## 2.3. Concentrations en glucides totaux dans les organes végétaux

Lors de l'échantillonnage du printemps, les feuilles et les racines des plantes issues des anneaux enrichis en CO₂ présentent une concentration en glucides totaux plus importante que celles des plantes issues des anneaux ambiants (P=0,019 et P=0,011 respectivement dans les feuilles et dans les racines ; Figure 24 a, b, Tableau 10).

Lors de l'échantillonnage d'automne, il n'y a pas de différence significative entre les concentrations en glucide totaux dans les feuilles des plantes issues des deux niveaux de CO₂ (P=0,361). En revanche, la concentration en glucides totaux dans les racines des plantes issues des anneaux enrichis en CO₂ est significativement plus élevée que celle des racines des plantes issues des anneaux ambiants (P=0,020 ; Figure 24 c, d ; Tableau 10).

Le fort apport d'azote augmente la concentration en glucide dans les feuilles seulement lors de l'échantillonnage du printemps (P=0,007 ; Figure 24 a). Dans tous les autres cas, l'apport d'azote n'influence pas la concentration en glucides totaux dans la plante.

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 24: Concentrations en glucides totaux exprimées en mol de glucide par kg d'échantillon en équivalent hexose, dans les feuilles (a, c) et dans les racines (b, d) après les échantillonnages du printemps (a, b) et de l'automne (c, d) au sein des monocultures de ray grass, pour deux niveaux de fertilisation azotée. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).</figcaption></figure>
## 2.4. Quantités de carbone dans la biomasse microbienne

La biomasse microbienne (mg C kg⁻¹ de sol) du SA n'est pas significativement affectée par l'élévation du CO₂ lors du prélèvement effectué au printemps, alors qu'elle est diminuée à l'automne (P<0,001; Figure 25, Tableau 10). La biomasse microbienne du SNA reste inchangée quelle que soit la date d'échantillonnage. Une biomasse microbienne plus importante dans le SA que dans le SNA est observée sous niveau ambiant de CO₂.

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Figure 25: C microbien (mg C kg⁻¹ de sol) du sol adhérent (SA) et non adhérent (SNA) lors des échantillonnages du printemps (a, c) et de l'automne (b, d) au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère ambiante ou enrichie en CO₂, sous deux niveaux de fertilisation. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

## 2.5. Cinétique de minéralisation du carbone total et des composés organiques ¹⁴C (C rhizodéposé et turnover de la biomasse microbienne marquée) dans le sol adhérent

Lors de l'expérience menée à l'automne, nous avons mesuré le devenir du carbone dans le sol en effectuant une cinétique du CO₂ total et du ¹⁴CO₂ respirés au niveau du sol adhérent. La période d'incubation du sol adhérent après la récolte est de 30 jours.
La fertilisation azotée n'a pas d'influence sur la minéralisation de la matière organique (évolution du carbone total) et des composés organiques marqués (¹⁴C).

Immédiatement après l'échantillonnage (48h après le marquage et avant la période d'incubation), la quantité de ¹⁴C présente dans le sol adhérent est significativement plus élevée sous CO₂ ambiant que sous CO₂⁺ (80 Bq g⁻¹ de SA sous CO₂ ambiant contre 64 Bq g⁻¹ de SA sous CO₂⁺, moyenne des deux niveaux d'azote ; P=0,024). Les cinétiques de minéralisation du carbone total et du ¹⁴C indiquent qu'à la fin de l'incubation (30 jours), les quantités de C total et de ¹⁴C minéralisées (exprimée en mg C g⁻¹ de sol adhérent pour le C total et en Bq g⁻¹ de sol adhérent pour le ¹⁴C) sont significativement plus élevées sous CO₂⁺ que sous CO₂ ambiant (P<0,001 pour le carbone total et pour le carbone 14 ; Figure 26a et 27). De même, les flux de minéralisation du C total et du ¹⁴C (quantité totale de C et de ¹⁴C respirée par unité de temps en mg g⁻¹ SA jour⁻¹ et Bq g⁻¹ SA jour⁻¹) sont significativement plus élevés sous CO₂ élevé (0,049 mg C g⁻¹ SA jour⁻¹ et 0,81 Bq g⁻¹ SA jour⁻¹, moyenne des traitements azotés) que sous CO₂ ambiant (0,034 mg C g⁻¹ SA jour⁻¹ et 0,63 Bq g⁻¹ SA jour⁻¹, moyenne des traitements azotés) (P<0,001 et P=0,012 respectivement pour le carbone total et le ¹⁴C).

Trente % du ¹⁴C initialement présent dans le sol adhérent sont minéralisés sous CO₂ ambiant alors que 44% du ¹⁴C initialement présent dans le sol adhérent sont minéralisés sous CO₂ élevé, à l'issue des 30 jours d'incubation (moyenne des deux niveaux de fertilisation) P=0,002 ; Figure 26b).
<figure><img src="image_34.png" /></figure>

Figure 26 a et b: Production de ¹⁴CO₂ pendant l'incubation de sol adhérent (SA) exprimée en Bq respiré par g de sol adhérent (SA) (26a) et en % de ¹⁴C présent au début de l'incubation dans le sol (26b) lors de l'échantillonnage de l'automne au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère enrichie ou ambiante en CO₂, sous deux niveaux de traitement azoté. Les points sont reliés par une courbe de tendance logarithmique afin de faciliter la lecture. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Figure 27: Production de CO₂ pendant l'incubation de sol adhérent (SA) exprimée en mg de C respiré par g de sol adhérent (SA) lors de l'échantillonnage de l'automne au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère enrichie ou ambiante en CO₂ sous deux niveaux de traitement azoté. Les points sont reliés par une courbe de tendance logarithmique afin de faciliter la lecture. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).
## 2.5. Quantités de carbone total dans le sol et ratio C/N

La quantité moyenne de carbone dans le sol sur une profondeur de 0 à 20 cm est comprise entre 6178 et 7108 g m⁻² (sol adhérent et sol non adhérent confondu) lors du prélèvement effectué au printemps. A l'automne, ces valeurs sont comprises entre 5718 et 6578 g m⁻². Ainsi, aucune différence significative n'est observée entre chaque traitement.

<table><caption>Tableau 10 : Résultats des analyses statistiques des différents paramètres : production de biomasse, répartition du ¹⁴C, du ¹⁵N. et carbone microbien du sol adhérant et du sol non adhérent. Les effets CO₂, azote (N) et les interactions CO₂ X N sont testés et considérés comme significative au seuil de 5%.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Variables</th><th colspan="4">Printemps</th><th colspan="4">Automne</th></tr><tr><th colspan="2">CO₂</th><th colspan="2">N</th><th colspan="2">N X CO₂</th><th colspan="2">CO₂</th></tr><tr><th></th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="9"><strong>Production de biomasse</strong></td></tr><tr><td>Parties aériennes</td><td>0,011</td><td>0,923</td><td>20,31</td><td>&lt;0,001</td><td>0,821</td><td>0,371</td><td>3,331</td><td>0,142</td></tr><tr><td>Racines</td><td>0,015</td><td>0,909</td><td>4,836</td><td>0,033</td><td>0,001</td><td>0,983</td><td>1,625</td><td>0,271</td></tr><tr><td>Totale</td><td>0,001</td><td>0,992</td><td>4,183</td><td>0,047</td><td>0,394</td><td>0,533</td><td>3,246</td><td>0,148</td></tr><tr><td>PR/PA</td><td>3,421</td><td>0,138</td><td>16,13</td><td>&lt;0,001</td><td>1,373</td><td>0,248</td><td>2,162</td><td>0,215</td></tr><tr><td colspan="9"><strong>Répartition du <sup>14</sup>C %RTR</strong></td></tr><tr><td>Parties aériennes</td><td>0,307</td><td>0,609</td><td>20,86</td><td>&lt;0,001</td><td>0,068</td><td>0,795</td><td>6,534</td><td>0,062</td></tr><tr><td>Compartiment souterrain</td><td>0,275</td><td>0,627</td><td>20,74</td><td>&lt;0,001</td><td>0,073</td><td>0,788</td><td>6,851</td><td>0,058</td></tr><tr><td>Racines</td><td>1,991</td><td>0,231</td><td>3,057</td><td>0,088</td><td>0,093</td><td>0,761</td><td>0,784</td><td>0,425</td></tr><tr><td>RR</td><td>0,091</td><td>0,777</td><td>7,151</td><td>0,011</td><td>0,035</td><td>0,851</td><td>4,492</td><td>0,101</td></tr><tr><td>Sol</td><td>0,247</td><td>0,645</td><td>6,622</td><td>0,014</td><td>0,117</td><td>0,733</td><td>7,980</td><td>0,047</td></tr><tr><td colspan="9"><strong>Répartition du <sup>15</sup>N %NDFA</strong></td></tr><tr><td>Feuilles</td><td>79,52</td><td>&lt;0,001</td><td>8,575</td><td>&lt;0,001</td><td>0,736</td><td>0,396</td><td>39,70</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>Tiges</td><td>23,86</td><td>&lt;0,001</td><td>6,765</td><td>&lt;0,001</td><td>0,564</td><td>0,476</td><td>4,209</td><td>0,015</td></tr><tr><td>Racines</td><td>0,221</td><td>0,640</td><td>1,675</td><td>0,203</td><td>0,173</td><td>0,679</td><td>0,544</td><td>0,465</td></tr><tr><td>Sol adhérent</td><td>0,342</td><td>0,522</td><td>2,062</td><td>0,159</td><td>0,574</td><td>0,452</td><td>32,13</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td colspan="9"><strong>Concentration en sucre totaux</strong></td></tr><tr><td>Feuilles</td><td>14,19</td><td>0,019</td><td>7,822</td><td>0,007</td><td>0,144</td><td>0,705</td><td>1,055</td><td>0,361</td></tr><tr><td>Racines</td><td>19,73</td><td>0,011</td><td>19,73</td><td>0,011</td><td>0,117</td><td>0,733</td><td>5,872</td><td>0,02</td></tr><tr><td colspan="9"><strong>Carbone microbien</strong></td></tr><tr><td>Sol adhérent</td><td>0,908</td><td>0,394</td><td>0,851</td><td>0,361</td><td>0,005</td><td>0,983</td><td>42,91</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>Sol non adhérent</td><td>2,943</td><td>0,156</td><td>0,032</td><td>0,858</td><td>0,443</td><td>0,510</td><td>0,926</td><td>0,389</td></tr></tbody></table>
### III. Discussion

#### 3.1. Production de biomasse et répartition des photo-assimilats dans le système plante-sol

Dans les premiers mois suivant la mise en place du dispositif FACE Suisse en 1993, il a été montré que la production de biomasse des plantes n'était pas significativement stimulée par l'enrichissement de l'atmosphère en CO₂ (Hebeisen et al., 1997). Nos résultats de production de biomasse lors de l'échantillonnage de printemps (après une courte période d'exposition des plantes à une concentration élevée en CO₂), corroborent ces précédentes observations, puisque l'élévation du CO₂ n'influence pas significativement la production de biomasse totale des plantes au printemps.

En revanche, les effets de la fertilisation azotée sont plus prononcés que ceux du CO₂ atmosphérique. Un apport élevé d'azote stimule la production de biomasse totale ainsi que celle des parties aériennes mais diminue le ratio de biomasse PR/PA. On constate logiquement qu'un apport élevé d'azote stimule l'allocation de carbone récent aux parties aériennes des plantes et réduit l'allocation de carbone récent au compartiment souterrain, alors que l'élévation du CO₂ n'a aucune influence sur la répartition du carbone dans le système plante-sol. Ces effets sont typiquement rencontrés chez des plantes dont la croissance a été stimulée par un apport conséquent d'azote (Johansson, 1992; Marschner et al., 1996; Henry et al., 2005); les plantes bien pourvues en N privilégient l'allocation des assimilats aux parties aériennes ce qui a pour conséquence de diminuer le ratio PR/PA.

Les résultats sont nettement différents pour l'échantillonnage effectué à l'automne, pour lequel les plantes ont été défoliées et fertilisées 3 fois, alors qu'au printemps les plantes n'ont été défoliées et fertilisées qu'une seule fois. Ainsi, à l'automne, une interaction entre les effets CO₂ et les effets azote est observée pour la production de biomasse des parties aériennes. Une stimulation de la biomasse des parties aériennes apparaît lors d'un apport important d'azote. Par conséquent, la disponibilité en azote dans le système apparaît comme le moteur de la réponse de la croissance des parties aériennes au CO₂, confirmant ce qui a été démontré précédemment sur le même dispositif (Hebeisen et al., 1997; Daepp et al., 2000). Les études précédentes expliquent que cette réponse peut être une conséquence de la défoliation. En effet, après une défoliation, la biomasse résiduelle des parties aériennes n'est pas la même sur une parcelle où l'apport d'azote est élevé par rapport à une parcelle où l'apport d'azote est
plus faible. La densité de méristèmes actifs subsistant après la défoliation est plus élevée lors d'une fertilisation azotée forte que lors d'une fertilisation azotée faible, due à une densité de talles plus élevée (Schneider, 2003). Ainsi, la croissance des parties aériennes des plantes défoliées est favorisée suite à un apport important d'azote.

La biomasse racinaire ainsi que le ratio de biomasse PR/PA ne sont pas stimulés par l'élévation du CO2. Ces données vont à l'encontre des résultats précédents montrant une stimulation de la biomasse racinaire, engendrant un ratio PR/PA plus élevé sous CO2 élevé (Casella et Soussana, 1997; Loiseau et Soussana, 1999 Daepp et al., 2001; Soussana et al., 1996; Suter et al., 2002). Une des raisons à ce résultat pourrait être une limitation de la croissance racinaire par les cylindres en PVC. Cependant, cela ne semble pas être le cas puisque le volume de sol du cylindre n'a pas été complètement exploré par les racines lors de la récolte des plantes. La densité moyenne de racines dans chaque cylindre est comprise entre 1,6 et 5 mg de racine par cm⁻³ de sol. La courte période de croissance des plantes est probablement le facteur explicatif de ce résultat.

Lors de l'échantillonnage de l'automne, sous CO2 élevé et après un fort apport d'azote, en accord avec la stimulation de biomasse des parties aériennes, le carbone récemment assimilé est préférentiellement alloué aux parties aériennes des plantes et par conséquent, l'allocation de carbone récent au compartiment souterrain est proportionnellement réduite. Il en résulte une diminution de la croissance microbienne, certainement limitée par la disponibilité en carbone dans le sol, plus que par la disponibilité en azote dans le sol (aucun effet de la fertilisation n'est observée sur le carbone de la biomasse microbienne du sol adhérent). Si on admet que la biomasse microbienne est corrélée avec les flux de carbone libérés par les racines (Darrah, 1991), plus particulièrement la rhizodéposition, les flux de rhizodéposition sont réduits par une élévation de la concentration en CO2 de l'atmosphère, lors de l'échantillonnage d'automne. La taille du système racinaire étant inchangée par le CO2, il est probable que l'exsudation spécifique soit diminuée (par g de racine, par longueur de racine ou encore par site d'exsudation).

Les flux spécifiques nets d'entrée de carbone dans le système plante-sol sont réduits sous CO2 élevé (P=0,036 ; Tableau 11 ; exprimé en KBq retrouvé par g⁻¹ de parties aériennes) indiquant que l'assimilation nette de CO2 était certainement plus faible sous CO2 élevé que sous CO2 ambiant au moment de notre expérimentation. Ainsi, une acclimatation de la photosynthèse sous CO2 élevé peut être supposée (Ainsworth et al., 2003 a; b). La concentration en glucides totaux dans la plante augmentant, celle-ci a pu engendrer une acclimatation de la
photosynthèse comme cela a déjà pu être observé chez *Lolium perenne* (Fischer *et al.*, 1997). En effet, l'expression des gènes contrôlant la photosynthèse est directement dépendante du métabolisme des glucides dans la plante (Sheen, 1994). L'augmentation de la concentration en glucide, due à la repousse suite à une défoliation est exacerbée par le CO₂ élevé (Fischer *et al.*, 1997). Notre échantillonnage d'automne intervient suite à 3 défoliations des plantes, la dernière défoliation ayant eu lieu 25 jours plus tôt. Nos analyses de la concentration en glucides totaux des tissus foliaires ne montrent aucune différence entre les deux traitements CO₂. Néanmoins, la concentration en glucides totaux dans les tissus racinaires est significativement augmentée chez les plantes CO₂⁺. Ainsi pendant les jours ayant précédé notre échantillonnage, une acclimatation de la photosynthèse a pu avoir lieu, en raison d'une accumulation de glucides dans les tissus foliaires et racinaires (régulation de la photosynthèse par l'activité puits). Du fait d'une réduction de l'activité photosynthétique, les glucides présents en grande quantité dans les tissus de la plante sont utilisés pour la croissance et la maintenance de la plante. Par la suite, la diminution de la concentration en glucide dans les feuilles permet de restaurer l'équilibre source-puits. L'acclimatation de la photosynthèse peut être également un effet du CO₂ dépendant de la saison, comme cela été observé sur le même dispositif mais sur des plants de *Trifolium repens* à l'automne (Ainsworth *et al.*, 2003b).

La défoliation, la fertilisation, le rythme des saisons ponctuent le développement d'une prairie gérée de manière intensive, les flux de rhizodéposition dépendent de l'ensemble de ces facteurs.

