# Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans un processus physiologique

Joël Gautron

► To cite this version:

Joël Gautron. Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans un processus physiologique. Master. M2R physiopathologies. Analyse des génomes: aspects fondamentaux et approches méthodologiques, Tours (FR), France. 2019. hal-04217854

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# Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans un processus physiologique

**Joël GAUTRON**, UR 083 Unité de Recherches Avicoles, INRA, 37380 Nouzilly, France

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# Plan

## I. Introduction

## II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l'œuf d'oiseau

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

## III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit
Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

## IV. Conclusion

<figure><img src="image_8.png" /></figure>
68.2 MT d'œufs produites dans le Monde en 2013
> 1200 Milliards d'œufs chaque année

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## Production Monde 2013

* + 2% /an de 2003-13 (+ 4% /an de 93-03)

1. Chine 24.7MT

2. UE-28 6.2 MT

3. USA 5.6 MT

4. Inde 3.8 MT

5. Japon 2.5 MT

6. Mexique 2.2 MT

Les plus gros consommateurs d'œufs sont les asiatiques et les mexicains, avec une consommation annuelle par habitant de plus de 340 œufs.

Itavi d'après FAO, Commission et FranceAgriMer

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Evolution des systèmes de production dans l'UE

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<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Source Commission européenne

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Répartition de la consommation globale
française en 2013

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ITAVI d'après SSP, Kantar et Douanes
# Microbiologie de l'œuf et des ovoproduits

* Au moment de la ponte, le contenu des œufs est généralement stérile

* Le pourcentage d'œufs frais contaminés reste souvent inférieur à 1 %

* Contamination verticale est rare

* La contamination horizontale est beaucoup plus fréquente

* Se produit après la ponte par contact avec les microorganismes

* * fientes

* * environnement élevage

* * centre de conditionnement

* * circuit de commercialisation

* * consommateur...

* Les œufs et produits d'œufs sont consommés crus (mayonnaise...)

* Impliqués dans 45% des salmonelloses (62 % pour salmonella enteritidis)

> Le risque de contamination par les microorganismes et notamment *Salmonella* est donc une préoccupation pour la filière œufs et ovoproduits

<figure><img src="image_17.png" /></figure>
# L'œuf de poule

* ✓ Ingrédient de base pour la consommation humaine
(Éléments nutritionnels parfaitement équilibrés)

## Chambre isolée pour permettre le développement de l'embryon

Doit contenir la totalité des composants nécessaires au développement embryonnaire

→ Systèmes de protection (défenses naturelles de l'œuf)

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

→ Source majeure de composés avec un large spectre d'activités biologiques

## Valorisation alimentaire et non alimentaire de l'œuf et des produits d'œufs

<figure><img src="image_19.png" /></figure>
# L'œuf de poule

* ✓ Ingrédient de base pour la consommation humaine
(Éléments nutritionnels parfaitement équilibrés)

Chambre isolée pour permettre le développement de l'embryon

→ Rôle central des protéines déposées
dans l'œuf

→ Identification et caractérisation des
protéines de l'œuf

→ Source majeure de composés avec un large spectre d'activités biologiques

Valorisation alimentaire et non alimentaire de l'œuf et des produits d'oeufs
# Plan

## I. Introduction

## II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l'œuf d'oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

## III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit
Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

## IV. Conclusion

<figure><img src="image_20.png" /></figure>
# Identification des protéines de l'œuf

## Les techniques classiques

* Biochimie (Fractionnement des composés de l'œuf par chromatographie, électrophorèses...) et biologie moléculaire

→ 2006, environ 50 protéines de l'œuf (10 dans la coquille)

## Les développements récents

* 2004, Publication de la séquence génomique de la poule

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

* Genome-wide non redundant catalog of 33 838 different genes

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Mise à disposition des techniques « omics » et des outils de data mining pour identifier de nouvelles protéines de l'œuf

* cDNA and ESTs libraries (Identification of 600 434 functional genes in chickens)

