# Intérêt de l'électrophorèse pour l'identification des génotypes de pommier

Elisabeth Chevreau

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

## To cite this version:

Elisabeth Chevreau. Intérêt de l'électrophorèse pour l'identification des génotypes de pommier. 4ème Colloque sur les Recherches Fruitières, 1985, NA, France. hal-01601148

HAL Id: hal-01601148

https://hal.science/hal-01601148

Submitted on 4 Jun 2020

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution - ShareAlike 4.0 International License
Elisabeth CHEVREAU

Institut National de la Recherche Agronomique, I.N.R.A.
Station d'Arboriculture Fruitière, Beaucouzé, 49000 ANGERS

# Intérêt de l'électrophorèse pour l'identification des génotypes de pommier

## RESUME

L'électrophorèse enzymatique permet de séparer des isozymes, produits de séries d'allèles codominants, à déterminisme génétique simple. Son emploi chez les arbres fruitiers est encore limité.

Quatre types d'applications de cette méthode à l'identification des génotypes de Pommier sont présentés. L'analyse de 8 systèmes enzymatiques a été réalisée à partir d'extraits de pollen.

Le polymorphisme ainsi révélé a permis l'identification de 26 variétés. Les mutants d'un même génotype ne peuvent être distingués ; le nombre limité des marqueurs analyses en est la cause principale. Les zymogrammes de 18 clones de porte-greffes "Paradis Jaune de Metz" sont identiques ; ceci confirme leur grande proximité génétique. Enfin, cette méthode a permis la détection de pollinisations extérieures lors d'une autofécondation.

Les perspectives d'utilisation des marqueurs enzymatiques sont très vastes, tant dans le domaine pratique que fondamental.

## A - ELECTROPHORESE ENZYMATIQUE ET AMELIORATION DES ESPECES FRUITIERES

### 1. INTERET ET LIMITES DE LA METHODE

L'électrophorèse permet de séparer les différentes formes moléculaires d'une même enzyme en fonction de leur charge et de leur taille. L'analyse de plusieurs systèmes enzymatiques à partir d'un fragment d'organe permet de caractériser un individu par ses zymogrammes.

Un des principaux intérêts de cette méthode est le déterminisme génétique simple des marqueurs ainsi révélés. L'existence de différents isozymes à contrôle génétique peut s'expliquer par l'apparition, au cours de l'évolution d'une espèce, de mutations affectant la mobilité électrophorétique de l'enzyme (modifications de charge, de conformation de la molécule). Des series d'allèles codominants sont ainsi constituées, aux différents loci codant pour la synthèse d'un type d'enzyme. (SHAW, 1969).

L'électrophorèse permet d'observer un phénotype enzymatique en lien direct avec le génotype. Cependant, l'expression des gènes de structure est soumise à différentes influences :
- l'ensemble du génome intervient, par son niveau de ploïdie, l'existence de gènes de régulation et les relations d'épistasie entre loci.

- l'état physiologique de l'organe analysé est déterminant : de son choix précis dépendra la reproductibilité des analyses.

- des altérations postérieures à la transcription peuvent aussi conduire à l'apparition d'isozymes dits "secondaires", sous forme de bandes mineures accompagnant les bandes principales du zymogramme.

Un certain nombre de précautions sont donc nécessaires pour interpréter les diagrammes enzymatiques. A cette condition, l'électrophorèse permet l'analyse rapide, à partir d'un petit échantillon végétal, de marqueurs enzymatiques à hérédité simple.

## 2. EMPLOI DE L'ELECTROPHORESE CHEZ LES ARBRES FRUITIERS

Les connaissances génétiques chez les espèces fruitières pérennes restent limitées. En effet, la longueur de la période juvénile, l'encombrement des descendances, et parfois les contraintes du régime de reproduction sont autant d'obstacles aux études de déterminisme ou de génétique quantitative.

L'analyse des marqueurs enzymatiques doit permettre un progrès rapide dans la connaissance de ces espèces. Cependant l'emploi de l'électrophorèse chez les arbres fruitiers est récent (une dizaine d'années), et encore limité à un petit nombre d'espèces. Un bilan de ces travaux est présenté au Tableau I ; l'essentiel des données est issu de la revue de TORRES (1983). On constate la place restreinte occupée par les études de déterminisme génétique.

