# Immunité innée intestinale: les peptides antimicrobiens (PAMs)

Anne-Christine Lalmanach

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Anne-Christine Lalmanach. Immunité innée intestinale: les peptides antimicrobiens (PAMs). Master. Infectiologie Cellulaire et Moléculaire, Vaccinologie, Anticorps Thérapeutiques (Immunité innée intestinale), 2016, 34 diapositives. hal-02801716

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M2 Infectiologie Cellulaire et Moléculaire,
Vaccinologie, Anticorps Thérapeutiques

LALMANACH A-C, UMR ISP, INRA Centre de Recherche Val de Loire, Nouzilly

Module 5 Immunité innée intestinale:
Les peptides antimicrobiens (PAMs)

- Caractéristiques

- Cellules productrices

- Structures

- Activités biologiques
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

*In natura:* plus de 2600 peptides antimicrobiens recensés en 2015.

Antimicrobial peptide database: http://aps.unmc.edu/AP/main.php

**Eléments essentiels de l'immunité innée de l'épithélium: fonction barrière intrinsèque.**

Deux familles majeures de peptides antimicrobiens des mammifères :

* Les cathélicidines, à grande variété de structure primaire et secondaire mais prorégion hautement conservée (domaine Nterm cathelin, Cterm LL37).

* Les défensines, α, β, ou θ. Environ 50 α et 90 β chez les mammifères.

Les deux sous-familles α et β de défensines sont codées par un cluster d'au moins 8 gènes sur le chromosome 8p23 chez l'homme.

Les peptides antimicrobiens sont ≤ 5 kDa (30 à 50 AA). Charge nette + et caractère amphipathique.

Tous possèdent une activité bactéricide directe à large spectre (gram+ et gram-), à faible concentration micromolaire in vitro.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

Autres facteurs anti-microbiens:

* Chez la souris, CRS (cryptdin related sequence) peptides formant des homo ou hétérodimères.

* BPI protéine de 55kDa, constituant des polynucléaires neutrophiles, capable de se lier au lipide A du LPS et déstabiliser la membrane externe des bactéries gram-.

* Enzymes intestinales antimicrobiennes: PLA2 et lysozyme, dans les granules de Paneth et de neutrophiles

* Angiogénine 4 (REG3 gamma)
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

Les peptides antimicrobiens sont des facteurs de l' immunité innée relativement bien conservés au cours de l'évolution.

* Retrouvés dans le règne végétal et animal (invertébrés et vertébrés).

* Chez les mollusques jusqu'à l'homme en passant par les oiseaux (β-défensines les plus ancestrales, les α apparaissent chez les mammifères et les θ uniquement chez les primates).

* Analogie des séquences signal des β-défensines aviaires et des peptides cytotoxiques de venin de serpent¹.

* Analogie structurale des peptides du venin de platypus, de la β-défensine 1 de neutrophile bovin et d'un peptide neurotoxique de l'anémone de mer

* Les premières défensines ont été décrites il y a plus de 25 ans à partir d'extraits de neutrophiles².
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Les cellules productrices intestinales

Les défensines identifiées à partir des cellules de Paneth: les α-défensines dans les granules sécrétrices.

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Localisation of HD5 mRNA (left, silver staining) and peptide (right, brown peroxydase product)*.

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

### Position stratégique en protection des cellules souches multipotentes de l'épithélium

Les entérocytes différenciés du gros intestin peuvent produire des β-défensines et des cathélicidines.

<footnote>* G. Diamond & C.L. Bevins, Clin. Immunol. Immunopathol. 1998, 88: 221-225.
E. Porter et al. Infect. Immun. 1997, 65: 2389-2395.</footnote>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Les cellules productrices

Produits par les cellules épithéliales et les phagocytes :

- Les phagocytes (polynucléaires neutrophiles) stockent les peptides antimicrobiens dans des granules.

- Les cellules de Paneth peuvent sécréter les peptides anti-microbiens et/ou les stocker dans des granules.

- De manière générale, les α-défensines sont plutôt exprimées constitutivement, leur sécrétion étant régulée par stimulation.

Nature, 2003,
422: 522-526

**Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin**

Nita H. Salzman*†, Dipankar Ghosh†‡, Kenneth M. Huttner§,
Yvonne Paterson|| & Charles L. Bevins‡

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

HIS, sonde ARN AS
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Les cellules productrices

Les cellules épithéliales expriment les β-défensines de manière constitutive ou inductible (hBD=human beta-defensin):

- hBD1, hBD3 et hBD4 exprimés constitutivement par les cellules épithéliales du petit et gros intestin

- L'expression d'hBD2 est stimulée par les cytokines inflammatoires, par l'IL-17¹, par les voies des récepteurs pour les PAMP, motifs moléculaires de pathogènes, TLR2 et TLR4², par la voie NOD2/CARD15³.

