# Imagerie spectroscopique corrélative des métaux et des protéines : application à l'étude des processus de neurodégénérescence

Asuncion Carmona

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Asuncion Carmona. Imagerie spectroscopique corrélative des métaux et des protéines : application à l'étude des processus de neurodégénérescence. Chimie analytique. Université de Bordeaux, 2022. tel-04157937

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Habilitation à Diriger les Recherches

Présentée

A l'UNIVERSITE DE BORDEAUX

Ecole Doctorale des Sciences Chimiques

Spécialité : Chimie Analytique et Environnementale

Par Asuncion CARMONA

Chargée de recherche

# Imagerie spectroscopique corrélative des métaux et des protéines : application à l'étude des processus de neurodégénérescence

## Membres du jury

Marie-Pierre ISAURE, Maître de Conférence HDR, Université de Pau et des Pays de l'Adour, Rapportrice

Yolanda PREZADO, Chargée de Recherche CNRS HDR, Institut Curie, Rapportrice

Sophie LECOMTE, Directrice de Recherche CNRS, Université de Bordeaux, Rapportrice

Richard ORTEGA, Directeur de Recherche CNRS, Université de Bordeaux, Garant

Clotilde POLICAR, Professeure, Ecole Normale Supérieure, Université Paris Sciences et Lettres, Examinatrice
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Habilitation à Diriger les Recherches

Présentée

A l'UNIVERSITE DE BORDEAUX

Ecole Doctorale des Sciences Chimiques

Spécialité : Chimie Analytique et Environnementale

Par Asuncion CARMONA

Chargée de recherche

# Imagerie spectroscopique corrélative des métaux et des protéines : application à l'étude des processus de neurodégénérescence

## Membres du jury

Marie-Pierre ISAURE, Maître de Conférence HDR, Université de Pau et des Pays de l'Adour, Rapportrice

Yolanda PREZADO, Chargée de Recherche CNRS HDR, Institut Curie, Rapportrice

Sophie LECOMTE, Directrice de Recherche CNRS, Université de Bordeaux, Rapportrice

Richard ORTEGA, Directeur de Recherche CNRS, Université de Bordeaux, Garant

Clotilde POLICAR, Professeure, Ecole Normale Supérieure, Université Paris Sciences et Lettres, Examinatrice
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# Sommaire

## Préambule .................................................................................................................. 1

## Partie A. Curriculum Vitae.................................................................................... 3

1. Fonction actuelle .................................................................................................................. 3

2. Parcours professionnel antérieur.................................................................................... 3

3. Titres............................................................................................................................................ 3

4. Publications ................................................................................................................................ 4

4.1 Revues à comité de lecture ............................................................................................ 4

4.2 Revues sans comité de lecture .................................................................................... 9

4.3 Actes de colloques ............................................................................................................ 9

4.4 Chapitre d'ouvrages........................................................................................................ 10

5. Encadrement ........................................................................................................................ 10

5.1 Post-Doctorants .................................................................................................................. 10

5.2 Doctorant.................................................................................................................................. 10

5.3 Stages de formation........................................................................................................ 11

6. Communications.................................................................................................................... 11

6.1 Conférences invitées dans des congrès internationaux................................................ 11

6.2 Communications dans des congrès, séminaires et conférences.................................... 12

7. Collaborations scientifiques .......................................................................................... 18

7.1 Internationales.................................................................................................................. 18

7.2 Nationales.......................................................................................................................... 18

8. Participation à programmes de recherche.................................................................. 19

8.1 Principaux programmes de recherche auxquels j'ai participé .................................... 19

9. Autres responsabilités........................................................................................................ 20
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>1. Introduction</td>
      <td>23</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. Analyse par faisceau d'ions</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1 La plateforme AIFIRA et la ligne de haute résolution spatiale</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2 Techniques PIXE et RBS</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3 Exemple d'application cellulaire : toxicité pulmonaire du Co</td>
      <td>30</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4 Exemple d'application aux tissus : imagerie intratumorale du Gd</td>
      <td>34</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. Imagerie par rayonnement synchrotron</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1 Caractéristiques d'une installation synchrotron</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2 Fluorescence de rayons X par synchrotron (SXRF) et Spectroscopie de structure près du seuil d'absorption des rayons X (XANES)</td>
      <td>38</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3 Lignes de lumière synchrotron</td>
      <td>40</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>a. Anciennes lignes de lumière à l'ESRF</td>
      <td>41</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>b. ID21 à l'ESRF</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>c. Nanoscopium à SOLEIL</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>d. P06 à DESY</td>
      <td>43</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>e. ID16A à l'ESRF</td>
      <td>43</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>f. Ligne 9-ID-B (Bionanoprobe) à l'APS</td>
      <td>44</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4. La microscopie photonique : marquage des protéines</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.1 Lumière transmise</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2 Microscopie à fluorescence</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>a. La microscopie à épifluorescence</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>b. La microscopie à super résolution STED</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5. Préparation des échantillons</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1 La culture cellulaire</td>
      <td>52</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2 Fixation chimique</td>
      <td>53</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.3 Méthodes cryogéniques</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>a. Le rinçage du milieu de culture</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>b. La cryofixation (ou plunge-freezing)</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>c. La lyophilisation (freeze-drying)</td>
      <td>58</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
6. Imagerie corrélative métaux-protéines .................................................................................. 59

6.1 Imagerie corrélative dans les cellules/neurones.................................................................. 59

6.2 Imagerie corrélative dans les tissus biologiques .................................................................. 63

7. Applications : métaux et neurodégénérescence.................................................................... 66

7.1 La neurotoxicité du manganèse ................................................................................................. 66

a. Localisation du Mn dans l'appareil de Golgi : mise en évidence indirecte.................... 66

b. Imagerie corrélative du Mn et de l'appareil de Golgi et spéciation subcellulaire............ 68

c. Formes familiales de parkinsonisme : accumulation du Mn dans l'appareil de Golgi........ 70

d. Validation de la localisation d'un senseur fluorescent du Mn ........................................ 73

7.2 Fer et maladie du Parkinson .................................................................................................... 75

a. Modèle animal .................................................................................................................... 76

b. Fer et synucléine dans les cellules .................................................................................... 78

c. Fer et Lewy bodys dans des tissus humains .................................................................... 81

7.3 Neurotoxicité de l'uranium naturel .................................................................................... 84

a. Imagerie PIXE de l'uranium ................................................................................................ 85

b. Imagerie corrélative SXRF et épifluorescence des organites ............................................ 87

7.4 Cu et Zn et le cytosquelette neuronal .................................................................................... 90

a. Premières indications de l'interaction du Cu et du Zn avec le cytosquelette neuronal..... 90

b. Imagerie SXRF de neurones primaires ............................................................................ 92

c. Imagerie corrélative à super-résolution des métaux et des protéines du cytosquelette neuronal .................................................................................................................... 94

## Partie C. Projet de recherche et conclusions ................................................................. 101

1. Projet de recherche : cryocorrélative.................................................................................. 101

1.1 Cryofixation............................................................................................................................ 102

1.2 Cryocorrélative : épifluorescence-SXRF............................................................................ 103

1.3 Cryocorrélative : cryo-PALM et nano-SXRF .................................................................... 105

1.4 Applications ............................................................................................................................ 106

2. Conclusions................................................................................................................................. 109

## Partie D. Références ................................................................................................................. 111
<figure><img src="image_6.png" /></figure>
J'écris ce mémoire dans le cadre de ma demande d'habilitation à diriger des recherches à l'école doctorale de Sciences chimiques de l'Université de Bordeaux. Je tiens à préciser que pendant mes études universitaires j'ai suivi une formation en physique et que mon titre de docteur a également été délivré dans cette matière. Cependant, dès mon arrivée en France, au laboratoire de Chimie nucléaire analytique & bioenvironnementale (CNAB) à Bordeaux, j'ai embrassé et plus jamais quitté cette discipline qu'est la chimie analytique. Depuis que j'ai été recrutée en section 13 du CNRS (chimie physique, théorique et analytique) je travaille au sein d'une équipe interdisciplinaire, l'équipe ICS (Imagerie Chimique et Spéciation). Nos recherches se fondent sur l'utilisation des techniques de spectrométrie, comme la spectroscopie de fluorescence des rayons X, avec pour but de comprendre le rôle et les mécanismes de toxicité des métaux dans les systèmes biologiques, avec un intérêt particulier pour les métaux impliqués dans les maladies dégénératives. Je postule à une HDR en chimie parce que j'estime que, pour mes recherches, l'encadrement de jeunes chimistes serait pertinent, avec par exemple, un encadrement de thèse dans les spécialités de l'école doctorale chimie analytique ou chimie et technologies pour le vivant.

Je voudrais tout d'abord remercier les membres de mon jury. Merci à Yolanda Prezado, dont j'admire beaucoup la réussite, pour le courage dont elle a fait preuve en quittant l'Espagne, où elle occupait un poste hospitalier, pour poursuivre sa vocation de chercheuse, d'abord à l'ESRF, puis au CNRS, à l'Institut Curie à Paris.

Merci à Marie-Pierre Isaure, que je connais depuis longtemps par l'intermédiaire de Richard. Elle est calme, agréable et totalement passionnée par ses travaux de recherche, qu'elle combine avec l'enseignement sans jamais se plaindre. Je partage avec elle l'utilisation des techniques d'analyse synchrotron et de préparation cryogénique.

Je tiens à remercier Sophie Lecomte d'avoir accepté sans hésitation d'être rapportrice. Et ce, malgré toutes ses fonctions de directrice du laboratoire de Chimie et Biologie des Membranes et des Nano-objets. J'espère sincèrement que nous pourrons envisager des collaborations conjointes sur l'étude des maladies neurodégénératives, en combinant ses recherches sur l'implication de certaines protéines et notre expertise dans la détermination des métaux.

Je suis reconnaisante à Clotilde Policard d'avoir accepté de faire partie du jury. Je sais qu'elle a de nombreuses obligations professionnelles notamment en tant que professeure et directrice des études à l'Ecole Normale Supérieure. Son équipe de recherche est très active sur des sujets proches des nôtres, comme l'étude des métalloprotéines et l'utilisation des techniques d'imagerie synchrotron. J'espère donc que cette HDR servira de point de départ à des projets communs.

Et je remercie Richard Ortega, mon mentor. Il m'a toujours fait confiance et m'a encouragé pour mon concours CNRS en 2008, et aussi aujourd'hui pour mon HDR. Il est convaincu que les métaux jouent un rôle très important dans le fonctionnement du cerveau et il le démontre dans chaque publication, dans chaque demande de financement, lors des conférences, mais aussi dans sa vie quotidienne. Son enthousiasme de chercheur déborde de partout. Merci Richard pour ta patience, tu sais que sans toi je ne serais pas là où je suis aujourd'hui et je n'aurais pas fait tout ce que j'ai fait, tout ce que nous avons fait.
Ce mémoire de demande d'habilitation à diriger des recherches est structuré en cinq parties. Tout d'abord je présente mon curriculum vitæ détaillé, avec notamment la liste des publications scientifiques que j'ai produites et les conférences dans lesquelles ces travaux ont été diffusés. Dans cette partie, j'énumère aussi les étudiants que j'ai pu encadrer pendant toutes ces années et la position actuelle pour certains d'entre eux. Dans un deuxième temps, je fais un bilan de mes recherches depuis que je travaille au CNRS. Je présente les objectifs de mes recherches au sein de mon équipe, les techniques analytiques que nous utilisons ainsi que les processus de préparation des échantillons et de corrélation d'images que nous développons. À la fin de cette partie, je développe quelques projets avec lesquels j'illustre les capacités et les limites de nos techniques d'analyse, ce que nous ont apporté les avancées techniques et comment nous les avons adaptées à chaque étape et bien évidemment les résultats majeurs que nous avons mis en évidence. Dans la troisième partie, j'expose mon futur projet de recherche. Comment la réalisation de ce projet devient cruciale et inévitable dans l'avancement de mes recherches avec les outils actuels, comment la mise en œuvre de ce projet pourra nous aider à approfondir notre compréhension du rôle des métaux dans les systèmes biologiques. Ensuite je présente les conclusions que je retiens après avoir fait cette synthèse de mes activités. Finalement, dans la quatrième et dernière partie, je liste les références les plus importantes sur lesquelles je me suis appuyée, dont je me suis inspirée et avec lesquelles j'ai acquis d'innombrables connaissances.

Dans ce document vous constaterez que j'écris parfois à la première personne du singulier et d'autres à la première personne du pluriel. Cela est dû au fait que ces projets et ces recherches ont été réalisés avec mon équipe et mes collaborateurs sans lesquels ils n'auraient pas vu le jour. J'ai du mal – et je ne veux pas non plus – me détacher d'eux pour rédiger ce mémoire parce qu'ils m'ont accompagnée, indéniablement, dans mon esprit. Ainsi, considérez ce mémoire comme le fruit d'un travail commun dont j'ai fait la synthèse en présentant les parties dans lesquelles mon implication a été prépondérante.
# Partie A. Curriculum Vitae

Asunción CARMONA LUQUE

Née le 11 Septembre 1978 à Montalbán de Córdoba (Espagne).

Nationalité Espagnole

## 1. Fonction actuelle

Chargée de Recherche CNRS Classe Normale depuis 2008.

Institut de chimie, Section 13 : Chimie physique, théorique et analytique

Affectation : Laboratoire de Physique des 2 Infinis de Bordeaux

UMR5797-CNRS-Université de Bordeaux

19 Chemin du solarium, 33170 Gradignan, France

Tél : + (33) 557 120 908

Email : asuncion.carmona@u-bordeaux.fr

## 2. Parcours professionnel antérieur

Juin 2007-Octobre 2008, Chercheuse (post-doctorat) au CNRS, laboratoire de Chimie Nucléaire Analytique & Bioenvironnementale (CNAB) à Bordeaux, France, sous la direction du Dr R. Ortega. Le titre de mon projet était « Multimodal chemical imaging using ion beam analyses and synchrotron radiation for inorganic elements speciation in biological samples ».

## 3. Titres

Juillet 2005-Mars 2007, Doctorat en Physique. Réalisé au Centre National d'Accélérateurs (CNA), à l'Université de Séville, Espagne, sous la direction du Dr M. Respaldiza. Le titre de ma thèse était « Distribución de elementos químicos en células neuronales mediante técnicas nucleares de análisis ».

Mai 2002-Juillet 2005, DEA en Physique. Réalisé au Centre National d'Accélérateurs (CNA), à l'Université de Séville, Espagne, sous la direction du Dr M. Respaldiza. Mon travail du DEA portait le titre de « Determinación cuantitativa de fármacos a base de platino en tumores cerebrales de rata mediante aceleradores de partículas ».

Septembre 1996-Juin 2001, Master en Physique. Université de Cordoue, Espagne.
## 4. Publications

Depuis que je travaille dans la recherche j'ai participé à 50 publications dans des revues à comité de lecture dont 11 comme première auteur. Ces travaux ont été cités plus de 1700 fois avec un indice-h de 21 (Source Google Scholar Juillet 2022). Je suis co-auteure de 3 articles dans des revues sans comité de lecture, 8 comptes-rendus de conférences avec comité de lecture et 2 chapitres d'ouvrages.

### 4.1 Revues à comité de lecture

#### 2022

Trist BG, Genoud S, Roudeau S, Rookyard A, Abdeen A, Cottam V, Hare DJ, White M, Altvater J, Fifita JA, Hogan A, Grima N, Blair IP, Kysenius K, Crouch PJ, **Carmona A**, Rufin Y, Claverol S, Van Malderen S, Falkenberg G, Paterson DJ, Smith B, Troakes C, Vance C, Shaw CE, Al-Sarraj S, Cordwell S, Halliday G, Ortega R, Double KL. (2022) Altered SOD1 maturation and post-translational modification in amyotrophic lateral sclerosis spinal cord. Brain, awac165.

Ortega R., **Carmona A.** (2022) Neurotoxicity of Environmental Metal Toxicants: Special Issue. Toxics, 10, 382.

**Carmona A.**, Chen S., Domart F., Choquet D., Ortega R. (2022) Imaging the structural organization of chemical elements in growth cones of developing hippocampal neurons. Metallomics, 14(1), mfab073.

#### 2021

**Carmona A.**, Roudeau S., Ortega R. (2021) Molecular mechanisms of environmental metal neurotoxicity: focus on the interactions of metals with synapse structure and function. Toxics, 9(9), 198.

Roudeau S., Trist B., **Carmona A.**, Davies K., Halliday G., Rufin Y., Claverol S., Van Malderen S., Falkenberg G., Double K., Ortega R. (2021). Native separation and metallation analysis of SOD1 protein from the human central nervous system: a methodological workflow. Analytical Chemistry, 93, 32, 11108–11115.

**Carmona A.**, Porcaro F., Somogyi A., Roudeau S., Domart F., Medjoubi K., Aubert M., Isnard H., Nonell A., Rincel A., Paredes E., Vidaud C., Malard V., Bresson C., Ortega R. (2021). Cytoplasmic aggregation of uranium in human dopaminergic cells after continuous exposure to soluble uranyl at non-cytotoxic concentrations. NeuroToxicology, 82, 35-44.

Mitchell E.J., Frisbie S.H., Roudeau S., **Carmona A.**, Ortega R. (2021). How much manganese is safe for infants? A review of the scientific basis of intake guidelines and regulations relevant to the manganese content of infant formulas. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 65, 126710.

#### 2020

Domart F., Cloetens P., Roudeau S., **Carmona A.**, Verdier E., Choquet D., Ortega R. (2020). Correlating STED and synchrotron XRF nano-imaging unveils cosegregation of metals and cytoskeleton proteins in dendrites. eLife, 9, e62334.
Mitchell E.J., Frisbie S.H., Roudeau S., **Carmona A.**, Ortega R. (2020). Estimating daily intakes of manganese due to breast milk, infant formulas, or young child nutritional beverages in the United States and France : Comparison to sufficiency and toxicity thresholds. *Journal of Trace Elements in Medicine and Biology*, 62:126607.

2019

Frisbie S.H., Mitchell E.J., Roudeau S., Domart F., **Carmona A.**, Ortega R. (2019). Manganese levels in infant formula and young child nutritional beverages in the United States and France : comparison to breast milk and regulations. *PLoS ONE*, 14 (11) : e0223636.

**Carmona A.**, Roudeau S., Perrin L., Carcenac C., Vantelon D., Savasta M., Ortega R. (2019). Mapping chemical elements and iron oxidation states in the substantia nigra of 6-hydroxydopamine lesioned rats using correlative immunohistochemistry with proton and synchrotron micro-analysis. *Frontiers in Neuroscience*, 13:1014.

Das S., **Carmona A.**, Khatua K., Porcaro F., Somogyi A., Ortega R., Datta A. (2019). Manganese mapping using a fluorescent Mn2+ sensor and nanosynchrotron X-ray fluorescence reveals the role of the Golgi apparatus as a manganese storage site. *Inorganic Chemistry*, 58 (20), 13724-13732.

Das S., Khatua K., Rakshit A., **Carmona A.**, Sarkar A., Bakthavatsalam S., Ortega R., Datta A. (2019). Emerging chemical tools and techniques for tracking biological manganese. *Dalton Transactions*, 48 (21), 7047-7061.

**Carmona A.**, Zogzas C.E., Roudeau S., Porcaro F., Garrevoet J., Spiers K., Salome M., Cloetens P., Mukhopadhyay S., Ortega R. (2019). SLC30A10 mutation involved in parkinsonism results in manganese accumulation within nano-vesicles of the Golgi apparatus. *ACS Chemical Neuroscience*, 10 (1), 599-609.

2018

**Carmona A.**, Malard V., Avazeri E., Roudeau S., Porcaro F., Paredes E., Vidaud C., Bresson C., Ortega R. (2018). Uranium exposure of human dopaminergic cells results in low cytotoxicity, accumulation within sub-cytoplasmic regions, and down regulation of MAO-B. *NeuroToxicology*, 68, 177-188.

Porcaro F., Roudeau S., **Carmona A.**, Ortega R. (2018). Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. *Trends in Analytical Chemistry*, 104, 22-41.

2017

Trist B.G., Davies K.M., Cottam V., Genoud S., Ortega R., Roudeau S., **Carmona A.**, De Silva K., Wasinger V., Lewis S.J.G., Sachdev P., Smith B., Troakes C., Vance C., Shaw C., Al-Sarraj S., Ball H.J., Halliday G.M., Hare D.J., Double K.L. (2017). Amyotrophic lateral sclerosis-like superoxide dismutase 1 proteinopathy is associated with neuronal loss in Parkinson's disease brain. *Acta Neuropathologica*, 134 (1), 113-127.

Perrin L., Roudeau S., **Carmona A.**, Domart F., Petersen J.D., Bohic S., Yang Y., Cloetens P., Ortega R. (2017). Zinc and copper effects on stability of tubulin and actin networks in dendrites and spines of hippocampal neurons. *ACS Chemical Neuroscience*, 8 (7), 1490-1499.

**Carmona A.**, Roudeau S., L'Homel B., Pouzoulet F., Bonnet-Boissinot S., Prezado Y., Ortega R. (2017). Heterogeneous intratumoral distribution of gadolinium nanoparticles within U87 human glioblastoma xenografts unveiled by micro-PIXE imaging. *Analytical Biochemistry*, 523, 50-57.
Edou-Minko A., Moussavou M., Sato T., Tchikoundzi C., Sawaki Y., Ndong Ondo S., Ortega R., Maire R., Kaestner A., Mbina Mounguengui M., Roudeau S., Fleury G., **Carmona A.**, de Parseval Ph., Mvoubou M., Moussavou B.M., Agondjo M.O., Sasaki O., Maruyama S. (2017). An Akouemma hemisphaeria organic macrofossils colony hosting biodiversity assemblage on the seafloor of Okondja Basin (Gabon) dated at 2.2 Ga. *Journal of Geology and Geophysics*, 6, 2.

Edou-Minko A., Moussavou M., Sato T., Sawaki Y., Ndong Ondo S., Maire R., Fleury G., Mbina Mounguengui M., Kaestner A., Ortega R., Roudeau S., **Carmona A.**, Mvoubou M., Moussavou B.M., Sasaki O., Maruyama S. (2017). Growth, duplication and lateral mutual compressive deformation of Akouemma hemisphaeria on the seafloor of Okondja Basin at 2.2 Ga (Gabon). *International Journal of Geosciences*, 8 (9), 1172-1191.

2016

Ortega R., **Carmona A.**, Roudeau S., Perrin L., Dučić T., Carboni E., Bohic S., Cloetens P., Lingor P. (2016). α-Synuclein over-expression induces increased iron accumulation and redistribution in iron-exposed neurons. *Molecular Neurobiology*, 53 (3), 1925-1934.

2015

Perrin L., **Carmona A.**, Roudeau S., Ortega R. (2015). Evaluation of sample preparation methods for single cell quantitative elemental imaging using proton or synchrotron radiation focused beams. *Journal of Analytical Atomic Spectrometry*, 30 (12), 2525-2532.

Roudeau S., Chevreux S., **Carmona A.**, Ortega R. (2015). Reduced net charge and heterogeneity of pl isoforms in familial amyotrophic lateral sclerosis mutants of copper/zinc superoxide dismutase. *Electrophoresis*, 36 (19), 2482-2488.

Moussavou M., Edou-Minko A., Mbina Mounguengui M., Ortega R., Fleury G., Roudeau S., **Carmona A.**, Genty D., Blamart D., Tchikoundzi C., Makaya Mvoubou., Musavu Moussavou B., Ndong Ondo., Ogandaga Agondjo M., Dewilde F., Delorme G., de Parseval Ph., Weil R., Maire R. (2015). Multicellular Consortia Preserved in Biogenic Ductile-Plastic Nodules of Okondja Basin (Gabon) by 2.1 Ga. *Journal of Geology & Geophysics*, 4 (195), 2.

Gil S., **Carmona A.**, Martínez-Criado G., León A., Prezado Y., Sabés M. (2015). Analysis of platinum and trace metals in treated glioma rat cells by X-ray fluorescence emission. *Biological Trace Element Research*, 163 (1-2), 177-183.

2014

Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin L., Ortega R. (2014). Correlative organelle fluorescence microscopy and synchrotron X-ray chemical element imaging in single cells. *Analytical and Bioanalytical Chemistry*, 406 (27), 6979-6991.

