# Identifier et mobiliser les ressources biologiques du sol pour développer une agriculture durable en Martinique

Le rapport final d'exécution a été transmis à la CTM en 2024.
Le présent rapport est une version revue et consolidée publiée en 2025

Coordination scientifique du projet :
Mathieu Coulis, CIRAD, UPR GECO, F-97285 Le Lamentin, Martinique, France

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CE PROJET A ETE FINANCE PAR L'UE (FOND FEDER) LE CPER ET LA CTM
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**Montage du projet** : Mathieu Coulis, Antoine Galiana, Odile René-Corail

**Coût total du projet** : 736 k€

**Subvention attribuée** : 541 k€ (67% FEDER, 10% CPER, 7% CTM)

**Projet porté par** :

CIRAD, UPR GECO, F-97285 Le Lamentin, Martinique, France
GECO, CIRAD, University Montpellier, Montpellier, France

**Partenaire financé** :

Station d'expérimentation en agroécologie (SEA) Val d'Or, à Sainte-Anne, Martinique

**Partenaires scientifiques du projet** :

* UPEC : Université Paris-Est Créteil, Sorbonne Université, CNRS, INRAE, IRD, iEES-Paris, 61 avenue du Général de Gaulle, F-94010 Créteil (France)

* Conservatoire Botanique National de Martinique (CBN mq) CBN martinique, 30 Rue des Ecoles de Briant. Fort-de-France 97200
https://cbn-martinique.org/

* IRD, UMR LSTM, Campus Agro-Environnemental Caraibe, Martinique, France

* Department of Regenerative Agriculture, Maharishi International University, 1000 N 4th St, Fairfield, IA, 52557 (United States)

**Coordination** : Mathieu Coulis

**Contributeurs** : M. Coulis, J. Allongout, D. Argence, A. Bâ, O. Birba, A. Blot, C.-M. Brunet, J. Daniel, L. Doussinault, L. Dupont, M. El Jaouhari, M. Faye, B. Ferlay, Q. Gabriac, A. Galiana, L. Hannibal, S. James, C. Julian, T. Lechopier, M. Lemoine, M. Luce, J-M. Mac, C. Mauriol, L. Milome, S. Minatchi, L. Mouilou, M. Pastoret, J. Roy, J. Soudès, N. Telle, C. Thibaut, B. Vincent

**Rédaction du rapport** : M. Coulis, L. Dupont, A. Galiana, L. Hannibal, B. Vincent, J.M. Mac, S. Simon

UPEC
Communauté-d'Action

UNIVERSITÉ
PARIS-EST CRÉTEIL
VAL DE MARNE

cbn

CONSERVATOIRE
BOTANIQUE NATIONAL
MARTINIQUE

IRD
Institut de Recherche
pour la Développement
FRANCE

LST&M
LABORATOIRES DES SYMBOLES
TROPICALES
MEDECINEMAINE

**Citation conseillée** : Coulis M., L. Dupont, A. Galiana, L. Hannibal, B. Vincent, J.M. Mac, S. Simon. 2025, Rapport scientifique du projet Feder-CTM REBIOS : Identifier et mobiliser les ressources biologiques du sol pour développer une agriculture durable en Martinique. CIRAD Lamentin, Martinique 168 pages.
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TABLE DES MATIERES

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Introduction générale ..................................................................................................................0

Axe 1 : Identifier les ressources biologiques du sol dans les différents écosystèmes de Martinique ..................................................................................................................13

ACTION 1-1 : inventaire de la biodiversité des vers de terre épigés de la Martinique ............14

ACTION 1-2 : Connectivité entre des populations de vers de terre de deux aires naturelles protégées..................................................................................................................24

ACTION 1-3 : Diversité des rhizobia associées aux légumineuses en Martinique ....................33

ACTION 1-4 : Diversité des champignons mycorhiziens à arbuscules en Martinique ............44

Axe 2 : Caractérisation fonctionnelle des auxiliaires du sol ..................................................70

ACTION 2-5 : Test d'acclimatation des vers aux conditions de culture et production d'inoculum ..................................................................................................................71

ACTION 2-6 : Caractérisation fonctionnelle et efficience des symbioses ....................................76

ACTION 2-7 : Effet de la macrofaune sur la décomposition des litières son effets en cascade sur la croissance du bananier : résultats d'une expérimentation en serre....................................91

Axe 3 : Mobiliser les ressources biologiques du sol ................................................................117

ACTION 3-8 : Essai de lombricompostage à grande échelle ....................................................118

ACTION 3-9 : Evaluation des propriétés fertilisantes du lombricompost ....................................124

ACTION 3-10 : Evaluation de l'impact agronomique des microorganismes symbiotiques en maraîchage ..................................................................................................................144

Conclusion générale..................................................................................................................163

Une meilleure connaissance de la biodiversité des sols de Martinique ....................................164

Comment mobiliser ces ressources dans les agroécosystèmes de Martinique ? ....................166
# INTRODUCTION GENERALE

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Enjeux de connaissance et de conservation de la biodiversité des sols

La Martinique fait partie du « Hotspot de biodiversité » des îles de la Caraïbe. Sa particularité est d'abriter un grand nombre d'espèces de plantes et de vertébrés endémiques (Myers, 2000). Ces espèces sont particulièrement menacées car elles vivent sur des territoires insulaires extrêmement restreints qui concentrent d'importantes pressions anthropiques (tourisme, urbanisation, etc.) et des risques naturels élevés (cyclones, glissements de terrain, séismes, etc.). Bien que très utiles pour prioriser les enjeux de conservation, la notion de Hotspot de biodiversité est uniquement basée sur la diversité des plantes et des vertébrés et ne prend pas en compte la diversité des invertébrés alors qu'il est reconnu que 95 % des espèces vivantes sur terre sont des invertébrés. La richesse biologique de ces invertébrés constitue un patrimoine naturel qu'il est important d'étudier et de préserver pour sa **valeur intrinsèque** (Patrimoniale). Il en est de même pour les communautés microbiennes des sols, notamment symbiotiques dont la diversité est inféodée à celle des organismes supérieurs. Pour préserver efficacement les habitats et la biodiversité et assurer la conservation des espèces il est important d'avoir une compréhension de la connectivité entre leur différentes populations (Allendorf et al., 2010). En effet, le degré de connectivité entre populations adjacentes peut affecter la persistance des populations et leur réponse face aux perturbations (Hastings et Botsford, 2006). Afin de préserver et valoriser au mieux cette biodiversité il est important d'inventorier et d'étudier les aires de répartition des espèces de Martinique.

Ces organismes ont également une **valeur utilitaire**. En effet, cette biodiversité joue un rôle primordial dans le fonctionnement biologique du sol en remplissant de nombreux services écosystémiques tels que le recyclage des éléments minéraux et leur meilleure assimilation par les plantes, la fixation symbiotique de l'azote atmosphérique, l'amélioration de la structure physique du sol mais aussi la régulation des ravageurs. Parmi ces organismes, certains groupes fonctionnels présentent un intérêt pour développer une agriculture basée sur l'utilisation des processus écologiques naturels (agroécologie). Chez les microorganismes, les bactéries symbiotiques fixatrices d'azote (rhizobia) et les champignons mycorhiziens, permettent d'améliorer significativement la nutrition, la tolérance aux stress environnementaux et la santé des plantes cultivées. Chez la macrofaune du sol, les vers de terre, véritables ingénieurs de l'écosystème, peuvent modifier les propriétés physico-chimiques de leur environnement et ainsi créer des conditions favorisant la croissance des plantes.

Malgré ce réel potentiel, la biologie des sols de Martinique reste encore très peu étudiée. Pourtant le contexte climatique (zone tropicale humide) et la situation de la Martinique dans le hotspot de biodiversité des îles de la Caraïbes, suggèrent que les sols de l'île renferment une forte biodiversité d'auxiliaires.
Transition agro-écologique, quels leviers mobiliser ?

La transition agroécologique vise à réduire au maximum l'utilisation d'engrais et de produits phytosanitaires de synthèse en les remplaçant par des pratiques basées sur l'utilisation de processus écologiques.

L'agriculture conventionnelle est très dépendante des énergies fossiles pour fabriquer les engrais minéraux, notamment la fabrication d'engrais azotés *via* le procédé Haber-Bosch qui a un coût carbone très élevé. Dans un contexte de transition agroécologique, il est donc primordial de mobiliser les processus naturels de fonctionnement du sol favorisant la fertilité biologique des sols.

Il existe plusieurs groupes fonctionnels d'organismes du sol qui jouent des rôles importants dans le cycle des nutriments et le maintien de la fertilité :

* Les espèces de **vers de terre** natives de la Martinique. Les vers de terre rendent un grand nombre de services à la société. Leur action sur le sol est très utile pour l'agriculture et la lutte contre l'érosion (aération, infiltration de l'eau, recyclage des nutriments, etc.) et ils peuvent également être utilisés pour produire du compost via la lombriculture. Ce procédé particulier de compostage permet de produire des fertilisants mais également d'utiliser les vers qui sont riches en protéines pour la nutrition animale (Francis 2003).

* Les **rhizobia, bactéries symbiotiques du sol fixatrices d'azote**, sont quant à elles associées aux légumeuses au niveau de nodosités racinaires qui permettent aux espèces de cette famille de fixer l'azote atmosphérique et ainsi de croître sur des sols pauvres en azote. Les légumeuses sont également mycorhizées et cette double symbiose mycorhizes/rhizobia améliore la fertilité des sols lorsque des légumeuses sont introduites dans un cycle de rotations de cultures ou en association avec d'autres cultures (plantes de couverture sous plantes pérennes, associations de cultures annuelles alimentaires ou fourragères, associations agroforestières,...). La diversité des légumeuses autochtones en Martinique est très grande, qu'elles soient herbacées ou ligneuses, à l'instar de celle présente dans les Caïraïbes et en Amérique latine (de Faria et al., 2010). Encourager leur introduction dans les systèmes de cultures, dans une perspective de valorisation des ressources locales, représente une alternative innovante et prometteuse pour l'amélioration de la fertilité biologique des sols de façon durable.

* Les **champignons mycorhiziens arbusculaires** (CMA) sont associés symbiotiquement à la plupart des espèces du règne végétal (80% des espèces de plantes), tant dans les écosystèmes naturels qu'au sein des agro-systèmes et sous toutes les latitudes (Brundrett, 2002). Les CMA qui colonisent les racines des plantes favorisent les échanges de nutriments entre la plante et le sol, notamment grâce au prolongement des racines par les hyphes mycéliennes des CMA dans le sol permettant une meilleure exploration du sol et une meilleur assimilation des éléments minéraux, en particulier le phosphore (Smith et al., 2011). Les CMA confèrent en générale une meilleure tolérance des plantes aux microorganismes pathogènes ainsi qu'aux stress environnementaux (sècheresse, salinité des sols, toxicité aux métaux lourds,...) (Gianinazzi et al., 2010).

A ce jour, ces ressources ont été peu étudiées en Martinique. Il est parfois nécessaire d'avoir recours à l'importation en l'absence de solution locale (exemple : lombricompost, microorganismes bénéfiques du sol, introduction de plantes de services introduites, etc.). Comme ces ressources contiennent un grand nombre d'organismes et de microorganismes d'origine exotique, le risque d'introduction d'espèces invasives est particulièrement élevé en milieu insulaire tropical, d'où la nécessité d'explorer les ressources biologiques locales.
## Objectif général : Comment valoriser la biodiversité des organismes du sol dans le cadre de la transition écologique de l'agriculture ?

Ce projet a donc pour objectif d'identifier, de caractériser et de tenter de mobiliser les ressources biologiques du sol propres à la Martinique. Les organismes auxiliaires vus comme des ressources biologiques dans ce projet seront : les différentes espèces locales de champignons mycorhiziens, les couples symbiotiques légumineuses-rhizobia et les espèces de vers de terre endémiques (ou natives) de Martinique.

## Axe 1 : Identifier les ressources biologiques du sol dans les différents écosystèmes de Martinique.

L'objectif de ce premier axe est de contribuer à combler le manque de connaissances disponibles sur les organismes du sol. Les connaissances acquises pourront être utilisées pour la conservation mais l'objectif est également de focaliser cet inventaire sur trois groupes d'organismes auxiliaires ayant un impact bénéfique sur la fertilité biologique des sols.

### Biodiversité des vers de terre de Martinique

#### Etat de lieux sur la connaissance des espèces de Martinique :

En Martinique, il existe très peu de documentation sur les vers de terre. Des travaux ont été menés sur l'écologie fonctionnelle de *Polypheretima elongata*, une espèce endogée originaire d'Asie vivant dans les sols profonds du sud de l'île (Loranger, 1998 ; Rossi, 1997) mais la diversité biologique des espaces naturels, notamment les forêts du nord de l'île, est restée inexplorée. Cette zone de la Martinique constitue donc un réservoir abritant une biodiversité inexplorée. Des prospections anciennes (S. James dans les années 90, non publié) et plus récentes (M. Coulis dans le cadre du projet d'inventaire de la RBI des pitons du Carbet) nous suggèrent qu'il existe une biodiversité comparable à celle que l'on trouve en Guadeloupe (13 espèces endémiques) (Czusdi et Pavlivek, 2009 ; James 1996 ; James et Gamiette, 2016). Sur un gradient d'altitude de la zone nord Caraïbe, il a été trouvé plus de 5 morpho-espèces de vers de terre vivant dans le sol (Coulis, 2017). Comparativement à la diversité des arthropodes, cette biodiversité est relativement faible. Cela s'explique par le fait que la plupart des espèces de vers de terre des Petites Antilles a une écologie bien particulière. En effet, de nombreuses espèces de vers indigènes sont pour la plupart épigées et occupent des habitats aériens comme par exemple sur la végétation épiphyte, dans les réservoirs des broméliacées (phytothelme) ou encore dans des accumulations de matière organique morte entremêlées dans les branches des arbres.

#### Problématique de conservation

La faune de vers de terre de Martinique compte des espèces endémiques ayant une aire de répartition extrêmement étroite. Leur habitat est très restreint et présente un fort niveau de fragmentation ce qui pose la question de leur préservation et de leur capacité à coloniser les milieux semi-naturels à proximité des aires protégées.

#### Objectifs :

Un inventaire le plus exhaustif possible des espèces des milieux naturels et cultivés de l'île sera entrepris. Une attention particulière sera portée à l'échantillonnage des microhabitats dans les milieux naturels de la Martinique (Pitons et Montagne Pelée, forêts mésophiles du sud) où il est plus probable de retrouver des espèces de vers de terre endémiques natives pouvant être utilisées en lombriculture.
# Diversité des bactéries fixatrices d'azote du sol associées aux légumineuses

## Etat des connaissances en Martinique :

Aucune recherche sur la diversité des symbioses microbiennes fixatrices d'azote n'a été réalisée à ce jour en Martinique, ni même dans les autres îles des Petites Antilles, alors que la diversité en espèces de légumineuses y est particulièrement élevée. L'un des objectifs majeurs de cette action est de décrire la diversité des bactéries fixatrices d'azote associées aux légumineuses herbacées et ligneuses locales afin de promouvoir l'utilisation de ces associations symbiotiques au sein des systèmes agricoles ou agroforestiers en Martinique. Ceci sachant que la plupart des légumineuses qui y sont utilisées comme plantes de service actuellement (plantes de couverture, plantes assainissantes, arbres de haies, ...) sont très souvent des espèces introduites à caractère parfois envahissant. Si la diversité des espèces de rhizobia associées aux légumineuses exotiques introduites en Martinique a été largement étudiée dans d'autres régions du Monde, notamment les légumineuses arborées communément introduites dans les systèmes agroforestiers tropicaux (Bala et al., 2003), la diversité des rhizobia associés aux légumineuses locales reste totalement inexplorée. L'un des autres objectifs majeurs de cette action est de conserver cette diversité microbienne via la création d'une collection de souches de rhizobia d'origine locale au sein du CAEC, cas unique dans les Petites Antilles, dans une perspective d'utilisation sous forme d'inoculums biofertilisants.

## Problématique :

Il existe en Martinique une grande diversité de légumineuses arborées autochtones dont on ne connaît ni le statut symbiotique (aptitude à fixer l'azote atmosphérique symbiotiquement) ni la diversité de leurs *rhizobia* associés, et ce, même dans les autres îles des Petites Antilles. A l'inverse, on connaît mieux les propriétés symbiotiques de nombreuses espèces de légumineuses arborées exotiques introduites en Martinique, lesquelles ont été également largement diffusées à travers le monde, notamment pour leur intérêt agroforestier, sylvopastoral ou ornemental en zone tropicale humide, comme *Albizia lebbeck*, *Albizia saman*, *Calliandra houstoniana* var. *calothyrsus*, *Enterolobium cyclocarpum*, *Erythrina spp.*, *Gliricidia sepium*, *Leucaena leucocephala*, *Pithecellobium dulce*.

Les légumineuses arborées autochtones introduites au sein des divers agrosystèmes de Martinique, tels que les bananeraies, les vergers d'arbres fruitiers ou les systèmes maraîchers, sont susceptibles de fournir de nombreux et importants services environnementaux dans le cadre de pratiques agroécologiques visant à réduire l'apport des intrants de synthèse polluants et coûteux.

## Objectifs :

Cette action vise à caractériser la diversité des bactéries fixatrices d'azote locales associées à une sélection de légumineuses autochtones en Martinique (parmi environ 40 espèces herbacées et 40 espèces arborées) et de constituer une collection de souches bactériennes locales.
# Diversité des champignons mycorhiziens à arbuscules

## Etat des connaissances en Martinique :

Aucune étude sur la diversité taxonomique et la phylogénie des champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) n'a été réalisée à ce jour en Martinique, autant au sein d'écosystèmes naturels que d'agrosystèmes. En revanche, quelques études de diversité des CMA ont déjà été réalisées en Guadeloupe (Geoffroy et al., 2017). En Martinique, des observations préliminaires réalisées au CAEC en 2018 ont montré que la plupart des plantes cultivées, tels que les bananiers ou les agrumes, ou utilisées comme plantes de service (crotalaires et diverses légumineuses de couverture) étaient spontanément colonisées par des champignons mycorhiziens à arbuscules à des degrés divers selon les conditions culturales (résultats non encore publiés). Cependant, aucune souche de CMA locale n'a encore été isolée en Martinique. La diversité et la distribution de ces souches à l'échelle de la Martinique est encore inconnue. Ces informations sont crucialles pour connaître le potentiel infectieux des sols (qui pourront être utilisés comme source d'inoculum) à l'échelle de la Martinique ainsi que le périmètre géographique et écologique d'action de différentes souches de CMA.

## Problématique :

Les cultures intensives de banane et de canne à sucre en Martinique ont probablement appauvri la diversité des CMA autochtones dans les sols de la majorité des exploitations, comme cela a été constaté partout à travers le monde (Oehl et al. 2003, Tchabi et al., 2008). Il est également connu que l'utilisation de grandes quantités d'engrais chimiques riches en azote et en phosphore sur le long terme réduit drastiquement l'abondance des propagules mycorhiziennes dans ces sols et leur potentiel infectieux (PIM=Potentiel Infectieux Mycorhizien) (Treseder, 2004). Ainsi, la substitution des fonctions naturelles des microorganismes du sol - comme celles fournies par les CMA qui améliorent naturellement la nutrition des plantes en phosphore et en azote - par des apports massifs d'éléments minéraux directement assimilables par les plantes, engendre une forte diminution de la diversité et de l'abondance des populations microbiennes, notamment des CMA. De plus, il est vraisemblable que la très faible diversité génétique représentée au sein des principales plantes de culture (notamment la banane dessert) engendre une érosion de la diversité microbienne et symbiotique associée. A l'inverse, il a été montré que la diversité d'un sol en champignons mycorhiziens favorisait la diversité du couvert végétal à partir des stocks de semences du sol (Van der Heijden, 1998).

Ainsi, dans un but de stimulation des fonctions biologiques du sol au bénéfice de la croissance et la nutrition des cultures, l'utilisation d'inoculum à base de souches mycorhiziennes d'origine autochtone adaptées aux sols de Martinique devient incontournable et urgente en Martinique, d'autant que des inoculums d'origine exotique y sont déjà commercialisés. Ceci nécessite l'isolement, la conservation et la multiplication de souches des mycorhizes à arbuscules locales. A notre connaissance, ces actions novatrices, que nous proposons de développer au sein du CAEC dans le cadre de ce projet, n'ont encore jamais été mises en œuvre dans les Petites Antilles.

## Objectifs :

L'objectif de ce premier sous-axe du projet est d'isoler, de caractériser et de constituer une collection de base de champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) locaux provenant de plusieurs types de sols et d'écosystèmes Martiniquais.
## Axe 2 : Caractérisation fonctionnelle des auxiliaires du sol

De nombreuses études ont montrées le rôle bénéfique de la biodiversité dans le fonctionnement des écosystèmes naturels et cultivés. Les résultats de ces études montrent que ce n’est pas le nombre d’espèces qui importe le plus mais plutôt la diversité des fonctions écologiques remplies par les espèces présentes dans la communauté (diversité fonctionnelle) (Mouillot et al., 2011). Afin de maximiser les services écosystémiques rendus par la biodiversité il faut donc rechercher à maximiser la diversité fonctionnelle dans les agroécosystèmes. Pour mettre en œuvre une telle démarche, il est nécessaire de bien connaitre le potentiel des espèces en mesurant des traits fonctionnels, morphologiques et physiologiques sur des individus de chaque espèce (Violle al., 2007).

Cette étape de caractérisation fonctionnelle est nécessaire pour sélectionner les espèces utiles pour développer des pratiques agroécologiques.

## Etude du cycle biologique et caractérisation fonctionnelle des espèces de vers de terre endémiques de Martinique

### Etat des connaissances en Martinique :

Les espèces de vers de terre endémiques ont un mode de vie « hors sol » qui est très original. Cette caractéristique laisse penser qu’elles pourraient être utilisées en lombriculture. Les vers épigés de Guadeloupe ainsi que ceux collectés en Martinique partagent plusieurs traits d’histoire de vie originaux : (1) une taille moyenne, (2) un corps fortement pigmenté et (3) ils peuvent atteindre des fortes densités de population dans les broméliacées (plus de 20 individus par plante). Enfin, le trait le plus important de la biologie de ces espèces est (4) leur capacité à se nourrir exclusivement de matière organique morte. Cette caractéristique est un trait fonctionnel original chez les vers de terre. En effet, la plupart des espèces de vers ont besoin de mélanger dans leur régime alimentaire de la matière organique morte à du sol minéral. L’ensemble de ces caractéristiques biologiques font de ces vers de terre de très bons candidats pour être utilisés en lombricompostage.

