est associée aux trions négatifs ($X^-$); et la composante rapide $\tau_3$ à un mélange ici indiscernable de biexcitons et trions positifs ($XX/X^+$) : d'où leur notation respective $\tau_1 = \tau_X$; $\tau_2 = \tau_{X^-}$; $\tau_3 = \tau_{XX}/\tau_{X^+}$ sur la Figure 3.14 ci-dessous.

<figure><img src="image_89.png" /><figcaption>Le poids relatif des déclins est exprimé à la fois par la taille des marqueurs et par une échelle de couleur : par exemple, la couleur la plus bleue indique un poids entre 0 et 0,1; la plus rouge entre 0,9 et 1. Les valeurs de durée de vie moyenne $\tau_m$ sont également données pour chaque mesure. (a) Le cas des cœurs CdSe nécessite 3 déclins exponentiels pour être correctement fité. (b) Les QDs après croissance des coquilles sont généralement bien fités avec un modèle bi-exponentiel.</figcaption></figure>

La Figure 3.14 montre également que l'ajout des coquilles ne modifie pas tellement la durée de vie moyenne $\tau_m$, mais tend à faire disparaître les trions négatifs $X^-$ au profit des excitons $X$. Au niveau des fits, cela se manifeste par des valeurs de $\tau_m$ strictement identiques que le modèle utilisé soit bi ou tri-exponentiel.

<caption>FIGURE 3.14 – Résultats des mesures de durées de vie sur 12 synthèses de QDs.</caption>

### 3.2.3.4 Estimation du rendement quantique en solution

Les calculs de taux de recombinaisons radiatives $k_r$ n'étant valables que pour les cœurs CdSe, nous avons dû estimer le rendement quantique des QDs$_{cœurs/coquilles}$ par comparaison. Connaissant le rendement quantique des cœurs de QDs $\phi_c$, que l'on a calculé à partir de la relation Éq. (3.2.9), il est en effet possible de remonter expérimentalement au rendement quantique des hétéro-structures cœurs/coquilles $\phi_{cc}$ grâce au ratio de ces 2 grandeurs, qu'on peut rapporter au rapport de leurs signaux $I_i$ ($s^{-1}$) normalisé par le rapport de leurs extinctions molaires $\varepsilon_i^{\lambda_e}$ (L/mol/cm) corrigé de la différence de puissance d'excitation $L_i^{\lambda_e}$ (W/cm$^2$) – cf. Éq. (3.2.17). Cette relation se retrouve à partir des définitions données en Éq. (3.2.18) à (3.2.20), où $\eta_d$ est l'efficacité de détection; $k_{\lambda_e}$ le taux d'excitation à une longueur d'onde donnée ($s^{-1}$); $\sigma_{abs}^{\lambda_e}$ la section efficace d'absorption (m$^2$); $h\nu_e$ l'énergie des photons d'excitation (J); et $N_A$ le nombre d'Avogadro. Les valeurs des différents ratios sont directement déterminables via les spectres d'absorption et de photoluminescence réalisés après les synthèses – le mon-

$$ \frac{\phi_{cc}}{\phi_c} = \frac{\frac{I_{cc}}{I_c}}{\frac{\varepsilon_{cc}^{\lambda_e}}{\varepsilon_c^{\lambda_e}} \cdot \frac{L_{cc}^{\lambda_e}}{L_c^{\lambda_e}}} \quad (3.2.17) $$

$$ I = \eta_d \cdot \phi \cdot k_{\lambda_e} \quad (3.2.18) $$

$$ k_{\lambda_e} = \sigma_{abs}^{\lambda_e} \frac{L^{\lambda_e}}{h\nu_e} \quad (3.2.19) $$

$$ \varepsilon^{\lambda_e} = \sigma_{abs}^{\lambda_e} \frac{N_A}{10^3 \ln(10)} \quad (3.2.20) $$
tage utilisé pour la réalisation des spectres de photoluminescence permet en particulier d'obtenir la puissance d'excitation. La Figure 3.15 synthétise alors les valeurs de rendement quantique $\phi_c$ obtenus pour les cœurs CdSe et $\phi_{cc}$ pour les QDs CdSe/CdS/CdZnS/ZnS.

<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>FIGURE 3.15 – Valeurs de rendement quantique $\phi$ déterminées pour nos QDs dans l'héxane.</figcaption></figure>

$\phi_c$ pour les QDs$_{cœurs}$

$\phi_{cc}$ pour les QDs$_{cœurs/coquilles}$

La photoluminescence de mes premières synthèses de QDs ayant été caractérisées à l'aide d'un spectromètre commercial dont la fiabilité a plus tard été constatée comme défaillante$^{67}$, certaines de nos valeurs de rendement quantique $\phi_c$ n'ont pas pu donner lieu à une estimation fiable de $\phi_{cc}$. Le coefficient multiplicateur$^{68}$ à appliquer est cela dit systématiquement dans l'intervalle 3 à 4, ce qui m'a permis de proposer des valeurs approximées de $\phi_{cc}$ pour ces cas. Pour la grande majorité des QDs utilisés par la suite, dont le rayon R = 1,4-1,6 nm, on peut retenir qu'en moyenne, $\phi_c = 0,21 \pm 0,03$ et $\phi_{cc} = 0,79 \pm 0,07$.

67. Variation de la puissance d'excitation non contrôlable.

68. Issu des différents rapports $\phi_{cc}/\phi_c$ déterminés de façon fiable.

## 3.3 ÉCHANGES DE LIGANDS DE SURFACE

### 3.3.1 DIVERSITÉ DES MOLÉCULES ET APPLICATIONS

Le champ disciplinaire de la physico-chimie des surfaces a établi que la présence d'espèces chimiques tensioactives ou adsorbées$^{69}$ sur des surfaces cristallines peut altérer leur réactivité ainsi que leurs propriétés électroniques. Plusieurs mécanismes peuvent alors intervenir, comme un couplage entre les orbitales des atomes de la surface et celles des espèces chimiques adsorbées$^{70}$. Les molécules tensioactives interagissent avec les atomes présents en surface d'une manière analogue à des molécules formant un complexe de coordination avec un ion métallique. C'est la raison pour laquelle le terme ligand est souvent employé dans la littérature dans le cas des boites quantiques pour désigner les molécules stabilisant les solutions colloïdales de QDs – et/ou les fonctionnaliser$^{71}$.

69. Respectivement connues sous les noms *Surfactants* et *Adsorbates*, dans la littérature.

70. Ces effets sont importants dans le cas des nanocristaux, et notamment des boites quantiques.

71. La revue de Boles et al. [205], qui sert de support principal à cette section, propose ainsi de nommer ces molécules *ligands de surface*, pour souligner cette dualité tensioactif-ligand – j'utiliserai néanmoins le terme "ligand" régulièrement par la suite, pour simplifier.
Les ligands de surface permettent en premier lieu de contrôler la dispersion et l'agrégation des boites quantiques en solution, en jouant sur l'encombrement stérique et/ou les interactions électrostatiques. Ces 2 mécanismes emploient des ligands différents, comme l'illustre la Figure 3.16. La nature des ligands de surface utilisés détermine ainsi la solubilité générale des QDs : les chaînes carbonées permettent une solubilisation stable en milieu apolaire (héxane, toluène, etc.), tandis que les espèces ioniques sont utilisées pour les milieux polaires (eau, éthanol, etc.). Les ligands de surface passivent aussi les défauts de surface des QDs, en particulier pour des cœurs simples. Ces défauts de surfaces rendent possibles des états d'énergie intermédiaires entre les niveaux $1S_{3/2}$ et $1S_e$, capables de piéger les trous ou les électrons, et donc de limiter la luminescence des boites quantiques ou de modifier leurs caractéristiques spectrales. En couplant leurs propres niveaux d'énergie avec ces niveaux intermédiaires, les ligands de surface peuvent "écarter" ces pièges et ainsi limiter ces problèmes. Enfin, les ligands de surface permettent de fonctionnaliser les boites quantiques pour des applications spécifiques, par exemple en opto-électronique ou en biologie [206]. Toutes ces fonctions peuvent être combinées via un design modulaire des ligands de surfaces, comme le montre la Figure 3.17, avec en ligne de mire les applications en biologie.

<figure><img src="image_91.png" /><figcaption>FIGURE 3.16 – Schéma, adapté de [205], de l'interaction entre 2 QDs stabilisées soit par :</figcaption></figure>

(a) encombrement stérique *via* des ligands à longues chaînes hydrocarbonées.

(b) répulsion électrostatique avec des ligands ioniques, où • représentent les ions et o les contre-ions.

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

(a) Les ancres (*anchors*) relient les molécules recouvrant les QDs par des interactions variables avec les ligands natifs ou par des liaisons atomiques se liant directement à la surface du nanocristal; (b) Des ligands stabilisateurs comme le polyéthylèneglycol (PEG) ou des chaînes zwitterioniques donnent un caractère hydrophile et empêchent l'adsorption non spécifique. (c) Les ligands de surface peuvent aussi comporter des groupes réactifs servant d'adaptateur/coupleur (*tether*) pour la conjugaison covalente avec des molécules biofonctionnelles après échange de ligands. (d) Des unités biofonctionnelles peuvent offrir des capacités de ciblage, de thérapie ou de détection.

<caption>FIGURE 3.17 – Design modulaire des ligands de surface utilisés pour l'obtention de nanocristaux biocompatibles [205].</caption>
Le développement et la caractérisation de ces ligands constitue un champ scientifique à part entière, nécessitant l'utilisation de méthodes variées et complémentaires, récapitulées dans la Figure 3.18 en fonction de leur domaine d'intérêt :

- Étudier les liaisons chimiques entre un nanocristal et ses ligands de surface se fait par simulations numériques à l'aide de la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT) ; spectroscopie photo-électronique X (XPS) ; et, dans certains cas, à l'aide de la microscopie électronique à transmission (TEM).

- Les techniques comme la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) ou la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (NMR) permettent d'élucider la composition et la structure des molécules de ligands.

- Déterminer les propriétés effectives de l'ensemble, telles que l'épaisseur de la couche, le potentiel zêta ($V_c$), ou la densité et la constante diélectrique. Pour cela on utilisera la microscopie à force atomique (AFM), ou encore les spectroscopies de diffusion dynamique de la lumière (DLS) et diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS).

Sachant que les ligands de surface s'adsorbent sur les QDs *via* des interactions moins énergétiques que les liaisons covalentes, ils présentent différents degrés de labilité. Cette notion désigne le fait qu'un ligand peut être plus ou moins facilement échangé par un autre [207]. À l'issue d'une synthèse, les boites quantiques sont souvent en milieu apolaire, recouvertes de ligands de surface à base de chaînes carbonées, car ce sont à l'heure actuelle les espèces chimiques les plus appropriées pour un contrôle fin de la taille et forme des QDs. Passer les boites quantiques dans un solvant polaire nécessite alors de changer les ligands de surface. L'adsorption de ligands sur les surfaces de QDs est généralement modélisé par une courbe de Langmuir classique [208-211] ou adaptée [212]. Il en découle que les échanges de ligands consistent, dans leur version la plus simplifiée, à diluer une solution de QDs avec leurs ligands natifs dans une solution de ligands souhaités, de manière à créer une situation de compétition favorable à l'échange<sup>72</sup>. Les parties suivantes vont nous permettre de présenter les différents ligands de surface que j'ai utilisés durant ma thèse, ainsi que les protocoles d'échange associés.

### 3.3.1.1 Acide oléique (OA)

<figure><img src="image_93.png" /></figure>

L'acide oléique est un acide gras répandu dans la nature, présent dans les huiles végétales et le corps humain – sous une forme triglycéride. Contenu dans les savons ou les produits cosmétiques, il est

<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>FIGURE 3.18 – Résumé des techniques utilisées pour l'analyse de l'interface QD/ligand, regroupées par domaine. Extrait de [205].</figcaption></figure>

72. Il est parfois nécessaire de fournir un apport d'énergie sous la forme d'agitation ou de chaleur, notamment lorsque l'échange de ligands vise à transférer les QDs dans un environnement aqueux dans lequel la solubilité n'est pas possible au départ.

<caption>FIGURE 3.19 – Structure de la molécule acide oléique (OA).</caption>
couramment utilisé dans les synthèses de nanoparticules pour influen-
cer la cinétique de réaction et ainsi contrôler la taille comme la la mor-
phologie des produits de la synthèse – voir [213] par exemple. Dans
le cas des boites quantiques, plusieurs travaux ont eu pour objectif
de remplacer la voie purement "organo-métallique", utilisée dans les
années 90 [152], par des approches plus écologiques, plus simples, et
nécessitant des éléments moins toxiques<sup>73</sup>. Cela a de plus permis une
progression des connaissances sur la croissance des nanocristaux en
général et les moyens de la contrôler. L'acide oléique s'est ainsi imposé
dès le début des années 2000 comme un ligand de surface de choix, que
ce soit comme environnement de synthèse et/ou comme stabilisateur
colloïdal de QDs en milieux organiques [184, 186, 216-222]. C'est le
ligand de surface de nos boites quantiques après synthèse, incompa-
tible avec notre processus de fonctionnalisation final<sup>74</sup> et qui nécessite
donc d'être remplacé pour la suite des expériences.

73. Par exemple, le remplacement du diméthylcadmium Cd(CH₃)₂ par l'oxyde de cadmium CdO, le séléniure de trioctylephosphine Se-TOP par du Se élémentaire, etc. [214-216]

74. Voir chapitre 4.

3.3.1.2 Trioctylphosphine et son oxide (TOP/TOPO)

<figure><img src="image_95.png" /><figcaption>FIGURE 3.20 – Structure des molécules trioctylephosphine (TOP) et oxide de trioctylphosphine (TOPO).</figcaption></figure>

Sous l'inspiration des travaux de Stuczynski *et al.* [223], le TOP ou les mixtures TOP/TOPO ont d'abord été introduits comme solvant pour la synthèse de QDs CdSe par Murray *et al.* [152], sur la base de la stabilité et facilité de préparation des composés TOP-Se. Ils ont progressivement été mis de côté pour cet usage au profit de solvants non-coordonnants<sup>75</sup> comme l'octadécène [217, 220-222]. Cela permet notamment un plus grand contrôle de la nucléation et croissance des QDs en jouant sur l'ajout de ligands de surface en cours de synthèse. Le TOP ou les mélanges TOP/TOPO restent néanmoins couramment utilisés comme ligand de surface en milieu organique, car cela permet une stabilisation colloïdale relativement efficace mais plus labile que ce qui est obtenu avec l'OA<sup>76</sup>. Ce sont typiquement ces ligands que nous avons donc utilisés pour nos préparations de surfaces de QDs en milieu organique.

75. Ne formant pas de complexe de coordination avec les ions métalliques en solution.

76. En raison de la taille inférieure des chaines carbonées et d'une moindre rigidité en l'absence de double liaison, ce qui facilite les processus de fonctionnalisation.
### 3.3.1.3 Acide dihydrolipoïque-sulfobétaïne (DHLA-SB)

<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>FIGURE 3.21 – Structure de la molécule acide dihydrolipoïque-sulfobétaïne (DHLA-SB).</figcaption></figure>

Le DHLA-SB a été introduit comme ligand de surface en milieu aqueux en 2010, par l'équipe de T. Pons et en particulier dans les travaux de E. Muro [224-226]. Il s'agissait d'une réponse aux limitations de 2 ligands classiques à ce moment : le DHLA et le PEG, parfois utilisés de manière couplée. Les *thiols* (terminaisons SH) sont notamment connues pour former des liaisons stables avec l'or, et ainsi à la base de nombreuses applications en nanosciences [227]. Dans le cas de QDs présentant du souffre sur leur couche externe, les *thiols* peuvent former des ponts disulfures. Les QDs stabilisées par des ligands de surface DHLA permettaient d'obtenir des nanoparticules stables et compactes, mais propices aux interactions non-désirées en raison de leur charge négative. L'utilisation de PEG permettait de limiter ces soucis contre une moindre stabilité dans les milieux salés et une taille de nanoparticules plus importante, pouvant empêcher leur utilisation comme sonde dans certains environnements biologiques. L'utilisation d'une terminaison SB zwiterionnique permet de répondre à ces différents impératifs sans compromis<sup>77</sup>. Pour rendre nos QDs compatibles avec une fonctionnalisation en milieu aqueux, ce fut notre premier choix.

77. Les zwitterions sont des espèces chimiques disposant de charges locales opposées sur des atomes non-adjacents, dont le signe effectif dépend du pH, ce qui leur confère des propriétés très intéressantes pour la bio-compatibilité et la passivation de surface [228-230].

### 3.3.1.4 Acide mercaptopropionique (MPA)

<figure><img src="image_97.png" /><figcaption>FIGURE 3.22 – Structure de la molécule acide mercaptopropionique (MPA).</figcaption></figure>

Le MPA est un ligand de surface basé sur une accroche mono-thiol<sup>78</sup>, très labile en raison de (a) sa petite taille ; (b) la sensibilité de l'accroche à la photo-oxydation ; et (c) la facilité de formation de ponts disulfures entre ligands MPA, qui ne peuvent alors plus se lier aux QDs [231-233]. À notre connaissance, sa première utilisation comme stabilisateur colloïdal de boites quantiques provient des travaux de Mitchell *et al.* [234]. Il faut noter que les QDs[MPA], solubles dans le N,N-diméthylformamide (DMF), ne deviennent compatibles avec les solvants aqueux qu'à la condition de d'abord déprotoner les ligands

78. Contrairement aux ligands basés sur le DHLA, dont l'accroche est qualifiée de bi ou di-thiol.
MPA par réaction avec un composé basique, puis maintenir l'environnement à un pH ≥ 8. Dans ces conditions, les QDs[MPA] obtenus sont stables, et surtout monodisperses, à l'échelle d'une journée. Nous nous sommes repliés sur ces ligands de surface après nos difficultés à utiliser les QDs[DHLA-SB] pour la réalisation de surfaces fonctionnalisées ou pour les expériences de FRET<sup>79</sup>.

79. Voir chapitres 4 et 5.

### 3.3.2 PROTOCOLES D'ÉCHANGES DE LIGANDS

#### 3.3.2.1 QDs[TOP] dans le toluène

Pour obtenir des QDs[TOP], on introduit, dans un tricol 250 mL, un quart d'une synthèse de QDs[OA] (2,5 mL) avec 10 g de TOPO<sup>80</sup> et 5 mL de TOP<sup>81</sup>. L'ensemble est chauffé sous agitation jusqu'à atteindre 70°C, ce qui fait fondre le TOPO. On dégaze alors le contenu du tricol pour évacuer l'héxane et l'oxygène, avant de passer sous atmosphère argon. On laisse le mélange sous argon et avec agitation durant 1 h à 70°C, puis l'on récupère la solution résultante dans des tubes Falcon<sup>82</sup> de 50 mL que l'on complète avec de l'éthanol. Après une centrifugation à 10 000 g pendant 5 min, on peut jeter le surnageant et resolubiliser les QDs[TOP] dans de l'héxane ou du toluène<sup>83</sup>, au choix.

80. 223301-100G, 99%, Sigma-Aldrich.

81. 718165-100ML, 97%, Sigma-Aldrich.

82. 734-0448, VWR.

83. 179418-2.5L, 99,5%, Sigma-Aldrich.

#### 3.3.2.2 QDs[DHLA-SB] dans un tampon Hepes

Cet échange de ligands nécessite 2 grandes étapes : (a) l'échange de ligand et (b) l'ultrafiltration des QDs[DHLA-SB] obtenus<sup>84</sup>. Avant toute chose, on dissout 100 mg d'acide lipoïque-sulfobétaïne LA-SB<sup>85</sup> avec 2 mL d'eau distillée ultra-pure, dans une fiole de 25 mL. Sous agitation, on ajoute 20 mg de borohydrure de sodium<sup>86</sup> NaBH<sub>4</sub>, ce qui va permettre d'ouvrir le cercle aromatique à 2 soufres, qui vont être protonés, nous permettant alors d'obtenir une solution aqueuse de DHLA-SB sous 30-45 min. En parallèle, il faut rinçer les QDs[OA] pour éliminer le maximum d'OA présent. Une quantité de 4 nmol de QDs[OA], généralement entre 100 et 150 µL, est mélangée à au moins 1,5 mL d'éthanol dans un tube à centrifuger 2 mL pour rinçage. Après 5 min à 13 300 g<sup>87</sup>, on remplace le surnageant résultant par de l'éthanol. L'ensemble est mis aux ultrasons pour redispersion, et l'on centrifuge une nouvelle fois. Les QDs rincés et précipités sont ensuite repris dans 2 mL de chloroforme<sup>88</sup>, puis mélangés à la solution de DHLA-SB. La fiole de 25 mL utilisée permet d'étaler les solutions non miscibles et ainsi maximiser la surface d'échange. Après avoir laissé l'ensemble sous agitation durant 1 h, la plupart des QDs sont passés en phase aqueuse. La fiole avec bouchon non vissé est laissée dans une étuve à 60°C, sans agitation pendant une nuit, pour évaper le chloroforme à travers la phase aqueuse et compléter l'échange de ligands. On obtient alors une solution de QDs[DHLA-SB] limpide, d'environ 1,5-2 mL avec parfois un reste de chloroforme<sup>89</sup>. L'ultrafiltration de la solution obtenue nécessite l'utilisation de tubes à centrifugation Vivaspin 500 µL<sup>90</sup>, disposant de membranes de filtration en PES et d'un

84. Ce protocole est adapté de Muro *et al.* [224].

85. Fourni par T. Pons.

86. 4051.1, 97%, Roth.

87. Sauf précision contraire, ces mêmes paramètres seront conservés pour chaque occurrence du mot "centrifugation" dans cette partie et la suivante.

88. 1.02445.2500, 99-99,4 %, Supelco.

89. Pour résoudre cela, il est possible de centrifuger l'ensemble à 9000 g durant 5 min pour obtenir une nette séparation des phases, ce qui facilite l'extraction de la phase aqueuse surlageante

90. VS0132, Sartorius Stedim Biotech. 10459512, Fisher Scientific.
réservoir. On effectue tout d'abord une centrifugation de rinçage avec 4 tubes remplis d'eau distillée ultra-pure, ce qui permet de nettoyer les membranes de filtration de potentielles traces de glycérine et azide de sodium, minimisant ainsi tout risque de pollution. La solution de QDs[DHLA-SB] est ensuite répartie dans les 4 tubes, puis l'on centrifuge à 13 300 g durant 30 min, ce qui concentre en 25 µL environ les 500 µL présents au départ dans chaque tube⁹¹. On complète alors les tubes avec une solution de tampon Hepes à 0,1 M dans laquelle on ajoute du 200 mM de NaCl, et dont le pH est ajusté à 8 *via* l'ajout de soude NaOH à 10 M. Cette préparation est centrifugée 10 min pour rinçer les QDs. Après avoir répété cette opération de rinçage, on récupère des QDs[DHLA-SB] concentrés dans l'Hepes, pour une concentration proche de 30-40 µM sans dilution⁹².

### 3.3.2.3 QDs[MPA] dans un tampon NaHCO<sub>3</sub>

De même que pour l'échange de ligands de surface précédent, nous procédons en 2 grandes étapes : ici il s'agit (a) de l'échange de ligands proprement dit et (b) le transfert vers un solvant aqueux⁹³. La procédure de rinçage des QDs[OA] est la même que décrite dans la partie précédente, toujours pour une quantité de 4 nmol. Les QDs rincés et précipités sont ensuite repris dans un volume de 400 µL de MPA⁹⁴ et dispersés par ultrasons. La solution est laissée dans une étuve à 60°C pendant une nuit sans besoin d'agitation, pour compléter l'échange de ligands. Après quoi on ajoute 1 mL de chloroforme et l'on centrifuge pour faire précipiter les QDs[MPA], qu'il est ensuite possible de reprendre dans 0,5-1 mL de N,N-diméthylformamide (DMF)⁹⁵. Pour pouvoir transférer ces QDs[MPA] dans l'eau, il faut alors ajouter 20-40 mg de *tert*-butoxide de potassium⁹⁶ t-BuOK puis soumettre l'ensemble aux ultrasons pour disperser le tout et déprotoner les ligands MPA. Ce mélange est centrifugé, et le surnageant évacué. Après une redispersion pour rinçage dans l'éthanol, suivi d'une centrifugation, on peut évacuer le surnageant pour alors solubiliser les QDs[MPA] dans 400 µL de tampon bicarbonate de soude NaHCO<sub>3</sub> à 0,1 M, dont le pH est ajusté à 9 avec de la soude NaOH à 10 M. Après avoir effectué un spectre d'absorption, on peut vérifier que la concentration de la solution obtenue se situe bien aux alentours de 10 µM, comme il est prévu au regard des 4 nmol initialement prélevés⁹⁷.

### 3.3.3 CARACTÉRISATIONS SPECTRALES EN SOLUTION ET SUR SURFACES

Comme nous l'avons présenté en partie 3.3.1, les propriétés physiques des QDs peuvent être affectées par les ligands de surface, en particulier dans le cas de cœurs sans coquilles. Avec coquilles, cet effet est normalement marginal, cependant, nos mesures spectrales ont montré qu'il était bien possible d'observer des modifications en fonction des ligands de surface. La Figure 3.23 (a) montre que, lorsque caractérisés en solution⁹⁸, tous les échanges de ligands ne produisent pas les mêmes effets. L'échange OA(Héxane) → TOP(Toluène) ne modifie

91. Le solvant en trop est évacué dans un réservoir que l'on vide après la centrifugation.

92. Dilution qui peut néanmoins avoir son intérêt dans le but de minimiser les pertes lors de la récupération, tant qu'elle reste raisonnable : ces QDs sont stables en solution au moins 1 mois, lorsque stockés dans un réfrigérateur, à condition de rester au-dessus de 8 µM.

93. Ce protocole est repris de Matoussi *et al.* [235].

94. 63768-25ML, 99%, Sigma.

95. 270547-1L, 99,9%, Aldrich.

96. 156671-25G, ≥98%, Aldrich.

97. Le MPA ayant tendance à s'oxyder et former des ponts disulfures qui ne se lient plus aux QDs, ce type de solution doit être utilisée relativement rapidement, si possible dans la journée, et sans avoir effectué de rinçage trop important des ligands en excès.

98. Dans toute cette section, la concentration des solutions vaut environ 100 nM.
par le spectre de photoluminescence, les spectres sont donc confondus. À l'inverse, l'échange OA(Héxane) → DHLA-SB(Hepes/Eau distillée) produit un léger resserrement du profil d'émission et un décalage vers le rouge, ce qui est particulièrement notable lorsque l'on se focalise sur le pic d'émission en Figure 3.23 (b).

