<figure><img src="image_93.png" /></figure>

Figure 78 : Représentation schématique du processus ECL issu de l'oxydation du glucose par le système NAD+, GDH et de l'ouverture des liposomes à l'électrode.

Dans ce contexte, notre stratégie consiste à encapsuler dans des liposomes géants les réactifs nécessaires à un processus enzymatique unique, celui correspondant à la réaction de dégradation de glucose. Ce système est complété par le luminophore de la réaction d'électrochimiluminescence. Ensuite, au cours de la réaction de la transformation du glucose en glucono-δ-lactone qui se déroulera à l'intérieur des liposomes, le NAD+ sera réduit en NADH (co-réactif de la réaction d'ECL). Notre objectif est de mettre en évidence par ECL et de façon très préliminaire la formation de NADH à l'issue de l'oxydation du glucose dans le liposome, après ouverture de ce dernier à la surface d'une électrode polarisée. Nous reprenons donc la stratégie ECL décrite au chapitre 2, dans laquelle la rupture de la membrane lipidique du liposome est réalisée au contact de l'électrode polarisée.

### III. Résultats / Discussions

#### 1. Etude électrochimique de la formation du NADH provenant de la dégradation du glucose

Pour commencer, il était important de réaliser une étude par voltammétrie cyclique du co-enzyme authentique dans le but d'identifier sa signature électrochimique et ses propriétés rédox. La Figure 79 montre un voltamogramme typique du NADH obtenu en milieu tampon phosphate (PBS) sur une électrode de platine. Dans ces conditions, le NADH s'oxyde de
manière irréversible à un potentiel de 0,7 V vs. Ag/AgCl ce qui correspond bien à la valeur
trouvée dans la littérature (0,7 V).

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

Figure 79 : voltampérométrie cyclique d'une solution tampon phosphate salin (PBS ; C = 10 mM ; pH = 7,5) réalisée en absence (noir) et présence (bleu) de NADH (C = 10 mM) sur une électrode de platine (diam. 0,5 mm) et à v = 50 mV/s. Contre électrode : fil de platine de diamètre égal à 1mm et de longueur égale à 1cm. Expérience réalisée à température ambiante.

En vue des études à réaliser par microscopie dans la suite de ce travail, nous avons également
tenté d'obtenir la signature électrochimique du NADH sur une électrode en ITO.
Malheureusement cela s'est avéré infructueux à cause d'une passivation de la surface de
l'électrode par le co-enzyme. Pour des raisons pratiques (impossibilité de nettoyer la surface
en ITO sans abimer le matériau), la formation du NADH provenant de la dégradation du
glucose a donc été étudiée avec une électrode en platine en milieu PBS. Dans ces conditions,
le mélange des trois réactifs (NAD+ à 10 mM, l'enzyme GDH à 80 U/mL, et le glucose à 0.7 M)
conduit très rapidement (moins de cinq minutes), à une vague d'oxydation possédant les
mêmes caractéristiques que celle observée précédemment pour l'oxydation du NADH
authentique. En outre, l'absence de l'un des trois réactifs en solution n'engendre aucune vague
d'oxydation (Figure 80). La vague obtenue en présence des trois réactifs peut donc être
attribuée à l'oxydation du NADH provenant de la dégradation enzymatique du glucose.
<figure><img src="image_95.png" /></figure>

Figure 80 : Etude voltampérométrique montrant, en couleur rouge, la formation de NADH cinq minutes après avoir mélangé les trois réactifs suivants : NAD⁺ (10.10⁻³ mol.L⁻¹), GDH (80 U/mL) et glucose (0,7 mol.L⁻¹). Les voltamogrammes en noir et vert ont été obtenus respectivement en absence de GDH et de glucose. Conditions expérimentales : solvant PBS (10 mM, pH = 7.54), électrode de travail en platine (diamètre : 0.5 mm) et contre électrode en platine (fil de platine). Température : 20 °C.

Suite à ce résultat, il nous a semblé intéressant d'estimer le temps nécessaire pour une production maximale de NADH à partir de nos conditions expérimentales. Pour ce faire, nous avons suivi en fonction du temps, et par voltammétrie cyclique, la formation de NADH à partir d'une solution PBS contenant les trois réactifs nécessaires : NAD⁺ (10 mM), GDH (80 U/mL) et glucose (0,7 M) (Figure 81).
<figure><img src="image_96.png" /></figure>

Figure 81 : Etude voltampérométrique montrant la formation de NADH en fonction du temps à partir d'une solution de PBS (1.10⁻² mol.L⁻¹, pH = 7.54) contenant du NAD⁺ (1.10⁻² mol.L⁻¹), l'enzyme GDH (80 U/mL), et du glucose (0,7 mol.L⁻¹). Courbe noire (PBS), courbe orange (t = 0 min.), courbe jaune (5 min.), courbe rouge (20 min.), courbe verte (30 min.), courbe bleu (60 min.). La courbe en couleur grise correspond à une solution contenant du NADH authentique à une concentration de 1.10⁻² mol.L⁻¹. Conditions : électrode de travail en Pt (diam. 0.5 mm), et contre électrode en Pt (fil). Vitesse de balayage : v = 50 mV/s. Température ambiante (20 °C).

La Figure 81 montre que la production de NADH est très rapide aux temps courts (t < 5 minutes) mais devient plus lente aux temps longs (5 < t < 60 minutes). Au-delà de 60 minutes, l'intensité de la vague d'oxydation du NADH n'augmente plus mais diminue légèrement indiquant très vraisemblablement un début de dégradation du NADH produit ou/et de l'enzyme (non montré dans la Figure 81). Par comparaison avec le voltamogramme obtenu à partir d'une solution de NADH authentique (à C = 10 mM) on peut dire que dans nos conditions la dégradation enzymatique du glucose a permis de transformer près de 75 % du NAD⁺ de départ en une heure. Autrement dit, nos conditions expérimentales ont permis de produire, en une heure, du NADH à une concentration de 7.5 mM. Cette concentration devrait être suffisante pour générer un signal ECL.
2. Mise en évidence d'un signal d'électrochimiluminescence combinant le complexe $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ et le NADH comme co-réactif.

Après avoir montré que le NADH peut être formé par oxydation enzymatique du glucose dans nos conditions expérimentales, il était également important de montrer que l'oxydation de ce co-enzyme, combinée à celle d'un luminophore tel que le complexe $[Ru(bpy)_3]^{2+}$, peut conduire à une émission de lumière.

Pour ce faire, le couplage des enregistrements du signal faradique (courant) et du signal électrochimiluminescent a été réalisé lors du balayage voltampérométrique d'une solution contenant le luminophore ($C = 2,5 \cdot 10^{-4} \text{ mol.L}^{-1}$) et le NADH ($C = 10 \text{ mM}$). Cette expérience a été mise en œuvre sur une électrode en ITO (diamètre : 7 mm) combiné à un microscope inversé lui-même relié à une caméra EM-CCD.

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

Figure 82 : (a) Evolution du signal électrochimiluminescent en fonction du potentiel appliqué. Conditions expérimentales : milieu PBS ($1 \cdot 10^{-2} \text{ mol.L}^{-1}$; pH = 7.54); $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ ($C = 2,5 \cdot 10^{-4} \text{ mol.L}^{-1}$) ; NADH ($C = 1 \cdot 10^{-2} \text{ mol.L}^{-1}$) ; électrode de travail en ITO (diam. : 7 mm) ; contre-électrode : fil de platine. Les images montrent l'intensité lumineuse observée à la surface de l'électrode à différentes valeurs du potentiel. La figure (b) montre voltampérométrie cyclique d'une solution de PBS réalisée en absence (noir) et présence (bleu) de $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ ($C = 2,5 \cdot 10^{-4} \text{ mol.L}^{-1}$) sur une électrode en ITO (diam. 0.9 mm).
Le couplage entre l'électrochimie et la luminescence (Figure 82) montre que l'intensité de la lumière varie de façon synchronisée avec le potentiel avec un maximum vers +1,05 V. A ce potentiel, on oxyde donc à la fois le co-réactif (NADH) et le luminophore en accord avec le mécanisme dit du « co-reactif ».

Cette étude permet d'identifier le potentiel à appliquer pour obtenir un maximum d'émission lumineuse. Vers 1,05 V on a une intensité lumineuse maximale synchronisée avec le courant faradique, lié principalement à l'oxydation du NADH qui est introduit en excès par rapport au ruthénium. Mais dans la suite de ce chapitre, nous avons utilisé un potentiel égal à +1,2 V parce que les expériences ont montré que, en présence de liposomes, l'intensité maximale d'ECL est obtenue à +1,2V.

### 3. Mise en évidence, par imagerie ECL, de la présence de NADH authentique à l'intérieur d'un liposome

Nous venons de montrer qu'un signal électrochimiluminescent peut être émis à partir d'une solution, contenant du NADH et le complexe $[Ru(bpy)_3]^{2+}$, directement en contact avec une électrode. L'étape suivante consiste maintenant à vérifier qu'un signal luminescent peut également être obtenu quand les deux réactifs, préalablement encapsulés dans des liposomes géants, sont libérés dans le milieu extérieur par perméabilisation de la membrane lipidique. Pour réaliser cela, nous reprenons la stratégie ECL décrite dans le chapitre 2, dans laquelle la rupture de la membrane lipidique du liposome est réalisée au contact de l'électrode polarisée.

Comme dans le second chapitre, nous avons opté pour des liposomes dissymétriques DOPC/DOPG (feuillet interne / feuillet externe). Le mode de préparation de ces liposomes est identique à celui décrit dans le chapitre 2 (cf. Chapitre 2 et Partie Expérimentale). De la même façon, nous avons gardé la même concentration en luminophore ($C ([Ru(bpy)_3]^{2+}) = 2,5 \cdot 10^{-4}$ mol.L$^{-1}$) mais avons divisé par dix la concentration en co-réactif ([NADH] = 10 mM). Une étude réalisée par microscopie optique montre clairement la présence de $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ et de NADH à l'intérieur des liposomes grâce à l'utilisation de longueurs d'onde excitatrices et de filtres adéquats ($\lambda_{exc.} = 450$ et $340$ nm, respectivement associé à des filtres "Rhodamine" et "DAPI").

Afin de déclencher et d'imager la perméabilisation membranaire des liposomes contenant le NADH et le luminophore, nous avons repris le même dispositif décrit dans le chapitre 2
permettant de coupler l'électrochimiluminescence, l'ampérométrie et la photoluminescence.
Pour rappel, le dispositif est à nouveau montré dans la Figure 83.

<figure><img src="image_98.png" /><figcaption>Figure 83 : Dispositif et acquisition utilisés pendant le couplage de l'ECL à l'électrochimie et à la photoluminescence.</figcaption></figure>

Comme réalisé jusqu'ici, les liposomes contenant le luminophore et le co-réactif NADH ont été déposés en haut de la cellule électrochimique de façon à les laisser sédimenter à la surface de l'électrode en ITO polarisée (E = + 1,2V vs. Ag/AgCl). Cette polarisation est susceptible de
déclencher la perméabilisation membranaire des liposomes et d'oxyder, par conséquent, les réactifs ECL libérés dans le milieu extra-vésiculaire. La Figure 84 regroupe deux planches d'images obtenues en ECL et en photoluminescence (Figure 84 (a)), ainsi que les études quantitatives correspondantes en électrochimie, photoluminescence (PL) et ECL (Figure 84 (B)).
<figure><img src="image_99.png" /></figure>

Figure 84 : (a) Images obtenues en ECL et PL montrant la perméabilisation d'un liposome de type DOPC/DOPG. Le liposome, qui repose sur une surface en ITO polarisée (E = + 1.2 V vs. Ag/AgCl) contient initialement du NADH (10 mM) et le complexe $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ (2,5.10-4 mol.L-1). Afin d'éviter tout chevauchement entre les deux types d'informations visuelles, les images ECL et PL ont une différence de temps d'acquisition initiale de 500 ms. Pendant l'imagerie ECL et PL la mise au point a été faite au niveau de la surface de l'électrode en ITO. Les traits blancs en pointillés dans les images PL et ECL représentent la région d'intérêt (ROI) typique prise en compte pour les analyses quantitatives des intensités correspondantes (cf. (b)). (b) Évolution des signaux PL (courbe verte), ECL (courbe rouge) et ampérométrique (courbe bleue) obtenus en fonction du temps pour un seul liposome [indiqué en (A)] perméabilisé par polarisation de la surface en ITO. Barre d'échelle : 100 µm. Note : t = 0 sec. correspond à l'ajout des liposomes dans la cellule électrochimique.

La planche d'images en PL montre la présence de deux vésicules proches l'une de l'autre (cf. images prises à t = 64 et 65 secondes). Pour $t \le 65$ secondes, aucun signal ECL n'est visible indiquant l'absence de fuite au niveau des liposomes observés en PL. Puis, entre 65 et 68 secondes un signal ECL en forme d'arc de cercle apparaît au niveau du liposome situé le plus à gauche de l'image. Dans le même temps, la lumière émise en PL par ce liposome devient
diffuse et moins intense. Ces deux évènements, observés dans la même gamme de temps en PL et ECL, indiquent clairement une fuite du liposome. Cependant, et contrairement aux observations faites en présence du co-réactif TPrA, le signal ECL ne se propage pas très loin de l'endroit d'où vient la fuite. Cela peut s'expliquer par une différence des coefficients de diffusion des co-réactifs (plus petit dans le cas du NADH). En outre, et comme déjà observé jusqu'ici, aucun signal ECL n'est émis à l'endroit où est posé le liposome en accord avec le fait qu'aucun transfert de charge ne peut avoir lieu à cet endroit, c'est-à-dire au travers de la bicouche lipidique.

De façon à mieux rationaliser ce phénomène de perméabilisation, une zone d'intérêt correspondant au liposome en question a été définie. Les intensités correspondantes en ECL et PL ont été reportées sur la Figure 84(b) En outre, l'intensité du signal électrochimique obtenue en fonction du temps a également été ajoutée sur cette figure. Entre 0 et 60 secondes, le signal PL est le seul dont l'intensité varie. Plus particulièrement, l'augmentation de l'intensité du signal PL entre 15 et 20 secondes correspond à l'arrivée (par gravité) du liposome à la surface de l'électrode car, dans nos expériences, la mise au point du microscope est faite au niveau de la surface de l'électrode en ITO. Puis, en accord avec les observations précédentes, le liposome se met à fuir entre 65 et 68 secondes entrainant une forte diminution du signal PL dont l'intensité est proportionnelle à la concentration en luminophore. Dans la même gamme de temps, l'intensité ECL ainsi que le courant faradique augmentent très rapidement en accord avec l'oxydation des réactifs fuitant du liposome.

Contrairement aux études réalisées en présence de TPrA comme co-réactif, les signaux ECL et électrochimique diminuent ici très rapidement en intensité (une quinzaine de secondes) reflétant une diffusion moins rapide du co-réactif NADH.

4. Mise en évidence par imagerie ECL de la formation de NADH issu de l'oxydation enzymatique du glucose à l'intérieur d'un liposome

Après avoir vérifié que l'on peut imager par ECL la perméabilisation membranaire de liposomes géants contenant du NADH comme co-réactif, l'objectif final était de mettre en évidence (toujours par ECL) la formation de NADH à l'issue de l'oxydation du glucose dans un liposome, après ouverture de ce dernier à la surface d'une électrode polarisée.
L'approche est analogue à celle détaillée dans le paragraphe précédent à la différence que le NADH (10 mM) a été remplacé par la forme oxydée du co-enzyme ([NAD⁺] = 10 mM). Afin de transformer le NAD⁺ en NADH, il a fallu également encapsuler dans les liposomes l'enzyme GDH (80 U/mL) ainsi que du glucose (0,35 M) en plus du complexe de ruthénium (2,5·10⁻⁴ mol·L⁻¹). A noter que du sucrose (0,35 M) a aussi été ajouté de façon à faciliter la sédimentation des liposomes vers la surface de l'électrode. Dans ces conditions, nous avons réussi à préparer en une heure (temps requis pour une production maximale de NADH ; cf. § précédents) des liposomes stables et en quantité suffisante pour nos expériences d'imagerie.

