# Etude et développement d'une microbalance à quartz pour la réalisation d'un immunocapteur. Application à la détection d'antigènes en milieu liquide.

Karine Bizet

► To cite this version:

Karine Bizet. Etude et développement d'une microbalance à quartz pour la réalisation d'un immunocapteur. Application à la détection d'antigènes en milieu liquide. Biotechnologies. Université Paris V, 1997. Français. NNT: 1997PA05CD09. tel-04157143

HAL Id: tel-04157143

https://theses.hal.science/tel-04157143

Submitted on 10 Jul 2023

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PARIS V

Spécialité : Biotechnologie

Option : Anticorps et récepteurs cellulaires pour immunoanalyse et ciblage

Présentée par

Karine BIZET

Pour obtenir le grade de Docteur de l'Université Paris V

Sujet de la thèse :

Etude et développement d'une microbalance à quartz pour la
réalisation d'un immunocapteur

Application à la détection d'antigènes en milieu liquide

Soutenue le 18 décembre 1997, devant le jury composé de :

<table><tr><td>Monsieur Jacques INGRAND</td><td>Président</td></tr><tr><td>Madame Nicole JAFFREZIC</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Monsieur Jean Louis MARTY</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Monsieur Claude GABRIELLI</td><td>Directeur de thèse</td></tr><tr><td>Monsieur Patrice BINDER</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>Monsieur Pierre COULET</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>Monsieur Hubert PERROT</td><td>Examineur</td></tr></table>
Remerciements

Je tiens tout d'abord à exprimer ma sincère reconnaissance aux membres du jury qui ont accepté de consacrer du temps à l'examen de ce travail.

Je remercie Madame Nicole Jaffrezic-Renault, Directeur de recherche à l'Ecole Centrale de Lyon et Monsieur Jean-Louis Marty, Professeur à l'Université de Perpignan, d'avoir bien voulu rapporter sur ce mémoire et participer au jury de ma thèse.

Mes remerciements vont aussi à Messieurs Jacques Ingrand, Professeur à l'Université Paris V, Pierre Coulet, Professeur à l'Université de Lyon I et Patrice Binder, Médecin Colonel à la DSP, qui me font l'honneur de participer au jury de ma thèse.

Ce travail a été effectué au Laboratoire de Physique des Liquides et Electrochimie (UPR 15 du CNRS) en collaboration avec le Laboratoire des Biotechnologies du Centre d'Etudes du Bouchet. J'exprime mes remerciements à Monsieur Michel Froment ainsi qu'à Monsieur Michel Keddam qui lui a succédé à la direction de l'UPR 15 pour m'avoir accueillie dans leur laboratoire.

Mes remerciements vont aussi à Monsieur Claude Eon, Directeur du Centre d'Etudes du Bouchet, pour m'avoir permis d'effectuer une partie de mon travail de recherche dans son établissement et à Messieurs Lucien Coppet, Sous-Directeur scientifique, Gérard Trouiller, Chef du département Biologie et Jean-Louis Gouasdoué, Chef du service d'évaluation du matériel de défense biologique pour m'avoir accueillie au sein de leurs équipes.

Que la DRET soit remerciée du soutien financier qu'elle a apporté à ce travail.

J'exprime toute ma gratitude à Monsieur Claude Gabrielli, Directeur de recherche à l'UPR 15, pour m'avoir intégrée dans son équipe ainsi que pour avoir suivi et dirigé mes recherches.

J'exprime particulièrement ma reconnaissance et mon amitié à Monsieur Hubert Perrot, Chargé de recherche à l'UPR 15, qui a assuré la co-direction de cette thèse pour son aide et la patience dont il a fait preuve pendant l'encadrement de ce travail. L'enthousiasme et l'intérêt qu'il a toujours manifesté pour le sujet ont été des atouts majeurs pour entretenir ma motivation et pour mener à bien ce travail.
Ce travail de thèse n'aurait pas pu être réalisé sans le soutien et l'aide de Monsieur Joël Therasse, Responsable du Laboratoire des Biotechnologies du Centre d'Etudes du Bouchet qui a initié le sujet. Je le remercie sincèrement pour m'avoir accueillie au sein de son laboratoire ainsi que pour avoir suivi et orienté rigoureusement mon travail.

Je tiens à adresser toute ma sympathie et ma reconnaissance à Monsieur Jean-Pierre Toqué pour l'aide constante qu'il m'a apportée concernant la réalisation technique de ce travail, mais aussi et surtout pour la bienveillance et la disponibilité dont il a fait preuve pendant mon séjour à l'UPR 15.

Je remercie d'une manière générale les membres du Laboratoire de Physique des Liquides et Electrochimie, notamment les membres du secrétariat et de l'atelier ainsi que plus particulièrement :

- Messieurs L. Beaunier et S. Borensztajn pour les observations réalisées par microscopie électronique à balayage ;

- Madame C. Henry de Villeneuve et Monsieur P. Allongue pour les observations réalisées par AFM et par STM ;

- et Madame I. Choquet pour son travail de relecture de ce manuscrit.

Que Mesdames Chantal Broustal et Bernadette Montigny, Mesdemoiselles Patricia Sylvestre et Béatrice Elouard et Monsieur Joël Pastre, membres du Laboratoire des Biotechnologies du Centre d'Etudes du Bouchet soient remerciés pour m'avoir accueillie avec bienveillance au laboratoire et pour la disponibilité dont ils ont toujours fait preuve pendant mon séjour au CEB. Que les personnes qui m'ont aidée dans la réalisation de ce travail trouvent ici l'expression de ma sincère reconnaissance.

J'exprime ma sympathie aux thésards, stagiaires en tout genre et amis rencontrés au CEB ainsi qu'à l'UPR 15 pendant ces années, notamment à Guy Patra, Jacques Faberon, Stéphan Borenzstajn ainsi qu'à Corinne Le Pape.

Je remercie sincèrement Ursula Vincent et Roberta Collino pour leur aide, leurs conseils, leurs discussions... Qu'elles sachent combien leur amitié m'est essentielle !

Je tiens enfin à remercier ma famille et mes amis qui m'ont aidée et encouragée durant mes années d'études, en particulier mes parents, ma soeur et Olivier Aude.

Ce manuscrit est dédié à mon grand-père.
# Sommaire

## Introduction 6

## Chapitre I : les biocapteurs 10

### Introduction 11

1. Définition 11

2. Généralités 12

2. 1. Historique 12

2. 2. Intérêts et domaines d'application 13

2. 3. Classification 14

2. 4. Critères d'évaluation et problèmes à résoudre 16

3. Les transducteurs 17

3. 1. Transduction électrochimique 17

3. 1. 1. Transduction potentiométrique 17

3. 1. 2. Transduction ampérométrique 18

3. 1. 3. Transduction conductimétrique et impédancemétrique 19

3. 2. Transduction optique 20

3. 3. Transduction piézoélectrique 21

4. La couche bioréceptrice 22

4. 1. Les biorécepteurs 22

4. 2. Les techniques d'immobilisation 23

4. 2. 1. L'adsorption 24

4. 2. 2. Greffage covalent 25

4. 2. 3. L'inclusion 26

4. 2. 4. Techniques d'assemblage en multicouches 26

4. 3. L'interaction antigène / anticorps 27

4. 3. 1. Rappels d'immunologie 27

4. 2. 2. Les techniques immunoanalytiques classiques 33

5. Etat de l'art des immunocapteurs piézoélectriques 36

### Conclusion 38
# Chapitre II : Les transducteurs piézoélectriques - aspects théoriques

39

## Introduction

40

## 1. Les transducteurs piézoélectriques

40

### 1. 1. Généralités sur le quartz

40

1. 1. 1. Structure et propriétés du quartz α

41

1. 1. 2. L'effet piézoélectrique

42

1. 1. 3. Les différentes coupes de quartz et effet de la température

43

### 1. 2. Les différents dispositifs piézoélectriques

45

1. 2. 1. TSM

45

1. 2. 2. SAW

47

1. 2. 3. APM

48

## 2. Principe de la microbalance à quartz

49

2. 1. L'équation de Sauerbrey

49

2. 2. Comparaison des sensibilités massiques des différents transducteurs piézoélectriques

54

2. 3. Comportement d'une microbalance à quartz en milieu liquide

55

2. 2. 1. Influence du liquide

55

2. 2. 2. Influence combinée du liquide et d'un dépôt

57

## 3. Etude du mécanisme de transduction de la microbalance à quartz par des mesures d'admittance électroacoustique

58

3. 1. Introduction

58

3. 2. Définitions et intérêt de la mesure de l'admittance électroacoustique

58

3. 3. Théorie

59

## 4. Modélisation du fonctionnement du résonateur à quartz

62

4. 1. Introduction

62

4. 2. Rappels généraux

62

4. 3. Modélisation

64

4. 3. 1. Cas d'un matériau non piézoélectrique

64

4. 3. 2. Cas d'un résonateur à quartz ou d'un matériau piézoélectrique seul

65

4. 3. 3. Cas d'un résonateur à quartz chargé

66

4. 3. 4. Cas de la microbalance à quartz avec un dépôt et en milieu liquide

67

4. 4. Simulation du fonctionnement de la microbalance à quartz

69

4. 4. 1. Généralités

69

4. 4. 2. Influence du coefficient de cisaillement élastique du film sur la réponse du résonateur

70

4. 4. 3. Influence de la viscosité du film sur la réponse du résonateur

71

4. 5. Conclusion

73

## Conclusion

73
# Chapitre III : Mise au point et caractérisation du dispositif piézoélectrique

74

## Introduction

75

1. La microbalance à quartz

75

1. 1. Augmentation de la sensibilité

75

1. 1. 1. But et principe

75

1. 1. 2. Caractéristiques des quartz

76

1. 1. 3. Les oscillateurs

78

1. 2. Les montages expérimentaux réalisés

79

1. 2. 1. Montage sur plaquette

79

1. 2. 2. La cellule à jet immergé

80

1. 2. 3. La cellule miniature

82

1. 3. Le logiciel "multimes"

83

1. 4. Etude de la stabilité et du bruit de fond de la fréquence d'oscillation

84

1. 4. 1. Influence de la température

84

1. 4. 2. Influence de la circulation des solutions

89

1. 4. 3. Influence de la nature des solutions

92

2. La mesure couplée de la fréquence de la microbalance à quartz et de l'admittance électroacoustique

95

2. 1. Rappels et but

95

2. 2. Mise au point du dispositif de mesure

96

2. 3. Mise au point de la mesure

97

3. Etudes préliminaires - analyse de la réponse du transducteur piézoélectrique

100

3. 1. Expériences réalisées avec la microbalance à quartz

100

3. 1. 1. Calibration par dépôt électrochimique de cuivre

100

3. 1. 2. Mesure de l'adsorption de protéines

104

3. 2. Mesures couplées pendant l'adsorption de protéines

111

## Conclusion

114

# Chapitre IV : Elaboration et caractérisation de la couche immunosensible

115

## Introduction

116

1. Immobilisation des anticorps sur les électrodes en or de la microbalance à quartz

116

1. 1. Choix du couple antigène/anticorps

116

1. 2. Les différentes techniques d'immobilisation utilisées

117

1. 2. 1. Greffage covalent

117
<table><tbody><tr><td>1. 2. 2. Adsorption</td><td>122</td></tr><tr><td>2. Contrôle de l'immobilisation</td><td>123</td></tr><tr><td>2. 1. Mesure de l'activité peroxydasique</td><td>123</td></tr><tr><td>2. 2. Techniques d'imagerie</td><td>125</td></tr><tr><td>3. Résultats</td><td>126</td></tr><tr><td>3. 1. Mesure de l'activité peroxydasique</td><td>126</td></tr><tr><td>3. 1. 1. Comparaison de la quantité de peroxydase mesurée pour les différentes méthodes d'immobilisation</td><td>126</td></tr><tr><td>3. 1. 2. Choix de la concentration optimale en anticorps</td><td>128</td></tr><tr><td>3. 1. 3. Influence de l'hydrophobicité de la surface des électrodes</td><td>129</td></tr><tr><td>3. 2. Etude de la surface des électrodes immunosensibilisées par les techniques d'imagerie</td><td>130</td></tr><tr><td>4. Etude de l'influence du flux de la solution de peroxydase et de la vibration des quartz sur l'interaction antigène/anticorps</td><td>133</td></tr><tr><td>4. 1. But</td><td>133</td></tr><tr><td>4. 2. Matériel et méthodes</td><td>133</td></tr><tr><td>4. 2. 1. Préparation des quartz et mesure de la quantité de peroxydase</td><td>133</td></tr><tr><td>4. 2. 2. Système sans flux et sans vibration</td><td>134</td></tr><tr><td>4. 2. 3. Système avec flux et sans vibration</td><td>134</td></tr><tr><td>4. 2. 4. Système avec flux et avec vibrations</td><td>134</td></tr><tr><td>4. 3. Résultats</td><td>135</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>137</td></tr></tbody></table>

## Chapitre V : Détection spécifique d'antigènes en milieu liquide à l'aide de la microbalance à quartz

<table><tbody><tr><td>Introduction</td><td>140</td></tr><tr><td>1. Détection de la peroxydase</td><td>140</td></tr><tr><td>1. 1. But</td><td>140</td></tr><tr><td>1. 2. Matériel et méthodes</td><td>140</td></tr><tr><td>1. 3. Résultats</td><td>142</td></tr><tr><td>1. 3. 1. Evaluation de la spécificité</td><td>142</td></tr><tr><td>1. 3. 2. Réponse de la microbalance à quartz à l'antigène</td><td>143</td></tr><tr><td>2. Détection d'immunoglobulines G</td><td>147</td></tr><tr><td>2. 1. But</td><td>147</td></tr><tr><td>2. 2. Matériel et méthodes</td><td>147</td></tr><tr><td>2. 3. Résultats</td><td>148</td></tr><tr><td>2. 3. 1. Evaluation de la spécificité</td><td>148</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>2. 3. 2. Réponse de la microbalance à quartz à l'antigène</td><td>149</td></tr><tr><td>3. Détection de la SEB</td><td>152</td></tr><tr><td>3. 1. But</td><td>152</td></tr><tr><td>3. 2. Matériel et méthodes</td><td>152</td></tr><tr><td>3. 3. Résultats</td><td>152</td></tr><tr><td>3. 3. 1. Evaluation de la spécificité</td><td>152</td></tr><tr><td>3. 3. 2. Réponse de la microbalance à quartz à l'antigène</td><td>155</td></tr><tr><td>Conclusion et discussion</td><td>157</td></tr></table>

Conclusion 160

Références bibliographiques 164

Annexes 172
Introduction
Un grand nombre d'interactions moléculaires sont mises en jeu pour assurer le bon fonctionnement des organismes vivants. Les réactions enzyme/substrat, récepteur/ligand, antigène/anticorps... participent aux fonctions métaboliques vitales de ces organismes, contrôlent leur développement et assurent leur défense dans leur environnement. Ces réactions, bien connues car très étudiées par les biologistes, sont mises à profit par les biotechnologistes qui utilisent ce "savoir faire" du monde vivant.

Dans le domaine des biocapteurs, les composants biologiques capables de se lier spécifiquement avec une molécule cible sont utilisés pour constituer une couche bioréceptrice à la surface d'un transducteur qui assure la conversion de l'interaction moléculaire en un signal physique. La réponse d'un biocapteur est relative à la présence de l'analyte à détecter et peut être reliée à sa concentration dans l'échantillon.

Le développement des biocapteurs est lié à l'émergence de besoins nouveaux dans des secteurs économiquement importants où la détection spécifique et rapide de molécules ou de micro-organismes est un problème crucial. Les biocapteurs fournissent une réponse non différée et ce sans manipulation délicate de l'échantillon à analyser. Nous avons donc décidé de développer un biocapteur pour répondre à ces besoins analytiques.

Les activités de recherche liées au développement des biocapteurs sont en pleine expansion depuis ces dix dernières années car elles bénéficient du transfert de technologie des disciplines de la microtechnologie et des biotechnologies. Néanmoins, l'obtention d'une couche réceptrice fonctionnelle sur une surface transductrice et la maîtrise du mécanisme de transduction, en terme de sensibilité et de stabilité, sont difficiles à combiner. Nous avons donc focalisé notre étude sur ces deux points dans le but de concevoir et d'étudier un immunocapteur reposant sur une mesure de masse.

Nous avons choisi d'utiliser, parmi les différents transducteurs existants, un dispositif piézoélectrique basé sur une microbalance à quartz, en association avec une couche d'anticorps, pour mesurer les variations de masse consécutives à la fixation spécifique des antigènes à détecter. En effet, la microbalance à quartz, constituée d'une pastille de quartz pourvue d'électrodes métalliques, vibre à une certaine fréquence, proche de sa fréquence dite de résonance, entretenue par une électronique appropriée : le tout constitue un oscillateur à quartz qui peut fonctionner même en milieu liquide. Grâce aux propriétés piézoélectriques du cristal de quartz, les variations de la fréquence d'oscillation sont proportionnelles aux variations de masse ayant lieu au niveau de l'une des électrodes métalliques. Le principe de transduction des biocapteurs basés sur une microbalance à quartz repose sur cette propriété. La sensibilité massique de ces dispositifs augmentant avec le carré de la fréquence de
résonance des cristaux, nous pouvons accroître cette sensibilité en utilisant des quartz ayant une fréquence de résonance plus élevée. Ce paramètre est toutefois limité par l'épaisseur du quartz qui le contrôle : plus sa fréquence de résonance est élevée, plus le quartz est mince et donc plus fragile.

Le problème majeur lié au développement des biocapteurs en général, et notamment à la microbalance à quartz, concerne les quantités très faibles à détecter qui mettent souvent en défaut la sensibilité de ces différents dispositifs. C'est dans ce cadre que nous avons choisi une voie nouvelle pour concevoir une microbalance à quartz de haute sensibilité, notre objectif étant de pouvoir réaliser directement l'immunodétection spécifique et rapide de différents antigènes solubles à l'aide de ce nouveau transducteur.

La compréhension du mécanisme de transduction est primordiale. Que mesure réellement le transducteur pendant l'interaction des deux partenaires ? Il est important de se poser cette question lors de la mise au point d'un biocapteur pour s'assurer de la spécificité du signal mesuré. Comme nous l'avons vu, la microbalance à quartz est sensible à la masse, mais elle est également sensible à la température, aux propriétés physico-chimiques des solutions avec lesquelles elle est en contact et aux propriétés viscoélastiques de la couche déposée à sa surface. Une étude approfondie de la réponse de ce transducteur dans nos conditions d'utilisation s'avérait essentielle. Nous avons donc mis au point une méthodologie d'analyse et de mesure, basée sur l'admittance électroacoustique, pour étudier le mécanisme de transduction du résonateur à quartz en milieu liquide recouvert d'une couche de protéines.

L'élaboration de la couche d'anticorps est une étape primordiale dans le développement d'un immunocapteur puisque la qualité de cette couche va conditionner la réponse du capteur en terme de spécificité, de sensibilité et de reproductibilité. Pour l'élaboration de cette couche, nous avons examiné différentes techniques d'immobilisation des immunoglobulines du couple antigène/anticorps modèle que nous avons choisi en comparant les résultats en terme d'immunoréactivité mesurée au niveau de la surface de l'électrode. De plus, différentes techniques d'imagerie ont été mises à profit afin de caractériser la couche d'immunoglobulines formée. En outre, nous avons étudié l'influence de la vibration des quartz sur l'interaction antigène/anticorps.

Enfin, nous avons utilisé "notre" microbalance à quartz pour l'immunodétection en milieu liquide d'antigènes de poids moléculaires différents. Dans chaque cas, des contrôles concernant la spécificité de la mesure et de la réaction antigène/anticorps ont été effectués.

Le premier chapitre de ce manuscrit fera l'état de l'art des biocapteurs aujourd'hui. Nous aborderons ensuite l'étude théorique des transducteurs piézoélectriques. Nous décrirons
dans les deux chapitres qui suivront, le travail que nous avons réalisé d'une part, pour mettre
au point et caractériser notre dispositif expérimental et d'autre part, pour élaborer et
caractériser la couche immunosensible. Enfin, nous montrerons dans un dernier chapitre, la
faisabilité de l'immunodétection directe, spécifique, en temps réel et en milieu liquide, à l'aide
de la microbalance à quartz développée. Trois exemples concernant la détection de la
peroxydase, d'immunoglobulines G et de l'entérotoxine B de Staphylocoque seront présentés.
# Chapitre I

## LES BIOCAPTEURS
# INTRODUCTION

Ce premier chapitre est une introduction aux biocapteurs où après avoir donné quelques définitions et généralités, nous présenterons plus en détail les deux entités qui composent les biocapteurs. Après avoir fait un inventaire des différents transducteurs et de leur principe de transduction, nous aborderons la couche bioréceptrice. Nous présenterons les différentes techniques d'immobilisation des composants biologiques sur la surface d'un transducteur. Nous rappellerons ensuite quelques notions d'immunologie, l'interaction antigène/anticorps étant à la base même du fonctionnement de notre biocapteur. Après avoir rappelé le principe des techniques immunoanalytiques classiques, nous présenterons alors un état de l'art des immunocapteurs piézoélectriques.

## 1. DEFINITION

Un biocapteur peut être défini comme un dispositif constitué de l'association d'une couche bioréceptrice spécifique (molécules biologiques capables d'interaction moléculaire spécifique) et d'un transducteur qui convertit l'interaction moléculaire en un signal physique, généralement électrique, facilement exploitable (Coulet, 1991).

La réponse d'un biocapteur est relative à la présence de l'analyte à détecter et doit être correlable à sa concentration dans l'échantillon. Il faut noter que le terme "bio" de biocapteur caractérise la couche réceptrice et non pas l'analyte à détecter.

Différents composants biologiques doués de fonction de liaison spécifique peuvent être utilisés pour élaborer la couche réceptrice et différents systèmes de transduction peuvent être retenus comme le présente la figure 1.

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1 : Représentation schématique d'un biocapteur</figcaption></figure>
## 2. GENERALITES

### 2. 1. Historique

Les premiers travaux concernant la mise au point d'un biocapteur peuvent être attribués à Clark et Lyons (Clark et Lyons, 1962) qui utilisèrent l'électrode à oxygène de Clark pour la détection du glucose. La glucose oxydase retenue sur l'électrode permettait la détection ampérométrique spécifique du glucose. Le premier capteur électrochimique à enzyme pour la détection du glucose voyait le jour grâce à la glucose oxydase qui, encore aujourd'hui, est l'enzyme de référence pour ce type de détection. Les travaux qui suivirent concernèrent l'amélioration des techniques d'immobilisation des enzymes sur les électrodes. Par la suite, Guilbault et Montalvo (Guilbault et Montalvo, 1969) présentèrent le premier capteur potentiométrique pour la détection de l'urée.

Depuis les années 1970, une centaine d'enzymes ont été utilisées en association avec une détection électrochimique et parallèlement d'autres types de biorécepteurs, en particulier des immunoglobulines, ont été utilisés en association avec d'autres transducteurs. Ainsi en 1975 le premier immunocapteur à fibre optique est conçu (Kronick et Little, 1975). C'est en 1972 que Shons (Shons et al., 1972) utilise pour la première fois un transducteur piézoélectrique constitué d'une microbalance à quartz revêtue d'antigènes pour détecter les anticorps correspondants. Depuis un grand nombre d'immunocapteurs ont été décrits notamment depuis l'avènement des anticorps monoclonaux.

Plus récemment, des bicouches lipidiques, déposées sur un transducteur, incorporant des protéines de transport ou des récepteurs cellulaires ont été utilisées comme élément sensible (Kiefer et al., 1991) ; ainsi que des acides nucléiques (Caruso et al., 1997; Su et al., 1997).
## 2.2. Intérêts et domaines d'application

Les biocapteurs permettent une détection spécifique rapide et directe, dans les meilleurs cas, de l'analyte à détecter par le biais de la conversion par le transducteur, en quasi temps réel, de l'interaction moléculaire en signal électrique.

Les intérêts de l'utilisation des biocapteurs dépendent du domaine d'application, mais les deux avantages principaux sont la rapidité de l'analyse et la simplicité.