<figure><img src="image_98.png" /><figcaption>FIGURE 3.23 – Spectres normalisés de photoluminescence pour différents ligands de surfaces et solvants – première synthèse étudiée.</figcaption></figure>

Les Figures 3.24 (a) et (b) montrent, d'une part, que ce phénomène est reproductible sur une autre synthèse de boites quantiques et, d'autre part, que l'échange OA(Héxane) → MPA(NaHCO₃) produit lui aussi resserrement du profil et un décalage du pic d'émission, de façon moins prononcée. Les spectres de photoluminescence des cœurs de QDs sont donnés pour référence, et permettent de remarquer que l'opération de croissance des coquilles peut permettre de "rattraper" une mauvaise synthèse de cœurs, en réduisant la dispersion en taille des nanocris- taux.

Maximums d'émission des QDs :

[OA]/[TOP] : 607 nm

[DHLA-SB] : 609 nm

LMH des spectres :

[OA]/[TOP] : 35,2 ± 0,2 nm

[DHLA-SB] : 33,1 ± 0,1 nm

<figure><img src="image_99.png" /><figcaption>FIGURE 3.24 – Spectres normalisés de photoluminescence pour différents ligands de surfaces et solvants – seconde synthèse étudiée.</figcaption></figure>

Il est intéressant de noter qu'un phénomène semblable peut se produire au moment de la fonctionnalisation des boites quantiques sur substrat ⁹⁹. La Figure 3.25 nous montre en effet que, pour des QDs[TOP], le passage de la solution colloïdale à la monocouche sur verre montre là encore un décalage vers le rouge de quelques nanomètres. L'influence du milieu semble pour le coup jouer un rôle plus minime : le fait d'ajouter de l'eau sur la monocouche de QDs[TOP] ne modifie qu'à la marge

Maximums d'émission des QDs :

[OA]/[TOP] : 590-591 nm

[MPA] : 592 nm

[DHLA-SB] : 594 nm

LMH des spectres :

[OA]/[TOP] : 33,5 ± 0,2 nm

[MPA] : 31,3 ± 0,1 nm

[DHLA-SB] : 31,1 ± 0,1 nm
la position du maximum du spectre par rapport à celui de la même
monocouche, laissée à l'air libre. En ce qui concerne le resserrement
spectral, il est présent dans le cas d'une interface verre-eau, mais la mo-
nocouche en interface verre-air présente plutôt un léger élargissement.

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

Ce phénomène est moins marqué pour les QDs[MPA], comme le
montre la Figure 3.26, où les tracés des spectres de photoluminescence
de QDs sur surface sont remarquablement bien superposés. Plusieurs
éléments peuvent entrer en jeu et contribuer de manière complexe à ce
phénomène : la qualité des coquilles ; la différence de passivation des
surfaces de QDs selon les ligands ; l'influence du couplage avec la sur-
face [192] ; ainsi qu'un phénomène de FRET entre QDs compatibles par
leur légère différence de taille ¹⁰⁰. Le fait que l'on ne constate pas de
différence spectrale entre les QDs[OA] dans l'héxane et les QDs[TOP]
dans le toluène, comme nous l'avons illustré en Figures 3.23 et 3.24,
semble *a priori* mettre la qualité des coquilles hors de cause. À l'in-
verse, on constate un décalage spectral en solution alors qu'il ne peut
y avoir, dans cette situation, de FRET entre les QDs.

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

Pour tenter de déterminer les contributions respectives de l'échange
de ligands et la fonctionnalisation sur surface, la Figure 3.27 retrace les
différents spectres des 2 Figures précédentes, séparés par situation, en
se focalisant sur les pics d'émissions : en solution, à l'interface verre-

FIGURE 3.25 – Spectres nor-
malisés de photoluminescence
des QDs[TOP] dans différentes
situations, en solution ou en
monocouche.

Maximums d'émission QDs[TOP] :

En solution : 590-591 nm

Verre-Air : 593 nm

Verre-Eau : 594 nm

LMH des spectres :

En solution : 33,5 ± 0,2 nm

Verre-Air : 33,80 ± 0,06 nm

Verre-Eau : 32,20 ± 0,04 nm

100. Lunz et al. [236] ont étudié l'occurrence de FRET entre QDs de ce type lorsque déposées en monocouches et séparées de 5 nm ou moins. Les caractérisations MEB de nos surfaces dans le chapitre suivant montrent que nous nous situons bien dans cette configuration.

FIGURE 3.26 – Spectres nor-
malisés de photoluminescence
des QDs[MPA] dans différentes
situations.

Maximums d'émission QDs[MPA] :

En solution : 592 nm

Verre-Air : 593 nm

Verre-Eau : 593 nm

LMH des spectres :

En solution : 31,3 ± 0,1 nm

Verre-Air : 33,72 ± 0,07 nm

Verre-Eau : 32,12 ± 0,06 nm
air, et verre-eau. Il apparaît alors que le décalage spectral de 2 nm constaté en solution entre QDs[TOP] et QDs[MPA] disparaît après dépôt en monocouche, quelque soit la nature du milieu – air ou eau.

<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>(a) En solution</figcaption></figure>

<figure><img src="image_103.png" /><figcaption>(b) Sur surface Verre-Air</figcaption></figure>

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>(c) Sur surface Verre-Eau</figcaption></figure>

Nous proposons d'interpréter ces résultats de la manière suivante : en solution, la différence de structure, taille et liaison de nos ligands MPA induit une moins bonne passivation de la surface des coquilles que les QDs[TOP]. Après fonctionnalisation, les monocouches de QDs obtenues sont peu recouvertes de ligands dans les 2 cas, de telle manière que, quelque soit le ligand, l'éventuelle passivation est alors moindre. À défaut de pouvoir réaliser une étude détaillée parfaitement concluante, ces caractérisations spectrales nous permettent néanmoins de fixer un aspect instrumental important : pour optimiser la position du spectre d'émission de notre monocouche donneuse FRET, il est nécessaire d'anticiper le décalage spectral se manifestant après fonctionnalisation. Il faut donc synthétiser des boites quantiques d'émission centrée vers 590 nm plutôt que 600 nm, pour minimiser voire supprimer le signal de débordement spectral du donneur FRET dans la fenêtre de détection de l'accepteur ¹⁰¹.

FIGURE 3.27 – Comparaison des spectres normalisés de photoluminescence des QDs[TOP] et QDs[MPA] dans chaque situation.

## 3.4 CONCLUSIONS SUR LES BOITES QUANTIQUES

En présentant les propriétés fondamentales des boites quantiques, nous avons confirmé leur intérêt comme donneuses FRET. La démonstration de la maitrise de leur synthèse et des échanges de ligands nécessaires à la suite de nos travaux a été faite. J'ai également donné une estimation du rendement quantique de nos QDs. La caractérisation de leur spectre d'émission, tant en solution que sur surfaces, dans différentes conditions, nous a quant à elle permis de montrer que le ligand de surface des boites quantiques en solution n'a pas d'influence sur l'émission après leur fonctionnalisation ¹⁰². Nous avons aussi pu fixer un pic d'émission cible à 590 nm pour les synthèses devant nous fournir des boites quantiques adaptées à leur rôle de donneuses FRET pour le dispositif expérimental TIRF détaillé au chapitre 2. Le chapitre suivant va donc être l'occasion de nous focaliser sur le travail réalisé concernant la fonctionnalisation et microstructuration des QDs sur surfaces en verre.

101. Nous avons défini le débordement spectral du donneur en section 2.2.3.2 et présenté notre dispositif de sélection spectrale pour l'imagerie en 2.4.2.4. On montrera en chapitre 5, partie 5.3.3.3, que malgré notre anticipation, le débordement spectral du donneur, aussi faible soit-il, reste un signal polluant du FRET équivalent à l'excitation directe dans notre cas.

102. Dans la suite de ce document, on ne spécifiera donc les ligands utilisés que lorsque nous détaillerons les différences de protocole et résultats dans le processus de fonctionnalisation et microstructuration.
<figure><img src="image_105.png" /></figure>
# Microstructuration des surfaces

4

Ce chapitre présente le développement ainsi que la caractérisation de la fonctionnalisation et la microstructuration de surfaces de verre, à l'aide de nos QDs, pour l'imagerie NEF.

## 4.1 FONCTIONNALISATION À GRANDE ÉCHELLE DE LAMELLES DE VERRE

### 4.1.1 MÉTHODES DE FONCTIONNALISATION EXISTANTES

Dans la littérature, les expressions "fonctionnalisation de surface" ou "adsorption sur surface", dans le contexte des "boites quantiques", renvoient majoritairement vers des publications concernant la modification de surface des QDs en suspension colloïdale, assimilables aux démarches d'échanges de ligands que nous avons exposées au chapitre précédent – section 3.3.1 – ou aux procédures d'enrobage via une couche de silice par exemple. Ces nombreux travaux de recherche traduisent l'engouement actuel pour ces nanoparticules, autant en biophysique qu'en nanophotonique. Les QDs biofonctionnalisées sont utilisées comme marqueurs pour l'imagerie ou comme agents sensibilisants en thérapie photo-dynamique [237]. Elles sont également employées dans la fabrication de dispositifs opto-électroniques à faible coût, par des méthodes comme l'impression par injection (inkjet printing) [238].

Les travaux concernant l'utilisation de boites quantiques déposées sur des surfaces sont en comparaison moins nombreux, mais néanmoins variés. La méthode historique consistait généralement en un dépôt par spin coating de solutions colloïdales de QDs diluées dans une solution de polymère (PMMA, PEDOT, etc.), ce qui permet d'obtenir une couche mince de densité surfacique contrôlable selon la dilution [192]. Cependant, ce n'est pas la méthode la plus reproductible pour obtenir une parfaite monocouche, si bien que diverses alternatives ont été proposées à partir des années 2000 : épitaxie par jet moléculaire [239]; évaporation [240]; dépôt par couches atomiques [241] ou couches de poly-électrolytes alternés [242]; par contrôle de flux électro-osmotique [243] ou électrophorétique [244]; recuit de fusion [245]; méthode "Sol-Gel" [246]; déposition par laser pulsé [247]; ou encore écriture laser directe par faible absorption de photon unique [248].

Si ces méthodes permettent l'obtention, au choix, de monocouches denses de QDs comme de nanocristaux isolés¹, les boites quantiques sont ici généralement piégées dans une matrice. Il est donc impossible par la suite de les biofontionnaliser². Ainsi, les immobilisations de QDs sur surfaces visant une application en biologie tendent à privilégier des

4.1 Fonctionnalisation à grande échelle de lamelles de verre 81

Méthodes de fonctionnalisation existantes
Nettoyage et activation des surfaces
Silanisation de lamelles de verre
Adsorption des QDs

4.2 Microstructuration des QDs 95

Choix du procédé
Photo-lithographie UV avec PRIMO

Développement du protocole de microstructuration

Résolution et homogénéité des micro-motifs 2D de QDs

4.3 Conclusions sur la micro-structuration des QDs 106

1. Contribuant ainsi à des études ap-profondies sur des QDs uniques ou à diverses applications électro-optiques.

2. Une alternative étant de préparer des boites quantiques piégées dans un matériau hybride adapté [249, 250].
voies de fonctionnalisation reposant sur une simple couche d'accrochage intermédiaire, sur laquelle s'adsorbent les QDs – ce qui les laisse ensuite disponibles à diverses possibilités de bioconjugaison. Cette couche intermédiaire est généralement basée sur des protéines [251, 252] ou bien des espèces chimiques [253] auto-assemblées³, dont les composés de type silanes [254-258] sont parmi les plus répandus. Les applications concernées relèvent principalement du domaine des capteurs, et les surfaces ainsi fonctionnalisées ne sont pas nécessairement planes [259]. On notera que ces travaux ne s'attachent généralement pas à produire une caractérisation poussée du processus de fonctionnalisation lui-même, contrairement à ce qui peut être fait dans d'autres champs [260, 261].

Dans la première partie de ce chapitre, je présenterai la méthode de fonctionnalisation que nous avons retenue, et la caractérisation des surfaces résultantes. L'enjeu de la microstructuration sera abordé dans la seconde partie.

3. SAM dans la littérature, pour Self-Assembled Monolayers.

## 4.1.2 NETTOYAGE ET ACTIVATION DES SURFACES

Les surfaces de verre fonctionnalisées sont des lamelles de verre⁴ de 24×24 mm de côté, et 0,17 ± 0,01 mm d'épaisseur. Avant toute autre chose, ces lamelles doivent être nettoyées et activées. Deux procédures ont été retenues dans ce cadre.

4. 41014521, Hecht Assistent.

### 4.1.2.1 Mélange Piranha ($H_2SO_4 + H_2O_2$)

Le mélange dit "Piranha" est un moyen classique de nettoyage et d'activation des surfaces, constitué d'un mélange 50-50 d'acide sulfurique⁵ pur et d'eau oxygénée⁶ à 30 %. Ces deux composés réagissent ensemble de manière très exothermique pour former, notamment, des radicaux libres qui vont éliminer les contaminants organiques des surfaces de verre – Éq. (4.1.1) – comme cela est illustré en Figure 4.1. La surface présente (après 30 min à 1 h de traitement) des terminations SiOH, la rendant extrêmement hydrophile, au point qu'il n'est pas vraiment possible de mesurer un angle de contact lorsque l'on y dépose une goutte d'eau. Dans de précédents travaux de l'équipe, la rugosité d'une telle surface avait été caractérisée par AFM pour un résultat ≤ 1 nm [72].

5. X945.1, Roth.

6. 9683.1, Roth.

$$H_2SO_4 + H_2O_2 \rightarrow \underset{(4.1.1)}{HSO_4^-} + H_3O^+ + O^\bullet$$

<figure><img src="image_106.png" /><figcaption>FIGURE 4.1 – Traitement de la-melles de verre au Piranha.</figcaption></figure>
### 4.1.2.2 Ultrasons dans Éthanol 70 % + Plasma-Air

Une autre méthode permettant d'atteindre des résultats semblables consiste à nettoyer les lamelles de verre dans un bain à ultrason ⁷, pendant 5 min, dans une solution d'éthanol à 70 % pour éliminer les traces de contaminants. Après séchage à l'air comprimé, les lamelles sont en-suite exposées à un plasma-air ⁸ durant 2 min, généralement suffisant pour obtenir une surface très hydrophile – i.e. sans angle de contact mesurable. L'intérêt principal de ce type de méthode réside dans le fait que, par rapport au Piranha, elle présente des avantages tant du point de vue écologique que de la sécurité des personnes réalisant la manipulation.

7. Elmasonic S 10, Elma.

8. PDC-002, Harrick Plasma.

### 4.1.3 SILANISATION DE LAMELLES DE VERRE

Les silanes sont des monomères basés sur la présence d'un "cœur" de silicium Si, appartenant à la même colonne d'éléments que le carbone C mais d'électronégativité plus faible, donnant ainsi accès à des réactions typiques inaccessibles *via* des composés organiques classiques. Comme présenté dans l'ouvrage de synthèse de G. T. Hermanson [262], la grande réactivité de cette famille d'espèces chimiques et leur capacité à former des liaisons covalentes fait qu'elles sont couramment utilisées pour la réalisation de monocouches auto-organisées solidement liées à des surfaces de verre, de silicium, ou de PDMS⁹. La structure générale des composés organosilanes est présentée sur la Figure 4.2. Elle comprend un groupe fonctionnel ou réactif, noté R, à l'extrémité d'une chaîne alkyle. À l'autre extrémité de cet espaceur organique, on retrouve des sites de liaison de l'atome de silicium central, auquel sont également attachés jusqu'à trois groupes hydrolysables, notés X. L'intérêt de ce type de dérivés est de favoriser la liaison des QDs à une surface de verre, *via* d'une part, une réaction de couplage des groupes hydrolysables X avec la surface de verre et, d'autre part, l'accroche des QDs au groupe fonctionnel R.

9. Polydiméthylsiloxane.

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

FIGURE 4.2 – Structure générale d'un agent de couplage silane. Adapté de [262].

#### 4.1.3.1 Couplage des groupes hydrolysables des organosilanes

Les silanes les plus courants sont des alkoxysilanes, dont les groupes hydrolysables sont des chaînes carbonées courtes proches de l'éther méthylique ou éthylique ¹⁰ et doivent ainsi subir une hydrolyse préalable

10. Les silanes concernés étant alors respectivement nommés "méthoxysilanes" et "éthoxysilanes".
pour former un intermédiaire réactif appelé silanol, qui se couple en-
suite au substrat. Comme décrit par la Figure 4.3, la formation de si-
lanols est suivie d'une condensation à proximité de la surface de verre,
qui permet d'assembler les silanes ensemble en une matrice polymère
liée par des liaisons -Si-O-Si- ; puis d'une interaction avec la surface
de verre, avec apparition d'un réseau de liaisons hydrogène entre les
terminaisons -OH des silanols et les groupements -OH de la surface.

<figure><img src="image_108.png" /><figcaption>FIGURE 4.3 – Schéma des différentes réactions impliquées dans le couplage d'un organosilane à une surface inorganique contenant des groupes -OH disponibles, ici avec l'exemple d'un triéthoxysilane. Adapté de [262].</figcaption></figure>

À terme, une seconde réaction de condensation se produit ¹¹ et
génère un polymère d'organosilane lié à la surface de manière covalente,
avec des liaisons siloxane stables. Dans le cadre de la thèse, nous avons
essentiellement travaillé avec des méthoxysilanes et éthoxysilanes. Ces
derniers sont typiquement non-réactifs sans hydrolyse, tandis que les
méthoxysilanes sont plutôt utilisés dans un solvant organique anhydre
et forment spontanément des monocouches attachées à la surface de
verre par liens siloxanes [262].

11. Il peut être nécessaire de chauffer ou pomper pour éliminer l'eau.
### 4.1.3.2 Choix de la terminaison fonctionnelle

S'il existe des travaux poussés témoignant de la possibilité de fonctionnaliser une monocouche de QDs avec coquille ZnS relativement dense sur une surface, en utilisant des silanes terminés par un groupe amine¹² [260], notre équipe a choisi dès les travaux de L. Riachy [263] d'utiliser des silanes terminés par un thiol SH : MPTMS et MPTES¹³, dont la structure est présentée en Figure 4.4. Comme cela a déjà été mentionné en partie 3.3.1.3, les thiols forment des ponts disulfure avec le souffre de la couche externe des boites quantiques, ce qui permet d'obtenir *in fine* des couches de QDs immobilisées intégralement par des liaisons covalentes.

<figure><img src="image_109.png" /><figcaption>(a) MPTMS
Mercapto-propyl-tri-méthoxy-silane</figcaption></figure>

<figure><img src="image_110.png" /><figcaption>(b) MPTES
Mercapto-propyl-tri-éthoxy-silane</figcaption></figure>

12. APTMS :
Amino-Propyl-Tri-Méthoxy-Silane

13. Respectivement :
175617-25G, Sigma-Aldrich.
AB 111218, abcr.

FIGURE 4.4 – Structure des silanes MPTMS et MPTES utilisés. Le code couleur reprend celui des Figures 4.2 et 4.3.

Le MPTMS est ainsi utilisé comme couche d'accrochage depuis au moins les années 1990 et encore de nos jours [264-266], pour sa grande réactivité facilitant l'obtention finale de monocouches de nano-particules (NPs) denses et résistantes, et n'impactant peu ou pas les différentes propriétés électro-optiques des NPs considérées [267, 268].

### 4.1.3.3 Protocoles de silanisation et caractérisation

Nous avons repris le protocole de silanisation en solution présenté dans l'ouvrage *Bioconjugate Techniques* [262], et testé divers ajustements pour sélectionner le processus le plus simple permettant d'arriver au résultat désiré¹⁴. Après activation au piranha ou au plasma-air des lamelles de verre, ces dernières sont placées en atmosphère neutre¹⁵ et incubées une nuit dans une solution de MPTMS diluée à une concentration entre 2 et 5 % dans du toluène anhydre¹⁶. On rince ensuite les échantillons dans un bain de toluène anhydre soumis aux ultrasons pendant 10 à 20 s, de manière à éliminer les silanes non liés de façon covalente à la surface.

Dans le cas des MPTES, l'incubation et le rinçage se fait dans les mêmes gammes de concentration. Le solvant utilisé est un mélange éthanol + eau distillée à 95 + 5 %, dont le pH est ajusté entre 4,5 et 5,5 avec de l'acide acétique. Il est recommandé de laisser se produire l'hydrolyse des MPTES durant au moins 5 min avant d'incuber les lamelles à fonctionnaliser. Hormis ces 2 variations, les étapes du protocole sont conservées à l'identique. Avant caractérisation par angle de contact, les surfaces silanisées obtenues sont ensuite soumises à un séchage dans une pompe à vide, ou dans une étuve – 30 min à 110°C.

14. Une monocouche dense de QDs sur une surface de verre.

15. Via une boite à gants sous argon, disposant de pièges à eau et oxygène.

16. 244511-2L, Sigma-Aldrich.
(a) Caractérisation par mesure d'angle de contact

Le principe de cette caractérisation est schématisé en Figure 4.5. L'étalement d'une goutte sur une surface dépend des 3 tensions d'interfaces : $\gamma_{SV}$, $\gamma_{SL}$, et $\gamma_{LV}$ – notations qui représentent respectivement les tensions de surface pour les interfaces solide-vapeur, solide-liquide, et liquide-vapeur. L'angle de contact $\vartheta_A$ à l'équilibre représenté sur la Figure 4.5 (a) est donné par la relation de Young – Éq. (4.1.2) – et permet alors d'évaluer la mouillabilité de la surface. Une surface hydrophile ou hydrophobe se caractérise ainsi par un petit ou grand angle de contact¹⁷. Après rinçage et séchage, elles sont amenées sur un banc de caractérisation permettant d'observer le profil des gouttes – Figure 4.5 (b). À l'aide d'une seringue, montée sur un pousse-seringue, on dépose une goutte d'eau distillée de 1 µL sur la lamelle. Une source de lumière diffuse permet d'acquérir, à l'aide d'une une caméra à l'opposé du banc, une image contrastée du profil de la goutte à partir de laquelle on peut estimer les valeurs d'angle de contact. La silanisation rendant la surface hydrophobe¹⁸, cette méthode est une façon rapide d'évaluer l'efficacité du dépôt, par comparaison avec une surface nettoyée et activée par piranha ou plasma-air.

$$ \cos \vartheta_A = \frac{\gamma_{SV} - \gamma_{SL}}{\gamma_{LV}} \quad (4.1.2) $$

17. Entre 0 et 180°, on a :
0-30° : très hydrophile à modérément hydrophile.

30-90° : modérément hydrophobe à hydrophobe.

90-150° : hydrophobe à très hydrophobe.

150-180° : super-hydrophobe

18. Comme indiqué en partie 4.1.2.1, les lamelles après nettoyage / activation sont extrêmement hydrophiles : $\vartheta_{A0} \approx 0°$ sert alors de référence.

<figure><img src="image_111.png" /></figure>

L'opération est répétée à plusieurs endroits de la lamelle pour évaluer l'homogénéité de la silanisation. Les résultats sont représentés via un graphe dit "boîte à moustaches" (boxplot), dont le principe est illustré sur la Figure 4.6. Cela permet de fournir une représentation rapide de la distribution des données. La largeur de la boîte n'a aucune signification et est simplement fonction de l'espacement choisi pour les points représentant des données de valeurs identiques. Sur les lamelles de verre utilisées pour ces caractérisations, il a été possible de déposer jusqu'à 26 gouttes sur une même lamelle. Certains résultats présentés dans les sections suivantes sont composés de distributions de plus de 26 points : ils sont obtenus par l'agrégation des données de plusieurs lamelles.

<figure><img src="image_112.png" /><figcaption>FIGURE 4.6 – Aide pour l'interprétation d'une figure type "boîte à moustaches".</figcaption></figure>
(b) Reproductibilité

Cette compilation de données ne vaut que si l'on peut montrer que le protocole est reproductible. Les résultats de notre expérience de vérification de cette reproductibilité sont présentés sur la Figure 4.7. Dans cette expérience, les lamelles de verre ont toutes été silanisées via une solution MPTMS diluée à 5 %. On constate qu'il peut y avoir une légère baisse de la qualité de la silanisation au cours du temps, tra-duite par une diminution de l'angle de contact moyen et une hausse de l'écart-type : 71,7 ± 2,0° en agrégeant les 2 premières caractérisations et 65,4 ± 3,8° pour les 2 suivantes. On reste malgré tout sur des valeurs bien supérieures à la référence avant silanisation de $\vartheta_{A0} \approx 0$.

<figure><img src="image_113.png" /><figcaption>FIGURE 4.7 – Reproductibilité de la silanisation des surfaces. Les angles $\vartheta_{AG}$ et $\vartheta_{AD}$ désignent respectivement l'angle de contact mesuré à gauche du profil de la goutte et l'angle de contact mesuré à droite.</figcaption></figure>

Cette modification au cours du temps s'explique tout simplement par la baisse d'efficacité de l'étape de nettoyage et activation, causée par le vieillissement¹⁹ de l'eau oxygénée (1) utilisée pour le mélange piranha. Ainsi, l'utilisation d'une nouvelle bouteille (2), permet de retrouver des distributions de mesures semblables aux caractérisations initiales, avec un angle de contact agrégé de 70,5 ± 2,4°. On confirme de plus que notre méthode fonctionne aussi bien pour des lamelles de verre borosilicate que des substrats de silicium pur²⁰. Il faut toutefois remarquer qu'en raison de la taille bien plus réduite des échantillons Si, le nombre de mesures est limité à 5 ou 6 points par échantillon.

(c) Comparaison des méthodes de séchage

Comme le montre la Figure 4.8, notre méthode de caractérisation n'a pas permis de mettre en évidence une variation significative de la valeur moyenne des angles de contact entre les surfaces traitées par pompe à vide ou à l'étuve²¹. Cependant l'homogénéité est meilleure lorsque l'on pompe sous ultra-vide : les valeurs d'angle de contact agrégé valent respectivement 73,8 ± 3,9° après dégazage à la pompe, et 74,8 ± 5,3° après séchage à l'étuve. Cela peut s'expliquer par le fait que l'étuve utilisée est commune au laboratoire, et que son utilisation a plus de probabilité d'entrainer des contaminations – même si cela reste peu prononcé.