La Figure 85 regroupe deux planches d'images obtenues en ECL et en photoluminescence (PL) (Figure 85 (A)) ainsi que les études quantitatives correspondantes en électrochimie, photoluminescence (PL) et ECL (Figure 85 (B)).
<figure><img src="image_100.png" /></figure>

Figure 85 : (A) Images obtenues en ECL et PL montrant la perméabilisation d'un liposome ayant joué le rôle d'un microréacteur pour la dégradation du glucose par l'enzyme GDH en présence de NAD+. Le liposome, qui repose sur une surface en ITO polarisée (E = +1.2 V vs. Ag/AgCl) contient initialement : NAD+ (10 mM), [Ru(bpy)₃]²⁺ (2,5·10⁻⁴ mol.L⁻¹), GDH (80 U/mL), glucose (0,35 mol.L⁻¹). La réaction enzymatique conduit à la production de NADH qui est utilisé comme co-réactif dans le processus ECL. Les traits blancs en pointillés dans les images PL et ECL représentent la région d'intérêt (ROI) typique prise en compte pour les analyses quantitatives des intensités correspondantes (cf. (B)). (B) Évolution des signaux PL (courbe verte), ECL (courbe rouge) et ampérométrique (courbe bleue) obtenus en fonction du temps pour un seul liposome [indiqué en (A)] perméabilisé par polarisation de la surface en ITO. Barre d'échelle : 100 µm. Note : t = 0 sec. correspond à l'ajout des liposomes dans la cellule électrochimique.

Parmi les liposomes observés dans la Figure 85(A) et dans la fenêtre de temps comprise entre 14 et 52 secondes, seule celui positionné en bas et au centre de l'image est pertinent en termes de perméabilisation (liposome cerclé par un trait pointillé).
Pour $t < 24$ secondes, ce liposome apparaît intact en photoluminescence (PL) ; d'ailleurs, les images correspondantes obtenues en ECL ne montrent aucun signal lumineux dans cette gamme de temps. Par contre, les images obtenues en PL à partir de 24 secondes montrent une déformation du liposome couplée à une diffusion de la lumière dans l'espace situé à proximité de la vésicule. Dans la même gamme de temps, les images en ECL montrent l'apparition d'un signal lumineux (en bas des images) dont l'intensité diminue au cours du temps (cf. les 3 images ECL prises entre 24 et 52 secondes). D'une part, les observations faites en PL montrent que le liposome observé subit une perméabilisation membranaire. D'autre part, la présence d'un signal ECL indique sans ambigüité que du NADH a bien été formé par oxydation enzymatique du glucose à l'intérieur du liposome et avant la perméabilisation de ce dernier.

Parallèlement à ces observations, nous avons également tracé en fonction du temps l'évolution des intensités lumineuses (PL et ECL) et du courant faradique pour le liposome en question (cf. zone d'intérêt en pointillée). L'évolution de ces trois signaux est tout à fait similaire à celle observée en présence de NADH authentique. Tout d'abord (pour $0 < t < 10$ secondes), l'intensité PL augmente en accord avec l'arrivée du liposome à la surface de l'électrode et au niveau de laquelle est faite la mise au point. Puis, l'intensité reste constante une dizaine de secondes indiquant que le liposome est posé à la surface de l'électrode et reste intact pendant ce laps de temps. Aux alentours de $t = 20$ secondes, l'intensité du signal PL diminue (pendant 20 secondes environ) en accord avec une « électro-perméabilisation » de la membrane du liposome. Cette perméabilisation libère dans le milieu extérieur une partie du contenu du liposome qui peut alors être oxydé au contact de la surface en ITO. Cette oxydation se traduit non seulement par une augmentation du courant faradique mais aussi par l'apparition d'un signal ECL dont l'intensité suit celle du courant.

En termes d'intensité de courant, il est intéressant de noter que la valeur obtenue ici est environ cinq fois plus intense que celle observée avec du NADH authentique (pour une même concentration en co-enzyme). Se basant sur nos études électrochimiques présentées au début de ce chapitre dédiées à la production de NADH par voie enzymatique, ce résultat montre tout simplement que la fuite du liposome étudié ici est plus importante que celle observée avec le liposome contenant du NADH authentique.
## IV. Conclusion

L'objectif de ce chapitre était de mettre en évidence par imagerie ECL la formation de NADH à l'issue de l'oxydation du glucose dans un liposome géant, après ouverture de ce dernier à la surface d'une électrode polarisée. Les résultats obtenus montrent clairement que cette approche expérimentale est parfaitement adaptée à ce type d'étude. Comparée aux méthodes basées sur la fluorescence, notre approche peut apparaître comme « destructive » puisqu'il faut perméabiliser le liposome pour obtenir un signal ECL. Cependant, il ne faut pas oublier la plus grande sensibilité de l'approche ECL par rapport à celles basées sur la fluorescence. En outre, la perméabilisation du liposome permet d'obtenir d'autres informations précieuses comme la quantité de réactifs libérés et donc produits à l'intérieur du microréacteur. Finalement, considérant les nombreuses réactions fonctionnant avec le couple NADH/NAD+, ce travail ouvre des perspectives intéressantes pour l'analyse de réactions enzymatiques ayant lieu en milieu confiné.
Conclusion Générale

&

Perspectives
<figure><img src="image_101.png" /></figure>
Conclusion Générale & Perspectives

Ce travail de thèse s'inscrit dans la continuité des travaux initiés dans l'équipe sur le développement de méthodologies associant l'électrochimie et la luminescence en vue d'analyser des processus de passage transmembranaire de biomolécules ou la perméabilisation de membranes lipidiques.

Dans ce cadre, je me suis attachée à mettre au point les conditions expérimentales permettant d'imager par électrochimiluminescence (ECL) la perméabilisation de membranes de liposomes géants (Chapitre 2). La stratégie a consisté à encapsuler préalablement les réactifs ECL (la tripropylamine et le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺) à l'intérieur de liposomes, puis de déclencher leur perméabilisation membranaire au contact d'une surface polarisée et transparente en ITO permettant ainsi d'oxyder et de visualiser l'écoulement des réactifs vers le milieu extra-vésiculaire. Cela nous a permis d'imager, en temps réel, l'évènement de libération du contenu d'un liposome avec une bonne résolution spatiale (de l'ordre du micromètre) et temporelle (de l'ordre de la ms). La dispersion spatiale du signal ECL après l'éclatement des vésicules a confirmé la nature diffusionnelle de l'efflux des réactifs de l'ECL au cours de la libération liposomale. Par ailleurs, le couplage de l'ECL avec la photoluminescence et l'ampérométrie nous a permis d'obtenir des informations complémentaires comme (i) le suivi de l'état du liposome avant et après l'évènement de la libération, (ii) l'attribution de chaque signal à son liposome d'origine, ainsi que (iii) la quantité de tri-*n*-propylamine libérée par chaque liposome.

A partir de ces résultats et de travaux récemment réalisés dans le domaine de l'ECL, nous avons eu ensuite la curiosité d'explorer une nouvelle approche considérée comme l'approche inverse de celle qui vient d'être décrite et appelée ECL négative (Chapitre 3). Cette seconde approche consiste à imager un objet par contraste optique négatif grâce au blocage de l'électrode par l'objet d'intérêt (le liposome). Contrairement à l'approche "ECL positive", le luminophore et le co-réactif sont ici directement mis en solution (et non plus encapsulés dans les liposomes) de façon à générer de la lumière sur toute la surface de l'électrode dès que cette
dernière est polarisée. Dans ces conditions, nous avons pu montrer que la mise en contact d'un
liposome avec la surface d'une électrode sous polarisation génère une tache noire (disparition
de la lumière) dont la taille grandit à mesure que la solution intra-vésiculaire s'écoule vers le
milieu extra-vésiculaire luminescent. Par dilution des réactifs ou par désactivation de l'état
excité grâce à l'utilisation d'un "quencher", l'ECL négative donne des informations sur
l'événement d'ouverture de liposomes en accord avec ceux révélés par l'approche positive de
cette méthode. A titre d'exemple, nous avons retrouvé une valeur du coefficient de diffusion
du luminophore très proche de la valeur déterminée dans le chapitre précédent et qui
correspond à la valeur attendue pour une molécule de la taille de la tripropylamine.

Il nous a ensuite semblé intéressant d'explorer de façon très préliminaire quelques applications
bio-analytiques possibles. Cette valorisation s'est faite exclusivement en s'appuyant sur la
première approche consistant à imager une génération de lumière (ECL positive).

Ainsi, la première application (décrite dans le chapitre 4) visait à mettre en évidence la
perméabilisation de liposomes engendrée par la présence de peptides actifs vis-à-vis des
membranes lipidiques en adaptant la méthodologie ECL mise au point au chapitre 2. En
présence d'un peptide anti-microbien (AMP) emblématique (la mélittine), l'ECL apparaît
constituer une approche sensible et pertinente pour révéler en temps réel les évènements de
perméabilisation. Pour ce qui concerne les peptides pénétrants (CPP) étudiés, dont les
mécanismes de passage transmembranaire ne sont pas systématiquement associés à la
formation de pores, il faudra pour devenir significative que la méthode soit améliorée dans le
sens d'un contrôle fin du rapport peptide/lipide que ne permet pas notre première approche.

La seconde application, décrite dans le chapitre 5, visait à mettre en évidence la formation de
NADH à l'issue de l'oxydation enzymatique du glucose dans un liposome géant, après
ouverture de ce dernier à la surface d'une électrode polarisée. Là encore, les résultats obtenus
ont pu montrer la pertinence de cette approche expérimentale pour ce type d'étude impliquant
des "microréacteurs". Comparée aux méthodes basées sur la fluorescence, notre approche peut
apparaître comme « destructive » et a posteriori puisqu'il faut perméabiliser le liposome pour
analyser son contenu. Malgré tout on observe une plus grande sensibilité apportée par
l'approche ECL par rapport aux méthodes basées sur la fluorescence. En outre, la
perméabilisation du liposome permet d'obtenir d'autres informations précieuses comme la
quantité de réactifs libérés et donc générés à l'intérieur du microréacteur. Enfin, compte tenu du grand nombre de réactions fonctionnant avec le couple NADH/NAD⁺, ce travail ouvre des perspectives intéressantes pour l'analyse et le bilan réactionnel du système chimique constitué par la solution interne du liposome.

Finalement, imager par ECL la perméabilisation membranaire de liposomes géants apparaît être une approche intéressante pour caractériser l'avancement de réactions mettant en jeu la conversion de NAD⁺ en NADH au sein de ce type d'architecture lipidique. Néanmoins, la variabilité associée à la taille des liposomes et à leur ouverture ont fait émerger un axe d'amélioration au niveau du dispositif électrochimique. Plus précisément, à l'avenir, l'enjeu va consister à concevoir des dispositifs expérimentaux permettant d'analyser un liposome unique au contact de l'électrode. Une première piste serait de mettre au point un dispositif microfluidique permettant d'isoler et de déplacer sans altération un liposome unique dans un canal micrométrique et de le positionner au niveau d'une électrode transparente. Une autre option serait de garder le principe du dispositif actuel mais de réduire suffisamment la surface de l'électrode de travail en ITO (800 µm de diamètre actuellement) de façon à n'avoir qu'un seul liposome à la fois à sa surface. Par contre, contrairement à la première option où l'immobilisation du liposome à la surface de l'électrode serait gérée par des pompes microfluidiques, il faudrait ici pouvoir immobiliser le liposome à la surface de l'électrode *via* une approche adossée à la reconnaissance moléculaire comme, par exemple, la formation de complexes streptavidine-biotine. Pour reprendre l'exemple des peptides, ces améliorations permettrait d'analyser plus finement l'action de peptides actifs vis-à-vis des membranes lipidiques pour deux raisons. Tout d'abord, cela permettrait de mieux contrôler le rapport peptide/lipide et, à terme, de pouvoir discriminer rapidement les peptides se comportant comme des AMP de ceux se comportant comme des CPP. Ensuite, ces nouveaux dispositifs devraient également permettre d'améliorer, du point de vue électrochimique, le rapport signal/bruit (i.e., courant faradique/courant capacitif) et de rendre plus quantitatif le signal ampérométrique obtenu en plus des signaux PL et ECL.
<figure><img src="image_102.png" /></figure>
# Partie expérimentale
<figure><img src="image_103.png" /></figure>
# Partie expérimentale

## I. Préparation des dispositifs

1. Fabrication de la cellule électrochimique utilisée pour la détection de la perméabilisation de la bicouche lipidique

La cellule électrochimique est composée d'une lamelle d'ITO (90% In₂O₃/10% SnO₂, ACM, Villiers Saint Fredéric, France) de dimensions 22 mm × 22 mm × 0,13 mm et d'épaisseur d'ITO égale à 150 nm. Sur cette lamelle est collée un bloc de PDMS d'épaisseur 5 mm, par plasma.

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

Figure 86 : Cellule électrochimique composée par un bloc de PDMS trouvé et collé sur une lamelle d'ITO (22 mm × 22 mm × 0,13 mm), par plasma.

Sur la lamelle d'ITO, une couche de platine a été déposée à l'aide d'un métalliseur (Leica) par pulvérisation cathodique en utilisant une cible de platine et en appliquant les paramètres suivants : 125 mA, deux cycles de 1min30.

Le PDMS (Le polydiméthylsiloxane —[O-Si(CH₃)₂]ₙ—) est un polymère fluide qui devient dur quand il est mélangé avec un agent réticulent et mis l'étuve. Pour rendre ce polymère utilisable pour la fabrication de nos cellules électrochimiques, nous avons mélangé le PDMS avec l'agent réticulent et une partie de ce mélange est coulé dans un moule (boite de pétri). Le mélange coulé dans le moule est mis à dégazer par une pompe à vide et placé, après, à l'étuve pendant
1h30 min à 80°C. Après, nous obtenons le PDMS sous sa forme solide et il ne nous reste plus que couper des carrés du PDMS ont les mêmes dimensions que les lames de verre/ITO et faire quatre trous, à l'aide d'un emporte pièces de 2 mm pour délimiter la surface de l'électrode à utiliser. Ces trous nous permettent d'avoir des électrodes de travail de 0,8 mm de diamètre.

L'étape de collage par plasma d'air (Electronic diener- Femto) consiste à placer les matériaux à traiter dans une chambre sous vide d'air, dans laquelle on injecte un gaz de procédé comme l'argon, l'oxygène ou l'air (dans notre cas), à une pression de 0,46 mbar. Par l'application d'un champ électrique externe le gaz se décompose partiellement : c'est l'état de plasma. Les espèces issues de cette décomposition, et plus particulièrement les radicaux, vont réagir avec la pièce à traiter pour modifier ses propriétés de surface. A la fin de cette étape, nous collons les deux faces, qui ont subi le traitement de surface par plasma, l'une sur l'autre.

Après, un fil électrique est fixé sur le dépôt de platine à l'aide d'une soudure à l'étain, afin de permettre le contact électrique avec le potentiostat.

2. Préparation des cellules électrochimiques utilisées pour la caractérisation
électrochimique des espèces électroactives

Les dispositifs préparés sont des cellules électrochimiques constituées par des puits en polydiméthylsiloxane (PDMS), d'épaisseur d'environ 1cm, collés (par plasma) à la surface d'une lame de verre et dans lesquels la solution de réactif à étudier est mise.
<figure><img src="image_105.png" /></figure>

Figure 87 : Collage d'un bloc de PDMS sur une lame de verre afin d'obtenir la cellule électrochimique.

Quand l'électrode de travail est une électrode de carbone vitreux (une électrode de 3 mm de diamètre tenue par une tige en verre), elle est plongée dans le puit de PDMS rempli de solution mais dans le cas d'une électrode de travail en ITO ou graphène, le matériau transparent est déposé sur la surface de verre.

### 3. Dépôt de l'ITO et du graphène sur une lame de verre

#### 3.1. Le graphène

Le dépôt de graphène a été réalisé au département de physique de l'ENS à l'aide d'Aurélie PIERRET. Le graphène est commercialisé sur des substrats en cuivre sous forme d'un disque de 4 pouces de diamètre (10,16 cm) avec une fine couche du graphène au-dessous.
<figure><img src="image_106.png" /><figcaption>Figure 88 : Photo d'un disque de graphène commercial et schéma de sa composition.</figcaption></figure>

Le dépôt du film du graphène à la surface du substrat en verre se fait en plusieurs étapes :

Dépôt d'une couche de $Al_2O_3$

On coupe des morceaux de graphène sur lesquels on va déposer une fine couche de $Al_2O_3$ par ALD (Atomic Layer Deposition).

<figure><img src="image_107.png" /><figcaption>Figure 89 : Composition des morceaux de graphène après le dépôt de $Al_2O_3$</figcaption></figure>

Dépôt d'une couche du Le poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA)

On dépose les morceaux obtenus sur une plaque tournante et on ajoute sur chaque morceau 3 à 4 gouttes d'une solution de PMMA. On utilise une tournette (Spin coating) pendant 30 s à une vitesse de rotation de 4000 tr/min pour évaperer le solvant contenu dans la solution PMMA. Après, on déplace les échantillons sur une plaque chauffante pendant 10 min à 160°C. On obtient une couche de PMMA de 500 nm d'épaisseur.
<figure><img src="image_108.png" /><figcaption>Figure 90 : Composition des morceaux de graphène après le dépôt du PMMA</figcaption></figure>

Le PMMA et le Al₂O₃ jouent le rôle d'un support mécanique protecteur du graphène contre sa rupture lors du transfert (Nous pouvons utiliser le PMMA seul sans alumine).

