# Altérations environnementales du développement du testicule fœtal : zoom sur les phtalates

## Environmental effects on development of the foetal testis: phthalates under the microscope

R. Habert · V. Muczynski · A. Lehraiki · D. Moison · R. Lambrot · C. Levacher · C. Lécureuil · R. Frydman · V. Rouiller-Fabre

Reçu le 19 octobre 2010 ; accepté le 18 janvier 2011
© SALF et Springer-Verlag France 2011

Résumé L'augmentation de plusieurs anomalies de la fonction de reproduction masculine suscite de grandes inquiétudes. Au cours des quatre dernières décennies, le nombre de spermatozoïdes chez l'homme a nettement diminué, et l'incidence du cancer testiculaire a doublé. De plus, les cas de cryptorchidie et d'hypospadias sont également en augmentation. L'hypothèse la plus couramment admise est que tous ces effets néfastes sur la fonction reproductive masculine résulteraient d'anomalies survenant lors du développement du testicule pendant la vie fœtale et néonatale. En outre, de nombreuses données épidémiologiques, cliniques et expérimentales suggèrent que ces troubles pourraient être dus aux effets de xénobiotiques appelés perturbateurs endocriniens qui sont de plus en plus concentrés et présents dans notre environnement. Parmi les perturbateurs endocriniens, nous avons choisi de focaliser cette revue sur les phtalates pour diverses raisons : 1) ils sont très répandus dans l'environnement ; 2) leurs concentrations dans de nombreux fluis des biologiques humains ont été mesurées y compris pendant la grossesse ; 3) les données expérimentales utilisant le

modèle rat et suggérant une reprotoxicité sont nombreuses et pertinentes ; 4) les effets délétères des phtalates sur le développement et sur les fonctions du testicule fœtal de rat ont largement été étudiés ; 5) quelques données épidémiologiques humaines suggèrent un effet reprotoxique des phtalates aux concentrations retrouvées dans l'environnement, au moins durant la vie néonatale. Cependant, les effets directs des phtalates sur le testicule fœtal humain n'avaient jamais été étudiés. Comme nous l'avions fait chez le rat dans les années 1990, nous avons récemment développé et validé un système de culture organotypique de testicule fœtal humain qui permet de maintenir en vitro le développement des différents types cellulaires. Dans ce système, l'ajout de $10^{-4}$ M de MEHP (mono-2-éthylhexyl phtalate), le phtalate le plus répandu, n'a aucun effet sur la production de testostérone basale ou stimulée par l'hormone lutéinisante (LH), mais il réduit le nombre de cellules germinales en augmentant leur apoptose et sans modifier leur prolifération. Nos données constituent la première donnée expérimentale montrant que les phtalates altèrent le développement du testicule fœtal humain. En outre, en utilisant le même système de culture organotypique, il est intéressant de comparer la réponse au MEHP chez l'Homme et chez les rongeurs pour analyser la pertinence des tests toxicologiques basés sur le modèle rongeur. *Pour citer cette revue : Andrologie 21 (2011).*

**Mots clés** Perturbateurs endocriniens · Testicule fœtal · Développement · Culture organotypique · Test de toxicologie in vitro · Phtalates

**Abstract** There are great concerns about the increasing incidence of abnormalities in male reproductive function. Human sperm counts have markedly dropped, and the rate of testicular cancer has clearly increased over the past four decades. Moreover, the prevalence rates of cryptorchidism and hypospadias are also probably increasing. It has been

R. Habert (✉) · V. Muczynski · D. Moison · R. Lambrot · C. Levacher · C. Lécureuil · V. Rouiller-Fabre
Laboratoire de développement des gonades,
CEA-DSV/IRCM/SCSR/LDRG,
F-92265 Fontenay-aux-Roses, France
e-mail: rene.habert@cea.fr

R. Habert · V. Muczynski · A. Lehraiki · D. Moison · R. Lambrot · C. Levacher · C. Lécureuil · V. Rouiller-Fabre
Université Paris-Diderot-Paris VII,
F-92265, Fontenay-aux-Roses, France

