# Fascicule Formation à la Microscopie Corrélative - ANF CNRS-INRAE

Christine Péchoux, Claire Boulogne

► To cite this version:

Christine Péchoux, Claire Boulogne. Fascicule Formation à la Microscopie Corrélative - ANF CNRS-INRAE. École thématique. Applications de la microscopie corrélative à la biologie Cellulaire, Jouy-en-Josas (FR), France. 2021, pp.12. hal-04569717

HAL Id: hal-04569717

https://hal.inrae.fr/hal-04569717

Submitted on 6 May 2024

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entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
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abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

Public Domain
# Fascicule Formation à la Microscopie Corrélative - ANF CNRS-INRAE

Christine Péchoux, Claire Boulogne

► To cite this version:

Christine Péchoux, Claire Boulogne. Fascicule Formation à la Microscopie Corrélative - ANF CNRS-INRAE. École thématique. Applications de la microscopie corrélative à la biologie Cellulaire, Jouy-en-Josas (FR), France. 2021, pp.12. [hal-04569717](https://hal-inrae.fr/hal-04569717v1)

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ANF CNRS- INRAE

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

<figure><img src="image_2.png" /></figure>
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<figure><img src="image_2.png" /></figure>
# ATELIER 1

## LOCALISATION DE L'ACTINE MUSCULAIRE
LISSE DANS LA GLANDE MAMMAIRE DE LAPINE EN GESTATION (G14)
# ATELIER 1

## LOCALISATION DE L'ACTINE MUSCULAIRE
LISSE DANS LA GLANDE MAMMAIRE DE LAPINE EN GESTATION (G14)
# PROTOCOLE

## Etape I : Préparation des échantillons en vue de l'immunofluorescence

### Résumé de l'étape 1

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

### Etape Fixation – inclusion OCT - Congélation

Prélèvement du tissu

Rinçage rapide en PBS/PO4

Immerger les échantillons de 4-5 mm³ (maximum) avec le mélange de fixation : paraformaldéhyde 4%, glutaraldéhyde 0,025%, en tampon phosphate 0.1M.
→ 1h à TA

Passer en paraformaldéhyde 4% seul, en tampon phosphate 0.1M, pendant 1h à TA.
+ ON à 4°C

Rinçage : 3 fois 15 min tampon phosphate 0.1M.

Puis imprégnation en tampon sucrose : graduellement 10%/ 2x 40% à +4°C et sous agitation

Eliminer le maximum de saccharose sur un papier filtre, enrober dans du milieu d'enrobage OCT ou autre et congeler -80°C sur une plaque de métal.

Transférer dans des moules et conserver à -80°C.

<figure><img src="image_4.png" /></figure>
# PROTOCOLE

## Etape I : Préparation des échantillons en vue de l'immunofluorescence

### Résumé de l'étape 1

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

### Etape Fixation – inclusion OCT - Congélation

Prélèvement du tissu

Rinçage rapide en PBS/PO4

Immerger les échantillons de 4-5 mm³ (maximum) avec le mélange de fixation : paraformaldéhyde 4%, glutaraldéhyde 0,025%, en tampon phosphate 0.1M.
→ 1h à TA

Passer en paraformaldéhyde 4% seul, en tampon phosphate 0.1M, pendant 1h à TA.
+ ON à 4°C

Rinçage : 3 fois 15 min tampon phosphate 0.1M.

Puis imprégnation en tampon sucrose : graduellement 10%/ 2x 40% à +4°C et sous agitation

Eliminer le maximum de saccharose sur un papier filtre, enrober dans du milieu d'enrobage OCT ou autre et congeler -80°C sur une plaque de métal.

Transférer dans des moules et conserver à -80°C.

<figure><img src="image_4.png" /></figure>
# Etape coupes cryostat – Immunofluorescence – acquisition images

## 1- Coupes cryostat

Réaliser des coupes cryostat : la température dépend du tissu, sa dureté, son contenu en lipides.... Donc entre -20°C et -40°C

Les coupes d'au moins 10µm sont récupérées directement sur les lamelles corrélatives. Pour plus de praticité ces dernières sont maintenues par une goutte d'eau sur une lame de verre

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Dépôt de la goutte d'eau et de la lamelle</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Elimination de l'excédent d'eau</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Lamelle prête à l'emploi</figcaption></figure>

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Lamelle recouverte de la coupe de tissu</figcaption></figure>

Astuce : les lamelles peuvent être ensuite maintenues sur la lame par une goutte de vernis

Les coupes de tissus peuvent être conservées à -80°C dans une boîte plastique pour lame et contenant du silicagel pour limiter l'humidité et fermées avec un scotch.

