$$v(t) = A \sum_{n=-\infty}^{\infty} (-1)^n J_n(\beta) \cos \left[ (\omega_p + n\omega_m) t \right] \quad (II.3.9)$$

En analysant l'Eq. (II.3.9), on peut tirer les conclusions suivantes :

- la construction du spectre est symétrique autour de la porteuse;

- les bandes latérales sont séparées de la fréquence de modulation;

- l'amplitude de la modulation est argument de la fonction de Bessel de première espèce d'ordre $n$;

- plus $\beta$ est élevé, plus la bande passante du spectre est large.

Ces constatations sont confirmées par la Fig. II.3.1 qui présente les résultats obtenus en utilisant l'Eq. (II.3.7).

Par la suite, nous nous intéresserons aux petites amplitudes de modulation. Dans ce cas, comme le montre la Fig. II.3.1(c) l'essentiel de l'information est concentrée dans les premiers termes de l'Eq. (II.3.9).

### 3.1.2 Quelques propriétés des modulations de fréquence de faible amplitude ($\beta \ll 1$)

Comme j'ai pu l'évoquer précédemment, dans le cas d'une modulation de faible amplitude, l'essentiel de l'énergie du spectre de la modulation sera compris dans les composantes en $\omega_p$, $\omega_p - \omega_m$ et $\omega_p + \omega_m$. Ces composantes sont respectivement d'amplitude $|J_0(\beta)|$, $|J_{-1}(\beta)|$, et $|J_{+1}(\beta)|$. Il est à noter que l'indice de modulation $\beta$ peut être retrouvé à partir de l'analyse du spectre de la modulation. En effet, si on considère deux fonctions de Bessel de première espèce et d'ordre consécutif, on peut écrire [54] :

$$\frac{|J_1(\beta)|}{|J_0(\beta)|} \approx 2\beta. \qquad (II.3.10)$$

Ainsi, toute grandeur physique liée à $\beta$ pourra être retrouvée en calculant le rapport de deux fonctions de Bessel de première espèce consécutives. Cette propriété sera avantageusement utilisée en vibrométrie comme nous le verrons par la suite. La propriété énoncée Eq. (II.3.10) restera valable pour des fonctions de Bessel d'ordre plus élevé. On prendra néanmoins garde à ce que la fonction de Bessel du dénominateur soit non nulle.

### 3.1.3 Application à la mesure quantitative d'amplitudes de vibrations mécaniques

Je détaillerai ici la méthodes et les principaux résultats développés dans les références [72, 74].

Intéressons nous tout d'abord aux vibrations hors-plan, en régime harmonique, d'une cale piézo-électrique (PZT). Cette cale est mise en vibration à la pulsation $\omega$, et éclairée avec un laser de pulsation $\omega_L$. Il en résulte une modulation de la phase de l'onde réfléchie $\Phi(t)$ par la surface du PZT telle que :

$$\Phi(t) = \Phi_0 \sin(\omega t). \qquad (II.3.11)$$

Comme évoqué précédemment, le spectre de l'onde réfléchie par le PZT peut être décomposé sur une base de fonctions de Bessel de première espèce $J_n(\Phi_0)$ en utilisant l'Eq. (II.3.9). On peut ainsi écrire le champ $E$ réfléchi par l'objet comme :

$$E = \sum_{n=0}^{\infty} E_n = \sum_{n=0}^{\infty} \varepsilon_n e^{i(\omega_L + n\omega)t}. \qquad (II.3.12)$$
Une interprétation de l'Eq. (II.3.12) est que la modulation de phase du champ objet E à la pulsation ω donne naissance à des harmoniques d'amplitude complexe εn. Comme nous travaillerons sur de petites amplitudes de vibration, l'essentiel de l'énergie sera concentrée sur les harmoniques d'ordre ±1. L'amplitude εn de l'harmonique d'ordre n est dans ce cas donnée par :

$$
\epsilon_n = \epsilon J_n(\Phi_0), \qquad (II.3.13)
$$

où ε est l'amplitude de l'illumination, et Φ₀ la profondeur de modulation mécanique due à
la vibration du PZT et telle que

$$
\Phi_0 = \frac{4\pi z}{\lambda}, \qquad (II.3.14)
$$

où z est l'amplitude de vibration hors-plan. Ce comportement est mis en évidence par la Fig.

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>FIGURE II.3.2 – Spectre de la lumière réfléchie par un modulateur piézoélec-
trique en vibration harmonique à 10 kHz.</figcaption></figure>

II.3.2. Ici, nous avons réalisé une acquisition hétérodyne en balayant la fréquence des AOM sur ±25 kHz pour analyser la lumière réfléchie par un modulateur piézoélectrique en vibration harmonique à ω/2π = 10 kHz. Comme prévu par l'Eq. (II.3.12), le spectre reconstruit comporte des harmoniques à la fréquence de vibration. Le nombre limité d'harmoniques constaté dans le spectre de la Fig. II.3.2 s'explique par la faible amplitude de la vibration. Ainsi, en utilisant l'Eq. (II.3.10) on peut estimer l'amplitude de vibration hors plan z qui est telle que

$$
z = \frac{\lambda J_1(\Phi_0)}{2\pi J_0(\Phi_0)} \qquad (II.3.15)
$$

L'enjeu devient alors de mettre au point un dispositif permettant de mesurer le mode fondamental et l'un des deux harmoniques de la vibration. Le schéma de principe du dispositif mis en place est proposé Fig. II.3.3. Il s'agit d'une configuration Mach-Zenhder en réflexion. On illumine ici un module PZT oscillant à la pulsation ω. Pour être en mesure d'accéder au spectre de la vibration, et de mesurer simultanément le mode fondamental de vibration et l'un des harmoniques de fréquence, nous pilotons les AOM de telle sorte à réaliser un multiplexage fréquentiel dans la bande passante de la caméra [83]. Ainsi, le premier AOM est piloté à sa fréquence de fonctionnement ωC, le second AOM permettra de réaliser la détection 4 phases de ε₀ et ε₋₁.

D'un point de vue temporel, l'onde de référence (oscillateur local) ELO peut être vue comme la somme des deux contributions ELO₁ et ELO₂ de telle sorte que :

$$
\begin{align*}
E_{LO} &= E_{LO_1} + E_{LO_2} \\
E_{LO_1} &= \varepsilon_{LO1} e^{i(\omega_L + \omega_S/4)t} \tag{II.3.16} \\
E_{LO_2} &= \varepsilon_{LO2} e^{i(\omega_L + \omega + \omega_S/4)t},
\end{align*}
$$
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>FIGURE II.3.3 – Schéma de principe de la détection d'amplitudes de vibration par holographie hétérodyne.</figcaption></figure>

avec $\varepsilon_{LO_1} = \alpha\varepsilon_{LO}$ et $\varepsilon_{LO_2} = \beta\varepsilon_{LO}$. Ici $\alpha$ et $\beta$ sont les poids relatifs des deux composantes d'oscillateur local dans l'onde de référence $\varepsilon_{LO}$. Ils satisfont à la relation $\alpha + \beta = 1$.

Le principe de l'acquisition à multiplexage temporel est proposé Fig. II.3.3. Il s'agit d'une configuration Mach-Zehnder en réflexion. La lumière réfléchie par le module piézoélectrique, oscillant à $\omega = 10$ kHz, est recombinée, dans le plan du capteur, avec l'onde de référence. Cette dernière est multiplexée temporellement. Le premier AOM est mis en fonction à sa pulsation $\omega_C$. Pour réaliser le multiplexage temporel, le second AOM est couplé à un combineur radiofréquence de signaux. Le premier signal, à la pulsation $\omega_C + \omega_S/4$ permettra de détecter, en quatre phases, l'ordre 0. Le second signal, à la pulsation $\omega_C + \omega - \omega_S/4$ permettra de détecter l'ordre +1 de l'oscillation mécanique.

Pour comprendre l'intérêt de la méthode, reprenons l'Eq. (I.2.12) :

$$I_{H_{PS}} = \sum_{k=0}^{N-1} I_{H_k} e^{-i2\pi k/N}.$$

En l'état, l'application directe de l'Eq. (I.2.12) permet de démoduler l'ordre +1 de diffraction soit le terme à la pulsation $\omega_C + \omega - \omega_S/4$. En modifiant l'équation précédente de telle sorte que :

$$I_{H_{PS-1}} = \sum_{k=0}^{N-1} I_{H_k} e^{i2\pi k/N},$$

il est possible, à partir des mêmes données d'accéder à l'ordre $-1$ et donc l'information liée à la composante d'ordre 0 de l'oscillation mécanique. On peut donc relever les deux contributions simultanément tout en maintenant la cohérence de phase des signaux.

Avant d'analyser plus en détail le contenu fréquentiel des hologrammes tels qu'ils seront acquis par la caméra, concentrons nous sur le contenu spectral de l'onde de référence. Le spectre de l'onde de référence est reporté Fig. II.3.4(a). On voit que deux composantes de fréquence sont présentes :

- une composante à 0 Hz qui correspond à la signature du terme associé à $|\varepsilon_{LO_1}|$ de l'Eq. (II.3.16);

- une composante à 10 kHz caractéristique du terme associé à $|\varepsilon_{LO_2}|$.
<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>FIGURE II.3.4 – Spectres du module PZT. (a) Spectre fréquentiel de l'onde de référence. (b) Spectre de l'hologramme dans la bande passante de la caméra.</figcaption></figure>

On peut remarquer ici que le poids relatif des deux composantes d'oscillateur local est de l'ordre de $\alpha/\beta = 1/10$. Cette caractéristique devra être prise en compte lors de l'estimation du déplacement hors-plan du module PZT.

On peut maintenant déterminer l'expression de l'intensité de l'hologramme dans le plan de la caméra comme la somme du champ réfléchi par le PZT (voir Eq. (II.3.12)) et l'onde de référence donné par l'Eq. (II.3.16)

$$I = \left| \sum_{n=0}^{\infty} E_n + E_{LO1} + E_{LO2} \right|^2. \qquad (II.3.17)$$

En se limitant à la bande passante temporelle de la caméra, à savoir $\pm\omega_S/2$, seules 3 composantes de fréquence peuvent être extraites. De plus, compte-tenu de la configuration hors-axe, le contenu de l'hologramme filtré $H(t)$ est le suivant :

$$H(t) = \varepsilon_0 \varepsilon_{LO1}^* e^{-i\omega_S t/4} + \varepsilon_1 \varepsilon_{LO2}^* e^{i\omega_S t/4}. \qquad (II.3.18)$$

Le spectre $\tilde{H}(\omega_k)$ est illustré Fig. II.3.4(b). De là en démodulant ces deux informations, il est possible d'estimer l'amplitude de la vibration hors plan en utilisant l'Eq. (II.3.15) :

$$z \approx \frac{\lambda}{2\pi} \frac{\alpha}{\beta} \left| \frac{\langle \tilde{H}(\omega_S/4) \rangle}{\langle \tilde{H}(-\omega_S/4) \rangle} \right|. \qquad (II.3.19)$$

Ici $\langle \cdot \rangle$ correspond au moyennage spatial de l'image du PZT sur une zone de 100×100 pixels. Afin de montrer la validité de la démarche, une série d'acquisitions a été réalisée pour des tensions d'alimentation décroissantes. Pour chaque valeur de tension, 256 hologrammes avec un seul oscillateur local et 256 hologrammes avec les 2 oscillateurs locaux sont acquis, soit 32 accumulations en champ démodulées en 4 phases. L'amplitude de la vibration est calculée grâce à l'Eq. (II.3.19). Les valeurs obtenues avec un et deux oscillateurs locaux ainsi que l'évolution théorique de l'amplitude de vibration $z$ sont reportées Fig. II.3.5. On remarque que la méthode à deux oscillateurs locaux proposée permet d'obtenir une amplitude de vibration subnanométrique. À titre de comparaison, nous avons calculé le même déplacement si les acquisitions ne sont plus multiplexées, c'est à dire que l'on alterne des acquisitions de l'ordre 0 et de l'ordre +1 sur tout le spectre de la vibration. On remarque que cette fois, le niveau de détection est limité à 10 nm. Ceci est dû à la perte de cohérence de phase entre les acquisitions des deux ordres. Dans le cas d'une méthode multiplexée, les acquisitions des deux ordres sont simultanées, ce qui garantit la cohérence de phase. Ce point est mis en
<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>FIGURE II.3.5 – Amplitude de vibration en fonction de la tension d'alimentation du PZT pour une analyse à un ou deux oscillateurs locaux.</figcaption></figure>

évidence par les diagrammes de constellation en insert de la Fig. II.3.5. Il s'agit d'une représentation, dans le plan complexe du rapport entre les deux bandes latérales démodulées. On peut remarquer que l'information donnée par les deux méthodes est similaire aux grandes amplitudes de vibration alors qu'aux plus petites amplitudes, l'information est beaucoup dispersée pour la méthode à un seul oscillateur local. On peut cependant remarquer que si le signal dans la composante $\epsilon_0$ est nul, l'Eq. (II.3.19) ne permet plus d'estimer le déplacement hors-plan.

Nous avons pu proposer une alternative lors de mon post-doc à Montpellier [74]. Ici, la mesure simultanée de $E_0$ et $E_1$ associée au calcul de l'Eq. (II.3.19) est remplacée par le calcul du produit de corrélation des harmoniques 0 et 1 qui pourront être acquises simultanément ou successivement. Dans ce cas, on peut montrer que l'amplitude complexe $\Phi(x, y)$ de la vibration s'écrit

$$ \Phi(x, y) = 2 \frac{\langle E_1 E_0^* \rangle_{x,y}}{\langle |E_0|^2 \rangle_{x,y}}, \qquad (II.3.20) $$

où $\langle E_1 E_0^* \rangle_{x,y}$ est la corrélation entre les harmoniques d'ordre 0 et d'ordre 1, et $\langle |E_0|^2 \rangle_{x,y}$ est l'autocorrélation de l'ordre 0. De là, on peut déduire l'amplitude $z$ et la phase $\varphi$ de l'oscillation

$$ \begin{gathered} z(x, y) = \frac{\lambda}{2\pi} \left| \frac{\langle E_1 E_0^* \rangle_{x,y}}{\langle |E_0|^2 \rangle_{x,y}} \right| \\ \varphi(x, y) = \arg[\Phi(x, y)]. \end{gathered} \qquad (II.3.21) $$

Pour démontrer l'intérêt de la méthode, nous avons estimé l'amplitude de vibration d'une hanche de clarinette mise en vibration grâce à un haut-parleur. Pour chaque valeur de la tension d'alimentation, 128 hologrammes de la porteuse $E_0$ puis de la bande latérale $E_1$
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>FIGURE II.3.6 – Amplitude de vibration en fonction de la tension d’excitation de la hanche de clarinette.</figcaption></figure>

sont acquis et démodulés en 4 phases. Ainsi, pour chaque tension d'alimentation du haut-
parleur, nous avons pu calculer le rapport ⟨E₁E*₀⟩ₓ,y / ⟨|E₀|²⟩ₓ,y ≈ Φ/2 et tracer son évo-
lution. Les résultats obtenus sont proposés Fig. II.3.6. Les mesures sont ici superposées à la
théorie donnée par l'Eq. (II.3.10). On remarque que les données sont bien représentées par
le modèle jusqu'au seuil de bruit. Ce seuil représente la limite du shot-noise, à savoir un
photo-électron par pixel sur la durée de l'acquisition. Ce seuil correspond à une amplitude
du champ diffusé de |Φ| ≈ 7 × 10⁻⁵ soit un déplacement z ≈ 10⁻² nm c'est à dire λ/78000,
ce qui est bien en dessous des limites prévues pour des méthodes conventionnelles [84].

L'un des intérêts de l'holographie hétérodyne réside dans le fait qu'une modification du signal de pilotage permet, sans modifier la partie optique du montage, de changer le comportement du dispositif. Sur ce principe, nous avons développé un montage stroboscopique que je vais maintenant détailler.

**3.1.4 Imagerie laser Doppler stroboscopique**

Pour réaliser l'imagerie stroboscopique d'une sollicitation mécanique, nous reprenons le montage présenté Fig. II.3.3 et modifions le pilotage des modulateurs acousto-optiques. Le dispositif et les signaux de pilotage des modulateurs sont reportés Fig. II.3.7. On cherche ici à caractériser l'amplitude et la phase de l'amplitude de vibration mécanique d'une languette cartonnée. Pour ce faire, l'oscillateur local est modulé en amplitude par un signal rectangulaire $H_{\text{AM}}(t)$ et s'écrit alors :

$$
E_{\text{LO}} = \varepsilon_{\text{LO}} e^{i(\omega_{\text{L}} + \Delta\omega)t} H_{\text{AM}}(t), \qquad (\text{II.3.22})
$$

où ω_L est la pulsation du laser, Δω le décalage de la porteuse, et ε LO l'amplitude complexe de
l'oscillateur local. Le rapport cyclique du signal H AM correspond ici à l'inverse du nombre
d'images n qui sera utilisé pour le phase-shifting. On notera τ S la période d'acquisition de
la caméra, τ P la période du signal de modulation H AM (t) et τ M la période de l'oscillation
mécanique. La languette cartonnée est excitée par un signal sinusoïdal d'amplitude z max tel
que :

$$
z(t) = z_{\text{max}} \sin (\omega_M t + \psi). \qquad (\text{II.3.23})
$$
<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>FIGURE II.3.7 – Montage d'imagerie laser Doppler stroboscopique. (b) Chronogrammes des acquisitions pour une séquence de n images. Le signal stroboscopique est décalé d'un $m^{\text{ième}}$ de période. (c) Signal après $m \times n$ acquisitions. Dans cet intervalle de temps, le signal stroboscopique parcourt l'oscillation mécanique. $\tau_S$: période caméra, $\tau_M$: période mécanique, $\tau_P$: période stroboscopique. Adapté de la référence [73].</figcaption></figure>

Ici, $\psi$ est le déphasage entre la phase de l'excitation mécanique et la phase locale de la languette cartonnée.

Le principe de pilotage des modulateurs est donné par les chronogrammes de la Fig. II.3.7(b,c). Nous raisonnons ici sur une démodulation temporelle à n images par « instant » de l'oscillation mécanique. La période de l'oscillation sera découpée en m « instants ». Ainsi, le signal stroboscopique, de pulsation $\omega_P$ sera décalé d'un $m^{\text{ième}}$ de période toutes les n images. On procède de même pour les m positions sur la période mécanique de l'oscillation. Ainsi pour obtenir le décalage désiré, la pulsation du signal stroboscopique est telle que :

$$ \omega_P = \omega_M + \frac{\omega_S}{nm}. \qquad (II.3.24) $$

De plus, un décalage fréquentiel $\Delta\omega = \omega_M + \omega_S/n$ est ajouté pour réaliser la détection de la première bande latérale. La démodulation de la séquence de $m \times n$ hologrammes $I_k$ est alors réalisée en deux temps :

1. Les m instants de l'oscillation mécanique $M_p$ avec $p = 1...m$ sont extraits de la séquence d'hologrammes :

$$ M_p = \sum_{k=1}^{n} I_{k+(p-1)m} \exp \left( -\frac{2i\pi k}{n} \right). \qquad (II.3.25) $$

2. L'intensité des images mécaniques démodulées $|M_p|^2 \propto z_{\text{max}} \sin(2p\pi\omega_M/\omega_S + \psi)$ est utilisée pour construire la carte locale de la vibration Q qui s'obtient comme :

$$ Q = \sum_{p=1}^{m} |M_p|^2 \exp \left( -\frac{2i\pi p}{m} \right). \qquad (II.3.26) $$

Dans le cas où $z_{\text{max}} \ll \lambda$, l'amplitude de la vibration est proportionnelle à l'amplitude de la carte de vibration soit $|Q| \propto z$ et l'argument de Q renseigne sur le déphasage entre l'excitation mécanique et la languette vibrante : $\psi \equiv \arg(Q)$ [$2\pi$]. Pour vérifier le concept, nous avons réalisé des acquisitions de séquences de $m \times n = 16$ hologrammes pour des valeurs de $\psi$ entre 0 et $2\pi$ rad. Nous nous intéresserons ici davantage à la phase de l'oscillation
mécanique étant donné que la partie liée à l'amplitude a été traitée dans la section précé-
dente. L'ensemble des résultats obtenus est regroupé Fig. II.3.8. Le champ optique mesuré

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>FIGURE II.3.8 – Etude de la vibration mécanique d’une languette de carton. (a) amplitude du champ optique. (b-d) cartes de phase mécaniques (c) pour $\psi = 0$, (d) pour $\psi = \pi$ et (b) sans régime stroboscopique. (e) profils de niveaux de gris extraits sur les lignes AB et A'B'. (f) déphasage mesuré par rapport au déphasage de l'excitation. Adapté de la référence [73].</figcaption></figure>

sur la bande latérale (a) met en évidence la présence de nœuds (bandes noires) et de ventres (bandes blanches) de vibration. Nous n'avons en revanche aucune information quant au sens du déplacement. De même, si l'illumination n'est pas stroboscopique (b), il est impossible de distinguer la phase de la vibration mécanique. Lorsque le mode stroboscopique est activé (c,d), il est possible de visualiser les zones en phase et en opposition de phase. Ce point est d'ailleurs confirmé par le tracé des profils de niveaux de gris le long des lignes AB et A'B'. Pour valider le tout, nous avons de plus comparé le déphasage mesuré sur la languette par rapport au déphasage de l'excitation. Les relevés (f) présentent un bon accord avec les résultats attendus.
Jusqu'ici, je suis revenu sur les applications de l'holographie hétérodyne pour la détection de phénomènes harmoniques. Cependant, si on s'intéresse aux applications biomédicales de la technique, les signaux détectés sont très rarement harmoniques. L'intérêt de l'holographie hétérodyne réside dans la facilité de pilotage des modulateurs. Ainsi, si l'on cherche à mesurer un spectre élargi, on pourra balayer les modulateurs en fréquence pour reconstruire l'information. Discutons maintenant ces aspects autour de l'extraction quantitative du flux sanguin chez le Danio Rerio.

## 3.2 Imagerie laser Doppler pour la caractérisation de flux sanguins

### 3.2.1 Principe de l'holographie hétérodyne appliquée à la détection de flux

La problématique ici est très différente de la vibrométrie. En effet dans le cas d'un flux sanguin, nous ne réalisons pas une détection de bande latérale. En effet, comme le montre

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>FIGURE II.3.9 – Principe de la mesure de flux sanguin par imagerie laser Doppler. (a) Élargissement Doppler. (b) Illustration du filtrage hétérodyne pour la mesure de spectre étendu. Adapté de la référence [77].</figcaption></figure>

la Fig. II.3.9(a) à la traversée d'un milieu diffusant, le champ incident $E_i(k_i, \omega_i)$ est diffusé pour donner le champ $E_s(k_s, \omega_s)$. Le spectre du champ diffusé est élargi et l'ensemble des vecteurs d'ondes $k_s$ porte la signature de l'interaction avec le milieu. À noter que les vecteurs $k_s$ sont collectés dans un cône limité par l'ouverture numérique du système optique de collection. L'onde diffusée est soumise à un décalage Doppler. En considérant un milieu faiblement diffusant, ce dernier est donné par :

$$ \omega_s - \omega_i = \mathbf{q} \cdot \mathbf{v}, \qquad (II.3.27) $$

où $\mathbf{q} = (k_s - k_i)$ est le vecteur diffusion. Ainsi, la mesure du vecteur diffusion permettra d'accéder au vecteur vitesse v des particules diffusantes. Cependant, comme évoqué précédemment, la composante diffusée n'est mesurable que dans un cône borné par l'ouverture numérique de l'optique de collection. De plus, si la bande passante de la caméra utilisée est inférieure à $\omega_s - \omega_i$, alors la caméra agit comme un filtre de bande qui empêche une mesure complète du spectre. Ce filtre, dont la largeur est fixée par la bande passante de la caméra, est centré sur la pulsation de l'oscillateur local $\omega_{LO}$. L'intérêt d'une détection hétérodyne est que l'on peut modifier la valeur de $\omega_{LO}$ et ainsi déplacer notre filtre de bande et parcourir l'ensemble du spectre, comme on le ferait avec un analyseur de spectre en électronique (voir le principe de la détection superhétérodyne Fig. II.2.6).
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>FIGURE II.3.10 – Schéma de principe du montage pour l’analyse du flux san-
guin du zebrafish. La mise en forme de la source et le bâti de microscopie sont
séparés pour faciliter l’utilisation. Adapté de la référence [77].</figcaption></figure>

3.2.2 Dispositif expérimental

Comme nous avons pu le remarquer, le principe de la détection hétérodyne repose essen-
tiellement sur le pilotage des modulateurs acousto-optiques, la partie optique du montage
demeurant en général inchangée. Pour cette étude particulière, nous sommes partis d'un
microscope droit modifié afin d'accueillir l'onde de référence et l'onde d'illumination. Pour
ce faire, nous avons séparé la partie mise en forme de la source de la partie interferométrie,
rattachée au bâti de microscope. Nous reposons une nouvelle fois sur une configuration de
Mach-Zenhder. Les modulateurs acousto-optiques sont pilotés aux pulsations ω₁ et ω₂ de
telle sorte que ωLO = ωi + Δω, où Δω = ω₂ - ω₁. L'onde de référence et l'onde objet sont en-
suite couplées par fibre optique à un bâti Olympus CX41. L'objet est imagé au travers d'un
objectif Olympus DPlan 10×, NA=0.25 DIN. Nous nous sommes ici intéressés à l'étude du
développement vasculaire du Danio Rerio à un stade embryonnaire précoce (< 5 jours).

L'onde d'illumination de l'objet ($E_i$), est diffusée par le mouvement des cellules sanguines du *Danio*. Nous noterons le champ diffusé $E_s$ (voir Fig. II.3.9). Les deux ondes ($E_s$ et $E_{LO}$) sont recombinées par un cube légèrement tilté angulairement pour introduire une porteuse hors-axe dans les acquisitions. Les interférences $E_s + e^{i\Delta\omega t} E_{LO}$ sont enfin enregistrées sur un capteur CCD à $\omega_s/2\pi = 10$ Hz.

