# Desenvolvimento e validação de uma plataforma de genotipagem em larga escala para Coffea canephora

Fernanda de Araújo Carneiro, Sinara Oliveira de Aquino, Nathália Gomes Mattos, Jéssica Coelho Valeriano, Wendel William de Jesus Carneiro, Pierre Marraccini, Orzenil Bonfim da Silva Júnior, Dario Grattapaglia, Alan Carvalho Andrade

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Fernanda de Araújo Carneiro, Sinara Oliveira de Aquino, Nathália Gomes Mattos, Jéssica Coelho Valeriano, Wendel William de Jesus Carneiro, et al. Desenvolvimento e validação de uma plataforma de genotipagem em larga escala para Coffea canephora. Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil, Consórcio Pesquisa Café, Oct 2019, Vitória, Brazil. 4 p. hal-05174339

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# DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UMA PLATAFORMA DE GENOTIPAGEM EM LARGA ESCALA PARA *Coffea canephora*<fnref n="1" />

Fernanda de Araújo Carneiro<fnref n="2" />, Sinara Oliveira de Aquino<fnref n="3" />, Nathália Gomes Mattos<fnref n="4" />, Jéssica Coelho Valeriano<fnref n="5" />, Wendel William de Jesus Carneiro<fnref n="6" />, Pierre Marraccini<fnref n="7" />, Orzenil Bonfim da Silva Júnior<fnref n="8" />, Dario Grattapaglia<fnref n="9" />, Alan Carvalho Andrade<fnref n="10" />

**RESUMO:** O cultivo de espécies de café como *Coffea canephora* e *C. arabica*, são muito importantes em regiões tropicais de todo o mundo e possuem grande valor econômico e cultural. As plataformas de genotipagem de SNPs oferecem ensaios altamente multiplexados a um custo relativamente baixo e podem ser uma ferramenta válida para a identificação dos marcadores associados a características de interesse. Neste trabalho é proposto o desenvolvimento e a validação de uma plataforma de genotipagem Affymetrix Axiom (®) para *C. canephora* (Coffee Axiom chip – 26K) com SNPs identificados a partir de dados de resequenciamento de *pools* de *C. canephora*, cobrindo a maior parte da diversidade genética conhecida para a espécie, e distribuídos ao longo de todo o genoma. Mais de 1.500 indivíduos de *C. canephora* foram genotipados com o chip para se avaliar a eficácia do mesmo. A grande maioria dos SNPs (20.920 ou 82%) pertence à classe de polimorfismos de alta resolução. O chip Coffee Axiom - 26K- se constitui uma ferramenta de referência para a pesquisa de genética molecular e genética de populações em espécies de café.

**PALAVRAS-CHAVE:** *C. canephora*, SNP, diversidade genética, DNA array.

# DEVELOPMENT AND VALIDATION OF A LARGE SCALE GENOTYPING PLATFORM FOR *Coffea canephora*

**ABSTRACT:** Coffee species such as *Coffea canephora* and *C. arabica* are important crops in tropical regions around the world, and has great economic and cultural value. Single nucleotide polymorphism arrays offer highly multiplexed assays at a relatively low cost per data point and can be a valid tool for the identification of the markers associated with traits of interest. Here, we describe the development and validation of a Affymetrix Axiom(®) genotyping array for *C. canephora* (Coffee Axiom chip – 26K) whose genome – wide distributed SNP content was discovered from pooled whole-genome resequencing of *C. canephora* accessions covering most of its known genetic diversity. More than 1,500 *C. canephora* individuals have been genotyped with the chip to assess the effectiveness of the array. A large majority of SNPs (20,920 or 82%) fell in the stringent class of poly high resolution polymorphisms. The Coffee Axiom chip – 26K will likely be a reference tool for molecular breeding and population genetics investigation within coffee species.

**KEY WORDS:** *C. canephora*, SNP, genetic diversity, DNA array.

# INTRODUÇÃO

O café é uma das commodities agrícolas mais importantes mundialmente e é o principal meio de subsistência para mais de 125 milhões de pessoas, sendo produzido em mais de 60 países. As duas espécies *C. arabica* e *C. canephora* predominam na produção mundial, representando aproximadamente 60% e 40% do mercado cafeeiro, respectivamente (ICO, 2018).

