# Etude de la stabilité des étalons analytiques pour la surveillance des milieux aquatiques -Cas des antibiotiques

Céline Guillemain, Morgane Philippe, Pierre Boutet, Amandine Daval,
Christelle Margoum

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To cite this version:

Céline Guillemain, Morgane Philippe, Pierre Boutet, Amandine Daval, Christelle Margoum. Etude de la stabilité des étalons analytiques pour la surveillance des milieux aquatiques -Cas des antibiotiques. INRAE RiverLy; AQUAREF. 2021, pp.42. hal-03969660

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Submitted on 2 Feb 2023

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# Etude de la stabilité des étalons analytiques pour la surveillance des milieux aquatiques - Cas des antibiotiques

C. Guillemain, M. Philippe, P. Boutet, A. Daval, C. Margoum

Septembre 2021

Document final

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## Contexte de programmation et de réalisation

Ce rapport a été réalisé dans le cadre du programme scientifique et technique AQUAREF pour l'année 2021, au titre de l'action E1B2 du thème E - Garantir la qualité des données bancarisées, Outils pour assurer la qualité des données.

Auteur (s) :

Céline Guillemain
INRAE
celine.guillemain@inrae.fr

Morgane Philippe
INRAE

Pierre Boutet
INRAE

Amandine Daval
INRAE

Christelle Margoum
INRAE
christelle.margoum@inrae.fr

Vérification du document :

Sophie Lardy-Fontan
LNE
sophie.lardy-fontan@lne.fr

Laurence Almaric
BRGM
l.almaric@brgm.fr

## Les correspondants

OFB : Nicolas Gaury

INRAE : Marina Coquery

Référence du document : Céline Guillemain, Morgane Philippe, Pierre Boutet, Amandine Daval, Christelle Margoum - Etude de la stabilité des étalons analytiques pour la surveillance des milieux aquatiques - Cas des antibiotiques - Rapport AQUAREF 2021 - 48 p.

Droits d'usage : Accès libre

Couverture géographique : International

Niveau géographique : National

Niveau de lecture : Professionnels, experts

Nature de la ressource : Document
<table><tr><td>1. CONTEXTE</td><td>6</td></tr><tr><td>2. BIBLIOGRAPHIE</td><td>7</td></tr><tr><td>3. MATERIELS ET METHODES</td><td>8</td></tr><tr><td>3.1 Molécules</td><td>8</td></tr><tr><td>3.2 Protocole de l'étude de stabilité</td><td>10</td></tr><tr><td>3.2.1 Solvants de préparation des solutions</td><td>10</td></tr><tr><td>3.2.2 Type de flaconnage</td><td>12</td></tr><tr><td>3.2.3 Durée et température de stockage des solutions</td><td>12</td></tr><tr><td>3.3 Méthode d'analyse</td><td>13</td></tr><tr><td>3.4 Traitement des données : évaluation statistique de tendances avec HYPE</td><td>14</td></tr><tr><td>4. RESULTATS ET DISCUSSIONS</td><td>15</td></tr><tr><td>4.1 Fidélité des analyses sur la durée de l'étude</td><td>15</td></tr><tr><td>4.2 Critères d'influence et de stabilité</td><td>17</td></tr><tr><td>4.2.1 Evaluation de l'influence du type de solvant et du type de flaconnage</td><td>18</td></tr><tr><td>4.2.2 Evaluation de la stabilité des solutions mères</td><td>18</td></tr><tr><td>4.2.3 Stabilité des solutions filles et des gammes étalons</td><td>18</td></tr><tr><td>4.3 Influence du solvant pour chaque temps de conservation</td><td>19</td></tr><tr><td>4.4 Influence du flaconnage pour chaque temps de conservation</td><td>20</td></tr><tr><td>4.5 Evaluation de la stabilité dans le temps</td><td>26</td></tr><tr><td>4.5.1 Stabilité des solutions mères</td><td>26</td></tr><tr><td>4.5.2 Stabilité des solutions filles et solutions étalons</td><td>30</td></tr><tr><td>4.5.2.1 Variabilité du Diuron D6</td><td>30</td></tr><tr><td>4.5.2.2 Influence de la congélation des solutions diluées et en mélange</td><td>31</td></tr><tr><td>5. RECAPITULATIF DES CONDITIONS DE STOCKAGE DES ANTIBIOTIQUES</td><td>32</td></tr><tr><td>6. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES</td><td>34</td></tr><tr><td>Annexe 1 : Pureté des produits antibiotiques du fournisseur CIL Cluzeau</td><td>39</td></tr><tr><td>Annexe 2 : Préparation des solutions filles A et C dans l'eau</td><td>40</td></tr><tr><td>Annexe 3 : Préparation des solutions filles B et D dans l'eau</td><td>41</td></tr><tr><td>Annexe 4 : Préparation des gammes d'étalonnage A, B, C et D dans l'eau</td><td>42</td></tr></table>
## Liste des figures :

<table><tr><td>Figure 1 : schéma du l'étude de stabilité</td><td>8</td></tr><tr><td>Figure 2 : Schéma récapitulatif du protocole de l'étude de stabilité</td><td>14</td></tr><tr><td>Figure 3 : Aires moyennes du Diuron D6 (n = 6) obtenues à chaque temps de l'étude et dans chaque condition de stockage testée</td><td>16</td></tr><tr><td>Figure 4 : Ratios d'aires obtenus pour l'enrofloxacine dans les solutions étalons à 10µg/L (n=1) au cours du temps pour chaque type de solvant dans les flacons en PP et dans les flacons en verre</td><td>20</td></tr><tr><td>Figure 5 : Evolution du ratio d'aires de l'ampicilline et de l'ampicilline d5 sur le diuron D6 au cours du temps dans les différents modes de stockage pour la solution étalon à 20 µg/L</td><td>20</td></tr><tr><td>Figure 6 : Gammes d'étalonnages obtenues à T0 pour la danofloxacine dans les différentes conditions de stockage</td><td>21</td></tr><tr><td>Figure 7 : Comparaison des ratios d'aires obtenus entre les flacons en PP et en verre pour l'enrofloxacine et l'enrofloxacine d5 sur le diuron D6 dans la solution étalon à 5µg/L</td><td>22</td></tr><tr><td>Figure 8 : Comparaison des ratios d'aires obtenus pour les flacons en PP et en verre pour la tétracycline sur le diuron D6 dans la solution étalon à 10µg/L dans le méthanol</td><td>23</td></tr><tr><td>Figure 9 : Comparaison des ratios d'aires obtenus pour les flacons en PP et en verre pour la doxycyline dans la solution étalon à 10µg/L dans le méthanol</td><td>24</td></tr><tr><td>Figure 10 : Graphiques de tendance HYPE obtenus pour l'enrofloxacine (A) et la danofloxacine (B) dans les flacons en PP et l'eau dans l'étalon à 20 µg/L (T0 correspondant au 1er point au mois de juin sur le graphique)</td><td>26</td></tr><tr><td>Figure 11 : Graphiques de tendance HYPE obtenus pour l'amoxicilline (A) et l'ampicilline (B) dans les flacons en PP et l'eau dans l'étalon à 20 µg/L (T0 correspondant au 1er point au mois de juin sur le graphique)</td><td>27</td></tr><tr><td>Figure 12 : Graphiques de tendance HYPE obtenus pour la norfloxacine en aire (A) et ratio aire / aire diuron D6 (B) dans les flacons en PP et le méthanol dans l'étalon à 20 µg/L (T0 correspondant au 1er point au mois de juin sur le graphique)</td><td>28</td></tr><tr><td>Figure 13 : Aires moyennes du Diuron D6 obtenues dans chaque condition de stockage pour l'étude de congélation des solutions filles et des gammes étalons</td><td>30</td></tr></table>

## Liste des tableaux :

<table><tr><td>Tableau 1 : Liste des molécules de l'étude de stabilité</td><td>10</td></tr><tr><td>Tableau 2 : Liste des molécules deutérées de l'étude de stabilité</td><td>10</td></tr><tr><td>Tableau 3 : Types de solvant testés par molécules</td><td>11</td></tr><tr><td>Tableau 4 : Nomenclature des solutions préparées en fonction des types de solvant et de flaconnage utilisés</td><td>12</td></tr><tr><td>Tableau 5 : Aires moyennes du traceur d'injection Diuron D6 et coefficients de variation obtenus pour chaque condition testée sur la durée de l'étude</td><td>15</td></tr><tr><td>Tableau 6 : Récapitulatif de l'influence des paramètres testés (solvant et flaconnage) sur chaque antibiotique et paramètre optimal choisi</td><td>25</td></tr><tr><td>Tableau 7 : Récapitulatif des tendances significatives obtenues par antibiotique et par condition de stockage</td><td>29</td></tr><tr><td>Tableau 8 : Coefficients de détermination R² et ratios des pentes des droites d'étalonnage obtenus pour l'étude de congélation des solutions filles et gammes étalons</td><td>33</td></tr><tr><td>Tableau 9 : Tableau récapitulatif des conditions de stockage préconisées par antibiotique en solutions mères et en solutions diluées</td><td>34</td></tr></table>
## RESUME

La plupart des antibiotiques sont considérés comme des contaminants émergents des milieux aquatiques à surveiller en raison de leur persistance dans l'environnement et de leur impact sur le biote et la santé humaine. La disponibilité de méthodes analytiques exactes et sensibles pour détecter et quantifier ces composés est donc cruciale pour répondre à de nombreuses questions environnementales soulevées par leur présence dans l'environnement.

Certains groupes d'antibiotiques comme les pénicillines, les céphaslosporines et les tétracyclines sont connus pour être très instables. Différentes méthodes recommandent de préparer les solutions étalons d'antibiotiques le jour de l'analyse ou de vérifier systématiquement avant utilisation l'état de dégradation des solutions d'antibiotiques.

Durant des développements et validations de nouvelles méthodes analytiques au Laboratoire de chimie des Milieux Aquatiques d'INRAE, des problèmes de stabilité ont été identifiés sur les macrolides, les tétracyclines, les fluoroquinolones, les pénicillines et les céphalosporines dans le mode de conservation habituel du laboratoire.

