# Les coacervats de protéines sériques: des nouveaux agents d'encapsulation naturels et fonctionnels

Anne Laure Chapeau

► To cite this version:

Anne Laure Chapeau. Les coacervats de protéines sériques: des nouveaux agents d'encapsulation naturels et fonctionnels. Journée PROFIL - La plasticité des protéines du lait: un atout majeur pour concevoir des assemblages fonctionnels, Institut National de Recherche Agronomique (INRA). UMR UMR INRA / AgroCampus Rennes: Science et Technologie du Lait et de l'?uf (1253)., Sep 2017, Rennes, France. hal-01595711

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Submitted on 5 Jun 2020

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La plasticité des protéines du lait,
Un atour majeur pour concevoir des assemblages fonctionnels.

## Session: Encapsulation

Les coacervats de protéines sériques:
des nouveaux agents d'encapsulation naturels et fonctionnels

Anne-Laure CHAPEAU, Saïd BOUHALLAB - UMR STLO, INRA Rennes

Marieke VAN AUDENHAEGE - Sodiaal
# L'encapsulation en agro-alimentaire – Contexte

## Dualité des attentes de consommation :

Aliments naturels **et** offrant des bénéfices améliorés pour la santé... **aliments naturels fonctionnels**

Incorporation de molécules **bioactives**... molécules **sensibles** aux dégradations

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

### Encapsulation

- Incorporation

- Protection

- Vectorisation

- Liberation

Capsule

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Matrice

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Avec des protéines de lait

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Produits laitiers naturels et fonctionnels

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

### Bioactif

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<figure><img src="image_12.png" /></figure>

<figure><img src="image_13.png" /></figure>
# Stratégies d'encapsulation utilisant les protéines sériques – Contexte

## Liaison

(binding)

### Interactions avec un ligand

(liaisons hydrophobes et/ou interactions électrostatiques)

### Favorisée par la conformation structurale de la protéines

### Formation de complexe

*Ex: β-lactoglobuline + acide gras*

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

(Synthèse par Le Maux et al., 2014)

## Process descendant

(top down)

### Emulsion

### Gélification +/- extrusion

(Schmitt et al., 2009)

### Electrospraying

### Spray drying (Pérez et al., 2015)

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Microcapsules (2 mm) formées par electrospraying d'un concentré de protéines sériques</figcaption></figure>

(Lopez-Rubio et al., 2012)

## Process montant

(Bottom-up)

### Agrégation thermique

### Désolvatation

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

(Lohcharoenkal W. et al, 2014)

### Co-assemblages spontannés

### Coacervation (Bouhallab et Croguennnec, 2014)

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Coacervats de β-Lactoglobuline et lactoferrine en solution (Tavares et al., 2015)</figcaption></figure>
# La coacervation complexe des protéines sériques – Contexte

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Biopolymère (+)
Lactoferrine</figcaption></figure>

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Biopolymère (-)
Beta-lactoglobuline</figcaption></figure>

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Protéine acide</figcaption></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Agents
d'encapsulations</figcaption></figure>

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Microsphères de
coacervats LF-BLG</figcaption></figure>

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Attractions
électrostatiques</figcaption></figure>

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Libération de
contre-ions</figcaption></figure>

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Protéine
basique</figcaption></figure>

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Formation
d'un complexe</figcaption></figure>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Séparation de phase
Coalescence</figcaption></figure>

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Paramètres clés : pH,
force ionique, concentrations,
charges, conformation...

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Agrégats

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Coacervats
de LF+BLG</figcaption></figure>

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Phase
diluée</figcaption></figure>

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Phase
concentrée</figcaption></figure>
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Dans quelles conditions physico-chimiques ?

