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# ANNEXE

## Protocole de Culture de chondrocytes articulaires des sourceaux

### A. Matériel et Produits

* 1 boîte de dissection comprenant :

- 1 paire de gros ciseaux

- 1 paire de petits ciseaux fins

- 1 pince courbe très fines

- 1 pince droite pointue très fine

- 1 scalpel

* des Boîtes de Pétri P60 (Boîtes Corning ou Costar)

* 1 tube de 30mL de PBS stérile

- + Peni-Strepto 1%

* Milieu de culture « DMEM PS-Glu »

- 500mL de DMEM 1g/L de Glucose

- + Peni-Strepto 1%

- + L-Glutamine 1%

* Milieu de culture « DMEM complet »
  Au cours du protocole, le milieu sera complété

- + SVF 10%

* Solution de libérase : à préparer extemporanément

- Poudre « Liberase TM Research Grade »

- Solution mère aliquotée par 100µL (-20°C) :
  En DMEM PS-Glu (sans SVF) à 26 U/mL

- Préparer 10mL de solution de libérase à utiliser :

En DMEM PS-Glu (sans SVF) à 0.52 U/mL (dilution 1/50 : 200µL)

### B. Méthode

1. Dissection sur sourceaux de 5/6 jours (matin)

* Sacrifier la mère par la technique d'élongation des cervicales

* Tuer le sourceau en lui coupant la tête avec des gros ciseaux
* Mettre le sourceau sur le ventre et épingler les deux pattes avant

* Enlever la peau :

- Découper avec de petits ciseaux fins la peau en partant du haut de la queue et en longeant la colonne vertébrale jusqu'au-dessus des hanches

- Déshabiller les pattes

* Couper les pattes au-dessus du niveau des hanches

* Dégager le squelette en enlevant les tissus mous au scalpel

* Prélever les têtes fémorales :

- Trouver la très petite bille entre le fémur et la hanche

- A l'aide d'une pince courbe très fine la prélever et la mettre dans un tube Falcon contenant 30mL de PBS stérile

* Prélever les genoux :

- Trouver l'articulation et prélever le cartilage: deux parties blanches, une reliée au bas du fémur, l'autre au tibia

- La couper en faisant attention de pas prendre d'os avec

- Déposer le genou en deux parties dans le tube de PBS +P/S

- Conserver à 4°C jusqu'à la digestion enzymatique

2) Digestion enzymatique (2h en fin d'après-midi + nuit)

* Rincer les articulations au PBS

* Transvaser les articulations dans une P60

* Enlever le PBS puis digérer dans 4mL de Liberase à 0.52 U/ml

i. Incuber 45min à 37°C

* Agiter avec une pipette de 25mL (aspirer/refouler)

* Passer les explants dans une nouvelle boite P60 puis digérer dans 4mL de Liberase à 0.52 U/mL

i. Incuber de nouveau 45min à 37°C

* Laver 3 fois en PBS pour éliminer le tissu fibreux (en tube Falcon de 50mL, avec 25-30mL de PBS)

* Digérer dans 6mL de Liberase à 0.13 U/mL dans une nouvelle boite P60 en diluant la solution précédente au ¼ en DMEM PS-Glu (sans SVF)

i. Incuber 1 nuit à 37°C

3) Mise en culture (lendemain matin)
* Aspirer/Refouler à la pipette pour séparer les cellules des os (25, 10 et 5mL et cône de 1000µL)

* Compléter avec au moins 1 volume de DMEM complet (+ SVF)

* Filtrer sur tamis cellulaire 100µm dans un tube de Falcon 50mL

* Compter les cellules sur cellule de Malassez

* Ensemencer les cellules (cf. tableau)

<table><tr><td>P100</td><td>59.5 cm²</td><td>750 000 cellules</td><td>10mL DMEM complet</td></tr><tr><td>P60</td><td>22 cm²</td><td>275 000 cellules</td><td>3mL DMEM complet</td></tr><tr><td>6 puits (P35)</td><td>9.6 cm²</td><td>120 000 cellules</td><td>2mL DMEM complet</td></tr><tr><td>12 puits</td><td>3.8 cm²</td><td>60 000 cellules</td><td>2mL DMEM complet</td></tr></table>

### 4) Entretien de la culture

* milieu « complet »

i. Laisser les cellules adhérer aux boîtes 48h

ii. vendredi (j3)

* chondrocytes différenciés environ 80% confluence

i. lundi (j6)

#### Pour différenciation ostéogénique

* milieu DMEM 4.5g/L glucose P/S Gln Hepes 10%SVF décomplémenté

i. lundi (j6)

* milieu « VitC + beta-glycéro »

i. mardi (j7)

ii. vendredi (j10)

iii. lundi (j13)

* chondrocytes « minéralisants »

i. vendredi (j17)