En effet, les étapes de séparation de l'analyte libre de l'analyte lié ne sont pas nécessaires puisque la réponse du biocapteur est spécifique de la partie liée sur la couche biosensible du transducteur, quel que soit le type de transduction. C'est cette caractéristique qui minimise le temps de l'analyse par rapport aux autres techniques analytiques et en particulier par rapport aux techniques immunoenzymatiques (comme l'ELISA) où les temps d'incubations sont longs et les étapes de lavages et de révélations sont nécessaires. Typiquement la réponse d'un biocapteur est donnée en quelques minutes contre plusieurs heures pour les techniques classiques. De plus, ces dispositifs peuvent être miniaturisés et peuvent être utilisés sur le "terrain" : l'analyse est réalisée sur le lieu même où l'échantillon est prélevé, celui-ci ne risque donc pas de se détériorer pendant un transport jusqu'au laboratoire d'analyse. Ce gain de temps supplémentaire est primordial quand il faut faire face, rapidement, à un événement critique.

D'autre part, l'utilisation d'un biocapteur ne requiert pas la manipulation de produits dangereux comme des molécules marquées par des isotopes radioactifs.

De plus, certains dispositifs permettent de visualiser la cinétique de l'interaction couche sensible / molécule cible en continu et en temps réel. Ceci permet d'étudier les interactions protéines/protéines (antigènes/anticorps, ligands/récepteurs), protéines/acides nucléiques, acide nucléiques/acides nucléiques... Ces dispositifs, plus destinés au domaine de la recherche, reposent sur une transduction optique et sont commercialisés, entre autre, par les sociétés BIAcore AB (BIAcore) et Affinity Sensors (IASYS).

Les secteurs concernés par l'utilisation des biocapteurs sont variés et quelques exemples typiques sont donnés dans la liste qui suit :

- le secteur médical et de la santé pour le diagnostic rapide et en continu, pour les "home test" comme par exemple le capteur pour le dosage du glucose (Exactech commercialisé par la société Medisense) qu'utilisent les diabétiques pour contrôler leur glycémie (figure 2),
- le secteur agro alimentaire et industriel pour le contrôle de qualité (de l'eau notamment), pour le suivi des processus de fermentation, la détection de la prolifération de micro-organismes dans les aliments...

- le secteur environnemental pour la détection de polluants (pesticides, herbicides, engrais...) dans différents milieux,

- le secteur militaire pour l'identification rapide de toxines, de virus ou de bactéries,

- le secteur de la recherche pour l'étude des interactions biomoléculaires en temps réel (figure 3).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2 : Le "stylo" à glucose Exactech (Medisense)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 3 : Exemple de dispositif permettant l'étude des interactions moléculaires en temps réel, le "BIAcore" (BIAcore AB)</figcaption></figure>

## 2.3. Classification

Les biocapteurs peuvent être classés en fonction de la nature de la couche biosensible et du type d'interactions mises en jeu avec la molécule cible (figure 4).

Nous pouvons ainsi distinguer 4 classes de biocapteurs :

- les systèmes de bioaffinité (figure 4a),

- les systèmes catalytiques (figure 4b),
- les systèmes transmembranaires (figure 4c),

- et les systèmes à cellules entières (figure 4d).

Il faut néanmoins noter que la majorité des capteurs composés de cellules entières ou de membranes font aussi appel à des principes d'affinité ou catalytique.

Dans tous les cas un transducteur approprié doit rendre compte de l'interaction moléculaire, le choix du système de transduction est de ce fait conditionné par le type d'interaction ayant lieu à sa surface.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 4 : Représentation schématique des différentes couches biosensibles (d'après Göpel et al. 1995). L'analyte à détecter est noté A, le transducteur T et le signal mesuré S</figcaption></figure>

Pour les capteurs de bioaffinité, l'analyte se fixe spécifiquement sur la couche sensible (antigène/anticorps, récepteur/ligand, ADN/ADN...). Les transducteurs les plus adéquats pour
convertir ce type d'interaction sont les systèmes optiques (mesure de la variation de l'indice de réfraction et de l'épaisseur de la couche) et les systèmes piézoélectriques (mesure de la variation de masse).

Pour les systèmes catalytiques, l'analyte est transformé par des enzymes immobilisées E en produit P. Une transduction de type électrochimique ("électrode à enzyme") est la mieux adaptée pour rendre compte de ces réactions de catalyse.

Pour les systèmes membranaires, une protéine formant un canal (figure 4c, 1) laisse passer spécifiquement l'analyte à détecter ou laisse passer une autre espèce après fixation spécifique de l'analyte (figure 4c, 2). Une protéine transmembranaire peut aussi activer une cascade de réactions enzymatiques en fixant spécifiquement l'analyte à détecter (figure 4c, 3). Une transduction électrochimique est souvent associée à ce type de couche sensible.

Pour les capteurs à cellule entière, l'analyte est soit converti en produit (figure 4d, 1) soit se fixe sur la cellule (figure 4d, 2).

## 2. 4. Critères d'évaluation et problèmes à résoudre

Les performances d'un biocapteur doivent être évaluées par des critères analytiques classiques comme : la sensibilité, la spécificité, la reproductibilité, la répétabilité, la justesse, le temps de réponse, la linéarité de la réponse, la limite de détection...

Malgré un essor considérable des activités de recherche liées au développement des biocapteurs, peu de dispositifs sont actuellement commercialisés car plusieurs paramètres doivent être encore améliorés en particulier la sensibilité des dispositifs et la reproductibilité des mesures qui doivent, au moins, atteindre celle des techniques classiques.

En ce qui concerne la spécificité, les problèmes de fixation non spécifique doivent être minimisés.

La couche biosensible doit être stable dans le temps et doit rester fonctionnelle même dans des conditions de pH et de force ionique extrêmes. De plus, la régénération de cette couche (pour les systèmes affins n'étant pas à usage unique) ne doit pas entraîner une perte de son activité biologique.

Enfin, l'aspect de la durée de vie et du coût de revient des biocapteurs doivent être pris en compte si nous voulons augmenter leur diffusion et leur utilisation.
## 3. LES TRANSDUCTEURS

Le transducteur est l'élément physique du biocapteur qui convertit l'interaction moléculaire entre l'analyte à détecter et la couche bioréceptrice en un signal facilement exploitable.

Le transducteur doit donc rendre compte des modifications physico-chimiques liées à l'interaction biomoléculaire.

Différents paramètres physico-chimiques associés à cette interaction peuvent être mesurés. Par exemple, l'interaction peut aboutir à la production d'ions et à un transfert d'électrons, ces signaux étant facilement mesurables par des transducteurs électrochimiques (mesure ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique et impédancemétrique). L'interaction peut aussi entraîner une variation de température facilement détectable par un transducteur calorimétrique ou une variation de l'épaisseur de la couche et de son indice de réfraction détectables par un transducteur optique. Enfin, les variations de masse consécutives à la fixation de l'analyte sur la couche biosensible peuvent être mesurées directement par les transducteurs piézoélectriques.

Le choix du transducteur est de ce fait conditionné par la nature des paramètres physico-chimiques que nous voulons mesurer et qui varient pendant ou consécutivement à l'interaction.

### 3. 1. Transduction électrochimique

#### 3. 1. 1. Transduction potentiométrique

Les dispositifs potentiométriques mesurent les variations de densités de charges à la surface d'une électrode qui se traduisent par des changements de potentiel à l'interface. Ces derniers sont mesurés entre une électrode de travail et une électrode de référence.

Un des exemples le plus représentatif de ce type d'électrode est l'ISE" (Ion Selective Electrode) où l'interaction spécifique d'ions en solution avec une membrane sensible provoque une variation de la différence de potentiel entre l'électrode ionosensible et une électrode de référence aussi en contact avec la solution. Cette variation de potentiel est proportionnelle au logarithme de la concentration en ions en-solution. La sélectivité de l'électrode dépend de la nature de la membrane ionosensible utilisée. Les électrodes à pH ont d'abord été mises au point, puis des électrodes à $NH_4^+$, $K^+$, $Na^+$... ont été développées.
Le principe des capteurs potentiométriques à enzymes repose sur cette transduction : des enzymes sont immobilisées sur une "ISE" et la variation de potentiel consécutive à l'apparition d'un produit de la réaction enzymatique ($H^+, CO_2, NH_3$...) est mesurée.

Des immunocapteurs peuvent aussi être réalisés avec ce type d'électrode. Des antigènes marqués par une enzyme, peuvent se fixer spécifiquement sur des anticorps immobilisés à la surface d'une électrode. La réaction enzymatique du marqueur génère un produit qui provoque une variation de potentiel détectée par le dispositif. L'antigène non marqué (i.e. l'analyte à détecter) et l'antigène marqué par l'enzyme entrent en compétition pour les sites de fixation sur les anticorps immobilisés. La concentration de l'analyte à détecter est alors inversement proportionnelle à la variation de potentiel généré par l'activité de l'enzyme.

D'autres dispositifs potentiométriques reposant sur la mesure du courant de drain d'un transistor à effet de champ ("Field Effect Transistor ou FET") peuvent être utilisés comme transducteur (Gardies et al., 1990). Ces transducteurs peuvent être associés à des enzymes ("Enzyme field effect transistor ou ENFET") ou à des anticorps ("Immuno field effect transistor ou IMFET). Le principe de mesure des FET est équivalent à celui des ISE, mais la mesure est facilitée par la faible impédance de sortie des dispositifs. De plus, ces dispositifs sont de petite taille et peuvent être produits en grande quantité par les techniques de microélectronique.

### 3. 1. 2. Transduction ampérométrique

Les dispositifs ampérométriques mettent en jeu une mesure de courant. Ils sont en général associés à des enzymes ("électrode à enzyme") qui génèrent, ou consomment, une espèce électroactive proportionnellement à la concentration de l'analyte (substrat) à détecter. Ces espèces peuvent réagir (oxydation ou réduction), plus ou moins directement, à la surface de l'électrode ce qui génère un courant. Celui-ci est lié linéairement à la concentration de l'analyte en solution. La plupart des enzymes associées à une détection ampérométrique sont des oxydoréductases et des hydrolases.

L'exemple de la glucose oxydase, qui catalyse l'oxydation du glucose, est très représentatif de ce type de transduction ampérométrique (Sethi, 1994). Sur les figures 5 et 6, l'enzyme sous forme oxydée (GOD($FAD^+$)) réagit spécifiquement avec le glucose, pour le transformer en gluconolactone, et se retrouve sous forme réduite (GOD($FADH_2$)).

Dans le cas d'une réaction sans médiateur (figure 5) l'enzyme est régénérée par oxydation avec une molécule d'oxygène ce qui produit une molécule de peroxyde d'hydrogène. C'est cette
dernière qui va être détectée ampérométriquement par l'électrode après transformation en 2H⁺ + O₂ + 2e⁻. La réponse du capteur est proportionnelle à la quantité de peroxyde d'hydrogène généré par la réaction enzymatique et le courant mesuré peut donc être corrélé à la concentration de l'analyte.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5 : Représentation schématique des étapes intervenant dans la détection ampérométrique sans médiateur du glucose</figcaption></figure>

Dans d'autres cas, l'oxygène peut être remplacé par un médiateur pour régénérer l'enzyme sous forme active (figure 6). Un médiateur est constitué d'un couple redox de bas poids moléculaire qui va servir de "navette" pour les électrons qui sont transférés du centre redox de l'enzyme à la surface de l'électrode.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 6 : Représentation schématique des étapes intervenant dans la détection ampérométrique avec médiateur du glucose</figcaption></figure>

Des immunocapteurs à transduction ampérométriques peuvent aussi être mis au point. Dans ce cas les anticorps (ou les antigènes) sont marqués par une enzyme qui peut être détectée ampérométriquement. Des tests en "sandwich" et en compétition peuvent être réalisés.

### 3. 1. 3. Transduction conductimétrique et impédancemétrique

La mesure de la conductivité d'une solution peut être utilisée comme système de transduction d'un biocapteur car les espèces chimiques libérées ou consommées lors d'une réaction peuvent entraîner des modifications de la conductivité de la solution.

Les mesures d'impédance peuvent caractériser les propriétés bloquantes de la surface d'une électrode (ou d'un autre substrat). Les protéines immobilisées à la surface d'une électrode
peuvent faire varier cette propriété. La fixation spécifique, par exemple, d'antigènes sur des anticorps immobilisés à la surface d'une électrode, ou d'une autre structure, va augmenter le caractère bloquant de la couche de protéine et peut être "visualisée" par la mesure de la capacité interfaciale (Billard, 1991; Maupas et al., 1997).

## 3. 2. Transduction optique

Les transducteurs optiques mesurent les variations des propriétés optiques d'une couche comme son indice de réfraction et son épaisseur (Brecht et Gauglitz, 1995). La transduction optique apparaît donc particulièrement bien adaptée pour rendre compte des réactions de bioaffinité. Dans le cas d'une interaction anticorps/antigène, récepteur/ligand l'indice de réfraction de la couche biologique et son épaisseur varient : la mesure de ses paramètres par un transducteur optique permet donc de détecter et de caractériser cette interaction.

Le principe des différents transducteurs optiques reposent le plus souvent sur le phénomène de réflexion totale et sur le phénomène d'onde évanescente qui lui est associé. Quand un rayon lumineux illumine l'interface plane séparant deux milieux transparents d'indice de réfraction différents ($n_1$ et $n_2$), le phénomène de réflexion totale apparaît dans le milieu d'indice de réfraction le plus élevé ($n_1$) si l'angle d'incidence du rayon lumineux est supérieur à un angle critique. Le faisceau incident est alors totalement réfléchi. Avant de revenir dans le milieu d'indice $n_1$, une onde électromagnétique, appelée onde évanescente, est générée au niveau de l'interface et transite dans le milieu d'indice de réfraction le plus faible ($n_2$) avec une certaine profondeur de pénétration qui dépend de l'angle d'incidence. Cette onde évanescente peut être utilisée pour "sonder" le milieu extérieur dans une zone délimitée par sa profondeur de pénétration. Si l'onde évanescente n'est pas perturbée dans le second milieu, la propagation s'effectue sans perte d'énergie au niveau du faisceau réfléchi. En revanche, si les propriétés optiques du milieu extérieur sont modifiées par la présence de molécules (modification locale de l'indice $n_2$) la propagation de la lumière sera perturbée et une mesure de la variation de l'intensité du faisceau réfléchi sera effectuée.

Un autre phénomène optique, la résonance des plasmons de surface (Surface Plasmon Resonance : SPR) peut aussi rendre compte de l'interaction d'un analyte sur un récepteur spécifique immobilisé (Collino, 1994). Ce type de transduction est à la base des dispositifs "BIAcore" et "BIAcore probe" commercialisés par la société BIAcore AB. La résonance des plasmons de surface repose sur le principe de la réflexion totale de la lumière à l'interface d'un film métallique et d'une solution. Bien que la lumière soit totalement réfléchie, une onde évanescente pénètre à l'interface et peut interagir avec les électrons libres du film métallique. Une partie de l'énergie du faisceau de lumière incidente est perdue dans le film métallique ce
qui provoque une diminution de l'intensité de la lumière réfléchie (extinction du faisceau réfléchi se traduisant par un creux dans la courbe de réflectivité). Ce phénomène n'a lieu que pour un angle d'incidence précis qui dépend de l'indice de réfraction du milieu en contact avec le métal. Lors d'un changement des propriétés optiques survenant par exemple lors de la fixation d'une espèce biologique sur la surface du transducteur, un déplacement des pics de réflectivité pourra être observé. La limitation principale de cette technique repose sur son principe même de transduction. En effet, ces dispositifs mesurent les variations d'épaisseur d'une couche et les variations de son indice de réfraction. Comme ces paramètres dépendent du poids moléculaire et de la quantité d'analyte qui se fixe, des molécules de bas poids moléculaire et en concentration faible seront difficilement détectables.

Il existe d'autres systèmes de transduction optiques, que nous ne détaillerons pas ici, comme l'ellipsométrie, l'interférométrie, la technique du miroir résonnant... Il faut noter que, d'une manière générale, le coût des dispositifs optiques est élevé.

### 3. 3. Transduction piézoélectrique

Ce type de transduction a retenu toute notre attention du fait, entre autre, de son "universalité". En effet, les dispositifs piézoélectriques mesurent des variations de masse à la surface d'une électrode de travail et permettent donc de mettre en évidence la fixation spécifique d'un analyte sur une couche bioréceptrice grâce à la variation de masse que cette fixation occasionne.

De tous les systèmes de transduction, les transducteurs piézoélectriques sont les seuls qui permettent de mesurer une grandeur physique - la masse - directement reliable à la quantité de molécules fixées.

Ce type de transduction repose sur les propriétés piézoélectriques des matériaux utilisés et en particulier du cristal de quartz. En effet, il existe, dans certaines conditions, une relation linéaire entre les variations de la fréquence d'oscillation d'un cristal de quartz et les variations de masse ayant lieu au niveau d'électrodes métalliques déposées sur le cristal. Ainsi, l'enregistrement des variations de la fréquence de résonance d'un cristal de quartz rend directement compte des variations de masse ayant lieu au niveau du transducteur. C'est le principe de la microbalance à quartz (aussi appelée QCM pour Microbalance).

Il existe d'autres dispositifs piézoélectriques comme les dispositifs à ondes de surface (SAW pour Surface Acoustic Wave) et les dispositifs à ondes de plaque (APM pour Acoustic
Plate Mode) qui diffèrent par la nature de l'onde acoustique générée au sein du cristal. Dans tous les cas, la variation de masse perturbe la propagation de cette onde au sein du cristal et il existe toujours une relation reliant la variation de fréquence à la variation de masse.

Ces différents dispositifs sont à la base de nombreux capteurs et biocapteurs (Ward et Buttry, 1990) mais le plus attractif est la microbalance à quartz du fait de son coût modique et de sa simplicité de mise en oeuvre et d'utilisation. C'est ce dispositif de transduction qui a fait l'objet de notre étude dans le but de concevoir et d'étudier un immunocapteur.

Une étude théorique sur le fonctionnement des transducteurs piézoélectriques et de la microbalance à quartz en particulier fera l'objet du deuxième chapitre.

# 4. LA COUCHE BIORECEPTRICE

## 4. 1. Les biorécepteurs

La sélectivité des biocapteurs est assurée par la couche bioréceptrice élaborée au niveau de la surface du transducteur.

De nombreux composants biologiques doués de fonction de reconnaissance et de liaison spécifiques peuvent être utilisés pour élaborer la couche bioréceptrice d'un biocapteur. Les enzymes et les anticorps sont le plus souvent utilisés, mais on retrouve également des acides nucléiques, des récepteurs et autres protéines membranaires, des lectines et des cellules entières*.

Les enzymes et les anticorps sont deux types de protéines qui reconnaissent une structure spécifique et complémentaire sur leur partenaire (substrat ou antigène). Le plus souvent, les enzymes sont utilisées en association avec une détection électrochimique et les anticorps avec des dispositifs optiques et piézoélectriques.

<footnote>* Des techniques récentes permettent d'élaborer une couche chimique de polymère dont la structure "mime" celle des sites de reconnaissance de molécules biologiques, c'est la notion d'empreinte moléculaire (Wulff, 1996). En effet, on peut provoquer la polymérisation de réactifs chimiques en présence d'une molécule biologique (enzyme ou anticorps par exemple) puis celle-ci est retirée après la polymérisation : le polymère se comporte comme un "moule" de la molécule biologique en gardant ses propriétés structurales et fonctionnelles. Ce principe est évidemment très schématique et la sensibilité de telles couches est bien moins grande que celle d'une "vraie" couche biologique. Néanmoins cette voie d'étude est intéressante, notamment pour le gain en stabilité de la couche réceptrice.</footnote>
La contrainte liée à l'utilisation d'enzyme pour l'élaboration d'une couche bioréceptrice est que l'analyte à détecter doit intervenir dans la réaction enzymatique (substrat ou inhibiteur).

L'utilisation des anticorps offre plus de possibilités dans le choix de l'analyte à détecter puisqu'il est possible de fabriquer des anticorps contre, à peu près, n'importe quelle molécule. La connaissance actuelle concernant la technologie des anticorps (depuis l'avènement des anticorps monoclonaux et plus récemment avec les anticorps coliclonaux et les abzymes) en font des molécules de choix pour l'élaboration d'une couche réceptrice hautement spécifique; de plus leur obtention sous forme monoclonale, leur conservation et leur manipulation sont maintenant bien établies.

Nous utiliserons donc des anticorps pour former la couche bioréceptrice à la surface des électrodes d'or de notre microbalance à quartz.

## 4. 2. Les techniques d'immobilisation

L'immobilisation des biorécepteurs à la surface du transducteur est une étape fondamentale dans le développement d'un biocapteur car la qualité de la couche obtenue conditionnera l'efficacité du biocapteur en terme de sélectivité, sensibilité, répétabilité et reproductibilité.

La couche devra répondre à certains critères comme le maintien de l'activité biologique, une quantité suffisante de molécules immobilisées et une bonne stabilité vis-à-vis des variations de pH, de la force ionique et des étapes de régénération de la surface... Ces critères seront déterminés par la méthode d'immobilisation choisie. Celle-ci doit aboutir à la préparation d'une couche plus ou moins structurée à la surface du transducteur de manière reproductible et homogène. Du fait de la taille importante des molécules à immobiliser et pour garantir une accessibilité suffisante pour l'analyte qui doit se fixer, une séparation spatiale suffisante des molécules doit être obtenue : la réalisation d'une monocouche n'est donc pas forcément un objectif.

Les techniques d'immobilisation peuvent être réparties en 4 classes majoritaires : l'adsorption, le greffage covalent, l'inclusion et les techniques d'assemblage moléculaire en multicouches (figure 7).
Le principe des différentes techniques d'immobilisation des biorécepteurs repose sur la nature chimique de ces derniers, le plus souvent il s'agit de protéines, comme pour les enzymes et les anticorps, ou d'acides nucléiques.

Les supports majoritaires pour réaliser l'immobilisation des biorécepteurs sont en or, en platine, en silice et en carbone.

Chaque technique d'immobilisation possède ses spécificités, le choix de la technique à utiliser dépendra du type de support, du type de molécules à immobiliser et du but recherché.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 7 : Représentation schématique de différentes techniques d'immobilisation</figcaption></figure>

## 4. 2. 1. L'adsorption

L'adsorption des protéines sur un support est la plus simple des méthodes d'immobilisation et elle est couramment utilisée, par exemple, en immunologie analytique pour le revêtement des "plaques ELISA". L'établissement de nombreuses liaisons faibles (interactions hydrophobes, ioniques, force de Van der Waals, liaisons hydrogène) entre la surface et la protéine gouverne son adsorption. La nature du support conditionne le phénomène d'adsorption. Sur l'or celui-ci est renforcé par l'affinité très importante des atomes de soufre, présents dans les protéines, pour ce métal. Dans certains cas, l'adsorption des protéines peut entraîner leur dénaturation d'où une perte d'activité biologique. De plus, ce phénomène n'est pas contrôlable, il peut être réversible et ne permet pas de régénérer la
surface en gardant intacte la couche sensible. Toutefois cette technique est assez utilisée, surtout pour préparer des transducteurs à usage unique (Kößlinger et al., 1992; Muratsugu et al., 1993). Elle peut être réalisée directement sur la surface native du transducteur (figure 7a1) ou sur la surface modifiée par des monocouches d'alkyl thiols qui s'auto-assemblent, par des couches mono et bilipidiques... (figure 7a2).

### 4.2.2. Greffage covalent

Le greffage covalent des biomolécules est une technique d'immobilisation chimique qui permet l'établissement de liaisons covalentes entre la molécule et le support (figure 7b1). Le greffage est réalisé par l'intermédiaire d'un agent de couplage (glutaraldéhyde, carbodiimide...) qui va créer une liaison covalente entre un groupement chimique de la surface et une fonction chimique de la molécule.

Pour les protéines il existe un grand nombre d'agent de couplage qui peuvent réagir avec différents groupements de la protéine à immobiliser (fonctions amines, thiols, hydroxyles, phénols, carboxyles, et carbohydrates).