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

β-Lactoglobuline (BLG)

Vitamine B9
(hydrophile)

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Effet changement d'échelle

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Quelle libération du bioactif?
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

<figure><img src="image_41.png" /></figure>
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption># Optimisation des conditions de coacervation de LF-BLG en présence de B9 – Résultat 1</figcaption></figure>

Dosage par chromatographie
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

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# Augmentation de l'échelle de production des coacervats B9-PS – Résultat 2

Rendement d'encapsulation de B9 (%)

Rendement de coacervation des PS (%)

µL

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

Rendement d'encapsulation = 98 %

Rendement de coacervation = 58 %

## Système en batch
Pâle à hélice

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

### Système en batch

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Après optimisation
→ Rendement
d'encapsulation
similaires sur les 2
systèmes et
équivalent à l'échelle
du laboratoire.

## Système continu
Mélangeur statique

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

### Système continu

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

Meilleur
rendement de
coacervation des
protéines
sériques avec le
système continu.
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

<figure><img src="image_50.png" /></figure>
# Effet protecteur des coacervats de PS sur la dégradation de B9 – Résultat 3

→ **2 types d'échantillons :**
B9 seule vs coacervats B9-PS

→ **Dégradations = temps longs...**

**Test en degradation accélérée / induite :**
*irradiation UV,
*oxydation induite par $H_2O_2$

→ **Dosage de la forme native de B9**
= **Forme bioactive :**
*spectrométrie de masse, ELISA*

**Conservation de la forme native de B9**
dans le coacervat vis à vis des **différentes conditions de dégradations** testées

→ **Maintient de la forme bioactive**

→ **Effet protecteur du coacervat de PS**

## Dégradation (oxidation)

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

→ **Limitation de la perte de la forme native de B9 quand encapsulée dans les coacervats**
de PS par rapport à
B9 seule en solution
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

### Bioactif modèle

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

### Vitamine B9
(hydrophile)

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

- 2 systèmes : batch vs continu

- sans perte de l'efficacité d'encapsulation

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

- photodégradation (UV)

- oxydation ($H_2O_2$)

- thermo dégradation (surgélation / lyophilisation)

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

<figure><img src="image_63.png" /></figure>
# Amélioration in vivo de la biodisponibilité de B9 par les coacervats de PS – Résultat 4

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

Groupes
expérimentaux

10 rats
Sprague Dawley
Mâles, ≈ 450g

B9

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Coacervats
de B9-PS

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

Etude
pharmaco-
cinétique

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

Alimentation
ad libitum
sans B9

Administration
de B9 ou coacervats
de B9-PS

Prélèvements sanguins
(T0, T30min, T1h, T2h, T4h, T6h, T10h)

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

Dose de B9
administrée
oralement

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

500 µg B9 / rat
en solution seule
ou par les
coacervats de PS

Concentration
plasmatique de B9

Cinétique de dosage
par ELISA

Collaboration
internationale

Lauréate
Bourse
Erasmus +

N. Bertrand : Chercheur sur l'utilisation des **biomatériaux pour la pharmacie**

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

UNIVERSITÉ
LAVAL
Québec

Laboratoire
Nanopharmacology and
Pharmaceutical Nanosciences
FACULTÉ DE PHARMACIE - UNIVERSITÉ CAYAL

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

CHU
de Québec
Université Laval

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

Centre de recherche

INSTITUT DE RECHERCHE
ALIMENTATION - SANTÉ
# Amélioration in vivo de la biodisponibilité de B9 par les coacervats de PS – Résultat 4

Concentrations plasmatiques de vitamine B9 chez le rat après une administration orale (T0) d'une dose de 500 µg de B9 en solution seule, ou en coacervat de protéines sériques

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

→ **1 courbe**

pharmacocinétique = **moyenne**
des prélèvements sanguins
**des 5 rats** sur les 7 temps

→ **2 paramètres étudiés :**

- $C_{max}$ : concentration maximale de B9 absorbée

- **AUC** = aire sous la courbe ≈ quantité totale de B9 absorbée

→ **Evaluer la biodisponibilité globale de B9**

A dose égale en B9 administrée la :

