<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Figure 63 : Evolution de la variation de la fréquence de la microbalance (a) et de la fréquence série (b) déterminée à partir des mesures d'admittance électroacoustique pendant la circulation d'une solution de PBS et de β-D-galactosidase</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de β-D-galactosidase provoque une diminution de la fréquence d'oscillation du quartz de 335 Hz consécutive à l'adsorption de la protéine (figure 63 a), les intervalles observés sur cette figure correspondent aux instants où la mesure de l'admittance est réalisée. Quand la mesure de la fréquence d'oscillation est de nouveau réalisée, à la fin d'une mesure d'admittance, la fréquence se stabilise après un régime transitoire qui dure une trentaine de secondes. La fréquence série expérimentale, déterminée à partir des mesures d'admittance (équation 24, chapitre II), est aussi sensible à l'adsorption des protéines et la diminution en valeur relative de cette fréquence est similaire à celle de la fréquence de la microbalance à quartz (figure 63 b).

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Figure 64 : Evolution de la fréquence absolue de la microbalance à quartz et de la fréquence série absolue
(a) et évolution des variations des deux fréquences remises à zéro (b) pendant la circulation d'une
solution de PBS et de β-D-galactosidase</figcaption></figure>
En valeur absolue, les deux fréquences sont différentes (figure 64 a) et la valeur de la fréquence d'oscillation de la microbalance est systématiquement plus grande que celle de la fréquence série (dans l'air comme en milieu liquide). Si nous représentons sur le même graphique (figure 64 b) la variation des deux fréquences remises à zéro (pour la fréquence d'oscillation, nous avons pris la dernière mesure de fréquence avant la mesure d'admittance qui suit) nous pouvons voir que ces variations sont pratiquement confondues. Ainsi, même si en valeur absolue les deux fréquences sont différentes, leurs variations sont identiques.

La mesure de l'activité enzymatique au niveau de l'électrode du quartz réalisée à la fin de l'expérience a permis d'estimer la masse à 20 ng de β-D-galactosidase enzymatiquement active. La réponse en fréquence (335 Hz) équivaut à une masse 117 ng pour notre électrode, nous observons donc un écart de 6 entre les deux estimations.

L'évolution de la résistance motionelle pendant l'expérience est représentée figure 65. L'arrivée de la protéine provoque une augmentation de la valeur de la résistance de 6 Ω, puis la résistance diminue lors du rinçage au PBS.

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Figure 65 : Evolution de la résistance déterminée à partir des mesures d'admittance électroaccoustique pendant la circulation d'une solution de PBS et de β-D-galactosidase</figcaption></figure>

La résistance caractérise l'amortissement du quartz et ce paramètre est sensible aux propriétés viscoélastiques de la couche, comme les simulations à l'aide de notre modèle l'ont montrées (chapitre II, paragraphe 4. 4). L'arrivée de la protéine provoque une variation de la résistance et l'effet du lavage est aussi visible. Celui-ci peut entraîner un remaniement de la couche de protéine pouvant s'expliquer par un changement de conformation des protéines et/ou par la légère désorption observée sur la réponse en fréquence. Ces phénomènes (formation de la couche et remaniement) sont accompagnés de changements de la viscoélasticité au niveau du quartz que la résistance distingue.
Notre modèle nous a montré que des variations de la viscoélasticité de la couche déposée sur l'électrode de la microbalance à quartz pouvait induire une erreur de 8 % (au maximum) sur l'estimation de la masse du dépôt à partir de la variation de la fréquence série. Nous mesurons expérimentalement de telles variations des propriétés viscoélastiques par l'intermédiaire de la résistance. Comme les variations relatives de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz et celles de la fréquence série sont identiques, nous pouvons penser que la réponse en fréquence de la microbalance est aussi influençée par les changements viscoélastiques, en parallèle de l'effet massique, et dans les mêmes proportions. Une erreur de 8 % sur l'estimation de la masse déterminée à partir de la réponse en fréquence de la microbalance correspond à 9 ng pour les 117 ng correspondant aux 335 Hz de variation de fréquence. Ces résultats confirment l'hypothèse que la mesure de l'activité enzymatique des enzymes adsorbées sur l'or correspond à un dosage par défaut. En effet, même en tenant compte de l'erreur, l'estimation de la masse par la microbalance reste très différente des 20 ng estimés par le dosage.

Il semble que les mesures de masse effectuées à l'aide de la microbalance à quartz dans le cas d'une couche de protéine et en milieu liquide soient fiables avec une erreur maximale de 8 % dans le cas où la viscoélasticité de la couche au niveau de l'électrode varie.

## CONCLUSION

Ce chapitre avait pour but d'exposer le travail réalisé concernant la mise au point de notre microbalance à quartz et des techniques permettant son étude dans le cadre de son utilisation comme transducteur d'un immunocapteur.

Nous avons augmenté la sensibilité massique de notre dispositif en développant un oscillateur pour la microbalance permettant de faire osciller des quartz à 27 MHz en milieu liquide. Nous avons conçu et développé une cellule miniature permettant de faire circuler un faible volume de solution sur le quartz et nous avons optimisé l'ensemble du dispositif, notamment en ce qui concerne l'influence de la température, afin de réduire les dérives et le bruit de fond de la fréquence d'oscillation. La microbalance a ensuite été calibrée et son fonctionnement en milieu liquide, avec un dépôt de protéines, a été étudié et validé par le biais de la mise au point de mesures couplées de la fréquence d'oscillation et de l'admittance électroacoustique du résonateur. Ce dispositif, dorénavant bien caractérisé, est tout à fait exploitable comme transducteur pour la réalisation d'un immunocapteur.
Chapitre IV

ELABORATION ET CARACTERISATION
DE LA COUCHE IMMUNOSENSIBLE
# INTRODUCTION

L'immobilisation d'anticorps à la surface d'un transducteur est une étape primordiale dans la mise au point d'un immunocapteur car la qualité de la couche bioréceptrice conditionnera l'efficacité du capteur, entre autres, en termes de sensibilité et de spécificité. Le but à atteindre lors de cette étape n'est pas forcement une grande quantité d'immunoglobulines immobilisées mais plutôt le maintien d'une bonne immunoréactivité de ces anticorps quelle que soit la technique d'immobilisation utilisée.

Nous exposerons dans ce chapitre les techniques mises en œuvre pour immobiliser les anticorps du couple antigène/anticorps choisi. Nous présenterons les différentes méthodes utilisées pour contrôler cette immobilisation afin de pouvoir comparer les différentes techniques d'immobilisations testées. Enfin, nous étudierons l'influence du flux et de la vibration du quartz sur l'efficacité de la réaction antigène/anticorps.

# 1. IMMOBILISATION DES ANTICORPS SUR LES ELECTRODES EN OR DE LA MICROBALANCE A QUARTZ

## 1. 1. Choix du couple antigène/anticorps

Nous avons choisi un couple expérimental antigène/anticorps qui nous permet de contrôler facilement l'immunoréactivité des immunoglobulines. Il s'agit d'anticorps monoclonaux de souris anti-peroxydase et notre antigène est la peroxydase. Grâce à l'activité enzymatique spécifique de notre antigène, nous pouvons contrôler la quantité de peroxydase, enzymatiquement active, fixée spécifiquement sur les anticorps immobilisés et donc estimer la quantité d'anticorps immunoréactifs immobilisés.

Il faut noter que la détection de la peroxydase n'est d'aucun intérêt dans le domaine de la biologie médicale ni dans le secteur militaire, mais que ce couple antigène/anticorps constitue un modèle pour caractériser l'immobilisation des anticorps et étudier l'influence de la microbalance à quartz sur la réaction antigène/anticorps. Nous utiliserons, comme nous le verrons dans le dernier chapitre, deux autres couples antigène/anticorps plus représentatifs dans le cadre de la détection. Il s'agit d'anticorps anti-entérotoxine B de Staphylocoque (SEB) pour la détection de la SEB, et d'antioorps anti-immunoglobulines G (IgG) pour la détection d'IgG.
Les anticorps monoclonaux de souris (IgG1) et la peroxydase ont été fournis par la société Sigma. Le protocole de la préparation des anticorps est donné en annexe IV.

## 1. 2. Les différentes techniques d'immobilisation utilisées

Les techniques utilisables pour immobiliser des anticorps à la surface des électrodes (en or le plus souvent) d'une microbalance à quartz sont variées (cf tableau II, chapitre I). Nous retrouvons des techniques d'adsorption simple sur l'électrode, des techniques de greffage covalent par l'intermédiaire de réactifs pontants après fonctionnalisation de la surface (réaction d'organosilanes ou d'alkyl thiols sur l'or), des techniques d'inclusion dans un polymère déposé sur l'électrode et de revêtement de protéine A... Nous avons testé trois méthodes d'immobilisation différentes reposant sur différents principes. Notre but était d'optimiser cette étape en terme de quantité d'antigène fixé spécifiquement sur les anticorps immobilisés afin de pouvoir obtenir une réponse en fréquence la plus grande possible.

### 1. 2. 1. Greffage covalent

Les techniques de greffage covalent font intervenir un agent de couplage qui va relier chimiquement la protéine au "support" par l'établissement de liaisons covalentes entre une fonction chimique de la protéine à immobiliser et une fonction chimique du support. Le greffage covalent est, en théorie, un phénomène irréversible qui permet la régénération de la surface (par la désorption spécifique des antigènes, sans retirer les anticorps greffés), ce qui par conséquent la rend réutilisable. Toutefois certains auteurs estiment que 75 % des protéines liées de façon covalente sont simplement adsorbées (Williams et Blanch, 1994). De plus, il faut savoir que c'est l'adsorption qui va "initier" le greffage covalent dans le sens où les protéines doivent se rapprocher de la surface pour que les réactions chimiques aient lieu et que ce rapprochement est gouverné par les interactions électrostatiques entre la protéine en solution et le support. Les méthodes d'immobilisation faisant intervenir le greffage covalent restent très utilisées (notamment pour immobiliser des anticorps sur les surfaces transductrices des biocapteurs optiques comme le BIAcore et l'IAsys) et sont souvent inspirées des techniques décrites pour marquer des anticorps avec des enzymes. L'avantage principal des couches de protéines obtenues par greffage covalent est leur grande stabilité vis-à-vis des variations de pH et de force ionique.

Les surfaces en or ne permettent pas de réaliser un greffage direct et il est nécessaire de fonctionnaliser, préalablement, la surface pour introduire des groupements fonctionnels
susceptibles de réagir par la suite avec les agents de couplage. Nous avons utilisé la propriété des alkyl thiols qui s'auto-assemblent spontanément sur l'or pour former une monocouche (technique des "SAM : Self Assembled Monolayer") afin de fonctionnaliser la surface des électrodes en or de la microbalance. En effet, les thiols à chaîne saturée (SH-(CH2)n-X) en solution, mais aussi les disulfures, s'auto-organisent spontanément sur l'or pour former une monocouche dense et ordonnée, par l'établissement de liaisons pseudo-covalentes entre les atomes de soufre et d'or (Yamamoto et al., 1993; Cheng et Brajter-Toth, 1992). Les chaînes alkyles se compactent dans une conformation "zig-zag" et forment une structure inclinée de type cristallin (Nuzzo et al., 1990). Il a été montré que tout groupement fonctionnel compatible avec un alkyl thiol est susceptible d'être introduit à la surface d'un support en or par la formation de ces monocouches, bien que des groupement terminaux volumineux puissent gêner la densification des chaînes hydrocarbonées (Bain et al., 1989). Une représentation schématique d'une monocouche obtenue par cette technique est donnée figure 66.

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Figure 66 : Représentation schématique d'une monocouche d'alkyl thiol qui s'auto-organise spontanément sur l'or (d'après Allara 1995)</figcaption></figure>

Nous avons utilisé un disulfure, l'acide thioctique ($S_2-(CH_2)_7-COOH$) et un alcanethiol, la cystéamine ($SH-CH_2-CH_2-NH_2$) pour fonctionnaliser nos électrodes. L'extrémité carboxylique de la monocouche formée par l'acide thioctique nous permet de greffer les anticorps (sur une fonction aminée) par l'intermédiaire des réactifs suivants : le 1-éthyl-3-(diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et la N-hydroxysuccinimide (NHS). L'extrémité aminée de la monocouche formée par la cystéamine nous permet de greffer les anticorps (sur une fonction aminée) par l'intermédiaire du glutaraldéhyde.
## Fonctionnalisation

Avant chaque traitement, les quartz sont nettoyés extemporanément par immersion pendant 7 secondes dans un mélange chaud d'acide sulfurique concentré (4 volumes) et d'eau oxygénée à 30% (1 volume). Ce nettoyage est suivi de rinçages à l'eau désionisée, puis à l'éthanol absolu. Les quartz sont ensuite immergés dans une solution d'acide thioctique (Aldrich, T2806-6) ou de cystéamine (Aldrich, 12292-0) à 0,1 % (masse/masse) diluée dans l'éthanol absolu, durant 24 heures. Les quartz sont ensuite rincés à l'éthanol absolu et séchés sous un flux d'azote.

