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# Développements en Electrochimiluminescence en vue d'Imager la Perméabilisation Membranaire de Liposomes Géants

Fatma Ben Trad

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Fatma Ben Trad. Développements en Electrochimiluminescence en vue d'Imager la Perméabilisation Membranaire de Liposomes Géants. Chimie théorique et/ou physique. Université Paris Sciences & Lettres, 2023. Français. NNT: . tel-04062699

HAL Id: tel-04062699

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Submitted on 7 Apr 2023

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# Développements en Electrochimiluminescence en vue d'Imager la Perméabilisation Membranaire de Liposomes Géants

Soutenue par

**Fatma BEN TRAD**

Le 27 Février 2023

Ecole doctorale n° 388

L'école doctorale de Chimie
Physique et Chimie
Analytique de Paris Centre

Spécialité

Chimie physique et chimie
Analytique

## Composition du jury :

Fabienne Burlina
DR- CNRS - Sorbonne Université
Président

Laurent Bouffier
DR CNRS ISM Bordeaux
Rapporteur

Florence Geneste
DR CNRS Université de Rennes
Rapporteur

Neso Sojic
PR - ENSMAC Bordeaux
Examinateur

Sophie Griveau
Maître de conférences
Chimie ParisTech - PSL
Examinateur

Eric Labbé
PR Sorbonne Université
Examinateur (co-encadrant)

Olivier Buriez
DR CNRS-ENS
Directeur de thèse
<figure><img src="image_2.png" /></figure>
Remerciements

Je tiens tout d'abord à remercier Rodolphe Vuilleumier, directeur du département de chimie et du laboratoire PASTEUR et Anne Boutin, l'ancienne directrice du département de chimie, de m'avoir accueilli pour que je puisse effectuer cette thèse.

Je ne sais pas si un remerciement suffi pour exprimer ma gratitude et ma reconnaissance à mon directeur de thèse, Olivier Buriez, qui est toujours présent pour m'accompagner et m'aider à avancer. Je ne sais pas aussi si les mots peuvent décrire toute l'énergie positive qu'il me transmet chaque jour avec son sourire et son sens de l'humour. Merci beaucoup Olivier d'avoir rendu cette thèse la plus agréable possible.

Je remercie chaleureusement Eric Labbé, mon co-encadrant de thèse pour sa disponibilité, ses conseils constructifs et le temps qu'il m'a consacré pour m'aider à mener, au mieux, ce travail.

J'adresse mes remerciements aussi aux membres de jury présents à ma soutenance pour avoir accepté de juger mon travail. Je remercie tout particulièrement, Docteur Laurent Bouffier de l'université de Bordeaux et Docteur Florence Geneste de l'université de Rennes, pour avoir accepté d'être les rapporteurs de ma thèse. Mes remerciements vont également au Docteur Sophie Griveau pour avoir accepté d'être examinatrice de cette thèse. Un immense merci au Professeur Neso Sojic et Docteur Fabienne Burlina d'avoir accepté d'être dans le jury de ma thèse en tant qu'examineurs et surtout d'avoir participé à l'avancement de ce projet par leurs conseils et compétences scientifiques.

Mes remerciements vont également au Docteur Stéphane Arbault pour sa rigueur scientifique et pour avoir suivi et participé à ce projet.

Je tiens à remercier Mathieu Morel de m'avoir aidé à développer la méthode de fabrication des liposomes par microfluidique et je remercie sincèrement Jérôme Delacotte pour sa disponibilité et pour ces compétences qui m'ont permis de mieux avancer.
Un grand remerciement à Fréderic Lemaitre et Manon Guille pour l'intérêt qu'ils portent à
mon travail, leurs disponibilités pour suivre l'avancement de ma thèse et leurs compétences
scientifiques.

Je souhaite adresser mes remerciements à Aurélie Pierret qui m'a consacré son temps pour me
former à la déposition du graphène et à Ayako Yamada de m'avoir aidé à fabriquer des
nouveaux dispositifs microfluidiques.

Un immense merci à Bixente Carré, mon stagiaire, pour tout l'énorme travail réalisé pendant
un mois de stage et qui m'a permis d'avancer plus rapidement.

Un grand remerciement au Professeur Laurent Gaillon et Professeur Yannick Millot pour leurs
aides pour les enseignements de TP à Sorbonne Université. Je profite aussi pour remercier tout
le personnel des plateformes de TP.

Un chaleureux remerciement à Thomas de m'avoir accompagné pendant mes 4 ans dans le
laboratoire et à l'extérieur du laboratoire, merci Thotho pour tous les moments, les soirées et
les repas qu'on a partagés ensemble, merci pour ton soutien pendant les moments difficiles.
Tout simplement, merci pour ta présence.

Je tiens aussi à remercier toutes les personnes que j'ai rencontré dans le laboratoire et qui ont
participé à rendre cette thèse agréable : Aurélien, Justine, Yumeng, Thuvaraka, Karen et Reina.
Un remerciement spécial à Antoine et Aude et une pensée particulière à Léna.

Je souhaite exprimer mes sincères remerciements au Professeur Christian Amatore, à Laurent
Thouin, Cathrine Sella, Alexander Oleinick et Irina Svir pour toutes les discussions et la bonne
humeur dégagée.

Je remercie Xiaochen, Haoyue, et Boxin, mes collègues de bureau. Mes remerciements vont
également à toute l'équipe de l'administration.

Enfin, je veux exprimer ma reconnaissance et mon amour à ma mère pour son soutien et ses
efforts pour m'aider à avancer et j'offre cette thèse à mon père et je lui dis que je pense toujours
à lui.
# Sommaire

Liste des abréviations.................................................................................................................. 1

Introduction Générale.................................................................................................................. 7

1- Premier chapitre – Etat de l'art sur la méthodologie mise en œuvre (électrochimiluminescence) et sur les objets étudiés (liposomes géants).................................................. 15

I. Introduction................................................................................................................................. 15

II. L'électrochimiluminescence : histoire, fondamentaux et applications.................................. 15

1. Rappels sur les différents phénomènes à l'origine de l'émission de lumière (la luminescence).................................................................................................................. 16

2. L'électrochimiluminescence........................................................................................................ 18

3. Mécanismes de l'électrochimiluminescence........................................................................ 19

3.1. Approche dite « d'annihilation ».................................................................................. 20

3.2. Approche par co-réactif........................................................................................................ 21

4. Applications................................................................................................................................. 28

III. Les liposomes : généralités et applications........................................................................ 34

1. Introduction................................................................................................................................. 34

2. Composition des liposomes : les phospholipides.................................................................. 35

3. Classification des liposomes........................................................................................................ 41

4. Différentes méthodes de préparation et d'encapsulation dans les liposomes.................... 42

4.1. Electroformation.................................................................................................................. 43

4.2. Méthode de transfert de phase.................................................................................. 44

5. Différentes applications des liposomes.................................................................................. 45

5.1. Applications thérapeutiques : vectorisation de médicaments........................................ 45

5.2. Applications biochimiques et modèles biophysiques.................................................... 46

5.3. Utilisation dans les produits cosmétiques........................................................................ 47
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>5.4.</td>
      <td>Utilisation dans l'industrie alimentaire</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.</td>
      <td>Conclusion</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2-</td>
      <td>Deuxième chapitre – Développement d'une méthodologie d'électrochimiluminescence pour imager l'ouverture de liposomes géants</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.</td>
      <td>Contexte de l'étude</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.</td>
      <td>Préparation des liposomes : encapsulation des réactifs et stabilité</td>
      <td>52</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.</td>
      <td>L'osmolalité : généralité et calcul</td>
      <td>53</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.</td>
      <td>Choix de phospholipides</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.</td>
      <td>Fabrication de liposomes</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.</td>
      <td>Préparation de l'émulsion : formation de la première monocouche</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.</td>
      <td>Formation de la deuxième monocouche</td>
      <td>56</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.</td>
      <td>Visualisation des liposomes</td>
      <td>56</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.</td>
      <td>Effet du matériau d'électrode sur la réponse électrochimique des espèces électroactives</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.</td>
      <td>Les matériaux utilisés pour la fabrication des électrodes</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1.</td>
      <td>Les matériaux carbonés : les plus compatibles avec l'ECL</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2</td>
      <td>Electrode en ITO</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.</td>
      <td>Comportement électrochimique du luminophore</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.</td>
      <td>Comportement électrochimique du co-réactif</td>
      <td>62</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.</td>
      <td>Détection synchronisée du courant d'oxydation et du signal luminescent</td>
      <td>64</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.</td>
      <td>Détection électrochimique de l'évènement de l'ouverture à la surface d'une électrode polarisée</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.</td>
      <td>Cellule électrochimique utilisée pour la détection de l'ouverture du liposome et expérience réalisée</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.</td>
      <td>Résultats obtenus suite à la perméabilisation de la bicouche lipidique</td>
      <td>67</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.</td>
      <td>Mise en évidence électrochimique de la perméabilisation de liposomes ne contenant que du sucrose dans du PBS</td>
      <td>67</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>2.2.</td>
      <td>Détection électrochimique de l'évènement d'ouverture des liposomes contenant le complexe [Ru(bpy)3]2+ et la TPrA</td>
      <td>68</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.</td>
      <td>Etude statistique</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.</td>
      <td>Triple détection de l'évènement d'ouverture des liposomes : couplage de l'électrochimie, de la photoluminescence et de l'électrochimiluminescence</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.</td>
      <td>Dispositif utilisé pour coupler les trois techniques</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.</td>
      <td>Acquisition et collections des informations</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.</td>
      <td>Résultats et interprétation : étude visuelle et quantitative</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.</td>
      <td>Etude visuelle</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.</td>
      <td>Etude quantitative</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VI.</td>
      <td>Caractérisation de la dispersion du luminophore par électrochimiluminescence</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.</td>
      <td>Conclusion</td>
      <td>84</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3-</td>
      <td>Troisième chapitre – Perméabilisation de liposomes géants imagée par électrochimiluminescence négative (i.e., par contraste optique négatif)</td>
      <td>87</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.</td>
      <td>Introduction</td>
      <td>87</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.</td>
      <td>Contexte bibliographique</td>
      <td>87</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.</td>
      <td>Perméabilisation membranaire de liposomes géants imagée par contraste optique négatif</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.</td>
      <td>Stratégie – Hypothèse de départ</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.</td>
      <td>Choix de conditions expérimentales appropriées</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.</td>
      <td>Imagerie – Résultats</td>
      <td>92</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.</td>
      <td>En absence de liposomes</td>
      <td>92</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.</td>
      <td>En présence de liposomes contenant une solution de sucrose</td>
      <td>94</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.</td>
      <td>Caractérisation de la dispersion de la solution encapsulée et de la diffusion des réactifs</td>
      <td>97</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4.</td>
      <td>En présence de liposomes contenant un quencher</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.</td>
      <td>Conclusion</td>
      <td>101</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
4- Quatrième chapitre – Imagerie ECL de la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par des peptides anti-microbiens ou pénétrants .................................................... 105

I. Introduction et contexte.................................................................................................................... 105

II. Propriétés structurales des peptides antimicrobiens et interactions avec les membranes lipidiques .................................................................................................................................................... 107

1. Aspects structuraux.................................................................................................................... 107

1.1. Mécanismes conduisant à la formation de pores membranaires ................................. 108

2. Approches/Méthodologies décrites pour l'étude de la perméabilisation membranaire de liposomes géants par des peptides anti-microbiens ................................................................ 111

III. Imagerie par électrochimiluminescence de la perméabilisation membranaire de liposomes géants par un peptide antimicrobien : la mélittine................................................................................ 114

1. Choix des conditions expérimentales.................................................................................... 114

2. Combinaison de photoluminescence (PL) et d'électrochimiluminescence (ECL) pour imager la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par la mélittine.................................................................................................................................................... 118

3. Combinaison photoluminescence (PL) et électrochimiluminescence (ECL) pour imager la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par des peptides pénétrants.................................................................................................................................................... 127

IV. Conclusion.................................................................................................................................................... 129

5- Cinquième chapitre – ECL issue de la réalisation d'une réaction enzymatique au sein de liposomes.................................................................................................................................................... 133

I. Introduction et contexte.................................................................................................................... 133

II. Etude bibliographique .................................................................................................................... 134

1. Rôle du NADH dans le métabolisme cellulaire et les différentes méthodes de sa détection.................................................................................................................................................... 134

2. Utilisation de liposomes comme bioréacteurs................................................................................ 135

III. Résultats/Discussions.................................................................................................................... 137
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>1. Etude électrochimique de la formation du NADH provenant de la dégradation du glucose</td>
      <td>137</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. Mise en évidence d'un signal d'électrochimiluminescence combinant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ et le NADH comme co-réactif</td>
      <td>141</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. Mise en évidence, par imagerie ECL, de la présence de NADH authentique à l'intérieur d'un liposome</td>
      <td>142</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4. Mise en évidence par imagerie ECL de la formation de NADH issu de l'oxydation enzymatique du glucose à l'intérieur d'un liposome</td>
      <td>146</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV. Conclusion</td>
      <td>150</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Conclusion Générale &amp; Perspectives</td>
      <td>153</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Partie expérimentale</td>
      <td>159</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I. Préparation des dispositifs</td>
      <td>159</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. Fabrication de la cellule électrochimique utilisée pour la détection de la perméabilisation de la bicouche lipidique</td>
      <td>159</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. Préparation des cellules électrochimiques utilisées pour la caractérisation électrochimique des espèces électroactives</td>
      <td>160</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. Dépôt de l'ITO et du graphène sur une lame de verre</td>
      <td>161</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1. Le graphène</td>
      <td>161</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2. Fabrication de l'électrode d'ITO (ITO préparé au laboratoire)</td>
      <td>164</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4. Préparation de dispositif microfluidique</td>
      <td>165</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II. Préparation des liposomes</td>
      <td>167</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. Préparation des solutions nécessaires pendant l'étape de la fabrication des liposomes</td>
      <td>167</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1. Solution lipidique en phase organique</td>
      <td>167</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2. Préparation des solutions intra et extra-vésiculaires</td>
      <td>168</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3. Etape de la fabrication des liposomes</td>
      <td>169</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III. Fabrication des peptides</td>
      <td>171</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>IV. Déroulement des expériences</td><td>173</td></tr><tr><td>1. La caractérisation électrochimique</td><td>173</td></tr><tr><td>2. L'étude par électrochimiluminescence</td><td>173</td></tr><tr><td>3. La détection de la perméabilisation de la bicouche lipidique</td><td>173</td></tr><tr><td>Liste des figures</td><td>179</td></tr><tr><td>Liste des tableaux</td><td>191</td></tr><tr><td>Bibliographie</td><td>195</td></tr></table>
## Liste des abréviations

**AA** Acide Aminé

**AcOH** Acide acétique

**ADN** Acide DésoxyriboNucléique

**Ala ou A** Alanine

**AMP** AntiMicrobial Peptide pour peptide antimicrobien

**Arg ou R** Arginine

**Asn ou N** Aspargine

**Asp ou D** Aspartate

**B** Biotine

**BLM** Bilayer Lipid Membrane pour bicouche lipidique

**Bpy** 2,2-bipyridine

**CE** Contre Electrode

**CNT** Carbon Nano-Tube pour nanotube de carbone

**CPP** Cell Penetrating Peptide pour peptide pénétrant

**CRP** C Reactive Protein

**Cys ou C** Cystéine

**DOPC** 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine

**DOPG** 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol)

**DOTAP** 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane

**DPPE-NBD** 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)
ECL ElectriChimiLuminescence

FcMeOH Ferrocène Méthanol

GDH Glucose Déshydrogénase

GFP Green Fluorescent Protein

Gln ou Q Glutamine

Glu ou E Glutamate

Gly ou G Glycine

GUV Giant Unilamellar Vesicles pour les vésicules unilamellaires géantes

His ou H Histamine

HOBt 1-hydroxybenzotriazole

Ile ou I Isoleucine

ITO Indium Tin Oxide

L Liposome

Leu ou L Leucine

LUV Large Unilamellar Vesicles pour vésicules unilamellaires de grande taille

Lys ou K Lysine

M Microbilles magnétiques

Met ou M Méthionine

MLV Multi Lamellar vesicles pour vésicules multilamellaires

NADH Nicotinamide Adénine Dinucléotide réduit

NAD+ Nicotinamide Adénine Dinucléotide

NBD 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole

PBD Phosphate Buffer Saline
**PDMS** Polydiméthylsiloxane

**pH** potentiel Hydrogène

**Phe ou F** Phénylalanine

**Pro ou P** Proline

**RIE** Reactive Ion Etching

**S** Stréptavidine

**SECL** Shadow ECL

**Ser ou S** Sérine

**SUV** Small Unilamellar Vesicles pour vésicules unilamellaires de petite taille

**Thr ou T** Thréonine

**Trp ou w** Tryptophane
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
# Introduction générale
<figure><img src="image_4.png" /></figure>
Introduction Générale

L'idée d'associer l'électrochimie et la luminescence date du début des années 1990 avec des travaux initiés par des électrochimistes de renom comme A.J. Bard aux USA [1], R.G. Compton au Royaume-Uni [2], mais aussi C. Amatore en France [3]. Une quinzaine d'années plus tard, un réel essor est observé avec le développement de nombreux travaux de recherche dédiés à l'électrochimiluminescence (ECL), allant de l'électrofluorochromisme aux instruments d'analyse en passant par les études mécanistiques. en vue d'applications dans des domaines aussi variés que la chimie analytique, la physique et la biologie [4].

L'équipe dans laquelle j'ai réalisé mon travail de thèse s'intéresse depuis quelques années au développement de méthodologies originales combinant l'électrochimie et la luminescence pour apporter une dimension analytique et idéalement quantitative à des processus mettant en jeu notamment le passage transmembranaire de biomolécules ou la perméabilisation de membranes lipidiques.

A mon arrivée sur ce projet de thèse, l'équipe s'intéressait déjà à la problématique de la caractérisation du passage de molécules à travers des membranes lipidiques. La détection électrochimique n'offrant pas une sensibilité suffisante, les méthodologies ont évolué dans le sens d'une association de l'électrochimie à la fluorescence. Plus concrètement, elles se sont attachées à contrôler l'émission de fluorescence par électrochimie, grâce à l'utilisation de fluorophores possédant des propriétés rédox. Le schéma ci-dessous illustre cette évolution :
<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Figure 1: Evolution des approches associant électrochimie et luminescence (fluorescence) permettant d'étudier le passage transmembranaire de biomolécules ou de distinguer les propriétés physico-chimiques des deux feuillets d'une bicouche lipidique.

Dans cette thématique générale, des approches permettant de quantifier la fraction de peptides pénétrants (CPP pour "Cell Penetrating Peptide" en anglais) ayant traversé la membrane de vésicules nanométriques a pu être développée grâce à l'extinction électrochimique de la fluorescence des peptides situés à l'extérieur des vésicules [5]. Une approche similaire d'extinction électrochimique de la fluorescence a permis de discriminer les deux feuillets d'une bicouche lipidique de liposomes micrométriques (GUV) permettant ainsi de distinguer les propriétés physico-chimiques de chacun des deux feuillets comme, par exemple, le coefficient de diffusion des phospholipides. [6].

Les résultats obtenus dans ce cadre ont incité l'équipe à développer ensuite une méthodologie permettant d'imager en temps réel la perméabilisation de membranes lipidiques. La stratégie utilisée jusqu'alors en présence de membranes lipidiques s'attachait à mesurer l'intensité de fluorescence de molécules consécutif à la « sortie » des molécules fluorescentes d'un espace de volume réduit (une vésicule) à un volume extérieur beaucoup plus grand, avec l'effet de dilution associé. Cette approche ne paraissait pas pertinente en termes de sensibilité. Dans le but de gagner en sensibilité, l'idée a donc été de remplacer la fluorescence par un autre type de luminescence : l'électrochimiluminescence (abréviation ECL) ou chimiluminescence électrogénérée. Comparée à la fluorescence, l'électrochimiluminescence permet de gagner en sensibilité car aucune source de lumière excitatrice extérieure n'est nécessaire conduisant ainsi à un meilleur rapport signal/bruit. Plus particulièrement, en ECL, l'émission de lumière est
initiée par un transfert d'électron se produisant à la surface d'une électrode. Cette technique, est également intéressante par le caractère hétérogène des réactions électrochimiques, mettant en jeu une réaction exclusivement à la surface d'une électrode, permettant d'établir une discrimination entre les réactifs ECL localisés à l'électrode et ceux confinés dans d'autres compartiments du système étudié. Dans la majorité des travaux développés jusqu'à présent, et comme décrit dans le chapitre bibliographique de ce manuscrit (Chapitre 1), un luminophore (ex. [Ru(bpy)₃]²⁺) est utilisé en combinaison avec un co-réactif sacrificiel (ex. tri-n-propylamine). Dans une première étape, les deux réactifs sont oxydés à la surface d'une électrode. Les espèces électrogénérées réagissent ensuite ensemble via une réaction chimique exergonique conduisant le luminophore à un état excité. Enfin, le retour à l'état fondamental du complexe de coordination conduit à l'émission d'un photon et à la régénération du luminophore de départ (Figure 2).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 2 : Principe de l'électrochimiluminescence basée sur l'oxydation concomitante d'un luminophore et d'un co-réactif sacrificiel.</figcaption></figure>

Me basant sur le mécanisme décrit dans la Figure 2, mon premier objectif a été de développer une méthodologie permettant d'imager par ECL, en temps réel, la perméabilisation de membranes de liposomes géants (Chapitre 2). Pour ce faire, un premier défi a été d'encapsuler à la fois le luminophore et le co-réactif à l'intérieur de liposomes micrométriques. Suite à cela, j'ai pu démontrer que la mise en contact de ce type de liposomes avec une électrode polarisée permet de perméabiliser la membrane lipidique et de libérer son contenu (Figure 3) qui, au
contact de l'électrode, subit un processus d'oxydation générant un signal lumineux selon le mécanisme décrit dans la Figure 2.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 3 : Description de l'approche permettant d'imager la perméabilisation membranaire d'un liposome géant par électrochimiluminescence.</figcaption></figure>

Ce premier travail a révélé que le point de contact entre le liposome et l'électrode se matérialise par une tâche noire circulaire du fait du blocage de l'électrode par les lipides. Cette observation expérimentale nous a conduit à développer une approche inverse de celle décrite dans le chapitre précédent et consistant à imager les zones non-luminescentes associées à la perméabilisation membranaire de liposomes. Par analogie à la photographie, on peut parler d'ECL négative (ou "shadow ECL" (SECL)) par comparaison à l'ECL positive (production de lumière). Pour ce faire, le luminophore et le co-réactif ont été directement mis en solution (et non plus encapsulés dans les liposomes) de façon à générer de la lumière sur toute la surface de l'électrode dès que cette dernière était polarisée. Dans ces conditions, nous avons pu montrer que la mise en contact d'un liposome avec la surface d'une électrode sous polarisation génère une tâche noire dont la taille grandit à mesure que la solution intra-vésiculaire s'écoule (du fait de la perméabilisation) vers le milieu luminescent extra-vésiculaire. En outre, nous avons pu montrer que ce phénomène est d'autant plus marqué que le liposome contient un extincteur de luminescence.

Suite aux développements méthodologiques présentés dans les Chapitres 2 et 3, notre objectif a été ensuite de les valoriser au travers d'applications bio-analytiques.

Tout d'abord, dans le Chapitre 4 nous montrerons comment la génération de lumière peut être directement reliée à la perméabilisation de la membrane de liposomes géants par des peptides
anti-microbiens (AMP pour "Anti-Microbial Peptides en anglais) dont l'intérêt ne cesse de croître en raison de l'espoir qu'ils suscitent pour lutter contre la résistance aux antibiotiques.