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

dbEST: database of "Expressed Sequence Tags"

dbEST release 130101

<figure><img src="image_24.png" /></figure>
# Les banques cDNA et EST

## Le but

* Identifier les gènes fonctionnels

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

<figure><img src="image_26.png" /></figure>
# Les banques EST

## Le but

* Identifier les gènes fonctionnels

## Méthode

* Un catalogue compréhensible de l'ensemble des séquences d'un organisme ou d'un tissu spécifique ou d'une fonction biologique

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

<figure><img src="image_28.png" /></figure>
# Les banques EST

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

EST

Assembled into a genome-wide non-redundant
catalog of expressed genes
(Unigenes)

## Main projects for poultry:

- University Delaware (http://www.chickest.udel.edu/)

- University of Manchester (http://www.chick.umist.ac.uk/index.html)

- Inra (http://www.sigenae.org)

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

dbEST: database of "Expressed Sequence Tags"

dbEST release 130101

600 434 séquences (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html) pour 260 460 contigs et 129 842

singlets (http://public-contigbrowser.sigenae.org:9090/Gallus_gallus/index.html)
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Initial

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Growth

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

Uterine fluid

Terminal

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

N-terminal Amino acid sequencing :
VLGSGLSCAISPRAMQQVLSDAIIQTGGL

No correspondences in databases

Specific antibodies

<figure><img src="image_36.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

<figure><img src="image_40.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

- Identification de la séquence génomique de l'ovocalyxine-36
- Chromosome 20
- Position 9834141 et 9842177

<figure><img src="image_43.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

## Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

## Ovocalyxine-36, protéine apparentée à LBP/BPI et Plunc

- Se lient au lipopolysaccharide (LPS) de la paroi des bactéries à Gram négatif
- Mort de la bactérie

- Reconnaissance précoce des produits bactériens dans le système respiratoire supérieur
- chez les mammifères

<figure><img src="image_45.png" /></figure>
# Ovocalyxin-36

BIOLOGY OF REPRODUCTION 83, 893-900 (2010)
Published online before print 11 August 2010.
DOI 10.1095/biolreprod.110.085019

## Minireview

### What Makes an Egg Unique? Clues from Evolutionary Scenarios of Egg-Specific Genes¹

Xin Tian,³,⁴,⁵,⁶ Joel Gautron,⁷ Philippe Monget,³,⁴,⁵,⁶ and Géraldine Pascal²,³,⁴,⁵,⁶

UMR85,³ Physiologie de la Reproduction et des Comportements, INRA, Nouzilly, France

UMR6175,⁴ CNRS, Nouzilly, France

Université François Rabelais de Tours,⁵ Tours, France

Haras Nationaux,⁶ Nouzilly, France

UR83 Recherches Avicoles,⁷ INRA, Nouzilly, France

H. sapiens M. domestica Chr 20

G. Gallus Chr 1

Chr 20

Ultra90

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Developmental and Comparative Immunology xxx (2010) xxx-xxx

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

ELSEVIER

Contents lists available at ScienceDirect

### Developmental and Comparative Immunology

journal homepage: www.elsevier.com/locate/dci

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

Human Chromosome 20

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

### Identification and characterisation of the BPI/LBP/PLUNC-like gene repertoire in chickens reveals the absence of a LBP gene²

Shih-Chieh Chiang²,¹, Edwin J.A. Veldhuizenᵇ, Frances A. Barnesª, C. Jeremy Cravenᶜ, Henk P. Haagsmanᵇ, Colin D. Bingleª,⁺

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

<footnote>ªAcademic Unit of Respiratory Medicine, Department of Infection and Immunity, University of Sheffield, Sheffield S10 2JR, UK</footnote>

<footnote>ᵇDepartment of Infectious Diseases and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80 165, 3508 TD Utrecht, The Netherlands</footnote>

<footnote>ᶜKrebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, Sheffield S10 2TN, UK</footnote>
Evolution des gènes

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

Biology of Reproduction, 2010

<figure><img src="image_52.png" /></figure>
# Plan

## I. Introduction

## II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l'œuf d'oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

## III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit
Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

## IV. Conclusion

<figure><img src="image_53.png" /></figure>
# La formation de l'œuf

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

**Foie**

Protéines du jaune
(maturité sexuelle)

