quantiques est une nouvelle fois observable, comme le montre la Fi-
gure 6.11. À partir de ce quenching, l'efficacité du FRET calculée pour
les points 1 et 2 était respectivement de 26,3 ± 1,9 et 27,3 ± 1,6 %.
La taille de la zone émettant un signal FRET est ici très réduite, ce
qui montre que la cellule est essentiellement hors de portée du FRET.

6.3.2 SUPER-RÉSOLUTION LATÉRALE PAR CLIGNOTEMENT DE L'ACCEPTEUR

L'imagerie NEF offre naturellement une grande sélection axiale défi-
nie par la portée du transfert d'énergie non-radiatif, typiquement 10
à 20 nm. Cependant, la résolution latérale du système imageur reste li-
mitée par diffraction. Ainsi, nous nous sommes intéressés aux différentes
méthodes de super-résolution potentiellement combinables avec l'ima-
gerie NEF.

6.3.2.1 Principes des méthodes de super-résolution

Le terme générique de "microscopie de super-résolution" regroupe
un ensemble de techniques de microscopie optique ayant pour but
d'augmenter la résolution du système d'imagerie au-delà de la limite
de diffraction – section 2.3.1.2 – valant typiquement ~ 250 nm dans le
visible. Ces techniques sont très variées, comme en témoigne l'article
de revue de 2020 par Jacquemet et al. [333]. Chacune présente des
avantages et des inconvénients, que l'on peut classer selon différents
critères : résolution XYZ ; résolution temporelle ; versatilité ; fidélité<fnref n="32" /> ;
compatibilité avec l'imagerie multicolore ; avec l'épaisseur des échantil-
lons<fnref n="33" /> ; et, évidemment, capacité à étudier les cellules vivantes.

L'imagerie NEF s'inscrit dans ce programme de recherche et s'avère
de plus complémentaire avec les techniques de super-résolution basées
sur l'analyse des fluctuations de l'émission, notées FB-SRM <fnref n="34" />. La va-
riation de l'émission des fluorophores sous excitation continue <fnref n="35" /> peut
en effet être utilisée pour reconstruire numériquement une image de
résolution latérale inférieure à la limite de diffraction. Le profil d'intérêt
relatif des imageries NEF et FB-SRM est synthétisé en Figure 6.12,
l'imagerie classique en épi-fluorescence servant de référence.

Il existe principalement 2 méthodes FB-SRM existantes <fnref n="36" />, notées SOFI [334] et SRRF [335]. Elles demandent typiquement d'acquérir consécutivement quelques dizaines d'images, jusqu'à quelques centaines selon les échantillons. Cela limite légèrement leur résolution temporelle, mais celle-ci reste bien supérieure à ce qui peut être obtenu avec des techniques comme le PALM ou (d)STORM, où le nombre d'images à acquérir est typiquement de plusieurs milliers. En tant que méthodes purement numériques, elles sont intrinsèquement versatile et utilisables dans de très nombreuses configurations expérimentales [336]. Par contre, il est nécessaire de pré-tester les réglages algorithmiques de manière à optimiser les résultats. En comparaison avec les techniques de super-résolution basées sur la détection de molécules uniques, les méthodes FB-SRM ne demandent pas des irradiations très importantes, notamment lorsqu'elles sont utilisées avec des émetteurs très

<footnote n="32">32. Capacité de l'image super-résolue à reproduire la distribution des molécules à imager.</footnote>

<footnote n="33">33. Susceptibilité aux artefacts produits par diffusion.</footnote>

<footnote n="34">34. *Fluctuation-Based Super-Resolution Microscopy.*</footnote>

<footnote n="35">35. Dont nous avons introduit les bases théoriques en section 2.1.2.2 pour les molécules organiques classiques, et en 3.1.2.2 pour les boites quantiques.</footnote>

<footnote n="36">36. Respectivement :
*Super-resolution Optical Fluctuation Imaging*
*Super-Resolution Radial Fluctuations*</footnote>
fluctuants, comme des protéines fluorescentes *photo-commutables* [337]. Cela les rend plus adaptées aux études sur cellules vivantes.

