# Conception, synthèse et études biologiques de nouveaux inhibiteurs saccharidiques du métabolisme bactérien

Nicolas Barthes

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Nicolas Barthes. Conception, synthèse et études biologiques de nouveaux inhibiteurs saccharidiques du métabolisme bactérien. Chimie organique. Université montpellier II, 2006. Français. NNT: 2006MON20143. tel-04485073

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UNIVERSITE MONTPELLIER II
SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC

## THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE MONTPELLIER II

Discipline : Chimie organique, minérale, industrielle

Formation Doctorale : Chimie des biomolécules : synthèse, structure et réactivité

Ecole Doctorale : Sciences Chimiques et Physiques

présentée et soutenue publiquement

par

Nicolas BARTHES

le lundi 30 Octobre 2006

## Titre :

## Conception, synthèse et études biologiques de nouveaux inhibiteurs saccharidiques du métabolisme bactérien

## JURY

Me le Docteur Nathalie SOLLADIE (Toulouse III) , Rapporteur

M le Professeur Yves LE MERRER (Paris V) , Rapporteur

Me le Professeur Chantal FINANCE (Nancy I) , Examinateur

M le Professeur Bertrand CASTRO (Sanofi-Aventis) , Examinateur

M le Professeur Alain FRUCHIER (ENSCM) , Examinateur

Me le Professeur Claude GRISON (UM II) , Directeur de Thèse
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UNIVERSITE MONTPELLIER II

SCIENCES ET TECHNIQUES DU LANGUEDOC

## THESE

pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE MONTPELLIER II

Discipline : Chimie organique, minérale, industrielle

Formation Doctorale : Chimie des biomolécules : synthèse, structure et réactivité

Ecole Doctorale : Sciences Chimiques et Physiques

présentée et soutenue publiquement

par

Nicolas BARTHES

le lundi 30 Octobre 2006

## Titre :

## Conception, synthèse et études biologiques de nouveaux inhibiteurs saccharidiques du métabolisme bactérien

## JURY

Me le Docteur Nathalie SOLLADIE (Toulouse III) , Rapporteur

M le Professeur Yves LE MERRER (Paris V) , Rapporteur

Me le Professeur Chantal FINANCE (Nancy I) , Examinateur

M le Professeur Bertrand CASTRO (Sanofi-Aventis) , Examinateur

M le Professeur Alain FRUCHIER (ENSCM) , Examinateur

Me le Professeur Claude GRISON (UM II) , Directeur de Thèse
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Certains êtres humains sont tellement déshumanisés que je me demande parfois
si la mère n'a pas jeté le fœtus pour élever le placenta.

Patrick Sébastien - Carnet de notes (2001)
<figure><img src="image_6.png" /></figure>
Ce travail de thèse a été réalisé au **Laboratoire de Chimie BioMoléculaire** de l'Université Montpellier II, sous la direction de **Madame le Professeur Claude GRISON**.

Je la remercie particulièrement pour m'avoir donné l'occasion de travailler sur un sujet passionnant et malheureusement d'actualité, mais également pour ses conseils précieux et quotidiens. De plus, je la remercie sincèrement pour son dévouement à son travail de recherche et d'enseignement ainsi que pour sa gentillesse envers tous les doctorants du laboratoire.

Je remercie **Madame Chantal FINANCE**, Professeur et Doyen de la Faculté de Pharmacie - Nancy I qui a permis que les études bactériologiques sur les produits issus de mes travaux de synthèse soient menées au sein de son laboratoire par **Monsieur Raphaël DUVAL**. Je suis également très sensible au fait qu'elle ait accepté d'examiner cette thèse.

**Monsieur Yves LE MERRER**, Professeur à l'Université René DESCARTES - Paris V, et **Madame Nathalie SOLLADIE**, Docteur à l'Université Paul SABATIER - Toulouse III, ont alloué de leur temps pour juger ce travail en tant que rapporteur. Je les en remercie très sincèrement.

Je remercie également **Messieurs Bertrand CASTRO**, Professeur et Directeur Recherche et Développement Procédés Chimie et Biotechnologie chez SANOFI-AVENTIS, et **Alain FRUCHIER**, Professeur à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Montpellier qui ont accepté d'examiner mon travail de thèse en tant que membres du jury.

Enfin, je tiens à remercier les étudiants avec qui j'ai partagé mes journées et ma paillasse, en particulier Jaleh TAGHIPOUR, Edith PINOT, Magali JULLIAN, Céline CRAUSTE, Fiona SERRA, Mathieu AUZIAS, Adrien KAESER, Tomasz OLSZEWSKI, Maxime DURKA, Lionel MONTARGES, and last but not least Hicham CHIBLI.
<figure><img src="image_7.png" /></figure>
## SOMMAIRE
# PARTIE THEORIQUE

Abréviations

Avant-Propos

1

## INTRODUCTION

I - Rappels succincts sur les bactéries

7

I.1. Physiologie générale

7

I.2. La paroi cellulaire des bactéries : une cible thérapeutique séduisante

9

I.2.1. Paroi cellulaire des bactéries Gram-positives

10

I.2.2. Paroi cellulaire des bactéries Gram-négatives

10

II - Une approche originale : l'inhibition des phosphoénolpyruvates lyases

14

II.1. Rappels sur le métabolisme du KDO

14

II.2. La KDO8PS, nature et fonctionnement

16

II.3. La DAH7PS, une phosphoénolpyruvate lyase bactérienne peu étudiée

18

II.4. KDO8PS et DAH7PS : deux cibles séduisantes pour contrôler l'acquisition de la virulence

21

II.5. Hypothèses mécanistiques des réactions d'aldolisation catalysées par KDO8PS et DAH7PS

23

II.6. Stratégies d'inhibition de la KDO8PS

26

II.6.1. Analogues mimant un des intermédiaires ou des états de transition cycliques de l'hypothèse 2b

26

II.6.2. Composés divers présentant une activité inhibitrice intéressante

28

II.6.3. Analogues de bisubstrat ou de l'état de transition de l'hypothèse 1

28

II.6.4. Analogue de l'état de transition de l'hypothèse 2a

30

II.6.5. Résultats biologiques et enzymatiques issus des structures P et H

30

II.7. Choix des structures préparées

32
# PREMIERE PARTIE

## Synthèse d'inhibiteurs de la KDO8PS

I - Introduction 39

II - Synthèse du diphosphate chiral I 40

II.1. Stratégie de synthèse 40

II.2. Préparation du 2,3-O-isopropylidène-D-ribofuranose 2 41

II.3. Protection de la fonction hydroxyle primaire de 2 41

II.4. Réaction de Wittig et hydrogénation des oléfines formées 42

II.5. Essais de désoxygénation de 5 44

II.6. Optimisation de la préparation du 2,3,4,7-hydroxy heptanol 13 49

II.7. La diphosphorylation de 13 50

II.7.1. Rappels bibliographiques sur la phosphorylation 50

II.7.2 Résultats 51

III - Synthèse de la molécule cible II 52

III.1. Stratégie « benzylique » 52

III.2. Préparation de l'érythronolactone protégée 17 53

III.3. Seconde approche synthétique de la molécule cible II 56

III.3.1. Différentes stratégies envisagées 57

III.3.2. Etude de la voie A 59

III.3.3. Etude de la voie B 62

III.3.4. Etude de la voie C 63

III.3.5. Etude de la voie D 66

III.3.6. Etude de la voie E 69

III.3.7. Réduction des esters clés 41 en alcools 49 71

III.3.8. Tentative de phosphorylation de l'alcool 49b 72

IV - Synthèse des molécules cibles III, IV et V 73

IV.1. Introduction 73

IV.2. Stratégies de synthèse 74

IV.2.1. Etude de la voie A : réaction de Perkow 75

IV.2.2. Etude de la voie B : phosphorylation d'un énolate 90
IV.3. Synthèse de la molécule cible V 100

IV.3.1. Diphosphorylation de l'heptanediol 100

IV.3.2. Hydrogénation du phosphate d'énol IV 101

V - Conclusion 102

## DEUXIEME PARTIE

### Synthèse d'inhibiteurs de la DAH7PS

I - Introduction 109

II - Synthèse du phosphate d'énol VI 110

II.1. Introduction 110

II.2. Résultats et discussion 110

III - Synthèse de l'hexane-1,6-diphosphate VII 113

III.1. Résultats 113

III.2. Déprotection de la molécule cible VII 113

III.3. Deuxième approche de synthèse de VII' 117

IV - Synthèse de l'hydroxyphosphonate VIII 119

IV.1. Stratégie de synthèse 119

IV.2. Synthèse de l'ester glycidique α-chloré d'isopropyle 83 121

IV.3. Synthèse de l'α-cétoester d'isopropyle 82 122

IV.4. Synthèse de l'α-hydroxy-β-phosphonoester 81 123

IV.5. Déblocage de l'hydroxyphosphonate 81 123

IV.6. Monophosphorylation de $H_e$ 124

V - Synthèse du phosphoénolpyruvate IX 125

V.I. Stratégie de synthèse 125

V.2. Synthèse de l'α-cétoester-β-iodé 86 126

V.3. Synthèse du phosphoénolpyruvate 87 par la réaction de Perkow 127

V.4. Déblocage du phosphoénolpyruvate 87 129

V.5. Tentative de phosphorylation du phosphoénolpyruvate $P_e$ 130

VI - Conclusion 132
# TROISIEME PARTIE

## Etude biologique des inhibiteurs

### I', IV, V, VI, VII, VII' et VIII

I - Introduction 137

II - Choix des souches bactériennes 138

III - Etudes biologiques : techniques et méthodes 141

III.1. Introduction 141

III.2. Antibiogrammes par diffusion 142

III.3. Antibiogrammes par dilution 143

IV - Résultats 145

V - Conclusion 146

# QUATRIEME PARTIE

## Réaction d'« homologation » de la fonction aldéhydique de dialdoses et d'aldoses

I - Introduction et rappels bibliographiques 151

II - Etude de la réaction d'« homologation » 165

II.1. Choix des substrats glucidiques 165

II.2. Préparation des substrats glucidiques 167

II.3. Réaction d'Horner 168

II.4. Intérêt synthétique des carboxamides de Weinreb préparés 171

II.4.1. Plan d'étude 171

II.4.2. Résultats 172

III - Conclusion 178
## Partie Expérimentale

181

Table d'illustrations

255

Index des molécules

259

Bibliographie

267
Abréviations

<table><tr><td>A5P</td><td>D-arabinose-5-phosphate</td></tr><tr><td>ADN</td><td>Acide désoxyribonucléique</td></tr><tr><td>AIBN</td><td>Azobisisobutyronitrile</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Acide p-toluènesulfonique</td></tr><tr><td>ARN</td><td>Acide ribonucléique</td></tr><tr><td>CMP-KDO</td><td>Cytidine-monophosphate-KDO</td></tr><tr><td>Da</td><td>Dalton (unité de mesure de masse: 1 Da = 1 unité de masse atomique)</td></tr><tr><td>DAH</td><td>Acide 3-désoxy-D-arabino-2-heptulosonique</td></tr><tr><td>DAH7P</td><td>Acide 3-désoxy-D-arabino-2-heptulosonique-7-phosphate</td></tr><tr><td>DAH7PS</td><td>3-désoxy-D-arabino-2-heptulosonique-7-phosphate synthétase</td></tr><tr><td>DiBAI</td><td>Hydrure de DiisobutylAluminium</td></tr><tr><td>DIEA</td><td>Diisopropyléthylamine</td></tr><tr><td>DMAP</td><td>Diméthylaminopyridine</td></tr><tr><td>DMF</td><td>Diméthylformamide</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Diméthylsulfoxyde</td></tr><tr><td>E4P</td><td>D-érythrose-4-phosphate</td></tr><tr><td>éq.</td><td>Equivalent</td></tr><tr><td>ET</td><td>Etat de transition</td></tr><tr><td>HMDS</td><td>Hexaméthyldisilazane</td></tr><tr><td>HMPT</td><td>Hexaméthylphosphotriamide</td></tr><tr><td>KDO</td><td>Acide 3-désoxy-D-manno-2-octulosonique</td></tr><tr><td>KDO8P</td><td>Acide 3-désoxy-D-manno-2-octulosonique-8-phosphate</td></tr><tr><td>KDO8PS</td><td>3-désoxy-D-manno-2-octulosonique-8-phosphate synthétase</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Lipopolysaccharide</td></tr><tr><td>LTD</td><td>Carbanion lithié dérivé du 1,3-dithiane</td></tr><tr><td>Ms</td><td>Mésylate ou méthylsulfonate</td></tr><tr><td>NBS</td><td>N-bromosuccinimide</td></tr><tr><td>PEP</td><td>Phophoénolpyruvate</td></tr><tr><td>phe</td><td>Phénylalanine</td></tr><tr><td>Pi</td><td>Phosphate inorganique</td></tr><tr><td>PivCl</td><td>Chlorure de Pivaloyle</td></tr><tr><td>Rdt</td><td>Rendement</td></tr></table>
TBDMSCI : tert-butyldiméthylchlorosilane

TBDPSCI : tert-butyldiphénylchlorosilane

Tf : Triflate ou trifluorométhylsulfonate

THF : Tétrahydrofurane

trp : Tryptophane

tyr : Tyrosine
Avant-propos

Le développement des maladies infectieuses est actuellement un véritable problème de santé publique. Les récents événements concernant les maladies virales telles que la grippe aviaire et le chikungunya, la multiplication constante des infections antibiorésistantes et le développement incontrôlé des maladies nosocomiales, témoignent de la nécessité d'une mise au point de nouveaux traitements efficaces et spécifiques du problème ciblé.

De par sa compréhension des mécanismes réactionnels, le chimiste organicien est capable d'approcher à l'échelle moléculaire certaines transformations fondamentales des métabolismes viraux et bactériens. Son approche des systèmes biologiques lui permet de développer de nouveaux principes médicamenteux capables d'inhiber ou de contrôler des processus biologiques clés de la vie microbienne.

Depuis plusieurs années, un des objectifs principaux de notre équipe est précisément la conception et la construction de nouvelles structures antibiotiques dont le mode d'action est basé sur des conceptions inédites et performantes.

Les travaux présentés dans ce mémoire s'inscrivent dans cette démarche. Ils reposent sur la synthèse d'inhibiteurs glucidiques et sont basés sur une approche rationnelle et approfondie de mécanismes enzymatiques bactériens. Les enzymes ciblées sont spécifiques du métabolisme bactérien. Il s'agit de deux phosphoénolpyruvates lyases, la KDO-8-phosphate synthétase (KDO8PS) et la DAH-7-phosphate synthétase (DAH7PS).

La KDO8PS est spécifique des bactéries Gram-négatives, micro-organismes qui représentent le degré maximal de complexité lors de l'élaboration de nouveaux antibiotiques. Elle catalyse la dernière étape de la biosynthèse d'un sucre rare, l'acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique (ou KDO). Ce glucide particulier occupe une position clé dans la constitution de leur paroi et est indispensable à la multiplication de ces micro-organismes.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>KDO ou acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique</figcaption></figure>
La DAH7PS est une enzyme bactérienne responsable de la production de l'acide 3-désoxy-D-arabino-heptulosonique, intermédiaire important de la biosynthèse des acides aminés aromatiques, des acides foliques, des coenzymes Q et des entérobactines, qui sont des molécules essentielles à de nombreuses plantes et espèces bactériennes.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>DAHP ou acide 7-phosphate 3-désoxy-D-arabino-heptulosonique</figcaption></figure>

Ces deux enzymes sont donc des cibles privilégiées pour la conception de nouveaux antibiotiques du métabolisme bactérien.

La première partie de ce mémoire est consacrée à la synthèse de nouveaux inhibiteurs possibles de la KDO8PS. Leur structure est fondée sur une étude approfondie de données biochimiques et biologiques obtenues récemment par notre équipe. L'objectif est d'affiner les modèles d'état de transition de la réaction enzymatique et de progresser dans la description mécanistique de l'acte catalytique. L'objectif ultime est la mise au point d'antibiotiques originaux et efficaces.

Le deuxième volet de ce travail décrit la préparation d'inhibiteurs de la DAH7PS, enzyme que notre équipe étudie depuis peu comme cible thérapeutique à visée antibiotique. Des données biochimiques récentes confirment l'intérêt très particulier de cette enzyme à des fins médicamenteuses. L'objectif est ici de contribuer à la compréhension de la base moléculaire des facteurs de virulence de certaines bactéries, afin de développer une approche de traitement non antibiotique permettant de s'affranchir des phénomènes de résistance.

Pour valider l'approche que nous avons voulu rationnelle dans la conception de nouveaux antibiotiques, les composés préparés ont été testés au laboratoire de Microbiologie de Madame le Professeur Finance (GEVSM, UMR CNRS-UHP Nancy 1 7565). Les résultats préliminaires sont présentés en troisième partie.
Durant cette étude, une réaction d'homologation de dialdoses et d'aldoses a été proposée. Il nous a semblé intéressant d'étudier au passage les différentes possibilités synthétiques du procédé. Pour des raisons de cohérence, la description des résultats qui n'ont pas de relation directe avec les inhibiteurs osidiques recherchés est rapportée dans une partie indépendante (partie IV).
# INTRODUCTION
# I - Rappels succincts sur les bactéries

Les bactéries sont des cellules dont la taille moyenne se situe généralement entre 1 et 10 µm. Elles sont 10 à 1000 fois plus grosses que les virus, mais 10 à 100 fois plus petites que des cellules animales et sont considérées comme des micro-organismes. Les bactéries sont également procaryotes, car elles sont à la fois unicellulaires et dépourvues d'un véritable noyau à tous les stades de leur cycle de développement. Les bactéries se différencient donc nettement des virus, qui ne peuvent pas se multiplier de façon autonome.

Elles ne présentent pas de similarité dans leur structure générale. Ainsi, la structure fine (ultrastructure) aussi bien que la composition chimique de bactéries d'espèces différentes, peuvent varier grandement. Les données actuelles permettent de séparer les micro-organismes bactériens en deux grands groupes : les archæbactéries et les eubactéries. Les archæbactéries produisent du méthane par réduction du gaz carbonique. Inversement, les eubactéries effectuent une photosynthèse avec des pigments chlorophylliens ou proches de la chlorophylle. Dans la suite de ce mémoire, seules les eubactéries, espèces les plus nombreuses et les mieux connues, seront étudiées.

## I.1. Physiologie générale

Une cellule bactérienne est caractérisée par un métabolisme puissant et varié. La figure présentée ci-dessous résume quelques éléments particuliers des bactéries, sans en faire la liste complète :

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 1</figcaption></figure>

L'absence de noyau se traduit par la présence d'un ADN diffus dans toute la cellule. Cet ADN bactérien présente la propriété particulière d'être refermé sur lui-même. Ce repliement est indispensable dans la mesure où le brin d'ADN mesure 1,36 mm. Ainsi, le génome complet d'une
bactérie est représenté par une molécule d'ADN circulaire, que l'on nomme classiquement, mais abusivement chromosome. Des fragments d'ADN circulaire, mais beaucoup plus courts, constituent un autre type de déterminant génétique. Il s'agit des plasmides. Ils ne sont pas indispensables à la vie de la bactérie, mais ils lui confèrent diverses propriétés selon les gènes qui les constituent. Ils sont, par exemple, mis en cause dans les phénomènes d'antibiorésistance par acquisition d'information génétique. Les outils de base de la transcription (synthèse de l'ARN) et de la traduction (synthèse des polypeptides) présentent de fortes analogies entre bactéries et eucaryotes. Les ribosomes des bactéries sont proches de ceux des eucaryotes et les mécanismes de base qui s'y déroulent sont similaires. L'absence de noyau limite la phase de maturation, la traduction de l'ARN messager débute avant même que sa synthèse soit terminée et les protéines sont assemblées à proximité de l'ADN. La synthèse d'une protéine nouvelle peut donc être réalisée très rapidement et les bactéries ont ainsi la possibilité de s'adapter à de grands changements de leur environnement. De plus, la petite taille des bactéries facilite les échanges avec l'extérieur : la vitesse des oxydations est 10 à 50 fois plus intense à masse égale que celle d'une cellule animale en développement rapide et le rythme de multiplication s'en ressent : le doublement d'un colibacille est de 20 minutes à 37°C, alors que celui d'une cellule tumorale en culture est de 10 à 18 heures.

Une autre originalité du monde bactérien est, pour de nombreuses espèces, la capacité de colonisation des milieux anaérobies. Si l'on excepte les bactéries aérobies strictes qui ont besoin de dioxygène, les anaérobies facultatives ont la faculté de vivre avec ou sans dioxygène en modifiant leur métabolisme, les aéro-tolérantes supportent une petite quantité de dioxygène, les micro-aérophiles préfèrent une faible concentration de dioxygène et les anaérobies strictes ne supportent pas la présence de dioxygène.

Un autre élément particulier du métabolisme bactérien est la capacité à développer des voies de fermentation et de respiration que l'on ne rencontre pas chez les eucaryotes (oxydation du dihydrogène par les ions nitrates, assimilation du diazote, assimilation du dioxyde de carbone sans photosynthèse, etc.).

L'enveloppe membranaire est également un trait dominant du monde bactérien. Contrairement aux cellules animales, les cellules bactériennes sont entourées de parois cellulaires qui leur apportent un support mécanique et leur permettent de résister aux pressions osmotiques internes élevées. La face interne de la paroi est tapissée par une membrane cytoplasmique. Les parois cellulaires bactériennes et les substances qui leur sont associées sont d'une importance capitale, car elles sont en grande partie responsables de la virulence des bactéries. C'est pourquoi un développement particulier est présenté sur la structure des parois bactériennes.
## I.2. La paroi cellulaire des bactéries : une cible thérapeutique séduisante

Les eubactéries sont habituellement classées en bactéries Gram-négatives et en bactéries Gram-positives en fonction de leur réaction avec le colorant de Gram. Les bactéries qui gardent le colorant sont dites Gram-positives. Celles qui peuvent être décolorées, sont dites Gram-négatives. En voici quelques exemples (Tableau 1) :

<table><caption>Tableau 1</caption><thead><tr><th>Gram-négatives</th><th>Gram-positives</th></tr></thead><tbody><tr><td>Aeromonas</td><td>Bacillus</td></tr><tr><td>Klebsiella</td><td>Staphylococcus</td></tr><tr><td>Neisseria</td><td>Streptococcus</td></tr><tr><td>Veillonella</td><td>Erysipelothryx</td></tr><tr><td>Pseudomonas</td><td>Corynebacterium</td></tr><tr><td>Escherichia</td><td>Clostridium*</td></tr><tr><td>Yersinia</td><td>Listeria</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

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<figure><img src="image_18.png" /></figure>

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<figure><img src="image_20.png" /></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

La base de cette distinction, au départ empirique, est maintenant comprise. Elle correspond à une différence fondamentale dans la structure de la paroi.

<footnote>* L'exemple présenté est celui de *Clostridium difficile* responsable du décès de 14 personnes dans le Nord-Pas-de-Calais en 2006 des suites d'une infection nosocomiale</footnote>
### I.2.1. Paroi cellulaire des bactéries Gram-positives

Relativement épaisse, de 30 à 300 nm environ, elle est constituée de 40 à 80 % d'un polymère complexe et résistant : le peptidoglycane (ou muréine).

Ce dernier permet à la paroi de s'agrandir ou de s'étirer sans se déchirer. Il est principalement composé de chaînes linéaires hétéropolysaccharidiques pontées par de courts peptides formant une structure réticulée tridimensionnelle. Il est renouvelé par érosion de la partie extérieure et reconstruction depuis la partie interne. On retrouve liés au peptidoglycane des composés tels que (Figure 2) :

- les acides teïchoïques, qui sont des polymères substitués de glycérol phosphate ou de ribitolphosphate,

- des lipides,

- des glucides.

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 2</figcaption></figure>

Les traits inclinés épais caractérisent le réseau peptidoglycanique. Les traits horizontaux fins schématisent les ponts peptidiques. Une image de peptidoglycane de bactérie Gram-positive est présentée à droite (Figure 2).

### I.2.2. Paroi cellulaire des bactéries Gram-négatives

D'une épaisseur de 20 à 30 nm, la paroi des bactéries Gram-négatives est plus complexe. Le peptidoglycane constitue toujours le composant assurant les propriétés mécaniques de la paroi, mais il est relié à une membrane externe.
Cette membrane a une composition très particulière (Figure 3) : elle est constituée de phospholipides, de protéines et de lipopolysaccharides (ou LPS). Ces derniers, aussi appelés endotoxines, sont situés sur la surface externe de la bactérie.¹,²

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 3</figcaption></figure>

Les LPS comprennent trois parties (Figure 4) :

* la chaîne latérale O : de composition variable d'une espèce bactérienne à une autre, elle est la partie la plus externe terminant le cœur oligosaccharidique ;

* le cœur oligosaccharidique : constitué de chaînes osidiques se projetant vers l'extérieur ;

* le lipide A : il est le constituant principal de cette membrane (hydrophobe) et renferme deux résidus N-acétylglucosamines phosphorylés et des acides gras. Celui-ci est situé sur la face interne de cette couche et assure la liaison avec l'espace périplasmique.

<footnote>(1) Singleton, P. *Bactériologie 2e cycle*; 4e ed.; Ed. Dunod, 1999.</footnote>

<footnote>(2) Rietschel, E.; Brade, H. *Pour la Science* **1992**, *180*, 48.</footnote>
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 4</figcaption></figure>

La jonction entre le lipide A, interne à la membrane, et le cœur oligosaccharidique, est assurée par un sucre rare, totalement absent chez les mammifères, le KDO. Ce sucre occupe donc une position clé dans la construction de l'enveloppe bactérienne.²⁻⁵

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Schéma 1</figcaption></figure>

<footnote>(2) Rietschel, E.; Brade, H. *Pour la Science* **1992**, *180*, 48.</footnote>

<footnote>(3) Stuez, P. L.; Unger, F. M. *Bacterial Endotoxic Lipopolysaccharide*, 1993; Vol. 1.</footnote>

<footnote>(4) Raetz, C. R. H. *Annu. Rev. Biochem.* **1990**, *59*, 129.</footnote>

<footnote>(5) Rogers, H. J.; Perkins, H. R.; Ward, J. B. *Microbial Cells Walls and Membranes*; Chapman and Hall, London New York 1980.</footnote>
La membrane externe comporte en outre d'autres protéines comme des porines, des enzymes, et des protéines impliquées dans les mécanismes d'absorption (transport). Ces dernières se regroupent par 2 ou 3, formant des « pores » remplis d'eau, traversant la totalité de la membrane externe, ce qui permet le passage de certains ions et de petites molécules polaires telles les oses.