Le greffage covalent est un phénomène irréversible qui doit permettre la régénération de la surface : des antigènes ayant interagi avec des anticorps greffés sur un transducteur peuvent être désorbés et le capteur est à nouveau utilisable. De plus, l'introduction d'un bras de couplage confère à la molécule une mobilité et une liberté stérique importante ce qui augmente l'accessibilité pour l'analyte. Cette technique d'immobilisation peut, dans certains cas, permettre l'orientation des molécules (greffage sur les résidus glycosilés de la partie Fc des immunoglobulines par exemple) ce qui optimise la probabilité de reconnaissance (figure 7b2).

La plupart des surfaces transductrices ne permettent pas un greffage direct du fait de l'absence de groupement réactif intéressant. Il est souvent nécessaire de fonctionnaliser cette surface, c'est-à-dire d'introduire en surface du transducteur des groupements chimiques susceptibles de réagir avec l'agent de couplage ; la fonctionnalisation permet d'assurer la continuité chimique entre la surface et la molécule à immobiliser. Cette modification des propriétés de la surface peut aussi entraîner une diminution des phénomènes d'adsorption non spécifique.

Sur l'or, les modifications chimiques peuvent s'effectuer par deux voies principales : par réaction d'organosilanes sur la surface (silanisation) et par la formation de monocouche de thiols qui s'auto-assemblent spontanément sur l'or ("Self-Assembled Monolayers : SAM"). En effet, les atomes de soufre ont une grande affinité pour l'or et les thiols à chaîne saturée (SH-(CH2)n-X) en solution s'auto-organisent spontanément sur l'or pour former une
monocouche dense, ordonnée et stable, par l'établissement de liaisons pseudo-covalentes entre les atomes de soufre et d'or (Nuzzo et al., 1990). Les disulfures forment aussi des SAM, l'attachement à la surface d'or se faisant alors par l'intermédiaire de la liaison S-S (Cheng et Brajter-Toth, 1992). Tout groupement fonctionnel compatible avec un alkyl thiol pourra se retrouver en surface d'un support en or et pourra ensuite réagir avec un agent de couplage.

Le greffage covalent est très utilisé pour immobiliser des biorécepteurs en particulier pour les immunoglobulines (Billard, 1991; Johnsson et al., 1991; Duan et Meyerhoff, 1994).

### 4. 2. 3. L'inclusion

L'inclusion consiste à emprisonner la biomolécule dans un gel ou un polymère (figure 7c). Les matériaux les plus souvent utilisés sont l'acrylamide, le polyacrylamide, les sol-gels... et des matrices naturelles comme la gélatine et l'amidon. Cette technique d'immobilisation convient bien aux enzymes, mais entraîne souvent une diminution de l'immunoréactivité des anticorps (Avnir et al., 1992). L'inclusion de biomolécules peut aussi s'effectuer dans un film d'acides gras par la technique Langmuir-Blodgett (Barraud et al., 1993).

### 4. 2. 4. Techniques d'assemblage moléculaire en multicouches

Ces techniques reposent sur les propriétés de fixation spécifiques de certaines protéines (protéine A et avidine par exemple) et permettent la construction d'assemblage moléculaire en multicouches régénérables.

La protéine A et la protéine G sont deux protéines, extraites respectivement de la paroi de *Staphylococcus aureus* et de *Streptococcus sp*, qui se lient avec la partie Fc de certaines classes d'immunoglobulines. Le revêtement d'une surface transductrice par la protéine A (ou G) permet la fixation orientée d'anticorps (sites Fab à l'extrémité de la surface transductrice). Sur l'or, la protéine A est facilement utilisable car elle forme un complexe très stable avec ce métal sans perdre ses propriétés de fixation spécifique; elle a été, de ce fait, souvent utilisée, en particulier, sur les électrodes d'or de microbalances à quartz (Davis et Leary, 1989; König et Grätzel, 1994).

L'avidine est aussi utilisée pour immobiliser des biorécepteurs biotinylés (figure 7d). Cette glycoprotéine tétramérique, extraite du blanc d'oeuf, fixe quatre molécules de biotine avec une forte affinité (constante de dissociation à l'équilibre de l'ordre de 10<sup>-15</sup> M). La streptavidine est une protéine extraite de *Streptomyces avidinii* qui possède les mêmes propriétés de fixation vis-à-vis de la biotine. Toute molécule préalablement biotinylée pourra
facilement être immobilisée à la surface d'un transducteur revêtue d'avidine ou de streptavidine. Certains auteurs combinent la propriété des alkyls thiols qui s'auto-organisent sur l'or et la propriété de fixation streptavidine / biotine en utilisant des alkyls thiols biotinylés pour fonctionnaliser des électrodes d'or (Spinke et al., 1993).

## 4. 3. L'interaction antigène/anticorps

L'interaction antigène/anticorps étant à la base du fonctionnement des immunocapteurs et des techniques immunoanalytiques, nous allons rappeler des notions élémentaires d'immunologie et décrire les techniques immunoanalytiques classiques.

### 4. 3. 1. Rappels d'immunologie

#### Définitions

L'environnement contient une large variété de micro-organismes (bactéries, virus, champignons et parasites) qui peuvent être à l'origine de désordres pathologiques plus ou moins graves, voire mortels, chez un organisme infecté quand rien ne s'oppose à leur prolifération. Lors d'une infection, les individus normaux mettent en jeu leur système immunitaire pour combattre ces agents infectieux.

Le terme *immunité* caractérise la résistance des individus vis-à-vis des infections microbiennes et se définit comme l'ensemble des réactions humorales et cellulaires qui tendent à éliminer des substances étrangères.

Le système immunitaire met en jeu deux types de mécanismes : l'immunité naturelle et non spécifique, qui constitue une première ligne de défense souvent suffisante, représentée par la barrière cutéano-muqueuse et le système phagocytaire et l'immunité spécifique caractérisée par un ensemble de réactions dirigées spécifiquement contre le germe responsable et entraînant généralement sa destruction.

Les *antigènes* sont des substances, étrangères à l'organisme, capables de déclencher une réaction immunitaire spécifique puis de réagir spécifiquement avec les produits de cette réaction : les anticorps ou les lymphocytes sensibilisés.
Les anticorps sont définis comme des molécules dont la production, par l'organisme, est déclenchée par la présence d'un antigène et qui peuvent se lier spécifiquement avec lui.

Les motifs moléculaires présents sur l'antigène et qui sont reconnus spécifiquement par les anticorps sont les déterminants antigéniques ou épitopes.

Les anticorps appartiennent à la famille des immunoglobulines qui sont des glycoprotéines globulaires synthétisées par les lymphocytes B en réponse à une stimulation antigénique. Nous distinguons chez les mammifères cinq classes d'immunoglobulines : IgG, IgM, IgA, IgD et IgE qui diffèrent par leur structure et leur fonction (tableau I).

<table><caption>Tableau I : Caractéristiques des différentes immunoglobulines humaines</caption><thead><tr><th></th><th>IgG</th><th>IgM</th><th>IgA</th><th>IgD</th><th>IgE</th></tr></thead><tbody><tr><th scope="row">Nom</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row">Structure</th><td>monomère</td><td>pentamère</td><td>dimère</td><td>monomère</td><td>monomère</td></tr><tr><th scope="row">Représentation sérique</th><td>70 - 75 %</td><td>10 %</td><td>15 - 20 %</td><td>&lt;1 %</td><td>trace</td></tr><tr><th scope="row">PM g/mol</th><td>150000</td><td>970000</td><td>385000</td><td>184000</td><td>188000</td></tr><tr><th scope="row">Chaîne lourde</th><td>γ</td><td>μ</td><td>α</td><td>δ</td><td>ε</td></tr><tr><th scope="row">Particularité et fonction</th><td>lutte anti infectieuse</td><td>lutte anti infectieuse</td><td>présentes dans les sécrétions, lutte anti infectieuse locale</td><td>présentes dans la membrane des lymphocytes B</td><td>associées aux manifestations allergiques, lutte anti parasitaire</td></tr></tbody></table>

## Structure générale des immunoglobulines

Malgré la diversité structurale des différentes classes d'immunoglobulines, dont la fonction primordiale est de lier l'antigène, tous les anticorps ont une structure de base commune. La molécule d'IgG est l'exemple type de cette structure (figure 8).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 8 : Représentation schématique de la structure d'une immunoglobuline G</figcaption></figure>

La molécule d'immunoglobuline G est symétrique, elle est constituée de deux chaînes lourdes (H) identiques de 450 acides aminés reliées par deux ponts disulfures et de deux chaînes légères (L) identiques de 212 acides aminés reliées aux chaînes lourdes par un pont disulfure.

La classe et la sous classe des immunoglobulines sont déterminées par la nature de la chaîne lourde : γ1,γ2, γ3, γ4 pour les IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, μ pour les IgM, α1 et α2 pour les IgA1 et IgA2, δ pour les IgD et ε pour les IgE. Pour les chaînes légères, il en existe deux types : les chaînes κ et λ.

Les régions N terminales des chaînes lourdes et légères sont caractérisées par des séquences variables appelées VH et VL. Le reste de la molécule a une structure relativement constante. La partie constante de la chaîne lourde comprend trois régions différentes CH1, CH2 et CH3 : ce sont des régions globulaires stabilisées par des ponts disulfures intracaténaires appelés domaines.

Les deux sites de liaison à l'antigène sont localisés dans les domaines variables, constitués de régions hypervariables, des chaînes lourdes et légères. La séquence en acides aminés de ces régions et leur structure caractérisent la spécificité de liaison. Une molécule d'IgG peut se lier à deux molécules d'antigène.

La molécule d'IgG est bifonctionnelle, une protéolyse limitée par la papaïne la sépare en deux types de fragments :

- 2 fragments Fab formés par les chaînes légères et l'extrémité N terminale des chaînes lourdes qui conservent la capacité de fixer l'antigène,
- un fragment *Fc* formé par l'extrémité C terminale des chaînes lourdes qui est responsable des interactions avec les autres éléments du système immunitaire (cellules phagocytaires, cellules killer, complément).

## La liaison antigène/anticorps

De nombreuses liaisons non covalentes participent à la liaison entre l'épitope de l'antigène et les acides aminés (une douzaine) du site anticorps. Les forces attractives de ces liaisons sont faibles et sont très dépendantes de la complémentarité stérique entre le déterminant antigènique et le site anticorps, néanmoins leur grand nombre donne une énergie de liaison élevée.

Le déterminant antigènique et le site anticorps doivent posséder des structures complémentaires capables de se combiner. La forme du site anticorps doit être adaptée à l'épitope pour que plusieurs liaisons non covalentes puissent s'établir simultanément.

Les forces intervenant dans cette liaison sont de quatre types (figure 9) :

- les liaisons hydrogène qui résultent de la formation de ponts hydrogène entre des atomes appropriés,

- les forces électrostatiques qui sont liées à l'attraction de groupes ioniques de charges opposées,

- les forces de van der Waals qui sont créées par l'interaction entre différents nuages électroniques,

- les liaisons hydrophobes qui sont produites par l'association de groupements non polaires et hydrophobes d'où les molécules d'eau sont exclues, ces forces peuvent contribuer pour moitié à la force de liaison antigène/anticorps.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 9 : Représentation schématique des différentes forces attractives intermoléculaires impliquées dans la liaison antigène / anticorps</figcaption></figure>
Du fait de la nature des forces qui gouvernent l'interaction antigène/anticorps, celle-ci est fortement influencée par les conditions physico-chimiques du milieu dans lequel se déroule cette réaction. Des variations de pH, de force ionique et de température vont jouer sur l'ensemble des forces qui conditionnent l'interaction.

La force d'une liaison antigène/anticorps est appelée *affinité* de l'anticorps : elle représente l'ensemble des forces attractives et répulsives qui caractérisent l'interaction. Un anticorps de haute affinité implique des structures complémentaires parfaites (forces d'attraction importantes et faibles forces de répulsion), à l'inverse, un anticorps de faible affinité implique une complémentarité imparfaite (faibles forces d'attraction et fortes forces de répulsion).

La réaction antigène/anticorps est réversible :

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

où Ac représente le site anticorps, Ag le site antigène, k et k' les constantes de vitesse d'association et de dissociation du complexe antigène / anticorps.

La loi d'action de masse peut être appliquée ce qui permet de calculer l'affinité d'un anticorps à l'équilibre :

$$K = \frac{[AgAc]}{[Ag] \times [Ac]} = \frac{k}{k'}$$

où K définit la constante d'association intrinsèque de la réaction à l'équilibre et représente l'affinité du site anticorps pour l'antigène (en M⁻¹).

La stabilité du complexe immun est d'autant plus grande que K est élevée. D'une manière générale, il est préférable de travailler avec des anticorps qui ont une forte affinité pour leur antigène.

## Théorie de la sélection clonale, anticorps polyclonaux et monoclonaux

Dans un organisme, il existe un immense répertoire de clones de lymhocytes B qui portent chacun un récepteur (immunoglobuline membranaire IgD) de spécificité différente. Les récepteurs prééxistent à l'introduction de l'antigène, leur construction est le fruit du hasard (réarrangements dans la structure de l'ADN) qui se fait sans référence à un éventuel antigène.
La production d'immunoglobulines spécifiques d'un antigène donné repose sur le principe de la sélection clonale : après pénétration dans l'organisme l'antigène se fixe sur les récepteurs des lymphocytes B présentant pour lui la plus forte affinité. L'antigène sélectionne donc le(s) clone(s) de lymphocyte B qui possède(nt) des immunoglobulines le reconnaissant le plus exactement. Cette interaction entraîne l'activation spécifique de ce(s) clone(s) qui prolifère(nt) et se différencie(nt) en cellules sécrétrices d'anticorps spécifiques et en cellules mémoires.

En général, un antigène présente à sa surface plusieurs déterminants antigéniques de sorte que la réponse de l'organisme est polyclonale : différents anticorps spécifiques des différents épitopes reconnus sont produits par différents clones de lymphocytes B et toutes ces immunoglobulines se retrouvent dans la circulation sanguine (figure 10). Si un clone de lymphocytes B producteurs d'anticorps est isolé pour être mis en culture, le surnageant de culture contiendra des anticorps tous identiques (puisque descendant de la même cellule) : ce sont les anticorps monoclonaux. Il est possible maintenant de produire en quantité quasi illimitée des anticorps monoclonaux de spécificité connue grâce à la technique des hybridomes (Köhler et Milstein, 1975). Brièvement, un lymphocyte B sécrétant un anticorps donné est fusionné avec une cellule de myélome (type de tumeur de lymphocyte B). La cellule tumorale rend immortelle les cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces hybridomes pourront dès lors être maintenus en culture et continuer de sécréter des anticorps de spécificité définie. Après sélection et clonage de ces cellules, les anticorps produits sont des anticorps monoclonaux.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 10 : Représentation schématique d'une réponse immunitaire</figcaption></figure>

Les réactions antigène/anticorps sont très spécifiques, les sites de fixation des anticorps dirigés contre les épitopes d'un antigène ne sont pas complémentaires de ceux portés par un autre antigène. Toutefois, il se peut que des déterminants antigéniques soient communs à plusieurs antigènes et que des anticorps dirigés contre un épitope d'un antigène donné se fixent sur un autre antigène : nous parlons alors de réaction croisée.

### 4. 3. 2. Les techniques immunoanalytiques classiques

Le principe des techniques d'immunoanalyse classiques et des immunocapteurs repose sur la spécificité de la réaction antigène/anticorps, le but de ces techniques étant de déterminer qualitativement et si possible quantitativement la présence d'un antigène dans un échantillon.

Les techniques immunoanalytiques peuvent être classées en trois catégories en fonction
du type d'observation qui rend compte de l'interaction antigène / anticorps :

- nous pouvons observer directement les effets de la réaction en réalisant, par exemple, des tests de précipitation, d'immunodiffusion, d'hémagglutination...

- nous pouvons observer un effet biologique en réalisant des tests de lyse, de différenciation ou de modification cellulaire,

- et nous pouvons observer la réaction antigène / anticorps indirectement par l'intermédiaire d'un marqueur associé à un des partenaires de la réaction : c'est le principe des immunodosages.

Quel que soit le type de marqueur utilisé dans les immunodosages (fluorescent, luminescent, radioactif ou enzymatique), il existe deux formats de test : les tests en compétition et les tests en sandwich (figure 11).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 11 : Représentation schématique du principe des deux formats de test des immunodosages</figcaption></figure>

Dans les tests en compétition, l'antigène à doser (non marqué) est incubé avec les anticorps en présence d'une quantité connue d'antigène marqué : les antigènes de l'échantillon entrent en compétition avec l'antigène marqué pour les sites de fixation des anticorps et
déplacent les antigènes marqués. Le signal mesuré est alors inversement proportionnel à la quantité d'antigène dans l'échantillon.

Dans les tests en sandwich, les antigènes de l'échantillon se fixent sur les anticorps immobilisés, puis un deuxième anticorps marqué (conjugué) vient se fixer sur un autre épitope de l'antigène qui est pris en "sandwich". Le signal mesuré est alors proportionnel à la quantité d'antigène dans l'échantillon. La réalisation de ce format de test implique que l'antigène présente plusieurs épitopes.

La plupart des immunodosages se réalisent en phase hétérogène c'est-à-dire qu'il est nécessaire de séparer l'analyte libre dans l'échantillon de l'analyte lié sur les anticorps (le plus souvent par des étapes de rinçage).

Les marqueurs les plus utilisés sont les radioéléments qui caractérisent les dosages radioimmunologiques (RIA : Radio Immuno Assay) et les enzymes qui caractérisent les dosages immunoenzymatiques (EIA : Enzyme Immuno Assay) comme la technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) où l'un des partenaires est immobilisé sur un support solide.

Les méthodes RIA sont très précises, hautement reproductibles et très sensibles (jusqu'au pg/ml) mais elles sont contraignantes du fait de l'utilisation de la radioactivité (laboratoires spécialisés) et elles sont limitées à cause de la difficulté d'obtenir certains bioréactifs radiomarqués.

Les méthodes EIA sont plus faciles à réaliser et à préparer, les techniques de couplage d'enzymes (la peroxydase et la phosphatase alcaline sont les deux enzymes les plus couramment utilisées) sur les anticorps ou les antigènes sont maintenant bien définies (Ternynck et Avrameas, 1987). La révélation de la présence de l'antigène se fait par la mesure de la densité optique par spectrophotométrie d'un produit coloré apparu consécutivement à l'ajout du substrat de l'enzyme. La sensibilité de ces techniques peut atteindre celle des techniques RIA et elles sont aussi reproductibles et précises. C'est une méthode dérivée de la technique ELISA qui a été utilisée pour contrôler la fixation des anticorps sur notre transducteur.

Bien que ces deux types de technique d'immunoanalyse soient très sensibles, elles ne peuvent être réalisées que par un personnel qualifié dans un laboratoire d'analyse, elles sont relativement longues (plusieurs heures), nécessitent des molécules marquées et surtout elles ne permettent pas de visualiser en temps réel l'interaction antigène/anticorps. Ceci explique l'essor important des biocapteurs en général et des immunocapteurs qui permettent de suivre la cinétique d'interaction antigène/anticorps en particulier.
## 5. ETAT DE L'ART DES IMMUNOCAPTEURS PIEZOELECTRIQUES

Cette étude bibliographique a pour but de montrer l'éventail des possibilités d'utilisation de dispositifs piézoélectriques comme transducteur d'un immunocapteur et l'évolution de leur développement.

Nous nous limiterons à l'étude des dispositifs reposant sur une microbalance à quartz, les autres systèmes (SAW et APM) ne seront pas détaillés.

La microbalance est constituée d'un cristal de quartz recouvert de deux électrodes qui, placé dans un champ électrique adéquat par l'intermédiaire d'un oscillateur, oscille à une certaine fréquence proche de la fréquence de résonance du cristal de quartz. Cette fréquence de résonance variant proportionnellement avec la masse déposée sur l'électrode de travail, la microbalance à quartz peut être utilisée comme transducteur gravimétrique d'un immunocapteur : la variation de masse engendrée par la réaction antigène/anticorps est alors mesurée par l'intermédiaire de l'enregistrement de la fréquence d'oscillation. La relation qui relie les variations de la fréquence de résonance et les variations de masse est l'équation de Sauerbrey (Sauerbrey, 1959). Celle-ci prend en compte la fréquence de résonance du cristal : plus la fréquence de résonance du cristal est élevée plus la sensibilité massique est grande (cf chapitre II).

Shons et al. en 1972 furent les premiers à décrire un immunocapteur en utilisant une microbalance à quartz. De l'albumine bovine sérique (BSA) était immobilisée sur un cristal prérevêtu d'une solution de Nyebar C qui formait une couche très hydrophobe capable de retenir la BSA. La fréquence du cristal ainsi préparé était mesurée à l'air ($F_1$), puis celui-ci était plongé dans une solution contenant des anticorps anti-BSA. Après rinçage, le quartz était séché et la fréquence après réaction était mesurée ($F_2$). La variation de fréquence, mesurée dans l'air, ($\Delta F = F_1 - F_2$) était proportionnelle à la concentration d'anticorps en solution.

Cette technique de mesure de la fréquence dans l'air avant et après immunoréaction est retrouvée dans les travaux qui ont suivi. En effet, cette méthode dite du "dip and dry" était et est encore parfois utilisée car s'il est facile de faire osciller de manière stable une microbalance à quartz dans l'air, l'entretien des propriétés vibrationnelles d'un quartz immergé dans un liquide est plus compliqué. Les premières publications où nous trouvons une mesure directe de la fréquence d'oscillation d'un quartz immergé dans une solution datent de la fin des années 1980 (Davis et Leary, 1989), quand des oscillateurs plus performants, permettant d'entretenir les vibrations du cristal même en milieu liquide, ont été développés.
Le tableau suivant regroupe quelques exemples significatifs de travaux concernant l'utilisation de microbalance à quartz comme transducteur d'immunocapteur.

<table><caption>Tableau II : Exemples d'immunocapteurs reposant sur une microbalance à quartz</caption><thead><tr><th>Auteurs</th><th>Année</th><th>Fréquence de résonance (MHz)</th><th>Technique de mesure de la fréquence</th><th>Analyte à détecter</th><th>Biorécepteur immobilisé</th><th>Format du test</th><th>Technique d'immobilisation</th></tr></thead><tbody><tr><td>Muramatsu et al.</td><td>1986</td><td>9</td><td>dip and dry</td><td>Candida albicans en suspension en PBS</td><td>anticorps anti C. albicans</td><td>direct</td><td>silanisation et greffage covalent au glutaraldéhyde</td></tr><tr><td>Ngeh-Ngwainbi et al.</td><td>1986</td><td>9</td><td>en continu</td><td>parathion en milieu gazeux</td><td>anticorps anti parathion</td><td>direct</td><td>adsorption</td></tr><tr><td>Davis et Leary</td><td>1989</td><td>10</td><td>en continu</td><td>Ig G</td><td>anticorps anti Ig G</td><td>direct</td><td>adsorption de protéine A puis anticorps</td></tr><tr><td>Plomer et al.</td><td>1992</td><td>10</td><td>dip and dry</td><td>entéro-bactéries dans l'eau</td><td>anticorps anti entéro-bactéries</td><td>direct</td><td>- revêtement de polyéthyleneimine et glutaraldéhyde<br>- silanisation et glutaraldéhyde<br>- adsorption de protéine A puis Ig</td></tr><tr><td>Guilbault et al.</td><td>1992</td><td>10</td><td>dip and dry</td><td>atrazine dans l'eau</td><td>anticorps anti atrazine</td><td>direct</td><td>- revêtement de polyéthyleneimine et glutaraldéhyde<br>- silanisation et glutaraldéhyde<br>- adsorption de protéine A puis Ig</td></tr><tr><td>Kößlinger et al.</td><td>1992</td><td>20</td><td>en continu</td><td>anticorps anti HIV</td><td>peptide synthétique du HIV</td><td>direct</td><td>adsorption du peptide et saturation par la gélatine</td></tr><tr><td>Muratsugu et al.</td><td>1993</td><td>9</td><td>en continu</td><td>sérum albumine humaine</td><td>anticorps anti HSA</td><td>direct</td><td>adsorption des anticorps et saturation par BSA</td></tr><tr><td>Miura et al.</td><td>1993</td><td>6</td><td>en continu</td><td>metham-phétamine (MA) dans l'urine</td><td>methamphé-tamine couplée à la BSA</td><td>en compétition (échantillon +anticorps anti MA)</td><td>adsorption de la methamphétamine couplée à la BSA</td></tr><tr><td>König et Grätzel</td><td>1993</td><td>10</td><td>dip and dry</td><td>globules rouges humains</td><td>anticorps anti glycophorine A</td><td>direct</td><td>- revêtement de polyéthyleneimine et glutaraldéhyde<br>- silanisation et glutaraldéhyde<br>- adsorption de protéine A puis Ig</td></tr><tr><td>Geddes et al.</td><td>1994</td><td>9</td><td>en continu</td><td>IgG de souris ou de mouton</td><td>anticorps anti IgG de souris ou de mouton</td><td>direct</td><td>formation d'une SAM carboxylée et greffage covalent au carbodiimide</td></tr><tr><td>Sakai et al.</td><td>1995</td><td>6</td><td>en continu</td><td>HSA</td><td>anticorps anti HSA</td><td>en sandwich</td><td>adsorption des anticorps</td></tr><tr><td>Chu et al.</td><td>1995</td><td>10</td><td>dip and dry</td><td>IgM humaines</td><td>anticorps de chèvre anti IgM humaines</td><td>direct</td><td>revêtement d'un polymère (HEMA/MMA), puis greffage covalent au CNBr</td></tr><tr><td>Steegborn et Skadal</td><td>1997</td><td>10</td><td>en continu</td><td>atrazine dans l'eau</td><td>atrazine couplée à la BSA</td><td>en compétition</td><td>silanisation et greffage covalent de l'atrazine-BSA au glutaraldéhyde</td></tr></tbody></table>
Cette étude nous a permis d'orienter notre travail sur un certain nombre de points souvent négligés dans les publications, à la fois au niveau du transducteur et au niveau de la couche immunosensible.

