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## Thèse

Pour obtenir le grade de
Docteur de l'INPL

Discipline : Sciences Agronomiques
présentée et soutenue publiquement

par
Stéphane Bazot

le 2 juin 2005

# Contribution à l'étude de l'allocation des photoassimilats récents dans la plante et la rhizosphère chez une graminée pérenne

(Lolium perenne L.)

## Jury :

<table><tr><td>M. Jean-Bernard Cliquet</td><td>Maître de conférence, Université de Caen</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. Jean-François Soussana</td><td>Directeur de recherche INRA, Clermont Ferrand</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. Herbert Blum</td><td>Chercheur, ETH Zurich</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>M. Daniel Epron</td><td>Professeur, Université Henri Poincaré</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>M. Christophe Nguyen</td><td>Chargé de recherche INRA, Nancy</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>M. Christophe Robin</td><td>Chargé de recherche INRA, Nancy</td><td>Examinateur</td></tr></table>
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Seul je n'aurais pu réaliser le travail présenté dans cette thèse. A toutes les étapes de sa mise en œuvre, de nombreuses personnes y ont contribué. Je tiens donc à les remercier tout particulièrement et très chaleureusement.

Ce travail a été réalisé au sein de l'UMR INRA-INPL Agronomie-Environnement de Nancy. C'est donc au directeur de ce laboratoire, **Sylvain Plantureux** que vont mes premiers remerciements.

D'autre part, sans directeur de thèse, il n'y aurait pas de thèse! Je remercie donc tout particulièrement **Christophe Robin**, mon directeur de thèse de m'avoir avant tout fait confiance, de m'avoir confié ce travail de thèse et fait découvrir le métier passionnant qu'est celui de chercheur. Je te remercie, Christophe, pour ton suivi, ta disponibilité, ton aide, et ton implication dans mon travail ; tu étais là avec moi sur le terrain à faire de la Suisse un vrai gruyère avec une machine quelque peu « capricieuse »!!! Merci également de m'avoir permis d'être impliqué dans des collaborations (ETH Zurich) et dans un programme Européen (CONSIDER) mais aussi de m'avoir donné l'opportunité de participer à de nombreux workshops et colloques afin de présenter mon travail.

Je remercie également **Christophe Nguyen** pour m'avoir initié aux tests Glucose ¹⁴C, ainsi que pour ses conseils et son aide pour les analyses statistiques, ainsi que **Emile Benizri** pour ses explications concernant les étalements bactériens et les tests Biolog®. Je tiens également à remercier **Chhoy Vong** pour ses conseils avisés pour la manipulation des isotopes radioactifs et du compteur à scintillation liquide pas toujours simple.

Un immense merci, à **Herbert Blum** et **Manuel Schneider**, chercheurs à l'ETH de Zurich, pour leur patience, leur aide et leurs conseils lors de nos péripéties sur le dispositif FACE Suisse. Merci Herbert pour vos relectures de l'article sur l'expérimentation FACE.

Merci à **Juha Mikola**, chercheur à l'Université de Jyväskylä en Finlande. Merci de votre participation active à mon travail, sans vous l'expérimentation défoliation ainsi que la rédaction de l'article défoliation auraient été beaucoup moins enrichissantes, merci également de votre accueil lors de notre visite en Finlande.

Toute ma gratitude va également à **Claude Bazard**, chargé de recherche à l'INRA de Mirecourt. Grâce à vous, la gestion de mes parcelles de ray grass de l'expérimentation défoliation a été beaucoup plus simple. Merci pour votre convivialité et votre aide technique.

Merci à **Pascale Maillard**, chargée de recherche à l'INRA de Champenoux pour son aide dans la compréhension des calculs concernant les isotopes stables du carbone (¹³C).

Je tiens également à remercier les membres de mon comité de pilotage pour leurs remarques et leurs conseils.

Merci à **Jérôme Balesdent**, directeur de recherche INRA au CEA de Cadarache ainsi qu'à **Jean Marc Guehl**, directeur de recherche à l'INRA de Champenoux.
J'exprime toute ma gratitude à **Jean Bernard Cliquet**, maître de conférence à l'Université de Caen et **Jean François Soussana**, directeur de recherche à l'INRA de Clermont Ferrand pour avoir accepté de juger mon manuscrit en tant que rapporteur. Merci à **Daniel Epron**, président du jury, professeur à l'Université Henri Poincaré à Nancy d'avoir bien voulu juger ce travail en tant qu'examineur.

Une part des analyses effectuée pendant ce travail n'aurait pas été possible sans l'aide précieuse de **Patrice Marchal**, technicien au laboratoire. Un grand merci également à **Dominique Thiery** pour la fabrication des pots de culture, des containers de marquage et son aide sur le terrain ainsi qu'à **Michel Philbert** pour les lyophilisations.

Par ailleurs trois étudiants ont participé activement à la réalisation de ma thèse lors de leur stage. **Lina Ulff**, lors de son stage de fin d'étude, m'a secondé efficacement dans la récolte, l'analyse des échantillons et l'interprétation des résultats de l'expérimentation FACE. **Jennifer Tavernier**, lors de son stage de DEA a contribué activement à la mise en place de l'expérimentation défoliation et l'analyse des échantillons. Finalement **Pierre Louis Bonicoli**, lors de son stage de classe préparatoire d'entrée à l'ENSAIA a également participé significativement à l'analyse des échantillons de l'expérimentation défoliation.

Il m'est également impossible d'oublier la patience d'ange de **Thamara Olivier**, secrétaire du laboratoire, pour la mise en place des remboursements de mes différents déplacements ! Mais aussi merci pour votre grande gentillesse et votre disponibilité lors de la résolution des différents problèmes administratifs. Merci également à **Anne Marie Claude** et **Amina Gautier**, techniciennes au laboratoire qui m'ont également facilité le passage des commandes et la gestion des produits.

Merci également aux autres membres du laboratoire Agronomie-Environnement qui ont participé de près ou de loin à mon travail de thèse.

Les activités d'enseignement ont également occupé une part importante de ma thèse. Je remercie infiniment **Dominique Morlot**, professeur à L'IUT de Yutz-Thionville, mon tuteur de monitorat. Merci de m'avoir fait découvrir les joies de l'enseignement. Votre gentillesse, votre aide, vos conseils aussi bien pédagogiques que scientifiques m'ont été précieux. Je remercie également vivement l'ensemble de l'équipe pédagogique de l'IUT pour leur accueil. Au-delà de mon tuteur, c'est au CIES de Lorraine que je suis reconnaissant. Merci pour les formations et les journées de détente offertes.

J'exprime également toute ma sympathie à **Odile et Sophie**. Odile ma « co-bureautaire » et amie, et Sophie amie thésarde voisine souvent en visite pour mon plus grand plaisir. Merci à **Seb et PE** pour les bonnes soirées et les parties de tarots ! Je tiens à vous remercier pour votre amitié et votre bonne humeur pendant ces trois années ! Toutes ma gratitude va également aux anciens et nouveaux thésards et post-doc de la « thésards vallée » !!

Merci à **Anne-Laure**, **Benoît**, **Boris**, **Fabienne**, **Fred**, **Karine**, **Robert**, **Romain**, **Sébastien**, **Minh**, **Vincent**...

Je dois également beaucoup à mes parents, mes grands-parents pour leur soutien moral et financier !!! lors de mes années d'études (ouf j'en suis enfin venu à bout !!). Merci infiniment à **Jeannette et Roger**, vous avez
également été toujours présents et à l'écoute pendant ces trois années de thèse. Merci également à tous les autres que je ne cite pas ici, ma famille, mes amis...

Enfin, le dernier mot est pour toi **Gaëlle**, tout au long de cette thèse, tu as participé à mes moments d'enthousiasme mais aussi de doute et d'incertitude. Tu as toujours été là pour m'écouter patiemment, me rassurer, me donner confiance. Merci infiniment...
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INTRODUCTION GENERALE.................................................................................. 11

A. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE........................................................................ 14

I. Cycle du carbone et importance des écosystèmes prairiaux .................................... 14

1. La plante : un pourvoyeur de carbone dans la rhizosphère .................................... 15

2. Place des graminées pérennes dans le bilan de carbone des sols .................................... 16

II. Les transferts de carbone dans le continuum atmosphère plante sol ...................... 17

1. La répartition des assimilats carbonés dans la plante ............................................ 18

1.1. Les relations source-puits.................................................................................... 18

1.2. Modification des relations source-puits ................................................................ 19

2. Rhizosphère et rhizodéposition .................................................................................... 21

2.1. La rhizosphère............................................................................................................ 21

2.2. La rhizodéposition........................................................................................................ 22

2.2.1. Composition : ........................................................................................................ 22

2.2.2. Quantification ........................................................................................................ 23

2.2.3. Localisation............................................................................................................ 24

2.3. Rôle trophique des rhizodépôts................................................................................ 24

2.3.1. Manifestations de l'effet rhizosphère.................................................................... 25

2.3.2. Conséquences de l'effet rhizosphère .................................................................... 26

Figure 4: Représentation schématique des effets positifs et négatifs directs et indirects des rhizodépôts sur la croissance de la plante (d'après Jones et al., 2003). ................................. 27

3. Outils d'étude des transferts de carbone dans le continuum atmosphère-plante-sol ..... 27

3.1. Traçages isotopiques .................................................................................................... 28

3.1.1. Marquage court et marquage long des photoassimilats .................................... 29

3.1.2. Abondance naturelle en ¹³C .................................................................................... 30

3.2. Les variables indicatrices de la rhizodéposition................................................................. 30

3.2.1. Approche phénotypique d'étude des micro-organismes........................................ 31

3.2.2. Approche génétique d'étude des micro-organismes ............................................ 31

3.3. Couplage des techniques isotopiques et des techniques de biologie moléculaire... 32

3.4. Utilisation des micro-organismes bio-senseurs................................................................. 33

III. Facteurs modulant les transferts de carbone dans le système plante-sol-micro-organismes .................................................................................................................. 35
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>1. Le dioxyde de carbone</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1. Activité photosynthétique, production de biomasse et CO<sub>2</sub></td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2. Sorties de carbone de la plante</td>
      <td>39</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2.1. La respiration</td>
      <td>39</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2.2. La rhizodéposition</td>
      <td>39</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3. Les communautés microbiennes</td>
      <td>41</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. La défoliation</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1. La défoliation affecte la répartition du carbone dans la plante</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2. La défoliation affecte les entrées de carbone dans le sol</td>
      <td>43</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.1. Augmentation de la rhizodéposition suite à la défoliation</td>
      <td>43</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2. Aucun effet de la défoliation sur la rhizodéposition</td>
      <td>44</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.3. Diminution de la rhizodéposition</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. L'azote</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1. Répartition des assimilats et production de biomasse</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2. Disponibilité en azote et rhizodéposition</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3. Interactions carbone-azote</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>B. OBJECTIFS DE LA THESE</b></td>
      <td><b>49</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>C. MATÉRIELS ET MÉTHODES</b></td>
      <td><b>51</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>I. Matériel végétal</b></td>
      <td><b>51</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>II. Marquage des parties aériennes des plantes au <sup>14</sup>CO<sub>2</sub> ou au <sup>13</sup>CO<sub>2</sub></b></td>
      <td><b>51</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1. Séparation hermétique du compartiment souterrain</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2. Déroulement du marquage : les étapes clés</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.1. Production de <sup>14</sup>CO<sub>2</sub> et de <sup>13</sup>CO<sub>2</sub> dans l'atmosphère</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2. Maintien de l'activité spécifique dans la chambre</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.3. Fin du marquage</td>
      <td>56</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>III. Marquage des parties aériennes des plantes au <sup>15</sup>NH<sub>3</sub></b></td>
      <td><b>56</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>IV. Récolte</b></td>
      <td><b>57</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>V. Analyses</b></td>
      <td><b>59</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1 Analyses du C de la biomasse microbienne : technique d'extraction fumigation</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1.1. Principe</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1.2. Pré-extraction</td>
      <td>59</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>5.1.3. Fumigation des échantillons</td><td>60</td></tr><tr><td>5.1.4. Extraction des échantillons fumigés et des échantillons non fumigés</td><td>60</td></tr><tr><td>Figure 12 : Représentation schématique de la pré extraction, fumigation extraction (Vance et al., 1987)</td><td>61</td></tr><tr><td>5.2. Analyse du carbone total</td><td>62</td></tr><tr><td>5.2.1. Poudres des échantillons végétaux et de sol</td><td>62</td></tr><tr><td>5.2.2. Solutions</td><td>62</td></tr><tr><td>5.3. Analyse des concentrations en glucides totaux dans les tissus végétaux</td><td>63</td></tr><tr><td>5.4. Analyse du <sup>14</sup>C</td><td>63</td></tr><tr><td>5.4.1. Echantillons végétaux</td><td>63</td></tr><tr><td>5.4.2. Echantillons de sol</td><td>63</td></tr><tr><td>5.4.3. Echantillons liquides</td><td>64</td></tr><tr><td>5.4.4. Expression des résultats</td><td>64</td></tr><tr><td>5.5. Analyse du carbone 13 et de l'azote 15</td><td>65</td></tr></table>

## D. CONTRIBUTION DU CARBONE NOUVELLEMENT ASSIMILÉ A LA RHIZODÉPOSITION

### I. Matériel et méthodes

1.1. Conditions de culture

1.1.1. Le sol

1.1.2. Les plantes

1.2. Dispositif expérimental

1.2.1. Dispositifs de culture

1.2.2. Culture des plantes

1.3. Marquage long des parties aériennes au <sup>14</sup>C et au <sup>13</sup>C et récolte

1.4. Expression des résultats

1.5. Analyses statistiques

### II. Résultats

2.1. Production de biomasse

2.2. Répartition du carbone dans la plante et dans le sol

2.2.1. Répartition du carbone à la fin de chaque marquage : <sup>14</sup>C lors du premier marquage et <sup>13</sup>C lors du second marquage

2.2.2. Répartition du carbone 13 et du carbone 14 à la fin du second marquage
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>2.3. Contribution des deux sources de carbone à la rhizodéposition</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4. Biomasse microbienne</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>III. Discussion</strong></td>
      <td><strong>81</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1. Répartition du carbone dans la plante</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2. Contribution du carbone récemment assimilé à la rhizodéposition</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>IV. Conclusion</strong></td>
      <td><strong>86</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>E. CONSÉQUENCES DE L'ÉLÉVATION DE LA CONCENTRATION EN CO<sub>2</sub> ATMOSPHÉRIQUE SUR LA RÉPARTITION DES PHOTO-ASSIMILATS RÉCENTS ET LA RHIZODÉPOSITION CHEZ LOLIUM PÉRENNE</strong></td>
      <td><strong>88</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>I. Matériels et méthodes</strong></td>
      <td><strong>90</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1. Dispositif expérimental</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2. Mise en place de l'essai</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3. Marquage des parties aériennes au <sup>14</sup>CO<sub>2</sub> et au <sup>15</sup>NH<sub>3</sub> et récolte</td>
      <td>92</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.4. Mesure de la minéralisation du carbone total et du carbone 14 dans le sol adhérent</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.5. Expression des résultats du marquage à l'azote 15</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6. Analyses statistiques</td>
      <td>94</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>II. Résultats</strong></td>
      <td><strong>95</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1. Production de biomasse végétale</td>
      <td>95</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2. Allocation de carbone 14 et de l'azote 15 au compartiment souterrain</td>
      <td>96</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3. Concentrations en glucides totaux dans les organes végétaux</td>
      <td>100</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4. Quantités de carbone dans la biomasse microbienne</td>
      <td>101</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.5. Cinétique de minéralisation du carbone total et des composés organiques <sup>14</sup>C (C rhizodéposé et turnover de la biomasse microbienne marquée) dans le sol adhérent</td>
      <td>101</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>III. Discussion</strong></td>
      <td><strong>105</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1. Production de biomasse et répartition des photo-assimilats dans le système plante-sol</td>
      <td>105</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2. Concentration en carbone total du sol et devenir des photoassimilats récents dans la rhizosphère</td>
      <td>108</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3. Répartition de l'azote 15 dans la plante et rhizodéposition azotée</td>
      <td>109</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>IV. Conclusion</strong></td>
      <td><strong>110</strong></td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
F. INFLUENCE DE LA DÉFOLIATION SUR LA RÉPARTITION DES ASSIMILATS DANS LA PLANTE ET LES TRANSFERTS DE CARBONE VERS LA RHIZOSPHÈRE

<table><tr><td></td><td>112</td></tr></table>

I. Matériels et méthodes 116

1.1. Dispositif expérimental 116

1.2. Echantillonnages 116

1.3. Analyses sur les plantes et le sol 117

1.4. Analyses sur le compartiment microbien 117

1.4.1. Evaluation de l'activité microbienne et de la disponibilité en C pour la biomasse microbienne 118

1.4.2. Dénombrement des bactéries cultivables du sol 118

1.4.3. Analyse des aptitudes cataboliques des communautés microbiennes (Biolog®) 119

1.5. Analyse de la communauté de nématodes 120

1.6. Analyses statistiques 120

II. Résultats 121

2.1. Production de biomasse végétale 121

2.2. Concentrations en carbone total, azote total des organes végétaux et en glucides totaux dans les racines 122

2.3. Concentration en carbone et en azote du sol 124

2.4. Compartiment microbien 125

III. Discussion 129

3.1. La défoliation modifie la répartition de carbone dans la plante 129

3.2. La disponibilité en carbone et en azote dans la rhizosphère n'est pas modifiée par la défoliation 130

IV. Conclusion 132

G. CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES 133

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 137

FIGURES 159

TABLEAUX 164
<table><tr><td>PHOTOGRAPHIES</td><td>166</td></tr><tr><td>ANNEXES</td><td>167</td></tr></table>
# INTRODUCTION GENERALE

Le sol est le plus souvent un milieu très hétérogène en raison de sa composition et de l'activité biologique qui s'y déroule. Cette activité biologique dépend notamment du carbone entrant dans le sol depuis la plante. En effet, selon la zone de sol considérée et la composition des matières organiques qui s'y trouvent, les organismes vivants du sol opèrent des transformations de nature et d'intensité diverses influençant ainsi la qualité des sols. Le développement et l'activité de ces organismes, en particulier les micro-organismes, sont souvent limités par la disponibilité en carbone organique facilement assimilable. Ainsi, la plante et les couverts végétaux jouent un rôle majeur dans l'activité biologique du sol, en alimentant le sol en C organique. Les débris végétaux (litières de parties aériennes, racines en décomposition) constituent une zone de fortes activités biologiques (« hot spot ») appelée « détritusphère » (Stemmer et al., 1999) au même titre que le volume de sol entourant les racines vivantes, la rhizosphère. Ce terme a été introduit par Hiltner (1904) qui avait constaté une plus forte densité de micro-organismes dans cette zone à proximité des racines vivantes que dans le reste du sol. La rhizosphère est un milieu extrêmement complexe, où s'opèrent de multiples interactions entre la plante, le sol et les organismes telluriques. Sous l'influence du fonctionnement de la racine, la rhizosphère est caractérisée par des conditions abiotiques et biotiques particulières, qui diffèrent par conséquent de celles du sol non-rhizosphérique : excrétion de protons conduisant à des acidifications micro-locales, absorption d'eau et de minéraux modifiant les flux de masse et les équilibres hydriques et ioniques, modification des propriétés mécaniques du sol et des pressions partielles en CO₂ et O₂ par la croissance et les activités racinaires et microbiennes... La libération de composés organiques ou « rhizodéposition » (terme défini par Shamoot et al., 1968) représente :

- un apport annuel au sol de C organique non négligeable, estimé selon les études entre 710 et 1020 kg C ha⁻¹ an⁻¹ sous une culture de blé (Swinnen et al., 1994b)

- un coût énergétique significatif pour la plante puisqu'il est estimé que le flux de rhizodéposition représente de 5 à 15% de l'assimilation nette de carbone (Swinnen et al., 1994 a & b), avec un extrême à 40% (Johansson, 1992 ; Whipps, 1987).

Ces composés organiques libérés par les racines vivantes sont désignés sous le terme générique de « rhizodépôts ». Leur quantité et leur composition varient en fonction de
nombreux facteurs comme le stade de développement des plantes, la zone racinaire considérée et les paramètres environnementaux (Curl et Truelove, 1986). Essentiellement composés de glucides simples, d'acides aminés et organiques et de polysaccharides (Grayston et al., 1996), ils ont un rôle **trophique** majeur car ils servent de substrat pour les micro-organismes du sol. De plus, certains rhizodépôts en faible concentration sont des **signaux moléculaires** et participent ainsi à la structuration des communautés microbiennes du sol.

Bien que la rhizosphère ne représente le plus souvent qu'une très faible fraction du volume total du sol (2 à 3% selon Coleman et al., 1978), les micro-organismes étant le moteur du fonctionnement des sols, la stimulation du développement microbien par les rhizodépôts confère des enjeux agro-environnementaux importants aux recherches conduites sur la rhizosphère. Ainsi stimulées, les populations microbiennes du sol influencent l'état sanitaire des plantes (stimulation du développement de bactéries PGPR; Bally et al., 1999), la biodégradation des pesticides dans le sol (Fang et al., 2001b) et la bio-disponibilité en minéraux (Clarholm, 1985).

Ainsi, comprendre et quantifier la rhizodéposition, processus clé du fonctionnement rhizosphérique participe à la compréhension du fonctionnement des sols sous couvert naturel ou cultivé et à la gestion durable de leurs qualités agro-environnementales. La mesure de la rhizodéposition dans **des conditions écologiques et agronomiques réalistes** permettrait de compléter les bilans de C des plantes et des écosystèmes, en vue, par exemple, d'évaluer le rôle de la rhizosphère et des sols dans les changements climatiques en tant que puits de carbone.

Notre travail de thèse s'inscrit dans la thématique de recherche de l'équipe « Rhizosphère » de l'Unité Mixte de Recherche « Agronomie Environnement » INPL (ENSAIA)-INRA Nancy Colmar. **Le programme vise à mieux comprendre, quantifier et modéliser la rhizodéposition de plantes d'intérêt agronomique en vue de déterminer leur conséquence sur la disponibilité en N et en S pour la plante.** Ainsi, des travaux récents ont porté sur la quantification de la respiration rhizosphérique (Todorovic, 2000), les interactions entre la rhizodéposition et la disponibilité en azote minéral (Henry et al., 2005) et en soufre (Dedourge et al., 2004) dans la rhizosphère, les relations entre la photosynthèse, l'allocation de C aux racines et la rhizodéposition chez le maïs (Todorovic et al., 2001; Marchand et al., 2005).
Les travaux de l'équipe privilégient une démarche intégrée, mettant en relation le fonctionnement de la plante entière et la rhizodéposition. Ces études ont toujours concerné des plantes annuelles.

A la suite de ces travaux, nous avons opté pour la même démarche consistant à expliciter les transferts de C récent vers la rhizosphère en relation avec le fonctionnement de la plante entière chez une plante fourragère pérenne, le **ray grass anglais** (*Lolium perenne* L.) et ce, pour plusieurs raisons :

- chez une plante pérenne, il est probable que le carbone mis en réserve dans les organes de la plante contribue au pool de carbone libéré par les racines (rhizodépôts). Cet aspect reste encore peu étudié et pourrait contribuer à améliorer la connaissance sur les flux de rhizodéposition qui sont appréhendés le plus souvent sur des plantes annuelles.

- c'est une espèce d'intérêt agronomique représentative des prairies à gestion intensive, soumise à des interventions agronomiques comme la fertilisation et la fauche ou la pâture. Les conséquences de ces interventions sur les flux de C dans le système plante-sol sur des plantes se développant *in situ* restent à préciser.

- Il s'agit d'une plante modèle intéressante pour étudier le rôle de la rhizosphère dans les changements climatiques en tant que puits de carbone. Cette espèce est souvent implantée sur des dispositifs de longue durée installés dans des écosystèmes prairiaux conduits de manière intensive.