### Problématique :

La lombriculture présente de nombreux avantages par rapport au compostage classique. Cependant, le processus d’élaboration est beaucoup plus technique que celui du compost classique (Dominguez et al., 1997 ; Lazcano et al., 2008). Tout d’abord les déchets ne peuvent pas être empilés en couches épaisses, le tas ne doit pas dépasser 40 à 50 cm notamment pour éviter la montée en température du compostage classique (70°C) qui tuerait les vers. D’autre part, les vers sont extrêmement sensibles aux facteurs environnementaux. Une mauvaise gestion de ces paramètres peut les tuer ou les faire fuir. Il faut donc limiter l’ensoleillement, surveiller régulièrement et intervenir pour corriger l’humidité, la salinité et le pH. Enfin le principal facteur limitant est la masse initiale de vers très importante qu’il est nécessaire pour lancer le processus. Par exemple la lombriculture avec *Eudrilus eugeniae* requiert en moyenne 7 vers par litre de substrat ou 1.6 kg de vers par m³ (Byambas, 2017).

### Objectifs :

L’objectif général de cette partie est d’acquérir des données de base sur la biologie et l’écologie des espèces endémiques épigées de Martinique afin d’évaluer la possibilité de les utiliser en lombriculture.
# Caractérisation fonctionnelle et potentiel fixateur d'azote des symbioses rhizobia-légumineuses

## Etat des connaissances en Martinique :

Bien que de nombreuses espèces de légumineuses de service exotiques soient utilisées comme plantes de jachère ou de couverture dans les systèmes de culture agroécologiques en Martinique, leur fixation d'azote au champ n'a encore jamais été quantifiée *in situ*. De même, la flore de Martinique comporte une forte proportion d'espèces de légumineuses natives qui pourrait être utilisées comme plantes de service dans les agrosystèmes durables mais dont l'efficience symbiotique avec les souches de rhizobia locales n'a encore jamais été étudiée.

## Problématique :

De par l'aptitude des légumineuses à fixer directement l'azote de l'air grâce à leur association symbiotique avec les rhizobia, leur utilisation comme plante de service dans les systèmes de culture permettrait de réduire significativement les apports d'engrais azotés, polluants et coûteux en énergie fossile. Cependant, le potentiel fixateur d'azote varie selon les espèces de légumineuses et selon le type de sol (Peoples et al., 2001). Ainsi, les nitrates inhibant l'activité de la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation de l'azote synthétisé par les rhizobia à l'intérieur des nodosités racinaires), une trop forte teneur des sols en azote ou un apport d'engrais azotés trop élevé peuvent inhiber la fixation de l'azote et à des seuils variables selon les espèces (Tamagno et al., 2018). Des quantités d'engrais azotés minimales devant être apportées au pied des cultures, il est nécessaire d'évaluer la sensibilité des différentes espèces de légumineuses de service à l'azote minéral afin de sélectionner celles dont le potentiel fixateur reste élevé en présence de fortes teneurs du sol en azote.

## Objectifs :

L'objectif de cette action est de caractériser l'efficience des symbioses fixatrices au champ et en conditions contrôlées afin de sélectionner des associations symbiotiques rhizobia-légumineuses performantes améliorant la productivité durable des cultures. Ceci pour des légumineuses majeures déjà utilisées comme plantes de service mais aussi pour des légumineuses autochtones candidates. Ces travaux contribueront à intégrer l'efficience des symbioses comme l'un des critères à prendre en compte lors du choix d'espèces de légumineuses de service à introduire dans les agroécosystèmes.

# Caractérisation fonctionnelle des champignons mycorhiziens

## Etat des connaissances en Martinique :

Bien que les symbioses mycorhiziennes concernent la majorité des espèces cultivées et que leur rôle majeur dans le fonctionnement durable des agrosystèmes ait déjà été démontrés dans divers contextes, leur utilisation pour la transition agroécologie n'a jamais été envisagée en Martinique. Or, les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) ont un effet positif avéré sur la nutrition et la productivité, mais également sur la tolérance au stress hydrique et aux pathogènes (Ruiz-Lozano et al., 1995 ; Cameron et al., 2013). Par ailleurs, le développement des réseaux mycéliens dans le sol et la rhizosphère favorise les échanges de nutriments entre plantes dans les cultures mixtes ou pures (He et al., 2003 ; Thilakarathna et al., 2016). Des études pionnières ont été réalisées sur les mycorhizes en Martinique (Chave et al., 2017, Julan, 2018) mais elles n'ont pas encore débouché sur une valorisation scientifique sous forme de publication
ni sur une application concrète au champ. Dans ces derniers travaux, des expériences d'inoculation de souches de *Rhizophagus irregularis* provennant d'innoculums commerciaux ont montré ainsi leur effet positif sur la croissance de crotalaires et de tomates en conditions contrôlées (plantes cultivées dans des pots en serre). Cependant, les souches de CMA locales potentiellement plus adaptées aux sols Martiniquais n'ont jamais été testées de même que la réponse à l'inoculation mycorhizienne des principales espèces cultivées en Martinique comme le bananier, les agrumes ou diverses espèces maraîchères.

**Problématique :**

En plus des espèces et taxons de CMA considérés, les effets positifs de l'inoculation mycorhizienne sur la croissance et la nutrition des plantes sont fortement dépendants des espèces hôtes utilisées. Ainsi, une espèce hautement mycotrophe, et donc à forte dépendance mycorhizienne au niveau nutritionnel, sera plus sensible à l'inoculation qu'une plante à faible mycotrophie (Tawaraya, 2003). Cette réponse à l'inoculation dépend par ailleurs des conditions pédoclimatiques. Il est donc important de faire un diagnostic de la dépendance mycorhizienne d'espèces majeures cultivées en Martinique. A ce jour, aucune étude sur le niveau de colonisation spontanée *in situ* des plantes cultivées (ex. : bananier, agrumes, fruits et légumes) et des plantes de service n'a été entreprise en Martinique et leur réponse à l'inoculation n'a été testée que chez la tomate et la crotalaire en conditions contrôlées et jamais à partir de souches de CMA locales.

**Objectifs :**

Les objectifs spécifiques à cette action sont : i) d'évaluer le niveau de dépendance mycorhizienne de différentes espèces cultivées et de services (incluant des plantes herbacées et ligneuses) ; et ii) d'étudier la réponse de ces mêmes espèces à l'inoculation mycorhizienne avec des souches de CMA locales.
## Axe 3 : Mobiliser les ressources biologiques du sol

L'objectif de cet axe est d'étudier des pratiques culturales novatrices qui mobilisent les ressources biologiques précédemment identifiées afin de les introduire dans les systèmes de culture.

Les connaissances acquises lors des deux premiers axes du projet permettront de proposer des itinéraires techniques privilégiant l'utilisation d'une diversité d'associations symbiotiques plantes-microorganismes performantes d'origine locale. De plus, les espèces de vers de terre endémiques sélectionnées comme étant les plus adaptées à produire du lombricompost seront produites en quantité et diffusées pour mettre en place une production à plus grande échelle de lombricompost. Le lombricompost produit sera testé et des essais seront réalisés afin d'intégrer son utilisation à des itinéraires techniques de culture de différentes plantes.

## Production et évaluation agronomique de lombricompost provenant d'espèces endémiques de vers de terre

### Etat de lieux :

Produire du lombricompost à partir d'espèce de vers endémique permettrait de valoriser la biodiversité locale en évitant de disséminer les espèces de vers de terre potentiellement invasives qui sont actuellement utilisées en lombriculture (Eudrilus eugeniae et Peryonix excavatus). Promouvoir le lombricompost et donc la dissémination d'espèces exotiques en milieu insulaire est risqué dans un contexte global ou les espèces invasives sont une cause majeure d'érosion de la biodiversité (Clavero & García-Berthou, 2005). D'autant plus que de nombreuses espèces de vers de terre sont devenues invasives sur le continent nord-américain et causent actuellement des dégâts considérables aux écosystèmes naturels (James & Hendrix, 2004).

### Problématique :

Il est donc important de valoriser la biodiversité locale en recherchant des espèces de vers de terre endémiques ou indigènes capables d'être utilisées en lombriculture.

### Objectif :

Une production intensive de vers en conditions contrôlées permettra de fournir aux agriculteurs intéressés une quantité de vers de terre suffisante pour lancer leur propre unité de lombriculture. Si le lombricompost est produit en quantité suffisamment importante, la manière la plus intéressante d'intégrer le lombricompost dans des systèmes de culture maraichage en Martinique sera également étudiée par le moyen d'expérimentations. =

## Valorisation des associations symbiotiques plantes-microorganismes autochtones

### Etat de lieux :

Dans un contexte de transition agroécologique et de production durable où l'utilisation de plantes de service doit palier la diminution drastique d'intrants chimiques (engrais, herbicides, pesticides), plusieurs espèces candidates ont montré leur efficacité lorsqu'elles étaient intégrées dans des systèmes de culture annuels ou pérennes en zone tropicale. C'est le cas de plusieurs espèces de légumineuses déjà connues et très utilisées à travers le monde, qui en plus de leur aptitude à fixer l'azote de l'air et améliorer le bilan azoté des agrosystèmes, sont souvent proposées en tant que plantes de couverture ou assainissantes. Cependant, la plupart de ces espèces, d'origine exotique, ont souvent montré un caractère invasif une fois introduites dans les
systèmes cultivés, notamment en Martinique. Par ailleurs, la garantie d'un approvisionnement régulier en semences d'origine connue ou certifiée reste aléatoire pour ces espèces en plus d'un coût élevé.

**Problématique :**

Les connaissances acquises sur la diversité des symbioses locales dans le cadre de l'axe 1 du présent projet, la sélection de souches microbiennes et d'associations symbiotiques plantes-microorganismes locales performantes et adaptées accompagnée de la mise au point de techniques d'inoculation microbienne tels que programmés dans l'axe 2, doivent permettre de proposer des itinéraires techniques efficaces optimisant l'apport des fonctions symbiotiques, i.e. fixatrices et mycorhiziennes, au bénéfice des cultures cibles.

**Objectif :**

L'effet de l'inoculation de couples symbiotiques légumineuses-microorganismes sélectionnés sur la production et l'état sanitaire de cultures de tomates sera testé au champ en conditions réelles.

## Résultats attendus

L'objectif général du projet est de promouvoir l'utilisation de nouvelles pratiques agricoles issues de la valorisation des ressources biologiques du sol. Ces pratiques se veulent transversales sur l'ensemble de l'agriculture Martiniquaise et se basent sur la valorisation des débris végétaux par lombricompostage et l'utilisation de plantes à fort potentiel symbiotique pour maximiser la fixation symbiotique et la mycorhization.

## Bibliographie

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AXE 1 : IDENTIFIER LES RESSOURCES BIOLOGIQUES DU SOL DANS LES DIFFERENTS ECOSYSTEMES DE MARTINIQUE

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

L'objectif de ce premier axe est de contribuer à combler le manque de connaissances sur les organismes du sol en Martinique. Les connaissances acquises pourront être utilisées pour la conservation mais l'objectif est également de focaliser cet inventaire sur trois groupes d'organismes auxiliaires ayant un impact bénéfique sur la fertilité biologique des sols.
ACTION 1-1 : inventaire de la biodiversité des vers de terre épigés de la Martinique

Rédaction : M. Coulis, L. Dupont

Contributeurs : Gabriac Quentin, Samuel James, Lise Dupont, Carla-Marie Brunet, Mathieu Luce, Nelly Telle, Christiane Mauriol, Mathieu Coulis

Résumé : ce travail a permis de dresser une première liste exhaustive des espèces de vers de terre de la Martinique qui regroupe 49 espèces putatives dont 16 sont des espèces exotiques connues, 22 sont des espèces natives probablement nouvelles pour la science et 9 ont un statut incertain. Ce travail a également mis en évidence une grande diversité d'espèces inféodées aux habitats arboricoles (8 espèces). Cela constitue une particularité écologique remarquable pour des vers de terre et met en évidence un patrimoine biologique original à la Martinique qu'il est nécessaire de préserver d'autant plus qu'au moins une espèce exotique envahissante (Dichogaster andina) a pu être mise en évidence comme une potentielle menace pour les espèces arboricoles natives. Une étude plus approfondie des milieux agricoles a également permis de dresser une liste complète des espèces de vers de terre de ces milieux en Martinique. Ainsi la liste des espèces des milieux cultivés de Martinique passe de 5 à 10 espèces et une clef de détermination sera mis à disposition des gestionnaires pour faciliter les futures études sur les vers de terre de la Martinique.

Une publication technique en français à destination des techniciens agricoles et des gestionnaires d'espaces naturels permettant de reconnaitre et d'identifier les espèces de vers de terre des milieux agricoles des Antilles Françaises est disponible en ligne :

https://agritrop.cirad.fr/610272/

<figure><img src="image_7.png" /></figure>
## Documents produits dans le cadre de cette action :

1. Rapport de stage de Master 2 :

**Luce Mathieu.** 2020. Effets de l'altitude sur les communautés de vers de terre de Martinique : une comparaison sols-Broméliacées. Marseille : Université d'Aix-Marseille, 54 p. Mémoire de master 2 : Biodiversité, écologie, évolution : Université d'Aix-Marseille. https://agritrop.cirad.fr/598651/

2. Rapport de stage de Master 2 :

**Brunet Carla-Marie.** 2021. Analyse moléculaire de la diversité des vers de terre arboricoles endémiques de Martinique. Toulouse : Université Toulouse III Paul Sabatier, 30 p. Mémoire de master 2 : Ecologie et évolution : Université Toulouse 3 - Paul Sabatier. https://agritrop.cirad.fr/602287/

3. Guide de détermination des broméliacées :

**Ferlay Benjamin.** (2022). Guide des Bromélicées indigènes des Antilles françaises. Coédition CIRAD, CBN martinque. https://zenodo.org/records/7607486

4. Librairie de référence de barcode moléculaire :

Les données sont disponibles publiquement sur le site du Barcode of Life Data Systems (BOLD) grâce à cet identifiant « dataset dx.doi.org/10.5883/DS-CARMT » ou en suivant ce lien : https://www.boldsystems.org/index.php/Public SearchTerms?query=DS-CARMT

5. Publication scientifique :

**Dupont Lise, Brunet Carla-Marie, Fourcade Yoan, James Samuel, Gabriac Quentin, Coulis Mathieu.** 2023. Recording earthworm diversity on the tropical island of Martinique using DNA barcoding unveiled endemic species in bromeliad plants. Soil Biology and Biochemistry, 182:109038, 10 p. https://agritrop.cirad.fr/606225/

6. Conférence donnée au 12ème Symposium international sur l'écologie des vers de terre - du 10 au 15 juillet 2022 :

**Dupont Lise, Brunet Carla-Marie, James Samuel, Gabriac Quentin, Coulis Mathieu.** 2022. Biodiversity inventory of earthworms of Martinique through the use of DNA barcoding unveiled both native and introduced species. (ISEE12). Rennes, France, 10 Juillet 2022/15 Juillet 2022. https://agritrop.cirad.fr/602319/

7. Conférence donnée au 12ème Symposium international sur l'écologie des vers de terre - du 10 au 15 juillet 2022 :

**Gabriac Quentin, Dupont Lise, Brunet Carla-Marie, Coulis Mathieu.** 2022. Is there an ecological niche overlap between native and exotic earthworm species in Martinique? (ISEE12). Rennes, France, 10 Juillet 2022/15 Juillet 2022. https://agritrop.cirad.fr/602320/

8. Article de vulgarisation dans la revue The Conversation :

https://theconversation.com/des-vers-de-terre-qui-ne-vivent-pas-dans-la-terre-decouverts-en-martinique-209148
## Contexte

En Martinique, les quelques recherches conduites sur les vers de terre jusqu'en 2018 étaient encore fragmentaires et ne concernaient pas les forêts tropicales humides du nord de l'île situées dans les massifs de la Montagne Pelée et des Pitons du Carbet. Pourtant ces dernières constituent de réels réservoirs de biodiversité comme en témoigne leur classement en RBI (Réserve de Biodiversité Intégrale), respectivement en 2007 et 2014, leur labellisation en « forêts d'exception » en 2019 et leur inscription au patrimoine mondial de l'Unesco en 2023. Les données les plus récentes étaient issues d'une courte mission menée en 2018 par S. James et M. Coulis, dans le cadre du projet FEDER-RDI AgroBioDev (Coulis, 2018). A l'issue de cet inventaire, dont 2 des 7 zones d'échantillonnage étaient localisées dans ces forêts, une liste de 27 morpho-espèces a été établie, chiffre comparable à celui obtenu en Guadeloupe (James et Gamiette, 2016). Une large proportion de ces groupes semble potentiellement nouvelle pour la science.

L'objectif de cette action était d'améliorer la connaissance des vers de terre de l'île de la Martinique en faisant tout d'abord une synthèse bibliographique suivie de nouvelles collectes et de l'utilisation d'outils moléculaires permettant de remédier au déficit de connaissance taxonomique qui limite l'étude plus approfondie des espèces de vers de terre en Martinique. Un focus sur les vers de terre épigés et sur les vers de terre des milieux agricoles sera également fait dans le but d'inventorier des espèces potentiellement utilisables en agriculture et plus particulièrement en lombriculture.

## Méthodologie

### 1. Synthèse bibliographique

Une recherche bibliographique a été menée en recherchant dans les ouvrages de synthèse et dans les principaux moteurs de recherche en ligne (Google Scholar, Web of Science et Scopus) toute information publiée sur les vers de terre de la Martinique.

### 2. Collectes de spécimens

Dans les milieux cultivés les collectes ont été menées de manière exploratoire sans a priori. C'est-à-dire qu'un maximum de lieux différents répartis sur tout le territoire a été échantillonnés en prenant de soin de représenter les différents types de sol et les différentes cultures (Fig.1). Dans les milieux naturels, l'échantillonnage a été focalisé sur les zones d'altitude (RBI) où l'endémisme est le plus fort et où les vers sont les plus abondants. Des prélèvements ciblés dans les broméliacées qui sont connues pour abriter des espèces épigées ont été réalisés. Les individus ont été collectés à l'aide de deux méthodes complémentaires: une méthode quantitative qui consiste en l'extraction sur une parcelle homogène de 3 à 8 monolithes espacés d'au moins 15 mètres et d'une dimension de 30 x 30 x 30 cm (la profondeur peut être moindre selon les contraintes du milieu), suivi d'un tri manuel du sol, et un échantillonnage qualitatif ayant pour principe de rechercher des vers de terre dans divers microhabitats (Fig. 2), comme les broméliacées, les hampes et pseudotroncs de bananier en décomposition, le sol sous diverses roches, les déjections animales, divers mulchs et composts. Les échantillons ont tous été fixés et conservés dans l'alcool en vue des analyses moléculaires.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 1 : carte de la Martinique montrant l'ensemble des sites échantillonnés.</figcaption></figure>

### 3. Identification morphologique

Nous avons utilisé un processus de taxonomie itérative (Yeates et al., 2011) pour définir et affiner les limites des espèces à l'aide de preuves morphologiques et moléculaires. L'identification morphologique des vers de terre s'est faite en trois étapes. Tout d'abord, les vers de terre échantillonnés ont été regroupés en différents morphotypes sur la base de données morphologiques externes. Il s'agissait d'adultes et de certains juvéniles. Deuxièmement, en utilisant à la fois les données externes (nombre de setae par segment, distances entre les lignes sétales, emplacement et forme du capitellum, forme du prostomium, pigmentation, pores génitaux visibles, soies modifiées et marques génitales, y compris *tubercula pubertatis* le cas échéant) et internes (emplacement et nombre de gésiers, nombre et types de glandes calcifuges, emplacement des cœurs, des organes reproducteurs mâles, des spermathèques et des organes reproducteurs femelles, néphridies par segment, caractères intestinaux), certains des morphotypes ont pu être attribués sans ambiguïté à des espèces bien connues à l'aide de clés taxonomiques (Blakemore, 2002 ; Chang et al., 2016), tandis que d'autres n'ont pu être attribués qu'à des morpho-espèces.
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 2 photo montrant deux microhabitats fréquemment colonisés par les espèces arboricoles de vers de terre.</figcaption></figure>

## 4. Analyses moléculaires

Le protocole de la procédure de barcoding moléculaire utilisée est résumé Figure 3 et plus de détails sont disponibles dans le rapport de stage de Brunet (2021). L'extraction de l'ADN ainsi que les réactions d'amplification par polymérisation en chaîne (PCR) ont été réalisées au laboratoire iEES-Paris de Créteil.

Afin de construire une librairie de référence de code-barres ADN du gène mitochondrial de la sous-unité I de la cytochrome oxydase (COI), l'ADN de ces vers de terre a été extrait et le fragment du COI séquencé, selon les protocoles décrits ci-dessous, ce qui a permis d'obtenir 684 séquences. L'ensemble des séquences obtenues a été regroupé par haplotype en utilisant l'outil « Generate Haplotype data file » du logiciel DNA Sequence polymorphism version 6.12.03 (DNAsp). Tous les haplotypes ont été comparés aux séquences présentes dans la base de données BOLD (Ratnasingham et Hebert, 2013) en utilisant l'outil « Bold identification system ». Cette étape permet d'identifier les espèces des vers de terre déjà recensées dans cette base de données internationale. Les séquences ont ensuite été regroupées en MOTUs (unités moléculaires taxonomiques opérationnelles) qui correspondent à des espèces putatives, à l'aide de la méthode de délimitation ASAP : Assemble species by automatic partitioning (Puillandre et al. 2020). Cette méthode repose sur le calcul du « barcode gap », qui correspond à la valeur de la plus grande distance intraspécifique et de la plus petite distance interspécifique calculée au sein d'un ensemble de séquence. Les distances sont mesurées en utilisant le modèle de substitution Kimura 2 paramètres (Kimura 1980).
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 3 : Représentation schématique du processus d'identification d'un spécimen par barcode moléculaire</figcaption></figure>

Pour visualiser les relations de parenté entre les MOTUS, un arbre phylogénétique des haplotypes a été construit sous MEGA-X, en utilisant une méthode de Neighbour Joining (Saitou et Nei, 1987) et le modèle d'estimation des distances génétiques Kimura 2 paramètres. La robustesse des branches a été évaluée avec une analyse de Bootstrap de 1000 réplicas. L'arbre phylogénétique et l'assignation aux MOTU sont visualisés avec le package ggtree version 2.4.1 (Yu, 2020) sous Rstudio. Un arbre circulaire représentant les MOTUs est représenté à l'aide du logiciel iTOL v5 (Letunic and Bork, 2021).