La membrane externe est ainsi perméable aux petits ions et aux petites molécules hydrophiles, alors qu'elle est quasiment imperméable aux molécules hydrophobes ou amphipathiques.¹ C'est pourquoi de nombreux antibiotiques efficaces sur les bactéries Gram-positives (pénicillines par exemple) n'agissent pas, ou peu, sur les bactéries Gram-négatives. Une autre cause de cette moindre perméabilité serait une certaine rigidité des molécules de LPS.

Les endotoxines sont aussi responsables d'effets secondaires redoutables lors de la lyse bactérienne engendrée par l'action d'antibiotiques ou simplement lors de la croissance des colonies bactériennes. Elles possèdent en effet la capacité de stimuler les macrophages du système immunitaire. Cet effet peut se révéler bénéfique en aidant par exemple l'organisme à se défendre contre certaines pathologies. En revanche, une stimulation trop importante peut engendrer des conséquences désastreuses qui vont de la simple fièvre au choc septique en passant par l'étouffement des cellules de l'organisme provoqué par la coagulation du sang.

Enfin et surtout, ces endotoxines sont indispensables à la multiplication des bactéries. En effet, il a été montré qu'en présence d'analogues du KDO, les bactéries sont incapables de produire un lipide A fonctionnel et un lipopolysaccharide complet. L'arrêt de la biosynthèse des LPS se traduit par l'accumulation dans la membrane interne de précurseurs du lipide A. Cet arrêt est suivi par celui de la synthèse des ADN, ARN et protéines. Les bactéries cessent alors de se multiplier.²

On conçoit donc facilement que l'inhibition de la biosynthèse des endotoxines constitue non seulement une solution très intéressante à la prévention de leurs effets pathogènes, mais aussi une très puissante voie de blocage de la prolifération bactérienne. Dans ce but, l'inhibition d'une des réactions enzymatiques du métabolisme du KDO apparaît comme un objectif de choix dans la recherche de nouveaux antibiotiques.

<footnote>(1) Singleton, P. *Bactériologie 2e cycle*; 4e ed.; Ed. Dunod, 1999.</footnote>

<footnote>(2) Rietschel, E.; Brade, H. *Pour la Science* **1992**, *180*, 48.</footnote>
## II - Une approche originale : l'inhibition des phosphoénolpyruvates lyases

### II.1. Rappels sur le métabolisme du KDO

La compréhension de cette stratégie suppose la connaissance élémentaire du métabolisme du KDO qui figure ci-après.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 5</figcaption></figure>

Les trois premières étapes réalisent la synthèse du KDO à partir du D-érythropentulose-5-phosphate et les deux dernières concernent l'accrochage au lipide A.

Pour la plupart, les inhibiteurs connus du métabolisme du KDO prennent pour cible la CMP-KDO synthétase qui conduit à la forme biologiquement active du KDO, la cytidine-monophosphate-KDO.6-23 Cette cible est privilégiée car il s'agit de l'enzyme possédant l'activité spécifique la plus faible. Elle constitue de plus l'étape cinétiquement limitante du métabolisme.

<footnote>(6) Lopez-Herrera, F. J.; Sarabia-Garcia, F. *Tetrahedron* **1997**, *53*, 3325-3346.</footnote>

<footnote>(7) Barton, D. H. R.; Jaszberenyi, J. C.; Liu, W.; Shinada, T. *Tetrahedron* **1996**, *52*, 2717-2726.</footnote>

<footnote>(13) Lubineau, A.; Auge, J.; Lubin, N. *Tetrahedron* **1993**, *49*, 4639-4650.</footnote>

<footnote>(14) Tabyaoui, M. Thèse d'Université, Henry Poincaré - Nancy 1, 1993.</footnote>

<footnote>(16) Shing, T. K. M. *Tetrahedron* **1992**, *48*, 6777-6786.</footnote>

<footnote>(20) Hammond, S. M.; Claesson, A.; Jansson, A. M.; Larsson, L.-G.; Pring, B. G.; Town, C. M.; Ekstrom, B. *Nature* **1987**, *327*, 730-732.</footnote>

<footnote>(22) Goldman, R.; Kohlbrenner, W.; Lartey, P.; Pernet, A. *Nature* **1987**, *329*, 162-164.</footnote>

<footnote>(23) Ray, P. H.; Kelsey, J. E.; Bigham, E. C.; Benedict, C. D.; Miller, T. A. *ACS Symp. Ser.* **1983**, *231*, 141-169.</footnote>
D'autre part, le KDO n'existant pratiquement que dans le métabolisme des LPS des bactéries Gram-négatives, l'utilisation d'inhibiteurs enzymatiques analogues du KDO ciblant la CMP-KDO synthétase doit limiter au maximum les risques d'effets secondaires, puisque le KDO est spécifique de ce seul processus métabolique. Ces analogues structuraux du KDO, ont ainsi fait l'objet de nombreuses études.²⁴⁻³² Leur synthèse débute bien souvent par l'utilisation du KDO lui-même en tant que synthon chiral. C'est pourquoi, il existe un nombre important de méthodes de synthèse du KDO qui montre bien l'intérêt de la synthèse de ce composé pour la préparation ultérieure de ses analogues.⁶⁻⁵²

Le problème a été abordé par notre équipe en 1993 : une synthèse totale et rapide du KDO a été décrite. Le principe de la stratégie repose sur l'introduction en deux étapes d'un motif α-cétoester sur un D-mannose convenablement protégé.⁴⁵ D'autres travaux du laboratoire ont également concerné la synthèse d'analogues originaux du KDO tels que la préparation d'un analogue phosphoré où le groupe acide carboxylique est remplacé par un acide phosphonique.⁸

Il semble cependant encore plus intéressant de tenter l'inhibition de la biosynthèse du KDO en amont de l'étape (4), le plus tôt possible dans le métabolisme du sucre, afin de réduire au maximum la biosynthèse de fragments d'endotoxines dont l'effet pathogène est redoutable pour l'organisme.

C'est pourquoi, nous nous intéressons aujourd'hui à l'inhibition de la synthèse du KDO lui-même qui est catalysée par la KDO-8-phosphate synthétase (KDO8PS, étape (2)).

<footnote>(6)-(52) Cf. Bibliographie en fin de manuscrit</footnote>

<footnote>(8) Coutrot, P.; Grison, C.; Lecouvey, M. *Tetrahedron Lett.* **1996**, *37*, 1595-1598.</footnote>

<footnote>(24) Barton, D. H. R.; Almeida, M. V. D.; Liu, W.; Shinada, T.; Jaszberenyi, J. C.; Santos, H. F. D.; Hyaric, M. L. *Tetrahedron* **2001**, *57*, 8767-8771.</footnote>

<footnote>(25) Crestia, D.; Guerard, C.; Bolte, J.; Demuynck, C. *J. Mol. Catal. B: Enzym.* **2001**, *11*, 207-212.</footnote>

<footnote>(26) Reiner, M.; Schmidt, R. R. *Tetrahedron: Asymmetry* **2000**, *11*, 319-335.</footnote>

<footnote>(27) Burke, S. D.; Sametz, G. M. *Org. Lett.* **1999**, *1*, 71-74.</footnote>

<footnote>(28) Mlynarski, J.; Banaszek, A. *Org. Lett.* **1999**, *1999*, 1709-1711.</footnote>

<footnote>(29) Birck, M. R.; Holler, T. P.; Woodard, R. W. *J. Am. Chem. Soc.* **1998**, *120*, 11027-11032.</footnote>

<footnote>(30) Sugai, T.; Shen, G.-J.; Ichikawa, Y.; Wong, C.-H. *J. Am. Chem. Soc.* **1993**, *115*, 413-421.</footnote>

<footnote>(31) Ramage, R.; Macleod, A. M.; Rose, G. W. *Tetrahedron* **1991**, *47*, 5625-5636.</footnote>

<footnote>(32) Esswein, A.; R.Betz; Schmidt, R. R. *Helv. Chim. Acta* **1989**, *72*, 213-223.</footnote>

<footnote>(45) Coutrot, P.; Grison, C.; Tabyaoui, M. *Tetrahedron Lett.* **1993**, *34*, 5089-5092.</footnote>
## II.2. La KDO8PS, nature et fonctionnement

Cette enzyme (E.C. 4.1.2.16), de type aldolase, appartient à la famille des phosphoénolpyruvates lyases;<sup>53,54</sup> elle catalyse l'addition aldolique du phosphoénolpyruvate (PEP) sur l'arabinose-5-phosphate (A5P).

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Schéma 2</figcaption></figure>

Les connaissances concernant cette enzyme sont récentes et le mécanisme de la réaction d'aldolisation, hypothétique. La KDO8PS d'Escherichia coli est codée par le gène kdsA d'un plasmide.<sup>55</sup> Les premières études de l'enzyme cristallisée faisaient état d'un homotrimère, sous une forme α et une forme β, la première de groupe d'espace I23 (a = b = c = 118,0Å et α = β = γ = 90°) et la seconde de groupe d'espace I2₁₃ (a = b = c = 233,0Å et α = β = γ = 90°).<sup>56</sup>

Des travaux récents, confrontant les analyses de l'enzyme en solution et celles de sa structure cristalline, décrivent une structure de type homotétramère. Chaque monomère comporte 284 acides aminés pour une masse calculée de 30 833 Da. Ces cristaux isolés par Woodard et al.<sup>57,58</sup> sont de type monoclinique et appartiennent au groupe d'espace P2₁ (a ≈ 50,0Å ; b ≈ 140,0Å ; c ≈ 74,0Å ; β = 105°). Les interactions entre les différentes sous unités A, B, C, D seraient de type polaire et hydrophobe.

Le site actif de la KDO8PS n'a pas pu être directement identifié. Cependant la KDO8PS adopte une topologie en « tonneau » du même type que la triose phosphate isomérase (TIM), ce qui suggère que le site actif se trouve au niveau du C terminal du tonneau $(βα)₈$.

<footnote>(53) Fessner, W.-D. *Kontakte-Merck Ed. Française* **1994**, 2, 50.</footnote>

<footnote>(54) Fessner, W.-D.; Walter, C. *Top. Curr. Chem.* **1997**, **184**, 97-194.</footnote>

<footnote>(55) Woisetschlager, M.; Hogenauer, G. *Molecular & general genetics: MGG* **1987**, **207**, 369-373.</footnote>

<footnote>(56) Tolbert, W. D.; Moll, J. R.; Bauerle, R.; Kretsinger, R. H. *Proteins: Struct., Funct., Genet.* **1996**, **24**, 407-408.</footnote>

<footnote>(57) Radaev, S.; Dastidar, P.; Patel, M.; Woodard, R. W.; Gatti, D. L. *Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr.* **2000**, **D56**, 516-519.</footnote>

<footnote>(58) Radaev, S.; Dastidar, P.; Patel, M.; Woodard, R. W.; Gatti, D. L. *J. Biol. Chem.* **2000**, **275**, 9476-9484.</footnote>
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 6</figcaption></figure>

La séquence réactionnelle commencerait par l'incorporation du PEP puis de l'A5P, et se poursuivrait en libérant le Pi, puis le KDO8P. Cette séquence réactionnelle permettrait de mettre en évidence une coopération allostérique, la fixation du PEP augmentant l'affinité de l'enzyme pour l'A5P.

D'un point de vue stéréochimique, les structures configurationnelles du D-arabinose et du KDO8P sont telles que le PEP doit attaquer la face Ré de la fonction aldéhydique de l'arabinose (Schéma 3). La réaction enzymatique crée ainsi un nouveau carbone asymétrique de configuration R. L'arrangement configurationnel du squelette carboné devient donc celui du D-mannose, qui est aussi celui du KDO-8-phosphate. Récemment, il a été montré par marquage isotopique que la face Si du PEP attaquait la face Ré du motif aldéhydique du D-arabinose.⁵⁹

<footnote>(59) Kohen, A.; Berkovich, R.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1993**, *3*, 1577-1582.</footnote>
### Schéma 3

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

## II.3. La DAH7PS, une phosphoénolpyruvate lyase bactérienne peu étudiée

Un point important dans la recherche d'inhibiteurs de la KDO8PS réside dans son application potentielle à une autre cible enzymatique bactérienne déjà évoquée, la DAH7PS. Cette enzyme est également une phosphoénolpyruvate lyase (E.C. 4.1.2.15). Elle assure la transformation du D-érythrose-4-phosphate en acide 3-désoxy-D-arabino-heptulosonique-7-phosphate ou DAH7P au cours de la biosynthèse de l'acide shikimique.⁶⁰⁻⁶³

### Schéma 4

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Cet acide est un produit clé du métabolisme des cycles aromatiques chez les plantes et les bactéries. Il est à l'origine de la production des acides aminés aromatiques, acides foliques, ubiquinones et entérobactines comme illustré Figure 7.⁶⁰⁻⁶³

<footnote>(60) Walsh, C. T.; Liu, J.; Rusnak, F.; Sakaitani, M. *Chem. Rev.* **1990**, *90*, 1105-1129.</footnote>

<footnote>(61) Goudot-Perrot, A. *Les antimétabolites*; Maloine ed., 1986; Vol. 20.</footnote>

<footnote>(62) Ip, K.-M.; Doy, C. H. *Eur. J. Biochem.* **1979**, *98*, 431-440.</footnote>

<footnote>(63) Simpson, R. J.; Davidson, B. E. *Eur. J. Biochem.* **1976**, *70*, 509-516.</footnote>
La DAH7PS est sensible à certains acides aminés aromatiques variant suivant les micro-organismes dont elle est issue.⁶⁴ Ainsi, l'enzyme isolée à partir de Neurospora Crassa est inhibée par le tryptophane. Elle est de ce fait nommée DAH7PS(trp).⁶² Il existe aussi les DAH7PS(phe) et (tyr) indiquant l'inhibition de la réaction enzymatique par la phénylalanine et la tyrosine.⁶³,⁶⁵,⁶⁶

Toutes ces enzymes légèrement différentes entraînent différentes variations mineures des mécanismes enzymatiques correspondants.⁶⁷⁻⁷⁹ Un de leurs points communs importants est la présence indispensable d'un métal divalent pour rendre possible l'acte catalytique. Ainsi, dans leur état natif, elles ont environ les mêmes proportions en M²⁺. De plus, leurs affinités pour les cations divalents sont semblables : Mn²⁺>Cd²⁺; Fe²⁺>Co²⁺>Ni²⁺; Cu²⁺; Zn²⁺>>Ca²⁺.⁷⁷ La nécessité de ce cation métallique n'a pas encore été clairement établie. Il induirait un changement conformationnel de nature allostérique de l'enzyme active. Sa proximité du PEP dans le site actif laisse également supposer la formation préalable d'un complexe PEP-M²⁺ exaltant l'électrophilie du phosphore et diminuant la densité électronique des groupes anioniques du PEP.⁶⁴ Cette dernière supposition est corroborée par une diminution de l'activité enzymatique en présence de Pb²⁺ par rapport à celle observée en présence des cations M²⁺ précédemment cités. Cette observation est à rapprocher de la moindre capacité de Pb²⁺ à se complexer avec des motifs carboxyliques et phosphoniques.

Kafarski a exploité cette propriété pour préparer les seuls inhibiteurs connus de la DAH7PS : des aminobisphosphonates. Leur propriété, chélatante des cations métalliques divalents cofacteurs de l'enzyme, leur confère, comme attendu, un pouvoir inhibiteur de la DAH7PS. Mais ils ne présentent aucune spécificité d'action.⁸⁰,⁸¹

<footnote>(62) Ip, K.-M.; Doy, C. H. *Eur. J. Biochem.* **1979**, *98*, 431-440.</footnote>

<footnote>(63) Simpson, R. J.; Davidson, B. E. *Eur. J. Biochem.* **1976**, *70*, 509-516.</footnote>

<footnote>(64) Shumilin, I. A.; Kretsinger, R. H.; Bauerle, R. H. *Structure* (London) **1999**, *7*, 865-875.</footnote>

<footnote>(65) Simpson, R. J.; Davidson, B. E. *Eur. J. Biochem.* **1976**, *70*, 493-500.</footnote>

<footnote>(66) Schnappauf, G.; Hartmann, M.; Kunzler, M.; Braus, G. H. *Arch. Microbiol.* **1998**, *169*, 517-524.</footnote>

<footnote>(67) Sundaram, A. K.; Woodard, R. W. *Org. Lett.* **2001**, *3*, 21-24.</footnote>

<footnote>(68) Parker, E. J.; Bulloch, E. M. M.; Jameson, G. B.; Abell, C. *Biochemistry* **2001**, *40*, 14821-14828.</footnote>

<footnote>(69) Liao, H. F.; Lin, L. L.; Chien, H. R.; Hsu, W. H. *FEMS Microbiol. Lett.* **2001**, *194*, 59-64.</footnote>

<footnote>(70) Sheflyan, G. Y.; Sundaram, A. K.; Taylor, W. P.; Woodard, R. W. *J. Bacteriol.* **2000**, *182*, 5005-5008.</footnote>

<footnote>(71) Sundaram, A. K.; Woodard, R. W. *J. Org. Chem.* **2000**, *65*, 5891-5897.</footnote>

<footnote>(72) Wagner, T.; Shumilin, I. A.; Bauerle, R.; Kretsinger, R. H. *J. Mol. Biol.* **2000**, *301*, 389-399.</footnote>

<footnote>(73) Park, O. K.; Bauerle, R. *J. Bacteriol.* **1999**, *181*, 1636-1642.</footnote>

<footnote>(74) Sundaram, A. K.; Howe, D. L.; Sheflyan, G. Y.; Woodard, R. W. *FEBS Lett.* **1998**, *441*, 195-199.</footnote>

<footnote>(75) Akowski, J. P.; Bauerle, R. *Biochemistry* **1997**, *36*, 15817-15822.</footnote>

<footnote>(76) Stephens, C. M.; Bauerle, R. *J. Biol. Chem.* **1992**, *267*, 5762-5767.</footnote>

<footnote>(77) Stephens, C. M.; Bauerle, R. *J. Biol. Chem.* **1991**, *266*, 20810-20817.</footnote>

<footnote>(78) Ray, J. M.; Bauerle, R. *J. Bacteriol.* **1991**, *173*, 1894-1901.</footnote>

<footnote>(79) Paravicini, G.; Schmidheini, T.; Braus, G. *Eur. J. Biochem.* **1989**, *186*, 361-366.</footnote>

<footnote>(80) Forlani, G.; Lejczak, B.; Kafarski, P. *Journal of Plant Growth Regulation* **1999**, *18*, 73-79.</footnote>

<footnote>(81) Forlani, G.; Lejczak, B.; Kafarski, P. *Pestic. Biochem. Physiol.* **1996**, *55*, 180-188.</footnote>
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 7</figcaption></figure>
Des études récentes ont mis en évidence que la cystéine 61 et l'histidine 64 seraient impliquées
dans la chélation de M²⁺ quelle que soit la DAH7PS. Une oxydation de cette cystéine, inactive
l'enzyme.⁷³,⁷⁴,⁷⁶ On sait également que la séquence catalytique commence par l'incorporation du
PEP qui se lie avec la lysine 187, puis se poursuit par l'incorporation de l'E4P.⁶⁹

D'un point de vue métabolique, il est à noter que la DAH7PS catalyse la première étape de la biosynthèse des acides aminés aromatiques. Rappelons à ce titre que l'organisme humain n'est pas autotrophe, c'est-à-dire qu'il n'est pas capable de synthétiser des aminoacides tels que le tryptophane, la phénylalanine et donc la tyrosine qui en dérive directement.⁸² Ces acides aminés aromatiques sont apportés par l'alimentation. C'est pourquoi cette enzyme n'existe pas dans les cellules humaines. Son inhibition ne peut donc affecter que les espèces bactériennes (cyanobactéries, bactéries photosynthétiques, bactéries couplant l'assimilation de CO₂ à une réaction d'oxydation...) et certains végétaux. Ces acides aminés étant essentiels à la croissance de ces organismes, l'arrêt de leur biosynthèse doit se traduire par un arrêt de leur développement.

Il est également à remarquer que le DAH7P est le précurseur biosynthétique de l'acide *p*-aminobenzoïque. Celui-ci est ensuite converti en acide folique après liaison avec une molécule de ptérine et l'acide glutamique. Or l'acide folique a un rôle physiologique très important : il intervient dans la biosynthèse des purines. L'acide folique est donc indispensable à la croissance des cellules bactériennes. Une molécule bloquant sa production peut donc être un antibiotique remarquable. L'inhibition de la DAH7PS est également intéressante pour cette raison.

## II.4. KDO8PS et DAH7PS : deux cibles séduisantes pour contrôler l'acquisition de la virulence

Devant le développement des infections antibiorésistantes, les recherches s'orientent aujourd'hui vers des approches thérapeutiques dont le principe ne repose plus nécessairement sur une élimination indifférenciée et radicale des bactéries. Une démarche plus subtile consiste à interférer avec les stratégies ingénieuses que les micro-organismes bactériens développent constamment pour assurer leur survie, exprimer leur virulence face à une agression extérieure et finalement envahir l'organisme.

<footnote>(69) Liao, H. F.; Lin, L. L.; Chien, H. R.; Hsu, W. H. *FEMS Microbiol. Lett.* **2001**, *194*, 59-64.</footnote>

<footnote>(73) Park, O. K.; Bauerle, R. *J. Bacteriol.* **1999**, *181*, 1636-1642.</footnote>

<footnote>(74) Sundaram, A. K.; Howe, D. L.; Sheflyan, G. Y.; Woodard, R. W. *FEBS Lett.* **1998**, *441*, 195-199.</footnote>

<footnote>(76) Stephens, C. M.; Bauerle, R. *J. Biol. Chem.* **1992**, *267*, 5762-5767.</footnote>

<footnote>(82) Pelmont, J. *Enzymes*; Collection Grenoble-Sciences, Presses Universitaires de Grenoble ed., **1989**.</footnote>
Dans cet esprit, la connaissance des facteurs environnementaux qui provoquent la transformation d'une bactérie inoffensive en un être pathogène et virulent est essentielle.

Dans une première étape, les armes développées par des micro-organismes bactériens pour résister aux défenses immunitaires sont spectaculaires. Les bactéries construisent les LPS ou endotoxines bactériennes évoquées précédemment, qu'elles utilisent comme un véritable bouclier pour se protéger contre le système immunitaire : les glucides des LPS servent de manteau moléculaire en enveloppant la bactérie.⁸³,⁸⁴ L'inhibition de la KDO8PS pourrait être alors une excellente solution pour bloquer ce phénomène de résistance bactérienne, compte tenu de la position clé du KDO dans la construction des LPS (Cf. paragraphe II.2. - p.16).

Les stratagèmes utilisés par des espèces bactériennes pour envahir un tissu cellulaire particulier sont également impressionnants. Des équipes de l'Institut Pasteur ont mis en évidence la capacité de micro-organismes intracellulaires, comme *Shigella flexneri*, à développer une seringue moléculaire dont l'aiguille, telle une épée, est capable de transpercer la paroi des cellules intestinales avant l'infection. La conséquence est sans appel : la pénétration d'une petite centaine de cellules bactériennes entraîne une dysenterie bacillaire.⁸⁴,⁸⁵ Ce processus serait induit par une élévation de température ou un déficit en fer.

Une stratégie thérapeutique consiste à interférer avec la capacité des bactéries à se multiplier dans le sang, où elles s'approprient le fer qui y transite et qui est nécessaire à leur croissance, grâce à une molécule qu'elles produisent spécialement à cet effet : l'aérobactine. Les souches d'E. coli pathogènes aviaires utilisent ce processus pour se multiplier dans le sang avant de produire des lésions.⁸⁶ Là encore, l'aérobactine ne serait exprimée que dans le cas où E. coli se trouverait dans un environnement carencé en fer. La saturation des sites récepteurs de l'aérobactine, pourrait être une solution intéressante pour contrarier la réaction bactérienne.

D'autres expérimentations reposent sur l'identification de fins filaments protéiques disposés autour de certaines bactéries et terminés par une adhésine permettant la fixation spécifique des bactéries à un tissu cellulaire. Les souches d'E. coli pathogènes aviaires utilisent ce phénomène pour se fixer aux cellules du pharynx et de la trachée.

La suppression de cette interaction faciliterait l'élimination des micro-organismes par la toux et le mucus.

<footnote>(83) West, N. P.; Sansonetti, P.; Mounier, J.; Exley Rachel, M.; Parsot, C.; Guadagnini, S.; Prevost, M.-C.; Prochnicka-Chalufour, A.; Delepierre, M.; Tanguy, M.; Tang Christoph, M. *Science* **2005**, *307*, 1313-1317.</footnote>

<footnote>(84) Pelmont, J. *Bactéries et environnement - Adaptation Physiologique*; Presses Universitaires de Grenoble ed.; EDP Science, 1993.</footnote>

<footnote>(85) Sansonetti, P. "Pathogénie Microbienne Moléculaire", INSERM U786, 2005.</footnote>

<footnote>(86) Schouler, C.; Koffmann, F.; Amory, C.; Leroy-Setrin, S.; Moulin-Schouleur, M. *Microbiology (Reading, United Kingdom)* **2004**, *150*, 2973-2984.</footnote>
D'autres facteurs potentiels de virulence produits par les bactéries pathogènes sont actuellement
à l'étude. Une relation étroite entre l'expression de certains gènes de virulence et une surproduction
des acides aminés aromatiques a été établie pour certaines bactéries dont on redoute l'utilisation à
des fins bioterroristes, telles que *Bacillus anthracis* (agent de l'anthrax) ou *Brucella*. L'inhibition de
la biosynthèse des acides aminés essentiels à ces bactéries constituerait une approche de traitement
non antibiotique, car elle repose sur le contrôle spécifique des bactéries virulentes. Elle ne devrait
donc pas être exposée aux phénomènes de résistance. Dans ce contexte, l'inhibition de la DAH7PS
est une cible de choix au vu de son implication dans la voie métabolique de l'acide shikimique
conduisant à la biosynthèse des acides aminés aromatiques (Cf. paragraphe II.3.).