**Ovaire**

**infundibulum**

Membranes vitellines
(< 1 h)

**Magnum**

Protéines du blanc
(1h – 4h30)

**Isthme**

Membranes coquillières
(4h30-6h)

**Utérus**

Calcification de la coquille
(6h – 24 h)

<figure><img src="image_55.png" /></figure>
# La transcriptomique

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

**Foie :**
Protéines du jaune

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

**Ovaire et infundibulum :**
Membranes vitellines

**Magnum :**
Protéines du blanc

**Isthme :**
Membranes coquillières

**Utérus :**
Calcification de la coquille

L'appareil reproducteur de la poule est un modèle parfaitement adapté à une approche transcriptomique

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

Formation dans le temps et l'espace des constituants de l'œuf

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Spécialisation des tissus ou organes

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

Différents stades physiologiques

<figure><img src="image_61.png" /></figure>
# La transcriptomique

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

**Foie :**
Protéines du jaune

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

**Ovaire et infundibulum :**
Membranes vitellines

**Magnum :**
Protéines du blanc

**Isthme :**
Membranes coquillières

**Utérus :**
Calcification de la coquille

Utilisation de puces à ADN ou RNA-Seq

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

Comparaison de l'expression des gènes
entre les différents tissus

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Quantification des gènes specifiquement exprimés en
relation avec la formation du jaune, des membranes
vitellines, du blanc d'oeuf, des membranes coquillères et
de la calcification de la coquille

<figure><img src="image_66.png" /></figure>
# La transcriptomique

## Identification des gènes spécifiquement impliqués dans la synthèse du blanc, des membranes coquillières et la calcification de la coquille

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

**Magnum :**
Protéines du blanc

**Isthme :**
Membranes coquillières

**Utérus :**
Calcification de la coquille

Utilisation de puces à ADN

Comparaison de l'expression des gènes
entre les différents tissus

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

<figure><img src="image_69.png" /></figure>
# La transcriptomique

Several differentially expressed genes
(Fold difference range from 1.98 to 174.1)

Magnum

Uterus

Tissue specific genes ?

White Isthmus

<figure><img src="image_70.png" /></figure>
# La transcriptomique

Several differentially expressed genes
(Fold difference range from 1.98 to 174.1)

Magnum

Uterus

White Isthmus

<figure><img src="image_71.png" /></figure>
# La transcriptomique

Several differentially expressed genes
(Fold difference range from 1.98 to 174.1)

Magnum (egg white deposition)

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

Uterus (eggshell calcification)

White isthmus (eggshell membranes)

<figure><img src="image_73.png" /></figure>
# La transcriptomique

✓ Transcriptomics (microarrays, RNA seq)

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

**Liver:** 582 ←
Egg yolk proteins (several weeks)

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

**Ovary and infundibulum:**
Vitelline membranes (less 1 h)

Bourin et al. BMC Genomics 2012, 13:457
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/457

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

BMC
Genomics

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Transcriptomic profiling of proteases and
antiproteases in the liver of sexually mature hens
in relation to vitellogenesis

Marie Bourin, Joël Gautron, Magali Berges, Christelle Hennequet-Antier, Cédric Cabau, Yves Nys and Sophie Réhault-Godbert*

New insights in egg white proteins using cDNA microarrays and extensive proteomic data mining

EggMeat symposia 2011 - Leipzig

## Nombreuses Etudes de RNA SEQ en cours

## Milliers de nouvelles séquences géniques

Brionne et al.
http://www.

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Hen uterine gene expression profiling during eggshell formation reveals putative proteins involved in the supply of minerals or in the shell mineralization process

Aurélien Brionne, Yves Nys, Christelle Hennequet-Antier and Joël Gautron*

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Gene expression profiling to identify eggshell proteins involved in physical defense of the chicken egg

Vincent Jonchère¹, Sophie Réhault-Godbert¹, Christelle Hennequet-Antier¹, Cédric Cabau¹, Vonick Sibut¹,³, Larry A Cogburn², Yves Nys¹, Joel Gautron¹*