19. Une fois la bouteille ouverte, la concentration de l'eau oxygénée diminue car cette dernière se dismute, selon l'équation :

$$2\text{H}_2\text{O}_2 \rightarrow 2\text{H}_2\text{O} + \text{O}_2$$

20. Que nous avons utilisées pour nos premiers tests d'images MEB des surfaces de QDs, l'imagerie MEB sur lamelles de verre n'étant pas aisée.

21. Les lamelles de verre ont toutes été nettoyées par le même mélange piranha, et silanisées via la même solution MPTMS, de nouveau à 5 %.
<figure><img src="image_114.png" /></figure>

FIGURE 4.8 – Comparaison entre les méthodes de séchage *via* pompe ou étuve. Les angles $ϑ_{AG}$ et $ϑ_{AD}$ désignent respectivement l’angle de contact mesuré à gauche du profil de la goutte et l’angle de contact mesuré à droite.

(d) Comparaison MPTMS / MPTES

Enfin, nous avons comparé les angles de contact obtenus entre les silanisations MPTMS et MPTES. Conformément aux stratégies de silanisation exposées en [262], nous avons caractérisé l'utilisation de MPTES à différentes concentrations comprises dans l'intervalle 2-5 %, avec comme référence notre silanisation MPTMS par incubation à 5 %. Les résultats de l'expérience 1, rapportés en Figure 4.9 (a), semblent suggérer que les surfaces MPTES sont moins hydrophobes que leurs homologues MPTMS pour les incubations à concentration faible 22, l'angle de contact moyen du MPTES à 2 % valant 59,2 ± 3,1°, contre 66,2 ± 2,9° pour le MPTMS à 5 %. Cela est cependant réfuté lors d'une 2e expérience – cf. Figure 4.9 (b) – où des résultats très similaires ont été obtenus : 68,1 ± 2,5° contre 70,5 ± 2,3°. Dans l'expérience n°2, les lamelles MPTES ont cette fois-ci été caractérisées en premier. Le banc de mesure d'angles de contact étant situé hors des salles blanches où sont réalisées les étapes de fonctionnalisation, on peut supposer que la silanisation MPTES, sur l'ensemble de l'intervalle 2-5 %, est en réalité autant efficace que la silanisation MPTMS à 5 %, mais qu'elle se dégrade plus rapidement.

22. Ce qui traduirait une moindre densité de la fonctionnalisation.

<figure><img src="image_115.png" /></figure>

Nous avons donc vérifié l'efficacité et la fiabilité de notre étape de silanisation, pour 2 types de silanes différents. Au cours de la suite du projet doctoral, nous avons finalement privilégié les MPTMS pour leur compatibilité avec notre protocole de microstructuration – voir section 4.2.3.3. L'expression "lamelles silanisées" désignera ainsi par la

FIGURE 4.9 – Comparaison entre les silanes sur leurs domaines respectifs de concentrations d'incubation.
suite "lamelles fonctionnalisées avec des MPTMS". Nous avons aussi
baissé la concentration d'incubation des MPTMS à 2 % sans que cela
n'influence les surfaces de QDs résultantes, mais nous n'avons malheu-
reusement pas eu l'occasion de contrôler cela par mesure d'angles de
contact en raison de l'indisponibilité du banc de mesure, en réparation.

4.1.4 ADSORPTION DES QDS

Pour adsorber les boites quantiques sur les lamelles silanisées, ces dernières ne sont pas séchées mais directement ré-incubées après le rinçage dans une solution de toluène anhydre accompagné d'ultrasons. La concentration de la solution de QDs utilisée pour cette nouvelle incubation vaut environ 1 µM, ce qui permet d'affaiblir l'effet de stabilisation des ligands de surface, sans pour autant produire une agrégation rapide de la solution colloïdale. Dans le cas des QDs[TOP], la solution diluée est filtrée avant incubation à l'aide d'un filtre en PTFE<sup>23</sup> dont la porosité vaut 20 nm, afin d'éliminer tout agrégat éventuel. L'incubation doit durer environ 24 h, puis est rincée au toluène anhydre. Pour les QDs[MPA], 15 à 20 min d'incubation suffisent, et le rinçage se fait à l'eau distillée. Cependant, le meilleur filtre compatible avec des solutions aqueuses<sup>24</sup> à notre disposition permettait de filtrer jusqu'à 200 nm seulement. Il était donc inutile de l'utiliser.

23. Anotop 10 Plus, Whatman.
GE Healthcare Life Sciences.
WHA68093002, Sigma-Aldrich.

24. À base de polyfluorure de vinylidène (PVDF).

4.1.4.1 Nécessité du changement de ligands

Obtenir une adsorption efficace nécessite que les boites quantiques
colloïdales utilisées disposent de ligands de surface adaptés. Comme
cela a été exposé en partie 3.3, les QDs après synthèse sont stabilisées
via de l'acide oléique OA. Les longues chaînes carbonées de ce genre ne
permettent pas le dépôt d'une monocouche homogène de nanocristaux
sur les silanes, comme le montre la Figure 4.10 (a).

<figure><img src="image_116.png" /></figure>

FIGURE 4.10 – Images TIRF des surfaces obtenues, avec QDs[OA] et après échange de ligands avec des QDs[TOP] ou QDs[MPA]. Couleurs artificielles.

En milieu organique, il convient donc de préalablement réaliser
l'échange de ligands OA(Héxane) → TOP(Toluène)²⁵, ce qui per-
met d'obtenir des surfaces présentant une monocouche dense et ho-
mogène, comme l'illustre la Figure 4.10 (b). Dans le cas de solutions
colloïdales aqueuses, le ligand DHLA–SB²⁶ stabilisait tellement bien

25. Voir parties 3.3.1.2 et 3.3.2.1

26. Voir présentation en 3.3.1.3
les QDs qu'il ne nous était pas possible de fixer les boites quantiques sur la surface de verre, ainsi avons nous privilégié l'échange de ligands OA(Héxane) → MPA(Eau+NaHCO₃)²⁷. Nous allons maintenant pouvoir discuter des caractéristiques des surfaces ainsi obtenues, en comparant les résultats obtenus avec les QDs[TOP] et QDs[MPA].

27. Voir parties 3.3.1.4 et 3.3.2.3

### 4.1.4.2 Caractérisation des lamelles homogènes QDs[TOP] / QDs[MPA]

#### (a) Densité surfacique de QDs et homogénéité

L'évaluation de la densité surfacique des boites quantiques sur nos surfaces est faite à partir d'images MEB²⁸. Je remercie à ce titre Jérémie Béal pour le temps passé avec moi à réaliser ces images. Les valeurs présentées sont obtenues à partir d'un décompte manuel des QDs sur 3 à 5 images différentes²⁹, enregistrées sur une même lamelle. Nous avons en effet réalisé cette caractérisation conjointement avec une caractérisation TIRF, ce qui imposait d'utiliser des lamelles de verre, sur lesquelles le contraste n'était généralement pas suffisant pour que les décomptes issus d'algorithmes de traitement d'images soient fiables.

Les QDs[TOP] présentent une dynamique d'adsorption très lente : il faut au moins 24 h pour atteindre une densité surfacique de l'ordre de 3000 QDs/µm². À l'inverse, les QDs[MPA] atteignent une densité surfacique de 2000 QDs/µm² en 1 min seulement, qui peut monter jusqu'à plus de 5000 QDs/µm² au bout de 6 h d'incubation³⁰ – cf. Figure 4.11 (a). Cependant, nous avons pu constater, en imagerie TIRF comme au MEB, une organisation préférentielle des QDs sous la forme d'oligomères³¹, favorisant la formation de complexes 3D dans le cas d'une incubation de QDs[MPA] au-delà de 30 min. Cela crée une rupture dans l'homogénéité de nos surfaces, comme cela est illustré en Figure 4.11 (b) et (c). Nous avons donc dû nous limiter à des temps d'incubation de 15 à 20 min, ce qui correspond au début d'un plateau de densités surfaciques entre 3000 et 4000 QDs/µm² sur l'intervalle de temps d'incubation 15 min à 2 h.

28. MEB à effet de champ. SU 8030 FEG-SEM, Hitachi.

29. Pour des grandissement différents.

30. La taille de nos QDs synthétisés valant 10 nm environ, les différentes densités surfaciques mentionnées correspondent respectivement à des taux de remplissage d'environ 30 ; 20 ; et 50 %.

31. Constat valable aussi bien pour les QDs[TOP] que les QDs[MPA].

<figure><img src="image_117.png" /></figure>

Les cercles jaunes mettent en évidence les complexes 3D de QDs qui apparaissent à partir de 30 min d'incubation.

**FIGURE 4.11** – Influence du temps d'incubation sur la densité surfacique des QDs[MPA].
Concernant la caractérisation de l'homogénéité des surfaces, la mé-thode employée est la suivante : sur chaque image TIRF, on extrait les valeurs des pixels issus de la zone centrale, sur un carré de grande envergure pouvant aller jusqu'à 30×30 ou 50×50 µm². À partir de ces données, il est possible de calculer la valeur moyenne $\langle I \rangle$ et l'écart-type $\sigma_I$ du signal de photoluminescence enregistré. L'écart-type $\sigma_I$ peut être normalisé par rapport à la valeur moyenne, et exprimé en pourcentages – Éq. (4.1.3). Cette grandeur, notée $\sigma_N$, permet ainsi d'évaluer l'ho-mogénéité du signal de photoluminescence sur une image. Enfin, pour caractériser l'homogénéité des surfaces à l'échelle d'une lamelle entière, on enregistre 10 images à différents points de la lamelle. Cela permet de calculer la grandeur $\sigma_{NL} – Éq. (4.1.4) –$ à partir de la moyenne $M_{\langle I \rangle}$ des valeurs de $\langle I \rangle$, et de l'écart-type $\sigma_{\langle I \rangle}$. La Figure 4.12 illustre, pour une lamelle, les acquisitions d'images nécessaires à l'obtention de ces différentes grandeurs.

J'ai tout d'abord quantifié l'éventuel effet de la taille de la surface d'analyse. À partir de 10 images sélectionnées aléatoirement, la Figure 4.13 (a) permet d'estimer que ce biais issu d'aires d'extraction différentes se situe dans un intervalle de 1 à 2 % pour une variation de 10 µm de côté de la surface d'analyse. La caractérisation de l'irradiance laser du montage – section 2.4.2.1 – nous permet d'attribuer cette légère variation au profil gaussien de l'illumination. Pour réaliser une évaluation comparative des surfaces que l'on peut obtenir via des QDs[TOP] ou QDs[MPA], on agrège les valeurs de $\sigma_N$ extraites de 60 à 70 images, réalisées sur un peu moins d'une dizaine de lamelles pour chaque configuration. Les distributions résultantes sont récapitulées en Figure 4.13 (b). On peut constater que les lamelles obtenues à partir de QDs[MPA] tendent à être légèrement plus homogènes, i.e. de valeurs $\sigma_N$ plus faibles, et ce malgré le biais de surestimation lié à l'aire d'extraction de pixels plus grande. Les valeurs aberrantes sont associées à la présence d'un complexe 3D de QDs sur l'image concernée. Dans les 2 situations, nous obtenons des surfaces dont le signal présente une variabilité locale majoritairement comprise dans l'intervalle 6-12 %.

$$ \sigma_N = \frac{\sigma_I}{\langle I \rangle} \qquad (4.1.3) $$

$$ \sigma_{NL} = \frac{\sigma_{\langle I \rangle}}{M_{\langle I \rangle}} \qquad (4.1.4) $$

<figure><img src="image_118.png" /><figcaption>FIGURE 4.12 – Schéma du processus d'obtention des grandeurs $\sigma_N$ et $\sigma_{NL}$.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_119.png" /><figcaption>FIGURE 4.13 – Caractérisation de l'homogénéité des surfaces de QDs par imagerie TIRF.</figcaption></figure>
La Figure 4.13 (c) propose une comparaison des valeurs moyennes de $\sigma_{NL}$ obtenues pour les lamelles de QDs[TOP] et QDs[MPA] étudiées. La grandeur $\sigma_{NL}$ est très synthétique, ce qui limite le nombre de points. On peut néanmoins constater que l'on a, à l'échelle de lamelles entières, une variation entre 4 à 9 %. L'ensemble de ces données permet donc de démontrer une bonne homogénéité du signal de photoluminescence, que ce soit à l'échelle locale d'une aire d'acquisition qu'à l'échelle globale d'une surface millimétrique. Ces résultats montrent aussi une bonne homogénéité entre des lamelles différentes. Tout cela démontre la robustesse de notre méthode de fonctionnalisation.

(b) Dynamique temporelle de la photoluminescence des surfaces

Une propriété photo-physique étonnante des boites quantiques consiste en leur photo-activation progressive, comme présenté au début du chapitre précédent³². Ce phénomène est très marqué sur nos surfaces de QDs, et nous avons donc pris soin de le caractériser via des images TIRF acquises périodiquement, toutes les minutes, sous une illumination continue durant 10 min, et cela à divers niveaux d'irradiance. La Figure 4.14 récapitule les dynamiques de photoluminescence des lamelles QDs[MPA] étudiées précédemment, dans le cas d'une interface verre/air. Le niveau de photoluminescence³³ est normalisé par l'image acquise à $t = 0$. On peut constater que ni la densité surfacique ni l'irradiance laser ne semblent influencer l'évolution de la photo-activation.

<figure><img src="image_120.png" /></figure>

(a) ~2000 QDs/µm²

<figure><img src="image_121.png" /></figure>

(b) ~3500 QDs/µm²

<figure><img src="image_122.png" /></figure>

(c) ~5500 QDs/µm²

Différentes densités surfaciques de QDs, à une interface verre-air, pour plusieurs niveaux d'irradiances laser à 458 nm.

Si l'on choisit cette fois de faire varier la nature du milieu qui recouvre la surface et/ou la nature des ligands des QDs, on peut alors observer des dynamiques très variées. La Figure 4.15 montre l'effet du changement de milieu pour différentes irradiances d'illuminations. Chaque courbe est construite de la même manière que précédemment. L'ajout d'eau distillée par rapport au cas verre/air produit un photoblanchiment précoce après une courte période de photo-activation, d'autant plus prononcé que l'irradiance laser est importante. Remplacer l'eau distillée par une solution de tampon Hepes à pH basique³⁴ permet d'atténuer légèrement cette photo-dégradation, sans pour autant modifier significativement la dynamique observée.

32. Voir section 3.1.2.3.

33. Les points représentent les valeurs moyennes $\langle I \rangle$ du signal sur l'aire extraite d'une image TIRF, et l'enveloppe à l'écart-type $\sigma_I$ correspondant.

FIGURE 4.14 – Évolution temporelle de la photoluminescence des surfaces de QDs[MPA] sous illumination continue.

34. Hepes 10 mM, NaCl 200 mM, pH = 8 ajusté via l'ajout de NaOH.
<figure><img src="image_123.png" /></figure>

(c) 0,056 W/cm² ; t<sub>acq</sub> = 100 ms

Pour une irradiance supérieure à 1 W/cm², on observe une photo-
dégradation notable de la photoluminescence. Il est possible de re-
stabiliser les boites quantiques avec des ligands de surface plus adaptés.
En l'occurrence, nous avons utilisé le ligand de biofonctionnalisation
His-RGD que nous présentons avec son protocole d'utilisation dans le
chapitre 5, section 5.1.2.1. Lorsque les QDs sont stabilisées par ce li-
gand, on constate une nette amélioration de la photo-stabilité et même
une amplification de la photoluminescence. Le photo-blanchiment est
quant à lui réduit au domaine des fortes irradiances d'illumination
(> 1 W/cm²) et absent en-dessous.

FIGURE 4.15 – Évolution tem-
porelle de la photoluminescence
des surfaces de QDs sous illumi-
nation continue, pour différents
milieux, ligands et irradiances.

(c) Relation entre luminescence et densité surfacique

Dans le cadre des études FRET, il est souvent utile d’estimer la stœ-
chiométrie donneur-accepteur. Pour notre méthode d’imagerie NEF, il
faut donc pouvoir évaluer la densité surfacique de boites quantiques
pour chaque échantillon. Passer systématiquement par de l’imagerie
MEB n’est ici pas envisageable pour des raisons de temps. Ainsi, nous
avons réalisé une calibration, par comparaison entre la luminescence
obtenue en TIRF – pour l’interface verre/air, avant toute biofonction-
nalisation ou passivation de surface – et la densité surfacique mesurée
à partir d’images MEB. La Figure 4.16 présente les résultats ainsi ob-
tenus avec les incubations à base de QDs[TOP] et QDs[MPA], qui per-
mettent de couvrir des intervalles de densité surfacique différents. Les
valeurs de photo-luminescence représentent le signal moyen extrait de
l’aire centrale 50×50 µm² des images TIRF obtenues à différentes irra-
diances laser et temps d’acquisition. La barre d’erreur correspondante
représente l’écart-type de la distribution de valeurs de pixels pour
l’aire considérée. De manière à limiter le biais lié à la photo-activation
présenté dans la partie précédente, l’acquisition des images associées
à une lamelle est précédée de 10 min d’illumination continue. Les va-
leurs de densité surfacique sont issues d’images MEB réalisées après ca-
ractérisation TIRF. La Figure 4.16 montre qu’il semble possible d’uti-
liser la photo-luminescence des surfaces pour discriminer relativement
finement la densité surfacique des QDs, lorsque cette dernière est plutôt
faible, i.e. < 3000 QDs/µm².
<figure><img src="image_124.png" /><figcaption>FIGURE 4.16 – Niveaux de photo-luminescence en fonction de la densité surfacique pour les QDs[TOP] et QDs[MPA].</figcaption></figure>

Cette méthode se révèle moins fiable pour les densités surfaciques élevées avec lesquelles nous travaillons, i.e. > 3000 QDs/µm². Il est d'ailleurs possible de mettre en évidence un phénomène de saturation de la photoluminescence en fonction de la concentration de boites quantiques en agrégeant et interpolant les données issues des incubations QDs[TOP] et QDs[MPA], comme cela est fait en Figure 4.17. Cette saturation est liée à la présence de plus en plus importante d'oligomères, voire d'agrégats de QDs sur la surface – Figure 4.11 (b). Au sein de ces structures, le self-quenching augmente avec le nombre de QDs, limitant ainsi l'augmentation de la photoluminescence générée lors de l'adsorption de QDs supplémentaires. Autrement dit, au-delà d'un certain seuil de concentration, le nombre de QDs "actifs" ³⁵ à l'intérieur d'un spot limité par diffraction (de diamètre ~0,25 µm²) est limité, et vaut ~150 QDs, ce qui est équivalent à ~30 QDs/px.

35. Susceptibles d'émettre simultanément des photons de luminescence.

<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>FIGURE 4.17 – Agrégation des données des Figures 4.16 (a) et (b). Ajustement par une fonction de saturation type Éq. (4.1.6); où y₀, a, et x_s sont 3 paramètres ajustables.</figcaption></figure>

$$y = y_0 + a \frac{x}{1 + \frac{x}{x_s}} \quad (4.1.6)$$
La Figure 4.17 montre également que l'on peut ajuster l'irradiance laser et le temps d'acquisition de manière à optimiser finement la confi-guration d'imagerie selon les priorités d'une expérience donnée : suivi au temps long à irradiance la plus faible possible, ou au contraire grande vitesse d'acquisition pour enregistrer un grand nombre d'images successives³⁶. L'exemple le plus parlant, à cet égard, est la proxi-mité des courbes obtenues pour les réglages (0,056 W/cm², 300 ms), (0,150 W/cm², 100 ms), et (1,231 W/cm², 20 ms), qui permettent tout trois d'atteindre un signal moyen ≥ 3000 coups/pixel, soit déjà 30 fois la valeur du bruit d'obscurité de la caméra.

36. Ce qui est nécessaire pour de l'ima-gerie super-résolue, comme on le verra au chapitre 6, section 6.3.2.

## 4.2 MICROSTRUCTURATION DES QDs

La pertinence des différentes voies de fonctionnalisation actée, la seconde partie de ce chapitre vise à montrer leur compatibilité avec l'exigence de microstructuration, que l'on a présentée dans notre pre-mier chapitre.

### 4.2.1 CHOIX DU PROCÉDÉ

#### 4.2.1.1 Méthodes de microstructuration existantes

Le champ des nanosciences a conduit, ces 20 dernières années, à la mise au point de diverses techniques de fabrication et structuration des substrats. Concernant la microstructuration des boites quantiques, cette diversité a largement été mise à profit, principalement poussée par les activités de recherche et développement des QLEDs³⁷. Les méthodes dominantes sont l'impression par injection [238, 269-273]; l'impression par transfert, par contact [274-278]; la photolithographie "directe" [279-283] où les QDs sont employées au sein d'un mélange photosensible; ou la photolithographie "indirecte", en au moins 2 éta-pes [284-287], où les QDs sont utilisées de façon indépendante. Il existe aussi des techniques plus exotiques, comme l'utilisation de chambres de microfluidique croisées [251]; le moulage/démoulage à partir d'un substrat préalablement structuré [288]; le brossage direct au pinceau à commande numérique [289]; ou la photostructuration assistée par FRET [290]. Lorsqu'une précision sub-micronique est nécessaire, la lithographie à faisceau d'électron (EBL) est une méthode éprouvée et donc souvent mise à profit [291-297]. Il existe toute une combina-toire de ces méthodes de microstructuration avec les méthodes de fonc-tionnalisation décrites en section 4.1.1. Sauf exceptions³⁸, il ne s'agit généralement pas de micro-structurer des monocouches; et, même dans ces exemples, les boites quantiques ne sont pas nécessairement dispo-nibles pour une bioconjugaison.

37. LEDs à base de QDs.
LEDs : *light emitting diodes*, soit diodes électroluminescentes.

38. Représentées par les travaux présentés dans les références [276, 284, 286, 296].

#### 4.2.1.2 Méthode envisagée

Sur la base de la fonctionnalisation présentée dans la thèse de L. Ria-chy [263] m'ayant précédé, et de nos propres résultats caractérisés en détail dans la première partie de ce chapitre, nous avons donc privilégié
la méthode de photolithographie "indirecte", via une microstructuration *top-down* avant fonctionnalisation, à l'aide d'une résine photosensible. L'avantage de cette méthode est qu'après microstructuration, les zones où la résine est éliminée permet de réaliser notre fonctionnalisation à grande échelle. À ce titre, le travail de Na et al. [285] en 2008 est à reconnaître comme précurseur. Cependant, l'absence d'optimisation de chacune des étapes de réalisation avait logiquement conduit à des résultats relativement décevants<fnref n="39" />. Outre la mise à profit d'une méthode de fonctionnalisation optimisée, permise par notre maîtrise de bout en bout des étapes de fabrication, l'apport de ce travail, exposé dans les sections suivantes, réside aussi dans son originalité : la réalisation de la photolithographie à l'aide d'un dispositif numérique à micro-miroirs (DMD)<fnref n="40" />.

## 4.2.2 PHOTO-LITHOGRAPHIE UV AVEC PRIMO

### 4.2.2.1 Principe des dispositifs numériques à micro-miroirs

Les objets appelés "dispositifs numériques à micro-miroirs" 41, communément utilisés dans les vidéo-projecteurs, reposent sur l'agencement matriciel de plusieurs centaines de milliers de miroirs déformables de taille micrométrique et individuellement contrôlables. Par exemple, ces derniers peuvent permettre de projeter sur un plan n'importe quelle image numérique, en commutant les différents miroirs en position *on* ou *off* de manière à inclure ou exclure du chemin optique telle ou telle partie du faisceau d'illumination – Figure 4.18. Faire alterner, à haute vitesse, les miroirs entre leur position *on/off* permet de plus d'obtenir différents niveaux d'intensité lumineuse.

<figure><img src="image_126.png" /><figcaption>FIGURE 4.18 – Schéma du principe d'un dispositif optique utilisant un DMD pour projeter une image sur un plan. Adapté de [298].</figcaption></figure>

Les DMD sont donc des systèmes intéressants pour la lithographie : plus besoin de masques en chrome coûteux, au profit d'un *design* rapidé du motif à l'aide d'un logiciel de dessin <fnref n="42" />. L'introduction de ces

<footnote n="39">39. Il est même difficile de parler de "micro-motifs" pour les qualifier.</footnote>

<footnote n="40">40. Digital Micromirror Device.</footnote>

<footnote n="41">41. Ou, parfois, "matrices à micro-miroirs".</footnote>

<footnote n="42">42. Comme Inkscape, logiciel libre et *open source*.</footnote>
dispositifs dans le champ de la photo-lithographie semble dater de
la fin des années 2000. À la suite de quelques travaux précurseurs,
Zhao *et al.* [299] en 2009 et Kattipparambil Rajan *et al.* [300] en 2010
démontraient la possibilité de créer à la volée des motifs sur résines
photo-sensibles, avec une précision de 10 à 20 µm, à partir de montages
rudimentaires maison, mis au point à partir de DMD commerciaux de
l'époque. Parallèlement, Chen *et al.* relevaient en 2009 la pertinence
d'employer un DMD pour microstructurer des protéines 43 sur une sur-
face en activant des fonctions thiols par irradiation UV [301] ; perti-
nence qui sera confirmée en 2012 par Waldbaur *et al.* [298] sur un mon-
tage optimisé permettant d'atteindre une résolution de 2,5 µm. Dans
un contexte d'engouement pour les méthodes de micropatterning cel-
lulaire [7], ces avancées ont généré une demande de mise au point d'un
outil "clé-en main" 44 dont le dispositif PRIMO est un représentant-
type.

43. Avec, là encore, une précision de l'ordre de la dizaine de µm² au maximum.

44. Aussi nommés avec malice : outils "presse-bouton".

4.2.2.2 Système optique PRIMO

Commercialisé par la société française Alvéole, le système PRIMO a
fait l'objet d'une publication de démonstration par Strale et al. [302] fin
2015. Le principe d'illumination de ce système est présenté Figure 4.19.
L'émission cohérente du laser UV passe à travers un diffuseur rotatif
RD, de manière à minimiser le phénomène de speckle. Le faisceau col-
limaté arrive ensuite sur le dispositif numérique à micro-miroirs DMD.
Les images sont projetées à l'aide d'un système imageur dont le der-
nier élément est un objectif de microscope ×10 ou ×20. L'ensemble
est piloté grâce au logiciel dédié "Leonardo" d'Alvéole, qui prend en
entrée des images de dimension 1824×1140 px codées en 8 bits, soit
256 niveaux de gris.

<figure><img src="image_127.png" /><figcaption>FIGURE 4.19 – Schéma du montage optique du système PRIMO d’Alvéole. Adapté de [302].</figcaption></figure>

UV laser : Diode laser à λ = 375 nm.

