# L'apporto della tecnologia dei protoplasti nel milglioramento genetico delle specie legnose

Sergio Ochatt

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Sergio Ochatt. L'apporto della tecnologia dei protoplasti nel milglioramento genetico delle specie legnose. Convegno Agro Bio Frut su Biotecnologie e resistenze genetiche nelle piante da frutto e da orto, Agro Bio Frut. FRA., Oct 1991, Cesena, Italy. hal-01601202

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AGRI CESENA

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI
CIRB - CENTRO INTERDIPARTIMENTALE
DI RICERCHE BIOTECNOLOGICHE
BOLOGNA

SOCIETÀ ORTICOLA ITALIANA
FIRENZE

BIOTECNOLOGIE
E RESISTENZE
GENETICHE
NELLE PIANTE
DA FRUTTO

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Agro•Bio•Frut - Cesena

Camera di Commercio I.A.A., Forlì

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A cura di
S. Sansavini
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Atti del Convegno "Agro•Bio•Frut"

su:

BIOTECNOLOGIE E RESISTENZE GENETICHE
NELLE PIANTE DA FRUTTO E DA ORTO

e

Seminari del Dottorato di Ricerca in Colture Arboree

su:

Tecnologie avanzate per il miglioramento genetico
delle piante da frutto

Coordinatore: S. Sansavini

Collaborazione Editoriale: B. Mezzetti

Dipartimento Colture Arboree, C.M.V.F. - Università di Bologna

Dottorato di Ricerca in "Colture Arboree"

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AGRO•BIO•FRUT - CESENA, 5 OTTOBRE 1991

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ANNO ACCADEMICO 1991/92
# L'apporto della tecnologia dei protoplasti nel miglioramento genetico delle specie legnose

S. OCHATT, E. M. PATAT-OCHATT, *Station d'Amélioration des Espèces Fruitières et Ornamentales*, INRA, Angers, Francia

## INTRODUZIONE

Negli ultimi 30 anni è stato possibile ottenere piante intere partendo da cellule coltivate in vitro (Reinert, 1959). Numerosi progressi sono stati ottenuti nello studio teorico e pratico del processo di rigenerazione, in particolare nell'utilizzo delle colture in vitro per il miglioramento genetico (Ochatt e Power, 1992).

Nel 1902, Haberlandt ha postulato che ogni singola cellula con il nucleo intatto possieda la capacità di originare una pianta intera sia direttamente (embriogenesi somatica) sia passando attraverso una fase intermedia di proliferazione come callo (organogenesi). Questo fenomeno è conosciuto con il nome di "totipotenza delle cellule", mentre il termine "rigenerazione" è stato impiegato fino ad oggi per descrivere la produzione di un intero organismo vegetale partendo da cellule, tessuti, organi o embrioni zigotici coltivati in vitro.

La rigenerazione di piante da colture in vitro si ottiene spesso più facilmente partendo da tessuti che possiedono già un certo livello di organizzazione e che quindi hanno una maggiore capacità di sviluppo. Gli espianti in questo caso sono predeterminati alla differenziazione. La migliore dimostrazione della totipotenza è rappresentata dalla rigenerazione di intere piante da cellule veramente isolate, cioè da protoplasti.

Sebbene tutte le cellule siano teoricamente totipotenti (Reinert, 1959), di fatto però c'è sempre una differenza sostanziale nella capacità morfogenetica. cioè nell'espressione della totipotenza. Infatti, una progressiva riduzione dell'organizzazione dei tessuti altera lo stadio di differenziazione delle cellule che, in vitro, non sono sottoposte alle influenze stabilizzatrici ed industrici dei tessuti e delle cellule vicine. Conseguentemente, lo stadio cellulare differenziato, che fornisce la capacità morfogenetica, può essere perso o non recuperato facilmente durante uno stadio relativamente non organizzato. In questo contesto, i tre fattori che maggiormente influenzano la capacità rigenerativa sono il genotipo, lo stadio ontogenetico degli espianti originali e le condizioni colturali (cioè la composizione del substrato, luce e temperatura). Tutti sono stati utilizzati per caratterizzare e stabilire le condizioni ottimali per la morfogenesi di ogni specie.

## I PROTOPLASTI COME ORIGINE DI COLTURE RIGENERABILI

Il termine protoplasto indica una intera cellula vegetale privata della parete cellulare. I primi protoplasti sono stati isolati meccanicamente, ma la resa variabile e la mancanza di ripetibilità in isolamenti successivi hanno rapidamente condotto a riconoscere che l'impiego di enzimi per la degradazione della parete cellulare è il metodo più efficace per l'iso-
lamento di una maggiore quantità di protoplasti vitali dalla maggior parte dei tessuti.

Purtroppo è proprio il trattamento delle cellule con preparati enzimici "crudi" che può avere un effetto negativo sulla vitalità dei protoplasti, a causa delle molte sostanze contaminanti, inevitabilmente presenti nei preparati stessi. Inoltre, l'elevata pressione osmotica richiesta durante gli stadi iniziali della coltura e l'accumulo di prodotti metabolici durante la coltura stessa contribuiscono a diminuire la vitalità cellulare. Al momento è possibile isolare i protoplasti praticamente da qualsiasi specie e/o tessuto, ma la possibilità di isolare protoplasti capaci di divisioni mitotiche elevate e con una successiva proliferazione di callo e rigenerazione di piante, è ancora limitata ad un numero assai scarso di specie.

## ISOLAMENTO DI PROTOPLASTI

Cocking (1960) è stato il primo ad avere successo nell'isolamento di protoplasti utilizzando metodi enzimatici, usando un estratto di enzimi idrolitici su apici di radice di pomodoro. A partire da queste prime esperienze, sono state utilizzate combinazioni enzimatiche diverse e, oggi, la maggior parte degli enzimi idrolitici impiegati è disponibile commercialmente.

Le cellulasi e le emicellulasi, miscelate con le pectinasi, hanno un ruolo cruciale per la produzione di protoplasti. Le ultime sono necessarie per separare le cellule dai tessuti, affinchè le cellulasi possano effettuare la degradazione della parete cellulare. In questo contesto, è interessante ricordare che i primi esperimenti sull'isolamento di protoplasti usavano trattamenti enzimatici sequenziali al posto del trattamento misto, impiegato oggi dalla maggior parte dei ricercatori. Così i tessuti erano prima macerati con pectinasi per separare le singole cellule e poi le cellule venivano incubate con le cellulasi per digerire le pareti e liberare i protoplasti (Fowke e Gamborg, 1980).

Le foglie sono state il tessuto impiegato più di frequente per l'isolamento di protoplasti, ma anche altri tessuti sono stati utilizzati come materiale di partenza. In questo contesto, l'origine dei tessuti di partenza (ex vitro versus in vitro) gioca un ruolo fondamentale sull'efficienza dell'isolamento di protoplasti ed anche sul successivo comportamento durante la loro coltura. Non ci si deve quindi stupire se un numero crescente di ricercatori abbia scelto, particolarmente per i genotipi recalcitranti, di usare germogli coltivati in vitro come materiale di partenza. Questo non solo permette una continua disponibilità di materiale per l'isolamento su vasta scala di protoplasti, ma fornisce anche condizioni di crescita più uniformi e ripetibili per i tessuti di origine. È importante segnalare che, tanto per le specie erbacee come per quelle legnose, i tessuti giovani utilizzati come materiale di partenza, sono capaci di fornire le migliori risposte. Per quanto riguarda le specie legnose, le colture in vitro di piantine sono anche utili poichè forniscono tessuti nella fase giovanile di crescita (McCown e Russell, 1987; Revilla et al., 1987; Ochatt et al., 1992). Ciò vale anche nel caso dell'isolamento di protoplasti da tessuti diversi dalle foglie, giacchè lo stadio fisiologico dei materiali di origine è importante anche per i calli e le sospensioni cellulari. Le risposte migliori sono state ottenute quando le cellule sono state convertite in protoplasti durante la fase di crescita esponenziale (Ochatt et al., 1990; Ochatt e Power, 1992).

Le specie monocotiledoni meritano una trattazione a parte poichè, fino ad oggi, le migliori risposte nelle divisioni dei protoplasti sono sempre state ottenute partendo da sospensioni cellulari embriogeniche, che sono state le uniche capaci di rigenerare intere piante (Vasil, 1988). Al contrario, in queste specie, raramente sono state indotte divisioni ripetute a partire da protoplasti ottenuti da foglie (Hahne et al., 1991).
## Trattamenti preliminari ai tessuti di partenza, prima della digestione enzimatica

Diversi fattori hanno una grande influenza sulla vitalità dei protoplasti appena isolati, in particolare nelle specie arboree, per quelli isolati da mesofillo fogliare. Questi fattori possono modificare significativamente le loro risposte durante la coltura. Quindi, la determinazione delle condizioni ottimali di isolamento è fondamentale per il successo.