# Résultats et discussion

## 1. Biodiversité des vers de terre des milieux cultivés de Martinique

Les résultats de la synthèse bibliographique montrent la présence de 5 espèces déjà mentionnées dans la littérature. Les collectes récentes ont permis de recenser 10 espèces nouvelles pour la Martinique: *Dichogaster (Diplothecodrilus) affinis* (Michaelsen, 1890), *Dichogaster (Dt.) annae* (Horst, 1893), *Dichogaster (Diplothecodrilus) bolaui* (Michaelsen, 1891), *Dichogaster (Dt.) saliens* (Beddard, 1893), *Drawida barwelli* (Beddard, 1886), *Eudrilus eugeniae* (Kinberg, 1867), *Metaphire houleti* (Perrier, 1872), *Perionyx excavatus* Perrier, 1872 et *Polypheretima taprobanae* (Beddard, 1892) ainsi que deux espèces non-décrites : *Periscolex* sp. et *Rhinodrilidae* sp. La liste mise à jour des vers de terre des milieux agricoles de la Martinique compte donc 15 espèces actuellement. L'ensemble de ces données est intégré dans une clé de détermination richement illustrée permettant d'identifier 20 espèces dont la présence est avérée ou fortement probable non seulement en Martinique mais aussi dans les milieux cultivés de l'ensemble des Antilles Françaises. Cette clé rédigée en français est en cours de publication dans la revue Zoosystema et sera librement accessible en ligne prochainement.
<table><caption>Tableau 1. Synthèse des espèces recensées dans les milieux agricoles de Martinique.</caption><thead><tr><td>Espèces</td><td>Références</td></tr></thead><tbody><tr><td>Amynthas rodericensis (Grube, 1879)</td><td>Coulis 2021</td></tr><tr><td>Dichogaster (Diplothecodrilus) affinis (Michaelsen, 1890)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Dichogaster (Diplothecodrilus) annae (Horst, 1893)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Dichogaster (Diplothecodrilus) bolaui (Michaelsen, 1891)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Dichogaster (Diplothecodrilus) saliens (Beddard, 1893)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Drawida barwelli (Beddard, 1886)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Eudrilus eugeniae (Kinberg, 1867)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Metaphire houleti (Perrier, 1872)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Perionyx excavatus Perrier, 1872</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Periscolex sp.</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Polypheretima elongata (Perrier, 1872)</td><td>Brossard et al. 1996, Rossi et al. 1997, Lattaud et al. 1998, Loranger et al. 1998, Hartmann et al. 1998, Villenave et al. 1999, Blanchart et al. 2000, Chevalier et al. 2001, Blanchart et al. 2004</td></tr><tr><td>Polypheretima taprobanae (Beddard, 1892)</td><td>Cette étude</td></tr><tr><td>Pontoscolex (Pontoscolex) corethrurus (Müller, 1857)</td><td>Fragoso et al. 1999, Coulis 2021</td></tr><tr><td>Pontoscolex (Pontoscolex) cuasi Righi, 1984</td><td>Fragoso et al. 1999</td></tr><tr><td>Pontoscolex (Pontoscolex) spiralis Borges & Moreno, 1990</td><td>Fragoso et al. 1999</td></tr></tbody></table>

## 2. Biodiversité des vers de terre de l'ensemble de la Martinique :

Les 81 sites échantillonnés en Martinique étaient répartis uniformément dans deux catégories correspondant à des environnements naturels et anthropisés. Nous avons obtenu un total de 684 séquences d'un fragment du gène COI. La délimitation MOTU et l'identification morphologique ont suggéré que cet ensemble de données correspondait à 49 espèces putatives, dont 16 étaient des espèces exotiques connues (Fig. 4). La courbe de raréfaction suggère que l'effort d'échantillonnage n'était pas suffisant pour capturer la diversité totale des vers de terre dans l'environnement naturel et que de nombreuses autres espèces pourraient y être découvertes (Fig.5). Nous avons trouvé 8 espèces différentes dans des plantes épiphytes, dont trois presque exclusivement dans des broméliacées échantillonnées à plus de 1,4 m du sol. Plusieurs de ces espèces sont probablement endémiques à la Martinique et nouvelles pour la science. Mais il y avait également des espèces exotiques dans cet habitat, notamment l'espèce *Dichogaster (Diplothecodrilus) andina*, collectée dans les broméliacées et aussi dans les plantes du genre *Heliconia*. Cette étude met donc en évidence la grande diversité des vers de terre en Martinique, tout en soulignant une menace qui pèse sur cette biodiversité, à savoir la présence d'espèces exotiques envahissantes.
<figure><img src="image_11.png" /></figure>

Figure 4 : arbre phylogénétique en Neighbor Joining des 684 séquences COI obtenues à partir de l'analyse des vers de terre collectés en Martinique. Les MOTUs sont représentées par des triangles dont les bords latéraux plus longs et plus courts représentent la divergence intra maximale et minimale. Les MOTUs sont considérées comme des espèces putatives et le nom de l'espèce identifiée est indiqué lorsque cela est possible, sinon seul un nom de genre est proposé ou l'espèce est considérée comme indéterminée. Les noms d'espèces putatives colorés en rouge correspondent à des espèces exotiques ; les branches d'espèces putatives colorées en vert correspondent à des espèces arboricoles (c'est-à-dire dont le spécimen se trouve plus de 90 % du temps dans des arbres). Les singletons sont représentés en petite taille de police.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 5** : Courbes de raréfaction pour l'ensemble des données (marron), et séparément pour les sites dans les environnements anthropisés (bleu) et naturels (orange). Les formes à l'extrémité de la ligne continue correspondent au nombre d'espèces réellement observées. Les lignes pointillées représentent le nombre d'espèces obtenu par extrapolation.</figcaption></figure>

### 3. Etudes des broméliacées de Martinique

La forte diversité de vers de terre dans les plantes épiphytes et notamment dans les broméliacées nous a poussé à mettre en place une collaboration avec le Conservatoire Botanique National (CBN) Martinique au cours du projet. Cette collaboration a permis la réalisation d'un guide illustré sur les broméliacées de Martinique (Ferlay, 2022). Ce guide s'adresse aux naturalistes passionnés, aux gestionnaires, aux chercheurs ainsi qu'à l'ensemble des acteurs de l'environnement de la Martinique et plus largement des Antilles Françaises. Il permet l'identification sur des critères végétatifs ou floraux des 30 espèces de la famille des broméliacées présentes dans les milieux naturels des Antilles Françaises.

Le guide illustré sur les broméliacées de Martinique est disponible en ligne :

https://zenodo.org/records/7607486

<figure><img src="image_13.png" /></figure>
Bibliographie

Blakemore, R.J. (2002). Cosmopolitan earthworms - An eco_taxonomic guide to the peregrine species of the world. Ver-mecology, 426 p.

Blanchart, E., Albrecht, A., Chevallier, T., & Hartmann, C. (2004). The respective roles of roots and earthworms in restor-ing physical properties of Vertisol under a Digitaria decumbens pasture (Martinique, WI). Agriculture, Ecosystems and Environment, 103(2), 343-355. lien

Blanchart, E., Achouack, W., Albrecht, A., Bellier, G., Cabidoche, Y.-M., Hartmann, C., Heulin, T., Larre-Larrouy, C., Ma-hieu, M., & Thomas, F. (2000). Déterminants biologiques de l'agrégation dans les vertisols des Petites Antilles: Con-séquences sur l'érodibilité. Etude et Gestion des sols, 7(4), 309-328.

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Chevallier, T., Blanchart, E., Girardin, C., Mariotti, A., Albrecht, A., & Feller, C. (2001). The role of biological activity (roots, earthworms) in medium-term C dynamics in vertisol under a Digitaria decumbens (Graminae) pasture. Applied Soil Ecology, 16, 11-21. lien

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Coulis, M. (2018). Inventaire des espèces de vers de terre de Martinique rapport de mission FEDER-RDI Agrobiodev. CI-RAD, p. 4. lien

Ferlay B. (2022). Guide des Bromélicées indigènes des Antilles françaises. Coédition CIRAD, CBN martinque. https://ze-nodo.org/records/7607486

Fragoso, C., Kanyonyo, J., Moreno, A., Senapati, B.K., Blanchart, E., & Rodriguez, C. (1999). A survey of tropical earth-worms: Taxonomy, biogeography and environmental plasticity, Earthworm Management in Tropical Agroecosys-tems. CABI Wallingford, p. 1-26.

Gabriac, Q., James, S., Dupont, L., & Coulis, M. (à paraître en 2024). Biodiversité des vers de terre (Annelida: Clitellata) des milieux cultivés des Antilles françaises. Zoosystema.

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ACTION 1-2 : Connectivité entre des populations de vers de terre de deux aires naturelles protégées

Rédaction : M. Coulis, L. Dupont

Contributeurs : Gabriac Quentin, Samuel James, Lise Dupont, Carla-Marie Brunet, Mathieu Luce, Nelly Telle, Christiane Mauriol, Mathieu Coulis

Résumé : À la suite de l'inventaire général mené dans le cadre de l'action 1-1, cette action concerne la conservation des espèces arboricoles de vers de terre. Deux menaces pesant sur la conservation de ces espèces ont été abordées : d'une part, le maintien de la diversité génétique dans un contexte de fragmentation de l'aire de répartition par les activités humaines, et d'autre part, la menace que pourraient représenter des espèces exotiques de vers de terre présentes en Martinique.

Pour répondre à cet objectif, deux espèces natives de vers de terre arboricoles ont été étudiées ainsi que les espèces exotiques capables de coloniser les mêmes habitats arboricoles. L'effet de la fragmentation de leur habitat sur la diversité de ces deux espèces arboricoles a été étudiée à travers le paysage agricole du Morne Rouge, notamment dans les différents éléments pouvant servir de corridor écologique de dispersion (haies, parcelles forestières, etc.) entre les zones protégées de la Montagne Pelée et des Pitons du Carbet. Ce travail a permis d'inventorier cinq espèces exotiques dans les habitats arboricoles de Martinique. Ces espèces présentent différents niveaux de menace pour les espèces de vers de terre arboricoles natives. Une espèce en particulier (*Dichogaster andina*) peut être qualifiée d'espèce exotique envahissante (EEE) car elle représente une menace potentielle importante pour les espèces natives. Ensuite, les liens phylogénétiques ont été mis en relation avec la répartition géographique des sites de collecte. Les deux espèces natives ont montré des résultats contrastés. *Dichogaster sp6*, une espèce de petite taille, n'a montré aucun lien entre proximité géographique et proximité génétique, suggérant des flux de gènes réguliers entre les massifs de la Montagne Pelée et des Pitons du Carbet. En revanche, pour *Dichogaster sp11A*, une structuration génétique marquée a été mise en évidence, suggérant un isolement reproductif entre les populations de ces deux zones protégées. Les perspectives pour améliorer la conservation des espèces arboricoles de vers de terre seraient de favoriser les trames verte et bleue dans les zones agricoles du Morne Rouge et d'y limiter au maximum la propagation des espèces exotiques envahissantes.

Une publication à destination du grand publique sur les vers de terre arboricole de Martinique et les enjeux de leur conservation est disponible en ligne :

https://doi.org/10.64628/AAK.4ca5ap7wd

<figure><img src="image_14.png" /></figure>
## Documents produits dans le cadre de cette action :

1. Rapport de stage de Master 2 :

**Brunet Carla-Marie.** 2021. Analyse moléculaire de la diversité des vers de terre arboricoles endémiques de Martinique. Toulouse : Université Toulouse III Paul Sabatier, 30 p. Mémoire de master 2 : Ecologie et évolution : Université Toulouse 3 - Paul Sabatier.
https://agritrop.cirad.fr/602287/

2. Publication scientifique :

**Dupont Lise, Brunet Carla-Marie, Fourcade Yoan, James Samuel, Gabriac Quentin, Coulis Mathieu.** 2023. Recording earthworm diversity on the tropical island of Martinique using DNA barcoding unveiled endemic species in bromeliad plants. Soil Biology and Biochemistry, 182:109038, 10 p. https://agritrop.cirad.fr/606225/

3. Librairie de référence de barcode moléculaire :

Les données sont disponibles publiquement sur le site du Barcode of Life Data Systems (BOLD) grâce à cet identifiant « dataset dx.doi.org/10.5883/DS-CARMT » ou en suivant ce lien :
https://www.boldsystems.org/index.php/PublicTerms?query=DS-CARMT
## Contexte

La Martinique possède deux vastes zones naturelles protégées qui peuvent être considérées comme des réservoirs de biodiversité : la Montagne Pelée et les Pitons du Carbet. Ces espaces à fort couvert forestier abritent de nombreuses espèces endémiques et emblématiques de l'île. Du fait de la forte biodiversité qu'ils abritent, ces espaces ont été proposés à l'inscription au patrimoine mondial de l'Unesco en 2018 et leur inscription a été effective en 2023. De nombreuses espèces présentes sont menacées d'extinction selon l'UICN, les perturbations d'origines anthropiques étant l'une des raisons principales. En effet, les espaces forestiers du nord de la Martinique sont fragmentés par l'utilisation des terres pour l'agriculture et l'urbanisation. Cette perte d'habitat forestier est un frein à la dispersion des espèces et peut avoir des conséquences importantes sur leur diversité génétique, par exemple en diminuant trop fortement la taille efficace de leurs populations. Les surfaces forestières sont actuellement protégées en Martinique et leur évolution n'est pas préoccupante. Mais l'intensification des activités humaines dans les zones agricoles et la réduction des habitats intermédiaires tels que les haies et les patchs forestiers en zone agricole (qui ne sont pas protégés) peut avoir une influence importante sur la conservation des espèces car cela diminue la connectivité entre les différentes zones cœurs de leurs habitats. De plus, les introductions d'espèces exotiques sont particulièrement à surveiller car elles sont un facteur important d'extinctions d'espèces à travers le monde. Pour l'ensemble de ces raisons, il est important d'acquérir des connaissances pouvant aider à mieux préserver la biodiversité dans cette zone qui est aujourd'hui inscrite au patrimoine mondial de l'humanité.

En particulier pour préserver la biodiversité des vers de terre. Il existe en Martinique des espèces ayant la particularité d'être arboricoles. C'est un phénomène assez rare bien que déjà documenté dans d'autres régions du monde. L'objectif de ce travail sera donc double : documenter plus précisément l'habitat de ces espèces et mieux comprendre leur mécanisme de dispersion à travers le paysage de manière à aider à la conservation.

Pour comprendre l'isolement génétique entre populations de vers de terre vivant dans les broméliacées des deux aires protégées d'intérêt majeur que sont la Montagne Pelée et les Pitons du Carbet, des outils de génétique des populations seront mobilisés. La caractérisation de la structure génétique à l'échelle de ces deux zones d'étude permettra de renseigner sur le flux de gènes entre les sites et ainsi d'estimer la connectivité fonctionnelle entre les populations. Ce type d'approche, sera couplé à une caractérisation fine du paysage pour identifier des frontières et des corridors à la dispersion des espèces de vers de terre.

## Méthodologie

### 1. Choix des sites étudiés :

La zone d'étude dans son ensemble a été choisie car elle englobe les deux zones protégées d'intérêt majeur et inscrites au patrimoine mondial de l'humanité que sont les volcans et forêts de la Montagne Pelée et les Pitons du Nord de la Martinique. Les résultats de l'action 1 ont confirmé le caractère exceptionnel de la diversité biologique des vers de terre de cette zone. La plupart des espèces de vers de terre natives potentiellement nouvelles pour la science qui présentent un enjeu de conservation y ont été recensées. Néanmoins, un des problèmes de cet ensemble inscrit à l'UNESCO est la discontinuité des deux zones cœur protégées qui pourrait avoir des conséquences négatives sur la conservation des espèces si la connectivité en ces deux zones n'est pas effective. En effet il existe entre la Montagne Pelée et les Pitons du Carbet une zone
agricole où les habitats naturels ne sont pas protégés. Il s'agit donc de cette zone qui présente un enjeu important et que nous avons choisi d'étudiée. Pour cela 18 sites ont été choisis dans la matrice agricole ou à proximité de manière à présenter des habitats potentiellement favorables aux espèces étudiées (Fig.1). C'est-à-dire avec présence d'arbres et de végétation épiphyte.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 1 : carte montrant la zone étudiée au Morne Rouge qui est située entre les zones protégées de la Montagne Pelée et des Pitons du Carbet.</figcaption></figure>

## 2. Choix des espèces de vers de terre étudiées

A partir des résultats de l'action 1, deux espèces de vers de terre arboricole ont été ciblées selon les critères suivants. Elles devaient (1) être suffisamment abondantes pour que l'on puisse collecter un grand nombre de spécimens ; (2) avoir une aire de répartition englobant à la fois la montagne Pelée et les Pitons du Carbet ; (3) appartenir à un taxon natif et donc probablement endémique de l'île pour justifier un travail sur leur conservation. Deux espèces ont été sélectionnées selon ces critères, elles appartiennent au genre Dichogaster et ont été nommées de manière provisoire (en attendant leur description formelle) Dichogaster sp6 et Dichogaster sp11A (Fig.2 et 3). Les spécimens appartenant à ces deux espèces ont donc été collectés et analysés sur les 18 sites cités précédemment et les spécimens déjà collectés précédemment (action1) ont également été inclus dans les analyses pour constituer un pool d'individus provenant des zones cœurs (Pitons et Pelée). De par la menace potentielle qu'ils constituent pour les espèces natives une attention particulière a été portées sur les espèces de vers de terre exotiques. Il est important de noter que l'identification de vers de terre sur le terrain n'est pas possible car elle requiert un examen approfondi à la loupe binoculaire. Tous les individus ont donc été collectés avant d'être identifiés et ne seront conservés pour les analyses que les deux espèces natives susmentionnées ainsi que les espèces exotiques.
### 3. Collecte de spécimens

La surface échantillonnée est définie par un rayon de 10 m centré sur un point prédéfini. La collecte de vers de terre est réalisée en chasse à vue standardisée pendant une durée de 1h dans le but de prélever tous les individus matures ou juvéniles observés. La chasse à vue a été réalisée dans les milieux accessibles par l'homme ou atteignables à l'aide d'une perche pour atteindre des habitats pouvant aller jusqu'à 7 m de hauteur.

Les individus collectés sur le terrain sont stockés dans une boite contenant de la matière organique provenant du micro-habitat dans lequel ils ont été récoltés. Les boites sont stockées dans une glacière jusqu'au laboratoire. Les vers de terre sont ensuite nettoyés dans une coupelle d'eau, puis tués de manière douce dans de l'alcool à 10%. Les vers sont ensuite placés dans une solution d'éthanol à 70 % puis stockés dans des tubes individuels au congélateur pour assurer une préservation optimale en vue des analyses moléculaires.

### 4. Analyses moléculaires

Pour les deux espèces (D. sp6 et D. sp11A), nous avons évalué la diversité génétique et sa distribution en réanalysant les séquences de cytochrome oxydase I (COI) publiées dans Dupont et al. (2023) et accessibles au public dans le jeu de données dx.doi.org/10.5883/DS-CARMT, accessible dans BOLD. Le nombre de sites polymorphes, le nombre d'haplotypes, la diversité des haplotypes (gènes) et la diversité des nucléotides (Pi ; Ney 1987) ont été calculés pour chaque espèce à l'aide du logiciel DnaSP v. 5 (Librado et Rozas 2009). Afin d'étudier les relations entre les différents haplotypes, un réseau d'haplotypes a été déduit à l'aide de l'algorithme TCS décrit par Clement et al. (2002) tel qu'il est implémenté dans le logiciel POPART (Leigh & Bryant, 2015).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 2 : Photo d'un individu vivant de Dichogaster sp6.</figcaption></figure>
Résultats et discussion

L'échantillonnage et l'utilisation des spécimens déjà collectés lors de l'action 1 ont permis de rassembler au total 183 individus appartenant aux deux espèces préalablement sélectionnées pour cette étude (Tableau 1). *Dichogaster sp6* (Fig. 2) a été collectée sur 18 sites différents compris entre 432 m et 1204 m d'altitude. Son habitat est essentiellement arboricole avec une majorité des spécimens collectés dans des broméliacées de 5 espèces différentes (Tableau 1). D'autres microhabitats sont également colonisés par cette espèce tels que le bois mort aérien, les inflorescences en décomposition d'Héliconia et l'aisselle de feuille de palmiers. *Dichogaster sp11A* (Fig. 3) a été collecté sur 16 sites différents compris entre 432 m et 1396 m d'altitude. Son habitat est essentiellement arboricole avec une très grande majorité des spécimens collectés dans des broméliacées de 5 espèces différentes. L'habitat de cette espèce semble être assez spécialisé dans les broméliacées, elle n'a été collectée que marginalement dans d'autres habitats (Tableau 1). Il est néanmoins impossible de déterminer si ces habitats sont temporaires car ils permettent aux vers de se déplacer entre 2 broméliacées ou s'ils constituent un milieu de vie à part entière.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 3 : photo d'un individu vivant de Dichogaster sp11A.</figcaption></figure>

L'échantillonnage et l'utilisation des spécimens déjà collectés lors de l'action 1 ont permis de rassembler au total 317 individus appartenant à des espèces exotiques et vivant dans des habitats pouvant être considérés comme arboricole ou « hors sol ». L'ensemble de ces spécimens appartient à 5 espèces différentes parmi lesquelles 2 peuvent être considérées comme ayant un mode de vie arboricole car plus de 50 % de leurs spécimens ont été collectés dans des habitats arboricoles. Il s'agit de *Dichogaster andina* et de *Dichogaster annae*. Ces deux espèces constituent donc une menace pour les espèces arboricoles natives puisqu'elles occupent un microhabitat similaire et sont donc susceptibles d'entrer en compétition avec elles. L'espèce qui constitue une menace particulièrement élevée pour la faune des vers de terre arboricole native est *D. andina* qui a été trouvée dans 4 espèces de broméliacées et dans des microhabitats appréciés par *Dichogaster sp6* tels que les inflorescences d'Héliconia, les aisselles de feuilles de palmier et le
bois mort aérien. *D. annae* pourrait constituer également une menace bien que, pour le moment, son aire de répartition chevauche moins celle des espèces natives (gamme d'altitude de 10 m à 582 m) et que *D. annae* soit majoritairement présent dans les milieux agricoles d'où sont absentes les espèces natives. Les trois autres espèces exotiques (*Eudrilus eugeniae*, *Amynthas rodericensis* et *Peryonix excavatus*) ont été mentionnées dans ce travail car elles sont présentes sur tout le territoire Martiniquais et ont été retrouvées marginalement dans des microhabitats arboricoles ce qui démontre leur capacité à les coloniser. La menace est pour le moment faible mais il n'est pas impossible que des changements de l'environnement tels que des changements du climat ou un changement d'usage des sols provoque une colonisation de ces microhabitats par ces espèces exotiques à la répartition pantropicale.

