# Bioremédiation des métaux lourds par les bactéries sulfato-réductrices

Caroline Michel, Bruno Chardin, Mireille Bruschi

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Caroline Michel, Bruno Chardin, Mireille Bruschi. Bioremédiation des métaux lourds par les bactéries sulfato-réductrices. Environnement, Ingénierie & Développement, 2000, N°17 - 1er trimestre 2000, pp.34-37. 10.4267/dechets-sciences-techniques.332. hal-03181639

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Submitted on 25 Mar 2021

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# BIOREMEDIATION DES MÉTAUX LOURDS PAR LES BACTÉRIES SULFATO-REDUCTRICES

Caroline Michel, Bruno Chardin, Mireille Bruschi

CNRS Marseille

Le traitement des sols et nappes pollués par des métaux lourds constitue un enjeu économique et environnemental. Le développement de nouveaux procédés impliquant des micro-organismes pourrait permettre d'apporter des solutions alternatives écologiques et moins coûteuses que les procédés chimiques actuellement utilisés. De par leur activité métal-réductase, les bactéries sulfato-réductrices sont de bonnes candidates pour une dépollution à l'échelle industrielle. La caractérisation des enzymes compétentes pour la réduction des métaux par ces bactéries permettra d'améliorer le processus de bioremédiation.

The treatment of soils and ground water polluted by heavy metals is of economical and environmental interest. The development of new processes using micro-organisms may offer alternative ecological solutions less expensive than usual chemical processes. In addition to the chemical indirect reduction due to the production of H₂S, sulfate-reducing bacteria can also reduce metals directly by an enzymatic way. So, these bacteria are good candidates for industrial metal removal. The characterization of competent enzymes for metal reduction will improve the bio-remediation process. Among them, a low redox potential tetrahemic cytochrome c₃ is a constitutive enzyme of the sulfate-reducing bacteria. The reduction of U (VI) and Cr (VI) by this cytochrome has already been demonstrated. Studies presented here show that others homologous cytochromes can reduce V (V), Mn (IV), Fe (III) and Cr (VI). The results indicate that only the low redox potential cytochromes present in sulfate-reducing bacteria can act as metal-reductases. We also observed that sulfate-reducing bacteria rapidly reduce chromate. Growth with Cr (VI) induces morphological changes and a decrease in the growth rate of the bacteria.

Les métaux toxiques représentent une des sources de pol- lution les plus difficiles à éliminer au niveau des sols, des sédiments et des effluents. En effet, les métaux tels que le mercure, le cadmium, l'arsenic, le plomb, le cuivre, le chrome... sont particulièrement dangereux, de même

que leurs composés. Dans le cas du chrome, par exemple, l'ion Cr(VI) est un oxydant puissant qui s'accumule dans tous les organes. L'exposition chronique provoque des cancers parfois 20 à 30 ans après exposition.

Le développement industriel (chimie, pétrochimie, métal- lurgie, automobile, traitement de surface...) est respon- sable de l'augmentation des rejets comportant des métaux lourds toxiques aussi bien pour l'environnement au sens général que pour l'homme. Pour les mines pratiquant l'extraction des métaux de base, les eaux de drainage acides présentent un pH compris entre 2 et 4, et des concentrations élevées en sulfate et métaux (Fe, Al, Cu, Zn, As, Ni, Co, Cd, Pb...).

Contrairement aux polluants organiques, les métaux et métalloïdes ne sont pas dégradés. La neutralisation à la chaux, couramment appliquée, est efficace mais relative- ment coûteuse. De plus, ce traitement chimique génère des quantités non négligeables de résidus solides non valo- risables. À l'heure actuelle, il n'existe pas de procédé éco- nomiquement rentable permettant une réutilisation des sols ou des matériaux contaminés par des métaux toxiques. Les techniques existantes impliquent soit un traitement chi- mique (mise en solution des ions métalliques toxiques par lixiviation en réacteur ou fixation des ions métalliques dans les matériaux conduisant à l'inertage des sols), soit un confinement pur et simple des sols et matériaux sur le site par encapsulation ou hors-site dans un site d'en- fouissement technique. Dans tous les cas, les solutions exis- tantes interdisent une réutilisation des sols et des maté- riaux, qui contiennent toujours (en absence de lixiviation) les métaux polluants ou les produits chimiques utilisés pour les éliminer. La réduction des métaux par les bactéries pourrait donc être une technique alternative efficace, éco- logique et moins coûteuse que les techniques chimiques, pour détoxifier les milieux pollués.

