# Rapport de retour d'expérience 2024: note technique sur la conservation de l'ADN de diatomées et ring-test pour l'application de la méthodologie ADN-diatomées

Laurine Viollaz, Benoît Paix, Frédéric Rimet

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Laurine Viollaz, Benoît Paix, Frédéric Rimet. Rapport de retour d'expérience 2024: note technique sur la conservation de l'ADN de diatomées et ring-test pour l'application de la méthodologie ADN-diatomées. UMR Carrtel, USMB, INRAE. 2022. hal-05184637

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Submitted on 24 Jul 2025

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<figure><img src="image_1.png" /></figure>

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**Rapport de retour d'expérience 2024 : note technique sur la
conservation de l'ADN de diatomées et ring-test pour l'application
de la méthodologie ADN-diatomées**

Laurine VIOLLAZ<fnref n="1" />, Benoît PAIX<fnref n="1" />, Frédéric RIMET<fnref n="1" />,<fnref n="2" />,

<footnote n="1">¹INRAE – UMR CARRTEL, F-74500 Thonon-les-Bains, France</footnote>

<footnote n="2">²ECLA – Pôle RD Ecosystèmes Lacustres (ECLA) – France</footnote>
# 1. Retour d'expérience sur la conservation de l'ADN et propositions de protocoles

## 1.1. Retour d'expérience sur la conservation de l'ADN

Ce retour d'expérience se base sur une étude menée à l'échelle européenne, dans le cadre du réseau Cost DNAquaNet et pour lequel INRAE a été l'organisateur principal. Un article scientifique a été publié et accessible en open access :

Baricevic, A., C. Chardon, M. Kahlert, S. M. Karjalainen, D. M. Pfannkuchen, M. Pfannkuchen, F. Rimet, M. S. Tankovic, R. Trobajo, V. Vasselon, J. Zimmermann, & A. Bouchez, 2022. Recommendations for the preservation of environmental samples in diatom metabarcoding studies. Metabarcoding and Metagenomics Pensoft Publishers 6: e85844. https://doi.org/10.3897/mbmg.6.85844

Ce retour d'expérience se base sur cette publication qui est résumé ci-dessous.

### 1.1.1 Objectifs

Plusieurs études ont permis de comparer les différentes étapes du métabarcoding afin de corriger les différences entre les données de microscopie et les données biomoléculaires (Tapolczai et al. 2019, Rivera et al. 2020, Bailet et al. 2020 et Kang et al. 2021). Pour cela, plusieurs protocoles ont été comparés afin de déterminer la meilleure méthode d'extraction d'ADN à appliquer (Vasselon et al. 2017b). Cependant, les différents processus d'échantillonnage suivi de la conservation des échantillons n'avaient pas été pris en compte jusqu'à cette étude.

L'objectif de cette étude a été de déterminer quelle est la meilleure méthode de préservation des échantillons benthiques et de phytoplancton destiné au métabarcoding des Diatomées. Plusieurs méthodes de préservation ont été testées afin de permettre une standardisation de la méthode. Pour répondre aux objectifs de l'étude, trois méthodes de préservation communément utilisées ont été sélectionnées avec différentes durées de stockage allant de 1 jour à 1 an : 1) éthanol, 2) congélation ou 3) solution de préservation des acides nucléiques. Cependant, d'autres méthodes de conservation pourraient être envisagées pour une durée de stockage supérieure à 1 an qui dépendent de la capacité des laboratoires et qui n'ont pas été abordées dans cette étude. Les trois méthodes ont été comparées en se basant sur l'analyse de la quantité et la qualité de l'ADN extrait, la diversité et la structure des communautés de Diatomées par l'approche de métabarcoding et enfin, les valeurs d'indices de qualité écologique ont été comparés.

### 1.1.2 Matériels et méthodes

Le protocole expérimental est présenté en **figure 1**. Six sites d'échantillonnage ont été choisis au niveau européen puis échantillonnées (liste présentée en **tableau 1**). Ils ont été sélectionnés pour couvrir des différences importantes au niveau de leur typologie et en termes de qualité de l'eau.

Le phytobenthos d'eau douce a été échantillonné à partir de biofilms conformément à la norme européenne (CEN, 2014). La suspension de biofilm obtenue a été transférée dans une bouteille stérilisée de 1 litre qui a été ensuite stockée dans une glacière contenant des packs de glace sur le terrain (température maximum de +4°C) pour un envoi immédiat sur un délai de 1 jour au laboratoire. Après réception, les échantillons ont décanté trois heures à +5°C puis ont été concentrés par élimination du surnageant pour obtenir un volume final de 900mL de biofilm en suspension. Les
échantillons ont ensuite été homogénéisés puis sous-échantillonnés dans trois bouteilles stérilisées (une bouteille de 300mL/méthode de conservation).

Le phytoplancton marin a été échantillonné par un trait de filet vertical sur les deux sites marins (LC et ES) à l'aide d'un filet (maille 50µm) de 15m de profondeur jusqu'à la surface. Chaque échantillon de filet a été filtré sur des filtres en cellulose de 1,2µm (Milipore) ou microfibre de verre GF/F (Whatman). Pour chaque site, 18 filtres ont été placés dans des tubes stockés dans une glacière contenant des blocs de glace en vue d'un envoi immédiat dans un délai de 1 jour au laboratoire. Les filtres ont ensuite été coupés afin d'obtenir 12 sous-échantillons/méthode de préservation et durée de stockage.

