# Méthodes alternatives in vitro pour l'étude des interactions hôte-pathogène du poumon

Aude Remot, Delphyne Descamps, Alexandra Erny, Claire Chottin, Carole

Drajac, Florence Carreras, Cécile Ferret, Archer Fabienne

► To cite this version:

Aude Remot, Delphyne Descamps, Alexandra Erny, Claire Chottin, Carole Drajac, et al. Méthodes alternatives in vitro pour l'étude des interactions hôte-pathogène du poumon. INRAE Productions Animales, 2023, 36 (2), pp.7574. 10.20870/productions-animales.2023.36.2.7574. hal-04171731

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# Méthodes alternatives in vitro pour l'étude des interactions hôte-pathogène du poumon

INRAE Prod. Anim.,
2023, 36 (2), 7574

REMOT Aude<fnref n="1" />, DESCAMPS Delphyne<fnref n="2" />, ERNY Alexandra<fnref n="3" />, CHOTTIN Claire<fnref n="2" />, DRAJAC Carole<fnref n="2" />, CARRERAS Florence<fnref n="1" />, FERRET Cécile<fnref n="2" />, ARCHER Fabienne<fnref n="3" />

Courriel : aude.remot@inrae.fr & fabienne.archer@inrae.fr

■ Les maladies infectieuses respiratoires ont un fort impact en santé animale et humaine. L'étude des agents pathogènes animaux est nécessaire pour mieux comprendre les pathologies respiratoires non résolues et également mieux anticiper de nouvelles émergences. Cette revue fait le point sur les méthodes alternatives in vitro pour l'étude des interactions hôte-pathogène du poumon, en présentant les travaux d'équipes INRAE travaillant chez le bovin.

## Introduction

Chez l'homme, les infections des voies respiratoires basses se placent au quatrième rang des principales causes de mortalité (source de l'Organisation Mondiale de la Santé, OMS). Chez l'animal elles sont la première cause de mortalité (source de l'Organisation Mondiale de la Santé Animale, OIE). Ces infections représentent un enjeu majeur de bien-être et de santé, et sont particulièrement préoccupantes quant à leur impact sociétal et économique. La pandémie COVID-19, une crise majeure de santé publique humaine causée par un virus potentiellement d'origine animale, souligne l'importance et la pertinence du concept « One Health », une seule santé, pour comprendre et affronter les risques sanitaires mondiaux à l'interface santé animale – santé humaine. Souvent utilisée pour coordonner des efforts multisectoriels de prévention et de réponse aux maladies zoonotiques (c'est-à-dire transmissibles de l'animal à l'humain ou de l'humain à l'animal), la démarche « One Health » est primordiale pour contrôler des maladies

telles que la rage, la grippe aviaire ou la tuberculose (https://www.oie.int/fr/ce-que-nous-faisons/sante-et-bien-etre-animale/). Selon les chiffres de l'OIE, 60 % des agents pathogènes connus responsables des maladies humaines proviennent des animaux domestiques et de la faune sauvage, et 75 % des agents pathogènes humains émergents sont d'origine animale.

L'étude des interactions entre les agents pathogènes animaux, dont ceux des espèces de rente, avec leur espèce cible est nécessaire pour mieux comprendre et combattre les pathologies respiratoires non résolues sur le terrain et également mieux anticiper de nouvelles émergences dans le futur.

■ Le complexe respiratoire bovin : plusieurs pathogènes, une seule maladie

Les maladies respiratoires bovines sont la principale cause de morbidité et mortalité en élevage chez les veaux

(laitiers ou allaitants) avec des pics de mortalité pouvant atteindre 20 % certains hivers, en fonction des agents pathogènes impliqués et des conditions d'élevage (Perrin, 2012 ; Pardon et al., 2020). Chez les adultes, la mortalité due aux problèmes respiratoires est de 3 % (Perrin, 2012). Les pertes pour la filière sont estimées à 576 millions € par an en Europe (Nicholas et Ayling, 2003). Plus de la moitié des coûts est liée à la diminution de la masse corporelle des animaux, la mortalité et les coûts associés au travail supplémentaire pour l'éleveur et les soignants (séparation des animaux infectés, traitements vétérinaires). Les pertes par animal sont estimées à 65 € pour un veau laitier, et 123 € pour un veau de race à viande (Andrews, 2000). Les agents pathogènes incriminés sont multiples, ils sont d'origine bactérienne (Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni, Mycoplasma bovis...) ou virale (Virus Respiratoire Syncytial bovin (VRS), Rhinotrachéite Infectieuse Bovine (IBR), Parainfluenza 3 virus (PI3V), Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV), coronavirus...) ; plus rarement

<footnote n="1">¹INRAE, Université de Tours, ISP, 37380, Nouzilly, France</footnote>

<footnote n="2">²INRAE, Université Paris-Saclay, UVSQ, VIM, 78350, Jouy-en-Josas, France</footnote>

<footnote n="3">³Université de Lyon, Université Lyon 1, INRAE, UMR754, Viral Infections and Comparative Pathology, Université Lyon 1, INRAE, 69007, Lyon, France</footnote>
d'origine parasitaire (strongles pulmo-
naires) ou fongique (Aspergillus). La
fréquence des pathogènes incriminés
varie selon les études et les élevages
(Caron, 2018 ; Pardon et al., 2020).

Pour les maladies respiratoires
bovines, on parle de Complexe
Respiratoire Bovin (CRB) car les associa-
tions de pathogènes sont fréquentes,
par exemple une infection virale pré-
disperse souvent à une surinfection
bactérienne (Pardon et al., 2020). Ces
associations se traduisent par des traite-
ments antibiotiques qui favorisent l'ap-
parition de résistance chez les bactéries.

Au niveau clinique, la fièvre, la toux,
le jetage nasal, l'abattement et l'hyper-
ventilation sont les signes d'alerte pour
les éleveurs (Mosier, 2014 ; Ferraro et al.,
2021). Les signes cliniques et les don-
nées épidémiologiques peuvent per-
mettre d'établir le diagnostic, mais des
examens complémentaires sont sou-
vent nécessaires (lavage broncho-al-
véolaire, prélèvements rhinopharyngés,
prises de sang, autopsies). La préven-
tion des pathologies respiratoires passe
notamment par la vaccination (Riffault
et al., 2020 ; Makoschey et Berge, 2021),
l'optimisation des conditions d'héber-
gement (nombre d'animaux par aires,
ventilation, exposition à la poussière...)
et la réduction du stress (transport,
allotement).