Ortega R., Bresson C., Darolles C., Gautier C., Roudeau S., Perrin L., Janin M., Floriani M., Aloin V., **Carmona A.**, Malard V. (2014). Low-solubility particles and a Trojan-horse type mechanism of toxicity: the case of cobalt oxide on human lung cells. *Particle & Fibre Toxicology*, 11, 14.
**Carmona A.**, Roudeau S., Perrin L., Veronesi G., Ortega R. (2014). Environmental manganese compounds accumulate as Mn(II) within the Golgi apparatus of dopamine cells : relationship between speciation, subcellular distribution, and cytotoxicity. *Metallomics*, **6 (4)**, 822-832.

Davies K.M., Bohic S., **Carmona A.**, Ortega R., Cottam V., Hare D.J., Finberg J.P.M., Reyes S., Halliday G.M., Mercer J.F.B, Double K.L., (2014). Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease. *Neurobiology of Ageing*, **35 (4)**, 858-866.

Matsuyama S., Ishii K., Watanabe K., Terakawa A., Kikuchi Y., Fujiwara M., Sugai H., Karahashi M., Nozawa Y., Yamauchi S., Fujisawa M., Ishiya M., Nagaya T., Ortega R., **Carmona A.**, Roudeau S. (2014). Improvement and recent applications of the Tohoku microbeam system. *Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B*, **318**, 32-36.

Matsuyama S., Ishii K., Toyama S., Watanabe K., Koshio S., Kasahara K., ItoS., Terakawa A., Fujikawa M., Suzuki Y., **Carmona A.**, Roudeau S., Ortega R. (2014). 3D imaging of human cells by using PIXEµCT. *International Journal of PIXE*, **24 (01n02)**, 67-75.

2013

Bresson C., Darolles C., **Carmona A.**, Gautier C., Sage N., Roudeau S., Ortega R., Ansoborlo E., Malard V. (2013). Cobalt chloride speciation, mechanisms of cytotoxicity on human pulmonary cells, and synergistic toxicity with zinc. *Metallomics*, **5 (2)**, 133-143.

2012

Ortega R., **Carmona A.**, Llorens I., Solari P.L. (2012). X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. *Journal of Analytical Atomic Spectrometry*, **27 (12)**, 2054-2065.

Ortega R., **Carmona A.** (2012). High spatial resolution chemical imaging of inorganic and organometallic pesticides. *Journal of Environmental Analytical Toxicology*, **S4-005**.

Chevreux S., Llorens I., Solari P.-L., Roudeau S., Devès G., **Carmona A.**, Testemale D., Hazemann J.L., Ortega R. (2012). Coupling of native IEF and Extended X-ray Absorption Fine Structure to characterize zinc binding sites from pl isoforms of SOD1 and A4V pathogenic mutant. *Electrophoresis*, **33 (8)**, 1276-1281.

Kosior E., Bohic S., Suhonen H., Ortega R., Devès G., **Carmona A.**, Marchi F., Guillet J.F., Cloetens P. (2012). Combined use of hard X-ray phase contrast imaging and X-ray fluorescence microscopy for subcellular metal quantification. *Journal of Structural Biology*, **177 (2)**, 239-247.

2010

**Carmona A.**, Devès G., Roudeau S., Cloetens P., Bohic S., Ortega R. (2010). Manganese accumulates within Golgi apparatus in dopaminergic cells as revealed by synchrotron X-Ray fluorescence nano-imaging. *ACS Chemical Neurosciences*, **1 (3)**, 194-203.

2009

Chevreux S., Roudeau S., Fraysse A., **Carmona A.**, Devès G., Solari P.-L., Mounicou S., Lobinski R., Ortega R. (2009). Multimodal analysis of metals in copper-zinc superoxide dismutase isoforms separated on electrophoresis gels. *Biochimie* **91 (10)**, 1324-1327.
Ortega R., Devès G., **Carmona A.** (2009). Bio-metals imaging and speciation in cells using proton and synchrotron radiation X-ray micro-spectroscopy. J. R. Soc. Interface 6 (suppl_5), S649–S658.

Devès G., Roudeau S., **Carmona A.**, Lavielle S., Gionnet K., Déléris G., Ortega R. (2009). Fluorine micro-imaging and quantification using nuclear reaction analysis : a new tool for tissue distribution validation of positron emission tomography tracers. Applied Physics Letters 95 (2), 023701.

Kawamura Y., Ishii K., Matsuyama S., Nakhostin M., Fujiwara M., Tsuboi S., Yamanaka K., Watanabe M., Okura S., Hashimoto Y., Fujikawa M., Hatori Y., Hamada N., Fujiki K., Yamazaki H., Ortega R., Deves G., **Carmona A.** (2009). 3D imaging of human cells by using PIXE-μ-CT. International Journal of PIXE, 19 (01n02), 29-37.

2008

Chevreux S., Roudeau S., Fraysse A., **Carmona A.**, Devès G., Solari P.L., Weng T.C., Ortega R. (2008). Direct speciation of metals in copper-zinc superoxide dismutase isoforms on electrophoresis gels using X-ray absorption near edge structure. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 23 (8), 1117-1120.

**Carmona A.**, Cloetens P., Devès G., Bohic S., Ortega R. (2008). Nano-imaging of trace metals by synchrotron X-ray fluorescence into dopaminergic single cells and neurite-like processes. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 23 (8), 1083-1088.

**Carmona A.**, Devès G., Ortega R. (2008). Quantitative micro-analysis of metal ions in subcellular compartments of cultured dopaminergic cells by combination of three ion beam techniques. Analytical Bioanalytical Chemistry, 390 (6), 1585-1594.

Respaldiza M.A., Ager F.J., **Carmona A.**, Ferrer J., García M., García J., García I., Gómez B., Morilla Y., Ontalba M.A., Ortega I. (2008). Accelerator-based research activities at "Centro Nacional de Aceleradores", Seville (Spain). Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 266, 2105-2109.

2007

Ortega R., Cloetens P., Devès G., **Carmona A.**, Bohic S. (2007). Iron storage within dopamine neurovesicles revealed by chemical nano-imaging. PLoS ONE, 2(9), e925.

Bacquart T., Devès G., **Carmona A.**, Tucoulou R., Bohic S., Ortega R. (2007). Subcellular speciation analysis of trace element oxidation states using synchrotron radiation micro-X-ray absorption near edge structure. Analytical Chemistry, 79 (19), 7353-7359.

2006

Wierzchos J., Ascaso C., Ager F.J., García I., **Carmona A.**, Respaldiza M.A. (2006). Identifying elements in rocks from the Dry Valleys desert (Antarctica) by ion beam proton induced X-ray emission. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 249, 571-574.

2005

Ortega R., Biston M.C., Devès G., Bohic S., **Carmona A.** (2005). Nuclear microprobe determination of platinum quantitative distribution in rat brain tumors after cisplatin or carboplatin injection for PAT treatment of glioma. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 231, 321-325.
## 4.2 Revues sans comité de lecture

**Carmona A.**, Cloetens P., Devès G., Bohic S., Ortega R. (2008). Nano-imaging of trace metals by synchrotron X-ray fluorescence into dopaminergic single cells and neurite-like processes. Virtual Journal of Chemical Biology, 9.

Chevreux S., Roudeau S., Fraysse A., **Carmona A.**, Devès G., Solari P.L., Weng T.C., Ortega R. (2008). Direct speciation of metals in copper-zinc superoxide dismutase isoforms on electrophoresis gels using X-ray absorption near edge structure. Virtual Journal of Chemical Biology, 9.

## 4.3 Actes de colloques

**Carmona A.**, Zogzas C., Roudeau S., Porcaro F., Garrevoet J., Spiers K., Salomé M., Cloetens P., Mukhopadhyay S., and Ortega R. (2019) SLC30A10 mutation involved in parkinsonism results in manganese accumulation within nano-Vesicles of the Golgi apparatus revealed by synchrotron X-Ray fluorescence imaging. *The Toxicologist, Supplement to Toxicological Sciences*, 168 (1), 94.

Trist B., Davies K., Cottam V., Genoud S., Ortega R., Roudeau S., **Carmona A.**, Silva D.K., Wasinger V., Halliday G., Hare D., Double K. (2017). Novel superoxide dismutase-1 proteinopathy is associated with Lewy pathology and neuronal loss in Parkinson's disease. Journal of Neurochemistry 142, 111-111

Trist B.G., Davies K.M., Genoud S., Smoothy V., Halliday G.M., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K.L. (2016). Sod1 aggregation : A pathological link between Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis?. *Movement Disorders, 31*, S241-S242.

Ortega R., Roudeau S., Perrin L., **Carmona A.** (2016) Correlative Chemical Element Imaging in Cells Using Fluorescence Microscopy and Synchrotron X-ray Fluorescence. *Microscopy and Microanalysis* 22 (S3), 1094-1095.

**Carmona A.**, Roudeau S., Ortega R., Pouzoulet F., Prezado Y. (2016) Particle Induced X-ray Emission Imaging of Gadolinium Distribution into Xenograft U87 Human Glioblastoma after AGuIX Nanoparticles Injection. *Microscopy and Microanalysis* 22 (S3), 210-211.

Trist B., Davies K.M., Genoud S., Smoothy V., Halliday G.M., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K.L. (2016) SOD1 aggregation: A pathological link between Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis? *Movement Disorders, 31*, S241-S242.

Bresson C., Darolles C., **Carmona A.**, Gautier C., Sage N., Roudeau S., Ortega R., Ansoborlo E., Malard V. (2013). Cobalt chloride speciation, mechanisms of cytotoxicity on human pulmonary cells, and synergistic toxicity with zinc. *Toxicology Letters*, 221, S167-S168.

49th Congress of the European-Societies-of-Toxicology (EUROTOX)

Bohic S., Carmona A., Ortega R., Reyes S., Carew-Jones F., Double K. (2009). P3. 052 Metallomics of neuromelanin in Parkinsonian syndromes. *Parkinsonism & Related Disorders* 15, S161-S162.
## 4.4 Chapitre d'ouvrages

Ortega R., Carmona A. Golgi apparatus functions in manganese homeostasis and detoxification. In: Golgi apparatus: Structure, Functions and Mechanisms. Ed: Christopher J. Hawkins, Nova Science Publishers, Inc., New York pp.151-160. ISBN 978-1-61122-051-3, 2011.

Ager F.J., Carmona A., Ferrer F.J., García-López J., García-Orellana I., Gómez-Tubío B., Morilla Y., Ontalba M.A., Respaldiza M.A., Ynsa M.D. Caracterización de materiales mediante técnicas IBA en el Centro Nacional de Aceleradores, In: Avances en Ciencia y Tecnología del Acero Inoxidable II, Eds. J.A. Odriozola, J. Botella, C. Merino, pp. 309-316, 2003.

# 5. Encadrement

## 5.1 Post-Doctorants et visiteurs scientifiques

-2017-2019. Co-responsable du post doctorat de Dr Francesco PORCARO. « Imagerie chimique par faisceau d'ions de la distribution neuronal de l'uranium ». Université de Bordeaux. Publications : 5. Communications : 9. Actuellement attaché de recherche clinique dans la société Covance en Italie.

-2017 (3 mois). Co-encadrement visiteur scientifique, Dr Erin MCALLUM. The Florey Institute of Neuroscience, Université de Melbourne, Australie. « Metals and protein aggregation in neurodegenerative disease ».

-2010-2015. Co-responsable du post doctorat de Dr Laura PERRIN-VERDUGIER. « Nano-chemical imaging of the dopaminergic cells ». Université de Bordeaux. Publications : 8. Communications : 13. Actuellement professeur de Biotechnologie à L'Académie de Poitiers.

-2015 (1 mois). Co-encadrement du séjour de formation du Dr M. El Bast, venu au laboratoire avec le programme international « Training Program IAEA Scientific Visitor » pour se former aux techniques d'analyse par faisceaux d'ions.

-2013 (1 mois). Co-encadrement du séjour de formation du Dr Joanna DUDALA, venue au laboratoire avec le programme international. « Training Program IAEA Scientific Visitor ». L'objectif de son stage était d'apprendre les softwares GUPIX et SIMNRA utilisés pour le traitement de données des techniques PIXE et RBS (techniques de faisceau d'ions) pour la quantification des éléments dans des tissues fins biologiques.

## 5.2 Doctorant

-2016-2019. Co-encadrement du doctorat de Florelle DOMART. « Nano-imagerie corrélative de fluorescence X synchrotron et de super résolution des métaux et des protéines dans les synapses de neurones d'hippocampe ». Université de Bordeaux. Ecole doctorale des Sciences Chimiques. Publications : 4. Congrès : 4. Actuellement en post doc à l'Université de Göttingen.
-2010 Encadrement de Silvia GIL DURAN, doctorante de l'Université de Barcelone, lors de son séjour au laboratoire pour se former à la préparation des échantillons biologiques pour analyses par fluorescence de rayons X. En 2012 j'ai fait partie de son jury de thèse intitulé « New strategies in the treatment of radio resistant tumor cells by using synchrotron radiation and metallic compounds » soutenue à l'Université de Barcelone.

## 5.3 Stages de formation

-2022 (2 mois). Encadrement du stage L3 Physique Chimie de Isaac Robinson-Johnston. « Imagerie ultra-structurale et chimique des métaux dans les synapses neuronales : analyses par microscopie électronique ». Convention d'échanges entre l'Université de Bordeaux et Northern Arizona University.

-2016 (6 mois). J'ai participé à l'encadrement du stage M2 de Hao ZHOU. « Métallation des isoformes de point isoélectrique de la superoxyde dismutase 1 ». Université de Bordeaux- UTC Université de Technologie Compègne.

-2015 (6 mois). Co-encadrement du stage M2 du Batiste L'HOMEL. « Imagerie chimique cellulaire : étude des mécanismes de toxicité des composés environnementaux du manganèse ». Université de Bordeaux. Publications :1.

-2012 (6 semaines). Co-encadrement du stage L2 d'Elise GILABERT. « Stress chimique cellulaire suite à l'exposition au cobalt insoluble ». Université de Bordeaux.

-2012 (4 semaines). Co-encadrement du stage de Matthias PORTELLANO comme assistant laboratoire. Université de Bordeaux-UTC Université de Technologie Compègne. Il a travaillé sur le design d'un porte-échantillon spécifique à AIFIRA pour des échantillons biologiques de « grand taille ».

Pendant plusieurs années j'ai aussi accueillie des élèves de troisième qui venaient découvrir le laboratoire. Ils étaient accueillis dans le cadre d'un projet du laboratoire, nome START, dans lequel l'objectif était de résoudre une enquête après avoir rencontré et compris les activités des différentes équipes qui composent le laboratoire.

# 6. Communications

## 6.1 Conférences invitées dans des congrès internationaux

Frisbie Seth, Michell Erika, Ortega R, Roudeau S, **Carmona A.** « Excess Manganese in Infant Formula». International Virtual Seminar organized by the Universities of Norwich and Bordeaux, 23 February 2021.

**Carmona A.**, Roudeau S., Pouzoulet F., Prezado Y., and Ortega R. Imaging the distribution of metallic compounds used for cancer treatment within tumors using micro-PIXE. 9th International symposium on BioPIXE. Iguazu Falls, Brazil, 7-12 January 2018.
## 6.2 Communications dans des congrès, séminaires et conférences

2022

**Carmona A.**, Somogyi A., Roudeau S., Porcaro F., Medjoubi K., Vidaud C., Malard V., Bresson C., Ortega R. X-ray fluorescence imaging of uranium distribution in human dopaminergic cells. 15th International Conference on X-ray Microscopy, 19-24 June 2022 (poster, virtual).

Domart F., Cloetens P., Roudeau S., **Carmona A.**, Verdier E., Choquet D., **Ortega R.** Correlating STED and synchrotron XRF nano-imaging to explore metal functions in synapses. 15th International Conference on X-ray Microscopy, 19-24 June 2022 (conference, virtual).

**Roudeau S.**, Trist B.G., **Carmona A.**, Davies K.M., Halliday G.M., Rufin Y., Claverol S., Van Malderen S.J.M., Falkenberg G., Double K.L., Ortega R. Coupling SEC and IEF to SXRF for the metallation analysis of SOD1 enzyme isolated from the human central nervous system. 15th International Conference on X-ray Microscopy, 19-24 June 2022 (poster, virtual).

**Carmona A.**, Roudeau S., **Ortega R.** Synchrotron X-ray fluorescence nano-imaging as a tool to study the mechanisms of metal-induced synaptic neurotoxicity. 61st Annual Meeting Society of Toxicology, San Diego, USA, March 21-31, 2022 (poster - virtual).

2019

**Carmona A.**, Zogzas C.E., Roudeau S., Porcaro F., Garrevoet J., Spiers K.M., Salomé M., Cloetens P., Mukhopadhyay S., Ortega R. SLC30A10 mutation involved in parkinsonism results in manganese accumulation in Golgi vesicles revealed by synchrotron XRF nano-imaging. ESRF User Meeting, Symposium: X-ray microscopy in biology: recent applications, challenges and opportunities. Grenoble, France, 4-6 February, 2019 (oral).

**Carmona A.**, Zogzas C.E., Roudeau S., Porcaro F., Garrevoet J., Spiers K.M., Salomé M., Cloetens P., Mukhopadhyay S., **Ortega R.** SLC30A10 mutation involved in parkinsonism results in manganese accumulation within nano-vesicles of the Golgi apparatus revealed by synchrotron X-ray fluorescence imaging. 58th Annual Meeting of the Society of Toxicology. Baltimore, Maryland, USA, 10-14 March 2019 (poster).

**Carmona A.**, Zogzas C.E., Roudeau S., Porcaro F., Garrevoet J., Spiers K.M., Salomé M., Cloetens P., Mukhopadhyay S., **Ortega R.** SLC30A10 mutation involved in parkinsonism results in manganese accumulation within nano-vesicles of the Golgi apparatus revealed by synchrotron X-ray fluorescence imaging. Cell Biology of Metals Gordon Research Conference. Castelldefels, Spain, 14-19 July 2019 (poster).

Domart F., Cloetens P., **Carmona A.**, Roudeau S., Verdier E., Choquet D., **Ortega R.** Correlating Super Resolution Microscopy with Synchrotron X-ray Fluorescence Imaging to Study Metal Functions in Neuronal Synapses. Workshop: Quelques défis scientifiques à la lumière des synchrotrons de 4ème génération. Paris, France 16-17 September 2019 (poster).

**Domart F.**, **Carmona A.**, Roudeau S., Porcaro F., Cloetens P., Choquet D., Ortega R. Development of nanoscopic correlative imaging (X-ray/photonic) to study the role of metals in the neuronal cytoskeleton. NeuroFrance, Marseille, France, 22-24 May 2019 (poster).
**Domart F., Carmona A.** Roudeau S., Porcaro F., Cloetens P., Choquet D., Ortega R. Nanoscopic Correlative Imaging (X-ray/photonic): A New Method to Study the Role of Metals in neuronal cytoskeleton and plasticity. Cell Biology of Metals Gordon Research Conference. Castelldefels, Spain, 14-19 July 2019 (poster).

**Trist B.**, Cordwell S., Hare D., Blair I., Fifita J., Roudeau S., **Carmona A.**, Ortega R., Double K. SOD1 dysfunction and disease mechanisms in postmortem ALS tissue. 39th Annual Meeting of the Australasian Neuroscience Society. Adelaide, Australia, 2-5 December 2019 (oral).

**Trist B.**, Cordwell S, Hare D, Fifita J, Roudeau S, Carmona A, Ortega R and Double K. SOD1 dysfunction and disease mechanisms in postmortem ALS tissues. 30th International Symposium in Motor Neuron Disease. Perth, Australia, December 4-6 2019 (oral)

**Bresson C.**, Paredes E., Malard V., Vidaud C., Ortega R., **Carmona A.**, Roudeau S., Porcarod F., Avazeri E., Robert M., Guigonis J.M. Investigation of uranium effects on neuron-like cells: an interdisciplinary analytical approach. European Winter Conference on Plasma Spectrochemistry. Pau, France, 3-8 February 2019 (poster).

2018

**Das S.**, Khatua K., **Carmona A.**, Porcaro F., Ortega R., Datta A. Sensing Manganese(II). 9th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference AsBIC. Singapour, 9-14 December, 2018 (oral).

**Carmona A.**, Roudeau S., Porcaro F., Malard V., Vidaud C., Paredes E., Bresson C., **Ortega R.** Contribution of micro-PIXE imaging to understand the mechanisms of uranium neurotoxicity. 9th International Symposium on BioPIXE. Iguazu Falls, Brazil, 7-12 January 2018 (oral).

**Porcaro F., Carmona A.**, Roudeau S., Domart F., Somogyi A., Malard V., Vidaud C., Bresson C., Ortega R. Uranium distribution in human dopaminergic cells imaged by means of synchrotron XRF with 300 nm spatial resolution. 1ères Journées d'Etude de la Chimie sous Rayonnement et de la Radiochimie, Strasbourg, France, 27 May 1 Jun 2018 (oral).

2016

**Carmona A.**, Roudeau S., Ortega R., Pouzoulet F., Prezado Y. Particle induced X-ray emission imaging of gadolinium distribution into xenograft U87 human glioblastoma after AGuIX nanoparticles injection. Microscopy and Microanalysis, Columbus, USA, 24-28 July 2016 (poster).

**Trist B.**, Genoud S., Davies K.M., Smoothy V., Halliday G.M., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K.L. A pathological link between Parkinson's disease and Amyotrophic Lateral Sclerosis? 20th International Congress of Parkinson's Disease and Movement Disorders, Berlin, Germany, 19-23 June, 2016 (poster).

**Trist B.**, Genoud S., Davies K.M., Cottam V., Halliday G.M., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K.L. A novel vulnerability specific pathology in the Parkinson's brain provides support for coinciding neuropathological paradigms. The Australian Biology of Aging Conference, Coogee, Australia, April 29 2016 (oral).
**Roudeau S.**, Davies K., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Double K.L., Ortega R. Characterization of SOD1 pl isoforms in amyotrophic lateral sclerosis and Parkinson's disease: net charge, metal content and number of isoforms. 6th International Conference on Metals in Genetics, Chemical Biology, and Therapeutics, Bangalore, India, 17-20 February 2016 (oral).

**Davies K.M.**, Trist B., Cottam V., Hare D., Bohic S., **Carmona A.**, Ortega R, Double K. (2016) Copper and iron changes in Parkinson's disease brain; implications for aetiology and potential for novel treatments. 14th Meeting of The Asian-Pacific Society for Neurochemistry, Kuala Lumpur, Malaysia, 27-30 August 2016 (oral).

**Trist B.**, Genoud S., Davies K.M., Smoothy V., Halliday G., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K. (2016) A novel vulnerability specific pathology in the Parkinson's brain; providing support for coinciding neuropathological paradigms, 39th annual meeting of the Japanese Neuroscience Society, Yokohama, Japan, 20-22 July, 2016 (poster).

2015

**Carboni E.**, Lingor P., **Carmona A.**, Roudeau S., Barski E., Ortega R. Alpha-synuclein affects trace metal content in primary neuronal cultures. 45th Annual Meeting of Society for Neuroscience (SfN), Chicago, USA, 17-21 October 2015 (poster).

**Trist B.G.**, Davies K.M., Cottam V., Halliday G.M., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K.L. A novel proteinaceous aggregate associated with neuronal loss in Parkinson's disease. 25th Meeting of the International Society for Neurochemistry, Cairns, Australia, 23-27 August, 2015 (poster).

**Trist B.G.**, Davies K.M., Cottam V., Halliday G.M., Roudeau S., **Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Ortega R., Double K.L. A novel proteinaceous aggregate associated with neuronal loss in Parkinson's disease. Dementia, Aging and Neurodegenerative Diseases ISN Satellite Meeting, Cairns, Australia, August 22, 2015 (oral).

2014

**Carmona A.**, Roudeau S., Perrin L., Ortega R. Organelle fluorescence microscopy and synchrotron X-ray chemical element imaging in single cells. 12th International Conference on X-Ray Microscopy, Melbourne, Australia, 26-31 October 2014 (poster).

**Ortega R.**, Roudeau S., Perrin L., Veronesi G., **Carmona A.** Environmental manganese compounds accumulate as Mn(II) within the Golgi apparatus of dopamine cells: relationship between speciation, subcellular distribution and cytotoxicity. 12th International Conference on X-Ray Microscopy, Melbourne, Australia, 26-31 October 2014 (poster).

**Ortega R.**, **Carmona A.**, Roudeau S., Perrin L., Darolles C., Gautier C., Janin M., Flriani M., Aloin V., Bresson C., Malard V. Contribution of micro-PIXE to investigate the toxicology of particulate cobalt on human lung cells. 14th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications, Padova, Italy, 6-11 July 2014 (poster).