L'objectif de ce travail est d'étudier la stabilité de 2 pénicillines, 1 macrolide, 1 céphalosporine, 8 fluoroquinolones et 4 tétracyclines pour identifier les conditions optimales de conservation des étalons analytiques. Cette étude a été menée sur un an et la conservation au congélateur des étalons analytiques a été testée dans deux solvants de dissolution des antibiotiques et dans deux types de flaconnage.

Les résultats de cette étude ont permis de définir la durée et les conditions optimales de conservation des étalons analytiques pour assurer une stabilité de chacun des antibiotiques. L'influence du type de flaconnage utilisé pour la conservation au congélateur des solutions s'est avérée plus importante que l'influence du solvant de dissolution des antibiotiques.

HYPE est un outil d'analyse statistique des séries temporelles d'évolution de la qualité des eaux souterraines sous environnement R développé par le BRGM. Cet outil permet de calculer de manière automatique les statistiques de bases pour caractériser des séries temporelles d'évolution des contaminants et d'identifier des tendances et des ruptures des séries chronologiques.

Le traitement statistique des données obtenues dans HYPE a permis d'identifier des tendances significatives à la stabilité ou non des antibiotiques étudiés.

Ce travail nous a également permis de proposer des pistes d'amélioration sur la méthodologie des futures études de stabilité qui seront menées au laboratoire.

## Mots clés :

Etude de stabilité, antibiotiques, étalons analytiques, flaconnage, solvant de dissolution, traitement statistique.
# 1. CONTEXTE

Les antibiotiques sont un groupe de produits pharmaceutiques très préoccupants en raison de leur forte consommation autant humaine que vétérinaire et de leur persistance dans l'environnement. De plus, on soupçonne que l'exposition chronique aux antibiotiques pourrait induire le développement de pathogènes résistants aux antibiotiques, ce qui pourrait être un cas d'alarme en raison de l'impact ultérieur sur le biote et la santé humaine (1). La présence d'antibiotiques dans différents compartiments environnementaux, tels que l'eau, le sol et le biote, a été étudiée au cours des dernières années (1), (2). Les antibiotiques sont des contaminants émergents à surveiller (3). La disponibilité de méthodes analytiques exactes et sensibles pour détecter et quantifier ces composés est cruciale pour répondre à de nombreuses questions environnementales soulevées par leur présence dans l'environnement.

Les pénicillines, les macrolides, les fluoroquinolones, les céphalosporines et les tétracyclines sont connues pour être très instables (4), (5).

Durant le développement et la validation de deux méthodes d'analyse multi-résidus permettant de détecter et quantifier des médicaments à usage humain et des médicaments vétérinaires issus de la liste des contaminants émergents du réseau Norman(3), le Laboratoire de chimie des milieux aquatiques (LAMA) a constaté des problèmes de stabilité de certains antibiotiques tels que les macrolides, les tétracyclines, les fluoroquinolones, les pénicillines et les céphalosporines dans les conditions de stockage et conservation mises en place. En effet, des problèmes de détection des étalons à faible niveau de concentration (sub µg/L) ont été constatés au cours du temps.

La méthode EPA 1694(4) recommande de vérifier avant chaque préparation de solution et analyse, la dégradation potentielle de ces antibiotiques. Afin de s'affranchir de cette vérification systématique, il est nécessaire d'étudier la stabilité de ces molécules pour définir les conditions de conservation des solutions étalons pour s'assurer de la justesse des résultats d'analyse finaux.

Nous avons donc choisi de réaliser une étude de stabilité des étalons analytiques en mélange de 16 antibiotiques : 2 pénicillines, 1 macrolide, 1 céphalosporine, 8 fluoroquinolones et 4 tétracyclines. Des recherches bibliographiques définiront les critères de préparation et stockage des solutions étalons qui influencent la stabilité des antibiotiques. Les résultats de cette étude permettront de définir pour chaque antibiotique testé les conditions de conservation optimales (flaconnage, solvant, durée de conservation) pour assurer leur stabilité.
## 2. BIBLIOGRAPHIE

La stabilité d'une molécule organique en solution peut être influencée par de nombreux facteurs comme le solvant de dissolution, la température, la durée de conservation, le type de flaconnage utilisé pour le stockage, le pH ...
Malheureusement, il existe très peu de bibliographie sur des études de stabilité prenant en compte toutes les familles d'antibiotiques en solution. De plus, la plupart des méthodes préconisent un suivi de la stabilité des antibiotiques avant analyses à chaque utilisation(4) et de refaire les solutions très régulièrement voire à chaque jour d'analyse.

Concernant les solvants de dissolution utilisés pour les composés sélectionnés dans ce travail, ils peuvent être très différents selon les études. Pour les pénicillines et les céphalosporines, les solvants utilisés sont l'eau(6), un mélange eau/méthanol (50/50, v/v) (12) et le méthanol (13). Pour les quinolones et fluoroquinolones, les solvants utilisés sont la soude(6), différents mélanges de méthanol et de soude : méthanol + 0,1% NaOH 1M (11), 0,04M NaOH dans méthanol (12) et le méthanol (13). Pour les macrolides, les solvants utilisés sont l'eau, un tampon phosphate (8) et le méthanol (12),(13). Pour les tétracyclines, le méthanol est utilisé dans la plupart des méthodes analytiques pour la dissolution, l'extraction et l'élution ; et il est aussi utilisé dans la formulation de plusieurs médicaments contenant des tétracyclines(6),(9),(12),(13).

Concernant le flaconnage seulement 2 types ont été testés dans la littérature : le verre (10) et le polypropylène(6),(9),(12),(13), ambrés et transparents. Toutefois une attention particulière est portée à l'exposition à la lumière notamment pour les fluoroquinolones qui peuvent être photodégradées en quelques minutes (11).

Les différentes températures de stockage étudiées sont la température ambiante (9), 4°C (7),(10),(11), -20°C (6),(7),(9),(10),(12) et -76°C (7),(12). Gaugain et al (12) ont montré dans leur étude qu'il n'y avait pas de différence entre une conservation à -20°C et -76°C sur la stabilité des antibiotiques étudiés.
Dans toutes les études, un aliquotage des solutions a été réalisé pour limiter les variations de température apportées par la décongélation/re-congélation des solutions préparées. Les durées de conservation testées vont jusqu'à maximum un an.

Concernant le pH, il n'a été testé que par Soeberg et al (10) dans leur étude sur la dégradation de la chlortétracycline. Nous avons donc choisi de ne pas tester ce paramètre dans notre étude.

Pour notre étude de stabilité des antibiotiques en solution, dont le protocole général est présenté en Figure 1, nous avons donc choisi de tester sur une durée d'un an avec une approche chronologique (14), les paramètres suivants :

- 2 types de solvants,

- 2 types de flaconnage,

- Conservation au congélateur à -20°C après aliquotage des solutions.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 1 : schéma du l'étude de stabilité</figcaption></figure>

# 3. MATERIELS ET METHODES

## 3.1 MOLECULES

Les 16 molécules choisies pour cette étude de stabilité (Tableau 1) sont les antibiotiques qui présentaient des problèmes de stabilité lors des développements et validations des méthodes antérieures.

Les molécules deutérées (Tableau 2) sont d'habitude utilisées comme des traceurs d'extraction ou d'injection. Pour cette étude de stabilité, nous avons décidé de les ajouter à l'étude et de leur appliquer le même protocole que pour leurs analogues non deutérés. Nous pourrons ainsi confirmer ou infirmer les résultats de stabilité obtenus et vérifier que leur comportement est identique à celui des analogues non deutérés.

Le diuron D6 a également était ajouté à une concentration connue et identique dans tous les flacons d'analyse sur toute la durée de cette étude. Le diuron D6 est un composé très stable que le laboratoire utilise en traceur d'injection. Il permet donc de mettre en évidence la potentielle variabilité du système analytique.
<table><caption>Tableau 1 : Liste des molécules de l'étude de stabilité</caption><thead><tr><td>Antibiotique</td><td>Abréviation</td><td>Groupe chimique</td><td>N° CAS</td><td>Formule</td><td>Masse (Da)</td><td>Réglementation / liste de surveillance</td></tr></thead><tbody><tr><td>Amoxicilline</td><td>AMX</td><td>Penicilline</td><td>26787-78-0</td><td>C16H19N3O5S</td><td>365,1</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>APC</td><td>Penicilline</td><td>69-53-4</td><td>C16H19N3O4S</td><td>349,1</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Azithromycine</td><td>AZI</td><td>Macrolide</td><td>117772-700</td><td>C38H72N2O12</td><td>748,5</td><td>2008/105/DCE</td></tr><tr><td>Ceftiofur</td><td>CTF</td><td>Cephalosporine</td><td>80370-57-6</td><td>C19H17N5O7S3</td><td>523,0</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Chlortetracycline</td><td>CTC</td><td>Tetracycline</td><td>57-62-5</td><td>C22H23ClN2O8</td><td>478,1</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine</td><td>CIPRO</td><td>Fluoroquinolone</td><td>85721-33-1</td><td>C17H18FN3O3</td><td>331,4</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>DFX</td><td>Fluoroquinolone</td><td>112398-08-0</td><td>C19H20FN3O3</td><td>357,2</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>DXC</td><td>Tetracycline</td><td>564-25-0</td><td>C22H24N2O8</td><td>444,2</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>EFX</td><td>Fluoroquinolone</td><td>93106-60-6</td><td>C19H22FN3O3</td><td>359,2</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>MBF</td><td>Fluoroquinolone</td><td>115550-35-1</td><td>C17H19FN4O4</td><td>362,1</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>NORFLO</td><td>Fluoroquinolone</td><td>70458-96-7</td><td>C16H18FN3O3</td><td>319,1</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>OFLO</td><td>Fluoroquinolone</td><td>82419-36-1</td><td>C18H20FN3O4</td><td>361,1</td><td>2008/105/DCE</td></tr><tr><td>Oxytetracycline</td><td>OTC</td><td>Tetracycline</td><td>79-57-2</td><td>C22H24N2O9</td><td>460,2</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>PFX</td><td>Fluoroquinolone</td><td>70458-92-3</td><td>C17H20FN3O3</td><td>333,2</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>SFX</td><td>Fluoroquinolone</td><td>110871-86-8</td><td>C19H22F2N4O3</td><td>392,2</td><td>Emergents Norman</td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>TTC</td><td>Tetracycline</td><td>60-54-8</td><td>C22H24N2O8</td><td>444,2</td><td>Emergents Norman</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 2 : Liste des molécules deutérées de l'étude de stabilité</caption><thead><tr><td>Molécule</td><td>Abréviation</td><td>N° CAS</td><td>Formule</td><td>Masse (Da)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Amoxicilline d4</td><td>AMX d4</td><td>26787-78-0</td><td>C16H15D4N3O5S</td><td>369,1</td></tr><tr><td>Ampicilline d5</td><td>APC d5</td><td>69-53-4</td><td>C16H14D5N3O4S</td><td>354,1</td></tr><tr><td>Ceftiofur d3</td><td>CTF d3</td><td>80370-57-6</td><td>C19H14D3N5O7S3</td><td>526,0</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>CIPRO d8</td><td>85721-33-1</td><td>C17H10D8FN3O3</td><td>339,4</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>DFX d3</td><td>112398-08-0</td><td>C19H17D3FN3O3</td><td>360,2</td></tr><tr><td>Doxycycline d3</td><td>DXC d3</td><td>564-25-0</td><td>C22H21D3N2O8</td><td>447,2</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>EFX d5</td><td>93106-60-6</td><td>C19H17D5FN3O3</td><td>364,2</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>NORFLO d5</td><td>70458-96-7</td><td>C16H13D5FN3O3</td><td>324,1</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>OFLO d3</td><td>82419-36-1</td><td>C18H17D3FN3O4</td><td>364,1</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>PFX d3</td><td>70458-92-3</td><td>C17H17D3FN3O3</td><td>336,2</td></tr></tbody></table>