Après échantillonnage, les trois méthodes de préservation ont été appliquées sur les échantillons provenant des sites marins et des sites d'eau douce :

- Préservation par éthanol (ET) : pour les échantillons d'eau douce, trois volumes d'éthanol à 96% ont été ajoutés à un volume de biofilm afin d'obtenir une concentration finale en éthanol de 70%. Cette méthode a été appliquée sur un flacon de 300mL sous agitation. La solution de biofilm préservé a ensuite été stocké à l'obscurité à +4°C.

- La congélation (FR) : douze sous-échantillons de 2mL de la suspension de biofilm ont été obtenus à partir d'un flacon de 300mL maintenu sous agitation pour chaque site. Les sous-échantillons ont ensuite été centrifugés, le surnageant a été éliminé et le culot a été congelé à -20°C pour les échantillons provenant d'eau douce.

Solution de conservation des acides nucléiques (RL) : la solution de préservation a été fabriquée à partir de 3.5M de sulfate d'ammonium, 17mM de citrate de sodium et 13mM d'acide d'éthylène-diamine-tetra-acétique (EDTA) suivi d'une stérilisation par filtration à 0,2µm. Pour les échantillons d'eau douce, un volume de la solution de conservation a été ajouté à un volume de biofilm échantillonné, pour une bouteille de 300mL sous agitation. Des sous-échantillons de la solution de biofilm préservé ont été stockés à -20°C pour chaque site.

<table><caption>**Tableau 1.** Description des sites d'échantillonnage : localisation, références géographiques selon le système WGS84, caractéristiques du site, écosystème aquatique et compartiment biotique sont indiqués.</caption><thead><tr><td>Code du site</td><td>Emplacement</td><td>Coordonnées GPS (Latitude,Longitude)</td><td>Etat trophique</td><td>Ecosystème aquatique</td><td>Compartiment biotique</td></tr></thead><tbody><tr><td>LC</td><td>Baie de Lim - Croatie</td><td>45,132529, 13,66059</td><td>mésotrophe</td><td>marin</td><td>phytoplancton</td></tr><tr><td>ES</td><td>Baie de l'Ebre - Espagne</td><td>40,816710, 0,73077</td><td>mésotrophe</td><td>marin</td><td>phytoplancton</td></tr><tr><td>OF</td><td>Rivière Edian - France</td><td>46,255750, 6,72342</td><td>oligotrophe</td><td>eau douce</td><td>phytobenthos</td></tr><tr><td>MS</td><td>Fleuve Ebre - Espagne</td><td>40,815005, 0,51997</td><td>mésotrophe</td><td>eau douce</td><td>phytobenthos</td></tr><tr><td>EG</td><td>Chaîne Teltow - Allemagne</td><td>52,437615, 13,32039</td><td>eutrophe</td><td>eau douce</td><td>phytobenthos</td></tr><tr><td>HF</td><td>Rivière Kalimenoja - Finlande</td><td>65,169722, 25,86889</td><td>humique</td><td>eau douce</td><td>phytobenthos</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.** Workflow of the study presenting the 3 methods of preservation (FR: congélation, RL: solution of preservation of acides nucléiques, ET: ethanol) applied on the samples of microalgae benthic d'eau douce and phytoplankton marine.</figcaption></figure>

### 1.1.3 Résultats et discussion

#### Qualités et quantités d'ADN extraits

L'extraction d'ADN has been realized with the kit Macherey-Nagel NucleoSpin Soil filter kit from Vautier et al. 2020. The quality and quantity of ADN have been verified for each method.
de préservation et chaque temps de préservation. Des différences en quantité d'ADN ont été observées entre les échantillons (figure 2). Ces résultats peuvent s'expliquer par la diversité environnementale des sites choisis, les biomasses de diatomées présentes dans les biofilms, ainsi que leurs statuts trophiques, ce qui est un résultat attendu et explique les différences en termes de quantité d'ADN sur les méthodes de préservation entre les sites marins et les sites d'eau douce. Par ailleurs, le choix de la méthode de conservation a un effet sur la quantité d'ADN de Diatomées. Une diminution significative de la quantité d'ADN a été constaté à partir de 3 mois de stockage pour les échantillons préservés dans l'éthanol (ET) avec une quantité ADN inférieure au deux autres méthode (FR et RL). Par ailleurs, la mesure par spectrophotométrie (ratio 260/280nm) a révélé une bonne qualité d'ADN pour l'ensemble des échantillons. La méthode n'influe pas sur la qualité de l'ADN. Cependant, si on considère les critères quantité et qualité, la congélation semble être la meilleure méthode pour conserver les échantillons d'eau douce sur une longue durée. En ce qui concerne les sites marins, aucune différence significative en termes de concentration ADN n'est observée entre les 3 méthodes. Le choix de la méthode n'a donc aucun impact sur la quantité d'ADN pour les échantillons provenant de sites marins. Ces résultats ont été également observés pour la durée de conservation (pas de variation significative des concentrations en ADN entre les différentes durées de conservation).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2.** Concentration d'ADN en fonction du temps de stockage (D : jour, W : semaine, M : mois) allant de 1 jour à 12 mois pour les 3 méthodes de préservation (ET : éthanol, FR : congélation, RL : solution de préservation) avec les sites marins (LC et ES) et les sites d'eau douce (OF, MS, EG et HF).</figcaption></figure>

## Structure des communautés de Diatomées

L'impact des méthodes de préservation et de la durée de stockage sur la structure des communautés de Diatomées ont été évaluées avec des analyses multidimensionnelles non paramétriques (figure 3).