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

INRA
SCIENCE & IMPACT

Gautron J. / Eggshell formation

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

<figure><img src="image_79.png" /></figure>

<figure><img src="image_80.png" /></figure>
# La protéomique

(Mass spectrometry-based methods for protein identification)

Digestion protéique (trypsine)

Séparation des protéines

(Chromatographie 2D, Electrophorèse 2D)

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

Fragments peptidiques des protéines

<figure><img src="image_84.png" /></figure>

Waters® nanoscale LC/MS/MS System integrates the CapLC®XE Pump and Autosampler, the Micromass® Q-Tof Ultima™ API Mass Spectrometer with integral NanoLockSpray™ Ionization Source and Masslynx™ 4.0 Software.

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

Détermination de la masse Réelle des peptides
# La protéomique

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

Masse expérimentale des peptides

Séquences génomiques
Séquences cDNA et ESTs

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

Digestion in Silico des protéines

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

Masse virtuelle des peptides

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

Comparaison

MEPSPLLLLLLLLAPCGRGWAVSGRAPAEETARTDGR/SVLPEKDDFHPRTDTDPTTNCVNNCRDDGNCRGSRKCCHIRCPFRCPQPVPARPDTYPKKKVPHIIGCCNSTCSSDTDFPNHLRCCQPMRRSSRITVALSLLGLGCWWCSDPEKLCRLIPEHRLCRGRAYCYACIPALRSCRVFVHSSCGGNANNFRTLAECQQVCQHGLHKH

Identification protéique
La protéomique

L'analyse protéomique se base sur la protéine (unité fonctionnelle)

Toutefois elle est limitée aux protéines dont la séquence est disponible

L'analyse transcriptomique est basée sur les ARNm

Elle permet donc l'analyse des gènes et des protéines non identifiées dans les bases

<figure><img src="image_93.png" /></figure>
# La protéomique

✓ **Proteomics** (Mass spectrometry-based methods for protein identification)

178

DOI 10.1002/pmic.200700790

Proteomics 2008, 8, 178–191

RESEARCH ARTICLE

## The chicken egg yolk plasma and granule proteomes

Karlheinz Mann and Matthias Mann

Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Proteomics und Signaltransduktion, Martinsried, Germany

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

ELSEVIER

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Chromatography A

journal homepage: www.elsevier.com/locate/chroma

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

Chicken egg yolk cytoplasmic proteome, mined via combinatorial peptide ligand libraries

Alessia Farinazzoª, Umberto Restucciaᵇ, Angela Bachiᵇ, Luc Guerrierᶜ, Frederic Fortisᶜ, Egisto Boschettiᶜ, Elisa Fasoliª, Attilio Citterioª, Pier Giorgio Righettiª,⁺

3558

DOI 10.1002/pmic.200700397

RESEARCH ARTICLE

## The chicken egg white proteome

Karlheinz Mann

Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Proteomics und Signaltransduktion, Martinsried, Germany

Journal of proteome research

2008, **7**, 3461–3474

### Exploring the Chicken Egg White Proteome with Combinatorial Peptide Ligand Libraries

Chiara D'Ambrosio,¹ Simona Arena,¹ Andrea Scaloni,¹ Luc Guerrier,¹ Egisto Boschetti,¹ Martha Elena Mendilea,⁸ Attilio Citterio,⁸ and Pier Giorgio Righetti⁸⁻⁹

yolk

Karlheinz Mann

Vitelline membranes

<figure><img src="image_96.png" /></figure>

egg white

shell

Quantitative proteomics provides new insights into chicken eggshell matrix protein functions during the primary events of mineralisation and the active calcification phase

Pauline Marieª, Valérie Labasᵇ, Aurélien Brionneª, Grégoire Harichauxᵇ, Christelle Hennequet-Antierª, Alejandro F

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

Proteo eggsh

Megan Ri

**Quantitative proteomics and bioinformatic analysis**
**provide new insight into protein function during**
**avian eggshell biomineralization**

Pauline Marieª, Valérie Labasᵇ, Aurélien Brionneª, Grégoire Harichauxᵇ, Christelle Hennequet-Antierª, Yves Nysª, Joël Gautronª,⁺