Com os avanços recentes na genômica do cafeeiro, como o sequenciamento completo do genoma de referência de *C. canephora* (DENOEUD et al., 2014), uma redução significativa em tempo e custo na seleção de plantas com características de interesse ao melhoramento pode ser alcançada. O genoma de referência juntamente com as tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) forneceram as ferramentas necessárias para a genotipagem de SNPs em larga escala. As plataformas de genotipagem de SNPs em larga escala resultam em uma alta cobertura e alta precisão, características essenciais para realizar a predição genômica e a descoberta de genes em estudos de associação genômica (GWAS).

O desenvolvimento de chips de genotipagem de DNA, com milhares de SNPs cobrindo todo o genoma, tem aumentado significativamente e já foram desenvolvidos para diversas culturas (BASSIL et al., 2015; BIANCO et al., 2016;

<footnote n="1">¹ Trabalho financiado pelo Consórcio Pesquisa Café</footnote>

<footnote n="2">² Doutora em Biotecnologia Vegetal, UFLA, Lavras-MG, Brasil, fearca14@gmail.com</footnote>

<footnote n="3">³ Bolsista Pós-Doutorado PNPD/CAPES, PhD, UFLA, Lavras-MG, Brasil, saquinobiotec@gmail.com</footnote>

<footnote n="4">⁴ Doutoranda em Biotecnologia Vegetal, UFLA, Lavras-MG, Brasil, nagm7@hotmail.com</footnote>

<footnote n="5">⁵ Doutoranda em Biotecnologia Vegetal, UFLA, Lavras-MG, Brasil, jessicacoelho_bio@hotmail.com</footnote>

<footnote n="6">⁶ Bolsista Consórcio Pesquisa Café, wendelwill11@gmail.com</footnote>

<footnote n="7">⁷ Pesquisador, PhD-HDR, CIRAD, UMR IPME, Instituto of Agricultural Genetics (AGI) LMI RICE2, Hanoi, Vietnã, marraccini@cirad.fr</footnote>

<footnote n="8">⁸ Pesquisador, PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF, Brasil, orzenil.silva@embrapa.br</footnote>

<footnote n="9">⁹ Pesquisador, PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF, Brasil, dario.grattapaglia@embrapa.br</footnote>

<footnote n="10">¹⁰ Pesquisador, PhD, Embrapa Café/INOVACAFÉ, Lavras-MG, Brasil, alan.andrade@embrapa.br</footnote>
HULSE-KEMP et al., 2015; KONING-BOUCOIRAN et al., 2015; LEE et al., 2015). Neste trabalho foi desenvolvida e validada uma plataforma de genotipagem em larga escala para *C. canephora* (Coffee Axiom chip – 26K), contendo SNPs informativos e de alta qualidade. Em resumo, espera-se que o Coffee Axiom chip – 26K forneça uma base sólida para o estabelecimento da genotipagem de alto rendimento, o que é de grande importância para a pesquisa, avançando em estudos na área genética/genômica e em aplicações de melhoramento dentro do gênero *Coffea*.

## MATERIAL E MÉTODOS

A partir dos dados gerados pelo resequenciamento genômico de pools formados por indivíduos de *C. canephora*, abrangendo a maior parte da diversidade genética presente na espécie, obteve-se uma lista de 25.456 marcadores SNPs filtrados de alta qualidade que foram utilizados na construção da plataforma de genotipagem. Após o desenvolvimento da plataforma (Coffee Axiom chip – 26K), avaliou-se a eficácia do chip a partir da validação dos SNPs incluídos no mesmo. Para a validação, o DNA de 296 indivíduos de *C. canephora* foi extraído, conforme o protocolo descrito por Russel et al. (2010), e a plataforma Affymetrix Gene Titan® foi usada para genotipar o “conjunto de validação” com o chip desenvolvido. Vale ressaltar que esses materiais utilizados como “conjunto de validação” incluem os diferentes grupos de diversidade de *C. canephora*, as principais variedades clonais resultantes dos programas de melhoramento do INCAPER e Embrapa Rondônia, bem como representantes da população proveniente da Embrapa Cerrados.
O software Axiom™ Analysis Suite (v. 1.1.1.66) foi usado para o processamento dos dados de intensidade de hibridização, agrupamento e chamada de genótipos. Amostras que apresentaram valor de Dish QC (DQC) < 0.82 e call rate < 0.97 foram removidas da análise. Executando o Axiom Best Practices Genotyping Workflow os SNPs identificados foram classificados dentro de seis tipos, de acordo com critérios de qualidade. A plataforma (Coffee Axiom chip – 26K) desenvolvida e validada para *C. canephora* foi utilizada na genotipagem em larga escala de 1.319 indivíduos selecionados na população de melhoramento da Embrapa Cerrados, a partir de avaliações fenotípicas realizadas entre os anos de 2012 e 2014, levando em consideração características como produção, tamanho e formato de grãos, tamanho e formato de frutos cereja e peso de 100 grãos (CARNEIRO et al., 2013).

