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# Microstructuration 2D de boites quantiques : biofonctionnalisation et imagerie NEF

Paul Robineau

► To cite this version:

Paul Robineau. Microstructuration 2D de boites quantiques: biofonctionnalisation et imagerie NEF. Micro et nanotechnologies/Microélectronique. UTT-Université de Technologie de Troyes, 2022. Français. NNT: 2022TROY0039 . tel-04280646

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Submitted on 11 Nov 2023

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Paul ROBINEAU

Microstructuration 2D
de boites quantiques :
biofonctionnalisation & imagerie NEF

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Champ disciplinaire :
Sciences pour l'Ingénieur
THESE

pour l'obtention du grade de

DOCTEUR

de l'UNIVERSITE DE TECHNOLOGIE DE TROYES

en SCIENCES POUR L'INGENIEUR

Spécialité : MATERIAUX, MECANIQUE, OPTIQUE ET NANOTECHNOLOGIE

présentée et soutenue par

Paul ROBINEAU

le 16 décembre 2022

Microstructuration 2D de boites quantiques :
biofonctionnalisation et imagerie NEF

JURY

M. Michaël MOLINARI

Mme Hélène DELANOË-AYARI

M. Ngoc Diep LAI

M. Pascal DIDIER

Mme Aurélie DUPONT

M. Rodolphe JAFFIOL

PROFESSEUR DES UNIVERSITES

MAITRE DE CONFERENCES - HDR

MAITRE DE CONFERENCES - HDR

PROFESSEUR DES UNIVERSITES

CHARGEE DE RECHERCHE CNRS - HDR

PROFESSEUR DES UNIVERSITES

Président

Rapporteure

Rapporteur

Examinateur

Examinatrice

Directeur de thèse

Personnalités invitées

M. Thomas PONS

M. Cyrille VEZY

CHARGE DE RECHERCHE INSERM - HDR

PROFESSEUR ASSISTANT UTT

Directeur de thèse
Remerciements

Je tiens tout d'abord à remercier Hélène Delanoë-Ayari et Ngoc Diep Lai, pour avoir accepté de contribuer à la qualité de ce document par le rôle de rapportrice et rapporteur ; ainsi que Pascal Didier, Aurélie Dupont, et Michael Molinari pour leur participation à mon jury de soutenance.

Ce travail de doctorat a été mené dans l'unité recherche L2n¹ de l'Université de technologie de Troyes, et à ce titre mes pensées vont à l'ensemble des personnes y travaillant où y ayant travaillé sur le temps de ce projet de recherche. Cela aura été un cadre humain particulièrement confortable pour développer mes travaux, tant sur l'accompagnement entre pairs que pour les discussions au-delà du cadre scientifique. J'adresse en particulier ma reconnaissance à Régis Durche, Jérémie Béal et Serguei Kochtcheev pour leurs contributions directes et indirectes à mes recherches, par leur bonhomie quotidienne et, plus prosaïquement, leur gestion de la plateforme Nano'Mat – on oublie souvent de reconnaitre à leur juste valeur l'importance de l'infrastructure proprement technique de la recherche². Merci à William pour son amitié ; Anna pour son enthousiasme permanent ; Théo, Anisha ; Agnieszka ; pour le temps pris à échanger sur divers processus expérimentaux ; et un remerciement tout particulier à Aurélie Brousier pour son humour, et pour m'avoir donné l'occasion de contribuer à des travaux connexes à mon sujet principal. Enfin, je salue Christophe Couteau et Jérôme Plain, respectivement directeur de l'unité de recherche et directeur adjoint de l'UTT, pour leur accueil, leur capacité d'écoute, et nos échanges sur la nécessité de prise en compte des enjeux socio-écologiques dans le milieu académique.