Les quartz, ainsi fonctionnalisés, sont alors installés entre deux plaques en plexiglas (figure 67). La plaque supérieure est perçée de six puits, de sorte que seules les électrodes supérieures des quartz soient en contact avec la solution déposée dans le puits. Un joint torique à la base du puits et de même diamètre que l'électrode assure l'étanchéité au niveau de l'électrode. Jusqu'à 300 µl de solution peuvent être déposés dans chaque puits.

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Figure 67 : Représentation schématique en coupe de la "plaque 6 puits" utilisée pour réaliser les greffages</figcaption></figure>

## Greffage covalent au carbodiimide et à la N-hydroxysuccinimide après fonctionnalisation de l'électrode d'or par une monocouche d'acide thioctique

Le protocole du greffage a été établi à partir du protocole d'immobilisation d'immunoglobulines sur le gel de dextran carboxylé déposé sur la surface transductrice du BIAcore (Johnsson et al., 1991). Le principe de ce couplage est schématisé sur la figure suivante.
<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>Figure 68 : Principe du greffage covalent d'immunoglobulines par la méthode au carbodiimide et à la N-hydroxysuccinimide sur une monocouche d'acide thioctique formée sur l'électrode de la microbalance à quartz</figcaption></figure>

Une fraction des fonctions carboxyliques de l'extrémité de la monocouche d'acide thioctique réagit avec le carbodiimide (1-éthyl-3-(diméthylaminopropyl) carbodiimide) et la N-hydroxysuccinimide pour former des esters succinimidiques très réactifs. Ces sites réagissent ensuite avec les fonctions α-aminées des protéines (et aussi avec les fonctions ε-aminées des lysines). Les protéines sont ainsi retenues sur le support par liaison covalente. Les sites ester qui n'ont pas réagi sont ensuite désactivés par l'action de l'éthanolamine. Pour optimiser le greffage il faut préconcentrer au maximum les protéines à la surface. Pour cela, nous pouvons jouer avec le pH et la force ionique du tampon dans lequel est solubilisée la protéine. En effet, plus la différence de charge entre la surface et les protéines en solution sera grande, plus les interactions électrostatiques seront importantes et plus les protéines auront tendance à se rapprocher de la surface. L'idéal est d'utiliser un tampon de faible force ionique et ayant un pH inférieur au point isoélectrique de la protéine et supérieur au pKa des molécules à la surface. De cette façon, les protéines, plutôt chargées positivement, se rapprochent de la surface, plutôt chargée négativement, sans qu'il y ait trop de compétition avec les ions du tampon.

Le protocole d'immobilisation retenu est le suivant. Six quartz nettoyés et fonctionnalisés sont installés entre les deux plaques en plexiglas. 200 µl de tampon HEPES
(contenant 10 mM d'hépes, 0,15 M de NaCl, 3,4 mM d'EDTA et 0,05% de surfactant P20, pH 7,4) sont déposés dans chaque puits et sont laissés 1 minute. Le tampon est ensuite retiré (par aspiration) et 200 µl d'un mélange extemporané, volume à volume, d'une solution de N-hydroxysuccimide 0,05 M et d'une solution de 1-éthyl-3-(diméthylaminopropyl) carbodiimide 0,2 M sont déposés dans chaque puits et sont laissés pendant 10 minutes. La solution est ensuite retirée et remplacée par 100 µl d'une solution d'anticorps anti-peroxydase concentrée à 100 µg/ml diluée en tampon acétate 10 mM à pH 5. Pour chaque série de six quartz, nous réalisons systématiquement un quartz témoin d'adsorption non spécifique, c'est-à-dire un quartz fonctionnalisé et activé mais sur lequel nous déposons 100 µl de tampon hépes à la place de la solution d'anticorps. Celui-ci nous servira à vérifier que notre antigène, la peroxydase, ne s'adsorbe pas d'une manière non spécifique sur la surface de l'électrode dépourvue d'anticorps. Après 1 heure d'incubation, la solution (anticorps et tampon pour le quartz témoin) est retirée et remplacée par 200 µl d'une solution d'éthanolamine 1 M à pH 8,5 laissée pendant 10 minutes. La solution est ensuite retirée et 100 µl d'HCl 10 mM sont déposés dans chaque puits et sont laissés pendant 3 minutes. Cette étape permet de désorber les immunoglobulines non fixées de manière covalente. Les électrodes sont ensuite rincées 5 fois par l'ajout de 200 µl de tampon hépes laissés 1 minute. La surface est enfin saturée par l'ajout de 200 µl d'une solution d'albumine sérique bovine concentrée à 1 % diluée dans le tampon hépes. Cette étape de saturation dure 1 heure, temps au bout duquel la surface est rincée 5 fois par 200 µl de tampon.

## Greffage covalent par l'intermédiaire du glutaraldéhyde après fonctionnalisation de l'électrode d'or par une monocouche de cystéamine

Les fonctions aminées de l'extrémité de la monocouche formée par la cystéamine sur les électrodes des quartz permettent de réaliser un greffage covalent des anticorps anti-peroxydase par l'intermédiaire du glutaraldéhyde. Le glutaraldéhyde, $CHO-(CH_2)_3-CHO$, est un réactif de couplage homobifonctionnel des protéines très couramment utilisé pour relier deux groupements aminés. La réaction du glutaraldéhyde avec les protéines implique principalement la fonction $\epsilon$ aminée de la lysine, mais aussi les fonctions $\alpha$ aminées, et les fonctions thiols des cystéines (Van Regenmortel et al., 1988). Le glutaraldéhyde se présente sous différentes formes en fonction du pH (Billard, 1991). A pH 7-8 (pH auquel nous l'avons utilisé) il semble que la forme dimérique soit prépondérante. La figure 69 présente schématiquement le principe du greffage.
<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>Figure 69 : Principe du greffage covalent d'immunoglobulines par l'intermédiaire du glutaraldéhyde sur une monocouche de cystéamine formée sur l'électrode de la microbalance à quartz</figcaption></figure>

Le protocole du greffage a été établi à partir de la littérature (Ternynck et Avrameas, 1987), il s'agit d'un couplage en deux étapes. Six quartz nettoyés et fonctionnalisés par la cystéamine sont installés entre les deux plaque en plexiglas. Après un rinçage au tampon phosphate 0,1 M pH 6,8, 100 µl de glutaraldéhyde (Sigma) à 1 % dilué en tampon phosphate 0,1 M pH 6,8 sont déposés dans chaque puits et sont laissés pendant 24 heures. Les quartz sont ensuite rinçés avec le tampon phosphate : 5 fois 200 µl pendant 1 minute. 100 µl de la solution d'anticorps concentrée à 100 µg/ml et diluée en tampon phosphate sont déposés et laissés pendant 24 heures, pour le quartz témoin la solution d'anticorps est remplacée par du tampon. Après 5 rinçages, la réaction est stoppée par l'addition de 200 µl d'une solution de lysine 1 M diluée en tampon phosphate 0,1 M pH 7,4, laissés pendant 1 heure. Après 5 rinçages avec le tampon phosphate 0,1 M pH 7,4, une étape de saturation des sites de fixation non spécifique est réalisée par l'ajout de 200 µl d'une solution d'albumine sérique bovine concentrée à 1 % diluée dans du tampon PBS. Cette étape de saturation dure 1 heure, temps au bout duquel la surface est rincée 5 fois par 200 µl de tampon PBS.

### 1. 2. 2. Adsorption

La technique d'immobilisation d'anticorps par adsorption physique est extrêmement simple puisqu'elle consiste seulement à mettre en contact les immunoglobulines en solution avec le support. Un grand nombre de liaisons faibles (interactions hydrophobes, ioniques, forces de van der Waals, liaisons hydrogène) entre la surface et la protéine peuvent s'établir, et l'ensemble de ses forces peut aboutir à un assemblage très stable. Néanmoins, une variation importante du pH, de la force ionique ou de la température peut provoquer une désorption
des anticorps du support. Et contrairement aux techniques de greffage covalent, la technique d'adsorption ne permet pas de régénérer la surface en désorbant seulement les antigènes liés aux anticorps, puisque ces derniers comme les antigènes vont se désorber de la surface en présence d'un tampon de désorption. Ce type d'immobilisation convient bien pour un usage unique, ou pour tester différents couples anticorps/antigène sur un même transducteur.

L'immobilisation des anticorps par adsorption simple à été réalisée directement sur les électrodes d'or des quartz nettoyés et sur des quartz dont l'électrode a été fonctionnalisée par une monocouche de mercaptan. Le mercaptan est un alcanethiol (SH-(CH₂)₁₇-CH₃) qui nous permet de modifier la surface de l'électrode en la rendant plus hydrophobe. En effet, nous pourrons ainsi comparer l'effet de l'état de la surface sur l'adsorption des anticorps. En général, les protéines s'adsorbent mieux sur un support hydrophobe et leur désorption du support par modification du pH ou de la force ionique est très difficile (Andrade, 1985). Pour fonctionnaliser les électodes par le mercaptan, les quartz nettoyés sont immergés pendant 24 heures dans une solution de mercaptan (Aldrich, O-185-8) concentrée à 0,1 % diluée dans l'hexane. Les quartz sont ensuite rincés à l'hexane et séchés sous un flux d'azote. Pour chaque série de six quartz, un témoin négatif est réalisé. Le protocole d'immobilisation des anticorps anti-peroxydase par adsorption est le suivant (que ce soit pour des quartz fonctionnalisés par le mercaptan ou non). Les quartz sont installés entre les deux plaques en plexiglas et 100 µl d'une solution d'anticorps concentrée à 100 µg/ml diluée dans le tampon PBS sont déposés sur les électrodes et sont laissés durant une nuit à la température du laboratoire. Pour le témoin d'adsorption non spécifique, la solution d'anticorps est remplacée par du PBS. Le lendemain, les électrodes sont rincées 5 fois par 200 µl de PBS laissés pendant 1 minute. Les sites de fixation non spécifique sont alors saturés par l'ajout de 200 µl d'une solution d'albumine sérique bovine concentrée à 1 % diluée dans du tampon PBS. Cette étape de saturation dure 1 heure, temps au bout duquel la surface est rincée 5 fois par 200 µl de tampon PBS.

## 2. CONTROLE DE L'IMMOBILISATION

Nous avons mis en œuvre différentes techniques pour contrôler l'immobilisation des anticorps et notamment pour vérifier leur immunoréactivité après leur immobilisation.

### 2. 1. Mesure de l'activité peroxydasique

L'antigène de notre couple anticorps/antigène expérimental, la peroxydase, est douée d'activité enzymatique ce qui nous permet de mesurer la quantité d'enzymes (enzymatiquement active) fixées spécifiquement sur les anticorps immobilisés et donc
d'estimer la quantité d'anticorps immunoréactifs. Pour ce faire, les quartz sur lesquels les anticorps ont été immobilisés (et quelle que soit la technique utilisée) sont mis en contact avec une solution de peroxydase pendant un temps déterminé. Après rinçages, nous révélons l'activité peroxydasique, au niveau de l'électrode des quartz, par l'ajout du substrat de l'enzyme et d'un chromogène. Au bout d'un certain temps, la densité optique de la solution (qui s'est colorée par l'apparition des produits de la réaction enzymatique proportionnellement à la quantité d'enzyme active présente) est mesurée et est comparée à la densité optique d'une gamme d'enzyme réalisée en solution mesurée dans les mêmes conditions et au bout du même temps de réaction. Le principe de cette mesure est donné schématiquement sur la figure 70.

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>Figure 70 : Représentation schématique du principe du dosage de la peroxydase fixée sur les anticorps immobilisés sur l'électrode d'or de la microbalance à quartz</figcaption></figure>

Ce dosage n'est pas absolu car nous comparons l'activité enzymatique de la peroxydase fixée sur les anticorps immobilisés à l'activité de l'enzyme en solution. De plus, l'activité spécifique de l'enzyme, en solution, incubée avec les anticorps dans un rapport molaire, est légèrement diminuée (Bizet, 1994). Ce dosage sous-estime donc la quantité de peroxydase fixée mais si nous faisons l'hypothèse que l'activité de l'enzyme est toujours modifiée de la même façon, nous pouvons comparer cette quantité pour les différentes méthodes d'immobilisation. Ceci nous permet d'estimer facilement et rapidement la quantité d'anticorps immunoréactifs immobilisés afin de comparer les différentes techniques d'immobilisation et d'étudier l'influence du flux et de la vibration des quartz sur l'interaction antigène/anticorps. De plus, nous pouvons, grâce à ce test, vérifier la spécificité de la fixation des antigènes (c'est-à-dire l'absence d'adsorption non spécifique après la saturation de la surface) en dosant la quantité d'enzyme sur les quartz témoins sans anticorps.
Le protocole du dosage est le suivant. Après avoir réalisé l'immobilisation des anticorps, nous déposons sur les quartz, installés entre les deux plaques de plexiglas, 100 µl d'une solution de peroxydase concentrée à 10 µg/ml et diluée dans du tampon PBS. Une incubation standard de 30 minutes a été choisie. Pendant ce temps, une gamme de dilution à partir d'une solution mère de peroxydase est réalisée en tampon PBS de 1 µg/ml à 1,4 ng/ml (dilutions géométriques de raison 3). 10 µl de chaque dilution et 10 µl de tampon PBS pour le blanc sont déposés dans les puits d'une plaque de microtitration. Au temps zéro, 100 µl d'une solution d'ABTS (2,2'-azino-di-(3-éthylbenzthiazoline)acide sulfonique) concentrée à 1 mM, diluée en tampon citrate phosphate pH 4,3 et contenant 0,01 % d'H₂O₂ à 30% ajoutés extemporanément, sont déposés dans chaque puits. Au bout de 10 minutes, la réaction enzymatique est stoppée par l'ajout de 50 µl d'une solution d'azide de sodium concentrée à 0,1 g/l et la densité optique de chaque puits est mesurée à 405 nm à l'aide d'un lecteur de plaque (Metertek, ε960). Cette gamme est réalisée en triple exemplaire. Nous pouvons ensuite tracer la droite d'étalonnage (moyenne des DO en fonction de la concentration de peroxydase par puits). Après les 30 minutes d'incubation avec la solution de peroxydase, les quartz sont rincés (200 µl de PBS par puits pendant 1 minute) et sont installés entre deux plaques propres (car la peroxydase peut se fixer dans les puits en plexiglas). 200 µl de la solution d'ABTS sont alors déposés sur chaque électrodes. Au bout de 10 minutes, 110 µl de solution sont prélevés et déposés dans un puits d'une plaque de microtitration contenant 50 µl d'une solution d'azide de sodium concentrée à 0,1 g/l, et la densité optique est immédiatement mesurée. La concentration de peroxydase (C), correspondant à la DO du quartz, déterminée graphiquement grâce à la droite d'étalonnage, permet d'estimer la quantité de peroxydase active fixée sur le quartz ($Q = C \times V_{ABTS}$).