2322

DOI 10.1002/pmic.200800032

Proteomics 2008, 8, 2322–2332

RESEARCH ARTICLE

## Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane

Proteomics 2006, **6**, 3801–3810

DOI 10.1002/pmic.200600120

RESEARCH ARTICLE

### Proteomic analysis of the acid-soluble organic matrix of the chicken calcified eggshell layer

CrossMark

5

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

proteins

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

CrossMark

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

INRA

SCIENCE & IMPACT

Gautron J. / Eggshell formation

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

<footnote>ªINRA, UR83 Recherches Avicoles, Fonction et Régulation des Protéines de l'œuf, F-37380 Nouzilly, France</footnote>

<footnote>ᵇINRA, UMR INRA85, UMR CNRS 7247, Université de Tours, IFCE, Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Plate-forme d'Analyse Intégrative des Biomolécules, Laboratoire de Spectrométrie de Masse, F-37380 Nouzilly, France</footnote>
# « omics » to identify novel egg proteins

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

✓ **Proteomics** (Mass spectrometry-based methods for protein identification)

>4000 different protein identifiers in the different egg proteomes from 3 different databases
IPI (closed), GeneBank and UniProt

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

Lot of redundancies

Majority of them were not annotated

<figure><img src="image_106.png" /></figure>

How many in each compartments ?

What is common, what is compartment specific ?

Functions in the egg ?

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

<figure><img src="image_108.png" /></figure>

Data mining and bioinformatics tools

<figure><img src="image_109.png" /></figure>

Loading of the sequences, multi alignment to eliminate redundancies

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

Repartition in individual egg compartments

<figure><img src="image_111.png" /></figure>

Update of functional annotations

<figure><img src="image_112.png" /></figure>
# Novel egg proteins

894 genes encode egg proteins

<figure><img src="image_113.png" /></figure>

Protein variants
and isoforms

1261 non redundant proteins in the egg

<figure><img src="image_114.png" /></figure>

<figure><img src="image_115.png" /></figure>
# Plan

I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines de l'œuf

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit
Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

IV. Conclusion

<figure><img src="image_116.png" /></figure>
# Egg defences

<figure><img src="image_117.png" /></figure>

<figure><img src="image_118.png" /></figure>

<figure><img src="image_119.png" /></figure>
# La coquille : une barrière physique contre la pénétration bactérienne

→ L'intégrité de la coquille est cruciale pour la sécurité alimentaire du consommateur

<figure><img src="image_120.png" /></figure>

Comprendre les mécanismes de fabrication de la coquille et déterminer l'origine de ses faiblesses

Développer de nouveaux outils pour la sélection
La coquille (défense physique)

<figure><img src="image_121.png" /></figure>
# Eggshell biomineralization in uterus

## Supply of minerals for shell mineralization

<figure><img src="image_122.png" /></figure>

## 3 main phases in the uterine fluid (acellular milieu)

<figure><img src="image_123.png" /></figure>

<figure><img src="image_124.png" /></figure>
# La Biominéralisation

## PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

* Dépôts de minéraux sous conditions physiologiques dans un organisme vivant qui aboutit à la formation de structures très diversifiées avec des formes, des tailles et des couleurs différentes

### Biominéralisation acellulaire dite contrôlée

<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>Perle</figcaption></figure>

<figure><img src="image_126.png" /><figcaption>Coccolithes</figcaption></figure>

<figure><img src="image_127.png" /></figure>

<figure><img src="image_128.png" /><figcaption>Corail</figcaption></figure>

<figure><img src="image_129.png" /><figcaption>Coquilles d'oiseaux</figcaption></figure>

<figure><img src="image_130.png" /><figcaption>Coquilles de mollusques</figcaption></figure>

<figure><img src="image_131.png" /></figure>

<figure><img src="image_132.png" /><figcaption>gastéropodes</figcaption></figure>

<figure><img src="image_133.png" /></figure>

<figure><img src="image_134.png" /></figure>
# La Biominéralisation

→ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principes

<figure><img src="image_135.png" /></figure>

<figure><img src="image_136.png" /></figure>
# La Biominéralisation

→ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principe

→ 95% de carbonate de calcium sous forme de calcite

<figure><img src="image_137.png" /><figcaption>Calcite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_138.png" /><figcaption>Aragonite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_139.png" /><figcaption>Vatérite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_140.png" /></figure>