Une nette différence entre les sites est observée dans un premier temps : l'origine du prélèvement influence significativement la structure des communautés de Diatomées. En effet, il y a une différence
significative de dans la structure et composition des communautés de Diatomées entre les différents sites d'échantillonnage en termes de présence/absence de taxons. Suite à ces résultats, les effets de la méthode de préservation et la durée de stockage ont été testés site par site : aucune différence significative n'a été observée entre les différentes méthodes pour l'ensemble des sites (p>5%). Cependant, l'approche NMDS a révélée des différences dans la composition et assemblage des communautés pour les taxons rares (taxons présentant moins de 100 reads sur 14 190 reads, soit moins de 0,7% des reads) entre échantillons d'un même site. La diversité des Diatomée n'est pas affectée par la méthode de préservation.

Une comparaison du nombre de taxons partagés entre les différentes méthodes de préservation a été réalisée. Au total, 75% des taxons sont partagé dans l'ensemble des échantillons, indépendamment des durées de stockage (les taxons uniques à chaque durée présentant une faible abondance < 100 reads). Les taxons rares sont donc souvent spécifiques à une méthode et disparaissent et apparaissent au cours du temps sans distinction d'un pattern évident.

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Figure 3.** Méthode de positionnement multidimensionnel non paramétrique (NMDS) pour tous les échantillons provenant des différents sites (marins et eau douce) en prenant en compte l'abondance des reads. Les 3 méthodes de préservations sont représentées par des couleurs différentes, les temps de préservation sont représentés par des formes des points différents. Chaque ellipse représente un site.

L'impact des différentes méthodes de conservation sur la diversité de l'assemblage des communautés de Diatomées a été comparé via le nombre de reads présents dans les échantillons provenant de sites marins et d'eau douce (figure 4). Après la prise en compte des différentes méthodes ainsi que les durées de stockage, les sites d'eau douce sont caractérisés par un nombre de reads (41 222 reads/échantillon), une richesse en OTU et taxons (433 OTU/échantillon et 111 taxon/échantillon) ainsi que des valeurs d'indice de diversité (Shannon) plus élevées par rapport aux sites marins (27 155 reads/échantillon, 199 OTU et 67 taxons/échantillon).

Le nombre moyens d'OTUs et de taxons pour l'ensemble des sites est similaire entre les différentes méthodes et durées de préservation testées. Les trois méthodes de conservation n'ont pas d'impact
significatifs sur le nombre de reads, le nombre d'OTUs et le nombre de taxons ainsi que sur l'indice de Shannon pour les sites marins et eau douce. Les paramètres de la diversité ne changent pas au cours du temps. Il n'y a donc pas d'effet significatif de la durée de conservation sur la diversité de l'assemblage des communautés de Diatomées.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4.** Paramètres de diversité des assemblages de Diatomées. Diagramme en boîtes pour (a) le nombre de reads, (b) l'indice de Shannon, (c) le nombre d'OTU et (d) le nombre de taxons pour les trois méthodes de conservation (bleu : ET, jaune : FR, gris : RL) pour les sites marins (LC, ES) et les sites d'eau douce (OF, MS, EG, HF). Les cases représentent l'intervalle interquartile, la médiane étant indiquée par une ligne et les moustaches s'étendant aux valeurs les plus élevées et les plus basses.</figcaption></figure>

## Indices de qualité écologique (IPS et IBD)

L'étape de préservation des échantillons ainsi que la durée de stockage sont des étapes crucales qui peuvent avoir des effets sur l'évaluation de la qualité écologique selon la méthode utilisée. L'indice de qualité écologique spécifique IPS (Indice de Polluosensibilité Spécifique, mis au point par M. Coste in Cemagref 1982) a été calculé afin de comparer les méthodes de préservation dans un contexte de biosurveillance (figure 5). L'indice IPS ne varie ni entre les trois méthodes de préservation testées, ni entre les 6 durées de préservation : aucune différence significative n'a été observée.
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 5.** Indice de polluo-sensibilité spécifique (SPI) calculé pour les trois méthodes de préservation (ET : éthanol en bleu, FR : congélation en jaune, RL : solution de préservation des acides nucléiques en gris). A partir des résultats de l'étude, les indices IBD ont été calculés pour les échantillons des sites d'eau douce puis comparés entre les différentes méthodes et durées de préservation en plus des résultats de cette étude (Figure 6). Aucun effet significatif sur les valeurs de l'indice n'a été observé pour les 3 méthodes de conservation et durée de stockage pour les sites d'eau douce. Le choix de la méthode de conservation n'influe pas sur la qualité des indices biotiques (IPS et IBD).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

**Figure 6.** Indice Biologique Diatomées (IBD) calculé pour les trois méthodes de conservation (ET : éthanol en bleu, FR : congélation en jaune, RL : solution de préservation des acides nucléiques en gris). Les IBDs ont été calculés à partir des données originales de l'étude. Les durées de stockage sont représentées par 1J : 1 jour, 1S : 1 semaine, 1M : 1 mois).