Numerosi trattamenti ai tessuti prima della incubazione enzimatica giocano un ruolo fondamentale sul miglioramento della successiva vitalità dei protoplasti isolati. Soprattutto per le specie recalcitranti, essi determinano anche un miglioramento delle risposte durante la coltura.

Così, ad esempio, un periodo di "plasmolisi dei tessuti" prima dell'incubazione enzimatica ha migliorato l'efficienza dell'isolamento di protoplasti a partire da mesofillo fogliare, calli e sospensioni cellulari, per un gran numero di specie (Gamborg et al., 1981; Ochatt e Power, 1992). La plasmolisi dura normalmente un'ora e si effettua in una soluzione avente composizione salina ed osmotica uguale a quella della soluzione enzimatica.

Un'altra strategia utilizzata comunemente per migliorare l'attività degli enzimi sui tessuti consiste nel tagliare i tessuti in piccoli pezzettini (125 mm') oppure in sottili fettine (di 1 mm di larghezza) prima della digestione. Alternativamente, si possono grattare le foglie con una spazzola morbida, con la lama del bisturi, oppure si possono fare trattamenti con carborundum (un abrasivo), cutinasi, etc. (Fowke e Constabel, 1985; Power et al., 1989). Alcuni autori incubano le piante al buio per 12-24 ore prima dell'isolamento dei protoplasti (Evans e Bravo, 1983), per favorire la diminuzione del turgore cellulare e quindi agevolare il distacco dell'epidermide inferiore.

Altri trattamenti sono stati utilizzati per migliorare l'efficienza di isolamento: in partita la coltura in vivo delle piante madri in condizioni particolari (Shepard e Totten, 1977), la preincubazione delle piantine in vitro in particolari substrati ottimizzati nella *Medicago sativa* (Kao e Michayluk, 1980) e nel melo (Wallin e Welander, 1985). Per quanto riguarda la maggior parte dei fruttiferi rigenerati da protoplasti fino ad oggi la pre-coltura delle piante su substrati speciali non si è dimostrata indispensabile (Ochatt et al., 1992).

Tutte queste tecniche sono valide per la maggior parte delle specie studiate e per i diversi tessuti di partenza. Ci sono però alcune eccezioni, ad esempio nel genere *Asparagus* le cellule sono liberate da una omogeneizzazione manuale prima del trattamento enzimatico (Bui-Dang-Ha e Mackenzie, 1973). Un altro esempio è quello dei granuli pollinici che devono prima essere idratati in acqua corrente per separare lo strato di esina, e solo successivamente possono essere incubati nella soluzione enzimatica.

## Condizioni per la digestione enzimatica dei tessuti e la liberazione dei protoplasti

I metodi per ottenere un ottimo isolamento di protoplasti vengono in genere determinati empiricamente; in ogni caso la maggior parte dei procedimenti si effettua ad una temperatura di circa 25°C, al buio o con illuminazione costante di bassa intensità (100-500 lux) e per periodi variabili fra le 4 e le 20 ore. Inoltre, l'agitazione delle miscele enzimatiche durante la digestione dei tessuti (30-60 volte/min) ha un effetto positivo.

Le soluzioni enzimatiche sono spesso addizionate di tamponi (per tenere costante il pH a 5.5-6.0), come ad esempio l'acido morfolinoetanosulfonico (MES), che assicura il mantenimento della vitalità, tamponando la riduzione del pH che può verificarsi naturalmente durante la digestione dei tessuti (Gamborg, 1976). Un'altra sostanza aggiunta volta alla miscela enzimatica è il solfato destrano di potassio (generalmente ad una concentrazione di 0.5% p/v), che elimina gli effetti delle proteine contaminanti (in genere enzimi idrolitici) e dei prodotti della lisi cellulare. Infine, l'aggiunta alla soluzione
enzimatica di antiossidanti come il polivinilpirrolidone (PVP) aiuta a mantenere un'alta vitalità dei protoplasti, particolarmente con i genotipi recalcitranti. Infatti, per i fruttiferi legnosi il PVP-10 (PM= 10000) all'1% (p/v) si è dimostrato essenziale nell'isolamento di protoplasti vitali.

Qualora i protoplasti, appena isolati, venissero direttamente trasferiti in un substrato di coltura normale, scoppierebbero. La pressione osmotica, prima sopportata meccanicamente dalla parete cellulare, deve essere sostituita con una pressione osmotica adeguata. Poichè la sintesi di una nuova parete è influenzata direttamente dalla concentrazione e dal tipo di osmotico impiegato, i protoplasti devono essere sottoposti a leggera plasmolisi durante l'isolamento.

## Purificazione dei protoplasti

Al termine dell'incubazione enzimatica si ottiene normalmente una miscela di protoplasti, cellule e detriti cellulari che deve essere purificata al fine di ottenere protoplasti puliti (i.e. senza residui cellulari contaminanti). Sono stati sviluppati diversi metodi con risultati differenti (Gamborg et al., 1981; Power et al., 1989; Ochatt e Power, 1992).

La tecnica di purificazione utilizzata più di frequente consiste nella filtrazione e successiva centrifugazione della sospensione ottenuta al termine della digestione. I protoplasti, ancora nella soluzione enzimatica, vengono passati attraverso un filtro di metallo o un setaccio di nylon (con un diametro delle maglie compreso fra 30 e 100 µm a seconda delle dimensioni dei protoplasti), al fine di trattenere le cellule non digerite, gli aggregati cellulari e tutti i resti dei tessuti vascolari. Poi, i protoplasti e i detriti cellulari (vacuoli, plastidi e cristalli di riserva) vengono recuperati dal filtrato e sottoposti a centrifugazione ad una velocità e per un tempo sufficienti a sedimentare i protoplasti, mentre i piccoli detriti cellulari rimangono in sospensione. Normalmente, questa centrifugazione si effettua a 100xg (5-10 min) e successivamente si elimina il supermatante. I protoplasti vengono poi lavati con la soluzione osmotica e risospesi in una soluzione salina oppure nel mezzo di coltura (Power et al., 1989). L'aggiunta di sale nella soluzione di lavaggio serve a compensare la perdita subita durante l'isolamento (Cocking, 1972).

La centrifugazione e il lavaggio possono essere ripetuti più volte sino ad ottenere un preparato di protoplasti abbastanza puliti. Infine, i protoplasti vengono sospesi a densità di coltura definite e nel mezzo appropriato. In confronto alle altre tecniche di purificazione, questo metodo, che ha il vantaggio di utilizzare lo stesso osmotico durante tutto il processo di isolamento fino alla purificazione, evitando così un possibile shock osmotico ai protoplasti, è stato utilizzato con successo per l'isolamento di protoplasti da calli e sospensioni cellulari in molte specie (Evans e Bravo, 1983).

Per la preparazione di protoplasti più semplici (e.g. quelli da foglie), questo metodo causa un eccessivo danno cellulare per cui in questi casi si preferisce ricorrere ai metodi di flottazione (Ochatt et al., 1992).

Visto che i protoplasti hanno una densità relativamente bassa (in confronto a frammenti cellulari ed organelli), sono stati utilizzati numerosi tipi di gradiente di densità o soluzioni dense (tipicamente di saccarosio) per sedimentare i detriti e facilitare il recupero dei protoplasti stratificati. Una soluzione di uno zucchero (di solito saccarosio 20-23%) o di uno zucchero alcool (sorbitolo) possono essere mescolate con la soluzione enzimatica. Adottando una velocità di centrifugazione appropriata (normalmente determinata empiricamente), i protoplasti vengono recuperati dallo strato superiore nei tubi. Poichè i protoplasti che galleggiano si accumulano in uno strato molto sottile, alcuni ricercatori hanno utilizzato bottiglie "Babcock" simili a quelle utilizzate per l'analisi del latte (Ochatt
e Caso, 1986; Shepard e Totten, 1977). La concentrazione di saccarosio utilizzata varia tra 0,3 e 0,6 M, e la velocità di centrifugazione adottata arriva fino a 350xg, però ridotta a 100xg o meno per i protoplasti più fragili come quelli del pomodoro (Evans e Bravo, 1983), dei *Prunus* (Ochatt, 1992), del pero (Ochatt, 1992), del melo (Patat-Ochatt, 1992) e delle specie legnose in genere (Ochatt et al., 1992). Di solito la durata della centrifugazione varia tra 3 e 10 minuti. Un altro metodo per la purificazione dei protoplasti consiste nell'aggiungere al metodo precedente una filtrazione prima della centrifugazione. Questo favorisce una riduzione nel numero di protoplasti rotti durante la purificazione.

