<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Fig. 7B.7. Exemples représentatifs de l'imagerie SXRF du potassium et du manganèse dans des cellules HeLa transfectées avec une construction SLC30A10 (vert) et exposées à 500 µM de Mn. Comparaison avec la distribution de l'appareil de Golgi (rouge) et du noyau (bleu) obtenus par microscopie à épifluorescence sur cellule vivante. (A) cellules transfectées avec GFP-Rab5, donc condition témoin ; (B) cellules transfectées avec GFP-SLC30A10-WT, donc la protéine est normale. Seules les cellules en vert expriment la protéine sauvage ; (C) cellules transfectées avec GFP-SLC30A10-Δ105-107, donc protéine mutante, causant la maladie. Les flèches indiquent la colocalisation du Mn et de l'appareil de Golgi. Images obtenues sur la ligne P06 à DESY (Carmona 2019 a).</figcaption></figure>

La nano-imagerie cryogénique SXRF récemment développée à l'ESRF ID16A (résolution < 50 nm) nous a permis de mettre en évidence que le Mn était piégé dans des vésicules uniques à l'intérieur de l'appareil de Golgi (figure 7B.8). Nos résultats confirment le rôle de la protéine SLC30A10 dans l'efflux de Mn et l'accumulation de Mn dans les cellules exprimant la mutation de la SLC30A10-Δ105-107 causant la maladie. De plus, nous avons identifié les vésicules de l'appareil de Golgi comme le principal compartiment d'accumulation de Mn dans les mutants SLC30A10, ce qui suggère des interactions avec le mécanisme de trafic vésiculaire comme cause de la maladie (Carmona 2019 a). Les protéines mutantes pathologiques SLC30A10-Δ105-107 sont bloquées dans le réticulum endoplasmique, empêchant la translocation vers la membrane plasmique et l'écoulement du Mn. De ce fait, l'excès de Mn est stocké à l'intérieur des vésicules de l'appareil de Golgi. Il est connu que, à des concentrations élevées, le Mn devient toxique, probablement parce qu'il perturbe les fonctions de l'appareil de Golgi où il s'accumule fortement en l'absence de SLC30A10 fonctionnelle. Nous supposons que l'altération du trafic vésiculaire pourrait être à l'origine de la toxicité des mutations de la SLC30A10. Ensuite, il serait intéressant d'étudier si le Mn provoque des défauts dans le trafic vésiculaire de Golgi et par conséquent sur les neurotransmetteurs ou l'excrétion endocrine. Il sera aussi très intéressant de voir si le manganèse sort de l'appareil de Golgi et de déterminer à quelle protéine il est fixé dans ces vésicules.
<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Figure 7B.8. Distributions du potassium (K) et du manganèse (Mn) obtenues à haute résolution spatiale dans une cellule transfectée avec la protéine SLC30A10-Δ105-107-GFP et exposée à 500 µM Mn. Un zoom dans la zone riche en Mn révèle la distribution ponctuelle du Mn dans des structures uniques et aussi petites que la taille du faisceau, 50 nm. Images obtenues sur la ligne ID16A à l'ESRF (Carmona 2019 a).

### d. Validation de la localisation d'un senseur fluorescent du Mn

Toujours sur le manganèse, mais cette fois en collaboration avec des collègues de l'Institut de chimie de l'institut TATA à Mumbai en Inde nous avons travaillé sur la localisation intracellulaire d'un capteur fluorescent de manganèse qu'ils ont développé. Nos collègues ont mis au point un capteur qui émet de la fluorescence en fonction de la quantité de manganèse présent dans les cellules. Ils ont exposé les cellules HEK293T au capteur, appelé M1, et afin d'identifier les compartiments intracellulaires dans lesquels il s'accumule, ils ont marqué aussi l'appareil de Golgi, les endosomes, les lysosomes et les mitochondries. Des images représentatives des expériences de microscopie confocale sont présentées sur la figure 7B.9. Les données d'émission du capteur M1 ont montré une coloration périnucléaire qui s'est nettement colocalisée avec le traceur de Golgi, figure 7B.9. Donc le capteur développé, M1, s'accumule dans l'appareil de Golgi et l'intensité de la fluorescence augmente en fonction de la quantité de manganèse à laquelle les cellules ont été exposées.
<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Figure 7B.9 (A) De gauche à droite, images confocales de cellules HEK293T vivantes avec : aucune exposition externe au Mn croissante, et une exposition à 250 µM MnCl₂ suivie d'une exposition à un chélateur d'ions métalliques divalents (TPEN). Les cellules ont été transduites avec CellLight Golgi-RFP et incubées avec 5 µM M1. a) Émission du capteur M1 dans le vert ; b) Émission de Golgi-RFP dans le rouge. Toutes les cellules n'ont pas incorporé le traceur Golgi ; c) Superposition d'images confocales. Des flèches blanches indiquent les régions représentatives à forte intensité dans les canaux rouge et vert, ce qui indique une colocalisation. Barres d'échelle = 30 µm (Das 2019).

Avec la technique de SXRF, sur la ligne Nanoscopium au synchrotron français SOLEIL, nous avons mis en évidence que dans les cellules HEK293T le manganèse s'accumule bien dans l'appareil de Golgi (figure 7B.10). Nous avons montré aussi que la quantité de manganèse dans l'appareil de Golgi augmente en fonction de la quantité de manganèse dans le milieu de culture, comme la fluorescence du capteur. Ces expériences ont permis de valider de manière cruciale la capacité qu'a le capteur M1 de détecter le Mn²⁺ dans les cellules vivantes, puisque les deux s'accumulent au même endroit, dans l'appareil de Golgi. Dans l'avenir, la capacité du capteur M1 à détecter le manganèse ouvrira des possibilités de quantification des niveaux de Mn puisqu'il pourra être utilisé sur des cellules vivantes pour évaluer en temps réel l'incorporation du manganèse dans les cellules en fonction des conditions d'expositions (Das 2019). Néanmoins, la stabilité du capteur après synthèse chimique étant très courte des progrès sur la structure permettant d'en améliorer la stabilité sont encore nécessaires pour le rendre plus facilement utilisable.
<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 7B.10. (A) Images de transmission représentatives de cellules HEK 293T exposées à 250 µM Mn²⁺ après cryofixation et lyophilisation. (B) Images d'épifluorescence du traceur de Golgi (rouge) et de coloration du noyau (bleu) sur cellules vivantes, toutes les cellules n'ont pas incorporé le traceur de Golgi. Images par nano-SXRF des mêmes cellules indiquées en B (C) image du Mn. (D) Carte de potassium et (E) Carte de chlorure. Les flèches indiquent la colocalisation du Golgi et du Mn. Images obtenues sur la ligne Nanoscopium à SOLEIL. Barres d'échelle : 10 µm (Das 2019).</figcaption></figure>

## 7.2 Fe et maladie du Parkinson

La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par la perte progressive de neurones dopaminergiques dans la substantia nigra pars compacta (SNpc). L'étiologie de la MP est mal comprise et est multifactorielle, avec des apports de facteurs génétiques, environnementaux et endogènes, parmi lesquels la dyshoméostasie du Fe. Dans la MP, il y a une augmentation spécifique de la concentration de Fe dans la SNpc par rapport aux individus du même âge non atteint de la maladie (Jellinger 2013; Ward 2014), qui pourrait être impliquée dans la perte sélective de neurones dopaminergiques dans cette région du cerveau (pour revue : Sian-Hülsmann 2011 ; Ward 2014 ; Liddell 2018). Il a été proposé comme biomarqueur pour le diagnostic précoce de la MP la quantification d'une augmentation du Fe chez les patients en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM) (Guan 2017). Mais certaines études n'ont pas observé une telle augmentation dans la SN des cerveaux de parkinsoniens (revue dans : Friedman 2012). En plus certaines études montrent que la teneur en Fe est plus élevée dans la SNpr des individus sains (la région de la SN qui n'est pas affectée par la perte neuronale dans la MP) que dans la SNpc (Drayer 1986 ; Morris 1994 ; Morawski 2005).

Tous ces résultats reflètent la complexité de cette évaluation du contenu en fer dans la substance noire. Pour ce motif, nous avons décidé d'utiliser la microanalyse par PIXE et par rayonnement synchrotron pour obtenir la distribution du contenu en Fe (et autres éléments) dans des régions cérébrales spécifiques. Pour ce fait nous avons utilisé un modèle animal pour reproduire cette dyshoméostasie de Fe dans la SN. Et nous avons employé l'imagerie corrélatif sur des tissus adjacents en identifiant la SNpc et la SNpr par marquage immuno-histochimique de la tyrosine hydroxylase (TH) dans des coupes de cerveau animal.
Nous avons également étudié des modèles cellulaires de la MP. Les corps de Lewy ou Lewy bodys (LBs) sont des inclusions protéiques intraneuronales caractéristiques des maladies à corps de Lewy (LBDs), dont la MP. Les LBs sont principalement composés d'alpha-synucléine et sont considérés comme caractéristiques de la MP (Lashuel 2013) (Wakabayashi 2013). Dans ce sens nous avons étudié la distribution et quantification du fer dans des cellules surexprimant la protéine d'alpha-synucléine et nous avons mis en évidence que le fer se relocalise quand cette protéine est surexprimée dans ce qui semble être des agrégats d'alpha-synucléine. Après ces résultats encourageants et sur des tissus du cerveau humain nous avons marqué les LB et les neurones à neuromélanine (par marquage histochimique). Grâce à l'imagerie corrélatивne sur tissus adjacents nous avons identifié ces structures sur les coupes non marquées et nous les avons analysées par PIXE. Nous n'avons pas trouvé de différences dans le contenu en fer de LB et des neurones à neuromélanine. Ce qui indiquerait que le rôle des LBs dans la pathologie de cette maladie n'est pas de complexer les métaux. En plus nous avons mis en évidence que les patients atteints de la MP n'ont pas tous comme caractéristique commune l'augmentation du fer dans la substance noire. Donc notre conclusion est que l'augmentation en fer n'est pas une condition requise pour développer la maladie, donc le fer jouerait un rôle plutôt d'accélérateur ou serait une conséquence, mais il ne serait pas le déclencheur de la maladie.

### a. Modèle animal

Des modèles animaux tels que le rat lésé à la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) ont été développés pour étudier la MP. La 6-OHDA induit une dégénérescence progressive de la voie nigrostriatale, principale caractéristique anatomique de la MP (He 1996 ; Wang 2004 ; Hare 2009, Hare 2010 ; Dexter 2011). Nous avons utilisé ce modèle animal pour reproduire certaines caractéristiques de la dyshoméostasie du Fe dans la MP, en particulier l'augmentation du Fe dans la SNpc. Nous avons réalisé ce projet en collaboration avec Marc Savasta et Carole Carcenac de l'Institut des neurosciences de l'Université Grenoble Alpes.

Dans cette étude, nous avons analysé des coupes de tissus provenant de 15 animaux lésés (6-OHDA) et 12 animaux témoins (sham). La lésion était unilatérale, mais les deux côtés du cerveau ont été analysés (IpsiL : lésé ; ContraL : non lésé). Comme expliqué dans la section 6.2, nous avons utilisé l'imagerie corrélatивne sur tissus adjacents. Le cerveau des animaux a été cryofixé et sectionné en gardant des coupes adjacentes. Une dans laquelle par marquage immuno-histologique de la tyrosine hydroxylase (TH) nous avons coloré les zones dopaminergiques : substantia nigra pars compacta (SNpc), substantia nigra pars reticulata (SNpr) et l'aire tegmantale ventrale (VTA). Et la section adjacente qui a été lyophilisée et gardée en conditions natives. Par superposition des deux coupes, nous avons identifié les zones dopaminergiques dans la coupe non marquée (figure 6B.6) et quantifié par PIXE le contenu métallique dans les différentes zones (figure 7B.11).