<table><caption>TABLEAU I

LES TRAVAUX REALISES PAR ELECTROPHORESE ENZYMATIQUE

CHEZ LES ARBRES FRUITIERS</caption><thead><tr><th rowspan="2">Espèces Fruitières</th><th colspan="2">Nombre de systèmes enzymatiques</th></tr><tr><th>ayant fait l'objet d'analyses</th><th>à déterminisme génétique connu</th></tr></thead><tbody><tr><td>Citrus</td><td>12</td><td>8</td></tr><tr><td>Avocatier</td><td>9</td><td>7</td></tr><tr><td>Palmier dattier</td><td>5</td><td>5</td></tr><tr><td>Figuier</td><td>5</td><td>4</td></tr><tr><td>Pommier</td><td>7</td><td>1</td></tr><tr><td>Olivier</td><td>16</td><td>0</td></tr><tr><td>Pistachier</td><td>9</td><td>0</td></tr><tr><td>Manguier</td><td>3</td><td>0</td></tr><tr><td>Poirier</td><td>1</td><td>0</td></tr></tbody></table>
Le cas du Pommier illustre bien cette situation : la plupart des travaux ont porté sur les peroxydases ; c'est le seul système enzymatique dont l'hérédité a été étudiée (MISIC et al. 1981). Plusieurs auteurs ont cherché à mettre en évidence une relation entre un type d'isozyme et un caractère précis, d'intérêt agronomique ; leurs résultats sont le plus souvent négatifs. Seule une équipe chinoise fait mention d'une liaison entre la présence d'une bande de peroxydase et le caractère "spur" (ZHANG et al. 1983). L'identification variétale a été l'objectif de deux études : VINTERHALTER et JAMES (1982/83) ont pu classer 108 variétés de Pommier en 26 groupes phénotypiques d'après leurs zymogrammes de peroxydases d'écorce ; tout récemment, une équipe américaine travaillant sur 7 systèmes enzymatiques a identifié 35 variétés et porte-greffes de Pommier (MÉNENDEZ et al, 1984).

## B - QUELQUES APPLICATIONS DE L'ELECTROPHORESE A L'IDENTIFICATION DE GENOTYPES DE POMMIER

Une étude de l'apport de l'analyse enzymatique à la connaissance de la génétique du Pommier vient d'être réalisée, dans le cadre d'un travail de thèse. On a choisi d'analyser le pollen car cet organe correspond à un stade physiologique précis, peu sensible aux conditions du milieu ; l'activité de plusieurs enzymes y est élevée. Enfin, les protéines du pollen sont codées par le génotype haplotype de la plante.

Huit systèmes enzymatiques ont été analysés en gel d'amidon ou d'acrylamide (les méthodes d'extraction, de migration et de révélation sont données par CHEVREAU, 1984). Ce sont les suivants : estérides (EST), phosphatases acides (PA), leucine aminopeptidases (LAP), endopeptidases (ENP), alcool déshydrogénases (ADH), isocitrate déshydrogénases (IDH), phosphoglucomérisases (PGI) et phosphoglucomutases (PGM). Le déterminisme génétique de 7 d'entre eux a été établi.

Quatre exemples d'utilisation de ces marqueurs, pour l'identification de génotypes de Pommier sont présentés ici.

### 1. IDENTIFICATION VARIETALE

Un échantillon de 36 variétés de Pommier a été analysé pour 8 systèmes enzymatiques ; il comprenait :

- les principales variétés cultivées en France ("Golden Delicious", Granny Smith", plusieurs mutants du groupe "Delicious").

- des variétés étrangères, de provenance très variée.

- d'anciennes variétés, d'origine régionale, peu ou pas cultivées.

- quelques hybrides issus de programmes de sélection.

La présence ou l'absence de 26 allèles a été notée ; leur fréquence dans l'échantillon de variétés est donnée au Tableau II.
<table><caption>TABLEAU II