## 3.2 PROTOCOLE DE L'ETUDE DE STABILITE

L'étude bibliographique réalisée pour cette étude de stabilité a montré que différents facteurs pouvaient influencer la stabilité des antibiotiques sélectionnés. Ces facteurs sont le solvant de préparation des solutions, le flaconnage utilisé pour le stockage de ces solutions ainsi que la durée et la température de stockage.

### 3.2.1 Solvants de préparation des solutions

Les solutions mères ont été préparées à partir de produit pur de chacun des composés fournis par CIL Cluzeau (Sainte Foy la Grande, France) ayant une pureté connue comprise entre 89.7 % et 99.9% (Annexe 1 : Pureté des produits antibiotiques du fournisseur CIL Cluzeau). Chaque composé a été pesé
précisément et dissous avec 25 mL de solvant pour obtenir des solutions à environ exactement 200 mg/L.

Les solvants (Biosolve, Dieuze, France) testés sont le méthanol (MeOH), l'eau, l'acétonitrile (ACN) et du méthanol avec addition de 0,1 % de soude à 1 M (MeOH + 0,1 % NaOH 1 M). Dans le Tableau 3 sont présentés les deux solvants (les plus cités lors de la recherche bibliographique et les plus faciles à mettre en œuvre au laboratoire) testés par molécules. Pour les molécules de la famille des tétracyclines, seul le méthanol a été testé (cf. 1) car la recherche bibliographique n'a pas montré que d'autres solvants étaient utilisés. Pour l'azithromycine, l'acétonitrile (même si ce solvant n'a pas été identifié dans la bibliographie) a été testé pour comparer les pratiques initiales du laboratoire et les informations trouvées dans la littérature.

<table><caption>Tableau 3 : Types de solvant testés par molécules</caption><thead><tr><th>Molécule</th><th>Solvant 1</th><th>Solvant 2</th></tr></thead><tbody><tr><td>Amoxicilline</td><td>MeOH</td><td>Eau</td></tr><tr><td>Amoxicilline d4</td><td>MeOH</td><td>Eau</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>MeOH</td><td>Eau</td></tr><tr><td>Ampicilline d5</td><td>MeOH</td><td>Eau</td></tr><tr><td>Azithromycine</td><td>MeOH</td><td>ACN</td></tr><tr><td>Ceftiofur</td><td>MeOH</td><td>Eau</td></tr><tr><td>Ceftiofur d3</td><td>MeOH</td><td>Eau</td></tr><tr><td>Chlortetracycline</td><td></td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td></td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Doxycycline d3</td><td></td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Oxytetracycline</td><td></td><td>MeOH</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>MeOH</td><td>MeOH + 0,1% NaOH 1M</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td></td><td>MeOH</td></tr></tbody></table>

Les solutions filles préparées à partir d'un mélange de toutes les solutions mères sont réalisées dans l'eau MilliQ LC-Pak (Merck Millipore) et à une concentration de 500 µg/L. La solution fille est ensuite diluée dans l'eau MilliQ LC-Pak pour préparer la gamme étalon par dilutions successives (voir annexes 2, 3 et 4).
L'eau MilliQ LC-Pak a été utilisée comme solvant de préparation des gammes étalons pour rester conforme aux méthodes analytiques validées avec lesquelles ces antibiotiques sont analysés.

### 3.2.2 Type de flaconnage

Les solutions mères préparées dans les deux types de solvants ont ensuite été aliquotées (environ 300 µL) dans deux types de flaconnages (flacons) différents : flacons en verre ambré TruView LCMS Waters et flacons en polypropylène (PP) QuanRecovery Waters.

Les gammes étalons préparées ensuite à partir de ces solutions mères sont stockées dans les mêmes types de flaconnages. La nomenclature choisie au laboratoire est présentée dans le Tableau 4.

<table><caption>Tableau 4 : Nomenclature des solutions préparées en fonction des types de solvant et de flaconnage utilisés</caption><thead><tr><td>Nomenclature</td><td>Flaconnage</td><td>Solvant</td></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>Verre</td><td>1</td></tr><tr><td>B</td><td>Verre</td><td>2</td></tr><tr><td>C</td><td>PP</td><td>1</td></tr><tr><td>D</td><td>PP</td><td>2</td></tr></tbody></table>

Pour la mise en flacon des étalons et des blancs solvants avant analyse, le Diuron D6 a été ajouté en tant que traceur d'injection et elle est réalisée comme suit en fonction du volume des flacons :

- Blanc solvant dans flacons en verre : 50 µL de solution de Diuron D6 à 20 µg/L + 950 µL d'eau MilliQ LC-Pak

- Etalons dans flacons en verre : 25 µL de solution de Diuron D6 à 20 µg/L + 475 µL d'étalon

- Etalons dans flacons en PP : 12,5 µL de solution de Diuron D6 à 20 µg/L + 237,5 µL d'étalon

### 3.2.3 Durée et température de stockage des solutions

Cette étude de stabilité a été menée sur 12 mois avec différents temps de préparation de solutions filles et de gammes étalons et d'analyse : T0, T1j, T4j, T7j, T14j, T28j (1 mois), T60j (2 mois), T91j (3 mois), T119j (4 mois), T152j (5 mois), T182j (6 mois), T275j (9 mois) et T367j (12 mois).

Durant cette période, les solutions mères aliquotées précédemment dans les différents solvants et flaconnages sont conservées au congélateur à -20°C. Au temps de prélèvement, les aliquotes de chacune des solutions mères sont décongelées. Les 4 solutions filles (1 par type de solvant et par type de flaconnage) sont préparées et diluées pour réaliser les gammes étalons A, B, C et D.

De plus, pour tester la congélation des solutions diluées pendant une semaine, les 4 solutions filles et les 4 gammes étalons préparées à T0 et T7j ont été
conservées à -20°C. A T0+7j et T7j+7j, les 4 gammes d'étalonnage ont été décongelées pour analyse et les 4 solutions filles ont été décongelées puis diluées pour préparation des 4 gammes d'étalonnage correspondantes.

Toutes les gammes d'étalonnage préparées aux différents temps sont conservées à 4°C sur le passeur d'échantillon pendant la séquence d'analyse. Pour chaque temps de prélèvement, les durées de chacune des étapes (temps de décongélation, temps de préparation des solutions filles, temps passé sur le passeur avant analyse) ont été maitrisées. Cette durée totale de manipulation/analyse est de 20h donc seule la durée de conservation peut influencer sur la stabilité des antibiotiques. Aucun réplicat n'a été réalisé lors de cette étude pour ne pas dépasser cette durée de 20h de manipulation/analyse.

La Figure 2 ci-après présente un schéma récapitulatif du protocole de l'étude.

## 3.3 METHODE D'ANALYSE

Le dosage des différentes molécules a été réalisé par chromatographie liquide ultra haute performance (UHPLC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (UHPLC Acquity - Spectromètre de masse Xevo TQ-XS Waters).

La séparation se fait sur colonne HSS T3 Waters (2,1 mm * 100 mm, 1,8 µm) à une température de 30°C. Le volume d'injection est de 10 µL. Le débit de la phase mobile est de 0,5 mL/min avec un gradient eau et acétonitrile acidifiés à 0,1 % avec de l'acide formique. La séparation dure 23 min. La source d'ionisation utilisée est l'électrospray UniSpray avec acquisition en ionisation positive.

Afin de s'assurer que les analyses se déroulent bien en terme de sensibilité, de répétabilité et de reproductibilité, un traceur deutéré d'injection le diuron D6 est ajouté lors de la mise en flacons des solutions étalons et des blancs solvants. Même si le diuron D6 n'est pas représentatif des familles d'antibiotiques ciblées dans cette étude, nous avons choisi de l'utiliser car nous savons qu'il est stable sur la durée de cette étude de stabilité. Ce traceur est à la même concentration dans tous les flacons. Un coefficient de variation des réponses de ce traceur peut donc être calculé afin d'évaluer la variabilité des injections. Des blancs solvants sont injectés régulièrement afin de s'assurer de l'absence de contamination.
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 2 : Schéma récapitulatif du protocole de l'étude de stabilité</figcaption></figure>

## 3.4 TRAITEMENT DES DONNEES : EVALUATION STATISTIQUE DE TENDANCES AVEC HYPE

Afin d'identifier si les antibiotiques sont stables ou non en solution sur la durée de l'étude, nous avons choisi d'utiliser HYPE(15).