## RESULTADOS E DISCUSSÃO

Do conjunto total de sondas incluídas no chip (25.456), 25.411 cobriram todos os 11 cromossomos de *C. canephora* e o “cromossomo 0”, que consiste em um conjunto de scaffolds não ordenados, fornecendo uma boa representação do genoma total da espécie (Figura 1), com uma média de 2.117 sondas por cromossomo e 45 sondas foram excluídas por mapearem em múltiplos locais.

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figura 1. Distribuição dos SNPs contidos nas sondas para cada cromossomo de *C. canephora*. A quantidade de SNPs varia de 0 (em cinza claro) até >120 (em vermelho) SNPs por Mb para os 11 cromossomos de *C. canephora*, incluindo o cromossomo 0.</figcaption></figure>

Verifica-se na Tabela 1 que o maior número de sondas localiza-se no cromossomo 2 (4.209), sendo este o maior cromossomo da espécie, com aproximadamente 54 Mb, enquanto que o menor número de sondas foram mapeadas no cromossomo 9 (1.257). Com relação às posições genômicas dos SNPs fixados no chip 26K de *C. canephora*, 68% estavam presentes em região gênica, sendo que desses, 42% estavam localizados em éxons (região codante – CDS) e 26% em íntrons. Os demais SNPs identificados no chip (8.348) estavam localizados em regiões intergênicas.
<table><caption>Tabela 1. Número de SNPs mapeados em cada cromossomo de *C. canephora*.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2">Tam. cromossomo (Mb)</th><th rowspan="2">Nº de sondas mapeadas</th><th colspan="2">Região Gênica</th><th rowspan="2">Região intergênica</th></tr><tr><th>CDS</th><th>Íntron</th></tr></thead><tbody><tr><td>Chr 0</td><td>205.6</td><td>3.381</td><td>830</td><td>563</td><td>1.988</td></tr><tr><td>Chr 1</td><td>38.2</td><td>2.121</td><td>928</td><td>576</td><td>617</td></tr><tr><td>Chr 2</td><td>54.5</td><td>4.209</td><td>1.915</td><td>1.248</td><td>1.046</td></tr><tr><td>Chr 3</td><td>32.0</td><td>1.400</td><td>599</td><td>372</td><td>429</td></tr><tr><td>Chr 4</td><td>28.2</td><td>1.789</td><td>841</td><td>436</td><td>512</td></tr><tr><td>Chr 5</td><td>29.1</td><td>1.478</td><td>651</td><td>332</td><td>495</td></tr><tr><td>Chr 6</td><td>37.3</td><td>2.553</td><td>1.102</td><td>715</td><td>736</td></tr><tr><td>Chr 7</td><td>29.8</td><td>2.047</td><td>984</td><td>575</td><td>488</td></tr><tr><td>Chr 8</td><td>31.6</td><td>1.688</td><td>685</td><td>490</td><td>513</td></tr><tr><td>Chr 9</td><td>22.3</td><td>1.257</td><td>503</td><td>331</td><td>423</td></tr><tr><td>Chr 10</td><td>27.6</td><td>1.762</td><td>777</td><td>444</td><td>541</td></tr><tr><td>Chr 11</td><td>33.5</td><td>1.726</td><td>764</td><td>402</td><td>560</td></tr></tbody><tfoot><tr><td></td><td><strong>570</strong></td><td><strong>25.411</strong></td><td><strong>10.579</strong></td><td><strong>6.484</strong></td><td><strong>8.348</strong></td></tr></tfoot></table>