### Propriétés mécaniques

- Environ 300 µm d'épaisseur

- Résiste à 4 kg de pression

→ 3,5% de matière organique (matrice organique)

*Protéines et protéoglycanes*

<figure><img src="image_141.png" /></figure>
# La Biominéralisation

→ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principes

Un espace biologiquement compartimenté (utérus pour la poule)

C'est dans cet espace que les entrées ioniques et organiques sont contrôlées pour atteindre les conditions physico-chimiques précises

Une hypersaturation du milieu

→ Les ions constitutifs du minéral doivent se trouver en conditions saturantes

La nucléation et la croissance du minéral

→ L'initiation de la cristallisation se fait à partir de sites se trouvant dans le milieu (nucléation)

La matrice organique joue souvent ce rôle dans les biominéraux

- Elle inhibe la croissance du minéral selon un ou plusieurs axes

<figure><img src="image_142.png" /></figure>
# La Biominéralisation

→ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principes

Un espace biologiquement compartimenté (utérus pour la poule)

C'est dans cet espace que les entrées ioniques et organiques sont contrôlées pour atteindre les conditions physico-chimiques précises

Une hypersaturation du milieu

→ Les ions constitutifs du minéral doivent se trouver en conditions saturantes

La nucléation et la croissance du minéral

→ L'initiation de la cristallisation se fait à partir de sites se trouvant dans le milieu (nucléation)

La matrice organique joue souvent ce rôle dans les biominéraux

- Elle inhibe la croissance du minéral selon un ou plusieurs axes

<figure><img src="image_143.png" /></figure>

<figure><img src="image_144.png" /></figure>
# La formation de la coquille, un processus de bioméralisation

→ Séquence temporale de la nucléation, de la croissance

→ Modulée par la matrice organique

<figure><img src="image_145.png" /></figure>

C. R. Palevol (2004), 3, 549-562

→ Identification et caractérisation des protéines de la matrice organique
# Functions of eggshell matrix proteins

## LA FORMATION DE LA COQUILLE

<figure><img src="image_146.png" /></figure>

Rôle déterminant des protéines de la matrice

### Approches globales et non hiérarchisées

* ✓ Plus de 900 protéines

* ✓ Plus de 600 transcrits spécifiques

### Lesquelles ?

### Quand ?

### Où ?

### Pourquoi faire ?

### Comment faire ?

<figure><img src="image_147.png" /></figure>
# Eggshell biomineralization

Hiérarchiser les acteurs moléculaires prépondérants lors du processus de minéralisation

## Etudes à différents stades de la minéralisation

<figure><img src="image_148.png" /></figure>

High-throughput quantitative proteomics, Uterine RNA-seq, statistical and bioinformatic functional analyses of matrix proteins

To sort major protein candidates involved in particular key points of the eggshell mineralization

<figure><img src="image_149.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux

<figure><img src="image_150.png" /></figure>

Recueil du tissu utérin (ARNm), et des coquilles (protéines de la matrice)

<figure><img src="image_151.png" /></figure>

Analyse protéomique
sur LTQ-VelosOrbitrap
des bandes

Identification des protéines

Etablissement d'une liste non
redondante de 316 protéines
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux

* 316 protéines quantifiées

* Détermination de l'abondance relative dans chacun des 5 stades

* Analyses statistiques

<figure><img src="image_152.png" /></figure>

ANOVA

Protéines ont des variations d'abondance significatives selon les stades

<figure><img src="image_153.png" /></figure>

Cluster hiérarchique profils d'abondance protéique

<figure><img src="image_154.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux

## Classement des protéines selon leur profil d'abondance

<figure><img src="image_155.png" /><figcaption>13 proteins overabundant during ACC transformation into calcite aggregates</figcaption></figure>

<figure><img src="image_156.png" /><figcaption>70 proteins overabundant during rapid growth phase</figcaption></figure>