Li : diverses lentilles convergentes.

AD : Diaphragme d'ouverture.

Mi : Miroirs diélectriques UV montés sur une monture cinématique.

RD : Diffuseur rotatif.

DMD : Dispositif numérique à micro-miroirs.

DM : Miroir dichroïque placé dans la
tourelle de filtre du microscope.

Obj : Objectif du microscope.

Lorsque l'on suit le protocole d'utilisation constructeur, basé sur le
dépôt d'une couche de PLL-PEG que l'on va localement détruire *via*
l'ajout d'un photo-initiateur, la résolution annoncée des microstruc-
tures en utilisant un objectif ×20 est de 1,2 µm. Dans le cas où l'on
utilise un objectif ×10, cette résolution se situe vers 2 µm environ. La
dose UV d'illumination en mJ/mm² est réglable et la puissance laser
est modulable.

4.2.2.3 Utilisation de PRIMO dans la littérature

Le système PRIMO est, en toute logique, utilisé majoritairement
dans le champ de la biophysique et biologie cellulaire <fnref n="45" />. Depuis 2016,
on compte au moment de la rédaction de ce document presque 70 ar-
ticles scientifiques <fnref n="46" /> utilisant cet outil [303]. Il ne s'agit évidemment
pas ici de toutes les présenter en détail. Cependant, il est intéressant
de relever que les publications portent autant sur le micropatterning
cellulaire que la fabrication de chambres de microfluidique ou la struc-
turation d'hydrogels : la versatilité d'un outil comme PRIMO est déjà
reconnue en biophysique. Pourtant, malgré l'intérêt du champ de la
photo-lithographie pour les DMD, le système PRIMO ne semble pas,
jusqu'ici, avoir été "détourné" pour de la microstructuration de sur-
face au-delà du domaine de la recherche en biologie et ses applications,
et ce malgré sa pertinence évidente au regard de ses caractéristiques
détailées en section précédente. C'est donc dans cet esprit que nous
avons choisi de nous reposer sur le système PRIMO disponible au labo-
ratoire pour microstructurer de façon top-down nos surfaces; surfaces
dont nous avons par ailleurs présenté, dans la première partie de ce
chapitre, la possibilité de fonctionnalisation bottom-up.

4.2.3 DÉVELOPPEMENT DU PROTOCOLE DE MICROSTRUCTURATION

Dans cette section du chapitre, nous allons présenter la résine pho-
tosensible sélectionnée pour notre processus de microstructuration, la
caractérisation des paramètres de ce processus, ainsi que l'ajustement
du protocole de fonctionnalisation nécessaire.

4.2.3.1 Propriétés générales et protocole d'utilisation de la résine S1813 G2

La série Microposit S1800 regroupe un ensemble de résines photo-
sensibles très utilisées depuis plus de 20 ans en micro-électronique en
raison de leur facilité d'utilisation <fnref n="47" /> ainsi que de la qualité des couches
obtenues <fnref n="48" />. La S1813 G2 est la deuxième version développée de la
résine S1813, qui se distingue par une résolution de motifs pouvant al-
ler jusqu'à 0,48 µm, et la possibilité d'obtenir des épaisseurs de couche
déposée entre 1-1,9 µm selon la vitesse de rotation sélectionnée lors
du *spin coating*. Elle est particulièrement adaptée à notre procédé de
fonctionnalisation, en raison de : (a) sa sensibilité à la longueur d'onde
375 nm, avec une valeur d'énergie à apporter relativement faible de
150 mJ/cm², ce qui permet des temps d'expositions courts; et (b)
ses différentes propriétés de solubilité. La S1813 G2 est plutôt inso-
luble dans le toluène et l'eau – solvants de base pour nos étapes de
fonctionnalisation MPTMS et QDs – mais très soluble dans l'éthanol

<footnote n="45">45. Cet outil est d'ailleurs couramment utilisé dans l'équipe pour réaliser du *patterning* de cellules de manière à contrôler la contractilité cellulaire, par la maîtrise de l'organisation du cytosquelette.</footnote>

<footnote n="46">46. Ce nombre correspond aux publications recensées par la société Alvéole sur leur site web.</footnote>

<footnote n="47">47. Qui regroupe les qualités :
d'adhésion à divers substrats, en
particulier semi-conducteurs; et
déposition simple, par exemple par
*spin coating*.</footnote>

<footnote n="48">48. Uniformité des dépôts et résolution.</footnote>
ou l'acétone, substances dans lesquelles les MPTMS et QDs sont eux-mêmes insolubles, ce qui permet une étape de *lift-off* n'endommageant pas, ou à la marge, la fonctionnalisation réalisée. Dans le cadre de mes travaux, j'ai utilisé des dépôts de résine de 1,3 µm d'épaisseur, ce qui permet d'une part, à la couche de résister à plusieurs dizaines d'heures d'incubation dans du toluène ou de l'eau; et d'autre part, obtenir – après développement de la résine – des puits de profondeur suffisamment faible pour ne pas entraver l'accès des molécules de fonctionnalisation (silanes comme QDs) aux surfaces de verre découvertes.

Le protocole d'obtention de ces couches est synthétisé en Figure 4.20. Après nettoyage et activation des lamelles de verre, on dépose la couche de résine S1813 G2⁴⁹ par *spin coating* avec les paramètres suivants : 4000 RPM⁵⁰; 3000 ACC⁵¹; 30 s. Après un pré-recuit (*softbake*) à 115°C durant 1 min sur plaque chauffante⁵², qui stabilise le dépôt, on passe à la phase d'illumination avec PRIMO. Une fois cette étape réalisée, un recuit à 110°C durant 10 min solidifie la couche non insolée de manière à ce qu'elle résiste au développement. Ce dernier peut être réalisé à l'aide de 2 solutions : MF-319 ou MF-26A⁵³.

Spin coating de la S1813
4000 RPM ; 3000 ACC ; 30 s
SiO₂

Illumination UV 375 nm
(minimum : 150 mJ/cm²)
SiO₂
↑
↑

Pré-recuit sur plaque chauffante
115°C ; 1 min

(b) Illumination UV

(a) Dépôt de la S1813 G2

La résine S1813 G2 est annoncée comme étant optimisée en résolution pour le développeur MF-319, mais cela concerne essentiellement les applications comme les puits de profondeur intermédiaire. Dans notre cas, nous souhaitions pouvoir enlever toute la résine, et c'est avec le MF-26A que nous avons constaté les meilleurs résultats⁵⁴. Après divers essais, le développement optimal afin d'obtenir le meilleur rendu des motifs nécessite une incubation d'1 min des lamelles dans le MF-26A, sous agitation manuelle légère, suivie d'un rinçage à l'eau distillée. Les lamelles sont ensuite séchées à l'air comprimé.

#### 4.2.3.2 Influence de l'objectif de microscope utilisé

Ayant à notre disposition un objectif ×10 et ×20, nous avons souhaité vérifier la différence de résolution réalisable avec la résine S1813 G2. Le logiciel "Léonardo" permettant le pilotage de PRIMO n'accepte en entrée que des valeurs de dose d'illumination en mJ/mm², et uniquement des entiers naturels. La valeur fabricant de 150 mJ/cm² pour la S1813 G2 équivalant à 1,5 mJ/mm², cela nous oblige à envoyer une dose de 2 mJ/mm² au minimum.

49. Megaposit S1813 G2, Dupont.

50. Rotations par minute.

51. Accélération, en RPM².

52. EchoTerm, Torrey Pines Scientific.

53. Dans les 2 cas : Megaposit, Dupont.

<figure><img src="image_128.png" /></figure>

(c) Développement des motifs

FIGURE 4.20 – Protocole de microstructuration de la résine photo-sensible S1813 G2.

54. Chaque test était contrôlé par microscopie optique classique, à divers niveaux de grandissement, pour une évaluation qualitative des motifs obtenus.
La Figure 4.21 donne le profil topographique obtenu par profilométrie de micro-motifs réalisés avec des doses d'illumination de 2 et 3 mJ/mm² avec les objectifs ×10 et ×20. On constate tout d'abord que l'épaisseur de la couche déposée correspond bien à 1,3 µm, ce qui suggère que l'étape de développement permet d'enlever efficacement toute la résine jusqu'à laisser apparent la surface de verre.

<figure><img src="image_129.png" /></figure>

Profilomètre utilisé : DektakXT, Bruker. L'échelle verticale en (a) est ajustée de manière à faciliter la lisibilité.

<figure><img src="image_130.png" /></figure>

(b) Motif projeté et sens du balayage du profilomètre

La S1813 G2 étant fluorescente sous excitation à 458 nm, il a été possible de confirmer cela en imagerie TIRF sur notre montage optique, comme illustré en Figure 4.22. Cependant, la meilleure résolution reproductible est obtenue, contre toute attente, avec l'objectif ×10. L'utilisation d'un objectif ×20 implique, dans notre situation, une plus grande difficulté à obtenir une bonne mise au point. En effet, la seule manière de faire la mise au point consiste à illuminer une lamelle recouverte d'un couche fluorescente ⁵⁵, puis de remplacer cette lamelle de mise au point par la lamelle recouverte de S1813 G2 pour procéder à l'illumination finale ⁵⁶. Cette étape cause nécessairement, malgré toute notre application dans la réalisation de cette échange de lamelles, un léger décalage de la mise au point, qui se révèle manifestement suffisant pour annuler le bénéfice attendu d'un grandissement 2 fois plus élevé. Notons qu'une partie de ce défaut de focalisation est lié aux potentielles variations de planéité entre les lamelles de verre. Pour l'objectif ×10, la taille latérale du plus petit motif bien distinguable vaut environ 2 µm, et a été obtenu pour une dose d'illumination de 3 mJ/mm² ; et ce sans que cette valeur de dose ne produise une moins bonne définition des motifs de taille plus grande.

Ces premières expériences de prise en main de la microstructuration *top-down* ayant été faites, nous avons alors adapté notre procédure de fonctionnalisation afin de vérifier la possibilité de réaliser des micro-motifs de QDs ; pour, ensuite, caractériser par imagerie TIRF les microstructures 2D obtenues.

<caption>FIGURE 4.21 – Caractérisation des micro-motifs de S1813 G2 selon l'objectif utilisé, pour 2 doses d'illumination UV.</caption>

55. Appliquée avec un feutre Stabilo.

56. Une méthode alternative évidente serait d'illuminer la lamelle S1813 G2 avec la source de lumière blanche classique du microscope, qu'on filtrerait par un passe-haut adapté. La mise au point pourrait alors se faire *via* les poussières à l'interface verre / résine photo-sensible. Malheureusement, l'étape de nettoyage et activation des lamelles avant dépôt de la S1813 G2 rend de telles poussières parfaitement introuvables.

<figure><img src="image_131.png" /><figcaption>FIGURE 4.22 – Image TIRF de la résine S1813 G2 après développement au MF26-A.</figcaption></figure>
### 4.2.3.3 Ajustement du protocole de fonctionnalisation

L'étape de microstructuration s'insère nécessairement entre l'étape (a) de nettoyage/activation⁵⁷ et l'étape (b) de silanisation par les MPTMS⁵⁸. Elle ne peut pas être réalisée en amont de l'étape (a) car le Piranha comme le bain ultrasons dans l'éthanol à 70% dissolvent la S1813 G2. De plus, elle ne peut être réalisée après l'étape (b) au risque de dégrader la couche de silanes. Le temps nécessaire à la réalisation des micro-motifs dans la résine photo-sensible, et le dépôt de la résine elle-même, affectent cependant le niveau d'activation des surfaces de verre. C'est pourquoi nous avons rajouté une étape de "ré-activation" des surfaces, qui s'insère entre l'étape de microstructuration de la S1813 G2 et la silanisation par les MPTMS. Elle consiste en un simple passage de 2 min au Plasma-Air⁵⁹. Pour cette durée, nous n'avons pas observé de dégradation significative de la bordure des micro-motifs réalisés dans la résine. Les étapes de silanisation et d'incubation des QDs – avec ligands de surface MPA ou TOP/TOPO – restent inchangées. Les boites quantiques étant liées à la surface de verre par l'intermédiaire des MPTMS, cette fonctionnalisation covalente résiste sans problème à l'étape finale de *lift-off* de la S1813 G2, qui consiste en un bain sous ultrasons de 5 min dans l'acétone⁶⁰. Les lamelles sont ensuite rincées délicatement à l'air comprimé. La Figure 4.23 témoigne de la grande liberté de formes que cette microstructuration *top-down* permet, tout en conservant les qualités de densité et d'homogénéité de notre méthode de fonctionnalisation *bottom-up*.

57. Voir section 4.1.2.

58. Voir section 4.1.3.

59. Empiriquement, et comme mentionné en partie 4.1.2.2, une exposition de 2 min est suffisante pour rendre hydrophile une surface de verre.

60. 24201-5L, Honeywell.

<figure><img src="image_132.png" /></figure>

Une fois cette preuve de concept réalisée, nous avons pu entreprendre de caractériser plus finement le protocole dans son ensemble et, en particulier, étudier l'impact des paramètres d'illumination de la résine photo-sensible sur les micro-motifs finaux de QDs obtenus.

**FIGURE 4.23** – Démonstration de la variété des micro-motifs 2D de QDs réalisables. Exemple avec des QDs[TOP]. (A) Image MEB de l'intérieur d'un micro-motif. (B-H) Images TIRF de diverses microstructures.
### 4.2.3.4 Influence des paramètres d'illumination UV

Il y a 2 paramètres contrôlables lors de l'étape d'illumination. La puissance laser 61 à 375 nm permet de contrôler la rapidité de l'impulsion des motifs pour une dose donnée. L'irradiance totale, ou dose 62, définit la quantité d'énergie envoyée sur la résine photo-sensible. C'est donc l'influence de ces 2 grandeurs que nous allons détailler dans les paragraphes suivants.

**(a) Vérification de l'absence d'effet de la puissance laser**

Nous n'avons pas réussi à mettre en évidence un quelconque effet de la puissance laser utilisée sur les micro-motifs finaux. À titre d'exemple, la Figure 4.24 montre la superposition des courbes obtenues par profilomètre de motifs issus d'illumination UV de 10 et 100%. Ces résultats sont représentatifs de l'étude paramétrique que nous avons menée, en croisant les variations de puissance laser avec les variations d'irradiance UV totale dans le but d'identifier de potentielles configurations faisant office d'exception 63. En l'absence d'effet, nous avions alors tout intérêt à utiliser en permanence la puissance laser la plus élevée possible, de manière à minimiser le temps d'exposition.

<figure><img src="image_133.png" /></figure>

Ainsi, le temps d'illumination nécessaire pour un motif, dans le cas d'une irradiance de 2 ou 3 mJ/mm², est de l'ordre de la seconde. Le champ d'illumination correspondant au DMD avec l'objectif ×10, 924×574 µm², permet alors de réaliser, de façon automatisée et sans défaut de mise au point, un ensemble de 5×3 projections d'images sur une lamelle en moins d'une minute. Soit une taille totale de 4,6×1,72 mm².

**(b) Effet de la variation de la dose**

En ce qui concerne la dose d'irradiation, deux aspects nécessitaient d'être étudiés : l'influence de ce paramètre sur la fidélité des micro-motifs vis-à-vis de l'image numérique projetée; et sur la qualité de la photo-activation de la résine. Concernant ce deuxième point, les éléments donnés en section 4.2.3.3 corroboreraient plutôt solidement l'idée que l'étape de développement enlève l'intégralité de la S1813 G2 dès l'apport d'une dose UV d'au moins 2 mJ/mm². La Figure 4.25 présente la comparaison des signaux de photoluminescence de micro-motifs de QDs, où l'on a fait croître la dose d'irradiation UV.

FIGURE 4.24 – Mesure au profilomètre des micro-motifs de S1813 G2 selon la puissance laser d'illumination UV.

<footnote n="61">61. Exprimée en pourcentages de la valeur maximum, ~5 mW en sortie d'objectif.</footnote>

<footnote n="62">62. Exprimée en mJ/mm² dans le logiciel Leonardo</footnote>

<footnote n="63">63. Les résultats ont essentiellement été évalués qualitativement par microscopie classique.</footnote>
<figure><img src="image_134.png" /></figure>

FIGURE 4.25 – Influence de la dose UV reçue par la résine S1813 G2 sur le signal de photoluminescence des micro-motifs de QDs.

Moyenne et écart-type du signal obtenu pour l'axe vertical central des différents motifs :

S₂ = 6483 ± 674 coups/px

S₄ = 5526 ± 536 coups/px

S₆ = 6184 ± 620 coups/px

De fait, on ne constate pas de modification du niveau de signal corrélée à la dose totale d'irradiance UV utilisée. Les signaux apparaissent même comme quasi-strictement équivalents à partir des valeurs de coups/pixel moyennes enregistrées – cf. Figure 4.25 (d). Par contre, la fidélité des motifs de QDs est bien affectée par l'augmentation de la dose UV d'illumination, comme cela est mis en évidence en Figure 4.26. À l'aide d'un *design* de motif bien choisi, on peut effectivement mettre en évidence un phénomène de "bavure", présent dès 4 mJ/mm² qui peut aller jusqu'à une fusion des motifs les plus proches, normalement séparés de 5 µm. Ainsi, l'ensemble des éléments développés dans cette section plaide donc en faveur d'une dose UV la plus faible possible, ici 2 mJ/mm².

<figure><img src="image_135.png" /></figure>

FIGURE 4.26 – Influence de la dose UV reçue par la résine S1813 G2 sur la fidélité des micro-motifs de QDs.

En revanche, nos résultats préliminaires au profilomètre semblaient indiquer que les micro-motifs les plus petits étaient plus susceptibles d'être obtenus *via* une dose UV de 3 mJ/mm². La section suivante permettra donc de clarifier ce point et montrer ce que l'on peut atteindre à l'aide de notre méthode de microstructuration.
### 4.2.4 RÉSOLUTION ET HOMOGÉNÉITÉ DES MICRO-MOTIFS 2D DE QDs

#### 4.2.4.1 Résolution limite des motifs

Nous avons réalisé plusieurs essais comparés de micro-motifs de QDs pour des doses UV valant 2 ou 3 mJ/mm². L'image projetée sur la résine photo-sensible pour cette étude est donnée Figure 4.27. Chaque ligne verticale est associée à un nombre exprimant la largeur de la ligne en pixels – avec l'objectif ×10, 1 px = 0,5 µm. La ligne de QDs la plus fine visible par imagerie TIRF nous donne accès à la limite de résolution de notre protocole. La Figure 4.28 présente un exemple de détermination de la résolution maximale atteinte : on constate sans grande surprise que la limite de taille de nos micro-motifs (~2 µm) correspond à la limite en résolution du dispositif PRIMO.

<figure><img src="image_136.png" /></figure>

De manière générale, nous n'avons observé aucune différence significative entre les doses UV de 2 et 3 mJ/mm², que ce soit sur le plan de la fidélité comme de la résolution optimale atteignable. Cependant, la mise au point<sup>64</sup> a de nouveau été identifiée comme un facteur critique de ce procédé. Sans pouvoir produire d'étude statistique probante, notre expérience sembler indiquer que l'irradiance UV à 3 mJ/mm² permet plus souvent de compenser un éventuel défaut de mise au point lors de l'étape d'illumination UV de la résine photo-sensible, ce qui est particulièrement critique lorsque l'on souhaite réaliser un motif à la limite de résolution du système PRIMO. C'est donc cette dose UV que nous avons choisie pour notre protocole de référence.

#### 4.2.4.2 Homogénéité des motifs

La photolithographie employée élimine simplement des zones accessibles au processus de fonctionnalisation. Il était attendu que le niveau d'homogénéité de répartition des QDs sur les surfaces microstructurées soit la même que ce que nous avions déjà observé sans microstructuration. C'est ce que l'on peut constater lorsque l'on emploie les QDs[TOP], comme cela est montré sur les Figures 4.29 (a) et (b), où les micro-motifs obtenus sont bien délimités et leur constitution interne

<figure><img src="image_137.png" /><figcaption>FIGURE 4.27 – Image numérique projetée sur la résine S1813 G2 pour l'étude de la résolution optimale des micro-motifs de QDs.</figcaption></figure>

<caption>FIGURE 4.28 – Motif le plus petit réalisable par microstructuration des surfaces avec des QDs.</caption>

(A) Image TIRF des plus petits micro-motifs de QDs.

(B) Profil moyen de la ligne de 5 px de large, soit en théorie 2,5 µm. La largeur à mi-hauteur (LMH) mesurée sur les images TIRF est de 2 µm.

64. Dont les enjeux ont été donnés en partie 4.2.3.2.
est homogène. Ce résultat change lorsque l'on utilise les QDs[MPA] :
nous avons pu observer l'apparition très régulière d'agrégats, toujours
situés au bord des micro-motifs – Figures 4.29 (c) et (d).

<figure><img src="image_138.png" /><figcaption>FIGURE 4.29 – Micro-motifs obtenus avec des QDs[TOP] et QDs[MPA].</figcaption></figure>

(a) Image TIRF de micro-motifs obtenus avec des QDs[TOP].

(b) Image MEB au bord d'un micro-motif de l'image (a).

(c) Image TIRF d'un micro-motif obtenu avec des QDs[MPA].

(d) Image MEB au bord du micro-motif de l'image (c).

En étudiant par imagerie d'épifluorescence⁶⁵ l'étape d'incubation de la solution de QDs[MPA] elle-même, nous avons pu mettre en évidence – voir Figure 4.30 – la présence de micro-bulles formées sur les *patterns* de S1813 G2. Ce phénomène, cause probable de la formation des agrégats, résulte de l'hydrophobicité du verre silanisé et de la résine S1813 G2 – les QDs[MPA] sont solubilisées dans un tampon NaHCO₃. Nous avons tenté d'éviter la formation de ces micro-bulles de diverses manières⁶⁶, mais sans réussir à les faire disparaitre.

65. IX73, Olympus; objectif ×10; illumination à 490 nm; pE-4000 CoolLED.

<figure><img src="image_139.png" /></figure>

66. Immersion verticale des lamelles; ultrasons pendant incubation.

<caption>FIGURE 4.30 – Mise en évidence de micro-bulles sur les motifs lors de l'incubation de QDs[MPA]. Excitation à 490 nm.</caption>
## 4.3 CONCLUSIONS SUR LA MICROSTRUCTURATION DES QDs

Au cours de ce chapitre, j'ai présenté notre protocole de fonctionnalisation de lamelles de verre déjà initié dans la thèse de L. Riachy [263]. Ce protocole a été enrichi en mettant à profit le savoir-faire, en termes d'échanges de ligands, que nous avons exposé au chapitre précédent, et j'ai réalisé une caractérisation approfondie des surfaces obtenues. Les monocouches de boites quantiques obtenues peuvent atteindre des densités surfaciques très élevées$^{67}$ – plus de 3000 QDs/µm$^2$ – ce qui est indispensable pour adapter l'irradiance laser ou le temps d'acquisition dans le contexte de l'imagerie NEF. Les boites quantiques étant liées de manière covalente à la surface en verre par l'intermédiaire de silanes, la fonctionnalisation se révèle très résistante, ce qui nous a permis de montrer la pertinence de combiner cette approche bottom-up avec une pré-microstructuration top-down par photolithographie UV avec la résine photo-sensible S1813 G2. Les micro-motifs de QDs ainsi obtenus ont eux-aussi été caractérisés, et la résolution maximum a été établie comme ~2 µm. Le protocole complet issu de cette étude est résumé Figure 4.31. Dans le chapitre suivant, on s'attachera alors à présenter nos travaux de biofonctionnalisation de ces microstructures 2D, et démontrer la possibilité d'obtenir un signal FRET dans une situation modèle.

67. Pour obtenir des densités faibles, on peut jouer sur : les ligands de surface, en privilégiant les TOP/TOPO; le temps d'incubation; ou encore la concentration de la solution de QDs utilisée pour l'incubation – ce qui en fait une technique adaptable à de nombreux besoins. Des travaux annexes avec des collègues du L2n, A. Broussier et C. Couteau, ont par exemple permis de montrer la possibilité de descendre à une densité surfacique de 1 QD/µm$^2$, avec une solution de 10 nM incubée durant 30 s. Il a pu être démontré que ces QDs étaient émetteurs de photons uniques et qu'ils pouvaient être couplés avec des guides d'ondes, permettant l'obtention de photons uniques en sortie d'une fibre optique.

<figure><img src="image_140.png" /><figcaption>FIGURE 4.31 – Résumé du processus de microstructuration 2D de boites quantiques.</figcaption></figure>
# Surfaces actives pour l'imagerie NEF

5

Le but de ce chapitre est de démontrer la possibilité de biofonctionnaliser des surfaces microstructurées pour l'imagerie NEF. Nous y présentons la nécessité de passiver le verre autour des micro-motifs, ainsi qu'une analyse quantitative de FRET dans une situation modèle.

## 5.1 PRINCIPE

Comme on a pu le voir en section 3.3, il existe de nombreuses manières de fonctionnaliser des boites quantiques en jouant sur le *design* modulaire de leurs ligands de surface. Le protocole de fonctionnalisation présenté au chapitre précédent facilite vraisemblablement le remplacement des ligands présents sur les QDs par d'autres, bio-compatibles, dont la fonctionnalisation peut être adaptée. Après avoir exposé la stratégie de conception des ligands utilisés dans cette étude, je présenterai les résultats expérimentaux ouvrant la voie à l'étude de l'adhésion cellulaire par imagerie NEF sur des surfaces microstructurées.

### 5.1.1 CHÉLATION ET COMPLEXES DE COORDINATION

#### 5.1.1.1 Éléments généraux sur la chélation

La très grande majorité des composés dits métalliques sont, de fait, des complexes de coordination, où un atome métallique central est entouré d'un certain nombre de ligands. Dans le cas général, on parle indifféremment de coordination ou complexion. Le terme de chélation¹ est employé lorsque l'ion métallique complexé² est lié au ligand de coordination³ par au moins 2 liaisons de coordinations. La formation de tels complexes, outre son omniprésence dans la nature, est un phénomène reconnu comme d'importance vitale chez la plupart des organismes vivants multicellulaires⁴.