### 1.1.4 Conclusion

Cette étude as permis de mettre en évidence que les différences de méthodes de conservation et de durée de stockage testées n'ont pas d'effet sur la structure des communautés de Diatomées d'eau douce ainsi que sur le calcul de l'indice de qualité écologique. Cependant, les choix de la méthode de préservation peuvent affecter l'identification d'espèces rares difficiles à détecter (représentant moins de 0.7% du nombre de reads). Aux vues de ces résultats, une durée de stockage légèrement supérieure à 1 an ne devrait pas affecter la préservation des échantillons en termes de structures des communautés et d'indice IBD et IPS. Pour une durée supérieure à un an, il est conseillé de préserver les ADN extrait à -20°C en évitant les cycles de congélation-décongélation.

Cependant, la méthode de conservation de l'ADN par l'éthanol semble la moins efficace quand on considère la quantité d'ADN, puisque la quantité d'ADN diminue au cours du temps. Cependant, la conservation à l'éthanol n'a ni d'effets sur la structure des communautés au cours du temps (donc pas de perte de qualité de l'ADN au cours du temps) ni sur les indices IPS et IBD.

Pour conclure, les trois méthodes de préservation (éthanol, solution de préservation, congélation) peuvent être utilisées. Le choix peut être laissé aux opérateurs de terrain en fonction des possibilités et moyens financiers qu'ils ont à disposition :

- L'éthanol présente l'avantage d'être bon marché, facile à acheter, mais peut présenter des problèmes lorsque des quantités importantes sont transportées (douanes, inflammabilité) et lorsque l'échantillon doit être analysé longtemps après le prélèvement (baisse des quantités
d'ADN par lyse des cellules qui conduit à un relargage de l'ADN dans la solution d'éthanol. Cependant, cette méthode n'influe pas sur la diversité des communautés ni sur les indices de qualité (IBD, IPS) et peut être utilisée pour des périodes de stockage courtes (24h) et permet également de stocker un grands nombre d'échantillons.

- La solution de préservation présente l'avantage de bien conserver l'ADN dans le temps, mais nécessite d'être préparé en amont et de présenter quelques désavantages lorsque l'étape d'extraction est abordée.

- La congélation présente l'avantage de bien conserver l'ADN dans le temps, mais demande de pouvoir retourner rapidement au laboratoire pour centrifuger et congeler rapidement l'échantillon. De plus, les cycles de congélation-décongélation sont à éviter car ces cycles peuvent altérer la stabilité de l'ADN au cours du temps et par conséquent altérer les résultats.

Pour la conservation de l'ADN, le choix de la méthode doit être adaptée au contexte d'échantillonnage. Pour l'organisation sur le terrain, sans accès direct au laboratoire, la meilleures méthode pour conserver l'ADN est l'ajout d'une solution de préservation des acides nucléiques ou d'éthanol. L'éthanol semble être la meilleure stratégie pour conserver le plus facilement à moindre coût un grand nombre d'échantillon sur le terrain pour une durée inférieure aux deux autres méthodes. L'ensemble des étapes dans le choix de la méthode de préservation la mieux adaptée en fonction des besoins des laboratoires est résumé figure 7.

Toutes ces méthodes sont incluses dans le rapport technique du CEN (CEN 2018) et dans la nouvelle version de la norme EN 13946 de 2024 (CEN 2024). Nous détaillons dans la partie suivante les protocoles à suivre pour chacune des méthodes.
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**Figure 7.** Logigramme pour la conservation des échantillons bruts ADN de Diatomées. Sans accès direct au laboratoire, il est préférable de conserver les échantillons par ajout d'une solution de préservation en fonction du nombre d'échantillons (éthanol 96% : grand nombre d'échantillons, solution de préservation des acides nucléiques). Si un accès direct au laboratoire est possible, les échantillons peuvent être conservés par congélation directement (-20°C pour les échantillons marins et -80°C pour les échantillons d'eau douce).
1.1.5 Références

Afnor, 2024. NF EN 13946 - Qualité de l'eau - Guide pour l'échantillonnage en routine et le prétraitement des diatomées benthiques de rivières et de plans d'eau. Afnor 1-18

Bailet B, Apothéloz-Perret-Gentil L, Baričević A, Chonova T, Franc A, Frigerio J-M, Kelly M, Mora D, Pfannkuchen M, Proft S, Ramon M, Vasselon V, Zimmermann J, Kahlert M (2020) Diatom DNA metabarcoding for ecological assessment: Comparison among bioinformatics pipelines used in six European countries reveals the need for standardization. The Science of the Total Environment 745: 140948. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140948

Bruce K, Blackman RC, Bourlat SJ, Hellström M, Bakker J, Bista I, Bohmann K, Bouchez A, Brys R, Clark K, Elbrecht V, Fazi S, Fonseca VG, Hänfling B, Leese F, Mächler E, Mahon AR, Meissner K, Panksep K, Pawlowski J, Luis P, Yáñez S, Seymour M, Thalinger B, Valentini A, Woodcock P, Traugott M, Vasselon V, Deiner K (2021) A practical guide to DNA-based methods for biodiversity assessment. Advanced Books 1: e68634. https://doi.org/10.3897/ab.e68634

Cemagref, 1982. Etude des méthodes biologiques quantitative d'appréciation de la qualité des eaux : 1-218

CEN, 2014. Water quality – Guidance standard for the routine sampling and pretreatment of benthic diatom from rivers. EN 13946:2014. Comité Européen de Normalisation, Geneva.