## 2- Immunofluorescence

- Sortir la boîte de lame et la laisser revenir à Température ambiante avant de l'ouvrir

- Hydratation des coupes en PBS 5/10 min

- NH4 Cl 0,5M 4 x 5 min

- Rinçages en PBS 3 x 5 min

- Blocage PBS/BSA 2% 30 min

- Perméabilisation Saponine 0.1% 30 min

- Anticorps laire soit 2h à TA ou ON à 4°C

- Rinçages en PBS 4x3 min

- Anticorps Ilaire (fluorNano G ou Fluorescent + gold) 1 H

- Rinçages en PBS 4x3 min

- Coloration des noyaux DAPI (5µg/mL) 15 min à 37°C

- Rinçages en Eau bidistillée 4x3 min

- Montage des lamelles en Prolong Gold sur les boîtes Fluorodish
# Etape coupes cryostat – Immunofluorescence – acquisition images

## 1- Coupes cryostat

Réaliser des coupes cryostat : la température dépend du tissu, sa dureté, son contenu en lipides.... Donc entre -20°C et -40°C

Les coupes d'au moins 10µm sont récupérées directement sur les lamelles corrélatives. Pour plus de praticité ces dernières sont maintenues par une goutte d'eau sur une lame de verre

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Dépôt de la goutte d'eau et de la lamelle</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Elimination de l'excédent d'eau</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Lamelle prête à l'emploi</figcaption></figure>

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Lamelle recouverte de la coupe de tissu</figcaption></figure>

Astuce : les lamelles peuvent être ensuite maintenues sur la lame par une goutte de vernis

Les coupes de tissus peuvent être conservées à -80°C dans une boîte plastique pour lame et contenant du silicagel pour limiter l'humidité et fermées avec un scotch.

## 2- Immunofluorescence

- Sortir la boîte de lame et la laisser revenir à Température ambiante avant de l'ouvrir

- Hydratation des coupes en PBS 5/10 min

- NH4 Cl 0,5M 4 x 5 min

- Rinçages en PBS 3 x 5 min

- Blocage PBS/BSA 2% 30 min

- Perméabilisation Saponine 0.1% 30 min

- Anticorps laire soit 2h à TA ou ON à 4°C

- Rinçages en PBS 4x3 min

- Anticorps Ilaire (fluorNano G ou Fluorescent + gold) 1 H

- Rinçages en PBS 4x3 min

- Coloration des noyaux DAPI (5µg/mL) 15 min à 37°C

- Rinçages en Eau bidistillée 4x3 min

- Montage des lamelles en Prolong Gold sur les boîtes Fluorodish
## 3-Acquisition et conservation à +4°C jusqu'à l'étape 2

# Etape II : Préparation des échantillons en vue de la MET

## Résumé de l'étape 2

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

## Etape Inclusion directe – coupes/repérage - acquisition images

### 1- Inclusion Epon

- Les lamelles sont délicatement sorties du Tampon PBS

- Fixation GA 1% 30 min

- Rinçages PBS 3x3 min

- Post-fixation à l'Osmium 1% 1h

- Eau 3X3 min

- Déshydratation en éthanol 50%/70%/90% 5 min/chaque

- Déshydratation en éthanol 100% 3x5 min

- Substitution éthanol/epon : 1/1 – Pur 1heure chaque

- Inclusion

- Polymérisation

2- La lamelle de plastique est décollée du support en résine. Le marquage reste collé sur l'épon

### 3- Repérage/coupes semi-fines

- NB : si il y a plusieurs zones d'intérêt sur la surface et suffisamment distantes on peut recouper le bloc à l'aide d'une scie à lame fine

- Le bloc est recoupé autour de la zone d'intérêt (3-4 carreaux)

- Coupes semi-fines (0,5 µm)

- Coloration au bleu

- Visualisation et contrôle des zones coupées
### 3-Acquisition et conservation à +4°C jusqu'à l'étape 2