Enfin, dans le Chapitre 5, nous montrerons que l'approche par ECL positive peut également servir à analyser indirectement une réaction-modèle du vivant ayant eu lieu en milieu confiné.

Plus précisément, nous montrerons comment l'approche ECL a pu être utilisée pour mettre en évidence la réduction du NAD⁺ en NADH, catalysée par l'enzyme glucose déshydrogénase, à l'intérieur de liposomes géants. Dans ce cas, le principal défi a été la préparation de liposomes stables contenant l'enzyme, le co-enzyme (NAD⁺), le substrat (glucose), et le luminophore ([Ru(bpy)₃]²⁺). Dans ces conditions, la production de NADH à l'intérieur des liposomes a pu être révélée par ECL après perméabilisation de leurs membranes. En effet, le NADH produit lui permet de jouer le rôle de co-réactif ECL et d'être, par conséquent, à l'origine d'un signal luminescent.
<figure><img src="image_8.png" /></figure>
# Premier chapitre – Etat de l'art sur la méthodologie mise en œuvre (électrochimiluminescence) et sur les objets étudiés (liposomes géants)
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# 1- Premier chapitre – Etat de l'art sur la méthodologie mise en œuvre (électrochimiluminescence) et sur les objets étudiés (liposomes géants)

## I. Introduction

L'objectif central du travail présenté dans ce manuscrit est la mise au point d'une méthode d'électrochimiluminescence (ECL) pour imager la perméabilisation de membranes de liposomes micrométriques. Le choix de mettre en œuvre une technique d'ECL et de privilégier les liposomes plutôt que d'autres architectures lipidiques se fonde sur plusieurs propriétés spécifiques à cette technique et à ces objets, dont nous allons exposer les points saillants dans la suite de ce chapitre.

Nous allons dans un premier temps présenter l'origine et l'évolution du concept d'électrochimiluminescence, puis rappeler les propriétés des liposomes pour souligner les possibilités qu'offre l'implémentation de l'ECL dans la mise en évidence de la perméabilisation des liposomes.

## II. L'électrochimiluminescence : histoire, fondamentaux et applications

La chimiluminescence électrogénérée ou électrochimiluminescence (ECL) est une technique analytique basée sur la détection de la lumière générée suite à une réaction électrochimique initiée à la surface d'une électrode polarisée.

Dans ce projet, nous avons eu recours à cette technique parce qu'elle associe la sélectivité de l'électrochimie à la sensibilité de la luminescence. Cette association fait de l'électrochimiluminescence une méthode puissante capable de croiser deux types de signaux : i) un courant d'origine faradique et ii) une émission lumineuse. Nous verrons tout l'intérêt de cette double détection dans la suite du manuscrit.
1. Rappels sur les différents phénomènes à l'origine de l'émission de lumière (la luminescence)

La luminescence, découverte en 1888 par Eilhard Wiedemann, se définit comme l'émission d'un rayonnement électromagnétique qui n'est pas d'origine thermique. [7] Elle se déroule en deux phases : une phase d'excitation suivie par une phase de relaxation matérialisée par l'émission de photons.

Chaque typologie de luminescence possède son mode d'excitation propre et son domaine d'application, comme le résume le Tableau 1 :

<table><caption>Tableau 1: Définitions des différents types de luminescence et exemples de leurs applications.</caption><thead><tr><td>Type de luminescence</td><td>Mode d'excitation</td><td>Applications</td></tr></thead><tbody><tr><td>Photoluminescence</td><td>L'excitation est la conséquence d'un évènement d'absorption de photons (Interaction matière – Lumière).</td><td>Analyses bio-médicales [8]<br>Analyses chimiques et physico-chimiques [9].</td></tr><tr><td>Radioluminescence</td><td>Excitation des atomes ou des molécules par absorption de rayons X ou de particules de haute énergie comme les rayonnement α, β et γ (Interaction matière – rayonnement ionisant).</td><td>Diagnostic médical : surveillance de la radiothérapie [10].</td></tr><tr><td>Cathodoluminescence</td><td>L'état excité est issu de l'interaction d'électrons accélérés avec la matière (Interaction matière – électron).</td><td>Domaine de la géologie et plus précisément la branche minéralogie [11].</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Electroluminescence</td><td>L'excitation est la conséquence d'une interaction de la matière avec un champ électrique.</td><td>Ce type de luminescence est utilisé dans l'éclairage des vaisseaux spatiaux [12].</td></tr><tr><td>Chimiluminescence</td><td>Génération de l'état excité des molécules par une réaction chimique.</td><td>Diagnostic médical et criminologie [13].</td></tr><tr><td>Bioluminescence</td><td>L'état excité est la conséquence d'une réaction chimique catalysée par une enzyme dans un organisme vivant.</td><td>Domaine de la biomédecine : thérapie photodynamique et contrôle des neurones [14].</td></tr><tr><td>Triboluminescence</td><td>Dans ce type de luminescence, l'émission de la lumière est due à un frottement ou cassure de la matière.</td><td>Capteurs de fissures et de dégâts dans la construction industrielle [15].</td></tr><tr><td>Sonoluminescence</td><td>Lumière émise suite à la soumission de bulles à des ondes acoustiques.</td><td>Sonochimie [16].</td></tr><tr><td>Thermoluminescence</td><td>Emission de la lumière consécutive à une irradiation thermique.</td><td>Domaine de la datation archéologique et géologique. [17]</td></tr><tr><td>Electrochimiluminescence</td><td>Emission de lumière obtenue suite à une réaction électrochimique.</td><td>Diagnostic médical (voir paragraphe application de l'électrochimiluminescence).</td></tr></table>
## 2. L'électrochimiluminescence

L'électrochimiluminescence (ECL) ou chimiluminescence électrogénérée est donc une émission de lumière observée suite à une réaction électrochimique initiée à la surface d'une électrode polarisée.

Pour comprendre l'intérêt de l'ECL dans une problématique analytique, il est intéressant de rappeler succinctement son histoire.

L'apparition de l'électrochimiluminescence remonte aux années 1920. Elle a été observée pour la première fois en 1927 au cours d'une réaction d'électrolyse des organomanésiens mixtes, appelés également les composés de Grignard, dans un milieu anhydre, par Dufford et al.[18]. En 1929, Harvey a démontré que l'émission de lumière au cours d'une électrolyse est observée aussi dans un milieu aqueux [19]. Après ces deux observations, ce phénomène d'émission de lumière par initiation électrochimique n'a été repris que dans les années 1960 où son mécanisme a été exploré, de l'excitation à l'émission. Les premières études ont été réalisées par Hercules [20] et Chandross [21] en 1964 qui ont constaté que les produits d'électrolyse d'hydrocarbures aromatiques comme le 9,10-diphenylanthracene (DPA), formellement notés R⁺ et R⁻, réagissent l'un avec l'autre selon :

$$R⁺ + R⁻ → R + R* \text{ où } R* \text{ représente la molécule photoexcitée qui se désexcite en émettant un photon.}$$

L'électrochimiluminescence a réellement pris son essor en 1972 dans le groupe d'Allen Bard, lorsque le complexe de Tris (2,2'-bipyridine) ruthenium(II) s'est avéré générer de la lumière sous un balayage de potentiel [22].

En 1977, une nouvelle approche de la réaction d'ECL a été découverte, toujours dans l'équipe de Bard, basée sur l'utilisation d'un co-réactif, pour générer la lumière grâce à l'électro-oxydation simultanée de ce dernier et d'un luminophore [23]. Dix ans plus tard, les amines aliphatiques et en particulier la tri-*n*-propylamine se sont révélées être des co-réactifs plus efficaces [24] [25].
A partir des années 1990, l'ECL a commencé à être utilisée dans les tests biologiques, donnant lieu à l'émergence d'une instrumentation commercialisée, en 1994, par Roche Diagnostic [26].

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Figure 4 : Frise chronologique de l'évolution des expériences d'électrochimiluminescence au cours du temps inspiré de la référence [26].

Ainsi l'ECL, qui était à l'origine d'un phénomène physico-chimique assez « confidentiel » tend donc à devenir une méthode analytique en développement grâce à plusieurs qualités parmi lesquelles nous notons :

(a) Le bon rapport signal/bruit par rapport à la fluorescence lié à un mode d'excitation non-photonique : contrairement à la fluorescence, l'ECL ne nécessite pas une excitation par une source lumineuse ce qui permet d'avoir un bruit de fond très faible [27] ;

(b) l'intensité de l'émission dépend de la concentration des réactifs engagés dans la réaction ;

(c) il n'y a pas besoin d'utiliser une sonde fluorescente qui peut être spécifique pour chaque réactif ;

(d) la bonne limite de détection qui peut atteindre des pg/µL ;

(e) le temps d'analyse court, la grande stabilité des réactifs et le faible volume d'échantillon qui sont des critères de base dans les applications biologiques ;

### 3. Mécanismes de l'électrochimiluminescence.

Le phénomène d'électrochimiluminescence résulte souvent d'une réaction entre une ou des espèces électrogénérées à la surface d'une électrode polarisée. Le produit instable formé se
désexcite en émettant un photon, le processus partant donc d'une réaction électrochimique pour aboutir à un évènement de nature radiative. [28]

Cette réaction de génération de lumière peut être obtenue selon différents modes que nous présentons dans le paragraphe suivant.

### 3.1. Approche dite « d'annihilation »

Cette approche repose sur la réaction entre une espèce oxydée et une espèce réduite à la surface d'une électrode consécutive à une impulsion alternée du potentiel appliqué à cette électrode.

Comme on le voit dans le mécanisme ci-dessous, une espèce A, en contact avec une électrode, génère deux types d'intermédiaires : un cation radicalaire A•+, produit d'une réaction d'oxydation, et un anion radicalaire A•-, obtenu par réduction. Ces deux espèces formées α réagissent ensemble pour générer l'état excité A* qui va émettre de la lumière au cours de la relaxation.

$$A \rightarrow A^{\bullet+} + e^{-} \quad (1) \quad \text{Réaction d'oxydation}$$

$$A + e^{-} \rightarrow A^{\bullet-} \quad (2) \quad \text{Réaction de réduction}$$

$$A^{\bullet+} + A^{\bullet-} \rightarrow \alpha A^{\bullet} + \beta A \quad (3) \quad \text{Formation de l'état excité}$$

$$A^{\bullet} \rightarrow A + h\nu \quad (4) \quad \text{Émission de lumière}$$

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 5 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche d'annihilation</figcaption></figure>

Cette réaction peut également se produire dans des systèmes mixtes où le cation radicalaire et l'anion radicalaire proviennent de différentes molécules [29].
Au cours de la réaction de l'équation (3), le transfert d'électron entre les deux espèces électrogénérées est un processus favorisé par la thermodynamique de la réaction (l'enthalpie libre de cette réaction est négative $ΔG°<0$) mais il est cinétiquement lent ($ΔG°< -λ$, $λ$ est l'enthalpie libre standard de réorganisation). Dans ces conditions, la réaction d'annihilation et la formation de l'état excité (A*) est spontanée. Ici, on parle de région inverse de Marcus que, au cours de laquelle, une réaction est d'autant plus lente que cette dernière est facilitée thermodynamiquement. L'électrochimiluminescence est un phénomène qui met en évidence la théorie de Marcus.

## 3.2. Approche par co-réactif

### 3.2.1. Définition

L'ECL, selon son approche du co-réactif, met en jeu l'utilisation d'un luminophore et d'un co-réactif pour lesquels l'état excité est issu de l'oxydation ou la réduction directe, à la surface de l'électrode, d'au moins l'un des réactifs. Le co-réactif utilisé dans cette approche est une espèce qui, suite à une réduction ou oxydation, produit un intermédiaire réactif qui peut réagir avec le luminophore pour générer l'état excité [28].

Nous devons faire remarquer que, dans cette approche, nous n'avons pas besoin d'une polarisation par impulsion alternée du potentiel ce qui présente un avantage par rapport à l'approche d'annihilation car cela nous permet de travailler dans des solvants possédant une fenêtre de potentiel réduite ainsi que dans des solutions aqueuses non-désaérées.

Nous reviendrons plus loin sur ce point, mais signalons déjà que selon la nature du co-réactif, la réaction d'électrochimiluminescence peut être obtenue soit par oxydation du co-réactif à la surface de l'électrode [30], soit par sa réduction [31]. Il s'ensuit des réactions qui dépendent de plusieurs facteurs comme la concentration des réactifs et le potentiel d'oxydation.
### 3.2.2. Exemples de systèmes mettant en jeu un co-réactif

* $[Ru(bpy)₃]^{2+}$ / Oxalate

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 6 : Formules chimiques des deux réactifs engagés dans la réaction d'électrochimiluminescence le complexe de ruthénium (a) et l'oxalate (b).</figcaption></figure>

L'oxalate est le premier co-réactif découvert et utilisé dans cette approche [32]. C'est un système dans lequel l'oxalate est oxydé en milieu aqueux pour former un radical qui réagit avec le luminophore oxydé pour générer l'état excité selon le mécanisme suivant :

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+}} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+}} + \mathrm{e}^{-} \quad (5) $$

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+}} + \mathrm{C_{2}O_{4}^{2-}} \rightarrow \mathrm{C_{2}O_{4}^{\cdot -}} + \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+}} \quad (6) $$

$$ \mathrm{C_{2}O_{4}^{\cdot -}} \rightarrow \mathrm{CO_{2}} + \mathrm{CO_{2}^{\cdot -}} \quad (7) $$

$$ \mathrm{CO_{2}^{\cdot -}} + \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+}} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+*}} + \mathrm{CO_{2}} \quad (8) $$
* $[Ru(bpy)₃]^{2+} / S₂O₈^{2-}$

C'est un système qui met en jeu le peroxodisulfate comme co-réactif [33].

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 7 : Formules chimiques des deux réactifs engagés dans la réaction d'électrochimiluminescence : le complexe de ruthénium (a) et le peroxodisulfate (b).</figcaption></figure>

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+}} + 1\mathrm{e}^{-} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{+}} \quad (10) $$

$$ S_2O_8^{2-} + 1e^{-} \rightarrow SO_4^{2-} + SO_4^{+2} \quad (11) $$

$$ SO_4^{2-} + Ru(bpy)_3^+ \rightarrow Ru(bpy)_3^{2+} + SO_4^{+2} \quad (12) $$

* Ru(bpy)₃²⁺/Tri-n-propylamine

La tri-n-propylamine est considérée comme un co-réactif important parce qu'elle permet de travailler dans des milieux aqueux et à un pH physiologique, ce qui explique son utilisation dans les applications biologiques.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 8 : Formules chimiques des deux réactifs engagés dans la réaction d'électrochimiluminescence : (a) le complexe de ruthénium et (b) la tri-n-propylamine.</figcaption></figure>

Le luminophore de ce couple aussi est très utilisé dans le domaine biologique parce qu'il offre la possibilité de fonctionnalisation de ses ligands bipyridine par des agents biologiques comme
les anticorps. Cette combinaison est d'ailleurs appliquée dans plusieurs domaines, comme
nous allons le voir dans la suite.

3.2.3. Mécanismes d'ECL du couple [Ru(bpy)₃]<fnref n="2" />⁺/Tri-n-propylamine

Le couple [Ru(bpy)₃]<fnref n="2" />⁺/tri-n-propylamine est un système « oxydatif-réductif <fnref n="1" /> » dans lequel le co-réactif est oxydé pour former un intermédiaire qui réagit avec le luminophore pour générer l'état excité.

Comme nous l'avons mentionné, la concentration des réactifs et le potentiel d'oxydation déterminent le mécanisme aboutissant à l'état excité pour ce luminophore.

Le luminophore et le co-réactif sont oxydés à la surface de l'électrode

Dans ce mécanisme, l'état excité provient d'une oxydation simultanée du luminophore et du co-réactif à la surface de l'électrode polarisée. L'espèce formée de l'oxydation de l'amine est un intermédiaire qui libère un proton pour former un radical (TPrA•). Ce radical réagit avec le luminophore oxydé pour former l'état excité. Et lors du retour à l'état fondamental, le luminophore émet un photon à une longueur d'onde de l'ordre de 620 nm.

$$
\mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{3+} + e^{-}} \qquad (13)
$$

$$
\mathrm{TPrA} \rightarrow \mathrm{TPrA}^{\bullet+} + \mathrm{e}^{-} \qquad (14)
$$

$$
\mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+} + TPrA \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + TPrA^{\bullet+}} \quad (15)^{2}
$$

Réaction de déprotonation

$$
\mathrm{TPrA}^{\bullet+} \rightarrow \mathrm{H}^{+} + \mathrm{TPrA}^{\bullet} \qquad (16)
$$

<footnote n="1">¹ Un système « oxydatif-réductif » est un système au cours duquel le co-réactif est oxydé pour former un ion radicalaire.</footnote>

<footnote n="2">² L'équation de la réaction (15) correspond à un autre mécanisme (seul le luminophore est oxydé à la surface de l'électrode) mais elle est présentée ici parce que la réaction peut avoir lieu si les deux espèces sont présentes, dans le milieu réactionnel.</footnote>
Formation de l'état excité

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+} + TPrA^{\bullet} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+*} + \text{Produits}} \quad (17) $$

Emission de la lumière

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+*} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + h\nu} \quad (18) $$

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 9 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche du co-réactif en utilisant le couple [Ru(bpy)₃]²⁺/Tri-n-propylamine - Mécanisme 1.</figcaption></figure>

Il faut mentionner qu'au cours de ce mécanisme, un autre chemin de génération de l'état excité est possible qui consiste à réduire [Ru(bpy)₃]²⁺ en [Ru(bpy)₃]⁺ par le radical cation formé. Cette étape est suivie par la génération de l'état excité selon un processus annihilation, comme le montre le mécanisme suivant :

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+} + TPrA^{\bullet} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{+} + \text{Produits}} \quad (19) $$

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+} + Ru(bpy)_{3}^{+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+*} + Ru(bpy)_{3}^{2+}} \quad (20) $$
Dans plusieurs travaux, il a été montré que l'intermédiaire réactionnel issu de l'oxydation de l'amine tertiaire TPrA a une durée de demi vie estimée à 0,2 ms [34] ce qui le rend suffisamment stable pour jouer le rôle de médiateur rédox pour la génération de l'état excité, selon le mécanisme suivant :

Réaction d'oxydation du co-réactif à la surface d'une électrode polarisée

$$ TPrA \rightarrow TPrA^{\bullet+} + 1e^{-} \quad (21) $$

Réaction de déprotonation

$$ TPrA^{\bullet+} \rightarrow H^{+} + TPrA^{\bullet} \quad (22) $$

Formation de l'état excité

$$ TPrA^{\bullet} + Ru(bpy)_{3}^{2+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{+} + Produits \quad (23) $$

$$ Ru(bpy)_{3}^{+} + TPrA^{\bullet+} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+*} + TPrA \quad (24) $$

Emission de la lumière

$$ Ru(bpy)_{3}^{2+*} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + hv \quad (25) $$
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 10 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche du co-réactif en utilisant le couple Ru(bpy)₃²⁺/Tri-n-propylamine - Mécanisme 2</figcaption></figure>

### Seul le luminophore est oxydé à la surface de l'électrode

Un dernier mécanisme de la réaction d'électrochimiluminescence est proposé dans plusieurs travaux [34], mécanisme au cours duquel la formation du radical cation, responsable de la génération de l'état excité, est réalisée par transfert d'électron homogène par le complexe [Ru(bpy)₃]³⁺ obtenu suite à l'oxydation de [Ru (bpy)₃]²⁺ à l'électrode.

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+}} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+}} + \mathrm{e}^{-} \qquad (26) $$

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+}} + \mathrm{TPrA} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+}} + \mathrm{TPrA}^{\bullet+} \qquad (27) $$

Réaction de déprotonation

$$ \mathrm{TPrA}^{\bullet+} \rightarrow \mathrm{H}^{+} + \mathrm{TPrA}^{\bullet} \qquad (28) $$

Formation de l'état excité

$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{3+}} + \mathrm{TPrA}^{\bullet} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+}}^{\bullet+} + \mathrm{Produits} \qquad (29) $$
$$ \mathrm{Ru}(\mathrm{bpy})_{3}^{2+*} \rightarrow \mathrm{Ru}(\mathrm{bpy})_{3}^{2+}+\mathrm{h} v \qquad (30) $$

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 11 : Mécanisme d'électrochimiluminescence selon l'approche du co-réactif en utilisant le couple [Ru(bpy)₃]²⁺/Tri-n-propylamine - Mécanisme 3</figcaption></figure>

## 4. Applications

Comme nous venons de le voir, l'électrochimiluminescence, littéralement définissable comme la génération électrochimique d'un évènement de luminescence, permet d'envisager d'associer de l'imagerie à une mesure de courant faradique.

Elle offre à ce titre deux types d'information dont la superposition permet de délimiter l'évènement de luminescence dans le temps et de le quantifier du point de vue faradique. D'autre part et comme nous l'avons déjà mentionné, cette méthode offre un meilleur rapport signal/bruit que par exemple la fluorescence, du fait d'une génération de la lumière dans un milieu sombre.
Comme nous pouvons le voir sur la Figure 12, l'utilisation de l'électrochimiluminescence pour faire de l'imagerie n'a commencé qu'en 1987 [35], vingt ans après les premières expériences d'ECL.

Au début, l'imagerie ECL a été utilisée pour analyser les surfaces d'électrodes et elle a continué à évoluer en termes de résolution jusqu'à l'observation d'objets microscopiques, notamment de la dimension de cellules vivantes, cette propriété constituant le socle de mon travail de thèse.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 12 : Frise chronologique de l'évolution de l'imagerie en électrochimiluminescence au cours du temps [36]</figcaption></figure>

Dans ce paragraphe, nous allons donner quelques exemples de l'utilisation de l'imagerie ECL dans des différents domaines.

## Imagerie dans le domaine de l'analyse biologique

L'électrochimiluminescence a été utilisée, en 2007, par A. Bard pour le dosage d'une protéine humaine, la CRP (C Reactive Protein) [37]. Dans cet exemple, la mesure de l'intensité de lumière générée suite à une réaction d'ECL permet de quantifier la CRP, cette dernière étant associée au fluorophore, comme schématisé ci-dessous, grâce à un système streptavidine-biotine qui constitue un lien très solide pour accrocher des biomolécules. La force de ce système est dû à la grande affinité de la streptavidine pour la biotine, qui peut être complexée à plusieurs molécules biologiques (Figure 13).
Cette association entre le système streptavidine-biotine et les réactifs ECL a facilité l'utilisation de l'ECL dans les diagnostics médicaux par les laboratoires d'analyses.

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

Figure 13 : Forme sandwich de l'immunodosage de la protéine humaine CRP composé par : B, biotine; L, liposomes; S, streptavidine; C, protéine (analyte); et M, microbilles magnétiques [37].

L'électrochimiluminescence permet d'imager des cellules vivantes dans l'objectif de comprendre des phénomènes biologiques et aussi de réaliser des tests immunologiques pour identifier des maladies graves [36].

L'ECL a été utilisée pour analyser des lipides comme le cholestérol, intermédiaire fondamental dans la régulation hormonale et métabolique, [38] dans la membrane plasmique. elle a permis de suivre l'activation de ce lipide sur les membranes cellulaires et de mettre en évidence l'hétérogénéité cellulaire associée aux différents phénomènes d'activation du cholestérol membranaire [39].