<figure><img src="image_193.png" /></figure>

La qualité des reconstructions dépend de la densité des émetteurs, ce qui rend particulièrement puissante la combinaison de ces méthodes avec les dispositifs offrant une grande sélection axiale, comme par exemple le TIRF ou l'imagerie NEF, beaucoup moins sujets aux artefacts produits par diffusion dans les échantillons épais. Notons que les images générées par SOFI ou SRRF dépendent plus des fluctuations d'intensité que de l'intensité elle-même. Ainsi, l'intensité des pixels de ces reconstructions traduit surtout une confiance sur la localisation : la présence d'émetteurs non-fluctuants limitera d'ailleurs nécessairement la fidélité de l'image obtenue de l'échantillon. Ces 2 méthodes de FB-SRM sont parfaitement compatibles avec l'imagerie multi-couleurs. Leur limite la plus importante réside dans la résolution axiale Z : ces algorithmes ne permettent tout simplement pas de traiter directement cette dimension³⁷. Or, il s'agit précisément du domaine de prédilection de l'imagerie NEF. La méthode SRRF, la plus récente des deux, dispose d'une implémentation sous la forme d'un *plug-in* nommé NanoJ-SRRF [338] sur le logiciel libre Fiji (version étendue d'ImageJ), ce qui la rend très facilement utilisable. De plus, selon les réglages choisis, elle permet de réaliser un traitement algorithmique semblable à celui opéré par SOFI [339]. C'est donc cette méthode que nous avons choisie pour réaliser nos premiers tests.

### 6.3.2.2 L'algorithme SRRF

La première étape de l'algorithme consiste à diviser chaque pixel d'une image – symbolisés par les lignes larges en Figure 6.13 – en une matrice de sous-pixels. Le nombre de sous-pixels créés est défini par le $1^{er}$ paramètre entrant $R_m$ (*Radiality Magnification*). Chaque sous-pixel se voit attribuer une probabilité de contenir un émetteur. Le calcul de cette probabilité repose en premier lieu sur une analyse spatiale, illustrée en Figure 6.14 (a). Pour chaque sous-pixel, des vecteurs représentant les gradients d'intensité sont mesurés pour un disque de sous-pixels voisins – les flèches indiquant la direction de l'augmentation

<caption>FIGURE 6.12 – Cartographie comparée des techniques d'imagerie par épifluorescence; FB-SRM; NEFI.</caption>

Les évaluations pour les méthodes épifluorescence et FB-SRM sont extraites de [333] et simplifiées à 3 niveaux pour mettre en avant les performances relatives. Les scores de l'imagerie NEF sont attribués par nos soins, en cohérence avec les aspects retenus dans la publication de Jacquemet *et al*. La bordure du cercle correspond à de bonnes performances relatives pour le critère considéré. Le centre du cercle correspond à de mauvaises performances relatives.

<figure><img src="image_194.png" /><figcaption>FIGURE 6.13 – Illustration de la création des matrices de sous-pixels par l'algorithme SRRF. Adapté de [336].</figcaption></figure>
d'intensité. L'aire du champ circulaire évalué est définie par le rayon de l'anneau de circonférence, noté $R_r$ (Ring Radius) – $2^e$ paramètre en entrée.

<figure><img src="image_195.png" /><figcaption>FIGURE 6.14 – Schéma du procédé SRRF. Adapté de [335]</figcaption></figure>

(a) Processus d'analyse temporelle : une PSF sous illumination grand-champ devient une cartographie des radialités en établissant le degré de convergence des vecteurs de gradient d'intensité pour chaque sous-pixel de l'image artificielle.

(b) L'acquisition d'un stack d'images permet de préciser la position des émetteurs par l'analyse de l'évolution des radialités.

Le $3^e$ et dernier paramètre est le nombre de points de calculs défini sur la circonférence de cet anneau – on le note $A_r$ (Axes in Ring). Le degré de convergence des vecteurs de gradient est nommé radialité. Comme le montre la Figure 6.13, plus les sous-pixels sont proches de la "vraie" position de l'émetteur, plus leur radialité sera forte. On passe donc d'une PSF limitée par diffraction à une carte de probabilités de présence. Cette cartographie est effectuée pour chaque image de l'empilement (stack) analysé. L'analyse temporelle – Figure 6.14 (b) – complète ce premier niveau d'analyse à partir de l'évolution de la radialité. La fluctuation temporelle permet en effet d'évaluer à quel degré le sous-pixel est effectivement centré sur l'émetteur, ce qui peut permettre, sur l'image finale issue du stack, de résoudre 2 fluorophores là où l'imagerie limitée par diffraction ne permettait aucune distinction.