## 2. 2. Techniques d'imagerie

Nous avons essayé d'utiliser des techniques d'imagerie, disponibles au laboratoire, pour "visualiser" la surface des électrodes des quartz avant et après l'immobilisation des anticorps. Ces études sont assez peu courantes dans le domaine des biocapteurs et notre but était principalement d'apprécier le recouvrement de la surface des électrodes d'or par les immunoglobulines. Nous avons observé la surface des électrodes par microscopie électronique à balayage (MEB) et par microscopie à force atomique (AFM).

Le microscope électronique à balayage permet l'observation directe de la morphologie d'une surface. L'analyse est réalisée sous vide et les échantillons non conducteurs, comme les protéines, doivent être préalablement métallisés. La résolution atteinte avec ces dispositifs est de l'ordre de 5 nm. Le microscope disponible au laboratoire est un modèle S 440 (Leica).
La microscopie à force atomique repose sur les interactions d'une pointe avec la surface de l'échantillon analysé. Les forces mises en jeu sont le plus souvent de type van der Waals. Le signal recueilli par le dispositif permet de reconstruire une image de la surface à l'échelle atomique. Le microscope AFM utilisé est de marque Topometrix.

# 3. RESULTATS

## 3. 1. Mesure de l'activité peroxydasique

### 3.1.1. Comparaison de la quantité de peroxydase mesurée pour les différentes méthodes d'immobilisation

Nous avons comparé la quantité de peroxydase révélée par la mesure de l'activité peroxydasique au niveau des électrodes après l'immobilisation des anticorps par les différentes méthodes décrites. Après chaque immobilisation, les électrodes sont laissées en présence d'une solution d'antigène concentrée à 10 µg/ml pendant 30 minutes. L'activité peroxydasique est alors mesurée après le rinçage des électrodes (et leur changement de plaque). Les résultats de la quantité de peroxydase déterminée sont donnés en masse pour la surface de l'électrode sur la figure 71. Ces résultats correspondent à la moyenne de deux séries de six quartz (10 quartz sur lesquels les anticorps ont été immobilisés et 2 quartz témoins sans anticorps) pour les trois méthodes d'immobilisation.

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>Figure 71 : Quantité moyenne de peroxydase révélée sur les quartz pour les différentes méthodes d'immobilisation testées</figcaption></figure>
Le tableau suivant regroupe les résultats en masse de peroxydase mesurée sur l'électrode et en nombre de molécules correspondant par cm² pour les quartz revêtus d'anticorps pour les trois méthodes d'immobilisation.

<table><caption>Tableau XIV : Comparaison de la quantité de peroxydase mesurée par le test enzymatique après l'immobilisation des anticorps anti-peroxydase par les différentes méthodes.</caption><thead><tr><th></th><th>Glutaraldéhyde</th><th>NHS-EDC</th><th>Adsorption</th></tr></thead><tbody><tr><td>Quantité de peroxydase moyenne sur l'électrode après l'immobilisation des anticorps en pg</td><td>109 +/- 53<br>RSD = 49 %</td><td>902 +/- 93<br>RSD = 10 %</td><td>1179 +/- 42<br>RSD = 3,5 %</td></tr><tr><td>Nombre moyen de molécules de peroxydase par cm² après l'immobilisation des anticorps</td><td>7,5.10<sup>9</sup></td><td>61,7.10<sup>9</sup></td><td>80,6. 10<sup>9</sup></td></tr></tbody></table>

Nous pouvons, tout d'abord, remarquer la très faible adsorption non spécifique de la peroxydase pour les deux techniques de greffage covalent et son absence dans le cas de l'adsorption des anticorps. L'étape de saturation réalisée pour les trois méthodes (100 µl de BSA à 1 % pendant 1 heure) est efficace. La peroxydase mesurée sur les quartz où nous avons immobilisés les anticorps est donc bien fixée spécifiquement sur les anticorps immunoréactifs.

D'autre part, les trois techniques donnent des résultats différents à la fois en terme de quantité mesurée et en terme de reproductibilité. Nous avons fait l'hypothèse que l'activité enzymatique de la peroxydase fixée sur ses anticorps était modifiée, mais constante quelle que soit la méthode d'immobilisation, nous pouvons donc conclure que la méthode qui donne les meilleurs résultats, à la fois en terme de quantité maximale d'antigène fixé et de reproductibilité, est la technique d'adsorption. Les mauvais résultats obtenus pour le greffage au glutaraldéhyde peuvent venir d'un problème au niveau de la fonctionnalisation de l'électrode d'or par la cystéamine. En effet, cette molécule est petite (SH-CH₂-CH₂-NH₂) et la monocouche formée par la technique des SAM est vraisemblablement mal organisée et peu dense ce qui expliquerait la mauvaise qualité du greffage et la dispersion de la quantité de peroxydase mesurée.

Notre objectif concernant l'élaboration de la couche d'anticorps était d'obtenir une quantité maximale d'antigènes fixés spécifiquement afin d'optimiser la réponse de la microbālance, c'est-à-dire d'obtenir une masse d'antigènes fixés spécifiquement la plus grande possible pour pouvoir détecter directement les antigènes sans avoir recours à un système d'amplification comme une technique "sandwich". Nous avons donc décidé d'élaborer notre couche immunosensible par la technique d'adsorption qui, de plus, est la plus simple et la plus
rapide, même si elle ne nous permet pas de réutiliser les quartz. En effet, nous ne réaliserons
qu'un seul test sur chaque quartz préparé et nous ferons l'hypothèse que tous les quartz
présentent la même quantité d'anticorps immunoréactifs (l'écart type relatif de la quantité de
peroxydase mesurée est de 3,5 %) sans tenir compte d'un éventuel vieillissement de la couche.
Ces résultats sont en accord avec la littérature, en utilisant la technique d'adsorption
d'anticorps sur une électrode d'or d'une microbalance à quartz, certains auteurs (Caruso et al.,
1996) ont mesuré un accroissement de 30 % du nombre de molécules d'anticorps immobilisés
par rapport à différentes techniques de greffage covalent. La plus grande quantité d'anticorps
présents sur l'électrode doit expliquer la plus grande quantité d'antigènes fixés spécifiquement.

3. 1. 2. Choix de la concentration optimale en anticorps

Nous avons, par la suite, vérifié que la concentration d'anticorps choisie (100 µg/ml) et
utilisée classiquement, correspondait bien à une quantité saturante pour l'électrode. Nous
avons donc adsorbé des anticorps en concentrations différentes en suivant le protocole
expérimental décrit plus haut (100 µl de solution d'anticorps pendant 1 nuit suivi par l'étape
de saturation). Puis, nous avons révélé par le test enzymatique la quantité de peroxydase fixée
spéciquement après une incubation de 30 minutes avec une solution d'enzyme à 10 µg/ml. Les
résultats obtenus sont présentés figure 72.

<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>Figure 72 : Quantité de peroxydase mesurée sur les électrodes après l'adsorption d'anticorps à différentes concentration</figcaption></figure>

La quantité de peroxydase révélée croît d'abord avec la concentration d'anticorps utilisée
pour revêtir les électrodes puis atteint un plateau à partir d'une concentration en anticorps à
100 µg/ml traduisant une saturation des sites d'adsorption de la surface pour les anticorps à
cette concentration. Une concentration en anticorps de 100 µg/ml est donc optimale et raisonnable pour immobiliser les immunoglobulines sur la surface de nos électrodes.

### 3.1.3. Influence de l'hydrophobicité de la surface des électrodes

Dans le but d'optimiser la quantité d'antigènes fixés nous avons étudié l'influence de l'hydrophobicité de la surface sur l'adsorption des anticorps. Pour ce faire, nous avons fonctionnalisé les électrodes par une monocouche de mercaptan (SH-(CH₂)₁₇-CH₃) afin de rendre la surface plus hydrophobe. Les quartz natifs et fonctionnalisés ont été préparés avec une solution d'anticorps à 100 µg/ml. La solution de peroxydase à différentes concentrations a été laissée 30 minutes sur les électrodes et l'activité peroxydasique au niveau des électrodes a été mesurée. La figure 73 présente les résulats de ces expériences.

<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>Figure 73 : Comparaison de la quantité de peroxydase mesurée pour différentes concentrations de la solution d'antigène déposée sur des quartz préalablement traités ou non par le mercaptan avant l'adsorption des anticorps</figcaption></figure>

D'une part, nous pouvons observer qu'une concentration en antigène de 1 µg/ml sature tous les sites de fixation des anticorps immunoréactifs présents sur la surface. D'autre part, la quantité de peroxydase fixée spécifiquement sur les anticorps adsorbés sur une surface hydrophobe est considérablement diminuée. Nous pouvons faire deux hypothèses pour expliquer cette observation. Soit les anticorps se fixent en moins grande quantité sur la surface rendue hydrophobe ; soit ils se fixent dans les mêmes proportions ou en quantité plus importante mais leur immunoréactivité est très diminuée à cause d'un encombrement stérique trop important ou d'une orientation préférentielle des anticorps sur la surface hydrophobe par
les extrémités Fab. Ce traitement de surface n'améliore pas la quantité d'antigènes fixés spécifiquement sur la couche immunosensible élaborée, il a donc été abandonné.

## 3. 2. Etude de la surface des électrodes immunosensibilisées par les techniques d'imagerie

Des observations en microscopie électronique à balayage ont été réalisées sur les quartz avec et sans anticorps adsorbés sur les électrodes. Notre but était d'apprécier le recouvrement de la surface par les immunoglobulines adsorbées. Il faut savoir, cependant, que les images réalisées au MEB ne reflètent pas l'état réel du dépôt car ces observations sont réalisées sous vide et la conformation des protéines est, dans ce cas, certainement modifiée. Avant chaque observation, la surface des quartz est métallisée par l'évaporation sous vide d'une épaisseur de 150 Å d'or (même pour les quartz témoins sans anticorps).

La figure suivante présente une image (obtenue avec le plus fort grossissement possible) de la surface d'un quartz au niveau de l'électrode d'or, incubé une nuit avec une solution de tampon PBS et rincé à l'eau distillée.

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>Figure 74 : Image de la surface d'une électrode d'or d'un quartz incubé une nuit dans du PBS et rincé à l'eau distillée</figcaption></figure>

Nous pouvons observer à cette échelle la forte rugosité de la surface qui ne présente toutefois pas de défauts majeurs. La surface de l'électrode d'or incubée avec du PBS et rincée à l'eau distillée (pour retirer les dépôts de NaCl) présente le même aspect qu'une électrode d'un
quartz nettoyé. Nous retrouvons quelquefois des impuretés ou des cristaux déposés qui présentent des tailles avoisinant le µm.

Les figures 74 et 75 présentent une image de la surface de l'électrode d'un même quartz incubé pendant une nuit avec une solution d'anticorps anti-peroxydase à 1 mg/ml et rincé à l'eau distillée.

<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>Figure 74 : Image de la surface d'une électrode d'or d'un quartz incubé avec une solution d'anticorps pendant une nuit et rincé à l'eau distillée</figcaption></figure>

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Figure 75 : Image de la surface de l'électrode d'or du même quartz à un autre endroit</figcaption></figure>
Nous pouvons observer sur la figure 74 la présence éparse de particules sphériques d'une centaine de nm de diamètre. Il semble qu'elles se disposent préférentiellement au niveau des arêtes présentant des angles rentrants. Sur l'image de la figure 75 qui présente la surface du même quartz à un autre endroit sur l'électrode, nous pouvons observer un tapis de particules sous forme de bâtonnets d'une longueur d'une centaine de nm, dont certains présentent des formes caractéristiques en Y. Il pourrait s'agir de nos immunoglobulines. Sur l'image, nous pouvons voir que ce tapis n'est pas retrouvé sur toute la surface, certains endroits (par exemple sur la partie gauche de l'image et en bas à droite) ne sont pas recouverts. Comme sur la photo précédente, nous retrouvons sur la surface les formes sphériques notamment au niveau des angles de la surface.