- L'expression d'hBD2 est stimulée par le BCG⁴, par Campylobacter jejuni⁵...

1- Kao et al. 2004, J. Immunol. 173 : 3482-3491.

2- Vora et al. 2004, J. Immunol. 173 : 5398-5405.

3- Voss et al. 2006, J. Biol. Chem. 281 : 2005-2011.

4- Mendez-Samperio et al. 2006, Cell Immunol. 239, 61-66.

5- Zilbauer et al. 2005, Infect. Immun. 73 : 7281-7289.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Les cellules productrices

- Les cathélicidines sont beaucoup moins régulées par les TLR et/ou les cytokines.

- Les cathélicidines sont régulées positivement par l'acétylation des histones.

- Les cathélicidines sont régulées positivement par la vitamine D (1,25 D3).

- La di-hydroxy vitamine D3 est aussi capable de réguler positivement l'expression des TLRs.

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

boucle amplificatrice pour la production de peptides antimicrobiens.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Les cellules productrices

Dans les polynucléaires neutrophiles (PMN) humains :

- 4 α -défensines stockées dans les granules azurophiles qui iront fusionner avec le phagosome.

- 1 cathélicidine (LL-37) stockée dans des granules spécifiques secondaires et délivrée dans le milieu extracellulaire.

Le type et le nombre de peptides antimicrobiens dans les PMN de mammifères varie selon l'espèce.

La sécrétion des peptides antimicrobiens par les PMN et les cellules épithéliales peut être simultanément multiple (20 PAM identifiés dans la peau humaine).

Les peptides antimicrobiens sont pour la plupart produits sous forme de pro-peptides: maturation par clivage de la pro-région.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### La structure

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Figure 1. Structure of selected antimicrobial peptides (AMPs). AMPs are present in a wide variety of structural conformations, such as peptides with α-helix structures, peptides with β-sheet structures stabilized by disulfide bridges or peptides with extended or loop structures. (a) α-helix. NMR-structure of the LL37 core peptide of cathelicidin bound to detergent micelles (PDB ID: 2FBS). (b) β-sheet. Solution structure of the defensin hBD2 by two-dimensional proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (PDB ID: 1FQO). (c) extended structure. NMR structure of the bovine antimicrobial peptide indolicidin bound to dodecylphosphocholine (DPC) micelles (PDB ID: 1G89). (d) loop structure. 3D structure of a cyclic defensin from the leucocytes of rhesus macaques (PDB ID: 1HVZ). PDB ID: ID of peptide structure in Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) protein data bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). The style of LL37 in (a) is shown as secondary coloring shortcuts, whereas the styles of peptides in (b-d) are shown in rainbow coloring shortcuts.

Peptides très compacts, présentant une structure en hélice α (principalement cathélicidines et certaines α -défensines) ou en feuillet β (défensines), stabilisée par plusieurs ponts disulfure.

Les défensines θ, cycliques, ne sont présentes que chez les primates. 10
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### La structure

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>RK-1</figcaption></figure>

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>HNP-3</figcaption></figure>

<caption>Dimeric human α-defensin</caption>

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>hBD-1</figcaption></figure>

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>RTD-1</figcaption></figure>

<caption>Rhesus Macaque θ-defensin</caption>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### La structure

Feuilles beta caractéristiques des α et β défensines.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>α-defensin</figcaption></figure>

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>β-defensin</figcaption></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### La structure

#### Comparaison des sous-familles de défensines des vertébrés

<table><thead><tr><td></td><td>Structure</td><td>Taille (kDa)</td><td>Résidus</td><td>Appariements Cys</td><td>Source</td></tr></thead><tbody><tr><td>α -Défensines</td><td>feuillet β</td><td>3,5-4</td><td>29-35</td><td>1-6, 2-4, 3-5</td><td>hum., lapin, rat souris</td></tr><tr><td>β -Défensines</td><td>feuillet β</td><td>4-6</td><td>38-42</td><td>1-5, 2-4, 3-6</td><td>hum., bov., poulet mouton, porc...</td></tr><tr><td>θ -Défensines</td><td>cyclique</td><td>2</td><td>18</td><td>1-4, 2-5, 3-6</td><td>singe</td></tr></tbody></table>

La connectivité des 6 résidus cystéine dans la séquence, pour former 3 ponts disulfure stabilisant la structure 3D : définit la sous-famille de défensine.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Homologies structurales liées à homologies de séquence

#### Les α défensines

Chez la souris il existe 20 isoformes d' α défensines nommées cryptdines.

La cystéine 1 est localisée côté N-terminal.

<figure><img src="image_13.png" /></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Homologies structurales liées à homologies de séquence

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Les β défensines</figcaption></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Production de la forme active

Maturation par clivage de la prorégion pour libérer le peptide actif.

