# Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans un processus physiologique

Joël Gautron

► To cite this version:

Joël Gautron. Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans un processus physiologique. Master. Master 2 Recherche Physiopathologies- UE analyse des génomes, 2016. hal-02794726

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# Apport des techniques à haut débit pour l'identification des gènes et des protéines impliqués dans un processus physiologique

**Joël GAUTRON**, UR 083 Unité de Recherches Avicoles, INRA, 37380 Nouzilly, France

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I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l’œuf d’oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

IV. Conclusion

STAGE ?
# L'œuf de poule

## Au niveau mondial en 2012

☐ 66,4 millions de tonnes par an (>1200 milliards d'œufs)

☐ Accroissement du marché de 2.2 %

☐ Premier producteur est la Chine (24,5 MT – 37 % de la production mondiale)

☐ Union européenne second producteur mondial (6 MT- 9 % de la production mondiale)

## Filière française en 2013

☐ 15,2 milliards d'œufs (47 millions de poules pondeuses)

☐ 1.37 milliards d'Euros

☐ 4 % de la valeur des productions animales

☐ 1.7 % de la valeur des productions agricoles

## Consommation

☐ 145 œufs par an et par habitant dans le monde

☐ 216 œufs par an et par personne en France

☐ 60% sous forme d'œufs en coquille

☐ 40% sous forme d'ovoproduits

Source ITAVI
# Le contexte européen

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Interdiction des cages conventionnelles

Directive EU 1999/74
Animal welfare

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<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Cages aménagées, volières ou autres systèmes au sol

## Segmentation du marché de l'œuf (source ITAVI)

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

Consommation en France 2012

Cages aménagées (50 %)

Autres systèmes (50 %)

## Impact sur la qualité hygiénique de l'œuf ?
# Microbiologie de l'œuf et des ovoproduits

☐ Au moment de la ponte, le contenu des œufs est généralement stérile

☐ Le pourcentage d'œufs frais contaminés reste souvent inférieur à 1 %

☐ Contamination verticale est rare

☐ La contamination horizontale est beaucoup plus fréquente

☐ Se produit après la ponte par contact avec les microorganismes

* fientes

* environnement élevage

* centre de conditionnement

* circuit de commercialisation

* consommateur...

→Les œufs et produits d'œufs sont consommés crus (mayonnaise...)

→Impliqués dans 45% des salmonelloses (62 % pour salmonella enteritidis)

Le risque de contamination par les microorganismes et notamment *Salmonella* est donc une préoccupation pour la filière œufs et ovoproduits
# L'œuf de poule

* ✓ Ingrédient de base pour la consommation humaine (Éléments nutritionnels parfaitement équilibrés)

## Chambre isolée pour permettre le développement de l'embryon
Doit contenir la totalité des composants nécessaires au développement embryonnaire

* ☐ Systèmes de protection (défenses naturelles de l'œuf)

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

* ☐ Source majeure de composés avec un large spectre d'activités biologiques

## Valorisation alimentaire et non alimentaire de l'œuf et des produits d'oeufs

<figure><img src="image_13.png" /></figure>
# L'œuf de poule

* ✓ Ingrédient de base pour la consommation humaine (Éléments nutritionnels parfaitement équilibrés)

Chambre isolée pour permettre le développement de l'embryon

→ Rôle central des protéines déposées dans l'œuf

→ Identification et caractérisation des protéines de l'œuf

Microbe
S

☐ Source majeure de composés avec un large spectre d'activités biologiques

Valorisation alimentaire et non alimentaire de l'œuf et des produits d'oeufs

<figure><img src="image_14.png" /></figure>
I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l’œuf d’oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

Mieux comprendre les défenses de l’œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

IV. Conclusion
# Identification des protéines de l'œuf

## Les techniques classiques

* Biochimie (Fractionnement des composés de l'œuf par chromatographie, électrophorèses...) et biologie moléculaire

☐ 2006, environ 50 protéines de l'œuf (10 dans la coquille)

## Les développements récents

* 2004, Publication de la séquence génomique de la poulie

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

* ✓ Genome-wide non redundant catalog of 33 838 different genes

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Mise à disposition des techniques « omics » et des outils de data mining pour identifier de nouvelles protéines de l'œuf

* ✓ cDNA and ESTs libraries (Identification of 600 434 functional genes in chickens)

<figure><img src="image_17.png" /></figure>
# Les banques cDNA et EST

## Le but

* Identifier les gènes fonctionnels

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

<figure><img src="image_19.png" /></figure>
# Les banques EST

## Le but

* Identifier les gènes fonctionnels

## Méthode

* Un catalogue compréhensible de l'ensemble des séquences d'un organisme ou d'un tissu spécifique ou d'une fonction biologique

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>
# Les banques EST

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

EST

Assembled into a genome-wide non-redundant catalog of expressed genes
(Unigenes)

## Main projects for poultry:

- University Delaware (http://www.chickest.udel.edu/)

- University of Manchester (http://www.chick.umist.ac.uk/index.html)

- Inra (http://www.sigenae.org)

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

dbEST: database of "Expressed Sequence Tags"

dbEST release 130101

**600 434 séquences** (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html) **pour 260 460 contigs et**
**129 842 singlets** (http://public-contigbrowser.sigenae.org:9090/Gallus_gallus/index.html)

<figure><img src="image_24.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

## Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 282, NO. 8, pp. 5273-5286, February 23, 2007
© 2007 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.

## Cloning of Ovocalyxin-36, a Novel Chicken Eggshell Protein Related to Lipopolysaccharide-binding Proteins, Bactericidal Permeability-increasing Proteins, and Plunc Family Proteins*

Received for publication, November 3, 2006, and in revised form, December 14, 2006. Published, JBC Papers In Press, December 19, 2006, DOI 10.1074/jbc.M610294200

Joël Gautron<sup>†</sup>, Emi Murayama<sup>§</sup>, Alain Vignal<sup>¶</sup>, Mireille Morisson<sup>¶</sup>, Marc D. McKee<sup>||</sup>, Sophie Réhault<sup>‡</sup>, Valérie Labas<sup>**</sup>, Maya Belghazi<sup>**</sup>, Mary-Laure Vidal<sup>‡</sup>, Yves Nys<sup>‡</sup>, and Maxwell T. Hincke<sup>‡‡</sup>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

<figure><img src="image_26.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

<figure><img src="image_28.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

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# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

5'

3'

## Séquence DNA (1995 bp) de l'ARNm de l'ovocalyxin-36

<figure><img src="image_31.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine de la matrice organique de la coquille

## Architecture du gène

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

## Ovocalyxine-36, protéine apparentée à LBP/BPI et Plunc

Se lient au lipopolysaccharide (LPS) de la paroi des bactéries à Gram négatif Mort de la bactérie

Reconnaissance précoce des produits bactériens dans le système respiratoire supérieur chez les mammifères

<figure><img src="image_33.png" /></figure>
Ovocalyxin-36

BIOLOGY OF REPRODUCTION 83, 893-900 (2010)

Published online before print 11 August 2010.