Impossible d'ailleurs de ne pas mentionner que ces 3 années de doctorat n'ont pas seulement été un temps de recherche, mais aussi un temps d'enseignement et d'engagement associatif. À ce titre, je remercie Lou Grimal, Claudine Gillot et Tatiana Reyes, de l'unité de recherche InSyTE³ de l'UTT, pour m'avoir accordé leur confiance, me permettant de contribuer à la création de l'unité d'enseignement "Modélisation des interactions Humain·e·s – Systèmes techniques – Nature". Je remercie aussi Davy Gérard, responsable du programme d'ingénierie MTE⁴, d'avoir acté la création de cet enseignement ; ainsi que Timothée Toury, initiateur et secrétaire général de l'EUT+⁵, pour m'avoir permis de participer à la formalisation de ce projet, et pour son accompagnement dans mon parcours. Ma gratitude va enfin au collectif UTTransition et l'association Ulisse⁶, déterminés depuis longtemps à faire vivre la discussion des enjeux socio-écologiques à l'UTT.

1. Light, nanomaterials & nanotechnologies.

2. De manière analogue, une personne comme Alexandra Elbakyan est sans aucun doute une, si ce n'est la contribrice majeure à la possibilité même de faire des sciences au XXIème siècle.

3. Interdisciplinary research on Society-Technology-Environment interactions.

4. Matériaux : technologie et économie.

5. European University of Technology.

6. Union locale d'ingénierie sociale, solidaire et environnementale.
Ces détours ne sauraient faire oublier la contribution déterminante de mes directeurs de thèse, Cyrille Vézy et Rodolphe Jaffiol, sur tous les plans. Je vous remercie infiniment pour votre éthique d'encadrement, qui vous conduit à privilégier la qualité du suivi au nombre de doctorant·e·s ou stagiaires sous votre responsabilité. Et cela, sans sacrifier mon autonomie dans l'organisation de mes activités ; me donnant ainsi l'occasion de proposer des *designs* d'expérimentation ou de poursuivre des fils de recherche connexes. Cette qualité d'encadrement s'est aussi manifestée dans le fait de m'avoir laissé errer quand il le fallait, de manière à me faire développer des compétences intimement liées certaines expériences spécifiques<fnref n="7" />. J'admire votre détermination à continuer de faire vous-mêmes les manipulations expérimentales les plus "basiques" et à maîtriser l'intégralité des processus pratiques impliqués, sans jamais rogner sur les exigences de compréhension théorique et de rigueur interprétative. Toutes les discussions liées ont été extrêmement importantes pour moi. Merci, enfin, pour tous les échanges extra-scientifiques qui ont jalonné ce travail commun durant 3 ans.

Je tiens aussi à tout particulièrement remercier Thomas Pons du LPEM<fnref n="8" /> de l'ESPCI Paris. Ton accompagnement de ces travaux, ta gentillesse et ta disponibilité pour répondre à mes questions les plus diverses – sur les détails les plus théoriques des boites quantiques, notamment au printemps 2020, jusqu'aux aspects les plus pratiques – me conduisent à te considérer comme un quasi 3ᵉ directeur de thèse.

Bien que ce soit particulièrement convenu, je ne peux pas ne pas adresser ma reconnaissance à ma famille, en particulier mes parents comme mon frère et ma sœur, pour leur soutien malgré le peu de temps que je leur ai accordé.

Pour finir, je manifeste ma fierté de pouvoir compter parmi mes ami·e·s et amours des personnes aussi extraordinaires, avec qui l'expression "famille choisie" prend tout son sens. Merci à Adam, Adrien, Aliou, Audrey, Axel, Baptiste, Camille, Charles, Clément, Eddy, Éloi, Juliette, Marianne, Marius, Morghane, Pierre, Pierre-Louis, Valentin, Simon ; au Croc'llectif devenu compagnie Grande ; et tout·e·s les autres qui se reconnaitront, pour tous ces moments et projets collectifs partagés – depuis plus de 10 ans pour certain·e·s. À Maya-Lune et Quentin : merci, pour tout.