Inserm, unité 967,
F-92265, Fontenay-aux-Roses, France

R. Frydman
Service de gynécologie-obstétrique,
Université Paris-Sud, hôpital A.-Béclère,
F-92141 Clamart, France
hypothesized that all these adverse trends in male reproduc-
tion result from abnormalities in the development of the
testis during foetal and neonatal life. Furthermore, many
recent epidemiological, clinical and experimental data sug-
gest that these male reproductive disorders could be due to
xenobiotics termed endocrine disruptors, which are beco-
ming more and more concentrated and prevalent in our envi-
ronment. Among these endocrine disruptors, we chose to
focus this review on phthalates for different reasons: 1)
they are widespread in the environment; 2) their concentra-
tions in many human biological fluids have been measured;
3) the experimental data using rodent models suggesting a
reprotoxicity are numerous and are the most convincing; 4)
their deleterious effects on the development and function of
the rat foetal testis have been largely studied; 5) some epide-
miological data in humans suggest a reprotoxic effect at
environmental concentrations at least during neonatal life.
However, the direct effects of phthalates on human foetal
testis have never been explored. Thus, as we did for the
rat in the 1990s, we recently developed and validated an
organotypic culture system, which allows maintenance of
the development of the different cell types of human foetal
testis. In this system, the addition of 10⁻⁴ M MEHP (mono-
2-ethylhexyl phthalate), the most produced phthalate, had no
effect on basal or LH-stimulated production of testosterone,
but it reduced the number of germ cells by increasing their
apoptosis, without modifying their proliferation. This is the
first experimental demonstration that phthalates alter the
development of the foetal testis in humans. Using our orga-
notypic culture system, it is interesting to compare these
results obtained in humans with the response to MEHP in
the mouse and the rat testes to analyse the relevance of
toxicological tests based on rodent models. To cite this
journal: *Andrologie* 21 (2011).

**Keywords** Endocrine disruptors · Fetal testis · Development · Organotypic culture · In vitro toxicological assay · Phthalates

Altération de la fonction reproductive masculine

Les changements environnementaux et leurs conséquences
sur la fonction reproductive masculine sont une préoccupa-
tion majeure depuis ces 20 dernières années [1-4]. Les
altérations de la fonction de reproduction masculine ont
d'abord été observées dans la faune sauvage. De nombreuses
études décrivent les effets de contaminations de l'environne-
ment naturel par des produits chimiques estrogéniques
ou anti-androgéniques. Ces changements engendrent des
modifications subtiles, voire permanentes telles que la fémi-
nisation ou des variations du comportement reproducteur

[2,5]. Guillette et al. ont étudié les fonctions reproductives d'alligators mâles du lac Apopka qui avait été pollué par un important déversement accidentel de produits chimiques de type DDT en 1980. Ces animaux ont des niveaux plus faibles de testostérone, un micropénis et des structures testiculaires désorganisées [6,7]. Au contraire, aucune de ces altérations n'a été observée chez les alligators du lac Woodruff situé à proximité, mais n'ayant pas été pollué. Il est important de souligner qu'aucun produit chimique n'a pu être détecté dans les eaux du lac Apopka au moment de ces études. Par conséquent, les alligators ont simplement été exposés de par leur position au sommet de la chaîne alimentaire. D'autres perturbations ou altérations de l'activité et de la physiologie reproductive ont été corrélées avec l'exposition des poissons, des amphibiens, des reptiles, des oiseaux et des mammifères à des polluants (pour détail voir la revue de Vos et al. et Edwards et al. [5,8]). La plupart des effets décrits sur la faune sauvage ont été observés chez des organismes aquatiques, cela étant lié à la concentration de polluants au cours de la chaîne alimentaire. Chez l'homme, plusieurs données rapportent que le sex-ratio à la naissance est altéré dans les régions industrielles et par l'exposition à des produits chimiques industriels et environnementaux. Les conclusions du rapport de la communauté Aamjiwnaang First Nation au Canada sont frappantes [9], c'est-à-dire la proportion de garçons à la naissance a régulièrement diminué entre 1990 et 2003 dans cette communauté, le sex-ratio étant seulement de 0,3 actuellement. Beaucoup d'études épidémiologiques convergent pour montrer un accroissement des troubles de la fonction reproductrice chez l'homme au cours des 50 dernières années (Fig. 1). Le cancer testiculaire, qui est le cancer le plus fréquent chez l'homme jeune, a régulièrement augmenté

