# Caracterisation immunocytochimique et ultrastructurale des cellules a prolactine chez le Cyprin (Carassius auratus)

P. Dubourg, Patrick Prunet, Fabienne Gonnet, Olivier Kah

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P. Dubourg, Patrick Prunet, Fabienne Gonnet, Olivier Kah. Caracterisation immunocytochimique et ultrastructurale des cellules a prolactine chez le Cyprin (Carassius auratus). Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série III, Sciences de la vie, 1986, 303 (9), pp.361-366. hal-02728623

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ENDOCRINOLOGIE. — Caractérisation immunocytochimique et ultrastructurale des cellules à prolactine chez le Cyprin (Carassius auratus). Note de Pierrette Dubourg, Patrick Prunet, Francis Gonnet et Olivier Kah, présentée par Maurice Fontaine.

Un immunsérum dirigé contre la prolactine de Saumon chinook (Onchorynchus tschawytscha) permet d'obtenir le marquage de petites cellules de forme variable, exclusivement localisées dans la pars distalis rostrale de l'hypophyse du Cyprin. En microscopie électronique, le marquage, principalement localisé sur les grains de sécrétion, permet de distinguer les cellules à prolactine des autres types cellulaires de la pars distalis rostrale dont les caractéristiques ultrastructurales sont très voisines.

Ces résultats sont comparés avec les données existantes concernant la localisation immunocytochimique des cellules à prolactine chez les téléostéens obtenues à l'aide de divers immunsérums dirigés contre des hormones mammaliennes ou de téléostéens.

ENDOCRINOLOGY. — Immunocytochemical and ultrastructural characterization of prolactin cells in the Goldfish (Carassius auratus).

An antiserum directed against chinook Salmon (Onchorynchus tschawytscha) prolactin reacts with small cells, variable in shape and exclusively located in the rostral pars distalis. At the electron microscope level, the labeling is primarily localized on the secretory granules and allows discrimination of prolactin cells from other cell types of the rostral pars distalis, whose ultrastructural characteristics are quite similar.

These results are compared with previous data concerning the immunocytochemical localization of prolactin cells in teleosts gained by means of different antisera against mammalian or teleostean hormones.

Au sein des vertébrés, les poissons téléostéens constituent un groupe privilégié pour l'étude des relations neuroendocriniennes en raison de l'existence d'une innervation directe des cellules adénohypophysaires par des terminaisons axonales d'origine cérébrale. Il est donc possible d'étudier l'innervation propre à chacun des types cellulaires à condition toutefois de pouvoir les identifier. Si la reconnaissance de certaines catégories cellulaires sur la base de leur aspect ultrastructural est aisée dans certains cas, il en est d'autres où l'identification est problématique. Ainsi, chez le Cyprin, la distinction entre les éléments somatotropes et gonadotropes de la pars distalis proximale (PDP) est aisée ([1] à [5]) et a pu être vérifiée par immunocytochimie ultrastructurale ([6], [7]). Par contre, la pars distalis rostrale (PDR) renferme des éléments d'autre nature ([1], [2]) dont les critères ultrastructuraux très voisins rendent difficile leur identification ([3], [5], [8]). Dans ce cas, l'immunocytochimie appliquée en microscopie électronique permet de lever toute ambiguïté.

Les cellules à prolactine (PRL) de téléostéens, dont le rôle dans l'osmorégulation n'est plus à démontrer [9], ont été identifiées par immunohistochimie chez différentes espèces à l'aide d'anticorps dirigés contre la prolactine mammalienne ([10] à [14]), ou contre des prolactines de téléostéens ([15] à [19]); mais, à ce jour, aucun travail n'a été réalisé en microscopie électronique.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Des Cyprins (Carassius auratus) des deux sexes, pêchés dans un étang de la région bordelaise, sont élevés au laboratoire en eau courante, à une température de 17-18°C sous une photopériode naturelle. Après décapitation sous anesthésie (MS 222, Sandoz), l'hypophyse est rapidement disséquée et traitée selon l'un des protocoles suivants :

*Microscopie photonique.* — Les hypophyses sont immergées dans du Bouin-Hollande sublimé pendant 48 h puis rincées en eau courante et incluses dans du Paraplast. Les coupes, d'une épaisseur de 8 µm sont rehydratées dans du tampon phosphate (0,1 M-pH 7,4), utilisé pour tous les rinçages et dilutions d'immunsérums (IS), puis traitées par la méthode péroxydase-antipéroxydase (PAP). L'anticorps primaire, dirigé contre la prolactine de Saumon chinook (Onchorynchus tschawytscha, anti-sPRL), est dilué au 1/1 000 ou au 1/2 000 [20].