■ La tuberculose bovine :
maladie zoonotique
et règlementaire

Un autre pathogène respiratoire qui
cause d'important problème en élevage
est Mycobacterium bovis (Mb), l'agent
de la Tuberculose Bovine (bTB). De par
son caractère zoonotique, la bTB est sou-
mise à une règlementation très stricte
au sein de l'Union Européenne. Elle est
associée à l'abattage systématique des
animaux dépistés positifs par un test
de sensibilisation à la tuberculine. Ce
diagnostic étant très précoce, les ani-
maux ne présentent quasiment jamais
de signes cliniques. Les pertes écono-
miques liées au contrôle de la bTB sont
estimées à 3 milliards de dollars dans
le monde (Schiller et al., 2011). Pour la
France, les programmes de contrôle de
la bTB représentent 20 millions d'euros

par an (communication du labora-
toire national de référence sur la bTB)
incluant les montants compensatoires
pour les éleveurs. Outre ces pertes éco-
nomiques, la bTB est associée à une
problématique croissante de l'accept-
abilité de l'abattage systématique des
animaux, aussi bien par les éleveurs
que la société. L'éradication de la bTB
est un objectif affiché par l'OIE ([https://](https://www.oie.int/app/uploads/2021/03/roadmap-zoonotic-tb.pdf), mais elle se
heurte au manque de connaissances
sur la pathophysiologie chez l'animal,
notamment les étapes précoces de
l'infection dans le poumon qui condi-
tionnent le contrôle et l'élimination de
Mb versus sa survie et dissémination.

■ Physiologie du poumon et immunité

La grande sensibilité des bovins aux
infections respiratoires est en partie due
à la morphologie de leur système respi-
ratoire : la trachée et les bronches sont
étroites et les poumons sont petits et
mal vascularisés par rapport à la masse
corporelle (Veit et Farrell, 1978). Le
volume respiratoire est ainsi réduit par
rapport à d'autres mammifères de poids
équivalent comme le cheval (Gallivan
et al., 1989). Pour pallier ce manque d'ef-
ficacité, les bovins sont obligés d'ins-
pirer beaucoup plus d'air dans leurs
poumons pour oxygéner le sang, ce
qui augmente les risques d'infections.

Les poumons des bovins sont com-
posés de 8 lobes, 3 gauches et 5 droits
(figure 1). Cette morphologie pul-
monaire est à la fois asymétrique et
très compartimentée, avec peu de
connexions entre les lobes. L'épithélium
pulmonaire a une fonction d'échange
gazeux et également de défense. C'est
une barrière physique qui bloque l'en-
trée de molécules étrangères ou de
microorganismes. D'un point de vue
histologique, l'appareil respiratoire
est tapissé d'un épithélium qui est dit
« pseudo-tratifié en colonne », c'est-à-
dire que toutes les cellules n'atteignent
pas la surface. La structure de l'épithé-
lium varie en fonction de sa locali-
sation le long de l'arbre respiratoire
(figure 1). Son épaisseur est d'environ
60 µm dans les bronches, 10 µm dans
les bronchioles et inférieur à 1 µm dans

les alvéoles (Patton et Byron, 2007). Il
repose sur une membrane basale et un
tissu conjonctif, la lamina propria sous
laquelle se situe la sous-muqueuse, riche
en glande séromuqueuses. Au niveau
de la trachée ou des bronches, mais pas
des bronchioles, la sous-muqueuse est
attachée au cartilage. L'épithélium est
très actif, en particulier grâce à ses fonc-
tions de sécrétion (mucus, surfactant et
molécules immunitaires), d'épuration
(clairance muco-ciliaire, macrophages
alvéolaires) et de transport (ions, autres
substances). Cependant, cette vision
de l'épithélium en tant que simple
barrière physique entre l'hôte et son
environnement est réductrice. En effet,
de nombreux travaux de recherche
démontrent son implication dans l'im-
munité (Fehrenbach, 2001 ; Hippenstiel
et al., 2006 ; Tam et al., 2011 ; Vareille
et al., 2011). Les cellules épithéliales
sont dynamiques et plurifonctionnelles,
elles peuvent détecter la présence de
microorganismes via des récepteurs
spécifiques et déclencher le recrute-
ment et l'activation de cellules immu-
nitaires par la sécrétion de diverses
cytokines ou chimiokines.

L'épithélium est identique dans
les bronches et bronchioles (Rock et
Hogan, 2011), il est composé majori-
tairement de cellules ciliées, de cel-
lules caliciformes (goblet cells), de
cellules Club, de cellules basales et de
cellules en brosse (Tuft ou brush cells).
Les cellules ciliées, qui s'étendent de
la membrane basale à la surface de
l'épithélium, comportent environ 200
cils par cellule et de fines microvillo-
sités, visibles en microscopie électro-
nique à balayage. Certaines infections
diminuent le battement des cils et
la ciliogénèse, rendant plus difficile
l'épuration des voies aériennes (Mata
et al., 2012). Les cellules caliciformes
ou « Goblet cells » contiennent des gra-
nules et sécrètent le mucus, qui forme
un film continu à la surface des cils
(Hermans et Bernard, 1999). Les cellules
Club (anciennement nommées cellules
de Clara), non-ciliées, contiennent de
petits granules de sécrétion et sont
localisées dans les bronchioles termi-
nales. Ces cellules sécrètent des molé-
cules immunomodulatrices (Wang
et al., 2003) et servent de progéniteurs
pour renouveler les cellules caliciformes
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 1. Morphologie des poumons bovins et composition cellulaire.**</figcaption></figure>

Created in BioRender.com bìo

Les poumons des bovins sont composés de 8 lobes, 3 gauches et 5 droits. Au niveau des bronches et des bronchioles (caractérisées par un diamètre inférieur à 1 mm), l'épithélium est composé de cellules ciliées, de cellules caliciformes sécrétrices de mucus, de cellules basales, de cellules Club, de cellules neuroendocrines et de cellules en brosse. Au niveau des alvéoles, deux populations sont présentes : les pneumocytes de type I qui forment la paroi de l'alvéole et assurent les échanges gazeux ; et les pneumocytes de type II qui sécrètent le surfactant.

(Rock et Hogan, 2011). Les cellules Club sécrètent Scgb1a1, une uteroglobine, la protéine la plus abondante trouvée dans les fluides respiratoires (Rawlins et al., 2009) et sont également l'unique source de CC10 pour « Clara Cell secretory protein 10 » (ou CCSP), une protéine importante pour l'immunité anti-virale (Wang et al., 2003). Les cellules basales sont petites et adhèrent à la membrane basale sans atteindre la surface de l'épithélium. Ces cellules sont impliquées dans la régénération des cellules épithéliales (Inayama et al., 1988). Les cellules en brosse (Tuft cells) contiennent moins de cils que les cellules ciliées (120 cils par cellule). Leur fonction n'est pas encore connue, et différentes hypothèses ont été formulées,

notamment celle d'un rôle dans l'im-
munosurveillance, car ces rares cel-
lules sont stratégiquement localisées
au niveau des bifurcations bronchiques
(Reid et al., 2005). Elles sont décrites
chez les rongeurs et les bovins (Tizzano
et al., 2006; Tizzano et al., 2011). Leur
nombre est augmenté après une infec-
tion sévère par le virus de la grippe chez
la souris (Rane et al., 2019).