### 6.3.2.3 Étude préliminaire sur une surface de QDs à faible densité surfacique

Pour évaluer la possibilité de combiner l'imagerie NEF et méthode SRRF, nous avons réalisé une expérience "modèle" sur le même principe que notre expérience démonstrative de FRET sur microstructures. Cette fois-ci, des lamelles homogènes sont réalisées, où l'on diminue la densité de boites quantiques fonctionnalisées. Même avec des QDs[MPA] s'adsorbant rapidement sur la lamelle, il suffit de diminuer la concentration de la solution de QDs à 2 nM et de limiter le temps d'incubation à 30 s. Le reste du protocole de fonctionnalisation reste identique. Le ligand fluorescent Im-AF647 est incubé via une solution à 1 µM sur ces lamelles$^{38}$ durant 10 min puis rincé au tampon Hepes. La Figure 6.15 donne l'allure typique des surfaces ainsi obtenues.
<figure><img src="image_196.png" /><figcaption>(a-b) L'irradiance à 458 nm est de 14,1 W/cm², contre (c) 1 W/cm² à 633 nm. $I_{AA} = 175 \pm 11$ coups/px, soit 6 % de variation par rapport à la moyenne. Les images, dont le contraste est ajusté, sont toutes issues de la moyenne de 25 acquisitions de 0,1 s. Barre d'échelle : 10 µm</figcaption></figure>

La puissance utilisée pour enregistrer les images $I_{DD}$ et $I_{DA}$ – Figure 6.15 (a) et (b) – est plus élevée que dans nos expériences précédentes. Cette configuration a été déterminée empiriquement afin d'obtenir un début de clignotement dans la fenêtre de détection de l'accepteur tout en conservant des durées d'acquisition relativement réduites. Il est alors possible de déterminer le niveau des différents bruits de fond ³⁹.

La valeur moyenne de $I_{AA}$ vaut ici $175 \pm 11$ coups/px et le coefficient de correction $\delta^{DE}$ pour cette irradiance laser vaut au maximum 0,18. Cela conduit à estimer une contribution maximum de $\delta^{DE}I_{AA} = 31 \pm 2$ coups/px pour l'excitation directe de l'accepteur. Ce type de bruit de fond est homogène sur l'image $I_{DA}$ – Figure 6.15 (b) – puisque le dépôt de Im-AF647 est plus ou moins homogène sur l'ensemble de la surface – Figure 6.15 (c). Le coefficient de correction $\alpha^{BT}$ ne dépend pas de l'irradiance d'excitation, et vaut donc toujours $0,0018 \pm 0,0006$. Le signal mesuré $I_{DD}$ sur la Figure 6.15 (a) vaut entre 1000 et 2000 coups/px, indiquant que la contribution du signal de débordement spectral $\alpha^{BT}I_{DD}$ des QDs lors d'une observation dans la fenêtre de l'accepteur ne dépasse pas 2 à 5 coups/px.

Le bruit de fond enregistré sur l'image $I_{DA}$ vaut en moyenne 30 à 50 coups/px, ce qui correspond aux contributions dues au débordement spectral des QDs et à l'excitation directe de l'accepteur. Autrement dit, les spots brillants observés sur la fenêtre de détection de l'accepteur – et qui clignotent au cours du temps – correspondent à du FRET. Ce signal $I_{DA}^{corr}$, après correction des différents bruits, vaut typiquement 30 à 60 coups/px au minimum. Autrement dit, même dans une configuration expérimentale aussi défavorable, nous pouvons détecter un clignotement de l'accepteur issu du FRET. Pour tester différents réglages de l'algorithme SRRF, nous avons acquis 1000 images successives puis sélectionné une zone d'intérêt d'environ 10 µm de côté. La Figure 6.16 donne un aperçu de l'évolution temporelle du signal avant traitement.

FIGURE 6.15 – Signal détecté dans chacune des configurations en TIRF.

39. Toutes les valeurs données ici ont fait l'objet d'une correction par le bruit d'obscurité de la caméra à 0,1 s de temps d'acquisition, soit 100 coups/px.
<figure><img src="image_197.png" /><figcaption>L'irradiance à 458 nm est de 14,1 W/cm², le temps d'acquisition par image est de 0,1 s. Barre d'échelle : 2 µm.</figcaption></figure>