<footnote n="7">7. Je pense, au particulier, au montage du dispositif TIRF, qui m'a permis de dépasser mon aversion pré-existante pour l'optique géométrique.</footnote>

<footnote n="8">8. Laboratoire de Physique et d'Étude des Matériaux.</footnote>
# Table des matières

## INTRODUCTION 7

1 ÉLÉMENTS DE BIOPHYSIQUE DE L'ADHÉSION CELLULAIRE 11

1.1 DYNAMIQUES DU VIVANT 11

1.1.1 Généralités 11

1.1.2 Adhésion cellule/substrat 13

1.2 TECHNIQUES POUR ÉTUDIER L'ADHÉSION 17

1.2.1 Méthodes pour l'étude des forces d'adhésion 17

1.2.2 Méthodes d'imagerie optique pour l'étude de l'adhésion 19

1.2.3 Contrôle de l'adhésion et migration cellulaire 24

1.3 CONCLUSIONS SUR L'ÉTUDE DE L'ADHÉSION CELLULAIRE 26

2 DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL : PRINCIPES, THÉORIE, ET MONTAGE 27

2.1 FLUORESCENCE & LUMINESCENCE 27

2.1.1 Introduction 27

2.1.2 Bases de la théorie quantique de la fluorescence 27

2.2 TRANSFERT D'ÉNERGIE NON-RADIATIF DE TYPE FÖRSTER 30

2.2.1 FRET : formalisme théorique 30

2.2.2 Exemples d'imagerie FRET en biologie 35

2.2.3 Analyse quantitative en FRET 36

2.3 IMAGERIE DE FLUORESCENCE GRAND-CHAMP 39

2.3.1 Imagerie en épifluorescence 39

2.3.2 Principes de l'imagerie TIRF 40

2.4 MONTAGE EXPÉRIMENTAL 41

2.4.1 Description du montage 41

2.4.2 Caractérisation du dispositif TIRF 45

2.5 CONCLUSIONS SUR LE DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL NEFI 49

3 BOITES QUANTIQUES (QDs) : SYNTHÈSE ET CARACTÉRISATIONS 51

3.1 PROPRIÉTÉS FONDAMENTALES 51

3.1.1 Structure et confinement électronique 51

3.1.2 Propriétés photophysiques des QDs 53
3.2 SYNTHÈSES ET CARACTÉRISATIONS EN SOLUTION 56

3.2.1 Banc de synthèse 56

3.2.2 Synthèses réalisées 57

3.2.3 Caractérisations photo-physiques 64

3.3 ÉCHANGES DE LIGANDS DE SURFACE 70

3.3.1 Diversité des molécules et applications 70

3.3.2 Protocoles d'échanges de ligands 75

3.3.3 Caractérisations spectrales en solution et sur surfaces 76

3.4 CONCLUSIONS SUR LES BOITES QUANTIQUES 79

4 MICROSTRUCTURATION DES SURFACES 81

4.1 FONCTIONNALISATION À GRANDE ÉCHELLE DE LAMELLES DE VERRE 81

4.1.1 Méthodes de fonctionnalisation existantes 81

4.1.2 Nettoyage et activation des surfaces 82

4.1.3 Silanisation de lamelles de verre 83

4.1.4 Adsorption des QDs 89

4.2 MICROSTRUCTURATION DES QDS 95

4.2.1 Choix du procédé 95

4.2.2 Photo-lithographie UV avec PRIMO 96

4.2.3 Développement du protocole de microstructuration 98

4.2.4 Résolution et homogénéité des micro-motifs 2D de QDs 104

4.3 CONCLUSIONS SUR LA MICROSTRUCTURATION DES QDS 106

5 SURFACES ACTIVES POUR L'IMAGERIE NEF 107

5.1 PRINCIPE 107

5.1.1 Chélation et complexes de coordination 107

5.1.2 Ligands à ancrage Imidazole 108

5.2 FRET EN SOLUTION AQUEUSE 110

5.2.1 Méthodologie 110

5.2.2 Absence de FRET avec les QDs[DHLA-SB] 110

5.2.3 FRET avec les QDs[MPA] 111

5.3 FRET SUR SURFACES MICROSTRUCTURÉES 115

5.3.1 Signal d'excitation directe l'accepteur à 458 nm 115

5.3.2 Compétition entre chélation et adsorption résiduelle 116

5.3.3 Mise en évidence du FRET sur les microstructures 120

5.4 CONCLUSIONS SUR LES SURFACES ACTIVES POUR NEFI 130

6 APPLICATIONS À L'ÉTUDE DE L'ADHÉSION CELLULAIRE 131

6.1 ADHÉSION CELLULAIRE SPÉCIFIQUE SUR MICROSTRUCTURES 131

6.1.1 Dynamique d'étalement sur surfaces homogènes 131
6.1.2 Adhésion cellulaire sur microstructures 134

6.2 OBSERVATION DU RÉCEPTEUR EGFR 135

6.2.1 Marquages cellulaires 135

6.2.2 Résultats de l'étude NEFI 137

6.3 PERSPECTIVES 140

6.3.1 FRET sur cellules vivantes par marquage membranaire 140

6.3.2 Super-résolution latérale par clignotement de l'accepteur 142