HYPE est un outil d'analyse statistique des séries temporelles d'évolution de la qualité des eaux souterraines sous environnement R développé par le BRGM. Cet
outil permet de calculer de manière automatique les statistiques de bases pour caractériser des séries temporelles d'évolution des contaminants et d'identifier et modéliser des tendances et des ruptures des séries chronologiques.

Le module « Caractérisation » de HYPE permet de calculer les statistiques de base de séries temporelles de données en préalable à d'autres tests statistiques. Ainsi, la moyenne, l'écart-type, la médiane, la fréquence de quantification, la normalité de distribution des données et l'autocorrélation des données sont calculées. Deux fichiers de sortie sont générés un fichier .txt et un fichier .pdf regroupant respectivement toutes les données caractéristiques des séries temporelles et leurs représentations graphiques.

Le module « Tendances » de HYPE permet d'identifier si les séries temporelles d'évolution des contaminants présentent ou pas des tendances à la baisse ou à la hausse par différents tests statistiques comme le test de tendance non paramétrique de Mann-Kendall et le test de tendance paramétrique de régression linéaire. Un test de rupture (test de Pettitt ou de Buishand en fonction de la distribution des données) est également appliqué afin d'identifier un possible changement de moyenne et/ou une inversion de tendance dans les séries temporelles d'évolution des contaminants. Deux fichiers de sortie sont générés un fichier .txt présentant les tests effectués, leur significativité et leurs résultats et un fichier .pdf avec les représentations graphiques des tendances et ruptures identifiées.

# 4. RESULTATS ET DISCUSSIONS

## 4.1 FIDELITE DES ANALYSES SUR LA DUREE DE L'ETUDE

A chaque temps de prélèvement, après la préparation des solutions étalons et lors de la mise en flacons, le diuron D6 a été ajouté à tous les flacons analysés, à la même concentration de 1 µg/L. Une aire moyenne pour chaque condition testée peut donc être calculée ainsi qu'un coefficient de variation pour déterminer la répétabilité analytique de cette étude.

Dans le Tableau 5, on constate que les coefficients de variation obtenus sont du même ordre de grandeur (environ 25%) quelles que soient les conditions de stockage testées pour toute la durée de cette étude.

<table><caption>Tableau 5 : Aires moyennes du traceur d'injection Diuron D6 et coefficients de variation obtenus pour chaque condition testée sur la durée de l'étude</caption><thead><tr><td>Flaconnage</td><td>Solvant</td><td>Aire moyenne DiuD6</td><td>Ecart Type</td><td>%CV n=78</td></tr></thead><tbody><tr><td>verre</td><td>1</td><td>582666</td><td>144990</td><td>25</td></tr><tr><td>verre</td><td>2</td><td>583415</td><td>144337</td><td>25</td></tr><tr><td>PP</td><td>1</td><td>548857</td><td>118843</td><td>22</td></tr><tr><td>PP</td><td>2</td><td>548511</td><td>137810</td><td>25</td></tr></tbody></table>
Sur la Figure 3, on constate que les aires moyennes obtenues aux temps T7j, T14j et T3 mois (91j) ne sont pas comprises dans la fenêtre ± 25% car elles sont inférieures aux autres aires moyennes pour les 4 conditions de stockage testées. Les aires moyennes obtenues à T367j ne sont pas comprises dans la fenêtre ± 25% car elles sont supérieures.

Dans les flacons en PP et quel que soit le solvant utilisé, les aires moyennes obtenues à T4j ne sont pas comprises dans la fenêtre ± 25% car elles sont supérieures. Dans les flacons en verre et quel que soit le solvant utilisé, les aires moyennes obtenues à T4 mois (119j) ne sont pas comprises dans la fenêtre ± 25% car elles sont supérieures.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 3 : Aires moyennes du Diuron D6 (n = 6) obtenues à chaque temps de l'étude et dans chaque condition de stockage testée</figcaption></figure>

Le Diuron D6 est donc représentatif de la variabilité de la sensibilité analytique aux différents temps d'analyse. Pour s'affranchir de cette variabilité de la sensibilité de l'équipement dans le temps, nous avons choisi de normaliser les
aires obtenues pour les antibiotiques par l'aire du diuron D6. Tous les résultats présentés dans la suite du rapport seront donc corrigés par le Diuron D6 (Aire de l'antibiotique / Aire du Diuron D6).

## 4.2 CRITERES D'INFLUENCE ET DE STABILITE

A chaque temps de cette étude de stabilité et pour chaque antibiotique, une gamme d'étalonnage est réalisée dans deux types de solvants et dans deux types de flaconnage. Pour chaque condition (couple solvant/flaconnage) les ratios des aires de l'antibiotique sur l'aire du Diuron D6 sont calculés pour tous les étalons et des régressions linéaires sont tracées. La comparaison des ratios d'aires des étalons et des gammes d'étalonnage (solutions mères diluées dans l'eau) obtenus à chaque temps permettront de définir si les solutions mères sont stables ou non.
### 4.2.1 Evaluation de l'influence du type de solvant et du type de flaconnage

Afin d'identifier si le type de solvant ou le type de flaconnage utilisé à une influence sur la conservation des antibiotiques, les coefficients de détermination ($R^2$) des régressions linéaires tracées pour chaque antibiotique dans chaque condition de stockage sont comparés.

Si le $R^2$ obtenu est inférieur à 0,99 alors nous considérons qu'il y a une perte de linéarité et donc une influence du paramètre testé. De plus, si les étalons de faible niveau de concentration ne sont pas ou plus détectés au cours du temps alors nous considérons qu'il y a une influence du paramètre testé. Enfin, si les ratios d'aire des antibiotiques sur l'aire du Diuron D6 au même temps et entre 2 facteurs (solvant 1 ou 2, flacon verre ou PP) testés présentent une différence supérieure à 30% alors nous considérons qu'il y a une influence du paramètre (solvant ou flacon) testé. Cette valeur très large de 30% a volontairement été choisie pour s'assurer que l'influence du facteur soit significative par rapport à la variabilité analytique.

### 4.2.2 Evaluation de la stabilité des solutions mères

Le logiciel HYPE caractérise et identifie des tendances d'évolution de contaminants sur des séries temporelles. Une série temporelle correspond aux valeurs des ratios d'Aire de l'antibiotique / Aire du Diuron D6 obtenus tout au long de l'étude pour un type de solvant dans un type de flaconnage et pour une concentration d'étalon.

Le Diuron D6 a également été inclus afin d'identifier s'il y avait une évolution de son aire au cours du temps.

Ainsi 648 séries temporelles (27 composés x 6 étalons x 4 conditions de stockage) ont été caractérisées et testées avec HYPE. Les deux tests de tendance (Mann-Kendall et régression linéaire) ont été appliqués. Pour certaines séries temporelles, le test de Mann Kendall n'a pas permis de modéliser de tendances temporelles par manque de données. Nous avons donc choisi de ne traiter que les données issues du test de régression linéaire pour l'étude de l'évaluation de la stabilité des solutions mères.

L'identification ou non de tendances significatives pour un composé dans un mode de stockage (couple solvant/flaconnage) a été validée seulement si les 6 niveaux de concentration des étalons présentaient une tendance identique.

Concernant l'identification de dates de rupture ou d'inversion des tendances, nous avons choisi de garder la date immédiatement avant la rupture indiquée pour les séries temporelles d'un même antibiotique dans un mode de stockage.

### 4.2.3 Stabilité des solutions filles et des gammes étalons

La stabilité des solutions filles et des gammes d'étalonnage suite à une congélation de 7 jours a été évaluée uniquement sur la condition de stockage (type de solvant et type de flaconnage) optimale identifiée. Les 2 gammes étalons (une gamme étalon obtenue à partir de la solution fille congelée 7 jours et une gamme étalon congelée 7 jours et décongelée pour analyse) obtenues ont été comparées à la gamme étalon non congelée. Les coefficients de détermination ($R^2$) des différentes droites d'étalonnage ont été calculés et
comparés pour identifier si la congélation apporte une perte de linéarité ($R^2$ < 0,99).

Les pentes des droites obtenues ont également été comparées, un ratio des pentes a été calculé entre les gammes étalons congelées et celle non congelée. Ce ratio doit être compris entre 0,90 et 1,10 pour que les solutions congelées soient considérées comme stables à la congélation. Cette valeur de 10% a été choisie en fonction de la variabilité analytique observée sur le diuron D6.

De plus, si les étalons de faible niveau de concentration ne sont pas détectés dans les gammes étalons congelées alors nous considérons que la congélation n'est pas possible pour la conservation des solutions diluées.

## 4.3 INFLUENCE DU SOLVANT POUR CHAQUE TEMPS DE CONSERVATION

Pour tous les antibiotiques, aucune influence du solvant n'est constatée sur la linéarité. En effet, les $R^2$ obtenus sont tous du même ordre de grandeur pour les 2 solvants dans chaque type de flaconnage.

Pour les fluoroquinolones : il n'y a pas d'influence du solvant dans les deux types de flaconnage testés. Sur la Figure 4 sont présentés les ratios d'aires de l'enrofloxacine sur l'aire du diuron D6 obtenus à chaque temps de l'étude. On constate que quel que soit le type de flaconnage PP ou verre, les ratios entre les deux solvants sont du même ordre de grandeur et présentent des différences inférieures à 30%.

Par contre dans les flacons en verre, on constate pour les solutions étalons de faibles niveaux de concentration une perte plus précoce et plus importante pour le solvant 2 (MeOH + 0.1% NaOH 1M). En effet, la perte de détection dans ce solvant pour les fluoroquinolones débute à T14j et peut aller jusqu'à 3 solutions étalons non détectés (jusqu'à 2µg/L) à T4 mois (119j) alors que dans le méthanol (solvant 1) la perte de détection ne dépasse pas 1µg/L. Ces pertes de détection des étalons de faibles niveaux de concentration ne sont pas dues à la baisse de sensibilité du diuron D6 constatées aux temps de prélèvement T7j et T14j (Figure 3). En effet, ces étalons ne sont plus détectés sur toute la durée restante de l'étude de stabilité alors que la sensibilité du diuron D6 revient à T28j.

<figure><img src="image_7.png" /></figure>
Figure 4 : Ratios d'aires obtenus pour l'enrofloxacine dans les solutions étalons à 10µg/L (n=1) au cours du temps pour chaque type de solvant dans les flacons en PP et dans les flacons en verre.

