# Production de données Haut-Débit visant à établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet

Amandine Suin

► To cite this version:

Amandine Suin. Production de données Haut-Débit visant à établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet. Sciences du Vivant [q-bio]. 2019. hal-04459957

HAL Id: hal-04459957

https://hal.inrae.fr/hal-04459957

Submitted on 16 Feb 2024

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

Public Domain
<figure><img src="image_1.png" /></figure>

HAL
open science

# Production de données Haut-Débit visant à établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet

Amandine Suin

► To cite this version:

Amandine Suin. Production de données Haut-Débit visant à établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet. Sciences du Vivant [q-bio]. 2019. hal-04459957

HAL Id: hal-04459957

https://hal.inrae.fr/hal-04459957v1

Submitted on 16 Feb 2024

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

Public Domain
<figure><img src="image_1.png" /></figure>

# Production de données Haut-Débit visant à établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet

Amandine SUIN

Stage : du 06/09/2018 au 10/09/2019

Institut National de la Recherche Agronomique, 24 Chemin de Borderouge, 31 Auzeville

Maître de stage : Nathalie IANNUCCELLI

Tuteurs académiques : Thérèse COMMES et Anthony BOUREUX

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

INRA
SCIENCE & IMPACT

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Génie
Biologique
Montpellier
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

# Production de données Haut-Débit visant à établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet

Amandine SUIN

Stage : du 06/09/2018 au 10/09/2019

Institut National de la Recherche Agronomique, 24 Chemin de Borderouge, 31 Auzeville

Maître de stage : Nathalie IANNUCCELLI

Tuteurs académiques : Thérèse COMMES et Anthony BOUREUX

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

INRA
SCIENCE & IMPACT

I.U.T
MONTPELLIER-SETE

Génie
Biologique
Montpellier
<figure><img src="image_4.png" /></figure>
<figure><img src="image_4.png" /></figure>
## Remerciements

Pour commencer, je souhaite remercier Julie Demars pour m'avoir accueillie dans l'équipe de Génétique et Epigénétique moléculaire des espèces animales utilisées en croisement (GenEpi). Je la remercie pour sa gentillesse et pour l'aide qu'elle m'a apportée tout au long de mon expérience professionnelle.

Je tiens à remercier toute l'Unité de Génétique Physiologie et Systèmes d'Elevage (GenPhySE) pour son accueil chaleureux, et notamment Maguy Bonnet, Katia Feve et Isabelle Hochu, qui ont partagé le bureau pour leur gentillesse et leur disponibilité.

Je souhaite adresser mes remerciements à toutes les personnes ayant participé à l'acheminement du projet de recherche et spécialement à Julien Sarry et au personnel de la plateforme Génomique et Transcriptomique de Toulouse.

Je remercie également Sophie Leroux qui m'a beaucoup aidée lors de la mise au point des manipulations et qui a toujours été présente pour répondre à mes questions.

De plus, j'adresse mes remerciements à Thérèse Commes et Anthony Boureux pour leur disponibilité.

Bien entendu, mon attention se porte tout particulièrement à Nathalie Iannuccelli, sans qui je n'aurais pu vivre mon expérience à l'INRA. Elle a été présente durant mon apprentissage mais aussi lors de la rédaction de ce dossier et m'a beaucoup appris. Je lui témoigne toute ma reconnaissance.
## Remerciements

Pour commencer, je souhaite remercier Julie Demars pour m'avoir accueillie dans l'équipe de Génétique et Epigénétique moléculaire des espèces animales utilisées en croisement (GenEpi). Je la remercie pour sa gentillesse et pour l'aide qu'elle m'a apportée tout au long de mon expérience professionnelle.

Je tiens à remercier toute l'Unité de Génétique Physiologie et Systèmes d'Elevage (GenPhySE) pour son accueil chaleureux, et notamment Maguy Bonnet, Katia Feve et Isabelle Hochu, qui ont partagé le bureau pour leur gentillesse et leur disponibilité.

Je souhaite adresser mes remerciements à toutes les personnes ayant participé à l'acheminement du projet de recherche et spécialement à Julien Sarry et au personnel de la plateforme Génomique et Transcriptomique de Toulouse.

Je remercie également Sophie Leroux qui m'a beaucoup aidée lors de la mise au point des manipulations et qui a toujours été présente pour répondre à mes questions.

De plus, j'adresse mes remerciements à Thérèse Commes et Anthony Boureux pour leur disponibilité.

Bien entendu, mon attention se porte tout particulièrement à Nathalie Iannuccelli, sans qui je n'aurais pu vivre mon expérience à l'INRA. Elle a été présente durant mon apprentissage mais aussi lors de la rédaction de ce dossier et m'a beaucoup appris. Je lui témoigne toute ma reconnaissance.
<figure><img src="image_5.png" /></figure>
<figure><img src="image_5.png" /></figure>
# SOMMAIRE

LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................................. 1

PRESENTATION DE LA STRUCTURE D'ACCUEIL .................................................................................. 2

☐ L'INRA au niveau National .................................................................................................................. 2

☐ L'Unité Mixte de Recherche GenPhySE ........................................................................................ 2

INTRODUCTION ET OBJECTIFS DU STAGE ........................................................................................ 3

SCHEMA SYNTHETIQUE RESUMANT LE PROJET ........................................................................ 6

I. MATERIELS ET METHODES ................................................................................................................ 7

1) Animaux et prélèvements.................................................................................................................. 7

2) Contrôles Qualité de l'ARN ................................................................................................................ 7

A. Spectrophotométrie (Nanodrop) ........................................................................................................ 7

B. Fluorométrie (Qubit)........................................................................................................................ 8

C. Electrophorèse (Fragment Analyzer).......................................................................................... 8

3) Production des séquences d'ARN ........................................................................................................ 9

A. Préparation des libraries .................................................................................................................. 9

B. Contrôles Qualité des libraries ........................................................................................................ 9

1. Electrophorèse (Fragment Analyzer) .......................................................................................... 9

2. PCR quantitative (QuantStudio6) ........................................................................................................ 9

3. Pré-séquençage (MiSeq) .................................................................................................................. 10

C. Séquençage Haut-Débit Illumina (NovaSeq) ............................................................................ 10

D. Contrôle Qualité du séquençage ........................................................................................................ 11

4) Analyses bio-informatiques.................................................................................................................. 12

II. RESULTATS .................................................................................................................................................. 13

1) Contrôles Qualité de l'ARN ................................................................................................................ 13

A. Spectrophotométrie et fluorométrie........................................................................................................ 13

B. Electrophorèse ............................................................................................................................................ 14

2) Contrôles Qualité des libraries ........................................................................................................ 15

A. Electrophorèse ............................................................................................................................................ 15

B. PCR quantitative............................................................................................................................................ 15

C. Pré-séquençage ............................................................................................................................................ 16

3) Contrôle Qualité du séquençage........................................................................................................ 17

4) Analyses Bio-informatiques des données de séquençage ................................................................ 18

DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES SCIENTIFIQUES .................................................. 20

BILAN PERSONNEL DU STAGE ............................................................................................................ 22
# SOMMAIRE

LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................................. 1

PRESENTATION DE LA STRUCTURE D'ACCUEIL .................................................................................. 2

☐ L'INRA au niveau National .................................................................................................................. 2

☐ L'Unité Mixte de Recherche GenPhySE .......................................................................................... 2

INTRODUCTION ET OBJECTIFS DU STAGE .......................................................................................... 3

SCHEMA SYNTHETIQUE RESUMANT LE PROJET ................................................................................ 6

I. MATERIELS ET METHODES ................................................................................................................ 7

1) Animaux et prélèvements.................................................................................................................. 7

2) Contrôles Qualité de l'ARN ................................................................................................................ 7

A. Spectrophotométrie (Nanodrop) ........................................................................................................ 7

B. Fluorométrie (Qubit).................................................................................................................... 8

C. Electrophorèse (Fragment Analyzer).......................................................................................... 8

3) Production des séquences d'ARN ........................................................................................................ 9

A. Préparation des libraries .................................................................................................................. 9

B. Contrôles Qualité des libraries ........................................................................................................ 9

1. Electrophorèse (Fragment Analyzer) .......................................................................................... 9

2. PCR quantitative (QuantStudio6) ........................................................................................................ 9

3. Pré-séquençage (MiSeq) .................................................................................................................. 10

C. Séquençage Haut-Débit Illumina (NovaSeq) .................................................................................. 10

D. Contrôle Qualité du séquençage ........................................................................................................ 11

4) Analyses bio-informatiques.................................................................................................................. 12

II. RESULTATS .................................................................................................................................................. 13

1) Contrôles Qualité de l'ARN .................................................................................................................. 13

A. Spectrophotométrie et fluorométrie........................................................................................................ 13

B. Electrophorèse .................................................................................................................................................. 14

2) Contrôles Qualité des libraries ................................................................................................................ 15

A. Electrophorèse .................................................................................................................................................. 15

B. PCR quantitative.................................................................................................................................................. 15

C. Pré-séquençage .................................................................................................................................................. 16

3) Contrôle Qualité du séquençage........................................................................................................ 17

4) Analyses Bio-informatiques des données de séquençage ................................................................ 18

DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES SCIENTIFIQUES ................................................ 20

BILAN PERSONNEL DU STAGE ........................................................................................................ 22
<table><tr><td>DOCUMENTS DE REFERENCE ET BIBLIOGRAPHIE</td><td>23</td></tr><tr><td>ANNEXE</td><td>25</td></tr></table>
<table><tr><td>DOCUMENTS DE REFERENCE ET BIBLIOGRAPHIE</td><td>23</td></tr><tr><td>ANNEXE</td><td>25</td></tr></table>
LISTE DES ABREVIATIONS

Cf : Confer : se référer

ADNg : Acide Désoxyribonucléique génomique

ARNm : Acide Ribonucléique messager

ARNr : Acide Ribonucléique ribosomique

NGS : Next Generation Sequencing

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

% : Pourcent

PCR : Polymerase Chain Reaction

BET : Bromure d'Ethidium

UV : Ultra-Violet

µL : Microlitre

nm : Nanomètre

DO : Densité Optique

ng : Nano gramme

µg : Microgramme

pg : Picogramme

mL : Millilitre

ADNc : Acide Désoxyribonucléique complémentaire

Gb : Giga base

pb : Paire de bases

b : base

kb : kilo base

LED : Light-Emitting Diode (Diode Électroluminescente)

CCD : Charged Coupled Device

°C : Degrés Celsius

qPCR : quantitative Polymerase Chain Reaction

RQN : RNA Quality Number

LW : Large White

MS : Meishan

H₂O : Eau

nM : NanoMolaire

pM : PicoMolaire

EDTA : Ethylène Diamine Tétracétique

RT : Reverse Transcriptase

nt : nucléotide

IGV : Integrative Genomics Viewer

STAR : Spliced Transcripts Alignment to a Reference

GATK : Genome Analysis ToolKit
LISTE DES ABREVIATIONS

Cf : Confer : se référer

ADNg : Acide Désoxyribonucléique génomique

ARNm : Acide Ribonucléique messager

ARNr : Acide Ribonucléique ribosomique

NGS : Next Generation Sequencing

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

% : Pourcent

PCR : Polymerase Chain Reaction

BET : Bromure d'Ethidium

UV : Ultra-Violet

µL : Microlitre

nm : Nanomètre

DO : Densité Optique

ng : Nano gramme

µg : Microgramme

pg : Picogramme

mL : Millilitre

ADNc : Acide Désoxyribonucléique complémentaire

Gb : Giga base

pb : Paire de bases

b : base

kb : kilo base

LED : Light-Emitting Diode (Diode Électroluminescente)

CCD : Charged Coupled Device

°C : Degrés Celsius

qPCR : quantitative Polymerase Chain Reaction

RQN : RNA Quality Number

LW : Large White

MS : Meishan

H₂O : Eau

nM : NanoMolaire

pM : PicoMolaire

EDTA : Ethylène Diamine Tétracétique

RT : Reverse Transcriptase

nt : nucléotide

IGV : Integrative Genomics Viewer

STAR : Spliced Transcripts Alignment to a Reference

GATK : Genome Analysis ToolKit
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure n°1 : Organigramme de l' Unité Mixte de Recherches (UMR) GenPhySE</figcaption></figure>
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure n°1 : Organigramme de l' Unité Mixte de Recherches (UMR) GenPhySE</figcaption></figure>
# PRESENTATION DE LA STRUCTURE D'ACCUEIL

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

## L'INRA au niveau National

L'**Institut National de la Recherche Agronomique** est un institut public de recherche scientifique qui exerce ses activités dans le domaine de l'**agronomie** (1). La recherche scientifique dans l'agronomie est très vaste, puisqu'elle s'intéresse aux domaines **animal**, **végétal et microbien**. L'INRA interagit avec plusieurs **acteurs externes** : des **plateformes de services**, des **filières**, des **collaborateurs de recherche** scientifiques internationaux, et des **consommateurs**. L'Institut a également un rôle de formation à la recherche en lien avec les **Universités**. L'INRA comprend 7 903 agents titulaires, dont 630 sur le centre INRA Occitanie-Toulouse.

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

## L'Unité Mixte de Recherche GenPhySE

L'**Unité GenPhySE** est une UMR localisée sur **4 sites** de la région toulousaine (2). Elle est rattachée à **2 départements scientifiques** de l'INRA (Génétique Animale et PHysiologie Animale et Systèmes d'Elevage). L'Unité comprend 136 permanents, répartis dans **10 équipes de recherches** (dont l'équipe **GenEpi**) (Cf. Figure n°1). Sur le site d'Auzeville, se trouvent aussi 2 Unités de Service : la **plateforme Génomique et Transcriptomique** (GeT PlaGe) qui met à disposition outils scientifiques et expertises technologiques et SIGENAE (Système Informatique du GENome des Animaux d'Elevage) qui réalise des analyses bio-informatiques. Sur le site INRA d'Auzeville, l'Unité GenPhySE est répartie sur 2 bâtiments qui comprennent chacun des bureaux et des **salles de laboratoire spécialisées** dans un domaine technique donné avec les équipements associés : extraction d'ADN, pré-PCR (pré - Polymerase Chain Reaction) et post-PCR, électrophorèse, ARN (Acide Ribonucléique), protéines, bactériologie... Les protocoles expérimentaux sur l'espèce porcine sont mis au point sur l'**UE** (Unité Expérimentale) **du Magneraud**. Par ailleurs, l'UE **Pectoul** met au point des dispositifs expérimentaux sur les lapins et l'UE de **Langlade** met au point les dispositifs expérimentaux en ovins.

L'Unité GenPhySE est un **laboratoire de recherche** qui exerce ses activités essentiellement en génétique quantitative et moléculaire. Ces 2 disciplines se complètent pour mettre en évidence des gènes responsables de certains phénotypes dans l'objectif d'optimiser la **sélection animale**.

L'équipe **GenEpi** s'intéresse aux recherches en **génétique moléculaire** sur le **porc**, le **lapin** et les **volailles**. Les compétences **techniques** utilisées au sein de l'équipe sont : le prélèvement des échantillons biologiques, l'extraction d'ADN et d'ARN, la PCR, la qPCR (quantitative PCR), le **séquençage**, le **génotypage**.
# PRESENTATION DE LA STRUCTURE D'ACCUEIL

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

## L'INRA au niveau National

L'**Institut National de la Recherche Agronomique** est un institut public de recherche **scientifique** qui exerce ses activités dans le domaine de l'**agronomie** (1). La recherche scientifique dans l'agronomie est très vaste, puisqu'elle s'intéresse aux domaines **animal**, **végétal et microbien**. L'INRA interagit avec plusieurs **acteurs externes** : des **plateformes de services**, des **filières**, des **collaborateurs de recherche** scientifiques internationaux, et des **consommateurs**. L'Institut a également un rôle de formation à la recherche en lien avec les **Universités**. L'INRA comprend 7 903 agents titulaires, dont 630 sur le centre INRA Occitanie-Toulouse.

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

## L'Unité Mixte de Recherche GenPhySE

L'**Unité GenPhySE** est une UMR localisée sur **4 sites** de la région toulousaine (2). Elle est rattachée à **2 départements scientifiques** de l'INRA (Génétique Animale et PHysiologie Animale et Systèmes d'Elevage). L'Unité comprend 136 permanents, répartis dans **10 équipes de recherches** (dont l'équipe **GenEpi**) (Cf. Figure n°1). Sur le site d'Auzeville, se trouvent aussi 2 Unités de Service : la **plateforme Génomique et Transcriptomique** (GeT PlaGe) qui met à disposition outils scientifiques et expertises technologiques et SIGENAE (Système Informatique du GENome des Animaux d'Elevage) qui réalise des analyses bio-informatiques. Sur le site INRA d'Auzeville, l'Unité GenPhySE est répartie sur 2 bâtiments qui comprennent chacun des bureaux et des **salles de laboratoire spécialisées** dans un domaine technique donné avec les équipements associés : extraction d'ADN, pré-PCR (pré - Polymerase Chain Reaction) et post-PCR, électrophorèse, ARN (Acide Ribonucléique), protéines, bactériologie... Les protocoles expérimentaux sur l'espèce porcine sont mis au point sur l'**UE** (Unité Expérimentale) **du Magneraud**. Par ailleurs, l'UE **Pectoul** met au point des dispositifs expérimentaux sur les lapins et l'UE de **Langlade** met au point les dispositifs expérimentaux en ovins.

L'Unité GenPhySE est un **laboratoire de recherche** qui exerce ses activités essentiellement en génétique quantitative et moléculaire. Ces 2 disciplines se complètent pour mettre en évidence des gènes responsables de certains phénotypes dans l'objectif d'optimiser la **sélection animale**.

L'équipe **GenEpi** s'intéresse aux recherches en **génétique moléculaire** sur le **porc**, le **lapin** et les **volailles**. Les compétences **techniques** utilisées au sein de l'équipe sont : le prélèvement des échantillons biologiques, l'extraction d'ADN et d'ARN, la PCR, la qPCR (quantitative PCR), le **séquençage**, le **génotypage**.
<figure><img src="image_9.png" /></figure>
<figure><img src="image_9.png" /></figure>
# INTRODUCTION ET OBJECTIFS DU STAGE

Dans le cadre de la Licence Professionnelle de Biologie Analytique et Expérimentale (LP BAE), j'ai été accueillie à l'INRA dans l'UMR GenPhySE. J'ai intégré l'équipe GenEpi et j'ai collaboré avec la plateforme GeT PlaGe.

Un programme de recherche appelé « Pré-PIPETTE » (Pré-projet imPrIntome to PiglET birTh wEight) a été développé dans le but d'établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale ou imprintome, dans le tissu sanguin chez le porcelet au stade post-natal.

Les mammifères sont des organismes diploïdes dont les cellules somatiques possèdent un ensemble de chromosomes en double exemplaire (sauf les chromosomes sexuels présents en un seul exemplaire). Pour un gène donné, le descendant reçoit une copie de l'allèle du père et une copie de l'allèle de la mère. Ainsi, les mammifères ont deux copies de chaque gène autosomal. En général, l'expression du gène est dite bi-allélique, les allèles maternel et paternel s'expriment et chaque copie peut être co-exprimée dans chaque cellule. Cependant, certains gènes ont une expression mono-allélique « classique » (à allèle spécifique), ce qui signifie qu'un seul allèle, toujours le même sera exprimé, peu importe qu'il soit transmis par le père ou la mère. Il existe un certain nombre de gènes appelés **gènes à empreinte parentale**, pour lesquels l'expression est caractérisée comme « **expression mono-allélique à empreinte paternelle ou maternelle** », ce qui signifie qu'un seul allèle s'exprime en fonction de son origine parentale. L'empreinte affecte à la fois la progéniture masculine et la progéniture féminine, c'est donc une conséquence de l'héritage parental et non du sexe.

La liste des gènes à empreinte est appelée imprintome, elle regroupe l'ensemble des gènes ayant une expression mono-allélique à empreinte parentale (Bartolomei and Ferguson-Smith, 2011 (3)).

L'empreinte peut varier selon le **stade de développement** de l'individu (Grafodatskaya et al., 2013), elle a un rôle majeur dans le développement fœtal, ainsi que dans le comportement, d'où l'importance d'étudier les gènes présentant ce mode de régulation atypique. L'empreinte varie aussi en fonction du **tissu**. Des profils d'empreinte différents peuvent être observés entre le placenta, le cerveau et les autres tissus (Babak et al., 2015). Il est donc important de cartographier les gènes soumis à empreinte parentale dans différents tissus et différentes espèces (Barlow and Bartolomei, 2014). De nombreuses pathologies humaines et animales sont la conséquence de modification de l'empreinte parentale de certains gènes (Eggermann et al., 2015, 2016; O'Doherty et al., 2015). Les gènes soumis à empreinte sont souvent retrouvés en groupe de gènes et généralement **conservés** entre les espèces. Une centaine de gènes soumis à empreinte parentale sont connus chez l'Homme (Monk, 2015) et chez la souris contre seulement une vingtaine chez le porc (Bischoff et al., 2009) (http://www.geneimprint.com/).

La mise en évidence d'un gène à empreinte parentale nécessite de suivre la transmission allélique entre parents et descendant pour identifier chez le descendant quel allèle provient de son père et quel allèle provient de sa mère. Afin de distinguer plus facilement l'origine parentale, il est préférable de choisir des parents génétiquement différents comme par exemple des individus de races différentes.
# INTRODUCTION ET OBJECTIFS DU STAGE

Dans le cadre de la Licence Professionnelle de Biologie Analytique et Expérimentale (LP BAE), j'ai été accueillie à l'INRA dans l'UMR GenPhySE. J'ai intégré l'équipe GenEpi et j'ai collaboré avec la plateforme GeT PlaGe.

Un programme de recherche appelé « Pré-PIPETTE » (Pré-projet imPrIntome to PiglET birTh wEight) a été développé dans le but d'établir la liste des gènes soumis à empreinte parentale ou imprintome, dans le tissu sanguin chez le porcelet au stade post-natal.