La figure ci-dessous montre un exemple d'étude de l'activation du cholestérol, par électrochimiluminescence en utilisant le peroxyde d'hydrogène et le luminol comme couple de réactifs.
<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Figure 14 : Utilisation du luminol pour l'analyse du cholestérol de la membrane plasmique de la cellule. Le peroxyde d'hydrogène est un produit de l'oxydation du cholestérolmembranaire en présence de l'enzyme cholestérol oxydase. La réaction d'ECL du couple H₂O₂/Luminol génère de la lumière bleue à 428 nm (Schéma reproduit de la référence [40]).

Dans le même contexte, un surdosage d'un marqueur tumoral protéique dans l'organisme pourrait être une indication précoce de la présence d'un cancer. En outre, ce taux de protéine peut être estimé par plusieurs techniques dont des tests immunologiques type ELISA d'immunoadsorption enzymatique utilisé par les laboratoires de biologie médicale, des dosages radio-immunologiques, des dosages par électrophorèse des protéines ou encore la spectrométrie de masse. Mais ces techniques présentent des limites et des désavantages (coût élevé, difficulté de multiplexage, la lenteur du dosage et la limite de détection).

Sur cette même problématique, une approche basée sur l'électrochimiluminescence (Figure 15) a été utilisée. Celle-ci a permis de doser les marqueurs tumoraux protéiques avec une simplicité de mesure et une bonne limite de détection (de l'ordre du pg/mL) [41].

Cette technique a attiré l'intérêt des laboratoires d'analyse comme Roche Diagnostics et Meso Scale discovery pour réaliser des tests immunologiques (anticorps SARS-CoV-2, les marqueurs de l'anémie, les maladies infectueuses, les soins de grossesse...).

Le principe général de ces immunoanalyses par ECL est présenté sur le schéma suivant :
<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Figure 15 : Représentation de la méthode d'immunodosage par ECL basée sur une association Streptavidine-Biotine et anticorps-luminophore.

## L'ECL pour imager les objets uniques

Les avantages de l'électrochimiluminescence ont permis son utilisation pour faire de l'imagerie à l'échelle des objets uniques [42] comme l'imagerie des nanoparticules d'un polymère conjugué qui, en présence d'un co-réactif, peut générer de la lumière [43].

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Figure 16 : La figure est issue de la référence [43]. Elle représente le dispositif utilisé pour imager les nanoparticules de polymère conjugué F8BT (à gauche) et le résultat obtenu suite à une émission de lumière due à une réaction d'électrochimiluminescence entre la TPrA et le F8BT.

L'ECL a été utilisée pour imager les surfaces d'électrodes et les processus électrochimiques qui se déroulent sur cette surface. En 2015, Willets et al. ont imagé une nanofibre d'or dans le but d'étudier l'activité électrochimique et d'analyser l'hétérogénéité des particules d'or plasmoniques quand elles sont utilisées comme électrode nanométrique [44].
La sensibilité de l'électrochimiluminescence a permis de l'utiliser pour réaliser des mesures optiques à l'échelle de la cellule unique comme, par exemple, l'analyse de glucose qui se trouve dans le cytosol (milieu intra-cellulaire), lieu de déroulement de la réaction de glycolyse. La génération de la lumière est observée, au niveau d'une cellule unique, suite à une réaction entre le luminol et le peroxyde d'hydrogène qui est le produit d'une réaction d'oxydation de glucose en présence d'une enzyme « glucose oxydase » (Figure 17) [45].

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

Figure 17 : Imagerie ECL de la détection de glucose intra-cellulaire sur des cellules individuelles. Le couple de réactifs ECL utilisé dans ce cas est le L012/H₂O₂. Le peroxyde d'hydrogène est obtenu suite à une réaction d'oxydation de glucose en présence d'enzyme [45].

Dans le même contexte de l'imagerie des cellules unique, l'ECL a été utilisé pour imager les protéines membranaires des cellules vivantes [46], les adhésions et les liaisons cellulaires [47] et même des organelles comme les mitochondries [48].
### III. Les liposomes : généralités et applications

Si l'ECL est la technique retenue pour notre étude, les liposomes en constituent les objets. Nous allons succinctement en rappeler les propriétés essentielles.

#### 1. Introduction

Les liposomes sont des vésicules formées par une ou plusieurs couches phospholipidiques qui séparent deux milieux aqueux. Cette architecture lipidique en fait le premier modèle artificiel et pertinent pour mimer des cellules vivantes. Ils peuvent encapsuler des substances hydrophiles dans le milieu aqueux intérieur (lumen) et hydrophobes dans l'espace inter-feuillets de la membrane, comme le montre le schéma ci-dessous [49].

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 18 : Possibilités d'encapsulation dans un liposome [50]</figcaption></figure>

Les liposomes ont été décrits pour la première fois en 1965 par Bangham et al. qui ont montré qu'en présence d'une solution aqueuse, les phospholipides ont tendance à se réorganiser pour former des objets sphériques [51].

Ces structures sont largement utilisées en tant que modèle de la membrane cellulaire pour explorer leur perméabilité, le potentiel de la membrane ou encore le mécanisme d'action des anesthésiques locaux ... [52]

Les liposomes ont commencé à être utilisés dans plusieurs applications comme des bioréacteurs en biologie moléculaire [53] et des vecteurs de molécules en pharmacologie [54], en biologie cellulaire, biochimie moléculaire afin de réaliser des libérations programmées de
médicaments et dans l'industrie alimentaire pour l'encapsulation des enzymes [55], [56]comme nous le verrons plus en détail par la suite. Ces structures phospholipidiques sont aussi utilisées dans le domaine des biocapteurs grâce à leur capacité d'encapsuler plusieurs éléments qui permet d'avoir des limites de détection faibles [57] et pour étudier des réactions de catalyse enzymatique comme par exemple la réaction d'oxydation de glucose.[58], [59] Cela explique l'intérêt que nous portons aux liposomes dans notre projet.

Dans cette partie du chapitre, nous allons présenter des généralités sur les liposomes en commençant par leur composition et la classification de ces structures, puis nous intéresser aux différentes méthodes de préparation et enfin nous détaillerons les domaines d'application et nous expliquerons nos choix de composition de liposome et les méthodes de préparation retenues pour notre projet.

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 19 : Structure générale d'un liposome.</figcaption></figure>

## 2. Composition des liposomes : les phospholipides

### 2.1. Différents types de phospholipides

Les liposomes sont composés essentiellement de phospholipides au sein de la bicouche lipidique. Les phospholipides sont des molécules amphiphiles : une extrémité est polaire et l'autre est apolaire. Un glycérophospholipide est composé d'une base de glycérol sur laquelle sont condensés par estérification deux acides gras en position 1 et 2, formant ainsi la partie hydrophobe (apolaire) de la molécule. La troisième position porte un groupement phosphoryle fonctionnalisé par un groupement -R. Un phospholipide est nommé selon la nature de ce résidu -R [60].
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 20 : Exemple de structure d'un phospholipide [61].</figcaption></figure>

<table><caption>Tableau 2 : Nom du phospholipide selon la nature du résidu.</caption><thead><tr><th>Résidu -R</th><th>Nom du phospholipide</th></tr></thead><tbody><tr><td>-H</td><td>Acide phosphatidique (PA)</td></tr><tr><td>-CH<sub>2</sub>CHOH-CH<sub>2</sub>OH</td><td>Phosphatidylglycérol (PG)</td></tr><tr><td>-CH<sub>2</sub>-CH-(COO)NH<sub>3</sub><sup>+</sup></td><td>Phosphatidylsérine (PS)</td></tr><tr><td>-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-NH<sub>3</sub><sup>+</sup></td><td>Phosphatidyléthanolamine (PE)</td></tr><tr><td></td><td>Phosphatidylinositol (PI)</td></tr><tr><td>-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-N(CH<sub>3</sub>)<sub>3</sub><sup>+</sup></td><td>Phosphatidylcholine (PC)</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>
La deuxième partie apolaire est une chaine carbonée qui peut être saturée ou insaturée et qui peut contenir entre 14 et 18 atomes de carbone. Ces molécules de phospholipides sont d'origine soit naturelle, soit synthétique. Dans le tableau ci-dessous, nous avons présenté les phospholipides les plus couramment utilisés dans la fabrication de liposomes [60], [61].

<table><caption>Tableau 3: Différents types de phospholipides.</caption><thead><tr><th></th><th>Nom de phospholipide</th><th>Nombre d'atome de carbone sur la chaine apolaire : insaturation</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="8">Phospholipides synthétiques</td><td>Dipalmitoylphosphatidylcholine<br>DPPC</td><td>16 :0</td></tr><tr><td>Distéaroylphosphatidylcholine<br>DSPC</td><td>18 :0</td></tr><tr><td>Dipalmitoylphosphatidyléthanolamine<br>DPPE</td><td>16 :0</td></tr><tr><td>Dipalmitoylphosphatidylsérine<br>DPPS</td><td>16 :0</td></tr><tr><td>Dipalmitoyl acide phosphatidique<br>DPPA</td><td>16 :0</td></tr><tr><td>Dipalmitoylphosphatidylglycérol<br>DPPG</td><td>16 :0</td></tr><tr><td>Dimyristoylphosphatidylcholine<br>DMPC</td><td>14 :0</td></tr><tr><td>Dimyristoylphosphatidyléthanolamine<br>DMPE</td><td>14 :0</td></tr><tr><td></td><td>Distéaroylphosphatidyléthanolamine<br>DSPE</td><td>18 :0</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>Dimyristoylphosphatidylglycérol<br>DMPG</td><td>14 : 0</td></tr><tr><td></td><td>Dioleoylphosphatidylcholine<br>DOPC</td><td>18 : 1</td></tr><tr><td></td><td>Dioleoylphosphatidylglycérol<br>DOPG</td><td>18 : 1</td></tr><tr><td></td><td>Dioleoylphosphatidyléthanolamine<br>DOPE</td><td>18 : 1</td></tr><tr><td rowspan="2">Phospholipides<br>naturels</td><td>Phosphatidylcholine de jaune d'oeuf<br>EPC</td><td>Pas d'insaturation</td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine de soja SPC</td><td>Pas d'insaturation</td></tr></table>

## 2.2. Choix des phospholipides composant les liposomes pour notre projet

Le choix des phospholipides tient compte de leur température de transition de phase Tg (melting Temperature). Au-delà de cette température, les phospholipides passent d'une phase gel (Lβ), ordonnée, vers une phase fluide désordonnée (Lα). La valeur de la température de transition varie avec la longueur de la chaine et avec le degré d'insaturation des chaines d'acide gras.

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 21 : Changement de phase d'un phospholipide suite à un changement de température.</figcaption></figure>
Dans le contexte de notre étude, nous observerons et favoriserons des évènements d'éclatement ou de perméation de liposomes. Dans cette optique, nous avons choisi de travailler avec des phopholipides s'associant au sein de phases fluides à température ambiante. Plus spécifiquement, nous avons choisi le DOPG (=Dioléyl phosphatidylglycérol) comme phospholipide, qui présente une température de transition de phase très basse égale à -18°C. Ce phospholipide contient, dans sa partie polaire, un groupement phosphatidylglycérol (PG). C'est un des composants principaux des membranes de cellules bactériennes mais aussi dans les membranes de cellules animales et végétales à plus faibles concentrations. Le PG est chargé négativement à pH physiologique [62].

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 22 : Structure du DOPG 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) avec des chaines en C18 et une température de transition de phase Tg= -18°C</figcaption></figure>

Nous utilisons également le DOPC qui est un phospholipide zwitterionique et qui a une température de transition de phase également très basse (-17°C). Ce phospholipide est une phosphatidylcholine (PC) qui représente environ 50% de la composition de toutes les membranes cellulaires du corps humain.

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 23 : 1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) avec des chaines en C18 et une température de transition de phase Tg= -17°C.</figcaption></figure>

Afin de mieux visualiser les vésicules par microscopie, nous avons également ajouté des lipides marqués par du NBD (NitroBenzoxaDiazole) qui est une petite sonde fluorescente (2-3% de DPPE-NBD avec λex = 460 nm et λem = 535 nm).
Le DPPE dispose d'un groupement phosphatidyléthanolamine (PE) qui est généralement le phospholipide le plus abondant dans les cellules eucaryotes mais également dans les cellules bactériennes [63].

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Figure 24 : Structure du DPPE-NBD 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium Salt) avec des chaines en C16 et un fluorophore nitobenzoxadiazole.

## 2.3. Autres composants

Il existe une grande variété de composants pouvant entrer dans la composition d'une membrane d'un liposome :

-Les sphingolipides : qui contiennent des complexes de saccharide et des résidus d'acide sialique, dans leur partie polaire, et qui assure la rigidité des liposomes. Ces molécules sont chargées négativement à pH neutre [60].

-Les stérols : le cholestérol (Figure 25 : Structure du cholestérol. et ses dérivés composent une majorité des membranes cellulaires comme les membranes plasmiques. Ces molécules sont ajoutées dans la composition de la membrane d'un liposome pour assurer sa bonne organisation, [39]diminuer sa perméabilité à l'eau et diminuer également sa fluidité [60]. D'ailleurs, les membranes qui contiennent un pourcentage élevé de cholestérol sont les plus faciles à manipuler (car elles sont plus rigides) en culture cellulaire [39].
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 25 : Structure du cholestérol.</figcaption></figure>

-Autres composants : dans la membrane d'un liposome, on peut aussi trouver des lipides cationiques comme le DOTAP et des polymères.

### 3. Classification des liposomes

Selon le protocole de fabrication utilisé, les liposomes peuvent avoir des tailles différentes allant de 10 nanomètres de diamètre à plusieurs dizaines de micromètres et un nombre de feuillets variable. Selon ces deux critères, les liposomes sont classés en 5 catégories : [64]

- Les SUV (Small Unilamellar Vesicles) ou vésicules unilamellaires de petite taille où le diamètre est inférieur à 100 nm ;

- Les LUV (Large Unilamellar Vesicles) ou vésicules unilamellaires de grande taille où le diamètre varie entre 100 et 1000 nm ;

- Les GUV (Giant Unilamellar vesicles) ou vésicules unilamellaires géantes de diamètre supérieur à 1000 nm ;

- Les MLV (Multi Lamellar vesicles) ou vésicules multilamellaires

- Les vésicules multivésiculaires.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 26 : Classification des liposomes [65].</figcaption></figure>

## 4. Différentes méthodes de préparation et d'encapsulation dans les liposomes

Après avoir étudié de plus près les différents types de liposomes et les principaux composants qui constituent leurs membranes, venons-en maintenant aux différentes méthodes utilisées pour les préparer.

Le procédé de préparation de liposomes est généralement choisi selon les spécificités et les propriétés attendues des liposomes que nous voulons préparer : Taille, nombre de bicouches, solution encapsulée...

Dans le cadre de notre projet, nous sommes intéressés par les liposomes qui ont une taille proche de celle d'une cellule réelle (entre quelques micromètres et des dizaines de micromètres). Pour préparer ces liposomes, dits géants, il existe deux types de procédure : électroformation ou transfert de phase [66].
4.1. Electroformation

Cette technique de fabrication de liposomes géants a été développée en 1986 par Angelova et Dimitrov [67] et elle est basée sur un gonflement de vésicules dans un milieu aqueux en présence d'un champ électrique alternatif (de l'ordre de 2V-10Hz).

L'avantage de l'électroformation est qu'elle permet d'obtenir un nombre très important de liposomes, néanmoins, cette méthode nécessite l'utilisation d'une faible concentration en sel donc, elle ne permet pas de travailler dans les conditions physiologiques et aussi elle ne permet pas de fabriquer des liposomes dissymétriques avec une composition de phospholipide différente sur chaque feuillet, interne et externe. Parce que nous devrons travailler dans des conditions physiologiques et nous serons amenés à préparer des liposomes dissymétriques, nous n'avons pas utilisé cette technique d'électroformation dans ce projet et nous lui avons préféré la méthode de transfert de phase.

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

Figure 27 : Schéma de principe de l'électroformation et observation des liposomes obtenus [68].
## 4.2. Méthode de transfert de phase

La méthode de transfert de phase est un processus qui se déroule en deux étapes au cours desquelles des monocouches individuelles sont transformées en bicouches. Cette méthode permet de préparer des liposomes [69]. La première étape consiste à former des micelles inversées contenant un petit volume de solution aqueuse entourée d'une monocouche de phospholipides.

Dans ce travail, nous utilisons un dispositif microfluidique à deux entrées, destiné à la génération de gouttes, pour préparer des micelles inverses. Comme nous pouvons le voir dans la Figure 28, ces micelles inversées sont formées suite au passage des gouttes aqueuses dans un canal qui contient une solution de phospholipides dissous dans l'huile.

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Figure 28 : Schéma d'un dispositif microfluidique générateur de gouttes : étape de la formation des micelles inversées.

Quant à la deuxième étape, grâce à une différence de densité entre le milieu intra-vésiculaire (sucrose) et le milieu extra-vésiculaire (glucose), les gouttelettes d'eau enrobées de phospholipides passent à travers une interface eau/huile où des phospholipides sont arrangés. Cela transforme les micelles inversées en liposomes [69].
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Figure 29 : Formation des liposomes par transfert de phase (figure prise de la référence [70]).

## 5. Différentes applications des liposomes

### 5.1. Applications thérapeutiques : vectorisation de médicaments

Dans l'objectif de garder l'efficacité d'un médicament et éviter les transformations possibles d'un principe actif qui peuvent avoir lieu pendant son trajet dans l'organisme vers l'endroit cible, les liposomes ont été utilisés comme un moyen de ciblage de médicament.

L'encapsulation d'un principe actif dans un liposome permet de réaliser une libération programmée qui va protéger d'une part le principe actif d'une dégradation prématurée et d'autre part protéger les cellules saines de l'effet d'un médicament qui pourrait être toxique.

[71] La libération programmée ou ciblée est utilisée dans les traitements du cancer où les
liposomes jouent le rôle de « véhicule » qui transportent le médicament vers les cellules
cancéreuses. Ce ciblage de cellule dépend de plusieurs caractéristiques : d'une part, les cellules
cancéreuses modifient localement l'environnement dans le corps en modifiant, par exemple,
le pH (inférieur au pH physiologique) et en possédant des marqueurs biologiques qui
permettent de les repérer par les liposomes. D'autre part, les liposomes sont guidés, dans le
corps, vers les cellules cancéreuses selon trois chemins : i)- Après leurs injections, ils sont
reconnu par le corps comme des éléments « étrangers » et donc ils sont capturés par le foie où
ils seront détruits. Cette méthode est utilisée pour viser le foie. ii)- Pour aller plus loin dans le
corps et s'échapper du foie, les liposomes peuvent être camouflés par un greffage d'un
polymère pour qu'ils ne soient pas reconnus par le corps. iii)- Dans le but d'avoir une libération
plus précise, un greffage de molécules capables de reconnaitre les cellules cancéreuses, sur le
polymère de camouflage, est utilisé.

Cette méthode est efficace non seulement pour vectoriser le traitement du cancer [72] mais aussi pour l'administration d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires [54].

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Figure 30 : Schéma explicatif des bénéfices des nanovecteurs ou liposomes dans le domaine de la vectorisation des médicaments [73].

5.2. Applications biochimiques et modèles biophysiques

Les liposomes sont utilisés en tant que modèles biophysiques simples de cellules, débarrassés de la complexité de la cellule vivante et de ses composants tout en gardant une structure
membranaire comparable à celle des membranes cellulaires. Donc les liposomes géants ont attiré l'attention de plusieurs chercheurs pour étudier les phénomènes qui peuvent avoir lieu sur les membranes biologiques vu leur taille (diamètre supérieur à 1 µm) qui facilite l'observation par microscopie optique. Ils étaient utilisés pour étudier les phénomènes transmembranaires ou intracellulaires qui peuvent avoir lieu au cours des échanges entre les différents composants de la cellule comme, par exemple, la fusion (Figure 31), la migration, la perméabilisation... ou les interactions qui peuvent avoir lieu entre les membrane de ces structures et des molécules biologiques comme les protéines [74].

Toutes ces caractéristiques des liposomes nous ont permis de constater qu'ils sont le modèle biophysique le plus favorable pour étudier en premier lieu l'événement de la libération liposomale et la perméabilisation membranaire par des peptides (chapitre 4).

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Figure 31 : fusion de deux vésicules en présence d'un tensio-actif (Tween 20) par ouverture simultanée de deux pores [75].

Ces structures font aussi fonction de micros-réacteurs pour des processus biologiques comme la réplication de l'ADN. [53]

## 5.3. Utilisation dans les produits cosmétiques

L'encapsulation des substances cosmétiques dans les liposomes présente plusieurs avantages tels que :
- Amélioration de l'absorption percutanée et la perméation des substances dans la peau ce qui augmente leur efficacité [76] ;

- Eviter l'huile et l'alcool qui sont utilisés comme excipients dans plusieurs produits cosmétiques et qui pourraient endommager la peau [77].

## 5.4. Utilisation dans l'industrie alimentaire

Dans le secteur agroalimentaire, les enzymes jouent un rôle central dans la conservation des produits. Afin d'augmenter la durée de conservation de produits alimentaires, ces enzymes sont encapsulées dans des liposomes.

Cette technique offre la possibilité d'augmenter la quantité de production des produits alimentaires en gardant toujours la bonne qualité des produits sur toute la durée de conservation [78].

## IV. Conclusion

Ces rappels bibliographiques avaient pour ambition de rappeler d'une part les principes fondamentaux de l'ECL en soulignant les bénéfices de cette technique en imagerie et d'autre part les propriétés des liposomes en tant que structures lipidiques fluides et dynamiques en 3D qui en font des modèles adaptés au suivi du passage de substances du milieu intravésiculaire au milieu extérieur.

La stratégie retenue pour mon projet a ainsi consisté à utiliser l'électrochimiluminescence pour imager le passage transmembranaire issu de la perméabilisation d'une membrane lipidique à partir de liposomes.
# Deuxième chapitre – Développement d'une méthodologie d'électrochimiluminescence pour imager l'ouverture de liposomes géants
<figure><img src="image_39.png" /></figure>
# 2- Deuxième chapitre – Développement d'une méthodologie d'électrochimiluminescence pour imager l'ouverture de liposomes géants

## I. Contexte de l'étude

La détection électrochimique de la libération du contenu liposomal suite à une perméabilisation de la membrane phospholipidique a été reportée pour la première fois en 2014 dans le groupe de Compton [79]. Les auteurs ont quantifié, par chronoampérométrie, la vitamine C libérée à la surface d'une microélectrode de carbone en encapsulant ce principe actif dans des liposomes. Une année plus tard, en 2015, Ewing et al. ont quantifié par chronoampérométrie la libération d'une catécholamine (Figure 32)[80].

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 32 : Détection de la libération liposomale par électrochimie de la vitamine C (a) [79] et de la catécholamine (b) [81].</figcaption></figure>

Dans ces travaux, l'ampérométrie est la méthode utilisée pour quantifier le contenu libéré, ce qui présente l'avantage d'une très bonne résolution en temps, mais d'une sensibilité réduite. L'implémentation d'une approche par ECL dans la révélation et la quantification d'un efflux depuis le milieu intravésiculaire permet, en plus d'une sensibilité accrue, d'envisager une imagerie de l'évènement.

Pour ce faire, nous avons décidé de nous baser sur l'approche ECL la plus populaire consistant à oxyder simultanément un luminophore ([(Ru(bpy)₃]²⁺) et un co-réactif (Tri-*n*-propylamine ; TPrA).
Dans ce cadre, la stratégie a consisté, tout d'abord, à encapsuler le luminophore et le co-réactif dans des liposomes géants. Dans ces conditions, c'est-à-dire tant que le liposome reste intact, les réactifs ECL ne peuvent être oxydés à la surface de l'électrode car ils sont séparés de l'électrode et du milieu extérieur par la membrane lipidique. Néanmoins, en cas de rupture de la bicouche phospholipidique, par un stimulus externe (polarisation de l'électrode dans notre cas), le contenu vésiculaire entre en contact avec la surface de l'électrode polarisée et déclenche un signal lumineux dont l'intensité doit varier de façon synchronisée avec l'intensité du courant faradique associée à l'oxydation des réactifs.