**Ortega R.**, **Carmona A.**, Roudeau S., Perrin L., Darolles C., Gautier C., Janin M., Flriani M., Aloin V., Bresson C., Malard V. Contribution of micro-PIXE to investigate the toxicology of soluble and particulate cobalt on human lung cells. 8th International Symposium on BioPIXE, Bled, Slovenia, 14-19 September 2014 (orale).
**Roudeau S.**, Davies K.M., **Carmona A.**, Perrin L., Double K.L., Ortega R. Coupling of isoelectric focusing with PIXE for the study of CuZnSOD in neurodegenerative diseases. 8th International Symposium on BioPIXE, Bled, Slovenia, 14-19 September 2014 (oral).

**Carboni E.**, Roudeau S., Barski L., Tatenhorst L., Bähr M., **Carmona A.**, Ortega R., Lingor P. Influence of α-synuclein on intracellular levels of transition metals. 9th FENS Forum of Neuroscience, Milan, Italy, 5-9 July 2014 (poster).

2013

**Carmona A.**, **Ortega R.** Iron storage within dopamine vesicles revealed by synchrotron radiation X-ray fluorescence nano-imaging. 4th European Synapse Meeting, Bordeaux, France, 28-30 August 2013 (poster).

**Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Carcenac C., Roudeau S., Bohic S., Carrez D., Wu T.D., Marco S., Guerquin-Kern J.L., Savasta M., Ortega R. Iron distribution in 6-OHDA animal and cellular models of Parkinson's disease using high spatial resolution PIXE, SXRF and SIMS. 13th International Conference on Particle Induced X-ray Emission, Gramado, Brazil, 3-8 March 2013 (oral).

**Matsuyama S.**, Ishii K., Terakawa A., Kikuchi Y., Fujiwara M., Sugai H., Karahashi M., Nozawa Y., Yamauchi S., Watanabe K., Fujisawa M., Ishiya M., Nagaya T., Ortega R., **Carmona A.**, Roudeau S. Improvement of the Tohoku microbeam system for nanoscopic analysis. 13th International Conference on Particle Induced X-ray Emission, Gramado, Brazil, 3-8 March 2013 (poster).

**Bresson C.**, Darolles C., **Carmona A.**, Gautier C., Sage N., Roudeau S., Ortega R., Ansoborlo E., Malard V. Cobalt chloride speciation, mechanisms of cytotoxicity on human pulmonary cells, and synergistic toxicity with zinc. 49th Congress of the European Societies of Toxicology (EUROTOX), Interlaken, Suisse, 1-4 September 2013 (poster).

**Bresson C.**, Darolles C., **Carmona A.**, Gautier C., Sage N., Roudeau S., Ortega R., Ansoborlo E., Malard V. Speciation and toxicity of cobalt on human lung cells : an interdisciplinary study. XXXVIII Colloquium Spectroscopicum Internationale, Tromsø, Norway, 16-20 June 2013 (oral).

**Ortega R.**, Roudeau S., **Carmona A.** Methods for micro-chemical imaging of inorganic elements in speleothems from the Human Cradle in South Africa and from other origins. Biennial Conference of Association of Southern African Professional Archaeologists (ASAPA), Gaborone, Botswana, 3-7 July 2013 (poster).

2012

**Ortega R.**, **Carmona A.**, Roudeau S., Bresson C., Darolles C., Gautier C., Ansoborlo E., Malard V. Imagerie chimique par microfaisceau d'ions pour l'étude de la toxicologie nucléaire du cobalt. XIIIèmes Journées Nationales de Radiochimie et de Chimie Nucléaire, Nantes, France, 4-5 Octobre 2012 (oral).

**Bresson C.**, Darolle C., **Carmona A.**, Gautier C., Roudeau S., Ortega R., Ansoborlo E., Malard V. Cobalt chloride toxicity, speciation, subcellular distribution and impact on Zn-homeostasis on human pulmonary epithelial cells. 5th International meeting dedicated to Metals Homeostasis (IMBG), Autrans, France, 19-21 September 2012 (poster).
**Carmona A.**, Perrin-Verdugier L., Roudeau S., Devès G., Bohic S., Carrez D., Wu T.D., Marco S., Guerquin-Kern J.L., **Ortega R.** Trace element distribution in dopaminergic cells using micro-PIXE and other high spatial resolution element imaging techniques. 7th International Symposium on BioPIXE, Sendai, Japan, 30 October - 4 November 2011 (poster).

**Barberet Ph.**, Daudin L., Sorieul S., Simon M., Seznec H., Devès G., Ortega R., **Carmona A.**, Roudeau S., Incerti S., Habchi C., Delalée F., Serani L., Moretto Ph. First results obtained with the CENBG nanobeam line : performances and applications. 12th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications. Leipzig, Germany, 26-30 July 2010 (oral).

**Ceccone G.**, Marmorato P., Ponti J., Rossi F., Kaulich B., Gianoncelli A., Kiskinova M., Salomé M., Ortega R., Devès G., **Carmona A.**, Pascolo L. Synchrotron radiation X-ray fluorescence mapping of cobalt ferrite nanoparticles in BALB 3T3 fibroblast cells. AVS 57th International Symposium & Exhibition, Albuquerque, USA, 17-22 October 2010 (oral).

**Carmona A.** Spéciation et imagerie des métaux à l'échelle subcellulaire par microsondes de rayonnement X. Séminaire de Toxicologie Nucléaire Environnementale et humaine. Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris, France, 26 Décembre 2010 (oral).

**Ortega R.**, Devès G., Roudeau S., **Carmona A.** Application des techniques d'analyse par faisceau d'ions pour l'imagerie chimique cellulaire. 3ème rencontres Francophones sur les techniques d'analyse par faisceaux d'ions rapides, Namur, Belgique, 15-18 Novembre, 2010 (oral).

**Bohic S.**, **Carmona A.**, Ortega R., Reyes S., Carew-Jones F., Double K. Metallomics of neuromelanin in Parkinsonian syndromes. 29th Meeting of the Australian Neuroscience Society, Canberra, Australia, 27-30 January 2009 (oral).

**Carmona A.**, Devès G., Ortega R. Nuclear microprobe quantification of manganese in PC12 dopaminergic cells. 11th International Conference on Nuclear Microprobe Technology and Applications, Debrecen, Hungary, 20-25 July 2008 (poster).

**Devès G.**, **Carmona A.**, Ortega R. Imagerie et quantification des éléments chimiques cellulaires par combinaison des techniques d'analyse par faisceaux d'ions STIM, µ-RBS et µ-PIXE. 2ème Rencontres Analyse par Faisceaux d'Ions Rapides, Carcans, France, 13-15 Octobre, 2008 (oral)

**Matsuyama S.**, Ishii K., Yamazaki H., Kikuchi Y., Terakawa A., Fujiwara M., Kawamura Y., Tsuboi S., Watanabe M., Deves G., **Carmona A.**, Ortega R. 3D imaging of carcinogenic chromium compounds in human lung cells, SAKURA project. 25th Symposium on PIXE, Maebashi, Japan, 10-12 September 2008 (oral).
**Chevreux S.**, Roudeau S., Fraysse A., **Carmona A.**, Devès G., Solari P.L., Weng T.S., Mounicou S., Lobinski R., Ortega R. Direct analysis and speciation of metals in copper-zinc superoxide dismutase isoforms separated on electrophoresis gels. 4th International Conference on Metals and Genetics, Paris, France, 21-24 July, 2008 (oral).

**Carmona A.**, Devès G., Cloetens P., Bohic S., Ortega R. Manganese distribution into dopaminergic cells using synchrotron radiation X-ray fluorescence nano-chemical imaging. 4th International Conference on Metals and Genetics, Paris, France, 21-24 July, 2008 (poster).

**Bacquart T.**, Devès G., **Carmona A.**, Ortega R. Direct speciation analysis of arsenic in subcellular compartments using micro-X-ray absorption spectroscopy. 2nd International Congress on Arsenic in the Environment, Valencia, Spain, 21-23 May 2008 (oral).

2007

Carmona A., Cloetens P., Devès G., Bohic S., Ortega R. Nano-imaging of iron X-ray fluorescence into dopaminergic single cells. 1st International Symposium on Metallomics, Nagoya, Japan, 28 november – 1st December 2007 (poster).

**Ortega R.**, **Carmona A.**, Devès G., Matsuyama S., Ishii K. Imaging of chromium carcinogenic compounds using ion beam analysis. The 8th international conference on surface and interface analysis by ion beams, Sendai, Japan, 7-8 December 2007 (oral).

**Ortega R.**, Fraysse A., Chevreux S., Roudeau S., Devès G., **Carmona A.**, Solari P.-L., Mounicou S., Lobinski R. Direct metal analysis of CuZnSOD on isoelectrofocusing gels using ion beam analysis, LA-ICP-MS, and X-ray absorption spectroscopy. Spectrométrie de masse et analyse protéomique (SMAP), Pau, France, 17-20 September 2007 (oral).

2005

**Wierzchos J.**, Ascaso C., Ager F.J., García I., **Carmona A.**, Respaldiza M.A. Identifying elements in rocks from the Dry Valleys desert (Antarctica) by ion beam proton induced X-ray emission. 17st International Conference on Ion Beam Analysis, Seville, Spain, 26 June - 1st July 2005 (poster).

2004

Ortega R., Biston M.C., Devès G., Bohic S., **Carmona A.** Nuclear microprobe determination of platinum quantitative distribution in rat brain tumor after cisplatin or carboplatin injection for PAT treatment of glioma, 9th International Conference Nuclear Microprobe Technology and Applications, Dubrovnik, Croatia, 13-17 September 2004 (poster).

2003

**Carmona A.**, Ynsa M.D., Ortega R., Respaldiza M.A., Ager F.J. Aplicaciones de Carácter Biológico en el Centro Nacional de Aceleradores. XXIX Reunión Bienal de Física y Química, Madrid, Spain, 13-17 June 2003 (oral).

Respaldiza M.A., **Ferrer F.J.**, Ager F.J., **Carmona A.**, Ferrero, A. García-López J., García-Orellana I., Gómez-Tubío B., Morilla Y., Ontalba M.A., Ynsa M.D. Caracterización no destructiva de materiales mediante técnicas de análisis basadas en haces de iones. X Congreso Nacional de Ensayos no Destructivos, Cartagena, Spain, June, 2003 (oral).
# 7. Collaborations scientifiques

## 7.1 Internationales

**Professeur Kay DOUBLE.** Neuroscience Research (NeuRA), Université de Sydney, Australie. « Copper pathology in Parkinson's disease ».

**Dr Erin MCALLUM.** The Florey Institute of Neuroscience, Université de Melbourne, Australie. « Metals and protein aggregation in neurodegenerative disease».

**Dr Somshuvra MUKHOPADHYAY.** Institute for Cellular and Molecular Biology and Institute for Neuroscience, Université de Texas, Austin, United States. « Imagerie cellulaire du manganèse et parkinsonisme ».

**Dr Seth FRISBIE.** Department of Chemistry and Biochemistry, Université de Norwich, Northfield, USA. « Manganese intakes in infant formula milk».

**Dr Byron JONES.** Biobehavioral Health and Pharmacology, Université de Pennsylvanie, Pennsylvanie, USA. « Iron imaging in substantia nigra from mice ».

**Dr Paul LINGOR.** Department of Neurology, Université de Médecine, Göttingen, Allemagne. « Chemical speciation, imaging and quantification of metals in alpha-synuclein cellular models of Parkinson's disease ».

**Dr Ankona DATTA.** Tata Institute of Fundamental Research, Mumbai, Inde. « Manganese imaging in cells ».

**Dr Keizo ISHII.** Department of Quantum Science and Engineering, Université de Tohoku, Sendai, Japon. « Computed tomography 3D imaging of carcinogenic chromium compounds in human lung cells ».

## 7.2 Nationales

**Dr Daniel CHOQUET.** Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (IINS), Université de Bordeaux – CNRS.

**Dr Véronique MALARD.** Institute of Biosciences and Biotechnologies of Aix Marseille (BIAM), CEA – Université Aix Marseille – CNRS. « Programme de Toxicologie Nucléaire : Spéciation du Cobalt ».

**Dr Carole BRESSON.** Service d'Etudes Analytiques et de Réactivité des Surfaces (SEARS), CEA – Université Paris-Saclay. « Programme de Toxicologie Nucléaire : Spéciation du Cobalt ».

**Dr Yolanda PREZADO.** Imagerie et Modélisation en Neurobiologie et Cancérologie (IMNC). Université de Paris 7 et 11 – CNRS.

**Dr Catherine LEBLANC.** Laboratoire de Biologie Intégrative des Modèles Marins. Station Biologique de Roscoff. Sorbonne Université – CNRS.

**Dr Marc SAVASTA.** Institute de Neuroscience de Grenoble (GIN), Université de Grenoble Alpes – INSERM, Grenoble. « ANR PIRIBio Nano-chemical imaging of the dopaminergic cell ».

**Dr Jean-Luc GUERQUIN-KERN.** Chemistry, Modeling and Imaging for Biology (CMIB), Institute Curie – Université Paris Sud – INSERM. « ANR PIRIBio Nano-chemical imaging of the dopaminergic cell ».
**Dr Sylvain BOHIC.** Institut de Neuroscience de Grenoble (GIN), Université de Grenoble Alpes – INSERM, Grenoble. « ANR PIRIBio Nano-chemical imaging of the dopaminergic cell ».

**Dr Peter CLOETENS.** ID16A Nano-Imaging Beamline, ESRF, Grenoble, France. « Développement de méthodes de microspectoscopie par rayonnement synchrotron ».

# 8. Participation à programmes de recherche

## 8.1 Principaux programmes de recherche auxquels j'ai participé

**CNRS MITI-Osez l'interdisciplinarité (2018-2020):** "Imagerie corrélative de super résolution (40 nm) des protéines et des métaux synaptiques". Collaborations: Institut Interdisciplinaire de Neuroscience et synchrotron européen ESRF.

**PEPS CNRS-IDEX Bordeaux (2018-2020):** "Imagerie corrélative de super résolution (40 nm) des protéines et des métaux synaptiques". Collaborations: Institut Interdisciplinaire de Neuroscience et synchrotron européen ESRF.

**PEPS CNRS-IDEX Bordeaux (2016-2017):** Développement de l'imagerie chimique nanoscopique corrélative (rayonnement X / photonique) pour l'étude du rôle des métaux dans la plasticité synaptique (CorXsyn) ". Collaborations: Institut Interdisciplinaire de Neuroscience et synchrotron européen ESRF.

**PEPS CNRS FaiDoRA (2016-2017):** « Seuils et mécanismes cellulaires de neurotoxicité de l'uranium naturel à faibles doses ».
Collaborations: CEA Saclay et Marcoule.

**Programme de Toxicologie Nucléaire (2014-2017):** « Uranium à faibles concentrations dans des cellules NEURonales humaines en culture : Cibles biologiques, Imagerie et Spéciation ».
Collaborations: CEA Saclay et Marcoule.

**NEEDS-Environment (2013-2015):** "Chemical speciation and distribution of stable and radioactive iodine in marine algal kelps" CNRS, Végétaux marins et biomolecules, Roscoff, France

**ANR Blanc Subcelif (2012-2016):** "Distribution intra-cellulaire du fer chez les plantes, spéciation chimique et nouvelles fonctions" Biochimie & Physiologie Moléculaire des Plantes, INRA, Montpellier, France.

**Partenariats Hubert Curien (2011-2012):** "Chemical speciation, imaging and quantification of metals in alpha-synuclein cellular models of Parkinson's disease".
University of Medicine of Göttingen, Allemagne.

**Partenariats Hubert Curien (2011-2012):** "Micro-computed tomography 3D imaging of carcinogenic compounds in human lung cells".
Tohoku University, Sendai, Japon.

**ANR PIRIBio (2010-2012):** "Nano-chemical imaging of the dopaminergic cell".
Institut Curie, Grenoble Institute of Neurosciences, France.

**Programme de Toxicologie Nucléaire (2010-2011):** "Toxicité et accumulation intracellulaire du cobalt soluble et particulaire dans des cellules pulmonaires humaines en culture".
Collaborations: CEA Saclay et Marcoule.
**Integrated Infrastructure Initiative (I3)** funded by the European Commission (2009-2010): "Mapping of cobalt ferrite nanoparticles in BALB 3T3 fibroblast cells". Collaboration: Institute for Health and Consumer Protection, Italy.

**Partenariats Hubert Curien** (2009-2010): "Computed tomography 3D imaging of carcinogenic chromium compounds in human lung cells". Collaborations Tohoku University, Japon.

## 9. Autres responsabilités

-Depuis Mai 2022: Editeur Asocié dans Brain Imaging Methods, une section special des revues Frontiers in Neuroscience, Frontiers in Neurology and Frontiers in Neuroimaging.

-Depuis Janvier 2022 : membre du commitee du programme de temps de faisceau, pannel 5 ‘Biologie, santé’, à SOLEIL, Paris, France.

-Depuis Septembre 2021 : membre du commitee du programme de temps de faisceau, beamlines P05 and P06, à DESY, Hambourg, Allemagne.

-Entre 2020-2021 j’ai été éditeur invité pour la coordination d’un numéro spécial dans la revue Toxics, intitulé « Neurotoxicity of Environmental Metal Toxicants ».

-De 2018-2020 membre du Conseil de Laboratoire du CENBG.

-De 2011 et jusqu'au fin 2015 j'étais membre de la commission d'hygiène et sécurité de mon laboratoire.

-Réviseuse dans des revues scientifiques comme : Journal of The Royal Society Interface, Journal of Environmental and Occupational Science, Journal of Clinical Toxicology, International Journal of Nanomedicine, Langmuir, Metallomics, Nuclear Instruments and Methods.

-Membre du comité organisateur de « 17th International Conference on Ion Beam Analysis » tenue du 26 Juin au 1 Juillet 2005 à Séville.
## 1. Introduction

Mes activités de recherche sont liées au développement et à l'application de techniques de chimie analytique, fondées sur l'utilisation d'accélérateurs de particules, pour comprendre la toxicologie et/ou élucider le rôle des métaux (Mn, Fe, Cu, Zn, Co, U...) et leurs protéines associées dans des maladies neurodégénératives. À cette fin, j'ai utilisé des techniques de spectroscopie d'analyse par faisceau d'ions ou rayonnement synchrotron pour la détermination des métaux (imagerie, quantification et spéciation), tels que PIXE (Particle Induced X-Ray Emission), SXRF (Synchrotron X-Ray Fluorescence), XANES (X-Ray Absorption Near Edge Structure) et des techniques de microscopie de fluorescence : épifluorescence, confocale, STED (Stimulated Emission Depletion) pour l'analyse des protéines.

La connaissance de la répartition des éléments chimiques dans les organites cellulaires peut révéler leur fonction dans une variété de processus cellulaires. Voici quelques-unes des questions fondamentales que nous abordons : Quelle est la répartition des métaux traces dans les cellules ? Certains éléments s'accumulent-ils dans les organites sub-cellulaires de manière spécifique ? Quelles sont les espèces chimiques des éléments présents dans ces organites ? Pour localiser précisément la répartition des éléments, il faut identifier les organites cellulaires ; cela peut être réalisé en marquant les protéines d'intérêt avec des fluorochromes. Le but étant de corréler la distribution des protéines et des métaux, j'ai développé et adapté les méthodes de préparation des échantillons pour permettre la compatibilité de ces techniques tout en préservant l'état natif des échantillons.

Pour étudier les métaux, nous utilisons des accélérateurs des particules, notamment la plateforme AIFIRA (Applications interdisciplinaires des faisceaux d'ions en région Aquitaine) et les techniques PIXE (Particle Induced X-Ray Emission) et RBS (Rutherford Backscattering Spectroscopy) pour quantifier les éléments chimiques dans les échantillons biologiques. Cet instrument est d'une grande utilité pour l'analyse des tissus et la quantification d'un grand nombre des cellules. Mais si on souhaite étudier les métaux à l'intérieur des cellules, la résolution spatiale n'est pas suffisante. Nous avons donc aussi eu recours à des plus grandes installations avec des accélérateurs de type synchrotron, ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble), SOLEIL (Source optimisée de lumière d'énergie intermédiaire du LURE, Saint-Aubin), DESY (Deutsches Elektronen-Synchrotron, Hambourg) et APS (Advanced Photon Source, Chicago) et fait usage des techniques SXRF (Synchrotron X-ray Fluorescence) et XANES (X-ray Absorption Near Edge Structure). La première de ces techniques nous permet de déterminer la distribution de la composition élémentaire dans nos échantillons et la seconde de déterminer l'état d'oxydation des éléments puisque la réactivité et la toxicité de métaux dépendent, entre autres paramètres, de son état redox. Dans ces lignes de lumière, la résolution spatiale est en dessous de 1 µm, pouvant aller actuellement jusqu'à 10 à 30 nm. Également l'intensité de faisceau est un paramètre très important puisque nous étudions des éléments chimiques présents à l'état de trace, voire ultratrace, dans les échantillons.

Ces techniques d'imagerie spectroscopique sont d'une grande utilité pour déterminer la distribution et la quantification des métaux, mais pour comprendre leurs mécanismes de toxicité nous avons besoin de déterminer les protéines auprès desquelles ils interviennent. Ainsi, tout au long de mes recherches, nous avons développé une microscopie corrélative métaux-protéines. Nous avons utilisé les microscopies
d'épifluorescence, confocales ou STED en fonction de la résolution spatiale nécessaire, couplées avec les techniques PIXE, SXRF ou XANES. L'imagerie des métaux nécessite des méthodes cryogéniques pour la préparation des échantillons afin de préserver leur concentration et distribution native dans les tissus biologiques, donc nous avons aussi adapté les techniques de microscopie de fluorescence en fonction de la préparation d'échantillon. Cette méthodologie corrélatивement était décomposée en trois étapes : premièrement le marquage *in vivo* des protéines d'intérêt, grâce à l'utilisation de protéines fluorescentes ; deuxièmement la cryopréparation et lyophilisation des échantillons et, en dernière étape, l'analyse des métaux dans les mêmes échantillons et pour les mêmes zones observées en fluorescence.

En utilisant ces techniques analytiques, nous nous sommes intéressés à différents sujets de recherche. Par exemple nous avons étudié l'implication du Mn et du Fe dans la maladie du Parkinson (en anglais *Parkinson disease PD*) et leur interaction avec différentes biomolécules, protéines ou neurotransmetteur: α-synucléine, dopamine et SLC30A10. De même, nous nous sommes intéressés au possible rôle du Cu et du Zn dans la plasticité synaptique et leur interaction avec l'actine et la tubuline. Nous avons étudié la solubilité des microparticules du Co et la neurotoxicité de l'uranium, deux éléments auxquels les professionnels travaillant dans les centrales nucléaires peuvent être exposés. Grâce à ces techniques, j'ai pu aussi prêter main-forte dans d'autres domaines, comme l'étude de l'accumulation d'iode dans l'algue brune *Laminaria digitata*, la détermination de la distribution élémentaire des macrofossiles et j'ai mis en valeur l'utilisation de ces techniques dans l'étude de l'incorporation des composés métalliques antitumoraux dans les tumeurs dans le but d'une utilisation en radiothérapie ou en chimiothérapie.

## 2. Analyse par faisceau d'ions

Les techniques de spectrométrie par faisceau d'ions sont fondées sur la mesure du rayonnement émis lorsqu'une particule chargée et accélérée interagit avec un échantillon. Concrètement, nous avons utilisé un faisceau de protons accélérés à 3 MeV, la ligne de faisceau dite « de haute résolution spatiale » de la plateforme AIFIRA du CENBG (Centre d'études nucléaires de Bordeaux Gradignan, aujourd'hui LP2iB Laboratoire de Physique des 2 infinis de Bordeaux) et nous avons mis en œuvre les techniques PIXE et RBS.