Lorsque l'on compare les côtés et les régions d'intérêt entre les animaux lésés et les témoins, les concentrations de Fe sont inchangées (figure 7B.11). Ce résultat indique que l'injection de 6-OHDA n'a pas modifié de manière significative la teneur en Fe dans la SNpc, la SNpr et la VTA des animaux atteints de lésions, malgré une diminution de l'expression du TH de l'ordre de 35 à 85 % (moyenne de 60 %). D'autre part, la teneur en Fe a été trouvée statistiquement plus élevée dans la SNpr que dans la SNpc et que dans la VTA, pour chaque côté du cerveau et pour toutes les conditions (figure 7B.11). Nous avons constaté que la teneur en Fe est bien compartimentée dans les trois régions dopaminergiques, les valeurs les plus faibles étant relevées dans la VTA et les plus élevées dans la SNpr. Donc, la lésion avec la 6-OHDA, même si elle induit une dégénérescence des neurones dopaminergiques, ne conduit pas à une augmentation du fer dans
la *substantia nigra*. En revanche, nos résultats mettent en garde sur le fait que si la maladie de Parkinson provoque une perte de neurones de la *substantia nigra pars compacta* et que la quantité de fer dans la *substance totale nigra* est mesurée, alors une augmentation fictive de la concentration en fer sera obtenue si nous mesurons le fer dans la *substantia nigra* dans sa globalité pour des individus atteints de la maladie. Augmentation qui vient du fait que nous ne mesurons pratiquement que le fer dans la *substantia nigra pars reticulata* et la quantité dans cette zone du cerveau est plus élevée que dans la *pars compacta*.

Une partie des échantillons préparée pour l'analyse par fluorescence des rayons X a été maintenue en condition congelée-hydratée (sans être lyophilisée) pour pouvoir déterminer l'état d'oxydation. Pour ces échantillons, à la jonction entre la SNpc et SNpr, nous avons cartographié la distribution du Fe et du Mn par micro-SXRF (le Mn était inférieur à la limite de détection pour les analyses en micro-PIXE mais pouvait être détecté par SXRF qui est une méthode plus sensible). Nous avons observé que, contrairement à la distribution du Fe, l'intensité du Mn est plus élevée dans la SNpc que dans la SNpr (figure 7B.12). Cette accumulation préférentielle de Mn dans la SNpc apparaît dans les cas d'animaux témoins et lesés par la 6-OHDA et dans les deux parties du cerveau, IpsiL et ContraL, donc elle est physiologique. Grâce aux méthodes de corrélation, nous avons mis en évidence une compartimentation inverse du Fe et du Mn à l'intérieur des deux zones (*pars compacta* et *pars reticulata*) qui composent la *substantia nigra*. Finalement nous avons analysé par micro-XANES l'état d'oxydation du fer et nous n'avons pas constaté de variations selon la lésion ou la zone du cerveau. Nos données indiquent que le Fe était présent exclusivement à l'état d'oxydation Fe(III) dans tous les échantillons, et avec une signature spectrale XANES similaire à celle de la ferritine (figure 7B.13).

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 7B.11. Boîtes à moustaches des concentrations élémentaires (P, S, Cl, K, Ca, Fe, Cu, Zn) (exprimées en µg/g de masse sèche) pour les animaux lésés au 6-OHDA et contrôles dans les différentes régions du cerveau (SNpc, SNpr, VTA) et pour les deux côtés du cerveau (IpsiL et ContraL). Quantification faites à AIFIRA par PIXE/RBS (Carmona 2019 b).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_50.png" /></figure>

Figure 7B.12. Cartes de distribution micro-SXRF représentatives du Fe et du Mn à la jonction de la SNpc et la SNpr. (A) le côté ContraL d'un cerveau de rat témoin. (B) le côté ContraL d'un cerveau de rat lésé par la 6-OHDA. Des distributions similaires ont été trouvées dans d'autres cas, ce qui montre que la distribution compartimentée du Mn n'est pas un effet du 6-OHDA. Ligne synchrotron LUCIA, SOLEIL (Carmona 2019 b).

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

Figure 7B.13. Spectres d'absorption des rayons X (XAS) à proximité du seuil d'absorption du Fe pour les composés FeO, Fe₂O₃ et standard de ferritine ainsi que les spectres obtenus dans les échantillons de tissu pour les animaux témoins et lésés à la 6-OHDA dans la SNpc et SNpr pour les deux côtés cérébraux. Les spectres obtenus sur les échantillons présentent la forme de celui de la ferritine et le standard de Fe(III).
Ligne synchrotron LUCIA, SOLEIL (Carmona 2019 b).

## b. Fe et synucléine dans les cellules

Comme dit précédemment, une des caractéristiques principales de la MP est la formation des agrégats protéiques intraneuronaux, appelés corps de Lewy (LB), qui se composent principalement de la protéine α-synucléine. Il a été suggéré que la présence de niveaux accrus de fer peut favoriser l'agrégation de l'α-synucléine (Ostrerova 2000 ; Kostka 2008) et aussi que le fer a un rôle dans l'oligomérisation et l'agrégation de l'α-synucléine (Li 2010 ; Hillmer 2010 ; Peng 2010 ; He 2011 ; Jinsmaa 2014). Dans la présente étude, et en collaboration avec Paul Lingor de l'Université de médecine de Göttingen, nous avons examiné l'hypothèse selon laquelle l'augmentation des niveaux intracellulaires d'α-synucléine pourrait modifier la teneur en fer intracellulaire (Ortega 2016).
Le professeur Seung-Jae Lee de l'Université Konkuk en Corée (Lee 2002) nous avait aimablement fourni le vecteur adénovirus α-synucléine pour la transfection des cellules. En transfectant les cellules avec cet adénovirus, la protéine α-synucléine est surexprimée dans les cellules. La détection de celle-ci se fait par immunofluorescence et donc, comme expliqué dans la section 6B.1, nous avons préparé deux séries d'échantillons de manière indépendante. D'un côté nous avons préparé des échantillons pour l'analyse PIXE et SXRF sans marquage et par méthode cryogénique et d'un autre côté des échantillons marqués avec des anticorps contre cette protéine α-synucléine en utilisant des méthodes de fixation chimique et en localisant la protéine par immunofluorescence. Dans les deux séries nous avons six types d'échantillons : témoin (sans aucune exposition), témoin+Fe (cellules exposées à un excès de fer dans le milieu de culture), U₀ (cellules exposées à une construction adénovirus vide), U₀+Fe (cellules exposées à l'adénovirus vide et au fer), Syn (cellules exposées à la construction adénovirus qui surexprime l'α-synucléine), Syn+Fe (cellules exposées à l'adénovirus α-synucléine et un excès de fer).

Sur les échantillons colorés par immunofluorescence nous avons obtenu que la distribution de l'α-synucléine endogène dans les cellules PC12 n'a pas été modifiée par l'exposition au fer (figure 7B.14 a, d) ou après traitement avec le vecteur adénoviral vide (figure 7B.14 b, e). Cette distribution est comparable aux résultats précédemment publiés montrant une petite distribution en pointillé de la protéine dans le cytoplasme (Zhu 2012 ; Rendón 2013). Cependant dans les cellules surexprimant l'α-synucléine, des points riches en α-synucléine apparaissent en abondance autour des noyaux, donc cette protéine s'agglomère autour du noyau avec des spots d'une très forte intensité (figure 7B.14 c, f).

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

Figure 7B.14. Images d'immunofluorescence de l'α-synucléine (en rouge) sur des cellules PC12 et marquage du noyau avec Hoechst 33342 (en bleu). a) Cellules PC12 natives ; b) Cellules infectées par le vecteur adénovirus vide U₀ ; c) Cellules infectées par l'adénovirus α-synucléine ; d) Cellules natives exposées au fer ; e) Cellules infectées par le vecteur adénovirus vide et exposée au fer ; f) Infectées par l'adénovirus α-synucléine et exposées au fer. Barres d'échelle 20 µm (Ortega 2016).
Les échantillons préparés pour l'analyse par fluorescence des rayons X ont été cryofixés et lyophilisés et nous les avons analysés à AIFIRA pour quantifier les éléments chimiques (notamment le fer) selon les conditions d'exposition et nous les avons aussi analysés à la ligne ID22NI du synchrotron ESRF pour déterminer la localisation des éléments en fonction des expositions. Le S et le Zn, ici montrés dans la figure 7B.15, mais aussi le P, Cl, K et Ca étaient distribués de manière assez homogène dans les cellules, et n'ont pas été modifiés par les expositions au fer ou suite à la surexpression de l'α-synucléine. Les cellules exposées à l'adénovirus vide et au fer (U₀+Fe) montrent le fer distribué sous forme de petits spots partout dans le cytoplasme (figure 7B.15). En revanche, les cellules surexprimant l'α-synucléine et exposées au fer (Syn+Fe) montrent le fer redistribué sous forme de gros grains autour du noyau (figure 7B.15). Cette distribution du fer ressemble à la distribution de l'α-synucléine obtenue par immunofluorescence (figure 7B.14) et, de plus, la redistribution apparaît lorsque l'α-synucléine et le fer sont en excès tous les deux. Ces résultats suggèrent une relocalisation du fer par effet de l'α-synucléine, et que le fer se relocalise dans les inclusions riches en α-synucléine.

La quantification des éléments chimiques montre que, quand les cellules sont exposées à un excès du fer dans le milieu de culture, cet élément s'accumule de manière significative dans les cellules qui surexpriment l'α-synucléine (Syn+Fe) par rapport aux cellules témoins, transfectées avec un adénovirus vide (U₀+Fe) (figure 7B.16). Lorsqu'il n'y a pas d'excès de fer extracellulaire, cet élément se trouve en même quantité dans les cellules qui surexpriment l'α-synucléine (Syn) par rapport aux cellules témoins, transfectées avec un adénovirus vide (U₀) (figure 7B.16). Pour les autres éléments quantifiés K, Ca, Cu or Zn aucune différence significative n'a été mesurée selon les différentes expositions. Ainsi, nous montrons avec la fluorescence des rayons X que, dans les cellules exposées à un excès de fer, la simple surexpression de l'α-synucléine entraîne une augmentation des niveaux de fer intracellulaire et une redistribution du fer du cytoplasme vers la région périnucléaire au sein de ce qui semble être des inclusions riches en α-synucléine. Nos résultats établissent un lien entre deux caractéristiques moléculaires de la maladie de Parkinson, à savoir l'agrégation de l'α-synucléine et l'augmentation du taux de fer.

A

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

Figure 7B.15. Imagerie par nano-SXRF de la distribution des éléments chimiques dans : A) Cellule PC12 exposée au vecteur vide et un excès de Fe (U₀+Fe) et B) Cellule PC12 surexprimant la protéine α-synucléine et exposée à un excès de Fe (α-Syn+Fe). Barres d'échelle 5 µm. Images obtenues sur la ligne ID22NI de l'ESRF (Ortega 2016).
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

Figure 7B.16. Quantification des éléments intracellulaires déterminée par la combinaison de micro-PIXE et de micro-RBS à AIFIRA et exprimée en microgrammes d'élément par gramme de masse sèche. Les concentrations sont présentées comme la moyenne et l'erreur-type de la moyenne pour « n » mesures. Chaque analyse a été effectuée sur des zones d'environ 200 × 200 µm², contenant 10 à 18 cellules. Les différences significatives sont indiquées par * 0,01 < P < 0,05 (Ortega 2016).

