Une explication plausible est que la radiothérapie pourrait également induire une immunosuppression. Des mécanismes impliquant d'une part la biologie moléculaire et d'autre part la radiobiologie plus classique pourraient l'expliquer.

## Immunosuppression radio-induite

Généralement, les mécanismes immunogènes peuvent aussi produire une réaction inverse dont l'effet tend à stabiliser puis stopper la réaction immunitaire:

Ainsi l'irradiation du stroma tumoral augmenterait la production des cytokines immunosuppressives comme le TGF-β. L'interprétation la plus répandue de son action est que le TGF-β restaure le caractère immunotolérant du microenvironnement tumoral en diminuant la prolifération des cellules effectrices (NK, lymphocytes T CD8+), tout en augmentant la prolifération des cellules immuno modulatrices (Treg). Cependant pour certains auteurs, le rôle du TGF-β n'est pas complètement univoque (rôle dans la différenciation des lymphocytes-mémoire?), on trouvera une revue complète dans (94).

L'irradiation tend aussi à augmenter l'expression des inhibiteurs de checkpoints (les freins immunitaires) comme le PD-L1 (95). L'irradiation pourrait aussi augmenter le recrutement de cellules myéloïdes immunosuppressives via l'augmentation de la chimiokine CCL2 (96).

Cette liste n'est pas exhaustive et d'autres mécanismes similaires seront certainement mis au jour.

Il est donc plausible que de multiples effets moléculaires immunosuppresseurs soient enclenchés, après une courte phase initiale pro-inflammatoire liée aux dégâts dans l'ADN. Il n'est donc pas certain que l'activation de la réponse immunitaire adaptative soit durable ou même possible. Cependant, ces modèles animaux, sur des tumeurs particulières, avec des schémas d'irradiation souvent unidose ne sont pas extrapolables directement à la radiothérapie fractionnée chez l'Homme.

## Mécanismes radiobiologiques d'immunosuppression

### Déplétion des lymphocytes extra-tumoraux

En clinique, des lymphopénies radio-induites sont fréquentes en cas d'irradiation prolongée et s'expliquent probablement par la grande radiosensitivité des lymphocytes, qui se trouvent à la fois dans le microenvironnement tumoral mais aussi dans les ganglions de drainage, les organes de voisinage, la moelle hématopoïétique, le sang
circulant...compartiments qui reçoivent tous une dose d'irradiation plus ou moins élevée et répétée.

Les lymphocytes seraient les cellules immunitaires les plus radiosensibles: dans la littérature, leur fraction survivante à 2 Gy est une des plus basses ($SF_{2 Gy} = 0.45$, soit $\alpha = 0.41 Gy^{-1}$) et les lymphopénies induites par la radiothérapie sont une complication fréquente des irradiations prolongées (97,98).

Cette radiosensibilité est exploitée depuis longtemps dans la radiothérapie des lymphomes, dans laquelle les doses tumoricides sont nettement inférieures à celles utilisées dans les tumeurs solides (de 20 à 40 Gy pour le traitement des lymphomes, contre environ le double pour la plupart des tumeurs solides).

Des auteurs ont récemment modélisé mathématiquement l'irradiation des lymphocytes circulants et ont décrit précisément les lymphopénies rencontrées en clinique (dans le cas d'une irradiation pancréatique), et ils ont retrouvé des valeurs de radiosensitivité très proches des données de la littérature (1). Leurs travaux indiqueraient qu'une grande partie de la lymphopénie serait due à l'irradiation des organes de voisinage, dans lequel le sang circule lentement, en plus de la circulation dans les grands axes vasculaires.

Sans utiliser de modélisation, des données cliniques rétrospectives confirment que les lymphopénies radio-induites sont fréquentes en cas d'irradiation prolongée (> 5 fractions) et que le risque de décès est doublé en cas de lymphopénie profonde à l'initiation de l'immunothérapie (99). Ces données sont cohérentes avec d'autres publications, par exemple (97,98). Dans l'essai randomisé d'immuno-radiothérapie du MDACC (93), la baisse moyenne des lymphocytes était de -19% chez les patients traités par stéréotaxie en 4 fractions, mais de -47% en cas de radiothérapie conventionnelle en 15 fractions (p=0.003).

Dans l'essai d'immuno-radiothérapie des cancers ORL CheckRad-CD8 (irradiation cervicale conventionnelle en 33 à 35 fractions), le taux de leucopénie de grade 3 ou 4 a atteint 48% avec 29% d'infections en cours de traitement; les résultats d'efficacité sont en attente (100).

Si la causalité n'est pas certaine, il existe donc un faisceau d'indices en faveur d'un effet toxique de la radiothérapie sur le système immunitaire, qui serait potentiellement délétère pour l'efficacité des immunothérapies.
Déplétion des lymphocytes intra-tumoraux

Les mêmes arguments radiobiologiques que pour les lymphocytes circulants devraient s'appliquer, d'autant plus que les lymphocytes intra-tumoraux sont dans la zone soumise aux doses maximales de rayonnements ionisants. Cependant, comme ils ne sont pas directement observables, leur véritable destin après irradiation ne peut être inféré qu'à partir de modèles (animaux ou radiobiologiques).

Complication supplémentaire: le stroma tumoral est composé de cellules
immunitaires de polarisation opposée: par exemple pour les lymphocytes, les
cytotoxiques (CD8+) mais aussi les immunosuppresseurs (Treg). En supposant (sur une
base radiobiologique raisonnable) que la radiothérapie éradique temporairement
presque tous ces lymphocytes, du moins à court terme, il est difficile de prédire quelle
sera la nature du prochain équilibre entre CD8+ et Treg lors de la reconstitution
immunitaire.

Pour certains auteurs se basant sur des modèles animaux (101), les Treg
deviendraient majoritaires une semaine après une irradiation unique à haute dose (10
Gy). Les causes de ce phénomène pourraient impliquer le TGF-β ou le PD-L1 mais les
auteurs n'ont pas pu le confirmer dans ce modèle. Quoiqu'il en soit, l'effet de stimulation
immunitaire de la radiothérapie serait alors limité dans le temps. Bien sûr,
l'extrapolation de ce modèle à l'Homme et à des schémas de radiothérapie fractionnés à
dose plus faible est difficile.

D'autres auteurs ont affirmé récemment que les lymphocytes *intra-tumoraux* possèdent un degré de radiorésistance exceptionnellement élevé (102), à la différence des lymphocytes circulants: dans leur expérimentation, des lymphocytes intra-tumoraux auraient majoritairement résisté à une dose unique de 20 Gy (à cette dose, la fraction survivante pour une valeur de radiosensibilité α = 0.41 Gy⁻¹, typique des lymphocytes, est pourtant normalement inférieure à 0.03%). La viabilité et la fonctionnalité des lymphocytes a été affirmée sur leur nombre, leur motilité et leur capacité à produire de l'interféron γ, ces grandeurs étant évaluées ponctuellement peu de temps après l'irradiation; en revanche leur capacité de prolifération était devenue nulle, ce qui est conforme aux données établies de la radiobiologie et diminue la portée de leurs conclusions; le rationnel de cette radiorésistance supposée pourrait impliquer
l'infiltration du stroma tumoral par les cellules myéloïdes, le TGF-β ou une possible "reprogrammation moléculaire" similaire à celles des tumeurs. Les auteurs extrapolent que chez l'homme, l'irradiation locale n'est pas immunosuppressive et qu'il est donc souhaitable d'augmenter le nombre de cibles et de traiter autant de métastases qu'il est techniquement possible (103).

Outre le fait que ces conclusions soient incompatibles avec (101) et (96), leur rapport bénéfice-risque reste à établir (voir Toxicités). De plus, la pérennité de la réponse immunitaire semble compromise si les lymphocytes intra-tumoraux irradiés ne peuvent plus se diviser et d'autant plus si leur renouvellement est limité par une lymphopénie radio-induite. Enfin, les autres effecteurs immunitaires intra-tumoraux n'ont pas été étudiés, comme les cellules présentatrices d'antigènes, indispensables à l'activation et l'amplification des lymphocytes intra-tumoraux naifs nouvellement recrutés.

La controverse scientifique est donc ouverte, il faut souhaiter que des modélisations supplémentaires ou des essais cliniques viendront clarifier si des stratégies d'irradiation maximalistes telles que celles proposées dans (103) sont pertinentes.

Pris globalement, ces résultats indiquent que la radiothérapie semble présenter un risque d'immunosuppression qui pourrait antagoniser l'efficacité des immunothérapies et représenter un frein à l'effet abscopal. Ceci n'est pas en contradiction avec un mécanisme d'efficacité de la radiothérapie partiellement immuno-dépendant, mais représente probablement un des freins à lever. Là encore, des modélisations radiobiologiques seraient utiles, afin de synthétiser de nombreux résultats obtenus sur modèles animaux.

## Toxicités

### Une synergie toxique?

Le profil de toxicité de la radiothérapie est généralement connu statistiquement, surtout si elle est utilisée en monothérapie et dans une moindre mesure quand elle est combinée à certaines chimiothérapies; des méthodes rigoureuses existent pour maintenir les fréquences de ces toxicités dans des limites tolérables (voir supra): elles consistent surtout à optimiser la conformité de l'irradiation pour limiter au maximum les volumes d'organes sains irradiés; en deuxième intention des concessions de dose peuvent être nécessaires.
Le profil de toxicité des immunothérapies commence à être mieux cerné; son spectre est plus large que celui de la radiothérapie, puisque ses complications sont auto-immunes (irAE: immune-related adverse event) et touchent de nombreux organes, sans lien avec la localisation tumorale (104).

Le plus souvent ces toxicités sont mitigées en excluant *a priori* les patients aux antécédents de maladie auto-immune, par l'usage de stéroïdes quand les irAEs surviennent, par une interruption temporaire ou parfois définitive de l'immunothérapie.

Cependant, cette approche empirique n'est pas optimale: dans le cancer du poumons NPC métastatique, on sait depuis peu que les patients atteints par des maladies auto-immunes peuvent recevoir des inhibiteurs de checkpoint sans nécessairement exacerber leur maladie, que l'usage des stéroïdes à l'initiation du traitement serait un facteur pronostic indépendant péjoratif pour la survie (avec un effet dose mesurable dès les faibles doses), et que le traitement peut souvent être repris après résolution, sans récidive de l'effet secondaire, dans environ 50% des cas, et sans aggravation en cas de récidive (105). La gestion des irAEs semble actuellement prête à évoluer dans le sens d'un élargissement des indications des immunothérapies, une plus grande tolérance vis-à-vis de l'occurrence des irAEs, avec des rechallenges, l'emploi dynamique de stéroïdes. La fréquence des irAE aura donc tendance à augmenter, à mesure que l'aversion au risque des prescripteurs diminue.

Cette tendance pourrait compliquer la gestion des irAEs en combinaison avec la radiothérapie. Actuellement, les toxicités des combinaisons de radiothérapie avec les immunothérapies ne sont pas encore connues: si certains auteurs affirment, peut-être un peu vite, que cette toxicité serait superposable aux données de monothérapie (75), pour d'autres ces toxicités restent largement à découvrir (88). A l'heure actuelle, les données de toxicités prospectives viennent encore majoritairement d'essais précoces avec de petits effectifs, parfois sans bras contrôle (106).

Des arguments biologiques existent pour supporter l'hypothèse que les immunothérapies peuvent aggraver les toxicités aiguës et tardives de la radiothérapie.

On a vu précédemment que la radiothérapie, même à basse dose (0.1 - 1 Gy par fraction) pourrait entraîner des mécanismes inflammatoires, et que ces niveaux de dose concernent les organes de voisinage de la tumeur, surtout en cas de radiothérapie externe en conditions non stéréotaxique, avec des gradients de dose faible. L'ajout d'une
immunothérapie pourrait théoriquement induire une réponse immunitaire délétère dans ces organes de voisinage.

Le rôle du système immunitaire dans le processus de cicatrisation est également essentiel: l'inflammation puis la réponse immunitaire doivent, après élimination du pathogène, promouvoir la cicatrisation et la restauration des tissus lésés, partiellement ou ad integrum. En inhibant les freins de la réponse immunitaire, les ICI peuvent donc altérer cette cicatrisation. Ainsi l'expression des checkpoints PD1-PDL1 dans les cellules des tissus sains a été jusqu'ici été peu explorée, les modèles précliniques ayant jusqu'ici cherché à expliquer quasi-exclusivement les mécanismes d'efficacité anti-tumorale des immunothérapies.

En conséquence, les dommages tissulaires causés par la radiothérapie sont donc susceptibles d'être moins réparés en cas de combinaison avec immunothérapie.

Or, les doses usuelles de radiothérapie sont normalement les doses maximales déterminées en fonction des tolérance des organes à risque: il n'existe que peu de "marge de manœuvre" à la hausse en cas de potentialisation des effets toxiques. La question de la concession posologique sur la radiothérapie (ou sur l'immunothérapie, ou sur les deux) est donc ouverte.

Une complication chronique de la radiothérapie fréquente est la fibrose radio-induite. Elle résulte de dommages microvasculaires entraînant hypoxie, nécrose, inflammation puis des phénomènes cicatriciels avec production de collagène; le processus peut être auto-entretenu et progresser pendant des années après l'irradiation. Le TGF-β, produit dans tous les tissus irradiés, s'oppose à l'inflammation en créant un environnement immunotolérant, qui stimule la production de collagène et contribue à la fibrose (107). Cette voie de signalisation représente donc une piste dans la mitigation des irAEs.

En résumé, pour diminuer ces toxicités, on pourrait donc considérer des baisses de dose de radiothérapie et/ou d'immunothérapie, des fractionnements différents, des volumes d'irradiation plus réduits, l'emploi de thérapies ciblées (comme des antagonistes du TGF-β), l'emploi de radioprotecteurs, le développement de biomarqueurs prédictifs des irAEs.

Des modèles animaux ou radiobiologiques de toxicité de l'immuno-radiothérapie seraient utiles. Certains auteurs ont créé un modèle animal de pneumopathie radio-induite, mais sans immunothérapie pour le moment (108). Les modèles radiobiologiques classiques n'ont jusqu'ici pas été adaptés pour produire des limites de
doses valables en immuno-radiothérapie, (comme c'est le cas pour la chimio-radiothérapie). Le formalisme des histogrammes dose-volume n'est pour le moment pas adapté à l'immuno-radiothérapie.

## Fréquence des irAEs et nombre de lésions traitées

Les effets secondaires immunologiques semblent logiquement augmenter avec le nombre de lésions traitées par immuno-radiothérapie.

Ainsi dans une étude prospective non randomisée où l'on a comparé des patients sous inhibiteurs de checkpoints irradiés sur 2 à 5 métastases contre des patients avec une seule métastase irradiée (109), les effets secondaires immunologiques sont presque triplés dans le groupe 2 à 5 métastases par rapport au groupe mono-métastase: 11 sur 27 (41%) vs 4 sur 23 (17%), p=0.07.

Dans une étude prospective randomisée sur des patients atteints d'un cancer ORL en récidive, sous immunothérapie (nivolumab), où une seule lésion était irradiée (110), les toxicités de haut grade étaient similaires entre le bras nivolumab et le bras nivolumab-SBRT (13.3% vs 9.7%, p=0.70).

Pris globalement, ces résultats reflètent une corrélation positive entre le nombre de cibles irradiées et la fréquence des effets secondaires immunologiques, impliquant un effet de volume, comme pour les complications radiobiologiques classiques.

## Fréquence des irAEs et dose de radiothérapie

Il n'existe sur ce sujet que très peu de données cliniques, car les doses de radiothérapie utilisées en immuno-radiothérapie sont dans la grande majorité des cas des doses ablatives.

L'essai clinique de Ratnayake et al représente une exception (111): pour des patients atteints de mélanome métastatique et traité par inhibiteurs de checkpoint de type anti PDL1 et/ou anti CTLA 4, les auteurs ont comparé deux doses uniques non-ablatives de 10 Gy et 15 Gy. Les auteurs trouvent une augmentation des toxicités de grade 3 pour 15 Gy: dose 10 Gy, 1 sur 10 (10%) vs dose 15 Gy, 4 sur 14 (29%), p=0.36, test exact de Fisher.

Ces résultats, non significatifs statistiquement, sont générateurs d'hypothèses mais seraient à confirmer avec des études de plus forte puissance et moins de biais. Par exemple, les sites d'irradiations étaient variables selon les patients, certains recevaient
une mono immunothérapie mais d'autres une combinaison d'immunothérapie. Ces facteurs confondants n'ont pas été analysés en raison des petits effectifs.

La survie sans progression semble avoir été plus importante dans le bras ayant reçu la dose plus faible de 10 Gy; les auteurs évoquent des arguments biologiques impliquant l'activation de l'exonucléase Trex, mais les nombreux biais pourraient contribuer aussi aux différences d'efficacité.

Récemment, l'équipe de S. Formenti a documenté les effets d'un traitement sous-ablatif (3 x 8 Gy sur 3 jours consécutifs) en néoadjuvant dans le cancer du poumon en combinaison avec le durvalumab (112), sans trouver de sur-toxicité par rapport au durvalumab monothérapie.

Ces études ont le mérite d'ouvrir le débat sur l'utilisation de doses sous-ablatives en immuno-radiothérapie. Cependant, faut-il prendre le risque d'un mauvais contrôle local si une immunothérapie, à l'efficacité *a priori* versatile, est combinée? Nous verrons que les deux modèles mathématiques présentés dans cette thèse cherchent à intégrer les immunothérapies dans le champ de la radiobiologie classique et nous pensons qu'il ne sera pas nécessaire de diminuer le contrôle local pour augmenter l'immunogénicité, ceci sera développé en particulier dans le deuxième modèle.

## Pneumopathies auto-immunes

Dans le cancer du poumon non à petites cellules (NPC), la combinaison entre radiothérapie stéréotaxique et inhibiteurs de checkpoint augmenterait significativement le taux de pneumopathie auto-immune de haut grade (G3 ou plus): Tian et al (113) ont reporté (rétrospectivement) un taux de 10.7% pour la combinaison immuno-radiothérapie contre 0% pour la radiothérapie seule (p<0.01), malgré le respect des contre-indications à l'immunothérapie et des contraintes de dose aux poumons (technique: SBRT). Cette fréquence est aussi nettement supérieure au taux de pneumopathie auto-immune observé sous immunothérapie seule (de type anti-PD1), qu'une méta-analyse estime à 4.1% (IC 95%: 2.4 - 6.3) pour les pneumopathies tous-grades dans le cancer du poumon NPC traité par anti-PD1 en monothérapie (65): comme les pneumopathies de haut-grade n'en représentent qu'une fraction minoritaire, on peut donc les estimer à quelques pourcents.

Une analyse rétrospective de l'étude KEYNOTE-001 (pembrolizumab dans le cancer du poumon NPC métastatique) a également montré une augmentation des
pneumopathies auto-immunes en cas d'antécédent d'irradiation thoracique (mais avec des effectifs non significatifs)(114).

Dans l'étude Pembro-RT (92), un doublement des pneumopathies et des dyspnées auto-immunes de tout grade est observée dans le groupe SBRT + pembrolizumab par rapport au groupe pembrolizumab. Le site d'irradiation majoritaire était intra-thoracique (à 55%). En raison du petit effectif, ces résultats étaient non significatifs. On observe aussi dans le bras combiné un *triplement* du taux de pneumopathies supposées non auto-immunes (26% vs 8% p=0.06), ce qui pose question<fnref n="31" /> et aurait mérité des clarifications.

Dans l'étude du MDACC (93), les effets secondaires liés au traitement ne sont pas significativement plus élevés pour le groupe combiné pembrolizumab et radiothérapie, mais les effets secondaires non attribués au traitement par les investigateurs ne sont pas mentionnés (comme le taux de pneumopathie *toutes causes*).

Dans l'étude PACIFIC (115), 20% de pneumopathie radique tous grades dans le bras durvalumab vs 16% dans le groupe placebo (p=0,16 test khi-2), et 1.5% vs 0.4% pour les grades 3-4 (p=0.16, test khi-2³²): non statistiquement significatifs, ces résultats pourraient faire discuter une *tendance* à l'augmentation des pneumopathies sous durvalumab.

Dans l'étude (non contrôlée) NICOLAS, nivolumab concomitant avec radiochimiothérapie, 42.5% de pneumopathies tous grades, 10% de G3, 0% de G4, sans lien avec la dose moyenne aux poumons ou la V20 (116).

Globalement, avec les réserves liées aux données rétrospectives ou aux petits effectifs, et en l'attente de méta-analyses ou d'essais prospectifs de plus grand effectif, on soupçonne une potentialisation des effets secondaires, plutôt qu'une simple addition des toxicités.

## Lymphopénies et leucopénies

Les lymphopénies ont été évoquées en détail dans le chapitre sur les toxicités de la radiothérapie. Il n'existe pas encore d'arguments pour savoir si une potentialisation par l'immunothérapie existe.

<footnote n="31">³¹ Dans les pneumopathies en contexte radique, la distinction entre inflammation et infection n'est pas toujours possible, les deux causes sont fréquemment impliquées et le traitement est souvent une combinaison de stéroïdes et d'antibiotiques, visant à traiter les deux causes à la fois.</footnote>

<footnote n="32">³² L'approximation du khi-2 est valable en raison du grand effectif, par rapport au test de Fisher.</footnote>
## Dysphagie

La dysphagie est une complication difficile à traiter de l'irradiation cervicale dans les cancers ORL, pouvant nécessiter le recours à une nutrition entérale, ainsi que dans l'irradiation thoracique dans les cancers du poumons (117). Elle est favorisée par la dose reçue par les muscles constricteurs du pharynx et par le larynx en radiothérapie ORL, et par la dose à l'oesophage en radiothérapie thoracique. En combinaison avec un double blocage PDL1 et CTLA 4 (durvalumab et tremelimumab), le taux de dysphagie de grade 3 ou 4 monte à 53% dans l'essai ORL toutes localisations CheckRad-CD8 selon une étude préliminaire (100). Il n'est pas précisé s'il s'agit des toxicités aiguës ou tardives, les résultats définitifs sont en attente.

Ce chiffre brut semble élevé, dans l'absolu et relativement au traitement standard: une étude dosimétriques de chimio-radiothérapie des cancers de l'oropharynx a montré que la probabilité de complication tardive ne dépasse 30% que dans des situations rares où la dose moyenne aux muscles constricteurs du pharynx excède 65 Gy ou quand la dose moyenne au larynx excède 60 Gy (118). On surveillera donc le taux de dysphagie tardive de CheckRad-CD8 quand il sera reporté. Les données de NTCP<fnref n="33" /> seront alors possiblement à réévaluer en immuno-radiothérapie.

## Autres toxicités

Celles-ci impliquent principalement la peau, le colon, le foie. Peu de données existent actuellement sur les combinaisons immunothérapie-radiothérapie, mais des essais sont en cours et de nouvelles données sont imminentes.

## Essais cliniques publiés et en cours

Les essais en cours sont désormais très nombreux, on ne pourra tous les citer. Initialement concentrées sur les patients métastatiques à faible masse tumorale (oligo métastatiques), les recherches s'orientent vers des stades plus précoces, comme la maladie localement avancée et le néo-adjuvant.