DOI 10.1095/biolreprod.110.085019

Minireview

What Makes an Egg Unique? Clues from Evolutionary Scenarios
of Egg-Specific Genes¹

Xin Tian,³,⁴,⁵,⁶ Joel Gautron,⁷ Philippe Monget,³,⁴,⁵,⁶ and Géraldine Pascal²,³,⁴,⁵,⁶

UMR85,³ Physiologie de la Reproduction et des Comportements, INRA, Nouzilly, France

UMR6175,⁴ CNRS, Nouzilly, France

Université François Rabelais de Tours,⁵ Tours, France

Haras Nationaux,⁶ Nouzilly, France

UR83 Recherches Avicoles,⁷ INRA, Nouzilly, France

Developmental and Comparative Immunology xxx (2010) xxx-xxx

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

ELSEVIER

Contents lists available at ScienceDirect

Developmental and Comparative Immunology

journal homepage: www.elsevier.com/locate/dci

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Identification and characterisation of the BPI/LBP/PLUNC-like gene repertoire in
chickens reveals the absence of a LBP gene<sup>ª</sup>

Shih-Chieh Chiang<sup>2,1</sup>, Edwin J.A. Veldhuizen<sup>b</sup>, Frances A. Barnes<sup>a</sup>, C. Jeremy Craven<sup>c</sup>,
Henk P. Haagsman<sup>b</sup>, Colin D. Bingle<sup>a,∗</sup>

H. M. domestica G. Gallus
sapiens
Chr 20

O. latipes
Ultra90

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Human Chromosome 20

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

<footnote><sup>ª</sup>Academic Unit of Respiratory Medicine, Department of Infection and Immunity, University of Sheffield, Sheffield S10 2JF, UK</footnote>

<footnote><sup>b</sup> Department of Infectious Diseases and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80.165, 3508 TD Utrecht, The Netherlands</footnote>

<footnote><sup>c</sup>Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, Sheffield S10 2FN, UK</footnote>
# Evolution des gènes

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Biology of Reproduction, 2010

<figure><img src="image_40.png" /></figure>
I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l’œuf d’oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

Mieux comprendre les défenses de l’œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

IV. Conclusion
# La formation de l'œuf

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

**Foie**

Protéines du jaune
(maturité sexuelle)

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

**Ovaire**

**infundibulum**

Membranes vitellines
(< 1 h)

**Magnum**

Protéines du blanc
(1h – 4h30)

**Isthme**

Membranes coquillières
(4h30-6h)

**Utérus**

Calcification de la coquille
(6h – 24 h)

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

- Membranes coquillières

- Couche calcifiée

<figure><img src="image_44.png" /></figure>
## Transcriptomique

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

* Foie
* Infundibulum
* Magnum
* Isthme
* Utérus

## Protéomique

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

* Jaune
* Membranes vitellines
* Blanc
* Coquille

Analyse bioinformaticque et séquences protéiques
(Homologie avec des protéines de mammifères, domaines conservés, réseaux d'interactions moléculaires, analyse intégrative des données de la littérature)

## Etablir une liste de protéines fonctionnelles

## Validation biologique et étude de leur potentiel de valorisation

* Formation de l'œuf

* Analyse intégrative des activités biologiques des constituants de l'œuf

<figure><img src="image_47.png" /></figure>
# La transcriptomique

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

**Foie :**

Protéines du jaune

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

**Ovaire et infundibulum :**

Membranes vitellines

**Magnum :**

Protéines du blanc

**Isthme :**

Membranes coquillières

**Utérus :**

Calcification de la coquille

L'appareil reproducteur de la poule est un modèle parfaitement adapté à une approche transcriptomique

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

Formation dans le temps et l'espace des constituants de l'œuf

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

Spécialisation des tissus ou organes

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

Différents stades physiologiques

<figure><img src="image_53.png" /></figure>
# La transcriptomique

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

**Foie :**
Protéines du jaune

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

**Ovaire et infundibulum :**
Membranes vitellines

**Magnum :**
Protéines du blanc

**Isthme :**
Membranes coquillières

**Utérus :**
Calcification de la coquille

Utilisation de puces à ADN ou RNA-Seq

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

Comparaison de l'expression des
gènes entre les différents tissus

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

Quantification des gènes specifiquement exprimés en
relation avec la formation du jaune, des membranes
vitellines, du blanc d'oeuf, des membranes coquillères et
de la calcification de la coquille

<figure><img src="image_58.png" /></figure>
# La transcriptomique

## I- Foie (Jaune d'œuf)

Bourin et al. BMC Genomics 2012, 13:457
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/457

BMC
Genomics

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

**RESEARCH ARTICLE**

Open Access

Transcriptomic profiling of proteases and
antiproteases in the liver of sexually mature hens
in relation to vitellogenesis

Marie Bourin, Joël Gautron, Magali Berges, Christelle Hennequet-Antier, Cédric Cabau, Yves Nys and Sophie Réhault-Godbert*

Les constituants du jaune ont pour origine le foie

Comparaison de l'expression des gènes du foie avant maturité sexuelle (absence d'œuf) et après maturité sexuelle (dépôt de jaune).