Plasma pour attaquer le graphène qui est en dessous et dissolution du cuivre

Le graphène qui est au-dessous des échantillons est attaqué par gravure ionique réactive RIE (Reactive Ion Etching) et les échantillons sont, ensuite, mis dans des béchers contenant une solution du persulfate d'ammonium ((NH₃)₂S₂O₃) à 0.05 M durant toute la nuit.

<figure><img src="image_109.png" /><figcaption>Figure 91 : Composition des morceaux de graphène après la dissolution du cuivre</figcaption></figure>

Nettoyage des substrats

Nous mettons les lames de verres dans de l'acétone sous ultrasons pendant 5 min (On refait la même étape dans l'isopropanol). Il ne nous reste que la fonctionnalisation de la surface (pour la rendre hydrophobe prête au collage du graphène) en mettant les substrats sous un environnement de plasma oxygène.
Dépôt du graphène

-Nous chassons le graphène, flottant à la surface de l'eau, en mettant les substrats au-dessous du graphène pour déposer ce dernier à la surface. Nous mettons les lames obtenues avec le graphène à la surface sur une plaque chauffante à 110°C pendant 3 min.

-Nous enlevons le PMMA en chauffant les substrats dans l'acétone à 50°C pendant 15min.

-L'oxyde d'aluminium est éliminé en mettant les échantillons dans l'acide phosphorique à 50°C pendant 1min30.

-Nous rinçons à l'eau et on sèche à l'air comprimé.

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

Figure 92 : Graphène déposé sur une lamelle de verre et observé par microscopie optique.

3.2. Fabrication de l'électrode d'ITO (ITO préparé au laboratoire)

La métallisation est effectuée à l'aide d'un métalliseur « Leica » qui permet de déposer un
matériau sur un substrat par pulvérisation cathodique.

1) Mise en place des échantillons dans le métalliseur sur le plateau tournant.

2) Lancement du programme de métallisation (Pour l'ITO : Courant 150 mA, 84 s et 10 cycles), la durée de la métallisation est d'environ 45 minutes pour 150 nm d'épaisseur.

L'étape suivante est une étape de recuit, dans un four classique, capable de monter à 300°C, à l'air et sous pression atmosphérique. Nous avons utilisé un programme de température en 3 étapes : 1- rampe de température de 1H30 pour passer de 0 à 290 °C. 2- plateau de température de 3H15 à 290°C. 3- Arrêt du four. L'ITO obtenu a une transparence de 80% et une conductivité 25-35 Ohms.
Pour préparer la cellule électrochimique, nous faisons, d'abord, le dépôt de platine qui permet le contact électrique. Ensuite, il faut passer la lame d'ITO et le PDMS au plasma pour faire le collage et, enfin, nous réalisons le point de contact à l'aide d'un fil électrique. Dans le cas du graphène, seul le PDMS est passé au plasma (pour ne pas abimer la couche de graphène).

## 4. Préparation de dispositif microfluidique

Pour préparer le dispositif microfluidique nous commençons par un dessin sur le logiciel Clewin qui est transféré, après, sur un masque en chrome ou en plastique. Ce masque est utilisé pour fabriquer le moule, par lithographie, qui contient le dessin en relief.

Sur une plaque en silicium, nous déposons une couche de résine négative avec la bonne épaisseur qui va décider la hauteur des canaux microfluidiques. Nous passons après à la polymérisation par UV, cette étape permet de polymériser les zones transparentes sur le masque qui correspondent à la forme de notre dispositif. L'étape suivante est appelée « le développement » et elle consiste à un traitement de la surface par un solvant qui enlève la résine qui n'était pas exposé à l'UV (le résine qui était protégé par les zones sombres du masque). Donc sur le moule final nous avons le schéma du dispositif, en relief.

L'étape d'après consiste à couler du PDMS dans le moule, dégazer et mettre le tout à l'étuve à 80°C pendant, au moins, 1 heure. Le décollage du PDMS dur permet d'obtenir le schéma de notre dispositif creusé dans le bloc de PDMS. A l'aide d'un emporte-pièce, nous perçons le PDMS pour permettre l'insertion des tuyaux en plastique dans lesquels circulent les solutions. Ce bloc de PDMS est, ensuite, collé, par plasma, sur une couche en PDMS d'épaisseur 0,5 mm afin de former des canaux dans lesquels les solutions peuvent circuler. Après son passage au plasma, le PDMS hydrophobe devient hydrophile, donc il faut le mettre sur une plaque chauffante pendant, au moins, 2 heures pour augmenter son hydrophobicité, ce qui est nécessaire pour la formation des gouttes.
<figure><img src="image_111.png" /><figcaption>Figure 93 : Schéma des étapes de récupération du dispositif microfluidique sur le PDMS</figcaption></figure>

<figure><img src="image_112.png" /><figcaption>Figure 94 : Dispositif microfluidique collé.</figcaption></figure>
## II. Préparation des liposomes

### 1. Préparation des solutions nécessaires pendant l'étape de la fabrication des liposomes

#### 1.1. Solution lipidique en phase organique

##### 1.1.1. Pour la fabrication manuelle des liposomes

Pour observer les vésicules géantes en microscopie optique, la composition lipidique de la bicouche intègre des lipides marqués.

Le ratio molaire lipides non marqués/lipides marqués est fixé à 98/2 de sorte à ne pas modifier le comportement dynamique de la membrane dictée par le lipide majoritaire.

1- A l'aide d'une seringue HAMILTON®, nous prélèvons un volume de la solution de phospholipides dans le chloroforme et nous l'introduisons dans un pilulier en verre. Nous répétons le prélèvement des autres lipides d'intérêt de sorte à atteindre le ratio molaire 98/2 V1 = 19,53 µL (Phospholipide non marqué DOPG) V2 = 4,65 µL (Phospholipide marqué DPPE-NBD).

2- Sous vide, nous évaporons le chloroforme en imprimant un mouvement de rotation au pilulier pour répartir uniformément les lipides sur les parois de verre de pilulier. L'évaporation du solvant doit être lente de sorte à limiter les éclaboussures de la solution sur les parois. On laisse le pilulier sous vide pendant deux heures.

3- Nous solubilisons les lipides déposés sur les parois par l'ajout de n-dodécane (sigma Aldrich) de sorte à atteindre une concentration massique lipidique totale de 0,1 mg.mL⁻¹. Nous mettons la solution sous l'effet des ultrasons pendant une heure pour assurer l'homogénéisation de la solution.

4- Nous conservons la solution à 4°C.

##### 1.1.2. Pour la préparation de l'émulsion dans des dispositifs microfluidique

Pour cette méthode, la solution de phospholipides à 0.5 mg/mL dans l'huile minérale (Mineral oil, Sigma Aldrich). Nous commençons par un prélèvement, à l'aide d'une seringue HAMILTON®, de 121 µL de la solution des phospholipides dissouts dans du chloroforme et
ce volume est mis dans un pilulier en verre. Sous vide, nous évaporons le chloroforme. Nous laissons le pilulier sous vide pendant deux heures. Après, nous solubilisons les lipides déposés sur les parois par l'ajout de 2 mL de l'huile minérale de sorte à atteindre une concentration massique lipidique totale de 0,5 mg. mL⁻¹. Nous mettons la solution sous l'effet des ultrasons pendant une heure pour assurer l'homogénéisation de la solution. La solution est conservée à 4°C.

Ces étapes sont utilisées pour la préparation des différentes solutions phospholipidiques. Nous prélevons 121 µL du DOPC (18 :1(Δ9-cis)PC(DOPC) dans du chloroforme à 10 mg.mL⁻¹, Avanti Polar Lipids) pour préparer la solution qui permet de former la monocouche interne et nous remplaçons ce phospholipide par du DOPG(18 :1(Δ9-Cis)PG dans du chloroforme à 10mg.mL⁻¹, Avanti Polar Lipids) pour préparer la solution phospholipidique qui intervient dans la formation de la monocouche externe. Pour observer par microscopie optique la bicouche lipidique, il faut ajouter un phospholipide marqué avec un ratio molaire lipides non marqués/lipides marqués à 98/2 de sorte à ne pas modifier le comportement dynamique de la membrane dictée par le lipide majoritaire. Le phospholipide marqué choisi est le DPPE-NBD (16 :0 NBD PE à 1 mg.mL⁻¹, Avanti Polar Lipids).

## 1.2. Préparation des solutions intra et extra-vésiculaires

Les solutions sont préparées dans un tampon phosphate PBS à 10 mM à un pH autour de 7,4. La solution extra-vésiculaire est une solution de glucose de concentration 0,7 M obtenu par dissolution de 1,261 g de de glucose (D- (+) - Glucose, Sigma Aldrich) dans 10 mL de PBS (Phosphate Buffer Saline tablet, Sigma Aldrich).

Pour préparer la solution intra-vésiculaire, **pour les chapitres 2 et 4, nous préparons, d'abord, une solution de sucrose à 0,7 M (2,4 g de sucrose dans 10 mL de PBS). Ensuite, nous ajoutons dans cette solution 190 µL de Tri-*n*-propylamine et nous ajustons le pH avec une solution d'acide phosphorique H₃PO₄ à 1M afin d'obtenir une solution de TPrA à 100 mM et un pH autour de 7,4. Enfin, nous utilisons 1 mL de la solution obtenue pour dissoudre 1,84 mg du complexe de ruthénium [Ru(bpy)₃]²⁺ pour préparer une solution à 2,5 mM et nous réalisons une dilution par 10, afin d'obtenir une concentration égale à 250 µM.
Pour le chapitre 3, la solution intra-vésiculaire est, dans la première partie, une solution de sucrose à 0,7 M et, dans la deuxième partie, une solution de FcMeOH (ferrocenemethanol, Acros Organics) à 500 µM dans le sucrose. Dans le chapitre 5, nous utilisons deux solutions intra-vésiculaires, une première solution de sucrose à 0,7 M contenant du NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide réduit, Merck) à 10 mM (14,19 mg dans 2 mL de sucrose) et cette solution permet de préparer une solution de [Ru(bpy)₃]²⁺ à 250 µM. La deuxième solution est aussi une solution de sucrose à 0,7 M qui contient le NAD⁺ (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, Merck) à 10 mM (13,7 mg dans 2 mL de sucrose). Nous utilisons après cette solution (NAD⁺ dans le sucrose) pour diluer une masse d'enzyme Glucose DéshydroGénase GDH (Glucose dehydrogenase from Pseudomonas sp, Merck) pour obtenir 80 unités dans le volume totale de la solution (l'enzyme est à 236 U/mg). Cette deuxième solution qui contient le NAD⁺ et l'enzyme GDH va servir à dissoudre une masse de la poudre du complexe de ruthénium [Ru(bpy)₃]²⁺ (1,87 mg dans 1 mL) et faire une dilution afin d'obtenir une concentration finale égale à 250 µM de [Ru(bpy)₃]²⁺.

Avant de commencer la fabrication des liposomes, les osmolalités des deux solutions (intra et extra-vésiculaire) sont contrôlées et ajustées pour avoir des valeurs proches avec une différence qui ne dépasse pas 10 mosmol.kg⁻¹.

## 1.3. Etape de la fabrication des liposomes

### 1.3.1 Fabrication manuelle

1. Dans un Eppendorf® de 1,5 mL, nous introduisons 200 µL de la solution externe et 200 µL de la solution lipidique dans le n-dodécane et nous fermons l'Eppendorf®.

2. Nous plaçons l'échantillon diphasique à l'étuve à 45°C pendant au moins 4 heures pour permettre la mise en place d'une monocouche lipidique à l'interface entre les 2 phases.

3. Dans un Eppendorf® de 1,5 mL, nous introduisons 10 µL de la solution interne et 100 µL de la solution lipidique dans le n-dodécane.

4. Nous réglons la pipette à 30 µL et nous réalisons une émulsion par aspirations/refoulements rapides à la pipette pendant environ une minute. Nous prélèvons 30 µL à l'issue de la dernière aspiration.
5-Nous injecte ce volume dans la phase organique surnageante de l'Eppendorf® contenant la phase lipidique dans le n-dodécane et la solution externe. L'injection doit être brève et nette car la coalescence de l'émulsion dans le cône est rapide.

6-Après la sédimentation, il faut centrifuger l'échantillon à une accélération de 67 g, c'est-à-dire 1000 tours/min en utilisant la centrifugeuse MiniSpin® de rotor r = 6 cm, pendant 1 minute.

7-Nous éliminons la phase organique surnageante et nous prélèvons la solution externe contenant les vésicules géantes pour une utilisation directe.

### 1.3.2 La fabrication des liposomes à l'aide du dispositif microfluidique

Dans un Eppendorf® de 0,5 mL, nous introduisons 250 µL de la solution externe et 250 µL de la solution phospholipidique du DOPG (ou DOPC dans le chapitre 3) dans l'huile minérale et on ferme l'Eppendorf®. Nous plaçons le système diphasique à l'étuve à 45°C pendant au moins 4 heures pour permettre la mise en place d'une monocouche lipidique à l'interface entre les 2 phases.

<figure><img src="image_113.png" /><figcaption>Figure 95 : Eppendorf contenant le système biphasique : une solution de phospholipide (DOPG) dans l'huile minérale et une solution de glucose</figcaption></figure>

Pour préparer l'émulsion des micelles inversées, nous utilisons le dispositif microfluidique à deux entrées : dans la première, nous mettons la solution de phospholipide dans l'huile minérale et dans la deuxième la solution à encapsuler (qui est différente selon la partie du projet). A l'aide d'un système de régulation de pression lié à une pompe et en ajustons les pressions des deux entrées à des valeurs qui permettent de former des gouttes sphériques, nous générons les micelles inversées. Ces micelles passent, ensuite, dans le système diphasique en mettons la sortie du dispositif microfluidique dans la phase organique (la phase d'huile) et
grâce à la différence de densité entre le glucose et le sucrose, les micelles traversent l'interface, afin de former la deuxième monocouche.

<figure><img src="image_114.png" /></figure>

Figure 96 : Système utilisé pour la fabrication des liposomes : le dispositif microfluidique est inséré dans le système biphasique.

### III. Fabrication des peptides

Dans notre projet, nous avons utilisé la mélittine synthétisée dans le laboratoire de Biomolécules à Sorbonne Université, avec Dr. Fabienne Burlina. La synthèse de ce peptide a été effectué sur support solide, en stratégie Fmoc (les acides aminés sont protégés par un groupement fluorénylméthoxycarbonyle Fmoc) avec une résine Rink Amide AM et un taux de substitution de 0,26 mmol/g sur une échelle de synthèse fixée à 0,1 mmol ce qui nous a amené à peser 385 g de résine. L'étape de synthèse est effectuée dans un synthétiseur automatique et les acides aminés, protégé par le groupement Fmoc, sont activés avec une solution DIC/HOBt dans du DMF. A la fin de cette étape, nous avons récupéré 850 mg de peptide couplé à la résine. Après, nous avons effectué un clivage (séparer la résine du peptide) en ajoutant une solution de clivage (10 mL pour un gramme de résine) composé par TFA/TIS/H₂O MQ avec les ratios 95 : 2,5 : 2,5 (v/v) et nous avons laissé le mélange pendant au moins 2 heures. Après, nous avons récupéré le surnageant qui contient que le peptide, en filtrant le mélange et en rinçant la résine, avec la solution de clivage, afin de récupérer un
maximum de peptide. Le TFA est, ensuite, évaporé sous argon, pendant 1 heure, et nous avons ajouté de l'éther froid (200 mL pour 1g de peptide-résine) et nous avons centrifugé la solution obtenue pour favoriser la précipitation du peptide. Après, nous avons enlevé l'éther pour solubiliser les peptides dans un mélange de AcOH/eau milli Q (10%/90%) et passer à l'étape de lyophilisation.

La deuxième grande étape, pendant la synthèse d'un peptide est la purification qui permet de récupérer le peptide pur. La purification a été réalisée par HPLC sur une colonne RP-C18 (ACE 5 C18-300 250 x 10 mm) avec un gradient d'analyse de 35% à 60% de B dans A, pendant 30 minutes, (A est une solution d'eau avec 0,1% de TFA et B est une solution D'ACN avec 0,1% de TFA) et un débit fixé à 6 mL/min. Avant de commencer la purification, le peptide a été solubilisé dans un mélange de 70% de la solution A et 30% de la solution B et filtré avant l'injection dans l'appareil de HPLC. La longueur d'onde de détection a été fixée à 220 nm. Pendant chaque injection, nous avons récupéré la partie de la solution qui correspond au pic détecté et les échantillons obtenus ont été analysés par HPLC sur une colonne RP-C18 (ACE C18-300, 100 x 4.6 mm) pendant 10 min et un débit fixé à 1 mL/min avec un gradient d'analyse de 40% à 65% de B dans A. Selon leurs puretés, les échantillons ont été rassemblés et lyophilisé (après une congélation dans de l'azote liquide). La masse finale obtenue est égale à 37,7 mg. Le peptide a été caractérisé par spéctrométrie de masse (Maldi-TOF) en mode ion positif réflecteur en utilisant une matrice CHCA à 10 mg/mL in CH<sub>3</sub>CN/H<sub>2</sub>O/TFA, 50:50:0.1 et nous avons obtenu le résultat ci-dessous qui montre un bon accord entre le pic trouvé (de masse 2845,4) et la valeur de m/z calculée (2845,7).