<figure><img src="image_157.png" /><figcaption>47 proteins overabundant when large calcite crystal units are formed</figcaption></figure>

<figure><img src="image_158.png" /><figcaption>18 proteins overabundant at stages associated with the presence of calcite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_159.png" /></figure>

<figure><img src="image_160.png" /></figure>
<figure><img src="image_161.png" /><figcaption># Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux</figcaption></figure>

<figure><img src="image_162.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux

<figure><img src="image_163.png" /></figure>

Use of DESeq2 (R package),
normalization, adjustment of p-values using the Benjamini-Hochberg method (5%)

↓

↓

↓

↓

Transcripts with an absolute Fold Change (Fc) upper than 1.5 in one stage

↓

↓

↓

↓

4502 differentially expressed transcripts representing 3766 different genes

<figure><img src="image_164.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux

## Profiling of the 4502 transcripts DE highlight 13 different clusters

<figure><img src="image_165.png" /></figure>
# Rôle of uterine differentially expressed genes

<figure><img src="image_166.png" /></figure>

→ Predictive analysis of DE genes coding for secreted proteins

<figure><img src="image_167.png" /></figure>
# Uterine genes and eggshell matrix proteins

<figure><img src="image_168.png" /></figure>

<figure><img src="image_169.png" /></figure>

<figure><img src="image_170.png" /></figure>

1335
secreted
proteins
(29,6 %)

444 Main candidate proteins to be involved in the shell biomineralization process

<figure><img src="image_171.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la bioméralisation de la coquille des oiseaux

<figure><img src="image_172.png" /></figure>

## Proteomics and transcriptomics:

### Distribution and variation of abundance of 444 matrix proteins

### Predicted functional activities of the identified matrix proteins ?

(Marie et al., 2014, 2015a,b)

<figure><img src="image_173.png" /></figure>

Impact
(2013-2017)

### Literature, data mining and bioinformatics tools

### Classification in 3 different groups according to their potential functions

- Associated to mineralization process

- Involved in the regulation of activity of proteins

- Antimicrobial and other proteins

<figure><img src="image_174.png" /></figure>
# Function of matrix proteins at pivotal events

## ☐ Proteins having a direct involvement in eggshell mineralization

* ✓ Proteins with established role in the **biomineralisation**

<figure><img src="image_175.png" /></figure>

First events of shell mineralization (initiation)

<figure><img src="image_176.png" /></figure>
# Function of matrix proteins at pivotal events

## ☐ Proteins having a direct involvement in eggshell mineralization

* ✓ Proteins with established role in the **biomineralisation**

<figure><img src="image_177.png" /></figure>

Freeman et al, 2010

<figure><img src="image_178.png" /><figcaption>**First events of shell mineralization (initiation)**</figcaption></figure>

<figure><img src="image_179.png" /></figure>
# Function of matrix proteins at pivotal events

## ☐ Proteins having a direct involvement in eggshell mineralization

* ✓ Proteins with established role in the **biomineralisation**

* ✓ Calcium binding proteins (CaBPs) interacting with calcium, favoring crystal nucleation and driving the morphology of crystals

* Proteins with EF-hand and EGF-like calcium binding domains

<figure><img src="image_180.png" /></figure>

First events of shell mineralization (initiation)

<figure><img src="image_181.png" /></figure>
# Function of matrix proteins at pivotal events

## ☐ Proteins having a direct involvement in eggshell mineralization

* ✓ Proteins with established role in the **biomineralisation**

* ✓ Calcium binding proteins (CaBPs) interacting with calcium, favoring crystal nucleation and driving the morphology of crystals

* Proteins with EF-hand and EGF-like calcium binding domains

* ✓ Proteoglycans and proteoglycan binding proteins

* proteoglycans have a negative charge to attract Ca2+ ions

<figure><img src="image_182.png" /></figure>

First events of shell mineralization (initiation)

<figure><img src="image_183.png" /></figure>
# Function of matrix proteins at pivotal events

## Proteins involved in the regulation of proteins driving mineralization

* ✓ Proteins involved in the proper folding of the eggshell matrix to ensure calcium and mineral interactions and to ensure template to the mineralized structure

* ✓ Proteins inhibiting or activating proteins present in the mineralization milieu (non cellular).
  → Direct interaction with other proteins.