En effet nos objectifs concernant le transducteur étaient, d'une part, de mettre au point une microbalance à quartz de grande sensibilité et stabilité et, aussi, d'étudier son mécanisme de transduction en milieu liquide avec une couche de protéine afin de valider son utilisation dans le domaine des immunocapteurs. Au niveau de la couche immunosensible, nous avons aussi cherché à contrôler son élaboration, à vérifier son immunoréactivité, à éviter les problèmes d'adsorption non spécifique et à vérifier la spécificité de la réponse.

Plus concrètement, notre but était de développer et d'étudier un immunocapteur reposant sur une microbalance à quartz fonctionnant à 27 MHz, en milieu liquide, avec une circulation des échantillons, et permettant la détection spécifique et directe de trois antigènes solubles (entérotoxine de Staphylocoque B, peroxydase et immunoglobulines G) de masses molaires différentes (28000, 44000 et 150000 g/mol) dans des gammes de concentrations intéressantes.

## CONCLUSION

Ce premier chapitre avait pour but de présenter et de faire le point sur les biocapteurs. En effet ces outils analytiques connaissent un essor considérable quant au nombre de publications depuis quelques années car ils répondent à un besoin émergeant dans de nombreux domaines d'application : détecter et identifier spécifiquement, en temps réel et de façon simple une molécule ou un micro-organisme.

Parmi les différents systèmes de transduction et les différents biorécepteurs nous avons choisi d'utiliser une microbalance à quartz en association avec un film d'anticorps qui rend spécifique la surface de notre transducteur. Ce système de transduction est parfaitement adapté pour rendre compte des interactions antigène/anticorps par la mesure de la variation de masse consécutive à la fixation des antigènes sur la couche d'anticorps immobilisés. De plus, le suivi en continu de ces variations de masse, par la mesure de la fréquence de la microbalance, permet d'étudier les cinétiques d'interactions antigène/anticorps. Un des avantages de ces dispositifs est son faible coût de revient et d'utilisation surtout au regard des dispositifs optiques déjà commercialisés mais onéreux.
Chapitre II

LES TRANSDUCTEURS PIEZOELECTRIQUES
ASPECTS THEORIQUES
# INTRODUCTION

Ce deuxième chapitre sera consacré à l'étude théorique des transducteurs piézoélectriques qui sont à la base du développement de nombreux capteurs et biocapteurs. Après avoir rappelé quelques généralités sur le quartz et l'effet piézoélectrique, nous présenterons les principaux dispositifs mettant en jeu la propagation d'ondes ultrasonores pouvant être utilisés pour la réalisation de transducteurs. Ensuite, nous étudierons le principe de fonctionnement de la microbalance à quartz et sa sensibilité à différents paramètres physico-chimiques : la sensibilité à la masse sera exposée en détail. Enfin, nous présenterons le principe de la mesure d'admittance électroacoustique. Cette technique sera mise en œuvre afin de valider et de modéliser le fonctionnement de la microbalance à quartz dans nos conditions d'utilisation (milieu liquide et couches de protéines). Un nouveau modèle, plus explicite et plus complet que ceux existants, sera présenté brièvement : celui-ci permet de discerner clairement l'effet des différents paramètres physico-chimiques sur la réponse du résonateur.

## 1. LES TRANSDUCTEURS PIEZOELECTRIQUES

Les transducteurs piézoélectriques forment une classe de transducteurs qui mesurent, en premier lieu, des variations de masse à leur surface.

En fonction du dispositif utilisé et du type d'onde acoustique générée, des mesures peuvent être réalisées sous vide, en phase gazeuse ou en milieu liquide.

Le principe de ces transducteurs repose sur les propriétés piézoélectriques des matériaux utilisés comme, notamment, le cristal de quartz qui est majoritairement utilisé dans les applications capteurs du fait de son inertie vis-à-vis des produits chimiques et de son faible coût.

### 1.1. Généralités sur le quartz

Le quartz est l'un des minéraux les plus abondants de l'écorce terrestre : il forme 12% de la composition de la lithosphère comme constituant majoritaire des roches. Toutefois pour des applications nécessitant des quartz de bonne qualité, des quartz de synthèse (quartz α) sont préférentiellement utilisés aux quartz naturels. Le quartz de synthèse peut être obtenu en grande quantité, à faible coût et avec une bonne qualité cristalline.
1. 1. 1. Structure et propriétés du quartz α.

Le quartz α cristallise dans un système hexagonal. Sa structure de base se compose de tétraèdres élémentaires de formule brute $SiO_4$ (figure 12) liés entre eux par les sommets, chaque atome d'oxygène étant commun à deux tétraèdres. Chaque atome de silicium est entouré de quatre atomes d'oxygène.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 12 : Représentation schématique du tétraèdre $SiO_4$</figcaption></figure>

Le cristal de quartz (figure 13) ne possède pas de centre de symétrie, ce qui en fait un matériau piézoélectrique. Le quartz est un matériau d'une grande dureté et est chimiquement inerte. L'acide fluorhydrique est pratiquement le seul acide qui l'attaque et sa solubilité dans des solutions basiques est quasi nulle à température et pression ordinaires.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 13 : Représentation schématique d'un cristal de quartz dans l'espace</figcaption></figure>
1. 1. 2. L'effet piézoélectrique

En 1880, Jacques et Pierre Curie découvrent l'effet piézoélectrique direct en constatant qu'une contrainte mécanique appliquée sur les faces d'un solide cristallin provoque une déformation du cristal qui s'accompagne d'une polarisation électrique, l'amplitude du potentiel électrique étant proportionnelle à la contrainte appliquée. Cette propriété existe seulement dans les matériaux dits acentriques, c'est-à-dire qui cristallisent dans un réseau sans centre de symétrie.

Concernant le cristal de quartz, la force appliquée sur ce cristal provoque un déplacement des atomes entraînant une déformation de la liaison SiO. Cette déformation génère l'apparition de dipôles électriques conduisant à une distribution de charges électriques sur les faces du cristal. Le préfixe piézo vient du grec "piezein" qui signifie presser, la piézoélectricité traduit donc l'interdépendance des propriétés électriques et mécaniques de certains cristaux.

A l'inverse, et c'est l'effet piézoélectrique inverse, si une différence de potentiel est appliquée entre les faces d'un matériau piézoélectrique cela fait apparaître des contraintes au sein du matériau qui induisent sa déformation.

Cet effet est à la base du fonctionnement des transducteurs piézoélectriques. Le champ électrique issu d'une polarisation induit une réorientation des dipôles du matériau ce qui provoque sa déformation (figure 14). C'est dans les années 1920, que Cady a démontré que l'effet piézoélectrique inverse pouvait être exploité pour développer des oscillateurs très stables. En effet, l'application d'un champ électrique alternatif au sein d'un cristal de quartz provoque sa déformation : le cristal se met alors à vibrer, nous parlons d'oscillations, et une onde acoustique est générée au sein du matériau. Le quartz vibre préférentiellement à une certaine fréquence proche de la fréquence dite de résonance du cristal de quartz et ce en fonction de différents critères. Quand le quartz est inséré dans un circuit électronique approprié (oscillateur) la vibration peut être entretenue. La fréquence de l'oscillation est alors proche de la fréquence de résonance du cristal et l'amplitude de l'onde générée est maximum.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 14 : Représentation schématique de la déformation d'un quartz de coupe AT polarisé</figcaption></figure>
Le couplage électromécanique et les contraintes résultant du champ électrique appliqué dépendent de la symétrie du cristal, de son angle de coupe et de la configuration des électrodes excitatrices.

Le type d'ondes acoustiques générées dépend essentiellement de la coupe du cristal et de la direction du champ électrique appliqué. Il existe différents modes de vibration comme le mode de vibration en flexion, le mode de vibration longitudinale, le mode de vibration de cisaillement de face et d'épaisseur. Ce dernier mode est utilisé pour les microbalances à quartz classiques.

### 1. 1. 3. Les différentes coupes de quartz et l'effet de la température

La coupe du cristal de quartz, par rapport à ses axes cristallographiques, caractérise son mode de vibration, son domaine de fréquence et sa sensibilité aux variations de température. Le tableau III regroupe quelques coupes avec leurs modes de vibration respectifs.

<table><caption>Tableau III : Caractéristiques de quelques coupes du cristal de quartz</caption><thead><tr><td>Nom de la coupe</td><td>Angle par rapport à l'axe de symétrie</td><td>Mode de vibration</td></tr></thead><tbody><tr><td>AT</td><td>+35°15'</td><td>Cisaillement d'épaisseur</td></tr><tr><td>BT</td><td>-49°</td><td>Cisaillement de face</td></tr><tr><td>CT</td><td>38°</td><td>Cisaillement de face</td></tr><tr><td>DT</td><td>-52°</td><td>Cisaillement de face</td></tr><tr><td>+5°X-cut</td><td>66°</td><td>Longitudinale</td></tr><tr><td>NT</td><td>-</td><td>Flexion</td></tr></tbody></table>

La représentation schématique des différentes coupes du cristal de quartz par rapport aux axes cristallographiques est donnée figure 15.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 15 : Représentation des différentes coupes de cristal de quartz (d'après Mason 1964)
a) coupe X, Y, Z, b) coupes par rapport aux principaux axes, c) coupe GT</figcaption></figure>

Les lames de quartz issues de ces différentes coupes sont plus ou moins sensibles à la température c'est-à-dire que leur fréquence de résonance varient plus ou moins en fonction des variations de température.

Les courbes de la variation relative de la fréquence de résonance en fonction de la température, pour différentes coupes, sont représentées figure 16.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 16 : Variation relative de la fréquence de résonance en fonction de la température pour différentes coupes de quartz (d'après Mason 1964)</figcaption></figure>
La coupe du cristal de quartz sera choisie en fonction des propriétés souhaitées. Dans le cas d'une utilisation de type biocapteur, nous préférerons la coupe AT qui est la plus stable vis-à-vis des variations de température et ce dans un domaine de température assez large (de 0 à 55°C).

La coupe GT présente aussi une grande stabilité vis-à-vis des variations de température mais elle est plus difficile à réaliser et son coefficient de qualité est inférieur à celui de la coupe AT.

# 1. 2. Les différents dispositifs piézoélectriques

## 1. 2. 1. TSM

Les dispositifs à TSM (Thickness Shear Mode) sont basés sur la propagation d'ondes acoustiques en mode de cisaillement d'épaisseur (figure 17) au sein d'une lame de cristal de quartz de coupe AT. Ces dispositifs sont à la base des microbalances à quartz aussi appelées "QCM" pour Quartz Crystal Microbalance.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 17 : a) Représentation schématique d'une onde de cisaillement d'épaisseur dans un cristal de quartz pour le mode de vibration fondamental (n=1) et pour la troisième harmonique (n=3), b) représentation de la vibration en cisaillement d'épaisseur</figcaption></figure>
L'élément actif d'une microbalance à quartz (figure 18) est constituée d'une fine lame de quartz recouverte de deux électrodes métalliques (une sur chaque face).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 18 : Représentation schématique d'une microbalance à quartz</figcaption></figure>

Les électrodes permettent d'établir un champ électrique alternatif au sein du cristal par l'intermédiaire d'un oscillateur dans lequel la lame de quartz est insérée. Le quartz oscille alors à une fréquence proche de la fréquence de résonance du cristal, ce dernier paramètre étant conditionné par l'épaisseur du cristal. Une variation de masse au niveau des électrodes induit une variation de la fréquence d'oscillation qui varie proportionnellement à cette masse. Cette variation peut alors être mesurée par l'intermédiaire d'un fréquencemètre.

La sensibilité massique d'une microbalance à quartz dépend de la fréquence de résonance du cristal : plus la fréquence de résonance est élevée plus la sensibilité est grande. La sensibilité massique de ces transducteurs peut donc être modulée en jouant sur l'épaisseur des cristaux : plus les cristaux sont fins, plus la fréquence de résonance est élevée et plus la sensibilité du dispositif est grande. Classiquement la fréquence des microbalances à quartz utilisables en milieu liquide est comprise entre 5 et 10 MHz (cf tableau II, chapitre I).

Ces dispositifs sont, comme nous l'avons vu dans le chapitre précédent, parfaitement bien adaptés aux applications de type biocapteur. La microbalance à quartz est de ce fait le dispositif piézoélectrique le plus couramment utilisé dans ces applications en raison de sa simplicité de mise en œuvre et de son coût modique. Nous l'avons donc choisi comme transducteur de notre immunocapteur. Toutefois, il existe d'autres transducteurs piézoélectriques que nous allons décrire brièvement maintenant.
### 1. 2. 2. SAW

Les dispositifs à ondes acoustiques de surface (SAW : Surface Acoustic Wave) reposent sur la technologie des électrodes interdigitées (IDTs : Interdigital Transducers). Un exemple de configuration de telles électrodes est donné figure 19.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 19 : Exemple de configuration d'électrodes interdigitées</figcaption></figure>

Ces dispositifs sont basés sur l'étude de la perturbation de la vitesse de propagation d'une onde acoustique (onde de Rayleigh) se propageant entre deux paires d'électrodes interdigitées à la surface d'une plaque de quartz (généralement de coupe ST).

La vitesse de propagation de l'onde, v, est caractéristique du matériau utilisé et de la coupe du cristal. La fréquence de ces dispositifs est simplement fonction de l'espacement des doigts des peignes pour un matériau piézoélectrique donné.

La figure 20 représente un dispositif à onde de surface en configuration ligne à retard : deux paires de peignes sont disposées en vis-à-vis sur une plaque de quartz. La couche sensible est comprise entre ces deux paires d'électrodes. Lorsque cette couche s'alourdit la vitesse de propagation de l'onde acoustique va diminuer proportionnellement à la masse déposée.

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 20 : Représentation schématique d'un dispositif à ondes de surface (SAW)</figcaption></figure>
Les fréquences atteintes avec ce type de dispositif sont en général de l'ordre de 30 à 200 MHz et la sensibilité massique augmente avec le carré de la fréquence comme pour les microbalances à quartz. Des sensibilités massiques très importantes peuvent donc être obtenues mais ces dispositifs à onde de Rayleigh ne fonctionnent qu'en milieu gazeux et ne permettent pas de mettre au point des capteurs utilisables en milieu liquide.

Un autre type d'onde acoustique de surface peut être utilisé avec un autre matériau piézoélectrique que le cristal de quartz pour un fonctionnement en milieu liquide. Il s'agit du dispositif à SH-SAW (Shear Horizontally polarized Surface Acoustic Wave) fonctionnant avec des matériaux piézoélectriques à base de tantalate de lithium (Welsch et al., 1996).

### 1.2.3. APM

Les dispositifs à onde de plaque (APM : Acoustic Plate Mode) sont constitués d'un quartz (plus épais que dans le cas des dispositifs à ondes acoustiques de surface) servant de guide d'onde et de deux paires d'électrodes interdigitées, l'une servant de générateur et l'autre de collecteur de l'onde acoustique. Une représentation schématique d'un dispositif à onde de plaque est donnée figure 21.

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 21 : Représentation schématique d'un dispositif à onde de plaque</figcaption></figure>

Les transducteurs interdigités sont déposés sur la face arrière du quartz alors que la zone sensible est localisée sur la face avant du cristal : ces dispositifs peuvent donc être utilisés en milieu gazeux comme en milieu liquide (les contacts électriques n'ont pas besoin d'être isolés puisqu'ils ne sont pas en contact avec le liquide).

Les ondes de plaques se propagent par réflection sur les parois du substrat piézoélectrique. La superposition de ces ondes donne naissance à une série d'ondes de plaque ayant chacune une fréquence différente. La diminution de l'épaisseur du quartz induit
l'augmentation de la fréquence des ondes de plaque ainsi que l'augmentation de la différence de fréquence entre deux modes.

Les dispositifs à ondes de plaque et leur électronique associée sont conçus pour fonctionner sur un mode particulier. Leurs fréquences de fonctionnement vont de 25 à 200 MHz. Comme pour les dispositifs à SAW, une variation de masse au niveau de la zone sensible se répercutera sur la vitesse de propagation de l'onde de plaque (Hoummady, 1991).

Si les dispositifs à onde de surface et à onde de plaque sont des transducteurs théoriquement très sensibles, peu d'applications de type biocapteur sont retrouvées dans la littérature. Ceci est en partie dû au bruit de fond très important de la fréquence, celui-ci étant d'autant plus difficile à minimiser que la fréquence du dispositif est élevée. De plus, la mise en œuvre de ces dispositifs (électronique associée, électrodes interdigitées) est compliquée et coûteuse et fait appel à des techniques de microtechnologie assez sophistiquées.

## 2. PRINCIPE DE LA MICROBALANCE A QUARTZ

### 2. 1. L'équation de Sauerbrey

Les propriétés piézoélectriques du cristal de quartz permettent de corréler les variations de la fréquence d'oscillation et la masse déposée (ou retirée) sur la surface active du quartz.

Sauerbrey en 1959 fût le premier à établir une équation simple reliant les variations de masse et de fréquence, dans l'air, en considérant que la variation de masse consécutive à un dépôt est assimilable à une augmentation de masse du quartz lui-même.

L'épaisseur du quartz, $e$, est liée à la fréquence de résonance du cristal par la relation suivante :

$$e = \frac{n\lambda_n}{2}$$

$$\text{avec } \lambda_n = v \times T = v \times \frac{1}{f_n}$$

où : $n$ est le rang de l'harmonique (1, 3, 5...), $\lambda_n$ est la longueur d'onde correspondant à la fréquence, $v$ est la vitesse de propagation de l'onde ultrasonore
dans le quartz (3340 m. s⁻¹), T est la période et *f*<sub>n</sub> est la fréquence de résonance du cristal en Hz (fréquence fondamentale pour n = 1 ou fréquence correspondant à l'harmonique pour n différent de 1).

$$e = \frac{nN}{f_n} \qquad (1)$$

$$\text{avec } N = \frac{v}{2}$$

L'épaisseur du quartz est aussi liée à sa masse par la relation suivante :

$$e = \frac{m}{A\rho} \qquad (2)$$

où : m est la masse du quartz en g, A est la surface du quartz active (i.e. la surface des électrodes) en cm² et ρ est la densité du quartz (2,648 g. cm⁻³).

En combinant les équations (1) et (2), la relation suivante est obtenue :

$$f_n = \frac{nNA\rho}{m} \qquad (3)$$

Si une masse Δm, s'attachant uniformément sur une des électrodes, de surface A, est ajoutée et en faisant l'hypothèse que cette masse correspond à une augmentation de masse du quartz lui-même l'équation devient :

$$\Delta f_n + f_n = \frac{nNA\rho}{m + \Delta m} \qquad (4)$$

où : Δf<sub>n</sub> correspond à la variation de fréquence consécutive à la variation de masse.

En réarrangeant l'équation (4) nous obtenons :

$$\Delta f_n + f_n = \frac{nNA\rho}{m(1 + \frac{\Delta m}{m})} \qquad (5)$$
En faisant l'hypothèse que $\Delta m$ est très petit devant $m$, sont obtenues successivement :

$$ \Delta f_n + f_n = \frac{nNa\rho}{m} \times \left(1 - \frac{\Delta m}{m}\right) \qquad (6) $$

$$ \Delta f_n = \frac{nNa\rho}{m} \times \left(1 - \frac{\Delta m}{m}\right) - f_n \qquad (7) $$

$$ \Delta f_n = \frac{nNa\rho}{m} \times \left(1 - \frac{\Delta m}{m}\right) - \frac{nNa\rho}{m} \qquad (8) $$

$$ \Delta f_n = - \frac{nNa\rho}{m^2} \times \Delta m \qquad (9) $$

En remplaçant $m$ par $\frac{nNA\rho}{f_n}$ la relation suivante est finalement obtenue :

$$ \Delta f_n = -\frac{1}{N\rho} \times \frac{f_n^2}{n} \times \frac{\Delta m}{A} \qquad (10) $$

L'application numérique donne alors :

$$ \Delta f_n = -2,26 \times 10^{-6} \times \frac{f_n^2}{n} \times \frac{\Delta m}{A} \qquad (11) $$

$$ \text{d'où } \Delta f_n = -k \times \frac{\Delta m}{A} \qquad (12) $$

avec $k = 2,26 \times 10^{-6} \times \frac{f_n^2}{n}$ en Hz. g$^{-1}$.cm$^2$ qui représente le coefficient de sensibilité massique de la microbalance à quartz.

L'équation de Sauerbrey (11) montre qu'une augmentation de masse au niveau de l'électrode provoque une diminution de la fréquence et que la sensibilité massique d'une microbalance à quartz augmente avec le carré de la fréquence de résonance du cristal utilisé.

Cette propriété est particulièrement intéressante puisqu'il suffit, pour augmenter la sensibilité d'une microbalance, d'utiliser des quartz ayant une fréquence de résonance élevée.
La fréquence de résonance fondamentale d'un cristal de quartz est inversement proportionnelle à son épaisseur : plus le quartz est mince, plus sa fréquence de résonance est élevée. C'est donc l'épaisseur du cristal qui limite la sensibilité des microbalances puisqu'en dessous d'une certaine limite les quartz sont trop fins et deviennent alors difficilement manipulables. De plus, l'électronique associée aux fréquences de résonance élevées est aussi plus difficile à mettre en oeuvre.

Par exemple, un cristal de coupe AT oscillant à 6 MHz en mode fondamental a une épaisseur de 280 µm, et pour une fréquence fondamentale de 9 MHz l'épaisseur est de 190 µm. La limite physique pour des quartz d'une taille classique (diamètre de l'ordre d'une dizaine de millimètres) se situe aux alentours de 10 MHz en fréquence de résonance fondamentale.

Néanmoins, la sensibilité d'une microbalance à quartz peut encore être augmentée, malgré cette limite, en travaillant sur une *harmonique* de la fréquence fondamentale. C'est cette voie que nous avons choisie pour mettre au point une microbalance "ultrasensible" fonctionnant à 27 MHz. En effet, des quartz ayant une fréquence de résonance fondamentale de 9 MHz peuvent osciller à 27 MHz sur la troisième harmonique par le biais d'un oscillateur adéquat.

Le tableau IV regroupe les différents coefficients de sensibilité théorique correspondant à différentes fréquences de résonance.