REPARTITION DES ALLELES SELON LEUR FREQUENCE

DANS UN ECHANTILLON DE 36 VARIETES</caption><thead><tr><th>Rares<br>Fréquence &lt;15%</th><th>Moyens<br>30%-60%</th><th>Fréquents<br>&gt;75%</th><th>Constants<br>100%</th></tr></thead><tbody><tr><td>Pgi<sup>c</sup></td><td>Lap<sup>a</sup></td><td>Pgm<sup>a</sup></td><td>Enp<sup>b</sup></td></tr><tr><td>Enp<sup>c</sup></td><td>βEst<sup>2</sup></td><td>Pgm<sup>b</sup></td><td>Lap<sup>d</sup></td></tr><tr><td>Pa<sup>c</sup></td><td>Pa<sup>b</sup></td><td>βEst<sup>1</sup></td><td>Pa<sup>a</sup></td></tr><tr><td>Pgi<sup>d</sup></td><td>αEst<sup>2</sup></td><td>αEst<sup>1</sup></td><td>Pgm<sup>d</sup></td></tr><tr><td>Lap<sup>c</sup></td><td>Idh<sup>b</sup></td><td>Lap<sup>b</sup></td><td>Idh<sup>a</sup></td></tr><tr><td>Pgm<sup>c</sup></td><td></td><td>Enp<sup>a</sup></td><td>Adh<sup>a</sup></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Adh<sup>b</sup></td><td>Pgi<sup>a</sup></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Pgi<sup>b</sup></td></tr></tbody></table>

Malgré la présence constante de 8 allèles, il est possible de distinguer une à une toutes les variétés, à l'exception de 3 groupes :

- les 6 mutants du type "Delicious" de cet échantillon ont des zymogrammes identiques.

- il en est de même pour 2 mutants de la variété "Jonathan".

- la variété "Florina", résistante à la tavelure, ne peut être distinguée de l'hybride P5 R42 A52, porteur d'un gène de résistance à la tavelure issu du même programme de croisement (gène Vf, de Malus floribunda 821).

## 2. DISTINCTION DES MUTANTS

La reconnaissance et la distinction des mutants de Pommier est un problème actuel ; en effet, la place des mutants parmi les nouvelles obtentions est importante (environ 35 %), et le nombre de mutants issus d'un même génotype est parfois considérable, comme dans le groupe des "Delicious". Les différences entre clones sont souvent minimes, et les critères morphologiques sont parfois insuffisants pour les distinguer.
Il était donc intéressant d'évaluer les possibilités et les limites de l'électrophorèse enzymatique comme critère d'identification de mutants d'un même génotype. Pour cela on a fait l'analyse de 25 mutants, spontanés ou induits, de 4 variétés ; cet échantillon fournit une gamme importante de types de mutations : coloration des fruits, port de l'arbre, sensibilité à la rugosité, date de maturité, productivité, niveau d'autocompatibilité. Des mutants tétraploïdes de 6 variétés ont également été analysés. La liste de l'ensemble des clones étudiés est donnée au Tableau III.

<table><caption>TABLEAU III
COMPOSITION DE L'ECHANTILLON DE MUTANTS ANALYSES</caption><thead><tr><th>Variétés d'origine</th><th>Mutants spontanés</th><th>Mutants induits</th></tr></thead><tbody><tr><td>Reine des<br>Reinettes</td><td>R. Reinettes Tasse<br>R. Reinettes Lepage<br>R. Reinettes Plassart</td><td>Belrène<br>P1 R14-18<br>X82 - D.25B</td></tr><tr><td>Melrose</td><td>Melrouge<br>Belrouge</td><td>X248-2-1-a<br>C2-R12-A19<br>6-4-8<br>16-2-50<br>X 2976</td></tr><tr><td>Golden</td><td>Smoothee<br>Belgolden<br>Supergolden<br>Golden'Morspur<br>Golden 4x</td><td>Lysgolden<br>X972-46-45-1</td></tr><tr><td>Delicious</td><td>Topred<br>Redspur<br>Wellspur<br>Early Red One<br>Starking<br>Starkrimson<br>Delicious 4x</td><td></td></tr><tr><td>Jonathan</td><td>Jonathan 4x</td><td></td></tr><tr><td>Ontario</td><td>Ontario 4x</td><td></td></tr><tr><td>Mac Intosh</td><td>Mac Intosh 4x</td><td></td></tr><tr><td>Wealthy</td><td>Wealthy 4x</td><td></td></tr></tbody></table>
L'analyse de 8 systèmes enzymatiques n'a révélé que 2 différences, entre niveau diploïde et tétraploïde :

- plusieurs clones tétraploïdes possèdent une bande d'isocitrate déshydrogènase supplémentaire, de position intermédiaire entre les 2 bandes existant chez les variétés diploïdes. Cette enzyme fonctionnant comme dimère chez de nombreuses espèces végétales, on peut supposer que la bande supplémentaire correspond à une molécule hétérodimérique, qui ne peut être synthétisée que dans des grains de pollen diploïdes.