$C_{max}$ B9-PS > $C_{max}$ B9 et l' AUC B9-PS > AUC B9

→ **Donc la vitamine B9 administrée par le coacervat de protéines sériques serait mieux absorbée que la B9 administrée en solution**
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

Lactoferrine (LF)

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

Bioactif modèle

+

+

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

<figure><img src="image_79.png" /></figure>

✓ **Cartographie des assemblages**
+ optimisation des
**conditions de coacervation**

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

β-Lactoglobuline (BLG)

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

Vitamine B9
(hydrophile)

✓ **Scale-up µL → L**

- 2 systèmes : batch vs continu
- sans perte de l'efficacité
d'encapsulation

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

<figure><img src="image_84.png" /></figure>

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

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<figure><img src="image_87.png" /></figure>

✓ **Propriétés protectrices**

- photodégradation (UV),

- oxydation ($H_2O_2$),

- thermo dégradation
(surgélation / lyophilisation).

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

✓ **Amélioration de la biodisponibilité du bioactif par le coacervat de PS**

- tests in vivo (rats)

- collaboration
internationale

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

<figure><img src="image_93.png" /></figure>

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

<figure><img src="image_96.png" /></figure>

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

Devenir en matrice
laitière
# Resuspension des coacervats B9-PS en matrices laitières: première approche – Résultat 5

Coacervat
« Natif »

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

Eau milliQ
pH 5.5

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

Solution **non homogène**
→ coacervat B9-PS **non redispersable**
dans l'eau à pH 5.5

Cycles de
vortex et
sonication

Perméat
d'ultra-filtrat

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

(PUF)

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

T0

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

T 48H

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

Stable

Solution **homogène** → Resuspention du coacervat B9-PS **en petites particules/goutelettes sphériques (≈ 2 à 5 µm)**

Lait demi
écrémé UHT

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

<figure><img src="image_106.png" /></figure>

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

Solution **homogène**
→ Resuspention du coacervat
B9-PS **identique à celle du PUF**
# Comment utiliser le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive ? – Stratégie

<figure><img src="image_108.png" /></figure>

<figure><img src="image_109.png" /></figure>

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<figure><img src="image_111.png" /></figure>

<figure><img src="image_112.png" /></figure>
# Le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive – Applications potentielles

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## 100 mg de coacervats B9-PS

450 µg B9

50 µg Fer

25 mg de protéines sériques
(dont LF : peptides bioactifs et activités métaboliques)

Utiliser le coacervat B9-PS comme ingrédient ou composé bioactif naturel et fonctionnel

## Complément alimentaire pour femme enceinte

<figure><img src="image_114.png" /></figure>

<figure><img src="image_115.png" /></figure>

## Par gélule

400 µg B9

14 mg Fer

Pas de proteins

<figure><img src="image_116.png" /></figure>

## Poudre infantile (portion)

30 µg B9

2 mg Fer

4 g protéines de lait

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## Aliment quotidien "nutrition santé"

### Par portion (30g)

100 µg B9

3.5 mg Fer

2.7 g protéines végétales

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### NOS INFORMATIONS NUTRITIONNELLES