Cependant, pour certains ions métalliques vitaux comme le cuivre, le fer, et le zinc, une régulation homéostatique défectueuse dans l'organisme peut conduire à l'apparition de pathologies. De nombreuses études suggèrent par exemple un lien entre ces problèmes de régulation et l'apparition des maladies d'Alzheimer ou Parkinson, ainsi que de certains cancers. Les stratégies thérapeutiques intègrent donc l'utilisation de molécules capables de chélater ces métaux pour promouvoir leur excrétion, de manière à soulager l'organisme dans sa tâche de régulation homéostatique [304]. Outre ces applications strictement médicales, les agents chélatants sont aussi utilisés dans des domaines aussi divers que la purification de protéines, des procédés industriels

5.1 Principe 107
Chélation et complexes de coordination
Ligands à ancrage Imidazole

5.2 FRET en solution aqueuse 110
Méthodologie
Absence de FRET avec les QDs[DHLA-SB]
FRET avec les QDs[MPA]

5.3 FRET sur surfaces micro-structurées 115
Signal d'excitation directe l'accepteur à 458 nm

Compétition entre chélation et adsorption résiduelle
Mise en évidence du FRET sur les microstructures

5.4 Conclusions sur les surfaces actives pour NEFI 130

1. Dérivé du mot grec χηλή, "khêlê", qui renvoie aux pinces du homard mais aussi d'autres crustacés.

2. Le chélaté.

3. Le chélatant, ou chélateur.

4. Les ions métalliques dans les systèmes biologiques sont généralement répartis entre quatre états différents *in vivo*. Il y a d'abord les formes inertes du complexe métallique, qui peuvent être présentes dans une matrice solide, comme le calcium dans les os et les dents, soit être complexées dans une protéine non réactive. Il existe ensuite trois états d'espèces labiles. Les protéines métalliques liées de manière réversible à des ions métalliques sont connues sous le nom d'espèces de masse moléculaire élevée. Celles-ci sont en équilibre avec les complexes dits de faible masse moléculaire. Enfin, il doit y avoir des ions métalliques directement complexés avec l'eau, bien que cela soit hautement improbable à un pH = 7,4 en raison du phénomène d'hydrolyse [207].
très variés⁵ et des produits de consommation courante⁶, ou encore
pour contrôler la chimie des métaux; mais également comme agents
d'adoucissement de l'eau dure, comme conservateurs alimentaires ou
composants d'engrais microélémentaires. Ils jouent aussi un rôle essen-
tiel dans les processus métallurgiques avec des applications à chaque
étape du traitement du minerai⁷ [305].

5.1.1.2 Terminaison de ligands pour adsorption sur les QDs

Concernant la fonction d'ancrage des ligands à la surface des QDs,
notre choix s'est donc porté sur les cycles imidazole⁸. Ces groupes
fonctionnels sont notamment présents dans l'histidine, un acide aminé
capable de complexer une grande variété d'ions métalliques de transi-
tion bivalents (Zn, Ni, Cu, Fe, Co, Mn)⁹. Cette propriété émerge de la
présence de 2 atomes d'azote¹⁰ qui peuvent être protonés/déprotonés
dans les conditions adéquates [306]. La Figure 5.1 représente les confi-
gurations possibles de l'histidine. Ayant un premier pKa ≈ 6,5, la
chaîne latérale est entièrement protonée et chargée positivement dans
des conditions acides. Dans des conditions physiologiques, l'un des
atomes d'azote¹¹ est déprotoné et la chaîne latérale n'est alors pas
chargée, ce qui permet la liaison avec un atome métallique.

<figure><img src="image_141.png" /></figure>

Le choix de l'imidazole comme fonction d'ancrage, *via* l'utilisation d'histidines ou plus directement de cycles imidazole, permet donc une accroche spécifique et stable sur le zinc à la surface des boites quantiques *via* la formation d'un complexe de coordination. Cette approche a d'ailleurs déjà été employée pour des QDs en solution colloïdale [307-310] et même pour l'immobilisation de boites quantiques et nanoparticules d'or sur des surfaces [311]. Cette méthode présente également l'avantage d'ouvrir la voie à un nettoyage simple des lamelles de QDs après expérience, par un rinçage dans une solution d'imidazole pur, ce qui permettrait la réutilisation des surfaces préparées.

5.1.2 LIGANDS À ANCRAGE IMIDAZOLE

Durant ma thèse, j'ai utilisé 2 ligands à ancrage imidazole différents. Ils se distinguent essentiellement par leur autre terminaison, et donc leur usage – Figure 5.2. Le premier dispose à son extrémité du peptide RGD pour permettre l'adhésion cellulaire ; le second d'un fluorophore : l'Alexa Fluor 647. Ce 2ᵉ ligand a été utilisé pour mettre en évidence l'adsorption sur les QDs, et pour des expériences de FRET.

5. Pâte et papier, traitement photograp-
phique, ainsi que l'industrie nucléaire.

6. Détergents ménagers, nettoyants pour surfaces dures, dégraissants, agents de lavage des voitures, détartrants marins, fixateurs de colorants, etc.

7. De la flottation à l'obtention d'un métal en passant par la lixiviation, l'enrichissement et la séparation.

8. Voir Figure 3.17.

9. L'histidine est par ailleurs le chélatant le plus commun de Zn dans le vivant, suivi par la cystéine *via* un atome de souffre et l'aspartate/glutamate *via* un atome d'oxygène [304].

10. Ici notés Nπ et Nτ, en accord avec la référence mobilisée.

11. Généralement Nπ.

<caption>FIGURE 5.1 – Chimie de l'histidine et fixation des métaux. Adapté de de [306].</caption>

(a) Structure chimique de l'acide aminé histidine (His) dans des conditions physiologiques (pH ≈ 7,5).

(b) En fonction du pH, la chaîne latérale imidazole de l'histidine peut exister sous plusieurs formes. La liaison du métal M²⁺ ne peut se produire que lorsqu'un proton est perdu par au moins un atome d'azote.

<figure><img src="image_142.png" /><figcaption>FIGURE 5.2 – Schéma des deux ligands utilisés et leur fonction.</figcaption></figure>
### 5.1.2.1 Ligand terminé RGD : His-RGD

<figure><img src="image_143.png" /></figure>

Le premier ligand est représenté sur la Figure 5.3. Il correspond à la séquence peptidique RGDSPKGAGAKG-HHHHHHH, de masse mo laire égale à 2117 g/mol. Le bloc de 7 histidines permet une accroche stable à la surface des QDs par leurs cycles d'imidazole : certaines liaisons peuvent se défaire temporairement, mais il est relativement im probable que les 7 cycles imidazole se délient des QDs en même temps. À l'autre extrémité, le tri-peptide RGD permet l'adhésion cellulaire via sa reconnaissance par les intégrines des cellules – voir présentation en chapitre 1. L'effet de la fonctionnalisation des surfaces de QDs par ce ligand His-RGD ont été décrites en section 4.1.4.2, et plus particu lièrement avec la Figure 4.15. Pour obtenir ces résultats, une incu bation des lamelles avec une solution de His-RGD à 1 µM dans un tam pon Hepes¹² permet un recouvrement quasiment instantané des boites quantiques. En pratique, la phase d'incubation est généralement laissée entre 5 et 10 min, avant un rinçage avec la solution tampon Hepes. Le ligand His-RGD a été synthétisé sur la plateforme de synthèse peptidique de l'Institut de Biologie Paris-Seine. À ce titre, nous remercions tout particulièrement Christophe Piesse.

<caption>FIGURE 5.3 – Structure chimique de His-RGD. Produite à partir de PepDraw et vectorisée via InkScape.</caption>

12. Comme en partie 3.3.2.2 : Hepes à 0,1 M avec 200 mM de NaCl, et dont le pH est ajusté à 8 via de la soude à 10 M.

### 5.1.2.2 Ligand terminé Alexa Fluor 647 : Im-AF647

Le second ligand est composé d'un premier bloc d'environ 8 cycles imidazole jouant le même rôle que les histidines du His-RGD, puis un second bloc d'environ 26 molécules de sulfobétaine¹³ pour promouvoir la solubilité dans l'eau et minimiser les phénomènes d'adsorption non-spécifique [228-230] – cf. Figure 5.4. Après un lien tri-éthylène-glycol, le ligand est terminé par un groupement aminé $N_3$ conjugué au colorant AF647-DBCO. La masse molaire de l'ensemble vaut 8300 g/mol, et la taille du Im-AF647 lorsque complètement déplié vaut 4 à 5 nm, ce qui permet de placer l'accepteur à une distance idéale de la surface des QDs pour le FRET. La concentration de la solution mère est d'environ 3 mM dans un tampon Hepes à 0,1 M, qui contient 150 mM de NaCl, à pH = 7. Au cours des expérimentations de ce chapitre, la dilution a systématiquement été faite dans la même solution tampon Hepes que décrite au paragraphe précédent. Nous remercions ici Thomas Pons pour nous avoir fourni ce ligand.

13. On reconnaîtra la même espèce chimique zwiterionique utilisée par l'équipe de T. Pons pour concevoir le ligand DHLA-SB, décrit en partie 3.3.1.3.
<figure><img src="image_144.png" /><figcaption>FIGURE 5.4 – Structure chimique de Im-AF647, fournie par T. Pons.</figcaption></figure>

## 5.2 FRET EN SOLUTION AQUEUSE

Dans le but de vérifier la conjugaison entre nos QDs et le ligand Im-AF647, nous avons tout d'abord réalisé une série d'expériences en solution. Cette conjugaison permet de coupler les donneurs (QDs) et les accepteurs (AF647) de façon à initier le transfert d'énergie non-radiatif (FRET) entre les 2 espèces chimiques. Pour cela, nous avons utilisé nos QDs rendus solubles en milieu aqueux, que ce soit *via* des ligands DHLA-SB ou MPA ¹⁴.

### 5.2.1 MÉTHODOLOGIE

L'ensemble des spectres de photoluminescence présentés dans cette section ont été obtenus sur le même spectrophotomètre UV-visible Cary Eclipse¹⁵. La vitesse de scan était de 120 nm/min avec un intervalle de 1 nm entre chaque point de mesure, pour un temps d'acquisition par point de 0,5 s. Ce dispositif commercial présente certaines limitations notables. L'illumination fournie par ce spectrophotomètre UV-visible utilise un ensemble de lampes dont l'allumage précis va varier à chaque mise en route. Autrement dit, l'irradiance effective de l'échantillon étudié peut varier selon les jours – ou même au sein d'une même journée si la machine est malencontreusement éteinte par des collègues. Ce dispositif ne permettant pas de contrôler la valeur absolue de l'illumination, il n'est en pratique pas possible de comparaer quantitativement des courbes issues de journées d'expérimentation différentes¹⁶. D'autres biais peuvent également apparaitre dans le cadre de ce type de mesures en solution. Par exemple, à faible concentration¹⁷, il est crucial d'utiliser la même micropipette équipée du même cône si l'on veut minimiser les incertitudes de dilutions des différentes espèces.

### 5.2.2 ABSENCE DE FRET AVEC LES QDS[DHLA-SB]

L'utilisation des QDs[DHLA-SB] permet une expérience de contrôle, avec une situation dans laquelle il n'est pas possible d'échanger le ligand des QDs par celui qui intègre l'accepteur AF647 ¹⁸. Dans cette expérience, nous partons de 2 solutions initiales à 100 nM : une de QDs[DHLA-SB], une autre de ligand Im-AF647. Après une mesure de

14. Cf. parties 3.3.1.3 et 3.3.1.4 pour leur description, et parties 3.3.2.2 et 3.3.2.3 pour les protocoles d'échange de ligands depuis les QDs[OA] obtenus après synthèse.

15. FL1102M006, Agilent

16. En revanche, à l'échelle d'une demijournée, l'illumination reste suffisamment stable pour que nous n'ayons pas pu mettre en évidence de variation du signal obtenu pour une même solution.

17. Typiquement $\leq 0,5$ µM.

18. Comme nous l'avons mentionné dans la section 4.1.4.1, la stabilisation par les ligands de surface DHLA-SB est très efficace, au point qu'ils ne permettent pas la fonctionnalisation des QDs sur verre dans le cadre de notre protocole.
chaque solution, les 2 espèces chimiques sont mélangées dans la cuvette de spectroscopie, de façon à travailler à volume constant. J'ai fait varier la proportion de donneur et accepteur de 1:1 à environ 1:5. Les spectres mesurés à chacune de ces étapes sont donnés en Figure 5.5.

<figure><img src="image_145.png" /></figure>

Le très léger signal sur l'intervalle spectral 640-700 nm ne dépasse pas ce qui est observé pour le Im-AF647 seul à 458 nm, comme on peut le vérifier sur la Figure 5.5 (b). Il s'agit donc uniquement de l'excitation directe de l'accepteur à cette longueur d'onde. Cette expérience semble ainsi confirmer la trop grande passivation causée par les ligands DHLA-SB, que nous avions déjà constaté sous une autre forme – section 4.1.4.1. Dans cette situation, il n'y aucun signal de FRET car le ligand Im-AF647 ne s'adsorbe pas à la surface des QDs.

**FIGURE 5.5** – Spectres de photoluminescence des différentes solutions de QDs[DHLA-SB] (Donneur) et Im-AF647 (Accepteur).

### 5.2.3 FRET AVEC LES QDs[MPA]

#### 5.2.3.1 Démonstration spectrale du FRET

Pour cette seconde expérience, une série de mélanges de QDs[MPA] et Im-AF647 sont préparés séparément de manière à obtenir des solutions de ratio donneur : accepteur les plus précises possible¹⁹, tout en conservant une concentration du donneur à 50 nM dans chaque cas. La Figure 5.6 récapitule l'ensemble des spectres mesurés pour cette expérience. Les paramètres du spectrophotomètre, sont ajustés de manière à ce que le signal d'excitation directe de l'accepteur (Im-AF647) soit nul. Cela permet ainsi de considérer – Figure 5.6 (a) – l'ensemble de l'éventuel signal observé sur l'intervalle 640-800 nm comme étant généré par du FRET²⁰. On constate alors que ce dernier se manifeste sans ambiguïté dès un ratio donneur : accepteur de 1:1. Augmenter la fraction de l'accepteur Im-AF647 par rapport aux QDs[MPA] se caractérise par une augmentation progressive du quenching de la photoluminescence des boites quantiques, corrélée à l'augmentation du signal issu du FRET.

19. Les ratios donneur : accepteur effectifs de l'expérience précédente peuvent être biaisés si les dynamiques d'adsorption des QDs[DHLA-SB] et Im-AF647 sur les parois des cuvettes en quartz sont trop différentes. Nous minimisons cette possibilité en réalisant à chaque fois une nouvelle solution de mélange à partir des mêmes solutions mères, qu'on caractérise immédiatement.

20. Avec une contribution marginale du débordement spectral des QDs.
<figure><img src="image_146.png" /></figure>

Les spectres des ratios donneur : accepteur 1:15 et 1:20 ont été réalisés à partir d'une solution de Im-AF647 différente des spectres allant de 1:1 à 1:10. L'agrégation de ces courbes est néanmoins justifiée par la précision suffisante des réalisations de solutions, comme montré par le spectre 1:10 (2) qui nous sert de contrôle. La Figure 5.6 (b) permet de contrôler la présence de l'accepteur *via* l'acquisition du spectre de fluorescence sous une excitation à 633 nm.

Il est également possible de calculer l'intégrale de ces différents spectres, de manière à mieux visualiser l'évolution des signaux en fonction du ratio accepteur/donneur – cf. Figure 5.7. Le *quenching* de photoluminescence des boites quantiques décroit avec l'augmentation de la proportion d'accepteur Im-AF647. À l'inverse, le signal issu du FRET augmente jusqu'à un plateau.

<figure><img src="image_147.png" /><figcaption>FIGURE 5.6 – Spectres de photoluminescence des différentes solutions de QDs[MPA] (donneur) et Im-AF647 (accepteur).</figcaption></figure>

(a) Le signal de FRET de l'accepteur est ajusté par la fonction de saturation donnée par l'Éq. (5.2.1). La PL des QDs est ajustée par une fonction de même type, mais décroissante – Éq. (5.2.2). La grandeur $x_s$ correspond au seuil de saturation, donné en ratio accepteur/donneur. (b) L'intégrale spectrale A est ajustée par une fonction linéaire, l'intégrale spectrale A/D par un polynôme du second degré.

<caption>FIGURE 5.7 – Intégrales spectrales des signaux des différentes solutions de QDs[MPA] (Donneur) et Im-AF647 (Accepteur).</caption>
Réaliser un fit du signal de FRET et de la photoluminescence des QDs – Figure 5.7 (a) – à l'aide de fonctions de saturation de type Langoir – Éq. (5.2.1) et (5.2.2) – permet d'obtenir des valeurs de seuil de saturation, données en ratio accepteur/donneur, de $x_s(\text{PL}) = 5 \pm 1$ et $x_s(\text{FRET}) = 3,1 \pm 0,3$. La différence de valeur n'est pas surprenante. En effet, le ligand Im-AF647 stabilise la photoluminescence des QDs de la même façon que le ligand His-RGD – cf. section 4.1.4.2. La valeur $x_s(\text{PL})$ tirée de l'évolution du quenching est donc nécessairement sur-estimée. À partir de $x_s(\text{FRET})$, on peut évaluer la constante de dissociation $K_d = C_A \cdot x_s \approx 155 \text{ nM} \approx 1,55 \cdot 10^{-7} \text{ M}$. La constante d'association$^{21}$ vaut donc $K_a = 1/K_d \approx 6,45 \cdot 10^6 \text{ M}^{-1}$. Le plateau de signal semble débuter avec l'équilibre entre émission des donneurs et émission générée par FRET des accepteurs, i.e. pour un ratio donneur : accepteur entre 1:12 et 1:13 – Figure 5.7 (b). Au-delà, le quenching de photoluminescence des QDs se poursuit sur un rythme moins soutenu, et le signal issu du FRET reste relativement constant. Cette expérience met donc clairement en évidence le FRET entre nos boites quantiques et l'Alexa Fluor 647. Elle semble également montrer qu'il n'est pas possible de quencher complètement la photoluminescence des QDs avec le ligand Im-AF647.

### 5.2.3.2 Démonstration de la spécificité de liaison entre donneur et accepteur

Il est possible de montrer, même dans le contexte d'études en solution, que l'apparition du signal de FRET est bien liée à la formation d'assemblages entre donneurs et accepteurs sur la base d'une liaison spécifique – ici, la chélation. Pour ce faire, nous créons une situation de compétition entre les ligands terminés AF647 et de l'imidazole pure, afin d'entraver la formation du complexe QDs—Im-AF647. Le protocole général d'expérimentation reste le même que précédemment. La Figure 5.8 donne les résultats pour l'ajout d'imidazole à 2 M, premier niveau de concentration où l'on peut observer un effet tangible.

<figure><img src="image_148.png" /><figcaption>FIGURE 5.8 – Effet de l'ajout d'imidazole à 2 M en compétition avec le Im-AF647.</figcaption></figure>

$$y = a \frac{x}{1 + \frac{x}{x_s}} \qquad (5.2.1)$$

$$y = y_0 - a \frac{x}{1 + \frac{x}{x_s}} \qquad (5.2.2)$$

21. Ces valeurs peuvent être comparées au grandeurs correspondant aux constantes d'association et dissociation des complexes Im-Zn$^{2+}$ dans la littérature, respectivement :

$$K_a \approx 10^{9,2} \text{ M}^{-1}$$

$$K_d \approx 6,3 \cdot 10^{-10} \text{ M}$$

On pourrait interpréter cette différence comme signifiant que dans notre configuration expérimentale, l'adsorption de notre ligand sur les QDs est moins forte que prévue. La littérature sur le sujet est cependant difficile d'accès et les valeurs incertaines [312, 313].

La comparaison avec une constante de dissociation bien connue, celle de la liaison biotine-avidine ($10^{-15} \text{ M}$) [314] indique néanmoins que la liaison QDs-Im-AF647 est bien moins stable que cette liaison de référence.
En intégrant les spectres sur l'intervalle 640-800 nm, le contrôle à 633 nm en Figure 5.8 (b) montre que, malgré une quantité d'accepteur légèrement supérieure à la situation où l'accepteur est seul (+16%), on constate une forte diminution (-78%) du signal généré par FRET – Figure 5.8 (a)²². Pris ensemble, ces éléments confirment l'hypothèse que le FRET observé dans les sections précédentes résulte de la formation spécifique d'assemblages QDs—Im-AF647. De façon surprenante, la baisse importante du signal de FRET ne s'accompagne cependant pas d'une augmentation de la photoluminescence des boites quantiques²³.

J'ai réalisé la même expérience en augmentant la concentration d'imidazole à 8 M. Les résultats sont alors plus proches de ce qui est attendu, comme le montre la Figure 5.9. Une nouvelle fois, le contrôle à 633 nm garantit la présence du ligand Im-AF647 à une concentration proche de 500 nM, et l'on observe bien une diminution du signal de FRET corrélée à une augmentation de la photoluminescence des QDs, qui se rapproche de la photoluminescence observée pour la solution de boites quantiques seules à 50 nM.

22. Et ce alors que le ratio donneur : accepteur théorique cible étant 1 : 10, on devrait observer un ratio des intégrales spectrales A/D entre 0,85 et 0,89 d'après la Figure 5.7 (b). Ici, dans le cas de référence sans imidazole, on se situe à 1,06 – indiquant un ratio donneur : accepteur empirique proche de 1:13.

23. Cet effet n'est pas le résultat d'un problème de manipulation : il est reproductible en solution, et on peut aussi le constater sur les surfaces de QDs, où le nombre de boites quantiques est fixe.

<figure><img src="image_149.png" /><figcaption>FIGURE 5.9 – Effet de l'ajout d'imidazole à 8 M en fonction du temps.</figcaption></figure>

La Figure 5.9 montre aussi une accentuation progressive de cette dynamique avec le temps – et une légère agitation de la solution en cuvette avant chaque nouvelle acquisition de spectre. Ces résultats confirment donc définitivement le lien entre le FRET observé dans la configuration QDs + Im-AF647, et la formation de complexes de coordination entre les 2 espèces chimiques. Cette validation faite, j'ai étudié le signal FRET sur surfaces microstruturées, de manière à prouver la possiblité d'études NEFI dans ce type de configuration, mais aussi déterminer le meilleur processus de dépôt spécifique du ligand His-RGD sur les boites quantiques, en vue des expériences d'étude de l'adhésion cellulaire. Le détail de ces différents éléments constitue le reste de ce chapitre.
## 5.3 FRET SUR SURFACES MICROSTRUCTURÉES

Dans cette partie, nous établirons premièrement le domaine d'irradiance laser adapté à nos expérimentations. Après avoir montré comment mettre en œuvre le ligand Im-AF647 lorsque les boites quantiques sont déposées sur une surface en verre²⁴, nous présenterons nos observations FRET en imagerie TIRF sur nos microstructures.

24. Et par conséquent, comment mettre en œuvre le ligand His-RGD.

### 5.3.1 SIGNAL D'EXCITATION DIRECTE L'ACCEPTEUR À 458 NM

Pour correctement analyser le signal enregistré à travers la fenêtre de détection dédiée au FRET dans notre dispositif TIRF²⁵, il faut déterminer au mieux le bruit de fond provenant de l'excitation directe de l'accepteur à 458 nm – cf. section 2.2.3. Pour cela, on dépose le ligand Im-AF647 à 100 µM sur une surface de verre nettoyée par Piranha. Un puits de PDMS est utilisé pour pouvoir conserver la solution sur la surface de façon stable lorsque la lamelle de verre est étudiée sur le microscope. Ce puit permet également de réaliser le rinçage sans démonter l'échantillon de son support – cf. Figure 5.10.

25. Présenté en section 2.4. La fenêtre de détection du FRET $F_A$ sélectionne la gamme spectrale $\lambda = 672-696$ nm.

<figure><img src="image_150.png" /><figcaption>FIGURE 5.10 – Schéma du dépôt de Im-AF647 sur lamelle de verre avec puits de PDMS.</figcaption></figure>

#### 5.3.1.1 Caractérisation spectrale

Le signal de référence permettant de contrôler la présence du Im-AF647 est produit par une excitation à 633 nm, et détecté à l'aide du spectrophotomètre de notre montage optique – section 2.4.1.4. Un filtre passe-haut sélectionnant les longueurs d'ondes $\lambda \ge 500$ nm est placé sur le chemin optique. Les spectres résultant de cette expérience sont tracés sur la Figure 5.11.

<figure><img src="image_151.png" /></figure>

L'irradiance d'illumination de contrôle à $\lambda = 633$ nm est d'environ 1 W/cm², pour un temps d'acquisition $t_{acq} = 1$ s. Les spectres tracés sont le résultat d'une moyenne de 25 spectres. Pour une excitation à 458 nm, on enregistre des spectres du même type mais cette fois pour des valeurs d'irradiance entre 0,05 et 4,5 W/cm². Le rinçage est réalisé par la solution de tampon Hepes déjà décrite en section 5.1.2.2.

<caption>FIGURE 5.11 – Caractérisation spectrale du signal de l'accepteur Im-AF647 déposé à 100 µM sur du verre.</caption>
Le domaine d'irradiance propice aux mesures FRET correspond alors au cas où l'on ne détecte pas de signal issu de l'excitation directe de l'accepteur, que ce soit avant ou après rinçage de la solution de Im-AF647. Une irradiance d'environ 1 W/cm² à 458 nm semble définir cette limite.

### 5.3.1.2 Caractérisation sur la caméra

Sur le plan de l'imagerie TIRF, on réalise le même type de mesures, si ce n'est que le temps d'acquisition des images vaut 0,5 s, et que le signal est enregistré à travers la fenêtre de détection centrée à 684 ±14 nm. La Figure 5.12 synthétise les résultats de cette expérience.

<figure><img src="image_152.png" /><figcaption>(a) Image de normalisation – couleur artificielle.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_153.png" /><figcaption>(b) Signal de l'accepteur à 458 nm</figcaption></figure>

Les valeurs présentées sont préalablement corrigées par le bruit d'obscurité de la caméra (dark count) qui, dans cette situation, s'élève à 109 ± 2 coups/px. À λ = 458 nm, pour une irradiance de 0,9 W/cm², on enregistre 28 ± 6 coups/px avant rinçage et 20 ± 5 coups/px après. Le facteur de correction $\delta^{DE}$ est défini par l'Éq. (2.2.20).

On constate un nombre de coups/px dépassant le bruit d'obscurité de la caméra relativement faible à toutes les irradiances à 458 nm. Atteindre une parfaite absence de signal d'excitation directe est cependant difficile, sauf pour une irradiance d'environ 0,06 W/cm². Comme on l'a présenté en section 2.2.3.2, réaliser de l'imagerie NEF quantitative à partir de l'émission de l'accepteur nécessite de disposer d'un facteur de correction permettant de relier le signal émis sous excitation à 633 nm au signal d'excitation directe (DE) obtenu à 458 nm dans la fenêtre de détection du FRET. Le résultat du calcul²⁶ de ce facteur $\delta^{DE}$ est donné dans la partie supérieure de la Figure 5.12 (b).