Comme illustré Fig. II.3.9, le spectre du signal est l'association de deux composantes :

1. Un pic centré sur $\omega_i$ qui correspond à la lumière balistique ou aux composantes dif-
fusées par des parties immobiles de l'échantillon.

2. Une composante large provenant des photons diffusés par les objets en mouvement et collectée dans le cône de collection de l'objectif de microscope. En revenant à l'Eq. (II.3.27), on peut remarquer que la largeur du spectre dépend de la vitesse des objets diffusants. Cependant, comme l'ouverture numérique (NA) de l'objectif de microscope limite la gamme des vecteurs $\mathbf{k}_s$ accessibles, on peut écrire que $|\mathbf{q}| = \text{NA} |\mathbf{k}_i|$. La largeur du spectre mesuré est donc également liée à NA. En d'autres termes, c'est l'ouverture numérique de l'objectif de microscope qui limitera la largeur du spectre mesurable et donc la vitesse des objets diffusants que nous serons en mesure de caractériser. La largeur du spectre mesurable dans notre cas sera de l'ordre de la centaine de Hz.
<figure><img src="image_61.png" /></figure>

FIGURE II.3.11 – Filtrage spatial et principe de la reconstruction. (a) Hologramme $\mathcal{H}(x, y)$. (b) Hologramme de Fourier $\mathcal{H}_1(k_x, k_y)$. (c) Hologramme de Fourier filtré et recentré $\mathcal{H}_2(k_x, k_y)$. (d) Hologramme $\mathcal{H}_3(x, y)$. Les hologrammes de Fourier sont représentés en intensité moyenne et en échelle logarithmique. Adapté de la référence [77].

Les interférences étant enregistrées avec une caméra à 10 Hz, nous ne pouvons détecter le signal que dans une bande de ±5 Hz autour de $\omega_{LO}/2\pi$. Il sera donc nécessaire de balayer $\omega_{LO} = \omega_i + \Delta\omega$ pour acquérir l'ensemble du signal Doppler et analyser son spectre.

### 3.2.3 Acquisition et reconstruction des données : vers une extraction quantitative de la vitesse des cellules sanguines

Les hologrammes sont acquis en balayant la fréquence de l'oscillateur local $\Delta\omega/2\pi$ de 0 à 100 Hz avec un pas qui est multiple de $\omega_{CCD}/2\pi$. En d'autres termes $\Delta\omega = m\omega_{CCD}$ avec $m \in [0; 10]$. Pour chaque décalage de fréquence $\Delta\omega/2\pi$, une séquence de 32 images est acquise. Ce qui permet d'accumuler 16 fois le signal dans le cadre d'une démodulation 2 phases.

En plus de la démodulation temporelle, une démodulation spatiale doit être réalisée de part la configuration hors-axe adoptée. Cette étape est illustrée Fig. II.3.11 dans le cadre d'une acquisition 4 phases, mais peut être généralisée à n'importe quelle modulation temporelle.

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

FIGURE II.3.12 – Élimination de la composante balistique. (a) Détection de la composante à $\omega_i$. (b) Détection de l'élargissement Doppler.

Partons de l'hologramme $\mathcal{H}(x, y)$, calculé après démodulation 4 phases selon l'Eq. (I.2.12). Le zebrafish imagé ici est figé dans un gel d'agar. Néanmoins, ses cellules sanguines restent en mouvement. La démodulation temporelle ne suffit donc pas à éliminer les ordres 0 et -1 et doit être complétée par une démodulation spatiale. Pour ce faire, nous nous plaçons
dans le plan focal arrière de l'objectif de microscope et faisons en sorte de rendre nette la pu-
pille de ce dernier. On obtient ainsi l'hologramme de Fourier $\mathcal{H}_1(k_x, k_y)$ (b) qui est donné
par :

$$
\mathcal{H}_1(k_x, k_y) = \mathcal{F} \left\{ \mathcal{H}(x, y) e^{i|\mathbf{k}|(x^2+y^2)/2d} \right\}. \qquad (II.3.28)
$$

Si l'onde de référence est une onde plane, $d$ correspond à la distance entre la caméra et l'objectif de microscope. Sinon, $d$ correspond à la différence de courbure entre l'onde de référence et l'onde objet. Un filtre passe-bande est ensuite appliqué à $\mathcal{H}_1$ pour ne conserver que la pupille, puis la porteuse hors-axe introduite est compensée pour donner l'hologramme $\mathcal{H}_2(k_x, k_y)$ (c). Enfin, l'hologramme reconstruit $\mathcal{H}_3(x, y, z)$ (d) par propagation du spectre angulaire

$$
\mathcal{H}_3(x, y, z) = \mathcal{F}^{-1} \left\{ \mathcal{H}_2 e^{i(k_x^2 + k_y^2)/2z} \right\}. \qquad (II.3.29)
$$

Ici $z$ est la distance entre l'image de l'objet et le capteur. Dans la plupart des cas, nous ferons
en sorte d'avoir une image nette du zebrafish soit $z = 0$.

Pour la suite, et afin de limiter la durée des acquisitions, nous nous placerons en détec-
tion 2 phases. Comme on peut le voir Fig. II.2.3, la composante balistique de fréquence $\omega_i$ est
rejetée dans un 0 de la PSF ce qui facilitera la détection de l'élargissement Doppler. Ce point
est illustré par la Fig. II.3.12. On voit ici clairement l'effet de la détection hétérodyne. En (a)
la détection de la composante balistique est favorisée. Pour ce faire, un seul hologramme de
la séquence est utilisé puis démodulé spatialement. En revanche en réalisant une détection
à 2 phases (b), la détection de la composante Doppler est favorisée.

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>FIGURE II.3.13 – Mesure de la composante Doppler pour $\Delta\omega/2\pi \in [0; 80 \text{ Hz}]$.</figcaption></figure>

Pour mesurer l'élargissement spectral dû au mouvement des cellules sanguines, nous
<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>FIGURE II.3.14 – Tracé du signal holographique en fonction de la fréquence $\Delta\omega/2\pi$ en échelle linéaire et en échelle logarithmique.</figcaption></figure>

avons réalisé des acquisitions pour des décalages $\Delta\omega/2\pi$ allant de 0 à 80 Hz. Les hologrammes moyennés $\langle|\mathcal{H}_3|^2\rangle$ obtenus sont regroupés Fig. II.3.13. Le décalage de fréquence imposé va de 0 Hz (a) à 80 Hz (i). Comme la contribution des photons balistiques a été supprimée, l'image des cellules sanguines apparaît sur fond sombre. On peut également remarquer que les différentes structures du *Danio* ne sont pas visibles de la même manière sur l'ensemble des images. Pour quantifier la largeur spectrale du signal, nous avons moyenné spatialement ce dernier dans différentes zones telles que : (A) la veine caudale, (B,C) l'artère caudale, (D) un vaisseau intersegmentiel, et (E) le fond (qui permet d'extraire la fonction d'appareil de la détection). Les courbes présentées Fig. II.3.14 permettent de visualiser les différentes zones choisies pour caractériser le flux sanguin du *Danio*. On peut remarquer la décroissance régulière du signal dans la veine (A) et l'artère (B,C) caudales. On remarque également que le signal issu du vaisseau intersegmentiel (D) est plus faible d'un ordre de grandeur et tend à osciller. Ceci est probablement lié au fait que le signal est relativement faible par rapport à la fonction d'appareil (E) de la détection. L'élargissement Doppler donne une information sur la vitesse moyenne du déplacement des cellules sanguines. En revanche, l'information liée à leur sens de circulation est perdue. Cependant, notre configuration expérimentale permet de retrouver ce signal.

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>FIGURE II.3.15 – Illustration du filtrage directionnel de $k_s$. (a) $H_2(k_x, k_y)$. (b) Filtre $k_{\varphi=0}$. (c) Filtre composite $k_{\varphi=0}$ (bleu), $k_{\varphi=2\pi/3}$ (vert), $k_{\varphi=4\pi/3}$ (rouge).</figcaption></figure>

Rappelons que la pupille de l'objectif de microscope permet, dans l'ouverture numérique de ce dernier, d'accéder aux vecteurs d'onde diffusés $k_s$. Il est donc possible de réaliser une discrimination angulaire de l'information. En revenant à l'Eq. (II.3.27), on remarque que si on connaît l'orientation des $k_s$, alors on connaît l'orientation des vecteurs vitesse **v**. Nous
<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>FIGURE II.3.16 – Imagerie Doppler quantitative de la vitesse par filtrage de la pupille de l’objectif de microscope.</figcaption></figure>

avons donc proposé le filtrage illustré Fig. II.3.15. En passant en coordonnées sphériques, on
peut définir le vecteur **k**<sub>ϕ</sub> = cos ϕ**k**<sub>x</sub> + sin ϕ**k**<sub>y</sub>. De là il est possible de construire une image
RGB composite qui correspondra à l'association des trois filtres de pupilles associés à ϕ = 0
(bleu), ϕ = 2π/3 (vert) et ϕ = 4π/3 (rouge) tels que représentés Fig. II.3.15(c).

Nous avons appliqué ce filtrage aux images obtenues Fig. II.3.13. Les résultats sont présentés Fig. II.3.16. Comme on pouvait s'y attendre, l'image sans décalage Doppler (a) ne permet pas de distinguer le sens de circulation des cellules sanguines. En revanche, dès que l'on augmente la valeur de Δω, il devient possible de séparer un couple veine/artère dans la région caudale du Danio. On peut enfin remarquer que le signe du décalage imposé aux modulateurs a son importance. En effet, selon que celui-ci soit positif ou négatif le filtrage RGB réalise une inversion de contraste de l'image (voir (g) et (h)).

Cette étude a permis de démontrer pour la première fois la possibilité de réaliser de
l'imagerie laser Doppler quantitative en transmission. Ici, les vaisseaux sanguins fixent la di-
rection de propagation des cellules sanguines, l'élargissement Doppler permet de connaître
la norme des vecteurs vitesse v, et le filtrage RGB permet de déduire le sens de circulation
des cellules et ainsi de lever l'ambiguïté sur le signe des vecteurs vitesse. Notons que ces
travaux, initiés dans le cadre de mon Post-Doctorat au laboratoire Charles Coulomb ont été
poursuivis et ont donné lieu à de nouvelles publications notamment en combinant différents
point de vue pour obtenir une reconstruction tomographique in-vivo de la vascularisation
du Danio [85, 86].

3.3 Quelques remarques sur la détection hétérodyne

Cette partie était l'occasion de présenter l'holographie à hétérodynage temporel et dis-
cuter de ses applications. Nous avons ici fait le choix d'une configuration à double hété-
rodynage spatial et temporel qui permet d'atteindre une meilleure sensibilité de détection.
Dans tous les cas d'application présentés, le montage optique reposait sur une configuration
Mach-Zehnder soit en transmission, soit en réflexion. L'utilisation de modulateurs acousto-
optiques offre une grande liberté de pilotage temporelle de l'onde de référence et permet
de varier les applications par une simple modification du signal électronique de pilotage. Nous avons ainsi pu démontrer les capacités de la méthode pour l'analyse de signaux harmoniques (applications en vibrométrie) et pour la mesure de spectres Doppler (application en imagerie biomédicale et microfluidique).

L'imagerie hétérodyne en mode laser Doppler permet, sans marquage d'ajouter un nouveau contraste au système d'imagerie en discriminant les parties statiques et les parties dynamiques au sein du même échantillon, comme on peut le constater sur la Fig. II.3.17. Nous

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>FIGURE II.3.17 – Représentation composite du contraste Doppler pour une languette cartonnée (a,b,c) et pour la circulation sanguine du *Danio* (d,e,f). (a,d) Images sans contraste Doppler, (b,e) Images du contraste Doppler, (c,f) Images composites.</figcaption></figure>

avons ici repris les images de la languette cartonnée (a,b,c) et du *Danio* sur lesquelles nous avons superposé l'information Doppler extraite par le dispositif. Ainsi dans le cas de la languette, il est possible d'ajouter en composite la phase de l'oscillation mécanique entre $-\pi$ (bleu) et $\pi$ (rouge) (c). De la même manière, nous avons pu ajouter le contraste Doppler lié au mouvement des cellules sanguines à l'image de la chair du *Danio*. Rappelons une derrière fois que tous ces résultats sont obtenus sans avoir recours à un agent de contraste.

Dans cette partie, je me suis attardé sur les développements expérimentaux liés à l'imagerie laser Doppler. En effet, ceux-ci seront au cœur de mon projet. Depuis mon arrivée à l'IRIMAS en 2016, j'ai intégré l'équipe IMTIS (Imagerie Multimodale, Traitement de l'Information et du Signal) et participe au développement de la Microscopie par Tomographie Diffractive (MTD). Nous le verrons par la suite, cette méthode permet d'accéder à l'indice de réfraction complexe 3D des échantillons analysés. Je profiterai donc de la partie suivante pour présenter les grands concepts de la technique et discuterai des travaux de Thèse et de Master que j'ai encadrés dans ce contexte.
<figure><img src="image_68.png" /></figure>
# Troisième partie

## Vers la troisième dimension : la microscopie par tomographie diffractive
<figure><img src="image_69.png" /></figure>
# Chapitre 1

## Introduction : microscopie par tomographie diffractive de la 2,5D à la 3D

Telle qu'elle a été proposée par Gabor [2], l'holographie vise à enregistrer le front d'onde issu d'un objet plutôt que d'enregistrer l'image de l'objet lui-même. Les divers développements, qui ont été réalisés depuis, et que j'ai partiellement présenté dans le début de ce document, ont visé à exploiter les propriétés de la technique pour réaliser des mesures tridimensionnelles et quantitatives en phase. Qu'en est-il réellement ? Ce court chapitre introduitif apporte quelques éléments de réponse.

### 1.1 Holographie et troisième dimension

Comme j'ai pu l'évoquer dès le début de ce document, l'holographie permet, à partir d'une acquisition unique, d'accéder à l'amplitude et la phase du champ. De plus la distance entre l'objet et le capteur étant codée dans les interférences, il est possible de reconstruire l'hologramme dans différents plans perpendiculaires à l'axe optique du système. On re-

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>FIGURE III.1.1 – Reconstruction holographique et 3D. (a) Reconstruction classique. (b) Inversion de Fourier 3D.</figcaption></figure>

construit alors une succession de plans de transmittance complexe $T(x, y, z)$ comme illustré Fig. III.1.1(a). On reconstruit donc un volume 3D comme une succession de plans 2D. De la même manière, on peut considérer que le spectre de l'hologramme permet de reconstruire une partie du spectre 3D de l'objet et, par inversion, remonter à la transmittance 3D
<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>FIGURE III.1.2 – Reconstruction holographique de la phase d’un pollen de topinambour (Helianthus Tuberosus). (a) Coupe dans le plan {$x, y$}. (b) Coupe dans le plan {$x, z$}</figcaption></figure>

complexe (voir Fig. III.1.1(b)). L'ensemble doit en théorie mener à une reconstruction tridimensionnelle de l'objet. Pour vérifier ce point, examinons la reconstruction de l'hologramme d'un pollen de topinambour (Helianthus Tuberosus). Nous nous concentrerons sur la phase optique de la reconstruction. En effet, le pollen de topinambour a un contraste d'absorption faible. La phase optique de l'hologramme reconstruit (Fig. III.1.2) donne des résultats cohérents, pour une coupe axiale dans le plan {$x, y$}, si on se compare aux images conventionnelles de ce type de pollens [87]. En revanche, en analysant plus finement la coupe sagittale dans le plan {$x, z$}, on constate qu'il n'est plus possible de distinguer le pollen, et son image s'étend sur l'ensemble du volume reconstruit. Pour comprendre ce phénomène, repartons de la Fig. III.1.1(b) et estimons la bande passante fréquentielle de détection pour un microscope holographique. Considérons un objectif de microscope d'ouverture NA travaillant dans un milieu d'immersion $n_{imm}$. L'objectif peut collecter la lumière dans un cône de demi-angle au sommet $\theta_m$ donné par [88] :

$$ \theta_m = \arcsin \left( \frac{NA}{n_{imm}} \right). \qquad (III.1.1) $$

La représentation du spectre 3D proposée Fig. III.1.3(a) nous permet de remarquer qu'une

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>FIGURE III.1.3 – Estimation de la bande passante 3D de l'holographie. (a) Représentation du contenu spectral 3D. (b) Coupe dans le plan {$x, z$} ou {$y, z$}.</figcaption></figure>
acquisition holographique remplit l'équivalent d'une calotte de sphère creuse dont la corde dépend de $\theta_m$. Notons $f_0$ la fréquence de l'onde collectée par l'objectif. De part son ouverture limitée, il collecte ce signal sous un angle $2\theta_m$. Compte-tenu de la forme du support fréquentiel projeté dans le plan $\{x, z\}$ (ou par raison de symétrie $\{y, z\}$), il est possible de calculer la bande passante latérale du système BP$_{x,y}$ (en vert Fig. III.1.3(b)) et la bande passante axiale BP$_z$ (en bleu Fig. III.1.3(b)). Elles sont données par :

$$ BP_{x,y} = 2f_0 \sin \theta_m; \quad BP_z = f_0 (1 - \cos \theta_m). \qquad (III.1.2) $$

Pour comprendre un peu plus finement le problème posé Fig. III.1.2(b), prenons quelques ordres de grandeurs. L'image du pollen a été acquise au travers d'un objectif de microscope d'ouverture NA = 1,4 à immersion huile ($n_{imm} = 1,518$), les bandes passantes latérales et axiale, en fonction de $f_0$, sont donc respectivement BP$_{x,y} = 2,35f_0$ et BP$_z = 0,61f_0$. On constate dans un premier temps que la bande passante latérale du DHM est bien meilleure que sa bande passante axiale. Néanmoins, ce seul fait ne suffit pas à expliquer la quasi absence de résolution dans la reconstruction de la Fig. III.1.2(b). Cette absence apparente de résolution est également (et surtout) liée au fait que nous ne disposons que de l'information contenue sur une calotte de sphère d'épaisseur nulle pour reconstruire notre spectre 3D de l'objet. Le spectre 3D de l'objet est donc très mal déterminé selon l'axe optique du système.

## 1.2 Holographie et imagerie quantitative

Intéressons nous maintenant à l'aspect quantitatif des mesures en holographie. En effet, l'holographie est présentée comme une méthode d'imagerie quantitative de phase (QPI) [71]. Pour ce faire, basons nous sur la configuration Mach-Zehnder en transmission classique proposée Fig. III.1.4. L'onde issue du laser est séparée en deux ondes : l'onde de référence et l'onde d'illumination de l'objet. Ces deux ondes sont recombinées et interfèrent dans le plan du capteur d'imagerie. L'analyse des interférences ainsi produites permet d'estimer la variation d'amplitude $\Delta A(x, y)$ et la variation de phase $\Delta \varphi(x, y)$ qu'engendre la traversée de l'objet. Concentrons nous sur la contribution de la phase. La variation de phase de l'onde d'illumination de l'objet est associée à la réfraction de ce dernier et est donnée par :

$$ \Delta\varphi(x, y) = \frac{2\pi}{\lambda} \int_{\varepsilon} \Delta n(x, y, z) dz. \qquad (III.1.3) $$

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>FIGURE III.1.4 – Schéma de principe d'un interféromètre de Mach-Zehnder.</figcaption></figure>
L'Eq. (III.1.3) montre que le seul moyen d'avoir une mesure quantitative de la variation de phase est de connaître l'épaisseur $\varepsilon$ de l'objet. De plus, la variation de phase seule ne permet pas de remonter à une valeur de l'indice de réfraction de l'objet analysé, mais uniquement à la différence de chemin optique (couplage indice/épaisseur).

Nous verrons par la suite que la microscopie par tomographie diffractive, une extension de la microscopie holographique, permet d'apporter des solutions à ces deux problèmes, tout en maintenant le caractère « sans-marquage » de la technique.

## 1.3 Organisation générale de la partie

Cette partie sera l'occasion de discuter de la microscopie par tomographie diffractive en transmission et de ses applications. Ses capacités et ses limitations seront discutées pour m'amener vers les développements qui seront ceux de mes projets de recherche à venir autour de la simplification et l'accélération des acquisitions d'une part et de leur fonctionnalisation d'autre part. Ainsi, je discuterai les résultats obtenus au cours de la Thèse de Ludovic Foucault pour la simplification des dispositifs de microscopie par tomographie diffractive [89, 90], de l'optimisation des acquisitions et de la reconstruction vectorielle des données, abordés par Asemare Mengistie Taddese [91-94] et des voies de fonctionnalisation des acquisitions et reconstruction qui sont au cœur de la Thèse de Riadh Abbessi [95].
# Chapitre 2

## Principes de la microscopie par tomographie diffractive

Comme j'ai pu l'évoquer précédemment, les méthodes d'imagerie interférométriques permettent d'accéder à une information quantitative sur un phénomène qui déphase et/ou absorbe l'onde d'illumination. Il est néanmoins nécessaire d'avoir des *a priori* très forts sur l'objet analysé pour être quantitatif. En effet, la phase code une information de différence de chemin optique intégrée sur l'épaisseur de l'échantillon. Il est de fait impossible de séparer l'épaisseur de l'échantillon de son indice de réfraction.

Une réponse à ces problèmes peut être amenée par les méthodes tomographiques. Le but est de multiplier les acquisitions de l'objet en modifiant les conditions d'illumination. On peut par exemple faire varier l'angle d'incidence de l'onde d'illumination ou faire tourner l'objet en maintenant l'illumination fixe, ou de manière équivalente, faire tourner le dispositif autour d'un objet fixe. Cette dernière possibilité est d'ailleurs celle qui a été retenue pour la tomodensitométrie (CT-scan) rayon X [96-98]. Ces concepts ont par la suite été appliqués à l'imagerie microscopique [99, 100]. L'hypothèse ici faite est que les photons se propagent en ligne droite. Le modèle direct et le modèle inverse reposent alors sur l'utilisation de transformations du type de la transformée de Radon. Ces études ne prennent cependant pas en compte les phénomènes de diffraction qui peuvent être rencontrés lorsque l'on image des structures à des dimensions de l'ordre de la longueur d'onde de l'illumination.

On doit le formalisme théorique de la tomographie diffractive à Emil Wolf [101] et une des premières mises en œuvre appliquée à la microscopie à Vincent Lauer [102]. Ce chapitre sera l'occasion de revenir brièvement sur le formalisme, les dispositifs ainsi que les méthodes de traitement mises en place à l'IRIMAS. Comme pour toute méthode d'imagerie optique non-conventionnelle, je commencerai par le détail du modèle de formation d'image, avant d'aborder les méthodes d'inversion et les aspects algorithmiques.

### 2.1 Modèle de formation d'image : des équations de Maxwell au potentiel objet 3D

#### 2.1.1 Des équations de Maxwell à l'équation d'Helmholtz

Les équations de Maxwell regroupent les 4 grands théorèmes de l'électromagnétisme :

1. Le théorème de Gauss qui lie le champ électrique $E$ à la densité de charges électriques $\rho$

$$ \nabla \cdot \mathbf{E} = \frac{\rho}{\varepsilon_0}, \qquad (III.2.1) $$

avec $\varepsilon_0$ la permittivité diélectrique du vide.
2. Le théorème de Thompson qui prouve l'absence de monopôle magnétique

$$ \nabla \cdot \mathbf{B} = 0 \qquad (III.2.2) $$

3. Le théorème de Faraday qui lie le champ électrique à la variation du champ magnétique (phénomène d'induction)

$$ \nabla \times \mathbf{E} = -\frac{\partial \mathbf{B}}{\partial t} \qquad (III.2.3) $$

4. Le théorème d'Ampère qui lie l'existence d'un champ magnétique au déplacement des charges électriques

$$ \nabla \times \mathbf{B} = \mu_0 \mathbf{j} + \mu_0 \varepsilon_0 \frac{\partial \mathbf{E}}{\partial t}, \qquad (III.2.4) $$

avec j le vecteur densité de courant.

En utilisant les Eqs. (III.2.1), (III.2.3), et (III.2.4) et les propriétés des opérateurs vectoriels, on obtient l'équation d'onde homogène (ou d'alembertien du champ électrique) :

$$ \nabla^2 \mathbf{E} - \frac{1}{c^2} \frac{\partial^2 \mathbf{E}}{\partial t^2} = 0, \qquad (III.2.5) $$

avec $c = 1/\sqrt{\mu_0\varepsilon_0}$ la vitesse de la lumière dans le vide. Pour une onde monochromatique (analyse harmonique), l'Eq. (III.2.5) a une valeur propre donnée par :

$$ \nabla^2 \mathbf{E} + k^2 \mathbf{E} = 0, \qquad (III.2.6) $$

c'est l'équation d'Helmholtz homogène.

### 2.1.2 Résolution de l'équation d'Helmholtz et approximation de Born

Pour mettre en place le modèle de formation d'image, nous considérerons un objet de distribution d'indice de réfraction $n(\mathbf{r})$ situé dans un milieu d'immersion d'indice $n_{imm}$. Notons $k_0 = 2\pi/\lambda_0$ la norme du vecteur d'onde de propagation du champ dans le vide. On a alors $k_{imm} = k_0 n_{imm} = 2\pi n_{imm}/\lambda_0$ pour une onde se propageant dans le milieu d'immersion et $\mathbf{k} = k_0 n(\mathbf{r})$ pour l'onde se propageant dans le milieu d'indice $n(\mathbf{r})$.

