieu. La proximité des cellules épithéliales avec les nombreuses cellules
659 immunitaires des Plaques de Peyer est à l'origine de la différenciation des cellules épithéliales
660 en cellules M via la production de RANKL. Ainsi, en ajoutant la protéine recombinante
661 RANKL dans une culture d'organoïde intestinal humain, des cellules M ont été obtenues *in
662 vitro* permettant d'étudier la capture de microparticules et le tropisme préférentiel de
663 *Salmonella* pour ces cellules (Rouch et al. 2016).

664 Une étude récente a décrit la présence de cellules immunitaires de type macrophage, cellules
665 dendritiques et dans une moindre mesure de cellules NK et de lymphocytes B, dans une culture
666 d'entéroïdes de poulets dérivés de cryptes isolées d'embryon de poulet pendant 7 jours. Les
667 cellules immunitaires présentes dans la culture sont fonctionnelles et capables de phagocytose,
668 toutefois, l'étude ne révèle pas si la présence de ces cellules persiste au fur et à mesure des
669 passages des organoïdes (Nash et al. 2021).

670 Toutes ces études ouvrent des perspectives pour étudier *in vitro* par exemple les interactions
671 hôtes pathogènes et plus particulièrement la coopération cellules épithéliales et cellules
672 immunitaires dans cette réponse, chez les animaux de rente.
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## b. Complexification par ajout de terminaisons nerveuses

Un autre des composants majeurs du tube digestif est le SNE. Le système nerveux entérique joue un rôle essentiel dans l'absorption des nutriments, la perméabilité de la barrière intestinale et la motilité. Des avancées récentes ont permis de mettre au point des co-cultures d'organoïdes intestinaux humains avec des cellules de crête neurales obtenues *in vitro* à partir de PSC. Co-cultivées avec les cellules épithéliales intestinales de l'organoïdes, elles migrent dans le mésenchyme où elles se différencient en neurones et cellules gliales et permettent l'obtention d'un système nerveux fonctionnel, mimant ainsi les fonctions physiologiques du tissu chez l'homme (Workman et al. 2017; Schlieve et al. 2017). Ce modèle n'a pas encore été développé chez l'animal de rente, mais il est aujourd'hui d'un grand intérêt pour les études en neurogastro-entérologie chez l'Homme.

## c. Intestin sur puce : de la fluidique pour permettre la co-culture d'un épithélium avec un microbiote intestinal complexe

Les nouveaux dispositifs dit « d'intestin sur puce » représentent une technologie révolutionnaire pour reproduire au mieux le compartiment intestinal en complexifiant la culture « statiques » des cellules épithéliales intestinales. Il comporte un dispositif microfluidique qui reproduit la structure physique, le microenvironnement, les mouvements et la circulation des fluides dans l'intestin (Figure 6). Le développement de ces modèles offre des perspectives inespérées pour accélérer la recherche sur le microbiote intestinal et leur utilisation en santé humaine et animal.
Paramètres modulables:

- Flux * (débit)

- Contraintes mécaniques de la membrane pour mimer le péristaltisme (**)

- Possibilité d'introduire un « squelette » mimant les villosités intestinales

- ...

Possibilité d'étudier :

- Microbiote

- Nutriment

- Métabolites

- Pathogènes

- ...

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 6. Dispositif d'un intestin sur puce.</figcaption></figure>

En effet, le rôle du microbiote intestinal vis-à-vis de la santé est un domaine de recherche en pleine expansion et une thématique porteuse d'innovation en santé humaine et animale. Les connaissances autour du microbiote intestinal sont source de nouvelles solutions préventives ou thérapeutiques qui intéressent de nombreux secteurs industriels (agroalimentaire, pharmaceutique, diagnostic, ou nutrition-santé, humaine ou animale).

La croissance de communautés bactériennes intestinales complexes est faisable *in vitro* mais nécessite des conditions de milieu et d'oxygénation particulières. Le dispositif dit « intestin sur puce » permet d'introduire une culture stable de communautés microbiennes complexes au contact des cellules épithéliales d'organoïdes. Le cœur du dispositif est une puce miniaturisée qui comprend une membrane poreuse sur laquelle sont ensemencées les cellules intestinales entourée de deux micro-canaux pour alimenter respectivement les pôles apical et basal des cellules épithéliales. Cette disposition permet de simuler la barrière entre la lumière intestinale et le système vasculaire drainant. L'apport continu de nutriments est assuré par les canaux de microfluidique reliés à des pompes. Parce que ce dispositif permet d'appliquer des conditions de culture distinctes entre deux compartiments, c'est aujourd'hui l'outil le plus performant et le plus pertinent pour modéliser *in vitro* les interactions entre cellules digestives et les micro-organismes (Siwczak et al. 2021). Aujourd'hui, ce dispositif n'a pas encore été utilisé avec les organoïdes des animaux de rente mais seulement à partir d'organoïdes humain (Kasendra et al. 2018; Beaurivage et al. 2020). Il a notamment permis de montrer qu'il était possible de maintenir des communautés bactériennes avec plusieurs espèces sur une période de quelques jours à quelques semaines (Kim et al. 2016; Marzorati et al. 2014). Des études plus récentes sur ce nouveau modèle de puces démontrent la possibilité de cultiver des bactéries aérobies et anaérobies sur plusieurs jours en soumettant au dispositif un gradient d'oxygène du côté basal au côté luminal (Jalili-Firoozinezhad et al. 2019). La complexité de ce nouveau dispositif avec une architecture physique « Crypte -villosités » et des paramètres physiologiques de flux
733 continus et de péristaltisme semble également reproduire des conditions favorables pour une
734 infection par des agents pathogènes entériques. Lors d'une infection *in vitro* par la bactérie
735 pathogène humaine *Shigella*, l'expression des facteurs d'invasion est activée favorisant ainsi
736 son entrée dans les cellules épithéliales (Grassart et al. 2019).
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## Conclusion

