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# Cancer avec addiction oncogénique, détection de nouvelles cibles et recherche de mécanismes de résistance

Philippe Jamme

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Philippe Jamme. Cancer avec addiction oncogénique, détection de nouvelles cibles et recherche de mécanismes de résistance. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de Lille, 2021. Français. NNT: 2021LILUS018. tel-04558810

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Submitted on 25 Apr 2024

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École doctorale biologie – santé

UMR 9020 CNRS - UMR-S 1277 Inserm - Université de Lille - Institut Pasteur de Lille - CHU de Lille

Thèse de doctorat

En vue de l'obtention du grade de

Docteur de l'Université Lille 2 Droit et Santé

Spécialités : physiologie, physiopathologie, biologie systémique médicale

Spécialité : Biologie

Cancer avec addiction oncogénique, détection de nouvelles cibles et recherche de mécanismes de résistance

Soutenue le 25 Janvier 2021 par Philippe Jamme

Sous la direction de : M. le Pr Alexis Cortot

Co-encadrante : Mme le Dr Zoulika Kherrouche

Présidente du Jury : Mme le Pr Réjane Paumelle-Lestrelin

Rapporteurs : Mr le Pr Nicolas Girard

Mr le Dr Antonio Maraver

Examinateur : Mme le Dr Stephanie Kermogant
"Science sans conscience n'est que ruine de l'âme"

François Rabelais,

Pantagruel,
Table des matières

1 Résumé de la thèse .................................................................................................................... 4

2 ABRÉVIATIONS ................................................................................................................................. 9

3 Liste des Figures et des Tableaux: ................................................................................................ 12

1 Les cancers bronchopulmonaire avec addiction oncogénique ........................................ 15

1.1 Généralités sur les cancers pulmonaires................................................................................ 15

1.2 Prise en charge des CBNPC avec addiction oncogénique .................................................. 18

1.2.1 Les outils thérapeutiques disponibles................................................................................ 18

1.2.2 Les CBNPC avec mutation EGFR................................................................................................ 21

1.2.3 Les CBNPC avec réarrangement ALK................................................................................ 23

1.2.4 Les autres altérations moléculaires dans les CBNPC ........................................................ 26

2 Structure et rôle physiologique du récepteur MET et de son ligand l'HGF ...... 30

2.1 Découverte et structure du récepteur MET ................................................................................ 30

2.2 Structure et synthèse de l'HGF........................................................................................................ 32

2.3 Rôle physiologique du récepteur MET.................................................................................. 34

3 Activation, voies de signalisation et régulation du récepteur MET ...................... 36

3.1 Activation du récepteur MET ........................................................................................................ 36

3.2 Voies de signalisation du récepteur MET ................................................................................ 37

3.2.1 La voie MET-PI3K........................................................................................................................ 37

3.2.2 La voie MET-MAPKinase........................................................................................................ 41

3.2.3 La voie MET-STAT3................................................................................................................ 41

3.2.4 La voie MET-CRK-RAC1........................................................................................................ 42

3.3 Régulation du récepteur MET ........................................................................................................ 43

3.3.1 Voie de régulation HGF-dépendante................................................................................ 43

3.3.2 Voie de régulation HGF-indépendante................................................................................ 44

4 Les altérations de MET dans le cancer .................................................................................... 47

4.1 Les mutations du domaine kinase de MET (MET/DK) ................................................................. 47

4.2 Les mutations du domaine sémaphorine (MET/DS) ................................................................. 48

4.3 Les fusions du gène MET ................................................................................................................ 50

4.4 Les amplifications du gène MET ........................................................................................................ 52

4.5 Les mutations METex14.................................................................................................................... 54

4.5.1 Découverte des mutations METex14.................................................................................... 54

4.5.2 Caractéristiques cliniques histologiques et moléculaires des patients porteurs d'un CBNPC avec mutation METex14........................................................................................................ 55

4.5.3 Revue des ITK MET dans la prise en charge des CBNPC mutés METex14 .................... 56

5 Objectif de la thèse ................................................................................................................................. 60

6 ARTICLE........................................................................................................................................................................ 61

7 DISCUSSION .................................................................................................................................................... 95

7.1 Médecine de précision et mécanisme de résistance........................................................................ 96

7.1.1 Définition d'un mécanisme de résistance ................................................................................ 96

7.1.2 Revue des mécanismes de résistance et des biomarqueurs de réponse aux ITK MET 98

7.2 Voie PI3K et résistance aux thérapies anticancéreuses ........................................................ 104

7.3 Détection des biomarqueurs : enjeux et problématiques ........................................................ 105

7.3.1 Place des différents outils de biologie cellulaire et moléculaire dans la détection des altérations moléculaires en oncologie........................................................................................................ 106

7.3.2 Enjeu et défi de la détection des mécanismes de résistances en routine clinique108

7.3.3 Impact de la détection de co-altérations sur le choix thérapeutique ................................. 109
<table><tr><td>7.4</td><td>Conclusion</td><td>109</td></tr><tr><td>8</td><td>Reference</td><td>111</td></tr><tr><td>9</td><td>Annexe</td><td>138</td></tr></table>

# 1 Résumé de la thèse

## Introduction
La détection d'altérations moléculaires susceptibles de répondre à des thérapies ciblées ainsi que l'identification des mécanismes de résistance à ces thérapies représentent deux aspects majeurs de la médecine de précision qui ont été étudiés dans mes travaux de thèse.

## Articles

Mes travaux de thèses se sont d'abord focalisés sur l'étude des altérations de la voie PI3K-AKT dans la résistance aux inhibiteurs tyrosines kinase MET (ITK MET) dans les cancers bronchiques non à petites cellules porteurs d'un saut de l'exon 14 de MET (CBNPC-METex14) (article n°1). En constituant une cohorte de 65 patients, nous avons mis en évidence que des altérations de la voie PI3K (i.e mutation PIK3CA et perte de PTEN) étaient communes dans les CBNPC-METex14. Nous avons observé que le taux de réponse à un ITK MET des patients porteurs d'une co-altération MET/PI3K était plus faible que dans les CBNPC-METex14 sans altération PI3K. *In vitro*, l'étude de lignées cellulaires mutées METex14 avec une altération de la voie PI3K a permis de confirmer la résistance aux ITK MET, surmonter par l'ajout d'un inhibiteur PI3K.

Par la suite, nous nous sommes intéressés à la recherche de nouveaux biomarqueurs prédictifs de réponse aux ITK MET. Nous avons identifié un patient porteur d'un cholangiocarcinome avec une fusion CAPZA-2-MET. Ce patient, initialement réfractaire à la chimiothérapie, a reçu un ITK MET (capmatinib) permettant l'obtention d'une réponse objective. Après plusieurs mois de traitement, une progression tumorale nous a conduit à mettre en évidence l'émergence d'une mutation du domaine kinase de MET (article n°2).

Enfin, nous nous sommes intéressés à la faisabilité de la recherche des mutations de résistance à d'autres thérapies ciblées, les ITK ALK, chez les patients porteurs d'un CBNPC ALK+ (article n°3). Nous avons établi une cohorte de 23 patients porteurs d'un CBNPC ALK+ traité par un ITK ALK pour lesquels une biopsie à progression était disponible. Un mécanisme de résistance a été identifié chez 9 patients (39%). Tous les patients ayant reçu un ITK ALK présumé actif sur le mécanisme de résistance détecté ont présenté une réponse de leur maladie. Ces résultats confirment l'utilité de rechercher les mécanismes de résistance afin d'orienter les choix thérapeutiques

## Conclusion

Ces travaux illustrent la pertinence d'identifier des cibles thérapeutiques nouvelles, comme les mutations METex14 ou les fusions de MET. Ils illustrent aussi les limites de cette approche avec la survenue de mécanismes de résistance primaire ou acquise, et la nécessité de les identifier pour pouvoir mieux les surmonter.

## Introduction
The identification of mechanisms of resistance to targeted therapies and the detection of new predictive biomarkers of response are crucial to improving patient management. My PhD thesis work focuses on these two aspects of precision medicine.

## Articles

My thesis work explores the study of alterations in the PI3K-AKT pathway as a mechanism of resistance to MET tyrosine kinase inhibitors (MET TKI) in non-small cell lung cancers (NSCLC) with MET exon 14 skipping mutation (NSCLC-METex14) (Article #1). We reviewed clinical data from 65 patients with METex14 NSCLC, assessing PI3K pathway alterations. We observed that PI3K pathway alterations (i.e., PIK3CA mutation and loss of PTEN expression) are common in METex14 NSCLC. We discovered that the clinical activity of MET TKI is lower in patients with METex14 NSCLC and PI3K alteration. *In vitro* studies of METex14 mutated cell lines with alterations in the PI3K pathway confirmed resistance to METTKI, which can be overcome by the addition of a PI3K inhibitor.

Subsequently, we focused on research for new predictive biomarkers of response to MET TKI. We examined a cholangiocarcinoma patient with a CAPZA-2-MET fusion and observed that MET fusion is associated with a response to the MET TKI capmatinib. We also found the emergence of a MET kinase mutation (D1228N) as a potential resistance mechanism to first generation MET TKI (Article #2).

Finally, we investigated the feasibility and relevance of detection of mechanisms of resistance to ALK inhibitors in ALK-rearranged NSCLC. We reviewed clinical data from 23 patients with advanced ALK-rearranged NSCLC who had undergone at least one repeat biopsy at progression during an ALK TKI treatment. A resistance mechanism was identified in 9 of the 23 patients (39%). All patients who received a TKI presumed to act on the detected ALK mutant achieved disease control. These results confirm that the detection of mechanism of resistance is suitable for routine practice and can help select the best treatment for patients.

## Conclusions

This work illustrates the relevance of identifying new therapeutic targets, such as METex14 mutations or MET fusions. It also illustrates the limitations of this strategy with the emergence of primary or acquired mechanisms of resistance, and the necessity to identify them in order to overcome them.

## REMERCIEMENTS
Je remercie le Pr Nicolas Girard et le Dr Antonio Maraver, pour avoir accepté d'évaluer mes
travaux en tant que rapporteur. Je remercie le Pr Rejane Paumelle d'être présidente de mon
jury de thèse et d'avoir accepté d'examiner mes recherches. Je remercie le Dr Stephanie
Kermogant d'avoir accepté d'être examinatrice à mon jury de thèse

Au Pr Alexis Cortot et Dr Zoulika Kherrouche pour m'avoir accompagné durant ces dernières années et d'avoir fait preuve de patience et de pédagogie. Trois belles années au sein de l'UMR 8161 qui m'auront beaucoup apportées tant sur le plan humain que sur la rigueur.

Au Dr David Tulasne pour ses conseils tout au long de mon parcours et aux (très nombreuses) questions lors des présentations trimestrielles qui m'ont permis de progresser sur mon sujet.

Au Pr Marie-Christine Copin et au Dr Clotilde Descarpentries pour l'écoute et la grande aide apportée durant ces années à la réalisation de nos travaux. Je remercie le docteur Sarah Humez d'avoir assuré la continuité du Pr Copin sur les différents projets et lui souhaite plein de réussite. Je remercie l'ensemble des membres de l'équipe « Target, Efficacy and resistance to anti-tumor targeted therapies » pour ces moments de joies partagés. Catherine, Fabrice, Audrey, Angela (et la petite Julia), Sonia.

Je remercie mes amis et amies doctorants et étudiants pour leurs conseils, leurs aides et leurs sens de l'humour : Simon, Leslie, Anthony, Marie et Martine, Camille, Vincent, Erwan, Alexandre, Abhishek, Marta et Sarah.

Je remercie toute l'équipe du service de Dermatologie du Pr Laurent Mortier de m'avoir accueilli pour la réalisation du clinicat.

Je remercie toute ma famille

A ma Maman et Eric d'un grand soutien ces derniers mois

A Matthieu, Amélie et mes deux neveux Léopold et Côme

A Arielle et François pour le soutien inconditionnel

A Estelle et ma fille Albane, les deux femmes de mon cœur
# PUBLICATIONS EN LIEN AVEC LES TRAVAUX DE THÈSE

## Publications :

**Jamme P**, Fernandes M, Copin MC, Descarpentries C, Escande F, Morabito A, Grégoire V, Jamme M, Baldacci S, Tulasne D, Kherrouche Z* and Cortot AB*. Alterations in the PI3K pathway drive resistance to MET inhibitors in NSCLC harboring MET exon 14 skipping mutations. Journal of Thoracic Oncology. 2020 May;15(5):741.

Baldacci S., Figeac M., Antoine M., Descarpentries C., Kherrouche Z., **Jamme P.**, Copin MC., Tulasne D., Nanni I., Beau-Faller M., Melaabi S., Levallet G., Quoix E., Moro-Sibilot D., Friard S., Missy P., Barlesi F., Cadranel J., and Cortot AB. High MET overexpression does not predict the presence of MET exon 14 splice mutations in NSCLC: results from the IFCT Predict.amm study. J Thorac Oncol. 2020 Jan;15(1):120-124.

**Jamme P.**, Descarpentries C., Gervais R., Dansin E., Wislez M., Grégoire V., Richard N., Baldacci S., Rabbe N., Kyheng M., Kherrouche Z., Escande F., Copin MC. and Cortot AB. Relevance of detection of mechanisms of resistance to ALK inhibitors in ALK+earranged NSCLC in routine practice. Clin Lung Cancer. 2019 Jul;20(4):297-304.

Descarpentries C, Leprêtre F, Escande F, Kherrouche Z, Figeac M, Sebda S, Baldacci S, Grégoire V, **Jamme P**, Copin MC, Tulasne D, Cortot AB. Optimization of routine testing for MET exon 14 splice site mutations in non-small cell lung cancer patients. J Thorac Oncol. 2018 Dec;13(12):1873-1883.

Duplaquet L, Kherrouche Z, Baldacci S, **Jamme P**, Cortot AB, Copin MC, Tulasne D. The multiple paths towards MET receptor addiction in cancer. Oncogene. 2018 Jun;37(24):3200-3215.

## Communications :

### Posters:

ESMO 2018 1036 - Clinical characteristics and outcomes of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients harboring MET exon 14 splice sites mutations.

### Communications Orales :

WCLC 2017: MA 07.06: Detection of Mechanisms of Resistance to ALK Inhibitors in Routine Practice: A Retrospective Study
## 2 ABRÉVIATIONS

**ADAM** : A Disintegrin And Metalloproteinase

**AC** : Anticorps

**AGC** : cAMP-dependent, cGMP-dependent and protein kinase C

**AKT** : AKT8 virus oncogene cellular homolog

**ALK** : Anaplastic Lymphoma Kinase

**AMM** : Autorisation de Mise sur le Marché

**ANSM** : L'agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé

**ARN** : Acide RiboNucléique

**ATU** : Autorisation temporaire d'utilisation

**BAD** : Beclin (Bcl)-2 antagonist of cell death

**BCR-ABL** : Breakpoint cluster region protein- Abelson murine leukemia virus

**BRAF** : b-Rapidly Accelerated Fibrosarcoma

**BTK** : tyrosine kinase de Bruton

**CAPZA2** : F-actin-capping protein subunit alpha-2

**CBL** : Casitas B-lineage Lymphoma

**CBNPC** : Cancer Bronchique Non à Petites Cellules

**CEP7** : Pericentromeric regions of chromosomes 7

**CLIP2** : CAP-Gly Domain Containing Linker Protein 2

**CRK** : CT regulator kinase

**CTLA-4** : Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4

**DCTN1** : Dynactin subunit 1

**EGFR** : Epidermal Growth Factor Receptor

**EML4/ALK** : Echinoderm microtubule-associated protein like 4

**ERK** : Extracellular signal Regulated Kinase

**EPS15** : Epidermal Growth Factor Receptor Pathway Substrate 15

**ETS-1** : Avain Erythroblastosis Virus E26 homolog-1

**FAK** : Focal Adhesion kinase

**FAS** : Fibroblast Associated

**FGFR** : Fibroblast growth factor receptor

**FLIP** : FLICE-like inhibitory protein/Protéine FLICE-Like inhibitrice

**FLT3** : fms like tyrosine kinase 3

**FISH** : Fluorescence In Situ Hybridization

**GAB1** : GRB2-associated binder 1

**GRB2** : Growth factor Rreceptor –Bbound protein 2

**GSK3** : Glycogen synthase kinase 3 beta

**HER** : Human Epidermal growth factor Receptor

**HGF/SF** : Hepatocyte Growth Factor/ Scatter Factor

**HLA-DRB1** : HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain

**HRS** : HGF Regulated tyrosine kinase Substrate
**IGF-1R**: Insulin growth factor receptor 1

**INSR**: Insulin receptor precursor

**IPT**: Immunoglobulin-like region in Plexin and Transcription factors

**ITK**: Inhibiteur de Tyrosine Kinase

**ITSK**: serine-threonine kinase

**KIF5**: Kinesin-related protein 5

**KLC1**: Kinesin light chain 1

**KRAS**: V-Ki-ras2 Kirsten Rat Sarcoma viral oncogene homolog

**LBx**: Liquid biopsy

**LRRFIP1**: Leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1

**MAPK**: Mitogen Activated Protein Kinase

**MET/HGFR**: Hepatocyte growth factor receptor

**MEK**: Mitogen-activated extracellular signal-regulated protein kinase

**MDM2**: Murine Double Minute 2

**mTOR**: mammalian Target Of Rapamycin

**NGS**: Next generation sequencing

**NTRK**: Neurotrophic tyrosine kinase

**PD-1/L-1**: Programme death-1/ligand-1

**PEA3**: Polyoma enhancer activator 3

**PH**: Pleckstrin Homology domain/ Domaine d'homologie à la pleckstrin

**PI3K**: Phosphatidyl Inositol 3 Kinase

**PIP2 (4, 5)**: Phosphatidyl Inositol (4, 5) biPhosphate

**PIP3 (3, 4, 5)**: Phosphatidyl Inositol (3, 4, 5) triphosphate

**PKC**: Protéine kinase C

**PP2A**: Protéine phosphatase 2A

**PPFIB1**: Liprin-beta-1

**PSI**: Plexin Semaphorin Integrin

**PTEN**: Phosphatase and TENsin homolog

**PTPN3**: Protein tyrosine phosphatase, non receptor type 3

**PTPRZ1**: protein tyrosine phosphatase receptor type Z1

**RAC1**: RAs-related C3 botulinum toxin substrate 1

**RAF**: Rapidly Accelerated Fibrosarcoma

**RET**: Rearranged during transfection

**ROS1**: ROS Proto-Oncogene 1

**RTK**: Récepteur Tyrosine Kinase

**RT-PCR**: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

**SEMA**: Semaphorin

**SHC**: SH2 domain containing transforming protein

**SRC**: Sarcome proto-oncogene

**STK22D**: Serine/threonine kinase 22D
**TBx**: Tumor Biopsy

**TFG**: TRK-Fused Gene

**TGF**: Transforming growth factor

**TPR**: Translocated Promoter Region

**TRIM4**: Tripartite motif-containing protein 4

**ZKSCAN1**: Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains
**3 Liste des Figures et des Tableaux:**

**Figure 1:** Les altérations moléculaires responsables d'une addiction oncogénique dans les CBNPC et les différentes thérapies ciblées (page 16)

**Figure 2:** Représentation schématique de la structure du récepteur MET et des principaux sites de régulation et d'activation (page 32)

**Figure 3:** Représentation schématique de la structure de l'HGF (page 34)

**Figure 4:** Représentation schématique des PI3K de classe I (page 38)

**Figure 5:** Représentation schématique des différentes voies de signalisation du récepteur MET (page 40)

**Figure 6:** Représentation schématique de la voie de signalisation MET-PI3K-AKT (page 42)

**Figure 7:** Représentation schématique des voies de régulation HGF-dépendantes et HGF-indépendantes du récepteur MET (page 46)

**Figure 8:** Représentation des mutations du domaine SEMA, du domaine juxtamembranaire et du domaine kinase de MET identifiées dans les CBNPC (page 46)

**Figure 9:** Représentation schématique des fusions du gène MET. Figure issue de la publication « The multiple paths towards MET receptor addiction in cancer » par Duplaquet et al. (page 51)

**Figure 10:** Représentation schématique des mutations des sites d'épissage de l'exon 14 de MET. Schéma issu de l'article « MET exon 14 splicing sites mutations: a new therapeutic opportunity in lung cancer » de Baldacci et al. (page 56)

**Table 1:** Essais cliniques des ITK MET dans les CBNPC METex14 (page 59)
Introduction

La médecine personnalisée, appelée également médecine de précision, a pour objectif d'individualiser la prise en charge de chaque patient.

En oncologie, l'identification des oncogènes a été l'une des grandes avancées de la médecine personnalisée (Eifert et Powers 2012). Le premier oncogène v-src responsable du sarcome du poulet a été découvert en 1976. Cette découverte a été récompensée d'un prix Nobel en 1989.
Un oncogène se définit par une altération moléculaire sur un gène responsable de la transformation d'une cellule normale en cellule tumorale (oncogenèse). Lorsque l'activité de cet oncogène est nécessaire et suffisante au processus oncogénique, il est appelé driver car il est responsable d'une addiction oncogénique. L'addiction oncogénique se définit par la dépendance en termes de survie, d'invasion et de prolifération de la cellule tumorale vis-à-vis des modifications générées par l'expression et/ou l'activité anormale d'un oncogène.

Bien que conférant un avantage, cette dépendance est également une faiblesse pouvant être ciblée afin de bloquer la prolifération des cellules tumorales. Deux types de thérapies ciblées sont utilisées en oncologie : les inhibiteurs protéine kinase regroupant les inhibiteurs tyrosine kinase (ITK) et serine-thréonine kinase (ITSK), d'une part, et les anticorps monoclonaux (Ac monoclonaux), d'autre part (Kannaiyan et Mahadevan 2018 ; Pento 2017). L'utilisation des thérapies ciblées est récente, datant du début des années 2000, avec l'arrivée des anti-HER2 (Human Epidermal growth factor Receptor 2) dans les cancers du sein (Romond et al. 2005), des anti-EGFR (Epidermal growth factor Receptor) dans les cancers du poumon (Shepherd et al. 2005), et des inhibiteurs des fusions bcr-abl (Breakpoint cluster region protein-Abelson murine leukemia virus) dans les leucémies myéloïdes chroniques (Druker et al. 2001).
Aujourd'hui, les thérapies ciblées sont utilisées dans une grande majorité des cancers. Bien qu'elles montrent une bonne efficacité, avec des taux de réponse fréquemment supérieurs à 70 %, leur durée d'action est parfois assez limitée, et la progression tumorale est inéluctable après plusieurs mois de traitement. Les mécanismes de résistance présents avant traitement (résistance primaire) ou émergeant sous traitement (résistance acquise) sont les principales causes d'échec thérapeutique.
L'identification de toutes les altérations moléculaires à l'origine d'un processus oncogénique ou responsables de la résistance est un défi pour la médecine de précision dans laquelle s'inscrit mon projet de thèse.

La première partie du manuscrit sera tout d'abord consacrée à l'étude des carcinomes bronchiques non à petites cellules (CBNPC). Environ 50 % des CBNPC présentent un oncogène driver dont la majorité est actionnable par une thérapie ciblée (Planchard et al. 2018). Durant mes travaux de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés aux CBNPC avec altération du récepteur MET (Hepatocyte growth Factor receptor). Dès lors, nous proposons une revue du récepteur MET et de ses altérations dans le cancer.