<figure><img src="image_115.png" /><figcaption>Figure 97 : spectrométrie de masse (Maldi-TOF) du peptide pur en mode ion positif réflecteur en utilisant une matrice CHCA à 10 mg/mL in CH<sub>3</sub>CN/H<sub>2</sub>O/TFA, 50:50:0.1.</figcaption></figure>
#### IV. Déroulement des expériences

##### 1. La caractérisation électrochimique

Les études par Voltampérométrie cyclique ont été réalisées à l'aide d'un potentiostat Autolab et l'enregistrement des données a été réalisé par le logiciel NOVA 2.2.

La cellule électrochimique composée par un puit en PDMS collé sur une lamelle de verre ou sur l'électrode de travail, est directement branchée au potentiostat.

##### 2. L'étude par électrochimiluminescence

Cette étude a été effectuée sur les mêmes cellules électrochimiques en enregistrant à la fois le signal électrochimique et le signal luminescent.

La détection luminescente a été réalisée par un microscope inversé ZEISS (Allemagne) couplé à une caméra EM-CCD Digital Camera de HAMAMATSU (Japon) reliée au logiciel HCImage Live. Le traitement des images a été fait par le logiciel ImageJ.

##### 3. La détection de la perméabilisation de la bicouche lipidique

Cette partie consiste à coupler l'électrochimiluminescence à l'ampérométrie et à la photoluminescence. Pour réaliser ce couplage, nous utilisons le dispositif ci-dessous :
<figure><img src="image_116.png" /><figcaption>Figure 98 : Montage utilisé pendant le couplage</figcaption></figure>

Ce dispositif est composé d'une cellule électrochimique reliée à un potentiostat (mini Autolab) et déposée sur un microscope inversé ZEISS (Allemagne) couplé à une caméra EM-CCD Digital Camera de HAMAMATSU (Japon) reliée au logiciel HCImage Live. Une diode a été mise en place pour permettre l'excitation de luminophore et grâce à un système de synchronisation E-corder, nous avons réussi à contrôler cette diode : elle s'allume pendant 100 ms et elle s'éteint pendant 900 ms.

La pointe de pipette est remplie par une solution de glucose, dans les chapitres 2, 4 et 5. Dans le chapitre 3, la pointe est remplie par une solution de glucose à 0,7 M contenant Le co-réactif TPrA (tripropylamine, Sigma Aldrich) à 20 mM (38 µL de TPrA dans 10 mL de Glucose) et en ajustant le pH de la solution à 7,4. Après, la solution obtenue est utilisée pour dissoudre une masse de $[Ru(bpy)₃]^{2+}$ (Tris(2,2'-bipyridyl)dichloro-ruthenium(II) hexahydrate, Sigma Aldrich). Afin d'obtenir une concentration égale à 30 µM, il faut d'abord préparer une solution à 2,5 mM en solubilisant 9,36 mg dans 5 mL de la solution déjà préparée. Après, une dilution est nécessaire pour obtenir une solution à 30 µM (60 µL de la solution à 2,5 mM dans 4940 µL de la solution de TPrA à 20 mM).
Les liposomes sont ajoutés en haut de la cellule électrochimique et les images sont enregistrer
avec une sensibilité maximale de la caméra (255) et un temps d'exposition égal à 250 ms.
<figure><img src="image_117.png" /></figure>
Listes des figures et des
tableaux
<figure><img src="image_118.png" /></figure>
## Liste des figures

Figure 1 : Evolution des approches associant électrochimie et luminescence (fluorescence) permettant d'étudier le passage transmembranaire de biomolécules ou de distinguer les propriétés physico-chimiques des deux feuillets d'une bicouche lipidique. 8

Figure 2 : Principe de l'électrochimiluminescence basée sur l'oxydation concomitante d'un luminophore et d'un co-réactif sacrificiel. 9

Figure 3 : Description de l'approche permettant d'imager la perméabilisation membranaire d'un liposome géant par électrochimiluminescence. 10

Figure 4 : Frise chronologique de l'évolution des expériences d'électrochimiluminescence au cours du temps inspiré de la référence [26]. 19

Figure 5 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche d'annihilation. 20

Figure 6 : Formules chimiques des deux réactifs engagés dans la réaction d'électrochimiluminescence le complexe de ruthénium (a) et l'oxalate (b). 22

Figure 7 : Formules chimiques des deux réactifs engagés dans la réaction d'électrochimiluminescence : le complexe de ruthénium (a) et le peroxodisulfate (b). 23

Figure 8 : Formules chimiques des deux réactifs engagés dans la réaction d'électrochimiluminescence : (a) le complexe de ruthénium et (b) la tri-n-propylamine. 23

Figure 9 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche du co-réactif en utilisant le couple [Ru(bpy)₃]²⁺/Tri-n-propylamine - Mécanisme 1. 25

Figure 10 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche du co-réactif en utilisant le couple Ru(bpy)₃²⁺/Tri-n-propylamine - Mécanisme 2. 27

Figure 11 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche du co-réactif en utilisant le couple [Ru(bpy)₃]²⁺/Tri-n-propylamine - Mécanisme 3. 28

Figure 12 : Frise chronologique de l'évolution de l'imagerie en électrochimiluminescence au cours du temps [36]. 29

Figure 13 : Forme sandwich de l'immunodosage de la protéine humaine CRP composé par : B, biotine; L, liposomes; S, streptavidine; C, protéine (analyte); et M, microbilles magnétiques [37]. 30
Figure 14 : Utilisation du luminol pour l'analyse du cholestérol de la membrane plasmique de la cellule. Le peroxyde d'hydrogène est un produit de l'oxydation du cholestérol membranaire en présence de l'enzyme cholestérol oxydase. La réaction d'ECL du couple H₂O₂/Luminol génère de la lumière bleue à 428 nm (Schéma reproduit de la référence [40]). 31

Figure 15 : Représentation de la méthode d'immunodosage par ECL basée sur une association Streptavidine-Biotine et anticorps-luminophore. 32

Figure 16 : La figure est issue de la référence [43]. Elle représente le dispositif utilisé pour imager les nanoparticules de polymère conjugué F8BT (à gauche) et le résultat obtenu suite à une émission de lumière due à une réaction d'électrochimiluminescence entre la TPrA et le F8BT. 32

Figure 17 : Imagerie ECL de la détection de glucose intra-cellulaire sur des cellules individuelles. Le couple de réactifs ECL utilisé dans ce cas est le L012/H₂O₂. Le peroxyde d'hydrogène est obtenu suite à une réaction d'oxydation de glucose en présence d'enzyme [45]. 33

Figure 18 : Possibilités d'encapsulation dans un liposome [50]. 34

Figure 19 : Structure générale d'un liposome. 35

Figure 20 : Exemple de structure d'un phospholipide [61]. 36

Figure 21 : Changement de phase d'un phospholipide suite à un changement de température. 38

Figure 22 : Structure du DOPG 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) avec des chaines en C18 et une température de transition de phase Tg= -18°C. 39

Figure 23 : 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) avec des chaines en C18 et une température de transition de phase Tg= -17°C. 39

Figure 24 : Structure du DPPE-NBD 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium Salt) avec des chaines en C16 et un fluorophore nitobenzoxadiazole. 40

Figure 25 : Structure du cholestérol. 41

Figure 26 : Classification des liposomes [65]. 42

Figure 27 : Schéma de principe de l'électroformation et observation des liposomes obtenus [68]. 43
Figure 28 : Schéma d'un dispositif microfluidique générateur de gouttes : étape de la formation des micelles inversées. 44

Figure 29 : Formation des liposomes par transfert de phase (figure prise de la référence [70]). 45

Figure 30 : Schéma explicatif des bénéfices des nanovecteurs ou liposomes dans le domaine de la vectorisation des médicaments [73]. 46

Figure 31 : fusion de deux vésicules en présence d'un tensio-actif (Tween 20) par ouverture simultanée de deux pores [75]. 47

Figure 32 : Détection de la libération liposomale par électrochimie de la vitamine C (a) [79] et de la cathécholamine (b) [81]. 51

Figure 33 : Stratégie adoptée pour imager l'ouverture d'un liposome par électrochimiluminescence. 52

Figure 34 : Fabrication de liposomes par la méthode de transfert de phase et la préparation de l'émulsion par microfluidique. 55

Figure 35 : Observation microscopique de vésicules contenant $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ à $2,5 \cdot 10^{-4}$ mol.L$^{-1}$ ainsi que le co-réactif TPrA à $0,1$ mol.L$^{-1}$, et posées sur une surface en polystyrène. Observation (a) en contraste de phase, (b) avec un filtre GFP et (c) avec un filtre rhodamine. Barre d'échelle : 300 µm. 56

Figure 36 : Longueur d'onde d'excitation et d'émission du NBD. 57

Figure 37 : Dispositif électrochimique pour l'enregistrement des voltampérogrammes avec une électrode de travail en carbone vitreux (a) et une autre transparente déposée à la surface de la lamelle de verre(b) (l'électrode est en ITO ou graphène). 60

Figure 38 : Voltampérométrie cyclique d'une solution de complexe $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ à $1$ mmol.L$^{-1}$ dans un milieu tampon phosphate à $10$ mmol.L$^{-1}$ et pH = 7,54, sur différents matériaux d'électrode. Nature de l'électrode de travail : (a) carbone vitreux de diamètre $d = 3$ mm, (b) oxyde d'indium-étain commercial de diamètre $d = 7$ mm, (c) oxyde d'indium-étain préparé au laboratoire et $d= 7$ mm, (d) graphène de diamètre $d= 7$ mm. Vitesse de balayage $v = 50$ mV.s$^{-1}$. L'électrode de référence est en Ag/AgCl et la contre électrode est un fil de platine de diamètre $1$ mm et de longueur $1$ cm. 61

Figure 39 : Voltampérométrie cyclique d'une solution de tri-$n$-propylamine à $0,1$ mol.L$^{-1}$ dans un milieu tampon phosphate à $10$ mmol.L$^{-1}$ et pH = 7,54, sur différents matériaux d'électrode.
Figure 46 : La loi de Weibull et la superposition d'un pic isolé du chronoampérogramme obtenu (en noir) et de la modélisation du pic par la loi de Weibull (en pointillé rouge) qui montre que cette loi offre la meilleure modélisation pour nos pics. .................................................... 73

Figure 47 : Les étapes suivies lors du traitement mathématique au cours de l'étape de déconvolution. .................................................................................................................... 74

Figure 48 : Etude de la distribution de tailles de liposomes obtenues à partir des pics d'oxydation de la solution encapsulée dans ces liposomes contient le [Ru(bpy)₃]²⁺ (C= 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹) et la TPrA (C= 0,1 mol.L⁻¹). La figure représente le pourcentage de liposomes en fonction des valeurs de rayons obtenues par intégration, pour 27 évènements d'oxydation. 76

Figure 49 : Dispositif utilisé pour le couplage de l'ECL avec l'électrochimie et la photoluminescence. .................................................................................................................... 78

Figure 50 : Acquisition utilisée pour la collection simultanée des données en électrochimie, ECL et photoluminescence. La figure correspond à l'acquisition pendant 2 secondes. ............ 79

Figure 51 : Images obtenues en ECL et en photoluminescence qui montrent l'ouverture d'un liposome (cerclé en traits pointillés rouge) à la surface d'une électrode et la détection d'ECL. Barre d'échelle : 200 µm. Le t = 0 s correspond au moment de déclenchement de la mesure. 80

Figure 52 : Combinaison typique des signaux obtenu en ampérométrie (bleu), photoluminescence (vert) et ECL (rouge) suite à la perméabilisation de la membrane d'un liposome (montré dans la Figure 53) à la surface d'une électrode polarisée. ................................. 81

Figure 53 : Images en photoluminescence et en ECL qui mettent en évidence la perméabilisation d'un liposome. Barre d'échelle = 200µm. La région d'intérêt (ROI) correspond aux cercles en pointillé blanc. .................................................................................................................... 82

Figure 54 : Variation typique de la distance apparente δ² de la propagation du signal lumineux de la réaction d'électrochimiluminescence en fonction du temps. L'étude a été réalisée sur 7 liposomes et nous avons obtenu une valeur moyenne de pente (4D) égale à 20.10⁻⁶ ± 3.10⁻⁶ cm².s⁻¹. .................................................................................................................................................... 83

Figure 55 : Observation de l'empreinte digitale sur une électrode en ITO, par microscopie à fond clair (a) et ECL négative (b) en présence d'un potentiel positif (1,13 V vs. Ag/Ag/Cl). Le luminophore est le [Ru(bpy)₃]²⁺ (C = 5.10⁻⁴ M) et le co-réactif TPrA (C = 50.10⁻³ M) dans du PBS à 0,01 M et pH = 7,4. Les images numérotées de 1 à 4 montrent qu'avec l'approche d'ECL
négative, il est possible d'observer les irrégularités de l'empreinte digitale. Figure issue de la référence [90].

Figure 56 : La figure présente deux séries d'images en microscopie à fond clair de (a) à (c) et en ECL négative de (d) à (f) de cellules vivantes PC12. Le luminophore est le [Ru(bpy)₃]²⁺ est à 5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ et HEPES à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du PBS à 0,01 M et pH = 7,4. L'ECL est obtenue par application d'un potentiel positif égal à 1,3 V (vs. Ag/Ag/Cl) à une électrode en ITO couverte par une membrane en silice. La barre d'échelle : 20 µm. La figure vient de la référence [2] et elle a été modifiée par rapport à la figure d'origine.

Figure 57 : Une image de mitochondries déposées à la surface d'une électrode de carbone vitreux obtenue en ECL négative (a), en ECL négative avec inversion de couleur (b), en photoluminescence de NADH (c) et du MitoTracker rouge (d). L'électrochimiluminescence négative a été réalisée avec le [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et la TPrA à 0,1 mol.L⁻¹. L'électrode était polarisée à +1,45 V. La barre d'échelle : 10 mm [48].

Figure 58 : Schéma de la stratégie adoptée pour détecter la perméabilisation de la bicouche lipidique par ECL négative.

Figure 59 : Surface d'une électrode en ITO de diamètre d = 0,8 mm non polarisée (a) et polarisée (b) à un potentiel de +1,2 V (vs. Ag/AgCl). Le milieu est une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et un pH = 7,54 contenant le luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹. la barre d'échelle : 200 µm.

Figure 60 : Intensité d'électrochimiluminescence en fonction du temps avant et après déclenchement du potentiel. L'expérience a été réalisée sur une surface d'électrode d'ITO de diamètre d = 0,8 mm. Le potentiel appliqué est +1,2 V (vs. Ag/AgCl). La solution contient le luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH = 7,54.