Si l'on positionne un détecteur à la sortie de l'objet, il enregistrera le champ $u_t(\mathbf{r})$ qui est tel que :

$$ u_t(\mathbf{r}) = u_d(\mathbf{r}) + u_i(\mathbf{r}), \qquad (III.2.7) $$

avec $u_d$ le champ diffracté par l'objet et $u_i$ le champ d'illumination de l'objet. Ce dernier est solution de l'Eq. (III.2.6) et on peut écrire :

$$ (\nabla^2 + k_{imm}^2) u_i(\mathbf{r}) = 0. \qquad (III.2.8) $$

De la même manière, le champ total $u_t(\mathbf{r})$ est solution de l'Eq. (III.2.6)

$$ [\nabla^2 + \mathbf{k}(\mathbf{r})^2] u_t(\mathbf{r}) = 0. \qquad (III.2.9) $$

En combinant les Eqs. (III.2.8), (III.2.9) et en exploitant l'expression du champ total (Eq. (III.2.7)), on peut obtenir le champ diffracté en fonction du champ total sous la forme :

$$ (\nabla^2 + k_{imm}^2) u_d(\mathbf{r}) = -k_0^2 [n^2(\mathbf{r}) - n_{imm}^2] u_t(\mathbf{r}). \qquad (III.2.10) $$
En mettant l'indice de réfraction du milieu d'immersion $n_{imm}$ en facteur, on peut enfin écrire :

$$ (\nabla^2 + k_{imm}^2) u_d(\mathbf{r}) = -k_{imm}^2 \left[ \frac{n^2(\mathbf{r})}{n_{imm}^2} - 1 \right] u_t(\mathbf{r}) = -\mathcal{P}(\mathbf{r}) u_t(\mathbf{r}). \qquad (\text{III.2.11}) $$

Ici $\mathcal{P}(\mathbf{r})$ est le potentiel de diffraction de l'objet. Classiquement, pour résoudre les problèmes différentiels tels que celui rencontré Eq. (III.2.11) on introduit une fonction de Green $G(\mathbf{r})$ telle que :

$$ (\nabla^2 + k_{imm}^2) G(\mathbf{r}) = \delta(\mathbf{r}), \qquad (\text{III.2.12}) $$

avec $\delta(\mathbf{r})$ la distribution de Dirac. Le principal intérêt est que l'on peut réexprimer l'Eq. (III.2.11) comme le produit de convolution suivant :

$$ u_d(\mathbf{r}) = \int_V \mathcal{P}(\mathbf{r}') u_t(\mathbf{r}') G(\mathbf{r} - \mathbf{r}') d\mathbf{r}', \qquad (\text{III.2.13}) $$

où $V$ est le volume du domaine sur lequel on considère la diffraction. Dans notre cas $G(\mathbf{r})$ correspond à un émetteur sphérique dans un milieu d'indice $n_{imm}$ :

$$ G(\mathbf{r}) = \frac{1}{4\pi} \frac{e^{ik_{imm}|\mathbf{r}|}}{|\mathbf{r}|} \qquad (\text{III.2.14}) $$

Toute la difficulté consiste à déterminer le potentiel objet $\mathcal{P}(\mathbf{r})$ à partir de la mesure du champ diffracté $u_d(\mathbf{r})$ en utilisant l'Eq. (III.2.13). En effet le champ diffracté intervient également dans le terme source au travers de $u_t(\mathbf{r})$.

L'Eq. (III.2.13) peut être résolue en considérant que l'objet diffuse peu la lumière. En d'autres termes que le champ diffracté $u_d(\mathbf{r})$ est très faible devant le champ incident $u_i(\mathbf{r})$. Il vient naturellement que

$$ u_t(\mathbf{r}) = u_d(\mathbf{r}) + u_i(\mathbf{r}) \approx u_i(\mathbf{r}) \qquad (\text{III.2.15}) $$

et l'Eq. (III.2.13) se réécrit

$$ u_d(\mathbf{r}) = \int_V \mathcal{P}(\mathbf{r}') u_i(\mathbf{r}') G(\mathbf{r} - \mathbf{r}') d\mathbf{r}'. \qquad (\text{III.2.16}) $$

Une interprétation géométrique de l'Eq. (III.2.16), dans l'espace de Fourier, est proposée Fig. III.2.1. L'onde incidente, portée par le vecteur $\mathbf{k}_i$ est diffractée (champ $u_d$ représenté par l'ensemble des vecteurs $\{\mathbf{k}_d\}$). La sphère d'Ewald (en noir) délimite le domaine dans lequel la lumière diffractée est émise et dont le rayon vaut

$$ R_{\text{Ewald}} = \frac{2\pi n_{\text{imm}}}{\lambda_0}. \qquad (\text{III.2.17}) $$

Après décomposition de la fonction de Green sur une base d'ondes planes et passage dans l'espace de Fourier on peut, à partir de l'Eq. (III.2.16), exprimer la transformée de Fourier 3D du potentiel objet $\tilde{\mathcal{P}}$ en fonction du spectre du champ diffracté $\tilde{u}_d$, enregistré par un capteur 2D situé à une distance $z$ de l'objet :

$$ \tilde{\mathcal{P}}(k_{ox}, k_{oy}, k_{oz}) = \frac{ik_{dz}}{\pi} e^{-ik_{dz}z} \tilde{u}_d(k_{dx}, k_{dy}), \qquad (\text{III.2.18}) $$

où $k_{dx,y,z}$ sont les coordonnées des vecteurs d'ondes diffractés $\mathbf{k}_d$ et $k_{ox,y,z}$ les coordonnées
<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>FIGURE III.2.1 – Schéma de principe de la diffraction d’une onde par un objet.</figcaption></figure>

des vecteurs d'onde objet $\mathbf{k}_o$. Dans le cadre de la première approximation de Born, les vecteurs d'onde objets peuvent être déduits des vecteurs d'onde diffractés :

$$ \mathbf{k}_o = \mathbf{k}_d - \mathbf{k}_i. \qquad (III.2.19) $$

Les Eqs. (III.2.18) et (III.2.19) montrent que la mesure du spectre 2D du signal diffracté permet de reconstruire le spectre 3D de l'objet. Les coordonnées 3D des vecteurs $\mathbf{k}_d$ et $\mathbf{k}_i$ sont obtenues à partir des mesures 2D : l'ensemble de la pupille (spectre des hologrammes acquis) permettant d'en retrouver les coordonnées $k_{d,x,y}$ et le point spéculaire les coordonnées $k_{i,x,y}$. Les coordonnées $k_{d,z}$ et $k_{i,z}$ sont obtenues par projection du spectre sur une calotte de sphère de rayon $R_{\text{Ewald}}$ (voir Eq. (III.2.17)) de telle sorte que :

$$ k_{i,d_z} = \sqrt{R_{\text{Ewald}}^2 - k_{i,d_x}^2 - k_{i,d_y}^2}. \qquad (III.2.20) $$

Cependant, comme le montre la Fig. III.2.1 il n'est pas possible de reconstruire l'intégralité du spectre 3D à partir d'une seule acquisition 2D. En effet, l'objet diffracte la lumière sur un angle solide de $4\pi$ sr alors que le capteur ne peut détecter que la partie transmise ou la partie rétrodiffusée. De plus, le système d'imagerie offre une ouverture numérique limitée notée $NA_{\text{trans}}$ pour la partie transmise et $NA_{\text{refl}}$ pour la partie réfléchie. Ainsi le spectre objet 3D de l'objet est collecté sur une calotte de sphère dont le rayon correspond à la norme du vecteur d'onde que l'objectif peut collecter au maximum $k_{\text{max}}$ :

$$ k_{\text{max}} = \frac{2\pi NA}{\lambda_0}, \qquad (III.2.21) $$

en d'autres termes $k_{i,d_x,y} \le k_{\text{max}}$, c'est la pupille de McCutchen [103]. On peut remarquer que seule une petite partie de la sphère d'Ewald est effectivement collectée si l'on utilise un capteur 2D. Nous verrons dans la suite les méthodes mises en place pour améliorer la quantité de contenu accessible à la méthode.

### 2.1.3 Approximation de Rytov

L'approximation de Born permet de reconstruire le potentiel 3D de l'objet. Une alternative peut être trouvée au travers de l'approximation de Rytov. Je ne reviendrai pas sur les avantages et inconvénients des deux approches, je préciserai juste que l'approximation de Rytov permet de traiter des objets faisant varier la phase au delà de la longueur d'onde<fnref n="1" />.

<footnote n="1">1. Les limites des approximations de Born et de Rytov demeurent floues. Ce point sera discuté dans le projet.</footnote>
Nous restons ici cependant limités au cas des objets faiblement diffusants.

Dans le cadre de l'approximation de Rytov, le champ total $u_t(\mathbf{r})$ est exprimé sous la forme d'une phase complexe $\varphi_t(\mathbf{r})$ de telle sorte que [88, 104] :

$$u_t(\mathbf{r}) = e^{\varphi_t(\mathbf{r})} = u_d(\mathbf{r}) + u_i(\mathbf{r}), \qquad (\text{III.2.22})$$

avec

$$u_i(\mathbf{r}) = e^{\varphi_i(\mathbf{r})} \qquad (\text{III.2.23})$$

Le champ total ainsi obtenu est également solution de l'équation d'Helmholtz (Eq. (III.2.6)). Notons $\varphi_R(\mathbf{r})$ la phase complexe de Rytov, en considérant que $\varphi_R(\mathbf{r}) \approx \varphi_d(\mathbf{r})$ on obtient :

$$\varphi_R(\mathbf{r}) = \ln \left( \frac{u_t(\mathbf{r})}{u_i(\mathbf{r})} \right) = \ln \left( \frac{\alpha_t(\mathbf{r})}{\alpha_i(\mathbf{r})} \right) + i[\phi_t(\mathbf{r}) - \phi_i(\mathbf{r})]. \qquad (\text{III.2.24})$$

avec $\alpha_{t,i}$ l'amplitude du champ diffracté et du champ incident et $\phi_{t,i}$ la phase respective des mêmes champs. Le lien entre les approximations de Born et de Rytov est mis en évidence par l'Eq. (6) de la Ref. [104] :

$$\varphi_R = \frac{u_d^{(B)}}{u_i(\mathbf{r})}, \qquad (\text{III.2.25})$$

où $u_d^{(B)}$ est le champ calculé sous l'approximation de Born et donné par l'Eq. (III.2.16). Ainsi, l'Eq. (III.2.25) prouve que nous pourrons utiliser les mêmes méthodes de reconstruction que le champ ait été obtenu sous l'approximation de Born ou sous l'approximation de Rytov.

## 2.2 Synthèse d'ouverture 3D

Pour augmenter le contenu fréquentiel (au sens spatial du terme) des acquisitions on procède à ce que l'on appelle une synthèse d'ouverture. Le but est de combiner, dans l'espace de Fourier, des acquisitions pour lesquelles on fait varier les conditions d'illumination de l'objet. Trois méthodes sont communément utilisées pour réaliser la synthèse :

1. Le balayage de l'illumination sur l'objet.

2. La mise en rotation de l'objet dans une illumination fixe.

3. Le changement de longueur d'onde d'illumination.

Ces trois procédés sont représentés Fig. III.2.2 pour aider à comprendre la construction du spectre 3D de l'objet à partir d'une succession bidimensionnelle d'acquisitions. Ainsi partant d'une portion de la sphère d'Ewald (b), il est possible de remonter au potentiel objet associé en retirant la contribution de l'onde d'illumination (vecteur $k_i$ (b)). Ces points seront communs à toutes les méthodes de synthèse abordées ici.

### 2.2.1 Balayage de l'onde d'illumination

Dans ce cas, l'objet est éclairé avec une onde plane à $k_i$ variable. L'information est réallouée dans l'espace de Fourier en retranchant la contribution des $k_i$ aux spectres acquis (vecteurs {$k_d$}) pour chaque hologramme. Le support fréquentiel reconstruit ou fonction de transfert optique du système (OTF), ainsi que deux coupes centrales dans les plans $(x, z)$ et $(x, y)$, sont proposées Fig. III.2.2(c). On constate que, par rapport à l'holographie, le support fréquentiel est plein et la résolution latérale est doublée. La résolution axiale est plus faible que la résolution latérale (voire nulle au centre du spectre) mais bien meilleure que dans le cas d'une acquisition unique. Remarquons de plus l'absence d'information au centre de
<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>FIGURE III.2.2 – Principe de la synthèse d’ouverture 3D. (a) Portion de la sphère d’Ewald collectée. (b) Réallocation de l’information dans un cube fréquentiel aux dimensions doublées. Synthèse d’ouverture en faisant varier (c) l’angle d’illumination, (d) l’angle de l’objet mis en rotation, (e) la longueur d’onde d’illumination.</figcaption></figure>

l'OTF. C'est le cône manquant qui est bien connu des utilisateurs de méthodes de microscopie optique plein champ en transmission [105].

### 2.2.2 Rotation de l'échantillon

On utilise ici une onde d'illumination à $k_i$ fixe dans laquelle l'objet est mis en rotation. Différentes méthodes peuvent être considérées reposant sur une rotation mécanique de l'échantillon [106-108], le déplacement de l'échantillon dans un environnement confiné [109] ou encore un piégeage optique de l'échantillon [110]. Il est cependant nécessaire d'avoir accès à l'angle de rotation de l'objet pour procéder au recalage de l'information dans l'espace de Fourier. Comme une rotation de l'objet est équivalente à une rotation du support de son spectre, il est possible de reconstruire un support fréquentiel étendu en combinant les différents points de vue comme illustré Fig. III.2.2(d). Dans ce cas, le gain en résolution latérale est de $\sqrt{2}$ par rapport à l'holographie [100]. En revanche, comme on peut le voir sur
<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>FIGURE III.2.3 – Combinaison rotation de l'échantillon et balayage de l'illumination. (a) Rotation complète de l'objet + 1 balayage d'illumination [115, 116]. (b) Balayage de l'illumination pour chaque angle de rotation [108, 115]</figcaption></figure>

la projection du plan central en $f_x, f_z$ le support n'est pas défini selon l'axe de rotation du spécimen [111].

### 2.2.3 Variation de la longueur d'onde d'illumination

Dans ce cas, on travaille à $k_i$ et angle de l'objet fixes. Les Eqs. (III.2.17) et (III.2.21) montrent qu'à objectif fixé, le rayon de la sphère d'Ewald, et donc les fréquences spatiales maximales que l'on peut collecter, sont inversement proportionnels à la longueur d'onde de l'illumination dans le vide. Ainsi en réalisant des acquisitions à plusieurs longueurs d'ondes, on peut étendre le support de fréquence collecté [112-114]. Cet aspect est illustré Fig. III.2.2(e). On remarque ici que le support fréquentiel est beaucoup moins étendu que dans les deux configurations précédentes. Notons néanmoins qu'une imagerie multi-longueur d'onde peut se montrer avantageuse pour la caractérisation d'échantillons absorbants.

### 2.2.4 Combinaison rotation d'échantillon et balayage d'illumination

Aucune des méthodes de synthèse d'ouverture abordée jusqu'ici ne permet de remplir uniformément le spectre de l'objet. Une solution à ce problème vise à combiner les acquisitions. Ainsi, dans un article théorique publié en 2011, S. Vertu propose une combinaison du balayage d'illumination et de la rotation de l'objet [115]. Les deux principales réalisations sont résumées Fig. III.2.3 pour une combinaison d'une rotation complète de l'objet et d'un balayage de l'illumination (a), et d'un balayage d'illumination par angle de rotation de l'objet (b). Les deux configurations ont par la suite été mises en place expérimentalement [108, 116]. Le nombre d'acquisitions nécessaires couplées aux problématiques de recalage des images limitent les champs d'applications, mais ces techniques permettent une imagerie microscopique à résolution isotrope.

## 2.3 Algorithmes de traitement et reconstruction des données

Jusqu'ici je suis revenu sur les modèles de formation des images liés à la MTD. Nous verrons dans cette partie comment extraire l'information tomographique à partir d'acquisitions d'hologrammes en transmission réalisées avec un balayage d'illumination. Le procédé repose sur deux étapes principales : le prétraitement de l'information au cours duquel nous
<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>FIGURE III.2.4 – Schéma synoptique du prétraitement des hologrammes.</figcaption></figure>

extrayons le champ optique sous l'approximation de Born (Eq. (III.2.16) ou sous l'approximation de Rytov (Eq. (III.2.24)), et la reconstruction tomographique qui vise à reconstruire de spectre 3D de l'objet. L'ensemble des codes associés sont disponibles dans le dépôt GitHub suivant : https://github.com/madeba/MTD_transmission/tree/master/Python_Tomo.

## 2.3.1 Prétraitement des hologrammes

Cette étape a pour but d'extraire le champ optique à partir des hologrammes et les principales étapes mises en jeu sont résumées Fig. III.2.4. Chaque hologramme, acquis pour des vecteurs d'onde $k_i$ différents, est traité séquentiellement.

La première étape est la démodulation des acquisitions. Le but est d'obtenir l'amplitude complexe du champ objet. Selon que les acquisitions aient été faites en holographie à décalage de phase, ou en holographie hors-axe, la méthode de démodulation sera adaptée : on utilisera l'Eq. (I.2.12) pour l'holographie à décalage de phase et l'Eq. (I.2.11) en holographie hors-axe. À l'issue de cette étape, on obtient l'hologramme complexe $I_{\text{dem}}$ et les coordonnées $(k_{ix}, k_{iy})$ du vecteur d'onde d'illumination $k_i$.

Ensuite, il est possible d'extraire l'amplitude $a_t$ et la phase $\phi_{t[-\pi, \pi]}$ du champ total. La phase étant connue dans un intervalle $[-\pi, \pi]$, il est nécessaire de dérouler $\phi_{t[-\pi, \pi]}$. Parmi la grande variété de méthodes existantes nous avons opté pour une méthode non-itérative basée sur l'estimation et l'intégration des gradients latéraux de la phase [117]. En fin d'étape nous avons accès à l'amplitude et la phase du champ total respectivement notées $a_t$ et $\phi_t$. Notons que l'étape de déroulement de la phase est facultative dans le cas de l'approximation de Born, mais obligatoire pour travailler sous l'approximation de Rytov.

Avant de calculer le champ objet, une dernière étape consiste à corriger les inhomogénités du fond et les aberrations de phase restantes. Contrairement aux méthodes d'imagerie incohérentes, nous pouvons corriger les aberrations numériquement [118, 119]. La méthode consiste à fitter un polynôme d'ordre 3 ou 4 sur la partie de l'amplitude ou de la phase ne contenant pas d'objet [120]. Ceci permet d'estimer la contribution du fond et de la supprimer afin d'obtenir l'amplitude et la phase corrigées $a_{\text{corr}}$ et $\phi_{\text{corr}}$.

Le champ objet est enfin déterminé sous l'approximation de Born :

$$U_{(\text{B})} = (a_{\text{corr}} - 1) e^{i\phi_{\text{corr}}}, \qquad (\text{III.2.26})$$
<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>FIGURE III.2.5 – Schéma synoptique de la reconstruction par inversion directe.</figcaption></figure>

ou sous l’approximation de Rytov :

$$ \varphi_R = \ln(a_{\text{corr}}) + i\phi_{\text{corr}}. \qquad (\text{III.2.27}) $$

Nous allons maintenant aborder rapidement la reconstruction des données tomographiques. L'inversion proposée ici pourra être utilisée quelque soit l'approximation considérée pour calculer le champ. En effet, l'Eq. (III.2.25) montre que l'on peut facilement passer d'une approximation à l'autre. Nous pourrons donc appliquer les mêmes méthodes de reconstruction que le champ ait été calculé sous l'approximation de Born ou sous l'approximation de Rytov.

## 2.3.2 Reconstruction par inversion directe

L'étape de reconstruction des données, illustrée Fig. III.2.5 a pour but de reconstruire le potentiel objet diffracté à partir d'une succession d'acquisitions bidimensionnelles du champ optique. Lors de l'étape précédente, le champ optique sous l'approximation de Born (Eq. (III.2.26)), ou sous celle de Rytov (Eq. (III.2.27)), ainsi que les coordonnées $(k_{ix}, k_{iy})$ du vecteur d'onde d'illumination ont été déterminées. De là, pour chaque vecteur d'illumination $k_i$ le spectre du champ est calculé afin d'obtenir les coordonnées $(k_{dx}, k_{dy})$ du spectre 2D du champ diffracté par l'objet.

Pour reconstruire le spectre 3D, on projette les coordonnées du vecteur $k_d$ sur la sphère d'Ewald. On obtient ainsi la coordonnée $k_{dz}$ donnée par :

$$ k_{dz} = \sqrt{R_{\text{Ewald}}^2 - k_{dx}^2 - k_{dy}^2}. \qquad (\text{III.2.28}) $$
<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>FIGURE III.2.6 – Comparaison des reconstructions holographique et tomographique de l'indice de réfraction d'un pollen de topinambour (Helianthus Tuberosus). (a) Reconstruction holographique : coupe dans le plan {$x, y$}. (b) Reconstruction holographique : coupe dans le plan {$x, z$}. (c,d) Reconstructions tomographiques dans les mêmes plans.</figcaption></figure>

Nous ferons de même avec le vecteur d'onde d'illumination $k_i$ pour obtenir $k_{iz}$ :

$$k_{iz} = \sqrt{R_{\text{Ewald}}^2 - k_{ix}^2 - k_{iy}^2}. \qquad (\text{III.2.29})$$

En utilisant la relation d'élasticité proposée Eq. (III.2.19), il est possible de déterminer les coordonnées vectorielles $k_{ox,y,z}$ du vecteur d'onde objet $k_o$. De là, il est possible de reconstruire le spectre 3D du potentiel objet $\tilde{P}(k_{ox}, k_{oy}, k_{oz})$ en utilisant l'Eq. (III.2.18). En calculant la transformée de Fourier inverse 3D du spectre obtenu, on peut déterminer la réfraction et l'absorption de l'échantillon. Notons $n = n' + in''$, la contribution réfractive est alors

$$n' = \Re \left\{ \mathcal{F}_{3D}^{-1} \left[ \tilde{P}(k_{ox}, k_{oy}, k_{oz}) \right] \right\}, \qquad (\text{III.2.30})$$

et le coefficient d'absorption $\alpha = 4\pi n'' n_{\text{imm}} / \lambda$, avec $n''$

$$n'' = \Im \left\{ \mathcal{F}_{3D}^{-1} \left[ \tilde{P}(k_{ox}, k_{oy}, k_{oz}) \right] \right\}. \qquad (\text{III.2.31})$$

Pour illustrer l'intérêt de la MTD par rapport à la microscopie holographique, les résultats obtenus pour le même échantillon sont comparés Fig. III.2.6. Les résultats obtenus en holographie (voir également Fig. III.1.2) (a,b) montrent que la méthode ne permet pas d'accéder à une information le long de l'axe optique du système. En revanche, on peut constater
<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>FIGURE III.2.7 – Schéma de principe et photographie du montage de MTD en transmission à balayage de l’illumination.</figcaption></figure>

que, dans le cas de la MTD (c,d) le procédé de synthèse d'ouverture 3D permet, d'une part d'améliorer la résolution latérale, et d'autre part de retrouver une résolution axiale. Ici la reconstruction est réalisée en considérant une synthèse d'ouverture par balayage de l'illumination sur 600 angles.

## 2.4 Montage expérimental

Jusqu'ici, j'ai détaillé les grands principes de microscopie par tomographie diffractive. Concentrons nous maintenant sur sa mise en œuvre expérimentale. Le montage proposé Fig. III.2.7 illustre une configuration de MTD en transmission avec synthèse d'ouverture par balayage de l'onde d'illumination de l'objet. On reconnaît ici une configuration de Mach-Zehnder classique. Le balayage de l'onde d'illumination est assuré par un miroir tip/tilt positionné en conjugaison au plan objet par rapport au système optique formé par le condenseur et la lentille de tube $LT_1$. La lentille de tube permet de focaliser l'onde issue du miroir de balayage dans le plan focal arrière du condenseur. Ainsi l'échantillon est éclairé en onde plane. L'angle d'illumination dépend alors de la position ($k_x, k_y$) du point focal dans le plan pupillaire du condenseur. L'objet, positionné dans le plan focal objet de l'objectif de collection, diffracte la lumière. Son image agrandie est formée dans le plan conjugué du système optique formé par l'objectif et la lentille de tube $LT_2$. Selon les dimensions du capteur et l'ouverture numérique de l'objectif, un doublet de rééchantillonnage composé des lentilles $LE_1$ et $LE_2$ est ajouté. Il permet, en ajustant le rapport de focales des deux lentilles, de modifier le grandissement total du dispositif.

L'onde référence, également collimatée, interfère dans le plan du capteur avec l'illumination de l'objet (en bleu) et la composante diffractée par ce dernier (en vert). Sur la Fig. III.2.7 le cube est tilté angulairement pour introduire une porteuse hors-axe. On pourra également envisager l'introduction d'une modulation temporelle entre le bras de référence et le bras objet. Dans les deux cas, le but est de faciliter l'extraction de la phase du champ optique à partir des acquisitions holographiques successives.
## 2.5 Les voies d'amélioration

Les bases de la MTD en transmission ont été posées dans le cas d'un balayage de l'onde d'illumination (ce qui correspond à l'essentiel des dispositifs que nous développons au laboratoire). Les prochains chapitres seront consacrés :

- aux améliorations apportées à la technique dans le cadre de la Thèse de Ludovic Foucault concernant la simplification des acquisitions en MTD;

- à l'optimisation du balayage de l'illumination de l'objet dans le cadre la Thèse d'Asemare Mengistie Taddese;

- à l'ajout de modalités d'imagerie, le tout sans marquage, dans le cadre des Thèses de Riadh Abbessi et d'Asemare Mengistie Taddese.
# Chapitre 3

## Simplification des acquisitions en MTD en transmission

Ces travaux ont été menés dans le cadre de la Thèse de Ludovic Foucault et concernent les Refs. [89, 90]. Le but de la Thèse était d'explorer les voies de simplification des dispositifs de MTD. Ainsi, nous nous sommes ici intéressés :

- aux simplifications des acquisitions pour des échantillons présentant des symétries spécifiques;

- à l'exploitation de l'effet miroir pour transformer un montage de MTD en réflexion en un montage de MTD en transmission;

- à l'utilisation de capteurs de fronts d'ondes pour proposer un dispositif de MTD sans bras de référence.