Dans la première partie du manuscrit, nous proposons une analyse bibliographique, visant à établir un bilan des connaissances actuelles sur les transferts de C dans le continuum atmosphère-plante-sol, la rhizodéposition et les principaux facteurs modulant ces flux. Ce bilan permettra de dégager les principales hypothèse et d'étayer les objectifs de la thèse. Nous présentons ensuite les dispositifs, méthodes et matériels utilisés dans cette étude. Enfin, les principaux résultats sont présentés puis discutés. Une conclusion générale synthétisant le travail et ses perspectives est proposée en fin de document.

Ce travail a permis jusqu'à présent la rédaction de 2 articles et de 5 communications dans des colloques et workshops internationaux (Annexe 1).
# A. SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

## I. Cycle du carbone et importance des écosystèmes prairiaux

Afin de comprendre l'intérêt d'étudier les transferts de carbone depuis la plante vers le sol, il est nécessaire de situer ce travail dans un contexte plus large présentant de manière générale les principales caractéristiques du cycle du carbone ainsi que les principales modifications observées au cours des dernières années suite au changement global.

La rhizosphère constitue un maillon du cycle du carbone. Son rôle a longtemps été sous estimé du fait de son petit volume (quelques mm³ de sol entourant les racines) et de la difficulté à la définir. Néanmoins dans les zones où la végétation domine (forêts, prairies, cultures), la rhizosphère peut représenter un volume non négligeable de sol dépendant de la biomasse et de la densité racinaire, par exemple, jusqu'à 100% des premiers centimètres des sols prairiaux.

Les principaux stocks de carbone sont présents dans l'atmosphère, l'océan et les écosystèmes terrestres (Figure 1).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 1 : Flux annuels et stocks de carbone en giga-tonnes (milliards de tonnes de carbone) (Figure tirée de "L'Avenir Climatique", d'après GIEC, 1996). L'atmosphère contient 750 giga tonnes (Gt) de carbone, valeur calculée à partir de la concentration moyenne annuelle au pôle sud. L'océan renferme 39973 Gt de carbone. Les sols renferment 1580 Gt, alors que la végétation qui les recouvre renferme seulement 610 Gt de carbone.</figcaption></figure>
Une des conséquences principales du changement global est un déséquilibre du cycle du carbone. La concentration en CO₂ atmosphérique augmente très rapidement depuis la révolution industrielle (Gammon et al., 1985). Elle est actuellement de 360 vpm, et des estimations annoncent une concentration de 550 vpm d'ici les années 2050. La déforestation et l'utilisation des énergies fossiles sont les principales responsables de cet accroissement. Les émissions anthropiques de dioxyde de carbone libèrent 7.5 Gt de C par an. Parmi ces 7.5 Gt, différents compartiments absorbent ce C et le stockent. On appelle ces compartiments des puits de carbone. Trois Gt et demi sont absorbées par l'atmosphère, 2 Gt C sont retrouvées dans les océans et environ 2 Gt C sont considérées comme « puits manquant » de carbone (Scharpenseel, 1993 ; Amthor, 1995). Le stockage de carbone dans les écosystèmes terrestres (végétation et sol), en réponse à l'élévation des teneurs en CO₂ atmosphérique apparaît comme étant ce puits manquant (Gifford, 1994). Au niveau des sols, en fonction de leur mode d'occupation, les stocks de carbone peuvent varier. Ainsi, en France, pour une épaisseur de sol de 30cm, les stocks les plus élevés (100tC/ha) sont présents dans les sols d'alpage d'altitude, et dans les sols de forêts ou de prairies (70 à 80 tC/ha). En revanche les stocks sont moindres dans les sols cultivés, notamment dans les sols de vigne (Robert et Saugier, 2003).

# 1. La plante : un pourvoyeur de carbone dans la rhizosphère

Le carbone contenu dans la végétation représente presque autant que celui stocké dans l'atmosphère sous forme de CO₂. La plante constitue un pourvoyeur de carbone pour le sol. On peut distinguer différentes voies d'entrée du carbone dans le sol depuis la plante :

- les parties aériennes de la plante tombent au sol et se décomposent, elles enrichissent la matière organique : la chute de litière (60 à 70% de la matière organique entrant dans le sol, Grayston et al., 1996);

- du carbone organique est libéré dans la rhizosphère par les racines vivantes de la plante : la rhizodéposition ;

- des fragments de racines entrent en sénescence et se décomposent dans le sol : le renouvellement racinaire.

La rhizodéposition et le renouvellement racinaire représentent de 30 à 40% de la matière organique entrant dans le sol (Grayston et al., 1996).
En comparaison avec la rhizodéposition et le renouvellement racinaire, les voies d'entrée de carbone dans le sol depuis la litière sont largement étudiées, ce, pour différents types d'écosystèmes (Kuzyakov et Domanski, 2000). Les définitions de la rhizodéposition sont parfois confuses dans la littérature. En effet, selon les auteurs le renouvellement racinaire est inclus ou non dans la rhizodéposition. Or, le renouvellement racinaire ne fait pas partie de la rhizodéposition car l'échelle de temps à laquelle le carbone est libéré dans le sol est plus longue. De plus, au sens strict, la rhizodéposition concerne uniquement les composés organiques libérés par les racines vivantes. C'est cette définition que nous adoptons dans notre travail qui porte sur les transferts du carbone récent à la rhizosphère.

## 2. Place des graminées pérennes dans le bilan de carbone des sols

Du fait de leur étendue (25% de la surface émergée du globe), le sol des prairies peut présenter un stock de carbone majeur, contribuant de manière significative à la séquestration du carbone. La majorité des prairies ne sont plus des prairies naturelles mais le résultat de l'activité agricole. Ces prairies semi-naturelles sur sol fertile sont souvent dominées par le ray grass pérenne (*Lolium perenne* L.) et le trèfle blanc (*Trifolium repens* L.).

Les graminées pérennes constituent un bon modèle d'étude des transferts de carbone vers le sol mais restent néanmoins moins étudiées que les plantes annuelles. Elles libèrent une proportion plus importante du carbone fixé que les plantes annuelles (Grayston et al., 1996). Chez ce type de plante les entrées de carbone dans le sol sont cycliques, correspondant aux périodes de croissance des racines (printemps et été) suivi d'un arrêt de la croissance racinaire et de la décomposition des tissus racinaires en hiver (Whipps, 1990). Les entrées de carbone dans le sol vont dépendre de la part de carbone mis en réserve dans les tissus racinaires, notamment pendant l'hiver (Whipps, 1990). Le système racinaire des plantes annuelles se décompose après récolte alors que celui des plantes pérennes est continuellement renouvelé. De plus, du fait d'une plus longue période de croissance, les graminées pérennes présentent une allocation de carbone au compartiment souterrain plus complexe. Cette allocation dépend de nombreux facteurs (défoliation, température...) engendrant des variations dans la taille du système racinaire et donc des fluctuations de la quantité de carbone libérée par les racines (Delting et al., 1979 ; Warenbourg et Paul, 1977). Chez les graminées pérennes, plus encore que chez les plantes annuelles, ce n'est pas seulement la quantité de résidus issus de la plante mais également la distribution du carbone assimilé dans le temps et dans l'espace
(cycles nycthéméraux, saisonniers, variations annuelles) qui influencent les transferts de carbone vers le sol. Très peu de travaux sur la rhizodéposition prennent en compte la distribution du carbone dans la plante; seules quelques études sur la défoliation se sont intéressées à la remobilisation des réserves de la plante et au transfert de carbone remobilisé vers le sol (Johansson, 1993 ; Crawford *et al.*, 2000).

Le ray grass anglais (*Lolium perenne* L.) est une espèce très compétitive lors de forte fréquence de fauche ou de pâturage intensif. Sa production et ses qualités nutritionnelles sont élevées (Holmes, 1980). De plus, le ray grass dispose d'un système racinaire dense, composé de racines adventives générant ainsi un volume de sol rhizosphérique conséquent.

## II. Les transferts de carbone dans le continuum atmosphère plante sol

Le dioxyde de carbone est assimilé par la plante au niveau de ses parties aériennes grâce à la photosynthèse. Le dioxyde de carbone fixé par la RubisCO provient de la diffusion du CO₂ atmosphérique au travers des stomates dans un premier temps, puis au travers des cellules de la feuille jusqu'au stroma des chloroplastes. Le cycle de Calvin (cycle des Pentoses Phosphate) engendre la formation de composés carbonés instables, réduit ensuite en phosphoglycéraldéhyde permettant la synthèse de glucides. Dans le chloroplaste, le carbone peut être intégré dans des composés plus ou moins polymérisés (hexose, amidon, saccharose). Dégradés en trioses, ces glucides quittent le chloroplaste pour être utilisés soit localement par les processus de respiration ou être stockés dans la vacuole sous forme de réserves (fructanes, hexoses), soit pour être transportés à plus ou moins longue distance pour la croissance et l'entretien des organes de la plante. Ces composés carbonés peuvent être directement libérés au niveau des racines des plantes par rhizodéposition ou d'abord mis en réserve puis remobilisés et ultérieurement libérés par les racines. Dans le sol, le carbone est utilisé comme source d'énergie pour les micro-organismes. L'activité microbienne est alors stimulée et l'abondance des micro-organismes accrue, plus particulièrement dans la rhizosphère. En retour, la majorité de ces micro-organismes contribuent au fonctionnement de la plante, notamment en augmentant la disponibilité en éléments nutritifs dans le sol. Les transferts de carbone vers le sol peuvent être contrôlés, d'une part par la plante elle-même, d'autre part par l'environnement dans lequel la plante évolue. En effet, il a été montré par exemple que la rhizodéposition était largement variable qualitativement et quantitativement, à la fois au sein d'une même espèce mais également d'une espèce à l'autre (Van der Krift *et al.*, 2001). De
même, par le biais de retro-contrôle, les micro-organismes du sol stimulent les flux de rhizodéposition. Ces flux de carbone peuvent être également modifiés par des facteurs externes (gestion des écosystèmes, climat... ; Van de Geijn et Van Veen, 1993).

# 1. La répartition des assimilats carbonés dans la plante

## 1.1. Les relations source-puits

Les transferts de carbone dans la plante et donc la répartition des assimilats dépendent des relations source-puits. Généralement, « source » et « puits » sont des descriptions fonctionnelles des organes de la plante, définissant leur aptitude à fournir ou à utiliser un substrat. Un aspect majeur, intrinsèque au concept de source et de puits est la continuité physique entre les sources et les puits par les connections vasculaires (Figure 2). Les sources de carbone sont définies comme les organes de la plante exportateurs nets de carbone vers d'autres parties de la plante. Les puits de carbone correspondent aux organes importateurs nets de carbone (Farrar, 1996a, Farrar, 1996b).

Les organes sources sont généralement les organes photosynthétiquement actifs, comme les feuilles matures. Les organes puits correspondent aux méristèmes, aux racines, aux jeunes feuilles et autres organes de stockage. En revanche les jeunes feuilles deviennent progressivement sources nettes de carbone lorsqu'elles se développent, et les organes de stockage également source de carbone quand les demandes en carbone de la plante vont excéder la photosynthèse (Farrar, 1996a, Farrar, 1996b). Dans ce cas, il s'agit d'une remobilisation des réserves. Les organes puits utilisent les assimilats pour leur respiration, leur croissance ou leur stockage.

Un puits ou une source peut être caractérisé par :

- son activité, correspondant à la croissance et au fonctionnement des organes puits et des organes sources ;

- sa capacité, correspondant à leurs aptitudes à transférer ou à stocker le carbone assimilé par la plante.
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 2 : Représentation schématique de la répartition du carbone dans une plante au stade reproducteur. Concepts de source et de puits. (d'après Tabourel-Tayot, 1997).</figcaption></figure>

## 1.2. Modification des relations source-puits

Les relations privilégiées entre les puits et les sources au cours du cycle de croissance sont soumises aux fluctuations de l'environnement de la plante. Toutes modifications de l'apport de carbone à la plante entraînent un changement de ces relations. Par exemple une augmentation de la luminosité ou de la pression partielle en CO₂ atmosphérique accroît
l'activité des organes sources, alors que la défoliation diminue l'activité des organes sources (Tableau 1).

<table><caption>Tableau 1 : Effets de quelques facteurs à impact majeur sur l'assimilation et la répartition des assimilats dans la plante. Ces éléments bibliographiques sont tirés d'articles de synthèses et de résultats expérimentaux.</caption><thead><tr><th>Facteurs</th><th>Effets</th><th>Références bibliographiques</th></tr></thead><tbody><tr><td>Température</td><td>Chez la plupart des végétaux, la vitesse de circulation des assimilats décroît en deçà de 10-15°C et au delà de 40°C.</td><td>Bonnemain (1975)</td></tr><tr><td>Défoliation</td><td>La quantité d'assimilats et les potentialités d'acquisition de C sont réduites, provoquant des ré-allocations vers les méristèmes foliaires et vers les jeunes feuilles en croissance. Des remobilisations des réserves carbonées sont également observées</td><td>Ryle et Powell (1975),<br>Davidson et Milthorpe (1966).</td></tr><tr><td>CO<sub>2</sub></td><td>Une augmentation de la biomasse végétale est habituellement observée, mais les conséquences sur la répartition entre parties aériennes et parties racinaires sont variables. Dans certains cas les réserves augmentent ce qui ne permet plus d'assimilation supplémentaire de C car la totalité des demandes de la plante est déjà satisfaite.</td><td>Kimball (1983),<br>Farrar et William, (1991),<br>Fischer et al. (1997).</td></tr><tr><td>Azote</td><td>L'assimilation augmente en même temps que les réserves augmentent. La croissance racinaire est réduite, au profit des parties aériennes.</td><td>Lawlor et al. (1989),<br>Powell et Ryle (1978).</td></tr></tbody></table>

De plus, les modèles de répartition du carbone chez les plantes pérennes sont très complexes, du fait de la présence de tissus avec des structures d'âge variable. La variation des taux de glucides dans les différents tissus de la plante constitue un mécanisme de contrôle de la répartition des ressources entre les organes sources et les organes puits (Koch, 1996 ; Sheen et al., 1999). Ces mécanismes de variation des taux de glucides fournissent un moyen d'ajuster
la croissance de la plante et l'allocation du carbone dans la plante en réponse à des contraintes et des changements environnementaux (Koch, 1996; Farrar et Jones, 2000). Ainsi une diminution des teneurs en glucides engendre une stimulation de l'activité photosynthétique au niveau des organes sources ainsi qu'une remobilisation des réserves présentes au niveau des organes puits, alors qu'une augmentation des taux de glucides stimule leur mise en réserve et leur utilisation dans les organes puits (Andersen, 2003).

> L'environnement agit sur l'assimilation et la répartition du carbone dans la plante ce qui modifie le fonctionnement des organes sources et des organes puits. Les organes sources (parties aériennes) contribuent à l'allocation de carbone aux organes puits (racines). Ainsi toutes modifications du fonctionnement des organes sources (au niveau des parties aériennes) affectent les transferts de carbone vers les racines (aussi bien le carbone directement transféré vers le sol que le carbone stocké dans la plante) et vers le sol. Au-delà de la plante, la rhizosphère peut jouer un rôle majeur dans la régulation des relations sources-puits dans la plante.

## 2. Rhizosphère et rhizodéposition

### 2.1. La rhizosphère

Son volume est variable selon le développement racinaire : il représente entre 0,1 et 1% du sol global des écosystèmes forestiers et près de 100% des premiers centimètres des sols prairiaux. C'est un milieu complexe et hétérogène qui présente des caractéristiques très particulières. Ainsi, la rhizosphère présente des propriétés structurales (porosité-agrégation) et des caractéristiques physico-chimiques singulières (pH, $pO_2$, minéraux, potentiel hydrique). Quant à la composante biologique, des études montrent une densité et une activité microbienne à proximité de la racine particulièrement intenses, en comparaison au sol non rhizosphérique (Lynch et Whipps, 1990). Cette microflore se compose majoritairement de bactéries, les champignons, protozoaires et algues unicellulaires étant moins fortement représentés (Subba Rao, 1999).
Ces caractéristiques, propres à la rhizosphère, résultent d'interactions qui ont lieu entre la plante, le sol et les micro-organismes (Grayston et al., 1996). Les processus racinaires impliqués dans ces interactions sont entre autres la rhizodéposition, la respiration de la racine, l'absorption d'eau et de nutriments.

## 2.2. La rhizodéposition

### 2.2.1. Composition :

Les composés libérés par rhizodéposition sont très diversifiés, reflétant ainsi les capacités de biosynthèse de la plante. La classification des rhizodépôts établie par Rovira (1969) les regroupe en quatre classes en fonction de leur composition (Tableau 2). Ils sont constitués majoritairement de composés carbonés mais également, en quantité moins importante, de composés azotés (Rovira, 1979). Le carbone est libéré sous forme de glucides, acides organiques, tandis que l'azote est libéré sous forme d'acides aminés et de peptides (Rovira, 1969). Le ratio C/N est un paramètre important intervenant au niveau des bilans d'azote dans le sol. Grayston et al., (1996) considèrent que les composés très labiles, diffusibles comme les exsudats (glucides, acides aminés, acides organiques) ont un ratio C/N de l'ordre de 2,5-13. D'après les données de Jones et Darrah (1993), les acides aminés étant minoritaires, le ratio C/N des exsudats est estimé comme supérieur à 70. Pour les composés plus complexes majoritairement représentés par les mucilages, leur ratio C/N est de l'ordre de 65 (Mary et al., 1993).

Ce type de nomenclature citée ci-dessus, en fonction de la nature biochimique des composés, est à la base de classifications communément adoptées (Neumann et Römheld, 2000 ; Rovira, 1979). Cependant, Killham et Yeomans (2001) ainsi que Meharg (1994) suggèrent de classer les rhizodépôts selon leur aptitude à être dégradés par les micro-organismes. Finalement, le mode de libération des composés par les racines peut être également pris en compte pour classer les différentes catégories de composés libérés (diffusion passive ou transport actif). Il n'existe donc pas de classification universelle des rhizodépôts, chacune trouvant sa pertinence selon si la démarche concerne plutôt le compartiment microbien, la physiologie de la racinaire ou la biochimie des composés libérés.
<table><caption>Tableau 2 : les différentes catégories de rhizodépôts (d'après Rovira, 1969) selon leur composition biochimique et leur mode de libération.</caption><thead><tr><th colspan="2">Types de rhizodépôts</th></tr></thead><tbody><tr><td>Les exsudats</td><td>Composés hydrosolubles de faible poids moléculaire, libérés passivement par les racines vers la solution du sol selon un gradient de concentration. Représentés principalement par des sucres (glucose, fructose, maltose...) des acides aminés, carboxyliques et phénoliques et en moins grande proportion par des vitamines, des régulateurs de croissance, des enzymes et des nucléotides.</td></tr><tr><td>Les secrétions</td><td>Composés de poids moléculaire variable, libérés par transport actif. Ce sont notamment des glucides</td></tr><tr><td>Les mucilages</td><td>Composés de poids moléculaire élevé. Libérés principalement au niveau des apex voire même des poils absorbants. Représentés par des sucres polymérisés et des protéines.</td></tr><tr><td>Le mucigel</td><td>Mélange complexe de mucilage, de débris racinaires, bactériens et de particules minérales.</td></tr></tbody></table>

### 2.2.2. Quantification

Chez les céréales, entre 20 et 30% de la fraction de carbone total assimilé sont transférés aux racines alors que chez les espèces prairiales elle atteint 30 à 40% (Kuzyakov et Domanski, 2000). La répartition du carbone dans la plante et dans le sol est similaire entre les graminées annuelles et les graminées pérennes : la moitié de ce carbone sert à la croissance et à l'entretien de la plante, un quart est retrouvé dans la respiration rhizosphérique (microbienne et racinaire), le dernier quart étant incorporé dans la biomasse microbienne et dans la matière organique du sol. Dans le cas d'études menées sur des plantes cultivées *in situ*, le carbone libéré par les racines vivantes correspond à 5 à 10% du carbone net fixé par la plante. Néanmoins, Jones *et al.*, (2004) considèrent comme plus réaliste d'estimer la rhizodéposition comme étant comprise entre 2 et 4 % du carbone net fixé sur la base d'une modélisation de la rhizodéposition tenant compte des principaux facteurs susceptibles de faire varier les flux de rhizodéposition. La quantité de carbone rhizodéposé reste néanmoins difficile à mesurer. En
combinant un traçage isotopique et un modèle de rhizodéposition, Swinnen et al. (1994b) montrent que la rhizodéposition carbonée correspond à un apport annuel de C organique compris entre 710 et 1020 kg C ha⁻¹ an⁻¹ sous une culture de blé.

Pour l'azote, les études sont beaucoup moins nombreuses; celles-ci montrent que 18 à 33% de l'azote assimilé par des plants de blé sont libérés dans la rhizosphère pendant la période de croissance des plantes (Janzen, 1990). A l'échelle de la parcelle la rhizodéposition azotée rend compte d'une libération nette comprise entre 8 et 40 kg N ha⁻¹ (Merbach et al., 1999; Janzen, 1990), ce qui est loin d'être négligeable pour la gestion de la fertilisation azotée car cet azote est bio-disponible rapidement pour micro-organismes favorisant ainsi leur activité.

La grande variabilité des résultats de quantification de la rhizodéposition carbonée et azotée résulte de différences du point de vue de la méthodologie, et des conditions environnementales (facteurs biotiques et abiotiques) (Grayston et al., 1996).

### 2.2.3. Localisation

La libération de composés par la racine n'est ni qualitativement, ni quantitativement homogène le long de la racine et varie d'une espèce à l'autre. Dans le cas des arbres et des graminées, les sites majeurs de libération se situent au niveau des apex et des zones d'élongation racinaire (Whipps et Lynch, 1985; Curl et Truelove, 1986). Selon la zone de la racine, la nature de la rhizodéposition varie (Rovira et al., 1979; Lynch et Whipps, 1990; Grayston et al., 1996). Il apparaît que la libération de glucides a lieu tout au long de la racine (Jones et Darrah, 1994), alors que la libération d'acides aminés et d'acides organiques a lieu préférentiellement dans les zones apicales (Hoffland, 1992; Jones et Darrah, 1994). De même, les photosynthétats récemment assimilés sont majoritairement alloués vers les jeunes racines (Matthew et Kemball, 1997). Néanmoins, la contribution de ce carbone plus ancien à la rhizodéposition n'est pas encore quantifiée.

### 2.3. Rôle trophique des rhizodépôts

Les rhizodépôts jouent un rôle trophique majeur mais également un rôle signal (production de métabolites secondaires). Dans notre travail c'est le rôle trophique des rhizodépôts par rapport au cycle du carbone qui nous intéresse puisque ces rhizodépôts sont utilisés en tant que substrats pour le développement de la microflore du sol. Cependant en terme de structuration
des communautés du sol, la part du trophique par rapport à celle du signal reste à étudier. La nature et la quantité de ces substrats produits dépendent directement du fonctionnement de la plante. L’activité des micro-organismes est généralement limitée par la disponibilité en carbone. Ceci est moins vrai dans la rhizosphère grâce à l’apport continu de carbone labile, rapidement disponible et assimilable par la microflore hétérotrophe (Lynch et Whipps, 1990 ; Cheng *et al.*, 1996). En revanche, si dans la rhizosphère, le carbone n’est pas limitant pour les micro-organismes, la disponibilité en azote peut l’être. Dans ce cas, c’est à la fois la croissance des micro-organismes et celle de la plante qui sont limitées. Dans le cas contraire, les micro-organismes rendent disponible l’azote minéral, par minéralisation de l’azote organique, utile à la nutrition des plantes. Le fonctionnement de la plante ainsi que l’activité microbienne sont alors modifiés, affectant ensuite les entrées de carbone dans le sol par rhizodéposition.