FIGURE 5.12 – Caractérisation du signal d'excitation directe à 458 nm de l'accepteur Im-AF647 sur la caméra, déposé à 100 µM sur du verre.

26. Défini dans le cadre méthodologique QuanTI-FRET – section 2.2.3.2.

### 5.3.2 COMPÉTITION ENTRE CHÉLATION ET ADSORPTION RÉSIDUELLE

Le deuxième élément que nous souhaitions étudier est la manière dont le ligand Im-AF647 se dépose sur nos surfaces microstructurées. Différents essais successifs ont permis d'identifier l'intervalle de concentrations 1-100 µM comme particulièrement pertinent. Sur une surface
donnée de boites quantiques, un recouvrement homogène de la surface est quasiment instantané même à 1 µM. De plus, pour une concentration donnée, le dépôt ne semble pas vraiment évoluer en fonction du temps d'incubation. C'est donc le paramètre de la concentration qu'il faut ajuster.

### 5.3.2.1 Adsorption résiduelle autour des microstructures

Comme le montre la Figure 5.13, le bloc fonctionnel de 26 sul-fobétaines présent dans la structure du ligand Im-AF647 ne parvient pas à minimiser l'adsorption résiduelle sur le verre comme nous l'avions espéré. La Figure 5.13 (a) illustre un cas typique pour des micro-structures rapprochées, de taille entre 20 et 30 µm. Sous excitation à $\lambda = 633$ nm, le signal détectable en dehors des microstructures de boites quantiques$^{27}$ vaut typiquement la moitié de celui émis au sein des micro-motifs de QDs. Ce résultat ne dépend ni de la densité en QDs des microstructures, ni de la concentration de la solution de Im-AF647 incubée.

27. Sur verre seul, donc.

<figure><img src="image_154.png" /></figure>

Les images sont obtenues après incubation de 15 min du Im-AF647 puis rinçage au tampon Hepes. Des formes circulaires sont identifiables au niveau de la zone de dépôt du Im-AF647 sur le verre en (c). Il s'agit vraisemblablement de traces de séchage apparaissant lorsque trop de solvant est soustrait d'un coup lors de l'étape de rinçage.

Les images des Figures 5.13 (b) et (c) montrent de plus un phénomène inattendu : différents niveaux de dépôt sont observables autour des microstructures. En s'éloignant des micro-motifs, la densité du dépôt de Im-AF647 devient proche de ce qui peut être observé sur les micro-structures elles-mêmes. Dans le cas des micro-motifs de grande taille, la zone déplétée suit la forme des microstructures, ce qui suggère l'existence d'une compétition entre l'attraction sur les QDs et sur le verre. Quel que soit le détail des interactions mises en jeu, l'objectif de mon travail était de trouver le moyen de passiver la surface de verre, de façon à minimiser – voire empêcher complètement – l'adsorption autour des microstructures, sans pour autant entraver la fonctionnalisation des boites quantiques elle-même$^{28}$.

FIGURE 5.13 – Démonstration de l'adsorption résiduelle autour des microstructures de QDs par imagerie TIRF à 633 nm.

28. Le but étant de pouvoir déposer le His-RGD le plus spécifiquement possible sur les boites quantiques pour réaliser du micropatterning cellulaire.
### 5.3.2.2 Échec de la passivation avec la BSA

Nous avons en premier lieu testé l'albumine de sérum bovin (BSA). Il s'agit d'une protéine très utilisée en biologie. Ses propriétés de passivation de surfaces sont couramment utilisées pour les tests ELISA [317], *Western Blot* [318], ou PCR [319]. La période récente a aussi vu émerger son usage pour des biocapteurs en microfluidique [320], ainsi que pour la stabilisation et passivation de nanoparticules, essentiellement pour des applications médicales [321, 322].

Pour cette expérience, une lamelle contenant des micro-motifs de QDs est d'abord incubée 1 h avec une solution de BSA 29 diluée à 1% dans une solution tampon de PBS 30, puis rincée à l'eau distillée. On réalise ensuite une incubation de 10 min avec une solution de ligand Im-AF647 à 1 µM. Après rinçage au tampon Hepes, les images obtenues sont données Figure 5.15. On peut constater l'obtention d'un résultat contraire à ce qui est souhaité : il semble n'y avoir aucun dépôt de Im-AF647 sur les boites quantiques, tout est adsorbé sur le verre. Cela peut s'expliquer par la capacité de la BSA à former des complexes de coordination avec le cuivre ou le zinc, comme en témoignent les travaux de Lee *et al.* [323].

<figure><img src="image_155.png" /><figcaption>FIGURE 5.14 – Structure de la BSA, déterminée par diffraction aux rayons X. Extrait de [315] citant [316].</figcaption></figure>

29. A3803-10G, Sigma.

30. *Phosphate-buffered saline* : 20010-019, Gibco.

<figure><img src="image_156.png" /><figcaption>(a) $I_{DD}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_157.png" /><figcaption>(b) $I_{DA}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_158.png" /><figcaption>(c) $I_{AA}$</figcaption></figure>

Les images (couleurs artificielles) sont issues d'une moyenne de 25 acquisitions de 100 ms, où l'irradiance à 458 et 633 nm – indiquées par e458 et e633 – valent respectivement 4,5 et 3,8 W/cm². La lettre f indique la longueur d'onde sur laquelle la fenêtre de détection est centrée. Les signaux $I_{DD}$, $I_{DA}$, $I_{AA}$ sont été définis chapitre 2, section 2.2.3.2.

Si cette expérience n'a pas permis de montrer l'utilité de la BSA pour passiver nos surfaces de manière à promouvoir exclusivement l'adsorption sur les microstructures de QDs, elle corrobore l'affirmation que le ligand Im-AF647 – lorsque c'est possible – se lie avec les boites quantiques de manière spécifique par chélation. Ici, la BSA chélate les atomes de zinc en surface des boites quantiques, ce qui "interdit" la présence de Im-AF647 sur les QDs. On peut cependant noter que la passivation des boites quantiques par la BSA n'est pas totale : il existe bien un faible signal $I_{AA}$, autour de 200 coups/px, au niveau de la zone correspondant au micro-motif de QDs. À cela correspond un très léger signal $I_{DA}$, autour de 130 coups/px, sur la fenêtre de détection du FRET.

<caption>FIGURE 5.15 – Signal détecté à 458 et 633 nm, dans les différentes conditions d'intérêt d'une étude NEFI. Motifs de 40 µm de côté.</caption>
### 5.3.2.3 Passivation des surfaces à l'aide de PEG

Pour passiver nos surfaces et éviter l'adosprtion du ligand Im-AF647, nous avons finalement utilisé des molécules de PLL-g-PEG. Cette espèce chimique est un copolymère avec un squelette de poly-L-lysine (PLL) et des chaînes périphériques de poly-éthylène-glycol (PEG) connectées aux lysines – typiquement 1 lysine sur 3 ou 4. Le squelette de PLL, chargé positivement, se déplie par attraction électrostatique avec le verre chargé négativement ³¹, tandis que les PEG s'étendent verticalement depuis la surface pour former une brosse polymère avec une haute densité – Figure 5.16. Le PLL-g-PEG est très utilisé en sciences de la vie depuis le début des années 90 [325], notamment pour bloquer l'adsorption non spécifique de protéines ou empêcher l'adhésion cellulaire. Il peut aussi être fonctionnalisé par un fluorophore ou une molécule d'intérêt impliquée dans des phénomènes biologiques [324]. Dans mon travail, j'ai utilisé le PLL-g-PEG ³² dilué en solution à 0,15 ou 0,3 mg/mL – pas de différence observée – dans un solvant Hepes à 10 mM, avec du NaCl à 150 mM et à un pH ~ 7,4.

Pour mettre en évidence l'effet de cette molécule, j'ai comparé 2 surfaces microstructurées de QDs issues d'un même lot de lamelles fonctionnalisées. Un puit de PDMS est ajouté pour réaliser les différentes étapes d'incubation et de rinçage ³³. La passivation ciblée du verre obtenue par le PLL-g-PEG est testée en incubant une des lamelles pendant 1 h, que l'on rince ensuite à l'eau distillée. On ajoute alors une solution de Im-AF647 à 10 µM sur les 2 lamelles, pour une incubation de 30 min, puis un rinçage au tampon Hepes, qui sert ensuite de milieu pour les observations sur le montage expérimental TIRF. Notre hypothèse de travail est que le PLL-g-PEG se dépose essentiellement sur le verre, autour et entre les boites quantiques, de telle manière à ce que les brosses PEG repoussent les ligands Im-AF647 sauf au niveau des QDs elles-mêmes, comme l'illustre schématiquement la Figure 5.17.

La comparaison expérimentale entre la surface passivée avec le PLL-g-PEG et la surface témoin est présentée en Figure 5.18. Sans PLL-g-PEG, on observe ce que l'on a constaté précédemment, i.e. une forte adsorption du ligand Im-AF647 sur et autour des microstructures de QDs, avec la présence d'une zone intermédiaire déplétée – cf. Figure 5.18 (a). Refaire un cycle d'incubation d'une solution de Im-AF647 (ici à 50 µM) et un rinçage ne modifie pas cette répartition spatiale, comme le montre la Figure 5.18 (b). L'adsorption supplémentaire obtenue est uniforme, comme le traduit l'augmentation du signal sous illumination à 633 nm, qui est multiplié par 1,5 en moyenne.

Par contre, l'incubation de PLL-g-PEG – Figures 5.18 (c) et (d) – joue bien le rôle attendu : l'adsorption non spécifique du ligand autour des QDs est largement supprimé. Ce phénomène se caractérise par une quasi-disparition du signal du ligand autour des micro-motifs et une diminution du signal à l'intérieur de ces derniers, liée au fait que les QDs n'occupent pas l'entièreté de l'espace disponible ³⁴. Le signal hors des micro-motifs vaut typiquement 15 à 20 % du signal capté au niveau des microstructures ³⁵, d'après la Figure 5.18 (d). Reproduire sur

<figure><img src="image_159.png" /><figcaption>FIGURE 5.16 – Schéma de l'adsorption de PLL-g-PEG sur la melle de verre. Adapté de [324].</figcaption></figure>

31. Par exemple : le verre activé par nettoyage Piranha ou Plasma-Air présente des groupements silanol SiOH.

32. PLL(20)-g(3.5)-PEG(2), SuSoS.

33. Suivant le modèle présenté en section précédente via la Figure 5.10.

<figure><img src="image_160.png" /><figcaption>FIGURE 5.17 – Schéma de la passivation du substrat avec du PLL-g-PEG.</figcaption></figure>

34. Comme nous l'avons caractérisé au chapitre précédent, on peut estimer la compacité de notre monocouche à environ 30 %.

35. Contre 50 à 100 % sans PLL-g-PEG, selon la distance par rapport au micro-motif.
cette surface passivée le test d'une seconde incubation de Im-AF647<sup>36</sup> permet de constater une augmentation non-uniforme de l'adsorption spécifique et non-spécifique : le signal du ligand Im-AF647 est multiplié par 1,25-1,40 sur les microstructures, contre une augmentation de 1,60-1,80 sur le verre, ce qui suggère une limite à la robustesse de la passivation.

<figure><img src="image_161.png" /><figcaption>(a) Im-AF647 sur surface sans PLL-g-PEG</figcaption></figure>

<figure><img src="image_162.png" /><figcaption>(c) Im-AF647 sur surface avec PLL-g-PEG</figcaption></figure>

<figure><img src="image_163.png" /><figcaption>(b) Profil horizontal sans PLL-g-PEG</figcaption></figure>

<figure><img src="image_164.png" /><figcaption>(d) Profil horizontal avec PLL-g-PEG</figcaption></figure>

36. Ici de nouveau à 10 µM, plutôt que 50.

FIGURE 5.18 – Passivation des surfaces à l'aide du PLL-g-PEG.

(a) et (c) Images TIRF obtenues à partir de la moyenne de 25 acquisitions dans les conditions suivantes :
Excitation à 633 nm
Irradiance = 2 W/cm²
$t_{acq}$ = 500 ms

La flèche en (a) et (c) indique la position du profil réalisé permettant de respectivement obtenir (b) et (d). La ligne grise en (b) et (d) correspond au bruit d'obscurité de la caméra.

La passivation fournie par l'incubation des surfaces avec la molécule de PLL-g-PEG permet cependant d'obtenir des images bien contrastées, comme l'atteste la Figure 5.18 (c). La vérification que ce niveau de passivation est suffisant pour permettre le *micropatterning* cellulaire sur les microstructures de QDs sera présentée dans le chapitre suivant.

### 5.3.3 MISE EN ÉVIDENCE DU FRET SUR LES MICROSTRUCTURES

Nous devons introduire ici différentes notations permettant de quajifier précisément les conditions d'observation dans les expériences qui suivent :

- [D] : Les QDs, jouant le rôle de donneur FRET, sont seules.

- [DA] : Les donneurs FRET sont mis en présence d'accepteurs FRET (dans ce chapitre, le ligand Im-AF647).

- [DAI] : Les surfaces [DA] ont subi un rinçage à l'aide d'une solution d'imidazole à 2 M.
L'ajout la lettre **R** à la fin des sigles précédents signifie que la surface a été rinçée avec le tampon Hepes, 5 fois de suite. Pour chacune des conditions, j'ai imagé les surfaces dans 3 configurations différentes :

— **e458f590**: l'excitation est à 458 nm et le signal est enregistré à travers la fenêtre de détection $F_D$ centrée à 590 ± 20 nm, ce qui correspond au signal $I_{DD}$ ciblant l'excitation des QDs et leur émission.

— **e458f684**: l'excitation est à 458 nm et le signal est enregistré à travers la fenêtre de détection $F_A$ centrée à 684 ± 14 nm, ce qui correspond au signal $I_{DA}$ associé au FRET.

— **e633f684**: l'excitation est à 633 nm et le signal est enregistré à travers la fenêtre de détection $F_A$ centrée en 684 ± 14 nm, ce qui correspond au signal $I_{AA}$ résultant de l'excitation et l'émission de l'accepteur.

### 5.3.3.1 Méthode expérimentale

Plusieurs méthodes ont été explorées avant de fixer celle qui est présentée dans cette section. Les premiers tests nous ont permis de mettre en évidence l'importance des ligands His-RGD et Im-AF647. Au chapitre précédent³⁷, j'ai montré qu'ils modifient favorablement le comportement de photo-émission des monocouches de QDs obtenues à partir des QDs[TOP] et QDs[MPA], en promouvant la photo-activation des QDs en milieu aqueux. Ainsi, lors des acquisitions en situation [D], il est nécessaire d'avoir déjà réalisé l'échange de ligands [TOP/MPA] → [His-RGD], de manière à ne pas fausser la comparaison avec les situations [DA] et [DAI] lorsque celles-ci étaient étudiées successivement sur le même groupe de micro-motifs. Considérant la stabilisation de la photoluminescence des QDs permise par le ligand His-RGD; la possibilité d'effectuer l'échange de ligands His-RGD → Im-AF647 par simple incubation à haute concentration de ce dernier; ainsi que la robustesse de notre protocole de microstructuration donnant lieu à des micro-motifs de densité homogène sur une même lamelle, nous avons finalement mis en œuvre la méthode suivante :

— Une unique lamelle à micro-motifs de QDs est étudiée³⁸. L'ajout d'un puit de PDMS autour des microstructures permet de les étudier successivement³⁹ dans les différentes conditions suivantes.

— Les microstructures de QDs sont incubées 1 h avec le PLL-g-PEG à 0,3 mg/mL, rincées à l'eau distillée, puis incubées 10 min avec une solution de His-RGD à 1 µM, rincée au tampon Hepes. La situation [D] est ensuite caractérisée spectralement et par imagerie en milieu Hepes.

— Afin de garantir l'échange de ligands His-RGD → Im-AF647, le tampon Hepes est remplacé par une solution hautement concentrée de Im-AF647 à 100 µM. Cette situation [DA] est caractérisée, puis l'on rince avec le tampon Hepes pour aboutir à la situation [DAR] qui fait l'objet de la même caractérisation que précédemment.

37. cf. Figure 4.15

38. Pour éliminer la contribution d'inhomogénéité de la densité surfacique de QDs entre lamelles, évaluée à 5-10 % en partie 4.1.4.2.

39. Sans démonter l'échantillon de son support.
— La dernière situation à étudier, [DAIR], est obtenue en effectuant un lavage par de l'imidazole à 2 M (5 fois), puis un rinçage au tampon Hepes, avant d'incuber de nouveau les microstructures de QDs avec une solution de His-RGD à 1 µM, rincée au tampon Hepes : l'idée étant de se rapprocher au maximum des conditions initiales en [D].

Dans chacune de ces conditions, la caractérisation spectrale est issue de l'étude de 10 microstructures de QDs sélectionnées aléatoirement sur l'échantillon, et dont les spectres sont moyennés de manière à pouvoir comparer quantitativement les différents cas. La caractérisation par imagerie sert d'expérience complémentaire, et est à chaque fois réalisée sur un micro-motif choisi au hasard<sup>40</sup>. Avant chaque acquisition spectrale ou par imagerie, on illumine 1 min à 458 nm avec une irradiance de 4,5 W/cm<sup>2</sup>, de manière à atteindre le plateau de photo-activation des QDs – Figure 4.15 – sans pour autant photo-dégrader les donneurs et/ou accepteurs.

40. Le caractère comparable de ces différents micro-motifs est établi *via l'étude spectrale détaillée dans la section suivante.*

### 5.3.3.2 Démonstration spectrale

Cette partie de l'expérience est issue d'une moyenne de 10 spectres par condition d'illumination (458 ou 633 nm), pour chaque situation [D], [DA], [DAR], et [DAIR]. Chaque spectre associé à une microstructure est le résultat d'une moyenne de 25 mesures successives d'une seconde. Les 10 spectres de micro-motifs de QDs associés à une situation et configuration d'excitation donnée sont ensuite moyennés pour aboutir aux différents résultats, présentés sur la Figure 5.19. Le signal observé entre 640 et 800 nm, après ajout du Im-AF647 puis rinçage de la solution d'incubation (situations [DA] et [DAR]) est ainsi attribuable sans ambiguïté au phénomène de FRET.

<figure><img src="image_165.png" /></figure>

L'irradiance après l'étape de photo-activation est de 0,9 W/cm² à 458 nm et 1 W/cm² à 633 nm. Le spectre d'une microstructure est issu de la moyenne de 25 acquisitions de 1 s. Les spectres des 10 microstructures pour chaque condition sont moyennés (ligne pleine) et présentés avec l'écart-type (enveloppe).

**FIGURE 5.19** – Démonstration spectrale du FRET sur microstructures de QDs.
L'expérience contrôle présentée en section 5.3.1.1 nous permet même de quantifier précisément la part du FRET dans le signal obtenu. En re-prenant la notation QuanTI-FRET [143] présentée en section 2.2.3.2 :

— Pour la situation [DA] : on utilise le ratio des intégrales spectrales à 458 et 633 nm obtenues dans la situation contrôle de l'accepteur isolé [A] pour calculer le facteur $\delta^{DE} = 0,0079 \pm 0,0002$. On prédit donc un signal intégré d'excitation directe à 458 nm : $1156 \pm 36$ coups. On obtient le facteur $\alpha^{BT} = 0,013 \pm 0,003$ grâce à la situation [D], via le ratio du signal intégré sur l'intervalle 640-800 nm par rapport à l'intervalle 500-640 nm. On calcule ainsi un débordement spectral des donneurs sur l'intervalle 640-800 nm : $1539 \pm 439$ coups. L'intégrale spectrale du signal mesuré sous excitation à 458 nm, sur l'intervalle 640-800 nm, en situation [DA] vaut : $40421 \pm 3464$ coups. Si l'on corrige cette valeur par les contributions des bruits de fond estimées, on obtient que le FRET représente $93 \pm 3\%$ du signal enregistré sur cet intervalle de longueurs d'onde.

— Pour la situation [DAR] : la variation de présence de l'accepteur demande de re-calculer le facteur de correction de l'excitation directe à 458 nm. Ici, $\delta_R^{DE} = 0,0086 \pm 0,0014$. Le fait que les valeurs $\delta^{DE}$ et $\delta_R^{DE}$ calculées soient si proches confirme que notre choix d'irradiance laser à 458 nm est pertinent. La contribution de l'excitation directe de l'accepteur est donc : $184 \pm 29$ coups. La valeur de $\alpha^{BT}$ ne dépend pas de la présence de l'accepteur, le débordement spectral des QDs vaut alors : $3348 \pm 1064$ coups. L'intégrale spectrale du signal mesuré sous excitation à 458 nm, sur l'intervalle 640-800 nm, en situation [DAR] vaut : $26581 \pm 4008$ coups. Le même processus de calcul que précédemment nous donne alors un signal FRET représentant $87 \pm 10\%$ du signal enregistré sur cet intervalle de longueurs d'ondes.

L'augmentation de l'incertitude provient de (a) la diminution et dispersion plus importante du signal sur l'intervalle 640-800 nm, et (b) la diminution du quenching de la photoluminescence des QDs, ce qui cause une multiplication par 2 du débordement spectral sur ce même intervalle. Le fait que l'on constate plus de quenching des boites quantiques et plus de FRET dans la situation [DA] que dans la situation [DAR] est attendu : dans la situation [DA] avant rinçage, il y a un réservoir important d'accepteurs sur la surface des QDs du fait de la haute concentration (100 µM) utilisée. Le rinçage avec la solution tampon change l'équilibre thermodynamique et un nombre significatif de ligands Im-AF647 se désorbe de la surface des boites quantiques. On peut alors tenter d'estimer le nombre de ces derniers aux différentes étapes de cette expérience, de 2 manières : par comparaison avec les spectres obtenus en solution, ou en utilisant un modèle physique du FRET, comme celui des multiples accepteurs$^{41}$.

On a tracé en Figure 5.7 (b) le ratio du signal accepteur/donneur en fonction du ratio accepteur/donneur. Les signaux utilisés correspondent aux intégrales spectrales de l'accepteur sur l'intervalle 640-800 nm et du donneur sur l'intervalle 500-640 nm, en solution. Les

$$ \delta^{DE} \int_{640}^{800} I_{633nm}^{[DA]} d\lambda = 1156 \pm 36 \text{ coups} $$

$$ \alpha^{BT} \int_{500}^{640} I_{458nm}^{[DA]} d\lambda = 1539 \pm 439 \text{ coups} $$

$$ \int_{640}^{800} I_{458nm}^{[DA]} d\lambda = 40421 \pm 3464 \text{ coups} $$

$$ \delta_R^{DE} \int_{640}^{800} I_{633nm}^{[DAR]} d\lambda = 184 \pm 29 \text{ coups} $$

$$ \alpha^{BT} \int_{500}^{640} I_{458nm}^{[DAR]} d\lambda = 3348 \pm 1064 \text{ coups} $$

$$ \int_{640}^{800} I_{458nm}^{[DAR]} d\lambda = 26581 \pm 4008 \text{ coups} $$

<footnote n="41">41. Présenté dans le chapitre 2, section 2.2.1.3.</footnote>
concentrations des mélanges en solution étant connues, on peut se servir de la courbe obtenue comme moyen de calibration pour cette expérience sur surfaces microstructurées. Dans la situation [DA], ce ratio vaut 0,36 ± 0,05, et 0,10 ± 0,02 pour la situation [DAR]. À l'aide du fit polynomial réalisé, on obtient, respectivement, les valeurs $n_{[DA]}^{A/D} = 3,3 \pm 0,4$ et $n_{[DAR]}^{A/D} = 1,0 \pm 0,2$. Autrement dit : au regard des spectres mesurés pour nos expériences sur surfaces, tout se passe comme si l'on avait entre 3 et 4 ligands Im-AF647 par QD lors de l'incubation à 100 µM, et seulement 1 ligand Im-AF647 encore accroché après rinçage.

Le modèle FRET à multiples accepteurs de Clapp et al. [114], dont la forme a été donnée par l'Éq. (2.2.12), peut être ré-arrangé sous la forme de l'Éq. (5.3.1), où $\chi = r/R_0$. Le rapport $n_{[DA]}^{A/D} / n_{[DAR]}^{A/D}$ donne l'Éq. (5.3.2) où $\chi$ n'apparaît plus. Dans notre situation expérimentale, l'efficacité moyenne du FRET peut être calculée à partir du quenching de la photoluminescence des QDs, cf. Éq. (2.2.11). Pour les situations [DA] et [DAR], ce calcul donne respectivement 75 ± 9 % et 45 ± 7 %. On obtient alors $n_{[DA]}^{A/D} / n_{[DAR]}^{A/D} = 3,7 \pm 1$. Si cette méthode permet uniquement d'obtenir des proportions relatives d'accepteurs, on constate que la valeur donnée correspond bien à ce que l'on a estimé à partir du ratio A/D des intégrales spectrales.

Cela étant dit, ces résultats témoignent aussi de la solidité de l'acroche des ligands Im-AF647 aux QDs : comme dans les expériences en solution, il faut en effet nettoyer les surfaces avec de l'imidazole à 2 M pour constater la disparition du signal FRET – situation [DAIR]$^{42}$. On constate de nouveau cet effet étonnant de l'inhibition des boites quantiques par l'imidazole, que l'on aurait pu attribuer à une perte de QDs causée par les rinçages successifs, si on ne l'avait pas aussi constaté durant nos expériences en solution – cf. Figure 5.8. Il semble donc clair qu'à un certain niveau, la présence d'imidazole pur à la surface des boites quantiques modifie leur photo-émission de façon délétère.

$$E_{MA} = \frac{1}{1 + \frac{\chi^6}{n^{A/D}}} \qquad (5.3.1)$$

$$\frac{n_{[DA]}^{A/D}}{n_{[DAR]}^{A/D}} = \frac{\frac{1}{E_{MA}^{[DAR]}} - 1}{\frac{1}{E_{MA}^{[DA]}} - 1} \qquad (5.3.2)$$

42. Plusieurs itérations de cette expérience ont été réalisées jusqu'à ce que nous nous décidions à monter la concentration. Nos solutions d'imidazole initiales étaient de concentration d'environ 450 mM, mais cela n'avait essentiellement d'effet que sur les ligands Im-AF647 adsorbés sur le verre ou le PLL-g-PEG.