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

**Fig. 1** Évolution du nombre de spermatozoïdes et des anomalies de l'appareil de reproduction masculin au cours des dernières décennies. Ces données sont issues de [1,10]
dans tous les pays où les études ont été réalisées, passant par exemple de 3,4 pour 10 000 en 1973 à 5,5 pour 10 000 en 1997 en Amérique du Nord [10]. Si la diminution de la production de spermatozoïdes reste contestée par certaines études locales, les études prospectives à grande échelle utilisant des méthodes normalisées ont montré un déclin de 150 à 70 millions de spermatozoïdes par millilitre entre 1940 et 1990 en Europe [1,11]. Enfin, les cas d'hypospadias et de cryptorchidie se sont aussi fortement accrus, passant de 0,2 et 2 % respectivement en 1970 à 0,38 et 3,5 % respectivement en 1991 [10].

Ces quatre anomalies (cancer testiculaire, baisse du nombre de spermatozoïdes, hypospadias et cryptorchidie) semblent être liées entre elles. Par exemple, une étude comparative faite dans divers pays européens a montré que l'incidence de chacune de ces quatre altérations est maximale au Danemark et minimale en Finlande [12]. De plus, la cryptorchidie est un facteur de risque des trois autres désordres [13], avec un facteur de 3 à 17 dans le cas du cancer testiculaire [14]. De même, l'hypospadias augmente les risques de développer un cancer testiculaire [1] ainsi que l'oligospermie [15,16]. Par conséquent, il a été suggéré que ces quatre altérations seraient les symptômes d'un même syndrome : le syndrome de dysgénésie testiculaire (TDS) [16,17].

## Ces anomalies surviennent durant le développement fœtal

Le testicule fœtal est formé par les cellules somatiques en croissance à la surface du mésonéphros et par les cellules germinales primordiales qui colonisent la gonade et qui sont appelées gonocytes [18,19]. Le testicule fœtal exerce deux fonctions crucales : la gamétogenèse et la stéroïdogenèse (Fig. 2). Les cellules de Leydig fœtales secrètent de la testostérone et de l'insuline like hormone 3 (Ins13) qui sont primordiales pour assurer la masculinisation de l'embryon [20,21]. Après la naissance, les gonocytes deviennent des spermatogonies souches adultes. Le développement normal de la lignée des cellules germinales pendant la vie embryonnaire/fœtale est donc essentiel pour la production de spermatozoïdes durant toute la vie adulte.

L'hypothèse la plus couramment admise est que le TDS serait dû à des perturbations survenant lors du développement des testicules chez le fœtus [16]. L'hypospadias résulte d'une altération de la production ou de l'action des androgènes durant le développement fœtal alors que la cryptorchidie résulte d'anomalies de la production et/ou de l'action de Ins13 et/ou des androgènes régulant la descente transabdominale et transinguinale des testicules [21]. Beaucoup de travaux suggèrent que le cancer testiculaire aurait une origine

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Fig. 2** Les deux fonctions du testicule fœtal : le testicule fœtal produit des hormones indispensables à la masculinisation phénotypique du fœtus et assure la mise en place de la lignée germinale indispensable à la fertilité adulte. Les microphotographies mettent en évidence les cellules de Leydig (microphotographie du haut) et de Sertoli (microphotographie du bas) par révélation immunohistoloque du cytocrome P450 side chain cleavage (P450 scc) et de l'hormone antimüllérienne (AMH) respectivement</figcaption></figure>
fœtale et résulterait d'une anomalie du développement des gonocytes [17,22]. Le carcinome in situ (CIS) qui est une lésion locale maligne précédant le cancer testiculaire (séminomes et non-séminomes) montre des cellules ayant des caractéristiques voisines des gonocytes en termes de morphologie et de marqueurs immunohistologiques (c-kit, phosphatase alcaline, etc.) [23]. De multiples raisons peuvent expliquer la diminution de la production spermatique observée au cours des dernières décennies et, parmi elles, une altération du développement de la lignée germinale fœtale. Le stock de gonocytes, défini durant la vie fœtale, détermine le nombre de cellules germinales souches chez l'adulte. La réduction expérimentale du nombre de gonocytes durant le développement fœtal entraîne une diminution de la production de spermatozoïdes chez l'adulte [24]. Des résultats similaires ont été obtenus quand le nombre de cellules de Sertoli est réduit durant la vie périnatale [25]. Par conséquent, la production de spermatozoïdes chez l'adulte dépend en partie du développement des cordons séminifères fœtaux. De nombreuses données cliniques, épidémiologiques et expérimentales soutiennent l'hypothèse que le TDS est engendré par les perturbateurs endocriniens agissant durant la vie fœtale ou néonatale [2, 26–28]. Ainsi, il est clairement établi que la période fœtale est une période particulièrement sensible à la perturbation endocrinienne [2,4]. Il convient cependant de souligner ici que cette hypothèse n'est pas exclusive. L'exposition à des perturbateurs endocriniens limitée à la vie