Les images de ces formes sphériques sont toujours retrouvées sur des quartz ayant subi le même traitement d'adsorption des anticorps (même pour des concentrations plus basses comme 100 µg/ml), mais nous n'avons jamais revu ce tapis de formes plus caractéristiques... Quoi qu'il en soit, si ces sphères représentent bien les anticorps, il s'avère que la surface de l'électrode n'est pas entièrement recouverte (pas de monocouche).

Les images obtenues en microscopie à force atomique permettent d'obtenir une meilleure résolution et cette technique présente l'avantage de fonctionner en milieu liquide et à la pression atmosphérique. La surface d'une électrode d'un quartz recouverte d'une solution de PBS, analysée par cette technique montre que l'or se présente sous forme de grains présentant un diamètre d'environ 10 nm. A partir du moment où la solution d'anticorps est déposée, la surface de l'électrode, au même grossissement, apparaît différente mais les images sont difficilement interprétables car la pointe du microscope balaie littéralement la surface en entraînant les protéines avec lesquelles elle interagit trop. Des expériences réalisées avec des quartz sur lesquels ont été immobilisés les anticorps par un greffage covalent (technique NHSEDC) ont donné les mêmes résultats. La technique d'AFM, dans nos conditions, ne permet "d'imager" fidèlement la surface de nos électrodes à cause des fortes interactions entre la pointe du microscope et la couche d'immunoglobulines telle que nous l'élaborons. Des études de la surface en microscopie à effet tunnel (STM) pourraient nous donner de meilleurs résultats et nous permettre d'estimer plus sûrement le recouvrement de l'électrode par les anticorps ainsi que le type de dépôt formé (agrégats ou molécules isolées).
# 4. ETUDE DE L'INFLUENCE DU FLUX DE LA SOLUTION DE PEROXYDASE ET DE LA VIBRATION DES QUARTZ SUR L'INTERACTION PEROXYDASE/ANTICORPS ANTI-PEROXYDASE

## 4. 1. But

Nous avons réalisé une série d'expériences afin d'étudier l'influence de deux paramètres sur l'interaction antigène/anticorps de notre couple expérimental, à savoir l'influence de la vibration des quartz et l'influence de la circulation de la solution d'antigène. Nous comparerons les résultats de l'interaction antigène/anticorps en terme de quantité de peroxydase, enzymatiquement active, fixée sur les anticorps immobilisés sur les électrodes pour les différents modes opératoires suivants :

- système sans flux et sans vibration (quartz installé entre les deux plaques de plexiglas, cf figure 67),

- système avec flux et sans vibration (quartz installé dans la cellule à circulation miniature sans connexion à l'oscillateur),

- et système avec flux et avec vibrations (quartz installé dans la cellule à circulation miniature et connecté à l'oscillateur).

Dans tous les cas, le revêtement des anticorps sur les électrodes des quartz est réalisé de la même façon, les temps de réaction des différentes solutions (PBS et solution de peroxydase) sont identiques ainsi que la procédure de dosage de la quantité de peroxydase fixée. Nous aurions pu ajouter un quatrième cas de figure correspondant à un système sans flux et avec vibration (quartz monté sur un support en verre époxy et immergé dans la solution d'antigène) mais nous n'avons pas réussi à mettre au point, pour ce cas, un dispositif expérimental nous permettant de doser la peroxydase uniquement au niveau de l'électrode du quartz.

## 4. 2. Matériel et méthodes

### 4. 2. 1. Préparation des quartz et mesure de la quantité de peroxydase

Tous les quartz sont nettoyés avant d'immobiliser les anticorps sur les électrodes par adsorption simple sur la surface d'or. Le protocole d'adsorption est le même que celui décrit précédemment, il est aussi suivi de l'étape de saturation par la BSA. En attendant d'être utilisés,
les quartz préparés sont laissés recouverts de PBS. Pour chaque système un quartz témoin sans anticorps est réalisé.

Pour chaque expérience et dans toutes les configurations expérimentales, la solution de peroxydase (différentes concentrations ont été utilisées) est laissée 30 minutes en contact avec les électrodes et un rinçage au PBS durant 5 minutes est ensuite réalisé. La quantité de peroxydase fixée au niveau des électrodes est alors mesurée.

### 4. 2. 2. Système sans flux et sans vibration

Les quartz immunosensibilisés sont installés dans un jeu de plaques 6 puits. 100 µl de solution de peroxydase concentrée à 1, 5, 10, 25 et 50 µg/ml sont déposés sur cinq quartz. Sur le quartz témoin sans anticorps nous déposons 100 µl de la solution d'antigène la plus concentrée (50 µg/ml). La solution de peroxydase est laissée 30 minutes, puis les électrodes sont rincées au PBS (200 µl/puits pendant 1 minute, 5 fois). La quantité de peroxydase au niveau des électrodes est alors mesurée par notre test enzymatique.

### 4. 2. 3. Système avec flux et sans vibration

Les quartz immunosensibilisés sont installés dans la cellule à circulation miniature (sans pose préalable d'embases métalliques car les quartz ne vibrent pas). La solution de PBS est mise à circuler au débit de 50 µl/min suivie de la solution de peroxydase (différentes concentrations pour chaque quartz) qui circule pendant 30 minutes. Pour le quartz témoin sans anticorps, c'est la solution de peroxydase la plus concentrée (50 µg/ml) qui circule. Nous devons noter que la solution antigénique qui circule sur le quartz est toujours renouvelée (circulation en circuit ouvert). Un rinçage au PBS est ensuite effectué pendant 5 minutes. Les quartz sont alors récupérés et installés dans un jeu de plaques 6 puits pour doser la peroxydase au niveau de l'électrode.

### 4. 2. 4. Système avec flux et avec vibrations

Les quartz immunosensibilisés sont installés dans la cellule miniature après la pose d'embases métalliques qui sont soudées aux fils électriques de la cellule, elle-même connectée à l'oscillateur. Ainsi, les quartz vibrent à une fréquence d'oscillation de 27 MHz. Comme pour le système précédent, le tampon PBS circule au débit de 50 µl/min puis est suivi de la solution de peroxydase (différentes concentrations pour chaque quartz) qui circule, en circuit ouvert, pendant 30 minutes. Un rinçage au PBS, pendant 5 minutes, est ensuite effectué, puis les quartz sont récupérés (les embases sont ôtées) pour être installés dans un jeu de plaques 6 puits où le dosage de la quantité de peroxydase au niveau des électrodes est réalisé.
## 4. 3. Résultats

Les résultats de la quantité de peroxydase mesurée sur les électrodes pour les trois systèmes et en fonction de la concentration de la solution de peroxydase mise en contact avec les quartz sont représentés sur la figure 76.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Figure 76 : Quantité de peroxydase mesurée sur les électrodes des quartz pour les trois systèmes et en fonction de la concentration de la solution de peroxydase mise en contact avec les quartz</figcaption></figure>

Chaque colonne de l'histogramme correspond à une expérience sur un seul quartz. Les barres d'erreurs ajoutées correspondent à une erreur fixée arbitrairement à 5 % (nous n'avons pas étudié la reproductibilité de la quantité de peroxydase mesurée pour chaque système et pour chaque concentration). Pour le système statique (c'est-à-dire sans flux et sans vibration) et pour le système avec circulation et sans vibration, une concentration de 1 µg/ml est déjà saturante pour les sites de fixation des anticorps immunoréactifs adsorbés sur les électodes. Les différences observées en fonction de la concentration de peroxydase pour le système non oscillant et avec une circulation, comme pour le système statique, ne sont pas considérées comme significatives.

Nous pouvons, tout d'abord, observer l'absence de fixation non spécifique de la peroxydase sur les électrodes des quartz témoins (sans anticorps mais avec l'étape de
saturation). Ni la circulation de la solution de peroxydase, ni la vibration du quartz n'augmentent l'adsorption non spécifique de la peroxydase par rapport à un système statique.

L'effet de la circulation sur la quantité de peroxydase mesurée par rapport au système statique est difficile à distinguer. En effet, pour trois quartz (ceux mis en contact avec une solution de peroxydase à 5, 10 et 50 µg/ml) les différences semblent significatives et la quantité de peroxydase mesurée, dans le cas du système avec flux, s'avère diminuée ; mais pour les deux autres quartz (1 et 25 µg/ml) la quantité de peroxydase mesurée est semblable pour les deux systèmes.

L'effet de la vibration des quartz est quant à lui nettement visible. La quantité de peroxydase mesurée sur les quartz qui vibrent et sur lesquels la solution d'antigène circule est toujours diminuée par rapport au système sans vibration et avec circulation (et par rapport au système statique). La vibration du quartz modifie l'état de la couche d'anticorps et/ou l'interaction antigène/anticorps, ce qui conduit finalement à une moins grande quantité d'antigène fixée spécifiquement à la surface du transducteur. Nous voyons donc que le principe même de transduction de la microbalance à quartz n'est pas sans effet sur le phénomène que l'on veut mesurer (c'est-à-dire l'interaction antigène/anticorps). Cette diminution peut s'expliquer par différentes hypothèses :

- la vibration des quartz provoque la désorption des anticorps adsorbés sur l'or, le nombre moins important de molécules d'anticorps présents à la surface expliquant la quantité moins importante de molécules de peroxydase mesurée,

- le nombre de molécules d'anticorps à la surface reste stable mais l'immunoréactivité de ces immunoglobulines est diminuée par la vibration du quartz (changements de conformation des sites de fixation des anticorps),

- la vibration du quartz ralentit simplement la cinétique de l'interaction antigène/anticorps (sans diminuer l'immunoréactivité des anticorps).

Nous pouvons parmi ces hypothèses rejeter la première. En effet, si la vibration des quartz entraînait une désorption des anticorps, nous devrions observer, en mesurant la fréquence des quartz, une remontée de la fréquence d'oscillation du quartz témoignant du relargage des molécules de la surface (diminution de la masse sur l'électrode). Or ce phénomène n'est pas remarqué. De plus, si cette hypothèse était vraie, la BSA devrait aussi se désorber, ce qui devrait conduire à une augmentation de l'adsorption non spécifique de la peroxydase, ce que nous n'observons pas non plus. Restent valables les deux autres hypothèses qui ne sont pas exclusives. Ce phénomène de "ralentissement" ou de "gêne" d'un processus sur des quartz en oscillation a déjà été observé par rapport à des quartz sans oscillation. Concernant l'adsorption de BSA sur une électrode d'or d'un quartz par exemple (Lacour et al., 1992), il a
été montré, par des mesures de capacité interfaciale, que la vibration du quartz (à 6 MHz) diminuait à la fois la cinétique d'adsorption de la protéine et la quantité maximale de protéine adsorbée.

Le principe de fonctionnement de la microbalance à quartz modifie donc l'interaction antigène/anticorps ce qui n'empêche pas d'utiliser ce transducteur pour mesurer en temps réel les variations de masse conséutives à la fixation spécifique des antigènes sur les anticorps immobilisés. Néanmoins, les études concernant l'interaction antigène/anticorps, comme la mesure des constantes d'affinité, sont, pour l'instant, plus délicates à réaliser étant données les modifications introduites par l'appareil de mesure.

## CONCLUSION

Cette étude a permis de montrer que parmi les différentes méthodes d'immobilisation testées, la technique d'adsorption simple des anticorps sur la surface d'or native des électrodes des quartz donnait les meilleurs résultats en terme de quantité d'antigène fixé spécifiquement (et enzymatiquement actif). Suivent ensuite la technique de greffage covalent par le carbodiimide et la N-hydroxysucinimide sur les électrodes fonctionnalisées par une monocouche d'acide thioctique et la technique de greffage covalent par la méthode au glutaraldéhyde sur les électrodes fonctionnalisées par une monocouche de cystéamine. L'adsorption des anticorps sur l'électrode rendue plus hydrophobe n'améliore pas la quantité d'antigène fixé par rapport à une électrode native.

Les études réalisées au microscope électronique à balayage et en microscopie à force atomique nous ont permis d'estimer l'état de la surface des électrodes. Les images réalisées de la surface sans anticorps et de la surface avec anticorps montrent systématiquement des différences pour les deux techniques. Le MEB permet de visualiser, sur les quartz avec les anticorps, des formes sphériques d'une centaine de nm de diamètre. Le recouvrement de l'électrode par ces formes est assez faible. Une seule image plus convaincante au niveau de la forme des particules a été obtenue mais n'a pas pu être reproduite.

L'influence de la circulation de la solution d'antigène et de la vibration des quartz sur la quantité de peroxydase mesurée par rapport à une configuration statique a été étudiée. Concernant la vibration des quartz, nous avons clairement montré que l'oscillation des quartz à 27 MHz diminuait la quantité d'antigènes fixés en diminuant l'immunoréactivité des anticorps adsorbés et/ou en modifiant l'interaction antigène/anticorps. Néanmoins, la couche d'anticorps
élaborée est tout à fait utilisable pour mesurer à l'aide de la microbalance à quartz les variations de masse consécutives à la fixation spécifique des antigènes sur cette couche.
Chapitre V

DETECTION SPECIFIQUE D'ANTIGENES
EN MILIEU LIQUIDE A L'AIDE DE LA
MICROBALANCE A QUARTZ
# INTRODUCTION

Ce dernier chapitre sera consacré à l'application du dispositif de microbalance à quartz que nous avons mis au point pour la détection *directe, spécifique* et en *temps réel* d'antigènes en milieu liquide. Notre but était de montrer la faisabilité d'une telle immunodétection à l'aide de la microbalance à quartz développée. Nous avons utilisé trois couples antigène/anticorps différents :

- les anticorps monoclonaux de souris anti-peroxydase et la peroxydase,

- et des anticorps de chèvre anti-immunoglobulines G de lapin (IgG) et des IgG de lapin,

- des anticorps monoclonaux de souris anti-entérotoxine B de Staphylocoque (SEB) et la SEB.