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

Figure 33 : Stratégie adoptée pour imager l'ouverture d'un liposome par électrochimiluminescence.

En nous inspirant de l'électroporation ou électroperméabilisation utilisée pour augmenter la perméabilité des membranes cellulaires [82], nous avons choisi de déclencher la perméabilisation de la membrane par la seule polarisation de l'électrode à + 1,2 V/ Ag/AgCl.

Dans cet objectif de mettre en évidence l'ouverture d'un liposome par électrochimiluminescence, nous avons commencé par fabriquer des liposomes géants contenant le co-réactif et le luminophore selon la méthode de transfert de phase évoquée dans le chapitre bibliographique et détaillée pour nos conditions dans le paragraphe suivant.

## II. Préparation des liposomes : encapsulation des réactifs et stabilité

Ce paragraphe aborde la méthodologie utilisée pour préparer des liposomes stables contenant le luminophore et le co-réactif.
Les principaux points à contrôler pour assurer la stabilité des liposomes sont :

- L'osmolalité (ou osmolarité) des solutions intra et extra vésiculaire

- Le choix des phospholipides qui répond à deux contraintes : 1) éviter les interactions électrostatiques entre les phospholipides et les réactifs ECL qui pourraient déstabiliser la membrane phospholipidique donc empêcher la formation des liposomes et 2) favoriser l'instabilité des liposomes sur une surface d'électrode polarisée pour permettre la libération de la solution encapsulée.

## 1. L'osmolalité : généralité et calcul

L'osmolalité est le nombre d'osmoles de soluté par kilogramme de solvant. Il ne faut pas la confondre avec l'osmolarité qui est le nombre d'osmoles de soluté par litre de solution. La différence d'osmolalité entre deux milieux se traduit par la pression osmotique Π selon l'équation suivante :

$$ \Pi = \text{Pint} - \text{Pext} = R T \Delta C_{\text{osm}} \quad (31) $$

Les liposomes sont stables tant que la pression osmotique ne dépasse pas la pression de LAPLACE $\Delta P_{\text{Laplace}} = \frac{4\gamma}{r}$ avec r le rayon de la vésicule (prenant 10 µm comme le rayon de la plus petite vésicule) et $\gamma \sim 50 \text{ mJ.cm}^{-2}$ la tension de surface entre l'eau et un milieu phospholipidique : [83]

$$ \Delta P_{\text{Laplace}} \approx \Pi \quad (32) $$

$$ \Delta C_{\text{osm}} \approx \frac{4\gamma}{rRT} \quad (33) $$

$$ \Delta C_{\text{osm}} \approx 10 \text{ mosmol.L}^{-1} \quad (34) $$

Donc la différence d'osmolalité entre le milieu intra vésiculaire et le milieu extra vésiculaire ne doit pas dépasser $10 \text{ mosmol.L}^{-1}$ pour avoir des liposomes stables.

Pour obtenir des valeurs d'osmolalité extérieur et intérieure proches, on a utilisé des solutions aqueuses de glucose et de sucrose. Ce sont deux solutions électrochimiquement inertes permettant de conférer des densités différentes à concentrations osmotiques égales.
$$ \gamma \text{ osm glucose} \approx \gamma \text{ osm sucrose} \qquad (35) $$

$$ \text{M sucrose} \approx 2 \text{ M glucose} \qquad (36) $$

La différence de densité est un enjeu à prendre en compte dès la fabrication des vésicules afin de permettre la sédimentation des vésicules (qui contiennent le luminophore et le co-réactif à l'intérieur) et qui sont placées dans une solution de glucose.

## 2. Choix de phospholipides

Au début de ce travail, nous avons tenté de préparer des liposomes constitués exclusivement de phospholipides DOPG (phospholipide négatif qui compose 98% des phospholipides de la solution lipidique) sur les deux feuillets interne et externe des liposomes. Avec cette composition, nous avons remarqué que les liposomes ne se formaient pas.

Notre interprétation est que l'instabilité de liposomes provient d'interactions électrostatiques entre le phospholipide chargé négativement et le co-réactif (TPrA) chargé positivement (pKa du co-réactif égal à 10,65 et le pH de la solution est autour de 7,4) présent à l'intérieur des liposomes et donc directement en contact avec le feuillet interne. Nous avons donc décidé de remplacer le phospholipide négatif par un phospholipide zwitterionique, globalement neutre, sur le feuillet interne qui est en contact direct avec la solution de luminophore et du co-réactif.

In fine, le feuillet interne globalement neutre ne donne lieu à aucune association électrostatique avec le co-réactif. D'autre part, conserver sur le feuillet externe un phospholipide chargé négativement comme le DOPG est très important pour la suite de notre projet afin de favoriser l'association de peptides, chargés positivement. Cette interaction électrostatique initiale est à l'origine des processus de perméation ou de passage de peptides dans ces couches lipidiques.

## 3. Fabrication de liposomes

Pour la fabrication de liposomes dissymétriques de type DOPG/DOPC (feuillet externe/feuillet interne), nous avons utilisé la méthode de transfert de phase qui est basée sur deux grandes étapes. La première étape consiste à préparer des micelles inversées qui préfigurent la solution intra-vésiculaire entourée par une monocouche de phospholipides. La deuxième étape a pour objectif la formation de la monocouche externe de lipides.
### 3.1. Préparation de l'émulsion : formation de la première monocouche

Pour préparer l'émulsion, nous avons, tout d'abord, utilisé une méthode manuelle qui consiste à la préparation de l'émulsion de micelles inversées en utilisant une micropipette qui sert à mélanger un volume de la solution aqueuse à encapsuler dans un volume de la solution de phospholipides (phospholipides dissous dans du *n*-dodécane). Néanmoins, avec cette méthode, le nombre de liposomes obtenu s'est avéré trop faible pour pouvoir réaliser les expériences et leur distribution en taille hétérogène.

Pour augmenter le nombre et homogénéiser la taille des liposomes, nous avons fait appel à une méthode microfluidique permettant de générer un grand nombre de gouttes de taille homogène (rayon = 50 µm). Comme montré dans la partie expérimentale de ce manuscrit, ce dispositif contient deux voies :

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Figure 34 : Fabrication de liposomes par la méthode de transfert de phase et la préparation de l'émulsion par microfluidique

Une voie amène la solution des phospholipides dissous dans l'huile minérale (98% du DOPC + 2% DPPE-NBD qui permet de visualiser les liposomes en photoluminescence), l'autre voie amène la solution aqueuse intra-vésiculaire composée par le luminophore à une concentration égale à $2,5 \cdot 10^{-4} \text{ mol.L}^{-1}$ et le co-réactif à $0,1 \text{ mol.L}^{-1}$, les deux dissous dans une solution de sucrose à $0,7 \text{ mol.L}^{-1}$ dans du PBS à $1,10^{-2} \text{ mol.L}^{-1}$. Le pH de cette solution a été ajusté à 7.4 (valeur du pH physiologique).

Après la préparation de l'émulsion, nous passons à l'étape suivante qui consiste à la formation de la deuxième monocouche.
## 3.2. Formation de la deuxième monocouche

Dans un système biphasique composé par une solution de glucose de concentration égale à 0,7 mol.L⁻¹ et une solution de phospholipide (98% DOPG + 2% DPPE-NBD), les phospholipides composés d'une tête polaire et d'une queue apolaire ont tendance, à une température plus élevée que leur température de transition de phase, à s'organiser de façon à ce que la partie polaire soit dirigée vers le milieu aqueux et la partie apolaire vers le milieu organique (Figure 34).

Grâce à la différence de densité entre le glucose et le sucrose, les micelles inversées formées peuvent traverser la monocouche de phospholipides et être enrobées par une deuxième monocouche.

Les liposomes obtenus sont observés par microscopie comme illustré ci-dessous.

## 4. Visualisation des liposomes

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

Figure 35 : Observation microscopique de vésicules contenant [Ru(bpy)₃]²⁺ à 2,5·10⁻⁴ mol.L⁻¹ ainsi que le co-réactif TPrA à 0,1 mol.L⁻¹, et posées sur une surface en polystyrène. Observation (a) en contraste de phase, (b) avec un filtre GFP et (c) avec un filtre rhodamine. Barre d'échelle : 300 µm.

### a) En contraste de phase

Nous avons tout d'abord observé les liposomes en contraste de phase grâce à la différence d'indice de réfraction entre le glucose (1.3635 à 20°C) présent dans la solution extra-vésiculaire et le sucrose (1,38115 à 20°C) présent dans la solution intra-vésiculaire.
b) Avec un filtre GFP (Green Fluorescent Protein)

C'est un filtre qui possède une longueur d'onde d'excitation comprise entre 465-495 nm et une longueur d'onde d'émission comprise entre 515-555 nm, ce qui est adéquat avec les caractéristiques de la sonde fluorescente NBD (Figure 36) greffée sur le DPPE (phospholipide qui constitue 2 % de la membrane lipidique)

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 36 : Longueur d'onde d'excitation et d'émission du NBD</figcaption></figure>

c) Avec un filtre Rhodamine : un jeu de filtre 74 HE

Ce filtre possède les caractéristiques suivantes :

Longueur d'onde d'excitation = Filtre passe bande DBP 480 / 30 – DBP 525 / 31

Longueur d'onde d'émission = Filtre passe bande DBP 525 / 31 – DBP 616 / 57

Ces caractéristiques sont adéquates avec le complexe de ruthénium sous sa forme cationique ($Ru(bpy)_3^{2+}$) qui est de couleur jaune-orangée et donc absorbe à $\lambda_{abs} = 454$ nm pour une émission située à $\lambda_{em} = 620$ nm.
Notre expérience de ces liposomes a montré qu'ils éclatent spontanément sous polarisation de l'électrode à 1,2 V. La polarisation de l'électrode sera donc, dans un premier temps, notre stimulus permettant de déstabiliser les liposomes et d'étudier le phénomène de la libération liposomale.

### III. Effet du matériau d'électrode sur la réponse électrochimique des espèces électroactives

A ce stade et avant de commencer la détection électrochimique de l'événement d'ouverture, il était important d'étudier le comportement électrochimique des différentes espèces qui interviennent dans l'évènement d'ECL afin de choisir le matériau d'électrode le plus adapté et d'identifier le potentiel à appliquer pour avoir un maximum d'intensité faradique et lumineuse.

#### 1. Les matériaux utilisés pour la fabrication des électrodes

##### 1.1. Les matériaux carbonés : les plus compatibles avec l'ECL

Les différents matériaux d'électrode à base de carbone ont des caractéristiques intéressantes pour notre étude, parmi lesquelles nous retenons :

- Une grande inertie chimique ;

- Une forte conductivité pour les carbones ayant une hybridation sp2 ;

- Un large domaine d'électro-activité ;

- Un coût faible ;

- Une résistance mécanique et une conservation des propriétés lors de l'immersion prolongée dans des milieux aqueux.

###### 1.1.1. Le carbone vitreux (Glassy carbone GC)

Le carbone vitreux est un matériau amorphe dont les premières voies d'élaboration ont été brevetées dans les années 1960 [84]. Ce matériau possède de bonnes propriétés électriques mais aussi mécaniques, une large fenêtre de potentiel, une certaine inertie chimique et une bonne reproductibilité nécessaire pour les analyses électrochimiques. Mais l'opacité de ce matériau constitue un obstacle pour une utilisation avec un microscope et le développement d'électrodes transparentes en carbone vitreux reste pour l'heure non-abouti.
En effet, un dépôt transparent de carbone vitreux par pulvérisation cathodique entraine une perte de la conduction du carbone vitreux.

### 1.1.2. Le graphène

Le graphène est un cristal de carbone bidimensionnel, il est composé de cellules hexagonales en forme de nid d'abeilles. La liaison C-C qui la forme mesure 0,142 nm.

Contrairement au carbone vitreux, le graphène est un matériau compatible avec une utilisation en microscopie d'autant plus qu'il peut être utilisé en monocouche.

### 1.1.3. Les nanotubes de carbone (CNT)

Les nanotubes de carbone sont des tubes de très faible diamètre (nanométrique), le plus petit détecté est de l'ordre de 3Å. Leur longueur est de l'ordre de cent à plus de dix millions de fois le diamètre dont le plus long détecté est de l'ordre de 18,5 cm [85], [86].

Avec leur structure en feuillets de graphène, les nanotubes de carbone présentent un matériau conducteur et transparent compatible avec l'utilisation électrochimique et microscopique.

## 1.2 Electrode en ITO

L'oxyde mixte d'indium-étain ou l'ITO (Indium Tin Oxide) est un semi-conducteur composé d'un mélange de deux oxydes avec une proportion massique de 10% d'oxyde d'étain $SnO_2$ et 90% d'oxyde d'indium $In_2O_3$.

C'est un matériau qui combine conductivité et transparence. Au cours de ma thèse j'ai travaillé avec de l'ITO commercial et de l'ITO préparé au sein du laboratoire.

## 2. Comportement électrochimique du luminophore

L'analyse des propriétés électrochimique du tris(bipyridine)ruthénium (II), $[Ru(bpy)_3]^{2+}$, a été réalisé par voltampérométrie cyclique à des vitesses de balayage de l'ordre égale à 50 mV.s⁻¹ en mettant dans le puit de l'électrode 20 µL d'une solution aqueuse de ruthénium à 0,02 mol.L⁻¹ avec 380µL d'une solution de tampon phosphate PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹. La concentration finale du complexe de ruthénium dans le puits est de l'ordre de 1 mM.
Cette expérience a été effectuée sur des électrodes en carbone vitreux, en ITO commercial et préparé au laboratoire ainsi que sur une électrode en graphène.

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Figure 37 : Dispositif électrochimique pour l'enregistrement des voltampérogrammes avec une électrode de travail en carbone vitreux (a) et une autre transparente déposée à la surface de la lamelle de verre (b) (l'électrode est en ITO ou graphène).

La caractérisation électrochimique du luminophore a été réalisée par voltampérométrie cyclique pour quatre types de matériaux d'électrode différents.
<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Figure 38 : Voltampérométrie cyclique d'une solution de complexe $[Ru(bpy)₃]^{2+}$ à 1 mmol.L⁻¹ dans un milieu tampon phosphate à 10 mmol.L⁻¹ et pH = 7,54, sur différents matériaux d'électrode. Nature de l'électrode de travail : (a) carbone vitreux de diamètre d = 3mm, (b) oxyde d'indium-étain commercial de diamètre d = 7 mm, (c) oxyde d'indium-étain préparé au laboratoire et d= 7 mm, (d) graphène de diamètre d= 7 mm. Vitesse de balayage v = 50 mV.s⁻¹. L'électrode de référence est en Ag/AgCl et la contre électrode est un fil de platine de diamètre 1 mm et de longueur 1 cm.

Lorsque l'électrode de travail est immergée dans une solution de ruthénium, on constate l'apparition d'une vague d'oxydation entre +1 et +1,2 V selon la nature du matériau d'électrode utilisé correspondant à l'oxydation du RuII en RuIII.

L'intensité de pic de cette vague d'oxydation diffère également d'un matériau à l'autre car les électrodes présentent des aires géométriques différentes. De façon à pouvoir comparer correctement les résultats obtenus, les intensités de courant ont donc été transformées en densité de courant sachant que les diamètres des électrodes utilisés étaient de 3mm (carbone vitreux) et de 7 mm (ITO et graphène).

$$ \text{La densité de courant J en A/m}^2 = \frac{\text{l'intensité en A}}{\text{la surface de l'électrode en m}^2} $$
<table><caption>Tableau 4 : comparaison des densités de courant de pic d'oxydation (obtenu par lecture directe sur les voltampérogrammes) du complexe du ruthénium (bpyridine) (II) sur différents matériaux d'électrode.</caption><thead><tr><td>Matériau</td><td>Surface (m²)</td><td>Densité (A/m²)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Carbone vitreux</td><td>7.10<sup>-6</sup></td><td>5.71</td></tr><tr><td>ITO commercial</td><td>4.10<sup>-5</sup></td><td>1</td></tr><tr><td>ITO « maison »</td><td>4.10<sup>-5</sup></td><td>1.5</td></tr><tr><td>Graphène (Monocouche)</td><td>4.10<sup>-5</sup></td><td>0.5</td></tr></tbody></table>

D'après les résultats regroupés dans le tableau ci-dessus, on peut observer que la densité de courant d'oxydation du complexe de ruthénium est meilleure sur une électrode en carbone vitreux.

La voltampérométrie cyclique révèle également que l'oxydation du complexe $[Ru(bpy)₃]^{2+}$ est réversible (existence d'une vague de réduction lors du balayage retour). Pour l'ITO préparé au laboratoire, on a constaté une cinétique de transfert d'électron plus rapide, ce que matérialise une largeur de pic beaucoup plus faible que sur les autres voltampérogrammes rendant la vague de réduction plus visible au balayage retour.

### 3. Comportement électrochimique du co-réactif

Sur les mêmes matériaux utilisés précédemment, nous avons réalisé une étude électrochimique de la tris-*n*-propylamine à une concentration de 0,1 mol.L⁻¹.

Les voltampérogrammes sont présentés dans la Figure 39 :
<figure><img src="image_48.png" /></figure>

Figure 39 : Voltampérométrie cyclique d'une solution de tri-*n*-propylamine à 0,1 mol.L⁻¹ dans un milieu tampon phosphate à 10 mmol.L⁻¹ et pH = 7,54, sur différents matériaux d'électrode. Electrode de travail : (a) carbone vitreux de diamètre d = 3 mm, (b) oxyde d'indium-étain commercial de diamètre d= 7 mm, (c) oxyde d'indium-étain préparé au laboratoire et d = 7 mm, (d) graphène de diamètre d = 7 mm. Vitesse de balayage v = 50 mV.s⁻¹. L'électrode de référence est en Ag/AgCl et la contre électrode est un fil de platine de diamètre 1mm et de longueur 1cm.

Les voltampérogrammes montrent que la tris-*n*-propylamine présente une vague d'oxydation irréversible entre +1 et +1,4 V selon la nature du matériau. En calculant les densités de courant, on a obtenu le tableau suivant :

<table><caption>Tableau 5 : Comparaison des densités de courant de pic d'oxydation (obtenu par lecture directe sur les voltampérogramme) de la tri-*n*-propylamine sur différents matériaux d'électrode.</caption><thead><tr><td>Matériau</td><td>Surface (m²)</td><td>Densité (A/m²)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Carbone vitreux</td><td>7.10<sup>-6</sup></td><td>12,8</td></tr><tr><td>ITO commercial</td><td>4.10<sup>-5</sup></td><td>1,25</td></tr><tr><td>ITO « maison »</td><td>4.10<sup>-5</sup></td><td>5</td></tr><tr><td>Graphène (monocouche)</td><td>4.10<sup>-5</sup></td><td>1,25</td></tr></tbody></table>
L'oxydation de la TPrA est mieux marquée sur le carbone vitreux et sur l'ITO préparé au laboratoire.

Cette étude électrochimique, effectuée sur le luminophore et le co-réactif, montre que la vitesse de transfert de charge est importante sur l'électrode de carbone vitreux mais aussi sur l'ITO préparé au laboratoire pour les deux espèces réactives utilisés.

Les résultats obtenus sont très différents selon le type de matériau, la densité de courant est beaucoup plus élevée sur l'électrode de carbone vitreux que sur les autres matériaux et cette différence est très vraisemblablement liée à la surface réellement active de l'électrode. Cette surface ne correspond pas à la surface géométrique mais plutôt à la surface conductrice de l'électrode. Sur ITO ou sur graphène, les défauts en surface donnent des valeurs de densité de courant « apparentes » peu reproductibles. Ce qui veut dire aussi que la densité de courant représente au final les défauts de phase (graphène) ou les hétérogénéités des surfaces d'électrode.

## 4. Détection synchronisée du courant d'oxydation et du signal luminescent

Le couplage des enregistrements du signal faradique (courant) et du signal électrochimiluminescent a été réalisé lors du balayage voltampérométrique.

Cette expérience a été mise en œuvre sur les électrodes en carbone vitreux, en ITO et en graphène. Pour chaque expérience on a mis dans le puits de la cellule électrochimique 20 µL de la solution de ruthénium de concentration 0,02 mol.L⁻¹ et 380 µL de la solution de tri-*n*-propylamine de concentration 0,1 mol.L⁻¹ et pH = 7,3.

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

Figure 40 : Dispositif du couplage électrochimiluminescent avec une électrode de travail en carbone vitreux.
<figure><img src="image_50.png" /></figure>

Figure 41 : Propriétés électrochimiluminescentes du système [Ru(bpy)₃]²⁺ et tri-*n*-propylamine. Voltampérogrammes cycliques (en bleu) et intensité d'électrochimiluminescence (en orange) enregistrés sur différents matériaux d'électrode. (a) carbone vitreux (b) ITO commercial (c) ITO préparés au laboratoire. Vitesse de balayage v = 50 mV·s⁻¹. (d) Image en microscopie optique en absence d'irradiation sur une électrode de carbone vitreux. Conditions : 380 µL d'une solution de tri-*n*-propylamine (C = 0,1 mol·L⁻¹) et de [Ru(bpy)₃]²⁺ (C = 1 mmol·L⁻¹) dans un tampon phosphate à 10 mmol·L⁻¹ (pH = 7,54). L'électrode de référence est en Ag/AgCl et la contre électrode est un fil de platine de diamètre 1mm et de longueur 1 cm.

Le couplage entre l'électrochimie et la luminescence montre que l'intensité de la lumière varie de façon synchronisée avec le potentiel avec un maximum vers +1,2 V. A ce potentiel, on oxyde donc à la fois le co-réactif et le luminophore en accord avec le mécanisme dit du « co-réactif ».

Cette étude permet d'identifier le potentiel à appliquer pour obtenir un maximum d'émission lumineuse. Vers 1,2 V on a une intensité lumineuse maximale synchronisée avec le courant faradique, lié principalement à l'oxydation de la TPrA qui est introduite en excès par rapport au complexe de ruthénium.

Nous avons enregistré l'apparition d'un signal lumineux sur tous les matériaux d'électrode mais la transparence de l'ITO en fait un matériau plus adapté pour le reste du travail.

L'identification du potentiel auquel apparaissent simultanément un maximum d'intensité de courant et d'émission de lumière établit les conditions optimales pour détecter, par
électrochimiluminescence, la perméabilisation de la membrane et la libération du contenu d'un liposome à la surface d'une électrode polarisée.

#### IV. Détection électrochimique de l'évènement de l'ouverture à la surface d'une électrode polarisée

Avant d'arriver à la détection de l'ouverture des liposomes par électrochimiluminescence, nous avons décidé de mettre en évidence cette ouverture, d'abord, par électrochimie, comme décrit dans les travaux de Compton et Ewing.

1. Cellule électrochimique utilisée pour la détection de l'ouverture du liposome et expérience réalisée

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

Figure 42 : Cellule électrochimique préparée au laboratoire et utilisée pour la détection de l'ouverture des liposomes par électrochimie. L'électrode de travail est une lamelle de verre d'épaisseur $e_1$ = 130 µm couverte par une couche d'ITO d'épaisseur $e_2$ = 150 nm. L'électrode de référence est un fil d'Ag/AgCl et la contre électrode est un fil de platine de diamètre égal à 1mm et de longueur égale à 1 cm.