<table><caption>Tableau IV : Sensibilité théorique de différentes microbalances ayant différentes fréquences de résonance</caption><thead><tr><td>Fréquence de résonance en MHz</td><td>Épaisseur du cristal en µm</td><td>Coefficient de sensibilité théorique calculé à partir de l'équation de Sauerbrey en Hz.g<sup>-1</sup>.cm<sup>2</sup></td><td>Gain en sensibilité par rapport à une microbalance à 6 MHz</td></tr></thead><tbody><tr><td>6 sur le mode fondamental</td><td>278</td><td>8,14. 10<sup>7</sup></td><td>-</td></tr><tr><td>9 sur le mode fondamental</td><td>185</td><td>18,31. 10<sup>7</sup></td><td>x2,25</td></tr><tr><td>9 sur le partiel 3 soit 27 MHz</td><td>185</td><td>54,95. 10<sup>7</sup></td><td>x6,75</td></tr><tr><td>27 sur le fondamental</td><td>62</td><td>164,85. 10<sup>7</sup></td><td>x20,25</td></tr></tbody></table>

En passant d'une microbalance à quartz fonctionnant à 6 MHz à un dispositif oscillant à 27 MHz (sur le partiel trois d'un quartz à 9 MHz) une augmentation de la sensibilité massique théorique d'un facteur environ 7 est obtenue. Ce gain est 3 fois plus important en travaillant à
27 MHz sur la fréquence de résonance fondamentale (soit une augmentation d'un facteur 20 de la sensibilité par rapport à un dispositif fonctionnant à 6 MHz).

Les limites de détection théoriques peuvent être calculées à partir des coefficients de sensibilité pour différentes microbalances, celles-ci sont présentées dans le tableau V.

<table><caption>Tableau V : Limites de détection théoriques pour différentes microbalances à quartz</caption><thead><tr><td>Fréquence de résonance en MHz</td><td>Coefficient de sensibilité théorique calculé à partir de l'équation de Sauerbrey (en Hz.g<sup>-1</sup>.cm<sup>2</sup>)</td><td>Masse correspondant à une chute de fréquence de 1 Hz (en ng/cm<sup>2</sup>)</td><td>Masse correspondant à une chute de fréquence de 1 Hz pour une électrode de 0,2 cm<sup>2</sup> (en ng)</td></tr></thead><tbody><tr><td>6 sur le mode fondamental</td><td>8,14. 10<sup>7</sup></td><td>12,28</td><td>2,457</td></tr><tr><td>9 sur le mode fondamental</td><td>18,31. 10<sup>7</sup></td><td>5,46</td><td>1,092</td></tr><tr><td>9 sur le partiel 3 soit 27 MHz</td><td>54,95. 10<sup>7</sup></td><td>1,82</td><td>0,364</td></tr></tbody></table>

Les fréquencemètres permettent de mesurer la fréquence des quartz avec une précision inférieure au dixième de Hz, nous pourrions donc envisager une limite de détection encore plus basse. Néanmoins, il faut considérer le bruit de fond de la fréquence, qui augmente avec la sensibilité, et qui peut être stabilisé au niveau du Hz dans le meilleur des cas.

La limite de détection théorique du dispositif mis au point est de 364 pg pour une électrode de 0,2 cm² et pour une variation de fréquence de 1 Hz. Du point de vue pratique, nous nous sommes limités à un quartz à 9 MHz sur le partiel 3 car les quartz de fréquence de résonance 27 MHz sont de diamètre trop faible.
## 2. 2. Comparaison des sensibilités massiques des différents transducteurs piézoélectriques

Le tableau VI regroupe les différentes sensibilités théoriques des trois principaux transducteurs piézoélectriques : les dispositifs TSM, SAW et APM.

<table><caption>Tableau VI : Sensibilités massiques théoriques des différents transducteurs piézoélectriques</caption><thead><tr><th>Dispositif</th><th>Coefficient de sensibilité théorique k en Hz. g<sup>-1</sup>. cm<sup>2</sup></th><th>Δmasse correspondant à un Δf de 1 Hz pour une fréquence de résonance donnée (f)</th></tr></thead><tbody><tr><td>TSM<br>[Image: Transducer TSM]</td><td>k = -2,26.10<sup>-6</sup> × <sup>f<sub>n</sub><sup>2</sup></sup>/<sub>n</sub></td><td>f = 6 MHz → 12,3 ng.cm<sup>-2</sup><br>f = 27 MHz (9 MHz sur le partiel 3) → 1,8 ng.cm<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>SAW<br>[Image: Transducer SAW]</td><td>k = -2,26.10<sup>-6</sup> × f<sup>2</sup></td><td>f = 200 MHz → 0,01 ng.cm<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>APM<br>[Image: Transducer APM]</td><td>k = -20f (pour n≥1)</td><td>f = 104 MHz → 0,5 ng.cm<sup>-2</sup></td></tr></tbody></table>

Les dispositifs à SAW présentent la meilleure sensibilité théorique (10 pg.cm⁻²) mais ne fonctionnent qu'en milieu gazeux.

Pour des dispositifs fonctionnant en milieu liquide, les transducteurs à modes de plaque sont théoriquement plus sensibles que les microbalances à quartz, bien que cet écart soit moins important pour des microbalances fonctionnant à haute fréquence comme notre dispositif. Mais, pratiquement le bruit de fond des dispositifs à mode de plaque est très important et difficile à réduire en raison des fréquences d'utilisation très élevées. Ceci relativise cette différence de sensibilité par rapport aux microbalances à quartz, qui sont, en outre, beaucoup plus faciles à mettre en œuvre pour un coût considérablement moins important.
### 2.3.2. Influence combinée du liquide et d'un dépôt

Martin (Martin et al., 1991) a démontré que dans le cas d'un dépôt de faible masse effectué dans un liquide Newtonien, les variations de fréquence dues à la masse déposée et au couplage avec le liquide sont additives.

Sa théorie repose sur une analyse électromécanique qui aboutit à une modélisation électrique d'un résonateur simultanément chargé par un film mince et un liquide. En faisant les hypothèses suivantes : épaisseur des électrodes négligeable, masse déposée rigidement liée au quartz, continuité du déplacement à l'interface quartz / film (hypothèses de Sauerbrey) et en considérant que le liquide est d'épaisseur semi infinie, l'équation suivante est obtenue :

$$ \Delta_f \equiv - \frac{2f_s^2}{n\sqrt{c_{66}\rho_q}} \left[ \rho_f h_f + \left( \frac{\rho_L \eta_L}{4\pi f_s} \right)^{1/2} \right] \quad (17) $$

où : $f_s$ est la fréquence de résonance série du quartz, $n$ est l'ordre de l'harmonique, $c_{66}$ est la constante élastique complexe du quartz, $\rho_L$ la densité du liquide, $\rho_q$ la densité du quartz, $\rho_f$ la densité du film, $\eta_L$ la viscosité dynamique du liquide et $h_f$ l'épaisseur du film.

En introduisant $\sqrt{\frac{c_{66}}{\rho_q}} = v_q$, vitesse de propagation de l'onde acoustique dans le quartz, et en se plaçant sur le mode fondamental (n=1), l'équation (17) devient :

$$ \Delta_f \equiv - \left[ \frac{2f_s^2}{v_q \rho_q} \rho_f h_f + f_s^{1/2} \left( \frac{\rho_L \eta_L}{\pi c_{66} \rho_q} \right)^{1/2} \right] \quad (18) $$

Nous pouvons remarquer que deux termes distincts s'ajoutent : le premier correspond à la variation de fréquence liée au film déposé (d'après Sauerbrey, équation (11)) et le deuxième correspond à la variation de fréquence liée au contact avec le liquide (d'après Kanazawa, équation (15)). Ainsi, les variations de fréquence de la microbalance à quartz dues à la masse déposée et au liquide sont additives.

Cette relation montre que pour relier strictement la variation de fréquence à la masse d'un dépôt (purement élastique), les propriétés du liquide (viscosité et densité) et la température doivent rester constantes lors du dépôt. D'une part, une variation de température peut faire varier la fréquence de résonance (même pour des quartz de coupe AT qui sont les moins
sensibles à ce facteur) et d'autre part, une variation de température peut entraîner une modification de la viscosité des solutions ce qui conduit aussi à une variation de fréquence.

De plus, le dépôt lui-même n'est pas purement élastique comme il est considéré dans les hypothèses de départ, surtout si nous considérons une couche de protéines. Les propriétés visco-élastiques de cette couche peuvent aussi jouer sur la fréquence de résonance de la microbalance en parallèle de l'effet purement massique.

Dans le cadre de notre application immunocapteur, nous nous intéressons à une réponse *relative* de la microbalance et non pas à une réponse absolue, puisque nous réalisons une gamme d'étalonnage avec des solutions d'antigène en concentration connue et que la réponse de la solution à tester est comparée à cette gamme d'étalonnage. Il est néanmoins important de comprendre et de modéliser, le comportement de la microbalance en milieu liquide et avec une (ou plusieurs) couche(s) de protéines. En particulier, pour essayer de discriminer les différents effets (masse du dépôt et propriétés physico-chimiques du liquide et du dépôt) qui font varier la fréquence de la microbalance.

# 3. ETUDE DU MECANISME DE TRANSDUCTION DE LA MICROBALANCE A QUARTZ PAR DES MESURES D'ADMITTANCE ELECTROACOUSTIQUE

## 3. 1. Introduction

Nous avons vu qu'il était important de comprendre le mécanisme de transduction de la microbalance à quartz dans le cadre de notre étude et en particulier pour discriminer les effets sur la réponse en fréquence de différents paramètres. Ceci est possible grâce à la mesure de l'admittance électroacoustique du résonateur à quartz.

## 3. 2. Définitions et intérêt de la mesure d'admittance électroacoustique

Un résonateur à quartz peut être modélisé par un *circuit électrique équivalent* (figure 22), connu sous le nom de Butterworth-van Dyke, constitué d'une capacité statique, $C_p$, en parallèle avec une branche dynamique (une résistance, R, une inductance, L et une capacité, C, placées en série).
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 22 : Circuit électrique équivalent modélisant le comportement électrique d'un quartz</figcaption></figure>

Les caractéristiques électriques de la microbalance à quartz peuvent être évaluées à travers une grandeur physique appelée *admittance électroacoustique*, définie comme le rapport entre le courant traversant le quartz et la tension d'excitation appliquée entre ses électrodes (l'admittance électroacoustique, Y, est la grandeur inverse de l'impédance électroacoustique, Z).

La mesure de l'admittance électroacoustique permet donc de déterminer les éléments du circuit équivalent qui peuvent être reliés aux propriétés physiques du quartz mais aussi aux propriétés du dépôt massique et aux propriétés du liquide en contact avec le quartz (Granstaff et Martin, 1994). Elle peut permettre ainsi de faire la distinction entre les effets, sur la réponse globale en fréquence de la microbalance, des différents phénomènes qui surviennent à la surface du transducteur, telles que les variations de masse, de viscosité et de densité de la solution et de viscoélasticité de la couche sensible déposée à la surface du quartz.

Notons que lors de cette mesure le quartz est dit *passif* : il est soumis à une tension électrique sinusoïdale et son admittance au voisinage de sa fréquence de résonance est mesurée, alors qu'un quartz utilisé en microbalance est dit *actif* : c'est-à-dire que nous le soumettons à des oscillations, entretenues par le quartz lui-même, sur son mode fondamental ou sur ses harmoniques et les variations de sa fréquence de résonance sont mesurées.

### 3.3. Théorie

Pour un résonateur à quartz, en référence au circuit équivalent de Butterworth-van-Dyke modélisant un quartz non chargé (figure 22), l'admittance électroacoustique calculée est donnée par la relation suivante :
$$Y = j\omega C_p + \frac{1}{R + j\omega L + \frac{1}{j\omega C}} \quad (19)$$

En séparant partie réelle et imaginaire, l'admittance devient :

$$Y = G + jB \quad (20)$$

où G est la conductance telle que,

$$\mathrm{Re}(Y) = G = \frac{R}{R^2 + \left( L\omega - \frac{1}{C\omega} \right)^2} \quad (21)$$

et B la susceptance,

$$\mathrm{Im}(Y) = B = \omega C_p - \frac{L\omega - \frac{1}{C\omega}}{R^2 + \left( L\omega - \frac{1}{C\omega} \right)^2} \quad (22)$$

En combinant ces expressions, au voisinage de la résonance, la relation suivante est obtenue :

$$(G - \frac{1}{2R})^2 + (B - \omega_s C_p)^2 = \left(\frac{1}{2R}\right)^2 \quad (23)$$

avec $\omega_s = 2 \pi f_s$

Dans le plan de Nyquist, où l'axe des abscisses correspond à l'axe des réels et l'axe des ordonnées correspond à l'axe des imaginaires, l'équation (23) est celle d'un cercle tangent à l'axe des imaginaires, de rayon $1/2R$ et de centre de coordonnées $(1/2R, \omega_s C_p)$. La figure 23 donne une représentation de l'admittance d'un quartz dans le plan de Nyquist (Reese et Kanazawa, 1986).
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 23 : Représentation de l'admittance d'un quartz dans le plan de Nyquist</figcaption></figure>

Des fréquences particulières peuvent être définies dans la représentation dans le plan de Nyquist, elles sont visualisées dans la figure 23. Celles-ci peuvent être comparées à la fréquence délivrée par la microbalance.

La fréquence $f_s$ est la fréquence correspondant au maximum de la conductance, elle est appelée fréquence de résonance série. Elle est définie par l'équation suivante (Noël et Topart, 1994) :

$$f_s = \frac{1}{2\pi \sqrt{LC}} \qquad (24)$$

Cette fréquence série dépend de la masse, des propriétés visco-élastiques de la couche et de la viscosité et de la densité du liquide. Les fréquences $f_{\phi1}$ et $f_{\phi2}$ sont les fréquences pour lesquelles la partie imaginaire de l'admittance du résonateur s'annule (dites fréquences à phase nulle). Expérimentalement, la fréquence d'oscillation mesurée à l'aide d'un dispositif microbalance se situe toujours en valeur absolue entre $f_s$ et $f_{\phi1}$ pour les oscillateurs que nous utilisons et pour des mesures en milieu liquide.

L'évolution de la fréquence de la microbalance consécutivement à un dépôt en milieu liquide est facilement mesurable (c'est notre transducteur) mais nous ne savons pas la calculer théoriquement. Par contre, $f_s$ est à la fois facilement déterminable (comme nous venons de le voir à partir des mesures d'admittance) et nous pouvons calculer théoriquement ses variations en fonction des différents paramètres caractéristiques du dépôt et du liquide (comme nous le
verrons plus loin). Il est donc intéressant de comparer les variations de la fréquence de la microbalance et celles de la fréquence série. Pour ce faire, nous avons mis au point un dispositif expérimental qui nous permet de réaliser alternativement sur le même transducteur des mesures d'admittance (quartz en mode passif) et de fréquence microbalance (quartz en mode actif).

Nous pouvons également déterminer la valeur de la résistance motionnelle, R, à partir des mesures d'admittance. Ce paramètre n'est pas sensible à la masse, mais dépend des propriétés viscoélastiques de la couche, de la densité et de la viscosité du liquide.

# 4. MODELISATION DU FONCTIONNEMENT DU RESONATEUR PIEZOELECTRIQUE

## 4.1. Introduction

L'objectif de la modélisation est de calculer théoriquement la fréquence série et la résistance motionelle d'un résonateur à quartz en tenant compte des caractéristiques physico-chimiques du film et du liquide. Il s'agira de prédire l'influence de ces paramètres sur la réponse du résonateur. Parmi tous les modèles physiques qui permettent de simuler le comportement du résonateur à quartz (Granstaff et Martin, 1994; Filiâtre, 1994), le modèle développé par Gabrielli (Gabrielli et al., soumise) présente une approche relativement simple, claire et complète du problème. De plus, ce modèle permet de simuler facilement le comportement électroacoustique de couches additionnées successivement sur le résonateur à quartz. Nous commencerons, dans ce sous-chapitre, par donner la définition de quelques grandeurs caractéristiques puis nous présenterons rapidement le modèle. Enfin, nous terminerons par une simulation concernant l'évolution de la fréquence série et de la résistance motionelle en fonction des paramètres caractéristiques du film : masse et coefficient de cisaillement complexe. Ce dernier caractérise les propriétés viscoélastiques du dépôt.

## 4.2. Rappels généraux

Au sein des matériaux piézoélectriques, les propriétés élastiques et piézoélectriques sont couplées. Avec les notations habituelles pour un cristal de quartz deux équations sont obtenues en fonction de deux variables indépendantes, S<sub>6</sub> et E<sub>2</sub> :

$$ T_6 = c_{66}S_6 - e_qE_2 + \eta_q \frac{\partial S_6}{\partial t} \quad (25) $$
$$D_2 = e_{26}S_6 + \varepsilon_q E_2 \qquad (26)$$

La première partie de l'équation (25) représente la relation linéaire (modèle à une seule dimension) entre le tenseur des contraintes ($T_6$) et le tenseur des déformation du matériau ($S_6$), le coefficient $c_{66}$ étant la constante de rigidité élastique. Cette relation est communément appelée loi de Hooke. Le deuxième élément correspond à la contribution piézoélectrique où $E_2$ est le champ électrique et $e_q$ la constante piézoélectrique. La dernière partie concerne le terme de perte ou d'adsorption ("viscosité du matériau") où la constante de viscosité du cristal, $\eta_q$, est introduite. La deuxième équation (26) représente l'expression du déplacement électrique, $D_2$, en fonction des contraintes et du champ électrique, $\varepsilon_q$ étant la constante diélectrique du quartz.

Le déplacement en cisaillement, $u_x(y,t)$, peut s'écrire d'après la loi de Newton. Pour un modèle unidimensionnel, l'équation de propagation s'écrit alors :

$$\frac{\partial T}{\partial y} = \rho \frac{\partial^2 u_x}{\partial t^2} = \rho \frac{\partial v_x}{\partial t} \qquad (27)$$

où T est la contrainte externe, $v_x$ la vitesse et $\rho$ est la masse volumique du cristal.

A partir de cette équation, il est alors possible de trouver une solution générale et de calculer les vitesses de déplacement, $v_x$.

Une impédance électrique correspond au rapport entre une tension et un courant. Par analogie en mécanique, il est possible d'assimiler la tension électrique à la contrainte ($T_6$) et le courant électrique avec la vitesse ($v_x$). Dans ce cas, Z, l'impédance acoustique du matériau est définie par :

$$Z = -\frac{T_6}{v_x} \qquad (28)$$

En réorganisant cette relation (Rosembaum, 1988), il vient :

$$Z = \sqrt{\rho \times C} \qquad (29)$$

où $\rho$ représente la masse volumique du matériau et C le coefficient complexe de cisaillement.

Il faut aussi définir la constante de propagation complexe :
$$ \theta = j \times \omega \times \sqrt{\frac{p}{C}} \qquad (30) $$

### 4. 3. Modélisation

Une analogie entre les variables mécaniques et électriques permet de calculer, relativement simplement, l'admittance électroacoustique du résonateur à quartz chargé. Des rappels sur les modèles basés sur les lignes de transmission seront donnés et plusieurs cas seront distingués : matériau non piézoélectrique chargé ou non, matériau piézoélectrique non chargé et chargé et enfin résonateur chargé plongeant dans un liquide. Ce dernier cas correspond à notre configuration, c'est-à-dire au résonateur à quartz fonctionnant en milieu liquide avec un film déposé à sa surface.

#### 4. 3. 1. Cas d'un matériau non piézoélectrique

La figure 24 présente le cas d'un matériau non piézoélectrique chargé. Il est alors possible de calculer son impédance caractéristique, $Z_{in}$. L'impédance de charge est notée $Z_L$ et correspond à l'impédance caractéristique vue par notre matériau. Ce dernier est caractérisé par son impédance acoustique, Z, sa constante de propagation complexe, $\theta$ et son épaisseur, h.

Alors $Z_{in}$ se calcule à partir l'équation suivante :

$$ Z_{in} = Z \times \frac{Z_L + Z \times \text{th}(\theta h)}{Z + Z_L \times \text{th}(\theta h)} \qquad (31) $$

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 24 : Représentation schématique de l'impédance caractéristique, $Z_{in}$, d'un matériau ou d'une solution en fonction de l'impédance de charge, $Z_L$</figcaption></figure>
Pour le cas particulier où le matériau est dans l'air, l'impédance de charge, $Z_L$, peut être considérée comme nulle et il vient pour l'impédance caractéristique après simplification :

$$Z_{in} = Z \times \tanh(\theta h) \qquad (32)$$

Lorsque plusieurs couches, non piézoélectriques, sont placées les unes sur les autres, il est possible de calculer l'impédance caractéristique globale. Chaque couche, i, sera caractérisée par son impédance acoustique, $Z_i$, sa constante de propagation complexe, $\theta_i$, et son épaisseur, $h_i$. $Z_{in}$ pour la couche i est calculée grâce à l'équation 31 où l'impédance de charge correspond à l'impédance caractéristique de la couche i+1.

### 4. 3. 2. Cas d'un résonateur à quartz ou d'un matériau piézoélectrique seul

Le circuit équivalent de Mason (O'Donnell et al., 1981) permet de calculer l'impédance électroacoustique du résonateur non chargé comme nous pouvons le voir sur la figure 25. Ce modèle basé sur les lignes de transmission est utilisé et des paramètres fondamentaux, caractéristiques du matériau piézoélectrique, sont alors définis :

$$Z_1 = A Z_q \tanh (\theta_q h_q / 2) \qquad (33)$$

$$Z_2 = A \frac{Z_q}{\sinh (\theta_q h_q)} \qquad (34)$$

où A est la surface active du transducteur, $Z_q$ l'impédance acoustique du quartz, $\theta_q$ la constante de propagation complexe de l'onde ultrasonore et $h_q$ l'épaisseur du quartz.

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 25 : Représentation schématique du circuit équivalent de Mason du quartz seul dans l'air</figcaption></figure>
La capacité statique du cristal, C₀, est définie classiquement comme suit :

$$C_o = \frac{\epsilon_q A}{h_q} \qquad (35)$$

où $\epsilon_q$ représente la constante diélectrique du quartz, A la surface active et h_q l'épaisseur du quartz.

Un terme de transformation, caractéristique du phénomène piézoélectrique, est alors posé afin de faciliter les calculs :

$$N = \left( \frac{e_q C_o}{\epsilon_q} \right)^2 \qquad (36)$$

L'impédance motionelle du résonateur, Zm, s'écrit alors :

$$Z_m = \frac{j}{\omega \times C_o} + \frac{Z}{N^2} \qquad (37)$$

où Z se calcule avec Z₁ et Z₂ (figure 25).

Il vient alors :

$$Z = Z_2 + \frac{1}{\frac{1}{Z_1} + \frac{1}{Z_1}} \qquad (38)$$

L'admittance électroacoustique théorique, Y, du résonateur est calculée à partir des deux branches du circuit équivalent : statique et motionnelle, avec l'impédance motionnelle, Zm.

$$Y = jC_o\omega + \frac{1}{Z_m} \qquad (39)$$

### 4. 3. 3. Cas d'un résonateur à quartz chargé

Dans le cas d'un dispositif chargé (électrode, film, solution...), l'impédance globale doit tenir compte des impédances de charge sur chaque face du cristal (figure 26).
Nous avons toujours :

$$Z_m = - \frac{1}{j\omega C_o} + \frac{Z}{N^2} \qquad (40)$$

mais dans ce cas, en tenant compte de $Z_{L1}$ et $Z_{L2}$, il vient :

$$Z = Z_2 + \frac{1}{\frac{1}{Z_1} + \frac{1}{Z_1 + Z_{L2}}} \qquad (41)$$

où $Z_{L1}$ et $Z_{L2}$ représentent les impédances de charge sur chacune des faces du cristal.