Les antigènes à détecter ont des masses molaires différentes allant de 28000 g/mol pour la SEB, à 44000 g/mol pour la peroxydase et à 150000 g/mol pour les IgG.

Dans les trois cas de figures, les quartz sont préparés par adsorption simple des anticorps sur l'électrode en or suivie d'une étape de saturation par la BSA. Chaque quartz préparé est utilisé une seule fois pour une seule expérience, nous faisons donc l'hypothèse que la couche immunosensible est stable et identique pour chaque quartz.

# 1. DETECTION DE LA PEROXYDASE

## 1. 1. But

Le couple anticorps anti-peroxydase/peroxydase, que nous avons utilisé pour élaborer et caractériser la couche d'immunoglobulines, a été le premier à être utilisé dans le cadre de ces expériences de détection à l'aide de la microbalance à quartz. Nous avons réalisé les premières expériences d'immunodétection en utilisant des quartz immunofonctionnalisés par ces anticorps anti-peroxydase, en enregistrant leur fréquence d'oscillation pendant la circulation de solutions de PBS et de peroxydase à différentes concentrations.

## 1. 2. Matériel et méthodes

Les quartz ont été préparés comme nous l'avons vu précédemment par adsorption simple sur l'électrode d'or après nettoyage. Les électrodes des quartz installés dans un jeu de plaques 6 puits sont incubées pendant une nuit à la température du laboratoire avec 100 µl d'une solution d'anticorps à 100 µg/ml. Après 5 rinçages au PBS (200 µl/puits pendant 1
minute), les électrodes sont saturées par l'ajout de 200 µl/puits d'une solution de BSA à 1 % (masse/masse) pendant 1 heure. Les quartz sont ensuite rincés et sont laissés recouverts de PBS jusqu'à ce qu'ils soient utilisés.

Le protocole expérimental suivi pour ces expériences va maintenant être rappelé. Avant d'installer chaque quartz (un par un) dans la cellule miniature, des embases métalliques sont insérées autour du quartz, au niveau des électrodes, et un dépôt de laque argent est réalisé (1 goutte) pour assurer les contacts électriques entre les électrodes et les embases. La laque est laissée sécher pendant 15 minutes. Les embases sont alors soudées aux fils électriques de la cellule, eux-mêmes connectés à l'oscillateur. La cellule est refermée, en centrant l'électrode au niveau des deux joints toriques, et sans trop comprimer le quartz.

Toutes les solutions qui vont circuler sur le quartz (PBS et solution de peroxydase diluée en PBS) sont thermostatées. Pour ce faire, les solutions sont déposées dans des tubes à hémolyse qui contiennent un barreau aimanté. Ces tubes sont disposés dans un bécher à double paroi, rempli d'eau, dans lequel circule de l'eau thermostatée à + 20 °C par un cryothermostat. Ce bécher est posé sur un agitateur magnétique de sorte que les solutions contenues dans les tubes soient agitées grâce aux barreaux aimantés. Les solutions circulent sur le quartz au débit de 50 µl/min grâce à une pompe péristaltique (P1, Pharmacia). Une représentation de ce dispositif expérimental est donnée sur la figure 47 du chapitre III. Le tuyau d'entrée de la pompe est plongé dans la solution de PBS ou de peroxydase. Pour changer de solution, sans introduire de bulle dans le circuit, la circulation est stoppée, le tuyau est rapidement changé de solution et la circulation est de nouveau mise en route. Ce changement, bien qu'assez rapide, provoque souvent une variation de fréquence de quelques Hz. Avec les tuyaux utilisés et le débit de 50 µl/min, les solutions mettent 5 minutes pour atteindre l'électrode du quartz. En général, quand le quartz a été installé, sa fréquence d'oscillation est enregistrée à l'air, puis pendant le remplissage de la cellule et pendant la circulation de PBS. Durant les premières minutes de la circulation de PBS, la fréquence peut dériver sur une dizaine de Hz mais elle se stabilise généralement en l'absence de variation de température. Cette dérive n'est pas attribuée à une désorption massive de la couche (anticorps et/ou BSA) car ces variations de fréquences sont trop faibles et semblent aléatoires car elles vont dans les deux sens (augmentation et diminution de la fréquence). Quand la fréquence d'oscillation s'est stabilisée pendant la circulation de PBS, la solution de peroxydase est mise à circuler. Le principal problème du dispositif est l'apparition inopinée de bulles qui se "collent" sur l'électrode et qui introduisent alors un bruit de fond important sur la fréquence enregistrée.

Après chaque expérience, la cellule et tous les tuyaux sont soigneusement nettoyés par une solution d'acide chlorhydrique à 0,1 M et sont rincés à l'eau distillée.
# 1. 3. Résultats

## 1.3.1. Evaluation de la spécificité

Nous avons tout d'abord étudié la spécificité de la réaction antigène/anticorps. En effet, nous voulions vérifier que la peroxydase ne se fixe pas non spécifiquement sur une électrode sans anticorps mais saturée par la BSA.

La figure suivante présente la variation de la fréquence d'oscillation d'un quartz témoin sans anticorps et saturé par la BSA, en fonction du temps, pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de peroxydase à 10 µg/ml et de PBS. La solution de peroxydase est diluée dans du tampon PBS. Les solutions circulent au débit de 50 µl/min et la fréquence du quartz est mesurée toutes les 3 secondes. Les flèches correspondent aux moments où les solutions arrivent sur l'électrode. La figure 77 présente les résultats bruts de la fréquence d'oscillation enregistrée.

<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>Figure 77 : Variation de la fréquence d'oscillation d'un quartz témoin (sans anticorps mais saturé par la BSA) en fonction du temps pendant la circulation d'une solution de PBS, de peroxydase et de PBS</figcaption></figure>

Nous pouvons observer que la fréquence d'oscillation de ce quartz présentait une légère dérive avant de se stabiliser au moment où la solution de peroxydase arrivait sur l'électrode. L'arrivée de cette solution ne provoque pas de diminution de la fréquence d'oscillation qui reste stable puis remonte légèrement pour se stabiliser à son niveau de base pendant le rinçage au PBS. Pendant la durée de cette expérience la fréquence du quartz a varié sur une douzaine
de Hz, cette variation de la fréquence d'oscillation étant de l'ordre de grandeur du bruit de fond de la mesure.

Nous pouvons conclure, d'une part, que pendant la circulation du tampon PBS, la BSA ne se désorbe pas de l'électrode et d'autre part, nous observons que la peroxydase ne se fixe pas non spécifiquement sur la couche saturée en l'absence d'anticorps, comme nous l'avions mesuré par le dosage enzymatique (cf chapitre IV, paragraphe 3. 1. 1.).

De plus, nous voyons que la variation des propriétés physico-chimiques de la solution de peroxydase (notamment les variations de sa densité, de sa viscosité et de sa conductivité) par rapport au tampon PBS seul, ne se répercutent pas sur la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz. Cette observation est fondamentale pour la réalisation de l'immunocapteur. En effet, nous montrons que des variations significatives de la fréquence d'oscillation (en l'absence de variation de température et sans tenir compte des modifications viscoélastiques de la couche) peuvent être attribuées de manière sûre à des variations de masse. Le signal mesuré est donc bien caractéristique de ce que nous voulons mesurer, c'est-à-dire les variations de masse consécutives à la fixation des antigènes sur les anticorps immobilisés.

### 1.3.2. Réponse de la microbalance à quartz à l'antigène

La figure 78 présente la variation de la fréquence d'oscillation mesurée d'un quartz immunofonctionnalisé pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de peroxydase concentrée à 10 µg/ml et de PBS.

<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>Figure 78 : Variation de la fréquence d'oscillation d'un quartz immunofonctionnalisé (anticorps anti-peroxydase adsorbés et saturation par la BSA) pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de peroxydase à 10 µg/ml et de PBS</figcaption></figure>
La fréquence du quartz présentait une légère dérive positive pendant la circulation de la solution de PBS. L'arrivée de la solution de peroxydase concentrée à 10 µg/ml au niveau du quartz provoque immédiatement une diminution rapide de la fréquence d'oscillation du quartz qui atteint un plateau. La fréquence remonte ensuite légèrement puis se stabilise pendant le rinçage au PBS. La diminution de la fréquence correspond à la fixation spécifique des antigènes sur les anticorps immobilisés. La variation globale de la fréquence consécutive à la fixation des antigènes est de 30 Hz ce qui correspond à une masse de 10,5 ng de protéine fixée sur l'électrode (en utilisant le coefficient expérimental de sensibilité égal à 350 pg/Hz).

La figure 79 présente les variations de la fréquence d'oscillation brute de plusieurs quartz immunofonctionnalisés, pendant la circulation de solutions de peroxydase à différentes concentrations. Pour plus de clarté, les fréquences ont été remises à zéro à partir du moment où la solution d'antigène arrive sur les électrodes.

<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>Figure 79 : Variation de la fréquence d'oscillation brute de différents quartz pendant la circulation de différentes solutions de peroxydase à différentes concentrations</figcaption></figure>

Sur cette figure, les différences concernant l'évolution de la fréquence brute des différents quartz sont assez difficiles à distinguer étant donnée la faible amplitude des réponses et le bruit de fond assez important de la fréquence.
La figure 80 présente l'évolution de la fréquence des quartz filtrée numériquement à l'aide de la fonction "transformée de Fourier" (les moments correspondant au rinçage au PBS ne sont pas indiqués car ils n'ont pas tous été réalisés au même temps).

<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>Figure 80 : Evolution de la fréquence lissée des quartz pendant la circulation de différentes solutions de peroxydase à différentes concentrations</figcaption></figure>

Nous pouvons alors plus nettement distinguer la réponse de la microbalance pour les différentes concentrations en antigènes. Pour les quatre concentrations testées, l'arrivée de la solution au niveau du quartz provoque une diminution rapide de la fréquence d'oscillation. Les cinétiques de la variation de fréquence dépendent de la concentration en peroxydase de la solution : plus la solution d'antigène qui circule est concentrée, plus la cinétique est rapide. Les fréquences atteignent rapidement (environ 5 minutes) un plateau, traduisant la saturation de la surface par les antigènes. La valeur du plateau pour les différentes concentrations est pratiquement identique. Pour la concentration la plus élevée, la réponse est d'abord plus importante puis la fréquence remonte pour atteindre quasiment la même valeur de plateau (environ - 30 Hz). Il est possible que pour cette concentration, la peroxydase se fixe sur les anticorps sous forme d'agrégats qui se relarguent pendant le rinçage au PBS.

La réaction antigène/anticorps à l'équilibre (régie par les constantes d'association et de dissociation) aboutit théoriquement à une quantité de complexes antigène/anticorps formés croissante en fonction de la concentration en antigène pour des valeurs non saturantes de cette
concentration et pour une quantité fixe d'anticorps. Pour des concentrations en antigène correspondant à un large excès par rapport à la quantité de sites anticorps présents à la surface, la quantité de complexes formés (traduisant la saturation de la surface) devient théoriquement constante.

Bien que nous ne soyons pas dans un réel état d'équilibre, mais plutôt dans un état de pseudo-équilibre (car la solution en antigène est constamment renouvelée), nos résultats montrent que la plus faible concentration de peroxydase détectable (1 µg/ml) est déjà saturante. Cette observation peut s'expliquer par une trop faible quantité de sites anticorps immunoréactifs présents sur la surface du transducteur. Nous ne pouvons donc pas, dans ce cas, réaliser une courbe d'étalonnage à partir de la valeur des plateaux. Néanmoins, nous pouvons effectuer une telle calibration sur les pentes des différents cinétiques (c'est-à-dire au niveau des vitesses initiales de la réaction antigène/anticorps).

La figure 81 présente la variation de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz 2 minutes après l'arrivée de la peroxydase sur l'électrode en fonction de la concentration en peroxydase.

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>Figure 81 : Variation de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz 2 minutes après l'arrivée de la solution de peroxydase sur l'électrode en fonction de la concentration de la solution de peroxydase</figcaption></figure>

Nous pouvons observer une bonne corrélation entre la variation de la fréquence au bout de ce temps et la concentration de peroxydase, dans une gamme de 1 à 10 à µg/ml. La linéarité
de la réponse est moins bonne pour une gamme de 1 à 50 µg/ml. La limite de détection pour la
solution de peroxydase est dans ce cas de 1 µg/ml soit une concentration molaire de 22,7 nM.