Le compartiment alvéolaire, site spé-
cifique des échanges gazeux, est très
différent des bronches et bronchioles.
Au niveau cellulaire, les sacs alvéolaires
sont composés de deux populations :
les pneumocytes de type I qui forment
la paroi de l'alvéole et assurent les
échanges gazeux et les pneumocytes

de type II qui sécrètent le surfactant,
fluide visqueux d'une part essentiel au
maintien de l'élasticité de l'alvéole lors
des mouvements mécaniques d'inspi-
ration-expiration et d'autre part proté-
geant le poumon contre les agressions
et les agents infectieux (molécules de
défenses, opsonisation) (Fehrenbach,
2001). À l'intérieur des alvéoles, des
macrophages alvéolaires assurent
un rôle de sentinelle et patrouillent
les alvéoles (en proportion 1 macro-
phage pour 2-3 alvéoles) (Neupane
et al., 2020 ; Remot et al., 2021). En cas
d'agression, d'autres cellules immuni-
taires sont recrutées dans le poumon,
grâce aux signaux envoyés par les cel-
lules épithéliales et les macrophages
alvéolaires (Fehrenbach, 2001).
## ■ Comment mimer le poumon in vitro ?

Mieux comprendre le fonctionnement normal ou pathologique du poumon et sa réponse aux agressions nécessite de disposer de modèles manipulables en laboratoire, et permettant de multiplier et reproduire les conditions testées. Comme expliqué ci-dessus, les voies aériennes conductrices et respiratoires sont tapissées d'un épithélium hautement spécialisé qui assure l'interface avec le micro-environnement interne et l'environnement externe. La surface apicale de l'épithélium est exposée à l'air et aux substances inhalées, tandis que la surface basale est en contact avec la muqueuse sous-jacente (matrice extra-cellulaire, cellules interstitielles et système vasculaire). L'interface air-liquide (ALI) uniquement présente dans les voies respiratoires explique pourquoi l'épithélium joue le rôle de première ligne de défense contre les particules, les toxines et les pathogènes inhalés (Nicod, 1999 ; Gohy et al., 2020). L'architecture complexe du poumon et notamment l'interface ALI qui le caractérise, est difficile à reproduire *in vitro* et constitue un vrai challenge méthodologique. En effet, mimer un poumon *in vitro* implique : i) de reproduire la complexité des voies respiratoires, de ses différentes régions (bronches-bronchioles versus alvéoles) et de ses différents types cellulaires ; ii) de reproduire des fonctions spécifiques de protection du poumon par la sécrétion de mucus spécifique (piégeage des matières externes) et par une activité de battement ciliaire active (élimination des matières piégées dans le mucus), et iii) d'imiter l'espace alvéolaire où les échanges gazeux essentiels se produisent à travers une fine couche de cellules épithéliales vers le système vasculaire. Aujourd'hui encore, les modèles *in vitro* largement utilisés dans les laboratoires sont des versions très simplifiées de la microarchitecture, la matrice extracellulaire et/ou le micro-environnement, et ils ne représentent que partiellement la diversité des populations cellulaires. Les cellules épithéliales pulmonaires différenciées adultes restent difficiles à isoler en raison de leur faible taux de renouvellement. Elles perdent rapidement leur phénotype

en culture, elles peuvent présenter une grande variabilité dans la composition cellulaire d'un isolement ou d'un animal à l'autre, et ne peuvent souvent être développées que par dédifférenciation. Par ailleurs, les quelques lignées cellulaires immortalisées d'épithélium pulmonaire disponibles commercialement (A549, 16-HBE, Calu-3...) montrent un niveau de différenciation relativement limité. Cependant, des progrès remarquables ont été réalisés ces dernières années (cultures polarisées 2D, culture dans des matrices extracellulaires 3D, organoïdes) aboutissant à des modèles *in vitro* plus proches de la physiologie du poumon. La grande majorité des protocoles publiés sont développés à partir de tissus murins et humains, avec description des méthodes d'isolement et de culture des cellules épithéliales pulmonaires en épithélium polarisé (2D), à l'interface ALI, dans des matrices 3D ou organoïdes. Peu de données sont disponibles sur d'autres espèces animales notamment celles d'intérêt agro-nomique. Cependant plusieurs articles sur les cellules pulmonaires porcines (Xie et al., 2018), bovines (Cozens et al., 2018a ; Cozens et al., 2018b ; Lee et al., 2018 ; Lee et Chambers, 2019), équines (Abs et al., 2019) et ovines (Archer et al., 2007 ; Archer et al., 2013) méritent d'être cités.

Les approches *in vitro* telles que les coupes de précisions de poumons (PCLS) ont l'avantage de conserver un degré de complexité cellulaire, et de préserver des interactions entre cellules.

Ces différentes approches fournissent des outils précieux pour mieux comprendre les interactions hôtes/pathogènes, évaluer la pathogénicité des agents biologiques, et mieux prédire l'efficacité de traitement préventif ou curatif. Par ailleurs, ces approches sont des méthodes alternatives à l'expérimentation animale qui permettent de répondre au principe éthique des 3R : Remplacement des animaux par des alternatives si possible, Réduction du nombre d'animaux en expérimentation et Raffinement des protocoles expérimentaux. Dans cette revue, nous détaillerons des nouveaux modèles *in vitro*, organoïdes et culture ALI, et les approches d'explants pulmonaires (PCLS).

## 1. Organoïdes et culture Air-Liquide-Interface (ALI)

Les organoïdes sont des autoassemblages *in vitro* de différents types cellulaires, en trois dimensions (3D) qui miment l'organe natif, en termes de type cellulaires, de structure, d'architecture et de fonctions. Cette organisation en 3D permet des interactions cellule-celule et cellule-matrice biologiquement pertinentes. Les organoïdes sont générés à partir de cellules souches ou de progéniteurs selon un processus qui simule les étapes moléculaires et cellulaires du développement de l'organe, en l'occurrence ici le poumon (figure 2).

Ces organoïdes peuvent être mis en culture sur des membranes sur lesquelles les cellules s'organisent en 2D en couches pluristratifiées polarisées, dont la face apicale est en contact avec l'air et la face basale en contact avec le milieu nutritif (figure 3F).

Lorsqu'elles sont établies en 3D grâce aux matrices extracellulaires, ces cultures peuvent reproduire l'architecture *in vivo*, l'organisation spatiale et la diversité génétique des populations cellulaires présentes dans l'organe d'origine avec une fidélité remarquable. En tant que structures 3D autoorganisées et auto-renouvelables, les organoïdes présentent un avantage certain par rapport à la culture en monocouche car ils sont un modèle plus proche de la structure physiologique.