### 2.3.1. Manifestations de l’effet rhizosphère

L’entrée de carbone dans la rhizosphère, via la rhizodéposition, gouverne la taille, l’activité et la composition génétique de la biomasse microbienne (Lynch, 1991). L’augmentation de la densité de micro-organismes à proximité de la racine : « l’effet rhizosphère », se quantifie par le rapport entre les micro-organismes rhizosphériques et les micro-organismes non rhizosphériques. Ce ratio est estimé en moyenne pour les bactéries entre 10 et 20, parfois plus. En revanche, il est moins important pour les actinomycètes et les champignons (Subba Rao, 1999), démontrant que les bactéries sont plus sensibles à la rhizodéposition que ne le sont les champignons et les actinomycètes. Cependant, la densité du pool bactérien rhizosphérique est variable. La présence ou l’absence de plantes (Nguyen et Guckert, 2001 ; Kandeler *et al.*, 2002 ; Lemanceau *et al.*, 1995), l’espèce végétale (Grayston *et al.*, 1998 ; Fang *et al.*, 2001a) ou encore différents cultivars (Dalmastri *et al.*, 1999) sont des facteurs susceptibles de faire varier l’activité respiratoire microbienne et/ou la composition des communautés microbiennes. Certains groupes bactériens sont ubiquistes, retrouvés à la fois dans le sol rhizosphérique et non-rhizosphérique, alors que d’autres sont spécifiques à la rhizosphère (Marilley et Aragno, 1999).
### 2.3.2. Conséquences de l'effet rhizosphère

L'effet rhizosphère favorise la croissance et la qualité végétale. En effet, les microorganismes rendent disponibles dans la solution du sol des éléments tels le fer, le calcium et le phosphore initialement présents sous forme organique stable et complexe, forme inaccessible pour la plante. De plus, les bactéries sont un puits d'éléments minéraux : ils stockent dans leur biomasse des atomes de carbone, d'azote, de phosphore, de soufre etc..., qui deviennent à leur mort une source de nutriments pour les végétaux. Ils sont aussi impliqués dans la dégradation de certaines catégories d'herbicides (Fang *et al.*, 2001b) et dans l'état sanitaire des plantes. Certaines bactéries comme les bactéries PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria), améliorent directement la croissance végétale en synthétisant des phytohormones de croissance (auxines) ou indirectement en limitant la croissance d'agents pathogènes via la production d'antifongiques (Benizri *et al.*, 2001) (Figure 3). Néanmoins du fait d'une intensification des processus dans la rhizosphère, on observe également une stimulation du développement de pathogènes (bactéries, champignons) ; la présence importante de composés toxiques et également une compétition entre plante et microorganismes pour un certain nombre de nutriments.

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

**Figure 3:** Modèle simplifié présentant le carbone issu de la photosynthèse importé jusqu'aux racines puis transféré dans le sol (d'après Dilkes *et al.*, 2004). Ce schéma vient en complément du schéma précédent (Figure 2) caractérisant la répartition du carbone dans la plante. La rhizodéposition devient un des termes du bilan carboné de la plante entière.
Les flux de rhizodéposition sont plus importants chez les plantes pérennes que chez les plantes annuelles (jusqu’à 40% du C assimilé chez les plantes annuelles et jusqu’à 70% chez les plantes pérennes). L’environnement de la plante conditionne les relations sources-puits de la plante. La rhizodéposition représente une perte d’énergie pour la plante mais un apport trophique pour les micro-organismes telluriques. Par conséquent, en échange de cet apport d’énergie, les micro-organismes peuvent rendre disponibles pour la plante des nutriments nécessaires à sa croissance. Ils peuvent également être impliqués dans la santé de la plante en la protégeant de certains pathogènes. De plus, ces micro-organismes entretiennent la fonction puits de la rhizosphère de part leur activité et leur capacité à stocker le carbone. Le concept des relations sources-puits peut alors être étendu à la rhizosphère, celle-ci étant un puits de C par le biais de la rhizodéposition (Figure 4). Les termes d’activité et de capacité puits ou source de carbone issu de la plante apparaissent donc applicables à la rhizosphère.

**EFFETS POSITIFS DIRECTS**
Augmente la disponibilité en nutriment.
Effet PGPR.
Favorise l’assimilation de l’eau du sol.
Induit la formation de nodosités (légumineuses).
Stimule l’infection mycorhizienne.

Carbone libéré dans la rhizosphère

**EFFETS POSITIFS INDIRECTS**
Induit la production d’hormone et de vitamines par les microbes ce qui augmente la croissance de la plante.
Lieu de fixation de N₂ et du transfert d’N à la plante

**EFFETS NEGATIFS DIRECTS**
Induit la croissance de champignons pathogènes.
Attire les nématodes consommant les racines.

**EFFETS NEGATIFS INDIRECTS**
Induit l’immobilisation d’éléments nutritifs les rendant indisponibles à la plante.
Induit la production de phytotoxines microbiennes

Figure 4: Représentation schématique des effets positifs et négatifs directs et indirects des rhizodépôts sur la croissance de la plante (d’après Jones *et al.*, 2003).

### 3. Outils d'étude des transferts de carbone dans le continuum atmosphère-plante-sol

La quantification *in situ* de la rhizodéposition est impossible en raison d'un écueil méthodologique majeur. En effet, les rhizodépôts sont rapidement adsorbés sur les
composants du sol comme les argiles (Guckert et al., 1975), ou encore dégradés par les micro-
organismes (Griffin et al., 1976; Kraffczyk et al., 1984; Groleau-Renaud, 1998). C'est
pourquoi la majorité des études concernant les transferts de carbone de la plante vers le sol et
l'analyse de la composition biochimique des rhizodépôts menées jusqu'à ce jour ont souvent
été réalisées en conditions hydroponiques stériles (Warembourg et Billes, 1979; Kraffczyk et
al., 1984; Kuzyakov et Domanski, 2000; Hodge et al., 1996...). Toutefois, dans ces
conditions, l'analyse quantitative et qualitative de la rhizodéposition est souvent perturbée par
la nature des ions de la solution, l'absence de contrainte mécanique liée au sol (Groleau-
Renaud et al., 1998) et l'absence de micro-organismes (Whipps 1990).

3.1. *Traçages isotopiques*

La majorité des informations disponibles concernant le transfert du carbone assimilé par la
plante depuis l'atmosphère jusqu'au sol a été obtenue grâce à l'utilisation de marqueurs
isotopiques : ¹⁴C, ¹³C, ¹¹C (synthèse de Kuzyakov, 2001). Cette technique faisant appel au
traçage isotopique permet de distinguer le carbone libéré par les racines du carbone
initialement présent dans le sol. Elle permet d'établir un bilan net de carbone libéré par les
racines dans des conditions réalistes.

Deux approches distinctes peuvent être considérées :

- le marquage des photo-assimilats de la plante en enrichissant le CO₂ atmosphérique avec un isotope stable (¹³C) ou radioactif (¹⁴C, ¹¹C) (Domanski *et al.*, 2001 ; Toal *et al.*, 2000 ; Warembourg et Esterlich, 2001),

- l'analyse des variations de l'abondance naturelle du ¹³C de la matière organique du sol (Balesdent et Balabane, 1992 ; 1996 ; Rochette et Flanagan, 1997 ; Rochette et al., 1999).

Néanmoins si l'on souhaite déterminer l'origine du carbone au sein d'un compartiment, à
savoir s'il provient de la re-mobilisation des réserves ou du carbone récemment assimilé, un
double marquage long (Schnyder, 1992 ; Johansson, 1993 ; Gebbing et al., 1999 ; Crawford et
al., 2000) peut être envisagé. En effet, les auteurs précédemment cités, procèdent à 2 marquages consécutifs des plantes avec deux isotopes différents du carbone (¹³C/¹⁴C).

### 3.1.1. Marquage court et marquage long des photoassimilats

Dans le cas du marquage court, les plantes assimilent le CO₂ marqué pendant une courte période. Cette technique n'est cependant valable que pour quantifier le transfert d'assimilats récents dans le système plante-sol (Meharg et Killham, 1990 ; Nguyen et al., 1999 ; Swinnen et al., 1994a, b ; Warembourg et Billes, 1979). L'ensemble du carbone n'étant pas marqué uniformément, les mouvements de carbone provenant des réserves et du renouvellement des tissus dont l'origine est antérieure au marquage ne peuvent être étudiés dans ce cas. De même, le marquage court (ponctuel) reflète l'aptitude de la plante à répartir le carbone au moment où le marquage isotopique est réalisé. La distribution du carbone à un stade donné de développement de la plante ne peut pas être extrapolée à la période entière de croissance de la plante. En revanche une série de marquages courts intervenant à différents stades de développement de la plante peut fournir une bonne estimation de la répartition du carbone dans le système plante-sol-micro-organismes pendant la croissance de la plante (Gregory et Atwell 1991 ; Jensen 1993 ; Swinnen et al., 1994a, b ; Kuzyakov et al., 1999, 2000).

Dans le cas d'un marquage long, les plantes assimilent le CO₂ marqué pendant une longue période par exemple depuis le stade plantule jusqu'à la date de récolte de la plante (Helal et al., 1986 ; Zagal, 1994). Cela correspond à la distribution du carbone aussi longtemps que l'atmosphère environnant la plante a été enrichie.

Le carbone 14, isotope radioactif est couramment utilisé dans les études avec des marquages courts ou des marquages longs. Ceci est dû à la facilité de détection d'éléments radioactifs dans un compartiment et aux faibles coûts des analyses suite au marquage. Néanmoins le ¹³C a l'avantage d'être un isotope stable du carbone, sa manipulation nécessite moins de précautions que celle du ¹⁴C, ce qui permet son utilisation au champ. Quant au ¹¹C, sa demi-vie est particulièrement faible (20.4 minutes) ce qui rend son utilisation encore plus difficile face à une demi-vie de 5730 ans pour le ¹⁴C (Minchin et Thorpe, 2003).
### 3.1.2. Abondance naturelle en ¹³C

Cette technique est basée sur la discrimination isotopique du ¹³C et du ¹²C pendant la phase d'assimilation du CO₂ par des plantes ayant un fonctionnement photosynthétique différent. L'enzyme Rubisco chez les plantes à métabolisme C3 engendre un appauvrissement en ¹³C dans la plante δ¹³C≈ -27‰ (unité delta qui permet ensuite de calculer le ratio ¹³C / ¹²C de l'échantillon) comparé au ¹²CO₂ de l'atmosphère. En revanche, l'enzyme Phosphoenol Pyruvate Carboxylase chez les plantes à métabolisme C4 entraîne un appauvrissement en ¹³C dans la plante δ¹³C≈ -12‰. La méthode est donc basée sur la culture d'une plante C3 (δ¹³C≈ -27‰) sur un sol ayant un historique C4 (δ¹³C devant approcher -12‰) ou inversement. Ainsi l'estimation de la rhizodéposition est réalisée en déterminant le rapport ¹²C/¹³C dans les différents compartiments du sol (Cheng et al., 1996 ; Rochette et Flanagan 1997 ; Rochette et al., 1999 ; Van Kessel et al., 2000a). Cette méthode présente l'avantage de pouvoir être appliquée au champ. Toutefois, ces mesures fournissent des bilans nets de flux de carbone vers la rhizosphère intégrant toute la période allant du semis jusqu'à l'échantillonnage. Cette technique a néanmoins permis d'évaluer la libération totale de carbone par les racines (rhizodéposition + renouvellement racinaire) d'une culture de maïs à 570-2555 kg C ha⁻¹ an⁻¹ (Balesdent et Balabane, 1996 ; Qian et Doran, 1996).

### 3.2. *Les variables indicatrices de la rhizodéposition*

L'estimation de la libération de carbone par les racines peut également se faire de manière indirecte en s'intéressant à différentes variables corrélées avec la rhizodéposition. C'est par exemple le carbone soluble intra-racinaire (Marchand, 2003), le carbone soluble (Haynes et Francis, 1993) du sol adhérent ou encore le compartiment microbien. Pour ce dernier, la biomasse microbienne est plus pertinente que l'étude des communautés microbiennes ou du nombre de bactéries cultivables car ces variables ne permettent de caractériser qu'une faible fraction des micro-organismes du sol. Toutes ces variables ne présentent pas les flux de carbone de la plante vers le sol, mais elles rendent compte de la disponibilité en carbone dans le sol, résultat direct des transferts de carbone de la plante vers le sol. Lors d'expérimentation en plein champ, ces variables peuvent être utilisées comme indicateurs de la rhizodéposition, alors que les techniques de marquages isotopiques sont lourdes à mettre en place. Notre
équipe a récemment utilisé ou développé ces indicateurs comme outil d'estimation de la
rhizodéposition *in situ*.

3.2.1. Approche phénotypique d'étude des micro-organismes

Les techniques de culture *in vitro* des micro-organismes après étalement ou encore le test
Biolog® sont basées sur la physiologie et le métabolisme microbien. L'inconvénient majeur
de ces outils est qu'ils ne rendent compte au maximum que de 10% de la population totale,
étant donné que la fraction cultivable des micro-organismes est de l'ordre de 1-10% de la
microflore totale (Torsvik *et al.*, 1990). En revanche cette fraction cultivable peut être
envisagée comme un indicateur de la disponibilité en carbone dans la rhizosphère pour les
micro-organismes et s'avère donc utile dans des études comparatives. Le test Biolog® est
utilisé pour caractériser les communautés microbiennes en fonction de leurs aptitudes
cataboliques (Garland et Mills, 1991 ; Zak *et al.*, 1994 ; Garland, 1997). Ce test rend compte
de la capacité d'oxydation de différents substrats (95 généralement) par des communautés
microbiennes et plus spécifiquement bactériennes. Il permet de mettre en évidence des
changements dans la qualité des composés rhizodéposés.

3.2.2. Approche génétique d'étude des micro-organismes

Depuis une vingtaine d'années, le développement des techniques de biologie moléculaire a permis l'émergence de nouvelles méthodes permettant la description des communautés microbiennes sur la base de l'analyse de l'ADN extrait des échantillons à caractériser (Ranjard et al., 2000a). Ces outils peuvent être utilisés pour cerner l'effet de variations de la disponibilité de carbone organique, c'est à dire des variations dans les transferts de carbone de la plante vers le sol, sur les structures de communautés microbiennes du sol. Néanmoins, des modifications de la structure des communautés microbiennes s'expliquent par un changement quantitatif et/ou qualitatif de l'entrée de carbone dans le sol mais sont également influencées par les caractéristiques édaphiques ou micro-climatiques. On peut par exemple citer les travaux de Montealegre et al. (2000) utilisant la technique RISA (Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). Les résultats obtenus montrent une modification de la structure des communautés bactériennes du sol après une augmentation de la concentration en CO2
atmosphérique. Les auteurs suggèrent que la rhizodéposition a pu être affectée qualitativement ou quantitativement par le CO₂ mais ne mettent pas directement en évidence les conséquences du CO₂ sur la disponibilité en carbone dans le sol.

Au-delà de la structure génétique des communautés bactériennes, de nouvelles techniques permettent d'appréhender les relations structures/ fonctions des communautés microbiennes *in situ*. Les techniques FISH (Fluorescence *in situ* hybridization) combinées à des techniques de micro-autoradiographie MAR (Lee *et al.*, 1999) permettent, par exemple, d'identifier et de caractériser *in situ* l'incorporation de substrats carbonés dans des cellules bactériennes présentes au sein d'une population bactérienne donnée (Nielsen *et al.*, 1999 ; Adamczyk *et al.*, 2003). La micro-autoradiographie permet de localiser la distribution des radioéléments dans un micro-organisme après exposition sur un film photographique sensible aux rayonnements radioactifs. Couplé à la technique FISH, permettant de révéler la présence des bactéries par fluorescence, il est possible de quantifier les bactéries ayant assimilé le substrat radioactif par rapport à la communauté bactérienne totale (Lee *et al.*, 1999 ; Ouverney *et al.*, 1999). Avec cet outil, il est possible de tester les conséquences de la variation de la disponibilité d'un substrat carboné donné sur la communauté bactérienne du sol.

### 3.3. Couplage des techniques isotopiques et des techniques de biologie moléculaire

Le couplage du traçage isotopique avec la biologie moléculaire microbienne devrait permettre prochainement de suivre la répartition d'un isotope du carbone dans tout le système plante-sol-micro-organismes : ce sont les techniques récentes ADN / ARN Stable Isotope Probing (SIP) (Radajewski *et al.*, 2000 ; 2002 ; Morris *et al.*, 2002 ; Lueders *et al.*, 2004). La technologie SIP devrait à terme permettre d'identifier *in situ* les membres actifs de groupes métaboliques de micro-organismes définis, ayant incorporé l'isotope du carbone issu du marquage de la plante (¹³C par exemple) dans l'ADN ou l'ARN de leurs cellules suite à la consommation d'un substrat marqué issu de la rhizodéposition. L'incorporation au niveau de l'ARN permet de caractériser les populations microbiennes actives car ayant transcrit leur ADN. Ainsi une diminution de la disponibilité de carbone au niveau du sol va se traduire par une moindre incorporation des composés marqués, issus de la plante, dans l'ADN ou l'ARN des populations bactériennes présentent. Néanmoins cette technique est en cours de mise au point et n'était pas opérationnelle pour ce travail de thèse.
Ces techniques SIP présentent également l'avantage de pouvoir être couplées aux techniques d'analyse phénotypique des micro-organismes de type PLFA. Ces techniques PLFA (profil d'acides gras phospholipidiques) permettent la comparaison de structures des communautés microbiennes, basée sur la caractérisation de lipides membranaires extraits des microbes présents dans le sol (Pennanen et al., 1998 ; Broughton et Gross, 2000 ; Kozdroj et Van Elsas, 2001). Les différents acides gras des membranes des cellules bactériennes sont caractérisés et peuvent être utilisés comme bio-marqueurs d'un groupe microbien donné. Ces techniques sont notamment employées pour apprécier l'effet structurant sur les communautés microbiennes de divers paramètres : espèces végétales (Priha et al., 1999 ; Germida et al., 1998), élévation du CO₂ atmosphérique (Kandeler et al., 1998) ou encore présence de métaux lourds (Kozdroj et Van Elsas, 2001), tous ces facteurs influençant de manière significative les entrées de carbone dans le sol. Les limites de cette technique résident dans le fait que certains PLFA sont communs à la plante et aux micro-organismes.

En combinant PLFA et SIP, il est possible de distinguer un type de micro-organismes donné ayant incorporé du carbone marqué dans ses membranes. Ainsi, il devient possible de distinguer les micro-organismes impliqués dans les changements biogéochimiques intervenant au niveau du sol (Treonis et al., 2004).

### 3.4. Utilisation des micro-organismes bio-senseurs

Une méthode récente, qui reste prospective car pas encore au point pour des investigations *in situ*, a pour but de quantifier, localiser et caractériser les rhizodépôts libérés. Cette technique renseigne directement les flux de rhizodéposition. Elle consiste à insérer dans le plasmide ou le chromosome d'une bactérie un ou plusieurs gènes dont l'expression, sous le contrôle d'un promoteur plus ou moins spécifique, permet une discrimination phénotypique de la bactérie modifiée (Daunert et al., 2000 ; Leveau et L window, 2002). Il existe ainsi de nombreux promoteurs stimulés par des signaux chimiques ou biologiques. Parmi les plus simples d'utilisation figurent ceux codant pour la luminescence et la fluorescence (Killham et Yeomans, 2001). On peut citer par exemple les micro-organismes bio-senseurs adaptés aux études de la rhizodéposition : *Pseudomonas fluorescens* marqué avec un gène de luminescence *lux*. La luminescence produite par les bactéries transformées est proportionnelle à la disponibilité en composés carbonés simples dans leur environnement (Yeomans et al., 1999). Ces *Pseudomonas* ont été utilisées pour rendre compte de la disponibilité en carbone
dans la rhizosphère en relation avec la fertilisation azotée (Darwent et al., 2003 ; Henry, 2005). Ainsi cet outil permet de mettre en évidence l'effet dépressif ou stimulateur de la disponibilité en carbone sur l'activité des micro-organismes. Néanmoins, une des limites de cette technique réside dans le fait que les glucides dosés peuvent provenir de sources autres que les rhizodépôts, comme par exemple la dégradation des parois bactériennes ou racinaires.

La quantification de la rhizodéposition s'avère délicate. Les techniques utilisant les isotopes du carbone semblent les mieux appropriées, mais difficiles à mettre en place dans des conditions de plein champ. Dans de telles conditions, les indicateurs de la rhizodéposition apparaissent comme plus facilement utilisables. Ils permettent une estimation de la rhizodéposition mais pas sa mesure. En revanche, le développement récent des techniques couplant les isotopes du carbone et la biologie moléculaire sont prometteuses mais ne sont pas encore opérationnelles pour des études in situ. Néanmoins, elles présentent l'avantage de pouvoir étudier un système complet regroupant plante, sol et micro-organismes. L'échelle d'analyse des communautés microbiennes est fine et permet de caractériser précisément quelles populations bactériennes sont stimulées lors d'un changement de la disponibilité de composés carbonés issus de la plante au niveau du sol.
### III. Facteurs modulant les transferts de carbone dans le système plante-sol-micro-organismes

Des facteurs propres à la plante et de nombreux facteurs environnementaux influencent l'activité source et l'activité puits des plantes (Tableau 1) et sont à l'origine des variations quantitatives et qualitatives des transferts de carbone de la plante vers le sol.

Whipps et Lynch (1985), estiment que tout facteur qui affectant la physiologie de la plante perturbe les processus de rhizodéposition.

Les principaux facteurs biotiques qui modifient la rhizodéposition sont :

- l'espèce,

- la variété,

- le stade de développement de la plante,

- la présence ou non de micro-organismes à proximité des racines vivantes.

Les principaux facteurs abiotiques peuvent être classés en 2 catégories :

- les facteurs abiotiques au niveau des parties aériennes de la plante, c'est à dire la température de l'air, les conditions d'éclairement, la concentration en CO₂ atmosphérique, la défoliation,

- les facteurs abiotiques racinaires, c'est à dire la température du sol, le statut hydrique et nutritionnel du sol, et la texture du sol.

Face à ces modifications des processus de rhizodéposition, la capacité de puits ou la capacité de source du sol peut être amplifiée grâce à la rhizosphère.

Nous allons développer les effets de trois facteurs sur les transferts de carbone dans le système plante, sol, micro-organismes : le CO₂, la défoliation et l'azote (Figure 5). Ces trois facteurs ont été choisis comme **outils d'étude des transferts de carbone** de par leur conséquences contrastées sur les relations source-puits de la plante, mais également de par leurs **intérêts agro-environnementaux** et leurs conséquences avérées ou supposées sur les flux de C vers la rhizosphère.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 5: Schéma récapitulatif des effets de l'élévation du CO₂, de la défoliation et de la fertilisation azotée sur les transferts de C dans la plante.</figcaption></figure>

L'élévation de la concentration atmosphérique en dioxyde de carbone est une des conséquences principales du changement global affectant le cycle du carbone et plus largement la séquestration de carbone par les écosystèmes. Le CO₂ correspond à la seule source de carbone pour les plantes, hormis quelques composés organiques simples pouvant être assimilés directement par les racines. En augmentant la concentration en CO₂ dans l'environnement de la plante, l'apport de carbone pour cette dernière est accru, ce qui va modifier les relations source-puits et donc affecter les transferts de carbone dans la plante et vers le sol notamment *via* la rhizodéposition. Nous ne développerons pas dans notre travail la capacité de séquestration des sols; nous étudierons les flux à court terme de carbone vers le
sol et les processus rhizosphériques pouvant intervenir sur la capacité de séquestration des sols.

La défoliation constitue un bon outil de variation des relations source-puits en réduisant de manière significative l'entrée de carbone dans la plante, du fait d'une réduction drastique de la taille des organes photosynthétiquement actifs, exportateurs de carbone (organe source). De plus, dans le contexte actuel d'étude des conséquences du changement global sur le cycle du carbone, il est important de comprendre comment la défoliation, principal facteur de gestion agronomique des prairies affecte la rhizodéposition, pouvant ainsi influencer la séquestration de carbone dans le sol de ce type d'écosystème.