<table><caption>Tableau 11 : Flux spécifiques nets d'entrée de ¹⁴C dans le système plante-sol exprimés en KBq retrouvé par g⁻¹ de parties aériennes, après l'échantillonnage d'automne pour les deux niveaux de CO₂ (CO₂⁺ : enrichi, CO₂⁻ : ambiant) et les deux niveaux de fertilisation (56 et 14 g. m⁻²). Les valeurs entre parenthèses correspondent aux intervalles de confiance, n=3. On fait l'hypothèse que la respiration des parties aériennes (non mesurée dans notre étude) n'est pas modifiée par l'enrichissement en CO₂.</caption><thead><tr><th></th><th>Apport d'azote<br>(g.m<sup>-2</sup>)</th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>+</td><td>56</td><td>263 (74,9)</td><td></td></tr><tr><td>14</td><td>295 (52,9)</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub></td><td>56</td><td>400 (74,4)</td><td></td></tr><tr><td>14</td><td>392 (58,1)</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">Statistiques</td><td></td><td>Valeur de F</td><td>Proba</td></tr><tr><td>CO<sub>2</sub></td><td>4,71</td><td>0,036</td></tr><tr><td>N</td><td>0,03</td><td>0,858</td></tr><tr><td></td><td>N X CO<sub>2</sub></td><td>0,1</td><td>0,743</td></tr></tbody></table>
## 3.2. Concentration en carbone total du sol et devenir des photoassimilats récents dans la rhizosphère

La stimulation de la production de biomasse des plantes sous CO₂ élevé, observée à l'automne, est le résultat, à l'échelle de la repousse, d'une stimulation de l'activité photosynthétique. Par conséquent, du fait de cette quantité de carbone entrant dans la plante plus importante, les entrées de carbone dans le sol (litière aérienne, rhizodéposition, renouvellement racinaire) auraient du être accrues augmentant ainsi la concentration en carbone total du sol. Nos données montrent d'une part qu'après 9 années consécutives d'enrichissement en CO₂ de l'atmosphère, les flux de rhizodéposition ne sont pas affectés au printemps et diminués à l'automne par le CO₂. D'autre part, aucun changement significatif de la concentration en carbone total du sol n'a été constaté. Ces données sont confirmées par des résultats précédents obtenus sur le même site (Van Kessel et al., 2000 a, b ; Horwath et al., 2000; Van Groeningen et al., 2002 ; de Graff et al., 2004). La teneur équivalente en carbone total du sol entre les deux niveaux de CO₂ peut également s'expliquer par :

- la difficulté de déceler une faible variation du pool de C total sous l'influence de la plante

- l'absence de modifications des flux entrants de C dans le sol

- un turnover plus rapide du carbone labile supplémentaire issu de la plante et entrant dans la rhizosphère sous CO₂ élevé (Horwath et al., 2000).

De Graff et al. (2004) observent sur le système FACE Suisse que le sol des parcelles de L. perenne après 9 années d'exposition à des teneurs enrichies en CO₂ et un apport d'azote faible montre une respiration significativement plus élevée que le sol issu des parcelles ambiantes en CO₂.

En effet, nos résultats montrent que le taux de minéralisation du carbone (carbone 14 rhizodéposé et carbone total) est plus élevé dans le sol adhérent des plantes enrichies, ce, malgré une biomasse microbienne de plus petite taille. Deux hypothèses peuvent être formulées pour expliquer cet accroissement de l'activité minéralisatrice sous CO₂ élevé :

i) Une modification de l'activité et de la structure des communautés microbienne du sol adhérent sous CO₂ élevé (Monteallegre et al., 2002 ; Van Groeningen et
al., 2005). Ces communautés microbiennes peuvent être composées de populations bactériennes capables de minéraliser plus facilement et plus rapidement la matière organique labile.

ii) La seconde hypothèse concerne la composition des rhizodépôts. On ne peut pas exclure que des composés plus facilement décomposables peuvent être exsudés en proportions plus importantes sous CO₂ élevé que sous CO₂ ambiant. Ces composés sont par conséquents plus rapidement minéralisables.

Cette minéralisation plus rapide n'influence cependant pas significativement la respiration rhizosphérique (respiration racinaire + respiration microbienne). Un rapide calcul montre que l'augmentation de la capacité des micro-organismes à minéraliser le carbone rhizodéposé ne peut pas influencer la respiration rhizosphérique. Si on exprime ces valeurs en flux journaliers, les rendant ainsi comparables, la respiration rhizosphérique produit en moyenne entre 17 Bq g⁻¹ SA j⁻¹ et 20 Bq g⁻¹ SA j⁻¹ respectivement sous CO₂ élevé et CO₂ ambiant, alors que la minéralisation des composés marqués libérés dans le sol produit entre 0,63 Bq g⁻¹ SA j⁻¹ et 0,81 Bq g⁻¹ SA j⁻¹ respectivement sous atmosphère ambiante et atmosphère enrichie en CO₂, ce qui ne peut pas induire de variations significative de la respiration rhizosphérique.

L'importance de la respiration racinaire par rapport à l'efflux total de CO₂ du sol a déterminé précédemment mise en évidence sur d'autre dispositif FACE. Andrews et al. (1999) ont montré que la respiration racinaire correspondait à 55% de la respiration total du sol dans une forêt de pins. Pendall et al. (2001) ont montré sur une culture de blé en système FACE que la proportion de CO₂ issu de la respiration racinaire pouvait atteindre 65% de la respiration totale du sol.

### 3.3. Répartition de l'azote 15 dans la plante et rhizodéposition azotée

Le marquage au ¹⁵N des parties aériennes a été réalisé en vue de déterminer la rhizodéposition azotée. Il s'agissait d'une première tentative dans notre laboratoire. L'interprétation des résultats est complexe car la mesure du ¹⁵N résulte d'un flux net, résultante d'un efflux (diffusion passive d'acides aminés selon un gradient de concentration ; Paynel et al., 2001) et d'un influx (mécanisme actif de réabsorption ; Jones et Darrah, 1994). Des études complémentaires seraient nécessaires pour approfondir cet aspect.
Après l'échantillonnage du printemps, la rhizodéposition azotée n'est affectée ni par la disponibilité en azote dans le sol ni par le CO₂. En revanche, lors de l'échantillonnage d'automne, la répartition de l'N dans le système plante-sol montre une augmentation de 14% de l'allocation de l'N vers la rhizosphère pour les plantes ayant évoluées dans les parcelles où l'azote est disponible en grande quantité. Néanmoins, notre étude ne permet pas de déterminer quels sont les mécanismes en cause, même s'il a été montré que la rhizodéposition azotée est stimulée par une augmentation de la disponibilité en azote dans le sol (Janzen, 1990). A l'automne, l'augmentation de la concentration en CO₂ dans l'atmosphère stimule également l'allocation d'N vers la rhizosphère (33%). Ainsi, la rhizodéposition azotée est stimulée à la fois par le CO₂ et par l'apport de fertilisant. La rhizodéposition azotée a pu être stimulée en raison d'une disponibilité élevée en azote dans le sol.

Les micro-organismes peuvent minéraliser l'azote organique libéré par la plante et le rendre ainsi de nouveau disponible pour la croissance de la plante. Nos données ont montré que la production de biomasse des plantes était particulièrement stimulée sous atmosphère enrichie en CO₂ avec un apport élevé d'azote. Dans les parcelles où l'azote est disponible en grande quantité, la rhizodéposition azotée contribue à augmenter cette disponibilité en azote dans le sol.

## IV. Conclusion

Nos résultats montrent qu'au printemps, après une seule coupe et un seul apport d'azote, la rhizodéposition carbonée n'est pas affectée par le CO₂. En revanche, à l'automne après 3 défoliations et 4 apports d'azote, la rhizodéposition carbonée est diminuée sous CO₂ enrichi. Les flux de rhizodéposition apparaissent comme fluctuant au cours de la saison, déterminés par le statut physiologique de la plante en réponse aux conditions environnementales et à la gestion agronomique (fauche, fertilisation N). La contribution de la rhizodéposition aux entrées de C dans le sol est donc difficile à prédire et à modéliser. Pour en rendre compte, il est nécessaire d'appréhender ces flux tout au long de la saison de croissance.

La disponibilité en azote dans le sol est le moteur de la réponse de la croissance des plantes au CO₂. Ainsi, à l'automne, la production de biomasse des parties aériennes des plantes soumises au fort apport d'azote est stimulée par le CO₂.

A l'automne, nous observons un accroissement de la minéralisation par les micro-organismes du carbone de la matière organique du sol ainsi que des rhizodépôts sous CO₂ enrichi. Les
micro-organismes utilisant l'azote organique pour leur fonctionnement et leur développement, l'augmentation de la rhizodéposition azotée constatée à l'automne a pu par conséquent stimuler leur activité minéralisatrice. Ainsi le carbone supplémentaire entrant dans le sol est rapidement minéralisé, ce qui pourrait expliquer pourquoi la quantité de C retrouvé dans le sol n'est pas modifiée après 9 années d'enrichissement.
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Photographies 7 et 8 : Parcelle d'expérimentation à l'INRA-SAD de Mirecourt (88). Les photographies ont été
prises après la seconde coupe. Les piquets délimitent les parcelles et permettent de repérer plus facilement les
cylindres de PVC. La parcelle est régulièrement nettoyée de toutes mauvaises herbes.

<figure><img src="image_37.png" /></figure>
## F. INFLUENCE DE LA DÉFOLIATION SUR LA RÉPARTITION DES ASSIMILATS DANS LA PLANTE ET LES TRANSFERTS DE CARBONE VERS LA RHIZOSPHÈRE

Alors que le CO₂ atmosphérique accroît la disponibilité en carbone pour la plante, la défoliation, en revanche, la réduit en supprimant des organes source d'assimilats récents. Ainsi, au niveau de la plante entière et de l'écosystème prairial, la défoliation par la fauche ou par la pâture altère transitoirement l'assimilation de C et sa répartition dans la plante (Painter et Detling, 1981; Richards, 1993; Morvan-Bertrand et al., 1999). Il est maintenant clairement établi qu'immédiatement après la défoliation, le C est remobilisé à partir des réserves pour alimenter le métabolisme des méristèmes et assurer les coûts de maintenance de la plante. Ensuite, le C récemment assimilé au niveau des feuilles néo-formées après la défoliation contribue à cette repousse et à la reconstitution des réserves utilisées dans les heures qui suivent la défoliation (Welker et al., 1985; Briske et Richards, 1995; De Visser et al., 1997). Les graminées prairiales re-mobilisent majoritairement le C provenant des feuilles et des tiges résiduelles (subsistant après la coupe) plutôt que des racines (Richards et Caldwell, 1985; Briske et Richards, 1995). Malgré tout, la croissance racinaire (Davidson et Milthorpe, 1966; Richards, 1993) et le prélèvement d'azote (Jarvis et Macduff, 1989; Macduff et al., 1989) sont affectés par la défoliation en raison de la diminution de la disponibilité en assimilats dans les racines.

Alors que les effets de la défoliation sur l'allocation de C dans la plante sont maintenant bien renseignés, il n'en est pas de même pour ses conséquences sur l'allocation de C vers la rhizosphère et sa disponibilité pour les micro-organismes rhizosphériques : par exemple, la défoliation peut augmenter (Holland et al., 1996; Paterson et Sim, 1999; Murray et al., 2004), ne pas modifier (Todorovic et al., 1999) ou diminuer (Mikola et Kytöviita, 2002; Dilkes et al., 2004) les quantités de C libéré par les racines. Ces différences tiennent à plusieurs raisons : stratégies de repousse et d'allocation de C différentes entre espèces (Guitian et Bardgett, 2000), différentes fractions de C assimilé utilisées pour représenter le C libéré par les racines (Mikola et Kytöviita, 2002), essais le plus souvent en conditions contrôlées (cf la partie bibliographique pour plus d'éléments explicatifs sur ces aspects). La défoliation a des impacts avérés sur les organismes rhizosphériques, comme les micro-organismes (Guitian et Bardgett,
2000; Hamilton et Franck, 2001), probablement en conséquence de la modification du flux d'énergie disponible alimenté par les racines pour la croissance microbienne. Mais cela reste à démontrer. Au-delà des conséquences sur la libération de C par les racines, la défoliation peut affecter la qualité des tissus racinaires (Seastedt, 1985; Hokka et al., 2004) et stimuler la mortalité des racines (Jarvis et Macduff, 1989). L'importance relative de ces différents mécanismes n'est pas quantifiée; or, il est évident qu'au niveau d'un écosystème prairial, un enjeu majeur consiste à évaluer les conséquences des modifications induites par la défoliation sur le fonctionnement des sols car des effets en retour existent sur la croissance des plantes, le prélèvement et l'allocation d'azote dans la plante (Hamilton et Frank, 2001; Mikola et al., 2005).

En vue d'obtenir une image réaliste sur le plan agronomique et écologique des conséquences de la défoliation sur le transfert du C récent de la plante vers le sol, nous avons établi une expérimentation au champ dans laquelle des parcelles de ray grass sont défoliées ou non.

La quantification *in situ* de la rhizodéposition étant impossible et l'utilisation d'isotopes du carbone en plein champ très contraignante, nous avons estimé les conséquences de la défoliation par la mesure d'indicateurs de la rhizodéposition (cf synthèse bibliographique). Ainsi, nous avons déterminé la croissance de la plante, la disponibilité en C dans la rhizosphère, l'abondance, l'activité et la taille de la communauté microbienne rhizosphérique, 2 et 4 jours après la dernière défoliation. En effet, Paterson et Sim (2000) ont montré un accroissement de la libération de C par les racines pendant les 2 premiers jours suivant la coupe, suivi d'un retour à l'état initial dans les 3 jours suivant ce pic de libération de C par les racines. L'abondance de différents groupes de nématodes (criblés selon leur aptitude trophique) a été déterminée 6 jours après la coupe (Mikola et al., 2001 a, b). Certains groupes de nématodes sont des prédateurs de micro-organismes. Leur abondance est donc proportionnelle à celle des micro-organismes elle-même déterminée par la disponibilité en carbone dans la rhizosphère car le C est le facteur le plus limitant du développement microbien dans le sol. Les populations de nématodes pourraient constituer ainsi un indicateur supplémentaire de la rhizodéposition.

De plus, comme il a été montré que la disponibilité en éléments nutritifs (notamment azote) peut affecter la libération de composés organiques à partir des racines (Hale *et al.*, 1971; Grayston *et al.*, 1996; Henry *et al.*, 2005), l'étude a été conduite avec 2 niveaux contrastés de disponibilité en N dans le sol.
Dans ce contexte, nous avons testé au champ l'hypothèse suivante : **les modifications d'allocation de C dans la plante (Holland et al., 1996) et des concentrations en C soluble intra-racinaire (Paterson et Sim, 1999) induites par la défoliation modifient la disponibilité en C dans la rhizosphère et influencent, en conséquence, l'abondance et l'activité des micro-organismes et de leurs prédateurs.**

Les analyses sur les nématodes du sol, principaux prédateurs des micro-organismes, ont été effectuées par Juha Mikola, chercheur de l'Université de Jyväskylä (Finlande) qui collaboré avec nous dans le cadre d'un projet Européen (réseau thématique CONSIDER) sur la conservation de la biodiversité des sols dans des environnements changeants.

Ce chapitre a fait l'objet d'une publication dans *Functional Ecology*.

Bazot S., Mikola J., Nguyen C., Robin C. (2005). Do defoliation-induced changes in C allocation of field-grown *Lolium perenne* affect C availability, microbes and microbial feeders in soil? *Functional Ecology*, 19 (5), 886-896.
# I. Matériels et méthodes

## 1.1. Dispositif expérimental

Cette expérience a été menée à la station expérimentale l'INRA SAD de Mirecourt dans le département des Vosges (6° 81' E & 53° 6' N, Lorraine, France) (Photographies 7 et 8). Avant la mise en place du dispositif, la parcelle a été traitée avec du glyphosate pour détruire les adventices. Trois parcelles expérimentales, chacune constituant un bloc, (4 x 4 m chacune), ont été semées à la volée (graines de ray grass cv. Canasta mélangées à du sable pour assurer un semis homogène) à raison de 25 kg ha⁻¹ le 2 septembre 2002. Le 15 mars 2003, les blocs sont coupées à 5 cm au-dessus de la surface du sol pour éliminer la biomasse résiduelle en sortie d'hiver et homogénéiser les couverts. Chaque bloc est ensuite divisée en 2 parcelles (2 x 4 m) et chacune de ces parcelles divisée en 2 sous-parcelles (1 x 4 m). Pour faciliter l'individualisation de plantes, 4 plantes ont été choisies au hasard dans chaque sous-parcelle et le sol autour de chaque plante isolé en enfonçant un cylindre de PVC (diamètre = 8cm, hauteur = 25cm) autour de la plante. Ainsi, le sol de chaque cylindre n'est pas remanié et la récolte de la plante facilitée.

Le dispositif comporte 2 traitements : défoliation et addition d'azote. Le traitement N est au niveau de la parcelle (une parcelle de chaque bloc choisie au hasard et recevant 10 g N m⁻² a⁻¹ correspondant à 100 kg ha⁻¹, l'autre ne recevant pas d'N). Le traitement défoliation est appliqué au niveau sous-parcelle (une sous parcelle défoliée, l'autre laissée intacte). Les défoliations interviennent lorsque le couvert végétal atteint 20cm de hauteur. La première défoliation intervient le 30 avril 2003, la seconde défoliation intervient le 19 mai 2003. L'azote est apporté sous forme d'une solution de NH₄NO₃ en deux fois : 5 g m⁻² après chaque défoliation, tandis que les parcelles sans addition de N reçoivent uniquement de l'eau.

