Exposition de courte durée aux pesticides et installation du microbiote intestinal chez l'abeille

L'exposition des abeilles aux pesticides peut provoquer des effets délétères qui altèrent, en autres, les fonctions de mémoire et d'apprentissage, le métabolisme énergétique, l'équilibre oxydatif, le développement larvaire et les fonctions de détoxication des abeilles. Mais quel est l'effet des pesticides sur le microbiote intestinal dont le rôle est essentiel au bon fonctionnement du système immunitaire ? Cet article expose les principaux résultats de travaux récemment publiés en anglais<fnref n="1" />, « Une exposition chronique aux pesticides, à une concentration environnementale faible, altère les marqueurs physiologiques de la santé des abeilles sans perturber l'installation du microbiote intestinal de base ».

Par Luc Belzunces et Hanine Almasri, Docteurs ès sciences

INRAE, Laboratoire de Toxicologie Environnementale, UR 406 Abeilles & Environnement,
84000 Avignon.

Les abeilles possèdent un microbiote intestinal, encore appelé flore intestinale. Il est constitué de bactéries, de levures, de champignons et de virus. Il assure un équilibre fin qui protège l'hôte, en empêchant l'installation des agents pathogènes, participe à la transformation des aliments et des substances étrangères à l'organisme (incluant les toxiques) et permet un dialogue entre le tissu digestif et différents systèmes biologiques, notamment le système immunitaire. À l'émergence, les individus sont dépourvus de microbiote et celui-ci s'acquiert, dans les premiers jours de la vie, par contact avec les congénères, les aliments (miel, pollen et pain d'abeille) et les matrices de la ruche.

L'effet des pesticides sur le microbiote intestinal de l'hôte a récemment bénéficié d'un intérêt croissant, l'intestin constituant le site principal d'interaction avec les polluants ingérés. L'intestin de l'abeille abrite une communauté bactérienne spécifique de faible complexité dominée par huit à dix groupes bactériens, ou phylotypes, chaque groupe comprenant des bactéries proches génétiquement. Parmi ces phylotypes, cinq (Gilliamella apicola, Snodgrassella alvi, Bifidobacterium asteroides, Lactobacillus Firm-4 et Lactobacillus Firm-5) représentent le microbiote intestinal de base trouvé chez chaque abeille ouvrière à travers la planète. Outre ces espèces bactériennes, d'autres espèces moins abondantes peuvent également être présentes.

<footnote n="1">¹ Belzunces L, Brunet J-L., Almasri L., Liberti J., Engel P., 2022, « Mild chronic exposure to pesticides alters physiological markers of honey bee health without perturbing the core gut microbiote », *Scientific Reports* 12:4281.</footnote>
## ENCADRE/Une nouvelle étude sur les effets des pesticides sur le microbiote intestinal des abeilles