Les mammifères sont des organismes diploïdes dont les cellules somatiques possèdent un ensemble de chromosomes en double exemplaire (sauf les chromosomes sexuels présents en un seul exemplaire). Pour un gène donné, le descendant reçoit une copie de l'allèle du père et une copie de l'allèle de la mère. Ainsi, les mammifères ont deux copies de chaque gène autosomal. En général, l'expression du gène est dite bi-allélique, les allèles maternel et paternel s'expriment et chaque copie peut être co-exprimée dans chaque cellule. Cependant, certains gènes ont une expression mono-allélique « classique » (à allèle spécifique), ce qui signifie qu'un seul allèle, toujours le même sera exprimé, peu importe qu'il soit transmis par le père ou la mère. Il existe un certain nombre de gènes appelés **gènes à empreinte parentale**, pour lesquels l'expression est caractérisée comme « **expression mono-allélique à empreinte paternelle ou maternelle** », ce qui signifie qu'un seul allèle s'exprime en fonction de son origine parentale. L'empreinte affecte à la fois la progéniture masculine et la progéniture féminine, c'est donc une conséquence de l'héritage parental et non du sexe.

La liste des gènes à empreinte est appelée imprintome, elle regroupe l'ensemble des gènes ayant une expression mono-allélique à empreinte parentale (Bartolomei and Ferguson-Smith, 2011 (3)).

L'empreinte peut varier selon le **stade de développement** de l'individu (Grafodatskaya et al., 2013), elle a un rôle majeur dans le développement fœtal, ainsi que dans le comportement, d'où l'importance d'étudier les gènes présentant ce mode de régulation atypique. L'empreinte varie aussi en fonction du **tissu**. Des profils d'empreinte différents peuvent être observés entre le placenta, le cerveau et les autres tissus (Babak et al., 2015). Il est donc important de cartographier les gènes soumis à empreinte parentale dans différents tissus et différentes espèces (Barlow and Bartolomei, 2014). De nombreuses pathologies humaines et animales sont la conséquence de modification de l'empreinte parentale de certains gènes (Eggermann et al., 2015, 2016; O'Doherty et al., 2015). Les gènes soumis à empreinte sont souvent retrouvés en groupe de gènes et généralement **conservés** entre les espèces. Une centaine de gènes soumis à empreinte parentale sont connus chez l'Homme (Monk, 2015) et chez la souris contre seulement une vingtaine chez le porc (Bischoff et al., 2009) (http://www.geneimprint.com/).

La mise en évidence d'un gène à empreinte parentale nécessite de suivre la transmission allélique entre parents et descendant pour identifier chez le descendant quel allèle provient de son père et quel allèle provient de sa mère. Afin de distinguer plus facilement l'origine parentale, il est préférable de choisir des parents génétiquement différents comme par exemple des individus de races différentes.
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

→ 4 portées

→ 2 descendants (1 mâle et 1 femelle) / portée = 8 porcelets

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**Légende :**

A : Adénine

LW : race Large White

C : Cytosine

MS : race Meishan

G : Guanine

T : Thymine

<caption>**Figure n°2a-b :** (a) Croisements réciproques et (b) intégration de données génomiques et transcriptomiques</caption>
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

→ 4 portées

→ 2 descendants (1 mâle et 1 femelle) / portée = 8 porcelets

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**Légende :**

A : Adénine

LW : race Large White

C : Cytosine

MS : race Meishan

G : Guanine

T : Thymine

<caption>**Figure n°2a-b :** (a) Croisements réciproques et (b) intégration de données génomiques et transcriptomiques</caption>
Dans le protocole expérimental, la variabilité génétique a été optimisée en utilisant, une race de porc d'origine européenne LW (**Large White**) et une race d'origine chinoise MS (**Meishan**). Seuls les **descendants hétérozygotes** à un locus donné sont informatifs. Le suivi de la transmission de l'ensemble des loci d'un gène permet de définir les 2 haplotypes parentaux.

La mise en évidence d'un gène à empreinte nécessite aussi la mise en place de **croisements réciproques**. Ces croisements permettent de distinguer les différents types d'expression bi-allélique, mono-allélique allèle spécifique ou mono-allélique dépendante de l'origine parentale conduisant à un profil d'expression en miroir (Frésard et al., 2014). Les croisements réciproques ont donc été effectués entre pères de race LW et mères de race MS, et inversement pères MS et mères LW.

Enfin, l'identification d'un gène soumis à empreinte, nécessite de disposer de 2 types de données pour chaque descendant : d'une part, des **données génomiques** (séquences d'ADN), et d'autre part, des **données transcriptomiques** (séquences d'ARNm (Acide Ribonucléique messager)). L'analyse des données transcriptomiques produites permettra de définir l'expression mono-allélique et/ou bi-allélique d'un gène. L'analyse des données génomiques permettra d'identifier l'allèle parental exprimé dans le cas d'une expression mono-allélique. La comparaison entre croisements réciproques permettra de distinguer un gène soumis à empreinte d'un gène à allèle spécifique.

En effet, c'est en combinant les informations d'origine des haplotypes parentaux (ADN) ET les informations d'expression (ARNm) chez un individu qu'il est possible de mettre en évidence un gène soumis à empreinte parentale. (Cf. Figure n°2a-b).

Avec l'avènement des technologies Haut-Débit, il est aujourd'hui possible de mettre en évidence efficacement l'imprintome dans un tissu et à un stade de développement chez une espèce en considérant le génome et le transcriptome d'un individu. Plusieurs technologies Haut-Débit sont disponibles et peuvent être utilisées pour produire les données (Nezer et al., 1999).

Le **Séquençage Nouvelle Génération** (NGS) est la technologie la plus adaptée, car elle permet de produire de nombreuses séquences d'ARN et d'ADN. Le séquenceur le plus approprié dans le cadre du projet est le NovaSeq6000 Illumina (4) car il produit 10 fois plus de lectures qu'un autre type d'instrument. Ainsi le projet Pré-PIPETTE exploite les nouvelles technologies de séquençage Haut-Débit avec notamment la production des données génomiques et transcriptomiques et il intègre les technologies d'analyses Bio-informatique et Bio-statistique.

Dans Pré-PIPETTE, le tissu sanguin a été choisi car il est facile à prélever et il reflète le métabolisme de l'individu. Cependant, c'est un tissu qui contient une protéine en quantité majoritaire (80%), l'hémoglobine. De ce fait, afin de tenir compte de ce problème, les données issues du séquençage d'ARN doivent être très nombreuses.

De plus, l'obtention de nombreuses séquences d'ADN permet une meilleure précision pour déterminer des haplotypes de façon fiable.
Dans le protocole expérimental, la variabilité génétique a été optimisée en utilisant, une race de porc d'origine européenne LW (**Large White**) et une race d'origine chinoise MS (**Meishan**). Seuls les **descendants hétérozygotes** à un locus donné sont informatifs. Le suivi de la transmission de l'ensemble des loci d'un gène permet de définir les 2 haplotypes parentaux.

La mise en évidence d'un gène à empreinte nécessite aussi la mise en place de **croisements réciproques**. Ces croisements permettent de distinguer les différents types d'expression bi-allélique, mono-allélique allèle spécifique ou mono-allélique dépendante de l'origine parentale conduisant à un profil d'expression en miroir (Frésard et al., 2014). Les croisements réciproques ont donc été effectués entre pères de race LW et mères de race MS, et inversement pères MS et mères LW.

Enfin, l'identification d'un gène soumis à empreinte, nécessite de disposer de 2 types de données pour chaque descendant : d'une part, des **données génomiques** (séquences d'ADN), et d'autre part, des **données transcriptomiques** (séquences d'ARNm (Acide Ribonucléique messager)). L'analyse des données transcriptomiques produites permettra de définir l'expression mono-allélique et/ou bi-allélique d'un gène. L'analyse des données génomiques permettra d'identifier l'allèle parental exprimé dans le cas d'une expression mono-allélique. La comparaison entre croisements réciproques permettra de distinguer un gène soumis à empreinte d'un gène à allèle spécifique.

En effet, c'est en combinant les informations d'origine des haplotypes parentaux (ADN) ET les informations d'expression (ARNm) chez un individu qu'il est possible de mettre en évidence un gène soumis à empreinte parentale. (Cf. Figure n°2a-b).

Avec l'avènement des technologies Haut-Débit, il est aujourd'hui possible de mettre en évidence efficacement l'imprintome dans un tissu et à un stade de développement chez une espèce en considérant le génome et le transcriptome d'un individu. Plusieurs technologies Haut-Débit sont disponibles et peuvent être utilisées pour produire les données (Nezer et al., 1999).

Le **Séquençage Nouvelle Génération** (NGS) est la technologie la plus adaptée, car elle permet de produire de nombreuses séquences d'ARN et d'ADN. Le séquenceur le plus approprié dans le cadre du projet est le NovaSeq6000 Illumina (4) car il produit 10 fois plus de lectures qu'un autre type d'instrument. Ainsi le projet Pré-PIPETTE exploite les nouvelles technologies de séquençage Haut-Débit avec notamment la production des données génomiques et transcriptomiques et il intègre les technologies d'analyses Bio-informatique et Bio-statistique.

Dans Pré-PIPETTE, le tissu sanguin a été choisi car il est facile à prélever et il reflète le métabolisme de l'individu. Cependant, c'est un tissu qui contient une protéine en quantité majoritaire (80%), l'hémoglobine. De ce fait, afin de tenir compte de ce problème, les données issues du séquençage d'ARN doivent être très nombreuses.

De plus, l'obtention de nombreuses séquences d'ADN permet une meilleure précision pour déterminer des haplotypes de façon fiable.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure n°3 : Projet PréPIPETTE</figcaption></figure>
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure n°3 : Projet PréPIPETTE</figcaption></figure>
En effet, plus les lectures sont nombreuses à un endroit particulier du génome (profondeur de lecture), plus les chances de visualiser tous les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sont élevées en alignant les lectures sur le génome de référence de l'espèce étudiée.

Par ailleurs, l'haplotypage est d'autant plus facile à réaliser quand les fragments d'ADN ayant servis au séquençage sont longs, pour un assemblage plus simple et plus rapide. A cet égard, la technologie **10X Genomics Chromium** est particulièrement adaptée car elle repose sur l'utilisation d'**ADN génomique de haut Poids Moléculaire**.

Les retombées de ce pré-projet d'imprintome serviront de base à des projets sur l'empreinte parentale dans l'espèce porcine. Les résultats permettront (i) d'améliorer l'annotation du génome du porc, (ii) d'étudier les mécanismes d'un gène particulier soumis à empreinte parentale, dans une espèce et entre des espèces et enfin, (iii) de rechercher les effets d'un gène empreint sur un caractère donné (Nezer et al., 1999).

Dans l'équipe GenEpi, ce projet Pré-PIPETTE servira de base au projet PIPETTE qui a comme finalité d'identifier si certains gènes soumis à empreinte parentale ont un effet sur le poids à la naissance des porcelets.

L'objectif de mon stage a été de participer au Pré-projet visant à établir la liste exhaustive des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet. Dans ce cadre, j'ai été impliquée de la production de données Haut-Débit à leur analyse Bio-informatique. Les animaux utilisés pour le projet de recherche avaient été produits à l'UE et les ARN étaient déjà extraits, car ils ont servi à un autre programme (Cf. Figure n°3).

Afin de lister les variants ARN, j'ai réalisé les manipulations (préparation des librairies True Seq Starnded RNA, séquençage NGS) et effectué le Contrôle Qualité de toutes les étapes d'acquisition des données biologiques et Bio-informatiques. La formation Bio-informatique que j'ai suivie m'a permis d'écrire et de valider un script sur un fichier test contenant les 20 000 premières lectures de séquençage d'un animal (10 000 lectures de type 1 et 10 000 lectures de type 2).

Par ailleurs, en vue de l'haplotypage, j'ai mis au point l'extraction d'ADNg de haut Poids Moléculaire pour extraire les ADNg sur les échantillons biologiques des mêmes animaux que ceux utilisés pour produire les ARN.

J'ai effectué les manipulations et le Contrôle Qualité de toutes les données biologiques (ARN et ADNg), mais en ce qui concerne leur analyse Bio-informatique, je l'ai réalisée sur les données ARN uniquement. Dans ce rapport de stage, j'ai donc choisi de présenter mon travail réalisé sur les données transcriptomiques.
En effet, plus les lectures sont nombreuses à un endroit particulier du génome (profondeur de lecture), plus les chances de visualiser tous les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sont élevées en alignant les lectures sur le génome de référence de l'espèce étudiée.

Par ailleurs, l'haplotypage est d'autant plus facile à réaliser quand les fragments d'ADN ayant servis au séquençage sont longs, pour un assemblage plus simple et plus rapide. A cet égard, la technologie **10X Genomics Chromium** est particulièrement adaptée car elle repose sur l'utilisation d'**ADN génomique de haut Poids Moléculaire**.

Les retombées de ce pré-projet d'imprintome serviront de base à des projets sur l'empreinte parentale dans l'espèce porcine. Les résultats permettront (i) d'améliorer l'annotation du génome du porc, (ii) d'étudier les mécanismes d'un gène particulier soumis à empreinte parentale, dans une espèce et entre des espèces et enfin, (iii) de rechercher les effets d'un gène empreint sur un caractère donné (Nezer et al., 1999).

Dans l'équipe GenEpi, ce projet Pré-PIPETTE servira de base au projet PIPETTE qui a comme finalité d'identifier si certains gènes soumis à empreinte parentale ont un effet sur le poids à la naissance des porcelets.

L'objectif de mon stage a été de participer au Pré-projet visant à établir la liste exhaustive des gènes soumis à empreinte parentale dans le tissu sanguin chez le porcelet. Dans ce cadre, j'ai été impliquée de la production de données Haut-Débit à leur analyse Bio-informatique. Les animaux utilisés pour le projet de recherche avaient été produits à l'UE et les ARN étaient déjà extraits, car ils ont servi à un autre programme (Cf. Figure n°3).

Afin de lister les variants ARN, j'ai réalisé les manipulations (préparation des librairies True Seq Starnded RNA, séquençage NGS) et effectué le Contrôle Qualité de toutes les étapes d'acquisition des données biologiques et Bio-informatiques. La formation Bio-informatique que j'ai suivie m'a permis d'écrire et de valider un script sur un fichier test contenant les 20 000 premières lectures de séquençage d'un animal (10 000 lectures de type 1 et 10 000 lectures de type 2).

Par ailleurs, en vue de l'haplotypage, j'ai mis au point l'extraction d'ADNg de haut Poids Moléculaire pour extraire les ADNg sur les échantillons biologiques des mêmes animaux que ceux utilisés pour produire les ARN.

J'ai effectué les manipulations et le Contrôle Qualité de toutes les données biologiques (ARN et ADNg), mais en ce qui concerne leur analyse Bio-informatique, je l'ai réalisée sur les données ARN uniquement. Dans ce rapport de stage, j'ai donc choisi de présenter mon travail réalisé sur les données transcriptomiques.
<figure><img src="image_13.png" /></figure>
<figure><img src="image_13.png" /></figure>
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption># SCHEMA SYNTHETIQUE RESUMANT LE PROJET</figcaption></figure>
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption># SCHEMA SYNTHETIQUE RESUMANT LE PROJET</figcaption></figure>
<figure><img src="image_15.png" /></figure>
<figure><img src="image_15.png" /></figure>
# I. MATERIELS ET METHODES

## 1) Animaux et prélèvements

Le protocole expérimental utilisé compte au total 16 animaux, dont 8 parents et 8 descendants. Les parents sont issus de 2 races différentes (LW et MS) et le protocole est composé de 4 familles (2 pères LW croisés avec 2 mères MS et 2 pères MS croisés avec 2 mères LW). Afin d'obtenir un profil d'expression en miroir, les animaux ont été croisés réciproquement. Dans chaque famille, 2 descendants, 1 mâle et une femelle (pour éviter les biais d'expression qui pourraient être liés au sexe) ont été sélectionnés au stade de développement de 1 jour.

A mon arrivée au laboratoire, tous les animaux du protocole avaient été produits. Les ARN des 8 descendants avaient été extraits à partir de prélèvements sanguins, mais aucun ADN n'étaient extraits.

Je disposais donc de 8 ARN conservés à -80 °C dans du tampon EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique), pour lesquels j'ai effectué différents Contrôles Qualité afin de vérifier les spécifications données pour le séquençage NGS.

## 2) Contrôles Qualité de l'ARN

### A. Spectrophotométrie (Nanodrop)

L'ARN solubilisé est dosé par mesure de l'**absorbance** dans le domaine de l'UV (Ultra-Violet), à l'aide du Nanodrop 8000 (ND8000LAPTOP, Thermo Fisher Scientific, Etats-Unis), un spectrophotomètre permettant de travailler sur des micro-volumes (0.5 µL à 2 µL). Ce dosage est réalisé afin d'évaluer la quantité et la qualité des acides nucléiques extraits (5).

Le Nanodrop mesure la Densité Optique à 3 longueurs d'ondes différentes :

* **280 nm** : absorbance des protéines

* **260 nm** : absorbance des nucléotides

* **230 nm** : absorbance des sels.

Ces mesures permettent de calculer 2 rapports :

* **DO 260/280** : estimation de la quantité de protéines restantes

* **DO 260/230** : estimation de la quantité de sels restants.

Les concentrations sont proportionnelles à la DO dans une gamme allant de 2 ng/µL à 3750 ng/µL. Le calcul de la concentration d'ADN suit la formule suivante : **1 unité de DO à 260 nm = 40 µg d'ARN / mL de solution**
# I. MATERIELS ET METHODES

## 1) Animaux et prélèvements

Le protocole expérimental utilisé compte au total 16 animaux, dont 8 parents et 8 descendants. Les parents sont issus de 2 races différentes (LW et MS) et le protocole est composé de 4 familles (2 pères LW croisés avec 2 mères MS et 2 pères MS croisés avec 2 mères LW). Afin d'obtenir un profil d'expression en miroir, les animaux ont été croisés réciproquement. Dans chaque famille, 2 descendants, 1 mâle et une femelle (pour éviter les biais d'expression qui pourraient être liés au sexe) ont été sélectionnés au stade de développement de 1 jour.

A mon arrivée au laboratoire, tous les animaux du protocole avaient été produits. Les ARN des 8 descendants avaient été extraits à partir de prélèvements sanguins, mais aucun ADN n'étaient extraits.

Je disposais donc de 8 ARN conservés à -80 °C dans du tampon EDTA (Ethylène Diamine Tétra Acétique), pour lesquels j'ai effectué différents Contrôles Qualité afin de vérifier les spécifications données pour le séquençage NGS.

## 2) Contrôles Qualité de l'ARN

### A. Spectrophotométrie (Nanodrop)

L'ARN solubilisé est dosé par mesure de l'**absorbance** dans le domaine de l'UV (Ultra-Violet), à l'aide du Nanodrop 8000 (ND8000LAPTOP, Thermo Fisher Scientific, Etats-Unis), un spectrophotomètre permettant de travailler sur des micro-volumes (0.5 µL à 2 µL). Ce dosage est réalisé afin d'évaluer la quantité et la qualité des acides nucléiques extraits (5).

Le Nanodrop mesure la Densité Optique à 3 longueurs d'ondes différentes :

* **280 nm** : absorbance des protéines

* **260 nm** : absorbance des nucléotides

* **230 nm** : absorbance des sels.

Ces mesures permettent de calculer 2 rapports :

* **DO 260/280** : estimation de la quantité de protéines restantes

* **DO 260/230** : estimation de la quantité de sels restants.

Les concentrations sont proportionnelles à la DO dans une gamme allant de 2 ng/µL à 3750 ng/µL. Le calcul de la concentration d'ADN suit la formule suivante : **1 unité de DO à 260 nm = 40 µg d'ARN / mL de solution**
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure n°4 :** Séparation et migration de l'ARN sur Fragment Analyzer Advanced Analytical (Agilent) (schéma adapté de (6))</figcaption></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure n°5 :** Profil du marqueur de taille ARN du Fragment Analyzer (Agilent)</figcaption></figure>
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure n°4 :** Séparation et migration de l'ARN sur Fragment Analyzer Advanced Analytical (Agilent) (schéma adapté de (6))</figcaption></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure n°5 :** Profil du marqueur de taille ARN du Fragment Analyzer (Agilent)</figcaption></figure>
## B. Fluorométrie (Qubit)

L'ARN solubilisé est dosé à l'aide du Qubit 2.0 (Q32866, Life Technologies, Etats-Unis), un fluoromètre permettant de doser les acides nucléiques très précisément grâce à l'incorporation d'un **intercalant** qui ne fluoresce que lorsqu'il est lié aux bases azotées (7). Cet appareil permet de doser uniquement les acides nucléiques (pas les contaminants) et permet de travailler sur des micro-volumes (de 1 à 20 µL). La lecture de la **fluorescence** est effectuée dans le domaine de l'UV à 260 nm, la longueur d'ondes à laquelle les nucléotides absorbent la lumière. Le kit utilisé est RNA HS Assay Kit, 100 assays (Q32852, Life Technologies, Etats-Unis). La lecture des concentrations est possible dans une gamme allant de 250 pg/µL à 100 ng/µL. Afin de déterminer la concentration de l'acide nucléique à doser, 10 µL de 2 standards de concentrations connues (0 ng/µL et 10 ng/µL) sont utilisés.

## C. Electrophorèse (Fragment Analyzer)

Afin de valider la **non dégradation des ARN**, il est aussi nécessaire de vérifier leur RQN (RNA Quality Number) à l'aide du 5200 Fragment Analyzer Advanced Analytical (M5310AA, Agilent, Etats-Unis) ou analyseur de fragments (8) (9). Cet appareil utilise le principe de l'électrophorèse capillaire sur gel de polyacrylamide (Cf. Figure n°4) et permet de séparer les acides nucléiques en fonction de leur Poids Moléculaire (taille + charge).