L'inhibition des deux phosphoénolpyruvates lyases bactériennes KDO8PS et DAH7PS est donc très intéressante. Elle constitue une approche moléculaire qui devrait apporter des informations complémentaires sur les corrélations entre facteurs de virulence et processus pathogènes. Elle devrait également permettre d'accéder à des solutions thérapeutiques nouvelles.

## II.5. Hypothèses mécanistiques des réactions d'aldolisation catalysées par KDO8PS et DAH7PS

L'inhibition de la DAH7PS n'a pas encore fait l'objet de conception rationnelle fondée sur des
bases mécanistiques solides. Peu d'équipes ont perçu l'intérêt d'une telle cible pour développer de
nouveaux agents anti-infectieux. Les seuls travaux existants concernent la recherche de têtes de
série capables d'inhiber des enzymes voisines trouvées dans les plantes et ayant conduit à des
herbicides.

Dans le cas de la KDO8PS, des études plus fouillées ont été réalisées. Cependant, en 1998,
aucune idée précise n'existait sur la nature de l'entité nucléophile provoquant la réaction
d'aldolisation catalysée par la KDO8PS.

Une réflexion sur le mécanisme de cette transformation enzymatique a conduit notre équipe à
imaginer que la réaction puisse être initiée par addition d'une molécule d'eau sur le centre
phosphoré dont l'électrophile serait exaltée par la formation préalable d'un complexe avec un
cation métallique (hypothèse 1).

Cette hypothèse est étayée par l'existence de phosphoénolpyruvates lyases cation dépendantes.
Ainsi par exemple, dans le cas de certaines DAH7PS, il a été mis en évidence la formation d'un
complexe stable entre le PEP et un cation divalent Co²⁺.⁸⁷

<footnote>(87) Srinivasan, P. R.; Sprinson, D. B. *J. Biol. Chem.* **1959**, *234*, 716-722.</footnote>
Si la KDO8PS fonctionne selon une telle hypothèse, l'eau libérerait le carbanion énolate pyruvique (ou l'énol) à partir du phosphoénolpyruvate.

Le carbanion énolate pyruvique (ou l'énol) ainsi formé réagirait alors sur la fonction aldéhydique masquée du D-arabinose.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Schéma 5</figcaption></figure>

Des publications biochimiques récentes envisagent cependant que la réaction sur l'aldéhyde masqué du D-arabinose puisse être initiée par une attaque nucléophile sur la double liaison éthylénique ; le phosphoénolpyruvate ne se comporterait pas en accepteur de Michaël, mais subirait une attaque nucléophile en une position inhabituelle, sur le carbone éthylénique porteur du phosphate et du carboxylate (hypothèse 2). Cette attaque nucléophile entraînerait l'attaque de la double liaison sur l'aldéhyde de l'arabinose.⁵⁹,⁸⁸⁻⁹⁷

<footnote>(59) Kohen, A.; Berkovich, R.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1993**, *3*, 1577-1582.</footnote>

<footnote>(88) Baasov, T.; Belakhov, V. *Recent Res. Devel. Organic. Chem.* **1999**, *3*, 195-206.</footnote>

<footnote>(89) Baasov, T.; Kohen, A. *J. Am. Chem. Soc.* **1995**, *117*, 6165-6174.</footnote>

<footnote>(90) Dotson, G. D.; Dua, R. K.; Clemens, J. C.; Wooten, E. W.; Woodard, R. W. *J. Biol. Chem.* **1995**, *270*, 13698-13705.</footnote>

<footnote>(91) Kohen, A.; Jakob, A.; Baasov, T. *Eur. J. Biochem.* **1992**, *208*, 443-449.</footnote>

<footnote>(92) Hedstrom, L.; Abeles, R. *Biochem. Biophys. Res. Commun.* **1988**, *157*, 816-820.</footnote>

<footnote>(93) Liang, P.-H.; Lewis, J.; Anderson, K. S.; Kohen, A.; D'Souza, F. W.; Benenson, Y.; Baasov, T. *Biochemistry* **1998**, *37*, 16390-16399.</footnote>

<footnote>(94) D'Souza, F. W.; Benenson, Y.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 2457-2462.</footnote>

<footnote>(95) Liang, P.-H.; Kohen, A.; Baasov, T.; Anderson, K. S. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 2463-2468.</footnote>

<footnote>(96) Sheffer-Dee-Noor, S.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1993**, *3*, 1583-1588.</footnote>

<footnote>(97) Baasov, T.; Sheffer-Dee-Noor, S.; Kohen, A.; Jakob, A.; Belakhov, V. *Eur. J. Biochem.* **1993**, *217*, 991-999.</footnote>
Cette étape serait suivie d'une rupture de la liaison C-O reliant ce phosphate au carbone porteur également à ce moment d'un OH géminé libérant ainsi une fonction carbonyle et non P-O.⁹² L'eau (hypothèse 2a) ou les motifs hydroxyles portés par les carbones 2 ou 3 (hypothèses 2b) semblent être des sites nucléophiles possibles pour initier le processus.⁹⁰,⁹¹

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Schéma 6</figcaption></figure>

<footnote>(90) Dotson, G. D.; Dua, R. K.; Clemens, J. C.; Wooten, E. W.; Woodard, R. W. *J. Biol. Chem.* **1995**, *270*, 13698-13705.</footnote>

<footnote>(91) Kohen, A.; Jakob, A.; Baasov, T. *Eur. J. Biochem.* **1992**, *208*, 443-449.</footnote>

<footnote>(92) Hedstrom, L.; Abeles, R. *Biochem. Biophys. Res. Commun.* **1988**, *157*, 816-820.</footnote>
Il reste ainsi beaucoup d'incertitudes sur le mécanisme exact de cette réaction et d'autres écritures sont certainement possibles. C'est probablement ce qui explique des publications récentes d'inhibiteurs possibles dont la conception n'est pas toujours rationnelle. Une présentation succincte des différentes stratégies publiées d'inhibition de la KDO8PS est présentée ci-après.

## II.6. Stratégies d'inhibition de la KDO8PS

Les différents inhibiteurs proposés peuvent être classés en quatre catégories :

1) des analogues mimant un des intermédiaires ou des états de transition cycliques de l'hypothèse 2b ;

2) des dérivés ayant fait l'objet d'un criblage systématique et dont la structure est sans relation directe avec l'un des mécanismes envisagés.

3) un analogue de bisubstrat ou de l'état de transition de l'hypothèse 1 ;

4) un analogue de l'état de transition de l'hypothèse 2a.

### II.6.1. Analogues mimant un des intermédiaires ou des états de transition cycliques de l'hypothèse 2b

La recherche de tels analogues a été essentiellement développée par l'équipe Baasov qui est à l'origine de l'hypothèse 2b.⁵⁹,⁸⁹,⁹⁴,⁹⁶,⁹⁸-¹⁰¹ Ainsi, différents mimes des intermédiaires cycliques du type 1-phosphate pyranique et oxonium ont été préparés dans le but de valider cette hypothèse mécanistique.

<footnote>(59) Kohen, A.; Berkovich, R.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1993**, *3*, 1577-1582.</footnote>

<footnote>(89) Baasov, T.; Kohen, A. *J. Am. Chem. Soc.* **1995**, *117*, 6165-6174.</footnote>

<footnote>(94) D'Souza, F. W.; Benenson, Y.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 2457-2462.</footnote>

<footnote>(96) Sheffer-Dee-Noor, S.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1993**, *3*, 1583-1588.</footnote>

<footnote>(98) Baasov, T.; Tkacz, R.; Sheffer-Dee-Noor, S.; Belakhov, V. *Curr. Org. Chem.* **2001**, *5*, 127-138.</footnote>

<footnote>(99) Kohen, A.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Tetrahedron Lett.* **1994**, *35*, 3179-3182.</footnote>

<footnote>(100) Du, S.; Faiger, H.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem.* **1999**, *7*, 2671-2682.</footnote>

<footnote>(101) Du, S.; Tsipori, H.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 2469-2472.</footnote>
<table><caption>Tableau 2</caption><thead><tr><th>Intermédiaires supposés</th><th>Mimes proposés</th><th>Résultats</th></tr></thead><tbody><tr><td>[<img src="image_0.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OOC<sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."></td><td><img src="image_1.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OPO<sub>3</sub><sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."><br>A: R<sub>1</sub>=COO<sup>2</sup>; R<sub>2</sub>=OPO<sub>3</sub><sup>2</sup><br>A': R<sub>1</sub>=OPO<sub>3</sub><sup>2</sup>; R<sub>2</sub>=COO<sup>2</sup></td><td>A': Ki =35µM<br>B: Ki =1300µM<br>B': Ki =160µM</td></tr><tr><td>[<img src="image_2.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OOC<sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."></td><td><img src="image_3.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OPO<sub>3</sub><sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."><br>C</td><td>C: Ki =5µM</td></tr><tr><td>[<img src="image_4.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OOC<sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."></td><td><img src="image_5.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OPO<sub>3</sub><sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."><br>D: X=H<br>D': X=OH</td><td>D: IC<sub>50</sub> >25µM<br>D': IC<sub>50</sub>=3,8µM</td></tr><tr><td>[<img src="image_6.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OOC<sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."></td><td><img src="image_7.png" alt="Chemical structure of a 3-oxo-2-phenylbut-2-ene derivative with an OPO<sub>3</sub><sup>2</sup> group at the 3-position of the phenyl ring and an OOH group at the 2-position of the phenyl ring. The structure is shown in a box with a black line around it. The black arrow points to the 3-oxo ring. The 3-oxo ring has a double bond at the 2-position of the phenyl ring. The 3-oxo ring is connected to the phenyl ring at the 2-position by a single bond."><br>E</td><td>E: Ki =3,3µM</td></tr></tbody></table>

Si l'on se réfère aux $K_i$ mesurés, le pouvoir d'inhibition des analogues A', B et B' est relativement modeste et ne confirme pas nettement l'hypothèse 2b. Le diphosphate A' est un exemple très particulier, car il correspond à la structure d'un intermédiaire du mécanisme proposé par Baasov. C'est pourquoi l'activité biologique de ce composé a également été étudiée en tant que substrat de la KDO8PS. Cependant, il n'induit aucune activité enzymatique. 89,94,99 L'interprétation de ce dernier résultat reste toutefois délicate compte-tenu de l'instabilité évidente de A'.

<footnote>(89) Baasov, T.; Kohen, A. *J. Am. Chem. Soc.* **1995**, *117*, 6165-6174.</footnote>

<footnote>(94) D'Souza, F. W.; Benenson, Y.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 2457-2462.</footnote>

<footnote>(99) Kohen, A.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Tetrahedron Lett.* **1994**, *35*, 3179-3182.</footnote>
La synthèse de l'analogue phosphonique C est une alternative intéressante à ce problème. Le remplacement de la liaison O-P par un lien C-P en position anomère confère une meilleure stabilité à la molécule et permet d'analyser valablement les résultats biologiques. Or, le Kᵢ obtenu laisse supposer que la molécule C présente un caractère inhibiteur tout à fait intéressant vis-à-vis de la KDO8PS.⁹⁶ L'étude réalisée par Liu et Kim avec le dérivé D' corrobore ce résultat.¹⁰²

Cependant, Baasov propose récemment un analogue synthétique E d'un intermédiaire acyclique et obtient le meilleur inhibiteur connu de la KDO8PS !¹⁰⁰,¹⁰¹

### II.6.2. Composés divers présentant une activité inhibitrice intéressante

En 2000, Woodard, biochimiste ayant réussi à isoler la KDO8PS, réalise un criblage à l'aide d'une librairie de 150 000 composés dans le but d'apporter des indices sur les caractéristiques structurales requises pour concevoir de nouveaux inhibiteurs. 22 présentent un $IC_{50} \le 10 \mu M$;

parmi eux F retient l'attention avec un $K_i = 25 nM \pm 1$ in vitro. Cependant, rapidement métabolisé ou exporté des cellules, il perd une grande partie de son activité in vivo.¹⁰³

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 9</figcaption></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

En 2001, le même auteur étudie l'activité enzymatique d'un ensemble de composés cycliques et acycliques actifs sur la chorismate mutase (E.C. 5.4.99.5), enzyme possédant des similarités structurales et électroniques avec la KDO8PS.

Parmi les composés étudiés, seul le composé acyclique G présente un $IC_{50} < 500 \mu M$. Inhibiteur irréversible de la KDO8PS, il présente un $K_i$ de 2,3 mM. Il se lie de manière covalente à l'enzyme, et ce malgré l'absence de groupement phosphate. L'auteur conclut, contrairement à Baasov, à l'existence d'un mécanisme non cyclique et suggère la conception d'inhibiteurs non phosphorylés en position 8.¹⁰⁴

### II.6.3. Analogues de bisubstrat ou de l'état de transition de l'hypothèse 1

Un composé constitué d'une partie phosphoénolpyruvate et d'un reste arabinose ou d'un analogue en bonne position, c'est-à-dire lié par le carbone 1 au phosphate d'énol, possède une grande similitude structurale avec le bisubstrat, voire même avec l'état de transition envisagé.

<footnote>(96) Sheffer-Dee-Noor, S.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1993**, *3*, 1583-1588.</footnote>

<footnote>(100) Du, S.; Faiger, H.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem.* **1999**, *7*, 2671-2682.</footnote>

<footnote>(101) Du, S.; Tsipori, H.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 2469-2472.</footnote>

<footnote>(102) Liu, H.; Li, W.; Kim, C. *U. Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1997**, *7*, 1419-1420.</footnote>

<footnote>(103) Birck, M. R.; Holler, T. P.; Woodard, R. W. *J. Am. Chem. Soc.* **2000**, *122*, 9334-9335.</footnote>

<footnote>(104) Birck, M. R.; Husain, A.; Sheflyan, G. Y.; Ganem, B.; Woodard, R. W. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **2001**, *11*, 2795-2798.</footnote>
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 10</figcaption></figure>

Un tel composé peut conduire à une inhibition compétitive avec les substrats naturels au niveau du site actif de l'enzyme, rendant ainsi de plus en plus difficile la réaction « d'aldolisation » conduisant au KDO-8-phosphate. C'est pourquoi notre équipe a imaginé la synthèse de phosphoénolpyruvates $P_a$ (Figure 10, n=1) où l'on trouve dans la partie terminale les trois carbones asymétriques de l'arabinose (C-5, C-6 et C-7) et au début de squelette carboné le phosphoénolpyruvate (C-1, C-2 et C-3). Le carbone médian C-4 présente la configuration inverse de celle qui est acquise par le carbone aldéhydique de l'arabinose après attaque par le PEP dans la réaction naturelle, afin que les analogues synthétiques n'aient pas une trop forte affinité pour l'enzyme et ne jouent le rôle d'un bisubstrat de l'enzyme ce qui conduirait au KDO lui-même. L'arrangement configurationnel du squelette carboné est donc celui du D-glucose.

L'homologue $P_e$ reliant une partie phosphoénolpyruvate à un reste érythrose (Figure 10, n=0) a également été envisagé dans le but d'étudier l'inhibition de la DAH7PS.

L'accès à des structures phosphoénolpyruviques partiellement débloquées (esters de méthyle et d'isopropyle) a également été envisagé par notre groupe afin de rechercher la meilleure balance hydrophile/hydrophobe nécessaire à une bonne pénétration de la bactérie. Tous ces composés ont été synthétisés en 1999 par une approche originale qui sera présentée plus loin.¹⁰⁵

Les études enzymatiques et biologiques de ces différents inhibiteurs osidiques sont résumées dans le paragraphe qui suit. À la suite de ces travaux et au vu de ces résultats, notre équipe a souhaité affiner encore davantage la structure des inhibiteurs de la KDO8PS. Ainsi, une nouvelle

<footnote>(105) Coutrot, P.; Dumarcay, S.; Finance, C.; Tabyaoui, M.; Tabyaoui, B.; Grison, C. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1999**, *9*, 949-952.</footnote>
stratégie d'inhibition a été imaginée en tenant compte des indices structuraux et mécanistiques les plus récents publiés sur la KDO8PS. Elle répond à l'hypothèse mécanistique 2a.

### II.6.4. Analogue de l'état de transition de l'hypothèse 2a

Aucun analogue synthétique d'un intermédiaire ou d'un état de transition répondant au mécanisme de l'hypothèse 2a n'avait été envisagé. C'est pourquoi notre équipe a réalisé la construction d'analogues de structure **H**, qui doivent représenter de bons mimes de l'état de transition de l'hypothèse mécanistique 2a. La seule modification structurale est le remplacement d'un oxygène du groupe phosphate par un $CH_2$ afin de conférer à la structure une stabilité suffisante pour qu'ils soient isolables et donc synthétisables.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 11</figcaption></figure>

Les résultats biologiques et les informations qui en découlent sur les caractéristiques nécessaires à l'inhibition de la KDO8PS sont rassemblés dans le paragraphe suivant.

### II.6.5. Résultats biologiques et enzymatiques issus des structures P et H

Les composés de structure **P** et **H** ont été soumis à des épreuves de sensibilité bactérienne en réalisant différents antibiogrammes en collaboration avec Madame le Professeur Finance (UMR CNRS-UHP Nancy I 7565).

Les activités antibactériennes les plus spectaculaires sont obtenues avec les structures **P** présentant un groupe carboxylate d'isopropyle et **H** renfermant un motif phosphonate de diéthyle. Ces résultats sont en accord avec la nature intracytoplasmique des enzymes ciblées et la nécessité de traverser les membranes externe (polaire à l'extérieur) et interne (phospholipidique) pour les atteindre.

Des résultats intéressants ont été obtenus avec les esters phosphoénolpyruviques $P_a$ et $P_e$ comportant un ester d'isopropyle. Dans ce cas, un changement d'aspect des espèces bactériennes est observé. Elles prennent une allure visqueuse filaire qui peut s'interpréter par une accumulation en
surface des glucides ne pouvant plus être utilisés pour la construction des LPS. Une étude approfondie a clairement montré que les esters $P_a$ et $P_e$ présentent une activité sur *Pseudomonas aeruginosa* qui ne synthétise plus de Pyoverdine. Une réflexion sur le métabolisme et le rôle biologique de ces pigments a été entreprise. Ainsi, dans le cas de *Pseudomonas aeruginosa*, il a été montré que la coloration verte des colonies témoins résultait d'un mélange de deux pigments principaux, la Pyoverdine et la Pyocyanine, directement issues de la voie shikimique, dont la synthèse du DAHP, par la DAH7PS, est une des premières étapes. L'arrêt de la production de tels pigments serait donc le témoin visuel de l'inhibition de la DAH7PS. La nature du squelette glucidique ne serait pas essentielle pour la reconnaissance de la DAH7PS. Un glucide de configuration *D-arabino* ($P_e$) ou *D-gluco* ($P_a$) présentant un reste phosphoénolpyruvique serait capable de bloquer la voie métabolique commune aux deux types de bactéries Gram-positive et Gram-négative, celle de la DAH7PS. Ces résultats pourraient signifier que le dérivé *D-gluco* permet l'inhibition conjointe des deux phosphoénolpyruvates lyases présentes, DAH7PS et KDO8PS.

Les deux esters hydroxyphosphonates $H_a$ et $H_e$ ont un comportement très différent de celui des phosphoénolpyruvates glucidiques $P_a$ et $P_e$. Il apparaît que l'inhibiteur dérivé du *D*-glucose $H_a$ est spécifique des bactéries Gram-négatives, tandis que l'inhibiteur $H_e$ issu du *D*-arabinose est efficace sur les deux types de bactéries. L'ensemble de ces résultats peut être directement corrélaté au matériel enzymatique des bactéries étudiées. La structure pariétale différente de ces types de bactéries suggère alors l'inhibition de la DAH7PS par $H_e$, seule phosphoénolpyruvate lyase commune aux métabolismes de l'ensemble de ces espèces. $H_e$ serait, comme attendu, un inhibiteur spécifique de la DAH7PS. Ces résultats constituent une voie antibiotique très originale basée sur la découverte de substrats pouvant bloquer deux voies métaboliques très différentes, dont le choix de la structure configurationnelle permet soit une inhibition très spécifique des bactéries Gram-négatives, soit une inhibition à spectre large.

L'activité enzymatique de l'inhibiteur $P_a$ a fait l'objet d'une étude enzymatique en collaboration avec le Professeur Woodard (Univ. Michigan). $P_a$ cible la KDO8PS, que Woodard a été le premier à isoler. Dans la mesure où il s'agit ici d'une étude d'inhibition réalisée directement sur l'enzyme isolée, seules les structures totalement débloquées ont été étudiées, afin de garantir le maximum d'affinité de ces composés pour la KDO8PS. Le glucide $P_a$ s'est comporté comme un inhibiteur compétitif du PEP très intéressant ($IC_{50}$ = 180µM). Ce résultat devrait être facilement optimisable par la phosphorylation de la fonction hydroxyle primaire de l'inhibiteur osidique.
À la suite de ces résultats très encourageants, des études d'interaction directe entre l'acide phosphoénolpyruvique P_a et la KDO8PS d'Aquifex æolicus ont été entreprises par Dominico Gatti (Univ. Michigan). Les mêmes essais ont été réalisés avec l'acide hydroxyphosphonique H_a.

Le principe de ces études d'affinité repose sur l'inclusion des inhibiteurs P_a et H_a dans le site catalytique à des concentrations atteignant 40 mM. Les interactions inhibiteur-site catalytique ont été appréciées par l'observation de modifications de densité électronique par rapport à une carte de densité expérimentale préalablement établie à partir de données de diffraction enregistrées à 3Å de résolution sur des cristaux de KDO8PS gelés rapidement à 140K. Les résultats obtenus ont permis de définir des structures d'inhibiteurs « idéaux » avec beaucoup de précision et sans aucune approximation, contrairement aux études de modélisation.

Les travaux de synthèse de ces nouveaux inhibiteurs sont précisément l'objet de ma thèse. Ils doivent permettre de développer des structures particulièrement actives et de progresser dans la compréhension des phénomènes de virulence.

## II.7. Choix des structures préparées

Les études d'affinité réalisées ont dégagé des indices importants sur les caractéristiques nécessaires à une bonne reconnaissance KDO8PS-substrat. Ils sont regroupés sur la Figure 12 en ce qui concerne la structure P_a. Des conclusions identiques ont été déduites de H_a.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 12</figcaption></figure>
Ces études menées sur l’évaluation de la contribution de chacun des groupements des inhibiteurs **P** et **H** conduisent à concevoir de nouveaux dérivés potentiellement actifs. Les résultats concernant l’inhibition de la KDO8PS sont rassemblés sur la figure suivante :

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 13</figcaption></figure>

Tous ces composés présentent deux groupes phosphorylés terminaux indispensables à une bonne activité. Compte tenu des études biologiques précédentes réalisées sur **H** et **P**, les composés seront préférentiellement préparés et testés sous forme d'esters phosphoriques (R = Et ou Me) sur les colonies bactériennes. Le groupe carboxylique et les deux hydroxyles terminaux, dont le rôle est mineur, ne sont plus présents : ces retraits permettent d'espérer une bonne pénétration transmembranaire sans perte d'affinité.

Le premier centre de chiralité des structures I, II et III est inversé par rapport à $P_a$ et $H_a$, afin de respecter la structure du centre asymétrique naissant lors de la réaction enzymatique. Cette modification est importante et devrait renforcer l'activité biologique des inhibiteurs préparés.
Rappelons que cette contrainte configurationnelle n'avait pu être respectée avec $P_a$ et $H_a$ pour des raisons de difficulté de synthèse.

La structure aminophosphate **II** est retenue pour étudier l'hypothèse mécanistique proposée récemment par Baasov et qui correspond aux meilleurs inhibiteurs connus de la KDO8PS (Cf. paragraphe II.6.1). Dans le même esprit que précédemment, les motifs carboxylique et hydroxyles terminaux sont omis.

Les structures **IV** et **V**, non chirales, possèdent les deux groupes phosphates essentiels pour espérer une bonne reconnaissance. L'étude de l'activité biologique de ces composés devrait permettre de valider ou d'invalider notre analyse. L'absence d'hydroxyles est intéressante pour espérer une bonne pénétration, en revanche elle peut nuire à une spécificité d'action de tels inhibiteurs.

En ce qui concerne l'inhibition de la DAH7PS, l'approche est légèrement différente, car cette enzyme est beaucoup plus tolérante vis-à-vis de ses substrats. Ceci laisse à penser que les structures diphosphoriques **VI** et **VII** possédant un bras espaceur adapté (6 carbones au lieu de 7 dans le cas de la KDO8PS) sont des composés simples et attractifs pour inhiber la DAH7PS. D'autre part, les inhibiteurs $P_e$ et $H_e$ déjà synthétisés au laboratoire possèdent la structure configurationnelle requise pour réaliser une inhibition efficace, mais ils n'ont pas été jusqu'alors phosphorylés en position terminale. C'est pourquoi nous tenterons de synthétiser les deux structures **VIII** et **IX** analogues de $P_e$ et $H_e$ mais possédant un groupe phosphate en position terminale, c'est-à-dire en position 7.