### ■ 1.1. Quelles cellules de départ ?

#### a. Cellules souches et progéniteurs du poumon

Le poumon adulte a la particularité d'être un tissu hautement quiescent avec un taux de renouvellement cellulaire faible (< 1 % par jour) des épithéliums des voies respiratoires et des alvéoles (Kotton et Morrisey, 2014). Cependant, et en réponse à une lésion tissulaire, il montre une extraordinaire capacité de régénération avec multiplication et/ou différentiation de cellules progénitrices et restauration des fonctions. Bien que précédemment basée sur des études morphologiques
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 2.** Représentation schématique des différents stades de développement du poumon.</figcaption></figure>

En jaune/orange, les stades de développement et les gènes caractéristiques de chaque stade, exprimés. En gris, Les voies de signalisation impliquées dans l'induction des différents stades : Activation (flèche montante) ou inhibition (flèche descendante) des voies. En violet, les sources de cellules utilisées par les équipes de recherche pour l'obtention des modèles *in vitro*.

et ultrastructurales, la connaissance de
la diversité des cellules pulmonaires
et de leur lignage complexe (cellules
souches pluripotentes, progéniteurs
multipotents) a dernièrement fait un
grand pas grâce aux approches de tra-
cage de lignées cellulaires, des analyses
par cytométrie en flux, des méthodes
de séquençage de l'ARN de cellules
uniques, de protéomique, de transcrip-
tomique et aux progrès de l'imagerie.
De nombreuses revues décrivent les
différentes populations de cellules
souches pulmonaires, principalement
caractérisées chez l'homme et la souris
(Rawlins et Hogan, 2006 ; Morrisey et
Hogan, 2010 ; Rackley et Stripp, 2012 ;
Kotton et Morrisey, 2014 ; Schilders
et al., 2016). Les descriptions de cellules
souches pulmonaires chez d'autres
mammifères tels que les animaux d'éle-
vage sont encore très rares, à l'excep-
tion de notre travail sur l'identification
de progéniteurs bronchoalvéolaires

ovins à double potentiel de différen-
ciation (Archer et al., 2013).

b. Organoïdes dérivés de cellules souches embryonnaires ou de cellules souches pluripotentes induites (iPS)

L'une des premières descriptions de
la culture d'organoïdes pulmonaires a
été publiée par Zimmermann (1987). En
isolant et en cultivant des cellules pro-
venant de fœtus de souris, l'auteur a pu
générer une structure organoïde, avec
la formation d'une lumière au centre
des agrégats organisés, la différen-
ciation des cellules vers le type pneu-
mocytes de type II (présence de corps
lamellaires) et la production d'une
matrice par les cellules mésenchyma-
teuses entourant les organoïdes. Bien
que ces premières expériences aient
ouvert la voie à la production in vitro
d'organoïdes pulmonaires à partir de

différentes espèces, le processus de
culture reste complexe et nécessite de
reproduire les étapes spécifiques de
la différenciation du tissu pulmonaire,
avec activation ou inactivation de voies
de signalisation clés régulant le déve-
lopment embryonnaire du poumon
(figure 2) (Tadokoro et al., 2016 ; Chung
et al., 2018). Des approches étape par
étape ont été établies avec succès
pour la différenciation des Cellules
Souches Embryonnaires (CSE) en cel-
lules fonctionnelles des voies respira-
toires et alvéolaires (Wang et al., 2007 ;
Longmire et al., 2012). Dans la première
étape de l'induction en différenciation
des cellules souches, l'Activin-A, qui
appartient à la voie de signalisation du
facteur de croissance transformant β
(TGFβ), joue le rôle clé déclencheur
dans l'activation de la spécification de
l'épiblaste vers la couche germinale
de l'endoderme. L'inhibition de cette
même voie permet ensuite de conduire
les cellules dans la lignée de l'intestin primitif antérieur. Ensuite, l'activation des voies de signalisation Wnt et FGF permet la différenciation des cellules en progéniteurs pulmonaires, puis en progéniteurs des bronches ou des alvéoles (figure 2). En plus de l'activation fine et séquentielle de voies de signalisation très spécifiques, l'obtention des cultures en 3D ou organoïdes nécessite de cultiver les cellules enchâssées dans une matrice gélatineuse issue d'extrait de membrane basale ; cette matrice participe physiquement à l'architecture de la structure et favorise, de par ses propres facteurs biochimiques, la maturation cellulaire. Plus de 40 jours de ces protocoles très précis et séquentiels sont nécessaires pour aboutir à des organoïdes différenciés.

Une autre source de cellules souches possible est les cellules souches pluripotentes induites, appelées « iPSC ». Elles sont issues de cellules somatiques (fibroblastes de peau par exemple) et ont été reprogrammées génétiquement (expression des facteurs OCT4+, SOX2+, SSEA4+, TRA1-60+) dans un état semblable à celui d'un embryon. Ces iPSC ont plusieurs avantages : il est possible de i) les produire en grande quantité et les conserver, ii) les différencier en de nombreux types cellulaires ; iii) générer des cultures à partir d'individus ou d'animaux d'espèces différentes. Afin de transformer les iPSC en épithélium pulmonaire, il est nécessaire, comme pour les CSE, de suivre un protocole de différenciation par étapes afin de générer des cellules de l'endoderme définitif (facteurs CXCR4+, SOX17+, FOXA2+), puis des cellules de l'endoderme de l'intestin antérieur (NKX2.1+, PAX9+, SOX2+) et, par la suite, d'obtenir des populations de cellules basales, caliciformes, ciliées, clubs, pneumocytes de type I et de type II. Huang et al. ont rapporté une méthode optimisée pour générer des cellules progénitrices FOXA2+NKX2.1+ à partir de cellules endodermiques humaines définitives avec un taux d'efficacité de 86 % (Huang et al., 2014). Ces progéniteurs ont donné naissance à des cellules basales, des cellules club, des cellules caliciformes, des cellules ciliées, des pneumocytes de type I et de type II. Les pneumocytes de type

Il dérivés d'iPSC humaines présentent une capacité d'auto-renouvellement et pourraient présenter une réactivité immunitaire (Ghaedi et al., 2013 ; Jacob et al., 2017 ; Yamamoto et al., 2017).

### c. Organoïdes dérivés de cellules souches adultes

Pour surmonter la complexité et la lourdeur des protocoles de différenciation des cellules souches pluripotentes (CSE ou iPSC), de nouvelles approches ont été développées à partir de tissus adultes, en tirant parti du potentiel d'autorenouvellement et de différenciation des cellules souches résidantes. Parmi toutes les cellules épithéliales qui tapissent les voies respiratoires, les cellules basales (région trachéobronchique), les cellules Club et les cellules souches broncholoalvéolaires-BASC (région bronchio-laire), les pneumocytes de type II (régions alvéolaires) sont capables de générer des organoïdes chez la soumis et l'homme (Choi et al., 2016). Les variations de protocoles incluent la composition des milieux (hormones de croissance spécifiques, activateurs ou inhibiteurs de voies spécifiques), des étapes d'isolement différentiel de cellules souches/progéniteurs spécifiques, la coculture avec ou sans cellules stromales, et l'éventuelle première étape de culture en conditions 2D avec une interface air-liquide (ALI) avant la culture en matrice. Les facteurs les plus importants dans la génération d'organoïdes pulmonaires à partir de cellules souches adultes impliquent les voies d'activation WNT et FGF, et de répression ROCK, MAPK, TGF et BMP. Récemment, Salahudeena et ses collègues ont mis au point une culture reproductible de progéniteurs pulmonaires humains distaux sous forme d'organoïdes dérivés de cellules basales (KRT5+) ou de pneumocytes de type II. Les organoïdes issus de pneumocytes de type II présentaient un potentiel de transdifférenciation en pneumocytes de type I, tandis que les organoïdes issus de cellules basales développaient progressivement des lumières tapissées de cellules ciliées et de cellules Club différenciées (Salahudeen et al., 2020). Outre le tissu pulmonaire prélevé par voie chirurgicale, des organoïdes ont

pu être générés à partir de la culture de cellules épithéliales pulmonaires prélevées dans le liquide de Lavage Broncho-Alvéolaire (LBA) (Sachs et al., 2019).