## 1.2. Echantillonnages

L'essai est échantillonné 3 fois : 2, 4 et 6 jours après la dernière défoliation de mai. Au 1er et 2ème prélèvement, 2 cylindres de PVC incluant leur plante individualisée sont prélevés sur chaque sous-parcelle en vue des mesures et analyses au laboratoire. Au 3ème échantillonnage, 2 carottes de sol (surface 9,6 cm², hauteur 10 cm) sont prélevées aléatoirement sous des
plantes de chaque sous-parcelle en vue d'examiner la communauté de nématodes dans la rhizosphère.

A chacun des 2 premiers échantillonnages, les cylindres de sol et leur plantes sont rapportés rapidement au laboratoire. Toutes les talles sont coupées et les feuilles et les tiges sont séparées puis séchées et pesées. Les racines et le sol adhérent sont prélevés selon le protocole décrit précédemment.

## 1.3. Analyses sur les plantes et le sol.

La plupart des techniques analytiques ont été décrites précédemment. Seuls seront décrits les éléments spécifiques à cette expérimentation. Après lyophilisation, les concentrations en C et N dans les échantillons végétaux et le sol sont mesurées. La concentration en glucides totaux dans les racines est mesurée par la méthode au phénol (Dubois et al., 1956). La concentration en C soluble dans le sol adhérent est également déterminée grâce à la technique décrite ci-dessous.

La concentration en carbone soluble du sol adhérent est mesurée grâce à la technique d'extraction à l'eau chaude. Cette technique permet de mesurer la concentration en carbone organique labile du sol (C issu de la biomasse microbienne et de la matière organique formant un pool de carbone facilement disponible pour les micro-organismes (Sparling et al., 1998)). Du sol frais est séché pendant 12h à 37°C puis 5g sont finement broyés. Ils sont ensuite mélangés à 25ml d'eau dans un flacon placé ensuite dans un bain-marie à 80°C pendant 18h. Après agitation, le mélange sol et eau chaude est filtré sur papier Whatman n°42. La concentration en carbone du filtrat est analysé au COTmètre (Shimadzu TOC-VCSH).

## 1.4. Analyses sur le compartiment microbien

Le carbone de la biomasse microbienne est analysée par la technique d'extraction fumigation (Vance et al., 1987) décrite précédemment.
### 1.4.1. Evaluation de l'activité microbienne et de la disponibilité en C pour la biomasse microbienne

L'activité microbienne et la disponibilité en C pour la BM sont évalués à l'aide d'un test mis au point dans notre laboratoire et décrit par Nguyen et Henry (2002). Brièvement décrit, le principe consiste à déterminer l'activité microbienne grâce à un apport de micro-quantités de ¹⁴C-glucose à un sol; le glucose n'est que l'entraîneur du ¹⁴C car il est apporté en quantité infime pour ne pas influencer la taille du pool de C soluble et l'activité du compartiment microbien (de l'ordre du nanogramme supplémentaire de C apporté par g de sol). La mesure des quantités de ¹⁴C-glucose minéralisé (¹⁴CO₂) est une mesure de l'activité microbienne. Il a été montré que la proportion de ¹⁴C incorporé dans le compartiment microbien augmente (¹⁴Cfe) et la proportion de ¹⁴C-glucose minéralisé (¹⁴CO₂) par la biomasse microbienne diminue lorsque la disponibilité en C dans le sol diminue (Nguyen et Henry, 2002) Ainsi, le ratio ¹⁴CO₂/ ¹⁴Cfe est un indicateur de la disponibilité en C dans le sol : plus le ratio est élevé, plus la quantité de C disponible pour la BM est élevée.

Pour réaliser ce test, 2 piluliers en verre de 25 ml contenant chacun 4 g de sol adhérent frais (destiné à une extraction fumigation) sont placés dans un récipient d'incubation de 100ml contenant 25ml de NaOH 1M. Dans chacun des deux piluliers en verre est appliquée une aliquote de 100µL de ¹⁴C-glucose (37 KBq.ml⁻¹). Le récipient est immédiatement hermétiquement fermé et mis à incuber à 22°C à l'obscurité pendant 6 jours.

Le ¹⁴CO₂ respiré est ensuite régulièrement quantifié (1, 2, 6, 24, 30, 36, 49, 59, 72, 106, 130 et 144h après le début de l'incubation) par comptage en scintillation liquide de 0,5ml de soude mélangé avec 5ml de Ultima Gold (Packard). Après l'incubation, une extraction fumigation permet de doser le ¹⁴C incorporé dans le compartiment microbien (¹⁴Cfe).

### 1.4.2. Dénombrement des bactéries cultivables du sol

Les bactéries cultivables du sol représentent au plus 10% des bactéries totales du sol. Cependant, ces bactéries utilisent pour se développer du carbone labile libéré par les racines. Leur abondance dans la rhizosphère est ainsi un indicateur de la quantité de carbone libéré par les racines et constitue un outil d'estimation de la rhizodéposition.

Cinq g de sol adhérent frais sont mis à agiter (40 tr.min⁻¹) pendant 10 minutes dans 50 ml de tampon phosphate (PBS ; 7,2g de NaCl, 2,8g de N₂HPO₄ et 0,4g de KH₂PO₄ par litre à pH
7,2). Après centrifugation (10 min à 750 rpm), 2 ml de surnageant contenant les micro-organismes sont placés dans un tube auto-clavé contenant 18ml de PBS. Quatre dilutions en cascade sont effectuées en série de 10⁻² à 10⁻⁵. Cent micro-litres des solutions 10⁻³, 10⁻⁴ et 10⁻⁵ sont ensuite étalées sur boites de Pétri contenant du milieu nutritif TSA (Tryptone Soy Agar, Difco). Pour chaque dilution, 2 répétitions sont effectuées. Les boites de Pétri sont incubées à 27°C à l'obscurité pendant 10 jours. Un premier comptage des colonies développées est effectué 2 jours après le début de l'incubation (bactéries à stratégie r). Un second comptage est effectué à la fin des 10 jours d'incubation (bactéries à stratégie k). Les résultats sont exprimés en log CFU (Colony Forming Unit) par g de sol adhérent sec.

### 1.4.3. Analyse des aptitudes cataboliques des communautés microbiennes (Biolog®)

Cette méthode permet de mettre en évidence la structuration des communautés microbiennes rhizosphériques selon les aptitudes cataboliques de la fraction cultivable des micro-organismes. L'inoculation de plaques Biolog® GN2 est effectuée à partir de la dilution 10⁻³. Cent cinquante microlitres sont inoculés dans chacun des 96 puits de la plaque. Chaque puits contient un substrat. Les plaques sont placées à 27°C à l'obscurité pendant 72h. L'absorbance de chaque puits correspondant au degré d'oxydation par les micro-organismes du composé présent dans chaque puits est mesurée régulièrement à une longueur d'onde de 550nm grâce à un lecteur de plaque (MR 7000 Dynatech).

Pour chaque puits, il est possible de tracer une courbe d'évolution de l'absorbance en fonction du temps. L'intégration de cette courbe d'évolution donne une valeur caractérisant la consommation du substrat sur la durée d'incubation. Les valeurs inférieures à celle obtenue sur le puits ne contenant aucun substrat carboné sont considérées comme égales à zéro. Le calcul d'une aire pour chaque puits permet de déterminer l'utilisation relative par les micro-organismes de chacune des 95 sources carbonées. De même le calcul de l'indice de Shannon H permet de déterminer la diversité globale d'utilisation des substrats par les micro-organismes (Preston-Mafham et al., 2002).

$$H = -\sum \left( \left( \frac{A_i}{\sum A_i} \right) \times \log_{10} \left( \frac{A_i}{\sum A_i} \right) \right),$$
avec Ai l'aire calculée sur le puits i. Nous cherchons ensuite parmi les différentes classes biochimiques de substrat (glucides, acides aminés, acides organiques...), par le biais d'une analyse de variance si l'une ou plusieurs de ces classes sont plus spécifiquement utilisées par les micro-organismes (Preston-Mafham et al., 2002).

## 1.5. Analyse de la communauté de nématodes

Les nématodes sont extraits à partir de 30 g de sol adhérent frais en utilisant un dispositif en entonnoir (Sohlenius, 1979). Le nombre total d'individus est compté et à partir d'échantillons de 150 individus, les genres de nématodes sont identifiés et alloués dans des groupes selon leur aptitude trophique d'après Yeates *et al.* (1993).

## 1.6. Analyses statistiques

L'analyse statistique des données est réalisée, pour chaque variable, en faisant la moyenne de deux échantillons par sous-parcelle. Les effets de la défoliation, de l'apport d'azote, de la date de récolte, ainsi que les interactions entre ces différents facteurs sont analysées grâce à une analyse de variance à facteurs hiérarchisés (du fait des 2 dates d'échantillonnages) avec le logiciel SPSS (Statistical package ; SPSS, 2001). L'homogénéité des variances est testée en utilisant le test de Levene. Dans le cas où l'homogénéité des variances n'est pas conservée, les valeurs sont exprimées en logarithme. Si une interaction significative est mise en évidence entre l'effet date et l'effet défoliation ou entre l'effet date et l'effet azote, les effets défoliation et azote sont traités séparément. Si une interaction est significative entre défoliation et azote, les facteurs sont alors analysés un par un.

Sur les figures, les barres verticales correspondent à 2 intervalles de confiances de la moyenne.
## II. Résultats

### 2.1. Production de biomasse végétale

On observe une interaction entre les effets de la fertilisation azotée et de la défoliation sur la production de biomasse (biomasse résiduelle + biomasse récoltée) des parties aériennes (Tableau 12); l'apport d'azote stimule 3,3 fois la production de biomasse des parties aériennes des plantes non défoliées ($P<0,001$), mais n'a aucun effet sur les plantes défoliées ($P=0,223$). La défoliation diminue de 27% la production de biomasse des parties aériennes des plantes fertilisées ($P=0,023$), mais n'a pas d'effet significatif sur les plantes non fertilisées ($P=0,178$) (Figure 28a, d).

La fertilisation et la défoliation n'ont pas d'effet sur la production de biomasse racinaire. (Figure 28b, e; Tableau 12). Le rapport de biomasse racines sur parties aériennes (PR/PA) est diminué de 61% en moyenne par l'apport d'azote mais n'est pas affecté par la défoliation (Figure 28c, f; Tableau 12).

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 28 : Production de biomasse sèche des plantes (g plante⁻¹, biomasse défoliée + biomasse récoltée) et ratio racines parties aériennes, 2 et 4 jours après la coupe dans les parcelles mono spécifiques de ray grass avec (1) ou sans (0) apport d'azote. Les barres verticales correspondent aux intervalles de confiances (n=3).</figcaption></figure>
## 2.2. Concentrations en carbone total, azote total des organes végétaux et en glucides totaux dans les racines

La défoliation réduit la concentration en carbone dans les feuilles et les tiges respectivement de 12 et 7% en moyenne, mais n'a aucune conséquences sur la concentration en C des racines. L'apport d'N augmente la concentration en C des racines et des tiges respectivement de 7 et 9% en moyenne, mais ne modifie pas la concentration en carbone des feuilles (Figure 29 et Tableau 12).

L'apport d'azote augmente les concentrations en azote dans la plante, avec 111, 101 et 38% d'augmentation dans les feuilles, les tiges et les racines, respectivement (Figure 29 et Tableau 12). La défoliation réduit la concentration en azote des feuilles de 27% lors du 1er échantillonnage (P=0,022) mais n'a aucun effet lors du second (P=0,585). La défoliation augmente la concentration en azote dans les tiges de 14% en moyenne pour les deux échantillonnages. La concentration en azote des racines reste inchangée (Figure 29 et Tableau 12). Entre les deux récoltes, la concentration en carbone et en azote dans les racines est diminuée de 16 et 8%, alors que les concentrations dans les feuilles et les tiges restent équivalentes (Figure 29 et Tableau 12). Les rapports C/N des différents organes de la plante sont significativement diminués par l'apport d'azote, alors que la défoliation augmente ce ratio dans les racines, le diminue dans les tiges et n'a pas d'effet significatif dans les feuilles.
<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Figure 29 : Concentrations en carbone et en azote, exprimées en pourcentage de la MS dans les feuilles, les tiges, les racines, ratio C/N dans les feuilles les tiges et les racines, 2 (1<sup>ère</sup> récolte) et 4 (2<sup>ème</sup> récolte) jours après la coupe des plants de ray grass avec (1) ou sans (0) apport d'azote. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

La défoliation augmente la concentration en glucides totaux dans les tissus racinaires de 26% et de 18% respectivement lors de la première et de la seconde récolte (P=0,001 ; P=0,021). L'apport d'azote n'a pas d'effet sur ce paramètre (Figure 30).
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Figure 30 : Concentrations en glucides totaux dans les racines, exprimée en mol. kg⁻¹ de carbone en équivalent hexose pour les différents traitements (0 : sans apport d'azote, 1 : avec apport d'azote), 2 (a) et 4 (b) jours après la coupe. Les barres verticales correspondent aux intervalles de confiance (n=3).

## 2.3. Concentration en carbone et en azote du sol

Les concentrations en carbone total, carbone soluble et azote total du sol ne sont pas modifiées par la défoliation et l'apport d'azote (Figure 31, Tableau 12).

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

Figure 31 : Pourcentage de carbone (a, d) et d'azote total (b,e) ; concentration en carbone soluble (mg.kg⁻¹ de sol sec ; c, f) dans le sol adhérant (SA) des plantes coupées et des plantes non coupées issues des parcelles fertilisées (1) et non fertilisées (0) après la première (a, b, c) et la seconde récolte (d, e, f). Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).
## 2.4. Compartiment microbien

Le carbone et l'azote (mg C. kg⁻¹ et mg N. kg⁻¹) de la biomasse microbienne du SA reste inchangée pour les deux dates d'échantillonnage quel que soit le traitement (Figure 32 et Tableau 12).

Dans le cas du test ¹⁴C-glucose, la proportion de ¹⁴C ajouté qui est respirée par la biomasse microbienne est diminuée par l'apport d'azote au 1er prélèvement (P=0,018). Aucun autre effet de N ou de la défoliation est observé; le ratio ¹⁴CO₂/¹⁴Cfe n'est pas significativement affecté par la fertilisation azotée et la défoliation, pour les deux dates de prélèvement (Figure 32 et Tableau 12).

Le nombre de bactéries cultivables à stratégie r (2 jours d'incubation) n'est pas modifié par les traitements (Figure 32 et Tableau 12). Les profils d'activité cataboliques des microorganismes (Biolog®, après 72h d'incubation) ne sont pas significativement affectés par la défoliation et la fertilisation azotée aux deux d'échantillonnage; l'indice de Shannon correspondant à la diversité d'utilisation des substrats carbonés par les micro-organismes du sol adhérent reste le même quel que soit le traitement (Figure 32 et Tableau 12).
<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Figure 32 : Carbone et azote microbien (mg C et N par kg de sol sec) pour le sol adhérent (SA); mesure de l'activité microbienne (test glucose ¹⁴C) ¹⁴CO₂ : ¹⁴C respiré (¹⁴CO₂), ¹⁴C<sub>FE</sub> : ¹⁴C de la biomasse microbienne et ¹⁴CO₂/¹⁴C<sub>FE</sub> : activité microbienne exprimée proportionnellement à la biomasse microbienne dans le sol adhérent, Nombre de bactéries cultivables à stratégie r (2 jours de développement) exprimée en log de CFU (Colonies formant unités) par gramme de sol adhérent sec et indice de Shannon correspondant à la diversité d'utilisation des substrats carbonés par les micro-organismes du sol adhérent des plantes coupées et des plantes non coupées issues des parcelles fertilisées (1) et non fertilisées (0) après la première et la seconde récolte. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).
## 2.5. Nématodes

L'abondance des nématodes herbivores est supérieure à celle des fongivores et bactérivores. La défoliation diminue l'abondance des nématodes fongivores et herbivores en moyenne de 70 et 47% respectivement, mais n'a pas d'effet significatif sur l'abondance des nématodes bactérivores, omnivores et des nématodes prédateurs. Aucun groupe de nématodes n'est affecté par l'apport d'azote (Figure 33).