Figure 61 : la figure représente une série d'images du signal électrochimiluminescent obtenu à la surface d'une électrode de travail en ITO (d=0,8 mm) suite à l'application d'un potentiel égal à 1,2V (vs. Ag/Ag/Cl) et en présence d'une solution de luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,54. Les liposomes contiennent une solution de sucrose à 0,7 mol.L⁻¹ dans du PBS. La figure montre l'apparition de la lumière suite à l'application du potentiel à 7 secondes, les tâches noires, sur l'image à 7 secondes, sont des défauts à la surface
de l'électrode. A noter que l'enregistrement d'images en photoluminescence n'est pas pertinent ici car le luminophore est présent dans tout le milieu extérieur. Barre d'échelle : 200 µm. Ici, la région d'intérêt correspond à toute l'image. 95

Figure 62 : Série d'images obtenues en ECL (a) et courbes représentant la variation de l'intensité ECL en fonction du temps au niveau du cercle blanc (b) et sur toute l'image (c). L'expérience a été réalisée sur une électrode en ITO en présence d'un potentiel égal à 1,2 V (vs. Ag/Ag/Cl). Le milieu extérieur est composé d'une solution de luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et du co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans du PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,54. Les liposomes contiennent une solution de sucrose à 0,7 M dans le PBS. 96

Figure 63 : Variation typique de la distance apparente δ² de la propagation de la tâche noire due à la dilution des réactifs du milieu extérieur (une solution de luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et du co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH = 7,54) en fonction du temps. La solution encapsulée est une solution de sucrose à 0,7 M dans du PBS. Le liposome étudié sur cette figure correspond au liposome montré sur la Figure 62. 98

Figure 64 : Variation de l'intensité ECL en fonction du temps sur une électrode d'ITO en présence de potentiel (1,2 V vs. Ag/AgCl). Le milieu extérieur est composé du luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹, du co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹, et de glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,54. Les liposomes contiennent une solution de sucrose à 0,7 mol.L⁻¹ dans le PBS ainsi que le quencher FcMeOH à 5.10⁻⁴ mol.L⁻¹. La zone d'intérêt correspond à la totalité de l'image. Barre d'échelle : 120 µm. 100

Figure 65 : Les différents mécanismes qui expliquent comment un peptide antimicrobien peut déstabiliser la membrane lipidique. 109

Figure 66 : séquence de la mélittine (a) et un dessin schématique en 3d (b) [169] 113

Figure 67 : Images photoluminescentes d'un liposome géant asymétrique composé de DOPG et de DOPC sur ses feuillets externe et interne, respectivement. Le liposome contient les réactifs ECL ([Ru(bpy)₃]²⁺ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹) et TPrA (0,1 mol.L⁻¹ )) et repose sur une surface en ITO recouverte de poly-L-lysine polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. Images enregistrées à t = 5 min. et t = 30 min. de polarisation. Ces images de microscopie obtenues en photoluminescence (PL)
révèlent clairement la localisation du complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ à l'intérieur du liposome avec une lumière excitatrice à λex = 455 nm.................................................................................................................. 115

Figure 68 : Voltampérogramme cyclique d'une solution de [Ru(bpy)₃]²⁺ à 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ dans une solution de glucose à 0,7 mol.L⁻¹, dissout dans du PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,5. L'expérience est réalisée sur une électrode de travail en ITO, couverte (rouge) et non-couverte (bleu) par de la poly-L-lysine, polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. La vitesse de balayage égale à 50 mV.s⁻¹.................................................................................................................................................................................. 116

Figure 69 : Voltampérogramme cyclique d'une solution de [Ru(bpy)₃]²⁺ à 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ et tri-n-propylamine à 0,1 mol.L⁻¹ dans une solution de glucose à 0,7 mol.L⁻¹, dissout dans du PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,5. L'expérience est réalisée sur une électrode de travail en ITO, couverte (rouge) et non couverte (bleu) par de la poly-L-lysine, et polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. La vitesse de balayage égale à 50 mV.s⁻¹.................................................................................................................. 116

Figure 70 : Variation de l'intensité ECL en fonction du temps d'un mélange comprenant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹), la tri-n-propylamine (0,1 mol.L⁻¹), et du glucose (0,7 mol.L⁻¹), dissouts dans du PBS (10 mmol.L⁻¹, pH= 7,5). L'expérience est réalisée sur une électrode de travail en ITO avec un balayage de potentiel de -0,1 V à +1,6 V vs. Ag/AgCl, couverte (rouge) et non-couverte (bleu) par de la poly-L-lysine.................................................. 117

Figure 71 : Protocole d'acquisition échantillonnée utilisé pour l'enregistrement simultané des données en électrochimie, ECL et photoluminescence. La figure correspond à une durée totale d'acquisition de 2 secondes.................................................................................................................. 119

Figure 72 : (a) Superposition d'images ECL (en haut) et PL (en bas) montrant la perméation d'un liposome DOPC/DOPG par la mélittine à 1.10⁻⁵ mol.L⁻¹. Le liposome contenant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ à 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 0,1 mol.L⁻¹ repose sur une électrode en ITO polarisée (+1,2 V vs. Ag/AgCl) et modifiée par de la poly-L-lysine. Pour éviter tout chevauchement entre les deux types d'informations visuelles, les images ECL et PL présentent une différence de temps d'acquisition initiale de 500 ms. La mise au point a été faite à la surface de l'électrode ITO pendant l'imagerie ECL et PL. Les carrés blancs en pointillés dans les images PL et ECL représentent la région d'intérêt (ROI) typique prise en compte pour les analyses quantitatives des intensités correspondantes. Barre d'échelle : 100 µm. (b) Évolution des signaux PL (courbe bleue) et ECL (courbe rouge) obtenus en fonction du temps pour un seul liposome [présenté en (A)] perméabilisé par la mélittine. .................................... 120
Figure 78 : Représentation schématique du processus ECL issu de l'oxydation du glucose par le système NAD+, GDH et de l'ouverture des liposomes à l'électrode.................................... 137

Figure 79 : voltampérométrie cyclique d'une solution tampon phosphate salin (PBS ; C = 10 mM ; pH = 7,5) réalisée en absence (noir) et présence (bleu) de NADH (C = 10 mM) sur une électrode de platine (diam. 0,5 mm) et à v = 50 mV/s. Contre électrode : fil de platine de diamètre égal à 1mm et de longueur égale à 1cm. Expérience réalisée à température ambiante.
.................................................................................................................................................. 138

Figure 80 : Etude voltampérométrique montrant, en couleur rouge, la formation de NADH cinq minutes après avoir mélangé les trois réactifs suivants : NAD+ (10.10⁻³ mol.L⁻¹), GDH (80 U/mL) et glucose (0,7 mol.L⁻¹). Les voltamogrammes en noir et vert ont été obtenus respectivement en absence de GDH et de glucose. Conditions expérimentales : solvant PBS (10 mM, pH = 7.54), électrode de travail en platine (diamètre : 0.5 mm) et contre électrode en platine (fil de platine). Température : 20 °C.
.................................................................................. 139

Figure 81 : Etude voltampérométrique montrant la formation de NADH en fonction du temps à partir d'une solution de PBS (1.10⁻² mol.L⁻¹, pH = 7.54) contenant du NAD+ (1.10⁻² mol.L⁻¹), l'enzyme GDH (80 U/mL), et du glucose (0,7 mol.L⁻¹). Courbe noire (PBS), courbe orange (t = 0 min.), courbe jaune (5 min.), courbe rouge (20 min.), courbe verte (30 min.), courbe bleu (60 min.). La courbe en couleur grise correspond à une solution contenant du NADH authentique à une concentration de 1.10⁻² mol.L⁻¹. Conditions : électrode de travail en Pt (diam. 0.5 mm), et contre électrode en Pt (fil). Vitesse de balayage : v = 50 mV/s. Température ambiante (20 °C).
.................................................................................................................................................. 140

Figure 82 : (a) Evolution du signal électrochimiluminescent en fonction du potentiel appliqué. Conditions expérimentales : milieu PBS (1.10⁻² mol.L⁻¹ ; pH = 7.54) ; [Ru(bpy)₃]²⁺ (C = 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ ) ; NADH (C = 1.10⁻² mol.L⁻¹) ; électrode de travail en ITO (diam. : 7 mm) ; contre-électrode : fil de platine. Les images montrent l'intensité lumineuse observée à la surface de l'électrode à différentes valeurs du potentiel. La figure (b) montre voltampérométrie cyclique d'une solution de PBS réalisée en absence (noir) et présence (bleu) de [Ru(bpy)₃]²⁺ (C = 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ ) sur une électrode en ITO (diam. 0.9 mm).
.................................................................................. 141

Figure 83 : Dispositif et acquisition utilisés pendant le couplage de l'ECL à l'électrochimie et à la photoluminescence.
.................................................................................................................................................. 143
Figure 84 : (a) Images obtenues en ECL et PL montrant la perméabilisation d'un liposome de type DOPC/DOPG. Le liposome, qui repose sur une surface en ITO polarisée (E = + 1.2 V vs. Ag/AgCl) contient initialement du NADH (10 mM) et le complexe $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹). Afin d'éviter tout chevauchement entre les deux types d'informations visuelles, les images ECL et PL ont une différence de temps d'acquisition initiale de 500 ms. Pendant l'imagerie ECL et PL la mise au point a été faite au niveau de la surface de l'électrode en ITO. Les traits blancs en pointillés dans les images PL et ECL représentent la région d'intérêt (ROI) typique prise en compte pour les analyses quantitatives des intensités correspondantes (cf. (b)). (b) Évolution des signaux PL (courbe verte), ECL (courbe rouge) et ampérométrique (courbe bleue) obtenus en fonction du temps pour un seul liposome [indiqué en (A)] perméabilisé par polarisation de la surface en ITO. Barre d'échelle : 100 µm. Note : t = 0 sec. correspond à l'ajout des liposomes dans la cellule électrochimique.................................................................................................................. 145

Figure 85 : (A) Images obtenues en ECL et PL montrant la perméabilisation d'un liposome ayant joué le rôle d'un microréacteur pour la dégradation du glucose par l'enzyme GDH en présence de NAD⁺. Le liposome, qui repose sur une surface en ITO polarisée (E = + 1.2 V vs. Ag/AgCl) contient initialement : NAD⁺ (10 mM), $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹), GDH (80 U/mL), glucose (0,35 mol.L⁻¹). La réaction enzymatique conduit à la production de NADH qui est utilisé comme co-réactif dans le processus ECL. Les traits blancs en pointillés dans les images PL et ECL représentent la région d'intérêt (ROI) typique prise en compte pour les analyses quantitatives des intensités correspondantes (cf. (B)). (B) Évolution des signaux PL (courbe verte), ECL (courbe rouge) et ampérométrique (courbe bleue) obtenus en fonction du temps pour un seul liposome [indiqué en (A)] perméabilisé par polarisation de la surface en ITO. Barre d'échelle : 100 µm. Note : t = 0 sec. correspond à l'ajout des liposomes dans la cellule électrochimique.................................................................................................................. 148

Figure 86 : Cellule électrochimique composée par un bloc de PDMS trouvé et collé sur une lamelle d'ITO (22 mm × 22 mm × 0,13 mm), par plasma. .................................................................................................................. 159

Figure 87 : Collage d'un bloc de PDMS sur une lame de verre afin d'obtenir la cellule électrochimique.................................................................................................................................................................................. 161

Figure 88 : Photo d'un disque de graphène commercial et schéma de sa composition. .................................................................................................................. 162

Figure 89 : Composition des morceaux de graphène après le dépôt de $Al_2O_3$. .................................................................................................................. 162

Figure 90 : Composition des morceaux de graphène après le dépôt du PMMA. .................................................................................................................. 163
<table><tr><td>Figure 91 : Composition des morceaux de graphène après la dissolution du cuivre</td><td>163</td></tr><tr><td>Figure 92 : Graphène déposé sur une lamelle de verre et observé par microscopie optique</td><td>164</td></tr><tr><td>Figure 93 : Schéma des étapes de récupération du dispositif microfluidique sur le PDMS</td><td>166</td></tr><tr><td>Figure 94 : Dispositif microfluidique collé</td><td>166</td></tr><tr><td>Figure 95 : Eppendorf contenant le système biphasique : une solution de phospholipide (DOPG) dans l'huile minérale et une solution de glucose</td><td>170</td></tr><tr><td>Figure 96 : Système utilisé pour la fabrication des liposomes : le dispositif microfluidique est inséré dans le système biphasique</td><td>171</td></tr><tr><td>Figure 97 : spectrométrie de masse (Maldi-TOF) du peptide pur en mode ion positif réflecteur en utilisant une matrice CHCA à 10 mg/mL in CH3CN/H2O/TFA, 50:50:0.1</td><td>172</td></tr><tr><td>Figure 98 : Montage utilisé pendant le couplage</td><td>174</td></tr></table>
## Liste des tableaux

<table><caption>Tableau 1: Définitions des différents types de luminescence et exemples de leurs applications.</caption><tr><td></td><td>16</td></tr><tr><td>Tableau 2 : Nom du phospholipide selon la nature du résidu.</td><td>36</td></tr><tr><td>Tableau 3: Différents types de phospholipides.</td><td>37</td></tr><tr><td>Tableau 4 : comparaison des densités de courant de pic d'oxydation du complexe du ruthénium (bpyridine) (II) sur différents matériaux d'électrode.</td><td>62</td></tr><tr><td>Tableau 5 : Comparaison des densités de courant de pic d'oxydation de la tri-n-propylamine sur différents matériaux d'électrode.</td><td>63</td></tr></table>
<figure><img src="image_119.png" /></figure>
Références Bibliographiques
<figure><img src="image_120.png" /></figure>
Bibliographie

[1] P. McCord et A. J. Bard, « Electrogenerated chemiluminescence », *J. Electroanal. Chem. Interfacial Electrochem.*, vol. 318, n° 1-2, p. 91-99, nov. 1991, doi: 10.1016/0022-0728(91)85296-2.

[2] R. G. Compton, A. C. Fisher, et R. G. Wellington, « A thin-layer electrode cell for fluorescence. Measurements on electrogenerated intermediates », *Electroanalysis*, vol. 3, n° 1, p. 27-29, janv. 1991, doi: 10.1002/elan.1140030105.

[3] Christian. Amatore, Bruno. Fosset, K. M. Maness, et R. Mark. Wightman, « Theory of electrochemical luminescence at double band electrodes. An examination of "steady-state" diffusion at ultramicroelectrodes », *Anal. Chem.*, vol. 65, n° 17, p. 2311-2316, sept. 1993, doi: 10.1021/ac00065a024.

[4] F. Miomandre et P. Audebert, Éd., *Luminescence in Electrochemistry*. Cham: Springer International Publishing, 2017. doi: 10.1007/978-3-319-49137-0.

[5] R. de Oliveira et al., « Electrochemical quenching of the fluorescence produced by NBD-labelled cell penetrating peptides: A contribution to the study of their internalization in large unilamellar vesicles », J. Electroanal. Chem., vol. 788, p. 225-231, mars 2017, doi: 10.1016/j.jelechem.2017.02.006.

[6] A. I. Perez Jimenez, L. Challier, E. Aït-Yahiatène, J. Delacotte, E. Labbé, et O. Buriez, « Selective Electrochemical Bleaching of the Outer Leaflet of Fluorescently Labeled Giant Liposomes », *Chem. - Eur. J.*, vol. 23, n° 28, p. 6781-6787, mai 2017, doi: 10.1002/chem.201605786.

[7] P. Audebert et F. Miomandre, Éd., *Luminescence in Electrochemistry: Applications in Analytical Chemistry, Physics and Biology*, 1st ed. 2017. Cham: Springer International Publishing: Imprint: Springer, 2017. doi: 10.1007/978-3-319-49137-0.

[8] L. Marcu, « Fluorescence Lifetime Techniques in Medical Applications », *Ann. Biomed. Eng.*, vol. 40, n° 2, p. 304-331, févr. 2012, doi: 10.1007/s10439-011-0495-y.

[9] F. Zu et al., « The quenching of the fluorescence of carbon dots: A review on mechanisms and applications », *Microchim. Acta*, vol. 184, no 7, p. 1899-1914, juill. 2017, doi: 10.1007/s00604-017-2318-9

[10] J. S. Klein, C. Sun, et G. Pratx, « Radioluminescence in biomedicine: physics, applications, and models », *Phys. Med. Biol.*, vol. 64, n° 4, Art. n° 4, févr. 2019, doi: 10.1088/1361-6560/aaf4de.

[11] G. Remond, « Applications of cathodoluminescence in mineralogy », *J. Lumin.*, vol. 15, n° 2, Art. n° 2, juin 1977, doi: 10.1016/0022-2313(77)90015-1.

[12] H. Degenhardt, « Principles and applications of electroluminescence », *Sci. Nat.*, vol. 63, n° 12, Art. n° 12, déc. 1976, doi: 10.1007/BF00622787.

[13] zainab jabarah, I. Mahdi, et wurood jaafer, « Lumonil Compounds in Criminal Chemistry (A review part I) », *Egypt. J. Chem.*, vol. 0, n° 0, Art. n° 0, avr. 2019, doi: 10.21608/ejchem.2019.9697.1651.

[14] A. J. Syed et J. C. Anderson, « Applications of bioluminescence in biotechnology and beyond », *Chem. Soc. Rev.*, vol. 50, n° 9, Art. n° 9, 2021, doi: 10.1039/D0CS01492C.

[15] Y. Xie et Z. Li, « Triboluminescence: Recalling Interest and New Aspects », *Chem*, vol. 4, n° 5, Art. n° 5, mai 2018, doi: 10.1016/j.chempr.2018.01.001.
[16] Tandiono, Siew-Wan Ohl, Dave S. W. Ow, Evert Klaseboer, Victor V. Wong, Rainer Dumke, and Claus-Dieter Ohl., « Sonochemistry and sonoluminescence in microfluidics », Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 108, no 15, p. 5996-5998, avr. 2011, doi: 10.1073/pnas.1019623108.

[17] S. St. J. Warne, « Thermoluminescence in the earth sciences and archeology », *J. Therm. Anal.*, vol. 48, n° 1, Art. n° 1, janv. 1997, doi: 10.1007/BF01978964.

