# Exploration des signaux Harmoniques en microscopie multiphotonique pour le phénotypage tissulaire

Laurence Dubreil

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Laurence Dubreil. Exploration des signaux Harmoniques en microscopie multiphotonique pour le phénotypage tissulaire. XXXème congrès de l'AFH: les nouveaux mondes de l'histologie, Association Française d'Histotechnologie (AFH). FRA., Jun 2017, Nantes, France. hal-01547568

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# Exploration des Signaux Harmoniques en Microscopie Multiphotonique pour le phénotypage tissulaire

Laurence Dubreil, PhD
UMR 703 PAnTher INRA/Oniris, Nantes

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# Principe de la microscopie biphotonique

* 1931 : absorption à deux photons décrite dans les travaux de thèse de M. Goeppert-Mayer (1906-1972)

## Principe de la fluorescence

Excitation a 1 photon

Excitation 488 nm
E=2,5eV

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Fluorescence
emission

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Excitation 976 nm
E=1,25eV

GFP

Excitation 2 Photons

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Fluorescence
emission

Chacun des 2 photons apporte la moitié de l'énergie nécessaire à la transition électronique de la molécule excitée.

* 1961 : 30 ans plus tard, l'invention des lasers permet la 1ère vérification expérimentale

* 1990 : application à la microscopie (Winfried Denk, Jim Strickler et Watt W. Webb)
Conditions expérimentales pour l'excitation multiphotonique

* L' excitation à 2 Photons nécessite l'utilisation de lasers pulsés

* Un laser pulsé permet d'obtenir une très forte concentration de photons sur un temps très court (femtoseconde) pour ne pas altérer l'échantillon. (imagerie en profondeur adaptée au vivant)

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# L'excitation à 2 photons permet d'obtenir plusieurs contrastes

* Fluorescence multiphotonique = absorption et émission de photons

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* Des phénomènes optiques non linéaires dus aux interactions lumière/matière

- Les signaux de seconde harmonique (SHG), fréquence doublée

Génération de SHG = absence de centrosymétrie
(collagène, bande de myosine, amidon)

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- Les signaux de troisième harmonique (THG), fréquence triplée

Génération de THG = changement d'indice de réfraction
(vésicules lipidiques)

Eau / huile

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La première observation de Génération de Second Harmonique (GSH) par Franken et al. 1961
# Signaux de seconde harmonique du collagène

## Cancer de l'ovaire :
Anomalies de la matrice de collagène

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Ovaire normal

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Ovaire malade

Methods in cell biology 123C : 531-546 · June 2014

## Maladies cardio-vasculaires :
Anomalie de la paroi artérielle

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Elastine (Fluorescence)

Collagène (SHG)

Cytometry A, 2006. Jan; 69(1)/20-6
# Signaux de troisième harmonique, quelles structures imagées?

* Changement local d'indice de réfraction : - Les membranes cellulaires

- Les vésicules lipidiques

- Les axones myélinisés

Moelle épinière

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Imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using Third Harmonic Generation Microscopy. Biophysical Journal (2011) 1362-1371.

Cellular membranes and ECM structures in mouse skin

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Third harmonic generation of cells and tissue. Organisation. Journal of Cell Sciences (2016) 129,245-255.
# Microscope biphotonique A1RMP plateforme APEX de l'UMR703

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CENN
CENTER OF EXCELLENCE
NIKON NANTES

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Julien Pichon

* Laser Insight Deepsee Infra-rouge 680-1300 nm

* 3 Détecteurs GaAsp hautement sensibles

* Imagerie multimodale, fluorescence, SHG, THG

* Scanner resonant pour l'imagerie du vivant

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* Exploration des tissus en profondeur

* Phototoxicité réduite
# Myopathie de Duchenne : fibrose musculaire détectée par la SHG générée par le collagène de type I

* Maladie génétique

* Mutation du gène de la dystrophine

* Dégénérescence des muscles

* Accumulation de fibrose endomysiale (collagène de type I)

Microscopy and imaging science: practical approaches to applied research and education (A. Méndez-Vilas, Ed.)

## Multiphotonic and Harmonic generation microscopy: an attractive label free imaging and non-destructive observation of collagenic and adipose tissues in pathological muscle context

Laurence Dubreil <fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Mireille Ledevin <fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Claire Lovo <fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Thibaut Larcher <fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Romain Fleurisson <fnref n="1" />,<fnref n="2" />
Lydie Guigand <fnref n="1" />,<fnref n="2" /> and Karl Rouger <fnref n="1" />,<fnref n="2" />

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Imagerie du collagène de type I, par immunomarquage (vert) par les signaux de SHG (bleu)

A : chien sain

B : chien myopathe

<footnote n="1">¹ INRA UMR703 PAnTher, F-44307 Nantes, France</footnote>

<footnote n="2">² LUNAM Université, Oniris, École nationale vétérinaire, agro-alimentaire et de l'alimentation Nantes-Atlantique, Nantes, F-44307, France</footnote>
# Maladie de Pompe : anomalie sarcomérique détectée grâce à la SHG générée par les bandes de myosine

* Maladie génétique lysosomale

* Déficience acide-α-1,4-glucosidase (GAA)

* Accumulation glycogène dans les lysosomes

* Forte autophagie avec des conséquences sur la morphologie des sarcomères

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video

sain

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Malade

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Thomas Auger, Sylvain Prigent
# Signaux de troisième harmonique exploités pour le phénotypage tissulaire

Adipocytes

Fluorescence des lipides
Rouge de Nil

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Fluorescence/THG

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THG
Vésicule lipidique

Section transversale
muscle dystrophique

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THG
Tissu adipeux

Section transversale
moelle épinière

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THG
Myéline
# Nanoparticules Harmoniques (HNPs) : BiFeO3 nanocristaux non centrosymétriques, 100-120 nm, signaux SHG et THG.

## HNPs : Sondes pour du tracking cellulaire

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### Cellules avec NPs

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### Tracking cellulaire dans le muscle injecté

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Collaborateurs, L. Bonacina et S. Gerber Université de Genève, EPFL

Journal: ACS Nano

Manuscript ID: nn-2017-007736.R1

Title: "Multi-Harmonic Imaging in the Second Near-Infrared Window of Nanoparticle-Labeled Stem Cells as Effective Monitoring Tool in Tissue Depth"

Author(s): Dubreil, Laurence; Leroux, Isabelle; Ledevin, Mireille; Schleder, Cindy; Lagalice, Lydie; Lovo, Claire; Fleurisson, Romain;

Passemard, Solène; Kilin, Vasyl; Gerber-Lemaire, Sandrine; Colle, Marie-Anne; Bonacina, Luigi; Rouger, Karl
Conclusion

La microscopie multiphotonique représente une approche à haut potentiel pour le
phénotypage tissulaire

Apports technologiques majeurs :

- imagerie du tissu non marqué compatible avec le vivant (Signaux harmoniques, autofluorescence, phototoxicité réduite, imagerie en profondeur)

Applications innovantes :

Pour le diagnostique :

- Endoscopie harmonique (THG) pour le diagnostique de tumeur du cerveau chez l'homme, délimitation précise du contour de la tumeur, aide à la chirurgie (Kuzmin et al., 2016)

Pour la recherche préclinique :

- développement de nanoparticules harmoniques pour l'imagerie (Ronzoni F et al., 2014)
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# REMERCIEMENTS

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>L. Bonacina et S. Gerber
Université de Genève, EPFL</figcaption></figure>

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