# Impact écotoxicologique des composés organiques présents dans les boues d'épuration valorisées par épandage sur les sols agricoles

Aline Ghanem, Jacques Einhorn, Francois Laurent, Luiz Felippe de Alencastro, Yves Lévi, Claude Jolivalt, Dominique Patureau, Christian Mougin

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## To cite this version:

Aline Ghanem, Jacques Einhorn, Francois Laurent, Luiz Felippe de Alencastro, Yves Lévi, et al. Impact écotoxicologique des composés organiques présents dans les boues d'épuration valorisées par épandage sur les sols agricoles. 3ème Séminaire d'Écotoxicologie de l'INRA, Sep 2006, Dinard, France. hal-01601604

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3ème Séminaire d'Écotoxicologie
de l'INRA

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Dinard, 17-19 septembre 2006

ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT

INRA
# Programme

## Dimanche 17 septembre 2006

15:00 - 17:30 Accueil et inscription des participants

18:00 **Ouverture du Séminaire**
*Comité d'Organisation*

18:10 – 18:30 Allocution de bienvenue
*Gérard Maisse (Président du Centre de Recherches de Rennes)*

18:30 – 18:50 L'écotoxicologie à l'INRA : état des lieux et perspectives
*Laurent Lapchin (Directeur Scientifique Adjoint DS EcoNat)*

18:50 – 19:20 Implication du Ministère de l'Écologie et du Développement Durable dans la programmation et le soutien des recherches en écotoxicologie
*Eric Vindimian (Chef du Service de la Recherche et de la Prospective, D4E, MEDD)*

19:20 – 19:50 7ème PCRD (2007-2013) : enjeux politiques et structuration
*Nicolas Trift (Direction de l'Action Régionale, de l'Enseignement Supérieur et de l'Europe, INRA)*

20:00 Cocktail de bienvenue et dîner

## Lundi 18 septembre 2006

### Session 1 : Biodisponibilité et dynamique des contaminants dans l'environnement et les chaînes alimentaires

Animateurs : Sylvie Nélieu – Philippe Hinsinger

08:30 – 08:50 Influence d'amendements organiques et minéraux sur la rétention de pesticides
*V. Chaplain, A. Brault, E. Gosset, D. Tessier et C. Mougin*

08:50 – 09:10 Intérêts et limites de la DGT (Diffusive Gradient in Thin Films) comme méthode d'évaluation de la phytodisponibilité des métaux
*L. Denaix, J.-Y. Cornu, Y Soulacroix, A. Schneider et V. Sappin-Didier*

09:10 – 09:30 Biodisponibilité et dynamique des contaminants métalliques et organiques : des mollusques gastéropodes terrestres aux réseaux trophiques
*R. Scheifler, F. Gimbert, F. Hispard, M. Coeurdassier, P.-M. Badot et A. de Vaufleury*

09:30 – 09:50 Cinétique d'accumulation du cadmium : évaluation in situ du transfert solplante-escargot
*F. Gimbert, A. de Vaufleury, M. Mench, R. Scheifler, M. Coeurdassier et P.-M. Badot*
10:10 – 10:30 Transfert de la bromadiolone dans les réseaux trophiques : des appâts ... vers les campagnols ... jusqu'aux prédateurs

M. Coeurdassier, M. Sage, R. Defaut, P. Berny et P. Giraudoux

10:30 – 11:00 Pause

11:00 – 11:20 Photodégradation de chlorophénylurées induite par les nitrates et les nitrites et impact écotoxicologique en milieu aquatique

S. Nélieu, M.V. Shankar, F. Bonnemoy, J. Bohatier, L. Lefeuvre, L. Kerhoas, L. Lagadic et J. Einhorn

11:20 – 11:50 Synthèse – Discussion

Animateurs : Sylvie Nélieu – Philippe Hinsinger

## Session 2 : **Altérations physiologiques et comportementales**

Animateurs : Axel Decourtye – Gilles Monod

11:50 – 12:10 Intérêt des biomarqueurs de génotoxicité en écotoxicologie

A. Devaux, Y. Gania et S. Bony

12:10 – 12:30 Les milieux marins tropicaux sous surveillance : utilisation d'un biomarqueur de génotoxicité

S. Lemoine

12:30 – 14:00 Déjeuner

14:00 – 14:20 Induction d'exoenzymes fongiques : biomarqueurs d'exposition aux métaux ?

J. Lebrun, I. Lamy et C. Mougin

14:20 – 14:40 Effets du parathion sur le tube digestif de ver de terre

C. Mazzia, B. Mazet, M. Rault et Y. Capowiez

14:40 – 15:00 Inhibition des cholinestérase : un biomarqueur d'exposition chez le ver de terre, en vergers de pommiers

M. Rault, C. Mazzia, O. Mascle et Y. Capowiez

15:00 – 15:20 Le comportement excavateur du ver de terre comme source de biomarqueurs

Y. Capowiez, O. Mascle, M. Rault et C. Mazzia

15:20 – 15:40 Une nouvelle méthode d'élevage larvaire *in vitro* pour tester les effets des pesticides sur le couvain d'abeille

P. Aupinel, D. Fortini, B. Michaud, J.-N. Tasei et J.-F. Odoux

15:40 – 16:00 Effets sublétaux du fipronil sur l'orientation de l'abeille domestique (Apis mellifera L.) dans un labyrinthe complexe

A. Decourtye, S. Lefort, J. Devillers, M. Gauthier, M. Tisseur et P. Aupinel

16:00 – 16:20 Effets d'un herbicide sur la relation prédateur-proie entre des tétards de grenouille rousse (Rana temporaria) et des larves de salamandre tachetée (Salamandra salamandra)

A.-L. Mandrillon et P. Saglio

16:20 – 16:50 Synthèse – Discussion

Animateurs : Axel Decourtye – Gilles Monod

16:50 – 17:20 Pause
## Session 3 : **Effets sur les populations : approches dynamiques et génétiques**

Animateurs : Marie-Agnès Coutellec – Laurent Lapchin

17:20 – 17:40 Élaboration d'un modèle basé sur les individus pour aider à la prise de décision sur la significativité des effets des polluants chimiques au niveau de la population chez un poisson, la gambusie

R. Beaudouin, V. Ginot et G. Monod

17:40 – 18:00 Évaluation expérimentale *in situ* des effets de produits de démoustication sur les populations de daphnies dans les zones humides littorales atlantiques et méditerranéennes

C. Duchet, E. Franquet, C. Lagneau et L. Lagadic

18:00 – 18:20 Plasticité phénologique et restauration des populations d'invertébrés aquatiques

T. Caquet et M. Roucaute

18:20 – 18:40 Xénobiotiques et processus stochastiques dans les populations exposées : approche expérimentale chez *Lymnaea stagnalis*

M.-A. Coutellec

18:40 – 19:10 Synthèse - Discussion
Animateurs : Marie-Agnès Coutellec – Laurent Lapchin

19:10 – 19:30 Publier dans la revue *Agronomy for sustainable Development*

E. Lichtfouse, P. Debaeke et F. Papy

20:00 Dîner de gala

## Mardi 19 septembre 2006

## Session 4 : **Altérations de la dynamique des communautés**

Animateurs : Jean-François Humbert – Benoît Sauphanor

08:00 – 08:20 Sur la piste des β-ketoadipates à la recherche de marqueur fonctionnel de la qualité microbiologique des sols : la 3,4-protocatechuate dioxygenase et la 1,2-catechol dioxygenase deux gènes candidats ?

N. El Azhari, N. Rouard et F. Martin-Laurent

08:20 – 08:40 Comparaison entre descripteurs biologiques et chimiques pour décrire l'impact du cuivre dans un sol

J. Sebastia, D. Lejon, I. Lamy et L. Ranjard

08:40 – 09:00 Impact d'un herbicide sur la diversité microbienne aquatique. Une approche expérimentale

A. Bouchez, A. Villeneuve, C. Leboulanger J.-F. Humbert et B. Montuelle

09:00 – 09:20 Bioindicateurs d'impact du recyclage de produits résiduaires organiques en sols cultivés : lien avec la disponibilité de micropolluants organiques et métalliques

S. Houot, P. Benoit, E. Barriuso, G. Bodineau, V. Etievant, J.-N. Rampon, M. Deschamps, Y. Capowiez, P. Cambier, J.-P. Petraud, A. Jaulin, T. Lebeau, J. Kuntz, C. Leyval, T. Beguiristain, P. Leglize, C. Steinberg, V. Edel-Hermann, N. Gautheron, C. Francou et M. Poitrenaud

09:20 – 09:40 Organisation des communautés végétales et distribution des traits fonctionnels d'espèces d'intérêt pour révéler la phytotoxicité des sols sur un site de traitement du bois

M. Mench, M. Aulen et C. Bes

09:40 – 10:00 Caractéristiques des modèles d'écosystèmes aquatiques et conséquences pour l'évaluation des risques écotoxicologiques

S. Sourisseau, A. Bassères, F. Perié et T. Caquet

10:00 – 10:30 Synthèse - Discussion
Animateurs : Jean-François Humbert – Benoît Sauphanor
10:30 – 11:00 Pause

## Session 5 : Stress toxiques et stress environnementaux

Animateurs : Jean-Pierre Garrec – Daniel Tessier

11:00 – 11:20 Application des isotopes stables à l'étude des conséquences des perturbations environnementales en milieu aquatique

T. Caquet, J.-M. Roussel, J. Haury et M. Roucaute

11:20 – 11:40 Élaboration et validation d'un indice d'état biologique des sols

S. Barray, K. Laval, M. Legras, C. Mougin, S. Taibi et D. Tessier

11:40 – 12:00 Caractérisation de l'écotoxicité des sols d'un site de traitement de bois avant leur phytoremédiation

M. Mench et C. Bes

## Session 6 : Bioremédiation et bioprocédés

Animateurs : Laurence Denaix – Dominique Patureau

12:00 – 12:20 Phytotoxicité d'un sol contaminé par des produits de traitement du bois après un amendement pour stabiliser des contaminants

C. Bes et M. Mench

12:30 – 14:00 Déjeuner

13:50 – 14:10 Traits fonctionnels d'espèces d'intérêt (Sporobolus tenacissimus, Carex praecox, Amorpha fruticosa, Agrostis capillaris), pour phytoremédier des sols contaminés sur un site de traitement du bois

M. Mench, H. Gasté, J. Taberly, M. Aulen et S. Gawronski

14:10 – 14:30 Mécanismes physico-chimiques d'action de l'immobilisation in situ des éléments traces dans les sols

V. Sappin-Didier et L. Denaix

14:30 – 14:50 Utilisation de plantes agronomiques pour la phyto-dépollution des sols contaminés par des explosifs

M. Vila, S. Pascal-Lorber et F. Laurent

14:50 – 15:10 Devenir des estrogènes et de l'activité estrogénique dans les systèmes de traitement des eaux usées urbaines

M. Müller, F. Rabenoelina, N. Delgènes, D. Patureau, P. Balaguer et G. Hernandez-Raquet

15:10 – 15:30 Impact écotoxicologique des composés organiques présents dans les boues d'épuration valorisées par épandage sur les sols agricoles

A. Ghanem, J. Einhorn, F. Laurent, F. de Alencastro, Y. Levi, C. Jolivalt, D. Patureau et C. Mougin

15:30 – 16:00 Synthèse - Discussion

Animateurs: Laurence Denaix - Jean-Pierre Garrec - Dominique Patureau - Daniel Tessier

16:00 – 16:30 Conférence de clôture :
Les questions et attentes de l'ADEME dans le domaine de la recherche en écotoxicologie des sols

A. Bispo et C. Grand (ADEME)

16:30 Clôture du séminaire
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INRA

Résumés

INGÉNIEUR D'INGÉNÉRATION ET DE TECHNOLOGIE
Sauf autorisation
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INRA

Conférences plénières

Inaugural Conference of the International Society for Ecological Cybernetics
Organized by the Ecological Cybernetics Society, London, England 2008
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Dimanche 17 septembre 2006

# 7ème PCRD (2007-2013) : enjeux politiques et structuration

N. Trift

INRA, Direction de l'Action Régionale, de l'Enseignement Supérieur et de l'Europe (DARESE), 147 rue de l'Université, 75338 Paris Cedex 07

## Contexte et enjeux politiques

Depuis 1984, les Programmes Cadres de Recherche et Développement (PCRD) sont les principaux instruments financiers et juridiques de l'UE pour mettre en œuvre la politique de recherche de l'Union Européenne et en particulier pour soutenir la construction de l'espace européen de la recherche (EER). L'EER figure désormais parmi les priorités de l'agenda politique européen (stratégie de Lisbonne : « Faire de l'Europe l'économie de la connaissance la plus dynamique et la plus compétitive du monde ») et s'inscrit dans le cadre de la stratégie de Barcelone visant à accroître les investissements dans la recherche à 3 % du PNB total de l'UE d'ici 2010 (objectifs de Barcelone, mars 2002).

Pour faire de l'économie de la connaissance une réalité, le 7ème PCRD (2007 - 2013) sera articulé avec le programme-cadre « Compétitivité et innovation », le programme « Formation et éducation » ainsi que les Fonds structurels. Il s'inscrit dans la continuité du 6ème PCRD, mais se développe aussi dans de nouvelles directions.

## Structuration du 7ème PCRD

Le 7ème PCRD sera organisé en quatre programmes spécifiques, correspondant à quatre objectifs importants de politique de la recherche européenne:

* le programme "Coopération" stimulera la collaboration entre l'industrie et le monde de la recherche publique et universitaire à travers l'Europe en vue d'obtenir la première place dans des secteurs clés technologiques. Sur cette base, des programmes de travail précisant les objectifs techniques, le niveau d'intégration ou l'implication souhaitée des PME seront élaborés. Les instruments à sa disposition seront : les réseaux d'excellence, les projets collaboratifs et les actions de coordination/support.

Dix thèmes de recherche ont été ciblés :

* santé,

* alimentation, agriculture et biotechnologies,

* technologies de l'information et de la communication,

* nano sciences, nanotechnologies, matériels et nouvelles technologies de procédés de production,

* énergie,

* environnement et changements climatiques,

* transport (dont transport aérien),

* sciences socio-économiques,

* sécurité,

* espace.

* le programme "Idées" est le programme innovant du 7ème PCRD. Il sera mis en œuvre par le Conseil européen de la recherche qui soutiendra la recherche exploratoire d'équipes individuelles sur la seule base de l'excellence scientifique. Il est donc proche de la recherche fondamentale et transdisciplinaire. La recherche est
menée libre de contrainte et de cadre formel. Le programme concerne toutes les disciplines. Deux types de projets seront financés sous forme de bourses : les bourses pour les jeunes chercheurs (moins de 10 ans après la thèse) et celles pour les chercheurs expérimentés.

> le programme "Personnel" (anciennement « Marie Curie » dans le 6ème PCRD) apportera un soutien significatif à la mobilité et à l'évolution de carrières des chercheurs, à la fois en Europe et dans les pays tiers.

> le programme "Capacités" contribuera au développement des capacités dont l'Europe a besoin pour devenir une société de la connaissance prospère et comprendra pour la première fois un soutien aux établissements de recherche à grande échelle au niveau européen. Il comprendra les 6 actions suivantes : soutenir le développement des infrastructures de recherche, financer les projets de recherche des PME, favoriser les coopérations entre régions européennes, renforcer leur potentiel de recherche, mettre en valeur le rôle de la science dans la société, développer la coopération internationale.

Concernant le fonctionnement et la gestion des programmes, la création d'agences exécutives dédiées à chacun des quatre programmes est en projet.

A ces quatre thèmes spécifiques, s'ajoutent :

- le programme spécifique "Euratom" (recherche sur l'énergie de fusion et la fission nucléaire/radioprotection),

- le programme spécifique pour les activités nucléaires du centre commun de recherche,

- le programme spécifique du Centre commun de recherche pour les activités non nucléaires.

## Simplification des règles de participation

La simplification des règles et des procédures administratives et financières constitue un facteur décisif de la réussite du programme - cadre. Une série de mesures ont été proposées sur la base du rapport Marimon réalisé à mi-parcours du 6ème PCRD :

- rationaliser les instruments de financement par une nouvelle approche fondée sur un éventail d'instruments financiers simplifié,

- employer un langage plus clair,

- réduire la quantité et la taille des documents,

- réduire le nombre de choses demandées aux participants et instaurer une procédure de soumission légère, réduire les contrôles a priori,

- accroître l'autonomie des consortiums,

- rationaliser le processus de sélection,

- rechercher de nouveaux modes de financement et simplifier le système de financement calculé en fonction des coûts.

## Budget

La Commission européenne avait initialement proposé un budget de 76 milliards d'euros, ce qui marquait sa volonté de placer la recherche au cœur des grandes priorités européennes puisque le 6ème PCRD sur 4 ans disposait d'un budget de 20 milliards. Lors du compromis budgétaire fin 2005, le montant consacré à la politique de recherche a été arrêté à 72 milliards d'euros sur un total du budget européen qui s'élève à 862 milliards.

Suite aux discussions entre le Parlement européen et le Conseil, le budget total a été réduit à 50,2 milliards<fnref n="1" /> (dont 66 % pour le programme spécifique coopération).

<footnote n="1">¹ Dont 48,43 Mds€ pour les actions indirectes « coopération, personnel, idées et capacités »</footnote>
La moyenne annuelle du budget accordé au 7ème PCRD est d'environ 6,9 milliards d'euros. Cependant, la Commission propose de doter le 7ème PCRD en 2007 d'un budget de 4,8 milliards et d'augmenter graduellement les dépenses annuelles pour atteindre 9,6 milliards d'euros de budget en 2013. Il en résulte que les 1ers appels à propositions du 7ème PCRD disposeraient d'un budget identique voire plus faible que le dernier appel du 6ème PCRD (notamment pour la future priorité thématique 2 « Agriculture, alimentation et biotechnologie » qui concerne directement l'INRA).

<table><thead><tr><th></th><th>Moyenne PC6</th><th>2007</th><th>2008</th><th>2009</th><th>2010</th><th>2011</th><th>2012</th><th>2013</th><th>TOTAL</th><th>Moyenne PC7</th></tr></thead><tbody><tr><td>PC7: Actions indirectes</td><td>4.262</td><td>4.857</td><td>5.281</td><td>5.812</td><td>6.615</td><td>7.640</td><td>8.588</td><td>9.638</td><td>48.432</td><td>6.919</td></tr><tr><td>COOPERATION</td><td>3.479</td><td>3.671</td><td>3.744</td><td>3.885</td><td>4.273</td><td>4.818</td><td>5.495</td><td>6.316</td><td>32.202</td><td>4.600</td></tr><tr><td>Santé</td><td>670</td><td>720</td><td>735</td><td>751</td><td>791</td><td>864</td><td>987</td><td>1.137</td><td>5.984</td><td>855</td></tr><tr><td>Alim, Agric, Biotech.</td><td>200</td><td>215</td><td>219</td><td>224</td><td>235</td><td>297</td><td>346</td><td>399</td><td>1.936</td><td>277</td></tr><tr><td>TIC</td><td>1.012</td><td>1.107</td><td>1.108</td><td>1.136</td><td>1.196</td><td>1.317</td><td>1.506</td><td>1.710</td><td>9.080</td><td>1.297</td></tr><tr><td>Nano</td><td>381</td><td>409</td><td>417</td><td>427</td><td>450</td><td>509</td><td>583</td><td>671</td><td>3.467</td><td>495</td></tr><tr><td>Energie</td><td>237</td><td>254</td><td>259</td><td>264</td><td>278</td><td>339</td><td>389</td><td>452</td><td>2.236</td><td>319</td></tr><tr><td>Environnement</td><td>205</td><td>224</td><td>229</td><td>233</td><td>246</td><td>281</td><td>318</td><td>356</td><td>1.886</td><td>269</td></tr><tr><td>Transport</td><td>451</td><td>478</td><td>488</td><td>499</td><td>526</td><td>616</td><td>714</td><td>831</td><td>4.150</td><td>593</td></tr><tr><td>Sc. Socio-éco</td><td>66</td><td>72</td><td>73</td><td>75</td><td>79</td><td>90</td><td>102</td><td>117</td><td>607</td><td>87</td></tr><tr><td>Sécu & espace</td><td>66</td><td>191</td><td>216</td><td>276</td><td>473</td><td>506</td><td>551</td><td>645</td><td>2.858</td><td>408</td></tr><tr><td>IDEES</td><td></td><td>300</td><td>550</td><td>810</td><td>1.137</td><td>1.335</td><td>1.624</td><td>1.704</td><td>7.460</td><td>1.066</td></tr><tr><td>PERSONNEL</td><td>433</td><td>454</td><td>466</td><td>497</td><td>531</td><td>747</td><td>902</td><td>980</td><td>4.577</td><td>654</td></tr><tr><td>CAPACITES</td><td>350</td><td>432</td><td>522</td><td>620</td><td>674</td><td>740</td><td>567</td><td>639</td><td>4.193</td><td>599</td></tr><tr><td>Infrastructures</td><td>179</td><td>210</td><td>296</td><td>383</td><td>425</td><td>374</td><td>160</td><td>160</td><td>2.008</td><td>287</td></tr><tr><td>Recherche/PME</td><td>118</td><td>127</td><td>130</td><td>132</td><td>139</td><td>206</td><td>231</td><td>264</td><td>1.228</td><td>175</td></tr><tr><td>Régions/connaissance</td><td></td><td>11</td><td>11</td><td>17</td><td>18</td><td>20</td><td>22</td><td>28</td><td>126</td><td>18</td></tr><tr><td>Potentiel /recherche</td><td></td><td>27</td><td>27</td><td>28</td><td>29</td><td>63</td><td>67</td><td>80</td><td>320</td><td>46</td></tr><tr><td>Sciences/société</td><td>36</td><td>39</td><td>40</td><td>41</td><td>43</td><td>47</td><td>53</td><td>66</td><td>329</td><td>47</td></tr><tr><td>Coopé internationale</td><td>17</td><td>18</td><td>18</td><td>19</td><td>20</td><td>30</td><td>35</td><td>43</td><td>182</td><td>26</td></tr></tbody></table>

## Développements récents et prochaines étapes

Le 7ème PCRD doit être adopté à la fois par le Conseil (Conseil Compétitivité) et le Parlement (commission parlementaire « Industrie de la recherche et de l'énergie » (ITRE)) selon une procédure de codécision. La Commission européenne, qui initie cette procédure, leur a transmis ses propositions concernant le 7ème PCRD, le 6 avril 2005, les programmes spécifiques, le 23 septembre 2005, et les règles de participation, le 30 décembre 2005.

Cependant, les négociations interinstitutionnelles sur le 7ème PCRD entre la Commission, le Conseil et le Parlement européens n'ont réellement démarré qu'en avril 2006 car il a fallu attendre l'accord interinstitutionnel sur les perspectives financières 2007-2013 pour connaître le montant global définitif qui serait attribué au 7ème PCRD.

Après l'adoption par le Conseil des perspectives financières de l'UE pour la période 2007-2013 (fin avril 2006) et le vote en plénière sur le budget au Parlement (mi-mai 2006), la Commission a présenté en mai 2006 une nouvelle proposition du 7ème PCRD en tenant compte du budget réduit.

Ainsi, la « 1ère navette » entre la Commission, le Conseil et le Parlement, caractéristique de la procédure de codécision sur le 7ème PCRD, a pris fin le 28 juin, mais il reste un second «round» de négociation...