582 transcrits surexprimés (ratio 1,3 à 65)

Similaires

Inconnus

Connus

<figure><img src="image_60.png" /></figure>
# La transcriptomique

## Identification des gènes spécifiquement impliqués dans la synthèse du blanc, des membranes coquillières et la calcification de la coquille

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

**Magnum :**
Protéines du blanc

**Isthme :**
Membranes coquillières

**Utérus :**
Calcification de la coquille

Utilisation de puces à ADN

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

Comparaison de l'expression des gènes entre les différents tissus

<figure><img src="image_63.png" /></figure>
La transcriptomique

Several differentially expressed genes

<figure><img src="image_64.png" /></figure>
# La transcriptomique

Several differentially expressed genes
(Fold difference range from 1.98 to 174.1)

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

ALIMENTATION
AGRICULTURE
ENVIRONNEMENT

<figure><img src="image_68.png" /></figure>
# La transcriptomique

Several differentially expressed genes
(Fold difference range from 1.98 to 174.1)

Magnum (egg white deposition)

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

Uterus (eggshell calcification)

White isthmus (eggshell membranes)

<figure><img src="image_70.png" /></figure>
# La transcriptomique

## Transcriptomics (microarrays, RNA-Seq)

Bourin et al. BMC Genomics 2012, 13:457
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/457

BMC
Genomics

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

**Liver:** **582** ←
Egg yolk proteins (several weeks)

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

**Ovary and infundibulum:**
Vitelline membranes (less 1 h)

**Magnum:** **828** ←
egg white proteins (1 to 4 h 30)

**Isthmus:** **135** ←
eggshell membranes (4h30 to 6 h)

**Uterus:** **605** ←
eggshell calcification (6 to 24 h)

Brionne et al. BMC Genomics 2014, 15:220
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/15/220

BMC
Genomics

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Transcriptomic profiling of proteases and
antiproteases in the liver of sexually mature hens
in relation to vitellogenesis

Marie Bourin, Joël Gautron, Magali Berges, Christelle Hennequet-Antier, Cédric Cabau, Yves Nys and Sophie Réhault-Godbert¹

New insights in egg white proteins using cDNA microarrays and extensive proteomic data mining

**EggMeat symposia 2011 - Leipzig**

Joël Gautron¹, Aurélien Brionne¹, Christelle Hennequet-Antier¹, Cédric Cabau¹, Nicolas Guyot¹, Larry Cogburn², Sophie Réhault-Godbert¹, Yves Nys¹

Identifying specific proteins involved in eggshell membrane
formation using gene expression analysis and bioinformatics.

Jingwen Duª, Maxwell Hinckeª, d, Aurelien Brionneb, Christelle Hennequet-Antierb, Larry A. Cogburnc, Yves Nysb, Joel Gautronb

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Hen uterine gene expression profiling during
eggshell formation reveals putative proteins
involved in the supply of minerals or in the shell
mineralization process

Aurélien Brionne, Yves Nys, Christelle Hennequet-Antier and Joël Gautron*

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Gene expression profiling to identify eggshell
proteins involved in physical defense of the
chicken egg

Vincent Jonchère¹, Sophie Réhault-Godbert¹, Christelle Hennequet-Antier¹, Cédric Cabau¹, Vonick Sibut¹, ³, Larry A Cogburn², Yves Nys¹, Joel Gautron¹*

Jonchère et al. BMC Genomics 2010, 11:57
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/57

BMC
Genomics

<figure><img src="image_73.png" /></figure>
# La protéomique

(Mass spectrometry-based methods for protein identification)

## Digestion protéique (trypsine)

### Séparation des protéines

(Chromatographie 2D, Electrophorèse 2D)

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

### Fragments peptidiques des protéines

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

Waters® nanoscale LC/MS/MS System integrates the CapLC®XE Pump and Autosampler, the Micromass® Q-Tof Ultimo™ API Mass Spectrometer with integral NanoLock.Spray™ Ionization Source and MassLynx™ 4.0 Software.

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

<figure><img src="image_79.png" /></figure>

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

TOF LD+
4.45e3

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

## Détermination de la masse Réelle des peptide

<figure><img src="image_82.png" /></figure>
# La protéomique

<figure><img src="image_83.png" /></figure>
# La protéomique

L'analyse protéomique se base sur la protéine (unité fonctionnelle)

Toutefois elle est limitée aux protéines dont la séquence est disponible

L'analyse transcriptomique est basée sur les ARNm

Elle permet donc l'analyse des gènes et des protéines non identifiées dans les bases

<figure><img src="image_84.png" /></figure>
# La protéomique

✓ **Proteomics** (Mass spectrometry-based methods for protein identification)

178

DOI 10.1002/pmic.200700790

Proteomics 2008, 8, 178–191

RESEARCH ARTICLE

## The chicken egg yolk plasma and granule proteomes

Karlheinz Mann and Matthias Mann

Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Proteomics und Signaltransduktion, Martinsried, Germany

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

ELSEVIER

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Chromatography A

journal homepage: www.elsevier.com/locate/chroma

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

yolk

Karlheinz Mann

## Vitelline membranes

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

egg white

shell

Proteomics 2006, 6, 3801–3810

DOI 10.1002/pmic.200600120

RESEARCH ARTICLE

## Proteomic analysis of the acid-soluble organic matrix of the chicken calcified eggshell layer

3801

3

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

CrossMark

Quantitative proteomics provides new insights into chicken eggshell matrix protein functions during the primary events of mineralisation and the active calcification phase

Chicken egg yolk cytoplasmic proteome, mined via combinatorial peptide ligand libraries

Alessia Farinazzoª, Umberto Restucciaᵇ, Angela Bachiᵇ, Luc Guerrierᶜ, Frederic Fortisᶜ, Egisto Boschettiᶜ, Elisa Fasoliª, Attilio Citterioª, Pier Giorgio Righettiª,\*

3558

DOI 10.1002/pmic.200700397

Proteomics 2007, 7, 3558–3568

RESEARCH ARTICLE

## The chicken egg white proteome

Karlheinz Mann

Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung Proteomics und Signaltransduktion, Martinsried, Germany

Journal of proteome research articles

2008, 7, 3461–3474

## Exploring the Chicken Egg White Proteome with Combinatorial Peptide Ligand Libraries

Chiara D'Ambroso,¹ Simona Arena,¹ Andrea Scaloni,¹ Luc Guerrier,¹ Egisto Boschetti,¹ Martha Elena Mendieta,⁵ Attilio Citterio,⁵ and Pier Giorgio Righetti⁵,\*

Pauline Marieª, Valérie Labasᵇ, Aurélien Brionneª, Grégoire Harichauxᵇ, Christelle Hennequet-Antierª, Alejandro I

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

Proteo eggsh

Megan Ri

## **Quantitative proteomics and bioinformatic analysis**
provide new insight into protein function during
avian eggshell biomineralization

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

CrossMark

proteins

Pauline Marieª, Valérie Labasᵇ, Aurélien Brionneª, Grégoire Harichauxᵇ, Christelle Hennequet-Antierª, Yves Nysª, Joël Gautronª,\*

ªINRA, UR83 Recherches Avicoles, Fonction et Régulation des Protéines de l'œuf, F-37380 Nouzilly, France

ᵇINRA, UMR INRA85, UMR CNRS 7247, Université de Tours, IFCE, Physiologie de la Reproduction et des Comportements, Plate-forme d'Analyse Intégrative des Biomolécules, Laboratoire de Spectrométrie de Masse, F-37380 Nouzilly, France

ALIMENTATION

AGRICULTURE

ENVIRONNEMENT

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

2322

DOI 10.1002/pmic.200800032

Proteomics 2008, 8, 2322–2332

RESEARCH ARTICLE

## Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

<figure><img src="image_93.png" /></figure>

3

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

3

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

3

<figure><img src="image_96.png" /></figure>
# « omics » to identify novel egg proteins

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

* ✓ **Proteomics** (Mass spectrometry-based methods for protein identification)

> 4000 different protein identifiers in the different egg proteomes from 3 different databases
IPI (closed), GeneBank and UniProt

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

Lot of redundancies
Majority of them were not annotated

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

How many in each compartments ?
What is common, what is compartment specific ?
Functions in the egg ?