Pour comparaison, la même limite de détection a été déterminée avec un dispositif
optique (BIAcore) en greffant directement sur la surface de dextran carboxylé du transducteur,
les anticorps anti-peroxydase par la méthode NHSEDC. Ce résultat montre que la sensibilité
atteinte par les deux dispositifs (optique basé sur la résonance des plasmons de surface et
piézoélectrique basé sur la microbalance à quartz) pour un même couple antigène/anticorps est
identique comme l'ont montré certains auteurs (Köblinger et al., 1995).

## 2. DETECTION D'IMMUNOGLOBULINES G

### 2. 1. But

La détection et le dosage d'immunoglobulines G (IgG) peuvent s'avérer utiles dans
certaines pathologies. Nous avons donc essayé d'utiliser notre microbalance à quartz pour la
détection d'IgG à l'aide d'un couple anticorps de chèvre anti-IgG de lapin et des IgG de lapin.
De plus, ce système Ig anti-IgG/IgG devrait nous permettre d'obtenir des réponses de plus
grande amplitude en microbalance car la masse molaire importante (150000 g/mol) des IgG
doit provoquer une plus importante variation de masse sur l'électrode immunofonctionnalisée.

### 2. 1. Matériel et méthodes

Les anticorps polyclonaux de chèvre anti IgG de lapin ont été fournis par la société Immunotech et les IgG polyclonales de lapin par la société Jackson Immunoresearch Labs. La préparation des électrodes concernant l'immobilisation des anticorps de chèvre a été effectuée comme pour les anticorps anti-peroxydase. Le même dispositif expérimental que celui décrit précédemment a été utilisé pour réaliser les expériences de microbalance.
## 2. 3. Résultats

### 2.3.1. Evaluation de la spécificité

La figure 82 présente l'évolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz témoin sans anticorps, mais saturé par la BSA, pendant la circulation de PBS et d'une solution d'IgG de lapin concentrée à 25 µg/ml.

<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>Figure 82 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz témoin sans anticorps pendant la circulation de PBS et d'une solution d'IgG de lapin concentrée à 25 µg/ml</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution d'IgG de lapin au niveau de l'électrode du quartz témoin sans anticorps ne provoque pas de diminution de la fréquence de la microbalance qui se stabilise pendant le rinçage au PBS. Les IgG de lapin ne s'adsorbent donc pas non spécifiquement sur la surface saturée et la variation des propriétés physico-chimiques de la solution, par rapport au PBS, ne se répercutent pas sur la fréquence de la microbalance.

Toute diminution de fréquence consécutive à la circulation de la solution d'IgG de lapin sur une surface présentant les anticorps anti-IgG de lapin pourra donc être considérée comme spécifique.

La figure suivante présente l'évolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz revêtu d'anticorps anti-IgG de lapin et saturé par la BSA pendant la circulation d'une solution de
phosphatase alcaline (c'est-à-dire une protéine différente de celle que nous voulons détecter) concentrée à 25 µg/ml.

<figure><img src="image_86.png" /><figcaption>Figure 83 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz revêtu d'anticorps anti-IgG de lapin pendant la circulation d'une solution de phosphatase alcaline concentrée à 25 µg/ml</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de phosphatase alcaline sur la surface de l'électrode du quartz revêtue d'anticorps anti-IgG de lapin et saturée par la BSA ne provoque aucune variation concomitante de la fréquence d'oscillation du quartz.

Cette expérience nous permet de confirmer la spécificité de la réponse de notre immunocapteur et en particulier l'absence d'effet de la viscosité, de la densité et de la conductivité des solutions de protéines que nous utilisons sur la fréquence de la microbalance à quartz recouverte d'une couche d'immunoglobulines.

De plus, nous pouvons aussi conclure que ni les anticorps adsorbés sur l'électrode d'or, ni la BSA ne se désorbent pendant la circulation de tampon.

### 2. 3. 2. Réponse de la microbalance à quartz à l'antigène

La figure 84 présente l'évolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz immunofonctionnalisé pendant la circulation d'une solution d'IgG de lapin concentrée à 25 µg/ml.
<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>Figure 84 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz immunofonctionnalisé par des anticorps anti-IgG de lapin pendant la circulation d'une solution d'IgG de lapin concentrée à 25 µg/ml</figcaption></figure>

La fréquence du quartz diminue rapidement lors du passage de la solution d'antigène sur l'électrode, puis se stabilise pour atteindre un plateau (en environ 10 minutes) lors du rinçage au PBS. Cette variation de fréquence correspond à la fixation spécifique des IgG de lapin sur la couche d'anticorps de chèvre. Nous pouvons voir que le poids moléculaire des antigènes à détecter est un paramètre important dans la réponse de la microbalance à quartz. L'immunodétection d'un analyte par la microbalance à quartz sera d'autant facile à réaliser que son poids moléculaire sera important.

<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>Figure 85 : Evolution de la fréquence brute des quartz immunofonctionnalisés pendant la circulation de différentes solutions d'IgG de lapin à différentes concentrations</figcaption></figure>
Nous observons sur la figure 85 les différentes cinétiques de la réponse de la microbalance en fonction de la concentration de la solution d'antigène qui circule (les moments correspondant au rinçage au PBS ne sont pas indiqués car ils n'ont pas tous été réalisés au même temps).

Comme dans le cas de la peroxydase, les différentes réponses se rejoignent pratiquement pour une même valeur de plateau. Ceci traduit la saturation des anticorps immunoréactifs présents à la surface même pour la plus faible concentration détectable. La variation maximale de la fréquence d'oscillation est d'environ -150 Hz (sauf pour la solution la plus concentrée) ce qui équivaut à 52,5 ng de protéine fixée. Pour la réponse de la solution la plus concentrée, nous pouvons supposer que pour cette concentration, les IgG forment des agrégats, ce qui provoque une diminution de fréquence plus importante. Les cinétiques correspondant aux plus faibles concentrations sont très lentes, mais nous distinguons nettement une réponse spécifique pour la solution concentrée à 0,5 µg/ml. En dessous de cette concentration, nous n'avons pas observé de variation significative de la fréquence d'oscillation des quartz. La limite de détection pour les IgG est donc de 0,5 µg/ml ce qui correspond à une concentration molaire de 3,33 nM.

Une droite d'étalonnage de la réponse en fréquence de l'immunocapteur pour ce couple anticorps anti-IgG/IgG a été tracée en prenant la variation de fréquence brute mesurée 3 minutes après l'arrivée de la solution d'IgG sur la microbalance (figure 86).

<figure><img src="image_89.png" /><figcaption>Figure 86 : Variation de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz 3 minutes après l'arrivée de la solution d'IgG sur l'électrode en fonction de la concentration de la solution d'IgG</figcaption></figure>
Cette droite d'étalonnage montre une bonne corrélation entre le signal mesuré et la concentration en antigène. La réponse du dispositif s'avère, dans ce cas, linéaire pour une gamme de concentration en immunoglobulines G allant de 0,5 à 25 µg/ml.

# 3. DETECTION DE L'ENTEROTOXINE B DE STAPHYLOCOQUE

## 3. 1. But

La bactérie *Staphylococcus aureus* est un coque gram + qui prolifère facilement dans certains aliments mal conservés en produisant différentes toxines. La plus importante en terme de toxicité est l'entérotoxine B (SEB pour Staphylococcal Enterotoxin B) qui provoque de graves intoxications alimentaires. Nous avons donc appliqué notre microbalance à quartz à l'immunodétection de cette toxine. Cet antigène est celui qui présente la masse molaire la plus faible des trois molécules que nous avons testées, en effet la SEB est formée d'une chaîne polypeptidique de 28000 g/mol.

## 3. 1. Matériel et méthodes

Les anticorps anti-SEB utilisés ont été produits par culture cellulaire au laboratoire des Biotechnologies du Centre d'Etudes du Bouchet. Il s'agit d'anticorps monoclonaux de souris (F₁₁) de classe G et sous classe 1. Leur affinité pour la SEB a été déterminée en ELISA et est de 2,5·10⁹ M⁻¹. Le point isoélectrique de ces IgG₁ déterminé par isoélectrofocalisation est de 5,8. La SEB utilisée dans ces expériences a été fournie par la société Sigma.

La préparation des électrodes concernant l'immobilisation des anticorps a été effectuée comme pour les anticorps anti-peroxydase. Le même dispositif expérimental, que celui décrit précédemment, a été utilisé pour réaliser les expériences de microbalance.

## 3. 3. Résultats

### 3. 3. 1. Evaluation de la spécificité

La figure 87 présente l'évolution de la fréquence d'un quartz témoin sans anticorps, mais saturé par la BSA, pendant la circulation d'une solution de SEB à 20 µg/ml.
<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>Figure 87 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz témoin sans anticorps pendant la circulation de PBS et d'une solution de SEB concentrée à 20 µg/ml</figcaption></figure>

La fréquence du quartz présentait une légère dérive négative pendant la circulation de la solution de PBS. L'arrivée de la solution de SEB, sur la surface de l'électrode sans anticorps, ne provoque pas une diminution caractéristique de la fréquence d'oscillation qui continue légèrement à dériver. Lors du rinçage au PBS, la fréquence remonte pour atteindre son niveau de base.

Comme dans le cas des deux molécules précédentes, la SEB ne se fixe pas de manière non spécifique sur la surface de l'électrode saturée, et la BSA ne se désorbe pas de l'électrode.

La figure 88 présente l'évolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz immunofonctionnalisé par les anticorps anti-SEB pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de SEB à 10 µg/ml, de PBS, de peroxydase à 10 µg/ml et de PBS.
<figure><img src="image_91.png" /><figcaption>Figure 88 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz revêtu d'anticorps anti-SEB pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de SEB à 10 µg/ml, de PBS, de peroxydase à 10 µg/ml et de PBS</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de SEB sur le quartz revêtu d'anticorps spécifiques provoque immédiatement une diminution rapide de la fréquence d'oscillation qui était stable pendant la circulation préalable de PBS. Cette variation de fréquence correspond à la fixation spécifique de la SEB sur les anticorps adsorbés (qui ne se désorbent pas pendant la circulation de PBS). La fréquence du quartz se stabilise pendant le rinçage au PBS, la variation relative de la fréquence est d'environ - 70 Hz.

La solution de peroxydase qui circule, après le rinçage au PBS, ne provoque aucune variation de la fréquence d'oscillation qui reste stable durant le deuxième rinçage. Comme nous l'avons vu précédemment, la circulation d'une solution de protéine, autre que la protéine à détecter, n'a aucun effet sur la fréquence des quartz immunofonctionnalisés et saturés par la BSA.

La figure 89 présente l'évolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz immunofonctionnalisé par les anticorps anti-SEB pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de peroxydase à 20 µg/ml, de PBS, de SEB à 20 µg/ml et de PBS. Il s'agit de la même expérience que celle montrée précédemment mais l'ordre des solutions qui circulent est inversé (les concentrations sont aussi différentes).
<figure><img src="image_92.png" /><figcaption>Figure 89 : Evolution de la fréquence d'oscillation d'un quartz revêtu d'anticorps anti-SEB pendant la circulation successive d'une solution de PBS, de peroxydase à 20 µg/ml, de PBS, de SEB à 20 µg/ml et de PBS</figcaption></figure>

L'arrivée de la solution de peroxydase sur le quartz immunofonctionnalisé par des anticorps anti-SEB ne provoque pas de diminution caractéristique de la fréquence du quartz qui dérivait légèrement pendant la circulation préalable de PBS. Pendant le rinçage de la surface par le PBS, la fréquence d'oscillation se stabilise, puis celle-ci diminue rapidement à l'arrivée de la solution de l'antigène à détecter. Lors du dernier rinçage au PBS, la fréquence se stabilise et la variation relative de la fréquence correspondant à la fixation spécifique de la SEB sur les anticorps est d'environ -80 Hz.

Cette expérience nous permet de confirmer que la circulation d'une solution de protéines différentes de l'antigène à détecter ne provoque pas de variation de fréquence et nous montrons, de plus, que la surface de l'électrode immunofonctionnalisée reste active pour fixer spécifiquement ses antigènes dans un second temps.

### 3. 3. 2. Réponse de la microbalance à l'antigène

La figure 90 présente les variations de la fréquence d'oscillation brute de plusieurs quartz immunofonctionnalisés, pendant la circulation de solutions de SEB à différentes concentrations (les fréquences ont été remises à zéro à partir du moment où la solution d'antigènes arrive sur les électrodes).
<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>Figure 90 : Evolution de la fréquence brute des quartz immunofonctionnalisés par les anticorps anti-SEB pendant la circulation de différentes solutions de SEB à différentes concentrations</figcaption></figure>

Nous observons sur cette figure les différentes réponses de la microbalance en fonction
de la concentration de la solution de SEB qui circule.

Comme dans le cas de la détection de la peroxydase et des immunoglobulines G, les différentes réponses se rejoignent pratiquement pour une même valeur de plateau. La variation maximale de la fréquence d'oscillation est d'environ - 70 Hz ce qui correspond à une masse de 24,5 ng de protéine fixée. Comme précédemment, la cinétique des réponses dépend des concentrations testées. Néanmoins, les différences concernant la réponse en fréquence pour les concentrations à 5 et 10 µg/ml sont faibles et les deux courbes se confondent rapidement. Nous avons, tout de même, établi une droite d'étalonnage sur la période qui précède la réunion des deux courbes.