## 1.2. Des organoïdes et des cultures pulmonaires en ALI pour étudier les interactions hôte-pathogènes

Dans l'ensemble, ces protocoles donnent naissance à des organoïdes composés de populations épithéliales pulmonaires proximales et/ou distales qui peuvent être développés à long terme, amplifiés, congelés, exposés à différents stimuli et analysés (Dye et al., 2016 ; Barkauskas et al., 2017 ; Chen et al., 2017 ; Miller et al., 2019 ; Deprez et al., 2020 ; Li et al., 2020). Comme mentionné ci-dessus, tous les protocoles ont quasiment tous été développés et testés sur cellules humaines et murines. À l'heure actuelle, aucun exemple d'organoïde pulmonaire d'animaux domestiques utilisant des cellules souches pluripotentes n'a été publié. Sur la base des protocoles d'organoïdes pulmonaires humains, nous avons réussi à obtenir des organoïdes pulmonaires bovins et des cultures air-liquide-interface ALI, à partir de poumons embryonnaires (résultats non publiés), prélevés à différents stades de maturation (figure 3 A, F). Ces deux types de cultures ont montré un niveau élevé de différentiation et de fonctionnalisation avec présence des différents types cellulaires des voies aériennes (bronches, bronchioles) et des alvéoles (figure 3 B-E, G-J), de cellules ciliées, cellules basales, pneumocytes de type I et pneumocytes de type II. Que ce soit en conditions de culture 3D organoïdes ou en conditions ALI, l'activité des cils des cellules ciliées est observable en microscopie optique et l'architecture typique des cils est observable en microscopie confocale et microscopie électronique (figure 3 D, E, H, J). La fonction de sécrétion des cellules est mise en évidence par l'observation de mucus à la surface des cultures ALI et à l'intérieur des organoïdes, ainsi que des corps lamellaires (vésicules spécialisées dans la sécrétion du surfactant) dans les pneumocytes de type II (figure 3 C, I).
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 3.** Modèles pulmonaires bovins issus de poumons embryonnaires en organoïde et en interface Air-Liquide (ALI).</figcaption></figure>

A : Illustration et représentation schématique de la culture en organoïde en goutte de Matrigel®. B : Organoïdes amplifiés en goutte de Matrigel®. C : Pneumocyte de type II de l'alvéole avec corps lamellaires (CL, flèches blanches) caractéristiques de ce type cellulaire en microscopie électronique à transmission. D, E, H : Cellules ciliées (Cils, flèche noire) de la bronche et la bronchiole en (D) microscopie photonique et en (E, G) microscopie électronique à transmission. F : Illustration et représentation schématique de la culture en ALI. G : Cellules embryonnaires cultivées en ALI pendant 16 jours. I, J : Doubles marquages immunofluorescents des cellules en culture en interface air-liquide. Mise en évidence de la présence de pneumocytes de type I (pl) et II (pll) de l'alvéole et des cellules basales et ciliées de la bronche et bronchiole, microscopie confocale.

Ces organoïdes et ces cultures ALI permettent d'étudier l'infection par différents pathogènes bovins problématiques (RSV, *Mycobacterium bovis*, *Mycoplasma bovis...*). Pour cela, les organoïdes ou les cultures ALI sont exposés aux différents pathogènes soit

par microinjection (organoïdes) soit par mise en contact à la face apicale des ALI. Le modèle ALI permet un contrôle aisé de la dose infectieuse, du suivi de la réponse cellulaire à l'infection (immunomarquages, dosages de cytokines dans le surnageant... **figure 4**). Le ciblage

spécifique de certains types cellulaires (tropisme) et les dérégulations cellulaires induites par les différents pathogènes sont à l'étude dans nos laboratoires, ainsi que le criblage de molécules thérapeutiques afin de proposer des nouveaux traitements anti-infectieux.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 4.** Infection du modèle de culture ALI par des pathogènes bovins.</figcaption></figure>

A, B : Doubles marquages immunofluorescents des cellules infectées par une souche de RSV bovin à 48 h (A) et 6 jours (B) post-infection. Mise en évidence de l'évolution de l'infection de cellules ciliées par le virus RSV (rouge + vert). C : Double marquage immunofluorescent des cellules infectées par une souche de mycoplasme bovin à 8 h post-infection, microscopie confocale. D : Marquage immunofluorescent des cellules infectées par une souche de mycobactérie fluorescente GFP (vert) bovine à 48 h post-infection, microscopie confocale.
## 2. Le modèle des explants de poumon ou PCLS (« Précision-Cut Lung Slices ») pour étudier le tissu pulmonaire natif

L'utilisation des PCLS présente l'avantage de réduire le nombre d'animaux nécessaire à une étude tout en augmentant le nombre de paramètres pouvant être analysés en parallèle (Sewald et Braun, 2013). Elles peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs jours (Goris et al., 2009). Si l'on compare les PCLS à des cellules isolées en culture (lignées ou cultures primaires), l'intégrité du tissu est conservée, si bien que les interactions et les différences de répartition des particules infectieuses dans les différents compartiments tissulaires peuvent être analysées. Chez le poulet et le bovin, les macrophages alvéolaires conservent leur capacité dynamique in situ et restent mobiles à l'intérieur de la PCLS en réponse à une infection bactérienne (Bryson et al., 2020; Remot et al., 2021).