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 14</figcaption></figure>
# PREMIERE PARTIE

## Synthèse
d'inhibiteurs de la KDO8PS
# I - Introduction

Les synthèses des dérivés I à V posent des problèmes différents selon l'aménagement fonctionnel à réaliser. Elles sont donc présentées séparément et successivement. Les fonctionnalités à introduire sont des phosphates terminaux sur un heptanediol sous forme énantiopure (I) ou sur un heptane non chiral (V), un aminophosphonate (II) ou des phosphates d'énol dérivés d'aldéhyde (III et IV). Ces groupes phosphorés possèdent une particularité commune, leur fragilité. Il est donc souhaitable de les introduire le plus tardivement possible dans les schémas de synthèse envisagés. En outre, la fonction phosphate d'énol dérivée d'aldéhyde est quasiment inconnue dans la littérature.

Les glucides s'imposent comme source chirale pour la préparation des molécules cibles I, II et III. Chacune de ses structures nécessite une élongation du squelette carboné visant la construction de désoxysucres à 7 carbones (I et III) ou 6 carbones (II). Des stratégies utilisant des précurseurs non glucidiques seront étudiées pour la synthèse des molécules IV et V.

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 13</figcaption></figure>
# II - Synthèse du diphosphate chiral I

## II.1. Stratégie de synthèse

Dans le cas particulier du diphosphate chiral I, les liens carbone-carbone à introduire à chaque extrémité du motif diol vicinal sont de longueur différente. Cette difficulté sous-entend soit une séquence réactionnelle permettant leur introduction successive de part et d'autre du groupe diol d'un tétrose, soit l'utilisation d'un pentose soumis à un seul allongement du squelette carboné suivi d'une réaction de désoxygénation. Compte-tenu de la plus grande disponibilité des pentoses, la seconde stratégie nous a semblé la plus judicieuse (Schéma 7).

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Schéma 7</figcaption></figure>

La matière première chirale utilisée est tout naturellement le D-ribose 1, facilement disponible et peu coûteux. Une protection régiosélective du motif diol 2,3 sous forme de cétal d'isopropylidène suivie d'une éthérification de la fonction alcool primaire terminale sous forme d'éther silylé permet l'élongation du squelette carboné requise par réaction de Wittig avec la forme aldéhydique masquée du carbone anomère de 3.

Après hydrogénation de la double liaison éthylénique, l'étape de désoxygénation est envisagée par la séquence classique activation / réduction de la fonction alcool libre de 5. Si cette étape de
réduction est réalisée à l'aide du tétrahydrure de lithium aluminium, la réduction parallèle du groupe ester en alcool est envisageable.

Une simple déprotection de l'éther silylé de 7 doit alors permettre la phosphorylation concomitante des deux hydroxyles terminaux pour obtenir 9.

Finalement, une déprotection chimiosélective de la fonction cétal doit conduire à la molécule cible I.

## II.2. Préparation du 2,3-O-isopropylidène-D-ribofuranose 2

Le ribose protégé 2 est préparé selon la méthode préconisée par Pearson, c'est-à-dire par dissolution du D-ribose dans l'acétone (Schéma 8).¹⁰⁶ Une simple catalyse acide par $H_2SO_4$ concentré permet d'obtenir en 4 heures le 2,3-O-isopropylidène-D-ribofuranose 2 avec un rendement de 88%. (Un allongement du temps réactionnel ou l'addition de sulfate de cuivre anhydre favorise la formation du ribopyranose et la protection des positions 1,2 et 3,4).

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Schéma 8</figcaption></figure>

## II.3. Protection de la fonction hydroxyle primaire de 2

L'éther de *tert*-butyldiphenylsilyle (TBDPS) a été décrit pour la première fois par Hanessian et Lavallée.¹⁰⁷ Ce groupe protecteur est apprécié pour sa stabilité et sa faible aptitude à la migration.

Nous l'avons donc retenu comme protection possible de la fonction alcool primaire.
Cependant, son encombrement conjugué à celui du groupe cétal dans le composé 6 peut être une gêne stérique importante lors de la réduction de 6 en 7 ; c'est pourquoi l'éther de *tert*-butyldiméthylsilyle (TBDMS) a été préparé parallèlement. Ces deux réactions sont décrites dans la littérature selon des conditions classiques de silylation (chlorosilane activé par la DMAP ou l'imidazole) et ne posent pas de problème majeur (Schéma 9).¹⁰⁸,¹⁰⁹

<footnote>(106) Pearson, W. H.; Ren, Y.; Powers, J. D. *Heterocycles* **2002**, *58*, 421-430.</footnote>

<footnote>(107) Hanessian, S.; Lavallée, P. *Can. J. Chem.* **1975**, *53*, 2975-2977.</footnote>

<footnote>(108) Choi, W. J.; Moon, H. R.; Kim, H. O.; Yoo, B. N.; Lee, J. A.; Shin, D. H.; Jeong, L. S. *J. Org. Chem.* **2004**, *69*, 2634-2636.</footnote>

<footnote>(109) Jin, Y. H.; Liu, P.; Wang, J.; Baker, R.; Huggins, J.; Chu, C. K. *J. Org. Chem.* **2003**, *68*, 9012-9018.</footnote>
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Schéma 9</figcaption></figure>

## II.4. Réaction de Wittig et hydrogénation des oléfines formées

Les ylures de Wittig ou les carbanions phosphonates d'Horner sont des réactifs de choix pour déplacer l'équilibre hémiacétalique d'un glucide vers sa forme ouverte et réagir alors avec la fonction aldéhydique présente. La principale différence entre ces réactifs phosphorés est la capacité du réactif d'Horner à favoriser une réaction de Michaël intramoléculaire après la réaction d'oléfination.¹¹⁰ Cette tendance s'explique certainement par sa plus grande basicité, entraînant alors la formation d'un alcoolate capable d'attaquer la double liaison éthylénique activée (Schéma 10).

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Schéma 10</figcaption></figure>

C'est pourquoi nous avons préféré la réaction de l'(éthoxycarbonylméthylène) triphénylphosphorane sur les dérivés du ribose **3a** et **3b**.

<footnote>(110) Batty, D.; Crich, D. *J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1* **1992**, 3193-3204.</footnote>
<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Schéma 11</figcaption></figure>

La réaction de Wittig conduit aux oléfines intermédiaires avec un rendement moyen de 50% quelles que soient les conditions de solvant (THF ou $CH_2Cl_2$), de température (20 à 50°C) ou d'équivalents d'ylures (1,5 à 4). Lors des différents essais, environ 50% des riboses **3a** et **3b** engagés sont recueillis en fin de réaction. Un mélange d'oléfines *cis* et *trans* est obtenu dans un rapport proche de 65/35 en faveur des oléfines *cis*. La séparation des oléfines **4** et des riboses **3** n'ayant pas réagi est délicate. Il est préférable d'engager le mélange oléfines **4** / ribose **3** directement dans l'étape suivante.

La réduction de la double liaison carbone-carbone des oléfines formées est facilement réalisée par hydrogénation catalytique à l'aide de palladium à 10% sur charbon sous une pression de 10 bars. Les produits hydrogénés **5a** et **5b** sont alors aisément séparés des riboses **3a** et **3b** n'ayant pas réagi dans la réaction de Wittig.

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>Schéma 12</figcaption></figure>
## II.5. Essais de désoxygénation de 5

Dans un premier temps, le dérivé **5b** a été choisi comme modèle d'étude et soumis à une réaction de sulfonylation à l'aide d'anhydride triflique en présence de diisopropyléthylamine dans le dichlorométhane à -40°C. La réaction est suivie par chromatographie sur couche mince : la disparition progressive de l'alcool **5b** est facilement repérée au profit de la formation du triflate **6b** qui est révélé en UV. Une purification sommaire, destinée à préserver le triflate **6b** de toute dégradation, est réalisée par lavage à l'aide d'une solution aqueuse saturée en NaCl.

Le dérivé triflé **6b** est ensuite traité par 1,5 équivalent de $LiAlH_4$ dans l'éther. Bien que nous n'ayons pu le prouver de façon formelle, il semble que l'encombrement dû au groupe TBDPS ne permette pas la réduction attendue : l'hydrure n'attaquerait pas le carbone de l'enchaînement C-O-S mais directement l'atome de soufre, régénérant ainsi l'alcool de départ. Lors de cette réaction, la fonction ester carboxylique est réduite totalement (**10b**). De façon surprenante, l'éther silylé est légèrement dégradé (**11**).

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Schéma 13</figcaption></figure>

Parallèlement à la réalisation de ces travaux, notre équipe a montré la possibilité d'accéder à des dérivés iodés en position encombrée de substrats glucidiques. Le système $I_2 / PPh_3 / Imidazole$ est en effet capable de réaliser l'iodation de l'hydroxyle 5 d'un mannose ou d'un glucose encombré par un groupe TBDPS ou trityle dans les conditions opératoires préconisées par Rossi.¹¹¹

<footnote>(111) Rondot, B.; Durand, T.; Rossi, J.-C.; Rollin, P. *Carbohydr. Res.* **1994**, *261*, 149-156.</footnote>
<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Schéma 14</figcaption></figure>

L'utilisation des conditions adoptées avec les deux exemples précités s'avère inefficace dans notre cas. Seule la dégradation du substrat **5b** est observée.

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Schéma 15</figcaption></figure>

Il semble donc que l'encombrement du TBDPS conjugué à celui du motif céal adjacent soit trop important pour espérer réussir la désoxygénation de la position 6. De nouveaux essais ont donc été réalisés sur le dérivé **5a** porteur d'un TBDMS.

Le mésylate, plus fréquemment utilisé dans ce genre de séquence et moins fragile que le triflate, a été préparé à partir de **5a**. Il est obtenu avec un excellent rendement de 90%. Cependant, l'addition de $LiAlH_4$ à basse température n'entraîne que la réduction de l'ester carboxylique.

Le mésylate n'est pas touché. Le composé **12** peut être purifié par chromatographie après réduction de l'ester et isolé avec 58% de rendement.
<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Schéma 16</figcaption></figure>

Différentes tentatives de substitution du mésylate par NaI ont été entreprises afin de soumettre le dérivé iodé, plus réactif, à $LiAlH_4$.

25 équivalents de NaI dans l'acétone ou le DMF sont incapables de déplacer le groupe OMs. Seul un début de dégradation du squelette glucidique est détecté !

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>Schéma 17</figcaption></figure>

Lors des essais de réduction du mésylate dérivé de **5a**, aucune réduction du groupe OMs n'a été observée. En revanche, un début de coupure du motif O-TBDMS a pu être détecté. Il nous a semblé intéressant d'exploiter cette fragilité inhabituelle de l'éther silylé en milieu réducteur, afin de tenter l'obtention directe et concomitante des fonctions alcools terminales en traitant **6a** par $LiAlH_4$ dans des conditions plus énergiques.

Cet objectif a été atteint avec un excès d'hydrure (2éq. de $LiAlH_4$) à reflux de THF. Ces conditions très dures induisent également un déblocage du cétal en quantité importante.

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Schéma 18</figcaption></figure>
Ce résultat est intéressant, mais très surprenant, car les éthers silylés encombrés tels que O-TBDMS et O-TBDPS résistent habituellement à l'action de LiAlH₄. Seuls quelques exemples de coupure du groupe O-TBDMS ont été signalés avec le DIBAL à température ambiante.¹¹² En revanche, la coupure du motif O-TBDMS n'est pas une solution à l'inertie initiale du groupement mésylate ; les composés finaux **11** et **13** ne sont pas désoxygénés en position 6.

La résistance du mésylate à la réduction s'explique très probablement par l'encombrement autour du carbone 6 qui gène considérablement l'approche du réducteur en cette position.

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>Schéma 19</figcaption></figure>

Dans une telle situation, la méthode de désoxygénation de Barton-McCombie peut être une solution intéressante, puisque dans cette réaction la désoxygénation procède non pas par attaque directe sur le carbone en position 6, mais *via* une addition sur l'atome de soufre de l'intermédiaire thiocarbonaté.¹¹³

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Schéma 20</figcaption></figure>

<footnote>(112) Corey, E. J.; Erickson, B. W. *J. Org. Chem.* **1971**, *36*, 3553-3560.</footnote>

<footnote>(113) Barton, D. H. R.; McCombie, S. W. *J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1* **1975**, 1574-1585.</footnote>
L'hydroxyle 6 du composé **5a** a donc été estérifié par le chlorure de phénylthionocarbonate dans l'acétonitrile en présence d'un excès de DMAP pour former le *O*-alkylthionocarbonate intermédiaire. Ce dernier n'est pas purifié. Il est directement soumis à la désoxygénation radicalaire par l'hydrure de tributylétain dans le toluène à reflux en présence d'AIBN.

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Schéma 21</figcaption></figure>

Malheureusement, la réaction de désoxygénation de Barton ne permet pas l'obtention du produit réduit **14**. La formation du *O*-alkylthionocarbonate intermédiaire est lente et difficile. De plus, sa réduction à Bu₃SnH entraîne la décomposition rapide de l'éther silylé. Après une longue séparation chromatographique de l'ensemble des produits obtenus, c'est finalement l'ester désilylé **15** qui est recueilli majoritairement.

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Schéma 22</figcaption></figure>

Il est probable qu'une des limitations importantes à la préparation de la molécule **14** soit le choix de la protection de l'alcool primaire du ribose ; le groupe TBDMS est à la fois encombrant et anormalement fragile. D'autres essais seront tentés selon une stratégie utilisant des protections initiales différentes. Mais dans un premier temps et par souci d'efficacité, il nous a semblé intéressant de poursuivre nos efforts sur le 2,3,4,7-hydroxy heptanol **13**, plus accessible et qui constitue un bon candidat à l'inhibition de la KDO8PS s'il est diphosphorylé (composé **I'**).
<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Schéma 23</figcaption></figure>

La phosphorylation d'une structure polyol n'est pas une transformation aisée. Elle est sujette à de nombreuses réactions secondaires : manque de sélectivité, formation de phosphates cycliques ou encore migration de phosphates sur des hydroxyles libres. La réussite de cette dernière étape laisse donc supposer une mise au point fine des conditions opératoires. Nous avons souhaité optimiser la préparation du composé **13**, afin de rendre ce dernier plus accessible.

## II.6. Optimisation de la préparation du 2,3,4,7-hydroxy heptanol 13

La préparation de **13** s'inspire des observations précédentes : le groupe TBDMS de **5a** est anormalement fragile et peut-être débloqué lors de la réduction du motif ester carboxylique. Ainsi **5a** a été soumis directement à un excès de $LiAlH_4$. La fonction ester est réduite à -78°C et une remontée en température à -20°C entraîne le déblocage du groupe TBDMS. Le motif cétal d'isopropylidène du triol **11** obtenu est ensuite débloqué en 4 heures par de l'acide trifluoroacétique à 90% dans le dichlorométhane. La réaction est quantitative.

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>Schéma 24</figcaption></figure>
## II.7. La diphosphorylation de 13

### II.7.1. Rappels bibliographiques sur la phosphorylation

Deux approches complémentaires sont proposées dans la littérature<sup>114</sup> :

- la *première* repose sur l'utilisation d'un **P(III)** suivie de l'oxydation du phosphite résultant ;<sup>115,116</sup>

- la *seconde* est l'utilisation directe d'un **P(V)**.<sup>117</sup>

L'utilisation des agents de phosphorylation **P(III)** nécessite une étape d'oxydation du phosphite intermédiaire, mais ils sont appréciés pour leur grande réactivité et permettent d'envisager des réactions de polyphosphorylation, y compris de diols vicinaux. Ces réactifs peuvent être des chlorophosphites de dialkyle, chlorodiisopropylaminoalkoxyphosphine ou phosphoramidates. Ces derniers, plus stables, peuvent être plus facilement purifiés par chromatographie. Le groupe partant est une amine secondaire, fréquemment la diéthylamine.

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Schéma 25</figcaption></figure>

L'intermédiaire phosphite est ensuite oxydé en phosphate par l'acide *méta*-chloroperbenzoïque ou l'hydroperoxyde de *tert*-butyle.

Les réactifs de phosphorylation **P(V)** présente des avantages et inconvénients différents : ils sont plus stables, plus faciles à manipuler, mais moins réactifs.

La phosphorylation de diols vicinaux avec ces agents phosphorylants P(V) est souvent peu efficace et se traduit fréquemment par la formation de phosphates cycliques. Dans notre cas, le problème n'est pas celui d'une polyphosphorylation d'alcools secondaires voisins, mais une

<footnote>(114) Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. *Protective Groups in Organic Synthesis*. 2nd Ed; Wiley, 1991.</footnote>

<footnote>(115) Poirot, E.; Bourdon, H.; Chretien, F.; Chapleur, Y.; Berthon, B.; Hilly, M.; Maugerb, J. P.; Guillon, G. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1995**, *5*, 569-572.</footnote>

<footnote>(116) Alewood, P. F.; Perich, J. W.; Johns, R. B. *Synth. Commun.* **1982**, *12*, 821-828.</footnote>

<footnote>(117) Gigg, J.; Gigg, R.; Payne, S.; Conant, R. *J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1* **1987**, 1757-1762.</footnote>
bisphosphorylation sélective des seuls alcools primaires. L'approche P(V) est donc bien adaptée au problème ciblé. Différents phosphorochloridates ou pyrophosphates peuvent être utilisés (Schéma 26).¹¹⁸ Les esters phosphorés de diéthyle sont les structures qui se sont révélées les plus intéressantes lors des tests biologiques avec les composés $H_a$ et $H_e$ présentés en introduction. Le chlorophosphate de diéthyle est ainsi le réactif que nous avons retenu.

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Schéma 26</figcaption></figure>

## II.7.2 Résultats

L'approche P(V) utilisant le chlorophosphate de diéthyle dans la pyridine et une quantité catalytique de DMAP a été mise en place.

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Schéma 27</figcaption></figure>

La réaction de phosphorylation peut être suivie en RMN $^{31}$P; le diphosphate I' est plus blindé que le chlorophosphate de diéthyle. Les déplacements chimiques sont respectivement de +0,33 ppm et +1,90 ppm. La réaction est très lente et après 48h d'agitation à 20°C, le taux de diphosphorylation est estimé à 30%. En revanche, la réaction est univoque. Une étude fine des couplages C-P en RMN $^{13}$C du mélange réactionnel permet d'affirmer qu'aucune phosphorylation d'alcool secondaire n'est obtenue.

Le traitement du milieu réactionnel est l'autre phase délicate de la réaction. Après concentration du milieu réactionnel, le chlorophosphate de diéthyle n'ayant pas réagi et la pyridine résiduelle sont éliminés par lavages successifs à l'éther. Une chromatographie sur silice, difficile compte-tenu de la polarité des produits à séparer, permet d'isoler I'. Sa caractérisation par

<footnote>(118) Ley, S. V.; Parra, M.; Redgrave, A. J.; Sternfeld, F. *Tetrahedron* **1990**, *46*, 4995-5026.</footnote>
spectroscopie RMN est cependant sans ambiguïté. I' a fait l'objet d'études biologiques présentées en quatrième partie.

### III - Synthèse de la molécule cible II

#### III.1. Stratégie « benzylique »

La synthèse de la molécule cible II présente cinq difficultés majeures :

* la construction d'un désoxysucre de configuration L ;

* l'introduction d'un motif aminophosphonate ;

* la phosphorylation finale en présence du groupe aminophosphoré ;

* le déblocage d'une molécule fragile et polaire ;

* la purification d'un aminoacide phosphonique.

Une première stratégie a été envisagée en tenant compte de l'ensemble de ces difficultés (Schéma 28). Une approche de type « benzylique » est toujours séduisante dans une telle situation, car elle permet d'envisager un déblocage ultime par hydrogénolyse dont les conditions sont douces, chimiosélectives et réalisables en milieu non aqueux, ce qui facilite les traitements.

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Schéma 28</figcaption></figure>
La matière première chirale est ici l'érythrose. Fragile, il n'est pas commercial. En revanche, la D-érythronolactone **16** est disponible.

La stratégie choisie impose une protection préalable des hydroxyles libres de l'érythronolactone sous forme d'éthers de benzyle **17**. La réduction ménagée de **17** est la meilleure méthode d'accès à l'érythrose dibenzylé **18**. L'elongation du squelette carboné est envisagée comme précédemment, c'est-à-dire selon la séquence Wittig / hydrogénation.

Le groupe aminophosphonate est introduit par substitution nucléophile du triflate **21** à l'aide d'une amine appropriée. En accord avec la stratégie benzylique retenue, l'aminométhylphosphonate de dibenzyle **22** est un premier nucléophile phosphoré possible. Par ailleurs, l'utilisation du benzylaminométhylphosphonate de dibenzyle **26** peut également se révéler intéressante pour deux raisons :

- un aminophosphonate secondaire est plus stable et plus facile à préparer qu'un dérivé primaire ;

- la condensation d'un aminophosphonate secondaire sur la position terminale d'un érythrose convenablement protégé conduit à une amine tertiaire qui ne doit pas interférer avec la phosphorylation finale de l'alcool primaire **28**.

En revanche, **26** est moins nucléophile que **22**. Les deux possibilités seront donc étudiées.

Après réduction de l'ester carboxylique, phosphorylation de l'alcool obtenu **28**, puis hydrogénolyse, la molécule cible **II** doit être obtenue.

### III.2. Préparation de l'érythronolactone protégée 17

La protection sous forme d'éthers de benzyle est fréquemment utilisée en chimie glucidique. Cependant un seul article décrit la préparation de l'érythronolactone dibenzylée **17**.¹¹⁹ Bien que les rendements diffèrent entre parties théorique et expérimentale (38 et 48%) et que certaines imprécisions expérimentales aient été relevées dans cet article, nos premiers résultats révèlent une réaction délicate, que nous nous sommes proposés de réétudier de façon détaillée.

La méthode proposée est l'utilisation du système BnBr/Ag₂O. Les essais réalisés sont regroupés dans le Tableau 3.

<footnote>(119) Marshall, J. A.; Seletsky, B. M.; Luke, G. P. *J. Org. Chem.* **1994**, *59*, 3413-3420.</footnote>
<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Schéma 29</figcaption></figure>

Un mélange de trois composés protégés séparables par chromatographie est obtenu. Il s'agit de la lactone dibenzylée attendue **17**, les lactones monobenzylées **30** et **30'**, et enfin l'ester perbenzylé **31**.

<table><caption>Tableau 3</caption><thead><tr><th>Essai</th><th>BnBr</th><th>Ag<sub>2</sub>O</th><th>Conditions particulières</th><th>BnO<br>17</th><th>BnO<br>30<br>+<br>30'</th><th>BnO<br>31</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>2,7 éq.</td><td>3,3éq.</td><td>Et<sub>2</sub>O/22h/20°C<br>A l'abri de la lumière</td><td>22%</td><td>28%</td><td>11%</td></tr><tr><td>2</td><td>2,7 éq.</td><td>3,3éq.</td><td>Et<sub>2</sub>O/22h/20°C<br>A l'abri de la lumière<br>+ CaSO<sub>4</sub></td><td>18,5%</td><td>18,5%</td><td>-</td></tr><tr><td>3</td><td>2,7 éq.</td><td>3,3éq.</td><td>Et<sub>2</sub>O/86h/20°C<br>A l'abri de la lumière<br>+ CaSO<sub>4</sub></td><td>18,5%</td><td>18,5%</td><td>-</td></tr><tr><td>4</td><td>5 éq.</td><td>4 éq.</td><td>DMF/45h/20°C<br>A l'abri de la lumière<br>+ CaSO<sub>4</sub></td><td>36%</td><td>32%</td><td>-</td></tr></tbody></table>

La formation de l'ester de benzyle **31** peut être évitée par la présence de sulfate de calcium qui permet de s'affranchir de toute trace d'eau capable de provoquer l'ouverture de la lactone. En revanche, le rapport dibenzylation (**17**) / monobenzylation (**30-30'**) reste constant quelles que soient les conditions adoptées.

D'autres systèmes de benzylation ont été explorés. L'objectif recherché est de développer une méthode séquencée permettant :

1/ la monobenzylation contrôlée et efficace de l'érythronolactone **16** en **30-30'** ;

2/ dans une deuxième étape, la monobenzylation de **30-30'** en **17**.
Pour atteindre cet objectif, nous avons eu recours à l'utilisation d'hydrure de sodium connu pour monodéprotoner spontanément un diol-1,2, ce qui est a priori une garantie de monobenzylation.
Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 4

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Tableau 4</figcaption></figure>

<table><thead><tr><th>Essai</th><th>BnBr</th><th>NaH</th><th>Conditions particulières</th><th>BnO<br>17</th><th>BnO<br>30<br>+<br>30'</th><th>BnO<br>31</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>4 éq.</td><td>2,4éq.</td><td>DMF/20°C<br>Procédure :<br>i) 4éq. NaH / 30min<br>ii) 2,4éq. BnBr / 16h</td><td>20%</td><td>31%</td><td>-</td></tr><tr><td>2</td><td>2 éq.</td><td>2 éq.</td><td>DMF/0°C<br>Procédure :<br>i) 1éq. NaH / 30min<br>ii) 1éq. BnBr / 2h<br>iii) 1éq. NaH / 30min<br>iv) 1 éq. BnBr / 4h</td><td>30%</td><td>23%</td><td>-</td></tr><tr><td>3</td><td>2,5 éq.</td><td>10éq.</td><td>DMF/20°C<br>Procédure :<br>i) 2,5éq. NaH / 30min<br>ii) 10éq. BnBr / 5h</td><td>35%</td><td>38%</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Là encore, il semble difficile d'orienter la réaction vers la lactone dibenzylée **14** de façon exclusive ou même majoritaire.
Un dernier essai a été réalisé en essayant de préparer la lactone monoprotégée **30-30'**, de l'isoler, puis de la soumettre à des conditions de benzylation acide en présence de trichloroacétamidate de benzyle.¹²⁰,¹²¹

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Schéma 31</figcaption></figure>

Seuls 17% de lactone dibenzylée sont isolés, accompagnés de 15% du mélange **30-30'** et d'un produit d'élimination de structure **32**.