La seconde partie sera consacrée à nos travaux de recherche. Dans un premier temps, nous nous sommes focalisés sur l'étude des mécanismes de résistance dans les CBNPC porteurs d'une mutation responsable d'un saut de l'exon 14 de MET (CBNPC METex14). Sur la base des données d'efficacités des inhibiteurs de MET dans les CBNPC METex14 (≈ 50 % de taux de réponse), nous avons émis l'hypothèse de la présence de mécanismes primaires de résistance. Nos données ont permis d'identifier la voie de signalisation PI3K-AKT dans la résistance aux inhibiteurs tyrosine kinase de MET (ITK MET). Par ailleurs, nous avons proposé une stratégie thérapeutique afin de surmonter ces résistances.

Dans un second temps, nous avons identifié un patient porteur d'un cholangiocarcinome avec une fusion de MET. Un traitement par ITK MET a été introduit et a permis l'obtention d'une réponse importante, malheureusement de courte durée. La recherche d'un mécanisme de résistance acquis sous ITK MET nous a conduit à identifier une mutation du domaine kinase de MET.

Enfin, un dernier travail a porté sur la faisabilité et l'utilité dans la pratique clinique de la recherche des mécanismes de résistance dans les CBNPC porteurs d'un réarrangement du gène ALK (CBNPC ALK+). En établissant une cohorte de patients ayant présenté une progression sous ITK ALK, nous avons identifié plusieurs tumeurs pour lesquelles un mécanisme de résistance a pu être identifié. De plus, l'ensemble des patients ayant reçu un ITK ALK, adapté au mécanisme de résistance identifié, avait présenté une réponse. Ces travaux ont ainsi démontré que dans les CBNPC ALK+ la recherche des mécanismes de résistance était possible et pouvait influencer la décision thérapeutique.
# 1 Les cancers bronchopulmonaire avec addiction oncogénique

## 1.1 Généralités sur les cancers pulmonaires

En 2018, environ 50 000 nouveaux cas de cancers bronchiques ont été diagnostiqués en France. Les cancers du poumon se situent au quatrième rang des cancers incidents, tous sexes confondus (deuxième rang chez l'homme et quatrième rang chez la femme). Environ 85 % des cancers pulmonaires diagnostiqués sont des CBNPC. Avec environ 31 000 décès par an en France, les cancers bronchiques sont la première cause de mortalité par cancer. Durant la période 1990-2018, la mortalité par cancers du poumon a progressivement diminué chez l'homme (- 0,3 %/an) mais a crû chez la femme (+ 5,3 %/an) du fait d'une augmentation du tabagisme (cf. référentiel de l'institut national du cancer).

Malgré les progrès thérapeutiques récents (thérapies ciblées et immunothérapies), le taux de survie à cinq ans, tous stades confondus, est inférieur à 20 % (Planchard et al. 2018).

L'identification d'altérations moléculaires sur des oncogènes a profondément modifié la prise en charge des patients.

L'analyse moléculaire représente une part prépondérante de la prise en charge des patients atteints d'un CBNPC. On estime à environ 60 % les tumeurs porteuses d'une altération moléculaire impliquant un oncogène dont plus de la moitié sont actionnables par une thérapie (Planchard et al. 2018) (Figure 1).

Diverses techniques sont régulièrement utilisées pour la détection de anomalies moléculaires telles que le séquençage de nouvelle génération (NGS), l'hybridation *in situ* en fluorescence (FISH), la puce d'hybridation génomique comparative (CGH) (Gregg, Li et Yoneda 2019). On distingue trois grandes familles d'anomalies moléculaires : les mutations dont le gène KRAS (*V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog*) est le plus fréquemment altéré dans les cancers du poumon (33 %), suivi par le gène EGFR dans environ 10 à 15 % des cas et par les gènes MET, BRAF (*b-Rapidly Accelerated Fibrosarcoma*), HER2, PIK3CA (*phosphatidylinositol-3,4-bisphosphate kinase*) dans 1 à 3 % des cas (Figure 1). Les mutations peuvent être des substitutions (remplacement d'un nucléotide), des délétions (perte d'une séquence nucléotidique) ou des insertions (ajout d'une séquence nucléotidique). Les
mutations sont le plus souvent retrouvées au niveau du domaine kinase de la protéine (ex : EGFRdel19, PIK3CAH1044R, BRAFV600E) ou au niveau d'un site régulateur (ex : PIK3CAE544K, METex14).

Les translocations ou réarrangements correspondent à des échanges de matériels chromosomiques entre deux chromosomes non homologues. Dans les CBNPC, plusieurs gènes peuvent être impliqués dans des mécanismes de réarrangement tels que les gènes ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase), ROS1 (ROS Proto-Oncogene 1) et NTRK (Neurotrophic tyrosine kinase).

Les amplifications se définissent par une accumulation surnuméraire d'un segment chromosomique. Elles ont pour conséquence une augmentation du nombre de copies d'un gène conduisant à une surexpression du transcrit de ce gène. Parmi les gènes les plus fréquemment amplifiés dans les CNBPC, on retrouve HER2, FGFR (Fibroblast growth factor receptor) et MET.

À ce jour, une majorité des altérations moléculaires responsables d'une addiction oncogénique dans les CBNPC sont actionnables par une thérapie ciblée. Nous disposons de plus d'une vingtaine de molécules disponibles pour la prise en charge des CBNPC et leur nombre ne cesse de croître chaque année (Figure 1).

Nous nous intéresserons aux différentes altérations responsables d'une addiction oncogénique décrites dans les CBNPC.
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1 : Les altérations moléculaires responsables d'une addiction oncogénique dans les CBNPC et les différentes thérapies ciblées</figcaption></figure>
## 1.2 Prise en charge des CBNPC avec addiction oncogénique

### 1.2.1 Les outils thérapeutiques disponibles

Il existe trois options thérapeutiques disponibles dans la prise en charge des CBNPC métastatiques avec une addiction oncogénique : les thérapies ciblées (ITK, ISTK et Ac monoclonaux), la chimiothérapie et l'immunothérapie.

Les ITK, qui constituent la majorité des thérapies ciblées utilisées dans les CBNPC avec addiction oncogénique, sont rapidement devenus le traitement standard en première (voire deuxième) ligne des CBNPC avec addiction oncogénique ciblable, compte tenu de leur supériorité par rapport à la chimiothérapie. Les ITK appartiennent à une famille de petites molécules capables d'inhiber les récepteurs tyrosine kinase (RTK) en ciblant le domaine kinase du récepteur, bloquant ainsi la phosphorylation de la protéine et l'activation des voies de signalisation en aval (Hubbard 2002).

On distingue deux grandes sous-familles : les inhibiteurs dits « irréversibles » qui ont la particularité de former des liaisons covalentes avec le domaine kinase et les inhibiteurs réversibles. Les ITK sont également divisés en deux groupes selon leur mode de liaison : les inhibiteurs compétitifs (types I et II) et allostériques (types III et IV) (Roskoski 2015). Les inhibiteurs compétitifs se fixent au niveau du site de liaison à l'ATP et entrent directement en compétition avec ce dernier. Les inhibiteurs de type I occupent la poche de l'ATP dans une conformation active appelée « DFG-in », tandis que les inhibiteurs de type II occupent la poche de l'ATP dans une conformation inactive appelée « DFG-out » (Zhang, Yang et Gray 2009). Les inhibiteurs allostériques vont venir se fixer à un site allostérique différent du site de fixation de l'ATP. Les inhibiteurs de type III se fixent au niveau d'un site proche de la poche de l'ATP tandis que les inhibiteurs de type IV se fixent sur un site éloigné (Zhang, Yang et Gray 2009).

La chimiothérapie, est actuellement recommandée en 1ère ligne pour les patients porteurs d'un CBNPC, sans addiction oncogénique, et présentant une contre-indication à l'immunothérapie (D. Planchard et al. 2018). Le protocole de chimiothérapie de référence repose sur une combinaison associant une chimiothérapie de 3ème génération (paclitaxel, gemcitabine, docetaxel, vinorelbine) et un sel de platine (carboplatin, cisplatine) (Schiller et
al. 2002). Une méta analyse de 2005 a montré que le doublet de chimiothérapie (3ème
génération + sel de platine) est associé à une réduction du risque de décès de 22%
("Chemotherapy and Supportive Care versus Supportive Care Alone for Advanced Non-Small
Cell Lung Cancer" 2010). En présence de certains oncogènes driver, la chimiothérapie a
rapidement montré son infériorité par rapport aux ITK. Dès lors, dans la prise en charge des
CBNPC avec une addiction oncogénique, la chimiothérapie est reléguée en deuxième ou
troisième ligne thérapeutique (Girard 2015).

L'immunothérapie a profondément modifié la prise en charge des CBNPC en situation métastatique. Les molécules de référence actuellement recommandées, dans la prise en charge des CBNPC, sont des anticorps monoclonaux ciblant des points de contrôle de l'immunité tels que les anti PD-1/PDL-1 (Programme Death 1/Ligand) et les anti CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)(D. Planchard et al. 2018). La place de l'immunothérapie dépend essentiellement de 2 différents biomarqueurs, le score d'expression de PDL-1 de la tumeur et sa charge mutationnelle. En présence d'un CBNPC avec un score PDL-1 > 50%, le traitement recommandé en 1ère ligne métastatique repose sur l'association chimiothérapie plus pembrolizumab (anti PD-1). Cette combinaison a été validée, suite aux résultats de l'essai KEYNOTE 024 comparant la chimiothérapie associée au pembrolizumab versus une chimiothérapie seule. La combinaison chimiothérapie plus pembrolizumab a démontré un bénéfice net en termes de taux de réponse objectif (45 % contre 28 %), de survie sans progression (10.3 mois contre 6.0 mois) et de survie globale (HR 0,6, 95 % IC 0,41-0,89, P=0,005) (Reck et al. 2016). En l'absence d'information concernant le statut PDL-1, plusieurs options thérapeutiques sont proposées. En cas de charge mutationnelle élevée (> 10 mutations par méga-base), la combinaison nivolumab (anti PD1) plus ipilimumab (anti CTLA-4) a démontré, dans l'essai CHECKMATE 227, sa supériorité face à la chimiothérapie avec une survie sans progression supérieure (HR 0, 58, 97,5% IC 0,41-0, 81, P<0,001) (Boumber 2018). Concernant les autres possibilités thérapeutiques, pour les patients porteurs d'un adénocarcinome pulmonaire, la combinaison atezolizumab (anti PD-L1), bevacizumab (anti VEGFR) plus chimiothérapie a démontré, dans l'essai IMPOWER150, sa supériorité par rapport au protocole de chimiothérapie standard avec un bénéfice net de survie sans progression (8,3 contre 6,8 mois) et de survie globale (19,9 contre 14,9mois). Par ailleurs, pour les patients porteurs d'un adénocarcinome pulmonaire métastatique, l'essai de
phase 3 IMPOWER130 a démontré l'efficacité de la combinaison atezolizumab (anti PD-L1) plus nab-placitaxel, suivie d'une maintenance par atezolizumab plus pemetrexed, par rapport à la chimiothérapie standard, avec un gain de survie globale (18,6 contre 13,9 mois) et de survie sans progression (7.0 versus 5.5 mois).

IMPOWER130 est un essai de phase 3 ayant inclus des patients porteurs d'un adénocarcinome pulmonaire métastatique. Dans cet essai, les patients étaient randomisés soit pour recevoir 4 à 6 cycles d'atezolizumab plus du nab-placitaxel suivie d'une maintenance par atezolizumab plus pemetrexed, soit de la chimiothérapie standard ("IMpower132: Efficacy of Atezolizumab (Atezo) + Carboplatin (Carbo)/Cisplatin (Cis) + Pemetrexed (Pem) as 1L Treatment in Key Subgroups with Stage I... | OncologyPRO" n.d.). Cet essai a démontré un gain en termes de survie globale (18.6 contre 13.9 mois) et de survie sans progression PFS (7.0 versus 5.5 mois) dans le bras chimiothérapie plus immunothérapie établissant ainsi une nouvelle option thérapeutique pour ces patients.

Concernant les patients porteurs d'un carcinome épidermoïde pulmonaire, l'étude KEYNOTE-407 a évalué une stratégie thérapeutique reposant sur 4 cycles d'une combinaison carboplatine plus placitaxel ou nab-placitaxel en association avec le pembrolizumab versus chimiothérapie standard. Une maintenance par pembrolizumab ou placebo était également proposée. La combinaison chimiothérapie plus pembrolizumab a démontré une plus grande efficacité en termes de taux de réponse (58.4% contre 35.0%) et de survie globale (15,9 contre 11,3 mois) (Paz-Ares et al. 2018). Toutefois, en présence d'un oncogène driver, la place de l'immunothérapie reste à définir (Mhanna et al. 2019). Récemment, une étude multicentrique, rétrospective, menée sur 551 patients porteurs d'un CBNPC avec une altération moléculaire responsable d'une addiction oncogénique, a révélé une efficacité variable de l'immunothérapie selon le sous-groupe moléculaire. L'immunothérapie était associée à un taux de réponse de 26 % en présence d'une mutation de *KRAS* alors que ce taux était de 0 % en présence d'une altération ALK (Mazieres et al. 2019). Malgré le caractère rétrospectif de cette étude, l'immunothérapie est à ce jour considérée comme une option en deuxième ou troisième ligne chez les patients porteurs d'un CBNPC avec driver oncogénique.
### 1.2.2 Les CBNPC avec mutation EGFR

#### 1.2.2.1 Découverte des mutations EGFR

Le récepteur EGFR, codé par le gène *EGFR*, est une glycoprotéine transmembranaire, constituée d'un domaine extracellulaire, composé notamment du domaine liaison au ligand (EGF), et d'une partie intracellulaire où se situe le domaine tyrosine kinase. EGFR appartient à une famille de quatre récepteurs tyrosine kinases apparentés (ERBB) et agit comme un médiateur clé dans les voies de signalisation cellulaire impliquant la prolifération cellulaire, l'apoptose, l'angiogenèse et l'invasion (Ayati et al. 2020).

Les premières mutations du gène *EGFR* dans les CBNPC ont été décrites en 2004 (Lynch et al. 2004). Ces mutations sont localisées dans le domaine kinase EGFR (codé par les exons 18 et 21). Les délétions dans l'exon 19 et la substitution L858R dans l'exon 21 représentent plus de 90 % de ces altérations. De manière plus rare, on retrouve des insertions dans l'exon 20 dans 5 % des cas et des mutations T790M (exon 20) et L861Q (exon 21) dans 2 % des cas (Ayati et al. 2020). Les mutations du domaine kinase EGFR sont responsables d'une addiction oncogénique rendant possible son inhibition par des thérapies ciblées.

En Occident, les mutations *EGFR* sont détectées chez environ 10 à 15 % des patients atteints de CBNPC. Ce taux de détection atteint 50 % chez les patients asiatiques porteurs d'un CBNPC (Shi et al. 2014). Elles sont retrouvées majoritairement chez des patients non-fumeurs, d'âge jeune et de sexe féminin. Le type histologique le plus fréquent est l'adénocarcinome (Tsao et al. 2006).

#### 1.2.2.2 Place des inhibiteurs tyrosines kinase EGFR dans la prise en charge des CBNPC mutés EGFR

La prise en charge des CBNPC EGFR mutés a été révolutionnée par l'arrivée des ITK EGFR. Les ITK EGFR ont d'abord été évalués dans des populations non sélectionnées atteintes d'un CBNPC réfractaire à la chimiothérapie. Malgré des résultats peu spectaculaires, les ITK EGFR ont obtenu une autorisation de mise sur le marché (AMM) en deuxième et troisième lignes. L'identification des mutations *EGFR* a permis de mieux sélectionner les patients et, ainsi, de démontrer la supériorité des ITK EGFR par rapport à la chimiothérapie dans une population choisie.
Par la suite, les ITK EGFR ont rapidement obtenu une AMM en première ligne. La découverte des mutations de résistance conduisant au développement des ITK de deuxième et troisième générations, plus performants que leurs ainés, a amené à réfléchir sur la place de chaque inhibiteur dans la prise en charge des CBNPC EGFR mutés (Girard et al. 2020).

À ce jour cinq molécules sont disponibles dans le cadre du traitement des CBNPC EGFR mutés (Figure 1). Le géfitinib et l'erlotinib, sont des inhibiteurs spécifiques de l'EGFR, de première génération, qui se fixent de façon réversible au récepteur muté. Le géfitinib et l'erlotinib ont démontré leur supériorité par rapport à un doublet de chimiothérapie dans les études de phase III IPASS, OPTIMAL et EURTAC (Rosell et al. 2012 ; Mok et al. 2009 ; Zhou et al. 2011). Avec un gain en survie sans progression (9.7-13.1 contre 4.6-5.2 mois) et des taux de réponse d'environ 70 à 80 % dans le sous-groupe de patients mutés EGFR, le géfitinib et l'erlotinib disposent d'une AMM dans les CBNPC EGFR mutés en première ligne, respectivement obtenues en 2009 et 2012.

L'afatinib et le dacomitinib sont des ITK de deuxième génération qui se lient à EGFR de façon irréversible. L'afatinib a obtenu une AMM en 2014 suite aux résultats de l'essai LUX-Lung 3 l'ayant comparé à un doublet de chimiothérapie (Cisplatine-Pemetrexed). L'afatinib a démontré sa supériorité en matière de taux de réponse (56% versus 23%) et de PFS (13,6 mois versus 6,9 mois). Par la suite, dans l'étude LUX-Lung 7, l'afatinib a démontré son équivalence en première ligne par rapport au géfitinib en matière de survie globale (27,9 versus 24,5 mois) (Paz-Ares et al. 2017). Le dacomitinib a également prouvé son équivalence face au géfitinib en première ligne dans l'étude ARCHER (Wu et al. 2017). Le dacomitinib a obtenu une AMM dans les CBNPC EGFR mutés en première ligne en 2019.

L'osimertinib est un ITK EGFR de troisième génération développé afin de cibler la mutation de résistance EGFR-T790M. L'osimertinib était initialement recommandé en deuxième ligne et en cas de survenue d'une mutation EGFR-T790M (Soria et al. 2018 ; Mok et al. 2017). L'AMM a récemment changé suite à l'étude FLAURA qui, comparant l'osimertinib à des inhibiteurs de première génération en première ligne métastatique, a démontré un bénéfice net en termes de survie globale et sans récidive en faveur de l'inhibiteur de troisième génération (18). Ce dernier a obtenu une AMM en première ligne thérapeutique. Par ailleurs, l'osimertinib devrait bénéficier prochainement d'une AMM en adjuvant chez des patients porteurs d'un CBNPC EGFR muté stade II et III réséqué, compte tenu des résultats de l'essai ADAURA révélant une réduction de 83 % du risque de récidive à deux ans (Wu et al. 2020).
### 1.2.3 Les CBNPC avec réarrangement ALK

#### 1.2.3.1 Découverte des réarrangements ALK et caractérisation clinique

Le gène ALK est situé sur le bras court du chromosome 2 (2p23), codant, pour la protéine ALK, un RTK transmembranaire appartenant à la superfamille des récepteurs de l'insuline (Soda et al. n. d.). La principale altération du gène ALK identifiée dans les cancers du poumon est le réarrangement. Ce dernier résulte de la translocation entre deux gènes conduisant à la formation d'une protéine chimérique anormalement activée. Dans les CBNPC, le réarrangement du gène ALK a été décrit pour la première fois en 2007 (Soda et al. n. d.). Il s'agissait du réarrangement EML4/ALK (Echinoderm microtubule-associated protein like 4) qui représente le variant le plus fréquent dans les CBNPC (90 % des altérations ALK) (Du et al. 2018). Le réarrangement EML4/ALK résulte d'une fusion entre la partie N-terminale du gène EML4 qui code pour le domaine coiled coil et la région c-terminale du gène ALK codant pour le domaine tyrosine kinase. Il en résulte une protéine de fusion EML4/ALK, présentant une activation constitutive de l'activité kinase, indépendante de la fixation d'un ligand (Lantuejoul et al. 2012). La protéine de fusion EML4-ALK active plusieurs voies de signalisation intracellulaires telles que la voie des MAPK (Mitogen activated protein kinase) et PI3K-AKT/mTOR (mammalian Target Of Rapamycin) (Soda et al. n. d.). De nombreux autres gènes partenaires ont été identifiés, tels que les KIF5 (Kinesin-related protein 5), KLC1 (Kinesin light chain 1), TGF (Transforming growth factor), PTPN3 (Protein tyrosine phosphatase, non receptor type 3), conduisant également à l'activation du domaine kinase de la protéine ALK (Du et al. 2018). Les réarrangements du gène ALK représentent 5 à 6 % des cas de CBNPC (CBNPC ALK+).

Concernant les caractéristiques cliniques, l'âge médian des patients atteints d'un CBNPC ALK+ est de 55 ans. Ils sont majoritairement non fumeurs. Le sexe ne semble pas influencer la survenue de cette altération (Kang et al. 2014).

Le diagnostic des réarrangements ALK repose sur différentes techniques telles que l'immunohistochimie, la RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) ou l'hybridation in situ par fluorescence (FISH) (Hofman 2017).
### 1.2.3.2 Place des inhibiteurs ALK dans le traitement des cancers bronchiques non à petites cellules métastatiques avec réarrangement ALK

Le traitement des CBNPC ALK+ repose principalement sur l'utilisation d'ITK ALK. L'émergence de mécanismes de résistance, majoritairement des mutations du domaine kinase ALK, est la principale cause d'échec thérapeutique. À ce jour, on compte plus d'une quinzaine de mutations de résistance du gène ALK identifiées dont les plus fréquentes sont les mutations ALK C1156Y, L1196M et G1202R. Le développement des inhibiteurs de nouvelle génération est, notamment, basé sur la capacité à surmonter ces mutations de résistance.

À ce jour, cinq ITK ALK disposent d'une AMM dans la prise en charge des CBNPC ALK+ (Figure 1) : le crizotinib, le céritinib, l'alectinib, le brigatinib et le lorlatinib.