- le clone "Ontario 4x" possède une bande d'endopeptidase supplémentaire par rapport à la variété diploïde ; cette différence peut être attribuée à une mutation.

Tous les autres mutants analysés ont des zymogrammes identiques à ceux de leur variété d'origine.

Ces résultats confirment ceux obtenus par VINTERHALTER et JAMES (1982/1983) à partir de peroxydases d'écorce. Ils peuvent être expliqués ainsi :

- les mutants sont généralement très proches de la variété d'origine, pour l'ensemble des caractères morphologiques et agronomiques : seule une partie très limitée du génome a dû être modifiée.

- le marquage réalisé par l'analyse de ces 8 systèmes enzymatiques est d'environment une dizaine de loci sur l'ensemble du génome ; de plus, seule une partie des mutations pouvant affecter ces loci peut être décelée par électrophorèse.

Par cette méthode, il est donc très improbable de déceler des différences au niveau enzymatique entre mutants d'une même variété. D'autres types d'analyses biochimiques permettent un marquage du génome beaucoup plus fin ; ainsi, l'électrophorèse bidimensionnelle des protéines dénaturées doit être un outil efficace pour la distinction des mutants.

### 3. ANALYSE DE PLUSIEURS CLONES DE "PARADIS JAUNE DE METZ"

Les porte-greffes du type "M9" constituent un groupe de clones sélectionnés dans différents pays d'Europe à partir d'une même population d'origine appelée "Paradis Jaune de Metz". Une variabilité existe parmi ces clones, pour des caractères morphologiques et agronomiques ; MASSE RON (1983) a pu classer 30 clones d'origines variées en 4 groupes morphologiques, d'après les caractères des feuilles et des rameaux. Actuellement, aucune hypothèse n'a été proposée, pour expliquer l'origine de cette variabilité.
Afin d'évaluer l'homogénéité de leurs caractéristiques enzymatiques, 18 clones de "Paradis Jaune de Metz" ont été analysés pour 8 systèmes enzymatiques. La composition de cet échantillon est donnée au Tableau IV ; les provenances géographiques sont variées et les 4 groupes morphologiques sont représentés.

TABLEAU IV

CARACTERISTIQUES DES CLONES DE "PARADIS JAUNE DE METZ" ANALYSES

<table><thead><tr><th>Nom</th><th>Origine</th><th>Groupe morphologique (d'après MASSERON,1983)</th></tr></thead><tbody><tr><td>M9 EMLA</td><td>Angleterre</td><td>I</td></tr><tr><td>KL 19</td><td>Belgique</td><td>II</td></tr><tr><td>KL 29</td><td>Belgique</td><td>III</td></tr><tr><td>T337</td><td>Pays-Bas</td><td>I</td></tr><tr><td>T338</td><td>Pays-Bas</td><td>I</td></tr><tr><td>T339</td><td>Pays-Bas</td><td>I</td></tr><tr><td>T340</td><td>Pays-Bas</td><td>I</td></tr><tr><td>M9 B</td><td>France</td><td>I</td></tr><tr><td>Clone K</td><td>France</td><td>II</td></tr><tr><td>Clone P</td><td>France</td><td>II</td></tr><tr><td>Lx 94</td><td>France</td><td>II</td></tr><tr><td>Clone G (LANCEP)</td><td>France</td><td>III</td></tr><tr><td>Clone H</td><td>France</td><td>III</td></tr><tr><td>Clone J</td><td>France</td><td>III</td></tr><tr><td>Clone M</td><td>France</td><td>III</td></tr><tr><td>Clone L</td><td>France</td><td>III</td></tr><tr><td>Lx 95</td><td>France</td><td>III</td></tr><tr><td>CEPILAND</td><td>France</td><td>IV</td></tr></tbody></table>

Aucune différence dans la composition des zymogrammes de ces 18 clones n'a pu être mise en évidence ; les génotypes de ces clones sont donc certainement très voisins. Une origine par semis est très improbable ; en effet, une hybridation aurait sans doute modifiée plus ou moins la composition enzymatique. La variabilité morphologique de ces clones est probablement due à l'apparition de mutations spontanées. Cependant, on ne peut exclure l'hypothèse d'une variabilité limitée préexistante à l'intérieur de la population d'origine et due par exemple à un certain taux d'autofécondation. En effet quelques générations d'autofécondations peuvent conduire à des génotypes très voisins, et expliquer également la faible vigueur intrinsèque de ces sélections.
## 4. DETECTION DE POLLINISATIONS EXTERIEURES, EN AUTOFECONDATION :

Un programme d'autofécondation de plusieurs variétés de Pommier a été entrepris à la Station d'Angers. Les pollinisations ont été réalisées en plaçant des ruchettes d'abeilles à l'intérieur des cages isolant les arbres. Pour déduire des renseignements génétiques précis des descendances ainsi obtenue il est nécessaire de vérifier que seul l'autopollen a participé aux fécondations ; l'électrophorèse enzymatique peut fournir dans ce cas des renseignements importants.