Le Conseil doit adopter rapidement sa Position commune et des trilogues interinstitutionnels doivent prendre place durant l'été 2006 afin que le Parlement se prononce en 2ème lecture à la rentrée et que le 7ème PCRD soit officiellement adopté à la fin de l'année 2006 (la conférence de lancement du 7ème PCRD est prévue pour décembre 2006, à la fin de la Présidence finlandaise)

Les premiers appels à propositions du 7ème PCRD devraient avoir lieu en décembre 2006.
Lundi 18 septembre 2006

# Publier dans la revue Agronomy for Sustainable Development

E. Lichtfouse<fnref n="1" />, P. Debaeke<fnref n="2" /> et F. Papy<fnref n="3" />

## Présentation de la revue

La revue *Agronomy for Sustainable Development*<fnref n="2" /> est une des huit revues de l'INRA sous la tutelle de la Direction de l'Innovation et des Systèmes d'Information (DISI). Elle est adossée aux départements Environnement et Agronomie (EA) et Sciences pour l'Action et le Développement (SAD). Les articles sont évalués par un comité de présélection à la soumission et par 28 éditeurs thématiques pour l'évaluation approfondie. La revue est commercialisée par EDP Sciences. Les thèmes majeurs de la revue sont les suivants, les thèmes concernant l'écotoxicologie étant soulignés.

- Sustainable agriculture, ecological production. Innovations in farming systems.

- Agriculture and preservation of natural resources. Sustainable land use.

- Agriculture and global changes. Agroclimatology and modelling.

- Biogeochemistry of agrosystems. Pollutants in agrosystems.

- Ecological pest control and biopesticides.

- Ecological, economical and social impacts of genetic engineering applications.

- Environmental impact on soil, water, air and biodiversity.

- Risk assessment for food, ecotoxicology. Food quality, food safety, supply chain management, and geographical indication.

- Environmental management in agriculture. Decision support systems and companion modelling.

- Organic farming. Ecological cropping and farming systems.

- Agricultural production of renewable energies.

- Genetically modified organisms (GMOs) in cropping systems.

- Social and economical issues of agricultural changes.

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Le facteur d'impact 2005, c'est-à-dire de nombre de citation moyen en 2005 des articles publiés en 2003 et 2004, est de 1,008, classant la revue 16e/48 dans la

<footnote n="1">¹INRA, Département Environnement et Agronomie, BP 86510, 21065 Dijon Cedex</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR Agrosystèmes Cultivés et Herbagers, Chemin de Borde-Rouge - Auzeville, BP 52627, 31326 Castanet-Tolosan Cedex</footnote>

<footnote n="3">³INRA, UMR SADAPT Systèmes agraires et développement : activités, produits, territoires, 16 rue Claude Bernard, 75231 Paris Cedex 05</footnote>

<footnote n="2">² Contact : Josiane Ménassieu, secrétaire éditoriale, agronomy@avignon.inra.fr, www.edpsciences.org/agro.</footnote>
catégorie *Agronomy* (schéma). En 2005, la revue a publié 63 articles dont 60 articles primaires et 3 articles de synthèse totalisant 524 pages, soit environ 8 pages par article. Le statut actuel des 105 articles soumis en 2005 est : 21 acceptés (20%), 57 rejetés à la soumission (54%), 21 rejetés après évaluation approfondie (20%), 6 en cours d'évaluation. Le délai moyen de publication est de 6,4 mois pour la version en ligne et 7,4 mois pour la version papier. Ce délai se décompose de la manière suivante : 0,3 mois pour la présélection à la soumission ; 4,1 mois pour l'évaluation approfondie des éditeurs thématiques ; et 2 ou 3 mois pour la production par EDP Sciences de la version en ligne et papier, respectivement. Ces délais vont décroître grâce à la mise en ligne immédiate (on-line first) des articles sans pagination avec un identifiant numérique (digital object identifier - DOI).

## Conseils de rédaction

**Le caractère novateur.** *Straight to the point.* Le lecteur doit saisir très rapidement le point nouveau de l'article. L'erreur de loin la plus fréquente est l'absence d'explication du caractère novateur des résultats par rapport aux connaissances actuelles, notamment dans le résumé. Sans cette explication, le correcteur n'aura pas de base pour juger le degré d'innovation de l'article. L'aspect novateur doit apparaître dans le titre, si possible. Il doit être décrit de manière très succincte dans le résumé par opposition à ce qui est déjà connu. L'introduction doit "préparer le terrain" de cette innovation en partant d'un cadre assez général sur l'importance du sujet et la justification des travaux, pour aboutir à l'identification d'un manque de connaissance. La section "résultats et discussion" doit être organisée en sous-sections thématiques, chaque sous-section étant centrée autour de la démonstration d'un seul point nouveau en évoquant successivement : la description du résultat avec une illustration, son interprétation, sa signification particulière et générale puis une dernière phrase résumant clairement la "découverte majeure". La conclusion rassemble ces différents points innovants. Enfin, un lecteur ne retenant généralement qu'un seul point nouveau par article, il est vivement conseillé de centrer l'article sur la démonstration de ce point en élaguant les résultats qui ne servent pas directement à conforter ce point. Ceci pour éviter la "dilution de la nouveauté".

**La présentation.** *Slack presentation equal slack science.* Cet adage anglo-saxon un peu abrupt résume néanmoins bien l'impression que donne un article mal présenté aux éditeurs et correcteurs. Les défauts majeurs de présentation sont les suivants. Trop d'articles ne respectent pas les instructions aux auteurs à la lettre. Ceci donne tout d'abord une impression négative à la soumission. Puis cela provoque des pertes de temps lors des demandes de remise en conformité. De manière paradoxale, la qualité des illustrations diminue, malgré - ou plutôt à cause de - l'apparente facilité à dessiner des graphiques avec un logiciel. On assiste ainsi à une recrudescence de figures incompréhensibles par leur complexité : 8 graphiques par figure, 6 courbes par graphique, graphique en 3 dimensions, graphique inséré dans un autre graphique, etc. Certains articles comportent aussi 8 tableaux, 8 graphiques et seulement 5 pages de texte, car il est plus facile d'élaborer un graphique que de rédiger un paragraphe bien pensé. Le nombre d'illustrations doit être équilibré avec la longueur du texte. L'illustration montrant le point nouveau de l'article doit être préparée avec le plus grand soin. Les légendes des figures sont souvent trop brèves car "une figure doit être comprise sans avoir à lire le texte principal de l'article". Il est donc conseillé d'expliquer au lecteur dans la légende la tendance à observer et sa signification scientifique. Nous assistons également à un usage abusif des abréviations qui rendent difficile la lecture de l'article, diminuant par voie de conséquence l'impact de cet article. Enfin nous recevons encore beaucoup de rapports d'évaluation soulignant la qualité médiocre de la rédaction en anglais, allant
jusqu'au refus d'évaluation par le correcteur qui ne peut juger un article dont certains passages sont incompréhensibles.

**La vulgarisation.** Accessible au plus grand nombre. Trop d'auteurs ne prennent pas le temps d'introduire un minimum de vulgarisation et d'éducation dans leurs articles, diminuant d'autant l'impact de l'article vers un public varié : étudiants, collectivités, professionnels. Le caractère éducatif doit apparaître non seulement dans l'introduction en citant des synthèses bibliographiques pertinentes, mais aussi dans la description de la signification générale des résultats. Il facilitera aussi la lecture de l'article par les correcteurs et les éditeurs.

En guise d'épilogue traduisant bien un des biais des nouvelles technologies, voici un extrait d'un message de soumission d'un article : *Subject: Paper submitted to Agronomie. Kindly find attached file (MS Word) of my paper entitled "Salt-induced injury symptom, changes in nutrient and pigment composition, and yield characteristics of mungbean grown under warm ambient temperature" for publication in Plant Science. I hope the paper meets the laid down criteria of publication.*
Mardi 18 septembre 2006

# Les questions et attentes de l'ADEME dans le domaine de la recherche en écotoxicologie des sols

A. Bispo<fnref n="1" /> et C. Grand<fnref n="2" />

## 1. Les domaines et moyens d'intervention de l'Agence De l'Environnement et de la Maîtrise de l'Énergie (ADEME)

L'ADEME intervient notamment dans les domaines (i) des déchets, (ii) des sites et sols pollués et (iii) de la protection des sols. Ces différents domaines nécessitent de disposer d'éléments scientifiques et techniques sur les impacts environnementaux et notamment écotoxicologiques des différentes solutions de gestion des déchets et des sols. Sur ces sujets, l'ADEME peut intervenir notamment en :

- orientant, animant et cofinançant des programmes de recherche et des thèses,

- élaborant des outils méthodologiques,

- finançant des opérations exemplaires et de démonstration,

- mettant en place des actions d'information et de communication.

L'objectif de l'ADEME n'est pas uniquement de cofinancer des programmes de recherche afin d'acquérir des connaissances nouvelles mais également de développer des méthodes, de réaliser des ouvrages diffusables et d'acquérir un retour d'expériences afin d'accompagner les décisions des organismes publics.

## 2. Exemples de collaborations entre l'ADEME et l'INRA dans le domaine de l'écotoxicologie terrestre

Avant de détailler les questions et les attentes de l'ADEME dans le domaine de l'écotoxicologie terrestre, certaines collaborations entre l'INRA et l'ADEME ont été choisies afin d'illustrer des questions de recherche et des valorisations.

### 2.1. Les boues de station d'épuration épandues ont elles un impact sur les champignons mycorhizogènes ?

Cette question a donné lieu à 2 thèses cofinancées par l'ADEME et la Région Bourgogne en collaboration avec l'INRA de Dijon. Les travaux de thèse ont montré, d'une part, un impact possible des boues si celles-ci sont employées en dehors du cadre réglementaire (forte dose et/ou contamination excessive) et, d'autre part, l'intérêt d'utiliser les champignons mycorhizogènes comme indicateurs d'impact. En collaboration avec le CNRS de Nancy, l'INRA de Dijon soutenu par l'ADEME a normalisé deux protocoles utilisant ces organismes à l'échelle nationale (NF XP X31-205-1, -2) et bientôt à l'échelle internationale.

### 2.2. Les boues de station d'épuration contiennent-elles des herbicides et si oui, ceux-ci se comportent- ils après épandage des boues de la même manière que lors d'une pulvérisation sur le sol ?

Cette question a été abordée dans le cadre d'un contrat de recherche en collaboration avec l'INRA de Versailles (programme PNETOX). Le développement des méthodes d'analyse des herbicides a permis de réaliser une campagne de suivi de 4 boues de station d'épuration qui a mis en évidence la présence à des teneurs variables des herbicides recherchés (diuron, glyphosate et AMPA). Le devenir et les

<footnote n="1">¹Département Gestion Biologique et Sols, ADEME, 2 square La Fayette, BP 90406, 49004 Angers Cedex 01</footnote>

<footnote n="2">²Département Sites et Sols Pollués, ADEME, 2 square La Fayette, BP 90406, 49004 Angers Cedex 01</footnote>
impacts des herbicides dans les boues ont été suivis en mésocosmes : (i) la persistance des herbicides augmente dans les sols s'ils sont apportés dans les boues, par rapport à une pulvérisation directe, (ii) les quantités de composés transférés vers les eaux de lixiviation ou les végétaux sont très faibles et (iii) aucun effet négatif sur les différents organismes testés (micro-organismes du sol, végétaux, insectes, cultures cellulaires) n'a été constaté aux doses épandues en agriculture.

**2.3. Est-il possible, sur un site pollué, de mettre en évidence les transferts de polluants dans les chaînes trophiques terrestres et de mesurer les effets à différents niveaux trophiques ?**

Cette question a donné lieu à un contrat de recherche qui a démarré fin 2005 avec l'Université de Besançon, unité associée INRA, sur une zone de 40 km² incluant le site de Metaleurop (Nord-Pas-de-Calais) et ses alentours contaminés par le Pb et le Cd. Il s'agit d'une part d'acquérir des connaissances nouvelles sur les processus impliqués dans la biodisponibilité, les transferts et les effets des contaminants dans les réseaux trophiques terrestres (étude du réseau trophique en place incluant des plantes, les invertébrés du sol, les mammifères et les oiseaux) à l'échelle individuelle et populationnelle. D'autre part, l'objectif est également de renforcer la prise en compte des processus de bioaccumulation et de transfert des contaminants dans les études d'évaluation des risques pour les écosystèmes sur les sites pollués.

**2.4. Est-il possible, pour les sols, de proposer une méthode permettant de démontrer la « non mobilité » et la « non biodisponibilité » des éléments traces ?**

Cette question est issue de la réglementation sur l'épandage des boues de station d'épuration (arrêté du 8 janvier 1998) qui interdit les épandages de boues sur les sols présentant des teneurs élevées en éléments traces, sauf s'il est démontré que ceux-ci ne sont ni mobiles, ni biodisponibles. Un groupe de travail incluant des chercheurs de l'INRA a rédigé un guide technique téléchargeable proposant une démarche et des outils pour répondre à cette question d'une manière simple et opérationnelle.

**3. Les questions et les attentes de l'ADEME**

En considérant une définition large de l'écotoxicologie (depuis la dispersion des contaminants dans les sols jusqu'aux impacts) les questions et les attentes sont multiples. Elles concernent essentiellement l'absorption et les effets des agents chimiques sur les individus et plus largement les écosystèmes. Il s'agit non seulement d'acquérir les connaissances mais également de les transposer en méthodes et/ou modèles et/ou référentiels destinés à être appliqués ensuite à une plus grande échelle et mieux connaître leurs limites d'utilisation.

**3.1. Questions de connaissance**

L'acquisition de connaissances concerne d'une part la biodisponibilité au sens large des contaminants pour les organismes du sol, mais également l'écologie des sols, encore trop méconnue.

**3.1.1. Biodisponibilité des contaminants dans les sols**

La biodisponibilité au sens de la norme ISO/DIS 17402 peut être définie comme un processus dynamique en trois étapes :

- Disponibilité du contaminant dans le sol (= disponibilité environnementale), qui intègre notamment la spéciation/partition des contaminants inorganiques/organiques dans les sols, les réactions biotiques/abiotiques de sorption/désorption et/ou de dégradation. Ces recherches doivent permettre de prévoir le comportement des contaminants dans les sols.
- Absorption du contaminant par l'organisme (= biodisponibilité environnementale) qui s'intéresse au passage du contaminant dans l'organisme cible considéré (ex : Quelles sont les voies de contamination ? Sont-elles passives ou actives ? L'organisme influence-t-il l'absorption ?). Ces recherches doivent notamment permettre d'expliquer les variations inter- et intra-spécifiques.

- Accumulation et/ou effet du contaminant dans les organismes cibles (= biodisponibilité toxicologique) qui intègre les modes par lesquels le contaminant est stocké dans l'organisme et/ou agit sur celui-ci (ex : effets biochimiques, physiologiques, comportementaux, inhibition du développement et de la reproduction, létalité).

Dès lors, l'acquisition de connaissances concerne l'ensemble de ces étapes et intègre l'étude des mécanismes et des phénomènes qui ont lieu ainsi que leur modélisation, tant pour comprendre que pour agir à terme afin de limiter les transferts et donc les impacts (ex : les techniques de traitement permettent-elles de réduire l'exposition ?). Si toutes ces questions se posent au niveau individuel (et c'est généralement ce qui est considéré), il va de soi que les conséquences au niveau des populations et des communautés du sol et plus largement des écosystèmes terrestres doivent également être étudiées (ex : dispersion des contaminants dans les chaînes trophiques).

### 3.1.2. Écologie des sols

Pour être en mesure d'appréhender les conséquences des contaminants sur les écosystèmes du sol, et plus largement terrestres, il convient d'accorder une place plus importante aux recherches en écologie du sol (ex : diversité spécifique et fonctionnelle, relations trophiques dans le sol et dans l'écosystème terrestre) afin de caractériser les équilibres naturels et être en mesure de juger des perturbations liées aux activités humaines (érosion, pratiques agricoles, retombées atmosphériques et activités industrielles). Ces recherches doivent permettre de définir les espèces à protéger et/ou les fonctions-clés de l'écosystème terrestre à protéger.

## 3.2. Attentes en termes de transfert de connaissances et d'opérations de démonstration

Les transferts de connaissances concernent non seulement l'obtention de méthodes et ou d'outils nécessaires à la gestion des milieux multi-contaminés, mais également la démonstration à l'échelle pilote ou parcelle que ces outils ou méthodes sont utilisables et pertinents.

### 3.2.1. Définition de méthodes/d'outils et référentiels

Les connaissances acquises sur les transferts des contaminants et leurs effets individuels et populationnels doivent à terme déboucher sur la proposition de méthodes ou de modèles ou d'outils utilisables en routine, hors du monde de la recherche (ils doivent alors être accompagnés de référentiels pour faciliter l'interprétation des résultats). Ces connaissances nouvelles et le savoir faire des laboratoires doivent également pouvoir être mobilisés dans le cadre d'expertises nationales ou internationales telles que des questions d'actualité ou des projets de normes.

### 3.2.2. Opération de démonstrations notamment pour les Évaluations des Risques pour les Écosystèmes sur sites pollués

L'Évaluation des Risques pour les Écosystèmes reste une approche difficile à conduire en raison notamment des imprécisions sur la démarche et la difficulté de l'évaluation des risques. En effet, il reste à transformer les résultats sur les effets observés en termes d'actions opérationnelles pour réduire ces effets à un niveau jugé acceptable (qui reste à définir). Au sein de la démarche d'Évaluation des
Risques pour les Écosystèmes, plusieurs approches existent pour évaluer les expositions et les effets des substances :

- approche par substance à l'aide de modèles de transferts,

- approche à l'aide de bioessais réalisés sur des échantillons prélevés in situ,

- approche écologique en utilisant des inventaires floristiques et faunistiques, des bioindicateurs de terrain...

Ces approches et les outils qui y sont liés doivent faire l'objet d'essais et de comparaisons in situ afin de mettre en évidence la faisabilité d'une telle démarche. L'application de ces approches sur des cas concrets n'est pas à dissocier complètement des aspects d'acquisition de connaissances car elles posent souvent des questions complémentaires, telles que les stratégies d'échantillonnage, la transposition des résultats obtenus au laboratoire à ceux mesurés sur le terrain...

## 4. Conclusions

L'écotoxicologie présente un intérêt certain pour l'ADEME qui doit traiter des matrices complexes, potentiellement multi-contaminées (ex : sols issus de sites pollués, sols agricoles contaminés par des boues ou des retombées atmosphériques, déchets organiques) pour lesquelles une démarche purement analytique s'avère complexe, coûteuse voire impossible et parfois inutilisable car il est encore difficile de prévoir la toxicité de mélanges. L'écotoxicologie, par son caractère intégrateur permet de répondre à ce besoin.

Afin de promouvoir l'acquisition de connaissances, le transfert technologique (vers des outils et/ou référentiels) et le retour d'expériences dans la mise en œuvre de nouveaux outils/méthodes, l'ADEME a mis en place plusieurs programmes de recherche et notamment : le programme STARTT qui vise à comprendre les transferts et les effets des contaminants dans les chaînes trophiques à proximité d'un site pollué (voir § 2.3) et le programme national sur les bioindicateurs de qualité des sols qui vise à mieux comprendre l'écologie du sol et à définir des indicateurs biologiques opérationnels pour la gestion des sols.
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INRA

Communications scientifiques
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Session 1

Biodisponibilité et dynamique des contaminants
dans l'environnement et les chaînes alimentaires
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# Influence d'amendements organiques et minéraux sur la rétention du diuron

V. Chaplain, A. Brault, E. Gosset, D. Tessier et C. Mougin

INRA, Unité PESSAC, Physico-chimie et Écotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex

## Introduction

Les amendements minéraux répétés ou la valorisation agricole des boues de stations d'épuration modifient considérablement les propriétés physicochimiques des sols. Ces modifications peuvent influencer le devenir de polluants organiques tels que les pesticides. Une expérience de longue durée sur les 42 parcelles de l'INRA de Versailles a démontré en absence de végétation l'impact majeur d'amendements minéraux sur le pH du sol et sur leur texture. Il n'existe pas de données relatives à l'adsorption de molécules pesticides sur ces différentes parcelles. A l'inverse, l'étude du devenir d'un mélange de trois molécules herbicides apporté au sol *via* des boues de station d'épuration a montré l'influence du type de traitement des boues sur la persistance des molécules. Le compostage des boues semble en particulier favoriser la dégradation des polluants. Les tests écotoxicologiques ont révélé des effets bénéfiques des boues à dose agronomique et toxiques à plus forte dose. La contribution respective des boues ou des polluants est difficile à déterminer. De façon générale, les phénomènes de rétention de polluants sur les sols ou les boues déterminent pour une large part le devenir et l'impact écotoxicologique potentiel des molécules organiques. Dans cette étude on s'intéresse donc aux conséquences des amendements minéraux ou organiques sur la rétention d'une molécule organique herbicide modèle.

## Matériel et Méthodes

Le diuron a été retenu comme molécule modèle en raison de sa stabilité et de sa neutralité sur une large gamme de pH. L'adsorption se fait préférentiellement sur les matières organiques du fait de son hydrophobicité. Des échantillons de 6 parcelles ont été retenus afin de couvrir une gamme de pH allant de 5,3 à 9,2 correspondants à différents amendements minéraux acides, neutres ou basiques, apportés chaque année depuis 1929. Les parcelles étant exemptes de végétation la matière organique labile a disparu au cours du temps. Les teneurs en carbone organique total sont toutefois variables et connues. Parallèlement trois échantillons de boues de stations d'épurations urbaines ont été collectés correspondant à des traitements finaux différents : le chaulage, le séchage et le compostage. Les paramètres physico-chimiques de ces boues sont caractérisés par des taux de carbone très élevés, respectivement 396 g/kg, 336 g/kg et 231 g/kg pour le séchage, le compostage et le chaulage, et des pH variables, respectivement 6, 7,7 et 12,5.

Enfin trois sols témoins ont été retenus, un sol n'ayant reçu aucun traitement ni végétation depuis 1929, de pH acide et de COT 0,709 %. Un sol prélevé sur la parcelle des Grands Closeaux à Versailles, de texture limono-argileuse de taux de carbone organique total 1,19 % et de pH 8,13. Un sol prélevé à Dijon de texture argilo-limoneuse, de pH 7,9 et de taux de carbone organique 1,36 % pour lequel nous disposions d'un grand nombre de mesure d'adsorption du diuron dans différentes conditions physicochimiques.

Les isothermes d'adsorption sur les sols et les boues sont classiquement mesurées selon la méthode des restes. Les sols sont séchés à l'air et tamisés à 2 mm, 3 g de phase solide sont mis en contact avec 10 mL de solution aqueuse de diuron, de concentrations variables de 5,
10, 15, 20 µg/mL et contenant 20000 dpm/mL. Pour chaque concentration trois répétitions sont réalisées. Après 24 h d'agitation rotative, la phase solide est séparée par centrifugation pendant 20 min à 6000 tr/min. Les surnageants sont ensuite analysés par scintillation liquide selon trois prélèvements de 50 µl dans 15 mL de liquide scintillant. La quantité de diuron fixée par gramme de solide est calculée à partir des mesures de concentrations initiales et à l'équilibre.

## Résultats

Pour les échantillons issus des 42 parcelles, globalement les amendements minéraux augmentent la rétention du diuron par rapport au sol témoin, avec un effet plus prononcé pour les parcelles acides. Les isothermes sont non linéaires et modélisées par l'isotherme de Freundlich. Des corrélations entre le paramètre kF et les paramètres clés, pH, CEC des échantillons de sols ont été recherchées sans mettre en évidence de relation directe.

La rétention du diuron sur les trois échantillons de boues montre d'une part la plus forte réactivité liée à la teneur en carbone organique mais aussi l'importance des traitements finaux sur la rétention du diuron. En particulier les quantités de diuron fixées par les boues chaulées sont comparables à celles fixées par le sol témoin malgré les différences importantes de carbone organique. Les boues séchées et compostées ont une très forte réactivité atteignant les 200 µg/g dans la zone de concentration étudiée.

Afin de tenter de comparer la réactivité de ces différentes matières organiques, nous avons tracé pour une concentration à l'équilibre de diuron égale à 10 ppm les quantités adsorbées rapportées au COT en µg/g en fonction du pH des échantillons (Fig. 1). Il ressort de cette comparaison que les réactivités des boues et des matières organiques anciennes des 42 parcelles sont voisines et s'expriment simplement en fonction du pH. L'augmentation du pH augmente la charge des matières organiques, réduit l'hydrophobicité et donc la rétention. La parcelle ayant reçu du CaCO₃ s'exclut légèrement de cette tendance, probablement du fait de la rétention du diuron sur la calcite. En revanche les deux sols « frais » ont une réactivité très largement supérieure.