## Etape II : Préparation des échantillons en vue de la MET

### Résumé de l'étape 2

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

## Etape Inclusion directe – coupes/repérage - acquisition images

#### 1- Inclusion Epon

- Les lamelles sont délicatement sorties du Tampon PBS

- Fixation GA 1% 30 min

- Rinçages PBS 3x3 min

- Post-fixation à l'Osmium 1% 1h

- Eau 3X3 min

- Déshydratation en éthanol 50%/70%/90% 5 min/chaque

- Déshydratation en éthanol 100% 3x5 min

- Substitution éthanol/epon : 1/1 – Pur 1heure chaque

- Inclusion

- Polymérisation

2- La lamelle de plastique est décollée du support en résine. Le marquage reste collé sur l'épon

#### 3- Repérage/coupes semi-fines

- NB : si il y a plusieurs zones d'intérêt sur la surface et suffisamment distantes on peut recouper le bloc à l'aide d'une scie à lame fine

- Le bloc est recoupé autour de la zone d'intérêt (3-4 carreaux)

- Coupes semi-fines (0,5 µm)

- Coloration au bleu

- Visualisation et contrôle des zones coupées
4- Coupes ultra-fines

- Réaliser les coupes ultra-fines et les déposer selon leur surface sur des grilles de 150 à 200 mesh

- Contre coloration

5- Observation au MET

- Repérage des zones conjointes entre microscopie optique et électronique
4- Coupes ultra-fines

- Réaliser les coupes ultra-fines et les déposer selon leur surface sur des grilles de 150 à 200 mesh

- Contre coloration

5- Observation au MET

- Repérage des zones conjointes entre microscopie optique et électronique
ATELIER 2

LOCALISATION DE CELLULES EN CULTURE
SUIVIES PAR UN MARQUEUR
FLUORESCENT
ATELIER 2

LOCALISATION DE CELLULES EN CULTURE
SUIVIES PAR UN MARQUEUR
FLUORESCENT
# PROTOCOLE

## Cellules Adhérentes

On utilise la fluo pour repérer un événement rare (transfection, infection par un parasite, etc...). Grâce au repère sur la lamelle, on note la position des cellules marquées, on applique ensuite un protocole morpho classique. On coupe ensuite sur les zones repérées et on va en MET. Il n'y a pas vraiment de corrélation précise entre fluo et MET.

## Matériel biologique :

- Cellules adhérentes poussées sur lamelles de verre à fond gravé (type Mattek/Ibidi)

### Jour 1

1. Observation de la fluorescence

2. Repérage des cellules d'intérêt grâce aux repères

3. Fixation GA 1h
Rinçages 15min
Post-fixation 1h
Déshydratation 1h
Imprégnation résine 2-4h
Polymérisation

4. Préparation de grilles (dépôt des billes d'or)

### Jour 2

5. Coupes résine (coupes sériées ?)

6. Contraste des coupes

### Jour 3

7. Observation en MET

8. Merge : plus compliqué

NB : là on ne préserve pas la fluorescence, c'est peut-être moins intéressant. Mais on a de la résine morpho, c'est plus joli au MET.
# PROTOCOLE

## Cellules Adhérentes

On utilise la fluo pour repérer un événement rare (transfection, infection par un parasite, etc...). Grâce au repère sur la lamelle, on note la position des cellules marquées, on applique ensuite un protocole morpho classique. On coupe ensuite sur les zones repérées et on va en MET. Il n'y a pas vraiment de corrélation précise entre fluo et MET.

## Matériel biologique :

- Cellules adhérentes poussées sur lamelles de verre à fond gravé (type Mattek/Ibidi)

### Jour 1

1. Observation de la fluorescence

2. Repérage des cellules d'intérêt grâce aux repères

3. Fixation GA 1h
Rinçages 15min
Post-fixation 1h
Déshydratation 1h
Imprégnation résine 2-4h
Polymérisation

4. Préparation de grilles (dépôt des billes d'or)

### Jour 2

5. Coupes résine (coupes sériées ?)

6. Contraste des coupes

### Jour 3

7. Observation en MET

8. Merge : plus compliqué

NB : là on ne préserve pas la fluorescence, c'est peut-être moins intéressant. Mais on a de la résine morpho, c'est plus joli au MET.
REACTIFS ET MATERIELS
# REACTIFS ET MATERIELS
# 1-Réactifs