Ci sono anche metodi alternativi, quale l'impiego di un gradiente in due strati ottenu-
to con un polisaccaride, come il Ficoll (al 6% sopra e 9% sotto), sciolto nel mezzo MS
(Murashige e Skoog, 1962) col 7% di sorbitolo (Larkin, 1976), oppure di gradienti
discontinui dove i protoplasti si accumulano, come un anello, fra due interfasi (Ochatt e
Power, 1992). In genere, queste strategie implicano la distribuzione dei protoplasti com-
presi tra la soluzione contenente l'osmotico e quella contenente una sostanza ad alto peso
molecolare come il Percoll o il Ficoll. Questo metodo è preferibile all'impiego di saccaro-
sio poichè sia il Percoll che il Ficoll, essendo osmoticamente inerti, evitano uno shock
osmotico durante l'isolamento e migliorano la vitalità. C'è purtroppo un problema da con-
siderare e cioè che queste sostanze devono essere in seguito eliminate dal mezzo (per suc-
cessive risospensioni e centrifugazioni) e quindi i protoplasti più fragili potrebbero essere
danneggiati durante tali processi (Ochatt, 1990).

Infine, per quei sistemi dove i protoplasti sono fragili e non galleggiano facilmente,
c'è un'altra strategia che consiste nella filtrazione in serie della sospensione ottenuta al
ternine della digestione. Per far questo, la sospensione viene fatta passare attraverso setacci
con pori di diametro decrescente (ad esempio 100, 80, 70, 60, 50, 30 e 20 µm) in funzione
del diametro dei protoplasti. Questo metodo causa però un calo notevole della resa e nor-
malmente non fornisce preparati completamente puliti.

Determinazione della purezza, vitalità, dimensione e resa dei protoplasti

Subito dopo l'isolamento e la purificazione, i protoplasti vengono lasciati a riposo
per 30-60 min. per determinare i parametri che permettono di calcolare l'efficienza del-
l'isolamento.

VERIFICA DELLA PRESENZA/ASSENZA DELLA PARETE CELLULARE.

Numerose strategie possono essere applicate. Talvolta viene usata, come unica pro-
va, la forma veramente sferica e/o l'assenza di birifrangenza osservando i protoplasti al
microscopio in contrasto di fase (Fowke e Constabel, 1985). L'impiego di sostanze fluo-
rescenti è però molto più preciso. Il calcoflour white aggiunto allo 0.1% al substrato di
coltura è senza dubbio la sostanza utilizzata più frequentemente, associata all'osservazio-
ne sotto luce U.V. (Nagata e Takebe, 1970). L'agente fluorescente tinapol è stato usato
per determinare la presenza di cellulosa (Cocking, 1985). La purezza del preparato è mol-
to importante e solamente quelli che sono completamente privi di detriti e cellule non di-
gerite devono essere usati, giacchè la rigenerazione di piantine a partire da cellule e
sferoplasti è comunque possibile.

DETERMINAZIONE DELLA VITALITÀ DEI PROTOPLASTI.

Parecchi parametri vengono usati per determinare la vitalità. Alcuni sono stati fre-
quentemente utilizzati malgrado la loro imprecisione, come ad esempio una attiva ciclosi,
una distribuzione uniforme degli organelli (oppure, per i protoplasti da foglie,
l'autofluorescenza rossa della clorofilla sotto luce U.V.), la variazione delle dimensioni a seguito di modificazioni osmotiche e l'attività fotosintetica. Generalmente, l'impiego di coloranti fornisce risultati molto più affidabili e, in questo contesto, la fenosafranina (specifica per i protoplasti morti) (Evans e Bravo, 1983), il blu di Evans (Kanai e Edwards, 1973), e la fluorisceina diacetato (FDA) (Widholm, 1972) sono i più utilizzati. La maggior parte dei ricercatori ha adottato l'FDA. L'impiego di FDA implica il miscelare un'aliquota (100 µl) della sospensione di protoplasti (in osmotico o in mezzo di coltura) con un uguale volume dello stesso mezzo contenente FDA (0.1 ml prelevati da una soluzione madre a 5 mg/ml in acetone per ogni 10 ml di mezzo) e la successiva analisi al microscopio sotto la luce UV. Le molecole di FDA, un composto non fluorescente, attraversano liberamente la membrana plasmatica, poi vengono idrolizzate dalle sterasi (Larkin, 1976; Widholm, 1972). Così viene prodotta la fluoresceina che però è trattenuta solamente all'interno dei protoplasti con la membrana intatta. Solo i protoplasti metabolicamente attivi, cioè vivi, risultano quindi fluorescenti, di colore verde/giallo, per eccitazione della fluoresceina accumulata sotto la luce U.V.

Devono essere contati almeno 500 protoplasti per analizzare la vitalità e i risultati sono dati in percentuale. Affinchè un sistema sia buono, la vitalità non deve essere inferiore al 50%. In tutti i preparati con vitalità inferiore all'80-90%, la densità iniziale di coltura dovrebbe essere corretta per avere il giusto numero di protoplasti vivi per ml di substrato. È importante sottolineare che in tutte le specie, e principalmente nelle legnose, la percentuale di vitalità normalmente diminuisce durante i primi giorni di coltura.

## CONTEGGIO DELLA RESA IN PROTOPLASTI.

Il numero totale di protoplasti isolati si calcola conteggiando con un ematocitometro un campione del preparato purificato di protoplasti e la resa si considera in termini di protoplasti per ml. Questo dato viene poi moltiplicato per il volume totale della sospensione ottenuta, e riferito al peso totale dei tessuti digeriti. Infine, la resa si esprime come numero di protoplasti per grammo di peso fresco.

## DETERMINAZIONE DELLA DIMENSIONE DEI PROTOPLASTI.

La caratterizzazione dei protoplasti sulla base del loro diametro è un prerequisito per ottenere buoni risultati durante la loro manipolazione nel contesto della fusione e/o per la scelta di eterocarionti per citometria di flusso. Esiste una chiara correlazione tra il diametro dei protoplasti e la loro capacità a tollerare impulsi elettrici durante studi di elettroporazione, sia per il trasferimento genico diretto, sia per il miglioramento delle risposte in coltura. La dimensione media è determinata misurando almeno 200 protoplasti per campione. Nelle dicotiledoni i protoplasti fogliari sono in genere più piccoli di quelli isolati da calli o sospensioni cellulari della stessa specie, con un diametro di 10-30 µm e più di 30 µm rispettivamente. Al contrario, nelle monocotiledoni i protoplasti hanno un diametro inferiore a 30 µm, indipendentemente dai tessuti di partenza.

# COLTURA DI PROTOPLASTI

## Composizione del mezzo di coltura

### MEZZI DI BASE IMPIEGATI PER LA COLTURA DI PROTOPLASTI

Normalmente, la composizione dei substrati di coltura per i protoplasti deriva dalla modificazione dei mezzi comunemente utilizzati nella coltura dei tessuti, in quanto i
fabbisogni nutrizionali dei tessuti e delle cellule sono simili a quelli dei protoplasti. I mezzi usati più frequentemente sono MS, B5 (Gamborg et al., 1968) o KM (Kao e Michayluk, 1975) con parecchie (minime, ma critiche) modificazioni.

Per quanto riguarda le modifiche dei componenti dei mezzi, varie alterazioni chiave sono state proposte relativamente alla concentrazione di ammonio, all'aggiunta di microelementi e alle sostanze organiche per ottenere risposte positive in determinati sistemi di coltura.

In particolare, si è notato che gli ioni ammonio possono essere nocivi per la sopravvivenza dei protoplasti. ed alcuni autori hanno utilizzato mezzi con una concentrazione ridotta di ammonio (ad es. per *Broussonetia kazinoki*; Oka e Ohyama. 1985), ed anche qualche mezzo completamente privo di ammonio, ad esempio per alcuni genotipi di pomodoro (Zapata et al., 1981), patata (Upadhya. 1975), tabacco (Caboche. 1980), per tutti i genotipi di pero esaminati fino ad oggi (Ochatt. 1992) ed anche per molte altre specie legnose (Ochatt e Power. 1992). Al contrario, la concentrazione dello ione calcio, ritenuta importante per la stabilità delle membrane, è stata in certi casi aumentata 2-4 volte rispetto alla concentrazione abitualmente utilizzata nella coltura di tessuti (Eriksson. 1977).