6.4 CONCLUSIONS SUR L'APPLICATION AUX ÉTUDES D'ADHÉSION CELLULAIRE 147

CONCLUSION 149

BIBLIOGRAPHIE 155
À toutes ces expériences "ratées" qui, néanmoins, produisent des images incomparables...

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Cristal</figcaption></figure>

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Dragon</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Pégase</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Fleur</figcaption></figure>

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Abysse</figcaption></figure>

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Léopard</figcaption></figure>
# Introduction

## CONTEXTE

L'imagerie optique est un champ de recherche important des sciences du vivant, et tout particulièrement de la biologie cellulaire. Les dimensions caractéristiques des phénomènes mis en jeu sont très variées : les tailles des cellules de mammifères vont typiquement de 1 à 100 µM de diamètre, l'ordre de grandeur des tailles des protéines est plutôt le nm [1]. Ainsi, l'un des défis importants de l'imagerie contemporaine en biologie cellulaire est d'accéder à des informations relatives à des phénomènes de dimensions nanométriques, tout en conservant une vue d'ensemble des cellules et donc un large champ d'observation.

Le cas de l'adhésion cellulaire est, à ce titre, représentatif. Ce phénomène met en jeu un ensemble d'interactions spécifiques et non-spécifiques<fnref n="1" />. La spécificité est liée à la reconnaissance entre un *ligand* et un *récepteur* transmembranaire. Dans le cadre de l'adhésion cellulaire, les cadhérines sont des récepteurs impliqués dans l'adhésion intercellulaire, et les intégrines dans l'adhésion avec le micro-environnement des cellules [2]. Ce milieu, aussi appelé matrice extra-cellulaire (ECM<fnref n="2" />), est constitué de l'agencement complexe de diverses molécules et protéines [2, 3]. L'interaction spécifique des intégrines avec certaines de ces protéines constitue la base de la formation de plaques d'adhésion reliant le cytosquelette des cellules à l'ECM – Figure 1. L'adhésion est associée à l'ouverture de multiples canaux de signalisation à doublesens, qui affectent l'intégralité du comportement cellulaire [4].

La compréhension fine de ces phénomènes bio-physico-chimiques nécessite des outils permettant de rendre compte de l'articulation entre les interactions protéiques et le comportement global de la cellule, ce qui met en avant les aspects dynamiques de l'adhésion. Or, comme j'aurais l'occasion de le détailler durant le chapitre 1, les techniques majoritairement utilisées actuellement permettent d'étudier un ou plusieurs aspects du phénomène, mais au prix de compromis parfois très importants. Par exemple, la microscopie optique, comme le contraste de phase, permet d'accéder aux comportements globaux grâce à son grand champ d'observation et à une vitesse d'acquisition élevée, mais l'étude précise des zones d'adhésion est impossible en raison de la limite de résolution due à la diffraction (~250 nm dans le visible). À l'opposé, les méthodes modernes dépassant la limite de diffraction<fnref n="3" /> sont limitées en termes de champ d'observation, de dynamiques temporelles accessibles et, de façon plus cruciale, elles sont généralement incompétibles avec l'étude de cellules vivantes en raison des fortes irradiances d'excitation utilisées.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>FIGURE 1 – Illustration des protéines d'adhésion transmembranaires reliant le cytosquelette aux structures extracellulaires. Adapté de [2].</figcaption></figure>