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 1. Réactivité des différents substrats vis-à-vis du diuron (○ : boues de STEP ; + : sols témoins ; ● : 42 parcelles)</figcaption></figure>

## Conclusion

Des travaux antérieurs ont montré la présence de diuron préalablement adsorbé dans les boues mais les teneurs maximales mesurées n'excèdent pas les 50 ppb avant traitement. Ces quantités sont donc négligeables par rapport à celles mesurées au cours de l'adsorption. Il serait intéressant de poursuivre l'étude de l'adsorption du diuron sur des mélanges sols-boues de concentrations variables afin de quantifier l'additivité de réactivités. Il serait également intéressant de tester l'influence d'autres polluants organiques ou de métaux sur la rétention du diuron.
# Intérêts et limites de la DGT (Diffusive Gradient in Thin films) comme méthode d'évaluation de la phytodisponibilité des métaux

L. Denaix, J.-Y. Cornu, Y. Soulacroix, A. Schneider et V. Sappin-Didier

INRA, UMR TCEM, Transfert Sol-Plante et Cycle des Éléments Minéraux dans les Écosystèmes Cultivés, 71 avenue E. Bourleaux, BP 81, 33883 Villenave-d'Ornon Cedex

## Introduction

Les plantes cultivées sur des sols contaminés en éléments traces métalliques (ETM) peuvent absorber et accumuler ces éléments dans leurs parties consommées. Selon Decloître [1], les végétaux contribuent de manière majoritaire à l'exposition humaine au Cd et Pb (fumeurs et expositions professionnelles exceptés). Afin d'évaluer le risque pour la santé humaine associé à la contamination des sols en ETM, il est nécessaire de pouvoir prédire la phytodisponibilité des ETM dans les sols, i.e. la fraction d'ETM du sol susceptible d'être absorbée par une plante et d'interagir avec son métabolisme. La phytodisponibilité des ETM est cependant facile à définir mais difficile à mesurer. Beaucoup de méthodes ont été proposées pour évaluer la phytodisponibilité des métaux dans les sols (extractions chimiques, mesures en solution de sol, ...), mais peu sont à la fois simples, robustes et bon marché [2]. Davison & Zhang [3] ont développé une technique nommée gradient de diffusion en gels fins (DGT) pour évaluer la biodisponibilité des ETM dans l'environnement. Cette technique précisément décrite par Zhang *et al.* [4] utilise une résine chélatante séparée de la surface du sol par un gel de diffusion de manière à ce que le prélèvement d'ETM par la DGT soit contrôlé par diffusion. La DGT abaisse localement la concentration d'ETM en solution et fournit une mesure quantitative du flux d'ETM induit. La concentration effective($C_E$), dont la valeur est calculée sur la base de cette mesure, intègre la participation du pool cinétiquement labile d'ETM de la phase solide. Dans une perspective de prédiction de la phytodisponibilité des ETM dans les sols, plusieurs résultats encourageants ont été rapportés pour Cu [5], Zn [6] et plus récemment pour Cd et Pb [7] : parmi des sols de degrés et origines de contamination contrastés, $C_E$ était décrit comme le meilleur indicateur de la phytodisponibilité des métaux. Cependant, des mesures similaires de $C_E$ s'avérèrent moins prédictives [8], de sorte que Nolan *et al.* [7] conclurent que les capacités prédictives de la DGT dépendraient de la combinaison des métaux, du degré de contamination des sols et de la plante considérée. La nature du sol et l'origine de contamination pourraient également être des facteurs à considérer. La robustesse de la mesure DGT est donc toute relative. L'utilisation de cet outil dans un contexte d'évaluation des risques liés à la contamination des sols cultivés nécessite de valider ses capacités prédictives au sein de sites agricoles, pour des végétaux consommés. Aussi, cette étude a pour but de tester au sein de plusieurs sites dont la nature de la contamination est diverse, les capacités de la DGT à prédire la phytodisponibilité de Zn, Pb, Cu et Cd pour différents végétaux.

## Matériel et Méthodes

Quatre sites contaminés seront présentés :

* un site contaminé par des épandages de boues de station d'épuration et de compost de déchets ménagers (C)

* un site contaminé par de l'irrigation avec des eaux usées non épurées (P)

* un site contaminé par des retombées atmosphériques issues d'industries de métaux non ferreux (M)
* un site contaminé par des épandages de bouillie bordelaise (B).

Pour chaque site, un ensemble de 6 à 20 sols de surface différents ont été sélectionnés pour l'expérimentation.

Les niveaux de contamination de ces sites sont résumés dans le tableau 1.

<table><caption>**Tableau 1.** Caractéristiques physicochimiques des sols étudiés (minimum-maximum).</caption><thead><tr><th>Site</th><th>Nombre de sols</th><th>pH</th><th>C (g/kg MS)</th><th>Cu (mg/kg MS)</th><th>Cd (mg/kg MS)</th><th>Pb (mg/kg MS)</th><th>Zn (mg/kg MS)</th></tr></thead><tbody><tr><td>C</td><td>20</td><td>4,7-6,7</td><td>-</td><td>-</td><td>0,1-2</td><td>17-39</td><td>15-117</td></tr><tr><td>M</td><td>9</td><td>4,4-7,7</td><td>10-16,5</td><td>-</td><td>0,9-2,9</td><td>71-111</td><td>103-360</td></tr><tr><td>P</td><td>9</td><td>7,2-8,3</td><td>8,1-97,9</td><td>-</td><td>0,25-5,5</td><td>20-560</td><td>33-1190</td></tr><tr><td>B</td><td>6</td><td>5,5-8,5</td><td>6,1-17,1</td><td>100-157</td><td>-</td><td>-</td><td>66-101</td></tr></tbody></table>

Sur le site C, des laitues (Lactuca sativa cv Appia), du maïs (Zea mays cv INRA 260), des pommes de terre (Solanum tuberosum cv BEA) et des carottes (Daucus carota cv Touchon) ont été cultivés en plein champ. Un échantillon composite pour chaque parcelle a été collecté et analysé.

Pour les sites P et M, des cultures de laitues (Lactuca sativa cv Appia) ont été conduites en chambre climatique dans des pots contenant 2 kg MS de chacun des sols.

Pour le site B, du blé dur (Triticum durum cv. Acalou) a été cultivé sous serre dans des pots de 2 kg. L'humidité des sols a été maintenue à environ 80 % de la capacité au champ, par addition quotidienne d'eau déionisée après pesée.

Les parties aériennes et les racines pour les laitues, les feuilles et les grains pour le maïs, les racines de carottes et les tubercules de pomme de terre ont été récoltés, rincés à l'eau déionisée, séchés à 80°C, pesés et broyés. Les teneurs en métaux ont été déterminées par GF-AAS après minéralisation micro-onde dans HNO₃.

Les dispositifs DGT ont été mis en contact pendant 16 heures à 28°C sur des sols saturés en eau. Chaque sol a donné lieu à 3 répétitions. La masse de métal M accumulée dans la résine chélatante a été déterminée par SAA après élution dans HNO₃ 1M. Les concentrations effectives en Zn et Cd ont été calculées à partir cette masse M suivant les relations décrites par Harper et al. [9]. Le ratio R<sub>diff</sub> a été calculé à l'aide du modèle numérique dynamique DIFS propre au système sol-DGT [9].

## Résultats et Discussion

Pour les sites M et C, la concentration en Zn, et dans une moindre mesure la concentration en Cd, des parties aériennes des laitues augmente significativement avec la concentration effective (C<sub>E</sub>) du sol (Fig. 1). En considérant la concentration effective en Zn, une relation de type linéaire est observée avec les teneurs en Zn des parties aériennes de laitue (r²=0,95 pour site M et r²=0,71 pour le site C). Pour le Cd sur ces deux sites, les relations sont plus lâches, surtout lorsque les CE sont élevées. Ceci pourrait s'expliquer par une réaction de la plante à des concentrations élevées bien que des symptômes de phytotoxicité ne soient pas visibles. Des processus physiologiques actifs sembleraient réguler le prélèvement et la translocation de Cd dans la laitue même pour des niveaux modérés de contamination.

Par contre, on constate que les relations diffèrent suivant le site. Cela peut dépendre, soit de la nature du sol, bien que ces deux sols soient sableux, soit du type de contamination (d'origine minérale pour l'un, d'origine organique pour l'autre) soit du mode de culture (culture en conditions contrôlées/culture en plein champ).

Pour le Pb, aucune relation n'a pu être mise en évidence, quel que soit le site considéré.
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 1.** Relation entre la concentration en Zn et Cd dans des feuilles de laitues et la concentration effective mesurée par DGT.</figcaption></figure>

Comme rapporté par Nolan et al. [7] sur le blé et Zhang et al. [6] sur le cresson, $C_E$ s'avère être le meilleur indicateur de la concentration en Zn et Cd des parties aériennes de laitue, notamment meilleur que la concentration de l'ion libre en solution. Cela confirme que dans certains sols les processus de réapprovisionnement en métaux de la solution sont à considérer pour les mesures de phytodisponibilité. Cela suggère également que dans les sites C et M, le réapprovisionnement en Zn de la solution se fait majoritairement par diffusion et mobilisation de la phase solide.

Sur le site C, d'autres végétaux ont été cultivés. Pour tous les végétaux testés, des relations plus ou moins strictes ont pu être mises en évidence entre la concentration en Cd ou Zn dans les organes considérés et les valeurs de $C_E$ mesurées. Par contre, elles dépendent de l'espèce et de l'organe considéré.

Pour le site P pour Cd et Zn et pour le site B pour le Cu, aucune relation directe entre ces paramètres n'a pu être mise en évidence. Pour le site B, des symptômes de phytotoxicité sont apparus sur le blé pour certains sols (décolorations et nécroses des extrémités des feuilles). La mesure des surfaces racinaires a également permis de mettre en évidence une diminution de l'élongation racinaire. L'accumulation dans un végétal est le résultat d'une interaction entre une disponibilité de l'élément dans le sol et un prélèvement racinaire. Si la surface racinaire est modifiée, le prélèvement le sera également. Ainsi, pour ces mêmes sols, nous avons calculé un prélèvement potentiel en utilisant la surface racinaire et le flux DGT mesuré. Cette fois, nous obtenons une bonne relation avec le prélèvement effectif mesuré, avec toutefois une surestimation d'un facteur 3.

Pour conclure, cette étude illustre les capacités de la DGT à potentiellement prédire la phytodisponibilité de différents métaux (Cd, Cu, Zn) via le paramètre CE ou le prélèvement en utilisant le flux mesuré.

Références bibliographiques

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# Biodisponibilité et dynamique des contaminants métalliques et organiques : des mollusques gastéropodes terrestres aux réseaux trophiques

R. Scheifler, F. Gimbert, F. Hispard, M. Cœurdassier, P.-M. Badot et A. de Vaufleury

Laboratoire de Biologie Environnementale, EA 3184 UsC INRA, Université de Franche-Comté, Place Leclerc, 25030 Besançon Cedex

## Introduction

Le Laboratoire de Biologie Environnementale mène depuis 1997 des recherches visant à évaluer la biodisponibilité, le transfert et les effets d'éléments traces métalliques (ETMs : As, Cr, Cd, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn) et de contaminants organiques (pesticides, hydrocarbures...) chez des mollusques gastéropodes terrestres, en particulier chez *Helix aspersa aspersa* Müller (Escargot Petit-gris). Les objectifs fondamentaux de ces travaux visent à comprendre les mécanismes impliqués dans les transferts et les effets de ces polluants à différents niveaux d'organisation biologique. Les résultats obtenus ont permis de proposer des outils d'aide à la décision utilisables dans les procédures d'évaluation des risques environnementaux. Ainsi, un biotest basé sur la réduction de croissance d'escargots exposés à des sols ou des déchets pollués a été normalisé au niveau international (ISO 15952). Des microcosmes permettant des expositions *in situ* ont également été mis au point pour des travaux de biosurveillance. L'objectif de ce texte est de présenter quelques-uns des résultats récents les plus significatifs.

## Principaux résultats obtenus

*Biodisponibilité et cinétique de transfert sol – plante – escargot des polluants métalliques et organiques*

De nombreuses expériences d'exposition d'escargots à des sols contaminés ont permis d'évaluer la biodisponibilité des polluants en mesurant leurs concentrations dans les tissus des animaux exposés durant une période donnée [1,2]. Des expériences plus spécifiques, réalisées en collaboration avec le Laboratoire Sols et Environnement (INRA-ENSAIA Nancy), suggèrent que, contrairement aux hypothèses classiques, le pool non isotopiquement échangeable du Cd dans un sol est partiellement biodisponible pour *H. aspersa aspersa* [3] (Fig. 1).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 1.** Représentation schématique de la concentration totale en Cd dans un sol et des pools labiles (= isotopiquement échangeables), non labiles et biodisponibles pour *Helix aspersa aspersa*.</figcaption></figure>
La cinétique de transfert des ETMs, caractérisée par les taux d'absorption, pourrait être un indicateur de biodisponibilité complémentaire des concentrations internes [4]. Des travaux récents reposant sur des expositions de long terme (3 mois d'exposition à des sols contaminés et 3 mois consécutifs sur sol sain) et des modélisations mathématiques ont permis d'estimer les taux d'absorption du Cd, du Pb et du Zn sur des sols de natures différentes (sols ISO et sols contaminés par des retombées industrielles prélevés *in situ*) et contaminés à des concentrations croissantes. Pour le Cd, les concentrations à l'équilibre sont obtenues dans les viscères des organismes après 2 semaines d'exposition quels que soient le type de sol et le degré de contamination [5]. Les taux d'absorption varient de 0,060 à 0,544 µg·j⁻¹ et pourront servir d'indicateurs de biodisponibilité en comparaison avec ceux obtenus sur d'autres types de sol et/ou chez d'autres organismes.

Ces travaux ont ensuite été élargis aux transferts sol – plante – escargot grâce à l'utilisation de microcosmes. Une première expérience basée sur ces systèmes simples mais écologiquement représentatifs suggère que la contribution du sol dans le transfert des ETMs vers les escargots est de 2 à 40 % pour le Cd, de plus de 80 % pour le Pb et de 30 à 60 % pour le Zn [6]. Ces données nuacent les hypothèses classiques qui suggéraient que le transfert des ETMs chez les invertébrés terrestres (hors annélides) provenait principalement de la nourriture. Dans le cadre d'une collaboration avec l'Institute of Soil Ecology (GSF, Munich), ce type d'étude a été élargi à une substance organique, l'isoproturon (herbicide). En exposant des escargots dans des microcosmes contenant des sols et/ou des plantes contaminés par de l'isoproturon marqué au ¹⁴C, il a été montré que le sol était le vecteur principal de transfert des résidus radioactifs (Fig. 2). La nature de la plupart des résidus a pu être déterminée par radio-HPLC dans les sols et les plantes. Dans les tissus des escargots, les résidus E1 pourraient correspondre à des conjugués de l'isoproturon et les résidus E2 sont des métabolites indéterminés [7]. Ces données sont les premières, à notre connaissance, concernant l'évaluation de la biodisponibilité, du transfert et l'identification des métabolites de pesticides chez des mollusques terrestres.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 2.** Concentration en résidus radioactifs chez des escargots *H. aspersa aspersa* exposés à des sols et/ou des plantes contaminés par de l'isoproturon marqué au ¹⁴C.</figcaption></figure>

## Intégration des mollusques gastéropodes terrestres dans un contexte écosystémique

Les résultats précédents ont permis de caractériser un certain nombre de mécanismes impliqués dans la partie « Biodisponibilité et transfert sol – organismes » de la figure 3. Les travaux actuels ou prévus visent à compléter ces études en abordant, par exemple, l'influence de paramètres biotiques (présence de vers de terre [8]) et de paramètres abiotiques (paramètres physico-chimiques des sols) sur la disponibilité (évaluée par extraction chimique ou technique isotopique) et le transfert des ETMs vers les mollusques. Ces expériences, basées sur des comparaisons de modalités avec ou sans vers de terre, montrent des résultats contradictoires suggérant que l'effet des annélides dépend du type de sol, de la nature du polluant et de l'espèce de vers. D'autres travaux visent à évaluer le rôle
des mollusques en tant que vecteurs de contaminants lors des transferts trophiques dans les écosystèmes (partie « Transfert dans les réseaux trophiques » de la figure 3). Les formes de stockage du Cd dans les tissus (granules, métallothionéines) et leur influence sur le transfert du Cd vers le rat sont étudiées dans le cadre de la thèse de F. Hispard. Ces travaux permettent d'acquérir des informations concernant la biodisponibilité toxicologique des ETMs pour les escargots. Ces informations sont complémentaires de celles obtenues lors des études des effets des ETMs réalisées au LBE [9]. Ces données renseignent également sur la biodisponibilité pour d'éventuels prédateurs, les ETMs sous forme de métallothionéines étant considérés comme plus biodisponibles que les ETMs stockés sous forme de granules dans les tissus [10].

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 3.** Schéma synthétique des mécanismes étudiés.</figcaption></figure>

En conclusion, les travaux menés depuis une dizaine d'année au LBE ont contribué à la compréhension des mécanismes de transfert des polluants dans des systèmes sol – plante – escargot. Les études en cours s'appuient sur ces résultats pour aborder le rôle des mollusques dans un contexte écosystémique plus large. Cette thématique est actuellement abordée dans le cadre du programme STARTT soutenu par l'ANR et l'ADEME.

Références bibliographiques

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[3] Scheifler et al., 2003. *Environ. Sci. Technol.* 37, 81-86.

[4] Van Straalen et al., 2005. *Environ. Pollut.* 136, 409-417.

[5] Gimbert et al., 2006. *Environ. Int.* Sous presse.

[6] Scheifler et al., 2006. *Environ. Toxicol. Chem.* 25, 815-822.

[7] Scheifler, 2002. Thèse de doctorat. pp 196. Université de Franche-Comté, Besançon.

[8] Coeurdassier et al., 2006. *Appl. Soil Ecol.* Sous presse.

[9] de Vaufleury et al. 2006. *Environ. Toxicol. Chem.* 25, 797-806.

[10] Wallace & Luoma, 2003. *Mar. Ecol. Prog. Ser.* 257, 125-137.
# Cinétique d'accumulation du cadmium : évaluation in situ du transfert sol-plante-escargot

F. Gimbert<fnref n="1" />, A. de Vaufleury<fnref n="1" />, M. Mench<fnref n="2" />, R. Scheifler<fnref n="1" />, M. Coeurdassier<fnref n="1" /> et P.-M. Badot<fnref n="1" />

## Introduction

Selon la définition générale de Spellerberg [1], un indicateur biologique est une espèce reflétant l'état de l'environnement dans lequel elle se développe. Ce concept d'espèce sentinelle est basé sur l'existence d'une relation quantitative ou semi-quantitative entre la concentration en contaminant dans l'environnement et celle détectée dans l'organisme. Si cette relation existe, elle est sous la dépendance de facteurs liés à l'espèce, aux caractéristiques du milieu et de l'élément considéré qui conditionnent sa biodisponibilité, c'est-à-dire de sa fraction réellement transférable dans les organismes [2]. La concentration totale d'un contaminant ne peut être totalement prédictive de sa biodisponibilité. Des études cinétiques ont montré en laboratoire que les taux d'absorption, plutôt que les concentrations internes, étaient de bons estimateurs de la biodisponibilité des métaux pour les isopodes [3] et pour les escargots [4]. Parmi la faune du sol, ces mollusques gastéropodes ont montré leurs capacités de bioindication de la qualité de l'environnement [5]. L'objectif ici est d'étudier in situ les cinétiques du transfert sol-plante-escargot du Cd permettant l'évaluation de taux d'absorption à des fins de caractérisation du risque environnemental représenté par les sols contaminés. Il s'agira également d'analyser la sensibilité du modèle biologique retenu à l'influence de facteurs environnementaux comme la concentration d'exposition, le pH du sol et la saison.

## Matériel et Méthodes

**Organismes.** Les escargots sont des Petit-gris (Helix aspersa aspersa Müller) juvéniles (1 mois), élevés au laboratoire et pesant 0,93 ± 0,11 g matière fraîche (MF) conformément à la recommandation du test standardisé [6].

**Site expérimental.** L'expérimentation s'est déroulée sur un site expérimental (dispositif AGIR), géré et mis à disposition par l'INRA de Bordeaux-Aquitaine. Le sol (Arenic Udifluvent, de texture sablo-argileuse) a été contaminé entre 1988 et 1990 par apport de Cd(NO₃)₂ pour atteindre des concentrations théoriques de 0, 20 et 40 mg Cd.kg⁻<fnref n="1" /> sol sec. Le pH théorique des sols dans l'horizon de surface des parcelles présente deux modalités, i.e. pH 5,5 et 7. La végétation de couverture est de type prairial (Poa trivialis, Trifolium repens, Ranunculus repens et Holcus lanatus) avec une fauche annuelle.

**Modalités d'exposition.** Sur chacune des six parcelles, trois microcosmes cylindriques en acier inoxydable (diamètre : 0,25 m, hauteur : 0,50 m, [5]) ont été placés. Dans chaque microcosme, 15 escargots ont été introduits. Après 1, 2, 3, 5 et 8 semaines, deux individus ont été échantillonnés dans chaque microcosme. Deux campagnes d'exposition ont été réalisées : au printemps et en automne 2004.

**Analyses chimiques.** Les sols de chaque parcelle, les échantillons de végétation et les escargots ont été analysés (n > 3) par spectrométrie d'absorption atomique (Varian 220Z)

<footnote n="1">¹Laboratoire de Biologie Environnementale, EA 3184 UsC INRA, Université de Franche Comté, Place Leclerc, 25030 Besançon Cedex</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR BIOGECO, Biodiversité, Gènes et Écosystèmes, 1 avenue des Facultés, 33405 Talence</footnote>
après digestion acide. La justesse des analyses a été vérifiée avec du matériel standard de référence pour chaque type de matrice.

**Modélisation et statistiques.** Les cinétiques d'accumulation du Cd ont été décrites avec le modèle à un compartiment suivant :

$$C_{esc}(t) = C_{esc}(0) + \frac{k_1}{k_2} (1 - e^{-k_2 t})$$

où $C_{esc}$ est la concentration en Cd dans l'escargot (mg.kg⁻¹), $k_1$ est le taux d'absorption (µgCd·gesc⁻¹·j⁻¹), $k_2$ est le taux d'excrétion (j⁻¹) et $t$ est le temps (j). Les paramètres cinétiques de l'accumulation ($k_1$ et $k_2$) ainsi que les concentrations internes dans les plantes ont été comparés entre traitements et entre saisons par ANOVA suivie du test de comparaison multiple de Tukey.

## Résultats et discussion

La figure 1 présente les concentrations en Cd dans les parties aériennes des espèces végétales selon les modalités d'exposition au printemps (Fig. 1A) et en automne (Fig. 1B).

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 1.** Concentrations en Cd dans les espèces végétales prélevées sur les différentes parcelles : A au printemps et B en automne. Pour la même espèce végétale, les valeurs présentant des lettres identiques ne sont pas significativement différentes (ANOVA, p<0,05).</figcaption></figure>

Les végétaux des parcelles contaminées présentent des concentrations en Cd supérieures à celles des plantes des parcelles témoins (ANOVA, p<0,001), quelle que soit l'espèce considérée. Cette accumulation dans les tissus végétaux aériens reflète la concentration en Cd dans le sol et n'est pas influencée par la saison. L'impact du pH du sol est variable avec, aux fortes concentrations et au printemps, des réponses interspécifiques opposées (Fig. 1A).