### 2.1 La plateforme AIFIRA et la ligne de haute résolution spatiale

AIFIRA est un accélérateur électrostatique simple étage de 3,5 MV de type Singletron de la société HVEE (https://www.lp2ib.in2p3.fr/aifira/). Ce type d'accélérateur fournit une haute brillance du faisceau et stabilité énergétique, pouvant accélérer des protons, deutérons et particules *alpha*. À la sortie du tank d'accélération, le faisceau trouve un profileur, une cage de Faraday et des fentes d'ouverture et de direction pour le transporter vers l'aimant d'analyse à 90°. L'intensité appliquée à cet aimant va nous permettre de sélectionner les particules d'intérêt et leur énergie. Après l'aimant d'analyse, le faisceau passe par des fentes de régulation, qui assurent la stabilité énergétique, et par un deuxième profileur de suivi de trajectoire. Après quoi le faisceau est dirigé vers la « chambre objet » utilisée pour la définition de la taille du faisceau et l'ajustement de la trajectoire. Enfin, le faisceau passe par l'aimant de commutation qui dévie les ions vers la ligne de faisceau sélectionnée (figure 2B.1). Dans le cas d'une utilisation de la ligne de haute résolution spatiale, le faisceau n'est pas dévié et continue sur une trajectoire rectiligne (ligne à 0°).
<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 2B.1 Vue schématique de l'installation AIFIRA au CENBG (Sorieul 2014).</figcaption></figure>

Nos analyses sont menées sur la ligne de microfaisceau à haute résolution (figure 2B.2). Le système de focalisation est fondé sur l'utilisation de deux séries de quadrupôles électromagnétiques (Barberet 2009) qui peuvent fournir une résolution spatiale d'environ 1 µm avec une intensité de centaines de pA. La chambre d'analyse est équipée de deux détecteurs de rayons X Si(Li) de 80 mm² placés à ± 45° pour la technique PIXE et d'un détecteur à barrière de surface annulaire ORTEC (surface de 150 mm², profondeur d'appauvrissement égale à 1 000 µm) disponible pour RBS. Cette ligne est équipée d'un système de balayage et d'imagerie du microfaisceau qui permet : d'un côté de réduire les dommages causés par les radiations dans l'échantillon et de l'autre de produire des cartes élémentaires avec une résolution de 256×256 pixels. Le système de balayage électrostatique est basé sur un double ensemble de plaques parallèles utilisées pour dévier le faisceau dans les directions verticale et horizontale de façon contrôlée et en enregistrant les spectres PIXE/RBS pour chaque position.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 2B.2. Vue de la ligne de haute résolution spatiale de l'installation AIFIRA au CENBG (Barberet 2009).</figcaption></figure>
## 2.2 Techniques PIXE et RBS

Nous avons fait usage de la technique PIXE, plus concrètement micro-PIXE, puisque nous utilisons un faisceau d'ions incident d'une résolution spatiale de l'ordre du micron. Cette technique est fondée sur le principe d'interaction des ions d'un faisceau incident avec les électrons qui composent l'échantillon (Johansson 1976). Quand une particule chargée accélérée incidente interagit avec un électron situé sur les couches internes d'un atome qui constitue l'échantillon, alors cet électron peut être éjecté de sa couche. Immédiatement une réorganisation électronique a lieu et un électron d'une couche plus externe vient combler la lacune. La différence d'énergie entre les deux couches électroniques peut être libérée sous forme de rayonnement X, d'énergie $E_1 = E_K - E_L$ ou $E_2 = E_L - E_M$ (figure 2B.3).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 2B.3. Schéma de production des raies-X d'émission K et L. Le faisceau incident peut être sous forme de particules chargées accélérées (méthode d'analyse PIXE) ou de rayonnement X (méthode d'analyse XRF).</figcaption></figure>

La technique PIXE consiste à mesurer l'énergie des photons X émis par l'échantillon. L'énergie de liaison ($E_K$, $E_L$) d'un électron engagé dans une couche interne (n) d'un atome est caractéristique de l'élément considéré (Z). Donc, l'énergie des photons émis ($E_1$, $E_2$) est caractéristique du numéro atomique Z de l'élément excité et des transitions électroniques impliquées (K, L, M). En mesurant cette énergie émise il est possible d'identifier les éléments constitutifs de la cible irradiée, notre échantillon d'intérêt. Les énergies des raies X émises sont connues et répertoriées pour chaque élément en fonction de la couche électronique ionisée et de la transition X impliquée. La transition électronique de la couche électronique L vers la couche K est appelée *Ka*, la transition de la couche M vers la couche K, $K\beta$, de la couche M vers la couche L, $L\alpha$, et ainsi de suite. La technique PIXE permet une analyse multi-élémentaire et la détection de rayons X émis se fait au moyen de détecteurs X à dispersion d'énergie, dans notre cas nous utilisons des détecteurs au silicium dopés au lithium qui permettent de détecter tous les éléments à partir du sodium ($Z \ge 11$), soit par l'intermédiaire de leurs raies K, soit de leurs raies L (figure 2B.4).
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 2B.4. Spectre PIXE représentatif des échantillons biologiques montrant les principaux éléments chimiques détectés.</figcaption></figure>

En pratique, la sensibilité de détection dépend fortement de la matrice constituant l'échantillon. Dans le cas des échantillons biologiques et fins la composante du bruit de fond dans le spectre est faible et du fait de la taille réduite du faisceau, la limite absolue de détection peut être abaissée jusqu'à $10^{-16} - 10^{-19}$ g. L'analyse PIXE par microsonde nucléaire s'avère particulièrement utile pour la détermination multi-élémentaire quantitative d'éléments endogènes (métaux essentiels, Mn, Fe, Cu, Zn) ou exogènes (composés pharmacologiques, métaux toxiques...) dans des échantillons organiques.

L'analyse quantitative nécessite la calibration de certains paramètres du système de détection à partir de matériaux standards de référence. La formule de base utilisée pour déterminer le nombre d'atomes par unité de surface (A) d'un élément présent dans un échantillon fin peut être simplifiée et calculée à partir de la surface du pic correspondant sur le spectre X ($N_x$), selon la formule ci-dessous. Certains paramètres dépendent du système d'acquisition, c'est pourquoi il faut le calibrer ($\Delta\Omega$, T, $\varepsilon$), d'autres sont connus et répertoriés ($\sigma_p$) et d'autres sont à déterminer expérimentalement directement à partir du spectre PIXE ($N_x$) ou grâce à la technique RBS ($n_p$).

$$N_x = A \cdot n_p \cdot \sigma_p \cdot \frac{\Delta\Omega}{4\pi} \cdot T \cdot \varepsilon$$

Avec A : nombre d'atomes ou grammes de l'élément recherché par unité de surface ; $N_x$ : nombre d'événements enregistrés (surface du pic) ; $n_p$ : nombre de particules ayant interagi avec la cible ; $\sigma_p$ : section efficace de production de la raie X considérée ; $\Delta\Omega$ : angle solide de détection ; T : facteur de transmission à travers le filtre du détecteur ; $\varepsilon$ : efficacité du détecteur pour la raie X considérée. En pratique la quantification est faite avec le logiciel GupixWin (Campbell 2010). Il répertorie les sections efficaces de production de rayons X pour chaque élément en fonction des caractéristiques des particules incidentes. Et il est capable de calculer d'autres paramètres, comme le facteur de transmission et l'efficacité du détecteur, en fonction des données expérimentales que nous introduisons.
La spectrométrie de rétrodiffusion des particules incidentes (RBS) est complémentaire et se réalise simultanément à l'analyse PIXE. Elle nous permet de déterminer les éléments légers, principaux constituants des échantillons biologiques, comme le carbone, l'azote et l'oxygène, ainsi que l'épaisseur (g/cm²) de cette matrice organique. D'un autre côté, la technique RBS nous permet de déterminer le nombre de particules qui ont interagi avec la cible (n<sub>p</sub>), un paramètre nécessaire pour la quantification par PIXE. Le couplage de deux techniques nous permet d'exprimer les concentrations surfaciques des éléments obtenus par PIXE (g/cm²) en concentrations massiques (µg/g) (Carmona 2008 a).

Le principe est fondé sur la diffusion nucléaire élastique, ou diffusion Rutherford, l'interaction nucléaire prédominante pour des particules de basse énergie (< 3 MeV). Lors de la collision entre une particule incidente et le noyau d'un atome cible, l'interaction coulombienne élastique se caractérise par la conservation de l'impulsion totale et de l'énergie cinétique totale du système (Chu 1978). Lorsqu'un projectile de masse M<sub>1</sub> ayant une énergie E<sub>0</sub> interagit avec un noyau cible de masse M<sub>2</sub>, il est diffusé selon un angle θ avec une énergie E<sub>1</sub> (figure 2B.5). Cette énergie de diffusion E<sub>1</sub> peut se relier à l'énergie de la particule incidente (E<sub>0</sub>) par la formule E<sub>1</sub> = K E<sub>0</sub>. Où K est un facteur cinématique défini par les masses de deux particules mises en œuvre et l'angle de diffusion.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 2B.5. Schéma de principe de diffusion de type Rutherford d'une particule légère (M1) avec les atomes (M2) d'un échantillon.</figcaption></figure>

$$K = \left( \frac{M_1 \cos \theta + \sqrt{M_2^2 - M_1^2 \sin^2 \theta}}{M_1 + M_2} \right)^2$$

Si le détecteur de particules est placé devant l'échantillon (θ > 90°), la technique d'analyse mise en œuvre est appelée spectrométrie par rétrodiffusion de Rutherford ou RBS. L'identification de la masse de l'atome cible M<sub>2</sub> s'obtient à partir de la mesure de E<sub>1</sub>, pour un angle de rétrodiffusion donné θ, en connaissant E<sub>0</sub> et M<sub>1</sub> (énergie et masse des particules du faisceau incident). Cette technique multi-élémentaire nous permet une analyse quantitative. Il est possible de remonter au nombre de noyaux de l'élément recherché (A) d'après la formule suivante :
$$N_{RBS} = A n_p \frac{d\sigma}{d\Omega} \Delta\Omega$$

Avec N<sub>RBS</sub> : nombre de particules rétrodiffusées détectées ; A : nombre de noyaux de l'élément recherché par unité de surface ; n<sub>p</sub> : nombre de particules incidentes ; Δσ/ΔΩ : section efficace différentielle de diffusion Rutherford (b/sr) ; ΔΩ : angle solide de détection (sr). Certains paramètres sont à déterminer à partir du spectre RBS (N<sub>RBS</sub>, n<sub>p</sub>), d'autres sont mesurés après calibration du système (ΔΩ) et d'autres sont répertoriés pour chaque élément suivant la nature et l'énergie des particules incidentes et l'angle de détection (Δσ/ΔΩ).

Dans un spectre RBS, l'aire du pic est proportionnelle à la concentration de l'élément dans la cible. Mais sa forme constitue également une source d'information (figure 2B.6). Le ralentissement des particules dans la matière se traduit par une perte d'énergie proportionnelle à l'épaisseur traversée. Donc la largeur du spectre RBS varie en fonction de la perte d'énergie du projectile lorsqu'il traverse la matrice. C'est-à-dire que la largeur du spectre dépend donc de l'épaisseur de la cible. Ainsi, la mesure de la perte d'énergie permet de connaître l'épaisseur de l'échantillon analysé par la formule suivante :

$$\Delta E = E - E_0 = \int_{0}^{x_e} \frac{dE}{dx} | E(x) dx$$

Avec E<sub>0</sub> : énergie des particules incidentes (KeV) ; E : énergie des particules ayant traversé une épaisseur x<sub>e</sub> de matériau (KeV) ; dE/dx : pouvoir d'arrêt du matériau à l'énergie E(x) (KeV/µm). Le pouvoir d'arrêt d'une cible constituée d'éléments différents (i.e. matrice organique C<sub>x</sub>H<sub>y</sub>O<sub>z</sub>) peut être calculé (loi de Bragg) à partir des pouvoirs d'arrêt atomiques. Eux-mêmes sont répertoriés pour chaque élément cible en fonction de l'énergie des projectiles. Tous ces paramètres sont tabulés ou calculés avec le logiciel Simnra (Mayer 1997).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 2B.6. Spectre RBS représentatif des échantillons biologiques, la largeur des pics est proportionnelle à l'épaisseur de l'échantillon.</figcaption></figure>
La combinaison de ces deux techniques PIXE et RBS à l'échelle micrométrique est d'une grande utilité pour l'analyse des tissus biologiques et la quantification d'un grand nombre des cellules. Elles nous permettent de mettre en évidence des localisations élémentaires et de les quantifier. Pour illustrer le potentiel de ces techniques dans des applications biologiques, je vais présenter ci-après deux projets de recherche auxquels j'ai participé notamment pour la mise en œuvre des conditions expérimentales de préparation des échantillons, de leur analyse par faisceau d'ions et pour le traitement des données: le premier sur l'étude de la toxicologie du cobalt dans des modèles cellulaires humains et le deuxième sur la distribution intratumorale dans un modèle animal d'un composé métallique utilisé dans le traitement de tumeurs.

## 2.3 Exemple d'application cellulaire : toxicité pulmonaire du Co

Nous avons collaboré pendant plusieurs années avec deux équipes du CEA pour étudier les mécanismes de toxicité du cobalt, élément produit par l'industrie nucléaire, dans le cadre du Programme interorganismes de toxicologie nucléaire. Avec l'équipe de Carole Bresson du CEA de Marcoule et l'équipe de Véronique Malard du CEA de Saclay, notre objectif était d'évaluer les effets cytotoxiques du cobalt soluble ($CoCl_2$, $6H_2O$) et particulaire ($Co_3O_4$) sur des cellules pulmonaires humaines en culture, et cela en relation avec la spéciation biochimique du cobalt dans le milieu de culture et à l'intérieur des cellules.

**Toxicité du cobalt soluble** ($CoCl_2$, $6H_2O$). L'imagerie de la distribution intracellulaire du cobalt a été réalisée sur des cellules épithéliales pulmonaires humaines (lignée BEAS-2B), choisies comme modèles des expositions par inhalation, une voie d'exposition occupationnelle importante rencontrée dans l'industrie électronucléaire. Tout d'abord, la cytotoxicité du cobalt a été évaluée sur les cellules après une exposition de 24 heures à des concentrations croissantes de cobalt dans le milieu de culture. La concentration de cobalt pour laquelle l'inhibition de la croissance est inférieure de 25 % (IC25) à celle des cellules non exposées s'est révélée être de $8 \mu g \cdot mL^{-1}$. Les valeurs de concentration du cobalt pour les IC50 et IC75 étaient respectivement de 20 et 50 $\mu g \cdot mL^{-1}$. Suite à quoi nous avons déterminé par la technique PIXE/RBS sur l'accélérateur AIFIRA du CENBG la distribution multi-élémentaire dans des cellules exposées au cobalt soluble. Nous avons révélé une distribution homogène du cobalt dans les cellules (figure 2B.7). L'analyse quantitative du cobalt intracellulaire pour des expositions aux IC25 et IC50 a montré une altération de l'homéostasie du Zn, cependant la concentration des autres éléments endogènes tels que K, Ca, Fe, Cu n'était pas modifiée (figure 2B.8) (Bresson 2013).
<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Figure 2B.7. Imagerie du phosphore, soufre, potassium, cobalt, et fer obtenue par analyse PIXE dans les cellules BEAS-2B exposées à 20 µg·mL⁻¹ de cobalt soluble (Bresson 2013).

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

Figure 2B.8. Analyse quantitative PIXE/RBS de la teneur élémentaire (µg par gramme de masse sèche) dans les cellules BEAS-2B exposées au cobalt à 0 (CTRL), 8 (IC25) et 20 (IC50) µg·mL⁻¹ pendant 24 heures. Dans les boîtes à moustaches sont représentées, les valeurs médiane, maximale et minimale ainsi que les limites de 25 et 75 % de la population. Les étoiles indiquent les différences significatives par rapport au contrôle (Bresson 2013).

Ces résultats nous ont conduits à étudier plus en détail l'effet du cobalt sur l'homéostasie du Zn. Dans un premier temps, des expériences de toxicité ont été réalisées en combinant des expositions simultanées au cobalt et au zinc qui ont montré une toxicité accrue, de manière dose-dépendante (figure 2B.9). L'exposition seule au zinc dans le milieu de culture n'induit pas de toxicité et, d'un autre côté, l'exposition seule à 8 µg·mL⁻¹ de cobalt conduit à une inhibition de 25% de la croissance (IC25). Mais la co-exposition à 8 µg·mL⁻¹
de cobalt et 3 µg·mL⁻¹ de zinc conduit à une IC75 allant jusqu'à une IC95 pour le zinc à 4 µg·mL⁻¹. Une hypothèse est que le cobalt pourrait interagir avec les protéines de transport du zinc, soit en augmentant l'absorption du zinc par les cellules, soit en inhibant l'efflux de zinc. Dans les recherches bibliographiques nous avons trouvé que la protéine ZnT1 est impliquée dans l'efflux et dans le stockage du zinc dans le réticulum endoplasmique. Pour évaluer l'implication possible du ZnT1 dans l'accumulation de zinc, nous avons mesuré son expression par western blots dans des lysats de cellules exposées au zinc seul et co-exposées au zinc et au cobalt. Nous avons montré qu'une concentration non toxique de zinc est associée à une augmentation du ZnT1. En revanche, après exposition aux deux métaux, l'expression du ZnT1 a été réduite (figure 2B.9). Ce résultat suggère que le transport du zinc pourrait être inhibé en cas d'exposition au cobalt, grâce à la modulation de l'expression de la protéine ZnT1 par le cobalt. Aussi nos résultats mettent en garde sur un risque de toxicité ignoré jusqu'à présent puisque le Zn ne présente généralement qu'une très faible toxicité, or en cas de co-exposition avec le cobalt, la toxicité combinée du Zn et du Co devient préoccupante.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 2B.9.** (A) Cytotoxicité sur les cellules BEAS-2B à la suite d'une exposition croissante au zinc pendant 24 heures (courbe bleue) ou une co-exposition au zinc auquel on a ajouté du cobalt (courbe rose). (B) Expression de la protéine ZnT1 évaluée par western blot dans des lysats cellulaires provenant de cellules témoins, de cellules exposées au zinc, et exposées au zinc et cobalt (2,1 µg·mL⁻¹ de zinc ; 8 µg·mL⁻¹ de cobalt) (Bresson 2013).</figcaption></figure>

**Toxicité du cobalt particulaire (Co₃O₄).** Bien que les particules d'oxyde de cobalt (Co₃O₄) présentent une faible toxicité *in vitro*, elles pourraient entraîner des effets néfastes à long terme sur les cellules pulmonaires *in vivo*, car elles ont un long temps de rétention dans le poumon. Une faible proportion de particules d'oxyde de cobalt peut rester dans les poumons pendant plusieurs mois ou années après l'inhalation. Pour étudier la toxicité du Co particulaire (Co₃O₄ 'insoluble' dans l'eau), nous avons établi une relation entre l'exposition au cobalt insoluble, la quantité de cobalt dissous dans le milieu de culture et la quantité vraiment internalisée par les cellules, avec l'idée de discerner si la toxicité du cobalt particulaire vient de sa solubilité, même très faible. Nous avons évalué la cytotoxicité des particules d'oxyde de cobalt sur les cellules BEAS-2B après 72 heures d'exposition à des concentrations croissantes. Les résultats montrent que la toxicité de ces particules de cobalt est beaucoup plus faible que celle induite par le chlorure de cobalt soluble avec des durées d'exposition similaires (figure 2B.10).
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 2B.10. Toxicité des particules de Co₃O₄ sur les cellules primaires BEAS-2B (A). Les cellules BEAS-2B étaient exposées à des particules de Co₃O₄ (0 – 1 000 µg·mL⁻¹ Co), à des billes de latex LB-3 (0 – 1 000 µg·mL⁻¹) comme témoins négatifs, ou à du cobalt soluble (CoCl₂) pendant 72 heures (0 – 50 µg·mL⁻¹ Co) (Ortega 2014).</figcaption></figure>

La solubilisation intracellulaire des particules d'oxyde de cobalt est un point clé pour tenter de déterminer une relation entre le cobalt solubilisé intracellulaire et la toxicité. Nous avons utilisé l'analyse PIXE pour quantifier le cobalt provenant des particules intracellulaires et le cobalt total, ce qui permet de déterminer la fraction soluble à l'intérieur de la cellule (figure 2B.11). L'analyse quantitative a mis en évidence que la teneur en cobalt solubilisé intracellulaire après exposition aux particules de Co₃O₄ (6,5 fg/cellule) est similaire à celle après exposition au composé soluble, CoCl₂ (5,4 fg/cellule), pour les mêmes conditions de cytotoxicité (IC25). Cela veut dire que les particules d'oxyde de cobalt se dissolvent à l'intérieur des cellules et que la toxicité du cobalt particulière est due aux formes solubles (Co²⁺) retrouvées en quantité infime dans les cellules (IC25 0,07 % solubilisation, IC50 0,55 % solubilisation). Nous pensons que de manière générale la toxicité des particules métalliques dites « insolubles » est due essentiellement à leur solubilisation lente en milieu biologique venant se substituer aux métaux essentiels et provoquer une toxicité spécifique. Ce nouveau paradigme pose le problème de l'évaluation de la toxicité des particules métalliques de faible solubilité et de faible clairance, comme c'est le cas des particules d'oxyde de cobalt dans les poumons qui peuvent résider dans les organes exposés pendant des périodes longues (effet cheval de Troie) (Ortega 2014).

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 2B.11. Exemple d'analyse micro-PIXE d'une seule cellule BEAS-2B exposée à des particules d'oxyde de cobalt (50 µg·mL⁻¹ Co) pendant 72 heures (IC25). La distribution du potassium délimite les limites de la cellule et la position du noyau (A). La fraction la plus élevée de cobalt se trouve dans le cytoplasme dans sa forme particulière. Une petite fraction du cobalt est solubilisée, comme le montre le spectre local PIXE à l'extérieur des particules d'oxyde de cobalt (B) (Ortega 2014).</figcaption></figure>
## 2.4 Exemple d'application aux tissus : imagerie intratumorale du Gd

Les nanoparticules métalliques ont un grand potentiel dans le traitement du cancer comme médicaments théranostiques en combinant leurs propriétés d'agents de contraste pour l'imagerie médicale et de radiosensibilisation. Comme tout autre médicament anticancéreux, la diffusion intratumorale dépend du mode d'administration et de l'affinité pour les cellules cancéreuses, les deux principaux facteurs limitant l'efficacité thérapeutique.

Nous avons collaboré avec Yolanda Prezado de l'IMNC (Imagerie et Modélisation en Neurobiologie et Cancérologie) et Frédéric Pouzoulet de l'Institut Curie, tous les deux à Paris, avec l'objectif de déterminer la distribution quantitative des nanoparticules de gadolinium après une injection intratumorale directe sur un modèle animal. Nous nous sommes servis des techniques PIXE et RBS, avec un faisceau de protons d'une résolution spatiale de 2 µm pour déterminer la distribution quantitative du gadolinium dans des sections de tumeurs de plusieurs centimètres. Nous avons fait usage de particules AguIX (Activation and Guiding of Irradiation by X-ray), des particules de 3 nm composées d'un réseau de polysiloxanes entouré de chélateurs de gadolinium, et comme modèle tumoral nous avons utilisé des tumeurs de glioblastome humain U87 greffées chez la souris (Carmona 2017).

Les figures 2B.12 et 2B.13 montrent les distributions de Si, P, S, Cl, K, Ca, Fe et Gd dans deux sections de glioblastomes xénogreffes provenant de différents animaux. Dans les deux cas, les distributions de Gd et de Si dans les tumeurs entraînent leur diffusion hétérogène. Les deux éléments suivent le même schéma de distribution puisque les nanoparticules AguIX sont composées d'un réseau de polysiloxanes entouré de chélateurs de gadolinium. Le Gd et le Si se trouvent à des concentrations élevées près du point d'injection et diminuent rapidement dans le reste de la tumeur. La distribution du potassium met en évidence des nodules intratumoraux d'environ 1 mm de diamètre délimitant des amas cellulaires de densités variables. Les nanoparticules du gadolinium semblent s'accumuler autour de ces sous-domaines intratumoraux probablement liés aux variations de la densité cellulaire.
<figure><img src="image_18.png" /></figure>

Figure 2B.12. Distribution du Si, P, S, Cl, K, Ca, Fe et Gd dans une première tumeur de glioblastome. Les intensités des rayons X pour chaque élément mesuré par PIXE ont été normalisées par la charge locale déposée, mesurée par RBS. Les niveaux d'intensité des rayons X passent du minimum en noir/violet au maximum en jaune/blanc, comme le montre l'échelle des couleurs. Analyses PIXE réalisées à AIFIRA (Carmona 2017).