## FONTE DI CARBONIO E SCELTA DELL'OSMOTICO

Visto che i protoplasti non sono in grado di effettuare la fotosintesi, la somministrazione esogena di una fonte di carbonio è necessaria per assicurare la loro proliferazione (Evans e Bravo. 1983; Fowke e Constabel. 1985; Power et al., 1989). Il glucosio è la fonte di carbonio preferita in alcuni sistemi (Gamborg, 1977), poichè questo zucchero viene rapidamente metabolizzato dai protoplasti, e il suo utilizzo è direttamente proporzionale ai fabbisogni osmotici che sono ridotti dopo che la parete cellulare è stata risintetizzata. Una fonte di carbonio alternativa, o anche supplementare, come il saccarosio, può tuttavia essere preferita o necessaria per alcune specie (Michayluk e Kao, 1975). Analogamente, un osmotico non metabolizzabile, come il mannitolo, può risultare necessario in alcuni casi (Von Arnold e Eriksson, 1977). Infatti, in anni recenti, si è trovato che il mannitolo era il composto osmoticamente attivo più appropriato per un gran numero di genotipi di piante erbacee e legnose (Ochatt e Power, 1992). Parecchie specie hanno inoltre fornito ottimi risultati con una miscela di differenti fonti organiche di carbonio (Gamborg et al., 1981; Ochatt e Caso, 1986).

La pressione osmotica può essere regolata con l'aggiunta di parecchi zuccheri e zuccheri alcooli nella soluzione d'isolamento e di coltura. Sono stati impiegati mannitolo, sorbitolo, glucosio e saccarosio; il mannitolo ed il sorbitolo, soli o in combinazione, sono i composti utilizzati più spesso (Evans e Bravo, 1983). Miscele complesse, di vari agenti osmotici (mannitolo, sorbitolo, xilitolo, inositolo, saccarosio, glucosio), sono state utilizzate con successo per i protoplasti di patata (Gamborg et al., 1981) e anche di pero selvatico (Ochatt e Caso, 1986). Il glucosio è stato anche impiegato con successo in alternativa a tutti i precedenti per l'isolamento di protoplasti da cellule di tabacco (Evans e Bravo, 1983; Kao e Michayluk, 1974). Infine, alcuni ricercatori hanno utilizzato soluzioni saline (ad es. di cloruro di calcio o di potassio) al posto del mannitolo, nonostante non ci siano prove sperimentali che dimostrino il migliore effetto di queste.

La concentrazione osmotica effettiva dipende dalla pressione osmotica endogena delle cellule al momento dell'isolamento e questa è influenzata dalle condizioni della coltura (Shepand e Totten, 1977; Wallin et al., 1977) e dall'età (Kao e Michayluk, 1980) dei tessuti di partenza. Concentrazione di mannitolo tra 0.23 e 0.9 M sono state utilizzate con successo durante la coltura di protoplasti in un gran numero di specie (Evans e Bravo, 1983;
Fowke e Constabel, 1985; Ochatt et al., 1990; Ochatt e Power, 1992).

## IL RUOLO DEI COMPONENTI ORGANICI

Per quanto riguarda i costituenti organici dei mezzi, sono state saggiate numerose sostanze. Nella maggior parte dei casi, in particolare per molte specie erbacee dicotiledoni, i fabbisogni vitaminici (tiamina, piridossina ed acido nicotinico) sembrano essere uguali per cellule e protoplasti (Evans e Bravo, 1983). Invece, Kao e Michayluk (1975) hanno suggerito l'aggiunta di varie vitamine, acidi organici, zuccheri, zuccheri alcooli e altri nutrienti, quali l'idrolizzato di caseina ed il latte di cocco, per la coltura di protoplasti a bassa densità. Questo mezzo, nella sua formulazione originale o con numerose modifiche, è stato impiegato con successo per un gran numero di specie, inclusi cereali (Thompson et al., 1986), leguminose (Gilmuor et al., 1987), ornamentali (Power et al., 1988) e fruttiferi (Patat-Ochatt, 1992). In molti casi, tuttavia, molti di questi fattori non sono veramente essenziali e, di conseguenza, parecchi autori hanno eliminato alcune di queste sostanze (Fowke e Constabel, 1985).

Le differenze nel fabbisogno in sostanze organiche possono essere molto grandi fra i diversi genotipi all'interno della stessa specie e ciò indipendentemente dal tessuto di partenza (Ochatt, 1990). Ad esempio, grandi differenze sono evidenti tra portinnesti e varietà di melo (Patat-Ochatt, 1992) e di pero (Ochatt, 1992).

## FITOREGOLATORI

Come nella coltura di cellule e/o tessuti, lievi modifiche della concentrazione dei regolatori di crescita hanno una notevole importanza sulla risposta dei protoplasti coltivati. Infatti, il tipo e la concentrazione dei fitoregolatori sono le componenti più studiate e cambiate del mezzo, essendo chiaramente specifiche per i genotipi e i tessuti utilizzati (Evans e Bravo, 1983; Pental e Cocking, 1985; Ochatt e Power, 1992).

Auxine e citochinine sono entrambe normalmente richieste per la divisione dei protoplasti. L'auxina 2,4-D è il fitoregolatore più comunemente usato, ma per alcune specie vengono preferite altre auxine, come il NAA e l'IBA. Assieme alle auxine, la zeatina e la benziladenina sone le due citochinine più frequentemente utilizzate per favorire la divisione e la proliferazione dei protoplasti coltivati di numerose specie. Ci sono solo alcuni lavori in cui si riporta che è stato sufficiente un solo ormone per indurre la divisione di protoplasti con capacità di rigenerare. Le sole auxine bastano per i protoplasti di tabacco (Uchimiya e Murashige, 1976) mentre nel ciliegio acido (*Prunus cerasus* L.) i protoplasti da foglie sono in grado di dividersi in un mezzo che contiene la sola zeatina (Ochatt e Power, 1988b). Nella maggior parte dei sistemi di protoplasti che hanno bisogno di auxine e citochinine, un rapporto auxine/citochinine a favore delle prime è generalmente idoneo a indurre divisioni ripetute. Per i sistemi recalcitranti, invece, come le specie legnose, mezzi ricchi di citochinine sono richiesti per mantenere una continua proliferazione fino allo stato di microcalli. Ciò si è verificato nella maggior parte dei genotipi di *Prunus* studiati (Ochatt, 1992).

## Condizioni di coltura

### SCELTA DELLE CONDIZIONI DI COLTURA

La composizione del mezzo e le condizioni di coltura ottimali dipendono dalla specie e, talvolta, anche dalla varietà/linea (Pental e Cocking, 1985; Evans e Bravo, 1983; Ochatt e Power, 1992). Ciò vale anche per quanto concerne le condizioni ottimali di luce
o buio impiegate durante la coltura.

Molti sistemi non hanno bisogno di luce per iniziare la divisione, mentre altri sono già sensibili alla luce in questa fase. La gamma di temperature normalmente usata è di 25-30°C, ma i protoplasti della maggior parte delle specie crescono a 25°C (Evans e Bravo, 1983; Power et al., 1989; Ochatt et al., 1992). Per qualche specie come *Atropa belladona* (Gosch et al., 1975) e *Lycopersicon peruvianum* (Zapata et al., 1977) la temperatura è risultata critica per la divisione. Quando è necessaria l'illuminazione, le scatole Petri possono ricevere una luce fluorescente continua di bassa intensità, fino a 1000 lux (Evans e Bravo, 1983; Power et al., 1989) oppure essere coltivate sotto un regime di fotoperiodo simile a quello impiegato per parecchi fruttiferi (Ochatt et al., 1992) e per il pero selvatico (Ochatt e Caso, 1986).