Ainsi l'essai de phase III PACIFIC dans le cancer du poumon non à petites cellules localement avancé traité par chimio-radiothérapie, avec l'ajout d'un anti-PD-L1 en séquentiel (119), a montré une augmentation cliniquement et statistiquement significative de la survie sans progression, en dépit d'un schéma d'administration

<footnote n="33">³³ NTCP: Normal Tissue Complication Probability</footnote>
séquentiel théoriquement non-optimal. Une analyse en sous-groupe a montré une efficacité plus grande lorsque l'immunothérapie est commencée moins de 2 semaines après la fin de la radiothérapie. Aussi, l'essai de phase III PACIFIC-2, en cours, cherchera à évaluer une chimio-radiothérapie concomitante avec le durvalumab (NCT03519971). L'association concomitante du nivolumab avec une chimio-radiothérapie a été évaluée dans NICOLAS, une phase II non contrôlée.

L'essai PACIFIC-3, en cours, cherche à évaluer le durvalumab associé à la radiothérapie stéréotaxique des cancers pulmonaires localisés sans atteinte ganglionnaire.

D'autres essais de phase III chercheront également à valider le principe d'un inhibiteur de checkpoint concomitant avec une radiochimiothérapie (NCT03745222 RATIONALE 001). Dans l'essai NCT03774732 (NIRVANA-Lung), une irradiation de la tumeur primitive (totale ou partielle, selon la taille), concomitante au pembrolizumab, sera évaluée chez des patients atteints d'un cancer du poumon NPC métastatique.

Dans le cancer du poumon NPC au stade précoce en néoadjuvant<fnref n="34" />, une phase II randomisée (112) a montré une forte augmentation du taux de réponse pathologique complète après stéréotaxie et durvalumab concomitant (27%) vs durvalumab seul (0%) et un taux de réponse pathologique majeure également très supérieur (53% vs 7%, p<0.001). Cependant, l'effet de la radiothérapie seule n'a pas été évalué dans cet essai et il est potentiellement majeur puisque dans cette catégorie de patients, la stéréotaxie seule (mais à plus haute dose<fnref n="35" />), offre des taux de contrôle local supérieurs à 80%, comparables à la chirurgie<fnref n="36" />. A la lumière de ces résultats, on peut se demander si la stéréotaxie à dose réellement ablative, combinée à l'immunothérapie concomitante, pourrait un jour supplanter la chirurgie dans cette indication<fnref n="37" />.

Dans le cancer du rectum, l'essai non contrôlé AVANA a testé en néoadjuvant l'ajout de l'avelumab à la radiochimiothérapie normo fractionné classique (50.4 Gy en 28 séances + capécitabine, ou CAP50), le taux de réponse pathologique complète (ypCR) est 23%, mais de seulement 8% pour les patients sans instabilité microsatellitaire (MSS). Ces résultats sont à mettre en perspective avec un taux de réponse pathologique

<footnote n="34">³⁴ traitement néoadjuvant : traitement pré-chirurgical</footnote>

<footnote n="35">³⁵ Plusieurs schémas existent, par exemple 12 Gy x 4 (48 Gy) ou 18 Gy x 3 (54 Gy).</footnote>

<footnote n="36">³⁶ On pourrait envisager de clarifier l'apport de chaque composante par des méthodes de micro-simulations avec des modèles de Markov, comme présenté plus haut.</footnote>

<footnote n="37">³⁷ Il faudrait éviter l'activation de la voie de l'exonucléase Trex (par exemple avec 10 Gy x 5), et maîtriser la tolérance et les irAEs avec une escalade de dose sur l'immunothérapie.</footnote>
complète (ypCR) de 13.9% avec une radiochimiothérapie de type CAP45 dans l'essai ACCORD12 pour des patients globalement comparables (sans précision de statut microsatellitaire). Ces résultats pourraient en fait traduire une utilité restreinte aux patients avec instabilité microsatellitaire (MSI), censés être meilleurs répondeurs à l'immunothérapie. Une randomisation avec un bras contrôle est donc nécessaire pour clarifier. La question de l'immunogénicité des schémas normofractionnés est aussi posée (voir deuxième article). Il serait intéressant d'utiliser le fractionnement de l'essai CR07 (120) en 5 Gy x 5, plus proche des schémas "immunogènes" prônés par l'équipe de Silvia Formenti, entre autres.

De nombreux essais randomisés dont plusieurs phases III sont en cours, dont les résultats sont attendus dans plusieurs années.

Pris dans leur ensemble, les résultats en néoadjuvant montrent que les schémas concomitants sont prometteurs mais leur bénéfice reste à établir et il est possible que des fractionnements différents doivent être utilisés pour réellement potentialiser les deux modalités.

## Tendances actuelles

Certaines voies de signalisation moléculaires impliquées dans la résistance à la radiothérapie pourraient être de futures cibles thérapeutiques: activation du facteur de croissance TGFβ, recrutement de lymphocytes T régulateurs.

Le ciblage individuel des lésions cancéreuses (primitives et métastases) par les techniques de radiothérapie modernes, permet de réduire partiellement le fardeau tumoral: cette action, même sans immunothérapie, peut améliorer significativement le pronostic, comme l'ont montré plusieurs essais randomisés, dans diverses tumeurs solides (121-123). Pour certains auteurs (75), ces résultats suggèrent que l'élagage (debulking) de la masse tumorale permet au système immunitaire de reprendre, temporairement, le contrôle de la maladie résiduelle, et qu'il faut poursuivre dans cette voie en ciblant un maximum de métastases et en potentialisant le système immunitaire par l'adjonction d'immunothérapies.

Ainsi, dans un nombre croissant de centres, le nombre maximal de lésions irradiées au niveau cérébral a fortement augmenté: le nombre médian de lésions cérébrales traitées chez un même patient peut ainsi dépasser 30 avec des techniques d'épargne hippocampique (124), tandis que les dernières recommandations européennes incitent
désormais à traiter jusqu'à 10 métastases cérébrales en pratique courante (125). Il existe donc une tendance de fond pour offrir au patient métastatique des traitements locaux de plus en plus souvent. Des techniques de radiothérapie actuellement émergentes comme la stéréotaxie guidée par une IRM embarquée devraient accroître encore les possibilités, en supprimant la nécessité de placer des repères métalliques à proximité de la cible et en permettant une visualisation optimale des tissus mous.

L'immuno-radiothérapie pourra donc se développer en capitalisant sur des possibilités techniques appelées à se développer dans les prochaines années.

Mais ce domaine émergent est actuellement limité par le nombre encore limité d'oncologues-radiothérapeutes expérimentés en immuno-radiothérapie. Les standards de traitement ne sont pas établis, les profils de toxicités encore non connus et une frilosité naturelle en découle, hors des centres experts avec une expérience déjà significative.

Le développement de ces techniques pourra faire appel à des technologies innovantes de suivi de la réponse immunitaire sous immuno-radiothérapie, comme l'analyse de l'ADN tumoral circulant, des exosomes, du répertoire des lymphocytes T. L'intelligence artificielle pourrait également fournir des biomarqueurs non invasifs basés sur l'imagerie (ou radiomics)(8), qui permettraient de distinguer environnement tumoral "chaud" ou "froid" et de proposer des prises en charge adaptées à chaque cas.

Enfin, des modèles mathématiques permettront peut-être, à terme, de proposer une méthodologie permettant une prescription plus rationnelle et sécurisée en immuno-radiothérapie, en dépassant les modèles animaux. Ce fut l'objet de ce travail de modélisation, qui se présente en deux modèles : le premier, assez complet, représente une première étape d'abstraction pour passer du modèle animal au modèle numérique. Le deuxième modèle, plus épuré, est à vocation plus pratique et cherche à définir mathématiquement l'immunogénicité intrinsèque d'un schéma d'irradiation pour créer une "boussole" servant à s'orienter dans l'ensemble de toutes les combinaisons possibles de dose par fraction, de dose totale et d'étalement. Leurs hypothèses, leurs limites, leurs enseignements sont présentés dans la suite.
## Premier article

"Mathematical modeling of cancer immunotherapy and its synergy with radiotherapy" ou Modélisation de l'effet synergique entre immunothérapie et radiothérapie dans le traitement du cancer. Introduction, présentation du modèle mathématique

## Présentation du modèle mathématique

Dans un souci de clarté, on présente d'abord le modèle en français, mais sans sacrifier à la rigueur de la description. Le formalisme mathématique est présenté en détail dans la reproduction de l'article publié, avec toutes les données supplémentaires permettant de reproduire les résultats (dont les valeurs des paramètres du modèle).

Dans ce travail de modélisation est défini un système dynamique (dépendant du temps) constitué d'une tumeur cancéreuse en croissance, en interaction avec son micro environnement, qui n'est constitué ici que du système immunitaire, décrit par une population de cellules effectrices (de nature non spécifiée). La figure 1 donne une représentation de ce système dynamique.
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.**
Schematic representation of the relations between the components of the proposed mathematical model. Tumor antigens (An) are produced either naturally by the tumor cells (Tn) or by the radiation cell kill. They induce the production of immune effector cells (Ln) that exert a cytotoxic effect on the tumor cells via an immunologic attack that is composed of a primary and a secondary response. The primary response can be downregulated by the tumor via the production of PD-L1, and this tumor inhibition can be mitigated by inhibitors of the PD1-PDL1 axis. The secondary response cannot be downregulated by the tumor and has a long-lasting effect. The secondary response is dependent on the intensity and duration of the primary response and can be potentiated by inhibitors of the CTLA4 pathway. Arrows with a solid line symbolize a relation of stimulation, whereas arrows with a dotted line symbolize a relation of inhibition.</figcaption></figure>

Le nombre de cellules tumorales est supposé croître avec un temps de doublement constant (selon une loi exponentielle). Au cours de ce processus, certaines cellules cancéreuses meurent, soit spontanément et en "petite" quantité, soit en plus grande quantité sous l'action de la radiothérapie.

Equation de la dynamique du volume tumoral (Tn):

$$T_{n+1} = S_n(\mathbf{d}) \cdot T_n \cdot e^{\mu -Z_{\text{prm},n} -Z_{\text{sec},n}}$$

L'action cytotoxique de la radiothérapie est représentée par la proportion (Sn), entre 0 et 1, la croissance est exponentielle mais potentiellement ralentie par l'action du système immunitaire (Zprm et Zsec: détails plus bas).

Comme on l'a vu dans la section sur les notions de cancérogenèse, la mort spontanée des cellules cancéreuses s'explique par une inadéquation entre leurs besoins en
ressources (oxygène, acides aminés, sucres...) et leurs apports, qui sont fournis par le micro-environnement et par l'intermédiaire de la néo-vascularisation tumorale. Ainsi se constituent les centres nécrotiques au centre des grandes tumeurs (lorsqu'elles atteignent plusieurs cm de diamètre), tandis que la bordure invasive continue de progresser.

Par simplicité, cette vascularisation tumorale n'a pas été représentée mathématiquement, mais elle pourrait l'être, par exemple pour étendre la modélisation aux combinaisons entre les immunothérapies et les médicaments *antiangiogéniques*. La représentation mathématique de cette mort cellulaire spontanée repose sur un seul paramètre, supposé constant, qui décrit la proportion de cellules cancéreuses qui meurt spontanément par unité de temps. C'est en modifiant ce paramètre, que l'on pourrait par exemple modéliser l'effet d'un médicament antiangiogénique, sans apporter de modification à la structure du modèle.

De cette mort cellulaire tumorale s'ensuit la production d'antigènes tumoraux (issus du métabolisme des débris cellulaires) qui stimulent l'activité anti-tumorale des effecteurs immunitaires. Ces antigènes tumoraux sont représentés par une grandeur mathématique dynamique qui progresse avec la masse tumorale. On suppose qu'ils disparaissent au cours du temps selon une loi de décroissance exponentielle, avec une certaine demi-vie. Biologiquement, cette clairance des antigènes est un reflet simplifié d'un métabolisme cellulaire complexe.

L'effet de la radiothérapie est de tuer les cellules cancéreuses (et les effecteurs immunitaires au voisinage), en fonction de la dose administrée, selon le modèle linéaire-quadratique déjà présenté. Ce modèle est valide jusqu'à des doses par fraction de 6 ou 8 Gy, au-delà des ajustements à cette formule sont nécessaires (mais on peut aussi augmenter le rapport $α/β$).

La mort cellulaire induite par la radiothérapie n'est pas immédiate et intervient généralement après un certain nombre de mitoses; ceci n'est pas pris en compte dans la formulation classique du modèle linéaire-quadratique, qui suppose que l'on se trouve suffisamment à distance de l'irradiation pour que toutes les cellules censées mourir aient disparu. Cependant les données expérimentales à notre disposition étaient de court terme, de quelques jours à quelques semaines et il était important de pouvoir décrire des variations de volume tumoral sur cet horizon de temps. Nous avons donc modifié légèrement le modèle linéaire quadratique pour décrire une mort cellulaire qui
s'étale progressivement sur quelques jours. Les aspects mathématiques sont disponibles
dans les données supplémentaires.

Dans ce modèle, les cellules tumorales tuées par la radiothérapie libèrent des antigènes tumoraux qui viennent s'ajouter aux antigènes tumoraux produits par la mort spontanée. Cette sommation ne s'effectue pas de manière équilibrée (dans laquelle 1 unité d'antigène produit par la radiothérapie aurait le même effet que 1 unité d'antigène produit par la mort spontanée). En réalité, afin de décrire les résultats expérimentaux, il a été nécessaire d'introduire une pondération très importante au profit de la radiothérapie: pour une cellule cancéreuse tuée, la quantité d'antigènes "immunogène" produit par la radiothérapie, serait plus de 100 fois supérieure à la quantité produite par une mort spontanée. Ceci reflète possiblement la différence d'immunogénicité entre la mort programmée par apoptosis et la mort par nécrose, plus fréquente en cas d'irradiation.

Dans les expériences que nous avons cherché à décrire, les doses par fraction étaient importantes (> 6 Gy), provoquent des dégâts vasculaires, de la nécrose et sont particulièrement immunogènes. Il n'est donc pas surprenant que ce type de radiothérapie soit particulièrement immunogène. Ce modèle mathématique permet de mieux prendre la mesure du potentiel d'immunogénicité qui pourrait être libéré grâce à la radiothérapie, qui semble supérieure à l'immunogénicité spontanée d'une tumeur laissée à sa propre croissance.

Cependant les antigènes tumoraux ne représentent qu'un potentiel d'immunogénicité, qui ne se traduit pas automatiquement par une efficacité anti-tumorale: dans ce modèle, l'action des effecteurs immunitaires a été modulée par la masse tumorale. A mesure qu'une tumeur grandit, il est établi qu'elle s'affranchit progressivement du contrôle du système immunitaire: ce phénomène est soupçonné depuis le début du 20ème siècle et prouvé depuis les années 1970 lorsqu'il a été décrit dans plusieurs expériences animales.

La figure 2 montre ainsi la probabilité de rejeter une métastase dans des conditions expérimentales, en fonction de la durée écoulée depuis l'implantation de la tumeur (durée liée à la taille tumorale, selon une loi approximativement exponentielle); les valeurs mesurées sont tirées de (36) et indiquées par les cercles, la ligne qui joint ces valeurs expérimentales montre le résultat du modèle mathématique.
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2.</figcaption></figure>

On sait désormais qu'un grand nombre de facteurs contribuent à cet échappement immunitaire, comme la sélection de clones faiblement immunogènes, l'apparition dans l'environnement péri-tumoral de cellules immunitaires polarisées négativement (dont l'action tend à antagoniser la réponse immunitaire) comme les Treg, les MDSC, ou les macrophages-M2 (voir la présentation plus détaillée dans la section sur l'immunothérapie) Ainsi le système immunitaire est progressivement "éteint" dans l'environnement tumoral, et la tumeur peut croître sans rencontrer de résistance (autre que ses ressources limitées). En d'autres termes, l'échappement immunitaire est une condition nécessaire de la croissance tumorale.

Ainsi, plutôt que de décrire l'ensemble de tous les effecteurs immunitaires et leurs interactions complexes, il a été choisi de décrire l'échappement immunitaire uniquement par une traduction macroscopique: la taille tumorale.

Une relation liant les effecteurs immunitaires et la taille tumorale a donc été introduite, puis ses paramètres ont été calibrés sur des données expérimentales publiées.

Cette relation est traduite par l'intermédiaire des antigènes tumoraux, produits en majeure partie par irradiation d'une part et par le taux de mort cellulaire spontanée au sein de la tumeur d'autre part.

Equation de la dynamique des antigènes tumoraux (An):

$$A_{n+1} = (1 - \lambda).A_n + \rho.T_n + \psi.(1 - S_n(\mathbf{d})).T_n$$
Le premier terme décrit la clairance des antigènes, le second terme la production des antigènes de par l'apoptose ou la nécrose spontanée des cellules tumorales (Tn), le dernier terme décrit la production d'antigènes par les cellules tuées par la radiothérapie.

Les antigènes tumoraux modulent la présence d'une population d'effecteurs immunitaires au sein du microenvironnement tumoral (effecteurs immunitaires qui peuvent être temporairement détruits par irradiation, ce qui tient compte du fractionnement).

Equation de la dynamique des effecteurs immunitaires (Ln):

$$L_{n+1} = (1 - \phi) \cdot \delta_n \cdot L_n + \lambda \cdot A_n$$

Le premier terme décrit la clairance des effecteurs, qui peut être spontanée et progressive (leur durée de vie étant limitée) ou provoquée et brutale, de par l'irradiation du micro-environnement tumoral.

Ceci crée une relation positive entre l'immunogénicité et la masse tumorale, du moins dans la phase initiale de la croissance tumorale; cette relation décrit aussi une stimulation positive de l'immunité par l'irradiation.

Cette population d'effecteurs immunitaire voit ensuite sa polarisation modulée par la taille tumorale: à mesure que la tumeur croît, la proportion d'effecteurs immunitaires à polarisation positive diminue, au profit d'effecteurs inactifs, polarisés négativement.

Ceci crée une relation biphasique entre l'immunogénicité et la taille tumorale: après une période initiale de croissance conjointe entre la taille tumorale et l'immunogénicité, vient un plateau puis une chute brutale de la réponse immunitaire anti-tumorale, au-delà d'une taille critique.

Ce modèle suppose donc qu'il existe un point de non-retour, au-delà duquel une masse tumorale n'est plus contrôlable par le système immunitaire, quel que soit le degré de stimulation antigénique.

Dans ce modèle, les très petites tumeurs sont trop peu immunogènes pour produire une réponse immunitaire. Les simulations numériques montrent que la taille tumorale aura tendance à se stabiliser à long terme, plutôt qu'à s'annuler. C'est un comportement lié au modèle, mais en réalité, il est possible que le système immunitaire soit capable d'une éradication complète de la maladie.

Il existe également un plateau de réponse immunitaire aux environs d'une taille tumorale optimale, où le rendement immunologique de l'irradiation est maximum. En
pratique, ceci plaide pour irradiier suffisamment de cibles en immuno-radiothérapie et
de tenir compte de la masse totale irradiée.

La réponse immunitaire s'oppose à la croissance tumorale avec une action
cytotoxique. Cette réponse est composée de deux composantes additives, l'une décrivant
une réponse immunitaire *primaire*, l'autre une réponse immunitaire *secondaire*.

Equation de la réponse primaire:

$$
Z_{\text{prm,n}} = \frac{\omega \cdot L_n}{1 + \frac{\kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n}{1 + p_1}}
$$

Celle-ci est modulée négativement par la taille tumorale (Tn) au dénominateur, positivement par les effecteurs immunitaires (Ln), ainsi que par la concentration des inhibiteurs de checkpoint anti-PD1 (p1).

D'un point de vue mécanistique, la réponse immunitaire primaire résulte globalement de l'activation et de l'expansion lymphocytaire T CD8+, après stimulation par l'action de l'immunité innée. Cette réponse primaire varie en fonction de la stimulation antigénique, avec une modulation de la polarisation par la taille tumorale précédemment décrite.

La réponse secondaire décrit une réponse immunitaire de long terme, qui résulte de stimulations successives de la réponse primaire. Elle est traduite mathématiquement comme une intégrale (ou somme) de la réponse primaire, pondérée par un facteur multiplicatif.

Equation de la réponse secondaire:

$$
Z_{sec,n} = \sum_{k=0}^{n} \gamma \cdot \frac{1+c_4}{r+c_4} \cdot Z_{prm,k}
$$

D'un point de vue mécanistique, elle décrit de manière simple la différenciation des lymphocytes T en helpers (phénotype CD4+) et l'apparition de lymphocytes T mémoire. Une fois que cette réponse secondaire est apparue, elle est insensible à la modulation par la taille tumorale et elle se maintient dans le temps de manière potentiellement indéfinie. Cette réponse secondaire décrit donc un effet de vaccination de long terme, qui est acquis après un certain nombre de stimulations antigéniques ayant produit suffisamment de réponses primaires.
Une description de la pharmacodynamie des inhibiteurs de checkpoint anti-PD1 et anti CTLA 4 est présente dans le modèle. Il semble logique de faire porter prioritairement l'action des anti-PD1 (ou PD-L1) sur la réponse primaire, en raison du rôle de PD-1 dans l'expansion lymphocytaire T CD8+ mais aussi dans certains effecteurs de la réponse innée (NK et macrophages).

Pour les anti CTLA 4, le choix est différent: CTLA 4 inhibe la costimulation lymphocytaire T (signal 2), il est potentiellement exprimé par toutes les populations lymphocytaires (dont les T CD8+ et NK) mais il est *surexprimé* chez les lymphocytes T auxiliaires (CD4+), indispensables à l'apparition des lymphocytes T *mémoire*. CTLA 4 n'est, à notre connaissance, pas exprimé au sein des populations non-lymphocytaires (il n'a de fonction connue qu'en inhibiteur compétitif de la co stimulation du TCR). En raison de cette surexpression dans les lymphocytes auxiliaires et de son rôle de frein à la co stimulation, le choix a été fait de ne faire porter son action uniquement sur la réponse immunitaire *secondaire*.

D'un point de vue mécanistique, cette simplification néglige la part de l'action de CTLA 4 dans la réponse primaire, et c'est peut-être une limite du modèle. En pratique, l'ajout d'un terme "croisé" dans la réponse immunitaire primaire qui aurait intégré simultanément PD-1 et CTLA 4 aurait été possible mais aurait rendu la calibration du modèle plus difficile. La description des données expérimentales est d'ailleurs correcte sans introduire cette complexité supplémentaire.

Globalement, le modèle permet donc de décrire toutes les combinaisons possibles, et en particulier un blocage simple par anti-PD1 (ou PD-L1) et un double blocage anti-PD1 + anti CTLA 4, en combinaison avec de la radiothérapie. Qualitativement, l'ajout du double blocage, dans cette description, résulte en un effet relativement insensible au début, précédant l'établissement d'une réponse mémoire plus puissante.

Des simulations numériques (Figure 5) montrent que l'intérêt du double blocage est plus fort pour des tumeurs agressives avec temps de doublement très court, tandis que le simple blocage anti-PD1 combiné avec la radiothérapie est suffisant pour des tumeurs moins agressives et d'efficacité comparable au double blocage<fnref n="38" />.