Je détaillerai l'utilisation de capteurs d'imagerie alternatifs dans un chapitre dédié. Nous allons ici nous concentrer sur les symétries d'échantillons et leurs implications sur les simplifications tant au niveau du dispositif que des acquisitions.

### 3.1 Contexte de l'étude

Cette étude s'inscrit dans les développements des dispositifs d'acquisition et de traitement des données en MTD. Lors de la Thèse de Jonathan Bailleul soutenue en 2016, il a été démontré la possibilité d'accéder à une résolution 3D isotrope [108] mais également de réaliser les reconstructions tomographiques à très haute cadence [121]. Cependant, dans le premier cas, la complexité générale des acquisitions est augmentée par la combinaisons du balayage d'illumination et de la rotation d'échantillon, dans la seconde approche, la complexité algorithmique limite les possibilités d'intervention dans les algorithmes.

Pour certaines classes d'échantillons, il est possible de limiter la quantité d'acquisitions, tout en conservant une bonne résolution [89]. On peut de plus montrer qu'une préparation adéquate des échantillons permet de modifier un microscope en réflexion en un microscope en transmission ce qui offrira, à terme (voir dans la partie Projet), la possibilité de réaliser une configuration de MTD-4π [90, 102]. Un dernier point d'attention a été porté à la simplification des dispositifs de MTD dans le but de s'affranchir de l'utilisation d'un bras de référence externe et sera lui aussi détaillé dans la partie projet.

### 3.2 Exploitation des symétries d'échantillon et simplification des reconstructions

Comme évoqué dans le chapitre précédent, la synthèse d'ouverture 3D utilisée en MTD nécessite de multiplier les acquisitions pour des conditions d'illumination variables. Ainsi, selon les méthodes de synthèse, quelques centaines d'images sont acquises pour obtenir
<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>FIGURE III.3.1 – OTF obtenue pour un objet de phase en holographie (a) dans l'axe, (b) à illumination tiltée, (c) illumination tiltée à l'angle extrême de collection de l'objectif de microscope.</figcaption></figure>

une information quantitative 3D. Cependant, pour des échantillons présentant des symétries particulières, comme par exemple les fibres textiles ou d'autres fibres naturelles comme les toiles d'araignées, on peut limiter le nombre d'acquisitions et compléter le support fréquentiel par raison de symétrie. Détaillons maintenant les principales symétries auxquelles nous serons confrontés.

### 3.2.1 Symétries dans l'espace de Fourier : les symétries hermitiennes

Le procédé de synthèse d'ouverture employé en MTD permet de reconstruire la transformée de Fourier du potentiel objet et par extension la distribution d'indice de réfraction complexe de ce dernier. Ainsi, on pourra, en fonction des propriétés de l'objet, exploiter les propriétés de la transformée de Fourier pour limiter la quantité de données acquises.

Exploitons dans un premier temps les symétries hermitiennes de la transformée de Fourier. Pour ce faire, on considérera un objet de phase pure. Dans cette situation, l'indice de réfraction 3D de l'objet est un réel pur. Par symétrie hermitienne, on sait que :

— le module de la transformée de Fourier de l'indice est pair :

$$|\mathcal{F}\{n(x, y, z)\}| = |\mathcal{F}\{n(-x, -y, -z)\}| \qquad (III.3.1)$$

— la phase de la transformée de Fourier de l'indice est impaire

$$\arg[\mathcal{F}\{n(x, y, z)\}] = -\arg[\mathcal{F}\{n(-x, -y, -z)\}] \qquad (III.3.2)$$

Dans ces conditions, Noda a montré que l'OTF de la MTD se comportait comme Fig. III.3.1 [122, 123] pour une illumination orthogonale à l'échantillon (a), tiltée angulairement
<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>FIGURE III.3.2 – Illustration de la relation entre rotation de l'objet et rotation du support fréquentiel (a) objet, (b) support fréquentiel.</figcaption></figure>

(b), et tiltée angulairement à l'angle maximal de collection de l'objectif de microscope (c). De là, on peut montrer qu'un balayage annulaire simple permet de remplir l'OTF de l'instrument, par symétrie hermitienne, si l'échantillon imagé est un objet de phase pure (Fig. III.3.1(d)). Notons que c'est la méthode utilisée, en complément d'algorithmes de déconvolution, dans la plupart des instruments commerciaux [124, 125]. Dans ce cas, on réalise une acquisition à l'angle maximal de collection de l'objectif de microscope. Ceci permet de reconstruire la partie supérieure de l'OTF (en bleu que la Fig. III.3.1(c)). De là, en considérant que l'échantillon est de phase pure (indice de réfraction réel), et en utilisant les Eqs. (III.3.1) et (III.3.2), on peut compléter l'OTF (partie rouge Fig. III.3.1(d)).

### 3.2.2 Cas des symétries d'échantillon

Nous nous intéresserons ici au cas des échantillons disposant d'au moins une symétrie de révolution selon un axe perpendiculaire à la direction de propagation de l'onde d'illumination. En effet, on peut montrer qu'une rotation dans l'espace objet est équivalente à une rotation du spectre dans l'espace de Fourier du même angle [126]. Cette propriété sera exploitée par la suite pour limiter le nombre d'acquisitions. Prenons le cas du cylindre orienté selon l'axe y du repère cartésien illustré Fig. III.3.2(a). On considérera un détecteur, perpendiculaire au cylindre orienté sur l'axe z de propagation de la lumière. Le cylindre est mis en rotation autour de l'axe y d'un angle θ par rapport à sa normale. Notons g la fonction décrivant le cylindre. On peut écrire :

$$g(x', y', z') = g(x \cos \theta + z \sin \theta, y, -x \sin \theta + z \cos \theta), \qquad (III.3.3)$$

où x', y', z' sont les coordonnées spatiales après rotation. De plus, comme l'objet présente une symétrie de révolution selon l'axe y, on a :

$$g(x', y', z') = g(x, y, z). \qquad (III.3.4)$$

Dans l'espace image, on a donc une invariance par rotation. En revanche, on peut réallouer l'information associée dans l'espace de Fourier pour reconstruire le spectre que l'on aurait obtenu en faisant physiquement tourner l'échantillon comme illustré Fig. III.3.2(b). Ainsi, on a

$$g(x', y', z') = \mathcal{F}^{-1} \{ \mathcal{F} [f_x \cos \theta + f_z \sin \theta, f_y, -f_x \sin \theta + f_z \cos \theta] \}. \qquad (III.3.5)$$

Un combinaison de ces concepts avec un balayage de l'illumination pour également être envisagé.
<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>FIGURE III.3.3 – Exemples d’échantillons présentant une symétrie de révolution. (a) Fibre de soie d’araignée [127], (b) Microrésonateurs optiques attachés à une fibre de silice [128], (c) microcapillaire en microscopie optique [129], (d) Capillarité, forces électrostatiques et ponts de Taylor [130]</figcaption></figure>

## 3.3 Application à l'analyse de fibres

Une partie de cette étude a été motivée par le projet PIR (Projets Innovants et Risqués) TEFNOUT (Tomographie pour l'Étude de Fibres Naturelles OU Transformées). Les fibres synthétiques ou naturelles présentent, la plupart du temps, une symétrie de révolution qui nous permet d'exploiter les propriétés énoncées dans la section précédente. Quelques exemples de fibres naturelles (a), artificielles (b) ou d'échantillons axisymétriques (c,d) sont proposés Fig. III.3.3 pour illustration. Dans ce but, deux méthodes de reconstruction : FINER (Fourier Image NumErical Rotation) et TINER (Tomographic Image NumErical Rotation) reposant respectivement sur une acquisition holographique ou tomographique ont été proposées [89].

### 3.3.1 Reconstruction à partir d'acquisitions holographiques (FINER)

Pour cette première méthode, nous considérons le cas d'un cylindre de dimension infinie selon sa génératrice. Le cylindre est illuminé perpendiculairement à cette dernière. Le

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>FIGURE III.3.4 – Principe de la méthode FINER. D’après la référence [89].</figcaption></figure>
schéma de principe est proposé Fig. III.3.4. On réalise une acquisition holographique de l'objet original, ce qui permet de récupérer l'information du spectre de l'objet sur la calotte de sphère représentée en rouge. En appliquant une rotation numérique de cette dernière le long de l'axe de symétrie de l'échantillon, on peut reconstruire le support fréquentiel 3D de l'objet et ainsi, par inversion son image 3D. La Fig. III.3.5 propose quelques simulations réa-

<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>FIGURE III.3.5 – Reconstruction de différentes fibres par la méthode FINER.</figcaption></figure>

lisées en utilisant FINER. Dans chaque cas de figure, on simule l'hologramme d'une fibre de dimension infinie selon l'axe y. Le spectre 3D associé à cet objet est complété en exploitant les propriétés de symétrie de révolution des fibres. On constate que FINER permet de bien prendre en compte les variations d'indice de réfraction de l'échantillon.

### 3.3.2 Reconstruction à partir d'acquisition tomographiques (TINER)

<figure><img src="image_86.png" /><figcaption>FIGURE III.3.6 – Principe de la méthode TINER. D'après la référence [89].</figcaption></figure>

On considère ici le cas d'un cylindre fini. On réalise une acquisition tomographique par balayage de l'illumination selon l'axe de symétrie du cylindre. On obtient la portion du spectre 3D de l'objet illustrée Fig. III.3.6. Pour construire le spectre complet, on procède à une rotation numérique du spectre acquis selon l'axe de révolution du cylindre. Une transformée de Fourier 3D inverse permettra enfin de reconstruire la distribution d'indice de réfraction de l'objet. Pour illustrer les bénéfices de la méthode, nous avons simulé un tronçon de fibre optique d'indice de gaine 1,45 et d'indice de cœur 1,43 immergée dans un milieu d'indice 1,51. Les résultats sont proposés Fig. III.3.7. Ici les résultats obtenus en holographie (MHN), en MTD et avec la méthode TINER à deux angles de rotation montrent les bénéfices de l'ap-proche. On constate en effet qu'une acquisition holographique seule permet de reconstruire
<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>FIGURE III.3.7 – Reconstruction d'une fibre simulée par la méthode TINER.</figcaption></figure>

la morphologie de la fibre sur une coupe axiale, en revanche, on perd la valeur de l'indice qui est intégrée sur l'épaisseur de la fibre. La situation est pire sur les coupes sagittales pour lesquelles il n'est pas possible de retrouver la morphologie de la fibre. L'utilisation d'une acquisition tomographique permet d'améliorer la situation. En effet, on retrouve une information quantitative sur l'indice de réfraction dans la coupe centrale axiale. En revanche, la résolution sagittale est dégradée par le cône de fréquences manquantes illustré sur l'OTF. Ce cône est enfin rempli par la méthode TINER qui combine différentes acquisitions tomographiques et permet une reconstruction à résolution isotrope dans le cas d'un échantillon à symétrie axiale.

### 3.3.3 Application à la reconstruction d'une fibre optique

Pour montrer l'applicabilité de la méthode à des données expérimentales, nous sommes repartis des données présentées dans l'article de B. Simon et al. lié à la MTD à résolution isotrope [108]. Il est ici montré qu'en combinant 4 balayages complets de l'illumination selon 4 angles de rotation de l'objet, on pouvait obtenir une résolution 3D isotrope. Ce point est illustré Fig. III.3.8 en comparant la MTD et la MTD avec 4 angles de rotation de l'objet. On remarque ici clairement que la résolution le long de l'axe de propagation de la lumière est très fortement améliorée. Pour reproduire ce résultat avec TINER, nous sommes partis d'une des acquisitions tomographiques et avons appliqué une rotation numérique selon les mêmes 4 angles que précédemment. Les résultats sont comparables à ceux obtenus expérimentalement. Bien que limitée à des échantillons axi-symétriques, l'intérêt de TINER est qu'elle permet de remplacer la rotation physique de l'échantillon par une rotation numérique. Ainsi, partant du même jeu de données, il est possible d'ajouter davantage d'angles
<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>FIGURE III.3.8 – Reconstruction d'une fibre par la méthode TINER. Illustration adaptée des références [89, 108]</figcaption></figure>

de rotation comme illustré Fig. III.3.8 pour 20 angles de rotation. L'avantage ici est que l'on s'affranchit de l'éventuel recalage des différents points de vue qui peut être compliqué pour des objectifs à grandissement élevé.

Je suis revenu jusqu'ici sur les méthodes numériques de simplification des acquisitions en exploitant les symétries d'échantillon. Dans ce cas particulier, on peut accéder à une résolution 3D quasi-isotrope tout en limitant la quantité d'acquisitions. Une résolution 3D isotrope peut être atteinte expérimentalement en combinant balayage angulaire de l'illumination et rotation de l'échantillon [108]. Un dispositif de type 4 π (illumination et collection à la fois en transmission et en réflexion) a également été proposé mais n'a pour l'heure jamais été implémenté [102]. Sa mise en œuvre fait d'ailleurs partie des objectifs de l'ANR PRC TARANIS qui nous associe à l'équipe SEMO de l'Institut Fresnel de Marseille pour cette réalisation et un schéma de principe est proposé Fig. III.3.9. Dans ce cas, et pour simplifier l'extraction de l'information, on peut imaginer une configuration à deux caméras et deux miroirs de balayage. La mesure est réalisée de manière séquentielle. Dans un premier temps, on règle le miroir tip/tilt 2 de telle sorte que l'illumination ne puisse pas passer par le second objectif et on réalise un balayage complet du miroir tip/tilt 1. Dans ce cas, la première caméra détecte les composantes réfléchies par l'objet pendant que la seconde caméra détecte les composantes transmises. En réalisant la même opération pour le second miroir tip/tilt, il sera possible de mesurer une nouvelle fois les composantes transmises tout en mesurant les composantes réfléchies par l'autre partie de l'objet.

En 2010, l'équipe SEMO a également proposé un dispositif simplifié, reposant sur l'utilisation de l'effet miroir permettant, en théorie, de réaliser en une seule fois la mesure des deux composantes transmises et réfléchies par l'échantillon [131]. L'utilisation de lames miroir permet à l'objectif condenseur de jouer le rôle de l'objectif collecteur ce qui permet
<figure><img src="image_89.png" /><figcaption>FIGURE III.3.9 – Schéma de principe d'un MTD $4\pi$ et contenu fréquentiel accessibles à chacune des caméras. Inspiré de la référence [92].</figcaption></figure>

d'enregistrer simultanément les composantes :

- transmises

- réfléchies par la partie inférieure de l'objet

- réfléchies par la partie supérieure de l'objet.

La difficulté étant par la suite de séparer les différentes composantes de fréquence dans le spectre acquis.

Dans le cadre de la Thèse de Ludovic Foucault, nous avons proposé une simplification de ce procédé dans le cas d'objets faiblement réfléchissants [90]. Nous avons ainsi pu montrer que la technique permettait de réaliser des acquisitions en transmission avec un microscope en réflexion.

## 3.4 Microscopie tomographique diffractive assistée par miroir

### 3.4.1 Dispositif expérimental

Le dispositif reposant sur l'effet miroir est proposé Fig. III.3.10. Ici, l'objectif condensateur sert également d'objectif de collection, comme dans le cas d'un TDM en réflexion. La préparation des lames échantillons permet de faire fonctionner le dispositif comme une version "repliée" de celui illustré Fig. III.3.9. L'échantillon à analyser est positionné au dessus d'une lame réfléchissante. Ainsi, en éclairant l'échantillon on peut accéder aux composantes réfléchies par la partie haute et la partie basse de l'échantillon ainsi qu'aux composantes transmise par l'échantillon puis réfléchies par la lame.

La principale difficulté réside dans la préparation de l'échantillon. En effet, la maîtrise de la distance entre l'échantillon et la lamelle est cruciale pour pouvoir séparer convenablement les différentes composantes. Il est important que l'image de l'objet et sa réflexion ne puissent pas « overlapper ». Il est dès lors nécessaire de recourir à des « spacers » d'épaisseur calibrée dont l'indice de réfraction est comparable à celui du milieu d'immersion. Dans
<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>FIGURE III.3.10 – Schéma de principe d'un MTD 4π basé sur l'effet miroir, support fréquentiel mesurable et préparation spécifique de l'échantillon. Inspiré des références [90, 131].</figcaption></figure>

le cas de manipulation avec un objectif à air, on peut envisager le recours à un système de pinces optiques pour maintenir l'objet au dessus de la lame. Dans ce cas, on pourra envisager l'utilisation d'une lame semi-transparente moyennant une perte de signal.

<figure><img src="image_91.png" /><figcaption>FIGURE III.3.11 – Simulation d’un fantôme acquis en MTD miroir et influence du balayage.</figcaption></figure>

### 3.4.2 Simplification dans le cas d'échantillons très faiblement réfléchissants

L'extraction de l'information acquise par la configuration proposée Fig. III.3.10 s'avère délicate. En effet, toutes les composantes fréquentielles sont mélangées ce qui limite l'utilisation de méthodes de filtrage conventionnelles. Il y a cependant un cas de figure dans lequel cette configuration peut permettre de simplifier les acquisitions et le traitement de l'information, c'est le cas des échantillons très peu réfléchissants. Dans ce cas particulier, on peut négliger les composantes fréquentielles associées à la lumière rétrodiffusée par l'objet. Le microscope en réflexion ici construit se transforme alors en un microscope en transmission.
Le dernier effort porte alors sur la composante transmise. Compte-tenu de la préparation spécifique de l'échantillon, elle est enregistrée deux fois :

- après transmission directe, réflexion par le miroir puis collection par l'objectif de microscope;

- après réflexion par la lame, transmission par l'objet et collection par l'objectif de microscope.

Le couplage de ces deux composantes, se traduit par l'enregistrement de l'image de l'objet et de son reflet. De plus, si l'échantillon est peu absorbant, on pourra se contenter, moyennant symétrisation, d'un balayage annulaire comme discuté Fig. III.3.1. Nous avons réalisé une simulation (voir Fig. III.3.11) pour comprendre les problématiques posées par la technique. Nous avons ici simulé le fantôme d'une cellule à la fois absorbante et réfractante. Nous avons ensuite reconstruit les images que nous aurions obtenues si nous avions réalisé un balayage complet de l'illumination, ou un balayage annulaire à l'angle maximal de collection de l'objectif de microscope. On peut remarquer que l'on parvient à reconstruire l'objet et son image miroir aussi bien en absorption qu'en réflexion pour le cas d'un balayage complet d'illumination. En revanche, dans le cas d'un balayage annulaire à ouverture maximale, on constate un mélange entre la partie réflexion et la partie absorption de l'échantillon. Ceci est dû à la dissymétrie du spectre acquis lorsque l'on se contente d'un balayage annulaire sans symétrisation du spectre de l'objet.

<figure><img src="image_92.png" /><figcaption>FIGURE III.3.12 – Simulation d'un fantôme acquis en MTD miroir et influence du balayage.</figcaption></figure>

Dans notre cas, nous cherchons à n'obtenir que l'image de l'objet. Nous voulons donc que les parties réflexion et absorption soient bien séparées, tout en limitant la quantité d'acquisitions. La méthode repose sur l'utilisation d'acquisition avec un balayage annulaire et est proposée Fig. III.3.12. L'objet considéré est le même que celui de la Fig. III.3.11. Dans un
<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>FIGURE III.3.13 – Reconstruction tomographique de cristaux de KCl acquis en tomographie miroir. Représentation des projections 3D en maximum d'intensité avec rotation d'un angle $\theta$ autour de l'axe $y$. (a) $\theta = 0^{\circ}$, (b) $\theta = 45^{\circ}$, $\theta = 90^{\circ}$</figcaption></figure>

premier temps, nous séparons l'image reconstruite de l'objet de sa réflexion, pour calculer le spectre associé à chacune. Le spectre est en théorie identique. Ainsi, nous retournons l'une des deux parties de spectre obtenu pour former le spectre complet de l'objet. Ce dernier est formé en additionnant les deux contributions extraites. En calculant la transformée de Fourier inverse du spectre, nous parvenons à reconstruire la réfraction et l'absorption de l'objet sans le mélange partie réelle et partie imaginaire que nous avions précédemment.

Pour vérifier cet effet expérimentalement, nous nous sommes rapprochés de nos collègues du Laboratoire de Photochimie et d'Ingénierie Macromoléculaires (LPIM) afin de réaliser la préparation très spécifique des lames miroirs. Un dépôt d'or est réalisé sur des lamelles de microscope, puis un polymère, d'indice de réfraction proche du verre et de l'huile d'immersion des objectifs, est déposé par *spin coating*. Son épaisseur doit permettre de séparer l'image de l'objet de son reflet. Pour illustrer l'effet miroir, nous avons réalisé une acquisition sur des cristaux de KCl déposés sur lame ITO. Afin de visualiser l'objet et son image miroir dans le volume reconstruit, nous avons réalisé une projection 3D en maximum d'intensité que nous avons par la suite mis en rotation selon un axe perpendiculaire à l'axe optique. Les résultats illustrés Fig. III.3.13 pour une vue de face (a), avec une rotation de 45° (b), et de 90° (c). On constate clairement l'objet et son image miroir sur les acquisitions.

<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>FIGURE III.3.14 – Reconstruction tomographique d'une bille de latex acquise en tomographie miroir. (a) Coupe reconstruite dans le plan $(x, z)$, (b) Résultat de la démodulation, (c) Comparaison des profils d'indice de réfraction.</figcaption></figure>

Regardons maintenant le résultat de la démodulation proposée sur l'image d'une bille de latex acquise en TDM miroir. Les acquisitions sont réalisées en immersion dans l'huile ($n_{imm} = 1,518$). Les billes utilisées sont des billes de latex données pour un indice de 1,59 et ont un diamètre de 5 µm. Les résultats obtenus dans ce cadre sont reportés Fig. III.3.14(a)
selon une coupe axiale dans le plan (x, z) du volume reconstruit avant démodulation. On constate que l'image de l'objet et son reflet (respectivement associés aux couleurs rouge et verte) sont de dimension légèrement différente. En effet, la bille de latex se comporte comme une lentille, ce qui influence les dimensions de l'image miroir. Il reste néanmoins possible d'appliquer la méthode de démodulation proposée Fig. III.3.12, pour obtenir l'image de la bille (b). Afin de valider nos résultats, nous avons comparé les profils de contraste d'indice de réfraction tirés au centre des billes le long de l'axe x. On peut remarquer que l'objet reconstruit (en bleu) s'accorde convenablement au profil « théorique » de la bille.

## 3.5 Conclusion

Ce chapitre était l'occasion de revenir sur une partie des travaux de Thèse de Ludovic Foucault qui posent les jalons d'un volet du projet de recherche qui sera développé par ailleurs autour de la simplification et de la fonctionnalisation des dispositifs de MTD. Dans tous les cas, nous cherchons à préserver autant que possible la résolution d'imagerie des systèmes développés. À cette fin, il est nécessaire d'optimiser les acquisitions pour pouvoir se permettre d'en limiter la quantité. Nous nous attarderons donc, dans le chapitre suivant aux problématiques d'optimisation du balayage de l'illumination en MTD.
# Chapitre 4

## Optimisation du balayage de l'illumination en MTD

Ces travaux ont été menés dans le cadre de la Thèse d'Asemare Mengistie Taddese et concernent les Refs. [91, 92]. Le but de la Thèse était, entre autres choses, d'optimiser les acquisitions et reconstructions tomographiques. Cette Thèse était financée dans le cadre de l'ANR HORUS en partenariat avec le Laboratoire Hubert Curien de Saint-Étienne et l'IGBMC à Strasbourg. Nous avons ici :

- exploré les différentes méthodes de balayage de l'illumination que ce soit en microscopie en transmission, en réflexion ou en $4\pi$;

- discuté les paramètres optimaux des différents schémas de balayage;

- exploité la nature vectorielle de la lumière au travers de l'utilisation de capteurs d'imagerie sensibles à la polarisation.

Comme ce fût le cas pour le chapitre précédent, je n'aborderais pas le dernier point qui sera traité dans un chapitre à part.

### 4.1 Contexte de l'étude

Ces travaux s'inscrivent dans la continuité de la Thèse de Ludovic Foucault, soutenue en 2019, qui visait à explorer les voies de simplification des dispositifs MTD. En effet, la MTD repose sur l'acquisition séquentielle de multiples hologrammes, ce qui limite pour l'heure son application à la caractérisation d'échantillons fixés, ou *a minima* immobiles sur la durée des acquisitions. Des optimisations logicielles ont d'ores et déjà été envisagées [121] permettant de réaliser des acquisitions/reconstructions d'un volume tomographique toutes les 3 secondes soit 0,3 Hz pour des volumes de 512×512×512 pixels.

Une autre voie pour accélérer les acquisitions consiste, de manière évidente, à limiter la quantité de données acquises. Se pose alors la question de la qualité des reconstructions. En d'autres termes nous cherchons ici à répondre aux questions suivantes :

- quel est le nombre d'angles d'illumination nécessaire pour obtenir une reconstruction de bonne qualité ?

- À nombre d'illuminations constant, quel le meilleur moyen de balayer la pupille du condenseur ?

### 4.2 Balayage de la pupille du condenseur

Les dispositifs que nous développons au sein de l'équipe reposent pour l'essentiel sur un balayage de l'illumination sur l'objet. Pour ce faire, il est nécessaire de faire varier l'angle de l'onde plane d'illumination d'une acquisition à l'autre. Ceci revient à décaler spatialement le point focal formé par la lentille tube du condenseur dans le plan focal arrière de ce dernier. Le choix de la méthode de balayage est alors dicté par différents facteurs aussi bien liés à
<figure><img src="image_95.png" /><figcaption>FIGURE III.4.1 – Quelques schémas de balayage classiques de l’illumination vus dans le plan focal arrière du condenseur (unités normalisées par le rayon de la sphère d’Ewald) et du point de vue du vecteur d’onde d’illumination $k_i$. (a) balayage annulaire, (b) balayage en étoile, (c) balayage en fleur, (d) balayage en spirale, (e) balayage en spirale de Fermat, (f) balayage optimisé pour la projection sur une demi-sphère.</figcaption></figure>

des contingences matérielles, comme le temps d'amortissement du miroir de balayage en cas de variation brutale de tension, qu'à des choix liés à la nature de l'objet à imager. Enfin, certaines applications peuvent nécessiter des acquisitions rapides et résolues. Dans ce cas, l'accent sera mis sur les méthodes de balayage qui rempliront le plus rapidement possible l'espace de Fourier.