### c. Fe et Lewy bodys dans des tissus humains

Précédemment, nous avons montré que le fer semble s'accumuler avec l'α-synucléine dans des cultures cellulaires, et il est connu que les LBs sont composés principalement d'α-synucléine. Pour approfondir sur le rôle du fer dans la maladie du Parkinson et toujours en collaboration avec Paul Lingor de l'Université de médecine de Göttingen, nous avons décidé d'étudier la composition des LBs dans des tissus humains. Nous avons fait une demande à l'UK Brain Bank pour avoir accès à la substantia nigra (SN) de personnes décédées de la maladie du Parkinson pour étudier si les corps de Lewy fixent le fer ou autres métaux (article en cours de rédaction).

La neuromélanine (NM) est un pigment foncé qui est surtout présent dans les neurones catécholaminergiques situés dans la SN. Chimiquement, la NM est un sous-produit du métabolisme de la dopamine qui s'accumule naturellement avec l'âge et représente un agrégat complexe ayant la capacité de se lier au Fe, réduisant ainsi les niveaux de stress oxydatif dans les neurones (Zucca 2017). Ainsi, dans un premier temps, notre objectif était de comparer la composition élémentaire (P, S, Cl, K, Fe, Cu et Zn) des neurones à neuromélanine (NM-neurons) et la composition des corps de Lewy (LB) dans la substantia nigra de tissus de cerveau humain parkinsonien post-mortem. Pour la détermination de ses structures et quantification des éléments, nous avons suivi le protocole d'anlayse corrélatif expliqué dans la partie B section 6.2 et combiné aux techniques de micro-PIXE/RBS à AIFIRA (émission de rayons X induite par les particules et spectrométrie de rétrodiffusion de Rutherford).

L'UK Brain Bank nous a fourni des tissus de la substantia nigra de cerveaux cryofixés provenant de patients décédés de la MP et de personnes non atteintes de la maladie. Comme expliqué dans le protocole d'imagerie corrélatif, nous avons monté les tissus (déjà cryofixés) de la SN dans le cryomicrotome et percé quelques trous d'épingle pour la phase de repérage, après quoi nous avons procédé à la réalisation des coupes consécutives. La première section a été colorée par histochimie avec de l'hématoxyline-éosine (H&E) et la section adjacente a été laissée non colorée (native) pour les analyses PIXE/RBS. Nous avons identifié les
agrégats de corps de Lewy dans la section colorée et par superposition nous avons déterminé la position de ces agrégats dans la coupe native. Nous avons analysé plusieurs corps de Lewy, des neurones et des tissus adjacents pour les différents patients. Nous avons pu clairement mettre en évidence la non-modification du Fe, Cu ou d'autres éléments dans les neurones à neuromélanine par rapport aux corps de Lewy, ce qui suggère que les LB ne jouent pas un rôle de promoteur de la maladie en raison d'une dysrégulation du contenu métallique dans le cerveau (figure 7B.17).

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Figure 7B.17. Contenu élémentaire dans des neurones à neuromélanine (NM-neurons) et de corps de Lewy (LB) provenant de tissus des personnes décédées de la maladie du Parkinson. Les axes Y représentent le contenu élémentaire exprimé en µg d'élément/g d'échantillon sec. Les box-plot montrent la valeur moyenne pour chaque groupe, les valeurs individuelles, maximum et minimum, ainsi que les écarts-types à 25 et 75 %. Quantification faite à AIFIRA, article en préparation.</figcaption></figure>

En complément de ces résultats et suivant le même protocole de préparation des échantillons, nous avons comparé aussi le contenu métallique dans les neurones à neuromélanine et le tissu extraneuronal dans la substantia nigra de personnes atteintes de la maladie de Parkinson (n = 8), de sclérose en plaques (SEP) (n = 7) et d'individus témoins (n = 3). La sclérose en plaques (MS : multiple sclerosis en anglais) est aussi une maladie neurodégénérative où le fer est modifié (Jellinger 2013; Stankiewicz 2014; Stephenson 2014; Popesku 2017). Comme l'illustre la figure 7B.18, les neurones à NM (vert) présentaient des concentrations moyennes de Fe significativement plus élevées dans la MP et la SEP que dans les contrôles. Dans le tissu périneuronal (magenta) la teneur en Fe est significativement plus élevée dans la MP par rapport aux témoins, et le contenu en fer semble être plus élevé dans la SEP que dans les témoins, mais la différence n'est pas significative. Il est intéressant de noter que les concentrations en Cu montrent une tendance inverse au fer, avec des valeurs plus faibles dans le groupe PD par rapport aux échantillons SEP ou témoins, à la fois dans le tissu périneuronal et dans les neurones à NM.
Si nous nous intéressons à variabilité interindividuelle dans la composition des éléments chimiques des neurones à NM et du tissu périneuronal au sein d'une même maladie nous avons obtenu aussi quelques différences remarquables (figure 7B.19). Un patient PD (PD029) présente une teneur en Fe beaucoup plus faible dans les neurones à NM que tous les autres patients. Et quatre patients atteints de la maladie de Parkinson présentent une faible teneur en Fe dans le tissu périneuronal (PD029, PD074, PD153 et PD268) par rapport aux cinq autres patients atteints du PD (figure 7B.19). Pour la SEP, la variabilité interindividuelle du Fe dans les neurones NM est encore plus importante, avec 3 patients sur 7 avec une teneur faible en Fe dans les neurones NM et avec 4 patients sur 7 avec une teneur faible en Fe dans le tissu périneuronal (figure 7B.19). Le contenu en cuivre, par exemple, présente moins de variations interpatients, avec seulement 1 patient SEP avec un faible contenu par rapport aux autres, mais pour ce patient une seule mesure avait été faite.

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

Figure 7B.18. Contenu en éléments dans les neurones à NM et du tissu périneuronal par groupe de maladies. Diagrammes en boîtes à moustaches montrant les valeurs médianes, les intervalles interquartiles, les valeurs minimales et maximales et les mesures individuelles de chaque groupe. Les valeurs p utilisant le test de Mann-Whitney indiquent les différences statistiquement significatives * = p < 0,05 ; ** = p < 0,01.

Quantification faite à AIFIRA, article en préparation.
Neurones à NM

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

Iron

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Tissu périneuronal

Ctrl

MS

PD

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

Copper

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

Figure 7B.19. Contenu élémentaire (exprimé en µg.g⁻¹) dans les neurones à NM et le tissu périneuronal de chaque patient. Diagrammes en boîtes à moustaches montrant les valeurs médianes, interquartiles, minimales et maximales ainsi que les mesures individuelles quantifiées par PIXE/RBS à AIFIRA, article en préparation.

## 7.3 Neurotoxicité de l'uranium naturel

Nous travaillons depuis quelques années en collaboration avec la docteure Carole Bresson du CEA à l'Université Paris-Saclay et avec la docteure Véronique Malard de l'Institut de biosciences et biotechnologies du CEA du Marcoule, sur la toxicité de certains métaux de l'industrie nucléaire. Nous avons étudié le cobalt et l'uranium naturels puisque les travailleurs des centrales peuvent être accidentellement exposés à ces métaux qui s'avèrent potentiellement cancérigènes ou neurotoxiques. J'ai déjà parlé de la toxicité du cobalt dans la partie B section 2.3, ainsi, ici, je vais exposer nos récentes recherches sur la neurotoxicité de l'uranium naturel. Chez l'animal, quelle que soit la voie d'exposition, une faible quantité d'uranium atteignant le cerveau est associée à certains effets neurologiques comme la perturbation du système dopaminergique (Bussy 2006 ; Barber 2007 ; Briner 2008 ; Bensoussan 2009 ; Dinocourt 2015). De tels effets neurologiques, voire neurotoxiques, sont également suspectés chez l'homme et représentent une problématique émergente. Le but de ce projet était d'apporter des éléments de compréhension sur les mécanismes de perturbation induits par des faibles concentrations d'U naturel, sur un modèle cellulaire neuronal humain (lignée SH-SY5Y). Sa distribution dans les organites cellulaires, son impact sur l'homéostasie des métaux traces essentiels endogènes, et les protéines intracellulaires auxquelles il est lié, ont été identifiés. Premièrement, la viabilité des cellules a été évaluée (figure 7B.20), montrant que la cytotoxicité de l'uranium s'est seulement produite à des concentrations d'exposition élevées (> 125 µM), loin des valeurs attendues pour l'uranium dans le sang, même après une exposition professionnelle.
<figure><img src="image_62.png" /></figure>

Figure 7B.20. Courbe de cytotoxicité de l'ATP après 7 jours d'exposition continue de cellules SH-SY5Y différenciées à l'uranium naturel (RLU : relative luminescence units) (Carmona 2018).

### a. Imagerie PIXE de l'uranium

Les cellules différenciées SH-SY5Y ont ensuite été exposées en continu à 1, 10, 125 ou 250 µM d'uranium naturel pendant 7 jours, et la distribution subcellulaire quantitative de l'uranium a été étudiée par des moyens de micro-PIXE (émission de rayons X induite par des particules). Dans un premier temps, nous avons trouvé que l'uranium était situé dans des régions périnucléaires définies du cytoplasme, ce qui suggérait son accumulation dans des organites et que la distribution était semblable à celle de l'appareil de Golgi (figure 7B.21). Nous avons décidé d'exposer les cellules à la BFA, un composé qui entraîne une perturbation de l'appareil de Golgi. Comme l'illustre la figure 7B.22, l'exposition à la BFA entraîne une large distribution cytoplasique du marquage Golgi-GFP, mais l'uranium est resté localisé dans une région étroite du cytoplasme (figure 7B.22). Ce résultat indique fortement que l'appareil de Golgi n'est pas le principal organite d'accumulation de l'uranium dans les cellules. L'uranium n'a pas été détecté dans le noyau des cellules différenciées. L'analyse quantitative a mis en évidence une très faible concentration intracellulaire d'uranium à des niveaux d'exposition non cytotoxiques (10 µM). À des niveaux d'exposition plus élevés (125 et 250 µM), lorsque les effets cytotoxiques commencent, une accumulation intracellulaire d'uranium plus importante et disproportionnée a été observée (figure 7B.23) (Carmona 2018).

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

Figure 7B.21. Distribution intracellulaire de K et U dans des cellules exposées à 125 µM (haut) et à 250 µM (bas) d'uranium pendant 7 jours. Nous observons que l'uranium est d'un côté du noyau (noyau marqué avec le Hoechst en bleu). Imagerie PIXE obtenue à AIFIRA (Carmona 2018).
<figure><img src="image_64.png" /></figure>

Figure 7B.22. Microscopie optique et imagerie micro-PIXE d'une cellule SHSY5Y après une exposition continue de 7 jours à 125 µM d'uranium et 4 heures d'exposition à la BFA (brefeldin A). (A) Microscopie à épifluorescence de Golgi-GFP montrant la perturbation de l'appareil de Golgi induite par la BFA avec l'appareil de Golgi répandue dans tout le cytoplasme. (B) Microscopie optique à épifluorescence de Hoechst 33342. (C) Superposition des images du noyau et du Golgi. (D) Distribution du potassium. (E) Répartition de l'uranium. (F) Images superposées du noyau et de la distribution de l'uranium. Imagerie PIXE obtenue à AIFIRA (Carmona 2018).