Concernant la limite de détection, la réponse spécifique de la microbalance pour une
solution de SEB de 1 µg/ml est clairement observable, en dessous de cette valeur la fréquence
des quartz ne varie pas de façon suffisante pour se distinguer du bruit de fond. Cette
concentration de 1 µg/ml correspond à une concentration molaire de 35 nM. Pour
comparaison, la limite de détection de la SEB par mesure directe à l'aide du BIAcore est de 0,5
µg/ml.

La droite d'étalonnage de la réponse en fréquence de l'immunocapteur pour ce couple
anticorps anti-SEB/SEB est présentée sur la figure 91. Elle a été tracée en prenant la variation
de fréquence brute mesurée 3 minutes après l'arrivée de la solution de SEB sur la microbalance.
<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>Figure 91 : Variation de la fréquence d'oscillation de la microbalance à quartz 3 minutes après l'arrivée de la solution de SEB sur l'électrode en fonction de la concentration de la solution de SEB</figcaption></figure>

Une bonne corrélation entre la fréquence des quartz et la concentration de la solution de SEB est observée. La réponse de l'immunocapteur est, dans ce cas, linéaire pour des concentrations allant de 1 à 20 µg/ml.

## CONCLUSION ET DISCUSSION

L'immunodétection spécifique, rapide et en milieu liquide des trois antigènes que nous avons utilisés est possible grâce à la mesure en continu de la fréquence d'oscillation de quartz fonctionnant à 27 MHz. La sensibilité massique de notre microbalance à quartz s'avère suffisante pour détecter directement les trois antigènes ayant des masses molaires allant de 28000 à 150000 g/mol, avec des limites de détection de l'ordre du µg/ml pour les plus faibles masses molaires.

Toutefois, ces limites de détection pourraient être améliorées, sans modification du transducteur, en réalisant des tests en "sandwich". La fixation d'un second anticorps sur les antigènes fixés sur les premiers anticorps immobilisés sur la microbalance permettrait d'amplifier la réponse et donc d'abaisser les limites de détection. Les variations de fréquence non distinguables directement du bruit de fond "sortiraient" de ce bruit de fond. La sensibilité
de la mesure (c'est-à-dire le rapport signal sur bruit) serait donc augmentée (par augmentation du signal pour le même bruit de fond).

Concernant la spécificité de la réponse en fréquence de la microbalance, nous avons clairement montré que la variation des propriétés physico-chimiques d'une solution de protéine diluée dans du PBS par rapport au tampon seul n'a aucun effet sur la fréquence d'oscillation des quartz dont l'électrode est saturée par la BSA (en présence ou en l'absence d'anticorps). Par conséquent, la réponse en fréquence de la microbalance à quartz ne dépend pas des variations physico-chimiques des solutions, dans nos conditions d'utilisation.

Nous avons également montré, pour chaque couple antigène/anticorps, la spécificité de la fixation des antigènes sur les anticorps : aucune des molécules testées ne s'adsorbe non spécifiquement sur la surface de l'électrode saturée et les variations de la fréquence d'oscillation des quartz immunofonctionnalisés consécutives à la circulation de la solution d'antigène sont dues à la fixation spécifique des antigènes sur les anticorps immobilisés.

Nous n'avons pas, dans cette étude de faisabilité, tenu compte de la reproductibilité des résultats obtenus en microbalance à quartz. Pour des molécules ayant un poids moléculaire élevé, comme dans le cas des IgG, celle-ci est meilleure que pour des plus petites protéines. Ce paramètre devra impérativement être étudié et amélioré. Cependant, la configuration actuelle de notre dispositif, c'est-à-dire avec des anticorps simplement adsorbés sur l'électrode, n'est certainement pas la meilleure pour optimiser ce paramètre. L'idéal serait de réaliser un greffage covalent des anticorps pour pouvoir calibrer la réponse des quartz pour les différentes concentrations en antigène sur le même transducteur, et réaliser le test de détection avec la solution inconnue sur ce même quartz.

Nous avons vu, pour les trois antigènes, que la variation de la fréquence des quartz immunofonctionnalisés pendant la circulation des solutions d'antigènes atteint rapidement un plateau. Ce plateau correspond à la saturation des sites anticorps présents à la surface et dépend théoriquement (pour des conditions d'équilibre et en fonction de l'affinité du couple antigène/anticorps) de la concentration en antigène. Or, la valeur de ces plateaux est pratiquement identique pour les différentes concentrations testées, y compris pour les plus basses concentrations détectables. Ce phénomène de saturation rapide de la surface laisse penser que le nombre d'anticorps actifs à la surface est faible, ce qui limite la réponse du capteur à la fois au niveau de la limite de détection et au niveau de la gamme de linéarité. En optimisant cette quantité d'anticorps immunoréactifs sur la surface, nous pourrions augmenter à la fois la limite de détection et la plage de linéarité de la réponse de la microbalance. D'autre part, cette observation signifie aussi que la sensibilité de notre dispositif n'est pas suffisante pour mesurer, directement, les plus faibles variations de masse provoquées par des
concentrations en antigène non saturantes pour la quantité de sites anticorps présents à la surface du transducteur.

Néanmoins, la microbalance à quartz que nous avons mise au point, fonctionnant à 27 MHz et dont l'électrode en or est revêtue d'anticorps spécifiques, est utilisable pour détecter de manière spécifique, directe et rapide un antigène soluble de poids moléculaire moyen, avec une limite de détection de l'ordre du µg/ml.
## Conclusion
Cette étude avait pour but de contribuer à la mise au point d'un immunocapteur piézoélectrique. Notre objectif était de développer un transducteur piézoélectrique reposant sur une microbalance à quartz (QCM) fonctionnant en milieu liquide, celle-ci devant être suffisamment sensible pour nous permettre de détecter directement et spécifiquement les variations de masse occasionnées par la fixation d'antigènes sur une couche d'anticorps correspondants élaborée à la surface du quartz.

La microbalance à quartz permet de mesurer, par l'intermédiaire de sa fréquence d'oscillation, les variations de masse ayant lieu au niveau d'une des électrodes métalliques qui recouvrent le cristal. L'équation de Sauerbrey, qui relie les variations de masse aux variations de la fréquence d'oscillation du quartz, montre que la sensibilité massique des QCM augmente avec le carré de leur fréquence de résonance. Ce paramètre dépend de l'épaisseur du cristal et plus le cristal est mince, plus sa fréquence de résonance est élevée. L'augmentation de la sensibilité massique d'une microbalance est donc, physiquement, limitée car en dessous d'une certaine épaisseur le cristal n'est plus manipulable. Pour contourner cette limite, nous avons développé une microbalance à quartz oscillant à 27 MHz sur le partiel trois de quartz à 9 MHz. Ce transducteur présente alors une sensibilité massique théorique de 364 pg/Hz.

Nous avons mis au point l'ensemble du dispositif expérimental constitué d'un oscillateur, permettant d'entretenir les vibrations du quartz à 27 MHz même en milieu liquide, et d'une cellule miniature dans laquelle est installée la microbalance. Celle-ci permet de faire circuler des faibles volumes de solutions au niveau de l'électrode de travail. Une étude de l'influence de différents paramètres sur la stabilité et le bruit de fond de la fréquence d'oscillation à 27 MHz a été menée. Nous avons montré que la répercussion des variations de la température sur la fréquence de la microbalance était importante. Nous avons donc adapté notre dispositif expérimental, pour s'affranchir de cet effet, en thermorégulant finement l'oscillateur et en thermostatant les solutions en contact avec le quartz. Un bruit de fond de la fréquence inférieur à 10 Hz et une bonne stabilité dans le temps ont été obtenus, ces résultats sont très satisfaisants étant donnée la fréquence d'oscillation élevée de notre transducteur.

La microbalance à quartz a ensuite été calibrée par l'intermédiaire de dépôts électrochimiques de cuivre sur l'électrode. Un coefficient de sensibilité massique expérimental de $57.10^7$ Hz.g$^{-1}$.cm$^2$ a été obtenu ce qui correspond, pour la surface de nos électrodes, à une sensibilité de 350 pg/Hz (pour un dépôt élastique). Nous avons donc bien augmenté la sensibilité massique de notre transducteur dans les proportions prévues par la théorie de Sauerbrey et la réponse de la microbalance est, dans le cas d'un dépôt métallique, purement massique. La microbalance à quartz a ensuite été utilisée pour mesurer les cinétiques d'adsorption de différentes enzymes. L'idée était de comparer la masse de protéine adsorbée estimée par la mesure de son activité enzymatique et estimée à partir de la variation de la
fréquence d'oscillation occasionnée par l'adsorption (en prenant le coefficient masse/fréquence déterminé à partir des dépôts de cuivre). La microbalance s'est révélée être un outil performant pour mesurer ces processus d'adsorption mais un écart entre les deux estimations de la masse de protéine déposée a été observé. Cet écart pouvait être attribué d'une part, à un problème lié à la mesure de l'activité enzymatique des enzymes adsorbées et d'autre part, à une mauvaise estimation de la masse à partir de la réponse en fréquence de la microbalance. En effet, la réponse, globale, de la microbalance à quartz, prend en compte la masse du dépôt mais aussi ses propriétés viscoélastiques ainsi que les propriétés physico-chimiques des solutions de protéine en contact avec le quartz.

C'est dans ce cadre que nous avons étudié le mécanisme de transduction de la microbalance à quartz pour valider les pesées réalisées dans le cas d'un dépôt non élastique comme les dépôts de protéines. Néanmoins, il n'est pas possible de calculer simplement l'évolution de la fréquence d'oscillation de la microbalance en fonction des différents paramètres : masse déposée, viscosité/densité de la solution et viscoélasticité de couche de protéine. Par conséquent, une autre approche, basée sur le principe de l'admittance électroacoustique, a été envisagée pour discriminer les différents effets pouvant interférer sur la réponse purement massique du transducteur. Le résonateur à quartz peut être modélisé par un circuit équivalent, caractérisé par certains paramètres et notamment par la fréquence série. Cette fréquence série, caractéristique du résonateur, est une grandeur, contrairement à la fréquence d'oscillation, facilement calculable. Un nouveau modèle, développé par Gabrielli et al., adapté à nos conditions permet de simuler l'admittance électroacoustique du résonateur et d'estimer numériquement l'influence des paramètres cités précédemment (viscosité/densité de la solution, viscoélasticité et masse de la couche de protéines) sur le circuit équivalent du résonateur et par conséquent sur la fréquence série. Une simulation a permis de calculer l'influence des propriétés viscoélastiques du film sur les variations de la fréquence série pour une masse de protéines adsorbées constante tout en fixant les propriétés de la solution. Nous avons pu montrer que, pour ce type de film mince et dans ces conditions, l'erreur sur l'estimation de la masse, en utilisant classiquement Sauerbrey, est inférieure à 10 %. Cette erreur est attribuée aux changements des propriétés viscoélastiques de la couche et se traduit par une variation de la résistance. Afin de vérifier expérimentalement ce résultat, nous avons couplé la mesure de la fréquence d'oscillation de la microbalance à une mesure d'admittance électroacoustique sur le même résonateur afin de comparer l'évolution de la fréquence série et de la fréquence d'oscillation de la microbalance. Les mesures couplées, réalisées pendant l'adsorption de protéine, ont montré que les variations des deux fréquences étaient identiques. Par conséquent, il semble que les mesures de masse effectuées à l'aide de la microbalance à quartz, dans le cas d'une couche de protéine et en milieu liquide, sont fiables avec une erreur maximale de 10 % dans le cas où la viscoélasticité de la couche varie. La différence observée entre les deux estimations de la masse de protéine adsorbée sur l'électrode de la microbalance à
quartz s'expliquerait plutôt par un problème au niveau de la mesure de l'activité enzymatique
qui aboutit à une sous-estimation de la quantité de protéine déposée.

Après avoir mis au point et étudié notre transducteur, nous nous sommes intéressés à
l'élaboration de la couche d'anticorps qui rend la surface de l'électrode spécifique. Tout
d'abord, nous avons choisi un couple antigène/anticorps modèle constitué d'anticorps
monoclonaux de souris anti-peroxydase et de la peroxydase. Ce couple nous a permis de
contrôler l'immunoréactivité des anticorps immobilisés par la mesure de l'activité enzymatique
de la peroxydase fixée spécifiquement sur les anticorps correspondants immobilisés.
Différentes techniques d'immobilisation des immunoglobulines sur l'or ont été réalisées et
comparées en terme de quantité de peroxydase, enzymatiquement active, fixée spécifiquement
sur les anticorps. La technique de l'adsorption simple sur l'or a été privilégiée par rapport aux
techniques de greffage covalent après fonctionnalisation de l'électrode d'or car c'est celle qui
donne la plus grande quantité de peroxydase active fixée (ce qui optimise la réponse directe du
capteur). L'influence de l'hydrophobicité de la surface de l'électrode, de la circulation de la
solution d'antigène et de la vibration de la microbalance a été étudiée. Nous avons montré
qu'augmenter l'hydrophobicité de la surface de l'électrode n'améliorait pas la quantité
d'antigène fixé spécifiquement sur les anticorps immobilisés. Concernant la vibration du
quartz, son influence sur la réaction antigène/anticorps s'est révélée nette : la quantité
d'antigène fixé sur une couche d'anticorps adsorbés est significativement diminuée quand le
quartz vibre par rapport à un quartz sans vibration ; cet effet a été attribué à une diminution
de l'immunoréactivité des anticorps immobilisés due à la vibration du quartz. Afin de
caractériser l'électrode des quartz et la couche d'anticorps, nous avons réalisé des études en
microscopie électronique à balayage et en microscopie à force atomique. Les images réalisées
de la surface de l'électrode avec et sans anticorps montrent des différences, mais il est difficile
de conclure sur la nature des observations réalisées. Il semble que le recouvrement de
l'électrode par les immunoglobulines ne soit pas total.