Les escargots introduits dans les microcosmes sont contaminés par le sol à la fois directement *via* l'ingestion de particules et la diffusion du Cd par l'épithélium du pied et indirectement *via* la nourriture composée par les espèces végétales peuplant les parcelles. Cette double exposition n'induit pas de mortalité, ni d'inhibition de croissance quelles que soient les conditions environnementales. Pourtant, un transfert non négligeable du Cd du milieu vers les escargots a été quantifié (Fig.2).

L'évolution des concentrations dans les escargots exposés aux différents traitements est présentée dans la figure 2A. Ces cinétiques d'accumulation du Cd reflètent la contamination du milieu. L'accumulation exprimée par le taux d'absorption ($k_1$) est contamination-dépendante quels que soient le pH et la saison (ANOVA, p<0,001). Les concentrations internes dans les escargots (15 à 20 mg Cd.kg⁻¹) soulignent la contamination du milieu de façon plus marquée que les parties aériennes des plantes (1 à 2 mg Cd.kg⁻¹). Le pH n'a pas, aux valeurs étudiées, d'effet sur l'accumulation du Cd dans les escargots exposés au printemps. En automne, pour la plus forte contamination, le taux d'absorption à pH=7 est supérieur à celui modélisé à pH=6 (0,750 et 0,280 µgCd·gesc⁻¹·j⁻¹, respectivement) (ANOVA, p<0,001). Cependant, les teneurs en Cd dans le sol présentant une différence importante (42,4 contre 29,4 mg Cd.kg⁻¹ sol), l'effet pH ne peut être discriminé. Un effet saison sur le transfert de Cd est mis en évidence, en particulier à pH=7 où les paramètres modélisés
montrent une accumulation plus importante en automne et ce quelle que soit la concentration d'exposition (ANOVA, p<0,001).

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 2.** Cinétiques d'accumulation du Cd dans les tissus mous des escargots exposés sur les différentes parcelles : A en concentrations et B en quantités. Les valeurs présentant des lettres identiques ne sont pas significativement différentes (ANOVA, p<0,05). NS = non significatif.</figcaption></figure>

La figure 2B présente les données exprimées en quantités, unité plus adaptée aux problématiques de transfert dans les réseaux trophiques. Dans cette configuration, la biodisponibilité du Cd des sols est toujours reflétée par les taux d'absorption ($k_1$ en µg Cd·j⁻¹) mais de façon moins discriminante entre 15,3 et 42,4 mg Cd.kg⁻¹ sol. Ce mode d'expression ne met pas non plus en évidence d'effet pH sur le transfert du Cd. Par contre, à la différence de ce qui est observé en considérant les concentrations, l'évolution des quantités accumulées dans les animaux ne montre pas d'influence de la saison. Ce résultat doit être mis en relation avec la croissance des escargots qui, à durée d'exposition équivalente, est moins importante en automne, quels que soient la contamination et le pH du sol (ANOVA, p<0,001). La saison n'influence donc pas le transfert du Cd mais agit indirectement sur les concentrations internes en modifiant la masse des organismes, probablement en liaison avec une photopériode décroissante entre septembre et novembre.

## Conclusion

Cette étude cinétique de bioindication active précise les capacités des escargots, indicateurs biologiques situés à l'interface sol-plante, à mettre en évidence la contamination du milieu. Ces capacités sont généralement exprimées *via* un facteur de bioaccumulation (ratio $[Cd]_{esc}/[Cd]_{sol}$) qui apporte une information ponctuelle et ne permet pas d'intégrer l'évolution des concentrations internes en fonction du temps. Les taux d'absorption/élimination ($k_1$ et $k_2$) qui ont pu être définis répondent à ce besoin et permettent également de distinguer des niveaux de contamination du sol entre 15 et 40 mg Cd.kg⁻¹ sol. Ce travail montre également que cette bioaccumulation contamination-dépendante est faiblement influencée par la variation d'une unité de pH et indirectement modifiée par la saison. Ces résultats constituent des informations importantes pour une mise en œuvre rationnelle des escargots en biosurveillance de l'environnement.

## Références bibliographiques

[1] Spellerberg I.F., 1991. Monitoring ecological change. Cambridge University Press, Cambridge, England.

[2] Peijnenburg & Jager, 2003. *Ecotoxicol. Environ. Saf.* 56, 63-77.

[3] van Straalen et al., 2005. *Environ. Pollut.* 136, 409-417.

[4] Gimbert et al., 2006. *Environ. Intern.*, in press.

[5] de Vaufléury et al., 2006. *Environ. Toxicol. Chem.* 25, 797-806.

[6] ISO 15952, 2006. International Standardisation Organisation. Geneva, Switzerland
Ce travail a été financièrement soutenu par l'ADEME et le Conseil Régional de Franche-Comté.
# Transfert de la bromadiolone dans les réseaux trophiques : des appâts ... vers les campagnols ... jusqu'aux prédateurs

M. Cœurdassier<fnref n="1" />, M. Sage<fnref n="1" />, R. Defaut<fnref n="2" />, P. Berny<fnref n="3" /> et P. Giraudoux<fnref n="1" />

## Introduction

Les anticoagulants sont largement utilisés pour contrôler les populations de rongeurs à travers le monde [1,2]. La lutte chimique utilisant la bromadiolone a été préconisée afin d'optimiser le contrôle du Campagnol terrestre *Arvicola terrestris* et de limiter l'impact sur les espèces non cibles. Cependant, contrairement aux conclusions d'essais réalisés en conditions contrôlées [3], la consommation de campagnols intoxiqués peut entraîner une mortalité importante de prédateurs en nature [4]. L'estimation de l'exposition secondaire aux anticoagulants doit prendre en compte la quantité de résidus disponibles dans les campagnols [5] qui est liée à la persistance de la molécule dans les appâts utilisés en champs. Les seules données disponibles sur la persistance de la bromadiolone dans les sols ont été obtenues en laboratoire. Concernant l'intoxication des populations de campagnols en nature, une seule étude est disponible, relative aux 10 jours qui suivent un traitement [6]. Les objectifs de ce travail sont (i) d'évaluer la persistance de la bromadiolone dans les appâts « grains de blé » en conditions réelles de traitement et de déterminer les facteurs environnementaux (édaphiques et climatiques) et comportementaux (mise en réserve d'appâts par les campagnols) modulant cette persistance [7] ; (ii) d'évaluer la cinétique d'intoxication d'une population de campagnols dans une parcelle traitée et (iii) de modéliser à partir de ces données, l'évolution temporelle du risque d'empoisonnement secondaire pour le renard.

## Matériels et méthodes

**Persistance dans les appâts** - Le traitement a été réalisé sur des parcelles situées dans la Zone Expérimentale de Lutte Anti-Campagnol (ZELAC - Doubs). Trois sols représentatifs des zones de traitement (brun à pellicule calcaire, brun à pseudogley, brun lessivé) et 2 périodes, automnale et printanière, ont été retenus. L'influence de la modalité de présence des appâts dans les parcelles traitées (i.e. galeries artificielles conformes au traitement ou réserves simulant celles faites par des campagnols) a été étudiée. Des échantillons d'appâts ont été récoltés régulièrement pendant 30 jours suite au traitement dans les galeries artificielles et pendant 80 jours dans les réserves. Les concentrations en bromadiolone dans les appâts (µg/g MF) ont été mesurées en HPLC.

**Cinétique d'intoxication des populations de campagnols** - Le traitement a été réalisé en automne sur une parcelle de la ZELAC (densité estimée de 150 campagnols/ha). La quantité d'appâts utilisée pour le traitement est de 20 kg/ha. L'échantillonnage des campagnols terrestres, basé sur un piégeage raisonné, a débuté le lendemain du traitement. Il a été effectué tous les jours pendant 10 jours puis espacé progressivement sur une durée totale de 135 jours. Les concentrations en bromadiolone ont été mesurées dans les animaux entiers en HPLC.

<footnote n="1">¹Laboratoire de Biologie Environnementale, EA 3184 UsC INRA, Université de Franche Comté, Place Leclerc, 25030 Besançon Cedex</footnote>

<footnote n="2">²Fédération Régionale de Défense contre les Organismes Nuisibles (FREDEC), 191 rue de Belfort, 25043 Besançon Cedex</footnote>

<footnote n="3">³INRA, UMR Mycotoxines et Toxicologie Comparée des Xénobiotiques, École Nationale Vétérinaire de Lyon, 1 avenue C. Bourgelat, 69280 Marcy l'Étoile</footnote>
Évaluation du risque pour le renard – Le simulation élaborée considère un renard adulte de 6 kg consommant, dans la parcelle traitée, 6 campagnols terrestres par jour (tirés au hasard et avec remise au temps post-traitement dans le tableau de données). La quantité de bromadiolone ingérée ($Q_{ing}$ en µg par kg de masse corporelle et par jour) est comparée à la plus faible dose létale ($DL_{mini}$) déterminée chez le chien, 150 µg/kg/j [8]. Pour chaque jour, le scénario est répété 1000 fois, le risque correspond à la probabilité que $Q_{ing} \ge DL_{mini}$.

## Résultats et discussion

*Persistance dans les appâts* – Dans les galeries artificielles, la demi-vie (DT50) de la bromadiolone varie de 3,0 à 6,2 jours, aucune différence significative n'est déterminée quels que soient le type de sol et la saison (Fig. 1).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 1.** Persistance de la bromadiolone dans les appâts (○... sol brun à pellicule calcaire ; △--- sol brun à pseudogley ; □--- sol brun lessivé ; ●--- réserves).</figcaption></figure>

La mise en réserve des appâts entraîne une augmentation des DT50, qui sont de 42,7 et 24,6 jours en automne et au printemps respectivement. Plus que les conditions environnementales, le comportement des campagnols multiplie la persistance de la bromadiolone dans les appâts par un facteur de 5 à 10.

*Cinétique d'intoxication des populations de campagnols* - Les quantités de bromadiolone par individu sont maximales entre le 6ème et le 10ème jour (194,4 µg en moyenne ; Fig. 2).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 2:** Variation temporelle de la quantité de bromadiolone (en µg) par campagnol terrestre suite à un traitement en nature.</figcaption></figure>

Évaluation du risque pour le renard – Les simulations suggèrent que les doses de bromadiolone ingérées par un renard peuvent dépasser 100 µg/kg/j dès le premier jour qui suit le traitement. Entre le 2ème et le 16 jour les doses médianes ingérées varient entre 250 et 100 µg/kg/j et le risque calculé sur cette période dépasse 0,90 sauf aux jours 10 et 13 (Fig. 3). Ensuite, les quantités journalières de bromadiolone ingérée diminuent progressivement et conduisent toutes au calcul d'un risque nul (Fig. 3), et 135 jours après un traitement, un
renard reste susceptible d'être exposé à une dose de bromadiolone pouvant atteindre 50 µg/kg/j dans les cas extrêmes.

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 3.** Dose de bromadiolone ingérée par un renard (médiane et quartiles) qui consomme quotidiennement 6 campagnols dans une parcelle traitée. Pour chaque jour, le scénario est répété 1000 fois et la probabilité de dépasser la DL<sub>mini</sub> est reportée en italique.</figcaption></figure>

## Conclusion

Ces résultats apportent des éléments essentiels à la compréhension du transfert de la bromadiolone dans les réseaux trophiques et sur son impact sur des vertébrés non-cibles. La persistance de la molécule dans une parcelle traitée peut être considérablement allongée par la mise en réserve d'appâts par les campagnols. Les résidus dans les campagnols atteignent rapidement des valeurs maximales, le scénario élaboré pour évaluer le risque létal pour le renard suggère un risque maximum dans les 15 jours qui suivent le traitement. Des travaux actuellement en cours visent à évaluer l'exposition réelle des prédateurs en nature. Ces connaissances serviront à améliorer la qualité environnementale des méthodes de contrôle des populations de campagnols.

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Ces travaux bénéficient du soutien financier de l'INRA, du Conseil Régional de Franche-Comté et des Conseils Généraux du Doubs et du Jura.
# Photodégradation de chlorophénylurées induite par les nitrates et les nitrites et impact écotoxicologique en milieu aquatique

S. Nélieu<fnref n="1" />, M.V. Shankar<fnref n="1" />, F. Bonnemoy<fnref n="2" />, J. Bohatier<fnref n="2" />, L. Lefeuvre<fnref n="3" />, L. Kerhoas<fnref n="1" />, L. Lagadic<fnref n="3" /> et J. Einhorn<fnref n="1" />

Les eaux naturelles sont fréquemment polluées par des herbicides de la famille des chlorophénylurées, qui sont largement utilisés depuis plus de 40 ans. Cette contamination est susceptible d'induire des effets écotoxicologiques sur les organismes aquatiques. De plus, certains des produits issus de la dégradation de ces pesticides présentent une toxicité supérieure à celle du parent. Parmi les différents processus de dégradation biotiques et abiotiques pouvant intervenir dans les eaux naturelles de surface, nous nous intéressons plus particulièrement à la photodégradation induite par les nitrates et les nitrites (Fig. 1). Après excitation lumineuse, ces deux anions conduisent non seulement à la formation de radicaux hydroxyles (très oxydants), mais aussi à des espèces nitrées (NO°, NO₂°, N₂O₃, N₂O₄) qui réagissent avec les pesticides. Notre étude a pour objectif de préciser la nature, l'importance et l'impact écotoxicologique de ce processus de photodégradation induite dans des eaux naturelles.

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 1.** Schéma de la photodégradation du chlorotoluron induite par les ions nitrate et nitrite.</figcaption></figure>

La cinétique de photodégradation du diuron induite par les nitrates et les nitrites a été étudiée en laboratoire, en considérant la pseudo-constante cinétique k' (du 1er ordre, déterminée en début de réaction) ou la demi-vie (qui prend aussi en compte la réactivité des produits de phototransformation). Nous avons observé une dégradation significative du diuron à des concentrations en inducteur équivalentes à celles des eaux naturelles : k' 10,8 et 11,8 10⁻⁶ s⁻<fnref n="1" /> respectivement pour [NO₃⁻] 0,5 mM et [NO₂⁻] 0,01 mM. Une augmentation de la concentration en nitrates accélère la dégradation, alors que l'effet est plus complexe dans le cas des nitrites du fait de recombinaisons de radicaux pour [NO₂⁻] supérieure à 0,1 mM. Le pH joue également un rôle prépondérant sur la cinétique en cas de photoinduction par les nitrites : k' est multiplié par un facteur 4 quand on passe de pH 6,4 à pH 4. Ceci s'explique

<footnote n="1">¹INRA, Unité Phytopharmacie et Médiateurs Chimiques, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex</footnote>

<footnote n="2">² UMR Biologie des Protistes, Université Blaise Pascal, Campus des Cézeaux, 63177 Aubière Cedex</footnote>

<footnote n="3">³ INRA, UMR EQHC, Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex</footnote>
par la réactivité supérieure de HNO₂ (en équilibre acido-basique avec NO₂⁻, pKₐ 3,37) pour former des radicaux hydroxyles. Ces facteurs environnementaux présentent une influence similaire dans le cas d'autres chlorophénylurées (linuron, monolinuron, monuron, chlorotoluron).

Les identifications réalisées par LC-MS-MS ont permis de proposer des schémas de dégradation, qui présentent pour tous les pesticides testés les quatre voies suivantes : dégradation N-terminale, substitution du chlore par un hydroxyle, hydroxylation ou nitration du cycle aromatique (Fig. 2). Le chlorotoluron présente de plus une 5ème voie, l'oxydation du méthyle du cycle aromatique. En présence de NO₃⁻ les di-chlorophénylurées (diuron et linuron) conduisent essentiellement à des produits de dégradation N-terminale (de type N-monométhyle, N-formyle et carbinolamine). En revanche, la variété de photoproduits est supérieure dans le cas des mono-chlorophénylurées, avec en particulier une accumulation notable de composés nitrés. Ces produits nitrés, spécifiques de la photodégradation induite par NO₃⁻/NO₂⁻, constituent des marqueurs du processus en milieu naturel (où la biodégradation peut également intervenir et conduire à la plupart des autres produits).

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 2.** Répartition des photoproduits de chlorophénylurées entre les voies de dégradation, en présence de nitrates (haut) ou de nitrites (bas) (Chaque barre représente la somme des produits d'une voie de dégradation / somme des produits détectés ; % au-dessus des barres représente la somme produits détectés).</figcaption></figure>

Des expériences ont par ailleurs été réalisées en extérieur (lors de journées ensoleillées, à Versailles) sur des solutions de diuron et de chlorotoluron dans des réacteurs pyrex cylindriques (100 mL) et dans des réservoirs ouverts impliquant une pénétration lumineuse
supérieure (20 L, profondeur 25 cm). La photodégradation induite a été mise en évidence aux deux échelles d'étude, à la fois par les effets de paramètres (concentration en inducteur et en pesticide) et par la formation de photoproduits nitrés, qui est même supérieure à celle obtenue en laboratoire dans le cas du chlorotoluron. Les demi-vies sont de l'ordre de quelques jours (par ex. 3 j pour une solution de chlorotoluron 1 mg/L et $NO_3^-$ 1 mM). Parmi les paramètres explorés, citons notamment la composition en nitrates et nitrites au sein de mélanges de proportions variables. Selon les conditions (concentrations environnementales réalistes en $NO_3^-$ et $NO_2^-$), on a pu observer soit i) un effet d'additivité des constantes de vitesse de photodégradation dues à chacune des espèces prise séparément, soit ii) un effet d'inhibition partielle de la réactivité de $NO_3^-$, l'espèce majoritaire. Par ailleurs, la réaction n'est que légèrement ralentie en eau de mésocosme (effet matrice).

L'impact écotoxicologique des produits formés est étudié sur des organismes modèles typiques des milieux aquatiques (bactérie *Vibrio fischeri* par test Microtox®, protozoaire cilié *Tetrahymena pyriformis*, gastéropode *Lymnaea stagnalis*). Les mesures effectuées concernent principalement des effets sub-létaux, afin de préciser les relations concentration/toxicité ou structure/toxicité et les effets synergiques ou antagonistes en particulier avec les ions nitrites et nitrates. Les tests effectués sur des "bruts réactionnels" (obtenus à 0, 20 et 70 % de photodégradation de diuron ou de chlorotoluron 1 ou 5 mg/L et en présence de $NO_3^-$ 1 ou 5 mM) montrent que, dans certaines conditions, l'irradiation accentue la toxicité des solutions (tests Microtox®, certaines enzymes de biotransformation de lymnées).

Des études en mésocosmes aquatiques sont en cours afin de permettre i) la caractérisation et le suivi analytique de photoproduits spécifiques formés *in situ* et ii) des mesures biologiques sur les mêmes organismes modèles qui, en mésocosmes, représentent trois niveaux-clés des réseaux trophiques.
Session 2

Altérations physiologiques et comportementales
<figure><img src="image_25.png" /></figure>
# Intérêt des biomarqueurs de génotoxicité en écotoxicologie

A. Devaux<fnref n="1" />, Y. Gania<fnref n="1" />, S. Bony<fnref n="2" />

L'un des défis auxquels est confrontée l'écotoxicologie est d'élaborer des méthodes performantes permettant non seulement de porter un diagnostic sur la qualité du milieu, mais aussi de prédire les effets à long terme d'une contamination chimique chronique sur les populations, les communautés et les écosystèmes. Le thème abordé ici concerne l'intérêt en écotoxicologie des biomarqueurs de génotoxicité, l'accent étant mis sur les écosystèmes aquatiques, en particulier lotiques.

De manière générale, l'impact de la contamination chimique de l'environnement aquatique se traduit chez les organismes vivants par des effets quantifiables aux différents niveaux de la hiérarchie biologique. C'est l'utilisation simultanée de plusieurs biomarqueurs étudiés chez diverses espèces animales et végétales qui a été choisie jusqu'à présent comme étant l'approche la plus adaptée au diagnostic des effets des polluants sur les organismes, et, associée aux études au niveau des populations et des communautés, à l'évaluation des risques écologiques. **Ce dernier point reste souvent théorique** car il nécessite d'établir des liens entre chaque niveau de complexité pour évaluer la valeur prédictive **éventuelle** des biomarqueurs sur les effets écologiques à long terme d'une pollution et pour décrypter ainsi les mécanismes de réponse des populations et des communautés au stress chimique. Cet aspect est historiquement à l'origine de controverses scientifiques dans le domaine de l'écotoxicologie et a fait l'objet récemment de réflexions pouvant être constructives [1]. Nous n'aborderons pas cette question ici, tout en essayant de rester prudents sur l'interprétation de la réponse des biomarqueurs présentés.

Les biomarqueurs de génotoxicité, du fait du rôle central de l'ADN, support biochimique de l'hérédité et cible potentielle de nombreux xénobiotiques, peuvent être considérés comme des marqueurs précoces d'exposition aux polluants. Ils présentent un intérêt original au sein des différents biomarqueurs, du fait de la pérennisation possible du message toxique suite à l'exposition à des polluants majeurs de l'environnement comme par exemple les pesticides, les hydrocarbures et les métaux lourds. Ainsi Shugart & Theodorakis [2] considèrent qu'une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les interactions des xénobiotiques avec le matériel génétique des organismes pourrait aider à définir les modifications plus complexes au niveau de l'écosystème. C'est dans l'optique de l'étude de biomarqueurs de phénomènes génotoxiques exprimés au niveau de la structure même de l'ADN, que sont effectuées dans nos laboratoires des mesures de cassures de brins d'ADN, de délétions de bases et d'apparition de sites alcalilabiles qui représentent des lésions à forte probabilité d'apparition après exposition des organismes à des polluants majeurs de l'environnement, qu'ils soient mutagènes ou pas.

Notre équipe mène trois approches complémentaires dans ce cadre d'éco-génotoxicologie. La première concerne le développement au laboratoire de

<footnote n="1">¹INRA EFPA, 54280 Champenoux et Laboratoire des Sciences de l'Environnement, ENTPE, Rue Maurice Audin, 69518 Vaulx en Velin</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR Mycotoxines et Toxicologie Comparée des Xénobiotiques, École Nationale Vétérinaire de Lyon, 1 avenue C. Bourgelat, 69280 Marcy l'Étoile</footnote>
biomarqueurs de génotoxicité sur différents organismes aquatiques appartenant à des niveaux trophiques variés (algues unicellulaires, invertébrés, amphibiens et poissons) en prenant en compte l'importance du contexte cellulaire (origine et fonction des cellules lésées) et des phénomènes de réparation. Ces recherches visent d'une part à mieux connaître les mécanismes d'action génotoxique des polluants, notamment en ce qui concerne la nature et l'origine des lésions à l'ADN produites et à étudier d'autre part l'importance des interactions entre polluants au sein de mélanges complexes. Ces travaux ont permis de mettre au point depuis une dizaine d'années l'analyse de biomarqueurs de génotoxicité dans des situations qualitativement et quantitativement contrastées de contamination chez des organismes tels que les algues unicellulaires, les invertébrés, les amphibiens et les poissons [3,5]. Une illustration peut être donnée par l'étude de la génotoxicité du cadmium chez le poisson. Nos recherches ont démontré clairement que la formation suite à l'exposition à ce métal de cassures simple et double brins à l'ADN nucléaire d'hépatocytes de truite était liée à la production d'entités réactives de l'oxygène dont l'action pouvait être modulée par un agent antioxydant [6].

La seconde approche concerne l'évaluation du potentiel génotoxique global de matrices telles que les effluents d'origine agricole, urbaine et industrielle, ainsi que les sédiments pollués ou les percolats obtenus dans des situations environnementales variées (sols pollués, mâchefers d'incinération d'ordures ménagères). A titre d'exemple, ce type d'approche a été mis en œuvre dans le cadre d'une démarche d'analyse du risque écotoxicologique de sédiments de curage provenant de canaux de navigation soumis à différents flux polluants dans l'Est et le Nord de la France. Des travaux menés en microcosmes de laboratoire ont ainsi permis de classer la dangerosité de ces matrices contaminées en fonction de différents biomarqueurs et en particulier de leur potentiel génotoxique mesuré chez des invertébrés comme *Limnaea stagnalis* ou des larves d'amphibiens exposés à ces sédiments [7,8].