Une descendance de deuxième génération d'autofécondation (I₂) de la variété "Golden Delicious" a été étudiée : 37 individus issus du parent P7 R34 A20 (I₄) ont été analysés pour 7 systèmes enzymatiques. Les résultats sont les suivants :

- pour 4 systèmes enzymatiques (PA, ENP, ADH, PGI) tous les descendants ont un zymogramme identique à celui du parent P7 R34 A20.

- au locus β Est, un allèle nul est en ségrégation dans la descendance.

- pour les systèmes IDH et PGM, 2 et 3 individus respectivement possèdent une bande supplémentaire par rapport au parent de l'autofécondation (Cf. Fig. 1).

Ceci démontre que ces 3 individus (n° 15, n° 17 et n° 64) sont issus de fécondation par de l'allopollen, probablement introduit sous la cage par les abeilles.

<table><caption>**Figure 1.** Zymogrammes de PGM et IDH de P7 R34 A20 (I₄ de Golden) et de sa descendance (I²) d'autofécondation.</caption><thead><tr><th></th><th>P7 R34 A20</th><th>n°15</th><th>n°17</th><th>n° 64</th><th>Autres descendants</th></tr></thead><tbody><tr><td>PGM</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>IDH</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Il est intéressant de constater que ces résultats sont confirmés par une observation morphologique des arbres au champ. La vigueur de ces individus a été évaluée en mesurant le tour de tronc (à 20 centimètres au-dessus du sol) des arbres sur leurs propres racines, plantés depuis 10 ans.

L'ensemble de cette descendance manifeste une forte réduction de vigueur, attribuable aux deux générations d'autofécondation. Seuls 2 individus (n° 15 et n° 17) ont un tour de tronc plus élevé (Cf. Fig. 2). Ceci est en accord avec leur origine hybride, démontrée par l'électrophorèse.
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2.** Distribution du caractère vigueur dans la descendance (I²) d'autopécondation de P7 R34 A20 (I¹ de Golden).</figcaption></figure>
Les premiers résultats du travail entrepris sur le Pommier sont encourageants. En effet, l'analyse de 8 systèmes révèle un polymorphisme enzymatique suffisant pour identifier la plupart des variétés ou pour distinguer des génotypes, si leur parenté n'est pas trop étroite. Quelques essais réalisés sur des variétés de Poirier indiquent chez cette espèce l'existence d'un polymorphisme au moins aussi élevé.

L'emploi de l'électrophorèse au cours de ce travail a été limité par 2 facteurs :

- Seuls 8 systèmes enzymatiques ont pu être analysés ; le marquage du génome ainsi réalisé reste limité. Cependant, une amélioration des techniques de migration et de révélation doit permettre d'augmenter le nombre de ces marqueurs ; il existe actuellement des réactions de coloration permettant de visualiser l'activité d'une cinquantaine de systèmes enzymatiques.

- Le choix du pollen comme organe à analyser constituait une autre limite : seuls des arbres adultes ont pu être étudiés. Une adaptation de la technique à l'analyse des feuilles est en cours ; elle permettra une détermination précoce des caractéristiques enzymatiques, sur de jeunes semis.

Une seule des applications possibles de l'électrophorèse (identification de génotypes) a été illustrée ici par 4 exemples. Le champ d'utilisation de cette méthode est beaucoup plus vaste, comme en témoigne un certain nombre de travaux déjà réalisés sur des espèces fruitières :

- l'électrophorèse permet de déterminer l'origine génétique de certains individus. Cette technique s'est révélée particulièrement efficace chez des Citrus, pour distinguer les semis issus d'embryons nucellaires ou zygotiques. (TORRES et al, 1982).