A validação da plataforma de genotipagem apresentou mais de 97% de taxa de sucesso de amostragem, sendo que as 8 amostras excluídas não passaram devido ao QC *call rate*, que variou de 92,03 a 96,94 para essas amostras. As amostras incluídas como replicatas, dentro e entre placas, apresentaram uma concordância > 99,82 entre os resultados. Um total de 22.679 SNPs (89%) foram classificados como de excelente qualidade (Tabela 2; Figura 2). Destes, cerca de 90% eram polimórficos (PHR) (Figura 2A), os outros 10% eram marcadores que apresentavam somente dois *clusters* (NMH) (Figura 2B) e marcadores monomórficos (MHR) (Figura 2C). Os marcadores remanescentes (CRBT+OTV+Other) e que apresentam menor acurácia, representaram menos de 11% (2.777) do total de SNPs (Figuras 2D, 2E e 2F).

<table><caption>Tabela 2. Número e porcentagem de SNPs classificados em cada uma das seis categorias.</caption><thead><tr><th>Categoria do SNP</th><th>Número de SNPs</th><th>% dos SNPs</th></tr></thead><tbody><tr><td>PHR</td><td>20.920</td><td>82,18%</td></tr><tr><td>NMH</td><td>1.569</td><td>6,16%</td></tr><tr><td>MHR</td><td>190</td><td>0,74%</td></tr><tr><td>CRBT</td><td>571</td><td>2,24%</td></tr><tr><td>OTV</td><td>583</td><td>2,29%</td></tr><tr><td>Other</td><td>1.623</td><td>6,38%</td></tr></tbody><tfoot><tr><td><strong>TOTAL</strong></td><td><strong>25.456</strong></td><td></td></tr></tfoot></table>

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Figura 2. Classificação quanto à qualidade dos SNPs gerada pelo Axiom Best Practices Genotyping Workflow. (A) *Poly High Resolution* (PHR) - SNPs polimórficos e que passaram por todos os controles de qualidade (CQ); (B) *No Minor Homozygote* (NMH) - SNPs passaram pelo CQ, porém somente dois *clusters* são observados; (C) *Mono High Resolution* (MHR) - SNPs passaram em relação à qualidade mas são monomórficos; (D) *Call Rate Below Threshold* (CRBT) – SNPs que apresentaram *call rate* abaixo de 97%; (E) *Other* - o padrão resultante de *cluster* de SNP não se encontra em nenhuma das classes anteriores; (F) *Off-Target Variant* (OTV) - apresentam um *cluster* adicional, de baixa intensidade, resultante de desajustes entre a sonda e as sequências para esse grupo de indivíduos.
A partir da validação da plataforma de genotipagem de *C. canephora*, pode-se dizer que a genotipagem se mostrou coerente e confiável, gerando uma grande quantidade de marcadores SNPs polimórficos de qualidade. Este resultado está de acordo com outros chips publicados, melhorando as 60% e 74% das variantes PHR obtidas no chip 180K SoyaSNP (LEE et al., 2015) e Apple 480K (BIANCO et al., 2016), desenvolvidos para soja e maçã, respectivamente, mas ficando aquém dos 92% de variantes PHR apresentadas pela matriz Maize 600K (UNTERSEER et al., 2014), desenvolvida para milho.

Os marcadores moleculares têm sido amplamente utilizados para avaliação da diversidade genética, estudos evolutivos e de mapeamento. A aplicabilidade desses no melhoramento depende do custo, facilidade e precisão, tornando os SNPs uma escolha indispensável. O rápido progresso nas tecnologias de NGS durante a última década permitiu a produção de dados de sequência a baixo custo e em muito menos tempo (THUDI et al., 2012). As tecnologias baseadas em NGS foram efetivamente utilizadas para sequenciamento e resequenciamento de genomas, possibilitando a identificação de um número muito grande de marcadores SNPs. No cafeeiro, diferentes plataformas de genotipagem de SNPs foram desenvolvidas para várias aplicações (CARNEIRO et al., 2014, FERRÃO et al., 2017; SANT'ANA et al., 2018). Atualmente são os chips de DNA, com uma alta densidade de SNPs, que tem se mostrado uma ferramenta poderosa para o melhoramento molecular e a investigação genética de populações dentro de espécies de café (ANDRADE et al., 2017; MEROT-L'ANTHOENE et al., 2018), pois são de fácil utilização e econômicos para a geração e análise de dados de genotipagem. Além disso, a plataforma apresenta alta precisão e reprodutibilidade.