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>Schéma 32</figcaption></figure>

Malgré le nombre d'essais réalisés, le rendement maximal en lactone **17** espérée est finalement de 38% Ce résultat nous a semblé insuffisant pour entreprendre la synthèse totale de l'inhibiteur **II** à partir de ce précurseur. Une autre stratégie a été envisagée à partir d'une érythronolactone protégée plus accessible.

### III.3. Seconde approche synthétique de la molécule cible II

La seconde approche que nous avons envisagée pour préparer la molécule **II** est fondée sur le même principe général que celui de la stratégie benzylique. Le précurseur glucidique choisi est la 2,3-*O*-isopropylidène-D-érythronolactone, qui est un dérivé commercial. La transformation clé du schéma de synthèse est l'introduction du motif **aminophosphonate** sur le groupe

<footnote>(120) Wessel, H. P.; Iversen, T.; Bundle, D. R. *J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1* **1985**, 2247-2250.</footnote>

<footnote>(121) Iversen, T.; Bundle, D. R. *J. Chem. Soc., Chem. Commun.* **1981**, 1240-1241.</footnote>
4,5-O-isopropylidenehexanoate énantiopur, lui-même construit à partir de la 2,3-O-isopropylidène-D-érythronolactone (Schéma 33).

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>Schéma 33</figcaption></figure>

Conscient de la difficulté d'introduction du groupe aminophosphoré, différentes approches directes ou indirectes ont été envisagées. Elles sont regroupées sur le Schéma 34.

### III.3.1. Différentes stratégies envisagées

L'intermédiaire clé de l'ensemble des stratégies étudiées est l'aminophosphonate chiral 41 dérivé de la 2,3-O-isopropylidène-D-érythronolactone.

Le Schéma 34 peut être décomposé en deux parties distinctes :

- la première partie (**Voies A, B et C**) vise la préparation de l'intermédiaire **41a** ($R=R'=Bn$), soit une amine tertiaire ;

- la seconde partie (**Voies D et E**) cible la préparation de l'intermédiaire **41b** ($R=Et$, $R'=H$), soit une amine secondaire.
<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>Schéma 34</figcaption></figure>

La construction de l'intermédiaire clé **41** peut être envisagée selon 3 conceptions fondamentales :

- la première repose sur la substitution nucléophile d'un triflate glucidique de type 4,5-dihydroxyhexenoate d'éthyle **33** (**voie A**) ou 4,5-dihydroxyhexanoate d'éthyle **38** (**voie D**) par un aminophosphonate secondaire **34** (**voie A**) ou primaire **39** (**voie D**);

- la seconde correspond à une inversion de polarité : le dérivé glucidique est aménagé en nucléophile (**35** ou **37**). C'est alors le phosphonate qui est activé à l'état de triflate **33** et soumis à la substitution nucléophile par les amines chirales **35** ou **37** (**voies B et C**);

- la troisième est une aminoréduction de l'aldéhyde glucidique **40** issu de la 2,3-O-isopropylidène-D-érythronolactone à l'aide de l'aminophosphonate primaire **39** (**voie E**).
Chaque stratégie présente des avantages suffisants pour nécessiter une étude particulière :

- les **voies A** et **D** sont en faveur d'une préparation rapide de la matière première chirale, qui est la plus précieuse ;

- les **voies B** et **C** évitent la préparation d'électrophiles encombrés peu aptes à la substitution nucléophile ;

- la **voie E** est inspirée de la synthèse d'un dérivé analogue, l'aminophosphonate **E** décrit par Baasov et présenté en introduction.¹²²

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>**Schéma 35**</figcaption></figure>

### III.3.2. Etude de la **voie A**

L'étude de la **voie A** suppose la préparation de deux précurseurs : le triflate glucidique **33** et le benzylaminophosphonate de dibenzyle **34**.

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

#### A/ Préparation du triflate glucidique **33**

Afin d'obtenir le triflate glucidique **33**, nous avons préparé préalablement l'alcool précurseur **44** selon le schéma suivant.

<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>**Schéma 36**</figcaption></figure>

<footnote>(122) Du, S.; Faiger, H.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem.* **1999**, *7*, 2671-2682.</footnote>
La réduction ménagée de la 2,3-O-isopropylidène-D-érythronolactone **42** est effectuée selon la méthode classique par action du DIBAL à -78°C dans $CH_2Cl_2$.¹²³ L'excès de DIBAL est neutralisé par ajout de MeOH. Après reprise à l'aide d'un mélange $H_2O/AcOEt$, les sels d'aluminium sont précipités par acidification à l'aide d$H_2SO_4$ 2N à pH 2,9. Le lactol **40** est purifié rapidement par lavage avec une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium, puis engagé rapidement dans l'étape suivante, pour éviter sa dégradation.

L'accès à l'oléfine **44** est effectué par le biais de la réaction de Wittig. L'action de l'éthoxycarbonylméthylène triphénylphosphorane sur le 2,3-O-isopropylidène-D-érythrose **43** dans le THF à -25°C permet d'obtenir l'ester $\alpha,\beta$-éthylénique **44**. La réaction est peu stéréosélective. La constante de couplage de 14 Hz entre les deux protons vinyliques du stéréoisomère majoritaire est en faveur de la configuration Z (62%) ; les hydrogènes vinyliques de l'oléfine E (38%) sont caractérisés par une constante de 19 Hz. Les deux stéréomères éthyléniques sont séparables par chromatographie. Comme dans le cas du dérivé du ribose **3**, l'addition intramoléculaire de Michaël peut être évitée par le choix du réactif d'oléfination (ylure et non carbanion phosphonate) et de la température du milieu réactionnel.

Le rendement global en oléfines **44** est de 33% par rapport à la 2,3-O-isopropylidène-D-érythronolactone **42**.

Disposant de l'alcool **44**, la préparation du triflate **33** a été étudiée. Ce substrat est préparé par addition lente du mélange alcool **44** - diisopropyléthylamine (DIEA) à 0°C sur l'anhydride triflique dans le dichlorométhane. Le rôle attendu de la DIEA est analogue à celui de la lutidine ou de la collidine, bases couramment utilisées dans ce type de réaction. Elle permet de maintenir un pH basique, mais n'est pas capable de substituer le triflate formé compte-tenu de sa faible nucléophilie.

La formation du triflate **33** est confirmée par l'apparition d'une couleur orange prononcée et la disparition de l'alcool **44** en ccm. Instable, **33** est utilisé dès formation.

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>Schéma 37</figcaption></figure>

<footnote>(123) Cohen, N.; Banner, B. L.; Lopresti, R. J.; Wong, F.; Rosenberger, M.; Liu, Y. Y.; Thom, E.; Liebman, A. A. *J. Am. Chem. Soc.* **1983**, *105*, 3661-3672.</footnote>
## B/ Préparation du N-benzyl aminophosphonate de dibenzyle 34

L'aminophosphonate 34 n'est pas décrit dans la littérature. Il a été préparé par décomposition de la 1,3,5-tribenzylhexahydro-s-triazine par le dibenzylphosphite. Cette méthode est inspirée des travaux de Ratcliffe et Christensen utilisant le diéthylphosphite.¹²⁴

<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>Schéma 38</figcaption></figure>

Alors que la réaction est très efficace avec le diéthylphosphite (91%), seuls 27% de composé 34 sont isolés avec le dibenzylphosphite. Le faible rendement observé confirme les difficultés habituellement rencontrées dans la préparation de phosphonates de dibenzyle, à savoir une décomposition du groupe benzylique.

## C/ Tentative de substitution du triflate glucidique 33 par l'aminophosphonate 34

Soucieux de limiter au maximum le nombre d'étapes, nous avons tenté l'introduction directe de l'aminophosphonate 34 sur le triflate 33 tout en conservant la double liaison éthylénique jusqu'à l'étape d'hydrogénolyse des motifs phosphonate et amino afin de réaliser en une seule étape l'hydrogénation catalytique de la double liaison et l'hydrogénolyse des groupes benzyliques.

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Schéma 39</figcaption></figure>

La substitution s'avère impossible. Après traitement, seuls le triflate 33, son produit d'hydrolyse 44 et l'aminophosphonate de départ 34 sont recueillis. La récupération d'une fraction de 33 est le témoin de la bonne formation du triflate et donc d'une SN extrêmement difficile.

<footnote>(124) Ratcliffe, R. W.; Christensen, B. G. *Tetrahedron Lett.* **1973**, *No. 46*, 4645-4648.</footnote>
### III.3.3. Etude de la voie B

La voie B est une alternative intéressante aux difficultés rencontrées lors de la voie A, puisque son principe repose sur une SN mettant en jeu un électrophile peu encombré, le triflate **36**. Sa difficulté repose en revanche sur la préparation de l'amine glucidique **35**, qui est inconnue.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>**Schéma 40**</figcaption></figure>

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

#### Préparation de l'amine glucidique **35**

Le triflate glucidique **33**, dont la synthèse a été présentée lors de l'étude de la voie A, constitue le précurseur immédiat de **35**. Compte tenu de sa fragilité, le dérivé activé **33** est utilisé brut, en présence des sels de DIEA. Un large excès de benzylamine est nécessaire pour déplacer le motif triflate à 20°C. Après 24h d'agitation, la substitution nucléophile conduit à un mélange complexe d'amines difficiles à séparer. Deux d'entre elles ont été identifiées : le composé **35** attendu, accompagné de son isomère cyclique résultant d'une réaction de Michaël intramoléculaire.

<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>**Schéma 41**</figcaption></figure>

Au vu de ces résultats, il nous a semblé préférable de renoncer à l'étude de la voie B et d'étudier l'introduction du groupe benzylamino sur le triflate dérivé du dihydroxyhexanoate d'éthyle **38**, évitant toute possibilité de cyclisation intramoléculaire (voie C).
### III.3.4. Etude de la voie C

Afin de tester les possibilités de la **voie C**, la préparation de l'amine précurseur chirale **37** a été examinée.

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

#### A/ Préparation de l'amine chirale 37

Comme précédemment, la préparation de l'amine chirale **37** nécessite la synthèse préalable du triflate glucidique **38**. Le schéma de synthèse de **37** est présenté ci-dessous.

<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>**Schéma 42**</figcaption></figure>

L'hydrogénation catalytique de l'oléfine **44** est quantitativement réalisée par le système $H_2/Pd/C$ à 10%.¹¹⁰ Le triflate **38** est obtenu comme son analogue **33**, c'est-à-dire à l'aide du système $Tf_2O/DIEA/0°C/CH_2Cl_2$. Au vu de son instabilité, il est engagé dès formation dans l'étape suivante.

La substitution du triflate **38** nécessite également un large excès de benzylamine. La réaction est ici univoque, mais la difficulté est la séparation de l'amine formée **37** et de l'excès de benzylamine. Une chromatographie longue et fastidieuse est nécessaire et conduit à 72% en produit **37** isolé pur.

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>**Schéma 43**</figcaption></figure>

#### B/ Préparation du triflate phosphonate 36

Le triflate phosphonate **36** est préparé à partir de l'hydroxyméthylphosphonate de dibenzyle **46**, dont la synthèse préalable repose sur la réaction de Pudovik.

<footnote>(110) Batty, D.; Crich, D. *J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1* **1992**, 3193-3204.</footnote>
<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>Schéma 44</figcaption></figure>

Le principe de préparation des hydroxyméthylphosphonates de dialkyle selon Pudovik est l'addition de dialkylphosphites sur du formol généré par dépolymérisation du paraformaldéhyde.¹²⁵ Cette réaction est donc une variante de type Michaelis-Becker (utilisation d'un phosphite secondaire sur un dérivé halogéné) de la réaction d'Abramov (addition d'un phosphite tertiaire sur un dérivé carbonylé).

<figure><img src="image_86.png" /><figcaption>Schéma 45</figcaption></figure>

La difficulté d'une telle réaction est la fragilité de l'hydroxyméthylphosphonate formé en milieu basique qui a tendance à donner une réaction de rétro-Pudovik. C'est pourquoi l'utilisation de bases faibles est préconisée.

<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>Schéma 46</figcaption></figure>

<footnote>(125) Phillion, D. P.; Andrew, S. S. *Tetrahedron Lett.* **1986**, *27*, 1477-1480.</footnote>
Cette réaction est largement décrite pour les phosphonates de dialkyle. Son efficacité est correcte dans le cas classique du phosphonate de diéthyle (R = Et, 65%), mais faible avec le phosphonate dibenzylique **46** (R=Bn, 27% dans la littérature).¹²⁶ Différentes tentatives d'amélioration de la réaction ont été essayées (variation de la température et de la durée, utilisation d'un solvant), mais elles ont toutes été infructueuses. Il n'a jamais été possible de dépasser 15% de rendement en **46**.

Paradoxalement, l'activation de l'alcool **46** à l'état de triflate est moins délicate (Schéma 44).¹²⁷ L'addition d'anhydride triflique sur le mélange alcool-lutidine à -50°C conduit aisément au triflate attendu **36** après retour à température ambiante. De simples lavages suffisent à sa purification. Fragile, le composé **36** doit être utilisé dès formation.

### Cl/Tentative de substitution du triflate phosphonate 36 par l'amine chirale 37

Disposant de l'amine chirale **37**, un essai de substitution du triflate phosphorylé **36** par le nucléophile **37** a été tenté selon le schéma de la **voie C**. La réaction est lente et requiert un excès d'amine chirale (3 éq.) Après 48h d'agitation et une purification par chromatographie, 70% de produit de substitution **41a** sont isolés purs. Ce résultat est très satisfaisant, puisque le rendement est établi par rapport à l'alcool précurseur de **36**, l'hydroxyméthylphosphonate de dibenzyle **46**. En revanche, la réaction est très consommatrice d'amine **37** (3 éq.) ; il n'est possible de récupérer que 50% de la fraction non réactive de **37**.

### Schéma 47

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

Par cette procédure, il est ainsi possible de préparer pour la première fois l'ester clé de la synthèse **41a**. Toutefois, le rendement global de la synthèse totale de **41a** est limité par la difficulté de préparation de l'hydroxyméthylphosphonate de dibenzyle de départ **46** (15%). Il paraissait donc naturel d'étudier parallèlement un schéma de synthèse qui n'est pas tributaire de la préparation du précurseur phosphoré **46**. C'est l'objet de la **voie D**.

<footnote>(126) Bischofberger, N.; Waldmann, H.; Saito, T.; Simon, E. S.; Lees, W.; Bednarski, M. D.; Whitesides, G. M. *J. Org. Chem.* **1988**, *53*, 3457-3465.</footnote>

<footnote>(127) Xu, Y.; Flavin, M. T.; Xu, Z.-Q. *J. Org. Chem.* **1996**, *61*, 7697-7701.</footnote>
### III.3.5. Etude de la voie D

La voie D prévoit la substitution du triflate 38 par l'aminophosphonate de diéthyle 39, dont la préparation reste à réaliser.

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

#### A/ Préparation de l'aminométhylphosphonate de diéthyle 39

##### i) rappels bibliographiques

La préparation des aminophosphonates de dialkyle a été très étudiée, car ces composés sont les analogues stricts des aminoesters carboxyliques.¹²⁸

La plupart des auteurs décrivent l'accès à des aminophosphonates protégés, car les dérivés primaires sont fragiles. La méthode la plus répandue est la réaction de Kabachnik-Fields.¹²⁹ Elle consiste à faire réagir un dialkyphoshite sur une imine en milieu basique. De nombreuses variantes de cette réaction ont été étudiées. Nous en citerons un exemple particulièrement intéressant à titre d'illustration.¹³⁰

Le phosphanion lithié du diéthylphosphite est additionné sur une aldimine homochirale. La chélation entre le cation lithium, l'atome d'oxygène de l'éther et l'azote de l'imine permet un contrôle stéréochimique qui mérite d'être signalé. L'hydrogénolyse du groupe aminé, qui est de type benzylique, conduit à l'aminophosphonate primaire.

##### Schéma 48

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

Une synthèse rapide d'aminophosphonates a également été proposée par Gajda.¹³¹ Elle est basée sur une réaction de Mitsunobu entre un hydroxyméthylphosphonate et l'acide hydrazoïque. L'inconvénient est tout naturellement l'utilisation de HN₃.

##### Schéma 49

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

<footnote>(128) Kukhar, V. P.; Hudson, H. R.; Editors *Aminophosphonic and Aminophosphinic Acids: Chemistry and Biological Activity*; Wiley, 2000.</footnote>

<footnote>(129) Murphy, P. J.; Editor *Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry*; Oxford University Press, 2004.</footnote>

<footnote>(130) Smith, A. B., III; Yager, K. M.; Taylor, C. M. *J. Am. Chem. Soc.* **1995**, *117*, 10879-10888.</footnote>

<footnote>(131) Gajda, T.; Sikora, D.; Nonas, T. *Phosphorus, Sulfur Silicon Relat. Elem.* **1999**, *144-146*, 581-584.</footnote>
Notre équipe a développé une méthode d'accès générale aux aminophosphonates par réarrangement de Curtius des acylazides correspondants, facilement accessibles à partir des acides dialkyl-2-phosphonoalkanoïques.<sup>132,133</sup>

<figure><img src="image_92.png" /><figcaption>Schéma 50</figcaption></figure>

La méthode autorise une grande variété de structures au niveau du carbone chiral en α du phosphore, compte tenu de la facilité d'accès aux acides dialkyl-2-phosphonoalkanoïques diversement substitués. Cependant, elle ne permet pas la préparation de **39**, car cette amine primaire est extrêmement soluble dans l'eau.

## ii) préparation de l'aminophosphonate 39

Une synthèse efficace, proposée par Martin repose sur une réaction de Michaelis-Arbuzov entre le triéthylphosphite et le N-bromométhylphtalimide.<sup>134</sup> Bien décrite, nous l'avons retenue dans un premier temps.

<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>Schéma 51</figcaption></figure>

Le N-bromophtalimide est préparé par bromation du N-hydroxysuccinimide à l'aide du couple HBr/H₂SO₄. Après 5h à 70°C, 85% de produits bromés sont obtenus. La réaction de Michaelis-Arbuzov est conduite dans des conditions classiques : sans solvant et à haute température (4h à 85-100°C). Le bromure d'éthyle formé est distillé en fin de réaction. Le phtalimidométhylphosphonate

<footnote>(132) Coutrot, P.; Grison, C.; Charbonnier-Gerardin, C. *Tetrahedron* **1992**, *48*, 9841-9868.</footnote>

<footnote>(133) Grison, C.; Comoy, C.; Coutrot, P. *Actualite Chimique* **2001**, 38-48.</footnote>

<footnote>(134) Davidsen, S. K.; Phillips, G. W.; Martin, S. F. *Org. Synth.* **1987**, *65*, 119-134.</footnote>
de diéthyle est précipité par addition de benzène. Le déblocage du groupe phtalimide est réalisé par de l'hydrazine à 95% dans l'éthanol. La réaction est lente (15h à 20°C, puis 4h à reflux), mais conduit à 80% d'aminométhylphosphonate de diéthyle **39**. Fragile, cette amine peut être purifiée et stockée sous forme d'imine dérivée du benzaldéhyde.

Un nouvel accès à **39** a été étudié, dans le but de développer un procédé rapide et univoque à ce composé, permettant de s'affranchir de toute purification.

L'expérience acquise dans la préparation du triflate phosphonate de dibenzyle **36** a été facilement mise à profit dans la synthèse du triflate phosphonate analogue de diéthyle **48**.

<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>Schéma 52</figcaption></figure>

La séquence Pudovik / triflation permet l'obtention aisée de **48** avec un rendement global satisfaisant de 52%.

Disposant du triflate dérivé de l'hydroxyméthylphosphonate de diéthyle **48**, la première étape de synthèse de l'aminophosphonate de diéthyle **39** est le déplacement du groupe triflate par un large excès d'azoture de sodium dans le DMF. La substitution est totale après 15 heures de réaction. Cette méthode est une amélioration d'une synthèse voisine qui réalise la substitution de l'α-(p-tolylsulfonyloxy)benzylphosphonate de diéthyle, moins réactif. Elle peut être réalisée sur de grosses quantités (~20g) et l'azidométhylphosphonate de diéthyle est purifié par distillation sous pression réduite sans difficulté.

La réduction du motif azido est réalisée quantitativement sous 45 bars de pression d'hydrogène. La méthode est efficace ; mais l'amine **39** est fragile et doit être utilisée rapidement.

<figure><img src="image_95.png" /><figcaption>Schéma 53</figcaption></figure>
BI Etude de la substitution du triflate glucidique 38 par l'aminométhylphosphonate
de diéthyle 39.

<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>Schéma 54</figcaption></figure>

L'amine phosphorylée primaire **39**, plus réactive que son analogue N-benzylé **34**, est capable de réagir avec le triflate chiral **38** en 12h à 20°C à condition d'utiliser 5 équivalents d'amine. La séparation de l'amine formée **41b** de l'aminophosphonate précurseur **39** affecte le rendement en produit isolé (66%). La séparation chromatographique est d'autant plus délicate, que **41b** se révèle être instable. Sa décomposition en hydroxyméthylphosphonate de diéthyle **47** est catalysée par SiO₂ ou Al₂O₃.

La *voie D* représente donc un accès possible à l'intermédiaire clé **41b**, mais reste délicate à mettre en œuvre.

### III.3.6. Etude de la voie E

Baasov a montré que **E**, le 1-désoxy-1-[ [N-(phosphonométhyl)-2-oxoéthyl]amino]-D-mannitol pouvait être préparé par aminoréduction du D-mannose à l'aide du glycophosphate. L'amination réductrice est effectuée « *one-pot* » en présence de cyanoborohydrure de sodium dans le méthanol.¹²²

<figure><img src="image_97.png" /><figcaption>Schéma 55</figcaption></figure>

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

<footnote>(122) Du, S.; Faiger, H.; Belakhov, V.; Baasov, T. *Bioorg. Med. Chem.* **1999**, *7*, 2671-2682.</footnote>
Ce procédé est davantage connu avec les amines primaires. Il est généralement réalisé à pH 6,2 : l'imine formée intermédiairement est protonée en iminium ; cette protonation permet une réduction rapide de la double liaison carbone-azote en amine sans toucher à la fonction aldéhydique du substrat.

<figure><img src="image_99.png" /><figcaption>Schéma 56</figcaption></figure>

Son application au cas de l'aldéhyde **40** méritait donc d'être tentée.

Elle nécessite la préparation préalable de **40**. Ce dernier est décrit comme un substrat très fragile.¹¹⁰ Il ne peut être préparé que dans des conditions très précises en assurant un pH proche de la neutralité : le chlorochromate de pyridinium (PCC) en présence d'acétate de sodium permet une oxydation douce et conduit à 91% de rendement en produit brut. Très fragile, cet aldéhyde ne peut être purifié.

<figure><img src="image_100.png" /><figcaption>Schéma 57</figcaption></figure>

L'amination réductrice de **40** échoue totalement : la formation de l'imine est extrêmement lente. La réduction de la fonction aldéhydique par NaBH₃CN, l'attaque de la fonction ester par l'amine **39** et la dégradation de l'aldéhyde sont les seules évolutions détectées. Ce résultat est imputable à la fragilité de l'aldéhyde **40** et sa faible réactivité ; la voie E n'a pas été explorée davantage.

<footnote>(110) Batty, D.; Crich, D. *J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1* **1992**, 3193-3204.</footnote>
<figure><img src="image_101.png" /><figcaption>Schéma 58</figcaption></figure>

À ce stade de la synthèse, le succès rencontré dans la préparation difficile des esters clés **41a** et **41b** par les voies *C* et *D* nous a encouragé à étudier leur réduction en alcools **49a** et **49b**.

### III.3.7. Réduction des esters clés 41 en alcools 49

La réduction du groupe ester de **41** est envisagée par $LiAlH_4$ selon le Schéma 59.

<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>Schéma 59</figcaption></figure>

Cette étape s'est montrée beaucoup plus difficile qu'attendue. Avec le phosphonate de benzyle **41a**, l'hydrure de lithium aluminium entraîne la dégradation complète du groupe phosphorylé par coupure des liaisons Bn-O et C-P.

Dans le cas du phosphonate de diéthyle **41b**, la réduction du motif ester carboxylique est chimiosélective et totale. Le motif ester phosphonique est totalement préservé. Aucun produit secondaire n'est observé en ccm. En revanche, il est extrêmement difficile de récupérer le produit de réduction **49b** après traitement. Quel que soit le pH d'hydrolyse ou les conditions d'extraction, l'alcool **49b** reste complexé aux sels d'aluminium. Cette difficulté est souvent observée avec les
aminoalcools. Un traitement par $(HOCH_2CH_2)_3N$, excellent ligand de l'Aluminium(III), avant addition d'eau, permet finalement d'isoler **49b** avec 42% de rendement.¹³⁵

### III.3.8. Tentative de phosphorylation de l'alcool 49b

Compte-tenu de la fragilité du motif aminophosphonique en milieu acide, nous avons choisi de réaliser la phosphorylation de l'alcool **49b** en milieu basique. La méthode procède en 2 étapes :

- la préparation de l'alcoolate lithié dérivé de **49b** ;

- l'addition de cet alcoolate sur le diéthylchlorophosphate.

<figure><img src="image_103.png" /><figcaption>Schéma 60</figcaption></figure>

Ces conditions opératoires conduisent à une dégradation totale et rapide du phosphonate **49b**.

Nous nous sommes alors intéressés à la stabilité de ce composé phosphoré en fonction du pH. Une décomposition rapide en hydroxyméthylphosphonate de diéthyle quel que soit le pH du milieu donne à réfléchir sur l'intérêt d'études biologiques d'une molécule si sensible. C'est pourquoi nous n'avons pas souhaité nous investir davantage dans cette voie dans le cadre de ce mémoire. Nous prévoyons d'effectuer d'autres essais de phosphorylation utilisant des agents phosphorylants P(III) plus réactifs et d'étudier son degré de stabilité après phosphorylation complète et déblocage.