## INTÉRÊT DES BACTÉRIES SULFATO-REDUCTRICES

Les bactéries sulfato- et soufre-réductrices constituent un groupe de bactéries anaérobies dont la caractéristique commune est l'utilisation du soufre et/ou de ses formes
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Observation en microscopie optique de Desulfomicrobium norvegicum
a/en absence de Cr (VI), b/en présence de 250 µM Cr (VI). Référence = 10 µm</figcaption></figure>

oxydées comme accepteur d'électrons. Cette respi-
ration des sulfates se distingue des autres types de respi-
ration par l'implication de cytochromes c multihémiques
de très bas potentiels. Un grand nombre de cytochromes
c possédant 4, 8 ou 16 hèmes ont été découverts chez
les bactéries soufre- et sulfato-réductrices, conduisant à
la définition d'une superfamille de cytochromes c3. Divers
traitements biologiques utilisant des bactéries sulfato-
réductrices (BSR) ont été élaborés depuis plusieurs
dizaines d'années. Mais, jusqu'à une date récente, il était
généralement admis que la précipitation des métaux résul-
tait du métabolisme bactérien de façon indirecte, par l'ef-
fet conjugué d'une alcalinisation du milieu et de la pro-
duction d'hydrogène sulfuré. En 1991, Lovley et al[1,2]
signalent que la réduction des métaux dans les milieux
anaérobies est souvent le résultat d'une réduction enzy-
matique directe par les bactéries. Ainsi, Desulfovibrio desul-
furicans, une BSR, est capable de réduire enzymatiquement
l'uranium qui précipite sous forme d'uranite (UO2).

L'étude de ce mécanisme de réduction a établi que le
cytochrome c₃, caractéristique des BSR du genre
Desulfovibrio, était responsable de la réduction enzymatique
de l'uranium. En présence d'hydrogénase, son partenai-
re physiologique, et d'hydrogène, il réduit l'U(VI), et
entraîne sa précipitation. Ce même processus peut être

étendu à la réduction du chrome[3] et du méthyl-mercu-
re[4]. Ce cytochrome peut être considéré comme le pre-
mier enzyme modèle pour la réduction de métaux lourds.
Aussi, il est envisageable d'utiliser des cellules entières,
libres ou fixées, en bioréacteurs ou de mettre en œuvre des
enzymes efficaces dans des réacteurs à enzymes fixées.
Lorsque des cellules entières seront utilisées, les deux
mécanismes de précipitation, réduction enzymatique et
réaction avec l'H2S d'origine bactérienne seront combinés.

ÉTUDE DE L'IMPACT DU CR (VI) SUR
LES BACTÉRIES SULFATO-RÉDUCTRICES

Malgré la toxicité des métaux lourds, la présence de micro-organismes, notamment de BSR, a été mise en évidence dans des milieux contaminés. Notre démarche a donc été d'étudier les effets du Cr(VI) sur la croissance et la morphologie des BSR.

Pour cette étude, *Desulfomicrobium norvegicum* a été cul-
tivée (inoculation à 10 % (vol/vol)) sur milieu de Starkey
(pH 7,2) en conditions anaérobies à 37 °C en présence
de Cr (VI) à diverses concentrations. Il a été observé
que cette souche est capable de croître en présence
d'une concentration de Cr(VI) pouvant aller jusqu'à
500 µM, et ceci pendant plusieurs repiquages successifs.
Cependant la croissance est ralentie en présence du
métal : la phase stationnaire est atteinte après 24 heures de croissance (au lieu de 20 heures en absence de Cr(VI)). L'observation par microscopie optique des cellules a montré un changement de morphologie (photos 1a et 1b) : en présence de Cr(VI), les bactéries forment de longs filaments. On peut donc supposer que le Cr (VI) affecte la séparation des cellules après leur division. On peut également observer un allongement et un épaississement des cellules en présence de Cr(VI).