Plusieurs applications sont possibles à l'aide de cet appareil (Contrôle Qualité des ARN, des ADNg ou des fragments d'ADN lors de la vérification de librairies NGS) et pour chacune d'elle un kit différent (incluant un standard de taille différent) est utilisé. Lorsque la qualité des ARN est vérifiée, le kit utilisé est : Standard Sensitivity RNA Analysis Kit, 15nt Advanced Analytical (DNF-471-0500, Agilent, Etats-Unis). Il permet de séparer et visualiser l'ARN dans une gamme allant de 200 bases (b) jusqu'à 6000 b à partir de micro-volumes (2µL d'échantillon entre 5 ng/µL et 500 ng/µL).

Les échantillons d'ARN sont dénaturés pour éviter les conformations secondaires. Un intercalant (Diluent Marker) est ajouté dans chaque échantillon. Le marqueur de taille (Cf. Figure n°5) est toujours positionné en colonne 12. Le gel est chargé dans les capillaires et une tension est appliquée pour injecter les échantillons et les déplacer à travers les capillaires individuels. Au cours de la migration les échantillons passent dans une fenêtre de détection où une lumière LED (Light-Emitting Diode) excite les molécules intercalées dans l'acide nucléique. La fluorescence émise est captée par un détecteur CCD (Charged Coupled Device) qui retransmet le temps de sortie de l'échantillon. Une fois la migration terminée, une image de gel est restituée grâce au logiciel PROSize Data Analysis Software v3.0 (Agilent, Etats-Unis), qui permet de déterminer la taille des molécules analysées (en fonction du marqueur de taille) et leur concentration en fonction de l'intensité de leur pic (quantité d'intercalant).
## B. Fluorométrie (Qubit)

L'ARN solubilisé est dosé à l'aide du Qubit 2.0 (Q32866, Life Technologies, Etats-Unis), un fluoromètre permettant de doser les acides nucléiques très précisément grâce à l'incorporation d'un **intercalant** qui ne fluoresce que lorsqu'il est lié aux bases azotées (7). Cet appareil permet de doser uniquement les acides nucléiques (pas les contaminants) et permet de travailler sur des micro-volumes (de 1 à 20 µL). La lecture de la **fluorescence** est effectuée dans le domaine de l'UV à 260 nm, la longueur d'ondes à laquelle les nucléotides absorbent la lumière. Le kit utilisé est RNA HS Assay Kit, 100 assays (Q32852, Life Technologies, Etats-Unis). La lecture des concentrations est possible dans une gamme allant de 250 pg/µL à 100 ng/µL. Afin de déterminer la concentration de l'acide nucléique à doser, 10 µL de 2 standards de concentrations connues (0 ng/µL et 10 ng/µL) sont utilisés.

## C. Electrophorèse (Fragment Analyzer)

Afin de valider la **non dégradation des ARN**, il est aussi nécessaire de vérifier leur RQN (RNA Quality Number) à l'aide du 5200 Fragment Analyzer Advanced Analytical (M5310AA, Agilent, Etats-Unis) ou analyseur de fragments (8) (9). Cet appareil utilise le principe de l'électrophorèse capillaire sur gel de polyacrylamide (Cf. Figure n°4) et permet de séparer les acides nucléiques en fonction de leur Poids Moléculaire (taille + charge).

Plusieurs applications sont possibles à l'aide de cet appareil (Contrôle Qualité des ARN, des ADNg ou des fragments d'ADN lors de la vérification de librairies NGS) et pour chacune d'elle un kit différent (incluant un standard de taille différent) est utilisé. Lorsque la qualité des ARN est vérifiée, le kit utilisé est : Standard Sensitivity RNA Analysis Kit, 15nt Advanced Analytical (DNF-471-0500, Agilent, Etats-Unis). Il permet de séparer et visualiser l'ARN dans une gamme allant de 200 bases (b) jusqu'à 6000 b à partir de micro-volumes (2µL d'échantillon entre 5 ng/µL et 500 ng/µL).

Les échantillons d'ARN sont dénaturés pour éviter les conformations secondaires. Un intercalant (Diluent Marker) est ajouté dans chaque échantillon. Le marqueur de taille (Cf. Figure n°5) est toujours positionné en colonne 12. Le gel est chargé dans les capillaires et une tension est appliquée pour injecter les échantillons et les déplacer à travers les capillaires individuels. Au cours de la migration les échantillons passent dans une fenêtre de détection où une lumière LED (Light-Emitting Diode) excite les molécules intercalées dans l'acide nucléique. La fluorescence émise est captée par un détecteur CCD (Charged Coupled Device) qui retransmet le temps de sortie de l'échantillon. Une fois la migration terminée, une image de gel est restituée grâce au logiciel PROSize Data Analysis Software v3.0 (Agilent, Etats-Unis), qui permet de déterminer la taille des molécules analysées (en fonction du marqueur de taille) et leur concentration en fonction de l'intensité de leur pic (quantité d'intercalant).
1. Purification et fragmentation

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

2. Synthèse du 1er brin d'ADNc

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

3. Synthèse du 2nd brin d'ADNc

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

4. Adénylation en 3'

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

5. Ligation des adaptateurs

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

6. Enrichissement PCR et purification

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

7. ADN obtenu à la fin de la librairie

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

**Figure n°6 :** Principe de la préparation de librairie d'ARN Illumina (schéma adapté de (10))

<table><thead><tr><td>Animal</td><td>Séquence des indexes</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>GAGATTCC-ATAGAGGC</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>GAGATTCC-TAATCTTA</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>GAGATTCC-GGCTCTGA</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>GAGATTCC-CAGGACGT</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>GAGATTCC-GTACTGAC</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>GAGATTCC-TATAGCCT</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>GAGATTCC-CCTATCCT</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>GAGATTCC-AGGCGAAG</td></tr></tbody></table>

**Figure n°7 :** Séquences des indexes (Illumina)

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

**Figure n°8 :** Profil du marqueur de taille NGS du Fragment Analyzer (Agilent)
1. Purification et fragmentation

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

2. Synthèse du 1er brin d'ADNc

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

3. Synthèse du 2nd brin d'ADNc

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

4. Adénylation en 3'

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

5. Ligation des adaptateurs

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

6. Enrichissement PCR et purification

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

7. ADN obtenu à la fin de la librairie

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

**Figure n°6 :** Principe de la préparation de librairie d'ARN Illumina (schéma adapté de (10))

<table><thead><tr><td>Animal</td><td>Séquence des indexes</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>GAGATTCC-ATAGAGGC</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>GAGATTCC-TAATCTTA</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>GAGATTCC-GGCTCTGA</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>GAGATTCC-CAGGACGT</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>GAGATTCC-GTACTGAC</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>GAGATTCC-TATAGCCT</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>GAGATTCC-CCTATCCT</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>GAGATTCC-AGGCGAAG</td></tr></tbody></table>

**Figure n°7 :** Séquences des indexes (Illumina)

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

**Figure n°8 :** Profil du marqueur de taille NGS du Fragment Analyzer (Agilent)
### 3) Production des séquences d'ARN

#### A. Préparation des librairies

Le kit utilisé pour préparer les **librairies** d'ARN est le TrueSeq Stranded mRNA (20020595, Illumina, Etas-Unis) (Cf. Figure n°6). La quantité d'ARN utilisé est de 2 µg dans un volume de 50 µL d'H2O RNA free.

→ Les **ARNm** sont **purifiés** à l'aide de billes sur lesquelles sont fixés des oligonucléotides poly-T. Ils sont ensuite **fragmentés** chimiquement par la chaleur en fragments compris entre 120 bases (b) et 210 b. Des lavages sont effectués pour éliminer les ARN non fixés avec des billes magnétiques AMPure XP (A63882, Beckman, Etats-Unis).

→ Une RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) est ensuite réalisée avec un mélange réactionnel contenant des amorces aléatoires et une enzyme (Superscript II Reverse Transcriptase Invitrogen (18064071, Fisher Scientific, Etats-Unis)) pour synthétiser le 1er **brin d'ADNc** (ADN complémentaire).

→ Le 2nd **brin d'ADNc**, est synthétisé. Une fois l'ADNc double brin produit, une purification est effectuée pour éliminer les ARN. Les sels sont ensuite retirés avec de l'éthanol et l'ADN purifié est re-suspendu dans un tampon neutre.

→ L'adénylation en 3' (ajout d'une base d'Adénine aux extrémités 3' des fragments) empêche les fragments de se lier les uns aux autres lors de la ligation des adaptateurs.

→ La **ligation des adaptateurs indexés** (20019792, Illumina, Etats-Unis) permet l'identification des librairies (Cf. Figure n°7). La ligation des adaptateurs est réalisée avec une ligase et les ADN sans adaptateurs sont éliminés par lavages.

→ Les ADN ayant intégrés les adaptateurs subissent un **enrichissement par PCR** (grâce à 2 amorces complémentaires des extrémités P5 et P7).

#### B. Contrôles Qualité des librairies

##### 1. Electrophorèse (Fragment Analyzer)

La librairie est contrôlée à l'aide du 5200 Fragment Analyzer Advanced Analytical (M5310AA, Agilent, Etats-Unis) pour vérifier le **profil et la taille des fragments** d'ADN (ayant intégrés les adaptateurs indexés) de chaque échantillon. Le principe de cet appareil est expliqué à la page 8.

Le kit utilisé est High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical (DNF-474-0500, Agilent, Etats-Unis). Le marqueur de taille permet de séparer et visualiser les librairies de 25 pb à 6 000 pb (Cf. Figure n°8) à partir de micro-volumes (2µL d'échantillon entre 50 pg/µL et 5000 pg/µL). Les fragments doivent être compris entre 200 pb et 700 pb.

##### 2. PCR quantitative (QuantStudio6)

Afin d'estimer précisément la concentration des fragments de chaque librairie, une **PCR quantitative** ou PCR en temps réel est effectuée à l'aide du QS6 (4485694, Thermo Fisher Scientific, Etats-Unis) (11).
### 3) Production des séquences d'ARN

#### A. Préparation des librairies

Le kit utilisé pour préparer les **librairies** d'ARN est le TrueSeq Stranded mRNA (20020595, Illumina, Etas-Unis) (Cf. Figure n°6). La quantité d'ARN utilisé est de 2 µg dans un volume de 50 µL d'H2O RNA free.

→ Les **ARNm** sont **purifiés** à l'aide de billes sur lesquelles sont fixés des oligonucléotides poly-T. Ils sont ensuite **fragmentés** chimiquement par la chaleur en fragments compris entre 120 bases (b) et 210 b. Des lavages sont effectués pour éliminer les ARN non fixés avec des billes magnétiques AMPure XP (A63882, Beckman, Etats-Unis).

→ Une RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) est ensuite réalisée avec un mélange réactionnel contenant des amorces aléatoires et une enzyme (Superscript II Reverse Transcriptase Invitrogen (18064071, Fisher Scientific, Etats-Unis)) pour synthétiser le 1er **brin d'ADNc** (ADN complémentaire).

→ Le 2nd **brin d'ADNc**, est synthétisé. Une fois l'ADNc double brin produit, une purification est effectuée pour éliminer les ARN. Les sels sont ensuite retirés avec de l'éthanol et l'ADN purifié est re-suspendu dans un tampon neutre.

→ L'adénylation en 3' (ajout d'une base d'Adénine aux extrémités 3' des fragments) empêche les fragments de se lier les uns aux autres lors de la ligation des adaptateurs.

→ La **ligation des adaptateurs indexés** (20019792, Illumina, Etats-Unis) permet l'identification des librairies (Cf. Figure n°7). La ligation des adaptateurs est réalisée avec une ligase et les ADN sans adaptateurs sont éliminés par lavages.

→ Les ADN ayant intégrés les adaptateurs subissent un **enrichissement par PCR** (grâce à 2 amorces complémentaires des extrémités P5 et P7).

#### B. Contrôles Qualité des librairies

##### 1. Electrophorèse (Fragment Analyzer)

La librairie est contrôlée à l'aide du 5200 Fragment Analyzer Advanced Analytical (M5310AA, Agilent, Etats-Unis) pour vérifier le **profil et la taille des fragments** d'ADN (ayant intégrés les adaptateurs indexés) de chaque échantillon. Le principe de cet appareil est expliqué à la page 8.

Le kit utilisé est High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical (DNF-474-0500, Agilent, Etats-Unis). Le marqueur de taille permet de séparer et visualiser les librairies de 25 pb à 6 000 pb (Cf. Figure n°8) à partir de micro-volumes (2µL d'échantillon entre 50 pg/µL et 5000 pg/µL). Les fragments doivent être compris entre 200 pb et 700 pb.

##### 2. PCR quantitative (QuantStudio6)

Afin d'estimer précisément la concentration des fragments de chaque librairie, une **PCR quantitative** ou PCR en temps réel est effectuée à l'aide du QS6 (4485694, Thermo Fisher Scientific, Etats-Unis) (11).
<figure><img src="image_26.png" /></figure>
<figure><img src="image_26.png" /></figure>
La qPCR est utilisée dans l'objectif de mélanger les échantillons de façon à avoir une **quantité équimolaire** de chacun. Le kit utilisé est : Illumina Quantification Kit-Universal qPCR Mix (KK4824, CliniSciences, France) (12). Il est basé sur l'incorporation d'un agent **intercalant**, le SYBR Green I qui ne fluoresce que lorsqu'il est incorporé entre les bases azotées. Grâce à l'intercalant fluorescent, la qPCR permet de visualiser l'amplification en temps réel (détection de la fluorescence à chaque cycle d'amplification) et de quantifier les librairies par mesure de la fluorescence émise. Le QS6 détermine un bruit de fond et lors de la phase exponentielle, à l'intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence, il mesure la valeur du premier cycle (Threshold Cycle : cycle seuil) pour lequel la fluorescence est considérée comme supérieure au bruit de fond.

L'augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons ayant intégrée les adaptateurs P5 et P7, puisque les amorces utilisées sont spécifiques aux extrémités P5 et P7.

Les librairies sont dosées avec une quantification relative. L'interprétation des résultats passe tout d'abord par l'établissement d'une droite standard qui permet de corréler le nombre de cycles à la quantité d'amplicons générés. Elle est obtenue grâce à l'utilisation d'une gamme de 6 standards de concentrations connues (de 20 pM à 0,0002 pM) et permet de calculer l'efficacité de la qPCR pour contrôler sa qualité. Ensuite, les résultats sont normalisés avec un ADN contrôle qui a une concentration de 9 nM et une taille de 565 pb. La concentration des librairies à quantifier ne doit pas dépasser la limite de détection de l'appareil qui est de 20 nM dans un volume de 15 µL.

### 3. Pré-séquençage (MiSeq)

Afin de procéder à un séquençage permettant d'avoir le **même nombre de lectures entre échantillons**, un mélange des 8 échantillons d'ARN en quantités équimolaires a été effectué (56,25 pM de chaque échantillon). L'équimolarité est vérifiée grâce à un séquençage à Bas-Débit à l'aide du séquenceur **MiSeq** (SY-410-1003, Illumina, Etas-Unis). Le kit 300-cycle MiSeq Reagent Nano Kit v2 (MS-102-2002, Illumina, Etas-Unis) est utilisé. La cellule de séquençage du MiSeq est composée d'une seule ligne et la profondeur de lecture est de 0.3 Gb. Le volume de mélange chargé sur la cellule de séquençage est de 600 µL à une concentration de 20 pM. Ce mélange contient 1 % de PhiX (ADN du bactériophage PhiX, ayant une taille moyenne de 500 pb), un contrôle de qualité utilisé systématiquement pour valider le fonctionnement du séquençage Illumina, quel que soit le séquenceur.

### C. Séquençage Haut-Débit Illumina (NovaSeq)

Après le passage sur le MiSeq, si le nombre de lectures n'est pas tout à fait équilibré entre les librairies, les quantités sont réajustées et le séquençage proprement dit est réalisé sur **NovaSeq6000** (Illumina, Etas-Unis) (13). La cellule de séquençage utilisée est composée de 4 lignes et 1 seule ligne est utilisée pour le mélange d'ADN des 8 librairies.
La qPCR est utilisée dans l'objectif de mélanger les échantillons de façon à avoir une **quantité équimolaire** de chacun. Le kit utilisé est : Illumina Quantification Kit-Universal qPCR Mix (KK4824, CliniSciences, France) (12). Il est basé sur l'incorporation d'un agent **intercalant**, le SYBR Green I qui ne fluoresce que lorsqu'il est incorporé entre les bases azotées. Grâce à l'intercalant fluorescent, la qPCR permet de visualiser l'amplification en temps réel (détection de la fluorescence à chaque cycle d'amplification) et de quantifier les librairies par mesure de la fluorescence émise. Le QS6 détermine un bruit de fond et lors de la phase exponentielle, à l'intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence, il mesure la valeur du premier cycle (Threshold Cycle : cycle seuil) pour lequel la fluorescence est considérée comme supérieure au bruit de fond.

L'augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons ayant intégrée les adaptateurs P5 et P7, puisque les amorces utilisées sont spécifiques aux extrémités P5 et P7.

Les librairies sont dosées avec une quantification relative. L'interprétation des résultats passe tout d'abord par l'établissement d'une droite standard qui permet de corréler le nombre de cycles à la quantité d'amplicons générés. Elle est obtenue grâce à l'utilisation d'une gamme de 6 standards de concentrations connues (de 20 pM à 0,0002 pM) et permet de calculer l'efficacité de la qPCR pour contrôler sa qualité. Ensuite, les résultats sont normalisés avec un ADN contrôle qui a une concentration de 9 nM et une taille de 565 pb. La concentration des librairies à quantifier ne doit pas dépasser la limite de détection de l'appareil qui est de 20 nM dans un volume de 15 µL.

### 3. Pré-séquençage (MiSeq)

Afin de procéder à un séquençage permettant d'avoir le **même nombre de lectures entre échantillons**, un mélange des 8 échantillons d'ARN en quantités équimolaires a été effectué (56,25 pM de chaque échantillon). L'équimolarité est vérifiée grâce à un séquençage à Bas-Débit à l'aide du séquenceur **MiSeq** (SY-410-1003, Illumina, Etas-Unis). Le kit 300-cycle MiSeq Reagent Nano Kit v2 (MS-102-2002, Illumina, Etas-Unis) est utilisé. La cellule de séquençage du MiSeq est composée d'une seule ligne et la profondeur de lecture est de 0.3 Gb. Le volume de mélange chargé sur la cellule de séquençage est de 600 µL à une concentration de 20 pM. Ce mélange contient 1 % de PhiX (ADN du bactériophage PhiX, ayant une taille moyenne de 500 pb), un contrôle de qualité utilisé systématiquement pour valider le fonctionnement du séquençage Illumina, quel que soit le séquenceur.

### C. Séquençage Haut-Débit Illumina (NovaSeq)

Après le passage sur le MiSeq, si le nombre de lectures n'est pas tout à fait équilibré entre les librairies, les quantités sont réajustées et le séquençage proprement dit est réalisé sur **NovaSeq6000** (Illumina, Etas-Unis) (13). La cellule de séquençage utilisée est composée de 4 lignes et 1 seule ligne est utilisée pour le mélange d'ADN des 8 librairies.
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>3. Amplification totale des clusters</figcaption></figure>

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>2. Amplification des clusters par pont</figcaption></figure>

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>4. Séquençage</figcaption></figure>

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Image digitale

**Figure n°9 :** Principe du séquençage Illumina
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>3. Amplification totale des clusters</figcaption></figure>

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>2. Amplification des clusters par pont</figcaption></figure>

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>4. Séquençage</figcaption></figure>

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

**Figure n°9 : Principe du séquençage Illumina**
La longueur totale de lecture possible est de 600 Gb. Le kit utilisé est le NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit 300 cycles (Illumina, 20012866, Etas-Unis). Le volume de mélange chargé sur la cellule de séquençage est de 130 µL à une concentration de 450 pM.

→ Les ADN sont chargés sur la cellule de séquençage sur laquelle est fixée des sondes oligonucléotidiques qui vont permettre aux fragments d'ADN monocaténaires de s'hybrider par leur séquences P5 et P7 (Cf. Figure n°9).

→ Les ADN non fixés sont éliminés et les ADN hybridés sont amplifiés par PCR en pont à l'aide de nucléotides libres et d'une polymérase.

→ Les ADN bicaténaires sont ensuite dénaturés et plusieurs fragments monocaténaires, regroupés en cluster, sont obtenus.

→ La lecture des séquences commence alors et plusieurs cycles (détection de la fluorescence émise à chaque incorporation d'un nucléotide) sont réalisés afin d'obtenir une image digitale pour l'analyse des données.

Les étapes clés de ce type de séquençage sont : (i) l'incorporation de nucléotides fluorescents (bloqués en 3') et (ii) l'élimination des nucléotides non utilisés, puis (iii) la mesure de la fluorescence émise par le nucléotide incorporé et (iv) l'élimination de la molécule bloquante et fluorescente afin de permettre l'incorporation d'un nouveau nucléotide au cycle suivant. Afin d'obtenir les lectures de type 1, une centaine de cycles sont effectués grâce à l'amorçage avec Rd1 SP (Read 1 Sequence Primer) et à l'issue du séquençage du brin sens, une nouvelle série de cycles de séquençage est réalisée pour obtenir le séquençage du brin complémentaire (lectures de type 2 grâce à l'amorçage avec Rd2 SP (Read 2 Sequence Primer)). Le séquençage est réalisé en parallèle sur des milliards de fragments et les données issues du séquenceur sont enregistrées dans 2 fichiers Fastq (lectures de type 1 et lectures de type 2).