### 5.3.3.3 Démonstration par imagerie du FRET sur microstructures

Par imagerie, on utilise systématiquement des filtres passe-bande permettant de bien sélectionner les signaux du donneur et de l'accepteur. Les images obtenues sont issues de la moyenne de 25 acquisitions de 0,5 s. Les conditions d'illumination et de photo-activation restent inchangées. La Figure 5.20 récapitule les différentes images obtenues. Les résultats exposés dans la section précédente restent valables et ne nécessitent pas d'être répétés, à la différence que les filtres passe-bande permettent de considérablement augmenter le rapport signal sur bruit de la détection du FRET, comme je vais le montrer. On peut cependant relever que l'imagerie permet ici de confirmer l'apport du PLL-g-PEG pour la passivation des surfaces : après rinçage de la solution de Im-AF647 – situation [DAR] – le signal émis hors des micro-motifs de QDs sous excitation à 633 nm est indétectable à l'œil – Figure 5.20 (i) – alors même que la forte concentration de 100 µM avait induit une très forte présence du ligand, détectable en situation [DA] – Figure 5.20 (f).
<figure><img src="image_166.png" /><figcaption>(a) $I_{DD}^{[D]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_167.png" /><figcaption>(b) $I_{DA}^{[D]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_168.png" /><figcaption>(c) $I_{AA}^{[D]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_169.png" /><figcaption>(d) $I_{DD}^{[DA]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_170.png" /><figcaption>(e) $I_{DA}^{[DA]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_171.png" /><figcaption>(f) $I_{AA}^{[DA]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_172.png" /><figcaption>(g) $I_{DD}^{[DAR]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_173.png" /><figcaption>(h) $I_{DA}^{[DAR]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_174.png" /><figcaption>(i) $I_{AA}^{[DAR]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_175.png" /><figcaption>(j) $I_{DD}^{[DAIR]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_176.png" /><figcaption>(k) $I_{DA}^{[DAIR]}$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_177.png" /><figcaption>(l) $I_{AA}^{[DAIR]}$</figcaption></figure>

(a-c) Donneur seul [D]; (d-f) Donneur+Accepteur 100 µM [DA]; (g-i) Donneur+Accepteur après rinçage [DAR];

(j-l) Après rinçage à l'imidazole [DAIR]. Les couleurs sont artificielles.

FIGURE 5.20 – Images TIRF de motifs de 30 µm de côté, pour les différentes configurations d'observation et conditions de préparation.
<figure><img src="image_178.png" /></figure>

Les valeurs moyennes et écarts-types sont obtenues à partir d'un ROI (region of interest) sur l'entièreté des micro-motifs en excluant les bords. N ≈ 7 × 10⁴ pixels par motif. Les courbes tracées à partir de profils des images servent à illustrer les variations des signaux.

Pour pousser plus loin l'analyse, et préciser l'intérêt du dispositif d'imagerie par rapport à l'étude spectrale, il est nécessaire de procéder à une analyse quantitative en extrayant, à partir des images originales, les valeurs des pixels associés aux microstructures pour chaque configuration d'acquisition, dans les différentes situations de [D] à [DAIR]. Ces données sont compilées Figure 5.21, avec les profils de micro-motifs correspondants à titre d'illustration. Après correction du bruit propre de la caméra<fnref n="43" />, on peut se placer dans le cadre QuanTI-FRET pour déterminer la proportion de FRET attribuable au signal $I_{DA}$. La situation [D] permet<fnref n="44" /> d'établir la valeur du facteur de correction $\alpha^{BT} = 0,0018 \pm 0,0006$. Pour chaque situation [DA], [DAR], et [DAIR], on trouve alors les valeurs effectives $\alpha^{BT} I_{DD}^{[i]}$ correspondant au débordement spectral des QDs enregistré dans la fenêtre de détection du FRET. Ces valeurs, qu'on doit retrancher au signal $I_{DA}$, sont rassemblées dans la Table 5.1 ci-dessous. Parallèlement, on peut utiliser l'expérience contrôle présentée en section 5.3.1.2 pour construire une prédiction du signal d'excitation directe de l'accepteur à 458 nm, pour une irradiance de 0,9 W/cm². Les facteurs de correction $\delta^{DE}$ pour les situations avant et après rinçage de la solution d'incubation, présentés en Figure 5.12 (b), valent respectivement 0,007 ± 0,002 et 0,010 ± 0,0030. Les signaux $\delta^{DE} I_{AA}^{[i]}$, à retrancher au signal $I_{DA}$, sont eux aussi compilés dans la Table 5.1.

<table><caption>FIGURE 5.21 – Quantification des signaux enregistrés sur les micro-motifs de QDs présentés Figure 5.20</caption><thead><tr><th>α<sup>BT</sup> I<sub>DD</sub><sup>[i]</sup> moyen ± écart-type</th><th>DA</th><th>DAR</th><th>DAIR</th></tr></thead><tbody><tr><td>En Nb coups/px</td><td>8 ± 3</td><td>15 ± 6</td><td>5 ± 2</td></tr><tr><td>En (%) du signal I<sub>DA</sub></td><td>0,2 ± 0,1</td><td>0,5 ± 0,2</td><td>2,7 ± 0,1</td></tr></tbody><thead><tr><th>δ<sup>DE</sup> I<sub>AA</sub><sup>[i]</sup> moyen ± écart-type</th><th>DA</th><th>DAR</th><th>DAIR</th></tr></thead><tbody><tr><td>En Nb coups/px</td><td>29 ± 9</td><td>14 ± 5</td><td>4 ± 2</td></tr><tr><td>En (%) du signal I<sub>DA</sub></td><td>0,6 ± 0,2</td><td>0,4 ± 0,2</td><td>3,5 ± 1,2</td></tr></tbody></table>

$$I_{DD}^{[D]} = 19276 \pm 1427 \text{ coups/px}$$

$$I_{DA}^{[D]} = 36 \pm 9 \text{ coups/px}$$

<caption>TABLE 5.1 – Valeurs des signaux de débordement spectral des QDs dans la fenêtre de détection de l'accepteur FRET et des signaux d'excitation directe de l'accepteur Im-AF647.</caption>

<footnote n="43">43. De valeur 109 ± 2 coups/px</footnote>

<footnote n="44">44. Via les signaux :</footnote>
Nous pouvons donc corriger les signaux bruts $I_{DA}$ de manière adéquate, c'est-à-dire de façon à quantifier la proportion de signal FRET $I_{DA}^{corr}$ pour les différentes étapes expérimentales. Ces résultats sont présentés dans la Table 5.2, et permettent de démontrer la pertinence de nos choix de paramètres d'illumination, d'acquisition, comme de la sélection spectrale réalisée par nos fenêtres de détection : le signal enregistré provient ici quasi-exclusivement du FRET.

<table><caption>TABLE 5.2 – Valeurs corrigées des signaux $I_{DA}^{corr}$ correspondant au FRET.</caption><thead><tr><th>Signal moyen ± Écart-type</th><th>DA</th><th>DAR</th><th>DAIR</th></tr></thead><tbody><tr><td>En Nb coups/px</td><td>4506 ± 296</td><td>3247 ± 280</td><td>103 ± 19</td></tr><tr><td>En (%) du signal I<sub>DA</sub></td><td>99,2 ± 0,3</td><td>99,1 ± 0,4</td><td>92,1 ± 4,5</td></tr></tbody></table>

Comme dans la section précédente, il est possible de déterminer une valeur d'efficacité du FRET, tout d'abord une nouvelle fois à partir du signal des QDs. Par cette méthode, on obtient $E = 76 \pm 11 \%$ en situation [DA] et $E = 58 \pm 10 \%$ en situation [DAR], ce qui est proche des résultats issus de l'analyse spectrale. Il faut aussi noter qu'ici, l'écart-type sur les valeurs d'efficacité du FRET rend compte de la variation locale pour chaque pixel de l'image d'un motif de QDs de surface $\sim 30 \times 30 \ \mu m^2$, tandis que les calculs à partir des données spectrales concernent une surface d'acquisition environ 3 fois inférieure, mais intègrent une variabilité inter-motifs. Le calcul de $n_{[DA]}^{A/D} / n_{[DAR]}^{A/D}$ à partir de l'Éq. (5.3.2) donne une valeur de $2,3 \pm 0,7$. La robustesse de la méthode de calcul de l'efficacité du FRET par le quenching des donneurs peut varier selon les contextes expérimentaux [135]. La concordance empirique globale ici observée peut s'expliquer par la conjonction de plusieurs facteurs favorables$^{45}$ – en plus de l'absence de facteurs de confusion pouvant mener à un quenching parasite des donneurs.

### 5.3.3.4 Comparaison avec l'approche QuanTI-FRET

Cela étant dit, j'ai également souhaité utiliser le formalisme QuanTI-FRET pour comparer ces résultats à une approche basée sur l'émission de l'accepteur. Idéalement, ce formalisme nécessite de réaliser une calibration à l'aide d'échantillons de stœchiométrie S connue et pour plusieurs distances D-A fixées [143], de manière à déterminer les facteurs de correction $\beta^X$ et $\gamma^M$. N'ayant pas de tels échantillons de calibrations – qui doivent être basés sur le même couple FRET – j'ai plutôt tenté d'estimer directement ces facteurs de correction à partir des données instrumentales et photo-physiques, que nous pouvions measures. En effet, si l'on se réfère aux équations (2.2.21) et (2.2.22)$^{46}$, $\gamma^M$ dépend des rendements quantiques de l'accepteur (Im-AF647) et du donneur (les QDs utilisés), ainsi que de l'efficacité de détection des différents canaux. Le facteur $\beta^X$ est construit à partir des intensités d'excitation aux différentes longueurs d'onde, et des sections efficaces d'absorption. Toutes ces grandeurs nous sont accessibles avec plus ou moins de précision, et peuvent faire l'objet d'une estimation préalable.

45. On a en effet montré :

(a) que la distribution spectrale suggérait une configuration donneur : accepteur telle que l'on se situe dans l'intervalle entre 10 : 1 et 1 : 10, ce qui est requis pour faire du FRET quantitatif [135];

(b) que les données spectrales comme d'imagerie témoignent d'une répartition homogène des donneurs comme de l'accepteur sur l'ensemble des micro-motifs d'une lamelle;

(c) que notre dispositif expérimental et les paramètres d'illumination choisis permettent une bonne spécificité dans l'imagerie des QDs et du Im-AF647, comme en témoigne la Table 5.2.

46. Voir section 2.2.3.2.
À partir de la courbe de rendement quantique de notre caméra, que l'on intègre sur les bandes spectrales de nos fenêtres de détection, on peut estimer le rapport des efficacités de détection$^{47}$. Il est connu que la présence d'une interface diélectrique influence fortement le rendement quantique de nos émetteurs, mais les facteurs de correction à appliquer peuvent être postulés très proches pour le donneur et l'accepteur. Sachant que c'est le ratio des rendements quantiques qui intervient dans la définition de $\gamma^M$, et à défaut de pouvoir mesurer précisément le rendement quantique *in situ*, nous prenons les valeurs de $\phi$ en solution pour ce calcul. Pour les QDs, la moyenne déterminée au chapitre 3, section 3.2.3.4, est de 79 %. Concernant l'Alexa Fluor 647, nous prenons la valeur de référence (33 %), en l'absence d'autres éléments. On obtient alors $\gamma^M \approx 0,464$.

Les valeurs d'irradiance laser sont connues – chapitre 2, section 2.4.2.1. Le rapport des sections efficaces d'absorption peut être estimé à partir du rapport des valeurs d'extinction molaires aux longueurs d'onde d'excitation du montage optique. Ces valeurs ont été mesurées à partir de spectres d'absorption réalisés avec des solutions de concentration connue. Là encore, $\sigma$ est fortement modifiée au voisinage d'une surface, pour les mêmes raisons que $\phi$. Mais $\beta^X$ faisant intervenir le rapport des sections efficaces d'absorption, on peut tout de même tenter d'estimer ce facteur. On obtient ainsi $\beta^X \approx 0,181$.

Le dispositif expérimental et les espèces chimiques mises en jeu étant identiques pour les situations de [D] à [DAIR], ces valeurs restent constantes. On peut alors calculer les distributions de E et S à partir des équations (2.2.25) et (2.2.26) et tracer les valeurs de S en fonction de E – Figure 5.22.

<figure><img src="image_179.png" /></figure>

Comme attendu, le tracé sans calibration donne des valeurs complètement différentes de ce que nous avons obtenu par l'analyse spectrale ou par imagerie. À l'inverse, après calibration, les distributions de valeurs de E et S sont cohérentes avec nos précédents résultats.

47. Les données constructeur de nos filtres, indiquées dans le chapitre 2, section 2.4.1.4, annoncent un même taux de transmission (93 %) pour leurs fenêtres spectrales respectives. J'admettons cela pour simplifier mes calculs.

$$ \gamma^M = \frac{\phi_A \cdot \eta_{Adet}^{Aem}}{\phi_D \cdot \eta_{Det}^{Dem}} = \frac{0.33 \cdot 1,00}{0,79 \cdot 0,90} \approx 0.464 $$

$$ \beta^X = \frac{\frac{L_A}{h\nu_A} \cdot \sigma_{Adex}^A}{\frac{L_D}{h\nu_D} \cdot \sigma_{Dex}^D} = \frac{\frac{1,013}{h\nu_A} \cdot 160854}{\frac{0,893}{h\nu_D} \cdot 729862} \approx 0.181 $$

<caption>FIGURE 5.22 – Distributions de $S(E)$ pour les différentes situations expérimentales.</caption>
<table><caption>TABLE 5.3 – Valeurs moyennes de *E* et *S* obtenues par QuanTI-FRET après calibration. N ≈ 7 × 10⁴.</caption><thead><tr><th></th><th>DA</th><th>DAR</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>E</i> (%)</td><td>68,1 ± 0,9</td><td>46,6 ± 1,5 %</td></tr><tr><td><i>S</i></td><td>0,23 ± 0,01</td><td>0,47 ± 0,02</td></tr><tr><td><i>n</i><sup>A/D</sup></td><td>3,34 ± 0,04</td><td>1,13 ± 0,04</td></tr></tbody></table>

Les valeurs d'efficacités du FRET – Table 5.3 – sont situées à la bordure inférieure de l'écart-type de nos précédents calculs. Cette baisse de l'efficacité estimée peut être associée à une sur-estimation de $\gamma^M$, essentiellement causée par une sous-estimation de $\phi_D$ et/ou une sur-estimation de $\phi_A$. La réduction de l'écart-type dans cette approche est quant à elle liée au fait que le calcul avec calibration de *E* est réalisé pixel par pixel. Or, d'après nos résultats d'imagerie, les donneurs comme les accepteurs sont répartis de façon plutôt homogène. De plus, les distances D-A devraient par construction être relativement identiques. Il est donc plutôt logique d'observer de faibles variations de $E^{48}$. Les valeurs moyennes de *S* sont converties en valeurs de $n^{A/D}$ à l'aide de l'Éq. (2.2.26). On constate une grande cohérence avec nos estimations faites à partir des spectres⁴⁹. L'estimation faite de $n^{A/D}_{[DA]} / n^{A/D}_{[DAR]} = 2,3 \pm 0,7$, à partir des calculs d'efficacité du FRET basés sur les valeurs de quenching des donneurs obtenues par image-rie, est centrée sur une valeur légèrement plus basse que nos autres estimations mais reste proche. On peut associer ce léger décalage à la valeur de $E_{[DAR]} = 58 \pm 10\%$ obtenue de cette façon, elle aussi légèrement différente. La légère asymétrie des spectres d'émission des QDs, et leur faible décalage vers le rouge entre la situation [D] et les situations [DA/DAR], auraient pu créer un biais affectant les valeurs de signal obtenues lors de la sélection spectrale réalisée pour l'imagerie. Cependant, si l'on re-calcule $E_{[DAR]}$ à partir des intégrales spectrales des QDs, sur l'intervalle 580-600 nm correspondant à notre fenêtre de détection, on retrouve le même résultat que le calcul réalisé précédemment sur l'intervalle 500-640 nm. Il ne s'agit donc pas de la source des légères différences constatées. Un phénomène de décrochage d'un certain nombre de donneurs, causée par les différents rinçages entre les situations de [D] à [DAIR], pourrait cependant expliquer cette valeur de *E* légèrement plus élevée lorsque calculée à partir du quenching des QDs.

Enfin, on constate aussi la présence de corrélations variables entre *E-S*. Avant calibration, cette corrélation est attendue, et les coefficients de Spearman $R_S$ rapportés en Table 5.4 suggèrent qu'elle est faible en [DA] et modérée en [DAR]. Après calibration, elles deviennent très faible en [DA] et faible en [DAR], ce qui suggère⁵⁰ une pertinence réelle mais imparfaite de notre l'estimation de $\beta^X$ et $\gamma^M$.

<table><thead><tr><th>Avant calibration</th><th>DA</th><th>DAR</th><th>Après calibration</th><th>DA</th><th>DAR</th></tr></thead><tbody><tr><td>$R_S$</td><td>-0,190</td><td>-0,436</td><td>$R_S$</td><td>-0,097</td><td>-0,35</td></tr><tr><td>$p$</td><td>0,007</td><td>0,007</td><td>$p$</td><td>0,007</td><td>0,007</td></tr></tbody></table>

48. De par notre protocole expérimental, cela est possible uniquement par cette approche, où les signaux permettant de calculer *E* proviennent du même motif, avec la même aire d'extraction des valeurs de pixels. Par construction, le calcul de *E* à partir du quenching des donneurs donne des valeurs nécessairement plus dispersées ici, car nous observons un motif différent à chaque situation, de [D] à [DAIR].

49. Que ce soit par ratio des intégrales spectrales ou à partir des efficacités de FRET dans le cadre du modèle à multiples accepteurs.

50. La persistance d'une corrélation pourrait aussi s'expliquer par une répartition locale inhomogène des accepteurs sur les donneurs.

<caption>TABLE 5.4 – Évaluation de la corrélation entre les distributions *E* et *S*. $R_S \ge p$ indique la présence d'une corrélation ($|R_S^{max}| = 1$). N ≈ 7 × 10⁴.</caption>
## 5.4 CONCLUSIONS SUR LES SURFACES ACTIVES POUR NEFI

Le ligand Im-AF647 a servi de plateforme de test pour démontrer la possibilité de mener une étude d'imagerie NEF. Les premières expériences, réalisées en solution, ont fourni des données aidant à la mise au point et l'interprétation de l'expérience de démonstration sur surfaces de QDs microstructurées. Les différentes configurations avec et sans accepteur FRET ont été caractérisées spectralement et par imagerie, ce qui m'a permis d'exposer la pertinence du montage optique présenté dans le chapitre 2. En déterminant précisément les bruits de fond issus du signal de débordement spectral des QDs dans la fenêtre de détection de l'accepteur, et de l'excitation directe de l'accepteur à 458 nm, j'ai démontré que la sélection spectrale et le régime d'irradiance privilégié permettent d'enregistrer des images dont le signal provient à 99 % du FRET. L'utilisation de méthodes variées pour déterminer les ratios accepteurs/donneurs et l'efficacité du FRET a permis de constater une grande proximité dans les résultats obtenus. Ces derniers sont complés dans la Table 5.5. Enfin, l'émission du ligand Im-AF647 a permis de caractériser une méthode de passivation de la surface en verre de nos substrats, de manière à optimiser la spécificité de l'adsorption de nos ligands s'adsorbant par chélation sur les boites quantiques. Cet élément était nécessaire pour pouvoir réaliser du micropatterning célulaire via des micro-motifs de QDs[His-RGD]. La démonstration de cette capacité, et l'exploration des études qui en découlent, sont l'objet du dernier chapitre.

<table><thead><tr><th>Type de données</th><th>Méthode de calcul</th><th>E<sub>[DA]</sub> (%)</th><th>E<sub>[DAR]</sub> (%)</th><th>n<sup>A/D</sup><sub>[DA]</sub></th><th>n<sup>A/D</sup><sub>[DAR]</sub></th><th>n<sup>A/D</sup><sub>[DA]</sub> / n<sup>A/D</sup><sub>[DAR]</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Spectres</td><td>Calibration solution</td><td>—</td><td>—</td><td>3,3 ± 0,4</td><td>1,0 ± 0,2</td><td>3,3 ± 1,1</td></tr><tr><td>Quenching donneurs</td><td>75 ± 9</td><td>45 ± 7</td><td>—</td><td>—</td><td>—</td></tr><tr><td>Modèle FRET<sub>MA</sub></td><td>—</td><td>—</td><td>—</td><td>—</td><td>3,7 ± 1</td></tr><tr><td rowspan="3">Imagerie</td><td>Quenching donneurs</td><td>76 ± 11</td><td>58 ± 10</td><td>—</td><td>—</td><td>—</td></tr><tr><td>Modèle FRET<sub>MA</sub></td><td>—</td><td>—</td><td>—</td><td>—</td><td>2,3 ± 0,7</td></tr><tr><td>QuanTI-FRET</td><td>68,1 ± 0,9</td><td>46,6 ± 1,5</td><td>3,34 ± 0,04</td><td>1,13 ± 0,04</td><td>2,96 ± 0,14</td></tr></tbody></table>

Modèle FRET<sub>MA</sub> renvoie au calcul du ratio $n_{[DA]}^{A/D} / n_{[DAR]}^{A/D}$ réalisable à partir du réarrangement de l'équation du modèle FRET à multiples accepteurs.

<caption>TABLE 5.5 – Compilation des estimations de E et $n^{A/D}$.</caption>
# Applications à l'étude de l'adhésion cellulaire

6

Ce chapitre expose les travaux préliminaires réalisés sur les surfaces micro-structurées par imagerie NEF. J'y présente aussi les perspectives dans le domaine de la localisation latérale super-résolue des accepteurs FRET.

## 6.1 ADHÉSION CELLULAIRE SPÉCIFIQUE SUR MICROSTRUCTURES

Afin de vérifier le bon fonctionnement de la terminaison RGD du ligand de surface His-RGD présent sur les boites quantiques, j'ai observé l'adhésion de cellules sur des surfaces homogènes et sur des microstructures.

### 6.1.1 DYNAMIQUE D'ÉTALEMENT SUR SURFACES HOMOGÈNES

Comme nous l'avons présenté durant le chapitre 1, section 1.1.2, la séquence peptidique RGD contenue dans plusieurs de protéines de la matrice extra-cellulaire (ECM)¹, est reconnue par beaucoup d'intégrines². Lorsque le ligand RGD est présent sur une surface, la reconnaissance RGD-intégrines promeut l'adhésion (étalement) des cellules. À l'inverse, lorsque les surfaces sont recouvertes d'une molécule qui empêche l'adhésion spécifique, par exemple des PEGs, les cellules ne peuvent plus s'étaler. Elles adopteront une forme globulaire – i.e. sphérique. Après plusieurs heures, certains types cellulaires sont capables de s'étaler sur des surfaces non-adhésives en fabriquant leur propre matrice extra-cellulaire. Dans le cadre de ce projet doctoral, nous souhaitions étudier la lignée cellulaire U87-EGFR-WT, fournie par Laurence Choulier du LBP³ de l'Université de Strasbourg – cf. présentation partie 6.2. C'est donc à l'aide de ces cellules que j'ai réalisé mes expériences de dynamiques d'étalement. Pour observer un grand nombre de cellules dans les différentes conditions testées, nous utilisons ici des surfaces de QDs homogènes. Ces observations étant faites en microscopie à contraste de phase, il n'était pas nécessaire de marquer les cellules avec un fluorophore.

### 6.1.1.1 Première vérification de la bio-fonction du ligand His-RGD

Dans cette expérience, une lamelle homogène de QDs est préparée selon le même protocole que pour nos microstructures en section 5.3.3.1, de manière à obtenir des états de surface identiques à ceux visés pour le micropatterning cellulaire – à la microstructuration près. Après une incubation durant 1 h avec du PLL-g-PEG à 0,3 mg/mL rincée à l'eau distillée, on réalise une incubation de 10 min avec une solution de

6.1 Adhésion cellulaire spécifique sur microstructures 131

Dynamique d'étalement sur surfaces homogènes

Adhésion cellulaire sur microstructures

6.2 Observation du récepteur EGFR 135

Marquages cellulaires
Résultats de l'étude NEFI

6.3 Perspectives 140

FRET sur cellules vivantes par marquage membranaire

Super-résolution latérale par clinotement de l'accepteur

6.4 Conclusions sur l'applicatiion aux études d'adhésion cellulaire 147

1. Rappel : Extra Cellular Matrix.

2. comme α₅β₁, αᵥβ₃, αIIbβ₃, etc.

3. Laboratoire de Bio-imagerie et Pathologies.
His-RGD à 1 µM, rincée 5 fois au tampon Hepes⁴, puis à l'eau distillée. Cette lamelle est l'objet du test d'adhésion. Pour comparaison, 2 lamelles de verre subissent un nettoyage Piranha. La première est fonctionnalisée avec du PLL-g-PEG à 0,3 mg/mL. Cela sert de témoin négatif (absence d'adhésion spécifique), qu'on note [-]. La seconde est incubée 1 h avec une solution de fibronectine 5 à 10 µg/mL puis rincée à l'eau distillée, ce qui nous donne un témoin positif (présence d'adhésion spécifique) noté [+]. Les 3 lamelles de test sont réalisées en parallèle, et des cellules provenant d'une même préparation y sont incubées en même temps, selon la procédure suivante. Après, un rinçage au PBS⁶, les cellules sont décollées avec une solution de Trypsine-EDTA 0,05 %⁷ pendant 5 min à 37°C. Après ajout du milieu de culture⁸, cette suspension de cellules est ensuite déposée sur les surfaces. Les 3 échantillons sont ensuite conservés dans l'enceinte d'un microscope ⁹ à contraste de phase où la température est maintenue à 37°C, avec un taux de CO₂ à 5 %, et imagés toutes les 15 min durant 6 h. Dès 15 min, on observe un étalement des cellules sur les substrats recouverts de fibronectine [+] et sur nos lamelles de QDs biofonctionnalisées. Cet étalement s'intensifie au cours du temps, tandis que les cellules restent sphériques sur les lamelles recouvertes de PLL-g-PEG, témoin négatif [-]. La Figure 6.1 présente les images obtenues au bout d'une heure : les cellules sont quasiment toutes bien étalées, sauf sur le susstrat recouvert de PLL-g-PEG, et cette différentiation n'évolue plus jusqu'à la fin des 6 h de l'expérience.