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Figure 7B.23. Spectres PIXE obtenus à AIFIRA à différentes conditions d'exposition d'uranium. Nous observons qu'il n'y a pas d'uranium dans le noyau (spectre rouge) dans aucune des conditions d'exposition (Carmona 2018).

D'un autre côté, l'expression des gènes liés à la dopamine a été quantifiée en utilisant la qRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction). Le site d'expression du gène de la monoamine-oxydase B (MAO-B) a diminué de manière statistiquement significative après l'exposition à l'uranium alors que d'autres gènes liés à la dopamine n'ont pas été modifiés. La dérégulation de l'expression de la MAO-B a été confirmée au niveau des protéines. Ce résultat original suggère que l'inhibition du catabolisme de la
dopamine, mais aussi d'autres substrats MAO-B, pourrait constituer des effets sélectifs de la neurotoxicité de l'uranium (figure 7B.24) (Carmona 2018).

<table><thead><tr><th>Gene</th><th>Name</th><th>Function</th><th>U 10 µM</th><th>U 125 µM</th><th>U 250 µM</th></tr></thead><tbody><tr><td>DDC</td><td>Dopa decarboxylase</td><td>Biosynthesis of dopamine</td><td>-1.2</td><td>1</td><td>1.4</td></tr><tr><td>DRD1</td><td>D1 subunit of dopamine receptor</td><td>Dopamine receptor</td><td>-3.2</td><td>1.1</td><td>-1.5</td></tr><tr><td>DRD3</td><td>D3 subunit of dopamine receptor</td><td>Dopamine receptor</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td></tr><tr><td>MAOB</td><td>Monoamine oxidase B</td><td>Catabolism of monoamines</td><td>-1.8*</td><td>-4.1*</td><td>-5.1*</td></tr><tr><td>SLC18A2 / VMAT2</td><td>VMAT2 Vesicular Monoamine Transporter 2</td><td>Transport of monoamines neurotransmitters</td><td>1.3</td><td>1.4</td><td>1.4</td></tr><tr><td>SLC6A3 / DAT</td><td>DAT Dopamine transporter</td><td>Dopamine transport</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td></tr><tr><td>TH</td><td>Tyrosine hydroxylase</td><td>Biosynthesis of dopamine</td><td>-3.7*</td><td>-1.2</td><td>-3.1</td></tr></tbody></table>

Figure 7B.24. Analyse par RT-qRT-PCR de l'expression des gènes liés à la dopamine dans des cellules SHSY-5Y différenciées après une exposition continue de 7 jours à 10, 125 et 250 µM d'uranium naturel. L'expression des gènes a été comparée au témoin non traité correspondant. Les niveaux d'expression du gène cible ont été normalisés au niveau d'expression des gènes ACTB (bêta-actine) et GAPDH (glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase). * p-value < 0,05 ; ND : non détecté (Carmona 2018).

## b. Imagerie corrélatif SXRF et épifluorescence des organites

Nous avons entrepris des études supplémentaires pour identifier les organites d'accumulation de l'uranium. Cette fois-ci nous avons étudié la localisation intracellulaire de l'uranium au moyen de la fluorescence X induite par radiation synchrotron qui nous permet d'attendre une très haute résolution spatiale (< 300 nm) et une haute sensibilité analytique (< 1 µg·g⁻¹ par pixel de 300 nm). Des cellules humaines SH-SY5Y différenciées en un phénotype dopaminergique de type neuronal ont été exposées en continu pendant 7 jours à une concentration non cytotoxique (10 µM) d'uranyle naturel soluble. Même à des concentrations non cytotoxiques, des agrégats cytoplasmiques d'uranium submicronique ont été observés, représentant en moyenne 62 % de la teneur en uranium intracellulaire. Les agrégats d'uranium ne contenaient ni calcium ni phosphore, ce qui indique que les mécanismes de détoxification dans les cellules de type neuronal sont différents de ceux décrits dans les cellules osseuses ou rénales (Keith 2008 ; Boonrungsiman 2012). Dans certains agrégats, l'uranium et le fer ont été colocalisés, ce qui suggère des voies métaboliques communes entre le stockage de l'uranium et du fer. Le fer est le seul élément qui se distribue sous forme de granules et qui présente une colocalisation partielle avec l'uranium (figure 7B.25) (Carmona 2021).
<figure><img src="image_66.png" /></figure>

Figure 7B.25. Colocalisation partielle de l'uranium et du fer dans les cellules SH5Y-SY. A) Cartes élémentaires du potassium, les limites des cellules sont tracées avec une ligne noire en pointillée. B) Images fusionnées de l'uranium (vert) et du fer (magenta), et les limites des cellules (pointillés blancs). La colocalisation du fer et de l'uranium est révélée par la couleur blanche des images fusionnées et mise en évidence par des flèches blanches. Barres d'échelle : 5 µm. Analyses effectuées sur la ligne Nanoscopium à SOLEIL (Carmona 2021).

La distribution intracellulaire de l'uranium a été comparée à la distribution des organites marqués par fluorescence (lysosomes, endosomes précoces et tardifs) et à la fétuin-E, une protéine de haute affinité pour l'uranium. Une corrélation stricte n'a pas pu être mise en évidence entre l'uranium et les organelles marquées (figure 7B.26, figure 7B.27), ou avec les vésicules contenant la fétuin-A (figure 7B.28). Nos résultats indiquent un nouveau mécanisme d'agrégation cytoplasmique de l'uranium après une exposition à l'uranyle non cytotoxique. Ce mécanisme d'agrégation pourrait être impliqué dans la défense neuronale des cellules par séquestration de l'uranium dans des espèces moins réactives.

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

Figure 7B.26. Distribution de l'uranium et comparaison avec la localisation du noyau, lysosome et endosome précoce. A) Imagerie par microscopie de fluorescence sur cellules vivantes de l'endosome précoce (rouge), le lysosome (vert) et le noyau (bleu). B) L'imagerie SXRF, sur la ligne Nanoscopium à SOLEIL, de potassium (rouge) et uranium (vert) superposés avec l'imagerie de fluorescence du noyau (bleu) après lyophilisation (mêmes cellules présentées en A). Les astérisques blancs indiquent la présence d'agrégats d'uranium dans les zones cytoplasmiques où la fluorescence des lysosomes est dense. Barres d'échelle : 10 µm (Carmona 2021).
<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Figure 7B.27. Distribution de l'uranium et comparaison avec la localisation du noyau et l'endosome tardif.</figcaption></figure>

A) Imagerie par microscopie de fluorescence sur cellules vivantes de l'endosome tardif (vert) et de noyau (bleu). B) L'imagerie SXRF, sur la ligne Nanoscopium à SOLEIL, de potassium (rouge) et uranium (vert) superposés avec l'imagerie de fluorescence du noyau (bleu) après lyophilisation (mêmes cellules présentées en A). Les astérisques blancs indiquent la présence d'agrégats d'uranium dans les zones cytoplasmiques où la fluorescence des endosomes tardifs est dense. Barres d'échelle : 10 µm (Carmona 2021).

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Figure 7B.28. Distribution de l'uranium et comparaison avec la localisation de la fétuin-A. A) Imagerie par microscopie de fluorescence sur cellules vivantes de la fétuin-A marquées avec Alexia-488 (vert) et de noyau (bleu). B) L'imagerie SXRF, sur la ligne Nanoscopium à SOLEIL, de potassium (rouge) et uranium (vert) superposés avec l'imagerie de fluorescence du noyau (bleu) après lyophilisation (mêmes cellules présentées en A). Barres d'échelle : 10 µm (Carmona 2021).</figcaption></figure>

En conclusion, nous avons révélé l'altération de la voie de dégradation des monoamines dans des cellules dopaminergiques après exposition continue à des concentrations d'uranium non cytotoxiques. Nous avons également cartographié la distribution de l'uranium en utilisant l'imagerie PIXE, avec une résolution micrométrique, et nous avons signalé la présence d'uranium dans les régions cytoplasmiques. Grâce à l'excellente sensibilité et à la résolution spatiale de la technique SXRF, nous avons exposé des cellules de type neuronal à 10 µM d'uranyle, et nous avons révélé la formation d'agrégats submicroniques d'uranium dans le cytoplasme qui ne pouvait pas être observée auparavant.
En outre, nous avons mis en évidence la colocalisation du fer et de l'uranium dans certains agrégats. Ce résultat suggère une potentielle interaction de l'uranium avec les protéines de stockage du fer intracellulaire telles que la ferritine, une protéine cytosolique dont il a été démontré qu'elle séquestrerait l'uranyle dans les essais biochimiques. Cependant, comme seulement une petite fraction des agrégats d'uranium contenait du fer, une interaction directe de l'uranium avec la protéine de stockage du fer ne peut pas expliquer tout le mécanisme d'agrégation de l'uranium. Nous avons également exploré d'autres hypothèses pour identifier la nature de l'uranium en comparant la distribution de l'uranium avec celle des autres organelles vésiculaires (lysosomes, endosomes précoces et tardifs) et avec des vésicules contenant la fétuiné-A. Nos résultats ne suggèrent pas une colocalisation stricte de l'uranium par la voie endo-lysosomale ou avec des vésicules contenant la fétuiné-A. Il est probable que les agrégats d'uranium se forment directement dans le cytosol des neurones SH-SY5Y. Nous proposons que l'agrégation de l'uranium puisse être un mécanisme de défense cellulaire contre la neurotoxicité de l'uranyle, et commence à des faibles niveaux d'exposition continue à l'uranyle, ce qui entraîne la séquestration de l'uranium dans des espèces moins réactives. La fraction soluble restante de l'uranium serait responsable de la complexation avec les protéines et des effets neurotoxiques qui en résultent (Carmona 2021).

## 7.4 Cu et Zn et le cytosquelette neuronal

Le zinc et le cuivre sont impliqués dans la différenciation neuronale et la plasticité synaptique, mais les mécanismes moléculaires à l'origine de ces processus sont encore insaisissables, en partie en raison de la difficulté à imager ses métaux à l'état de traces (Chang 2015 ; Vergano 2014 ; Barr 2017 ; D'Ambrosi 2015 ; Xiao 2018 ; Hatori 2016). Les ions de zinc sont stockés dans des vésicules présynaptiques dans un sous-ensemble de neuro-alvéoles glutamatergiques et ils sont libérés dans la fente synaptique lors de la neurotransmission (Vergnano 2014 ; Barr 2017). Le rôle du cuivre dans la fonction neuronale est moins bien décrit que celui du zinc, mais on sait que des ions de cuivre sont également libérés dans la fente synaptique où ils peuvent moduler l'activité des récepteurs de neurotransmetteurs (D'Ambrosi 2015). Cependant, les ions labiles de ces éléments ne représentent probablement que la partie émergée de l'iceberg, d'autres fonctions neuronales sont suspectées d'être liées à ces métaux.