Les effets des pesticides sur le microbiote intestinal des abeilles ont été évalués dans des études récentes. Cependant, plusieurs incertitudes existent encore pour comprendre l'effet des pesticides sur l'établissement du microbiote intestinal et les impacts sur la santé de l'abeille. En ce qui concerne les études sur le glyphosate, celles-ci étaient fondées sur l'exposition des abeilles à l'herbicide à des concentrations importantes, peu réalistes dans le cadre d'une expérience de semi-terrain. Ces concentrations étaient au moins cinq fois supérieures à celles rencontrées par les abeilles émergentes avec les matrices de la ruche dont les concentrations ne dépassaient pas 350 µg/kg dans le miel et 60 µg/kg dans le pain d'abeille. Les études sur l'imidaclopride n'ont pas analysé les effets sur le processus de colonisation intestinale précoce par le microbiote. Les fongicides triazoles n'ont pas fait l'objet d'études sur le microbiote intestinal des abeilles malgré leur forte utilisation en agriculture et leur détection fréquente dans les matrices des ruches. Dans la présente étude, nous avons considéré l'effet d'une exposition chronique à l'imidaclopride, au difénoconazole et au glyphosate, individuellement et en mélange ternaire, à une concentration environnementale de 0,1 µg/L<fnref n="2" />, sur la colonisation précoce par le microbiote intestinal et sur la physiologie des abeilles émergentes. La concentration de 0,1 µg/L a été choisie car elle correspond à la concentration la plus faible pour laquelle il a été démontré que l'imidaclopride, le difénoconazole et le glyphosate peuvent interagir en synergie lorsqu'ils se présentent sous forme de mélanges binaires ou ternaires<fnref n="3" />. Pour évaluer les effets sur la charge totale et la composition du microbiote intestinal, nous avons amplifié un gène codant pour une molécule spécifique (ARN ribosomal 16S) d'une structure cellulaire bactérienne et séquencé les segments amplifiés. Nous avons aussi quantifié les effets des pesticides et de la colonisation intestinale sur l'état physiologique des abeilles en étudiant la modulation de cinq marqueurs physiologiques : deux marqueurs impliqués dans la détoxication, la glutathion-S-transférase (GST) et la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH), un marqueur du métabolisme, la lactate déshydrogénase (LDH), et deux marqueurs immunitaires, la phosphatase alcaline (ALP) et la phénol oxydase (POx). Cette approche s'apparente à ce qui est pratiqué en analyse médicale où des marqueurs physiologiques sont utilisés comme témoins de l'état de santé des individus.

## Effets des pesticides sur l'installation du microbiote intestinal

Pour comprendre l'influence de l'exposition chronique aux pesticides sur la colonisation précoce de l'intestin, l'étude a été conduite en reprenant le protocole de celle précédemment publiée sur l'herbicide glyphosate par Motta et al. 2020, mais à une concentration environnementale inférieure plus réaliste. Les effets de deux autres pesticides, l'insecticide imidaclopride (I) et le fongicide difénoconazole (F), seuls ou en mélange ternaire (T) avec le glyphosate (H), ont été aussi considérés. L'étude a été menée sur des abeilles mellifères nouvellement émergées (émergentes) ayant subi une colonisation de leur intestin par le microbiote au moyen d'un homogénat intestinal<fnref n="4" /> (pour une partie d'entre elles, et pour l'autre, non), et exposées pendant cinq jours consécutifs aux pesticides<fnref n="5" />. Après cinq jours d'exposition aux pesticides, il apparaît

<footnote n="2">² La dose de 1 µg/L de sirop de saccharose correspond à 0.84 µg/kg.</footnote>

<footnote n="3">³ Almasri, H., et al., *Mixtures of an insecticide, a fungicide and a herbicide induce high toxicities and systemic physiological disturbances in winter Apis mellifera honey bees*. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2020. **203**.</footnote>

<footnote n="4">⁴ L'homogénat intestinal est obtenu par broyage de l'intestin de l'abeille (sans le jabot) dans un milieu stérile. Le broyat subit ensuite une courte centrifugation, pour éliminer les débris cellulaires, et un ajout de 20% glycérol. Il et est ensuite réparti dans des tubes stériles pour être stocké à -80°C jusqu'à utilisation.</footnote>

<footnote n="5">⁵ Les abeilles ont été récoltées à l'émergence (Jour 0 (J0)). Un jour après émergence (J1), les abeilles ont été exposées (ou non : contrôles non colonisés NCL) pendant 3 jours par voie orale à l'extrait intestinal contenant le microbiote des ouvrières adultes. Au jour J4, les abeilles ont été exposées (ou non : contrôles</footnote>
que les charges bactériennes intestinales constitutives d'un microbiote physiologique étaient jusqu'à trois fois plus élevées chez les abeilles des groupes dont l'intestin avait été colonisé par le microbiote CL (avec ou sans exposition aux pesticides) que chez les abeilles des groupes dont l'intestin n'avait pas été colonisé par le microbiote NCL (avec ou sans pesticides) - ce qui était attendu (les abeilles NCL n'étaient colonisées que par des bactéries opportunistes, probablement installées dans les heures qui ont suivi l'émergence, car résidant dans l'environnement de la ruche). Il a été aussi observé que les abondances bactériennes intestinales étaient similaires chez les abeilles exposées ou non aux pesticides et ce, pour chaque groupe d'individus, avec les intestins colonisés par le microbiote (CL) et non colonisés (NCL). Ainsi, les pesticides, seuls ou en mélange ternaire, n'ont pas eu d'incidence notable sur l'installation du microbiote intestinal en termes d'abondance bactérienne.