<table><caption>Tableau 1 : information sur les microhabitats des espèces de vers de terre arboricoles étudiés.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Espèces natives</th><th colspan="5">Espèces exotiques</th></tr><tr><th>Dichogaster sp6</th><th>Dichogaster sp11A</th><th>Dichogaster andina</th><th>Dichogaster annae</th><th>Eudrilus eugeniae</th><th>Amynthas rodericensis</th><th>Peryonix excavatus</th></tr></thead><tbody><tr><td>Nombre d'individus</td><td>123</td><td>62</td><td>203</td><td>22</td><td>43</td><td>38</td><td>11</td></tr><tr><td>Nombre de sites</td><td>18</td><td>16</td><td>19</td><td>12</td><td>13</td><td>18</td><td>8</td></tr><tr><td>Distribution altitudinale</td><td>432-1204</td><td>432-1396</td><td>253-740</td><td>10-582</td><td>30-654</td><td>32-1005</td><td>15-380</td></tr><tr><td>Hauteur (min.-max.)</td><td>0-30</td><td>0-4.5</td><td>0-6.8</td><td>0-1.5</td><td>0-2.15</td><td>0-3</td><td>0-1.5</td></tr><tr><td>Proportion d'arboricoles</td><td>94%</td><td>92%</td><td>99%</td><td>64%</td><td>16%*</td><td>10%*</td><td>3%*</td></tr><tr><td colspan="8"><u>Espèces de broméliacées :</u></td></tr><tr><td>Glomeropitcairnia penduliflora</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guzmania lingulata</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guzmania megastachya</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guzmania plumieri</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Werauhia ringens</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Werauhia urbaniana</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="8"><u>Autres habitats arboricoles :</u></td></tr><tr><td>Bois mort aérien (dans le bois en décomposition ou sous l'écorce)</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Manchon de mousse sur tronc</td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Inflorescences d'Héliconia</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>Aisselles des feuilles de palmiers</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Aisselles des feuilles de bananiers</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td></tr><tr><td colspan="8"><u>Habitats épigés non arboricole :</u></td></tr><tr><td>Pseudotronc de bananier au sol</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x*</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>Compost</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x*</td><td>x</td></tr><tr><td>Bois mort au sol</td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Accumulation de MO sur roche</td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>litière et sol supperficiel</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x*</td><td>x</td></tr></tbody></table>

<footnote>*Ces espèces sont également présentes dans le sol et la litière des milieux agricoles. Pour éviter une surestimation de leur proportion d'arboricole, nous avons inclus pour le calcul d'autres données issues de prélèvement de sol fait en Martinique et provenant de la base de données des invertébrés du sol du CAEC.</footnote>
L'analyse de la diversité génétique intraspécifique montre des résultats contrastés pour chacune des deux espèces. Aucune relation entre la proximité géographique et la proximité génétique ne semble exister chez D. Sp6 (Fig. 4-A). Effet, la plupart des clusters qui symbolisent des individus proches génétiquement sont composés de spécimens collectés dans des sites éloignées. Cela suggère qu'il y a des flux de gènes réguliers entre les populations de la Montagne Pelée, des Pitons du Carbet et du Morne Rouge (zone intermédiaire). Par conséquent, D. sp6 possède probablement des capacités de dispersion importantes qui permet à des individus de se déplacer d'une zone à l'autre. Plusieurs hypothèses peuvent être faites sur le mode de dispersion utilisé par D. sp6 ; (1) Une dispersion par les cours d'eau, par exemple un bois mort ou une noix de coco en décomposition pourrait être transportée par le courant, cette hypothèse qui est assez probable pour expliquer la colonisation des zones basses à partir des zones d'altitude explique mal la dispersion vers les sommets ; (2) une hypothèse à envisager serait une forme de zoochorie, par exemple le transport des cocons par des animaux plus mobiles tels que des petits mammifères ou des oiseaux.

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

Figure 4 : Réseau TCS déduit des séquences COI 114, 57, 40 et 12 de *Dichogaster sp6* et *Dichogaster sp11A*. Les nœuds de séquences correspondant aux échantillons collectés dans les Pitons du Carbet sont en noir, les séquences de la Montagne Pelée sont en blanc et les séquences de la zone intermédiaire sont en gris. Les mutations inférées entre les haplotypes sont représentées par des marques de hachures.
A l'inverse, une relation nette entre la proximité géographique et la proximité génétique est visible chez l'espèce D. sp11A (Fig. 4-B). Cela se traduit par des clusters qui regroupent uniquement des individus appartenant à la même zone géographique et suggère que les flux de gènes entre les populations de la Montagne Pelée, des Pitons du Carbet et du Morne Rouge (zone intermédiaire, cf. Fig.1) sont faibles. Par conséquent, il semble peu probable que D. sp11A soit en mesure de se disperser dans le paysage actuel.

Si certains spécimens ont été collectés dans la zone intermédiaire située au Morne Rouge, aucun spécimen appartenant à D. sp6 ou D. sp11A n'a été collecté dans un site de cette zone très agricole. Les échantillonnages ont pourtant ciblé des patchs de forêt entre les champs, des haies avec des broméliacées ou des fourrés d'Héliconia. Il est possible que notre échantillonnage ait été incomplet et que certains individus arrivent à occuper des sites dans cette zone mais il semble que le secteur du Morne Rouge soit un habitat défavorable à ces espèces arboricoles natives. Ce résultat va également à l'encontre de l'hypothèse d'une dispersion de proche en proche reliant la Montagne Pelée et les Pitons du Carbet. De plus amples études seraient nécessaires sur le sujet. Il est possible de proposer certains types d'aménagement qui favoriseraient l'habitat de ces espèces natives dans la zone du Morne Rouge et participeraient à renforcer la trame verte et bleu pour ces organismes. Tout aménagement augmentant le pourcentage de couvert forestier dans cette zone ainsi que plus de haies permettraient d'augmenter la connectivité et de favoriser la colonisation et le maintien de population de ces vers de terre natif dans cette zone agricole.

## Bibliographie

* M. Clement, Q. Snell, P. Walke, D. Posada and K. Crandall, "TCS: estimating gene genealogies," in Parallel and Distributed Processing Symposium, International, Fort Lauderdale, California, 2002. 7 pp. doi: 10.1109/IPDPS.2002.1016585

* L. Dupont, C.-M. Brunet, Y. Fourcade, S. James, Q. Gabriac, M. Coulis, Recording earthworm diversity on the tropical island of Martinique using DNA barcoding unveiled endemic species in bromeliad plants, Soil Biology and Biochemistry 182 (2023) 109038. https://doi.org/10.1016/j.soilbio.2023.109038.

* J.W. Leigh, D. Bryant, POPART: full-feature software for haplotype network construction, Methods in Ecology and Evolution 6 (2015) 1110-1116.

* Librado P, Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics. 2009 Jun 1;25(11):1451-2. doi: 10.1093/bioinformatics/btp187. Epub 2009 Apr 3. PMID: 19346325.
ACTION 1-3 : Diversité des rhizobia associées aux légumineuses en Martinique

Rédaction : Antoine Galiana

Contributeurs : Amadou Bâ, Alexandra Blot, Marine Faye, Antoine Galiana, Laure Hannibal, Coralie Julan, Sonia Minatchi, Bryan Vincent.

Résumé : Les travaux réalisés à travers cette action ont permis d'acquérir de nouvelles et nombreuses informations sur la diversité et la dynamique des associations symbiotiques plantes-microorganismes du sol au sein des agro-écosystèmes. Concernant la diversité des bactéries fixatrices d'azote (rhizobia) isolées à partir d'environ 80 espèces de légumineuses arborées et herbacées prospectées à travers une quinzaine de sites (agrosystèmes et écosystèmes naturels) en Martinique, 250 souches ont pu être caractérisées par séquençage (gène ARNr16S). L'analyse phylogénétique de ces souches bactériennes a montré une très grande diversité de taxons et mis en évidence la présence de nodules fixateurs d'azote chez la majorité des espèces prospectées dont 20 nouvelles espèces de légumineuses autochtones jamais étudiées auparavant. Nos travaux ont également permis de constituer la première collection de souches bactériennes symbiotiques en Martinique, conservée au congélateur à -80°C au CAEC. Les souches de cette collection permanente, d'origine autochtone, pourront ainsi être utilisées ultérieurement comme biostimulants en les inoculant à des espèces de légumineuses de service afin d'accroître sensiblement leur fixation d'azote au champ et diminuer ainsi les apports d'engrais azotés d'origine chimique, coûteux et polluants.
## Documents produits dans le cadre de cette action :

### 1. Publication scientifique :

**Julan Coralie, Coulis Mathieu, Vincent Bryan, Hannibal Laure, Galiana Antoine.** Mycorrhizal dynamics, diversity and sharing of mycorrhizal communities within banana plantations subjected to different agronomic practices in Martinique. *En préparation*

### 2. Communications orales dans conférence internationale :

**Julan Coralie, Vincent Bryan, Coulis Mathieu, Hannibal Laure, Bâ Amadou, Galiana Antoine.** 2022. Diversity and sharing of mycorrhizal communities within banana plantations subjected to different agronomic practices in Martinique. In: 19th International Conference of the AABNF (African Association for Biological Nitrogen Fixation), Held at UCAD, Dakar, Senegal, November 29-September 1st 2022. Oral communication. Book of abstracts, p.35.
https://agritrop.cirad.fr/606229/

### 3. Rapports de stage :

**Prissaint Lavigna.** 2020. Caractérisation des microorganismes symbiotiques associées aux légumineuses utilisées comme plantes de service dans les systèmes agricoles en Martinique. Rapport de stage de 2ème année de BTS Bio-Analyses et Contrôle du Lycée de Bellevue (Fort-de-France, Martinique). 33 p.

**Faye Marine.** 2023. Caractérisation de la diversité et de l'efficience des symbioses microbiennes associées aux légumineuses natives et introduites en Martinique : rapport de stage de Césure – Certificat d'Expérience à l'International du cycle ingénieur AgroParisTech. Stage effectué du 30/01 au 13/07/2023, 20 p.
## Contexte

Avant nos présents travaux entrepris dans le cadre du projet REBIOS, aucune étude descriptive sur la diversité des symbioses microbiennes fixatrices d'azote (associations légumineuses-rhizobium), n'avait été réalisée en Martinique, ni même dans les îles voisines des Petites Antilles. Ceci alors que la diversité des légumineuses en particulier y est particulièrement élevée, comme dans tout le bassin Caribéen. Les objectifs de cette action étaient : i) de décrire la diversité des bactéries fixatrices d'azote ; ii) d'identifier l'effet des pratiques culturales ou d'autres variables environnementales sur cette diversité ; et iii) de promouvoir l'utilisation des associations symbiotiques d'origines autochtones dans les systèmes agricoles ou agroforestiers en Martinique. Ceci sachant que la plupart des légumineuses qui y sont utilisées comme plantes de service actuellement (plantes de couverture, assainissantes, arbres de haies, ...) sont des espèces exotiques introduites ayant parfois un caractère envahissant. Ainsi, notre étude vise à valoriser des espèces de légumineuses autochtones ayant un intérêt écologique ou à potentiel agronomique et agroforestier et utilisables comme plantes de services. L'un des autres objectifs opérationnels majeurs de cette action était de conserver cette diversité microbienne *via* la création d'une collection de souches microbiennes d'origine locale, cas unique dans les Petites Antilles, dans une perspective d'utilisation sous forme d'inoculum biofertilisants.

## Méthodologie

### 1. Etude bibliographique

Les espèces de légumineuses à rechercher dans nos prospections ont été répertoriées d'après la Flore illustrée des phanérogames de Guadeloupe et de Martinique (Tome 1, pages 572 à 763) de Fournet (2002) et d'après la liste des phanérogames autochtones de Martinique établie par le Conservatoire Botanique de Martinique (Bernard et al., 2015).

### 2. Collecte des nodosités racinaires et autres échantillons végétaux

L'isolement des souches de rhizobia a été effectué à partir de nodosités racinaires, de racines et de sol rhizosphérique. Ces échantillons ont été prélevés sur des légumineuses autochtones ou introduites et de ports différents (herbacé, arbustif et arboré) réparties dans différentes zones bioclimatiques de Martinique, autant en milieu naturel (forêts humides, mésophiles et sèches) qu'anthropisé (cultures, friches). En parallèle ont été collectés des feuilles, des graines et d'autres organes végétaux pour : i) une éventuelle identification botanique des espèces collectées d'après la Flore de Fournet en cas de doute ; ii) procéder à des analyses isotopiques afin d'estimer leur potentiel fixateur d'azote (Voir § II-1 du rapport ci-dessous) ; et iii) pour le piégeage de souches bactériennes à partir de nodules racinaires en partant des graines récoltées. Au total, 25 sites différents ont été explorés du Sud au Nord de l'île de 2021 à 2023, dont 20 correspondent à des écosystèmes naturels et 5 à des milieux cultivés (collectes « bord de champ ») (voir localisation des points de prospection à la Figure 1).
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 1 : Localisation des points de prospection des nodules des légumineuses en Martinique dans le cadre du projet Rebios.</figcaption></figure>

Les échantillons de racines portant les nodosités ont été prélevées à l'aide d'une petite pelle au pied des plants des différentes espèces en s'assurant, pour les espèces arborées, qu'elles étaient bien rattachées au pied-mère ciblé. Ces échantillons ont été ensachés dans des sacs plastiques et transportés dans une glacière jusqu'au laboratoire du CAEC.

### 3. Isolement des souches bactériennes :

L'isolement des souches bactériennes contenues dans les nodosités a été réalisé au laboratoire sous hotte à flux laminaire après un rinçage des nodules à l'eau du robinet. Les nodules d'une même plante (Fig. 2), toujours attachés à un petit segment de racine, sont ensuite lavés délicatement par trempage dans de l'eau distillée additionnée de quelques gouttes de savon liquide, avant de les immerger dans de l'alcool à 70°C pendant 30 secondes. Puis, les nodules
sont stérilisés en surface par immersion dans de l'hypochlorite de calcium à 5% (w/v) pendant 1 à 4 minutes selon la taille du nodule avant leur rinçage dans 3 bains successifs d'eau stérile de 1, 5 et 10 minutes respectivement. Les nodules individualisés sont ensuite soit écrasés avec une lame de scalpel stérile dans une goutte d'eau stérile lorsqu'ils sont petits (< 1-2 mm de diamètre), soit coupés en deux au scalpel avant prélèvement de cortex nodulaire interne. Les broyats ainsi mis en suspension sont enfin transférés à l'aide d'une öse stérile par la méthode des stries dans des boîtes de Petri contenant chacune 25 ml de milieu YEM gélosé (YEMA, Yeast Extract Mannitol Agar). Après incubation des boites de Petri en étuve à 30°C pendant 5 à 10 jours, les isolats obtenus issus de colonies sont purifiés par au moins deux nouveaux transferts et étalements successifs en boîtes de Petri sur milieu YEMA additionné de Rouge Congo (25 ppm w/v), colorant sélectif contrastant permettant d'éliminer les isolats bactériens contaminants (Figure 3).

4. Identification moléculaire des souches bactériennes et analyse phylogénétique

Les isolats bactériens ainsi obtenus ont été caractérisés par amplification et séquençage (méthode Sanger) du gène ARNr16S (sous-unité 16S de l'ARN ribosomal) par la société Fertil'Innov Environnement. Les séquences brutes ont été corrigées à l'aide du programme de visualisation de séquences 4Peaks de Mekentosj B.V. Les alignements multiples et la construction d'arbres phylogénétiques ont été réalisés à l'aide du logiciel SeaView version 5 (Gouy et al., 2021) en utilisant le modèle probabiliste avec la méthode Phylogénies à maximum de vraisemblance (PhyML). Les séquences du gène de l'ARNr 16S des souches types des différents genres utilisés dans cette étude ont été récupérés à partir de la base de données internationale GenBank/NCBI et utilisé pour les analyses cladistiques. Ces analyses phylogénétiques sont accompagnées d'un bootstrap utilisant 100 réplications. Les séquences brutes obtenues sont en cours d'enregistrement dans la base de données GenBank.

5. Conservation des isolats bactériens caractérisés

Après l'isolement et identification moléculaire, les souches ont été conservées au congélateur à -80°C au CAEC dans des cryotubes à raison de 2 réplicats par souche. Pour ce faire, chaque isolat bactérien caractérisé par PCR a été ensemencé sur milieu YEM liquide avant incubation à 30°C sur agitateur rotatif thermorégulé pendant 3 à 7 jours. Ensuite, 0,5 ml de suspension bactérienne mélangé à 0,5 ml de glycérol stérile à 60 % (v/v), soit 1 ml à une concentration finale à 30% de glycérol, a été transféré dans chaque cryotube. Les souches bactériennes pures ainsi conservées à -80°C pourront être ultérieurement recultivées et utilisées comme biofertilisants locaux en les inoculant au champ aux espèces de légumineuses d'origine dans une perspective de développement et dans le cadre de projets agroforestiers les intégrant comme plantes de services.
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 2 :** Nodosités fixatrices d'azote sur des racines de *Piscidia carthagenensis*</figcaption></figure>

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 3 :** Aspect d'une souche de rhizobium pure cultivée en boîte de Petri après 5 jours de croissance sur milieu YEMA additionné de Rouge Congo</figcaption></figure>

Résultats et discussion

1. Diversité des rhizobia associés aux espèces de légumineuses au sein des écosystèmes naturels et des agro-écosystèmes Martiniquais

Les résultats obtenus dans le cadre de cette sous-action 3-l-a (Action 3 du projet REBIOS) ont été acquis avec l'appui de Bryan Vincent, VSC recruté en novembre 2021 pour une période de 1 an, puis en 2022-2023 par Alexandra Blot et Marine Faye, élèves d'AgroParisTech en stages de césure de 6 mois chacune. A ce jour, plus de 450 souches bactériennes ont été isolées à partir de nodules récoltés sur 88 espèces de légumineuses hôtes herbacées (51 espèces) et arborées (30 espèces d'arbres et 7 d'arbustes) prospectées à travers une vingtaine de sites (5 agrosystèmes et 20 écosystèmes naturels) de Martinique (voir sites de prélèvements sur la carte représentée dans la Figure 1 ci-dessus et dans le Tableau 1 du rapport de Vincent et coll. en annexe). Parmi ces isolats, 230 souches ont été caractérisées par séquençage Sanger du gène ARNr16S (voir § Matériels et Méthodes). D'après les résultats d'identification par Blast basés sur le plus fort pourcentage d'homologie de séquences obtenu avec les souches bactériennes de référence enregistrées dans la base de données GenBank/NCBI, 183 des 230 séquences obtenues (soit 80% des souches) appartiennent à 6 des principaux genres connus de bactéries fixatrices d'azote nodulant les légumineuses (BNL), et par ordre décroissant d'abondances relatives : *Rhizobium* (40 %), *Bradyrhizobium* (39 %), *Burkholderia* / *Paraburkholderia* (14 %), *Ensifer* / *Sinorhizobium* (3,5 %), *Mesorhizobium* (2,5 %), *Cupriavidus* (1 %) (voir Fig. 4 ci-dessous).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 4 : Proportions du nombre de souches par genre bactérien fixateur d'azote associées à 69 espèces de Légumineuses échantillonnées en Martinique (nombre total de souches identifiées par PCR du gène ARNr 16S = 183).</figcaption></figure>

2. Effet du statut d'espèce autochtone vs introduite sur la diversité des bactéries symbiotiques :

Les proportions de ces différents genres de BNL entre espèces autochtones (84 souches isolées au total pour 43 espèces prospectées) et exotiques introduites (99 souches sur 45 espèces) sont considérées comme similaires. Ces distributions homogènes suggèrent que le caractère envahissant connu d'une proportion élevée d'espèces exotiques (EEE), parmi celles que nous avons prospectées en Martinique, n'est pas liée à leurs propriétés symbiotiques fixatrices d'azote et à leur association avec des taxons bactériens spécifiques qui favoriseraient la propagation et la régénération de ces espèces par la voie générative (semis).