Les PCLS sont obtenues stérilement grâce au « Alabama R&D Tissue Slicer » (anciennement appelé Krumdieck Tissue Slicer), qui est un microtome dans lequel circule un milieu stérile permettant la survie du tissu (Smith et al., 1985). Les explants de poumons sont réalisés à partir de prélèvements post-mortem, par exemple dans les abattoirs commerciaux pour le bovin. Au laboratoire, le lobe accessoire droit bovin est rempli à l'aide d'une canule avec du milieu de culture (RPMI) et de l'agarose à bas point de fusion chauffé puis maintenu à 38 °C. Pour des plus petits animaux, comme la souris par exemple, l'intégralité de la lumière des poumons est remplie d'un mélange RPMI/agarose *via* une canule insérée dans la trachée. Le lobe de poumon gonflé avec le mélange RPMI/Agarose est ensuite placé sur un champ stérile sur lit de glace. Cette étape permet de préserver la structure pulmonaire avant de réaliser des biopsies à l'aide d'un punch de 8 mm de diamètre. Les punches sont insérés dans l'appareil Alabama R&D Tissue Slicer, placé sous un PSM en condition stérile. Les PCLS sortent avec un débit moyen de 1 coupe toutes les 3,5 secondes, leur épaisseur peut varier

entre 100 et 1000 µm. Les coupes sont placées dans des plaques de culture cellulaire et incubées à 37 °C 5 % CO₂, le milieu sera changé toutes les 30 min pendant 2 h pour enlever toute trace d'agarose. Ainsi, il est possible de préparer de très fines coupes, d'épaisseur bien calibrée et de les mettre en contact in vitro avec des ligands ou des pathogènes afin d'étudier la réactivité des PCLS à l'exposition (Goris et al., 2009). Il est possible d'évaluer la viabilité des explants pulmonaires par différentes méthodes comme l'observation de l'activité ciliaire des cellules ciliées des bronchioles, le marquage des mitochondries (MitoTracker Deep Red, figure 5A et B) ou la quantification de la libération de la lactate déshydrogénase (LDH, figure 5C et D).

La réponse du tissu à une infection peut également être mesurée par le dosage des médiateurs (cytokines, chimiokines, molécules antimicrobiennes...) dans le

surnageant de culture (protéines) ou dans le tissu (transcrits ARN). De nombreux travaux ont montré des résultats comparables entre des études menées *in vivo* et *in vitro* en utilisant le modèle PCLS. Par exemple, sur PCLS murines, humaines et porcines, utilisées respectivement pour étudier la bronchoconstriction induite en réponse à des allergènes (Henjakovic et al., 2008), la réponse immunologique à différents ligands de TLR (Switalla et al., 2010; Marquant et al., 2021) et la virulence de différents sous-types de virus influenza A porcins (Meng et al., 2013), les résultats obtenus sur PCLS concordaient avec ceux obtenus *in vivo* sur l'Homme ou l'animal. La présence de *Mycobacterium bovis* GFP a pu être visualisée dans les macrophages alvéolaires suite à l'exposition de PCLS bovins à la bactérie (figure 6A). Par des techniques d'immunofluorescence ou de microscopie électronique, des équipes allemandes ont localisé et suivi

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 5.** Étude de la survie de PCLS dans le temps ou selon différentes stimulations.</figcaption></figure>

Le marquage des mitochondries vivantes des cellules (coloration rouge) a été réalisé par incubation avec le MitoTracker® Deep Red 24 h (A) ou 48 h (B) après obtention des PCLS de souris adultes. Les noyaux ont été marqués au DAPI (bleu). Les images ont été obtenues au microscope confocal (grossissement x40). C PCLS de veaux ont été incubées 24 h en présence de différents ligands de TLR (LPS, CpG et polyl-C) ou avec le milieu de culture seul. D PCLS de souris adultes ont été incubées 6 h et 24 h en présence de différents ligands de TLR (LPS, CpG et polyl-C) ou avec le milieu de culture seul. Les symboles correspondent au nombre d'animaux testés (n = 2 souris). La cytotoxicité tissulaire est exprimée en pourcentage d'activité de lactate déshydrogénase (LDH) dans le surnageant de culture par rapport à la totalité de l'activité LDH (tissu et surnageant). La moyenne est représentée en histogramme.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 6.** Visualisation par immunohistochimie ou bioluminescence de la présence de pathogènes dans les PCLS.</figcaption></figure>

A : Détection de Mycobacterium bovis-GFP ou (B) du VRS bovin dans des PCLS bovines exposées aux pathogènes 48 h post infection. Les noyaux ont été marqué au DAPI (marquage bleu). La bactérie Mycobacterium bovis est visualisée directement par le GFP qu'elle exprime suite à la modification génétique de la bactérie. La détection du VRS bovin-GFP a été amplifiée par immunomarquage de la protéine F du virus grâce à un anticorps anti-F couplé au fluorochrome Alexa 488 (marquage vert). L'anticorps anti-pancytokeratine couplé à l'APC permet de visualiser les cellules épithéliales (marquage rose). Les cellules immunitaires type macrophages sont détectées par un anticorps anti-CMH-II marqué à l'Alexa 555 (marquage rouge) et les cellules dendritiques par un anticorps anti-DC-SIGN couplé à l'Alexa647 (marquage rose). C : Quantification de la bioluminescence induite par le VRS-luciférase dans des PCLS de souris adultes 48 h post-infection. Les PCLS ont été infectées avec 55 000 pfu, 5 500 pfu ou 550 pfu de VRS-luciférase ou incubées avec la préparation témoin (mock) pendant 48 h. Le substrat de la luciférase a été ajouté sur les PCLS à 48 h. L'émission de photons est quantifiée grâce au système Ivis®. Une image digitale pseudo-colorée est générée en fonction de l'émission de photons par seconde par surface de tissu (radiance).

la réplication du VRS au sein de cellules épithéliales pulmonaires grâce aux PCLS murines ou bovines (Ebsen et al., 2002 ; Goris et al., 2009, figure 6B). La réplication virale dans les PCLS peut aussi être visualisée par émission de bioluminescence. Des PCLS issues d'une souris adulte ont été infectées par des doses croissantes de VRS codant la luciférase (VRS-Luc, 550, 5 500 et 55 000 pfu). La production de la luciférase reflète la réplication du VRS-Luc (Rameix-Welti et al., 2014). Chaque lecture de bioluminescence est précédée par l'ajout du substrat (lucéfrine) de l'enzyme (luciférase) sur les PCLS murines (figure 6C). La bioluminescence émise lors de la réplication du VRS est proportionnelle à la dilution de la charge virale lors de l'inoculation du virus initialement déposée sur les PCLS (figure 6C).

Toutefois, en raison de la viabilité tisulaire limitée dans le temps et de l'ab-

sence de connections avec les réseaux lymphatiques et sanguins, il est impossible d'obtenir des informations sur une infection persistante ou sur des phénomènes de recrutements cellulaires (Ebsen et al., 2002).

### 3. L'avenir de ces modèles

D'un point de vue éthique et sociétal, le développement de méthodes alternatives à l'expérimentation animale est aujourd'hui une nécessité. Les nouvelles méthodes alternatives doivent satisfaire à un ou plusieurs principes des règles des 3R : remplacement (substitution des modèles animaux chaque fois que cela est possible), réduction (réduction du nombre d'animaux dans l'expérimentation), et raffinement (optimisation de la méthodologie appliquée aux animaux).

Les PCLS permettent de travailler avec un explant de poumon dont l'architecture est préservée, et on y retrouve toutes les cellules résidentes au moment du prélèvement du tissu. À l'intérieur d'un incubateur au laboratoire, les cellules sont en présence du même taux d'oxygène que celui de l'air (21 % O₂). Or dans les organes, ce taux est bien inférieur (et propre à chacun), on parle de physioxie. Cette notion est très peu prise en compte dans les études en biologie. Paddenberg et al. (2014) ont démontré une fluctuation des phénomènes de vasoconstriction d'artères en fonction du taux d'oxygène sur des PCLS murines. À l'avenir, des études d'infection de PCLS en conditions physioxiques permettraient de mimer plus fidèlement l'environnement pulmonaire et d'obtenir des analyses plus pertinentes des voies biologiques mises en jeu. Pour pallier le manque de recrutement cellulaire post-infection, l'ajout de
cellules comme les neutrophiles ou les lymphocytes peut également être envisagé dans les puits de culture.