## D. Contrôle Qualité du séquençage

Avant de commencer l'analyse Bio-informatique des données de séquençage, il est nécessaire d'effectuer un **Contrôle Qualité des séquences brutes** (format « fq.gz ») issues du séquenceur. Le serveur NG6 (14) développée par la plateforme GeT-Genotoul.bioinfo a été utilisée. La plateforme GeT PlaGe réalise une pré-analyse des données de séquençage en terme de nombre de lectures et de qualité, qu'elle met à disposition sur le site NG6 (Genotoul.bioinfo). Cette analyse permet d'identifier les séquences non conformes aux pré-requis qualité de l'instrument et donne des statistiques sur : l'assignation de chaque lecture à un échantillon, le comptage des séquences de contaminants, la taille des inserts. La qualité des séquences produites visualisée sur NG6, est effectuée avec l'outil FastQC (15). Il est possible de refaire cette analyse pour obtenir d'autres informations, comme par exemple le score de qualité par séquence, le pourcentage de bases (Adénosine, Cytosine, Guanine, Thymine) contenues dans la séquence, le nombre de bases non identifiées ou encore le niveau de duplication des séquences.
La longueur totale de lecture possible est de 600 Gb. Le kit utilisé est le NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit 300 cycles (Illumina, 20012866, Etas-Unis). Le volume de mélange chargé sur la cellule de séquençage est de 130 µL à une concentration de 450 pM.

→ Les ADN sont chargés sur la cellule de séquençage sur laquelle est fixée des sondes oligonucléotidiques qui vont permettre aux fragments d'ADN monocaténaires de s'hybrider par leur séquences P5 et P7 (Cf. Figure n°9).

→ Les ADN non fixés sont éliminés et les ADN hybridés sont amplifiés par PCR en pont à l'aide de nucléotides libres et d'une polymérase.

→ Les ADN bicaténaires sont ensuite dénaturés et plusieurs fragments monocaténaires, regroupés en cluster, sont obtenus.

→ La lecture des séquences commence alors et plusieurs cycles (détection de la fluorescence émise à chaque incorporation d'un nucléotide) sont réalisés afin d'obtenir une image digitale pour l'analyse des données.

Les étapes clés de ce type de séquençage sont : (i) l'incorporation de nucléotides fluorescents (bloqués en 3') et (ii) l'élimination des nucléotides non utilisés, puis (iii) la mesure de la fluorescence émise par le nucléotide incorporé et (iv) l'élimination de la molécule bloquante et fluorescente afin de permettre l'incorporation d'un nouveau nucléotide au cycle suivant. Afin d'obtenir les lectures de type 1, une centaine de cycles sont effectués grâce à l'amorçage avec Rd1 SP (Read 1 Sequence Primer) et à l'issue du séquençage du brin sens, une nouvelle série de cycles de séquençage est réalisée pour obtenir le séquençage du brin complémentaire (lectures de type 2 grâce à l'amorçage avec Rd2 SP (Read 2 Sequence Primer)). Le séquençage est réalisé en parallèle sur des milliards de fragments et les données issues du séquenceur sont enregistrées dans 2 fichiers Fastq (lectures de type 1 et lectures de type 2).

## D. Contrôle Qualité du séquençage

Avant de commencer l'analyse Bio-informatique des données de séquençage, il est nécessaire d'effectuer un **Contrôle Qualité des séquences brutes** (format « fq.gz ») issues du séquenceur. Le serveur NG6 (14) développée par la plateforme GeT-Genotoul.bioinfo a été utilisée. La plateforme GeT PlaGe réalise une pré-analyse des données de séquençage en terme de nombre de lectures et de qualité, qu'elle met à disposition sur le site NG6 (Genotoul.bioinfo). Cette analyse permet d'identifier les séquences non conformes aux pré-requis qualité de l'instrument et donne des statistiques sur : l'assignation de chaque lecture à un échantillon, le comptage des séquences de contaminants, la taille des inserts. La qualité des séquences produites visualisée sur NG6, est effectuée avec l'outil FastQC (15). Il est possible de refaire cette analyse pour obtenir d'autres informations, comme par exemple le score de qualité par séquence, le pourcentage de bases (Adénosine, Cytosine, Guanine, Thymine) contenues dans la séquence, le nombre de bases non identifiées ou encore le niveau de duplication des séquences.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure n°10 : « Workflow » des analyses Bio-informatiques</figcaption></figure>
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure n°10 : « Workflow » des analyses Bio-informatiques**</figcaption></figure>
## 4) Analyses Bio-informatiques

Les outils Bio-informatiques ayant servi pour l'analyse des données sont utilisés pour traiter la plupart des données « omiques ». Les données Bio-informatiques ont été traitées à l'aide du cluster de calculs Genotoul Bioinformatics de Toulouse (16). Je précise que l'analyse a été réalisée sur les 20 000 premières lectures de séquences (type 1 et type 2) d'un animal (FR17MAG201001173) ayant servi de test afin de valider le « workflow » utilisé (338 291 018 séquences totales pour chaque lecture). Le « workflow » (Cf. Figure n°10) permet d'identifier les variants d'ARN dans le but de visualiser leur position sur le génome de référence (Sus Scrofa 11.1) à l'aide du logiciel IGV (Integrative Genomics Viewer) (17). Les différentes étapes du « workflow » sont :

1. Nettoyage des données brutes (format « .fq.gz ») : élimination des séquences des adaptateurs P5 et P7 mais sans enlever les indexes avec l'outil Cutadapt (18)

2. **Alignement** de l'ensemble des lectures (format « .bam ») sur le génome de référence avec l'outil STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference) (19). Afin de prendre en compte les jonctions d'épissage, l'alignement doit être réalisé 2 fois avec l'option *twopass mode* (1 : alignement de toutes les lectures sur le génome de référence ; 2 : alignement des lectures sur le génome de référence avec les jonctions d'épissage identifiées).

3. Nettoyage des lectures :

- Regrouper les lectures de type 1 et 2 dans un seul groupe avec l'option `--AddOrReplaceReadGroups` de l'outil Picard (20) pour limiter l'impact de la qualité qui est souvent moins bonne pour la seconde lecture car les fluorochromes et les réactifs s'épuisent (le séquençage débute avec le brin sens) ;

- Identifier les duplicats (séquences d'ADN identiques) avec l'option `--MarkDuplicates` de l'outil Picard pour ne garder que la meilleure lecture et les trier avec l'option `--SortSam` de l'outil Picard ;

- Eliminer les lectures qui ne s'alignent pas sur le génome de référence à cause des événements d'épissage avec l'outil GATK (Genome Analysis ToolKit) (21) en utilisant l'option `-T SplitNCigarReads` ;

- Identifier les régions nécessitant un **réalignement** (régions comportant des insertions et/ou délétions « indels ») pour obtenir la meilleure séquence consensus (la plus fréquente à chaque position d'un réalignement) avec les options `-T Realigner TargetCreator` et `-T IndelRealigner` de l'outil GATK ;

- Corriger les données pour toutes les lectures afin de re-calibrer les scores de qualité, en utilisant l'option *BaseRecalibrator* de l'outil GATK. Puis pour convertir le fichier généré en fichier « .bam », utiliser l'option *ApplyBQSR* de l'outil GATK.

4. Recherche des variants et identification des régions variables pour déterminer les différents génotypes avec l'option *HaplotypeCaller* (format « .vcf ») de l'outil GATK.

L'outil utilisé pour contrôler la qualité des séquences au cours du script est Qualimap (22). Cet outil fonctionne à partir d'un fichier « .bam » issu de l'alignement et donne différentes informations comme l'histogramme de la couverture sur le génome. Le Contrôle Qualité a été réalisé sur les étapes que sont : l'alignement et le réalignement.
4) <u>Analyses Bio-informatiques</u>

Les outils Bio-informatiques ayant servi pour l'analyse des données sont utilisés pour
traiter la plupart des données « omiques ». Les données Bio-informatiques ont été traitées à
l'aide du cluster de calculs Genotoul Bioinformatics de Toulouse (16). Je précise que l'analyse
a été réalisée sur les 20 000 premières lectures de séquences (type 1 et type 2) d'un animal
(FR17MAG201001173) ayant servi de test afin de valider le « workflow » utilisé (338 291 018
séquences totales pour chaque lecture). Le « workflow » (Cf. Figure n°10) permet d'identifier
les variants d'ARN dans le but de visualiser leur position sur le génome de référence (Sus
Scrofa 11.1) à l'aide du logiciel IGV (Integrative Genomics Viewer) (17). Les différentes étapes
du « workflow » sont :

1) Nettoyage des données brutes (format « fq.gz ») : élimination des séquences des adaptateurs P5 et P7 mais sans enlever les indexes avec l'outil Cutadapt (18)

2) **Alignement** de l'ensemble des lectures (format « .bam ») sur le génome de référence avec l'outil STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference) (19). Afin de prendre en compte les jonctions d'épissage, l'alignement doit être réalisé 2 fois avec l'option *twopass mode* (1 : alignement de toutes les lectures sur le génome de référence ; 2 : alignement des lectures sur le génome de référence avec les jonctions d'épissage identifiées).

3) Nettoyage des lectures :

- Regrouper les lectures de type 1 et 2 dans un seul groupe avec l'option --AddOrReplaceReadGroups de l'outil Picard (20) pour limiter l'impact de la qualité qui est souvent moins bonne pour la seconde lecture car les fluorochromes et les réactifs s'épuisent (le séquençage débute avec le brin sens) ;

- Identifier les duplicats (séquences d'ADN identiques) avec l'option --MarkDuplicates de l'outil Picard pour ne garder que la meilleure lecture et les trier avec l'option -- SortSam de l'outil Picard ;

- Eliminer les lectures qui ne s'alignent pas sur le génome de référence à cause des événements d'épissage avec l'outil GATK (Genome Analysis ToolKit) (21) en utilisant l'option -T SplitNCigarReads ;

- Identifier les régions nécessitant un **réalignement** (régions comportant des insertions et/ou délétions « indels ») pour obtenir la meilleure séquence consensus (la plus fréquente à chaque position d'un réalignement) avec les options -T Realigner TargetCreator et -T IndelRealigner de l'outil GATK ;

- Corriger les données pour toutes les lectures afin de re-calibrer les scores de qualité, en utilisant l'option BaseRecalibrator de l'outil GATK. Puis pour convertir le fichier généré en fichier « .bam », utiliser l'option ApplyBQSR de l'outil GATK.

4) Recherche des variants et identification des régions variables pour déterminer les différents génotypes avec l'option HaplotypeCaller (format « .vcf ») de l'outil GATK.

L'outil utilisé pour contrôler la qualité des séquences au cours du script est Qualimap (22). Cet outil fonctionne à partir d'un fichier « .bam » issu de l'alignement et donne différentes informations comme l'histogramme de la couverture sur le génome. Le Contrôle Qualité a été réalisé sur les étapes que sont : l'alignement et le réalignement.
<table><caption>Tableau n°1 : Contrôles Qualité des 8 échantillons d'ARN par spectrophotométrie et fluorométrie</caption><thead><tr><th>Animal</th><th>Père</th><th>Mère</th><th>Croisement père x mère</th><th>Sexe</th><th>Concentration obtenue par spectrophotométrie (ng/µL)</th><th>Volume (µL)</th><th>Quantité obtenue par spectrophotométrie (µg)</th><th>DO 260/DO 280</th><th>DO 260/DO 230</th><th>Concentration obtenue par fluorométrie (ng/µL)</th><th>Quantité obtenue par fluorométrie (µg)</th></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>FR17MAG200905064</td><td>FR17MAG200901131</td><td>LWxMS</td><td>Mâle</td><td>605</td><td>80</td><td>48</td><td>2,13</td><td>1,52</td><td>958</td><td>77</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>FR17MAG200905064</td><td>FR17MAG200901131</td><td>LWxMS</td><td>Femelle</td><td>401</td><td>80</td><td>32</td><td>2,14</td><td>1,37</td><td>558</td><td>45</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>FR17MAG200905119</td><td>FR17MAG200905910</td><td>LWxMS</td><td>Mâle</td><td>723</td><td>80</td><td>58</td><td>2,09</td><td>1,59</td><td>816</td><td>65</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>FR17MAG200905119</td><td>FR17MAG200905910</td><td>LWxMS</td><td>Femelle</td><td>653</td><td>80</td><td>52</td><td>2,09</td><td>1,61</td><td>792</td><td>63</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>FR17MAG200905540</td><td>FR17MAG200905191</td><td>MSxLW</td><td>Femelle</td><td>653</td><td>80</td><td>52</td><td>2,1</td><td>1,59</td><td>792</td><td>63</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>FR17MAG200905540</td><td>FR17MAG200905191</td><td>MSxLW</td><td>Mâle</td><td>318</td><td>80</td><td>25</td><td>2,14</td><td>1,23</td><td>528</td><td>42</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>FR17MAG200904198</td><td>FR17MAG200905223</td><td>MSxLW</td><td>Mâle</td><td>1411</td><td>80</td><td>113</td><td>2,13</td><td>1,88</td><td>1260</td><td>101</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>FR17MAG200904198</td><td>FR17MAG200905223</td><td>MSxLW</td><td>Femelle</td><td>954</td><td>80</td><td>76</td><td>2,06</td><td>1,68</td><td>902</td><td>72</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Tableau n°1 : Contrôles Qualité des 8 échantillons d'ARN par spectrophotométrie et fluorométrie</caption><thead><tr><td>Animal</td><td>Père</td><td>Mère</td><td>Croisement père x mère</td><td>Sexe</td><td>Concentration obtenue par spectrophotométrie (ng/µL)</td><td>Volume (µL)</td><td>Quantité obtenue par spectrophotométrie (µg)</td><td>DO 260/DO 280</td><td>DO 260/DO 230</td><td>Concentration obtenue par fluorométrie (ng/µL)</td><td>Quantité obtenue par fluorométrie (µg)</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>FR17MAG200905064</td><td>FR17MAG200901131</td><td>LWxMS</td><td>Mâle</td><td>605</td><td>80</td><td>48</td><td>2,13</td><td>1,52</td><td>958</td><td>77</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>FR17MAG200905064</td><td>FR17MAG200901131</td><td>LWxMS</td><td>Femelle</td><td>401</td><td>80</td><td>32</td><td>2,14</td><td>1,37</td><td>558</td><td>45</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>FR17MAG200905119</td><td>FR17MAG200905910</td><td>LWxMS</td><td>Mâle</td><td>723</td><td>80</td><td>58</td><td>2,09</td><td>1,59</td><td>816</td><td>65</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>FR17MAG200905119</td><td>FR17MAG200905910</td><td>LWxMS</td><td>Femelle</td><td>653</td><td>80</td><td>52</td><td>2,09</td><td>1,61</td><td>792</td><td>63</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>FR17MAG200905540</td><td>FR17MAG200905191</td><td>MSxLW</td><td>Femelle</td><td>653</td><td>80</td><td>52</td><td>2,1</td><td>1,59</td><td>792</td><td>63</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>FR17MAG200905540</td><td>FR17MAG200905191</td><td>MSxLW</td><td>Mâle</td><td>318</td><td>80</td><td>25</td><td>2,14</td><td>1,23</td><td>528</td><td>42</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>FR17MAG200904198</td><td>FR17MAG200905223</td><td>MSxLW</td><td>Mâle</td><td>1411</td><td>80</td><td>113</td><td>2,13</td><td>1,88</td><td>1260</td><td>101</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>FR17MAG200904198</td><td>FR17MAG200905223</td><td>MSxLW</td><td>Femelle</td><td>954</td><td>80</td><td>76</td><td>2,06</td><td>1,68</td><td>902</td><td>72</td></tr></tbody></table>
## II. RESULTATS

### 1) Contrôles Qualité de l'ARN

#### A. Spectrophotométrie et fluorométrie

A mon arrivée au laboratoire, les ARN des 8 descendants avaient déjà été extraits car ils avaient été utilisés pour un autre projet de recherche. Je me suis donc assurée qu'ils étaient toujours utilisables pour le projet Pré-PIPETTE, et qu'ils remplissaient les critères requis pour le séquençage NGS.

Pour chaque ARN, j'ai déterminé la concentration à l'aide du Nanodrop, ainsi que les rapports DO 260/ DO 280 et DO 260/ DO 230 (Cf. Tableau n°1).

Les concentrations lues par spectrophotométrie varient entre 318 ng/µL et 1411 ng/µL et sachant que le volume est de 80 µL, les quantités (32 µg et 113 µg) sont suffisantes car seulement 2 µg sont requis. Les rapports de DO 260/ DO 280 sont entre 2,06 et 2,14. Sachant que les rapports optimaux sont compris entre 1.8 et 2,2 les résultats sont satisfaisants en terme de contamination protéique. Les rapports de DO 260/ DO 230 varient entre 1,23 et 1,88. Les résultats sont faibles comparé à l'optimal qui est de 2, ce qui signifie qu'il reste des traces de sels.

Malgré que les rapports de DO 260/ DO 230 soient faibles, les 8 ARNm extraits sont quantitativement et qualitativement utilisables pour la suite des manipulations.

J'ai ensuite effectué une quantification plus précise par fluorométrie. Les concentrations obtenues varient entre 528 ng/µL et 1260 ng/µL. Elles sont légèrement supérieures aux concentrations obtenues par spectrophotométrie.

Il est plus courant cependant d'obtenir des concentrations par spectrophotométrie supérieures à celles obtenues par fluorométrie, car le spectrophotomètre dose aussi les contaminants. De ce fait, j'ai procédé à un 2^nd^ dosage par fluorométrie qui m'a permis de valider les concentrations. Je n'ai toutefois pas re-dosé les échantillons par spectrophotométrie, car les concentrations utilisées par la suite sont celles issues du dosage par fluorométrie.

Les pré-requis pour la préparation de librairies étant de 2 µg dans un volume de 50 µL, un aliquot de chaque échantillon prélevé est dilué à partir de la concentration obtenue par fluorométrie.

Les échantillons d'ARN ont ensuite été traités sur la plateforme GeT PlaGe car le l'Unité GenPhySE ne dispose pas des technologies de séquençage NGS (différentes en fonction des applications et maintenance très couteuses notamment pour une utilisation occasionnelle).
## II. RESULTATS

### 1) Contrôles Qualité de l'ARN

#### A. Spectrophotométrie et fluorométrie

A mon arrivée au laboratoire, les ARN des 8 descendants avaient déjà été extraits car ils avaient été utilisés pour un autre projet de recherche. Je me suis donc assurée qu'ils étaient toujours utilisables pour le projet Pré-PIPETTE, et qu'ils remplissaient les critères requis pour le séquençage NGS.

Pour chaque ARN, j'ai déterminé la concentration à l'aide du Nanodrop, ainsi que les rapports DO 260/ DO 280 et DO 260/ DO 230 (Cf. Tableau n°1).

Les concentrations lues par spectrophotométrie varient entre 318 ng/µL et 1411 ng/µL et sachant que le volume est de 80 µL, les quantités (32 µg et 113 µg) sont suffisantes car seulement 2 µg sont requis. Les rapports de DO 260/ DO 280 sont entre 2,06 et 2,14. Sachant que les rapports optimaux sont compris entre 1.8 et 2,2 les résultats sont satisfaisants en terme de contamination protéique. Les rapports de DO 260/ DO 230 varient entre 1,23 et 1,88. Les résultats sont faibles comparé à l'optimal qui est de 2, ce qui signifie qu'il reste des traces de sels.

Malgré que les rapports de DO 260/ DO 230 soient faibles, les 8 ARNm extraits sont quantitativement et qualitativement utilisables pour la suite des manipulations.

J'ai ensuite effectué une quantification plus précise par fluorométrie. Les concentrations obtenues varient entre 528 ng/µL et 1260 ng/µL. Elles sont légèrement supérieures aux concentrations obtenues par spectrophotométrie.

Il est plus courant cependant d'obtenir des concentrations par spectrophotométrie supérieures à celles obtenues par fluorométrie, car le spectrophotomètre dose aussi les contaminants. De ce fait, j'ai procédé à un 2^nd^ dosage par fluorométrie qui m'a permis de valider les concentrations. Je n'ai toutefois pas re-dosé les échantillons par spectrophotométrie, car les concentrations utilisées par la suite sont celles issues du dosage par fluorométrie.

Les pré-requis pour la préparation de librairies étant de 2 µg dans un volume de 50 µL, un aliquot de chaque échantillon prélevé est dilué à partir de la concentration obtenue par fluorométrie.

Les échantillons d'ARN ont ensuite été traités sur la plateforme GeT PlaGe car le l'Unité GenPhySE ne dispose pas des technologies de séquençage NGS (différentes en fonction des applications et maintenance très couteuses notamment pour une utilisation occasionnelle).
<figure><img src="image_34.png" /></figure>
<figure><img src="image_32.png" /></figure>
a

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure n°11a-b:** (a) Image du gel et (b) Profils des 8 échantillons d'ARN obtenus par électrophorèse sur Fragment Analyzer (Standard Sensitivity RNA Analysis Kit, 15nt)</figcaption></figure>
a

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure n°11a-b:** (a) Image du gel et (b) Profils des 8 échantillons d'ARN obtenus par électrophorèse sur Fragment Analyzer (Standard Sensitivity RNA Analysis Kit, 15nt)</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau n°2 : Contrôle Qualité des 8 échantillons d'ARN par électrophorèse sur Fragment Analyzer (Standard Sensitivity RNA Analysis Kit, 15nt)</caption><thead><tr><td>Animal</td><td>RNA Quality Number (RQN)</td><td>Rapport 28S/18S</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>8,9</td><td>1,5</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>9,5</td><td>1,3</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>9,2</td><td>1,7</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>9</td><td>1,8</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>9,4</td><td>1,9</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>9,4</td><td>1,3</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>8,9</td><td>1,1</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>8,9</td><td>1,3</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Tableau n°2 : Contrôle Qualité des 8 échantillons d'ARN par électrophorèse sur Fragment Analyzer (Standard Sensitivity RNA Analysis Kit, 15nt)</caption><thead><tr><td>Animal</td><td>RNA Quality Number (RQN)</td><td>Rapport 28S/18S</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>8,9</td><td>1,5</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>9,5</td><td>1,3</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>9,2</td><td>1,7</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>9</td><td>1,8</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>9,4</td><td>1,9</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>9,4</td><td>1,3</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>8,9</td><td>1,1</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>8,9</td><td>1,3</td></tr></tbody></table>
## B. Electrophorèse

Après dosages spectrophotométrique et fluorométrique, un Contrôle Qualité de l’intégrité des ARN est effectué par électrophorèse sur Fragment Analyzer.