## METODI DI COLTURA

I protoplasti possono essere coltivati in parecchie forme a seconda del tipo di esperimenti (Evans e Bravo, 1983; Gamborg et al., 1981; Power et al., 1989). Tra i vari metodi utilizzati i più frequenti sono:

1) coltura in mezzo agarizzato: un volume noto di protoplasti, in sospensione ad una densità doppia di quella iniziale di coltura, viene miscelato con un uguale volume di mezzo agarizzato (1.2%) ancora liquido (a 40°C);

2) coltura in gocce pendenti: piccole gocce (20-40 µl) di sospensioni di protoplasti in mezzo liquido vengono poste in una scatola di Petri, circondate da gocce di mezzo (o acqua) per evitare la loro disidratazione. Le scatole sono poi mantenute in camera umida (Potrykus et al., 1976);

3) liquido sopra agar: uno strato sottile di mezzo agarizzato è versato nelle scatole di Petri e lasciato fermo per qualche minuto fino alla solidificazione, poi un volume uguale di sospensione di protoplasti, alla concentrazione doppia di quella ottinale, è versato sulla superficie del mezzo solidificato. Così la densità iniziale di coltura dei protoplasti viene ridotta alla metà;

4) coltura in pezzi con agarosio: una sospensione autoclavata di agarosio a bassa temperatura di gelificazione, concentrata 4 volte (2.4-4%, P/V') in acqua distillata, viene diluita (1:1) con il mezzo appropriato per la coltura al doppio della concentrazione. Questa sospensione diluita di agarosio viene poi miscelata (1:1) ai protoplasti nel mezzo di coltura, ma al doppio della densità necessaria per la coltura iniziale, e infine viene versata come uno strato sottile nelle Petri (Shillito et al., 1983);

5) coltura di pezzi di agarosio ("bead culture": Shillito et al., 1983): 4.0 ml di una sospensione di protoplasti in mezzo ancora liquido (a 40°C) vengono versati in piccole Petri (di 35-50 mm di diametro). In seguito alla solidificazione, lo strato formato viene tagliato in 4 blocchi della stessa misura che vengono trasferiti in scatole più grosse (90 mm di diametro) contenenti un mezzo liquido con la stessa composizione;

6) coltura in gocce di agarosio: i protoplasti sono sospesi in un mezzo semisolido, poi vengono versati come microgocce (50-150 µl) sul fondo di una Petri e, dopo la loro solidificazione, vengono coperte con un identico mezzo liquido. Questa tecnica è particolarmente interessante per tutti quei protoplasti che sono altamente sensibili alle variazioni osmotiche (ad es. il ciliegio acido, Ochatt e Power, 1988b) oppure quando è difficile ottenere una riduzione graduale della pressione osmotica del mezzo. In questo modo è possibile coprire le gocce all'inizio della coltura con un mezzo privo di sostanze osmoticamente attive e in tal modo assicurare una progressiva diminuzione della pressione osmotica per semplice diffusione (Ochatt et al., 1990).
La tecnica di coltura in agar/agarosio è stata associata a quella dell'utilizzo di protoplasti "nutrici" per migliorare l'efficienza di proliferazione nelle specie recalcitranti. Per fare questo, un preparato di protoplasti appena isolati è irradiato con raggi X, per bloccare la divisione cellulare, poi è miscelato con una sospensione di protoplasti normali e vitali, ma a bassa concentrazione. Infine, questa popolazione mista di protoplasti normali e irradiati viene miscelata con agar/agarosio allo 0.6% e versata nelle scatole Petri (Raveh et al., 1973). Cella e Galun (1980) hanno ideato una tecnica alternativa nella quale ciascuna delle due sospensioni è miscelata separatamente con agar/agarosio e poi vengono versate nelle Petri l'una sopra l'altra. Un'altra tecnica efficace per aumentare la frequenza di divisione dei protoplasti di specie recalcitranti, consiste nella loro co-cultura assieme a protoplasti capaci di rapida divisione (Evans, 1979). Analogamente, cellule albine sono utilizzate come nutrici per colture di protoplasti (soprattutto di foglie) visto che le colonie cellulari derivate da ciascuna fonte possono essere identificate visualmente attraverso il loro colore (Menczel et al., 1978).

## DENSITÀ INIZIALE DI COLTURA

Per la maggior parte dei sistemi, i protoplasti vengono coltivati a una densità tra 5 x 10⁵ e 1 x 10⁷/ml (Evans e Bravo, 1983; Gamborg et al., 1981; Ochatt e Power, 1992) mentre per quanto riguarda le specie recalcitranti, nelle quali le interazioni tra i protoplasti giocano un ruolo chiave nella risposta della coltura. È sempre necessaria una densità iniziale di coltura elevata, di solito maggiore a 1 x 10⁵ protoplasti/ml, come per i cereali (Vasil, 1988) e le specie legnose (Ochatt, 1990; Ochatt et al., 1992).

Recentemente, si è sviluppato un forte interesse verso la coltura di protoplasti singoli, giacchè questo approccio sarebbe particolarmente utile nel contesto della manipolazione genica basata sulla fusione cellula/cellula o sulla selezione di cloni derivati da protoplasti isolati dopo mutagenesi. In questo contesto, Kao e Michayluk (1975) hanno studiato in dettaglio i fabbisogni nutrizionali di cellule e protoplasti di *Vicia hastata* coltivati a concentrazioni comprese tra 2 e 5600 cellule/ml. Successivamente Gleba (1978) e Kao (1977) hanno allargato con successo questa tecnica alla coltura di protoplasti ed eterocarionti singoli di tabacco. Cellule nutrici irradiate sono state anche impiegate come supporto per coltivare protoplasti di tabacco ad una densità ultra-bassa: 5-500/ml (Raveh e Galun, 1975). Più recentemente, Koop e Schweiger (1985) hanno sviluppato un sistema di coltura in microgocce di 20-80 ml di mezzo incluse in una microgoccia di 1 ml di olio minerale, che ha permesso la rigenerazione di piante intere di tabacco cv "Xanthi" da singoli protoplasti. La stessa strategia è stata applicata con successo per la rigenerazione di piante da protoplasti singoli di *Brassica napus* (Spangenberg et al., 1986).

## Risposta dei protoplasti coltivati

### RIGENERAZIONE DELLE PARETI CELLULARI

Il processo di rigenerazione della parete cellulare è stato studiato in particolare con la microscopia elettronica in protoplasti di tabacco (Fowke e Gamborg, 1980; Nagata e Yamaki, 1973). Questi studi hanno mostrato che, nei protoplasti appena isolati, le membrane cellulari presentano microtubuli intorno ai quali sono distribuite le microfibrille di cellulosa appena sintetizzate. Più tradi, questa matrice di cellulosa diventa più spessa e le fibrille si orientano parallele al plasmalemma, formando una parete cellulare continua. La regolarità della rigenerazione della parete cellulare, come la durata del periodo che precede l'inizio della sintesi di cellulosa e la formazione della parete, dipendono in parte dalla
specie studiata, ma anche dal grado di differenziazione delle cellule d'origine dei protoplasti. In questo contesto, i protoplasti della maggior parte delle *Solanaceae* e molte specie del genere *Brassica* formano presto le pareti, in 24-40 ore (Evans e Bravo, 1983; Gamborg et al., 1981). Al contrario, i protoplasti dei cereali (Vasil, 1988) e i protoplasti fogliari delle leguminose (Davey e Power, 1988) possono richiedere fino a 4 giorni per la rigenerazione della parete, mentre un periodo ancora più lungo è necessario per i protoplasti della maggior parte delle specie legnose (McCown e Russell, 1987; Ochatt et al., 1992; Vardi e Galun, 1988).

La gemmazione ("budding") dei protoplasti (dovuta ad una sintesi incompleta della parete) è stata frequentemente osservata in un certo numero di specie, ed è il risultato dell'azione della pressione osmotica sulle parti deboli della parete di nuova sintesi (Fowke e Gamborg, 1980). In genere, la gemmazione si verifica su mezzi subottimali (Evans e Bravo, 1983), in presenza di alte concentrazioni di saccarosio e sorbitolo (Shepard e Totten, 1977), oppure per quelle specie caratterizzate da un fabbisogno ormonale specifico.

## DIVISIONE DELLE CELLULE DERIVATE DA PROTOPLASTI

Molti fattori giocano un ruolo importante sull'inizio e sulla continuazione della divisione cellulare a partire dai protoplasti. Vanno inclusi il genotipo, il substrato (in particolare i fitoregolatori) e le condizioni di coltura (luce e temperatura), lo stato fisiologico (età), i trattamenti sanitari con fertilizzanti sui tessuti utilizzati all'origine per l'isolamento (Evans e Bravo, 1983; Gamborg et al., 1981; Ochatt e Power, 1992).