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

Data mining and bioinformatics tools

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

Loading of the sequences, multi alignment to eliminate redundancies

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

Repartition in individual egg compartments

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

Update of functional annotations

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

<figure><img src="image_106.png" /></figure>

<figure><img src="image_107.png" /></figure>
# Novel egg proteins

894 genes encode egg proteins

<figure><img src="image_108.png" /></figure>

Protein
variants and
isoforms

1174 non redundant proteins in the
egg

Repartition in egg compartments

<figure><img src="image_109.png" /></figure>

Common, shared and specific proteins

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

<figure><img src="image_111.png" /></figure>

<figure><img src="image_112.png" /></figure>

<figure><img src="image_113.png" /></figure>
I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines de l’œuf

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

Mieux comprendre les défenses de l’œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

IV. Conclusion
# Egg defences

<figure><img src="image_114.png" /></figure>

<figure><img src="image_115.png" /></figure>

## Microbial quality of eggs ?

<figure><img src="image_116.png" /></figure>

### Humans toxi-infections

<figure><img src="image_117.png" /></figure>

<figure><img src="image_118.png" /></figure>

<figure><img src="image_119.png" /></figure>
# La coquille : une barrière physique contre la pénétration bactérienne

<figure><img src="image_120.png" /></figure>

L'intégrité de la coquille est cruciale pour la sécurité alimentaire du consommateur

<figure><img src="image_121.png" /></figure>

Comprendre les mécanismes de fabrication de la coquille et déterminer l'origine de ses faiblesses

Développer de nouveaux outils pour la sélection
La coquille (défense physique)

<figure><img src="image_122.png" /></figure>

<figure><img src="image_123.png" /></figure>
# Eggshell biomineralization in uterus

## Supply of minerals for shell mineralization

<figure><img src="image_124.png" /></figure>

## 3 main phases in the uterine fluid (acellular milieu)

<figure><img src="image_125.png" /></figure>

<figure><img src="image_126.png" /></figure>

<figure><img src="image_127.png" /></figure>

<figure><img src="image_128.png" /></figure>
# La Biominéralisation

## ☐ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

* Dépôts de minéraux sous conditions physiologiques dans un organisme vivant qui aboutit à la formation de structures très diversifiées avec des formes, des tailles et des couleurs différentes.

### Biominéralisation acellulaire dite contrôlée

<figure><img src="image_129.png" /><figcaption>Perle</figcaption></figure>

<figure><img src="image_130.png" /><figcaption>Coccolithes</figcaption></figure>

<figure><img src="image_131.png" /></figure>

<figure><img src="image_132.png" /><figcaption>Corail</figcaption></figure>

<figure><img src="image_133.png" /><figcaption>Coquilles d'oiseaux</figcaption></figure>

<figure><img src="image_134.png" /><figcaption>Coquilles de mollusques</figcaption></figure>

<figure><img src="image_135.png" /></figure>

<figure><img src="image_136.png" /><figcaption>gastéropodes</figcaption></figure>

<figure><img src="image_137.png" /></figure>

<figure><img src="image_138.png" /></figure>
# La Biominéralisation

☐ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principes

<figure><img src="image_139.png" /></figure>
# La Biominéralisation

<figure><img src="image_140.png" /></figure>

PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principe

<figure><img src="image_141.png" /></figure>

95% de carbonate de calcium sous forme de calcite

<figure><img src="image_142.png" /></figure>

<figure><img src="image_143.png" /></figure>

3,5% de matière organique (matrice organique)

Protéines et protéoglycanes

<figure><img src="image_144.png" /></figure>
# La Biominéralisation

<figure><img src="image_145.png" /></figure>

PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principes

Éfinir un espace biologiquement compartimenté (utérus pour la poule)

C'est dans cet espace que les entrées ioniques et organiques sont contrôlées pour atteindre les conditions physico-chimiques précises

Une hypersaturation du milieu

<figure><img src="image_146.png" /></figure>

Les ions constitutifs du minéral doivent se trouver en conditions saturantes

La nucléation et la croissance du minéral

L'initiation de la cristallisation se fait à partir de sites se trouvant dans le milieu (nucléation)

Le processus d'élaboration des minéraux est étudié à l'aide des axes

<figure><img src="image_147.png" /></figure>

Cristal initial

<figure><img src="image_148.png" /></figure>

<figure><img src="image_149.png" /></figure>

du cristal
# La Biominéralisation

## ☐ PROCESSUS UNIVERSEL ET CONSERVE SUR TERRE

Malgré la diversité de formes et de fonctions, les structures biominérales se forment toujours selon les mêmes principes

definir un espace biologiquement compartimenté (utérus pour la poule)

C'est dans cet espace que les entrées ioniques et organiques sont contrôlées pour atteindre les conditions physico-chimiques précises

Une hypersaturation du milieu

☐ Les ions constitutifs du minéral doivent se trouver en conditions saturantes

La nucléation et la croissance du minéral

☐ L'initiation de la cristallisation se fait à partir de sites se trouvant dans le milieu (nucléation)

La matrice organique joue souvent ce rôle dans les biominéraux

- Elle inhibe la croissance du minéral selon un ou plusieurs axes

<figure><img src="image_150.png" /></figure>

<figure><img src="image_151.png" /></figure>
# La formation de la coquille, un processus de biominéralisation

* Séquence temporale de la nucléation, de la croissance

* Modulée par la matrice organique

<figure><img src="image_152.png" /></figure>

C. R. Palevol (2004), 3, 549-562

<figure><img src="image_153.png" /></figure>

□ Identification et caractérisation des protéines de la matrice organique

<figure><img src="image_154.png" /></figure>
# Eggshell matrix proteins

* 11 eggshell proteins were identified in 2006

* Major advances came recently

Eggshell matrix proteins

* More than 670 proteins

* More than 700 specific transcripts

<figure><img src="image_155.png" /></figure>

## Functions and biological activities of the eggshell proteins ?

Literature, data mining and bioinformatics tools

<figure><img src="image_156.png" /></figure>

Classification in 3 different groups according to their potential functions

<figure><img src="image_157.png" /></figure>

Associated to
Mineralization process

<figure><img src="image_158.png" /></figure>

Involved in the
regulation of activity of
proteins

<figure><img src="image_159.png" /></figure>

Antimicrobial
proteins

<figure><img src="image_160.png" /></figure>

<figure><img src="image_161.png" /></figure>
# Functions of eggshell matrix proteins

## Proteins associated to shell mineralization process

* ✓ Proteins involved in the **biomineralization** of shell or other biominerals (bones, molluscan...)