Le crizotinib est un inhibiteur de type I, qui cible les protéines MET, ALK et ROS1 (Zou et al. 2007). Il est le premier inhibiteur à avoir obtenu une AMM en 2012 dans la prise en charge des CBNPC ALK+. L'approbation du crizotinib repose sur les résultats de l'étude de phase I PROFILE 1001. Contrairement au développement des ITK EGFR, le crizotinib a, d'emblée, été évalué chez des patients sélectionnés porteurs d'un CBNPC ALK+ prétraité par chimiothérapie. Les taux de réponse obtenus ont été de 60,8 % avec une médiane de survie sans progression de 9,7 mois (Camidge et al. 2012). Ces résultats ont été validés par l'étude de phase II PROFILE 1005 dans laquelle un taux de réponse de 59,8 % et une médiane de survie de 8,1 mois ont été obtenus (D.-W. Kim et al. 2012). Enfin, le crizotinib a montré sa supériorité par rapport à la chimiothérapie à base de sels de platine dans les études de phase III, PROFILE 1007 puis 1014, avec une survie sans progression (10,9 mois versus 7,0 mois, p < 0,001) et un taux de réponse (74 % versus 45 %) qui ont permis l'obtention de l'AMM en première ligne chez les patients naïfs de traitement (Tsang Shaw et al. 2016 ; Solomon et al. 2014). Toutefois, les limites du crizotinib ont rapidement émergé. En effet, il possède une diffusion cérébrale faible conduisant à une progression cérébrale fréquente. Par ailleurs, une exposition prolongée au crizotinib conduit à l'émergence de mutations kinase ALK dans environ 30 % des cas, ce qui entraine une perte de son efficacité (Dagogo-Jack et Shaw 2016 ; Ng et Camidge 2016).
Le céritinib est un ITK de deuxième génération, ciblant les protéines ALK, IGF-1R (Insulin growth factor receptor 1), INSR (Insulin receptor precursor), STK22D (Serine/threonine kinase 22D) et FLT3 (fms like tyrosine kinase 3), développé afin de surmonter les résistances induites par le crizotinib telles que les mutations ALK L1196M, G1269A et I1171T (Fontana et al. 2015). Le céritinib dispose d'un AMM en première ligne dans la prise en charge des CBNPC ALK+. Il a été évalué en première ligne en comparaison avec la chimiothérapie dans le cadre de l'étude ASCEND-4. La médiane de survie sans progression était supérieure dans le bras traité par céritinib (16,6 versus 8,1 mois) avec un taux de réponse plus élevé (72,5 % versus 26,7 %) (Soria et al. 2017). La même année, le céritinib a été évalué chez des patients réfractaires au crizotinib. Le taux de réponse obtenu était de 56 % avec une survie sans progression supérieure en faveur du céritinib par rapport à la chimiothérapie (5,4 mois versus 1,6 mois, p < 0,001) (Tsang Shaw et al. 2017). Le céritinib a obtenu une AMM en première ligne en 2018. L'exposition prolongée au céritinib conduit à l'émergence de résistance dont, notamment, les secondes mutations ALK G1202R, V1180L et C1156Y (Gainor et al. 2016).

L'alectinib est un ITK ALK de deuxième génération ciblant le gène ALK. L'alectinib a été développé afin de surmonter les mutations de résistance ALK L1196M, C1156Y et F1174L (Okada et al. 2019). L'alectinib a été évalué chez les patients prétraités par crizotinib et naïfs de traitement dans le cadre de l'essai NP28763 avec un taux de réponse de 50 % et une médiane de survie sans progression de 8,9 mois. En 2017, l'alectinib a, dans un premier temps, obtenu l'AMM en deuxième ligne après échec du crizotinib dans les CBNPC ALK+ (Tsang Shaw et al. 2016). Par la suite, l'étude ALEX a comparé l'alectinib et le crizotinib en première ligne. L'alectinib a démontré sa supériorité face au crizotinib avec une médiane de survie sans progression de 25,7 mois versus 10,4 mois (p < 0,001) (Peters et al. 2017). Comparé au crizotinib, l'alectinib est caractérisé par un taux important de réponse intracérébrale (81 % versus 50%) et une durée médiane de réponse intracrânienne de 17,3 mois versus 5,5 mois. Les mécanismes de résistance émergeants après exposition à l'alectinib sont les mutations ALK G1202R, L1196M et V1180L (Gainor et al. 2016).

Le brigatinib est un ITK de deuxième génération ciblant les protéines ALK, ROS1 et EGFR. Il a été développé afin de surmonter les mutations de résistance C1156Y, F1174L, L1196M et G1202R (Gainor et al. 2016). Le brigatinib été évalué dans une étude de phase I/II chez des patients prétraités par ITK ALK et naïfs de traitement (Gettinger et al. 2016). Les taux
de réponse étaient de respectivement 72 % et 100 %. L'étude de phase II du brigatinib (ALTA) a examiné 2 dosages, 90 et 180 mg (D.-W. Kim et al. 2017). L'efficacité du brigatinib était dose-dépendante avec une médiane de survie sans progression de 12,9 mois pour le bras 180 mg et de 9,2 mois pour le bras 90 mg. Le brigatinib possède une AMM pour les CBNPC ALK+ prétraités par crizotinib. Une étude de phase III a comparé le brigatinib avec le crizotinib en première ligne chez des patients porteurs d'un CBNPC ALK+ (Camidge et al. 2018). Le taux de survie sans progression à 12 mois était de 67% dans le bras brigatinib contre 43% dans le bras crizotinib. Les principaux mécanismes de résistance émergeants sous brigatinib sont les mutations ALK E1210K et G1202R (Gainor et al. 2016).

Le lorlatinib est un ITK de troisième génération ciblant les protéines ALK et ROS1. Il a été développé afin de surmonter les mutations ALK G1202R, L1196M, G1269A, C1156Y, F1174L et S1206Y (Zou et al. 2015a). Le lorlatinib a présenté des signes d'activité intéressants chez des patients prétraités par un ou plusieurs ITK ALK avec des taux de réponse globale allant de 17 à 40 % selon l'ITK ALK reçu préalablement. (Felip Font et al. 2017). Plus récemment, une étude de phase III a comparé le lorlatinib avec le crizotinib en première ligne chez des patients porteurs d'un CBNPC ALK+. Le lorlatinib a démontré sa supériorité avec un taux de patients n'ayant pas récidivé à 1 an de 78% versus 39% dans le groupe crizotinib (Alice T. Shaw et al. 2020).

### 1.2.4 Les autres altérations moléculaires dans les CBNPC

Outre les mutations EGFR et les réarrangements ALK, il existe d'autres altérations pour lesquelles des thérapies ciblées ont été évaluées dont les fusions des gènes ROS1, NTRK et RET (Rearranged during transfection) ainsi que les mutations des gènes BRAF, KRAS (KRASG12C), HER2 et MET (METex14) (qui feront l'objet d'une partie spécifique du chapitre 4 « Les altérations de MET dans le cancer ») (Figure 1).

La protéine ROS1 est un RTK appartenant à la superfamille des récepteurs à insuline à l'instar du récepteur ALK. Les fusions du gène ROS1 constituent environ 1 à 2 % des CBNPC (Davies et Doebele 2013 ; Zhu et al. 2015). Il existe plus de 26 gènes identifiés comme partenaires de fusion de ROS1, dont les plus fréquents sont CD74, SLC34A2 et SDC4 (Ou et
Nagasaka 2020). Les fusions de *ROS1* sont plus fréquemment observables chez les femmes jeunes, peu ou non fumeuses et d'origine asiatique (Zhu *et al.* 2015). Plusieurs études ont été menées avec des ITK préalablement évalués dans les CBNPC ALK+ tels que le crizotinib, le céritinib et le lorlatinib avec des taux de réponse aux alentours de 60 % (Tsang Shaw *et al.* 2019 ; Cho *et al.* 2017 ; Tsang Shaw *et al.* 2017). Les résultats les plus prometteurs ont été obtenus dans les essais de phase II STARTRK-2 et TRIDENT-1 ayant étudié respectivement l'entrectinib et le reprotectinib, des inhibiteurs ALK/ROS1/TRK avec des taux de réponse aux alentours de 80 % (Drilon, Siena *et al.* 2017 ; Cho *et al.* 2019).

Les fusions du gène *NTRK* représentent moins de 1 % des CBNPC (Cocco, Scaltriti et Drilon 2018). Néanmoins, elles ont été décrites dans de nombreux cancers tels que les cancers ORL, les sarcomes, les cancers thyroïdiens. À ce jour, deux ITK ont été évalués dans la prise en charge des CBNPC avec fusion du NTRK : l'entrectinib et le larotrectinib. Le larotrectinib a, notamment, été examiné dans une étude de phase ½ ayant inclus 55 patients dont quatre porteurs d'un CBNPC avec fusion du NTRK avec un taux de réponse de 75 % (Drilon *et al.* 2018).

Les fusions du gène *RET* concernant 1 à 2 % des patients porteurs d'un CBNPC. Elles touchent principalement les patients jeunes et non fumeurs. Les essais évaluant des inhibiteurs de RET multikinases (cabozantinib, lenvatinib et sorafenib) ont présenté des résultats décevants avec des taux de réponse évalués entre 0 et 28 % (Drilon *et al.* 2016 ; Horiike *et al.* 2016 ; Hida *et al.* 2019). Toutefois, récemment, deux inhibiteurs spécifiques du RET, le selpercatinib et le pralsetinib, évalués dans des essais de phase I/II, ont révélé des taux de réponse de respectivement 68 et 56 % (Solomon *et al.* 2020 ; Gainor *et al.* 2019 ; Drilon *et al.* 2020).

Les protéines RAS, sont de petites GTPases de 21 kDa (comportant quatre isoformes *HRAS*, *NRAS*, *KRAS4A* et *KRAS4B*) codées par trois gènes distincts *KRAS* (Kirsten RAS chromosome 12p12.1), *HRAS* (Harvey RAS, chromosome 11p15.5) et *NRAS* (Neuroblastoma RAS, chromosome 1p13.2). Les altérations du gène *KRAS* sont retrouvées dans approximativement 20 à 25% des CBNPC en Occident et dans 10 à 15% des cas en Asie. Il s'agit de l'altération moléculaire potentiellement actionnable la plus fréquente des CBNPC. Les mutations *KRAS* affectent principalement les codons 12 et 13 situés dans l'exon 2 au niveau
du site de liaison au GTP (Pylayeva-Gupta, Grabocka, and Bar-Sagi 2011). Parmi les CBNPC KRAS mutés, le variant le plus fréquemment identifié est KRAS-G12C dans environ 39-40% (13 % des CBNPC totaux), suivie de KRAS-G12V dans 18-21% et KRAS-G12D dans 17-18% (Hong et al. 2020). Les mutations KRAS ont longtemps été considéré comme non-actionnables compte tenu de la très haute affinité des protéines RAS pour le GTP et de l'abondance de ce dernier dans le cytoplasme (P. Liu, Wang, and Li 2019). L'arrivée du sotorasib (AMG-510), pourrait modifier la prise en charge des patients porteurs d'un CBNPC KRAS-G12C. En effet, cet inhibiteur, développé pour former une liaison covalente irréversible avec le résidu de cystéine de la forme mutée de KRAS, est un inhibiteur spécifique de la mutation KRASG12C qui a montré, dans un essai de phase I, un taux de réponse de 32,2 % et un contrôle de la maladie de 88,1 % (Hong et al. 2020)(P. Liu, Wang, and Li 2019).

Les mutations du gène *BRAF* représentent 2 % des CBNPC (Planchard *et al.* 2017). Il s'agit essentiellement de la mutation BRAF V600E localisée dans l'exon 15 du gène BRAF (codant pour le domaine kinase). À l'instar de ce qui est proposé dans la prise en charge des mélanomes BRAV V600E-mutés, la combinaison du dabrafenib, un inhibiteur de RAF, et du tramétinib, un inhibiteur de MEK (*Mitogen-activated extracellular signal-regulated protein kinase*), a été évaluée chez 85 patients porteurs d'un CBNPC BRAF V600E avec un taux de réponse de 64 % (Planchard *et al.* 2017).

Les altérations du gène *HER2* sont fréquentes dans les CBNPC avec des amplifications et des mutations (majoritairement de l'exon 20) retrouvées dans respectivement 4 % et 1 % des cas. Bien que de nombreuses molécules aient été développées afin de cibler la protéine HER2, elles n'ont pas prouvé d'efficacité dans les CBNPC avec une altération de *HER2*. La sélection des patients inclus peut expliquer cela. En effet, dans de nombreuses études, la présence d'une surexpression de la protéine HER2 (identifiée dans 30 % des CBNPC) en l'absence d'anomalie du gène était autorisée. Néanmoins, quatre essais ont spécifiquement sélectionné des patients porteurs d'altérations du gène *HER2*, et malheureusement là encore, les résultats étaient décevants. Ainsi, le dacomitinib a obtenu des taux de réponse de 12 % pour les patients porteurs d'un CBNCP *HER2* muté et de 0 % pour les patients porteurs d'un CBNCP *HER2* amplifié (Kris et al. 2015). L'afatinib quant à lui a obtenu, dans l'étude NICHE de phase II, un taux de réponse de 7 %.
Néanmoins, les résultats concernant les anticorps conjugués ciblant HER2 sont prometteurs. Le TDM-1, un anticorps couplant un anti HER2 (le trastuzumab) et un inhibiteur des microtubules (l'emtansine) a été évalué chez 18 patients porteurs d'un CBNPC avec mutation HER2. Le TDM-1 a permis d'obtenir un taux de réponse de 44 % avec une survie sans progression de cinq mois (Li et al. 2018). Récemment, dans l'essai de phase II Destiny Lung 01, le T-DXd, un anticorps conjugué couplant le trastuzumab avec un inhibiteur de la topoisomérase I (deruxtecan), a permis d'obtenir un taux de réponse de 61,9 %. Une autorisation temporaire d'utilisation est actuellement octroyée pour le T-DXd dans la prise en charge des CBNPC HER2-mutés (exon 20) (Smit et al. 2020).
# 2 Structure et rôle physiologique du récepteur MET et de son ligand l'HGF

## 2.1 Découverte et structure du récepteur MET

Le récepteur MET (appelé également HGFR) est un RTK qui a été pour la première fois décrit dans une lignée cellulaire humaine d'ostéosarcome (HOS) exposée à un carcinogène, le n-Methyl-n'-nitro-n-nitrosoguanidine (MNNG), auquel il doit sa dénomination (Cooper et al. 1984). L'étude des altérations causées par le carcinogène sur la lignée HOS a permis de mettre en évidence une translocation entre une partie du gène *TPR* (*translocated promoter region*) situé sur le chromosome 1 et le gène *MET* situé sur le chromosome 7. La protéine de fusion TPR-MET générée comporte le domaine d'oligomérisation de la nucléoporine principale du complexe de pore nucléaire TPR couplé au domaine kinase de MET. La partie intracellulaire de la protéine MET, bien que tronquée de son domaine extracellulaire, conserve son ancrage à la membrane *via* le domaine TPR qui provoque la dimérisation et l'activation constitutive du récepteur en l'absence de ligand responsable du caractère oncogénique (Park *et al.* 1987; Giordano *et al.* 1989; Rodrigues et Park 1993).

Le gène *MET* comprend 21 exons et 20 introns pour une longueur totale de 126 kb. Localisé sur le bras long du chromosome 7 q21-q31, le gène *MET* est transcrit sous forme de différents ARN (acide ribonucléique) messagers dont la forme majoritaire est de 8 kb (Lin *et al.* 1998; Duh *et al.* 1997). La traduction de l'ARN messager majoritaire mène à la synthèse d'une protéine immature de 170 kDa. Cette forme immature subira différentes modifications post-traductionnelles incluant la N-glycosylation du domaine extracellulaire (Giordano *et al.* 1989) et un clivage protéolytique par la furine entre la lysine 307 et l'arginine 308 menant à la formation de deux sous-unités, α (chaine extracellulaire de 50 kDa) et β (chaine extracellulaire, transmembranaire et intracellulaire de 145 kDa) (Komada *et al.* 1993). Les chaines α et β sont reliées par un pont disulfure conduisant à l'établissement d'une protéine fonctionnelle de 190 kDa appelée p190MET (Tempest, Stratton et Cooper 1988). Il existe
également un isoforme minoritaire de MET appelé p170MET, issu d'un épissage alternatif de l'ARN messager 8 Kb, non dimérisé, incomplètement glycosylé et constitué de 18 acides aminés supplémentaires dans le domaine extracellulaire (Rubin, Bottaro, and Aaronson 1993).

Sur le plan structurel, le récepteur MET se compose de dix domaines :

- la partie extracellulaire comporte six domaines :

o un domaine SEMA, nommé ainsi car présentant une homologie avec les domaines des sémaphorines, jouant un rôle dans la fixation du ligand (Ma, Maulik, et al. 2003),

o un domaine riche en cystéines appelé PSI (*Plexin Semaphorin Integrin*) de par son homologie avec les domaines des plexines dont la fonction est d'orienter le fragment extracellulaire de MET afin qu'il lie correctement son ligand (Kozlov et al. 2004),

o quatre domaines homologues aux immunoglobulines IPT (*Immunoglobulin-like region in Plexin and Transcription factors*) (Ma, Maulik, et al. 2003) (Figure 2);

- le domaine transmembranaire également appelé hélice transmembranaire relie les parties extracellulaire et intracellulaire ;

- la partie intracellulaire comprend :

o un domaine juxtamembranaire, adjacent à la partie membranaire, qui comporte trois sites essentiels à la régulation du récepteur : la sérine 985, l'acide aspartique 1002 la tyrosine 1003 (Peschard et al. 2004),

o un domaine kinase, qui est responsable de l'activité de la protéine via la phosphorylation des sites tyrosine 1234 et 1235 (Asses et al. 2009),

o un domaine C-Terminal, qui présente les site d'ancrages aux protéines de signalisation d'aval grâce à la phosphorylation des sites tyrosine 1349 et 1356 (Ma, Maulik, et al. 2003).
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2 : Représentation schématique de la structure du récepteur MET et des principaux domaines de régulation et d'activation</figcaption></figure>

## 2.2 Structure et synthèse de l'HGF

Le facteur de croissance hépatocytaire ou Scatter factor (HGF/SF) est le ligand à haute affinité du récepteur MET. Sa découverte a été réalisée dans les années 1980 par deux équipes indépendantes, ce qui explique cette double dénomination. L'HGF/SF a ainsi été identifié comme facteur de croissance des hépatocytes, mais également comme facteur favorisant la migration et la dispersion des cellules épithéliales (Nakamura, Nawa et Ichihara 1984 ; Stoker et al. 1987).
La similitude entre l'HGF et le SF, ainsi que le lien étroit avec le récepteur MET, ont été établis par diverses équipes quelques années plus tard. En 1990, Weider et ses collaborateurs ont, dans un premier temps, purifié les deux molécules (le SF issu de fibroblastes et l'HGF humain issu du placenta) révélant une similarité structurelle (Weidner et al. 1990). En 1991, l'équipe de Naldini a mis en évidence l'augmentation de l'activité kinase de MET après exposition à l'HGF de la lignée d'adénocarcinome gastrique portant une amplification du gène *MET* (GTL16) confirmant ainsi le lien étroit entre l'HGF et MET (Naldini, Weidner, Vigna, Gaudino, Bardelli, Ponzetto *et al.* 1991). La même année, ces auteurs, comparant les réponses biologiques de l'HGF et du SF, ont mis en évidence des réponses similaires de croissance cellulaire, de mobilité et d'invasion. L'interaction du récepteur MET avec l'HGF a également été confirmée par des expériences d'immunoprécipitation (Naldini, Weidner, Vigna, Gaudino, Bardelli, Ponzetto *et al.* 1991).

Le gène *HGF* se compose de 18 exons et de 17 introns et se situe sur le chromosome 7 en position 7q21 (Fukuyama et al. 1991). Synthétisé en une protéine immature (pro HGF), l'HGF est convertie par clivage protéolytique en une glycoprotéine hétérodimérique active de 90 kDa, composée d'une chaine α et d'une chaine β reliées par un pont disulfure (Naldini et al. 1992). Diverses protéines permettant la réalisation de ces clivages, telles que l'antithrombine, l'hepsine ou la kallikréine, ont été identifiées (Kirchhofer et al. 2005 ; Mukai et al. 2008 ; Chen et al. 2013). Sur le plan structurel, la chaine α se compose d'un site de liaison à l'héparine situé sur le domaine N-terminal suivi de quatre domaines kringle (boucles reliées par trois liaisons disulfures intrachaines). La sous-unité β se compose d'un domaine présentant une homologie aux sérines protéases (SPH) mais dénué d'activité catalytique (Stamos et al. 2004) (Figure 3).
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 3 : Représentation schématique de la structure de l'HGF</figcaption></figure>

## 2.3 Rôle physiologique du récepteur MET

De nombreuses fonctions physiologiques de MET ont été identifiées. Au cours de l'embryogénèse, l'expression de MET et de l'HGF fluctue au cours des étapes du développement. Durant la seconde phase du développement embryonnaire, au cours du processus de gastrulation, ), l'expression de MET et de son ligand est concomitante dans le mésoderme (feuillet cellulaire intermédiaire de l'embryon) et l'ectoderme (feuillet externe de l'embryon) témoignant d'un mode d'activation autocrine (Andermarcher, Surani et Gherardi 1996). Pendant l'organogenèse, l'expression de MET et de l'HGF est séparée. MET est exprimé dans les cellules épithéliales de nombreux organes (cœur, reins et poumons) tandis que l'HGF est principalement exprimé par le tissu mésenchymateux témoignant d'un mode d'activation paracrine.

De manière similaire, dans le modèle murin, l'invalidation des gènes *MET* et *HGF* mène à un trouble du développement placentaire conduisant au décès *in utero* précoce (Schmidt *et al.* 1995). Des troubles du développement au niveau du foie et des muscles ont également été observés en raison d'une perturbation dans la migration des myoblastes (Schmidt *et al.* 1995). La mise en place d'un système d'extinction conditionnelle de *MET* via un système CRE/LOX a permis la mise en évidence du rôle de MET dans la formation alvéolaire pulmonaire, des reins et des muscles (Prunotto *et al.* 2004 ; Ishibe *et al.* 2009 ; Calvi *et al.* 2013).
Chez l'adulte, l'expression de MET est retrouvée dans les cellules épithéliales, nerveuses, endothéliales et hématopoïétiques (Prat et al. 1991 ; Bussolino et al. 1992 ; Nishino et al. 1995), tandis que l'HGF est quasi exclusivement exprimé par les cellules du mésenchyme (Stoker et al. 1987).

La voie MET/HGF est impliquée dans la réparation, la régénération et l'homéostasie tissulaire. Ainsi, une augmentation de la quantité d'expression plasmatique de l'HGF a été décrite en cas de lésion tissulaire au niveau cutané, ainsi qu'au niveau du parenchyme hépatique, pulmonaire et rénal (Hamanoue et al. 1992 ; Igawa et al. 1993). Ces travaux ont été complétés par des expériences d'extinction conditionnelle montrant le rôle de MET dans la cicatrisation cutanée et dans la fibrose hépatique et rénale (Marquardt et al. 2012).

L'activation de la voie MET/HGF a également un rôle protecteur au niveau hépatique. Kosai et ses collaborateurs ont étudié l'impact de l'HGF dans la prévention de l'hépatite. Les auteurs ont ainsi démontré que l'injection intrapéritonéale d'HGF, préalablement à l'injection d'anticorps anti-FAS (*Fibroblast associated*, permettait de prévenir de manière drastique la survenue de l'hépatite fulminante (Kosai et al. 1998).
# 3 Activation, voies de signalisation et régulation du récepteur MET

## 3.1 Activation du récepteur MET

À l'instar de nombreux récepteurs à activité tyrosine kinase, la fixation de l'HGF sur MET entraine la dimérisation et la stabilisation de ce dernier, ce qui conduit à une autophosphorylation sur les résidus des tyrosines Y1234 et Y1235 situés dans le domaine kinase du récepteur (Longati et al. 1994 ; Naldini, Weidner, Vigna, Gaudino, Bardelli, Ponzetto Narsimhan et al. 1991). La phosphorylation des résidus des Y1234 et Y1235 entraine une modification conformationnelle de MET conduisant à la phosphorylation du résidu tyrosine 1003, situé dans le domaine de régulation juxtamembranaire, et des tyrosines Y1349 et Y1356, situées dans le domaine d'ancrage. Ces deux derniers résidus constituent, une fois phosphorylés, un site d'ancrage multisubstrats impliqué dans la transduction du signal au récepteur MET (Ponzetto et al. 1994).