Pour 100 g

Par portion de 30 g

<table><thead><tr><th>ENERGIE</th><th>1588 kJ<br>375 kcal</th><th>476 kJ<br>113 kcal</th></tr></thead><tbody><tr><td>MATIÈRES GRASSES<br>dont acides gras saturés</td><td>1,5 g<br>0,3 g</td><td>0,5 g<br>0,1 g</td></tr><tr><td>GLUCIDES<br>dont sucres</td><td>79 g<br>15 g</td><td>24 g<br>4,5 g</td></tr><tr><td>FIBRES ALIMENTAIRES</td><td>4,5 g</td><td>1,4 g</td></tr><tr><td>PROTÉINES</td><td>9 g</td><td>2,7 g</td></tr><tr><td>SEL</td><td>1 g</td><td>0,3 g</td></tr><tr><td>VITAMINES :</td><td>(% AR)</td><td>(% AR)</td></tr><tr><td>D</td><td>8,4 µg (167)</td><td>2,5 µg (50)</td></tr><tr><td>THIAMINE (B1)</td><td>1,8 mg (167)</td><td>0,55 mg (50)</td></tr><tr><td>RIBOFLAVINE (B2)</td><td>2,3 mg (167)</td><td>0,70 mg (50)</td></tr><tr><td>NIACINE (B3/PP)</td><td>13,4 mg (84)</td><td>4,0 mg (25)</td></tr><tr><td>B6</td><td>1,2 mg (84)</td><td>0,35 mg (25)</td></tr><tr><td>ACIDE FOLIQUE (B9)</td><td>334 µg (167)</td><td>100 µg (50)</td></tr><tr><td>B12</td><td>2,1 µg (84)</td><td>0,6 µg (25)</td></tr><tr><td>SELS MINÉRAUX:</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FER</td><td>11,6 mg (83)</td><td>3,5 mg (25)</td></tr><tr><td>ZINC</td><td>8,5 mg (83)</td><td>2,5 mg (25)</td></tr></tbody><tfoot><tr><td colspan="3">(%AR) = Apports de Référence</td></tr></tfoot></table>
# Le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive – Conclusion et perspectives

**Au 1er plan** : Preuve de **concept** (de l'échelle laboratoire à pré-industrielle), effet **protecteur**, vectorisation/libération, **stabilité** des coacervats B9-PS en matrice laitière...

... et avec un peu de recul : Nouvelle approche de la coacervation hétéroprotéique, par son application pour l'encapsulation de bioactif

## Connaissances scientifiques

<figure><img src="image_119.png" /></figure>

→ Caractérisation de la phase resuspendue des gouttelettes de coacervats de PS : (en cours, stage Master 2, L. Masbernat)

* Composition (dynamique de l'eau)

* Interactions moléculaires

* Rhéologie...

→ Nouvelles connaissances sur les propriétés du coacervats hétéroprotéiques et ses modifications en fonction de sa cinétique de formation, de son milieu...

<figure><img src="image_120.png" /></figure>

## Application

→ Optimisation des paramètres de fabrication:

* Production à échelle pilote

* Forme utilisable (lyophilisation, séchage...)

* Rendement d'encapsulation selon le type de bioactif.

→ Digestion in vitro du coacervat : comprendre les mécanismes de libération du bioactif et analyses des peptides générés par les coacervats
# Le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive – Valorisations

<figure><img src="image_121.png" /></figure>

<figure><img src="image_122.png" /></figure>

<figure><img src="image_123.png" /></figure>

<figure><img src="image_124.png" /></figure>

Stage ingénieur –
Master 2 en cours
# Le coacervat de protéines sériques comme agents d'encapsulation d'une molécule bioactive – Travail d'équipe !

<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>**Equipe IS-FPL du STLO**
(Pascaline Hamon, Thomas Croguennec, Valérie Briard-Bion, Laurena Masbernat, Florence Rousseau, Saïd Bouhallab)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_126.png" /><figcaption>**Equipe ONIRIS**
(Denis Poncelet)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_127.png" /><figcaption>**Equipe Québecoise du CHUL**
(Nicolas Bertrand)</figcaption></figure>

**Pilotage PAO** (Stephan Rouverand, Morgane Raison)

**BBA et Comité technique industriels Axe 4 Profil** (Marieke Van Audenhaege, Daniel Senocq, Marie-Laure Sansous, Carole Prost, Anne Ranc, Caroline Puel, Anne Bernard, Marie Chevallier, Raphaël Chacon, Isabelle Proudy, ...)
Merci de votre attention

Et pour en savoir plus...

<figure><img src="image_128.png" /></figure>

Jeudi 26 octobre 2017, 9h30
Soutenance de Thèse A-L Chapeau,
au STLO, à Rennes.

<figure><img src="image_129.png" /></figure>