[18] R. T. Dufford, D. Nightingale, et L. W. Gaddum, « Luminescence of grignard compounds in electric and magnetic fields, and related electrical phenomena », J. Am. Chem. Soc., vol. 49, no 8, Art. no 8, août 1927, doi: 10.1021/ja01407a002.

[19] N. Harvey, « Luminescence during Electrolysis », *J. Phys. Chem.*, vol. 33, n° 10, Art. n° 10, oct. 1929, doi: 10.1021/j150304a002.

[20] D. M. Hercules, « Chemiluminescence Resulting from Electrochemically Generated Species », *Science*, vol. 145, n° 3634, p. 808-809, août 1964, doi: 10.1126/science.145.3634.808.

[21] R. E. Visco et E. A. Chandross, « Electroluminescence in Solutions of Aromatic Hydrocarbons », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 86, n° 23, Art. n° 23, déc. 1964, doi: 10.1021/ja01077a073.

[22] N. E. Tokel et A. J. Bard, « Electrogenerated chemiluminescence. IX. Electrochemistry and emission from systems containing tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(II) dichloride », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 94, n° 8, Art. n° 8, avr. 1972, doi: 10.1021/ja00763a056.

[23] M.-M. Chang, T. Saji, et A. J. Bard, « Electrogenerated chemiluminescence. 30. Electrochemical oxidation of oxalate ion in the presence of luminescers in acetonitrile solutions », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 99, n° 16, Art. n° 16, août 1977, doi: 10.1021/ja00458a028.

[24] J. B. Noffsinger et N. D. Danielson, « Generation of chemiluminescence upon reaction of aliphatic amines with tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(III) », *Anal. Chem.*, vol. 59, n° 6, Art. n° 6, mars 1987, doi: 10.1021/ac00133a017.

[25] J. K. Leland et M. J. Powell, « Electrogenerated Chemiluminescence: An Oxidative-Reduction Type ECL Reaction Sequence Using Tripropyl Amine », *J. Electrochem. Soc.*, vol. 137, n° 10, Art. n° 10, oct. 1990, doi: 10.1149/1.2086171.

[26] W. Miao, « Electrogenerated Chemiluminescence and Its Biorelated Applications », *Chem. Rev.*, vol. 108, n° 7, Art. n° 7, juill. 2008, doi: 10.1021/cr068083a.

[27] L. Bouffier, S. Arbault, A. Kuhn, et N. Sojic, « L'électrochimiluminescence : une méthode de choix pour la bioanalyse », *Innov. Technol.*, mai 2018, doi: 10.51257/a-v1-p156.

[28] M. M. Richter, « Electrochemiluminescence (ECL) », *Chem. Rev.*, vol. 104, n° 6, Art. n° 6, juin 2004, doi: 10.1021/cr020373d.

[29] S. P. Forry et R. M. Wightman, « Electrogenerated Chemiluminescence Detection in Reversed-Phase Liquid Chromatography », *Anal. Chem.*, vol. 74, n° 3, Art. n° 3, févr. 2002, doi: 10.1021/ac0110193.

[30] G. Valenti, A. Fiorani, H. Li, N. Sojic, et F. Paolucci, « Essential Role of Electrode Materials in Electrochemiluminescence Applications », *ChemElectroChem*, vol. 3, n° 12, Art. n° 12, déc. 2016, doi: 10.1002/celc.201600602.

[31] E. Rampazzo, Bonacchi, Genovese, Juris, Marcaccio, Montalti, Paolucci, Sgarzi, Valenti, Zaccheroni, Prodi « Nanoparticles in metal complexes-based electrogenerated chemiluminescence for highly sensitive applications », Coord. Chem. Rev., vol. 256, no 15-16, Art. no 15-16, août 2012, doi: 10.1016/j.ccr.2012.03.021.
[32] I. Rubinstein et A. J. Bard, « Electrogenerated chemiluminescence. 37. Aqueous ecl systems based on tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(2+) and oxalate or organic acids », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 103, n° 3, Art. n° 3, févr. 1981, doi: 10.1021/ja00393a006.

[33] F. Bolletta, A. Rossi, et V. Balzani, « Chemiluminescence on oxidation of tris(2,2'-bipyridine)chromium(II): Chemical generation of a metal centered excited state », *Inorganica Chim. Acta*, vol. 53, p. L23-L24, janv. 1981, doi: 10.1016/S0020-1693(00)84729-5.

[34] W. Miao, J.-P. Choi, et A. J. Bard, « Electrogenerated Chemiluminescence 69: The Tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(II), (Ru(bpy)₃²⁺)/Tri-n-propylamine (TPrA) System RevisitedA New Route Involving TPrA •⁺ Cation Radicals », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 124, n° 48, Art. n° 48, déc. 2002, doi: 10.1021/ja027532v.

[35] R. C. Engstrom, K. W. Johnson, et Scott. DesJarlais, « Characterization of electrode heterogeneity with electrogenerated chemiluminescence », *Anal. Chem.*, vol. 59, n° 4, p. 670-673, févr. 1987, doi: 10.1021/ac00131a028.

[36] T. H. Fereja, F. Du, C. Wang, D. Snizhko, Y. Guan, et G. Xu, « Electrochemiluminescence Imaging Techniques for Analysis and Visualizing », *J. Anal. Test.*, vol. 4, n° 2, Art. n° 2, avr. 2020, doi: 10.1007/s41664-020-00128-x.

[37] W. Zhan et A. J. Bard, « Electrogenerated Chemiluminescence. 83. Immunoassay of Human C-Reactive Protein by Using Ru(bpy)₃²⁺-Encapsulated Liposomes as Labels », *Anal. Chem.*, vol. 79, n° 2, Art. n° 2, janv. 2007, doi: 10.1021/ac061336f.

[38] Parick Delmas, Françoise Padilla, et Corinne Poilbout, « Le cholestérol cellulaire, un régulateur important de la douleur inflammatoire », p. 115-118.

[39] F. R. Maxfield et I. Tabas, « Role of cholesterol and lipid organization in disease », *Nature*, vol. 438, n° 7068, Art. n° 7068, déc. 2005, doi: 10.1038/nature04399.

[40] G. Ma, J. Zhou, C. Tian, D. Jiang, D. Fang, et H. Chen, « Luminol Electrochemiluminescence for the Analysis of Active Cholesterol at the Plasma Membrane in Single Mammalian Cells », *Anal. Chem.*, vol. 85, n° 8, Art. n° 8, avr. 2013, doi: 10.1021/ac303304r.

[41] N. P. Sardesai, J. C. Barron, et J. F. Rusling, « Carbon Nanotube Microwell Array for Sensitive Electrochemiluminescent Detection of Cancer Biomarker Proteins », *Anal. Chem.*, vol. 83, n° 17, Art. n° 17, sept. 2011, doi: 10.1021/ac201292q.

[42] J. Zhang, S. Arbault, N. Sojic, et D. Jiang, « Electrochemiluminescence Imaging for Bioanalysis », *Annu. Rev. Anal. Chem.*, vol. 12, n° 1, p. 275-295, juin 2019, doi: 10.1146/annurev-anchem-061318-115226.

[43] Y.-L. Chang, R. E. Palacios, F.-R. F. Fan, A. J. Bard, et P. F. Barbara, « Electrogenerated Chemiluminescence of Single Conjugated Polymer Nanoparticles », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 130, n° 28, p. 8906-8907, juill. 2008, doi: 10.1021/ja803454x.

[44] A. J. Wilson, K. Marchuk, et K. A. Willets, « Imaging Electrogenerated Chemiluminescence at Single Gold Nanowire Electrodes », *Nano Lett.*, vol. 15, n° 9, Art. n° 9, sept. 2015, doi: 10.1021/acs.nanolett.5b02383.

[45] J. Xu, P. Huang, Y. Qin, D. Jiang, et H. Chen, « Analysis of Intracellular Glucose at Single Cells Using Electrochemiluminescence Imaging », *Anal. Chem.*, vol. 88, n° 9, Art. n° 9, mai 2016, doi: 10.1021/acs.analchem.6b01073.

[46] G. Valenti., Scarabino., Goudeau., Lesch., Jović., Villani., Sentic., Rapino., Arbault., Paolucci., Sojic., « Single Cell Electrochemiluminescence Imaging: From the Proof-of-Concept to Disposable Device-Based Analysis », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 139, no 46, p. 16830-16837, nov. 2017, doi: 10.1021/jacs.7b09260.
[47] H. Ding, W. Guo, et B. Su, « Imaging Cell-Matrix Adhesions and Collective Migration of Living Cells by Electrochemiluminescence Microscopy », *Angew. Chem. Int. Ed.*, vol. 59, n° 1, p. 449-456, janv. 2020, doi: 10.1002/anie.201911190.

[48] Y. Ma, C. Colin, J. Descamps, S. Arbault, et N. Sojic, « Shadow Electrochemiluminescence Microscopy of Single Mitochondria », *Angew. Chem. Int. Ed.*, vol. 60, n° 34, p. 18742-18749, août 2021, doi: 10.1002/anie.202105867.

[49] A. Gonzalez Gomez et Z. Hosseinidoust, « Liposomes for Antibiotic Encapsulation and Delivery », *ACS Infect. Dis.*, vol. 6, n° 5, Art. n° 5, mai 2020, doi: 10.1021/acsinfecdis.9b00357.

[50] G. Husseini, Y. Abbas, et N. Awad, « The Potential of Ultrasound Technology and Chemotherapy Carriers in Breast Cancer Treatment », *Al Qasimi Found.*, mai 2018, doi: 10.18502/aqf.0059.

[51] A. D. Bangham, M. M. Standish, et J. C. Watkins, « Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids », *J. Mol. Biol.*, vol. 13, n° 1, Art. n° 1, août 1965, doi: 10.1016/S0022-2836(65)80093-6.

[52] Carine Sebaaly, « Préparation à petite et grande échelle des liposomes encapsulant l'huile essentielle de clou de girofle libre et sous forme de complexe d'inclusion dans l'hydroxypropyl-β-cyclodextrine : caractérisation des nanostructures et évaluation de leur effet antioxydant », 2016. [En ligne]. Disponible sur : https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01359588/document

[53] H. Pick, A. C. Alves, et H. Vogel, « Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications », *Chem. Rev.*, vol. 118, n° 18, Art. n° 18, sept. 2018, doi: 10.1021/acs.chemrev.7b00777.

[54] T. M. Allen et P. R. Cullis, « Liposomal drug delivery systems: From concept to clinical applications », *Adv. Drug Deliv. Rev.*, vol. 65, n° 1, Art. n° 1, janv. 2013, doi: 10.1016/j.addr.2012.09.037.

[55] M. Reza Mozafari, C. Johnson, S. Hatziantoniou, et C. Demetzos, « Nanoliposomes and Their Applications in Food Nanotechnology », *J. Liposome Res.*, vol. 18, n° 4, Art. n° 4, janv. 2008, doi: 10.1080/08982100802465941.

[56] T. M. Taylor, J. Weiss, P. M. Davidson, et B. D. Bruce, « Liposomal Nanocapsules in Food Science and Agriculture », *Crit. Rev. Food Sci. Nutr.*, vol. 45, n° 7-8, Art. n° 7-8, oct. 2005, doi: 10.1080/10408390591001135.

[57] Q. Liu et B. J. Boyd, « Liposomes in biosensors », *The Analyst*, vol. 138, n° 2, Art. n° 2, 2013, doi: 10.1039/C2AN36140J.

[58] P. Walde et S. Ichikawa, « Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications », *Biomol. Eng.*, vol. 18, n° 4, Art. n° 4, oct. 2001, doi: 10.1016/S1389-0344(01)00088-0.

[59] M. Yoshimoto, Y. Miyazaki, M. Sato, K. Fukunaga, R. Kuboi, et K. Nakao, « Mechanism for High Stability of Liposomal Glucose Oxidase to Inhibitor Hydrogen Peroxide Produced in Prolonged Glucose Oxidation », *Bioconjug. Chem.*, vol. 15, n° 5, Art. n° 5, sept. 2004, doi: 10.1021/bc049909n.

[60] Kant Shashi, Kumar Satinder, et Prashar Bharat, « A complete review on : liposomes », *International Research Journal of Pharmacy*, vol. 3, no 7, Art. no 7, 2012. ISSN 2230 – 8407

[61] « Components and Structure - Biology - OpenStax CNX.html »ublié à https://cnx.org.at https://github.com/cnx-user-books/derived-from-osbooks-biology-bundle
[62] « Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes - Google Livres.htm ». EditeursNeale D. Ridgway et Roger S. McLeo https://doi.org/10.1016/C2013-0-18457-7

[63] « Manual on Membrane Lipids - Rajendra Prasad - Google Livres.htm ».

[64] G. Gregoriadis et Y. Perrie, « Liposomes », in eLS, 1re éd., John Wiley & Sons, Ltd, Éd. Wiley, 2010. doi: 10.1002/9780470015902.a0002656.pub2.

[65] A. Jash, A. Ubeyitogullari, et S. S. H. Rizvi, « Liposomes for oral delivery of protein and peptide-based therapeutics: challenges, formulation strategies, and advances », *J. Mater. Chem. B*, vol. 9, n° 24, p. 4773-4792, 2021, doi: 10.1039/D1TB00126D.

[66] H. A. H. Rongen, A. Bult, et W. P. van Bennekom, « Liposomes and immunoassays », *J. Immunol. Methods*, vol. 204, n° 2, Art. n° 2, mai 1997, doi: 10.1016/S0022-1759(97)00041-0.

[67] M. I. Angelova et D. S. Dimitrov, « Liposome Electroformation », p. 13.

[68] A.-M. Cazabat *et al.*, « Dépôt de matière et formation de motifs sur une surface solide : Méthodes microuidiques, Contrôle par forces capillaires et Génération de vésicules géantes », p. 250.

[69] S. Pautot, B. J. Frisken, et D. A. Weitz, « Engineering asymmetric vesicles », *Proc. Natl. Acad. Sci.*, vol. 100, n° 19, p. 10718-10721, sept. 2003, doi: 10.1073/pnas.1931005100.

[70] Y. Elani et al., « Measurements of the effect of membrane asymmetry on the mechanical properties of lipid bilayers », *Chem. Commun.*, vol. 51, no 32, Art. no 32, 2015, doi: 10.1039/C5CC00712G.

[71] G. H. Bobo, « L' utilisation des liposomes comme vecteurs médicamenteux », p. 61.

[72] V. P. Torchilin, « Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers », *Nat. Rev. Drug Discov.*, vol. 4, n° 2, Art. n° 2, févr. 2005, doi: 10.1038/nrd1632.

[73] « Vectorisation de médicaments _ Onconano.html ».

[74] J. Zimmerberg et M. M. Kozlov, « How proteins produce cellular membrane curvature », *Nat. Rev. Mol. Cell Biol.*, vol. 7, n° 1, p. 9-19, janv. 2006, doi: 10.1038/nrm1784.

[75] E. Karatekin, O. Sandre, et F. Brochard-Wyart, « Transient pores in vesicles », *Polym. Int.*, vol. 52, n° 4, p. 486-493, avr. 2003, doi: 10.1002/pi.1007.

[76] D. Lasic, « Novel applications of liposomes », *Trends Biotechnol.*, vol. 16, n° 7, Art. n° 7, juill. 1998, doi: 10.1016/S0167-7799(98)01220-7.

[77] A. Lorin, C. Flore, A. Thomas, et R. Brasseur, « Les liposomes : description, fabrication et applications », p. 14.

[78] « encapsulation des enzymes.html ».

[79] W. Cheng et R. G. Compton, « Investigation of Single-Drug-Encapsulating Liposomes using the Nano-Impact Method », *Angew. Chem. Int. Ed.*, vol. 53, n° 50, Art. n° 50, déc. 2014, doi: 10.1002/anie.201408934.

[80] J. Dunevall, H.Fathali, N.Najafinobar, J.Lovric, J.Wigstrom, A.S0. Cans, and A.G. Ewing, « Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 137, n° 13, p. 4344-4346, avr. 2015, doi: 10.1021/ja512972f.

[81] X. Li, J. Dunevall, L. Ren, et A. G. Ewing, « Mechanistic Aspects of Vesicle Opening during Analysis with Vesicle Impact Electrochemical Cytometry », *Anal. Chem.*, vol. 89, n° 17, Art. n° 17, sept. 2017, doi: 10.1021/acs.analchem.7b02226.

[82] E. Neumann, M. Schaefer-Ridder, Y. Wang, et P. H. Hofschneider, « Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. », *EMBO J.*, vol. 1, n° 7, p. 841-845, juill. 1982, doi: 10.1002/j.1460-2075.1982.tb01257.x.