adulte est également susceptible d'altérer les fonctions de reproduction masculine en l'absence d'exposition préalable pendant la vie fœtale. Les perturbateurs endocriniens ont augmenté quantitativement et qualitativement dans notre environnement durant ces dernières décennies. Leurs sources sont diverses, incluant les plantes (phytoestrogènes), l'agriculture (insecticides, herbicides, fongicides) et de nombreux produits chimiques (produits pharmaceutiques, plastiques, résines, détergents, PCB, retardateurs de flamme, bisphénol A, parabens antimicrobiens, dioxines, cadmium...). Dans cette revue, nous nous sommes focalisés sur les phtalates.

## Exposition aux phtalates présents dans l'environnement

Les phtalates sont des esters de l'acide phtalique (Fig. 3). Ce sont des composés industriels de plus en plus utilisés depuis 1930. Leur production mondiale est passée de 1,8 à 4,3 millions de tonnes entre 1970 et 2006. Ils sont ajoutés aux polymères pour rendre le PVC plus doux et flexible. Ils entrent dans la composition d'une large gamme de produits en PVC comme les matériaux de construction tels que les câbles, les planchers, les murs et les toits. Ils entrent dans la composition d'équipements médicaux, de tuyaux, des rideaux de douche, des films plastiques, des jouets, de l'intérieur des voitures, des vêtements, des emballages

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Fig. 3** Structure et métabolisme du DEHP : un phtalate est formé par l'estérification de l'acide phtalique avec un ou deux alcools. Lorsque l'alcool est l'éhynyl hexanol, le phtalate est le diéthylhexyl phtalate (DEHP) ou le monoéthylhexyl phtalate (MEHP). Le DEHP est le phtalate largement utilisé pour la fabrication de très nombreux objets. Il est biologiquement très peu actif, mais il est facilement transformé en MEHP par l'organisme, qui, lui, est biologiquement actif</figcaption></figure>
alimentaires, des capsules médicamenteuses... Les phtalates sont aussi utilisés comme solvants dans les huiles, les insecticides et dans d'autres produits organiques. Ils sont additionnés aux peintures et laques, aux adhésifs et mastics, aux cosmétiques, aux lubrifiants, aux parfums, aux déodorants, aux sprays... Le di(2-éthylhexyl) phtalate (DEHP) est le plus largement utilisé, 1,5 million de tonnes sont produites chaque année dans le monde (40 % en Europe). Les phtalates n'étant pas liés de façon covalente aux plastiques, ils peuvent s'infiltrer dans les produits au cours du temps. À titre d'exemple, ils sont retrouvés dans les poussières domestiques [29]. L'exposition cutanée par les vêtements et les cosmétiques a aussi été observée ainsi que la contamination via les équipements médicaux. Les hommes sont constamment exposés aux phtalates par voies orale, cutanée et par inhalation [30,31]. Dans l'organisme, les phtalates sont rapidement hydrolysés par des estérase dans l'intestin et dans d'autres tissus en monoesters qui sont les molécules actives [32]. Par exemple, le DEHP est métabolisé en mono-(2-éthylhexyl)phtalate (MEHP) (Fig. 3) et le DBP en monobutyl phtalate (MBP). Alors que beaucoup des perturbateurs endocriniens persistent dans l'environnement et s'accumulent dans les graisses, la demi-vie des phtalates n'excède pas 36 heures dans l'organisme. Chez l'homme, 75 % du DEHP ingéré est métabolisé et excrété dans les urines dans les deux jours qui suivent l'absorption [33]. Cependant, comme les phtalates sont largement répandus dans l'environnement, l'être humain y est exposé de façon chronique. Selon une étude publiée en 2003, 12 % des Allemands sont exposés à une dose journalière de DEHP supérieure aux recommandations européennes qui est de 37 µg/kg de poids corporel par jour [34]. Dans une étude épidémiologique, au moins quatre phtalates différents ont été retrouvés dans les urines de 75 % des hommes [35]. Les concentrations de phtalates dans les fluides biologiques humains montrent de grandes variations individuelles [36-41]. Les valeurs de MEHP sont reportées dans le Tableau 1, celles du MBP sont similaires ou plus élevées. Les concentrations urinaires chez les femmes enceintes