L'activité chromate réductase de Desulfomicrobium norvegicum a été mesurée à 37 °C en suivant la disparition du chrome hexavalent réduit en Cr(III) dans un milieu (tampon bicarbonate, pH 6,8) ne contenant pas de sulfate afin d'éviter une production d'H₂S par les bactéries (figure 1). Le dosage du Cr(VI) se fait par la méthode du diphénylcarbazide[3]. Les résultats montrent que la réduction du Cr(VI) par Desulfomicrobium norvegicum (10¹⁰ cellules environ) a lieu dès les premières minutes ; tout le Cr(VI) disparaît en 30 minutes. Desulfomicrobium norvegicum cultivée en présence de chromate (sur milieu de Starkey) pendant plusieurs générations possède toujours la capacité de réduire le métal. L'activité Cr(VI) réductase est cependant plus faible que celle obtenue lorsque la souche est cultivée en absence de chromate. Nous avons aussi étudié l'activité Cr(VI) réductase de la souche en fonction du donneur d'électrons (figure 2) : Desulfomicrobium norvegicum est capable de réduire le Cr(VI) en utilisant le lactate (6 g/l) ou l'hydrogène (présent en excès) comme donneurs d'électrons. Ce dernier résultat est intéressant d'un point de vue industriel, l'H₂ étant un substrat industriel peu onéreux.

## ÉTUDE DE LA REDUCTION DES MÉTAUX PAR LES CYTOCHROMES C₃

Les cytochromes c₃ sont des protéines périplasmiques présentes chez toutes les BSR du genre Desulfovibrio et sont les partenaires physiologiques (accepteurs d'électrons) des hydrogénases également périplasmiques. La présence de trois types différents de cytochromes c multihémiques formant la superfamille des cytochromes c₃ a été mise en évidence dans notre laboratoire[5] :

- le cytochrome c₃ tétrahémique (Mr 13000), possédant 4 hèmes par molécule ;

- le cytochrome c₃ octahémique (Mr 26000), composé de deux sous-unités identiques et huit hèmes par molécule;

- et le cytochrome Hmc de poids moléculaire 65500 Da, comportant 16 hèmes par molécule.

Ces cytochromes ont été purifiés selon le protocole décrit dans la référence 5.

Tous ces cytochromes sont homologues et sont le résultat de mutations et/ou de fusions de gènes produits au cours de l'évolution de ces bactéries anciennes (environ 3 milliards d'années). Le cytochrome c₃ tétrahémique est l'unité structurale de base de la superfamille des cytochromes c₃. Tous les hèmes de ces cytochromes sont caractérisés par les mêmes ligands axiaux du fer, qui sont

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 1 : Activité chromate réductase de Desulfomicrobium norvegicum cultivée en absence (●) ou en présence (○) de 250 µM Cr (VI).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 2 : activité chromate réductase de Desulfomicrobium norvegicum en fonction du donneur d'électrons : lactate (●), H₂ (○). Aucune réduction du Cr (VI) n'est observée en absence de donneurs d'électrons</figcaption></figure>

deux résidus d'histidine au lieu d'histidine et méthionine dans les cytochromes mitochondriaux, et qui sont responsables de leur potentiel d'oxydoréduction très bas (-200 à -400 mV). Ces cytochromes possèdent de plus des propriétés de conductivité et de thermostabilité remarquables (température de dénaturation supérieure à 100 °C)[6], ce qui présente des avantages certains au niveau d'une utilisation industrielle. Leur structure tridimensionnelle ne montre aucune similarité structurale avec le cytochrome c mitochondrial.
Un autre cytochrome n'appartenant pas à la superfamil-
le des cytochromes c₃ a été mis en évidence chez les
BSR. Le cytochrome c553[7] est un cytochrome monohé-
mique ayant un potentiel positif (+40 mV) et dont l'hè-
me possède une coordination histidine-méthionine du
fer.

Une approche électrochimique (études cinétiques du transfert d'électrons entre protéines et métaux par vol-tamétrie cyclique) a été utilisée afin d'étudier la réduction de métaux, comme le Fe(III), le V(V), le Mn(IV) et le Cr(VI) par des cytochromes purifiés[8,9,10]. Ces cytochromes appartiennent soit à la superfamille des cytochromes c3 (cytochrome c3 tétrahémique de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, de Desulfomicrobium norvegicum et Desulfovibrio gigas, cytochrome c7 de Desulfuromonas ace-toxidans), soit à la classe I des cytochromes (cytochrome c553 de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, cytochrome c mitochondrial du cœur de cheval). La classe I regrou-pe des cytochromes monohémiques de potentiel positif, avec une coordination histidine-méthionine du fer de l'hème.