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

Figure 33 : Nombre de fongivores (a), herbivores (b) et bactérivores (c) par gramme de sol, dans les parcelles coupées et non coupées, fertilisées (1) et non fertilisées (0). Les barres verticales correspondent aux intervalles de confiance. Les différentes lettres montrent des différences significatives au seuil de 5%.
<table><thead><tr><th rowspan="2">Variables</th><th colspan="2">Défoliation</th><th colspan="2">Azote</th><th colspan="2">Récolte</th><th colspan="2">D x N</th><th colspan="2">D x R</th><th colspan="2">N x R</th><th colspan="2">D x N x R</th></tr><tr><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th><th>F</th><th>P</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="15"><strong>Production de biomasse</strong></td></tr><tr><td>Parties aériennes</td><td>0,05</td><td>0,843</td><td>35,9</td><td>0,004</td><td>0,09</td><td>0,775</td><td>16,5</td><td>0,015</td><td>0,14</td><td>0,729</td><td>0,36</td><td>0,582</td><td>&lt;0,01</td><td>0,976</td></tr><tr><td>Racines</td><td>5,24</td><td>0,084</td><td>0,83</td><td>0,413</td><td>3,52</td><td>0,134</td><td>5,06</td><td>0,088</td><td>0,11</td><td>0,757</td><td>1,84</td><td>0,247</td><td>0,16</td><td>0,71</td></tr><tr><td>PR /PA</td><td>2,88</td><td>0,165</td><td>24,4</td><td>0,008</td><td>0,83</td><td>0,413</td><td>2,64</td><td>0,18</td><td>0,26</td><td>0,636</td><td>1,31</td><td>0,317</td><td>0,64</td><td>0,469</td></tr><tr><td>C concentration (feuilles)</td><td>58</td><td>0,002</td><td>1,32</td><td>0,315</td><td>0,48</td><td>0,526</td><td>0,05</td><td>0,834</td><td>2,77</td><td>0,172</td><td>0,34</td><td>0,592</td><td>0,02</td><td>0,895</td></tr><tr><td>C concentration (tiges)</td><td>9,97</td><td>0,034</td><td>8,05</td><td>0,047</td><td>0,16</td><td>0,712</td><td>0,09</td><td>0,776</td><td>7,07</td><td>0,056</td><td>0,02</td><td>0,89</td><td>0,01</td><td>0,915</td></tr><tr><td>C concentration (racines)</td><td>2,5</td><td>0,189</td><td>9,75</td><td>0,035</td><td>8,5</td><td>0,043</td><td>&lt;0,01</td><td>0,955</td><td>0,68</td><td>0,457</td><td>0,8</td><td>0,421</td><td>3,66</td><td>0,128</td></tr><tr><td colspan="15"><strong>Concentration en sucre</strong></td></tr><tr><td>totaux (racines)</td><td>31,5</td><td>0,005</td><td>0,07</td><td>0,801</td><td>1,83</td><td>0,247</td><td>2,66</td><td>0,178</td><td>10,3</td><td>0,033</td><td>0,55</td><td>0,5</td><td>0,59</td><td>0,485</td></tr><tr><td>N concentration (feuilles)</td><td>9,27</td><td>0,038</td><td>336</td><td>&lt;0,001</td><td>11,1</td><td>0,029</td><td>0,05</td><td>0,831</td><td>9,92</td><td>0,035</td><td>1,19</td><td>0,337</td><td>0,12</td><td>0,752</td></tr><tr><td>N concentration (tiges)</td><td>16,3</td><td>0,016</td><td>204</td><td>&lt;0,001</td><td>0,78</td><td>0,428</td><td>2,65</td><td>0,179</td><td>0,4</td><td>0,564</td><td>0,31</td><td>0,61</td><td>0,69</td><td>0,454</td></tr><tr><td>N concentration (racines)</td><td>3,25</td><td>0,146</td><td>13,5</td><td>0,021</td><td>7,81</td><td>0,049</td><td>0,12</td><td>0,744</td><td>0,06</td><td>0,825</td><td>1,92</td><td>0,238</td><td>0,48</td><td>0,527</td></tr><tr><td>C /N feuilles</td><td>0,37</td><td>0,578</td><td>152</td><td>&lt;0,001</td><td>17,8</td><td>0,014</td><td>0,01</td><td>0,93</td><td>10,3</td><td>0,033</td><td>0,02</td><td>0,909</td><td>2,22</td><td>0,211</td></tr><tr><td>C /N tiges</td><td>105</td><td>0,001</td><td>204</td><td>&lt;0,001</td><td>0,95</td><td>0,385</td><td>4,09</td><td>0,113</td><td>0,62</td><td>0,476</td><td>0,02</td><td>0,891</td><td>0,1</td><td>0,765</td></tr><tr><td>C /N racines</td><td>21,2</td><td>0,01</td><td>10,7</td><td>0,031</td><td>3,55</td><td>0,133</td><td>&lt;0,01</td><td>0,966</td><td>0,03</td><td>0,867</td><td>1,25</td><td>0,326</td><td>1,14</td><td>0,345</td></tr><tr><td colspan="15"><strong>Sol adhérent</strong></td></tr><tr><td>C Totale</td><td>0,65</td><td>0,465</td><td>0,1</td><td>0,773</td><td>12,5</td><td>0,024</td><td>7,01</td><td>0,057</td><td>0,58</td><td>0,488</td><td>1,91</td><td>0,24</td><td>0,02</td><td>0,893</td></tr><tr><td>Carbone soluble</td><td>0,5</td><td>0,524</td><td>0,92</td><td>0,392</td><td>0,01</td><td>0,926</td><td>0,02</td><td>0,889</td><td>1,08</td><td>0,407</td><td>2,42</td><td>0,18</td><td>3,98</td><td>0,184</td></tr><tr><td>N Totale</td><td>&lt;0,01</td><td>0,968</td><td>2,38</td><td>0,197</td><td>6,02</td><td>0,07</td><td>1,92</td><td>0,239</td><td>1,48</td><td>0,291</td><td>0,01</td><td>0,946</td><td>0,86</td><td>0,406</td></tr><tr><td colspan="15"><strong>Compartiment microbien</strong></td></tr><tr><td>C microbien</td><td>0,14</td><td>0,723</td><td>0,01</td><td>0,923</td><td>7,8</td><td>0,048</td><td>0,14</td><td>0,723</td><td>1,76</td><td>0,277</td><td>0,62</td><td>0,473</td><td>14,3</td><td>0,032</td></tr><tr><td>N microbien</td><td>2,64</td><td>0,151</td><td>0,02</td><td>0,884</td><td>18,9</td><td>0,006</td><td>4,51</td><td>0,073</td><td>1,02</td><td>0,388</td><td>11,9</td><td>0,016</td><td>1,87</td><td>0,265</td></tr><tr><td><sup>14</sup>CO<sub>2</sub></td><td>0,26</td><td>0,64</td><td>0,76</td><td>0,434</td><td>23,9</td><td>0,008</td><td>0,35</td><td>0,586</td><td>2,51</td><td>0,188</td><td>10,6</td><td>0,031</td><td>0,13</td><td>0,734</td></tr><tr><td><sup>14</sup>C<sub>FF</sub></td><td>3,33</td><td>0,142</td><td>1,16</td><td>0,342</td><td>0,02</td><td>0,907</td><td>6</td><td>0,07</td><td>&lt;0,01</td><td>0,989</td><td>&lt;0,01</td><td>0,961</td><td>1,65</td><td>0,269</td></tr><tr><td><sup>14</sup>CO<sub>2</sub>/<sup>14</sup>C<sub>FF</sub></td><td>2,01</td><td>0,229</td><td>1,36</td><td>0,309</td><td>4,93</td><td>0,091</td><td>2,87</td><td>0,165</td><td>0,46</td><td>0,534</td><td>1,45</td><td>0,295</td><td>0,76</td><td>0,432</td></tr><tr><td>Strategie r bacterie</td><td>2,14</td><td>0,217</td><td>&lt;0,01</td><td>0,972</td><td>7,65</td><td>0,051</td><td>2,31</td><td>0,203</td><td>0,06</td><td>0,825</td><td>&lt;0,01</td><td>0,963</td><td>0,64</td><td>0,47</td></tr><tr><td>Strategie k bacterie</td><td>2,65</td><td>0,179</td><td>&lt;0,01</td><td>0,967</td><td></td><td></td><td>0,27</td><td>0,633</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indice de Shannon</td><td>0,01</td><td>0,933</td><td>0,22</td><td>0,666</td><td>11,4</td><td>0,028</td><td>0,62</td><td>0,476</td><td>0,04</td><td>0,844</td><td>0,27</td><td>0,629</td><td>1,62</td><td>0,272</td></tr></tbody></table>

Tableau 12 : Résultats des analyses statistiques pour les différents paramètres analysés : Production de biomasse, concentration en C et en N et ratio C/N dans les différents organes de la plante, Concentration en carbone, azote total et carbone soluble du sol adhérent, C et N microbien, activité microbienne (test glucose ¹⁴C), étalement bactérien et test Biolog® (indice de Shannon). Les effets défoliation, azote et date de récolte sont testés, ainsi que les interactions Défoliation X Azote, Défoliation X Récolte, Azote X Récolte, Défoliation X Azote X Récolte. Les effets sont considérés comme significatifs au seuil de 5%.
### III. Discussion

A notre connaissance, cette étude est la première s'intéressant aux conséquences de la défoliation sur la plante, les micro-organismes du sol et leurs prédateurs sur des plantes se développant dans un couvert végétal au champ. En effet, tous les travaux précédents ont été conduits en conditions contrôlées et étudiaient indépendamment les plantes et les micro-organismes (Dyer et Bokhari 1976; Bokhari 1977; Delting et Painter 1983; Holland et al., 1996; Paterson et Sim 1999, 2000; Hamilton et Frank 2001; Paterson et al., 2003). Nous souhaitions maintenir un réalisme agronomique (notamment pour l'apport de fertilisant, la coupe à 5 cm de hauteur maintenant une surface foliaire résiduelle, échantillonnage après deux défoliations successives) pour tester l'hypothèse d'une modification de la disponibilité en C dans la rhizosphère par la défoliation.

#### 3.1. La défoliation modifie la répartition de carbone dans la plante

Les changements quantitatifs et qualitatifs des paramètres de croissance de la plante induits par la défoliation dépendent de la disponibilité en azote dans le sol. En effet, la réponse de la plante à l'apport d'azote est forte. La fertilisation azotée stimule la production de biomasse et le ratio de biomasse racines sur parties aériennes (PR/PA) est réduit. Lorsque l'azote est limitant, une augmentation de la biomasse racinaire et de la longueur des racines est classiquement observée. Ceci permet une exploration plus importante du compartiment souterrain afin de puiser au mieux les nutriments présents dans le sol (Fitter, 1985; Paterson et al., 1999).

Après la défoliation la production de biomasse des parties aériennes dans les parcelles fertilisées est réduite. A l'inverse dans les parcelles non fertilisées, la défoliation n'affecte pas la croissance des plantes. La défoliation réduit l'assimilation de nutriment par les racines (Jarvis et Macduff, 1989; Donaghy et Fulkerson, 1998). Ainsi, l'apport d'azote ayant lieu après la coupe, la réduction de croissance des plantes défoliées présentes au sein des parcelles fertilisées, peut être le résultat de cette capacité réduite à utiliser l'azote supplémentaire disponible dans le sol. Ces données sont confirmées par le fait que l'apport d'azote n'augmente pas de manière significative la production de biomasse des parties aériennes quand les plantes sont coupées, mais stimule la production de biomasse des parties aériennes des plantes non coupées.
Au-delà de ces aspects quantitatifs, la défoliation induit des changements qualitatifs dans la répartition du carbone dans la plante. La concentration en carbone dans les talles est plus faible, alors que la concentration en glucides totaux dans les racines est significativement augmentée. Ces résultats vont à l'encontre des observations habituelles, expliquant que les plantes tolèrent la défoliation en mobilisant le carbone issu des réserves vers les méristèmes foliaires à la base des talles, au dépend des racines (Caldwell et al., 1981; Miller and Rose 1992; Briske et Richards, 1995; Strauss et Agrawal 1999). Peu de changements sont observés dans notre cas au niveau des racines, sans doute parce que les réserves y étant stockées sont peu mobilisées. L'augmentation de l'activité photosynthétique des nouvelles feuilles (Delting et al., 1979; Richards et Caldwell, 1984; Hiernaux et Turner, 1996) conjointement à la remobilisation des réserves présentes à la base des talles (Morvan-Bertrand et al., 1999a, b) contribuent à la repousse de la plante.

Le modèle d'allocation du carbone dans la plante illustre la stratégie qu'adopte les plantes défoliées en stockant préférentiellement le carbone dans des organes moins accessibles pour les herbivores (base des talles, racines).

## 3.2. La disponibilité en carbone et en azote dans la rhizosphère n'est pas modifiée par la défoliation

La disponibilité en carbone dans la rhizosphère est le moteur des activités microbiennes dans la rhizosphère, qui en retour vont influencer le fonctionnement de la plante. En effet l'accroissement de l'activité photosynthétique chez les plantes défoliées couramment observée (Delting et Painter, 1983; Richards et Caldwell, 1985) n'est pas simplement une réponse physiologique de la plante à la défoliation, incluant une remobilisation des ressources vers les parties aériennes, mais est également le résultat d'un rétrocontrôle positif entre les plantes coupées et les communautés microbiennes de la rhizosphère. Ces communautés, dont le développement et l'activité dépendent de la disponibilité en C facilement assimilable, minéralisent les nutriments et les rendent ainsi disponibles pour la plante. Par conséquent, il est primordial d'évaluer si la défoliation peut moduler la disponibilité en carbone pour les micro-organismes.

Des études précédentes menées par l'équipe, montrent une relation positive entre la concentration en composés solubles dans les racines et la rhizodéposition (Marchand, 2003; Henry, 2004). Cette même relation a été mise en évidence dans d'autres travaux (Mikola et
Kytöviita, 2002; Dilkes et al., 2004). L'augmentation de l'allocation de photo-assimilats aux racines après la coupe (Holland et al., 1996) ainsi que l'accroissement de la concentration en carbone soluble dans les racines des plantes défoliées (Paterson et Sim, 1999) devrait donc logiquement entraîner une stimulation de la rhizodéposition carbonée. Or, nos résultats ne confirment pas cette relation; l'augmentation de la concentration en composés solubles dans les racines suite à la défoliation n'est pas accompagnée d'une plus grande disponibilité en C dans la rhizosphère. Cette relation contradictoire a été également observée par Paterson et al. (2003) qui montrent que la coupe diminue la concentration en C soluble dans les racines de fétuque rouge mais augmente l'exsudation racinaire. Murray et al. (2004) a récemment montré qu'il n'y avait pas de changement significatif de l'exsudation de carbone total par les racines de Agrostis capillaris suite à une défoliation. Dans d'autres études sur les graminées, la libération de carbone par les racines augmente (Holland et al., 1996; Paterson et al., 1999, 2000; Paterson et al., 2003) ou diminue (Mikola et Kytöviita, 2002; Nguyen et al., 2002; Dilkes et al., 2004) après la défoliation.

L'activité et la biomasse microbienne, ainsi que l'abondance des nématodes bactérivores montrent également que la disponibilité en composés carbonés labiles dans la rhizosphère n'est probablement pas affectée par la défoliation.

Toutes ces études suggèrent que les conséquences de la défoliation sur la libération de carbone par les racines sont controversées et donc difficiles à prédire. Ces études diffèrent cependant de la nôtre et entre elles au niveau des espèces utilisées, du régime de coupe ou encore de la fraction du carbone assimilé mesuré dans la rhizosphère (Mikola et Kytöviita, 2002). Face à ces travaux, nos résultats ont l'avantage d'avoir été obtenus dans des conditions de plein champ en respectant un réalisme agronomique. Dans ce contexte, la défoliation n'a pas d'effets majeurs sur l'allocation de C à la rhizosphère.

La moindre densité de nématodes herbivores (se nourrissant notamment de débris racinaires) est probablement causée par une modification de la qualité des tissus racinaires après la coupe (ratio C/N plus élevé). Cependant, il est fréquent d'observer une augmentation de la qualité des tissus racinaires après la coupe (Seastedt, 1985; Seastedt et al., 1988; Hokka et al., 2004). Pour ce qui est des fongivores, la réponse est plus inattendue. Leur abondance est diminuée après la coupe. Celle-ci dépend directement du développement des champignons. Dans nos analyses nous n'avons pas de mesure directe des conséquences de la défoliation sur le
compartiment fongique. Un moindre développement de ce dernier a pu réduire l'abondance des fongivores.

La fertilisation azotée n'affecte pas la communauté de nématodes du sol. La seule conséquence observable de l'apport d'azote concerne l'activité minéralisatrice des micro-organismes après la première récolte. Cette dernière est réduite et peut illustrer une plus faible compétition entre la plante et les micro-organismes lorsque l'azote n'est pas limitant.

Hamilton et Frank (2001) ont récemment montré que l'augmentation de la libération de carbone par les racines de *Poa pratensis* après la coupe stimule la croissance des micro-organismes, augmente la disponibilité en azote dans la rhizosphère et finalement engendre un accroissement de la concentration en N dans les parties aériennes des plantes défoliées. Contrairement à ces travaux et à ceux d'Hokka *et al*. (2004) montrant une forte augmentation de la concentration en azote chez *Phleum pratense* après la coupe, dans notre cas, la défoliation n'a qu'un faible impact sur la concentration en azote dans la plante. Ainsi, dans notre étude, la disponibilité en azote dans la rhizosphère n'est probablement pas augmentée par la défoliation car la libération de C, la croissance et l'activité microbienne ne sont pas stimulée.

## IV. Conclusion

Dans notre expérimentation au champ, la défoliation n'engendre pas de modifications de la quantité de composés organiques libérés par les racines ou les variations des flux d'exsudation sont beaucoup trop faibles pour provoquer des variations de la biomasse, de l'activité ou de la structure du compartiment microbien dans les quatre premiers jours suivant la coupe.

En revanche, cette expérimentation montre que la libération de composés organiques par les racines n'est pas toujours dépendante de la concentration en carbone soluble intra-racinaire. Ainsi, dans le cadre de cette étude, la concentration en carbone soluble dans les racines ne constituerait pas un bon indicateur de la rhizodéposition, contrairement à ce qui est classiquement observé en conditions plus contrôlées au laboratoire.
# G. CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES

La rhizosphère constitue une interface par laquelle transitent des composés organiques libérés par les racines. Cet efflux, qui contribue aux transferts de C d'origine végétale vers le sol, est étroitement dépendant du fonctionnement de la plante.

Ainsi, dans ce contexte, notre travail vise à étudier le **couplage entre l'écophysiologie de la plante et la rhizodéposition**. Nous avons choisi de travailler sur une graminée pérenne : le ray grass anglais *Lolium perenne* L. Cette plante possède des **réserves carbonées** qui sont périodiquement remobilisées et reconstituées du fait des régimes de défoliation et des rythmes nycthéméraux et saisonniers ponctuant sa période de vie. Ces réserves carbonées sont susceptibles de contribuer aux flux de rhizodéposition.