Les profils obtenus sur l'image du gel issu de l'électrophorèse sont identiques pour les échantillons d'ARN des 8 animaux (Cf. Figure n°11a-b), avec 2 principales bandes. Ces 2 bandes représentent les 2 sous-unités de l'ARNr (Acide Ribonucléique ribosomique) des eucaryotes. Les ARN des cellules eucaryotes sont majoritairement (90 % à 98 %) des ARNr et ils sont utilisés afin de vérifier la qualité des ARN totaux. La bande positionnée entre 1500 nucléotides (nt) et 3000 nt, correspond à la petite sous-unité (18S) qui comporte 1869 nt. La bande positionnée entre 5000 nt et 6000 nt, correspond à la grande sous-unité (28S) qui comporte 5070 nt.

La dégradation de l'ARN est vérifiée avec le RQN, qui doit être proche de 10 (Cf. Tableau n°2). Le RQN utilise des algorithmes qui prennent en compte la proportion entre les sous unités ainsi que d'autres caractéristiques électrophorétiques. Les RQN obtenus sont entre 8,9 et 9,5 ce qui signifie que les ARN sont de bonne qualité.

La qualité est aussi vérifiée grâce au rapport 28S/18S qui évalue la proportion de chaque sous unité. Les rapports 28S/18S obtenus sont entre 1,1 et 1,9. Le rapport optimal est entre 1,3 et 2. Les rapports sont tous corrects, sauf celui de l'animal FR17MAG201005771 qui est à 1,1. Ce rapport est toutefois proche de 1,3 et le RQN correspondant est élevé, ce qui signifie que l'ARN de cet animal reste de qualité acceptable.

La qualité des extractions est validée.

Les 8 échantillons d'ARN sont utilisables pour poursuivre les expérimentations et ainsi construire les librairies pour le séquençage Haut-Débit.
## B. Electrophorèse

Après dosages spectrophotométrique et fluorométrique, un Contrôle Qualité de l’intégrité des ARN est effectué par électrophorèse sur Fragment Analyzer.

Les profils obtenus sur l'image du gel issu de l'électrophorèse sont identiques pour les échantillons d'ARN des 8 animaux (Cf. Figure n°11a-b), avec 2 principales bandes. Ces 2 bandes représentent les 2 sous-unités de l'ARNr (Acide Ribonucléique ribosomique) des eucaryotes. Les ARN des cellules eucaryotes sont majoritairement (90 % à 98 %) des ARNr et ils sont utilisés afin de vérifier la qualité des ARN totaux. La bande positionnée entre 1500 nucléotides (nt) et 3000 nt, correspond à la petite sous-unité (18S) qui comporte 1869 nt. La bande positionnée entre 5000 nt et 6000 nt, correspond à la grande sous-unité (28S) qui comporte 5070 nt.

La dégradation de l'ARN est vérifiée avec le RQN, qui doit être proche de 10 (Cf. Tableau n°2). Le RQN utilise des algorithmes qui prennent en compte la proportion entre les sous unités ainsi que d'autres caractéristiques électrophorétiques. Les RQN obtenus sont entre 8,9 et 9,5 ce qui signifie que les ARN sont de bonne qualité.

La qualité est aussi vérifiée grâce au rapport 28S/18S qui évalue la proportion de chaque sous unité. Les rapports 28S/18S obtenus sont entre 1,1 et 1,9. Le rapport optimal est entre 1,3 et 2. Les rapports sont tous corrects, sauf celui de l'animal FR17MAG201005771 qui est à 1,1. Ce rapport est toutefois proche de 1,3 et le RQN correspondant est élevé, ce qui signifie que l'ARN de cet animal reste de qualité acceptable.

La qualité des extractions est validée.

Les 8 échantillons d'ARN sont utilisables pour poursuivre les expérimentations et ainsi construire les librairies pour le séquençage Haut-Débit.
<figure><img src="image_37.png" /></figure>
<figure><img src="image_35.png" /></figure>
a

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Figure n°12a-b : (a) Image du gel et (b) Protils des 8 librairies obtenus par électrophorèse sur Fragment Analyzer (High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit DNF-474)
a

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Figure n°12a-b : (a) Image du gel et (b) Protils des 8 librairies obtenus par électrophorèse sur Fragment Analyzer (High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit DNF-474)
Tableaux n°3a-b: Contrôle Qualité par qPCR (a) des 8 librairies diluées et (b) du mélange des 8 librairies diluées

a

<table><thead><tr><td>Animal</td><td>Taille librairie (pb)</td><td>Concentration librairie estimée par la 2ème qPCR (nM)</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>444</td><td>26,36</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>457</td><td>16,80</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>450</td><td>18,08</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>460</td><td>19,12</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>484</td><td>16,02</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>464</td><td>17,24</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>452</td><td>11,24</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>457</td><td>23,38</td></tr></tbody></table>

b

<table><thead><tr><td>Taille moyenne du mélange des 8 librairies (pb)</td><td>Concentration du mélange des 8 librairies estimée par la 3ème qPCR (nM)</td><td>Concentration du mélange des 8 librairies estimée par la 4ème qPCR (nM) après réajustement</td><td>Volume final du mélange des 8 librairies (µL)</td><td>Concentration finale théorique du mélange des 8 librairies (nM)</td></tr></thead><tbody><tr><td>458,50</td><td>27,68</td><td>19,00</td><td>32,01</td><td>17,50</td></tr></tbody></table>
Tableaux n°3a-b: Contrôle Qualité par qPCR (a) des 8 librairies diluées et (b) du mélange des 8 librairies diluées

a

<table><thead><tr><td>Animal</td><td>Taille librairie (pb)</td><td>Concentration librairie estimée par la 2ème qPCR (nM)</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173</td><td>444</td><td>26,36</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184</td><td>457</td><td>16,80</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309</td><td>450</td><td>18,08</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318</td><td>460</td><td>19,12</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743</td><td>484</td><td>16,02</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748</td><td>464</td><td>17,24</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771</td><td>452</td><td>11,24</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773</td><td>457</td><td>23,38</td></tr></tbody></table>

b

<table><thead><tr><td>Taille moyenne du mélange des 8 librairies (pb)</td><td>Concentration du mélange des 8 librairies estimée par la 3ème qPCR (nM)</td><td>Concentration du mélange des 8 librairies estimée par la 4ème qPCR (nM) après réajustement</td><td>Volume final du mélange des 8 librairies (µL)</td><td>Concentration finale théorique du mélange des 8 librairies (nM)</td></tr></thead><tbody><tr><td>458,50</td><td>27,68</td><td>19,00</td><td>32,01</td><td>17,50</td></tr></tbody></table>
## 2) Contrôles Qualité des libraires

### A. Electrophorèse

Après construction des librairies, la qualité est vérifiée par électrophorèse. La taille des fragments attendue pour des librairies NGS est d'environ 450 nt, car elle comprend la taille de l'insert (entre 120 b et 210 b) et celle des 2 adaptateurs (34 b + 58 b) qui se sont intégrés aux 2 extrémités.

Les profils obtenus sur l'image du gel issue de l'électrophorèse sont identiques pour les 8 librairies (Cf. Figure n°12a-b), avec un large pic principal sur le graphique entre 300 nt et 700 nt. Les tailles des librairies obtenues sont conformes à la taille attendue.

De plus, il n'y a pas de dimères d'amorces et/ou d'adaptateurs (aucun pic n'est présent entre 1 nt et 200 nt) ce qui signifie que les étapes de purification des librairies ont donc bien fonctionné.

Ces 2 critères ont permis de valider la qualité des librairies pour le séquençage NGS.

### B. PCR quantitative

Après vérification de la qualité des librairies, il est nécessaire de les quantifier précisément.

Afin d'avoir le même nombre de lectures de séquençage pour chaque animal, il est essentiel d'équilibrer le mélange des 8 librairies en quantité équivalente. La quantification des librairies est réalisée par qPCR, car elle permet de quantifier les amplicons (fragments d'ADN définis par un couple d'amorces) (Cf. Tableaux n°3a-b).

Une 1ère qPCR est réalisée tout d'abord pour être sûr que la dilution de chaque librairie ait une concentration comprise entre 5 nM et 27 nM (valeurs définies par la plateforme GeT PlaGe).

Certaines librairies ont été re-diluées lorsqu'elles étaient trop concentrées (> 27 nM). Une 2ème qPCR est réalisée pour valider les dilutions effectuées. Les concentrations des librairies obtenues varient entre 11,24 nM et 26,36 nM, elles sont acceptables pour procéder au mélange des 8 librairies avant séquençage.

Le mélange des 8 librairies est possible, car lors de leur construction, des indexes (situés sur les adaptateurs) permettent d'identifier chaque séquence avec un code barre unique.

Dans le mélange, les 8 librairies doivent être en quantités équimolaires afin que chacune d'elle ait le même nombre de lectures lors du séquençage. Une 3ème qPCR est effectuée pour vérifier l'équimolarité du mélange. La concentration du mélange des 8 librairies est de 27,68 nM. Elle est supérieure à la concentration théorique attendue qui est de 17,5 nM.
## 2) Contrôles Qualité des libraires

### A. Electrophorèse

Après construction des librairies, la qualité est vérifiée par électrophorèse. La taille des fragments attendue pour des librairies NGS est d'environ 450 nt, car elle comprend la taille de l'insert (entre 120 b et 210 b) et celle des 2 adaptateurs (34 b + 58 b) qui se sont intégrés aux 2 extrémités.

Les profils obtenus sur l'image du gel issue de l'électrophorèse sont identiques pour les 8 librairies (Cf. Figure n°12a-b), avec un large pic principal sur le graphique entre 300 nt et 700 nt. Les tailles des librairies obtenues sont conformes à la taille attendue.

De plus, il n'y a pas de dimères d'amorces et/ou d'adaptateurs (aucun pic n'est présent entre 1 nt et 200 nt) ce qui signifie que les étapes de purification des librairies ont donc bien fonctionné.

Ces 2 critères ont permis de valider la qualité des librairies pour le séquençage NGS.

### B. PCR quantitative

Après vérification de la qualité des librairies, il est nécessaire de les quantifier précisément.

Afin d'avoir le même nombre de lectures de séquençage pour chaque animal, il est essentiel d'équilibrer le mélange des 8 librairies en quantité équivalente. La quantification des librairies est réalisée par qPCR, car elle permet de quantifier les amplicons (fragments d'ADN définis par un couple d'amorces) (Cf. Tableaux n°3a-b).

Une 1ère qPCR est réalisée tout d'abord pour être sûr que la dilution de chaque librairie ait une concentration comprise entre 5 nM et 27 nM (valeurs définies par la plateforme GeT PlaGe).

Certaines librairies ont été re-diluées lorsqu'elles étaient trop concentrées (> 27 nM). Une 2ème qPCR est réalisée pour valider les dilutions effectuées. Les concentrations des librairies obtenues varient entre 11,24 nM et 26,36 nM, elles sont acceptables pour procéder au mélange des 8 librairies avant séquençage.

Le mélange des 8 librairies est possible, car lors de leur construction, des indexes (situés sur les adaptateurs) permettent d'identifier chaque séquence avec un code barre unique.

Dans le mélange, les 8 librairies doivent être en quantités équimolaires afin que chacune d'elle ait le même nombre de lectures lors du séquençage. Une 3ème qPCR est effectuée pour vérifier l'équimolarité du mélange. La concentration du mélange des 8 librairies est de 27,68 nM. Elle est supérieure à la concentration théorique attendue qui est de 17,5 nM.
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

<table><thead><tr><th>Animal</th><th>Nombre de séquences</th><th>Lecture (pb)</th><th>Qualité</th></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173 (R1)</td><td>94 756</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001173 (R2)</td><td>94 756</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R1)</td><td>134 614</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R2)</td><td>134 614</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R1)</td><td>101 292</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R2)</td><td>101 292</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R1)</td><td>111 188</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R2)</td><td>111 188</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R1)</td><td>100 536</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R2)</td><td>100 536</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R1)</td><td>103 946</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R2)</td><td>103 946</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R1)</td><td>121 637</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R2)</td><td>121 637</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R1)</td><td>111 721</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R2)</td><td>111 721</td><td>150</td><td>PASS</td></tr></tbody></table>

Figure n°13a-b : Résultats de pré-séquençage MiSeq issus de NG6 (a) du mélange des 8 librairies et (b) pour chaque librairie
<figure><img src="image_38.png" /></figure>

<table><thead><tr><th>Animal</th><th>Nombre de séquences</th><th>Lecture (pb)</th><th>Qualité</th></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173 (R1)</td><td>94 756</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001173 (R2)</td><td>94 756</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R1)</td><td>134 614</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R2)</td><td>134 614</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R1)</td><td>101 292</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R2)</td><td>101 292</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R1)</td><td>111 188</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R2)</td><td>111 188</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R1)</td><td>100 536</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R2)</td><td>100 536</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R1)</td><td>103 946</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R2)</td><td>103 946</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R1)</td><td>121 637</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R2)</td><td>121 637</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R1)</td><td>111 721</td><td>150</td><td>PASS</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R2)</td><td>111 721</td><td>150</td><td>PASS</td></tr></tbody></table>

**Figure n°13a-b :** Résultats de pré-séquençage MiSeq issus de NG6 (a) du mélange des 8 librairies et (b) pour chaque librairie
Les volumes ont donc été réajustés afin d'avoir une quantité équimolaire de chaque échantillon. Une 4ème qPCR a permis de quantifier le mélange après réajustement des volumes et la concentration obtenue est de 19 nM.

La concentration du mélange des 8 librairies (19 nM) est proche de la concentration théorique attendue (17,5 nM), ce qui signifie que le mélange est équimolaire.

Le mélange équimolaire des 8 librairies à une concentration de 19 nM peut être utilisé pour un pré-séquençage sur le MiSeq.

### C. Pré-séquençage

Après un séquençage sur une ligne de MiSeq, une analyse de la qualité des séquences est effectuée par la base de données NG6 qui fournit des valeurs de séquençage sur le mélange des 8 librairies et sur chacune des librairies (Cf. Figure n°13a-b).

Les spécificités d'un séquençage MiSeq en paires avec le kit utilisé sont : 0.3 Gb (Nombre de Gb = nombre de lectures x longueur des lectures) pour 1 ligne et 2 x 150 b pour 2 lectures.

La longueur totale des séquences sur la ligne pour l'ensemble des librairies est de 0,264 Gb. La longueur totale maximale des séquences indiquée dans les spécificités du kit est de 0,3 Gb. Il est peu courant d'atteindre la valeur maximale spécifiée par le kit, ce qui signifie que la valeur obtenue est convenable. Le nombre de séquences totales produites est de 1 759 380. Le nombre maximal de séquences spécifié par le kit est de 2 000 000 séquences totales ((300 000 000 x 1) / 150 = 2 000 000 séquences totales). Sachant que les spécificités fournisseur sont rarement atteintes, le nombre de séquences du mélange est donc correct.

Après avoir validé l'ensemble des lectures de la ligne de séquençage, les lectures de chaque animal sont vérifiées. Le nombre de séquences lues est identique entre les lectures de type 1 et 2. Le nombre de séquences observé varie entre (94 756) x 2 et (134 614) x 2. Lorsque les 8 librairies sont mélangées, le nombre de séquences en paires (lectures de type 1 et lectures de type 2) attendues par librairie dans des conditions optimales de séquençage est de 250 000 (2 000 000 / 8 = 250 000 séquences par librairie) pour les 2 types de lectures, soit environ 125 000 pour chaque type de lecture. Il y a moins de séquences pour les librairies des animaux FR17MAG201001173, FR17MAG201001309, FR17MAG201005743 et FR17MAG201005748. Bien que les précautions nécessaires aient été prises au préalable pour le mélange des 8 librairies, ces résultats suggèrent que le mélange n'est pas tout à fait en quantités équimolaires. Les volumes de ces 4 librairies ont donc été ajustés afin d'avoir un mélange équimolaire.

Le filtre qualité est caractérisé comme « PASS », ce qui signifie que le Contrôle Qualité est acceptable. Le pré-séquençage est donc de bonne qualité.

De plus, il a permis d'ajuster encore certains volumes dans le mélange afin d'optimiser un nombre de lectures équivalent entre les 8 librairies lors du séquençage complet.
Les volumes ont donc été réajustés afin d'avoir une quantité équimolaire de chaque échantillon. Une 4ème qPCR a permis de quantifier le mélange après réajustement des volumes et la concentration obtenue est de 19 nM.

La concentration du mélange des 8 librairies (19 nM) est proche de la concentration théorique attendue (17,5 nM), ce qui signifie que le mélange est équimolaire.

Le mélange équimolaire des 8 librairies à une concentration de 19 nM peut être utilisé pour un pré-séquençage sur le MiSeq.

### C. Pré-séquençage

Après un séquençage sur une ligne de MiSeq, une analyse de la qualité des séquences est effectuée par la base de données NG6 qui fournit des valeurs de séquençage sur le mélange des 8 librairies et sur chacune des librairies (Cf. Figure n°13a-b).

Les spécificités d'un séquençage MiSeq en paires avec le kit utilisé sont : 0.3 Gb (Nombre de Gb = nombre de lectures x longueur des lectures) pour 1 ligne et 2 x 150 b pour 2 lectures.

La longueur totale des séquences sur la ligne pour l'ensemble des librairies est de 0,264 Gb. La longueur totale maximale des séquences indiquée dans les spécificités du kit est de 0,3 Gb. Il est peu courant d'atteindre la valeur maximale spécifiée par le kit, ce qui signifie que la valeur obtenue est convenable. Le nombre de séquences totales produites est de 1 759 380. Le nombre maximal de séquences spécifié par le kit est de 2 000 000 séquences totales ((300 000 000 x 1) / 150 = 2 000 000 séquences totales). Sachant que les spécificités fournisseur sont rarement atteintes, le nombre de séquences du mélange est donc correct.

Après avoir validé l'ensemble des lectures de la ligne de séquençage, les lectures de chaque animal sont vérifiées. Le nombre de séquences lues est identique entre les lectures de type 1 et 2. Le nombre de séquences observé varie entre (94 756) x 2 et (134 614) x 2. Lorsque les 8 librairies sont mélangées, le nombre de séquences en paires (lectures de type 1 et lectures de type 2) attendues par librairie dans des conditions optimales de séquençage est de 250 000 (2 000 000 / 8 = 250 000 séquences par librairie) pour les 2 types de lectures, soit environ 125 000 pour chaque type de lecture. Il y a moins de séquences pour les librairies des animaux FR17MAG201001173, FR17MAG201001309, FR17MAG201005743 et FR17MAG201005748. Bien que les précautions nécessaires aient été prises au préalable pour le mélange des 8 librairies, ces résultats suggèrent que le mélange n'est pas tout à fait en quantités équimolaires. Les volumes de ces 4 librairies ont donc été ajustés afin d'avoir un mélange équimolaire.

Le filtre qualité est caractérisé comme « PASS », ce qui signifie que le Contrôle Qualité est acceptable. Le pré-séquençage est donc de bonne qualité.

De plus, il a permis d'ajuster encore certains volumes dans le mélange afin d'optimiser un nombre de lectures équivalent entre les 8 librairies lors du séquençage complet.
a

Adapter type : Illumina - Insert : 329pb for Sample FR17MAG201005748, 309pb for Sample FR17MAG201001173, 317pb for Sample FR17MAG201005771, 315pb for Sample FR17MAG201001309, 322pb for Sample FR17MAG201005773, 322pb for Sample FR17MAG201001184, 325pb for Sample FR17MAG201001318, 349pb for Sample FR17MAG201005743. [C] 450.0pM

> Project name: prePIPETTE

> Date: 19/03/19

> Species: PORC

> Type: 1/4 Flowcell A - Lane2

> Data nature: RNA-Stranded

> Number of sequences: 4 852 857 166

> Full sequences length: 727 928 574 900

> Sequencer: NovaSeq6000-A00318

b

<table><thead><tr><td>Animal</td><td>Nombre de séquences</td><td>Lecture (pb)</td><td>Qualité</td><td>Séquences surreprésentées</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173 (R1)</td><td>338 291 018</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001173 (R2)</td><td>338 291 018</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R1)</td><td>322 127 347</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R2)</td><td>322 127 347</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R1)</td><td>281 811 857</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R2)</td><td>281 811 857</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R1)</td><td>275 106 032</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R2)</td><td>275 106 032</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R1)</td><td>296 568 238</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R2)</td><td>296 568 238</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R1)</td><td>288 543 377</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R2)</td><td>288 543 377</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R1)</td><td>308 994 437</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R2)</td><td>308 994 437</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R1)</td><td>314 986 277</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R2)</td><td>314 986 277</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr></tbody></table>

Figure n°14a-b : Résultats de séquençage NovaSeq issus de NG6 (a) du mélange des 8 librairies et (b) pour chaque librairie
a

Adapter type : Illumina - Insert : 329pb for Sample FR17MAG201005748, 309pb for Sample FR17MAG201001173, 317pb for Sample FR17MAG201005771, 315pb for Sample FR17MAG201001309, 322pb for Sample FR17MAG201005773, 322pb for Sample FR17MAG201001184, 325pb for Sample FR17MAG201001318, 349pb for Sample FR17MAG201005743. [C] 450.0pM

> Project name: prePIPETTE

> Date: 19/03/19

> Species: PORC

> Type: 1/4 Flowcell A - Lane2

> Data nature: RNA-Stranded

> Number of sequences: 4 852 857 166

> Full sequences length: 727 928 574 900

> Sequencer: NovaSeq6000-A00318

b

<table><thead><tr><td>Animal</td><td>Nombre de séquences</td><td>Lecture (pb)</td><td>Qualité</td><td>Séquences surreprésentées</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR17MAG201001173 (R1)</td><td>338 291 018</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001173 (R2)</td><td>338 291 018</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R1)</td><td>322 127 347</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001184 (R2)</td><td>322 127 347</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R1)</td><td>281 811 857</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001309 (R2)</td><td>281 811 857</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R1)</td><td>275 106 032</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201001318 (R2)</td><td>275 106 032</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R1)</td><td>296 568 238</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005743 (R2)</td><td>296 568 238</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R1)</td><td>288 543 377</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005748 (R2)</td><td>288 543 377</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R1)</td><td>308 994 437</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005771 (R2)</td><td>308 994 437</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R1)</td><td>314 986 277</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr><tr><td>FR17MAG201005773 (R2)</td><td>314 986 277</td><td>150</td><td>PASS</td><td>FAIL</td></tr></tbody></table>

Figure n°14a-b : Résultats de séquençage NovaSeq issus de NG6 (a) du mélange des 8 librairies et (b) pour chaque librairie
### 3) Contrôle Qualité du séquençage

Après séquençage Haut-Débit des 8 librairies, une analyse de la qualité des séquences est également effectuée par la plateforme GeT PlaGe. Les résultats de qualité sont mis à disposition sur le serveur NG6 (Cf. Figure n°14a-b).