* Ovocleidins, ovocalyxins, lysozyme, ovotransferrin, DMP4 ...

* ✓ **Calcium binding proteins (CaBPs)** interact with calcium to favour crystal nucleation or drive the morphology of crystals

* Identification of numerous novel CaBPs

* Numerous proteins with EF-hand and EGF-like calcium binding domains are present in the shell

* ✓ **Proteoglycans** et proteoglycan binding proteins

* proteoglycans have a negative charge to attract Ca2+ ions

* ✓ **Eggshell membranes** proteins

* Collagens and collagens-like proteins, CREMP...

<figure><img src="image_162.png" /></figure>
# Functions of eggshell matrix proteins

## Proteins involved in the regulation of activity of proteins driving mineralisation

* ✓ Proteins involved in the **proper folding of the eggshell matrix**

* An appropriate conformation of proteins is required to ensure calcium and mineral interactions and to ensure template to the mineralized structure

* Molecular chaperone

* Protein assisting folding

* Proteins with interactive properties related to proteoglycans

* ✓ **Regulation of the activity of proteins** related to the shell deposit

* Shell mineralisation occurs in a non cellular milieu

* Direct action of proteins to inhibit or activate the molecular actors present in the milieu.

* Molecular chaperone interact with proteins driving mineralisation

* Proteases and protease inhibitors (specific and controlled role during calcification process, either by degrading proteins or regulating processing of proteins into their mature forms)

* ✓ Mineralisation depends of the **degree of protein phosphorylation** (Osteopontin, Hincke et al.)

* Kinases

* Phosphatases

<figure><img src="image_163.png" /></figure>

<figure><img src="image_164.png" /></figure>

<figure><img src="image_165.png" /></figure>
# Functions of eggshell matrix proteins

## Antimicrobial proteins

Presence of numerous antimicrobial proteins to keep the egg sterile

<figure><img src="image_166.png" /></figure>

<figure><img src="image_167.png" /></figure>

<figure><img src="image_168.png" /></figure>
# Eggshell biomineralization

95% de CaCO₃ (calcite)

<figure><img src="image_169.png" /></figure>

Interaction

<figure><img src="image_170.png" /></figure>

3,5% de matrice orga-
(protéines, protéogly-
n)

Contrôle
du
processus
de
calcification

<figure><img src="image_171.png" /></figure>

<figure><img src="image_172.png" /></figure>

Approches globales et non hiérarchisées

✓ Plus de 700 protéines

✓ Plus de 600 transcrits spécifiques

### Rarchiser les acteurs moléculaires prépondérants lors du processus de minéralisation

## Etudes à différents stades de la minéralisation

Proteomics

RNA-Seq

<figure><img src="image_173.png" /></figure>

<figure><img src="image_174.png" /></figure>

<figure><img src="image_175.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la biominéralisation de la coquille des oiseaux

<figure><img src="image_176.png" /></figure>

ACC deposition

ACC transformation
into calcite aggregates

<figure><img src="image_177.png" /></figure>

Calcite crystal units
formation

<figure><img src="image_178.png" /></figure>

## First events of shell mineralization (initiation 2 h)

<figure><img src="image_179.png" /></figure>

<figure><img src="image_180.png" /></figure>

## Rapid growth phase (12 h)

<figure><img src="image_181.png" /></figure>

## Terminal phase (2 h)

Analyse protéomique
sur LTQ-VelosOrbitrap
des bandes

Identification des protéines

Etablissement d'une liste
non redondante de 316

protéines

LIMENTATION

AGRICULTURE

ENVIRONNEMENT

<figure><img src="image_182.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées dans la biominéralisation de la coquille des oiseaux

- 316 protéines quantifiées

- Détermination de l'abondance relative dans chacun des 5 stades

- Analyses statistiques

- ANOVA

Protéines ont des variations d'abondance significatives selon les stades

- Cluster hiérarchique profils d'abondance protéique

<figure><img src="image_183.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées
dans la biominéralisation de la coquille des oiseaux

## Classement des protéines selon leur profil d'abondance

<figure><img src="image_184.png" /><figcaption>13 proteins overabundant during ACC
transformation into calcite aggregates</figcaption></figure>

<figure><img src="image_185.png" /><figcaption>70 proteins overabundant
during rapid growth phase</figcaption></figure>

<figure><img src="image_186.png" /><figcaption>47 proteins overabundant when large
calcite crystal units are formed</figcaption></figure>

<figure><img src="image_187.png" /><figcaption>18 proteins overabundant at stages
associated with the presence of calcite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_188.png" /></figure>
# Etude spatio-temporelle des protéines impliquées
dans la biominéralisation de la coquille des oiseaux

<figure><img src="image_189.png" /></figure>

ACC deposition

ACC transformation
into calcite aggregates

<figure><img src="image_190.png" /></figure>

Calcite crystal units
formation

<figure><img src="image_191.png" /></figure>

Preferential crystal
orientation

<figure><img src="image_192.png" /></figure>

Arrest of calcification

<figure><img src="image_193.png" /></figure>

First events of shell mineralization (initiation 2 h)

Rapid growth
phase (12 h)

Terminal
phase (2 h)

<figure><img src="image_194.png" /></figure>

<figure><img src="image_195.png" /></figure>

<figure><img src="image_196.png" /></figure>

<figure><img src="image_197.png" /></figure>

<figure><img src="image_198.png" /></figure>

## Prélèvement du tissu utérin à chacun de ces stades

## RNA seq (4502 Differentiellement exprimés)

<figure><img src="image_199.png" /></figure>
I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l’œuf d’oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