CEN, 2018. Water quality - CEN/TR 17245 - Technical report for the routine sampling of benthic diatoms from rivers and lakes adapted for metabarcoding analyses. CEN standard. CEN-CENELEC Management Centre: Rue de la Science 23, B-1040 Brussels, pages 1-8

CEN (2018b) CEN/TR 17245: Water quality. Technical report for the routine sampling of benthic diatoms from rivers and lakes adapted for metabarcoding analyses. In: CEN/TC 230/WG23, Aquatic Macrophytes and Algae, 1-8

Kang W, Anslan S, Börner N, Schwarz A, Schmidt R, Künzel S, Rioual P, Echeverría-Galindo P, Vences M, Wang J, Schwalb A (2021) Diatom Metabarcoding and Microscopic Analyses from Sediment Samples at Lake Nam Co, Tibet: The Effect of Sample-Size and Bioinformatics on the Identified Communities. Ecological Indicators 121: 107070. https://doi.org/10.1016/j.ecolind.2020.107070

Pawlowski J, Bonin A, Boyer F, Cordier T, Taberlet P (2021) Environmental DNA for biomonitoring. Molecular Ecology 30(13): 2931–2936. https://doi.org/10.1111/mec.16023

Tapolczai K, Keck F, Bouchez A, Rimet F, Kahlert M, Vasselon V (2019) Diatom DNA Metabarcoding for Biomonitoring: Strategies to Avoid Major Taxonomical and Bioinformatical Biases Limiting Molecular Indices Capacities. Frontiers in Ecology and Evolution 7: e409. https://doi.org/10.3389/fevo.2019.00409

Vasselon V, Domaizon I, Rimet F, Kahlert M, Bouchez A (2017b) Application of high-throughput sequencing (HTS) metabarcoding to diatom biomonitoring: Do DNA extraction methods matter? Freshwater Science 36(1): 162–177. https://doi.org/10.1086/690649

Vautier M, Vasselon V, Chardon C, Rimet F, Bouchez A, Domaizon I (2020) DNA extraction from environmental biofilm using the NucleoSpin Soil kit (Macherey-Nagel). https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bd52i88e
## 1.2 Proposition de protocoles pour la conservation des échantillons de diatomées

Trois protocoles de conservation sont proposés dans cette partie et sont en accord avec les résultats de l'étude présentée en §1.1, ainsi qu'avec les prescriptions du TR 17245 (CEN 2018) et de la nouvelle version de la norme EN13946 (CEN 2024).

### 1.2.1 Protocole pour la conservation de l'ADN par l'éthanol

#### Généralités

L'éthanol (>90%) est recommandé afin de stocker et conserver les échantillons directement sur le terrain sans altérer la qualité d'ADN présent en vue d'analyses moléculaires. Avec une conservation à l'éthanol, la quantité d'ADN dans l'échantillon diminue progressivement (Baricevic et al. 2022). L'utilisation de l'éthanol est donc recommandée pour conserver les échantillons sur une durée courte (environ 1 an) et si un retour au laboratoire n'est pas possible dans la journée (nécessaire pour les autres protocoles afin de congeler les échantillons). Le matériel utilisé (brosse à dent, cuvette, tubes) ne doit pas présenter de traces d'ADN de diatomées avant son utilisation. Il est également préférable d'utiliser des gants stériles pendant le prélèvement pour éviter toute contamination. Les volumes indiqués ci-dessous sont indicatifs.
# Méthode d'échantillonnage des biofilms pour conservation à l'éthanol

## Prélever 5 pierres

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Laisser égoutter quelques minutes

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Brosser le biofilm avec une brosse à dents dans une cuvette contenant **50mL d'éthanol**

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

Homogénéiser

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Verser 35mL du contenu de la cuvette (biofilm + éthanol) dans un tube de 50mL

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Compléter avec de l'éthanol pour une concentration finale à 70%
(Jusqu'à 50mL)

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Stockage des échantillons bruts sur une durée <1 an après échantillonnage, en chambre froide (+4°C) et à l'obscurité
### 1.2.2 Protocole pour la conservation de l'ADN par congélation

#### Généralités

La préservation par congélation est recommandée afin de stocker et conserver les échantillons directement sur le terrain sans altérer la qualité et la quantité d'ADN présent en vue d'analyse moléculaires. Les échantillons doivent être conservés au froid (7°C environ) immédiatement après le prélèvement. Les culots de biofilms doivent être stockés à -20°C dans les 5h après échantillonnage. Le matériel utilisé (brosse à dent, cuvette, tubes) ne doit pas présenter de traces d'ADN de diatomées avant son utilisation. Il est également préférable d'utiliser des gants stériles pendant le prélèvement pour éviter toute contamination. Les volumes indiqués ci-dessous sont indicatifs.