Le signal de nos accepteurs est très bruité. Dans ce cas, il est re-
commandé d'ajouter un poids relatif aux gradients d'intensité calculés
à partir de la largeur à mi-hauteur de notre PSF (~ 250 nm). Ce
paramètre supplémentaire a donc été fixé à 2,5 dans le plug-in NanoJ-
SRRF. Il s'articule avec l'aire du champ de gradients, qui doit être
suffisamment grande pour éviter l'apparition d'artefacts sur l'image
finale. La valeur de R<sub>r</sub> a donc été laissée à 1, sa valeur par défaut.
Dans ces conditions, il était inutile de chercher un très grand gain en
résolution. La valeur de R<sub>m</sub> maximum testée était donc de 5, ce qui
correspond à une résolution maximum atteignable de 40 à 50 nm. À
l'inverse, nous avons systématiquement maximisé le nombre de points
considérés pour le calcul de radialité, soit A<sub>r</sub> = 8, de manière à maxi-
miser le contraste<sup>40</sup>. Les Figures 6.17 (a) à (c) présentent les images
résultantes du calcul SRRF, pour différents nombres d'images prises
en compte dans l'analyse. On peut comparer ces résultats à l'image ob-
tenue en moyennant 25 images, assimilable à ce qui aurait été obtenu
pour une seule acquisition NEFI standard – Figure 6.17 (d).

<caption>FIGURE 6.16 – Exemple d'évolution du signal $I_{DA}$ pour quelques images d'un stack.</caption>

<figure><img src="image_198.png" /><figcaption>40. Dans le cas des images employées pour ces tests, l'augmentation de temps de calcul causée était marginale, le temps total de traitement par *stack* d'images ne dépassant pas 1 min.</figcaption></figure>

On constate un gain évident en résolution, même en ne prenant en compte que 100 images pour le calcul. Cela nous permet d'envisager des expositions relativement courtes (10 s) en situation réelle sur des cellules. Cependant, cet exemple nous permet aussi d'illustrer la limite principale de cette méthode : l'absence de fluctuation des émetteurs conduit à leur disparition sur l'image SRRF, comme on peut le voir pour le signal central présent sur toutes les images de la Figure 6.16 et sur la Figure 6.17 (d) ⁴¹.

<caption>FIGURE 6.17 – Comparaison des images obtenues par analyse SRRF selon le nombre d'images prises en compte dans le calcul, et acquisition NEFI classique (moyenne de 25 images). Barre d'échelle : 2 µm</caption>

<caption>41. Aucun *spot* n'est associé à ce signal FRET sur les images SRRF – Figure 6.17 (a-c).</caption>
## 6.4 CONCLUSIONS SUR L'APPLICATION AUX ÉTUDES D'ADHÉSION CELLULAIRE

Dans ce dernier chapitre, j'ai eu l'occasion de mettre à l'épreuve l'imagerie NEF dans des situations réelles d'imagerie cellulaire. Le ligand de surface His-RGD, introduit durant le chapitre 5, a pu être efficacement utilisé pour promouvoir l'adhésion spécifique de cellules sur nos microstructures de QDs. Cela a été l'occasion de montrer l'importance du design des micro-motifs, les cellules U87-EGFR-WT utilisées montrant des difficultés à bien s'étaler, en comparaison avec ce que nous avions pu observer sur des surfaces homogènes. Cela n'est pas la seule difficulté relevée : le choix d'une monocouche de QDs sans matrice d'immobilisation – jouant le rôle de couche protectrice – s'est révélé à double tranchant. Si cela permet effectivement une bioconjugaison directe de nos donneurs FRET, cela les rend aussi exposés à des phénomènes d'adsorption indésirables. Notre premier choix de marquage cellulaire, employant un aptamère conjugué à un accepteur FRET, a ainsi permis de mettre en évidence cette limitation. Un moyen de contourner ces problèmes serait de recourir à un marquage en amont, comme nous avons pu le montrer avec des cellules RPE-1 et WPMY-1 marquées à la DiD avant leur incubation sur nos surfaces. Enfin, nous avons présenté des résultats préliminaires encourageants quant au potentiel de combinaison de l'imagerie NEF avec les méthodes de super-résolution basées sur le traitement numérique des fluctuations d'émission, nous permettant d'envisager de futures études plus poussées sur la localisation et la dynamique des points focaux d'adhésion.
<figure><img src="image_199.png" /></figure>
# Conclusion

## CONCLUSION GÉNÉRALE

Mon projet doctoral a consisté à poursuivre le développement de l'imagerie NEF, méthode de nanoscopie l'étude de l'adhésion cellulaire basée sur le transfert d'énergie non-radiatif de type Förster (FRET). Pour cela, j'ai sélectionné dans la littérature les travaux de FRET quantitatif les plus pertinents et monté un dispositif TIRF qui a servi de technique usuelle d'observation pour tous mes travaux.