Cette cellule électrochimique préparée au laboratoire est percée de « puits » de diamètre millimétrique, ce qui nous a permis d'avoir un bon rapport signal/bruit pour l'enregistrement faradique.

Plus précisément, la partie inférieure de la cellule est constituée de puits en PDMS (polydiméthylsiloxane), de diamètre D = 2 mm, collés sur une lame de microscope en verre,
d'épaisseur égale à 130 µm, recouverte d'une fine couche d'oxyde d'indium et d'étain (ITO, 150 nm d'épaisseur).

La partie supérieure est un cône de micropipette (1 mL de volume) qui est inséré verticalement dans le puit en PDMS au contact de la surface verre/ITO, délimitant ainsi une électrode de travail dont la taille est proche du diamètre intérieur de la pointe de la micropipette (environ 800 µm mesuré par microscopie). Une électrode en Ag/AgCl et un fil de platine ont été utilisés comme électrode de référence et contre électrode respectivement placés dans la partie supérieure du cône.

## 2. Résultats obtenus suite à la perméabilisation de la bicouche lipidique

### 2.1. Mise en évidence électrochimique de la perméabilisation de liposomes ne contenant que du sucrose dans du PBS

En utilisant la méthode de préparation des liposomes décrite au début de ce chapitre, nous avons préparé des liposomes ne contenant qu'une solution de sucrose (0,7 M) dans du PBS. Ces liposomes sont ajoutés dans la cellule électrochimique tandis que l'électrode de travail est polarisée à un potentiel de 1,2 V.

Le courant est alors enregistré en fonction du temps et parallèlement, les images observées par microscopie montrent l'ouverture des liposomes à la surface de l'électrode. Cette expérience joue le rôle d'expérience de contrôle.

Dans ces conditions on a obtenu le graphique ci-dessous qui montre l'absence de courant faradique, preuve de l'oxydation de la solution encapsulée dans les liposomes.

<figure><img src="image_52.png" /></figure>
Figure 43 : Trace chronoampérométrique typique obtenue suite à l'ouverture des liposomes contenant une solution de sucrose de concentration C<sub>sucrose</sub> = 0,7M, à la surface d'une électrode de travail en ITO polarisée à 1,2 V vs. Ag/AgCl.

## 2.2. Détection électrochimique de l'évènement d'ouverture des liposomes contenant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ et la TPrA

Suite à l'introduction des liposomes dans la cellule formée par le cône de pipette et la surface d'ITO, la libération de la solution intra-vésiculaire d'une partie de la population de vésicules sur l'électrode de travail en ITO, polarisée à +1,2 V<fnref n="3" />, fournit la trace chronoampérométrique suivante (Figure 44).

<footnote n="3">³ A noter que quand l'électrode était polarisée à +0,5 V, nous n'avons pas observé des ouvertures sur les bicouches lipidiques et les liposomes sont restés stables.</footnote>
<figure><img src="image_53.png" /></figure>

Figure 44 : Signal chronoampérométrique typique montrant l'oxydation de la solution intra-vésiculaire ([Ru(bpy)₃]²⁺ (C=2,5·10⁻⁴ mol.L⁻¹) et TPrA (C=0,1 mol.L⁻¹)) à la surface d'une électrode polarisée à un potentiel égal à 1,2 V vs AgCl/Ag (a). La figure (b) montre les pics ampérométriques après déconvolution.

Dans cette expérience, les liposomes arrivent à la surface de l'électrode de façon erratique, par
cela nous voulons dire que nous ne contrôlons pas l'échelonnement de la sédimentation des
liposomes sur la surface d'ITO. Cela est très visible sur la trace chronoampérométrique
obtenue (Figure 44a) où l'arrivée simultanée de plusieurs liposomes se traduit par des pics de
courant d'oxydation superposés.

Pour pouvoir séparer ces pics chronoampérométriques et obtenir la Figure 44 b, nous sommes
passés par une étape d'analyse décrite et expliquée dans le paragraphe suivant.
### 2.2.1 Traitement déconvolutif du signal ampérométrique

Ce traitement se déroule en deux étapes principales, à savoir la soustraction de la ligne de base puis la déconvolution des pics superposés.

#### Première étape : soustraction du courant capacitif

Cette étape consiste, en premier lieu à simuler, à partir de la trace chronoampérométrique obtenue, la décroissance du courant capacitif qui représente la ligne de base des chronoampérogrammes.

Nous avons dans ce contexte utilisé une méthode développée au laboratoire, par le Dr.Yann Bouret et intégrée à un logiciel de simulation (« MultiExponentialFit ») qui consiste à modéliser la ligne de base d'un chronoampérogramme en se basant sur ses deux portions (au début et à la fin) qui ne contiennent pas de pics de courant faradique (Figure 45 a) par l'intermédiaire de l'équation suivante mettant en jeu la somme de plusieurs exponentielles décroissantes :

$$i_{baseline} = Ae^{-k_1 t} + Be^{-k_2 t} + Ce^{-k_3 t}$$

A, B, C, k1, k2 et k3 sont des constantes adaptées pour obtenir la meilleure simulation possible. Dans notre cas, le coefficient de régression linéaire est toujours excellent (R² > 0,99) pour les différentes traces traitées.

Le courant capacitif modélisé est alors soustrait de la trace chronoampérométrique brute et nous obtenons un chronoampérogramme avec une ligne de base proche de zéro et dont les pics, extraits de la trace brute, correspondent en totalité à la contribution faradique du courant. Ils restent toutefois, à ce stade, superposés pour la plupart et donc restent inexploitables.
<figure><img src="image_54.png" /></figure>

Figure 45 : Signal chronoampérométrique de l'oxydation de la solution intra-vésiculaire ([Ru(bpy)₃]²⁺ (C= 2,5·10⁻⁴ mol.L⁻¹) et TPrA (C= 0,1 mol.L⁻¹), à la surface d'une électrode d'ITO polarisée à un potentiel égal à 1,2 V vs. Ag/AgCl, avant (a) et après (b) la soustraction du courant capacitif.
## Deuxième étape : traitement du signal par déconvolution

Après avoir extrait les signaux faradiques de la trace chronoampérométrique brute, nous passons au traitement du signal afin de séparer les pics. Le principe de cette méthode de déconvolution consiste à modéliser chaque pic en n'ayant accès qu'à une partie de ce pic (i.e. la partie chevauchée avec un autre pic). Le principe est de pouvoir extrapoler ce fragment de pic pour l'extraire ensuite de la trace. Pour ce faire, il faut trouver la fonction qui modélise au mieux nos pics.

Comme nous pouvons le voir sur la figure, et malgré la présence de nombreux pics de courant superposés, il existe un seul pic bien isolé des autres (le dernier pic vers 270 s). Ce pic est donc mis à profit en tant que modèle représentatif pour définir la fonction qui les modélise le mieux.

Sigma Plot 12.0 (Systat Software Inc.) est un logiciel d'analyse et de traitement de données qui offre la possibilité de modéliser des pics par de nombreuses fonctions. Parmi ces dernières (Gauss, Lorentz, Voigt...), nous avons constaté, comme le montre la Figure 46, que la loi de Weibull à cinq paramètres était bien adaptée avec un R² dépassant toujours 0,99 quel que soit le pic isolé et analysé. Cette loi présente un intérêt en lien avec son expression mathématique « flexible » où 5 constantes (a, b, c, t0, x0) permettent, ensemble ou séparément, de définir pour un pic donné son amplitude (a,c), sa montée (b, t0), ainsi que sa largeur et son centrage (b, c, x0) [87].
$$i_{pic} = i_0 + a \left(\frac{c-1}{c}\right)^{\frac{1-c}{c}} \left[ \frac{t-t_0}{b} + \left(\frac{c-1}{c}\right)^{\frac{1}{c}} \right]^{c-1} e^{-\left[\frac{t-x_0}{b} + \left(\frac{c-1}{c}\right)^{\frac{1}{c}}\right]^{\frac{1}{c}}} + \frac{c-1}{c}$$

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

Figure 46 : La loi de Weibull et la superposition d'un pic isolé du chronoampérogramme obtenu (en noir) et de la modélisation du pic par la loi de Weibull (en pointillé rouge) qui montre que cette loi offre la meilleure modélisation pour nos pics.

Nous traitons, ici, un exemple de traitement mathématique pour séparer des pics superposés et les étapes suivies lors de cette analyse sont schématisées et expliquées sur la figure.

a) Le premier pic isolé (Figure 47 c) est extrait de la trace après la soustraction du courant capacitif (Figure 47 b)

b) Cette dernière est alors modélisée puis extrapolée par la fonction de Weibull (Figure 47 d)

c) Le pic reconstitué est alors extrait par soustraction du mélange de pics (Figure 47 f)

d) La procédure est alors répétée sur le pic suivant jusqu'à séparation de tous les pics de la trace.
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Figure 47 : Les étapes suivies lors du traitement mathématique au cours de l'étape de déconvolution.</figcaption></figure>
Cette méthode d'analyse tire sa force du fait qu'elle repose sur une approche robuste et rigoureuse en lien avec les points suivants :

- Il s'agit d'une analyse « semi-automatisée » en ce sens qu'elle permet de garder le contrôle sur le modèle et de faire les vérifications nécessaires entre les étapes. La partie automatique est donc réduite aux modélisations individuelles des pics

- En électrochimie, le courant capacitif en chronoampérométrie est généralement modélisé par une équation mono-exponentielle de forme $i = Ae^{-kt}$ résultant de la décharge de la double couche électrochimique. Toutefois, des matériaux d'électrodes plus complexes (semi-conducteurs ou surfaces non homogènes) conduisent à des lois moins triviales et nécessitent de prendre en compte des régions d'électrodes hétérogènes avec des constantes de temps distribuées qui sont modélisées par plusieurs contributions et donc par plusieurs exponentielles, en accord avec l'équation que nous avons utilisée ;

- La fonction de Weibull a été choisie pour son adéquation mathématique avec la morphologie des pics étudiés et sa facilité à modéliser une grande variété de courbes ayant la morphologie d'un pic. Il est à noter qu'elle n'est pas dénuée de sens physico-chimique. En effet, son expression mathématique est la convolution d'une fonction polynomiale croissante et d'une exponentielle décroissante. Ce type de comportement est en accord avec un mécanisme de libération de type « ouverture/diffusion » qui a été observé au sein de plusieurs travaux qui étudient la libération vésiculaire par électrochimie dans des phénomènes biologiques comme l'exocytose et le stress oxydant [88].

### 3. Etude statistique

Après déconvolution, chaque pic traduit la quantité d'espèces électroactives libérées et oxydées d'un seul liposome. Donc cela nous donne la possibilité de déterminer la charge Q de chaque pic, par intégration. En se basant sur la loi de Faraday et sur la concentration d'origine des réactifs dans le liposome, on peut alors relier cette charge au volume et donc au rayon des vésicules impliquées. Ainsi, nous avons déterminé le rayon de chaque liposome ouvert et tracé la courbe statistique qui montre la distribution de taille des liposomes.
$$Q = nF \times CV = \frac{4}{3}\pi n FCR^3$$

Exemple d'application numérique : Pour un liposome de 50 µm de rayon

$$Q = \frac{4}{3} \times \pi \times 1 \times 96500 \times 100 \times 10^{-3} \times (50 \times 10^{-6})^3 \times 10^3 = 5.10^{-6} C C$$

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

Figure 48 : Etude de la distribution de tailles de liposomes obtenues à partir des pics d'oxydation de la solution encapsulée dans ces liposomes contient le $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ (C= 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹) et la TPrA (C= 0,1 mol.L⁻¹). La figure représente le pourcentage de liposomes en fonction des valeurs de rayons obtenues par intégration, pour 27 évènements d'oxydation.

Sur le graphique ci-dessus, nous constatons que le rayon moyen des liposomes se situe autour de 50 µm, ce qui correspond bien au rayon des gouttes formées dans le canal microfluidique.

Cette correspondance atteste de l'oxydation de la totalité du contenu des liposomes concernés.

Sur la même figure, nous remarquons que l'intégration des pics a donné des valeurs de rayons inférieurs et supérieurs à 50µm.

Dans le cas des rayons inférieurs à 50 µm, nous pouvons dire que cela correspond à une oxydation partielle de la solution encapsulée. Cette oxydation partielle est due probablement
à la temporalité d'ouverture du liposome et à la localisation de la zone de perméabilisation par rapport à l'électrode. Plus le pore formé est proche de la surface de l'électrode, plus grande est la quantité de matière oxydée.

Pour les rayons recalculés supérieurs à 50 µm, une explication rationnelle est une fusion des gouttes lors de la première étape de fabrication des liposomes. Idéalement, la valeur du rayon augmente avec le nombre n de gouttes fusionnées selon la formule suivante :

$R = r^{3/n}$, Avec R : le rayon de la goutte obtenue de la fusion et r : rayon d'une goutte individuelle.

Après avoir établi l'ouverture de liposomes par électrochimie nous nous sommes tournés vers l'observation des évènements d'ouverture de vésicules par photoluminescence et par électrochimiluminescence.

## V. Triple détection de l'évènement d'ouverture des liposomes : couplage de l'électrochimie, de la photoluminescence et de l'électrochimiluminescence

### 1. Dispositif utilisé pour coupler les trois techniques

Pour coupler l'électrochimie à la photoluminescence et l'électrochimiluminescence, nous avons réalisé le dispositif suivant :
<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 49 : Dispositif utilisé pour le couplage de l'ECL avec l'électrochimie et la photoluminescence.</figcaption></figure>

Ce dispositif est composé de deux parties :

- Une première partie destinée aux mesures électrochimiques constituée par la cellule électrochimique, utilisée dans la partie précédente, reliée à un potentiostat et posée sur un microscope inversé.

- Une deuxième partie permet d'enregistrer les images en photoluminescence et en électrochimiluminescence grâce à une caméra EM-CCD. Les deux types d'images sont collectées par la même caméra à la faveur d'un échantillonnage réalisé à partir d'une diode clignotante et un jeu de filtre 43 HE (excitation à BP 550/25 (HE) et émission à BP 605/70 (HE). Ce filtre correspond au filtre d'excitation Ex sur la Figure 49) qui permet d'exciter à la fois le ruthénium encapsulé et le NBD dans les membranes.
## 2. Acquisition et collections des informations

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Figure 50 : Acquisition utilisée pour la collection simultanée des données en électrochimie, ECL et photoluminescence. La figure correspond à l'acquisition pendant 2 secondes.

Comme nous pouvons le voir sur la Figure 50, la caméra enregistre les images, de façon échantillonnée, avec un temps d'exposition égal à 250 ms ce qui a permis d'obtenir quatre images par seconde.

Sous le contrôle d'un système d'enregistrement de données (e-corder), la diode est programmée pour être allumée pendant 100 ms pour permettre l'excitation des fluorophores qui sont dans la membrane et à l'intérieur des liposomes et éteinte pendant 900 ms pour faciliter la détection de la lumière générée par ECL.

Les images en photoluminescence correspondent aux temps d'exposition au cours desquels la diode est allumée (exemple : images 1 et 5 sur la Figure 50) et les images en ECL sont sélectionnées quand la diode est éteinte (exemple : les images 3 et 7 sur la même figure sont les images en ECL sélectionnées pour éviter les chevauchements avec la photoluminescence).
## 3. Résultats et interprétation : étude visuelle et quantitative

### 3.1. Etude visuelle

Après la séparation des images, nous avons construit deux séries d'images, comme le montre la Figure 51.

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

Figure 51 : Images obtenues en ECL et en photoluminescence qui montrent l'ouverture d'un liposome (cerclé en traits pointillés rouge) à la surface d'une électrode et la détection d'ECL. Barre d'échelle : 200 µm. Le t = 0 s correspond au moment de déclenchement de la mesure.

Avant 2 secondes : nous remarquons que le liposome cerclé est intact et nous ne détectons aucun signal d'électrochimiluminescence. Cette constatation montre sans ambiguïté qu'en absence d'ouverture ou de déformation du liposome, aucune fuite de la solution encapsulée n'est détectée.

Entre 2 et 3 secondes : nous notons une déformation du liposome et l'apparition d'un signal lumineux dû à un évènement d'ECL.

Après 3 secondes, le cercle lumineux s'élargit indiquant une libération plus importante de la solution encapsulée et à la dispersion des réactifs.

Sur la série d'images en électrochimiluminescence, nous constatons l'existence d'une tache noire au milieu du cercle lumineux qui correspond au point de contact entre le liposome et la surface de l'électrode de travail. A ce point de contact, l'électrode est couverte de phospholipides et se trouve donc bloquée, ce qui empêche l'oxydation des réactifs et la génération de la lumière.
## 3.2. Etude quantitative

Nous avons superposé les 3 signaux collectés pour un seul liposome pour mieux caractériser l'évènement d'ouverture du liposome.

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

Figure 52 : Combinaison typique des signaux obtenu en ampérométrie (bleu), photoluminescence (vert) et ECL (rouge) suite à la perméabilisation de la membrane d'un liposome (montré dans la Figure 53) à la surface d'une électrode polarisée.

<figure><img src="image_62.png" /></figure>
Figure 53 : Images en photoluminescence et en ECL qui mettent en évidence la perméabilisation d'un liposome. Barre d'échelle = 200µm. La région d'intérêt (ROI) correspond aux cercles en pointillé blanc.

La courbe verte correspond au signal de photoluminescence. Son intensité augmente quand le liposome se rapproche de la surface de l'électrode et elle est maximale quand le liposome touche la surface d'ITO (plan focal localisé à la surface de l'électrode). La diminution rapide de cette intensité, vers 48 secondes, est due à l'instabilité du liposome à la surface de l'électrode polarisée ce qui entraine la libération de la solution encapsulée et sa dilution dans le milieu. Cette libération permet de déclencher une réaction d'électrochimiluminescence suite à l'oxydation du luminophore et du co-réactif en accord avec l'apparition d'un signal de courant suivi d'un signal lumineux. Les intensités de ces deux signaux augmentent, tout d'abord, avec l'enrichissement du milieu en réactifs puis diminuent du fait de la dispersion des réactifs en solution.

## VI. Caractérisation de la dispersion du luminophore par électrochimiluminescence

A partir des images obtenues, on voit que l'imagerie ECL permet aussi de suivre la dispersion du luminophore au cours du temps.

L'évolution de la limite apparente en distance ($δ$) de la propagation de la tache lumineuse par rapport au point de contact du liposome avec l'électrode (centre de la tache noire) a été suivie en fonction du temps pour plusieurs liposomes (une dizaine de liposomes).

Pour tous les liposomes, sur la courbe $δ^2 = f(t)$, nous avons observé un changement de pente qui marque un changement de régime de transport de la matière (Figure 54).

Aux temps courts l'allure obtenue correspond à un régime convectif de transport de la matière dû aux mouvements de solution générés lors de l'événement d'ouverture, notamment sous l'effet de la différence de densité entre le glucose (solution extra-vésiculaire) et le sucrose (solution intra-vésiculaire) [89].

Aux temps longs : l'évolution devient linéaire et indique l'établissement d'un régime de transport essentiellement diffusionnel. La valeur de cette pente correspond bien à celle attendue pour la diffusion de petites molécules dans les mêmes conditions.
La frontière entre les deux régimes s'établit entre 0,5 s et 4,5 s et dépend de la quantité de réactifs libérée à la surface de l'électrode et donc de la taille du liposome.

Sur la Figure 54, avant 4,5 s, le transport de la matière est d'origine principalement convective.

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

Figure 54 : Variation typique de la distance apparente $\delta^2$ de la propagation du signal lumineux de la réaction d'électrochimiluminescence en fonction du temps. L'étude a été réalisée sur 7 liposomes et nous avons obtenu une valeur moyenne de pente (4D) égale à $20.10^{-6} \pm 3.10^{-6} \text{ cm}^2\text{s}^{-1}$.
VII. Conclusion

Cette première approche d'électrochimiluminescence nous a permis d'imager, en temps réel, l'évènement de libération du contenu d'un liposome avec une bonne résolution spatiale (de l'ordre de micro-mètre) et temporelle (de l'ordre de la ms). Ensuite, le couplage de l'ECL avec la photoluminescence et l'ampérométrie nous a permis de compléter l'information collectée notamment autour de :

- La quantification de tri-*n*-propylamine libérée par chaque liposome grâce au suivi chronoampérométrique de l'évènement d'ouverture,

- Le suivi de l'état du liposome avant et après l'évènement de la libération et l'attribution de chaque signal à son liposome d'origine. Cela a été assuré par la technique de photoluminescence.

Enfin, l'ECL permet d'imager la dispersion de la solution et informe sur les régimes de transport de la matière au début et au cours de la libération liposomale.

A partir de ces résultats et des travaux récemment réalisés dans le domaine de l'électrochimiluminescence, nous avons eu la curiosité d'explorer une nouvelle approche considérée comme l'approche négative de celle développée dans ce chapitre et appelée électrochimiluminescence négative. Cette méthode sera étudiée en détail, dans le chapitre suivant.
# Troisième chapitre –
## Perméabilisation de
liposomes géants imagée par
electrochimiluminescence
négative (i.e., par contraste
optique négatif)
<figure><img src="image_64.png" /></figure>
# 3- Troisième chapitre – Perméabilisation de liposomes géants imagée par electrochimiluminescence négative (i.e., par contraste optique négatif)

## I. Introduction

Dans le chapitre précédent, la perméabilisation de membranes de liposomes géants a été mise en évidence grâce à une émission de lumière ayant pour origine l'oxydation de réactifs ECL (un luminophore combiné à un co-réactif) s'écoulant vers le milieu extra-vésiculaire. Au cours de ces expériences, nous avions également remarqué que le point de contact entre les liposomes et l'électrode apparaissait comme une tache noire circulaire. A cet endroit, en effet, l'électrode est dite bloquée car aucun transfert d'électron ne peut se produire à travers l'épaisseur de la membrane lipidique.

Ces observations expérimentales sont à mettre en relation avec des travaux récemment publiés consistant à imager un objet par contraste optique négatif grâce au blocage de l'oxydation des réactifs ECL et donc de la lumière électrogénérée. Cette approche est d'ailleurs dénommée SECL pour "Shadow ElectroChemiLuminescence".

Partant de nos propres observations expérimentales et des exemples décrits dans la littérature au sujet de la SECL, nous avons tenté une approche inverse à celle décrite dans le chapitre précédent. Celle-ci consiste à imager la perméabilisation de membranes de liposomes géants par contraste optique négatif, autrement dit par ECL négative ou SECL en anglais.

## II. Contexte bibliographique

L'électrochimiluminescence négative est une technique basée sur une « imagerie de l'ombre » d'un objet en contact avec une surface d'électrode associé au blocage de la surface de l'électrode par l'objet. Autrement dit, quand un objet est en contact avec la surface de l'électrode, il empêche le transfert d'électron entre l'électrode et les espèces électroactives responsables de la génération du signal électrochimiluminescent, générant ainsi une zone sombre si le reste de l'électrode est en situation de produire de l'ECL.
Cette technique a été initiée par le Prof. Su en 2012 [90] pour imager des empreintes digitales.
Le contact de la peau des doigts, généralement un peu grasse, avec une surface lisse, comme
par exemple une électrode de travail, permet de déposer des traces qui correspondent aux
empreintes digitales : les bosses laissent des traces et les creux laissent des espaces vides. Donc
la réalisation d'une réaction d'électrochimiluminescence sur cette électrode permet d'observer
une génération de la lumière au niveau des espaces vides (qui ne contiennent pas le gras laissé
par les doigts) et une absence de la lumière au niveau des traces laissées par les bosses du
dermatoglyphe (Figure 55).