Les spécificités du séquençage en paires appliqué avec le kit utilisé sont : 600 Gb pour 1 ligne et 2 x 150 b pour 2 lectures.

La longueur totale des séquences sur la ligne pour l'ensemble des librairies est de 728 Gb. La longueur totale maximale des séquences indiquée dans les spécificités du kit est de 600 Gb, ce qui signifie que le séquençage a très bien fonctionné. Le nombre de séquences totales produites est de 4 852 857 166. Le nombre maximal de séquences totales spécifié par le kit est de 4 000 000 000 ((600 000 000 000 x 1) / 150 = 4 000 000 000 séquences totales). Le séquençage est donc optimal, car il est rare d'obtenir plus de séquences totales que le nombre attendu.

Après avoir validé l'ensemble des lectures de la ligne de séquençage, les lectures de chaque animal sont vérifiées. Les données brutes montrent que le nombre de séquences lues est identique entre les lectures de type 1 et 2. De plus, le nombre de séquences est quasiment identique entre les librairies, car il varie entre (275 106 032) x 2 et (338 291 018) x 2. Lorsque les 8 librairies sont mélangées, le nombre de séquences en paires attendues par librairie dans des conditions de séquençage optimales est de 500 000 000 (4 000 000 000 / 8 = 500 000 000 séquences par librairie) pour les 2 types de lectures, soit environ 250 000 000 pour chaque type de lectures. Le nombre de séquences obtenu par librairie est supérieur à celui spécifié par le kit.

Le filtre qualité est caractérisé comme « PASS », ce qui signifie que le Contrôle Qualité est acceptable. J'observe que le filtre des séquences surreprésentées est caractérisé comme « FAIL », ce qui signifie qu'il y a beaucoup de lectures de mêmes séquences. Sachant que dans le sang, 80% des ARNm sont des ARNm d'hémoglobine, il est fort probable que les séquences surreprésentées correspondent aux séquences d'hémoglobine. Le résultat obtenu est donc cohérant.

Le séquençage est de bonne qualité. Par ailleurs, il y a plus de lectures par librairie que ce qui est indiqué par les spécificités du fournisseur. Cela indique que le séquençage des 8 transcriptomes a très bien fonctionné.
### 3) Contrôle Qualité du séquençage

Après séquençage Haut-Débit des 8 librairies, une analyse de la qualité des séquences est également effectuée par la plateforme GeT PlaGe. Les résultats de qualité sont mis à disposition sur le serveur NG6 (Cf. Figure n°14a-b).

Les spécificités du séquençage en paires appliqué avec le kit utilisé sont : 600 Gb pour 1 ligne et 2 x 150 b pour 2 lectures.

La longueur totale des séquences sur la ligne pour l'ensemble des librairies est de 728 Gb. La longueur totale maximale des séquences indiquée dans les spécificités du kit est de 600 Gb, ce qui signifie que le séquençage a très bien fonctionné. Le nombre de séquences totales produites est de 4 852 857 166. Le nombre maximal de séquences totales spécifié par le kit est de 4 000 000 000 ((600 000 000 000 x 1) / 150 = 4 000 000 000 séquences totales). Le séquençage est donc optimal, car il est rare d'obtenir plus de séquences totales que le nombre attendu.

Après avoir validé l'ensemble des lectures de la ligne de séquençage, les lectures de chaque animal sont vérifiées. Les données brutes montrent que le nombre de séquences lues est identique entre les lectures de type 1 et 2. De plus, le nombre de séquences est quasiment identique entre les librairies, car il varie entre (275 106 032) x 2 et (338 291 018) x 2. Lorsque les 8 librairies sont mélangées, le nombre de séquences en paires attendues par librairie dans des conditions de séquençage optimales est de 500 000 000 (4 000 000 000 / 8 = 500 000 000 séquences par librairie) pour les 2 types de lectures, soit environ 250 000 000 pour chaque type de lectures. Le nombre de séquences obtenu par librairie est supérieur à celui spécifié par le kit.

Le filtre qualité est caractérisé comme « PASS », ce qui signifie que le Contrôle Qualité est acceptable. J'observe que le filtre des séquences surreprésentées est caractérisé comme « FAIL », ce qui signifie qu'il y a beaucoup de lectures de mêmes séquences. Sachant que dans le sang, 80% des ARNm sont des ARNm d'hémoglobine, il est fort probable que les séquences surreprésentées correspondent aux séquences d'hémoglobine. Le résultat obtenu est donc cohérant.

Le séquençage est de bonne qualité. Par ailleurs, il y a plus de lectures par librairie que ce qui est indiqué par les spécificités du fournisseur. Cela indique que le séquençage des 8 transcriptomes a très bien fonctionné.
<figure><img src="image_41.png" /></figure>
<figure><img src="image_39.png" /></figure>
## Lecture 1 brute

(A partir des 10 000 premières lectures de séquences de l'animal FR17MAG201001173)

a

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Per base sequence quality

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

## Lecture 2 brute

(A partir des 10 000 premières lectures de séquences de l'animal FR17MAG201001173)

b

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

Per base sequence quality

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

**Figure n°15a-b** : Diagrammes obtenus sur NG6 représentant la qualité par base des séquences brutes issues du NovaSeq (a) des lectures de type 1 et (b) des lectures de type 2
## Lecture 1 brute

(A partir des 10 000 premières lectures de séquences de l'animal FR17MAG201001173)

a

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Per base sequence quality

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

## Lecture 2 brute

(A partir des 10 000 premières lectures de séquences de l'animal FR17MAG201001173)

b

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Per base sequence quality

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

**Figure n°15a-b** : Diagrammes obtenus sur NG6 représentant la qualité par base des séquences brutes issues du NovaSeq (a) des lectures de type 1 et (b) des lectures de type 2
a

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure n°16a-b :** Contrôle Qualité FastQC des séquences avant et après suppression des adaptateurs</figcaption></figure>
a

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure n°16a-b :** Contrôle Qualité FastQC des séquences avant et après suppression des adaptateurs</figcaption></figure>
## 4) Analyses Bio-informatiques des données de séquençage

L'analyse Bio-informatique des données de séquençage a pour objectif d'aligner les séquences lues sur le génome du porc et de détecter des variants. Hormis l'acquisition de compétences technologiques et méthodologiques en transcriptomique et génomique, le but du stage était également d'acquérir des compétences en Bio-informatique nécessaires à l'analyse des données omiques que j'ai produites.

De ce fait, pour limiter le temps de calcul du cluster (Genotoul) et la taille des fichiers générés, un script Bio-informatique (Cf. Figure I Annexe page 26) a été mis en place étape par étape sur l'analyse d'un fichier « test » avant l'analyse d'un échantillon complet. Ce script a été testé sur les 2 fichiers bruts (lecture de type 1 : 268 KiloBits et lecture de type 2 : 431 KiloBits) de l'animal FR17MAG201001173 (676 582 036 lectures totales) dont seulement les 20 000 premières lectures ont été utilisées. De plus, les étapes ont été réalisées une par une, car elles nécessitent une mémoire importante.

Par ailleurs, le fait d'utiliser différents outils Bio-informatiques implique des formats de fichiers différents. Cela pose problème lors de la conversion de ces fichiers en fichiers de sortie, car ils sont réutilisés en fichiers d'entrée pour les étapes suivantes. Ainsi, l'outil Samtools (23) a été utilisé pour convertir les fichiers concernés en fichiers BAM (étape qui n'est pas présente dans le workflow GATK).

Un **Contrôle Qualité des séquences brutes** issues du séquenceur a été effectué en ligne de commande avec l'outil FastQC. Cet outil permet d'une part de visualiser la qualité du séquençage des lectures de type 1 et 2 et d'autre part de vérifier si chaque étape a bien fonctionné (Cf. Figure n°15a-b). La qualité des lectures est évaluée selon un score qui représente indirectement la probabilité qu'il y ait une erreur de séquençage. Lorsque le score est de 30 la précision de séquençage est de 99,9 % ce qui signifie qu'il y a un risque de 1/1000 que la base séquencée soit fausse. Quelle que soit la lecture (type 1 ou type 2), la moyenne de qualité est supérieure à 28, ce qui signifie que le séquençage est de bonne qualité. Cependant, pour la lecture de type 2, des diagrammes en boîte (représentant les statistiques d'assignation d'une base à une position donnée sur un nombre de lectures défini), sont visibles, ce qui signifie que le séquençage est de moins bonne qualité (moyenne entre 33 et 35). La qualité du séquençage est meilleure pour la lecture de type 1 (moyenne à 36) ce qui est souvent le cas lors d'un séquençage Illumina car, plus le séquençage évolue, moins les fluorochromes sont performants et plus les réactifs s'épuisent. Les analyses ont donc été poursuivies.

Les données brutes sont ensuite « nettoyées » pour éliminer les séquences d'adaptateurs Illumina et ne conserver que des séquences porcines. Un **Contrôle Qualité des séquences sans adaptateurs** est alors réalisé. Le nombre total de séquences pour la lecture de type 1 par exemple, passe de 10 000 à 9 995 lorsque les lectures des adaptateurs sont éliminées (Cf. Figure n°16a-b). Il y a donc 5 séquences qui sont supprimées, ce qui signifie probablement que ces séquences étaient uniquement composées d'adaptateurs. De plus, la longueur des séquences diminue jusqu'à 60 b (longueur de lecture - longueur des adaptateurs), mais il y a tout de même quelques séquences à 150 b car les séquences d'adaptateurs n'ont pas été retrouvées.
## 4) Analyses Bio-informatiques des données de séquençage

L'analyse Bio-informatique des données de séquençage a pour objectif d'aligner les séquences lues sur le génome du porc et de détecter des variants. Hormis l'acquisition de compétences technologiques et méthodologiques en transcriptomique et génomique, le but du stage était également d'acquérir des compétences en Bio-informatique nécessaires à l'analyse des données omiques que j'ai produites.

De ce fait, pour limiter le temps de calcul du cluster (Genotoul) et la taille des fichiers générés, un script Bio-informatique (Cf. Figure I Annexe page 26) a été mis en place étape par étape sur l'analyse d'un fichier « test » avant l'analyse d'un échantillon complet. Ce script a été testé sur les 2 fichiers bruts (lecture de type 1 : 268 KiloBits et lecture de type 2 : 431 KiloBits) de l'animal FR17MAG201001173 (676 582 036 lectures totales) dont seulement les 20 000 premières lectures ont été utilisées. De plus, les étapes ont été réalisées une par une, car elles nécessitent une mémoire importante.

Par ailleurs, le fait d'utiliser différents outils Bio-informatiques implique des formats de fichiers différents. Cela pose problème lors de la conversion de ces fichiers en fichiers de sortie, car ils sont réutilisés en fichiers d'entrée pour les étapes suivantes. Ainsi, l'outil Samtools (23) a été utilisé pour convertir les fichiers concernés en fichiers BAM (étape qui n'est pas présente dans le workflow GATK).

Un Contrôle Qualité des séquences brutes issues du séquenceur a été effectué en ligne de commande avec l'outil FastQC. Cet outil permet d'une part de visualiser la qualité du séquençage des lectures de type 1 et 2 et d'autre part de vérifier si chaque étape a bien fonctionné (Cf. Figure n°15a-b). La qualité des lectures est évaluée selon un score qui représente indirectement la probabilité qu'il y ait une erreur de séquençage. Lorsque le score est de 30 la précision de séquençage est de 99,9 % ce qui signifie qu'il y a un risque de 1/1000 que la base séquencée soit fausse. Quelle que soit la lecture (type 1 ou type 2), la moyenne de qualité est supérieure à 28, ce qui signifie que le séquençage est de bonne qualité. Cependant, pour la lecture de type 2, des diagrammes en boîte (représentant les statistiques d'assignation d'une base à une position donnée sur un nombre de lectures défini), sont visibles, ce qui signifie que le séquençage est de moins bonne qualité (moyenne entre 33 et 35). La qualité du séquençage est meilleure pour la lecture de type 1 (moyenne à 36) ce qui est souvent le cas lors d'un séquençage Illumina car, plus le séquençage évolue, moins les fluorochromes sont performants et plus les réactifs s'épuisent. Les analyses ont donc été poursuivies.

Les données brutes sont ensuite « nettoyées » pour éliminer les séquences d'adaptateurs Illumina et ne conserver que des séquences porcines. Un Contrôle Qualité des séquences sans adaptateurs est alors réalisé. Le nombre total de séquences pour la lecture de type 1 par exemple, passe de 10 000 à 9 995 lorsque les lectures des adaptateurs sont éliminées (Cf. Figure n°16a-b). Il y a donc 5 séquences qui sont supprimées, ce qui signifie probablement que ces séquences étaient uniquement composées d'adaptateurs. De plus, la longueur des séquences diminue jusqu'à 60 b (longueur de lecture - longueur des adaptateurs), mais il y a tout de même quelques séquences à 150 b car les séquences d'adaptateurs n'ont pas été retrouvées.
a

Après alignement

Globsals

<table><tr><td>Reference size</td><td>2,501,912,388</td></tr><tr><td>Number of reads</td><td>16,210</td></tr><tr><td>Mapped reads</td><td>16,210 / 100%</td></tr><tr><td>Unmapped reads</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Mapped paired reads</td><td>16,210 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, first in pair</td><td>8,105 / 50%</td></tr><tr><td>Mapped reads, second in pair</td><td>8,105 / 50%</td></tr><tr><td>Mapped reads, both in pair</td><td>16,210 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, singletons</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Secondary alignments</td><td>21,876</td></tr><tr><td>Read min/max/mean length</td><td>89 / 150 / 351.52</td></tr><tr><td>Duplicated reads (estimated)</td><td>13,664 / 84.29%</td></tr><tr><td>Duplication rate</td><td>37.78%</td></tr><tr><td>Clipped reads</td><td>1,402 / 8.65%</td></tr></table>

b

Après réalignement

Globsals

<table><tr><td>Reference size</td><td>2,501,912,388</td></tr><tr><td>Number of reads</td><td>26,808</td></tr><tr><td>Mapped reads</td><td>26,808 / 100%</td></tr><tr><td>Unmapped reads</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Mapped paired reads</td><td>26,808 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, first in pair</td><td>12,078 / 45.05%</td></tr><tr><td>Mapped reads, second in pair</td><td>14,730 / 54.95%</td></tr><tr><td>Mapped reads, both in pair</td><td>26,808 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, singletons</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Secondary alignments</td><td>37,277</td></tr><tr><td>Read min/max/mean length</td><td>3 / 150 / 211.78</td></tr><tr><td>Duplicated reads (flagged)</td><td>7,399 / 27.6%</td></tr><tr><td>Clipped reads</td><td>21,957 / 81.9%</td></tr></table>

Figure n°17: Contrôle Qualité Qualimap des séquences après (a) alignement et (b) réalignement
a

Après alignement

Globsals

<table><tr><td>Reference size</td><td>2,501,912,388</td></tr><tr><td>Number of reads</td><td>16,210</td></tr><tr><td>Mapped reads</td><td>16,210 / 100%</td></tr><tr><td>Unmapped reads</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Mapped paired reads</td><td>16,210 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, first in pair</td><td>8,105 / 50%</td></tr><tr><td>Mapped reads, second in pair</td><td>8,105 / 50%</td></tr><tr><td>Mapped reads, both in pair</td><td>16,210 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, singletons</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Secondary alignments</td><td>21,876</td></tr><tr><td>Read min/max/mean length</td><td>89 / 150 / 351.52</td></tr><tr><td>Duplicated reads (estimated)</td><td>13,664 / 84.29%</td></tr><tr><td>Duplication rate</td><td>37.78%</td></tr><tr><td>Clipped reads</td><td>1,402 / 8.65%</td></tr></table>

b

Après réalignement

Globsals

<table><tr><td>Reference size</td><td>2,501,912,388</td></tr><tr><td>Number of reads</td><td>26,808</td></tr><tr><td>Mapped reads</td><td>26,808 / 100%</td></tr><tr><td>Unmapped reads</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Mapped paired reads</td><td>26,808 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, first in pair</td><td>12,078 / 45.05%</td></tr><tr><td>Mapped reads, second in pair</td><td>14,730 / 54.95%</td></tr><tr><td>Mapped reads, both in pair</td><td>26,808 / 100%</td></tr><tr><td>Mapped reads, singletons</td><td>0 / 0%</td></tr><tr><td>Secondary alignments</td><td>37,277</td></tr><tr><td>Read min/max/mean length</td><td>3 / 150 / 211.78</td></tr><tr><td>Duplicated reads (flagged)</td><td>7,399 / 27.6%</td></tr><tr><td>Clipped reads</td><td>21,957 / 81.9%</td></tr></table>

Figure n°17: Contrôle Qualité Qualimap des séquences après (a) alignement et (b) réalignement
La figure 16-b montre que pour les lectures de type 1 (lectures de type 2 non visualisées), les séquences des adaptateurs sont visibles (en rouge) sur le diagramme *Adapter Content* avec les *lectures brutes* et ne sont plus visibles après avoir été éliminées sur le diagramme *Adapter Content* avec les *lectures sans adaptateurs*. Ainsi, les étapes ultérieures peuvent donc être effectuées.

Les lectures sont ensuite **alignées** sur le génome de référence porcin. Cependant, lors de l'alignement il y a une difficulté particulière avec les ARNm.

Ces derniers subissent un épissage (mécanisme de maturation de l'ARN pré-messager en ARM messager avec élimination des introns), et une lecture peut donc s'aligner sur 2 exons. Pour en tenir compte, un alignement spécial est effectué avec l'outil STAR.

Par ailleurs, afin de visualiser ce qui a été fait à chaque étape des traitements Bio-informatiques apportant un changement important, un Contrôle Qualité est effectué à l'aide de Qualimap (Cf. Figure n°17). Le 1er Contrôle Qualité Qualimap est effectué après l'**alignement**. Sur 20 000 lectures analysées (10 000 lectures de type 1 et 10 000 lectures de type 2), toutes les lectures identifiées par l'algorithme ont été alignées sur le génome de référence, soit 16 210 lectures (8 105 lectures de type 1 + 8 105 lectures de type 2) alignées.

Les étapes suivantes peuvent donc être réalisées. Un regroupement des 2 types de lectures en 1 seul groupe est alors effectué. Les duplicats sont identifiés et seule la meilleure des lectures est conservée.

Le 2ème Contrôle Qualité Qualimap est effectué après **réalignement** sur le génome de référence. Le nombre de lectures réalignées augmente à 26 808 lectures, grâce aux étapes de « nettoyage ». Ce nombre, supérieur au nombre de lectures de départ (20 000) s'explique par le fait que certaines lectures peuvent être scindées en plusieurs lectures pour être correctement mappées sur le génome de référence (prise en compte des séquences introniques). Cela peut également expliquer la différence entre les 2 types de lectures mappées (12 078 lectures de type 1 et 14 730 lectures de type 2). De plus, le nombre de duplicats diminue (de 13 664 à 7 399), ce qui indique que l'identification des duplicats a relativement bien fonctionné.

L'évolution des chiffres entre l'alignement et le réalignement, signifie que les étapes intermédiaires de traitement Bio-informatique se sont bien déroulées.

Les différentes étapes sont validées, car les lectures ont été triées, « nettoyées » et leur qualité a été vérifiée. Les variants pourront donc être détectés avec ce type de script. Néanmoins, seule une infime partie des lectures de séquences d'un animal a été analysée, ce qui ne permet pas d'interpréter l'ensemble des résultats, mais plutôt d'avoir une idée globale sur le fonctionnement du script.
La figure 16-b montre que pour les lectures de type 1 (lectures de type 2 non visualisées), les séquences des adaptateurs sont visibles (en rouge) sur le diagramme *Adapter Content* avec les *lectures brutes* et ne sont plus visibles après avoir été éliminées sur le diagramme *Adapter Content* avec les *lectures sans adaptateurs*. Ainsi, les étapes ultérieures peuvent donc être effectuées.

Les lectures sont ensuite **alignées** sur le génome de référence porcin. Cependant, lors de l'alignement il y a une difficulté particulière avec les ARNm.

Ces derniers subissent un épissage (mécanisme de maturation de l'ARN pré-messager en ARM messager avec élimination des introns), et une lecture peut donc s'aligner sur 2 exons. Pour en tenir compte, un alignement spécial est effectué avec l'outil STAR.