<footnote n="38">³⁸ Il sera intéressant de comparer ces modélisations aux données cliniques des doubles blocages anti-PD1 + anti CTLA 4 récemment autorisés en bithérapie, puisque l'utilité du double blocage a été justement questionnée par les régulateurs (EMA, HAS), comme précédemment discuté. On pourra par exemple comparer les taux de réponse en mono vs bi-thérapie en fonction de la taille tumorale et des indices de prolifération (par exemple le Ki67, ou à défaut le grade de différenciation).</footnote>
<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Figure 5.**
Radiotherapy and concurrent PD1/PDL1 and CTLA4 blockades. Simulated Kaplan-Meier survival curves of blockade of PD1/PD-L1 axis and/or CTLA4 with or without radiotherapy (RT), inspired from the experimental results reported in ref. 14; solid line and circle marks, RT+α-PD-L1+α-CTLA4; solid line and cross mark, RT+α-PD-L1; dotted line and square mark, RT+α-CTLA4; dash-dot line and circle mark, α-PD-L1+α-CTLA4; solid line, no treatment; unique radiation dose on day 10, immunotherapies started on day 10, and drug serum concentrations assumed to be constant from that day on. **A**, the mathematical tumor model was adjusted to yield similar long-term survival rates than those reported in ref. 14, while the long-term survival rate of the tri-therapy RT+α-PD-L1+α-CTLA4 was about 80%, there was <5% long-term survival if irradiation was not used, even with a dual immune blockade α-PD-L1+α-CTLA4, as reported in ref. 14. **B**, simulated Kaplan-Meier survival curves using a less aggressive tumor, keeping the other parameters identical [E(μ) = 0.108 in B vs. E(μ) = 0.135 in A, where E(X) stands for the expectation of the random variable X] with this smaller tumor growth rate, the long-term survival rate of the dual immune blockade α-PD-L1+α-CTLA4 was increased to approximately 50%; however, the model predicts that RT+α-PD-L1 and RT+α-CTLA4 should significantly overperform the dual blockade with a long-term survival rate >80%. Numerical parameters are given in the Supplementary Material.

On discute ensuite les résultats principaux des simulations produites par ce modèle.

# Discussion

## Masse tumorale critique

Il apparaît que ce choix de modélisation plaide pour des stratégies de combinaison des immunothérapies avec des traitements de *debulking* (de réduction complète ou partielle) comme la radiothérapie ou éventuellement d'autres traitements cytoréducteur: chimiothérapies, chirurgie. Ce résultat est une *conséquence logique* d'avoir lié mathématiquement l'échappement immunitaire et la taille tumorale, sur la base de données expérimentales.

Cette simplification ignore qu'à taille égale, certaines tumeurs sont infiltrées par un système immunitaire compétent alors que d'autres tumeurs évoluent au contraire dans un "désert immunitaire". Des biomarqueurs permettent d'ailleurs de prédire, certes très imparfaitement, la réponse aux immunothérapies.

Mais il ne s'agit pas d'opposer un modèle à des outils biologiques utiles mais de compléter par une modélisation dynamique.

Aussi cet hypothétique point de non-retour, cette masse tumorale critique au-delà de laquelle le système immunitaire ne peut plus contrôler la tumeur et où les traitements cytoréducteurs "traditionnels" sont indispensables. La valeur de cette masse est
probablement impossible à prédire précisément: elle est probablement tumeur-, traitement- et patient- dépendante.

Cependant, dans ce modèle mathématique, on peut tirer une expression simple pour la masse critique. En effet, pour exprimer cette masse critique, on remarque qu'elle correspond à un point d'équilibre où la croissance tumorale et la réponse immunitaire se compensent (s'égalisent). Si l'on néglige la réponse immunitaire secondaire, en première approximation, en égalisant la croissance tumorale $\mu$ (qui varie comme l'inverse du temps de doublement Td) et la réponse primaire Zprm, on en déduit une expression de la taille tumorale critique (en négligeant le terme 1 au dénominateur):

$$T_{n+1} = S_n(\mathbf{d}) \cdot T_n \cdot e^{\mu - Z_{\text{prim},n} - Z_{\text{sec},n}}$$

$$Z_{\text{prim},n} = \frac{\omega \cdot L_n}{1 + \frac{\kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n}{1 + p_1}}$$

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Cette masse critique est donc proportionnelle au temps de doublement (élevée à la puissance 3/2), et cette masse critique peut être augmentée lorsqu'un inhibiteur de checkpoint de type anti-PD1 ou anti-PDL1 est utilisé (car dans ce cas: $p1 > 0$). A noter que, le terme $p1$ vaut environ 2 dans les expériences précliniques que nous avons décrites avec ce modèle, soit un triplement de la masse critique sous anti-PD(L)1.

Ainsi, sur le schéma ci-dessous, la masse critique se situe sur une courbe (noire) passant par l'origine dans un repère (Masse tumorale, Temps de doublement). Les tumeurs dont la masse et le temps de doublement sont dans la zone verte sont contrôlables par le système immunitaire, tandis que celles dans la zone rouge échappent au système immunitaire.

<figure><img src="image_6.png" /></figure>
L'effet des anti-PD(L)1 décale la courbe de la masse critique vers la droite, ce qui augmente la surface de la zone verte, ce qui se traduit par un contrôle immunitaire pour plus de tumeurs, toutes choses égales par ailleurs.

Il est intéressant de noter que des auteurs ont publié des schémas d'allure similaire sur des données expérimentales (126) qui lient également la réponse aux inhibiteurs de checkpoint à la taille tumorale et à un indice de prolifération (le Ki67), en cohérence avec les prédictions de notre modèle mathématique.

On reste cependant prudent sur la forme précise de cette hypothétique masse critique, mais on supposera à ce stade qu'il existerait une possible dépendance au temps de doublement, donc finalement au degré d'agressivité tumorale (plus l'agressivité est grande, plus petite est la taille tumorale critique sous ICI).

L'hypothèse que cette masse critique existe peut générer de nouvelles stratégies de traitement. Dans ce modèle, chez un patient progresseur sous immunothérapie, cette masse critique pourrait avoir été dépassée et il y aurait un intérêt à tenter une stratégie de debulking, en la combinant à une immunothérapie (nouvelle ligne ou ligne en cours). Ce debulking prend préférentiellement la forme de radiothérapie stéréotaxique à haute dose sur les lésions les plus symptomatiques, en incluant éventuellement d'autres lésions volumineuses, dans le but de créer une quantité maximale d'antigènes. Mais on pourrait évoquer d'autres justifications: évitement d'une défaillance d'organe ultérieure, limitation du risque d'apparition, de prolifération puis de diffusion de clones résistants, par exemple.

Cette stratégie a été tentée récemment, avec succès, pour des immunothérapies à base de CAR-T cells, dans les lymphomes à haut volume tumoral en progression sous chimio-immunothérapie (127); les auteurs ont bien observé des re-sensibilisations, des réponses complètes, et de manière peut-être moins prévisible, une paradoxale diminution des toxicités - malgré une escalade thérapeutique -, liée à la diminution du volume tumoral et donc de la fréquence des syndrome de lyse.

Une analyse rétrospective de la KEYNOTE-001 déjà citée (114) a mis en lumière une activité supérieure de l'inhibiteur de checkpoint Pembrolizumab en cas d'antécédent (même ancien) de radiothérapie. La taille tumorale au moment d'initier le Pembrolizumab n'est pas documentée dans cette étude, mais il est plausible que le fardeau tumoral était plus faible chez les patients ayant pu bénéficier d'une
radiothérapie, en particulier thoracique<fnref n="39" />, par rapport aux patients traités uniquement par traitement systémique. Le rôle de potentialisation des antigènes tumoraux libérés par la radiothérapie est possible, mais, dans ce modèle, il est moins plausible à mesure que le délai entre la radiothérapie et l'immunothérapie s'allongent. Dans le cancer du poumon NPC localement avancé non opérable, les résultats positifs de l'étude PACIFIC (ajout du durvalumab) sont également cohérents (115), puisque la radio-chimiothérapie réalisée peu de temps avant de débuter l'immunothérapie a contribué à réduire le fardeau tumoral; cependant comme les patients ont été randomisés sur l'immunothérapie (et pas sur la radiothérapie), l'argument est donc moins fort que pour les études précédentes.

Une étude monocentrique affirme avoir montré un bénéfice en survie sans progression et en survie globale à l'irradiation de toutes les lésions combiné à des inhibiteurs de checkpoint (PDL1 ou CTLA 4) par rapport à l'irradiation d'un seul site métastatique (109). Cependant, les patients n'ont pas été randomisés, mais traités sur toutes les lésions *lorsque c'était possible*, aussi le fardeau tumoral représente un facteur confondant évident. Dans le bras toutes lésions traitées, aucun patient n'avait 6 métastases ou plus, contre 48% pour les patients dans le bras où une seule lésion était traitée. Les auteurs n'ont pas analysé le nombre de lésion dans l'analyse multivariée, ni stratifié par nombre de métastases, le niveau de preuve est donc faible.

Dans une étude prospective randomisée où une seule métastase était irradiée chez des patients atteints d'un cancer ORL métastatique sous immunothérapie, aucun effet bénéfique n'a été mesuré sur le taux de réponse, la survie sans récidive, la survie globale ou la durée de réponse (110). Dans une étude en cours sur la même population de patients atteints d'un cancer ORL sous ICI, un volume minimum à irradier a été imposé (au moins 10 cc) et pourra intéresser jusqu'à 3 métastases (NCT03386357: Keynote 717, IMPORTANCE), reflétant probablement une volonté des investigateurs d'augmenter la quantité d'antigènes tumoraux produits par l'irradiation, tout en limitant les effets secondaires.

Pris dans leur globalité, ces résultats cliniques semblent cohérents avec les prédictions théoriques et encouragent à continuer d'explorer des irradiations avec

<footnote n="39">³⁹ En cas d'antécédent de radiothérapie thoracique à visée curative suivie d'une récidive à distance sur quelques localisations, le fardeau tumoral est généralement bien moindre qu'en cas d'une tumeur métastatique d'emblée ayant reçu uniquement de la chimiothérapie.</footnote>
objectif de *debulking*, ou de réduction significative de la taille tumorale, en maximisant le nombre de cibles, sans se limiter à une ou deux métastases symptomatiques, tout en essayant de maîtriser l'augmentation des effets secondaires.

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Par exemple, ce schéma propose le principe d'un essai clinique d'immuno-radiothérapie où les volumes d'irradiation et les thérapies systémiques pourraient être adaptés au risque de progression sous immunothérapie: les patients à bas-risque pourraient ne recevoir que de l'immunothérapie et éventuellement de la radiothérapie en cas de progression de lésions existantes ou de nouvelles lésions, tandis que les patients avec un risque de progression modéré ou élevé recevraient une radiothérapie de debulking visant à une réduction significative du fardeau tumoral (ici, au moins 50%), sans limitation a priori du nombre de cibles à irradier et sans se limiter aux métastases les plus menaçantes ou les plus symptomatiques. Une double immunothérapie, ou une bithérapie par chimio-immunothérapie pourraient même être envisagée pour les patients à risque maximum. La stratification du risque pourrait faire appel à de nombreux paramètres, en particulier le fardeau tumoral global et à l'agressivité tumorale comme défendu dans cette thèse, mais sans exclure a priori d'autres méthodes (biomarqueurs, signatures génomiques ou radiomics, etc).

## Durée de réponse aux inhibiteurs de checkpoint

Il a été présenté précédemment que tous les répondeurs aux immunothérapies ne sont pas des longs-répondeurs, même si certains patients peuvent répondre pendant des années. Beaucoup de patients rechutent après une réponse relativement courte de quelques mois. Les mécanismes de l'échappement aux immunothérapies après une réponse initiale ne sont pas clairement établis.
A l'intérieur des répondeurs, le modèle décrit un continuum de durée de réponse très variable, dans ce cas particulier selon le degré de synchronisme entre radiothérapie et début de l'inhibiteur de checkpoint (Figure 4-B). Dans ce modèle, une réponse courte à l'immunothérapie suivie d'une rechute n'est pas la résultante d'une inefficacité de l'immunothérapie, mais plutôt d'une inadéquation de la stratégie de potentialisation (dans ce cas particulier, la radiothérapie d'induction est commencée trop tôt avant le début de l'immunothérapie et la synergie est insuffisante).

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

Figure 4B de l'article: décrit comment une réponse initiale puis un échec de l'immuno-radiothérapie peut résulter, ici, d'un délai trop long entre la fin de l'irradiation et le début des inhibiteurs de checkpoint.

Ceci ouvre une discussion sur les stratégies de re-sensibilisation en cas d'échec d'immunothérapie après réponse initiale: plutôt que l'arrêt de l'immunothérapie avec changement de ligne, on pourrait envisager le maintien de l'immunothérapie avec tentative de "re-vaccination" soit par radiothérapie, soit par l'ajout ou le changement de thérapie systémique, ce qui pourrait faire l'objet d'essais cliniques<fnref n="40" />. La multiplicité des piliers de la cancérogenèse pourraient également inciter à tenter de conserver une action pro-immunitaire, même d'efficacité incomplète, et de la compléter par d'autres thérapies, plutôt que d'adopter une approche séquentielle plus facile à contourner, tant que la tolérance l'autorise.

## Toxicités

Ce modèle ne cherche à décrire que l'efficacité sans considérer les toxicités, dont l'importance a été présentée dans la présentation de l'immuno-radiothérapie.

<footnote n="40">⁴⁰ De telles stratégies de re-sensibilisation par debulking en radiothérapie ont été positives avec les CAR-T cells dans certaines hémopathies, comme vu précédemment.</footnote>
La raison principale est la rareté des données de toxicité disponibles à l'époque où ce modèle a été conçu (2016). Pourrait-on adapter ce modèle pour décrire les toxicités? C'est théoriquement possible: l'équation de la croissance tumorale devrait être supprimée; le tissu cible ne serait plus la tumeur mais un organe à risque, de volume constant. On conserverait le lien entre dose de radiothérapie à l'organe à risque, volume irradié, production d'antigènes tissulaires, réponse immunitaire et éventuellement effet secondaire auto-immun. Ensuite il faudrait calibrer les paramètres du modèle pour décrire au mieux les toxicités observées en clinique (utilisation nécessaire de logiciels pour les modèles non-linéaires à effets mixtes comme MONOLIX ou NONMEM). Un lien dose-effet pourrait alors en être déduit et on pourrait en tirer des limites sur les doses par fraction, les doses totales, les volumes d'organes à risque. Des données de dosimétrie seraient nécessaires: les histogrammes dose-volume devraient donc être des données de calibration.

Ce modèle aura donc tendance à lier naturellement dose, volume et probabilité de toxicité: ces concepts recoupent donc ceux de la radiobiologie classique.

Cette approche sera peut-être trop simpliste pour l'immuno-radiothérapie et on peut imaginer qu'elle pourrait être un jour complétée par des biomarqueurs, des radiomics, des signatures génétiques. Mais à moyen terme, les classiques histogrammes dose-volume sont non seulement encore d'actualité mais demeurent, jusqu'à preuve du contraire, le moyen privilégié d'analyse des toxicités.

## Modélisation des traitements antiangiogéniques

Dans ce modèle, un antagoniste de la néovascularisation tumorale aurait tendance à ralentir la croissance tumorale. D'un point de vue phénoménologique, ceci pourrait être décrit en augmentant le paramètre responsable du taux de nécrose tumorale spontanée, ce qui produirait une plus grande quantité d'antigènes tumoraux et viendrait mécaniquement augmenter le contingent des effecteurs immunitaires et donc l'effet anti-tumoral de l'immunothérapie. Du point de vue mécanistique, cette modélisation pourrait traduire une normalisation partielle de la vascularisation tumorale permettant une meilleure infiltration par le système immunitaire, ainsi qu'une diminution des ressources disponibles pour la croissance de la tumeur, entraînant une diminution de la croissance tumorale.
En résumé, ce modèle simple "tumeur-antigène-immunité" peut également décrire une synergie entre médicaments anti-angiogéniques et immunothérapies.

Effectivement, de telles combinaisons se sont montrées efficaces en clinique et ont été approuvées récemment dans le cancer du rein métastatique: essai positif Axitinib et Pembrolizumab en 2019 (128), puis l'essai Lenvatinib et Pembrolizumab en 2021 (129).

On pourrait ainsi modéliser la triple combinaison radiothérapie, immunothérapie, anti angiogénique, par exemple pour chercher à en réduire la toxicité. Il existe des doutes sur la sécurité de la combinaison de la radiothérapie avec les inhibiteurs multiples de tyrosine kinase (130). Quant au profil de tolérance de l'immuno-radiothérapie, il a été présenté précédemment. La trithérapie pourrait donc poser des problèmes de sécurité, susceptibles d'être adressés par la modélisation.

## Modélisation de l'immunogénicité des antigènes tumoraux

Dans ce modèle les antigènes tumoraux sont tous supposés contribuer de manière égale à la stimulation des effecteurs immunitaires. En réalité: seuls certains antigènes sont immunogènes, la plupart ne sont pas reconnus par le système immunitaire. Cependant, si l'on fait l'hypothèse moins forte que seule une minorité d'antigènes tumoraux est immunogène, mais que cette proportion reste sensiblement constante, alors ce modèle reste vrai (à une constante multiplicative près), seule la calibration d'un paramètre change.

Cependant, cette hypothèse de stabilité de l'immunogénicité est contestable: selon que la mort cellulaire est obtenue par apoptose ou nécrose, la quantité d'antigènes relarguée varie de manière importante (plus importante en cas de nécrose). Or si la radiothérapie provoque une mort cellulaire par nécrose et apoptose, leurs proportions relatives sont inconnues, et dépendent possiblement de la dose par fraction.

Aussi il conviendrait d'utiliser ce modèle dans des plages de dose par fraction à l'intérieur desquelles la biologie de la radiothérapie reste relativement stable. Par exemple: entre 1.8 et 3 Gy, entre 3 et 6 Gy et au-delà de 6 Gy. Mais une comparaison directe entre une irradiation utilisant des doses supérieures à 6 Gy avec des doses usuelles de 2 Gy par fraction serait sujette à caution.

Une autre remarque concerne l'imprédictibilité de l'immunogénicité des tumeurs. Ainsi la réponse aux immunothérapies en monothérapie est imprévisible au niveau d'un patient et les biomarqueurs prédictifs de réponse aux immunothérapie sont plutôt
décevants (comme l'expression de PD1), même si certains semblent plus fiables (TMB, statut MSI). Aussi, pour qu'un tel modèle de combinaison de traitement soit utilisable, il conviendrait de l'appliquer sur des populations de patients homogènes du point de vue des biomarqueurs prédictifs de réponse.

## Modélisation de la mémoire-immunitaire

Dans ce modèle, la réponse immunitaire produit progressivement une réponse de long-terme. Ceci a été modélisé en créant progressivement des effecteurs immunitaires-mémoire (réponse secondaire) à partir des effecteurs de la réponse primaire. Cette hypothèse a certainement des limites, mais elle permet de décrire une relation positive entre l'immunité de long terme et la quantité de stimulation antigénique (comme pour un vaccin avec une dose initiale puis des rappels). La simplicité de la formulation choisie comporte des limites: une très grande quantité d'antigènes tumoraux produite en une seule fois produirait la même réponse immunitaire que plusieurs quantité plus faibles, produites de manière espacée dans le temps. C'est probablement faux mais comme avec tout modèle, la connaissance des hypothèses simplificatrices est indispensable pour une utilisation rationnelle.

La modélisation de la réponse immunitaire de long terme est-elle utile? C'est en fait un sujet actuel: chez les patients long-répondeurs aux immunothérapies, se pose la question de l'arrêt du traitement, en particulier pour des raisons médico-économiques.

Des données empiriques peuvent être obtenues en clinique, puisque ces traitements, sauf échec, sont souvent arrêtés après une période de traitement comprise entre 12 et 24 mois. Il est donc envisageable de collecter des statistiques de récidive pour alimenter des modèles mathématiques ou statistiques.

L'intérêt de notre modèle est qu'il contient une modélisation du traitement administré (il est - partiellement - mécanistique). Après calibration du modèle sur les données de récidive, on pourrait donc théoriquement chercher des modifications de traitement censées augmenter la survie sans récidive à l'arrêt de la maintenance. De telles simulations numériques sont publiées dans l'article (Figure 3).
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Figure 3B de l'article: illustre comment une durée suffisante d'exposition aux inhibiteurs de checkpoint peut provoquer une stabilisation durable de la masse tumorale, même après arrêt du traitement, tandis qu'une exposition trop courte conduit à une récidive à l'arrêt.

Bien sûr, étant donné les hypothèses simplificatrices, une grande prudence serait de rigueur et les modifications se devraient d'être incrémentales.

On pourrait par exemple chercher à savoir si un certain nombre de "doses de rappel" de stimulation antigéniques sont protectrices contre la récidive en cas d'arrêt de l'immunothérapie. Ces "rappels" peuvent prendre la forme d'irradiation de métastases sous immunothérapie. Il serait possible de modéliser numériquement des scénarios et d'explorer *in silico* des stratégies.

Selon la quantité (et la variété) des données cliniques, d'autres approches sont possibles: de simples statistiques peuvent suffire, mais pour définir de nouvelles stratégies jamais tentées en pratique clinique, l'approche *in silico* est mieux appropriée.

Enfin, en dépit d'un grand nombre de patients désormais traités, la durée optimale de maintenance sous immunothérapie n'est toujours pas connue: si dans certains cas la poursuite au-delà de 12 mois diminue les taux de récidive (CHECKMATE-153), il demeure que de nombreux patients bénéficient d'une protection prolongée après une exposition minimale aux inhibiteurs de checkpoint (131,132). L'utilisation de modèles numériques, mécanistiques ou statistiques, pourrait être une piste pour clarifier quels sont les patients les plus à même de bénéficier d'un prolongement de la maintenance et s'il existe des stratégies d'irradiation pour raccourcir la durée nécessaire d'exposition aux inhibiteurs de checkpoint.
Dans ce modèle, la relation de causalité directe entre la production d'antigènes
tumoraux par l'irradiation et la stimulation de la réponse immunitaire, implique que le
maximum d'efficacité doit être obtenu si le patient est irradié au moment où il a déjà
atteint (ou est très proche de) son plateau d'exposition à l'inhibiteur de checkpoint. En
pratique clinique, ce plateau d'exposition ne sera atteint qu'après plusieurs cycles
d'immunothérapie: par exemple, dans le cas du Pembrolizumab, des études
pharmacocinétiques montrent que ce délai est supérieur à 6 semaines (133). On
pourrait éventuellement envisager l'utilisation de doses de charge d'immunothérapie,
afin de raccourcir ce délai.

Effectivement, dans l'essai récent de Ratnayake et al (111), les patients avec la
meilleure réponse sont ceux pour lesquels la radiothérapie a été commencée après le
3ème cycle d'immunothérapie, par rapport aux patients ayant débuté la radiothérapie
au 1er et 2ème cycles. Ces résultats cliniques postérieurs de plusieurs années à notre
modèle mathématique en soulignent la pertinence.

Comme le délai entre irradiation et mort cellulaire pourra être de plusieurs jours,
surtout en cas d'irradiation prolongée à de faibles doses par fraction, il est possible
qu'une certaine synergie résiduelle existe, même dans des conditions de
synchronisation non-optimales où l'immunothérapie est commencée avec du retard.

Des simulations numériques publiées dans l'article (Figures 4-B et 4-C) illustrent
l'importance potentielle de la synchronisation avec l'impact du retard entre l'irradiation
et le début du traitement par inhibiteur de checkpoint. Dans ces simulations, l'effet de
synergie est perdu si l'inhibiteur de checkpoint est débuté plus de 10 jours après
l'irradiation. Ce résultat est cohérent avec les expériences animales utilisées pour
calibrer le modèle, et argumente l'hypothèse que le mécanisme de cette perte
d'efficacité est expliqué par la disponibilité limitée dans le temps des antigènes
tumoraux libérés par irradiation.
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Figure 4C de l'article: courbe de survie expérimentales reproduisant in-silico l'impact du délai entre le début des inhibiteurs de checkpoint et la fin de l'irradiation (délai : 0, 10, 14 jours, avec et sans anti-PD1): au-delà de 10 jours la synergie disparaît.