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Figure 55 : Observation de l'empreinte digitale sur une électrode en ITO, par microscopie à fond clair (a) et ECL négative (b) en présence d'un potentiel positif (1,13 V vs. Ag/Ag/Cl). Le luminophore est le [Ru(bpy)₃]²⁺ (C = 5.10⁻⁴ M) et le co-réactif TPrA (C = 50.10⁻³ M) dans du PBS à 0,01 M et pH = 7,4. Les images numérotées de 1 à 4 montrent qu'avec l'approche d'ECL négative, il est possible d'observer les irrégularités de l'empreinte digitale. Figure issue de la référence [90].

Le même groupe a également réussi à imager et étudier l'adhésion de la matrice cellulaire des
cellules vivantes, à la surface d'une électrode en ITO modifiée, par une membrane en silice
[47]. Le contact entre les cellules et la surface est matérialisé, sur la Figure 56, par des zones
noires où l'ECL n'est pas générée parce que le passage des réactifs vers l'électrode est bloqué
par la cellule. Dans ce travail, ils ont mis en évidence que l'électrochimiluminescence révèle
plus d'informations par rapport à la technique de microscopie à fond clair parce qu'elle met en relief les zones d'adhérence et l'orientation des cellules au cours de la migration.

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

Figure 56 : La figure présente deux séries d'images en microscopie à fond clair de (a) à (c) et en ECL négative de (d) à (f) de cellules vivantes PC12. Le luminophore est le [Ru(bpy)₃]²⁺ est à 5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ et HEPES à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du PBS à 0,01 M et pH = 7,4. L'ECL est obtenue par application d'un potentiel positif égal à 1,3 V (vs. Ag/Ag/Cl) à une électrode en ITO couverte par une membrane en silice. La barre d'échelle : 20 µm. La figure vient de la référence [2] et elle a été modifiée par rapport à la figure d'origine.

Très récemment, le groupe du Prof. N. Sojic a montré qu'avec cette approche il est possible de visualiser des objets plus petits que les cellules vivantes telles que des mitochondries déposées à la surface d'une électrode. La stratégie est basée sur le confinement spatial de la couche réactive émettrice d'ECL. Autrement dit, la présence des mitochondries bloque d'une part la production de lumière à l'endroit où elles se situent et restreint, d'autre part, la diffusion du luminophore et du co-réactif. Cela permet d'imager chacune des mitochondries avec un contraste optique négatif remarquable. Finalement, cette approche reflète l'empreinte négative de chaque mitochondrie qui joue le rôle d'obstacle local à l'oxydation électrochimique des réactifs ECL [48].
<figure><img src="image_67.png" /></figure>

Figure 57 : Une image de mitochondries déposées à la surface d'une électrode de carbone vitreux obtenue en ECL négative (a), en ECL négative avec inversion de couleur (b), en photoluminescence de NADH (c) et du MitoTracker rouge (d). L'électrochimiluminescence négative a été réalisée avec le [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et la TPrA à 0,1 mol.L⁻¹. L'électrode était polarisée à +1,45 V. La barre d'échelle : 10 mm [48].

Dans ce travail, à partir de cette figure, ils ont montré que l'ECL négative permet d'observer un nombre important de mitochondries, avec un bon contraste, même les plus petites qui ne sont pas détectables par photoluminescence. Cette constatation confirme que l'approche de l'électrochimiluminescence négative permet d'avoir plus d'informations que la microscopie optique classique.

### III. Perméabilisation membranaire de liposomes géants imagée par contraste optique négatif

#### 1. Stratégie – Hypothèse de départ

Comme décrit dans le paragraphe précédent au travers de plusieurs exemples, l'approche SECL consiste à imager un objet par contraste optique négatif grâce au blocage de l'électrode qui empêche tout transfert d'électron et, par conséquent, de lumière électrogénérée à l'endroit où il se situe.

Par ailleurs, durant les expériences présentées dans le chapitre précédent, nous avions observé un phénomène similaire mais se produisant uniquement après le processus de perméabilisation membranaire. En effet, aucune lumière électrogénérée ne pouvait être émise tant que les réactifs ECL se trouvaient à l'intérieur des liposomes car protégés par la bicouche
lipidique. A partir du moment où les réactifs ECL commençaient à s'écouler vers le milieu extra-vésiculaire, une lumière d'origine électrochimique pouvait être alors émise autour du liposome perméabilisé. Dans ces conditions, le point de contact entre le liposome et l'électrode apparaissait comme une tâche circulaire noire par contraste optique négatif.

Partant des exemples décrits dans la littérature et de nos propres observations expérimentales, notre hypothèse de départ était que la présence d'un liposome à la surface d'une électrode polarisée et baignant dans une solution contenant les réactifs ECL (et donc illuminée) devrait conduire, non seulement, à une empreinte négative du liposome (i.e. présence d'une tache noire au point de contact entre le liposome et l'électrode) mais aussi à une propagation de l'extinction de la lumière en cas de perméabilisation membranaire. En effet, dans ces conditions, on s'attend à ce que l'écoulement du milieu intra- vers le milieu extra-vésiculaire conduise à une dilution des réactifs ECL présents à proximité de la fuite membranaire permettant ainsi d'imager le processus de perméabilisation par contraste optique négatif.

Cette approche est résumée dans le schéma suivant :

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Figure 58 : Schéma de la stratégie adoptée pour détecter la perméabilisation de la bicouche lipidique par ECL négative.</figcaption></figure>

## 2. Choix de conditions expérimentales appropriées

Contrairement à l'approche présentée dans le chapitre précédent, les réactifs ECL doivent être ici présents en solution, dès le début de l'expérience, de façon à illuminer la surface de l'électrode avant l'arrivée des liposomes. Compte tenu de cela, l'utilisation de liposomes dissymétriques constitués de DOPG au niveau de leurs feuillets externes n'est donc plus appropriée. En effet, dans le chapitre précédent, nous avons montré que le co-réactif tri-propylamine (TPrA) déstabilise les feuillets fabriqués à partir de phospholipides chargés
négativement comme le DOPG. Une telle déstabilisation empêcherait donc les liposomes d'arriver intacts à la surface de l'électrode. Par contre, nous avions également montré que les phospholipides de type DOPC sont compatibles avec la TPrA (d'où leur utilisation au niveau du feuillet interne pour encapsuler la TPrA). Par conséquent, nous avons décidé de travailler avec des liposomes symétriques et constitués de DOPC au niveau des feuillets interne et externe des liposomes.

Comparé aux liposomes dissymétriques DOPG/DOPC, la fabrication des liposomes symétriques DOPC/DOPC est simplifiée pour deux raisons : 1) la première étape consistant à la fabrication de gouttes d'eau (contenant du tampon phosphate, PBS, et du sucrose) recouvertes d'une monocouche de phospholipides ne nécessite plus l'encapsulation du luminophore et du co-réactif (qui seront désormais présent en solution et non plus confinés à l'intérieur des liposomes), et 2) la seconde étape consistant à la fabrication du feuillet externe des liposomes implique le même type de phospholipide (i.e., DOPC) que celui utilisé au cours de la première étape.

La cellule électrochimique, quant à elle, est identique à celle fabriquée et décrite dans le chapitre précédent.

## 3. Imagerie – Résultats

### 3.1. En absence de liposomes

Pour commencer, il était important de vérifier, en absence de liposomes, que la présence du luminophore ([Ru(bpy)₃]²⁺) et du co-réactif (TPrA) au contact d'une électrode conductrice et transparente (ITO) génère bien de la lumière quand l'électrode est sous polarisation.

Comme le montre la Figure 59, l'imposition d'un potentiel suffisamment positif pour oxyder à la fois le luminophore et le co-réactif (+1.2 V vs. Ag/AgCl) génère de la lumière au niveau de la surface de l'électrode (cela est indiqué par la différence du niveau d'intensité entre la Figure 59 (a) avant et (b) après l'application du potentiel. Comme déjà étudié, dans ces conditions la diffusion de la lumière est restreinte à une épaisseur d'environ 10 µm et est liée à la vitesse de diffusion et la stabilité du radical TPrA électrogénéré ($t_{1/2} \approx 700$ µs sur des distances supérieures à 1 µm avec un coefficient de diffusion $D = 7,4 \cdot 10^{-6} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$) [91].
<figure><img src="image_69.png" /></figure>

Figure 59 : Surface d'une électrode en ITO de diamètre d = 0,8 mm non polarisée (a) et polarisée (b) à un potentiel de +1,2 V (vs. Ag/AgCl). Le milieu est une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et un pH = 7,54 contenant le luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹. la barre d'échelle : 200 µm.

Contrairement à l'approche décrite dans le chapitre précédent, les concentrations en luminophore et TPrA sont égales à 30 µM et 20 mM, respectivement, pour que l'extinction de la lumière soit plus efficace (dilution des réactifs plus efficace) et que le contraste soit plus important. En effet, une intensité de lumière trop élevée pourrait camoufler les objets déposés à la surface de l'électrode.

De façon intéressante, l'image de la Figure 59(b) montre que la lumière électrogénérée n'est pas homogène sur la totalité de la surface de l'électrode. Autrement dit, la présence de zones non illuminées témoigne d'une inhomogénéité de l'électrode sur l'aspect conductivité/transferert de charge. Ce type d'expérience est finalement un bon moyen de vérifier l'état de surface de notre électrode avant l'ajout de liposomes.

Du point de vue quantitatif, nous avons pu montrer que l'intensité ECL générée à la surface de l'électrode augmente très fortement et instantanément au moment de la polarisation de l'électrode puis diminue de façon proportionnelle à 1/t(1/2) en accord avec un régime diffusionnel de transport des réactifs (Figure 60). Cette évolution de la lumière en fonction du temps et de la polarisation de l'électrode (Off vs. On) est tout à fait analogue à une expérience de chronoampérométrie avec l'avantage de pouvoir quantifier le processus à partir d'images luminescentes obtenues par microscopie.
<figure><img src="image_70.png" /></figure>

Figure 60 : Intensité d'électrochimiluminescence en fonction du temps avant et après déclenchement du potentiel. L'expérience a été réalisée sur une surface d'électrode d'ITO de diamètre d = 0,8 mm. Le potentiel appliqué est +1,2 V (vs. Ag/AgCl). La solution contient le luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH = 7,54.

## 3.2. En présence de liposomes contenant une solution de sucrose

Après avoir vérifié la présence de lumière électrogénérée au moment de la polarisation d'une électrode en ITO, des liposomes géants, contenant une solution de sucrose à 0,7 M, sont ajoutés en haut de la cellule électrochimique et laissés à sédimenter. Comme montré sur les images prises à t = 191 et 450 secondes (Figure 61), l'arrivée de liposomes à la surface de l'électrode entraîne clairement une diminution de l'intensité lumineuse.
<figure><img src="image_71.png" /></figure>

Figure 61 : la figure représente une série d'images du signal électrochimiluminescent obtenu à la surface d'une électrode de travail en ITO (d=0,8 mm) suite à l'application d'un potentiel égal à 1,2V (vs. Ag/Ag/Cl) et en présence d'une solution de luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,54. Les liposomes contiennent une solution de sucrose à 0,7 mol.L⁻¹ dans du PBS. La figure montre l'apparition de la lumière suite à l'application du potentiel à 7 secondes, les tâches noires, sur l'image à 7 secondes, sont des défauts à la surface de l'électrode. A noter que l'enregistrement d'images en photoluminescence n'est pas pertinent ici car le luminophore est présent dans tout le milieu extérieur. Barre d'échelle : 200 µm. Ici, la région d'intérêt correspond à toute l'image.

Plus précisément, l'image réalisée à t = 191 secondes montre bien l'apparition de taches noires de forme circulaire indiquant que des liposomes sont bien entrés en contact avec la surface de l'électrode bloquant ainsi tout transfert électronique à cet endroit et empêchant ainsi l'émission de lumière par voie électrochimique. Cependant, en y regardant de plus près, et contrairement à ce qui avait été observé dans le chapitre précédent, les taches noires ne semblent pas adopter de forme définie. Cette déformation pourrait s'expliquer par une perméabilisation de la membrane des liposomes (comme vérifié par ailleurs) conduisant à une dilution des réactifs ECL présents à proximité de la ou des zones de fuite. Aux temps longs (t = 450 sec.) la surface de l'électrode n'est quasiment plus illuminée à cause des phénomènes conjoints d'accumulation de liposomes et de la dilution des réactifs ECL.

Suite à cette analyse qualitative, il était important de réaliser une étude quantitative en essayant de restreindre les images au niveau d'un liposome isolé.

La Figure 62(a) montre une planche d'images obtenue pour la même expérience mais focalisée sur une zone de l'électrode où est venu se déposer un unique liposome.
<figure><img src="image_72.png" /></figure>

Figure 62 : Série d'images obtenues en ECL (a) et courbes représentant la variation de l'intensité ECL en fonction du temps au niveau du cercle blanc (b) et sur toute l'image (c). L'expérience a été réalisée sur une électrode en ITO en présence d'un potentiel égal à 1,2 V (vs. Ag/Ag/Cl). Le milieu extérieur est composé d'une solution de luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et du co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans du PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,54. Les liposomes contiennent une solution de sucrose à 0,7 M dans le PBS.

Comparée à une analyse globale de la surface de l'électrode, l'analyse d'une zone plus restreinte et focalisée sur un seul liposome apporte des informations supplémentaires et pertinentes. Tout d'abord, et du point de vue qualitatif, l'arrivée d'un liposome à la surface de l'électrode (avant d'entrer en contact avec la surface de l'électrode) entraîne une augmentation de l'intensité ECL (comparer les images prises à t = 30 sec. et t = 70 sec.). Ce phénomène peut s'expliquer par un effet transitoire de confinement des réactifs ECL qui se retrouvent en quelque sorte piégés entre la surface de l'électrode et le liposome. Autrement dit, les réactifs ECL ne peuvent plus diffuser aussi librement qu'avant l'arrivée du liposome concentrant ainsi la lumière électrogénérée dans un espace restreint. Bien évidemment, ce phénomène disparaît dès que le liposome entre en contact avec la surface de l'électrode entrainant ainsi l'apparition d'une tache noire.
Comme observé précédemment, la taille de cette tache devient beaucoup plus grande que la
zone de contact entre le liposome et l'électrode (image à t = 85 sec.) suggérant une dilution des
réactifs ECL suite à une perméabilisation de la membrane du liposome. D'ailleurs, l'image
obtenue à t = 110 sec. montre clairement un retour de la lumière dans la zone ayant subie une
extinction de luminescence (comparez avec l'image prise à t = 70 sec.). Ce phénomène rend
compte d'une diffusion des réactifs ECL vers la zone préalablement diluée confirmant ainsi la
perméabilisation du liposome. Néanmoins, cette diffusion se retrouve bloquée à l'endroit où
s'est posé le liposome en accord avec la réapparition d'une tache noire circulaire.

Cette analyse qualitative a été suivie d'une analyse quantitative en prenant comme région
d'intérêt soit l'image totale (Figure 62(c)), soit le liposome représenté par le cercle en pointillés
blanc (Figure 62(b)).

Concernant l'image entière, l'évolution de l'intensité ECL suit parfaitement la description
qualitative esquissée précédemment : en absence de potentiel (quelques premières secondes),
l'intensité est nulle et après, elle augmente brutalement, au moment de l'application de
potentiel. Cette intensité diminue, ensuite, de façon proportionnelle à t<sup>-1/2</sup>, jusqu'à 70 secondes
(nous observons une légère augmentation vers t = 40 secondes qui correspond à un artéfact,
pendant l'expérience). Le rapprochement du liposome de la surface de l'électrode entraine une
augmentation de l'intensité ECL (vers 70 secondes) et la libération de la solution encapsulée
diminue cette intensité à cause d'une dilution locale des réactifs. Puis, nous remarquons une
ré-augmentation de l'intensité ECL entre 85 et 110 secondes qui est due à la diffusion du
luminophore et du co-réactif de la zone la plus concentrée vers la zone la moins concentrée.
Sur la Figure 62 (b), nous retrouvons la même allure que la Figure 62 (c) mais avec l'absence
de la ré-augmentation de l'intensité d'ECL et donc l'absence de la diffusion des réactifs,
comme observé sur l'image à t = 110 secondes, parce que cette diffusion est bloquée par les
phospholipides déposés à la surface de l'électrode.

3.3. Caractérisation de la dispersion de la solution encapsulée et de la diffusion des réactifs

A partir des résultats discutés dans le paragraphe précédent, nous remarquons qu’il est
possible, non seulement, d’étudier la dispersion de la solution libérée mais aussi la diffusion
des réactifs du milieu extérieur (le plus concentré) vers la solution libérée (milieu le moins
concentré).
La figure ci-dessous présente l'évolution typique de la distance apparente (δ) de la tache noire, due à l'extinction de la lumière générée dans le milieu, en fonction du temps et montre deux types de pente (croissante puis décroissante) qui marque un changement de sens de propagation de la tache noire et un changement de mode majoritaire de transport de la matière : la libération de la solution, suite au contact avec la surface de l'électrode polarisée, est traduite sur la Figure 63 par les points rouge qui correspondent à un régime convectif de transport de la matière dû aux mouvements de solution générés lors de l'événement d'ouverture, notamment sous l'effet de la différence de densité entre le glucose (solution extra-vésiculaire) et le sucrose (solution intra-vésiculaire). La deuxième partie de la courbe, représentée par les points bleus, montre une pente décroissante plus faible que la première qui indique le passage des réactifs du milieu le plus concentré vers le milieu le moins concentré selon un régime essentiellement diffusionnel. La valeur de cette pente correspond bien à celle attendue pour la diffusion de petites molécules dans les mêmes conditions.

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

Figure 63 : Variation typique de la distance apparente δ² de la propagation de la tâche noire due à la dilution des réactifs du milieu extérieur (une solution de luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹ et du co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹ dans du glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH = 7,54) en fonction du temps.
La solution encapsulée est une solution de sucrose à 0,7 M dans du PBS. Le liposome étudié sur cette figure correspond au liposome montré sur la Figure 62.

### 3.4. En présence de liposomes contenant un quencher

#### 3.4.1. Comment fonctionne un quencher

L'extinction ou l'atténuation du signal lumineux généré au cours de la réaction d'électrochimiluminescence est dû à une désactivation de l'état excité du luminophore qui peut se dérouler selon plusieurs manières dont nous notons l'utilisation d'une molécule chimique appelée « quencher ». Parmi les quencher les plus utilisés dans la littérature, il y a le ferrocène et ses dérivés qui pourraient réagir selon un processus de transfert d'énergie ou de transfert d'électron pour désactiver l'état excité du complexe de ruthénium [92], [93].

Ces molécules de ferrocène ont montré une meilleure efficacité de quenching par rapport aux autres molécules utilisées habituellement [94].

Dans ce chapitre, le dérivé du ferrocène utilisé est le ferrocène méthanol (FcMeOH) qui, à une concentration de l'ordre de 500 µM, est capable d'éteindre plus de 99% de l'intensité d'ECL produite dans le milieu réactionnel [94].

Cette molécule agit sur la molécule de ruthénium à l'état excité $Ru(bpy)_{3}^{2+*}$ selon un mécanisme de transfert d'électron comme présenté ci-dessous : [95]

$$FcMeOH \rightarrow FcMeOH^{+} + 1 \text{ é} \qquad (37)$$

$$FcMeOH^{+} + Ru(bpy)_{3}^{2+*} \rightarrow FcMeOH + Ru (bpy)_{3}^{3+} \qquad (38)$$

#### 3.4.2. Expérience et résultat

Dans cette partie, les liposomes sont aussi symétriques DOPC/DOPC et la solution encapsulée contient du sucrose à 0,7 M ainsi que le quencher FcMeOH à 500 µM. Le milieu extérieur est toujours composé d'une solution de glucose contenant le luminophore $[Ru(bpy)_{3}^{2+}]$ à 30 µM et le co-réactif TPRA à 20 mM. La cellule électrochimique, décrite précédemment, est déposée sur un microscope inversé et les images sont enregistrées avec une caméra EM-CCD. Les résultats obtenus sont illustrés dans la figure ci-dessous :
<figure><img src="image_74.png" /></figure>

Figure 64 : Variation de l'intensité ECL en fonction du temps sur une électrode dITO en présence de potentiel (1,2 V vs. Ag/AgCl). Le milieu extérieur est composé du luminophore [Ru(bpy)₃]²⁺ à 30.10⁻⁶ mol.L⁻¹, du co-réactif TPrA à 20.10⁻³ mol.L⁻¹, et de glucose à 0,7 mol.L⁻¹ dissout dans une solution de PBS à 1.10⁻² mol.L⁻¹ et pH= 7,54. Les liposomes contiennent une solution de sucrose à 0,7 mol.L⁻¹ dans le PBS ainsi que le quencher FcMeOH à 5.10⁻⁴ mol.L⁻¹. La zone d'intérêt correspond à la totalité de l'image. Barre d'échelle : 120 µm.

La Figure 64 représente la variation de l'intensité ECL en fonction du temps. Elle montre d'abord l'augmentation de cette intensité suite à l'application du potentiel qui permet de générer un signal électrochimiluminescent. Ce dernier diminue ensuite selon un régime diffusionnel ($t^{(1/2)}$). Puis, l'arrivée d'un liposome à la surface de l'électrode entraine une deuxième diminution (vers 140 secondes) qui indique la libération de la solution encapsulée. Cette diminution est due non seulement à une dilution locale des réactifs mais aussi à un effet du « quencher » encapsulé dans le liposome. D'ailleurs, l'intensité ECL ne ré-augmente pas, comme dans le paragraphe précédent, mais elle continue à diminuer parce que la lumière apportée par la diffusion inverse des réactifs est éteinte par le FcMeOH.
## IV. Conclusion

Nous avons réussi à mettre en évidence l'événement de l'ouverture de liposomes par l'électrochimiluminescence négative qui est, contrairement à la première approche, basée sur la disparition de la lumière générée par ECL. Par dilution des réactifs ou par désactivation de l'état excité (quencher), l'ECL négative donne des informations sur l'événement d'ouverture de liposomes qui sont en bon accord avec l'approche positive de cette méthode : nous avons retrouvé une valeur de coefficient de diffusion très proche de la valeur déterminée dans le chapitre précédent et qui est en bonne adéquation avec celle attendue pour la diffusion d'une petite molécule.

Après le développement des deux approches de détection de la perméabilisation de la membrane lipidique, notre objectif suivant a été d'utiliser notre approche pour caractériser des phénomènes d'intérêt biologique comme la détection de la perméabilisation membranaire par des peptides ou pour suivre et contrôler des réactions enzymatiques. Cela sera développé dans les deux prochains chapitres.
<figure><img src="image_75.png" /></figure>
# Quatrième chapitre –
## Imagerie ECL de la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par des peptides anti-microbiens ou pénétrants
<figure><img src="image_76.png" /></figure>
# 4- Quatrième chapitre – Imagerie ECL de la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par des peptides anti-microbiens ou pénétrants

## I. Introduction et contexte

Les deux chapitres précédents développaient la méthodologie permettant d'imager par ECL la perméabilisation de membranes de liposomes géants mis au contact d'une électrode polarisée. Ce chapitre, ainsi que le suivant, portent sur la valorisation de cette approche ECL au travers d'applications bio-analytiques. Ainsi, dans ce quatrième chapitre, nous explorons l'effet d'une incubation de peptides décrits comme actifs vis-à-vis de la perméabilisation de membranes (AMPs et CPPs) sur des liposomes géants contenant les réactifs de l'ECL, l'émission de lumière au contact de l'électrode en ITO constituant la signature de l'efflux du contenu intra-vésiculaire vers le milieu extérieur.