Pour les 2 pénicillines, on ne constate pas d'influence du solvant dans les flacons en PP. Par contre dans le verre on constate une perte significative dans le méthanol (exemple de l'ampicilline et l'ampicilline D5 sur la Figure 5). Pour l'ampicilline D5, cette perte n'est pas significative mais bien présente en comparaison des 3 autres conditions.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 5 : Evolution du ratio d'aires de l'ampicilline et de l'ampicilline d5 sur le diuron D6 au cours du temps dans les différents modes de stockage pour la solution étalon à 20 µg/L</figcaption></figure>

Pour la céphalosporine et son homologue deutéré et pour le macrolide, aucune influence du solvant n'a été constatée. Pour les tétracyclines, seul le méthanol ayant été testé, l'évolution des ratios d'aires est traitée dans le paragraphe 4.5.

## 4.4 INFLUENCE DU FLACONNAGE POUR CHAQUE TEMPS DE CONSERVATION

Pour les fluoroquinolones, une forte influence du flaconnage a été constatée. En effet, comme le montre la Figure 6, dans les flacons en PP, les gammes d'étalonnage obtenues sont linéaires avec des R² > 0,99 alors que dans les flacons en verre les gammes d'étalonnage ne sont pas linéaires même à T0 (jour de préparation de l'ensemble des solutions étalons).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 6 : Gammes d'étalonnages obtenues à T0 pour la danofloxacine dans les différentes conditions de stockage</figcaption></figure>

De plus, dans les flacons en PP, les ratios d'aires obtenus sont beaucoup plus importants (les différences observées sont supérieures à 30%) comme le montre la Figure 7 et aucune perte de détection des solutions étalons de faible niveau de concentration n'est constatée contrairement à celles constatées dans les flacons en verre.
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 7 : Comparaison des ratios d'aires obtenus entre les flacons en PP et en verre pour l'enrofloxacine et l'enrofloxacine d5 sur le diuron D6 dans la solution étalon à 5µg/L</figcaption></figure>

Pour les pénicillines, il n'y a pas d'influence du flaconnage sauf pour les solutions conservées dans le méthanol pour lesquelles une tendance à la baisse est constatée dans les flacons en verre (voir paragraphe 4.3).

Pour la céphalosporine et son homologue deutéré, aucune influence du
flaconnage n'est constatée.

Par contre, pour le macrolide, une influence du flaconnage est observée avec des ratios d'aires obtenus plus importants en vial PP. Toutefois, pour l'azithromycine, nous n'avons jamais constaté de linéarité car toutes les droites d'étalonnage obtenues présentaient des R² < 0,99 quels que soient les conditions de stockage. Nous considérons donc que l'azithromycine n'est stable dans aucune des conditions testées lors de cette étude. Des essais complémentaires avec d'autres solvants ou une mise à pH spécifique doivent être réalisés pour conclure sur la stabilité de cet antibiotique.

Pour les tétracyclines, deux cas différents en fonction des composés sont constatés :

- pour la tétracycline et l'oxytétracycline, il n'y pas d'influence du flaconnage (différences observées inférieures à 30%) en tous cas pour les temps de l'étude jusqu'à 4 mois (T119j) comme le montre la Figure 8.

- Pour la doxycycline et la chlortétracycline, l'influence du flaconnage est plus marquée car les différences observées sont supérieures à 35% même sur les temps de début de l'étude de stabilité comme le montre la Figure 9.
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 8 : Comparaison des ratios d'aires obtenus pour les flacons en PP et en verre pour la tétracycline sur le diuron D6 dans la solution étalon à 10µg/L dans le méthanol</figcaption></figure>
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 9 : Comparaison des ratios d'aires obtenus pour les flacons en PP et en verre pour la doxycyline dans la solution étalon à 10µg/L dans le méthanol</figcaption></figure>

Concernant l'influence du flaconnage sur la linéarité, les mêmes résultats ont été obtenus en traçant les droites d'étalonnage avec les aires des antibiotiques sans correction du diuron D6.

Le Tableau 6 présente un récapitulatif des résultats obtenus pour chaque antibiotique lors de l'étude de l'influence des paramètres testés. En fonction de ces résultats et lorsque cela était possible, nous avons choisi un paramètre optimal pour la conservation des solutions mères d'antibiotiques. Pour les pénicillines et la céphalosporine, le choix du flaconnage et du solvant seront faits en fonction des résultats de l'étude de l'évolution de la stabilité dans HYPE au paragraphe suivant.
<table><caption>Tableau 6 : Récapitulatif de l'influence des paramètres testés (solvant et flaconnage) sur chaque antibiotique et paramètre optimal choisi.</caption><thead><tr><th>Groupe chimique</th><th>Antibiotique</th><th>Influence du solvant</th><th>Influence du flaconnage</th><th>Choix solvant optimal</th><th>Choix flaconnage optimal</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Pénicillines</td><td>Amoxicilline</td><td>oui</td><td>non</td><td>eau</td><td>à définir</td></tr><tr><td>Amoxicilline d4</td><td>oui</td><td>non</td><td>eau</td><td>à définir</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>oui</td><td>non</td><td>eau</td><td>à définir</td></tr><tr><td>Ampicilline d5</td><td>oui</td><td>non</td><td>eau</td><td>à définir</td></tr><tr><td rowspan="16">Fluoroquinolones</td><td>Ciprofloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>oui</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td rowspan="2">Céphalosporine</td><td>Ceftiofur</td><td>non</td><td>non</td><td>à définir</td><td>à définir</td></tr><tr><td>Ceftiofur d3</td><td>non</td><td>non</td><td>à définir</td><td>à définir</td></tr><tr><td rowspan="5">Tétracyclines</td><td>Chlortétracycline</td><td>N/A</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>N/A</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Doxycycline d3</td><td>N/A</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Oxytétracycline</td><td>N/A</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>N/A</td><td>oui</td><td>MeOH</td><td>PP</td></tr><tr><td>Macrolide</td><td>Azithromycine</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>
## 4.5 EVALUATION DE LA STABILITE DANS LE TEMPS

Pour cette étude, la stabilité des solutions mères ne sera évalué que dans les conditions optimales de flaconnage et de solvant identifiées dans le Tableau 6. Pour les conditions restant à définir, tous les paramètres seront étudiés.

### 4.5.1 Stabilité des solutions mères

Pour évaluer la stabilité des antibiotiques, nous avons choisi d'utiliser le logiciel HYPE(15) qui permet d'identifier des tendances significatives sur des séries temporelles de contaminants. Sur les deux tests de tendance (Mann-Kendall et régression linéaire) appliqués, nous avons choisi de ne traiter que les données issues du test de régression linéaire (voir paragraphe 4.2.2).

Si aucune tendance significative n'est identifiée alors le composé est stable dans le mode de stockage évalué (couple solvant/flaconnage) et pour la durée de conservation considérée. Si une tendance significative est identifiée, il faut que cette tendance soit significative pour tous les niveaux de concentration des étalons pour être considérée.

Pour les fluoroquinolones et leurs analogues deutérés dans les flacons en PP et le solvant MeOH, aucune tendance n'a été identifiée par contre, des dates de rupture de 4j (enrofloxacine, marbofloxacine, ofloxacine) à 4 mois (ciprofloxacine, danofloxacine, pefloxacine) ont été identifiées comme le montrent la Figure 10 et le Tableau 7. Pour la norfloxacine et la sparfloxacine, aucune date de rupture n'a été identifiée. Malgré le fait qu'aucune tendance ne soit significative pour toutes les fluoroquinolones, on constate une forte augmentation du ratio d'aire de l'antibiotique sur l'aire du Diuron D6 entre T0 et T7j (Figure 10). Cette augmentation est suivie d'une chute du ratio jusqu'à T4 mois (septembre 2020) puis d'une remontée à T5 mois avec un équilibre jusqu'à T1 an.

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 10 : Graphiques de tendance HYPE obtenus pour l'enrofloxacine (A) et la danofloxacine (B) dans les flacons en PP et l'eau dans l'étalon à 20 µg/L (T0 correspondant au 1er point au mois de juin sur le graphique)</figcaption></figure>
Au regard de cette forte augmentation du ratio des aires des antibiotiques sur l'aire du diuron D6, nous avons décidé de ne pas prendre en considération les dates de rupture jusqu'à T7j. De plus, nous avons décidé de prendre comme durée de conservation maximale de la solution, la date de prélèvement immédiatement avant la date de rupture identifiée et d'utiliser la même durée de conservation pour tous les composés d'un même groupe chimique. Par exemple, pour les fluoroquinolones, la durée de conservation maximale préconisée est de 3 mois car des dates de rupture à T4 mois ont été identifiées et que les dates de rupture à T4j ne sont pas prises en compte (Tableau 9).

Pour les pénicillines dans le solvant eau, aucune tendance significative n'a été identifiée quel que soit le flaconnage (verre ou PP). Comme le montre la Figure 11, pour l'amoxicilline (A) et son deutéré, aucune date de rupture n'a été identifié contrairement à l'ampicilline (B) et son deutéré pour lesquels une date de rupture à T4j a été identifiée (voir Tableau 7). Comme pour les fluoroquinolones, une forte augmentation du ratio d'aire des antibiotiques sur l'aire du diuron D6 est constaté entre T0 et T7j.

Pour les pénicillines dans le solvant eau, l'étude des tendances HYPE ne permet pas d'identifier un flaconnage optimal pour la conservation de ces composés en solutions mères. La durée de conservation maximale des solutions mères des pénicillines est de 1 an (Tableau 9).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 11 : Graphiques de tendance HYPE obtenus pour l'amoxicilline (A) et l'ampicilline (B) dans les flacons en PP et l'eau dans l'étalon à 20 µg/L (T0 correspondant au 1er point au mois de juin sur le graphique)</figcaption></figure>

Pour la céphalosporine, le flaconnage et le solvant optimaux restaient à définir. Pour le ceftiofur et son analogue deutéré, aucune tendance significative n'a été identifiée dans HYPE. Un flaconnage optimal ne peut donc toujours pas être défini. Concernant le solvant, une date de rupture à T4 mois est identifiée dans le MeOH pour le flacon PP (voir Tableau 7). Nous préconisons donc l'utilisation de l'eau comme solvant optimal. La durée maximale de conservation en solution mère du ceftiofur et de son analogue deutéré dans le solvant eau est de 1 an (Tableau 9).
Comme pour les fluoroquinolones et les pénicillines, une forte augmentation du ratio d'aire des antibiotiques sur l'aire du diuron D6 est constaté entre T0 et T7j.

