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Les « pièges extracellulaires »
formés par les granulocytes
neutrophiles pendant
la chimiothérapie anti-cancéreuse
induisent une chimiorésistance
par activation du TGF-β

Alexandra Mousset, Lola Bellone, Cédric Gaggioli, Jean Albrengues

> Malgré les progrès des thérapies anti-cancéreuses, le cancer du sein métastatique représente la première cause de décès par cancer chez la femme en France. En effet, bien que les femmes diagnostiquées au stade métastatique du cancer soient traitées par chimiothérapie, il est fréquent de constater une chimiorésistance des métastases, dont les causes restent mal connues. Le microenvironnement tumoral module la réponse au traitement antitumoral [1], en particulier parce qu'une partie des cellules dont il est constitué, appelées cellules stromales, sécrètent divers facteurs de croissance, des cytokines et des protéines de la matrice extracellulaire réduisant l'efficacité des traitements [2] (→)

(→) Voir la Synthèse
de J. Albrengues et al.,
m/s n° 4, avril 2014,
page 391

Alors que les cellules inflammatoires (monocytes, macrophages, et granulocytes neutrophiles) sont désormais reconues comme étant d'importants acteurs du contrôle de la progression tumorale, leur rôle dans l'efficacité des chimiothérapies reste à élucider [3]. Les chimiothérapies conventionnelles entraînent fréquemment une inflammation locale et générale [4], qui peut constituer un obstacle à leur efficacité. Nous avons tenté d'en comprendre la raison.

Bien que les granulocytes neutrophiles soient parmi les premières cellules à arriver sur le site de l'inflammation, leur rôle dans le cancer n'a attiré l'atten-

tion des chercheurs que récemment [5].
Lors d'une réponse physiologique à des
agents pathogènes, les granulocytes
neutrophiles les éliminent par trois prin-
cipaux mécanismes : 1) la phagocytose,
2) la dégranulation libérant enzymes et
protéases cytotoxiques, et 3) la forma-
tion de pièges extracellulaires (neutro-
phil extracellular traps, NET). Les NET
sont des filaments
d'ADN associés à
diverses enzymes
et protéases relâ-
chés dans le milieu
extracellulaire [6] (→)

(→) Voir la Nouvelle
de M.A. Gougerot-
Pocidalo et al.,
m/s n° 5, mai 2007,
page 464

Ils sont produits après citrullination<fnref n="1" />
des histones par l'enzyme protein
arginine deiminase 4 (PAD4), et sont
libérés dans le milieu extracellulaire
après la décondensation de la chroma-
tine, la désintégration de la membrane
nucléaire et la rupture de la membrane
plasmique [7]. Nos travaux de recherche
ainsi que ceux d'autres laboratoires
ont permis de montrer que les NET ont
des propriétés pro-métastatiques [8,
9]. Cependant, le rôle des granulocytes
neutrophiles, des NET, et plus générale-
ment de l'inflammation dans la chimio-
résistance reste mal connu.

Pour tenter de comprendre comment la
chimiothérapie modifie le microenvi-
ronnement inflammatoire métastatique,

nous avons utilisé un modèle murin de
métastases pulmonaires issues de car-
cinomes mammaires [10]. Nous avons
injecté des cellules murines provenant
de métastases de cancer du sein dans
la veine caudale de souris de la même
lignée (syngéniques). Les souris por-
teuses de métastases pulmonaires ont
ensuite été traitées par l'une ou l'autre
de deux chimiothérapies (cisplatine ou
association d'adriamycine et de cyclo-
phosphamide) utilisées dans le traite-
ment du cancer du sein métastatique.
Une analyse des métastases pulmo-
naires par cytométrie en flux après cette
chimiothérapie a montré l'infiltration
des métastases par des granulocytes
neutrophiles. Nous avons découvert
qu'en réponse à la chimiothérapie, les
cellules métastatiques sécrètent CXCL1
et CXCL5, des chimiokines à motif Cys-
X-Cys (où X désigne un acide aminé
quelconque) induisant ainsi le recru-
tement des granulocytes neutrophiles
en se liant au récepteur CXCR2 (C-X-C
motif receptor 2) présent à leur surface.
Nous avons montré le rôle fondamental
de ces cellules dans l'inefficacité des
chimiothérapies contre les métastases
pulmonaires du cancer du sein. En effet,
la déplétion des granulocytes neutro-
philes par un anticorps ou l'inhibition
pharmacologique du recrutement de
ces cellules dans les poumons métas-
tatiques améliore la sensibilité des cel-
lules cancéreuses métastatiques aux
chimiothérapies [10].