Une fois activé, MET recrute des protéines d'aval directement ou indirectement via l'interaction avec des protéines adaptatrices. Les principales protéines adaptatrices de MET sont les GRB2 (factor receptor bound protein 2), SRC (Sarcome proto-oncogene), SHC (sarcoma homology-2-containing), GAB 1 (GRB2-associated binding protein) et CRK (CT regulator kinase) (Ponzetto et al. 1994 ; Pelicci et al. 1995 ; Garcia-Guzman et al. 1999).

MET exerce de nombreuses fonctions cellulaires à travers l'activation de maintes voies de signalisations.
## 3.2 Voies de signalisation du récepteur MET

### 3.2.1 La voie MET-PI3K

#### 3.2.1.1 Les PI3K kinases de classe I

Les PI3K kinases sont une famille d'enzymes réparties en trois classes (I, II, III) dont la classe I est la seule capable de catalyser le phosphatidylinositol (4,5)-biphosphate en phosphatidylinositol (3,4,5)-triphosphate. Les PI3K de classe I sont sous-divisées en deux classes IA et IB. Celles de classe IA sont activées par les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK) tandis que celles de classe IB sont activées par des récepteurs couplés aux protéines (Goncalves, Hopkins et Cantley 2018). Les PI3K de classe I sont des hétérodimères composées d'une des quatre sous-unités catalytiques (p110 α, β, δ ou γ) codées par les gènes PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG et d'une sous-unité régulatrice (p85 α et ses isoformes p55 α et p50 α, p85 β, p55 γ) codées par les gènes PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R5 et PIK3R6. (Engelman, Luo et Cantley 2006; Jean et Kiger 2014; Goncalves, Hopkins et Cantley 2018). Les sous-unités catalytiques se composent de 5 domaines (ABD [adaptor-binding domain], RBD [RAS binding domain], C2, Hélice, Kinase) excepté la sous unité p110 γ qui n'en possède que 4. Le domaine ABD, situé en position N terminal, est impliqué dans l'interaction avec la sous unité régulatrice (Fruman et al. 2017). Le domaine RBD, situé en position N terminale, permet l'interaction avec la protéine effectrice RAS. Le domaine C2 permettant la fixation à la membrane et impliqué dans la régulation de la kinase. Le domaine hélice participe à la régulation négative de l'enzyme enfin le domaine catalytique kinase permet la phosphorylation du substrat (Figure 4).

Les sous-unités p110 α, β, δ interagissent spécifiquement avec les sous-unités régulatrices (p85 α, p55 α, p50 α, p85 β, p55 γ). Les sous-unités régulatrices se composent de domaines SH2 (N-SH2, C-SH2) entourant un domaine inter-SH2 interagissant avec le domaine ABD de la sous-unité catalytique (Figure 4). D'autres interactions participent à la diminution de l'activité basale de la sous-unité catalytique à travers une interaction entre les domaines C2, hélice et kinase et le domaine N-SH2. Les sous-unités catalytiques (p110 α, β) sont ubiquitairement exprimées tandis que les sous-unités p110 δ ou γ sont majoritairement présentes dans les cellules immunitaires.
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 4: Représentation schématique des PI3K de classe I</figcaption></figure>

### 3.2.1.2 Activation et régulation de la voie de signalisation PI3K

De multiples RTK tels que EGFR, PDGFR (Platelet-derived growth factor receptors), IR (Insulin receptor), GCPR (G protein-coupled receptors) ou kinases cytoplasmiques tels que ABL, SRC, JAK (Janus Kinase) et ZAP7 (Zeta-chain-associated protein of 70 kDa) sont capables de recruter le complexe p110 α / p85 α. Il existe trois voies d'activation du complexe p110 α / p85 α par les RTK. Toutes ces voies sont dépendantes de l'activation du RTK via un ligand. La première voie, directe, consiste au recrutement du complexe p110 α / p85 α via l'interaction entre un motif phospho-YXXM (X désignant un acide aminé) du RTK et le domaine N-SH2 de la sous-unité régulatrice p85 α (Mellor *et al.* 2012; Castellano et Downward 2011). La deuxième voie indirecte, consiste en l'interaction entre la p85 α et des protéines adaptatrices telles que les GRB2 se liant préférentiellement sur un motif YXN du RTK. Une fois recruté, GRB2 se liera à la protéine d'échafaudage GAB qui, à son tour, sera capable de se lier à la sous-unité p85 α. La troisième voie consiste en l'activation de PI3K via la protéine RAS. Elle s'effectue également par l'intermédiaire de GRB2 qui, une fois recrutée, est capable de se lier à la protéine SOS qui, à son tour, active RAS. Cette troisième voie interagira directement avec la sous-unité catalytique p110 α (Figure 5).

Cette interaction conduira au recrutement à la membrane du complexe p110 α / p85 α ainsi qu'à la levée de la répression de la sous-unité p110 α afin de permettre la phosphorylation du PIP2 (Phosphatidyl Inositol (4, 5) biPhosphate) en PIP3 (Phosphatidyl Inositol (4, 5)
*triPhosphate*) (Miled et al. 2007). Une fois formé, le PIP3 sera capable de recruter une variété d'effecteurs à la membrane plasmique à travers une interaction entre les domaines SH2 et les domaines PH (*Pleckstrin Homology domain*) de nombreuses tyrosines kinases telles que BTK (*tyrosine kinase de Bruton*), TEC ou AKT (*AKT8 virus oncogene cellular homolog*).

AKT appartient à la famille de serine/threonine kinases AGC (cAMP-dependent, cGMP-dependent and protein kinase C). AKT est composé de trois isoformes (AKT1, AKT2 et AKT3). Préalablement connu sous le nom de PKB, AKT joue un rôle majeur dans de nombreuses fonctions cellulaire tels que la progression du cycle cellulaire, la régulation du métabolisme, la stabilité du génome, la néo angiogénèse, la transcription et la synthèse protéique. (Bos, Rehmann, and Wittinghofer 2007). La liaison AKT sur le PIP3 permettra l'interaction avec d'autres protéines kinases telles que les PDK1 et mTORC2 phosphorylant AKT, respectivement sur la tyrosine 308 et la sérine 473 conduisant à son activation. Une fois activé, AKT contrôle de multiples voies de signalisation impliquées dans la survie cellulaire (FOXO), dans la croissance cellulaire (mTORC1, TSC2), dans l'absorption de glucose et la synthèse de glycogène (GSK3). Outre AKT, d'autres substrats de PIP3 ont été identifiés tels que les protéines RHO et RAC impliquées dans le remodelage du cytosquelette.

La régulation de la voie PI3K est essentiellement assurée par des phosphatases dont PTEN est la plus étudiée. Découverte en 1997 (Li *et al.* 1997), la protéine PTEN (codée par le gène *PTEN* sur le chromosome 10) est une phosphatase dont la fonction principale est de déphosphoryler le PIP3 en PIP2, ce qui en fait la principale protéine de régulation de la voie de signalisation PI3K-AKT (Song, Salmena et Pandolfi 2012). De par son activité régulatrice, *PTEN* est défini comme un gène suppresseur de tumeur (Li et Sun 1997). La protéine PTEN est retrouvée à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau où elle exerce des fonctions distinctes (Bononi et Pinton 2015).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5 : Représentation schématique de la voie de signalisation PI3K</figcaption></figure>

3.2.1.3 Description de la voie MET- PI3K

MET peut directement interagir avec les PI3K kinases de classe I via les domaines SH2 présents au niveau de la sous-unité régulatrice p85 (Ponzetto et al. 1993) . Des expériences de co-immunoprécipitations in vitro ont montré que PI3K de classe I immunoprécipite avec la forme phosphorylée de MET et peut se fixer sur diverses tyrosines : Y1307, Y1313, Y1349 et Y1356 (Graziani, Andrea, Danjela Gramaglia 1991).

Une voie d'interaction indirecte a également été identifiée par l'intermédiaire de différentes protéines partenaires telles que la GAB1 interagissant également avec la sous-unité régulatrice p85, la FAK (Focal adhesion kinase) et RAS (Rat sarcoma) (Liu et al. 2009 ; Ishibe et
al. 2004a; Rodriguez-Viciana et al. 1994). À travers l'activation de la voie PI3K, MET participe à de nombreuses fonctions cellulaires. La voie MET-PI3K-AKT est, notamment, impliquée dans la survie cellulaire *via* l'interaction avec des partenaires pro- et anti-apoptotiques tels que MDM2 (*Murine Double Minute 2*), BAD (*Beclin Bcl-2 antagonist of cell death*), FLIP (*FLICE-like inhibitory protein*) et GSK3β (*Glycogen synthase kinase 3 beta*) (Moumen et al. 2007; Liu 1999; Fan et al. 2001). La voie MET-PI3K est également impliquée dans la migration et l'invasion cellulaires *via* l'interaction avec les protéines RAC1 (RAS-related C3 botulinum toxin substrate 1) et FAK (Ishibe et al. 2004b) et la morphogenèse tissulaire (Niemann et al. 1998).

### 3.2.2 La voie MET-MAPKinase

L'activation de la voie MAPKinase s'effectue principalement par le recrutement de la protéine GRB2 menant au recrutement de la protéine SOS (*Son of sevenless*) puis à l'activation de la protéine membranaire RAS (Figure 6) (Graziani et al. 1993; Fixman et al. 1996). Une fois recrutée, la protéine RAS conduit ainsi au recrutement successif de RAF (*Rapidly accelerated fibrosarcoma*), MEK1/2 et ERK1/2 (*Extracellular signal-regulated kinases*), ce qui permet l'activation de facteurs de transcription appartenant à la famille ETS tels que ETS1 (*Avian erythroblastosis virus E26 homolog-1*) et PEA3 (*Polyoma enhancer activator 3*) (Paumelle et al. 2002; Kherrouche et al. 2015). Une autre voie d'activation s'effectue par l'interaction entre MET et le complexe GAB1 et SHP2 (Maroun, Naujokas et Park 2003). À travers l'activation de la voie MAPKinase, MET participe essentiellement à la prolifération cellulaire, la dispersion et la morphogenèse, la migration et l'invasion (Tulasne et al. 2002; Kherrouche et al. 2015).

### 3.2.3 La voie MET-STAT3

STAT3 (*Signal Transducer and Activator of Transcription 3*) est un facteur de transcription qui induit l'expression d'une variété de gènes impliqués, notamment, dans le phénomène d'inflammation. L'interaction avec MET s'effectue à travers le domaine SH2 de STAT3 (Boccaccio et al. 1998) (Figure 6). La phosphorylation de STAT3 sur la tyrosine Y705 conduit à son homodimérisation et sa translocation vers le noyau (Boccaccio et al. 1998). De manière intéressante, il a été observé que l'endocytose de MET est requise pour maintenir l'activation
de STAT3 après stimulation par l'HGF (Kermorgant et Parker 2008). La voie MET-STAT3 est impliquée dans l'invasion et la croissance sans ancrage (Zhang et al. 2002 ; Cramer et al. 2005).

### 3.2.4 La voie MET-CRK-RAC1

Via le recrutement de GAB1, MET est impliqué dans la migration cellulaire par le recrutement de CRK (CT regulator kinase like-proto oncogene) conduisant à l'activation de RAC1, une petite GTPase qui régule l'organisation du cytosquelette (Lamorte et al. 2002) (Figure 6).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 6 : Représentation schématique des différentes voies de signalisation du récepteur MET</figcaption></figure>
## 3.3 Régulation du récepteur MET

On distingue deux voies de régulation du récepteur MET. Une voie dite dépendante de la fixation de l'HGF et une voie indépendante de cette interaction (Figure 5).

### 3.3.1 Voie de régulation HGF-dépendante

Comme nous l'avons décrit précédemment, la fixation de l'HGF sur le récepteur MET conduit à sa dimérisation, suivie d'une cascade de phosphorylation dont la tyrosine 1003 située dans le domaine juxtamembranaire (Birchmeier et al. 2003).

La tyrosine 1003, une fois phosphorylée, participe au recrutement de la protéine CBL E3 (castias B-lineage lymphoma). Cette interaction s'effectue après reconnaissance du motif DpYR situé dans le domaine juxtamembranaire de MET (Mohapatra et al. 2013). Le récepteur est ensuite ubiquitinylé, internalisé puis transféré dans les endosomes tardifs afin de subir une dégradation lysosomale (Lefebvre et al. 2012).

La protéine CBL est une protéine adaptatrice. Une fois fixée à la tyrosine 1003, elle recrute différents partenaires protéiques dont la CIN85 et les endophilines afin de former un complexe nécessaire au processus d'endocytose de MET (Take et al. 2000). Les endophilines sont des acyltransférase capables de modifier les phospholipides membranaires afin d'induire une courbure négative et une invagination de la membrane plasmique (Petrelli et al. 2002). Les endophilines se lient à la CIN85 via le domaine SH3. Elle interagissent également avec la dynamine et la synaptojanine impliquées dans la voie de l'endocytose clathrine-dépendante (Verstreken et al. 2002; 2003). Une fois internalisé, MET emprunte la voie des endosomes précoces, pour être dégradé (endosome de tri) ou recyclé à la membrane (endosome de recyclage) (Teis et Huber 2003). Dans les endosomes, à l'instar des autres RTK, MET continue à interagir avec différents partenaires tels que les ERK, STAT3 et GRB2 (Joffre et al. 2011 ; Kermorgant et Parker 2008). De manière intéressante, il a été observé, en présence d'une mutation activatrice située dans le domaine kinase de MET (M1268T et D1246N), une accumulation intracellulaire du mutant MET, couplée à un important recyclage de ce dernier à la membrane. Il a également été démontré que l'endocytose du mutant MET est essentielle à la migration cellulaire et que l'utilisation d'un inhibiteur de la dynamine (dynasore) diminue
la prolifération tumorale des cellules exprimant la forme mutée de la protéine MET (Joffre et al. 2011).

Bien que la voie séparant le recyclage et la dégradation de MET ne soit pas complètement élucidée, il semblerait que l'ubiquitination de la protéine joue un rôle essentiel. Il a ainsi été prouvé que la mono-ubiquitination de MET participe au recrutement de la protéine HRS (HGF-regulated tyrosine kinase substrate) nécessaire au transfert de MET de la voie des endosomes précoces vers la voie des endosomes tardifs, appelé également complexe multivésiculaire (Raiborg, Rusten et Stenmark 2003).

Il a également été constaté que la présence d'une mutation au niveau de la tyrosine 1003 de MET conduit à un défaut de recrutement de la protéine CBL et à une diminution de la phosphorylation de l'HRS (Abella et al. 2005). Le protéasome semble également jouer un rôle dans la dégradation du récepteur MET. En effet l'utilisation d'un inhibiteur spécifique du protéasome (MG132) réduit la dégradation de MET après stimulation par l'HGF (Lee et al. 2018).

### 3.3.2 Voie de régulation HGF-indépendante

#### 3.3.2.1 Rôle des métalloprotéases

Les métalloprotéases de la famille ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase), liées à la membrane, sont des enzymes impliquées dans la régulation de MET dont le membre le plus étudié est l'ADAM 10 (Foveau et al. 2009) (Figure 7). Par des expériences d'invalidation génique, il a été démontré que l'expression de l'ADAM 10 est corrélée à l'expression membranaire de MET (Schelter et al. 2010).

L'action des métalloprotéases conduit à la génération de deux fragments ; un fragment libéré dans le milieu extracellulaire appelé MET soluble (ou MET-NTF) et un fragment intra membranaire appelé MET-CTF. Le fragment MET-NTF se compose de la chaine α et d'une partie tronquée de la chaine β formant ainsi un fragment de 130 kDa. Le fragment MET-CTF de 55 kDa subit un second clivage au niveau du domaine transmembranaire par des γ-sécrétases libérant un fragment cytosolique qui sera par la suite dégradé dans le
protéasome (Ancot et al. 2012). Il a ainsi été remarqué que le clivage de MET par l'ADAM
pouvait s'effectuer au niveau de la membrane plasmique mais également en intracellulaire.

3.3.2.2 Rôle des caspases

En condition de stress apoptotique, MET peut être clivé et dégradé par les caspases au niveau
des résidus D1002 et D1374 (Figure 7), ce qui entraine la formation d'un fragment
intracellulaire appelé p40MET (Lefebvre et al. 2013). Un fois libéré dans le cytosol, le fragment
p40MET se localise dans la région de la membrane du réticulum endoplasmique associée à la
mitochondrie (MAM). En favorisant le transfert de calcium entre le réticulum endoplasmique
et les mitochondries, le fragment p40MET à un rôle proapoptique (Duplaquet et al. 2020).

3.3.2.3 Rôle de la sérine 985

En dépit de son implication dans la régulation du récepteur MET, le rôle de la sérine 985 dans
la régulation est mal connu. En 1994, Gandino et al. ont observé qu'un stress oxydatif conduit
à la phosphorylation de la sérine 985 entrainant ainsi une réduction de la phosphorylation des
tyrosines du domaine kinase de MET, ce qui contribue à diminuer l'activité du récepteur
(Gandino et al. 1994). Une étude menée par Hashigasako et al. a permis de constater que la
phosphorylation de la sérine 985 est régulée de manière bidirectionnelle par la protéine
kinase C (PKC), responsable de la phosphorylation du site, et la protéine phosphatase 2A
(PP2A), responsable de la déphosphorylation (Hashigasako et al. 2004). Des données plus
récentes ont suggéré que la sérine 985 phosphorylée participait à la diminution de
l'expression membranaire de MET en favorisant l'endocytose de ce dernier (Nakayama et al.
2013). Les auteurs ont également démontré que la présence d'une sérine 985 phosphorylée
diminuait la capacité de l'HGF à activer le récepteur MET et à induire le pouvoir mitogène de
ce dernier.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 7 : Représentation schématique des voies de régulation HGF-dépendantes et HGF-indépendantes du récepteur MET</figcaption></figure>
# 4 Les altérations de MET dans le cancer

De nombreuses altérations du gène *MET*, conduisant à l'activation constitutive de la protéine MET, sont décrites dans les cancers humains. Il s'agit des mutations ponctuelles situées dans le domaine kinase de MET (MET/DK) et dans le domaine SEMA (MET/DS), des mutations responsables de l'épissage de l'exon 14 de *MET* (METex14), des fusions impliquant différents partenaires et des amplifications du gène *MET*.

## 4.1 Les mutations du domaine kinase de MET (MET/DK)

Les mutations du domaine kinase de MET (MET/DK) ont été décrites pour la première fois dans les formes sporadiques et héréditaires des carcinomes papillaires rénaux (HPRC) (Schmidt et al. 1997). Ces mutations sont maintenant repérées dans de nombreux cancers tels que les CBNPC, les gliomes de haut grade, les hépatocarcinomes, les cancers ORL et les cancers mammaires (Liu et al. 2015 ; Ghadjar et al. 2009 ; Lee et al. 2000 ; Di Renzo et al. 2000 ; Tovar et Graveel 2017).

À l'instar de celles des autres récepteurs à activité tyrosine kinase, ces mutations conduisent à une forme constitutivement active du récepteur MET, indépendante du ligand HGF.

Les mutations MET/DK impliquent différents sites, bien que les plus fréquentes se situent sur les valines 1092, 1188, 1200 et 1232, l'histidine 1094, les méthionines 1131 et 1250, les lysines 1228 et 1246 et les tyrosines 1230 et 1248 (Tovar et Graveel 2017) (Figure 8). En établissant par transfection stable plusieurs modèles de lignées NIH 3T3/METDK, Jeffers et al. ont démontré le potentiel tumorigène de ces mutations grâce à la formation de tumeurs sur modèle murins (Jeffers et al. 1997).

Afin de comprendre comment l'activation de MET par une mutation du domaine kinase affecte la tumorigenèse, des modèles de souris *knock-in* germinales ont été créés, portant des mutations MET D1226N, Y1228C, M1248T et M1248T/L1193V. Il est intéressant de noter que les différentes lignées de souris présentant une forme mutée de la protéine MET développent
différents types histologiques de cancer incluant des carcinomes, sarcomes et lymphomes
(Graveel et al. 2004).

Dans les CBNPC avec mutation METex14, l'apparition d'une mutation dans le domaine kinase du récepteur est la principale cause de résistance aux inhibiteurs de MET. À ce jour, plus d'une quinzaine de mutations ont été décrites dans ce modèle (cf discussion « 7.1.2 Revue des mécanismes de résistance et des biomarqueurs de réponse aux ITK MET»).

## 4.2 Les mutations du domaine sémaphorine (MET/DS)

Les mutations MET/DS sont des altérations bien décrites dans les cancers bronchopulmonaires. Le domaine sémaphorine joue un rôle essentiel dans la fixation du ligand HGF et la dimérisation du récepteur (Kong-Beltran, Stamos et Wickramasinghe 2004).
À l'instar des autres mutations du récepteur, les mutations MET/DS constituent un groupe hétérogène incluant les mutations MET E168D, L299F, S323G, N375S (Tovar et Graveel 2017) (Figure 8).

La mutation MET N375S est la plus fréquente des mutations MET/DS observées dans les cancers gastriques et pulmonaires (Liu et al. 2012 ; Kong et al. 2017). Toutefois, à ce jour, nous disposons de peu de données clinicobiologiques concernant l'efficacité des ITK MET en présence de cette mutation. Dans une étude de phase I, a été traité sans succès une patiente porteuse d'un adénocarcinome gastrique avec mutation MET N375S (Jardim et al. 2014). En outre, des données cliniques suggèrent un pronostic défavorable des patients porteurs d'une mutation MET N375S (Xu et al. 2018).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 8 : Représentation des mutations du domaine SEMA, du domaine juxtamembranaire et du domaine kinase de MET identifiées dans les CBNPC</figcaption></figure>
## 4.3 Les fusions du gène *MET*

Comme nous l'avons vu précédemment, la première fusion du gène *MET* a été décrite en 1984 (Cooper et al. 1984). Il s'agissait de la fusion entre l'oncogène *TPR* et le gène *MET*, découverte au sein d'une lignée cellulaire (NIH3T3) modifiée chimiquement par le MNNG. Depuis, plusieurs cas de fusions du gène *MET* ont été identifiées dans des cancers tels que les CBNPC, les carcinomes hépatocellulaires et les gliomes de haut grade (Wang et al. 2018 ; Gow et al. 2018 ; Zhu et al. 2019 ; Xu et al. 2018). Les fusions du gène *MET* peuvent être intra ou interchromosomiques. À ce jour, plus d'une dizaines de gènes partenaires ont été identifiés dont *TPR*, *TRIM4* (Tripartite motif-containing protein 4), *KIF5B* (Kinesin-1 heavy chain), *ZKSCAN1* (Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains), *PPFIB1* (Liprin-beta-1), *LRRFIP1* (Leucine-rich repeat flightless-interacting protein 1), *EPS15* (Epidermal Growth Factor Receptor Pathway Substrate 15), *DCTN1* (dynactin subunit 1), *PTPRZ1* (protein tyrosine phosphatase receptor type Z1), *NTRK1*, *CLIP2* (CAP-Gly Domain Containing Linker Protein 2), *TFG* (TRK-Fused Gene), *HLA-DRB1* (HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain) et *CAPZA2* (*F*-actin-capping protein subunit alpha-2) (Bao et al. 2014 ; Chowdhury et al. 2020 ; Nuga et al. 2018 ; Blanc-Durand et al. 2020 ; Yeh et al. 2015) (**Figure 9**). Les fusions du gène *MET* englobent généralement l'exon 15 du récepteur codant pour le domaine de kinase de *MET* et peuvent exclure l'exon 14 du gène et ainsi mimer les altérations METex14 (Yeh et al. 2015). Des données précliniques ont permis d'observer que la protéine chimérique issue d'une fusion de *MET* est associée à une phosphorylation constitutive du domaine kinase de *MET* et à des propriétés tumorigènes *in vivo* (Yeh et al. 2015). De manière intéressante, la fusion *PTPRZ1-MET*, englobant la quasi-totalité du gène *MET* (exon 2-21), est également associée à une phosphorylation constitutive du domaine kinase de *MET* et à une surexpression de la protéine (Chen et al. 2015).