Nous avons néanmoins évalué les effets des traitements des pesticides sur la représentation de chaque type de bactéries. Au total, 42 types de bactéries ont subi des effets significatifs des traitements (Figure 1). Sur ces 42 types, 24 étaient spécifiques des groupes d'abeilles non colonisées par le microbiote, 8 spécifiques des abeilles colonisées et 10 communs aux groupes d'abeilles colonisées (CL) et non colonisées (NCL). Seuls deux de ces derniers types de bactéries se trouvent couramment dans l'intestin des abeilles mellifères : *Frischella*, affecté uniquement chez les abeilles colonisées, et *Arsenophonus*, affecté à la fois chez les abeilles colonisées et non colonisées. Il apparaît donc que ces effets ne représentent que des changements dans les bactéries transitoires opportunistes, d'abondance relativement faible et de présence facultative dans les intestins d'abeilles individuels.

<caption>**Figure 1. Effets des pesticides sur les différents types de bactéries du microbiote intestinal de l'abeille**</caption>

Les pesticides ont altéré 42 types de bactéries. Sur ces 42 types, 24 étaient spécifiques des groupes d'abeilles non colonisées (■ NCL) par le microbiote intestinal, 8 spécifiques des abeilles colonisées (■ CL) et 10 communs aux groupes d'abeilles colonisées (CL) et non colonisées (NCL).

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

<footnote>colonisés CL et non colonisés NCL sans pesticides) pendant 5 jours aux pesticides seuls ou en mélange ternaire. Au jour J8, neuf jours après émergence, les abeilles sont analysées pour évaluer la composition du microbiote intestinal et l'état physiologique des individus.</footnote>
## Effets physiologiques des pesticides en fonction de la présence ou de l'absence d'un microbiote intestinal de base

Les effets des pesticides, seuls et en mélange ternaire, sur l'état physiologique des abeilles mellifères ont été déterminés en étudiant les modulations de cinq marqueurs physiologiques dans la tête, l'abdomen et l'intestin moyen (Tableau 1). Les modulations sont symbolisées par des flèches dirigées vers le haut (augmentation) ou vers le bas (diminution).

### Tableau 1. Effets physiologiques des pesticides et de la colonisation de l'intestin par le microbiote intestinal

Pour détecter l'impact potentiel de la colonisation intestinale sur l'état physiologique des abeilles, nous avons comparé les niveaux des marqueurs physiologiques des abeilles, colonisées (CL) et non colonisées (NCL) par le microbiote, exposées aux mêmes traitements pesticides.

Les flèches (↘) ou (↗) indiquent respectivement une diminution ou une augmentation du marqueur physiologique par rapport aux témoins non traités colonisés (CL-Témoins) et non colonisés (NCL-Témoins) pour chaque modalité d'exposition aux pesticides. Les symboles (+) et (-) indiquent respectivement une valeur supérieure ou inférieure du marqueur physiologique chez les abeilles colonisées (CL) et non colonisées (NCL) par le microbiote, pour chaque modalité d'exposition aux pesticides (comparer les symboles de même couleur pour chaque modalité d'exposition aux pesticides). « nm » : non modulé.