L'azote affecte également de manière significative les relations sources-puits dans la plante. Il a été largement démontré que l'azote stimulait la production de biomasse des parties aériennes des plantes et réduisait le ratio de biomasse racinaire sur la biomasse de parties aériennes. Les transferts de carbone vers le sol s'en trouvent changés. Dans notre travail l'azote n'est pas étudié comme un facteur à part entière, il est couplé avec les effets de l'augmentation de la concentration en CO₂ dans l'atmosphère et avec la défoliation. Comme nous l'avons signalé précédemment, la disponibilité en azote dans le sol est à l'origine de compétition entre les plantes et les micro-organismes. Ainsi, le fonctionnement du compartiment microbien est modifié, affectant la disponibilité en N pour la plante et agissant sur la rhizodéposition par l'entremise de boucles de rétro-actions (densité d'apex entretien du gradient de diffusion passive des exsudats...).

# 1. Le dioxyde de carbone

## 1.1. Activité photosynthétique, production de biomasse et CO₂

Parmi les premiers effets observés de l'augmentation de la concentration en CO₂ de l'atmosphère, on note une stimulation de l'activité photosynthétique des plantes en C3 (Mott, 1990). Néanmoins, des études récentes laissent penser que des expositions à plus long terme ne stimulent plus l'activité photosynthétique (Drakes et al., 1997; Rogers et al., 1998), montrant les limites des études à court terme. En effet, une augmentation des concentrations en glucide des feuilles est couramment observée sous atmosphère enrichie en CO₂ (Fischer et
al., 1997). La capacité puits des feuilles est alors accrue. En conséquence, les sources doivent réduire leur activité et une diminution de l'activité photosynthétique est alors observée, correspondant à une acclimatation des plantes aux concentrations élevées en CO2. Chez *Lolium perenne*, des études (Rogers et al., 1998 ; Isopp et al., 2000) ont montré que l'assimilation de CO2 par les feuilles était augmentée de 30 à 40% sous CO2 élevé pendant les 5 premières années suivant la mise en place d'un dispositif d'enrichissement à l'air libre des concentrations en CO2 (FACE :Free Air Carbon dioxide Enrichment) installé en Suisse. En revanche, après 10 années, une diminution de la capacité photosynthétique est observée (Ainsworth et al., 2003a). Ces résultats dépendent du niveau de fertilisation et sont nettement moins marqués à des niveaux élevés d'azote. Au champ, une acclimatation de l'activité photosynthétique pourrait avoir une importance écologique majeure. Les entrées de carbone dans le sol via la plante seraient réduites ce qui, à terme, limiterait la création de puits de carbone au niveau des sols prairiaux.

Une stimulation de la production de biomasse des plantes (Kimball, 1983 ; Kimball et al., 2002 ; Long et al., 1992) est généralement observée sous CO2 élevé. Sur le dispositif FACE Suisse, les plants de *Lolium perenne* soumis au CO2 présentaient une stimulation de 10% de leur production, lors de la mise en place du dispositif (Hebeisen et al., 1997). En revanche, Daepp et al., (2000) montrent après 6 années d'enrichissement en CO2 une stimulation de production de biomasse de 25% sous niveau élevé de fertilisation. Cette augmentation de production est souvent accompagnée d'une diminution de la concentration en azote dans la plante (Luo et al., 1994 ; Cotrufo et al., 1998). On observe une augmentation de l'allocation de carbone aux racines (ratio Parties racinaires/Parties aériennes augmenté) ainsi qu'une augmentation de l'assimilation des éléments nutritifs par la plante (Cure et Acock, 1986 ; Jongen et al., 1995 ; Gorissen 1996 ; Gorissen et al., 1995 ; Van Ginkel et al., 1996 ; Ross et al., 1995 ; Cheng 1999a,b ; Rattray et al., 1995 ; Hebeisen et al., 1997). Toutefois, l'augmentation de l'activité photosynthétique et l'augmentation de la production primaire ne sont pas proportionnelles. Une grande part du carbone supplémentaire assimilé par photosynthèse sous CO2 élevé n'est pas retrouvé dans la biomasse des plantes et, par conséquent, est libéré par la plante. Ce « puits manquant » pourrait se situer au niveau de la respiration des parties aériennes ou de leur sénescence (formation de litières), du renouvellement racinaire ou encore de la rhizodéposition.
## 1.2. Sorties de carbone de la plante

Comme nous l'avons décrit précédemment, il existe plusieurs voies par lesquelles le carbone assimilé est libéré par la plante : la respiration, la sénescence des parties aériennes (litière), le renouvellement racinaire ou la rhizodéposition. Les effets du CO₂ sur la sénescence des parties aériennes et la décomposition des litières sont peu étudiés. Les quelques résultats obtenus montrent une augmentation de la production de masse de litière proportionnelle à l'augmentation de la production de biomasse des parties aériennes. En réponse, la biomasse microbienne est stimulée, mais pas son activité (Sowerby et al., 2000). D'autres études ne montrent aucun effet du CO₂ sur l'apport de carbone au sol par les litières issues de plantes cultivées sous CO₂ élevé (Higgins et al., 2002).

### 1.2.1. La respiration

C'est pour sa croissance et sa maintenance que la plante respire le plus (Amthor, 1997). Sous atmosphère enrichie en CO₂, la respiration de *Lolium perenne* par unité de masse est diminuée (Schapendonk et al., 1997). Ceci résulte de la stimulation de la croissance des plantes ainsi que du contenu en protéines des tissus végétaux. En revanche, à l'échelle de l'écosystème, la respiration est augmentée du fait d'une augmentation de la production de biomasse (Ryle et al., 1992; Schapendonk et al., 1997; Casella et Soussana, 1997; Aeschlimann, 2003).

### 1.2.2. La rhizodéposition

Les conséquences à long terme des teneurs élevées en CO₂ sur la rhizodéposition sont encore peu connues. En effet, la majorité des expérimentations a été menée en conditions contrôlées et avec de courtes durées d'enrichissement en CO₂ de l'atmosphère du système sol-plante. Dans la majorité des cas, ces expérimentations montrent que sous CO₂ élevé, la rhizodéposition carbonée est stimulée (Norby et al., 1987; Van Veen et al., 1991; Billes et al., 1993; Cardon, 1996). De même, de nombreuses études montrent que la respiration rhizosphérique est significativement augmentée sous CO₂ élevé (Lekkerkerk et al., 1990; Van Ginkel et al., 1997; Paterson et al., 1999; Hungate et al., 1997).

En revanche, de telles observations ne sont pas vérifiées à plus long terme. Quelques résultats obtenus en conditions naturelles indiquent que l'augmentation potentielle des transferts de
carbone au niveau des sols serait moins importante que ne le prévoient les premières études
simulant les effets court terme de l'élévation des teneurs en CO2 atmosphérique (Arnone et
Körner, 1995). La rhizodéposition est que très rarement étudiée dans des conditions de plein
champ après de longue période d'enrichissement en CO2. Dans une étude récente à laquelle
notre laboratoire a participé sur le dispositif FACE Néo Zélandais, la rhizodéposition est
augmentée après 5 années d'enrichissement de l'atmosphère en CO2 (Allard et al., 2005). Sur
le dispositif FACE Suisse présentant un historique de 9 années d'enrichissement en CO2 du
sol d'une prairie fertilisée, il apparaît qu'après 6 et 8 années d'enrichissement, les teneurs en
carbone total du sol ne sont pas significativement modifiées (Van Kessel et al., 2000a, b ;
Horwath et al., 2000 ; Van Groenigen et al., 2002). Ces données sont en contradiction avec
les données de production de biomasse des plantes issues du même dispositif. En effet, une
augmentation de production de matière sèche des plants de ray grass est observée (Hebeisen
et al., 1997 ; Suter et al., 2002). Cette augmentation résulte de la stimulation de l'activité
photosynthétique des plantes. Ainsi la part de carbone entrant dans la plante est accrue,
provoquant une stimulation de l'activité source et donc un transfert de carbone plus important
vers les racines et vers le sol. Horwath et al. (2000) suggèrent, sans le démontrer, que la plus
grande quantité de carbone entrant dans le sol via la rhizodéposition est plus rapidement
minéralisée par les micro-organismes expliquant ainsi cette stabilité des concentrations en
carbone total du sol. Les résultats obtenus par Hungate et al. (1996) ; Niklaus et al. (2000) ;
Gill et al. (2002) ; Ross et al. (2004) sur d'autres dispositifs présentent également des
concentrations en carbone des sols comparables entre CO2 élevé et CO2 ambiant, quel que soit
le niveau de fertilisation. Néanmoins d'autres études montrent qu'après plusieurs années
d'exposition à des teneurs élevées en CO2 une quantité plus importante de carbone est
présente dans le sol de prairies (Williams et al., 2000 ; Leavitt et al., 1994 ; Pendall et al.,
2001). Des différences dans la minéralogie des sols, la production de biomasse, l'espèce, le
mode de gestion du dispositif étudiée peuvent être à l'origine de ces résultats contrastés
(Hassink, 1997).

Il apparaît clairement que les conclusions concernant la rhizodéposition après de longues
durées d'enrichissement de l'atmosphère en CO2 sont spéculatives. En conditions naturelles,
aucun résultat ne présente les conséquences directes du CO2 élevé sur la rhizodéposition après
une longue période d'enrichissement du sol en CO2. De plus, les mécanismes régissant les
transferts de carbone vers le sol (sites d'exsudation, taille des racines) et le processus
rhizosphériques associés (taille et activité du compartiment microbien) restent encore à
préciser.

1.3. *Les communautés microbiennes*

Les racines étant la principale source de carbone supplémentaire entrant dans le sol, on peut supposer que les premiers effets du CO₂ sur les populations microbiennes auront lieu dans la rhizosphère. Les micro-organismes de la rhizosphère seront plus facilement affectés par les changements intervenant à ce niveau (Sadowsky et Schortemeyer, 1997) en comparaison avec les micro-organismes vivant plus éloignés des racines.

Les résultats des études examinant les réponses des micro-organismes au CO₂ sont controversées (O’Neill, 1994). De nombreuses études rapportent une augmentation de la biomasse microbienne sous CO₂ élevé (Berntson et Bazzas, 1997 ; Hungate et al., 1996). Cependant, dans d’autres cas, il n’apparaît pas de stimulation évidente de la croissance des communautés microbienne par le CO₂. Schortemeyer et al. (1996) observent que la taille des populations microbiennes dans la rhizosphère du ray grass ou du trèfle blanc restent inchangées sous CO₂ élevé. Dans une autre étude, Shortemeyer et al. (2000) rapportent que l’activité, la biomasse microbienne et le nombre de bactéries cultivables ne sont pas augmentés dans une prairie naturelle de Floride soumise à des teneurs élevées en CO₂. Dans une étude conduite sur une prairie naturelle du Jura Suisse, Niklaus (1998) montre que la biomasse et l’activité microbienne ne sont pas influencées par le CO₂ élevé après 3 années d’enrichissement.

Peu d'études sont disponibles sur la composition des communautés microbiennes en réponse à l'augmentation du CO₂ atmosphérique. Des effets sont prévisibles du fait de modifications dans la disponibilité en substrats pour les micro-organismes. Certains travaux signalent un changement dans la composition des communautés microbiennes sous CO₂ élevé (Schortemeyer et al., 1997 ; Marilley et Aragno, 1999 ; Montealegre et al., 2000 ; 2002). Cependant d'autres études ne présentent aucune altération de la composition des communautés microbienne sous CO₂ élevé (Zak et al., 2000).

Si l'activité et la composition des communautés microbiennes est modifiée sous atmosphère enrichie en CO₂, on peut s'attendre ainsi à des conséquences sur le temps de résidence des
composés organiques dans le sol et ainsi sur le stockage de carbone dans le sol des écosystèmes prairiaux (Montealegre et al., 2002). Des changements de la composition des communautés microbiennes peuvent être également causés par des différences dans la nature des composés libérés par les plantes dans le sol.

Les conséquences à long terme de l'élévation de la concentration en CO₂ de l'atmosphère montrées sur la plante n'ont pas été clairement évaluées sur la rhizodéposition. Quelques dispositifs de terrain en conditions agronomiques réalistes (dispositifs FACE) permettent de prévoir les conséquences à plus long terme de l'élévation des concentrations en CO₂ atmosphérique. Chez le ray grass, il apparaît, sur ce dispositif FACE, une acclimatation de l'activité photosynthétique des plantes sous CO₂ élevé, dépendante de la disponibilité en N minéral dans le sol. De plus, la concentration en carbone total des sols n'est pas stimulée sous CO₂ élevé malgré un accroissement de la biomasse végétale. La majorité des travaux font l'hypothèse d'un apport supplémentaire de carbone au sol sous atmosphère enrichie en CO₂. Il reste à préciser si la rhizodéposition peut contribuer à cet apport supplémentaire. Les processus rhizosphériques associés (activité des communautés microbiennes) pourrait expliquer un turnover plus rapide du carbone supplémentaire présent dans le sol. Cette hypothèse reste à démontrer.

## 2. La défoliation

### 2.1. La défoliation affecte la répartition du carbone dans la plante

Durant les quelques jours suivant la défoliation (jusqu'à 5 jours), la biomasse, l'élongation, la respiration racinaire et l'absorption des nutriments par la racine sont réduites (Davidson et Milthorpe, 1966 ; Richards, 1993 ; Mawdsley et Bardgett, 1997 ; Mackie-Dawson, 1999). Cependant certains auteurs n'observent pas de réduction de l'élongation de la racine comme Paterson et Sim (1999) chez *Lolium perenne*.

Pour assurer la reconstruction de ses parties aériennes et donc assurer sa pérennité, deux sources principales de carbone interviennent chez une plante défoliée. Il s'agit des photo-
assimilats produits après la défoliation (post-défoliation), mais également des réserves
accumulées durant la période pré-défoliation (Johansson, 1993). L'adaptation à la défoliation
de nombreuses espèces végétales réside dans leur capacité à mobiliser ces composés carbonés
et azotés non structuraux stockés dans leurs tissus et à orienter préférentiellement les flux
d'assimilats vers les tissus en construction. Certaines études montrent que la contribution des
réserves carbonées employées pour la reconstruction des parties aériennes dépasse celles des
assimilats récents durant les premiers jours suivant la défoliation (de Visser et al. 1997,
Morvan-Bertrand et al., 1999a). Après cette courte période, les assimilats récents deviennent
quantitativement les plus importants : ils continuent d'être préférentiellement alloués aux
méristèmes foliaires jusqu'à ce que la demande de ces derniers soit satisfaite et que les feuilles
émergeantes soient photosynthétiquement actives (Welker et al., 1985; Briske et Richards,
1995). Les flux de carbone vers les racines pré-existantes sont ensuite rétablis (Richards,
1993). Ce sont plus particulièrement les réserves présentes à la base des feuilles qui vont
contribuer à la reconstruction de la plante chez les graminées (Morvan-Bertrand et al. 1999a).
En effet, certaines études signalent que les réserves des racines ne contribuent pas de manière
significative à la reconstruction de la plante (Oesterheld et McNaughton, 1988).
L'accroissement de l'activité photosynthétique des nouvelles feuilles (Delting et al., 1979;
Richards et Caldwell, 1985) ainsi que l'augmentation de l'assimilation de nutriments
(Wallace et Macko, 1993) contribuent plus à la repousse que les réserves présentes au niveau
des racines.

## 2.2. La défoliation affecte les entrées de carbone dans le sol

En modifiant l'orientation des flux de carbone au sein de la plante, la défoliation affecte les transferts de carbone vers le sol. En effet de nombreuses études montrent que la fauche et le pâturage affectent significativement les entrées de carbone organique dans le sol. Cependant, trois points de vue s'opposent : des augmentations, des diminutions ou encore aucun effet observés suite à la défoliation.

### 2.2.1. Augmentation de la rhizodéposition suite à la défoliation

Des études en conditions contrôlées suggèrent que l'allocation de carbone aux racines des plantes est augmentée après défoliation. Logiquement, une augmentation de la libération de
carbone dans la rhizosphère est à prévoir. A l'aide d'un marquage court au ¹⁴C, Paterson et Sim (1999 ; 2000) montrent que le ray grass anglais (*Lolium perenne*) et la fétuque rouge (*Festuca rubra*) soumis à quatre défoliations successives, présentent une augmentation de la libération de ¹⁴C par leurs racines, quel que soit le niveau de la fertilisation azotée. Ce phénomène est immédiat et transitoire; il se produit immédiatement après chaque coupe pour décliner 3 à 5 jours plus tard et revenir au niveau du témoin non défolié. Avec la même technique, Holland *et al.*, (1996) étudient les effets à court terme de la défoliation des parties aériennes de plantules de maïs (*Zea mays*) par des sauterelles. Vingt-six heures après la défoliation, une augmentation de l'allocation des composés carbonés nouvellement formés vers les racines est observée (+35% en défoliation sévère). De plus, la respiration rhizosphérique (racinaire et microbienne) et l'exsudation de composés solubles augmentent, d'autant plus que la surface défoliée est importante (25 et 50%). Dans le même temps, les flux de carbone vers les parties aériennes diminuent (-10% en défoliation sévère). Ceci peu illustrer la stratégie d'allocation des ressources chez les plantes défoliées qui stockent leurs réserves dans des organes moins accessibles pour les herbivores (Dyer *et al.*, 1991).

D'autres études montrant des effets positifs sur le compartiment microbien après une défoliation, suggèrent que la défoliation augmente les flux d'exsudation racinaire. En effet, Mawdsley et Bardgett (1997), par des études en microcosmes, montrent que la défoliation du trèfle blanc (*Trifolium repens*) provoque l'augmentation de la biomasse microbienne et de son activité dès le deuxième jour après la défoliation.

### 2.2.2. Aucun effet de la défoliation sur la rhizodéposition

Todorovic *et al.* (1999) à l'aide d'un marquage court au ¹⁴C n'observent aucun effet à court terme de la défoliation du trèfle blanc (*Trifolium repens*) sur la libération par les racines de composés carbonés récemment assimilés. L'étude de la respiration rhizosphérique (racines et micro-organismes), réalisée 24h après la défoliation, indique qu'elle n'est pas significativement différente de celle du témoin non défolié quelle que soit l'intensité de la coupe (27 ou 51% de la surface foliaire). Cela suggère qu'aucune modification de l'exsudation ne se produit 24h après la défoliation. La fraction du carbone nouvellement assimilé allouée vers les racines et le sol reste inchangée quelle que soit l'intensité de la coupe, alors que celle dirigée vers les parties aériennes est augmentée au dépend des stolons chez la plante
sévèrement défoliée. Ceci s'explique par la présence de réserves importantes dans les stolons et les racines de trèfle blanc.

### 2.2.3. Diminution de la rhizodéposition

En étudiant l'activité des bactéries présentes dans le sol rhizosphérique de plantules de maïs (âgées de 2 semaines) une semaine après leur défoliation, Nguyen et Henry (2002) montrent que la défoliation réduit l'activité des micro-organismes présents, ce qui suggère une diminution de la rhizodéposition après la défoliation. De même, Crawford et al., (1997) en conditions naturelles et Johansson (1993) en conditions contrôlées montrent une diminution immédiate de la respiration rhizosphérique après la défoliation respectivement chez *Medicago trunculata* et chez *Festuca ovina*. Pour *M. truncatula*, après 8 jours, elle redevient comparable à celle du témoin non défolié, alors que pour *F. ovina* la diminution se maintient 7 jours pour ensuite augmenter progressivement.

Quant à Mikola et al., (2002), ils observent immédiatement après la défoliation de *Phleum pratense* une réduction de la libération par les racines de composés carbonés nouvellement assimilés. En revanche, la défoliation n'affecte plus ce processus une semaine après.

Les conséquences de la défoliation sur la physiologie de la plante sont clairement établis (Richards, 1993). Immédiatement après la défoliation, l'activité photosynthétique des plantes défoliées est stimulée afin de faciliter leur reconstruction. Les réserves de la plante sont également re-mobilisées afin d'aider à cette reconstruction, ce jusqu'à ce que l'activité photosynthétique redevienne suffisante et puisse assurer la croissance et le développement de la plante. Néanmoins, les résultats contradictoires concernant l'effet de la défoliation sur la libération de carbone par les racines, peuvent être expliqués par de nombreux facteurs. En effet, les conditions expérimentales (surtout microcosmes et hydroponie) ne sont pas réalistes, ni comparables d'une étude à l'autre. Les études portent sur des espèces différentes, chacune étant plus ou moins adaptées à la coupe. Les intensités et les fréquences de défoliation sont également variables d'un essai à l'autre. Aucune étude visant à déterminer l'impact de la défoliation sur les flux de C récent à la rhizosphère n'a été réalisée à ce jour en conditions de plein champ.
### 3. L'azote

L'azote est un des déterminants les plus importants de la croissance des plantes. Le taux de croissance relatif est étroitement corrélé à la teneur en azote des plantes (Ingestad, 1977). Pour la plupart des espèces végétales, l'azote minéral du sol (nitrate et ammonium) est la seule source d'azote (Marschner, 1995). La disponibilité en azote minéral du sol influence donc grandement le métabolisme des plantes, depuis la régulation de l'expression des gènes jusqu'à la production de biomasse (Marschner, 1995 ; Stitt, 1999).

#### 3.1. Répartition des assimilats et production de biomasse

De fortes concentrations en azote au niveau du sol engendrent généralement une augmentation du taux net de photosynthèse (Mohammad, 1997 ; Cecchin, 1998). Ainsi, la taille (Wullschleger et Oosterhuis 1990) et l'activité des sources (Lawlor et al., 1989) sont stimulées. Il s'en suit une augmentation de la production de biomasse végétale. Néanmoins, le ratio racine/parties aériennes est diminué. L'exploration du sol par le système racinaire est moins importante du fait que ces derniers ont à disposition dans leur environnement proche les nutriments nécessaires à la croissance de la plante. La concentration en azote dans la plante est accrue, entraînant un taux d'acides aminés et de protéines plus important. Chez les graminées, la fertilisation azotée stimule le tallage et augmente la surface foliaire. Parallèlement à l'accroissement de la taille et de l'activité source, la quantité et la taille des puits sont stimulées par la fertilisation azotée (Hageman et Below, 1990).

#### 3.2. Disponibilité en azote et rhizodéposition

En modifiant les relations sources-puits, la fertilisation azotée affecte les transferts de carbone de la plante vers le sol (synthèse de Nguyen, 2003). Du fait d'une stimulation de la croissance de la plante il semblerait légitime de s'attendre à une augmentation de la rhizodéposition sous l'effet d'un apport d'azote en relation avec l'augmentation de la taille de la plante (Henry, 2005). Néanmoins, les études de Hodge et al. (1996) montrent une diminution de la rhizodéposition azotée totale en présence d'une plus grande disponibilité en azote. A partir du même dispositif, Paterson et Sim (1999 ; 2000) mettent en évidence aucune différence significative dans les quantités brutes de carbone libérées par les racines entre deux
traitements azotés contrastés. Toutefois, dans tous les cas, une plus grande disponibilité en azote réduit la proportion de carbone libéré proportionnellement à la biomasse totale des plantes. En effet, malgré une stimulation de la production de biomasse et de la photosynthèse, la fertilisation diminue l'allocation de carbone récemment assimilé aux racines (-14% et -35% respectivement après un marquage continu et un marquage court au ¹⁴C; synthèse de Nguyen, 2003). Cependant, en considérant uniquement le bilan carboné des compartiments souterrains, les pourcentages de ¹⁴C alloués à la respiration rhizosphérique et aux résidus du sol augmentent de 25% et 82% respectivement lorsque le sol est fertilisé en azote. Ceci peut être expliqué par le fait que les micro-organismes de la rhizosphère sont en compétition avec la plante pour l'azote minéral (Kaye and Hart, 1997). Un apport d'azote stimule la croissance microbienne et, par conséquent, augmente le flux d'exsudation passive.