Nous disposons de peu d'informations concernant l'efficacité des inhibiteurs de *MET* au sein de tumeurs arborant une fusion du gène *MET*. Quelques cas d'efficacité des ITK *MET* chez des patients porteurs de gliomes et de CBNPC ont été rapportés dont, notamment, une réponse partielle de huit mois obtenue chez un patient traité par crizotinib pour un CBNPC porteur de la fusion *HLA-DRB1-MET* (Davies et al. 2017).
Figure 9 : Représentation schématique des fusions du gène MET. Figure issue de la publication « The multiple paths towards MET receptor addiction in cancer » par Duplaquet et al.

<figure><img src="image_10.png" /></figure>
## 4.4 Les amplifications du gène *MET*

Une amplification se définit par une augmentation du nombre de copies d'un gène. L'amplification se distingue d'une polysomie par un ratio gène/centromère supérieur à 1 (Liang et Wang 2020).

Les amplifications du gène *MET* sont décrites de novo dans 2 à 5% des cas de CBNPC (Kawakami et al. 2014) et leur présence est associée à un mauvais pronostic (Finocchiaro et al. 2015).

Des études ont proposé une définition du niveau de l'amplification : (Alexander Drilon, Cappuzzo, et al. 2017; Noonan et al. 2016)

- faible, lorsque le ratio MET/CEP7 (Pericentromeric regions of chromosomes 7) est compris entre $\ge 1,8$ et $\le 2,2$ ;

- intermédiaire, lorsque ce ratio est compris entre $> 2,2$ et $< 5$ ;

- forte, lorsque ce ratio est $\ge 5$.

Le taux d'incidence des cancers bronchiques avec une amplification forte de *MET* est rare (0,34 %) (Liang et Wang 2020). Par ailleurs, contrairement aux amplifications faibles, aucun driver oncogénique n'est retrouvé dans les tumeurs arborant une amplification forte (MET/CEP7 >5), ce qui témoigne du fait que cette altération peut agir comme un driver oncogénique (Noonan et al. 2016).

Les amplifications ont également été dépeintes comme un mécanisme de résistance aux thérapies ciblées avec des taux allant de 5 à 20 % des patients traités par ITK EGFR pour un CBNPC EGFR-muté (Cortot et Janne 2014a). Ce mécanisme a également été identifié chez des patients traités par inhibiteur de ALK et de RAF dans des fréquences plus faibles (Dagogo-Jack et al. 2020).

D'un point de vue thérapeutique, de nombreux essais ont été menés pour évaluer l'efficacité des inhibiteurs de MET chez des patients atteints de tumeurs avec amplification de *MET*. L'étude PROFILE 1001 a évalué le crizotinib chez des patients porteurs d'un CBNPC répartis en trois groupes selon le niveau d'amplification. Il a ainsi pu être observé un taux de réponse de 67 % dans le groupe avec un niveau fort d'amplification versus 17 % et 0 % dans les groupes
de niveaux intermédiaire et faible (Tsang Shaw *et al.* 2019). Une récente étude de phase II a également évalué le crizotinib chez des patients porteurs d'un CBNPC avec une amplification mesurée à six copies du gène *MET* et un ratio MET/CEP7 > 2,2 (Camidge et al. 2014). Le taux de réponse globale était de 31 %. Lors de l'ASCO (American Society of Clinical Oncology) 2020, les données de l'essai GEOMETRY évaluant le capmatinib chez les patients porteurs d'un CBNPC METex14 ou d'une amplification forte du gène *MET* (nombre de copies du gène ≥ 10) ont été présentées : le taux de réponse était de 40 % chez les patients n'ayant reçu aucun traitement précédent l'inclusion dans l'étude et de 29 % pour les patients prétraités (Wolf *et al.* 2020).

Dans les autres tumeurs solides, nous disposons à ce jour de données dans l'hépatocarcinome avec un taux de réponse du capmatinib de l'ordre de 10 % pour l'ensemble des patients et pouvant atteindre 30 % chez des patients avec un nombre de copie du gène *MET* ≥ 5 et une surexpression de *MET* d'au moins 50 % de la tumeur (Qin et al. 2019). Dans les cancers œsophagiens et gastriques présentant une amplification de *MET*, les taux de réponse étaient de 18 % avec l'AMG 337 (Van Cutsem et al. 2019).

En présence d'une amplification de *MET* acquise secondairement aux ITK EGFR, plusieurs essais ont évalué une combinaison de thérapie ciblée par un ITK MET et EGFR. Le tepotinib en association avec le géfitinib a été évalué dans une étude de phase II incluant des patients porteurs d'un CBNPC (T790M négatif) préalablement traités par un ITK EGFR de première ou deuxième génération et ayant développé une amplification de *MET* (Park *et al.* 2019). Le taux de réponse objective était de 67 % avec une PFS de 16,6 mois. Le savolitinib et le capmatinib ont également été examinés en association avec le géfitinib chez des patients porteurs d'un CBNPC EGFR muté, préalablement traités par un ITK EGFR et ayant développé une amplification de *MET* (Wu *et al.* 2018 ; Yang *et al.* 2017). Les taux de réponse étaient plus faibles, respectivement de 25 et 29 %. Il convient de noter que le taux de patients porteurs d'une mutation T790M n'était pas connu. Le savolitinib a également été évalué en combinaison avec l'osimertinib dans trois essais de phase I (Sequist *et al.* 2020 ; Oxnard *et al.* 2020 ; Oxnard *et al.* 2019). Ces derniers ont inclus des patients porteurs d'un CBNPC EGFR muté, préalablement traités par un ITK EGFR de première, deuxième ou troisième génération et ayant développé une amplification du gène *MET* avec ou sans mutation T790M. Les taux de réponse étaient compris entre 64 et 67 % chez les patients n'ayant jamais reçu d'inhibiteur
EGFR de troisième génération et de 23 % chez les patients prétraités par un ITK EGFR de troisième génération.

## 4.5 Les mutations METex14

### 4.5.1 Découverte des mutations METex14

L'existence d'altérations susceptibles d'induire à un épissage alternatif conduisant à un saut de l'exon 14 de *MET* a été décrite pour la première fois en 2003 (Ma, Kijima, et al. 2003). En 2005, l'analyse d'ADN complémentaire dans une cohorte de 127 patients atteints d'un CBPNC a permis d'identifier un patient (0,78 %) porteur d'un saut de l'exon 14 de *MET* (Ma et al. 2005). En 2006, Kong *et al.* se sont intéressés aux conséquences fonctionnelles des mutations METex14. Après avoir identifié une lignée cellulaire (lignée H596) et deux lignées issues de patients porteurs d'un saut d'exon 14 de *MET*, les auteurs ont mis en évidence une surexpression du récepteur MET couplée à une expression prolongée de la forme phosphorylée de MET en réponse à l'HGF ainsi qu'une perte de fixation de l'ubiquitine ligase CBL (Kong-Beltran 2006). L'ensemble de ces résultats témoignent de l'impact des mutations METex14 dans la régulation du récepteur MET. De manière intéressante, l'efficacité d'un anticorps monoclonal ciblant MET (OA-5D5) sur la viabilité de la lignée H596 en présence de l'HGF a également été démontrée pour la première fois, ouvrant la voie aux possibilités thérapeutiques. En 2015, Frampton *et al.* ont rapporté l'analyse génomique de tumeurs (tous types) issues de 38 028 patients (Frampton et al. 2015). 221 cas ont été identifiés comme porteurs d'un saut de l'exon 14 de *MET*. Les altérations METex14 ont principalement été repérées dans 3 % des adénocarcinomes pulmonaire, 2,3 % des autres CBNPC, 0,4 % des gliomes et 0,4 % des tumeurs sans primitifs retrouvés. Par ailleurs, contrairement à ce qui est observé dans les autres modèles d'addiction oncogénique, le nombre d'altérations susceptibles d'induire un saut de l'exon 14 de MET était important avec 126 variants recensés.
4.5.2 Caractéristiques cliniques histologiques et moléculaires des patients
porteurs d'un CBNPC avec mutation METex14

En 2016, une étude a analysé ces caractéristiques sur 298 patients atteints d'un CBNPC muté
METex14 (Schrock et al. 2016). Il s'agissait principalement de femmes (60 %) d'âge médian
élevé (73 ans). Le statut tabagique était réparti de manière homogène. Les altérations
METex14 étaient plus communes dans le sous-type histologique adénosquameux (8,2 %), suivi
du sous-type sarcomatoïde (7,7 %) puis adenocarcinome (2,9 %) et épidermoïde (2,1 %). Les
altérations les plus fréquentes étaient des substitutions sur le site d'épissage donneur (49,1 %)
des insertions et/ou délétions sur le site accepteur (32,9 %) et des insertions/délétions sur le
site donneur (13,8 %) (Figure 10).

Plus récemment, Awad et al. ont présenté, lors de l'ASCO 2020, les résultats d'une étude portant sur 1 393 prélèvements issus de 1 387 patients porteurs d'un CBNPC METex14 (Awad et al. 2020). Ces patients ont été identifiés à partir d'une analyse génomique d'une cohorte de 60 495 patients portant ainsi le taux de mutation METex14 à 2,3 %. Les données cliniques n'étaient pas détaillées. Toutefois, sur le plan moléculaire, les mutations étaient réparties de manière hétérogène :

- sur le site donneur uniquement (42 % des cas) ;

- sur le site accepteur (4,7 %) ;

- sur le tractus polypyrimidine (15 %) ;

- à la fois sur l'accepteur et le tractus polypyrimidine (13 %) ;

- sur l'acide aspartique 1010 (23 %) ;

- sur la tyrosine 1003 (2,1 %).

Concernant les co-altérations, les amplifications *MDM2*, *CDK4* et *MET* ont été observées dans respectivement 32 %, 19 % et 12 % des cas. Dans 66 cas (4,8 %), une altération sur un autre oncogène driver a été identifié incluant *KRAS* (68 %) et *EGFR* (14 %).
Figure 10 : Représentation schématique des mutations des sites d'épissage de l'exon 14 de MET. Schéma issu de l'article « MET exon 14 splicing sites mutations: a new therapeutic opportunity in lung cancer » de Baldacci et al.

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

4.5.3 Revue des ITK MET dans la prise en charge des CBNPC mutés METex14

À ce jour, l'ANSM (L'agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé) autorise l'utilisation des inhibiteurs de MET : ils sont disponibles en ATU (Autorisation temporaire d'utilisation) dans la prise en charge des CBNPC METex14 après échec d'une première ligne thérapeutique.

Les résultats de sept essais cliniques évaluant un ITK MET dans la prise en charge des CBNPC METex14 ont été communiqués (Tableau 1).

L'étude de phase I PROFILE 1001 a inclus 69 patients avec un CBNPC METex14 traité par crizotinib (Drilon et al. 2018). Le taux de réponse objective était de 32 % avec une médiane de survie sans progression de 7,2 mois (5,4-9,2 mois). L'étude ACSE a évalué le crizotinib chez 28
patients porteurs d'une mutation de *MET*, dont 24 d'une mutation METex14 (Moro-Sibilot et al. 2018a). Le taux de réponse objective était de 18 % (4-32) avec une médiane de survie sans progression de 8,1 mois (4,1-12,7 mois).

L'essai de phase II METROS a inclus 26 patients porteurs CBNPC avez une dérégulation de *MET* traités par crizotinib (Landi et al. 2019). Seize tumeurs portaient une amplification de *MET*, neuf une mutation et une tumeur présentait à la fois une mutation et une amplification Le taux de réponse objective était de 27 % (IC 11-47 %) et le taux de contrôle de la maladie était de 69 %. La survie sans progression et la survie globale médiane étaient respectivement de 4,4 mois (95 % IC 3,0-5,8) et de 5,4 mois (95 % IC 4,2-6,5). Aucune différence de réponse selon le type d'altération de *MET* n'a été constatée.

GEOMETRY est une étude prospective, non randomisée et ouverte, évaluant le capmatinib, un inhibiteur de type I compétitif de l'ATP spécifique de MET, chez 97 patients adultes atteints d'un CBNPC METex14 localement avancé ou métastatique (Wolf *et al.* 2018). Le taux de réponse globale (ORR) était de 68 % chez les patients n'ayant jamais été traités et de 41 % chez les patients ayant au moins reçu une ligne de traitement. La durée médiane de la réponse était respectivement de 11,14 mois (IC à 95 % : [5,55-NE]) et de 9,72 mois (IC à 95 % : [5,55-12,98]). Le capmatinib a également été évalué, dans un essai de phase I, chez 55 patients atteints de CBNPC et de dérégulation de *MET* (Schuler et al. 2020). Bien que l'étude se soit particulièrement focalisée sur des patients présentant un CBNPC avec une amplification de *MET*, des patients porteurs d'un CBNPC avec un saut de l'exon 14 de *MET* ont également été inclus. Le taux de réponse objective était de 100 % (4 sur 4) dans les CBNPC présentant une mutation responsable d'un saut l'exon 14 de *MET*, de 16,6 % (2 sur 12) dans les CBNPC présentant une amplification mesurée entre quatre et six copies du gène et de 46,6 % (7 sur 15) dans les CBNPC présentant une amplification supérieure à six copies du gène (dont trois avec une mutation METex14). En l'absence d'amplification du gène, le taux de réponse était de 0 %.

VISION est un essai de phase II mono-bras qui a évalué le tepotinib, un inhibiteur de type I compétitif pour l'ATP, spécifique de MET, chez des patients atteints d'un CBNPC METex14, de stade IIIB/IV, ayant reçus une ou deux lignes de traitements systémiques (Paik *et al.* 2017 ; Felip *et al.* 2018 ; Paik *et al.* 2020). Deux cohortes ont été établies en fonction du type de
biopsie effectuée pour l'identification des mutations METex14 (biopsie liquide [LBx] ou biopsie
tumorale [TBx]). Le taux de réponse était de 48 % (IC à 95 %, 36 à 61) chez les 66 patients du
groupe LBx et de 50 % (IC à 95 %, 37 à 63) chez 60 patients du groupe TBx. Le taux de réponse
évalué par l'investigateur était de 56 % (IC à 95 %, 45 à 66) et s'avérait similaire quel que soit
le traitement antérieur reçu.

Le savolitinib, un inhibiteur de type I spécifique de MET est en cours d'évaluation dans le cadre d'un essai ouvert de phase II multicentrique, mono-bras, chez des patients atteints de CBNPC METex14 (Lu et al. 2020). Des résultats préliminaires après inclusion de 70 patients ont été récemment annoncés. Le taux de réponse globale (ORR) était de 47,5 % (34,6 %, 60,7 %) et la survie sans progression de 6,8 mois (4,2, 13,8).

Le telisotuzumab vedotin (ABBV-399) est un anticorps conjugué composé de l'anticorps
monoclonal humanisé anti-MET (ABT-700) couplé à la monométhylauristatine E (MMAE)
cytotoxique (Waqar et al. 2019). L'ABBV-399 a été évalué dans un essai de phase I chez des
patients présentant des tumeurs solides avancées avec sur expression de MET (IHC H-score
≥150) ou une amplification de MET (Camidge et al. 2019). Un des 48 patients inclus était
porteur d'un CBNPC avec une amplification de MET et une mutation METex14. Ce patient a
présenté une progression de sa maladie.

Le cabozantinib, un inhibiteur de type II qui cible les récepteurs MET, VEGFR2, RET, KIT, FLT-1/3/4, TIE2, et AXL (Yakes et al. 2011), et le mérestinib, un inhibiteur de type II qui cible les protéines MET (2nM), MST1R, FLT3, AXL, MERTK, TEK, ROS1, NTRK1/2/3, DDR1/2 et MKNK1/2 (Yan et al. 2013). Ces deux molécules sont actuellement en cours d'évaluation dans deux études de phase II multicentriques, mono-bras, chez des patients porteurs d'un CBNPC METex14 (NCT03911193, NCT02920996).
<table><caption>Table 1 : Essais cliniques des ITK MET dans les CBNPC METex14</caption><thead><tr><td>Molécule</td><td>Cible</td><td>Type</td><td>Essai</td><td>Phase</td><td>Résultats</td></tr></thead><tbody><tr><td>Capmatinib</td><td>MET</td><td>ITK1b</td><td>GEOMETRY</td><td>II</td><td>METexon14 :<br/>1L ORR : 67,9 % ; DOR : 11,1 mo<br/>2L+ ORR : 40,6 % ; DOR : 9,7 mo</td></tr><tr><td>Tepotinib</td><td>MET</td><td>ITK1b</td><td>VISION</td><td>II</td><td>TBx ORR : 48 % ; LBx ORR : 50 %</td></tr><tr><td>Crizotinib</td><td>MET, ALK, ROS1</td><td>ITK1a</td><td>PROFILE1001</td><td>I</td><td>ORR : 32 %</td></tr><tr><td>Crizotinib</td><td>MET, ALK, ROS1</td><td>ITK1a</td><td>ACSE</td><td>II</td><td>ORR : 18 %</td></tr><tr><td>Crizotinib</td><td>MET, ALK, ROS1</td><td>ITK1a</td><td>METROS</td><td>II</td><td>ORR : 27 %</td></tr><tr><td>Savolitinib</td><td>MET</td><td>ITK1b</td><td>NCT02897479</td><td>II</td><td>ORR : 47,5 %</td></tr></tbody></table>
# 5 Objectif de la thèse

La détection d'altérations moléculaires susceptibles de répondre à des thérapies ciblées ainsi que l'identification des mécanismes de résistance à ces thérapies sont cruciaux pour l'amélioration de la prise en charge en oncologie.

Dans les CBNPC METex14, les taux de réponse aux ITK MET sont sensiblement inférieurs à ceux observés dans d'autres modèles d'addiction oncogénique ce qui suggère la présence de mécanismes de résistances primaires. De nombreux travaux ont mis en évidence un lien étroit entre la voie PI3K-AKT et le récepteur MET.

* Mon premier objectif a été d'évaluer l'impact des altérations de la voie PI3K-AKT dans la résistance aux ITK MET dans les CBNCP METex14.

L'arrivée des ITK MET offre de nouvelles perspectives thérapeutiques pour les patients porteurs d'une altération du récepteur MET responsable d'une addiction oncogénique.

* Mon deuxième objectif a été d'étudier de potentiels nouveaux biomarqueurs prédictifs de réponse aux ITK MET.

Enfin, l'identification des mécanismes de résistance en routine clinique s'avère un enjeu essentiel.

* Mon 3ème objectif est d'évaluer la faisabilité de la recherche de mécanismes de résistance aux ITK ainsi que d'étudier l'impact sur le choix thérapeutique. Pour ce 3ème objectif nous avons choisi d'étudier le modèle des CBNPC ALK+ traités par ITK ALK.
6 ARTICLE

Article n°1 : Alterations in the PI3K pathway drive resistance to MET inhibitors in NSCLC harboring MET exon 14 skipping mutations (1er auteur, Article publié en 2020 dans le Journal of Thoracic oncology)

Article n°2 : Response to capmatinib in a MET fusion-positive cholangiocarcinoma (Dernier auteur, soumission prévue en janvier 2021 dans JCO precision oncology)

Article n°3: Relevance of detection of mechanisms of resistance to ALK inhibitors in ALK-rearranged NSCLC in routine practice (1er auteur, article publié en 2019 dans clinical Lung Cancer)
<figure><img src="image_12.png" /></figure>

# Alterations in the PI3K Pathway Drive Resistance to MET Inhibitors in NSCLC Harboring MET Exon 14 Skipping Mutations

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Check for updates

Philippe Jamme, MD, MSc,ª Marie Fernandes, MSc,ª

Marie-Christine Copin, MD, PhD,ª,ᵇ Clotilde Descarpentrries, MD,ᶜ

Fabienne Escande, MD, PhD,ᶜ Angela Morabito, PhD,ª Valérie Grégoire, PhD,ᵇ

Matthieu Jamme, MD,ᵈ Simon Baldacci, MD, PhD,ᵉ David Tulasne, PhD,ª

Zoulika Kherrouche, PhD,ª Alexis B. Cortot, MD, PhDª,ᵉ,\*

Received 29 September 2019; revised 23 January 2020; accepted 26 January 2020

Available online - 10 March 2020

## ABSTRACT

Hepatocyte growth factor receptor (MET) tyrosine kinase inhibitors (MET TKIs) have been found to have efficacy against advanced NSCLC with mutations causing MET exon 14 skipping (METex14 mutations), but primary resistance seems frequent, as response rates are lower than those for targeted TKIs of other oncogene-addicted NSCLCs. Given the known interplay between MET and phosphoinositide 3-kinases (PI3K), we hypothesized that in METex14 NSCLC, PI3K pathway alterations might contribute to primary resistance to MET TKIs. We reviewed clinical data from 65 patients with METex14 NSCLC, assessing PI3K pathway alterations by targeted next-generation sequencing (mutations) and immuno-histochemistry (loss of phosphatase and tensin homolog [PTEN]). Using a cell line derived from a patient with primary resistance to a MET TKI and cell lines harboring both a METex14 mutation and a PI3K pathway alter- ation, we assessed sensitivity to MET TKIs used alone or with a PI3K inhibitor and investigated relevant signaling pathways. We found a phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha (PIK3CA) mutation in two of 65 samples (3%) and loss of PTEN in six of 26 samples (23%). All three of the MET TKI-treated patients with a PI3K pathway alteration had been found to have pro- gressive disease at first assessment. Likewise, MET TKIs had no effect on the proliferation of METex14-mutated cell lines with a PI3K pathway alteration, including the PTEN-lacking patient-derived cell line. Treatment

combining a MET TKI with a PI3K inhibitor caused in- hibition of both PI3K and MAPK signaling and restored sensitivity to MET TKIs. PI3K pathway alterations are common in METex14 NSCLC and may confer primary resistance to MET TKIs. In preclinical models, PI3K in- hibition restores sensitivity to MET TKIs.

© 2020 International Association for the Study of Lung Cancer. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.