De manière remarquable, dans l'essai PACIFIC (115), quand la randomisation était effectuée moins de 14 jours après la fin de la radiothérapie, les patients semblent avoir bénéficié de l'immunothérapie (HR 0.42, IC 0.27-0.67), tandis qu'au-delà de ce délai, les résultats sont non statistiquement significatifs (HR 0.81, IC 0.62-1.06), même s'il existe une tendance au bénéfice de l'ajout de l'immunothérapie. Une "petite" marge de sécurité semble donc exister mais elle ne dépasserait pas une quinzaine de jours de délai, en cohérence avec les simulations numériques. Comme il s'agit d'une analyse rétrospective, on ne peut exclure que des facteurs confondants puissent également avoir joué (comme l'état général des patients, susceptible d'être lié au délai entre la fin de l'irradiation et le début de l'immunothérapie), il convient donc de rester prudent dans ces interprétations.

En résumé, une position intermédiaire devra être trouvée entre le désir de viser un optimum pharmacocinétique, éloigné dans le temps après le début de l'immunothérapie, et la nécessité de traiter le patient avant que la croissance tumorale n'engendre des complications.

Plusieurs essais cliniques en cours testent actuellement la concomitance de l'immunothérapie avec la radiothérapie: PACIFIC 2 (NCT03519971), similaire à PACIFIC mais le Durvalumab est désormais concomitant à la chimio-radiothérapie; RATIONALE001 (NCT03745222), où un nouvel anti PD1 (Tislelizumab) est testé en concomitant, en séquentiel et contre la chimioradiothérapie sur les mêmes patients que dans PACIFIC et PACIFIC 2; NIRVANA-Lung (NCT03774732), plus original, où le
Pembrolizumab sera concomitant à une radiothérapie commencée au deuxième cycle et à une chimiothérapie, chez des patients atteints de cancer du poumon NPC localement avancé ou métastatiques et pour lesquels une irradiation du primitif complète ou partielle est autorisée (selon le principe du *debulking*).

Cet argument de concomitance pourrait s'appliquer aux immunothérapies en général, pas seulement aux inhibiteurs de checkpoint. Dans l'essai L19-IL2, le traitement par interleukin 2 couplée à un anticorps monoclonal commence au maximum 7 jours après la fin de la radiothérapie stéréotaxique (134).

L'avenir dira si les traitements concomitants sont effectivement plus efficaces mais aussi suffisamment tolérables. L'expérience des radio chimiothérapies dans le cancer du poumon montre que peuvent coexister sur le long terme des approches séquentielles (moins efficaces) et des approches concomitantes (théoriquement optimales mais au profil de sécurité plus problématique). La sélection des patients pourrait être plus délicate avec les immunothérapies qu'avec la chimiothérapie, en l'absence de biomarqueurs validés.
# Mathematical Modeling of Cancer Immunotherapy and Its Synergy with Radiotherapy

Raphael Serre<fnref n="1" />, Sebastien Benzekry², Laetitia Padovani³, Christophe Meille⁴, Nicolas André<fnref n="1" />,⁵,⁶, Joseph Ciccolini<fnref n="1" />, Fabrice Barlesi<fnref n="1" />,⁷, Xavier Muracciole³, and Dominique Barbolosi<fnref n="1" />

## Abstract

Combining radiotherapy with immune checkpoint blockade may offer considerable therapeutic impact if the immunosuppressive nature of the tumor microenvironment (TME) can be relieved. In this study, we used mathematical models, which can illustrate the potential synergism between immune checkpoint inhibitors and radiotherapy. A discrete-time pharmacodynamic model of the combination of radiotherapy with inhibitors of the PD1-PDL1 axis and/or the CTLA4 pathway is described. This mathematical framework describes how a growing tumor first elicits and then inhibits an antitumor immune response. This antitumor immune response is described by a primary and a secondary (or memory) response. The primary immune response appears first and is inhibited by the PD1-PDL1 axis, whereas the secondary immune response happens next and is inhibited by the CTLA4 pathway. The effects of irradiation are described by a modified version of the linear-

quadratic model. This modeling offers an explanation for the reported biphasic relationship between the size of a tumor and its immunogenicity, as measured by the abscopal effect (an off-target immune response). Furthermore, it explains why discontinuing immunotherapy may result in either tumor recurrence or a durably sustained response. Finally, it describes how synchronizing immunotherapy and radiotherapy can produce synergies. The ability of the model to forecast pharmacodynamic endpoints was validated retrospectively by checking that it could describe data from experimental studies, which investigated the combination of radiotherapy with immune checkpoint inhibitors. In summary, a model such as this could be further used as a simulation tool to facilitate decision making about optimal scheduling of immunotherapy with radiotherapy and perhaps other types of anticancer therapies. *Cancer Res*; 76(17): 4931-40. ©2016 AACR.

## Major Findings

To help the design and efficacy analysis of combined anti-cancer therapies, this article proposes a set of mathematical equations that describe the pharmacodynamics of radiotherapy in combination with two paradigmatic immunotherapies, namely the blockers of the PD1-PDL1 axis and of the CTLA4 pathway. These equations explain several experimental results reported in preclinical and clinical settings. Together with published pharmacokinetic models, they pave the way for the efficient in silico design and optimization of combined anti-cancer therapies mixing immunotherapy and radiotherapy; this approach is currently under active investigation because of its strong potential synergism.

## Introduction

Immune checkpoint inhibitors are considered as a major advance in a variety of cancer diseases with dismal prognosis (1). Despite outstanding progress in melanoma and lung cancers, a majority of patients will nevertheless fail in achieving long-lasting responses. Associating radiotherapy with immunotherapy has shown synergistic effect and is now considered as a promising strategy to stretch both response and survival at bedside (2). However, combining radiotherapy and immunotherapy can be done following a variety of different modalities. Determining the exact scheduling of the radioimmunotherapy association is therefore critical, and standard empirical approaches (trial-and-error) will hardly meet the current requirements of fast-track approvals of novel therapies. In this respect, developing modeling and simulation tools able to describe biological and pharmacodynamics processes should

<footnote n="1">¹Aix Marseille University, SMARTc Unit, Inserm S 911 CRO2, Marseille, France. ²MONC team, Inria Bordeaux Sud-Ouest, Institut de Mathématiques de Bordeaux, Talence, France. ³Department of Radiotherapy Oncology, CHU La Timone, Assistance Publique-Hopitaux Marseille, Marseille, France. ⁴Novartis Pharma, Basel, Switzerland. ⁵Department of Pediatric Hematology and Oncology, CHU La Timone, Assistance Publique-Hopitaux Marseille, Marseille, France. ⁶Centre d'Essais Précoces Cancérologie Marseille (CEPCM), CHU La Timone, Assistance Publique-Hopitaux Marseille, Marseille, France. ⁷Multidisciplinary Oncology & Therapeutic Innovations Unit, Assistance Publique-Hopitaux Marseille, Marseille, France.</footnote>

<footnote>Note: Supplementary data for this article are available at Cancer Research Online (http://cancerres.aacrjournals.org/).</footnote>

<footnote>Corresponding Authors: Dominique Barbolosi, Aix-Marseille Université, UMR_S 911 INSERM, Faculté de Médecine et Faculté de Pharmacie, 27 Boulevard Jean MOULIN, Marseille cedex 05, 13385 France. Phone: 336-6253-7759; Fax: 334-9183-5667; E-mail: dominique.barbolosi@univ-amu.fr; and X. Muracciole, xavier.muracciole@ap-hm.fr</footnote>

<footnote>doi: 10.1158/0008-5472.CAN-15-3567
©2016 American Association for Cancer Research.</footnote>
Quick Guide to Equations and Assumptions

As a general modeling principle, no attempt was made to include all the currently available knowledge on immunology and radiotherapy. Trying to build a biologically exhaustive model would have resulted in an unnecessary complex mathematical framework of reduced practical interest. Instead, a limited number of biological hypotheses have been considered to derive a reduced set of equations. As a consequence, the model uses only a small number of parameters although sufficient to describe the experimental results of interest.

Biological hypotheses and mathematical interpretations

The following simplifying assumptions have been made:

* About the immune escape mechanism, we assumed that the growth of the tumor mass induces a progressive state of immune tolerance; this process has been reported in the 1970s by several authors and later attributed to a number of biological processes such as immune cell exhaustion, the activation, and accumulation of inhibitory immune cells such as Tregs, MDSCs, and M2-type tumor-infiltrating macrophages (8–11); other interesting contributing factors to immune escape, such as the selection of poorly immunogenic variants, have not been modeled because their additional explanatory power has been estimated relatively modest in comparison with their mathematical complexity;

* As a consequence of the immune escape mechanism, the activity of the immune response is a non-monotonic (or biphasic) function of the tumor mass; it increases with tumor mass as long as the volume remains below a certain threshold, then it decreases; this is coherent with results in refs. 9–11, 28–32. The coupling between the tumor dynamics and the immune response is obtained mathematically by the product of two mechanisms. In the first mechanism, the tumor produces antigens that stimulate the immune response in a tumor size-dependent manner; this explains the increasing part of the immune response curve as a function of tumor size. The second mechanism is a tumor size-dependent neutralization of the immune response, which produces the decreasing part of the immune response curve after the tumor-size has reached a critical threshold, where the effect of immune neutralization exceeds the effect of immune stimulation;

* The nonimmunologic effects of radiotherapy have been described by a linear-quadratic model (5–7), which we have modified to describe more finely the tumor mass dynamics after irradiation;

* On the stimulation of the immune response by irradiation, the different explanations given by several authors (15, 33–37), even though they differ by their biological nature, have been assumed to produce additive effects that can be approximately described by a unique equation, which involves the release of tumor antigens by radiotherapy;

* The downregulation of the immune response by irradiation is modeled by two mechanisms. First, radiotherapy may kill the immune effectors in the irradiation field. This is a mathematical interpretation of preclinical data published in ref. 37. Second, the immune effectors downregulate the immune response; because effectors are in relation with tumor antigens, and therefore the radiation dose, this creates a dose-dependent immune downregulation, in coherence with the preclinical data published in ref. 22, involving the PD1–PD-L1 axis, or with other biological models involving the TGFβ signaling pathway (20, 21);

* Because the blockade of the PD1–PDL1 axis promotes the antitumor activity of the T-cell response by reducing the expansion of tumor-infiltrating MDSC and T regulatory lymphocytes (1), we made the anti-PD1 mAb serum concentration an inhibitor of the immune response downregulation;

* Because the immune response in anti-CTLA4 mAbs treatment is thought to be mostly caused by an increased activity of CD4⁺ T cells and the subsequent stimulation of the secondary (or memory) immune response (1), we made the anti-CTLA4 mAb concentration a stimulating factor of the memory response and we neglected its direct contribution to the primary immune response (even though CTLA4 blockade does also have a modest effect on the primary immune response, which is caused by the increased inhibition that CTLA4 blockade exerts on the growth of the tumor mass; this smaller tumor mass reduces the inhibition of the primary immune response by the tumor mass according to Eq. D). Hence, our mathematical formulation of the immune response has been separated into two additive components: the primary immune response and the secondary (or memory) immune response, each part corresponding to its eponymous biological counterpart; the secondary response is assumed to appear progressively after the primary response, as a result of the cumulative effect of the primary response. The secondary response appears relatively slowly but has a long-lasting effect and it is not sensitive to tumor downregulation, contrary to the primary response. This is our mathematical interpretation of immunologic processes for which one can find a comprehensive review in ref. 1;

From these biological hypotheses, we derived the set of equations presented in the next section.

Mathematical model of radiation and immunology

The model is described by 5 discrete-time equations:

$$T_{n+1} = S_n(\mathbf{d}).T_n.e^{\mu^{-Z_{\text{pem},n}-Z_{\text{an},n}}} \quad (A)$$

$$A_{n+1} = (1 - \lambda).A_n + \rho.T_n + \psi.(1 - S_n(\mathbf{d})).T_n \quad (B)$$
$$L_{n+1} = (1 - \phi) \cdot \delta_n \cdot L_n + \lambda \cdot A_n \quad (C)$$

$$Z_{\text{prim},n} = \frac{\omega \cdot L_n}{1 + \frac{\kappa \cdot T_n^2}{1 + \rho_n}} \quad (D)$$

$$Z_{\text{sec},n} = \sum_{k=0}^{n} \gamma \cdot \frac{1 + c_4}{r + c_4} Z_{\text{prim},k} \quad (E)$$

Here, these equations describe the changes over a one-day period, between day n and day n + 1, though any time step could be chosen. A visual representation of the links between the variables is provided in Fig. 1, while the detailed explanations are provided in the next section.

help to better determine an optimal solution among numerous possibilities.

Radiotherapy is widely used in the treatment of primary and metastatic tumors. The biological effects of radiation on tumors

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 1.</figcaption></figure>

Schematic representation of the relations between the components of the proposed mathematical model. Tumor antigens (An) are produced either naturally by the tumor cells (Tn) or by the radiation cell kill. They induce the production of immune effector cells (Ln) that exert a cytotoxic effect on the tumor cells via an immunologic attack that is composed of a primary and a secondary response. The primary response can be downregulated by the tumor via the production of PD-L1, and this tumor inhibition can be mitigated by inhibitors of the PD1-PDL1 axis. The secondary response cannot be downregulated by the tumor and has a long-lasting effect. The secondary response is dependent on the intensity and duration of the primary response and can be potentiated by inhibitors of the CTLA4 pathway. Arrows with a solid line symbolize a relation of stimulation, whereas arrows with a dotted line symbolize a relation of inhibition.

include DNA damage, modulation of signal transduction and alteration of the inflammatory tumor microenvironment (TME). The induction of irreparable DNA damage and cell-cycle arrest can induce lethal mechanisms, including mitotic catastrophe, apoptosis, necrosis, autophagy, and senescence (3). Traditionally, the DNA damages and the subsequent tumor cell kill have been explained with the classical 4 R's of radiobiology: repopulation, reoxygenation, repair of sublethal damage, and redistribution within the cell cycle (4). These mechanisms have long been described by widely used radiotherapy models such as the linear-quadratic (5-7).

Cancer immunotherapy aims at stimulating the ability of the host immune system to eliminate tumor cells through the recruitment and activation of cytotoxic effector cells. A close relationship exists between the tumor cells, the innate and the adaptive immune cells (8); this interplay may be explained by the theory of immunosurveillance or the 3 E's: elimination, equilibrium, and tumor escape. The cancer cells are first eliminated by an innate immune response involving natural killer cells, then by a specific immune response provoked by antigen-specific cytotoxic T cells. But the strength of the immune response gradually decreases during the equilibrium phase, as a result of several distinct and nonexclusive mechanisms, which eventually help the tumor to escape the immune system. Even though these complex biological mechanisms could not be known at the time, the gradual loss of tumor immunogenicity had been established in the 1970s by pioneering studies on the link between the size of a tumor and its ability to induce an immune response (9-11).

This escape mechanism could be, at least partly, reversible: several preclinical and clinical studies have reported the ability of radiation to activate the immune system, to enhance the immune response and to contribute to the control of cancer (12-15). The CD8+ T lymphocytes play a major role in antitumor immunity, hence radiotherapy requires their presence for postirradiation tumor control (16) and their activity is stimulated by irradiation (17). Wattenberg and colleagues (18) reported on several cases where radiation sensitizes the tumor cells to immune-mediated killing, through a process called immunomodulation (18, 19). Importantly, they showed that the increase in the strength of the immune response was dose related.

Furthermore, the effect of radiation on the immune response may not be only one way: radiotherapy may also induce immunosuppressive effects by increasing the tumor cell expression of
Serre et al.

PD-L1, the secretion of TGFβ, the expansion of CD4⁺T regulatory (Treg) cells, of myeloid-derived suppressor cells (MDSC), the maturation of type M2 macrophages (20, 21), and the death of the immune effectors located in the irradiation field (22, 23). Hence, the effects of irradiation could involve a balance between immunostimulation and immunosuppression.

Enhancing the antitumor immune response has long been a field of intensive research. As of today, the most promising drugs having reached clinical approval belong to two types of immune checkpoint inhibitors. They consist in two families of mAbs: the first one (such as ipilimumab) targets the cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTLA-4); the second one (such as nivolumab, pembrolizumab, and lambrolizumab) targets the programmed cell death 1 (anti-PD1) or its ligand (anti-PDL1). Preclinical studies have provided evidence of the synergistic effect between radiation, anti-CTLA-4 mAbs and/or anti PD-1 or PD-L1 mAbs in different *in vivo* models (12, 22, 24).

The abscopal effect of radiotherapy is defined as a regression of tumor or metastases in a site outside the field of irradiation, occurring at such a distance that the effect cannot be explained by direct or scattered radiation; it is immune-mediated and probably caused by the release of danger signals that activate CD8+ cytotoxic T cells, which participate in the control of the nonirradiated residual tumor and metastases (15). The abscopal effect of radiation in combination with ipilimumab was reported in different case reports (14, 25-27). These data from preclinical and clinical studies have confirmed the concept that radiotherapy could lead to the conversion of the tumor into an *in situ* vaccine.

This diversity of medical options paves the way to multi-modal anticancer therapies that could unleash synergies between the different modalities. However, the determination of the most beneficial combination of immune therapies with radiation, in terms of doses, scheduling and synchronism for each modality, is crucial to the induction and persistence of a local and systemic antitumor immunity. To find such an optimal combination, a trial-and-error process would require too much effort and would most probably yield to the suboptimal selection of the best performing strategy among a very small set of candidates.

Herein, a mathematical model is proposed to help in the search of such a combined treatment. It contains a simplified model of tumor growth coupled with antitumor immune response. These equations correctly describe several experimental results about the relationship between the immunogenicity of a tumor and its mass dynamics. In particular, this framework explains how the tumor immunogenicity initially increases with its mass, but later vanishes as the TME becomes progressively more immunosuppressive. Then, by deriving a modified version of the linear-quadratic model, the effect of irradiation on the antitumor immune response are simply modeled by the release of tumor antigens out of irradiated tumor cells. Finally, pharmacodynamic equations are derived to describe the effects of the two families of immune checkpoints inhibitors (targeting either the PD1-PD-L1 axis or the CTLA4 pathway). These equations explain the experimental synergies between irradiation and immune checkpoint inhibitors that have been reported by several authors. Because this model is capable of describing a variety of experimental results, it could probably be used as a tool to simulate multimodal anticancer therapies and also help in the selection of the most efficient ones.

# Materials and Methods

## Tumor dynamics

The compartment $T_n$ is the tumor mass on day $n$, expressed in grams. The parameter $\mu > 0$ is constant and expresses a constant exponential growth. Hence, over a one-day period, in the absence of treatment and assuming no activity of the immune system, the tumor mass is multiplied by $\exp(\mu)$. This simplification is adequate to describe the experimental results presented here, involving small-size murine tumors, even though other tumor mass dynamics could be used, such as the Gompertz growth model for example, because the cell loss factor is probably volume dependent in human tumors as explained in refs. 38 and 39.

The immune system is the only antitumor agent explicitly considered: Depending on its intensity, it can merely slow down tumor growth or can provoke a shrinkage of the tumor mass and eventually eradicate it. The tipping point between these two behaviors is $Z_{\text{prim},n} + Z_{\text{sec},n} = \mu$. If $Z_{\text{prim},n} + Z_{\text{sec},n} < \mu$ the immune system slows down tumor growth, if $Z_{\text{prim},n} + Z_{\text{sec},n} > \mu$ the immune system makes the tumor mass shrink.

The constant $\mu$ implicitly includes other cell loss factors such as, for example, the necrosis of tumor cells resulting from inadequate vascularization and the resulting lack of nutrients or oxygen. Hence, $\mu$ could be made a dynamic parameter in a more complex model involving, for example, tumor angiogenesis.

The quantity $S_n(d)$ denotes the survival probability at time $n$ for a cumulative radiation dosing regimen $d = (d_1, \dots, d_n)$, where $d_i$ is the radiation dose received on day $i$ ($d_i$ being possibly zero). Its expression is derived from our modified formulation of the linear-quadratic model (see the Supplementary Material section for explicit mathematical derivation and expression).

The meaning of the primary and secondary components of the immune system (the terms $Z_{\text{prim},n}$ and $Z_{\text{sec},n}$, respectively) is detailed in Eqs. D and E.

## Antigen dynamics

The compartment $A_n$ models the amount of tumor antigens. Antigens are released either naturally by tumor cells at a constant rate $\rho$ or after irradiation at a rate $\psi[1-S_n(d)]$, where $S_n(d)$ is the radiation survival probability as defined previously. The constant rate $\rho$ controls the intrinsic (nonradiation-induced) immunogenicity of the tumor, while the constant $\psi$ controls the radiation-induced immunogenicity. The constant parameter $\lambda \in [0,1]$ controls the rate at which these antigens disappear from the system and produce immune effector cells $I_n$.

Note that despite the use of the word antigen, the proposed model is actually agnostic about the precise biological mechanism by which radiation stimulates an immune response: As long as this stimulation is approximately proportional to the number of cells killed, the model holds and the compartment $A_n$ may describe a time delay between irradiation and immune stimulation.

## Lymphocytes (or immune effectors) dynamics

The compartment $I_n$ models the immune effectors at the tumor site: tumor-infiltrating lymphocytes (TIL), tumor-associated macrophages (TAM), etc. This compartment is fed at a constant rate $\lambda > 0$ from the compartment of the tumor antigens $A_n$ that are either produced naturally or released by irradiation. Immune effectors exit the system at a constant rate $\varphi > 0$.

The immune cells that are located in the tumor when radiation is administered are killed and this is modeled by the survival
probability $\delta_{ir}$ for which we might have used a linear-quadratic model. However, for simplicity we have assumed that no immune effector in the tumor survives the doses used in clinical practice, hence: $\delta_n = 0$ if radiation is applied at day $n$ on the tumor, $\delta_n = 1$ otherwise.

### Primary immune response

The variable $Z_{\text{prim},n}$ models the primary activity of the immune system. As its name indicates, it is our mathematical formulation of the biological concept of primary immune response to the tumor, that is, it is biologically composed of an innate and of an adaptive immune response (but this breakdown is not reflected in this model).

According to our model, the primary immune response is proportional (with the constant $\omega$) to the number of immune effectors $L_n$ multiplied by the ratio of immune effectors that are active against the tumor, defined as $1/[1+(\kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n)/(1+p_1)]$:

The constant $\kappa$ models the intrinsic ability of the tumor to downregulate the immune system. For example, it could contain the propensity of the tumor to express immunomodulatory proteins along with the propensity of immune cells to express receptors for these factors, such as PD-L1 and PD1, respectively. *Ceteris paribus*, the higher the tumor volume, the higher the amount of immunomodulatory factors produced by the tumor, hence the term $T_n^{2/3}$. The power 2/3 is used because it provided a good fit of experimental data on tumor immunogenicity; it links the amount of immunomodulatory factors to the surface of the tumor rather than its volume, which makes sense if one considers that the center of a tumor may contain necrosis and should be less infiltrated by the immune effectors. *Ceteris paribus* again, the higher the number of immune effectors infiltrated in the tumor site, the higher the amount of immunomodulatory factors produced by the tumor cells as a result of increased interactions with the immune system, hence the term $L_n$. *In fine*, the term $\kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n$ can be thought as an amount of immunomodulatory factors produced by the tumor (or by the immune effectors themselves), in response to the attack by the immune effectors, multiplied by a factor that models the affinity for their receptors.