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 26 : Représentation schématique du circuit équivalent de type Mason du résonateur à quartz chargé</figcaption></figure>

L'admittance électroacoustique théorique, Y, du résonateur est calculée à partir des deux branches du circuit équivalent : statique et motionnelle, avec l'impédance motionnelle, $Z_m$.

$$Y = jC_o\omega + \frac{1}{Z_m} \qquad (42)$$

### 4.3.4. Cas de la microbalance à quartz avec un dépôt et en milieu liquide

Pour notre application, nous nous situons dans la configuration suivante :

- charge sur la face 1 du cristal : air / électrode d'or

- charge sur la face 2 du cristal : liquide semi infini / film / électrode d'or.
L'impédance de charge, $Z_L$, sur chaque face est calculée pour pouvoir estimer $Z$ (équation 37). Dans ce cas précis, la charge sur la face 1 devient, d'après la figure 27, et avec un contact avec l'air :

$$Z_{L1} = Z_{e1} \times \frac{\text{th}(\theta_{e1}, h_{e1})}{\theta_{e1}} \quad (43)$$

avec $Z_{L1}$ impédance de charge sur face 1, $Z_{e1}$, impédance acoustique de l'électrode en or, $\theta_{e1}$, constante de propagation complexe et $h_{e1}$ épaisseur de l'électrode.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 27 : Représentation schématique de l'impédance caractéristique d'une électrode à l'air</figcaption></figure>

Pour la face 2, il est nécessaire d'utiliser la relation (31) pour mettre "en cascade" les différents milieux comme le présente la figure 28. La charge constituée par la solution et le film devient :

$$Z_{EF} = Z_f \times \frac{Z_{so} + Z_f \times \text{th}(\theta_f, h_f)}{Z_f + Z_{so} \times \text{th}(\theta_f, h_f)} \quad (44)$$

où $Z_f$ est l'impédance acoustique du film, $\theta_f$, la constante de propagation complexe, $h_f$ l'épaisseur du film et $Z_{so}$ l'impédance acoustique de la solution.

Ainsi, l'impédance de charge de la face 2 se calcule comme suit à partir de $Z_{EF}$ (figure 28) :

$$Z_{L2} = Z_{e2} \times \frac{Z_{EF} + Z_{e2} \times \text{th}(\theta_{e2}, h_{e2})}{Z_{e2} + Z_{EF} \times \text{th}(\theta_{e2}, h_{e2})} \quad (45)$$
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 28 : Représentation schématique de l'impédance caractéristique d'une électrode chargée par un film au contact d'une solution</figcaption></figure>

La connaissance de $Z_{L1}$ et $Z_{L2}$ permet de calculer $Z$ et par conséquent $Z_m$. Lors de la simulation, l'impédance motionelle $Z_m$ est une fonction de la fréquence (pulsation) : nous pouvons calculer numériquement la valeur de fréquence qui annule la partie imaginaire de $Z_m$ et qui correspond à la fréquence série $f_s$. La résistance motionelle $R$ équivaut simplement à la partie réelle de $Z_m$.

## 4. 4. Simulation du fonctionnement de la microbalance à quartz

### 4. 4. 1. Généralités

Notre but est de calculer l'admittance électroacoustique, $Y$, d'un résonateur aux alentours de 27 MHz, sur lequel se trouve une monocouche fictive de protéines : nous tiendrons compte de la masse adsorbée et des propriétés viscoélastiques de cette dernière (caractérisées par le coefficient de cisaillement complexe). Dans ce calcul, la masse de protéines est maintenue constante et c'est le coefficient de cisaillement complexe qui est changé. Celui-ci tient compte, à la fois, du coefficient de cisaillement élastique du film (caractérisant son élasticité) et de sa viscosité. Son influence sur la réponse de la fréquence série et de la résistance motionelle sera examinée. L'idée est d'estimer l'importance de ce paramètre sur la réponse de notre transducteur par rapport à la contribution purement massique due au film déposé.

La densité du film est prise égale à 1200 kg/m³ (Rodalh et al., 1997) et son épaisseur est de 50 Å. Nous travaillons dans ce qui suit à masse constante, cette dernière correspond approximativement à celle d'un film de protéines. Les tableaux VII et VIII regroupent les différentes données relatives au quartz et aux électrodes en or (Bouché-Pillon, 1996) que nous avons fixées pour réaliser les simulations. Concernant la viscosité et la densité de la solution, nous avons pris les valeurs correspondant à celles de l'eau.
<table><caption>Tableau VII : Données utilisées concernant le quartz</caption><thead><tr><th>Epaisseur, µm</th><th>Masse volumique, kg/m³</th><th>Constante piézoélectrique, C/m²</th><th>Coefficient complexe de cisaillement</th></tr></thead><tbody><tr><td>183</td><td>2651</td><td>0,091</td><td>2,947x10<sup>10</sup>+jxω x50x10<sup>-4</sup></td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau VIII : Données utilisées concernant les électrodes en or</caption><thead><tr><th>Epaisseur, Å</th><th>Densité, kg/m³</th><th>Coefficient de rigidité élastique, N/m²</th></tr></thead><tbody><tr><td>1400</td><td>19300</td><td>27,8x10<sup>9</sup></td></tr></tbody></table>

### 4. 4. 2. Influence du coefficient de cisaillement élastique du film sur la réponse du résonateur

Nous allons d'abord étudier l'influence des propriétés élastiques du dépôt (assimilé à une couche de protéine) sur la réponse du résonateur en analysant les résultats des simulations de l'admittance ou plus précisément en calculant l'évolution de $f_s$ et R. Pour une viscosité constante de la couche (0,1 kg. m⁻¹. s⁻¹), la figure 29 présente l'évolution de $f_s$ retranchée de sa valeur dans l'eau sans film ($f_s$ dans l'eau = 26968002 Hz) en fonction du coefficient de cisaillement élastique.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 29 : Evolution de la fréquence série théorique en fonction du coefficient de cisaillement élastique</figcaption></figure>

Pour des valeurs de coefficient élastique de cisaillement, proche de $10^{10}$ N/m², le film peut être considéré comme purement élastique : la variation de $f_s$ correspondant à l'addition du film, en milieu liquide, correspond alors à une diminution de 328,5 Hz. Cette réponse équivaut
à la contribution purement massique du film. Pour une viscosité fixe et une masse constante, nous constatons que la réponse de $f_s$ en fonction du coefficient de cisaillement élastique varie peu, ces variations étant inférieures à 1 %, même pour une gamme de ce coefficient très grande. Les variations des propriétés élastiques de la couche de protéines adsorbées influencent donc peu la réponse de $f_s$ à la masse.

La résistance motionelle théorique, $R_{th}$, varie elle aussi faiblement en fonction du coefficient de cisaillement élastique comme le présente la figure 30 : pour une résistance théorique de 523,8 Ω dans l'eau sans film déposé sur le résonateur, la variation théorique n'atteint pas 0,1 % lorsque le coefficient de cisaillement élastique du film déposé varie. Il est à noter que cette valeur de $R_{th}$ ne varie pas lors de l'ajout d'un matériau purement élastique (coefficient de cisaillement de l'ordre de $10^{10}$ N/m²) comme le prévoit la théorie.

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 30 : Evolution de la résistance motionelle théorique en fonction du coefficient de cisaillement élastique</figcaption></figure>

### 4. 4. 3. Influence de la viscosité du film sur la réponse du résonateur

Pour étudier l'influence des variations de la viscosité du film sur la réponse du résonateur, nous avons maintenu constant le coefficient de cisaillement élastique (fixé à $10^6$ N/m²) pour s'affranchir des effets élastiques de la couche et n'étudier que ses propriétés visqueuses. Les figures 31 et 32 présentent l'influence des variations de la viscosité du film sur $f_s$ et $R_{th}$ calculées.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 31 : Evolution de la fréquence série théorique en fonction de la viscosité du film</figcaption></figure>

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 32 : Evolution de la résistance motionelle théorique en fonction de la viscosité du film</figcaption></figure>

Concernant la fréquence série, des modifications de la viscosité du film font varier $f_s$ d'environ 25 Hz ce qui correspondrait à une erreur d'environ 8 % au maximum sur l'estimation de la masse. Sur la résistance motionelle, des variations de la viscosité provoque une variation de R de l'ordre d'une dizaine de Ω ce qui correspond à une variation relative de 2 %. D'après notre modèle, la fréquence série et la résistance sont plus sensibles aux modifications de la viscosité du film qu'aux modifications de son élasticité. Nous pouvons noter que R ne dépend que des propriétés viscoélastiques du film et pas de la masse, alors que $f_s$ dépend des deux.
## 4. 5. Conclusion

En conclusion, notre modèle montre que les propriétés mécaniques du film, dans les conditions que nous avons fixées (épaisseur du film de 50 Å, densité du film de 1200 kg/m³, densité et viscosité du liquide assimilées à celles de l'eau), influencent peu la réponse du résonateur (sur $f_s$ et R). Par rapport à la réponse obtenue suite à un ajout de matière purement élastique (c'est-à-dire un dépôt qui correspond aux conditions idéales pour la réponse massique de la microbalance à quartz) l'erreur sur l'estimation de la masse calculée à partir de $f_s$ est, dans le pire des cas, de 8 %. Connaissant l'effet des propriétés viscoélastiques sur le comportement de $f_s$, il sera intéressant de comparer son évolution (mesurée par les mesures d'admittance) et l'évolution de la fréquence de la microbalance, afin d'estimer l'importance de ses effets sur la réponse de notre transducteur.

## CONCLUSION

Ce deuxième chapitre était consacré à l'étude théorique des transducteurs piézoélectriques. Ces différents transducteurs peuvent être utilisés pour la réalisation de biocapteurs, la microbalance à quartz nous paraissant comme l'un des mieux adaptés. Cette étude a permis, d'une part, d'orienter notre travail concernant la mise au point d'une microbalance à quartz de haute sensibilité fonctionnant en milieu liquide. D'autre part, nous avons vu qu'il était important de bien caractériser son fonctionnement, en particulier dans le cadre de notre application, c'est pourquoi nous avons développé un dispositif expérimental permettant de réaliser des mesures alternées de fréquence et d'admittance électroacoustique. Nous pourrons ainsi comparer nos résultats expérimentaux et les résultats de la simulation.
Chapitre III

MISE AU POINT ET CARACTERISATION
DU DISPOSITIF PIEZOELECTRIQUE
# INTRODUCTION

Nous exposerons dans ce troisième chapitre le travail réalisé concernant le développement et la caractérisation de notre transducteur piézoélectrique. Le but de ce travail était de mettre au point un dispositif piézoélectrique en tenant compte des exigences liées au domaine d'utilisation.

Un des objectifs de cette thèse était de concevoir, et d'étudier, une microbalance à quartz fonctionnant en milieu liquide avec une circulation de solutions, suffisamment sensible pour permettre une immunodétection directe, rapide et spécifique de différents antigènes solubles de poids moléculaires variés.

Plus précisément et en ce qui concerne la microbalance à quartz, nos objectifs étaient les suivants :

- augmenter la fréquence de résonance du quartz afin d'améliorer la sensibilité massique, ce qui nécessite la réalisation de nouveaux oscillateurs,

- réduire le bruit de fond et atteindre une bonne stabilité de la fréquence d'oscillation, en minimisant l'influence de certains paramètres (comme la température) sur la fréquence,

- calibrer le dispositif afin de déterminer le coefficient expérimental de sensibilité massique,

- et étudier le fonctionnement du résonateur dans nos conditions d'utilisation (milieu liquide et avec une couche de protéines) par le biais de mesures d'admittance électroacoustique afin de valider et de modéliser la réponse de la microbalance à quartz.

# 1. LA MICROBALANCE A QUARTZ

## 1. 1. Augmentation de la sensibilité

### 1. 1. 1. But et principe

Nous avons débuté notre travail avec une microbalance à quartz, disponible au laboratoire, fonctionnant à 6 MHz. Malheureusement ce dispositif s'est vite avéré inadéquat pour notre utilisation (Bizet et al., 1995). Ses performances, en terme de sensibilité massique et de stabilité du signal, ne permettaient pas de l'utiliser comme transducteur pour rendre
compte des faibles variations de masse occasionnées par la formation d'un complexe antigène/anticorps. Nous avons donc décider d'augmenter la sensibilité du dispositif en travaillant avec des quartz ayant une fréquence de résonance plus élevée.

Comme nous l'avons vu précédemment la sensibilité massique d'une microbalance à quartz augmente avec le carré de la fréquence de résonance du résonateur (équation 11, chapitre II), paramètre qui dépend de l'épaisseur du cristal.

Nous sommes donc passés d'une microbalance à 6 MHz à un dispositif oscillant à 9 MHz sur le mode fondamental. Puis nous avons développé une seconde génération d'oscillateur permettant à ces quartz d'osciller à 27 MHz sur leur troisième harmonique.

Nous avons choisi cette voie alternative car en dessous d'une certaine épaisseur (pour des quartz ayant une taille raisonnable) les quartz sont trop minces et ne sont plus facilement manipulables.

### 1. 1. 2. Caractéristiques des quartz

Les quartz utilisés dans cette étude sont des cristaux de coupe AT fonctionnant en mode de cisaillement d'épaisseur. Cette coupe a été choisie pour que les quartz soient peu sensibles aux variations de température. Ils ont été fournis par la société CQE (Troyes).

Ils sont constitués d'une pastille de quartz de 14 mm de diamètre. L'épaisseur du cristal est de 185 µm pour les quartz ayant une fréquence de résonance fondamentale de 9 MHz et de 278 µm pour les quartz ayant une fréquence de résonance fondamentale de 6 MHz.

Des électrodes métalliques sont déposées sur le cristal (une sur chaque face) pour permettre à l'oscillateur de générer et d'entretenir l'onde ultrasonore au sein du cristal.

Nous avons choisi des électrodes en or, ce métal étant celui le plus couramment utilisé du fait de son inertie vis-à-vis des produits chimiques et de sa faible tendance à s'oxyder. De plus, ce type de surface en or convient bien à nos applications car d'une part, les protéines s'adsorbent facilement sur ce métal et, d'autre part, il est aisé de fonctionnaliser la surface par des alkyl thiols qui s'auto-organisent spontanément en monocouche sur l'or.

L'or n'est pas déposé directement sur le quartz car il n'adhère pas suffisamment sur ce matériau. Une faible couche de chrome est d'abord déposée par évaporation sous vide puis l'or est évaporé sous vide sur cette couche "d'accrochage". Les quartz sont fournis avec une
épaisseur de chrome de 200 Å et une épaisseur d'or de 5000 Å. Une représentation schématique des quartz que nous avons utilisés est donnée figure 33.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 33 : Représentation schématique des quartz utilisés</figcaption></figure>

Il existe deux qualités de quartz : des quartz qualité "douci" et des quartz qualité "poli-optique". Les premiers sont polis mécaniquement à l'aide d'une pâte à base de poudre de diamant et les seconds ont une finesse de polissage beaucoup plus grande. Une image de la surface d'un quartz de qualité "poli-optique" et de qualité "douci" obtenues par microscopie électronique à balayage sont données figure 34.

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 34 : Images de la surface d'un quartz de qualité "poli-optique" (a) et de qualité "douci" (b) obtenues par microscopie électronique à balayage</figcaption></figure>
La surface des quartz de qualité "poli-optique" est effectivement beaucoup plus plane que la surface des quartz de qualité "douci" mais elle présente de nombreux défauts (trous), la surface des quartz "douci" est plus rugueuse mais plus homogène.

Nous avons utilisé des quartz de qualité "douci" principalement en raison de leur coût nettement inférieur à celui des quartz "poli-optique".

### 1. 1. 3. Les oscillateurs

Comme cela a été vu précédemment, une lame de quartz pourvue d'électrodes métalliques se met à vibrer quand une différence de potentiel alternative est appliquée entre ses électrodes. Dans le cas de la microbalance à quartz, le régime d'oscillation est maintenu par un circuit électronique appelé *oscillateur*. Celui-ci fournit régulièrement de l'énergie en phase avec le déplacement des plans cristallins pour entretenir la vibration du quartz.

Dans notre cas, l'oscillateur doit permettre l'entretien des oscillations au sein du quartz même s'il est en contact avec un liquide et une grande stabilité de ces oscillations sur une importante plage de fréquence devra être obtenue.

Il existe différents types d'oscillateur, celui mis au point pour la microbalance à 6 MHz est un oscillateur de type Miller (Matthys, 1983). Dans un premier temps, un nouvel oscillateur a été développé pour travailler à 9 MHz sur le mode fondamental de quartz prévus à cet effet. Puis, à partir de ce deuxième oscillateur, un troisième modèle a été réalisé pour permettre à des quartz ayant une fréquence de résonance fondamentale de 9 MHz d'osciller à 27 MHz sur leur troisième harmonique (Bizet et al., 1996).

L'oscillateur à 9 MHz a été assez facile à réaliser et a fonctionné d'une manière satisfaisante. Par contre, la conception et la réalisation de l'oscillateur à 27 MHz ont été plus compliquées. Le premier modèle réalisé ne permettait pas à tous les quartz d'osciller : certains oscillaient correctement à la bonne fréquence, d'autres ne "s'accrochaient" pas. Ce modèle a été amélioré par l'ajout d'une capacité variable (varicap) qui permet d'accorder manuellement l'oscillateur au quartz quelles que soient les conditions d'utilisation (air ou milieu liquide). Ainsi, notre oscillateur permet de faire osciller à 27 MHz systématiquement et quelles que soient les conditions expérimentales tout quartz correctement monté.

Il faut savoir que, quand nous avons débuté notre travail, aucune publication, à notre connaissance, ne rendait compte de la mise au point de tels oscillateurs faisant fonctionner des
quartz à cette fréquence, sur un mode harmonique, en milieu liquide et pour une utilisation de
type biocapteur.

1. 2. Les montages expérimentaux réalisés

Différents montages expérimentaux ont été développés, chacun présente des avantages
et des inconvénients et le choix du dispositif dépend du type d'application envisagée. Dans
tout les cas, des contacts électriques de bonne qualité doivent être établis entre les électrodes
du quartz et l'oscillateur, et ces contacts doivent être isolés du milieu liquide pour éviter tout
court circuit. Seule une face du quartz est en contact avec le liquide, l'autre restant à l'air.

Ces différents montages permettent de réaliser aussi bien la mesure de fréquence (mesure
de microbalance où le quartz est dit "actif") que la mesure d'admittance électroacoustique (où
le quartz est dit "passif").

1. 2. 1. Montage sur plaquette

Dans ce cas, le quartz est monté sur un support rectangulaire en verre epoxy muni de pistes de cuivre pour permettre d'établir les connexions électriques (figure 35).

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 35 : Représentation schématique d'un quartz monté sur support rectangulaire en verre epoxy</figcaption></figure>
Le quartz est posé sur le support et les contacts électriques entre les électrodes du quartz et les pistes de cuivre sont assurés par un dépôt de laque argent. Le dépôt d'un film de silicone (ou d'araldite) autour du quartz et sur les pistes de cuivre de la plaquette permet d'isoler les contacts, le quartz peut alors être plongé dans un liquide sans qu'il ne se produise de court circuit. L'extrémité de la plaquette est soudée sur un connecteur BNC qui est relié à l'oscillateur, lui-même connecté à un fréquencemètre. La figure 36 présente le montage expérimental réalisé avec ce type de support.

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 36 : Dispositif expérimental réalisé avec le montage sur plaquette</figcaption></figure>

Ce type de montage est utilisé pour réaliser des expériences qui ne nécessitent pas une circulation de la solution. Généralement la température de la solution, contenue dans un bécher, dans laquelle plonge le quartz, est maintenue constante grâce à un cryothermostat.

### 1. 2. 2. La cellule à jet immergé

Nous avons utilisé une cellule à jet immergé développée au laboratoire à l'origine pour réaliser des expériences d'électrochimie (figure 37). L'intérêt de ce type de cellule est que le quartz, disposé au fond de la cellule, ne subit pas les perturbations du jet. En effet, la buse d'arrivée de la solution est disposée à une hauteur précise de telle sorte que le quartz soit au
niveau de la zone de stagnation du jet, et à cet endroit le flux est en régime laminaire. Dans ce cas, la fréquence du quartz n'est pas perturbée par la circulation de la solution (Bouet, 1994).

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 37 : Dispositif expérimental incorporant la cellule à jet immergé</figcaption></figure>

Le quartz est monté sur un support circulaire en verre époxy qui s'emboîte parfaitement dans le fond de la cellule qui reste étanche. Le support, recouvert de pistes de cuivre, est percé de deux trous dans lesquels sont disposés deux fils électriques (figure 37). Ces fils sont soudés sur le support sur lequel le quartz est posé. Les contacts électriques entre les électrodes du quartz et les fils sont assurés par un dépôt de laque argent. Toutes les connections sont ensuite isolées par la pose d'un joint de silicone. Les fils électriques (sous le support) sont soudés à un connecteur BNC relié à l'oscillateur, lui-même connecté au fréquencemètre.

Les inconvénients de ce type de montage sont d'une part, l'important volume de solution nécessaire et d'autre part, la pompe utilisée. En effet, dans le domaine des biocapteurs il est préférable de pouvoir tester des faibles volumes d'échantillon. Or la cellule à jet classique
disponible au laboratoire présentait un volume interne d'environ 200 ml. Nous avons donc réduit le volume interne à une vingtaine de ml. Malgré cette réduction, le volume de solution nécessaire pour assurer une circulation reste grand et le débit utilisé doit être important (de l'ordre d'une centaine de ml/min) si nous voulons conserver les propriétés hydrodynamiques et renouveler rapidement la solution de la cellule. La pompe utilisée est une petite pompe à engrenage : elle permet d'assurer des débits importants, elle ne pulse pas et est autoamorçable mais elle présente l'inconvénient d'être "agressive" pour une solution de protéines. En effet, une solution de BSA, concentrée par exemple à 100 µg/ml, mousse quand elle est mise en circulation dans la cellule par le biais de la pompe. Ce type de cellule, a priori bien adapté à la mesure de fréquence, car la circulation de la solution ne se répercute pas sur la fréquence de la microbalance, ne convient pas parfaitement pour notre application.

### 1. 2. 3. La cellule miniature

Nous avons donc mis au point un troisième type de montage du quartz en concevant une cellule à circulation miniature, une représentation schématique et une photographie de celle-ci sont présentées figures 38 et 39.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 38 : Représentation schématique de la cellule miniature</figcaption></figure>
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 39 : Photographie de la cellule miniature dans laquelle un quartz est installé</figcaption></figure>

Des embases métalliques sont insérées autour du cristal, au niveau des électrodes, et sont soudées à deux fils électriques directement soudés sur un connecteur BNC. Un dépôt de laque argent permet d'assurer les contacts entre les embases et les électrodes du quartz. Celui-ci est maintenu entre les deux joints toriques de la cellule, le joint supérieur assurant l'étanchéité de la cellule. Seule l'électrode d'or supérieure est en contact avec le liquide. La circulation des solutions est réalisée par l'intermédiaire d'une pompe péristaltique et des tuyaux de faible diamètre en polyéthylène (diamètre externe de 1,8 mm et interne de 1mm). Le volume interne de la cellule est de 40 µl et le débit utilisé est généralement compris entre 50 et 100 µl/min. Nous avons utilisé une pompe péristaltique car les pompes à engrenages disponibles au laboratoire ne permettaient pas d'assurer des débits aussi faibles et les pompes à piston ne permettaient pas de thermostater correctement les solutions. Ce type de cellule nous a donné satisfaction alors, qu'a priori, cette configuration (quartz comprimé entre deux joints) n'était pas optimale pour le fonctionnement de la microbalance à quartz.

### 1. 3. Le logiciel "multimes"

Pour automatiser l'acquisition des données des expériences de microbalance (principalement l'enregistrement de la fréquence d'oscillation du quartz en fonction du temps) et pour piloter l'expérience par l'intermédiaire d'un P.C., le laboratoire a développé un logiciel nommé "multimes" fonctionnant sous DOS.

Celui-ci permet de configurer l'expérience en ce qui concerne le choix des mesures à effectuer (fréquence d'oscillation du quartz, température de différentes sondes), la cadence des mesures, la durée totale de l'expérience... Le logiciel permet l'affichage des mesures pendant l'expérience, l'évolution des différents paramètres est donc visualisée en "quasi temps réel".
Les résultats de l'expérience sont stockés dans un fichier, sous forme de colonnes (temps de la mesure, fréquence d'oscillation du quartz, température des sondes...), facilement exploitable.

Concrètement, l'oscillateur, sur lequel est connecté le quartz, est relié par câble BNC au fréquencemètre (PM 6685 Philips) qui mesure la fréquence d'oscillation du quartz. D'autre part, un multimètre (Keithley 2000) est utilisé pour enregistrer d'autres paramètres comme la température de l'oscillateur et des solutions qui circulent sur le quartz. Ces deux appareils de mesures sont reliés, par l'intermédiaire de câbles IEEE, au P.C. qui pilote l'expérience grâce au logiciel cité précédemment.