Keywords: TKI; Resistance; MET; PI3K; NSCLC

<footnote>ªUniversity of Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, UMR9020 - UMR-S 1277 - Canther - Cancer Heterogeneity, Plasticity and Resistance to Therapies, Lille, France</footnote>

<footnote>ᵇPathology Department, CHU Lille, University of Lille, Lille, France</footnote>

<footnote>ᶜDepartment of Biochemistry and Molecular Biology, Hormonology Metabolism Nutrition Oncology, CHU Lille, University of Lille, Lille, France</footnote>

<footnote>ᵈINSERM U-1018, CESP, Team 5 (EpReC, Renal and Cardiovascular Epidemiology), UVSQ, Villejuif, France</footnote>

<footnote>ªThoracic Oncology Department, CHU Lille, University of Lille, Lille, France</footnote>

<footnote>*Corresponding author.</footnote>

<footnote>Disclosure: Pr. Cortot participated in advisory boards or received honoraria from AstraZeneca, Bristol-Myers Squibb, Merck & Co., Pfizer, Roche, Novartis, and Takeda, and received grants paid to his institution from Novartis and Merck. Dr. Jamme reports nonfinancial support from Chugai Pharma, Roche, and Bristol-Myers Squibb, and personal fees from Boehringer Ingelheim, outside of the submitted work. Dr. Baldacci reports personal fees and nonfinancial support from Lilly, GlaxoSmithKline, Roche, Pfizer, and a grant from the Intergroupe Francophone de Cancérologie Thoracique, outside of the submitted work. Pr. Copin participates in advisory boards for Pfizer and Roche. Dr. Descarpentrries reports personal fees and nonfinancial support from AstraZeneca, Novartis Pharma S.A.S., Roche S.A.S., Boehringer Ingelheim France, and Pfizer, outside of the submitted work. The remaining authors declare no conflict of interest.</footnote>

<footnote>Address for correspondence: Alexis B. Cortot, MD, PhD, Hôpital Calm- ette, CHU Lille, Boulevard du Professeur Leclerc q, 59037 Lille, France. E-mail: alexis.cortot@chru-lille.fr</footnote>

<footnote>© 2020 International Association for the Study of Lung Cancer. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.</footnote>

<footnote>ISSN: 1556-0864</footnote>

<footnote>https://doi.org/10.1016/j.jtho.2020.01.027</footnote>
Introduction

Splice site mutations located in the regions flanking
exon 14 of the hepatocyte growth factor receptor (MET)
oncogene (METex14) have been reported in 3% of pa-
tients with NSCLC.¹,² Elderly persons and smokers
constitute a larger proportion of patients harboring
these mutations than those with alterations affecting
other key oncogene drivers, such as epidermal growth
factor receptor (EGFR) or anaplastic lymphoma kinase
(ALK).³ MET exon 14 skipping, which causes the absence
of the MET juxtamembrane domain (containing several
negative regulation sites), leads to increased MET re-
ceptor stability and activation.⁴ This activation results in
recruitment of effector proteins, such as GRB2-associ-
ated-binding protein 1 (GAB1), growth factor receptor-
bound protein 2 (GRB2), Src homology 2 domain-
containing (SHC), signal transducer and activator of
transcription (STAT), and phosphoinositide 3-kinase
(PI3K), leading to activation of downstream signaling
pathways, including the PI3K, mitogen-activated protein
kinase (MAPK), and Janus kinase (JAK)-STAT path-
ways.⁴,⁵ As METex14 mutations can confer sensitivity to
MET inhibition, several clinical trials have evaluated
MET tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in METex14
NSCLC. Reported objective response rates (ORRs) range
from 32% to 67.9%.⁶⁻⁹ These results are somewhat
lower than those observed with targeted therapies for
other oncogene-addicted NSCLCs, such as EGFR-mutated
or ALK-rearranged NSCLC. This may be due to a higher
frequency of primary resistance mechanisms in METex14
NSCLC, including concurrent molecular alterations.

The PI3K signaling pathway is involved in several
cell functions induced by activation of the MET receptor,
including cell migration and survival.¹⁰ The MET re-
ceptor interacts with class I PI3K isoforms directly
through their SH2 domain and indirectly through acti-
vation of GAB1, focal adhesion kinase (FAK), and RAS.¹⁰
PI3K promotes phosphorylation of phosphatidylinositol
(4,5)-bisphosphate (PIP2) to phosphatidylinositol
(3,4,5)-trisphosphate (PIP3), favoring plasma membrane
recruitment of the PDK1 kinase, leading notably to AKT
phosphorylation. The phosphatase and tensin homolog
(PTEN), in contrast, causes PIP3 dephosphorylation and
thus acts as the main regulator of the PI3K pathway. The
PI3K pathway is frequently dysregulated in NSCLC.
Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha
(PIK3CA) and AKT1 mutations are found in 4.1% to
5.2%¹¹⁻¹³ and 0.2% to 1.9%¹⁴⁻¹⁶ of lung cancers,
respectively, and loss of PTEN has been reported in 24%
of NSCLC. Several articles report the role of PI3K
pathway alterations in resistance to cancer therapy,
including TKI treatment.¹⁷,¹⁸ Given the role of the MET
receptor in direct activation of the PI3K pathway, we

hypothesized that alterations in this pathway might
contribute to the resistance of *METex14* NSCLC to MET
inhibitors.

Results

PI3K Pathway Alterations Are Common in
METex14 NSCLC

Considering the involvement of the PI3K pathway in
resistance to TKIs in several oncogene-addicted cancer
models, we focused retrospectively on PI3K pathway
alterations in a multicentric cohort of patients with
NSCLC whose tumors displayed METex14 mutations. All
tumor samples were obtained at diagnosis, before any
systemic treatment. Screening for mutations had been
done using the CLAPv1 optimized next-generation
sequencing (NGS) panel combined with fragment
length analysis, as previously described.² All these mu-
tations were previously described or predicted to induce
MET exon 14 skipping (Supplementary Table 1). The
median age was 75.0 years (range 49–88 y); there were
as many men as women (49%) and as many smokers as
never smokers (55%). Most patients had been diagnosed
at an advanced stage (67%). A total of 17 of them had
received a MET TKI, either off-label or as part of a
clinical trial (Fig. 1A).

The *METex14* mutations detected in this cohort were
of the following types: deletions in 30 patients (46%),
substitutions in 28 patients (42%), and indels in seven
patients (12%). A total of 39 samples had been tested for
*MET* gene amplification by fluorescence in situ hybridiz-
zation, of which five (13%) were positive: one with low
amplification (*MET/CEP7* ratio 1.8), one with interme-
diate amplification (*MET/CEP7* ratio 3.2), and three with
high amplification (clusters in 53%–78% of tumor cells)
(Supplementary Table 1).

Samples from all 65 patients had been tested for PI3K
pathway alterations (PIK3CA, AKT, and PTEN mutations)
by targeted NGS, revealing two PIK3CA mutations (3%)
(Fig. 1B) but no AKT or PTEN mutation. We further
evaluated PTEN expression by immunohistochemistry
(IHC) performed on 26 available tumor samples
(Supplementary Table 3). This revealed six samples
(23%) with total loss of PTEN expression (Fig. 1C)
(Supplementary Fig. 1).

In addition, the observed mutations included 15 tu-
mor protein 53 (TP53) mutations (27%), two KRAS
mutations (G13C), one NRAS mutation (Q61L), one EGFR
mutation (V774M), and one SMA- and MAD-related
protein 4 (SMAD4) mutation (D351N) (Supplementary
Table 1). Overall, six of the 26 samples tested by both
NGS and PTEN IHC (23%) displayed a PI3K pathway
alteration. This makes the PI3K pathway one of the most
altered pathways in METex14 NSCLC.
## Patients With METex14 With Concurrent Alterations in the PI3K Pathway Display Primary Resistance to MET TKIs

To determine whether PI3K pathway alterations might affect sensitivity to MET inhibition, we analyzed responses to treatment in 17 patients with METex14 NSCLC having received a MET TKI.

Tumor samples from three of these patients seemed, on the basis of either NGS or PTEN IHC, to have an impaired PI3K pathway (Fig. 1D).

In 14 patients, no alteration of the PI3K pathway was detected. This means that NGS revealed no PIK3CA, AKT, or PTEN mutation and that the corresponding tumor samples were either PTEN positive (four samples) or had not been analyzed by PTEN IHC (10 samples). Of these 14 patients, nine displayed an ORR (64%), one achieved disease stability for 6 months, and four had progressive disease at first assessment. Although none of these last four harbored a PIK3CA mutation, one of them, identified as PTEN positive, harbored an EGFR V774M mutation likely to explain primary resistance to MET TKI. The PTEN status of the other three was not available. The three patients positive for PTEN but with no EGFR, KRAS, or TP53 mutation all responded to MET TKI treatment.

In contrast, all three patients with an impaired PI3K pathway, including one with a PIK3CA mutation and two with total loss of PTEN expression, were found to have progressive disease at first radiological assessment (Fig. 1D and E). The clinical courses of these three patients are detailed in the subsequent texts.

Patient CHUL#11, who harbored a c.3082+1G>T MET mutation, was a 49-year-old former-smoker woman diagnosed with stage IV NSCLC. She received first-line platinum-based chemotherapy, but progression was observed after four cycles of treatment. The patient then received a MET TKI as part of a clinical trial. The treatment was stopped at first radiological assessment because of rapid disease progression (Fig. 1E). The patient further received an anti-programmed cell death protein 1 agent followed by a new course of chemotherapy with no efficacy. She died 9 months after the diagnosis. PTEN IHC performed on a right cervical lymph node obtained before treatment with the MET TKI revealed loss of PTEN expression (Fig. 1C).

Patient CHUL#18, who harbored a c.3067_3082+1delinsC MET mutation, was a 75-year-old woman diagnosed with advanced adenocarcinoma. She received six cycles of platinum-based chemotherapy with maintenance pemetrexed for 1 year. She then received a MET TKI as part of a clinical trial. The treatment was stopped at first radiological assessment because of new bone and adrenal gland metastases (Fig. 1E). The patient

died three months later. PTEN IHC performed on a pretreatment bronchial biopsy specimen revealed loss of PTEN expression (Supplementary Fig. 1).

Patient CHUL#20, who harbored a c.3082+1G>A MET mutation, was a 75-year-old woman diagnosed with metastatic pulmonary sarcomatoid carcinoma. The patient was not eligible for chemotherapy and therefore received a MET TKI as first-line therapy. The treatment was stopped at first radiological assessment because of lymph node progression (Fig. 1E). The patient died within 2 weeks after discontinuing the treatment. Targeted NGS performed on the lung tumor revealed an activating PIK3CA mutation (N1044K).

These three cases suggest that in patients with METex14 NSCLC, alterations in the PI3K pathway are associated with primary resistance to MET TKIs.

## PTEN Loss Is Associated With Sustained Activation of the PI3K Pathway and Resistance to MET TKIs in METex14 Cancer Cells

To decipher the role of PI3K pathway alterations in resistance to MET TKIs, we derived a cell line from a pleural effusion sample from patient CHUL#11, collected at progression on third-line therapy. The tumor sample from this patient harbored a METex14 mutation and displayed no PTEN expression detectable by IHC (Fig. 1C). Targeted NGS confirmed the presence of METex14 mutation c.3082+1G>T in this cell line (named ZORG), identical to that found in the patient tumor sample. As expected, the mutation leads to exon 14 skipping, as validated by fluorescence reverse-transcriptase polymerase chain reaction with primers located in MET exons 13 and 15. As shown in Figure 2A, the amplicon amplified from ZORG cells migrated as expected to 128 base pair, as observed with cell lines known to harbor METex14 mutations (Hs746T and H596). The amplicons from MET wild-type cell lines (A549, PC9, and GTL16) migrated to 286 base pair. In addition, the dissociation temperature of the amplicon from ZORG cells (74.8°C) was in agreement with that of MET lacking exon 14. Finally, Western blotting revealed a lack of PTEN in ZORG cells (Fig. 2B).

MET expression and downstream signaling in ZORG cells stimulated or not by the MET ligand hepatocyte growth factor (HGF) were investigated by Western blotting. As illustrated in Figure 2C, unstimulated METex14 and ERK displayed no phosphorylation, whereas HGF stimulation induced MET phosphorylation and subsequent activation of ERK. In contrast, as an expected consequence of PTEN loss, AKT was activated by its ligand even in the absence of MET activation. Stimulation by HGF led to overactivation of the PI3K
A

<table><thead><tr><th></th><th>n = 65</th></tr></thead><tbody><tr><td>Age, median (years) (range)</td><td>75 (49-88)</td></tr><tr><td>Male</td><td>33 (51%)</td></tr><tr><td>Female</td><td>32 (49%)</td></tr><tr><td>Adenocarcinoma</td><td>53 (80%)</td></tr><tr><td>Pulmonary sarcomatoid carcinoma</td><td>3 (6%)</td></tr><tr><td>Pleomorphic carcinoma</td><td>1 (2%)</td></tr><tr><td>Other</td><td>8 (12%)</td></tr><tr><td>Stage at diagnosis</td><td>n=64</td></tr><tr><td>Stage I-III</td><td>21 (33%)</td></tr><tr><td>Stage IV</td><td>43 (67%)</td></tr><tr><td>Tabac status</td><td>n=64</td></tr><tr><td>Current Smokers</td><td>4 (6%)</td></tr><tr><td>Former Smokers</td><td>25 (39%)</td></tr><tr><td>Never Smokers</td><td>35 (55%)</td></tr><tr><td>Treatment received (advanced stage)</td><td>n=36</td></tr><tr><td>Chemotherapy</td><td>23 (64%)</td></tr><tr><td>MET TKI</td><td>17 (47%)</td></tr><tr><td>Immunotherapy</td><td>9 (25%)</td></tr></tbody></table>

B

Molecular alterations

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

TP53

PI3KCA+TP53 mutation

NRAS mutation

KRAS mutation

TP53+SMAD4 mutation

EGFR+ SMAD4 mutation

No mutation

PTEN Expression

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Negative

Positive

C

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>CHUL #11</figcaption></figure>

PTEN positive

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>CHUL #15</figcaption></figure>

D

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

E

<figure><img src="image_19.png" /></figure>
pathway. All further experiments were performed under HGF supplementation.

The sensitivity of ZORG cells to MET TKIs was then analyzed in viability assays using methyl-thiazolyl-tetrazolium (MTT). Four MET TKIs (type I inhibitors crizotinib, capmatinib, and tepotinib and type II inhibitor foretinib) were tested at increasing doses. The viability of ZORG cells was practically unaffected by capmatinib or tepotinib at doses as high as 10 µM. Crizotinib (a multitarget inhibitor of MET, ROS, and ALK) and foretinib displayed low viability-reducing activity on ZORG cells, with a half-maximal inhibitory concentration (IC₅₀) above 1 µM after a 72-hour exposure to the drug. By comparison, all four TKIs reduced the viability of Hs746T cells, known to harbor both *METex14* mutation and amplification, with an IC₅₀ below 0.1 µM (Fig. 2D).

Investigation of signaling pathways by Western blotting revealed that all four MET TKIs inhibit MET phosphorylation in both ZORG and Hs746T cells. MET TKIs nearly abolished both AKT and ERK phosphorylation in Hs746T cells, but they had little effect in the ZORG cells (Fig. 2E). Overall, these results suggest that PTEN loss is associated with resistance to type I and type II MET TKIs in *METex14* cells through sustained activation of the PI3K pathway.

## Inhibition of PI3K Restores Sensitivity to MET TKIs in METex14 Cells Exhibiting PTEN Loss

To further establish the role of PI3K pathway alterations in resistance to MET TKIs, we tested whether PI3K inhibition might restore sensitivity of ZORG cells to MET TKIs. Proliferation of ZORG cells was unaffected by treatment with capmatinib, one of the most selective and potent MET TKIs,¹⁹ and was only slightly slowed down by GDC0941, a specific inhibitor of PI3Kα and δ (Fig. 3A). When these two inhibitors were combined, however, proliferation of ZORG cells was significantly reduced (*p* < 0.0001). The same inhibitor combination had no effect on cell lines with no MET alteration, such as A549 (KRAS G12S mutation) (*p* = 0.33; NS) and PC9 (EGFR E746-A750 deletion) (*p* = 0.79; NS). For the ZORG cells, the IC₅₀ for capmatinib shifted from over 10 µM, when

the inhibitor was used alone, to 0.034 µM, when it was used in combination with GDC0941 (1 µM) (Fig. 3B).

Analysis of the downstream signaling pathway revealed that addition of capmatinib or GDC0941 alone only slightly reduced the phosphorylation levels of ERK and AKT, whereas combination of both inhibitors fully abolished AKT activation and drastically inhibited ERK activation (Fig. 3C). Overall, these results reveal that the ZORG cells, which display both a *METex14* mutation and PTEN loss, rely on both the PI3K and MET pathways for cell growth, and that combining a MET inhibitor with a PI3K inhibitor is required to achieve cell growth arrest.

## Inhibition of PI3K Restores Sensitivity to MET TKIs in METex14 Cells Displaying a PIK3CA Mutation

Given the action of the PI3K-MET inhibitor combination on *METex14* cells with concurrent PTEN loss, we investigated whether the same is true when PI3K activation is due to a *PIK3CA* mutation. For this, we used the lung adenocarcinoma cell line H596, known to harbor the activating E545K *PIK3CA* mutation along with a *METex14* mutation.

We first confirmed in a viability assay that H596 cells are resistant to crizotinib, as previously revealed,⁵ and to the MET TKIs capmatinib, tepotinib, and foretinib (Fig. 4A). We then studied the effect of MET and PI3K inhibitors, added alone or in combination, on cell growth. Like that of the ZORG cells, H596 cell proliferation was unaffected by capmatinib alone. It was slowed down in the presence of GDC0941 alone. In the presence of combination of both inhibitors, full cell growth arrest was achieved (Fig. 4B).

Signaling pathway analysis revealed only a slight effect of capmatinib on AKT and ERK activation. When the MET and PI3K inhibitors were combined, both phospho-AKT and phospho-ERK levels decreased markedly (Fig. 4C). For the H596 cells, the IC₅₀ for capmatinib shifted from over 10 µM, when the inhibitor was used alone, to 0.06 µM, when it was used in combination with GDC0941 (Fig. 4D). Taken together, these results

**Figure 1.** Alterations in the phosphoinositide 3-kinases (PI3K) pathway are common in *METex14* NSCLC. (A) Baseline characteristics of and treatments received by the patients with an advanced *METex14* NSCLC. (B) Pie charts displaying the frequencies (%) of alterations of the examined genes in the cohort (n = 65) and phosphatase and tensin homolog (PTEN) expression within each tumor sample tested by immunohistochemistry (n = 19). (C) Left panel (PTEN negative) displays undetectable PTEN in cancer cells of tumor specimen from patient CHUL#11. Right panel (PTEN positive) displays expression of PTEN in cancer cells of tumor specimen from patient CHUL#15. Thin arrows indicate cancer cells, and large arrows indicate endothelial or immune cells (internal positive control). (D) Schematic presentation of patients based on the response to hepatocyte growth factor receptor (MET) tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment and to the presence or absence of a PI3K pathway alteration (n = 17). Del, deletion; indel, insertion-deletion; sub, substitution (E) Computed tomography scans of CHUL#11, revealing multiple lymph node metastases at baseline (upper left) and progression after 2 months of MET TKI treatment (upper right). Scans of CHUL#18, revealing emergence of bone metastases after 2 months of MET TKI treatment (middle right panel). Lower abdomen scans of CHUL#20, revealing lymph node metastases at baseline (lower left), which significantly increased after 1 month of MET TKI treatment (lower right panel).
<figure><img src="image_20.png" /></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

<table><thead><tr><th>MET TKI</th><th>ZORC<br>(IC50 μM)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Capmatinib</td><td>>10</td></tr><tr><td>Tapatinib</td><td>>10</td></tr><tr><td>Cristatinib</td><td>2.0<br>[1.45-2.75]</td></tr><tr><td>Rofectinib</td><td>1.23<br>[0.83-1.82]</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th>MET TKI</th><th>Hs746T<br>(IC50 μM)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Capmatinib</td><td>0.003<br>[0.001-0.005]</td></tr><tr><td>Tapatinib</td><td>0.016<br>[0.01-0.03]</td></tr><tr><td>Cristatinib</td><td>0.032<br>[0.02-0.05]</td></tr><tr><td>Rofectinib</td><td>0.027<br>[0.02-0.040]</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

**Figure 2.** Patient CHUL#11-derived cell line with phosphatase and tensin homolog loss reveals sustained activation of the phosphoinositide 3-kinases (PI3K) pathway and resistance to hepatocyte growth factor receptor (MET) tyrosine kinase inhibitor (TKI). (A) Melting curve analysis of MET splicing isoforms and agarose gel electrophoresis of the amplicons generated by fluorescence reverse-transcription polymerase chain reaction. cDNA from cell lines expressing a characterized MET exon 14 skipping alteration (Hs746T, H596) or a wild-type MET (A549, PC9, GTL16) were used as controls. (B) Immunoblots for ZORG cells versus phosphatase and tensin homolog-expressing cell lines. Tubulin was used as a loading control. (C) ZORG cells were serum-starved for 24 hours and stimulated or not for 30 minutes with 50 ng/mL hepatocyte growth factor. Cells were harvested and subjected to Western blotting with the indicated antibodies. (D) The viability of ZORG cells in response to MET TKIs was assessed by methyl-thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay after 72 hours of treatment. The sensitive Hs746T cell line was used as control. Results are presented as means ± SEM of at least three independent experiments. (E) Serum-starved ZORG and Hs746T cells were treated for 30 minutes with each MET TKI or dimethylsulfoxide (DMSO) at 1 µM in the presence of hepatocyte growth factor. Expression and activation of MET and its related signaling pathways were investigated by Western blotting. bp; base pair.

establish that the inhibition of both MET and PI3K is required to achieve full cell growth arrest and to suppress activation of the PI3K and MAPK pathways in *METex14* cells harboring a concurrent *PIK3CA* mutation.

## *METex14 Mutations Contribute to Resistance to PI3K Inhibition in PIK3CA-Mutated Cells*

Because PI3K pathway alterations confer resistance to MET TKIs in *METex14* cells, we investigated whether *METex14* mutations might similarly confer resistance to a PI3K inhibitor in *PIK3CA*-mutated cells.

For this purpose, we chose the epithelial cell line T47D, harboring a H1047F-activating *PIK3CA* mutation and expressing low levels of endogenous MET. To

observe the specific effect of *METex14* on the biological responses of such cells, we created the T47DMETex14 cell line by stable transfection with a vector expressing a mutant MET (*METex14*, c. 2887_3028del).

First, we confirmed the presence of the exogenous *METex14* in the T47DMETex14 cells and its absence in the parental T47D cells (Supplementary Fig. 2A). We then evaluated the sensitivity of these cells to MET TKIs. We found both T47D and T47DMETex14 cells to be resistant to all tested MET TKIs (Supplementary Fig. 2B).