Pour les tétracyclines et leurs analogues deutérés dans les flacons PP et le MeOH, aucune tendance significative n'a été identifiée. Des dates de rupture de 14j à 5 mois ont été identifiées (voir Tableau 7). Les tests HYPE ont permis d'identifier des dates de rupture différentes entre les mélanges en solvants 1 (uniquement MeOH) et 2 (mélange MeOH, Eau, ACN et MeOH+NaOH). Les dates de rupture les plus faibles sont observées avec les mélanges en solvant 2. Le solvant préconisé est donc le MeOH sans mélange avec d'autres solvants qui semblent avoir un impact même à faible proportion. La durée maximale de conservation est de 3 mois (Tableau 9).

Comme pour les fluoroquinolones, les pénicillines et la céphalosporine, une forte augmentation du ratio d'aire des antibiotiques sur l'aire du diuron D6 est constaté entre T0 et T7j.

Cette augmentation de signal entre T0 et T7j n'est pas liée à la perte de sensibilité du diuron D6 car la même augmentation est constatée en traitant les résultats en aire sans correction comme le montre la Figure 12 pour la norfloxacine. Cette augmentation est peut-être due à une période nécessaire pour la solubilisation des antibiotiques ou à une période d'équilibration entre les phénomènes potentiels d'absorption/désorption entre le flaconnage et le solvant de dissolution ou à une période d'équilibrage à la congélation. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour pouvoir répondre à cette question.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 12 : Graphiques de tendance HYPE obtenus pour la norfloxacine en aire (A) et ratio aire / aire diuron D6 (B) dans les flacons en PP et le méthanol dans l'étalon à 20 µg/L (T0 correspondant au 1er point au mois de juin sur le graphique)</figcaption></figure>

Suite à tous ces résultats, nous avons défini des conditions de stockage pour chaque antibiotique ainsi que des durées de conservation. Ces conditions sont présentées dans le Tableau 9.
<table><caption>Tableau 7 : Récapitulatif des tendances significatives obtenues par antibiotique et par condition de stockage</caption><thead><tr><th>Groupe chimique</th><th>Antibiotique</th><th>flaconnage</th><th>Solvant</th><th>Tendance</th><th>Date de rupture</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="8">Pénicillines</td><td rowspan="2">Amoxicilline</td><td>verre</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PP</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td rowspan="2">Amoxicilline d4</td><td>verre</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PP</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td rowspan="2">Ampicilline</td><td>verre</td><td>eau</td><td>=</td><td>T4j</td></tr><tr><td>PP</td><td>eau</td><td>=</td><td>T4j</td></tr><tr><td rowspan="2">Ampicilline d5</td><td>verre</td><td>eau</td><td>=</td><td>T4j</td></tr><tr><td>PP</td><td>eau</td><td>=</td><td>T4j</td></tr><tr><td rowspan="15">Fluoroquinolones</td><td>Ciprofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4j</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4j</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4j</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4j</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4j</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td rowspan="8">Céphalosporine</td><td rowspan="4">Ceftiofur</td><td>verre</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>verre</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>PP</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td rowspan="4">Ceftiofur d3</td><td>verre</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>verre</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PP</td><td>eau</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td rowspan="10">Tétracyclines</td><td rowspan="2">Chlortétracycline</td><td>PP</td><td>MeOH-1</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH-2</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td rowspan="2">Doxycycline</td><td>PP</td><td>MeOH-1</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH-2</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td rowspan="2">Doxycycline d3</td><td>PP</td><td>MeOH-1</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH-2</td><td>=</td><td>14j</td></tr><tr><td rowspan="2">Oxytétracycline</td><td>PP</td><td>MeOH-1</td><td>=</td><td>N/A</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH-2</td><td>=</td><td>5 mois</td></tr><tr><td rowspan="2">Tétracycline</td><td>PP</td><td>MeOH-1</td><td>=</td><td>4 mois</td></tr><tr><td>PP</td><td>MeOH-2</td><td>=</td><td>14j</td></tr><tr><td>Macrolide</td><td>Azithromycine</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

N/A : Non applicable, pas de date de rupture
### 4.5.2 Stabilité des solutions filles et solutions étalons

Les droites d'étalonnage (T0 et T7) ont été comparées d'une part avec les droites d'étalonnage réalisées à partir de la solution fille congelée 7 jours (SF_T0+7 et SF_T7+7) et d'autre part avec les droites d'étalonnage réalisées avec les solutions étalons congelées 7 jours (T0+7 et T7+7).

#### 4.5.2.1 Variabilité du Diuron D6

Le Diuron D6 présente une forte variabilité pour cette étude de congélation des solutions filles et gammes étalons. Les aires moyennes à chaque temps et dans chaque condition de stockage ont été comparées (Figure 13). On constate une forte baisse d'environ 50 % de l'aire du Diuron D6 entre T0 et T7 (T0+7, SF_T0+7, T7, T7+7 et SF_T7+7).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 13 : Aires moyennes du Diuron D6 obtenues dans chaque condition de stockage pour l'étude de congélation des solutions filles et des gammes étalons.</figcaption></figure>
Suite au constat de ces problèmes de variabilité analytique, le ratio des aires des antibiotiques sur l'aire du Diuron D6 a été utilisé pour tracer les droites d'étalonnage (R² et pentes). De plus, étant donné l'augmentation constatée sur les aires et les ratios d'aires entre T0 et T7j pour tous les antibiotiques (voir paragraphe 4.5.1), nous avons décidé de ne tenir compte pour cette étude de congélation des solutions filles et gammes étalons que des résultats obtenus à T7, T7+7 et SF_T7+7 dans les conditions définies au 4.5.1 et dans le Tableau 9.

### 4.5.2.2 Influence de la congélation des solutions diluées et en mélange

Pour tous les antibiotiques, aucune perte de linéarité n'est constatée suite à la congélation des solutions filles et des gammes étalons. En effet, tous les coefficients de détermination obtenus sont supérieurs à 0,99 (voir
Tableau 8).

Pour chaque antibiotique, les pentes des droites d'étalonnage obtenues avec la gamme étalon à T7j congelée 7 jours (T7+7) et celle obtenue à partir de la solution fille à T7 congelée 7 jours (SF_T7+7) ont été comparées à celle obtenue avec la gamme à T7 non congelée (T7). Les ratios des pentes ont été calculés et ils doivent être compris entre 0,90 et 1,10 pour que le composé soit considéré comme stable à la congélation en solution diluée et en mélange.

Les ratios obtenus sont présentés dans le Tableau 8. On constate que les solutions filles et les gammes étalons de l'amoxicilline, la ciprofloxacine, la danofloxacine, l'enrofloxacine, la norfloxacine, la pefloxacine, la sparfloxacine et la tétracycline ainsi que leurs analogues deutérés ne peuvent pas être conservées 7 jours au congélateur. Pour l'ampicilline et son analogue deutéré et l'oxytétracycline, seules les solutions filles peuvent être conservées au congélateur pendant 7 jours. Enfin, pour la marbofloxacine, l'ofloxacine et le ceftiofur ainsi que leurs analogues deutérés, seules les gammes étalons peuvent être congélées 7 jours au congélateur (Tableau 9).

La proportion d'eau dans ces solutions filles ou étalons doit avoir un impact sur la conservation au congélateur, nous préconisons donc de ne pas conserver ces solutions filles ou étalons mais de les préparer le jour de l'analyse.

## 5. RECAPITULATIF DES CONDITIONS DE STOCKAGE DES ANTIBIOTIQUES

Cette étude de stabilité nous a permis de définir pour chacun des 16 antibiotiques étudiés, les conditions de stockage comme le solvant de dissolution, le flaconnage ainsi que la durée de conservation les plus appropriés pour garantir la stabilité de ces composés en solutions mères. Une étude complémentaire sur la congélation en solutions diluées a également permis d'identifier la possibilité de conserver au congélateur les solutions filles et les gammes étalon pendant une semaine. Le Tableau 9 présente ces conditions par antibiotique.
<table><caption>Tableau 8 : Coefficients de détermination R² et ratios des pentes des droites d'étalonnage obtenus pour l'étude de congélation des solutions filles et gammes étalons</caption><thead><tr><th>Groupe chimique</th><th>Antibiotique</th><th>R² T7</th><th>R² SF-T7+7</th><th>R² T7+7</th><th>ratio T7+7/T7</th><th>ratio SF_T7+7/T7</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Pénicillines</td><td>Amoxicilline</td><td>0,999</td><td>1,000</td><td>0,992</td><td>0,63</td><td>0,71</td></tr><tr><td>Amoxicilline d4</td><td>0,999</td><td>1,000</td><td>0,991</td><td>0,63</td><td>0,70</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>0,999</td><td>1,000</td><td>0,999</td><td>0,83</td><td>0,90</td></tr><tr><td>Ampicilline d5</td><td>0,999</td><td>1,000</td><td>0,999</td><td>0,82</td><td>0,90</td></tr><tr><td rowspan="12">Fluoroquinolones</td><td>Ciprofloxacine</td><td>0,998</td><td>0,999</td><td>0,995</td><td>0,77</td><td>0,69</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>0,998</td><td>1,000</td><td>0,996</td><td>0,78</td><td>0,68</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>0,990</td><td>0,999</td><td>0,999</td><td>0,72</td><td>0,54</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>0,991</td><td>0,999</td><td>0,996</td><td>0,78</td><td>0,56</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>0,998</td><td>1,000</td><td>0,998</td><td>0,77</td><td>0,66</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>0,997</td><td>1,000</td><td>0,995</td><td>0,86</td><td>0,65</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>0,998</td><td>1,000</td><td>0,995</td><td>0,94</td><td>0,76</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>0,998</td><td>1,000</td><td>0,992</td><td>0,78</td><td>0,64</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>0,998</td><td>1,000</td><td>0,991</td><td>0,79</td><td>0,64</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>0,998</td><td>0,999</td><td>0,992</td><td>0,97</td><td>0,71</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>0,998</td><td>1,000</td><td>0,995</td><td>1,05</td><td>0,81</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>0,996</td><td>1,000</td><td>0,995</td><td>0,81</td><td>0,61</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>0,996</td><td>1,000</td><td>0,994</td><td>0,81</td><td>0,61</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>0,997</td><td>0,999</td><td>0,996</td><td>0,78</td><td>0,76</td></tr><tr><td rowspan="2">Céphalos porine</td><td>Ceftiofur</td><td>0,999</td><td>1,000</td><td>0,995</td><td>0,97</td><td>0,88</td></tr><tr><td>Ceftiofur d3</td><td>0,999</td><td>1,000</td><td>0,999</td><td>0,99</td><td>0,88</td></tr><tr><td rowspan="5">Tétracyclines</td><td>Chlortétracycline</td><td>0,991</td><td>1,000</td><td>0,996</td><td>1,02</td><td>1,15</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>0,997</td><td>1,000</td><td>0,994</td><td>1,06</td><td>1,07</td></tr><tr><td>Doxycycline d3</td><td>0,996</td><td>1,000</td><td>0,994</td><td>1,06</td><td>1,08</td></tr><tr><td>Oxytétracycline</td><td>0,999</td><td>0,999</td><td>0,991</td><td>0,59</td><td>0,98</td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>0,999</td><td>0,997</td><td>0,997</td><td>0,50</td><td>0,84</td></tr><tr><td>Macrolide</td><td>Azithromycine</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