### 3.3. *Interactions carbone-azote*

La présence de carbone organique facilement assimilable par les micro-organismes dans la rhizosphère fournit l'énergie nécessaire à l'activité et à la croissance des micro-organismes hétérotrophes (Hodge et al., 2000). Ces derniers étant les acteurs majeurs de la transformation de l'azote (immobilisation/minéralisation) dans le sol, la dynamique de l'azote dans les sols est donc intimement liée à celle du carbone (Chen et al., 2003; Hodge et al., 2000, Kudeyarov, 1999; Mary et al., 1996). En effet, il est admis que la rhizodéposition stimule le cycle interne de l'azote qui comprend notamment la phase de minéralisation de l'azote organique (Hart et al., 1994). De nombreuses études montrent, par exemple, une stimulation de la nitrification dans la rhizosphère de plants d'orge (Klemedtsson et al., 1987). Ces travaux signalent également une minéralisation plus importante de l'azote provenant de la matière organique dans les sols plantés que dans les sols nus (Van der Krift et al., 2001). Cette minéralisation plus importante peut profiter à la plante en améliorant sa nutrition minérale. Ainsi la relation entre rhizodéposition et nutrition minérale pourrait permettre à la plante de compenser la perte d'énergie que constitue la rhizodéposition (Hale et Moore, 1979). Néanmoins, l'azote minéralisé peut être immobilisé dans la biomasse microbienne (Clarholm, 1985; Norton et Firestone, 1996). Ce n'est alors qu'à la mort des micro-organismes que l'azote devient disponible pour la plante (Griffiths et Robinson, 1992).

Les rhizodépôts agissent également sur le statut azoté du sol en modifiant son ratio C/N, plus particulièrement dans la rhizosphère. Ce rapport influence grandement le comportement des
micro-organismes hétérotrophes. Comme nous l'avons signalé ci dessus, le carbone constitue un des principaux facteurs limitant le fonctionnement et le développement des micro-organismes, alors que pour la plante le facteur limitant est l'azote (Kaye et Hart, 1997). Par conséquent, si le ratio C/N du sol est faible, le développement et le fonctionnement des micro-organismes sont limités par le carbone. Ces derniers utilisent alors l'azote organique du sol comme source d'énergie, le minéralisent et le rendent disponible pour la plante. En revanche, si le C/N du sol est élevé, l'azote devient limitant pour les micro-organismes. Ces derniers entrent alors en compétition avec la plante pour l'azote (Jones et Darrah, 1992). Par conséquent le ratio C/N des rhizodépôts joue un rôle clé dans la dynamique de l'azote dans le sol (Grayston et al., 1996). Ainsi tout facteur agissant sur la physiologie de la plante et modifiant ce ratio a des conséquences importantes sur la dynamique de l'azote dans le sol, d'où l'intérêt d'étudier la dynamique des transferts de carbone vers la rhizosphère en fonction de la disponibilité de l'azote dans les sols.

L'azote est un élément majeur pour la croissance de la plante et le fonctionnement du sol. La compétition entre micro-organismes et plantes dépend de la disponibilité en carbone et en azote dans le sol. La qualité des exsudats racinaires, en terme de ratio C/N, conditionne l'activité microbienne, cette dernière stimulant la rhizodéposition spécifique (par apex). C'est pourquoi lorsqu'une contrainte appliquée aux parties aériennes des plantes influence les transferts de carbone vers le sol, il est important de déterminer si la réponse à la contrainte dépend de la disponibilité en azote dans le sol. Il a été montré par exemple que cette disponibilité était le moteur de la réponse du ray grass aux concentrations élevées en CO₂ de l'atmosphère (Daepp et al., 2000). Pour la défoliation, peu de données sont disponibles concernant ses conséquences sur la disponibilité en carbone dans le sol en fonction du niveau d'azote du sol.
## B. OBJECTIFS DE LA THESE

La rhizosphère est une zone particulière du sol car elle constitue **une interface** par laquelle transitent des composés organiques libérés par les racines. Cet efflux, qui contribue aux transferts de C d'origine végétale vers le sol, est étroitement dépendant du fonctionnement de la plante. En effet, l'analyse bibliographique tend à montrer que les facteurs influençant les relations source-puits dans la plante affectent les transferts de C non seulement dans la plante mais également vers la rhizosphère.

Le **couplage entre l'écophysiologie de la plante et la rhizodéposition** est encore peu connu notamment dans des conditions *in situ* avec une approche intégrée, examinant le transfert de C récent dans le continuum atmosphère-plante-sol-micro-organismes. Or, ces compartiments interagissent, impliquant des mécanismes de rétro-actions complexes qui modulent le fonctionnement de la plante et donc, en conséquence, la libération de C par les racines.

Ainsi, une meilleure connaissance de cette libération de C (quantité, dynamique, facteurs de variations) dans des **conditions écologiques réalistes** contribue à mieux comprendre des processus majeurs du fonctionnement des sols tels que la dynamique des matières organiques, le recyclage des éléments minéraux et la structuration du sol.

Les graminées pérennes accumulent des réserves. Ces réserves sont remobilisées notamment lors de la repousse printanière. Par conséquent, le carbone circulant dans la plante provient non seulement des assimilats récents issus de la photosynthèse mais également de la remobilisation de ces réserves. Les mécanismes de mobilisation-remobilisation du carbone dans la plante et la part du carbone issu des réserves par rapport à celle du carbone récemment assimilé pour la repousse d'un organe par exemple sont maintenant bien connus, néanmoins aucun résultat ne s'intéresse à la contribution de ces deux sources de C à la rhizodéposition. C'est pourquoi, dans une première étape, nous chercherons à **définir la contribution du carbone récemment assimilé par la plante à la rhizodéposition**. En effet, toutes les études conduites jusqu'à présent ont fait l'hypothèse que la rhizodéposition est alimentée par les photo-assimilats récents transférés directement aux racines. Or, les organes végétaux pourraient contribuer significativement à cet efflux par la remobilisation des composés de réserve. Ce volet a été abordé dans le premier chapitre des résultats.

Outre le C circulant dans la plante c'est également le C transféré vers le sol qui est dépendant de l'environnement dans lequel évolue la plante. Ainsi, dans une seconde étape, notre
objectif est d'évaluer comment des contraintes subies par les parties aériennes de la plante modulent les flux de C récent vers la rhizosphère. Ces contraintes ont été choisies en raison de leurs conséquences connues sur les relations source-puits dans la plante et de leurs intérêts agronomiques et environnementaux : concentration en dioxyde de carbone, défoliation, disponibilité en azote dans le sol. Il reste en effet à déterminer *in situ* si ces contraintes modifient significativement les efflux de C récent vers le sol.

La figure 6 présente les compartiments clés de notre étude ainsi que nos objectifs.

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Figure 6 : Schéma conceptuel présentant les différents compartiments de notre étude. Les transferts du carbone récemment assimilé dans la plante et vers la rhizosphère sont étudiés. Nous caractériserons dans un premier temps la contribution du C récemment assimilé et du C des réserves à la rhizodéposition. Nous évaluerons ensuite les conséquences de l'élévation des concentrations en CO₂ atmosphérique sur la libération des photoassimilats récents dans la rhizosphère, ainsi que leur devenir dans le sol, mais également sur la rhizodéposition azotée. Enfin, nous étudierons les conséquences de la défoliation sur la disponibilité de C récent dans la rhizosphère et sur l'activité du compartiment microbien dépendant de cette disponibilité de C dans la rhizosphère.
# C. MATERIELS ET METHODES

Dans ce chapitre nous présenterons le matériel végétal utilisé ainsi que la majorité des techniques d'analyses utilisées pendant ma thèse. Seules quelques points spécifiques à chaque expérimentation seront introduits au début des chapitres concernés.

## I. Matériel végétal

La plante utilisée pour chacune des trois expérimentations est une graminée pérenne : le ray grass anglais (*Lolium perenne* L.). Cette plante est le modèle d'étude le plus courant des écosystèmes prairiaux tempérés. Elle est en effet largement distribuée tout autour du globe, de l'Amérique du Nord, l'Europe en passant par l'Australie. C'est une plante ayant un intérêt économique important du fait d'une croissance rapide, d'une bonne capacité d'adaptation à différents types de sol et en raison d'un bon rendement et d'une bonne qualité fourragère. De plus, du fait de son système racinaire majoritairement composé de racines adventives, il est également utilisé pour limiter l'érosion des sols (Hannaway *et al.*, 1999).

## II. Marquage des parties aériennes des plantes au ¹⁴CO₂ ou au ¹³CO₂

Pour les expérimentations décrites dans les chapitres D et E, des marquages des parties aériennes au ¹⁴CO₂ ou au ¹³CO₂ sont effectués. Dans le chapitre D il s'agit de deux marquages longs successifs (10j), le premier étant un marquage au ¹⁴CO₂, le second étant un marquage au ¹³CO₂. Dans le chapitre E, il s'agit d'un marquage court au ¹⁴CO₂ (1 à 2h). Néanmoins, dans tous les cas, les modalités de marquage restent les mêmes.

### 2.1. Séparation hermétique du compartiment souterrain

Avant le second marquage long (¹³CO₂) effectué lors de l'expérimentation décrite dans le chapitre D, ainsi qu'avant le marquage court (¹⁴CO₂) effectué dans l'expérimentation décrite dans le chapitre E, les parties aériennes des plantes sont isolées hermétiquement des racines. Deux couvercles sont fixés à chaque extrémité des pots de culture. L'étanchéité totale du dispositif est assurée par l'ajout de silicone liquide (RTV 585, Rhône Poulenc, France) coulé
dans un tube en plastique entourant le collet des plantes. L'absence de fuite est contrôlée lorsque le silicone a durci : le compartiment souterrain est immergé dans l'eau et balayé par un flux d'air.

Durant le marquage et la chasse, le compartiment souterrain est continuellement balayé par un flux d'air sans CO₂ en utilisant deux orifices du couvercle supérieur des pots de culture. Ces deux orifices sont connectés à des tuyaux reliés à une extrémité à une cartouche de chaux sodée, qui fixe le CO₂ de l'air en amont du pot, l'aval étant relié à une pompe péristaltique permettant le bullage de l'air dans 200ml de NaOH 1M (Warembourg et Billes, 1979 ; Todorovic *et al.*, 1999 ; photographie 1).

Les plants sont placés dans l'enceinte de marquage (photographie 2). Cette enceinte de marquage d'un volume totale de 1600 litres (en raison de volumes morts sous le plateau soutenant les plantes), est composée d'une chambre en altuglas (1m X 1m X 0,70m). L'intérieur de la chambre est régulé en lumière, en température et en hygrométrie. Ces données seront précisées lors du descriptif de chaque expérimentation. La chambre en altuglas est disposée dans une rigole contenant de l'eau à pH 5. L'eau assure un joint d'étanchéité qui isole l'atmosphère de l'enceinte. L'acidité de l'eau empêche la formation de carbonates qui pourraient piéger ainsi le CO₂ de l'enceinte de marquage.

Afin de mesurer l'évolution de l'activité spécifique de l'atmosphère de la chambre lors du marquage au ¹⁴CO₂, un analyseur de radioactivité β- en flux continu (A500TR, Packard instrument, Co. Inc, CT, USA) est couplé à un analyseur de gaz infrarouge (IRGA, ADC 225 MK3, Hoddesdon, UK) et un système informatique (Figure 7). L'ensemble du système permet de réguler très finement à la fois l'activité ¹⁴C et la concentration en CO₂ de la chambre de marquage.

En revanche pour le marquage ¹³CO₂, l'activité ¹³C ne peut être contrôlée pendant le marquage. Ce n'est qu'a posteriori que l'abondance isotopique en ¹³C (atom% ¹³C) de l'atmosphère de l'enceinte est contrôlée après analyse de la teneur en ¹³C de solution de soude 1M (100ml) ayant piégé une partie de l'air de la chambre (Annexe 2).
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 7: Dispositif de marquage des parties aériennes des plantes au ¹⁴CO₂, ¹³CO₂, c chaux sodée, dm : débit massique, f : filtre de 0,2µm, o : ordinateur, pp : pompe péristaltique ; pa : pompe aquarium ; pe : piège à eau.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Photographie 1 : Pièges à soude contenant 200ml de NaOH 1M permettant de mesurer la respiration rhizosphérique. Il y a un piège à soude par pot.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Photographie 2 : Enceinte de marquage contenant les plantes. Ici ce sont les 24 plantes utilisées pour l'expérimentation décrite dans le chapitre E.</figcaption></figure>
## 2.2. Déroulement du marquage : les étapes clés

La durée des marquages longs est fixée à 10 jours. Pour l'expérimentation décrite dans le chapitre D, nous considérons également le fait que l'on souhaite caractériser le carbone marqué « ancien » du carbone marqué « nouveau ». En revanche, la durée des marquages courts est fixée à 1h ou 1h30, en fonction de l'assimilation des plantes juste avant le marquage et 48h de chasse. L'activité spécifique de l'atmosphère en ¹⁴C ou en ¹³C sera précisée lors de la description de chaque expérimentation. Ces 48 heures permettent l'allocation du carbone récent dans tous les compartiments du système plante-sol. Ce temps de chasse est choisi en fonction de travaux antérieurs effectués au laboratoire (Todorovic, 2000 ; Henry, 2004).

### 2.2.1. Production de ¹⁴CO₂ et de ¹³CO₂ dans l'atmosphère

La première étape du marquage consiste à augmenter le plus rapidement possible l'activité spécifique de l'atmosphère de la chambre de marquage à la valeur souhaitée. Pour se faire, une quantité *ad hoc* de NaH¹⁴CO₃ ou de NaH¹³CO₃ est ajoutée dans un réacteur contenant de l'acide lactique 1M en excès (Figure 7).

Le dégagement de ¹⁴CO₂ ou de ¹³CO₂ est obtenu en ajoutant une solution de NaH¹⁴CO₃ ou de NaH¹³CO₃ dans un flacon (réacteur) contenant de l'acide lactique 1M. Le mélange est agité par un barreau aimanté tout au long du marquage.

Le réacteur est ensuite continuellement balayé par de l'air prélevé dans la chambre à l'aide d'une pompe aquarium. L'air enrichi en ¹⁴CO₂ ou en ¹³CO₂ est redirigé vers l'enceinte où il barbote dans de l'eau acidifiée, ce qui permet de contrôler en permanence la circulation d'air entre le réacteur et l'enceinte durant le marquage.

### 2.2.2. Maintien de l'activité spécifique dans la chambre

Les plantes assimilent le ¹⁴CO₂ ou le ¹³CO₂ présent dans la chambre de marquage par photosynthèse. Pour maintenir la concentration en CO₂ et l'activité spécifique constantes pendant toute la durée du marquage, une pompe péristaltique reliée au système informatique et au dispositif de contrôle gérant l'ensemble des régulations de l'enceinte, permet de délivrer
le ¹⁴CO₂ ou le ¹³CO₂ en fonction des besoins des plantes. En dehors de la période de marquage, la concentration en CO₂ est maintenue constante à l'aide de régulateurs de débit massique reliés au dispositif de contrôle (Figures 7, 8 & 9).

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Figure 8 : Activité spécifique de la chambre pendant le marquage (exemple d'un marquage court de 1h). A la fin du marquage, l'activité spécifique dans la chambre de marquage décroît rapidement grâce au fonctionnement d'une pompe forçant l'air de l'enceinte à traverser un piège à chaux sodée piégeant le ¹⁴CO₂ encore présent dans l'enceinte de marquage.

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

Figure 9 : Evolution de la concentration en CO₂ dans l'enceinte de marquage, avant, pendant le marquage et après le marquage. Grâce au système informatique, la concentration en CO₂ dans l'enceinte de marquage reste constante tout au long de l'expérience.
2.2.3. *Fin du marquage*

A la fin de chaque marquage, une pompe force l'air de l'enceinte à passer à travers un piège à CO₂ de chaux sodée de grande capacité. Ce piège permet d'éliminer le ¹⁴CO₂ présent dans l'enceinte à la fin du marquage. Parallèlement, pour les marquages courts au ¹⁴CO₂, grâce au dispositif de régulation, une bouteille injecte du ¹²CO₂ pour maintenir la concentration en CO₂ constante dans la chambre durant la période de chasse. Ainsi l'activité spécifique du ¹⁴C diminue sans variation de la concentration en CO₂ dans la chambre de marquage. Il est important de contrôler de manière précise la quantité de ¹⁴CO₂ offerte aux plantes pendant le marquage. Cela permet d'éviter un stress provoqué par des fluctuations de la photosynthèse qui aurait alors des conséquences sur les flux de carbone dans la plante et vers le sol. Après récolte, il est possible d'établir un bilan de ¹⁴C consommé en fonction de ce que les plantes ont assimilé et de ce que l'on retrouve dans les différents compartiments analysés.

### III. Marquage des parties aériennes des plantes au ¹⁵NH₃

Pour l'expérimentation décrite dans le chapitre E, un marquage des parties aériennes au ¹⁵N a été réalisé (Figure 10). Ce marquage consiste à faire assimiler aux feuilles du ¹⁵NH₃ (Janzen et Bruinsma, 1989 ; Janzen, 1989). Après avoir placé les plantes dans la chambre de marquage et contrôlé la concentration en CO₂ de l'atmosphère, le ¹⁵NH₃ gazeux est vaporisé dans l'atmosphère de la chambre de marquage pendant 15 minutes. Ce dernier est obtenu en ajoutant un excès de NaOH 1M à une solution de sulfate d'ammonium à 10% (excès isotopique de 10 atom%) d'azote 15 (¹⁵(NH₄)₂SO₄) à l'aide d'une seringue, dans un réacteur étanche. La quantité de ¹⁵(NH₄)₂SO₄ initialement présente dans le réacteur est définie de manière à obtenir une concentration finale de 200µL.L⁻¹ de NH₃ dans la chambre de marquage. Une pompe aquarium permet d'injecter le ¹⁵NH₃ dans la chambre de marquage. La concentration en NH₃ de 200µL.L⁻¹ a été choisi du fait qu'elle n'a aucune conséquence toxique sur la plante et qu'elle permet d'obtenir un enrichissement isotopique suffisant du végétal (Janzen et Bruinsma, 1989 ; Merbach *et al.*, 2000). A la fin du marquage court au ¹⁴CO₂, le ¹⁵NH₃ restant dans la chambre est piégé dans de l'acide chlorhydrique 1M. Durant cette période de marquage, la concentration en CO₂ dans l'enceinte est maintenue constante grâce au dispositif de régulation, par injection de ¹²CO₂ issu d'une bouteille située à
l'extérieur de la chambre de marquage. Immédiatement après le marquage ¹⁵N a lieu le marquage au carbone 14.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 10 : Dispositif de marquage des plantes au ¹⁵NH₃. Les plantes assimilent le ¹⁵N par leurs parties aériennes. dm : débitmètre massique, o : ordinateur, pp : pompe péristaltique ; pa : pompe aquarium ; pe : piège à eau. L'eau basique permet d'éviter le piégeage du ¹⁵NH₃ pendant le marquage.</figcaption></figure>

## IV. Récolte

Pour chacune des trois expérimentations, des cylindres de PVC sont utilisés comme pot de culture. Après chaque phase de culture, les plantes sont récoltées selon le même protocole quelle que soit l'expérimentation (Figure 11).

La plante est coupée au niveau du collet. Les feuilles sont séparées du reste de la talle.

Lors de la récolte, le cylindre de PVC est vidé de son sol. Ce sol est séparé en sol adhérent (SA) et en sol non adhérent (SNA) suivant un protocole standard décrit par Todorovic (2000).

Après avoir soigneusement secoué 10 fois le système racinaire, de manière à éliminer le sol faiblement adhérent aux racines, le système racinaire est délicatement brossé afin de récupérer le sol adhérent. Un tri méticuleux est effectué pour éliminer le maximum de fragments de racines dans chaque fraction de sol. Les racines sont ensuite lavées avec une solution
isotonique de CaCl₂ à 0,5M, éliminant le sol adhérent tout en évitant un choc osmotique qui fragiliserait les structures du système racinaire et provoquerait un efflux de carbone des tissus racinaires. Le sol adhérent et non adhérent récolté est ensuite homogénéisé et tamisé à 2mm.

Les échantillons de feuilles et de racines sont immédiatement congelés dans de l'azote liquide et stockés à -30°C. Les échantillons de sol sont stockés à 4°C. Une aliquote de sol adhérent et de sol non adhérent frais est rapidement prélevée afin d'analyser le carbone de la biomasse microbienne. Le reste de sol ainsi que les échantillons végétaux sont ensuite lyophilisés, pesés afin de déterminer la masse sèche et broyés jusqu'à l'obtention d'une poudre très fine afin de permettre les analyses de carbone, azote, ¹⁴C, ¹³C ou encore ¹⁵N.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 11 : Protocole de récolte des plantes après la période de culture.</figcaption></figure>
# V. Analyses

## 5.1 Analyses du C de la biomasse microbienne : technique d'extraction fumigation

### 5.1.1. Principe

Le carbone de la biomasse microbienne des sols adhérents et des sols non adhérents est analysé par la technique de fumigation extraction.

Cette technique repose sur la mesure du carbone organique microbien par différence entre le carbone soluble contenu dans un échantillon fumigé par du chloroforme et celui du même échantillon non fumigé (Vance *et al.*, 1987). En effet, les vapeurs de chloroforme, en détruisant les membranes des microorganismes présents dans l'échantillon de sol étudié, provoquent la libération de leur contenu cytoplasmique dans la fraction soluble du sol. La différence de teneurs en carbone soluble des échantillons exposés au chloroforme et des échantillons non exposés correspond au carbone de la biomasse microbienne. Un facteur de correction (Kec) caractéristique de la nature du sol est ensuite appliqué pour déterminer le carbone total de la biomasse microbienne.

Formule : $C_{BM} = (C_{échantillon exposé} - C_{échantillon non exposé}) / Kec$

Lors de l'ensemble de nos expérimentations, au vu du statut argileux des différents sols utilisés, un facteur Kec =0,45 est utilisé (Beck *et al.*, 1997). (Figure 12).

### 5.1.2. Pré-extraction

Cette étape permet d'éliminer tous les débris organiques (racines) et cailloux restants dans l'échantillon de sol susceptibles de tronquer le résultat de l'analyse du carbone total de la biomasse microbienne. Deux fois 10 g de sol frais (échantillon fumigé et échantillon non fumigé) pesés dans un pilulier en verre sont mélangés avec 40 ml de $K_2SO_4$ 0,05M puis agités 45 minutes à 40 tours min$^{-1}$. La suspension est filtrée afin d'éliminer toutes impuretés, grâce à un tamis de 500µm. La solution contenant le sol éliminé de tous débris est recueillie dans un
flacon. La suspension de sol est ensuite filtrée sur papier Whatman n°42 afin de ne récupérer
que le sol. C'est sur ce sol contenu dans le filtre que les étapes suivantes sont réalisées.

5.1.3. Fumigation des échantillons

Les filtres avec le sol destiné à être fumigé sont placés dans des piluliers en verre disposés
ensuite dans un incubateur contenant un peu d'eau dans sa partie inférieure afin de limiter le
dessèchement du sol au cours de la fumigation. Quelques gouttes de chloroforme sont
ajoutées à chaque échantillon fumigé. Un flacon contenant des billes de verre et 50 ml de
chloroforme sans éthanol ainsi qu'un flacon de chaux sodée permettant de piéger le CO2
éventuellement libéré sont placés dans l'incubateur. Ce dernier est ensuite hermétiquement
fermé grâce à de la graisse silicone. Le vide est ensuite fait dans l'incubateur jusqu'à ce que le
chloroforme soit porté à ébullition (-0,7 bar). L'incubateur est alors placé 24 h à 25°C à
l'obscurité.

Après incubation, l'incubateur est ouvert, le flacon de chloroforme retiré, puis afin d'éliminer
les vapeurs de chloroforme restantes, le vide est à nouveau effectué. Cette opération est
répétée six fois.