Les méthodes de balayage sont très nombreuses, nous nous sommes ici limités aux plus utilisées [91, 92] qui sont regroupées Fig. III.4.1. Nous retrouvons ici les représentations du plan focal arrière du condenseur, normalisées par le rayon de la sphère d'Ewald, et l'évolution du vecteur $k_i$, lui même normalisé, dans le volume 3D. Nous retrouvons ici quelques balayages communs tels que (leurs propriétés seront détaillées par la suite) (a) le balayage annulaire, (b) en étoile, (c) « en fleur », (d) en spirale, (e) en spirale de Fermat, (f) optimisé pour la projection sur une demi-sphère. Ce dernier balayage a été nouvellement introduit dans le cadre de la Thèse d'Asemare Mengistie [91]. Détaillons quelque peu ces balayages.

### 4.2.1 Balayage annulaire

Pour ce balayage, il est nécessaire de fixer le nombre de cercles concentriques et le nombre de points à positionner. Pour obtenir un échantillonnage régulier, il faut déterminer la circonférence de chaque cercle. On peut déterminer $p_i$ le nombre de points sur le
cercle de rayon $r_i$ à partir du nombre de points $N$ à positionner comme :

$$p_i = \frac{r_i}{\sum_{i=1}^{\text{Nb}_{\text{circ}}} r_i} N. \qquad (\text{III}.4.1)$$

Les $p_i$ points sont alors positionnés de manière régulière, selon l'équation du cercle, sur un cercle de rayon $r_i$. Ce traitement est appliqué à l'ensemble des cercles balayés pour éclairer tout le plan focal arrière du condenseur.

On pourra remarquer que le balayage azimuthal à l'ouverture numérique du condenseur discuté précédemment est un cas particulier de balayage annulaire. Il est essentiellement utilisé et couplé à une symétrisation du spectre, pour la reconstruction d'objet non-absorbants. C'est d'ailleurs le balayage qui a été retenu dans la plupart des solutions commerciales [124, 125].

### 4.2.2 Balayage en étoile

Il est ici nécessaire de fixer le nombre de branches d'étoiles que l'on souhaite et le nombre de points à répartir. Les points sont répartis à équidistance sur chacune des droites formant l'étoile. Ces dernières sont orientées de telle sorte à balayer un angle de $2\pi$ sur la totalité des branches.

### 4.2.3 Balayage « en fleur »

Il s'agit d'une famille de courbes paramétriques dont les coordonnées cartésiennes s'écrivent :

$$x = \cos(k\theta); \quad y = \sin(k\theta) \qquad (\text{III}.4.2)$$

Si $k$ est impair, la fleur aura $k$ pétales. En revanche si $k$ est pair, la fleur disposera de $2k$ pétales. L'angle $\theta \in [0; 2\pi]$ sera échantillonné sur les $N$ points à positionner.

### 4.2.4 Balayage en spirale

Le balayage en spirale en coordonnées cartésiennes est défini par :

$$x = \theta \cos(\theta); \quad y = \theta \sin(\theta) \qquad (\text{III}.4.3)$$

où l'angle polaire $\theta \in [0; 2\pi t]$ est exprimé en fonction du nombre de tours $t$ à réaliser.

### 4.2.5 Balayage en spirale de Fermat

Ce balayage a été proposé par Vogel dans le but de proposer une représentation mathématique des têtes de tournesol [132]. Les équations cartésiennes du balayage s'écrivent

$$x = \sqrt{\theta} \cos(g\theta); \quad y = \sqrt{\theta} \sin(g\theta) \qquad (\text{III}.4.4)$$

où l'angle polaire $\theta \in [0; 2\pi t]$ est exprimé en fonction du nombre de tours $t$ à réaliser et $g = \pi (3 - \sqrt{5})$ l'angle d'or. Ce balayage est le plus régulier que l'on puisse imaginer en 2D. En revanche, il n'est pas optimal en 3D.

### 4.2.6 Balayage optimisé sur une demi-sphère

La méthode de meilleure répartition des illuminations sur une sphère a été proposée par Saff et al. [133]. Dans notre cas, cette répartition présente un grand intérêt étant donné que nous cherchons à optimiser la distribution 3D des vecteurs $k_i$ dans l'espace de Fourier 3D.
<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>FIGURE III.4.2 – Illustration de l'OTF accessible (a) en théorie, (b) pour un balayage en étoile, (c) pour un balayage en grille, (d) pour un balayage annulaire à 2 anneaux, (e) pour un balayage annulaire à 4 anneaux, (f) pour un balayage à double spirale, (g) pour un balayage en fleur, (h) pour une spirale de Fermat, (i) pour un balayage optimisé 3D.</figcaption></figure>

Ainsi pour construire ce balayage, les $k_i$ sont régulièrement répartis sur une demi-sphère selon l'algorithme discuté ref. [133]. Nous nous limitons à une demi-sphère car, en l'état, l'instrument ne permet pas de détecter et la composante transmise et la composante réfléchie par l'objet. Pour pouvoir réaliser le balayage dans le plan focal arrière du condenseur, les $k_i$
sont projetés dans le plan {$k_{ix}, k_{iy}$}, donnant naissance à la répartition illustrée Fig. III.4.1(f).

Afin de pouvoir caractériser les différentes méthodes, nous avons calculé les fonctions de transfert optique (OTF) associées pour les principaux balayages. Les résultats, présentés Fig. III.4.2 nous servirons de base de comparaison. L'OTF de référence sera celle représentée Fig. III.4.2(a). On peut d'ores et déjà remarquer que tous les motifs de balayage ne remplissent pas le support fréquentiel de manière uniforme. De plus, dans le cas où le motif de balayage est périodique et régulier, comme la structure de balayage en grille, des « trous » sont présents dans l'espace des fréquences.

## 4.3 Analyse des différentes familles de balayage

Nous avons vu précédemment que le balayage de la pupille du condenseur pouvait être réalisé d'une multitude de manières et, selon les méthodes, dépendre de bons nombres de paramètres. Nous allons ici nous intéresser à la manière dont chacune des méthodes proposées permet le remplissage de l'OTF théorique de la technique. On peut ainsi définir un taux de remplissage normalisé de l'OTF tel que

$$ \mathbb{F}(\%) = \frac{V_{\text{Pattern}}}{V_{\text{Theorique}}} \times 100. \qquad (\text{III.4.5}) $$

Ainsi, pour un balayage donné, plus $\mathbb{F}$ sera proche de 100 % plus le remplissage de l'OTF obtenu sera proche du balayage théorique. Ce critère ne rend pas nécessairement compte de

<figure><img src="image_97.png" /><figcaption>FIGURE III.4.3 – Estimation du remplissage de l'OTF $\mathbb{F}(\%)$ en fonction du nombre d'illumination pour différentes formes de balayage de la pupille du condenseur. En insert, zoom sur les 50 premiers angles d'illumination.</figcaption></figure>

la résolution finale que présentera l'image reconstruite. Néanmoins l'estimation de $\mathbb{F}$ reste un indicateur relativement fiable de la qualité d'un balayage par rapport à un autre.

Nous avons calculé l'Eq. (III.4.5) pour les différents balayages et des nombres d'angles allant de 1 à 600. Les résultats sont résumés Fig. III.4.3. On remarque ici que quelque soit le nombre d'angles d'illumination, le balayage optimisé pour la 3D donne les meilleurs remplissages de l'espace de Fourier. De plus si l'on revient sur la Fig. III.4.2, on remarque que l'information est répartie de manière très uniforme dans l'espace de Fourier, contrairement à
<figure><img src="image_98.png" /><figcaption>FIGURE III.4.4 – Reconstruction d'une bille simulée - partie réfraction (a-h), et partie absorption (i-l). (a), (e) et (i) Objet simulé. (b), (f) et (j) Balayage en étoile. (c), (g) et (k) Balayage en spirale de Fermat. (d), (h) et (l) Balayage optimisé 3D. La barre d'échelle vaut 1 µm</figcaption></figure>

d'autres balayages qui, bien qu'associés à un taux de remplissage élevé, favorisent les basses ou les hautes fréquences spatiales.

Nous allons maintenant comparer les résultats de reconstruction obtenus sur des images simulées et des images réelles. Nous ne considérons pas l'ensemble des balayages, nous utiliserons le balayage en étoile (qui semblait le plus mauvais dans notre configuration), le balayage en fleur (qui donne des résultats intermédiaires) et le balayage uniformisé pour la 3D (qui est le meilleur selon le test précédent).

### 4.3.1 Analyse des simulations

Considérons ici le cas d'une microsphère de 2 µm de diamètre et d'indice $n_{sphère} = 1,46$ dans l'huile d'immersion d'indice $n_{imm} = 1,49$. La microphère présente deux inclusions absorbantes de 0,8 µm et d'indice $n_{inc} = 1,46+0.02i$ disposées à $z = \pm 0,5$ µm du plan central du volume tomographique reconstruit. L'objet simulé est présenté Fig. III.4.4 (a) et (e) pour la partie réfraction et (i) pour la partie absorption. Nous avons ici simulé un balayage sur 600 angles dans chacun des cas.

On peut remarquer que sur la contribution réfractive, les différents balayages donnent des résultats similaires. En revanche, dans le cas de l'absorption, on remarque que les effets d'elongation sur l'axe $z$ sont moins présents dans le cas du balayage optimisé 3D et qu'il devient possible de distinguer les deux inclusions absorbantes. Ceci peut s'expliquer par la propension du balayage 3D à occuper l'espace de Fourier de manière équivalente que ce soit pour les hautes ou les basses fréquences. Au contraire, le balayage en étoile aura tendance à privilégier certains axes au détriment des autres.

Analysons maintenant l'effet du balayage et du nombre d'angles d'illuminations sur des données expérimentales.
<figure><img src="image_99.png" /></figure>

FIGURE III.4.5 – Reconstruction d'un pollen de topinambour - partie réfraction (a, c, c'), et partie absorption (b). (c, c') balayage optimisé 3D pour 600 angles. (d,d') balayage en étoile 60 angles. (e,e') spirale de Fermat 60 angles. (f,f') Balayage optimisé 3D 60 angles. (g) Profil tracé sur les structures identifiées en (c'-f')

4.3.2 Analyse des données expérimentales

Pour analyser l'influence du nombre d'angles sur la qualité des reconstructions, nous avons réalisé une série d'expériences pour visualiser les reconstructions, à nombre d'angles faible (60 illuminations), pour trois balayages : le balayage en étoile, le balayage en spirale
de Fermat et le balayage optimisé en 3D. Les résultats sont comparés aux résultats obtenus avec un balayage optimisé 3D à 600 angles et sont regroupés Fig. III.4.5.

Nous nous intéressons une nouvelle fois à un pollen de topinambour. En utilisant un balayage optimisé 3D à 600 angles d'illumination, on peut reconstruire les structures internes du pollen par sectionnement optique en réfraction (a) et en absorption (b). Com comparons maintenant les balayages en étoile, en spirale de Fermat, et optimisé 3D pour 60 angles d'illumination. Les résultats sont visibles sur les images (d, e, f) pour un plan externe du pollen et (d', e', f') pour les extrémités des pics. Notre vérité terrain sera le balayage uniforme 3D avec 600 angles (c, c'). Visuellement et sans grande surprise, les images obtenues avec 60 angles présentent moins de détails que celles obtenues avec 600 angles. Néanmoins, le sectionnement optique reste possible, et la qualité d'ensemble reste correcte pour un temps d'acquisition 10 fois plus faible.

## 4.4 Généralisation à la microscopie $4\pi$

Nous verrons dans la partie projet de ce document que notre collaboration avec l'institut Fresnel de Marseille, au travers de l'ANR TARANIS vise au développement d'un dispositif de MTD $4\pi$. Il est donc légitime de se demander si les développements présentés dans le cadre de la MTD en transmission demeurent valables.

<figure><img src="image_100.png" /><figcaption>FIGURE III.4.6 – OTF simulées pour un microscope $4\pi$. (a) Remplissage maximal. (b) Balayage en étoile. (c) Grille circulaire. (d) Balayage annulaire. (e) Balayage en spirale. (f) Spirale de Fermat. (g) Balayage en fleur. (h-i) Balayages optimisés 3D.</figcaption></figure>

Au moment où cette étude a été réalisée, nous ne disposions pas de dispositif expérimental adapté, la validation a donc été réalisée au travers de simulations [92].
Les OTF simulées sont reportées, en coupe ($k_y, k_z$), Fig. III.4.6. L'OTF complètement remplie (a) est donnée à titre de comparaison. Toutes les OTF suivantes sont données pour 600 angles d'illumination dans le cas, (b) d'un balayage en étoile, (c) d'une grille circulaire, (d) d'un balayage annulaire, (e) d'un balayage en spirale, (f) d'une spirale de Fermat, (g) d'un balayage en fleur et (h-i) de balayages respectivement optimisés en 3D sur une calotte de sphère ou sur une sphère complète. On remarque ici un comportement similaire au cas de la MTD en transmission présentée Fig. III.4.2. On pourra néanmoins remarquer des structures périodiques dans les composantes associées aux réflexions. Ceci est sans doute dû à la régularité de l'échantillonnage. En effet, ces méthodes ont été optimisées pour être les plus régulières possible en 3D. En utilisant l'Eq. (III.4.5) il est possible, comme dans le cas

<figure><img src="image_101.png" /><figcaption>FIGURE III.4.7 – Comparaison des taux de remplissage de l'OTF idéale en fonction des différentes méthodes de balayage pour un microscope 4π.</figcaption></figure>

précédant, de comparer les différents balayages entre eux. On remarque ainsi qu'une nouvelle fois, le balayage optimisé pour la 3D donne les meilleurs résultats. On remarque en revanche que le balayage annulaire est ici beaucoup plus performant que dans le cas de la MTD en transmission.

Illustrons les résultats qui pourront être obtenus en MTD $4\pi$ en simulant les données tomographiques reconstruites pour un fantôme de Shepp-Logan (Fig. III.4.8). Seuls les résultats obtenus avec le balayage optimisé pour la 3D avec 600 angles d'illumination sont représentés. On retrouve ici les coupes ($x, y$) (a-d) et ($y, z$) (e-h) du fantôme pour l'information obtenue en transmission (b,f), en réflexion (c,g) et en $4\pi$ (d,h). Comme on pouvait s'y attendre, la combinaison des acquisitions en transmission et en réflexion améliore la résolution axiale de la MTD. On peut le remarquer clairement sur la Fig. III.4.8(h) où l'on constate une fermeture complète de la membrane du Shepp-Logan. Il reste néanmoins un effet de dilation selon l'axe $z$ qui peut s'expliquer par les zones de fréquences manquantes dans les OTF du MTD $4\pi$ représentées Fig. III.4.6. Ce point peut être amélioré en augmentant l'ouverture numérique de l'objectif de collection.

Ces travaux, menés dans le cadre de la Thèse d'Asemare Mengiste Taddese et les réalisations autour de la MTD par à effet miroir (présentés dans le chapitre précédent) de la Thèse de Ludovic Foucault, sont au cœur des développements qui sont conduits dans l'ANR TARNIS (Acquisitions et reconstructions tomographiques pour les systèmes d'imagerie nanoscopique avancés) portée par les collègues de l'institut Fresnel et qui a permis le recrutement en Thèse de Carlos Alberto Chacon. Je rentrerai davantage dans les détails liés à ces
<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>FIGURE III.4.8 – TDM $4\pi$ appliquée à un fantôme de Shepp-Logan. (a,e) Objet simulé. (b,f) Objet reconstruit en transmission, (c,g) en réflexion, (d,h) en $4\pi$. La barre d'échelle vaut 10 µm</figcaption></figure>

développements dans la partie consacrée à mon projet de recherche.

## 4.5 Conclusion

Ce chapitre était l'occasion de revenir sur les travaux menés dans le cadre de la Thèse d'Asemare Mengiste Taddese autour de l'optimisation du balayage de l'illumination en MTD. Ces travaux seront d'autant important que l'on cherchera à acquérir des données tomographiques en temps réel, comme il sera discuté plus loin dans le projet de recherche. Nous avons ainsi pu quantifier l'efficacité des différentes méthodes à remplir l'OTF que ce soit dans une configuration en transmission, en réflexion ou en MTD $4\pi$.

Dans les chapitres suivants, nous aborderons les premières pistes que nous avons abordés pour ramener de la sélectivité aux reconstructions tomographiques du point de vue traitement, en abordant la possibilité de transformer un microscope tomographique en microscope optique universel, puis du point de vue expérimental en réalisant des acquisitions tomographiques résolues en polarisation.
# Chapitre 5

## Reconstruction multimodale : de la MTD au microscope numérique universel

Ces travaux ont été initiés dans le cadre du stage M2 de Steve Laroche et le début de la Thèse de Doctorat de Riadh Abbessi.

L'amélioration de la résolution et l'accès à de nouveaux contrastes d'imagerie sont toujours un des enjeux de la microscopie optique. En effet, les échantillons biologiques offrent, pour la plupart, des contrastes d'intensité relativement faibles. De plus la limite de diffraction des méthodes de microscopie optique fait que certaines structures des échantillons ne peuvent pas être résolues. Si l'on excepte les méthodes de microscopie super-résolues, qui sortent des cadres de ce document, de nombreuses méthodes sont d'ores et déjà disponibles afin d'améliorer le contraste des images acquises. Parmi les méthodes les plus utilisées, on pourra noter la microscopie à champ sombre (visant à filtrer les composantes spéculaires de l'onde d'illumination de l'échantillon), la microscopie à contraste de phase (introduisant un déphasage entre les composantes spéculaires de l'onde d'illumination et la part de l'onde ayant traversé l'objet). Dans certains cas, l'utilisation de plusieurs contrastes d'imagerie nécessite d'utiliser plusieurs bâti de microscopie, ce qui pose des problèmes de recalage des échantillons.

Nous proposons ici d'exploiter les propriétés d'acquisition et de reconstruction de la MTD pour simuler le fonctionnement des principales techniques de microscopie. Les méthodes ainsi simulées pourront être bidimensionnelles (si elles sont simulées à partir des hologrammes acquis) ou tridimensionnelles (dans ce cas, nous utiliserons les volumes de données MTD reconstruits). Comme évoqué précédemment, nous regrouperons ces modalités en trois grandes catégories :

1. Les méthodes reposant sur une sélection des angles d'illumination (e.g. champ large, illumination oblique)

2. Les méthodes reposant sur une modification de l'intensité (e.g. Champ Sombre, illumination de Rheinberg)

3. Les méthodes reposant sur une modulation de la phase du champ optique (e.g. Contraste de Phase, DIC)

Les simulations des différentes modalités peuvent être résumées par la Fig. III.5.1. Dans le cas 2D, la sélection des hologrammes est parfaitement équivalente au rôle joué par le condenseur : certaines modalités nécessiteront de ne prendre qu'une partie des angles de vue. Dans certains cas, il est également nécessaire d'ajouter un masque de phase dans le plan focal arrière de l'objectif de collection. Ce dernier correspond à un plan de Fourier sur les dispositifs et pourra donc être remplacé par un filtrage du spectre des hologrammes acquis. Enfin, comme nos acquisitions sont séquentielles, contrairement au cas d'un microscope grand champ classique, il est nécessaire de multiplexer angulairement les hologrammes traités,
<figure><img src="image_103.png" /><figcaption>FIGURE III.5.1 – Comparaison des principes de simulations 2D et 3D.</figcaption></figure>

c'est le rôle de la sommation des intensités. Ainsi, toutes les méthodes simulées en 2D ou en 3D reposeront sur ce principe (microscope DIC mis à part). Nous détaillerons les spécificités liées aux méthodes 3D un peu plus loin.

## 5.1 De la TDM à la microscopie numérique

Comme nous avons pu le voir précédemment, la MTD repose sur l'acquisition séquentielle d'hologrammes d'un objet vu sous différents angles. Chaque hologramme permet d'obtenir l'amplitude et la phase du champ optique de l'objet. En se plaçant dans l'approximation de Born, le spectre des différents hologrammes est projeté sur une calotte de sphère et réalloué dans un cube tridimensionnel afin de construire le spectre 3D de l'objet analysé. En calculant la transformée de Fourier 3D inverse de ce spectre, il est alors possible d'obtenir l'indice de réfraction 3D complexe de l'objet analysé. La reconstruction d'un pollen de topi-

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>FIGURE III.5.2 – Reconstruction tomographique d'un pollen de topinambour, (a) Réfraction, (b) absorption, le QR Code permet d'accéder à la reconstruction 3D de la réfraction.</figcaption></figure>

nambour est proposée figure III.5.2 à la fois en réfraction et en absorption. La reconstruction de la réfraction en volume (la séquence évolue selon l'axe z) est accessible en scannant le QR Code de la figure III.5.2. Ainsi, le multiplexage des acquisitions 2D permet d'obtenir une information quantitative en 3D.

La TDM nous permettant d'accéder à l'amplitude et la phase pour chaque angle d'illumination, nous allons voir par la suite comment utiliser ces données pour simuler différentes
<figure><img src="image_105.png" /></figure>

FIGURE III.5.3 – Modalités de microscopie bidimensionnelles simulées à partir des données tomographique. (a) Microscope champ clair. (b) Microscope champ sombre. (c,d) Microscope oblique. (e) Microscope à illumination de Rheinberg. (f) Microscope à contraste de phase positif. (g) Microscope à contraste de phase négatif. (h) Microscope DIC. Illustration issue de la référence [95].

modalités de microscopie. Comme évoqué précédemment, nous regrouperons ces modalités en deux grandes catégories : les méthodes de filtrage en intensité et les méthodes reposant sur une modification de la phase. La Fig. III.5.3 regroupe l'ensemble des modalités qui seront simulées en 2D. Nous discuterons dans la suite des éléments importants des modèles de formation d'image.

## 5.2 Modalités reposant sur une modification de l'intensité

### 5.2.1 Microscopie à champ large

La plus répandue des modalités de microscopie est la microscopie à champ large en transmission. Classiquement, l'échantillon est illuminé simultanément sous tous les angles. On enregistre l'intensité résultante sur une caméra. Pour simuler le fonctionnement d'un microscope champ large, il nous suffit alors de sommer les intensités des champs acquis par MTD. La synoptique de l'algorithme de simulation et l'image champ large obtenue sont reportées Fig. III.5.3(a).

### 5.2.2 Microscopie à champ sombre

Pour transformer notre MTD en un microscope champ sombre, la première étape est de ne sélectionner que les illuminations associées aux angles de balayage les plus élevés afin de ne jamais illuminer l'échantillon en incidence normale. En pratique, on choisira un condenseur avec une ouverture numérique plus grande que l'objectif de collection. Le spectre du champ de chaque hologramme sélectionné peut ensuite filtré passe-haut autour de sa composante spéculaire, si la première condition n'est pas validée. Cette opération est l'équivalent numérique du masque pupillaire d'un objectif champ sombre.
L'image simulée est proposée Fig. III.5.3(b). On constate bien l'effet du filtrage qui met en avant les structures de hautes fréquences spatiales en annulant les composantes continues.

### 5.2.3 Microscopie à l'illumination oblique

La microscopie à illumination oblique est très proche de la microscopie champ large. La principale différence vient du fait que l'on ne sélectionne qu'une partie des illuminations (la plupart du temps avec une discrimination « droite-gauche »). L'intensité du champ associé à chaque hologramme est enfin sommée pour obtenir l'image de microscopie oblique. Les résultats obtenus en appliquant ce traitement aux hologrammes sont proposés Figs. III.5.3(c,d). On remarque ici un effet de relief dans la direction du filtrage.

### 5.2.4 Microscopie à illumination de Rheinberg

La microscopie à illumination de Rheinberg, proposée en 1898 [134] est proche de la microscopie en champ sombre. La principale différence est que le contenu fréquentiel de l'hologramme est ici codé en couleur. La simulation d'un microscope de Rheinberg a récemment été proposée à partir de données d'holographie [135]. Ici, l'objet est toujours illuminé en incidence normale. Dans notre configuration, il nous faut de plus tenir compte de la direction de l'illumination.

Dans un premier temps, les hologrammes sont sélectionnés en fonction de l'angle d'illumination. Les hologrammes associés aux petits angles (proches de l'incidence normale) seront affectés à la couleur verte. Les hologrammes aux angles intermédiaires sont associés à la couleur rouge, et enfin les hologrammes aux forts angles seront associés à la couleur bleue. Les hologrammes démodulés sont ensuite filtrés (dans l'espace de Fourier [135]): les basses fréquences spatiales (spot spéculaire) sont affectées à la couleur verte, les fréquences intermédiaires à la couleur rouge et les fréquences élevée à la couleur bleue. Après retour dans l'espace image, l'intensité associée à chaque composante est additionnée permettant de construire une image composite RVB.

Le résultat obtenu est illustré Fig. III.5.3(e). L'avantage de la méthode par rapport à un illuminateur de Rheinberg classique réside dans le fait que les filtres d'illumination et les filtres pupillaires sont entièrement paramétrables.

La liste des méthodes basées sur un contraste d'intensité n'est pas exhaustive et il peut tout à faire être envisagé de les combiner entre-elles pour explorer de nouveaux contrastes. Comme il a été évoqué un peu plus haut, il est également possible d'agir sur la phase de l'onde.