peuvent atteindre $5 \times 10^{-6}$ M. Les données les plus récentes rapportent des taux moyens dans les urines et dans le liquide amniotique de $4 \times 10^{-7}$ M pour le MBP et $8 \times 10^{-8}$ M pour le MEHP [41]. Les concentrations maximales de MEHP observées dans le liquide amniotique sont de $8 \times 10^{-6}$ M.

## Effets des phtalates sur le développement et les fonctions du testicule chez les rongeurs : études in vivo

Les premières observations d'une atteinte testiculaire par les phtalates ont été rapportées dès 1945 chez le rat adulte [42]. Cette étude montre qu'une incorporation de 1,5 % de DEHP dans l'alimentation du rat pendant 90 jours induit une atrophie des tubules séminifères et une dégénération testiculaire. Par la suite, une atrophie tubulaire occasionnelle chez des rats absorbant 0,5 % de DEHP dans leur nourriture pendant 3 ou 24 mois a été décrite [43]. D'autres groupes ont confirmé et exploré les effets testiculaires des phtalates chez le rat adulte [44].

De nombreuses études conduites chez le rat ont montré que l'exposition in utero au di(n-butyl)phtalate (DBP) ou DEHP entraînent des altérations du développement des différents types cellulaires testiculaires [27,45]. Les perturbations du développement et des fonctions des cellules de Leydig ont beaucoup été étudiées [46-50]. L'exposition in utero aux phtalates induit une agrégation anormale des cellules de Leydig, l'apparition de cellules de Leydig au sein de l'épithélium séminifère, une réduction de la production de testostérone fœtale et de l'expression de l'Ins13. Cela conduit à une agénésie épididymaire, une réduction de la distance anogénitale, un hypospadias et une cryptorchidie. De plus, l'exposition in utero aux phtalates induit la prolifération subnormale des cellules de Ser-toli [51] et une modification de leur fonction [52]. Enfin, une formation de gonocytes multinuclés durant la vie néonatale et une réduction de la spermatogenèse chez l'adulte ont été décrites [52,53]. En conclusion, l'exposition in utero aux phtalates résulte en un ensemble de troubles comparables au TDS