Les quartz immunofonctionnalisés, par l'adsorption simple d'anticorps, ont ensuite été
utilisés pour mesurer, directement, les variations de masse consécutives à la fixation spécifique
des antigènes correspondants. Des essais d'immunodétection à l'aide du dispositif
expérimental mis au point ont été réalisés pour trois antigènes différents : la peroxydase, des
immunoglobulines G et l'entérotoxine B de Staphylocoque. Les expériences que nous avons
réalisées ont montré que la microbalance à quartz revêtue par une couche d'anticorps permet
de détecter directement, spécifiquement et rapidement (en moins de 10 minutes) les antigènes
solubles correspondants. La sensibilité massique de notre transducteur s'avère suffisante pour
détecter directement les trois antigènes testés ayant des masses molaires allant de 28000 à
150000 g/mol, avec des limites de détection de l'ordre du µg/ml.
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Annexes
# Annexe I : Préparation de la peroxydase et mesure de l'activité peroxydasique au niveau de l'électrode d'un quartz

La peroxydase est une enzyme qui catalyse la réduction d'H₂O₂ en H₂O, elle a été fournie par la société Sigma (P-6782, lot 62H95051). Les 50 mg d'enzyme, sous forme lyophilisée, contenus dans le flacon, ont été repris dans 2 ml de PBS (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, KH₂PO₄ 0,2 g/l, Na₂HPO₄ 1,45 g/l, pH 7,4). Une électrophorèse en conditions dénaturantes a été réalisée (Phast System, Pharmacia) afin de vérifier sa pureté et son poids moléculaire. La concentration protéique de la solution a été déterminée par la technique du Lowry (protein assay kit P5656, Sigma), celle-ci est de 22,47 mg/ml. L'activité spécifique de l'enzyme en UI/mg d'enzyme représente le nombre de micromoles de substrat (ou de chromogène comme ici l'A.B.T.S. : 2,2'-azino-di-(3-éthylbenzthiazoline)acide sulfonique) transformées par minute et par mg de protéine. L'activité spécifique a été calculée en mesurant la densité optique d'un mélange réactionnel, contenant une quantité connue d'enzyme, à partir de l'introduction du substrat et du chromogène (en respectant les conditions Michaéliennes telle que : concentration de substrat supérieure à 10 fois le Km de l'enzyme pour son substrat). Dans ces conditions l'activité spécifique, AS, se calcule de la manière suivante :

$$AS = \frac{DO}{\varepsilon \times l} \times v \times \frac{1}{t} \times \frac{1}{Q_{enzyme}}$$

avec : DO représentant la densité optique lue à 405 nm, ε le coefficient d'extinction molaire des produits d'oxydation de l'ABTS soit $3,6 \times 10^4 \text{ M}^{-1}\text{cm}^{-1}$, l le trajet optique soit 1 cm, v le volume du mélange réactionnel soit 1 ml, t le temps au bout duquel la mesure de DO est effectuée en minute et Q<sub>enzyme</sub> la quantité d'enzyme en mg.

L'activité spécifique de la peroxydase préparée est de 2200 UI/mg.

Après chaque expérience de microbalance (suivi de la cinétique d'adsorption), les quartz sont rincés au PBS et sont installés entre deux plaques de Plexiglas, dont la partie supérieure est percée de puits se situant juste au niveau des électrodes. Ceci permet de déposer jusqu'à 300 µl de solution au dessus de l'électrode (l'étanchéité est assurée par un joint torique de même diamètre que celui de l'électrode, disposé à la base du puits). 200 µl de la solution substrat (tampon citrate phosphate pH4,3 contenant 1 mM d'ABTS et en rajoutant extemporanément 0,01% d'H₂O₂ à 30%) sont déposés sur les électrodes et sont laissés pendant 10 min. 110 µl de la solution "substrat/produit" sont alors prélevés et déposés dans un puits d'une plaque de microtitration contenant 50 µl d'une solution d'arrêt d'azide de sodium. La densité optique de la solution est alors mesurée, à 405 nm, à l'aide d'un lecteur de
plaque (Metertek, ε960). Cette DO est alors reportée dans la courbe d'étalonnage : DO = f (concentration de peroxydase) établie à partir d'une gamme de peroxydase en solution réalisée à partir de la même solution que celle utilisée pour le test en microbalance. Ceci nous permet de déterminer la concentration d'enzyme active dans les 200 µl de la solution substrat ajoutée sur l'électrode et donc de déterminer la quantité de peroxydase active adsorbée sur l'électrode. La gamme d'étalonnage se réalise de la façon suivante, la peroxydase est diluée en PBS de façon à obtenir les concentrations indiquées : d1 = 1 µg/ml, d2 = 333 ng/ml, d3 = 111 ng/ml, d4 = 37 ng/ml, d5 = 12 ng/ml, d6 = 4 ng/ml et d7 = 1,33 ng/ml. Dans les puits d'une plaque de microtitration, on dépose 10 µl de chaque dilution et 100 µl de la solution substrat, les concentrations obtenues, qui nous serviront de référence, sont alors de :

$$10 \mu l \text{ d1} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 90909 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ d2} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 30303 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ d3} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 10101 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ d4} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 3367 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ d5} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 1122 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ d6} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 374 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ d7} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 122 \text{ pg de peroxydase/ml}$$

$$10 \mu l \text{ PBS} + 100 \mu l \text{ ABTS} = 0 \text{ pg de peroxydase/ml (blanc)}$$

La DO est lue au bout de 10 minutes d'incubation après l'ajout de 50 µl de solution d'arrêt d'azide de sodium. La DO mesurée sur la solution prélevée au niveau du quartz, après le même temps d'incubation, nous permet de déterminer la concentration en enzyme dans les 110 µl de la solution prélevée. Ce résultat est alors multiplié par le volume de solution substrat ajouté sur le quartz (0,2 ml) afin d'estimer la masse d'enzymes actives présentes sur l'électrode.

Un exemple de résultat obtenu pour la gamme est donnée dans les deux figures suivantes.

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

<figure><img src="image_96.png" /></figure>
Annexe II : Préparation de la phosphatase alcaline et mesure de son activité enzymatique au niveau de l'électrode d'un quartz

La phosphatase alcaline est une enzyme dimérique qui catalyse l'hydrolyse du p-nitrophényl phosphate (pNPP) en p-nitrophénol, elle a été fournie par la société Sigma (P-5778, lot 24H7090). L'enzyme contenue dans le flacon sous forme lyophilisée (1 mg) a été reprise dans 1 ml d'eau désionisée. Une électrophorèse en conditions dénaturantes a été réalisée (Phast System, Pharmacia) afin de vérifier sa pureté et le poids moléculaire de ses sous-unités. La concentration protéique de la solution a été déterminée par la technique du Lowry (protein assay kit P5656, Sigma), celle-ci est de 0,724 mg/ml.

Après chaque expérience de microbalance (suivi de la cinétique d'adsorption), les quartz sont rincés au PBS et sont installés entre deux plaques à puits. 200 µl de la solution substrat (tampon TRIS 0,2 M contenant 1 mg/ml de pNPP, Sigma fast pNPP, N-2770) sont déposés sur les électrodes et sont laissés pendant 20 min. 110 µl de la solution "substrat/produit" sont alors prélevés et déposés dans un puits d'une plaque de microtitration contenant 50 µl de solution d'arrêt (NaOH 3N). La densité optique de la solution est alors mesurée, à 405 nm, à l'aide du lecteur de plaque. Cette DO est alors reportée dans la courbe d'étalonnage : $DO = f(concentration de phosphatase alcaline)$ établie à partir d'une gamme de phosphatase alcaline en solution réalisée à partir de la même solution que celle utilisée pour le test en microbalance. Ceci nous permet de déterminer la concentration d'enzyme active dans les 200 µl de la solution substrat ajoutée sur l'électrode et donc de déterminer la quantité de phosphatase alcaline active adsorbée sur l'électrode. La gamme d'étalonnage de phosphatase alcaline est réalisée selon le même principe que pour la peroxydase. Ici, la solution d'enzyme est diluée de 2 en 2 à partir de 1 µg/ml jusqu'à 15,62 ng/ml et 10 µl de chaque dilution sont déposés dans les puits d'une plaque de microtitration et 100 µl de la solution substrat sont ajoutés. Les concentrations obtenues vont alors de 90909 pg/ml à 1420 pg/ml (plus un blanc). La DO est lue au bout de 20 min d'incubation après l'ajout de 50 µl de NaOH. La DO mesurée sur la solution prélevée au niveau du quartz nous permet de calculer la concentration d'enzyme dans cette solution et donc de déterminer la masse d'enzymes actives présentes sur l'électrode.

Un exemple de résultat obtenu pour la gamme d'étalonnage est donné ci-contre.

<figure><img src="image_97.png" /></figure>
# Annexe III : Préparation de la β-D-galactosidase et mesure de son activité enzymatique au niveau de l'électrode d'un quartz

La β-D-galactosidase est une enzyme tétramérique qui catalyse l'hydrolyse de l'o-nitrophenyl β D galactopyranoside (oNPGal) en o-nitrophénol, elle a été fournie par la société Sigma (G-5635, lot 55H6851). Les 2 mg enzyme ont été repris dans 1 ml de tampon phosphate 0,1 M à pH 7,3. Une électrophorèse en conditions dénaturantes a été réalisée (Phast System, Pharmacia) afin de vérifier sa pureté et le poids moléculaire de ses sous-unités. La concentration protéique de la solution a été déterminée par la technique du Lowry (protein assay kit P5656, Sigma), celle-ci est de 1,883 mg/ml.

Après chaque expérience de microbalance (suivi de la cinétique d'adsorption), les quartz sont rincés au PBS et sont installés entre deux plaques à puits. 200 µl de la solution substrat (tampon phosphate 0,1 M pH 7,3 avec 1 mM de MgCl2, 112 mM de βmercaptoéthanol et 2,3 mM d'ONPGalactopyranoside) sont déposés sur les électrodes et sont laissés pendant 15 min. 110 µl de la solution "substrat/produit" sont alors prélevés et déposés dans un puits d'une plaque de microtitration. La densité optique de la solution est alors mesurée, à 405 nm, à l'aide du lecteur de plaque. Cette DO est alors reportée dans la courbe d'étalonnage : $DO = f(concentration de β-D-galactosidase)$ établie à partir d'une gamme de β-D-galactosidase en solution réalisée à partir de la même solution que celle utilisée pour le test en microbalance. Ceci nous permet de déterminer la concentration d'enzyme active dans les 200 µl de la solution substrat ajoutée sur l'électrode et donc de déterminer la quantité de phophatase alcaline active adsorbée sur l'électrode. La gamme d'étalonnage de β-D-galactosidase est réalisée selon le même principe que pour la peroxydase. Ici, la solution d'enzyme est diluée de 2 en 2 à partir de 20 µg/ml jusqu'à 312 ng/ml et 10 µl de chaque dilution sont déposés dans les puits d'une plaque de microtitration et 100 µl de la solution substrat sont ajoutés. Les concentrations obtenues vont alors de 1818 ng/ml à 28,4 ng/ml (plus un blanc). La DO de la gamme est lue au bout de 15 min d'incubation. La DO mesurée sur la solution prélevée au niveau du quartz nous permet de calculer la concentration d'enzyme dans cette solution et donc de déterminer la masse d'enzymes actives présentes sur l'électrode.

Un exemple de résultat obtenu pour la gamme d'étalonnage est donné ci-contre.

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Annexe IV : Préparation des anticorps monoclonaux de souris anti-peroxydase

Les anticorps monoclonaux (IgG₁) contenus dans les ascites (P-2419, lot n° 041H4845) ont été purifiés sur colonne de protéine A (Prot A superose FPLC, Pharmacia). Les fractions éluées ont été dialysées une nuit contre du PBS puis concentrées après vérification de leur pureté par électrophorèse en gel de polyacrylamide et en conditions dénaturantes (PAGE SDS, Phast System, Pharmacia). L'immunoréactivité de chaque fraction a été contrôlée par ELISA avant de les pooler. La concentration protéique de la solution a été déterminée par la technique du Lowry (protein assay kit P5656, Sigma), celle-ci était de 1,86 mg/ml. Le point isoélectrique des anticorps purifiés a été déterminé par isoélectrophorèse (IEF, Phast System, Pharmacia), il est compris entre 5,88 et 6,55. Nous avons vérifié l'isotypie des anticorps à l'aide d'un BIAcore, les immunoglobulines sont des IgG₁. L'immunoréactivité des anticorps a été contrôlée par ELISA et l'affinité des anticorps pour la peroxydase a été déterminée à l'aide d'un BIAcore, celle-ci est de 4,9. 10⁸ M⁻¹. La solution d'immunoglobulines a ensuite été aliquotée et les aliquots ont été conservés au congélateur à -20°C.