The variable $p_1$ is the concentration of an anti-PD1 or an anti-PD-L1 immunotherapy drug, it depends from the dosing regimen and pharmacokinetics, which precise description is out of the scope of this article.

A more detailed explanation of the mathematical formulation is provided in the Supplementary Material, along with a discussion about the concurrent blockade of PD1 and PD-L1, and of the consequences of the existence of several concurrent ligands such as PD-L1 and PD-L2.

### Secondary (or memory) immune response

The variable $Z_{\text{sec},n}$ models the secondary activity of the immune system, that is, it corresponds to the biological concept of the memory response after a first encounter with a pathogen. The mechanism by which an anticancer secondary (or memory) immune response establishes itself following a primary immune response is complex and not fully understood. However, we used a small number of probable facts to base our mathematical formulation. For a comprehensive review of these mechanisms, the reader is referred to ref. 1.

The secondary response is probably mediated by auxiliary or helper T cells, or CD4⁺ T cells. The secondary response is conditional to the existence of a primary response and is a progressive

process that takes time to complete. Once it is established, the secondary response is long-lasting and relatively insensitive to downregulation by the PD1-PD-L1 axis. Because the inhibitory receptor CTLA4 is expressed mostly on CD4⁺ T cells, we decided that the effect of CTLA-4 blockade would be to inhibit solely the secondary immune response (even though this is probably a simplification). Then, we assumed that for each time step, a constant proportion $\gamma$ of the activated (or non-exhausted) effectors of the primary immune response will incrementally contribute to the secondary immune response. To secure the long-lasting memory effect, we further assumed that the intensity of the secondary response could not decrease, hence we did not use a clearance rate.

Hence, the secondary immune response follows the primary response, and its intensity is related to the cumulative effect of the primary response. Mathematically we defined the secondary response as the integral of the primary response over time; this integral is simplified into a discrete sum because of the discrete-time formalism.

The variable $\gamma$ is the propensity of the primary response to induce a secondary response per time-step. Biologically, this propensity could be related, among other things, to the number of CD4 lymphocytes (excluding the regulatory ones).

The variable $c_4$ is the concentration of an anti-CTLA4 immunotherapy drug, it depends from the dosing regimen and pharmacokinetics, that are out of the scope of this article.

The constant $r$ is chosen greater than 1. Hence, in the absence of the anti-CTLA4 drug, the propensity to induce a secondary immune response per time step is $\gamma/r < \gamma$. If an anti-CTLA4 drug is given, this propensity tends to $\gamma$ by inferior values.

The Supplementary Material contains more details on the mathematical formulation of the effect of the anti-CTLA4 agent on the secondary immune response.

## Results

### Abscalop effects and probability of metastatic rejection

Abscalop effects have been investigated for decades and there are numerous experimental data to choose from. We studied the results in ref. 9 because they provide very detailed data on the link between a tumor size and its propensity to induce an immune response.

After tumor implantation in mice, the author has quantified experimentally the development and decline of immune resistance (or abscopal effect) under the influence of the progressively growing tumor. Within the context of our model, we could replicate his findings and we correctly explain that, as the tumor grows, the percentage of tumor rejection initially increases, then reaches a plateau, ultimately followed by a rapid decline. As shown in Fig. 2, despite the simplifying assumptions of the proposed model, the theoretical tumor rejection probabilities are relatively close to the experimental data for a wide range of tumor volumes; hence, the proposed model was able to describe correctly the immunogenicity of a tumor as a function of its size. The reader is referred to the Supplementary Material section for more details on the mathematical approach that we used to derive a probability of tumor rejection from our dynamic model.

### Maintenance of a sustained response after treatment discontinuation

**Special case: no secondary immune response.** This case applies to a patient whose immune system has been so deeply depleted by
Serre et al.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 2.**</figcaption></figure>

Abscalop effects and probability of metastatic rejection. A, application of the model to describe the probability of metastasis rejection as a function of the number of days after tumor implantation. Circle dots represent percentage of rejection as published in ref. 9, showing the development and decline of immune resistance to tumor challenge under the influence of a progressively growing subcutaneous fibrosarcoma. Solid line represents percentage of rejection as per the model. B, original experimental data as published in ref. 9. We have fitted the data of percentage tumor rejection for a primary tumor left in situ (bottom curve).

disease or by chemotherapy that the remaining count of CD4⁺T cell is too low to generate any significant secondary immune response. For results on the depth and duration of CD4 lymphopenia induced by chemotherapy, see for example ref. 40. It is also well known by clinicians that the disease itself, even before chemotherapy, may cause a marked lymphopenia. In that case, Eq. E can be entirely removed since $Z_{sec,n} \approx 0$.

In this special case, tumor control cannot be maintained after treatment discontinuation and recurrence is highly expected (see Fig. 3B). According to our model, disease control for this type of patient requires theoretically a perpetual blockade of the PD1-PDL1 axis. We will see that this is not the case if a secondary immune response can be stimulated by the primary response. In

clinical practice, it is reasonable to assume that at least some residual level of secondary immune response persists, which motivates the more general model in the next section.

**General case: primary and secondary immune responses.** In the general case, disease recurrence may or may not occur after treatment discontinuation depending on its duration and the propensity to induce a secondary immune response (see Fig. 4).

In the proposed model, the concurrent blockade of CTLA4 accelerates the appearance of a long-lasting secondary response. The long-term persistence of the immune response after treatment discontinuation has been noted in several clinical trials of the blockade of the PD1-PDL1 axis, see for example ref. 41.

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 3.**</figcaption></figure>

PD1/PDL1 blockade in monotherapy. Simulated tumor mass with PD1-PDL1 blockade in monotherapy, starting on day 10 and ending on various points in time: day 40, 60, 130, 200, and 300 (solid lines); dotted line, no treatment. A, if no secondary (memory) immune response exists, disease recurrence occurs after treatment discontinuation, in all cases. B, with a secondary (memory) immune response, disease recurrence does not occur if the treatment has been maintained for 130 days or more. If immunotherapy is maintained indefinitely, the tumor volume tends towards an equilibrium value and slowly oscillates with waves of decreasing amplitudes.
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 4.**
Radiotherapy and PD1/PDL1 blockade. A, simulated PD1/PD-L1 axis blockade combined with radiotherapy (RT). Radiotherapy, 8 Gy administered as one unique dose on day 10. Immunotherapy was started on the same day and the drug serum concentration was assumed constant from day 10 to the end of the simulation; dotted line, no treatment; dash-dot, PD-L1 blockade; dashed line, radiotherapy; solid line, RT+α-PD-L1; the mathematical model was able to describe the synergy between immunotherapy and radiotherapy as reported by several authors in preclinical animal models (12, 22). B, simulation example, same setup as left except that PD1/PD-L1 blockade was started either on the day of irradiation or +10, +12, and +14 days after irradiation; in this numerical example, disease recurrence occurs if immunotherapy is started 10 days or more after irradiation; similar results have been reported with animal models (22) and this shows that our mathematical model correctly describes the impact of synchronization between radiotherapy and the blockade of the PD1/PD-L1 axis. C, simulated Kaplan-Meier survival curves of the above examples; solid line, no treatment; solid line and circle marks, α-PD-L1; dotted line and circle marks, radiotherapy; double dots and cross marks, RT+α-PD-L1 starting 14 days after radiotherapy; large dots and cross marks, RT+α-PD-L1 starting 10 days after radiotherapy; solid line and cross marks, RT+α-PD-L1 starting on the same day. Details on the production of the Kaplan-Meier curves are provided in the text.</figcaption></figure>

Synergy of radiotherapy and immunotherapy

**Radiotherapy and PD-L1 blockade.** Our model explains the synergistic effects of immunotherapy in combination with radiotherapy. In Fig. 4, we provide a numerical example inspired from various recent publications, such as ref. 12 or 22; this result shows that the model explains why combined treatment can result in sustained remission, whereas radiotherapy or immunotherapy alone only provide a temporary relief followed by recurrence.

**Synchronization of radiotherapy and PD1-PDL1 blockade.** As shown experimentally in ref. 22, the model predicts that radiotherapy and PD1 or PD-L1 blockade should have sufficient synchronization for a significant synergistic effect to exist. In the proposed model, the

rationale for synchronization relies on the finite quantity of tumor
antigens released by irradiation, and the finite lifetime of immune
effectors. As time after radiation passes, the quantity of antigens and
the immune effectors both decrease and after a while, this reduces
the efficacy of immunotherapy that does not produce a substantial
synergistic effect (Fig. 4). However, in clinical practice, the concom-
itant administration of several treatments may result in increased
toxicity and adverse events; therefore, more analysis is necessary to
derive optimized dosing schedules that are both efficient and have
an acceptable tolerability profile.

**Radiotherapy and concurrent PD1 and CTLA4 blockades.** Results published recently in ref. 14 provide many experimental data
Serre et al.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 5.**</figcaption></figure>

Radiotherapy and concurrent PD1/PDL1 and CTLA4 blockades. Simulated Kaplan-Meier survival curves of blockade of PD1/PD-L1 axis and/or CTLA4 with or without radiotherapy (RT), inspired from the experimental results reported in ref. 14; solid line and circle marks, RT+α-PD-L1+α-CTLA4; solid line and cross mark, RT+α-PD-L1; dotted line and square mark, RT+α-CTLA4; dash-dot line and circle mark, α-PD-L1+α-CTLA4; solid line, no treatment; unique radiation dose on day 10, immunotherapies started on day 10, and drug serum concentrations assumed to be constant from that day on. A, the mathematical tumor model was adjusted to yield similar long-term survival rates than those reported in ref. 14, while the long-term survival rate of the tri-therapy RT+α-PD-L1+α-CTLA4 was about 80%, there was <5% long-term survival if irradiation was not used, even with a dual immune blockade α-PD-L1+α-CTLA4, as reported in ref. 14. B, simulated Kaplan-Meier survival curves using a less aggressive tumor, keeping the other parameters identical [E(μ) = 0.108 in B vs. E(μ) = 0.135 in A, where E(X) stands for the expectation of the random variable X] with this smaller tumor growth rate, the long-term survival rate of the dual immune blockade α-PD-L1+α-CTLA4 was increased to approximately 50%; however, the model predicts that RT+α-PD-L1 and RT+α-CTLA4 should significantly overperform the dual blockade with a long-term survival rate >80%. Numerical parameters are given in the Supplementary Material.

on radiotherapy with the concurrent blockades of the PD1-PDL1 axis and/or the CTLA4 pathway. These works explore the abscopal immune effect of radiotherapy if only a fraction of the total tumor burden is irradiated, and how this immune effect may be magnified by blockades of checkpoint inhibitors. A numerical example directly inspired from their results is provided (Fig. 5, left), along with a theoretical simulation with a less aggressive tumor (with a longer doubling time, all other parameters being identical: Fig. 5, right).

The model was able to produce survival curves similar to those produced experimentally by these authors, hence showing that it is capable of modeling the synergy between radiotherapy and PD1/PD-L1 or CTLA4 blockades. The simulated example with the (theoretically) less aggressive tumor shows how the model can be used to compare different modalities while assuming various hypotheses about the underlying tumor.

The Kaplan-Meier survival curves have been produced numerically by assuming (i) that the death automatically results from the tumor mass exceeding a fixed threshold (set to 10 times the mass on day 1), and (ii) that the tumor growth rate is a random variable with a log-normal probability density function[whose SD has been set such that 95% of the tumors have a growth rate μ within (80%-120%) of the peak value]. Despite these simplifications, the model adequately describes the experimental survival curves. The possibility to simulate mathematically the Kaplan-Meier curves is both practical and intuitive for most clinicians.

## Discussion

For decades, improving cancer therapy has been achieved by trial-and-error practices. Most phase III registration studies or multicentric clinical trials calling for a change in practice have been designed on empirical basis. In some cases, such empirical designs have led to approving new drugs with suboptimal dosing

(for instance, sunitinib as a single agent has been a major breakthrough for treating renal carcinoma, but it took years of bedside practice to learn that the official dosing was probably not the optimal one; ref. 42). Defining optimal modalities of treatment turns to be even more complicated when several strategies or multitherapies are to be combined. Today, the ever-growing complexity of cancer biology and the plethora of new agents being regularly approved makes determination of optimal dosing and scheduling a challenging task that cannot be addressed anymore by empirical approaches. Consequently, developing computational-aided strategies to better design combined therapies is attractive, because *in silico* simulation can help to test numerous modalities in a time and cost-effective fashion.

The recent achievements in the field of cancer immunotherapy have been recognized as a major breakthrough. However, despite very encouraging results, improvements of the response rates and survival are still needed because many patients will fail in maintaining sustained clinical benefit. In this respect, association of immune checkpoint inhibitors with other strategies (e.g., chemo-therapy, radiotherapy) is a promising perspective, as the most striking past improvements in cancer therapy have been achieved thanks to the combination of a variety of strategies. Indeed, it is widely acknowledged now that beating cancer will not come from a single miraculous agent, but rather from the rational combination of a number of complementary strategies that could be chosen from various types of immunotherapy, radiotherapy protocols, antiangiogenic agents, targeted therapies, and different chemotherapy regimen. Ideally the dosing, duration, and relative scheduling of the different components should be optimized by taking into account the potential synergies as well as the possible antagonisms and toxicities. Given the countless possibilities of combinational therapy and the critical challenge of picturing all the interactions between complex and intricate pharmacologic processes, we believe that an integrated mathematical model
could be of great help to optimize these combinations in silico prior to test them in patients. In addition, such a mathematical model could help to choose strategies that are both medically and economically justified because they are the most likely to eventually yield clinical benefit.

For the first time (to our knowledge), our study introduces such a model that integrates radiotherapy combined with two important types of immunotherapy: the blockades of the PD1-PDL1 axis and of the CTLA4 pathway. This model has been designed to rely on a limited number of parameters that have a biological relevance (if not an exact biological equivalent) and it can be calibrated on experimental data. The mathematical complexity has been purposely kept to a minimum by the use of a small number of discrete-time equations. Indeed, we do believe that phenomenologic modeling will be more easily transposed to routine clinical practice than bottom-up, systems biology approaches (43).

The scientific relevance of the proposed model could be checked by its ability to explain and to reproduce *in silico* a number of experimental results, from decades-old data describing the link between tumor immunogenicity and its volume, to recent and cutting-edge results on the combination between different types of immunotherapy and radiotherapy protocols. Also, the model has a certain degree of robustness with respect to biological hypotheses because the complexity of the immune system has been summarized as an interaction between antigens and a compartment of immune effectors. Though this simplification does not capture all the complexity of the interplay between the many actors of the innate and the acquired immune response, its low level of granularity is sufficient to model the effect of PD-L1 or CTLA4 blockades. The practical interest of this model relies on its capacity to compare the outcome of different strategies and to allow optimizing dosing regimen *in silico*. For example, if the disease is deemed so aggressive that it mandates the use of very risky strategies that might result in poor tolerance or even death by treatment, such an integrated model can be of tremendous help to (i) quantify and justify the benefit-risk ratio of such an option with respect to other less risky strategies, and (ii) optimize the aggressive strategy to minimize its associated risks while preserving the chances of success.

## Conclusion and perspectives

The mathematical model presented can describe several experimental results on the combination between radiotherapy and immune checkpoint inhibitors targeting the PD1-PD-L1 axis and the CTLA4 pathway. Beyond the intellectual interest of achieving a mathematical description of experimental results, this model could have a practical interest by predicting the clinical outcome

of new combination of anticancer therapies and to test different scenario. In that respect, the ability to simulate Kaplan-Meier curves is a practical and intuitive way to compare different designs *in silico*, whereas the search of optimized protocols could be partially automated by using mathematical tools.

Future works will focus on the integration of such mathematical tools into clinical practice, and will therefore explore how to manage drug and radiation-induced toxicities in the optimization process. Dose-effect relationships will be investigated and a pharmacokinetic model will be integrated to better describe the relation between the experimental results and the actual dosing protocols. The combination with other therapeutic modalities such as metronomic chemotherapy or targeted agents (such as antiangiogenics) will also be the subject of future research.

## Disclosure of Potential Conflicts of Interest

J. Ciccolini is a consultant/advisory board for Celgene, Roche, Pierre Fabre, F. Barlesi is a consultant/advisory board member for BMS, Roche/Genentech, Astra-Zeneca. No potential conflicts of interest were disclosed by the other authors.

## Authors' Contributions

**Conception and design:** R. Serre, N. André, X. Muracciole, D. Barbolosi
**Development of methodology:** R. Serre, C. Meille, N. André, F. Barlesi, D. Barbolosi

**Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.):** R. Serre, I. Padovani, X. Muracciole, D. Barbolosi
**Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis):** R. Serre, I. Padovani, N. André, F. Barlesi, D. Barbolosi

**Writing, review, and/or revision of the manuscript:** R. Serre, S. Benzekry, C. Meille, N. André, J. Ciccolini, F. Barlesi, X. Muracciole, D. Barbolosi

**Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases):** R. Serre, J. Ciccolini, D. Barbolosi

**Study supervision:** R. Serre, X. Muracciole, D. Barbolosi

## Acknowledgments

The authors thank the Ligue Contre le Cancer de Corse du Sud for its support.

## Grant Support

This work was partly supported by the A'MIDEX Mars Project Funding. This study was supported by a public grant from the French State, managed by the French National Research Agency (ANR) in the frame of the "Investments for the future" Program IdEx Bordeaux - CPLI (ANR-10-IDEX-03-02).

The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked *advertisement* in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

Received January 14, 2016; revised May 3, 2016; accepted May 25, 2016; published OnlineFirst June 14, 2016.

## References

1. Topalian SL, Drake CG, Pardoll DM. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell 2015; 27:450-61.

2. Derer A, Deloch L, Rubner Y, Fietkau R, Frey B, Gaipl US. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses—pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol 2015;6:505.

3. Eriksson D, Stigbrand T. Radiation-induced cell death mechanisms. Tumor Biol 2010;31:363-72.

4. Tubiana M, Dutreix J, Wambersie A. Radiobiologie. Paris, France:Hermann; 1986.

5. Barendsen G. Dose fractionation, dose rate and iso-effect relationships for normal tissue responses. Int J Radiat Oncol Biol Phys 1982;8: 1981-97.

6. Dale RG. The application of the linear-quadratic dose-effect equation to fractionated and protracted radiotherapy. Br J Radiol 1985;58:515-28.

7. Fowler JF. The linear-quadratic formula and progress in fractionated radiotherapy. Br J Radiol 1989;62:679-94.

8. Dunn GP, Old LJ, Schreiber RD. The three Es of cancer immunoediting. Annu Rev Immunol 2004;22:329-60.

9. Vaage J. Influence of tumor antigen on maintenance versus depression of tumor-specific immunity. Cancer Res 1973;33:493-503.
Serre et al.

10. Deckers PJ, Davis RC, Parker GA, Mannick JA. The effect of tumor size on concomitant tumor immunity. Cancer Res 1973;33:33-9.

11. Berendt MJ, North RJ. T-cell-mediated suppression of anti-tumor immunity: an explanation for progressive growth of an immunogenic tumor. J Exp Med 1980;151:69-80.

12. Deng L, Liang H, Burnette B, Beckett M, Danga T, Weichselbaum RR, et al. Irradiation and anti-pd-11 treatment synergistically promote antitumor immunity in mice. J Exp Med 2014;124:687.

13. Formenti SC, Demaria S. Combining radiotherapy and cancer immunotherapy: a paradigm shift. J Natl Cancer Inst 2013;105:256-65.

14. Twyman-Saint Victor C, Rech AJ, Maity A, Rengan R, Pauken KE, Stelekati F, et al. Radiation and dual checkpoint blockade activate non-redundant immune mechanisms in cancer. Nature 2015;520:373-7.

15. Golden EB, Chhabra A, Chachoua A, Adams S, Donach M, Fenton-Kerimian M, et al. Local radiotherapy and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor to generate abscopal responses in patients with metastatic solid tumours: a proof-of-principle trial. Lancet Oncol 2015;16:795-803.

16. Lee Y, Ahn SL, Wang Y, Burnette B, Wang Y, Meng Y, et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require cd8⁺ cells: changing strategies for cancer treatment. Blood 2009;114:589-95.

17. Schaeu D, Comin-Anduix B, Ribas A, Zhang L, Goodglick I, Sayre JW, et al. T-cell responses to survivin in cancer patients undergoing radiation therapy. Clin Cancer Res 2008;14:4883-90.

18. Wattenberg MM, Fahim A, Ahmed MM, Hodge JW. Unlocking the combination potentiation of radiation-induced antitumor responses with immunotherapy. Radiat Res 2014;182:126-38.

19. Wattenberg MM, Kwilas A, Gameiro S, Dicker A, Hodge J. Expanding the use of monoclonal antibody therapy of cancer by using ionising radiation to upregulate antibody targets. Br J Cancer 2014;110:1472-80.

20. Barcellos-Hoff M, Derynck R, Tsang M, Weatherbee J. Transforming growth factor-beta activation in irradiated murine mammary gland. J Clin Invest 1994;93:892.

21. Wrzesinski SH, Wan YY, Flavell RA. Transforming growth factor-β and the immune response: implications for anticancer therapy. Clin Cancer Res 2007;13:5262-70.

22. Dovedi SJ, Adlard AL, Lipowska-Bhalla G, McKenna C, Jones S, Cheadle EJ, et al. Acquired resistance to fractionated radiotherapy can be overcome by concurrent pd-11 blockade. Cancer Res 2014;74:5458-68.

23. Rosen EM, Fan S, Rockwell S, Goldberg ID. The molecular and cellular basis of radiosensitivity: implications for understanding how normal tissues and tumors respond to therapeutic radiation. Cancer Invest 1999;17:56-72.

24. Dewan MZ, Galloway AE, Kawashima N, Dewyngaert JK, Babb JS, Formenti SC, et al. Fractionated but not single-dose radiotherapy induces an immune-mediated abscopal effect when combined with anti-cta4 antibody. Clin Cancer Res 2009;15:5379-88.

25. Hiniker SM, Chen DS, Reddy S, Chang DT, Jones JC, Mollick IA, et al. A systemic complete response of metastatic melanoma to local radiation and immunotherapy. Translat Oncol 2012;5:404-7.

26. Postow MA, Callahan MK, Barker CA, Yamada Y, Yuan J, Kitano S, et al. Immunologic correlates of the abscopal effect in a patient with melanoma. N Engl J Med 2012;366:925-31.

27. Golden EB, Demaria S, Schiff PB, Chachoua A, Formenti SC. An abscopal response to radiation and ipilimumab in a patient with metastatic non-small cell lung cancer. Cancer Immunol Res 2013;1:365-72.

28. Dubben H-H, Thames HD, Beck-Bornholdt H-P. Tumor volume: a basic and specific response predictor in radiotherapy. Radiother Oncol 1998;47:167-74.

29. Alexander BM, Othus M, Caglar HB, Allen AM. Tumor volume is a prognostic factor in non-small cell lung cancer treated with chemoradiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2011;79:1381-7.

30. Werner-Wasik M, Swann RS, Bradley J, Graham M, Emami B, Purdy J, et al. Increasing tumor volume is predictive of poor overall and progression-free survival: secondary analysis of the radiation therapy oncology group 93-11 phase i-ii radiation dose-escalation study in patients with inoperable non-small cell lung cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2008;70:385-90.

31. Soliman M, Yaromina A, Appold S, Zips D, Reiffenstuhl C, Schreiber A, et al. Gtv differentially impacts locoregional control of non-small cell lung cancer (nsclc) after different fractionation schedules: subgroup analysis of the prospective randomized chartwel trial. Radiother Oncol 2013;106:299-304.