Une part non-négligeable de mon travail a consisté à développer nos capacités d'utilisation des boites quantiques. Cela m'a demandé d'approfondir mes connaissances de leurs propriétés photo-physiques et chi-miques, mais aussi l'apprentissage de la synthèse de QDs cœurs/coquil-les de type CdSe/CdS/CdZnS/ZnS. La reproductibilité de ces synthèses a été étudiée, ainsi que les propriétés de photoluminescence des QDs obtenus. J'ai également mis en œuvre plusieurs protocoles d'échange des ligands de surfaces des QDs, afin de les solubiliser dans différents milieux.

Cette maîtrise de bout en bout m'a permis de reprendre la méthode de fonctionnalisation utilisée par l'équipe et d'en réaliser une caractéri-sation plus approfondie. J'ai ainsi pu mettre au point un protocole permettant d'obtenir des monocouches de QDs homogènes à grande échelle et de densité surfacique contrôlée. Un résultat particulièrement intéressant est la possibilité d'obtenir des densités surfaciques élevées (≥ 3000 QDs/µm²) en 20 min seulement lorsque l'on utilise le MPA comme ligands de surface, contre 24 h avec les ligands TOP utilisés précédemment. J'ai aussi pu montrer que la photoluminescence enre-gistrée de ces monocouches n'augmente pas linéairement avec la densité surfacique de QDs, mais suit un modèle de saturation où la photo-luminescence progresse faiblement passé un seuil d'environ 150 QDs dans un *spot* limité par diffraction. Enfin, j'ai montré qu'à l'aide d'un échange de ligand adapté – ici, le His-RGD – après fonctionnalisation des QDs sur le verre, il était possible de stabiliser l'émission de nos QDs sur le domaine de faibles irradiances $\le 1$ W/cm².

La méthode de fonctionnalisation *bottom-up* a en outre été enrichie par une microstructuration *top-down* réalisée par photolithographie dans le proche UV, en utilisant le dispositif PRIMO d'Alvéole, initia-lement conçu pour le *micropatterning* de cellules. Cet outil repose sur l'utilisation d'un dispositif numérique à micro-miroirs (DMD). Nous pouvons dorénavant créer aisément des monocouches de QDs de n'im-porte quelle forme, avec une résolution de l'ordre de 2 µm. Les travaux d'amélioration de notre procédé devraient à ce titre viser l'élimination complète du phénomène d'agrégation des QDs au bord des motifs,
constaté lors de l'utilisation de QDs[MPA] en milieu aqueux.

Dans le but de biofonctionnaliser les monocouches de QDs avec un ligand de surface capable de se lier aux intégrines (His-RGD), j'ai montré la nécessité de passiver la surface en verre avec des PEG, à l'aide d'un ligand fluorescent (Im-AF647) s'adsorbant sur les QDs de la même manière. Cette passivation permet de déposer les ligands spécifiquement sur les QDs, par chélation, ce qui ouvre la voie à diverses applications dans le champ des bio-détecteurs. Nous en avons profité pour réaliser une étude FRET par voie spectrale et par imagerie. Le ligand Im-AF647 est en effet fluorescent par la présence d'Alexa Fluor 647, qui joue le rôle d'accepteur FRET. Cette expérience m'a permis de comparer diverses méthodes de calcul de l'efficacité du FRET mais aussi et surtout de démontrer la pertinence de la sélection spectrale réalisée sur le dispositif TIRF. Dans la fenêtre de détection de l'accepteur, et sous le régime d'irradiance adéquat, nous sommes capables d'obtenir un signal issu à 99 % du FRET, ce qui simplifie considérablement l'analyse des signaux.

La dernière partie de ma thèse a consisté à explorer les possibilités d'utiliser mes substrats pour l'étude de l'adhésion cellulaire. Après vérification de la capacité du ligand His-RGD à promouvoir l'adhésion cellulaire, j'ai pu démontrer la possibilité de micropatterner des cellules à l'aide de nos micro-motifs de QDs. Si nous avons pu obtenir des premiers résultats prometteurs en FRET sur cellules en adhésion, nos expériences ont surtout permis d'identifier la nécessité de bien optimiser et contrôler le marquage cellulaire avec l'accepteur, afin d'éviter que ce dernier ne s'adsorbe sur les QDs. Les travaux ultérieurs devront donc impérativement utiliser des méthodes où le marquage est réalisé avant dépôt des cellules sur les microstructures. Enfin, nous avons également obtenu des résultats préliminaires portant sur la combinaison de l'imagerie NEF avec les techniques de super-résolution latérale par traitement numérique des fluctuations d'émission, qui demandent à être développés.