## Fixateurs

* Paraformaldéhyde – ampoule de PFA 16%

* Glutaraldéhyde – ampoule de GA 25%

* Tampon PBS ou PO4 (Sorrensen) 0.1M pH 7.4

## Préparation du tampon Phosphate (Sorrensen (PO4 0.5M pH 7.4))

### Solution de phosphate monosodique (NaH₂PO₄, 2H₂O (PM 156))

<table><tr><td>NaH₂PO₄</td><td>1.95 g</td></tr><tr><td>H₂O</td><td>25 mL</td></tr></table>

### Solution de phosphate disodique (Na₂HPO₄, 12H₂O (PM 358))

<table><tr><td>Na₂HPO₄</td><td>4,475 g</td></tr><tr><td>H₂O</td><td>25 mL</td></tr></table>

## Mélange tampon phosphate (volume final 100 mL) :

<table><thead><tr><td>pH</td><td>Solution de phosphate monosodique</td><td>Solution de phosphate disodique</td></tr></thead><tbody><tr><td>7,4</td><td>19 mL</td><td>81 mL</td></tr></tbody></table>

!! volumes indicatifs, ajuster la solution de phosphate disodique avec la solution monosodique en mesurant le pH en continu.

## Préparation des mélanges de fixation

### Paraformaldéhyde 4% - Glutaraldéhyde 0.025% final

(!! Le mélange de fixation doit se faire extemporanément, et ne se conserve pas)

<table><tr><td>PFA 16%</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>GA 25%</td><td>0.004 mL</td></tr><tr><td>PO4 0.5M</td><td>0.8 mL</td></tr><tr><td>QSQ H₂O MilliQ</td><td>2.196 mL</td></tr><tr><td>Vol final</td><td>4 mL</td></tr></table>

### Paraformaldéhyde 4% final

<table><tr><td>PFA 16%</td><td>1 mL</td></tr></table>
# 1-Réactifs

## Fixateurs

* Paraformaldéhyde – ampoule de PFA 16%

* Glutaraldéhyde – ampoule de GA 25%

* Tampon PBS ou PO4 (Sorrensen) 0.1M pH 7.4

## Préparation du tampon Phosphate (Sorrensen (PO4 0.5M pH 7.4))

### Solution de phosphate monosodique (NaH₂PO₄, 2H₂O (PM 156))

<table><tr><td>NaH₂PO₄</td><td>1.95 g</td></tr><tr><td>H₂O</td><td>25 mL</td></tr></table>

### Solution de phosphate disodique (Na₂HPO₄, 12H₂O (PM 358))

<table><tr><td>Na₂HPO₄</td><td>4,475 g</td></tr><tr><td>H₂O</td><td>25 mL</td></tr></table>

## Mélange tampon phosphate (volume final 100 mL) :

<table><thead><tr><td>pH</td><td>Solution de phosphate monosodique</td><td>Solution de phosphate disodique</td></tr></thead><tbody><tr><td>7,4</td><td>19 mL</td><td>81 mL</td></tr></tbody></table>

!! volumes indicatifs, ajuster la solution de phosphate disodique avec la solution monosodique en mesurant le pH en continu.

## Préparation des mélanges de fixation

### Paraformaldéhyde 4% - Glutaraldéhyde 0.025% final

(!! Le mélange de fixation doit se faire extemporanément, et ne se conserve pas)

<table><tr><td>PFA 16%</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>GA 25%</td><td>0.004 mL</td></tr><tr><td>PO4 0.5M</td><td>0.8 mL</td></tr><tr><td>QSQ H₂O MilliQ</td><td>2.196 mL</td></tr><tr><td>Vol final</td><td>4 mL</td></tr></table>

### Paraformaldéhyde 4% final

PFA 16% 1 mL
<table><tr><td>PO4 0.5M</td><td>0.8 mL</td></tr><tr><td>QSQ H2O MilliQ</td><td>2.2 mL</td></tr><tr><td>Vol final</td><td>4 mL</td></tr></table>

## Milieu d'enrobage

* OCT (tissu Tek ou autre marque)