We further studied the effect of MET and PI3K inhibitors, alone and in combination, on cell proliferation. In T47D cells, we found GDC0941 alone to suppress cell growth. Adding capmatinib had no additional impact.
A

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

<table><thead><tr><th></th><th>MET TO</th><th>ZORG<br>IC50 (µM)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Capmatinib</td><td>>10</td><td></td></tr><tr><td>GDC0941</td><td>1.09<br>[3.77-4.77]</td><td></td></tr><tr><td>Capmatinib +<br>GDC0941</td><td>0.034<br>[0.02-0.40]</td><td></td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

**Figure 3.** Phosphoinositide 3-kinases (PI3K) inhibition restores sensitivity to hepatocyte growth factor receptor (MET) tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in ZORG, a *METex14* cell line with phosphatase and tensin homolog loss. (A) Proliferation of ZORG cells treated with a MET TKI (capmatinib) at 0.5 or 1 µM, a PI3Kα/δ inhibitor at 0.5 or 1 µM (GDC0941), or both (each at 0.5 or 1 µM) plus hepatocyte growth factor at 20 ng/mL. IncuCyte confluence measurements were performed every 4 hours for 196 hours. Results are presented as means ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was calculated with the Wilcoxon test. (B) Dose-response curve of ZORG cells treated for 3 days with capmatinib, GDC0941, or both and assessed by methyl-thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay. (C) ZORG cells were serum-starved for 24 hours and treated for 30 minutes with dimethylsulfoxyde (DMSO), 1 µM capmatinib, 1 µM GDC0941, or capmatinib plus GDC0941 (at 1 µM each) and hepatocyte growth factor at 50 ng/mL. Western blot analyses with the indicated antibodies were performed on cell lysates. Tubulin was used as loading control.

Proliferation of these cells thus seems to depend strictly on the PI3K pathway (Fig. 5A). In contrast, treating T47DMETex14 cells with GDC0941 only slowed down cell growth. Capmatinib alone slightly increased cell growth. To achieve full cell growth arrest, combining GDC0941 with capmatinib was required. This suggests that proliferation of these cells relies on both the PI3K and MET pathways.

Analysis of the signaling pathways revealed that PI3K activation depends partly on MET activation in T47DMETex14 cells but not in T47D cells. ERK activation was found to depend strictly on MET activation. It proved necessary to combine MET and PI3K inhibitors to fully inhibit both AKT and ERK activation (Fig. 5B). For the T47DMETex14 cells, the IC₅₀ for capmatinib shifted from over 10 µM, when the inhibitor was used alone, to 0.007 µM, when it was used in combination with GDC0941 (Fig. 5C).

Taken together, these results reveal that *METex14* can induce MET addiction even in the presence of a concurrent oncogene mutation, such as a *PIK3CA* mutation, and that this leads to resistance to a MET or PI3K inhibitor used alone. Combined inhibition thus seems required in the case of concurrent alterations activating MET and a second signaling pathway.

## Discussion

*METex14* mutations define a new subgroup of patients with NSCLC who may benefit from targeted therapies against MET. Several MET TKIs have been found to have efficacy in ongoing clinical trials for patients with *METex14* NSCLC, with 32% to 67.9% ORR and a 7.3- to 10.8-month median progression-free survival.⁶⁻⁹ Yet, the observed ORR is lower than that for TKI treatment of EGFR-mutated or ALK-rearranged NSCLC, usually found to be 70% to 80%. Accordingly, the proportion of patients with *METex14*
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 4.** Inhibition of phosphoinositide 3-kinases (PI3K) restores sensitivity to a hepatocyte growth factor receptor (MET) tyrosine kinase inhibitor (TKI) in a *METex14* cell line with a *PIK3CA* mutation. (A) Viability curves of H596 cells treated with increasing doses of MET TKI. Viability was assessed by methyl-thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay. IC₅₀ values were calculated with GraphPad Prism version 5.01, as the means of three independent experiments. (B) IncuCyte analysis of proliferation measured as confluence per well of H596 cells treated with dimethylsulfoxide (DMSO), capmatinib, GDC0941, or capmatinib plus GDC0941 (each at 0.5 or 1 µM) and hepatocyte growth factor at 20 ng/ml. Results are presented as means ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was calculated with the Wilcoxon test. (C) MET expression and downstream signaling were investigated in H596 cell line by Western blotting. For 30 minutes before lysis, serum-starved cells were treated with each inhibitor alone and with both combined. (D) Dose-response curve of H596 cells treated for 3 days with capmatinib, GDC0941, or both and assessed by MTT assay.</figcaption></figure>

NSCLC having progressive disease as best response to MET TKIs ranged up to 32%,⁶⁻⁹ suggesting that these cancers are not driven by MET-dependent mechanisms only.

Primary resistance of oncogene-addicted cancers to targeted therapies may have several causes, including concurrent genomic alterations.²⁰ In this study, based on a cohort of 65 patients with *METex14* NSCLC, we find that alterations in the PI3K pathway, including PTEN loss and *PIK3CA* mutations, are common and can be associated with resistance to MET TKIs. We confirm here, using a patient-derived cell line combining *METex14* mutation with PTEN loss, that PI3K pathway alterations confer resistance to type I and type II MET TKIs. Importantly, we found that adding a PI3K inhibitor to the treatment can restore the sensitivity of these cells to the MET TKI. Similar results are obtained with *METex14* cells harboring a concurrent *PIK3CA* mutation. Overall, our data suggest that alteration of the PI3K pathway is one of the main mechanisms of primary resistance to MET TKIs in *METex14* NSCLC.

The most common PI3K pathway alteration observed in our cohort was PTEN loss. PTEN loss has been reported in 8% to 42.4% of patients with NSCLC, but previous studies have included different populations and used various thresholds for PTEN expression (stained cells 0%,²¹ <10%,²² or <50% of all cancer cells²³). The frequency of PTEN loss in oncogene-addicted NSCLC is poorly known. PTEN mutations have been reported in 5% of EGFR-mutated NSCLC,²⁴ and homozygous deletion of PTEN has been reported in one of 24 patients with EGFR-mutated NSCLC.²⁵ The wide diversity of genetic and epigenetic alterations affecting PTEN makes it hard to get a comprehensive molecular profile of the *PTEN* gene. This explains why IHC has emerged as an attractive and reliable technique for detecting PTEN loss. Like Soria et al.,²¹ we have chosen to define PTEN loss as the total absence of PTEN expression (0% stained cells). Using this criterion, we found a 23% rate of PTEN loss. One should note that as IHC misses PTEN mutations leading to loss of function without loss of expression, the
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 5.** Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit alpha (PIK3CA) mutations contribute to hepatocyte growth factor receptor (MET) inhibitor resistance in METex14 cells. (A) IncuCyte analysis of proliferation, measured as confluence per well, of T47D parental cells versus T47DMETex14 cells treated with imethylsulfoxyde (DMSO), capmatinib, GDC0941, or capmatinib plus GDC0941 (at 0.5 or 1 µM each) and hepatocyte growth factor at 20 ng/mL. Results are presented as means ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was calculated with the Wilcoxon test. (B) METexpression and downstream signaling were investigated in T47D and T47DMETex14 cell lines by Western blotting. For 30 minutes before lysis, serum-starved cells were treated with each inhibitor alone and with both combined. (C) Dose-response curve of T47DMETex14 cells treated for 3 days with capmatinib, GDC0941, or both and assessed by methyl-thiazolyl-tetrazolium (MTT) assay.</figcaption></figure>

rate of true PTEN loss may be underestimated in our cohort. The functional consequences of PTEN loss on responses to TKIs in oncogene-addicted cancers are still largely unknown.²⁶ In patients with EGFR-mutated NSCLC, PTEN expression is associated with prolonged survival.²⁷ In METex14 NSCLC, the impact of PTEN loss has never been addressed so far. Our results strongly suggest that PTEN loss contributes to resistance to MET TKIs in METex14 cancer cells through sustained activation of the PI3K pathway.

PIK3CA mutations are found in 4% to 5% of NSCLCs¹¹⁻¹³ and can occur concurrently with other oncogenic drivers, such as EGFR and KRAS.²⁸ EGFR-mutated NSCLC is the only oncogene-addicted NSCLC in which the impact of PIK3CA mutations on responses to TKIs has been studied, and results remain controversial. Preclinical data suggest that the PIK3CA mutation E545K decreases sensitivity of EGFR-mutated cells to EGFR TKIs.²⁹ Moreover, PIK3CA mutations were initially proposed as an acquired mechanism of resistance to EGFR TKI in patients with EGFR-mutated NSCLC³⁰ and were recently found in 3% of patients showing disease progression after first-line osimertinib.³¹ Yet, recent

findings indicate that the PIK3CA mutation rate in patients with EGFR-mutated NSCLC is similar whether the patients have been treated with EGFR TKIs or not.³² This suggests a limited role of PIK3CA mutations in resistance to EGFR TKIs. For patients with EGFR-mutated NSCLC, Eng et al.³³ report worse overall survival in the presence than in the absence of a concurrent PIK3CA mutation, but these authors observed no significant difference in ORR or time to progression in patients on EGFR TKIs. Our present findings suggest that alterations in the PI3K pathway may be associated with resistance to MET TKIs, because all the patients with METex14 NSCLC whose tumors harbored such an alteration displayed disease progression as best response on MET TKIs. The view that alterations of the PI3K pathway are involved in resistance to MET TKIs is further validated by our results obtained with cell lines, including a patient-derived cell line.

Besides the PI3K pathway alterations, other concurrent molecular alterations have been described in METex14 NSCLC, including KRAS mutation and amplification, murine double minute 2 (MDM2) amplification, murine double minute 2 (TP53) mutation, and EGFR
mutation. Frampton et al.³⁴ and Awad et al.³ found a concurrent alteration in 100 of 114 (88%) and 26 of 28 (92%) *METex14* samples, respectively. This high frequency of concurrent molecular aberrations may reflect the higher rate of smokers and elderly among patients with *METex14* NSCLC than those with EGFR-mutated or ALK-rearranged NSCLC. Interestingly, concurrent alterations may also impair the response to MET TKIs. Recently, *KRAS* mutations were found in 4.4% of patients with *METex14* NSCLC, and most of these mutations were identified before any treatment with MET TKI.³⁵ Amplification of wild-type *KRAS* has also been described in patients with *METex14* NSCLC as a mechanism of primary and acquired resistance.³⁵,³⁶ Thus, extensive molecular profiling of *METex14* tumors seems important in identifying patients who may benefit from MET TKIs, and this profiling should include screening for PTEN loss and *PIK3CA* mutations.

We find here that a combination of MET and PI3K inhibitors can inhibit the proliferation of cells harboring a *METex14* mutation and a concurrent *PIK3CA* mutation or PTEN loss. As *PIK3CA* mutations and PTEN loss lead to activation of the PI3K pathway, these results suggest that PI3K pathway alterations cause resistance to MET TKIs. Interestingly, Bahcall et al.³⁶ have found that the same combination can inhibit tumor growth in *METex14* tumors with concurrent wild-type *KRAS* amplification. Taken together, these results strongly suggest that a combination of MET and PI3K inhibitors might overcome several mechanisms of resistance to MET TKIs in *METex14* NSCLC. So far, in the clinical setting, the use of panPI3K inhibitors, either alone or in combination, has been hindered by safety issues.³⁷ A phase I study evaluating a combination of capmatinib and buparlisib in adult patients with recurrent glioblastoma was discontinued because of poor tolerance.³⁸ Yet, more selective drugs have recently been developed and might offer a better safety profile with promising activity. This would pave the way for future combinations.

In conclusion, although *METex14* mutations are associated with efficacy of MET TKIs in a number of patients, concurrent alterations can frequently occur and may impair the response to MET inhibition. Our results suggest that the PI3K pathway alterations are common and should be screened to identify patients most likely to benefit from MET TKIs. Combining MET and PI3K inhibitors could overcome resistances owing to PI3K pathway alterations.

## Acknowledgments

This work received French financial support from the Centre National de la Recherche Scientifique, the Institut Pasteur de Lille, the INSERM, the University of Lille, the

Cancéropôle Nord-Ouest, (n°54551) the Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE17-0020-05), and the Groupe Pasteur Mutualité. The authors thank Laurence Stechly for assistance in the screening of tumor samples by next-generation sequencing. The authors thank the Microscopy-Imaging-Cytometry Facility of the BioImaging Center Lille Nord-de-France for access to instruments and technical advice.

## Supplementary Data

Note: To access the supplementary material accompanying this article, visit the online version of the *Journal of Thoracic Oncology* at www.jto.org and at https://doi.org/10.1016/j.jtho.2020.01.027.

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<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure S1</figcaption></figure>
A

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

<table><thead><tr><th>MET TKI</th><th>T47DMETex14<br>IC50 (µM)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Capmatinib</td><td>&gt;10</td></tr><tr><td>Tepotinib</td><td>7.6<br>[5.5-10]</td></tr><tr><td>Crizotinib</td><td>2.0<br>[1.59-2.67]</td></tr><tr><td>Foretinib</td><td>2.3<br>[1.51-3.68]</td></tr></tbody></table>
**Table S1** Molecular characterization of the 65 NSCLC patients whose tumors harbored *METex14* mutations. Histological type was determined after hematin/eosin/safran staining. *METex14* mutations and other molecular alterations were diagnosed on FFPE tumor samples with the targeted CLAPv1 NGS Panel. The PTEN expression status established by immunohistochemistry is indicated when determined.

<table><thead><tr><td>Gene</td><td>Reference sequence</td><td>Exons analyzed</td></tr></thead><tbody><tr><td>ACVR1</td><td>NM_001105.4</td><td>6-9</td></tr><tr><td>AKT1</td><td>NM_005163.2</td><td>3</td></tr><tr><td>ALK</td><td>NM_004304.4</td><td>22 23 24 25</td></tr><tr><td>BRAF</td><td>NM_004333.4</td><td>11 15</td></tr><tr><td>CTNNB1</td><td>NM_001904.3</td><td>3</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>NM_005228.3</td><td>12 18 19 20 21</td></tr><tr><td>ERBB2</td><td>NM_004448.3</td><td>8 19 20 21</td></tr><tr><td>ERBB4</td><td>NM_005235.2</td><td>3</td></tr><tr><td>FGFR1</td><td>NM_023110.2</td><td>4 7 12 14</td></tr><tr><td>FGFR2</td><td>NM_000141.4</td><td>7 9 12 14</td></tr><tr><td>FGFR3</td><td>NM_000142.4</td><td>7 9 14 16 18</td></tr><tr><td>GNA11</td><td>NM_002067.4</td><td>4 5</td></tr><tr><td>GNAQ</td><td>NM_002072.4</td><td>4 5</td></tr><tr><td>GNAS</td><td>NM_000516.5</td><td>8</td></tr><tr><td>H3F3A</td><td>NM_002107.4</td><td>2</td></tr><tr><td>H3F3B</td><td>NM_005324.4</td><td>3</td></tr><tr><td>HIST1H3B</td><td>NM_003537.3</td><td>1</td></tr><tr><td>HIST1H3C</td><td>NM_003531</td><td>1</td></tr><tr><td>HRAS</td><td>NM_005343.2</td><td>2 3 4</td></tr><tr><td>IDH1</td><td>NM_005896.2</td><td>4</td></tr><tr><td>IDH2</td><td>NM_002168.3</td><td>4</td></tr><tr><td>KIT</td><td>NM_000222.2</td><td>8 9 11 13 14 17 18</td></tr><tr><td>KRAS</td><td>NM_033360.3</td><td>2 3 4</td></tr><tr><td>MAP2K1</td><td>NM_002755.3</td><td>2 3 6</td></tr><tr><td>MET</td><td>NM_001127500.1</td><td>2 14 15 16 17 18 19 20</td></tr><tr><td>NRAS</td><td>NM_002524.4</td><td>2 3 4</td></tr><tr><td>PDGFRA</td><td>NM_006206.4</td><td>12 14 18</td></tr><tr><td>PIK3CA</td><td>NM_006218.2</td><td>2 3 8 10 14 21</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>NM_000314.6</td><td>1 3 5 6 7 8</td></tr><tr><td>PTPN11</td><td>NM_001330437.1</td><td>3 7 8</td></tr><tr><td>SMAD4</td><td>NM_005359.5</td><td>4 6 8 9 10 11 12 13</td></tr><tr><td>TP53</td><td>NM_000546.5</td><td>2 4 5 6 7 8 10</td></tr></tbody></table>
<table><caption>**Table S2** Targeted NGS CLAPv1 panel genes.</caption><thead><tr><th>Patient identification</th><th>PTEN expression</th><th>Topography</th></tr></thead><tbody><tr><td>CHUL#1</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#2</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic</td></tr><tr><td>CHUL#3</td><td>Positive</td><td>Nuclear and nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#7</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#9</td><td>Negative</td><td></td></tr><tr><td>CHUL#11</td><td>Negative</td><td></td></tr><tr><td>CHUL#13</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic</td></tr><tr><td>CHUL#14</td><td>Negative</td><td></td></tr><tr><td>CHUL#15</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#18</td><td>Negative</td><td></td></tr><tr><td>CHUL#31</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#33</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#34</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic</td></tr><tr><td>CHUL#35</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic</td></tr><tr><td>CHUL#38</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#40</td><td>Positive</td><td>Nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#43</td><td>Positive</td><td>Nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#44</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic</td></tr><tr><td>CHUL#47</td><td>Positive</td><td>Nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#48</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#50</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#54</td><td>Negative</td><td></td></tr><tr><td>CHUL#55</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic and nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#56</td><td>Positive</td><td>Nucleolar</td></tr><tr><td>CHUL#57</td><td>Positive</td><td>Cytoplasmic, nucleolar and nuclear</td></tr><tr><td>CHUL#65</td><td>Negative</td><td></td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Table S3** PTEN immunohistochemistry of patient tumor samples. The expression and distribution of PTEN expression were evaluated for 26 *METex14*-mutated NSCLC tumors.</caption><thead><tr><th>Cell line</th><th>Site</th><th>Histology</th><th>Mutations</th></tr></thead><tbody><tr><td>ZORG</td><td>Lung</td><td>Sarcomatoid carcinoma</td><td>METex14 (c.3082+1G>T)/PTEN negative</td></tr><tr><td>H596</td><td>Lung</td><td>Adenocarcinoma</td><td>METex14 (c.3251+1 G>T)/PIK3CA E544K</td></tr><tr><td>A549</td><td>Lung</td><td>Adenocarcinoma</td><td>KRAS G12S</td></tr><tr><td>PC9</td><td>Lung</td><td>Adenocarcinoma</td><td>EGFR E746-A750del</td></tr><tr><td>GTL16</td><td>Gastric</td><td>Adenocarcinoma</td><td>MET amplification</td></tr><tr><td>T47D</td><td>Breast</td><td>Ductal carcinoma</td><td>PIK3CA H1047F</td></tr><tr><td>Hs746T</td><td>Gastric</td><td>Adenocarcinoma</td><td>METex14 (c.3082+1G>T)/MET amplification</td></tr></tbody></table>

<caption>**Table S4** Cell lines characteristics. The site of derivation and histological subtype are indicated</caption>
Figure S1

PTEN negative panel indicate undetectable PTEN in FFPE sections from five patients; PTEN positive panel indicate expression of PTEN in tumor specimens from 1 representative *METex14* NSCLC patients.

**Figure S2 (A)** Agarose gel electrophoresis of amplicons generated by fluorescence reverse-transcription PCR. Amplicons from cell lines expressing a MET-exon-14-skipping alteration (T47DMETex14, H596, and ZORG) migrate to the expected position, corresponding to a size of 128 bp, whereas a wild-type MET amplicon (T47D or GTL16) migrates to 286 bp. **(B)** Viability curves of T47DMETex14 cells treated for three days with increasing doses of the MET TKI capmatinib, crizotinib, tepotinib, or foretinib before the MTT assay.
## Response to capmatinib in a MET fusion-positive cholangiocarcinoma

Anthony Turpin¹, Clotilde Descarpentries², Valérie Grégoire³, Olivier Farchi², Alexis B Cortot⁴*, Philippe Jamme⁵*

1. Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, UMR9020 - UMR-S 1277 - Canther - Cancer Heterogeneity, Plasticity and Resistance to Therapies, Lille, France; Medical Oncology Department, CHU Lille, University of Lille, Lille, France.

2. Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, UMR9020 - UMR-S 1277 - Canther - Cancer Heterogeneity, Plasticity and Resistance to Therapies, Lille, France; Department of Biochemistry and Molecular Biology, Hormonology Metabolism Nutrition Oncology, CHU Lille, University of Lille, Lille, France.

3. Univ. Lille, CHU Lille, Pathology department, Lille, France.

4. Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, UMR9020 - UMR-S 1277 - Canther - Cancer Heterogeneity, Plasticity and Resistance to Therapies, Lille, France; Thoracic Oncology Department, CHU Lille, University of Lille, Lille, France.

5. Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, UMR9020 - UMR-S 1277 - Canther - Cancer Heterogeneity, Plasticity and Resistance to Therapies, Lille, France; Dermatology Department, CHU Lille, University of Lille, Lille, France.
## Introduction

Cholangiocarcinoma is the second most common liver cancer after hepatocellular carcinoma. In case of metastatic or unresectable disease, the recommended first-line treatment is platinum-based chemotherapy. There is no standard treatment for further lines. The prognosis remains poor with a median survival of less than 12 months (1). Several targeted therapies are currently being evaluated including FGFR, IDH1, PARP, ROS1, ALK and BRAF inhibitors (2). MET inhibitors have also been tested in cholangiocarcinoma. Cabozantinib, a non-specific MET tyrosine kinase inhibitor (TKI), was evaluated as a single agent in a phase 2 trial in patients with chemotherapy-refractory cholangiocarcinoma, but showed poor efficacy (median PFS 1.7 months, median OS 5.2 month (3). Tivantinib, another non-specific MET TKI, was evaluated in a phase I trial in combination with gemcitabine in patients with solid tumor. Eight patients with cholangiocarcinoma were included and one partial response was observed (4). These disappointing results may be due to the lack of specificity of these MET TKIs on the one hand, and the absence of any biomarker-based selection of patients on the other hand.

Here, we present the case of a patient with chemotherapy-refractory metastatic cholangiocarcinoma harboring a CAPZA-2-MET fusion along with MET amplification who dramatically responded to capmatinib, a specific MET TKI.

## Case presentation

In January 2019, a 49 years old male with no medical history was diagnosed with stage IV intrahepatic cholangiocarcinoma which was revealed by painful osteolytic metastases. MRI showed typical features of intrahepatic cholangiocarcinoma. He received radiation therapy on main bone metastases and a first-line chemotherapy cisplatin and gemcitabine (Gemcis protocol) which yielded an objective response that lasted 6 months. He then received a second-line chemotherapy with mFOLFOX but had disease progression at first radiological assessment.

A liver rebiopsy was performed to obtain tissue for molecular analysis. A comprehensive molecular analysis was performed using the Oncomine Comprehensive Assay (OCA V3) which revealed a fusion between exon 1 of CAPZA2
and exon 6 of MET (Figure1). The CAPZA2-MET fusion was predicted to lead to a chimeric protein with an intact MET kinase domain. Molecular analysis also detected a TP53 mutation (c.991C>T) and a RB1 mutation (c.[2087G>C;2099T>C]). FISH analysis revealed an elevated MET gene copy number (GCN) of 6.3, with a low ratio of GCN between MET and centromere of chromosome 7 of 2.1. IHC analysis revealed a high MET expression (100%).