## PERSPECTIVES D'OPTIMISATION ÉCOLOGIQUE

### PRINCIPES DE "CHIMIE VERTE" ET "NANOSCIENCES SOUTENABLES"

Tout travail de recherche devrait se préoccuper des conditions de sa compatibilité avec les enjeux socio-écologiques, a fortiori s'il souhaite ajouter une nouvelle couche matérielle à des techniques déjà existantes, comme c'est le cas de cette thèse. Les nanosciences, dans leur ensemble, tendent en pratique à fermer les yeux sur ces aspects, ou à les reléguer à un champ de recherche connexe. La discussion entre approches de soutenabilité faible et soutenabilité forte n'est donc même pas encore d'actualité. Pourtant, de nombreux cadres de travail existent depuis longtemps. En ce qui concerne la fabrication et la fonctionnalisation, qui relèvent souvent de processus chimiques, le cadrage qualitatif de la "chimie verte" a été posé – avec de nombreuses variantes – depuis le début des années 1990, et plusieurs estimateurs plus quantitatifs
ont été proposées pour les nanosciences. On peut par exemple citer le facteur d'économie atomique AE, le E-Factor, et diverses métriques basées sur l'énergie ou le flux de matière consommé [340]. Des feuilles de route spécifiques pour des démarches de "nanosciences soutenables" ont aussi pu être élaborées [341].

Cela étant dit, la meilleure base pour l'évaluation d'un procédé reste l'analyse de cycle de vie¹, ou ACV, méthode qui permet de donner une estimation quantitative et multifactorielle des impacts environnementaux. Comme le notait en 2012 une revue de l'emploi de l'ACV dans les nanosciences, plus de la moitié des (rares) études existantes se limitaient à l'analyse des flux d'énergie et de matières, sans prendre en compte les enjeux nanospécifiques de toxicité ou de fin de vie [342]. Lorsque ces éléments étaient présents, il n'y avait généralement pas d'évaluations quantitatives. En effet, une ACV approfondie nécessite que les éléments spécifiques aux nanoparticules soient effectivement compilés dans les bases de données sur le cycle de vie, ce qui se révèle d'une grande complexité tant ces éléments peuvent varier selon les matériaux, les géométries des nanoparticules, etc. Entre-temps, plusieurs outils plus qualitatifs ont été proposés (USE-tox, CalTOX, QSAR), mais ces derniers sont plus adaptés aux matériaux bulk. Plussieurs autres outils pertinents, comme les évaluations des risques, parallèles à l'ACV, ne doivent par ailleurs pas être écartés [342].

Contrairement à certains préjugés, il est cependant tout à fait possible de réaliser l'ACV de méthodes dont la maturité est celle du développement en laboratoire, à condition de définir adéquatement l'unité fonctionnelle étudiée². Par exemple, les différents procédés de synthèse de nanoparticules d'argent, de TiO₂ ou de Fe₃O₄, ont fait l'objet d'analyses de cycle de vie comparées [340]. C'est aussi le cas de la synthèse historique des cœurs de QDs CdSe [343], et cela s'est développé jusqu'à plusieurs de leurs applications [344, 345].

## ÉBAUCHE D'ANALYSE DE CYCLE DE VIE COMPARÉE

Cette préoccupation a été présente tout au long du travail de cette thèse. Le travail d'analyse du cycle de vie étant en cours, je me contenterais ici de présenter les stratégies mises en œuvre aux différentes étapes de notre procédé de microstructuration des QDs, et les premières estimations en termes de flux de matière que l'on peut en tirer. L'unité fonctionnelle choisie a ici été la réalisation de 5 lamelles de QDs microstructurées, car cela correspond au nombre classique de lamelles réalisées d'un coup, en raison du nombre de places du bac Hallendahl utilisé pour les incubations. La synthèse de QDs elle-même est prise comme un entrant fixé, car je n'ai pas eu l'occasion de tester des alternatives³. Cela permet par ailleurs de raisonner au niveau du procédé de microstructuration lui-même, qui est l'apport principal de mon travail.

En ce qui concerne l'étape de nettoyage et d'activation, j'ai menioned durant le chapitre 4 que l'usage d'un Piranha et d'un Plasma-Air donnait des résultats comparables. Cela est vrai pour les QDs[MPA]

1. Telle que définie par les normes : ISO 14 040 et ISO 14 044.

2. D'après l'ISO 14 040 (2006) :
Performance quantifiée d'un système de produits destinée à être utilisée comme unité de référence dans une analyse de cycle de vie. L'unité fonctionnelle définit la quantification des fonctions identifiées (caractéristiques de performance) du produit. L'objectif premier d'une unité fonctionnelle est de fournir une référence à laquelle les intrants et les extrants sont liés. Cette référence est nécessaire pour assurer la comparabilité des résultats d'une analyse du cycle de vie.