## CONCLUSÕES

1. O desenvolvimento da plataforma de genotipagem (Coffee Axiom chip – 26K) para *C. canephora*, com um grande número de SNPs validados e, acima de tudo, com a alta qualidade e reprodutibilidade destes marcadores, representam uma inovação na espécie estudada e disponibiliza uma ferramenta robusta para posteriores estudos de GWAS e seleção genômica ampla (SGA), genética populacional, podendo contribuir para o aumento na eficiência dos programas de melhoramento genético do cafeeiro.

## REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDRADE, A. C. et al. 'Towards GWAS and Genomic Prediction in Coffee: Development and Validation of a 26K SNP Chip for Coffea canephora', In XX INTERNATIONAL PLANT AND ANIMAL GENOME CONFERENCE, p. W173. Anais eletrônicos... Disponível em: <https://pag.confex.com/pag/xxv/webprogram/Paper23677.html>

BASSIL, N. V. et al. Development and preliminary evaluation of a 90 K Axiom(R) SNP array for the allo-octoploid cultivated strawberry Fragaria x ananassa. BMC Genomics, v. 16, n. 1, p. 1-30, 2015.

BIANCO, L. et al. Development and validation of the Axiom® Apple480K SNP genotyping array. The Plant Journal, v. 86, n. 1, p. 62-74, 2016.

CARNEIRO, F. A. et al. Phenotyping and genotyping a *Coffea canephora* population, cultivated at high altitude, aiming at a GWS program for coffee. In: THE 25TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON COFFEE SCIENCE, 2014, Colômbia.

CARNEIRO, F. A. et al. Phenotyping a *Coffea canephora* population, cultivated at high altitude, aiming at a GWS program for coffee. In: Workshop on Biotic and Abiotic Stress Tolerance in Plants: the Challenge for the 21st Century, 2013, Ilhéus. Book of abstracts, 2013.

DENOEUD, F. et al. The coffee genome provides insight into the convergent evolution of caffeine biosynthesis. Science, v. 345, n. 6201, p. 1181-1184, 2014.

HULSE-KEMP, A. M. et al. Development of a 63K SNP Array for Cotton and High-Density Mapping of Intraspecific and Interspecific Populations of *Gossypium* spp. G3: Genes, Genomes, Genetics, v. 5, n. 6, p. 1187-1209, 2015.

ICO – International Coffee Organization. Disponível em: <http://www.ico.org/>. Acesso em: 18 jan. 2019.

KONING-BOUCOIRAN, C. F. et al. Using RNA-Seq to assemble a rose transcriptome with more than 13,000 full-length expressed genes and to develop the WagRhSNP 68k Axiom SNP array for rose (Rosa L.). Frontiers in Plant Science, v. 6, n. 249, p. 1-10, 2015.

LEE, Y. G. et al. Development, validation and genetic analysis of a large soybean SNP genotyping array. The Plant Journal, v. 81, n. 4, p. 625-636, 2015.

MEROT-L'ANTHOENE, V. et al. Development and evaluation of a genome-wide Coffee 8.5K SNP array and its application for high-density genetic mapping and for investigating the origin of *Coffea arabica* L. Plant Biotechnology Journal, p. 1-13, 2019.

RUSSELL, A. et al. Phylogenetics and cytology of a pantropical orchid genus Polystachya (Polystachyinae, Vandeadae, Orchidaceae): evidence from plastid DNA sequence data. Taxon, v. 59, n. 2, p. 389-404, 2010.

THUDI, M. et al. Current state-of-art of sequencing technologies for plant genomics research. Briefings in Functional Genomics v. 11, n. 1, p. 3-11, 2012

UNTERSEER, S. et al. A powerful tool for genome analysis in maize: development and evaluation of the high density 600 k SNP genotyping array. BMC Genomics, v. 15, n. 1, p. 1-15. 2014.