5.1.4. *Extraction des échantillons fumigés et des échantillons non fumigés*

Tout comme pour les échantillons de sols fumigés, les filtres contenant le sol non fumigé sont
placés dans un pilulier en verre. Ces échantillons fumigés et non fumigés d'un même sol sont
extraits avec 40ml de K2SO4 à 0,5M. Le K2SO4 permet de solubiliser le carbone. Les
échantillons sont agités grâce à un agitateur rotatif pendant 45 minutes à 40 tours min-1. Le
mélange est ensuite filtré sur papier Whatman n°42.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 12 : Représentation schématique de la pré extraction, fumigation extraction (Vance et al., 1987).</figcaption></figure>
## 5.2. Analyse du carbone total

### 5.2.1. Poudres des échantillons végétaux et de sol

Le C total est dosée par chromatographie en phase gazeuse par un auto analyseur carbone / azote (Flash EA 1112, Thermo Finnigan). Une aliquote de poudre végétale (≈ 5 mg) ou de sol (≈ 10mg) est pesée exactement dans une nacelle en étain. La nacelle subit une combustion à 1030°C sous un flux d'oxygène et d'hélium (débits de 220 ml min⁻¹ et 120 ml min⁻¹ respectivement). Les différents éléments résultant de la combustion seront séparés par chromatographie sur colonne en phase gazeuse et détectés par catharométrie. La concentration en carbone de l'échantillon est calculée à partir d'une calibration de l'appareil réalisée au préalable avec un étalon d'atropine. Cette molécule présente un rapport C/N voisin de celui du matériel végétal analysé.

### 5.2.2. Solutions

Le carbone organique et l'azote organique des solutions de K₂SO₄ issu des analyses du carbone de la biomasse microbienne ainsi que le carbone respiré par les compartiments souterrains piégés dans les pièges à soude sont quantifiés au COTmètre (Shimadzu TOC-VCSH). Le principe de fonctionnement de l'appareil consiste en une combustion de l'échantillon à 680°C effectuée en présence d'un catalyseur qui optimise la réaction d'oxydation de la matière organique en CO₂. La combustion à cette température offre l'avantage de pouvoir analyser des échantillons ayant des matrices complexes, comme les solutions chargées de sels. Un détecteur à infrarouge est employé pour mesurer le CO₂ produit par l'oxydation de l'échantillon. Combiné avec un catalyseur de combustion à grande capacité, ce détecteur permet une limite de détection de l'ordre de 10ppb de carbone total. L'azote organique est mesuré en chimiluminescence par l'analyseur azote TNM-1 (Shimadzu, Japan) couplé en ligne au COTmètre.
## 5.3. Analyse des concentrations en glucides totaux dans les tissus végétaux

L'analyse des concentrations en glucides totaux dans les tissus racinaires est effectuée selon le protocole établi par Dubois et al. (1956). Cette méthode permet l'analyse des glucides simples, oligosaccharides, polysaccharides et de leurs dérivés. Environ 40mg de poudre de racine sont ajoutés à 2ml d'éthanol à 80%. Cette étape correspond à l'extraction à l'éthanol de la fraction de carbone soluble, principalement constituée de glucides. Le mélange est porté à 80° dans un bain-marie pendant 15min et ensuite centrifugé 10 min à 10 000 rpm. L'opération de centrifugation est répétée 2 fois afin de récupérer un maximum de glucides dans la poudre de tissus racinaires. Le surnageant est récupérer et l'éthanol est évaporé pendant une nuit au « Speed Vac ». Après évaporation, de l'éthanol, les glucides totaux sont récupérés par dissolution dans l'eau distillée. Deux ml de la solution eau distillée + glucide sont prélevés et mélangés à 1ml de phénol à 5% et 5ml d'acide sulfurique concentré. Une réaction colorimétrique survient alors, la coloration étant proportionnelle à la concentration en glucides totaux dans la solution. Le tout est agité et mis à reposer 20min à 25-30°C. Après 20min, l'absorption du mélange est mesurée par spectrophotométrie à 490 nm. Parallèlement une gamme étalon est établie avec des solutions dont la concentration en glucides est connue. Au final la concentration en glucides est exprimée en moles de glucides par kilogrammes de racines en équivalent hexose.

## 5.4. Analyse du ¹⁴C

### 5.4.1. Echantillons végétaux

La radioactivité des organes végétaux est dosée par comptage en scintillation. Le flux de gaz dégagé par la combustion des échantillons pour l'analyse C/N passe à travers un détecteur β-en flux continu (A500TR, Packard instrument, Co. Inc, CT, USA) relié en série à la sortie de l'auto analyseur C/N (Benoit et al., 1994). L'activité en ¹⁴C est ainsi mesurée.

### 5.4.2. Echantillons de sol
Du fait de la faible activité ¹⁴C des échantillons de sol, l'analyse n'est pas possible avec le détecteur β en flux continu (A500TR, Packard instrument, Co. Inc, CT, USA). Des aliquotes de sol de 150 mg sont préparés dans des nacelles en cellulose contenant 100 mg de poudre de cellulose favorisant ainsi la combustion de l'échantillon. La combustion des nacelles s'effectue dans un auto oxidiser (Model 307, Packard, USA). Après combustion de l'échantillon, le gaz dégagé est piégé dans 5 ml de Carbo Sorb (Packard, USA) mélangé à 5ml de liquide scintillant Permafluor (Packard, USA). La radioactivité est ensuite comptée pendant 10 minutes grâce à un compteur à scintillation liquide (Tri-Carb 2100 Tr, Packard, USA).

### 5.4.3. Echantillons liquides

L'activité ¹⁴C des solutions de soude 1M utilisées pour piéger le ¹⁴CO₂ issu de la respiration rhizosphérique ainsi que des solutions de K₂SO₄ issues de l'extraction fumigation est mesurée pendant 10 min sur un aliquote de 1ml de solution mélangée à 10 ml de liquide scintillant : Ultima Gold (Packard, USA) pour le NaOH et Ultima Flo (Packard, USA) pour le K₂SO₄. Dans l'Ultima Gold les solutions de K₂SO₄ ont tendance à rapidement décanter, faussant ainsi les mesures d'émissions de rayonnement β. Il a par conséquent fallu tester d'autres liquides scintillants permettant de conserver le mélange liquide scintillant-K₂SO₄ homogène pendant le comptage. L'Ultima Flo s'est révélé être le mieux adapté (annexe 3).

### 5.4.4. Expression des résultats

Lors de chaque marquage, la quantité de carbone 14 consommée par les plantes est déterminée, ce qui nous renseigne sur l'assimilation de ces plantes pendant le marquage. La quantité totale de radioactivité retrouvée dans le système plante sol micro organismes correspond à la somme du carbone 14 retrouvée dans chacun des compartiments analysés. Ainsi, la différence entre la quantité de carbone 14 assimilé pendant le marquage et la quantité de carbone 14 retrouvée dans le système plante sol micro organismes après récolte est calculée. Elle permet de connaître la part de carbone perdue par respiration des parties aériennes de toutes les plantes présentes dans l'enceinte de marquage, pendant la période de chasse de 48 heures ayant suivi le marquage.
Après récolte, la proportion de radioactivité retrouvée dans chaque compartiment composant le système plante sol micro organismes est exprimée par la proportion d'activité totale retrouvée : % RTR. Il rend compte de la distribution relative du carbone 14 dans chaque compartiment, en fonction de sa taille et de son activité métabolique. Il traduit la force de puits d'un compartiment donné (Cralle et Heichel, 1985; Robin et al., 1987).

$$ \%RTR = \frac{\text{activité } ^{14}\text{C (Bq) d'un compartiment donné}}{\text{activité } ^{14}\text{C (Bq) du système plante-sol complet}} \times 100 $$

L'activité ¹⁴C du système plante-sol complet correspond à la somme des activités en Bq retrouvées dans les feuilles, les tiges, les racines, le volume de sol adhérent et de sol non adhérent du pot, la respiration rhizosphérique et finalement dans la biomasse microbienne du sol adhérent et du sol non adhérent.

## 5.5. Analyse du carbone 13 et de l'azote 15

Le statut radioactif ¹⁴C des échantillons doublement marqués ¹⁴C-¹³C ou ¹⁴C-¹⁵N n'a pas permis leur analyse en spectrométrie de masse dans un laboratoire à proximité acceptant les échantillons marqués. C'est pourquoi les échantillons ont été envoyés au laboratoire isotopes de l'Université de Davis en Californie aux USA qui accepte des échantillons radioactifs. La spectrométrie de masse permet de mesurer la concentration en C et N total ainsi que l'excès et l'abondance isotopique de carbone de masse 13 et d'azote de masse 15 pour chaque échantillon.

Le carbone 13 piégé dans les solutions de NaOH 1M utilisées pour les mesures de la respiration rhizosphérique et de l'abondance isotopique *a posteriori* de l'atmosphère du marquage au ¹³C sont déterminées par ajout d'un excès de SrCl au NaOH. Le précipité formé (SrCO₃) est ensuite récolté après filtration et séchage.

De la même manière, les abondances isotopiques en ¹³C (atom%) et en ¹⁵N (atom%) des échantillons de plantes et de sol sont déterminées.
Environ 10 mg de poudre végétale et 60 mg de poudre de sol sont pesés exactement dans des nacelles en étain. Pour les échantillons de soude, 2mg de précipité de $SrCO_3$ sont placés dans les nacelles en étain.

L'abondance A est le rapport en pourcentage de l'isotope donné à l'ensemble des isotopes du même élément (Avice, 1997).

L'abondance $A_N$ est directement donnée par le spectromètre de masse. Elle correspond pour l'azote à :

$$A_N = \frac{^{15}\text{N}}{^{14}\text{N} + ^{15}\text{N}} \times 100$$

Pour le carbone 13, le spectromètre de masse fourni des valeurs en unités delta ($\delta$) qui permettent de calculer le ratio $R = ^{13}\text{C} / ^{12}\text{C}$ de l'échantillon :

$$R = (( \frac{\delta^{13}\text{C échantillon}}{1000} ) + 1) \times 0,0112372$$

Avec $R_{PDB} = ^{13}\text{C} / ^{12}\text{C} = 0,0112372$, valeur internationale de l'abondance $^{13}\text{C}$ de la bélemnite de Pee Dee (PDB) correspondant à $0 \delta (0\text{‰})$.

Dès lors, l'abondance (Ac) en $^{13}\text{C}$ de l'échantillon est calculé de la façon suivante :

$$A\% = ( \frac{R \text{ échantillon}}{R \text{ échantillon} + 1} ) \times 100$$

L'excès isotopique E est la différence entre l'abondance isotopique d'un échantillon et celle d'une référence. Des échantillons non marqués en carbone 13 et en azote 15 de chaque composé sont analysés afin de déterminer l'abondance naturelle. Ils sont analysés en spectrométrie de masse afin de déterminer l'abondance naturelle en $^{13}\text{C}$ et en $^{15}\text{N}$ ($A\%_{AN}$). Par conséquent,

$$E_C(\%) = A_C(\%) - A\%_{AN}$$

$$E_N(\%) = A_N(\%) - A\%_{AN}$$

Pour le carbone 13, nos dosages, réalisés sur des échantillons non marqués ayant subit le même traitement que les échantillons marqués, montrent que $A\%_{AN} = 1,106923$ dans les échantillons végétaux, $A\%_{AN} = 1,084038$ dans les échantillons de sol et $A\%_{AN} = 1,084016$
dans les échantillons de SrCO$_3$ issus des pièges à soude. Pour l'azote 15, A%AN = 0,3663 dans les échantillons végétaux (Avice, 1997) et A%AN = 0,3708 dans les échantillons de sol (Hogh-Jensen et Schjoerring, 2001).
D. CONTRIBUTION DU CARBONE NOUVELLEMENT ASSIMILE A
LA RHIZODEPOSITION

Les graminées pérennes accumulent des réserves (fructanes notamment) à la base des talles et
dans les racines (Morvan-Bertrand et al., 1999 a, b). Ces réserves sont remobilisées lors de la
repousse printanière, après chaque coupe et contribuent également lors de la nuit à
l'alimentation en C des puits. Par conséquent, le carbone circulant dans la plante provient non
seulement des assimilats récents issus de la photosynthèse mais également de la
remobilisation de ces réserves. Les mécanismes de mobilisation-remobilisation du carbone
dans la plante et la part du carbone issu des réserves par rapport à celle du carbone récemment
assimilé pour la repousse d'un organe par exemple sont maintenant bien connus, en raison de
nombreux travaux d'écophysiologie de la plante entière sur ce thème (Morvan-Bertrand et al.,
1999 a, b ; Johansson, 1993).

En revanche, on ignore encore largement quelle est la contribution du carbone issu de la
remobilisation des réserves dans les transferts de carbone à la rhizosphère. Les études visant à
quantifier la rhizodéposition s'intéressent au C récent et ignorent le C des réserves ou font
l'hypothèse qu'il ne contribue pas significativement à l'efflux de C à la rhizosphère. Le
carbone récemment assimilé par la plante constitue une part importante, mais certainement
pas exclusive du carbone rhizodéposé (Meharg et Kilham, 1988). En déterminant les
variations nycthémérales de la respiration rhizosphérique, Todorovic (2000) suggère que le C
remobilisé à partir de l'amidon des feuilles contribue significativement à la rhizodéposition du
maïs. Les études menées jusqu'à présent sur la rhizodéposition dans l'équipe « rhizosphère »
se sont intéressées au carbone récent (par marquages courts au ¹⁴C) ou au carbone sans
distinction de son origine (C récent et/ou remobilisé). Il est souvent fait l'hypothèse que les
flux de rhizodéposition sont composés majoritairement de C récemment assimilé par les
feuilles, transporté aux racines et libéré de manière passive dans le sol. L'allocation des
photoassimilats récents se fait majoritairement vers les jeunes axes racinaires (Matthew et
Kemball, 1997). Ainsi on peut supposer que le carbone libéré au niveau des axes racinaires
plus anciens correspond à du carbone plus anciennement assimilé par la plante. D'autre part il
a été montré que la nature biochimique des exsudats était différente en fonction de leur
origine le long du système racinaire (Jaeger et al., 1999). La nature biochimique des
rhizodépôts étant un facteur de structuration des micro-organismes rhizosphériques, le
fonctionnement de la rhizosphère s'en trouve ainsi influencé ce qui a pour conséquence
possible une rétro-action sur la croissance et le développement de la plante. Pour cette raison,
il est important de connaître la contribution à la rhizodéposition du carbone "ancien" et du
carbone "récent".

L'objectif de cette étude est d'évaluer l'importance de la contribution des assimilats récents à la rhizodéposition du ray grass cultivé sur du sol.

Pour cela, deux approches expérimentales ont été envisagées. La première repose sur
l'utilisation de 2 sources de CO₂ ayant des abondances en ¹³C différentes (δ¹³C= +200‰ et
δ¹³C= -45‰) permettant de réaliser un double marquage long des plantes et suffisamment
discriminant pour pouvoir quantifier la contribution de la plante au carbone présent dans la
rhizosphère. Il est impératif de choisir un sol présentant un historique de culture de plante de
type C4, c'est à dire avec un δ¹³C de sa matière organique avoisinant -12‰. Après les 2
marquages, en fonction de la signature isotopique d'un compartiment donné, on peut
quantifier le carbone présent dans un compartiment donné préférentiellement composé de
carbone issu du premier marquage ou de carbone issu du second marquage. Or, dans notre cas
(ray grass cultivé sur sol), la signature isotopique du sol influence fortement celle des
compartiments analysés et notamment au niveau de la rhizosphère (le C issu de la plante vient
se « diluer » dans une masse importante de C de la matière organique du sol). Les calculs que
nous avons effectués montrent que la discrimination n'est pas suffisante pour quantifier le
processus dans le pas de temps imparti pour l'étude de la rhizodéposition (annexe 4). La
deuxième approche consiste à enrichir les plantes en deux isotopes différents du carbone, par
exemple ¹⁴C puis ¹³C successivement, pour marquer de manière différente le carbone ancien
et le C récent (Schnyder, 1992 ; Deléens et al., 1994 ; Gebbing et al., 1999). Nous avons opté
pour cette approche. Les contraintes étaient de pouvoir réaliser deux marquages longs
consécutifs et de pouvoir analyser au spectromètre de masse l'abondance isotopique en ¹³C
d'échantillons radioactifs (marqués au ¹⁴C). Ceci a été possible en envoyant les échantillons à
analyser au laboratoire Isotopes de l'Université de Davis en Californie (USA).

Ainsi, un premier marquage long des plantes au ¹⁴CO₂ permet de tracer le carbone ancien, puis un second marquage long au ¹³CO₂ permet de tracer le carbone plus récemment assimilé par la plante. Ainsi, dès le début du second marquage long, on peut : i) déterminer l'origine du carbone libéré par les racines (¹⁴C ou ¹³C), ii) établir une cinétique de libération du carbone dans le sol iii) quantifier la contribution des 2 isotopes au flux de respiration rhizosphérique.
# I. Matériel et méthodes

## 1.1. Conditions de culture

### 1.1.1. Le sol

Le sol a été collecté sur un dispositif expérimental de terrain installé au domaine du Lycée agricole du Rheu en Bretagne (35) sur lequel l'équipe avait une expérimentation en cours (Action "Porcherie Verte"). Ce sol, composé de 18% d'argile, 23% de limon fin, 42% de limon grossier, 10% de sable fin et 7% de sable grossier, permet de collecter facilement les racines et de séparer le sol adhérent du reste du sol. Le pH de ce sol est de 6,4.

### 1.1.2. Les plantes

Des graines de ray grass (Lolium perenne) c.v. Canasta sont mises à germer sur papier filtre humide dans des boîtes de Pétri. Quatre jours plus tard, les plantules sont repiquées dans des tubes en PVC de 10 cm de hauteur et 6 cm de diamètre, rempli de sol à une densité de 1,3 kg.L⁻¹ (soit 308 g de sol sec). Quarante huit tubes sont mis en culture. Afin d'assurer la reprise d'au moins une plantule, 3 plantules sont repiquées par pot. Une fois la reprise d'au moins une plantule assurée, les deux autres sont éliminées.

## 1.2. Dispositif expérimental

### 1.2.1. Dispositifs de culture

Chaque dispositif est constitué de 2 compartiments. Un premier compartiment dit "compartiment racines" est le tube en PVC dans lequel les plantes ont été mises à germer. Un couvercle en PVC (percé en son milieu pour permettre le passage de la plante) est soudé à la partie supérieure. Ainsi, l'atmosphère du compartiment "racines" peut être isolée hermétiquement de l'atmosphère des parties aériennes afin de balayer ce compartiment par un flux d'air pour les mesures de la respiration rhizosphérique lors des marquages. Un second compartiment en PVC dit "compartiment rhizosphère" (5cm de hauteur, 6cm de diamètre, rempli exactement de 154 g de sol sec, à même densité que le précédent) est emboîté dans la
partie inférieure du compartiment racine à l'aide d'un collier (Figure 13). Une toile en nylon (Nytrel TI 45, Sefar Fyltis, France) d'une maille de 1µm, permet de maintenir les échanges gazeux, et de solution de sol tout en empêchant les racines et les hyphes mycéliens des mycorhizes d'explorer le compartiment 'rhizosphère'. Les deux compartiments sont ensuite scellés avec du mastic souple (Térostat, ruban de Normandie) (Figure 13). Le système racinaire de la plante repiquée dans le compartiment "racines" forme un tapis racinaire au contact de la toile et influence, de part la libération de composés organiques et de modifications physico-chimiques et biologiques, une zone de sol dans la partie supérieure du compartiment rhizosphère. Cette zone en contact, au travers de la toile de nylon, avec les racines de la plante sera définie arbitrairement comme du sol rhizosphérique sur une épaisseur de 5mm.

A la récolte, tout le sol du compartiment racine sera considéré comme du sol adhérent aux racines du fait de la colonisation importante de ce compartiment par le système racinaire.

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

Figure 13 : Schéma d'un dispositif de culture, constitué de deux compartiments en PVC s'emboîtant l'un dans l'autre grâce à un collier en PVC de plus gros diamètre. Ces 2 compartiments sont séparés par une toile de nylon de maille 1µm n'autorisant pas les racines à pénétrer dans le compartiment inférieur mais permettant la diffusion des composés organiques libérés par les racines. La partie supérieure est définie comme étant le compartiment « racine », la partie inférieure comme le compartiment « rhizosphère ».
1.2.2. Culture des plantes

Après avoir été repiquées, les plantes sont cultivées pendant 28 jours en phytotron (Photographie 3). Les conditions environnementales de culture sont les suivantes : 14h de photopériode, 22°C et une intensité lumineuse de 360µmol.m⁻².sec⁻¹. Deux jours après le repiquage, l'humidité de chaque compartiment est ajustée à 60% de la capacité au champ avec une solution nutritive N, P, K de Hoagland (équivalent à 270 kg N.ha⁻¹, 95 kg P.ha⁻¹ et 172 kg K.ha⁻¹ sous forme de Na₂HPO₄, KNO₃, Ca(NO₃)₂). Les plantes sont ensuite arrosées régulièrement avec de l'eau distillée de manière à maintenir l'humidité du sol constante (60% de la capacité au champ (Annexe 5).

Après 28 jours de culture en phytotron, la formation d'un tapis de racines sur la toile de nylon du compartiment « racines » est vérifiée (Photographie 4). Quatorze plantes, présentant le même niveau de développement, sont alors sélectionnées et transférées dans la chambre de marquage. Les conditions climatiques dans la chambre de marquage sont fixées et régulées de manière identique à celles dans le phytotron de croissance. La pression partielle en CO₂ dans la chambre est régulée à 36Pa pCO₂ par un analyseur infra-rouge (ADC 225 MKIII) couplé à un régulateur de débit massique.

1.3. Marquage long des parties aériennes au ¹⁴C et au ¹³C et récolte

Les modalités de marquage sont décrites dans le chapitre 'Matériels et Méthodes'. La figure 14 décrit les différentes étapes de l'expérimentation.

Deux marquages longs consécutifs (le premier au ¹⁴C, le second au ¹³C), chacun d'une durée de 10 jours, sont effectués. Après avoir mesuré l'assimilation nette de CO₂ des plantes lors de leur mise en place dans l'enceinte de marquage, l'activité spécifique ¹⁴C de l'atmosphère est ajustée à 4 KBq mg C⁻¹. Pour le ¹³C, l'excès isotopique en ¹³C est fixé à 5% (5 atom % ¹³C en excès).

L'ensemble des paramètres de marquage est régulé pendant la photopériode. Pour permettre l'arrosage des plantes à 60% de la capacité au champ, l'enceinte est ouverte tous les deux jours en fin de nuit après la purge du ¹⁴CO₂ ou du ¹³CO₂ présent dans l'enceinte sur un piège à chaux sodée. Une fois l'arrosage effectué, l'enceinte est refermée et le marquage est de nouveau mis en place selon le protocole décrit en 'Matériels et Méthodes'. Lors des 4 premiers
jours de marquages au ¹³C, la chambre est purgée à la fin de chaque nuit afin d'éviter une ré-assimilation par les feuilles du ¹⁴C susceptible d'avoir été respiré par les plantes.

Après les 10 jours de marquage au ¹⁴C, 7 plantes sont récoltées afin de déterminer la répartition du ¹⁴C. Les 5 premiers mm de sol au contact des racines de chaque compartiment 'rhizosphère' sont séparés du reste du sol.

Pour chaque plante restante, le compartiment "rhizosphère" est remplacé par un compartiment "rhizosphère" issu d'un dispositif similaire avec une plante cultivée en phytotron et conduite de la même manière que celle dans l'enceinte de marquage.

La substitution, à des intervalles de temps réguliers (3, 6, 8 et 10 jours après le début du marquage au ¹³C), des compartiments « rhizosphère » et des pièges à soude (NaOH 1M) permet d'estimer la proportion ¹⁴C / ¹³C libéré par le tapis racinaire retrouvée dans les 5 premiers mm de sol du compartiment « rhizosphère », ainsi que les quantités d'isotopes et la proportion ¹⁴C / ¹³C retrouvée dans la respiration rhizosphérique. Ainsi, une cinétique d'allocation de C marqué à la rhizosphère ainsi qu'une cinétique de la respiration rhizosphérique peuvent être établies.

A la fin du second marquage, les 7 plantes sont récoltées.

Le carbone de la biomasse microbienne du compartiment racine et du compartiment rhizosphère est mesuré. Dans le compartiment rhizosphère les 5 premiers mm de sol sont échantillonnés séparément du reste du compartiment, permettant de détecter un éventuel « effet rhizosphère » induit par le tapis racinaire au travers la toile de nylon.