## 5.3 Modalités reposant sur une modification de la phase

### 5.3.1 Microscopie à contraste de phase

La microscopie à contraste de phase, initialement proposée par Zernike [136-138], est parfaitement adaptée à l'imagerie d'échantillons biologiques peu diffusants. Ici, la composante de l'onde traversant l'échantillon est déphasée par rapport à la part de l'onde ne le traversant pas. Les deux contributions interfèrent sur le capteur, ce qui permet d'améliorer le contraste de l'image enregistrée. Afin de déphaser les composantes fréquentielles de l'objet par rapport à la composante spéculaire de l'illumination, un masque de phase $P(k_x, k_y)$ est appliqué au spectre des hologrammes. Ce dernier, défini par :

$$P(k_x, k_y) = \alpha(k_x, k_y) \exp[i\Phi(k_x, k_y)], \qquad (III.5.1)$$
permet de déphaser et atténuer la composante spéculaire des hologrammes. Dans l'Eq. (III.5.1), le terme $\alpha(k_x, k_y)$ permet l'attenuation de la composante spéculaire pendant que le terme $\Phi(k_x, k_y)$ modifie le déphasage. Ils sont respectivement donnés par

$$ \alpha(k_x, k_y) = \begin{cases} \alpha \text{ si } \sqrt{(k_x - k_{i_x})^2 + (k_y - k_{i_y})^2} \le \rho_{\text{pc}} \\ 1 \text{ sinon} \end{cases}, \qquad (\text{III.5.2}) $$

avec $k_{i_x}$, et $k_{i_y}$ les coordonnées du point spéculaire, and $\rho_{\text{pc}}$ le rayon du filtre pupillaire, et

$$ \Phi(k_x, k_y) = \begin{cases} \Phi \text{ si } \sqrt{(k_x - k_{i_x})^2 + (k_y - k_{i_y})^2} \le \rho_{\text{pc}} \\ 0 \text{ sinon} \end{cases}. \qquad (\text{III.5.3}) $$

Les résultats obtenus et illustrés Fig. III.5.3(f,g) montrent l'amélioration du contraste par rapport à une image champ large et l'influence du déphasage introduit par le masque de phase pour des déphasages positifs (f) et négatifs (g).

### 5.3.2 Microscopie à contraste interférentiel différentiel

Proposée en 1955 par Nomarski, la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) permet d'améliorer le contraste des échantillons faiblement diffusants [139]. Dans un microscope DIC, l'objet est éclairé selon deux polarisations orthogonales. Les deux informations interfèrent avec un léger décalage spatial ce qui donne un effet de gradient dans les images acquises. Comme nous ne disposons pas de formalisme vectoriel pour le traitement des images TDM, nous considérerons l'effet de la polarisation comme un déphasage entre les deux hologrammes acquis. Ainsi, pour chaque hologramme $\mathcal{H}_{\theta}$, on calculera le contraste interférentiel comme

$$ I_{\text{DIC}}(x, y, \theta) = |\mathcal{H}_{\theta}(x, y) - \mathcal{H}_{\theta}(x + \Delta x, y + \Delta y) e^{i\Phi_{N}}|^2, \qquad (\text{III.5.4}) $$

où $\Delta x, y$ est le décalage spatial entre les deux hologrammes (équivalent au décalage spatial introduit par le prisme de Nomarski), et $\Phi_N$ le déphasage entre les deux hologrammes. Un résultat obtenu pour $\Phi_N = 0, 01$ rad et $\Delta x = \Delta y = 3$ pixels est présenté Fig. III.5.3(h). On voit ici clairement l'effet de relief apporté par le décalage spatial.

## 5.4 Gestion du défocus

L'utilisation d'acquisitions holographiques pour la simulation de microscopes de routine nous permet également d'agir sur le focus de l'échantillon analysé. On pourra ainsi obtenir le même type de résultats qu'un utilisateur de microscope cherchant à faire la mise au point sur son échantillon. Notons $\mathcal{H}_{\theta}(x, y, z = 0)$ un hologramme acquis pour un angle d'illumination $\theta$. Pour être en mesure d'agir sur le défocus on calculera la propagation du spectre angulaire sur une distance $\Delta z$ pour chaque hologramme utilisé [12, 140]. Ainsi l'hologramme après propagation sur une distance $\Delta z$ pour être estimé comme

$$ \mathcal{H}_{\theta}(x, y, \Delta z) = \mathcal{F}_{x,y}^{-1} \{ \mathcal{F}_{k_x, k_y} [\mathcal{H}_{\theta}(x, y, z = 0)] \times H(k_x, k_y, \Delta z) \}, \qquad (\text{III.5.5}) $$

avec $H_{\Delta z}(k_x, k_y)$ le spectre angulaire, calculé dans un milieu d'indice de réfraction $n_{\text{imm}}$ sur une distance $\Delta z$ et défini par

$$ H_{\Delta z}(k_x, k_y) = \exp \left[ i \frac{2\pi n_{\text{imm}}}{\lambda} \Delta z \sqrt{1 - (\lambda k_x)^2 - (\lambda k_y)^2} \right]. \qquad (\text{III.5.6}) $$
<figure><img src="image_106.png" /><figcaption>FIGURE III.5.4 – Illustration de la gestion du défocus pour l'ensemble des méthodes proposées. En scannant le QR-Code, il est possible de voir l'effet du défocus sur chacune des méthodes.</figcaption></figure>

En appliquant les traitements présentés précédemment aux hologrammes défocalisés, on peut simuler le défocus tel qu'il se produirait sur un microscope conventionnel. Ce point est illustré Fig. III.5.4 pour l'ensemble des méthodes détaillées jusqu'ici. Le QR-Code proposé permet de visualiser la séquence pour différentes valeurs de défocus.

Les méthodes présentées jusqu'ici reposaient sur le traitement des hologrammes acquis sous différents angles de vue. Ces acquisitions permettent ainsi de simuler les méthodes d'imagerie bidimensionnelles les plus courantes. Dans la suite, nous proposons d'étendre ces résultats à l'imagerie tridimensionnelle.

## 5.5 Généralisation en 3D

Les méthodes de microscopie conventionnelles sont pour la plupart limitée à deux dimensions. L'utilisation des données de MTD nous permet de généraliser les résultats précédents en trois dimensions.

Le principe général des simulations 2D et 3D est résumé Fig. III.5.1. On peut remarquer que le principe des méthodes est relativement proche. Dans le cas de la simulation des méthodes tridimensionnelles, une étape de construction du spectre 3D des objets est ajoutée. L'étape finale de reconstruction tomographique revient alors à calculer la transformée de Fourier 3D inverse du spectre objet. Revenons rapidement sur les méthodes présentées précédemment afin de les généraliser en 3D.

### 5.5.1 Microscopie à champ sombre et microscopie à contraste de phase

Pour réaliser un microscope 3D à champ sombre ou à contraste de phase, il est nécessaire de procéder à un filtrage du spectre 3D de l'objet. En effet, dans le cas de la microscopie à champ sombre, on cherche à couper les composantes directes de la lumière transmise par l'objet (basses fréquences du spectre) [141], alors que pour ce qui est de la microscopie de phase, nous cherchons à les déphaser par rapport aux composantes diffractées par l'objet. Le principe de construction des deux méthodes est proposé Fig. III.5.1. Le filtre appliqué
<figure><img src="image_107.png" /><figcaption>FIGURE III.5.5 – Modalités de microscopie tridimensionnelles simulées à partir des données tomographiques. (a-e) Plan de coupe (x, y), (f,j) plan de coupe (x, z) (a,f) Microscope champ sombre. (b,g) Microscope à contraste de phase. (c,h) Microscope DIC. (d,i) Microscope à illumination de Rheinberg. (e,j) Représentation de l'OTF composite. Illustration adaptée de la référence [95].</figcaption></figure>

peut être défini par

$$P_{3D}(k_x, k_y, k_z) = \alpha_{3D}(k_x, k_y, k_z) \exp [i\Phi_{3D}(k_x, k_y, k_z)], \qquad (III.5.7)$$

avec

$$\alpha_{3D}(k_x, k_y, k_z) = \begin{cases} \alpha_{3D} & \text{if } \sqrt{k_x^2 + k_y^2 + k_z^2} \le \rho_{3D} \\ 1 & \text{sinon} \end{cases}, \qquad (III.5.8)$$

et

$$\Phi_{3D}(k_x, k_y, k_z) = \begin{cases} \Phi_{3D} & \text{if } \sqrt{k_x^2 + k_y^2 + k_z^2} \le \rho_{3D} \\ 0 & \text{sinon} \end{cases}. \qquad (III.5.9)$$

On note ici $k_{x,y,z}$ les fréquences spatiales du spectre de l'objet, $\rho_{3D}$ le rayon de la sphère utilisée comme masque de filtrage. L'atténuation et le déphasage induits par le filtre sont respectivement notés $\alpha_{3D}(k_x, k_y, k_z)$ et $\Phi_{3D}(k_x, k_y, k_z)$.

Pour simuler un microscope à champ sombre, les Eqs. (III.5.8) et (III.5.9) doivent être modifiées de telle sorte que

$$\alpha_{3D}(k_x, k_y, k_z) = \begin{cases} 0 & \text{if } \sqrt{k_x^2 + k_y^2 + k_z^2} \le \rho_{3D} \\ 1 & \text{elsewhere} \end{cases}, \qquad (III.5.10)$$

et

$$\Phi_{3D}(k_x, k_y, k_z) = 0. \qquad (III.5.11)$$

Les résultats obtenus en appliquant les Eqs. (III.5.7) à (III.5.11) sont proposés Fig. III.5.5 pour l'imagerie champ sombre (a,f) et à contraste de phase (b,g). On remarque ici que le filtre « champ sombre » a bien pour effet de mettre en évidence les détails haute-fréquence de l'objet alors que le filtre « contraste de phase » permet d'améliorer le contraste de l'objet par rapport au fond.
### 5.5.2 Microscopie à contraste interférentiel

La construction du microscope DIC 3D est similaire à la méthode 2D. La principale différence tient ici au fait que les hologrammes $H_θ(x, y)$ utilisés dans l'Eq. (III.5.4) sont remplacés par les volumes tomographiques classiquement reconstruits. On retrouve ainsi les propriétés du microscope DIC sur la Fig. III.5.5(c,h). De plus, contrairement à un microscope DIC

<figure><img src="image_108.png" /><figcaption>FIGURE III.5.6 – Microscope DIC, influence de la direction d’application du shearing. (a,c) Décalage latéral. (b,d) Décalage axial. Illustration adaptée de la référence [95].</figcaption></figure>

plus classique, l'application du shear n'est pas limité à une coupe latérale, mais peut être également réalisée dans la profondeur de l'échantillon comme illustré Fig. III.5.6. L'influence de la modification du shear est bien visible sur les coupes (x, z) (c,d).

### 5.5.3 Microscope à illumination de Rheinberg

La construction du microscope de Rheinberg 3D est très proche de celle de la version bidimensionnelle. Dans l'exemple illustré Fig. III.5.5(d,i), nous avons procédé à une sélection des vecteurs d'illumination $k_i$ en fonction de leur norme et procédé à une reconstruction tomographique pour chacune des classes RVB. Les OTF composites ainsi obtenues sont présentées en (e,j). Ici les zones blanches signent la présence des trois contenus fréquentiels dans une même région du spectre reconstruit, le rouge et le bleu sont quant à eux associés aux angles d'illumination les plus élevés.

### 5.5.4 Pour aller plus loin : couplage de modalités

L'un des intérêts de disposer d'une plateforme de simulation unique pour l'ensemble des modalités de microscopie optique est qu'il devient possible de coupler des modalités d'imagerie qui ne sont pas forcément compatibles entre-elles et pour lesquelles un couplage aurait nécessité de passer sur deux configurations distinctes et de recaler les données *a posteriori*.
<figure><img src="image_109.png" /></figure>

FIGURE III.5.7 – Couplage Illumination de Rheinberg et microscope DIC. (a) Coupe (x, y). (b) Coupe (x, z). Les canaux rouge et vert sont utilisés pour l’illumination de Rheinberg et le canal bleu pour le DIC. Illustration adaptée de la référence [95].

C'est par exemple le cas du couplage de l'illumination de Rheinberg associée au microscope DIC présenté Fig. III.5.7. Ici nous avons utilisé les canaux rouge et vert du cube pour la modalité Rheinberg et le canal bleu pour le DIC. Ceci n'est qu'un exemple des possibilités de la plateforme de simulation. D'autres modalités d'imagerie pourront être envisagées à l'avenir.

**5.6 Conclusion**

J'ai ici présenté la possibilité d'utiliser les acquisitions tomographiques pour simuler une
plateforme universelle de microscopie optique. L'intérêt de la démarche est qu'elle permet

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

FIGURE III.5.8 – Couverture du numéro de décembre 2022 de Journal of Microscopy.

de reconstruire des contrastes alternatifs qui peuvent être couplé à l'imagerie quantitative
d'indice qu'offre la MTD. Le passage d'une modalité à l'autre étant purement numérique,
aucune étape de recalage des données n'est nécessaire en cas de couplage des modalités.
Notons que ces travaux ont été sélectionnés pour paraître en couverture du numéro de dé-
cembre de Journal of Microscopy (Fig. III.5.8).

Ce chapitre marque un premier pas vers la fonctionnalisation de la MTD qui sera au cœur de mon projet de recherche. Dans la suite du document, nous discuterons des possibilités qu'offrent les capteurs polarisés et les masques de phase pour réaliser de l'imagerie fonctionnalisée en béfringence, ou pour simplifier les dispositifs expérimentaux.
# Chapitre 6

## Imagerie à contraste de polarisation : apport des capteurs d'imagerie « alternatifs »

Ces travaux se situent une nouvelle fois dans le cadre de la Thèse d'Asemare Mengiste Taddese. Comme nous avons pu le voir dans le Chapitre 4 de cette partie, le but initial était d'optimiser les motifs de balayage de l'objectif condenseur afin de permettre de limiter la quantité d'acquisition en MTD. Les résultats présentés ici couvrent les Refs. [93, 94].

### 6.1 Contexte de l'étude

Ces travaux s'inscrivent dans la suite des efforts qui ont été mis en œuvre dans l'équipe pour améliorer la MTD. Les efforts ont initialement été mis sur l'amélioration de la résolution et de la cadence des acquisitions. Néanmoins, comme j'ai pu le mentionner à de nombreuses reprises dans ce document, la MTD, comme la plupart des autres méthodes d'imagerie sans marquage, souffre d'un manque de sélectivité dans les données reconstruites.

Des informations structurelles peuvent être accessibles au travers de l'analyse de la polarisation de la lumière, ouvrant la voie à de nouvelles possibilités concernant l'imagerie des tissus biologiques [142]. Dès lors, les holographistes ont commencé à s'emparer de la technique pour la caractérisation d'échantillons biréfringents tels que des fibres optiques [143], ou pour l'imagerie tissulaire ou cellulaire [144-146]. Ces configurations offrent une analyse quantitative des paramètres de polarisation des échantillons, mais se limitent à de l'imagerie bidimensionnelle, le passage à la troisième dimension se faisant au détriment de l'aspect quantitatif de la mesure de polarisation [147].

Jusqu'ici, les traitements des données MTD présentés dans ce document reposent sur la théorie scalaire proposée par Wolf [101]. La prise en compte de la polarisation dans les modèles a été pour la première fois proposée par Vincent Lauer [102]. De premières mises en place expérimentales ont été proposées en réflexion [148] reposant sur une résolution discrète des équations de Maxwell. Depuis, quelques configurations expérimentales ont été mise en place pour la caractérisation d'embryons [149] ou adaptées à des microscopes tomographiques existants [150, 151]. Dans le second cas, les dispositifs sont modifiés pour permettre, en 4 acquisitions d'extraire les tenseurs de Jones associés à l'échantillon analysé. Couplées à des méthodes de reconstruction avancées, les approches ci-dessus permettent, de plus de s'affranchir des limites de la 1re approximation de Born et de traiter le cas d'échantillons diffusant.

Dans la suite je détaillerai rapidement le formalisme vectoriel utilisé et nous discuterons de notre configuration MTD à contraste de polarisation. Nous tirerons profit de la démo-cratisation des capteurs d'imagerie de type PAS (Polarization Array Sensor) disposant de micropolariseurs orientés selon les 4 principales composantes linéaires de polarisation, pour
limiter la quantité d'acquisitions nécessaires à une imagerie résolue en polarisation [93]. Nous verrons enfin que ce type de capteur permet également, si l'on omet l'étape d'inter-polation qui suit le démosaïquage des données [152], de mettre en place un microscope à contraste interférentiel de type DIC [94, 139].

## 6.2 Modèle de Born vectoriel

Pour mettre en place le modèle de Born vectoriel, nous nous placerons dans le cas d'un objet faiblement diffusant, présentant une anisotropie faible, situé dans un milieu homogène et non biréfringent. En dissociant les composantes spatiales et temporelles des champs élec-trique et magnétique, et en considérant une onde monochromatique de pulsation $\omega$, on peut écrire :

$$ \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) = \mathbf{E}(\mathbf{r}) e^{i\omega t}, \quad \mathbf{H}(\mathbf{r}, t) = \mathbf{H}(\mathbf{r}) e^{i\omega t}. \qquad (III.6.1) $$

On peut alors modifier les équations de Maxwell-Faraday (Eq. (III.2.3)) et de Maxwell-Ampère (Eq. (III.2.4)) [153] :

$$ \nabla \times \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) = i\omega\mu_0\mathbf{H}(\mathbf{r}, t) \qquad (III.6.2) $$

$$ \nabla \times \mathbf{H}(\mathbf{r}, t) = -i\omega\bar{\bar{\varepsilon}}_r(\mathbf{r})\mathbf{E}(\mathbf{r}, t) \qquad (III.6.3) $$

Dans le vide, et en appliquant les propriétés des opérateurs vectoriels, on peut écrire [150] :

$$ \nabla \times \nabla \times \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) = \nabla \nabla \cdot \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) - \nabla^2 \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) = \omega^2 \mu_0 \bar{\bar{\varepsilon}}_r(\mathbf{r}) \mathbf{E}(\mathbf{r}, t). \qquad (III.6.4) $$

Les opérateurs vectoriels présents dans l'Eq. (III.6.4) étant des opérateurs spatiaux, nous omettrons les composantes temporelles pour simplifier les notations. Nous avons ici introduit $\bar{\bar{\varepsilon}}_r(\mathbf{r})$ le tenseur de permittivité relative de l'échantillon. Il est tel que :

$$ \bar{\bar{\varepsilon}}_r(\mathbf{r}) = (n_{\text{imm}}\mathbb{I} + \delta\bar{n})^2 \approx n_{\text{imm}}^2\mathbb{I} + 2n_{\text{imm}}\delta\bar{n} = n_{\text{imm}}^2\mathbb{I} + \delta\bar{e}, \qquad (III.6.5) $$

avec $n_{\text{imm}}$ l'indice du milieu d'immersion. $\delta\bar{n}$ et $\delta\bar{e}$ sont respectivement les tenseurs d'indice de réfraction et de permittivité diélectrique de l'échantillon par rapport au milieu d'immersion et $\mathbb{I}$ la matrice identité. Le terme $\nabla\nabla \cdot \mathbf{E}(\mathbf{r}, t)$ permet d'aller au delà des limites classiques des théoriques paraxiales (scalaires ou non) [154] et permet, entre-autre, de prendre en compte les couplages de polarisation qui peuvent être rencontrés lors de la propagation de la lumière dans des milieux épais et fortement biréfringents [150]. Dans la discussion qui suit, nous considérerons un échantillon répondant à la première approximation de Born, mais présentant de la biréfringence. Nous pourrons donc considérer :

$$ \nabla \nabla \cdot \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) \approx 0. \qquad (III.6.6) $$

Notons que des développements complets de l'équation d'Helmholtz [154], ou des développements des équations de Maxwell en série de Born ont été proposés et semblent être des pistes prometteuses pour proposer des algorithmes de simulation/reconstruction avancés permettant de traiter les situations non-paraxiales avec couplages de polarisation [153, 155].

Dans ces conditions, l'Eq. (III.6.4), appliquée au champ vectoriel total $\mathbf{u}_t(\mathbf{r})$ devient :

$$ [\nabla^2 + k_{\text{imm}}^2] \mathbf{u}_t(\mathbf{r}) = k_{\text{imm}}^2 [\bar{\bar{\varepsilon}}_r - \mathbb{I}] \mathbf{u}_t(\mathbf{r}). \qquad (III.6.7) $$

De même, l'onde d'illumination $\mathbf{u}_i(\mathbf{r})$ est solution de l'équation d'Helmholtz vectorielle homogène :

$$ (\nabla^2 + k_{\text{imm}}^2) \mathbf{u}_i(\mathbf{r}) = 0. \qquad (III.6.8) $$
Les champs vérifiant la relation $\mathbf{u}_t(\mathbf{r}) = \mathbf{u}_d(\mathbf{r}) + \mathbf{u}_i(\mathbf{r})$, il est possible d'exprimer le champ diffracté $\mathbf{u}_d(\mathbf{r})$ en injectant l'Eq. (III.6.8) dans l'Eq. (III.6.7) :

$$ (\nabla^2 + k_{\text{imm}}^2) \mathbf{u}_d(\mathbf{r}) = -\bar{\mathcal{P}}(\mathbf{r}) \mathbf{u}_t(\mathbf{r}), \qquad (\text{III.6.9}) $$

où $\bar{\mathcal{P}}(\mathbf{r})$ est le tenseur de potentiel de diffraction donné par

$$ \bar{\mathcal{P}}(\mathbf{r}) = k_{\text{imm}}^2 \left[ \frac{\bar{n}^2(\mathbf{r})}{n_{\text{imm}}^2} - \mathbb{I} \right]. \qquad (\text{III.6.10}) $$

En considérant un échantillon faiblement diffusant et faiblement biréfringent, on peut écrire le tenseur d'indice de réfraction $\bar{n}(\mathbf{r})$

$$ \bar{n}(\mathbf{r}) = n_{\text{imm}}\mathbb{I} + \mathbf{R}(\phi, \theta) \begin{bmatrix} \delta n_1 & 0 & 0 \\ 0 & \delta n_2 & 0 \\ 0 & 0 & \delta n_3 \end{bmatrix} \mathbf{R}^{-1}(\phi, \theta), \qquad (\text{III.6.11}) $$

avec $\mathbf{R}(\phi, \theta)$ la matrice rotation introduite pour tenir compte de l'orientation de l'illumination [150] et définie par

$$ \mathbf{R}(\phi, \theta) = \begin{bmatrix} \cos^2(\phi) \cos(\theta) + \sin^2(\phi) & \sin(\phi) \cos(\phi) [\cos(\theta) - 1] & \sin(\theta) \cos(\phi) \\ \sin(\phi) \cos(\phi) [\cos(\theta) - 1] & \sin^2(\phi) \cos(\theta) + \cos^2(\phi) & \sin(\theta) \sin(\phi) \\ -\sin(\theta) \cos(\phi) & -\sin(\theta) \sin(\phi) & \cos(\theta) \end{bmatrix}. \qquad (\text{III.6.12}) $$

La résolution de l'Eq. (III.6.9) est de nouveau possible en utilisant la méthode de Feynman et en introduisant la fonction de Green dyadique (tenseur de Green) $\mathbf{G}(\mathbf{r})$ telle que

$$ \mathbf{G}(\mathbf{r}) = \mathbf{G}(\mathbf{r}) \mathbb{I}. $$

Résoudre l'Eq. (III.6.9) revient alors à résoudre le problème intégral suivant :

$$ \mathbf{u}_d(\mathbf{r}) = \int_V \mathbf{G}(\mathbf{r} - \mathbf{r}') \mathbf{u}_t(\mathbf{r}') \bar{\mathcal{P}}(\mathbf{r}') \, d\mathbf{r}' \qquad (\text{III.6.13}) $$

Comme ce fût le cas pour le modèle scalaire, nous considérerons que le champ diffracté $\mathbf{u}_d(\mathbf{r})$ est très faible devant le champ incident $\mathbf{u}_i(\mathbf{r})$, permettant de récrire l'Eq. (III.6.13) comme :

$$ \mathbf{u}_d(\mathbf{r}) = \int_V \mathbf{G}(\mathbf{r} - \mathbf{r}') \mathbf{u}_i(\mathbf{r}') \bar{\mathcal{P}}(\mathbf{r}') \, d\mathbf{r}'. \qquad (\text{III.6.14}) $$

C'est la première approximation de Born vectorielle.

## 6.3 Lien avec le formalisme de Jones

Si on se place dans un cas où l'échantillon ne dépolarise pas la lumière, le formalisme matriciel de Jones permet d'extraire une information quantitative en polarisation. Le formalisme de Jones permet de lier les composantes incidentes et diffractées du champ optique. Ainsi, en considérant une onde incidente totalement polarisée, et en négligeant la dépolarisation que peut induire l'objet, on peut écrire :

$$ \mathbf{u}_d(\mathbf{r}) = \mathcal{J}_{\text{obj}}(\mathbf{r}) \mathbf{u}_i(\mathbf{r}), \qquad (\text{III.6.15}) $$
<figure><img src="image_111.png" /><figcaption>FIGURE III.6.1 – Schéma de principe du montage de MTD polarisée en transmission à balayage de l’illumination.</figcaption></figure>

où $\mathcal{J}_{\text{obj}}(\mathbf{r})$ est le tenseur de Jones associé à l'objet que l'on exprimera de la manière suivante :

$$ \mathcal{J}_{\text{obj}}(\mathbf{r}) = \begin{bmatrix} J_{xx} & J_{xy} & J_{xz} \\ J_{yx} & J_{yy} & J_{yz} \\ J_{zx} & J_{zy} & J_{zz} \end{bmatrix}. \qquad (\text{III.6.16}) $$

Il est dès lors possible de lier les mesures du potentiel vecteur objet $\bar{\bar{\mathcal{P}}}$ au tenseur de Jones de l'objet

$$ \mathcal{F}_{k_x, k_y, k_z} \{\mathcal{J}_{\text{obj}}\} (\mathbf{k}_d - \mathbf{k}_i) = \frac{2i\pi}{k_{dz}} \mathcal{F}_{k_x, k_y, k_z} \{\bar{\bar{\mathcal{P}}}\} (\mathbf{k}_d - \mathbf{k}_i) \qquad (\text{III.6.17}) $$

Enfin, si l'on considère des échantillons faiblement dépolarisant dans la direction de propagation de la lumière, l'expression du tenseur de Jones se simplifie pour donner

$$ \mathcal{J}_{\text{obj}}^{\text{approx}} = \begin{bmatrix} J_{xx} & J_{xy} \\ J_{yx} & J_{yy} \end{bmatrix}. \qquad (\text{III.6.18}) $$

Ce tenseur pourra être déterminé à partir de 4 mesures de polarisation.