32. Segal N, Hamid O, Hwu W, Massard C, Butler M, Antonia S, et al. A phase I multi-arm dose-expansion study of the anti-programmed cell death-ligand-1 (pd-11) antibody medi4736: preliminary data. in Ann Oncol 2014;25(Suppl_4):iv365.

33. Reits EA, Hodge JW, Herberts CA, Groothuis TA, Chakraborty M, Wansley EK, et al. Radiation modulates the peptide repertoire, enhances mhc class i expression, and induces successful antitumor immunotherapy. J Exp Med 2006;203:1259-71.

34. Hagemann T, Balkwill F, Lawrence T. Inflammation and cancer: a double-edged sword. Cancer Cell 2007;12:300-1.

35. Ohshima Y, Tsukimoto M, Takenouchi T, Harada H, Suzuki A, Sato M, et al. γ-irradiation induces p2x7 receptor-dependent atp release from b16 melanoma cells. Biochim Biophys Acta 2010;1800:40-6.

36. Tang C, Wang X, Soh H, Seyedin S, Cortez MA, Krishnan S, et al. Combining radiation and immunotherapy: a new systemic. Cancer Immunol Res 2014;2:831-8.

37. Filatenkov A, Baker J, Mueller A, Kenkel JA, Ahn G-o, Dutt S, et al. Ablative tumor radiation can change the tumor immune cell microenvironment to induce durable complete remissions. Clin Cancer Res 2015;28:284.

38. Fowler JF. The phantom of tumor treatment-continually rapid proliferation unmasked. Radiother Oncol 1991;22:156-8.

39. Benzekry S, Lamont C, Beheshti A, Hlatky L, Hahnfeldt P. Classical mathematical models for description and forecast of preclinical tumor growth. PLoS Comput Biol 2014;10:e1003800.

40. Mackall CI, Fleisher TA, Brown MR, Andrich MP, Chen CC, Feuerstein IM, et al. Age, thymopoiesis, and cd4⁺ t-lymphocyte regeneration after intensive chemotherapy. N Engl J Med 1995;332:143-9.

41. Topalian SL, Sznol M, McDermott DF, Kluger HM, Carvajal RD, Sharfman WH, et al. Survival, durable tumor remission, and long-term safety in patients with advanced melanoma receiving nivolumab. J Clin Oncol 2014;32:1020-30.

42. Kalra S, Rini B, Jonasch E. Alternate sunitinib schedules in patients with metastatic renal cell carcinoma. Ann Oncol 2015;26:1300-4.

43. Barbolosi D, Ciccolini J, Lacarelle B, Barlesi F, André N. Computational oncology - mathematical modelling of drug regimens for precision medicine. Nat Rev Clin Oncol 2016;13:242-54.
Cancer Research

The Journal of Cancer Research (1916-1930) | The American Journal of Cancer (1931-1940)

Mathematical Modeling of Cancer Immunotherapy and Its Synergy
with Radiotherapy

Raphael Serre, Sebastien Benzekry, Laetitia Padovani, et al.

*Cancer Res* 2016;76:4931-4940. Published OnlineFirst June 14, 2016.

**Updated version** Access the most recent version of this article at:
doi:10.1158/0008-5472.CAN-15-3567

**Supplementary Material** Access the most recent supplemental material at:
http://cancerres.aacrjournals.org/content/suppl/2016/09/07/0008-5472.CAN-15-3567.DC1

**Cited articles** This article cites 41 articles, 14 of which you can access for free at:
http://cancerres.aacrjournals.org/content/76/17/4931.full#ref-list-1

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Premier article: données supplémentaires

Ces données supplémentaires relatives à l'article reproduit plus haut apparaissent telles qu'elles ont été publiées: elles sont rédigées en anglais.

Aggregated survival probability to irradiation

According to the linear-quadratic model the survival probability of one cancer cell to a dose of d Gy of radiation is given by [1, 2, 3]:

$$
P(d) = \exp(- \alpha \cdot d - \beta \cdot d^2)
$$

where α and β are the constants of the linear-quadratic model (constant, positive
real values). This is not supposed to model an *instantaneous* cell death: the original
linear-quadratic model is used on relatively larger time scales (spanning months or
years) than the time scale in this article (spanning days or weeks).

However, in a dynamic tumor volume model, a *delay* exists between the time of *irradiation* and the time of *death* of the tumor cell and this delay is long enough for the cell to undergo a small number of mitosis during which the tumor size may continue to grow [4]. Another reason for the tumor growing in *size* but not in *number* of tumor cells, is the inflammatory process provoked by irradiation and the resulting translocation of immune effector cells inside the tumor microenvironment. Even though this effect has not been modeled here, it could be included by adding a certain proportion of the compartment $L_n$ to the tumor volume. Therefore the linear-quadratic model was modified to distribute, or spread, the death of the tumor cells over a certain time span, by defining *daily weights*: $w_0, w_1, w_2...$ whose sum is equal to 1, and by defining the survival probability $k$ days after receiving a radiation dose of $d$ Gy as:

$$
P_k(d) = \exp\left((-\alpha \cdot d - \beta \cdot d^2) \cdot W_k\right)
$$

Where $W_k = \sum_{j=0}^{k} w_j$ is the partial sum of the daily weights up to day $k$.

Asymptotically, for sufficiently large values of *k*, $W_k = 1$ (by definition of the daily weights) and the survival probability equals that of the linear-quadratic model, which is the expected property.

Hence, for a given dose regimen $d = (d_1, \dots, d_n)$ on days $(1, \dots, n)$, the survival probability at time $n$ is then given by

$$
S_n(d) = \prod_{k=1}^{n-1} P_{n-k}(d_k)
$$
The daily weights have been defined by using a log-normal density probability function (which ensures that they have positive values, that their sum always equals 1, and creates a bell-shaped probability of occurrence of death as a function of time). The short-term variation of the simulated tumor mass obtained with that assumption could be made close to published experimental data of tumor volume after irradiation, such as those in [4], by adjusting the mean and standard deviation of the log-normal probability density function. All simulations used a mean of 5 days and a standard deviation of 1.5 days, i.e. 95% of the killed cells died between 2 and 8 days after irradiation. If longer experimental time scales had been used, this modification of the linear-quadratic model would have been unnecessary and its original equations would have been used.

Of course, the linear-quadratic model is not the only one that could be used, especially if large doses are administered (typically, in excess of 6 to 8 Gy), because of its tendency to over predict the number of cells killed. A mathematically simple modification of the linear-quadratic model could be a switch to a linear model for doses above a certain level, as in [5]. For a comprehensive review of several possible models, see for example [4].

## *How to compute a probability of tumor rejection*

This section describes how to transform the activity of the immune system against the primary tumor site into a probability of tumor rejection at a distant metastatic site, as in Figure 2, to describe the results published in [6]. Since the primary tumor volume increases at a quasi-constant rate $\mu_p$, it follows that the activity of the immune system against the primary tumor site must be smaller than $\mu_p$, since in the proposed model immunological attack is the only cause of cell loss (in the absence of irradiation). What is the probability of the immune system rejecting a hypothetical metastase? Since it is well known that human metastases have shorter doubling times than their primary tumor [7], which isn't controlled by the immune system, one could object that this probability has to be zero. However, this is not what happens experimentally. To explain this, it was hypothesized that *synthetic metastases*, that are implanted by the experimentator in predefined locations of the animal, do not benefit from the *unusually favorable milieu into which secondary tumors tend to be seeded*, as cited in [8].

It was therefore assumed that the initial growth rate of an *experimental* metastatic site $\mu_M$ can be considered smaller than $\mu_p$. For simplicity, it was also assumed that the immune system activity on the metastatic site is equal to $Z_n$. It follows that metastatic sites may be rejected if $\mu_M < Z_n$. Since metastatic sites have a certain degree of randomness in their initial properties (such as volume, localisation, interaction with their host animal...), their growth rate was assumed to follow a log-normal distribution of mean $\ln(\mu_M)$ and standard deviation $S$.
Hence, if a metastatic site is implanted on a mice N days after the implantation of the primary tumor, its rejection occurs if $\mu_M < Z_{prm,N} + Z_{sec,N'}$, where $\mu_M$ is a random variable and $Z_{prm,N} + Z_{sec,N'}$ is given, and this event has a probability:

$$P(N) = \int_{-\infty}^{\ln(Z_{prm,N}+Z_{sec,N})} f(x) dx$$

Where f is a Gaussian density: $f(x) = \frac{1}{S\sqrt{2\pi}} \exp\left(-\frac{(x-\ln(\mu_M))^2}{2S^2}\right)$. This formula has been used to transform $Z_N$, the activity of the immune system at the primary tumor site on day N, into a probability of tumor rejection.

### Model parameters: numerical values and definitions

The table 1 contains numerical values for the parameters that were used to produce the figures provided in this paper. When a parameter is not necessary to produce a result, its value is marked as NA (for example, in experiments that do not use radiation, no value for $\alpha$ or $\beta$ are provided, etc.). Drug concentrations are given in arbitrary units since this is a pure PD model; actual concentration units could be used at a later stage if a PK model is added.
The table 2 summarizes the model parameters and give their unit (when applicable).

<table><caption>Table 1: Values of parameters used in the model.</caption><thead><tr><th>Parameter</th><th>Figure 2</th><th>Figure 3</th><th>Figure 4</th><th>Figure 5</th></tr></thead><tbody><tr><td>α</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.05</td><td>0.05</td></tr><tr><td>β</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.005</td><td>0.005</td></tr><tr><td>p<sub>1</sub></td><td>NA</td><td>1.8</td><td>2</td><td>0.441</td></tr><tr><td>c<sub>4</sub></td><td>NA</td><td>0</td><td>0</td><td>150</td></tr><tr><td>ρ</td><td>0.5</td><td>0.5</td><td>0.1</td><td>0.1</td></tr><tr><td>ψ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20</td><td>20</td></tr><tr><td>μ</td><td>0.14</td><td>0.14</td><td>0.14</td><td>0.135 or 0.108</td></tr><tr><td>ω</td><td>0.007</td><td>0.007</td><td>0.007</td><td>0.007</td></tr><tr><td>γ</td><td>0.128</td><td>0 or 0.009</td><td>0.0314</td><td>0.0314</td></tr><tr><td>r</td><td>5</td><td>5</td><td>5</td><td>5</td></tr><tr><td>κ</td><td>0.01</td><td>0.01</td><td>0.01</td><td>0.01</td></tr><tr><td>λ</td><td>0.15</td><td>0.15</td><td>0.15</td><td>0.15</td></tr><tr><td>φ</td><td>0.1</td><td>0.1</td><td>0.1</td><td>0.1</td></tr></tbody></table>

NA: Not Applicable, or (equivalently) set to zero.
<table><caption>Table 2: Definitions of parameters and variables used in the model.</caption><thead><tr><th>Parameter</th><th>Description</th><th>Unit</th></tr></thead><tbody><tr><td>α</td><td>linear radiosensitivity of tumor cells</td><td>Gy<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>β</td><td>quadratic radiosensitivity of tumor cells</td><td>Gy<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>p<sub>1</sub></td><td>concentration of immunotherapy treatment (PD1-PD-L1 axis)</td><td>none<sup>*</sup></td></tr><tr><td>c<sub>4</sub></td><td>concentration of immunotherapy treatment (CTLA4 pathway)</td><td>none<sup>*</sup></td></tr><tr><td>ρ</td><td>natural daily rate of production of tumor antigens</td><td>none</td></tr><tr><td>ψ</td><td>daily rate of production of tumor antigens by radiation-killed tumor cells</td><td>none</td></tr><tr><td>μ</td><td>daily growth rate of the tumor</td><td>none</td></tr><tr><td>ω</td><td>sensitivity of the primary immune response to immune effectors</td><td>none</td></tr><tr><td>γ</td><td>max value of the propensity of the primary response to induce a secondary response</td><td>none</td></tr><tr><td>γ/r</td><td>min value of the propensity of the primary response to induce a secondary response</td><td>none</td></tr><tr><td>κ</td><td>sensitivity of the primary immune response to tumor down-regulation</td><td>none</td></tr><tr><td>λ</td><td>daily transformation of tumor antigens into immune effectors</td><td>none</td></tr><tr><td>φ</td><td>daily wash-out of the immune effectors</td><td>none</td></tr><tr><th>Variable</th><th>Description</th><th>Unit</th></tr><tr><td>T<sub>n</sub></td><td>tumor mass</td><td>g</td></tr><tr><td>A<sub>n</sub></td><td>tumor antigens</td><td>none</td></tr><tr><td>L<sub>n</sub></td><td>immune effectors</td><td>none</td></tr><tr><td>Z<sub>prim,n</sub></td><td>activity of the primary immune response</td><td>none</td></tr><tr><td>Z<sub>sec,n</sub></td><td>activity of the secondary immune response</td><td>none</td></tr><tr><td>S<sub>n</sub></td><td>ratio of tumor cells that survive on day n + 1 to irradiation received up to day n</td><td>none</td></tr></tbody></table>

Discussion on the mathematical formulation of Equation 4

<footnote>*: concentrations have been left without unit because this is a pure PD model, but actual concentrations units would be used if a PK model was added.</footnote>
Let us imagine a chemical reaction by which these $κ \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n$ immunomodulatory factors combine with $L_n$ immune effectors to produce exhausted or deactivated effectors that have lost their anti-tumor activity. As a first approximation, it seems reasonable to assume that the law of Guldberg and Waage holds for this chemical equilibrium, i.e, if $x$ denotes the fraction of free, or active immune effectors, there exists a constant $K_1$ such as:

$$ \frac{(1-x) \cdot L_n}{x \cdot L_n \cdot \kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n} = K_1 $$

it follows that the proportion $x$ of active immune effectors is:

$$ x = \frac{1}{1 + K_1 \cdot \kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n} $$

If we include the constant $K_1$ inside $κ$, we obtain Equation 4 for $p_1 = 0$.

Let us now assume that an immunotherapy drug in concentration $p_1$ binds to these immunomodulatory factors and inactivate them. This drug is either an anti-PD1 or anti-PD-L1 monoclonal antibody, depending of the context. For an anti-PD-L1, the fraction of free immunomodulatory factors is $\frac{1}{1+K_2 \cdot p_1}$, where $K_2$ is the constant from the law of Guldberg and Waage. Without loss of generality, we can include $K_2$ inside $p_1$ and we obtain Equation 4 with a concentration $p_1$ of an anti-PD-L1 drug. Symetrically, for an anti-PD1 drug, the same reasoning holds if we assume that $κ$ is proportionnal to the fraction of free PD1 receptors, since $κ$ contains the above described constant $K_1$ which describes the affinity between immunomodulatory factors and their receptors on the immune effectors. Hence, with an anti-PD1 drug, $κ$ has to decreases in proportion with the number of free receptors and must be replaced by $κ/(1 + K_3 \cdot p_1)$, where $K_3$ is again another equilibrium constant. This allows us to derive the same mathematical formulation for an anti-PD1 and for an anti-PD-L1 drug.

### Concurrent blockade of PD1 and PDL1

Though this concurrent blockade is relatively less synergistic it may be considered sometimes and we provide here a formula derived from the previous discussion. If $p_1$ and $p_2$ are the concentrations of the drugs, Equation 4 becomes:

$$ Z_n^{\text{prm}} = \frac{\omega \cdot L_n}{1 + \frac{\kappa \cdot T_n^{2/3} \cdot L_n}{(1+p_1)(1+p_2)}} $$
Where as already discussed, equilibrium constants K1 and K2 have been included in $p_1$ and $p_2$.

Modelling of redundant immunomodulatory factors: the example of PD-L1 and PD-L2

Since it is known that PD-L2 is another ligand of PD-1, with similar immunomodulatory properties [9], it is reasonable to question the validity of Equation 4 in the context of more than one immunomodulatory factor. For this question to be relevant, we must assume that the anti-PD-L1 drug in concentration $p_1$ has a different affinity for the ligand PD-L2. For both simplicity and conservatism, we assume that the anti-PD-L1 drug does not bind at all to PD-L2.

The quantity of immunomodulatory factors produced by the tumor is now the sum of the quantities of PD-L1 and PD-L2 ligands:

$$ \kappa T^{2/3} L = (\kappa_1 + \kappa_2) T^{2/3} L $$

Let $x$ be the ratio of free or active immune effectors, that do not bind to neither PD-L1 nor PD-L2, let $x_1$ be the proportion of inactive immune effectors that bind to PD-L1 and let $x_2$ be the proportion of inactive immune effectors that bind to PD-L2. Let us assume that the chemical equilibrium for each reaction is governed by the law of Guldberg and Waage whose $K_1$ and $K_2$ are the associated constants. We can write:

$$ x + x_1 + x_2 = 1 $$

$$ \frac{x_1 \cdot L}{x \cdot L \cdot \kappa_1 T^{2/3} L} = K_1 $$

$$ \frac{x_2 \cdot L}{x \cdot L \cdot \kappa_2 T^{2/3} L} = K_2 $$

We can solve directly the ratio of active effectors:

$$ x = \frac{1}{1 + (\kappa_1 K_1 + \kappa_2 K_2) T^{2/3} L} $$

Which proves that the general form of Equation 4 is still valid if one adds PD-L2. By recurrence, Equation 4 is valid for any number of ligands that would have a similar mechanism of action than PD-L1.

If, as previously assumed, the immunotherapy drug in concentration $p_1$ binds specifically to PD-L1 and has zero affinity for PD-L2, by the same reasoning, the ratio of free PD-L1 is $\frac{1}{1+K_3 p_1}$, where $K_3$ is again a constant of chemical equilibrium, that we can integrate inside $p_1$ and we can rewrite $x$:
$$x = \frac{1}{1 + \left( \frac{\kappa_1 K_1}{1+p_1} + \kappa_2 K_2 \right) T^{2/3} L}$$

In summary, to take into account the existence of more immunomodulatory factors with a similar mechanism than PD-L1, such as PD-L2, it suffices to rewrite Equation 4 as:

$$Z_{\text{prim},n} = \frac{\omega L_n}{1 + \left( \kappa_0 + \frac{\kappa_1}{1+p_1} \right) T_n^{2/3} L_n}$$

Where $\kappa_0 > 0$ is a new constant.

### Discussion on the mathematical formulation of Equation 5

This section explains the rationale for the term $\frac{1+c_4}{r+c_4}$. Let APC denote the number of Antigen Presenting Cells and let $Th$ be the number of CD4+ T cells. We assume that all Antigen Presenting Cells considered here are loaded with tumor antigens, that they present to $Th$ cells. There are three possibilities:

* APC can engage the inhibitory CTLA4 receptor of a CD4+ T cell, with an affinity $K^-$, which yields a deactivated CD4+ T cell, whose proportion is denoted by $Th^-$

* APC can engage the CD28 co-stimulatory receptor of CD4+ T cell, with an affinity $K^+$, which yields an activated CD4+ T cell, whose proportion is denoted by $Th^+$

* APC may not interact with any CD4+ T cells, and the proportion of these free T cells is denoted by $Th^0$

Note that the affinity of APC is greater for the inhibitory CTLA4 than for the co-stimulatory CD28 ($K^- > K^+$), which explains that the activation of CD4+ T cells requires that the antigenic stimulation exceeds some threshold before triggering the CD4 response; this is maybe a stabilizing mechanism of the immune response that helps inhibiting auto-immunity. If one assumes that a chemical equilibrium holds and that the law of Guldberg and Waage gives a good approximation of it, we can write that:

$$Th^0 + Th^+ + Th^- = 1$$

$$APC \times Th^0 \times K^+ = Th^+$$

$$APC \times Th^0 \times K^- = Th^-$$

Hence:

$$Th^+ = \frac{1 - Th^0}{1 + K^- / K^+}$$
Now, if one assumes that an anti-CTLA4 agent in concentration $c_4$ binds to the CTLA4 receptors and hides them from the APC, then the affinity $K^-$ is expected to decrease along with the number of free CTLA4 receptors. Assuming again that a chemical equilibrium holds for this reaction, one can replace $K^-$ by $K^-/(1 + K \cdot c_4)$ where K is the constant of this equilibrium. Then, the new proportion of activated CD4+ T cells become:

$$Th^+ = \frac{(1-Th^0)(1+K \cdot c_4)}{1+K^-/K^+ + K \cdot c_4}$$

Which proves the general form of Equation 5 if we include the constant of equilibrium K in the concentration $c_4$. Since $K^-/K^+ > 1$, this also proves that the constant r in Equation 5 is greater than 2. Also, the larger the ratio $K^-/K^+$ between the affinity of APC for inhibitory and co-stimulatory receptors, the bigger the necessary concentration of anti-CTLA4 to activate a significant proportion of CD4+ T cells. Hence the greater this concentration, the greater the risk of unwanted activation of CD4+ T cell specific antigens that are totally unrelated to the tumor, for example auto-antigens, and the bigger the risk of auto-immune disease.

One could object that $Th^0$, the proportion of free CD4+ T cells is unlikely to be constant over time. For simplicity, it was nevertheless assumed. Another reason could be that $1 - Th^0 \approx 1$: if the antigenic stimulation is large enough, APC could engage almost all CD4+ T cells and the vast majority of them should be either in the activated or in the inhibited state.

### Références bibliographiques pour les données supplémentaires

[1] G. Barendsen, "Dose fractionation, dose rate and iso-effect relationships for normal tissue responses," International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics, vol. 8, no. 11, pp. 1981-1997, 1982.

[2] R. G. Dale, "The application of the linear-quadratic dose-effect equation to fractionated and protracted radiotherapy," The British journal of radiology, vol. 58, no. 690, pp. 515-528, 1985.

[3] J. F. Fowler, "The linear-quadratic formula and progress in fractionated radiotherapy," The British journal of radiology, vol. 62, no. 740, pp. 679-694, 1989.

[4] M. Tubiana, J. Dutreix, and A. Wambersie, "Radiobiologie. hermann," 1986.

[5] C. Park, L. Papiez, S. Zhang, M. Story, and R. D. Timmerman, "Universal survival curve and single fraction equivalent dose: useful tools in understanding potency of
ablative radiotherapy," International Journal of Radiation Oncology* Biology* Physics, vol. 70, no. 3, pp. 847-852, 2008.

[6] J. Vaage, "Influence of tumor antigen on maintenance versus depression of tumor-specific immunity," Cancer research, vol. 33, no. 3, pp. 493-503, 1973.

[7] A. Charbit, E. Malaise, and M. Tubiana, "Relation between the pathological nature and the growth rate of human tumors," European Journal of Cancer (1965), vol. 7, no. 4, pp. 307-315, 1971.

[8] E. J. Hall and A. J. Giaccia, Radiobiology for the Radiologist. Lippincott Williams & Wilkins, 1993.

[9] Y. Latchman, C. R. Wood, T. Chernova, D. Chaudhary, M. Borde, I. Chernova, Y. Iwai, A. J. Long, J. A. Brown, R. Nunes, et al., "Pd-12 is a second ligand for pd-1 and inhibits t cell activation," Nature immunology, vol. 2, no. 3, pp. 261-268, 2001.
# Deuxième article

## Introduction

### Objectifs

L'importance du choix du fractionnement pour l'immuno-radiothérapie est reconnu par de nombreux auteurs, mais il n'existe pas de modèle approprié ni de consensus sur un fractionnement optimal (106).