- la recherche de tests précoces est un objectif important pour le sélectionneur d'espèces fruitières pérennes ; aussi de nombreux travaux ont-ils cherché à établir une liaison entre un type d'isozymes et un caractère agronomique important. En l'absence de connaissance sur le rôle physiologique exact des différents isozymes, on ne peut espérer mettre en évidence que des relations de proximité génétique entre 2 loci. C'est le cas chez le Figuier, où VALIZADEH (1978) a pu estimer à 15 unités de recombinaison la distance entre un locus de peroxydase et le facteur contrôlant le déterminisme du sexe.

- le polymorphisme enzymatique peut être un indicateur de la variabilité génétique d'une population ; il peut aussi servir de base au calcul de distances génétiques entre variétés ou espèces. Ainsi chez l'Olivier, l'analyse de 15 systèmes enzymatiques a apporté des arguments nouveaux concernant l'historique de la culture de cette espèce (LOUKAS et KRIMBAS, 1983).
grâce à leur déterminisme génétique simple, les marqueurs enzymatiques permettent une approche du fonctionnement et de l'organisation du génome. Chez le Pommier, par exemple, l'analyse du déterminisme de 7 systèmes enzymatiques semble indiquer une origine allopolyplöïde du génome de cette espèce (CHEVREAU, 1984).

Au delà des applications pratiques telles que l'identification variétale, on peut espérer, grâce au développement des méthodes d'électrophorèse, un progrès important dans la connaissance génétique des espèces fruitières.

## ABSTRACT

### THE USE OF ISOZYME ELECTROPHORESIS TO DISTINGUISH APPLE GENOTYPES

Multiple molecular forms of an enzyme (isozymes) are controlled by co-dominant alleles from one or several loci. These markers are not yet widely used among fruit species.

Four exemples in connection with the identification of apple genotypes are explained - Electrophoresis of 8 enzymes was applied to pollen extracts. 26 varieties could be individually distinguished based on their zymograms. Mutants from one genotype had identical patterns ; more markers are certainly needed to separate them. No difference was found between 18 rootstock selections from "Paradis Jaune de Metz" ; this result indicates a high level of genetic similarity. Moreover, out-crosses were detected in a self progeny by this method.

Other uses of these markers are reviewed : they concern practical applications as well as genetic studies.

## BIBLIOGRAPHIE

**CHEVREAU E., 1984.** Contribution à l'étude de la génétique du Pommier : Apport de l'analyse enzymatique. Thèse de docteur ingénieur - Orsay - 101 p.

**LOUKAS M., KRIMBAS C.B., 1983.** History of olive cultivars based on their genetic distances. *J. Hort. Sci.* 58 (1) : 121-127.

**MASSEON A., 1983.** Etude et sélection du Paradis Jaune de Metz, portegreffe du Pommier. 3° Colloque sur les Recherches Fruitières. Bordeaux. 23-24.

**MENENDEZ R.A., FRITTS R.J.R., LARSEN F.E., 1984.** Isozymic characterisation of apple (Malus domestica, Borkh.) clones. *Plant Physiol.* 75 (1) 57.

**MISIC P., VINTERHALTER D., TODOROVIC R., 1981.** The inheritance of isoperoxidases in apple. *Jugosl. Vocarstvo* 14 (1/2) : 43-47.

**SHAW C.R., 1969.** Isozymes : Classification, frequency and significance. *Intern. Rev. Cytol.* 25 : 297-331.
TORRES A.M., SOOST R.K., MAU-LASTOVICKA T., 1982. Citrus isozymes. Genetics and distinguishing nucellar from zygotic seedlings. *J. Hered.*, 73 : 335-339.

TORRES A.M., 1983. Fruit trees. In "Isozymes in Plant Genetics and Breeding, Part B" S.D. TANSKLEY and T.J. ORTON editors. Elsevier Science Publishers B.V., AMSTERDAM.

VALIZADEH M., 1978. Aspects génétiques, écologiques et agronomiques de l'étude de la variabilité des protéines chez les plantes supérieures. Cas de *Ficus carica* L. Thèse de doctorat - Montpellier - 182 p.

VINTERHALTER D.V., JAMES D.T., 1982-1983. The use of peroxydase polymorphism in the identification of apple scion cultivars. *Scienta Hortic.* 18 : 253-261.

ZHANG G.H., WANG G.H., ZHANG Q.Y., ZHANG W.Q., TANG X. Zh., 1983. Preselection of seedlings for spur type apples. *Acta Hortic.* 140 : 63-71.

*****