## 1.4. Expression des résultats

Afin de quantifier les isotopes ¹³C et ¹⁴C provenant du premier marquage et du second marquage, des unités comparables et quantitatives pour le ¹⁴C et pour le ¹³C doivent être utilisées. Les activités en ¹⁴C exprimées en KBq et les excès isotopiques en ¹³C exprimées en atom % sont converties en mg de ¹⁴C et de ¹³C (Johansson, 1993 ; Crawford *et al.*, 2000).

Ainsi pour le ¹⁴C, les quantités de ¹⁴C dans chaque compartiment sont calculées en faisant le rapport entre l'activité en ¹⁴C en KBq et l'activité spécifique (AS) de l'atmosphère pendant le marquage (fixée à 4KBq mg C⁻¹).

$$^{14}\text{C (mg)} = \frac{^{14}\text{C (KBq)}}{\text{AS atmosphère (KBq.mgC}^{-1})}$$
L'abondance naturelle en ¹³C du sol et des plantes est mesurée sur une série de plante non marquées cultivées en phytotron dans les mêmes conditions que les plantes marquées. Ainsi, les excès isotopiques ¹³C peuvent être calculés.

Les quantités en ¹³C dans chaque compartiment sont calculées en faisant le rapport entre la quantité de ¹³C dans un compartiment et l'excès isotopique de l'atmosphère pendant le marquage (5 atom % en excès).

$$^{13}\text{C (mg)} = \frac{(\text{Atom } \%^{13}\text{C en excès d'un compartiment donné}) \times (\text{masse totale de C du compartiment (mg)})}{\text{Atom } \%^{13}\text{C en excès de l'atmosphère}}$$

Les données de répartition du carbone 13 dans le système plante-sol sont exprimées en % de la masse totale de carbone 13 retrouvée dans le système.

$$\% \text{T } ^{13}\text{C retrouvé} = \frac{\text{Masse de } ^{13}\text{C dans un compartiment donné en mg}}{\text{Masse totale de } ^{13}\text{C dans le système en mg}} \times 100$$

## 1.5. Analyses statistiques

Les données sont analysées suivant un modèle en randomisation totale, avec six répétitions. Des analyses de variances sont effectuées grâce au logiciel JMP IN®, SAS institute. Les différences sont considérées comme significatives à 5%. Sur les figures, les barres verticales correspondent à 2 intervalles de confiance de la moyenne.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Photographie 3 : Plantes cultivées pendant 28 jours en phytotron et placées dans l'enceinte de marquage.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Photographie 4 : Le pot a été retourné et la toile de nylon découpée afin d'observer le tapis de racine formé sur la toile de nylon à l'interface entre le compartiment racine et le compartiment rhizosphère.</figcaption></figure>
## II. Résultats

### 2.1. Production de biomasse

Entre la fin du premier marquage ($^{14}$C) et la fin du second marquage ($^{13}$C), la production de biomasse totale des plantes augmente de 244% (P<0,001, Figure 15, Tableau 3). La répartition de biomasse entre les parties aériennes et les racines (ratio PR/PA) reste la même entre les deux dates de récolte (P=0,167).

<table><thead><tr><th>Statistiques</th><th>valeur de F</th><th>Proba</th></tr></thead><tbody><tr><td>Parties aériennes</td><td>109</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>Racines</td><td>26</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>Totale</td><td>99</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>PR/PA</td><td>2,41</td><td>&gt;0,05</td></tr></tbody></table>

Tableau 3: Analyses statistiques de la production de biomasse (parties aériennes, racines et totale) et du ratio de biomasse PR/PA des plantes récoltées à la fin du premier ($^{14}$C) et à la fin du second marquage ($^{13}$C). Seuil de significativité 5%; n=7.

### 2.2. Répartition du carbone dans la plante et dans le sol

#### 2.2.1. Répartition du carbone à la fin de chaque marquage : $^{14}$C lors du premier marquage et $^{13}$C lors du second marquage

La répartition du carbone dans les plantes reste la même aussi bien après le premier marquage qu'après le second marquage (P=0,339 et P=0,505 respectivement pour les parties aériennes et les racines). De même, globalement, l'allocation de carbone au sol (sol du compartiment racine + sol du compartiment rhizosphère + respiration rhizosphérique) est comparable entre les deux dates de récoltes (P=0,354); (Figure 16, Tableau 4).

<table><thead><tr><th>Statistiques</th><th>valeur de F</th><th>Proba</th></tr></thead><tbody><tr><td>Parties aériennes</td><td>1,00</td><td>0,339</td></tr><tr><td>Racines</td><td>0,47</td><td>0,505</td></tr><tr><td>Sol</td><td>0,94</td><td>0,354</td></tr></tbody></table>

Tableau 4: Analyses statistiques de la répartition du $^{14}$C à la fin du premier marquage et du $^{13}$C à la fin du second marquage dans les parties aériennes, les racines de la plante et le sol (sol adhérent des compartiments racines et rhizosphères, le sol non adhérent du compartiment rhizosphère et la respiration rhizosphérique). Seuil de significativité 5%; n=7.
### 2.2.2. Répartition du carbone 13 et du carbone 14 à la fin du second marquage

A la fin du second marquage ($^{13}$C), une proportion plus importante de carbone 13 que de carbone 14 est retrouvée dans les parties aériennes (P=0,004). En revanche, proportionnellement moins de carbone 13 que de carbone 14 est alloué aux racines (P=0,009) et au sol (P=0,004) (Figure 16 et Tableau 5).

<table><caption>Tableau 5: Analyses statistiques de la répartition du $^{14}$C et du $^{13}$C à la fin du second marquage dans les parties aériennes, les racines de la plante et le sol (sol adhérent des compartiments racines et rhizosphères, le sol non adhérent du compartiment rhizosphère et la respiration rhizosphérique) Seuil de significativité 5%; n=7.</caption><thead><tr><td>Statistiques</td><td>valeur de F</td><td>Proba</td></tr></thead><tbody><tr><td>Parties aériennes</td><td>14,00</td><td>0,004</td></tr><tr><td>Racines</td><td>10,25</td><td>0,009</td></tr><tr><td>Sol</td><td>13,16</td><td>0,004</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 15: Production de biomasse (Parties aériennes PA, racines, biomasse totale exprimées en g. plante$^{-1}$) des plantes récoltées à la fin du premier (récolte 1, $^{14}$C) et à la fin du second marquage (récolte 2, $^{13}$C).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Figure 16 : Répartition du ¹⁴C à la fin du premier marquage ainsi que du ¹³C et du ¹⁴C à la fin du second marquage dans la plante et le sol. Les résultats sont exprimés en % total retrouvé.

## 2.3. Contribution des deux sources de carbone à la rhizodéposition

Le prélèvement régulier des compartiments "rhizosphère" pendant le second marquage permet d'établir une cinétique de libération du carbone dans le sol adhérent. Jusqu'au prélèvement effectué 6 jours après le début du marquage ¹³C, plus de composés organiques-¹⁴C que ¹³C sont libérés dans le sol (P<0,001). Trois jours après le début du marquage au ¹³C, le carbone marqué présent dans le compartiment rhizosphère est composé de 9 % de ¹³C et de 91 % de ¹⁴C. A 6 jours, on retrouve 40 % de ¹³C et 60 % de ¹⁴C. Au delà du 6ème jour de marquage, la quantité de ¹³C libérée par les racines devient plus importante que la quantité de ¹⁴C (P=0,003 à 8 jours). Lors du dernier prélèvement, soit 10 jours après le début du marquage ¹³C, 94 % du carbone marqué présent dans le sol adhérent du pot inférieur est du carbone 13, les 6 % restants étant du carbone 14 (P<0,001) (Figure 17 et Tableau 6).

Le remplacement régulier des pièges à soude au cours du second marquage (au ¹³C) permet de quantifier la part de ¹⁴C et ¹³C retrouvé dans la respiration rhizosphérique, la respiration rhizosphérique incluse une fraction du C rhizodéposé (Figure 18 et Tableau 7). Jusqu'au 6ème jour après le début du marquage ¹³C, les quantités de ¹⁴C retrouvées dans la respiration rhizosphérique dépassent celles du ¹³C (P<0,001 à 3 jours et P=0,035 à 6 jours). Trois jours
après le début du marquage au ¹³C, la respiration rhizosphérique est composée pour 86% de ¹⁴C et 13% de ¹³C. A six jours, les proportions passent à 60 % de ¹⁴C et 40% de ¹³C. En revanche, 8 jours après le début du marquage, plus de ¹³C que de ¹⁴C est retrouvé dans la respiration rhizosphérique (P=0,011). A la fin du marquage, soit 10 jours après le début du marquage, la respiration rhizosphérique est composée à 81% par du ¹³C et à 19 % par du ¹⁴C.

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

<table><thead><tr><td>Statistiques</td><td>Valeur de F</td><td>Proba</td></tr></thead><tbody><tr><td>3 Jours</td><td>54</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>6 Jours</td><td>3,23</td><td>0,102</td></tr><tr><td>8 Jours</td><td>14</td><td>0,003</td></tr><tr><td>10 Jours</td><td>41</td><td>&lt;0,001</td></tr></tbody></table>

Figure 17 et Tableau 6: La figure représente la cinétique de libération du ¹⁴C et du ¹³C dans le sol adhérent du compartiment rhizosphère (exprimé en µg de C marqué par g de sol adhérent) à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance. Le tableau présente les valeurs statistiques issues de la comparaison des masses de ¹⁴C et de ¹³C libérées par les racines à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les différences sont significatives à 5 %. n=7.

<table><thead><tr><td>Statistiques</td><td>Valeur de F</td><td>Proba</td></tr></thead><tbody><tr><td>3 Jours</td><td>28</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>6 Jours</td><td>6,2</td><td>0,031</td></tr><tr><td>8 Jours</td><td>40</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>10 Jours</td><td>7,5</td><td>0,02</td></tr></tbody></table>

Figure 18 et Tableau 7: La figure représente la cinétique de l'allocation du ¹⁴C et du ¹³C à la respiration rhizosphérique (exprimé en µg de C marqué par g de sol adhérent) à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les barres verticales représentent les intervalles de confiance. Le tableau présente les valeurs statistiques issues de la comparaison des masses de ¹⁴C et de ¹³C allouées à la respiration rhizosphérique à J3, J6, J8 et J10 après le début du marquage au ¹³C. Les différences sont significatives à 5 %. n=7.
## 2.4. Biomasse microbienne

La biomasse microbienne des 5 premiers mm de sol du compartiment rhizosphère n'est pas significativement différente des 45 mm de sol suivant pendant les 3 premiers jours du marquage au carbone 13. Dès le 6ᵉ jour, un effet rhizosphère significatif est mis en évidence (P=0,011 ; P<0,001 et P< 0,001 respectivement après 6, 8 et 10 jours). La biomasse microbienne est plus importante dans les 5 premiers mm de sol du compartiment rhizosphère que dans les 45 mm suivants (Tableau 8). La biomasse microbienne du sol du compartiment racine n'est pas significativement différente de celle des 5 premiers mm de sol des compartiments rhizosphère prélevés 6, 8 et 10 jours après le début du marquage au ¹³C (P>0,5 ; 142 mg C. kg⁻¹). Lors des 3 premiers jours de marquage, la biomasse microbienne est significativement plus importante dans le compartiment racine que dans le compartiment rhizosphère.

<table><thead><tr><th rowspan="2">Jour de prélèvement du compartiment rhizosphère</th><th colspan="2">C microbien du compartiment rhizosphère (mg C. kg⁻¹)</th><th colspan="2">Effet rhizosphère</th></tr><tr><th>SA</th><th>SNA</th><th>Valeur de F</th><th>Proba</th></tr></thead><tbody><tr><td>0</td><td>44,5 (9,26)</td><td>50,6 (18,6)</td><td>0,35</td><td>0,568</td></tr><tr><td>3</td><td>86,8 (22,6)</td><td>74,9 (23,1)</td><td>0,25</td><td>0,627</td></tr><tr><td>6</td><td>96,8 (19,7)</td><td>64,4 (12,9)</td><td>9,03</td><td>0,011</td></tr><tr><td>8</td><td>175 (43,1)</td><td>95,6 (14,8)</td><td>17,1</td><td>&lt;0,001</td></tr><tr><td>10</td><td>160 (19,3)</td><td>83,1 (15,4)</td><td>30,5</td><td>&lt;0,001</td></tr></tbody></table>

Tableau 8 : Carbone microbien du sol adhérent (SA, 5 premiers mm de sol) et du sol non adhérent (SNA, 45mm de sol suivant) dans le compartiment rhizosphère 0, 3, 6, 8, 10 jours après le début du marquage au ¹³C. La différence significative de biomasse entre SA et SNA correspond à l'effet rhizosphère. Il est significatif au seuil de 5% (n=7).
### III. Discussion

La plupart des études visant à quantifier les flux de carbone vers la rhizosphère s'intéressent à la répartition du carbone récemment assimilé par la plante sans que l'on connaisse la contribution du carbone remobilisé à partir des pools de réserve. C'est pourquoi, nous avons établi un protocole expérimental visant à évaluer si la rhizosphère pouvait être alimentée significativement à partir de C plus anciennement fixé par la plante. Au-delà de ce questionnement scientifique, cette expérimentation avait pour objectif d'évaluer la faisabilité d'un double marquage sur plusieurs photopériodes consécutives, ce qui n'avait pas encore été réalisé dans le laboratoire.

#### 3.1. Répartition du carbone dans la plante

Aussi bien après 38 jours qu'après 48 jours de croissance et malgré une augmentation de biomasse de 244%, l'allocation de carbone aux différents organes de la plante est identique. La répartition de biomasse est également similaire entre les deux récoltes puisque le ratio PR / PA n'est pas différent. Ainsi les parties aériennes et les racines ont un taux de croissance équivalent au cours du temps, malgré l'accroissement significatif de la biomasse de la plante. Ce schéma d'allocation est identique à celui obtenu dans d'autres expérimentations décrivant la répartition du carbone récemment assimilé dans la plante (Rattray *et al.*, 1995 ; Swinnen *et al.*, 1994a ; Johansson, 1992 ; Crawford *et al.*, 2000 ; Butler *et al.*, 2004). Cette stabilité de la répartition du carbone dans la plante était une condition nécessaire pour étudier les flux vers la rhizosphère. En effet, sur ces jeunes plantes au stade végétatif de croissance, une modification de l'allocation de carbone aux racines entre les 2 échantillonnages aurait pu signifier une limitation de la croissance du système racinaire par le dispositif de culture. En conséquence, la rhizodéposition aurait pu être affectée. Notre dispositif expérimental n'entraîne pas de limitation de la croissance de la plante et notamment du système racinaire. Les plantes étant au stade végétatif de croissance, il n'y a donc pas de réorientations majeures de C dans la plante comme cela peut être par exemple le cas lors de l'épiaison.

La répartition du carbone 14 (admis comme étant du carbone plus anciennement assimilé) et du ¹³C (admis comme étant du carbone plus récemment assimilé) dans les plantes lors de la récolte finale, c'est à dire à la fin du marquage au ¹³C, montre que plus de carbone récent que de carbone ancien est retrouvé dans les parties aériennes et dans les racines. Les parties
aériennes et les racines des plantes présentent l'excès isotopique en ¹³C le plus élevé de l'ensemble des compartiments analysés (Tableau 9). L'excès isotopique de la respiration rhizosphérique est proche de celui de la plante, alors que celui du sol des compartiments racine et rhizosphère (cumul des 4 compartiments prélevés au cours du marquage) est beaucoup plus faible. Ainsi, le carbone retrouvé dans la respiration rhizosphérique vient très probablement majoritairement de la respiration racinaire. Nos résultats sont en accord avec ceux publiés très récemment par Thornton et al. (2004), sur des ray grass cultivés en hydroponie successivement dans deux atmosphères distinctes ayant des signatures isotopiques ¹³C contrastées. Après le changement de la signature isotopique de l'atmosphère, la signature isotopique des parties aériennes des plantes évolue de manière linéaire vers celle de la nouvelle atmosphère.

<table><caption>Tableau 9 : Excès isotopique dans les différents compartiments de notre dispositif de culture (Parties aériennes des plantes, racines, sol adhérent (SA) du compartiment racine, sol rhizosphérique (SR) du compartiment rhizosphère) après 10 jours de marquage au carbone 13 avec un excès isotopique de 5 atom %.</caption><thead><tr><th></th><th>Excès isotopique (atom%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Parties aériennes</td><td>1,330642</td></tr><tr><td>Racine</td><td>1,193525</td></tr><tr><td>SA Compartiment racine</td><td>0,017685</td></tr><tr><td>SR Compartiment rhizosphère</td><td>0,026447</td></tr><tr><td>Respiration rhizosphérique</td><td>1,311435</td></tr></tbody></table>

## 3.2. Contribution du carbone récemment assimilé à la rhizodéposition

Comme pour la répartition de la biomasse, la répartition du carbone récemment assimilé (en % du total retrouvé) dans la plante et le sol est restée la même pendant toute l'expérimentation. Seule la répartition entre compartiment racine et compartiment rhizosphère diffère. A la fin du premier marquage, le tapis racinaire n'était pas encore complètement développé sur la toile, le C récent (¹⁴C) est majoritairement retrouvé dans le compartiment « racine ». Ensuite, en raison du développement des racines sur la toile nylon qui sépare les 2 compartiments, le carbone récent (¹³C) est majoritairement alloué au compartiment rhizosphère à la fin du second marquage.
Nos résultats permettent de mettre en évidence l'évolution de la quantité de carbone ancien (¹⁴C) et de carbone récent (¹³C) présente dans le compartiment rhizosphère et retrouvé dans la respiration rhizosphérique. En raison des précautions prises lors des arrosages, le carbone marqué retrouvé dans le compartiment rhizosphère ne peut pas être issu du lessivage de composés carbonés libérés dans le compartiment « racines ». En effet, l'arrosage a été effectué par capillarité depuis la base des pots de cultures lors de chaque échantillonnage des compartiments rhizosphère. Le C retrouvé dans le compartiment « rhizosphère » provient donc bien du tapis racinaire.

Contrairement à ce que nous attendions, plus de carbone anciennement assimilé (¹⁴C) que de C récemment assimilé (¹³C) est retrouvé dans le compartiment rhizosphère et la respiration rhizosphérique au début du second marquage. Ce n'est que 6 jours après le début du marquage au ¹³C que la part de ¹³C libérée par la plante dans le compartiment rhizosphère et dans la respiration rhizosphérique augmente et va constituer la majeure partie du carbone libéré par la plante et du C respiré. La quantité de carbone ancien libérée diminue ensuite et fini par se stabiliser. Cette fraction de carbone ancien correspond probablement pour partie à du carbone issu de la minéralisation de racines fines et de débris racinaires à proximité de la toile. La libération de carbone dans le sol par cette voie ayant lieu à une échelle de temps plus longue que celle de la rhizodéposition, on retrouve cette fraction de carbone ancien dans le pool de carbone libéré par la plante et dans la respiration rhizosphérique pendant plus longtemps que la fraction correspondant au carbone rhizodéposé. On ne peut cependant pas exclure une re-circulation dans la plante de carbone issu de composés plus anciens.

D'autre part, la quantité de C total libérée par le tapis racinaire dans le compartiment rhizosphère est largement accrue entre la fin du premier marquage et la fin du second marquage. Cet accroissement de la rhizodéposition est du à la fois à une augmentation de la biomasse racinaire pendant le second marquage, mais également à une contrainte subie par le système racinaire causée par la toile de nylon. En effet il est reconnu qu'une contrainte mécanique appliquée au niveau du système racinaire stimule la rhizodéposition (Groleau-Renaud, 1998).

Dans la même étude que celle citée plus haut, Thornton et al. (2004) montrent qu'après avoir changé la signature isotopique de l'atmosphère dans laquelle évoluaient les plantes, la signature isotopique du carbone libéré par les racines tend vers celle de la nouvelle atmosphère. Cette expérimentation réalisée en hydroponie stérile met en évidence des différences d'allocation du carbone nouvellement assimilé tout au long de la racine. Tout
comme Matthew et Kemball (1997), ils constatent que c'est au niveau des apex racinaires qu'une part importante du carbone récemment assimilé est retrouvée. Cette étude permettant de définir finement les sites d'exsudation est néanmoins menée en hydroponie stérile. Or il a largement été montré que les micro-organismes du sol influençaient significativement la rhizodéposition. Ainsi, les résultats de Thornton peuvent être biaisés par les conditions de culture des plantes. En revanche, notre étude est menée en conditions *in situ*, ce qui permet l'obtention de résultats réalistes. De plus la caractérisation du carbone libéré dans la rhizosphère se fait dans la zone de sol proche des apex racinaires, puisque le tapis racinaire peut être considéré comme étant formé de racines actives. Nos résultats sont par conséquent, cohérents avec ceux de Thornton *et al.* (2004).

Bien que du C de la plante soit alloué au compartiment rhizosphère dès le début du second marquage (¹³C), ce n'est qu'à partir du 6ème jour après le début de ce marquage qu'un effet rhizosphère significatif (biomasse microbienne stimulée sous l'action de la rhizodéposition) est observé dans les 5 premiers mm de sol. Deux hypothèses peuvent expliquer ce résultat : la plus probable est que le tapis racinaire n'était pas suffisamment développé pour pouvoir influencer le développement microbien, qui en retour peut stimuler la rhizodéposition. Une autre explication est le délai nécessaire pour que la biomasse microbienne se développe et que le développement soit suffisant pour être perceptible avec la technique de quantification de la biomasse microbienne qui n'est pas très sensible.

La littérature montre que le fonctionnement de la plante contribue à transférer une fraction importante du carbone assimilé directement vers les racines. En effet, d'une part le carbone nouvellement assimilé est majoritairement transporté sous forme soluble (saccharose), facilement allouée vers les racines et par conséquent rapidement exsudée (Mühling et al., 1993), alors que le carbone ancien est incorporé dans les composés de structure insolubles ou stocké sous forme de macromolécules (fructane) pour lesquels il est difficile de traverser les membranes biologiques et par conséquent d'être rapidement transporté aux racines. D'autre part, les assimilats récents sont préférentiellement transférés vers les sites de division cellulaire et d'extension ayant une force de puits importante (Farrar et al., 1995). Ces sites ne sont pas morphologiquement matures, la diffusion y est alors facilitée (Bret-Harte et Silk, 1994). De plus, les micro-organismes de la rhizosphère exercent également une force de puits importante, attirant le carbone de la plante. Le carbone constitue une source d'énergie pour les micro-organismes. Sa disponibilité va stimuler leur croissance et leur activité. Les micro-
organismes en retour stimulent la rhizodéposition et dans ce cas, c'est le carbone le plus rapidement disponible qui est prioritairement transféré à la rhizosphère et par conséquent rapidement disponible pour les micro-organismes.

Cette expérimentation a permis de valider la faisabilité de marquage long avec le matériel de marquage disponible au laboratoire. De plus, l'utilisation d'un isotope stable du carbone, le carbone 13, plus facile à manipuler que le carbone 14, est entièrement envisageable dans des études à venir concernant l'étude des transferts de carbone dans la plante et vers la rhizosphère. Le seul inconvénient réside dans le fait qu'il est impossible de contrôler l'activité spécifique de l'atmosphère de marquage pendant le marquage. Ce n'est qu'a posteriori que l'on peut vérifier si cette activité spécifique était conforme à ce qui avait été fixé comme étant adapté à l'expérimentation.

Notre travail ne permet pas de conclure quant à la contribution du C ancien et du C nouveau à la rhizodéposition. Le carbone 14 retrouvé dans le compartiment rhizosphère 3 jours après le début du marquage au carbone 13 peut-il véritablement être considéré comme du carbone ancien ? De même, après 8 jours de marquage au carbone 13, la part de carbone 13 retrouvée dans le compartiment rhizosphère peut provenir aussi bien du carbone 13 assimilé au début du marquage, soit 8 jours plus tôt, que du carbone 13 assimilé dans les heures précédant le prélèvement du compartiment rhizosphère. L'absence d'effet rhizosphère dans le compartiment rhizosphère durant les 6 premiers jours du marquage au ¹³C est-elle due au faible développement du tapis racinaire ? Aurait-il été souhaitable de commencer les marquages isotopiques avec un tapis racinaire plus dense ? Dans ce cas de figure, une limitation du développement des racines et donc de la plante, affectant la libération de carbone par les racines se serait produite. De plus, dans ces conditions, une partie du C libéré pourrait provenir de la sénescence et de la minéralisation de racines anciennes dans le tapis racinaire. Ce flux de C non quantifiable est alors attribuable à la détritusphère et non plus à la rhizosphère. Il est ainsi primordial d'approfondir l'ensemble de ces points en améliorant ou modifiant notre dispositif d'étude.