<footnote n="1">1. Interactions de Van der Waals, interactions électrostatiques, répulsion stérique, hydrophobe, etc.</footnote>

<footnote n="2">2. *Extra Cellular Matrix.*</footnote>

<footnote n="3">3. Que l'on considère le cas des techniques dites de super-résolution optique ou même la microscopie électronique.</footnote>
L'imagerie NEF, pour *Non-radiative Excitation Fluorescence*⁴, est une proposition de technique s'inscrivant dans la famille des méthodes optiques utilisées pour étudier l'adhésion cellulaire, qui vise à s'affranchir de la limite de diffraction [5]. Basée sur le phénomène de transfert d'énergie non-radiatif de type Förster (FRET), l'imagerie NEF se propose de donner accès à la dynamique spatio-temporelle des points faux d'adhésion de cellules vivantes. Cette technique repose sur l'utilisation de surfaces de verre rendues "optiquement actives" via leur fonctionnalisation par des boites quantiques (QDs). Ces dernières jouent le rôle de donneurs dans le cadre du FRET. Ce phénomène de transfert à courte portée – quelques nm – permet alors de détecter des molécules fluorescentes⁵ lorsqu'elles sont à grande proximité du substrat. Les précédents travaux de l'équipe ont ainsi démontré la possibilité de measures la hauteur d'une membrane lipidique avec une résolution axiale nanométrique, pour des temps d'acquisition faibles et des puissances lasers minimes [6].

Parallèlement à ces enjeux, la diversité des comportements d'adhérence des cellules sur un substrat 2D – y compris au sein d'une même lignée cellulaire – a conduit au développement de surfaces permettant de contrôler l'adhésion, comme le micropatterning [7]. L'idée est de reproduire les contraintes géométriques et mécaniques, ainsi que la composition de la matrice extra-cellulaire, en microstructurant la répartition des protéines d'adhésion à la surface de substrats plus ou moins rigides.

L'enjeu de cette thèse a donc été de poursuivre le développement de l'imagerie NEF au regard de ces exigences. À partir de la maîtrise de la synthèse et des échanges de ligands de surface des boites quantiques, j'ai développé une méthode de microstructuration 2D de ces dernières en conjuguant une fonctionnalisation covalente *bottom-up* et une microstructuration *top-down* par photolithographie dans le proche UV. L'étape de microstructuration, à l'aide d'un dispositif numérique à micro-miroirs (DMD), permet d'obtenir des monocouches de QDs denses, dont on peut aisément contrôler la forme, avec une résolution micrométrique. Je montre ensuite la possibilité de biofonctionnaliser ces motifs de façon spécifique avec un ligand chélatant le zinc en surface des QDs. Ce ligand terminé RGD permet l'adhésion spécifique des cellules sur les micro-motifs de QDs. Outre la mise en évidence du FRET entre des cellules et nos substrats, j'ai également exploré l'association de l'imagerie NEF avec une méthode de super-résolution, basée sur la fluctuation de l'émission de l'accepteur FRET, pour augmenter la résolution latérale.

4. Qu'on abrégera donc parfois NEFI, avec I pour *Imaging*. Précédemment nommée NEFM, le M renvoyant à *Microscopy*.

5. Typiquement au niveau de la membrane cellulaire, ou marquant une protéine impliquée dans les points faux d'adhésion.
# APERÇU DE LA THÈSE

CE DOCUMENT EST DIVISÉ EN SIX CHAPITRES.