Chez la souris, les cryptdines sont maturées dans les granules des cellules de Paneth grâce à la MMP7 (matrix metalloprotease matrilysin).

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Chez l'homme, la pro-forme de l'HD5 est sécrétée puis maturée dans la lumière intestinale (pas de MMP7 connue). La forme active peut aussi être sécrétée.*
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

**Large spectre d'activité antimicrobienne: bactéries, champignon, (protozoaires et virus)**

* Escherichia coli

* Staphylococcus aureus

* Salmonella typhimurium

* Pseudomonas aeruginosa

* Listeria monocytogenes ...

**Large spectre anti-bactérien: Gram+ et Gram-**

### Démonstration in vivo: souris KO pour les gènes des peptides antimicrobiens

* Souris Camp -/-: sensibles à *Streptococcus*, herpes simplex virus, *Escherichia coli* et vaccinia virus.

* Souris mBD1 -/-: sensibles à *Haemophilus influenzae*, *Staphylococcus*.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Mesure de l'activité anti-microbienne: test de diffusion radiale en gélose

#### Activité biologique

- Bacteria added to LB 0.03% - type1 agarose underlay gel

- Peptide loaded into each well

- Peptide diffusion, 3h at 37°C

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Rich medium overlay added

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

+16h at 37°C

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

E. coli
ATCC
25922

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Concentration Min. Inh.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

### Perturbation et rupture membranaire des pathogènes.

* Molécules cationiques -> affinité pour les charges négatives de surface des membranes bactériennes (plus que sur les cellules eucaryotes)

* Molécules amphipathiques (analogues aux détergents) -> désorganisation membranaire et rupture des gradients électrochimiques

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

Destruction par éclatement des micro-organismes à forte pression osmotique interne
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

#### Perturbation membranaire : mécanismes d'action

Modèle de formation
de pore par les
peptides à hélice α.

<figure><img src="image_24.png" /></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

### Perturbation membranaire : mécanismes d'action

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Certains peptides peuvent pénétrer (CPP) et se lier à l' ADN pour détruire leur cellule cible.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

#### Pas d'effet sur les cellules de l'hôte : hypothèses

* Moins de charges négatives à la surface des cellules eucaryotes (les phospholipides à tête polaire négative sont plutôt orientés dans le feuillet interne de la bicouche).

* Contenu en cholestérol des membranes eucaryotes, apparaît protecteur (rigidification de la bicouche lipidique, expérience de la sarcotoxin sur des liposomes).

* Rôle protecteur de protéines sériques, de la matrice extracellulaire.

* Les concentrations cytotoxiques pour les cellules eucaryotes sont très supérieures aux concentrations microbicides (MIC LL37 et β-defensines de l'ordre du µM aux sites muqueux, cytotox > à 30µM). 22
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Résistance bactérienne aux peptides anti-microbiens

Réduction de la charge négative globale de la membrane bactérienne

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

limiter l'accès des peptides cationiques

* Modification du phosphatidyl glycerol avec la L-lysine (gène *mprF* de *S. aureus*).

* Alanylation de l'acide teichoïque et lipoteichoïque (opéron *dlt*).

* Acylation du lipide A du LPS (gènes *phoP-phoQ*, gène *pagP* de *S. Typhimurium*).
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Résistance bactérienne aux peptides anti-microbiens

#### Sécrétion de protéases dégradant les peptides anti-microbiens

* protéase de la membrane externe de S. Typhimurium (pgtE)

* protéases V8 et aureolysin de S. aureus (ciblant LL37)

#### Pompes d'efflux évacuant les peptides anti-microbiens

* gène *mtrCDE* de Neisseria gonorrhoeae

* gène *qacA* de Staphylococcus aureus

**Moyens bactériens globalement très limités**
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## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

Une surprenante similarité structurale entre les défensines et les chimiokines

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Fig. 1. Comparison of the tertiary structures of (a) murine macrophage inflammatory protein 3α (MIP-3α)/CCL20 and (b) human β-defensin-2</figcaption></figure>

### Activité similaire?

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

Découverte dans les années 2000:

Yang et al. 1999, Science, 286: 525-528.