Une première proposition consisterait à travailler dans des conditions de culture en hydroponie, en conservant la technique de double marquage (¹⁴C, ¹³C). Il serait alors plus facile de prélever les exsudats racinaires directement au niveau du système racinaire à des intervalles de temps réguliers afin de déterminer l'évolution de la proportion ¹⁴C / ¹³C des rhizodépôts.
Si on souhaite conserver des conditions de culture in situ, une seconde proposition consiste à réaliser un double marquage <sup>14</sup>C / <sup>13</sup>C sur des pots de culture. Après le début du second marquage, des prélèvements successifs permettront d'analyser l'évolution de la quantité de <sup>14</sup>C et de <sup>13</sup>C retrouvée dans le sol adhérent aux racines.

Les modalités de marquage peuvent être également modifiées et simplifiées. Le marquage long des plantes au <sup>14</sup>C est conservé afin de tracer le C des réserves de la plante. Immédiatement après la fin de ce marquage long, un marquage court au <sup>13</sup>C est alors réalisé sur une partie des plantes issues du premier marquage. D'autres marquages courts consécutifs sur des plantes restantes permettraient de caractériser l'évolution de la proportion C anciennement / C nouvellement libéré par les racines.

Un suivi de la dynamique des réserves et de leur activité <sup>14</sup>C ou abondance <sup>13</sup>C permettra de déterminer la contribution des réserves au pool de C libéré par les racines.

## IV. Conclusion

Le C ancien contribue significativement à la rhizodéposition. Néanmoins la proportion de C ancien par rapport au C nouveau libéré par les racines n'est pas déterminée. Il est difficile de dire si le <sup>13</sup>C libéré par les racines est toujours du C nouveau 6 jours après le début du marquage au <sup>13</sup>C. En revanche, notre travail montre qu'un effet rhizosphère apparaît dans le compartiment rhizosphère et que la libération de <sup>13</sup>C par les racines augmente très fortement à partir du 6<sup>ème</sup> jour après le début du marquage au <sup>13</sup>C. Le <sup>14</sup>C restant correspond à du C issu soit du renouvellement racinaire soit de la remobilisation du C des réserves. L'absence d'effet rhizosphère est probablement due au fait que le tapis racinaire n'était pas suffisamment développé au début du marquage <sup>13</sup>C pour pouvoir influencer le compartiment rhizosphère et permettre une libération suffisante de <sup>13</sup>C dans ce compartiment. Cette étude doit être approfondie afin de mieux caractériser la contribution du C ancien et du C récent à la rhizodéposition.
<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Photographies 5 et 6 : Vue d'un anneau enrichi du dispositif FACE Suisse. On peut distinguer la présence de buse permettant la diffusion du CO₂ au-dessus de la parcelle ainsi que la présence de capteurs de la concentration en CO₂, de la vitesse du vent et de la température.

<figure><img src="image_26.png" /></figure>
E. CONSEQUENCES DE L'ELEVATION DE LA CONCENTRATION EN CO₂ ATMOSPHERIQUE SUR LA REPARTITION DES PHOTO-ASSIMILATS RECENTS ET LA RHIZODEPOSITION CHEZ LOLIUM PERENNE

L'enrichissement de la concentration en CO₂ de l'atmosphère accroît la disponibilité en carbone pour la plante car il en résulte le plus souvent une stimulation de l'activité assimilatrice des feuilles sources (Rogers *et al.*, 1998). Si le concept des relations sources-puits est étendu à la rhizosphère, les entrées de carbone dans le sol notamment par le biais de la rhizodéposition sont à leur tour modifiées. Beaucoup d'études ont montré les conséquences de l'élévation du CO₂ sur les transferts de carbone dans le système plante-sol-micro-organismes en conditions contrôlées. Néanmoins en conditions naturelles ou semi-naturelles, peu de données sont disponibles concernant l'étude des transferts de carbone récemment assimilé par la plante, vers le sol en ayant intégré plante, sol et micro-organismes. De même, d'un point de vue plus environnemental, la contribution de la rhizosphère à la dynamique de la matière organique dans le sol après une longue période d'exposition de ce sol à une atmosphère enrichie en CO₂ est ni comprise, ni quantifiée.

Le dispositif FACE (Free Air Carbon dioxide Enrichment) de l'ETH de Zürich (Suisse) est un écosystème prairial à gestion agronomique intensive, sous régime de fauche (Hebeisen et al., 1997), ayant un historique d'enrichissement en CO₂ de 9 années consécutives (Photographies 5 et 6). Ce site unique a servi de support à notre étude car nous souhaitions étudier les conséquences de l'élévation des concentrations en CO₂ de l'atmosphère sur la répartition des photoassimilats récents dans la plante, la rhizodéposition et le devenir de ces photo-assimilats dans le sol avec un réalisme agronomique et écologique.

Ce type de dispositif a été développé au début des années 90 pour mieux comprendre, en conditions de plein champ, les réponses des plantes et des couverts végétaux à l'augmentation atmosphérique en CO₂ (photosynthèse, production et répartition de biomasse...). A partir des premiers résultats, on s'est rendu compte que les déterminismes des réponses des plantes se situait au niveau des interactions entre la plante, le sol, les micro-organismes et la faune du sol. Il est apparu notamment qu'une partie du surplus de C assimilé en réponse à l'augmentation de CO₂ n'était pas retrouvé dans la biomasse végétale. Il a été notamment fait l'hypothèse qu'une fraction du carbone assimilé était transporté vers le sol et qu'il était
nécessaire de déterminer quel flux de C était à l'origine de ce défaut de bilan. Dans le même temps, les travaux ne montraient aucun accroissement des concentrations en carbone dans le sol lorsque l'atmosphère est enrichie en CO₂. Ainsi des attentes sont apparues visant à quantifier les transferts de composés organiques de la plante au sol, et à déterminer les conséquences du fonctionnement rhizosphérique sur le devenir de ces composés dans le sol. Jusqu'à présent, les effets de l'élévation du CO₂ sur la rhizodéposition en conditions de plein champ ne sont que suppositions; aucune étude n'a formellement caractérisé les conséquences d'un enrichissement en CO₂ sur la rhizodéposition.

Dans ce contexte, nos objectifs sont d'évaluer :

i. les conséquences de l'élévation des concentrations en CO₂ atmosphérique sur la rhizodéposition chez de jeunes plantes de ray grass. Les plantes ayant poussé sur le dispositif FACE ont été ramenées au laboratoire en vue de suivre les transferts de C et de N des parties aériennes vers les racines et la rhizosphère par traçage isotopique au ¹⁴C et ¹⁵N ;

ii. l'influence, sous CO₂ élevé, de la fertilisation azotée sur la rhizodéposition;

iii. la vitesse de minéralisation du carbone récent et du carbone total présent dans la rhizosphère ;

iv. la concentration en carbone total du sol après 9 années d'enrichissement en CO₂.

Ce chapitre a fait l'objet d'une publication dans *Soil Biology and Biochemistry*.

Bazot S., Ulff L., Blum H., Nguyen C., Robin C. (2005). Effects of elevated CO₂ concentration on rhizodeposition of *Lolium perenne* grown on soil exposed to 9 years of CO₂ enrichment. *Soil Biology and Biochemistry*, sous presse.
# I. Matériels et méthodes

## 1.1. Dispositif expérimental

Le dispositif FACE Suisse était situé à la station expérimentale de l'ETH de Zurich à Eschikon (Photographies 5 et 6). Le premier enrichissement en CO₂ de l'atmosphère date du 31 Mai 1993 et il a été mis fin aux enrichissements à l'automne 2003.

Lors de notre expérimentation en 2002, le dispositif présentait un historique de 9 années d'enrichissement en CO₂. Le sol, désigné comme un sol argilo-limoneux, est composé à 28% d'argile, 33% de limon et 36% de sable. Les valeurs de pH du sol sont comprises entre 6,5 et 7,6 (Hebeisen et al., 1997). Ce dispositif est composé de trois blocs, formés chacun de deux anneaux : un anneau soumis à l'atmosphère ambiante en CO₂ (à environ 36Pa pCO₂) et un anneau enrichi (à environ 60Pa pCO₂). La source de dioxyde de carbone utilisée pour l'enrichissement de l'air est d'origine pétrochimique. L'enrichissement a lieu quotidiennement pendant la photopériode, de mars à octobre. L'émission de CO₂ est régulée en fonction de la vitesse et de l'orientation du vent.

Chaque anneau comporte, entre autres, des monocultures de ray grass (parcelles de 2,8 X 1,9 m) *Lolium perenne* cv Bastion. Chacune de ces parcelles est divisée en 2 parties, l'une soumise à un apport annuel d'azote de 14 g. m⁻² a⁻¹, l'autre à un apport élevé (56 g m⁻² a⁻¹), sous forme de NH₄NO₃. La quantité d'engrais est apportée annuellement dans les proportions suivantes : 30%, 20%, 20%, 15%, 15% depuis la première fauche (début juin) jusqu'à la cinquième et dernière fauche (début octobre).

## 1.2. Mise en place de l'essai

Notre intention au départ était d'utiliser des plantes en place dans le couvert végétal des anneaux FACE, ayant été soumis à l'augmentation du CO₂ atmosphérique pendant 9 années. Une discussion avec les gestionnaires du dispositif et une visite préalable de terrain nous ont orientés vers un repiquage de plantules de ray grass *Lolium perenne* cv Bastion sur le dispositif FACE. Les raisons sont les suivantes :

- une difficulté d'individualiser des plantes dans le couvert végétal en place

- une hétérogénéité de la densité du couvert et de la taille des plantes.
Des graines sont mises à germer au préalable en serre, permettant d'obtenir des plantes au même stade de croissance lors du repiquage. Ces jeunes plantes présenteront une croissance active, produisant de nombreuses talles. Ainsi, les flux de carbone dans ces plantes seront conséquents, du fait d'un métabolisme important. Les plantules sont transplantées sur le dispositif, racines nues, 35 jours après le semis. Le repiquage a lieu dans des monolithes de sol non perturbé, individualisés en enfonçant dans le sol des cylindres en PVC (diamètre : 8cm ; hauteur : 20cm). Les plantules sont repiquées le 19 avril pour l'échantillonnage du printemps et le 10 juillet pour l'échantillonnage d'automne dans les anneaux ambiants et les anneaux enrichis en CO₂. Le sol des anneaux FACE est hétérogène (structure, présence de cailloux...), souvent peu profond; l'horizon minéral (H2) est présent parfois dès 20 cm de profondeur. Par conséquent, la majorité des racines de ray grass évoluent dans les 20 premiers cm de sol. En raison de la présence de zones sans plantes en sortie d'hiver, il a été possible d'enfoncer les cylindres de PVC entre les plantes en place. Ainsi, le sol soumis à l'enrichissement pendant 9 ans n'a pas été perturbé par la mise en place de l'essai. Les jeunes plantes sont soumises pendant leur développement à la compétition pour la lumière comme les autres plantes déjà présentes sur la parcelle.

Les effets de l'enrichissement en CO₂ sont analysés en début et en fin de la saison de croissance. Les deux dates de prélèvements correspondent à des conditions climatiques contrastées et à un fonctionnement des plantes influencé par les défoliations et les fertilisations au cours de la saison de croissance. Quarante huit plantes sont récoltées au printemps (14 Juin, après 56 jours d'exposition au CO₂) et 48 plantes sont récoltées à l'automne (27 Septembre, après 79 jours d'exposition au CO₂). Les plantes récoltées au printemps ont été soumises à une seule défoliation suivie d'un apport d'azote (30% d'apport annuel), alors que les plantes prélevées à l'automne ont été soumises à 3 défoliations et à 4 apports d'azote (85% de l'apport annuel).

Immédiatement après chacun des 2 prélèvements, les plantes et leur monolithe de sol sont ramenés au laboratoire à Nancy où des marquages isotopiques au carbone 14 et à l'azote 15 sont réalisés. Les plantes des anneaux enrichis sont marquées séparément des plantes des anneaux ambiants afin d'établir la pression partielle en CO₂ correspondante (36 ou 60 Pa).

Nous avons opté pour un marquage au laboratoire plutôt que sur le terrain car la régulation des paramètres climatiques et de marquage est une nécessité si l'on souhaite étudier l'allocation de carbone récent aux compartiments rhizosphériques. Cette dernière est en effet fortement influencée par l'état physiologique de la plante. Une perturbation du métabolisme
causée par une variable climatique influence les flux de carbone dans la plante et à la rhizosphère. Cette régulation n'était pas envisageable sur le terrain, compte tenu du nombre de plantes impliquées. Après le transport (environ 6 heures), et dans l'attente du marquage au ¹⁴C, les plantes sont immédiatement placées dans des serres où la concentration en CO₂ correspond à celle observée sur le terrain. Les plantes issues des anneaux ambiants sont placées dans des serres ambiantes et les plantes issues des anneaux enrichis sont placées dans des serres où l'atmosphère est enrichie en CO₂.

### 1.3. Marquage des parties aériennes au ¹⁴CO₂ et au ¹⁵NH₃ et récolte

Les cylindres de PVC comportant les monolithes de sol avec un plant de ray grass, sont au préalable disposés dans un container en vue du marquage (diamètre :10 cm, hauteur : 35 cm ; Figure 19).

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Figure 19 : Container de marquage renfermant un cylindre de PVC planté d'un ray grass destiné à être marqué au ¹⁴CO₂. Le couvercle présente une ouverture permettant le passage de la plante. Cette ouverture, une fois la plante mise en place est bouchée avec du silicone liquide. Le couvercle présente également 2 trous permettant le branchement de 2 tuyaux reliés aux pièges à soude utilisés pour piéger le CO₂ issu de la respiration rhizosphérique.
La veille du marquage, les plantes sont transférées dans la chambre de marquage afin d'acclimater les plantes aux conditions climatiques de la chambre : densité du flux de photons à 400 µmoles.m⁻² s⁻¹ à la base des plantes, photopériode de 16h, température à 22°C jour et nuit.

La concentration en CO₂ est régulée à 36Pa pCO₂ ± 0.7Pa pCO₂ pour les plantes témoins et à 60Pa pCO₂ ± 1.3Pa pCO₂ pour les plantes issues des anneaux enrichis pendant toute la procédure de marquage. L'activité spécifique de l'atmosphère est fixée à 40 KBq mg C⁻¹ pour les marquages effectués au mois de juin et à 55 KBq mg C⁻¹ pour les marquages effectués au mois de septembre. Les plantes sont exposées pendant 1heure au ¹⁴CO₂ lors des marquages du mois de juin et 1h30 lors des marquages du mois d'octobre.

## 1.4. Mesure de la minéralisation du carbone total et du carbone 14 dans le sol adhérent

Pour l'échantillonnage effectué à l'automne, la minéralisation des composés organiques marqués au carbone 14 libérés par les racines, ainsi que la minéralisation de la matière organique du sol (C total) sont mesurées. Dans cette optique, 20 grammes de sol adhérent (SA) sont mis à incuber pendant 30 jours à 22°C dans le noir dans des bocaux en verre fermés hermétiquement. Le CO₂ total et le ¹⁴CO₂ minéralisés par la biomasse microbienne sont piégés dans 20ml de NaOH 1M disposés dans un pilulier placé dans le bocal d'incubation. Ces pièges à soude sont remplacés régulièrement afin d'établir une cinétique de minéralisation. Le carbone 14 contenu dans le NaOH est analysé en scintillation liquide (Tri-Carb 2100 Tr, Packard), en mélangeant 1ml de NaOH à 10ml de liquide scintillant Ultima Gold (Packard, USA). Le carbone total contenu dans chaque piège à soude est analysé grâce à l'analyseur COTmètre (Shimadzu TOC-VCSH). Un blanc NaOH est réalisé pour tenir compte du C piégé par la soude pendant la préparation du suivi de minéralisation.

## 1.5. Expression des résultats du marquage à l'azote 15

La répartition du ¹⁵N dans les différents compartiments composant le système plante-sol-micro-organismes (feuilles, tiges, racines, sol adhérent SA) est comparé pour les deux niveaux de fertilisation ainsi que les deux niveaux de CO₂. Le sol non adhérent n'a pas été
considéré car l'enrichissement était très faible voire nul. Cette répartition est exprimée en pourcentage de ¹⁵N dérivé de l'ammonium (%NDFA ; Janzen et Bruinsma, 1989).

$$ \%NDFA = \frac{\text{Excès isotopique dans un compartiment donné}}{\text{Enrichissement isotopique de l'atmosphère}} \times 100 $$

## 1.6. Analyses statistiques

Les données sont analysées à l'aide du logiciel JMP IN®, SAS institute. Le dispositif expérimental est un split-splot. Des analyses de variances à deux facteurs (CO₂ et azote) sont effectuées. Le CO₂ est considéré comme facteur principal, l'azote comme facteur secondaire. Chaque bloc correspond à une répétition, soit 3 répétitions. Le test de Tukey Kramer a permis de comparer les moyennes entre elles dans le cas d'une interaction entre les effets CO₂ et les effets azote. Sur les figures, les barres verticales correspondent à 2 intervalles de confiances de la moyenne.
## II. Résultats

### 2.1. Production de biomasse végétale

La production de biomasse totale n'est pas modifiée par l'enrichissement CO₂ lors du prélèvement effectué au printemps (P>0,1; Figure 20b, Tableau 10). Néanmoins, lors de l'échantillonnage d'automne, une interaction significative est observée entre les effets CO₂ et N (P=0,019 ; Tableau 10). Dans le cas de l'apport élevé d'azote, l'élévation du CO₂ augmente la production de biomasse des parties aériennes des plantes (P<0,001; test Tukey Kramer) (Figure 20e, Tableau 10). Aux deux dates de prélèvement, l'apport élevé d'azote augmente la production de biomasse (P<0,001; Figures 20b et f, Tableaux 10). Le rapport de biomasse Racines sur Parties aériennes (PR/PA) n'est pas significativement affecté par le CO₂, quelle que soit la date d'échantillonnage (Figures 20d et h). Il est cependant significativement réduit par le fort niveau de fertilisation azotée au printemps (P<0,001 ; Figure 20d, Tableau 10).

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

Figure 20 : Biomasse sèche des parties aériennes (a, e), des racines (c, g), biomasse sèche totale (b, f) de la plante en g. plante⁻¹ et ratio de matière sèche Parties racinaires PR / Parties aériennes PA (d, h) des plants de *Lolium perenne* récoltés en Juin (printemps : a, b, c, d) et en Septembre (automne, e, f, g, h) dans les anneaux enrichis en CO₂ et ambiants, pour les deux niveaux de fertilisation azotées (56 et 14 g N. m⁻²). Les différentes lettres représentent les résultats du test de Tukey Kramer, effectué lorsqu'une interaction significative est révélée par l'analyse de variance ; n=3.
## 2.2. Allocation de carbone 14 et de l'azote 15 au compartiment souterrain

### Allocation de carbone 14 :

#### Printemps

En moyenne, 46% et 50% du ¹⁴C assimilé sont alloués au compartiment souterrain respectivement sous CO₂ enrichi (CO₂+) et CO₂ ambiant (P>0.1, moyenne des traitements azotés). Trente trois% et 36% sont libérés par les racines (¹⁴C retrouvé dans la respiration rhizosphérique RR, le sol et la biomasse microbienne) respectivement sous CO₂+ et CO₂ ambiant (P>0.1, moyenne des traitements azotés ; Figure 21Ac, d,e ; Tableau 10).

L'allocation de ¹⁴C au compartiment souterrain est plus faible lors d'un fort apport d'azote que lors d'un faible apport (39% contre 57% lors d'un faible apport d'azote) : les racines libèrent proportionnellement moins de ¹⁴C lors d'un fort apport d'azote que lors d'un faible apport (27% contre 42% RTR dans la respiration rhizosphérique, le sol et la biomasse microbienne sous faible niveau d'azote; P<0,001; Figure 21Ac, d,e ; Tableau 10).

#### Automne

Une interaction est observée entre les effets azote et les effets CO₂ (P=0,057; P=0,059; Tableau 10) pour l'allocation de ¹⁴C aux parties aériennes et au compartiment souterrain respectivement. Avec un apport élevé d'azote, une plus faible proportion de ¹⁴C est allouée au compartiment souterrain (P<0,001; test Tukey Kramer). Les plantes enrichies en CO₂ allouent moins de ¹⁴C au sol (biomasse microbienne, sol adhérent SA et sol non adhérent SNA; P<0,05; Figure 21B c, d, e ; Tableau 10). L'azote n'a pas de conséquences majeures sur la répartition du ¹⁴C dans le système plante-sol (Figure 21B ; Tableau 10).
<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Figure 21: Répartition du ¹⁴C assimilé exprimé en pourcentage de ¹⁴C total retrouvé %RTR dans les parties aériennes (a, f), le compartiment souterrain (c, h) (racines b, g ; respiration rhizosphérique RR d, i ; et le sol incluant sol adhérent, sol non adhérent et biomasse microbienne e, j), lors des échantillonnages du printemps (a, b, c, d, e) et de l'automne (f, g, h, i, j) au sein des monocultures de ray grass, pour deux niveaux de fertilisation azoté (56 et 14 gN.m⁻²). Les barres verticales représentent les intervalles de confiance (n=3). Les différentes lettres représentent les résultats du test de Tukey Kramer, effectué lorsqu'une interaction significative est révélée par l'analyse de variance.
Allocation d'azote 15 :

## Printemps

Le pourcentage d'azote dérivé de l'ammonium (%NDFA) retrouvé dans les parties aériennes est significativement plus faible sous atmosphère enrichie en CO₂ que sous atmosphère ambiante (P<0,001 pour les feuilles et les tiges Figure 22a, b ; Tableau 10). En revanche, dans les racines et dans le sol adhérent, aucune différence n'est observée entre les différents traitements CO₂ (Figure 22c,d ; Tableau 10).

La fertilisation azotée diminue la proportion de ¹⁵N dérivée de l'ammonium retrouvée dans les parties aériennes (P=0,005). Aucun effet n'est observée au niveau des racines et du sol adhérent (Figure 22, Tableau 10).

## Automne

Le pourcentage d'azote dérivé de l'ammonium (%NDFA) retrouvé dans les parties aériennes est significativement plus faible sous atmosphère enrichie en CO₂ que sous atmosphère ambiante (P<0,001 pour les feuilles et les tiges, Figure 23 a, b ; Tableau 10). En revanche, dans le sol adhérent, la proportion de ¹⁵N dérivée de l'ammonium est significativement plus élevée sous atmosphère enrichie en CO₂ (P<0,001 ; Figure 23d ; Tableau 10).

La fertilisation azotée diminue la proportion de ¹⁵N dérivée de l'ammonium retrouvée dans les parties aériennes (P<0,001) mais augmente la proportion de ¹⁵N dérivée de l'ammonium retrouvée dans sol adhérent (Figure 23 ; Tableau 10).
<figure><img src="image_30.png" /></figure>

Figure 22 : Pourcentage de ¹⁵N dérivé de l'atmosphère dans les feuilles (a), les tiges (b), les racines (c) et le sol adhérent (d) pour les échantillonnages du printemps au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère ambiante ou enrichie en CO₂, sous deux niveaux de fertilisation. Les barres verticales présentent les intervalles de confiances (n=3).

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Figure 23 : Pourcentage de ¹⁵N dérivé de l'atmosphère dans les feuilles (a), les tiges (b), les racines (c) et le sol adhérent (d) pour les échantillonnages de l'automne au sein des monocultures de ray grass sous atmosphère ambiante ou enrichie en CO₂, sous deux niveaux de fertilisation. Les barres verticales présentent les intervalles de confiances (n=3).