En dehors de ces 6 genres de BNL connus, 46 autres isolats (représentant 20% des 230 souches caractérisées par séquençage Sanger) n'appartiennent pas à des genres ou espèces connus comme nodulant les légumineuses (e.g Agrobacterium, Bacillus, Enterobacter, Paenibacillus ou Pseudomonas parmi les genres les plus abondants). Ces dernières souches pourraient être : soit des souches contaminantes opportunistes présentes dans le cortex nodulaire ou dans les tissus internes des nodules ; soit des souches auxiliaires de nodulation co-existent avec les bactéries nodulant les légumineuses (BNL) à effet PGPR éventuel (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) ; soit des souches bactériennes nodulant les légumineuses de taxons microbiens non connus. Pour ces différentes raisons, nous avons conservé ces dernières souches dans notre collection stockée au congélateur à -80°C pour tester *in vitro* en conditions monoxéniques leur aptitude à re-noduler leurs espèces de légumineuses hôtes d'origine, dont les graines ont été conservées en chambre froide au CAEC (voir liste de la collection de graines récoltées *in situ* et conservées en chambre froide à +4°C dans le Tableau 3 en du rapport de Vincent et coll. en annexe).
<table><caption>Tableau 1 : Répartition par zone géographique des genres bactériens* des souches isolées chez 78 espèces de légumineuses, tous sites de collectes confondus au Nord, Centre ou Sud de la Martinique.</caption><thead><tr><th>Espèce hôte</th><th>Nord</th><th>Centre</th><th>Sud</th></tr></thead><tbody><tr><td>Abrus precatorius</td><td>R</td><td>Bu</td><td>R/Agrob</td></tr><tr><td>Acacia longifolia</td><td>423</td><td>R</td><td></td></tr><tr><td>Acacia mangium</td><td>B</td><td>Bu, R</td><td>R</td></tr><tr><td>Aeschynomene americana</td><td></td><td>Bu</td><td>R, 429</td></tr><tr><td>Albizia lebbeck</td><td>Enterobacter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alyticarpus vaginalis</td><td>B</td><td>R, B</td><td></td></tr><tr><td>Cajanus cajan</td><td>B</td><td>R</td><td>B, R</td></tr><tr><td>Calliandra purpurea</td><td></td><td></td><td>R</td></tr><tr><td>Calliandra surinamensis</td><td></td><td>PBu</td><td></td></tr><tr><td>Calopogonium mucunoides</td><td></td><td>R</td><td>B</td></tr><tr><td>Canavalia brasiliensis</td><td>R</td><td>R</td><td>B</td></tr><tr><td>Canavalia ensiformis</td><td>B</td><td>B(3)</td><td>Bu</td></tr><tr><td>Canavalia rosea</td><td></td><td></td><td>R/Agrob</td></tr><tr><td>Centrosema pascuorum</td><td></td><td>Enterobacter</td><td></td></tr><tr><td>Centrosema pubescens</td><td></td><td>B, R/Agrob</td><td>B, R</td></tr><tr><td>Chamaechrista glandulosa</td><td>396</td><td>397</td><td></td></tr><tr><td>Chloroleucon tortum (syn. Pithecellobium tortum)</td><td></td><td></td><td>399</td></tr><tr><td>Clitoria ternatea</td><td>B</td><td>R</td><td>R</td></tr><tr><td>Crotalaria juncea</td><td></td><td>B(2), R</td><td>R</td></tr><tr><td>Crotalaria purdiana</td><td></td><td></td><td>Lysobacter</td></tr><tr><td>Crotalaria retusa</td><td></td><td>B(2)</td><td>B 370</td></tr><tr><td>Crotalaria spectabilis</td><td>R</td><td>B</td><td>B</td></tr><tr><td>Crotalaria purdiana</td><td></td><td></td><td>R</td></tr><tr><td>Dalbergia ecastaphyllum</td><td></td><td></td><td>B</td></tr><tr><td>Desmanthus virgatus</td><td></td><td></td><td>S</td></tr><tr><td>Desmodium incanum</td><td></td><td>B(2), R, 431</td><td>R, R/Agrob, 432</td></tr><tr><td>Desmodium procumbens</td><td></td><td></td><td>Cronobacter</td></tr><tr><td>Desmodium scorpiurus</td><td>B</td><td>Pbu</td><td>B, 435</td></tr><tr><td>Desmodium tortuosum</td><td></td><td>R</td><td></td></tr><tr><td>Desmodium triflorum</td><td></td><td>B</td><td>R</td></tr><tr><td>Enterolobium cyclocarpum</td><td></td><td>R</td><td></td></tr><tr><td>Erythrina corallodendron</td><td></td><td>R</td><td></td></tr><tr><td>Flemingia strobilifera</td><td>B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gliricidia sepium</td><td>Bu</td><td>356</td><td>R</td></tr><tr><td>Grona heterocarpos (syn. Desmodium heterocarpon)</td><td>Pbu</td><td>B, Pbu</td><td>M</td></tr><tr><td>Desmodium heterophylla (syn. Desmodium heterophyllum)</td><td>R</td><td>R, Bu</td><td>B</td></tr><tr><td>Indigofera suffruticosa</td><td></td><td>R</td><td></td></tr><tr><td>Indigofera tinctoria</td><td>401 a,b</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Indigofera zollingeriana</td><td>439</td><td>R(2)</td><td></td></tr><tr><td>Inga ingoides</td><td>B</td><td>B, R</td><td></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Inga laurina</td><td>B</td><td>B</td><td></td></tr><tr><td>Lablab purpureus var. alba</td><td>R</td><td></td><td>B</td></tr><tr><td>Leptospron adenanthum (syn. Vigna adenantha)</td><td>B, 374</td><td>B(2)</td><td>B</td></tr><tr><td>Leucaena leucocephala</td><td>R, S</td><td>R, Pbu</td><td>S, E, R, R/Agrob</td></tr><tr><td>Lonchocarpus punctatus</td><td></td><td>B</td><td></td></tr><tr><td>Lonchocarpus roseus</td><td>386</td><td>R(2)</td><td>R</td></tr><tr><td>Macroptilium atropurpureum</td><td>B</td><td></td><td>B</td></tr><tr><td>Macroptilium lathyroides</td><td>R</td><td>B, R</td><td>B(2), R</td></tr><tr><td>Milletia pinnata (syn. Pongamia pinnata)</td><td></td><td>412</td><td></td></tr><tr><td>Mimosa arenosa</td><td></td><td></td><td>Bu</td></tr><tr><td>Mimosa pigra</td><td>Bu(2)</td><td>R (2)</td><td>R/Agrob</td></tr><tr><td>Mimosa pudica</td><td>Bu</td><td>Bu, R(2)</td><td>C</td></tr><tr><td>Mimosa casta</td><td></td><td>Bu, R</td><td>445</td></tr><tr><td>Mucuna urens</td><td>B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neptunia plena</td><td></td><td></td><td>Pbu, 409</td></tr><tr><td>Neustanthus phaseoloides (syn. Pueraria phaseoloides)</td><td>R</td><td>M</td><td>B</td></tr><tr><td>Ormosia monosperma</td><td></td><td>B</td><td></td></tr><tr><td>Piscidia carthagenensis</td><td>Pbu</td><td>R, B(2)</td><td>B(2)</td></tr><tr><td>Pithecellobium unguis-cati</td><td>Pbu</td><td>Bu</td><td>R</td></tr><tr><td>Pterocarpus officinalis</td><td>B</td><td>B(2)</td><td>B</td></tr><tr><td>Rynchosia minima</td><td>B(2)</td><td>369</td><td>B, R(2)</td></tr><tr><td>Senegalia muricata (syn. Parasenegalia muricata)</td><td></td><td>R</td><td>R, 426</td></tr><tr><td>Senna bicapsularis</td><td>R</td><td>R</td><td>B</td></tr><tr><td>Senna obtusifolia</td><td></td><td>R(2)</td><td></td></tr><tr><td>Sesbania sesban</td><td></td><td></td><td>R(2), E, S(2), 447</td></tr><tr><td>Stylosanthes guianensis</td><td></td><td>Bu(3)</td><td></td></tr><tr><td>Tephrosia senna</td><td></td><td>B</td><td>B(2)</td></tr><tr><td>Teramnus labialis</td><td>448</td><td>B</td><td>R/Ag(2), S, B, 450</td></tr><tr><td>Vachellia macracantha</td><td></td><td>R</td><td></td></tr><tr><td>Vachellia nilotica</td><td>R</td><td>R</td><td>M</td></tr><tr><td>Vachellia tortuosa</td><td></td><td></td><td>M</td></tr><tr><td>Vigna hosei</td><td>R</td><td>B(2), R</td><td>R(2)</td></tr><tr><td>Vigna luteola</td><td></td><td>R(2)</td><td>B</td></tr><tr><td>Vigna unguiculata (pois canne)</td><td></td><td>R</td><td>B</td></tr><tr><td>Vigna unguiculata subsp. sesquipedalis</td><td>R</td><td>382</td><td>B</td></tr><tr><td>Vigna vexillata</td><td></td><td>B</td><td>B, R/Agrob</td></tr><tr><td>Zornia microphylla</td><td>B</td><td></td><td></td></tr></table>

Nombre total de souches identifiées par séquençage : 36 84 71

* Abbréviations : R = Rhizobium ; B = Bradyrhizobium ; Bu = Burkholderia ; Pbu = Paraburkholderia

E : Ensifer ; S : Sinorhizobium.

(en rouge : 26 souches en cours de séquençage) (en bleu: souches non connues comme nodulantes ou fixatrices)
3. Analyse phylogénétique des souches bactériennes isolées :

L'arbre phylogénétique construit à partir des 61 premières souches séquencées isolées à partir
de nodosités prélevées sur le terrain (Figure 5) montre une grande diversité de souches
bactériennes nodulantes associées aux différentes espèces de légumineuses prospectées. Elles
appartiennent à 3 grands groupes bactériens apparentés aux Bradyrhizobiaceae, Rhizobiaceae et
Burkholderiaceae avec 6 genres bactériens répartis dans 4 familles : *Bradyrhizobium*
(Bradyrhizobiaceae), *Rhizobium* (Rhizobiaceae), *Sinorhizobium* (Rhizobiaceae), *Mesorhizobium*
(Phyllobacteriaceae), *Burkholderia* et *Paraburkholderia* (Burkholderiaceae). Les souches du genre
*Rhizobium* sont majoritaires avec environ 50 % du nombre total de souches représentées dans
l'arbre tandis que les *Bradyrhizobium* et les *Burkholderia lato sensu* sont en proportions moindres
avec 30 % et 20 % du nombre total de souches respectivement. Ce dendrogramme montre aussi
que la position taxonomique des souches isolées ne dépend pas de leur lieu d'origine
géographique, avec un assez bon équilibre des représentants de chaque phylum dans le Centre
ou le Sud de la Martinique (e.g. pour les 2 genres dominants : 46 % de souches de *Bradyrhizobium*
et 54 % de *Rhizobium* dans le Sud comme dans le Centre de l'île). Ces résultats montrent aussi
que les espèces de légumineuses dont on a isolé au moins 2 souches, soit 16 espèces sur 42 (26
espèces n'ayant qu'une seule souche isolée), sont en majorité ubiquistes avec des souches
appartenant à 2 genres bactériens très distincts. Seules quelques espèces de légumineuses,
comme *Lonchocarpus roseus* et *Stylosanthes guianensis*, sont exclusivement nodulées par des
bactéries du même genre. Cependant, le nombre de souches isolées par espèce et représentées
sur cet arbre phylogénétique est trop faible pour conclure sur le statut ubiquiste ou spécifique
des 42 espèces de légumineuses ici représentées.

Les séquences du gène ARNr16S de l'ensemble des souches caractérisées dans le cadre du projet
vont être prochainement déposées dans la banque de données internationale NCBI GenBank.
<figure><img src="image_23.png" /></figure>

**Figure 5 :** Arbre phylogénétique basé sur l'analyse de séquences du gène de l'ARNr 16S de 61 souches bactériennes nodulantes (BNL) nouvelles isolées chez 42 espèces de légumineuses* différentes et intégrant 13 souches de référence issues de la base de données GenBank/NCBI (en noir et caractères gras). La méthode Neighbor-Joining intégrant la distance Kimura 2 a été utilisée.

<footnote>* Les souches bactériennes dont le numéro indiqué dans l'arbre est précédé du nom de l'espèce de légumineuse hôte d'origine ont été indiquées en vert lorsqu'elles provenaient de nodules prospectés dans le Nord et le Centre de la Martinique tandis que celles indiquées en orange proviennent de la région Sud.</footnote>
# ACTION 1-4 : Diversité des champignons mycorhiziens à arbuscules en Martinique

**Rédaction** : Laure Hannibal, Antoine Galiana

**Contributeurs** : Amadou Bâ, Alexandra Blot, Marine Faye, Antoine Galiana, Laure Hannibal, Coralie Julan, Sonia Minatchi, Joshua Soudès, Olivier Birba, Bryan Vincent.

## Résumé :

Cette action est structurée en 2 parties. La première a pour objectif d'étudier la diversité des champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) en Martinique, en combinant des approches morphologiques, moléculaires (métabarcoding, PLFA) et expérimentales (piégeage par plantes hôtes). 18 sites aux usages variés (forêts, cultures, friches) et ayant des sols aux propriétés contrastées (pH, matière organique, rapport C/N) ont été échantillonnés. Les spores de CMA, extraites par tamisage, montrent une distribution spatiale hétérogène (1 373 à 7 359 spores/100 g de sol) et morphologique (68 % < 90 µm). Le métabarcoding (marqueur ARN 18S) a permis d'identifier 250 OTU appartenant à 14 genres, avec une dominance de Rhizophagus (55 %), sauf sur certains sites comme le Diamant (genre : Acaulospora). Les indices de Shannon révèlent deux groupes : les milieux naturels (ex. Ste-Marie, Fond Lahaye) affichent une diversité élevée (> 2,8), tandis que les zones cultivées (bananeraies, canne à sucre) sont plus pauvres, à l'exception des parcelles en agriculture biologique (ex. Sainte-Anne SEA). L'analyse des PLFA confirme que les sols naturels, riches en biomasse microbienne (> 1 200 nmol PLFA/g), abritent plus de CMA que les sols anthropisés. Le piégeage actif via des plantes-pièges (tomate, basilic, etc.) a permis d'isoler des espèces peu sporulantes, soulignant l'importance des méthodes complémentaires pour capturer la diversité réelle.

Dans un second volet, l'étude des agroécosystèmes bananiers (dispositif BANABIO) compare trois systèmes : conventionnel, bio-intensif et bio-diversifié/agroforestier. Les résultats montrent que les communautés fongiques varient fortement selon le mode de culture (conventionnel vs agroécologiques), avec peu d'OTU partagés entre systèmes (seulement 4 OTU communs aux trois). Le système agroforestier (avec légumineuses) favorise une diversité accrue de CMA chez le bananier. Cependant, les légumineuses (Inga, Indigofera) abritent des communautés distinctes entre elles et distinctes du bananier. Cela suggère des interactions spécifiques entre plantes hôtes et CMA. Ces travaux soulignent le rôle des pratiques culturales et de la biodiversité végétale dans le maintien des CMA, essentiels pour la résilience des sols. Ils ouvrent des pistes pour optimiser les agrosystèmes insulaires via des approches agroécologiques.
## Documents produits dans le cadre de cette action :

### 1. Communications orales dans conférence internationale :

Julan Coralie, Vincent Bryan, Coulis Mathieu, Hannibal Laure, Bâ Amadou, Galiana Antoine. 2022. Diversity and sharing of mycorrhizal communities within banana plantations subjected to different agronomic practices in Martinique. In: 19th International Conference of the AABNF (African Association for Biological Nitrogen Fixation), Held at UCAD, Dakar, Senegal, November 29-September 1st 2022. Oral communication. Book of abstracts, p.35.
https://agritrop.cirad.fr/606229/

### 2. Rapports de stage :

Prissaint Lavigna. 2020. Caractérisation des microorganismes symbiotiques associées aux légumineuses utilisées comme plantes de service dans les systèmes agricoles en Martinique. Rapport de stage de 2ème année de BTS Bio-Analyses et Contrôle du Lycée de Bellevue (Fort-de-France, Martinique). 33 p.
# Partie 1 : Exploration de la diversité des champignons mycorhiziens arbusculaires de Martinique

## Contexte

La Martinique, se caractérise par une mosaïque de paysages façonnés par des gradients bioclimatiques, des sols aux propriétés pédologiques variées et des usages anthropiques contrastés. Ces spécificités en font un terrain d'étude privilégié pour explorer la diversité des champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA). Les CMA, appartenant au phylum *Glomeromycota*, jouent un rôle central dans la nutrition minérale des plantes, l'amélioration de la résilience des sols et la structuration des communautés végétales. Pourtant, leur répartition, leur abondance et leur dynamique restent mal comprises, notamment dans les contextes insulaires où les pressions environnementales et humaines sont fortes.

Cette action dans l'axe 1 du projet REBIOS a pour objectif d'inventorier la diversité des CMA à l'échelle de l'île, en intégrant des sites naturels (forêts humides, sèches ou littorales) et anthropisés (cultures, friches, vergers). Dix-huit sites ont été sélectionnés pour refléter cette hétérogénéité, couvrant des altitudes allant du niveau de la mer à plus de 400 mètres, et des usages du sol allant de la forêt primaire dégradée aux bananeraies. L'originalité de cette action réside dans son approche méthodologique couplant des méthodes variées pour obtenir une vision complète de la diversité des CMA. Cette étude combine des méthodes basées sur i) la morphologie des propagules, ii) leur piégeage actif par des plantes pièges et iii) des approches moléculaires complémentaires utilisant les PLFA et le métabarcoding des communautés de CMA à l'aide du marqueur 18S.
# Méthodologie et résultats

## 1. Les sites de prélèvements

La composition des communautés de CMA peut être liée aux espèces hôtes, à la saison et au stade de vie de la plante hôte (Eom et al., 2000), mais aussi à l'usage des sols.

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 1 : localisation des sites d'échantillonnage du sol.**</figcaption></figure>

Il faut souligner que cette étude a été réalisée sur une seule date d'échantillonnage, en Mars 2022 alors que la structure des communautés de champignons MA peut changer au cours d'une saison et d'une année à l'autre. Des résultats différents auraient pu être obtenus à une autre date. Afin de refléter aux mieux les différents types de sols, 18 sites ont été échantillonnés (Fig. 1, Tableau 1). Ces sites correspondent à différentes zones bioclimatiques de Martinique, autant en milieu naturel (forêts humides, mésophiles et sèches) qu'anthropisé (cultures, friches) et donc à différents usages du sol (Tableau 2).
<table><caption>Tableau 1 : coordonnées GPS des sites étudiés.</caption><thead><tr><td>Lieu de prélèvement</td><td>Latitude</td><td>Longitude</td><td>Altitude (m)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Basse-Pointe</td><td>14.83168957</td><td>-61.11343084</td><td>220</td></tr><tr><td>Lorrain</td><td>14.83085934</td><td>-61.05188269</td><td>27</td></tr><tr><td>St Marie</td><td>14.77754499</td><td>-61.04203102</td><td>361</td></tr><tr><td>Trinité</td><td>14.75091241</td><td>-60.9905808</td><td>250</td></tr><tr><td>Vauclin BB</td><td>14.54492446</td><td>-60.84613471</td><td>6</td></tr><tr><td>Vauclin canne</td><td>14.54547666</td><td>-60.84421693</td><td>6</td></tr><tr><td>Vauclin FS</td><td>14.53888253</td><td>-60.84769811</td><td>95</td></tr><tr><td>Prêcheur</td><td>14.82804185</td><td>-61.22635067</td><td>2</td></tr><tr><td>Morne Rouge</td><td>14.78365481</td><td>-61.15092175</td><td>438</td></tr><tr><td>Fond Lahaye</td><td>14.62755469</td><td>-61.109575</td><td>15</td></tr><tr><td>St Joseph</td><td>14.6972772</td><td>-61.06603931</td><td>275</td></tr><tr><td>Ducos</td><td>14.59460702</td><td>-60.94612839</td><td>45</td></tr><tr><td>St Luce</td><td>14.5010234</td><td>-60.93373164</td><td>249</td></tr><tr><td>Trois îlets</td><td>14.53600779</td><td>-61.02565932</td><td>5</td></tr><tr><td>Diamant</td><td>14.47560914</td><td>-61.01172935</td><td>13</td></tr><tr><td>Anse d'Arlet</td><td>14.508497</td><td>-61.089961</td><td>32</td></tr><tr><td>Sainte-Anne SEA</td><td>14.43888375</td><td>-60.871912</td><td>21</td></tr><tr><td>Sainte-Anne</td><td>14.39539483</td><td>-60.86866242</td><td>2</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 2 : usages des sols sur chacun des sites échantillonnés.</caption><thead><tr><td>Lieu de prélèvement</td><td>Usage du sol</td></tr></thead><tbody><tr><td>Basse-Pointe</td><td>Forêt dégradée mahot grande feuille</td></tr><tr><td>Lorrain</td><td>Abords verger d'agrumes</td></tr><tr><td>St Marie</td><td>Forêt humide</td></tr><tr><td>Trinité</td><td>Jardin créole (Sous manguier, culture choux et curcuma)</td></tr><tr><td>Vauclin BB</td><td>Abords bananeraie</td></tr><tr><td>Vauclin CC</td><td>Champ de canne à sucre</td></tr><tr><td>Vauclin FS</td><td>Forêt sèche (campêche, bois d'inde et acacia)</td></tr><tr><td>Prêcheur</td><td>Bord de mer (sous cocotier, amandier, poirier)</td></tr><tr><td>Morne Rouge</td><td>Lisière forêt primaire dégradée (entre forêt et champ de patate douce)</td></tr><tr><td>Fond Lahaye</td><td>Forêt de bas fond à Lonchocarpus (humide)</td></tr><tr><td>St-Joseph</td><td>Forêt de bas fond (berge de rivière)</td></tr><tr><td>Ducos</td><td>Parcelle en friche</td></tr><tr><td>St Luce</td><td>Forêt à mahogany</td></tr><tr><td>Trois îlets</td><td>Abords mangrove (forêt à palétuviers)</td></tr><tr><td>Diamant</td><td>Forêt littorale (poiriers, gommier rouge)</td></tr><tr><td>Anse d'Arlet</td><td>Forêt littorale</td></tr><tr><td>Sainte-Anne (SEA)*</td><td>Parcelle en friche</td></tr><tr><td>Sainte-Anne</td><td>Forêt littorale (à mancenillier, patate bord de mer)</td></tr></tbody></table>

Les différents sols ont une matière organique (MO) comprise entre 2,7% et 10%; La majorité des sites montre une valeur de C/N de 10 en moyenne. Quatre sites présentent un C/N supérieur à 12 (pauvre en azote et qui se décompose mal) et deux sites présentent un rapport en dessous de 9.
<table><caption>Tableau 3 : Propriétés physico chimiques des sols prélevés.</caption><thead><tr><td>Lieu de prélèvement</td><td>pH</td><td>% humidité</td><td>MO %</td><td>C/N</td></tr></thead><tbody><tr><td>Basse-Pointe</td><td>6,1</td><td>34,67</td><td>7,63</td><td>11,8</td></tr><tr><td>Lorrain</td><td>6,04</td><td>31,17</td><td>4,24</td><td>10,4</td></tr><tr><td>Ste Marie</td><td>6,5</td><td>54,97</td><td>10,7</td><td>11,1</td></tr><tr><td>Trinité</td><td>6,8</td><td>31,13</td><td>6,98</td><td>10,2</td></tr><tr><td>Vauclin BB</td><td>6,45</td><td>32,08</td><td>2,07</td><td>9,6</td></tr><tr><td>Vauclin CC</td><td>6,53</td><td>31,43</td><td>3,26</td><td>11,9</td></tr><tr><td>Vauclin FS</td><td>6,35</td><td>27,62</td><td>7,65</td><td>14,1</td></tr><tr><td>Prêcheur</td><td>6,35</td><td>13,82</td><td>3,08</td><td>13,4</td></tr><tr><td>Morne Rouge</td><td>5,53</td><td>31,13</td><td>4,6</td><td>12,2</td></tr><tr><td>Fond Lahaye</td><td>6,15</td><td>17,65</td><td>3,94</td><td>11,6</td></tr><tr><td>St Joseph</td><td>5,18</td><td>44,08</td><td>nd</td><td>nd</td></tr><tr><td>Ducos</td><td>6,06</td><td>29,41</td><td>5,15</td><td>10,4</td></tr><tr><td>Ste Luce</td><td>5,47</td><td>34,87</td><td>10,94</td><td>8,6</td></tr><tr><td>Trois îlets</td><td>5,24</td><td>21,57</td><td>4,53</td><td>13,9</td></tr><tr><td>Diamant</td><td>6,97</td><td>14,67</td><td>5,7</td><td>16,1</td></tr><tr><td>Anse d'Arlet</td><td>5,83</td><td>15,69</td><td>10,19</td><td>5,3</td></tr><tr><td>Sainte-Anne (SEA)</td><td>6,82</td><td>9,27</td><td>2,72</td><td>10,3</td></tr><tr><td>Sainte-Anne</td><td>6,64</td><td>15,03</td><td>3,84</td><td>11,7</td></tr></tbody></table>

2. Potentiel mycorhizogène des sols : Extraction et dénombrement des spores de champignons à partir des sols

Les spores ont été extraites par tamisage humide (Gerdemann et Nicolson, 1963). 100 grammes de sol sont placés dans 1 litre d'eau, mélangés puis passés au travers d'un jeu de tamis décroissant de 200 µm, 90 µm et 50 µm. Cette opération est répétée cinq fois par sol. Après rinçage à l'eau du robinet, les spores retenues par les tamis sont récupérées, regroupées pour un volume d'environ 20 mL dans un tube de centrifugation de 50 mL. Il y a ajout de 10 mL de solution de sucrose à 60 %, puis les tubes sont centrifugés à 6000 rpm pendant 10 min à 4°C. A l'interface de la phase sucrée et de la phase aqueuse, les spores sont méticuleusement récupérées à l'aide d'une pipette puis rincés à l'eau du robinet. Les spores sont récupérées et mises en suspension dans un volume exact de 20 mL d'eau distillée. Après une brève agitation par bullage, 2 mL de la solution de spores sont placés dans une cellule quadrillée. Le quadrillage de la cellule représente un volume exact de 1mL. Le calcul de la densité est fait connaissant le volume total contenant les spores et le poids sec du sol.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 2 : Nombre de spores/g de sol piégés à partir des sols collectés sur chaque site.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 3 : Nombre de phénotypes de spores dans les sols collectés sur chaque site.</figcaption></figure>

Les Figures 2 et 3 montrent que sur certains sites, on peut retrouver peu de spores avec un nombre élevé de phénotypes ou au contraire, beaucoup de spores avec peu de phénotypes représentés. Cela s'explique par le fait que certaines espèces de CMA sporulent peu et d'autres beaucoup plus.
Toutefois les spores ne sont pas les seules propagules capables de coloniser le système racinaire. Certaines espèces de CMA réalisent l'enttièreté de leur cycle sans passer par la phase de sporulation, tandis que d'autres n'en produisent qu'en très petite quantité (Utobo et al. 2011). Il est difficile de déterminer la viabilité des spores comptées, certaines peuvent être mortes ou en dormance. L'isolement par tamisage ne fonctionne pas correctement pour toutes les spores, citons par exemple, Glomus intraradices (Rhizophagus irregularis) produisant des spores intraracinaires.