Dans la suite nous allons nous concentrer sur les conséquences de la prise en compte de la polarisation de la lumière sur les acquisitions.

## 6.4 Mise en place de la MTD résolue en polarisation

### 6.4.1 Configuration expérimentale

Le schéma de principe du MTD résolu en polarisation (P-MTD) est proposé Fig. III.6.1. Deux principaux changements sont à noter par rapport à un MTD classique :

- le capteur CMOS a été remplacé par une caméra à micropolariseurs LUCID® Pheonix PHX050S-PC. Ces caméras, initialement utilisées en vision industrielle, s'appuient sur un capteur Sony® IMX250MZR disposant d'analyseurs linéaires de polarisation positionnés pixel à pixel. Chaque « super-pixel » est alors l'association de 4 pixels polarisés à 90°, 45°, 135°, et 0°.
— une lame $\lambda/4$ a été ajoutée dans le bras de référence et dans le bras objet pour éclairer l'objet simultanément sous toutes les composantes de polarisation, tout en équilibrant le contraste de chacune des composantes d'analyse (en s'assurant qu'une intensité lumineuse équivalente pourra être collectée dans chacune des sous-images de polarisation).

Les lames $\lambda/4$ seront utilisées pour illuminer l'échantillon en polarisation circulaire droite et circulaire gauche. En extrayant les hologrammes associés à la polarisation 0° et à la polarisation 90°, nous disposons de l'information nécessaire pour construire le tenseur de Jones tel que donné Eq. (III.6.18). Ainsi, on peut écrire [156] :

$$ \mathcal{J}_{\text{obj}}^{\text{approx}} = \begin{bmatrix} \mathbf{u}_{d, \to}^{\text{cd}} + \mathbf{u}_{d, \to}^{\text{cg}} & i \left( \mathbf{u}_{d, \to}^{\text{cd}} - \mathbf{u}_{d, \to}^{\text{cg}} \right) \\ i \left( \mathbf{u}_{d, \uparrow}^{\text{cg}} - \mathbf{u}_{d, \uparrow}^{\text{cd}} \right) & \mathbf{u}_{d, \uparrow}^{\text{cd}} + \mathbf{u}_{d, \uparrow}^{\text{cg}} \end{bmatrix} \qquad (\text{III.6.19}) $$

avec

— $\mathbf{u}_{d, \to}^{\text{cd}}$ la mesure sur les pixels à 0° avec une illumination polarisée circulaire droite

— $\mathbf{u}_{d, \uparrow}^{\text{cd}}$ la mesure sur les pixels à 90° avec une illumination polarisée circulaire droite

— $\mathbf{u}_{d, \to}^{\text{cg}}$ la mesure sur les pixels à 0° avec une illumination polarisée circulaire gauche

— $\mathbf{u}_{d, \uparrow}^{\text{cg}}$ la mesure sur les pixels à 90° avec une illumination polarisée circulaire gauche.

## 6.4.2 Prétraitement et analyse des données

Pour extraire les informations nécessaires à la détermination du tenseur de Jones objet (Eq. (III.6.19)), il est nécessaire de réaliser deux acquisitions tomographiques distinctes avec illumination en polarisation circulaire gauche et en polarisation circulaire droite. Dans cette configuration, le capteur d'imagerie nous permet d'accéder à 4 états de polarisation linéaires. Pour extraire cette information, il est nécessaire de démosaïquer les hologrammes acquis comme illustré Fig. III.6.2. De nombreuses méthodes de démosaïcage et d'interpo-

<figure><img src="image_112.png" /><figcaption>FIGURE III.6.2 – Principe des acquisitions en caméra polarisée et démosaïcage.</figcaption></figure>

lation des données sont disponibles [152], nous nous contenterons ici d'une interpolation bilinéaire pour construire les 4 champs diffractés pour chacune des polarisations circulaires. De là, en conservant les informations associées aux angles de polarisation 0°et 90°, nous pouvons reconstruire le tenseur de Jones de l'objet, et par extension accéder aux composantes du tenseur d'indice de réfraction de l'objet.
<figure><img src="image_113.png" /><figcaption>FIGURE III.6.3 – Tenseur d’indice de réfraction d’un échantillon composé de granules d’amidon de pomme de terre et de billes de silice.</figcaption></figure>

Pour vérifier le bon fonctionnement de notre dispositif, nous avons réalisé des acquisitions sur un échantillon mélangeant des objets isotropes (billes de silice) et des objets anisotropes (granules d'amidon de pomme de terre). Les résultats obtenus sont proposés Fig. III.6.3. Les composantes diagonales du tenseur d'indice de réfraction ($n_{xx}, n_{yy}$) mettent en évidence à la fois les billes de silice (en noir) et les granules d'amidon. Les termes horizontale mettent en évidence les variations d'indice entre les deux directions $x$ et $y$. On peut remarquer que les billes de silice ne sont plus visibles. En effet, la silice étant un matériaux isotrope, l'indice de réfraction est le même dans les deux directions. *A contrario*, les granules d'amidon de pomme de terre sont biréfringentes. Cette anisotropie se traduit par l'observation d'une structure en « croix de Malte » qui est une signature caractéristique des échantillons biréfringents.

<figure><img src="image_114.png" /><figcaption>FIGURE III.6.4 – Démosaïcage et DIC 3D.</figcaption></figure>

### 6.4.3 Un peu de sérendipité : le DIC 3D

Il est des découvertes fortuites qui parfois ouvrent des pistes très intéressantes. Que se passe-t-il si on omet l'étape d'interpolation dans le démosaïcage des données ?
La Fig. III.6.4 répond partiellement à cette question. En effet, on constate ici, qu’un démosaïcage sans interpolation revient à calculer les gradients latéraux de l’image. Intéressons nous plus particulièrement à la situation entre l’image à 90°et celle à 0°. Dans le cadre d’une détection holographique d’objets isotropes, on peut montrer que [157] :

$$ \mathcal{H}_{90}(x, y) - \mathcal{H}_{0}(x, y) = \mathcal{H}_{90}(x, y) - \mathcal{H}_{90}(x + \Delta x, y + \Delta y) e^{i\pi/2}, \quad (III.6.20) $$

avec $\mathcal{H}_0(x, y)$ et $\mathcal{H}_{90}(x, y)$ respectivement les hologrammes associés à l'état d'analyse 0°et 90°. Ainsi, on calcule le gradient spatial, déphasé de $\pi/2$ du même objet. Cette étape est similaire à ce qui est réalisé dans un microscope DIC ou Nomarski [139]. Les résultats ob-

<figure><img src="image_115.png" /><figcaption>FIGURE III.6.5 – DIC 3D. (a-c) cas d’un échantillon isotrope. (a) $\mathcal{H}_{90}(x, y)$, (b) $\mathcal{H}_0(x, y)$, (c) $\mathcal{H}_{90}(x, y) - \mathcal{H}_0(x, y)$. (d-f) cas d’un échantillon anisotrope. (d) $\mathcal{H}_{90}(x, y)$, (e) $\mathcal{H}_0(x, y)$, (f) $\mathcal{H}_{90}(x, y) - \mathcal{H}_0(x, y)$.</figcaption></figure>

tenus dans ce cadre sont reportés Fig. III.6.5 pour un échantillon isotrope (a-c) et pour un échantillon mélangeant des objets isotropes et anisotropes (d-f). Considérons tout d'abord le cas d'échantillons isotropes. Nous avons ici enregistré le tomogramme d'un pollen d'olivier et extrait les composantes orthogonales à 0°(b) et 90°(a). Les différences semblent de prime abord minime. En revanche, en utilisant l'Eq. (III.6.20), on peut calculer l'image DIC associée [94]. On pourra regretter qu'il n'y ait aucun degré de liberté de réglage du shearing et du déphasage, contrairement à ce que permet un microscope expérimental, ou son équivalent numérique [95]. Cependant, nous sommes ici face à une mesure quantitative 3D du contraste DIC, qui n'est pas accessible sur une configuration expérimentale plus conventionnelle.

Dans le cas d'échantillons anisotropes (d-f), l'Eq. (III.6.20) n'est plus valable. On constate cependant que dans l'image DIC reconstruite (f), on retrouve la croix de Malte caractéristique de la biréfringence de l'amidon de pomme de terre, et un effet de gradient sur le pollen d'olivier qui lui est isotrope. Nous disposons dès lors d'une méthode de classification des échantillons en fonction de leur biréfringence.
## 6.5 Conclusion

Ce chapitre était l'occasion de revenir sur les travaux de Thèse d'Asemare Mengistie Taddese. Durant sa fin de Thèse, nous avons commencé à nous attaquer aux problématiques de manque de sélectivité tomographique. Ainsi, nous avons pu ajouter à la MTD un contraste de polarisation, ouvrant la voie à une sélectivité structurelle, sans marquage, dans les échantillons biologiques. À cette fin, nous nous sommes intéressés aux modèles de formation d'images permettant de prendre en compte, dans les équations de diffraction, la polarisation de la lumière. Nous nous sommes ensuite reposé sur l'utilisation de capteurs d'imagerie résolus en polarisation (initialement prévus pour la vision industrielle et les contrôles non-destructifs) pour proposer un dispositif simplifié permettant d'obtenir une information résolue en polarisation. Les possibilités du dispositif ont été démontrées au travers de l'analyse d'échantillons isotropes, anisotropes ou comprenant à la fois des deux classes d'objets. De plus nous avons discuté de la possibilité de transformer le MTD résolu en polarisation en une plateforme DIC 3D quantitative.

Il reste bien entendu beaucoup à explorer dans cette voie (mais également dans les autres travaux présentés tout au long de ce document) et les prochains développements envisagés seront laissés à la partie « projet » du document qui sera développée dans la dernière partie de ce manuscrit.
# Quatrième partie

## Conclusion générale et projet :
La quatrième dimension et au delà, le retour de la sélectivité en imagerie de phase optique
<figure><img src="image_116.png" /></figure>
# Chapitre 1

# Conclusion générale : imagerie optique non-conventionnelle et diagnostics optiques quantitatifs.

## 1.1 15 ans d'imagerie optique non-conventionnelle

Ce document était l'occasion de faire un bilan de carrière, et cette conclusion est donc le moment de faire le bilan du bilan.

15 ans maintenant depuis ma soutenance de Thèse, et malgré beaucoup de mobilité sur la première moitié du temps, j'ai pu garder ce fil conducteur et m'impliquer dans la communauté au travers de l'organisation des trois dernières éditions des Journées d'Imagerie Optique Non-Conventionnelle du GdR IASIS et les deux dernières éditions de la conférence Unconventional Optical Imaging (UOI) organisée dans le cadre de SPIE-Photonics Europe. Le plus difficile étant dans un premier temps de faire comprendre le concept d'imagerie optique non-conventionnelle. Dans les faits, beaucoup de personnes travaillent dans le domaine sans même s'en rendre compte. S'il est nécessaire de connaître le modèle de formation d'image pour « comprendre » les données acquises, alors il s'agit d'une méthode d'imagerie optique non-conventionnelle. Ceci étant dit, la couverture thématique du domaine devient extrêmement large et les compétences mises en œuvre sont variées.

C'est pourquoi ce document s'est articulé autour de trois parties distinctes qui correspondent aux principales problématiques que l'on peut rencontrer en imagerie optique non-conventionnelle :

- la mise en place des modèles de formation d'images;

- la mise en œuvre des dispositifs expérimentaux;

- la mise en place des algorithmes de reconstruction;

le tout permettant d'extraire des données quantitatives de manière non/peu intrusive.

Ce document a assez naturellement trouvé le fil conducteur de l'imagerie optique non-conventionnelle, les techniques et champs d'applications sont nombreux et variés. Ce document s'est focalisé sur l'utilisation de l'holographie pour l'extraction d'information quantitatives. Revenons rapidement sur les domaines d'applications auxquels j'ai été appelé à contribuer.

## 1.2 Holographie et mécanique des fluides : suivi 3D+t d'objets

Telle qu'imaginée par Gabor, l'holographie est l'une des premières méthodes d'imagerie optique non-conventionnelle. En effet, on n'enregistre plus l'image d'une scène mais le front d'onde issu de cette dernière. Une étape de post-traitement devient alors nécessaire pour extraire l'information. Fort heureusement, la situation a bien évolué depuis la fin des années 40 et nous disposons de la puissance de calcul nécessaire pour faire parler les hologrammes.
En mécanique des fluides, les capacités de l'holographie à localiser des objets dans un volume 3D sont très appréciées. En réalisant des séries d'acquisitions, il est possible de réaliser le suivi lagrangien 3D+t d'objets. C'est ainsi que j'ai été amené à développer des modèles de formation d'images et de reconstruction des hologrammes pour permettre de suivre des particules en 3D et au cours du temps dans des écoulements plus ou moins complexes et notamment dans des canalisations, en partenariat avec le LMFA (Laboratoire de Mécanique des Fluides et d'Acoustique) de Lyon et l'IFPEN (Institut Français du Pétrole et Énergies Nouvelles).

Dans ce type d'études, les modèles de formation d'images dépendent de peu de paramètres, typiquement les positions 3D et le diamètre de l'objet. Ainsi, il est possible d'améliorer la précision du tracking en optant pour une approche de type « problèmes inverses ». Ces méthodes sont très avantageuses ici : comme on ne cherche pas à reformer une image, on s'affranchit des artefacts classiques, ce qui améliore de fait le tracking. C'est ainsi que nous sommes parvenus à réaliser le tracking individuel d'une particule en mouvement brownien avec une résolution au centième de pixel.

Les approches inverses permettent dans ce type d'étude d'obtenir des précisions de localisation très élevées. Il n'en reste pas moins qu'un accès à l'image reste la plupart du temps indispensable. Notamment dans les points qui ont été développés ensuite autour de l'imagerie laser Doppler.

## 1.3 Holographie et contrôles non-destructifs : l'imagerie laser Doppler

Dans sa configuration hors-axe ou en phase-shifting, l'holographie donne un accès à la phase optique de l'onde diffusée par un objet, que ce soit en transmission ou en réflexion. Ainsi, l'holographie a, par le passé, été utilisée pour caractériser des surfaces en vibration [158-160]. Ces méthodes se basent en général sur une détection de l'harmonique fondamental de la vibration à partir de l'analyse de l'intensité holographique enregistrée. L'imagerie laser Doppler, telle que j'ai pu la développer à l'Institut Langevin de l'ESPCI permet, grâce à l'utilisation de modulateurs acousto-optiques de mesurer le spectre de la lumière réfléchie par l'échantillon en vibration. On peut alors se caler sur des harmoniques supérieurs et ainsi bénéficier d'une détection plus sensible ou à des amplitudes plus élevées.

Les possibilités offertes par l'imagerie laser Doppler vont bien au delà de la caractérisation de surfaces et s'étendent au domaine de l'imagerie du vivant.

## 1.4 Imagerie laser Doppler et mesures in-vivo

L'application de l'imagerie laser Doppler en imagerie biomédicale est plus délicate. En effet, contrairement à l'analyse de surfaces pour lesquelles les spectres sont discrets et bien définis, l'élargissement Doppler lié au mouvement, de cellules sanguines par exemple, est continu et nécessite un balayage fréquentiel qui complique les acquisitions. L'échantillon, dans sa globalité, doit être immobile sur la durée des acquisitions (l'écoulement sanguin étant bien entendu maintenu). Nous y sommes parvenus en maintenant le zebrafish dans un gel d'agarose et avons pu démontrer la mesure quantitative de la microcirculation en norme, sens et direction.
## 1.5 La tomographie diffractive et le passage à la troisième dimension

Nous avons pu voir que l'holographie permettait de localiser des objets en 3D. Néanmoins, il n'est pas possible de les imager en 3D. Pour ce faire, la MTD introduit un procédé de synthèse d'ouverture numérique qui permet de retrouver une résolution selon l'axe de propagation de la lumière. Ceci est rendu possible en faisant varier les conditions d'illumination de l'échantillon, soit en le faisant tourner dans une illumination fixe, soit en balayant l'illumination sur un échantillon fixe, soit en faisant varier la longueur d'onde de l'illumination. Il est par ailleurs possible de combiner les méthodes pour éventuellement aller jusqu'à une résolution d'imagerie isotrope dans les trois dimensions de l'espace.

Le principal inconvénient du procédé de synthèse d'ouverture est la nécessité de multiplier les acquisitions, ce qui ralentit l'imagerie et la limite la plupart du temps à l'imagerie d'échantillons fixés, ou tout du moins fixes à l'échelle de quelques secondes : notre meilleur système permet d'acquérir 400 hologrammes en 4 secondes. Nous sommes assez loin du temps réel, mais l'échelle temps permet d'envisager la réalisation de timelapses de phénomènes lentement variables. Pour pouvoir accélérer les acquisitions, il est nécessaire de limiter les angles d'illumination. Cette limitation est dans les fait essentiellement technologique : un système de balayage rapide couplé à une caméra haute-cadence peut d'ores et déjà permettre d'accélérer l'ensemble.

C'est ainsi que, dans le cadre de la Thèse d'Asemare Mengistie, nous nous sommes intéressés à l'optimisation des figures d'illuminations afin d'obtenir les meilleures images tout en ayant le moins d'angles de balayage. Ces considérations sont d'ailleurs valables pour la MTD en transmission, en réflexion et en combinant les deux dans le cadre d'une microscopie $4\pi$.

La MTD permet d'avoir accès à l'indice de réfraction complexe des objets analysés. Cependant, cette information n'offre pas la sélectivité que peuvent offrir d'autre méthodes avec ou sans marquage. Ainsi, j'ai pu commencer à explorer l'ajout de nouveaux contrastes, de manière numérique (dans le cadre de la thèse de Riadh Abbessi) et expérimentalement (dans le cadre des thèses d'Asemare Mengistie Taddese et de Riadh Abbessi). D'une part nous avons pu démontrer qu'en travaillant sur les méthodes de reconstruction, il était possible de simuler différents types de microscopes de routine offrant ainsi de nouveaux contrastes à la MTD. Du point de vue expérimental, nous avons pu démontrer la possibilité d'ajouter un contraste de polarisation à la méthode. Ces pistes seront à explorer car elles permettront d'ajouter un contraste signature de propriétés structurelles. De même dans le cadre de la thèse de Riadh Abbessi nous ajoutons un contraste Doppler (inspiré de l'imagerie laser Doppler que j'ai pu développer en post-Doc à l'Institut Langevin et au Laboratoire Charles Coulomb).

## 1.6 Quelques pistes pour l'avenir

Au final, l'ensemble de ce document peut se résumer à la Fig. IV.1.1 (presque triste de résumer 15 ans de carrière et plus avec quelques flèches :-) ). L'ensemble des travaux auxquels j'ai pu être associé au cours de mes post-Doc, ou pour lesquels j'ai été moteur depuis mon recrutement trouvent des perspectives communes qui seront développées dans le dernier chapitre.

Les axes qui seront développés se dégagent assez naturellement<fnref n="1" /> :

<footnote n="1">1. Cette liste n'est pas chronologique. De plus certains des challenges peuvent être traités en parallèle.</footnote>
<figure><img src="image_117.png" /><figcaption>FIGURE IV.1.1 – Résumé global de la carrière et pistes d'avenir.</figcaption></figure>

1. Simplification des dispositifs expérimentaux. En effet, il est nécessaire d'accéder à la phase optique pour réaliser la tomographie diffractive. Nous reposons pour l'heure sur l'utilisation d'une onde de référence externe, ce qui complique le dispositif.

2. Amélioration de la résolution. La résolution reste et restera toujours le nerf de la guerre de qui développera des techniques de microscopie. C'est ainsi que dans le cadre de la Thèse de Carlos Alberto Chacon, qui vient de démarrer et qui est financée par l'ANR TARANIS, nous démarrons, en commun avec l'Institut Fresnel, le développement de la microscopie tomographique $4\pi$. En collectant l'information liée aux deux composantes réfléchies et aux composantes transmises par l'objet, nous nous attendons à obtenir une résolution 3D quasi-isotrope. À plus long terme, et en exploitant la sensibilité et les propriétés temporelles offertes par l'holographie hétérodyne (et son extension tomographique) nous pourrons mettre au point une méthode de nanoscopie par modulation de l'indice de réfraction.

3. Fonctionnalisation de la technique pour permettre le retour de la sélectivité. L'une des limitations, qui constitue à l'heure actuelle un frein à l'adoption plus massive de la technique, notamment en imagerie biomédicale. A terme, nous travaillerons sur la sélectivité statique/dynamique, la sélectivité chimique, la sélectivité structurelle.

L'ensemble de ces points sera développé par la suite dans le chapitre final de ce document.
# Chapitre 2

## Projets de recherche à court, moyen et long terme

Voici arrivé le moment de penser plus loin. C'est également l'opportunité de nourrir mes projets futurs de mes expériences passées. La Fig. IV.1.1 présente quelques pistes dont l'exploration est amorcée ou qui sont des objectifs à plus long terme. Elles n'en représentent pas moins des challenges auxquels beaucoup de méthodes d'imagerie sans marquage cherchent à se confronter [161]. Les voies que je compte explorer par la suite seront à la fois liées aux développements expérimentaux et au traitement avancé des données. Quatre principaux axes se détachent dans ce que seront mes activités de recherche pour les années à venir :

1. La simplification des dispositifs.

2. La combinaison réflexion et transmission pour microscopie $4\pi$.

3. L'ajout de contrastes spécifiques en imagerie sans marquage.

4. L'amélioration de la résolution.

Cette liste n'est ni temporelle, ni exhaustive. Elle permet néanmoins d'envisager les 5 à 10 prochaines années de travaux.

### 2.1 Simplification des dispositifs de MTD

Les premières réflexions à ce sujet ont été menées pendant la thèse de Ludovic Foucault soutenue en 2019. Une partie de ses travaux a d'ores et déjà été présentée ici autour d'une part de l'exploitation des symétries d'échantillons et de la microscopie assistée par miroir. L'un des principaux enjeux des méthodes sans marquage en microscopie est l'extraction de la phase optique du champ. Pour ce faire, la plupart des équipes ont recours à des montages interférométriques à deux bras de type Mach-Zehnder. Ces montages peuvent poser des problèmes de sensibilité à l'environnement expérimental et peuvent parfois être délicats à régler côté utilisateur. Pour pallier ces limitations, des méthodes interférométriques dites « à chemin commun » ont été proposées, pour lesquelles l'interférence est générée par un élément diffractif [162, 163], ou par un décalage latéral de l'onde objet [164-166]. On pourra noter que les méthodes basées sur l'utilisation d'un élément diffractif sont difficilement adaptables à la MTD. En effet, ici l'onde de référence et le faisceau objet sont générés par des pinholes fixes, ce qui rend impossible la mise en place de toute méthode reposant sur un balayage de l'illumination.

Dans le cadre de la thèse de Ludovic, nous avions commencé à explorer la possibilité d'intégrer un dispositif à décalage quadrilateral (QWLSI : Quadri Wave Lateral Shearing Interferometer) [167, 168] tel que proposé par la société Phasics [169]. Cette caméra repose sur le principe de QWLSI qui permet de mesurer les gradients de la phase optique et ainsi, par intégration de remonter à la différence de marche optique de l'échantillon, moyennant l'acquisition préalable d'un blanc. Le montage expérimental que Ludovic a pu mettre en
<figure><img src="image_118.png" /><figcaption>FIGURE IV.2.1 – MTD avec l’ASO Phasics SID4Bio et traitement de données associé.</figcaption></figure>

place en fin de thèse est proposé Fig. IV.2.1, et ne nécessite que la colonne d'illumination. En effet les interférences sont générées dans le plan du capteur grâce à un masque de Hartmann modifié. L'œil aiguisé remarquera sur l'interférogramme le double réseau de franges caractéristique du masque de Hartmann. Comme souvent avec les méthodes interférométriques, il est nécessaire de passer dans l'espace de Fourier pour faire parler les acquisitions. Ici, l'ordre de diffraction central, après filtrage permet de remonter à l'intensité du champ issu de l'objet. Les ordres latéraux permettent d'obtenir les gradients latéraux du champ dans les deux directions. Ces derniers peuvent être par la suite intégrés pour donner accès à la différence de marche optique [117]. Dans ce cas, l'intégration des gradients latéraux du champ est finalement relativement proche de la résolution de l'équation de transport d'intensité (TIE) [170].

<figure><img src="image_119.png" /><figcaption>FIGURE IV.2.2 – Comparaison des acquisitions Phasics et Phasics avec synthèse d'ouverture sur une bille de latex.</figcaption></figure>

De premiers résultats, plutôt encourageants, ont été obtenus sur 32 angles d'illumination et sont reportés Fig. IV.2.2. On constate que la composantes réfractive du champ est bien reconstruite. On sera néanmoins surpris de la reconstruction d'une composante en absorption
pour des billes qui n'en présentent quasiment pas. Les problématiques liées à l'environnement propriétaire de la Phasics ont fait que nous ne sommes pas allés immédiatement plus loin.