Les peptides qui interagissent avec les membranes, désignés dans la littérature par la terminologie « membrane active peptides », constituent une classe de peptides qui « perturbent » localement les membranes lipidiques, pouvant *in fine* induire la rupture (lyse) de la membrane ou simplement sa restructuration transitoire pour permettre la translocation du peptide au travers de la bicouche lipidique [96]. Le passage d'espèces chargées (cationiques pour les peptides) au travers de membranes lipidiques a été considérée comme improbable jusqu'à la fin des années 1980. La membrane plasmique était en effet considérée comme infranchissable pour toutes les molécules hydrophiles ou les ions. Le caractère hydrophobe des chaînes grasses des phospholipides était supposé empêcher tout passage passif, induit par des gradients de concentration notamment, de composés tels que des peptides ou des oligonucléotides. Réciproquement, il était admis que plus une molécule est hydrophobe, plus elle passe facilement au travers une membrane.

Pourtant, en 1988, puis en 1991, les propriétés de pénétration de deux protéines (Tat et Antennapedia) ont été mises en évidence expérimentalement [97]–[99]. Ces résultats ont profondément remis en cause le quasi-dogme de l'imperméabilité membranaire aux ions, en particulier lorsqu'il a été démontré que l'internalisation n'impliquait pas d'interaction
spécifique avec un récepteur membranaire [100]. L'identification des séquences nécessaires et
suffisantes pour autoriser l'internalisation de ces protéines fut non moins surprenantes
puisqu'il s'agit de séquences polycationiques, la Pénétratine et Tat (Pénétratine:
RQIKIWFQNRRMKWKK, Tat : YGRKKRRQRRR, les résidus cationiques (R = arginine,
K=lysine) sont en rouge [101]. La Pénétratine et Tat jouent donc le rôle de vecteurs naturels
pour ces protéines. Les peptides constitués par ces seules séquences, les CPP ("Cell Penetrating
Peptides", en français "les peptides pénétrants") sont aussi capables d'induire leur propre
internalisation.

Depuis, de nombreux CPP ont été identifiés ou synthétisés. Généralement, les CPP sont de
petits peptides constitués de 30 acides aminés ou moins et sont capables de franchir la
membrane cellulaire à des concentrations de l'ordre du micromolaire, in vivo ou in vitro, sans
provoquer la rupture de la membrane. Cette propriété fait des CPP des candidats de choix
pour la vectorisation ciblée de molécules et de nanoparticules [102], [103]. Un exemple
représentatif de vectorisation d'un agent thérapeutique grâce à une association entre un
peptide et un liposome contenant le médicament a été décrit pour le paclitaxel®, l'association
peptide-liposome pouvant franchir la barrière hémato-encéphalique pour traiter des cellules
cancéreuses de patients atteints de gliome [104]. La délivrance d'acides nucléiques dans le
milieu intracellulaire, tels des plasmides (thérapie génique) ou de petits ARN interférents
(siRNA), est également facilitée par l'association avec des peptides [105]. Cette stratégie
consiste à intégrer dans les cellules des séquences de nucléotides modulant ou supprimant
l'expression de gènes de protéines responsables de la maladie.

Comme les CPP, les peptides anti-microbiens (AMP pour "Anti-Microbial Peptide" en anglais) constituent une classe de peptides cationiques possédant une grande affinité pour les membranes. Les AMP sont notamment envisagés en tant qu'alternative aux antibiotiques du fait du développement de résistances des bactéries à ces derniers. Contrairement aux CPP, les AMP interagissent avec les membranes chargées négativement pour en modifier localement la structure, générant des défauts ou des pores et pouvant conduire *in fine* à la lyse des bactéries [106]–[110].

Cette capacité de certains peptides à rendre les membranes lipidiques perméables ou poreuses
en fait des promoteurs très intéressants d'électrochimiluminescence dans des systèmes où les
liposomes encapsulent les réactifs de l'ECL et que l'on incube dans un milieu contenant ces peptides actifs. Dans ce contexte, nous nous sommes demandés si l'approche méthodologique initiée et décrite dans le chapitre 2 permet de mettre en évidence et surtout d'imager des évènements de perméabilisation de la membrane lipidique en présence de peptides actifs (CPP ou AMP) vis-à-vis des membranes.

## II. Propriétés structurales des peptides antimicrobiens et interactions avec les membranes lipidiques

### 1. Aspects structuraux

Les peptides antimicrobiens comprennent entre 12 et 50 acides aminés. La structure secondaire issue du repliement de cet enchainement peptidique sur lui-même voit notamment s'établir des liaisons hydrogène entre un groupement carbonylé C=O et un groupement amide N-H. Les structures secondaires rencontrées sont l'hélice α et le feuillet β. L'hélice α est caractérisée par des liaisons hydrogène parallèles à l'axe de l'hélice entre un acide aminé en position « n » et un consécutif espacé à la position « n+4 ». Dans cette structure, les résidus sont orientés vers l'extérieur de l'hélice. Le repliement en feuillet β est lui aussi une conséquence de liaisons hydrogène établies entre la chaîne peptidique d'un segment donné et celle d'un segment voisin pour construire une forme en « accordéon ». Dans ce type de structure, nous parlons de feuillet β parallèle si les segments de la chaîne peptidique vont dans le même sens et de feuillet β antiparallèle si les segments sont de sens opposés.

Pour ce qui relève des interactions intermoléculaires, qui gouvernent à la fois les associations entre peptides et les associations peptide-lipide, la distribution des charges portées par certains acides aminés le long de la chaîne peptidique doit être raccordée à la structure secondaire des peptides. En effet, les peptides antimicrobiens sont cationiques à pH physiologique du fait la protonation des acid.es aminés azotés (arginine, histidine, lysine). Ces charges peuvent s'engager dans des interactions de nature électrostatique avec les phospholipides possédants des têtes polaires chargées négativement [111]. Le caractère potentiellement amphiphile des peptides cationiques découle de la distribution des charges : les peptides amphipathiques primaires voient les résidus cationiques concentrés d'un seul côté de la chaîne peptidique, l'autre extrémité étant plus hydrophobe et constituée d'acides aminés neutres. Sous forme agrégée, cette première classe de peptide peut former des micelles.
Les amphipathiques secondaires génèrent des régions cationiques et d'autres hydrophobes à l'issue de leur repliement en feuillet β. Cette amphipathicité constitue le socle de la séquence d'interactions aboutissant soit à la perméabilisation de la membrane lipidique, soit à la translocation du peptide.

## 1.1. Mécanismes conduisant à la formation de pores membranaires

Les modes d'internalisation de peptides au sein de cellules se répartissent entre des processus qualifiables d'actifs et d'autres passifs. Les premiers mettent en jeu des étapes de reconnaissance spécifique au niveau de la membrane et mobilisent la « machinerie » cellulaire, qui met en jeu des étapes où des métabolites riches en énergie sont dégradés (par exemple l'ATP). Les seconds suivent les gradients de potentiel chimique et électrochimique et peuvent être modélisés sur des liposomes, sans assistance énergétique supplémentaire. Les modes actifs sont pour l'essentiel associés à l'endocytose de vésicules lipidiques ou à la macropinocytose (invagination de la membrane). Les modes passifs mettent tous en jeu une étape préliminaire d'association électrostatique entre le peptide et la tête polaire du lipide. Ensuite, les mécanismes diffèrent en fonction de la nature des peptides, leur concentration, entre autres conditions initiales. La figure suivante schématise les trois grands mécanismes gouvernant la perméation de membranes par des peptides classés dans la catégorie des AMP :
<figure><img src="image_77.png" /></figure>

Figure 65 : Les différents mécanismes qui expliquent comment un peptide antimicrobien peut déstabiliser la membrane lipidique.

Les trois modèles mécanistiques majeurs décrits pour expliquer la formation de pores dans les membranes lipidiques sont : (i) le modèle des pores en tonneaux ("barrel-stave model"), (ii) le modèle des pores toroïdaux ("toroidal-pore model"), et (iii) le modèle du tapis ("carpet-like model"). [112]–[114].

Dans le modèle en tonneaux ("barrel-stave model"), les peptides vont se positionner perpendiculairement à la membrane de façon à former des pores ayant l'apparence de tonneaux (ici, les peptides représentent les parois du tonneau) [112]. Dans ce modèle, le caractère amphipathique des peptides est essentiel pour l'interaction avec la membrane. Ainsi, la face externe du tonneau (i.e. du peptide), elle-même hydrophobe, est orientée vers les chaînes hydrophobes de la membrane tandis que la face interne hydrophile est orientée vers le centre du pore qui délimite un compartiment aqueux [115]–[117]. A noter que le nombre de résidus (acides aminés) pour « perforer » la membrane dépendra de la structure secondaire du peptide. Ainsi, 22 résidus seront nécessaires pour les peptides adoptant une structure en hélice α, alors que 8 acides aminés suffisent pour les peptides ayant une structure en feuilllets [113].
Les AMP connus pour former des pores selon ce mécanisme sont la pardaxine [118]–[120], l’alaméthicine et la dermcidine [121].

Le modèle du tapis ("carpet-like model") a été suggéré initialement pour décrire le mécanisme d'action de la dermaseptine S [122] et a ensuite été envisagé pour expliquer le mode d'action de la cécropine P1 [123]. Ce modèle est basé sur une disposition rigoureusement parallèle des peptides par rapport à la membrane [124]. En effet, les AMP agissant suivant ce modèle vont commencer par se déposer parallèlement à la bicouche phospholipidique en disposant leurs acides aminés hydrophobes en direction des chaînes lipidiques de la membrane et leurs acides aminés hydrophiles au contact des têtes polaires des phospholipides (Figure 65) [125]. Les peptides s'enfouissent partiellement dans la membrane et ne sont pas en contact avec le cœur hydrophobe de la bicouche. Après un accroissement considérable de la concentration en peptides (concentration seuil), la membrane est recouverte d'amas peptidiques à l'apparence d'un tapis provoquant des perturbations de l'agencement des phospholipides [116], [123], [126]–[128]. Cette altération engendre des perforations de la membrane qui induisent la libération des métabolites du cytoplasme puis une rupture complète de la membrane [112], [124].

Le modèle des pores toroïdaux ("toroidal-pore model") présente un mécanisme ressemblant à celui du modèle en tonneau à la différence que la membrane se retrouve courbée au niveau du pore. Dans ce cas de figure, les peptides sont en permanence liés aux têtes hydrophiles des phospholipides. [129] Autrement dit, les phospholipides de la bicouche s'intercalent avec les structures peptidiques dans le canal transmembranaire et font donc partie intégrante du pore (Figure 65) [112]. Dans la première étape de ce modèle, les peptides se lient à la membrane avec une orientation parallèle à la bicouche phospholipidique [130]. Puis, ils interagissent via leurs domaines hydrophobes ce qui induit un déplacement des têtes polaires des phospholipides provoquant de ce fait une courbure de la membrane. Lorsque la concentration seuil est atteinte, les peptides vont s'auto-assembler puis s'orienter perpendiculairement à la membrane et s'insérer à l'intérieur de celle-ci aboutissant ainsi à la formation des pores toroïdaux [116]. L'intérieur du pore est alors constitué du domaine polaire des structures peptidiques et des têtes polaires des phospholipides [112], [129], [131]. A noter que la charge peptidique diminue la stabilité des pores toroïdaux en raison de la répulsion électrostatique. Les temps de demi-vies des pores toroïdaux diminuent avec l'augmentation du nombre de
résidus chargés positivement [112], [116], [132]. La magainine 2 [133]–[135] ainsi que la
mélittine [129], [136] sont deux AMP typiques formant des pores toroïdaux. A noter que la
mélittine est l’archétype des AMP ; c’est donc cet AMP que nous avons sélectionné pour cette
étude.

2. Approches/Méthodologies décrites pour l'étude de la perméabilisation membranaire de liposomes géants par des peptides anti-microbiens

De nombreuses techniques biophysiques ont été développées pour étudier la perméabilisation des membranes par les AMP [115]. La fluorescence a été utilisée pour mettre en évidence la perméabilisation de la membrane par les peptides antimicrobiens et dimensionner les pores formés par une mesure de fuite d'une sonde fluorescente libérée à travers ces pores [137]–[139]. Le dichroïsme circulaire est une autre technique biophysique capable de déterminer l'orientation et les structures secondaires des peptides (hélice α, feuillet β...) grâce à une absorption différente de la lumière en fonction de la chiralité et de la structure secondaire d'un peptide. Dans le même contexte, la spectroscopie RMN du solide a été utilisée pour analyser en détail l'interaction phospholipide-peptide et la pénétration des peptides dans la membrane lipidique. La diffractométrie de neutrons, la diffraction des rayon X et la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier sont aussi des méthodes d'analyse qui ont permis d'analyser le phénomène de la perméabilisation membranaire par les AMPs.

L'emploi de ces techniques se fait généralement en présence d'architectures
phospholipidiques modèles comme les vésicules unilamellaires grandes / géantes (LUV/GUV
pour "Large Unilamellar Vesicles" et "Giant Unilamellar Vesicles" en anglais) ou les bicouches
lipidiques planes supportées. Néanmoins, l'utilisation de vésicules géantes est
particulièrement intéressante car leur grande taille permet de les manipuler et de les visualiser
aisément par microscopie optique [140]–[143].

Puisque mon travail met en jeu des liposomes géants, je vais maintenant présenter les principales approches utilisées actuellement pour d'étudier leur perméabilisation par des peptides antimicrobiens.

L'approche la plus populaire est la méthode dite de "suspension". Cette méthode, consiste à suspendre des vésicules géantes (GUV) dans une solution contenant une sonde fluorescente
hydrosoluble et imperméable à la membrane [144]–[148]. En présence d'un peptide actif vis-à-
vis de la membrane, la fluorescence du contenu vésiculaire évolue et la fluorescence à
l'extérieur des vésicules est alors mesurée et analysée par microscopie confocale tout au long
du processus de perméabilisation. Une alternative consiste à encapsuler la sonde fluorescente
hydrosoluble à l'intérieur des GUV. Dans ce cas, c'est la fuite de la sonde fluorescente qui est
analysée via la perte de fluorescence à l'intérieur de la vésicule. Là encore, l'intensité de la
fluorescence des GUV est observée en continu tout au long du processus par contraste de
phase et par microscopie confocale de fluorescence [149]–[154]. Très récemment, la fuite des
GUV a été étudiée en utilisant une méthode originale appelée "photo-voltage" qui consiste à
suivre l'évolution temporelle des impulsions de charge/décharge des électrons photoinduits
suite à la perméabilisation de la membrane par le peptide Tat et la détection du passage de la
calcéine par les pores formés [155]. Cette approche a également été combinée à des
observations par microscopie à fluorescence pour imager la fuite de GUV.

Dans ce contexte, l'approche méthodologique développée dans le chapitre 2 (basée sur l'ECL positive) peut se révéler intéressante et complémentaire des approches basées sur la fluorescence compte tenu notamment de la meilleure sensibilité de l'électrochimiluminescence.

Les mécanismes mis en jeu lors de la perméabilisation de liposomes géants (GUV) sont très
difficiles à rationaliser. En effet, les processus dépendent de la contribution de nombreux
paramètres expérimentaux comme la nature et la concentration du peptide, la composition
lipidique, la température, la force ionique, le pH, etc... Malgré tout, les GUV ont été très
utilisées pour étudier les processus mécanistiques impliqués dans leur perméabilisation au
contact d'AMP tels que la magainine 2, la mélittine, le LL37, ou la lactoferricine B [153], [156]–
[159]. Ces études soulignent le caractère stochastique de la perméabilisation, associé à la fuite
de la sonde fluorescente (initialement présente à l'intérieur des GUV). Concrètement, il est
impossible de définir à quel moment et à quel endroit de la GUV la fuite aura lieu. Malgré cela,
un évènement de perméabilisation se matérialise par une vésicule qui se vide rapidement (1 à
2 secondes).

Puisque la mélittine est un AMP typique, nous avons donc décidé de focaliser notre travail sur
la perméabilisation de membranes de liposomes géants par ce peptide antimicrobien.
La mélittine, qui est le principal composant du venin de l'abeille européenne, est un peptide linéaire cationique composé de 26 acides aminés. Elle est souvent utilisée comme système modèle pour étudier la structure, le repliement et la fonction des peptides et des protéines dans les membranes [160]. Elle a également fait l'objet d'études précliniques en tant qu'agent anticancéreux pour ses effets lytiques étendus sur plusieurs types de tumeurs [161], [162]. Malgré de nombreuses recherches, les mécanismes de perméabilisation membranaire déclenchés par la mélittine font toujours débat car ils peuvent être multiples [163], [164]. Dans des conditions spécifiques, il a été suggéré que la mélittine puisse s'assembler en faisceaux hélicoïdaux transmembranaires stables pour former des pores [129]. Cependant, dans les bicouches synthétiques, la mélittine adopte généralement une orientation d'équilibre qui est parallèle à la surface de la membrane [165], [166]. Cela conduit à une perméabilisation transitoire des membranes avec un pic de fuite survenant assez rapidement après l'ajout du peptide (< 1 minute). Il est intéressant de noter qu'après cette "explosion" initiale, la fuite ralentit ou s'arrête généralement [163], [164], [167], [168].

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Figure 66 : séquence de la mélittine (a) et un dessin schématique en 3d (b) [169]</figcaption></figure>
### III. Imagerie par électrochimiluminescence de la perméabilisation membranaire de liposomes géants par un peptide antimicrobien : la mélittine

#### 1. Choix des conditions expérimentales

Afin d'imager par électrochimiluminescence la perméabilisation de liposomes géants par la mélittine, il était important de définir les conditions expérimentales appropriées. Pour rappel, la stratégie décrite dans le chapitre 2 consiste à encapsuler le luminophore ([Ru(bpy)₃]²⁺) et le co-réactif (TPrA) de façon à générer de la lumière en cas de perméabilisation membranaire via l'oxydation des réactifs à la surface de l'électrode.

Le choix des phospholipides a été dicté non seulement par leur capacité à maintenir les liposomes imperméables tant qu'ils ne sont pas en contact avec le peptide antimicrobien (AMP), mais aussi pour leur pertinence dans l'exploration de la perméabilisation membranaire par les AMP [170], [171]. Comme montré dans le chapitre 2, l'utilisation d'un phospholipide zwitterionique de la série des phosphocholines, tel que le DOPC, sur le feuillet interne est nécessaire pour former des liposomes stables dont les lipides n'interagissent pas avec la tri-propylamine (TPrA) à l'intérieur des liposomes. En second lieu, considérant que les AMP sont globalement chargés positivement et que les principales forces motrices mises en jeu lors de l'interaction peptides/lipides sont l'attraction électrostatique et l'interaction hydrophobe [127], l'utilisation de DOPG chargé négativement sur le feuillet externe est apparu comme pertinent.

Cependant, comme nous l'avons montré dans le chapitre 2, les liposomes asymétriques de type DOPCint/DOPGext éclatent au contact avec une surface polarisée [172]. L'objectif ici étant la caractérisation de la perméabilisation de la membrane par la mélittine, il était donc crucial de s'affranchir de tout effet de l'électrode sur la stabilité de la membrane. Cet écueil a été contourné avec succès en couvrant la surface de l'électrode en ITO avec de la poly-L-lysine. Dans ces conditions, et comme montré en Figure 67, les liposomes se sont révélés être stables pendant au moins 30 minutes.
<figure><img src="image_80.png" /></figure>

Figure 67 : Images photoluminescentes d'un liposome géant asymétrique composé de DOPG et de DOPC sur ses feuillets externe et interne, respectivement. Le liposome contient les réactifs ECL ([Ru(bpy)₃]²⁺ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹) et TPrA (0,1 mol.L⁻¹)) et repose sur une surface en ITO recouverte de poly-L-lysine polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. Images enregistrées à t = 5 min. et t = 30 min. de polarisation. Ces images de microscopie obtenues en photoluminescence (PL) révèlent clairement la localisation du complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ à l'intérieur du liposome avec une lumière excitatrice à λex = 455 nm.

La présence de la poly-L-lysine à la surface de l'électrode polarisée permet bien de stabiliser les liposomes géants. Il nous restait à nous assurer qu'en cas de perméabilisation membranaire par la mélittine, la présence de poly-lysine ne bloquera pas les processus d'oxydation du luminophore et du co-réactif. Pour réponde à ces questions, nous avons comparé des études réalisées par voltamétrie cyclique sur des électrodes en ITO recouvertes ou non de poly-L-lysine.

La Figure 68 et la Figure 69 montrent les voltamogrammes obtenus pour le luminophore seul et en présence du co-réactif sur une électrode en ITO non modifiée (courbe bleue) ou modifiée par la poly-L-lysine (courbe rouge). Il apparaît que la présence du polymère ne bloque pas les processus rédox des réactifs ECL (allure et intensité du processus faradique quasi-identiques dans les deux cas).
<figure><img src="image_81.png" /></figure>

Figure 68 : Voltampérogramme cyclique d'une solution de $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ à $2,5 \cdot 10^{-4}$ mol.L$^{-1}$ dans une solution de glucose à $0,7$ mol.L$^{-1}$, dissout dans du PBS à $1.10^{-2}$ mol.L$^{-1}$ et pH= 7,5. L'expérience est réalisée sur une électrode de travail en ITO, couverte (rouge) et non-couverte (bleu) par de la poly-L-lysine, polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. La vitesse de balayage égale à 50 mV.s$^{-1}$.

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

Figure 69 : Voltampérogramme cyclique d'une solution de $[Ru(bpy)_3]^{2+}$ à $2,5 \cdot 10^{-4}$ mol.L$^{-1}$ et tri-n-propylamine à $0,1$ mol.L$^{-1}$ dans une solution de glucose à $0,7$ mol.L$^{-1}$, dissout dans du PBS à $1.10^{-2}$ mol.L$^{-1}$ et pH= 7,5. L'expérience est réalisée sur une électrode de travail en ITO, couverte (rouge) et non couverte (bleu) par de la poly-L-lysine, et polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. La vitesse de balayage égale à 50 mV.s$^{-1}$.
De la même façon, l'intensité ECL générée à partir d'une solution contenant le luminophore ([Ru(bpy)₃]²⁺ = 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹) et le co-réactif ([TPrA] = 0,1 mol.L⁻¹) n'est que très légèrement affectée. Comme montrée dans la Figure 70, une perte de luminescence d'environ 10 % est observée en présence du polymère indiquant que ce dernier ne forme pas un film opaque à la surface de l'électrode.

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

Figure 70 : Variation de l'intensité ECL en fonction du temps d'un mélange comprenant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹), la tri-*n*-propylamine (0,1 mol.L⁻¹), et du glucose (0,7 mol.L⁻¹), dissouts dans du PBS (10 mmol.L⁻¹, pH= 7,5). L'expérience est réalisée sur une électrode de travail en ITO avec un balayage de potentiel de -0,1 V à +1,6 V vs. Ag/AgCl, couverte (rouge) et non-couverte (bleu) par de la poly-L-lysine.

Pour conclure cet état des lieux sur la possibilité d'observer de l'ECL dans une configuration d'électrode permettant de stabiliser les GUVs, l'utilisation de liposomes géants de type DOPC/DOPG et d'une électrode en ITO recouverte de poly-L-lysine semble robuste et appropriée pour étudier la perméabilisation de membranes par la mélittine.
2. Combinaison de photoluminescence (PL) et d'électrochimiluminescence (ECL) pour imager la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par la mélittine

Après s'être assuré que la poly-L-lysine permet d'éviter une électroporation des liposomes et n'empêche pas de générer un signal ECL, nous avons étudié la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par la mélittine. Comme dans le Chapitre 2, l'approche ECL a été combinée à la photoluminescence de façon à obtenir des informations complémentaires sur l'état du liposome avant et pendant sa perméabilisation (localisation, forme géométrique, dynamique de fuite). Malheureusement, l'ampérométrie n'est pas ici une méthode quantitative du fait d'efflux trop faibles et/ou éloignés de la surface de l'électrode conduisant ainsi à des courants faradiques non-significatifs par rapport au courant capacitif.