Following multidisciplinary discussion in a molecular tumor board, and taking into account the lack of any approved alternative treatment and the efficacy of MET TKIs in cancer patients harboring a MET fusion, it was decided to propose the patient for a compassionate use of capmatinib.

Treatment with capmatinib (400 mg bid) was started on January 2020 in the context of an expanded access program. The first radiological assessment performed 2 months later showed a partial response (-36%) (Figure 2). Tolerance was good. However, the following radiological assessment performed 4 months after starting capmatinib showed progression of the primary tumor with stable bone lesions. Radiation therapy on the primary tumor was performed. Capmatinib was withdrawn during radiation therapy and then resumed. At the same time, a new liver biopsy and a circulating free DNA analysis were performed. Analysis of the tumor biopsy did not reveal the MET fusion anymore, but the TP53 and RB1 mutations were still detected. Circulating free DNA revealed the presence of TP53 and RB1 mutations and an additional MET domain kinase mutation D1228N. A new CT scan performed 2 months after the end of radiation therapy showed stable disease.

Discussion

Here we describe for the first time a case of response to MET TKI in a cholangiocarcinoma patient with a CAPZA-2-MET fusion.

MET alterations are rare in cholangiocarcinoma. MET amplifications and mutations are found in 2% and 0.7% of all cases, respectively (5,6). MET fusion-positive cholangiocarcinoma has been described only once in a 41-year-old patient with a EHBP1-MET fusion (7). Clinical studies evaluating MET inhibitors have failed so far. However, none of these studies has selected patients according to their molecular
status. However, MET alterations have been associated with efficacy of MET TKI in other types of cancer. In non small cell lung cancer (NSCLC), MET mutations affecting the splice sites of exon 14 are predictive of efficacy of capmatinib or tepotinib, two new-generation specific MET TKIs (Paik et al. NEJM 2020; Wolf et al. NEJM 2020). MET amplifications have also been found to predict efficacy of capmatinib in NSCLC, only in case of high-level amplification (GCN ≥10). In the present case, although GCN was increased, the ratio between MET and CEP7 was only 2.1, indicating a low-level of MET amplification. Such levels of MET amplification are usually associated with the presence of other oncogenic driver mutations and are not predictive of activity of MET inhibitors, suggesting that this amplification had no role in the response to capmatinib in the present case (Noonan et al. JTO 2016; Wolf et al. NEJM 2020).

MET fusions have been described at a low frequency in various cancers such as NSCLC, glioma, melanoma, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. To date, more than ten MET fusion partners have been identified. The most frequent *fusion* gene partners described are HLA-DRB1 (HLA class II histocompatibility antigen, DRB1 beta chain), CAPZA2 (F-actin-capping protein subunit alpha-2) and KIF5B (Kinesin-1 heavy chain). Clinical cases have reported clinical activity of MET TKI in MET fusion-positive tumors (8).

We have identified two potential mechanisms of resistance in this patient. First, we found the emergence of a MET D1228N kinase domain mutation on circulating free DNA. MET kinase mutations have already been described as a potential mechanism of resistance to MET TKIs in MET-driven cancers. Preclinical data have demonstrated a variable sensitivity to MET TKI according to the type of MET kinase mutation (9). The D1228X mutations are predicted to be resistant to Type I MET TKIs but sensitive to Type II MET TKIs. However, clinical data are still sparse which prevented us to use a type II TKI in this patient(9).

The second potential mechanism of resistance in this patient was the loss of MET fusion based on the biopsy performed at progression. Loss of the fusion has been previously proposed as a mechanism of resistance to targeted therapies but has never been reported with MET fusions. In this patient, MET fusion was initially detected at a
low frequency and was not detected at progression anymore, suggesting that the
fusion could be present as a sub-clonal variant. This hypothesis could explain the short
response observed on capmatinib.

Finally, we did not observe any adverse due to capmatinib in this patient, apart from a
grade I asthenia. Contrary to multikinase inhibitors, capmatinib is usually well tolerated.
The most common adverse events reported in METex14 NSCLC patients treated with
capmatinib were peripheral edema, nausea, and vomiting. However, these patients
were mostly elderly and had comorbidities, which may explain why tolerance was
better in this patient.

Overall, these results support molecular testing in cholangiocarcinoma patients, as
recently recommended (10). The low rate of MET alterations in this setting could justify
a basket clinical trial.

References

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8. Plenker D, Bertrand M, de Langen AJ, Riedel R, Lorenz C, Scheel AH, et al. Structural alterations of MET trigger response to MET kinase inhibition in lung adenocarcinoma patients. Clin Cancer Res [Internet]. 2018 Mar 15 [cited 2020 Sep 10];24(6):1337-43. Available from: http://clincancerres.aacrjournals.org/

9. Fujino T, Kobayashi Y, Suda K, Koga T, Nishino M, Ohara S, et al. Sensitivity and Resistance of MET Exon 14 Mutations in Lung Cancer to Eight MET Tyrosine Kinase Inhibitors In Vitro. J Thorac Oncol [Internet]. 2019 Oct [cited 2019 Oct 11];14(10):1753-65. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1556086419305519

10. Mosele F, Remon J, Mateo J, Westphalen CB, Barlesi F, Lolkema MP, et al. Recommendations for the use of next-generation sequencing (NGS) for patients with metastatic cancers: a report from the ESMO Precision Medicine Working Group. Vol. 31, Annals of Oncology. Elsevier Ltd; 2020. p. 1491-505.
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 1:** Schematic representation of CAPZA2-MET fusion.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure 2:** Computed tomography (CT) scan of the abdomen/pelvis performed between March 2019 and April 2020.</figcaption></figure>
# Relevance of Detection of Mechanisms of Resistance to ALK Inhibitors in ALK-Rearranged NSCLC in Routine Practice

Philippe Jamme,<sup>1,2</sup> Clotilde Descarpentries,<sup>3</sup> Radj Gervais,<sup>4</sup> Eric Dansin,<sup>5</sup> Marie Wislez,<sup>6</sup> Valérie Grégoire,<sup>7</sup> Nicolas Richard,<sup>8</sup> Simon Baldacci,<sup>1</sup> Nathalie Rabbe,<sup>6</sup> Maeva Kyheng,<sup>9</sup> Zoulika Kherrouche,<sup>2</sup> Fabienne Escande,<sup>3</sup> Marie Christine Copin,<sup>2,7</sup> Alexis B. Cortot<sup>1,2</sup>

## Abstract

Anaplastic lymphome kinase (ALK) mutations are responsible for resistance to ALK tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in ALK-rearranged non-small-cell lung cancer but their frequency and relevance has not been assessed in routine practice. In this retrospective multicenter study, the ALK mutation rate was 15% and 33% after failure of treatment with 1 and 2 TKIs, respectively. Most of the patients harboring an ALK mutation achieved an objective response with subsequent ALK TKI treatment.

**Background:** Anaplastic lymphoma kinase (ALK) tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have shown efficacy in the treatment of ALK-rearranged non-small-cell lung cancer (NSCLC), but the disease eventually progresses in all patients. In many cases, resistance to ALK TKIs arises through ALK mutations. Although clinical and biological data suggest variations in TKI efficacy according to the mechanism of resistance, ALK mutations are still rarely investigated in routine practice. **Materials and Methods:** We performed a retrospective multicentric study with an aim to determine the frequency and clinical relevance of ALK alterations detected using targeted next-generation sequencing in patients with advanced ALK-rearranged NSCLC after progression during an ALK TKI treatment. Data on clinical, pathological, and molecular characteristics and patient outcomes were collected. **Results:** We identified 23 patients with advanced ALK-rearranged NSCLC who, between January 2012 and May 2017, had undergone at least 1 repeat biopsy at progression during an ALK TKI treatment. A resistance mechanism was identified in 9 of the 23 patients (39%). The anomalies involved included 9 ALK mutations in 8 patients and one ALK amplification. The ALK mutation rate was 15% after failure of a first ALK TKI and 33% after failure of 2 ALK TKI treatments. Five of 7 patients who received a different ALK TKI after detection of an ALK mutation achieved an objective response. All of the patients who received a TKI presumed to act on the detected ALK mutant achieved disease control. **Conclusion:** Targeted next-generation sequencing is suitable for detecting ALK resistance mutations in ALK-rearranged NSCLC patients in routine practice. It might help select the best treatment at the time of disease progression during treatment with an ALK TKI.

*Clinical Lung Cancer, Vol. 20, No. 4, 297-304 © 2019 Elsevier Inc. All rights reserved.*

**Keywords:** Anaplastic lymphoma kinase, Lung neoplasm, Mutation, Real-world evidence, Resistance

<footnote n="1"><sup>1</sup>Thoracic Oncology Department, Univ. Lille CHU Lille, Lille, France</footnote>

<footnote n="2"><sup>2</sup>UMR 8161 M3T Mechanisms of Tumorigenesis and Targeted Therapies, Univ. Lille CNRS Institut Pasteur de Lille, Lille, France</footnote>

<footnote n="3"><sup>3</sup>Oncology and Molecular Genetics-Laboratory Division of Biochemistry and Molecular Biology, CHU Lille Univ. Lille, Lille, France</footnote>

<footnote n="4"><sup>4</sup>Thoracic Oncology Department, Centre François Bادesse, Caen, France</footnote>

<footnote n="5"><sup>5</sup>Head and Neck and Thoracic Cancers Department, Centre Oscar Lambret, Lille, France</footnote>

<footnote n="6"><sup>6</sup>Service de Pneumologie, AP-HP Hôpital Tenon Sorbonne Universités- UPMC Univ Paris 06 -GRC n°04 Theranoscan, Paris, France</footnote>

<footnote n="7"><sup>7</sup>Institut de Pathologie, Univ. Lille CHU Lille, Lille, France</footnote>

<footnote n="8"><sup>8</sup>Department of Genetics-Molecular Genetics Laboratory UNICAEN EA7450 Bio-TARGen, Caen Normandy University CHU de Caen, Caen, France</footnote>

<footnote n="9"><sup>9</sup>EA 2694 Santé publique: épidémiologie et qualité des soins, Univ. Lille CHU Lille, Lille, France</footnote>

<footnote>Submitted: Sep 5, 2018; Revised: Jan 2, 2019; Accepted: Feb 16, 2019; Epub: Feb 26, 2019</footnote>

<footnote>Address for correspondence: Alexis B. Cortot, MD, PhD, Hôpital Calmette, CHRU Lille, Boulevard du Professeur Lederq, 59037 Lille, France
Fax: +33 3 20 44 56 11; e-mail contact: alexis.cortot@chru-lille.fr</footnote>
# Resistance to ALK Inhibitors in Routine Practice

## Introduction

Anaplastic lymphome kinase (ALK) rearrangements are found in approximately 4% of nonsquamous non-small-cell lung cancer (NSCLC).¹ The fusion protein resulting from ALK rearrangements has a constitutively activated ALK kinase leading to activation of downstream signaling pathways involved in cell proliferation and cell survival.²,³ The discovery of ALK rearrangements has led to the development of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) targeting the ALK kinase. Crizotinib and ceritinib have shown superiority over chemotherapy in untreated advanced ALK-rearranged NSCLC patients, and alectinib has shown superiority over crizotinib in the same context.⁴⁻⁶ Several TKIs have proved active after failure of crizotinib treatment, including ceritinib, alectinib, brigatinib, and lorlatinib.⁷⁻¹⁰

Mechanisms of resistance to ALK TKIs in ALK-rearranged NSCLC patients are partly known and are of 2 main types: (1) on-target mechanisms, including mutation of the ALK kinase domain and amplification of the ALK-rearranged gene, and (2) off-target mechanisms, including activation of an alternative signaling pathway such as epidermal growth factor receptor (EGFR) or stem cell growth factor receptor (SCFR/KIT) and pathological transformation.¹¹

Anaplastic lymphome kinase mutations are the main cause of resistance to ALK TKIs. With high-throughput methods of detection,¹¹ they are found in 20% to 50% of tumor samples obtained at the time of progression during treatment with an ALK TKI. Numerous ALK kinase mutations can confer resistance to ALK TKIs in ALK-rearranged NSCLC,¹²⁻¹⁹ and the frequency and type of ALK mutations detected at the time of progression depend on the type of ALK TKI received.¹¹ Thus, each ALK TKI has its own spectrum of activity against ALK kinase mutants,²⁰ and a given ALK kinase mutant is not resistant to all ALK TKIs. For example, the L1196M mutation is reported to confer resistance only to crizotinib, the C1156Y mutation is associated with resistance to crizotinib and ceritinib but remains sensitive to alectinib and brigatinib, and the G1202R mutation leads to resistance to most ALK TKIs but not to lorlatinib.²¹⁻²⁴

Thus, identifying the mechanism of resistance to an ALK TKI might help in choosing the most appropriate treatment after disease progression during treatment with that ALK TKI, particularly because several ALK inhibitors are now available for use in this context. Herein we show that targeted next-generation sequencing (NGS) performed in routine practice is suitable and relevant for detecting ALK mutations in tumor tissue samples or circulating tumor DNA from ALK-positive NSCLC patients whose disease has progressed after treatment with an ALK TKI.

## Materials and Methods

### Study Design and Patients

In this observational, multicentric, retrospective study, we identified patients with advanced ALK-positive NSCLC from whom tumor samples had been obtained at the time of disease progression during treatment with an ALK TKI as part of the routine procedure. Tissue biopsies and circulating tumor DNA samples were considered. Clinical and molecular data were collected retrospectively at each center. The investigators used Response Evaluation Criteria In Solid Tumors 1.1 to evaluate responses to ALK TKIs. The objective

response rate was defined as the rate of complete or partial response. The disease control rate was defined as the rate of complete or partial response or stable disease. Overall survival was calculated from the start of the first ALK TKI treatment received.

All of the data reported in this study were extracted from a database approved by the French National Data Protection Authority. This noninterventional study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki and Good Clinical Practice guidelines. It was approved by a national ethics committee and by the French Advisory Committee on Information Processing Related to Research in the Field of Health. All included patients received information from their referring physician.

### Detection of ALK Mutations

Targeted NGS analysis was conducted using the NGS commercial panel "Ion AmpliSeq Colon and Lung Research Panel V2" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) at 2 molecular centers certified by the French National Cancer Institute. In the case of tissue samples, genomic DNA was extracted from formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) samples received in the 2 laboratories between February 2012 and February 2017. DNA was extracted using the QIAamp FFPE tissue kit (Qiagen, Duesseldorf, Germany) according to the manufacturer's instructions. In the case of blood samples, cell-free DNA was extracted from plasma with the QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. Extracted DNA was quantified with the Quant-it PicoGreent dsDNA Assay Kit (Thermofisher Scientific) using a Xenius XC spectrofluorometer (Safas Monaco, Monaco). AmpliSeq libraries were prepared with the Ion AmpliSeq Library Kit 2.0 Ion Xpress barcode adapters kit, primers (Ion AmpliSeq custom panel or Colon and Lung V2; Thermofisher Scientific), and 10 ng or less of each DNA sample according to the manufacturer's instructions (see Supplemental Table 1 in the online version). Emulsion polymerase chain reaction, enrichment, and chip loading were performed using an Ion Chef instrument with the Ion PI Hi-Q Chef Kit or the Ion 540 Chef Kit (Thermofisher Scientific). Samples were sequenced with Ion PI chips using an Ion Proton System or Ion 540 chips on the Ion S5XL system (Thermofisher Scientific). Data were analyzed using the Torrent suite software version 5.2.2 (Thermofisher Scientific). For the ALK, EGFR, and Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog (KRAS) genes, manual inspection of sequences was done using an integrative genomic viewer.

### Statistical Analysis

Quantitative variables are expressed as mean (SD) in the case of a normal distribution or as median (interquartile range) otherwise. Categorical variables are expressed as numbers (percentages). The normality of distributions was assessed using histograms and the Shapiro-Wilk test. Survival rates were calculated from the date of introduction of the first ALK TKI until the date of death or last news and derived from Kaplan-Meier survival curves. Medians of survival were calculated with confidence intervals. Statistical testing was conducted at a 2-tailed α level of .05. Data were analyzed using SAS software version 9.4 (SAS Institute, Cary, NC).

## Results

The study included 23 patients with advanced ALK-positive NSCLC who had undergone at least 1 biopsy at the time of disease
<table><caption>**Table 1** Baseline Characteristics (n = 23)</caption><thead><tr><th>Characteristic</th><th>Value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Median Age (Range), Years</td><td>57 (17-70)</td></tr><tr><td>Sex, n (%)</td><td></td></tr><tr><td>Male</td><td>12 (52)</td></tr><tr><td>Female</td><td>11 (48)</td></tr><tr><td>Adenocarcinoma, n (%)</td><td>23 (100)</td></tr><tr><td>Stage at Diagnosis, n (%)</td><td></td></tr><tr><td>III</td><td>2 (9)</td></tr><tr><td>IV</td><td>21 (91)</td></tr><tr><td>Never Smoker, n (%)</td><td>19 (83)</td></tr><tr><td>Number of Lines of Treatment Before First ALK TKI, n (%)</td><td></td></tr><tr><td>0</td><td>7 (30)</td></tr><tr><td>1</td><td>13 (57)</td></tr><tr><td>2 or more</td><td>3 (13)</td></tr><tr><td>Type of ALK TKI Received, n (%)</td><td></td></tr><tr><td>First generation</td><td>22 (96)</td></tr><tr><td>Second generation</td><td>17 (74)</td></tr><tr><td>Third generation</td><td>3 (13)</td></tr></tbody></table>

Abbreviations: ALK = anaplastic lymphoma kinase; TKI = tyrosine kinase inhibitor.

progression during treatment with an ALK TKI between January 2012 and May 2017 (Table 1). The patients were mostly never smokers (n = 19; 83%) and the median age was 57.0 years (range, 17-70 years). Sixteen patients (n = 16; 70%) had received platinum-based chemotherapy before ALK TKI treatment. Twenty two patients (n = 22; 96%) had received crizotinib as the first ALK TKI. A second-generation ALK TKI (alectinib, ceritinib, or brigatinib) had been given to 1 patient (4%) as first-line treatment and to 17 patients (74%)

after failure of crizotinib treatment. Three patients who had first received crizotinib and then a second-generation ALK TKI had subsequently received a third-generation ALK TKI (lorlatinib).

The number of biopsies performed on the 23 patients totaled 42, including 26 tissue biopsies and 16 liquid biopsies (cell-free DNA samples). This corresponds to a mean of 1.83 biopsies per patient (range, 1-7). Main biopsy sites were lungs in 8 patients, pleural effusion in 5 patients, and liver in 4 patients (see Supplemental Table 2 in the online version). The samples studied were from 13 of the 23 patients (57%) who had disease progression during treatment with a first TKI, 12 of the 15 patients (80%) who had disease progression during treatment with a second TKI, and 3 of the 7 patients (43%) who had disease progression during treatment with a TKI given as a third TKI or further. The studied samples also included 5 biopsies performed at the time of disease progression during therapies other than ALK TKIs.

The results of targeted NGS applied to these samples are as follows. ALK mutations were detected in 8 patients (35%). They included 4 G1202R mutations and 1 C1156Y, 1 V1180L, 1 I1171N, and 1 L1196M mutation. In one of the patients in whom a G1202R mutation was detected initially, a G1202R/G1269A compound mutation was found in a later biopsy. Seven ALK mutations were detected in tissue biopsies and 3 in circulating free DNA. For 3 patients, liquid and tissue biopsies were performed at the same time. The results were consistent in 1 patient.

An ALK amplification with no concomitant ALK mutation was detected using fluorescence in situ hybridization in 1 biopsy (4.34 %; Figure 1). In addition to an ALK mutation, 7 patients had a TP53 mutation (A138P, R175H, C238R, C277G, R248Q, R337C, R337P) and 1 had a N-methyl-N'-nitroso-guanidine human osteosarcoma transforming gene mutation in exon 18 (c.3686_3686 + 3del). No mutation was identified in any other oncogene tested with this NGS panel.

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 1** Distribution of Mechanisms of Resistance to ALK TKIs</figcaption></figure>

Abbreviations: ALK = anaplastic lymphoma kinase; TKI = tyrosine kinase inhibitor. * One patient with a G1202R mutation was found, after treatment with lorlatinib, to harbor a G1202R/G1269A compound mutation.
Resistance to ALK Inhibitors in Routine Practice

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 2** Treatment of ALK-Positive NSCLC Patients. Swimming Plot Showing, for Each Patient, the Treatments Received and the Number, Type(s), and Time of Completion of the Biopsies Performed. Each Bar Represents 1 Patient. Treatments Received Before the First ALK TKI are Not Represented</figcaption></figure>

Abbreviations: ALK = anaplastic lymphoma kinase; NSCLC = non-small-cell lung cancer; TKI = tyrosine kinase inhibitor.

Among the 9 ALK mutations detected, one was found in a sample taken at the time of disease progression during crizotinib treatment as the first TKI. The 8 remaining mutations were identified in samples from patients exposed to a second- or third-generation TKI. The rate of detection of ALK mutations at the time of disease progression was 15% after a first TKI (2 of 13 patients tested), 33% after a second TKI (4 of 12 patients tested), and 66% after a third TKI or more (2 of 3 patients tested; Figure 2).

Among patients during treatment with the first ALK TKI, the objective response rate was 74% (17/23) and the disease control rate was 91% (21/23). By the end of data collection, 12 patients (52%) had died. Median overall survival (OS) from the start of the first ALK TKI treatment was 37.28 months (95% confidence interval, 19.58- not reached). We did not observe any difference in OS between pa- tients with or without TP53 mutations. Among the 8 patients in whom an ALK mutation was identified, 7 (87%) received a new ALK TKI after the mutation was found (Figure 3).¹¹ In these 7 patients the objective response rate (ORR) with the new TKI was 71% (5/7). Among the patients in whom no ALK mutation was found, the ORR with the third ALK TKI was 33% (1/3).

Among the 7 patients with an *ALK* mutation who received a sub-
sequent ALK TKI, 6 received a TKI presumed on the basis of in vitro
data to act against the identified mutant.¹¹ Among these 6 patients, 5
achieved an objective response and 1 showed stable disease. To the
remaining patient alectinib was given despite detection of a G1202R
mutation, because at the time alectinib was the only available next-
generation TKI and data were still sparse regarding the activity of
different ALK TKIs according to the *ALK* mutation present. This
patient showed progressive disease at first assessment (Figure 3).

Discussion

The present study focused on targeted NGS, a technique now
widely used in daily molecular testing. We show that its use in
routine practice allowed identifying an ALK TKI resistance mech-
anism in 9 of 23 patients (39%) with advanced ALK-positive
NSCLC. Gainor et al reported a similar rate of ALK mutations
for other NGS panels.¹¹ Thus, targeted NGS appears suitable for
detecting ALK mutations in routine practice.

It is anticipated that *ALK* mutations will be detected more
frequently in the near future; Gainor *et al* have shown that they arise
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 3** Clinical Review of Patients Treated With a TKI After Identification of an ALK Mutation. Presumed Activity Was Defined by Sensitive or Intermediate IC50 on the Basis of In Vitro Data by Gainor et al</figcaption></figure>

Abbreviations: ALK = anaplastic lymphoma kinase; IC50 = half maximal inhibitory concentration; TKI = tyrosine kinase inhibitor.