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

Figure 2B.13. Distribution du Si, P, S, Cl, K, Ca, Fe et Gd dans une seconde tumeur de glioblastome. Les intensités des rayons X pour chaque élément mesuré par PIXE ont été normalisées par la charge locale déposée, mesurée par RBS. Les niveaux d'intensité des rayons X passent du minimum en noir/violet au maximum en jaune/blanc, comme le montre l'échelle des couleurs. Analyses PIXE réalisées à AIFIRA (Carmona 2017).
En comparant les images RBS et PIXE avec les coupes histologiques (figure 2B.14) nous montrons la présence de Gd dans le tissu extra-tumoral, plus concrètement dans le tissu musculaire adjacent. Nous avons quantifié la teneur en éléments dans différentes zones de la section tumorale (figure 2B.14) : les zones éloignées du point d'injection (5, 6, 7), les zones proches du point d'injection mais présentant un degré élevé d'hétérogénéité de Gd (8a, 8b) et de tissu musculaire (9). Les données quantitatives pour chacune de ces régions sélectionnées sont présentées dans la figure 2B.15.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 2B.14. (A) Coupe histologique de la deuxième tumeur; (B) image RBS de la distribution de la matrice (C, N, O) et (C) superposition des images PIXE des distributions du potassium (rouge), du fer (bleu) et du gadolinium (vert). Les nombres indiquent les zones quantifiées (Carmona 2017).</figcaption></figure>

L'analyse quantitative montre que la distribution quantitative de Gd dans la tumeur est très hétérogène, 57 % du gadolinium est accumulé dans 13 % de la surface de la tumeur. Les concentrations minimales de Gd dans les deux échantillons analysés sont respectivement de 37 et 61 µg·g⁻¹ et les concentrations maximales sont respectivement de 10 700 et 10 200 µg·g⁻¹. Toutes les régions tumorales contiennent du Gd mais avec des concentrations nettement différentes (ratio jusqu'au 250). La distribution du fer est très hétérogène, comme on pouvait s'y attendre en raison de la grande hétérogénéité et de la disposition chaotique du système vasculaire dans les tumeurs. Les autres éléments, P, S, Cl, K, Ca, Cu, Zn présentent une concentration assez homogène dans les zones analysées. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que l'injection directe de nanoparticules de Gd dans les glioblastomes entraîne une diffusion hétérogène des nanoparticules dans la masse tumorale. En conclusion, toutes les régions de la tumeur contiennent du Gd mais avec des concentrations nettement différentes, et la diffusion n'est pas limitée à la tumeur puisqu'elle peut atteindre le tissu sain adjacent.
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 2B.15. Concentration des éléments chimiques dans la seconde section tumorale, exprimée en µg·g⁻¹ de masse sèche et effectuée en combinant PIXE et RBS (AIFIRA).</figcaption></figure>

# 3. Imagerie des éléments chimiques par rayonnement synchrotron

## 3.1 Caractéristiques d'une installation synchrotron

Lorsqu'une particule chargée est soumise à une accélération, elle est déviée de sa trajectoire rectiligne et celle-ci émet des rayonnements électromagnétiques. Quand des électrons sont produits et accélérés dans une installation de type synchrotron, la lumière émise par ces électrons relativistes soumis à une accélération centripète s'appelle le rayonnement synchrotron.

Le rayonnement synchrotron présente des caractéristiques qui lui confèrent des qualités pour l'analyse spectroscopique bien supérieures à celles offertes par les sources classiques de lumière (Bertsch 2001). La continuité spectrale, de l'infrarouge lointain jusqu'aux rayons X, n'est atteinte par aucune autre source sur une aussi large plage de longueurs d'onde. La faible divergence d'émission dans le plan vertical, de l'ordre de 0,1 mrad, conduit à une brillance bien supérieure à celle des tubes de rayons X et permet une excellente focalisation des faisceaux. L'intensité du rayonnement synchrotron est de plusieurs ordres de grandeur supérieure à celle des générateurs de rayons X. Du fait de toutes ces caractéristiques, plusieurs installations de rayonnement synchrotron ont été construites à travers le monde.

Le fonctionnement d'un accélérateur de type synchrotron relève de trois étapes principales. Tout d'abord des électrons sont émis par un canon à électrons puis accélérés dans un accélérateur linéaire (linac) par des champs électriques jusqu'à atteindre une énergie de l'ordre de centaines de MeV. Ils sont ensuite envoyés dans un « booster » où ils vont gagner de l'énergie à chaque tour, jusqu'à atteindre une énergie de l'ordre du GeV, ils sont donc injectés dans l'anneau de stockage (figure 3B.1). Dans cet anneau, les électrons circulent sous des conditions d'ultravide de $10^{-9}$ mbar, à une vitesse relativiste et pendant des heures. Tout au long de ce parcours, les électrons passent par différents types des champs magnétiques qui les dévient de leurs trajectoires, perdant ainsi de l'énergie sous forme de rayonnement électromagnétique. Les principaux éléments de déviation sont les « aimants de courbure » (des aimants qui forcent les électrons à changer de direction), les onduleurs (constitués de petits aimants polarisés alternés forçant les électrons à suivre une trajectoire oscillante mais globalement rectiligne) et l'aimant focalisateur (lentilles électromagnétiques pour focaliser le faisceau de manière qu'il soit aussi étroit que possible). L'énergie émise par les électrons après
leur déviation par l'un de ces éléments est transportée à la ligne de faisceau ou ligne de lumière. Les lignes de lumière sont composées de trois cabines : optique (contient les éléments optiques qui servent à sélectionner la taille et l'énergie du faisceau), expérimentale (comprend le dispositif de montage de l'échantillon, des éléments de focalisation ainsi que les différents détecteurs) et de contrôle (permet de piloter les analyses). Chaque ligne de faisceau a des caractéristiques bien à elle, comme la zone spectrale du faisceau incident, l'intensité, et le système de focalisation, donc la résolution spatiale. L'ensemble de ces caractéristiques va faire qu'une ligne soit plus appropriée qu'une autre pour certains types d'analyses et techniques.

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 3B.1. Schéma montrant les principales structures d'une installation de rayonnement synchrotron.</figcaption></figure>

Les progrès récents dans la fabrication des optiques de focalisation pour le rayonnement synchrotron ont permis la construction de lignes de nano-analyse auprès d'installations synchrotron de troisième génération (Da Silva 2017). Des lignes synchrotron, opérant dans le spectre énergétique des rayons X durs, permettent la mise en œuvre, à l'échelle micro et nanoscopique, des techniques de fluorescence X induite par rayonnement synchrotron (μ-SXRF et nano-SXRF), et d'absorption de rayonnement X (μ-XAFS) (da Silva 2017). Nous avons employé ces techniques pour analyser les distributions intracellulaires d'éléments chimiques et pour déterminer la spéciation des états d'oxydation à l'intérieur cellulaire. Pour mener à terme mes recherches, j'ai travaillé sur différentes lignes de lumière auprès de différents accélérateurs, ESRF, SOLEIL, DESY ou APS. Ultérieurement, je décrirai brièvement ces lignes et leurs principales caractéristiques, il faut cependant noter que les systèmes de focalisation et de détection sont en constante évolution et amélioration.

## 3.2 Fluorescence de rayons X par synchrotron (SXRF) et Spectroscopie de structure près du seuil d'absorption des rayons X (XANES)

Les techniques SXRF et PIXE sont similaires dans leur approche fondamentale et sont fondées sur le fait commun que lorsqu'un électron est éjecté de l'enveloppe interne d'un atome, un électron d'une enveloppe supérieure tombe dans cette enveloppe inférieure pour remplir le trou laissé derrière, en émettant en même temps un photon d'une énergie égale à la différence d'énergie entre les deux couches électroniques impliquées. La principale différence entre SXRF et PIXE réside dans le mode d'excitation, des rayons X pour le premier, des protons pour le deuxième (Figure 2B.3).
À l'instar de la méthode PIXE, la fluorescence X induite par rayonnement synchrotron est une méthode d'analyse non destructive parfaitement adaptée à l'imagerie des éléments chimiques en faible teneur ; de plus elle peut atteindre des résolutions spatiales et des limites de détection beaucoup plus performantes (Adams 1998). Grâce au spectre continu en énergie et au haut flux et intensité des sources synchrotron, il est possible de sélectionner, à l'aide d'un monochromateur, l'énergie des photons incidents et travailler avec un faisceau monochromatique à n'importe quelle énergie dans l'intervalle des rayons X durs. L'énergie retenue doit se situer juste au-dessus de la raie d'absorption de l'élément recherché, ce qui permet d'augmenter considérablement le rapport signal/bruit et de reculer les limites de détection par rapport aux installations classiques de fluorescence X. Le haut flux et la faible divergence du rayonnement synchrotron peuvent être exploités par les systèmes de focalisation (lentilles de Fresnel, miroirs de type Kirkpatrick-Baez) en réduisant la taille du faisceau à des dimensions micrométriques, voire nanométriques (Hignette 2005, 2007).

La technique XANES (X-ray Absorption Near Edge Structure) est fondée sur la mesure du coefficient d'absorption quand un faisceau de rayons X traverse un échantillon (Ortega 2012). Cette technique fournit principalement des informations sur la géométrie et l'état d'oxydation de l'élément d'intérêt. La loi de Beer-Lambert permet de relier l'intensité du faisceau incident ($I_0$) et l'intensité transmise après traversée de l'échantillon (I), au coefficient d'absorption linéaire $\mu(E)$ du matériau selon la formule suivante : $I = I_0 e^{-\mu(E)X}$.
Le coefficient $\mu(E)$ dépend de l'énergie du faisceau incident et présente de fortes discontinuités à des énergies particulières, correspondant aux énergies de liaison des électrons du solide. Ces discontinuités appelées seuil d'absorption sont associées à l'excitation d'un électron depuis un niveau de cœur particulier vers un état vide.

Le spectre d'absorption de rayonnement X représente donc la variation du coefficient d'absorption linéaire $\mu$ en fonction de l'énergie E du faisceau incident. L'absorption se produit quand les rayons X incidents ont une énergie suffisante pour éjecter un électron du noyau d'un atome par effet photoélectrique. Quand ce processus a lieu, l'intensité du faisceau après la traversée varie considérablement par rapport à l'intensité initiale. Pour des faibles concentrations élémentaires, la mesure de l'intensité de fluorescence totale est le mode le plus approprié pour détecter ces changements d'intensité. Dans ce cas, l'intensité des rayons X secondaires émis ($I_f$) est proportionnelle au coefficient d'absorption $\mu(E)$ comme indiqué : $\mu(E) \approx I_f/I_0$. Le processus subatomique impliqué dans la fluorescence des rayons X est la relaxation radiative de l'élément à la suite de l'éjection d'un électron central. Lorsque l'éjection d'électrons d'une enveloppe interne se produit, des électrons des enveloppes externes remplissent les vides et émettent des rayons X avec des énergies caractéristiques et dépendant des niveaux électroniques impliqués.

Au voisinage immédiat de l'énergie du seuil d'absorption, à moins de 50 eV, on observe parfois d'autres structures, ou résonances qui proviennent des transitions entre les orbitales de l'atome absorbeur. Elles reflètent la symétrie du site et l'état électronique de l'élément excité qui renseignent sur les liaisons chimiques auxquelles participe cet atome. La spectroscopie d'absorption près du seuil d'absorption (figure 3B.2) fournit des informations sur l'ordre local autour de l'atome absorbeur. Au-dessus du seuil d'absorption, nous nous retrouvons dans la technique EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) qui fournit des informations sur des distances interatomiques, la coordination et également le désordre thermique. Mais je ne parlerai pas de cette technique puisque je ne l'ai pas mise en œuvre dans mes recherches, je m'intéresse aux éléments trace et ultratrace dans les cellules, et les faibles concentrations de ces éléments ne pemettent pas d'obtenir de signal suffisant pour bien interpréter un spectre EXAFS.
<figure><img src="image_23.png" /></figure>

Figure 3B.2. Spectres XANES correspondant à différents composés de manganèse. La forme du spectre varie aux alentours du seuil d'absorption du manganèse en fonction de son état d'oxydation. Ligne ID21 à l4ESRF (Carmona 2014).

## 3.3 Lignes de lumière synchrotron

Nous sommes intéressés par la détermination des éléments à l'état de trace dans des échantillons biologiques, principalement des cellules isolées. Pour mener à bon terme nos recherches, nous avons besoin de lignes de lumière avec une haute résolution spatiale et un grand flux de photons incidents. L'énergie du faisceau de rayons X incident doit être telle qu'elle puisse exciter les éléments biologiques d'intérêt. Le système de détection doit être adapté aux techniques SXRF et XANES, de même la cabine expérimentale doit être dotée de la possibilité d'analyser des échantillons biologiques et fins, elle doit notamment être équipée d'un microscope optique pour la sélection de cellules.

Chaque synchrotron et ligne d'analyse présente des caractéristiques bien définies et en fonction des besoins expérimentaux nous devons choisir la ligne la plus adaptée. Au début, pour l'analyse par SXRF des cellules isolées à température ambiante, nous avons eu recours à l'ESRF aux lignes ID19 et ID22NI, lignes qui, aujourd'hui, ne sont plus dédiées à la fluorescence des rayons X. L'évolution de la station ID22NI à donner naissance aux lignes actuelles ID16A et ID16B (Martinez Criado 2015 ; da Silva 2017). Plus récemment, nous avons aussi travaillé sur les lignes Nanoscopium à SOLEIL et P06 à DESY. Pour l'analyse de l'état d'oxydation des métaux dans les cellules par la technique XANES, il est nécessaire de maintenir les échantillons dans un environnement congelé-hydraté et nous avons fait appel à la ligne ID21 de l'ESRF. Avec les récentes améliorations des systèmes de focalisation, nous avons vu naître de nouvelles lignes de faisceau, comme ID16A à l'ESRF qui nous a permis d'analyser des terminaisons synaptiques et de discerner une compartimentation des métaux à l'intérieur. Récemment, cette ligne de lumière a été équipée d'un cryostat, ce qui signifie que les analyses seront menées dorénavant sur des cellules congelées-hydratées. Pendant l'upgrade de l'ESRF, nous avons fait appel à la lige 9-ID-B de l'APS, laquelle présente aussi une grande résolution spatiale, en dessous de 100 nm, et permet aussi l'analyse d'échantillons biologiques à l'état congelé-hydraté.
a. Anciennes lignes de lumière à l'ESRF

La première fois que nous avons utilisé la technique SXRF pour l'imagerie à haute résolution spatiale nous avons adapté la cabine expérimentale de la ligne ID19 avec un système de détection pour la fluorescence des rayons X (Ortega 2007). Un dispositif expérimental original avait été mis au point pour réaliser l'imagerie des éléments chimiques par fluorescence (SXRF) avec une résolution spatiale de 90 nm, un faisceau d'énergie entre 15 et 17 keV et un flux de l'ordre de $10^{12} \text{ ph} \cdot \text{s}^{-1}$. Cette résolution spatiale, combinée à une luminosité élevée, avait permis, pour la première fois au monde, d'imager les éléments chimiques à l'intérieur des cellules, dans des compartiments subcellulaires (figure 3B.3). Ce dispositif expérimental a ensuite été installé sur la ligne ID22NI de l'ESRF, laquelle présentait des caractéristiques bien similaires et que nous avons également souvent utilisée (figure 3B.4).

Ces premières expériences ont été menées à température ambiante sur des échantillons cryofixés et lyophilisés (processus qui permettent de préserver la structure et le contenu élémentaire des cellules). Nous avions montré que le fer est localisé à l'intérieur de la cellule en structures dites « vésiculaires », il se retrouve dans le cytoplasme, les ramifications et les terminaisons cellulaires. La localisation du fer, mise en évidence par nano-SXRF, dans des structures vésiculaires (figure 3B.4) ressemble à la distribution de la dopamine (figure 3B.3). Nous avons réalisé d'autres expériences de quantification par faisceau d'ions démontrant un détriment d'incorporation du fer dans les cellules après perturbation de la synthèse de dopamine, ce qui nous a permis de suggérer que le métabolisme du fer et de la dopamine interagissent dans les cellules dopaminergiques.

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Figure 3B.3. Le fer semble être localisé dans les vésicules de dopamine. (A) cellules lyophilisées observées avec la lumière visible, (B) microscopie à épifluorescence, sur les mêmes cellules lyophilisées, permettant l'identification de la dopamine oxydée, (C et D) images représentant la distribution du fer, obtenu par µ-SXRF sur la ligne ID19, en comparaison avec la distribution de la fluorescence de la dopamine oxydée (Ortega 2007).
<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Figure 3B.4. L'imagerie chimique par rayons X synchrotron révèle la distribution sub-cellulaire du fer dans des structures de type vésiculaire. Le fer est dans le cytoplasme et les terminaisons cellulaires. Images obtenues sur ID22NI à l'ESRF avec un faisceau d'une taille inférieure à 90 nm (Carmona 2008 b).

## b. Ligne ID21 à l'ESRF

La ligne ID21 du synchrotron ESRF permet de combiner l'analyse µ-SXRF et µ-XANES dans des échantillons biologiques (https://www.esrf.eu/UsersAndScience/Experiments/XNP/ID21). Pour assurer la préservation de l'état de spéciation des éléments, cette ligne est équipée d'un cryo-stage refroidi à l'azote liquide où le maintien de la température de l'échantillon se fait par contact thermique. ID21 permet de travailler dans la gamme des rayons X d'énergie comprise entre 2 et 9 keV, le faisceau est focalisé avec des lentilles de Fresnel jusqu'à $0,4 \ \mu\text{m} \times 1 \ \mu\text{m}$ avec un flux de l'ordre de quelque $10^9 \ \text{ph} \cdot \text{s}^{-1}$. Pour l'étude des échantillons peu concentrés, la technique micro-XANES peut être réalisée en mode de fluorescence en utilisant des détecteurs de silicium de grande surface active pour les deux techniques (Salomé 2013).

Cette ligne était particulièrement adaptée à notre étude sur la détermination de l'état d'oxydation du manganèse à l'intérieur des cellules exposées à différents composés environnementaux. Tout d'abord nous avons implémenté la technique µ-SXRF, où l'échantillon est aligné dans le plan focal et déplacé devant le microfaisceau pour recueillir des images des éléments en 2D. Une fois l'image de l'élément d'intérêt reconstruite, dans notre cas le manganèse, nous avons déterminé par µ-XANES l'état d'oxydation. Nous avons mis en œuvre la technique µ-XANES en mesurant la fluorescence émise par l'échantillon autour de l'énergie du seuil d'absorption du manganèse (6,520 à 6,660 keV) dans différents endroits à l'intérieur de l'appareil de Golgi de la cellule. Nous avons conservé nos cellules dans un état congelé-hydraté tout au long des analyses et en amont (Carmona 2014).

## c. Nanoscopium à SOLEIL

La ligne Nanoscopium du synchrotron français SOLEIL et la ligne P06 du synchrotron allemand PETRAIII à DESY présentent des caractéristiques similaires en matière d'énergie, résolution spatiale et flux ; elles sont une très bonne alternative aux anciennes lignes µ-SXRF de l'ESRF. Elles permettent, toutes les deux, de travailler avec un faisceau de rayons X durs qui peut être focalisé jusqu'à quelques centaines de microns, tout en maintenant une intensité de faisceau compatible avec l'analyse des éléments trace à l'intérieur des cellules.
Le synchrotron SOLEIL est un synchrotron français situé à Saint-Aubin près de Paris. La ligne Nanoscopium mesure 155 m de long et permet de travailler dans la gamme des rayons X durs entre 5 et 20 keV (Somogyi 2015). Le faisceau est focalisé dans la cabine expérimentale au moyen d'une lentille de Fresnel et de miroirs Kirkpatrick-Baez à couches multiples (ou miroirs KB), la taille minimale qui peut être atteinte est de 75 nm × 100 nm avec un flux de photons de l'ordre de $10^9$ photons·s⁻¹. Pour la technique SXRF, cette ligne est équipée de deux détecteurs de silicium situés à un angle de 20° de chaque côté de l'échantillon, et les analyses sont menées à température ambiante. Grâce à la large gamme d'énergie du faisceau incident disponible, cette ligne est particulièrement adaptée à l'étude des éléments plus lourds, comme l'uranium. Nous pouvons exciter les électrons de la couche L de l'uranium (aux alentours de 17 keV) et détecter l'émission de fluorescence X de cette couche qui est située dans une gamme d'énergie optimale pour la détection avec de détecteurs de silicium. Le flux de photons et la résolution spatiale étant liés de manière inverse, nous devons souvent faire un compromis. Pour l'analyse des éléments trace nous avons besoin de flux et pour l'analyse intracellulaire de résolution, un bon compromis dans cette ligne a été trouvé avec une résolution de 300 nm et un flux de quelque $10^{10}$ photons·s⁻¹ (Carmona 2021).

### d. Ligne P06 à DESY

La ligne P06 (Hard X-ray micro/nano-probe) du synchrotron PETRAIII à DESY (Deutsches Elektronen-Synchrotron) est une installation polyvalente orientée vers la microscopie de fluorescence à rayons X à balayage, la spectroscopie d'absorption des rayons X et le contraste de phase. Cette ligne est dotée de deux cabines expérimentales : microsonde (Boesenberg 2016) et nanosonde (Schroer 2016). La ligne est dotée de deux monochromateurs qui permettent de sélectionner l'énergie du faisceau entre 3 et 50 keV. Le faisceau est focalisé au moyen de miroirs KB avec la possibilité d'utiliser des lentilles de Fresnel pour des petites énergies. Dans la cabine nanosonde, la taille minimale du faisceau dépend de l'énergie incidente et peut atteindre entre 50 et 120 nm, en conséquence le flux aussi varie entre $10^7$ et $10^9$ ph·s⁻¹. Dans la cabine microsonde, le faisceau peut être focalisé à une taille de 450 nm × 450 nm avec un flux de l'ordre de $10^{10}$ photons·s⁻¹. Cette ligne se caractérise par son système de détection des rayons X, composé d'un détecteur MAIA de grand angle solide et placé en géométrie de rétrodiffusion (Boesenberg 2016) et qui limite la gamme spectrale entre 5 et 19,5 keV. Pour l'analyse de la distribution du manganèse dans les cellules, nous avons trouvé des conditions optimales en travaillant avec un faisceau à 10 keV, focalisé à 700 nm × 800 nm (vertical), donnant un flux de quelque $10^{10}$ photons·s⁻¹ et recueillant l'émission X avec le détecteur Maia en rétrodiffusion (Carmona 2019 a).

### e. Ligne ID16A à l'ESRF

Nous avons utilisé la ligne ID16A (Insertion Device 16 A) du synchrotron ESRF pour la nano-imagerie de fluorescence X et le contraste de phase à très haute résolution (da Silva 2017). Elle permet d'étudier la composition chimique et la morphologie de l'échantillon, et les analyses peuvent être réalisées en 2D ou en 3D (tomographie). Cette ligne de lumière nous a permis de gagner en résolution spatiale et d'imager la composition élémentaire à l'intérieur des compartiments neuronaux tels que les synapses. Le flux sans précédent de cette ligne nous a permis de détecter des éléments présents en quantité d'attogrammes, grâce à quoi nous avons mis en évidence une compartimentation de cuivre et zinc à l'intérieur des synapses. Ces analyses ont été menées dans un premier temps à température ambiante. Les seuls supports adaptés au
porte-échantillon de cette ligne sont des fenêtres de nitrure de silicium (Si₃N₄), et comme nous le verrons il n'a pas été facile de rendre compatible la culture des neurones, transfection et cryopréservation sur ces supports. Actuellement, pour mieux préserver les échantillons pendant les analyses, cette ligne est dotée d'un système de refroidissement, à la température de l'azote liquide. Donc, à présent, toutes les analyses pourront se réaliser sur des échantillons congelés-hydratés.

Comme caractéristiques notables, cette ligne permet de travailler dans la gamme des rayons X durs (> 10 keV) ; concrètement elle possède deux onduleurs qui fournissent une source de 17 keV ou de 33,6 keV. La ligne mesure 185 m de long et comprend, entre autres, deux paires de miroirs de focalisation KB, une pour chacune des énergies, qui permettent de travailler à très haute résolution spatiale avec une taille de faisceau pouvant descendre jusqu'à 13 nm (da Silva 2017). ID16A présente un flux supérieur à 10¹² photons·s⁻¹ à ΔE/E~1 % ce qui lui confère une très haute sensibilité. Elle est dotée de deux détecteurs à dispersion d'énergie disposés de part et d'autre de l'échantillon, ce qui rend possible la détection de très faibles concentrations d'éléments, et présente également un microscope optique à longue distance de travail permettant de placer l'échantillon dans le plan focal.