<footnote n="1">¹ Université Côte d’Azur, CNRS UMR7284,
Inserm U1081, Institut de recherche sur le
cancer et le vieillissement de Nice (IRCAN),
Nice, France
jean.albrengues@unice.fr</footnote>

<footnote n="1">¹ La citrullination désigne une modification post-traductionnelle des protéines : un résidu arginine est transformé en citrulline par désimination.</footnote>
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**Figure 1.** Les pièges extra-cellulaires des granulocytes neutrophiles entraînent la chimiorésistance des métastases pulmonaires de cancer du sein. En réponse à la chimiothérapie, les granulocytes neutrophiles infiltrent les métastases pulmonaires du cancer du sein, où ils forment des « pièges extra-cellulaires » (neutrophil extracellular traps, NET). Certaines cellules métastatiques tuées par la chimiothérapie sécrètent de l'ATP, ce qui active le récepteur purinergique P2RX7 sur les cellules métastatiques voïsines, entraînant l'activation de l'inflammasome NLRP3 et ainsi, la sécrétion de l'interleukine-1β (IL-1β) par ces cellules. Cette interleukine est alors responsable de la formation des NET. Deux protéines associées aux NET sont nécessaires pour induire

la chimiorésistance : l'intégrine-αvβ1 (ITGαvβ1), qui piège le TGF-β latent sécrété par les cellules métastatiques, et la métalloprotéïnase matricielle 9 (MMP9), qui clive et active le TGF-β latent piégé. L'activation du TGF-β provoque la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules cancéreuses et leur chimiorésistance.

Nous avons ensuite montré, par immunofluorescence, que les granulocytes neutrophiles recrutés dans les niches métastatiques pulmonaires forment des NET, dont nous avons découvert le rôle dans la chimiorésistance de ces métastases. En effet, l'inhibition de la formation des NET par ajout d'un inhibiteur de l'enzyme PAD4, ou leur dégradation par la DNase I, améliore la chimiosensibilité des métastases. Par des expériences in vitro, nous avons ensuite montré que l'interleukine (IL)-1β, sécrétée par les cellules tumorales traitées par chimiothérapie, est responsable de la formation des NET. Seules certaines cellules tumorales meurent en réponse à la chimiothérapie. En mourant, ces cellules libèrent de l'ATP (adénosine triphos-

phate), qui active le récepteur P2RX7 (P2X purinoceptor 7) à la surface des cellules tumorales qui n'ont pas été tuées par la chimiothérapie, entraînant l'activation de l'inflammasome NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain containing 3) dans ces cellules. L'activation de NLRP3 entraîne à son tour celle de l'IL-1β et sa sécrétion dans le microenvironnement tumoral (Figure 1). Ainsi, l'administration d'un anticorps bloquant cette interleukine ou d'un inhibiteur pharmacologique de NLRP3 chez la souris empêche la formation des NET induite par la chimiothérapie, et augmente son efficacité contre les métastases pulmonaires [10].

Une analyse du transcriptome des cellules tumorales métastatiques nous a

permis de comprendre les mécanismes moléculaires de la chimiorésistance induite par les NET. Nous avons découvert que les NET entraînent l'activation de la voie de signalisation du TGF-β (transforming growth factor β) dans les cellules tumorales, ainsi que l'augmentation de l'expression des gènes de la transition épithélio-mésenchymateuse. Or, cette transition promeut la chimiorésistance dans plusieurs types de cancers [11]. Nous avons ainsi montré que l'inhibition du récepteur du TGF-β (TGF-βR1) contrecarre la transition épithélio-mésenchymateuse induite par les NET et augmente l'efficacité de la chimiothérapie [10].

Le TGF-β est un facteur de croissance synthétisé et sécrété sous la forme d'un
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**Figure 2.** Illustration du rôle des pièges extra-cellulaires des granulocytes neutrophiles dans la chimiorésistance. Un granulocyte neutrophile « spiderman » (en vert) libère son « filet » sur un fond représentant l'épithélium pulmonaire (en violet), ce qui bloque l'efficacité de la chimio-thérapie et permet aux métastases pulmonaires de continuer à se développer. Les cellules tumo-rales mourantes sont colorées en marron, et les cellules tumorales qui survivent en rouge.