En revanche, ce travail a été l'occasion de développer l'accès à de nouvelles structures osidiques de configuration L-érythro, série peu étudiée, ainsi qu'un nouvel accès facile et efficace à l'aminométhylphosphonate de diéthyle **39**, compatible avec sa fragilité et sa grande polarité.
# IV - Synthèse des molécules cibles III, IV et V

## IV.1. Introduction

Cette partie concerne les synthèses des molécules cibles engageant un motif phosphate d'énol (III et IV) ou directement dérivées par hydrogénation de ce groupe fonctionnel (V).

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>Schéma 61</figcaption></figure>

De nombreux dérivés de phosphates jouent un rôle important dans les transformations métaboliques fondamentales de l'organisme. Il s'agit par exemple de l'ATP, l'acétylphosphate, le carbamylphosphate ou le phosphoénolpyruvate (PEP). Ces biomolécules naturelles se comportent comme des donneurs de phosphates à haut potentiel de transfert. Il s'agit donc de molécules très réactives dont la synthèse n'est pas aisée. Parmi elles, le PEP est le seul phosphate d'énol rencontré dans les cellules vivantes. Outre son rôle dans la construction des acides ulosoniques tels que KDO, DAH, KDN (cf. Introduction), il est également utilisé par l'organisme en tant que donneur de phosphate comme par exemple lors de la conversion de l'ADP en ATP par action d'une pyruvate kinase.¹³⁶

<footnote>(136) Stryer, L.; Editor *La Biochimie, 4e Edition Révisée*; W.H. Freeman and Company, 1996.</footnote>
<figure><img src="image_105.png" /><figcaption>Schéma 62</figcaption></figure>

Si cette transformation biosynthétique a fait l'objet d'études particulières, les phosphates d'énol autres que le PEP ont été très peu étudiés. La raison principale est certainement leur difficulté d'accès. Ils ne sont pas disponibles dans la nature et les quelques structures préparées sont des phosphates d'énol dérivés de cétones simples. 137

Dans cette partie, nous décrivons de nouvelles approches générales de phosphates d'énol dérivés d'aldéhydes dans le but d'ouvrir l'accès aux molécules cibles III et IV.

## IV.2. Stratégies de synthèse

Deux stratégies directes sont en théorie possibles. L'une repose sur l'adaptation de la réaction de Perkow à des aldéhydes halogénés (voie A). La seconde consiste à réaliser la *O*-phosphorylation d'un énolate d'aldéhyde (voie B).

<figure><img src="image_106.png" /><figcaption>Schéma 63</figcaption></figure>

<footnote>(137) Emsley, J.; Hall, D. *The Chemistry of Phosphorus*; Harper & Row: London, 1976.</footnote>
IV.2.1. Etude de la voie A : réaction de Perkow

A/ Rappels bibliographiques

La réaction de Perkow a été découverte lors de l'étude de l'action du triéthylphosphite sur un aldéhyde, le chloral ; le produit unique de cette réaction est le phosphate d'énol correspondant. ¹³⁸

<figure><img src="image_107.png" /><figcaption>Schéma 64</figcaption></figure>

Deux exemples similaires sont décrits avec le 2,2-dichloropropanal et le 2,3-dichlorobutanal.

Cette réaction a ensuite été étendue à diverses cétones α-halogénées aliphatiques et aromatiques. ¹³⁹ La réaction de Perkow est en fait une réaction concurrente de celle, plus classique et plus générale, de Michaelis-Arbuzov. ¹³⁷

<figure><img src="image_108.png" /><figcaption>Schéma 65</figcaption></figure>

Cette compétition entre les deux mécanismes est due à la présence du motif carbonyle. Le rapport entre les deux espèces phosphorées est fonction du solvant, de la température et de la nature de l'halogène :

- de faibles températures et un halogène fortement électronégatif favorisent la formation du phosphate d'énol ;

- des substituants sur le carbone porteur de l'atome d'halogène orientent également le déroulement de la réaction au profit du produit de Perkow.

<footnote>(137) Emsley, J.; Hall, D. *The Chemistry of Phosphorus*; Harper & Row: London, 1976.</footnote>

<footnote>(138) Perkow, W. *Chem. Ber.* **1954**, **87**, 755-758.</footnote>

<footnote>(139) Lichtenthaler, F. W. *Chem. Rev.* **1961**, *61*, 607-649.</footnote>
Si le mécanisme de la réaction de Michaelis-Arbusov est parfaitement connu, celui de la réaction de Perkow n'est pas résolu. Les difficultés qui se posent sont liées au nombre de sites d'attaque sur la cétone α-halogénée.

Une première hypothèse met en jeu une substitution sur le carbone porteur de l'halogène selon un mécanisme de type SN2.

<figure><img src="image_109.png" /><figcaption>Schéma 66</figcaption></figure>

Ce mécanisme semble peu vraisemblable dans la mesure où la réaction de Perkow est favorisée, aux dépends de la réaction d'Arbusov, par un encombrement stérique du carbone porteur de l'halogène. On devrait donc s'attendre à l'inverse, l'attaque nucléophile du phosphite devant être ralentie par l'encombrement stérique comme toute attaque nucléophile.

Une seconde hypothèse repose sur une attaque d'halogène positif.

<figure><img src="image_110.png" /><figcaption>Schéma 67</figcaption></figure>

L'iode étant plus polarisable que le brome, ce dernier étant lui-même plus polarisable que le chlore, on peut concevoir que cette réaction de déshalogénation soit plus facile avec un dérivé iodé et on peut imaginer la séquence I>Br>Cl.

Cette supposition n'est pourtant pas en accord avec les données de la littérature selon lesquelles le rapport phosphate d'énol/β-cétophosphonate augmente avec l'électronégativité de l'halogène.

Une troisième possibilité est l'addition du trialkylphosphite sur le carbone du motif carbonyl.
Schéma 68

<figure><img src="image_111.png" /></figure>

Cette éventualité est intéressante d'un point de vue mécanistique : l'alcoolate intermédiaire peut en effet évoluer soit vers le phosphate d'énol par attaque sur l'atome de phosphore tétravalent, soit vers l'époxydation par attaque du centre électrophile carboné.

Cette deuxième possibilité conduirait alors à un époxyphosphonate. La formation de ce dernier n'est jamais observée ; ce résultat est en accord avec la grande oxophilie de l'atome de phosphore, comportement régulièrement observé dans la chimie des dérivés phosphorés.

Par analogie avec un mécanisme admis pour la réaction de Mitsunobu,¹⁴⁰ ou avec la capacité connue des triphénylphosphines à réduire le diméthylsulfoxyde ou l'eau oxygénée,¹⁴¹ certains auteurs proposent également une attaque directe du phosphore trivalent sur l'atome d'oxygène.

Schéma 69

<figure><img src="image_112.png" /></figure>

Cette hypothèse expliquerait la facilité d'action d'un trialkylphosphite sur les cétones porteuses d'un atome d'halogène fortement électronégatif.

Lors des études mécanistiques des réactions catalysées par la KDO8PS (cf. Introduction, hypothèse 1), notre équipe a développé pour la première fois la transposition de la réaction de Perkow au cas d'un α-halogénoester dans le but de préparer des phosphoénolpyruvates glucidiques du type P_a et P_e.¹⁴²

<footnote>(140) Wada, M.; Mitsunobu, O. *Tetrahedron Letters* **1972**, *1279-1282*.</footnote>

<footnote>(141) Afarinkia, K.; Rees, C. W.; Cadogan, J. I. G. *Tetrahedron* **1990**, *46*, 7175-7196.</footnote>

<footnote>(142) Coutrot, P.; Dumarcay, S.; Finance, C.; Tabyaoui, M.; Tabyaoui, B.; Grison, C. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1999**, *9*, 949-952.</footnote>
<figure><img src="image_113.png" /><figcaption>Schéma 70</figcaption></figure>

Cette réaction est très performante et bien adaptée à la fragilité inhérente aux substrats glucidiques. Il s'agit donc d'une méthode de choix pour envisager la préparation de phosphates d'énols dérivés de sucres.

Nous avons donc étudié si cette réaction était généralisable à des aldéhydes α-halogénés, ce qui n'était à priori pas évident, car les substrats aldéhydiques sont beaucoup plus fragiles que les dérivés cétoniques, en particulier lorsqu'ils sont halogénés. Le premier problème à résoudre est celui de leur préparation.

## B/ Préparation des aldéhydes α-halogénés

La préparation des aldéhydes α-bromés et α-iodés est très peu décrite dans la littérature. Quelques exemples isolés ont été relevés lors de la publication de méthodes générales d'halogénation de cétones. Leur principe est basé sur l'halogénation de différents énols (éthers d'énols silylés, acétates d'énol ou énols).<sup>143</sup> Parmi les exemples relevés, deux méthodes directes sont proposées. La première, proposée par Barluenga, est l'utilisation du couple HgCl<sub>2</sub>(II)-I<sub>2</sub> capable de réaliser l'α-iodation d'un aldéhyde.<sup>144</sup> L'agent d'iodation semble être (HgICl<sub>2</sub>)<sub>I</sub><sup>+</sup>. Les conditions de température sont intéressantes pour une extension de la méthode en série glucidique (20°C) ; en revanche, la réaction libère de l'acide chlorhydrique. Si ce dernier est indispensable à l'énolisation de la fonction carbonylée, il est peut-être un inconvénient majeur en présence des protections fréquemment utilisées en chimie des glucides.

<figure><img src="image_114.png" /><figcaption>Schéma 71</figcaption></figure>

<footnote>(143) Rubottom, G. M.; Mott, R. C. *J. Org. Chem.* **1979**, *44*, 1731-1734.</footnote>

<footnote>(144) Barluenga, J.; Martinez-Gallo, J. M.; Najera, C.; Yus, M. *Synthesis* **1986**, 678-680.</footnote>
Marchelli a étudié les possibilités synthétiques d'un réactif de bromation constitué du mélange « *t*-BuBr-DMSO ».<sup>145</sup> À 65°C, ce système se décompose en bromure de bromodiméthylsulfonium. Il se comporte comme une source de brome positif capable de réagir avec de nombreux dérivés comportant un système π (alcènes, alcynes, indoles, phénols).

<figure><img src="image_115.png" /><figcaption>Schéma 72</figcaption></figure>

Une courte note de l'auteur signale la possibilité de bromation en α de la fonction cétone. Deux exemples d'aldéhydes simples sont également notés.

<figure><img src="image_116.png" /><figcaption>Schéma 73</figcaption></figure>

Le principe repose sur l'énolisation des dérivés carbonylés du côté le plus substitué, suivie de la bromation de la forme énolique. Le mécanisme proposé est en accord avec une catalyse acide.

<footnote>(145) Armani, E.; Dossena, A.; Marchelli, R.; Casnati, G. *Tetrahedron* **1984**, *40*, 2035-2039.</footnote>
<figure><img src="image_117.png" /><figcaption>Schéma 74</figcaption></figure>

Disposant de ces deux seules données de la littérature sur la préparation des aldéhydes α-iodés et α-bromés, nous avons choisi d'étudier les deux méthodes décrites sur des substrats modèles porteurs de différentes protections utilisées en chimie des glucides afin de cerner la chimiosélectivité de chaque réaction (Schéma 75). Ce travail préliminaire a pour objectif de nous orienter vers les meilleurs substrats glucidiques à choisir pour atteindre les molécules cibles III, IV et V.

<figure><img src="image_118.png" /><figcaption>Schéma 75</figcaption></figure>

Cette étude prévoit la synthèse des aldéhydes **51** et **52**.

i) Les aldéhydes **51** ont été préparés par coupure oxydante de Malaprade des dérivés **53** ou **55**, eux-mêmes obtenus à partir de l'acide 9,10,16-trihydroxyhexadécanoïque **54**, disponible dans le commerce.
<figure><img src="image_119.png" /><figcaption>Schéma 76</figcaption></figure>

Les résultats expérimentaux concernant la préparation, puis la coupure des diols vicinaux des composés **53** et **55** sont rassemblés dans le Tableau 5.

<table><caption>Tableau 5</caption><thead><tr><th></th><th>Produits</th><th>Conditions</th><th>Rendement</th></tr></thead><tbody><tr><td>Préparation de l'ester <b>56</b></td><td><b>56</b></td><td>BF<sub>3</sub>-Et<sub>2</sub>O / MeOH / 15h/35°C</td><td>75%</td></tr><tr><td rowspan="3">Préparation des diols <b>55</b></td><td><b>55b</b></td><td>PivCl (1 éq.) / Pyridine / 0°C / 2h</td><td>89%</td></tr><tr><td><b>55c</b></td><td>TBDMSCl (1,1 éq.) / Et<sub>3</sub>N (1,1 éq.) / DMAP (0,5 éq.) / 12h / CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub></td><td>88%</td></tr><tr><td><b>55d</b></td><td>CIP(O)(OEt)<sub>2</sub> (1 éq.) / DMAP (0,5 éq.) / 12h / 0°C / pyridine</td><td>96%</td></tr><tr><td rowspan="2">Préparation des diols <b>53</b></td><td><b>53c</b></td><td>TBDMSCl (2 éq.) / Et<sub>3</sub>N (2,1 éq.) / DMAP (0,5 éq.) / 72h / CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub></td><td>80%</td></tr><tr><td><b>53d</b></td><td>CIP(O)(OEt)<sub>2</sub> (1 éq.) / DMAP (0,5 éq.) / 12h / 0°C / Pyridine</td><td>97%</td></tr><tr><td rowspan="2">Coupure de Malaprade des diols <b>53</b></td><td><b>51c</b></td><td>NaIO<sub>4</sub> (1,1 éq.) / NaHCO<sub>3</sub><sup>a</sup> / H<sub>2</sub>O / 3MeOH / 18h / 20°C</td><td>35%<sup>b</sup></td></tr><tr><td><b>51d</b></td><td>NaIO<sub>4</sub> (1,1 éq.) / NaHCO<sub>3</sub><sup>a</sup> / H<sub>2</sub>O / 3MeOH / 18h / 20°C</td><td>59%</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td rowspan="2">Coupure de<br>Malaprade des</td><td>51a</td><td>NaIO<sub>4</sub> (1,1 éq.) /<br>H<sub>2</sub>O / 3MeOH / 18h / 20°C</td><td>60%</td></tr><tr><td>51b</td><td>NaIO<sub>4</sub> (1,1 éq.) /<br>H<sub>2</sub>O / 3MeOH / 18h / 20°C</td><td>66%</td></tr><tr><td rowspan="2">diols 55</td><td>51c</td><td>NaIO<sub>4</sub> (1,1 éq.) /<br>H<sub>2</sub>O / 3MeOH / 18h / 20°C</td><td>53%</td></tr><tr><td>51d</td><td>NaIO<sub>4</sub> (1,1 éq.) /<br>H<sub>2</sub>O / 3MeOH / 18h / 20°C</td><td>69%</td></tr></table>

a NaHCO3 est ajouté solide jusqu'à pH=9

b 26% de 51a sont recueillis

L'acide 9,10,16-trihydroxyhexadécanoïque **54** est estérifié en ester de méthyle **56** par catalyse acide du complexe $BF_3$-éthérate. La protection chimiosélective de la fonction alcool primaire en présence du motif diol vicinal de **56** est facilement réalisée sous forme d'ester de pivaloyle (**55b**, 89%), d'éther de *tert*-butyldiméthylsilyle (**55c**, 88%) ou de phosphate de diéthyle (**55d**, 96%). Fort de l'efficacité des ces réactions de protection, il nous a paru intéressant de les tenter directement sur l'acide libre **54**, afin de développer un accès rapide aux aldéhydes **51**. L'utilisation d'un excès de triéthylamine permet de neutraliser l'acidité de la fonction acide carboxylique, qui n'interfère pas avec la protection de la fonction alcool primaire. L'excellent rendement en phosphate **53d** est à remarquer (97%).

La coupure de Malaprade a été réalisée soit sur les acides **53c-d**, soit sur les esters méthyliques **55a-d**. Dans le cas de l'acide carboxylique **53c**, l'addition d'hydrogénocarbonate de sodium jusqu'à pH 9 permet une coupure oxydante comparable à celle des esters en termes de vitesse et d'efficacité. En revanche, dans le cas de l'acide **53c**, un début de coupure de la fonction protectrice (OTBDMS) est observé. Le rendement de préparation en **51c** reste toutefois correct (35%) pour une transformation directe.

La coupure oxydante du motif diol des composés **55** libère le 7-formylheptanoate de méthyle **51e** de façon quantitative. La présence simultanée d'une fonction ester carboxylique et d'un motif aldéhyde rend cette structure très intéressante dans le cadre de la séquence halogénation / Perkow.
<figure><img src="image_120.png" /><figcaption>Schéma 77</figcaption></figure>

ii) L'aldéhyde **52** n'est pas décrit dans la littérature. Nous avons imaginé sa préparation par homologation d'un dialdose facilement accessible, le 1,2,3,4-di-*O*-isopropylidène-dialdo-*α*-D-galactopyranoside **57**. La méthode d'homologation envisagée fait appel aux acquis de l'équipe concernant la chimie des phosphonopeptides et des peptides vinylogues dérivés.¹⁴⁶,¹⁴⁷ Ainsi, la préparation et l'utilisation du phosphonoacétamide de Weinreb **58** en réaction d'Horner nous a paru constituer une méthode de choix pour synthétiser l'aldéhyde **52**.

<figure><img src="image_121.png" /><figcaption>Schéma 78</figcaption></figure>

Le réactif d'Horner **58** est disponible dans le commerce, mais il est également extrêmement coûteux (190 euros / 5g). Nous l'avons préparé par couplage peptidique, pour la première fois, entre la *N*,*O*-diméthylethylhydroxylamine et l'acide phosphonoacétique activé par le réactif de Castro, le BOP (hexafluorophosphate de benzotriazolyl N-oxytrisdiméthylaminophosphonium) (Schéma 79).¹⁴⁸ La

<footnote>(146) Grison, C.; Geneve, S.; Halbin, E.; Coutrot, P. *Tetrahedron* **2001**, *57*, 4903-4923.</footnote>

<footnote>(147) Grison, C.; Coutrot, P.; Geneve, S.; Didierjean, C.; Marraud, M. *J. Org. Chem.* **2005**, *70*, 10753-10764.</footnote>

<footnote>(148) Castro, B.; Dormoy, J. R.; Evin, G.; Selve, C. *Tetrahedron Lett.* **1975**, *1219-1222*.</footnote>
réaction est totale après 2 heures d'agitation à température ambiante. Cette méthode est de loin la meilleure ; elle évite la réaction laborieuse de Michaelis-Arbuzov (24h à 80°C) qui nécessite la préparation préalable du chloroacétamide de Weinreb (schéma 70). ¹⁴⁹

<figure><img src="image_122.png" /><figcaption>Schéma 80</figcaption></figure>

<figure><img src="image_123.png" /></figure>

Si l'acide phosphonoacétique est activé sous forme d'anhydride mixte, le couplage avec la N,O-diméthylhydroxylamine échoue totalement ; seul le phosphonoacétate de méthyle est obtenu.

<figure><img src="image_124.png" /><figcaption>Schéma 81</figcaption></figure>

La réaction d'Horner (Schéma 82) consiste à déprotoner le phosphonate **58** au diisopropylamidure de lithium à -78°C, puis à additionner le dialdose **57** sur l'anion lithié formé. La réaction d'oléfination est suivie en RMN <sup>31</sup>P. La comparaison des intensités entre les signaux des atomes de phosphore de l'anion lithié dérivé de **58** et du diéthylphosphate de lithium formé permet d'apprécier l'avancement de la réaction. L'analyse des données RMN <sup>1</sup>H des oléfines formées est intéressante : l'hydrogène vinylique le plus déblindé est H-7t, lorsque celui-ci est en position *cis* de la fonction carboxamide. Il se situe à 6,85 ppm. La différence de déplacement chimique entre les hydrogènes H-5 de chaque oléfine est encore plus spectaculaire : 1 ppm sépare H-5c de H-5t. Dans chaque cas, les effets importants de déblindage sont certainement imputables à la proximité spatiale de la liaison C=O du groupe carboxamide sur H-7t et H-5c.

<footnote>(149) Nuzillard, J. M.; Boumendjel, A.; Massiot, G. *Tetrahedron Lett.* **1989**, *30*, 3779-3780.</footnote>
<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>Figure 15</figcaption></figure>

La réaction est stéréosélective en faveur de l'oléfine *E* (73%). Ce résultat est en accord avec le comportement des anions phosphonates lithiés dérivés des phosphonopeptides soumis au même dialdose **57**.

<figure><img src="image_126.png" /><figcaption>Schéma 82</figcaption></figure>

L'amide α,β-éthylénique **59** obtenu est ensuite réduit successivement par hydrogénation catalytique, puis par $LiAlH_4$ à basse température. Cette dernière étape passe par la formation d'un
chélate intermédiaire à 5 centres, inerte vis-à-vis du réducteur qui par hydrolyse libère l'aldéhyde correspondant. L'aldéhyde brut **52** est obtenu très pur et ne nécessite aucune purification.

<figure><img src="image_127.png" /><figcaption>Schéma 83</figcaption></figure>

Les bons résultats obtenus à l'issue de cette séquence d'homologation d'un dialdose, nous ont encouragés à étudier le potentiel synthétique du procédé sur d'autres substrats glucidiques. Cette étude particulière fait l'objet d'un chapitre présenté en fin de mémoire (Partie 4).

Disposant des aldéhydes **51** et **52**, les deux réactions d'α-halogénation relevées dans la littérature, l'α-bromation préconisée par Marchelli et l'α-iodation décrite par Barluenga, ont été étudiées. Les résultats obtenus sont présentés dans le *Tableau 6*.¹⁴⁴,¹⁴⁵

<table><caption>Tableau 6</caption><thead><tr><th>Substrat aldéhydique</th><th>Système d'halogénation</th><th>Produit obtenu</th><th>Rdt%</th></tr></thead><tbody><tr><td>CH<sub>3</sub>CHO</td><td>t-BuBr / DMSO</td><td>CH<sub>3</sub>(CH<sub>2</sub>Br)<sub>2</sub>CHO</td><td>26</td></tr><tr><td>CH<sub>3</sub>CHO</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>CH<sub>3</sub>(CH<sub>2</sub>I)<sub>2</sub>CHO</td><td>100</td></tr><tr><td>HO-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-CHO</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>HO-CH<sub>2</sub>(CH<sub>2</sub>I)<sub>2</sub>CHO</td><td>97</td></tr><tr><td>PivO-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-CH<sub>2</sub>-CHO</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>PivO-CH<sub>2</sub>(CH<sub>2</sub>I)<sub>2</sub>CHO</td><td>98</td></tr></tbody></table>

<footnote>(144) Barluenga, J.; Martinez-Gallo, J. M.; Najera, C.; Yus, M. *Synthesis* **1986**, 678-680.</footnote>

<footnote>(145) Armani, E.; Dossena, A.; Marchelli, R.; Casnati, G. *Tetrahedron* **1984**, *40*, 2035-2039.</footnote>
<table><tr><td>TDMSO-<br/>51c<br/>[Image of 51c structure]</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>HO-<br/>64a<br/>[Image of 64a structure]</td><td>90</td></tr><tr><td>(EtO)<sub>2</sub>(O)PO-<br/>51d<br/>[Image of 51d structure]</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>(EtO)<sub>2</sub>(O)PO-<br/>64d<br/>[Image of 64d structure]</td><td>98</td></tr><tr><td>MeOOC-<br/>51e<br/>[Image of 51e structure]</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>MeOOC-<br/>64e<br/>[Image of 64e structure]</td><td>100</td></tr><tr><td>[Image of 52 structure]</td><td>HgCl<sub>2</sub> / I<sub>2</sub></td><td>[Image of 65 structure]</td><td>0</td></tr></table>

L'α-bromation de l'heptanal nécessite un chauffage prolongé à 65°C entraînant la formation d'un mélange d'aldéhydes mono et dibromé, respectivement 26 et 15%, ainsi qu'à un début de dégradation. Après distillation, l'aldéhyde **62** est obtenu avec un rendement médiocre de 26%. Suite à ces résultats peu concluants, ces conditions n'ont pas été testées sur les substrats aldéhydiques plus élaborés.

La méthode d'α-iodation paraît beaucoup plus intéressante. Après 2 heures d'agitation à 20°C, la réaction est totale et univoque : aucun produit secondaire ou diiodé n'est observé. Une simple purification par lavage au thiosulfate de sodium puis à l'iodure de potassium permet l'obtention des aldéhydes iodés purs. La réaction est quantitative avec les aldéhydes possédant un groupe hydroxyle ou un groupe protecteur de type Piv ou phosphate. La compatibilité entre fonctions aldéhyde et ester carboxylique de **51e** est également à remarquer. L'ester ne subit aucune réaction d'iodation concurrente. En revanche, le cas de l'éther silylé **51c** est révélateur des limites de la méthode. Le déblocage de la fonction éther est plus rapide que l'α-iodation. Ce résultat est la conséquence logique de la libération d'acide chlorhydrique lors de l'avancement de la réaction. Ce résultat est inéluctable. Néanmoins, l'α-iodation a été obtenue, mais avec un déblocage total de l'éther silylé. L'addition d'oxyde mercurique pour tamponner le milieu et protéger l'éther silylé ne permet plus l'énolisation de l'aldéhyde et donc l'α-iodation.

Enfin, nous avons testé la réaction avec le dialdose **52**. Bien que les protections cédal d'isopropylidène du D-galactose fassent partie des plus résistantes, une dégradation rapide du substrat glucidique est observée. A l'issue de ces essais d'iodation, la réaction de Perkow a été étudiée sur les aldéhydes iodés préparés.
bromé **62** et de l'aldéhyde iodé **64a**. Ces résultats sont en accord avec le modèle de Borowitz qui s'appuie sur un mécanisme d'addition sur le groupe carbonyle et une représentation de Cram pour expliquer la stéréosélectivité E dominante fréquemment observée lors de la réaction de Perkow.<sup>150</sup> Dans l'hypothèse d'une induction asymétrique de type [1,2] lors de la première étape, les trialkylphosphites approcheraient la face Si du carbonyle du côté de l'hydrogène dans un modèle où le squelette carboné linéaire serait antiparallèle à la liaison C=O :

<figure><img src="image_128.png" /><figcaption>Schéma 86</figcaption></figure>

La séquence iodation / Perkow est donc une stratégie de synthèse intéressante pour accéder aux phosphates d'énol dérivés d'aldéhydes. La compatibilité de la méthode avec des groupes protecteurs phosphates constitue une approche très directe à l'obtention des phosphates d'énol **68c** et **68d qui sont les formes protégées de la molécule cible IV**. La seule restriction est finalement l'accès à des structures fonctionnalisées par des groupes fonctionnels sensibles en milieu acide, incompatibles avec les conditions d'α-iodation. C'est pourquoi une nouvelle stratégie de synthèse a été envisagée, afin de s'affranchir de cette limitation (voie B).