### f. Ligne 9-ID-B (Bionanoprobe) à l'APS

La ligne Bionanoprobe est dédiée à la fluorescence des rayons X aussi bien en mode cryogénique qu'à température ambiante. Elle permet de travailler dans la gamme des rayons X durs, entre 4,5 et 30 keV. Le faisceau est focalisé sur l'échantillon à l'aide de lentilles de Fresnel. Huit lentilles de Fresnel ont été installées pour couvrir une large gamme de tailles de faisceau focalisé pour différentes énergies incidentes, le tout en optimisant le flux. Cette ligne présente une très haute résolution spatiale avec une taille de faisceau pouvant descendre jusqu'à 50 nm. Les spectres de fluorescence des rayons X sont recueillis à l'aide d'un détecteur Vortex à quatre éléments, placé à 90° par rapport au faisceau. Un poste de travail hors ligne est utilisé pour pouvoir monter jusqu'à quatre échantillons congelés sur un porte-échantillon en aluminium et les introduire dans la cabine d'analyse. Ce poste de travail est refroidi à l'azote liquide et, pendant le transfert ou le stockage, des couvercles en cuivre sont utilisés pour protéger les échantillons contre d'éventuels dommages tels que des changements de température ou l'apparition de gel (Chen 2016).

Pendant l'upgrade et la fermeture provisoire de l'ESRF, nous avons fait appel pour la première fois aux capacités de cette ligne de nano-analyse. Nous avons imagé la distribution des éléments chimiques à l'intérieur de cônes de croissance de neurones en culture. Nous avons marqué deux protéines du cytosquelette, actine et tubuline, cherchant à voir une compartimentation de Cu et Zn par rapport à la distribution de ces protéines. L'analyse de petites structures comme les cônes de croissance (maximum 5 µm de largeur) nécessite un petit faisceau, nous avons travaillé avec une résolution spatiale entre 85 et 100 nm qui nous permettait d'avoir un flux de quelque 10⁹ photons·s⁻¹. Nous avons mis en évidence que les éléments chimiques semblent se concentrer au bout du cône de croissance, ce qui fait penser à une accumulation due à des processus biologiques liés à la plasticité (Carmona 2022).
## 4. La microscopie photonique : marquage des protéines

Je viens de décrire les techniques et lignes que nous utilisons pour l'imagerie, la quantification et la détermination de l'état chimique des métaux présents dans des échantillons biologiques. Pour pouvoir approfondir le rôle qu'ont ces métaux dans des processus biologiques comme les maladies neurodégénératives, ou pour connaître leur neurotoxicité, il est vital de déterminer les protéines avec lesquelles ces métaux interagissent, ou les organites subcellulaires dans lesquels ils s'accumulent. En général, les métaux vont être associés à des protéines de transport (des protéines qui leur permettent d'entrer dans la cellule) ou à de protéines de stockage (des protéines auxquelles ils sont liés une fois entrés dans les cellules en attendant d'être utilisés). Certains métaux sont essentiels à la vie et nécessaires pour le métabolisme cellulaire, donc la cellule va les capter en concentration contrôlée pour accomplir leur mission. Par contre, l'excès ou le déficit de ces métaux peuvent entraîner des conséquences pour le métabolisme cellulaire. D'autres éléments chimiques peuvent se substituer aux métaux essentiels au moment d'entrer dans la cellule et, en conséquence, perturber leur fonctionnement. Ainsi, notre intérêt est d'imager la localisation des protéines et métaux à l'intérieur cellulaire et de déterminer si la perturbation de l'un d'entre eux a de conséquences sur l'autre.

Les protéines d'intérêt peuvent être marquées par différents moyens et observées de différentes façons. Il faut savoir que la méthode de marquage est liée à la méthode d'observation et vice-versa. Ici, j'ai structuré cette section selon la méthode d'observation, en lumière transmise ou en mode fluorescence.

### 4.1 Lumière transmise

Dans le cas où l'observation se fait avec un microscope optique en lumière transmise, l'échantillon est souvent coloré pour rendre visible certaines caractéristiques d'intérêt. Les différentes techniques utilisées pour colorer un échantillon sont collectivement dénommées des techniques d'histochimie. L'histochimie consiste à colorer un échantillon biologique en fonction de son histologie. Le plus souvent ce sont des tissus qui vont être marqués pour révéler des caractéristiques morphologiques. Ainsi l'échantillon est exposé à des composés chimiques qui vont réagir et améliorer le contraste du tissu, et qui vont le colorer en fonction des caractéristiques des tissus et des structures microscopiques des cellules (Alturkistani 2016).

Les échantillons peuvent être colorés en utilisant un simple colorant, par exemple l'hématoxyline qui colore les noyaux en leur donnant une couleur bleu/violet ; l'éosine qui colore le cytoplasme en rose, etc. Ce type de marquage est couramment utilisé dans le diagnostic médical des tumeurs pour localiser les cellules malades ou tumorales ou d'autres cellules pathologiques (Musumeci 2014). Nous avons utilisé ce type de marquage pour identifier la nature cancéreuse du tissu dans l'étude de la distribution de nanoparticules de gadolinium (partie B, section 2.4).

Les techniques d'immunohistochimie sont aussi très utilisées pour révéler la localisation des protéines dans les tissus. Dans ce cas, les échantillons sont exposés à un anticorps qui se fixe de manière spécifique aux protéines pour lesquelles il a une affinité. Après quoi, la présence de cet anticorps, et donc la présence de la protéine d'intérêt, est révélée par coloration chimique et visible en utilisant un microscope optique en lumière transmise. C'est ce type de marquage que nous avons utilisé pour mettre en évidence de manière spécifique certaines régions du cerveau qui continent la protéine tyrosine-hydroxylase (je développerai cette application dans la partie B section 7).
Nombreux sont les protocoles et les produits chimiques disponibles pour la coloration histologique. Ces techniques font généralement appel à la fixation chimique (voir partie B section 5) et à des processus de lavage qui perturbent le contenu des éléments à l'intérieur des cellules et des tissus. Ce qui fait que l'utilisation de ces méthodes de marquage n'est pas toujours compatible avec nos techniques d'analyse. Une façon de les rendre compatibles est l'analyse des coupes adjacentes non colorées (voir section 6). Ce qu'il faut retenir pour tous ces types de marquage qui vont être révélés par coloration et lumière visible est qu'ils vont être faits sur des échantillons équivalents, adjacents, mais pas dans les mêmes échantillons, ils vont être analysés par les techniques de fluorescence des rayons X.

Le plus important dans nos travaux est la façon dont nous allons effectuer l'imagerie corrélative, la procédure à suivre avant le marquage histologique que j'expliquerai dans la section 6. En ce qui concerne le marquage, il faut simplement savoir qu'il existe des protocoles standardisés en fonction des caractéristiques que nous voulons révéler dans les tissus.

## 4.2 Microscopie à fluorescence

La fluorescence est un processus de photoluminescence dans lequel des atomes ou des molécules sont excités par l'absorption de radiations électromagnétiques. Les molécules qui ont été excitées se stabilisent ensuite pour revenir à l'état de base, en libérant l'excès d'énergie sous forme de photons. Pour mesurer cette propriété, l'échantillon est excité à la longueur d'onde d'absorption ou d'excitation, et l'émission est mesurée à une longueur d'onde plus grande, appelée longueur d'onde de fluorescence ou d'émission. Les organites ou protéines devront donc au préalable être marqués de manière spécifique avec des fluorochromes. Un fluorochrome est une molécule qui, excitée à une certaine longueur d'onde, va pouvoir émettre de la lumière à une longueur d'onde supérieure. Le décalage entre la longueur d'onde d'excitation et la longueur d'onde d'émission confère au fluorochrome ses propriétés.

Aujourd'hui il existe de nombreuses protéines fluorescentes, des protéines couplées à un fluorochrome émetteur de fluorescence à certaines longueurs d'onde précises. L'utilisation de ces fluorochromes et le couplage avec les protéines d'intérêt sont un procédé assez commun et routinier pour imager les protéines à l'intérieur des cellules. Il existe deux méthodes pour marquer et détecter les protéines : une directe ou une indirecte. Dans la première, nous introduisons dans les cellules la protéine d'intérêt directement fixée à un fluorochrome (ou nous la faisons synthétiser par la cellule) et nous imageons la fluorescence de ce dernier et donc la localisation de la protéine souhaitée. La méthode indirecte consiste à introduire dans les cellules une molécule qui se fixe aux protéines d'intérêt, ensuite seulement est introduit un fluorochrome qui reconnaît cette molécule et donc nous détectons la fluorescence émise par le fluorochrome qui est fixé à la molécule, laquelle est attachée à la protéine d'intérêt.

En revanche, il faut rendre compatible le marquage des protéines et l'analyse par SXRF, c'est-à-dire qu'il faut utiliser des techniques de marquage qui ne perturbent pas la composition chimique. Pour ce fait, nous avons choisi de faire de la microscopie à fluorescence sur cellule vivante, en utilisant la méthode directe. Je parlerai aussi brièvement de l'utilisation des anticorps fluorescents, parce que même si ce type de marquage demande une fixation chimique il peut être utile dans certains cas en analysant des échantillons équivalents.
Nous avons longtemps utilisé la microscopie en épifluorescence qui est disponible dans notre équipe et facile à mettre en œuvre mais présente des limites de résolution spatiale. Pour avoir des images de fluorescence avec des résolutions spatiales de l'ordre atteint dans le synchrotron, nous avons adapté l'utilisation des techniques dites de super résolution ; concrètement la microscopie STED qui peut atteindre jusqu'à 40 nm. Par la suite je vais décrire ces deux techniques utilisées et les compromis faits pour les rendre compatibles avec l'analyse par SXRF.

## a. La microscopie à épifluorescence

Dans un microscope à épifluorescence, un faisceau de lumière à spectre complet est émis par une lampe à mercure, plus récemment par des LED. Ce faisceau traverse ce qu'on appelle un « cube », c'est-à-dire un ensemble de miroirs dichroïques et de filtres d'excitation et d'absorption, qui va permettre de sélectionner la longueur d'onde de la lumière incidente. En fonction du filtre d'excitation, il est possible de choisir la longueur d'onde de la lumière qui va traverser l'objectif et arriver à l'échantillon. En choisissant une longueur d'onde incidente qui excite les fluorochromes de l'échantillon, les molécules fluorescentes sont excitées et émettent en réponse une lumière d'une longueur d'onde bien spécifique. Ces photons sont émis dans toutes les directions, et seule une fraction sera collectée par l'objectif. Cette lumière émise par l'échantillon traverse à nouveau le « cube », elle est filtrée en fonction des filtres d'absorption et elle est envoyée vers le port de la caméra située au-dessus. En filtrant complètement la lumière d'excitation sans bloquer la fluorescence émise, il est possible de voir uniquement les objets qui sont fluorescents (Coling 1997 ; Lichtman 2005).

Nous avons principalement fait usage de deux protéines fluorescentes, GFP (green fluorescent protein) et RPF (red fluorescent protein), couplées avec les organites cellulaires d'intérêt. Ces types de constructions fluorescentes vont servir à marquer une organelle de manière spécifique et sont fabriqués commercialement. Ainsi, si la protéine d'intérêt est liée avec la GFP nous devrions exciter l'échantillon avec de la lumière bleue et nous détecterions la distribution de la protéine en mesurant l'émission dans le vert. Si la protéine d'intérêt est liée avec la RPF (rouge) nous devrions exciter l'échantillon avec de la lumière le verte et mesurer dans le rouge (figure 4B.1). Aujourd'hui Thermofisher commercialise, sous le nom de CellLight™ reagents, de nombreux marqueurs fluorescents des organelles ou des protéines (https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cell-analysis/cell-structure/celllight-ready-to-use-fluorescent-protein-based-reagents.html). Ils utilisent une technologie nommée BacMam, fondée sur l'utilisation de virus d'insectes (baculovirus) pour transmettre l'information génétique de transcription et l'expression vers le noyau cellulaire. L'expression du gène, donc de la protéine fluorescente, commence dans les 4 à 6 heures après la transduction. La microscopie à fluorescence utilisant ce type de marquage est réalisée sur cellule vivante et elle ne modifie ni la composition chimique ni la structure.
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 4B.1.** Spectres d'absorption et d'émission (A) pour la protéine fluorescente EGFP (B) pour la protéine TagRFP, les deux vendues par ThermoFisher pour le marquage des organelles CellLight™. (https://www.olympus-lifescience.com)</figcaption></figure>

En plus des protéines fluorescentes mentionnées nous avons utilisé un marquage fluorescent du noyau cellulaire, avec le Hoechst 33342. Ce composé est un colorant de l'ADN qui doit être excité par la lumière ultraviolette et qui émet dans le bleu. Ce marqueur est une petite molécule, très peu toxique, qui se fixe au niveau de l'ADN dans les cellules vivantes et donc n'induit pas de modifications chimiques des éléments. Cette molécule garde ses propriétés de fluorescence même après la lyophilisation, caractéristique qui n'est pas la même pour le marquage de type GFP, comme nous pouvons l'observer sur la figure 4B.2. Pour cette raison la microscopie à épifluorescence est réalisée sur cellule vivante et non après lyophilisation.

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 4B.2.** (A, B) Fluorescence sur cellule vivante de la protéine Rab (GFP), de l'appareil de Golgi (RFP) et du noyau (bleu) ; (C) fluorescence du noyau après cryofixation et lyophilisation dans la même zone. Les fluorescences GFP et RFP sont éteintes après lyophilisation.</figcaption></figure>

La technique d'immunofluorescence consiste à introduire un anticorps de synthèse dans la cellule de façon qu'il se fixe à la protéine d'intérêt. Il existe deux options de détection en fluorescence, ou bien cet anticorps est lié directement à un fluorochrome ou bien il faut introduire un autre anticorps fluorescent qui s'agrippe au premier de manière spécifique. Ces anticorps, couplés avec la GFP ou des protéines fluorescentes équivalentes, sont commercialisés et il existe un grand choix pour marquer toutes sortes de protéines, aussi bien dans des tissus que dans des cellules. Le problème est que, pour les faire entrer dans les cellules, le protocole demande une fixation chimique et la perméabilisation des membranes cellulaires. Tout comme le marquage histologique, l'immunofluorescence n'est pas vraiment compatible avec nos techniques, mais
nous pouvons utiliser ce type de marquage sur des coupes adjacentes ou des cellules équivalentes. Je montre dans la partie B section 7 un exemple d'application de l'immunofluorescence sur cellules et comment cela peut nous aider à comprendre des mécanismes pathologiques. Mais il faut garder en tête que si nous utilisons des protocoles qui modifient le contenu élémentaire, nous ne pouvons pas analyser le même échantillon par microscopie photonique ou microscopie par rayons X.

## b. La microscopie à super résolution STED

La lumière, comme toute onde électromagnétique lorsqu'elle rencontre un objet, a la propriété de diffracter. En microscopie, l'image d'un point n'est pas un point mais une tache de diffraction appelée disque d'Airy. Cette diffraction va induire une limite dans la capacité d'un système à reproduire distinctement deux points objets. Cette limite est appelée la résolution du microscope. Donc un microscope peut reproduire l'image de deux points distants seulement s'ils sont séparés par une distance supérieure ou égale à la résolution du système, qui peut être définie grâce à la formule d'Abbe et le critère de Rayleigh comme:

$$d = \frac{0.61 \cdot \lambda}{ON}$$

où d correspond à la plus petite distance pouvant être résolue, λ la longueur d'onde d'émission de la lumière et ON correspond à l'ouverture numérique du microscope (NA, Numerical Aperture en anglais). Alors l'ouverture numérique se calcule selon : ON = n·sinα, avec n = indice de réfraction du milieu et α la moitié de l'angle d'ouverture de l'objectif du microscope. Ainsi pour un microscope qui utilise le spectre de la lumière visible (400 à 700 nm) et pour des observations faites dans l'air (indice de réfraction 1), la résolution spatiale limite est d'environ 200 nm. Si nous nous intéressons, par exemple, aux compartiments synaptiques qui mesurent en moyenne 1 µm et aux vésicules qui se trouvent à l'intérieur, une résolution de 200 nm ne permettra pas d'étudier les neurones à l'échelle des compartiments subsynaptiques. Si nous voulons descendre la limite de résolution spatiale photonique nous devons faire usage d'autres techniques dites super-résolutes.

En 2014, le prix Nobel de chimie a été attribué à Eric Betzig, Stefan Hell et William Moerner pour avoir développé les techniques de microscopie dites super-résolutes. Ces techniques permettent de descendre la limite de résolution en dessous de la limite imposée par la diffraction de la lumière (Hell 1994). L'une de ces microscopies à résolution, PALM (Photo Activated Localization Microscopy), est fondée sur la détection de la molécule unique (Betzig 2006). Le principe est d'activer les molécules fluorescentes tour à tour, de manière aléatoire, rapide et répétitive. Le concept de résolution est remplacé par celui de localisation de source unique, c'est par comparaison de toutes les images aléatoires de fluorescence que la localisation précise de chaque molécule unique sera obtenue. Je parlerai de cette technique dans mon projet de recherche, partie C.

Une autre technique est la microscopie STED, déplétion par émission stimulée (Hell 2004), c'est celle que nous avons mise en œuvre dans nos recherches (Domart 2019 ; Domart 2020). Elle permet d'obtenir une résolution latérale de l'ordre de 30 à 80 nm en diminuant directement la taille du point focal de fluorescence. Cette technique est fondée sur le principe de l'émission stimulée ; en plus du laser d'excitation, elle met en jeu un laser de déplétion en forme de tore qui va « éteindre » la fluorescence périphérique du point focal pour ne garder que la fluorescence de cœur. Il n'y aura pas d'émission de fluorescence isotropique autour
du point d'excitation et la tache de diffraction devient alors plus petite, ce qui permet d'augmenter considérablement la résolution, figure 4B.3 (Hell 2004 ; Nägerl 2008).

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 4B.3. Schéma du principe de la microscopie STED. Images des points d'excitation (bleu) et de déplétion (jaune) ainsi que la superposition des deux montrant l'annulation de la fluorescence périphérique pour ne garder que la fluorescence au centre de l'excitation. Lorsque la puissance du laser de déplétion est élevée, la résolution spatiale augmente (Adapté de Tam 2015).</figcaption></figure>

Nous nous sommes tournés vers des fluorochromes basés sur la « silicone rhodamine » (SiR) très stables et développés pour la microscopie STED : la SiR650 (communément appelée SiR) et la SiR700 (Lukinavičius 2014 ; Lukinavičius 2016) (Spirochrome). Ces fluorochromes, très brillants et très résistants au photoblanchiement fluorescent dans le rouge lointain, sont compatibles avec la microscopie sur cellule vivante. La membrane plasmique étant perméable à ce type de fluorochrome, leur utilisation ne nécessite pas d'électroporer ou de transfecter les cellules, et l'expression de la protéine ciblée reste endogène. Les cellules vivantes peuvent donc être marquées juste avant d'être cryofixées avec le seul ajout de ces fluorochromes dans le milieu de culture et sans suivre aucun procédé chimique.

Pour la microscopie photonique super-résolutive sur cellules vivantes, des lamelles de verre (sur lesquelles poussent les cellules) sont montées dans une chambre de type « Ludin » dans laquelle du milieu d'observation est ajouté. Nous avons dû adapter ce dispositif par rapport à nos supports de culture, les fenêtres de nitrure de silicium Si₃N₄. Nous avons disposé la face présentant les cellules contre la lamelle de verre, et en présence de milieu d'observation, en évitant la formation de bulles d'air. Le milieu d'observation a deux fonctions, la première de maintenir les cellules en vie pendant les observations et la deuxième de diminuer l'autofluorescence et donc de diminuer le bruit sur les images de fluorescence. Nous nous sommes tournés vers le Tyrode que nous avons préparé en conditions stériles et qui a été équilibré avant utilisation. Il est composé de 135 mM de chlorure de sodium, 5 mM de chlorure de potassium, 1,8 mM de chlorure de calcium, 0,4 mM de chlorure de magnésium, 1 mM de glucose et 1 mM d'HEPES, le tout dilué dans de l'eau ultra-pure, le pH et l'osmolarité sont ajustés à celle du milieu de culture des neurones.

Nous avons cherché à vérifier si la microscopie STED était réalisable sur des échantillons lyophilisés. Nous avons constaté que la lyophilisation induit une perte importante de fluorescence et donc une perte importante de signal. Pour pouvoir imager les échantillons, il est nécessaire de baisser la puissance du laser de déplétion et cela a une répercussion dramatique sur la résolution de l'image en STED, qui devient alors
comparable à la résolution obtenue par les techniques classiques de fluorescence. Sur figure 4B.4, la perte de signal de fluorescence après la lyophilisation est visible. C'est pour cette raison que la microscopie STED se réalise sur cellule vivante et pas sur des échantillons lyophilisés qui ont suivi tout le processus de préparation des échantillons (voir partie B, section 5).

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Figure 4B.4. Distribution de la tubuline (en vert) et de la F-actine (en magenta) dans les cônes de croissance des neurones de l'hippocampe. (A) Image confocale dans un neurone vivant DIV3. (B) image STED dans le cône de croissance marqué en A sur neurone vivant. (C) Image STED de la même région B après cryofixation et lyophilisation.

## 5. Préparation des échantillons

Quelle que soit la méthode d'analyse, la qualité du résultat est toujours dépendante de la qualité de la préparation des échantillons. Tout au long de mon parcours de recherche en chimie analytique, j'ai porté un soin tout particulier à l'élaboration, au perfectionnement et à la validation des protocoles de préparation des échantillons biologiques pour l'imagerie et la spéciation des éléments.

Nous utilisons des techniques d'analyse d'émission de rayons X, induite par des particules (PIXE) ou rayons X (SXRF), pour déterminer la distribution et le contenu des éléments qui constituent nos échantillons biologiques, coupes de tissus, ou cellules isolées. Ces techniques spectrométriques ne peuvent pas être réalisées directement sur des cellules vivantes en raison des dommages subis par l'échantillon, particulièrement par la radiolyse de l'eau sous l'effet du rayonnement. Les analyses sont nécessairement conduites sur des échantillons déshydratés ou sur des échantillons hydratés maintenus à très basse température.

La préparation des échantillons est une question critique, car ces techniques analytiques présentent des seuils de détection très bas et de très hautes résolutions spatiales. Les protocoles invasifs de préparation des échantillons généralement utilisés en imagerie biologique peuvent induire une contamination et/ou une redistribution des éléments au niveau cellulaire (Chwiej 2005 ; Hackett 2011 ; Al Ebraheem 2015 ; Perrin 2015). Par conséquent, nos techniques nécessitent donc des méthodes de préparation spécifiques pour répondre à ces besoins. Concrètement le protocole de préparation des échantillons doit répondre à trois critères : 1) préserver la structure cellulaire ; 2) ne pas altérer la répartition des éléments chimiques, en particulier des ions diffusibles et 3) éviter l'introduction d'éléments chimiques exogènes, de contaminants. Les méthodes cryogéniques sont la meilleure option pour ce type de préparation puisqu'elles consistent à immobiliser rapidement l'échantillon par cryofixation et donc à figer les structures cellulaires et les
distributions élémentaires à un instant donné. Donc la cryofixation garantit les trois critères demandés par l'imagerie quantitative par émission de rayons X : 1) préservation de la structure 2) conservation de la composition élémentaire et 3) pas d'apport d'éléments externes. Par exemple, en microscopie électronique la cryofixation est la seule méthode alternative à la fixation chimique utilisée conventionnellement pour la préparation des échantillons.

Cependant, les techniques de marquage utilisant la fixation chimique peuvent s'avérer d'une grande utilité pour l'analyse corrélative sur des échantillons adjacents ou pour l'analyse de la distribution sur des cellules équivalentes, mais provenant d'échantillons différents. Dans la section 6, partie B, je vais illustrer comment, dans certains cas, nous pouvons réaliser l'imagerie corrélative en utilisant la fixation chimique.

## 5.1 La culture cellulaire

Dans le cas de cultures secondaires de lignées cellulaires ou de cultures primaires de neurones dissociés, les cellules sont cultivées directement sur des supports spécifiques pour l'analyse par spectrométrie de fluorescence des rayons X. Ces techniques de fluorescence des rayons X ont des exigences spécifiques par rapport aux supports d'analyse : 1) les supports doivent être exempts de toute trace d'éléments chimiques susceptibles d'être dans les échantillons d'intérêt ou des produits toxiques ; 2) ils doivent être suffisamment fins pour permettre au faisceau incident de les traverser sans interagir avec eux et donc sans augmenter la radiation de freinage ou bremsstrahlung pour les faisceaux d'ions (ce que diminuerait la sensibilité) ; 3) ils doivent être plats pour avoir le même angle d'incidence entre faisceau et échantillon pour toute la cible et pouvoir faire la détection de rayons X émis à l'angle souhaité.