Durante la prima divisione si può verificare un'incompleta citochinesi, che determina fusioni spontanee e la produzione di protoplasti multinucleati (Fowke e Constabel, 1985). Per quanto riguarda i protoplasti di specie legnose, questa risposta è associata all'aggiunta di concentrazioni elevate di fitoregolatori nel mezzo (specialmente citochinine; Ochatt et al., 1990). In genere, i protoplasti multinucleati sono incapaci di dividersi e proliferare (Evans e Bravo, 1983).

I protoplasti isolati da colture cellulari in attiva crescita (cioè già in uno stato dedifferenziato nel momento dell'isolamento) spesso cominciano a dividersi prima (a volte in metà tempo) rispetto ai protoplasti da mesofilo (Ochatt et al., 1990; Power et al., 1989). Nei protoplasti delle specie legnose raramente trascorre un periodo più breve di 7 giorni prima dell'inizio delle divisioni (Ochatt, 1990; 1992), che giunge fino a 25 giorni nel caso particolare dei protoplasti di cotone (Bhojwani et al., 1977).

Fatta eccezione per i protoplasti delle specie legnose, la prima divisione cellulare si verifica dopo 2-7 giorni di coltura, poi le successive divisioni si susseguono rapidamente per produrre colonie multicellulari (Gamborg et al., 1981).

I protoplasti delle piante superiori, quelli degli alberi in particolare, subiscono una marcata diminuzione della vitalità cellulare, indipendentemente dal mezzo di coltura utilizzato (Ochatt, 1990). Tutto ciò può diventare vantaggioso nella scelta del mezzo e delle condizioni di coltura più adeguate, misurando la diminuzione della vitalità dei protoplasti mantenuti nella soluzione contenente l'osmotico e a bassa temperatura (Ochatt e Patat-Ochatt, 1991).

## FORMAZIONE DI COLONIE CELLULARI E RIDUZIONE DELLA PRESSIONE OSMOTICA DEL MEZZO DI COLTURA

Quando i protoplasti si moltiplicano rapidamente, è necessario aggiungere del substrato di coltura fresco ogni 1-2 settimane circa. Microcalli visibili a occhio nudo si formano sul mezzo iniziale di coltura 2/4 settimane dopo le prime divisioni mitotiche (che
sono più o meno sincronizzate).

Per mantenere le cellule derivate dai protoplasti in continua divisione, è necessario ridurre la pressione osmotica del substrato di coltura iniziale, questo può essere fatto gradualmente aggiungendo del mezzo fresco. Così, i protoplasti coltivati in strati o blocchi semisolidi vengono trasferiti sopra uno strato simile di mezzo con una pressione osmotica ridotta. Invece, per i protoplasti in gocce semisolide, il mezzo liquido circostante è sostituito con un mezzo a minore pressione osmotica, mentre, qualora il mezzo liquido iniziale non contenga sostanze osmoticamente attive, la pressione osmotica nelle gocce viene ridotta gradualmente per semplice diffusione. Infine, nelle colture liquide, la riduzione della pressione osmotica è ottenuta tramite aggiunta in ogni petri di un appropriato volume di substrato privo di agenti osmotici, ad intervalli variabili a seconda della specie.

Per la maggior parte dei sistemi studiati, la prima riduzione della pressione osmotica viene effettuata durante o immediatamente dopo la prima divisione, poi il procedimento è ripetuto quando le colonie cellulari contengono 10.20.30 e 50 cellule. Per i protoplasti più sensibili allo shock osmotico, quali, in genere, quelli da mesofillo (Evans e Bravo, 1983; Power et al., 1989), in particolare per i protoplasti di specie rosacee legnose (Ochatt et al., 1992) e di *Compositae* ornamentali (Al-Atabee e Power, 1989). La pressione osmotica del mezzo di coltura deve essere ridotta più gradualmente e quindi il numero di successive aggiunte deve essere aumentato.

La letteratura in generale indica che l'impiego di un mezzo di diluzione con una pressione osmotica pari al 70-75% di quella del substrato precedente di solito permette una proliferazione continua (Gamborg et al., 1981; Power et al., 1989). In ogni caso, il momento ottimale e il giusto rapporto delle successive diluizioni varia a seconda del genotipo e deve dunque essere determinato sperimentalmente per ogni sistema. Tra i parametri che suggeriscono quando diluire il mezzo troviamo l'imbrunimento e la riduzione della crescita nelle cellule in divisione, mentre la giusta quantità/rapporto di ogni aggiunta può di volta in volta essere stabilito in base al tempo che intercorre tra tale diluizione e la ripresa delle divisioni.

Normalmente, la risposta dei protoplasti coltivati viene espressa in termini di percentuale di efficienza di coltura, sulla base del numero iniziale di protoplasti coltivati (Evans e Bravo, 1983; Gamborg et al., 1981; Power et al., 1989). In questo contesto, Ochatt e Power (1992) hanno suggerito che i contenenti siano fatti in precisi momenti della coltura ed in relazione con la fase particolare di sviluppo, per risolvere la confusione esistente in letteratura. Per evitare i precedenti equivoci è stata quindi suggerita la seguente nomenclatura:

* IPE (efficienza iniziale coltura) = % dei protoplasti inizialmente coltivati che si dividono almeno una volta;

* MPE (efficienza intermedia di coltura) = % dei protoplasti che si dividono per dare colonie di 10 cellule ciascuna;

* FPE (efficienza finale di coltura) = % dei protoplasti inizialmente coltivati che proliferano fino allo stadio di microcallo di 1-2 mm di diametro.

L'indice MPE è importante nella scelta delle condizioni e del substrato di coltura, poichè lo stadio di 10 cellule per colonia è il limite dello sviluppo, dopo il quale le divisioni si fermano se essi non sono adeguati (Ochatt et al., 1992).

## PROLIFERAZIONE DEI MICROCALLI DA PROTOPLASTI

Quando i microcalli derivati dai protoplasti sono costituiti da almeno 100 cellule e dunque visibili (cioè hanno 1-2 mm di diametro), possono essere trasferiti (individualmente
o in gruppi di 20-25) su un mezzo semisolido, sia per tentare direttamente la rigenerazione di piante, come per la maggior parte delle specie erbacee (Evans e Bravo, 1983; Power et al., 1989), sia per passare attraverso una fase supplementare di proliferazione di callo, come per la maggior parte delle specie legnose (Ochatt, 1990; 1992). Questa differenza è necessaria, giacchè nelle specie arboree i microcalli da protoplasti frequentemente imbrunisco-no (a causa dell'accumulo di fenoli) e finiscono per morire se vengono trasferiti direttamente su mezzi di rigenerazione in uno stadio così precoce dello sviluppo (Ochatt et al., 1990; 1992). La necessità di ottenere una massa ben stabilita di callo (circa 125 mm³) prima di tentare la rigenerazione può essere messa in relazione al fatto che, per le specie legnose, la rigenerazione di piante da veri calli è rara (Bajaj, 1986) e, per gli alberi fruttiferi in particolare, la rigenerazione di piante da calli è basata sull'utilizzo di tessuti che contengono ancora porzioni dell'espianto originale (James, 1987). In mancanza di una tale porzione di espianto, come avviene chiaramente nel caso di calli da protoplasti, sembra essere richiesto un periodo più lungo di coltura prima di indurre l'eterogeneità e la polarità nei tessuti, entrambe necessarie per l'organogenesi (Ochatt e Power, 1992; Ochatt, 1990). C'è però il rischio che la coltura, durante un periodo troppo lungo, possa ridurre o perdere la capacità di organogenesi (Evans e Bravo, 1983; Ochatt et al., 1992). Questo periodo di proliferazione supplementare deve quindi essere ridotto al minimo possibile.

Per la maggior parte delle specie e dei tessuti di partenza, i microcalli da protoplasti mantengono una elevata capacità di proliferazione su mezzi di coltura tipo MS (includendo i mezzi N6 (Chu et al., 1975) e WPM (Lloyd e McCown, 1981)), sia sul mezzo B5 (includendo i mezzi KS e Km8 di Kao e Michayluk, 1975). Per quanto riguarda le condizioni di luce e di temperatura ed anche i fitoregolatori, essi sono gli stessi impiegati per la proliferazione di calli degli espianti.