*Microscopie électronique.* — Les hypophyses sont fixées à la glutaraldéhyde (6,25%, tampon Soerensen, 0,015 M-pH 7,4); après inclusion dans l'épon, les coupes ultrafines sont recueillies sur grilles de nickel et
exposées aux différents réactifs selon le protocole précédemment décrit [7]. Après traitement à l'eau oxygénée à 10%, les coupes, rincées, sont mises en présence de l'IS de lapin anti-sPRL dilué au 1/4000 dans du tampon phosphate 0,1 M. Après rinçage, elles sont exposées aux immunoglobulines anti-lapin (1/100), et enfin aux complexes PAP (1/100). La réaction est révélée par la diaminobenzidine (0,025%) additionnée d'eau oxygénée (0,006%). Les coupes sont légèrement colorées par l'acétate d'uranyle. Des coupes adjacentes à celles traitées pour l'immunohistochimie ont été contrastées à l'acétate d'uranyle et au citrate de plomb.

**Spécificité.** — La spécificité des réactions obtenues est vérifiée par l'omission de l'une des étapes de la réaction, le remplacement de l'IS primaire par un sérum de lapin non-immun, ou après épuisement de l'IS primaire par un excès de prolactine de Saumon.

**RÉSULTATS.** — En microscopie photonique, l'IS anti-sPRL met en évidence de petites cellules localisées dans la PDR. Elles sont isolées ou groupées en petits amas entre lesquels se trouvent des éléments non réactifs. A fort grandissement, ces cellules marquées apparaissent de forme variable, et présentent souvent un noyau indenté (fig. 1). Appliqué à l'échelle ultrastructurale, l'IS anti-sPRL marque un seul type cellulaire de la PDR (fig. 2 et 4). Ces cellules immunoréactives présentent un réticulum endoplasmique composé de deux ou trois lamelles périnucléaires; les complexes de golgi sont peu développés et les mitochondries sont petites et peu nombreuses. Les grains de sécrétion (100 à 225 nm) sont sphériques, uniformément denses aux électrons après coloration des coupes, et répartis régulièrement dans tout le cytoplasme (fig. 3 et 5). Les complexes PAP sont principalement localisés sur les grains de sécrétion (fig. 6). Les tests de spécificité effectués conduisent à l'extinction de la réaction.

EXPLICATIONS DE LA PLANCHE

Fig. 1. — Cellules immunoréactives (→) dans la pars distalis rostrale. (PAP) ($G \times 550$).

Fig. 1. — Immunoreactive cells (→) in the rostral pars distalis. (PAP) ($M \times 550$).

Fig. 2. — Coupe traitée par l'immunsérum et légèrement contrastée. Les cellules 1, 2 et 3 sont immunoréactives tandis que la cellule 4 est négative ($G \times 4700$).

Fig. 2. — Section treated with the antiserum and slightly counterstained. Cells 1, 2 and 3 are immunoreactive, while cell 4 is negative ($M \times 4,700$).

Fig. 3. — Coupe adjacente non traitée et contrecolorée. La cellule 4 négative correspond à une cellule de type 1 ($G \times 5500$).

Fig. 3. — Adjacent section untreated and counterstained. The negative cell 4 corresponds to type 1 ($M \times 5,500$).

Fig. 4. — Coupe traitée par l'immunsérum et légèrement contrastée. Les cellules 1, 2 et 3 sont immunoréactives, tandis que les cellules 4, 5 et 6 sont négatives ($G \times 5200$).

Fig. 4. — Section treated with the antiserum and slightly counterstained. Cells 1, 2 and 3 are immunoreactive, while cells 4, 5 and 6 are negative ($M \times 5,200$).

Fig. 5. — Coupe adjacente non traitée et contrecolorée. Notez la similarité entre les cellules positives et les cellules négatives qui correspondent au type II ($G \times 6800$).

Fig. 5. — Adjacent section untreated and counterstained. Note similarity between the positive cells and negative ones, which correspond to type II cells ($M \times 6,800$).

Fig. 6. — A fort grandissement, les complexes PAP apparaissent localisés sur les grains de sécrétion. Les granules de la cellule adjacente (→) sont négatifs ($G \times 27500$).

Fig. 6. — The PAP complexes are located on the secretory granules. The granules of the adjacent cell are negative ($M \times 27,500$).

Agr : cellule agranulaire.

Agr: agranular cell.
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Outre les cellules immunoréactives, la PDR renferme des cellules agranulaires et deux types de cellules sécrétrices (type I et II) qui ne sont jamais marqués. Malgré des caractéristiques ultrastructurales voisines de celles des cellules immunopositives, ces éléments présentent dans certains cas un aspect ultrastructural légèrement différent. Le type I se présente sous forme de cellules généralement allongées, avec un réticulum endoplasmique de type vacuolaire. Les grains de sécrétion, sphériques ou allongés, de densité électronique variable, sont regroupés en certaines zones de la cellule. Ces cellules possèdent également des globules de densité variable aux électrons (fig. 3). Le type II est constitué de cellules plus globuleuses, plus réticulées et moins granulées que le type immunoréactif. Les grains de sécrétion ont une densité aux électrons plus faible, et le cœur dense du granule est parfois décollé de la membrane limitante. De plus, ces cellules sont le plus souvent regroupées à proximité des troncs de la neurohypophyse (fig. 5).