### IV.2.2. Etude de la voie B : phosphorylation d'un énolate

D'un point de vue théorique, la phosphorylation d'un énolate peut être envisagée selon deux conceptions différentes étroitement liées à la façon de générer l'énolate :

- la première est l'*approche directe* : l'énolate est préparé par métallation du dérivé carbonylé précurseur, puis piégé dans son milieu de formation par un agent de phosphorylation adapté ;

- la seconde est l'*approche indirecte* : l'énolate est généré par hydroalumination d'un composé carbonylé α,β-éthylènique ; la seconde étape est la phosphorylation de l'énolate d'aluminium. Deux problèmes se posent alors : la préparation du dérivé carbonylé insaturé et la réactivité de l'énolate d'aluminium.

<footnote>(150) Borowitz, I. J.; Firstenberg, S.; Borowitz, G. B.; Schuessler, D. J. Am. Chem. Soc. **1972**, *94*, 1623-1628.</footnote>
Schéma 87

<figure><img src="image_129.png" /></figure>

Ces deux stratégies ont été étudiées successivement.

A/ *Approche directe* : métallation-phosphorylation

La réactivité régiocontrolée d'un carbanion énolate est un problème qui a été largement étudié. Si les réactions de C-alkylation sont fréquemment observées, la réaction du pôle oxygéné est favorisée par l'utilisation d'électrophiles durs, tels que les chlorosilanes. L'emploi des dérivés phosphochloridates est moins connu, mais pourtant très utile pour la construction de liens carbonés. Ce principe a été exploité par Nicolaou pour la fonctionnalisation de lactones et la préparation d'éthers macrocycliques.¹⁵¹

Schéma 88

<figure><img src="image_130.png" /></figure>

Les auteurs préconisent l'utilisation d'un chlorophosphate inhabituel, le chlorophosphate de diphényle. Il est préféré au chlorophosphate de diéthyle, car il peut être éliminé par un simple lavage à l'ammoniac et il conduit à un phosphate d'énol plus stable.

L'extension de ce schéma de synthèse à la préparation des phosphates d'énol dérivés de cétones et d'aldéhydes est délicate. Elle pose le problème immédiat de l'instabilité des énolates intermédiaires. Dans le cas des dérivés aldéhydiques, la tendance à la réaction d'auto-aldolisation

<footnote>(151) Nicolaou, K. C.; Shi, G. Q.; Gunzner, J. L.; Gaertner, P.; Yang, Z. *J. Am. Chem. Soc.* **1997**, *119*, 5467-5468.</footnote>
est redoutable. Pourtant un brevet récent fait état de cette possibilité.¹⁵² Il est exemplifié par la synthèse du vinylphosphate dérivé du phénylacétaldéhyde. La métallation est assurée par le DBU, suivie de l'addition de chlorophosphate de diphényle.

<figure><img src="image_131.png" /><figcaption>Schéma 89</figcaption></figure>

Les auteurs évoquent la possibilité d'utiliser d'autres bases telles que le LDA ou *t*-BuOK, mais aucun exemple n'est décrit.

Bien que cette approche nous paraisse délicate et incertaine, quelques essais exploratoires ont été réalisés. Deux aldéhydes modèles ont été testés : le phénylacétaldéhyde, décrit dans le brevet Pfizer (essais 1-4), et un aldéhyde moins énolisable, le butanal (essais 5-6). Les résultats obtenus sont regroupés sur le *Schéma 90*.

<figure><img src="image_132.png" /><figcaption>Schéma 90</figcaption></figure>

- Essais avec le phénylacétaldéhyde : La réaction décrite dans le brevet (essai 1) a été reproduite avec succès. En vue d'une extension à des substrats glucidiques, une purification

<footnote>(152) Miller, J. (Pfizer, Inc., USA; DSM N.V.). Process for preparing vinylaromatic compounds; Patent Application: US; N° 2002-171419-6608212; 20020604.; 12 pp.</footnote>
chromatographique a été tentée. Elle conduit à une dégradation totale du phosphate d'énol, quel que soit le support utilisé (SiO₂, Al₂O₃ neutre). L'essai 2 était évoqué dans le brevet, mais non décrit. Il a été réalisé par addition de l'aldéhyde sur le LDA, afin de limiter les risques d'aldolisation. Seuls 15% de phosphate d'énol attendus sont obtenus, accompagnés de nombreux produits difficilement identifiables. Les essais 3 et 4 avec LiHMDS et KHMDS ne sont pas meilleurs.

- Essais avec le butanal : l'essai 5 (KHMDS / (PhO)₂P(O)Cl) fournit un rendement médiocre en vinylphosphate souillé de formylphosphonate, résultant d'une C-phosphorylation partielle. Dans le cas du système DBU / (PhO)₂P(O)Cl (essai 6), un suivi par spectroscopie RMN confirme la formation partielle du phosphate d'énol espéré, mais celui-ci se dégrade totalement lors du traitement qui avait pourtant permis d'isoler le phosphate d'énol dérivé du phénylacétaldéhyde.

Devant ces résultats peu encourageants, la stratégie a été abandonnée.

## B/ Approche indirecte : hydroalumination-phosphorylation

Convaincus que l'étape limitante est la génération de l'énolate et non sa phosphorylation, nous avons essayé de concevoir la préparation de l'espèce énolique selon un schéma différent. Celui-ci est basé sur la réduction 1-4 d'un aldéhyde α,β-éthylénique par addition conjuguée d'hydrure. L'énolate formé peut alors être piégé par un phosphochloridate.

<figure><img src="image_133.png" /><figcaption>Schéma 91</figcaption></figure>

Selon ce schéma de synthèse, il est nécessaire de disposer d'une bonne méthode d'accès aux aldéhydes α,β-éthyléniques précurseurs. La méthode d'homologation proposée précédemment lors de la synthèse du dialdogalactose 52 permet d'envisager l'installation de l'insaturation aisément si l'on réduit régiosélectivement le carboxamide de Weinreb en présence de la double liaison éthylénique.
<figure><img src="image_134.png" /><figcaption>Schéma 92</figcaption></figure>

Cette séquence réactionnelle a été décrite sommairement par Massiot en 1989 sur des substrats simples.¹⁴⁹ Nous l'avons réétudiée en série glucidique sur deux substrats modèles : le dialdogalactose protégé **57** et le 2,3 ; 4,5-di-*O*-isopropylidène-D-arabinose **69**.

<figure><img src="image_135.png" /><figcaption>Schéma 93</figcaption></figure>

Toutefois, il convient de remarquer qu'une telle stratégie ne permet pas l'accès à la molécule cible **III**, puisqu'elle nécessiterait la préparation d'un aldéhyde α,β-éthylènique précurseur très particulier : un β-cétolaldéhyde chiral, dont la fonction cétonique serait protégée sous forme d'éther d'énol. Outre la difficulté d'accès à un tel substrat, pour atteindre **III**, il faudrait espérer une hydroalumination parfaitement stéréosélective en faveur du seul épimère L-érythro. Ces aspects n'ont donc pas été étudiés. Cependant, le projet global de synthèse d'accès à des phosphates d'énol dérivés de glucides modèles par hydroalumination, nous a semblé représenter un défi synthétique suffisamment intéressant en lui-même pour être étudié indépendamment de la motivation biologique d'accès à **III**.

<footnote>(149) Nuzillard, J. M.; Boumendjel, A.; Massiot, G. *Tetrahedron Lett.* **1989**, *30*, 3779-3780.</footnote>
<figure><img src="image_136.png" /><figcaption>Schéma 94</figcaption></figure>

i) Préparation des aldéhydes α,β-éthyléniques dérivés de 57 et 69

Notre premier travail a donc été la préparation des aldéhydes précurseurs 57 et 69.

- Le dialdogalactose 57 est synthétisé en deux étapes à partir du galactose.

<figure><img src="image_137.png" /><figcaption>Schéma 95</figcaption></figure>

Les fonctions hydroxyles secondaires sont bloquées sous forme de cétal d'isopropylidène. La protection est quantitative. L'alcool primaire est rapidement oxydé en aldéhyde 57 selon la méthode de Swern. Le dialdose 57 est donc facilement accessible, y compris sur des quantités importantes. Il est stable et peut donc être conservé plusieurs semaines à -15°C, sans décomposition notable. À ce double titre, il est un substrat de choix pour étudier une nouvelle réaction.

- La préparation de l'aldose 69 est plus lourde à mettre en œuvre. La structure configurationnelle du D-arabinose est telle qu'il est nécessaire d'ouvrir le cycle pyranique de D-arabinose avant de protéger les fonctions hydroxyles. Une méthode classique d'ouverture est la
formation d'un dithiocétal par addition d'éthanethiol en milieu acide, selon le protocole de Zinner, Rembarz et Klöcking.¹⁵³

<figure><img src="image_138.png" /><figcaption>Schéma 96</figcaption></figure>

Les hydroxyles 2, 3, 4 et 5 sont protégés sous forme d'acétals d'isopropylidène. L'acétalisation totale des fonctions alcools est assurée par une catalyse à l'acide sulfurique concentré dans l'acétone.

<figure><img src="image_139.png" /><figcaption>Schéma 97</figcaption></figure>

L'hydrolyse de la fonction dithiocétal a été décrite par Zinner, Rembarz et Klöcking.¹⁵³ Elle est réalisée par les auteurs selon le procédé classique de formation d'un thiolate de mercure à l'aide de HgCl₂. L'addition d'oxyde mercurique permet de maintenir la neutralité du milieu réactionnel, évitant ainsi l'hydrolyse des acétals.

<figure><img src="image_140.png" /><figcaption>Schéma 98</figcaption></figure>

<footnote>(153) Zinner, H.; Rembarz, G.; Klocking, H.-P. *Chem. Ber.* **1957**, *90*, 2688-2696.</footnote>
Une purification du brut réactionnel par « chromatoflash » conduit à l'aldéhyde **69** avec un très bon rendement.

## ii) Homologation des aldéhydes 57 et 69

La suite logique du travail est l'élongation du squelette carboné glucidique par un lien de type propénal. La partie éthylénique est élaborée par réaction de Wittig-Horner selon les conditions mises au point précédemment (Schéma 82 - p. 85). Les amides α,β-éthyléniques **67** et **69** sont réduits directement par $LiAlH_4$ à 0°C pour fournir respectivement les deux aldéhydes α,β-éthyléniques **71** et **73**. Les bons résultats obtenus illustrent l'intérêt de l'approche. Aucune réduction compétitive de la double liaison éthylénique n'est observée. L'aldéhyde, généré après hydrolyse, n'est pas non plus touché par le milieu réducteur utilisé. Il convient également de noter que la purification par chromatographie permet d'isoler un mélange d'oléfines **71** et **73** très enrichi en dérivé E.

<figure><img src="image_141.png" /><figcaption>Schéma 99</figcaption></figure>

## iii) Hydroalumination des aldéhydes 71 et 73

Disposant des deux aldéhydes α,β-éthyléniques **71** et **73**, leur hydroalumination a été étudiée.

La stratégie est basée sur les travaux pionniers de Tsuda qui a décrit l'alkylation et la silylation d'énolates d'aluminium générés par hydroalumination de composés carbonylés α,β-éthyléniques.¹⁵⁴

<footnote>(154) Tsuda, T.; Satomi, H.; Hayashi, T.; Saegusa, T. *J. Org. Chem.* **1987**, *52*, 439-443.</footnote>
<figure><img src="image_142.png" /><figcaption>Schéma 100</figcaption></figure>

En présence d'une quantité catalytique de méthylcuivre, le DiBAI dans le THF-HMPT libère un complexe de « CuH » qui favorise la réduction de la double liaison éthylénique seule. L'addition conjuguée de « CuH » génère ainsi un énolate d'aluminium intermédiaire, qui est suffisamment réactif pour réagir avec le chlorotriméthylsilane et fournir l'éther d'énol silylé correspondant. En revanche, vis-à-vis des dérivés halogénés, il est indispensable de transformer l'énolate d'aluminium en « ate » complexe par addition de méthyllithium pour espérer une réaction d'alkylation. Le principe de cette séquence réactionnelle a fait l'objet d'une étude complète avec les énones ; comme souvent, un seul exemple est décrit en série aldéhydique et conduit à un rendement très moyen d'alkylation (47%).

<figure><img src="image_143.png" /><figcaption>Schéma 101</figcaption></figure>

Notre projet de synthèse de phosphates d'énol à squelette glucidique nous a conduits à considérer cette possibilité avec beaucoup d'attention, car elle comporte l'avantage principal
d'utiliser des conditions réactionnelles compatibles avec les groupements protecteurs de type O-isopropylidène, contrairement à la méthode iodation / Perkow (voie A).

Dans une première étape, les aldéhydes α,β-éthyléniques **70** et **73** ont été soumis au système DIBAL / MeCu / THF-HMPT à -50°C. Après 1h, le suivi réactionnel par ccm laisse supposer la formation des énolates d'aluminium. Par souci d'efficacité, ces derniers ont été directement transformés en « ates » complexes d'aluminium et de lithium, espèces plus réactives, par addition de 1,1 équivalents de MeLi à -50°C. Après 15 min, le chlorophosphate de diéthyle est ajouté à -50°C. Le mélange réactionnel est agité 2 heures à -50°C, puis ramené très lentement à température ambiante en une nuit.

Un traitement adapté à la fragilité des phosphates d'énol préparés a été mis en œuvre :

- concentration du milieu réactionnel dans le but d'éliminer le THF ;

- reprise à l'éther ;

- centrifugation de la suspension afin d'éliminer les sels de cuivre et d'aluminium ;

- évaporation du surnageant ;

- reprise au dichlorométhane ;

- lavage rapide à l'eau pour éliminer les sels de lithium ;

- chromatographie « flash » sur SiO₂ (en 20 minutes) pour éliminer le chlorophosphate de diéthyle résiduel.

Dans ces conditions, 35% des phosphates d'énol attendus sont obtenus avec un bon degré de pureté, évalué en RMN à plus de 90%.

<figure><img src="image_144.png" /><figcaption>Schéma 102</figcaption></figure>

Il est ainsi possible d'isoler pour la première fois des phosphates d'énol dérivés d'aldéhyde en présence de fonctions cétals.
Bien que ces rendements paraissent modestes, ils correspondent à un rendement global qui est la résultante de trois étapes successives : addition conjuguée de « CuH », transformation d'un énolate d'aluminium en « ate » complexe, phosphorylation de ce dernier. De plus, l'examen des produits secondaires est intéressant : seuls les aldéhydes saturés dérivés de **71** et **73** ont été isolés. Cette observation témoigne du bon déroulement de la réduction régiosélective des aldéhydes α,β-éthyléniques. L'étape de phosphorylation est probablement l'étape limitante du procédé, mais qui paraît pouvoir être optimisée.

### IV.3. Synthèse de la molécule cible V

La synthèse de l'heptanediol 1,7-diphosphate V a été envisagée selon deux procédés :

- le *premier* est la diphosphorylation directe de l'heptanediol ;

- le *second* est l'hydrogénation du phosphate d'énol IV.

#### IV.3.1. Diphosphorylation de l'heptanediol

L'heptanediol, composé commercial, est mis en réaction avec 4 équivalents de chlorophosphate de diéthyle dans la pyridine en présence d'une quantité catalytique de DMAP. Après 16 heures d'agitation, la diphosphorylation est totale. Une purification chromatographique rapide permet de séparer le diphosphate V de l'agent phosphorylant excédentaire. Le rendement de la réaction est de 90% en produit isolé pur.

<figure><img src="image_145.png" /><figcaption>Schéma 103</figcaption></figure>
IV.3.2. Hydrogénation du phosphate d'énol IV

Les alcanediols n'étant pas tous disponibles dans le commerce ou relativement coûteux, nous avons exploré rapidement la possibilité d'accès aux diphosphates par réduction du phosphate d'énol IV, afin de proposer une alternative possible à la diphosphorylation directe d'un alcanediol.

L'hydrogénation catalytique du dérivé IV est facilement réalisée dans le méthanol sous 2 bars d'hydrogène. Elle donne quantitativement le diphosphate V après 12 h de réaction. La présence des deux groupes phosphates n'altère pas l'activité du palladium.

<figure><img src="image_146.png" /><figcaption>Schéma 104</figcaption></figure>
# V- Conclusion

Dans cette première partie, quatre molécules pouvant se comporter comme des inhibiteurs de la KDO8PS ont été préparées :

- le diphosphate chiral *I*', analogue proche de la molécule ciblée initialement *I*.

L'élongation du squelette carboné d'un ribose judicieusement protégé a été réussie et nous a permis d'approcher la molécule recherchée *I*. Cependant, les contraintes stériques imposées par les protections des fonctions hydroxyles couramment utilisées en chimie glucidique n'ont pas permis de réaliser la désoxygénation de la position 6.

La fragilité inhabituelle du groupe TBDMS a été mise à profit pour préparer le diphosphate chiral *I*' par une procédure rapide en 7 étapes.

<figure><img src="image_147.png" /><figcaption>Schéma 105</figcaption></figure>

- l'aminophosphate chiral **49b** précurseur immédiat de **II**.

La synthèse du composé **II** était motivée par la vérification d'une hypothèse mécanistique proposée récemment par Baasov. La simple suppression d'un motif carboxylique et d'un groupe hydroxy par rapport à la structure décrite, a complètement remis en cause la stratégie de synthèse proposée par l'auteur. Parmi les différentes approches étudiées, la substitution du triflate glucidique
**38** par l'aminométhylphosphonate de diéthyle **39** s'est révélée la plus fructueuse (voie D). Malheureusement, l'aminophosphate chiral **49b** précurseur immédiat de **II** s'est montré très fragile, excluant toute phosphorylation et étude biologique.

<figure><img src="image_148.png" /><figcaption>Schéma 106</figcaption></figure>

En revanche, ce travail a été l'occasion de développer l'accès à de nouvelles structures osidiques de configuration L-érythro, série peu étudiée, ainsi qu'un nouvel accès facile et efficace à l'aminométhylphosphonate de diéthyle **39**, compatible avec sa fragilité et sa grande polarité.

- *le phosphate d'énol IV.*

La recherche d'un schéma d'accès aux structures **III** et **IV** a nécessité la mise au point des premières méthodes de synthèse générale de phosphates d'énol dérivés d'aldéhyde.

<figure><img src="image_149.png" /><figcaption>Schéma 107</figcaption></figure>
i. La première repose sur la séquence iodation / Perkow (Voie A).

Directe et efficace, elle est compatible avec les groupes fonctionnels qui ne sont pas trop sensibles en milieu acide (esters carboxylique, phosphorique ; alcool). Cette voie a permis un accès rapide et efficace à la molécule cible **IV** sous forme de phosphates de tétraméthyle (68c) et de tétraéthyle (68d). Malheureusement, la méthode n'est pas transposable à la préparation du phosphate d'énol **III**.

ii. La seconde est basée sur l'hydroalumination d'un aldéhyde α,β-éthylénique (Voie B).

Elle constitue une alternative intéressante à la précédente pour la formation de phosphates d'énol construits sur des squelettes carbonés porteurs de groupes protecteurs fragiles en milieu acide, tels que les cétals d'isopropylidène, mais ne paraît pas pouvoir conduire facilement à **III** en raison de la difficulté d'accès au β-cétoaldéhyde précurseur.

- le diphosphate V.

Deux méthodes simples mais efficaces ont permis l'accès au diphosphate V : la diphosphorylation du diol correspondant et l'hydrogénation catalytique du phosphate d'énol IV.

<figure><img src="image_150.png" /><figcaption>Schéma 108</figcaption></figure>
# DEUXIEME PARTIE

## Synthèse

### d'inhibiteurs de la DAH7PS
# I - Introduction

Comme nous l'avons vu en introduction à ce mémoire, la DAH7PS est également une phosphoénolpyruvate lyase bactérienne très attrayante comme cible thérapeutique, au même titre que la KDO8PS. Ces deux enzymes présentent de nombreuses similitudes structurales et mécanistiques. Il est ainsi probable que des inhibiteurs conçus pour la KDO8PS interfère avec la DAHP7PS et réciproquement. Profitant de l'expérience acquise lors de la synthèse des phosphates d'énol **IV** et **V**, nous ciblons à présent l'accès à des dérivés homologues **VI** et **VII**, inhibiteurs possibles de la DAH7PS, ainsi que la forme déprotégée de **VII'**, **VII**.

<figure><img src="image_151.png" /><figcaption>Figure 16</figcaption></figure>

Le deuxième objectif est l'optimisation des résultats acquis antérieurement par l'équipe en séries phosphoénolpyruvique et hydroxyphosphonique. Sur la base des considérations mécanistiques développées en introduction, les dérivés **VIII** et **IX**, qui sont les dérivés phosphatés en position terminale de **H**<sub>e</sub> et **P**<sub>e</sub>, sont recherchés, car la phosphorylation de **H**<sub>e</sub> et **P**<sub>e</sub> n'a pas été jusqu'à présent réalisée.

<figure><img src="image_152.png" /><figcaption>Figure 17</figcaption></figure>
# II - Synthèse du phosphate d'énol VI

<figure><img src="image_153.png" /><figcaption>Figure 18</figcaption></figure>

## II.1. Introduction

Pour préparer le phosphate d'énol VI, nous avons choisi d'utiliser l'hexanediol comme substrat de départ, dans la mesure où contrairement à son homologue à sept carbones, il est peu coûteux. La synthèse passe alors par une fonctionnalisation sélective des deux hydroxyles. Pour cela, il est possible d'employer un jeu de protections-déprotections classique de la chimie des glucides.

Au vu des bons résultats obtenus lors de la synthèse des composés **68c** et **68d** par la séquence iodation / Perkow de l'aldéhyde phosphate **51d**, nous avons choisi d'utiliser le groupe phosphate comme groupe protecteur d'un hydroxyle.

Ainsi, l'hexanediol va être monophosphorylé, l'hydroxyle libre de **76** oxydé en aldéhyde, puis l'aldéhyde phosphate **77** ainsi obtenu soumis à la séquence iodation / Perkow mise au point précédemment.

<figure><img src="image_154.png" /><figcaption>Schéma 109</figcaption></figure>

## II.2. Résultats et discussion

Dès la première étape, nous avons donc introduit le premier groupe phosphate en tentant la monophosphorylation de l'hexanediol. La méthode classique, mettant en réaction du chlorophosphate de diéthyle, une quantité catalytique de DMAP et le diol dans la pyridine est
appliquée. Comme on pouvait l'attendre, l'hexanediol non consommé, les produits de mono et diphosphosphorylation sont obtenus en mélange.

Le diol est facilement éliminé par un lavage aqueux de la phase organique.

La phosphorylation, habituellement décrite avec un excès d'agent diphosphorylant conduit inévitablement à un mélange de mono et diphosphate. Avec un équivalent strict de $(EtO)_2P(O)Cl$, la monophosphorylation est favorisée (76 / 79 = 75 / 25), mais la lenteur de la réaction explique le faible rendement de 26% en composé **76** isolé pur.

Toutefois, la séparation des composés mono et diphosphorylé **76** et **79** par chromatographie ne pose pas de problème majeur. Compte tenu du faible coût des matières premières, la réaction n'a pas été optimisée.

<figure><img src="image_155.png" /><figcaption>Schéma 110</figcaption></figure>

L'oxydation ménagée de l'alcool phosphate **76** est ensuite réalisée selon les conditions de Swern. Pour cela, une solution de diméthylsulfoxyde est ajoutée à -55 °C à une solution de chlorure d'oxalyle dans le dichlorométhane sous courant d'azote. L'alcool est ajouté goutte à goutte à -55°C. Après 15 minutes, la solution est réchauffée à -30 °C et la triéthylamine est additionnée. Le mélange est ramené à température ambiante et traité. L'aldéhyde **77** est isolé avec un rendement satisfaisant de 60% après purification.
<figure><img src="image_156.png" /><figcaption>Schéma 111</figcaption></figure>

L'iodation de l'aldéhyde phosphate **77** est réalisée dans les conditions désormais classiques 1,5 éq. HgCl₂ / I₂ / CH₂Cl₂ à 20°C. La réaction conduit à 80% d'aldéhyde **78** α-iodé pur qui est directement engagé en réaction de Perkow. L'addition de triméthylphosphite conduit alors quantitativement au phosphate d'énol **VI**, isolé pur, sous forme d'un mélange d'isomères éthyléniques E/Z proche de 50/50.

<figure><img src="image_157.png" /><figcaption>Schéma 112</figcaption></figure>
# III - Synthèse de l'hexane-1,6-diphosphate VII

## III.1. Résultats

À ce stade, la préparation de l'hexane 1,6-diphosphate de tétraéthyle **VII** est réalisée aisément par mise en réaction de l'hexanediol avec un large excès de diéthylchlorophosphate (4 équivalents) dans les conditions décrites au paragraphe précédent. La réaction est univoque et totale. La seule difficulté est la séparation par chromatographie de l'agent phosphorylant excédentaire du diphosphate formé. 91% d'hexane-1,6-diphosphate **VII** sont obtenus purs.