<table><caption>**Tableau 1** Concentration de MEHP dans les fluides biologiques de la grossesse et de l'allaitement chez la femme</caption><thead><tr><td>Liquide biologique</td><td>Concentration minimum (M)</td><td>Concentration maximum (M)</td><td>Référence</td></tr></thead><tbody><tr><td>Urine de femme enceinte</td><td>5 × 10<sup>-9</sup></td><td>8 × 10<sup>-8</sup></td><td>[37]</td></tr><tr><td>Urine de femme enceinte</td><td>5 × 10<sup>-9</sup></td><td>3 × 10<sup>-8</sup></td><td>[38]</td></tr><tr><td>Urine de femme enceinte</td><td>5 × 10<sup>-8</sup></td><td>5 × 10<sup>-7</sup></td><td>[41]</td></tr><tr><td>Liquide amniotique</td><td>&lt; 3 × 10<sup>-9</sup></td><td>4 × 10<sup>-7</sup></td><td>[41]</td></tr><tr><td>Sang du cordon ombilical</td><td>Non détectable</td><td>8 × 10<sup>-6</sup></td><td>[36]</td></tr><tr><td>Lait</td><td>5 × 10<sup>-9</sup></td><td>5 × 10<sup>-6</sup></td><td>[39]</td></tr><tr><td>Lait</td><td>2 × 10<sup>-9</sup></td><td>2 × 10<sup>-8</sup></td><td>[40]</td></tr><tr><td>Plasma de mères allaitantes</td><td>2 × 10<sup>-9</sup></td><td>2 × 10<sup>-8</sup></td><td>[40]</td></tr><tr><td>Plasma de mères allaitantes</td><td>10<sup>-8</sup></td><td>2 × 10<sup>-7</sup></td><td>[40]</td></tr></tbody></table>
excepté pour le cancer testiculaire. Un seul papier s'intéresse
à la souris in vivo. Il rapporte que l'exposition in utero des
phtalates perturbe le développement de la gamétogenèse sans
altérer la stéroïdogenèse des testicules fœtaux de souris [54].

Effets des phtalates sur le développement
et les fonctions du testicule chez les rongeurs :
etudes in vitro

L'approche in vitro a aussi été utilisée pour étudier les effets
de phtalates sur le testicule fœtal de rat et de souris. Cette
approche permet facilement d'analyser les effets de molécu-
les en fonction du temps et de la dose. Pour que ces études in
vitro soient pertinentes en toxicologie, il faut que l'activité et
le devenir des cellules in vitro reproduisent la situation obser-
vée en vivo. Chez les mammifères, dans les systèmes de
culture cellulaire, les cellules de Leydig fœtales se dédifféren-
cient en l'absence de stimulation gonadotropique spécifique
[55-57]. Les gonocytes isolés survivent peu dans de tels sys-
tèmes [58,59]. Dès les années 1990, le système de culture
organotypique qui préserve l'architecture testiculaire et les
communications intercellulaires nous est apparu comme une
méthode satisfaisante pour maintenir le développement du
testicule fœtal et néonatal. De plus, un testicule peut être
cultivé en présence des molécules à tester, alors que le testi-
cule contralatéral peut servir de témoin remarquable, puisqu'il
est exactement au même stade de développement. Dans cette
perspective, une technique originale utilisant un système de
filtre a été développée par notre équipe (Fig. 4) [60]. Cette
technique reproduit le développement morphométrique, fonc-
tionnel et moléculaire des cellules de Leydig, de Sertoli et
des cellules germinales observé in vivo [56,57,61-64]. Le
système de culture organotypique s'est révélé être un outil
très puissant pour étudier les effets directs des perturbateurs
endocriniens sur le développement et les fonctions du testi-
cule fœtal en fonction de l'âge, du temps et de la dose [64].
Nous avons nommé cette méthode : *the rat fetal testis assay*
(rFETA). Puis, nous avons étendu cette méthode au testicule
fœtal de souris et d'humain [64–66] et nous avons appelé ces
techniques mFETA (*mouse FETA*) et hFETA (*human FETA*)
respectivement. Trois études ont été conduites pour analyser
les effets des phtalates sur le développement et les fonctions
du testicule fœtal de rat in vitro. Li et Kim, en utilisant
un système de filtre comparable au nôtre, ont montré une
altération du développement des cellules de Sertoli et des
gonocytes [67]. L'équipe de Sharpe utilise un système de
culture différent du nôtre et a observé une diminution de la
production de testostérone stimulée par l'hCG, mais pas de
modification de la production de testostérone basale [68].
L'équipe de Bernard Jégou, chez qui nous avons transféré
notre système de culture, a observé une diminution de la pro-
duction de testostérone, une altération des fonctions sertolien-