N/A : Non applicable
<table><caption>Tableau 9 : Tableau récapitulatif des conditions de stockage préconisées par antibiotique en solutions mères et en solutions diluées</caption><thead><tr><th>Groupe chimique</th><th>Antibiotique</th><th>Flaconnage</th><th>Solvant</th><th>Durée de conservation solution mère</th><th>Congélation 7 jours Solution Fille</th><th>Congélation 7 jours Gamme étalon</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Pénicillines</td><td>Amoxicilline</td><td>verre ou PP</td><td>Eau</td><td>1 an</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Amoxicilline d4</td><td>verre ou PP</td><td>Eau</td><td>1 an</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>verre ou PP</td><td>Eau</td><td>1 an</td><td>ok</td><td>non</td></tr><tr><td>Ampicilline d5</td><td>verre ou PP</td><td>Eau</td><td>1 an</td><td>ok</td><td>non</td></tr><tr><td rowspan="14">Fluoroquinolones</td><td>Ciprofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>ok</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>ok</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>ok</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>non</td><td>non</td></tr><tr><td rowspan="2">Céphalos porine</td><td>Ceftiofur</td><td>verre ou PP</td><td>Eau</td><td>1 an</td><td>non</td><td>ok</td></tr><tr><td>Ceftiofur d3</td><td>verre ou PP</td><td>Eau</td><td>1 an</td><td>non</td><td>ok</td></tr><tr><td rowspan="5">Tétracyclines</td><td>Chlortétracycline</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>ok</td><td>ok</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>ok</td><td>ok</td></tr><tr><td>Doxycycline d3</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>ok</td><td>ok</td></tr><tr><td>Oxytétracycline</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>ok</td><td>ok</td></tr><tr><td>Tétracycline</td><td>PP</td><td>MeOH</td><td>3 mois</td><td>ok</td><td>ok</td></tr><tr><td>Macrolide</td><td>Azithromycine</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

N/A : Non applicable

## 6. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Suite à des recherches bibliographiques, nous avons mené une étude de stabilité sur un an de 16 antibiotiques en solution pour tester la stabilité et définir les conditions de conservation les plus adaptées. Différents paramètres ont été pris en compte dans le protocole de cette étude comme la nature du flaconnage avec deux types de vial testés (verre ambré Truview Waters et PP Quanrecovery Waters) et le solvant de dissolution des antibiotiques avec deux types de solvants testés sauf pour les tétracyclines pour lesquelles seul le méthanol a été utilisé.
Une étude complémentaire sur les solutions diluées en mélange en solution fille ou en gamme étalon a été menée pour identifier si les antibiotiques étaient stables à la congélation.

Les résultats obtenus montrent que l'aliquotage des solutions mères pour limiter les étapes de décongélations/congélations successives au cours de l'utilisation des solutions mères d'antibiotiques est primordial pour garantir la stabilité de ces composés.

Sur les deux paramètres de conservation testés, le type de flaconnage a une forte influence sur la conservation des antibiotiques contrairement au type de solvant choisi pour la dissolution. Seules les pénicillines présentent une perte importante lorsqu'elles sont conditionnées dans du méthanol et des flacons en verre. Pour tous les autres antibiotiques, les flacons en PP Quanrecovery présentent un signal en spectrométrie de masse beaucoup plus intense que les flacons en verre, une linéarité des gammes étalons maintenues et pas de perte de détection pour les étalons de faibles niveaux de concentration. Nous recommandons donc l'utilisation de ce type de flacons pour la conservation des solutions mères des antibiotiques.

Pour les tétracyclines, il est recommandé de ne pas faire de mélanges avec des composés dilués dans un autre solvant que le méthanol.

Les durées de conservation maximales des antibiotiques varient de 3 mois pour les tétracyclines et les fluoroquinolones à 1 an pour les pénicillines et la céphalosporine.

Pour le macrolide azithromycine, aucune condition de stockage ne peut être préconisée car aucune des conditions testées n'a répondu à nos critères de linéarité des gammes étalons réalisées. Pour ce composé, une étude supplémentaire sera à réaliser en prenant en compte d'autres paramètres comme le pH ou le choix d'autres solvants de dissolution.

L'étude complémentaire sur la stabilité des antibiotiques en solutions diluées suite à une congélation de 7 jours a permis d'identifier :

- les composés stables en solutions filles et en gammes étalons congelées : Chlortétracycline et Doxycycline ;

- les composés stables uniquement en solutions filles congelées : Ampicilline et Oxytétracycline

- les composés stables uniquement en gammes étalon congelées : Ceftiofur, Marbofloxacine et Ofloxacine

- les composés instables en solutions filles et gammes étalons congelées : Amoxicilline, Ciprofloxacine, Danofloxacine, Enrofloxacine, Norfloxacine, Pefloxacine, Sparfloxacine et Tétracycline

Nous préconisons toutefois de réaliser, pour tous les antibiotiques testés dans cette étude, les solutions filles et gammes étalons le jour de l'analyse et de ne pas les conserver en solutions diluées (<500µg/L dans l'eau).

Cette étude a également montré que les analogues deutérés des antibiotiques présentent le même profil de stabilité que les non deutérés dans les conditions testées. Il semble donc important d'ajouter des analogues deutérés lors de la conservation d'échantillons pour identifier et corriger de potentiels problèmes de stabilité.
Etant donnée la forte augmentation de signal des antibiotiques observée entre T0 et T7j, il sera intéressant de mener une étude complémentaire pour comprendre et essayer d'identifier les phénomènes qui se produisent sur cette période.

D'un point de vue plus méthodologique sur ce genre d'étude de stabilité, afin d'avoir une bonne représentativité des traceurs choisi par rapport aux composés étudiés, il faudrait mener deux études de front :

- une pour les composés non deutérés avec, pour ajout de traceur, les analogues deutérés

- une pour les analogues deutérés avec, pour ajout de traceur, les analogues non deutérés.
Références bibliographiques :

(1) Monteiro SC., Boxall A.B.A. (2010), Occurrence and Fate of Human Pharmaceuticals in the Environment, Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 53-153.

(2) Richardson S.D. (2012), Environmental Mass Spectrometry: Emerging Contaminants and Current Issues. Analytical chemistry 84, 747-778.

(3) https://www.norman-network.com/nds/susdat/

(4) Method EPA 1694 (2007) : Pharmaceuticals and personal care products in water, soil, sediment, and biosolids by HPLC/MS/MS.

(5) US EPA, Office of water (2010), Stability of pharmaceuticals, personal care products, steroids, and hormones in aqueous samples, POTW effluents, and biosolids.

(6) Okerman L., Van Hende J., De Zutter L. (2007), Stability of frozen stock solutions of beta-lactam antibiotics, cephalosporins, tetracyclines and quinolones used in antibiotic residue screening and antibiotic susceptibility testing. Analytica Chimica Acta 586, 284-288.

(7) Riediker S., Rytz A., Stadler R. (2004), Cold-temperature stability of five β-lactams antibiotics in bovine milk and milk extracts prepared for liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry analysis. Journal of chromatography A 1054, 359-363.

(8) Zhang Y., Liu X., Cui Y., Huang H., Chi N., Tang X. (2009), Aspects of degradation kinetics of azithromycin in aqueous solution. Chromatographia 70, 67-73.

(9) Liang Y., Bonner Denton M., Bates R. (1998), Stability studies of tetracycline in methanol solution. Journal of chromatography A 827, 45-55.

(10) Soeborg T., Ingerslev F., Halling-Sorensen B. (2004), Chemical stability of chlortetracycline and chlortetracycline degradation products and epimers in soil interstitial water. Chemosphere 57, 1515-1524.

(11) Sturini M., Speltini A., Maraschi F., Pretali L., Profumo A., Fasani E., Albini A., Migliavacca R., Nucleo E. (2012), Photodegradation of fluoroquinolones in surface water and antimicrobial activity of the photoproducts. Water research 56, 5575-5582.

(12) Gaugain M., Chotard MP., Verdon E. (2013), Stability study for 53 antibiotics in solution and in fortified biological matrixes by LC/MS/MS. Journal of AOA international 96.
(13) Llorca M., Gros M., Rodriguez-Mozaz S., Barcelo D. (2014), Sample preservation for the analysis of antibiotics in water. Journal of chromatography A 1369, 43-51.

(14) Lardy-Fortan S., Lalere B. (2017), Lignes directrices pour la conduite et la validation d'études de stabilité des paramètres physico-chimiques dans le domaine de l'eau. Rapport AQUAREF.