LE CHAPITRE 1 présente le contexte scientifique de la biophysique de l'adhésion cellulaire. Il s'attarde en particulier sur les méthodes employées pour son étude.

LE CHAPITRE 2 sert d'introduction au cadre théorique de l'imagerie NEF : la luminescence/fluorescence et le transfert d'énergie non radiaatif de type Förster. Y sont aussi décrits les principes de l'imagerie grand-champ de type TIRF, ainsi que la mise en place du montage optique utilisé durant le projet doctoral.

LE CHAPITRE 3 expose les propriétés générales des boites quantiques (QDs), nanocristaux de semi-conducteurs particulièrement intéressants pour l'imagerie NEF. Il détaille la prise en main de leur synthèse et la modification de leurs ligands, ainsi que les différentes caractérisations photophysiques réalisées.

LE CHAPITRE 4 présente le développement et la caractérisation de la fonctionnalisation et de la microstructuration de surfaces de verre par nos QDs, afin d'obtenir des substrats adaptés à l'imagerie NEF.

LE CHAPITRE 5 se focalise sur la démonstration de la possibilité de fonctionnalisation des surfaces microstructurées pour l'imagerie NEF. Je présente notamment la nécessité de passiver le verre autour des micro-motifs, ainsi qu'une analyse de FRET quantitatif dans une situation modèle.

LE CHAPITRE 6 expose les travaux réalisés sur le micropatterning cellulaire, et les enjeux d'une étude NEFI en situation réelle. Je poursuis en élaborant autour des perspectives de localisation XY super-résolue des accepteurs FRET, à partir de la fluctuation de leur émission.

LA CONCLUSION synthétise les apports de mon travail et discute les possibilités d'optimisation écologique du processus de microstructuration développé.
<figure><img src="image_11.png" /></figure>
# Éléments de biophysique de l'adhésion cellulaire

1

Dans ce chapitre, je vais présenter plus en détail le contexte scientifique de la thèse. Je vais introduire les bases de l'adhésion cellulaire, puis je recenserai les principaux types de méthodes employées pour étudier et mesurer l'adhésion de cellules vivantes.

## 1.1 DYNAMIQUES DU VIVANT

### 1.1.1 GÉNÉRALITÉS

#### 1.1.1.1 Omniprésence de l'adhésion et de la migration

L'adhésion cellulaire joue un rôle de premier plan dans de nombreuses situations physiologiques et pathologiques¹. Ainsi, la prolifération cellulaire, le développement embryonnaire, ou la réponse inflamatoire contrôlent la manière dont les cellules adhèrent et migrent dans l'organisme [2]. Ces différents processus résultent d'interactions complexes entre les cellules et leur milieu : la matrice extra-cellulaire (ECM). Par ces interactions, diverses voies de signalisation intracellulaires sont activées et régulent l'adhésion par l'intermédiaire du cytosquelette.

Les situations où l'adhésion joue un rôle crucial sont nombreuses. Les phénomènes de croissance tumorale², de vascularisation tumorale³, et la métastatisation des cancers⁴ sont des exemples classiques de pathologies associés à des dérèglements de l'adhésion et de la migration. L'évolution des interactions entre cellules et matrice extra-cellulaire est ainsi essentiel pour chaque aspect de l'organisation, de la fonction et de la dynamique des structures multicellulaires, ce qui motive l'étude de ces phénomènes jusqu'à l'échelle de cellules uniques. Ici, je présenterais essentiellement des éléments relatifs à l'adhésion de cellules uniques avec la matrice extra-cellulaire⁵

#### 1.1.1.2 La matrice extra-cellulaire (ECM)

Le milieu des cellules est un mélange complexe de différentes macromolécules, produites par les cellules elles-mêmes. On y trouve en premier lieu des glycosaminoglycanes (GAGs) – polysaccharides forte-ment chargés négativement se liant aux protéines pour former des protéoglycanes – et des protéines fibreuses longues et rigides : les col- lagènes. Ces composants structurent l'architecture et les propriétés mécaniques de la matrice – Figure 1.1 (a) et (b). Le 3ème groupe est constitué de glycoprotéines, la plus connue étant la fibronectine, formée de 2 grandes sous-unités jointes par un pont di-sulfure – Figure 1.1 (c).