3. Une comparaison globale des 4 grandes catégories d'émetteurs pour l'imagerie et la bio-détection a été faite par Himmelstoß et al. [346]. Une étude comparée des synthèses existantes de nanocristaux semi-conducteurs a été faite par Reiss et al. [347], même si cela ne relève pas de l'ACV.
uniquement, où l'on peut facilement obtenir des densités surfaciques élevées. Avec des QDs[TOP], pour un même temps d'incubation de 24 h, la densité surfacique obtenue avec une étape d'activation initiale au Plasma-Air est 30 % inférieure – évaluation par imagerie TIRF du nb de coups/px moyen obtenu pour des lamelles préparées en même temps. Ce problème ne se pose plus avec les QDs[MPA], ce qui permet de supprimer totalement du processus la consommation d'acide sulfurique et d'eau oxygénée au profit d'environ 25 mL d'éthanol à 70 % – auquel il faudra ajouter, dans le cadre de l'ACV, la consommation électrique du bain d'ultrasons et de l'exposition au Plasma-Air.

J'ai montré dans ce même chapitre 4 que, pour l'étape de fonctionnalisation *bottom-up*, la monocouche d'accrochage à l'aide de silanes pouvait indifféremment se faire à l'aide de MPTMS solubles dans le toluène anhydre ou de MPTES solubles dans un mélange d'éthanol à 95 % et d'eau à 5 %. Cette dernière option devrait 4, à volume utilisé constant, mener à une nette baisse des impacts de cette étape lorsqu'évalués dans le cadre d'une ACV. Cependant, à l'heure actuelle, nous ne pouvons pas utiliser les MPTES pour obtenir des surfaces microstructurées en raison de la forte solubilité de la résine S1813 G2 dans l'éthanol. Une alternative intéressante pourrait être de réaliser l'étape de photolithographie à l'aide de PMMA associé à un photo-initiateur sensible dans l'UV 5. Dans le cas d'une couche de PMMA d'épaisseur supérieure à 1 µm, on constate en effet une résistance à l'éthanol compatible avec notre incubation d'une nuit des MPTES dans le mélange éthanol/eau. De plus, le PMMA lui-même peut être solubilisé dans un solvant alternatif au toluène, l'éthyle de lactate, non-toxique et issu de sources renouvelables [349].

Enfin, la substitution des QDs[TOP] par les QDs[MPA] est très probablement 6 une amélioration sous plusieurs aspects. Dans le cas des QDs[TOP], la réalisation de l'unité fonctionnelle choisie, avec notre matériel de laboratoire, nécessite environ 25 mL d'une solution à 1 µM, soit 25 nmol. Seule une faible proportion des QDs s'adsorbe effective sur les surfaces, une majorité est donc gâchée. Une manière de minimiser cela est de coller les lamelles par paires avec de la S1813 G2, car on ne souhaite microstructurer qu'une seule des faces de nos lamelles de verre 7. On multiplie ainsi le nombre de lamelles préparées par 2 pour les mêmes quantités consommées, i.e. on divise les quantités consommées par 2 pour notre unité fonctionnelle. Cependant, l'utilisation de QDs[MPA] permet des économies bien plus importantes. Premièrement, on supprime l'utilisation de toluène comme solvant, au profit d'un tampon aqueux avec NaHCO$_3$ à 0,1 M. Deuxièmement, l'incubation des QDs[MPA] se fait hors boîte à gant : nous les incubons donc individuellement avec environ 100 à 150 µL de solution à 1 µM par lamelle, soit 0,75 nmol effectivement nécessaires au total. Autrement dit, pour notre unité fonctionnelle de 5 lamelles réalisées, l'utilisation des QDs[MPA] permet de diviser la quantité de QDs consommés par 15 à 30, par rapport aux QDs[TOP], selon que l'on considère ou non la possibilité de coller les lamelles par paires dans le protocole utilisant les QDs[TOP].

4. Sauf surprise concernant l'impact de fabrication des MPTES par rapport à celle des MPTMS.

5. Par exemple l'Irgacure 651, comme montré par Carbaugh *et al.* [348].

6. Sous réserve que les impacts du processus de fabrication du MPA ne soient pas significativement supérieurs à ceux de la fabrication des composés TOP et TOPO.