# 1.4. Etude de la stabilité et du bruit de fond de la fréquence d'oscillation

Les premières expériences réalisées pour tester les oscillateurs à 9 et à 27 MHz, avaient pour but d'étudier la stabilité de la fréquence d'oscillation de quartz à l'air et en contact avec un liquide, et d'étudier l'influence de certains paramètres sur cette stabilité comme la température, la circulation des solutions et leur nature. En effet, il est évident que la fréquence d'oscillation de la microbalance (c'est-à-dire le signal de transduction de notre biocapteur) doit être la plus stable possible en l'absence de tout phénomène lié à une variation de masse. De plus, le bruit de fond de la fréquence devra être le plus bas possible afin d'obtenir une plus grande sensibilité.

## 1.4.1. Influence de la température

Même si les quartz utilisés, de coupe AT, sont les moins sensibles aux variations de température, il nous a semblé intéressant de contrôler l'influence de ce facteur sur la stabilité de la fréquence d'oscillation de nos microbalances à quartz.

Nous avons suivi l'évolution de la fréquence de quartz, montés sur plaquette, oscillant à 9 et à 27 MHz dans l'air en mesurant, simultanément, la fréquence d'oscillation et la température au niveau du quartz par l'intermédiaire d'une sonde de température disposée à côté du quartz. Les courbes de la figure 40 et 41 montrent que la température du milieu où est placé le quartz influence sa fréquence d'oscillation, même pour ce type de quartz.
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 40 : Evolution simultanée de la fréquence d'oscillation d'un quartz à 9 MHz dans l'air et de la température à proximité de la microbalance</figcaption></figure>

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 41 : Evolution simultanée de la fréquence d'oscillation d'un quartz à 27 MHz dans l'air et de la température à proximité de la microbalance</figcaption></figure>
De plus, la sensibilité d'un quartz (aussi bien à 9 qu'à 27 MHz) vis-à-vis de la température varie d'un quartz à l'autre. Pour un même quartz elle varie également en fonction de la plage de température comme le montre la figure 42 pour un quartz à 9 MHz. Ainsi, dans la plage 21-25°C la fréquence varie de 125 Hz/°C. Au-dessus et en dessous de cette plage le coefficient de température est négatif.

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 42 : Evolution de la fréquence d'un quartz à 9 MHz dans l'air en fonction de la température à proximité de celui-ci</figcaption></figure>

Il est donc primordial de thermostatater l'environnement du quartz c'est-à-dire, pour notre application, de thermostatater les solutions qui seront en contact avec le quartz. Nous avons utilisé un cryothermostat à circulation avec une régulation électronique (Ministat Huber, Bioblock) pour maintenir constante (et identique) la température de toutes les solutions. Une température de consigne de 20°C a été choisie et la régulation est efficace au dixième de degré. Lors de chaque expérience, nous enregistrons systématiquement la température du bain thermostaté afin de contrôler sa stabilité. De cette manière nous nous affranchissons totalement du risque de variation de fréquence liée à une variation de température du quartz.

Cependant, l'enregistrement de l'évolution de la fréquence de quartz immergés dans une solution thermostatée a encore révélé des dérives de la fréquence. Nous avons alors pourvu nos oscillateurs d'une sonde de température pour suivre la température à l'intérieur du boîtier de l'oscillateur. La figure suivante présente l'évolution simultanée de la fréquence d'un quartz à 9 MHz monté sur plaquette et plongé dans de l'eau thermostatée à +20°C et de la température de l'oscillateur.
<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 43 : Evolution simultanée de la fréquence d'oscillation d'un quartz à 9 MHz, monté sur plaquette et immergé dans de l'eau distillée thermostatée à + 20°C, et de la température du boîtier d'oscillateur</figcaption></figure>

Nous pouvons remarquer que les variations de la température à l'intérieur du boîtier de l'oscillateur se répercutent sur la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz. La figure 44 montre que la corrélation entre ces deux paramètres est importante.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 44 : Variation de la fréquence d'oscillation en fonction de la température du boîtier d'oscillateur</figcaption></figure>
Cet effet a également été observé pour l'oscillateur à 27 MHz. Ces variations de température à l'intérieur du boîtier de l'oscillateur sont dues à la chauffe des composants électroniques eux-mêmes et aux variations de la température ambiante. Nous avons ainsi été conduits à contrôler la température de nos oscillateurs pour nous affranchir de cet effet.

Différents systèmes de thermorégulation ont été mis en œuvre, le plus performant a été retenu. Il s'agit d'un régulateur de type PID (Watlow) constitué d'une sonde de température en platine et de deux résistances chauffantes disposées à l'intérieur du boîtier. La sonde mesure en continu la température du boîtier et contrôle la chauffe des résistances d'une manière très fine. Une température de consigne comprise entre 48 et 52 °C est généralement choisie, l'air de la pièce constituant la source froide.

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Figure 45 : Evolution de la température de l'oscillateur thermorégulé en fonction du temps</figcaption></figure>

La stabilité de la température de l'oscillateur obtenue par cette méthode est excellente : la température ne variant que dans une fourchette de un dixième de degré (figure 45). Néanmoins, nous prenons la précaution d'enregistrer systématiquement la température de l'oscillateur pendant nos mesures de fréquence (ainsi que la température des solutions) afin de nous assurer de l'absence de perturbations.

Aucun de tous les résultats d'expériences présentés, à partir de ce paragraphe, dans ce manuscrit, ne présentait de variation de température de l'oscillateur et des solutions.
La figure suivante présente l'évolution de la fréquence d'oscillation à 27 MHz d'un quartz monté sur plaquette et immergé dans une solution d'eau distillée thermostatée à +20°C pendant 2h30.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 46 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz monté sur plaquette et immergé dans de l'eau distillée thermostatée à +20°C</figcaption></figure>

Nous pouvons observer que l'amplitude de la fluctuation de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz est d'environ 2 Hz pour la durée de la mesure. La stabilité et le bruit de fond de la fréquence obtenus sont remarquables pour une mesure à cette fréquence et en milieu liquide.

### 1. 4. 2. Influence de la circulation des solutions

Comme nous venons de le voir, les oscillateurs mis au point permettent de faire osciller à 27 MHz et en milieu liquide la microbalance à quartz de manière tout à fait satisfaisante. Néanmoins, nous avons choisi d'utiliser ce transducteur dans une cellule à circulation de sorte que nous puissions changer de solution en enregistrant la fréquence d'oscillation en continu sans devoir remettre le quartz à l'air. Nous avons donc étudié l'influence de la circulation de solution dans la cellule miniature que nous avons utilisée, sur la stabilité et le bruit de fond de la fréquence d'oscillation de notre microbalance.
La circulation des solutions est assurée par une pompe péristaltique (modèle P1, Pharmacia). Toutes les solutions, qui doivent circuler sur le quartz, sont maintenues dans des tubes à essai disposés dans un bécher à double paroi rempli d'eau. La température de l'eau dans le bécher est maintenue constante grâce au cryothermostat. Une représentation schématique de ce dispositif expérimental, qui servira pour toutes nos expériences d'immunodétection avec la microbalance à quartz, est présentée figure 47.

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 47 : Représentation schématique du dispositif expérimental</figcaption></figure>

La figure qui suit présente l'évolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz installé dans la cellule avec une circulation d'eau distillée thermostatée à un débit de 50 µl/min.

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>Figure 48 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz installé dans la cellule pendant la circulation d'eau distillée thermostatée à +20°C à un débit de 50 µl/min</figcaption></figure>
La stabilité et le bruit de fond de la fréquence d'oscillation sont un peu moins bons que pour un quartz immergé mais restent tout à fait corrects pour ce type de fréquence.

En effet, la circulation d'une solution dans la cellule a une influence sur la fréquence d'oscillation du quartz, et joue surtout sur le bruit de fond de celle-ci. La pompe utilisée est une pompe péristaltique et les pulsations de la pompe se répercutent sur le signal mesuré. Cet effet est nettement visible sur la figure 49 où sont représentées les variations de la fréquence d'oscillation d'un même quartz (remises à zéro) pour deux débits différents.

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 49 : Variations de la fréquence d'oscillation d'un même quartz installé dans la cellule pendant la circulation d'eau distillée thermostatée à +20°C à deux débits différents</figcaption></figure>

La répercussion de la circulation d'une solution sur la fréquence du quartz varie en fonction du débit utilisé. Le quartz est sensible à la variation de la pression au niveau de la surface du quartz (assimilable à une variation de masse), et plus le débit est fort plus les répercussions sur la fréquence sont importantes. Nous avons choisi d'utiliser un débit faible (50 µl/min) qui perturbe le moins possible la fréquence d'oscillation et qui convient bien pour nos expériences d'immunodétection. Il faut noter que le bruit de fond introduit par la circulation se traduit par une perturbation périodique de la fréquence dont la période est inversement proportionnelle au débit et dont l'amplitude est proportionnelle au débit. Ce bruit de fond pourrait être éliminé par un traitement du signal puisqu'il est périodique pour un débit donné. Nous pourrons considérer un signal significatif quand la variation de fréquence sera supérieure à trois fois ce bruit de fond soit environ 15 Hz pour ce débit.
### 1. 4. 3. Influence de la nature des solutions

Dans cette partie, nous avons examiné l'influence de la nature des solutions qui circulent sur le quartz sur la fréquence d'oscillation de la microbalance.

Nous nous sommes d'abord intéressés à des solutions d'acide chlorhydrique qui sont classiquement utilisées comme solution de désorption. La figure 50 présente la variation de la fréquence d'oscillation d'un quartz pendant la circulation alternée d'eau distillée et de solutions d'HCl à différentes concentrations. Nous pouvons remarquer que la fréquence d'oscillation du quartz augmente lors du passage de la solution d'HCl et diminue pour retrouver son niveau de base lors du passage de l'eau.

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Figure 50 : Variation de la fréquence d'oscillation d'un quartz installé dans la cellule pendant la circulation alternée d'eau et de solutions d'HCl à 1, 10 et 25 mM au débit de 50 µl/min, la flèche représente le moment où la solution arrive sur le quartz</figcaption></figure>

L'effet de la circulation d'autres solutions comme le tampon phosphate salin (PBS) et des solutions de KCl par rapport à l'eau distillée a ensuite été étudié. Dans ces cas, la solution provoque aussi une augmentation réversible de la fréquence d'oscillation. La figure 51 présente la variation de fréquence d'oscillation d'un même quartz en fonction de la concentration de la solution de KCl qui circule sur le quartz. La variation de la fréquence d'oscillation provoquée par la solution de KCl augmente avec sa concentration puis se stabilise (le même effet est observé dans le cas de HCl).
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 51 : Variation de la fréquence d'oscillation d'un même quartz en fonction de la concentration de la solution de KCl</figcaption></figure>

Nous avons cherché à expliquer cet effet par la différence des propriétés physico-chimiques entre la solution et l'eau. Le tableau suivant donne les valeurs de certains paramètres correspondant aux différentes concentrations des solutions de KCl utilisées (tirées du Handbook of Chemistry and Physics, Ed 1982).

<table><caption>Tableau IX : Valeurs de la conductivité, de la densité et de la viscosité pour différentes concentrations de KCl</caption><thead><tr><th>Concentration<br>g/l</th><th>Concentration<br>mol/l</th><th>Conductivité<br>mmho/cm</th><th>Densité</th><th>Viscosité<br>cP</th></tr></thead><tbody><tr><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.9982</td><td>1.00219</td></tr><tr><td>1</td><td>0.013</td><td>3.5</td><td>0.9992</td><td>1.00159</td></tr><tr><td>10</td><td>0.134</td><td>15.6</td><td>1.0047</td><td>1.00041</td></tr><tr><td>20</td><td>0.268</td><td>29</td><td>1.0108</td><td>0.9991</td></tr><tr><td>50</td><td>0.671</td><td>69.3</td><td>1.0292</td><td>0.99516</td></tr><tr><td>75</td><td>1.006</td><td>102.8</td><td>1.0445</td><td>0.99188</td></tr><tr><td>100</td><td>1.341</td><td>136.3</td><td>1.0598</td><td>0.98861</td></tr></tbody></table>

Nous avons vu au deuxième chapitre que la densité et la viscosité des solutions jouaient sur la fréquence d'oscillation (formule de Kanazawa, équation 15, chapitre II) mais ce modèle prévoit une diminution de la fréquence d'oscillation quand le produit densité x viscosité augmente. Ici, le produit densité x viscosité augmente avec la concentration mais nous mesurons une augmentation de la fréquence d'oscillation. Nous avons alors simulé l'effet des variations de la conductivité de la solution par l'intermédiaire de la formule de Josse (Josse et al., 1990) pour contrôler l'influence de ce paramètre sur la fréquence.
La formule de Josse, ci-dessous, prend en compte d'une part, l'effet de la densité et de la viscosité de la solution (premier terme de l'équation) et d'autre part, l'effet de la conductivité de la solution (deuxième terme) :

$$ \frac{\Delta f}{f_0} = - \left( \frac{f_0 \rho_L \eta_L}{\pi \rho_q C_{66}} \right)^{\frac{1}{2}} + \frac{\delta \sigma^2 + \omega^2 \varepsilon_L (\varepsilon_L + \varepsilon_{22})}{\pi^2 \sigma^2 + \omega^2 (\varepsilon_L + \varepsilon_{22})^2} \quad (46) $$

$$ \text{avec } \delta = \frac{e_{26}^2}{C_{66}\varepsilon_{22}} \qquad (47) $$

où : $f_0$ est la fréquence de résonance du quartz, $\rho_L$ la densité du liquide, $\eta_L$ la viscosité du liquide, $\rho_q$ la densité du quartz, $C_{66}$ la constante élastique du quartz corrigée de l'effet piézoélectrique, $\sigma$ la conductivité du liquide, $\omega$ la fréquence angulaire, $\varepsilon_L$ la constante diélectrique du liquide, $\varepsilon_{22}$ la constante diélectrique du quartz, et $e_{26}$ la constante piézoélectrique.

La figure 52 présente les variations expérimentales et simulées de la fréquence d'oscillation du quartz en fonction de la concentration de la solution de KCl.

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 52 : Variation de la fréquence d'oscillation mesurée, simulée par la formule de Josse et simulée en ne tenant compte que de la densité et de la viscosité de la solution en fonction de la concentration de la solution de KCl qui circule sur le quartz</figcaption></figure>

Les variations de la conductivité des solutions de KCl expliquent, en partie, l'augmentation de la fréquence d'oscillation observée. Nous pouvons aussi voir sur la figure 52
que l'augmentation du produit densité x viscosité de la solution de KCl provoque bien une diminution de la fréquence, mais cet effet, combiné à celui de la conductivité, conduit globalement à une augmentation de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz.

Ainsi, certains paramètres physico-chimiques des solutions qui circulent sur le quartz jouent sur la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz. Dans le cas de l'utilisation de la microbalance à quartz comme transducteur d'un immunocapteur il est donc indispensable de faire circuler la solution d'antigène sur le quartz dans le même tampon que celui qui circule avant d'introduire la solution à tester. De plus, il est indispensable de vérifier la spécificité du signal mesuré en contrôlant qu'une solution de protéines différentes de l'antigène à détecter, diluées dans le même tampon, ne provoque aucune variation de la fréquence d'oscillation. Dans ce cas, nous sommes certains que la microbalance à quartz ne mesure que les variations de fréquence consécutives à la fixation des antigènes sur la couche d'anticorps immobilisée à la surface de l'électrode d'or de la microbalance à quartz.

## 2. LA MESURE COUPLEE DE LA FREQUENCE DE RESONANCE ET DE L'ADMITTANCE ELECTROACOUSTIQUE

### 2. 1. Rappels et but

La microbalance à quartz permet de mesurer des variations de masse, même en milieu liquide, par l'intermédiaire de la variation de sa fréquence d'oscillation, mais, comme nous l'avons vu, les propriétés physico-chimiques des solutions (et aussi celles de la couche déposée) peuvent aussi jouer sur la fréquence d'oscillation du quartz.

La réponse en fréquence de la microbalance à quartz est une réponse globale correspondant à la "somme" des différents effets influençant la fréquence d'oscillation du quartz. Afin d'essayer de discriminer ces différents effets sur la réponse globale de la microbalance nous avons mis au point un dispositif de mesure permettant de réaliser alternativement, sur le même quartz et pendant l'évolution d'un processus, des mesures d'admittance électroacoustique et des mesures de la fréquence d'oscillation de la microbalance. En effet, la mesure de l'admittance électroacoustique permet d'estimer les effets des caractéristiques viscoélastiques d'un dépôt et des propriétés des solutions sur un résonateur à quartz en regardant l'évolution des paramètres du circuit équivalent de ce résonateur.
A partir d'un même transducteur et pour un processus donné (dépôt métallique, adsorption de protéine, interaction antigène/anticorps...) nous pouvons mesurer l'admittance électroacoustique, qui nous permet de déterminer les paramètres du circuit équivalent, et la variation de la fréquence d'oscillation du quartz. Ainsi, nous pouvons comparer la variation de la fréquence d'oscillation du quartz et la variation de la fréquence série déterminée par la mesure d'admittance. Il sera aussi intéressant de comparer ces résultats à ceux obtenus grâce aux simulations du modèle d'admittance théorique développé.

Ce dispositif de mesure a donc été mis au point pour étudier le mécanisme de transduction de la microbalance à quartz en particulier pour notre application afin de valider les résultats dans le cadre de la mise au point d'un immunocapteur. Il s'agit de vérifier que le transducteur piézoélectrique ne mesure que les variations de masse consécutives à la fixation spécifique des antigènes sur les anticorps.

## 2.2. Mise au point du dispositif de mesure

Le dispositif de mesure est constitué d'un analyseur de réseaux (Hewlett Packard 4194A) qui permet de mesurer l'admittance électroacoustique d'un résonateur à quartz et d'un fréquence mètre (Hewlett Packard 53132A) qui permet de suivre sa fréquence d'oscillation.

Les deux appareils de mesure sont associés à un commutateur électronique permettant de passer séquentiellement d'un type de mesure à l'autre. L'ensemble est piloté par un PC par l'intermédiaire d'un programme développé sous le logiciel HP VEE. Une représentation schématique de ce dispositif est donnée figure 53.

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>Figure 53 : Représentation schématique du dispositif expérimental permettant de réaliser des mesures alternées d'admittance électroacoustique et de fréquence d'oscillation sur un même quartz</figcaption></figure>
Le logiciel permet de configurer la durée totale de la mesure, la plage du balayage en fréquence (la plage de fréquence étant déterminée automatiquement de façon optimale), la période de la mesure d'admittance (par exemple une mesure toutes les cinq minutes) et le cadencement du fréquencemètre (par exemple une mesure de fréquence toutes les deux secondes).

Une mesure couplée se déroule de la façon suivante : une première mesure d'admittance est réalisée au temps zéro, puis quand la mesure est finie le commutateur est activé et la fréquence d'oscillation du quartz est mesurée avec le cadencement choisi jusqu'au temps déterminé par la période de la mesure d'admittance (par exemple temps zéro plus cinq minutes) moment où la deuxième mesure d'admittance est réalisée etc... La mesure est totalement automatisée.

Les résultats sont stockés dans deux types de fichiers distincts. Dans une première série de fichiers sont stockés les résultats de la mesure d'admittance (partie réelle et imaginaire de l'admittance pour chaque fréquence de perturbation) pour chaque mesure. Le deuxième type de fichier stocke les résultats de la fréquence d'oscillation en fonction du temps.

Un logiciel développé au laboratoire ("Fratraq") permet d'estimer les valeurs approchées des paramètres du circuit équivalent pour chaque mesure d'admittance. Les valeurs de ces paramètres (R, L, C, $F_s$ et $f_φ$) sont obtenues d'une manière géométrique à l'aide du modèle de Butterworth van Dyke (Bouché-Pillon, 1996). Puis, ces valeurs sont affinées par l'intermédiaire d'un programme d'ajustement, développé en Fortran ("Ariane"), basé sur la méthode du simplex (ce programme minimise la somme des déviations relatives entre les mesures expérimentales de l'admittance et les valeurs calculées). La valeur des paramètres du circuit équivalent est donc obtenue pour chaque mesure d'admittance, de sorte que nous puissions suivre l'évolution dans le temps de tous les paramètres ainsi que l'évolution de la fréquence d'oscillation du quartz.

## 2.3. Mise au point de la mesure

L'influence de l'amplitude du signal de perturbation, du temps d'intégration et du moyennage sur la mesure d'admittance réalisée à l'aide de l'analyseur de réseau ont été examinées (Grada, 1996).

Le meilleur niveau de perturbation doit être choisi pour travailler dans la zone linéaire de fonctionnement du résonateur en fonction du milieu de mesure (air, eau et tampon PBS). Un trop faible niveau d'amplitude de perturbation ne permet pas d'obtenir une bonne précision de
mesure et avec un niveau trop fort la linéarité du système piézoélectrique n'est plus assurée. L'analyseur de réseaux dispose d'un générateur interne dont le niveau de perturbation peut varier de 126µV à 1,26V. Les figures suivantes montrent l'influence du niveau de perturbation sur la partie réelle et imaginaire de l'admittance électroacoustique d'un quartz monté sur plaquette à 27 MHz dans l'air et plongé dans du tampon PBS thermostaté.

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Figure 54 : Influence du niveau de perturbation sur la partie réelle et imaginaire de l'admittance électroacoustique mesurée pour un quartz à 27 MHz dans l'air</figcaption></figure>

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>Figure 55 : Influence du niveau de perturbation sur la partie réelle et imaginaire de l'admittance électroacoustique mesurée pour un quartz à 27 MHz dans le PBS</figcaption></figure>

Dans l'air comme dans le PBS, un faible niveau de perturbation conduit à un signal bruité ; le rapport signal sur bruit s'améliore en augmentant ce niveau mais à 100 mV le domaine de linéarité n'est plus respecté. Dans ces conditions, le choix d'un niveau de perturbation de 10 mV semble le plus judicieux.
L'influence de ce niveau de perturbation a aussi été étudiée en ce qui concerne la dispersion des valeurs des paramètres estimées à partir de la mesure de l'admittance d'un quartz à 27 MHz. La figure suivante montre l'influence du niveau de perturbation sur la dispersion des valeurs de la résistance, de l'inductance et de la capacité motionelle déterminées à partir de la mesure de l'admittance d'un quartz à 27 MHz dans du PBS.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 56 : Influence du niveau de perturbation sur la dispersion des valeurs de la résistance, de l'inductance et de la capacité motionnelle déterminées à partir des mesures d'admittance électroacoustique réalisées sur un quartz à 27 MHz dans du PBS</figcaption></figure>

Les valeurs des paramètres sont dispersées aléatoirement pour les niveaux de perturbations faibles (inférieurs à 5 mV). Pour des niveaux de perturbation importants (supérieurs à 500 mV) ces valeurs dévient de la valeur trouvée en régime linéaire. Par conséquent un niveau de 10mV apparaît comme un bon choix aussi bien pour la qualité de la mesure d'admittance que pour la détermination des éléments du circuit équivalent.

La précision de la mesure d'admittance peut être modulée par deux paramètres choisis lors de la configuration de l'analyseur de réseaux : le temps d'intégration (c'est-à-dire la durée d'une mesure, à choisir entre temps court, moyen et long) et le "moyennage" (c'est-à-dire le nombre de mesures qui sera moyenné, à choisir entre 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 et 256 mesures). Pour obtenir une bonne précision de la mesure dans un temps relativement court, un temps d'intégration moyen et un moyennage sur 16 mesures ont été choisis. De cette façon une mesure d'admittance électroacoustique sur un quartz à 27 MHz prend environ 90 secondes.
# 3. ETUDES PRELIMINAIRES - ANALYSE DE LA REPONSE DU TRANSDUCTEUR

## 3. 1. Expériences réalisées avec la microbalance à quartz

Après avoir mis au point la microbalance à quartz fonctionnant à 27 MHz en milieu liquide, nous l'avons calibrée afin de contrôler que la sensibilité massique de notre transducteur était augmentée comme le prévoyait la théorie de Sauerbrey. Puis, nous avons étudié la réponse en fréquence de la microbalance à quartz pendant l'adsorption de protéines sur l'électrode d'or.