Mieux comprendre les défenses de l’œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

IV. Conclusion
# Utilisation des avancées récentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

Stratégie de sélection pour améliorer les défenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_200.png" /></figure>

<figure><img src="image_201.png" /></figure>

Ian Dunn, Maureen Bain

Roslin Institute, University of Glasgow

**Hypothèse**

> "Une variation de l'expression des gènes codant pour les protéines de la matrice organique de la coquille provoque des différences mesurables de la qualité de la coquille

## Sélection génomique assistée par marqueurs (MAS)

- Sélection utilisant des marqueurs ADN spécifiques d'un caractère phénotypique difficile à utiliser de manière **pratique** en sélection

- Les gènes codant pour les protéines de la matrice organique de la coquille peuvent être considérés comme gènes candidats pour la MAS

Picture courtesy of I.Dunn
Matrix protein sequence

<figure><img src="image_202.png" /></figure>
# Utilisation des avancées recentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

Stratégie de sélection pour améliorer les defenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_203.png" /></figure>

Ian Dunn, Maureen Bain

Roslin Institute, University of Glasgow

<figure><img src="image_204.png" /></figure>

## Sélection assistée par marqueurs (MAS)

* Selectionner des gènes candidats

* Identifier des marqueurs génétiques (e.g. Single nucleotide polymorphism)

<figure><img src="image_205.png" /></figure>
# Utilisation des avancées recentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

Stratégie de sélection pour améliorer les defenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_206.png" /></figure>

Ian Dunn, Maureen Bain
Roslin Institute, University of Glasgow

<figure><img src="image_207.png" /></figure>

## Sélection assistée par marqueurs (MAS)

* Selectionner des gènes candidats

* Identifier des marqueurs génétiques (e.g. Single nucleotide polymorphism)

<table><thead><tr><th>Gene</th><th>position</th><th>From (bp)</th><th>To (bp)</th><th>Potential SNPs</th><th>Number of polymorphisms detected and verified</th><th>Number genotyped</th><th>Position</th><th>Effect</th><th>Frequency %</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ovalbumin</td><td>chr2:</td><td>67443891</td><td>67449174</td><td>7</td><td>2 (linked)</td><td>1</td><td>3' untranslated</td><td></td><td>63</td></tr><tr><td>Ovotransferrin</td><td>chr9:</td><td>9002347</td><td>9010408</td><td>17</td><td>2 (linked)</td><td>1</td><td>Coding exon</td><td>synonymous</td><td>83</td></tr><tr><td rowspan="2">Ovocalyxin 32</td><td rowspan="2">chr9:</td><td rowspan="2">21894117</td><td rowspan="2">21901605</td><td rowspan="2">8</td><td rowspan="2">2</td><td rowspan="2">2</td><td>Coding exon</td><td>Non-synonymous</td><td>75</td></tr><tr><td>Intron</td><td></td><td>76</td></tr><tr><td rowspan="2">Ovocleidin 116</td><td rowspan="2">chr4:</td><td rowspan="2">46253588</td><td rowspan="2">46257102</td><td rowspan="2">4</td><td rowspan="2">2</td><td rowspan="2">2</td><td>Promoter</td><td></td><td>62</td></tr><tr><td>Exon</td><td>Non-synonymous</td><td>69</td></tr><tr><td>Osteopontin</td><td>chr4:</td><td>46242099</td><td>46245071</td><td>23</td><td>3 (linked)</td><td>1</td><td>Promoter/intron</td><td>none</td><td>64</td></tr><tr><td>Ovocalyxin 36</td><td>chr20:</td><td>9812283</td><td>9844646</td><td>14</td><td>4</td><td>1</td><td>Intron/exon</td><td>synonymous</td><td>61</td></tr><tr><td>Ovocalyxin 21</td><td>chr22:</td><td>258000</td><td>261000</td><td>0</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
# Utilisation des avancées recentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

Stratégie de sélection pour améliorer les défenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_208.png" /></figure>

Ian Dunn, Maureen Bain
Roslin Institute, University of Glasgow

<figure><img src="image_209.png" /></figure>

## Sélection assistée par marqueurs (MAS)

* Selectionner des gènes candidats

* Identifier des marqueurs génétiques (e.g. Single nucleotide polymorphism)

* Recueillir des données phénotypiques

<figure><img src="image_210.png" /></figure>

Phenotypes mesurés :

Breaking strength, Static stiffness, Acoustic resonance, Elastic modulus, Fracture toughness

Total thickness, Effective thickness, Mammillary thickness

* Association analysis of genotype and phenotype
# Utilisation des avancées récentes en génétique et génomique pour améliorer la solidité de la coquille

Stratégie de sélection pour améliorer les défenses naturelles de l'œuf

<figure><img src="image_211.png" /></figure>

Ian Dunn, Maureen Bain
Roslin Institute, University of Glasgow

<figure><img src="image_212.png" /></figure>

## Sélection assistée par marqueurs (MAS)

### Approche gènes candidats
(Environ 16000 génotypages pour 8 gènes et 2066 descendants)

<table><thead><tr><th>Tests d'association</th><th>P value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ovocleidin-116<br>Module élastique</td><td>P= 0.0004</td></tr><tr><td>Ovocalyxin 32<br>Déformation à la fracture</td><td>P= 0.006</td></tr><tr><td>Ovocalyxin 32<br>Résistance à la rupture</td><td>P= 0.001</td></tr></tbody></table>

Les études d'associations suggèrent que les gènes candidats peuvent expliquer les variations des propriétés structurales de la coquille de l'oeuf de poule.
I. Introduction

II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l’œuf d’oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

Mieux comprendre les défenses de l’œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et biominéralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

IV. Conclusion
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

## Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

9

### Molecules involved in chemical defence of the chicken egg

S. Réhault-Godbert, V. Hervé-Grépinet, J. Gautron, C. Cabau and Y. Nys, Institut National de la Recherche Agronomique, France and M. Hincke, University of Ottawa, Canada

* Examination of egg protein sequences for specific domains related to molecular defence

* Identification of 142 molecules which could potentially degrade microbial components

Use of InterPro domains and signature 149 functional domains grouped in 9 families

Use of the most recent egg protein inventory 1174 protein sequences

<figure><img src="image_213.png" /></figure>

<figure><img src="image_214.png" /></figure>

of different proteins potentially involved in the chemical protection of the egg

<figure><img src="image_215.png" /></figure>

<figure><img src="image_216.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_217.png" /></figure>

<figure><img src="image_218.png" /></figure>

<figure><img src="image_219.png" /></figure>

<figure><img src="image_220.png" /></figure>

<figure><img src="image_221.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_222.png" /></figure>

## Immunoglobulins superfamily (74 in egg)

### Immunoglobulins

Yolk IgY most important in egg (>1mg/ml). Also IgM and IgA in yolk (20 µg/ml).