nes et un accroissement de l'apoptose germinale [69]. Chez la
souris, nous avons apporté la première analyse in vitro de
l'effet d'un phtalate sur le développement du testicule fœtal
et néonatal [70]. Nous avons montré que les phtalates indui-
sent une apoptose germinale et une réduction de l'expression
de l'AMH quelque soit l'âge du testicule fœtal cultivé. De
façon surprenante, nous avons montré que le MEHP induit
une augmentation de la production de testostérone chez les
testicules embryonnaires murins jeunes et au contraire, une
diminution de cette production en fin de vie fœtale ou en
début de vie néonatale. Le MEHP provoque une augmenta-
tion de l'apoptose des gonocytes à tous les stades où cette
apoptose existe naturellement. Tous ces effets sont maintenus
après invalidation du récepteur des androgènes démontrant
ainsi l'androgéno-indépendance de l'effet délétère du
MEHP. De même, alors que nous avions démontré que les
estrogènes inhibent le développement des gonocytes via le
récepteur bêta (ER bêta), l'effet délétère du MEHP est main-
tenu chez les testicules invalidés pour ER bêta, démontrant
également l'estrogéno-indépendance de l'effet du MEHP
sur la gamétogenèse fœtale et néonatale.

Effets des phtalates sur le développement
et les fonctions du testicule fœtal humain :
etudes épidémiologiques

Malgré le nombre important d'études concernant la toxicité
des phtalates dans les modèles animaux, nous disposons en

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Fig. 4** Un nouveau test toxicologique. Les testicules fœtaux sont prélevés, découpés en morceaux et placés sur un filtre qui flotte à la surface du milieu. Dans ce système, appelé *fetal testis assay* (FETA) qui maintient l'architecture testiculaire et les communications intercellulaires, tous les types cellulaires se développent. En outre, un testicule peut être cultivé en présence du perturbateur endocrinien à tester, alors que le testicule contralatéral est cultivé en son absence et sert de témoin. L'équipe de René Habert a mis au point ce test à partir de testicules fœtaux de rat (rFETA) [60–64], de souris (mFETA) [64] et d'Homme (hFETA, en collaboration avec le service de René Frydman) [65,66]. Les testicules photographiés dans cette figure sont des testicules fœtaux humains
fait de très peu d'informations sur leurs effets sur le développement de la fonction reproductive chez l'homme.

Les études épidémiologiques sont très difficiles à réaliser en raison du délai entre l'exposition fœtale et leurs conséquences à l'âge adulte. Ainsi, la diminution de la concentration des spermatozoïdes dans le sperme peut résulter d'une exposition à de très nombreux facteurs tels que les perturbateurs endocriniens, l'alcool, le tabac et le stress individuel pendant la vie adulte. En outre, parmi la multiplicité des facteurs agissant pendant la vie fœtale, l'identification d'un facteur impliqué est difficile d'autant plus que l'effet d'un même facteur peut différer en fonction du contexte environnemental. Enfin, il est important de prendre en compte la période d'exposition. Par exemple, une corrélation entre un faible nombre de spermatozoïdes chez l'homme adulte et l'exposition de leur mère au diéthylstilbestrol (DES), durant leur grossesse, a pu être mise en évidence seulement si on ne retient que les données correspondants à un traitement effectué durant le premier trimestre de grossesse [71]. Récemment, la distance anogénitale a été choisie chez l'homme comme un index de masculinisation et de l'activité androgénique du testicule. Une corrélation inverse a été trouvée entre la distance anogénitale mesurée chez les garçons âgés de 2-36 mois (en moyenne 12,6 mois) et les concentrations urinaires maternelles de MBP et de trois autres métabolites monoesters de phtalates mesurées à la fin de la grossesse [38]. De la même manière, une interaction dose-dépendante entre les phtalates dans le lait maternel et les niveaux d'hormones reproductives chez les garçons de trois mois a été observée [39]. Cependant, un article récent de Huang et al. n'indique aucune relation entre la distance anogénitale mesurée chez les garçons à la naissance et la concentration de phtalates dans le liquide amniotique ou dans l'urine maternelle durant la grossesse [41]. Prises dans leur ensemble, ces études épidémiologiques suggèrent

que quelques phtalates, aux concentrations environnementales, ont des effets antiandrogéniques durant la vie néonatale, mais leurs effets pendant la vie fœtale n'ont pas été clairement démontrés.