<figure><img src="image_158.png" /><figcaption>Schéma 113</figcaption></figure>

## III.2. Déprotection de la molécule cible VII

La préparation et l'évaluation biologique du diphosphate **VII** a pour but d'éprouver notre concept de structure diphosphorylée, indispensable à une bonne reconnaissance vis-à-vis d'une phosphoénolpyruvate lyase. En revanche, sa structure dépourvue d'hydroxyle en fait une molécule peu hydrophile et donc peu soluble dans l'eau. Sa solubilité en milieu aqueux a été estimée à ~0,3g/mL. Dans de telles circonstances, la réalisation de tests biologiques peut être facilitée par la solubilisation dans un mélange eau / DMSO. Cependant, ce manque global d'hydrophilie peut être un obstacle à une bonne pénétration de la bactérie, surtout s'il s'agit d'une bactérie Gram-négative dont la partie saccharidique des LPS est naturellement polaire. C'est pourquoi, le déblocage des motifs éthyle du groupe phosphate a fait l'objet d'une étude particulière.
La méthode la plus performante et la plus douce pour réaliser le déblocage d'un ester phosphonique ou phosphorique est la séquence silylation / solvolyse. Elle a été décrite initialement par McKenna, qui a préparé les diacides phosphoniques par silylation des phosphonates de diéthyle.¹⁵⁵

<figure><img src="image_159.png" /><figcaption>Schéma 114</figcaption></figure>

Le diester silylé est ensuite décomposé en diacide par méthanolyse. Ce traitement permet de s'affranchir de l'utilisation d'eau qui complique les purifications ultérieures. L'excès de méthanol et le triméthylméthoxysilane sont éliminés par évaporation sous pression réduite.

<figure><img src="image_160.png" /><figcaption>Schéma 115</figcaption></figure>

<footnote>(155) McKenna, C. E.; Higa, M. T.; Cheung, N. H.; McKenna, M. C. *Tetrahedron Lett.* **1977**, 155-158.</footnote>
Cette méthode a été largement exploitée par notre équipe pour réaliser les déprotections finales d'inhibiteurs enzymatiques phosphorylés qu'ils soient de type phosphonate ou phosphate. Ainsi par exemple, la méthode a été mise à profit pour réaliser le déblocage de l'hydroxyphosphonate de diéthyle précurseur de $H_a$ ou du phosphoénolpyruvate précurseur de $P_e$.

<figure><img src="image_161.png" /><figcaption>Schéma 117</figcaption></figure>

<figure><img src="image_162.png" /></figure>

Lors de l'étude de ces réactions de silylation, un suivi par RMN $^{31}$P a toujours révélé la formation rapide de l'ester monosilylé intermédiaire, puis l'évolution lente de ce dernier vers l'ester disilylé. Ces observations laissent supposer une régiosélectivité possible de la silylation, pouvant dans notre cas se limiter aux seuls groupes éthyle si l'on sait ajuster les conditions réactionnelles de la silylation. Compte tenu de la simplicité de la méthode, il nous a semblé intéressant de la tenter.

<figure><img src="image_163.png" /><figcaption>Schéma 118</figcaption></figure>
Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous :

<table><caption>Tableau 9</caption><thead><tr><th></th><th>Conditions</th><th>Résultats</th></tr></thead><tbody><tr><td>i)</td><td>2,2 Me<sub>3</sub>SiBr / CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub> / 6h / 30°C</td><td rowspan="2">50% de 1,6-dibromohexane +<br>nombreux phosphates</td></tr><tr><td>ii)</td><td>MeOH / 12h / 30°C</td></tr><tr><td>i)</td><td>4,4 Me<sub>3</sub>SiBr / CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub> / 6h / 30°C</td><td rowspan="2">56% de 1,6-dibromohexane +<br>nombreux phosphates</td></tr><tr><td>ii)</td><td>MeOH / 12h / 30°C</td></tr></tbody></table>

Les différents essais conduisent tous à un mélange très complexe de produits phosphorylés. L'analyse RMN fournit une information importante : du 1,6-dibromohexane est clairement identifié et est formé majoritairement, ce qui traduit une coupure préférentielle du groupe hexylidène lors de la silylation, dans des proportions supérieures même au seul facteur probabilité (1/3). La régiosélectivité n'est donc pas en faveur des groupes éthoxy.

<figure><img src="image_164.png" /><figcaption>Schéma 119</figcaption></figure>

Des essais sur l'heptane 1,7-diphosphate VI conduisent aux mêmes conclusions. 67% de 1,7-dibromoheptane sont obtenus avec 4,4 équivalents de bromotriméthylsilane.

Devant ces essais peu concluants, nous avons recherché une méthode de déprotection plus sélective.
### III.3. Deuxième approche de synthèse de VII'

Une méthode générale d'accès aux phosphates de monoalkyle consiste à phosphoryler un alcool avec POCl₃, suivi d'une hydrolyse sélective de l'intermédiaire monosubstitué ainsi formé.

La formation du dichlorophosphate est aisément réalisée avec les alcools primaires et les phénols.
En revanche, l'hydrolyse sélective du dichlorophosphate peut être délicate à maîtriser.

<figure><img src="image_165.png" /><figcaption>Schéma 120</figcaption></figure>

- L'hydrolyse basique classique se révèle non sélective. Les conditions basiques provoquent en effet la formation d'un mélange de diacide phosphorique, d'acide orthophosphorique et d'anhydride phosphorique, issu vraisemblablement de la présence simultanée de l'intermédiaire dichloré et de l'acide phosphorique.

- Cramer et Winter ont développé en 1959 la synthèse d'acides phosphoriques libres via l'hydrolyse en présence de ROP(O)Cl₂ par un mélange eau / acétonitrile, en présence d'oxyde d'argent.¹⁵⁶ Ces deux auteurs revendiquent de très bons rendements en acides phosphoriques libres purs.

- En 1992, Modro a repris les travaux de Cramer et Winter et a montré par RMN ³¹P que l'hydrolyse en présence d'Ag₂O n'est pas sélective.¹⁵⁷ En remplaçant l'oxyde d'argent par AgNO₃, Modro parvient à effectuer cette fois une hydrolyse entièrement sélective et quantitative, l'acide nitrique pouvant être éliminé sous pression réduite.

<figure><img src="image_166.png" /><figcaption>Schéma 121</figcaption></figure>

<footnote>(156) Cramer, F.; Winter, M. *Chem. Ber.* **1959**, *92*, 2761-2767.</footnote>

<footnote>(157) Modro, A. M.; Modro, T. A. *Org. Prep. Proced. Int.* **1992**, *24*, 57-60.</footnote>
Cette méthode particulièrement performante a été appliquée à la synthèse du dérivé **VII'**.

<figure><img src="image_167.png" /><figcaption>Schéma 122</figcaption></figure>

Le degré d'avancement de la phosphorylation de l'hexanediol est apprécié par $RMN^{31}P$. En général, la perte d'un chlore sur l'atome de phosphore génère un blindage de 2 ppm. Il est ainsi très facile de suivre la disparition de $P(O)Cl_3$ et la formation du chlorure d'acide diphosphorique intermédiaire. La réaction est totale après 4 heures à 0°C, puis une nuit d'agitation à température ambiante.

<figure><img src="image_168.png" /><figcaption>Figure 19</figcaption></figure>

L'hydrolyse est réalisée dans un mélange eau / acétonitrile en présence de 4 équivalents de nitrate d'argent. Le mélange est agité entre 0 et 5°C, puis gardé au congélateur durant la nuit pour favoriser la précipitation d'AgCl. De l'éthanol est ajouté après concentration du milieu réactionnel pour compléter la précipitation des sels d'argent. Cette étape a été réalisée avec le plus grand soin, afin de s'affranchir totalement des sels d'argent qui pourraient interférer avec les tests biologiques. En effet, les vertus bactériostatiques de l'ion argent sont connues et utilisées depuis longtemps !

La formation du composé **VII'** est quantitative.
# IV - Synthèse de l'hydroxyphosphonate VIII

## IV.1. Stratégie de synthèse

L'expérience acquise durant la synthèse des hydroxyphosphonates de type $H_e$ en série arabinose nous permet d'envisager une synthèse efficace de l'inhibiteur VIII.

<figure><img src="image_169.png" /><figcaption>Figure 20</figcaption></figure>

Une méthode simple et directe pour leur préparation est la phosphonométhylation par voie organolithienne de l'α-cétoester correspondant.

<figure><img src="image_170.png" /><figcaption>Schéma 123</figcaption></figure>

Cette conception est d'autant plus naturelle, que des travaux antérieurs du laboratoire ont montré qu'il était possible, à partir d'un dérivé carbonylé, d'introduire un motif α-cétoester, par le biais d'une réaction de Darzens utilisant des carbanions énolates dérivés de dihalogénoacétates d'alkyle.<sup>158-160</sup>

<footnote>(158) Coutrot, P.; Grison, C.; Tabyaoui, M. *Tetrahedron Lett.* **1993**, *34*, 5089-5092.</footnote>

<footnote>(159) Coutrot, P.; Grison, C.; Coutrot, F. *Synlett* **1998**, 393-395.</footnote>

<footnote>(160) Coutrot, P.; Grison, C.; Tabyaoui, M.; Czernecki, S.; Valery, J. M. *J. Chem. Soc., Chem. Commun.* **1988**, 1515-1516.</footnote>
La méthode procède en deux étapes :

1) Formation d'un ester glycidique α-halogéné :

<figure><img src="image_171.png" /><figcaption>Schéma 124</figcaption></figure>

2) Transformation de l'ester glycidique α-halogéné en α-cétoester β-iodé par un acide de Lewis, avec échange d'halogène.161-163 Un traitement au bisulfite de sodium permet de réduire la liaison C-I.

<figure><img src="image_172.png" /><figcaption>Schéma 125</figcaption></figure>

L'accès à l'inhibiteur VIII peut donc être conçu selon le schéma rétro-synthétique suivant :

<figure><img src="image_173.png" /><figcaption>Figure 21</figcaption></figure>

<footnote>(161) Coutrot, P.; Legris, C. *Synthesis* **1975**, *118-120*.</footnote>

<footnote>(162) Tabyaoui, M. Thèse d'Université, Henry Poincaré - Nancy 1, 1993.</footnote>

<footnote>(163) Coutrot, P.; Combret, J. C.; Villieras, J. *Tetrahedron Lett.* **1971**, *1553-1556*.</footnote>
L'inhibiteur potentiel **VIII** protégé doit donc être accessible à partir de l'α-cétoester **82** dérivé du D-arabinose. L'α-cétoester nécessaire à cette transformation peut être obtenu à partir de l'ester glycidique α-chloré **83**. Ce dernier est préparé par une réaction de Darzens entre la forme ouverte et bloquée de l'arabinose protégé **84** et le carbanion énolate issu d'un dichloroacétate d'alkyle.

## IV.2. Synthèse de l'ester glycidique α-chloré d'isopropyle 83

Il est obtenu par réaction de l'énolate potassique dérivé du dichloroacétate d'isopropyle sur l'aldéhyde **84** selon des conditions mises au point par notre équipe.¹⁵⁸⁻¹⁶⁰

L'énolate potassique est préparé en présence du dérivé aldéhydique par action de l'alcoolate de potassium sur le dichloroacétate d'alkyle en milieu alcoolique.

La nature du couple ROK/ROH influe nettement sur le déroulement de la réaction. La nature protique du solvant permet de stabiliser l'alcoolate intermédiaire par liaison hydrogène et de déplacer l'équilibre d'aldolisation vers la formation de l'ester glycidique α-chloré.

<figure><img src="image_174.png" /><figcaption>Schéma 126</figcaption></figure>

Cette stabilisation par solvatation ne doit pas être excessive, afin de ne pas trop ralentir l'étape de cyclisation ultérieure. Le meilleur compromis entre déplacement d'équilibre par solvatation et réactivité suffisante de l'alcoolate gem-dihalogéné est réalisé par addition d'un cosolvant, l'éther, dont le volume est ajusté en fonction de la nature de l'alcool.

Avec l'isopropanol, les conditions optimales sont obtenues avec deux équivalents d'alcoolate de potassium dans le couple éther / alcool (87 / 13) pour un équivalent d'aldéhyde.

<footnote>(158) Coutrot, P.; Grison, C.; Tabyaoui, M. *Tetrahedron Lett.* **1993**, *34*, 5089-5092.</footnote>

<footnote>(159) Coutrot, P.; Grison, C.; Coutrot, F. *Synlett* **1998**, 393-395.</footnote>

<footnote>(160) Coutrot, P.; Grison, C.; Tabyaoui, M.; Czernecki, S.; Valery, J. M. *J. Chem. Soc., Chem. Commun.* **1988**, 1515-1516.</footnote>
<figure><img src="image_175.png" /><figcaption>Schéma 127</figcaption></figure>

L'ester glycidique α-chloré d'isopropyle **83** a été obtenu avec un rendement très satisfaisant de 89% après chromatographie.

## IV.3. Synthèse de l'α-cétoester d'isopropyle 82

Le passage à l'α-cétoester **82** est une étape délicate de la synthèse. Bien que l'action du diiodure de magnésium sur un ester glycidique soit une réaction très douce, le dérivé époxydique **83** est fragile et se dégrade facilement dans le milieu réactionnel. Il est donc important de respecter des conditions opératoires strictes et adaptées à la fragilité particulière de la série arabinose. Ainsi, en ajustant la quantité de toluène (toluène/Et₂O : 1/4) et la température du milieu réactionnel (addition à -60°C, 2h d'agitation à -30°C), il est possible de trouver un compromis intéressant entre réactivité de MgI₂ et non-dégradation de **83**.¹⁶¹,¹⁶⁴,¹⁶⁵

<figure><img src="image_176.png" /><figcaption>Schéma 128</figcaption></figure>

Dans ces conditions, **82** est obtenu avec un bon rendement après chromatographie (76%).

<footnote>(161) Coutrot, P.; Legris, C. *Synthesis* **1975**, *118-120*.</footnote>

<footnote>(164) Grison, C.; Petek, S.; Finance, C.; Coutrot, P. *Carbohydr. Res.* **2005**, *340*, 529-537.</footnote>

<footnote>(165) Grison, C.; Petek, S.; Coutrot, P. *Synlett* **2005**, 331-333.</footnote>
## IV.4. Synthèse de l'α-hydroxy-β-phosphonoester 81

Le composé **81** peut être obtenu par réaction entre le carbanion lithié dérivé du méthylphosphonate de diéthyle **85** et l' α-cétoester **82**.

Le carbanion **85** est ajouté sur l'α-cétoester **82** à -78°C. Après 90 min d'agitation à cette température, le milieu réactionnel a été neutralisé à l'aide d'une solution d'HCl dans l'éther. Cette neutralisation douce du milieu réactionnel permet d'éviter la dégradation de l'alcool formé. Le seul produit secondaire observé est le pyruvate de départ issu d'une énolisation partielle dans le milieu réactionnel.

<figure><img src="image_177.png" /><figcaption>Schéma 129</figcaption></figure>

## IV.5. Déblocage de l'hydroxyphosphonate 81

La particularité de l'hydroxyphosphonate **81** est la fragilité inhabituelle de la fonction ester carboxylique. C'est pourquoi le déblocage partiel de **81** a été réalisé dans le but de conserver la fonction ester phosphonique protégée, afin d'assurer un rapport hydrophilie / hydrophobie nécessaire à une bonne pénétration des bactéries.

Selon les conditions mises au point par notre équipe, le composé **81** a été soumis à l'action d'acide bromhydrique généré par addition de 0,5 équivalent de bromotriméthylsilane dans le méthanol.166 Après 15h d'agitation à température ambiante, le dérivé Hₐ est obtenu quantitativement.

<footnote>(166) Coutrot, P.; Dumarcay, S.; Finance, C.; Tabyaoui, M.; Tabyaoui, B.; Grison, C. *Bioorg. Med. Chem. Lett.* **1999**, *9*, 949-952.</footnote>
<figure><img src="image_178.png" /><figcaption>Schéma 130</figcaption></figure>

## IV.6. Monophosphorylation de $H_e$

La monophosphorylation de $H_e$ a été effectuée par l'action de 2 équivalents de diéthylchlorophosphate activé par 2 équivalents de DMAP dans la pyridine.

<figure><img src="image_179.png" /><figcaption>Schéma 131</figcaption></figure>

Après 48h à 30°C, concentration et acidification du milieu réactionnel par une solution éthérée saturée en acide chlorhydrique gazeux, le produit brut est repris par un mélange éther / chloroforme permettant d'entraîner l'excès de diéthylchlorophosphate et de DMAP. La purification de **VIII** est parfaite par une chromatographie sur silice à l'aide d'un éluant adapté ($CH_2Cl_2 / EtOH : 8/2$). Le rendement en produit pur est estimé à 36%.

Ce résultat est facilement optimisable par l'utilisation d'un agent phosphorylant plus réactif (dérivé de P (III)) et des conditions de purification mieux adaptées à la structure très polaire de **VIII** (HPLC en phase inverse ou résine échangeuse d'ions). Malheureusement, nous n'avons pas pu en disposer.
Les signaux observés dans le spectre RMN ³¹P sont caractéristiques de la structure
diphosphorylée et permettent de repérer les deux épimères formés. L'épimère majoritaire présente
deux signaux RMN : le premier à 27,18 ppm se situe dans la région classique des phosphonates. Le
second à 0,33 ppm correspond au groupe phosphate introduit. L'épimère minoritaire présente le
même système : un signal à 26,32 ppm pour l'atome de phosphore du motif phosphonate et un
signal à -0.96 ppm pour l'atome de phosphore du groupe phosphate de diéthyle.

V - Synthèse du phosphoénolpyruvate IX

V.I. Stratégie de synthèse

De même que pour la synthèse de la molécule **VIII**, la préparation
de **IX** est en partie issue de l'expérience acquise par l'équipe à
propos des travaux concernant son précurseur direct **Pe**. La synthèse
de **VIII** a donc été reproduite et optimisée jusqu'à **Pe** ; l'étape de
phosphorylation finale est, en revanche, l'étape nouvelle du schéma
synthétique.

<figure><img src="image_180.png" /><figcaption>Figure 22</figcaption></figure>

Le phosphoénolpyruvate IX, comme son nom l'indique, est un phosphate d'énol. Une méthode
simple et décrite pour la préparation des phosphates d'énol est la réaction de Perkow.¹⁶⁷

<figure><img src="image_181.png" /><figcaption>Schéma 132</figcaption></figure>

Si l'on considère la molécule cible IX, on note que celle-ci possède la fonction phosphate d'énol, mais avec une fonction acide carboxylique supplémentaire sur la double liaison. Ainsi,

<footnote>(167) Perkow, W. *Chem. Ber.* **1954**, *87*, 755-758.</footnote>
l'aménagement de ce groupe fonctionnel a été réalisé en étudiant la transposition de la réaction de Perkow au cas d'un α-cétoester-β-halogéné, point clé de la stratégie.¹⁶⁸

L'α-cétoester-β-iodé dérivé du D-arabinose décrit au paragraphe précédent est un très bon substrat pour cette réaction.

C'est pourquoi le schéma rétrosynthétique conduisant au phosphoénolpyruvate IX peut être décomposé en trois étapes :

- adaptation de la réaction de Perkow à l' α-cétoester-β-iodé dérivé du D-arabinose **86** ;

- synthèse de l'α-cétoester-β-iodé **86** à partir de l'ester glycidique α-chloré **83** ;

- préparation de l'ester glycidique α-chloré **83** à partir de l'aldose protégé.

<figure><img src="image_182.png" /><figcaption>Schéma 133</figcaption></figure>

Lors de la réalisation de cette suite de réactions, deux étapes ont été particulièrement étudiées. Il s'agit :

- de la préparation de l'α-cétoester-β-iodé **86** à partir de l'ester glycidique α-chloré **83**. En effet, l'α-cétoester-β-iodé n'a pas été préparé selon ce procédé dans les travaux précédents. Il n'a pas non plus été isolé et purifié ;

- de l'étape ultime de phosphorylation du phosphoénolpyruvate $P_e$ où tout était à découvrir.

## V.2. Synthèse de l'α-cétoester-β-iodé **86**

L'ester glycidique **83**, dont nous avons décrit la synthèse précédemment, a été transformé en α-cétoester-β-iodé **86** par action du diiodure de magnésium, dans l'éther à reflux pendant 2h. Le milieu réactionnel a ensuite été hydrolysé (sans hydrogénosulfite de sodium). Après un traitement classique (extraction, séchage, évaporation) le brut a été analysé par spectroscopie RMN et IR.

<footnote>(168) Lichtenthaler, F. W. *Chem. Rev.* **1961**, *61*, 607-649.</footnote>
L'α-cétoester-β-iodé 86 obtenu est très pur et exclusivement sous forme cétonique. Aucune trace d'énol n'est détectée. Il a été engagé directement dans la réaction de Perkow, sans purification.

<figure><img src="image_183.png" /><figcaption>Schéma 134</figcaption></figure>

## V.3. Synthèse du phosphoénolpyruvate 87 par la réaction de Perkow

Le principe de la préparation du phosphoénolpyruvate 87 repose sur la réaction de Perkow entre un trialkylphosphite et un α-cétoester-β-iodé.

<figure><img src="image_184.png" /><figcaption>Schéma 135</figcaption></figure>

Si cette réaction a été largement étudiée dans le cas des cétones α-halogénées aliphatiques ou aromatiques, notre équipe a décrit pour la première fois la généralisation de cette réaction aux halogénocétoesters,¹⁶⁴ si l'on excepte le cas particulier du bromopyruvate d'éthyle. Les contours de la réaction sont maintenant bien maîtrisés. L'essentiel des résultats obtenus en série glucidique est schématisé ci-après.

<footnote>(164) Grison, C.; Petek, S.; Finance, C.; Coutrot, P. *Carbohydr. Res.* **2005**, *340*, 529-537.</footnote>
<figure><img src="image_185.png" /><figcaption>Schéma 136</figcaption></figure>

Une étude systématique de la réaction a permis de dégager deux grandes stratégies de préparation des phosphénolpyruvates glucidiques.

La première consiste à faire réagir le triméthylphosphite sur un α-halogénopyruvate ; ce dernier peut être bromé, iodé, isolé ou non. L'halogénopyruvate peut être préparé par la voie désormais classique des dihalogénures de magnésium ou in situ par isomérisation thermique de l'ester glycidique assistée de pyridine (voies B, C et D).

La seconde est une réaction nouvelle. Il s'agit de l'installation directe du motif phosphoénolpyruvique par réaction directe du triméthylphosphite sur un ester glycidique α-bromé, sans passer par l'intermédiaire halogénopyruvique. Cette séquence totalement originale est à remarquer, puisqu'elle permet d'atteindre en deux étapes un « phosphénolpyruvate glucidique » à partir d'un aldose. Elle est cependant moins générale que la première et est limitée aux glucides les plus réactifs (formes furanique ou linéaire) (voie A).

Nous nous sommes proposé de réaliser la synthèse du phosphoénolpyruvate **87** à l'aide de la méthode ménageant le plus de chances de succès, c'est-à-dire la voie β-iodo-α-cétoester / Perkow qui se déroule à température ambiante en quelques minutes et qui limite au maximum les risques de dégradation des réactifs.
Le triméthylphosphite a été additionné sur l'α-cétoester-β-iodé **86** dilué dans l'éther. La réaction est terminée après 15 min d'agitation.

<figure><img src="image_186.png" /><figcaption>Schéma 137</figcaption></figure>

Le rendement obtenu en produit purifié sur les deux étapes préparation de **86** / réaction de Perkow est de 38%. Les isomères éthyléniques ont été obtenus dans un rapport de 88 / 12 en faveur de l'oléfine E.

## V.4. Déblocage du phosphoénolpyruvate **87**

Le déblocage du phosphoénolpyruvate **87** a été réalisé jusqu'ici en une étape grâce à la réaction tandem silylation-méthanolyse permettant le déblocage simultané du groupe phosphate et des acétals. Contrairement à l'hydroxyphosphonate **81**, l'ester d'isopropyle n'est pas touché dans ces conditions.

<figure><img src="image_187.png" /><figcaption>Schéma 138</figcaption></figure>
La réaction de silylation est réalisée avec 4 éq. de $Me_3SiBr$ dans le dichloroéthane pendant 6h à température ambiante. Comme attendu, l'addition de bromotriméthylsilane engendre la silylation du motif phosphate. Une méthanolyle est ensuite réalisée par une agitation pendant 15h dans le méthanol. L'addition de méthanol entraîne le déblocage des acétals d'isopropylidène. Il est vraisemblable que cette réaction est due à la libération d'acide bromhydrique lors de l'addition du méthanol sur le milieu réactionnel, excédentaire en $Me_3SiBr$.

<figure><img src="image_188.png" /><figcaption>Schéma 139</figcaption></figure>

Le produit obtenu est purifié par reprise au chloroforme afin de solubiliser les impuretés organiques moins polaires que les produits débloqués, puis analysé en RMN $^1$H, $^{31}$P et $^{13}$C. La réaction est quantitative et **pour la première fois, le produit obtenu est pur en RMN**. Nous avons attribué ce résultat à un suivi très soigné de la réaction de silylation par RMN$^{31}$P, permettant d'éviter toute dégradation du substrat. Ce résultat est une amélioration significative des conditions de synthèse développées dans l'équipe, car la purification du composé $P_e$ est très délicate. Nos conditions permettent de se limiter à une purification sommaire par reprise au chloroforme.

## V.5. Tentative de phosphorylation du phosphoénolpyruvate $P_e$

Le phosphoénolpyruvate $P_e$ a été traité par le diéthylchlorophosphate comme agent phosphorylant. 2 équivalents de DMAP ont été utilisés comme agent activant dans la pyridine. Après 56 heures d'agitation à 30°C, la RMN $^{31}$P du produit brut montre que la phosphorylation souhaitée n'a pas eu lieu. Le phosphoénolpyruvate a évolué en une structure nouvelle non phosphorylée qui n'a pas pu être identifiée. Nous pouvons cependant affirmer que les signaux observés ne sont pas compatibles avec une structure pyruvique ou sa forme énolique, qui aurait pu constituer une évolution possible du groupe phosphoénolpyruvique.