Les organoïdes peuvent pallier le manque actuel de modèles pulmonaires *in vitro*, pertinents et efficaces, en tirant parti de la plasticité des cellules souches. En effet, bon nombre des limitations citées ci-dessus peuvent être surmontées en générant des organoïdes à partir de progéniteurs, de cellules souches pluripo-tentes, de cellules souches embryonnaires ou d'IPS qui sont facilement amplifiables. Des progrès sont constamment réalisés dans l'établissement de cultures d'or-ganoïdes physiologiques et pertinents, dans lesquelles de multiples types de cellules (stromales, endothéliales, immu-nitaires, nerveuses) sont combinés. Nous comprendrons ainsi comment les diffé-rents types cellulaires et compartiments, communiquent entre eux *in vivo* et com-ment ils sont affectés par les altérations telles que l'inflammation, les infections ou le vieillissement (Shojaie et al., 2015 ; Leeman et al., 2019). Toutefois, pour avan-cer dans cette voie, le perfectionnement des modèles d'organoides pulmonaires nécessitera l'identification d'un plus grand nombre de marqueurs de sur-face et/ou de rapporteurs pour isoler et purifier les sous-populations de cellules souches et progénitrices et de cellules de soutien stromales.

Il est également probable que les composants de la matrice extracellulaire (MEC) et les forces physiques jouent des rôles clés dans la régulation du comporte-ment et de la différenciation des cellules souches, et ces paramètres commencent également à être explorés à l'aide de sys-èmes organoïdes. La MEC du poumon natif est complexe et façonne le microen-vironnement cellulaire en fournissant des indices structurels, en régulant l'accès aux facteurs de croissance solubles et en contrôlant l'adhésion et la migration des cellules. Afin de créer un environnement physiologique pour les cellules pulmonaires, les chercheurs se sont tour-nés vers des approches de bioingénierie pour créer une variété d'échafaudages structurels (Matrigel, collagène, maté-riau synthétique tel que le PLGA...) et de micro-environnements pour imiter de manière reproductible le poumon (Shojaie et al., 2015).

Afin de modéliser les forces mécaniques du poumon (inspiration, expiration), les bioingénieurs développent des micro-systèmes innovants appelés « poumons sur puce » (*lung on a chip*), dans lesquels l'emplacement et la force mécanique exercée sur chaque cellule sont minutieu-sement définis pour modéliser à la fois les petites voies aériennes et l'étirement qui se produit dans le compartiment alvéolaire. Dans le poumon alvéolaire sur puce, les éléments structurels, fonction-nels et mécaniques de l'interface entre les alvéoles et le réseau capillaire ont été modélisés par un dispositif microflui-dique contenant deux canaux séparés par une fine membrane flexible recouverte de protéines de la MEC. Des cellules endo-théliales vasculaires sont cultivées dans une chambre, et des cellules épithéliales alvéolaires pouvant également être expo-sées à l'air sont cultivées dans l'autre. La régulation contrôlée de l'étirement de la membrane et des flux de fluides dans la chambre vasculaire permet d'étudier le passage de matériaux, de nutriments ou d'agents pathogènes de la région alvéo-laire au compartiment vasculaire. Ces sys-èmes modèles sont les seuls à intégrer un étirement mécanique contrôlé et un contrôle du flux de liquide pour simuler la fonction physiologique au niveau de l'organe (Nichols et al., 2014 ; Ishahak et al., 2020 ; Pasman et al., 2020). Park et al ont développé un système de coculture cel-lules épithéliales-cellules mésenchyma-teuses-cellules endothéliales sur puce en utilisant différents compartiments pour cultiver séparément les voies aériennes et la partie vasculaire. Ces compartiments ou chambres de culture étant communi-cants entre eux, ils ont pu étudier la com-munication entre les différents types de cellules (Park et al., 2018). Par rapport à une culture ALI, le contact avec le com-partiment vasculaire (contenant éga-lement des fibroblastes) entraîne une différenciation épithéliale plus robuste des voies respiratoires (mise en évidence par le nombre de cellules caliciformes et de cellules ciliées présentes) ainsi qu'une intégrité accrue de la barrière épithéliale (résistance transépithéliale plus éle-vée). Ces résultats soulignent l'avantage des modèles *in vitro* modulaires, où les réponses intégrées peuvent être com-parées à celles des cocultures monocel-lulaires pour identifier les éléments de communication inter-cellule et analyser

leur impact. Une fois encore, tous ces développements sont actuellement réa-lisés dans des modèles humains, mais ils devraient également profiter à d'autres espèces de mammifères.

## Conclusion

Les organoïdes, les cultures 2D ALI et les PCLS sont des modèles *in vitro* qui miment la structure tridimensionnelle du poumon, qui reflètent sa composi-tion multicellulaire et reproduisent dans une certaine mesure ces fonctionnalités (production de mucus, activités ciliaires). Les avantages et limites de ces systèmes sont reportés dans le **tableau 1**.