Par ailleurs, afin de visualiser ce qui a été fait à chaque étape des traitements Bio-informatiques apportant un changement important, un Contrôle Qualité est effectué à l'aide de Qualimap (Cf. Figure n°17). Le 1er Contrôle Qualité Qualimap est effectué après l'**alignement**. Sur 20 000 lectures analysées (10 000 lectures de type 1 et 10 000 lectures de type 2), toutes les lectures identifiées par l'algorithme ont été alignées sur le génome de référence, soit 16 210 lectures (8 105 lectures de type 1 + 8 105 lectures de type 2) alignées.

Les étapes suivantes peuvent donc être réalisées. Un regroupement des 2 types de lectures en 1 seul groupe est alors effectué. Les duplicats sont identifiés et seule la meilleure des lectures est conservée.

Le 2ème Contrôle Qualité Qualimap est effectué après **réalignement** sur le génome de référence. Le nombre de lectures réalignées augmente à 26 808 lectures, grâce aux étapes de « nettoyage ». Ce nombre, supérieur au nombre de lectures de départ (20 000) s'explique par le fait que certaines lectures peuvent être scindées en plusieurs lectures pour être correctement mappées sur le génome de référence (prise en compte des séquences introniques). Cela peut également expliquer la différence entre les 2 types de lectures mappées (12 078 lectures de type 1 et 14 730 lectures de type 2). De plus, le nombre de duplicats diminue (de 13 664 à 7 399), ce qui indique que l'identification des duplicats a relativement bien fonctionné.

L'évolution des chiffres entre l'alignement et le réalignement, signifie que les étapes intermédiaires de traitement Bio-informatique se sont bien déroulées.

Les différentes étapes sont validées, car les lectures ont été triées, « nettoyées » et leur qualité a été vérifiée. Les variants pourront donc être détectés avec ce type de script. Néanmoins, seule une infime partie des lectures de séquences d'un animal a été analysée, ce qui ne permet pas d'interpréter l'ensemble des résultats, mais plutôt d'avoir une idée globale sur le fonctionnement du script.
<figure><img src="image_50.png" /></figure>
<figure><img src="image_46.png" /></figure>
# DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES SCIENTIFIQUES

L'objectif de mon stage étant de produire des données biologiques Haut-Débit et de m'initier à la Bio-informatique, mon implication dans le rapport s'est principalement portée sur la production et l'analyse de données ARN.

Je disposais de 8 ARN issus des 8 descendants du protocole. Tout d'abord, j'ai contrôlé leur qualité (contamination protéique, présence en sels et intégrité) et leur quantité, qui étaient correctes pour construire les librairies. Ainsi, les librairies ont été préparées, et j'ai effectué un contrôle qualitatif (taille des fragments) et quantitatif qui m'a permis de les valider pour réaliser le séquençage NGS. J'ai ensuite contrôlé la qualité et la quantité du mélange des 8 librairies à l'aide d'un pré-séquençage à bas-débit m'ayant permis de m'assurer que le nombre de lectures de séquences était équivalent entre les librairies. Le séquençage complet a donc été effectué.

Afin d'établir la liste des variants ARN, les données brutes issues du séquençage Haut-Débit ont été « nettoyées » et alignées sur le génome de référence. Le séquençage des 8 transcriptomes a très bien fonctionné. De ce fait, j'ai réalisé un Contrôle Qualité des séquences brutes qui m'a permis de visualiser la qualité du séquençage des lectures de type 1 et 2 et de valider la construction des librairies. Puis, grâce au workflow GATK, j'ai écrit un script Bio-informatique, permettant le traitement des données brutes jusqu'à l'identification des variants ARN. Cependant, pour limiter le temps de calcul du cluster, ainsi que la mémoire utilisée, j'ai exploité seulement une infime partie des lectures de séquences d'un animal (20 000 lectures de type 1 et 2). En effet, cela ne permet pas de lister tous les variants d'un individu car il n'y a pas assez de données, mais ça m'a tout de même permis de valider le fonctionnement de mon script.

Avant l'alignement des lectures sur le génome de référence, une étape consistant à éliminer les lectures d'adaptateurs a été réalisée afin de limiter la taille des fichiers générés et le temps de calcul du cluster. De plus, l'ARN ayant subi un épissage, il est nécessaire d'effectuer un alignement spécial afin d'identifier les lectures alignées sur plusieurs exons pour procéder à un second alignement précis (twopass mode). Par ailleurs, du fait que le tissu sanguin du porc soit composé à 80% d'hémoglobine, la profondeur de lectures sur le reste du génome est diminuée, d'où le choix d'un séquençage à Haut-Débit afin de supprimer les lectures issues de l'hémoglobine, sans impacter la détection de potentiels variants sous exprimés. L'hémoglobine aurait pu être supprimée lors de l'extraction, mais cela aurait pu biaiser les résultats de par la mauvaise reproductibilité inter échantillons (variation de quantité) apportant toutefois une hétérogénéité non acceptable. Les lectures qui s'alignent sur l'hémoglobine seront éliminées lors de l'analyse Bio-informatique des données de séquençage du projet. Dans mon script, je n'ai pas supprimé les lectures d'hémoglobine, car l'intérêt n'était pas d'établir la liste des variants, mais d'avoir une 1ère approche de l'analyse Bio-informatique des données.

En ce qui concerne les données génomiques, j'ai développé l'extraction d'ADN de haut Poids Moléculaire à partir de prélèvements sanguins et biopsies de queues, pour préparer l'ADN des 16 animaux du protocole (8 parents + 8 descendants). J'ai vérifié que leur qualité (taille des fragments) et leur quantité respectaient les pré-requis pour la construction des librairies avec la technologies 10X Genomics Chromium.
# DISCUSSION, CONCLUSION ET PERSPECTIVES SCIENTIFIQUES

L'objectif de mon stage étant de produire des données biologiques Haut-Débit et de m'initier à la Bio-informatique, mon implication dans le rapport s'est principalement portée sur la production et l'analyse de données ARN.

Je disposais de 8 ARN issus des 8 descendants du protocole. Tout d'abord, j'ai contrôlé leur qualité (contamination protéique, présence en sels et intégrité) et leur quantité, qui étaient correctes pour construire les librairies. Ainsi, les librairies ont été préparées, et j'ai effectué un contrôle qualitatif (taille des fragments) et quantitatif qui m'a permis de les valider pour réaliser le séquençage NGS. J'ai ensuite contrôlé la qualité et la quantité du mélange des 8 librairies à l'aide d'un pré-séquençage à bas-débit m'ayant permis de m'assurer que le nombre de lectures de séquences était équivalent entre les librairies. Le séquençage complet a donc été effectué.

Afin d'établir la liste des variants ARN, les données brutes issues du séquençage Haut-Débit ont été « nettoyées » et alignées sur le génome de référence. Le séquençage des 8 transcriptomes a très bien fonctionné. De ce fait, j'ai réalisé un Contrôle Qualité des séquences brutes qui m'a permis de visualiser la qualité du séquençage des lectures de type 1 et 2 et de valider la construction des librairies. Puis, grâce au workflow GATK, j'ai écrit un script Bio-informatique, permettant le traitement des données brutes jusqu'à l'identification des variants ARN. Cependant, pour limiter le temps de calcul du cluster, ainsi que la mémoire utilisée, j'ai exploité seulement une infime partie des lectures de séquences d'un animal (20 000 lectures de type 1 et 2). En effet, cela ne permet pas de lister tous les variants d'un individu car il n'y a pas assez de données, mais ça m'a tout de même permis de valider le fonctionnement de mon script.

Avant l'alignement des lectures sur le génome de référence, une étape consistant à éliminer les lectures d'adaptateurs a été réalisée afin de limiter la taille des fichiers générés et le temps de calcul du cluster. De plus, l'ARN ayant subi un épissage, il est nécessaire d'effectuer un alignement spécial afin d'identifier les lectures alignées sur plusieurs exons pour procéder à un second alignement précis (twopass mode). Par ailleurs, du fait que le tissu sanguin du porc soit composé à 80% d'hémoglobine, la profondeur de lectures sur le reste du génome est diminuée, d'où le choix d'un séquençage à Haut-Débit afin de supprimer les lectures issues de l'hémoglobine, sans impacter la détection de potentiels variants sous exprimés. L'hémoglobine aurait pu être supprimée lors de l'extraction, mais cela aurait pu biaiser les résultats de par la mauvaise reproductibilité inter échantillons (variation de quantité) apportant toutefois une hétérogénéité non acceptable. Les lectures qui s'alignent sur l'hémoglobine seront éliminées lors de l'analyse Bio-informatique des données de séquençage du projet. Dans mon script, je n'ai pas supprimé les lectures d'hémoglobine, car l'intérêt n'était pas d'établir la liste des variants, mais d'avoir une 1ère approche de l'analyse Bio-informatique des données.

En ce qui concerne les données génomiques, j'ai développé l'extraction d'ADN de haut Poids Moléculaire à partir de prélèvements sanguins et biopsies de queues, pour préparer l'ADN des 16 animaux du protocole (8 parents + 8 descendants). J'ai vérifié que leur qualité (taille des fragments) et leur quantité respectaient les pré-requis pour la construction des librairies avec la technologies 10X Genomics Chromium.
<figure><img src="image_51.png" /></figure>
<figure><img src="image_47.png" /></figure>
Les librairies ont été contrôlées qualitativement (taille des fragments) et quantitativement afin de valider leur utilisation pour du séquençage Haut-Débit. Les données génomiques sont en cours de production.

Je rappelle que le projet Pré-PIPETTE a pour finalité l'obtention d'un « catalogue » des gènes à empreinte parentale chez le porc pour l'étude de caractères d'intérêts. La sélection intensive pour des caractères de production économiquement importants (tels que la croissance, la qualité de la viande et la fertilité) a entraîné des taux remarquables d'amélioration génétique et a conduit au développement de populations animales à haut rendement. Néanmoins, cela n'a pas été réalisé pour tous les caractères d'intérêts ni chez toutes les espèces. Par exemple, dans l'espèce porcine, la sélection sur le poids de naissance n'existe pas. L'implication de gènes à empreinte connus dans le contrôle du poids à la naissance permettrait d'identifier de nouveaux gènes d'intérêt via leur mode de régulation épigénétique. L'imprintome du porc, espèce ayant un fort intérêt agronomique, permettrait d'améliorer encore la sélection génétique en évolution constante. Par ailleurs, en recherche fondamentale sur l'évolution du génome, l'imprintome porcin aidera à évaluer la conservation de l'empreinte parentale entre les espèces pour lesquelles les gènes soumis à empreinte ont été cartographiés.

L'empreinte parentale est un modèle idéal pour étudier la régulation épigénétique des gènes, car il y a dans le même noyau un allèle parental actif et un autre silencieux. Il est important de comprendre comment la cellule contrôle l'information épigénétique, car des loci régulés épigénétiquement contribuent à la variation phénotypique héréditaire. Une dérégulation de la régulation épigénétique peut avoir un rôle dans les cancers, dans la reproduction assistée, mais également dans le processus du vieillissement. L'empreinte parentale est un modèle intéressant pour découvrir comment le génome des mammifères utilise les mécanismes épigénétiques pour réguler l'expression.

La liste des variants ARN pour un ou plusieurs animaux permet de distinguer des expressions bi-alléliques des mono-alléliques, sans pouvoir conclure sur l'origine parentale. Il faudra la combiner pour chaque animal avec les haplotypes parentaux du protocole en miroir afin de pouvoir conclure quant au type d'expression (mono-allélique à allèle spécifique ou à empreinte parentale) pour établir l'imprintome étudié. Afin de construire plus facilement et rapidement les haplotypes parentaux, la technologie 10X Genomics Chromium a été utilisée, mais dans la période consacrée à mon stage le séquençage n'a pas pu être effectué.

Pour finaliser le projet il faudra donc établir la liste des variants ARN pour les 8 animaux en s'appuyant sur le script que j'ai écrit. Ensuite il faudra construire les haplotypes des 16 animaux à partir des données génomiques.

Grâce aux croisements réciproques, la combinaison des données génomiques et transcriptomiques permettra de discriminer une expression mono-allélique à allèle spécifique d'une expression mono-allélique à empreinte parentale.

Enfin, des analyses statistiques permettront d'établir l'imprintome porcin.
Les librairies ont été contrôlées qualitativement (taille des fragments) et quantitativement afin de valider leur utilisation pour du séquençage Haut-Débit. Les données génomiques sont en cours de production.

Je rappelle que le projet Pré-PIPETTE a pour finalité l'obtention d'un « catalogue » des gènes à empreinte parentale chez le porc pour l'étude de caractères d'intérêts. La sélection intensive pour des caractères de production économiquement importants (tels que la croissance, la qualité de la viande et la fertilité) a entraîné des taux remarquables d'amélioration génétique et a conduit au développement de populations animales à haut rendement. Néanmoins, cela n'a pas été réalisé pour tous les caractères d'intérêts ni chez toutes les espèces. Par exemple, dans l'espèce porcine, la sélection sur le poids de naissance n'existe pas. L'implication de gènes à empreinte connus dans le contrôle du poids à la naissance permettrait d'identifier de nouveaux gènes d'intérêt via leur mode de régulation épigénétique. L'imprintome du porc, espèce ayant un fort intérêt agronomique, permettrait d'améliorer encore la sélection génétique en évolution constante. Par ailleurs, en recherche fondamentale sur l'évolution du génome, l'imprintome porcin aidera à évaluer la conservation de l'empreinte parentale entre les espèces pour lesquelles les gènes soumis à empreinte ont été cartographiés.

L'empreinte parentale est un modèle idéal pour étudier la régulation épigénétique des gènes, car il y a dans le même noyau un allèle parental actif et un autre silencieux. Il est important de comprendre comment la cellule contrôle l'information épigénétique, car des loci régulés épigénétiquement contribuent à la variation phénotypique héréditaire. Une dérégulation de la régulation épigénétique peut avoir un rôle dans les cancers, dans la reproduction assistée, mais également dans le processus du vieillissement. L'empreinte parentale est un modèle intéressant pour découvrir comment le génome des mammifères utilise les mécanismes épigénétiques pour réguler l'expression.

La liste des variants ARN pour un ou plusieurs animaux permet de distinguer des expressions bi-alléliques des mono-alléliques, sans pouvoir conclure sur l'origine parentale. Il faudra la combiner pour chaque animal avec les haplotypes parentaux du protocole en miroir afin de pouvoir conclure quant au type d'expression (mono-allélique à allèle spécifique ou à empreinte parentale) pour établir l'imprintome étudié. Afin de construire plus facilement et rapidement les haplotypes parentaux, la technologie 10X Genomics Chromium a été utilisée, mais dans la période consacrée à mon stage le séquençage n'a pas pu être effectué.

Pour finaliser le projet il faudra donc établir la liste des variants ARN pour les 8 animaux en s'appuyant sur le script que j'ai écrit. Ensuite il faudra construire les haplotypes des 16 animaux à partir des données génomiques.

Grâce aux croisements réciproques, la combinaison des données génomiques et transcriptomiques permettra de discriminer une expression mono-allélique à allèle spécifique d'une expression mono-allélique à empreinte parentale.

Enfin, des analyses statistiques permettront d'établir l'imprintome porcin.
<figure><img src="image_52.png" /></figure>
<figure><img src="image_48.png" /></figure>
# BILAN PERSONNEL DU STAGE

Lors de ce stage, j'ai été impliquée dans un projet de recherche qui m'a permis de voir à la fois le volet unité de recherche et le volet plateforme de services. Ainsi, j'ai pu appréhender les activités d'un Assistant Ingénieur, que ce soit en terme de manipulations, de traçabilité, de Contrôle Qualité, mais aussi quant à l'utilisation de logiciels et bases de données pour l'analyse des résultats. J'ai pu rendre compte de mes résultats grâce aux différents échanges au cours du projet dans lequel j'ai été impliquée. Ce stage a été une très bonne expérience, il m'a permis d'approfondir mes connaissances en biologie moléculaire et en « omique », et aussi de renforcer mon intérêt pour la recherche agronomique. J'ai appris à travailler en équipe mais également à être autonome. De plus, je suis allée du prélèvement biologique à l'analyse bio-informatique des données de séquences.

Je souhaite relever les excellentes qualités relationnelles des personnes de l'Unité GenPhySE qui m'ont très vite intégrée et qui ont rendu mon stage d'autant plus agréable. Le seul regret que j'ai est de ne pas avoir terminé le projet, mais je m'informerai de la suite de ce dernier auprès de ma maître d'apprentissage.

J'ai trouvé que les périodes d'alternance étaient très bien réparties. D'une part, les activités réalisées au cours du projet de recherche étaient en parfaite adéquation avec la formation suivie à l'IUT. D'autre part, le rapport bibliographique réalisée en début de stage a été d'une grande aide pour mieux comprendre le sujet et pour rédiger le rapport final.

De plus, dans le cadre du collectif, j'ai participé à un chantier de prélèvements sur l'Unité Expérimentale d'Artiguères avec des personnes de l'Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT). Par ailleurs, dans le cadre sociétal, je vais participer à la Nuit Européenne des chercheurs ce 27 septembre 2019 afin de présenter les activités de laboratoire au grand public.

Ce stage m'a aidée à prendre confiance en moi et à m'insérer professionnellement dans le cadre d'un CDD de 1 an en tant qu'Assistante Ingénieur à la plateforme GeT PlaGe.
# BILAN PERSONNEL DU STAGE

Lors de ce stage, j'ai été impliquée dans un projet de recherche qui m'a permis de voir à la fois le volet unité de recherche et le volet plateforme de services. Ainsi, j'ai pu appréhender les activités d'un Assistant Ingénieur, que ce soit en terme de manipulations, de traçabilité, de Contrôle Qualité, mais aussi quant à l'utilisation de logiciels et bases de données pour l'analyse des résultats. J'ai pu rendre compte de mes résultats grâce aux différents échanges au cours du projet dans lequel j'ai été impliquée. Ce stage a été une très bonne expérience, il m'a permis d'approfondir mes connaissances en biologie moléculaire et en « omique », et aussi de renforcer mon intérêt pour la recherche agronomique. J'ai appris à travailler en équipe mais également à être autonome. De plus, je suis allée du prélèvement biologique à l'analyse bio-informatique des données de séquences.

Je souhaite relever les excellentes qualités relationnelles des personnes de l'Unité GenPhySE qui m'ont très vite intégrée et qui ont rendu mon stage d'autant plus agréable. Le seul regret que j'ai est de ne pas avoir terminé le projet, mais je m'informerai de la suite de ce dernier auprès de ma maître d'apprentissage.

J'ai trouvé que les périodes d'alternance étaient très bien réparties. D'une part, les activités réalisées au cours du projet de recherche étaient en parfaite adéquation avec la formation suivie à l'IUT. D'autre part, le rapport bibliographique réalisée en début de stage a été d'une grande aide pour mieux comprendre le sujet et pour rédiger le rapport final.

De plus, dans le cadre du collectif, j'ai participé à un chantier de prélèvements sur l'Unité Expérimentale d'Artiguères avec des personnes de l'Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT). Par ailleurs, dans le cadre sociétal, je vais participer à la Nuit Européenne des chercheurs ce 27 septembre 2019 afin de présenter les activités de laboratoire au grand public.

Ce stage m'a aidée à prendre confiance en moi et à m'insérer professionnellement dans le cadre d'un CDD de 1 an en tant qu'Assistante Ingénieur à la plateforme GeT PlaGe.
<figure><img src="image_53.png" /></figure>
<figure><img src="image_49.png" /></figure>
# DOCUMENTS DE REFERENCE ET BIBLIOGRAPHIE

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

## Sitographie :

(1) http://www.inra.fr/

(2) https://genphyse.toulouse.inra.fr/

(3) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

(4) https://get.genotoul.fr/la-plateforme/get-plage/

(5) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-8000-GL

(6) https://files.aati-us.com/images/misc/fragment-analyzer-technology-diagram.jpg

(7) https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/newsletters-and-journals/bioprobes-journal-of-cell-biology-applications/bioprobes-issues-2011/bioprobes-64-april-2011/the-qubit-2-0-fluorometer-april-2011.html

(8) http://www.medicalexpo.fr/prod/advanced-analytical-100384.html

(9) https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/fragment-analyzer-systems

(10) https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseq-stranded-mrna-workflow/truseq-stranded-mrna-workflow-reference-1000000040498-00.pdf

(11) https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-instruments/quantstudio-6-flex-real-time-pcr-system.html

(12) file:///C:/Users/asuin/Downloads/KAPA-Library-Quant-Illumina-TDS_KR0405_v8.17.pdf

(13) https://www.illumina.com/techniques/sequencing.html

(14) https://ng6.toulouse.inra.fr/

(15) http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

(16) http://bioinfo.genotoul.fr/index.php/faq/

(17) http://software.broadinstitute.org/software/igv/

(18) https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/changes.html#v2-1-2019-03-15

(19) https://github.com/alexdobin/STAR

(20) http://broadinstitute.github.io/picard/

(21) https://software.broadinstitute.org/gatk/

(22) http://qualimap.bioinfo.cipf.es/

(23) http://samtools.sourceforge.net/
# DOCUMENTS DE REFERENCE ET BIBLIOGRAPHIE

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

## Sitographie :

(1) http://www.inra.fr/

(2) https://genphyse.toulouse.inra.fr/

(3) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

(4) https://get.genotoul.fr/la-plateforme/get-plage/

(5) https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-8000-GL

(6) https://files.aati-us.com/images/misc/fragment-analyzer-technology-diagram.jpg

(7) https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/references/newsletters-and-journals/bioprobes-journal-of-cell-biology-applications/bioprobes-issues-2011/bioprobes-64-april-2011/the-qubit-2-0-fluorometer-april-2011.html

(8) http://www.medicalexpo.fr/prod/advanced-analytical-100384.html

(9) https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/fragment-analyzer-systems

(10) https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseq-stranded-mrna-workflow/truseq-stranded-mrna-workflow-reference-1000000040498-00.pdf

(11) https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-instruments/quantstudio-6-flex-real-time-pcr-system.html

(12) file:///C:/Users/asuin/Downloads/KAPA-Library-Quant-Illumina-TDS_KR0405_v8.17.pdf

(13) https://www.illumina.com/techniques/sequencing.html

(14) https://ng6.toulouse.inra.fr/

(15) http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/

(16) http://bioinfo.genotoul.fr/index.php/faq/

(17) http://software.broadinstitute.org/software/igv/

(18) https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/changes.html#v2-1-2019-03-15

(19) https://github.com/alexdobin/STAR

(20) http://broadinstitute.github.io/picard/

(21) https://software.broadinstitute.org/gatk/

(22) http://qualimap.bioinfo.cipf.es/

(23) http://samtools.sourceforge.net/
<figure><img src="image_55.png" /></figure>
<figure><img src="image_51.png" /></figure>
<figure><img src="image_56.png" /></figure>

Babak, T., DeVeale, B., Tsang, E.K., Zhou, Y., Li, X., Smith, K.S., Kukurba, K.R., Zhang, R., Li, J.B., van der Kooy, D., et al. (2015). Genetic conflict reflected in tissue-specific maps of genomic imprinting in human and mouse. *Nat. Genet.* **47**, 544–549.