* ▪ Molecular chaperone interact with proteins driving mineralization

* ▪ Proteases and protease inhibitors (specific and controlled role during calcification process, either by degrading proteins or regulating processing of proteins into their mature forms)

* ✓ Mineralization depends on the degree of protein phosphorylation

* ▪ Kinases and Phosphatases

<figure><img src="image_184.png" /></figure>

First events of shell mineralization (initiation)
# Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans la formation de la coquille

* ✓RNA seq and Quantitative proteomics to classify and determine a hierarchy of proteins driving the mineralization → 444 candidates identified and a more restricted list of 22 pivotal candidate proteins with functions associated to mineralization

Use as biological markers for genomic selection to reinforce eggshell breaking strength

* ✓ Associate transcripts with published and private SNPs, QTLs related to shell quality

*(Collaboration with breeders and avian genetic teams)*
# Plan

## I. Introduction

## II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l'œuf d'oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

## III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit
Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

## IV. Conclusion

<figure><img src="image_185.png" /></figure>
# Utilisation des avancées récentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

## Stratégie de sélection pour améliorer les défenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_186.png" /></figure>

<figure><img src="image_187.png" /></figure>

INRA

SRA STATION DE RECHERCHES ANCIENNES
Houzey, 37380 MONNAIE, France

Ian Dunn, Maureen Bain

Roslin Institute, University of Glasgow

### Hypothèse

> "Une variation de l'expression des gènes codant pour les protéines de la matrice organique de la coquille provoque des différences mesurables de la qualité de la coquille

## Sélection génomique assistée par marqueurs (MAS)

- Sélection utilisant des marqueurs ADN spécifiques d'un caractère phénotypique difficile à utiliser de manière pratique en sélection

- Les gènes codant pour les protéines de la matrice organique de la coquille peuvent être considérés comme gènes candidats pour la MAS

<figure><img src="image_188.png" /></figure>
# Utilisation des avancées récentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

## Stratégie de sélection pour améliorer les défenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_189.png" /></figure>

INRA

SRA STATION DE RECHERCHES AYCOULES
Hôpital, 37380 MOHNRAE, France

Ian Dunn, Maureen Bain
Roslin Institute, University of Glasgow

<figure><img src="image_190.png" /></figure>

## Sélection assistée par marqueurs (MAS)

### Approche gènes candidats

(Environ 16000 génotypages pour 8 gènes et 2066 descendants)

<table><thead><tr><th>Tests d'association</th><th>P value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ovocleidin-116<br>Module élastique</td><td>P= 0.0004</td></tr><tr><td>Ovocalyxin 32<br>Déformation à la fracture</td><td>P= 0.006</td></tr><tr><td>Ovocalyxin 32<br>Résistance à la rupture</td><td>P= 0.001</td></tr></tbody></table>

Les études d'associations suggèrent que les gènes candidats peuvent expliquer les variations des propriétés structurales de la coquille de l'oeuf de poule.

<figure><img src="image_191.png" /></figure>
# Plan

## I. Introduction

## II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l'œuf d'oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

## III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

## IV. Conclusion

<figure><img src="image_192.png" /></figure>
# CONCLUSIONS

Les stratégies utilisant la génomique et la génomique fonctionnelle simultanément avec la protéomique offrent un potentiel important

→ Caractérisation des acteurs moléculaires

→ Criblage de nombreuses fonctions biologiques potentielles

Intérêts dans la science de l'œuf

→ protéines impliquées dans la biominéralisation de l'œuf

→ Protéines de défenses moléculaires

→ Autres activités biologiques

<figure><img src="image_193.png" /></figure>

Science des
biomatériaux

<figure><img src="image_194.png" /></figure>

Protection de l'œuf

-Défense physique

-Défense chimique

<figure><img src="image_195.png" /></figure>

Caractérisation de nouvelles
molécules d'intérêts

-Antimicrobiennes

-Antivirales

-Antihypertensives

-Antioxydantes

-Anti-inflammatoires...