Ils peuvent être développés à par-tir de différentes sources de cellules souches (embryonnaires, iPS, adultes) et de tissus (poumon embryonnaire ou adulte) et constituent une méthode réaliste pour étudier la physiologie et le développement des tissus et des organes, tout en limitant l'expérimen-tation animale. En plus d'apporter des outils précieux et puissants pour l'étude des maladies infectieuses comme décrit dans cette revue, et le test de molécules thérapeutiques, ces nouveaux modèles *in vitro* peuvent couvrir de nouveaux champs d'applications. D'un point de vue génétique, il est possible de générer des organoïdes d'espèces, de races et d'animaux différents, ce qui permet de générer des biobanques de références et de travailler sur nos espèces d'intérêt agronomiques, tout en tenant compte de la diversité génétique de différentes races de bovins, ainsi que la diversité génétique inter-individuelle au sein d'un troupeau. La diversité génétique des organoïdes générés peut permettre de mieux appréhender les différences inter-races ou inter-individuelles de la réponse aux pathogènes ou une certaine résilience d'une race par rapport à une autre. Bien que plus appliqués à la santé humaine pour le moment, les organoïdes pulmonaires sont des ressources importantes pour la modélisa-tion des maladies autres qu'infectieuses, notamment génétiques ou cancéreuses ainsi que pour le dépistage de médi-caments et de thérapies appropriés (Clevers, 2016 ; Ramamoorthy et al., 2019 ; Strikoudis et al., 2019 ; Wang et al.,
<table><caption>**Tableau 1. Avantages et limites des modèles in vitro.**</caption><thead><tr><th></th><th>Avantages</th><th>Limites</th></tr></thead><tbody><tr><td>PCLS</td><td><ul><li>Architecture tissulaire préservée ; Complexité cellulaire préservée</li><li>Différentiation complète des cellules et activité ciliaire</li><li>Présence des macrophages alvéolaires</li><li>Interactions cellulaires préservées</li><li>Rapidité d'obtention</li><li>Reproductibilité (calibrage explants)</li><li>Grand nombre de PCLS à partir d'un seul animal, permettant de nombreux tests</li><li>Coût des expériences</li><li>Réplicas biologiques possibles tout en respectant les impératifs éthiques de remplacement/réduction des animaux en expérimentation</li></ul></td><td><ul><li>Manque le recrutement des cellules sanguines post-infection</li><li>Maintien limité dans le temps (mortalité cellulaire au bout de quelques jours)</li><li>Pas de congélation possible</li><li>Absence de mouvements contractiles</li><li>Pas d'interface air-liquide</li><li>Infection peu physiologique (le pathogène est ajouté dans le puits de culture et a accès à tous les types cellulaires)</li></ul></td></tr><tr><td>Organoïdes – 3D</td><td><ul><li>Complexité cellulaire préservée</li><li>Interactions cellulaires préservées</li><li> Fonctionnalité avec activité ciliaire observable et production de mucus/surfactant</li><li>Maintien des organoïdes par passages</li><li> Congélation et décongélation possible. Biobanquing</li><li> Réplicas biologiques possibles tout en respectant les impératifs éthiques de remplacement/réduction des animaux en expérimentation</li></ul></td><td><ul><li>Complexité de la composition du milieu de culture</li><li> Coût de culture cellulaire (matrigel et autres suppléments du milieu de culture)</li><li> Difficulté d'accès à la face apicale des cellules cibles (matrice entourant l'organoïde, orientation dans l'organoïde)</li><li> Manque le recrutement des cellules sanguines post-infection</li><li> Manque vascularisation</li><li> Différentiation des cellules non totale</li><li> Absence de mouvements contractiles</li></ul></td></tr><tr><td>Tapis cellulaire 2D en ALI</td><td><ul><li>Complexité cellulaire préservée</li><li>Interface physiologique en système ALI</li><li> Fonctionnalité avec activité ciliaire mesurable, production de mucus/surfactant et résistance transépithéliale mesurable</li><li> Bonne orientation de l'épithélium (pôle apical et basal)</li><li> Facilité d'infection, accès à la face apicale simplifiée</li><li> Possibilité de contrôler les doses infectieuses (calcul MOI)</li><li> Facilité d'ajout de cellules en co-culture (macrophage par exemple)</li><li> Analyse simplifiée des facteurs libérés par les cellules (cytokines...)</li><li> Amplification, congélation, décongélation, passages</li></ul></td><td><ul><li>Complexité de la composition du milieu de culture</li><li> Coût de culture cellulaire (Transwell et autres suppléments du milieu de culture)</li><li> Absence de mouvements contractiles</li></ul></td></tr></tbody></table>

2020). Des approches de thérapie géné- tique sont testées sur les organoïdes pulmonaires humains pour corriger des mutations de certains récepteurs défectueux des cellules pulmonaires (Récepteur CFTR impliqué dans la mucoviscidose) (Ruan *et al.*, 2019). Une autre application possible touche à la médecine régénérative avec l'utilisation des organoïdes comme source durable de cellules fonctionnelles d'une part et comme outil de criblage de molécule stimulant la multiplication d'un type cellulaire spécifique afin de promouvoir son renouvellement dans des patholo- gies. À ce jour, ces nouveaux modèles *in vitro* efficaces sont principalement développés chez l'homme, mais des efforts doivent être faits pour s'assurer qu'ils peuvent bénéficier aux animaux

domestiques et apporter de nouveaux outils en adéquation avec les espèces d'intérêt. En conclusion, l'éventail de différents organoïdes qui peuvent être utilisés pour modéliser divers aspects du développement, de l'homéostasie, de la régénération et des maladies pulmonaires représente une nouvelle voie passionnante pour répondre aux questions restantes sur la biologie pul- monaire de diverses espèces d'intérêt.

## Remerciements

Les illustrations présentées dans cet article sont issues de travaux financés par le projet ANR EpiLungCell (grant ANR-17-CE20-0018), le projet Européen Veterinary Biocontained research facility

Network (VETBIONET), le projet ANIMALT FEDER/Region Centre Val de Loire (FEDER convention EX007516, Région Centre 2019-00134936, programme AE-2019- 1850) et le projet FINOVI projet Myco3D.

Les auteurs tiennent à remercier Pierre Germon, Sabine Riffault et Nathalie Winter pour leurs conseils et relecture. Les auteurs remercient la plateforme MIMA2 pour l'accès à l'ap- pareil IVIS200 qui a été financé par la région Île-de-France (SESAME). Les auteurs remercient Florence Tardy, Patrice Gaurivaud et Sandra Lacote de l'UMR MYCO (ANSES-VetAgro Sup) pour la réalisation des infections avec mycoplasmes ; et le professeur Georg Herrler qui a formé Aude Remot à l'ob- tention et l'infection de PCLS par le VRS.
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Résumé

Les maladies respiratoires, qu'elles touchent les animaux et/ou les hommes, ont un impact sanitaire et économique considérable sur notre société. Pouvoir mieux les contrôler, les traiter et les prédire, nécessite de pouvoir les étudier. Pour cela des modèles d'études pertinents, reproductibles, efficaces aisés d'utilisation, et alternatifs à l'expérimentation animale doivent être proposés. D'énormes progrès méthodologiques ont été réalisés ces dernières années avec l'émergence de modèles in vitro qui miment le poumon en reproduisant la diversité des types cellulaires, l'architecture du tissu et certaines de ses fonctionnalités (activité ciliaire, sécrétion). Cette revue présente les avancées dans la génération de ces modèles chez le bovin : les organoïdes, les cultures Air-liquide-interface (ALI) et les coupes fines de poumon (PCLS). Ils sont utilisés pour mieux décrire et comprendre les processus physiopathologiques induits par des infections (virus, bactérie, parasite) respiratoires et permettent de tester des approches prophylactiques ou curatives.

Abstract

Alternative in vitro methods for the study of host-pathogen interactions in the lungs

Respiratory diseases have a considerable health and economic impact on our society, whether they affect animals and/or humans. In order to better control, treat and predict them, it is necessary to have relevant, reproducible and efficient study models that are easy to use and alternative to animal experiments. Enormous methodological progress has been made in recent years in this field with the emergence of in vitro models that mimic the lung in terms of diversity of cell types, tissue architecture and specific functionalities (ciliary activity, secretion). This review presents advances in the generation of these models of the bovine lung, namely organoids, air-liquid-interface cultures (ALI) and thin precision-cut lung slices (PCLS). They are used to better describe and understand the pathophysiological processes induced by infections (viral, bacterial, parasitic) in the bovine lung and to test prophylactic or curative approaches.

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