IgY, IgM and IgA in egg white (10 µg/ml). Evidences for IgD and IgE.

## Proteins with Ig-like Domains

Widespread domain. Ig fold : antiparallel b-strands arranged into two sheets linked by a disulfide bond
Various tissue distribution.

<table><thead><tr><th>Protein name</th><th>Localization</th></tr></thead><tbody><tr><td>CEPU-Se alpha 2 isoform</td><td>EW, VM, ES</td></tr><tr><td>CEPU-1</td><td>EW, VM, ES</td></tr><tr><td>Protein CEPU-1</td><td>ES</td></tr><tr><td>Neogenin</td><td>ES</td></tr><tr><td>Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein</td><td>ES</td></tr><tr><td>Neuroplastin</td><td>Ut</td></tr><tr><td>Pro-neuregulin-1, membrane-bound isoform</td><td>EW</td></tr><tr><td>Semaphorin-3C</td><td>VM, ES</td></tr><tr><td>Muscle, skeletal receptor tyrosine protein kinase</td><td>EW</td></tr><tr><td>Butyrophilin subfamily 1 member A1</td><td>Ut</td></tr><tr><td>Basigin</td><td>ES</td></tr><tr><td>VH1 protein</td><td>ES</td></tr><tr><td>ICOS ligand</td><td>Ut</td></tr><tr><td>Beta-2-microglobulin (IR)</td><td>ES, Ut</td></tr><tr><td>T-cell surface glycoprotein CD1b4</td><td>EW</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_223.png" /></figure>

## Protease inhibitors

*Highly represented in egg (48)

<figure><img src="image_224.png" /></figure>

**Inactivation/hydrolysis of host proteins**

## Characterization of Ovoinhibitor

JOURNAL OF
AGRICULTURAL AND
FOOD CHEMISTRY

J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 12368–12374

pubs.acs.org/JAFC

### ARTICLE

Antimicrobial Potential of Egg Yolk Ovoinhibitor, a Multidomain Kazal-like Inhibitor of Chicken Egg

Marie Bourin,*,† Joël Gautron,† Magali Berges,† Sylvie Attucci,§ Gwenaelle Le Blay,¶ Valérie Labas,△ Yves Nys,† and Sophie Rehault-Godbert*,†

### Antimicrobial activity

- ☐ **Activity against Bacillus thuringiensis**

<figure><img src="image_225.png" /></figure>

<figure><img src="image_226.png" /></figure>

<figure><img src="image_227.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_228.png" /></figure>

## Hydrolases (46 egg proteins)

### Lysozyme

Similar to acyloxylhydrolase (Egg white)

*Hydrolyze bacterial peptidoglycan*

<figure><img src="image_229.png" /></figure>

Food preservative E1105 (Cheese, wine...)

Tablets for pain and inflammation of sore thro

<figure><img src="image_230.png" /></figure>

### Proteases

<figure><img src="image_231.png" /></figure>

### Several proteases in eggs

Antimicrobial activities already demonstrated in other species. No experimental evidences for chickens

*Direct action* (Degradation of antimicrobial proteins)

*Indirect action* (Activation of antimicrobial precursors, production of antimicrobial peptides)

<figure><img src="image_232.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_233.png" /></figure>

## Heparin and Lipopolysaccharide binding proteins

Heparin-binding proteins
Cluster (s) of exposed
positives charges

<figure><img src="image_234.png" /></figure>

<figure><img src="image_235.png" /></figure>

### Other negatively charged surfaces

Bacterial

Peptidoglycan

Eur. J. Biotechnol., 271, 12–13, 226 (2004) © FEBS 2004

doi:10.1111/j.1432-1033.2004.04035.x

### Antimicrobial activities of heparin-binding peptides

Emma Andersson¹, Victoria Rydengård¹, Andreas Sonesson¹, Matthias Mörgelin², Lars Björck²
and Artur Schmidtchen¹

### Heparin

Negatively charged
glycosaminoglycan

<figure><img src="image_236.png" /></figure>

### Heparin-binding proteins from egg

<figure><img src="image_237.png" /></figure>

✓15 proteins identified

✓5 new antimicrobial
candidates

Rehault-Godbert, S. et al. (2011). Patent "Fraction of proteins and peptides derived from egg white and protein derived from egg white and use thereof as antilisteria agents." WO 2011/151407 A1.

<figure><img src="image_238.png" /></figure>

<figure><img src="image_239.png" /></figure>

<figure><img src="image_240.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_241.png" /></figure>

## Heparin and Lipopolysaccharide binding proteins

**Ovalbumin-related protein X** (Réhault-Godbert et al. 2013)

<table><caption>Table 1 Minimal Active Concentration (MAC) of purified OVAX, Ovalbumin and Av-BD11 (positive control)</caption><thead><tr><th rowspan="2">Bacterial group, strains</th><th colspan="3">MAC (µM) ± std</th></tr><tr><th>AvBD11</th><th>Ovalbumin</th><th>OVAX</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>L. monocytogenes</i> (Gram +)</td><td>0.58 ± 0.36</td><td>&gt; 28</td><td>2.31 ± 0.00</td></tr><tr><td><i>S. Enteritidis</i> ATCC 13076 (Gram -)</td><td>0.50 ± 0.20</td><td>&gt; 51</td><td>10.04 ± 0.02</td></tr><tr><td><i>S. aureus</i> ATCC 29740 (Gram +)</td><td>7.73</td><td>&gt; 37</td><td>&gt; 37</td></tr><tr><td><i>E.Coli</i> ATCC 25922 (Gram -)</td><td>1.6</td><td>&gt; 37</td><td>&gt; 37</td></tr></tbody></table>

MAC, Minimum Active Concentration (corresponding to a 0.5 mm-clear zone)
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_242.png" /></figure>

<figure><img src="image_243.png" /></figure>

## Heparin and Lipopolysaccharide binding

### Lipopolysac proteins

**(BPI) proteins**

of inflammation upon infection etc.)