Les CMA peuvent être présents sous forme d'hyphes et de spores dans le sol et forment des structures d'échanges nutritionnelles (les arbuscules) et de stockage (les vésicules) au sein des racines. C'est pourquoi, les populations de spores ne reflètent pas fidèlement la communauté des CMA qui colonise réellement les racines des plantes. De plus les spores viables et identifiables sont éphémères et l'examen direct des spores dans le sol à un instant donné peut ne pas révéler toutes les espèces fongiques présentes dans ce sol. D'ailleurs, certaines spores peuvent être tellement altérées par les conditions du sol que les différences d'espèces ne peuvent être détectées. Pour pallier à ces limitations méthodologiques à l'analyse de la composition et diversité taxonomique des communautés, deux méthodes complémentaires, moléculaires, ont été déployées : l'analyse des PLFA et le séquençage de l'ADNr 18S, chacun étant des marqueurs taxonomiques des espèces ou groupes fongiques et microbiens.

3. Communautés microbiennes

**3-1 Analyses des phospholipides d'acides gras**

Les phospholipides d'acides gras (PLFA) sont le composant structurel essentiel de toutes les membranes cellulaires microbiennes (lors de la mort microbienne, les phospholipides se dégradent rapidement). Des biomarqueurs de PLFA, ou acides gras caractéristiques, permettent d'identifier la présence ou l'absence de divers groupes fonctionnels d'intérêt, tels que différents groupes bactériens, actinomycètes, champignons mycorhiziens arbusculaires, rhizobia, protozoaires, etc. (Bligh et Dyer 1959 ; Buyer et Sasser 2012). Ces communautés sont influencées par le type de sol, la matière organique, l'intensité et le type de travail du sol, ou encore la rotation des cultures. L'analyse des acides gras mesure deux attributs des communautés microbiennes : la biomasse microbienne viable et la structure de la communauté microbienne. Après extraction, les PLFA sont fractionnés en lipides neutres, glycolipides et lipides polaires sur une plaque SPE (Phenomenex, Torrance, CA, USA) par élution successive avec du chloroforme, de l'acétone et du méthanol. La fraction chloroforme (contenant les lipides neutres) et la fraction méthanol (contenant les phospholipides) sont soumis à une méthanolyle alcaline douce pour transformer les PLFA et les NLFA en esters méthyliques d'acides gras libres. Ceux-ci ont été analysés sur un chromatographe en phase gazeuse avec un détecteur à ionisation de flamme et une colonne capillaire Ultra 2 GC de 25m.
## 3-2 Bioindicateurs des CMA et autres communautés

Les PLFA 18: 2ω6.9 et 18:1ω9 sont utilisés comme indicateur des champignons saprophytes ; Pour les CMA ce sont les PLFA et NLFA 16:1w5. La somme des PLFA 16:0, 10Me, 17:0, 10Me and 18:0, 10Me indique les actinomycètes. Les bactéries à Gram positif ont comme indicateurs les PLFA a15:0, i15:0 ; i16:0 ; a17:0 ; i17:0 ; et la somme des PLFA cy 17:0 et cy 19:0 sert d'indicateur pour les bactéries à Gram négatif. Enfin les PLFA 16:0, 18:0 et 20:00 sont inclus pour avoir les PLFA totaux.

Les densités des bactéries et des champignons sont des paramètres importants pour décrire la qualité microbiologique d'un sol. En effet, plus ces densités sont importantes, plus le sol est considéré comme fertile. Ces bio-indicateurs sont de plus sensibles aux variations de mode d'usage des sols (Constancias et al., 2014).

Les analyses PLFA quantifient la biomasse microbienne vivante. Ceci est valable pour les CMA que ce soit la biomasse active mais aussi les propagules viables (% NLFA), contrairement au dénombrement des spores qui peut inclure des spores mortes incapables de germer.

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 4 : Biomasse microbienne vivante exprimée par la quantité totale de PLFA extraite des sols de chaque site</figcaption></figure>
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 5 : Biomasse microbienne vivante des communautés mycorhiziennes exprimées par la concentration du marqueur 16 :1w5 (PLFA et NLFA) extrait des sols de chaque site</figcaption></figure>

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 6 : Proportion relative des bactéries et des champignons dans les communautés, exprimée par le rapport entre les PLFA indicateurs de champignons et les PLFA indicateurs de bactéries (ratio F/B) extrait des sols de chaque site.</figcaption></figure>

Les sols considérés comme riches avec un total de PLFA > 1200 nmol de PLFA /g PS (Ste Marie, St Joseph, Ste Luce, Anses-d'Arlet) sont aussi les plus riches en CMA (Fig. 4 et 5). Ces sols proviennent tous des milieux naturels non impactés par l'activité humaine. Concernant le rapport Fungi/Bacteria (F/B), seuls 3 sols (Anse-d'Arlet, Diamant et Ste-Luce) présentent un rapport moyen > 0,2, les autres étant assez pauvres en champignons saprophytes (Figure 6).
4. Piégeage des CMA et multiplication

Afin d'identifier d'autres espèces CMA présentes sur le terrain, nous avons «piégé» les champignons dans des pots à partir de plantes, favorisant ainsi la croissance et induisant la sporulation chez les éventuelles espèces encore invisibles. Un piégeage direct à partir des sols a donc été réalisé en utilisant un mélange de différentes plantes mycotrophes (crotalaire, basilic, gombo, pois d'Angole, sorgho et maïs). L'utilisation d'un tel consortium de plantes pièges semble être supérieure à l'utilisation d'une seule plante piège pour piéger autant d'espèces de CMA que possible. Après 4 mois de culture, les racines mycorhizées ont été récoltées, mise à séchées, broyées puis conservées sous forme de poudre (complexes mycorhiziens). Ces complexes ont ensuite été multipliés sur un substrat neutre (mélange de sable de rivière et de vermiculite) pendant encore 3 mois dans des jardinières (Fig. 7). Une jardinière a été mise en place pour le sol de chaque site.

Suite au piégeage, deux litres de substrat ont alors été incorporés à chaque jardinière puis des tomates ont été plantées. Pour chaque site, les racines ont été analysées après 3 mois de croissance : vérification du taux de mycorhization, extraction des spores, abondance relative des différents morphotypes/site. Des mesures de hauteur des plants ont également été effectuées chaque semaine durant ces 3 mois.
### Etape 1 : piégeage sur plantes mycotrophes

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

**Substrat:** sable de rivière/vermiculite (3V/1V) + 30 g de sol

**Inoculum:** complexes mycorhiziens ou plants mycorhizés

### Etape 2 : piégeage des spores sur la tomate

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

**Figure 7 :** Photo montrant le dispositif expérimental installé dans une serre du CAEC visant à piéger et multiplier les CMA originaires de Martinique. L'étape 1 est effectuée avec un mélange de plusieurs espèces et l'étape 2 avec uniquement la tomate, plante sur laquelle les souche mycorhiziennes doivent ensuite être testées/

Gardons à l'esprit qu'utiliser la morphologie des spores pour mesurer la richesse des espèces de CMA reste un aspect controversé, mais permet d'avoir une première vue relative de la diversité à un coût réduit. Une espèce de CMA pourrait être présente à basse fréquence mais produire de nombreuses spores. Une autre pourrait être très abondante mais ne produire guère de spores. Dans notre expérience, les spores de CMA sont extraites par tamisages successifs du sol, puis classées dans différents types
morphologiques (aussi appelé morphotypes). Celles-ci peuvent ensuite être comptées afin d'obtenir leur abondance, puis utilisées pour reconstituer la structure communautaire ou peuvent simplement être enregistrées comme présentes / absentes afin d'obtenir une mesure de la richesse des espèces de CMA. Dans un premier temps, les morphotypes de spores sont triés par taille.

Après piégeage sur tomate, les résultats montrent que les différents sites contiennent des spores de tailles variables, moins nombreuses que dans les sols d'origine (Tableau 4). Cet enrichissement avait pour but de favoriser les espèces à sporulation lente et de grosse taille. La taille est un indice de classification des spores. Il a été montré que les Glomérales sont de petite taille (Smith et Read, 1997), tandis que les grandes tailles sont généralement caractéristiques des Gigasporales (260 à 440 µm pour Gigaspora margarita).

Dans les spores extraites, 68 % sont majoritairement de petite taille (> 90 µm). Glomus et Acaulospora produisent plus de spores en moins de temps que Gigaspora dans le même environnement. En effet, les grandes spores de Gigasporales nécessitent une période de développement plus longue que les petites spores.

Selon le site, les spores se répartissent comme suit :

<table><caption>Tableau 4 : Répartition de la taille des spores sur les sols abondance totale des spore sur les sols chaque sites.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">Taille et nombre de spores/100g PS</th><th rowspan="2">Total spores/site/100g PS</th></tr><tr><th>>50µm</th><th>>90µm</th><th>>200µm</th></tr></thead><tbody><tr><td>Basse-Pointe</td><td>5540</td><td>1773</td><td>46</td><td>7359</td></tr><tr><td>Lorrain</td><td>1629</td><td>1183</td><td>36</td><td>2848</td></tr><tr><td>Ste Marie</td><td>2080</td><td>1863</td><td>163</td><td>4106</td></tr><tr><td>Trinité</td><td>2566</td><td>1626</td><td>40</td><td>4232</td></tr><tr><td>Vauclin BB</td><td>1173</td><td>190</td><td>10</td><td>1373</td></tr><tr><td>Vauclin Cc</td><td>2100</td><td>406</td><td>93</td><td>2599</td></tr><tr><td>Vauclin FS</td><td>2220</td><td>1940</td><td>73</td><td>4233</td></tr><tr><td>Prêcheur</td><td>1323</td><td>749</td><td>17</td><td>2089</td></tr><tr><td>Morne Rouge</td><td>1973</td><td>560</td><td>26</td><td>2559</td></tr><tr><td>Fond Lahaye</td><td>3173</td><td>1366</td><td>146</td><td>4685</td></tr><tr><td>St Joseph</td><td>3400</td><td>1553</td><td>26</td><td>4979</td></tr><tr><td>Ducos</td><td>1500</td><td>680</td><td>13</td><td>2193</td></tr><tr><td>Ste Luce</td><td>3400</td><td>813</td><td>20</td><td>4233</td></tr><tr><td>Trois îlets</td><td>1446</td><td>1000</td><td>140</td><td>2586</td></tr><tr><td>Diamant</td><td>1413</td><td>526</td><td>120</td><td>2059</td></tr><tr><td>Anse d'Arlet</td><td>2100</td><td>406</td><td>93</td><td>2599</td></tr><tr><td>Sainte-Anne (SEA)*</td><td>1286</td><td>660</td><td>66</td><td>2012</td></tr><tr><td>Sainte-Anne</td><td>1233</td><td>573</td><td>66</td><td>1872</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 8 : Abondance relative des spores sur l'ensemble des sites</figcaption></figure>

La dispersion des types de spores dans les sites d'étude n'est pas homogène. De façon générale, les espèces de CMA ont des cycles de vie très différents et l'abondance relative de chacune d'elles à chaque étape du cycle (spores, hyphes, racines colonisées) peut changer selon le moment où a lieu l'échantillonnage (Brundett et al., 2002).

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 9 : Histogramme empilé montrant la répartition des types de spores (taille) dans les sols de chaque site.</figcaption></figure>

Il est connu que la sporulation d'espèces de CMA à grosses spores augmente significativement avec l'augmentation de la diversité végétale, alors que la sporulation des espèces à petites spores varie selon la diversité des hôtes.
## 5. Diversité des communautés mycorhiziennes : analyses moléculaires

Rappelons-nous que le morphotypage des spores ne reflète pas forcément la présence de toutes les espèces potentiellement engagées dans la symbiose mycorhizienne avec les plantes. C'est pourquoi, une analyse moléculaire plus fine vient compléter ces premiers résultats de morphotypage. Une analyse de metabarcoding par amplification et séquençage ARN18S a donc été réalisée sur les racines de tomates mycorhizées issues des jardinières respectives de chaque site. Cette technique basée sur l'analyse de l'ADN fongique, permet d'identifier les genres et parfois les espèces de champignons mycorhiziens présents dans un échantillon de sol, de racines ou de spores. L'ADN total contenu dans l'échantillon est extrait puis multiplier par une amplification ciblée de l'ADN en utilisant une PCR avec des amorces spécifiques aux type biologique recherché. La partie de l'ADN ciblée dans notre cas est celle de l'ARN ribosomique (ARNr). Ce gène, essentiel à la vie, est très conservée chez les espèces, mais reste assez variable pour au moins distinguer des genres, voire des espèces entre elles. Après amplification, les nombreux fragments d'ADNr produits sont séquencés de façon à connaître la nature et l'enchainement des bases constitutives de l'ADN. On obtient alors ce fameux « code-barre génétique ». Pour identifier les organismes derrière ces codes-barres, deux méthodes : 1) comparer nos séquences à celles des bases de données regroupant l'ensemble des séquences connues et enregistrées pour les champignons mycorhiziens (plus connue sous le nom de méthode BLAST), ou en réalisant des phylogénies en plaçant nos séquences avec des séquences de références sur un même arbre phylogénique. Que ce soit par BLAST ou en utilisant des arbres phylogénétiques, l'identification de séquences inconnues se fait en fonction des degrés d'homologie et des ressemblance obtenues avec d'autres séquences de références, permettant ainsi d'attribuer un nom de genre et parfois d'espèce à nos séquences.

Cependant, un problème majeur de l'identification moléculaire chez les champignons est la variabilité génétique chez les individus, liée à l'existence de centaines de noyaux hétérogènes dans une spore. Il existe un polymorphisme génétique incroyablement élevé de sorte qu'un individu puisse contenir plusieurs copies différentes d'un même gène (Sanders et al., 1996 ; 2010). Dans ces conditions, deux individus appartenant à des espèces apparentées peuvent être confondues. Enfin, il n'existe pas encore d'amorces pour l'identification de toutes les lignées (Redecker et al., 2003).

La caractérisation moléculaire des champignons mycorhiziens par séquençage partiel du gène rRNA18S a été réalisée par la méthode de Métabarcoding en sous-traitance avec la société ADNid (Montpellier). Les champignons mychoriziens à arbuscules appartiennent au phylum *Gloméromycota*, classe des gloméromycètes. Après séquençage et normalisation des données, nous avons obtenus un total de 250 unités taxonomiques opérationnelles (OTU). Ces 250 OTUs se répartissent dans 14 genres de *Glomeromycota* et se distribuent sur l'ensemble des sites de la Martinique. Environ 20 % des séquences sont inconnues ou multi-affiliées (Figure 11).
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 10 : Courbes de raréfaction montrant la relation entre le nombre total de séquence (Sample Size) et la diversité des séquences (Species Richness). Chaque courbe représente le sol d'un site.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 11 : Composition des communautés de CMA (niveau taxonomique : genre) dans les sols de chaque site.</figcaption></figure>
Une première analyse de cette diversité, en comparant le piégeage sur tomate et sur les autres plantes-piège utilisées, montre que la variance est due pour 5 % à ce facteur plante avec une p-value de 0,0083. Il s'avère que la tomate a piégé beaucoup plus de diversité mycorhizienne que les autres plantes. Toutes les données (autres plantes + tomate) ont été regroupées pour les autres analyses de variance de la diversité. Un problème d'irrigation lors de la multiplication du complexe mycorhizien de St Joseph nous a malheureusement contraint à abandonné cet échantillon ; les racines de tomates infectées par des galles n'ont pas permis d'obtenir des résultats cohérents. Le genre *Rhizophagus* est majoritaire (+ de 55%) dans presque tous les sites, excepté Le Diamant où le genre *Acaulospora* domine. Les communautés issues des sols de St-Luce et Trinité ont à peu près 50 % de chaque genre.

Le système de classification des *Glomeromycota*, basé sur des analyses morphologiques et moléculaires concomitantes ne cesse d'évoluer. Dans la dernière publication (Oehl 2011), sont acceptés, 5 ordres, 14 familles et 29 genres représentés dans le tableau ci-dessous :

<table><caption>Tableau 5 : Classification Glomeromycota selon Oehl (2011)</caption><thead><tr><th>ORDRES</th><th>FAMILLES</th><th>GENRES</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Archaeosporales</td><td>Archaeosporaceae</td><td>Archaeospora, Intraspora</td></tr><tr><td>Geosiphonaceae</td><td>Geosiphon</td></tr><tr><td>Ambisporaceae</td><td>Ambispora (= Appendicispora)</td></tr><tr><td rowspan="4">Diversisporales</td><td>Acaulosporaceae</td><td>Acaulospora, Kuklospora</td></tr><tr><td>Diversisporacea</td><td>Diversispora, Tricispora, Otospora, Redeckera</td></tr><tr><td>Sacculosporaceae</td><td>Sacculospora</td></tr><tr><td>Pacisporaceae</td><td>Pacispora</td></tr><tr><td rowspan="4">Gigasporales</td><td>Gigasporaceae</td><td>Gigaspora</td></tr><tr><td>Dentiscutataceae</td><td>Dentiscuta, Quatunica, Fuscutata</td></tr><tr><td>Racocetraceae</td><td>Racocetra, Cetraspora</td></tr><tr><td>Scutellosporaceae</td><td>Scutellospora, Orbispora</td></tr><tr><td rowspan="2">Glomerales</td><td>Glomeraceae</td><td>Glomus, Septoglomus, Funelliformis, Simiglomus</td></tr><tr><td>Entrophosporaceae<br>(= Claroideoglomeraceae)</td><td>Claroideoglomus, Viscospora, Entrophospora, Albahypha</td></tr><tr><td>Paraglomerales</td><td>Paraglomeraceae</td><td>Paraglomus</td></tr></tbody></table>

Archaesporales et Paraglomerales sont des lignées basales. Les Glomerales (*Rhizophagus*, *Funneliformis*, *Glomus*, *Sclerocystis*) colonisent rapidement le système racinaire (moins le sol) et pourraient réduire l'infection des racines par les agents pathogènes ;

Parmi les *Diversisporales*, *Acaulospora* est un mauvais colonisateur du sol et des racines par rapport aux espèces de *Redeckera* et *Diversispora*. Parmi les *Gigasporales*, (*Gigaspora*, *Racocetra*), les *Gigasporaceae* allouent plus de biomasse en dehors des racines (colonisent largement le sol) et semblent plus bénéfiques pour l'acquisition du phosphore de la plante, l'absorption des nutriments et de l'eau. Ces éléments induisent que du fait
d'analyser les racines il y a peut-être une sous-estimation des Gigaspora et une sur-estimation des Glomerales.

Pour chaque site, l'indice de diversité de Shannon (Tableau 6) permet de déterminer le niveau de structure de la communauté de CMA (compte les espèces proportionnellement à leur abondance). Plus l'indice est élevé plus la diversité est forte.