Des expérimentations animales ont montré que des schémas avec des doses radiobiologiques identiques (selon le modèle linéaire-quadratique) pouvaient avoir un potentiel de stimulation de l'immunité très différent: ainsi, en présence d'un inhibiteur de checkpoint, un schéma de 3 x 8 Gy stimule plus la réponse immunitaire anti-tumorale que le schéma 5 x 6 Gy (80). Cependant, les schémas d'irradiation fractionnés, les plus répandus en clinique, sont rarement étudiés dans les études sur animal, qui documentent majoritairement les effets des doses uniques<fnref n="41" />. Globalement, les études expérimentales en monodose montrent que l'effet abscopal serait dose-dépendant jusqu'à un certain point (peut-être situé vers 7-8 Gy), puis disparaîtrait progressivement au-delà de 10-15 Gy par fraction (80,135) et cette atténuation passerait par l'activation d'une exonucléase Trex1 (79). Cependant les schémas fractionnés prolongés, à faible dose par fraction (1.8 - 2 Gy), sont encore les plus fréquemment utilisés en clinique, pour d'excellentes raisons radiobiologiques de contrôle local et de tolérance. Mais il existe des raisons théoriques, et depuis peu des arguments cliniques, pour douter de leur efficacité à provoquer une réponse immunitaire systémique: déplétion prolongée des effecteurs immunitaires au sein du microenvironnement tumoral, lymphopénies induites, faible quantité ou faible immunogénicité des antigènes tumoraux libérés par fraction (voir section immuno-radiothérapie). Des données cliniques récentes vont dans le même sens: une analyse en sous-groupe de l'essai d'immuno-radiothérapie du MDACC avec pembrolizumab dans le cancer du poumon a montré un taux d'effet abscopal quatre fois plus grand avec la stéréotaxie (50 Gy en 4 fractions) qu'avec la radiothérapie

<footnote n="41">⁴¹ Les raisons du choix majoritaire de la dose unique ne sont pas claires. Il est possible que l'aspect pratique joue un rôle important (pas de problème de reproductibilité du positionnement, moindre contrainte de disponibilité du LINAC). Il faut donc saluer l'équipe de S. Formenti et S. Demaria pour leur travaux sur des schémas fractionnés réalistes et utilisables en clinique.</footnote>
classique avec hypofractionnement modéré (45 Gy en 15 fractions): 38% vs 10%
(tendance, p=0.11) (93).

Or, on a présenté (section immunothérapie) les taux de réponse attendus du
pembrolizumab *monothérapie*: ce taux de 10% obtenue avec radiothérapie classique et
pembrolizumab est dans le bas du spectre, compatible avec une *absence de
potentialisation*, voir une légère *antagonisation* de l'immunothérapie par la
radiothérapie classique.

Par ailleurs, cet essai du MDACC montre aussi qu'il est possible de concilier
radiothérapie stéréotaxique à dose ablative (4 x 12.5 Gy) et obtention d'un effet
abscopal, relativisant la notion de dose par fraction optimale sensée être de 8 Gy. Les
résultats de cet essai n'étaient pas connus à l'époque de la publication de notre modèle
(136), mais on montrera qu'ils sont bien décrits par celui-ci.

Globalement, il semble utile de progresser dans la modélisation du fractionnement en
immuno-radiothérapie en proposant un modèle mathématique simple d'utilisation,
étendant le modèle linéaire-quadratique, qui permette d'intégrer des résultats
expérimentaux et cliniques, afin de tester numériquement des hypothèses de
fractionnement pour éviter le double écueil des schémas classiques
(radiobiologiquement efficaces et sûrs, mais relativement peu immunogènes) et des
schémas stéréotaxiques plus immunogènes mais à dose sub ablative.

L'objectif d'optimiser le fractionnement pour l'immuno-radiothérapie peut
s'envisager du point de vue de son efficacité ou de ses effets secondaires. Nous avons déjà
discuté plus haut du possible lien entre la dose de radiothérapie et les effets secondaires
auto-immuns (irAEs): à ce jour, il existe encore assez peu de données de tolérance et
nous avons donc choisi de modéliser l'efficacité, en fonction du fractionnement utilisé.

Limites de la modélisation du premier article

Initialement, il a été envisagé d'utiliser le premier modèle publié, puisqu'il est
adaptable et contient toutes les équations utiles. A la réflexion, ce modèle ne nous
sembla pas le mieux maniable: il est spécifique d'un certain type d'immunothérapie (des
inhibiteurs de checkpoint anti PD1:PDL1 et anti CTLA 4) et n'aurait donc pas pu
s'adapter simplement à d'autres immunothérapies. Or il était très plausible que les
immunothérapies soient amenées à se diversifier, à se combiner et il semblait possible
que certaines pourraient devenir obsolètes (par exemple les anti CTLA 4 avaient alors
perdu beaucoup de terrain face aux anti PD1:PDL1, et il semblait plausible que les CAR-T
cells soient employées dans certaines tumeurs solides<fnref n="42" />). Il nous est donc apparu plus
pertinent de chercher un modèle polyvalent, non spécifique d'une classe particulière
d'immunothérapie.

De plus, le premier modèle est fortement paramétré: il utilise par exemple une
modélisation de la croissance tumorale (temps de doublement, etc) et plusieurs
paramètres non observables qui ont été déterminés par un processus de calibration
délicat nécessitant des données expérimentales. Sa capacité à être utilisé par des
non-spécialistes de la modélisation est donc limitée. Après la publication de notre
premier modèle, certains auteurs ont continué d'explorer la dimension mécanistique de
manière plus fine avec des modèles nécessitant plus de paramètres non observables
(137) : conceptuellement intéressants mais de mise en œuvre délicate, aussi
souhaitions-nous dépasser ce type d'approche complexe.

Enfin, si le premier modèle permettait d'explorer numériquement des scénarios très
variés (séquencement alternatifs, etc), nous souhaitions répondre à des questions
précises: est-il possible de quantifier l'immunogénicité d'un schéma *quelconque* de
radiothérapie ? Peut-on obtenir une quantification d'immunogénicité *indépendante* de
l'immunothérapie ? Peut-on construire un modèle qui englobe le modèle linéaire
quadratique et ne nécessite que très peu de paramètres supplémentaires (un ou deux au
maximum) ? Peut-on choisir des paramètres intuitifs, et extrapolables à partir de
données expérimentales publiées sans nécessiter de calibration complexe ni de
compétence en modélisation ? En résumé: peut-on construire un modèle de
fractionnement pour les oncologues-radiothérapeutes (et non les modélisateurs)
pratiquant l'immuno-radiothérapie ?

Présentation du deuxième modèle

Pour ce deuxième modèle, nous avons considéré que l'impact du fractionnement
(dose par fraction et temps inter-fraction) est l'élément essentiel pour moduler la
disponibilité des effecteurs immunitaires à l'intérieur du microenvironnement tumoral.

On suppose que chaque irradiation entraîne l'apoptose ou la nécrose d'une fraction
de cellules tumorales, donnée par l'équation du modèle linéaire quadratique et ses deux
paramètres de radiosensibilité α et β.

<footnote n="42">⁴² Ironiquement, ces deux intuitions se sont révélées, pour le moment, complètement fausses.</footnote>
Comme le modèle linéaire quadratique ne fait aucune hypothèse sur la dynamique de cette mort cellulaire, nous introduisons un facteur temps qui décrit la *cinétique* à laquelle les cellules irradiées meurent. Cette cinétique est décrite par un temps caractéristique, noté Td (*time to death*) qui correspond à la durée après l'irradiation pour que 50% des cellules soient effectivement mortes. Typiquement, ce paramètre est de l'ordre de quelques jours, et pour les applications numériques, il a donc été fixé semi-arbitrairement à 3 jours, en cohérence avec des notions de radiobiologie souvent présentées dans des manuels de référence<fnref n="43" />. La distribution du délai entre l'irradiation et la mort cellulaire varie entre quelques heures et quelques jours, et le pic de mort cellulaire est observé approximativement à Td = 3 jours. Il est simple de modifier cette valeur de Td (le modèle est disponible via un calculateur en ligne en libre accès, ses paramètres sont directement modifiables par l'utilisateur).

L'image suivante montre des captures d'écran du calculateur en ligne, qui est disponible ici (à la date de rédaction) http://www.smartcalculators.online

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Il n'est pas fait d'hypothèse sur le type de mort cellulaire. Le modèle est agnostique quant à la proportion de cellules qui meurent par nécrose (inflammatoire), par apoptose (non inflammatoire, mais cependant potentiellement immunogène) ou par les autres modes de mort cellulaires identifiés à ce jour. Comme il est plausible que le type de mort cellulaire soit modulé par la dose par fraction, il s'ensuit que le modèle sera d'autant

<footnote n="43">⁴³Perez & Brady Principles and Practice of Radiation Oncology, 2004.</footnote>
plus réaliste qu'il sera utilisé pour comparer des schémas utilisant des doses par fractions proches<sup>44</sup>.

On suppose ensuite que les effecteurs immunitaires mettent *un certain temps* pour être recrutés dans le microenvironnement tumoral, puis pour reconnaître les antigènes (pour les lymphocytes T), les phagocyter et les présenter (pour les cellules présentatrices d'antigènes). Là encore, un temps caractéristique de traitement des antigènes par le système immunitaire est introduit, noté *Tir* (*time to immune response*). Ce temps *Tir* représente la durée pour que 50% des antigènes tumoraux aient été traités par les effecteurs immunitaires. Une distribution de forme similaire à la précédente est utilisée pour décrire la cinétique de captation des antigènes tumoraux par les effecteurs immunitaires, avec un pic d'activité approximativement égal au temps caractéristique (*Tir*). Dans les applications numériques, on a choisi *Tir* = 5 jours, en cohérence avec des données expérimentales (138) qui montrent que le pic d'infiltration par les effecteurs immunitaires se situerait entre 4 et 8 jours après une irradiation (de 5 Gy). Il s'agit de données pré-cliniques à prendre comme des ordres de grandeur, non comme des valeurs précises. Il est également possible de modifier la valeur du paramètre *Tir* pour simuler une infiltration plus rapide, ou plus lente, par les effecteurs immunitaires.

On voit que le modèle ne fait pas d'hypothèse sur le caractère plus ou moins immunotolérant du microenvironnement tumoral, ni sur l'utilisation d'une immunothérapie de quelque classe thérapeutique. Comme expliqué plus haut, c'est une de ses caractéristiques recherchées.

On voit aussi que la complexité du traitement des antigènes par le système immunitaire n'est, volontairement, pas représentée: les étapes successives de recrutement, phagocytose puis présentation et reconnaissance des antigènes, stimulation, co-stimulation(s), activation lymphocytaire sous réserve de la levée des inhibiteurs de checkpoints...sont entièrement masquées. Il s'agit donc d'un modèle phénoménologique et non (ou très peu) mécanistique.

Comment la radiothérapie module-t-elle, dans ce modèle, la disponibilité des effecteurs immunitaires au sein du micro-environnement tumoral? Elle module positivement cette disponibilité en favorisant le recrutement, par un effet

<footnote n="44"><sup>44</sup> Alternativement, on peut modifier le ratio α / β pour moduler l'immunogénicité en fonction de la dose par fraction, ce qui n'est pas “propre” théoriquement mais commode pour comparer des schémas avec des doses par fraction très différentes avec des proportions d'apoptose ou nécrose variables.</footnote>
pro-inflammatoire du relargage antigénique, dont le pic temporel survient aux environs
de Td jours (3 jours), qui recrute des effecteurs dont le pic survient vers (Td + Tir) jours,
soit 3 + 5 = 8 jours, dans l'article.

Mais la radiothérapie module aussi *négativement* la disponibilité des effecteurs selon
la modélisation suivante: les effecteurs qui ont été recrutés dans le
micro-environnement tumoral sont tués (ou perdent leur fonctionnalité)
immédiatement après une nouvelle dose d'irradiation.

Ceci suppose des doses par fraction suffisamment importantes, de l'ordre de 1.8 - 2 Gy ou plus, doses auxquelles les lymphocytes T (naïfs<fnref n="45" />) sont très majoritairement tués (ou stérilisés) et où les fractions survivantes des autres effecteurs immunitaires sont également très faibles. Ce modèle n'est pas valable pour les basses doses (inférieures à 0.5 - 1 Gy), un domaine d'investigation également intéressant (discuté précédemment), dans lequel les fractions survivantes lymphocytaires ne sont pas négligeables, ce qui nécessite des ajustements à la formule et modifie significativement les résultats.

On traduit la modulation *négative* de la disponibilité des effecteurs par irradiation en considérant que les antigènes *relargués* qui n'ont pas encore été traités par le système immunitaire sont perdus et ne pourront donner lieu à une réponse immunitaire. Schématiquement: une fraction des antigènes tumoraux relargués *post-mortem* est supposée avoir été captée par des cellules présentatrices, mais n'a pas encore produit une activation lymphocytaire T, au moment où survient une nouvelle dose d'irradiation; dans ce cas, cellules présentatrices et lymphocytes T présents sont tués (ou inactivés ou stérilisés) et les antigènes tumoraux sont détruits définitivement avec eux.

En ce qui concerne les antigènes *non relargués* au moment de la nouvelle dose d'irradiation, parce qu'ils font partie d'une cellule tumorale irradiée mais qui n'est pas encore arrivée au bout de son processus de nécrose ou d'apoptose. Dans ce cas, la nouvelle irradiation ne les affecte pas: ces antigènes seront relargués plus tard et pourront donner lieu à un traitement par les effecteurs immunitaires et contribuer à la réponse immunitaire.

Ce processus est résumé par le schéma de principe ci-dessous:

<footnote n="45">⁴⁵ Les lymphocytes mémoires seraient moins radiosensibles (139).</footnote>
<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Et l'impact du fractionnement se représente, avec le schéma ci-dessous:

### Dose Immunologique Efficace (IED) : formule, explication qualitative

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

La traduction mathématique de cette cinétique quantifie la réponse immunitaire comme la somme discrète (sur chaque dose d'irradiation) des produits de *convolution* de la fonction décrivant la cinétique de la mort cellulaire multipliée par la fonction décrivant la cinétique de traitement par le système immunitaire<fnref n="46" />.

### Dose immunologique efficace

Ce modèle suppose donc que l'efficacité immunologique intrinsèque d'un schéma de radiothérapie s'évalue en fonction du nombre de cellules tumorales tuées par l'irradiation qui ont relargué des antigènes tumoraux traités par les effecteurs immunitaires, suffisamment tôt pour que ces effecteurs n'aient pas été détruits par l'irradiation suivante. Cette quantité ne dépend que des paramètres $\alpha$ et $\beta$ du modèle linéaire quadratique et de deux temps caractéristiques décrivant la cinétique de la mort

<footnote n="46">⁴⁶ Ce n'est pas une coïncidence: la durée entre l'irradiation et l'activation de la réponse immunitaire est une variable aléatoire, somme de deux variables aléatoires indépendantes: la durée entre l'irradiation et la mort cellulaire, et la durée entre la mort cellulaire et l'activation immunitaire. Or la distribution d'une somme de variables indépendantes est le produit de convolution des fonctions de distribution des deux variables. Ceci explique la forme des équations présentées dans l'article.</footnote>
cellulaire post-irradiation d'une part, et la cinétique du recrutement des effecteurs immunitaires d'autre part.

Comme il n'existe pas d'unité naturelle pour exprimer une "immunogénicité", on peut cependant en proposer une définition par l'intermédiaire d'une dose équivalente (en Gray) qui produirait le même effet. Les oncologues-radiothérapeutes sont familiers de cette pratique, car ils utilisent fréquemment des notions comme la dose équivalente en 2 Gy par fraction, notée EQD2, ou de la dose efficace biologique ou BED, lorsqu'il s'agit d'évaluer une efficacité radiobiologique (voir la section sur la radiothérapie pour les définitions).

Pour définir une dose immunologique efficace, on a choisi comme étalon une dose unique. En effet, une dose unique, sous les hypothèses de ce modèle, aurait une immunogénicité maximale puisque toutes les cellules mortes produisent des antigènes intégralement traités par le système immunitaire (en effet, aucune dose d'irradiation supplémentaire ne détruit les effecteurs).

En comparaison, l'immunogénicité d'un schéma en 2 Gy par fraction, serait très faible dans ce modèle (quelques pourcents de l'immunogénicité de la dose unique), à cause des irradiations répétées qui stérilisent les effecteurs, elle n'est donc pas un étalon adapté.

Nous avons donc exprimé l'immunogénicité d'un schéma comme celle d'une dose unique, et nous avons repris la même convention que la dose biologique efficace (BED), qui est une dose supposée administrée de manière suffisamment lente pour qu'il n'y ait pas de terme quadratique (c'est à dire, pas de β). Ce choix, qui est une simple convention (nous aurions pu choisir de garder le terme quadratique), permet d'égaliser dose biologique efficace et dose immunologique efficace dans le cas particulier d'une dose unique. Par exemple, pour une dose unique de 8 Gy avec $α / β = 10$: BED = IED = 14.4 Gy.

On utilise aussi la définition d'efficacité immunologique, qui quantifie le pourcentage de volume tumoral qui contribue à l'activation immunitaire. Par définition de l'IED, cette efficacité est un nombre entre 0 et 1 qui vaut $E = 1 - \exp(-α \text{ IED})$. Si l'efficacité immunologique vaut, par exemple, 20%, celà signifie que 20% des cellules tumorales ont libéré des antigènes qui ont été intégralement traités par le système immunitaire, tandis que les 80% restantes sont soit toujours en vie, soit mortes mais leur antigènes n'ont pas contribué à la réponse immunitaire, en raison des irradiations successives. Pour une dose unique de 10 Gy ou plus, cette efficacité immunologique est
généralement supérieure à 90%, tandis que pour un schéma normofractionné classique,
cette efficacité n'est que de quelques pourcents.

Propriétés de la dose immunologique efficace

Sous ces hypothèses, une dose unique a le meilleur rendement immunologique,
cependant l'oncologue-radiothérapeute doit en général fractionner le traitement: pour
arriver à administrer une dose totale tumoricide, et pour limiter les effets secondaires
tardifs qui dépendent fortement de la taille par fraction. On pense aussi que
l'immunogénicité diminuerait fortement au-delà de 10 à 15 Gy par fraction, en raison de
l'activation de l'exonucléase Trex (voir section immuno-radiothérapie).

En pratique, il pourrait donc être utile de quantifier l'immunogénicité de schémas
composés de 3 à 5 doses successives de 6 à 10 Gy pour la stéréotaxie. Des exemples
numériques sont donnés dans l'article.

On peut énoncer qualitativement les propriétés principales de la dose
immunologique efficace:

☐ lorsque plusieurs doses d'irradiation sont données dans un intervalle de temps suffisamment petit devant le temps caractéristique de mort cellulaire (Td), leur effet immunologique est pratiquement additif.

☐ Il existe une fenêtre temporelle durant laquelle les irradiations peuvent être très délétères sur l'immunogénicité du schéma car elles réduisent fortement la disponibilité des effecteurs immunitaires dans le microenvironnement tumoral. Le début de cette fenêtre temporelle est contrôlé par le premier temps caractéristique Td, tandis que sa durée est contrôlée par le deuxième temps caractéristique Tir.

☐ Au-delà de cette fenêtre temporelle, il est possible de ré-irradier sans impact notable sur l'immunogénicité.

Ces premières propriétés sont illustrées par le schéma ci-dessous, qui montre la dose
immunologique efficace pour deux doses de radiothérapie égales de 2 Gy séparées par
un intervalle de temps variable, entre 1 et 21 jours:
<figure><img src="image_19.png" /></figure>

Par ailleurs, il existe d'autres propriétés importantes:

☐ les premières doses de radiation sont les plus importantes pour l'immunogénicité, tandis que les doses suivantes sont importantes pour le contrôle local au sens de la radiobiologie classique. La raison est que le nombre *absolu* de cellules tumorales décroît rapidement au début, puis beaucoup plus lentement ensuite.

De ces propriétés peuvent être tirées quelques idées directrices:

☐ Il serait possible d'atteindre des doses tumoricides tout en utilisant un schéma fortement immunogène, en regroupant quelques doses sur une durée suffisamment courte et en n'irradiant pas dans la fenêtre temporelle sus-citée.

☐ La dose immunologique efficace est atteinte rapidement en début de traitement, il est par la suite indifférent d'utiliser du normofractionnement ou de l'hypofractionnement modéré. On pourrait donc envisager des schémas biphasiques (hypofractionnement plus ou moins fort pour les premières fractions, pause de traitement suffisamment longue, puis hypofractionnement modéré<fnref n="47" /> voir même normofractionnement).

## Applications de la dose immunologique efficace

### Nouveaux schémas d'irradiation

A partir de ces règles, on peut imaginer des schémas à la dose à la fois tumoricide et répartie de façon immunogène, des exemples de schémas ont été présentés dans l'article, mais il est aisé d'en proposer d'autres en fonction des contraintes.

<footnote n="47">⁴⁷ Le protocole ELAN du GORTEC constitue un exemple: 30 Gy en 10, 2 semaines de pause, 25 Gy en 10.</footnote>
Le tableau ci-dessous donne une dose immunologique efficace pour divers fractionnements.

<table><thead><tr><td>fractionnement</td><td>IED (Gy)</td><td>%IED</td><td>BED10 (Gy)</td></tr></thead><tbody><tr><td>3 x 8 Gy (3 jours)</td><td>9.4</td><td>0.76</td><td>43</td></tr><tr><td>3 x 8 Gy (5 jours)</td><td>2.9</td><td>0.36</td><td>43</td></tr><tr><td>5 x 6 Gy (5 jours)</td><td>3.0</td><td>0.36</td><td>48</td></tr><tr><td>10 x 3 Gy (12 jours)</td><td>0.3</td><td>0.05</td><td>39</td></tr><tr><td>3x8 Gy J1J3J5 + 10x3 Gy J8-J19</td><td>0.2</td><td>0.03</td><td>82</td></tr><tr><td>3x8 Gy J1J3J5 + 10x3 Gy J15-J26</td><td>1.7</td><td>0.23</td><td>82</td></tr><tr><td>2x8 Gy J1J3 + 25x2 Gy J15-J46</td><td>5.5</td><td>0.56</td><td>88</td></tr></tbody></table>

Interprétation: les schémas soulignés en vert seraient a priori significativement plus immunogènes que ceux soulignés en rouge. Ainsi, seraient peu immunogènes les schémas normo-fractionnés ou à hypo-fractionnement modéré (2-3 Gy par fraction, nombre de fraction > 5). Les schémas courts en hypofractionnement (< 5 fractions) seraient plus immunogènes, mais l'augmentation de l'étalement diminuerait la dose immunologique efficace (noter la différence entre 3 jours vs 5 jours de durée totale). Des schémas hybrides, avec variation de la dose par fraction, comme celui de la dernière ligne du tableau qui mixe de l'hypofractionnement fort au début et du normofractionnement à la fin, pourraient être fortement immunogènes, à condition de respecter une période de pause suffisante entre les deux temps de traitement (ici, 12 jours semble suffisant, mais une absence de pause entre les deux temps de traitement ferait perdre le bénéfice de l'hypofractionnement).