### a. Premières indications de l'interaction du Cu et du Zn avec le cytosquelette neuronal

Nous avons pu quantifier le contenu de cuivre dans des tissus humains, et nous avons mis en évidence que dans la substance noire des patients atteints de la maladie du Parkinson, il y a un détriment du cuivre par rapport à des sujets témoins (Davies 2014). Au niveau de la cellule, le cuivre est un élément très peu concentré dans le corps cellulaire, mais nous avons remarqué qu'il se localise spécifiquement dans des dendrites très fines des cellules différenciées en neurones (Carmona 2008 b). Et que dans certaines structures il était, avec le zinc, le composé majoritaire (figure 7B.29 et figure 7B.30).
<figure><img src="image_70.png" /></figure>

Figure 7B.29. Gauche : image optique des cellules PC12 après cryofixation et lyophilisation. Les cellules ont été cultivées avec 300 µM de fer pendant 24 heures et traitées au NGF (nerve growth factor) pour les différentiées. Les carrés noirs montrent les zones analysées par fluorescence des rayons X synchrotron sur la ligne ID22NI de l'ESRF. Les flèches blanches montrent les processus de type neurite fin. À droite : images par fluorescence des rayons X des éléments chimiques dans le corps cellulaire (A), la ramification principale (B) et dans les processus de type neurite fin (A, B, C, D) (Carmona 2008 b).

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

Figure 7B.30. Gauche : image optique d'une cellule PC12 après cryofixation et lyophilisation, cultivée en conditions de contrôle et traitée au NGF. Le carré noir montre la zone analysée par SXRF. À droite : images par fluorescence des rayons X sur la ligne ID22NI de l'ESRF des éléments chimiques dans un processus de type neurite fin. Le processus mince est riche en cuivre, en zinc et, dans une moindre mesure, en soufre et en plomb (Carmona 2008 b).
## b. Imagerie SXRF de neurones primaires

Après ces étonnants résultats, nous avons travaillé avec des neurones primaires de l'hippocampe du rat. Les neurones avaient été maintenus en culture pendant 21 jours pour leur permettre de développer des connexions synaptiques. Pour l'identification des épines, le premier jour, avant d'ensemencer les cellules, elles ont été électroporées avec des protéines fluorescentes (FingPSD-95 GFP) qui ciblent la protéine PSD95 endogène de la densité post-synaptique. Ce marquage avait comme objectif de vérifier que les neurones avaient bien développé les synapses après ces 21 jours de culture. Le contenu synaptique a été analysé par SXRF sur ID16NI à l'ESRF avec un faisceau focalisé à 21 nm × 38 nm et nous avons mis en évidence que le Zn, Ca, P, S et K sont présents dans toute l'épine dendritique, avec une proportion plus élevée à la tête de celle-ci, figure 7B.31. En revanche le Cu n'affichait qu'une colocalisation partielle avec ces éléments, il est spécifiquement situé dans le cou de l'épine et non dans la tête, comme on peut le voir sur les images de superposition (figure 7B.31).

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>Figure 7B.31. Répartition des éléments dans les épines dendritiques (ou compartiments post-synaptiques). (A) Images nano-SXRF sur la ligne ID16-NI de l'ESRF des distributions de Zn, Cu, Ca, P, S et K dans l'ensemble d'une l'épine dendritique provenant d'un neurone de l'hippocampe de rat. (B et C) Superposition d'images nano-SXRF et coefficient de corrélation de Pearson (r). (D) Délimitation schématique des zones synaptiques ; toute la région d'intérêt (roi) est en gris, le roi pour la tête en rouge, le roi pour le cou en vert, et le roi pour la tige dendritique en bleu (Perrin 2017).</figcaption></figure>

Dans des zones plus larges, figure 7B.32, nous apprécions que le cuivre et le zinc forment des points d'accumulation, nous pensons qu'ils sont très concentrés dans les épines et qu'ils sont en forte relation avec des protéines du cytosquelette synaptique, comme l'actine ou la tubuline. Toujours sur la figure 7B.32, nous apprécions, sur l'image de superposition, que la distribution du Cu est co-ségrégée à celle du zinc. Nous avons quantifié le contenu élémentaire dans les corps neuronaux et dans les dendrites avec la plateforme AIFIRA,
et nous avons confirmé que la plupart du cuivre se retrouve dans la partie dendritique, mais le zinc se retrouve partout dans la cellule (Figure 7B.32 B).

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

Figure 7B.32. Distributions de Zn et de Cu dans les dendrites. (A) Microscopie à épifluorescence d'un neurone d'hippocampe de rat en culture primaire (DIV21) marqué avec PSD-95-GFP (marqueur des compartiments post-synaptiques). (B) Images par nano-SXRF de Zn et Cu dans la zone dendritique encadrée en (A). (C) Image de la superposition de Zn et Cu, montrant une colocalisation partielle dans les dendrites, et une distribution séparée dans les épines isolées, comme illustré dans la région zoomée. (D) Comparaison des concentrations de Cu et de Zn (µg·g⁻¹ de masse sèche) dans les corps et les dendrites neuronales (moyenne ± s.e.m.), mesurées par micro-PIXE. (*** p < 0,001). Images obtenues sur la ligne ID16-NI de l'ESRF (Perrin 2017).

Après avoir élucidé cette compartimentation, nous nous sommes intéressés à la possible interaction entre le Zn, le Cu et des protéines de stabilisation du cytosquelette, comme l'actine et la tubuline. Nous avons effectué une microscopie d'immunofluorescence quantitative pour mesurer l'expression de la β-tubuline et la F-actine dans les neurones hippocampiques de rats qui ont été traités au Zn (ZnCl₂, 10 µM, 24 heures), et dans des cellules de contrôle. La supplémentation en Zn a entraîné une augmentation de 34 % de l'intensité moyenne de la fluorescence de la β-tubuline par rapport aux témoins et une augmentation de 8 % de l'intensité moyenne de la fluorescence de la F-actine (figure 7B.33). De même, nous avons fait de la microscopie d'immunofluorescence quantitative sur des neurones supplémentés avec des concentrations subcytotoxiques de Cu (CuSO₄, 5 µM, 24 heures). Nous avons mesuré que la supplémentation en Cu a entraîné une diminution de 15 % de l'intensité moyenne de la fluorescence de la β-tubuline par rapport aux témoins et une diminution de 13 % de l'intensité moyenne de la fluorescence de la F-actine (figure 7B.34). Afin de mieux comprendre ces résultats, le nombre de zones riches en F-actine, appelées *actine hot spots*, a été compté. Le nombre de ces *actine hot spots* est réduit de 9 % à la suite de l'exposition au Cu par rapport aux témoins. Ces résultats montrent une relation entre ces protéines et ces métaux.
<figure><img src="image_74.png" /></figure>

Figure 7B.33. Teneur en F-Actine et β-Tubuline dans les neurones témoins et les neurones traités au Zn. (A) Images représentatives au microscope à fluorescence de la F-actine (rouge) et de la β-tubuline (verte) dans les dendrites des neurones témoins et (B) neurones traités au Zn (10 µM, 24 heures). (C) Comparaison des intensités de fluorescence de la F-actine et de la β-tubuline (moyenne ± s.e.m) pour l'ensemble des groupes (** p < 0,01 ; **** p < 0,0001 ; test U de Mann-Whitney) (Perrin 2017).

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

Figure 7B.34. Teneur en F-Actine et β-Tubuline dans les neurones témoins et les neurones traités au Cu. (A) Images représentatives au microscope à fluorescence de la F-actine (rouge) et de la β-tubuline (verte) dans les dendrites des neurones témoins et (B) neurones traités au Cu (5 µM, 24 heures). (C) Comparaison des intensités de fluorescence de la F-actine et de la β-tubuline (moyenne ± s.e.m) pour l'ensemble des groupes (**** p < 0,0001 ; test U de Mann-Whitney) (Perrin 2017).

### c. Imagerie corrélative à super-résolution des métaux et des protéines du cytosquelette neuronal

Nous avons conçu un protocole spécifique consistant en une microscopie STED sur des cellules vivantes sur des supports de nitrure de silicium (Si₃N₄), suivies d'un traitement cryogénique des cellules avant l'imagerie par nano-SXRF. Dans la partie B section 6, j'ai présenté un workflow résumant cette méthodologie. Les neurones primaires de l'hippocampe du rat ont été cultivés *in vitro* pendant 15 jours (DIV15) sur des membranes Si₃N₄ stériles placées au-dessus d'une couche nourricière d'astrocytes. Les membranes sont biocompatibles, exemptes de métaux traces, d'épaisseur de 500 nm, transparentes, plates, rigides et développées pour la microscopie à rayons X. Pour effectuer la microscopie STED, nous avons coloré les neurones vivants avec des fluorochromes de type SiR, avec la SiR-tubulin et la SiR700-actin. Ce sont des
fluorophores spécifiquement développés pour la microscopie STED. Les images STED ont été enregistrées avec une résolution spatiale de 40 nm. Ensuite, les membranes ont été congelées par immersion dans du 2-méthylbutane refroidi à -165 °C et lyophilisées à -90 °C sous vide secondaire avant d'être analysées. Finalement les échantillons ont été analysés par nano-SXRF et imagerie à contraste de phase (PCI) par rayonnement synchrotron avec un faisceau de rayons X de 40 nm à une énergie de 17 KeV sur la ligne de lumière ID16A à l'ESRF.

Le cuivre est principalement situé à la base des protrusions où il est colocalisé avec le signal de fluorescence le plus élevé de l'actine-F (figure 7B.35). Même si le cuivre est concentré dans les régions les plus riches en actine-F des épines dendritiques, sa distribution n'est que partiellement localisée avec celle de l'actine-F. Le cuivre pourrait peut-être servir de cofacteur aux protéines de remodelage de l'actine comme la cofiline, comme suggéré par des études de métalloprotéomique (Smith 2004). Le résultat le plus frappant de cette approche de microscopie corrélatif est l'observation de la colocalisation du zinc et de la tubuline dans les processus dendritiques minces, comme l'illustre la figure 7B.36. Cette figure montre des filaments de microtubules parallèles observés par microscopie STED (vert), ces filaments de tubuline parallèles n'ont pas pu être résolus par microscopie confocale, mais uniquement par microscopie STED. La microscopie nano-SXRF effectuée sur la même zone a permis de séparer les distributions d'éléments des deux processus dendritiques minces (figure 7B.36 d-e). Le tracé du profil des intensités des signaux relatifs du zinc et de la tubuline à travers les deux filaments de tubuline montre la colocalisation de leurs distributions. Le zinc suivait la même distribution que les microtubules selon une stœchiométrie de 1:1, suggérant un rôle direct dans le processus dendritique du zinc sur la tubuline en accord avec le modèle de Löwe et les travaux de Eagle, Hesketh et Craddock (Eagle 1983 ; Hesketh 1983 ; Craddock 2012). De même, le zinc est fortement corrélé avec la densité de matière comme le montrent les images de contraste de phase, figure 7B.35 e-i, ce qui suggère que, dans le processus synaptique, le zinc pourrait être localisé dans la PSD, ce qui serait en accord avec les résultats montrant l'expression de ZnT1 dans la PSD (Sindreu 2014).