Dernièrement, Pierre Bon a mis à disposition, via la société Idylle [171], le masque de Hartmann modifié Phimask. Le principal intérêt pour nous est qu'il s'intègre parfaitement à notre environnement de développement actuel. Ainsi, dans le cadre de la thèse de Carlos qui a démarré en novembre 2023, nous sommes en train de mettre en place un montage à synthèse d'ouverture dédié au Phimask. Dans un premier temps nous réaliserons la synthèse d'ouverture avec un FSM 300 de chez Newport et une source à faible longueur de cohérence de chez Toptica. A terme, j'aimerais réactiver le partenariat que j'ai pu mettre en place lors de discussions au cours de la conférence optique de la SFO (à Toulouse) avec François Perraut, fondateur de la société Leida [172]. En effet, il propose des dispositifs d'illumination à LED RGB qui, en ce qui nous concerne, nous permettrons de nous affranchir du balayage mécanique pour la synthèse d'ouverture. De plus, comme le masque de phase Phimask est achromatique, nous pourrons envisager une détection multi-longueur d'onde. De plus, l'utilisation d'une illumination LED telle que celle-ci offrira une base de validation expérimentale des résultats de simulation des différents type de microscopie [95].

Nous pourrons éventuellement compléter ces travaux par des modalités d'imagerie en intensité. Il nous faudra pour ça en parallèle travailler à la mise au point ou mise en place d'algorithmes de reconstruction de la phase [173-175].

## 2.2 Microscopie Tomographique Diffractive $4\pi$

Le projet de microscopie $4\pi$ s'inscrit dans une collaboration de longue date avec Hugues Giovannini et Guillaume Maire de l'Institut Fresnel à Marseille. Cette collaboration s'est concrétisée par l'obtention de l'ANR PRS TARANIS (Acquisitions et reconstructions tomographiques pour les systèmes d'imagerie nanoscopiques avancés) portée par Guillaume Maire. Cette ANR a, entres autres, permis le recrutement de Carlos Alberto Chacon Avila en thèse au sein de l'IRIMAS.

Cette thèse vise à mettre en place un microscope $4\pi$ tel que présenté Fig. III.3.9. Un montage reposant sur le principe d'imagerie miroir sera développé en parallèle à l'Institut Fresnel. Outre le challenge expérimental, la principale difficulté résidera dans l'extraction des données.

Il sera dans tous les cas nécessaire de mettre en œuvre des algorithmes de reconstruction avancés. Dans ce genre de problématique, une approche de type problèmes inverses telle que développée dans le cadre de l'ANR PRC HORUS que nous portions de 2018 à 2022 pourrait donner d'excellents résultats [176]. Dans ce cas, il nous faudra cependant :

- un modèle de formation d'image fiable. Pour ce faire, nous pourrons nous tourner vers les approches basées sur une décomposition en séries de Born de l'équation de propagation [153, 155]

- un algorithme d'inversion efficace. En effet, compte-tenu des volumes de données à traiter, le temps de calcul alloué à la reconstruction pourra vite se montrer prohibitif.

Ce dernier point pourra être mené conjointement avec nos collègues du laboratoire Hubert Curien de Saint-Étienne et/ou du Centre de Recherche en Astrophysique de Lyon où l'équipe d'Éric Thiébaut développe les outils nécessaires à l'inversion de données massives.

En complément des algorithmes de reconstructions par approches inverses qui permettraient de traiter le problème des données de microscopie $4\pi$ lié au mélange des différentes contributions, nous travaillons actuellement à des solutions expérimentales pour séparer les différentes contributions. Ainsi, dans le cadre des travaux préliminaires de la thèse de Ludovic sur la tomographie par effet miroir, nous avons pu mettre en place un algorithme
qui permettait, par simple filtrage dans l'espace de Fourier, associé à un balayage annulaire
à ouverture maximale de l'échantillon de séparer les deux composantes transmises (effet
miroir). Restera à extraire les deux composantes de réflexion du signal. On pourra pour ça
envisager différentes pistes telles qu'un filtrage par cohérence optique ou en polarisation
par exemple.

Notons que ce projet permettra de réactiver, et de mettre en place des collaborations,
notamment autour des algorithmes de reconstruction qui pourraient se matérialiser, par
exemple, par le dépôt d'ANR-PRC sur les appels à projets génériques.

Ces travaux orientés résolution de la technique n'apportent pour l'heure pas de réponse
aux problématiques liées à la sélectivité des données en MTD et de manière plus générale en
imagerie quantitative de la phase optique. Ce volet occupera une grande partie des actions
à mener à plus ou moins long terme et représentent un enjeu pour la communauté [161].

## 2.3 Ajout de contrastes spécifiques en imagerie quantitative de phase

Comme j'ai pu le souligner à de multiples reprises dans ce document, les méthodes
d'imagerie quantitative de la phase souffrent d'un manque de sélectivité dans le contenu
reconstruit. Il convient dès lors d'explorer d'autre contrastes pour faciliter l'acceptation de
la MTD aux communautés de l'imagerie biologique, beaucoup plus habituées à manipuler
les méthodes avec marquage. Ainsi, nous envisagerons par la suite l'ajout de contrastes :

- structurels :

- de composition chimique ;

- statique/dynamique et amélioration de la sensibilité ;

### 2.3.1 Contrastes structurels

Pour l'heure, dans le cadre de la thèse d'Asemare, nous avons obtenu les premiers ré-
sultats de l'équipe en MTD résolue en polarisation. Contrairement aux travaux des autres
équipes s'étant penchées sur la question, nous limitons le nombre d'acquisitions en rempla-
cant le capteur conventionnel par un capteur à grille de polarisation. Le principal avantage
est que nous pouvons reconstruire le tenseur de Jones diffracté en ne réalisant que deux
mesures. Nous avons ainsi pu extraire la biréfringence ou l'orientation de l'axe rapide de
polarisation, comme illustré Fig. IV.2.3, extraite du manuscrit de thèse d'Asemare. Les com-
posantes du tenseur d'indice de réfraction (a) permettent d'accéder à la valeur moyenne
de l'indice (b), la retardance (moyennant diagonalisation du tenseur d'indice de réfraction)
(c) et l'orientation de l'axe principal. Ceci devrait à terme permettre de remonter à des in-
formation structurelles spécifiques qui, jusqu'ici n'étaient accessibles qu'aux méthodes de
microscopie non-linéaires ou super-résolues [177-179].

Ces premières expériences nous ont permis de nous assurer de la faisabilité des mesures. Cependant, de multiples hypothèses ont être faites pour estimer les différents paramètres. Nous avons notamment négligé la polarisabilité le long de l'axe optique du système. De plus, les échantillons considérés valident la première approximation de Born. La solution passe une nouvelle fois par la mise en place de modèles de formation d'images avancés permettant de prendre en compte la nature vectorielle du champ électromagnétique couplés à des méthodes de reconstruction avancées régularisées ou non [151, 180, 181].

À l'heure actuelle les limites des approches classiques restent floues. L'utilisation de la polarisation pourrait permettre d'en dresser les contours de s'attaquer progressivement à l'imagerie des milieux diffusants, ou plus modestement dans un premier temps de pouvoir traiter le cas de milieux ne respectant pas la première approximation de Born. Des solutions
<figure><img src="image_120.png" /></figure>

FIGURE IV.2.3 – Extraction d’informations quantitative de polarisation. (a) Composantes du tenseur d’indice de réfraction. (b) Indice de réfraction moyen. (c) Retardance. (d) Angle de l’axe rapide de polarisation.

complètes à ces problèmes existent mais nécessitent la mise en place de solutions itératives couplées à un éclairage actif [182, 183].

Il serait possible d'explorer une solution intermédiaire qui viserait à estimer la dépolarisation du milieu. À défaut de caractériser complètement le milieu diffusant, il serait ici possible de séparer les composantes « ballistiques » des composantes multi-diffusées. Cette méthode d'imagerie de photons marqués en polarisation couplée à une détection cohérente telle que l'holographie hétérodyne pourrait permettre d'imager des échantillons isotropes dans un environnement fortement diffusant. Le procédé reste bien entendu à valider et réprésenterait une piste de recherche à moyen terme.

## 2.3.2 Contraste de composition chimique : exploitation de l'absorption chromatique

Jusqu'ici, et finalement comme souvent dans la communauté de la MTD, je me suis très largement attardé sur la composante réfractive de l'indice de réfraction. En effet, c'est elle qui porte la plus grosse partie de l'information en imagerie biologique, et à plus forte raison pour des échantillons compatibles avec l'approximation de Born.

Il est d'ailleurs assez surprenant de voir ce contraste si peu utilisé<fnref n="1" />, on trouve néanmoins quelques études démontrant la faisabilité d'une mesure quantitative de l'absorption [184]. Nous avons également entamé, en collaboration avec les collègues du LIMA de Mulhouse

<footnote n="1">1. Ce point est sans doute lié au fait que l'absorption est partiellement accessible en microscopie grand champ conventionnelle. Le fait est qu'ici nous apportons une information quantitative en 3D</footnote>
<figure><img src="image_121.png" /><figcaption>FIGURE IV.2.4 – Analyse de la photocommutation en absorption de billes polymère. Une illumination à 405 nm rend les billes absorbantes quand une illumination à 532 nm les rend de nouveau transparentes.</figcaption></figure>

(Laboratoire d'Innovation Moléculaire et Applications) de premières études pour les aider à caractériser les chromophores, photocommutables en absorption, greffés sur des billes de silice, qu'ils développent. La formulation développée par les collègues du LIMA est telle que le polymère devienne absorbant lorsqu'il est illuminé à λ = 405 nm et redevienne transparent une fois éclairé à λ = 532 nm. Cet aspect est illustré Fig. IV.2.4. Ces premiers essais ont été réalisés dans le cadre du stage M2 de Nacer Jaafar. Pour pouvoir comparer les résultats, concentrons nous sur la zone rouge encadrée sur chaque image de réfraction. La même zone est marquée sur les images d'absorption. On peut en effet bien remarquer que lorsque le polymère est illuminé à 405 nm, la signature des billes est également visible dans l'absorption. Ce signal disparaît dès lors que l'échantillon est réilluminé à 532 nm. La MTD est donc bien sensible à la photocommutation. Ces premiers résultats ont été obtenus dans le cadre d'un projet financé par le GdR ImaBio et nous cherchons à pousser plus loin les analyses pour caractériser le plus complètement possible le phénomène (vitesse de commutation, seuil de puissance optique, nombre de cycles ...).

De plus, dans la logique des travaux de Sung [184] nous sommes en train de nous doter d'une source supercontinuum (marché en cours) afin de pouvoir extraire ce signal d'absorption dans toute la gamme visible, transformant ainsi la MTD en une méthode de spectroscopie visible. De là, l'absorption chromatique mesurée devrait pouvoir nous permettre de remonter à la nature chimique des espèces présentes dans les échantillons analysés. De plus, à l'instar de la proposition de nos collègues de l'Institut Fresnel, ce couplage de synthèse d'ouverture par balayage et synthèse multispectrale pourrait améliorer le remplissage de l'OTF et donc l'estimation de l'indice de réfraction [185].

Je me suis contenté jusqu'ici du domaine visible, mais le spectre électromagnétique est
<figure><img src="image_122.png" /></figure>

FIGURE IV.2.5 – Caractérisation Doppler d’un embryon de Zebrafish. (a) Image du contraste de phase. (b) Image composite phase + Doppler (le signal Doppler est en rouge).

bien plus vaste. Nous avons dernièrement entamé des contacts avec nos collègues du syn-
chrotron SOLEIL Frédéric Jamme et Hugo Chauvet qui ont montré de l’intérêt pour la MTD
et souhaiteraient, en complément sur leurs travaux en imagerie de fluorescence, voir avec
nous les possibilités et opportunités de portage de la tomographie dans le domaine UV
(≈ 300 nm).

**2.3.3 Contraste Doppler et imagerie haute-sensibilité**

Cette thématique, initiée dans le cadre de la thèse de Riadh et financée par l'ANR JCJC-THTTM, vise à combiner acquisitions tomographiques et imagerie laser Doppler pour essayer de bénéficier du meilleur des deux mondes. Le but ici est de permettre d'ajouter aux capacités d'imagerie 3D de la MTD, les propriétés de l'imagerie laser Doppler :

— sélectivité spectrale (au sens temporel du terme)

— imagerie au bruit de photon

<figure><img src="image_123.png" /></figure>

FIGURE IV.2.6 – Caractérisation 3D+t d’un embryon de Zebrafish. (a) Image du contraste de phase avec une illumination. (b) Image 3D dans l’axe du Zebrafish, (c) Autre point de vue. Adapté de [86].

À titre d'exemple, la Fig. IV.2.5 montre l'intérêt de l'ajout du contraste Doppler dans le cas d'un embryon de Zebrafish. Cette information est cependant limitée au cas bidimensionnel. A contrario, il a été montré qu'il était possible d'imager la structure veineuse du
Zebrafish en 3D en gardant la résolution temporelle [85, 86] (voir Fig. IV.2.6). Cependant, dans ce cas la mesure Doppler est perdue.

Nous cherchons ici à avoir accès et à la structure 3D, et à la signature Doppler des dif-fuseurs. Dans ce but, en partenariat avec l'IS2M (Institut des Sciences des Matériaux de Mulhouse) nous développons des structures microfluidique 3D pour montrer la faisabilité de l'approche.

À terme, j'aimerais aller jusqu'à la tomographie d'objet en mouvement. Dans ce but, il faudra accélérer la cadence des acquisitions. Dans ce cadre, les travaux sur l'optimisation du balayage d'illumination initiés dans le cadre de la thèse d'Asemare trouvent tout leur intérêt. On pourrait de plus envisager, pour limiter les problématiques liées au balayage de fréquence des AOM, réaliser des acquisitions avec une caméra rapide et réaliser une analyse temps fréquence du signal à la manière de ce que propose Michael Atlan en imagerie du fond de l'œil [186-188]. Pouvoir réaliser l'image Doppler et/ou d'un objet en mouvement demeure un challenge expérimental, tant d'un point de vue acquisition que traitement des données ce qui inscrit cette partie du projet dans le moyen terme.

## 2.4 Projet à moyen/long-terme : nanoscopie de perturbation

L'un des derniers enjeux à relever reste la résolution d'imagerie la technique. peut-on s'approcher de la résolution des méthodes de microscopie super-résolue type PALM, STORM, STED, Minflux [189-192] tout en conservant des méthodes sans marquage ?

Dans un premier temps, il est nécessaire de disposer une méthode de détection très sensible. Il n'est plus à démontrer que la microscopie hétérodyne, telle qu'utilisée en imagerie laser Doppler, permet de réaliser de l'imagerie au bruit de photon. Un détecteur hétérodyne se comporte en effet comme une détection cohérente et dès lors que l'on arrive à maintenir la cohérence de phase dans une série d'acquisition, on peut accumuler du signal. J'ai ainsi pu redémontrer que le rapport signal à bruit en holographie hétérodyne évoluait linéairement avec le nombre de pixels acquis [76]. De même, il est possible de marquer les photons pour favoriser la détection de phénomènes à une fréquence donnée [193].

On pourrait ici exploiter la dépendance de l'indice de réfraction à la température. Pour peu que l'on soit capable de moduler la température de l'échantillon à une fréquence suffisamment élevée pour ne pas tomber dans la fonction d'appareil de la détection.

Ce projet pourrait s'envisager sur trois volets :

- détermination de la limite de détection le variation d'indice de réfraction de la détection hétérodyne en MTD;

- application du principe à un échantillon simple pour validation du concept;

- mise en place du principe sur échantillon 3D réel.

### 2.4.1 Détermination des limites de sensibilité en indice de réfraction de la MTD

Pour déterminer le potentiel de la technique, il est, au préalable, nécessaire de déterminer la plus petite variation d'indice de réfraction à laquelle nous sommes sensibles. Dans un premier temps, nous savons d'ores et déjà que la détection hétérodyne en holographie est limitée par le bruit de photon (« shot-noise ») [76, 81]. Ce niveau est équivalent à considérer qu'au moins un photoélectron, en provenance du bras objet, est acquis par pixel résolu [194].

Pour s'en assurer, prenons le cas d'une de nos caméras Photonfocus® actuelle. La dynamique maximale est de 10 bits. On règle le dispositif de telle sorte que l'onde de référence occupe la moitié de la dynamique capteur, soit 512 LSB (Least Significant Bit). Le facteur de conversion de notre caméra étant de $13,3 \times 10^{-6} \times 10^{-1}$, l'intensité moyenne de la référence représente $6810 \times 10^{-6}$. Comme il suit une statistique poissonnienne, le bruit de photon a un
écart-type équivalent à la moyenne du signal reçu sur le capteur ce qui représente dans notre cas 83 $e^{-}$. Les autres sources classiques de bruit (bruit de conversion, bruit d'obscuration...) sont de l'ordre de 10 $e^{-}$. Le bruit de photon est donc bien la source dominante de bruit dans notre détection. De plus, nous nous placerons dans une configuration hors-axe avec phase-shifting et hétérodynage. Dans ce cas, les bruits statiques (courant d'obscurité, conversion), sont rejetés par le filtre temporel qu'amène l'hétérodynage, et les bruits dynamiques (fluctuations d'intensités...) sont filtrés par le hors-axe. Ainsi, le nombre de pixel résolus correspond au nombre de pixels constituant l'ordre +1 dans l'espace des $k$ (espace de Fourier), et la limite ultime de détection est atteinte dès lors que chaque pixel résolu aura converti un photon en électron.

Il deviendra donc nécessaire d'estimer théoriquement, et de vérifier expérimentalement la sensibilité que l'on est en mesure d'atteindre en fonction de la quantité de données acquises. Cette estimation est beaucoup plus délicate qu'en holographie. En effet, nous mesurons plusieurs centaines d'hologrammes pour réaliser la synthèse d'ouverture 3D permettant la reconstruction tomographique. Lors de la construction du potentiel objet 3D à partir des spectres 2D des zones de redondance apparaissent, affectant de fait l'estimation de la quantité de pixels résolus. Notons que la redondance d'information est prise en compte dans nos reconstructions classiques et que nous y avons donc facilement accès. On pourra cependant souligner que cette dernière dépendra de la manière d'effectuer le balayage de la pupille du condenseur. Autre difficulté, le cône manquant de fréquences dans l'OTF de la MTD. Ce dernier va fausser l'estimation absolue de l'indice. On pourra éventuellement considérer l'utilisation d'algorithmes de reconstruction sous contraintes légères de type Gerchberg-Papoulis qui, à peu de frais, moyennant des *a priori* sur la variation d'indice de réfraction et de l'absorption, permettent de remplir partiellement l'OTF [195, 196].

### 2.4.2 Validation du concept

D'un point de vue expérimental, nous pourrons d'ores et déjà commencer par vérifier les capacités d'imagerie au bruit de photon de la MTD en diminuant progressivement, au moyen de densités optiques, le poids du signal issu de l'objet dans le signal acquis. En accumulant de manière cohérente les tomogrammes, nous devrions être en mesure de conserver une détection correcte jusqu'au bruit de photon. L'objet idéal dans ce cas serait un objet présentant un gradient d'indice de réfraction latéral, et éventuellement axial.

Le montage expérimental envisagé est proposé Fig. IV.2.7. Il repose sur une modification de la plateforme hétérodyne développée dans le cadre de la thèse de Riadh. Ici, la perturbation sera introduite par un laser de pompe modulé à une pulsation $\omega_{\text{mod}}$. Les modulateurs acousto-optiques seront pilotés de telle sorte que l'écart de pulsation entre les deux soit de $\Delta\omega = \omega_{\text{mod}} + \omega_{\text{Cam}}/4$. Ainsi, la détection sera optimisée pour la perturbation tout en offrant la possibilité de faire du phase-shifting. Le laser pompe a ici pour but de générer une perturbation harmonique qui sera détectée de manière cohérente par la détection hétérodyne (sur le même principe qu'un lock-in). La perturbation sera enfin balayée sur l'ensemble de l'échantillon et devrait permettre d'offrir des images super-résolues, sans avoir recours à un marquage de l'échantillon.

Le principe de fonctionnement attendu de la technique est illustré Fig. IV.2.8. L'effet a été volontairement accentué. Partons d'une situation où deux objets sont suffisamment proches pour ne pas être résolus (a). L'application de la perturbation sur l'objet permettra de modifier localement l'indice de réfraction. Comme la détection est fréquentiellement verrouillée sur la fréquence de la perturbation, la détection de cette dernière sera favorisée par rapport au reste et il devrait être possible de détecter l'objet 1 (b). En déplaçant la perturbation dans l'objet, il devrait être possible d'appliquer le même principe au second objet (c). Ainsi,
<figure><img src="image_124.png" /><figcaption>FIGURE IV.2.7 – Schéma de montage envisagé pour la nanoscopie de perturbation.</figcaption></figure>

nous pourrions détecter les deux objets indépendamment et nous affranchir de la limite de résolution.

Cette méthode à balayage, sans marquage nécessitera une grande précision et sensibilité sur l'estimation de la variation d'indice de réfraction. À titre d'exemple, l'indice de réfraction de l'eau passe de 1,332 à 20°C à 1,329 à 40°C ce qui représente une variation de 0,5% lors de la modulation de l'indice de réfraction. Nous sommes ici très loin des standards en imagerie surper-résolue, ou avec assistance de nano-billes d'or [197], où les taux de modulation tendent vers 100%. Le choix de la source pour la modulation d'indice est également à étudier. Les premiers essais sur perturbation statique devraient permettre de vérifier la validité de l'approche.

<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>FIGURE IV.2.8 – Illustration du principe de perturbation de l'indice. (a) paire d'objets non-résolus, (b) perturbation harmonique appliquée sur l'objet 1, (c) perturbation appliquée sur l'objet 2.</figcaption></figure>
### 2.4.3 Application à l'imagerie super-résolue 3D sans marquage

La dernière étape sera d'appliquer la méthode à des échantillons épais. Pour ce faire, un dispositif de balayage 3D (par exemple un scanner confocal modifié) sera ajouté pour réaliser le balayage de la perturbation. Il n'en reste pas moins que la méthode nécessitera des acquisitions très longues (d'autant plus si on imagine acquérir un volume tomographique par position de la perturbation). Nous avons d'ores et déjà démontré la possibilité de réaliser des acquisitions/reconstructions tomographiques à 0,3 Hz [121] et il faudra sans doute envisager une solution intermédiaire dans un premier temps : réaliser le balayage de la perturbation en 2D au cours des acquisitions tomographiques. Selon le balayage choisi, et en combinant la technique de perturbation avec un « z-stack », nous pourrions limiter le nombre d'acquisitions nécessaires.

Les pistes restent nombreuses, comme j'ai pu l'évoquer plus tôt, c'est partie du projet est à plus long terme et les première solutions envisagées restent assez spéculatives tant qu'elles n'ont pas été confrontées à l'épreuve du terrain.

## 2.5 Une dernière conclusion

Je pense que le mot « conclusion » est un de ceux que j'ai le plus utilisé dans ce document (essentiellement à cause de sa structure), mais celle-ci sera la dernière ! J'ai ainsi pu présenter les pistes de recherches vers lesquelles je pense qu'il est opportun de se tourner à l'heure de l'écriture de ce document. L'imagerie non-conventionnelle évolue vite, les méthodes quantitatives sans marquage également et nous n'avons pas le monopole des idées. Une bonne idée des développements actuels et futurs peuvent être trouvés dans deux articles auxquels j'ai pu contribuer dernièrement. Ainsi, V. N. Astratov nous a contacté pour contribuer à une roadmap portant sur les développements futurs de l'imagerie super-résolue sans marquage [161]. De même j'ai été sollicité par la revue Sensors pour établir une revue de l'état de l'art et des opportunités offertes par la MTD [198], preuve s'il en était encore besoin de l'intérêt du domaine pour la communauté et de sa compétitivité.
<figure><img src="image_126.png" /></figure>
# Cinquième partie

## Annexes
<figure><img src="image_127.png" /></figure>
# Annexe A

## Présentation des activités

### A.1 Curriculum-vitæ

**Nicolas Verrier,**

Maître de Conférences à l'Université de Haute Alsace

nicolas.verrier@uha.fr

### A.2 Expérience professionnelle

<table><tr><td>2016-<br>(7 ans)</td><td>Maître de Conférences, Université de Haute-Alsace.<br><b>Enseignement</b> en électronique et bases de données à l'IUT de Mulhouse (dpt. GEii).<br><b>Recherche</b> en microscopie tomographique diffractive à l'Institut de Recherche en Informatique Automatique et Signal (UR 7499 - IRIMAS).</td></tr><tr><td>Début 2016<br>(5 mois)</td><td><b>Chercheur contractuel CNRS</b>, Observatoire de Lyon.<br>Financement ERC Opticon - Michel Tallon<br>« Tomographie atmosphérique par approches inverses ».</td></tr><tr><td>2014-2016<br>(2 ans)</td><td><b>Post-Doctorant</b>, Université de Saint-Étienne.<br>Financement IDEX - PALSE MORIN - Corinne Fournier<br>« Mesures optiques 3D pour la recherche et l'industrie ».</td></tr><tr><td>2013<br>(1 an)</td><td><b>Chercheur contractuel CNRS</b>, Université de Montpellier.<br>Financement ANR ICLM et 3D BROM - Michel Gross<br>« Application de l'holographie hétérodyne à la matière molle ».</td></tr><tr><td>2010-2012<br>(2,5 ans)</td><td><b>Post-Doctorant</b>, ESPCI - Institut Langevin.<br>Financement Fondation Pierre-Gilles de Gennes - Michael Atlan<br>« Microscopie holographique hétérodyne appliquée à l'imagerie de micro-organismes : détermination des propriétés mécaniques et structurales ».</td></tr><tr><td>2009-2010<br>(1 an)</td><td><b>ATER</b>, Université de Rouen.<br><b>Enseignement</b> à la Faculté des Sciences et Techniques, et à l'IUT GTE de l'Université de Rouen<br><b>Recherche</b> en holographie numérique à l'UMR 6614 - CORIA.</td></tr><tr><td>2006-2009<br>(3 ans)</td><td><b>Moniteur de l'enseignement supérieur</b>, Université de Rouen.<br>Service d'enseignement réalisé au sein du département GTE de l'IUT de Rouen.</td></tr><tr><td>2006-2009<br>(3 ans)</td><td><b>Allocataire de Recherche MESR</b>, Université de Rouen, CORIA.</td></tr></table>