Nous nous sommes placés dans un premier temps à l'échelle de la plante indépendante de son environnement afin de définir la **contribution du carbone récemment assimilé par la plante à la rhizodéposition**. La contribution du carbone issu de la remobilisation des réserves aux transferts de C à la rhizosphère n'avait jusqu'alors jamais étudiée. Cependant, il est reconnu qu'en fonction de leur origine le long du système racinaire, **la nature biochimique des rhizodépôts** varie, ce qui affecte l'activité et le développement microbien dans la rhizosphère, modifiant en retour par le jeu de rétro-contrôles la croissance et la physiologie de la plante.

Pour appréhender cette question, nous avons développé pour la première fois au laboratoire **un double marquage long des parties aériennes** des plantes ($^{14}$CO$_2$ / $^{13}$CO$_2$). Cette technique nous est apparue comme étant la plus adaptée pour déterminer *in situ* la contribution à la rhizodéposition du C anciennement assimilé par la plante par rapport à celle du C nouvellement assimilé. Contrairement à ce qui est admis généralement, **le C ancien apparaît comme contribuant significativement à la rhizodéposition**. Cependant, **nos résultats ne permettent pas de quantifier la part de C récent et de C ancien composant les flux de rhizodéposition**. Cette première étude devra être complétée pour quantifier *in situ* ou en conditions hydroponiques la part du C ancien et du C nouveau retrouvée dans la rhizodéposition (marquages longs et pulses). De plus, une étude ciblée sur la racine devrait permettre de quantifier ces 2 flux de rhizodéposition au niveau des sites d'exsudation (zone d'élongation et apex notamment).
Dans un second temps nous avons élargi notre travail à la plante interagissant avec son environnement. Nous avons ainsi cherché à évaluer comment des contraintes subies par les parties aériennes de la plante modulent les flux de C récent vers la rhizosphère. En conditions contrôlées, les facteurs étudiés (CO₂, défoliation, disponibilité en azote dans le sol) modulent les flux de C vers le sol et notamment les flux de rhizodéposition. Ainsi, les caractéristiques biotiques (micro-organismes) et abiotiques (structure, physicochimie) du sol sont modifiées et affectent les cycles biogéochimiques dans la rhizosphère et plus largement la qualité des sols.

En est-il de même sur des dispositifs de terrain conduits de manière intensive mais conservant un réalisme écologique et agronomique ? Peu d'études s'intéressent aux variations des flux de rhizodéposition à l'échelle de la plante interagissant avec son environnement.

L'utilisation du ¹⁴C et du ¹⁵N au laboratoire et d'indicateurs au champ de la disponibilité en C dans la rhizosphère nous ont semblé être les outils les plus adéquats à mettre en œuvre. Ainsi, notre étude a contribué au développement d'outils pour estimer ou mesurer la rhizodéposition (marquages isotopiques des parties aériennes, détermination de nématodes comme indicateurs de disponibilité en C dans la rhizosphère...).

Nos observations montrent qu'en conditions de plein champ, le fonctionnement de la plante est conditionné par l'ensemble des interactions entre tous les facteurs de l'environnement (gestion de la parcelle cultivée, climat...). C'est pourquoi, des effets nets de certains facteurs (comme ceux du CO₂ ou de la défoliation) observés en conditions contrôlées sont beaucoup moins marqués dans nos conditions de plein champ.

Notre étude montre que la disponibilité en azote dans le sol est un facteur déterminant la réponse des plantes à l'élévation des concentrations en CO₂ ou à la défoliation. Sous atmosphère enrichie en CO₂, l'azote est le moteur de la réponse de la production de biomasse des plantes au CO₂. La défoliation, après un apport d'azote, réduit la biomasse des plantes, alors qu'à l'inverse, sur les parcelles non fertilisées, la défoliation n'affecte pas la croissance des plantes.

Les flux de rhizodéposition apparaissent comme fluctuants, déterminés par le statut physiologique de la plante en réponse aux conditions environnementales et à la gestion agronomique (fauche, fertilisation N). Par ailleurs, en développant des indicateurs de la
rhizodéposition carbonée, l'équipe a précédemment démontré en conditions contrôlées une corrélation positive entre la concentration en C soluble racinaire et la concentration en C soluble dans la rhizosphère. Nos résultats obtenus en conditions naturelles ne le montrent pas pour les plantes défoliées, malgré un accroissement de la concentration en glucides totaux dans les racines. Ainsi, cette relation simple n'est probablement pas valide lorsque des facteurs biotiques et abiotiques de l'environnement racinaire interviennent sur la physiologie de la racine.

**La contribution de la rhizodéposition aux entrées de C dans le sol est donc difficile à prédire et à modéliser.** Pour en rendre compte, il est nécessaire d'appréhender ces flux tout au long de la saison de croissance.

Au travers de ce travail nous n'avons évalué qu'un des volets concernant les facteurs modulant les flux de rhizodéposition. Outre des contraintes appliquées aux parties aériennes de la plante, des contraintes appliquées au niveau du système racinaire peuvent influencer la rhizodéposition et les processus lui étant associés. En effet, l'architecture racinaire, le nombre d'apex racinaires, peuvent être affecté par l'environnement « sol ». Des contraintes mécaniques, des variations de températures ou d'humidité (relatives aux changements climatiques) peuvent modifier la morphologie du système racinaire, et affecter quantitativement et qualitativement la rhizodéposition. C'est alors le contrôle de la rhizodéposition par l'environnement racinaire qu'il serait nécessaire d'étudier.

Suite à ce travail il est nécessaire de s'interroger sur à l'intérêt de mesurer les flux de rhizodéposition puisque ces derniers ne varient que très faiblement en conditions de plein champ lorsque les plantes sont soumises à des contraintes tenant à l'environnement ou aux pratiques agronomiques. En effet, dans des agro-systèmes prairiaux intensifs tels que ceux qui ont constitué le cadre de notre étude, la rhizodéposition n'apparaît pas comme contribuant de manière significative à l'apport de C au sol. Ainsi, il paraît difficile d'agir sur la composante quantitative de la rhizodéposition par le biais de la plante afin d'améliorer la gestion et la qualité agro-environnementales des sols. Cependant, l'activité biologique est la clé du fonctionnement de la rhizosphère. Cette activité biologique dépend de la totalité du C entrant dans le sol (détritusphère et rhizosphère), aussi bien par le biais de la rhizodéposition, du renouvellement racinaire ou encore de la chute de litière. Celle-ci contrôle le fonctionnement des sols, comme nous avons pu l'observer sur le dispositif FACE où l'activité
minéralisatrice des micro-organismes est accrue. Cette activité provoque une libération sous forme de CO₂ plus rapide du C supplémentaire entrant dans le sol du fait d'une production de biomasse végétale stimulée sous atmosphère enrichie en CO₂. Au-delà du flux quantitatif de rhizodéposition, la qualité des rhizodépôts mais également la qualité de l'ensemble des composés carbonés issus de la plante (débris racinaires, litière) contrôlent l'activité et le développement des micro-organismes. En modifiant les relations source-puits dans la plante la nature des composés libérés par la plante peut varier influençant ainsi l'activité, la composition et le développement des micro-organismes. En conditions de plein champ, c'est donc le couplage entre l'écophysiologie de la plante, la nature biochimique des composés libérés dans sol (dont les rhizodépôts font partie) et l'activité biologique du sol qui serait intéressant d'étudier en vue de comprendre les processus clés du fonctionnement rhizosphérique et d'améliorer la gestion et la qualité agro-environnementale des sols.
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FIGURES

Figure 1 : Flux annuels et stocks de carbone en giga tonnes (milliards de tonnes de carbone) (Figure tirée de "L'Avenir Climatique", d'après GIEC, 1996).

Figure 2 : Représentation schématique de l'allocation et de la répartition du carbone dans la plante (d'après Tabourel-Tayot, 1997).

Figure 3: Modèle simplifié présentant le carbone issu de la photosynthèse importé jusqu'aux racines puis transféré dans le sol (d'après Dilkes et al., 2004). Ce schéma vient en complément du schéma précédent (Figure 2) caractérisant la répartition du carbone dans la plante. La rhizodéposition est en continuité avec la plante.

Figure 4: Représentation schématique des effets positifs et négatifs directs et indirects des exsudats racinaires sur la croissance de la plante (d'après Jones et al., 2003).

Figure 5: Schéma récapitulatif des effets de l'élévation du CO₂, de la défoliation et de la fertilisation azotée sur les transferts de C dans la plante.

Figure 6 : Schéma conceptuel récapitulant nos objectifs de travail

Figure 7: Dispositif de marquage des parties aériennes des plantes au ¹⁴CO₂, ¹³CO₂. c chaux sodée, dm : débitmètre massique, f : filtre de 0,2µm, o : ordinateur, pp : pompe péristaltique ; pa : pompe aquarium ; pe : piège à eau.

Figure 8 : Activité spécifique de la chambre pendant le marquage (exemple d'un marquage court de 1h). A la fin du marquage, l'activité spécifique dans la chambre de marquage décroît rapidement grâce au fonctionnement d'une pompe forçant l'ai re de l'enceinte à traverser un piège à chaux sodée piégeant le ¹⁴CO₂ encore présent dans l'enceinte de marquage.
Figure 9 : Evolution de la concentration en CO₂ dans l'enceinte de marquage, avant, pendant le marquage et après le marquage. Grâce au système informatique, la concentration en CO₂ dans l'enceinte de marquage reste constante tout au long de l'expérience.

Figure 10 : Dispositif de marquage des plantes au ¹⁵NH₃. Les plantes assimilent le ¹⁵N par leurs parties aériennes. dm : débitmètre massique, o : ordinateur, pp : pompe péristaltique ; pa : pompe aquarium ; pe : piège à eau.

Figure 11 : Protocole de récolte des plantes après la période de culture

Figure 12 : Représentation schématique de la pré-extraction, fumigation extraction (Vance et al., 1987).

Figure 13 : Schéma des pots de culture. Ces pots sont composés de deux cylindres de PVC s'emboîtant l'un dans l'autre grâce à un collier. Il sont séparés par une toile de nylon (maille 1µ). Le tube supérieur est défini comme étant le compartiment « racine », le tube inférieur comme le compartiment « rhizosphère ».

Figure 14 : Chronologie des différentes étapes de l'expérimentation. Pendant les 28 premiers jours les plantes sont placées en phytotron, ensuite 14 plantes sont mises dans l'enceinte de marquage afin de réaliser le marquage.

Figure 15 : Production de biomasse (Parties aériennes, racines, biomasse totale exprimées en g plante⁻¹) et ratio de biomasse PR/PA des plantes récoltées à la fin du premier (récolte 1, ¹⁴C) et à la fin du second marquage (récolte 2, ¹³C).

Figure 16 : Répartition du ¹⁴C à la fin du premier marquage ainsi que du ¹³C et du ¹⁴C à la fin du second marquage dans la plante et le sol. Les résultats sont exprimés en % total retrouvé.

Figure 17 : La figure représente la cinétique de libération du ¹⁴C et du ¹³C dans le sol adhérent du compartiment rhizosphère (exprimé en µg de C marqué par g de sol adhérent) à J3, J6 J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance.
Figure 18 : La figure représente la cinétique de l'allocation du ¹⁴C et du ¹³C à la respiration rhizosphérique (exprimé en µg de C marqué par g de sol adhérent) à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance.

Figure 19 : Container de marquage renfermant un cylindre de PVC planté d'un ray grass destiné à être marqué au ¹⁴CO₂. Le couvercle présente une ouverture permettant le passage de la plante. Cette ouverture, une fois la plante mise en place est bouchée avec du silicone liquide. Le couvercle présente également 2 trous permettant le branchement de 2 tuyaux reliés aux pièges à soude utilisés pour piéger le CO₂ issu de la respiration rhizosphérique.

Figure 20 : Biomasse sèche des parties aériennes (a, e), des racines (c, g), biomasse sèche totale (b, f) de la plante en g. plante⁻¹ et ratio de matière sèche Parties racinaires PR / Parties aériennes PA (d, h) des plants de *Lolium perenne* récoltés en Juin (printemps, a, b, c, d) et en Septembre (automne, e, f, g, h) dans les anneaux enrichis en CO₂ et ambiants, pour les deux niveaux de fertilisation azotées (56 et 14 g N. m⁻²). Les différentes lettres représentent les résultats du test de Tukey Kramer, effectué lorsqu'une interaction significative est révélée par l'analyse de variance ; n=3.

Figure 21 : Répartition du ¹⁴C assimilé exprimé en pourcentage de ¹⁴C total retrouvé %RTR dans les parties aériennes (a, f), le compartiment souterrain (c, h) (racines b, g; respiration rhizosphérique RR d, i ; et le sol incluant sol adhérent, sol non adhérent et biomasse microbienne e, j), lors des échantillonnages du printemps (a, b, c, d, e) et de l'automne (f, g, h, i, j) au sein des monocultures de ray grass, pour deux niveaux de fertilisation azoté (56 et 14 gN.m⁻²). Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3). Les différentes lettres représentent les résultats du test de Tukey Kramer, effectué lorsqu'une interaction significative est révélée par l'analyse de variance.

Figure 22 : Pourcentage de ¹⁵N dérivé de l'atmosphère dans les feuilles (a), les tiges (b), les racines (c) et le sol adhérent (d) pour les échantillonnages du printemps au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère ambiante ou enrichie en CO₂, sous deux niveaux de fertilisation.. Les barres verticales présentent les intervalles de confiances (n=3).
Figure 23 : Pourcentage de ¹⁵N dérivé de l'atmosphère dans les feuilles (a), les tiges (b), les racines (c) et le sol adhérent (d) pour les échantillonnages de l'automne au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère ambiante ou enrichie en CO₂, sous deux niveaux de fertilisation.. Les barres verticales présentent les intervalles de confiances (n=3).

Figure 24: Concentrations en glucide totaux exprimées en mol de glucide par kg d'échantillon en équivalent hexose, dans les feuilles (a, c) et dans les racines (b, d) après les échantillonnages du printemps (a, b) et de l'automne (c, d) au sein des monocultures de ray grass, pour deux niveaux de fertilisation azoté Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 25: C microbien (mg C kg⁻¹ de sol) du sol adhérent (SA) et non adhérent (SNA) lors des échantillonnages du printemps (a, c) et de l'automne (b, d) au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère ambiante ou enrichie en CO₂, sous deux niveaux de fertilisation. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 26a et b: Production de ¹⁴CO₂ pendant l'incubation de sol adhérent (SA) exprimée en Bq respiré par g de sol adhérent (SA) (26a) et en % de ¹⁴C présent au début de l'incubation dans le sol (26b) lors de l'échantillonnage de l'automne au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère enrichie ou ambiante en CO₂, sous deux niveaux de traitement azoté. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 27: Production de CO₂ pendant l'incubation de sol adhérent (SA) exprimée en mg de C respiré par g de sol adhérent (SA) lors de l'échantillonnage de l'automne au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère enrichie ou ambiante en CO₂ sous deux niveaux de traitement azoté. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 28 : Production de biomasse sèche des plantes (g plante⁻¹, biomasse défoliée + biomasse récoltée) et ratio racines parties aériennes, 2 et 4 jours après la coupe dans les parcelles mono spécifiques de ray grass avec (1) ou sans (0) apport d'azote. Les barres verticales correspondent aux intervalles de confiances (n=6).
Figure 29 : Concentrations en carbone et en azote, exprimées en pourcentage de la MS dans les feuilles, les tiges, les racines, 2 et 4 jours après la coupe des plants de ray grass avec (1) ou sans (0) apport d'azote. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 30 : Concentrations en glucides totaux dans les racines, exprimée en mol. kg⁻¹ de carbone en équivalent hexose pour les différents traitements (0 : sans apport d'azote, 1 : avec apport d'azote), 2 (a) et 4 (b) jours après la coupe. Les barres verticales correspondent aux intervalles de confiance (n=3).

Figure 31 : Pourcentage de carbone (a, d) et d'azote total (b,e) ; concentration en carbone soluble (mg.kg⁻¹ de sol sec ; c, f) dans le sol adhérant (SA) des plantes coupées et des plantes non coupées issues des parcelles fertilisées (1) et non fertilisées (0) après la première (a, b, c) et la seconde récolte (d, e, f). Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 32 : Carbone et azote microbien (mg C et N par kg de sol sec) pour le sol adhérent (SA); mesure de l'activité microbienne (test glucose ¹⁴C) ¹⁴CO₂ : ¹⁴C respiré (¹⁴CO₂), ¹⁴C<sub>FE</sub> : ¹⁴C de la biomasse microbienne et ¹⁴CO₂/¹⁴C<sub>FE</sub> : activité microbienne exprimée proportionnellement à la biomasse microbienne dans le sol adhérent, Nombre de bactéries cultivables à stratégie r (2 jours de développement) exprimée en log de CFU (Colonies formant unités) par gramme de sol adhérent sec et indice de Shannon correspondant à la diversité d'utilisation des substrats carbonés par les micro-organismes du sol adhérent des plantes coupées et des plantes non coupées issues des parcelles fertilisées (1) et non fertilisées (0) après la première et la seconde récolte. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3).

Figure 33 : Nombre de fongivores (a), herbivores (b) et bactérivores (c) par gramme de sol, dans les parcelles coupées et non coupées, fertilisées (1) et non fertilisées (0). Les barres verticales correspondent aux intervalles de confiance. Les différentes lettres montrent des différences significatives au seuil de 5%.
TABLEAUX

Tableau 1 : Effets de quelques facteurs à impact majeur sur l'assimilation et la répartition des assimilats dans la plante. Ces éléments bibliographiques sont tirés d'articles de synthèses et de résultats expérimentaux.

Tableau 2 : les différentes catégories de rhizodépôts (d'après Rovira et al., 1979) selon leur composition biochimique et leur mode de libération.