## Réactifs pour les immunomarquages utilisés

* Bloquants aldéhydiques : NH4-Cl

* Agents de saturation des sites a-spécifiques : BSA

* Perméabilisant : Saponine

* Anticorps primaire :

* Anticorps secondaires : fluorescent : FITC Jackson IgG total

10nm F(ab')2 fragment, Goat anti-mouse IgG (H et L)
(référence) 810.177 Aurion

* Dapi : 3-5 µg/mL (solution stock à 1 mg/mL)

## Milieux de montage :

* Prolong Gold Antifade Reagent : référence 11539306 – Fisher Scientific

## 2- Matériels

<table><thead><tr><th>Inclusion/Optique</th><th>Inclusion/MET</th></tr></thead><tbody><tr><td><ul><li>Roue pour agitation/grand frigo à+4°C pour mettre la roue dedans</li><li>Grande pince (pour plonger dans l'azote liquide)</li><li>Glace</li><li>Lunettes de protection</li><li>Gants de protection</li><li>Parafilm</li><li>Azote</li><li>Lames de rasoir</li><li>Congélateur -80°C</li><li>Moules d'inclusion</li><li>Lamelles corrélatives graduées :</li></ul></td><td><ul><li>Capsules Beam 750µL pour inclusion</li><li>Ultramicrotome</li><li>Diamant histo et ultrafines</li><li>Lames de verre</li><li>Bleu de méthylène/azur II/Bleu de Toluidine</li><li>Plaque chauffante</li><li>Boîte de Pétri avec plaque de rangement</li><li>Grilles : Cu Formvar carbone 2x1mm<br>- FCF2010-CU<br>Cu Formvar film 2x1 mm<br>- FF2010-CU</li></ul></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>PO4 0.5M</td><td>0.8 mL</td></tr><tr><td>QSQ H2O MilliQ</td><td>2.2 mL</td></tr><tr><td>Vol final</td><td>4 mL</td></tr></table>

## Milieu d'enrobage

* OCT (tissu Tek ou autre marque)

## Réactifs pour les immunomarquages utilisés

* Bloquants aldéhydiques : NH4-Cl

* Agents de saturation des sites a-spécifiques : BSA

* Perméabilisant : Saponine

* Anticorps primaire :

* Anticorps secondaires : fluorescent : FITC Jackson IgG total

10nm F(ab')2 fragment, Goat anti-mouse IgG (H et L)
(référence) 810.177 Aurion

* Dapi : 3-5 µg/mL (solution stock à 1 mg/mL)

## Milieux de montage :

* Prolong Gold Antifade Reagent : référence 11539306 – Fisher Scientific

## 2- Matériels

<table><thead><tr><td>Inclusion/Optique</td><td>Inclusion/MET</td></tr></thead><tbody><tr><td><ul><li>Roue pour agitation/grand frigo à+4°C pour mettre la roue dedans</li><li>Grande pince (pour plonger dans l'azote liquide)</li><li>Glace</li><li>Lunettes de protection</li><li>Gants de protection</li><li>Parafilm</li><li>Azote</li><li>Lames de rasoir</li><li>Congélateur -80°C</li><li>Moules d'inclusion</li><li>Lamelles corrélatives graduées :</li></ul></td><td><ul><li>Capsules Beam 750µL pour inclusion</li><li>Ultramicrotome</li><li>Diamant histo et ultrafines</li><li>Lames de verre</li><li>Bleu de méthylène/azur II/Bleu de Toluidine</li><li>Plaque chauffante</li><li>Boîte de Pétri avec plaque de rangement</li><li>Grilles : Cu Formvar carbone 2x1mm<br>- FCF2010-CU<br>Cu Formvar film 2x1 mm<br>- FF2010-CU</li></ul></td></tr></tbody></table>
CMC35-18 (Delta microscopies)

* Seringues/pastettes

* Fluorodish : FD35-100 (Fisher Scientific)

* Cryostat

* Microscope optique

* Microscope à fluorescence et/ou confocal

Cu-Pt 150/200 mesh

* Papier whatman ashless (ref : 1440-090)
CMC35-18 (Delta microscopies)

* Seringues/pastettes

* Fluorodish : FD35-100 (Fisher Scientific)

* Cryostat

* Microscope optique

* Microscope à fluorescence et/ou confocal

Cu-Pt 150/200 mesh

* Papier whatman ashless (ref : 1440-090)