Il existe deux types de supports, les films de polycarbonate posés sur des supports en PEEK (polyétheréthercétone) et les membranes de nitrure de silicium $Si_3N_4$ (Colvin 2016 ; Perrin 2015, 2017). Les supports 'PEEK' se composent d'un rectangle fait avec un plastique ultra-pur nommé PEEK avec au milieu un trou carré de 5 mm de côté et l'ensemble est recouvert d'une feuille de polycarbonate ultra-pur de 2 µm d'épaisseur (figure 5B.1). Les supports de nitrure de silicium $Si_3N_4$ se composent d'un cadre de silicium de 5 mm de côté et 200 µm d'épaisseur au centre duquel se trouve la membrane de $Si_3N_4$, également carrée, mesurant 1,5 mm de côté et présentant une épaisseur de 200 nm ou 500 nm (figure 5B.1). Une petite membrane carrée (de 100 µm de côté) est usinée près d'un des quatre coins du cadre de silicium afin de faciliter l'orientation du support et le calcul des positions des zones d'intérêt. Ces supports présentent par rapport aux supports 'PEEK' des propriétés optiques compatibles avec la microscopie photonique super-résolutive STED (Domart 2019) et sont les seuls supports compatibles avec la ligne ID16A de l'ESRF.

Pour rendre ces supports compatibles avec la culture cellulaire, ils sont stérilisés par immersion dans de l'éthanol ultra-pur pendant 2 heures, séchés sous une hotte à flux laminaire et traités pour que les cellules ou neurones y adhèrent. Dans le cas des cellules, les supports étaient traités, quelques jours auparavant, avec du gel de gélatine pendant 15 minutes, après quoi ils sont rincés à l'eau ultra-pure trois fois et séchés sous la hotte à flux laminaire pendant une demi-journée. Les neurones primaires sont beaucoup plus sensibles aux conditions de culture, nous avons opté pour l'utilisation d'un protocole d'adhésion similaire à celui des lamelles de verre. Les supports sont donc recouverts avec de la poly-lysine (à 1 mg·ml⁻¹) pendant 2 heures 30 minutes à 37 °C, ils sont rincés deux fois avec de l'eau ultra-pure et gardés dans l'incubateur en présence d'un milieu.
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 5B.1. À gauche une membrane de nitrure de silicium, à droite un support 'PEEK' couvert d'un film de polycarbonate.</figcaption></figure>

Les neurones primaires sont ensemencés sur les membranes de Si₃N₄ à une densité homogène d'environ 30 000 à 50 000 cellules par centimètre carré et ils sont incubés pendant 2 heures avec du milieu (temps suffisant pour qu'ils adhèrent à la membrane). Ensuite, les membranes sont déposées (neurones vers le haut) dans une boîte de Pétri présentant une couche de cellules gliales (astrocytes). Ces cellules gliales ont été ensemencées dans la boîte de Pétri 15 jours avant les neurones, elles sont nécessaires au développement et à la survie des neurones (Kaech 2006). Au 4ᵉ jour *in vitro* ou DIV4 (Day in vitro 4) les cultures sont traitées avec de la cytosine arabinoside à 2 µM pour freiner la prolifération des cellules gliales et permettre ainsi de sélectionner la population de neurones. Entre DIV15 et DIV21, le réseau dendritique et les épines des neurones sont bien développés. Les cellules sont ensemencées sur les membranes Si₃N₄ ou les supports PEEK, à basse densité soit 10 000 cellules par centimètre carré, le jour avant le début les expositions ou transfections. Les supports sont déposés dans des boîtes de Pétri, avec un couvercle permettant de les fermer et les garder en conditions stériles, ils sont maintenus dans l'incubateur à 37 °C, dans une atmosphère avec 5 % de CO₂. Dans le cas où le marquage de protéines nécessite l'utilisation de la fixation chimique, alors ces cellules ou neurones ne seront pas analysés par nos techniques de fluorescence des rayons X. Ainsi ces cellules ou neurones ne nécessitent pas d'être cultivés directement dans nos supports spécifiques et ils peuvent être cultivés sur des supports classiques comme les lamelles de verre.

## 5.2 Fixation chimique

La fixation chimique consiste à figer de manière irréversible la structure des échantillons (cellules ou tissus) de façon à rendre insolubles les composants cellulaires en formant des liaisons covalentes entre les protéines. Cependant, ce processus, couramment réalisé au moyen de fixateurs à base d'aldéhydes, comme le formol neutre tamponné (NBF), paraffine-formaline (paraformaldéhyde - PFA) ou glutaraldéhyde détruit et dénature les protéines, ce qui les rend dysfonctionnelles (Kiernan 2000 ; Alturkistani 2016).

Le processus de fixation chimique comporte aussi d'autres étapes comme la déshydratation, la perméabilisation et le rinçage. La première consiste à enlever l'eau des échantillons par déshydratation avec de l'éthanol. L'étape de perméabilisation est notamment utilisée par le marquage avec des anticorps. Elle
consiste à perméabiliser les membranes cellulaires, à l'aide de détergents comme le Triton X-100 ou le Tween 20, pour faire entrer les anticorps et leur permettre de se fixer aux protéines pour lesquelles ils sont spécifiques. Les étapes de rinçage ont lieu tout au long du processus de fixation avec l'objectif d'enlever toute liaison aspécifique. Une fois l'échantillon fixé, il est possible de révéler les zones histologiques d'intérêt par différents moyens. Par exemple, il est possible d'utiliser des produits chimiques, comme l'hematoxylin-eosin (H&E), pour marquer certaines parties ou caractéristiques des tissus (les noyaux des cellules) au moyen de la microscopie par lumière visible. Ou encore, il est possible d'utiliser des anticorps et révéler la localisation des protéines d'intérêt par différentes méthodes comme l'immunofluorescence ou immunohistochimie.

Nous avons démontré (Davies 2014; Roudeau 2014 ; Perrin 2015), ainsi que d'autres collègues (Chwiej 2005 ; Ralle 2009; Matsuyama 2010 ; James 2011 ; Hackett 2011 ; Robison 2012 ; Al-Ebraheem 2015 ; Jin 2017), que la fixation des cellules au moyen d'aldéhydes et détergents cause des modifications des éléments chimiques. Notamment la perte des éléments les plus légers et les ions les plus mobiles. La figure 5B.2 illustre deux spectres PIXE obtenus après cryofixation et freeze-drying (bleu) ou après fixation chimique (rouge). Nous pouvons constater que la fixation chimique induit des changements dans la concentration des éléments, notamment la perte du potassium, du chlore, du cuivre et du zinc. Donc la fixation chimique n'est pas un protocole optimal pour l'étude des éléments intra cellulaires, la cryofixation préserve mieux les pools intracellulaires des éléments chimiques, et donc nos techniques spectroscopiques par fluorescence des rayons X ne sont pas compatibles avec la fixation chimique.

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Figure 5B.2. a, b) Comparaison de la composition chimique élémentaire des cellules, pour deux types de préparations : fixation chimique (rouge) et cryofixation et freeze-drying (bleu). La fixation chimique induit une perte drastique des éléments diffusibles K, Cl mais aussi du Cu, du Zn, du carbone et de l'azote. La cryofixation préserve mieux les pools cellulaires des éléments chimiques (Roudeau 2014).
## 5.3 Méthodes cryogéniques

Pour la préparation d'échantillons, nous avons développé une méthode à plusieurs étapes, selon les besoins :
1) rinçage du milieu extracellulaire ;
2) cryofixation par immersion dans un fluide cryogénique ;
3) lyophilisation ou déshydratation sous vide et à basse température. Nous verrons, ci-après, pour chaque étape la procédure à suivre et les spécificités en fonction du type d'échantillons à préparer et les besoins analytiques.

Nous travaillons sur deux types d'échantillons biologiques : les tissus (à partir de coupes fines) et les cellules isolées. Dans le cas des tissus, en général, le bloc en entier est cryofixé par immersion, après (comme nous verrons dans la partie 6) des sections de la zone d'intérêt sont faites avec un cryomicrotome et puis ces sections sont lyophilisées. Pour l'analyse cellulaire, le protocole de préparation d'échantillons est plus complexe et détaillé ci-dessous.

### a. Le rinçage du milieu de culture

Les cellules et les neurones sont toujours immergés dans du milieu de culture tant qu'ils sont vivants. Ce milieu apporte les nutriments nécessaires pour le développement cellulaire (acides aminés, vitamines, glucose...), il est riche en sels minéraux, comme le Na, Cl, K ou Ca, et contient aussi d'autres éléments chimiques nécessaires pour la bonne croissance cellulaire (notamment les métaux essentiels Fe, Cu, Zn, etc.). De même, pour l'observation des protéines fluorescentes sur cellule vivante, elles sont maintenues immergées dans du milieu d'observation, comme le Tyrode.

Les éléments en forte quantité dans le milieu extracellulaire comme le Na, Cl, K, Ca peuvent provoquer une très forte émission de fluorescence X qui peut saturer le signal détecté par rapport à celui des éléments traces intracellulaires, et donc ils camoufleraient le signal provenant des cellules. Il est donc crucial d'éliminer ces éléments extracellulaires avant la cryofixation. De plus, il est important d'éliminer les restes de protéines, vitamines ou oligo-éléments qui sont présents en petites quantités dans le milieu pour pas confondre cette contribution extérieure avec la composition intérieure de cellules. Pour ces raisons les échantillons sont donc rincés avant cryofixation dans une solution qui permet d'éliminer tous les composants du milieu de culture et d'observation et, en même temps, cette solution doit éviter un quelconque choc osmotique.

Pour les cultures secondaires de lignées cellulaires, le rinçage se faisait initialement en deux étapes. Premièrement les cellules étaient immergées dans une solution de PBS (solution saline tamponnée au polyphosphate) de pH et d'osmolarité similaires au milieu de culture. Par ce rinçage rapide (< 20 secondes), l'objectif était d'éliminer le milieu extracellulaire. Un second rinçage était alors effectué avec de l'eau de haute pureté qui permettait d'éliminer les ions extracellulaires présents en grande quantité dans le PBS (par exemple Na et Cl). Le second rinçage devait être plus rapide, quelques secondes seulement, de sorte que la modification de la pression osmotique n'affecte pas la structure cellulaire avant la cryofixation. Après le second lavage, l'excès d'eau était éliminé avec du papier absorbant et l'échantillon rapidement cryofixé. Ce protocole était satisfaisant pour l'étude de cellules relativement résistantes au choc osmotique telles que les cellules tumorales (Carmona 2008 a).
Même si le rinçage est effectué sur un temps court avant la cryofixation, la solution de rinçage doit préserver la viabilité et la morphologie cellulaire en évitant un choc osmotique. L'eau distillée et le PBS sont des milieux hypotoniques par rapport au milieu de culture et il est connu que la morphologie des neurones primaires d'hippocampe varie rapidement dans ce type de milieu (Aitken 1998). De fait et dans le but d'avoir un protocole de préparation généralisé qui évite tout choc osmotique et qui puisse être utilisé avec n'importe quel type de culture de neurones ou de lignes cellulaires, nous avons testé différentes solutions de rinçage. Notre objectif était de comparer la composition élémentaire des cellules préparées selon différents protocoles inspirés de la littérature et de nos expériences (Matsuyama 2010 ; Dučić 2013 ; Dučić 2015). D'un côté, nous avons comparé l'utilisation comme solution de rinçage du couple PBS/eau et d'un autre côté l'utilisation d'une solution d'acétate d'ammonium. Nous avons préparé aussi des échantillons utilisant seulement le PBS et une technique de cryofixation différente, finalement nous avons comparé aussi ces types de préparations avec des échantillons fixés chimiquement en utilisant des conditions douces (PFA peu concentré et peu d'étapes de rinçage) (Perrin 2015).

Finalement, nous avons conclu que l'utilisation d'acétate d'ammonium comme solution de rinçage des éléments extracellulaires avant la cryofixation s'avérait être la meilleure option (Perrin 2015) puisqu'elle n'introduit pas de modifications des compositions élémentaires (figure 5B.3) et que la morphologie cellulaire est préservée. L'acétate d'ammonium, de formule $C_2H_7NO_2$, est un sel azoté comprenant uniquement des éléments légers qui ne perturbent pas les analyses spectroscopiques, car seuls les éléments de $Z > 11$ sont détectés. Cette solution tampon est préparée par dissolution dans de l'eau ultra-pure, et le pH et l'osmolarité sont ajustés à ceux du milieu de culture (dans notre cas avec la lignée PC12 pH = 7,4 et 310 mOsm). Enfin, la solution est stérilisée par filtration et équilibrée à 36,7 °C avant utilisation. Ainsi, depuis 2015, pour les neurones et pour toutes les lignées cellulaires, le rinçage se fait en une seule étape, avec de l'acétate d'ammonium d'osmolarité et pH ajustés à ceux du milieu de culture utilisé. Après le rinçage, l'excès de tampon est éliminé du support avec du papier absorbant et l'échantillon est rapidement cryofixé par immersion.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 5B.3. Comparaison du contenu élémentaire dans des cellules PC12 mesuré par micro-PIXE selon quatre protocoles différents : AC+cryo+FD : rinçage à l'acétate d'ammonium, cryofixation et freeze-drying (FD) ; PBS+cryo+FD : rinçage au PBS et à l'eau ultra-pure, cryofixation et freeze-drying ; PBS+PFA+AD : rinçage au PBS, fixation chimique au paraformaldéhyde et séchage à l'air (AD) ; PBS+meth+AD : rinçage au PBS, cryofixation au méthanol refroidi et séchage à l'air (AD) (Perrin 2015).</figcaption></figure>

## b. La cryofixation (ou plunge-freezing)

La cryofixation est une méthode de congélation rapide de l'échantillon. Pendant la congélation, des cristaux de glace se forment dans les échantillons (processus appelé nucléation) et la taille de ces cristaux dépend inversement de la vitesse de congélation. La cryofixation peut donc induire des dommages aux structures cellulaires, surtout si la taille des cristaux est grande. Pour éviter cela et obtenir des cristaux de glace de petite taille, la vitesse de refroidissement de l'échantillon doit être la plus élevée possible (Quintana 1994 ; Elder 1989). Pour obtenir une baisse rapide de la température, l'échantillon est immergé dans un liquide cryogénique qui est refroidi à basse température. Les liquides cryogéniques sont des composés avec un grand écart entre la température de fusion et d'ébullition et qui ont une bonne conductivité thermique, comme le
2-méthylbutane, le propane ou l'éthane. Pour nos échantillons biologiques nous avons utilisé du 2-méthylbutane refroidi à -165 °C par contact avec de l'azote liquide.

Concrètement, après le rinçage, il est nécessaire d'enlever l'excès de liquide dans les échantillons pour éviter la formation d'une couche de glace épaisse autour de la cible. Cette couche de glace peut atténuer les rayons X légers émis par l'échantillon. Donc, délicatement avec du papier absorbant non tissé (Whatman®), la solution de rinçage est absorbée puis les échantillons sont plongés rapidement, et maintenus pendant quelques dizaines de seconde, dans du 2-méthylbutane refroidi à -165 °C. Une fois l'échantillon refroidi, il est maintenu dans des vapeurs d'azote et les traces du 2-méthylbutane sont absorbées avec du papier absorbant non tissé refroidi au préalable à la même température que l'échantillon. À ce stade nos échantillons sont cryofixés et peuvent être stockés dans des vapeurs d'azote liquide avant d'être analysés sous la forme congelée-hydratée lorsqu'un porte-échantillon cryogénique est installé sur les lignes de lumière ou bien ils peuvent être lyophilisés (freeze-drying) si les analyses sont menées à température ambiante.

Dans le cas des tissus biologiques, comme des tumeurs ou parties d'organes d'intérêt, le tissu est extrait et directement cryofixé par immersion dans un liquide cryogénique. Le temps d'immersion doit être plus long pour les tissus que pour les cellules puisque le volume à refroidir est plus considérable. Après la cryofixation, le bloc de tissu congelé est soit stocké à basse température soit directement transféré dans un cryomicrotome refroidi à -25 °C. Le tissu est monté avec du milieu de congélation et des cryosections sont préparées et déposées sur les supports d'analyse (polycarbonate/PEEK). Pour éviter la déformation des tissus, la cryosection est recouverte d'un second porte-échantillon en PEEK/polycarbonate. De cette manière, maintenues entre les deux supports, les sections sont dans une position stable pendant la manipulation et l'analyse, et elles peuvent être stockées en congelées-hydratées ou lyophilisées.

### c. La lyophilisation (freeze-drying)

La lyophilisation que nous effectuons est appelée « freeze-drying », elle consiste à déshydrater l'échantillon sous vide et à très basse température. Les échantillons sont donc lyophilisés en conditions douces par sublimation de la glace en vapeur d'eau pour minimiser les effets de la déshydratation sur la structure cellulaire (Carmona 2008 a).

Nous avons deux types de lyophilisateurs : l'un de marque Christ modèle Alpha 1-2 LDplus et un second de marque Quorum modèle K775X. Dans le premier, de marque Christ, la température de lyophilisation est obtenue avec un condenseur et varie entre -50 et -80 °C en fonction du vide atteint. L'échantillon cryofixé est introduit dans le lyophilisateur, auparavant refroidi, et le vide est lancé rapidement. Le vide est réalisé au moyen d'une pompe à vide et atteint généralement 0,040 mbar ou moins. Les échantillons sont déshydratés à l'intérieur pendant deux à trois jours. Ensuite, nous laissons la température du condenseur remonter progressivement jusqu'à la température ambiante, enfin et doucement nous laissons entrer de l'air sec (l'air passe par des billes de gel de silice) jusqu'à atteindre la pression atmosphérique. À ce stade nous pouvons sortir les échantillons lyophilisés et les conserver à température ambiante dans un environnement sec jusqu'aux analyses.
Dans le second lyophilisateur, de marque Quorum, la température de lyophilisation (-120°C) est obtenue par contact thermique avec une plaque en cuivre refroidi avec de l'azote liquide. L'échantillon cryofixé est introduit dans le lyophilisateur précédemment refroidi et le vide est lancé rapidement. Les échantillons sont déshydratés pendant un jour, après quoi la température et la pression à l'intérieur sont remontées par paliers progressifs jusqu'à la température ambiante et la pression atmosphérique. Une fois la lyophilisation terminée, les échantillons peuvent être utilisés ou stockés dans un environnement sec et à température ambiante. Les deux lyophilisateurs donnent de bons résultats de préservation, avec le premier lyophilisateur nous pouvons préparer plus d'échantillons en même temps puisque sa surface est plus grande, il est donc plus adapté pour la lyophilisation des tissus et quand le nombre des cibles à lyophiliser est important.

# 6. Imagerie corrélative métaux-protéines

J'ai présenté les techniques d'analyse par fluorescence des rayons X induits par faisceau d'ions ou par rayonnement synchrotron que nous mettons en œuvre pour l'étude des métaux. J'ai présenté aussi les techniques de fluorescence des protéines pour la détermination de la distribution des organelles ou des protéines d'intérêt qui sont à notre disposition, et comment les rendre compatibles avec l'analyse des métaux, ainsi que la spécificité les méthodes cryogéniques de préparation des échantillons pour l'imagerie.

Par la suite j'expliquerai la procédure à suivre pour mener à terme l'imagerie corrélative. Premièrement, j'expliquerai les étapes et l'ordre dans lequel il faut les accomplir pour aboutir à l'imagerie corrélative sur des neurones ou cellules. Dans un deuxième temps, j'expliquerai comment nous procédons pour l'imagerie corrélative dans des tissus. Toujours avec le but de corréler la distribution des métaux mis en cause dans les processus de neurodégénérescence et la localisation les protéines qui régulent leur fonctionnement (entrée, transport, efflux, stockage...) ou des protéines qui agissent avec ou à cause d'eux.

## 6.1 Imagerie corrélative dans les cellules/neurones

Pour déterminer la distribution des métaux à l'intérieur des cellules et localiser les protéines ou organelles d'intérêt, nous avons développé un workflow sur la manière d'observer, préparer et analyser nos échantillons. En fonction de la ligne d'analyse et des besoins techniques, par exemple si nous travaillons à température ambiante ou si la résolution spatiale est nanométrique, nous devrons suivre, ou non, le protocole dans son intégralité. Le processus est illustré sur l'image 6B.1. La première étape 1) consiste à cultiver les cellules ou neurones dans les supports d'analyse adéquats, en fonction des caractéristiques et contraintes de la ligne synchrotron. Pendant cette étape se réalisent, si nécessaire, les expositions aux métaux et/ou produits toxiques, molécules perturbatrices, etc. La deuxième étape 2) consiste à marquer et observer les protéines d'intérêt, in vivo. Au cours de cette phase, les cellules vivantes seront cultivées avec des protéines fluorescentes qui entreront dans les cellules sans induire de modifications chimiques. L'observation se réalisera, si possible, à 37°C et sous atmosphère de 5% de CO₂ ou (à défaut) en limitant le temps d'observation afin que les cellules souffrent le moins possible et ne meurent pas. Il est important à ce stade d'enregistrer les positions des cellules fluorescentes d'intérêt par rapport à un point de repère pour pouvoir les retrouver après la préparation d'échantillons. Nous avons utilisé l'épifluorescence ou la technique STED en fonction de nos objectifs de résolution spatiale. Si nous voulons sonder des petits volumes, comme l'intérieur d'une synapse, il faudra du STED, en revanche si nous sommes intéressés par des organelles plus
grandes, comme le réticulum endoplasmique ou l'appareil de Golgi, nous pouvons nous contenter de l'épifluorescence. La troisième étape sera 3) la préparation des échantillons par méthode cryogénique. Cette partie est divisée en deux phases, cryofixation et lyophilisation, cette dernière est optionnelle et son exécution dépendra si la ligne d'analyse est équipée d'un cryostat ou si les analyses se font à température ambiante. Dans le premier cas, après la cryofixation, les échantillons seront conservés dans des vapeurs d'azote jusqu'au moment des analyses. En revanche, les échantillons qui peuvent être lyophilisés se conservent à température ambiante. Dans ce cas, il convient, une fois les échantillons lyophilisés, d'observer les cellules en microscopie optique pour vérifier la préservation globale de la cellule et aussi pour déterminer la localisation du noyau par fluorescence. Les images des noyaux nous permettront par superposition avant/après de reconnaître les cellules qui montraient de la fluorescence in vivo (voir figure 6B.2). La quatrième partie 4) consiste à analyser les métaux par SXRF ou XAS. Grâce aux positions enregistrées à l'étape 2 nous pouvons retrouver les cellules montrant de la fluorescence in vivo et les analyser. Nous pouvons utiliser la technique XAS si l'échantillon est conservé en congelé-hydraté et la technique SXRF pour imager la distribution des métaux si les échantillons sont conservés en congelé-hydraté ou en lyophilisé.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 6B.1. Workflow pour l'imagerie corrélatifée protéines-métaux dans les cellules et synapses (Roudeau 2014; Domart 2020).</figcaption></figure>

Dans l'exemple de la figure 6B.2, nous avons réalisé la microscopie de protéines d'intérêt sur cellule vivante. D'abord en confocal (A) nous obtenons la fluorescence de toute la cellule et nous enregistrons les positions de l'image. Ensuite, par STED, nous imageons la fluorescence dans le cône de croissance (B), dans le cas qui nous occupe nous avons marqué l'actine (C et en magenta en A et B) et la tubuline (D et en vert en A et B). Une fois l'échantillon observé, il a été cryofixé et lyophilisé. Avant les analyses par SXRF nous avons vérifié que les neurones et les cônes de croissance d'intérêt sont bien préservés dans la cible. Pendant la préparation des échantillons, notamment dans la phase de rinçage, il se peut que certaines cellules se décollent du support ou bien que certaines structures ne se lyophilisent pas correctement. Grâce aux positions, nous pouvons retrouver le même neurone avant et après la préparation des échantillons, signalé avec une flèche
en A et E. Nous pouvons identifier les cônes de croissance imagés par STED en B et entourés en E, et finalement retrouver et imager par SXRF (F) le cône de croissance sélectionné en B.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 6B.2. (A, B) Fluorescence de la tubuline (vert et image D) et l'actine (magenta et image C) sur des neurones en culture. Fluorescence en confocal (A) et STED (B, C, D). (E) Image en transmission de la même zone, les flèches indiquent le même noyau neuronal que (A) et le carré le même cône de croissance que (B). (F) images SXRF du cône de croissance encadré en (B) (Carmona 2022).</figcaption></figure>

Dans un autre exemple, nous pouvons apercevoir, quand on travaille avec des cellules, la nécessité de marquer le noyau et d'enregistrer les positions pour retrouver les cellules d'intérêt (Figure 6B.3). Par microscopie à épifluorescence sur cellule vivante (A, B) nous avons imagé en vert les cellules marquées avec la protéine d'intérêt (SLC30A10), en bleu le noyau et en rouge l'appareil de Golgi. Après cryofixation et lyophilisation et grâce aux positions nous avons retrouvé la zone d'intérêt, et grâce à la fluorescence du noyau après lyophilisation nous avons identifié les cellules qui fluoresçaient *in vivo* en vert et en rouge (C) et vérifié la bonne préservation de ces cellules (D). Après quoi nous avons imagé par SXRF les deux cellules voisines et obtenu la distribution des éléments. Ce sont les même cellules, encadrées, que nous analysons par épifluorescence et par SXRF (Figure 6B.3).
<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Figure 6B.3. (A, B) Fluorescence sur cellule vivante de l'appareil de Golgi (RFP), de la protéine SLC30A10 (vert) et du noyau (bleu) ; noyau après cryofixation et lyophilisation, nous retrouvons (C) la fluorescence du noyau dans la même zone et l'image en transmission de la même zone (D). En comparant les images de fluorescence des noyaux avant/après nous pouvons facilement identifier les cellules qui montraient la fluorescence et les analyser par SXRF (Carmona 2019 a).