1.1 Dynamiques du vivant 11

Généralités
Adhésion cellule/substrat

1.2 Techniques pour étudier l'adhésion 17

Méthodes pour l'étude des forces d'adhésion

Méthodes d'imagerie optique pour l'étude de l'adhésion

Contrôle de l'adhésion et migration cellulaire

1.3 Conclusions sur l'étude de l'adhésion cellulaire 26

1. Cette partie de chapitre a été construite essentiellement à partir des références [2, 8, 9].

2. Dérèglement de la prolifération cellulaire et du comportement migra-toire.

3. Migration des cellules endothéliales vers la tumeur.

4. Migration des cellules tumorales de la tumeur primaire via le réseau sanguin.

5. En situation physiologique, les cellules adhèrent entre elles, et les adhésions cellule-ECM et cellule-cellule interagissent [10, 11].
Ce dernier type de protéines est notamment étudié en synthétisant des séquences peptidiques particulières, dont on teste l'interaction avec les récepteurs transmembranaires associés à l'adhésion. C'est ainsi que la séquence peptidique RGD (tri-peptide Arginine – Glycine – Acide aspartatique) a pu être identifiée comme interagissant spécifiquement (*ligand*) avec certaines intégrines (*récepteur*) des cellules [2, 12, 13]. Enfin, diverses enzymes et facteurs de croissance jouent un rôle homéo-statique dans la matrice, en régulant les interactions cellules-ECM. Les enzymes activent ou clivent les protéines, ce qui réorganise continuellement la matrice extra-cellulaire. Les facteurs de croissance, synthétisés dans l'ECM, peuvent être libérés par l'activité enzymatique et influencent la croissance, la différentiation, le métabolisme, ainsi que l'adhésion et la migration. En particulier, le facteur de croissance EGF est présenté plus en détail dans le chapitre 6, section 6.2.1.2, car sur-exprimé par une lignée cellulaire que j'ai pu étudier.

### 1.1.1.3 Rôle du micro-environnement

Les facteurs environnementaux sont ainsi déterminants pour comprendre les dynamiques de l'adhésion et de la migration des cellules [8]. Les principales influences sont illustrées sur la Figure 1.2 avec leurs voies de signalisation [14]. Les facteurs influençant les cellules peuvent être bio-chimiques, comme on vient de le voir :

- On parle alors de chimiotaxie lorsque ces derniers diffusent dans l'environnement des cellules. La distribution de ces espèces chimiques peut être isotrope ou sous la forme de gradients de concentration, auquel cas il est possible d'observer un phénomène de migration dirigée.

- Lorsque les marqueurs biochimiques sont liés à une surface, comme c'est typiquement le cas pour une matrice extra-cellulaire supportant des cellules épithéliales, le terme employé est haptotaxie. Ce champ n'est actuellement compris que très incomplètement, en raison de la complexité des interactions entre les cellules (qui produisent et modifient l'ECM) et l'ECM (qui influence le comportement des cellules).

- Les cellules ont aussi la capacité de détecter des différences de rigidité de leur substrat – durotaxie. Une variation de cette rigidité peut ainsi promouvoir la croissance et vascularisation tumorale.

- La topotaxie est un processus parallèle, où les cellules détectent les variations topologiques de leur substrat.

- Enfin, pour donner un exemple d'influence moins évidente, il a aussi pu être montré que les cellules réagissaient à des champs électriques transitoires – galvanotaxie – comme par exemple dans le cas de la cicatrisation.

**(a) GAGs & protéoglycanes**

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

**(b) Protéines fibreuses**

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**(c) Glycoprotéines**

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

FIGURE 1.1 – Comparaison des formes et tailles des composants majeurs de l'ECM, distinguant GAGs (rouge) et protéines (vert). Adapté de [2].
<figure><img src="image_15.png" /></figure>

* **Chimiotaxie** : les cellules détectent le signal par l'intermédiaire de récepteurs membranaires fixant les signaux chimiques solubles.