<table><caption>Tableau 6 : Indice de diversité de Shannon calculé à partir des genres de CMA identifiés dans les sols de chaque site.</caption><thead><tr><td>Site</td><td>Indice de richesse de Shannon</td><td>Site</td><td>Indice de richesse de Shannon</td></tr></thead><tbody><tr><td>Ste -Marie</td><td>2,98</td><td>Anse d'Arlet</td><td>1,98</td></tr><tr><td>Fond -Lahaye</td><td>2,96</td><td>Morne-Rouge</td><td>1,84</td></tr><tr><td>Sainte-Anne (SEA)</td><td>2,87</td><td>Vauclin CC</td><td>1,77</td></tr><tr><td>Ste -Luce</td><td>2,86</td><td>Vauclin BB</td><td>1,62</td></tr><tr><td>Prêcheur</td><td>2,83</td><td>Ducos</td><td>1,62</td></tr><tr><td>Trois-îlets</td><td>2,81</td><td>Vauclin FS</td><td>1,53</td></tr><tr><td>Diamant</td><td>2,73</td><td>Lorrain</td><td>1,15</td></tr><tr><td>Trinité</td><td>2,59</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sainte - Anne</td><td>2,35</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basse -pointe</td><td>2,27</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

L'indice de Shannon est généralement compris entre 1 et 4,5. Ainsi, 2 groupes se dessinent ; Les sites présentant un indice > 2,25 (moyenne) avec une richesse relativement moyenne à bonne et les sites avec un indice de richesse < 2 et que l'on peut qualifier de pauvre en diversité mycorhizienne. Plusieurs paramètres tels que la caractéristique du sol, la richesse microbiologique, l'humidité, l'usage du sol ou encore l'altitude ont été utilisés dans des analyses statistiques ; aucun paramètre n'a pu expliquer les variations dans la composition des communautés de CMA.

Les facteurs contribuant à la diversité des CMA sont très complexes ; par exemple le site de Sainte-Anne SEA est un site géré biologiquement ; cela a contribué à un grand nombre d'espèces de CMA et de diversité, autant que celle trouvée dans les sites naturels. De même le site de Trinité est occupé par un jardin créole où la diversité d'espèce végétale contribue à la diversité de CMA. On constate que les sites où la biodiversité est moindre sont les sites cultivés à l'exception de Anse-d'Arlet et Vauclin FS qui sont des sites naturels, ce sont néanmoins deux sites très secs ce qui pourrait expliquer ce résultat. Ces 2 sites, largement dominés par le genre Rhizophagus, présentent pourtant un nombre important de grosses spores. Cependant, la majorité de la biomasse fongique des Gigasporaceae se trouve dans les hyphes situés à l'extérieur de la racine de la plante ce qui peut expliquer que l'analyse de métabarcoding réalisée uniquement sur les racines n'a pas fait apparaître toute la diversité de ces sites.
## Discussion

Ces résultats préliminaires suggèrent une relation complexe entre la diversité des CMA et les facteurs pédologiques et anthropiques. Par exemple, les sols naturels (Ste-Marie, Fond Lahaye) affichent des indices de Shannon élevés (> 2,8), synonymes d'une richesse spécifique importante, tandis que les sites cultivés (bananeraies, canne à sucre) montrent une diversité réduite, à l'exception notable de la parcelle en agriculture biologique (Sainte-Anne SEA), aussi diverse que les milieux forestiers. Ces observations intergagent le rôle des pratiques culturales et de la biodiversité végétale dans le maintien des communautés fongiques, ainsi que l'influence des paramètres pédoclimatiques (humidité, altitude, pH) sur leur structuration.

Cette étude ouvre ainsi des perspectives pour comprendre comment les CMA, acteurs invisibles mais essentiels, répondent aux perturbations environnementales en Martinique, et comment leur gestion pourrait optimiser la résilience des agrosystèmes insulaires.

## Bibliographie

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# Partie 2 : Diversité des champignons mycorhizien à arbuscules au sein d'agroécosystèmes bananiers en agroforesterie : le cas d'étude des 3 systèmes bananes du dispositif BANABIO

## Contexte

En continuité de la sous-partie précédente et pour aller plus loin dans la compréhension des facteurs structurant la biodiversité des CMA à l'échelle de la parcelle, une partie de nos travaux a porté plus précisément sur la diversité des champignons mycorhiziens à arbuscules (CMAs) associés aux légumineuses de service en bananeraie, notamment dans le cadre de la thèse de Doctorat de Coralie Julan (2020-2024 ; Université des Antilles) financée par une bourse de la CTM. Ces travaux avaient pour principaux objectifs : i) d'étudier l'effet de différents régimes de fertilisation sur la diversité et la distribution des CMAs associés aux bananiers en plantation, analysées par métabarcoding ciblant l'ADN ribosomal 18S (séquençage Illumina réalisé par ADNid) ; et ii) d'évaluer la contribution des CMAs dans l'aptitude de légumineuses de service arborées (Inga ingoides et Indigofera zollingeriana) à fixer l'azote de l'air et dans le transfert de cet azote fixé au bananier en conditions contrôlées de même qu'au sein de plantations agroforestières en mélange (dispositif Banabio), via l'utilisation de méthodes isotopiques ¹⁵N (enrichissement et abondance naturelle). Les résultats de ce second volet portant sur le fonctionnement des symbioses sont décrits plus loin dans l'Action 5 du présent rapport.

## Méthodologie

### 1. Collecte des échantillons à analyser et facteurs étudiés :

Les échantillons prélevés pour l'analyse metabarcoding, mais également pour l'évaluation du taux de mycorhization racinaire en parallèle (voir résultats dans l'Action 5 plus loin) ont été récoltés au sein du dispositif Banabio sur la station d'essai du CAEC à Rivière-Lézarde géré par l'UR GECO (Figure 12). L'essai est constitué d'un dispositif expérimental à 3 blocs complets équilibrés et randomisés, mis en place en 2018 (Coulis et al. 2022 ; Rohé et al. 2025) où 3 modes de systèmes agronomiques des bananeraies sont testés : Conventionnel (CO) avec monoculture de bananiers et ajout d'intrants chimiques (engrais et désherbant) ; Bio-Intensif (BI), en monoculture avec ajout de fertilisant organique ; et Bio-Diversifié (BD), système agroforestier avec même ajout de fertilisant organique que BI mais avec en plus une intégration de cacaoyers et de deux espèces de légumineuses arborées de service en culture intercalaire : le Pois-doux (Inga ingoides), et l'Indigotier (Indigofera zollingeriana), implantés 1 an après une jachère de Pois d'Angole (Cajanus cajan).

Au pied des espèces de plantes échantillonnées dans un rayon de 50 cm autour des stipes ou troncs ont été prélevés des fragments de racines ainsi que des échantillons de sol rhizosphérique sous-jacents (pour les sols sous bananiers uniquement), ceci en 3 points de prélèvements par plante pour constituer un échantillon composite (30 cm final pour les racines). Dans chaque parcelle élémentaire « bloc x espèce », soient 9 au total, 3 arbres de chaque espèce ont été échantillonnés avant de mélanger les fragments racinaires en un nouvel échantillon composite, donnant ainsi 9 échantillons de bananier, 3 de Pois-doux et 3 d'Indigotier sur l'ensemble de l'essai. Les échantillons ont ensuite été ramenés au laboratoire au CAEC avant de les sécher en
salle climatisée pendant 7 jours, les échantillons de racines ayant été préalablement lavés délicatement sous un filet d'eau courante pour les débarrasser des particules de sol. Les échantillons ont ensuite été transférés et conservés dans des tubes contenant des cristaux de silicagel avant leur envoi au laboratoire ADNid à Montpellier.

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 12 : Parcelle Biodiversifiée agroforestière bananiers/légumineuses arborées/cacaoyers</figcaption></figure>
## 2. Identification moléculaire des champignons à arbuscules :

L'étude de diversité des CMAs contenus dans les échantillons racinaires et de sols rhizosphériques a été réalisée par métabarcoding (séquençage d'un marqueur taxonomique de l'ensemble d'un échantillon environnemental). Après extraction de l'ADN total des échantillons, une amplification spécifique d'un fragment du gène d'ADNr 18S des *Glomeromycota* a été réalisée en utilisant les amorces moléculaires NS31/AML2 (Morgan & Egerton-Warburton, 2017), puis séquencées avec la technologie Illumina. Les fichiers d'extrémités appariées fastq.gz ont tous été traités ensemble à l'aide d'un pipeline CLI (Command Line Interface) basé sur FROGS 3.1 (http://frogs.toulouse.inra.fr) (Escudié et al., 2018) : 1) les reads forward et reverse ont été fusionnés en utilisant la région commune chevauchante, 2) les séquences obtenues ont été regroupées en unités taxonomiques opérationnelles (OTUs) en utilisant le paramètre de distance SWARM par défaut (Mahé et al., 2014 ; Mahé et al., 2015), 3) les séquences chimères ont ensuite été supprimées, 4) puis celles faiblement représentées (abondance < 2e-06), 5) et les OTUs ont été identifiées en utilisant le classificateur rdp et les bases de données BLASTn au format .biom, base de données produite à partir des taxons virtuels de Maarjam (Opik et al., 2010) ou des séquences complètes obtenues après 2015. La base de données plus généraliste Silva 138 SSU FROGS a également été utilisée pour réaliser un premier tri des OTU et éliminer les OTUs non-CMAs.

## 3. Traitement statistique des données de métabarcoding :

L'analyse de la structure des populations fongiques et du partage des communautés de CMAs entre systèmes de cultures et espèces végétales, basée sur la comparaison des différents niveaux taxonomiques (phylums/familles/ genres) et OTUs obtenus à partir des différents échantillons a été réalisée à l'aide du logiciel R et du package Phyloseq. Les résultats analysant les effets des facteurs « systèmes de culture » et « espèce végétale » sur la diversité taxonomique et le partage des communautés de CMAs entre traitements ont été soumis à diverses analyses statistiques : indices de diversités α et β, analyses multidimensionnelles de similarité du type NMDS (Non-Metric Dimensional Scaling) et CAH (Classification ascendante hiérarchique) et diagrammes de Venn.

# Résultats et discussion

## 1. Diversité des champignons mycorhiziens à arbuscules (CMAs) associés au bananier en fonction de différents systèmes de culture et chez deux espèces de légumineuses arborées co-cultivées en système agroforestier :

Les résultats de l'analyse de métabarcoding issus de la base de données Silva montrent une grande variation dans la composition taxonomique des 15 échantillons analysés malgré une relative homogénéité du nombre de séquences générées (moyenne de 6000 par échantillon) et un nombre important de séquences non affiliées à un niveau taxonomique de CMAs donné ou multi-affiliées. Au niveau de la Famille, on observe une prédominance des Glomeraceae chez les bananiers quel que soit le système de culture, sauf dans deux parcelles élémentaires du Bloc 3 (BI et BD) sur les 9 analysés (Figure 13). Néanmoins, la structure des communautés de CMAs varie fortement d'un système de culture à l'autre, avec des familles de CMAs présentes dans certains systèmes et absentes dans d'autres. Chez les bananiers, la plus grande diversité en taxons est observée au sein du système biodiversifié agroforestier (BD). Au sein de ce dernier système où
co-existent les 3 espèces analysées, on peut noter des similitudes dans la composition taxonomique des communautés mycorhiziennes entre Bananiers et Pois-doux (BD1.B vs BD1.P ; BD2.B vs BD2.P ; et BD3.B vs BD3.P respectivement), tandis que celle observée chez l'Indigotier apparaît très différenciée dans les 3 blocs du traitement BD (Figures 13 et 14).

On observe les mêmes patrons de distribution au niveau taxonomique inférieur du genre (résultats non montrés ici) en raison de genres très majoritaires au sein de chaque famille, soit par ordre décroissant d'abondance : *Rhizophagus* et *Sclerocystis* parmi les Glomeraceae (*Septoglomus* étant minoritaire), *Archaeospora* chez les Archaeosporaceae, *Dentiscutata* chez les Gigasporaceae (*Gigaspora* minoritaire), *Redeckera* pour les Diversisporaceae, *Paraglomus* dans Paraglomeraceae et *Acaulospora* dans Acaulosporaceae.

Au niveau encore inférieur des OTUs (Unités Taxonomiques Opérationnelles), la structure des communautés de CMAs apparaît beaucoup plus complexe et diversifiée. La représentation graphique des distances de similarité entre compositions en OTUs en fonction du type de système de culture, obtenue *via* une analyse multidimensionnelle NMDS, montre un degré élevé de similarité entre échantillons racinaires d'un même type de culture (voir Figure 15). Ces résultats montrent ainsi un effet important du mode de culture sur la diversité et la structure des communautés de CMAs associés aux bananiers. Par contre, au niveau du système biodiversifié/agroforestier, les communautés de CMAs associées aux bananiers, pois-doux et indigotiers sont peu structurées, ne montrant ainsi pas de spécificité entre OTUs et espèces de plantes hôtes, en raison notamment d'une variabilité inter-blocs élevée chez une même espèce de plante hôte (graphique de l'analyse NMDS non représenté ici).

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

**Figure 13 :** Compositions taxonomiques des champignons mycorhiziens au niveau familial observées dans les racines de bananiers, de Pois-doux et d'Indigotier dans les différentes parcelles élémentaires « systèmes de culture x bloc ».
<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 14 : Distribution des familles de CMAs en fonction des espèces de plantes, tous blocs confondus (BD.B = Bananier ; BD.P = Pois-doux ; BD.I = Indigotier).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 15 : Représentation graphique des distances de similarité en fonction du type de système de culture d'après l'analyse multidimensionnelle NMDS (Non-Metric Dimensional Scaling) (systèmes : CO = Conventionnel ; BI = Bio-Intensif ; BD = Bio-Diversifié / Agroforestier)</figcaption></figure>

Ainsi, nous avons observé un faible partage des communautés de CMAs entre systèmes de culture chez le bananier avec seulement 4 OTUs communs aux trois systèmes CO, BI et BD, soit 1,3% des 297 OTUs totaux mis en évidence. Seulement 11,7% du nombre total d'OTUs étaient partagés entre les trois systèmes (incluant les partages 2 à 2) avec un fort taux d'OTUs propres à chaque système de culture, environ la moitié des OTUs (49 % du total) étant confinés au système BI, 22% au système Conventionnel et 17% au système BD.

Au sein du système Bio-Diversifié / Agroforestier, nous avons également observé un faible partage des communautés de CMAs entre les bananiers et les deux espèces de légumineuses arborées étudiées, comme le montre le diagramme de Venn (Figure 16), soit 12,4% du nombre total d'OTUs observés. Ainsi, seulement 3 des 266 OTUs totaux, soit 1,3%, étaient communs aux 3 espèces de plantes hôtes et 12,4% du nombre total d'OTUs partagés entre les trois espèces (incluant les OTUs communs à 2 espèces) avec des taux d'OTUs propres à chaque espèce assez élevés, 34% du nombre total étant associés à l'indigotier, 33% au pois-doux et 20% aux bananiers.
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 16 : Diagramme de Venn représentant le partage des OTUs entre le bananier et les deux espèces de légumineuses arborées (Pois-doux et indigotier) du système agroforestier (BD).</figcaption></figure>

Conclusion

Les travaux réalisés dans le cadre de cette Action ont permis d'acquérir de nouvelles et nombreuses informations sur la diversité des associations fixatrices d'azote et mycorhiziennes au sein des agro-écosystèmes Martiniquais, et de mieux appréhender l'effet des pratiques culturales sur la diversité des microorganismes symbiotiques du sol, des champignons mycorhiziens en particulier. Ces données sont indispensables pour mieux comprendre le fonctionnement et le rôle de ces symbioses *in situ*, autant en conditions naturelles qu'au champ, et évaluer leur impact et contribution lors de la mise en œuvre et le développement de pratiques agroécologiques innovantes stimulant les activités biologiques naturelles du sol. Le fonctionnement et l'efficience de ces symbioses a été étudiée dans le cadre de l'Action 2-6 du projet dont les résultats sont rapportés plus loin.
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## AXE 2 : CARACTERISATION FONCTIONNELLE DES AUXILIAIRES DU SOL

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

De nombreuses études ont montrées le rôle bénéfique de la biodiversité dans le fonctionnement des écosystèmes naturels et cultivés. Les résultats de ces études montrent que ce n'est pas le nombre d'espèces qui importe le plus mais plutôt la diversité des fonctions écologiques remplies par les espèces présentes dans la communauté (diversité fonctionnelle) (Mouillot et al. 2011). Afin de maximiser les services écosystémiques rendus par la biodiversité il faut donc recherche à maximiser la diversité fonctionnelle dans les agroécosystèmes. Pour mettre en œuvre une telle démarche, il est nécessaire de bien connaitre le potentiel des espèces en mesurant des traits fonctionnels, morphologiques et physiologiques sur des individus de chaque espèce (Violle al., 2007).

Cette étape de caractérisation fonctionnelle est nécessaire pour sélectionner les espèces utiles pour développer des pratiques agro-écologiques.
ACTION 2-5 : Test d'acclimatation des vers aux conditions de culture et production d'inoculum

Rédaction : M. Coulis

Contributeurs : Quentin Gabriac, Meryem El Jaouhari, Maeva Pastoret, Thibault Lechopier, Mika Lemoine

Résumé : L'objectif de cette action était de tester la capacité des vers locaux à survivre et à se développer dans des conditions d'élevage spécifiques à la lombriculture, en utilisant des matières organiques locales. Nous avons tout d'abord effectué une synthèse bibliographique pour identifier quelles espèces de vers de terre parmi celles déjà recensées en Martinique pouvaient être utilisées en lombriculture. Une sélection de 3 espèces exotiques et 3 espèces natives a été retenue pour effectuer des tests afin d'évaluer leur capacité à supporter les conditions d'élevage et à consommer de la matière organique locale.

Nos résultats ont confirmé le potentiel de certaines espèces exotiques pour la lombriculture. Cependant, des difficultés importantes ont été rencontrées avec les espèces natives. En conclusion, nous considérons les 3 espèces natives étudiées ici peu adaptées à la lombriculture dans le contexte agricole Martiniquais. Nos résultats apportent des éléments en faveur d'une préconisation de l'utilisation de l'espèce *Eudrilus eugeniae* en raison de sa facilité d'élevage et de bonnes aptitudes à la transformation de la matière organique.

Une production de vers de cette espèce a été menée durant le projet. Cela a permis de produire plus de 500 vers qui ont été distribués à différents acteurs (privés ou institutionnels) pour lancer des actions autour de la lombriculture. Cela a également permis le développement d'une méthode simplifiée pour la multiplication d'Eudrilus eugeniae en vue de produire la quantité de vers nécessaire pour l'installation d'une unité de lombriculture.

Une fiche technique sur la reproduction du ver de terre Eudrilus eugeniae est disponible en ligne :

https://doi.org/10.18167/agritrop/20371

<figure><img src="image_44.png" /></figure>
## Contexte

Pour être cultivés puis utilisés en lombriculture, les vers doivent pouvoir survivre en condition d'élevage et dans les conditions spécifiques à l'environnement de lombricompostage. Le lombricompost est alimenté par de la matière organique (MO) disponible localement et souvent issus de l'agriculture (bagasse, hampes de bananes, crottin, etc.). Le processus de lombricompostage peut dégager de la chaleur et présente des conditions qui peuvent différée de celles du milieu naturel des vers. L'objectif de cette action est donc de tester la résistance et la capacité à se développer des vers locaux à ces conditions d'élevages particulières. Le principal verrou au développement de la lombriculture est la masse de vers très importante qu'il est nécessaire pour lancer le processus. Par exemple la lombriculture avec *Eudrilus eugeniae* requiert en moyenne 7 vers par litre de substrat ou 1,6 kg de vers par m² de tas de déchets. Les espèces qui pourront être reproduit facilement seront donc produites en quantité suffisante pour fournir, aux structures souhaitant se lancer dans le lombricompostage, la masse de vers nécessaire au démarrage de leur activité.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 1 : photographie de deux espèces épigées dont la capacité à être utilisée en lombriculture a été étudiée. A gauche, l'espèce native *Dichogaster sp11A* et à droite, l'espèce exotique *Eudrilus eugeniae*.</figcaption></figure>

## Méthodologie

### 1. Synthèse bibliographique

Une recherche bibliographique a été menée en consultant des ouvrages de synthèse ainsi que les principaux moteurs de recherche en ligne (Google Scholar, Web of Science et Scopus) pour recueillir toute information relative à l'utilisation des espèces de vers de terre déjà recensées en Martinique et pouvant être utilisées pour le lombricompostage.

### 2. Sélection des espèces de vers de terre

Étudier l'ensemble des espèces pouvant être utilisées en lombriculture était une tâche trop importante et pas forcément pertinente. Par conséquent, une sélection d'espèces a été réalisée selon les critères suivants : pour les espèces natives, celles sélectionnées devaient ne pas être trop rares et vivre dans des habitats épigés afin d'être susceptibles d'être utilisées en lombriculture. Pour les espèces exotiques, celles ayant les meilleures performances selon la littérature ont été choisies, tout en veillant à ne pas utiliser des espèces potentiellement envahissantes (cf. résultat de l'action 1-2). Cela nous a conduit à exclure de ces tests *Dichogaster*
andina et Dichogaster annae. Ainsi, ce sont 6 espèces qui ont été retenues pour cette étude (voir Tableau 1)

### 3. Test d'acclimatation

Les tests d'acclimatation ont été réalisés sur les espèces natives uniquement. Ils ont consisté à les placer dans des boîtes d'élevage (boîtes en PP de 10 x 20 cm) dans une enceinte à température contrôlée, avec de la matière organique prélevée sur leur lieu de collecte. Cette étape visait à vérifier que les espèces étaient capables de supporter des conditions de vie en élevage, un prérequis important pour être utilisées en lombriculture.

### 4. Test de consommation

Par la suite, des tests de consommation de matière organique locale ont été réalisés sur l'ensemble des espèces sélectionnées pour cette étude (voir Tableau 1). Dans un premier temps, de la bouse de vache a été utilisée comme source de nourriture. Bien qu'il ait été prévu d'explorer d'autres sources de nourriture, étant donné que la bouse de vache est le substrat connu comme étant le plus adapté et qu'elle a fonctionné correctement sur les espèces ayant réussi la phase d'acclimatation, nous n'avons pas expérimenté d'autres sources de nourriture.