[83] « Intermolecular and Surface Forces - Jacob N. Israelachvili - Google Livres.txt ».
[84] B. Redfera et G. Nortoia, « resole type phenol formaldehyde resin ratio 1:1.2, sodium hydroxide catalysed having a viscosity at 25° C. of 20 poises, was cured in a glass mould for 24 hours at 90° C. », p. 3.

[85] X. Wang et al., « Fabrication of Ultralong and Electrically Uniform Single-Walled Carbon Nanotubes on Clean Substrates », Nano Lett., vol. 9, n° 9, Art. n° 9, sept. 2009, doi: 10.1021/nl901260b.

[86] X. Zhao, Y. Liu, S. Inoue, T. Suzuki, R. O. Jones, et Y. Ando, « Smallest Carbon Nanotube Is 3 Å in Diameter », Phys. Rev. Lett., vol. 92, n° 12, Art. n° 12, mars 2004, doi: 10.1103/PhysRevLett.92.125502.

[87] W. Weibull, « A Statistical Distribution Function of Wide Applicability », J. Appl. Mech., vol. 18, n° 3, p. 293-297, sept. 1951, doi: 10.1115/1.4010337.

[88] C. Amatore, S. Arbault, M. Guille, et F. Lemaître, « Electrochemical Monitoring of Single Cell Secretion: Vesicular Exocytosis and Oxidative Stress », Chem. Rev., vol. 108, n° 7, p. 2585-2621, juill. 2008, doi: 10.1021/cr068062g.

[89] D. J. Walls, S. J. Haward, A. Q. Shen, et G. G. Fuller, « Spreading of miscible liquids », Phys. Rev. Fluids, vol. 1, n° 1, Art. n° 1, mai 2016, doi: 10.1103/PhysRevFluids.1.013904.

[90] L. Xu, Y. Li, S. Wu, X. Liu, et B. Su, « Imaging Latent Fingerprints by Electrochemiluminescence », Angew. Chem. Int. Ed., vol. 51, n° 32, p. 8068-8072, août 2012, doi: 10.1002/anie.201203815.

[91] A. Zanut et al., « Insights into the mechanism of coreactant electrochemiluminescence facilitating enhanced bioanalytical performance », Nat. Commun., vol. 11, n° 1, p. 2668, mai 2020, doi: 10.1038/s41467-020-16476-2.

[92] F. Li, Y. Yu, Q. Li, M. Zhou, et H. Cui, « A Homogeneous Signal-On Strategy for the Detection of *rpoB* Genes of Mycobacterium tuberculosis Based on Electrochemiluminescent Graphene Oxide and Ferrocene Quenching », Anal. Chem., vol. 86, n° 3, p. 1608-1613, févr. 2014, doi: 10.1021/ac403281g.

[93] L. Hu, M. Lei, J. Zhang, et Y. Dong, « An "off-on-off" mode ECL sensor for drug detection based on the host-guest interaction of cucurbit[7]uril », Sens. Actuators B Chem., vol. 344, p. 130328, oct. 2021, doi: 10.1016/j.snb.2021.130328.

[94] W. Cao, J. P. Ferrance, J. Demas, et J. P. Landers, « Quenching of the Electrochemiluminescence of Tris(2,2'-bipyridine)ruthenium(II) by Ferrocene and Its Potential Application to Quantitative DNA Detection », J. Am. Chem. Soc., vol. 128, n° 23, p. 7572-7578, juin 2006, doi: 10.1021/ja060162g.

[95] T. Wang, S. Fan, R. Erdmann, et C. Shannon, « Detection of Ferrocenemethanol and Molecular Oxygen Based on Electrogenerated Chemiluminescence Quenching at a Bipolar Electrode », Langmuir, vol. 29, n° 51, p. 16040-16044, déc. 2013, doi: 10.1021/la4037698.

[96] F. G. Avci, B. S. Akbulut, et E. Ozkirimli, « Membrane Active Peptides and Their Biophysical Characterization », Biomolecules, vol. 8, n° 3, p. 77, août 2018, doi: 10.3390/biom8030077.

[97] A. D. Frankel et C. O. Pabo, « Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus », Cell, vol. 55, n° 6, p. 1189-1193, déc. 1988, doi: 10.1016/0092-8674(88)90263-2.

[98] M. Green et P. M. Loewenstein, « Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein », Cell, vol. 55, n° 6, p. 1179-1188, déc. 1988, doi: 10.1016/0092-8674(88)90262-0.
[99] A. Joliot, C. Pernelle, H. Deagostini-Bazin, et A. Prochiantz, « Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. », *Proc. Natl. Acad. Sci.*, vol. 88, n° 5, p. 1864-1868, mars 1991, doi: 10.1073/pnas.88.5.1864.

[100] D. Derossi, S. Calvet, A. Trembleau, A. Brunissen, G. Chassaing, et A. Prochiantz, « Cell Internalization of the Third Helix of the Antennapedia Homeodomain Is Receptor-independent », *J. Biol. Chem.*, vol. 271, n° 30, p. 18188-18193, juill. 1996, doi: 10.1074/jbc.271.30.18188.

[101] E. Vivès, P. Brodin, et B. Lebleu, « A Truncated HIV-1 Tat Protein Basic Domain Rapidly Translocates through the Plasma Membrane and Accumulates in the Cell Nucleus », *J. Biol. Chem.*, vol. 272, n° 25, p. 16010-16017, juin 1997, doi: 10.1074/jbc.272.25.16010.

[102] S. M. Farkhani, A. Valizadeh, H. Karami, S. Mohammadi, N. Sohrabi, et F. Badrzadeh, « Cell penetrating peptides: Efficient vectors for delivery of nanoparticles, nanocarriers, therapeutic and diagnostic molecules », *Peptides*, vol. 57, p. 78-94, juill. 2014, doi: 10.1016/j.peptides.2014.04.015.

[103] F. Wang, Y. Wang, X. Zhang, W. Zhang, S. Guo, et F. Jin, « Recent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery », *J. Controlled Release*, vol. 174, p. 126-136, janv. 2014, doi: 10.1016/j.jconrel.2013.11.020.

[104] Y. Liu *et al.*, « Dual Receptor Recognizing Cell Penetrating Peptide for Selective Targeting, Efficient Intratumoral Diffusion and Synthesized Anti-Glioma Therapy », *Theranostics*, vol. 6, n° 2, p. 177-191, 2016, doi: 10.7150/thno.13532.

[105] J. Hoyer et I. Neundorf, « Peptide Vectors for the Nonviral Delivery of Nucleic Acids », *Acc. Chem. Res.*, vol. 45, n° 7, p. 1048-1056, juill. 2012, doi: 10.1021/ar2002304.

[106] M. Zasloff, « Antimicrobial peptides of multicellular organisms », *Nature*, vol. 415, n° 6870, p. 389-395, janv. 2002, doi: 10.1038/415389a.

[107] N. Mookherjee, M. A. Anderson, H. P. Haagsman, et D. J. Davidson, « Antimicrobial host defence peptides: functions and clinical potential », *Nat. Rev. Drug Discov.*, vol. 19, n° 5, p. 311-332, mai 2020, doi: 10.1038/s41573-019-0058-8.

[108] M. Magana *et al.*, « The value of antimicrobial peptides in the age of resistance », *Lancet Infect. Dis.*, vol. 20, n° 9, p. e216-e230, sept. 2020, doi: 10.1016/S1473-3099(20)30327-3.

[109] B. H. Gan, J. Gaynord, S. M. Rowe, T. Deingruber, et D. R. Spring, « The multifaceted nature of antimicrobial peptides: current synthetic chemistry approaches and future directions », *Chem. Soc. Rev.*, vol. 50, n° 13, p. 7820-7880, 2021, doi: 10.1039/D0CS00729C.

[110] Q.-Y. Zhang *et al.*, « Antimicrobial peptides: mechanism of action, activity and clinical potential », *Mil. Med. Res.*, vol. 8, n° 1, p. 48, déc. 2021, doi: 10.1186/s40779-021-00343-2.

[111] Z. Oren et Y. Shai, « Mode of action of linear amphipathic α-helical antimicrobial peptides », *Biopolymers*, vol. 47, n° 6, p. 451-463, 1998, doi: 10.1002/(SICI)1097-0282(1998)47:6<451::AID-BIP4>3.0.CO;2-F.

[112] M. R. Yeaman et N. Y. Yount, « Mechanisms of Antimicrobial Peptide Action and Resistance », *Pharmacol. Rev.*, vol. 55, n° 1, p. 27-55, mars 2003, doi: 10.1124/pr.55.1.2.

[113] Y. Shai, « Mode of action of membrane active antimicrobial peptides », *Biopolymers*, vol. 66, n° 4, p. 236-248, 2002, doi: 10.1002/bip.10260.

[114] M. Pushpanathan, P. Gunasekaran, et J. Rajendhran, « Antimicrobial Peptides: Versatile Biological Properties », *Int. J. Pept.*, vol. 2013, p. 1-15, juin 2013, doi: 10.1155/2013/675391.

[115] K. A. Brogden, « Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? », *Nat. Rev. Microbiol.*, vol. 3, n° 3, p. 238-250, mars 2005, doi: 10.1038/nrmicro1098.
[116] T.-H. Lee, K. N. Hall, et M.-I. Aguilar, « Antimicrobial Peptide Structure and Mechanism of Action: A Focus on the Role of Membrane Structure », *Curr. Top. Med. Chem.*, vol. 16, n° 1, p. 25-39, sept. 2015, doi: 10.2174/1568026615666150703121700.

[117] G. Ehrenstein et H. Lecar, « Electrically gated ionic channels in lipid bilayers », *Q. Rev. Biophys.*, vol. 10, n° 1, p. 1-34, févr. 1977, doi: 10.1017/S0033583500000123.

[118] F.-Y. Chen, M.-T. Lee, et H. W. Huang, « Evidence for Membrane Thinning Effect as the Mechanism for Peptide-Induced Pore Formation », *Biophys. J.*, vol. 84, n° 6, p. 3751-3758, juin 2003, doi: 10.1016/S0006-3495(03)75103-0.

[119] M. S. P. Sansom, « Alamethicin and related peptaibols? model ion channels », *Eur. Biophys. J.*, vol. 22, n° 2, juin 1993, doi: 10.1007/BF00196915.

[120] K. He, S. J. Ludtke, D. L. Worcester, et H. W. Huang, « Neutron scattering in the plane of membranes: structure of alamethicin pores », *Biophys. J.*, vol. 70, n° 6, p. 2659-2666, juin 1996, doi: 10.1016/S0006-3495(96)79835-1.

[121] C. Song et al., « Crystal structure and functional mechanism of a human antimicrobial membrane channel », *Proc. Natl. Acad. Sci.*, vol. 110, n° 12, p. 4586-4591, mars 2013, doi: 10.1073/pnas.1214739110.

[122] Y. Pouny, D. Rapaport, A. Mor, P. Nicolas, et Y. Shai, « Interaction of antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogs with phospholipid membranes », *Biochemistry*, vol. 31, n° 49, p. 12416-12423, déc. 1992, doi: 10.1021/bi00164a017.

[123] E. Gazit, I. R. Miller, P. C. Biggin, M. S. P. Sansom, et Y. Shai, « Structure and Orientation of the Mammalian Antibacterial Peptide Cecropin P1 within Phospholipid Membranes », *J. Mol. Biol.*, vol. 258, n° 5, p. 860-870, mai 1996, doi: 10.1006/jmbi.1996.0293.

[124] N. Sitaram et R. Nagaraj, « Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity », *Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr.*, vol. 1462, n° 1-2, p. 29-54, déc. 1999, doi: 10.1016/S0005-2736(99)00199-6.

[125] D. I. Fernandez, A. P. Le Brun, T. C. Whitwell, M.-A. Sani, M. James, et F. Separovic, « The antimicrobial peptide aurein 1.2 disrupts model membranes via the carpet mechanism », *Phys. Chem. Chem. Phys.*, vol. 14, n° 45, p. 15739, 2012, doi: 10.1039/c2cp43099a.

[126] Y. Shai et Z. Oren, « From "carpet" mechanism to de-novo designed diastereomeric cell-selective antimicrobial peptides », *Peptides*, vol. 22, n° 10, p. 1629-1641, oct. 2001, doi: 10.1016/S0196-9781(01)00498-3.

[127] K. Matsuzaki, « Membrane Permeabilization Mechanisms », in *Antimicrobial Peptides*, vol. 1117, K. Matsuzaki, Éd. Singapore: Springer Singapore, 2019, p. 9-16. doi: 10.1007/978-981-13-3588-4_2.

[128] K. Matsuzaki et al., « Relationship of Membrane Curvature to the Formation of Pores by Magainin 2 », *Biochemistry*, vol. 37, n° 34, p. 11856-11863, août 1998, doi: 10.1021/bi980539y.

[129] L. Yang, T. A. Harroun, T. M. Weiss, L. Ding, et H. W. Huang, « Barrel-Stave Model or Toroidal Model? A Case Study on Melittin Pores », *Biophys. J.*, vol. 81, n° 3, p. 1475-1485, sept. 2001, doi: 10.1016/S0006-3495(01)75802-X.

[130] T. Hara et al., « Effects of peptide dimerization on pore formation: Antiparallel disulfide-dimerized magainin 2 analogue », *Biopolymers*, vol. 58, n° 4, p. 437-446, avr. 2001, doi: 10.1002/1097-0282(20010405)58:4<437::AID-BIP1019>3.0.CO;2-I.

[131] H. Jenssen, P. Hamill, et R. E. W. Hancock, « Peptide Antimicrobial Agents », *Clin. Microbiol. Rev.*, vol. 19, n° 3, p. 491-511, juill. 2006, doi: 10.1128/CMR.00056-05.
[132] K. Matsuzaki, « Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes », *Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr.*, vol. 1462, n° 1-2, p. 1-10, déc. 1999, doi: 10.1016/S0005-2736(99)00197-2.

[133] S. J. Ludtke, K. He, W. T. Heller, T. A. Harroun, L. Yang, et H. W. Huang, « Membrane Pores Induced by Magainin », *Biochemistry*, vol. 35, n° 43, p. 13723-13728, janv. 1996, doi: 10.1021/bi9620621.

[134] K. Murzyn et M. Pasenkiewicz-Gierula, « Construction of a toroidal model for the magainin pore », *J. Mol. Model.*, vol. 9, n° 4, p. 217-224, août 2003, doi: 10.1007/s00894-003-0127-z.

[135] H. Leontiadou, A. E. Mark, et S. J. Marrink, « Antimicrobial Peptides in Action », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 128, n° 37, p. 12156-12161, sept. 2006, doi: 10.1021/ja062927q.

[136] M.-T. Lee, F.-Y. Chen, et H. W. Huang, « Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides », *Biochemistry*, vol. 43, n° 12, p. 3590-3599, mars 2004, doi: 10.1021/bi036153r.

[137] A. S. Ladokhin, M. E. Selsted, et S. H. White, « Sizing membrane pores in lipid vesicles by leakage of co-encapsulated markers: pore formation by melittin », *Biophys. J.*, vol. 72, n° 4, p. 1762-1766, avr. 1997, doi: 10.1016/S0006-3495(97)78822-2.

[138] K. Matsuzaki, S. Yoneyama, et K. Miyajima, « Pore formation and translocation of melittin », *Biophys. J.*, vol. 73, n° 2, p. 831-838, août 1997, doi: 10.1016/S0006-3495(97)78115-3.

[139] K. Matsuzaki, O. Murase, et K. Miyajima, « Kinetics of Pore Formation by an Antimicrobial Peptide, Magainin 2, in Phospholipid Bilayers », *Biochemistry*, vol. 34, n° 39, p. 12553-12559, oct. 1995, doi: 10.1021/bi00039a009.

[140] F. M. Menger et J. S. Keiper, « Chemistry and physics of giant vesicles as biomembrane models », *Curr. Opin. Chem. Biol.*, vol. 2, n° 6, p. 726-732, janv. 1998, doi: 10.1016/S1367-5931(98)80110-5.

[141] H.-G. Döbereiner, « Properties of giant vesicles », *Curr. Opin. Colloid Interface Sci.*, vol. 5, n° 3-4, p. 256-263, juill. 2000, doi: 10.1016/S1359-0294(00)00064-9.

[142] P. Messina et al., « Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes », *Angew. Chem. Int. Ed.*, vol. 53, n° 12, p. 3192-3196, mars 2014, doi: 10.1002/anie.201308990.

[143] A. I. Perez Jimenez, L. Challier, E. Aït-Yahiatène, J. Delacotte, E. Labbé, et O. Buriez, « Selective Electrochemical Bleaching of the Outer Leaflet of Fluorescently Labeled Giant Liposomes », *Chem. - Eur. J.*, vol. 23, n° 28, p. 6781-6787, mai 2017, doi: 10.1002/chem.201605786.