complexe protéique latent, qui doit être clivé pour être activé. Nous avons montré que les NET ne contiennent pas de TGF-β actif ou latent, et que les cellules tumo-rales sécrètent principalement, en grande quantité, la petite forme latente du TGF-β, dans laquelle la molécule active de TGF-β est associée à la protéine LAP (latency-associated peptide). Ce TGF-β latent est activé par la dégradation pro-téolytique de la LAP par la métallopro-téinase 9 (MMP9) associée aux NET. Alors que la destruction des NET par la DNase I améliore l'effet de la chimiothérapie in vivo, cette destruction n'a aucun effet sur l'activité enzymatique de la MMP9 [8], et nous avons donc émis l'hypothèse que la structure tridimensionnelle de l'ADN des NET est nécessaire pour induire la chimiorésistance par activation du TGF-β latent. Dans ce contexte, nous avons identifié la présence, dans les NET, de l'intégrine αvβ1, qui piège le TGF-β latent dans les « filets d'ADN » des NET en se liant au motif Arg-Gly-Asp (RGD) de la protéine LAP. L'enzyme MMP9 peut alors

cliver et activer le TGF-β, dont la signa-lisation induit une transition épithéli-mésenchymateuse des cellules cancé-reuses et leur chimiorésistance. Ainsi, l'inhibition pharmacologique de MMP9 et de l'intégrine αvβ1 augmente-elle l'efficacité des chimiothérapies contre les métastases pulmonaires du cancer du sein [10].

Nous avons donc montré que les NET formés en réponse à la chimiothé-rapie favorisent la chimiorésistance des métastases pulmonaires du cancer du sein chez la souris. Les NET pourraient ainsi constituer une cible thérapeu-tique chez les patientes présentant un cancer du sein métastatique (Figure 2). En effet, une analyse de la présence de NET dans le plasma sanguin de patientes en cours de chimiothérapie a permis de montrer que les NET augmentent après ce traitement, spécifiquement chez les patientes qui ne répondent pas ou qui répondent peu à la chimiothérapie. Cela suggère que le dosage des NET dans le sang pourrait être utilisé comme bio-marqueur pour identifier les patientes chez qui la chimiothérapie sera peu effi-cace et pourrait être rendue plus effi-cace en ciblant la voie de signalisation intégrine αvβ1/MMP9/TGF-β que nous avons identifiée dans les NET.

Bien que les cellules cancéreuses soient la principale source de TGF-β latent, il est possible que certaines cellules stro-males du microenvironnement tumoral métastatique en libèrent également. Le TGF-β agit sur de nombreux types de cellules, avec des effets à la fois physio-logiques et pathologiques. La formation des NET pourrait donc être impliquée plus largement dans la progression de la maladie cancéreuse. Par exemple, la signalisation par le TGF-β peut activer les fibroblastes en myofibroblastes, qui sont les principaux responsables de la fibrose tumorale favorisant la forma-tion d'une niche métastatique pouvant être chimiorésistante [2]. De plus, le TGF-β peut inhiber les lymphocytes T anti-tumoraux, favorisant ainsi la créa-tion d'une niche immunosuppressive.

Ainsi, l'activation du TGF-β dans le microenvironnement métastatique par les NET après une chimiothérapie pour-rait entraîner un remodelage profond de ce microenvironnement, favorisant la création d'une niche chimiorésistante. ◊ Neutrophil extracellular traps formed during chemotherapy confer treatment resistance via TGF-β activation

## LIENS D'INTÉRÊT

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article.

## RÉFÉRENCES

1. Bejarano L, Jordao MJC, Joyce JA. Therapeutic targeting of the tumor microenvironment. Cancer Discov 2021; 11: 933-59.

2. Albrengues J, Meneguzzi G, Gaggioli C. L'invasion des cellules tumorales : quand les fibroblastes s'en mêlent. Med Sci (Paris) 2014; 30: 391-7.

3. Klemm F, Joyce JA. Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer. *Trends Cell Biol* 2015; 25: 198-213.

4. Vyas D, Laput G, Vyas AK. Chemotherapy-enhanced inflammation may lead to the failure of therapy and metastasis. *Onco Targets Ther* 2014; 7: 1015-23.

5. Nolan E, Malanch I. Connecting the dots: Neutrophils at the interface of tissue regeneration and cancer. *Semin Immunol* 2022; 101: 598.

6. Gougerot-Pocidalo MA, El Benna J, My-Chan Dang P, Elbim C. La pêche miraculeuse du filet du neutrophile. *Med Sci (Paris)* 2007; 23: 464-5.

7. Papayannopoulos V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. *Nat Rev Immunol* 2018; 18: 134-47.

8. Albrengues J, Shields MA, Ng D, et al. Neutrophil extracellular traps produced during inflammation awaken dormant cancer cells in mice. *Science* 2018; 361.

9. Adover JM, McDowell SAC, He XY, et al. NETworking with cancer: The bidirectional interplay between cancer and neutrophil extracellular traps. *Cancer Cell* 2023; 41: 505-26.

10. Mousset A, Lecorgne E, Bourget I, et al. Neutrophil extracellular traps formed during chemotherapy confer treatment resistance via TGFβ activation. *Cancer Cell* 2023; 41: 757-75, 10 €.

11. Brabletz T, Kalluri R, Nieto MA, Weinberg RA. EMT in cancer. *Nat Rev Cancer* 2018; 18: 128-34.

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