Tableau 3: Analyses statistiques de la production de biomasse (parties aériennes, racines et totale) et du ratio de biomasse PR/PA des plantes récoltées à la fin du premier (¹⁴C) et à la fin du second marquage (¹³C). Seuil de significativité 5% ; n=7.

Tableau 4: Analyses statistiques de la répartition du ¹⁴C à la fin du premier marquage et du ¹³C à la fin du second marquage dans les parties aériennes, les racines de la plante et le sol (sol adhérent des compartiments racines et rhizosphères, le sol non adhérent du compartiment rhizosphère et la respiration rhizosphérique) Seuil de significativité 5% ; n=7.

Tableau 5: Analyses statistiques de la répartition du ¹³C et du ¹⁴C dans les parties aériennes, les racines de la plante et le sol (sol adhérent des compartiments racines et rhizosphères, le sol non adhérent du compartiment rhizosphère et la respiration rhizosphérique) à la fin du second marquage (histogramme (2) et (3)). Seuil de significativité 5% ; n=7.

Tableau 6 : Le tableau présente les valeurs statistiques issus de la comparaison des masses de ¹⁴C et de ¹³C libérée par les racines à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les différences sont significatives à 5 %, n=7.

Tableau 7 : Le tableau présente les valeurs statistiques issus de la comparaison des masses de ¹⁴C et de ¹³C allouées à la respiration rhizosphérique à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les différences sont significatives à 5 %, n=7.
Tableau 8 : Carbone microbien du sol adhérent (SA, 5 premiers mm de sol) et du sol non adhérent (SNA, 45mm de sol suivant) dans le compartiment rhizosphère 0, 3, 6, 8, 10 jours après le début du marquage au ¹³C. La différence significative de biomasse entre SA et SNA correspond à l'effet rhizosphère. Il est significatif au seuil de 5% (n=7).

Tableau 9 : Excès isotopique dans les différents compartiments de notre dispositif de culture (Parties aériennes des plantes, racines, sol adhérent (SA) du compartiment racine, sol rhizosphérique (SR) du compartiment rhizosphère) après 10 jours de marquage au carbone 13 avec un excès isotopique de 5 atom %.

Tableau 10 : Résultats des analyses statistiques des différents paramètres : production de biomasse, répartition du ¹⁴C, du ¹⁵N. et carbone microbien du sol adhérent et du sol non adhérent. Les effets CO₂, azote (N) et les interactions CO₂ X N sont testés et considérés comme significative au seuil de 5%.

Tableau 11 : Flux spécifiques nets d'entrée de ¹⁴C dans le système plante-sol exprimés en KBq retrouvé par g⁻¹ de parties aériennes, après l'échantillonnage d'automne pour les deux niveaux de CO₂ (CO₂⁺ : enrichi, CO₂ : ambiant) et les deux niveaux de fertilisation (56 et 14 g·m⁻²). Les valeurs entre parenthèses correspondent aux intervalles de confiance, n=3.

Tableau 12 : Résultats des analyses statistiques pour les différents paramètres analysés : Production de biomasse, concentration en C et en N et ratio C/N dans les différents organes de la plante, Concentration en carbone, azote total et carbone soluble du sol adhérent, C et N microbien, activité microbienne (test glucose ¹⁴C), étalement bactérien et test Biolog® (indice de Shannon). Les effets défoliation, azote et date de récolte sont testés, ainsi que les interactions Défoliation X Azote, Défoliation X Récolte et Azote X Récolte. Les effets sont considérés comme significative au seuil de 5%.
# PHOTOGRAPHIES

Photographie 1 : Pièges à soude contenant 200ml de NaOH 1M permettant de mesurer la respiration rhizosphérique. Il y a un piège à soude par pot.

Photographie 2 : Enceinte de marquage contenant les plantes. Ici ce sont les 24 plantes utilisées pour l'expérimentation décrite dans le chapitre E.

Photographie 3 : Plantes cultivées pendant 28 jours en phytotron et placées dans l'enceinte de marquage.

Photographie 4 : Le pot a été retourné et la toile de nylon découpée afin d'observer le tapis de racine formé sur la toile de nylon à l'interface entre le compartiment racine et le compartiment rhizosphère.

Photographies 5 et 6 : Vue d'un anneau enrichi du dispositif FACE Suisse. On peut distinguer la présence de buse permettant la diffusion du CO₂ au-dessus de la parcelle ainsi que la présence d'un capteur de la concentration en CO₂, de la vitesse du vent et de la température.

Photographies 7 et 8 : Parcelle d'expérimentation à l'INRA-SAD de Mirecourt (88). Les photographies ont été prises après la seconde coupe. Les piquets délimitent les parcelles et permettent de repérer plus facilement les cylindres de PVC. La parcelle est régulièrement nettoyée de toutes mauvaises herbes.
# ANNEXES

## ANNEXE 1 :

Au jour de la soutenance, ce travail de thèse a permis la rédaction de deux articles scientifiques :

Bazot S., Ulff L., Blum H., Nguyen C., Robin C. (2005). Effects of elevated CO₂ concentration on rhizodeposition of *Lolium perenne* grown on soil exposed to 9 years of CO₂ enrichment. *Soil Biology and Biochemistry*, sous presse;

Bazot S., Mikola J., Nguyen C., Robin C. (2005). Do defoliation-induced changes in C allocation of field-grown *Lolium perenne* affect C availability, microbes and microbial feeders in soil? *Functional Ecology*, 19 (5), 886-896.

Ce travail a également permis la présentation de 5 communications et posters présentés dans des réunions et colloques internationaux:

Bazot S., Ulff L., Blum H., Nguyen Ch., Robin Ch. (2003). Présentation de la problématique de thèse : transferts de carbone dans le système-plante-sol-micro-organismes. **Séminaire de l'Ecole Doctorale RP2E**, 23 janvier 2003, Nancy (France).

Bazot S., Ulff L., Blum H., Nguyen Ch., Robin Ch. (2003). Effet de l'augmentation de la concentration en CO₂ de l'atmosphère sur la libération de carbone dans la rhizosphère d'une graminée prairiale : le ray grass (*Lolium perenne*). **Cinquièmes Journées d'Ecologie Fonctionnelle**, 12-14 mars, Nancy (France).

Bazot S., Ulff L., Blum H., Nguyen Ch., Robin Ch. (2004). Carbon partitioning into rye grass (*Lolium perenne*) plant soil micro organisms system after 9 years of Free-air CO₂ enrichment. **International FACE Workshop 20 - 25 March 2004, Ascona (Suisse)**.

Bazot S, Tavernier J, Plantureux S., Robin Ch. (2004). Carbon partitioning into plant soil system of rye grass (*Lolium perenne*) sward after defoliation. **EGF 2004 General Meeting, Land use systems in grassland-dominated regions**. 21-24 June 2004, Luzern (Suisse).
Bazot S., Tavernier J., Mikola J., Robin Ch. (2004). Pattern of carbon allocation in the rhizosphere of rye grass (*Lolium perenne*) plant after defoliation. Proceedings 4ème colloque **Rhizosphère**, 12-17 Septembre 2004, Munich (Allemagne). A. Hartmann, M. Schmid, W. Wenzel, Ph. Hinsinger (Eds), p 201.
ANNEXE 2 : Calcul de l'analyse *a posteriori* de l'abondance isotopique en $^{13}$C de l'atmosphère dans l'enceinte de marquage des plantes :

Afin de déterminer l'excès isotopique de l'air de la chambre de marquage, un circuit fermé permet, pendant le marquage, de piéger l'air de la chambre dans 100ml de NaOH 1M pendant 30 min. Cette opération est répétée 3 fois chaque fois que le marquage au $^{13}$C est réinitialisé.

$\delta^{13}\text{C}$ atmosphère moyen (moyenne de 6 échantillons) = 3488 (donnée de l'analyse au spectromètre de masse (analyse effectuée par le laboratoire Isotope de l'université de Davis (USA).

$$ \text{R atmosphère} = 0,050434 \ (1) $$

$$ \text{A\% atmosphère} = 4,80 \ (\text{atom \%}) \ (2) $$

Formules utilisées :

$$ (1) \text{R}= \left( \left( \frac{\text{\textsuperscript{13}C échantillon}}{1000} \right) +1 \right) \times 0,0112372 $$

$$ (2) \text{A\%} = \left( \frac{\text{R échantillon}}{\text{R échantillon} + 1} \right) \times 100 $$
ANNEXE 3 : Test de validation de l'utilisation du liquide scintillant ULTIMA-FLO (Packard, USA).

Nous avons observé lors du passage au compteur à scintillation liquide du mélange K₂SO₄ (issue de l'extraction-fumigation) liquide scintillant de type Ultima Gold (Packard, USA) une séparation rapide du mélange en deux phases, le K₂SO₄ se retrouvant en dépôt au fond du tube de comptage. La mesure de la radioactivité est alors faussée. Par conséquent nous avons testé différent liquide scintillant dont l'Ultima Flo (Packard, USA). Le K₂SO₄ reste en suspension dans le liquide scintillant ce qui permet une stabilité de la mesure de radioactivité dans le temps (60h).

<figure><img src="image_44.png" /></figure>
ANNEXE 4 : Calculs préliminaires permettant d'évaluer la pertinence d'un double marquage en abondance naturelle de plantes avec deux atmosphères ayant une signature isotopique différente :

Durée du marquage : 10 jours

$\delta^{13}\text{C}$ du sol de culture choisi : -12‰

$\delta^{13}\text{C}$ atmosphère 1 : -45‰

$\delta^{13}\text{C}$ atmosphère 2 : +200‰

$\delta^{13}\text{C}$ théorique des exsudats issus des plantes évoluant dans l'atmosphère 1 : -45-20=-65‰

Masse de sol : 20g

Masse théorique totale d'exsudat produit : 0,014g soit 0,0014 mg d'exsudat produit par jour.

Base du calcul 70µg de C. g⁻¹ de sol sont libérés chaque jour et 20g de sol adhérent par plante.

Marquage atmosphère 1 pendant 10 jours

$R_{\text{sol}} = 0,011102 (1)$

Abondance isotopique du sol $A\% = 1,098044 (2)$

$R_{\text{exsudats}} = 0,010506 (1)$

$A\%_{\text{exsudats}} = 1,039753 (2)$

Masse $^{13}\text{C}$ sol (mg) = 219,6088 (3)

Masse $^{13}\text{C}$ exsudats (mg) = 0,143337 (3)

Quantité $^{13}\text{C}$ exsudats + sol (mg) = 219,7522

$$A\%_{\text{exsudats}} + \text{sol} = 1,098020 (4)$$

Marquage atmosphère 2 pendant 10 jours

$\delta^{13}\text{C}_{\text{sol}} = \delta^{13}\text{C}_{\text{exsudats}} + \text{sol}_{\text{en fin du marquage 1}} = -12,022268 \text{ ‰} (5) (6)$

$\delta^{13}\text{C}_{\text{des exsudats}} = 200-20= 180 \text{ ‰}$

$R_{\text{sol}} = 0,011102$
$$A\% \text{ sol} = 1,098020$$

$$R \text{ exsudats} = 0,013259$$

$$A\% \text{ exsudats} = 1,30863721$$

$$\text{Masse } ^{13}\text{C sol (mg)} = 219,6040$$

$$\text{Masse } ^{13}\text{C exsudats (mg)} = 0,176666$$

$$\text{Quantité } ^{13}\text{C exsudats + sol (mg)} = 219,7806$$

$$A\% \text{ exsudats} + \text{sol} = 1,098162$$

Au vu de ces résultats il apparaît très clairement qu'il est difficile de discriminer le carbone issu des deux atmosphères tellement la variation de l'abondance isotopique du mélange exsudats + sol est faible.

Formules utilisées :

$$(1) R = \left( \left( \frac{\delta^{13}\text{C échantillon}}{1000} \right) + 1 \right) \times 0,0112372$$

$$(2) A\% = \left( \frac{R \text{ échantillon}}{R \text{ échantillon} + 1} \right) \times 100$$

$$(3) \text{Masse } ^{13}\text{C} = \frac{\text{Masse échantillon} \times A\%}{100}$$

$$(4) A\% = \frac{\text{Masse de } ^{13}\text{C échantillon} \times 100}{\text{Masse de l'échantillon}}$$
$$ (5) R = \frac{A\%}{(100-A\%)} $$

$$ (6) \delta^{13}C = \frac{R}{R_{PDB}} - 1 \times 1000 $$
# ANNEXE 5 : Définition et mesure de la capacité au champ

La capacité au champ correspond à l'eau retenue par le sol après une période de pluie et un ressuyage de deux jours, le sol étend protégé contre l'évaporation, elle comprend donc l'eau capillaire augmentée d'une fraction variable d'eau de gravité à écoulement lent (Duchaufour, 1997).

Un pot contenant une masse connue de sol frais est saturé d'eau par immersion dans un bac. Après 24 heures, de l'eau s'écoule lorsque le pot est retiré du bac. Le pot est alors mis à ressuyer. Après 48 heures l'écoulement d'eau s'est arrêté. Le sol a atteint son point de ressuyage, il est à 100% de la capacité au champ. Il est ainsi possible d'estimer le pourcentage d'humidité de ce sol à 100% de la capacité et champ, et de calculer ensuite le pourcentage d'humidité du sol et donc la masse de sol à 60% de la capacité au champ.

## Calcul :

### a. Compartiment racine :

- Volume pot : 237 L

- Densité du sol : 1,3 kg de sol sec. L⁻¹

- Masse de sol sec dans le pot : 308 g

- A 100% de la capacité au champ on a 20% d'humidité soit une masse de sol de 370g.

- A 60% de la capacité au champ on a alors 12% d'humidité soit une masse de sol de 345 g.

### b. Compartiment rhizosphère :

- Volume pot : 118 L

- Densité : 1,3 kg de sol sec. L⁻¹

- Masse de sol sec dans le pot : 154 g

- A 100% de la capacité au champ on a 20% d'humidité soit une masse de sol de 185g.

- A 60% de la capacité au champ on a alors 12% d'humidité soit une masse de sol de 172g.
<figure><img src="image_45.png" /></figure>

ELSEVIER

Soil Biology & Biochemistry xx (2005) 1-8

Soil Biology &
Biochemistry

www.elsevier.com/locate/soilbio

Effects of elevated CO₂ concentration on rhizodeposition from *Lolium perenne* grown on soil exposed to 9 years of CO₂ enrichment

S. Bazotª, L. Ulffᵇ, H. Blumᶜ, C. Nguyenª, C. Robinª,\*

Received 9 February 2005; received in revised form 22 June 2005; accepted 22 June 2005

Abstract

The effects of enriched CO₂ atmosphere on partitioning of recently assimilated carbon were investigated in a plant-soil-microorganism system in which *Lolium perenne* seedlings were planted into cores inserted into the resident soil within a sward that had been treated with elevated CO₂ for 9 consecutive years, under two N fertilisation levels (Swiss FACE experiment). The planted cores were excavated from the ambient (35 Pa pCO₂) and enriched (60 Pa pCO₂) rings at two dates, in spring and autumn, during the growing season. The cores were brought back to the laboratory for ¹⁴C labelling of shoots in order to trace the transfer of recently assimilated C both within the plant and to the soil and microbial biomass. At the spring sampling, high N supply stimulated shoot and total dry matter production. Consistently, high N enhanced the allocation of recently fixed C to shoots, and reduced it to belowground compartments. Elevated CO₂ had no consequences for DM or the pattern of C allocation. At the autumn sampling, at high N plot, yield of *L. perenne* was stimulated by elevated CO₂. Consistently, ¹⁴C was preferentially allocated aboveground and, consequently belowground recent C allocation was depressed and rhizodeposition reduced. At both experimental periods, total soil C content was similar in all treatments, providing no evidence for soil carbon sequestration in the Swiss Free Air CO₂ Enrichment experiment (FACE) after 9 years of enrichment. Recently assimilated C and soil C were mineralised faster in soils from enriched rings, suggesting a CO₂-induced shift in the microbial biomass characteristics (structure, diversity, activity) and/or in the quality of the root-released organic compounds.

© 2005 Published by Elsevier Ltd.

Keywords: Carbon sequestration; Elevated CO₂; Microbial biomass; Mineralisation; Nitrogen fertilisation; Rhizodeposition; Rhizosphere respiration

**1. Introduction**

Living roots continually release organic carbon into the rhizosphere, the soil volume in the vicinity of roots (Rovira, 1969), with the amount representing a significant part of the total plant C budget. This process, referred to as rhizodeposition (Whipps and Lynch, 1983), is affected qualitatively and quantitatively by a wide range of factors including plant species, phenology and environmental conditions (Rovira, 1959; Hale and Moore, 1979; Curl and Truelove, 1986; Grayston et al., 1996). Within the global change context, the predicted rise of atmospheric CO₂

concentration is an important environmental change with
crucial implications for terrestrial ecosystems. Therefore,
the responses of plants and rhizosphere micro-organisms to
rising atmospheric CO₂ are particularly important to
quantify if the consequences of rising atmospheric CO₂
for soil C dynamics and nutrient cycling are to be predicted.

Most studies aiming to quantify the consequences of
elevated CO₂ on C fluxes from plants to the rhizosphere and
various soil compartments have been conducted under
controlled conditions that usually optimize plant growth.
Few field studies have been reported, despite their obvious
relevance for C dynamics. A survey of the literature shows
that for both controlled environment and field conditions,
elevated CO₂ frequently increases dry matter yield (Kimball,
1983; Ross et al., 1995, 1996; Hebeisen et al., 1997; Daepp
et al., 2000; Suter et al., 2002), in the absence of limiting
factors such as the availability of nitrogen. This CO₂-induced
yield increase is attributed to a stimulation of net CO₂

E-mail address: christophe.robin@ensaia.inpl-nancy.fr (C. Robin).