La troisième approche complémentaire des deux précédentes vise à mettre en œuvre sur le terrain les biomarqueurs de génotoxicité développés en amont au laboratoire parallèlement à d'autres marqueurs physiologiques (teneurs et activités enzymatiques de protéines impliquées dans la détoxication et le transport des xénobiotiques) dans le but de quantifier l'impact de contaminations diffuses ou géographiquement ciblées sur des populations de poissons. L'apport de connaissances sur les différentes réponses physiologiques pouvant être observées en fonction de la nature et de l'importance des flux contaminants permettent de caractériser la qualité des milieux étudiés et peuvent apporter des informations utilisables par les gestionnaires dans des démarches de remédiation environnementale [9,10].

Cependant, la mise en évidence de relations de cause à effet suite à l'exposition d'organismes tels que les poissons aux polluants chimiques reste un exercice difficile du fait de la complexité des écosystèmes aquatiques lotiques, particulièrement instables dans le temps et l'espace et source de variabilité dans les réponses mesurées. Par ailleurs, ces organismes vivants peuvent s'acclimater et s'adapter aux différents facteurs de stress de leur environnement. Ces processus physiologiques, évalués en particulier via les réponses des biomarqueurs de génotoxicité, peuvent avoir dans certains cas une base génétique. Une part significative de la variabilité des réponses des organismes vivants à une exposition chimique toxique, que ce soit à l'échelle des individus, des populations ou au sein des communautés entières, peut être attribuée à leur constitution génétique et se traduit par une variation de leur sensibilité au stress contaminant [11] (effet *bottom-up* de la pollution). La contamination peut alors devenir une force sélective capable de modifier la structure génétique des populations contaminées, ceci pouvant menacer à terme leur survie (effet *top-down* de la pollution). Un certain nombre de travaux ont été menés
récemment dans ce cadre au laboratoire pour essayer de répondre aux questions suivantes : est-il possible de détecter une altération de la diversité génétique de populations de chevaines (poisson cyprinidé d'eau douce, *Leuciscus cephalus*) vivant dans des sites peu ou fortement contaminés ? Existe-t-il des relations entre les réponses de marqueurs de génotoxicité et marqueurs génétiques aux niveaux individuel et populationnel ? Parmi les principaux résultats, l'analyse conjointe de la distribution du polymorphisme de marqueurs microsatellites et enzymatiques entre des populations de chevaines exposées à différents niveaux de contamination amène à retenir cette approche pour la mise en évidence d'effets sélectifs liés au stress chimique. Une confirmation de ces effets sélectifs peut être fournie via l'exploration des relations entre variabilité génétique et certains traits de la fitness, comme nous l'avons montré entre certains allèles ou génotypes enzymatiques et la capacité des individus à maintenir l'intégrité de leur ADN [12,13].

Références bibliographiques

[1] Forbes et al., 2006. *Environ. Toxicol. Chem.* 25, 272-280.

[2] Shugart & Theodorakis, 1998. *Biotherapy* 11, 119-27.

[3] Devaux et al., 1997. *Toxicol. in Vitro* 11, 71-79.

[4] Mouchet et al., 2005a. *Environ. Toxicol.* 20, 74-84.

[5] Mouchet et al., 2006. *Environ. Toxicol.* 21, 264-277.

[6] Risso-de Faverney et al., 2001. *Aquat. Toxicol.* 53, 65-76.

[7] Mouchet et al., 2005b. *J. Toxicol. Environ. Health* 68(A), 811-832.

[8] Clément et al., 2004. *Ecotoxicology* 12, 323-333.

[9] Larno et al., 2001. *Ecotoxicology* 10, 145-158.

[10] Flammarion et al., 2002. *Ecotoxicol. Environ. Saf.* 51, 47-56.

[11] Evenden & Depledge, 1997. *Environ. Health Persp* 105, 849-854.

[12] Larno et al. 2005. *Mol. Ecol. Notes* 5, 752-754.

[13] Devaux & Larno 2005. Effects of chemical contaminants on genetic diversity, DNA damage and fitness traits in feral fish populations. VI Comet Assay Workshop, Varsovie, 22-24 septembre 2005.
# Les milieux marins tropicaux sous surveillance : utilisation d'un biomarqueur de génotoxicité

S. Lemoine

Laboratoire de Biologie Marine, Équipe DYNECAR, EA 926 Dynamique des Ecosystèmes Caraïbes et Biologie des Espèces Inféodées, Université des Antilles et de la Guyane, Campus de Fouillole, 97157 Pointe-à-Pitre Cedex

De nombreux programmes de surveillance de l'environnement ont montré l'intérêt des biomarqueurs. En effet, beaucoup plus spécifiques de l'impact des composés toxiques sur un organisme, les biomarqueurs peuvent en outre être utilisés comme signaux précoces d'alerte. Ils peuvent apparaître avant que les conséquences ne se traduisent en termes écologiques. C'est le développement de ces méthodes que nous souhaitons réaliser en Guadeloupe.

Actuellement, deux programmes sont développés au sein de l'équipe DYNECAR (EA 926), le premier portant sur la contamination et l'impact par les métaux lourds chez l'huître de palétuvier *Crassostrea rhizophorae* et le deuxième sur les pesticides chez un crustacé d'eau douce *Macrobrachium faustinum* (ouassou). Pour ces deux programmes l'effet biologique est étudié par le biais de l'altération du génome (génotoxicité).

Le but de cette étude était de dresser un bilan des contaminations métalliques dans les deux culs-de-sac de la Guadeloupe. Des dosages de métaux ont été réalisés sur les sédiments ainsi que sur les huîtres de palétuvier provenant de 22 stations localisées sur la bande côtière de mangrove. D'autre part, les effets induits sur le génome (cassures de l'ADN) de ces organismes ont été évalués. Ainsi, il ressort que parmi les 22 stations étudiées, cinq d'entre-elles se caractérisent par de très fortes teneurs métalliques. Trois de ces cinq stations se localisent dans la Réserve Naturelle du Grand Cul-de-Sac Marin. Par ailleurs, au niveau des stations où d'importantes concentrations métalliques ont été enregistrées, l'altération de l'ADN des organismes était également importante. Ces premiers résultats nous ont donc permis de d'évaluer le degré de contamination de certaines zones de mangrove, écosystème dont l'importance est capitale en terme de reproduction des organismes marins [1]. En effet, cet écotone qui fait la transition entre les milieux marin et terrestre, est un lieu de ponte, une véritable nurserie, où grandissent les juvéniles de nombreuses espèces.

En Guadeloupe, les milieux aquatiques notamment la mangrove, sont très sensibles à toute forme de pollution, et une forte concentration des contaminants d'origine humaine peut avoir des effets néfastes sur la croissance des organismes marins, amener à des déséquilibres élémentaires, et ainsi exercer une action nuisible voir toxique sur les écosystèmes, ce qui pourrait à terme, engendrer une diminution des stocks exploités. Il est donc très urgent de compléter nos connaissances sur les niveaux de contamination des écosystèmes marins côtiers de la Guadeloupe.

Le développement des monocultures intensives que sont la culture de la canne et de la banane a impliqué le recours à bon nombre de produits phytosanitaires. La lutte contre le charançon a entraîné l'utilisation d'insecticides organochlorés, la dieldrine et le HCH dans les années 60-70 puis la chlordécone de 1972 à 1993. Les organochlorés et en particulier la chlordécone sont très persistants et se retrouvent
dans le sol même plusieurs dizaines d'années après leur épandage. Le transfert de ces pesticides des parcelles agricoles vers les cours d'eau représente une menace pour le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Une étude sur la contamination des milieux marins côtiers de la Guadeloupe montre également la contamination de certaines espèces marines par la chlordécone [2]. De très fortes concentrations ont été retrouvées au niveau d'espèces d'eau douce [3]. Une étude a donc été développée sur l'impact de ce pesticide sur ces populations. L'espèce choisie est *M. faustinum* prélevée par pêche électrique dans la rivière Grande Anse située au sud de la Basse Terre où sont localisées la majorité des sols contaminés par la chlordécone. L'altération de l'ADN est étudiée par la technique du « test comet » qui a été mis au point pour *M. faustinum*. Des individus ont été prélevés à différentes stations situées en amont, aval ou au niveau des zones de culture de la banane. Des expérimentations au laboratoire d'écotoxicologie avec des concentrations de chlordécone définies sont en cours et permettront de mieux connaître l'impact direct de ce pesticide.

Références bibliographiques

[1] Ramdine G., 2005. Contaminations métalliques dans le Grand et Petit Cul de Sac Marin (Guadeloupe). Mise en place d'une étude de biosurveillance par l'utilisation d'un biomarqueur de génotoxicité chez *Crassostrea rhizophorae*. Rapport de DEA.UAG. 42 pages.

[2] Bouchon C. et Lemoine S., 2003. Niveau de contamination par les pesticides des chaines trophiques des milieux marins côtiers de la Guadeloupe et recherche de biomarqueurs de génotoxicité.

[3] Monti D., 2005. Étude du niveau de contamination des organismes aquatiques d'eau douce par les pesticides, en Guadeloupe. Convention DIREN, 35 pages.
# Induction d'exoenzymes fongiques : biomarqueurs d'exposition aux métaux ?

J. Lebrun, I. Lamy et C. Mougin

INRA, Unité PESSAC, Physico-chimie et Écotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, RD 10, Route de Saint-Cyr, 78026 Versailles Cedex

## Contexte

Les micro-organismes du sol sont étudiés depuis de nombreuses années pour leur réactivité vis-à-vis des micropolluants dans les sols. Les recherches, notamment à l'INRA, se sont principalement focalisées sur les bactéries, et d'une façon générale les interactions polluants/champignons restent moins bien décrites.

Nous avons montré la capacité des champignons à interagir avec les composés trace organiques (CTO) en étudiant une variété de réponses physiologiques liées à la croissance, la reproduction ou à la capacité de biotransformation de ces organismes. D'autres réponses sont connues par ailleurs : mécanismes d'efflux, modification du métabolisme cellulaire... Mais les champignons sont aussi décrits pour concentrer les éléments trace métalliques (ETM) dans leurs cellules, et dans ce cas relativement peu de données sont disponibles à la fois sur les mécanismes de l'exposition et sur ceux responsables des impacts. On sait d'une part que ce n'est pas la concentration totale mais plutôt la forme sous laquelle se trouve le polluant qui est le plus important vis-à-vis de la toxicité pour un organisme, et d'autre part que les réponses des micro-organismes peuvent être différentes en fonction de la dose de polluant, et de la durée d'exposition de l'organisme à la forme toxique du polluant. Enfin, les réponses de ces organismes peuvent en retour induire des changements environnementaux qui modifient le milieu de façon non encore prévisible. Ainsi, il a été montré dans la littérature que le Cd exogène introduit dans un sol induisait une surexpression d'oxydases exocellulaires fongiques, sans que les conséquences n'en soient évaluées sur le plan fonctionnel. L'exposition des champignons aux métaux peut aussi s'accompagner de changements morphologiques. De plus, sur le terrain, on constate que les sols pollués en métaux sont très riches en champignons, et ce même pour des sols à pH alcalins (>8) alors que les champignons sont classiquement réputés acidophiles. Ceci suggère des mécanismes adaptatifs à élucider.

## Objectifs

Ce projet a pour vocation d'étendre aux éléments trace métalliques, par un couplage de descripteurs physico-chimiques et biologiques, la démarche développée dans le cadre de l'étude du rôle des systèmes enzymatiques fongiques sur la transformation des composés trace organiques et des effets en retour des composés sur ces mêmes systèmes enzymatiques. Il doit permettre d'avancer dans l'acquisition de données de base qui seront utilisées pour discuter l'exposition et l'impact aux pollutions, y compris les pollutions multiples impliquant CTO et ETM.

## Matériels et méthodes

Pour comprendre et décrire l'impact des polluants métalliques sur les champignons du sol, et leur réponse, nous développons une approche basée sur l'étude de la spéciation des métaux, leur évolution dans le temps, et la réponse
fongique à une exposition, par le couplage de descripteurs physico-chimiques et biologiques.

Les études sont réalisées dans un premier temps sur des souches fongiques cultivées en milieu liquide. Les effets des métaux sur la morphologie des champignons sont observés par microscopie électronique à balayage. L'activité des exoenzymes (laccases, peroxydases) est mesurée par spectrophotométrie.

## Résultats

### Effet des métaux sur la morphologie du basidiomycète Trametes versicolor

Le Cu et le Cd ont été ajoutés au milieu de culture à la concentration de 1 mM. En présence de Cu, les filaments fongiques sont plus gros et plus réguliers que dans les cultures témoins non traitées. De plus, le champignon synthétise une matrice extracellulaire (acides organiques) en faible quantité.

En présence de Cd, les filaments ont un aspect plus rugueux, et la matrice extracellulaire est plus dense. Cette matrice pourrait être induite par un stress chimique pour chélater des éléments métalliques potentiellement toxiques.

L'effet des métaux (Cu, Zn, Cd, Pb et Hg) sur la production de biomasse par le champignon a été mesuré à différentes concentrations. Seul le mercure a été montré comme toxique à la concentration de 1 mM.

### Induction des exoenzymes du basidiomycète Trametes versicolor par les métaux

L'effet des métaux (Cu, Zn, Cd, Pb et Hg) sur la production d'exoenzymes (laccases et peroxydases) a été mesuré sur une période de 17 jours, pour différentes concentrations de métaux (0,01-1 mM) dans un milieu de culture favorable à la croissance du champignon et à la production de laccase classiquement utilisé au laboratoire.

Cu, nécessaire à faible dose pour permettre l'expression de laccase active, stimule l'activité laccase par un facteur 3-4 à la plus forte concentration. Zn et Pb n'ont aucun effet sur la production d'enzymes. A l'inverse Cd et Hg semblent être des inducteurs relativement puissants des laccases fongiques dès la plus faible concentration du métal. Toutefois, pour le Hg, l'effet positif s'estompe au cours du temps, en raison de la toxicité exercée par cet élément sur le champignon.

En présence de Cu, Pb et Hg présentent des effets simulateurs comparables sur les manganèse-peroxydases de T. versicolor. Le Pb exerce un effet spécifique sur cette activité enzymatique alors qu'il n'a pas d'effet sur la production de laccase.

### Effet de la composition du milieu de culture sur la réponse de Trametes versicolor à l'exposition aux métaux

Différents milieux de culture, avec des compositions variables en oligo-éléments et en particulier des teneurs minimales en acides organiques, ont été testés dans le but de limiter la complexation des métaux.

Dans ces conditions, le Cu s'est montré un inducteur puissant qui entraîne une stimulation de l'activité laccase 6 fois supérieure à celle observée dans le milieu de culture classiquement utilisé au laboratoire, contenant des ligands organiques complexants. L'utilisation d'une électrode spécifique au Cu²+ montre que le métal est présent en quasi-totalité sous sa forme ionique dans le milieu simplifié alors qu'il est fortement complexé dans le milieu classique.

Dans le milieu simplifié, les activités laccases et manganèse-peroxydases sont stimulées dès les faibles concentrations en Cu de 10⁻⁶M, ce qui pourrait être lié à la présence de formes de Cu plus facilement assimilables par le champignon.

Des essais avec les métaux en mélange fournissent des résultats contrastés difficilement interprétables en première approche.
Conclusion

Ces premiers résultats montrent un impact positif de certains métaux sur l'activité d'oxydases exocellulaires chez le basidiomycète *Trametes versicolor* dans des cultures en milieu liquide. Il convient maintenant de vérifier que cet accroissement d'activité résulte bien d'un mécanisme d'induction par dosage des ARN codant pour ces enzymes, notamment pour le cuivre.

L'étude de la spéciation du cuivre dans les milieux est en cours pour connaître les formes métalliques à l'origine de l'induction.

Remerciements

Les résultats présentés ont été acquis dans le cadre d'un projet soutenu par le département Environnement et Agronomie de l'INRA. Les auteurs remercient tous les personnels de l'unité PESSAC qui se sont impliqués dans ces travaux.
# Effets du parathion sur le tube digestif de ver de terre

C. Mazzia, B. Mazet, M. Rault et Y. Capowiez

INRA, UMR Écologie des Invertébrés, Laboratoire de Toxicologie Environnementale, Site Agroparc, 84914 Avignon Cedex 9

## Introduction

En tant qu'ingénieur de l'écosystème, le ver de terre occupe un rôle central dans l'écosystème du sol en y influençant de manière importante les phénomènes physiques (propriétés de transfert), chimiques (cycles biogéochimiques) et biologiques (interactions avec les autres composantes de l'écosystème sol, des micro-organismes aux racines). Ce rôle majeur fait que le ver de terre tient une place importante dans les procédures d'évaluation des risques liés à l'utilisation de xénobiotiques. Ainsi en écotoxicologie, il est un marqueur de choix pour évaluer les impacts de ces molécules polluantes sur l'environnement.

Le parathion est un organophosphoré (OP) connu chez le ver de terre pour induire notamment une diminution de l'activité des cholinestérase, mais aussi des modifications de poids, de la reproduction et des caractéristiques anatomiques.

Le tube digestif de ver terre représente avec le tégument une des deux voies possibles de contamination par les xénobiotiques. Il peut être une voie de pénétration de ces molécules mais aussi une cible. Au cours de cette étude, nous avons étudié l'effet d'une solution commerciale contenant du parathion (Oléobladan, Bayer) sur des paramètres biochimiques (dosage des cholinestérase) et physiologiques (enregistrement de l'activité contractile) d'une partie du tube digestif de ver de terre, le jabot/gésier.

## Matériel et méthodes

Les expériences ont été réalisées sur des vers de terre de l'espèce *Apporectodea caliginosa* provenant d'un verger abandonné depuis au moins 5 ans. Après anesthésie dans de l'alcool à 10%, une ouverture dorsale est réalisée afin de prélever le jabot/gésier.

Pour le dosage des cholinestérase, nous avons utilisé le protocole d'Ellman et al. [1]. Pour les manipulations d'enregistrement de l'activité contractile, le complexe est placé dans une boite de Petri où l'extrémité duodénale est fixée dans le fond et l'autre extrémité (côté œsophage) reliée à un transducteur de force relié à un ordinateur. Pour les expériences d'étude de l'activité contractile, nous avons choisi comme paramètre de caractérisation le calcul d'Aire Sous la Courbe (ASC) qui permet d'évaluer le pouvoir contractile d'une substance en prenant en compte des données comme les variations d'amplitude et/ou de tonus et/ou de durée.

Ces expériences biochimiques et physiologiques ont été réalisées en parallèle et suivant deux modalités.

Dans un premier temps, nous avons prélevé des jabots/gésiers que nous avons immergés dans du liquide physiologique contenant 10⁻⁹M, 10⁻⁶M, 0,7.10⁻³M (=10X) ou 10⁻³M de parathion pendant 6 h à 4°C.

Dans un deuxième temps, nous avons travaillé sur des préparations provenant de vers de terre restés pendant 2 semaines dans un sol pollué avec du parathion à la dose de 6,25 mg/kg de terre sèche ce qui correspond à 10 fois la concentration prédite dans l'environnement (CPE). La solution vaporisée sur la terre correspond à
une solution contenant environ $0,7 \cdot 10^{-3} \text{M}$ (=10X) de parathion. Ces deux modalités ont été utilisées pour comparer deux modèles d'exposition différents.

Pour toutes les expériences physiologiques, nous avons soumis nos préparations à de l'acétylcholine (ACh) à la concentration de 100 nM et une solution riche en KCl (154 mM au lieu de 4 mM). Cette dernière permet dans des conditions « témoin » d'évaluer la capacité maximale de contraction de la préparation.

## Résultats

L'immersion des préparations dans du parathion pendant 6 h provoque une diminution de l'activité des cholinestérase d'environ 65 % pour les concentrations $0,7 \cdot 10^{-3}$ et $10^{-3} \text{M}$ (Tab. 1). Sur le plan physiologique, on observe une diminution significative de l'ASC après application d'ACh et de KCl par rapport au témoin uniquement pour une concentration de $10^{-3} \text{M}$ (Fig. 1).

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 1.** Valeurs d'ASC après immersion des préparations dans des solutions témoin (n = 15) ou contenant 0,7 mM (n = 8) ou 1 mM (n = 7) de parathion, pendant 6 h à 4°C et suite à la perfusion d'ACh. Les lettres différentes indiquent une différence significative (p < 0,05).</figcaption></figure>

Dans le cas des jabots/gésiers issus de vers de terre restés pendant 2 semaines dans un sol pollué, nous observons une diminution d'environ 70 % de l'activité des cholinestérase (Tab. 1). D'un point de vue physiologique, il n'y a pas de variations significatives de l'activité contractile suite à la perfusion d'acétylcholine ou de KCl par rapport au témoin.

<table><caption>**Tableau 1.** Pourcentage de l'activité des cholinestérase présente dans les jabots/gésiers selon les 2 modalités.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="4">Expériences d'immersion pendant 6 h à 4°C</th><th rowspan="2">Expériences avec un sol pollué (10X) pendant 2 semaines. (n=10)</th></tr><tr><th>10<sup>-9</sup>M (n=8)</th><th>10<sup>-6</sup>M (n=8)</th><th>0,7·10<sup>-3</sup>M (10X) (n=8)</th><th>10<sup>-3</sup>M (n=8)</th></tr></thead><tbody><tr><th>Activité spécifique (% par rapport au témoin)</th><td>100%</td><td>100%</td><td>44,4%</td><td>35,5%</td><td>29,5%</td></tr></tbody></table>

## Discussion et conclusion

Pour la première fois, des expériences montrent les effets d'un organophosphoré, le parathion, sur des paramètres biochimique et physiologique d'une portion du tube digestif de ver de terre, le jabot/gésier.
Dans les deux modalités réalisées au cours de cette étude, les résultats biochimiques confirment l'effet inhibiteur du parathion sur l'activité des cholinestéraseS. On note toutefois que cet effet au niveau du jabot/gésier n'apparaît que pour de fortes concentrations de parathion.

Sur le plan physiologique, nous avons observé une atteinte des caractéristiques contractiles de cet ensemble seulement lorsque les préparations sont immergées avec du parathion 10⁻³ M pendant 6 h. Les résultats avec le KCI montrent que le parathion affecte la machinerie contractile et que c'est certainement cet effet qui est la cause de la diminution de la réponse à l'ACh. Il ne semble donc pas y avoir de relations entre la variation biochimique des cholinestéraseS et la réponse contractile du jabot/gésier à l'ACh. Ceci est vérifié par le fait qu'on observe de fortes baisses de l'activité des cholinestéraseS sans qu'il y ait de modifications significatives de la réponse contractile à l'ACh.

Ces résultats montrent donc qu'à forte dose, le parathion affecte des caractéristiques biochimiques et physiologiques du jabot/gésier de ver de terre et que selon les modalités d'exposition, on peut observer des différences d'où l'intérêt de posséder plusieurs biomarqueurs.

La réponse contractile du jabot/gésier au KCI pourrait être utilisée pour d'autres xénobiotiques comme un biomarqueur d'exposition. Dans le cas du parathion, il serait aussi intéressant d'observer si, sur cette préparation, des réponses à d'autres neurotransmetteurs comme, la sérotonine, l'octopamine ou le GABA sont affectées. Enfin, ces résultats sur le tube digestif pourraient aussi expliquer en partie les pertes de poids ou les modifications du comportement excavateur observées pour ce xénobiotique dans notre laboratoire.