Barlow, D.P., and Bartolomei, M.S. (2014). Genomic Imprinting in Mammals. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. **6**.

Bartolomei, M.S., and Ferguson-Smith, A.C. (2011). Mammalian genomic imprinting. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. **3**.

Bischoff, S.R., Tsai, S., Hardison, N., Motsinger-Reif, A.A., Freking, B.A., Nonneman, D., Rohrer, G., and Piedrahita, J.A. (2009). Characterization of conserved and nonconserved imprinted genes in swine. *Biol. Reprod.* **81**, 906–920.

Eggermann, T., Perez de Nanclares, G., Maher, E.R., Temple, I.K., Tümer, Z., Monk, D., Mackay, D.J.G., Grønskov, K., Riccio, A., Linglart, A., et al. (2015). Imprinting disorders: a group of congenital disorders with overlapping patterns of molecular changes affecting imprinted loci. *Clin. Epigenetics* **7**, 123.

Eggermann, T., de Nanclares, G.P., Maher, E.R., Temple, I.K., Tümer, Z., Monk, D., Mackay, D.J.G., Grønskov, K., Riccio, A., Linglart, A., et al. (2016). Erratum to: Imprinting disorders: a group of congenital disorders with overlapping patterns of molecular changes affecting imprinted loci. *Clin. Epigenetics* **8**, 27.

Frésard, L., Leroux, S., Servin, B., Gourichon, D., Dehais, P., Cristobal, M.S., Marsaud, N., Vignoles, F., Bed’hom, B., Coville, J.-L., et al. (2014). Transcriptome-wide investigation of genomic imprinting in chicken. *Nucleic Acids Res.* **42**, 3768–3782.

Grafodatskaya, D., Cytrynbaum, C., and Weksberg, R. (2013). The health risks of ART. EMBO Rep. **14**, 129–135.

Monk, D. (2015). Genomic imprinting in the human placenta. Am. J. Obstet. Gynecol. **213**, S152-162.

Nezer, C., Moreau, L., Brouwers, B., Coppieters, W., Detilleux, J., Hanset, R., Karim, L., Kvasz, A., Leroy, P., and Georges, M. (1999). An imprinted QTL with major effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs. *Nat. Genet.* **21**, 155–156.

O’Doherty, A.M., MacHugh, D.E., Spillane, C., and Magee, D.A. (2015). Genomic imprinting effects on complex traits in domesticated animal species. *Front. Genet.* **6**.
<figure><img src="image_52.png" /></figure>

Babak, T., DeVeale, B., Tsang, E.K., Zhou, Y., Li, X., Smith, K.S., Kukurba, K.R., Zhang, R., Li, J.B., van der Kooy, D., et al. (2015). Genetic conflict reflected in tissue-specific maps of genomic imprinting in human and mouse. *Nat. Genet.* **47**, 544–549.

Barlow, D.P., and Bartolomei, M.S. (2014). Genomic Imprinting in Mammals. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 6.

Bartolomei, M.S., and Ferguson-Smith, A.C. (2011). Mammalian genomic imprinting. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3.

Bischoff, S.R., Tsai, S., Hardison, N., Motsinger-Reif, A.A., Freking, B.A., Nonneman, D., Rohrer, G., and Piedrahita, J.A. (2009). Characterization of conserved and nonconserved imprinted genes in swine. *Biol. Reprod.* **81**, 906–920.

Eggermann, T., Perez de Nanclares, G., Maher, E.R., Temple, I.K., Tümer, Z., Monk, D., Mackay, D.J.G., Grønskov, K., Riccio, A., Linglart, A., et al. (2015). Imprinting disorders: a group of congenital disorders with overlapping patterns of molecular changes affecting imprinted loci. *Clin. Epigenetics* **7**, 123.

Eggermann, T., de Nanclares, G.P., Maher, E.R., Temple, I.K., Tümer, Z., Monk, D., Mackay, D.J.G., Grønskov, K., Riccio, A., Linglart, A., et al. (2016). Erratum to: Imprinting disorders: a group of congenital disorders with overlapping patterns of molecular changes affecting imprinted loci. *Clin. Epigenetics* **8**, 27.

Frésard, L., Leroux, S., Servin, B., Gourichon, D., Dehais, P., Cristobal, M.S., Marsaud, N., Vignoles, F., Bed’hom, B., Coville, J.-L., et al. (2014). Transcriptome-wide investigation of genomic imprinting in chicken. *Nucleic Acids Res.* **42**, 3768–3782.

Grafodatskaya, D., Cytrynbaum, C., and Weksberg, R. (2013). The health risks of ART. EMBO Rep. **14**, 129–135.

Monk, D. (2015). Genomic imprinting in the human placenta. Am. J. Obstet. Gynecol. **213**, S152-162.

Nezer, C., Moreau, L., Brouwers, B., Coppieters, W., Detilleux, J., Hanset, R., Karim, L., Kvasz, A., Leroy, P., and Georges, M. (1999). An imprinted QTL with major effect on muscle mass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs. *Nat. Genet.* **21**, 155–156.

O’Doherty, A.M., MacHugh, D.E., Spillane, C., and Magee, D.A. (2015). Genomic imprinting effects on complex traits in domesticated animal species. *Front. Genet.* **6**.
<figure><img src="image_57.png" /></figure>
<figure><img src="image_53.png" /></figure>
ANNEXE

#Elimination des adaptateurs
cutadapt -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT \
--minimum-length 50 \
--output /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R1.trim.fq.gz \
--paired-output /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R2.trim.fq.gz \
/work/project/genepi/Nathalie/test_FR17MAG201001173_R1.fq.gz /work/project/genepi/Nathalie/test_FR17MAG201001173_R2.fq.gz

#Alignment sur le génome de référence
STAR --genomeDir /work/project/genepi/Julie \
--runThreadN 4 \
--readFilesCommand zcat \
--readFilesIn /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R1.trim.fq.gz /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R2.trim.fq.gz \
--twopassMode Basic \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--outFileNamePrefix /work/project/genepi/Nathalie/Bam/test_FR17MAG201001173

#Modification du fichier BAM (trié) en fichier bai (indexé) avec Samtools pour qu'il puisse être utilisé par Picard
samtools index /work/project/genepi/Nathalie/Bam/test_FR17MAG201001173Aligned sortedByCoord.out.bam

#Regroupement des lectures dans un groupe
java -jar -Xmx4g /usr/local/bioinfo/src/picard-tools/picard-2.18.2/picard.jar AddOrReplaceReadGroups \
INPUT=/work/project/genepi/Nathalie/Bam/test_FR17MAG201001173Aligned sortedByCoord.out.bam \
OUTPUT=/work/project/genepi/Nathalie/ReadsGroups/test_FR17MAG201001173.reads_groups.bam \
RGLB=none \
RGPL=illumina \
RGPU=none \
RGSM=test_FR17MAG201001173 \
SO=coordinate

#Identification des duplicats
java -jar -Xmx4g /usr/local/bioinfo/src/picard-tools/picard-2.18.2/picard.jar MarkDuplicates \
I=/work/project/genepi/Nathalie/ReadsGroups/test_FR17MAG201001173.reads_groups.bam \
O=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicates/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates.bam \
M=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicates/Metrix.txt

#Trie des duplicats avec Picard
java -jar -Xmx4g /usr/local/bioinfo/src/picard-tools/picard-2.18.2/picard.jar SortSam \
I=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicates/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates.bam \
O=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicatesSorted/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates_sorted.bam \
SO=coordinate

#Modification du format du fichier (indexage)
samtools index /work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicatesSorted/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates_sorted.bam

#Elimination des lectures d'introns
java -Xmx4g -jar /usr/local/bioinfo/src/GATK/GenomeAnalysisTK-3.8-1-0-gf15c1c3ef/GenomeAnalysisTK.jar \
-T SplitNCigarReads \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicatesSorted/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates_sorted.bam \
-o /work/project/genepi/Nathalie/SplitNCigarReads/test_FR17MAG201001173_SplitNCigarReads.bam \
-U ALLOW_N_CIGAR_READS \
-rf ReassignOneMappingQuality \
-RMQF 255 -RMQT 60

#Réalignement sur le génome de référence
java -Xmx4g -jar /usr/local/bioinfo/src/GATK/GenomeAnalysisTK-3.5/GenomeAnalysisTK.jar \
-T RealignerTargetCreator \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/SplitNCigarReads/test_FR17MAG201001173_SplitNCigarReads.bam \
-o /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ Realigner.intervals \
-known /work/project/genepi/Julie/sus_scrofa_sort.vcf
java -Xmx4g -jar /usr/local/bioinfo/src/GATK/GenomeAnalysisTK-3.5/GenomeAnalysisTK.jar \
-T IndelRealigner \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/SplitNCigarReads/test_FR17MAG201001173_SplitNCigarReads.bam \
-o /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ realigned.bam \
-targetIntervals /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ Realigner.intervals \
-known /work/project/genepi/Julie/sus_scrofa_sort.vcf

#Re-calibrer les scores de qualité
gatk --java-options "-Xmx4G" BaseRecalibrator \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ realigned.bam \
--known-sites /work/project/genepi/Julie/sus_scrofa_sort.vcf \
-O /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.table

#Sort un fichier BAM avec les nouveaux scores de qualité
gatk --java-options "-Xmx4G" ApplyBQSR \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ realigned.bam \
--bqsr-recal-file /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.table \
-O /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.bam

#Recherche de variants et identification de régions variables
gatk --java-options "-Xmx4G" HaplotypeCaller \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.bam \
-O /work/project/genepi/Nathalie/HaplotypeCaller/test_FR17MAG201001173_recal.g.vcf \
-ERC GVCF

<caption>Figure I: Script testé sur les 20 000 premières lectures d'un animal étape par étape</caption>
ANNEXE

#Elimination des adaptateurs
cutadapt -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC -A AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT \
--minimum-length 50 \
--output /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R1.trim.fq.gz \
--paired-output /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R2.trim.fq.gz \
/work/project/genepi/Nathalie/test_FR17MAG201001173_R1.fq.gz /work/project/genepi/Nathalie/test_FR17MAG201001173_R2.fq.gz

#Alignment sur le génome de référence
STAR --genomeDir /work/project/genepi/Julie \
--runThreadN 4 \
--readFilesCommand zcat \
--readFilesIn /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R1.trim.fq.gz /work/project/genepi/Nathalie/Trim/test_FR17MAG201001173_R2.trim.fq.gz \
--twopassMode Basic \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--outFileNamePrefix /work/project/genepi/Nathalie/Bam/test_FR17MAG201001173

#Modification du fichier BAM (trié) en fichier bai (indexé) avec Samtools pour qu'il puisse être utilisé par Picard
samtools index /work/project/genepi/Nathalie/Bam/test_FR17MAG201001173Aligned sortedByCoord.out.bam

#Regroupement des lectures dans un groupe
java -jar -Xmx4g /usr/local/bioinfo/src/picard-tools/picard-2.18.2/picard.jar AddOrReplaceReadGroups \
INPUT=/work/project/genepi/Nathalie/Bam/test_FR17MAG201001173Aligned sortedByCoord.out.bam \
OUTPUT=/work/project/genepi/Nathalie/ReadsGroups/test_FR17MAG201001173.reads_groups.bam \
RGLB=none \
RGPL=illumina \
RGPU=none \
RGSM=test_FR17MAG201001173 \
SO=coordinate

#Identification des duplicats
java -jar -Xmx4g /usr/local/bioinfo/src/picard-tools/picard-2.18.2/picard.jar MarkDuplicates \
I=/work/project/genepi/Nathalie/ReadsGroups/test_FR17MAG201001173.reads_groups.bam \
O=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicates/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates.bam \
M=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicates/Metrix.txt

#Trie des duplicats avec Picard
java -jar -Xmx4g /usr/local/bioinfo/src/picard-tools/picard-2.18.2/picard.jar SortSam \
I=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicates/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates.bam \
O=/work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicatesSorted/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates_sorted.bam \
SO=coordinate

#Modification du format du fichier (indexage)
samtools index /work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicatesSorted/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates_sorted.bam

#Elimination des lectures d'introns
java -Xmx4g -jar /usr/local/bioinfo/src/GATK/GenomeAnalysisTK-3.8-1-0-gf15c1c3ef/GenomeAnalysisTK.jar \
-T SplitNCigarReads \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.t LEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/MarkDuplicatesSorted/test_FR17MAG201001173_marked_duplicates_sorted.bam \
-o /work/project/genepi/Nathalie/SplitNCigarReads/test_FR17MAG201001173_SplitNCigarReads.bam \
-U ALLOW_N_CIGAR_READS \
-rf ReassignOneMappingQuality \
-RMQF 255 -RMQT 60

#Réalignement sur le génome de référence
java -Xmx4g -jar /usr/local/bioinfo/src/GATK/GenomeAnalysisTK-3.5/GenomeAnalysisTK.jar \
-T RealignerTargetCreator \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.tLEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/SplitNCigarReads/test_FR17MAG201001173_SplitNCigarReads.bam \
-o /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ Realigner.intervals \
-known /work/project/genepi/Julie/sus_scrofa_sort.vcf
java -Xmx4g -jar /usr/local/bioinfo/src/GATK/GenomeAnalysisTK-3.5/GenomeAnalysisTK.jar \
-T IndelRealigner \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.tLEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/SplitNCigarReads/test_FR17MAG201001173_SplitNCigarReads.bam \
-o /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ realigned.bam \
-targetIntervals /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ Realigner.intervals \
-known /work/project/genepi/Julie/sus_scrofa_sort.vcf

#Re-calibrer les scores de qualité
gatk --java-options "-Xmx4G" BaseRecalibrator \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.tLEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ realigned.bam \
--known-sites /work/project/genepi/Julie/sus_scrofa_sort.vcf \
-O /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.table

#Sort un fichier BAM avec les nouveaux scores de qualité
gatk --java-options "-Xmx4G" ApplyBQSR \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.tLEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/IndelRealignment/test_FR17MAG201001173_ realigned.bam \
--bqsr-recal-file /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.table \
-O /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.bam

#Recherche de variants et identification de régions variables
gatk --java-options "-Xmx4G" HaplotypeCaller \
-R /work/project/genepi/Julie/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.dna.tLEVELS \
-I /work/project/genepi/Nathalie/BaseRecalibration/test_FR17MAG201001173_recal.bam \
-O /work/project/genepi/Nathalie/HaplotypeCaller/test_FR17MAG201001173_recal.g.vcf \
-ERC GVCF

<caption>Figure I: Script testé sur les 20 000 premières lectures d'un animal étape par étape</caption>
## RESUME

L'imprintome regroupe, dans une espèce, à un stade de développement et dans un tissu, l'ensemble des gènes ayant une expression mono-allélique à empreinte parentale ce qui signifie qu'l seul allèle, dépendant de son origine parentale, est actif. L'établissement de la liste des gènes à empreinte permet d'améliorer l'annotation du génome, d'étudier des mécanismes de régulation et de mettre en évidence le rôle de l'empreinte sur des phénotypes. J'ai été impliquée dans un projet ayant pour but d'établir l'imprintome dans le tissu sanguin chez le porcelet. Un protocole expérimental adapté comptant 16 animaux, soit 8 parents génétiquement éloignés croisés réciproquement et 8 descendants a été mis en place. A mon arrivée au laboratoire, j'ai réalisé le Contrôle Qualité des 8 ARN (extraits préalablement) afin de respecter les spécifications requises pour du séquençage NGS. J'ai participé au déroulement des manipulations de construction des 8 librairies et de séquençage Haut-Débit sur la plateforme GeT PlaGe. J'ai réalisé le Contrôle Qualité Bio-informatique des séquences d'ARN produites. Afin de lister les variants des ARNm, j'ai aussi écrit un script que j'ai validé sur les 20 000 premières lectures de séquences d'l animal. Par ailleurs, j'ai réalisé l'extraction d'ADN génomique de haut Poids Moléculaire des 16 animaux et j'ai participé à la construction des 16 librairies à l'aide de la technologie 10X Genomics Chromium. Les séquences d'ADN sont en cours de production et permettront d'identifier les haplotypes parentaux de chaque descendant. L'ensemble des données transcriptomiques et génomiques de chaque descendant puis des 8 descendants sera combiné et traité statistiquement afin d'établir l'imprintome porcin.

**Mots-clés** : Porc, Imprintome, ARN, Nouvelle Génération de Séquençage, Analyses Bio-informatiques

## ABSTRACT

The imprintome gathers, in a species, at a stage of development and in a tissue, all the genes having a mono-allelic expression with a parental imprinting, which means that only 1 allele, depending on its parental origin, is active. The establishment of the list of imprinted genes makes it possible to improve genome annotation, study regulatory mechanisms and highlight the role of imprinting on phenotypes. I was involved in a project to establish the imprintome in blood tissue at piglets. An adapted experimental protocol involving 16 animals, including 8 genetically remote parents crossed by each other and 8 offspring, has been put in place. When I arrived at the laboratory, I performed the Quality Control of the 8 RNAs in order to observe the specifications required for NGS sequencing. I participated in the construction of the 8 libraries and broadband sequencing on the GeT PlaGe platform. I performed the Bioinformatics Quality Control of the RNA sequences produced. In order to list the variants of mRNAs, I also wrote a script that I validated on the first 20,000 sequence readings of 1 animal. In addition, I extracted high molecular weight genomic DNA from the 16 animals and participated in the construction of the 16 libraries using 10X Genomics Chromium technology. The DNA sequences are in process of production and will allow identify the parental haplotypes of each descendant. All transcriptomic and genomic data for each descendant and then for the 8 descendants will be combined and statistically processed to establish the porcine imprintome.

**Keywords** : Pig, Imprintome, RNA, Next Generation Sequencing, Bioinformatics Analysis
## RESUME

L'imprintome regroupe, dans une espèce, à un stade de développement et dans un tissu, l'ensemble des gènes ayant une expression mono-allélique à empreinte parentale ce qui signifie qu'l seul allèle, dépendant de son origine parentale, est actif. L'établissement de la liste des gènes à empreinte permet d'améliorer l'annotation du génome, d'étudier des mécanismes de régulation et de mettre en évidence le rôle de l'empreinte sur des phénotypes. J'ai été impliquée dans un projet ayant pour but d'établir l'imprintome dans le tissu sanguin chez le porcelet. Un protocole expérimental adapté comptant 16 animaux, soit 8 parents génétiquement éloignés croisés réciproquement et 8 descendants a été mis en place. A mon arrivée au laboratoire, j'ai réalisé le Contrôle Qualité des 8 ARN (extraits préalablement) afin de respecter les spécifications requises pour du séquençage NGS. J'ai participé au déroulement des manipulations de construction des 8 librairies et de séquençage Haut-Débit sur la plateforme GeT PlaGe. J'ai réalisé le Contrôle Qualité Bio-informatique des séquences d'ARN produites. Afin de lister les variants des ARNm, j'ai aussi écrit un script que j'ai validé sur les 20 000 premières lectures de séquences d'l animal. Par ailleurs, j'ai réalisé l'extraction d'ADN génomique de haut Poids Moléculaire des 16 animaux et j'ai participé à la construction des 16 librairies à l'aide de la technologie 10X Genomics Chromium. Les séquences d'ADN sont en cours de production et permettront d'identifier les haplotypes parentaux de chaque descendant. L'ensemble des données transcriptomiques et génomiques de chaque descendant puis des 8 descendants sera combiné et traité statistiquement afin d'établir l'imprintome porcin.

**Mots-clés** : Porc, Imprintome, ARN, Nouvelle Génération de Séquençage, Analyses Bio-informatiques

## ABSTRACT

The imprintome gathers, in a species, at a stage of development and in a tissue, all the genes having a mono-allelic expression with a parental imprinting, which means that only 1 allele, depending on its parental origin, is active. The establishment of the list of imprinted genes makes it possible to improve genome annotation, study regulatory mechanisms and highlight the role of imprinting on phenotypes. I was involved in a project to establish the imprintome in blood tissue at piglets. An adapted experimental protocol involving 16 animals, including 8 genetically remote parents crossed by each other and 8 offspring, has been put in place. When I arrived at the laboratory, I performed the Quality Control of the 8 RNAs in order to observe the specifications required for NGS sequencing. I participated in the construction of the 8 libraries and broadband sequencing on the GeT PlaGe platform. I performed the Bioinformatics Quality Control of the RNA sequences produced. In order to list the variants of mRNAs, I also wrote a script that I validated on the first 20,000 sequence readings of 1 animal. In addition, I extracted high molecular weight genomic DNA from the 16 animals and participated in the construction of the 16 libraries using 10X Genomics Chromium technology. The DNA sequences are in process of production and will allow identify the parental haplotypes of each descendant. All transcriptomic and genomic data for each descendant and then for the 8 descendants will be combined and statistically processed to establish the porcine imprintome.

**Keywords** : Pig, Imprintome, RNA, Next Generation Sequencing, Bioinformatics Analysis