#### Méthode d'échantillonnage des biofilms pour conservation par congélation

##### Prélever 5 pierres

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Laisser égoutter quelques minutes

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

Brosser le biofilm avec une brosse à dents dans une cuvette contenant **50mL d'eau stérile et déminéralisée**

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Homogénéiser

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Verser le contenu de la cuvette (biofilm + eau) dans un tube de 50mL

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Stocker les échantillons sur le terrain dans une boîte réfrigérante (température maximale environ 7°C soust 5h après l'échantillonnage)

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Pas de solution ajoutée

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

Au laboratoire, homogénéiser les échantillons puis transférer 2mL de la solution dans un tube Eppendorf 2mL

Centrifuger à 8 000g, 10 min

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Eliminer la quasi-totalité dusurnageant à l'aide d'une pipette de 100µL et garder le culot

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

Stocker les échantillons à -20°C
### 1.2.3 Protocole pour la préservation de l'ADN par ajout d'une solution tampon

#### Généralités

L'ADN environnemental de Diatomées peut être conserver dans une solution tampon pour les acides nucléiques ADN/ARN adaptée pour des analyses moléculaires. La solution peut être obtenue par mélange de 3,5 M de sulfate d'ammonium, 17 mM de citrate de sodium et 13 mM d'acide éthylènediamine-tétra-acétique (EDTA). Cette solution (« RNAlater ») peut être utilisée sous condition que les échantillons doivent être congelés à -20°C sous 24 heures. Le matériel utilisé (brosse à dent, cuvette, tubes) ne doit pas présenter de traces d'ADN de diatomées avant son utilisation. Il est également préférable d'utiliser des gants stériles pendant le prélèvement pour éviter toute contamination. Les volumes indiqués ci-dessous sont indicatifs.

#### Méthode d'échantillonnage des biofilms pour conservation par une solution tampon

##### Prélever 5 pierres

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Laisser égoutter quelques minutes

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Brosser le biofilm avec une brosse à dents dans une cuvette contenant **50mL d'eau stérile et déminéralisée**

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

Homogénéiser

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Verser 25mL du contenu de la cuvette (biofilm + eau) dans un tube de 50mL

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Compléter avec la solution tampon RNAlater à 50mL pour une concentration finale de 50%

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>
### 1.2.4 Références

CEN, 2018. Water quality - CEN/TR 17245 - Technical report for the routine sampling of benthic diatoms from rivers and lakes adapted for metabarcoding analyses. CEN standard. CEN-CENELEC Management Centre : Rue de la Science 23, B-1040 Brussels, pages 1–8.
## 2. Retour d'expérience sur les exercices d'intercalibration et de comparaison de méthodes d'extractions d'ADN et de PCR

Ce retour d'expérience se base sur une étude menée en collaboration avec 17 laboratoires européens dans le cadre du réseau Cost DNAqua-Net, et pour lequel INRAE a été l'organisateur principal (laboratoire de référence). Un article scientifique a été soumis dans le journal *Metabarcoding and Metagenomics* :

Vasselon, V., Rivera, S.F., Ács, É., Almeida, S.F.P., Andree, K.B., Apothéloz-Perret-Gentil, L., Bailet, B., Baričević, A., Beentjes, K. K., Bettig, J., Bouchez, A., Capelli, C., Chardon, C., Duleba, M., Elersek, T., Genthon, C., Jablonska, M., Jacas, L., Kahlert, M., Kelly, M.G., Macher, J.-N., Mauri, F., Moletta-Denat, M., Mortágua, A., Pawlowski, J., Pérez-Burillo, J., Pfannkuchen, M., Pilgrim, E., Pissaridou, P., Rimet, F., Stanic, K., Tapolczai, K., Theroux, S., Trobajo, R., Van der Hoorn, B., Vasquez, M.I., Vidal, M., Wanless, D., Warren, J., Zimmermann J., Paix, B. Proficiency testing and cross-laboratory method comparison to support standardisation of diatom DNA metabarcoding for freshwater biomonitoring. Submitted to *Metabarcoding and Metagenomics* (July 2024).

Ce retour d'expérience se base sur cette publication qui est résumée ci-dessous.

### 2.1. Contexte et objectifs

L'approche de métabarcoding de l'ADN, s'est récemment développée dans le domaine de la surveillance de la biodiversité aquatique (Kelly et al., 2024). Ces méthodes permettent d'obtenir des informations taxonomiques et génétiques à partir d'échantillons environnementaux, et sont maintenant utilisées dans le cadre de la Directive-cadre sur l'eau (DCE) pour évaluer la qualité écologique des écosystèmes aquatiques (Vasselon et al., 2019). Parmi les éléments de qualité biologique (BQE) surveillés, les diatomées benthiques sont particulièrement importantes, car elles sont sensibles à divers paramètres écologiques et sont largement utilisées pour évaluer la qualité des eaux douces.

Des avancées importantes ont été réalisées pour développer des techniques de métabarcoding ADN des diatomées, mais des différences dans les étapes clés du processus, telles que l'extraction de l'ADN et l'amplification par PCR, sont des sources majeures pouvant introduire de la variabilité dans les résultats. La variabilité des protocoles entre les laboratoires complique notamment la comparabilité des résultats, et leurs influences sur les données obtenues sont encore très largement inexplorés. Entre autres certaines étapes n'ont jamais été étudiées en termes de variabilité et repetabilité comme pour la PCR. D'autres étapes comme la préservation des échantillons, l'extraction d'ADN et les comparaisons de marqueurs génétiques restent encore peu appréhendées (Vasselon et al., 2017; Baricevic et al., 2022; Pérez-Burillo et al., 2022). C'est pourquoi des efforts ont été mis en place pour estimer (i) la répétabilité d'un seul et même protocole de métabarcoding ADN, mais aussi (ii) la variabilité induite par l'utilisation de différentes méthodes.