<table><thead><tr><th rowspan="3">Marqueurs Physiologiques</th><th colspan="5">Abeilles colonisées par le microbiote (CL)</th><th colspan="4">Abeilles non colonisées par le microbiote (NCL)</th></tr><tr><th>Non exposées</th><th colspan="4">Exposées aux pesticides (I, F, H et Mélange T)</th><th>Non exposées</th><th colspan="4">Exposées aux pesticides (I, F, H et Mélange T)</th></tr><tr><th>CL (Témoins)</th><th>CL-I</th><th>CL-F</th><th>CL-H</th><th>CL-T</th><th>NCL (Témoins)</th><th>NCL-I</th><th>NCL-F</th><th>NCL-H</th><th>NCL-T</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="11"><strong>Marqueurs de détoxication</strong></td></tr><tr><td>GST Tête</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td></tr><tr><td>GST Intestin</td><td>+</td><td>nm</td><td>↘</td><td>nm</td><td>nm</td><td>-</td><td>↗</td><td>↗</td><td>↗</td><td>↗</td></tr><tr><td>GST Abdomen</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>+</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>-</td></tr><tr><td>G6PDH Tête</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>+</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>●</td><td>nm</td></tr><tr><td>G6PDH Intestin</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td></tr><tr><td>G6PDH Abdomen</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td></tr><tr><td colspan="11"><strong>Marqueurs du métabolisme</strong></td></tr><tr><td>LDH Tête</td><td>nm</td><td>-</td><td>-</td><td>↗</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>↗</td><td>↗</td><td>↗</td></tr><tr><td>LDH Intestin</td><td>-</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td></tr><tr><td>LDH Abdomen</td><td>nm</td><td>+</td><td>nm</td><td>↗</td><td>nm</td><td>nm</td><td>-</td><td>↗</td><td>-</td><td>nm</td></tr><tr><td colspan="11"><strong>Marqueurs immunitaires</strong></td></tr><tr><td>ALP Intestin</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td></tr><tr><td>POx Intestin</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td><td>nm</td></tr></tbody></table>
Chez les abeilles disposant d'un microbiote bien installé (CL), le fongicide (CL-F) a augmenté l'activité du marqueur métabolique LDH dans la tête et a diminué l'activité du marqueur de détoxication GST dans l'intestin moyen. Les autres marqueurs, GST dans la tête et l'abdomen, la G6PDH dans la tête, l'abdomen et l'intestin moyen, la LDH dans l'abdomen et l'intestin moyen et l'ALP et la POx dans l'intestin moyen, n'ont pas été modulés après exposition aux pesticides.

## L'effet protecteur du microbiote intestinal

Chez les abeilles ne disposant pas d'un microbiote intestinal (NCL), la perturbation physiologique est plus importante que chez les abeilles colonisées par le microbiote (CL). Un plus grand nombre de marqueurs physiologiques a été modulé, et dans un plus grand nombre de tissus.

Ceci suggère fortement que le microbiote intestinal à un effet protecteur vis-à-vis des stresseurs environnementaux. Une partie de cet effet protecteur pourrait être due à la métabolisation partielle des pesticides, ingérés par les individus, par le microbiote intestinal, comme cela a été montré chez l'abeille. Cette hypothèse est appuyée par la baisse du marqueur de détoxication dans l'intestin des abeilles colonisées alors qu'une hausse est observée chez les abeilles non colonisées, comme pour pallier une déficience dans la détoxication des pesticides en absence de microbiote.

## Les effets physiologiques du microbiote

Il apparaît que le microbiote n'induit pas que des effets locaux au niveau de l'intestin, où il est installé. Il a une action systémique et son installation peut avoir des impacts sur la physiologie de compartiments tels que la tête ou de l'abdomen. Selon les situations environnementales de stress, ici une exposition à des pesticides seuls ou en mélange, le microbiote peut induire des effets différentiels dans les tissus de l'abeille qui ont des fonctions physiologiques différentes. Bien que ce résultat soit original, il n'est pas vraiment surprenant car des marqueurs physiologiques ayant des fonctions identiques peuvent avoir des rôles distincts dans les différents compartiments biologiques et peuvent présenter des structures légèrement différentes selon les tissus où ils sont localisés. Ainsi, pour un même stresseur ou un même facteur biologique, un marqueur donné pourra subir des variations différentes selon les fonctions biologiques qu'il a dans les différents tissus.

