# Les épitopes pour les nuls

Sandra Denery

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Sandra Denery. Les épitopes pour les nuls. Rencontres francophones d'allergologie moléculaire, Al-lergie France., Nov 2016, Paris, France. hal-01603569

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Submitted on 5 Jun 2020

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INRA
SCIENCE & IMPACT

# Les épitopes pour les nuls

Sandra DENERY

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Unité BIA INRA Nantes
Equipe Allergie
# Comment définit-on un épitope ?

## Définition fonctionnelle – notion d'antigénicité

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L'épitope B (déterminant antigénique) / 
↔ interaction anticorps - antigène
zone reconnue par le paratope d'un anticorps
↔ Entité relationnelle

Ex : nombre d'épitopes d'une protéine dépend du nombre d'Ac que l'on peut produire

L'épitope T : peptide issu d'un clivage protéolytique d'un antigène qui interagit avec le récepteur d'un lymphocyte T (TCR)

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# Interface du complexe allergène / anticorps

## Exemple d'un épitope de la β-lactoglobuline

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Vue de côté

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Vue de dessus

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>B</figcaption></figure>

Allergène entier
résidus épitopiques en bleu

## Le site de liaison de l'Ac : 6 boucles hypervariables

* 1 Clé de liaison de 50-70 résidus

* Le paratope = les résidus en contact = 10-20 résidus

* Autres résidus contribuent au maintien de la conformation

F. Dall'Antonia et al. / Methods 66 (2014) 3-21

## Epitope

* Patch d'acides aminés de antigène avec complémentarité structurale et chimique / Ac

* Liaisons hydrophobes, électrostatiques, complémentarité cavité / protrusion

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# Définition fonctionnelle : Spécificité - Réaction croisée...

Pas d'épitope B sans paratope ↔ 1 épitope = 1 paratope - Définition stricte
Relation 'souple'

* 1 épitope peut être reconnu par différents paratopes

* 1 Ac Mo peut se lier à des épitopes non identiques

* **Réaction croisée** : homologies de structures

* **Multi-réactivité** : plusieurs paratopes / site de liaison Ac

## Réactions croisées

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## Multi-réactivité

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# Définition méthodologique

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épitopes linéaires / conformationnels

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Classification fortement liée aux
techniques expérimentales

## Epitope linéaire, séquentiel, continu (B et T) - Structure I

- AA contigus dans la séquence primaire

- Capacité de fragments peptidiques à se lier à des anticorps (anti-protéine)

- Peptides d'environ 10 AA

## Epitope conformationnel, discontinu (B) – Structures II et III (IV)

- Plusieurs (2 à 5) courts segments dispersés dans la séquence mais proches dans l'espace

- Repliement de la protéine

- Recouvrent en général 15-20 AA

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# Définition méthodologique

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## Dichotomie artificielle

### Epitope continu

* Fragment peptidique capable de lier l'Ac

* Mais tous les AA n'interagissent pas

* Les AA essentiels à la liaison

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Allergène
(Antigène)

### Epitope conformationnel

* Ne peut pas s'extraire de la protéine bien conformée

* Mais plusieurs stretchs d'AA consécutifs dans la séquence

90% des épitopes sont conformationnels lors d'une réponse immunitaire
Quid dans l'allergie alimentaire ?

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# Comment identifier/localiser des épitopes ?

1. Pepscan : Capacité de peptides synthétiques de se lier à des anticorps dirigés contre des protéines – peptides d'environ 10 AA

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2. Création d'une librairie aléatoire de peptides (à la surface de phage) et sélection de mimotopes

3. Hydrolyse enzymatique, fragments protéine recombinante

4. Mutagénèse dirigée de l'antigène et mesure de l'affinité résiduelle

5. Compétition pour la liaison Antigène/Anticorps monoclonaux

6. Résolution de la structure 3D complexe antigène-anticorps
RMN – rayons X-cristallographie et déduction des points de contact atomiques

BLG

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A

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B

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C

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# Identifier/localiser des épitopes ?

## Les limites méthodologiques

## Relation avec les connaissances sur les structures 2D, 3D

### Ex allergènes du blé

- Protéines du gluten : gliadines, gluténines

- Protéines solubles : serpine, LTP

## Identification d'épitopes

Pepscan (peptides synthétiques)

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Mutagenèse dirigée

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## Structure

Dichroïsme circulaire (SRCD)

Diffusion dynamique de la
lumière (DLS)

Cristallographie

Modélisation

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## Activité fonctionnelle

Activation de basophiles (RBL)
# Identifier/localiser des épitopes par Pepscan

## Les protéines du gluten

protéine à structure étendue et flexible (modélisation)

Peptides répétés

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ω5-gliadine

Intérêt du pepscan +++

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N-term

C-term ?