Références bibliographiques

[1] Ellman et al., 1961. *Biochem. Pharmacol.* 7, 88-93.
# Inhibition des cholinestérase : un biomarqueur d'exposition chez le ver de terre, en verger de pommiers

M. Rault, C. Mazzia, O. Mascle et Y. Capowiez

INRA, UMR Écologie des Invertébrés, Laboratoire de Toxicologie Environnementale, Site Agroparc, 84914
Avignon Cedex 9

Les cholinestérase (ChEs) constituent une famille d'enzymes très sensibles aux pesticides organophosphorés et carbamates et sont largement utilisées comme biomarqueurs chez de nombreuses espèces. Parmi les cholinestérase on distingue l'acétylcholinestérase (AChE), enzyme du système nerveux impliquée dans la transmission cholinergique, et les pseudocholinestérase, essentiellement la butyrylcholinestérase (BuChE), présente dans les muscles, le plasma et d'autres tissus, dont le rôle est encore mal connu. Il est possible de distinguer la présence de l'une ou l'autre de ces deux formes enzymatiques, au sein d'un même tissu, en utilisant les substrats et inhibiteurs spécifiques de chaque ChE. Ces différentes formes pouvant présenter une sensibilité différente vis à vis des pesticides, il est indispensable de connaître la répartition de ces enzymes. Chez le ver de terre, l'inhibition des ChEs a été étudiée en conditions de laboratoire mais aucun effet n'a encore été mis en évidence dans les conditions de terrain. Afin de valider correctement ce biomarqueur chez le ver de terre, nous avons (i) caractérisé l'enzyme, étudié sa variabilité naturelle et son niveau d'activité chez différentes espèces de ver de terre prélevées au terrain ; (ii) suivi l'inhibition des ChE chez A. chlorotica et L. terrestris dans un réseau de vergers de pommiers (traités en agriculture conventionnelle, raisonnée, biologique, et vergers abandonnés) et (iii) analysé la dynamique d'inhibition en conditions de laboratoire, d'un organophosphoré modèle, le parathion, chez A. chlorotica et A. caliginosa.

## Caractérisation des ChE

Les ChE sont caractérisées dans différents tissus et différentes espèces, dont *Allolobophora chlorotica*, *A. caliginosa* et *Lumbricus terrestris*. L'activité des ChE, préférentiellement localisée dans le tissu nerveux, reste stable au sein d'une même espèce. Chez *L. terrestris*, l'activité spécifique des ChE est 3 fois plus élevée que chez *A. caliginosa* et *A. chlorotica*. L'absence d'inhibition des ChE en présence de Iso-OMPA (inhibiteur spécifique de la BuChE), ainsi qu'une hydrolyse préférentielle de l'acétylthiocholine permet de conclure que chez *A. caliginosa* et *L. terrestris* les ChEs sont essentiellement des AChEs alors que chez *A. chlorotica* on observe une proportion équivalente des AChE et BuChE

## Suivi de l'activité ChE chez A. chlorotica en vergers de pommiers

L'activité ChE est suivie chez les vers prélevés au terrain en avril (*L. terrestris* et *A. chlorotica*), en mai, en août et en novembre pour *A. chlorotica*. Aucune inhibition n'est observée en agriculture biologique et témoins (vergers abandonnés). Chez *A. chlorotica*, l'inhibition est observée dans la plupart des vergers traités (conventionnelle et raisonnée), alors que *L. terrestris* présente une inhibition dans seulement 2 vergers conventionnels et 1 verger en agriculture raisonnée (Fig. 1). La différence d'inhibition chez ces deux espèces peut être liée à la présence de formes différentes de ChE, ou à une exposition différente des vers liée à leur comportement.
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 1.** Activité spécifique des ChEs de *A. chlorotica* et de *L. terrestris* prélevés en avril dans chaque verger. Les barres de valeurs portant les étoiles sont significativement différentes des valeurs de références mesurées en vergers abandonnés.</figcaption></figure>

## Dynamique d'inhibition par le parathion des ChE chez *A. chlorotica* et *A. caliginosa*

Chez *A. chlorotica*, nous avons observé que l'activité ChE reste inhibée en novembre soit 2 mois après la dernière application de pesticides, dans certains vergers conventionnels. Nous avons alors suivi la dynamique d'inhibition des ChEs en conditions de laboratoire. Les vers sont exposés 14 jours dans des sols pollués de manière homogène, retirés du milieu puis placés dans un sol non pollué. L'activité des ChEs est suivie sur 70 jours. Deux doses de parathion (1 ppm équivalente à la concentration utilisée au terrain, et 10 ppm) sont étudiées. Les résultats sont comparés à un sol témoin. L'expérience est réalisée sur deux espèces de vers de terre, *A. chlorotica* et *A. caliginosa* et aucune mortalité n'est observée au cours de l'expérience.

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>**Figure 2.** Dynamique d'inhibition des ChE après exposition au parathion. Témoin (○) ; parathion 1ppm (●) ; parathion 10ppm (△).</figcaption></figure>

Quelle que soit l'espèce considérée, la dose 10ppm provoque une perte d'activité d'environ 30 % de l'activité initiale dès le troisième jour d'exposition (Fig. 2). L'activité ChE reste fortement inhibée (de 80 à 90 % de l'activité initiale pour *A. caliginosa* et de 70 à 80 % pour *A. chlorotica*) durant les 70 jours étudiés. Chez *A. caliginosa* aucune différence d'inhibition n'est observée entre les doses 1 ppm et 10 ppm. En revanche, chez *A. chlorotica* l'activité ChE est nettement moins inhibée à la dose 1 ppm. Non seulement après 3 jours d'exposition l'activité reste identique à celle du
témoin, mais de plus l'enzyme récupère progressivement son activité initiale au cours de la période étudiée.

## Conclusions

Le suivi de l'activité des ChEs dans un réseau de vergers, nous permet pour la première fois de valider ce biomarqueur pour estimer les impacts environnementaux liés aux protections phytosanitaires (en particulier l'utilisation des organophosphorés et carbamates). Nous avons montré par ailleurs qu'avec une molécule modèle (le parathion), les inhibitions peuvent durer longtemps ce qui expliquerait une inhibition prolongée des ChEs au-delà des derniers traitements.

La différence d'inhibition au terrain observée entre *L. terrestris* et *A. chlorotica* pourrait s'expliquer à la fois par une différence de comportement entre ces deux espèces de vers mais aussi par une différence de sensibilité des différentes formes de ChE.

Les travaux complémentaires seraient nécessaires pour évaluer plus précisément ces phénomènes, en testant plus particulièrement l'inhibition des BuChEs de *A. chlorotica*.
# Le comportement excavateur des vers de terre comme source de biomarqueurs

Y. Capowiez, O. Mascle, M. Rault et C. Mazzia

INRA, UMR Écologie des Invertébrés, Laboratoire de Toxicologie Environnementale, Site Agroparc, 84914 Avignon Cedex 9

De nombreux biomarqueurs sont développés actuellement en écotoxicologie, mais rares sont ceux qui permettent de prédire des effets à une échelle biologique plus importante (population, communautés) ou même directement au niveau de l'écosystème et son fonctionnement. Les biomarqueurs relatifs au comportement sont souvent réputés pouvoir combler ce défaut. Nous avons voulu tester cette hypothèse sur le modèle lombricien. En effet, si les vers sont couramment utilisés en écotoxicologie, leurs rôles multiples au sein du sol, qu'ils soient physiques (création de galeries et enfouissement de la matière organique), chimiques (cycles biogéochimiques) ou biologiques (interaction avec les autres êtres vivants, des micro-organismes aux racines) ne sont jamais pris en compte dans ces études. Cependant observer le comportement des vers n'est pas évident car ces animaux vivent cachés dans un milieu opaque. Nous avons donc dû adapter deux types d'outils spécifiques.

## Matériel et méthodes

Les terrariums 2D sont 2 plaques de verre de format A3, séparés de quelques mm et dans lesquels on peut recréer des horizons de sol à la densité voulue et introduire des vers [1]. Ces terrariums sont ensuite entreposés dans une chambre froide à l'obscurité de telle manière qu'il est possible de venir observer et noter les vers et leurs galeries (en lumière rouge) 3 fois par jour. Après une semaine, les réseaux des vers sont numérisés et analysés.

On peut également, pour obtenir des microcosmes plus réalistes, constituer des colonnes de sol grâce à une presse hydraulique. Les vers sont introduits dans ces colonnes et laissés à l'obscurité un mois. Passé ce délai, les colonnes sont alors analysées par tomographie aux rayons X afin d'obtenir des images (coupes transversales) où l'on peut distinguer la macroporosité d'origine lombricienne. Par des algorithmes spécifiques, il est alors possible de reconstruire les réseaux de galeries en 3D et d'obtenir leurs caractéristiques tridimensionnelles (longueur, diamètre moyen, tortuosité,...) en utilisant les outils dérivant de la morphologie mathématique.

Nous avons utilisé ces 2 techniques pour étudier les effets potentiels de l'imidaclopride (insecticide de la famille des néonicotinoides). Les sols ont été pollués de manière homogène afin de mieux contrôler l'exposition des vers. La concentration environnementale prédite (ou CEP) pour cette molécule est de 0,5 mg/kg de terre en sèche (ou ppm). De premières expériences au laboratoire nous ont permis de déterminer que la DL50 de l'imidaclopride concernant 2 espèces de vers représentatives (*Aporrectodea icterica* et *A. nocturna*) était de 3,74 et 2,81 ppm respectivement. Aucune mortalité n'est cependant observée à 1 ppm. Nous avons donc choisi de tester les doses sublétales 0,1 et 0,5 ppm d'imidaclopride sur le comportement des vers. L'imidaclopride étant peu soluble dans l'eau, nous avons dû ajouter du DMSO (à 0,25 %). Les résultats seront comparés à un sol témoin
contenant cette concentration en DMSO. Pour chaque dose testée, nous avons réalisé 10 terrariums 2D et seulement 3 colonnes de sol (pour chaque espèce).

## Résultats - Discussion

En terrariums 2D, nous observons des modifications du comportement excavateur des 2 espèces étudiées pour les 2 doses étudiées. Ces modifications concernent l'intensité du creusement (longueur des galeries moindre en présence d'imidaclopride; Fig. 1) mais également certains paramètres de forme des réseaux (par exemple, en présence d'imidaclopride, les réseaux réalisés sont significativement moins profonds et comportent moins de branchement).

Deux conclusions peuvent donc être tirées de cette expérience :

(i) le comportement des vers de terre de catégories écologiques différentes (un endogé et un anécique) peut être grandement modifié par des insecticides comme l'imidaclopride et ce, à des doses réalistes (inférieures à la CEP). Seul bémol, cependant, le mode de contamination est peu réaliste (pollution homogène du sol) ;

(ii) si cette technique rustique et peu onéreuse (terrariums 2D) permet de mettre ces effets en évidence, il est cependant difficile d'en estimer les conséquences en terme de fonctionnement du sol puisque les réseaux de galeries sont réalisés en conditions peu réalistes (effets de bords et limitation à 2 dimensions).

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>**Figure 1.** Longueurs (en cm) des galeries creusées par les vers des 2 espèces en terrariums 2D en sol sain (water et DMSO) et en sol pollué (0,5 et 0,1 ppm d'imidaclopride). Des barres portant des lettres différentes sont significativement différentes au seuil de 5 % (les tests sont réalisés séparément pour les 2 espèces).</figcaption></figure>

En colonnes de sol, après reconstruction 3D des réseaux de galeries (Fig. 2), les modifications touchent cette fois encore l'intensité de creusement (avec une sensibilité accrue pour *A. icterica* puisque la différence est significative aux 2 doses testées contrairement au cas *d'A. nocturna*) et certains paramètres de forme (le taux de branchement ainsi que la sinuosité mais uniquement pour *A. icterica*).

Pour tenter d'estimer si les modifications observées pouvaient avoir des répercussions sur le fonctionnement du sol, nous avons réalisé des expériences de diffusion gazeuse au sein des colonnes de sol. Pour cela, après avoir défauné les colonnes au chloroforme, nous injectons du butane en quantité connue à leur sommet et nous mesurons au cours du temps les concentrations en butane au fond de celles-ci grâce à un CPG. Paradoxalement, nous n'avons observé de différences significatives en matière de diffusion gazeuse qu'au sein des colonnes où résidaient des vers de l'espèce *A. nocturna* et à la plus forte concentration en imidaclopride (0,5 ppm). L'absence de différence pour l'espèce endogée (*A. icterica*) serait expliquée par le fait que les réseaux constitués par ces vers sont par nature peu continus (ces vers rebouchant leurs galeries par leurs déjections) et seraient donc moins efficaces pour le transfert de gaz au sein du sol.
<figure><img src="image_30.png" /></figure>

**Figure 2.** Reconstructions 3D des réseaux de galeries pour *A. icterica* pour le sol témoin (1ère colonne), le sol pollué à 0,1 (2ème colonne) et à 0,5 ppm d'imidaclopride (3ème colonne). Les couleurs sont utilisées pour le rendu 3D (jaune au premier plan et bleu en arrière plan).

Différentes conclusions peuvent être tirées de cette seconde expérience :

- (i) nous confirmons en conditions plus réalistes l'effet possible de certains pesticides sur le comportement excavateur des vers (même si, cette fois encore, la pollution homogène du sol n'est pas réaliste) pour des concentrations que l'on peut observer dans l'environnement ;

- (ii) nous avons démontré, en conditions expérimentales, que ces effets pouvaient modifier certaines propriétés du sol (transfert gazeux).

- (iii) les réductions (en pourcentage) concernant la longueur des réseaux de galeries suite à la présence d'imidaclopride sont très similaires en 2D et en 3D. La pertinence de ces observations reste à démontrer en conditions naturelles.

Une dernière remarque s'impose. Il est évident que les expériences utilisant les colonnes de sol et la tomographie sont lourdes et coûteuses et ne peuvent donc pas être généralisées ni proposées en routine (contrairement aux expériences en terrariums 2D). La solution vers laquelle nous nous sommes tournés consiste à développer, à partir de nos connaissances sur le comportement excavateur des vers, un modèle simulant ce comportement pour une communauté de vers dans un cube virtuel de 1 m³. Il nous est alors possible de simuler l'effet de la présence de pesticides sur ce comportement à l'échelle de la communauté. Un couplage avec un modèle d'écoulement (ou de diffusion gazeuse) serait une voie possible d'étude pour estimer les impacts de ces pesticides sur le fonctionnement du sol.

Références bibliographiques

[1] Evans, 1947. *Ann. Mag. Nat. Hist.* 11, 643-650.
# Une nouvelle méthode d'élevage larvaire *in vitro* pour tester les effets des pesticides sur le couvain d'abeille

P. Aupinel, D. Fortini, B. Michaud, J.-N. Tasei et J.-F. Odoux

INRA, Unité expérimentale d'Entomologie, Le Magneraud, BP 52, 17700 Surgères

## Introduction

Les directives européennes recommandent d'évaluer la toxicité des régulateurs de croissance sur couvain d'abeille. La méthode officielle utilisée [1] consiste à alimenter durant 24 h une ruche par un récipient contenant un litre de sirop contaminé par le produit à tester, puis à observer les effets du traitement sur le développement du couvain. L'influence des effets variables de l'environnement rend cette méthode peu reproductible. Le produit à tester peut ne pas être stocké au lieu d'être immédiatement consommé par les larves. L'apport de nectar par les butineuses peut diminuer sensiblement l'exposition au produit. Enfin, cette méthode ne permet pas de contrôler les quantités de produit ingérées par les larves. Pour ces raisons, l'élaboration de nouvelles méthodes, de préférence en laboratoire, s'est avérée nécessaire. Depuis une cinquantaine d'années, de nombreuses tentatives ont été réalisées [2-4]. Malheureusement, ces techniques se sont avérées peu fiables compte tenu des forts taux de mortalité observés sur les lots témoins non traités.

Les objectifs de ce travail sont de présenter :

- une nouvelle méthode standardisée d'élevage larvaire *in vitro*,

- l'illustration de ce test au travers de deux exemples d'insecticides : le diméthoate (famille des organophosphorés), le diflubenzuron (régulateur de croissance, inhibiteur de la chitine).

## Matériel et méthodes

La figure 1 illustre les principales opérations réalisées au cours d'un test larvaire *in vitro* [5,6].

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 1.** Schéma résumant les principales étapes du test *in vitro*.</figcaption></figure>
Afin de disposer de jeunes larves homogènes, la reine est isolée sur un cadre vierge durant environ 30 heures. Au terme de cette étape, les jeunes larves sont transférées du cadre dans des cellules individuelles en plastique (greffage) ayant préalablement reçu 20 µL d'aliment. Elles sont ensuite placées en étuve durant 7 jours à 34°C, et 96 % d'humidité relative. Les larves sont nourries une fois par jour suivant le protocole décrit dans la figure 1.

La composition des aliments varie selon l'âge des larves (Fig. 1, Tab. 1). Cette variation est caractérisée par une augmentation du taux de matière sèche due à une plus forte teneur en sucres et en extrait de levure. A J7, les prénymphes sont placées dans une boite d'élevage destinée à recueillir les adultes émergents, à 37°C et 75 % d'humidité relative. Cette technique parfaitement standardisée permet d'obtenir en routine des taux de mortalité témoin inférieurs à 10 %.

<table><caption>**Tableau 1.** Composition des différentes catégories d'aliments</caption><thead><tr><td>Aliment</td><td>A</td><td>B</td><td>C</td></tr></thead><tbody><tr><td>Gelée royale %</td><td>50</td><td>50</td><td>50</td></tr><tr><td>Extrait de levure %</td><td>1</td><td>1,5</td><td>2</td></tr><tr><td>D-glucose %</td><td>6</td><td>7,5</td><td>9</td></tr><tr><td>D-fructose %</td><td>6</td><td>7,5</td><td>9</td></tr><tr><td>Matière sèche %</td><td>29,55</td><td>33,05</td><td>36,55</td></tr></tbody></table>

L'intoxication se fait par voie orale, le produit à tester étant mélangé à l'aliment. En intoxication aiguë, la totalité de la dose du produit est distribuée à J4. En intoxication chronique, les larves reçoivent chaque jour (excepté J2) un aliment contenant le produit à une concentration constante. Chaque dose ou concentration est testée sur trois échantillons de 48 larves, constitués à partir de trois ruches différentes. Un test comporte 5 doses ou concentrations du produit à tester, ainsi qu'un témoin sain. L'illustration de la méthode porte sur les deux modes d'exposition : aiguë (diméthoate, diflubenzuron) ou chronique (diméthoate).

## Résultats

### Intoxication aiguë

Pour les deux molécules, on observe une très nette relation dose-effet (Fig. 2). La linéarité de cette relation permet, dans une gamme appropriée de doses testées, de calculer les DL50 à partir des équations des droites de régression donnant les mortalités corrigées en fonction des valeurs logarithmiques des doses. Dans ce cas précis, on peut évaluer les DL50 à 48 h pour le diméthoate (1,9 µg/larve), et le diflubenzuron (310 ng/larve).

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 2.** Mortalités larvaires ($x \pm S_d$) corrigées par la formule d'Abbott à J5 (24h) et J6 (48h) en fonction des doses de diméthoate (a) et de diflubenzuron (b) ingérées à J4.</figcaption></figure>

En prolongeant l'observation au-delà du stade larvaire, cette méthode peut révéler des effets différés, par exemple sur le taux d'émergence des adultes (Fig. 3). Dans cet exemple, on observe un effet significatif de la plus faible dose de diméthoate
testée sur la mortalité nymphale (environ 40 %), alors que cette même dose produit seulement 10 % de mortalité larvaire 48h après ingestion.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 3.** Taux d'émergence des adultes en fonction de la dose de diméthoate ingérée par les larves à J4 (moyenne ± S<sub>d</sub>).</figcaption></figure>

### Intoxication chronique

Comme précédemment, on note une relation entre la dose de diméthoate ingérée par les larves en intoxication chronique, et la mortalité larvaire (Fig. 4). La mortalité moyenne des témoins est de 9 % après 7 jours d'élevage, et ne diffère pas significativement de la mortalité observée pour une concentration de 2,5 mg/kg d'aliment (2500 ppb). Cette valeur détermine une NOAEC (Non Observed Adverse Effect Concentration) pour la mortalité larvaire à 7 jours.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 4.** Évolution de la mortalité larvaire en fonction de différentes doses de diméthoate en intoxication chronique (moyenne ± S<sub>d</sub>). # : écart significatif par rapport au témoin, test Khi2.</figcaption></figure>

### Conclusion

Cette nouvelle technique offre de multiples avantages. En premier lieu, elle s'affranchit de toute influence aléatoire liée à l'environnement et de ce fait s'avère facilement reproductible. La standardisation et la relative simplification des manipulations la rend relativement accessible et donc intégrable dans les procédures d'évaluation du risque. Enfin, seule cette méthode permet avec une grande précision le contrôle des quantités d'aliment et donc de matière active ingérée par les larves. Nous avons récemment amélioré les conditions de nymphose, ce qui se traduit par l'obtention d'adultes en nombre important (pertes inférieures à 10 %). Des vérifications portant sur certaines caractéristiques anatomiques (présence de corbeilles) ainsi que certaines fonctionnalités physiologiques (fonctionnement des glandes cirières, développement des glandes hypo pharyngiennes) et comportementales (regroupement autour d'un diffuseur de phéromone royale) propres aux ouvrières nous permettent d'affirmer que les individus produits relèvent tous de cette caste. Cette nouvelle étape ouvre des perspectives intéressantes
concernant l'évaluation des effets différés après une exposition larvaire. Cette
méthode permettait déjà d'apprécier ces effets sur l'aptitude à la métamorphose.
Nous avons maintenant la possibilité de tester la survie des adultes produits, mais
également il devient possible d'évaluer des effets sublétaux, notamment au travers
de tests sur le comportement.

Références bibliographiques

[1] Oomen *et al.*, 1992. *Bulletin OEPP / EPPO Bulletin* **22**, 613-616.

[2] Malone *et al.*, 2002. *Apidologie* **33**, 447-458.

[3] Vandenberg & Shimanuki, 1987. *J. Apicult. Res.* **26**, 90-97.

[4] Weaver, 1955. *Science* **121**, 509-510.

[5]Aupinel et al., 2005. *Bull. Insectol.* **58**, 107-111.

[6] Aupinel et al., 2006. *Pest mgmt Sci.* (sous presse).
# Effets sublétaux du fipronil sur l'orientation de l'abeille domestique (Apis mellifera L.) dans un labyrinthe complexe

A. Decourtye<fnref n="1" />, S. Lefort<fnref n="1" />, J. Devillers<fnref n="2" />, M. Gauthier<fnref n="3" />, M. Tisseur¹et P. Aupinel<fnref n="4" />

## Introduction

La mortalité est le principal paramètre considéré lors de l'évaluation de la toxicité d'un produit phytopharmaceutique chez l'abeille domestique [1]. Pourtant, les effets biologiques de pesticides ne se limitent pas à l'augmentation de la mortalité dans la population. Les interrogations survenues après la mise sur le marché d'insecticides illustrent la nécessité de prendre en considération les effets sublétaux, et tout particulièrement des effets comportementaux dont l'identification requiert des méthodologies spécifiques et complémentaires. Par exemple, le test d'extension du proboscis a été récemment développé pour mettre en évidence les effets sublétaux des pesticides sur l'apprentissage de l'abeille [2]. Réalisé en laboratoire, cet essai ne permet pourtant pas de révéler l'ensemble des effets sublétaux susceptibles d'affecter les différentes composantes du comportement de butinage, telles que les systèmes d'orientation. Dans ce contexte, nous avons étudié les effets du fipronil sur les capacités des butineuses à s'orienter dans un labyrinthe en suivant un repère visuel préalablement appris.

## Matériels et méthodes

### Dispositif expérimental

Le dispositif conçu à partir du labyrinthe de Zhang et al. [3] était constitué d'un assemblage de 20 cubes dont chaque face verticale a été percée en son milieu d'un trou de 4 cm de diamètre dans lequel les butineuses en vol passent pour évoluer dans le labyrinthe. La butineuse pénétrant dans le labyrinthe doit parcourir en vol un trajet prédéterminé par l'expérimentateur, en passant de cube en cube, par les trous marqués d'une tache verte (environ 4 x 4 cm, placé sous le trou). Cette tache verte constitue un indice visuel qui indique à l'abeille le trajet à suivre. A la fin du parcours, l'abeille arrive dans la boîte d'alimentation. Pour cela, la butineuse doit voler à travers les cubes qui sont de deux types : (1) « les cubes de non décision », où seuls deux trous sont accessibles, celui par lequel la butineuse arrive et celui marqué par la tache verte indiquant le trajet correct ; (2) « les cubes de décision », où la butineuse arrivant par un trou a le choix entre un trou marqué (trajet correct) et un trou non marqué qui aboutit à une voie sans issue (trajet incorrect).