## Stéréotaxie vs radiothérapie classique

Pour revenir sur l'essai du MDACC (93) qui a montré un taux d'effet abscopal de 38% pour 4 x 12.5 Gy (stéréotaxie) contre 10% pour 15 x 3 Gy (classique), en concomitant
avec du pembrolizumab, on peut calculer la dose immunologique efficace et juger de la pertinence du modèle sur des données cliniques: pour le cancer du poumon NPC, on prend α/β=20, pour les deux temps caractéristiques (Td: nécrose et Tir: réponse immunitaire) on choisit deux cinétiques différentes:

☐ cinétique rapide: Td = 2 jours, Tir = 5 jours

☐ cinétique lente: Td = 5 jours, Tir = 10 jours

La cinétique rapide est en ligne avec certaines expériences animales, réalisées avec des hautes doses par fraction, par exemple (138). La cinétique lente, globalement deux fois plus longue, est moins favorable<fnref n="48" /> et sert à obtenir une plage de valeurs plus représentative; on peut aussi supposer qu'avec de faibles doses par fraction, la cinétique de mort cellulaire sera plus lente (part plus grande de l'apoptose par rapport à la nécrose), l'inflammation moins forte et donc le recrutement immunitaire moins dynamique. Il est donc plausible (mais à valider) que la cinétique rapide soit associée à la stéréotaxie tandis que la cinétique lente soit appropriée pour la radiothérapie classique, mais ceci ne modifie pas la suite de la discussion.

Ainsi, selon la cinétique rapide ou lente, respectivement, la dose immunologique efficace du schéma *classique* est comprise entre **0.1 et 0.3 Gy**, soit entre **2% et 4%** si elle est exprimée en efficacité (le pourcentage du volume tumoral contribuant à la réponse immunitaire).

En comparaison, la dose immunologique efficace du schéma *stéréotaxique* (en supposant une fraction tous les 7 jours calendaires, pour une durée totale de 3 semaines<fnref n="49" />) est comprise entre **0.7 Gy et 4.4 Gy** soit entre **10% et 48%** si exprimée en efficacité, selon que la cinétique soit lente ou rapide, respectivement.

On constate donc que quelle que soit la cinétique considérée, la dose immunologique efficace est toujours *nettement plus grande pour le schéma stéréotaxique* que pour le schéma classique, et ce malgré une grande sensibilité à la cinétique. Ce résultat du modèle est cohérent avec la différence entre le taux d'effet abscopal observé en clinique entre les deux modalités (38% vs 10%).

<footnote n="48">⁴⁸ Moins favorable car le temps nécessaire à la stimulation immunitaire est plus long, ce qui augmente l'effet délétère du fractionnement sur l'immunogénicité.</footnote>

<footnote n="49">⁴⁹ Un telle durée entre les fractions est représentative des pratiques courantes, même si des variations existent.</footnote>
Globalement, le modèle de la dose immunologique efficace semble donc décrire, au moins qualitativement, les résultats de l'essai du MDACC (dont les résultats ont été publiés 2 ans après).

### Absence d'immunogénicité de la radiothérapie classique (?)

Le modèle de la dose immunologique efficace produit-il des valeurs trop basses pour la radiothérapie classique ? Au moment des résultats de l'étude PACIFIC I, cette critique a été formulée<fnref n="50" />, au regard des résultats positifs d'un schéma classique en 2 Gy par fraction (115). Aujourd'hui, à la lumière des résultats de l'essai du MDACC, il est permis de défendre le modèle avec plus de force. L'essai PACIFIC I avait utilisé un schéma non concomitant où la radiothérapie était terminée bien avant exposition à l'immunothérapie. L'essai du MDACC, en revanche, utilise un schéma réellement concomitant et montre un taux d'effet abscopal bien inférieur aux anticipations pour la radiothérapie classique: seulement 10%, contre 17% dans le bras pembrolizumab monothérapie du même essai, et de 27% à 39% de réponse objective pour le pembrolizumab monothérapie dans l'essai KEYNOTE-042 (selon que TPS est >1% ou > 50%). Devant ces chiffres, on peut même se demander si la radiothérapie classique n'aurait pas diminué l'efficacité de l'immunothérapie (par tous les mécanismes immunosuppresseurs déjà présentés).

Globalement, si le modèle de la dose immunologique efficace ne crédite l'irradiation classique que de quelques pourcents d'efficacité, les dernières données cliniques disponibles vont dans le sens du modèle et pourraient même indiquer qu'il suretime un effet immunologique en réalité délétère (possiblement lié aux lymphopénies fréquentes avec la radiothérapie prolongée à dose classique).

Cependant, l'effet plus important dans le sous-groupe de l'étude PACIFIC I qui a commencé l'immunothérapie moins de 2 semaines après la fin de la radiothérapie adjuvante, est effectivement cohérent avec une immunogénicité du normo-fractionnement. On peut risquer une explication: les volumes tumoraux irradiés étaient beaucoup plus importants dans PACIFIC I que dans l'étude du MDACC (tumeur primitive en place avec atteinte ganglionnaire vs oligométastases) ce qui peut avoir créé une stimulation antigénique suffisante malgré une immunogénicité sous-optimale du fractionnement.

<footnote n="50">⁵⁰ Lors d'une présentation orale au congrès Immunorad 2018.</footnote>
Plus de données cliniques, et des analyses rigoureuses des contributions de chaque thérapeutique (par exemple en utilisant des microsimulations avec des modèles de Markov) permettront peut-être de clarifier ce point.

## Sensibilité à la cinétique (immunitaire et mort cellulaire)

On a vu dans l'exemple précédent que la dose immunologique efficace varie rapidement avec les deux paramètres qui gouvernent la cinétique de la mort cellulaire d'une part et de la réponse immunitaire d'autre part, ce qui est attendu par rapport aux hypothèses du modèle. Qualitativement, la cinétique ne peut pas changer la supériorité des schémas stéréotaxiques ou fortement hypo fractionnés par rapport à la radiothérapie classique. Mais de manière plus quantitative, pour les schémas stéréotaxiques, cette dépendance à la cinétique impacte le choix du temps inter-fraction, et plus particulièrement l'espacement entre la 1ère et la 2ème fraction.

En attendant une hypothétique documentation de cette cinétique en clinique, on pourra respecter les règles suivantes:

- ☐ regrouper, quand c'est possible, les irradiations par "bloc" consécutifs ne dépassant pas 3 jours au total (par exemple administrer 3 x 8 Gy en 3 jours consécutifs);

- ☐ ne pas raccourcir l'espacement entre les deux premiers "blocs" de traitement à moins de 7 jours calendaires; par exemple, au moins 7 jours entre les deux premières fractions pour un 4 x 12 Gy; ceci afin de laisser "suffisamment" de temps aux effecteurs immunitaires;

- ☐ l'espacement des fractions (ou blocs) après le 2ème importe peu car la quantité absolue d'antigènes résiduels devient faible au-delà de 10 Gy de dose cumulée.

Le regroupement par "bloc" sur 2 à 3 jours est faisable dans certaines limites de dose par fraction et de localisation tumorale, et le modèle prévoit qu'elles auraient un effet immunologique constructif plutôt que destructif. Un essai clinique récent (112) a opportunément démontré la faisabilité d'un schéma 3 x 8 Gy sur 3 jours consécutifs en combinaison avec le durvalumab, en contexte néoadjuvant dans le cancer du poumon NPC, sans sur-toxicité significative<fnref n="51" />.

<footnote n="51">⁵¹ Malgré certaines limitations de cet essai (section immuno-radiothérapie), sa positivité est plutôt à mettre au crédit du modèle, qui lui prédit effectivement une bonne immunogénicité (voir article).</footnote>
Au-delà de l'utilisation de ces règles empiriques, peut-on envisager de documenter ces
deux paramètres de cinétique? On peut les estimer rétrospectivement sur des données
cliniques, comme il est possible de tirer des estimations du ratio α/β à partir de données
d'efficacité, mais à condition de construire de manière appropriée les schémas
d'irradiation.

Le paramètre le plus critique à estimer semble être celui de la cinétique immunitaire:
dans l'exemple du schéma de l'essai MDACC, une augmentation de 3 jours de Tir (de 7
jours à 10 jours) cause une baisse de l'efficacité immunologique de 22% à 12%, soit une
baisse relative de 15% par jour supplémentaire.

En comparaison, une augmentation du paramètre de cinétique de la mort cellulaire de 3 jours à 5 jours cause une baisse de l'efficacité immunologique de 22% à 19%, soit une baisse relative de 7% par jour supplémentaire.

De plus, la cinétique immunitaire est bien moins documentée que la cinétique de mort
cellulaire post irradiation (une notion radiobiologique classique), hormis quelques
données expérimentales comme celles de (138) dont la méthode de détermination
(invasive) est non applicable chez l'homme. De plus, il est probable que comme tout
phénomène immunitaire, cette cinétique soit variable selon les tumeurs et les individus.
Il serait intéressant d'estimer les paramètres de cinétique directement par des
méthodes non invasives comme de l'imagerie (scanner, IRM, TEP) ou par la mesure de
biomarqueurs. Les résultats préliminaires encourageants de certaines études de
radiomics, cherchant à qualifier l'état immunitaire du microenvironnement tumoral de
manière non invasive et facilement accessible comme un scanner, constituent un
exemple encourageant (8). Cependant, l'optimisme en matière d'imagerie de la réponse
immunitaire doit être modéré: le sujet n'est pas nouveau et pour le moment, les succès
expérimentaux n'ont pas pu être transformés en application clinique, comme le rappelle
une revue récente (140). Par exemple, l'utilisation de la TEP au FDG, pour imager la
réponse inflammatoire au sein du microenvironnement tumoral et en détecter son pic
en post-irradiation, semble naturelle et aurait l'avantage de reposer sur un radiotraceur
largement disponible. Cependant les approches reposant sur la mesure du SUV pour
quantifier l'infiltration immunitaire, ont pour le moment échoué (141). Ce problème
complexe nécessite de faire la part entre le métabolisme très rapide du glucose
séquestré par la tumeur contre le métabolisme plus lent lié à l'inflammation du
microenvironnement tumoral<sup>52</sup>, une tâche théoriquement possible avec les méthodes d'acquisition en deux temps<sup>53</sup>, comme par exemple celle proposée par Barbolosi et al (142). Cette discrimination serait compliquée par l'effet de la radiothérapie, qui modifie aussi la dynamique du métabolisme. D'autres approches d'imagerie de la réponse immunitaire en TEP requièrent des radiotraceurs ad-hoc et semblent prometteuses (143) mais sont plus difficiles d'accès.

Globalement, la difficulté prévisible des méthodes directes de détermination des paramètres de cinétique chez l'homme plaide plutôt en faveur de prioriser la réalisation d'essais cliniques. Les valeurs des paramètres de cinétique, ainsi déduites, permettront alors d'optimiser les schémas d'immuno-radiothérapie dans un second temps.

Immuno-radiothérapie à dose ablative vs sub ablative

Certains auteurs travaillent désormais sur des doses non tumoricides (sub ablatives) de radiothérapie en combinaison avec des inhibiteurs de checkpoint, comme l'équipe de S. Formenti qui explore depuis longtemps les effets immunogènes du schéma 3 x 8 Gy sur 3 jours consécutifs. Par exemple, la combinaison avec le durvalumab en néo-adjuvant dans le cancer du poumon n'entraînerait pas de sur-toxicité par rapport au durvalumab monothérapie (112). La dose équivalente en 2 Gy (EQD2) est 30.6 Gy (pour α/β=20), très inférieure au 66-70 Gy nécessaires pour être tumoricide dans le cancer du poumon. A l'inverse, d'autres équipes explorent des schémas à visée ablative, comme le 4 x 12.5 Gy de l'essai du MDACC (EQD2 =74 Gy pour α/β=20, en réalité moins en raison de la surestimation du modèle LQ pour une telle dose par fraction).

Les schémas très hypo fractionnés à dose sous-ablative présentent l'avantage de pouvoir être délivrés sur une courte période et d'être donc très immunogène (l'efficacité immunologique du 3 x 8 Gy est de **77%** pour α/β=20, Td=3j, Tir=7j, son IED = **9.7 Gy**, ce qui est nettement supérieur au schéma du MDACC, et cette immunogénicité est très stable par rapport aux paramètres de cinétique Td et Tir, un autre avantage).

En revanche, leur faible dose radiobiologique (ici, moins de 50% de la dose ablative) fait se demander si la combinaison de l'immunothérapie avec une radiothérapie aussi

<footnote n="52">52 Voir section *notions de cancérogenèse*, chapitre sur la reprogrammation du métabolisme cellulaire.</footnote>

<footnote n="53">⁵³ Les acquisitions biphasiques en TEP au FDG permettent de connaître indirectement la vitesse de séquestration du glucose, plutôt que l'état instantané du stock de glucose (qui est moins spécifique de l'activité tumorale). Elles sont réalisées en deux temps (temps précoce, temps tardif), par exemple 30 minutes puis 60 minutes. Elles sont basées sur un modèle pharmacocinétique multi-compartimental et requièrent souvent un ou plusieurs prélèvements sanguins, ce qui limite pour le moment leur applicabilité aux essais cliniques.</footnote>
peu dosée présente un intérêt par rapport à une combinaison avec chimiothérapie, qui produit des taux de résécabilité et de réponse complète au moins aussi élevés, pour des coûts plus faibles: voir cette revue récente (144). Quant aux éventuels effets bénéfiques des basses doses déjà discutés, de tels schémas utilisent des doses par fraction très supérieurs à ceux pour lesquels les effets immunogènes des basses doses ont été observés expérimentalement.

Le contrôle local devrait donc rester, à notre avis, un objectif prioritaire de l'immuno-radiothérapie et les concessions de dose envisagées avec une certaine prudence. Ceci pourrait passer par des schémas plus prolongés, un peu moins immunogènes, mais avec des modèles de fractionnement comme la dose immunologique efficace, on pourrait chercher à concilier forte dose totale et forte immunogénicité.

## Limites de la dose immunologique efficace

### Toxicités

Ces considérations théoriques d'efficacité ne tiennent pas compte de la toxicité. Or, si les toxicités ne sont pas contrôlées, l'immuno-radiothérapie pourrait se limiter à des doses sub ablatives, avec le risque de ne jouer qu'un rôle accessoire par rapport aux combinaisons avec des chimiothérapies ou des thérapies ciblées.

On a présenté plus haut les mécanismes supposés ainsi que les données (encore parcellaires) sur les toxicités des immunothérapies, seules et en combinaison avec la radiothérapie. S'il existait effectivement quelques données cliniques de tolérance, à l'époque où le modèle de la dose immunologique efficace a été développé (106), il n'a pas pu être identifié de méthode de modélisation de cette tolérance<fnref n="54" />.

A l'avenir, une des priorités sera d'évaluer si les histogrammes dose-volume peuvent continuer à être utilisé avec l'immuno-radiothérapie, ou si les toxicités sont tellement imprédictibles qu'il faut développer un nouveau formalisme, chercher des biomarqueurs, ou intégrer de nouveau modèles (comme la dose immunologique efficace).

<footnote n="54">⁵⁴ En particulier en raison de la non-disponibilité des volumes et doses d'irradiation aux organes à risque.</footnote>
Tout comme le modèle linéaire-quadratique, la dose immunologique efficace ne considère pas les volumes d'irradiation, mais ces volumes représentent un axe de recherche majeur:

☐ La quantité absolue d'antigènes tumoraux produits par irradiation varie en fonction pratiquement linéaire avec le volume irradié: celui-ci implique donc fortement l'immunogénicité d'un schéma de radiothérapie, tout comme le fractionnement. On a présenté un certain nombre d'essais d'immuno-radiothérapie et on a vu que désormais, de nombreux essais imposent un nombre minimum de lésions à irradier, à la suite de résultats décevants d'essai d'irradiation sur une seule lésion.

☐ Le volume irradié est lié à la toxicité en radiothérapie.

☐ Les volumes d'irradiation prophylactique concernent les aires ganglionnaires de drainage lymphatique, susceptibles d'être des sites d'extension tumorale infra-clinique. Ces aires ganglionnaires sont fréquemment irradiées par précaution, même en l'absence d'argument sur leur envahissement, sur des arguments statistiques (séries opératoires, nomogrammes basés sur des grandes séries de récidives). Cette approche peut être valide d'un point de vue de la radiothérapie classique (quoique ce sujet soit évolutif, avec des essais d'escalade ou de désescalade dans beaucoup de localisations). En revanche, on peut sérieusement questionner cette approche dans le cadre d'une immuno-radiothérapie.

## Prophylaxie ganglionnaire: amie ou ennemie?

Dans son discours de réception du prix nobel de médecine 2018, attribué pour la découverte de l'inhibiteur de checkpoint PD-1, le Pr Tasuku Honjo met explicitement en garde contre la chirurgie prophylactique des aires ganglionnaires<fnref n="55" /> (145), car il a montré expérimentalement que la destruction du réseau lymphatique de drainage entraîne l'inefficacité des inhibiteurs de checkpoint. Les ganglions de drainage de la tumeur sont probablement le site principal de la présentation antigénique et de l'activation lymphocytaire. Les inquiétudes de T. Honjo concernant la chirurgie sont

<footnote n="55">⁵⁵ "surgeons should avoid removing healthy lymph nodes during dissection of tumors in order to safeguard protective immune responses"</footnote>
potentiellement applicables à l'irradiation prophylactique ganglionnaire. Ces ganglions de drainage sont souvent situés à distance de plusieurs centimètres de la tumeur primitive (on peut le constater lors des procédures de repérage du ganglion sentinelle), ils sont donc techniquement épargnables lors de la radiothérapie. Il est pourtant une pratique très répandue de les irradier même en l'absence d'envahissement clinique. On donne deux exemples dans des localisations majeures: dans le traitement adjuvant du cancer du sein par irradiation, le premier relai ganglionnaire est le plus souvent enlevé chirurgicalement (procédure de ganglion sentinelle), tandis que l'aire axillaire est ensuite irradiée (en grande partie) à 50 Gy<fnref n="56" />. Dans le cancer de prostate, le curage ganglionnaire étendu à visée diagnostique est fortement recommandé en cas de prostatectomie chez les patients de haut risque, alors que son intérêt thérapeutique n'est pas démontré. En cas de radiothérapie radicale de prostate, la prophylaxie des aires ganglionnaires pelviennes est pratiquée chez certains patients à haut risque et s'appuie d'ailleurs désormais sur un bon niveau de preuve, comme la récente positivité de l'étude randomisée POP-RT (146). Par ailleurs, pratiquement toutes les localisations en radiothérapie ont été, ou sont encore, concernées par des débats sur l'irradiation ganglionnaire prophylactique.

Ceci pose au moins deux questions: en cas d'irradiation classique, sans immunothérapie, mais dans la perspective éventuelle d'une immunothérapie future en cas de récidive métastatique<fnref n="57" />, de larges volumes d'irradiation prophylactique pourraient-ils diminuer l'efficacité d'une immunothérapie à venir? La réponse est moins évidente que dans le cas d'un curage chirurgical, puisque l'irradiation prophylactique est à dose sub-ablative et que les phénomènes de fibrose post radique peuvent se développer sur des années, il n'est donc pas évident que le réseau de drainage lymphatique soit défaillant lors d'une récidive métastatique, en particulier si elle est relativement précoce; ceci constitue un axe de recherche clinique.

La deuxième question est plus pressante: en cas d'immuno-radiothérapie au stade localisé ou localement avancé, faut-il faire de la prophylaxie ganglionnaire ? Ceci semble

<footnote n="56">⁵⁶ Les données sur l'irradiation partielle du sein démontrent pourtant l'inutilité de traiter cette zone dans bon nombre de cancers à bas risque.</footnote>

<footnote n="57">⁵⁷ La probabilité de cette rechute est d'ailleurs d'autant plus forte que l'on se pose la question de l'irradiation prophylactique ganglionnaire, donc la question est pertinente.</footnote>
contre-productif du point de vue de l'immunothérapie<sup>58</sup>, mais potentiellement utile du point de vue de la radiobiologie classique.

Le modèle de la dose immunologique efficace considère que les chaînes ganglionnaires de drainage ne sont pas irradiées, que seul le microenvironnement tumoral l'est. Dans le cas où les premiers relais ganglionnaires sont également irradiés, et d'autant plus que cette irradiation se ferait sur un mode fractionné classique, on peut anticiper une baisse significative de l'immunogénicité, quel que soit le mode de fractionnement utilisé pour la tumeur primitive<sup>59</sup>. Ce problème des volumes prophylactiques interroge aujourd'hui certains acteurs de l'immuno-radiothérapie (106) et constitue un domaine de recherche pour l'avenir.

Le schéma ci-dessous propose le principe d'un essai clinique essayant de répondre à ces questions.

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Cet essai hypothétique pourrait randomiser des patients ORL entre (chimio)radiothérapie classique et (chimio)immuno-radiothérapie concomitante avec fractionnement modifié, avec ou sans prophylaxie ganglionnaire. La dose radiobiologique classique (BED ou EQD2) et l'étalement seraient identiques entre tous les bras, mais les 2 bras en fractionnement modifiés auraient une dose immunologique efficace plus grande. L'utilisation de fractionnement modifié avec dose variable par

<footnote n="58"><sup>58</sup> Possiblement contributifs aux résultats décevants en immuno-radiothérapie des cancers ORL.</footnote>

<footnote n="59"><sup>59</sup> On peut imaginer un découplage dans le temps entre l'irradiation de la tumeur primitive et la prophylaxie ganglionnaire. Un intervalle libre suffisant entre les deux séquences permettrait à la réponse immunitaire de s'effectuer dans le premier relai ganglionnaire et aux lymphocytes T activés de recirculer. D'ailleurs, cette pratique existe dans la curiethérapie de prostate suivie d'une irradiation prophylactique pelvienne séquentielle.</footnote>
fraction permet d'optimiser l'immunogénicité du schéma, tout en préservant la tolérance puisque l'essentiel de la dose est délivrée en normofractionnement à 2 Gy par fraction, avec un boost initial est réalisé avec 2 doses de 8 Gy.

## Microbiome intestinal

Enfin, dans une logique similaire, puisque l'on sait aujourd'hui que le tube digestif constitue le premier organe lymphoïde, une épargne maximale du tube digestif et de ses formations ganglionnaires semble indispensable pour ne pas perturber le microbiome intestinal, dont on sait l'importance pour la réponse aux immunothérapies. Sur ce point le consensus sera plus facile à obtenir, le tube digestif étant souvent contouré comme un organe à risque et épargné au maximum.

## Conclusion sur la dose immunologique efficace

Nous avons présenté un modèle pour calculer l'immunogénicité intrinsèque d'un schéma fractionné de radiothérapie, conçu comme une extension du modèle linéaire quadratique et qui ne nécessite que deux paramètres supplémentaires (l'un décrivant la cinétique de la mort cellulaire par irradiation, l'autre la cinétique de la réaction immunitaire), dont on connaît déjà des valeurs expérimentales (qui sont de l'ordre de quelques jours).

Ce modèle fait l'hypothèse que le choix du temps inter-fraction est aussi important que la dose par fraction et la dose totale pour l'immunogénicité. Il permet de simuler des schémas d'irradiation hypo fractionnés à la fois immunogènes et ablatifs.

Le résultat du modèle est exprimé, au choix, comme une *dose unique équivalente* (en Gray) produisant la même stimulation antigénique (que l'on nomme la *dose immunologique efficace*), ou bien comme un *pourcentage* exprimant la proportion de la tumeur qui contribue théoriquement à la stimulation antigénique.

Ce modèle décrit de façon cohérente les différences d'immunogénicité entre des fractionnements différents, sur des données expérimentales et cliniques (à l'heure actuelle: 3 x 8 Gy, 5 x 6 Gy, 15 x 3 Gy, 4 x 12.5 Gy): les taux de réponse semblent varier en fonction de la dose immunologique efficace.

La formulation mathématique comporte une somme discrète de produits de convolution, pour utiliser le modèle sans difficulté, on peut utiliser un calculateur (en accès libre sur internet).