Intérêt du pepscan ++

Gluténine FPM

Même modèle de
structure pour
α-gliadine

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Domaine Non répété : C-term - α-helix – compact

Domaine répété : N-term - étendu
# Identifier/localiser des épitopes par Pepscan

## Serpine du blé

Intérêt du pepscan +

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Serum #901

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<table><thead><tr><th colspan="10">Serpin WSZ2a</th></tr><tr><th>n°sérum</th><th>18</th><th>458</th><th>584</th><th>633</th><th>585</th><th>626</th><th>901</th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Pepscan</td><td rowspan="2">neg</td><td rowspan="2">neg</td><td rowspan="2">neg</td><td rowspan="2">neg</td><td>DGLKVLKLPY</td><td>ADASYADSP<br>R</td><td>DSPMPQGLRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>SSDGLKVLKL</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>DGLKVLKLP<br>Y</td><td>KQGGDKRQFS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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## Modèle de serpine du blé (WSZ2b)

Mameri et al., 2012

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Production de protéine recombinante
et domaines N-term et C-term

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Interactions structurales des domaines N-term et C-term
impact **certain** sur la réactivité IgE
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Protéine recombinante et
domaines N-term et C-term

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Antigen concentration (ng/mL)

Activation de basophiles ?

- Protéines entières : Oui + + +

- Protéines réduites : Oui +

- Dom C-term : NON

- Dom N-term : NON
# Identifier/localiser des épitopes par Pepscan ?
## Impact des caractéristiques structurales

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+++ épitopes conformationnels dans l'allergie alimentaire

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Les protéines de structure 3D compacte : ex LTP de blé

Identification/localisation des épitopes par mutagénèse dirigée

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Code (1GH1.pdb)

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LTP1:

Protéine globulaire 90 aa

9 kDa

4 ponts disulfures

4 hélices alpha

➤ Rôle +++ des ponts disulfure dans liaison IgE

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# Identification/localisation des épitopes par mutagénèse dirigée

## I. Produire la LTP1 recombinante sauvage

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## II. Muter la LTP1 recombinante

* Choix des mutations

* Ponts disulfure

* Études pepscan

* Résultats Mimotopes

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Épitope : 37-46 boucle entre H2 et H3

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D'après Denery-papini et al. 2011, Tordesillas et al. 2009

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# Bases de données sur les épitopes et prédiction ?

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Exposition en surface = critère généralement accepté pour localiser les épitopes B

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## Analyse de l'exposition en surface des épitopes sur base de données IEDB 60 molécules et 950 épitopes

* pas de différences significatives entre AA épitope / non épitope

* Pas de correspondance systématique épitope / exposition en surface

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* Pas de confirmation exposition en surface pour les épitopes

* Hétérogénéité des données ?

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INRA
SCIENCE & IMPACT
# Comment définit-on un épitope ?

## Notion opérationnelle Interaction = phénomène dynamique

* Définition de l'épitope basée sur les contacts réels entre les atomes Ag / Ac

* Détermination par la structure d'un cristal Ag / Ac = représentation statique

* D'une condition dynamique

* Contribution probable de différents résidus à la phase d'association (ex AA chargés interactions longue distance) et à celle d'équilibre

* Cinétiques d'association / dissociation – constante d'affinité

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# Dans l'allergie : activité fonctionnelle

## Activation de basophiles in vitro

### Systèmes modèles : Basophiles + IgE chimériques monoclonales

#### → Influence de l'affinité des IgE / épitopes

Dégranulation des Basophiles

IgE d'affinités différentes :

- Forte (k<10⁻⁹ M)

- Moyenne (k<10⁻⁸ M)

- Faible

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→ Coopération entre interactions d'affinités faibles et fortes/moyennes
# Conclusion

## Les épitopes dans l'allergie (alimentaire)

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* Plusieurs critères pour définir un épitope

* Au-delà des types continu et discontinu, le terme épitope B peut désigner:

* Les acides aminés réellement en contact avec les anticorps

* Des résidus contribuant +/- directement à l'interaction (épitopes fonctionnels)

* Prédiction *In silico* des épitopes B ? $\leftrightarrow$ Composition des bases de données

* Plus on étudie les épitopes d'une protéine plus on en trouve : notion d'épidémiologie à inclure

* Dans l'allergie alimentaire

* impact des procédés de transformation et de la digestion sur la conformation

* des allergènes $\leftrightarrow$ importance des épitopes conformationnels

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