Un parcours comprend 6 « cubes de non décision » et 3 « cubes de décision ». Un parcours d'entraînement et 5 parcours de tests différents ont été effectués. Quelque soit le parcours utilisé (entraînement, test, ligne de base), une marque verte a toujours été présente à l'entrée du labyrinthe.

<footnote n="1">¹ACTA, 1 avenue C. Bourgelat, 69280 Marcy l'Étoile</footnote>

<footnote n="2">²CTIS, 3 chemin de la gravière, 69140 Rillieux La Pape</footnote>

<footnote n="3">³Centre de Recherches sur la Cognition Animale, Université Paul Sabatier, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse</footnote>

<footnote n="4">⁴INRA, Unité exéprimentale d'Entomologie, Le Magneraud, BP 52, 17700 Surgères</footnote>
## Matériel biologique

Une colonie d'abeilles a été placée dans la cage. La colonie était constituée d'une reine fécondée, âgée d'un an, et d'environ 10000 ouvrières. Un site d'alimentation comprenant un nourrisseur à solution sucrée (sucre cristallisé/eau à 50 % m/m), un nourrisseur à pollen (multi-floral) a été placé à 1,5 m en face de la colonie. A proximité immédiate du nourrisseur à sirop a été placée une marque verte afin que les butineuses se familiarisent avec ce signal visuel et l'associent avec la présence de la nourriture. L'expérimentation a été réalisée à deux reprises, de manière successive, avec deux colonies homogènes, issues du même élevage.

## Traitement

Le traitement a consisté à contaminer la solution sucrée (eau/sucre cristallisé 50 % m/m) avec du fipronil à la concentration de 1 µg.kg⁻¹ de fipronil<fnref n="3" /> (98 % de pureté). L'expérimentation a duré pendant 3 semaines. Seul le nourrisseur placé à l'extérieur du labyrinthe a reçu le sirop contaminé. A chaque semaine correspond une période d'alimentation différente : (1) tout d'abord, une alimentation avec une solution sucrée non contaminée (période avant traitement), (2) puis une alimentation contaminée, soit 1,2 litre de solution sucrée contenant 1 µg.kg⁻¹ de fipronil, administré durant 2 jours (période pendant traitement), (3) et enfin, de nouveau une alimentation non contaminée (période après traitement).

## Démarche expérimentale

**Phase d'entraînement et de marquage** : Dans un parcours passant par 9 cubes dont 3 cubes de décision, l'entraînement des butineuses a consisté à familiariser les butineuses au labyrinthe. Pour cela, le nourrisseur à sirop (sucre cristallisé/eau à 50 % m/m, non contaminé), délivrant la récompense alimentaire, a été reculé progressivement dans le labyrinthe en débutant dans le cube d'entrée et en finissant dans la boîte d'alimentation. Ensuite, une centaine de butineuses capturées dans la boîte d'alimentation ont été marquées individuellement à l'aide de pastilles colorées et numérotées. Immédiatement après leur marquage, les butineuses ont été relâchées dans la cage.

**Phase de tests** : Les 5 parcours de test ont été différents les uns des autres mais ont toujours comporté 9 cubes dont 3 de décision. Le lendemain du jour de marquage des individus, nous avons débuté les tests. Dès qu'une butineuse a pénétré dans le labyrinthe, son parcours a été observé et chronométré. L'entrée du labyrinthe a été fermée pour éviter la présence simultanée de plusieurs abeilles. Les tests ont été réalisés durant 3 à 4 h par jour et cela durant 3 à 4 jours successifs. Avant chaque changement de parcours, le labyrinthe a été nettoyé à l'éthanol afin d'éviter la présence d'éventuelles traces olfactives.

Les deux phases détaillées précédemment ont été réalisées avant, pendant, et après le traitement. La répétition de la phase d'entraînement et de marquage a permis, pour une même colonie, de renouveler totalement les butineuses observées. Ainsi, les performances enregistrées lors des 3 périodes (avant, pendant et après traitement) ont été obtenues avec des butineuses différentes.

## Analyse des données

Chaque butineuse testée a été considérée une seule fois dans l'exploitation des données, ses parcours suivants étant alors censurés. Pour chaque butineuse volant dans le labyrinthe, nous avons classé ses performances selon 4 classes :

- Classe 1 : la butineuse atteint le nourrisseur en moins de 5 min, de manière directe, sans faire de retour en arrière, ni même d'erreur,

- Classe 2 : la butineuse atteint le nourrisseur en moins de 5 min mais en faisant un ou plusieurs retours en arrière,

- Classe 3 : la butineuse atteint le nourrisseur en moins de 5 min mais en faisant une ou plusieurs erreurs de parcours (mauvais choix dans un cube de décision),

<footnote n="3">³ Concentration quantifiée par analyses chimiques HPLC-MS (GIRPA, Angers).</footnote>
- Classe 4 : la butineuse n'atteint pas le nourrisseur durant les 5 min imparties. Pour les butineuses des classes 1 à 3, nous avons chronométré le temps nécessaire à celle-ci pour atteindre la boîte d'alimentation. Les nombres de butineuses inscrits dans chaque classe de performances ont été comparés par un test non paramétrique de Mann-Withney à 1 ddl (P<0,025) selon : la répétition, le parcours utilisé et la période (avant, pendant et après traitement). Le même test statistique a été utilisé pour comparer les temps de parcours des butineuses selon la période. Lorsque des comparaisons deux à deux ont été réalisées, le seuil de signification a été corrigé par la méthode de Dunn-Sidak<fnref n="4" /> (Sokal et Rohlf, 1995), soit P<0,0063.

## Résultats

Le taux de butineuses pénétrant dans le labyrinthe, et donc répondant à la marque verte placée à l'entrée, a été largement réduit chez les individus traités (16 % pendant le traitement *versus* 34 et 41 % avant et après traitement, respectivement).

Aucune différence significative n'a été mise en évidence entre les performances obtenues lors des deux expérimentations (P>0,025). De même, le type de parcours utilisé pour le test n'a pas d'influence sur les performances (P>0,025).

Les proportions de butineuses réparties selon les classes de performances d'orientation ont été d'un niveau très élevé et équivalentes avant et après le traitement (P=0,33). En dehors de la période de traitement, près de 90 % des butineuses ont parcouru le labyrinthe de manière directe, sans faire de retour en arrière, ni même d'erreur (Fig. 1). Lors de la période de traitement avec le fipronil à 1 µg.kg⁻¹, le taux de butineuses traitées parcourant sans fautes le labyrinthe a chuté à 60 %. Parallèlement, le taux de butineuses n'atteignant pas le nourrisseur dans les 5 minutes imparties fût élevé (35 % contre 4 % avant et après le traitement). Les performances d'orientation lors de l'administration du fipronil ont été significativement différentes de celles mesurées avant (P=0,0008) et après (P=0,004).

Le fipronil a augmenté significativement le temps de vol dans le labyrinthe (P<0,0125). Chez les butineuses réussissant à parcourir la totalité du parcours, le temps moyen de parcours a été respectivement de 59 et 40 s avant et après le traitement, alors qu'il a été de 96 s lors du traitement.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 1.** Butineuses classées selon leur performance.</figcaption></figure>

## Discussion

Nous avons utilisé pour la première fois un dispositif de labyrinthe complexe afin de rechercher les effets sublétaux d'un pesticide chez l'abeille. Le principe a consisté à enregistrer les performances de butineuses traitées ou non qui doivent s'orienter dans le labyrinthe en fonction d'un repère visuel préalablement appris. Les performances d'orientation des abeilles non traitées ont été très élevées et

<footnote n="4">⁴ $\alpha' = 1 - (1 - \alpha)^{1/k}$, où k est le nombre de comparaisons.</footnote>
répétables. Nous avons observé des effets sublétaux du fipronil des butineuses à une concentration très faible, déterminée par analyses chimiques à 1 µg.kg⁻¹. Lors du traitement, un grand nombre d'abeilles ne parviennent pas à s'orienter dans le labyrinthe et celles réussissant à réaliser le parcours le font beaucoup plus lentement que les abeilles non traitées. Puisque dans le dispositif utilisé, les performances d'orientation d'une butineuse reposent au préalable sur l'association entre un signal visuel et la récompense alimentaire, nous pouvons supposer que le fipronil affecte les capacités d'apprentissage visuel. Mais le produit semble également induire des effets négatifs sur la locomotion en vol de la butineuse.

Références bibliographiques

[1] Devillers, 2002. Acute toxicity of pesticides to honey bees. *In*: Honey bees: estimating the environmental impact of chemicals (Devillers J., Pham-Delègue M.H. eds). Taylor and Francis, London, 56-66.

[2] Decourtye et al., 2005. Toxicité et risques liés à l'emploi de pesticides chez les pollinisateurs : cas de l'abeille domestique. In: Enjeux phytosanitaires pour l'agriculture et l'environnement au XXIᵉ siècle (C. Regnault-Roger ed.), Tec et Doc Lavoisier, Paris, 283-299.

[3] Zhang et al., 1996. *Neurobiol. Learn. Mem.* 66, 267-282.
# Effets d'un herbicide sur la relation prédateur-proie entre le têtard de grenouille rousse (Rana temporaria) et la larve de salamandre tachetée (Salamandra salamandra)

A.-L. Mandrillon et P. Saglio

INRA, UMR EQHC, Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex

## Introduction

Dans la nature, les larves d'amphibiens sont soumises à une multitude de stress environnementaux. Ceux-ci peuvent être d'origine biotiques (compétiteurs, prédateurs, organismes pathogènes, etc.) ou abiotiques (polluants, rayonnement ultraviolet, pH, etc.). Dans la majorité des cas, ces différents facteurs de risque n'opèrent pas indépendamment, mais interagissent pour induire des effets combinés sur les organismes et les écosystèmes. En dépit de cette réalité, les études en écologie et écotoxicologie aquatiques ont été principalement centrées sur les effets de stress uniques. Afin de mieux comprendre la réponse des organismes et des communautés aux agressions environnementales, il est donc nécessaire de développer une approche multifactorielle permettant de rendre compte des effets conjugués de stress multiples.

Les organismes aquatiques peuvent être soumis à deux types de risques majeurs : l'un, naturel, lié à la présence de prédateurs, et l'autre, anthropique, lié à la contamination du milieu par des polluants. Des études récentes relatives aux interactions potentielles entre les effets de ces deux types de stress chez les amphibiens ont montré que les polluants pouvaient augmenter la vulnérabilité à la prédation [1,2], altérer les comportements anti-prédateurs [3] ou réduire l'aptitude prédatrice [4,5]. A l'inverse, la présence d'un risque de prédation peut augmenter la toxicité du polluant pour les proies [6-9].

L'objectif de cette étude est d'examiner les effets d'un herbicide sur la relation prédateur-proie entre des têtards de grenouille rousse (Rana temporaria) et des larves de salamandre tachetée (Salamandra salamandra). Les larves d'amphibiens constituent un modèle idéal pour conduire ce type d'expériences car elles présentent une importante plasticité phénotypique en réponse au risque de prédation, et peuvent être très vulnérables à la menace des pesticides. Dans cette étude, nous avons choisi d'étudier l'amitrole, un herbicide non sélectif, pouvant contaminer les milieux aquatiques par voie directe, lorsqu'il est utilisé pour traiter les adventices aquatiques, ou indirecte, via un écoulement depuis les terrains agricoles traités.

## Matériels et méthodes

Protocole expérimental - Des œufs de grenouille rousse et des larves de salamandre tachetée ont été collectés dans des mares temporaires à proximité de Rennes. Quinze jours après l'éclosion, des groupes de quinze têtards (stade de Gosner 25 ; [10]) ont été exposés pendant trois jours à cinq concentrations sublétales en amitrole (0, 0,01, 0,1, 1 et 10 mg L⁻¹) en l'absence ou en présence d'une larve de salamandre. Les deux concentrations en herbicide les plus basses peuvent être détectées dans les eaux superficielles se trouvant à proximité de terrains agricoles traités. La concentration de 1 mg L⁻¹ peut être atteinte lorsque l'amitrole est utilisé contre les adventices aquatiques. Enfin, la concentration de 10 mg L⁻¹ est supérieure aux
niveaux environnementaux pouvant être observés [11], mais demeure toutefois très inférieure à la valeur de CL₅₀,₉₆h documentée chez une larve d'amphibien anoure (3 g L⁻¹ chez *Ade lotus brebis* ; [12]).

*Variables mesurées* - Le comportement des têtards a été suivi quotidiennement à 10 et 16 h. Les observations, conduites au cours de sessions de trois minutes, consistaient à dénombrer les têtards visibles (hors d'une litière de feuilles mortes) et actifs toutes les 30 secondes. Après trois jours d'exposition, l'efficacité de prédation des larves de salamandre a été évaluée en dénombrant les têtards survivants dans chaque aquarium.

## Résultats

**Pourcentages de têtards visibles** – En l'absence de larve de salamandre, les têtards exposés à 0,01, 0,1 et 1 mg L⁻¹ d'amitrole sont significativement moins visibles que les têtards témoins. Ces différences n'apparaissent plus en présence du prédateur. De plus, pour chacune des concentrations en herbicide, les pourcentages de têtards visibles sont similaires, que le prédateur soit présent ou absent.

**Pourcentages de têtards actifs** – En l'absence de larve de salamandre, des réductions d'activité sont observées au cours des trois jours d'expérience chez les individus exposés à 0,01 mg L⁻¹ d'amitrole, et lors du deuxième jour chez ceux exposés à 0,01, 0,1 et 1 mg L⁻¹. En présence du prédateur, ces différences n'apparaissent plus, avec pour seule exception une augmentation d'activité le premier jour chez les individus exposés à 10 mg L⁻¹. Les têtards témoins sont les seuls à présenter une réduction d'activité en réponse à la larve de salamandre. En effet, les individus exposés aux quatre concentrations en amitrole présentent des niveaux d'activité similaire que le prédateur soit présent ou absent.

**Pourcentages de têtards survivants** – En l'absence de larve de salamandre, les taux de survie ne diffèrent pas entre les différents groupes de têtards : tous les individus survivent quelle que soit la concentration en amitrole à laquelle ils ont été exposés. La présence du prédateur conduit à une réduction significative du taux de survie chez tous les lots de têtards. Les têtards exposés à 0,01 et 0,1 mg L⁻¹ d'amitrole présentent des taux de survie en présence du prédateur similaires à ceux des témoins. En revanche, les individus exposés à 1 et 10 mg L⁻¹ présentent des taux de survie significativement plus élevés que les individus témoins. De plus, il est à noter que l'augmentation de survie en présence de l'amitrole est concentration-dépendante.

## Discussion

Les résultats de cette étude montrent qu'une contamination du milieu aquatique par des concentrations sublétales en amitrole peut affecter la relation prédateur-proie entre les têtards de grenouille rousse et les larves de salamandre tachetée, en altérant les comportements anti-prédateurs des têtards et en réduisant l'efficacité de prédation des salamandres.

En l'absence du prédateur, les têtards exposés à l'herbicide (0,01, 0,1 et 1 mg L⁻¹) sont moins visibles, et utilisent davantage la zone refuge constituée par la litière de feuilles mortes, que les têtards témoins. Des diminutions d'activité sont également notées tout au long de l'expérience chez les individus exposés à 0,01 mg L⁻¹, et le deuxième jour de l'expérience chez ceux exposés à 0,1 et 1 mg L⁻¹. Dans la nature, de tels effets de l'herbicide pourraient s'avérer néfastes pour les têtards. En effet, en l'absence de risque de prédation, les têtards devraient maximiser leur activité d'exploration trophique du milieu, en passant moins de temps en zone refuge, et en étant davantage actifs. En se comportant de la manière opposée, les individus exposés à l'amitrole risquent de ne pas acquérir les ressources énergétiques nécessaires pour atteindre une taille-refuge vis-à-vis des
prédateurs à ouverture de bouche réduite (ex. larve de salamandre) ou pour se métamorphoser avant l'assèchement de l'habitat temporaire. En présence du prédateur, la fréquentation du refuge est la même entre les individus contrôles et ceux exposés à l'amitrole. De plus, le premier jour de l'expérience, les têtards exposés à 10 mg L⁻¹ d'amitrole sont significativement plus actifs que les témoins. Un tel effet de l'amitrole peut être très désavantageux pour les têtards dans la mesure où il augmente leur probabilité d'être détectés ou de rencontrer le prédateur.

Les têtards témoins répondent à la présence de la salamandre par une réduction d'activité, un mécanisme anti-prédateur connu, mais n'altèrent pas leur fréquentation du refuge. Les larves de salamandre chassent dans la litière de feuilles mortes en utilisant deux stratégies. L'une consiste à attendre qu'un têtard passe à proximité pour l'attaquer brusquement. L'autre met en jeu la détection d'un têtard et l'approche progressive de celui-ci. Dans les deux cas, une stratégie anti-prédatrice consistant à se réfugier dans la litière de feuilles mortes ne constitue pas *a priori* un moyen de défense efficace puisqu'il s'agit du terrain de chasse privilégié du prédateur. Contrairement aux têtards témoins, les individus exposés à l'amitrole ne mettent en jeu aucun mécanisme comportemental en réponse à la larve de salamandre. Un tel effet de l'amitrole, altérant les comportements anti-prédateurs des têtards, peut augmenter leur vulnérabilité à la prédation.

Toutefois, en dépit de leurs défenses altérées, les têtards exposés à l'amitrole ne souffrent pas plus de la prédation par les larves de salamandre que les têtards non exposés. Au contraire, les individus exposés aux deux concentrations en herbicide les plus élevées (1 et 10 mg L⁻¹) bénéficient même d'une survie accrue par rapport aux témoins. Il semblerait donc que l'amitrole, à ces concentrations, nuise à l'efficacité de prédation des larves de salamandre, et libère les têtards du risque que représente la présence de ce prédateur.

Références bibliographiques

[1] Verrell, 2000. *Bull. Environ. Contam. Toxicol.* 64, 85-92.

[2] Broomhall, 2002. *Aquat. Toxicol.* 61, 243-250.

[3] Bridges, 1999. *J. Herpetology* 33, 303-306.

[4] Boone & Semlitsch 2003. *Oecologia* 137, 610-616

[5] Mills & Semlistch 2004. *Ecol. Appl.* 14, 1041-1054

[6] Relyea & Mills, 2001. *PNAS* 98, 2491-2496.

[7] Relyea, 2003. *Ecol. Appl.* 13, 1515-1521.

[8] Relyea, 2004. *Environ. Toxicol. Chem.* 23, 1080-1084.

[9] Relyea, 2005. *Arch. Environ. Contam. Toxicol.* 48, 351-357.

[10] Gosner, 1960. *Herpetologica* 16, 183-190.

[11] World Health Organisation 1994. *Amitrole Health and Safety Guide. International Program on Chemical Safety. Health and Safety Guide* 85.

[12] Johnson, 1976. *Zool. J. Linn. Soc.* 59, 79-83.
Session 3

Effets sur les populations :
approches dynamiques et génétiques
<figure><img src="image_36.png" /></figure>
Session 3

Effets sur les populations : approches dynamiques et génétiques

# Évaluation expérimentale in situ des effets de produits de démoustication sur les populations de daphnies dans les zones humides littorales atlantiques et méditerranéennes

C. Duchet<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, E. Franquet<fnref n="3" />, C. Lagneau<fnref n="1" /> et L. Lagadic<fnref n="2" />

## Introduction

Les zones humides, patrimoine naturel remarquable en raison de leur richesse biologique et des importantes fonctions naturelles qu'elles remplissent (régulation du régime des eaux, auto-épuration des cours d'eau, réservoirs biologiques, etc.), font l'objet de traitements anticulicidiens. Mais l'utilisation d'insecticides dans les écosystèmes aquatiques naturels peut avoir des répercussions sur la biodiversité des peuplements d'invertébrés même si le souci du moindre impact écologique incite à utiliser en priorité les insecticides plus sélectifs et moins rémanents. Il apparaît dès lors indispensable d'évaluer le risque écotoxicologique lié à leur utilisation. Or les tests d'écotoxicité réalisés en laboratoire ne peuvent suffire à eux seuls à cette évaluation tant les conditions du milieu où ils sont appliqués peuvent influencer leur biodisponibilité et leur toxicité. L'évaluation du risque pour les écosystèmes nécessite donc de mettre en œuvre des approches in situ, dans les milieux faisant l'objet de campagnes de démoustication.

Dans ce contexte, un projet de recherche, soutenu dans le cadre du PNETOX, s'inscrit précisément dans le cadre du développement d'une approche intégrée de l'évaluation du risque écotoxicologique de produits de démoustication en France métropolitaine, approche basée sur la combinaison de méthodes d'analyse des effets dans des conditions de complexité biologique croissante, allant jusqu'aux écosystèmes naturels (changement d'échelle d'observation des effets entre niveaux d'organisation biologique : individu – population – communauté).

L'étude présentée ici concerne les expérimentations à l'échelle de la population in situ menées dans des milieux différents (en zones humides atlantiques et en zones humides méditerranéennes) à différentes saisons (hiver et été) afin de confronter la méthodologie employée pour évaluer les effets de deux larvicides à mode d'action différent, le *Bacillus thuringiensis* serovar. *israelensis* (*Bti*) et le diflubenzuron.

## Matériels et méthodes

Deux larvicides ont été retenus pour cette étude : le *Bti*, un insecticide d'origine biologique qui agit par ingestion, et le diflubenzuron, un insecticide de synthèse de la famille des inhibiteurs de croissance, qui agit par contact et ingestion. Le modèle biologique étudié, des cladocères du genre *Daphnia*, a été choisi en fonction du mode d'action des larvicides et pour leur sensibilité soupçonnée vis-à-vis de ces produits.

Le même protocole expérimental est appliqué en zones humides littorales méditerranéennes et atlantiques. Trente microcosmes en plexiglas (50 x 50 x 50 cm) sont placés dans un marais à submersion temporaire puis sont traités avec

<footnote n="1">¹EID Méditerranée, 165 avenue Paul Rimbaud, 34184 Montpellier Cedex 4</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR EQHC, Écologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex</footnote>

<footnote n="3">³Institut Méditerranéen d'Écologie et de Paléoécologie, Université Aix-Marseille III, Avenue Escadrille Normandie-Niemen, 13397 Marseille Cedex 20</footnote>
du Dimilin® WP 25 (diflubenzuron) à 25, 50 et 100 g/ha ou avec du Vectobac® 12 AS (Bti) à 0,8 l/ha. Chaque concentration et le témoin (microcosmes non traités) sont répliqués 6 fois. Les daphnies sont collectées lors de 6 campagnes de prélèvements (avant traitement et 2, 4, 7, 14 et 21 jours après le traitement). Les températures de l'air et de l'eau, la hauteur d'eau, le pH, la conductivité, la salinité, l'oxygène dissous, la concentration en chlorophylle a, la teneur en matières en suspension et la concentration de diflubenzuron sont mesurés dans les microcosmes lors des prélèvements des organismes. Les effets des larvicides sur les populations de Daphnia sp. sont évalués grâce à l'analyse de l'abondance et de la structure de taille.

## Résultats – Discussion

Globalement, les tests statistiques ont montré une bonne homogénéité entre les plots pour les facteurs du milieu mesurés. Les paramètres environnementaux suivis ne présentent pas de différences significatives entre les plots avant et après traitement. Cependant, durant les deux expérimentations, la hauteur d'eau diminue et la concentration en chlorophylle a augmente dans tous les plots.