## Elettroporazione di protoplasti e miglioramento delle loro risposte in coltura

Per la maggior parte dei sistemi di protoplasti in cui fino ad ora si è avuto successo, sarebbe desiderabile migliorare l'efficienza di coltura, in particolare la loro capacità di rigenerazione. Inoltre, per i genotipi recalcitranti (come cereali, specie legnose ed alcune specie ornamentali) sarebbe interessante ridurre la durata dell'inevitabile fase che precede l'inizio delle divisioni mitotiche. Studi recenti, che valutano gli effetti dell'elettricità sulle risposte di colture di protoplasti di parecchie specie e tessuti, hanno dimostrato che questo è possibile. Per fare questo, protoplasti isolati sono stati sottoposti a un trattamento di elettroporazione, cioè ad un impulso elettrico di corrente diretta ad alto voltaggio e di breve durata, come quello impiegato negli studi di trasferimento genico diretto nelle specie erbacee (Shillito et al., 1985).

Così, Rech et al. (1987) hanno dimostrato che voltaggi compresi fra 250 e 1000 V/cm e con durate dell'impulso tra 20 e 40 µmsec, favoriscono una più precoce divisione cellulare, ed un aumento significativo dell'efficienza di coltura, sia nelle specie erbacee (Glycine, Solanum) che in quelle legnose (Prunus, Pyrus). Di conseguenza, un numero significativamente più elevato di microcalli viene prodotto da protoplasti elettroporati rispetto ai protoplasti di controllo.

Gli effetti dell'elettromanipolazione di protoplasti si sono manifestati anche successivamente nel ciliegio "Colt", nel pero "Conference" e nella specie medicinale legnosa Solanum dulcamara, con un miglioramento significativo della capacità di proliferazione del callo, di rigenerazione di germogli e della radicazione dei germogli ottenuti da protoplasti elettroporati (Ochatt et al., 1988; Chand et al., 1988; Ochatt, 1992). È anche importante far notare, in questo contesto, che tale miglioramento alle risposte in coltura si
è mantenuto per lungo tempo per il ciliegio "Colt", dove questi effetti promotori sono stati osservati anche dopo un gran numero di subcolture successive (Ochatt et al., 1988b).

In altri esperimenti, protoplasti ottenuti da sospensioni cellulari di *Solanum dulcamara* e di *Prunus avium x pseudocerasus* (ciliegio "Colt") sono stati marcati con timidina triziata, e poi è stata misurata la sua incorporazione nei composti acidi precipitabili, indice della sintesi di DNA per i protoplasti coltivati. Si è dimostrato che la sintesi di DNA era significativamente maggiore nei protoplasti elettroporati (Rech et al., 1988).

L'analisi dei risultati di tutti questi studi indica che la spiegazione più valida per le risposte osservate si trova nel miglioramento della sintesi di DNA, con una più precoce attivazione dei geni che controllano i primi stadi della differenziazione. Tutto ciò è poi associato ad una modificazione permanente della membrana che conduce ad un maggiore assorbimento dei componenti del substrato di coltura.

Infine, un altro significativo effetto dell'elettroporazione è stato verificato nella fusione di protoplasti, giacchè protoplasti parentali elettroporati prima della loro fusione chimica forniscono un numero significativamente più grande di eterocarionti rispetto al controllo (Ochatt et al., 1989; Ochatt e Patat-Ochatt, 1992). In più, tali eterocarionti possiedono una migliore capacità di proliferazione, quindi questa tecnica può anche servire per la selezione di calli derivati da prodotti di fusione.

## RIGENERAZIONE DI PIANTE DA CALLI OTTENUTI DA PROTOPLASTI

Fino a poco tempo fa, la rigenerazione di piante da protoplasti isolati era considerata come un fenomeno ristretto alla sola famiglia delle *Solanaceae* e, quindi, anche fino ad oggi, molte specie dei generi *Nicotiana*, *Petunia* e *Solanum* sono state impiegate come sistema modello nello sviluppo della tecnologia dei protoplasti (Evans e Bravo, 1983; Power et al., 1989), negli ultimi anni, però, la tecnologia dei protoplasti si è sviluppata rapidamente e ora è possibile rigenerare piante intere da protoplasti in un numero crescente di specie di diverse famiglie, sia monocotiledoni che dicotiledoni.

Nonostante questo sviluppo, le leguminose (Hammatt et al., 1987), i cereali (Vasil, 1988) e le specie legnose in genere (McCown e Russell, 1987; Ochatt et al., 1992) rimangono piante difficili e la rigenerazione di intere piante dai loro protoplasti è ancora limitata ad un numero ridotto di genotipi e tessuti di origine.

Di seguito vengono riportate le risposte ottenute nelle specie legnose, ed in particolare nelle piante legnose da frutto delle *Rosaceae*.

### Melo

Nonostante l'importanza economica mondiale del melo e il numero relativamente elevato di articoli sulla tecnologia dei protoplasti esistente in letteratura, la rigenerazione di intere piante è riuscita solamente per un piccolo numero di genotipi (Patat-Ochatt, 1992).

Il primo esempio di successo è quello dei portinnesti M.9 e M.106 e della varietà "Spartan" (Patat-Ochatt et al., 1988). Un anno più tardi, Wallin e Johansson (1989) hanno riportato la rigenerazione di piante del genotipo colonnare A1583, seguita nel 1990 dalla descrizione di metodi che permettono un netto miglioramento della quantità e qualità delle piante rigenerate del portinnesto M.106 (Patat-Ochatt e Power, 1990) basati sull'utilizzo di concentrazioni doppie delle vitamine B nel mezzo di rigenerazione.

Nel 1991, Huancaruna-Perales e Schieder hanno riportato la rigenerazione da protoplasti isolati di piantine da seme delle varietà "Gala" e "Florina", mentre Patat-Ochatt
et al. (1992) sono riusciti a rigenerare da protoplasti isolati da foglie e fusti di un genotipo aploide di "Golden Delicious". Quest'ultimo è stato il primo esempio di successo con protoplasti da fusti per una specie legnosa.

È interessante sottolineare che sono state notate differenze nei fabbisogni di coltura tra i protoplasti delle varietà e quelli dei portinnesti, giacchè i primi forniscono risposte positive sul mezzo modificato di Kao e Michayluk (1975), mentre i protoplasti dei portinnesti preferiscono un substrato MS modificato ed arricchito con una miscela complessa di componenti organici. È interessante far notare che l'impiego di forti concentrazioni di citochinine, utilizzate in combinazione, nel mezzo di rigenerazione è necessaria per indurre la caulogenesi su calli da protoplasti di melo (Patat-Ochatt. 1992).

### Pero

A differenza del melo (come del resto succede per tutte le altre *Rosaceae* legnose da frutto), il pero ha ricevuto una scarsa attenzione in termini di sviluppo e applicazione di approcci biotecnologici di miglioramento, e quindi gli articoli sull'isolamento e sulla coltura di protoplasti di pero sono scarsi (Ochatt. 1992).

Ciò nonostante, una forma di pero selvatico, *Pyrus communis* var *pyraster* L., è stato il primo esempio di successo nella rigenerazione di piante intere da protoplasti nelle rosacee legnose da frutto (Ochatt e Caso, 1986), ed anche il primo caso di individuazione di variabilità protoclonale in piante rigenerate di specie legnose (Ochatt, 1987).

Nel 1988, Ochatt e Power hanno ottenuto rizogenesi da calli da protoplasti nella varietà "Conference", ed anche la rigenerazione di piante nella varietà "Williams". Nel 1990, intere piante della varietà "Conference" sono state prodotte attraverso una tecnica indiretta, a partire da calli rizogenici ottenuti precedentemente (Ochatt, 1990).

Recentemente, sono state anche rigenerate intere piante da protoplasti fogliari nella varietà "Passa Crassana" e nel portinnesto "Old Home" (Ochatt et al., 1992), come nella varietà "Comice" e nel portinnesto OHF333 (Ochatt, 1992).

Per tutti i genotipi di pero studiati fino ad oggi, è stato necessario l'impiego di un mezzo MS senza ioni ammonio per indurre la proliferazione continua delle cellule derivate da protoplasti (Ochatt, 1992). Inoltre, indipendentemente dal tessuto di partenza, i protoplasti dei portinnesti hanno evidenziato fabbisogni in componenti organici maggiori rispetto ai protoplasti delle varietà, come già descritto per il melo.

### Prunus sp.

Tra le diverse specie di drupacee studiate fino ad oggi, è importante sottolineare il fatto che solo nel ciliegio e nel susino è stata ottenuta la rigenerazione di intere piante da protoplasti.