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740 De plus en plus et dans de nombreux domaines, les organoïdes remplacent les modèles de
741 culture *in vitro* traditionnels. En élevage, le développement de cet outil biologique est d'autant
742 plus important qu'il représente le seul modèle cellulaire disponible pour certaines espèces et
743 permet de réduire le nombre d'animaux en expérimentation répondant ainsi au principe des 3R
744 et à la demande sociétale. La création de biobanques d'organoïdes intestinaux d'animaux
745 d'élevage disponibles en tant que ressources ouvertes pour la communauté des chercheurs
746 contribuerait également à la réduction des expérimentations sur des animaux vivants. Comme
747 condition préalable à la création de biobanques partagées, l'harmonisation des protocoles
748 utilisés pour la culture d'organoïdes intestinaux d'animaux de rente (par exemple la composition
749 des milieux de culture) et la proposition de lignes directrices pour assurer la reproductibilité des
750 modèles entre les laboratoires sont absolument nécessaires.
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752 Les domaines d'application des organoïdes intestinaux des animaux de rente sont très nombreux
753 pour les études à la fois en recherche fondamentale et en recherche appliquée. Mieux
754 comprendre les infections (sensibilité ou résistance de l'hôte à une infection, ou expression de
755 facteurs de virulence des pathogènes dans un environnement particulier...), l'efficacité
756 alimentaire ou encore analyser le génome sont autant de questionnements qui seront plus faciles
757 à appréhender avec ces nouveaux outils. Ils seront également très utiles pour la recherche
758 appliquée avec principalement des cribages de molécules/microbes pour améliorer la santé
759 intestinale des animaux. Ils ne remplaceront pas les essais sur les animaux, mais permettront
760 de sélectionner les molécules/microbes intéressants à tester *in vivo* et ainsi réduire le nombre
761 d'animaux utilisés. Ces modèles ayant démontré leur intérêt en recherche, ils ont plus
762 récemment été développés pour les chiens et permettent d'envisager en santé vétérinaire une
763 thérapeutique adaptée pour les animaux de compagnie à partir d'une biopsie intestinale (Kramer
764 et al. 2020; Ambrosini et al. 2020; Chandra et al. 2019).
765

765

766 L'utilisation de ces outils devient donc incontournable pour les recherches futures et en
767 association avec d'autres nouvelles technologies telles que l'édition des génomes, ces outils
768 représentent des accélérateurs technologiques pour accroitre rapidement les connaissances en
769 recherche humaine et animale.
770

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771
772 **Contribution des auteurs**

773 Sonia Lacroix-Lamande (sonia.lamande@inrae.fr) et Agnès Wiedemann (agnes.wiedemann@inrae.fr)

774 ont contribué de façon similaire à l'élaboration cet article.

775

776 **Remerciements**

777 Les illustrations présentées dans cet article sont issues de travaux financés par le projet

778 ANIMALT FEDER/Region Centre Val de Loire (FEDER convention EX007516, Region

779 Centre 2019-00134936, programme AE-2019-1850), le projet Européen Veterinary

780 Biocontained research facility Network (VETBIONET) et la Fédération de recherche en

781 Infectiologie de la Région Centre Val de Loire (FéRI).

782 Nous remercions Ophélie Bernardi et Anissa Gagneux pour leur aide technique et Julien

783 Burgault-Gaillard de la plateforme de microscopie de l'Université de Tours pour les images de

784 microscopie électronique à transmission.

785 Nous remercions le GT organoïdes INRAE et plus particulièrement Dr. Martin Beaumont, Dr.

786 Fany Blanc, Dr. Claire Cherbuy, Dr. Giorgia Egidy et Dr. Elisabetta Giuffra avec qui nous

787 avons rédigé une revue internationale sur les organoïdes intestinaux des animaux de rente

788 (Beaumont et al. 2021) et dont cette synthèse découle en partie. Enfin, nous tenons également

789 à remercier Dr. Sandrine Menard pour la relecture de cette synthèse.

790

791 **Références**

792

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