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

Figure 7B.35. Microscopie STED corrélatif de la SiR-actine avec PCI et XRF synchrotron dans les épines. (a) Imagerie confocale d'un neurone primaire de l'hippocampe chez le rat marqué avec la SiR-actine montrant des protubérances riches en F-actine le long des dendrites. (b) Imagerie STED de la SiR-actine, de la zone entourée en a. (c) Zoom de la région b. (d) PCI par rayonnement synchrotron de la région dendritique encadrée en a. (e) Zoom sur la région encadrée en (d). (f-i) Cartes des éléments SXRF (P, S, Cu, Zn) de la région d'intérêt encadrée en (b) et (d). (j) Intensité de l'actine-F (rouge) et du cuivre (bleu) le long de la ligne rouge tracée en (h). Barres d'échelle : 200 nm, sauf pour (a) 10 mm, (b) et (d) 1 mm. L'imagerie synchrotron a été réalisée sur la ligne ID16A de l'ESRF (Domart 2020).
<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>Figure 7B.36. Imagerie STED et nano-SXRF corrélatif dans les dendrites. (a, g) Images STED de SiR-tubuline dans les dendrites. (b) Image confocale de SiR-tubuline de la région encadrée en (a). (c, h) STED SiR-tubuline image de la région encadrée en (a, g). (d, i) Cartes SXRF du soufre. (e, j) Cartes SXRF du zinc. (f) Profils de la courbe d'intensité du zinc, STED SiR-tubuline, et confocale SiR-tubuline le long d'une ligne de balayage traversant deux dendrites fines (ligne pointillée magenta en (e)). (k) Image superposée de STED SiR-tubuline (vert) et distribution du zinc (jaune). (l) Analyse des données quantitatives sur le soufre et le zinc exprimées en atom·nm⁻² pour 21 régions d'intérêt centrées sur les microtubules minces comme illustré pour les roi 1 à 3 encadrés en (d) et (i) (moyenne ± SD). Barres d'échelle : 500 nm, sauf pour a) et g) 1 mm. L'imagerie synchrotron a été réalisée sur la ligne ID16A de l'ESRF (Domart 2020).</figcaption></figure>

Toujours en relation avec l'étude de la liaison entre Cu, Zn et actine, tubuline, nous avons déterminé par SXRF la distribution des éléments chimiques qui composent les cônes de croissance et comparé cette localisation avec les distributions de la tubuline et la F-actine obtenues par la technique STED. Le cône de croissance neuronale est un site majeur de la dynamique de la surface membranaire, et il est associé à l'absorption et à la libération de matériaux, à la motilité et à l'extension des axones. De plus, ces structures montrent une compartimentation de la distribution d'actine et de la tubuline. En utilisant notre approche corrélatif, nous avons imagé la compartimentation de l'actine et de la tubuline dans les cônes de croissance des neurones vivants (DIV3) et à l'aide des sondes SiR-F-actine et SiR-tubuline en utilisant la microscopie STED. Les deux protéines ont montré une compartimentation très marquée, figure 7B.37, la tubuline (vert) le long des dendrites et la F-actine (magenta) davantage dans la tête du cône de croissance.
<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Figure 7B.37. Distribution de la tubuline (vert) et de la F-actine (magenta) dans les cônes de croissance des neurones de l'hippocampe. Images confocales (A), (B) et (C) dans les neurones vivants. (D), (E) et (F) images STED sur les cônes de croissance dans la région correspondante marquée en (A), (B) et (C) (Carmona 2022).</figcaption></figure>

Une fois les neurones imagés par STED, les échantillons ont été cryofixés et maintenus dans les vapeurs d'azote. Les analyses par nano-SXRF ont été réalisées sur la ligne 9-ID-B à l'APS avec une résolution spatiale de 95 nm et un flux de $10^9$ photons·s$^{-1}$. Les analyses menées en congelé-hydraté n'ont pas été un succès, à cause de la faible intensité du signal de détection. Probablement parce que la cryofixation, réalisée avec le méthylbutane, facilite la formation d'une couche de glace dans les échantillons, qui fait que les rayons X émis par l'échantillon sont atténués dans cette couche et la détection n'est pas performante. C'est pourquoi dorénavant nous allons mettre en œuvre la cryofixation avec du propane, que je développerai dans la partie C. Néanmoins, nous avons pu analyser les cônes de croissance sur des échantillons lyophilisés. Malheureusement, le cuivre n'a pas pu être détecté sûrement à cause de la faible intensité du faisceau de photons incidents qui fait que cet élément est en dessous de la limite de détection. Le flux de photons est 100 fois moindre que sur ID16A à l'ESRF (seule ligne où nous avons pu détecter le cuivre).

Cependant, les cônes de croissance contiennent S, Cl, K, Ca, Fe et Zn, ce qui indique que ces éléments sont essentiels au développement et à la mobilité des neurones (figure 7B.38). Ces éléments montrent un enrichissement à la tête des cônes de croissance, soit parce qu'il y a un enrichissement en protéines dans cette partie du cône, soit parce qu'ils sont spécifiquement nécessaires aux protéines impliquées dans la motilité. Une autre constatation est que le fer est présent sous forme de taches (figures 7B.38 et 7B.39), probablement dans des vacuoles, et qu'il n'est pas colocalisé avec un autre élément. Le Ca présente parfois une distribution granulaire (figure 7B.39), probablement aussi séquestrée dans des vacuoles, prêt à être transportée par les canaux du $Ca^{2+}$. Enfin, dans les dendrites emmenant jusqu'au cône de croissance, on observe la compartimentation du Cl, du K et du Ca, ce qui indique qu'ils sont séquestrés ou transportés par des protéines différentes (figure 7B.40).
<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Figure 7B.38. Distribution STED de la F-actine (A) et la tubuline (B), et images superposées (C) dans un cône de croissance sur cellule vivante. (D) Images confocales de l'actine et la tubuline dans le même cône après cryofixation et lyophilisation. (E) Images obtenues par nano-SXRF sur la ligne 9-ID-B de l'APS des éléments chimiques qui composent les cônes de croissance (Carmona 2022).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>Figure 7B.39. Distribution STED de la F-actine (A) et la tubuline (B), et images superposées (C) dans un cône de croissance sur cellule vivante. (D) Images obtenues par nano-SXRF sur la ligne 9-ID-B de l'APS des éléments chimiques qui composent les cônes de croissance (Carmona 2022).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_81.png" /></figure>

Figure 7B.40. Profil de distribution élémentaire dans les cônes de croissance. (A), (D) images SXRF fusionnées de K (vert) et Cl (rouge) ou Ca (magenta) dans deux cônes de croissance après cryofixation et lyophilisation. (B), (E) profils de l'intensité des rayons X pour chaque élément, dans la ligne plate correspondante (A) et (D). (C), (F) Images de la tubuline (vert) et de la F-actine (magenta) en microscopie STED, les mêmes cônes de croissance qu'en (A) et (D) mais sur cellule vivante (Carmona 2022).
## 1. Projet de recherche : imagerie cryo-corrélative

L'équilibre des métaux biologiques (en particulier le Mn, le Fe, le Cu et le Zn) est fortement altéré dans la plupart, voire la totalité, des maladies neurodégénératives (Acevedo 2019). Nombreux sont les troubles neurodégénératifs qui présentent une pathologie possiblement associée aux métaux à travers certaines métalloprotéines ou enzymes spécifiques (Jellinger 2013). Mes activités de recherche visent à mettre en évidence une colocalisation directe métal-protéine qui indiquerait des interactions spécifiques et contribuerait à élucider des mécanismes pathologiques.

L'approche corrélative développée dans la partie B section 6.1 s'avère suffisamment bonne pour identifier des grands organites, comme l'appareil de Golgi (Carmona 2019 a). Mais cette approche présente aussi des limitations quand les structures à corréler sont petites. Par exemple, nous avons vu dans le cas de l'uranium que toutes les vésicules du chemin endo-lysosomial sont proches les unes des autres et présentent une petite taille, quelques centaines de nanomètres. Nous avons montré une tendance, mais pas une corrélation parfaite, entre l'une des organelles marquées et l'uranium (Carmona 2021). Le principal frein à la corrélation vient de la phase de lyophilisation. Pendant la lyophilisation, les cellules perdent l'eau par sublimation, elles se dessèchent et donc rétrécissent. De ce fait, la taille et la position des structures cellulaires sont légèrement modifiées si nous comparons avant/après lyophilisation. Un autre facteur limitant dans l'approche corrélative est le temps qui s'écoule entre l'observation par fluorescence sur cellule vivante et la cryofixation. En général nous accomplissons l'imagerie sur cellule vivante en moins d'une heure et l'échantillon est cryofixé juste après l'observation. Malgré le délai court, nous avons vu, en étudiant les cônes de croissance, que ces structures sont très dynamiques et leur position pouvait changer légèrement durant ce laps de temps. Les marqueurs SiR-tubuline et SiR-actine que nous avons utilisés bloquent aussi la motilité des neurones, donc l'imagerie avant/après était faisable, en revanche j'ai aussi utilisé des marqueurs GFP-actine sur des cellules vivantes, et les cônes de croissance bougeaient le temps de réaliser deux images consecutives.

À l'échelle nanométrique, la localisation des protéines sur cellule vivante et la corrélation avec les images des métaux après le processus de préparation d'échantillons n'est pas souhaitable, et donc mon projet sera de développer une autre méthodologie corrélative plus généralisée. Ainsi l'idéal serait de faire la colocalisation sur des échantillons où nous savons qu'il n'y a pas de modifications ni de taille, ni de position. Comme déjà vu dans la partie B section 4, la microscopie photonique ne peut pas être effectuée sur des échantillons lyophilisés, car les fluorochromes sont altérés par ce processus. Nous avons vu que les sondes type GFP perdent leurs propriétés d'émission et que l'intensité de fluorescence des sondes type SiR est très faible après lyophilisation. En autre, par microscopie SXRF, si nous voulons imager le contenu métallique dans des petites structures cellulaires, il est nécessaire d'avoir un flux de photons très focalisé et intense. Cet intense flux de photons peut endommager les échantillons lors des analyses à température ambiante, en revanche, si les échantillons sont préservés dans un environnement cryogénique, la structure est préservée pendant l'analyse.
Toutes ces raisons nous amènent à combiner la microscopie photonique et SXRF en conditions cryogéniques. Si nous voulons nous affranchir de tous ces problèmes, nous sommes obligés de travailler en conditions cryogéniques à la fois pour l'observation des protéines et pour l'imagerie de métaux. Donc **mon objectif dans les prochaines années est de développer une microscopie corrélative en mode cryogénique. Les cellules seront d'abord cryofixées et après la microscopie photonique et l'imagerie par SXRF seront accomplies en maintenant tout au long du processus les cellules dans un état congelé-hydraté.** Le workflow de travail est présenté dan la figure C.1.

<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>Figure C.1. Workflow pour la correlation en conditions cryogeniques de la microscopie à fluorencence et de la fluorescence de rayons X par synchtrotron.</figcaption></figure>

Pour atteindre cet objectif, j'ai instauré trois étapes successives : la première est d'améliorer la cryofixation, la deuxième est de corréler en conditions cryogéniques l'épifluorescence et l'imagerie synchrotron, et la troisième de faire de l'imagerie corrélative en conditions de super-résolution. Ensuite, je vais développer chacune de ces étapes et illustrerai quelques exemples d'applications à haute résolution spatiale.