## Effets des phtalates sur le développement et les fonctions du testicule fœtal humain : études in vitro

Récemment, notre équipe a mis en évidence expérimentalement pour la première fois les effets délétères des phtalates sur les fonctions ou le développement testiculaire humain [72]. Dans le cadre d'une collaboration avec le service de gynécologie-obstétrique dirigé par René Frydman, nous avons analysé par des méthodes morphologiques, fonctionnelles et moléculaires l'impact du MEHP sur le développement des différents types cellulaires du testicule fœtal humain dans notre système de culture organotypique [65,66] (Fig. 4). Les testicules fœtaux humains ont été prélevés durant le premier trimestre (7-12 semaines) de la grossesse. Cette période du développement est une fenêtre temporelle cruciale dans la détermination du tractus reproducteur [73]. Les testicules ont été cultivés pendant trois jours avec ou sans MEHP dans des conditions basales ou stimulées avec l'hormone lutéinisante (LH). Quelle que soit la dose, le MEHP n'a pas eu d'effet sur la production de testostérone basale ou stimulée par la LH. Le MEHP n'a pas modifié l'expression des ARNm des acteurs de la stéroïdogenèse : P450c17, P450scc ou StAR. De même, nous n'avons observé aucune modification de l'expression de l'Ins13 qui est produit par les cellules de Leydig fœtales et qui est impliqué dans la descente testiculaire. Le MEHP (10⁻⁴ M) ne modifie ni la prolifération ni l'apoptose des cellules de Sertoli, mais il réduit l'expression de l'ARNm

<table><caption>**Tableau 2** Variation interspécifique de la sensibilité à un perturbateur endocrinien, le MEHP. En utilisant le même système de culture (système FETA), une même concentration de MEHP (10⁻⁴ M) réduit la production de testostérone chez le rat mais pas chez l'Homme. Chez la souris, son effet sur la production de testostérone dépend de l'âge fœtal. Dans les trois espèces étudiées, le MEHP réduit le développement de la lignée germinale en augmentant l'apoptose</caption><thead><tr><th></th><th>Nombre de cellules<br>germinales fœtales</th><th>Mort des cellules<br>germinales fœtales</th><th>Production<br>de testostérone</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td>Homme</td><td>→</td><td>→</td><td>→</td><td>[72]</td></tr><tr><td>Souris</td><td>→</td><td>→</td><td>→</td><td>[70]</td></tr><tr><td>Rat</td><td>→</td><td>→</td><td>→</td><td>[69]</td></tr></tbody></table>
de l'hormone antimüllérienne. Par contre, le MEHP (10⁻⁴ M) diminue le nombre de cellules germinales en augmentant leur apoptose mesurée par la détection des cellules germinales caspase-3-positive, sans modification de leur prolifération. Il s'agissait de la première mise en évidence expérimentale directe de l'effet d'un perturbateur endocrinien sur les fonctions de reproduction masculine. Rappelons qu'en utilisant le même système de culture chez les rongeurs, il a été montré récemment, que les phtalates agissent sur la gamétogenèse fœtale/néonatale, mais, contrairement à l'homme, ils modifient la production d'androgènes [69,70]. Cela met en évidence les différences de réceptivité aux perturbateurs endocriniens entre le modèle rongeur et le modèle humain (Tableau 2) et souligne combien les études de toxicologie, qui ne peuvent évidemment être réalisées à grande échelle que sur des modèles animaux, doivent impérativement être comparées au modèle humain.

**Remerciements** : Ce travail a été soutenu par l'université Paris Diderot-Paris-VII, le CEA, l'Inserm, l'Agence nationale pour la recherche (projet Phtalatestis 2008-2010) et le ministère de l'Écologie, du Développement durable, des Transports et du Logement (projet STORm, Ineris 2010-2012). V.M. et A.L. sont titulaires de bourses du ministère de l'Éducation nationale de la Recherche et de la Technologie. R.L. a bénéficié d'une bourse du Commissariat à l'énergie atomique. Nous remercions l'équipe du service obstétrique-gynécologique de l'hôpital Antoine-Béclère (Clamart, France). Nous remercions Aurélie Gouret pour sa précieuse aide pour le secrétariat et la gestion.

**Conflit d'intérêt** : les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d'intérêt.

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