<figure><img src="image_180.png" /><figcaption>(a) [+] : fibronectine</figcaption></figure>

<figure><img src="image_181.png" /><figcaption>(b) [-] : PLL-g-PEG</figcaption></figure>

<figure><img src="image_182.png" /><figcaption>(c) QDs[His-RGD]+PLL-g-PEG</figcaption></figure>

### 6.1.1.2 Confirmation de la spécificité de la liaison au His-RGD

Les résultats précédents ne permettent cependant pas de conclure définitivement sur un rôle "spécifique" du ligand. En effet, la surface des boites quantiques étant chargée¹⁰, il est possible que l'étalement observé soit aussi en partie attribuable à des interactions électrostatiques non spécifiques. Pour contrôler ce facteur, nous avons répété l'expérience d'étalement précédente en changeant les lamelles contrôles. La lamelle témoin positif pour l'adhésion [+], est cette fois-ci recouverte de PLL-g-PEG-RGD où, à l'extrémité des PEG qui forment une brosse sur

4. Hepes 10 mM; NaCl; 200 mM; pH ajusté à 8 par l'ajout de soude NaOH à 10 M.

5. F0895-1MG, Sigma-Aldrich.

6. Phosphate-buffered saline, Gibco.

7. Gibco.

8. EMEM
*Eagle Minimum Essential Medium*
Supplémenté avec :
* 10 % de Sérum de veau fœtal (SVF)
* 1 % d'antibiotique :
* Pénicilline/Streptomycine
* 1 % d'acides aminés non-essentiels
* 1 % de Pyruvate de sodium
(Tous provient de Gibco.)

9. IX73, Olympus; Objectif ×10.

FIGURE 6.1 – Comparaison des étalements de cellules U87-EGFR-WT au bout d'1 h, par imagerie à contraste de phase.

10. Fait constaté par des expériences complémentaires d'adsorption de fluorophores organiques (Atto 643; Atto 647N; Alexa Fluor 647).
la surface, on trouve le tripeptide RGD. La lamelle témoin négatif [-]
(absence d'adhésion), est une surface de QDs sur laquelle seule l'incu-
bation de PLL-g-PEG a été faite. Les 3 échantillons sont de nouveau
préparés en même temps, sur lesquels on dépose des cellules prove-
nant d'une même préparation. Considérant les précédents résultats,
nous avons réalisé des acquisitions toutes les 15 min dans les mêmes
conditions, mais sans aller au-delà d'une durée de 1 h 30.

<figure><img src="image_183.png" /></figure>

Identification des lamelles : [+] : PLL-g-PEG-RGD ; [-] : QDs+PLL-g-PEG ; Test : QDs[His-RGD]+PLL-g-PEG.

<caption>FIGURE 6.2 – Comparaison de l'étalement des cellules U87-EGFR-WT après 15 min, 1 h, et 1 h 30, par imagerie à contraste de phase.</caption>
Comme on peut le voir sur les images présentées sur la Figure 6.2 (a)-(c), les cellules s'étalent sur la surface recouverte de PLL-g-PEG-RGD [+]. En ce qui concerne la lamelle avec QDs+PLL-g-PEG, témoin négatif [-] sans ligand His-RGD, on constate cette fois-ci un début d'étalement entre 1 h et 1 h 30 – Figure 6.2 (d)-(f) – même si cette dynamique reste très lente. Le substrat Test, avec QDs[His-RGD]+PLL-g-PEG, présente quant à lui une dynamique similaire à notre contrôle positif [+]. Pris ensemble, ces éléments prouvent que notre ligand His-RGD à présent la surface des QDs induit une adhésion spécifique.

## 6.1.2 ADHÉSION CELLULAIRE SUR MICROSTRUCTURES

Les vérifications précédentes étant faites, je vais présenter maintenant les résultats obtenus *via* des lamelles microstructurées avec des QDs. Le protocole de préparation des lamelles microstructurées a été présenté durant le chapitre 4. Le dernier rinçage des lamelles à micro-motifs de QDs se fait au tampon PBS. La préparation des cellules U87-EGFR-WT est identique à celle exposée en section précédente. Afin d'anticiper la phase de marquage fluorescent présenté dans la suite de cette partie, l'observation finale des cellules se fait dans un tampon PBS cationique ¹¹.

11. Avec ions Ca²⁺ et Mg²⁺ à 1 mM.

### 6.1.2.1 Démonstration du micropatterning cellulaire

Pour démontrer notre capacité à faire adhérer spécifiquement les cellules sur les microstructures, une suspension de cellules dans leur milieu de culture est déposée sur l'échantillon durant 30 min dans l'in-cubateur à 37°C avec 5 % de CO₂. Les lamelles sont rincées 1 à 2 fois au PBS cationique de manière à ne laisser que les cellules ayant effec-tivement pu adhérer. Les images des échantillons sont alors obtenues sur notre dispositif TIRF ¹². Il est ainsi possible d'exciter les boites quantiques à 458 nm et en même temps d'éclairer les cellules en trans-mission avec de la lumière blanche – notée "diascopie LB" par la suite. Des exemples d'images ainsi acquises sont présentées Figure 6.3. Les cellules apparaissent uniquement au niveau des micropatterns.

12. Présenté au chapitre 2, section 2.4

<figure><img src="image_184.png" /></figure>

FIGURE 6.3 – Démonstration de l'adhésion spécifique de cellules U87-EGFR-WT sur micro-motifs de QDs[His-RGD].

Notons que les cellules semblent peu s'étaler, mêmes lorsqu'elles sont seules sur leur micro-motif de QDs.
Une façon d'évaluer de la qualité du procédé est de calculer le taux de remplissage, qui donne la proportion de motifs occupés ou remplis par une ou plusieurs cellules. Mais une telle mesure, pour faire sens, doit être réalisée pour un type de motifs donné, ce qui nécessite d'abord de tester différentes formes et tailles de motifs pour déterminer les plus appropriées. Or, pour des petits motifs à géométrie simple, les cellules U87-EGFR-WT ne réussissent pas vraiment à s'étaler, mêmes lorsqu'elles sont seules. Leur configuration peut aussi fortement varier pour une même forme de motif – Figure 6.4 – ce qui achève de démontrer le caractère inadapté des motifs choisis pour ces premières expériences.

<figure><img src="image_185.png" /><figcaption>FIGURE 6.4 – Illustration de la nécessité d'un *design* adéquat des micro-motifs.</figcaption></figure>

(a)-(c) Lorsqu'une seule cellule occupe un motif, elle peut présenter un début d'étalement à partir d'une adhésion sur les coins de micro-motifs, ce qui ne s'observe pas sur (d) les groupes de cellules. La seule cellule avec un étalement prononcé a été observée sur (e) des micro-motifs de QD très abîmés.

Dans le cadre de ce projet doctoral, nous n'avons pas pu approfondir cet aspect. De plus, j'ai rencontré d'importantes difficultés lors des expériences d'imagerie NEF sur ces cellules, nous conduisant à nous détourner de cette lignée cellulaire – voir section suivante.

## 6.2 OBSERVATION DU RÉCEPTEUR EGFR

### 6.2.1 MARQUAGES CELLULAIRES

#### 6.2.1.1 Aperçu des techniques existantes

Le but d'un marquage fluorescent est, par définition, de rendre visible un élément choisi des cellules. Même si certains composants cellulaires présentent une fluorescence intrinsèque¹³, il est quasi-systématiquement nécessaire de recourir à un marquage afin d'observer un élément particulier [326]. Les types de marquage peuvent se diviser en 3 grandes catégories : par adsorption physique, réaction biochimique, ou expression *in situ*. Une forme de marquage physique très commune est le marquage membranaire, par exemple avec des molécules de la famille des carbocyanines, colorants de synthèse composés d'une chaîne carbonée reliant des cycles aromatiques¹⁴ : DiD, DiO, etc. Ces espèces chimiques ont été conçues de manière à présenter une structure similaire aux phospholipides, et ainsi s'intercaler spontanément dans

13. On parle de phénomène d'autofluorescence.

14. Les propriétés d'absorption et d'émission peuvent être sélectionnées par la longueur de la chaîne carbonée ou par la présence d'espèces chimiques à certains endroits de la chaîne, comme de l'oxygène ou de l'azote.
les bicouches lipidiques. Une fois en place, ces fluorophores diffusent latéralement dans la membrane et permettent *in fine* d'obtenir une émission homogène à l'échelle de la cellule. Ce type de marquage très direct est cependant limité sur le plan des applications, dans la mesure où il existe peu de variantes différentes permettant de cibler des parties spécifiques des cellules.

Pour résoudre cela, des méthodes de marquage biochimique, comme l'immunofluorescence, ont été développées. Cela consiste par exemple à marquer une protéine d'intérêt à l'aide d'un ou deux anticorps couplé à un fluorophore<sup>15</sup>. La taille et la masse moléculaire importante de ces marqueurs<sup>16</sup> les a historiquement limités aux applications sur cellules fixées, mais divers travaux depuis 10 ans tendent à dépasser cette barrière en conjuguant les fluorophores à des portions utiles d'anticorps<sup>17</sup> uniquement [328]. Enfin, une autre méthode consiste à faire en sorte que les cellules étudiées expriment elles-mêmes des protéines fluorescentes. L'introduction dans une cellule – par transfection – de la séquence ADN codant la protéine souhaitée se traduit par une fabrication *in situ* de l'émetteur. La *Green Fluorescent Protein* (GFP) est la représentante la plus connue, et est massivement utilisée<sup>18</sup> – telle quelle ou par l'un de ses dérivés.

### 6.2.1.2 U87-EGFR-WT et aptafluorescence

Comme mentionné précédemment, j'ai eu l'occasion de travailler avec la lignée cellulaire U87-EGFR-WT, fournie par Laurence Choulier (LBP). Les lignées U87 sont des cellules humaines dérivées de glioblastome<sup>19</sup>. La lignée U87-EGFR est le résultat d'une sélection visant à obtenir une sur-expression du récepteur du facteur de croissance épithélial (EGFR)<sup>20</sup>. Le récepteur EGF fait partie de la famille des récepteurs de surface ayant une activité tyrosine kinase (RTK)<sup>21</sup>, qui participent à des voies de signalisation régulant la croissance, la différenciation, le métabolisme, l'apoptose, ainsi que l'adhésion et la migration. Un aspect crucial des cancers est la dérégulation de cette voie de signalisation, qui est associée à la progression des tumeurs [329, 330]. Cette stimulation est croisée (*crosstalk*) avec des corécepteurs tels que les intégrines, dont on a déjà présenté le rôle dans l'adhésion cellulaire – chapitre 1. Ainsi, le *crosstalk* intégrines-EGFR favorise la progression et l'agressivité des tumeurs, et contribue de plus à la résistance aux traitements, que ce soit à la chimiothérapie, à la radiothérapie ou aux thérapies ciblées [331]. EGFR est également présent dans l'environnement immédiat des clusters d'intégrines au sein des plaques d'adhésion focale.

Après avoir développé des échantillons pour l'imagerie NEF compatibles avec l'exigence de micropatterning, nous avons donc entrepris d'étudier les récepteurs EGFR sur ces cellules U87-EGFR-WT à l'aide d'un marquage très spécifique. Ce marquage est en effet réalisé biochimiquement, à l'aide d'un aptamère conjugué à l'Alexa Fluor 647, aussi fourni par Laurence Choulier (LPB). Les aptamères sont des acides nucléiques que l'on peut considérer comme des anticorps de

15. Selon les cas, le marquage peut se faire en 2 étapes, avec un anticorps primaire monoclonal très spécifique à la protéine d'intérêt et un anticorps secondaire polyclonal couplé à un fluorophore, qui va se lier avec l'anticorps primaire [327].

16. Environ 8 nm et 150-170 kDa [327, 328].

17. Réduisant ainsi la masse moléculaire à 30-55 kDa.

18. On peut donner un aperçu de l'ampleur de son usage en référant simplement les publications déjà citées dans ce document, et employant la GFP : [110, 120-124, 131, 132, 256].

19. Tumeur du cerveau aggressive la plus répandue.

20. Epithelial Growth Factor Receptor. WT signifie Wild Type.

21. Receptor Tyrosine Kinase.
synthèse, se liant à leur cible²² avec une sélectivité et une spécificité remarquable [332]. Le marquage utilisé pour cette étude est employé sur des cellules déjà adhérées. Le protocole est le suivant : un aliquot de 10 µL de solution d'aptamères fluorescents à 5 µM est chauffé 5 min à 95°C pour ouvrir l'aptamère. Cet aliquot est ensuite transféré sur un lit de glace durant 10 min, puis dilué dans 190 µL de solution tampon de PBS cationique pour obtenir une concentration finale de 250 nM. Ce mélange est laissé 5 min à température ambiante, puis ajouté sur les cellules déjà adhérées pendant 30 min dans l'incubateur à 37°C (5 % CO₂). Les lamelles sont ensuite rincées 3 fois à température ambiante avec la solution tampon et laissées 5 à 10 min dans l'incubateur avant l'observation TIRF à 37°C. Afin d'éviter la désorption de l'aptamère, l'observation doit se faire dans le PBS cationique et non dans un milieu de culture. Les lamelles utilisées sont des surfaces microstructurées de QDs sur lesquelles le ligand His-RGD est déposé spécifiquement après une première étape de passivation avec du PLL-g-PEG.

22. Sans interférer avec leur fonction biologique, ou très marginalement.

## 6.2.2 RÉSULTATS DE L'ÉTUDE NEFI

### 6.2.2.1 Adsorption de l'aptamère sur les microstructures

Nos premières observations ont révélé que l'aptamère fluorescent, s'il marquait les cellules U87-EGFR-WT de façon homogène – Figure 6.5 (d) – avait aussi tendance à s'adsorber de façon non-désirée sur les boites quantiques – Figure 6.5 (c). Cela crée un bruit de fond rendant invisible le signal FRET associé aux accepteurs présents à la surface des cellules – Figure 6.5 (b).

<figure><img src="image_186.png" /><figcaption>FIGURE 6.5 – Cellules U87-EGFR-WT marquées par l'aptamère fluorescent, sur micro-motif de QDs[His-RGD]+PLL-g-PEG.</figcaption></figure>

Une expérience très simple m'a permis de confirmer l'adsorption de l'aptamère sur les QDs. Pour cela, j'ai simplement incubé des micro-motifs de QDs[His-RGD] avec la solution d'aptamère fluorescent. J'ai ainsi pu enregistrer des images très similaires à celles présentées dans

Moyennes de 25 acquisitions
de 0,2 s

Irradiance à 458 nm : 0,3 W/cm²

Irradiance à 633 nm : 14,3 W/cm²

$I_{DD}$ : 1000-2000 coups/px

$I_{DA}$ : 200-250 coups/px

$I_{AA}$ : 1000-1400 coups/px
le chapitre précédent²³ où j'ai pu constater un signal FRET important corrélé à un quenching des QDs. Le signal important mesuré à 458 nm dans la fenêtre de détection du FRET – Figure 6.5 (b) – empêche toute possibilité de détection fine de EGFR dans les points focaux d'adhésion. Cette situation a rendu indispensable une passivation supplémentaire des surfaces avant l'adhésion des cellules et l'incubation de l'aptamère fluorescent.

### 6.2.2.2 Étude de la passivation des microstructures vis-à-vis de l'aptamère

Nous avons expérimenté des méthodes variées pour tenter de minimiser l'adsorption de l'aptamère. J'ai réalisé ces expériences sur des surfaces de QDs homogènes, en l'absence de cellules. Au vu de la spécificité de l'adsorption de l'aptamère sur les QDs, notre première stratégie a été de réaliser l'incubation de l'aptamère en l'accompagnant d'un agent chélatant²⁴ comme l'imidazole, de façon à créer une compétition entre eux. La présence d'imidazole à 10 mM n'a pas produit d'amélioration – Figure 6.6 (b).

<figure><img src="image_187.png" /></figure>

Un rinçage des surfaces après coup, avec de l'imidazole à 1 M, n'a pas été plus probant – Figure 6.6 (c). Les résultats présentés en partie 5.3.2.2 nous ont aussi suggéré une passivation plus directe, en re couvrant les QDs par de la BSA, dont nous avions vu précédemment qu'elle empêchait l'adsorption du ligand de surface Im-AF647. De plus, comme le montre la Figure 6.7, l'ajout de BSA ne modifie pas l'allure du comportement photoluminescent des surfaces de QDs[His-RGD]. Cependant, la diminution de l'adsorption de l'aptamère reste peu pro noncée ici – Figure 6.6 (d). Cette stratégie peut cependant être com binée avec notre première approche : nous avons obtenu des premiers résultats intéressants en combinant passivation des surfaces de QDs via la BSA et mise en compétition de l'adsorption par l'ajout d'un agent chélatant à la solution d'aptamère, ici avec de l'EDTA à 100 mM. Ces résultats restent malgré tout encore insuffisants – Figure 6.6 (e). Il faut aussi prendre en compte qu'en situation réelle, une partie des aptamères fluorescents marque effectivement le récepteur EGFR des cellules, ce qui diminue la population susceptible de s'adsorber sur les QDs. Si les surfaces de boites quantiques ont été préalablement

23. Voir Figure 5.20.

24. Voir section 5.1.1.1.

FIGURE 6.6 – Compilation des premiers tests de minimisation de l'adsorption de l'aptamère fluroescent.

Dans chaque situation, une image moyennée de 25 acquisitions est obtenue pour chaque configuration d'imagerie. La moyenne des valeurs de coups/px, accompagné de son écart-type, est extraite d'une aire de 50 µm de côté au centre de l'image. Les valeurs sont ensuite normalisées par le signal $I_{DD}$ pour écarter le biais issus de différences de densités surfaciques de QDs.

<figure><img src="image_188.png" /></figure>

FIGURE 6.7 – Comparaison de l'évolution temporelle de la photoluminescence des QDs sous illumination continue, avec et sans passivation à la BSA 1 %. Irradiance : 0,15 W/cm²
$t_{acq}$ = 50 ms.
passivées à la BSA, la présence de cellules permet de retrouver des résultats d'adsorption de l'aptamère identiques à la situation BSA + EDTA 100 mM – **Figure 6.6 (f).**

Cependant, une molécule comme la BSA est relativement grande par rapport à un aptamère, et n'est donc *a priori* pas la meilleure candidate pour la passivation de la surface des QDs. Nous avons donc évalué si nous obtenions de meilleurs résultats en employant de l'ARN de transfert (ARNt) issu de levure<sup>25</sup>, recommandé par Laurence Choulier. Ce composé est généralement utilisé à une concentration de 100 µg/mL. Tout comme pour la BSA, l'incubation est faite sur 1 h. Le rinçage des lamelles est réalisé avec la solution de tampon PBS cationique. Les résultats de ces expériences sont synthétisés sur la **Figure 6.8**. Dans chaque cas, 2 lamelles ont été préparées, la première servant de contrôle (texte normal et couleur hachurée) et la seconde correspondant à la concentration testée pour l'occasion (texte affiché en **gras** et couleur pleine). Par exemple, dans notre 1ère expérience, le cas d'un dépôt d'ARNt à une faible concentration de **20 µg/mL** est comparé au cas sans ARNt – **Figure 6.8 (a).**

25. AM7119, Thermo Fisher.

<figure><img src="image_189.png" /></figure>

Dans notre 2e expérience, ce dépôt à faible concentration de 20 µg/mL est reproduit, et sert de contrôle pour la comparaison avec un dépôt à une concentration importante de 200 µg/mL – **Figure 6.8 (b)** – où la lamelle est de plus conservée dans l'incubateur à 37°C. Nous avons ensuite souhaité évaluer l'effet d'une préparation de l'ARNt suivant le modèle de l'aptamère, avec l'ajout d'une étape de chauffe à 95°C, que l'on compare à la même concentration de dépôt sans chauffe préalable – **Figure 6.8 (c)**. Enfin, nous avons testé une haute concentration de 500 µg/mL, comparée à 200 µg/mL, sans chauffe avant le dépôt ou pendant – **Figure 6.8 (d)**. Comme le montre la **Figure 6.8** dans son ensemble, les différentes conditions testées n'ont permis au maximum qu'une division par environ 10 de l'adsorption de l'aptamère, ce qui reste insuffisant même en prenant en compte la captation de l'aptamère par les cellules lorsqu'elles sont présentes – cf. **Figure 6.6**. De fait, dans la situation ayant produit les meilleurs résultats, l'adsorption de l'aptamère sur les QDs en présence de cellules reste suffisamment importante pour donner lieu à un bruit de fond empêchant d'enregistrer un signal FRET attribuable aux récepteurs EGFR.

**FIGURE 6.8** – Compilation des tests de minimisation de l'adsorption de l'aptamère fluorescent *via* une passivation à l'ARNt.

Les valeurs sont obtenues selon la même procédure qu'en **Figure 6.6**. Seule une des 2 références $I_{DD}$ servant à la normalisation est affichée pour chaque expérience (a)-(d), afin d'éviter la redondance d'information.
Enfin, la Figure 6.9 met en lumière la propension de ces cellules à rapidement internaliser l'aptamère, ce qui se traduit par l'appariation de signaux associés à des vésicules rendant vite le marquage non-homogène. Pour ces différentes raisons, nous avons préférer abandonner l'utilisation de ces cellules pour nos expériences de démonstrations NEFI.

<figure><img src="image_190.png" /><figcaption>FIGURE 6.9 – Illustration du phénomène d'internalisation de l'aptamère.</figcaption></figure>

Cellule U87-EGFR-WT sur micro-motif de QDs[His-RGD]+PLL-g-PEG passivé à la BSA 1 %. Illumination à 633 nm en épifluorescence.

## 6.3 PERSPECTIVES

Malgré les résultats décevants présentés dans la partie précédente, plusieurs résultats permettent de penser que l'imagerie NEF peut continuer de se développer comme espéré dans le but de contribuer à l'étude de l'adhésion cellulaire.

### 6.3.1 FRET SUR CELLULES VIVANTES PAR MARQUAGE MEMBRANAIRE

À l'image des toutes premières observations faites à la fin des années 2000 par l'équipe [5], j'ai choisi d'observer les zones d'adhérence cellulaire en marquant simplement la membrane plasmique à l'aide de la DiD²⁶. Cette approche est très restrictive, car seules les zones où la membrane est très proche du substrat pourront être observées. Ces zones de contact proche entre la cellule et le substrat sont peu nombreuses et très dynamiques²⁷. L'avantage du marquage avec la DiD est que l'on peut observer les cellules à 37°C dans un milieu de culture sans générer de quenching de la fluorescence de l'accepteur, et ainsi conserver les cellules dans de bonnes conditions.

#### 6.3.1.1 Cellules RPE-1

Sur le temps de ce projet doctoral, nous avons eu accès à d'autres lignées cellulaires que les U87-EGFR-WT, comme par exemple les RPE-1²⁸. Ces dernières sont marquées au niveau de leur membrane avec de la DiD, selon le protocole suivant. Une solution mère de DiD à 4,7·10⁻⁴ M diluée dans le DMSO a été initialement préparée. Après avoir décollé les cellules avec de la Trypsine-EDTA 0,05 %, une solution d'environ 300000 cellules/mL a été préparée dans un tube contenant un milieu de culture²⁹ non-fluorescent à 458 nm. Un volume de 5 µL de solution mère de DiD est ajouté afin d'obtenir une concentration finale d'environ 2 µM. Après une agitation très douce, le tube est incubé à 37°C + 5 % de CO₂ pendant 5 min. Le tube est ensuite centrifugé 3 fois à 1500 RPM pendant 5 min de façon à éliminer la DiD non marquée. À chaque centrifugation, les cellules sont re-diluées dans le milieu non-fluorescent. À l'issue de ces étapes de centrifugations, une partie des cellules sont directement déposées sur le substrat et laissées 30 min à 1 h dans l'incubateur, avant d'être observées en TIRF. Dans l'exemple montré ici, la surface microstructurée de QDs n'est pas passivée à l'aide du PLL-g-PEG, ce qui conduit à une adhésion cellulaire non restreinte aux micro-motifs de QDs. L'intérêt était de pouvoir

26. D7757, Invitrogen.

27. La méthode de va-TIRF développée dans l'équipe permet de les observer [74].

28. Leur dénomination exacte est hTERT RPE-1. Il s'agit de cellules humaines épithéliales des pigments de la rétine.

29. DMEMgtp-2, Evrogen.
Complémenté par :
Hepes à 10 mM
L-glutamine à 2 mM
1 % de SVF
observer des cellules à cheval sur des motifs, ce qui rend l'exemple particulièrement démonstratif. J'ai ainsi pu mettre en évidence un signal FRET issu de l'adhésion partielle d'une cellule, visible sur l'image FRET – Figure 6.10 (b) – et parfaitement corrélée à un *quenching* des QDs – Figure 6.10 (a). L'efficacité *E* du FRET, calculée à partir du *quenching*³⁰ des QDs, était ainsi de 0,49 ± 0,10, ce qui signifie que la membrane est très proche du substrat.

30. Voir Éq. (2.2.11).

<figure><img src="image_191.png" /></figure>

(a-b) L'irradiance à 458 nm est de 0,3 W/cm², contre (c) 1 W/cm² à 633 nm. Les images sont toutes issues de la moyenne de 25 acquisitions de 0,5 s. Barre d'échelle : 10 µm

L'absence d'émission $I_{DA}$ de la DiD en dehors du micro-motif est une preuve extrêmement forte du transfert d'énergie non-radiatif entre les QDs et la DiD.

FIGURE 6.10 – Démonstration de la possibilité d'obtenir du signal FRET sur une cellule RPE-1 en adhésion.

### 6.3.1.2 Cellules WPMY-1

Nous avons aussi réalisé des expériences préliminaires avec des cellules WPMY-1 ³¹. Ces cellules ont une dynamique d'adhésion lente. Le marquage à la DiD est réalisé de la même manière que dans le cas des cellules RPE-1. Les surfaces de QDs utilisées sont cette fois homogènes.

31. Cellules humaines épithéliales du tissu conjonctif de la prostate (myofibroblastes).

<figure><img src="image_192.png" /></figure>

(a-b) L'irradiance à 458 nm est de 0,9 W/cm², contre (c) 0,6 W/cm² à 633 nm. Les images sont toutes issues de la moyenne de 25 acquisitions de 0,2 s. Barre d'échelle : 10 µm

Dans ce cas, un signal de FRET corrélé à un *quenching* des boites

FIGURE 6.11 – Démonstration de la possibilité d'obtenir du signal FRET sur une cellule WPMY-1 en adhésion.