Il primo esempio di rigenerazione a partire da protoplasti di *Prunus* è stato quello del portinnesto di ciliegio "Colt" (*P. avium* x *pseudocerasus*), col quale sono state ottenute piante da protoplasti di foglie (Ochatt et al., 1987), ed anche da protoplasti da sospensioni cellulari (Ochatt et al., 1988). Quest'ultimo è stato il primo esempio nelle specie legnose di organogenesi a partire da calli, ottenuti da protoplasti di origine diversa da quella fogliare.

Intere piante sono anche state rigenerate da protoplasti dei cloni di ciliegio acido CAB 4D e CAB 5H, e ciò attraverso una tecnica originale di induzione di caulogenesi sulle radici ottenute normalmente su calli da protoplasti (Ochatt e Power, 1988).

La stessa strategia è stata applicata più tardi da Ochatt (1990) con protoplasti del ciliegio acido CAB 4D.
Più recentemente, la rigenerazione di intere piante è riuscita anche partendo da protoplasti fogliari del portinnesto clonale di ciliegio dolce (P. avium L.) clone "Pontavium" (Ochatt, 1991). P. avium, infatti, risultava essere il più recalcitrante tra tutte le specie di Prunus studiate, e soltanto lo sviluppo di nuove tecniche originali di coltura ha permesso di ottenere buoni risultati con questa specie. Ad esempio, l'aggiunta di una forte concentrazione di glicina (0.2 M) al mezzo colturale dei protoplasti e in tutte le fasi successive di coltura è stata la chiave della riuscita nella rigenerazione di questi genotipi (Ochatt, 1991).

Infine, oltre ai ciliegi, le uniche specie di *Prunus* dove è riuscita la rigenerazione di piante da protoplasti sono un clone di mirabolano (P. cerasifera cl. P2980) e il clone P51 della specie ornamentale di susino *P. spinosa* (Ochatt, 1992), mentre studi recenti in albi-cocco (P. armeniaca) hanno condotto alla sporadica rigenerazione su calli ottenuti da protoplasti da foglie del clone ibrido H146 (Ochatt, non pubblicato).

## Selezione in vitro e induzione di variabilità protoclonale

Sono stati pubblicati solamente quattro articoli in questo settore di ricerca per quanto riguarda le specie frutticole di Rosaceae (Brisset et al., 1990; Ochatt, 1987; Ochatt e Power, 1989a,b). Tra questi una sola pubblicazione ha evidenziato l'assenza di variazione protoclonale spontanea tra le piante dei genotipi di pero Passa Crassana ed Old Home, mediante l'analisi dei profili isozemimatici delle piante rigenerate a confronto con piante micropropagate degli stessi genotipi (Ochatt et al., 1992).

Ciò è interessante, perchè evidenzia il fatto che questo fenomeno non sembra essere generalizzabile per tutti i genotipi di pero, giacchè nel pero selvatico si è trovata questa variabilità protoclonale spontanea (Ochatt, 1987). Infatti, sono stati idenficiati 6 protocloni differenti di questo genotipo, caratterizzati da una diversa capacità di proliferazione, rigenerazione e radicazione, talvolta associate a modificazioni del livello di ploidia (Ochatt, 1987).

In un altro lavoro, protoplasti di pero "William", "Passa Crassana" ed "Old Home" sono stati co-coltivati con *Erwinia amylovora*, agente responsabile del colpo di fuoco del-le Pomoideae. In questo studio, i protoplasti dei tre genotipi sono stati coltivati assieme a due ceppi del batterio, dei quali uno è quello più aggressivo esistente in Europa (CFBP1430) e l'altro un mutante di questo completamente non-aggressivo (PMV6046). I risultati sono stati espressi in termini di vitalità e capacità di proliferazione dei protoplasti. Ciò ha permesso lo sviluppo di una efficace strategia di selezione precoce di genotipi, in funzione della tolleranza al batterio, visto che le risposte osservate nei protoplasti sono risultate essere correlate positivamente con le risposte ben note delle piante intere in cam-po (Brisset et al., 1990).

Dopo questi studi, nuove ricerche sono state condotte, aumentando il numero di genotipi di pero e di ceppi batterici saggiati, osservando le colture fino alla rigenerazione di piante dai calli derivati da protoplasti coltivati in presenza del batterio. L'analisi di que-ste piante sembra suggerire l'induzione di variazione protoclonale tra i rigenerati (Ochatt, Paulin e Chevreau, in preparazione).

Per quanto riguarda le rimanenti pubblicazioni, entrambe riguardano studi di selezio-ne per il miglioramento della tolleranza a salinità e siccità con protoplasti del portainnesto Colt (Ochatt e Power, 1989a,b). Il primo lavoro (Ochatt e Power, 1989a) ha permesso la produzione di callo e di intere piante in grado di tollerare l'NaCl, KCl. Na₂SO₄ (stress sa-lino) e il mannitolo (stress idrico) fino a una osmolalità di 682 mOsm/kg. Per fare questo è stata ideata una tecnica originale di selezione ricorrente diretta, secondo la quale i calli
venivano trasferiti successivamente su mezzi con e senza l'agente di stress, per garantire l'assenza di fenomeni di adattamento fisiologico tra le cellule e i tessuti selezionati. Inoltre, la stabilità della tolleranza acquisita è stata confermata dalle piante ottenute.

L'ultimo lavoro in questo settore, riguarda lo studio della base cellulare della tolleranza alla salinità acquisita, e ha dimostrato che essa è strettamente correlata con la rigenerazione della parete cellulare per i protoplasti mantenuti in presenza di stress salino (Ochatt e Power, 1989b).

### Ibridazione somatica tra protoplasti di alberi da frutto nelle Rosaceae

Finora una sola volta è riuscita la rigenerazione di ibridi somatici per i fruttiferi appartenenti alle Rosaceae (Ochatt et al., 1989). In questo lavoro, protoplasti fogliari di pero selvatico (*Pyrus communis* var *pyraster* L.) sono stati fusi chimicamente con protoplasti ottenuti da sospensioni cellulari del ciliegio Colt (*Prunus avium* x *pseudocerasus*), a seguito di elettroporazione. È stata rilevata una efficienza di coltura molto bassa. Ciò nonostante sono stati prodotti alcuni calli in grado di mantenere una continua proliferazione che, dopo essere stati trasferiti su mezzi di rigenerazione, hanno originato 3 ibridi somatici. Dopo la radicazione dei germogli rigenerati, sono state prodotte intere piante da due dei tre cloni originali. L'analisi del fenotipo, del numero di cromosomi e dei profili isoenzimatici hanno confermato l'origine per ibridazione somatica delle piante rigenerate (Ochatt et al., 1989).

L'obiettivo di questa fusione era quello di produrre nuovi genotipi, utili come portinnesti per i fruttiferi di entrambe le 2 sottofamiglie, *Pomoideae* e *Prunoideae*. Successivi esperimenti condotti con le piante ibride hanno studiato la loro compatibilità tissutale, come callo ed anche mediante microinnesti tra queste piante e diversi genotipi delle due sottofamiglie, dimostrando che le piante ibride si sono comportate come compatibili, almeno in vitro, per tutte le combinazioni saggiate (Ochatt e Patat-Ochatt, 1992).

Questi risultati evidenziano la potenzialità della fusione di protoplasti come metodo per la creazione di variabilità genetica.

## CONCLUSIONI

Facendo particolare riferimento alle specie legnose, il miglioramento genetico convenzionale è solitamente reso difficile a causa di vari problemi, quali la sterilità, l'apomissia, i lunghi cicli riproduttivi, una fase giovanile abbastanza lunga ed il rischio di depressione per consanguineità. Per tutti questi motivi, queste specie risultano essere i soggetti ideali per il miglioramento mediante metodi biotecnologici, ed in particolare basati sull'impiego dei protoplasti.

Così, la variabilità protoclonale indotta assieme all'ibridazione somatica potrebbero permettere il superamento delle barriere esistenti al flusso genico e quindi la creazione di nuovi genotipi di interesse agronomico.

Malgrado questo, sono già passati trent'anni dall'inizio della tecnologia dei protoplasti ma solamente in questi ultimi dieci si è riusciti ad applicare questa tecnica con successo agli alberi da frutto. L'abilità nel rigenerare piante intere dipende ancora dall'utilizzo di strategie generalmente empiriche per questo gruppo di specie. Ciò nonostante il continuo sviluppo di nuove strategie per la coltura di protoplasti e i recenti progressi nella rigenerazione di piante e nell'ibridazione somatica continuano ad assottigliare rapidamente le differenze esistenti tra le specie erbacee e quelle legnose, includendo in queste ultime gli alberi da frutto.
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