L'innervation de la PDR est essentiellement composée de fibres de type B (diamètre des vésicules sécrétrices < 100 nm). La plupart d'entre elles se terminent sur la membrane basale séparant la neurohypophyse de l'adénohypophyse. Toutefois, de rares fibres entrent en contact direct avec les cellules sécrétrices.

**DISCUSSION.** — L'IS anti-sPRL de Saumon chinook permet d'obtenir le marquage de cellules dispersées ou groupées en petits amas et localisées exclusivement dans la PDR. Aucune cellule immunoréactive n'est décelée dans la PDP ou la pars intermedia (PI). Ces résultats s'ajoutant au fait que ces cellules sont érythrosinophiles [1] et légèrement sensibles aux variations de salinité [21] démontrent qu'elles sont de nature prolactinienne. D'un point de vue immunologique, nos observations sont en accord avec celles obtenues après utilisation d'IS dirigés contre la prolactine ovine ([10] à [13]) ou la prolactine de Saumon chum [17]. Ils sont par contre en contradiction avec des données montrant qu'in vitro des extraits hypophysaires de Cyprin ne croisent que très faiblement avec un IS dirigé contre la prolactine de Saumon chum [19]. Cette contradiction ne peut s'expliquer que par une forte spécificité d'espèce, puisqu'il a été montré que les prolactines de Saumon chum et chinook sont très semblables quant à leurs propriétés immunologiques et physicochimiques [19], et ne peut s'interpréter que par des différences entre les détermineants antigéniques des IS ou par des mécanismes de reconnaissance différents in vitro lorsque la prolactine est libre, et in situ après fixation. Ces mécanismes de reconnaissance semblent être indépendants de la distance phylogénique entre deux espèces puisque l'IS dirigé contre la prolactine de Saumon chinook marque les cellules PRL chez le Cyprin ou la Sole (J. Nunez-Rodriguez, P. Dubourg et O. Kah, résultat non publié) alors que des anticorps dirigés contre la prolactine de *Tilapia* ne reconnaissent aucune cellule chez le Cyprin ou l'Anguille [16].

Ce travail constitue la première étude immunocytochimique des cellules PRL de téléostéens en microscopie électronique. Il a permis de distinguer sans ambiguïté les cellules PRL des autres types cellulaires de la PDR dont les caractéristiques ultrastructurales sont, chez le Cyprin, extrêmement semblables. En effet, dans cette partie de l'hypophyse, il a été distingué sur la base de leurs affinités tinctoriales, outre des cellules PRL, des éléments corticotropes et des éléments thyréotropes [1]. Ces résultats sont confirmés par des études immunocytochimiques basées sur l'utilisation d'anticorps dirigés contre la 1-24 ACTH qui permet d'obtenir le marquage de cellules de forme arrondie dans la PDR ([22], [8]); de plus, un IS dirigé contre une préparation enrichie en hormone thyréotrope [23] réagit avec une autre population cellulaire de forme triangulaire [8]. Les caractéristiques ultrastructurales de ces différentes catégories cellulaires telles que nous
les avons observées sont identiques à celles déjà décrites chez la même espèce ([3], [4], [5], [8], [21]). Le regroupement des cellules de type II à proximité des troncs nerveux ainsi que leur forme arrondie, suggèrent que ces cellules correspondent aux corticotropes. Les cellules de type I, de forme plus géométrique, sont vraisemblablement de nature thyréotrope.

Nos observations concernant l'innervation de la PDR du Cyprin sont en accord avec les études précédentes ([3], [24], [8]). Il a été montré que certaines fibres de type B pénétrant la PDR étaient de nature catécholaminergique, et plus précisément, dopaminergique ([25], [26]), tandis que d'autres captent sélectivement l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) tritié ([27], [8]). Ces résultats sont en accord avec des données montrant une régulation dopaminergique des cellules PRL [28] et GABAergique des cellules corticotropes [29]. L'identification ultrastructurale des cellules PRL par immunocytochimie après enrobage, couplée sur la même préparation que celle avant enrobage des neuromédiateurs devrait permettre de préciser ces résultats.

Reçue le 28 avril 1986, acceptée le 23 juin 1986.

## RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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P. D. et O. K. : Laboratoire de Physiologie des Interactions cellulaires, avenue des Facultés, 33405, Talence Cedex;

P. P. et F. G. : Laboratoire de Physiologie des Poissons, I.N.R.A., campus de Beaulieu, 35042 Rennes.