Dans ce contexte, un exercice d'intercalibration a été mené avec 17 laboratoires de 14 pays européens. Ces laboratoires ont suivi (i) un protocole commun pour l'extraction de l'ADN et l'amplification par PCR afin d'étudier la répétabilité du protocole, mais également (ii) leurs propres méthodes, afin de comparer les résultats et d'évaluer la variabilité introduite par ces différentes approches. Les résultats
de cet exercice ont pour objectif d'améliorer nos connaissances sur la reproductibilité et la transférabilité des protocoles de métabarcoding entre laboratoires, afin de fournir des lignes directrices claires pour son utilisation dans la surveillance des écosystèmes d'eau douce, sans imposer un protocole universel.

## 2.2 Matériel et méthodes

Lors du workshop du réseau DNAqua-Net WG2 en 2019 à Limassol (Chypre), un comité s'est organisé pour conduire les expériences d'intercalibration sur les étapes d'extraction d'ADN et de PCR pour l'approche de métabarcoding de l'ADN des diatomées. Une équipe centrale, composée de l'Université de Technologie de Chypre (CUT), l'Office Français de la Biodiversité (OFB), Scimabio Interface, et le laboratoire de référence (INRAE CARRTEL), a coordonné l'étude. Dix-sept laboratoires issus de 14 pays, publics et privés, ont participé de manière anonyme. Deux types d'expériences ont été menés : des « tests de compétence » pour évaluer la reproductibilité d'un protocole unique, et des « comparaisons de méthodes » pour tester la variabilité induite par différents protocoles d'extraction d'ADN et d'amplification PCR (Figure 8).

Les échantillons utilisés dans les tests incluaient 2 échantillons de biofilms environnementaux prélevés dans le lac Léman et la rivière Edian, ainsi que des échantillons de communauté témoin dont la composition est connue à l'avance (mock) et des contrôles négatifs (sans biofilm ou ADN). Tous les participants ont utilisé les mêmes protocoles fournis par le laboratoire de référence pour l'extraction d'ADN et l'amplification PCR (en utilisant le marqueur rbcL) dans les tests de compétence. En parallèle un groupe restreint de 9 laboratoires ont aussi utilisé leurs propres méthodes d'extraction d'ADN et de PCR, dans le cadre de l'expérience de comparaisons de méthodes (Figure 8).

Les expériences ont été nommées de la manière suivante :

- E1 : test de compétence pour l'extraction d'ADN

- E2 : test de compétence pour la PCR

- E3 : test de comparaison de méthodes pour l'extraction d'ADN

- E4 : test de comparaison de méthodes pour la PCR

Les échantillons d'ADN et les produits PCR obtenus ont ensuite été envoyés au laboratoire de référence pour la préparation des bibliothèques et le séquençage MiSeq. Un total de 423 échantillons a été séquencé, et les données brutes ont été analysées avec le pipeline DADA2 et la base de donnée diat.barcode.
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 8.** Résumé du plan expérimental de l'étude, détaillant les étapes du « test de compétence » (bleu), du test de « comparaison des méthodes » (orange) et celles liées à l'organisation de l'ensemble de l'expérience par le laboratoire de référence (RL, vert).</figcaption></figure>

## 2.2 Résultats et discussion

### 2.2.1. Tests de compétences (E1 et E2)

Pour l'ensemble des échantillons (rivière, lac et mock), les résultats du test de compétence ont révélé une forte similarité dans la composition des communautés de diatomées entre les 17 participants et le laboratoire de référence (Figure 9), lorsqu'ils ont utilisé les mêmes protocoles d'extraction d'ADN (E1) et d'amplification par PCR (E2). Cependant, une anomalie a été observée chez le participant I pour l'échantillon de lac (L), probablement due à une erreur de traitement ou une contamination, ce qui a conduit à l'exclusion de cet échantillon des analyses ultérieures. Pour les espèces ayant une abondance relative supérieure à 0,71 % (E1) et 0,96 % (E2), tous les participants ont détecté ces taxons dans les échantillons. Cependant, la détection en dessous de ces seuils d'abondance semble varier, indiquant des différences dans la capacité de détection des taxons très rares entre les participants (qui n'affectent pas les indices de bioindications).
<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 9.** Histogrammes représentant la composition de la communauté de diatomées (à l'échelle de l'espèce) pour les quatre expériences (de E1 à E4). Les noms d'échantillons correspondent aux noms de codes des laboratoires participants (anonymisés). RL correspond au laboratoire de référence.</figcaption></figure>

Sur l'ensemble des mesures effectuées, la concentration d'ADN correspondait à celle qui présentait la plus grande variabilité parmi les participants, avec des coefficients de variation (CV) de 66,2 % pour les échantillons de rivière et de 48,5 % pour ceux de lac lors des expériences E1. En revanche, pour les autres métriques (indices de diversité), les variations sont minimes, avec CV inférieurs à 15 %, ce qui reflète une stabilité des résultats. En termes d'évaluation écologique, les scores d'IBD (Indice
Biologique Diatomée) étaient constants parmi tous les participants (score de 20, SD : 0), indiquant une réussite du test de compétence pour les protocoles E1 et E2. Pour l'IPS (Indice de Polluosensibilité Spécifique), de faibles variations ont été observées avec des écarts maximaux de 0,8 entre les participants, sans impacter la validation du test de compétence (Figure 10).