Yang et al. 2002, Trends in Immunology, 23: 291-296.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique

**Mesure de l'activité chimiotactique: test de migration des cellules en système « Transwell® ».**

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Numération des cellules dans la chambre inférieure.
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## Les peptides antimicrobiens

**Activité biologique : chimiotactisme, capacité de recrutement cellulaire**

hBD2 et CCL20 ont une structure 3D similaire et partagent la même affinité pour le récepteur CCR6 → Recrutement des cellules dendritiques (DC) et des cellules T

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

HNP1 et HNP2 (α-défensines) → Recrutement des monocytes
hBD3 et hBD4 (β-défensines)

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

LL37 (cathélicidine) → Recrutement des neutrophiles (boucle amplificatrice)

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

**Activité de type chimiokine : les défensines constituent un pont entre immunité innée et adaptative**

Remarque: inversement, il a été montré que certaines chimiokines présentent une activité bactéricide directe, analogues aux peptides antimicrobiens.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique : Régulation de l'inflammation

#### Stimulation de la production de cytokines

<table><tr><td>CXCL8 (IL-8)</td><td>Chimiokines: afflux de phagocytes</td></tr><tr><td>CCL2 (MCP1)</td><td></td></tr><tr><td>IFNα...</td><td>Effecteurs antiviraux</td></tr></table>

hBD2, hBD3, hBD4 et cathélicidine induisent la production

d' IL-6 (inflam)

d' IL-10 (anti-inflam)

<table><tr><td>de MCP1 (CCL2)</td><td rowspan="3">Chimiokines: afflux de phagocytes, cellules présentatrices d'Ag, lymphocytes...</td></tr><tr><td>de MIP3α (CCL20)</td></tr><tr><td>de RANTES (CCL5)</td></tr><tr><td>d' IL-18 (inducteur d' IFNγ, cytokine activatrice majeure des phagocytes)</td><td></td></tr></table>

### Effet adverse possible: Inhibition de la production de cytokines

Compétition avec ligands, perturbation de microdomaines membranaires à récepteur: cathélicidine.
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique : Activation des cellules immunitaires

Stimulation de l' expression des molécules de co-stimulation (CD80, CD86, CD40) sur les cellules présentatrice d' Ag

**Toll-Like Receptor 4-Dependent Activation of Dendritic Cells by β-Defensin 2**

Arya Biragyn,¹* Pier Adelchi Ruffini,¹† Cynthia A. Leifer,²
Elena Klyushnenkova,³ Alexander Shakhov,³ Oleg Chertov,⁴
Aiko K. Shirakawa,⁵ Joshua M. Farber,⁵ David M. Segal,²
Joost J. Oppenheim,⁶ Larry W. Kwak¹

SCIENCE VOL 298 1 NOVEMBER 2002

**Human β-defensin-3 activates professional antigen-presenting cells via Toll-like receptors 1 and 2**

Nicholas Funderburg*, Michael M. Ledorman*, Zhimin Fong†, Michael G. Draga¹, Julie Jadlowsky*, Clifford V. Harding,³, Aaron Weinberg†, and Scott F. Sieg*

PNAS, November 20, 2007, vol 104, No 47, 18631-18635
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique:

**Augmentation de l' immunité adaptative**

Les défensines produites par les neutrophiles (N) et les cellules épithéliales (Ep) peuvent:

a- recruter les précurseurs des cellules dendritiques (preDC).

b- se lier au pathogènes pour faciliter leur captation par les cellules présentatrices d'Ag.

c- stimuler la maturation des DC immatures (iDC) directement ou indirectement en induisant la production cytok. inflam. (TNF et IL-1).

d- favoriser l' afflux de lymphocytes effecteurs (T) spécifiques primés dans les ganglions (LN).

<figure><img src="image_33.png" /></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

## Activité biologique, selon les familles de défensines

<table><caption>Table 1. Classification, size, structure and activity of mammalian defensins</caption><thead><tr><th>Mammalian defensins</th><th>Size<sup>a</sup></th><th>Structure<sup>b</sup></th><th>Activities related to host defense</th></tr></thead><tbody><tr><td>α</td><td>29-35</td><td></td><td>Microbicidal activity, antiviral effect, chemotactic effect, activating macrophages, histamine release, cytokine induction, regulating C1 activation, corticostatic effect, immunoenhancing effect.</td></tr><tr><td>β</td><td>38-42</td><td></td><td>Microbicidal activity, chemotactic effect, activating mast cells, immunoenhancing effect.</td></tr><tr><td>θ</td><td>18</td><td></td><td>Microbicidal activity.</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

<footnote><sup>a</sup>The size given is the number of amino acid residues.</footnote>

<footnote><sup>b</sup>The consensus of each defensin is illustrated by conserved cysteines (C) linked by a dashed line (one dash represents one residue). Disulfide bonds are illustrated by solid lines. Green and light blue highlight amino acid residues that form β-strands and α-helices, respectively.</footnote>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique: résumé schématique

<figure><img src="image_38.png" /></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

### Activité biologique: résumé schématique

<figure><img src="image_39.png" /></figure>
# Immunité innée muqueuse

## Les peptides antimicrobiens

**Une nouvelle activité révélée en 2012: hD6 nanonets**

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Hiutung Chu et al.,
Human α-Defensin 6
Promotes Mucosal
Innate Immunity
Through Self-
Assembled Peptide
Nanonets.
Science 2012
Vol 337: 477.