<table><caption>Tableau 1. Synthèse des espèces recensées en Martinique et dont l'utilisation en lombriculture est mentionnée dans la littérature. Les espèces étudiées lors des tests de consommation sont indiquée par un surlignage en vert. L'espèce choisi pour la production d'inoculum est indiquée par un astérisque.</caption><thead><tr><th>Espèces exotiques</th><th>Références</th><th>Critère de sélection</th></tr></thead><tbody><tr><td>Dichogaster annae</td><td>(Martin & Eudoxie, 2018).</td><td>Cette espèce n'a pas été sélectionnée en raison de son potentiel invasif (cf. résultat de l'action 1-2)</td></tr><tr><td>Dichogaster bolaui</td><td>(Bhardwaj & Sharma, 2015)</td><td>Cette espèce a été retenue car elle est très ubiquiste</td></tr><tr><td>Dichogaster andina</td><td>NA</td><td>Cette espèce a un habitat épigé arboricole mais elle n'a pas été sélectionnée en raison de son potentiel invasif (cf. résultat de l'action 1-2)</td></tr><tr><td>Eudrilus eugeniae *</td><td>(Blakemore 2000, 2015; Sierra et al., 2013; Faverial et al. 2016)</td><td>Cette espèce a été retenue car elle montre de bonnes performances selon la littérature</td></tr><tr><td>Metaphire houleti</td><td>(Sharma, 2017; Chaudhuri & Debnath 2020)</td><td>Cette espèce n'a pas été sélectionnée car elle est moins performante selon la littérature</td></tr><tr><td>Perionyx excavatus</td><td>(Blakemore, 2000; Yong et al. 2001; Faverial et al., 2016)</td><td>Cette espèce a été retenue car elle montre de bonnes performances selon la littérature</td></tr><tr><td>Polypheretima elongata</td><td>(Chaudhuri & Debnath, 2020).</td><td>Cette espèce n'a pas été sélectionnée car elle est moins performante selon la littérature</td></tr><tr><th>Espèces natives</th><th>Références</th><th>Critère de sélection</th></tr><tr><td>Dichogaster sp11A</td><td>NA</td><td>Cette espèce a été retenue car elle a un habitat épigé arboricole</td></tr><tr><td>Dichogaster sp11B</td><td>NA</td><td>Cette espèce a été retenue car elle a un habitat épigé arboricole</td></tr><tr><td>Dichogaster sp6</td><td>NA</td><td>Cette espèce a été retenue car elle a un habitat épigé arboricole</td></tr></tbody></table>
Résultats et discussion

Les recherches bibliographiques nous ont permis d'identifier 6 espèces exotiques présentes en Martinique qui pourraient être utilisées en lombricompostage. Parmi ces espèces, toutes n'ont pas le même potentiel. Certaines ont été exclues d'emblée car leur potentiel ne semblait pas intéressant, comme c'est le cas de *Polypheretima elongata* et *Metaphire houleti*.

Les tests d'acclimatation réalisés sur les 3 espèces, *Dichogaster bolaui*, *Eudrilus eugeniae* et *Perionyx excavatus*, ont été réalisés avec succès. Les vers de terre de ces espèces ont pu être conservés dans des boîtes d'élevage pendant plusieurs semaines sans aucune difficulté. En revanche, les tests d'acclimatation réalisés sur les 3 espèces, *Dichogaster sp11A*, *Dichogaster sp11B* et *Dichogaster sp6*, ont été moins concluants. Les boîtes d'élevage mises en place étaient constituées d'un matériau drainant en granulat de ponce sur lequel de la matière organique de leur milieu de vie a été ajoutée. Les vers de terre ont pu être conservés quelques semaines, mais leur comportement était anormal : le substrat était peu consommé et il y a eu de la mortalité. Des substrats organiques de différentes natures ainsi que différentes modalités d'arrosage des boîtes ont également été essayés, mais cette étape d'acclimatation s'est globalement montrée peu satisfaisante pour les espèces natives.

Les 3 espèces de vers de terre exotiques ont pu être maintenues en élevage dans des boîtes avec de la bouse de vache. La bouse de vache était préalablement lessivée (trempage > 2h dans de l'eau) pour évacuer l'ammoniac et disposée sur un matériau drainant (de la ponce et des billes d'argile ont été utilisées). Cette technique a permis un maintien optimal en élevage et des reproductions ont été observée pour les 3 espèces exotiques. Ces résultats confirment le potentiel de ces trois espèces pour être utilisées en lombriculture. Cependant, en maintenant les élevages durant une longue période, l'espèce *Perionyx excavatus* a montré un comportement de fuite. Après plusieurs semaines d'élevage dans de bonnes conditions, les vers ont tous fui les boîtes. La raison en est encore inexplicée, mais cela laisse penser qu'un signal environnemental (pression atmosphérique, photopériode, etc.) aurait déclenché ce comportement collectif soudain. De tels événements ont également été rapportés par des lombriculteurs aux États-Unis (comm. pers. de Samuel W. James). Même si cette espèce montrait apparemment un bon taux de reproduction et une bonne capacité à transformer le substrat, nous avons arrêté de l'utiliser par la suite et nous déconseillons son utilisation pour éviter ce genre de déconvenue. L'espèce *Dichogaster bolaui*, qui a montré des aptitudes à l'élevage, est néanmoins de très petite taille, ce qui la rend très difficile à collecter et à identifier vivante. De plus, elle a montré une capacité à transformer le substrat moins intéressante que les 2 autres. Ces éléments nous ont poussés à préférer l'espèce *Eudrilus eugeniae*, qui a clairement montré les meilleures aptitudes à la lombriculture parmi les espèces étudiées.

Les espèces natives ont été introduites dans des boîtes avec de la bouse de vache, mais pour aucune des 3 espèces, un élevage n'a pu être maintenu ni de reproduction observée. Pour cette raison, nous concluons que les espèces de vers natives, du moins les 3 espèces étudiées ici, ne sont pas adaptées pour la lombriculture dans le contexte d'une exploitation agricole.

Une production de vers de terre de l'espèce *Eudrilus eugeniae* a donc été lancée dans le but de la fournir à des agriculteurs intéressés. Pour cela, une méthode d'élevage peu couteuse a été mise en place afin de produire facilement des vers. Ainsi, à la fois des vers de terre ont été fournis directement à des agriculteurs ou des acteurs du territoire souhaitant se lancer en lombriculture, et une méthode simplifiée pour être autonome sur la multiplication des vers a été rendue disponible en accès libre. Au total, environ 8 inocula (un inoculum correspond à une boîte d'environ 50 individus) ont été fournis à 4 acteurs différents. Les profils sont variés : ils couvrent bien l'ensemble du territoire martiniquais et représentent la diversité des profils pouvant être
intéressés par la lombriculture. Les destinataires comprennent un entrepreneur Maître composteur (M. Brosille) qui réalise du compost à Sainte-Marie, une association faisant de la sensibilisation sur une ferme en maraîchage AB à Fond-Saint-Denis (ferme de L. Tisgra), le SEA à Sainte-Anne, et en interne, une doctorante (M. El Jouhari) faisant de la recherche en agroécologie au Lamentin.

Bibliographie

Blakemore, R.J. (2000). Vermicology I. Ecological considerations of the earthworm species used in vermiculture: A review of the species.

Blakemore, R.J. (2015). Eco-taxonomic profile of an iconic vermicomposter—the 'African Nightcrawler' earthworm, Eu-drilus eugeniae (Kinberg, 1867). African Invertebrates, 56(3), 527–548. lien

Bhardwaj, P., & Sharma, R.K. (2015). Vermicomposting efficiency of earthworm species from eastern Haryana. Journal of Entomology and Zoology Studies, 3(3), 191–195.

Chaudhuri, P., & Debnath, S. (2020). Growth and Reproductive Biology of Earthworms in Organic Waste Breakdown Under the Indian Condition, Earthworm Assisted Remediation of Effluents and Wastes. Springer, 179–193.

Faverial, J., Cornet, D., Paul, J., & Sierra, J. (2016). Multivariate analysis of the determinants of the end-product quality of manure-based composts and vermicomposts using Bayesian network modelling. Plos One, 11(6), e0157884.

Martin, M., & Eudoxie, G. (2018). Feedstock composition influences vermicomposting performance of Dichogaster annae relative to Eudrilus eugeniae and Perionyx excavatus. Environmental Science and Pollution Research, 25(18), 17716–17725. lien

Sharma, D. (2017). Vermicompost potential of various local earthworm species of Jammu (India) on kitchen waste. International Research Journal of Environmental Sciences, 6(8), 48–50.

Sierra, J., Desfontaines, L., Faverial, J., Loranger-Merciris, G., & Boval, M. (2013). Composting and vermicomposting of cattle manure and green wastes under tropical conditions: Carbon and nutrient balances and end-product quality. Soil Research, 51(2), 142–151. lien
# ACTION 2-6 : Caractérisation fonctionnelle et efficience des symbioses

## Rédac

tion : Antoine Galiana

Contributeurs : Amadou Bâ, Alexandra Blot, Marine Faye, Antoine Galiana, Laure Hannibal, Coralie Julan, Mathieu Coulis, Sonia Minatchi, Bryan Vincent.

**Résumé** : Cette action, menée en parallèle avec l'Action 1-3 du projet avait pour objectif d'évaluer le potentiel symbiotique de légumineuses utilisables comme plantes de service (PDS) dans les systèmes agricoles et agroforestiers en Martinique. Nos travaux ont ainsi porté sur l'évaluation du potentiel fixateur d'azote atmosphérique d'une large variété de légumineuses introduites ou autochtones déjà cultivées en tant que PDS dans les systèmes agricoles de Martinique mais aussi d'espèces herbacées, arbustives ou arborées spontanées à potentiel PDS présentes au sein des écosystèmes naturels de Martinique. Sur la quinzaine de sites explorés du Nord au Sud de l'île, les résultats d'abondance isotopique naturelle en ¹⁵N ont permis d'estimer chez une cinquantaine d'espèces de légumineuses échantillonnées des taux de fixation d'azote (% Ndfa) *in situ* très élevés, variant de 57 % à 100 % (82 % en moyenne) chez les espèces herbacées, tandis que les espèces ligneuses (environ 15 espèces) fixaient généralement moins d'azote (58% en moyenne). Les résultats d'abondance isotopique naturelle en ¹⁵N ont également permis de mettre en évidence un taux élevé de restitution d'azote fixé au sein du système agroforestier Bananier x Pois-doux/Indigotier (10 à 20 kg de N par ha selon l'espèce de légumineuse) ainsi qu'un transfert net d'azote fixé significatif des légumineuses arborées vers les bananiers (environ 10 % du N total des bananiers étant d'origine symbiotique). La contribution des symbioses mycorhiziennes (CMAs) dans la nutrition et la productivité d'espèces cibles (bananier, tomate) a été étudiée au champ au sein de parcelles d'essais agronomiques ainsi qu'à travers une expérimentation réalisée en serre en conditions contrôlées sur l'association modèle Bananier-Pois doux (Inga ingoides), déjà expérimentée par le CIRAD sur le terrain. L'expérimentation en conditions contrôlées utilisant la méthode de dilution isotopique (marquage ¹⁵N) permet d'estimer plus précisément la contribution des réseaux mycorhiziens communs dans le transfert d'azote fixé entre pois-doux et bananiers. L'ensemble de ces résultats montrent l'intérêt d'utiliser diverses espèces de légumineuses de service à haut potentiel fixateur d'azote, notamment autochtones, dans les agrosystèmes à la Martinique dans un contexte de fertilisation raisonnée.
## Documents produits dans le cadre de cette action :

### 1. Communications orales dans conférences internationales :

**Coulis Mathieu, Sauvadet Marie, Prochasson Alice, Julan Coralie, Vincent Bryan, Bâ Amadou, Galiana Antoine.** 2022. Impact of the introduction of legume tree on the contribution of symbiotic nitrogen fixation to banana agroecosystems. In: 19th International Conference of the AABNF (African Association for Biological Nitrogen Fixation), Held at UCAD, Dakar, Senegal, November 29-September 1st 2022. Oral communication. Book of abstracts, p.35.
https://agritrop.cirad.fr/606228/

**Galiana Antoine, Sauvadet Marie, Prochasson Alice, Coulis Mathieu,** 2022. Assessing legume tree and shrub impacts on nitrogen cycling in banana cropping systems. In: En transition vers un monde viable. Québec : Université de Laval; IUAF ICRAF, 1 p. Congrès Mondial d'Agroforesterie. 5, 2022-07-17/2022-07-20, Québec (Canada). https://agritrop.cirad.fr/601932/

### 2. Rapports de stage :

**Faye Marine.** 2023. Caractérisation de la diversité et de l'efficience des symbioses microbiennes associées aux légumineuses natives et introduites en Martinique : rapport de stage de Césure – Certificat d'Expérience à l'International du cycle ingénieur AgroParisTech. Stage effectué du 30/01 au 13/07/2023, 20 p.
Contexte

Bien que les associations symbiotiques plantes-microorganismes soient largement utilisées à
travers le monde et constituent un élément clé du fonctionnement durable des agrosystèmes
tropicaux, elles restent sous-exploitées en Martinique. Quelques études préliminaires ont été
initiées sur les mycorhizes en Martinique mais elles n'ont encore débouché sur aucune
application concrète au champ. De même, pratiquement aucune étude n'a été entreprise sur
l'efficacité de la symbiose légumineuses-rhizobia au sein des agrosystèmes Martiniquais.
L'objectif de cette action est de caractériser l'efficience des symbioses fixatrices et
mycorhiziennes au champ ainsi qu'en conditions contrôlées afin de sélectionner des associations
symbiotiques plantes-microorganismes performantes améliorant la productivité durable des
cultures dans un contexte de transition agroécologique.

L'objectif majeur de ce thème de recherche était d'évaluer le potentiel fixateur d'azote d'une diversité d'espèces de légumineuses de services utilisées ou potentiellement exploitables comme plantes de couverture ou comme arbres agroforestiers au sein des agrosystèmes en Martinique, en valorisant la biodiversité locale sous-utilisée. Des expérimentations réalisées préalablement en serre en conditions contrôlées, utilisant la méthode de dilution isotopique (marquage ¹⁵N), avaient montré des potentiels de fixation de N contrastés chez plusieurs espèces de légumineuses de service soumises à différents régimes de fertilisation azotée, certaines pouvant fixer des proportions d'azote élevées aux doses d'azote minéral les plus fortes. Cette dernière propriété est d'autant plus intéressante à rechercher chez une espèce de PDS légumineuse candidate que l'ajout de fortes doses d'azote minéral sous forme d'engrais chimiques inhibe la fixation symbiotique de l'azote atmosphérique, sachant également que les apports de N minéral ou de N organique, même raisonnés, restent indispensables en culture conventionnelle ou biologique. La grande diversité en espèces de légumineuses, notamment autochtones, présentes en Martinique, et plus largement dans l'espace Caribéen, méritait une étude plus approfondie. Nos travaux ont visé ici à étendre l'évaluation du potentiel fixateur de N in situ à une plus large gamme d'espèces de légumineuses alors jamais explorées ni décrites dans la littérature auparavant. Dans une étude plus ciblée, nous avons également évalué le potentiel fixateur d'azote au champ de deux espèces de légumineuses arborées, le pois-doux (Inga ingoides) et l'indigotier (Indigofera zollingeriana) introduites dans un système agroforestier à base de bananiers ainsi que la part d'azote fixé transférée au bananier dans ce système de culture en mélange.
# Partie 1: Caractérisation fonctionnelle et potentiel fixateur d'azote des symbioses Rhizobia-légumineuses au sein des écosystèmes naturels et cultivés de Martinique

## Méthodologie

### 1. Sites de prospection

Pour estimer la fixation d'azote de différentes espèces de légumineuses spontanées au sein d'écosystèmes naturels et d'agrosystèmes, des échantillons foliaires ont été prélevés dans 11 sites naturels et 4 stations d'essais agronomiques (CAEC Rivière-Lézarde, CAEC Petit-Morne, SEA Sainte-Anne et Plantation Belle-Etoile à Vauclin) répartis du Nord au Sud de la Martinique (voir Figure 1 ci-dessous). Les sites ont été choisis pour leur richesse et forte densité en espèces de légumineuses, ce qui permettait également de réduire l'effort et l'étendue de l'échantillonnage.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 1 : Localisation des sites de récolte des échantillons foliaires pour les analyses d'abondance isotopique naturelle en ¹⁵N</figcaption></figure>
## 2. Échantillonnage

De 3 à 10 espèces de légumineuses par site ont été échantillonnées et à peu près autant d'espèces non-fixatrices de référence permettant de calculer la proportion d'azote fixé (%Ndfa) chez les légumineuses à partir de leurs valeurs respectives d'abondance naturelle en 15N. Nous avons prélevé de façon non destructive des feuilles entières matures dans la région subterminale des rameaux végétatifs sur 3 à 5 individus par espèce de plante à raison d'une cinquantaine de feuilles chez les arbres ou arbustes et d'une trentaine de feuilles chez les plantes herbacées. Les plantes échantillonnées de chaque espèce étaient distantes de 10 à 30 m chez les arbres et de 5 à 10 m chez les plantes herbacées. Les espèces de référence non-fixatrices étaient récoltées à une distance minimale des plants de légumineuses (2 à 5 m chez les plantes herbacées et 5 à 10 m chez les arbres ou arbustes selon leur taille) pour ne pas fausser leurs valeurs de $\delta^{15}$N, et donc le calcul du Ndfa % qui pourrait être impacté par un transfert indirect de N fixé des légumineuses vers les non-légumineuses.

## 3. Conditionnement des échantillons avant analyse isotopique

Les échantillons foliaires ainsi prélevés ont été ramenés au laboratoire puis séchés à l'étuve à 50°C pendant 72 h. Ils ont ensuite été réduits en poudre avec un broyeur à circulation CT 293 Cyclotec™ (FOSS). Entre 5 à 8 mg de poudre sèche et homogène par échantillon ont été pesés à l'aide d'un balance Sartorius MCE10 de précision micrométrique (sensibilité à 1 µg près) et transférés dans des capsules en étain de 5 x 9 mm, les boulettes obtenues ayant été déposées individuellement dans des microplaques 96 puits avant leur envoi pour analyses.

## 4. Analyses isotopiques

### Calcul de la proportion et de la quantité d'azote fixé par la méthode d'abondance naturelle en $^{15}$N ($\delta^{15}$N)

Les échantillons ont été envoyés au laboratoire du SIF (Stable Isotope Facility) à l'Université de Californie Davis afin d'analyser leurs abondances naturelles en $^{15}$N et $^{13}$C et teneurs en N et C avec un analyseur CN en tandem avec un spectromètre de masse à rapport isotopique à flux continu (Europa ANACA-GSL, PDZ Europa Ltd, Sandbach, Royaume-Uni).

La proportion d'azote fixé d'origine atmosphérique contenue dans l'échantillon (%Ndfa) a été calculée d'après la formule suivante (Shearer et Kohl, 1986) :

$$ \%Ndfa = \frac{(\delta^{15}N_{\text{plantes de référence}} - \delta^{15}Nf_{\text{légumineuse d'intérêt}})}{(\delta^{15}N_{\text{plantes de référence}} - \beta)} \times 100 $$

Où : $\delta^{15}$Néchantillon = ($^{15}$N/$^{14}$Néchantillon - $^{15}$N/$^{14}$Nair) / $^{15}$N/$^{14}$N de l'air x 1000 ; $\delta^{15}$Nplantes de référence = abondance moyenne en $^{15}$N des espèces de référence non-fixatrices d'azote dans un site donné ; et β le facteur de fractionnement isotopique, valeur propre à chaque espèce de légumineuse étudiée, mesurée dans des feuilles de plantes nodulées cultivées sur milieu complet mais dépourvu d'azote et fixant 100% d'azote atmosphérique. En l'absence de résultats disponibles de valeurs β dans la littérature pour une espèce donnée, nous avons utilisé des valeurs β = -1 ou la valeur β la plus faible mesurée chez une plante de cette espèce présente sur un site donné lorsque β < -1.
Résultats :

Estimation du potentiel fixateur d'azote chez différentes légumineuses au sein d'écosystèmes naturels par la méthode d'abondance naturelle en ¹⁵N (δ¹⁵N)

Sur les 15 sites explorés du Nord au Sud de l'île (voir Figure 1 plus haut), les résultats d'abondance isotopique naturelle en ¹⁵N (δ¹⁵N) n'ont pas pu être exploités pour estimer les taux de fixation d'azote dans 5 sites en raison de valeurs de δ¹⁵N très basses (proches de 0) ou légèrement négatives mesurées dans les feuilles des espèces de référence non-fixatrices d'azote. Dans les 10 autres sites, nous avons pu estimer chez une cinquantaine d'espèces de légumineuses échantillonnées des taux de fixation d'azote (%Ndfa) *in situ* très élevés, variant de 57% à 100% (82% en moyenne pour 37 espèces analysées) chez les espèces herbacées, tandis que les espèces ligneuses (15 espèces étudiées incluant arbres et arbustes) fixaient généralement moins d'azote (58% en moyenne) (Voir Tableau 1 ci-dessous). Chez les légumineuses herbacées, 10 espèces, soit plus d'un quart d'entre elles, ont un %Ndfa atteignant entre 95% et 100% : *Arachis pintoi*, *Centrosema pubescens*, *Coursetia caribaea*, *Crotalaria retusa*, *Crotalaria spectabilis*, *Desmodium heterocarpon*, *Desmodium incanum*, *Desmodium tortuosum*, *Teramnus labialis* et *Vigna hosei* (et 2 autres > 90% : *Aeschynomene americana* et *Crotalaria juncea*) (Tableau 1). Chez les légumineuses ligneuses arborées ou arbustives, 3 espèces, soit 20% d'entre elles, ont un %Ndfa supérieur à 95% et 100%, i.e. *Chamecrista glandulosa*, *Pithecellobium unguis-cati* et *Vachellia farnesiana*, tandis que *Chloroleucon tortum*, *Mimosa pigra* et *Vachellia tortuosa* ont un Ndfa% oscillant entre 90% et 95% (Tableau 1).

Chez certaines espèces distribuées dans plusieurs sites, on observe de grandes variations de leurs taux de fixation de N, comme chez *Gliricidia sepium* (0% à 54%), *Leucaena leucocephala* (23% à 45%) ou encore *Chloroleucon tortum* (32% à 91%).

Notons qu'une espèce de légumineuse herbacée de zone sèche assez rare, *Nissolia vincentina*, ne fixe pas d'azote sur le seul site où elle a été trouvée (Corniche Diamant) tandis que *Calliandra tergemina*, espèce d'arbuste souvent présente dans les bas-fonds humides, fixait très peu d'azote (9,4%) dans le seul site où on l'a échantillonnée.

Même si un faible nombre d'espèces est représenté dans plus d'un site (5 sites ayant été exclus de l'analyse pour des valeurs de δ¹⁵N des espèces non-fixatrices de référence trop faibles), ces résultats montrent globalement : i) des taux de fixation de N nettement plus élevés chez les espèces herbacées par rapport aux arbres (tant chez les espèces d'arbres appartenant à la sous-famille des Fabioideae que celles affiliées aux Mimosoideae) ; et ii) une variation importante de ces valeurs de %Ndfa chez les espèces d'arbres d'un site à l'autre contrairement aux espèces de légumineuses herbacées (dus à des taux de fixation nettement plus élevés chez ces dernières) de même qu'entre individus d'une même espèce au sein de chaque site (résultats non détaillés ici).