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 10.** Scores IPS obtenus pour les expériences E1 et E2 avec les échantillons « river » et « lake ».</figcaption></figure>

Ces résultats soulignent la grande reproductibilité des protocoles d'extraction d'ADN et de PCR pour l'approche de métabarcoding des diatomées utilisées dans le cadre de la surveillance de la qualité de l'eau, et valident la possibilité de transférer ces méthodes entre laboratoires. Cependant, malgré les conditions contrôlées, des sources de variabilité subsistent, liées aux différences d'équipements utilisés et de pratiques techniques inhérente à chaque expérimentateur. Ces facteurs montrent l'importance des tests de compétence pour identifier et corriger ces biais. En outre, bien que l'étude se concentre sur l'extraction d'ADN et l'amplification PCR, d'autres étapes du métabarcoding, telles que la préparation des bibliothèques et les technologies de séquençage, peuvent également introduire de la variabilité. Des études supplémentaires sur ces aspects sont nécessaires pour établir des protocoles standardisés.

### 2.2.2. Tests de comparaisons de méthodes (E3 et E4)

Pour l'ensemble des échantillons (rivière, lac et mock), les expériences d'intercomparaison E3 et E4 ont montré une forte similarité dans la composition des communautés de diatomées entre les participants (Figure 9), malgré l'utilisation de fortes différences dans les protocoles d'extraction d'ADN et de PCR utilisées par les participants. Cependant, une exception a été observée dans un réplicat de l'échantillon de lac (L) du participant P lors de l'expérience E4, probablement due à une erreur de manipulation de l'échantillon ou à une contamination, entraînant l'exclusion de ce réplicat des analyses. Tous les participants ont détecté des taxons avec une abondance relative supérieure à 1,73 % pour E3 et 0,85 % pour E4 dans les échantillons environnementaux. Dans l'expérience E3, où chaque participant a utilisé son propre protocole d'extraction, la diversité des méthodes de lyse (enzymatique et mécanique) a cependant contribué à une variabilité observée dans la détection des taxons peu abondants. Cependant, cette variabilité n'a pas affecté de manière significative les évaluations écologiques basées sur les indices IBD (score constant de 20, SD : 0) et IPS (écart maximum de 1.3), qui sont restées cohérentes entre les participants (Figure 11). Ces données reflètent aussi pour l'IBD une sensibilité plus faible aux variations de protocoles, et donc une stabilité plus forte pour cet indice en comparaison à l'IPS. Par ailleurs, dans l'expérience E4, bien que différentes méthodes d'amplification
par PCR aient été appliquées, les scores écologiques étaient comparables, avec des variations acceptables entre les participants.

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 11.** Scores IPS obtenus pour les expériences E3 et E4 avec les échantillons « river » et « lake ».</figcaption></figure>

Bien que les protocoles d'extraction d'ADN et de PCR puissent introduire des biais dans la composition taxonomique, ces résultats soulignent qu'ils n'ont pas d'impact significatif sur les indices écologiques utilisés pour l'évaluation des écosystèmes d'eau douce.

Ces expériences confirment la pertinence de la stratégie "*all for one, but prove them all*", qui permet l'utilisation de divers protocoles tant que leur validité est démontrée à travers des tests d'intercalibration. Cela favorise une harmonisation flexible des protocoles tout en évitant le risque de verrouillage technologique et en maintenant l'innovation scientifique dans le domaine du suivi écologique.

## 2.3 Conclusion

Les résultats obtenus mettent en évidence que l'approche par métabarcoding de l'ADN des diatomées offre une évaluation hautement reproductible, ce qui soutient son utilisation dans les études de surveillance environnementale. Les expériences d'intercalibration et de comparaison entre laboratoires montrent que les protocoles d'extraction d'ADN et d'amplification PCR peuvent être transférés efficacement d'un laboratoire à un autre, avec des résultats cohérents. Par ailleurs, même en utilisant des protocoles différents, la composition des communautés varie de manière limitée et sans affecter l'évaluation écologique des échantillons. L'étude propose le concept nommé "*all for on, but prove them all*", suggérant que différentes approches peuvent être utilisées à condition de prouver qu'elles donnent des résultats similaires en utilisant des standards moléculaires clés et répondent à des exigences minimales qui restent à définir dans le cadre de futures normes.

## 2.2 Références

* Baricevic, A., Chardon, C., Kahlert, M., Karjalainen, S.M., Pfannkuchen, D.M., Pfannkuchen, M., et al. (2022) Recommendations for the preservation of environmental samples in diatom metabarcoding studies. *Metabarcoding and Metagenomics* 6: e85844.
* Recommendations for the preservation of environmental samples in diatom metabarcoding studies. *Metabarcoding and Metagenomics* 6: e85844.

* Kelly, R.P., Lodge, D.M., Lee, K.N., Theroux, S., Sepulveda, A.J., Scholin, C.A., et al. (2024) Toward a national eDNA strategy for the United States. *Environmental DNA* 6: e432.
Pérez-Burillo, J., Mann, D.G., and Trobajo, R. (2022) Evaluation of two short overlapping *rbcL* markers for diatom metabarcoding of environmental samples: Effects on biomonitoring assessment and species resolution. *Chemosphere* **307**: 135933.

Vasselon, V., Domaizon, I., Rimet, F., Kahlert, M., and Bouchez, A. (2017) Application of high-throughput sequencing (HTS) metabarcoding to diatom biomonitoring: Do DNA extraction methods matter? *Freshw Sci* **36**: 162–177.

Vasselon, V., Rimet, F., Domaizon, I., Monnier, O., Reyjol, Y., and Bouchez, A. (2019) Assessing pollution of aquatic environments with diatoms’ DNA metabarcoding: experience and developments from France Water Framework Directive networks.