Le processus de réduction catalytique d'un complexe
soluble du métal par les cytochromes multihémiques per-
met de mesurer une constante de vitesse de second
ordre d'environ 5.10⁵ M⁻¹·s⁻¹. Les résultats obtenus[8,9]
montrent que les cytochromes c de type mitochondrial
et le cytochrome c553 de Desulfovibrio vulgaris
Hildenborough n'ont pas d'activité métal-réductase,
contrairement aux cytochromes de la superfamille des
cytochromes c₃, ce qui suggère que la réduction des
métaux nécessite la présence de centres hémiques de
bas potentiel coordinés par deux histidines au fer de l'hè-
me.

PERSPECTIVES

La sélection de différentes souches de BSR, isolées de bas-
sins miniers, ou de bactéries thermophiles, issues de
sources hydrothermales à grande profondeur, est en
cours afin de choisir les souches les plus performantes
pour la réduction de différents métaux lourds toxiques.
Un approfondissement de l'étude de l'impact du Cr(VI)
sur la croissance bactérienne et de la cinétique de réduc-
tion du Cr(VI) en conditions environnementales sont
également en réalisation par utilisation de la microcalo-
rimétrie.

D'une manière plus fondamentale, le mécanisme de réduc-
tion enzymatique est en cours d'étude. Des essais préli-
minaires en bioréacteurs ensemencés par des BSR mon-
trent un processus rapide de dépollution par passage à
travers le bioréacteur d'un effluent contaminé par des
métaux.

Caroline Michel, Bruno Chardin, Mireille Bruschi

CNRS - Bioénergétique et ingénierie des protéines - Institut de biologie structurale et microbiologie - 31, chemin Joseph Aiguier - 13402 Marseille cedex 20

Cette étude a pu être réalisée grâce au soutien de l'ADEME et du BRGM.

Bibliographie

1. Lovley D.R., Widman P.K., Woodward J.C. and Phillips E.J.P. (1992). *Reduction of uranium by Desulfovibrio desulfuricans*. *Appl. Environ. Microbiol.* **58**, 850-856.

2. Lovley D.R., Widman P.K.,
Woodward J.C. and Phillips E.J.P.
(1993). Reduction of uranium by cyto-
chrome c3 of Desulfovibrio vulgaris. Appl.
Environ. Microbiol. 59, 3572-3576.

3. Lovley D.R. and Phillips E.J.P. (1994). Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c3 cytochrome. *Appl. Environ. Microbiol.* **60**, 726-728.

4. Choi S.C., Chase T. and Bartha R. (1994). Enzymatic catalysis of mercury methylation by Desulfovibrio desulfuri-cans LS. *Appl. Environ. Microbiol.* **60**, 1342-1346.

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chromes from sulfate-reducing bacteria in
organic microbial sulfur metabolism. A
volume of methods in enzymology. John
N. Abelson and Melvin I. Simon Editors-
In-Chief (edited by H.D. Peck and J. Le
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6. Florens L., Bianco P., Haladjian J., Bruschi M., Protasevich I. and Makarov A. (1995). *Thermal stability of the polyheme cytochrome c3 superfamily*. F.E.B.S. Lett. 373, 280-284.

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10. Aubert C., Lojou E., Bianco P., Rousset M., Durand M.C., Bruschi M. and Dolla A. (1998). *The Desulfuromonas acetoxidans triheme cytochrome c7 produced in Desulfovibrio desulfuricans retains its metal reductase activity*. *Appl. Environ. Microbiol.* **64**, 1308-1312.

Déchets Design
Les ambassadeurs du futur

Gérard Bertolini

Déchets et Design

Les ambassadeurs du futur

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Rapprocher déchet et design
peut paraître singulier.
Pourtant, le déchet intervient
comme mécanisme de rappel;
au-delà, il interpelle les desi-
gners, et plus largement les
créateurs. De plus en plus, ils
devront avoir une démarche
prospective, anticipatrice, pré-
ventive, remettre en cause la
conception des produits pour
mieux tenir compte de l'après-
usage et des préoccupations
environnementales, qui consti-
tuent des valeurs d'avenir.

Et puis, une fois n'est pas assez. Réemploi, réutilisation, recyclage, boucles et cascades, les produits doivent devenir des re-produits, les créateurs des re-créateurs.

Enfin, le produit doit être efficace dans sa mission, ainsi que dans sa démission. Pour les déchets ultimes (à réduire autant que possible), leur concours peut là encore être pré-cieux.

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