## 1.1 Cryofixation

Nous avons déjà vu qu'avant l'analyse, les cellules doivent être vitrifiées par congélation en plongée rapide pour maintenir les ions métalliques près de leur état natif, maintenir la nano-morphologie des cellules et protéger davantage l'échantillon contre les dommages causés par les radiations. Jusqu'à présent (partie B section 5) nous avons réalisé la cryofixation par immersion rapide de l'échantillon dans un liquide cryoprotecteur refroidi au préalable à la température de l'azote liquide. Le liquide que nous utilisons est le 2-methylbutane mais l'utilisation d'éthane est encouragée puisque ce composé présente des propriétés plus adaptées à la cryofixation. Il est plus volatil et évite la formation de glace à la surface de l'échantillon.
Par exemple, nous avons utilisé le 2-methylbutane pour la congélation des cellules HeLa exprimant la protéine SLC30A10. À l'ESRF, sur la ligne ID16A, nous avons réussi à imager la distribution des éléments chimiques dans les cellules, mais pendant la manipulation, nous avions eu quelques difficultés. Nous avons constaté, avant de réaliser le transfert de l'échantillon à la chambre d'analyse, que certaines cibles étaient recouvertes d'une fine couche de glace. Nous avons transferé dans la chambre d'analyse seulement des cibles qui ne semblaient pas avoir de couche de glace, mais, à certains endroits, la détection des rayons X était très faible, voire quasiment nulle. Grâce au système d'acquisition, nous avons pu estimer la mesure de la couche de glace et constater qu'elle n'était pas homogène et, qu'effectivement, à certains endroits, la glace était si épaisse qu'elle empêchait la détection des rayons X. Une expérience similaire a été faite à l'APS, où l'analyse des neurones en congelé-hydraté n'a pas été possible. Cette fois-là, deux facteurs ont sûrement joué un rôle, le flux de photons et l'épaisseur de glace. Comme le flux de photons est environ 100 fois moins important qu'à l'ESRF, l'émission des rayons X par la cible et sa détection sont aussi plus faibles. Ce fait, ajouté à l'atténuation suivie par les rayons X émis quand ils traversent la couche de glace, nous a conduits à ne pas pouvoir réaliser d'images de ce type d'échantillons.

Nous réaliserons la cryofixation à l'aide d'une technologie de cryofixation de pointe en utilisant un congélateur en plongée automatisée (FEI Vitrobot) et qui utilise de l'éthane comme liquide cryogénique. Cet appareil disponible depuis peu au BIC (Bordeaux Imaging Center) contrôle l'humidité dans la chambre où est déposé l'échantillon avant l'immersion, il contrôle aussi la force et le temps de blotting des restes du liquide de rinçage, ainsi que la vitesse d'immersion de la cible dans l'éthane. D'autres équipes ont obtenu des résultats encourageants pour ce type de préparation dans des échantillons biologiques ; donc je suis confiante. Un autre point auquel il faut faire attention et qui fait partie du processus de cryofixation est le stockage. Il faut trouver un moyen de conserver les échantillons de manière à éviter l'humidité et leur contamination par contact avec de solutions non ultra-pures. Je pense notamment au cas où les cibles sont stockées en immersion dans l'azote ou par contact avec les vapeurs d'azote. Pour déterminer quels paramètres et conditions sont les plus appropriés, il faudra préparer des échantillons en changeant les conditions et vérifier la morphologie et la propreté des cibles.

## 1.2 Cryocorrélatif : épifluorescence-SXRF

Cette partie va être menée en collaboration avec le Bordeaux Imaging Center (BIC). Le BIC fait partie des infrastructures de base nationales (France Biolmaging) et européennes (EuroBiolmaging) et offre des ressources en microscopie photonique et électronique telles que la microscopie confocale, la microscopie STED, PALM, dSTORM, Light Sheet microscopy et CLEM. Le BIC développe et met en œuvre de nouveaux systèmes d'imagerie afin d'améliorer la résolution/détection en profondeur/vitesse d'acquisition. C'est cette infrastructure que j'ai utilisée pour la réalisation de la technique STED sur les membranes de nitrure de silicium et où je suis accueillie pendant les travaux d'infrastructure de mon laboratoire d'affectation. Aussi, récemment, le BIC électronique a implémenté la technique Cryo-CLEM, cryocorrélation par microscopies optique et électronique (de l'anglais *Cryo Correlative Light and Electron Microscopy*).

Pour l'observation des protéines fluorescentes nous utiliserons un cryomicroscope commercial récemment acquis au BIC pour la microscopie par cryofluorescence à résolution intermédiaire (système Leica EM-cryoCLEM). Ce microscope a été adapté avec des lasers d'excitation assez puissants pour pouvoir faire de la microscopie confocale ou d'épifluorescence sur des cellules cryofixées sans faire de coupes. La résolution
latérale de ce système est de l'ordre des 300 nm et compatible avec l'analyse de nombreux organites
cellulaires. Pour l'analyse des métaux dans des conditions cryogéniques à une résolution d'environ 300 nm,
plusieurs lignes de faisceaux synchrotron peuvent être utilisées à l'ESRF, l'APS ou DESY.

Nous l'avons testé, et certains points sont à dénouer. Le premier est d'avoir un support adapté à nos cibles
pour le transfert et l'observation. Les échantillons, après cryofixation, sont conservés dans les vapeurs
d'azote et doivent être maintenus à basse température à tout moment. Le système de transfert doit
permettre de manipuler l'échantillon et de le déposer dans un support adapté à l'observation. Ce support
sera introduit dans le cryomicroscope à l'aide d'un bras articulé, et il faut veiller à ce que le système soit
toujours refroidi. Aujourd'hui, nous sommes en contact avec la compagnie Leica qui a développé un système
de transfert et de stabilisation de nos supports de nitrure de silicium. Mais il doit être amélioré puisque, pour
le moment, l'humidité se dépose sur nos échantillons déjà avant le transfert et aussi pendant les analyses en
fluorescence. Ce problème peut venir du design de la boîte de transfert (il n'y a pas assez d'espace pour
maintenir la température de l'échantillon basse avec les vapeurs d'azote) ou parce que nous avons utilisé le
méthylbutane pour la cryofixation et que la petite couche de glace qui se forme attire l'humidité sur elle.
Nous devons donc faire des tests sur ce point une fois la cryofixation avec l'éthane réalisée.

Un autre point qu'il faut travailler pour mener la microscopie corrélative en conditions cryogéniques est
d'établir des positions de repère. En CLEM, des microsphères fluorescentes sont ajoutées aux échantillons
avant la cryofixation. Ces billes en plastique se collent sur le support et servent de points de repère grâce à
l'émission de fluorescence dans une large gamme du spectre. L'utilisation de ces billes nous permettrait de
positionner les deux images obtenues par les deux techniques. À cause de l'étape de rinçage avant la
cryofixation, l'ajout de ces billes n'est pas une tâche aisée, et la meilleure option est probablement d'ajouter
ces billes pendant la culture. D'autres points sont à vérifier : si les microsphères sont stériles et ultra-pures,
si elles donnent des signaux en SXRF ou avec une autre technique, comme le contraste de phase qui peut
être utilisé simultanément avec la fluorescence des rayons X.

Avec la microscopie cryocorrélative en mode épifluorescence nous obtenons l'avantage de l'immobilisation
des structures cellulaires pendant l'observation en fluorescence et le maintien de cette immobilisation pour
a posteriori la microscopie par SXRF. Ainsi, nous pourrons corréler des petites structures mobiles, comme les
vésicules que nous avons identifiées dans l'étude de la localisation du manganèse dans les cellules exprimant
la protéine SLC30A10 ou les vésicules contentant de l'uranium insoluble. Les images en épifluorescence, de
même que par SXRF, seront en deux dimensions avec une information sur tout le volume de la cellule ou du
neurone sondé. Cette microscopie présente des limitations en matière de résolution spatiale, par exemple il
ne sera pas possible de différencier des structures à l'intérieur d'une synapse ou de séparer deux points
distants de moins de 200 nm. Ainsi pour rompre les limites de résolution dues à la diffraction de la lumière,
je souhaite aussi développer la microscopie cryocorrélative en utilisant la technique cryo-PALM qui nous
permettra d'atteindre des résolutions spatiales de l'ordre de quelques dizaines de nanomètres, comme dans
les lignes synchrotron les plus puissantes.
## 1.3 Cryocorrélatif : cryo-PALM et cryo-nano-SXRF

L'adaptation du système STED pour faire de la microscopie en conditions cryogéniques n'est pas envisageable à cause de la complexité du système, des excitations/déplétions par différents lasers, des plusieurs objectifs interchangeables, la stabilité du système... Donc pour pouvoir développer un flux de travail entièrement cryogénique et en super-résolution, j'ai choisi d'implémenter la technique cryo-PALM pour la microscopie des protéines, puisque la faisabilité de la technique PALM en conditions cryogéniques a déjà été démontrée (Sartori 2007).

La technique PALM est fondée sur l'utilisation de deux lasers, un laser UV et un laser de lecture. Le laser UV active les fluorophores de manière stochastique. En choisissant une faible puissance UV, seule une petite fraction des molécules est activée, permettant d'isoler des molécules individuelles. Le laser de lecture permet ensuite de visualiser les fluorophores qui ont été activés. Les centroïdes de chacune des molécules fluorescentes sont alors calculés et considérés comme un pixel de l'image finale super-résolue. Le processus est répété des milliers de fois, et l'image est reconstruite par addition des centroïdes (Betzig 2006). La microscopie PALM utilise des protéines fluorescentes variantes de la GFP (Green Fluorescent Protein) (MacDonald 2015). Les cellules sont transfectées de manière à exprimer le gène codant pour la protéine d'intérêt (ou une protéine ligand) liée à la protéine fluorescente. La microscopie PALM présente la caractéristique d'être compatible avec l'imagerie sur cellules vivantes et avec l'imagerie en conditions cryogéniques avec les fluorophores appropriés. Le cryo-PALM offre de nombreuses applications biologiques pour identifier les organites (mitochondries, lysosomes, endosomes...), les structures des sous-organites, les compartiments subsynaptiques, et toute protéine d'intérêt à haute résolution spatiale (25 nm). De plus, la technique cryo-PALM sera compatible avec d'autres techniques que la SXRF, telles que la XAS par synchrotron (spectroscopie d'absorption des rayons X) pour déterminer la spéciation chimique des éléments d'intérêt.

Ce projet de développement sera mené en collaboration avec Monica Fernandez Monreal, du Bordeaux Imaging Center (BIC). Comme dit précédemment, le BIC est équipé d'un système commercial de microscopie par cryofluorescence (Leica EM-CryoCLEM, Linkam Cryo-stage) qui sera adapté pour effectuer la microscopie de localisation par cryo-photo-activation (Cryo-PALM) (Dahlberg 2020). Cette modalité de localisation de molécule unique est fondée sur l'expression de protéines fluorescentes photo-activables/commutables, dans l'activation stochastique de molécules uniques, et dans leur localisation par un logiciel dédié. Le BIC a déjà obtenu des résultats préliminaires passionnants montrant que les protéines photoconvertibles peuvent être activées dans des conditions cryogéniques (figure C.2) et il espère augmenter la résolution à 20 à 50 nm.
<figure><img src="image_83.png" /></figure>

Figure C.2. Images cryo-PALM d'une cellule COS-7 transfectée avec l'alpha-actinine marquée avec la protéine photosensible mEos2.0. Le panneau de gauche montre une image par diffraction et le panneau du milieu une image super-résolue par reconstruction des traceurs cryo-PALM. Le graphique de gauche montre le profil d'intensité des deux images. Barres d'échelle de 5 µm.

Cependant, cette approche doit être optimisée avec l'acquisition d'une caméra EMCCD (Electron Multiplying Charge-Couple Device) pour augmenter la sensibilité lors de l'acquisition. Nous devrons également adapter nos systèmes actuels à l'acquisition PALM avec un nouveau jeu de filtres pour deux faisceaux à excitation simultanée et pour collecter des bandes d'émission de longueurs d'onde spécifiques. Enfin, nous passerons au crible et caractériserons la photophysique des protéines photo-convertibles disponibles. En plus, l'Institut interdisciplinaire des neurosciences (IINS) (avec lequel nous collaborons depuis 2015) de l'Université de Bordeaux pourra nous fournir des constructions de protéines fluorescentes photo-convertibles (Nemet 2015) par le biais de son service de biologie cellulaire. Finalement, ce système nous permettra de réduire la résolution à 25 nm. Bien sûr, cette méthodologie corrélative pourra s'appliquer à de nombreuses études sur l'interaction métal-protéine. Nous pourrons être capables de marquer n'importe quelle protéine et déterminer si elle colocalise et/ou modifie la distribution de certains éléments chimiques.