7. Cette étape s'insère entre l'étape de développement de la résine et l'étape de réactivation au Plasma-Air. Elle permet de plus de ne pas avoir à nettoyer l'arrière des lamelles après l'étape d'adsorption des QDs.
Ces différents éléments prometteurs, pour être confirmés, devront être confrontés aux impacts associés tout au long du cycle de vie (de la fabrication des consommables jusqu'à leur élimination et traitement comme déchets), de manière aussi exhaustive que possible, pour conclure sur les gains réels de ces différentes stratégies alternatives. De plus, il faut ajouter à ce type d'analyse une évaluation de la *criticité* des différents matériaux mis en œuvre [350]. Cette notion englobe la question des impacts environnementaux, pour aussi prendre en compte les enjeux de disponibilité des ressources et susceptibilité aux risques d'approvisionnement. À titre d'exemple, un écueil fréquent de la recherche sur les boites quantiques est de considérer les QDs à cœurs InP comme plus "verts" que les CdSe, sur la base de la toxicité inférieure des cœurs InP. Or, cette qualification implique de mettre de côté (a) le fait que l'utilisation d'indium est considérée comme ayant plus d'impact sur le changement climatique et (b) que l'indium est un matériau considéré significativement plus critique – résultats qui sont consistants à travers l'ensemble de la littérature concernée [351-353]. Il sera donc nécessaire, pour produire une évaluation rigoureuse de nos efforts d'optimisation écologique, de considérer tous ces aspects.
<figure><img src="image_200.png" /></figure>
Bibliographie

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Paul ROBINEAU

Doctorat : Matériaux, Mécanique, Optique, Nanotechnologie

Année 2022

Microstructuration 2D de boites quantiques : biofonctionnalisation & imagerie NEF

La nanoscopie de fluorescence par excitation non radiative (NEF) est une technique d'imagerie basée sur le FRET. L'imagerie NEF s'inscrit dans la famille des méthodes optiques utilisées pour étudier l'adhésion cellulaire en imageant la dynamique spatio-temporelle des points focaux d'adhésion. À partir de la maîtrise de la synthèse de boites quantiques (QDs) et des échanges de leurs ligands, j'ai mis en oeuvre une microstructuration 2D des QDs conjuguant fonctionnalisation covalente bottom-up et microstructuration top-down par photolithographie UV. Ce procédé permet d'obtenir des monochouches denses de QDs organisées en motifs de forme variable, avec une résolution spatiale micro-métrique. Ces motifs jouent le rôle de donneurs FRET pour l'imagerie NEF, donnant accès à une résolution axiale nanométrique pour des temps d'acquisition faibles et des puissances laser minimes. J'ai montré la possibilité de biofonctionnaliser les QDs de façon spécifique avec un ligand chélatant le zinc à leur surface. Ce ligand terminé RGD permet l'adhésion des cellules et peut être utilisé pour réaliser du micropatterning cellulaire. Outre la démonstration du FRET entre des cellules et nos substrats, j'ai exploré la combinaison de l'imagerie NEF avec des méthodes de super-résolution basées sur l'analyse des fluctuations de fluorescence.

Mots clés : nanophotonique – points quantiques – fonctionnalisation des surfaces (chimie) – transfert d'énergie entre molécules fluorescentes – microscopie de fluorescence – biophysique – cellules, adhésivité.

Quantum Dots 2D Micropatterning: Bio-
functionnalization & NEF Imaging

Non-radiative Excitation Fluorescence (NEF) nanos-
copy is a promising FRET-based imaging technique,
recently introduced in the advanced optical tools
family devoted to study cell adhesion by imaging the
spatio-temporal dynamics of focal adhesion
plaques. From the quantum dots (QDs) synthesis to
their ligand exchange skills, I developed a 2D micro-
structuration method of QDs combining bottom-up
covalent functionalization and top-down micropat-
terning with UV- photolithography. This method
allows to obtain dense monolayers of QDs organized
in patterns of various shape, with a micrometric
resolution. These active patterns act as FRET donors
for NEF imaging, thus giving access to nanometric
axial resolution for high acquisition rate and mini-
mal laser power. I show the possibility to biofunc-
tionnalize the QDs, especially with a ligand chelating
zinc atoms onto the QD surface. This RGD-
terminated ligand enables specific cell adhesion and
therefore QDs can be used to perform cell micropat-
terning. In addition to usual FRET observations be-
tween cells and our substrates, I explored the imag-
ing breakthrough offer by fluorescence fluctuations-
based Super-Resolution technique in association
with NEF.

Keywords: nanophotonics – quantum dots – surface functionnalization – förster resonance energy transfert – fluorescence Microscopy – biophysics – cell adhesion.

Thèse réalisée en partenariat entre :