### 3. 1. 1. Calibration par dépôt électrochimique de cuivre

Nous avons déterminé le coefficient expérimental reliant la variation de masse à la variation de fréquence de la microbalance à quartz afin de contrôler l'augmentation de la sensibilité massique de notre nouveau transducteur. Ceci a été réalisé pour trois types de microbalances : la microbalance à 6 MHz en mode fondamental, à 9 MHz en mode fondamental et à 27 MHz (c'est-à-dire avec des quartz à 9 MHz sur le partiel 3).

Les coefficients de sensibilité expérimentaux ont été déterminés en mesurant l'évolution de la fréquence de résonance pendant un dépôt électrochimique de cuivre (dépôt élastique) sur l'électrode d'or.

En appliquant un courant au niveau de l'électrode de travail en or d'un quartz en contact avec une solution de CuSO₄ 0,5 M / H₂SO₄ 0,5 M, le cuivre présent en solution, sous la forme Cu²⁺, va se réduire et se déposer sur l'électrode (Cu²⁺ + 2 e⁻ → Cu sur l'électrode). Le dépôt qui s'accumule sur l'électrode de la microbalance va donc faire diminuer sa fréquence d'oscillation. La vitesse du dépôt et donc la quantité de cuivre fixée est proportionnelle au courant appliqué. Grâce à la loi de Faraday, il est aisé de calculer la quantité d'électrons mis en jeu dans la réaction, donc de déterminer la quantité de molécules de cuivre ayant réagi pour déterminer la masse du dépôt en supposant un rendement de 100 % :

$$i = \frac{\Delta Q}{\Delta t} \rightarrow \Delta Q = i \times \Delta t$$

$$1 \text{ mole e}^{-} \rightarrow 96500 \text{ C}$$

$$x \text{ moles e}^{-} \rightarrow \Delta Q = i \times \Delta t$$
$$ \text{soit x moles e}^{-} = \frac{i \times \Delta t}{96500} $$

dans la réaction nous avons 2 électrons pour 1 atome de cuivre

$$ \text{soit y moles de cuivre} = \frac{i \times \Delta t}{96500} \times \frac{1}{2} $$

$$ \text{la masse de cuivre déposée est donc : } \Delta m = \frac{i \times \Delta t}{96500} \times \frac{1}{2} \times M_{Cu} $$

En connaissant la masse de cuivre déposée et la variation relative de la fréquence d'oscillation au bout d'un certain temps, nous pouvons calculer le coefficient de sensibilité massique expérimental $k_{ex}$ :

$$ k_{ex} = \frac{\Delta F}{\Delta m} \times A $$

où : $\Delta F$ représente la variation relative de la fréquence d'oscillation en Hz, $\Delta m$ la masse de cuivre déposée sur l'électrode en g et A la surface de l'électrode en cm².

Les quartz sont nettoyés à l'acétone et rincés à l'éthanol avant d'être montés sur les supports en fibre de verre époxy (montage sur plaquette). Les plaquettes pourvues d'un connecteur BNC sont disposées sur un boîtier d'oscillateur (contenant un oscillateur à 6, 9 ou 27 MHz) relié au fréquencemètre.

Les courants appliqués à l'aide d'un galvanostat (Sotelem) sont compris entre 0,1 mA et 4 mA. En effet, les courants ne doivent pas être trop importants pour ne pas faire des dépôts de cuivre trop lourds ce qui aurait pour effet de faire "décrocher" la microbalance à cause d'un amortissement trop important. Cependant, les dépôts doivent être suffisamment réguliers et homogènes ce qui est difficile à obtenir avec des courants très faibles (inférieurs à 0,5 mA). Pour résoudre ce problème, nous imposons une impulsion de courant élevé (10 mA) pendant 1 seconde à l'aide d'un générateur (Wavetek, model 187), le courant constant de dépôt est ensuite appliqué. Ceci permet d'obtenir des dépôts homogènes sur toute la surface de l'électrode.

Les trois figures suivantes présentent l'évolution des variations de fréquence des trois microbalances testées (6, 9 et 27 MHz), en fonction du temps, pendant l'électrodéposition du cuivre réalisée à différents courants.
<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Figure 57 : Evolution de la variation de la fréquence de trois quartz oscillant à 6 MHz en fonction du temps pendant l'électrodéposition du cuivre réalisée à différents courants</figcaption></figure>

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Figure 58 : Evolution de la variation de la fréquence de trois quartz oscillant à 9 MHz en fonction du temps pendant l'électrodéposition du cuivre réalisée à différents courants</figcaption></figure>
<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Figure 59 : Evolution de la variation de la fréquence de trois quartz oscillant à 27 MHz en fonction du temps pendant l'électrodéposition du cuivre réalisée à différents courants</figcaption></figure>

La fréquence d'oscillation des quartz pendant le dépôt diminue de manière linéaire en fonction du temps (figures 57, 58 et 59). Cette variation est proportionnelle à la masse de cuivre déposé. Les coefficients de sensibilité massique expérimentaux (calculés et moyennés pour les différents courants) et théoriques (calculés à partir de l'équation de Sauerbrey) sont présentés dans le tableau X.

<table><caption>Tableau X : Coefficients de sensibilité expérimentaux et théoriques pour différentes fréquences de résonance</caption><thead><tr><th>Fréquence de résonance en<br>MHz</th><th>Coefficient de sensibilité massique<br>expérimental moyen en Hz.g<sup>-1</sup>.cm<sup>2</sup><br>(x10<sup>7</sup>)</th><th>Coefficient de sensibilité théorique<br>(Sauerbrey)<br>en Hz.g<sup>-1</sup>.cm<sup>2</sup> (x10<sup>7</sup>)</th></tr></thead><tbody><tr><td>6</td><td>7,49 +/- 0,29 RSD = 4 %</td><td>8,15</td></tr><tr><td>9</td><td>16,31 +/- 0,32 RSD = 2 %</td><td>18,3</td></tr><tr><td>27 (9 partiel 3)</td><td>57,07 +/- 1,69 RSD = 3 %</td><td>54,9</td></tr></tbody></table>

Les coefficients expérimentaux déterminés pour les différentes fréquences de résonance sont très proches des coefficients théoriques calculés à partir de l'équation de Sauerbrey. Les différences observées peuvent s'expliquer par le fait que la théorie de Sauerbrey a été validée pour des mesures de fréquence dans l'air et que nos mesures ont été réalisées en milieu liquide.
Pour estimer cette différence, le tableau suivant présente la masse correspondant à une variation de fréquence de 1 Hz pour une électrode de 0,2 cm² calculée à partir du coefficient de sensibilité expérimental et théorique pour les différentes microbalances. En terme de masse, ces différences sont très faibles surtout concernant le dispositif à 27 MHz.

<table><caption>Tableau XI : Comparaison des masses correspondant à une variation de fréquence de 1 Hz pour une électrode de 0,2 cm² calculées à partir du coefficient de sensibilité expérimental et théorique pour différentes fréquences de résonance</caption><thead><tr><th rowspan="2">Fréquence de résonance</th><th colspan="2">Masse correspondant à une variation de fréquence de 1 Hz pour une électrode de 0,2 cm² de surface calculée à partir :</th><th rowspan="2">Différence</th></tr><tr><th>du coefficient de sensibilité expérimental</th><th>du coefficient de sensibilité théorique</th></tr></thead><tbody><tr><td>6 MHz</td><td>2670 pg</td><td>2454 pg</td><td>216 pg</td></tr><tr><td>9 MHz</td><td>1226 pg</td><td>1093 pg</td><td>133 pg</td></tr><tr><td>27 MHz (p3)</td><td>350 pg</td><td>364 pg</td><td>14 pg</td></tr></tbody></table>

Nous avons donc vérifié que la sensibilité massique de la microbalance à quartz à 27 MHz (9 MHz sur le partiel 3) est bien augmentée dans les proportions prévues par l'équation de Sauerbrey. Pour ce type de dépôt quasi élastique et assez épais, la réponse de nos microbalances peut être considérée comme purement massique et la sensibilité atteint 350 pg/Hz pour le dispositif à 27 MHz développé.

### 3. 1. 2. Mesure de l'adsorption de protéines

L'étude de l'adsorption des protéines est particulièrement importante dans le cadre, par exemple, de la recherche de matériaux biocompatibles (et en particulier pour des matériaux en contact avec le sang), mais aussi dans le domaine de la pharmacie pour étudier l'influence du conditionnement d'un médicament sur ces propriétés actives... (Andrade, 1985). L'adsorption d'une protéine sur un support met en jeu des interactions électrostatiques et hydrophobes, des ponts hydrogène et des forces de van der Waals entre la protéine et le support. La microbalance à quartz est dans ce cadre un outil tout à fait intéressant car elle permet de suivre les cinétiques d'adsorption en temps réel (Rodahl et al., 1997).

Nous avons utilisé notre microbalance à quartz pour suivre les cinétiques d'adsorption de différentes protéines sur l'électrode d'or et pour étudier le comportement de notre transducteur avec une couche de protéine. Nous avons choisi d'utiliser trois protéines douées
d'activité enzymatique spécifique, de poids moléculaire et de structure différents. Il s'agit de la peroxydase, de la phosphatase alcaline et de la β-D-galactosidase (Sigma). Quelques caractéristiques de ces trois enzymes sont données dans le tableau suivant.

<table><caption>Tableau XII : Caractéristiques des enzymes utilisées</caption><thead><tr><td>Nom de l'enzyme</td><td>Classification</td><td>Poids moléculaire et structure</td><td>substrat et solution substrat</td><td>n° lot</td></tr></thead><tbody><tr><td>Peroxydase</td><td>EC 1. 11. 1. 7</td><td>44000 g/mol monomérique</td><td>tampon citrate phosphate pH 4,3 avec 0,01% d'H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> à 30% et 1 mM d'ABTS</td><td>62H95051</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline</td><td>EC 3. 1. 3. 1</td><td>140000 g/mol dimérique</td><td>tampon TRIS 0,2 M avec 1 mg/ml de pNPP</td><td>24H7090</td></tr><tr><td>β-D-galactosidase</td><td>EC 3. 2. 1. 23</td><td>470000 g/mol tétramérique</td><td>tampon phosphate 0,1 M pH 7,3 avec 1 mM de MgCl<sub>2</sub>, 112 mM de βmercaptoéthanol et 2,3 mM d'ONPGalactopyranoside</td><td>55H6851</td></tr></tbody></table>

Nous avons choisi d'utiliser des enzymes afin de pouvoir déterminer la quantité de protéines, enzymatiquement actives, adsorbées sur l'électrode d'or (après le suivi de la cinétique d'adsorption à l'aide de la microbalance à quartz) grâce à la mesure de l'activité enzymatique spécifique au niveau de l'électrode du quartz. En effet, en ajoutant la "solution substrat" adéquate au niveau de l'électrode, les enzymes actives dégradent leur substrat ce qui génère l'apparition d'un produit coloré, l'intensité de la coloration étant directement proportionnelle à la quantité d'enzyme active. La densité optique de la solution peut être mesurée et comparée à la densité optique mesurée d'une gamme d'enzyme en solution. Ceci doit nous permettre de calculer la quantité d'enzyme active sur l'électrode d'or. Cette valeur pourra ensuite être comparée à la valeur estimée par la réponse en fréquence de la microbalance et à la valeur théorique de la masse d'une monocouche d'enzymes. Les protocoles expérimentaux de la préparation des enzymes et de la mesure de leur activité enzymatique au niveau des électrodes est donnée en annexe (annexes I, II et III).

La figure 60 présente l'évolution de la variation de la fréquence d'oscillation d'un quartz en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS suivie d'une solution de peroxydase concentrée à 100 µg/ml (le débit utilisé est de 50 µl/min et les deux solutions sont thermostatées).
<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>Figure 60 : Evolution de la fréquence en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS et d'une solution de peroxydase concentrée à 100 µg/ml au débit de 50 µl/min</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de peroxydase provoque une diminution rapide de la fréquence d'oscillation du quartz d'une cinquantaine de Hz, celle-ci étant attribuée à l'augmentation de masse liée à l'adsorption de la protéine sur l'électrode d'or. Le rinçage effectué par le tampon PBS provoque une légère remontée de la fréquence pouvant être attribuée à une légère désorption de la peroxydase.

Nous pouvons faire le calcul théorique de la masse d'une monocouche de peroxydase en faisant l'hypothèse que la molécule est globulaire et en tenant compte de son poids moléculaire. Le diamètre de la peroxydase peut alors être estimé à 6,685 nm (Collino, 1997) et son poids est de 7,31. $10^{-20}$ g. En supposant que les molécules forment une monocouche, que chaque molécule occupe la surface d'un carré et en prenant comme coté la valeur du diamètre de la molécule, la densité surfacique pour la peroxydase peut être estimée à 163 ng/cm$^2$. En tenant compte de la surface de notre électrode, la masse théorique d'une monocouche de peroxydase correspond à 32,7 ng ce qui équivaut, pour notre dispositif, à une variation de fréquence de 93 Hz. La variation de fréquence mesurée (48 Hz) correspond à une masse de 16,8 ng (en utilisant le coefficient reliant la masse à la fréquence déterminé expérimentalement), il semble donc que la peroxydase ne forme pas une monocouche sur la surface de l'électrode.

De plus, la masse de peroxydase estimée par la mesure de l'activité peroxydasique au niveau de l'électrode de ce quartz est de 1,24 ng, nous observons donc un écart (x 13,5) entre la
masse estimée par la microbalance à quartz et la masse estimée avec la mesure de l'activité enzymatique; c'est-à-dire que la masse estimée par la microbalance est 13,5 fois plus importante que celle estimée par le dosage enzymatique.

Nous avons alors estimé le comportement d'autres protéines pour voir si cette différence entre la masse estimée par la microbalance et par le dosage enzymatique était aussi observée.

La figure 61 présente l'évolution de la variation de la fréquence d'oscillation de deux quartz (les deux fréquences sont remises à zéro) en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS puis d'une solution de phosphatase alcaline concentrée à 1 et 10 µg/ml. Les solutions circulent au débit de 50 µl/min et sont toutes thermostatées.

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Figure 61 : Evolution de la variation de la fréquence d'oscillation de deux quartz en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS et d'une solution de phosphatase alcaline concentrée à 1 et 10 µg/ml</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de phosphatase alcaline sur les quartz provoque une diminution de la fréquence d'oscillation. Les profils d'adsorption sont différents pour les deux concentrations, l'adsorption est plus lente pour la plus faible concentration (le profil de la cinétique d'adsorption d'une solution plus concentrée que 10 µg/ml coïncide avec celui obtenu pour la concentration de 10 µg/ml et le plateau atteint, après rinçage, est identique). Pour la concentration de 1 µg/ml, la variation de la fréquence d'oscillation après rinçage au PBS est de 137 Hz alors que pour la concentration de 10 µg/ml celle-ci atteint 241 Hz (en tenant compte
de la légère désorption). Ces deux variations de fréquence correspondent respectivement à 47,9 et 84,3 ng d'enzymes adsorbées sur l'électrode.

Le diamètre d'une molécule de phosphatase alcaline peut être estimé à 10 nm en faisant l'hypothèse que la molécule est sphérique (Collino, 1997) et son poids est de 2,326. 10⁻¹⁹g. Le calcul théorique de la densité surfacique d'une monocouche de phosphatase alcaline donne 233 ng/cm² (en suivant le même raisonnement que pour la peroxydase), soit une masse de 46,6 ng pour la surface de nos électrodes, ce qui correspond à une variation de fréquence de 133 Hz. La variation de fréquence occasionnée par la circulation de la solution de phosphatase alcaline concentrée à 1 µg/ml (137 Hz) est comparable à la variation de fréquence théorique associée à la formation d'une monocouche d'enzyme sur l'électrode (133 Hz). Pour la solution plus concentrée (10 µg/ml), la variation de fréquence mesurée (241 Hz) est supérieure à celle correspondant à la formation d'une monocouche. Pour cette concentration, il est possible que la phosphatase alcaline forme une première monocouche puis, presque, une seconde (266 Hz pour deux monocouches avec le calcul théorique) ou bien que les protéines s'agrègent sur cette première couche.

La masse de phosphatase alcaline estimée par la mesure de l'activité enzymatique spécifique au niveau des quartz est de 3,2 ng pour le quartz en contact avec la solution concentrée, à 1 µg/ml (contre 47,9 ng estimés par la réponse de la microbalance à quartz) et de 10,6 ng pour l'autre quartz en contact avec la solution concentrée à 10 µg/ml (contre 84,3 ng estimés par la réponse de la microbalance à quartz). Nous observons donc, encore, un écart entre les deux estimations de la masse. D'une part, les deux écarts observés pour la phosphatase alcaline (x 15 pour la solution à 1 µg/ml et x 8 pour celle à 10 µg/ml) sont différents de celui observé pour la peroxydase et d'autre part, pour la même molécule, l'écart varie en fonction de la concentration de la solution qui circule sur le quartz (donc en fonction de la quantité de protéines adsorbées).

La figure suivante présente l'évolution de la variation de la fréquence d'oscillation de deux quartz (les deux fréquences sont remises à zéro) en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS et d'une solution de β-D-galactosidase concentrée à 1 et 10 µg/ml. Les solutions circulent au débit de 50 µl/min et sont toutes thermostatées.
<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Figure 62 : Evolution de la variation de la fréquence d'oscillation de deux quartz en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS et d'une solution de β-D-galactosidase concentrée à 1 et 10 µg/ml</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de β-D-galactosidase sur les quartz provoque une chute de la fréquence d'oscillation des quartz, la cinétique d'adsorption de la protéine en faible concentration est plus lente que celle mesurée pour la solution plus concentrée. Comme dans le cas de la phosphatase alcaline, le profil de la cinétique d'adsorption obtenu pour une solution encore plus concentrée (100 µg/ml par exemple) est similaire à celui obtenu pour une solution de β-D-galactosidase concentrée à 10 µg/ml et le même plateau est atteint après rinçage. La variation de la fréquence d'oscillation mesurée est de 150 Hz pour la circulation de la solution concentrée à 1 µg/ml et de 300 Hz pour la solution concentrée à 10 µg/ml. Ces variations correspondent respectivement à 52,5 et 105 ng d'enzyme adsorbées sur les électrodes.

Le diamètre d'une molécule de β-D-galactosidase peut être estimé à 14,9 nm et son poids est de 7,807. 10⁻¹⁹g. Le calcul théorique de la densité surfacique d'une monocouche de β-D-galactosidase donne 350 ng/cm², soit une masse de 70 ng pour la surface de nos électrodes, ce qui correspond à une variation de fréquence de 200 Hz. Les variations de la fréquence d'oscillation mesurées se situent en dessous de la variation de fréquence théorique associée à la formation d'une monocouche de β-D-galactosidase pour la solution concentrée à 1 µg/ml et au dessus pour la solution concentrée à 10 µg/ml.

La masse de β-D-galactosidase estimée par la mesure de son activité enzymatique au niveau des électrodes est de 5,9 ng pour le quartz en contact avec la solution concentrée à 1
µg/ml (contre 52,5 ng estimés par la réponse en fréquence de la microbalance) et de 15 ng pour le quartz en contact avec la solution concentrée à 10 µg/ml (contre 105 ng estimés par la réponse en fréquence de la microbalance). Ici encore, nous observons un écart entre les deux estimations. Les écarts observés pour la β-D-galactosidase (x 9 pour la solution à 1 µg/ml et x 7 pour celle à 10 µg/ml) sont différents de ceux déjà observés pour les deux autres enzymes. Et comme dans le cas de la phosphatase alcaline, l'écart varie en fonction de la concentration de la solution qui circule sur la microbalance à quartz.

Deux hypothèses non exclusives peuvent être avancées pour expliquer ce problème de non concordance de l'estimation de la masse que nous retrouvons pour les trois types d'enzymes :

- soit la microbalance à quartz fournit une réponse surévaluée de la quantité de protéines adsorbées sur l'électrode,

- soit la mesure de l'activité enzymatique donne une quantité de protéine sous-évaluée.

Les résultats de nos expériences laissent suggérer que l'écart entre les deux estimations viendrait plutôt d'un problème concernant la mesure de l'activité enzymatique. En effet, d'une part, nous comparons l'activité enzymatique d'une enzyme adsorbée à l'activité enzymatique d'une enzyme en solution. Ceci peut introduire un biais dans le dosage mais cela n'explique pas pourquoi l'écart varie avec la concentration d'enzyme (donc avec la quantité d'enzyme adsorbée sur le quartz). D'autre part, ce dernier point est important car les enzymes en s'adsorbant peuvent se dénaturer ce qui diminue leur activité spécifique et le taux de dénaturation peut dépendre de la quantité d'enzyme sur la surface et de leur environnement. En effet, le fait de former plusieurs monocouches, ou une monocouche et des agrégats, peut protéger les enzymes de la dénaturation. Les enzymes adsorbées sur la première couche peuvent ainsi rester plus actives et dans ce cas la différence est alors moins grande entre les deux estimation de la masse. Néanmoins, nous ne pouvons pas non plus rejeter l'hypothèse d'une surestimation de la masse mesurée par la microbalance à quartz car nous utilisons pour calculer la masse déposée le coefficient masse/fréquence déterminé expérimentalement avec le dépôt d'une couche métallique. Les propriétés viscoélastiques du film formé par les protéines sont différentes de celle de la couche de métal et ce paramètre peut influencer la fréquence. Àfin d'étudier ces phénomènes nous avons réalisé des mesures couplées d'admittance électroaccoustique et de fréquence d'oscillation durant l'adsorption de protéines.

Il faut rappeler que dans le but de développer l'immunocapteur, ce n'est pas la réponse "absolue" de la microbalance à quartz (c'est-à-dire la masse d'antigènes fixés spécifiquement sur les anticorps immobilisés) qui est utilisée puisque nos résultats seront comparés à une gamme d'étalonnage réalisée avec la microbalance (variation de la fréquence d'oscillation en
fonction de la concentration en antigène). Néanmoins, il est important de bien comprendre le fonctionnement de la microbalance avec de tels films de protéines et dans un environnement aqueux, afin de valider son utilisation.

## 3. 2. Mesures couplées pendant l'adsorption de protéines

Ces expériences ont été réalisées à l'aide du dispositif de mesures couplées décrit précédemment. Nous avons mesuré alternativement la fréquence et l'admittance électroacoustique d'un résonateur à quartz avant (dans l'air) et pendant la circulation sur le quartz (installé dans la cellule miniature) d'une solution de PBS et d'une solution de protéine. Ces expériences ont été réalisées pendant l'adsorption des trois enzymes (peroxydase, phosphatase alcaline et β-D-galactosidase), mais nous ne décrirons que les résultats concernant l'adsorption de β-D-galactosidase car c'est l'adsorption de cette enzyme qui provoque la plus grande variation de fréquence. Les observations et les conclusions sont toutefois identiques pour les deux autres protéines.

Toutes les solutions sont thermostatées à + 20°C et circulent à un débit de 50 µl/min. La période entre deux mesures d'admittance est de 5 minutes et le cadencement du fréquenceемètre est de 5 secondes. Après chaque expérience, les résultats de la mesure d'admittance sont ajustés par les programmes Fratrac puis Ariane afin de déterminer les paramètres du circuit équivalent du résonateur à quartz. Le tableau XIII présente la valeur des paramètres du circuit équivalent et de la fréquence d'oscillation du quartz pour des mesures dans l'air et dans le tampon PBS.

<table><caption>Tableau XIII : Valeurs des paramètres du circuit équivalent déterminés à partir de la mesure d'admittance électroacoustique et valeur de la fréquence d'oscillation du quartz pour des mesures dans l'air et dans le PBS</caption><thead><tr><td>Mesure</td><td>R / Ω</td><td>L / mH</td><td>Cp / pF</td><td>Fs / Hz</td><td>Fmicrobalance / Hz</td></tr></thead><tbody><tr><td>dans l'air</td><td>17,78</td><td>13,04543</td><td>20,871</td><td>27018937</td><td>27020444</td></tr><tr><td>dans le PBS</td><td>510,11</td><td>13,05478</td><td>22,755</td><td>27013585</td><td>27015250</td></tr></tbody></table>

Les figures qui suivent présentent l'évolution en fonction du temps de la fréquence d'oscillation du quartz, de la fréquence série et de la résistance pendant la circulation des solutions. Sur les figures, les flèches indiquent le moment où la solution de protéine arrive sur le quartz et le moment où le rinçage au tampon PBS est effectué.