## 1.4 Applications

Pour valider cette méthodologie corrélative, je compte l'appliquer tout d'abord à notre projet ANR sur la toxicologie synaptique de métaux lourds et à plus long terme à l'étude de la distribution du manganèse.

### Projet de recherche sur la neurotoxicologie synaptique des métaux environnementaux

L'exposition environnementale aux métaux neurotoxiques est un problème de santé mondial. Quatre métaux (As, Cd, Hg et Pb) ont été répertoriés parmi les dix substances chimiques les plus préoccupantes pour la santé publique (WHO 2010). Ils ont tous des effets neurotoxiques (voir les profils toxicologiques de l'ATSDR, 2022). Le Mn et l'U sont deux autres éléments de plus en plus préoccupants (Dinocourt 2015 ; Miah 2020). L'impact exact de l'exposition environnementale aux métaux sur les fonctions neuronales est difficile à évaluer, mais on soupçonne qu'il affecte largement la population humaine. Les sources d'exposition environnementale humaine sont diverses, qu'il s'agisse de l'air, de l'alimentation ou de l'eau potable. Il existe de nombreux exemples d'expositions environnementales localisées, ou plus répandues, à des métaux toxiques dans le monde (Charron 2012) (Frisbie 2002).
Selon la période d'exposition au cours de la vie, ces métaux affectent le neurodéveloppement, le neurocomportement, la cognition et sont impliqués dans l'étiologie des maladies neurodégénératives (pour des revues : Weiss 2011 ; Charlet 2012 ; Modabbernia 2017 ; Ijomone 2020 ; Chandravanshi 2021). Par exemple, dans le cas de la MA, la forme la plus courante de démence qui touche plus de 50 millions de personnes dans le monde et qui devrait presque doubler tous les 20 ans selon l'OMS. Malgré des décennies de recherche, les causes de la maladie d'Alzheimer restent insaisissables. Une solution pour faire face à ce problème global est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la neurotoxicité des métaux et de concevoir des stratégies de prévention ciblées.

Notre hypothèse est que les métaux neurotoxiques pourraient se lier directement aux protéines du cytosquelette (actine, tubuline...) dans les neurones, ce qui entraînerait une désorganisation structurelle des synapses, conduisant à des altérations de la connectivité synaptique et finalement à la perte des synapses.

Il existe de plus en plus de preuves d'une toxicité spécifique de l'As, du Cd, du Hg, du Mn, du Pb et de l'U envers le cytosquelette neuronal. L'arsenic supprime la croissance des neurites, un mécanisme induit par la diminution, entre autres, des niveaux de tubuline (Aung 2013). De même, il réduit la différenciation neuronale et l'expression de la protéine β-tubuline (Stern 2014). Sur des systèmes non neuronaux, fibroblaste pulmonaire en culture, l'arsenic induit un désassemblage dose-dépendant des microtubules en ciblant la tubuline (Zhao 2012). Le cadmium induit le désassemblage du cytosquelette dans une variété de cellules neuronales en culture, en ciblant à la fois les réseaux d'actine (Ge 2019) et des microtubules (Gerspacher 2009) (Wang 2016). Sur des systèmes non neuronaux, cellules pulmonaires en culture, le cadmium provoque une oxydation significative des protéines régulant le cytosquelette d'actine (Go 2013). In vitro et dans des fibroblastes en culture, le plomb inhibe l'assemblage des microtubules et dépolymérise les microtubules de tubuline (Zimmermann 1988). Dans les cellules de neuroblastome, le mercure induit une perturbation des microtubules à des concentrations nettement plus faibles que dans les fibroblastes, ce qui indique une sensibilité particulière des cellules nerveuses au mercure (Stoiber 2004). L'exposition au mercure entraîne une réduction de l'expression de la tubuline dans différents types cellulaires (Choi 2011) (Stern 2014) (Li 2018). Dans les muscles des poissons, la β-actine est la principale protéine de liaison au Hg (Nong 2021). Des concentrations de manganèse pertinentes pour l'environnement altèrent la morphologie et la structure du cytosquelette dans les cellules souches neuronales adultes en diminuant la polymérisation de la F-actine (Parsons-White 2018). Récemment nous avons identifié les protéines du cytosquelette d'actine comme l'une des quatre principales voies canoniques ciblées par la toxicité de l'uranium (Vidaud 2020). Dans les cellules rénales humaines, l'expression des gènes et des protéines codant pour l'actine et la tubuline était régulée à la baisse lors de l'exposition à l'uranium (Prat 2005). Dans un modèle de poisson zèbre visant à étudier la toxicité environnementale de l'uranium, l'actine a été identifiée comme une protéine de liaison potentielle de l'uranium (Eb-Levadoux 2017).

L'actine et la tubuline sont les protéines du cytosquelette les plus largement exprimées et sont impliquées dans la formation, la plasticité et la stabilité des synapses (Bucher 2020 ; Parato 2021). L'actine est le principal élément du cytosquelette des épines dendritiques. La polymérisation ou dépolymérisation dynamique des filaments d'actine (F-actine) sert de force motrice pour la formation ou la rétraction des épines dendritiques. Les microtubules sont formés par la polymérisation d'hétérodimères αβ-tubuline et sont localisés principalement dans les axones et les dendrites mais aussi dans les synapses (Parato 2021). La désorganisation de la structure cytosquelettique synaptique est impliquée dans de nombreux
dysfonctionnements neurologiques, notamment les troubles neurodéveloppementaux (ex. : autisme) (Joensuu 2018 ; Lasser 2018), et les maladies neurodégénératives (ex. : MA) (Dent 2017 ; Pelucchi 2020).

En résumé, au niveau cellulaire, il existe de nombreuses preuves des effets toxiques des métaux sur le cytosquelette neuronal. Une information manquante importante que nous aimerions fournir est de montrer que les synapses sont les premières cibles des dommages du cytosquelette neuronal. Cela serait déterminant pour comprendre les effets neurotoxiques précoces puisque la perte de connectivité synaptique devrait précéder des altérations plus radicales telles que la neurodégénération. En comparant six métaux neurotoxiques, avec une réactivité (bio)chimique différente, notre objectif est de montrer que l'altération du cytosquelette synaptique induite par les métaux est un mécanisme d'action général.

En utilisant la nano-imagerie synchrotron XRF, nous avons déjà détecté la présence de niveaux endogènes de Pb le long des excroissances de neurites dans des cellules PC12 différenciées de type neurone (Carmona 2008 a). Pour cette expérience, aucun Pb n'a été ajouté au milieu de culture. Ce résultat prouve la faisabilité de l'imagerie du Pb à très faible concentration (endogène) dans les cellules, donc après exposition à des concentrations environnementales. Ce résultat indique également la probable colocalisation du Pb avec les microtubules. Ainsi, avec le cryo-PALM, notre objectif sera de déterminer la distribution de l'actine et de la tubuline à l'intérieur des synapses et dans les dendrites, et de corréler leur distribution avec celle des métaux toxiques. Grâce à la plateforme de biologie moléculaire de l'IINS, nous pourrons synthétiser d'autres protéines photo-activables qui jouent un rôle dans la stabilité de l'actine et de la tubuline. Notre objectif ultime sera de montrer la colocalisation des métaux toxiques avec une protéine unique à l'intérieur d'une synapse d'un neurone.

## Projet de recherche biomédicale sur la distribution du Mn dans des modèles cellulaires du parkinsonisme

A plus long term je tiens à aprofondir sur le role du manganese dans les formes de parkinsonisme familiel. Dans un premier temps avec une résolution spatiale intermédiaire, je déterminerai la localisation du manganèse pour quatre mutants SLC30A10 qui provoquent le parkinsonisme familial (L89P, Δ98-134, T196P, Q308Stop) et à haute résolution spatiale, je déterminerai si le manganèse est piégé dans le réseau cis ou trans Golgien ou s'il circule vers des compartiments en aval, comme les lysosomes, pour mieux comprendre ses mécanismes de toxicité. J'utiliserai, via le service de biologie cellulaire de l'IINS, différentes constructions des protéines d'intérêt (galactosyltransférase 1 pour le réseau trans-Golgi, GM130 pour le réseau cis-Golgi et LAMP1 pour les lysosomes) marquées avec des protéines fluorescentes photo-convertibles (Nemet 2015).
## 2. Conclusions

Dans mon bilan de recherche, nous pouvons apprécier le gain en résolution spatiale qu'a connu, ces dernières années, la technique de spectroscopie de fluorescence des rayons X. À chaque nouveau progrès s'ouvrent de nouvelles possibilités et de nouveaux champs de recherche. Ce qui nous a permis d'analyser des tissus, des cellules, l'intérieur des cellules, les synapses et même l'intérieur de ces synapses. Mais également à chaque échelle microscopique traversée s'ouvrent à nous de nouvelles difficultés ou défis pour identifier les cellules, les organelles, les protéines ou les molécules qui interagissent avec les métaux que nous étudions. Nous avons intégré à nos recherches la microscopie photonique, d'abord avec la mise en œuvre de l'épifluorescence et ensuite en rendant compatible la technique STED. Nous avons cherché des fluorochromes adaptés à la préparation d'échantillons et nous avons imaginé différentes façons de corréler les images métal-protéine obtenues par différentes techniques, que ce soit dans la même cellule, dans le tissu adjacent ou dans des systèmes biologiques équivalents.

Toutes ces évolutions et l'état de l'art actuel m'ont amenée à ce qui sera mon projet de recherche : développer l'imagerie corrélative en conditions cryogéniques et en rendant compatibles les techniques spectroscopiques XRF par synchrotron et PALM. Les deux techniques seront appliquées sur le même échantillon, la même cellule et la même zone, sans aucune modification de l'état physique, et les deux techniques seront conduites sur des échantillons congelés-hydratés.

J'espère que ce manuscrit reflète la grande implication au niveau expérimental que je me suis donnée pendant mes travaux. Mon implication et les recherches que j'ai entreprises ont été très empiriques et concernaient tant la culture des cellules et des neurones, la recherche de fluorochromes, l'amélioration des protocoles de préparation des échantillons et la réalisation de l'imagerie synchrotron. Pendant ces années j'ai travaillé avec nombreuses personnes qui ont séjourné dans l'équipe, doctorants, stagiaires, masters et postdoctorants, et avec d'autres que j'ai côtoyés pendant les expériences synchrotron. Certaines personnes ont été aussi sous ma tutelle et cette expérience a éveillé en moi l'envie de m'impliquer davantage dans le processus d'encadrement. Je souhaite partager mes projets, transmettre l'envie de la recherche et éveiller l'intérêt pour découvrir le rôle des métaux dans le cerveau. J'ai envie de le faire avec de jeunes chercheurs et de voir avancer mes projets en partageant des discussions scientifiques, des manipulations et des rêves. C'est donc pour ces motifs qu'aujourd'hui je me suis décidé à présenter mon HDR pour m'investir dans la formation par la recherche et l'encadrement.
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