[144] E. E. Ambroggio, F. Separovic, J. H. Bowie, G. D. Fidelio, et L. A. Bagatolli, « Direct Visualization of Membrane Leakage Induced by the Antibiotic Peptides: Maculatin, Citropin, and Aurein », *Biophys. J.*, vol. 89, n° 3, p. 1874-1881, sept. 2005, doi: 10.1529/biophysj.105.066589.

[145] A. Mishra et al., « Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions », *Proc. Natl. Acad. Sci.*, vol. 108, n° 41, p. 16883-16888, oct. 2011, doi: 10.1073/pnas.1108795108.

[146] S. A. Wheaten, F. D. O. Ablan, B. L. Spaller, J. M. Trieu, et P. F. Almeida, « Translocation of Cationic Amphipathic Peptides across the Membranes of Pure Phospholipid Giant Vesicles », *J. Am. Chem. Soc.*, vol. 135, n° 44, p. 16517-16525, nov. 2013, doi: 10.1021/ja407451c.
[147] P. Schön, A. J. García-Sáez, P. Malovrh, K. Bacia, G. Anderluh, et P. Schwille, « Equinatoxin II Permeabilizing Activity Depends on the Presence of Sphingomyelin and Lipid Phase Coexistence », *Biophys. J.*, vol. 95, n° 2, p. 691-698, juill. 2008, doi: 10.1529/biophysj.108.129981.

[148] B. Apellániz, J. L. Nieva, P. Schwille, et A. J. García-Sáez, « All-or-None versus Graded: Single-Vesicle Analysis Reveals Lipid Composition Effects on Membrane Permeabilization », *Biophys. J.*, vol. 99, n° 11, p. 3619-3628, déc. 2010, doi: 10.1016/j.bpj.2010.09.027.

[149] J. Md. Alam, T. Kobayashi, et M. Yamazaki, « The Single-Giant Unilamellar Vesicle Method Reveals Lysenin-Induced Pore Formation in Lipid Membranes Containing Sphingomyelin », *Biochemistry*, vol. 51, n° 25, p. 5160-5172, juin 2012, doi: 10.1021/bi300448g.

[150] Md. Z. Islam, J. Md. Alam, Y. Tamba, M. A. S. Karal, et M. Yamazaki, « The single GUV method for revealing the functions of antimicrobial, pore-forming toxin, and cell-penetrating peptides or proteins », *Phys Chem Chem Phys*, vol. 16, n° 30, p. 15752-15767, 2014, doi: 10.1039/C4CP00717D.

[151] Y. Tamba et M. Yamazaki, « Single Giant Unilamellar Vesicle Method Reveals Effect of Antimicrobial Peptide Magainin 2 on Membrane Permeability », *Biochemistry*, vol. 44, n° 48, p. 15823-15833, déc. 2005, doi: 10.1021/bi051684w.

[152] Md. Z. Islam, S. Sharmin, V. Levadnyy, S. U. Alam Shibly, et M. Yamazaki, « Effects of Mechanical Properties of Lipid Bilayers on the Entry of Cell-Penetrating Peptides into Single Vesicles », *Langmuir*, vol. 33, n° 9, p. 2433-2443, mars 2017, doi: 10.1021/acs.langmuir.6b03111.

[153] M.-T. Lee, T.-L. Sun, W.-C. Hung, et H. W. Huang, « Process of Inducing Pores in Membranes by Melittin », *Biophys. J.*, vol. 106, n° 2, p. 293a, janv. 2014, doi: 10.1016/j.bpj.2013.11.1710.

[154] J. Liu, S. Xiao, J. Li, B. Yuan, K. Yang, et Y. Ma, « Molecular details on the intermediate states of melittin action on a cell membrane », *Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr.*, vol. 1860, n° 11, p. 2234-2241, nov. 2018, doi: 10.1016/j.bbamem.2018.09.007.

[155] S. Sun., Xia., Liu., Dou., Yang., Yuan., Kang., « Real-time monitoring the interfacial dynamic processes at model cell membranes: Taking cell penetrating peptide TAT as an example », J. Colloid Interface Sci., vol. 609, p. 707-717, mars 2022, doi: 10.1016/j.jcis.2021.11.076.

[156] H. W. Huang, « Action of Antimicrobial Peptides: Two-State Model », *Biochemistry*, vol. 39, n° 29, p. 8347-8352, juill. 2000, doi: 10.1021/bi000946l.

[157] C.-C. Lee, Y. Sun, S. Qian, et H. W. Huang, « Transmembrane Pores Formed by Human Antimicrobial Peptide LL-37 », *Biophys. J.*, vol. 100, n° 7, p. 1688-1696, avr. 2011, doi: 10.1016/j.bpj.2011.02.018.

[158] M.-T. Lee, W.-C. Hung, F.-Y. Chen, et H. W. Huang, « Mechanism and kinetics of pore formation in membranes by water-soluble amphipathic peptides », *Proc. Natl. Acad. Sci.*, vol. 105, n° 13, p. 5087-5092, avr. 2008, doi: 10.1073/pnas.0710625105.

[159] Md. Moniruzzaman, J. Md. Alam, H. Dohra, et M. Yamazaki, « Antimicrobial Peptide Lactoferricin B-Induced Rapid Leakage of Internal Contents from Single Giant Unilamellar Vesicles », *Biochemistry*, vol. 54, n° 38, p. 5802-5814, sept. 2015, doi: 10.1021/acs.biochem.5b00594.
[160] S. Guha et al., « Applications and evolution of melittin, the quintessential membrane active peptide », *Biochem. Pharmacol.*, vol. 193, p. 114769, nov. 2021, doi: 10.1016/j.bcp.2021.114769.

[161] J. Zhou, C. Wan, J. Cheng, H. Huang, J. F. Lovell, et H. Jin, « Delivery Strategies for Melittin-Based Cancer Therapy », *ACS Appl. Mater. Interfaces*, vol. 13, n° 15, p. 17158-17173, avr. 2021, doi: 10.1021/acsami.1c03640.

[162] A. Wang, Y. Zheng, W. Zhu, L. Yang, Y. Yang, et J. Peng, « Melittin-Based Nano-Delivery Systems for Cancer Therapy », *Biomolecules*, vol. 12, n° 1, p. 118, janv. 2022, doi: 10.3390/biom12010118.

[163] W. C. Wimley et K. Hristova, « The Mechanism of Membrane Permeabilization by Peptides: Still an Enigma », *Aust. J. Chem.*, vol. 73, n° 3, p. 96, 2020, doi: 10.1071/CH19449.

[164] W. C. Wimley, « How Does Melittin Permeabilize Membranes? », *Biophys. J.*, vol. 114, n° 2, p. 251-253, janv. 2018, doi: 10.1016/j.bpj.2017.11.3738.

[165] S. Frey et L. K. Tamm, « Orientation of melittin in phospholipid bilayers. A polarized attenuated total reflection infrared study », *Biophys. J.*, vol. 60, n° 4, p. 922-930, oct. 1991, doi: 10.1016/S0006-3495(91)82126-9.

[166] K. Hristova, C. E. Dempsey, et S. H. White, « Structure, Location, and Lipid Perturbations of Melittin at the Membrane Interface », *Biophys. J.*, vol. 80, n° 2, p. 801-811, févr. 2001, doi: 10.1016/S0006-3495(01)76059-6.

[167] G. Wiedman, K. Herman, P. Searson, W. C. Wimley, et K. Hristova, « The electrical response of bilayers to the bee venom toxin melittin: Evidence for transient bilayer permeabilization », *Biochim. Biophys. Acta BBA - Biomembr.*, vol. 1828, n° 5, p. 1357-1364, mai 2013, doi: 10.1016/j.bbamem.2013.01.021.

[168] A. S. Ladokhin, W. C. Wimley, et S. H. White, « Leakage of membrane vesicle contents: determination of mechanism using fluorescence requenching », *Biophys. J.*, vol. 69, n° 5, p. 1964-1971, nov. 1995, doi: 10.1016/S0006-3495(95)80066-4.

[169] « Mélittine, Principal Composant Actif De L'apitoxine (venin D'abeille). Structure 3d ». https://img.freepik.com/photos-premium/melittine-principal-composant-actif-apitoxine-venin-abeille-structure-3d_261932-5307.jpg?w=1380

[170] G. Guidotti, L. Brambilla, et D. Rossi, « Cell-Penetrating Peptides: From Basic Research to Clinics », *Trends Pharmacol. Sci.*, vol. 38, n° 4, p. 406-424, avr. 2017, doi: 10.1016/j.tips.2017.01.003.

[171] C. Bechara et S. Sagan, « Cell-penetrating peptides: 20 years later, where do we stand? », *FEBS Lett.*, vol. 587, n° 12, p. 1693-1702, juin 2013, doi: 10.1016/j.febslet.2013.04.031.

[172] F. Ben Trad et al., « Dynamic Electrochemiluminescence Imaging of Single Giant Liposome Opening at Polarized Electrodes », *Anal. Chem.*, vol. 94, n° 3, p. 1686-1696, janv. 2022, doi: 10.1021/acs.analchem.1c04238.

[173] K. Splith et I. Neundorf, « Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa », *Eur. Biophys. J.*, vol. 40, n° 4, p. 387-397, avr. 2011, doi: 10.1007/s00249-011-0682-7.

[174] Y. Yuan, S. Han, L. Hu, S. Parveen, et G. Xu, « Coreactants of tris(2,2'-bipyridyl)ruthenium(II) Electrogenerated Chemiluminescence », *Electrochimica Acta*, vol. 82, p. 484-492, nov. 2012, doi: 10.1016/j.electacta.2012.03.156.

[175] A. Mayevsky et E. Barbiro-Michaely, « Use of NADH fluorescence to determine mitochondrial function in vivo », *Int. J. Biochem. Cell Biol.*, vol. 41, n° 10, p. 1977-1988, oct. 2009, doi: 10.1016/j.biocel.2009.03.012.
[176] X. Chen, B. Su, X. Song, Q. Chen, X. Chen, et X. Wang, « Recent advances in electrochemiluminescent enzyme biosensors », *TrAC Trends Anal. Chem.*, vol. 30, n° 5, p. 665-676, mai 2011, doi: 10.1016/j.trac.2010.12.004.

[177] T. S. Blacker et al., « Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM », *Nat. Commun.*, vol. 5, n° 1, p. 3936, sept. 2014, doi: 10.1038/ncomms4936.

[178] T. C. Selig, K. A. Drozda, et J. A. Evans, « Detection of ATP and NADH: A bioluminescent experience », *J. Chem. Educ.*, vol. 61, n° 10, p. 918, oct. 1984, doi: 10.1021/ed061p918.

[179] M. Musameh, J. Wang, A. Merkoci, et Y. Lin, « Low-potential stable NADH detection at carbon-nanotube-modified glassy carbon electrodes », *Electrochem. Commun.*, vol. 4, n° 10, p. 743-746, oct. 2002, doi: 10.1016/S1388-2481(02)00451-4.

[180] S. Kumar et S.-M. Chen, « Electroanalysis of NADH Using Conducting and Redox Active Polymer/Carbon Nanotubes Modified Electrodes-A Review », *Sensors*, vol. 8, n° 2, p. 739-766, janv. 2008, doi: 10.3390/s8020739.

[181] M. Milutinovic, S. Sallard, D. Manojlovic, N. Mano, et N. Sojic, « Glucose sensing by electrogenerated chemiluminescence of glucose-dehydrogenase produced NADH on electrodeposited redox hydrogel », *Bioelectrochemistry*, vol. 82, n° 1, p. 63-68, août 2011, doi: 10.1016/j.bioelechem.2011.05.005.

[182] A. Devadoss, L. Dennany, C. Dickinson, T. E. Keyes, et R. J. Forster, « Highly sensitive detection of NADH using electrochemiluminescent nanocomposites », *Electrochem. Commun.*, vol. 19, p. 43-45, juin 2012, doi: 10.1016/j.elecom.2012.03.003.

[183] M. Michel et al., « Giant Liposome Microreactors for Controlled Production of Calcium Phosphate Crystals », *Langmuir*, vol. 20, n° 15, p. 6127-6133, juill. 2004, doi: 10.1021/la049862u.

[184] P. Lefrançois, B. Goudeau, et S. Arbault, « Dynamic monitoring of a bi-enzymatic reaction at a single biomimetic giant vesicle », *The Analyst*, vol. 145, n° 24, p. 7922-7931, 2020, doi: 10.1039/D0AN01273D.

[185] B. Yang, S. Li, W. Mu, Z. Wang, et X. Han, « Light-Harvesting Artificial Cells Containing Cyanobacteria for CO₂ Fixation and Further Metabolism Mimicking », *Small*, p. 2201305, juill. 2022, doi: 10.1002/smll.202201305.

[186] I. N. Westensee, E. Brodszkij, X. Qian, T. F. Marcelino, K. Lefkimmiatis, et B. Städler, « Mitochondria Encapsulation in Hydrogel-Based Artificial Cells as ATP Producing Subunits », *Small*, vol. 17, n° 24, p. 2007959, juin 2021, doi: 10.1002/smll.202007959.

[187] N. A. Yewdall, « Life brought to artificial cells », *Nature*, p. d41586-022-02231-8, sept. 2022, doi: 10.1038/d41586-022-02231-8.

[188] C. Xu, N. Martin, M. Li, et S. Mann, « Living material assembly of bacteriogenic protocells », *Nature*, vol. 609, n° 7929, p. 1029-1037, sept. 2022, doi: 10.1038/s41586-022-05223-w.
<figure><img src="image_121.png" /></figure>
# RÉSUMÉ

Ce travail de thèse s'intéresse à mettre au point les conditions expérimentales permettant d'imager par électrochimiluminescence (ECL) la perméabilisation de membranes de liposomes géants. La stratégie retenue consiste à encapsuler les réactifs ECL (tri-*n*-propylamine et complexe [Ru(bpy)₃]²⁺) à l'intérieur de liposomes, puis de déclencher leur perméabilisation membranaire au contact d'une surface polarisée et transparente en ITO permettant ainsi d'oxyder et de visualiser l'écoulement des réactifs vers le milieu extra-vésiculaire. La mesure simultanée de l'ECL avec la photoluminescence et l'ampérométrie nous a permis d'obtenir des informations comme le suivi de l'état du liposome avant et après l'évènement de la libération, l'attribution de chaque signal à son liposome d'origine, ainsi que la quantité de tri-*n*-propylamine libérée par chaque liposome. Une seconde approche par ECL négative a consisté à imager un objet par contraste optique négatif grâce au blocage de l'électrode par l'objet d'intérêt (le liposome). Nous avons pu montrer que la mise en contact d'un liposome avec la surface d'une électrode sous polarisation génère alors une tâche noire, alors que les autres régions de la surface d'électrode polarisée restent luminescentes. Nous avons ensuite exploré quelques applications bio-analytiques par ECL positive. En présence d'un peptide antimicrobien (la mélittine), l'ECL a permis d'imager les évènements de perméabilisation. Enfin, nous avons révélé par ECL la formation de NADH dans une réaction d'oxydation du glucose catalysée par la GDH à l'intérieur du liposome, ouvrant des perspectives pour utiliser l'ECL dans le suivi de l'avancement de métabolismes rédox du vivant réalisés dans des cellules artificielles.

# MOTS CLÉS

Electrochimiluminescence - Liposomes Géants – Imagerie – Peptides à activité membranaire (AMP et CPP).

# ABSTRACT

This PhD work deals with the development of experimental conditions allowing the implementation of an electrochemiluminescence (ECL) imaging of the permeabilization of liposomes. Our strategy features the encapsulation of ECL substrates (tri-*n*-propylamine and [Ru(bpy)₃]²⁺) in the lipid vesicle and then to promote their permeabilization at the surface of a polarized transparent ITO electrode, allowing the electrochemical oxidation of the content and the visualization of the leaking process. The simultaneous ECL, photoluminescent and amperometric monitoring provides information on the liposome shape during permeabilization, the assignment of the corresponding signals to a specific liposome, as well as the quantification of the tri-*n*-propylamine released. An alternative approach has been carried out from « negative/shadow ECL », i.e. through the absence of luminescence at regions of the electrode electrochemically blocked by the lipid layer of liposomes in contact with ITO. Under these conditions, the deposition of liposomes at the polarized electrode yields a black spot while the rest of the electrode surface remains luminescent. Then we have explored some bio-analytical applications by classical (positive) ECL. First, ECL allowed the imaging of the permeabilization of liposomes by melittin, a representative antimicrobial peptide (AMP). Finally, we have monitored the intravesicular completion of a simple metabolism, the oxidation of glucose catalyzed by GDH, where the formation of NADH promotes the ECL process, opening avenues for the monitoring of in vivo redox metabolisms achieved in artificial cells.

# KEYWORDS

Electrochemiluminescence – Giant Liposomes – Imaging – Membrane Active Peptide (AMP and CPP).