## Les effets sur la survie des abeilles et la consommation de nourriture

Le taux de survie a été suivi pendant les 5 jours d'exposition aux pesticides de façon à pouvoir comparer les résultats avec l'étude publiée sur les effets du glyphosate sur le microbiote intestinal des abeilles. Aucune différence dans les taux de survie et de consommation de nourriture n'a été observée entre les abeilles non exposées colonisées et non colonisées (CL-Témoins et NCL-Témoins). De plus, aucun effet significatif des traitements aux pesticides n'a pu être observé entre les abeilles colonisées et non colonisées, même avec le mélange ternaire.

Ainsi, dans les conditions de l'étude précédemment publiée par Motta et al. en 2020, nous n'avons observé aucun effet des pesticides, du microbiote ou de la combinaison pesticide/microbiote sur la survie ou la consommation alimentaire des abeilles. Cependant, il n'est pas exclu que, pour des durées d'exposition supérieures ou des doses différentes, des effets sur la longévité des abeilles puissent être induits. Toutefois, comme l'a montré l'étude de Motta et al., la mortalité induite par le glyphosate paraît plus liée à des effets physiologiques de l'herbicide qu'à une perturbation du microbiote intestinal.
## Discussion : Du rôle du microbiote intestinal pour métaboliser les pesticides et réduire le stress qu'ils induisent

Globalement, nos résultats montrent que les trois pesticides et leur mélange ternaire, à la concentration 0,1 µg/L dans la nourriture, n'ont pas affecté significativement l'installation du microbiote intestinal de l'abeille, contrairement à ce qui avait été publié dans une étude mettant en œuvre des niveaux d'exposition non environnementaux. La charge bactérienne totale et l'abondance des espèces bactériennes centrales sont identiques chez les abeilles exposées et non exposées aux pesticides. Cependant, les pesticides induisent des changements dans les fonctions physiologiques clés, qui deviennent plus prononcés lorsque la communauté bactérienne centrale de l'intestin ne s'est pas établie.

La présence du microbiote intestinal semble contribuer à la métabolisation des pesticides et la réduction des stress qu'ils induisent car, en absence de microbiote, l'organisme réagit en augmentant l'activité de marqueurs de détoxication (GST) et de métabolisme (LDH). Il est à noter que l'effet le plus prononcé sur le marqueur de détoxication est observé dans l'intestin, ce qui pourrait paraître logique car cet organe est le premier site d'exposition aux pesticides ingérés et représente un site primaire de métabolisation des polluants. En revanche, aucun effet n'a été observé au niveau des marqueurs immunitaires (ALP et POX). Or, un très grand nombre d'études montrent qu'il s'établit, au niveau intestinal, « un dialogue » entre le microbiote, le tissu intestinal et le système immunitaire. Ainsi, l'absence d'effet au niveau immunitaire pourrait s'expliquer simplement par une situation non pathologique pour l'abeille liée à une absence d'exposition à des agents pathogènes (virus, levures, champignons, bactéries), du moins dans les premiers jours de la vie des individus, dans cette étude. Ainsi, il apparaît important de conduire des travaux sur les effets des pesticides sur l'installation et les modifications du microbiote dans des situations de co-exposition des abeilles à des agents pathogènes.

Finalement, cette étude n'a pas montré d'effet d'une exposition, à des doses environnementales, à un insecticide (imidaclopride), un fongicide (le difénoconazole) et un herbicide (le glyphosate) sur l'installation du microbiote intestinal de l'abeille. Cependant, il sera nécessaire de conduire des études avec des durées d'exposition supérieures, ou avec des expositions à différentes périodes de la vie des abeilles, pour voir si les pesticides peuvent modifier, à terme, la composition du microbiote intestinal et impacter la santé de l'abeille. De plus, cette étude met en œuvre un niveau d'exposition environnemental pour lequel il avait été trouvé une interaction synergique entre les trois pesticides étudiés. Aussi, il serait utile de considérer les effets de ces mêmes pesticides à différents niveaux d'exposition, supérieurs ou inférieurs.

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