### Milieu méditerranéen (février 2004)

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

### Milieu atlantique (juin 2005)

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 1.** Évolution des densités moyennes de daphnies en milieu méditerranéen et en milieu atlantique. T = témoin ; Bti = traité au Bti (0,8 l/ha) ; D25, D50 et D100 = traité au diflubenzuron (25, 50 et 100 g/ha). NS = non significatif (p > 0,05) ; * : significatif (p < 0,05) ; ** : hautement significatif (p < 0,01).</figcaption></figure>
Une analyse de la variance suivie d'un test de Newman-Keuls ont été utilisés pour mettre en évidence les éventuelles différences de densité de daphnies entre les différents traitements (Fig. 1).

Dans les deux cas, les microcosmes traités au *Bti* ne présentent pas de différences avec les microcosmes témoins sauf 15 jours après le traitement en février 2004, cette différence pouvant s'expliquer par l'importante variabilité observée dans la série traitée au *Bti*. En février, les microcosmes traités au diflubenzuron à 25 g/ha ne présentent pas de différences significatives avec le témoin une semaine après le traitement, alors que les microcosmes traités au diflubenzuron à 50 et 100 g/ha présentent des différences significatives avec le témoin 2 jours après le traitement. En revanche, en juin, les microcosmes traités au diflubenzuron à 25, 50 et 100 g/ha présentent des différences significatives avec la série témoin à partir de 2 jours après le traitement.

La mesure de la taille de chaque individu a permis d'observer l'évolution de la structure de taille des daphnies en fonction du traitement et au cours du temps. Cette étude a mis en évidence des structures identiques entre les microcosmes témoins et les microcosmes traités au *Bti* que ce soit en hiver en milieu méditerranéen ou en été en milieu atlantique.

L'étude menée en hiver a permis de voir que les jeunes daphnies étaient plus sensibles au diflubenzuron et disparaissaient les premières. En revanche, l'étude menée l'été a montré des effets du diflubenzuron sur toutes les classes de tailles (Fig. 2).

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 2.** Évolution de la structure de taille de *Daphnia* sp. en milieu méditerranéen (février 2004) et atlantique (juin 2005).</figcaption></figure>

## Conclusions

Les deux expérimentations menées dans des milieux différents et à des saisons différentes ont permis de montrer des différences de toxicité entre le *Bti* et le diflubenzuron. Elles ont également mis en évidence des différences d'action du diflubenzuron selon la température du milieu. Enfin, l'étude en hiver a permis de déceler des différences de sensibilité selon l'âge des organismes. Il serait donc intéressant de mener une nouvelle fois cette expérimentation sur les mêmes sites mais à des saisons différentes afin de confirmer ces observations.
# Évaluation des effets des polluants chimiques sur la dynamique de population d'un poisson, la gambusie (Gambusia holbrooki), en écosystème expérimental : Élaboration d'un modèle basé sur les individus pour aider à la prise de décision

R. Beaudouin<fnref n="1" />, V. Ginot<fnref n="2" /> et G. Monod<fnref n="1" />

## Introduction

Chez le poisson, l'évaluation expérimentale du danger des polluants chimiques a reposé jusqu'à présent principalement sur des études au niveau des performances individuelles. Or, l'extrapolation des effets sur les individus aux effets sur la population n'est pas simple. Il serait donc souhaitable de pouvoir expérimenter au niveau de la population. Mais, le nombre d'espèces de poissons pouvant être étudiées au niveau populationnel en condition expérimentale est très limité, en raison de la relative petite taille des écosystèmes expérimentaux (microcosmes) pouvant être mis en œuvre. La gambusie (Gambusia holbrooki) est un bon candidat pour ce type d'étude. Cependant, les expériences préliminaires menées dans notre laboratoire [1,2] ont montré qu'il existait une grande variabilité entre les populations témoins d'une même expérience. Or, les expériences en microcosme ne permettent la mise en œuvre que d'un nombre limité de réplicats. Ceci peut constituer une limite importante à l'interprétation des résultats du fait de la faible puissance, au sens statistique, des comparaisons entre un petit nombre fortement bruité de populations témoins et de populations exposées. Il est donc déterminant d'améliorer la puissance statistique des expériences.

Une piste possible pour répondre à cet enjeu pourrait être de compléter les données témoins réelles en simulant à l'aide d'un modèle probabiliste, l'ensemble des populations attendues en conditions témoins. Ceci devrait permettre de déterminer la probabilité que les populations exposées au polluant appartiennent à la distribution des populations témoins avec un faible risque de faux négatif.

L'objectif de cette étude a été de mettre au point un modèle probabiliste de la dynamique de population de la gambusie et de l'utiliser dans des études de cas pour évaluer la pertinence de la démarche. Une modélisation de type individu centré a été choisie car nous voulons simuler de façon réaliste la distribution de taille des individus des populations.

## Matériels et Méthodes

Le modèle individu centré a été réalisé à l'aide de la plateforme de modélisation Mobidyc [3] mise au point à l'Unité de Biométrie (INRA, Avignon). Le modèle décrit la croissance, la survie et la reproduction des poissons en distinguant trois types d'agents : juvéniles, mâles et femelles. Les principales variables environnementales qui agissent sur le cycle vital de la gambusie et le cycle reproducteur, température de l'eau et photopériode, sont les mêmes pour les simulations réalisées par le modèle que pour les expériences réelles. Les sorties descriptives des populations fournies

<footnote n="1">¹INRA SCRIBE, Station Commune de Recherche en Ichthyophysiologie, Biodiversité et Environnement, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex</footnote>

<footnote n="2">²INRA, Unité de Biométrie, Site Agroparc, 84914 Avignon Cedex 9</footnote>
par le modèle sont identiques à celles disponibles sur les populations réelles : effectif des différentes classes d'individus, sex-ratio et distribution de taille des individus d'une population.

Par conséquent, nous devons comparer deux types de sorties entre les populations réelles et simulées : des sorties scalaires (effectifs et sex-ratio ; Fig. 1) et des sorties de type distribution (distribution de taille des individus d'une population). Pour ces deux types de sorties, nous avons développé des méthodes statistiques pour évaluer si les réalisations d'une variable des populations réelles sont des événements probables de la distribution de cette variable simulée par le modèle. Pour les sorties de type scalaire nous avons développé un test de vraisemblance des valeurs observées par rapport à celles simulées. Pour les sorties de type distribution, un test basé sur la somme des écarts au carré calculée entre les classes de taille des populations simulées et celles des populations observées a été développé. La puissance statistique des deux tests a été explorée par simulation.

Pour paramétrer le modèle, des expériences visant à caractériser les traits d'histoire de vie de la gambusie à Rennes ont été nécessaires. En conditions de laboratoire, les expériences ont été réalisées sur la plateforme expérimentale de SCRIBE (INRA, Rennes) qui dispose de bassins de différentes tailles intégrés dans des circuits d'eau recyclée avec contrôle de la photopériode et de la température. Les expériences menées en conditions naturelles ont été réalisées sur la plateforme de microcosmes de l'Unité Expérimentale d'Ecologie et d'Ecotoxicologie Aquatique (INRA, Rennes).

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 1: Distribution simulée (histogramme) et points observés (point) du nombre de poisson par population pour une expérience réalisée en 2001</figcaption></figure>

## Résultats - Discussions

La première étape de notre travail a consisté à définir le modèle conceptuel du cycle de vie de la gambusie. Cette étape nous a permis de déterminer les traits d'histoire de vie de la gambusie que nous devions renseigner pour programmer le modèle. Ceux-ci concernent la croissance, la reproduction et la survie.

Concernant la croissance des individus, le modèle de von Bertalanffy est celui qui s'ajuste généralement le mieux aux données observées. Ce modèle comporte deux paramètres : la croissance initiale des individus (pente) et la taille maximale (asymptote horizontale). Nos résultats montrent que, les femelles et les mâles ont une croissance similaire pendant les 5 premiers jours. Le paramètre de pente du modèle de von Bertalanffy (croissance initiale) est donc le même pour les deux sexes. Les expériences réalisées ont montré que trois facteurs influencent la croissance initiale : la température, la taille à la naissance et la densité. Par ailleurs, nos résultats montrent que la taille maximale est différente entre les mâles (moyenne = 32 mm) et les femelles (moyenne = 54 mm). Concernant la reproduction, des expériences ont été menées pour caractériser la maturité sexuelle, l'effectif des portées et la taille à la naissance des alevins, l'intervalle inter parturition et la sex-ratio à la naissance. Lors de la première parturition la taille est influencée par la densité en individus de la population. Pour la maturité sexuelle l'intervalle inter-parturition correspond à un nombre constant de degré-jour. Il existe une relation croissante de type puissance entre la taille de la mère et le nombre d'alevins produits dans une portée (Fig. 2). La taille moyenne à la naissance des alevins est une fonction décroissante de l'effectif de la portée. La sex-ratio est équilibrée à la naissance. Chez

<figure><img src="image_41.png" /></figure>
le mâle, il apparaît deux sous-groupes présentant des tailles différentes lors de la maturité sexuelle. Lors de leurs 10 premiers jours de vie, hors prédation, la survie des alevins est proche de 100 %. A partir du suivi de la survie de groupes de poissons en microcosmes (présence de prédateurs) nous proposons une fonction croissante possédant une asymptote horizontale (à taille maximale la mortalité est nulle) reliant la taille des poissons à la probabilité de survie journalière.

A partir de ces informations, le modèle a été programmé sur la plateforme Mobidyc et le paramétrage du modèle a été réalisé en trois étapes : analyse de sensibilité, calibration et validation. Une analyse de sensibilité de notre modèle a été réalisée selon la méthode décrite par Ginot et al. [4]. Cette méthode combine une analyse locale et globale, incluant trois étapes : l'exploration paramètre par paramètre (un paramètre à un temps donné), l'analyse de sensibilité locale et l'analyse de sensibilité globale via une ANOVA. Ceci a permis d'explorer le comportement du modèle et d'identifier les paramètres importants pour réaliser le calage. En s'appuyant sur les résultats de l'analyse de sensibilité, le modèle a été calé par ajustement manuel des valeurs des paramètres afin que les écarts entre sorties observées et simulées soient satisfaisants par rapport aux objectifs assignés à notre modèle. Un point important de ce travail a été la validation du modèle. Comme le modèle est probabiliste, sa validation nécessite que l'espérance et la variance de ses sorties soient en accord avec celles des sorties observées chez les populations réelles. La qualité du test statistique dépend fortement du bon ajustement de la variance du modèle. En effet, la variance des sorties du modèle doit être à la fois supérieure ou égale à celle observée pour assurer la robustesse du test (c'est-à-dire de ne pas conclure faussement qu'un polluant à un effet quand ce n'est pas le cas) et suffisamment basse pour permettre que le test soit puissant (c'est-à-dire que l'on ne conclue pas faussement qu'un polluant n'a pas d'effet quand c'est le cas). Pour

s'assurer de cela, nous avons contrôlé que le modèle, sans modification des valeurs de ses paramètres, simule correctement les données de plusieurs expériences avec des scénarios thermiques différents (27 populations obtenues en conditions témoins lors de 4 années différentes ont servi à la validation) (Fig. 3). De plus, nous avons contrôlé que la variance des sorties du modèle est plus élevée que la limite supérieure de l'intervalle de confiance des données réelles (intervalle de confiance obtenu par bootstrap des données réelles).

L'aide à la décision apportée par le modèle à tout d'abord été évaluée sur deux cas de populations réelles atypiques délibérément générées. Dans une première expérience, les poissons de la première cohorte ont été supprimés des populations lors de leur naissance. Dans une seconde expérience, des populations ont été initiées avec un nombre différent de géniteurs initiaux de ceux des populations simulées (3, 12, 24 au lieu de 6 femelles initiales). Par ailleurs, nous avons essayé de mettre en évidence les conséquences populationnelles de l'exposition à l'éthynilœstradiol d'individus de gambusies lors de leur puberté (futurs géniteurs initiaux des populations).

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 3: Distribution de la distribution de taille des individus de 1000 populations simulées (Surface grise) et distribution de taille d'une population observée (point et ligne blanche).
Exemple de lecture : Pour la population observée, les individus de la classe 15-16 mm représentent 14 % de tous ses individus. 10% (niveau de gris) des 1000 populations présentent 14 % d'individus entre 15-16 mm.</figcaption></figure>

## Conclusion

En conclusion, lors des expériences pour évaluer les effets de polluants sur des populations de poissons en microcosme, la puissance statistique des comparaisons entre populations témoins et exposées est problématique car très faible. La modélisation probabiliste des populations témoins pourrait être une approche
intéressante pour augmenter la puissance statistique de ce type d'expérience. Notre modèle est actuellement opérationnel et son apport comme outil d'aide à la décision est en cours d'évaluation. De plus, comme un modèle individu centré simule chaque individu, cela permet de comprendre comment les propriétés individuelles déterminent le niveau de la population. Donc, dans le futur nous pourrions envisager d'utiliser ce modèle pour prédire les effets d'un polluant au niveau de la population en se basant sur les effets individuels.

Références bibliographiques

[1] Drèze *et al.*, 1998. *Bull. Fr. Pêche Piscicult.* 350-351, 465-477.

[2] Drèze, 2001. Thèse de doctorat de l'Université de Metz. 145 p.

[3] http://www.avignon.inra.fr/mobidyc.

[4] Ginot *et al.*, 2006. *Ecol. Model.* 193, 479-491.
# Plasticité phénologique et restauration des populations d'invertébrés aquatiques

T. Caquet et M. Roucaute

INRA, UMR EQHC, Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex

## Introduction

La phénologie des invertébrés aquatiques peut présenter une certaine plasticité pour différents traits : durée des différentes phases du cycle vital, voltinisme (nombre de générations par an), degré de synchronisation du développement, etc. Cette plasticité se manifeste en réponse à divers facteurs abiotiques (température, photopériode, niveau d'oxygénation, permanence de l'habitat, fréquence et caractère prévisible des perturbations, etc.) ou biotiques (disponibilité de la nourriture, densité de population, compétition intra- et inter-spécifique, etc.). L'influence de cette plasticité sur la dynamique de populations d'invertébrés aquatiques exposées à des substances toxiques et leur restauration a été jusqu'à présent très peu étudiée. Or, pour une espèce donnée, la phénologie peut conditionner fortement la probabilité de recolonisation d'un milieu perturbé, en fonction, par exemple, de la présence (ou de l'absence) de formes de dispersion ou d'œufs au moment où le niveau de contamination du milieu redevient compatible avec sa survie.

*Cloeon dipterum* L. est un insecte éphéméroptère de la famille des Baetidae qui est un hôte fréquent des milieux lentiques. Cette espèce ovovivipare et cosmopolite est connue pour présenter une plasticité phénologique importante puisque elle peut être univoltine (1 gén./an), bivoltine (2 gén./an), multivoltine (3 gén./an ou plus) ou unimultivoltine (partiellement univoltine et partiellement bivoltine) [1]. Cette plasticité est confirmée par l'analyse des patrons d'émergence de cette espèce lors d'études en mésocosmes réalisées en France. Dans le cas de populations univoltines, des adultes sont présents pendant une période brève (mai-juin) tandis que pour les populations bivoltines, des adultes sont présents du printemps à l'automne.

L'objectif de ce travail était d'analyser la phénologie de cette espèce dans des écosystèmes expérimentaux (mésocosmes) et d'évaluer les conséquences possibles de sa plasticité sur la restauration de ses populations suite à la contamination par un insecticide. Les conséquences sur la restauration et la structuration des communautés sont abordées en conclusion.

## Matériel et Méthodes

L'étude a été réalisée dans les mésocosmes circulaires de 9 m³ de la plateforme expérimentale de l'U3E de Rennes dans le cadre d'un programme financé par le programme Interface Expertise-Recherche SSM INRA-DGAL. Les mésocosmes ont été remplis avec de l'eau du réseau et un mélange de sédiments naturels et artificiels (sable et argile) y a été introduit. Pendant la phase de maturation d'un an qui a suivi, des organismes provenant d'élevages (lymnées) et de milieux naturels (phyto- et zooplancton, macrophytes) ont été introduits. Le développement spontané de macrophytes et la colonisation par de nombreux insectes a contribué à accroître le réalisme écologique des mésocosmes. Le jour du traitement, la moitié des mésocosmes a été contaminée avec de la deltaméthrine (concentration nominale : 2 µg/L), les autres systèmes étant conservés comme témoins. Les prélèvements de
macro-invertébrés ont été réalisés selon un plan d'échantillonnage stratifié, à l'aide de pièges à émergence pour les formes ailées et de substrats artificiels pour les formes larvaires. Les organismes ont été triés, identifiés et dénombrés au laboratoire. La taille du corps (hors cerques) des larves et des subimagos de *C. dipterum* a été mesurée à l'aide d'une loupe binoculaire équipée d'un oculaire micrométrique.

## Résultats - Discussion

La deltaméthrine a provoqué une mortalité très importante des larves de *C. dipterum* dans les mésocosmes traités et aucune émergence d'adultes n'a été observée au printemps (Fig. 1A). En revanche, l'émergence d'une seconde cohorte a été observée à la fois dans les mésocosmes témoins et dans les mésocosmes traités en été (Fig. 1A). L'analyse de la distribution des fréquences de taille des larves dans les échantillons de faune benthique (Fig. 1B) a confirmé que ces individus provenaient d'œufs déposés au printemps par les adultes ayant émergé à cette période et non pas de larves qui auraient survécu au traitement. La restauration de ce type d'organisme dans un milieu contaminé par un insecticide s'effectue donc à partir de sources externes et elle n'est possible que si des individus fertiles sont présents au moment où les conditions environnementales redeviennent favorables (disparition du toxique).

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>**Figure 1.** A. Abondance moyenne des subimagos de *C. dipterum* dans les pièges à émergence disposés dans les mésocosmes témoins et contaminés par la deltaméthrine. B. Distribution des fréquences de taille des larves de *C. dipterum* dans les échantillons de benthos provenant des mésocosmes témoins et contaminés par la deltaméthrine. La flèche indique la date du traitement.</figcaption></figure>

L'importance de la phénologie dans la dynamique de restauration des populations d'insectes en mésocosmes a déjà été soulignée [2] mais de nombreuses questions demeurent, notamment en ce qui concerne d'éventuelles différences de potentiel reproducteur (et donc d'efficacité de recolonisation) entre les individus des différentes cohortes. En effet, chez de nombreux invertébrés, dont les Baetidae, la fécondité des femelles est fortement dépendante de la taille des individus. La comparaison de la taille des subimagos émergents capturés au printemps et en été dans les mésocosmes de Rennes a montré que les femelles de la seconde cohorte étaient significativement plus petites (et donc sans doute moins fécondes ; Fig 2). Si une contamination se produit en été, la recolonisation suite à la reproduction d'adultes appartenant à la seconde cohorte et provenant de milieux non perturbés est possible mais le nombre d'œufs produits par individu sera plus faible, ce qui peut avoir des conséquences sur la dynamique de la recolonisation et son succès éventuel.

Le fait que toutes les espèces et toutes les populations ne présentent pas la même phénologie pourrait aussi avoir des conséquences importantes sur la dynamique de
restauration des communautés perturbées et sur la biodiversité des communautés restaurées, notamment dans les cas où la séquence de colonisation constitue un élément déterminant dans l'assemblage des communautés.

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 2.** Tailles moyennes des subimagos de *C. dipterum* échantillonnés à différentes dates dans les mésocosmes de Rennes. L'effet de la date est significatif (ANOVA, *p* < 0,001).</figcaption></figure>

La variabilité et l'évolution naturelles d'une communauté sont en effet dues à la combinaison des effets de différents paramètres environnementaux et des caractéristiques biologiques des espèces qui la composent (elles-mêmes déterminées par la plasticité phénotypique et la variabilité génétique de ces espèces). Certaines caractéristiques régionales (diversité taxonomique, connectivité des habitats) et locales (productivité, fréquence et intensité des perturbations) de l'environnement affecteraient la sensibilité de l'assemblage des communautés aux conditions environnementales et à la séquence de colonisation (Fig. 3). La plasticité phénologique pourrait jouer un rôle, non encore évalué, dans l'état final atteint par les communautés, en conditionnant la séquence de recolonisation de milieux perturbés.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 3.** Représentation schématique des mécanismes d'assemblage des communautés selon qu'il existe un seul (Single stable equilibrium) ou plusieurs états d'équilibre stable (Multiple stable equilibria). Lorsqu'il existe un seul état d'équilibre stable, la diversité locale (α) est le produit de la diversité régionale (γ) et de la sélection par les facteurs environnementaux ("filtres environnementaux"). Les différences de diversité entre sites (β) découlent de l'existence de différents filtres environnementaux. Lorsqu'il existe plusieurs états d'équilibre stable, des communautés différentes peuvent s'établir alors que les conditions environnementales sont identiques, selon l'ordre de colonisation des espèces. Les différences de diversité entre sites sont alors la conséquence de différentes séquences de colonisation. La plasticité phénologique pourrait avoir une influence à ce niveau (modifié d'après [3]).</figcaption></figure>

Références bibliographiques

[1] Clifford, 1982. *Quaest. Entomol.* 18, 15-90.

[2] van den Brink et al., 1996. *Environ. Toxicol. Chem.* 15, 1143-1153.

[3] Chase, 2003. *Oecologia* 136, 489-498.
# Xénobiotiques et processus stochastiques dans les populations exposées : approche expérimentale chez *Lymnaea stagnalis*

M.-A. Coutellec

INRA, UMR EQHC, Écobiologie et Qualité des Hydrosystèmes Continentaux, 65 rue de Saint-Brieuc, 35042 Rennes Cedex

## Introduction

L'estimation des effets des contaminants à l'échelle des populations présente un intérêt majeur pour l'évaluation du risque écotoxicologique, car ce niveau d'organisation biologique est essentiel dans de nombreux processus écologiques et évolutifs. En conséquence, la caractérisation des effets requiert des outils spécifiquement dédiés à cette échelle, et qui font appel à la théorie en dynamique et génétique des populations. Par sa nature prédictive, le paramètre *r*, taux d'accroissement d'une population, est directement applicable à l'évaluation du risque, en particulier du risque de déclin ou d'extinction. Parallèlement, l'effectif efficace, ou paramètre *Ne* en génétique des populations, peut renseigner sur les risques évolutifs encourus par la population, en particulier ceux liés à la dérive génétique. Ces paramètres et les modèles qui les sous-tendent représentent donc une mine d'outils potentiels pour l'écotoxicologie des populations. Dans ce contexte, on peut choisir de les appliquer directement dans un test d'effet, en comparant par exemple les taux d'accroissement de populations saines et contaminées, et en attribuant les différences observées au contaminant testé. Si la comparaison porte sur des populations naturelles, on se confronte au problème des facteurs confondants non contrôlés, qui peuvent être très divers (dont l'histoire évolutive propre des populations étudiées, la stabilité environnementale, les processus d'immigration / émigration).

Une approche alternative et qui peut être préliminaire à l'étude en milieu naturel, consiste à tester la valeur prédictive de ces indices dans un contexte expérimental, plus facile à manipuler du point de vue écotoxicologique. Cette seconde démarche a été appliquée dans le cadre de l'étude présentée, qui porte sur un mollusque d'eau douce, *Lymnaea stagnalis*. L'objectif en est de calibrer les effets de réductions démographiques expérimentales contrôlées sur les paramètres de dynamique et génétique des populations.

## Matériels et méthodes

*L. stagnalis* est un gastéropode pulmoné d'eau douce, présent dans les étangs et les lacs de l'hémisphère Nord. 16 populations expérimentales ont été créées en juillet 2002 à partir de lignées issues de populations d'étangs (Le Rheu) et implantées en mésocosmes extérieurs. Ces systèmes ont été mis en place 4 mois plus tôt, avec apport de sédiment, macrophytes, phyto- et zooplancton, suivi d'une colonisation naturelle par divers organismes (Unité Expérimentale d'Écologie et d'Écotoxicologie Aquatique, INRA Rennes). Les lignées ont fait l'objet d'un élevage préalable en isolement individuel au laboratoire, jusqu'à maturité sexuelle. En termes d'effectifs initiaux, 4 types de populations ont été créés (Tab. 1).