* Ovocalyxin-36 (Gautron et al., 2007) (eggshell and vitelline membrane)

* Identity and similarity with LBP/BPI and Plunc families proteins

* Binds to the lipopolysaccharide (LPS) cell wall of the gram negative bacteria (death of bacteria)

* Early recognition of bacterial product

* OCX-36 binds to E. Coli LPS (Correiro, Hincke et al., 2010)

* Modestly inhibit the bacterial growth of Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, E. Coli, Pseudomonas aeruginosa

*Other candidates (Réhault-Godbert et al., 2011, Gautron et al., 2011)

TENP (all compartments)

BPIL2 (Egg White, Vitelline membrane)

Similar to BPI (Egg white)

<figure><img src="image_244.png" /></figure>

(Tian et al., 2010)
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_245.png" /></figure>

## Chelators

### Molecules decreasing bioavailability of irons and vitamins

* Diminish bioavailability for microbes

* Affect growth and survival of bacteria

<table><thead><tr><th>Name</th><th>Localization</th><th>Antimicrobial activity</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ovotransferrin</td><td>ES, EW, MV, EY</td><td>+</td></tr><tr><td>RBP</td><td>ES, EW, MV, EY</td><td>+</td></tr><tr><td>Avidin</td><td>ES, EW, MV</td><td>+</td></tr><tr><td>Similar to avidin</td><td>EY</td><td>?</td></tr><tr><td>Vitellogenin 1</td><td>EY</td><td>?</td></tr><tr><td>Vitellogenin 2</td><td>EY</td><td>?</td></tr></tbody></table>

## Antimicrobial peptides

### Avian beta-defensins

Cationic peptides
Broad spectrum of antimicrobial activity

<figure><img src="image_246.png" /></figure>

### Characterization of AvBD-11 (Hervé-Grépinet et al. 2010)

<table><thead><tr><th rowspan="2">Bacterial group, species</th><th colspan="2">MIC<sup>a</sup> (µM) (95% confidence interval)</th></tr><tr><th>MSI-94<sup>b</sup></th><th>AvBD11</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Gram positive</strong></td><td></td><td></td></tr><tr><td><em>S. aureus</em> ATCC 29740</td><td>0.33 (0.19–0.48)</td><td>0.90 (0.27–1.7)</td></tr><tr><td><em>L. monocytogenes</em></td><td>0.28 (0.13–0.43)</td><td>0.18 (0.08–0.27)</td></tr><tr><td><strong>Gram negative</strong></td><td></td><td></td></tr><tr><td><em>S. Enteritidis</em> ATCC 13076</td><td>0.31 (0.25–0.35)</td><td>0.35 (0.27–0.46)</td></tr><tr><td><em>S. Enteritidis</em> LAs</td><td>0.15 (0.10–0.21)</td><td>0.40 (0.29–0.49)</td></tr><tr><td><em>S. Typhimurium</em> ATCC 14028</td><td>0.25 (0.11–0.40)</td><td>0.32 (0.31–0.32)</td></tr><tr><td><em>E. coli</em> ATCC 25922</td><td>0.37 (0.23–0.52)</td><td>0.05 (0.04–0.05)</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_247.png" /></figure>

<figure><img src="image_248.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_249.png" /></figure>

## Chelators

### Molecules decreasing bioavailability of irons and vitamins

* Diminish bioavailability for microbes

* Affect growth and survival of bacteria

<table><thead><tr><th>Name</th><th>Localization</th><th>Antimicrobial activity</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ovotransferrin</td><td>ES, EW, MV, EY</td><td>+</td></tr><tr><td>RBP</td><td>ES, EW, MV, EY</td><td>+</td></tr><tr><td>Avidin</td><td>ES, EW, MV</td><td>+</td></tr><tr><td>Similar to avidin</td><td>EY</td><td>?</td></tr><tr><td>Vitellogenin 1</td><td>EY</td><td>?</td></tr><tr><td>Vitellogenin 2</td><td>EY</td><td>?</td></tr></tbody></table>

## Antimicrobial peptides

### Avian beta-defensins

Cationic peptides
Broad spectrum of antimicrobial activity

<figure><img src="image_250.png" /></figure>

### Histones

Basic proteins from nucleosomes
Agent of innate host defense (Gram + and Gram - strains)

<figure><img src="image_251.png" /></figure>
# Egg antimicrobial proteins (chemical defence)

<figure><img src="image_252.png" /></figure>

## C-type lectin-like proteins

Major components of the calcified eggshell of multiple avian species

C-type lectin domain: 110 to 130 residues including four cysteines involved
in two disulfide bonds

Ovocleidin 17 (Hincke et al., 1995) (eggshell, eggwhite, vitelline membrane)

Bactericidal activity against *Bacillus subtilis*, *Staphylococcus aureus* and *Pseudomonas aeruginosa* (Wellman-Labadie et al. 2008)

Other candidates (Jonchere et al., 2009, Bourin et al., 2012)

- Tetranectin (egg yolk)

- Collagen XVIII (eggshell)

- DEC-205 protein (eggshell)

- Mannose binding protein (eggshell, uterus)

<figure><img src="image_253.png" /></figure>
## I. Introduction

## II. Approches à haut débit pour identifier les protéines déposées dans l'œuf d'oiseaux

1. Généralité – stratégie expérimentale

2. Utilisation combinée des banques et outils

3. Transcriptome de l'œuf

4. Protéome de l'œuf

## III. Mieux comprendre les défenses de l'œuf grâce aux approches à haut débit

1. Défense physique (coquille)

a) Protéines de la matrice organique et bioméralisation

b) Caractérisation fonctionnelle des protéines de la matrice

c) Avancées récentes en génomique pour améliorer la solidité de la coquille

2. Défense antimicrobienne

a) Analyse bioinformatique des protéines antimicrobiennes

b) Classement fonctionnel des protéines antimicrobiennes

## IV. Conclusion
# CONCLUSIONS

Les stratégies utilisant la génomique et la génomique fonctionnelle simultanément avec la protéomique offrent un potentiel important

- ☐ Caractérisation des acteurs moléculaires

- ☐ Criblage de nombreuses fonctions biologiques potentielles

Intérêts dans la science de l'œuf

- ☐ protéines impliquées dans la biominéralisation de l'œuf

- ☐ Protéines de défenses moléculaires

- ☐ Autres activités biologiques

<figure><img src="image_254.png" /></figure>

Science des
biomatériaux

<figure><img src="image_255.png" /></figure>

Protection de l'œuf

- Défense physique

- Défense chimique

<figure><img src="image_256.png" /></figure>

Caractérisation de
nouvelles molécules
d'intérêts

- Antimicrobiennes

- Antivirales

- Antihypertensives

- Antioxydantes

- Anti-inflammatoires...