<footnote>ªRhizosphere group, UMR INPL-INRA Agronomie et Environnement ENSAIA, 54505 Vandoeuvre-les-Nancy, France</footnote>

<footnote>ᵇDepartment of Soil Sciences, Division of Plant Nutrition and Soil Fertility, Swedish University of Agricultural Sciences, S-75007 Uppsala, Sweden</footnote>

<footnote>ᶜInstitute of Plant Sciences, Swiss Federal Institute of Technology (ETH), 8092 Zürich, Switzerland</footnote>

<footnote>* Corresponding author. Tel.: +33 3 83 59 58 56; fax: +33 3 83 59 57 99.</footnote>
assimilation (Long and Drake, 1991; Rogers et al., 1998; Ainsworth et al., 2003), but the consequences for the patterns of C allocation belowground, under field conditions, are more controversial. Indeed, field studies either demonstrate no influence of elevated CO₂ on soil C content even after long-term CO₂ enrichment, irrespective the nutrient status of the soil (Ross et al., 1996; Niklaus, 1998; Niklaus et al., 2000; 2001; Gill et al., 2002; Horwath et al., 2001; Van Kessel et al., 2000a,b; Van Groeningen et al., 2002; Ross et al., 2004), or an increase of soil C pools (Williams et al., 2000). None of those studies have measured either rhizodeposition or the contribution of rhizodeposits to the soil carbon pool. In those studies, the contribution of carbon of plant origin (i.e. C from litter fall, rhizodeposition or root turnover) to the soil carbon pool was assessed collectively and the studies involved long-time scales (months and years); thus individual fluxes were not determined. Quantification of rhizodeposition at elevated CO₂ is required, because in the main root-released organic compounds stimulate the growth and activity of microbes as the availability of carbon in the soil usually limits microbe activity. Additionally, rhizodeposition is a major fraction of soil C input in natural ecosystems (Stanton, 1988). Very few studies have investigated rhizodeposition under elevated CO₂ in undisturbed soil; elevated CO₂ stimulated rhizodeposition in a native C3–C4 grassland ecosystem (Pendall et al., 2004). Under intensively managed grassland Free Air CO₂ Enrichment (FACE) system as the Swiss FACE, there are no results available on the contribution of rhizodeposition to total soil C pool.

The Swiss FACE offers a unique opportunity for quantifying plant-soil carbon fluxes within an intensively managed rye grass sward under two distinct N fertilisation levels and long-term CO₂ enrichment under 9 consecutive years.

In this context, the aims of this study were to assess (i) the influence of elevated CO₂ on the partitioning of recently assimilated carbon within the *Lolium perenne* plant and to the belowground compartments and (ii) whether the responses to elevated CO₂ are mediated by the availability of N in the soil. Additionally, two indicators of the fate of carbon in the soil were assessed: the decomposition rate of root-released organic carbon in the rhizosphere soil and the C concentration in the soil after a 9 year CO₂ enrichment.

Pulse labelling of shoots with ¹⁴C as a tracer was used to study the allocation of recently fixed carbon within all compartments of the plant-soil-micro-organism ecosystem. In our study, plants were labelled in the laboratory in order to control and regulate the climatic and labelling parameters during labelling.

## 2. Materials and methods

### 2.1. Plant material and growth conditions

The FACE experiment is located at the Swiss Federal Institute of Technology (ETH) at the field station of

Eschikon, Switzerland. The first CO₂ enrichment on this system started the 31st May 1993. Thus, plants and soil of elevated CO₂ plots had been enriching for 9 years when the experiment started in 2002. The clay loam soil contained a mean of 28% clay, 33% silt and 36% sand. The soil pH value ranged between 6.5 and 7.6 (Hebeisen et al., 1997).

Three blocks were established. Within each block were a ring at ambient CO₂ concentration (at about 35 Pa pCO₂) and a ring at elevated CO₂ concentration (at about 60 Pa pCO₂ during daylight hours, during the growing period from March to October). Monoculture plots (2.8×1.9 m) of *L. perenne* cv. Bastion had been established within each ring in 1993. These plots received either a low or high fertilisation level of NH₄NO₃ fertiliser. The low N plots received 14 g m⁻² y⁻¹, whereas high N plots received 42 g m⁻² y⁻¹ m in 1993 and 56 g m⁻² y⁻¹ thereafter. The amount of the fertiliser was split into portions of 30, 20, 20, 15, 15% after the first to the fifth defoliation (5 cm cutting height), respectively.

Seeds of *L. perenne* cv. Bastion for this experiment were germinated in a greenhouse at ambient CO₂. Bare rooted seedlings were transplanted 35 d after sowing into undisturbed soil cores (April 19 for the spring sampling and July 10 for the autumn sampling; one plant per soil core) in enriched and ambient CO₂ rings. Soil cores were formed by pushing PVC tubes (diameter = 8 cm, height = 20 cm) into the soil. The mineral horizon (H2) was found below 20 cm. Therefore most of the rye-grass roots are found in the first 20 cm of soil. As the plant density of the previously established *L. perenne* plants was not high after 9 years, it allowed the PVC tubes to be randomly positioned in gaps between plants. Therefore, the test plants were grown in undisturbed soil cores and were subjected during their development to competition for light from the other resident plants in the plots. Sixteen soil cores were installed in each block. Forty eight cores (4×2 (N levels) ×2 (CO₂ concentration) ×3 (blocks)), each with a young ryegrass plant, were excavated both on June 14 (spring sampling) and on September 27 (autumn sampling). Plants of spring sampling were exposed to elevated CO₂ for 56 d. They were defoliated and fertilised once (30% of the total annual amount, i.e. 4.2 g m⁻² under low N and 16.8 g m⁻² under high N). Plants of the autumn sampling were exposed to elevated CO₂ for 79 d. They were defoliated three times and the soil monoliths fertilised four times (85% of the annual input, i.e. 11.9 g m⁻² under low N and 47.6 g m⁻² under high N). Immediately after excavation from the rings, the cylinders were brought back to the laboratory for ¹⁴C labelling in order to precisely regulate the climatic and labelling parameters during labelling.

### 2.2. ¹⁴C-CO₂ pulse labelling of plant soil cores

The soil cores were set into air tight PVC pipes (diameter = 10 cm, height = 35 cm) for ¹⁴CO₂ pulse labelling. Aboveground was separated from belowground
compartments for the measurement of the rhizosphere
respiration. PVC stopper and liquid silicon (Rhodorsil®
RTV 3428, Rhone Poulenc, France) ensured total air
tightness between the aboveground and belowground
compartments. Two 5 mm diameter holes in the stopper
served as the inlet/outlet for flushing of the belowground
compartment by a stream of CO₂ free air.

For the 24 h prior to labelling, the PVC pipes, with the
plants, were set within the assimilation chamber for
acclimation to climatic conditions of the chamber. Climatic
conditions were maintained as follows: photon flux density
of 400 µmoles m⁻² s⁻¹ at the top of the PVC pipes, 22 °C
day/night temperature. CO₂ partial pressure in the chamber
was continuously regulated at 36 ± 0.7 Pa for the cores
coming from ambient rings and at 60 ± 1.3 Pa for the cores
coming from enriched rings. A flow scintillation analyser
Radiomatic A500TR (Packard Instruments Co. Inc., CT,
USA), equipped with a 15 ml plastic scintillation cell
(Packard Instruments), was coupled with an Infra Red Gas
Analyser (IRGA; ADC 225 MK3, Hoddesdon, United
Kingdom) and computers in order to monitor both ¹⁴C
activity and CO₂ concentration within the chamber. The
¹⁴CO₂ was generated by addition of lactic acid (1 M) to
NaH¹⁴CO₃. The specific activity within the chamber (ratio
¹⁴C/¹²C) was maintained constant for 90 min at
40 kBq mg C⁻¹ for the labelling of the spring sampling
and at 55 kBq mg C⁻¹ for the autumn sampling. An
aquarium pump was used to rapidly inject the ¹⁴CO₂ into
the chamber. A fan ensured homogenisation of the
atmosphere within the chamber. At the end of the labelling,
air from the chamber was forced to pass through a soda lime
cartridge that trapped the remaining radioactivity and the
chamber was flushed with ¹²CO₂ to maintain constant CO₂
concentration. From the end of the labelling until the end of
the chase period, i.e. 48 h, the soil compartment of the PVC
pipe was continuously flushed with CO₂ free air and the CO₂
released from belowground (rhizosphere respiration, RR)
was trapped by bubbling into a glass tube containing 200 ml
of 1N NaOH.

2.3. Harvest

Plants were sampled 48 h after labelling and were
divided into laminae, sheaths and roots, carefully removed
from the soil by hand picking. Soil adhering to roots was
collected with a brush and sieved at 2 mm. Roots were then
washed with 0.5 M CaCl₂ (isotonic solution). Bulk soil was
sieved at 2 mm and considered as non-adhering soil. At
harvest, all samples were immediately frozen in liquid
nitrogen and stored at -30 °C until further analyses.

2.4. Analyses

Plant organs, aliquots of adhering soil and non-adhering
soil were lyophilised, weighed and ground to a fine powder.

Carbon content were determined by dry combustion using a
C auto-analyser (Flash EA 1112 series, Thermo Finnigan).

Fourteen C in plant material was counted with a ¹⁴C
analyser (Radiomatic series Flo-one A 500, Packard, USA)
on-line at the outflow of the C and N auto-analyser (Benoit
et al., 1994), without the use of a scintillation cocktail
compounds and therefore, this method generates no waste.
As soil ¹⁴C activity was too low to be analysed with the
previous method, a sample oxidizer (Model 307, Packard,
USA) was used and the CO₂ in the combustion products was
trapped in a liquid scintillation cocktail (Carbosorb and
Permafluor, Packard, USA) and counted with a liquid
scintillation counter (Tri-Carb 2100 Tr, Packard).

The microbial biomass of adhering and non-adhering soil
was estimated immediately after harvest on fresh samples
by chloroform fumigation-extraction (Vance et al., 1987).
Radioactivity of the microbial biomass was determined by
liquid scintillation counting (Tri-Carb 2100 Tr, Packard) on
1 ml aliquot of K₂SO₄ extraction solution (0.5 M) added to
10 ml Packard Ultima-Flo Cocktail. Carbon dioxide
radioactivity, captured from the rhizosphere respiration in
NaOH traps, was counted with Packard Ultima-Gold
Cocktail.

For the autumn sampling mineralisation of ¹⁴C root
released organic compounds and of organic matter was
assessed on 20 g of adhering soil incubated for 30 d at 22 °C
(the same temperature as for the rhizosphere respiration) in
the dark in glass jars. Total CO₂ and ¹⁴CO₂ mineralised by
microbial biomass was trapped in 20 ml of 1 M NaOH.
NaOH traps were counted regularly during the 30 d
incubation in order to establish the kinetics of mineralis-
ation. Fourteen C content of NaOH was counted in liquid
scintillation (Tri-Carb 2100 Tr, Packard) with the Packard
Ultima Gold Cocktail. The C and N content of liquid
solution (K₂SO₄ from extraction fumigation and NaOH
from rhizosphere respiration traps and incubation) was
analysed by a Total Organic Carbon analyser (TOC-VCSH,
Shimadzu, Japan) coupled on line with a N analyser (TNM-
1, Shimadzu, Japan).

Carbon 14 activity of a compartment was expressed as a
percentage of the activity recovered in the compartment
from total radioactivity recovered (%TRR) in the plant soil
system (plant, soil, C microbial biomass and belowground
respiration). The %TRR of a given compartment indicates
¹⁴C distribution as a result of both size and metabolic
activity of the compartment. It corresponds to the relative
sink strength of the compartment (Cralle and Heichel, 1985;
Robin et al., 1987).

2.5. Statistical analyses

The entire data set consists of 96 cores harvested
destructively (2 CO₂×2 N levels ×3 blocks ×2 dates
×4 cores per plot). The experiment was analysed as a split
plot design with CO₂ as the main-plot factor, N fertilization
the sub-plot and three replications (3 blocks; Hebeisen et al.,
1997). The data was statistically analysed by ANOVA and Tukey-Kramer test in order to compare all pairs of means in case of interaction between effects (JMPin, SAS Institute 1989–1997®). All tests were carried out at the 95% confidence level.

## 3. Results

### 3.1. Plant productivity

No significant stimulation of total dry matter (DM) production under elevated CO₂ was observed at spring sampling (Table 1). However, at autumn sampling, there was a significant interaction between CO₂ and N effects. Under high N treatment, elevated CO₂ increased DM production (*P* < 0.001; Tukey Kramer test). At both sampling dates, high N supply increased total DM (Table 1). The root to shoot biomass ratio was not significantly affected by CO₂ at either sampling date, but was significantly decreased by high N treatment at the spring sampling.

### 3.2. Belowground ¹⁴C partitioning

#### 3.2.1. Spring

Under elevated CO₂ and ambient CO₂ the ¹⁴C-assimilates allocated belowground were 46 and 50%

(mean of both N treatments), respectively (Table 2). A total of 33 and 36% of ¹⁴C in the elevated and ambient CO₂ treatments, respectively, was released from roots (¹⁴C in rhizosphere respiration, soil and microbial biomass) (Table 2). These values were not significantly different.

The belowground ¹⁴C allocation was lower in the high than in the low N treatment (39 vs. 57% TRR): proportionally less ¹⁴C was released from high than from low N plants (27 vs. 42% TRR in rhizosphere respiration, soil and microbial biomass; Table 2).

#### 3.2.2. Autumn

At the autumn sampling, there was an indication of an interaction between CO₂ and N (Table 2) for ¹⁴C allocation aboveground (*P* = 0.057) and belowground (*P* = 0.059). Under high N, a lower proportion of ¹⁴C was allocated belowground (*P* < 0.001; Tukey Kramer test; sum of the ¹⁴C allocated to microbial biomass, adhering and non-adhering soils).

Nitrogen had no significant effect on the pattern of ¹⁴C allocation in the plant-soil system other than reducing rhizosphere respiration at elevated CO₂ (Table 2).

### 3.3. Microbial C

A higher microbial biomass was found in adhering soil than in non-adhering soil under ambient CO₂ (Table 3). Microbial biomass (mgC kg⁻¹ soil) in

<caption>Table 1</caption>

Plant dry matter (g plant⁻¹) and Root to Shoot biomass ratio (R/S) at the spring and at the autumn samplings of rye grass monoculture plots at ambient (CO₂⁻) or enriched (CO₂⁺) CO₂, under two N treatments

<table><thead><tr><th>Spring sampling</th><th>N supply (g.m<sup>-2</sup>)</th><th colspan="2">Shoots (g)</th><th colspan="2">Roots (g)</th><th colspan="2">Total (g)</th><th colspan="2">R/S</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>+</td><td>56</td><td>2.8 (0.98)</td><td></td><td>1.2 (0.25)</td><td></td><td>4.0 (1.05)</td><td></td><td>0.43 (0.171)</td><td></td></tr><tr><td>14</td><td>1.2 (0.29)</td><td></td><td>1.7 (0.61)</td><td></td><td>2.9 (0.76)</td><td></td><td>1.41 (0.678)</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>-</td><td>56</td><td>2.5 (0.63)</td><td></td><td>1.2 (0.38)</td><td></td><td>3.7 (0.92)</td><td></td><td>0.48 (0.073)</td><td></td></tr><tr><td>14</td><td>1.5 (0.34)</td><td></td><td>1.6 (0.55)</td><td></td><td>3.1 (0.85)</td><td></td><td>1.07 (0.221)</td><td></td></tr><tr><th>Statistics</th><th></th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th></tr><tr><td rowspan="3">CO<sub>2</sub></td><td></td><td>0.011</td><td>NS</td><td>0.015</td><td>NS</td><td>0.001</td><td>NS</td><td>3.421</td><td>NS</td></tr><tr><td></td><td>20.31</td><td>**</td><td>4.836</td><td>*</td><td>4.183</td><td>*</td><td>16.13</td><td>**</td></tr><tr><td></td><td>0.821</td><td>NS</td><td>0.001</td><td>NS</td><td>0.394</td><td>NS</td><td>1.373</td><td>NS</td></tr><tr><th>Autumn sampling</th><th>N supply (g.m<sup>-2</sup>)</th><th colspan="2">Shoots (g)</th><th colspan="2">Roots (g)</th><th colspan="2">Total (g)</th><th colspan="2">R/S</th></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>+</td><td>56</td><td>2.9 (0.64)</td><td>a</td><td>1.3 (0.39)</td><td></td><td>4.2 (0.81)</td><td></td><td>0.45 (0.213)</td><td></td></tr><tr><td>14</td><td>1.1 (0.21)</td><td>b</td><td>0.8 (0.35)</td><td></td><td>1.9 (0.44)</td><td></td><td>0.73 (0.320)</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>-</td><td>56</td><td>1.5 (0.68)</td><td>b</td><td>1.1 (0.48)</td><td></td><td>2.6 (1.02)</td><td></td><td>0.73 (0.328)</td><td></td></tr><tr><td>14</td><td>0.7 (0.20)</td><td>b</td><td>0.6 (0.14)</td><td></td><td>1.3 (0.26)</td><td></td><td>0.86 (0.243)</td><td></td></tr><tr><th>Statistics</th><th></th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th></tr><tr><td rowspan="3">CO<sub>2</sub></td><td></td><td>3.331</td><td>NS</td><td>1.625</td><td>NS</td><td>3.246</td><td>NS</td><td>2.162</td><td>NS</td></tr><tr><td></td><td>23.24</td><td>**</td><td>3.691</td><td>*</td><td>15.76</td><td>**</td><td>1.062</td><td>NS</td></tr><tr><td></td><td>5.942</td><td>*</td><td>0.003</td><td>NS</td><td>2.372</td><td>NS</td><td>1.435</td><td>NS</td></tr></tbody></table>