Du point de vue expérimental, les liposomes géants sont tout d'abord ajoutés dans la cellule électrochimique (la même que celle utilisée dans les chapitres précédents). Après sédimentation des liposomes à la surface de l'électrode en ITO recouverte de poly-L-lysine, la mélittine est alors ajoutée tout en faisant attention à garder constante l'osmolalité de la solution (environ 1000 mosol.kg⁻¹). Les premières expériences ont été réalisées à une concentration de mélittine de 10 µM (concentration finale dans la cellule électrochimique). Dans ces conditions, les processus de perméabilisation des membranes des liposomes ont été observés, à la fois par photoluminescence (PL) et par ECL (acquisition dans la Figure 71), après seulement quelques dizaines de secondes suivant l'ajout des peptides. La Figure 72 (a) montre deux planches d'images ECL et PL enregistrées avant et pendant la perméabilisation de la membrane d'un liposome (cf. liposome situé dans le carré blanc en pointillés).
<figure><img src="image_84.png" /></figure>

Figure 71 : Protocole d'acquisition échantillonnée utilisé pour l'enregistrement simultané des données en électrochimie, ECL et photoluminescence. La figure correspond à une durée totale d'acquisition de 2 secondes.

Comme expliqué dans le deuxième chapitre de ce manuscrit, l'enregistrement des images est réalisé d'une manière échantillonnée qui donne la possibilité d'avoir deux types d'images : des images en photoluminescence obtenues grâce à la présence d'une diode clignotante allumée que pendant 100 ms par seconde et des images collectées quand cette diode est éteinte.
<figure><img src="image_85.png" /></figure>

Figure 72 : (a) Superposition d'images ECL (en haut) et PL (en bas) montrant la perméation d'un liposome DOPC/DOPG par la mélittine à 1.10⁻⁵ mol.L⁻¹. Le liposome contenant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺ à 2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹ et le co-réactif TPrA à 0,1 mol.L⁻¹ repose sur une électrode en ITO polarisée (+1,2 V vs. Ag/AgCl) et modifiée par de la poly-L-lysine. Pour éviter tout chevauchement entre les deux types d'informations visuelles, les images ECL et PL présentent une différence de temps d'acquisition initiale de 500 ms. La mise au point a été faite à la surface de l'électrode ITO pendant l'imagerie ECL et PL. Les carrés blancs en pointillés dans les images PL et ECL représentent la région d'intérêt (ROI) typique prise en compte pour les analyses quantitatives des intensités correspondantes. Barre d'échelle : 100 µm. (b) Évolution des signaux PL (courbe bleue) et ECL (courbe rouge) obtenus en fonction du temps pour un seul liposome [présenté en (A)] perméabilisé par la mélittine.

Avant l'action des peptides sur la membrane (t < 50 s), les images obtenues en PL montrent un liposome intact. En accord avec cela, les images correspondantes de la planche ECL sont « noires », entendez sans détection d'aucune émission lumineuse.
Pour 50 < t < 69 secondes, un signal ECL est détecté en bas de l'image, révélant une fuite des réactifs ECL depuis l'intérieur du liposome. Ceci est confirmé par les images PL qui montrent, de façon concomitante, une forte décroissance de la fluorescence suivie d'un déplacement du liposome dans la direction opposée à la fuite (c'est-à-dire vers le haut de l'image). Ce mouvement peut être expliqué par un effet de propulsion du liposome consécutif à la libération d'une partie du contenu vésiculaire vers l'extérieur.

A t = 110 secondes, le liposome est redevenu immobile et sa taille a fortement diminué en accord avec la fuite observée. L'absence de signal ECL montre que l'étape de libération du contenu vésiculaire est terminée.

A ce stade, il est important de noter que ce comportement montrant une "perméabilisation transitoire" est assez atypique. En effet, dans la plupart de nos expériences nous observons une fuite totale et complète aboutissant à une disparition de l'image du liposome en photoluminescence.

Ces observations qualitatives, tant en ECL qu'en PL, indiquent clairement une perméabilisation de la membrane par la mélittine ajoutée, en accord avec l'apparition d'un signal ECL résultant de la libération et de l'oxydation du contenu vésiculaire. Cela confirme i) que la couche de polylysine déposée sur l'électrode ITO permet le transfert d'électrons entre le luminophore/co-réactif libéré et l'électrode et ii) que la perméabilisation de la membrane est bien générée par la mélittine.

Nous avons reporté les intensités PL et ECL en fonction du temps en prenant comme zone d'intérêt celle délimitée par les tirets blanc pointillés (Figure 72 (a)). Comme le montre la Figure 72 (b), la combinaison des deux signaux permet un suivi complet de la perméabilisation d'un seul liposome et de la libération de son contenu. Ainsi, à t = 50 sec., la perméabilisation du liposome conduit tout d'abord à une augmentation très rapide (quelques secondes) du signal ECL alors que dans le même temps l'intensité du signal PL diminue en accord avec une fuite du liposome. Puis, l'intensité des deux signaux diminue avec la même cinétique confirmant que les deux réponses proviennent bien du même liposome. En outre, la durée et la forme du signal sont similaires pour l'ECL et le PL en accord avec le fait que ces deux types d'émission de lumière dépendent des caractéristiques du même luminophore (concentration, diffusion). On remarque également que les signaux lumineux diminuent pendant plusieurs
dizaines de secondes (environ 30 secondes), fenêtre de temps en accord avec celles observées dans d'autres études [88] révélant une fuite plutôt lente. L'ouverture brutale (éclatement) des liposomes observés sur une électrode non modifiée (Chapitre 2) permettait une mesure ampérométrique et une quantification du contenu vésiculaire, ce que n'autorise pas le flux trop faible déclenché par la mélittine.

Bien que la fuite observée sur la Figure 72 soit incomplète dans la fenêtre de temps explorée (arrêt de la fuite à t = 110 sec.), le liposome nouvellement formé s'est mis à fuir de nouveau environ deux minutes plus tard suite, vraisemblablement, au processus de perméabilisation par de nouveaux peptides arrivés au contact de la membrane. Les images PL et ECL des deux fuites successives se produisant sur le même liposome sont rassemblées sur la Figure 73.

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

Figure 73 : (a) Combinaison d'imagerie ECL (en haut) et PL (en bas) montrant deux processus successifs de perméation d'un liposome unique par la mélittine en fonction du temps. Dans ce cas, la région d'intérêt (ROI) correspond à l'image entière. Barre d'échelle : 100 µm. (b) Évolution de l'intensité PL (courbe bleue) et ECL (courbe rouge) en fonction du temps pour un seul liposome [présenté en (a)]. Mêmes conditions expérimentales que dans la précédente.
Par rapport à la première fuite, et comme le montre la désynchronisation entre les images PL et ECL, la seconde apparaît sur la face opposée du liposome (haut de l'image), le liposome restant immobile dans ce cas. La deuxième fuite est, cette fois, complète en accord avec la disparition de l'image du liposome (voir l'image PL à t = 250 s). Du point de vue quantitatif (cf. Figure 73 (b)), en prenant l'image complète comme zone d'intérêt, le second signal ECL (courbe rouge) apparaît moins intense que le premier indiquant que la plus grande partie du contenu du liposome a fuité durant le premier évènement. De la même façon, en PL, la baisse d'intensité du second signal est beaucoup plus faible que le premier et se confond presque avec le bruit de fond indiquant une moins bonne sensibilité par rapport à l'ECL.

Les résultats encourageants obtenus en présence de mélittine, utilisée à une concentration de 10 µM, nous ont conduits ensuite à tester la sensibilité de notre approche en travaillant avec des concentrations plus petites en peptide même si le ratio peptide/lipide ne peut être contrôlé strictement dans nos conditions expérimentales. Aussi, une série d'expériences a été réalisée à 1 µM et 100 nM en AMP (Figure 74 et Figure 75).
<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>Figure 74 : (a) Combinaison d'imagerie ECL (en haut) et PL (en bas) montrant un processus de perméation d'un liposome unique par la mélittine ($1.10^{-6}$ mol.L$^{-1}$) en fonction du temps. Barre d'échelle : 100 µm. (b) Évolution de l'intensité PL (courbe bleue) et ECL (courbe rouge) en fonction du temps pour un seul liposome [présenté en (a)]. Mêmes conditions expérimentales que dans la Figure 73 précédente sauf pour la concentration en mélittine ($1.10^{-6}$ mol.L$^{-1}$). Les régions d'intérêt sont représentées en traits pointillés blanc. Les flèches rouges indiquent l'emplacement de la fuite.</figcaption></figure>

Globalement, quelle que soit la concentration en AMP, des comportements similaires ont été observés tant en PL qu'en ECL. De manière générale, plus la concentration en peptide est faible, plus le délai entre l'ajout du peptide et le processus de perméabilisation est long et en conséquence plus l'intensité de l'ECL est faible. Plus précisément, à une concentration de 1 µM en mélittine (Figure 74), il est encore possible de localiser l'emplacement de la fuite par ECL
(des flèches rouges ont été ajoutées sur les images PL pour matérialiser la fuite), alors que cela est quasi-impossible par PL (comparer les images ECL et PL de la Figure 74(a)). La grande sensibilité de l'ECL par rapport à la PL trouve ici toute son utilité.

La perméabilisation des vésicules a pu être quantifiée non seulement par ECL, mais aussi par PL, à condition de sélectionner une zone d'intérêt ad-hoc (voir Figure 74(a) et Figure 74(b)). Comme nous l'avons observé à une concentration de 10 µM en AMP, la concomitance de la diminution de l'intensité PL et de l'augmentation de l'intensité ECL montre que les deux signaux proviennent du même liposome. En outre, la durée du signal ECL se situe dans la même gamme de temps que celle observée précédemment et, dans tous les cas étudiés, une fuite complète s'est produite.

Enfin, nous nous sommes demandés si l'imagerie ECL permettait encore de visualiser la perméation des liposomes si on diminue d'un facteur 10 la concentration en mélittine. La Figure 75 montre deux planches d'images obtenues en ECL et PL ainsi que l'analyse quantitative de ces images en prenant des zones d'intérêt adéquates (cf. traits pointillés blanc) obtenues pour une concentration de 100 nM en mélittine. A cette concentration, le signal ECL devient trop diffus pour localiser précisément la partie du liposome qui fuit (comparer les Figure 74(a) et Figure 75 (a)). La zone d'intérêt a dû être élargie de façon à pouvoir extraire le signal ECL du bruit de fond (Figure 75 (b)). Néanmoins, les signaux ECL et PL sont toujours concomitants et la durée du signal ECL se situe toujours dans la même fenêtre de temps que celles observées précédemment.
<figure><img src="image_88.png" /></figure>

Figure 75 : (a) Combinaison d'imagerie ECL (en haut) et PL (en bas) montrant deux processus successifs de perméation d'un liposome unique par la mélittine (1.10⁻⁷ mol.L⁻¹) en fonction du temps. Barre d'échelle : 100 µm. (B) Évolution de l'intensité PL (courbe bleue) et ECL (courbe rouge) en fonction du temps pour un seul liposome [présenté en (a)]. Mêmes conditions expérimentales que dans la Figure 74 précédente sauf pour la concentration en mélittine (1.10⁻⁶ mol.L⁻¹). Les régions d'intérêt sont représentées en traits pointillés blanc.
3. Combinaison photoluminescence (PL) et électrochimiluminescence (ECL) pour imager la perméabilisation de la membrane lipidique de liposomes géants par des peptides pénétrants

Les résultats obtenus avec la mélittine nous ont incités à étudier de possibles effets de perméabilisation de liposomes géants par des peptides pénétrants (CPP pour "Cell Penetrating Peptide" en anglais). Contrairement aux AMP, les CPP peuvent être considérés comme des peptides « neutres » du point de vue de la rupture (même locale) des membranes lipidiques.

Néanmoins, sous certaines conditions (ex. concentration élevée en peptide), les CPP peuvent se comporter comme des AMP c'est-à-dire conduire à la lyse des liposomes [173].

Pour ce travail, plusieurs CPP ont été synthétisés au sein du Laboratoire des Molécules (LBM – UMR 7203) par Dr F. Burlina et des anciens étudiants. Pour ce faire, notre choix s'est porté sur les peptides suivants : Ac-pénétratine (Ac-RQIKIWFWQNRRM(O2)KWKK-NH₂) ; Ac-tat (Ac-YGRKKRRQRRR-NH₂) ; R9 (apa-RRRRRRRRR-NH₂) ; Ac-Rw9 (RRWWRRWRR-NH2).

En transposant les conditions d'étude mises au point pour les AMP, nous avons étudié la perméabilisation de la membrane lipidique par les peptides pénétrants, à trois concentrations différentes : 10 µM, 1 µM et 100 nM.

Les résultats obtenus, à partir de différents peptides et différentes concentrations, ont montré une disparition des liposomes, détectée par photoluminescence, traduisant une perméabilisation membranaire par les CPP. Ce résultat préliminaire, obtenu pour une concentration relativement élevée de peptides induit une perméation de la membrane lipidique.

Néanmoins, ces observations n'étaient pas associées à un enregistrement des signaux ECL. Plusieurs hypothèses peuvent être émises pour expliquer ce comportement : (i) la libération du contenu se déroule trop loin de la surface de l'électrode pour permettre une oxydation significative du luminophore et du co-réactif. Les pores ou défauts formés par les CPP ne sont pas nombreux, ce qui diminue la quantité de solution libérée.

Ces résultats valident néanmoins notre méthodologie expérimentale pour imager le comportement de CPPs pour lesquels la concentration serait suffisante pour générer transitoirement et localement un efflux significatif du contenu vésiculaire.
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Figure 76 : Images photoluminescentes (lumière d'excitation à 455 nm) de plusieurs liposomes géants asymétriques composés de DOPG et de DOPC sur leurs feuillets externe et interne, respectivement. Les liposomes contiennent les réactifs ECL ([(Ru(bpy)₃]²⁺ (2,5.10⁻⁴ mol.L⁻¹) et TPrA (0,1 mol.L⁻¹)) et repose sur une surface en ITO recouverte de poly-L-lysine polarisée à +1,2 V vs. Ag/AgCl. Images enregistrées à t = 5 min. et t = 30 min. de polarisation. Les images montrent la disparition de deux liposomes suite à un ajout d'une solution contenant des peptides à t = 0 s. La solution ajoutée est une solution de glucose contenant des CPP (R9 dans ce cas) à 1.10⁻⁷ mol.L⁻¹. Une mesure de l'osmolalité de la solution de peptide a été réalisée, avant l'ajout dans la cellule électrochimique.
## IV. Conclusion

L'objectif du travail présenté dans ce chapitre était de mettre en évidence la perméabilisation de liposomes engendrée par la présence de peptides actifs vis-à-vis des membranes lipidiques en adaptant la méthodologie ECL mise au point au chapitre 2.

En présence d'un AMP emblématique (mélittine) l'ECL apparaît constituer une approche sensible et pertinente pour étudier en temps réel les évènements de perméabilisation. Pour ce qui concerne les CPPs étudiés, dont les mécanismes de passage transmembranaire ne sont pas systématiquement associés à la formation de pores, il faudra pour devenir significative que la méthode soit améliorée dans le sens d'un contrôle fin du rapport peptide/lipide. Une telle amélioration permettrait à terme de discriminer rapidement les peptides se comportant comme des AMP de ceux se comportant comme des CPP.

Afin de mieux maîtriser ce rapport peptide/phospholipide l'évolution que nous retenons est de travailler sur un liposome unique (i.e., un seul liposome au contact de l'électrode). Une option serait de mettre au point un dispositif microfluidique permettant d'isoler et de déplacer sans altération un liposome unique dans un canal micrométrique et de le positionner au niveau d'une électrode transparente. En outre, ce type de dispositif devrait également permettre d'améliorer, du point de vue électrochimique, le rapport signal/bruit et de rendre quantitatif le signal ampérométrique en plus des signaux PL et ECL.
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Cinquième chapitre – ECL
issue de la réalisation d'une
réaction enzymatique au
sein de liposomes
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# 5- Cinquième chapitre – ECL issue de la réalisation d'une réaction enzymatique au sein de liposomes.

## I. Introduction et contexte

Dans les chapitres précédents, nous avons montré que l'ECL constitue une approche expérimentale adaptée à la caractérisation de la perméabilisation de vésicules lipidiques, dont la conséquence physique est un efflux du contenu de la vésicule (contenu intégrant les réactifs de l'ECL) vers le milieu extérieur. L'objectif de ce dernier chapitre est de tenter de générer des évènements d'électrochimiluminescence à l'issue d'une réaction enzymatique menée dans le milieu confiné que constitue la vésicule lipidique. Les prérequis et étapes à respecter dans ce contexte sont i) de s'assurer qu'au moins un réactif de l'ECL soit formé durant la réaction étudiée et ii) de parvenir à « exfiltrer » ces réactifs vers une électrode polarisée. Le système que nous avons sélectionné pour l'inclure dans la vésicule est constitué de D-glucose, de glucose déshydrogénase (GDH), de NAD⁺ (nicotinamide adénine dinucléotide) comme agent oxydant et de [Ru(bpy)₃]²⁺ comme précurseur du luminophore. Sous sa forme réduite (NADH), ce cofacteur de la réaction enzymatique peut en effet devenir le co-réactif d'une réaction d'électrochimiluminescence engageant le complexe [Ru(bpy)₃]²⁺.

Jusqu'ici, l'ECL a été générée à partir de [Ru(bpy)₃]²⁺ et de TPrA. Cette amine tertiaire tripropylée n'est pas le seul co-réactif possible pour générer de l'ECL et peut être remplacée par d'autres composés comportant des amines tertiaires, comme le NADH.

[174] Avec ce co-réactif, la séquence d'ECL est obtenue selon le mécanisme suivant :

$$ \mathrm{NADH} \rightarrow \mathrm{NADH}^{\cdot +} + 1 \mathrm{e}^{-} \qquad (39) $$

$$ \mathrm{NADH} \rightarrow \mathrm{NADH}^{+} + 1 \mathrm{e}^{-} \qquad (40) $$

$$ \mathrm{Ru(bpy)}_{3}^{2+} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)}_{3}^{3+} + 1 \mathrm{e}^{-} \qquad (41) $$

$$ \mathrm{NADH}^{\cdot +} \rightarrow \mathrm{NAD}^{\cdot} + \mathrm{H}^{+} \qquad (42) $$

$$ \mathrm{Ru(bpy)}_{3}^{3+} + \mathrm{NAD}^{\cdot} \rightarrow \mathrm{Ru(bpy)}_{3}^{2+*} + \mathrm{NAD}^{+} \qquad (43) $$
$$ \mathrm{Ru(bpy)_{3}^{2+*} \rightarrow Ru(bpy)_{3}^{2+} + hv} \qquad (44) $$

Ainsi, un produit de la réaction enzymatique (NADH) peut compléter le système chimique à l'origine de l'évènement d'électrochimulinescence, comme cela a été décrit dans plusieurs réactions métaboliques qui font intervenir des enzymes déshydrogénases [175].

Nous allons succinctement rappeler d'une part l'importance du système NAD+/NADH dans les voies métaboliques du vivant et d'autre part l'état de l'art sur l'utilisation des liposomes en tant que bioréacteurs et/ou cellule artificielle.

## II. Etude bibliographique

### 1. Rôle du NADH dans le métabolisme cellulaire et les différentes méthodes de sa détection

Le couple NAD+/NADH est un « coenzyme » présent dans toutes les cellules du vivant et il intervient dans de nombreuses réactions métaboliques à caractère rédox et à ce titre, est associé aux réactions de dégradation de molécules riches en énergie (par exemple les sucres). C'est le cas des réactions catalysées par des déshydrogénases, NAD+ jouant alors le rôle d'accepteur d'électrons. Parmi les réactions enzymatiques d'intérêt pouvant donner lieu à des évènements d'ECL grâce à la conversion de NAD+ en NADH, nous pouvons citer : le catabolisme oxydatif du glucose, le métabolisme oxydatif de l'éthanol ou encore la conversion du pyruvate en CO2 dans le cycle de Krebs [176].

Différentes méthodes analytiques ont été développées pour caractériser la formation ou la présence de NADH : la fluorescence[175], par exemple, grâce à la capacité de la molécule de NADH à émettre de la lumière à 460 ±50 nm quand elle est excitée à 340 ± 30 nm [177]. Dans ce même champ, le NADH a été détecter par bioluminescence suite à un dosage d'une coenzyme luminescente FMNH2. [178] L'électrochimie reste la méthode analytique la plus utilisée pour la détection du NADH parce qu'elle offre plusieurs avantages dont la simplicité de mise en oeuvre, le faible cout des appareils et le faible volume des échantillons [179], [180]. L'électrochimiluminescence trouve maintenant sa place en tant que méthode analytique de détection de NADH [181] [182].
## 2. Utilisation de liposomes comme bioréacteurs

Le compartiment aqueux des liposomes, isolé du milieu extérieur par une membrane lipidique, a permis d’envisager leur utilisation en tant que micro-réacteurs clos [58] essentiellement pour mimer les conditions rencontrées dans les cellules réelles et ainsi mettre en œuvre et étudier des processus biochimiques et biologiques in vitro [183] mettant en jeu des réactions enzymatiques [184] [58]. Très récemment, les fonctionnalités propres à certaines cellules végétales, dont la réduction photochimique de CO₂ ont été reproduites au sein de GUVs [185]. La vésicule contient une cyanobactérie capable de convertir le CO₂ en glucose sous photo-stimulation, étape suivie de l’oxydation du glucose par le système enzymatique NAD⁺-GDH. Un second exemple récent a montré que l’encapsulation de mitochondries au sein de d’hydrogels à base de gélatine permet de conserver la fonctionnalité de synthèse d’ATP des mitochondries [186].

Cette quête de la reconstitution de cellules artificielles possédant l’essentiel des fonctionnalités métaboliques du vivant est un champ de recherche très actif. Récemment, Yewdall a publié dans Nature un article intitulé « Life brought to artificial cells » montrant l’état d’avancement des projets de reconstitution de fonctions métaboliques et de transcription génomique dans des assemblages mimant ceux des cellules réelles [187] [188].

La figure suivante illustre de façon synthétique les compartiments et organelles constitutifs d’assemblages ayant été récemment proposés dans le contexte de la réalisation de cellules artificielles :
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Figure 77 : Illustration non exhaustive des micro-organismes, organelles et enzymes encapsulés au sein de liposomes ou polymersomes pour intégrer des métabolismes et fonctionnalités mimant les cellules du vivant.

Stratégie

Pour ce qui se rapporte à nos objectifs dans le cadre de ce projet de thèse, nous avons réduit le système d'étude à une seule réaction enzymatique menée au sein de liposomes.

Ainsi, nous avons décidé d'étudier la réaction de dégradation de glucose en glucono-δ-lactone qui est catalysée par l'enzyme glucose déshydrogénase (GDH) et met en jeu le couple NAD+/NADH comme co-enzyme. Au cours de cette réaction, le NAD+ est réduit en NADH qui peut jouer le rôle d'un co-réactif, dans une réaction d'électrochimiluminescence, pour générer un signal lumineux. Cette approche est illustrée dans la figure suivante :