(15) Croiset N., Lopez B. (2013), HYPE Outil d'analyse statistique des séries temporelles d'évolution de la qualité des eaux souterraines - Manuel d'utilisation. Rapport ONEMA BRGM/RP-63066-FR, 64p.
# ANNEXES

## Annexe 1 : Pureté des produits antibiotiques du fournisseur CIL Cluzeau

<table><thead><tr><td>Molécule</td><td>Pureté (%)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Amoxicilline</td><td>98,0</td></tr><tr><td>Amoxicilline d4</td><td>98,0</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>98,5</td></tr><tr><td>Ampicilline d5</td><td>95,0</td></tr><tr><td>Azithromycine</td><td>99,9</td></tr><tr><td>Ceftiofur</td><td>91,8</td></tr><tr><td>Ceftiofur d3</td><td>98,6</td></tr><tr><td>Chlortetracycline</td><td>92,9</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine</td><td>92,3</td></tr><tr><td>Ciprofloxacine d8</td><td>89,7</td></tr><tr><td>Danofloxacine</td><td>95,2</td></tr><tr><td>Danofloxacine d3</td><td>98,0</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>99,3</td></tr><tr><td>Doxycycline d3</td><td>97,0</td></tr><tr><td>Enrofloxacine</td><td>99,7</td></tr><tr><td>Enrofloxacine d5</td><td>98,7</td></tr><tr><td>Marbofloxacine</td><td>98,3</td></tr><tr><td>Norfloxacine</td><td>96,1</td></tr><tr><td>Norfloxacine d5</td><td>93,6</td></tr><tr><td>Ofloxacine</td><td>96,5</td></tr><tr><td>Ofloxacine d3</td><td>93,5</td></tr><tr><td>Oxytetracycline</td><td>95,2</td></tr><tr><td>Pefloxacine</td><td>92,1</td></tr><tr><td>Pefloxacine d3</td><td>99,2</td></tr><tr><td>Sparfloxacine</td><td>99,0</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>97,1</td></tr></tbody></table>
Annexe 2 : Préparation des solutions filles A et C dans l'eau

<table><thead><tr><th>Composés</th><th>conc<br>Solution<br>Mère<br>(mg/L)</th><th>conc<br>Solution<br>Fille (µg/L)</th><th>Volume<br>final (mL)</th><th>Volume Solution<br>Mère prelevé<br>(µL)</th></tr></thead><tbody><tr><td>amoxicilline</td><td>178,8</td><td>500</td><td>10</td><td>27,96</td></tr><tr><td>amoxicilline d4</td><td>74,3</td><td>500</td><td>10</td><td>67,30</td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>226,8</td><td>500</td><td>10</td><td>22,04</td></tr><tr><td>ampicilline d5</td><td>61,4</td><td>500</td><td>10</td><td>81,44</td></tr><tr><td>azithromycine</td><td>275,6</td><td>500</td><td>10</td><td>18,15</td></tr><tr><td>ceftiofur</td><td>224,0</td><td>500</td><td>10</td><td>22,32</td></tr><tr><td>ceftiofur d3</td><td>90,5</td><td>500</td><td>10</td><td>55,23</td></tr><tr><td>chlortetracycline</td><td>283,5</td><td>500</td><td>10</td><td>17,63</td></tr><tr><td>ciprofloxacine</td><td>287,7</td><td>500</td><td>10</td><td>17,38</td></tr><tr><td>ciprofloxacine d8</td><td>181,5</td><td>500</td><td>10</td><td>27,55</td></tr><tr><td>danofloxacine</td><td>273,5</td><td>500</td><td>10</td><td>18,28</td></tr><tr><td>danofloxacine d3</td><td>55,1</td><td>500</td><td>10</td><td>90,67</td></tr><tr><td>doxycycline</td><td>330,1</td><td>500</td><td>10</td><td>15,15</td></tr><tr><td>doxycycline d3</td><td>53,1</td><td>500</td><td>10</td><td>94,14</td></tr><tr><td>enrofloxacine</td><td>371,0</td><td>500</td><td>10</td><td>13,48</td></tr><tr><td>enrofloxacine d5</td><td>192,8</td><td>500</td><td>10</td><td>25,94</td></tr><tr><td>marbofloxacine</td><td>307,1</td><td>500</td><td>10</td><td>16,28</td></tr><tr><td>norfloxacine</td><td>395,3</td><td>500</td><td>10</td><td>12,65</td></tr><tr><td>norfloxacine d5</td><td>131,1</td><td>500</td><td>10</td><td>38,14</td></tr><tr><td>ofloxacine</td><td>296,4</td><td>500</td><td>10</td><td>16,87</td></tr><tr><td>ofloxacine d3</td><td>149,4</td><td>500</td><td>10</td><td>33,46</td></tr><tr><td>oxytetracycline</td><td>246,1</td><td>500</td><td>10</td><td>20,31</td></tr><tr><td>pefloxacine</td><td>248,9</td><td>500</td><td>10</td><td>20,09</td></tr><tr><td>pefloxacine d3</td><td>108,5</td><td>500</td><td>10</td><td>46,07</td></tr><tr><td>sparfloxacine</td><td>259,7</td><td>500</td><td>10</td><td>19,25</td></tr><tr><td>tetracycline</td><td>309,6</td><td>500</td><td>10</td><td>16,15</td></tr></tbody></table>
Annexe 3 : Préparation des solutions filles B et D dans l'eau

<table><thead><tr><th>Composés</th><th>conc<br>Solution<br>Mère<br>(mg/L)</th><th>conc<br>Solution<br>Fille (µg/L)</th><th>Volume<br>final (mL)</th><th>Volume<br>Solution Mère<br>prelevé (µL)</th></tr></thead><tbody><tr><td>amoxicilline</td><td>232,7</td><td>500</td><td>10</td><td>21,49</td></tr><tr><td>amoxicilline d4</td><td>74,3</td><td>500</td><td>10</td><td>67,30</td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>281,9</td><td>500</td><td>10</td><td>17,73</td></tr><tr><td>ampicilline d5</td><td>60,9</td><td>500</td><td>10</td><td>82,04</td></tr><tr><td>azithromycine</td><td>224,6</td><td>500</td><td>10</td><td>22,27</td></tr><tr><td>ceftiofur</td><td>256,0</td><td>500</td><td>10</td><td>19,53</td></tr><tr><td>ceftiofur d3</td><td>88,5</td><td>500</td><td>10</td><td>56,52</td></tr><tr><td>chlortetracycline</td><td>283,5</td><td>500</td><td>10</td><td>17,63</td></tr><tr><td>ciprofloxacine</td><td>269,1</td><td>500</td><td>10</td><td>18,58</td></tr><tr><td>ciprofloxacine d8</td><td>127,7</td><td>500</td><td>10</td><td>39,14</td></tr><tr><td>danofloxacine</td><td>341,3</td><td>500</td><td>10</td><td>14,65</td></tr><tr><td>danofloxacine d3</td><td>77,6</td><td>500</td><td>10</td><td>64,45</td></tr><tr><td>doxycycline</td><td>330,1</td><td>500</td><td>10</td><td>15,15</td></tr><tr><td>doxycycline d3</td><td>53,1</td><td>500</td><td>10</td><td>94,14</td></tr><tr><td>enrofloxacine</td><td>306,6</td><td>500</td><td>10</td><td>16,31</td></tr><tr><td>enrofloxacine d5</td><td>153,0</td><td>500</td><td>10</td><td>32,68</td></tr><tr><td>marbofloxacine</td><td>331,8</td><td>500</td><td>10</td><td>15,07</td></tr><tr><td>norfloxacine</td><td>331,6</td><td>500</td><td>10</td><td>15,08</td></tr><tr><td>norfloxacine d5</td><td>127,1</td><td>500</td><td>10</td><td>39,34</td></tr><tr><td>ofloxacine</td><td>286,5</td><td>500</td><td>10</td><td>17,45</td></tr><tr><td>ofloxacine d3</td><td>130,5</td><td>500</td><td>10</td><td>38,31</td></tr><tr><td>oxytetracycline</td><td>246,1</td><td>500</td><td>10</td><td>20,31</td></tr><tr><td>pefloxacine</td><td>256,4</td><td>500</td><td>10</td><td>19,50</td></tr><tr><td>pefloxacine d3</td><td>161,1</td><td>500</td><td>10</td><td>31,04</td></tr><tr><td>sparfloxacine</td><td>257,1</td><td>500</td><td>10</td><td>19,45</td></tr><tr><td>tetracycline</td><td>309,6</td><td>500</td><td>10</td><td>16,15</td></tr></tbody></table>
Annexe 4 : Préparation des gammes d'étalonnage A, B, C et D dans l'eau

<table><thead><tr><th rowspan="2">Composés</th><th rowspan="2">conc SF µg/L</th><th>conc ET 20µg/L</th><th>conc ET 10µg/L</th><th>conc ET 5µg/L</th><th>conc ET 2µg/L</th><th>conc ET 1µg/L</th><th>conc ET 0,5µg/L</th></tr><tr><th>200µL de SF dans 5mL</th><th>100µL de SF dans 5mL</th><th>2,5mL de ET 20µg/L dans 10mL</th><th>1mL de ET 20µg/L dans 10mL</th><th>1mL de ET 10µg/L dans 10mL</th><th>1mL de ET 5µg/L dans 10mL</th></tr></thead><tbody><tr><td>amoxicilline</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>amoxicilline d4</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ampicilline</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ampicilline d5</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>azithromycine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>azithromycine d3</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ceftiofur</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ceftiofur d3</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>chlortetracycline</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ciprofloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ciprofloxacine d8</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>danofloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>danofloxacine d3</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>doxycycline</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>doxycycline d3</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>enrofloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>enrofloxacine d5</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>marbofloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>norfloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>norfloxacine d5</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ofloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>ofloxacine d3</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>oxytetracycline</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>pefloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>pefloxacine d3</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>sparfloxacine</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr><tr><td>tetracycline</td><td>500</td><td>20</td><td>10</td><td>5</td><td>2</td><td>1</td><td>0,5</td></tr></tbody></table>

Mise en vial :

- blanc : 50µL diud6 20µg/L + 950µL eau

- vials verre : 25µL diud6 20µg/L + 475µL Etalons

- vials PP : 12,5µL diud6 20µg/L + 237,5µL Etalons