Numbers given in parentheses represent standard deviation (n=3). Letters represent the results of the Tukey Kramer test when the interaction N X CO₂ is significant. Means followed by different letters are significantly different at *P* < 0.05 whatever the treatments, for a given compartment. NS, *, ** for *P* values > 0.05, < 0.05, < 0.01, respectively.
<caption>Table 2</caption>

$^{14}$C assimilate partitioning expressed as a percentage of total $^{14}$C recovered (%TRR) in shoots, belowground (roots; rhizosphere CO$_{2}$, RR; and soil including adhering soil, non adhering soil and microbial biomass), at the spring and at the autumn samplings in rye grass monoculture at ambient (CO$_{2}$ − ) or enriched (CO$_{2}$ +) CO$_{2}$, under two N treatments. Numbers given in parentheses represent standard deviation (n=3)

<table><thead><tr><th>Spring sampling</th><th>N supply (g.m<sup>-2</sup>)</th><th colspan="2">Shoots (%)</th><th colspan="2">Below ground (%)</th><th colspan="2">Roots (%)</th><th colspan="2">RR (%)</th><th colspan="2">Soil (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>+</td><td>56</td><td>62.0 (7.24)</td><td></td><td>38.0 (7.20)</td><td></td><td>11.2 (2.14)</td><td></td><td>12.1 (2.21)</td><td></td><td>14.7 (4.82)</td></tr><tr><td>14</td><td>45.0 (7.57)</td><td></td><td>54.0 (7.82)</td><td></td><td>15.0 (4.14)</td><td></td><td>16.5 (4.32)</td><td></td><td>22.5 (5.31)</td></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>-</td><td>56</td><td>60.0 (7.49)</td><td></td><td>40.0 (7.49)</td><td></td><td>13.0 (2.95)</td><td></td><td>11.0 (3.05)</td><td></td><td>16.0 (5.68)</td></tr><tr><td>14</td><td>40.0 (7.95)</td><td></td><td>60.0 (7.95)</td><td></td><td>14.6 (4.11)</td><td></td><td>15.4 (2.93)</td><td></td><td>30.0 (10.86)</td></tr><tr><th>Statistics</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th></tr><tr><td rowspan="3">CO<sub>2</sub></td><td>0.307</td><td>NS</td><td>0.275</td><td>NS</td><td>1.991</td><td>NS</td><td>0.091</td><td>NS</td><td>0.247</td><td>NS</td></tr><tr><td>20.86</td><td>**</td><td>20.74</td><td>**</td><td>3.057</td><td>NS</td><td>7.151</td><td>*</td><td>6.622</td><td>*</td></tr><tr><td>0.068</td><td>NS</td><td>0.073</td><td>NS</td><td>0.093</td><td>NS</td><td>0.035</td><td>NS</td><td>0.117</td><td>NS</td></tr><tr><th>Autumn sampling</th><th>N supply (g.m<sup>-2</sup>)</th><th colspan="2">Shoots (%)</th><th colspan="2">Below ground (%)</th><th colspan="2">Roots (%)</th><th colspan="2">RR (%)</th><th colspan="2">Soil (%)</th></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>+</td><td>56</td><td>75.0 (4.24)</td><td>a</td><td>25.0 (4.56)</td><td>a</td><td>11.6 (2.12)</td><td></td><td>7.2 (2.21)</td><td></td><td>6.2 (1.08)</td></tr><tr><td>14</td><td>64.0 (5.98)</td><td>ab</td><td>36.0 (5.71)</td><td>ab</td><td>12.5 (2.93)</td><td></td><td>12.9 (3.44)</td><td></td><td>10.6 (1.98)</td></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>-</td><td>56</td><td>57.1 (7.21)</td><td>b</td><td>42.9 (8.24)</td><td>b</td><td>9.3 (4.12)</td><td></td><td>10.8 (1.99)</td><td></td><td>22.8 (3.89)</td></tr><tr><td>14</td><td>56.4 (9.32)</td><td>b</td><td>43.6 (8.33)</td><td>b</td><td>8.7 (2.32)</td><td></td><td>13.0 (1.60)</td><td></td><td>21.9 (7.58)</td></tr><tr><th>Statistics</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th></tr><tr><td rowspan="3">CO<sub>2</sub></td><td>6.534</td><td>NS</td><td>6.851</td><td>NS</td><td>0.784</td><td>NS</td><td>4.492</td><td>NS</td><td>7.98</td><td>*</td></tr><tr><td>2.885</td><td>NS</td><td>2.806</td><td>S</td><td>0.141</td><td>NS</td><td>5.403</td><td>*</td><td>1.475</td><td>NS</td></tr><tr><td>3.821</td><td>NS</td><td>3.775</td><td>NS</td><td>0.755</td><td>NS</td><td>2.341</td><td>NS</td><td>1.28</td><td>NS</td></tr></tbody></table>

Letters represent the results of the Tukey Kramer test when the interaction N X CO$_{2}$ is significant. Means followed by different letters are significantly different at *P*<0.05 whatever the treatments, for a given compartment. NS, *, ** for *P* values >0.05, <0.05, <0.01, respectively.

adhering soil was not significantly affected by elevated CO$_{2}$ at the spring sampling, whereas it was decreased at the autumn sampling. Microbial biomass in non-adhering soil remained unaffected by all treatments in both experimental periods (Table 3).

### 3.4. Mineralisation of total carbon and of $^{14}$C-organic compounds in adhering soil (rhizodeposits and turn-over of labelled microbial biomass)

In the autumn experiment, total CO$_{2}$ (unlabelled and labelled carbon) and $^{14}$CO$_{2}$ effluxes from adhering soil (expressed in mgC per gram of adhering soil and in bequerel per gram of adhering soil) were measured for a 30 d incubation period after sampling. The amount of total C and $^{14}$C mineralised were significantly higher under elevated than under ambient CO$_{2}$ at the end of the 30 d incubation

period (*P*<0.001; Figs. 1(A) and 2). Thirty % of $^{14}$C initially present in adhering soil was mineralised under ambient CO$_{2}$, whereas 44% of $^{14}$C initially present in adhering soil was mineralised under elevated CO$_{2}$ (*P* = 0.002; Fig. 1(B)).

The flux of C mineralisation, i.e. the amount of total respired C (mgC kg$^{-1}$ adhering soil d$^{-1}$), was significantly higher (*P*=0.016) under elevated (0.049 mgC g$^{-1}$ adhering soil d$^{-1}$) than under ambient CO$_{2}$ (0.034 mgC g$^{-1}$ adhering soil d$^{-1}$).

Fertilisation had no effect on total CO$_{2}$ and $^{14}$CO$_{2}$ respiration fluxes (Figs. 1 and 2).

## 4. Discussion

At the beginning of the Swiss FACE experiment in 1993, harvestable biomass increased only by 10% in response to

<caption>Table 3</caption>

Microbial C (mgC kg$^{-1}$ soil) from adhering soil (AS) and non-adhering soil (NAS) at the spring and autumn samplings of rye grass monoculture plots at ambient (CO$_{2}$ − ) or enriched (CO$_{2}$ +) CO$_{2}$, under two N treatments (n=3)

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2">N supply (g.m<sup>-2</sup>)</th><th colspan="2">Spring sampling</th><th colspan="2">Rhizosphere effect</th><th colspan="2">Autumn sampling</th><th colspan="2">Rhizosphere effect</th></tr><tr><th>mgC. Kg<sup>-1</sup>AS</th><th>mgC. Kg<sup>-1</sup>NAS</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>mgC. Kg<sup>-1</sup>AS</th><th>mgC. Kg<sup>-1</sup>NAS</th><th>Fvalue</th><th>P</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>+</td><td>56</td><td>355 (99)</td><td>338 (79)</td><td>0.995</td><td>NS</td><td>304 (81)</td><td>304 (52)</td><td>0.389</td><td>NS</td></tr><tr><td>14</td><td>400 (94)</td><td>372 (89)</td><td>0.326</td><td>NS</td><td>343 (72)</td><td>363 (87)</td><td>0.491</td><td>NS</td></tr><tr><td rowspan="2">CO<sub>2</sub>-</td><td>56</td><td>528 (66)</td><td>291 (67)</td><td>3.254</td><td>*</td><td>538 (121)</td><td>307 (72)</td><td>3.123</td><td>*</td></tr><tr><td>14</td><td>471 (109)</td><td>263 (66)</td><td>4.214</td><td>*</td><td>646 (59)</td><td>311 (41)</td><td>4.112</td><td>*</td></tr><tr><th>Statistics</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th><th>F</th><th>value</th><th>P</th><th>Fvalue</th><th>P</th></tr><tr><td rowspan="3">CO<sub>2</sub></td><td></td><td>0.908</td><td>NS</td><td>2.943</td><td>NS</td><td>42.91</td><td>**</td><td>0.926</td><td>NS</td></tr><tr><td></td><td>0.851</td><td>NS</td><td>0.032</td><td>NS</td><td>3.123</td><td>NS</td><td>0.483</td><td>NS</td></tr><tr><td></td><td>0.005</td><td>NS</td><td>0.443</td><td>NS</td><td>0.721</td><td>NS</td><td>0.894</td><td>NS</td></tr></tbody></table>

NS, *, ** for *P* values >0.05, <0.05, <0.01, respectively.
<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Fig. 1. ¹⁴CO₂ production during incubation of adhering soil (AS), after the autumn sampling of rye grass monoculture plots at ambient (CO₂⁻) or enriched (CO₂⁺) CO₂, under two N treatments (n=3). (A): mineralisation expressed as Bq respired per g of adhering soil. (B): mineralisation expressed as % of the ¹⁴C activity in the sample at the beginning of the incubation. Vertical bars indicate standard deviation (n=3). ●: Enriched and N fertilised 56 g m⁻²; ○: enriched and N fertilised 14 g m⁻²; ▲: ambient and N fertilised 56 g m⁻²; △: ambient and N fertilised 14 g m⁻².

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Fig. 2. Total CO₂ production during incubation of adhering soil, expressed as mgC g⁻¹ of adhering soil, after the autumn sampling of rye grass monoculture plots at ambient (CO₂⁻) or enriched (CO₂⁺) CO₂, under two N treatments (n=3). Vertical bars indicate standard deviation (n=3). ●: Enriched and N fertilised 56 g m⁻²; ○: enriched and N fertilised 14 g m⁻²; ▲: ambient and N fertilised 56 g m⁻²; △: ambient and N fertilised 14 g m⁻².

elevated CO₂ (Hebeisen et al., 1997). In agreement with those previous results, elevated CO₂ had no consequences for DM production in the spring sampling (after 56 d exposure period to elevated CO₂). Fertilisation effects were more pronounced than CO₂ effects (Table 1). Consistently, high N supply stimulated the allocation of recently assimilated C to shoots and reduced allocation belowground, whereas elevated CO₂ had no effect (Table 2). This pattern of C allocation at high N is consistent with those reported in a number of other studies (Johansson, 1992; Marschner et al., 1996; Henry et al., 2005).

Results were quite different in the autumn sampling (exposure to elevated CO₂ for 79 d); there was an interaction between CO₂ and N for shoot DM (Table 1) as there was stimulation of shoot biomass only with high N. Therefore, the response of shoot growth to elevated CO₂ was dependent upon nitrogen availability as has previously been observed at this experimental site in rye grass (Hebeisen et al., 1997; Daepp et al., 2000). Previous studies suggested that this response could be the consequence of defoliation. Indeed, after defoliation, the residual shoot biomass differed between the high and low N treatments presumably because the tiller density was consistently greater under high than under low N (Schneider, 2003). Moreover, the plants harvested in autumn were defoliated three times vs. once for the plants sampled in spring. An influence of the defoliation regime cannot be excluded.

Root biomass and root to shoot ratio (R: S<sub>DM</sub>) were not affected by elevated CO₂ (Table 1), a result contrasting with those at the same site which show a stimulation of root production leading to a higher root to shoot ratio under elevated CO₂ (Soussana et al., 1996; Daepp et al., 2001; Suter et al., 2002). A possible cause for this difference could be a limitation of root growth induced by the cylinders. However, this was not the case because the whole soil volume of the cores was not explored at harvest and the root density was not high (range 1.6–5 mg roots cm⁻³ soil). A more probable cause for the differing results is likely to be the relatively short period of growth of the plants in this experiment (56 or 79 d). For the R: S<sub>DM</sub>, no effect of elevated CO₂ was observed on 73 d old *L. perenne* grown under controlled conditions; this was attributed to the short exposure of plants to elevated CO₂ (Suter et al., 2002).

At the autumn sampling, under high N, the stimulation of shoot biomass under elevated CO₂ was consistent and recently assimilated C was preferentially allocated above-ground. This meant that allocation to belowground compartments was proportionally lowered (Table 2). As a consequence under high N microbial growth was apparently limited by the availability of C (Table 3), rather than by the availability of N as there was no effect of N fertilisation on microbial C. If it is assumed that microbial biomass is correlated with the fluxes of C released by the roots (Darrah, 1991), especially rhizodeposition, then at the time of the autumn sampling, it can be concluded that the rhizodeposition was reduced under increased CO₂. As the size of root systems was unaffected by CO₂ exposure it is likely that
the specific exudation from roots (g exudation per g of roots, or per root length or per exudation site) was reduced in the plants exposed to elevated CO₂.

After 9 consecutive years of CO₂ fumigation, no significant change in total soil C was observed (data not shown), in accordance with previous data on the same site (Van Kessel et al., 2000a,b; Horwath et al., 2001; Van Groeningen et al., 2002; De Graaff et al., 2004). A more rapid turnover rate of labile C may explain the unchanged total soil C content of both CO₂ treatments (Horwath et al., 2001). Indeed, FACE increased soil respiration in a spring wheat and sugar beet fields with the rhizosphere respiration representing 65–70% of the soil respiration (Pendall et al., 2001; Soe et al., 2004). Soil from *L. perenne* sward after 9 years of exposure of FACE and low N fertilisation showed significantly higher respiration than the soil under *L. perenne* receiving ambient CO₂ (De Graaff et al., 2004). Our results, obtained after the autumn experimental period, were in agreement with those data under low N but the increased soil respiration after 9 years of elevated CO₂ in the present experiment also under high N. Indeed, easily decomposable rhizodeposited C (Fig. 1) and total C (unlabelled C coming from rhizodeposits and more recalcitrant C, Fig. 2) are mineralised faster in adhering soils from plants of enriched rings despite a lower microbial biomass in those soils. Two main hypotheses can be formulated: (i) that the structure and activity of the microbial communities has been modified during the 9 years of CO₂ enrichment as compared to ambient rings, as shown by Montealegre et al. (2002); Van Groeningen et al. (2005), so that they are able to mineralise labile organic matter faster and (ii) that the composition of rhizodeposits exuded at elevated rather than at ambient CO₂ contain a higher proportion of easily decomposable compounds which are thus mineralised faster than other components. Studies under controlled conditions indicate that the composition of rhizodeposits was influenced by elevated CO₂: lower amounts of phenolic acids and total sugars were exuded at elevated CO₂ (Hodge et al., 1998) and it has been suggested that exuded compounds exhibited a higher C:N ratio under elevated than at ambient CO₂ (Grayston et al., 1998). The changes in exudate composition could explain a shift in the microbial community structure but further experimental work is needed to prove that a CO₂ induced shift in the composition of rhizodeposits could induce higher mineralisation rate under elevated CO₂.

Mineralisation was higher in the elevated as opposed to ambient CO₂ treatment but the amounts of CO₂ were very small (0.032 Bq g⁻¹ adhering soil d⁻¹ and 0.041 Bq g⁻¹ adhering soil d⁻¹ under ambient and elevated CO₂ respectively, measured over 30 d at 22 °C) compared to rhizosphere respiration (17 Bq g⁻¹ adhering soil d⁻¹ and 20 Bq g⁻¹ adhering soil d⁻¹ under elevated and ambient CO₂, respectively, measured over 48 h at 22 °C: Table 2). Therefore, it can be argued from these data that the root respiration represents the major contributor of the

rhizosphere respiration, as shown by Pendall et al. (2001); Andrews et al. (1999). However, it should be mentioned that mineralisation rates were determined in vitro, on adhering soil sampled and, therefore, without the presence of roots. Consequently, it may underestimate the mineralisation rates in the rhizosphere as no additional C input by roots occurred during the incubation.

## 5. Conclusion

In young rye grass plants growing in the field in soil monoliths enriched with elevated CO₂ for 9 years there was no stimulation of allocation of recently assimilated C to the rhizosphere and no increase in sequestration of C in the soil. In the elevated as compared with the ambient CO₂ treatment there was less allocation of rhizodeposited C belowground at the autumn sampling. Patterns of C allocation in this plant-soil ecosystem are complex because they result from the physiological status of the plant which in turn is determined by multiple interactions with the environment (CO₂, climate) and the management of the plots (N, defoliations). The stimulation of C mineralisation by elevated CO₂ implies a shift in the structure and the activity of microbial communities and/or in the composition of root-released organic compounds.

## Acknowledgements

The authors wish to thank Dr P. Montpied (INRA Champenoux, France) for his advice on the statistical analyses, Dr M.J.M. Hay (AgResearch Grasslands, Palmerston-North, New Zealand) for his linguistic help, and the colleagues of the UMR for their participation in the samplings. The technical assistance provided by Mr P. Marchal for the CN and TOC analyses is also gratefully acknowledged.

## References

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