Comme nous l'avons vu dans la partie B section 4.2.a, si nous utilisons des anticorps pour le marquage des protéines par fluorescence, l'imagerie n'est pas corrélative en soi. Nous pouvons démontrer une tendance, une redistribution ou relocalisation, mais la microscopie est faite sur des cellules différentes. Cependant, cette technique peut s'avérer d'une grande utilité pour l'analyse sur des cellules équivalentes mais de populations différentes. Le workflow de la figure 6B.1 a subi quelques modifications. D'abord dans l'étape 1) les cellules ou neurones sont cultivés sur des supports différents selon qu'on analyse les métaux ou les protéines. Après quoi une partie des échantillons seront cryofixés/lyophilisés et analysés par SXRF/XAS, c'est-à-dire suivant les étapes 3 et 4 du workflow sans passer par l'étape 2. L'autre partie des échantillons sera fixée chimiquement et observée en fluorescence, donc suivant l'étape 2 du workflow.

Je vais illustrer l'utilité de la fixation chimique et le marquage par anticorps (malgré leurs limitations) par une étude que nous avons faite sur la relation entre le fer et la protéine synucléine, mise en cause dans la maladie de Parkinson (Ortega 2016). Dans cet exemple, les cellules ont été cultivées sur lamelle de verre, ont été transfectées avec un adénovirus α-synucléine, et exposées à un excès du fer dans le milieu de culture. Par immunofluorescence, nous avons révélé que la protéine α-synucléine se redistribue autour du noyau cellulaire quand celle-ci est surexprimée (figure 6B.4). De manière indépendante, une autre série d'échantillons avait été cultivée sur des supports synchrotron, aussi transfectée avec l'α-synucléine et exposée au fer, cryofixée, lyophilisée et analysée sur la ligne ID22NI de l'ESRF. Les images ont montré une redistribution du fer autour du noyau quand la protéine α-synucléine est surexprimée (figure 6B.4). En comparant les images, nous pouvons émettre l'hypothèse que le fer se relocalise dans les inclusions riches en α-synucléine.
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 6B.4. Images d'immunofluorescence de l'α-synucléine (en rouge) sur des cellules PC12 et marquage du noyau avec Hoechst 33342 (en bleu) en conditions natives (A) ou avec surexpression de la protéine α-synucléine (B). Distribution du Fe et du Zn par SXRF sur des cellules PC12 en conditions natives (C) ou avec une surexpression de la protéine α-synucléine (D). La distribution du fer est modifiée par la surexpression et semble avoir la même localisation que la protéine α-synucléine (Ortega 2016).</figcaption></figure>

## 6.2 Imagerie corrélatifve dans les tissus biologiques

L'homéostasie des métaux dans le cerveau est altérée dans de nombreuses maladies neurodégénératives et la concentration, la localisation et/ou la spéciation chimique des éléments peuvent être modifiées par rapport à des individus sains (Acevedo 2019). Ces modifications sont souvent spécifiques à la région du cerveau affectée par le processus neurodégénératif. Par exemple, la concentration en fer augmente dans la substantia nigra (SN) des patients atteints de la maladie de Parkinson et les réactions d'oxydoréduction du fer pourraient être impliquées dans la pathogénie. L'identification de la base moléculaire de la dyshoméostasie des métaux dans des régions spécifiques du cerveau fait l'objet de recherches intensives et les méthodes d'imagerie des éléments chimiques sont particulièrement utiles pour étudier cet organe.

Cependant, afin d'apporter des informations précises sur les modifications des métaux dans des zones spécifiques du cerveau, ces méthodes d'imagerie chimique doivent être corrélées à l'immunohistochimie des tissus cérébraux. Nous savons que les préparations immunohistochimiques basées sur la fixation chimique et la coloration ne sont pas adaptées à l'imagerie SXRF car elles sont connues pour modifier la distribution et la spéciation des éléments (Al-Ebraheem 2015 ; Chwiej 2005 ; Hackett 2011 ; Matsuyama 2010 ; Ralle 2009 ; James 2011 ; Jin 2017 ; Perrin 2015 ; Roudeau 2014 ; Davies 2014). Néanmoins, cette technique peut s'avérer d'une grande utilité pour l'analyse corrélatifve sur des échantillons adjacents. Dans ce but, je présente dans la figure 6B.5 le workflow à suivre pour la préparation d'échantillons si nous voulons rendre compatibles la préparation par histologie et observation en lumière transmise avec l'analyse des métaux.
<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Figure 6B.5. Déroulement de la procédure visant à corréler les régions cérébrales des cryocoupes colorées pour immunohistochimie avec des cryocoupes non colorées préparées pour l'imagerie des métaux (Carmona 2019 b).

Premièrement, il faut procéder à l'extraction et cryofixation du tissu. Après, et toujours en veillant à maintenir la température en dessous de zéro (optimum entre -35 et -25 °C), le tissu est monté dans un cryomicrotome. Une fois le système à la bonne température et le tissu monté, il faut procéder à la coupe et enlever le tissu jusqu'à arriver à la zone d'intérêt. Une fois aux alentours, il faut réaliser quelques trous dans le tissu avec une aiguille fine autour de la zone d'intérêt pour pouvoir orienter les coupes plus tard. À ce moment, il faut régler l'épaisseur des coupes. L'analyse des métaux nécessite la préparation des cryosections de tissu semi-minces ; un bon compromis est de travailler avec une épaisseur de 30 µm. La première cryosection est déposée sur un support adapté aux méthodes d'analyse par rayonnement synchrotron. Pour éviter la déformation du tissu, la coupe peut être recouverte d'un deuxième porte-échantillon. Le tissu sera placé en sandwich entre les deux de façon à le stabiliser pendant la manipulation et l'analyse. Une deuxième cryosection, immédiatement adjacente à la précédente, est coupée et placée sur une lamelle de microscopie pour la coloration histologique. Cette section peut être plus fine (5 µm) mais en pratique, il est fastidieux de modifier l'épaisseur du cryomicrotome entre chaque section, il est donc possible de la laisser à 30 µm. Les deux sections ont une face commune, celle qui est coupée par le couteau lors de la première section. C'est la face qui nous intéresse et elle doit être déposée vers le haut sur les deux porte-échantillons (synchrotron ou lamelle de verre). C'est sur cette face commune que les analyses histologiques et des métaux auront lieu. La première coupe sera lyophilisée et observée en lumière transmise pour avoir une image optique de toute la zone. La deuxième coupe sera colorée selon la méthode choisie et observée aussi en lumière transmise pour l'identification des zones d'intérêt. Grâce aux trous percés avant la coupe nous pouvons orienter et superposer les deux images des deux coupes et donc savoir quelles sont les zones d'intérêt dans la coupe non marquée. Finalement, il reste à analyser le contenu des éléments chimiques dans la zone d'intérêt qui n'est pas marquée par histologie.
Pour illustrer cette méthodologie, je vais présenter un exemple sur la figure 6B.6 dans lequel nous avons quantifié les éléments chimiques dans différentes régions cérébrales d'intérêt. Par immuno-histologie avec le marquage de la tyrosine hydroxylase (TH) nous avons coloré les zones dopaminergiques (substantia nigra pars compacta, SNpc ; substantia nigra pars reticulata, SNpr ; l'aire tegmantale ventrale, VTA) du cerveau de rat (A, D, G). D'un autre côté et après lyophilisation, les coupes préparées pour l'analyse des métaux sont également observées par microscopie optique, et la coupe complète reconstituée (B, C). La coupe histologique est retournée horizontalement (D) pour simuler, lors de la superposition, le fait que les deux faces se touchent. Les coupes pour l'analyse des métaux (E, F) sont retournées de manière à avoir les trous orientés de la même façon que dans la coupe histologique (D). La superposition de l'image histologique (G) avec l'image de l'échantillon lyophilisé (H, I) est obtenue par la superposition des marqueurs, des trous d'épingle (représentés par des étoiles bleues). Ainsi nous pouvons déterminer les zones d'intérêt sur la coupe non marquée en préservant la distribution des éléments.

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

**Figure 6B.6.** Procédure globale de superposition des sections immuno-histochimiques et natives pour l'analyse PIXE. (A) Section entière du cerveau colorée avec la tyrosine hydroxylase (TH) pour localiser les voies dopaminergiques : SNpc, SNpr, et VTA. (B, C) Images de microscopie à transmission optique de sections lyophilisées pour les analyses PIXE (B : côté cerveau lésé et C : côté cerveau sain). (D, G) Zoom de la région colorée pour distinguer les trous d'épingle percés autour du SN (indiqués par des étoiles bleues). Ces images ont un retournement horizontal par rapport à l'image initiale afin d'obtenir la même orientation pour les trous d'épingle que sur les échantillons lyophilisés puisque les faces marquées étaient adjacentes. (E, F) Images des sections PIXE, en appliquant une rotation, pour afficher la même orientation des trous d'épingle que sur la section immuno-histochimique. (H, I) Images correctement orientées en utilisant les trous d'épingle (marqués d'une étoile bleue) pour localiser précisément les régions SNpc, SNpr et VTA sur les sections pour l'analyse PIXE. Barres d'échelle = 1 mm (Carmona 2019 b).
# 7. Applications : métaux et neurodégénérescence

## 7.1 La neurotoxicité du manganèse

Nous nous sommes intéressés au manganèse, un métal trace essentiel, mais dont l'exposition à des niveaux élevés, en milieu professionnel ou environnemental, induit le parkinsonisme, un syndrome parkinsonien irréversible qui n'a pas de traitement (Saric 2007 ; Aschner 2009 ; Chen 2015). L'étude de la neurotoxicité du manganèse est un projet de longue date dans lequel nous avons fait usage de tous les avancements concernant l'imagerie corrélative et dans lequel nous montrons toutes les capacités de ce type d'analyses pour expliquer les mécanismes de toxicité des métaux. Et d'un autre côté, il illustre aussi les limitations auxquelles nous sommes confrontés aujourd'hui et d'où j'envisage mon projet de recherche à venir.

En premier lieu, nous avons élucidé par SXRF la localisation du manganèse autour du noyau cellulaire et mis en évidence, de façon indirecte, qu'il était stocké dans l'appareil de Golgi (Carmona 2010). Plus tard, nous avons pu faire de l'imagerie corrélative épifluorescence-SXRF et nous avons montré que le manganèse colocalisait avec l'appareil de Golgi (Carmona 2014). Après cette découverte, nous avons travaillé, avec des collèges américains de l'Université d'Austin, sur la localisation du manganèse dans des cellules qui expriment une mutation mise en cause dans des formes familiales de parkinsonisme. Nous avons décelé que la mutation conduit à une accumulation du manganèse dans cet appareil de Golgi (Carmona 2019). De même, nous avons collaboré avec des collègues de l'Université de Mumbai qui ont développé un senseur moléculaire qui émet de la fluorescence quand il y a du manganèse dans les cellules. Nous avons vérifié sa localisation et corroboré qu'il va dans l'appareil de Golgi et qu'il fixe le manganèse (Das 2019).

### a. Localisation du Mn dans l'appareil de Golgi : mise en évidence indirecte

Il y a quelques années, nous avons commencé à nous intéresser à la toxicité du manganèse et nous avons découvert par SXRF une localisation assez particulière du manganèse dans des cellules dopaminergiques. Les images de fluorescence des rayons X synchrotron ont révélé que dans les cellules PC12, le Mn était situé dans une région périnucléaire, toujours d'un côté du noyau (figure 7B.1). La même distribution est obtenue en conditions physiologiques, dans des cellules non exposées, ou dans des cellules exposées au manganèse à de concentrations toxiques (Carmona 2010).

Sur des cellules vivantes en culture nous avons marqué d'un côté l'appareil de Golgi (GA) avec une sonde GFP-Golgi CellLight™ reagents et d'un autre côté le réticulum endoplasmique aussi avec une sonde GFP de CellLight™. Nous avons pu observer que l'appareil de Golgi se trouvait près du noyau et toujours d'un côté de la cellule (figure 7B.2) et que le réticulum endoplasmique s'étendait dans tout le cytoplasme avec une fluorescence plus marquée tout autour du noyau (figure 7B.2). Ces résultats nous suggéraient que le manganèse s'accumule dans l'appareil de Golgi.

A l'époque de cette étude, nous n'avons pas pu préparer des échantillons marqués avec la fluorescence *in vivo* pour l'analyse par SXRF. Une toxicité apparaissait du moment où les cellules étaient co-exposées au marqueur fluorescent et au manganèse, les cellules se décollaient des supports très facilement et pendant les phases de rinçage et cryofixation toutes étaient perdues. Pour résoudre ce problème, nous avons démontré de manière indirecte que le manganèse était stocké dans l'appareil de Golgi. Nous avons exposé les cellules au manganèse et à la brefeldine A, une molécule connue pour provoquer spécifiquement
l'effondrement de l'appareil de Golgi. Après l'analyse par SXRF, il a été constaté que cette exposition entraîne une redistribution intracellulaire frappante du manganèse qui diffuse dans le cytoplasme et même le noyau (figure 7B.3) (Carmona 2010). Ces résultats indiquent que l'appareil de Golgi joue un rôle important dans la détoxification cellulaire du manganèse. En outre, nous avons quantifié la teneur en éléments traces, en utilisant la microanalyse par émission de rayons X induite par des particules (PIXE) et la spectrométrie de rétrodiffusion (RBS). Et il a été montré que l'exposition au manganèse induit une diminution de la teneur totale en fer, ce qui pourrait contribuer à la neurotoxicité globale du manganèse (Carmona 2010).

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 7B.1. À gauche image optique de la cellule après cryofixation et lyophilisation, le carré noir indique la zone analysée par SXRF. À droite images SXRF des éléments intracellulaires dans des cellules PC12 (Carmona 2010).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 7B.2. Localisation de l'appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique dans les cellules PC12. (A) et (C) images optiques des cellules PC12 vivantes dans le milieu de culture ; (B) image d'épifluorescence de l'appareil de Golgi sur cellule vivante (même zone que A) ; (D) image d'épifluorescence du réticulum endoplasmique sur cellule vivante (même zone que C) (Carmona 2010).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 7B.3. Images de fluorescence X d'éléments intracellulaires dans des cellules PC12 exposées à 300 µM de manganèse et à 30 µg/ml de Brefeldin A pendant 4 heures. À gauche image optique de la cellule après cryofixation et lyophilisation, le carré noir indique la zone analysée par SXRF. À droite images SXRF de K, Mn et Zn dans des cellules PC12 exposées au manganèse et à la Brefeldin A (Carmona 2010).</figcaption></figure>

b. Imagerie corrélative du Mn et de l'appareil de Golgi et spéciation subcellulaire

La principale source de Mn se trouve dans l'ingestion de nourriture et d'eau potable, mais la principale source d'excès de Mn est l'inhalation. Le Mn est présent dans les particules produites par les activités industrielles utilisant du Mn, ou par la combustion de carburant (Portier 2012). Dans des conditions d'exposition par inhalation, le Mn peut également atteindre directement le système nerveux central (SNC) par la voie olfactive (Henriksson 2000). Les formes physico-chimiques du Mn dans l'environnement sont diverses. Le Mn est présent dans des composés inorganiques solubles dans les aliments, dans des formes inorganiques insolubles dans les particules en suspension dans l'air ; dans des composés organométalliques tels que le fongicide manèbe (manganèse éthylène-1,2-bisdithiocarbamate) ou dans des adjuvants de l'essence, comme le MMT (méthylcyclopentadiényl manganèse tricarbonyle).

Il est connu que la spéciation chimique d'un élément détermine sa biodisponibilité et sa réactivité et donc la toxicité peut être très différente en fonction de sa spéciation chimique, par exemple en fonction de son état d'oxydation. Nous nous sommes intéressés à la neurotoxicité spécifique des différents composés environnementaux du Mn. Nous avons examiné les mécanismes de cytotoxicité de cinq composés du Mn (MnCl₂, MnSO₄, Mn₂O₃, manèbe et MMT) représentatifs des principales conditions d'exposition environnementale et présentant diverses caractéristiques physico-chimiques en matière d'état d'oxydation, de formes organiques/inorganiques et de solubilité (Henriksson 2000 ; Aschner 2006 ; Portier 2012 ; Bornhorst 2012).

Notre objectif était de déterminer quels composés environnementaux étaient les plus toxiques pour les cellules dopaminergiques, la distribution et la quantité de manganèse accumulée dans les cellules selon l'exposition et l'état d'oxydation que présentait le manganèse à l'intérieur des cellules. Pour chaque élément indépendamment nous avons étudié sa toxicité et déterminé par microscopie d'épifluorescence sur cellule vivante la localisation de l'appareil de Golgi. Après observation et enregistrement des positions des cellules montrant de la fluorescence, nous avons procédé à la cryofixation et conservation des échantillons refroidis dans des vapeurs d'azote jusqu'aux analyses. Cette fois les reagents CellLight™ n'induisaient pas de toxicité et les cellules marquées restaient accrochées aux supports pendant les étapes de rinçage et cryofixation.
Au synchrotron, grâce à la technique SXRF, nous avons déterminé la localisation du manganèse et, ensuite, avec la technique XANES (X-ray Absorption Near Edge Structure) nous avons déterminé l'état d'oxydation du manganèse qui se trouvait à l'intérieur de la cellule. Nous avons confirmé, par des analyses cryogéniques, que le manganèse s'accumule dans l'appareil de Golgi (figure 7B.4) et il le fait sous forme de Mn²⁺ indépendamment de l'état d'oxydation du composé initial (figure 7B.5). En conclusion, nous avons trouvé que dans le cytoplasme, en dehors de l'appareil de Golgi, il y a des quantités très faibles de manganèse. Nous avons, pour la première fois, fait de la spéciation à l'échelle d'un organite intracellulaire et nous avons élucidé que le manganèse se trouve sous forme Mn²⁺, une forme peu toxique. Nous avons conclu que la toxicité des différents composés semble venir de la partie soluble et que les composés organiques sont plus toxiques (Carmona 2014).

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Figure 7B.4. Colocalisation du Mn et de l'appareil de Golgi dans des cellules PC12 exposées à (A) 500 µM de MnCl₂ et (B) 500 µM de MnSO₄ pendant 24 heures. À gauche fluorescence de l'appareil de Golgi marquée avec les protéines GFP (vert) et du noyau à l'aide de la coloration de Hoechst 33342 (bleu) dans des cellules PC12 vivantes avant la cryofixation. Les carrés blancs indiquent les zones analysées par micro-SXRF en conditions cryogéniques. À droite les cartes élémentaires de S, K et Mn et les images fusionnées de K (rouge) et Mn (vert), obtenues sur la ligne ID21 à l'ESRF, barres d'échelle de 5 µm (Carmona 2014).

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

Figure 7B.5. Spectres XANES obtenus sur la ligne ID21 à l'ESRF en mode cryogénique du (A) standard MnCl₂ et du manganèse dans l'appareil de Golgi des cellules individuelles exposées au MnCl₂ et au MnSO₄ ; (B) du manganèse dans le cytoplasme des mêmes cellules analysées en A ; (C) du manganèse à l'intérieur des cellules individuelles exposées au MMT (Carmona 2014).
### c. Formes familiales de parkinsonisme : accumulation du Mn dans l'appareil de Golgi

Récemment, des mutations du gène SLC30A10 ont été associées à une nouvelle forme de parkinsonisme familial (Tuschl 2012 ; Quadri 2012 ; Mukhopadhyay 2018). Les analyses cliniques révèlent une augmentation du manganèse dans le foie, le sang et le cerveau des patients. La protéine SLC30A10 est un transporteur d'efflux de Mn localisé à la surface des cellules, qui réduit les niveaux de Mn et protège contre sa toxicité (Leyva-Illes 2014; Hutchens 2017 ; Zogzas 2016 ; Chen 2015). Il est important de noter que les mutations de la protéine SLC30A10, qui sont à l'origine du parkinsonisme familial, bloquent la capacité du transporteur à se rendre à la surface cellulaire et à servir de médiateur pour l'efflux de Mn. Bien que les expressions des mutations SLC30A10 causant la maladie ne soient pas délétères en elles-mêmes, les neurones exprimant ces mutants ont montré une sensibilité accrue à la toxicité du Mn (Leyva-Illes 2014). On peut s'attendre à ce que les mutations SLC30A10 modifient le stockage subcellulaire du Mn. La compréhension des voies moléculaires de détoxification du Mn dans les cellules normales et mutantes impliquées dans l'apparition de la forme familiale de parkinsonisme permettra par exemple d'envisager l'utilisation d'un efflux accru de Mn comme stratégie thérapeutique.

L'objectif de ce projet est d'élucider la distribution du manganèse dans les cellules exprimant la protéine SLC30A10, exprimant un de ses mutants pathologiques SLC30A10-delta 105-107 et des cellules contrôles, en utilisant l'imagerie par fluorescence des rayons X synchrotron (SXRF) et l'imagerie corrélative avec le marquage par épifluorescence de l'appareil de Golgi. Ce projet est le fruit d'une collaboration avec l'équipe de Somshuvra Mukhopadhyay, de l'Université du Texas à Austin, qui a développé des modèles cellulaires pour étudier les effets biologiques de la protéine SLC30A10 et des mutants associés (Leyva-Illes 2014). Nous avons découvert que le Mn s'accumule, dans des conditions physiologiques (figure 7B.6) et après exposition au Mn (figure 7B.7), dans l'appareil de Golgi des cellules transfectées avec le mutant SLC30A10-Δ105-107 causant la maladie. Les cellules contrôles, marquées avec une construction GFP Rab5, accumulent aussi le Mn puisque n'exprimant pas la protéine SLC30A10 à l'état basal. Et les cellules exprimant la protéine SLC30A10, montrent une teneur en Mn très faible après n'importe quelle condition d'exposition, ce qui confirme l'efficacité de l'efflux de Mn par cette protéine (figures 7B.6 et 7B.7). Ces premiers résultats ont été obtenus sur la ligne P06 du synchrotron allemand DESY et les analyses ont été réalisées à température ambiante sur des échantillons lyophilisés (Carmona 2019 a).
<figure><img src="image_44.png" /></figure>

Fig. 7B.6. Exemples représentatifs de l'imagerie SXRF du potassium (K) et du manganèse (Mn) dans des cellules HeLa transfectées avec une construction SLC30A10 (vert) et non exposées au Mn. Comparaison avec la distribution de l'appareil de Golgi (rouge) et du noyau (bleu) obtenus par microscopie à épifluorescence sur cellule vivante. (A) cellules transfectées avec GFP-Rab5, donc condition témoin ; (B) cellules transfectées avec GFP-SLC30A10-WT, donc la protéine est normale ; (C) cellules transfectées avec GFP-SLC30A10-Δ105-107, donc protéine mutante, causant la maladie. Les flèches indiquent la colocalisation du Mn et de l'appareil de Golgi. Images obtenues sur la ligne P06 à DESY (Carmona 2019 a).