* **Haptotaxie** : les cellules détectent les signaux liés à la surface à l'aide de leurs récepteurs, notamment les intégrines.

* **Durotaxie** : la rigidité du substrat est détectée par un ensemble de composants couplés mécaniquement dans le cortex cellulaire, dans le cytosol ou au niveau de l'enveloppe nucléaire.

* **Topotaxie** : les cellules détectent la géométrie de l'espace disponible et adaptent leur forme en modifiant l'orientation des protubérances membranaires parallèlement aux fibres alignées de la matrice extracellulaire (ECM), en détectant la courbure membranaire induite par la topographie grâce aux protéines de la famille BAR, ou en mesurant la déformation nucléaire résultant de la compression et du changement de forme.

* **Galvanotaxie** : le champ électrique est détecté par l'électromigration des composants de la membrane (y compris les récepteurs de signalisation) vers la cathode (+) ou l'anode (-).

FIGURE 1.2 – Détection par les cellules des principaux facteurs environnementaux. Adapté de [14].

## 1.1.2 ADHÉSION CELLULE/SUBSTRAT

### 1.1.2.1 Adhésion et motilité

Adhésion et migration sont deux processus intrinsèquement liés car ils ont en commun un grand nombre de voies de signalisation cellulaire. Il a pu être montré qu'en l'absence d'autres facteurs que l'haptotaxie, la migration dirigée de fibroblastes était principalement déterminée par la dynamique collective des *adhésions focales* (FA) et du cytosquelette d'actine [15]. Les *contacts focaux* sont des zones particulières où un récepteur membranaire – e.g. les intégrines – est lié d'une part à un composant de la matrice extra-cellulaire, d'autre part au cytosquelette d'actine, par l'intermédiaire d'autres protéines 6. Leur mise en évidence date de la fin des années 1970 / début 1980, par les travaux de Izzard & Lochner [16] ainsi que d'Abercrombie [17]. Dès cette époque, il était aussi remarqué que les contacts focaux étaient associés à une grande proximité entre la membrane des cellules et le substrat.

6. Voir section 1.1.2.2.
Le processus de migration 2D peut ainsi être schématisé en 3 étapes principales – Figure 1.3. Lors de la protusion, ou étalement, la cellule se polarise, avec l'apparition d'extensions de la membrane plasmique à l'avant de la cellule, formées par polymérisation de l'actine. Au niveau de ces extensions, on voit se former des contacts focaux – adhésion – permettant à la cellule de disposer de points d'ancrage pour son déplacement. L'arrière de la cellule est alors ramené vers l'avant par la contraction du cytosquelette : c'est la rétraction. L'adhésion cellulaire implique donc une reconnaissance entre ligands et récepteurs au niveau de la membrane, ce qui va promouvoir 2 types de forces générées par les structures d'actines : une force de protusion associée à la polymérisation de l'actine à la périphérie de la cellule, et une force contractile (force de traction) associée à l'élaboration de longues fibres d'actine que l'on nomme fibres de stress.

La polymérisation de l'actine a fait l'objet d'un modèle physique nommé tapis roulant (*treadmilling*) avec un mécanisme de nucléation de type *brownian ratchet* [18, 19]. De plus, de nombreuses protéines – rassemblées sous le nom ABP, pour *Actine Binding Proteins* – peuvent se lier à l'actine pour modifier son architecture. Un autre groupe de protéines, les GTPases, est impliqué dans des rôles plus spécifiques de détermination des structures de l'actine – Figure 1.4. Lors de la rétraction, une diminution de la contractilité du cytosquelette à l'arrière de la cellule se fait par dépolymérisation de l'actine, sous l'influence de plusieurs interactions faisant par exemple intervenir la protéine nommée myosine [9].

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

(a) Les fibroblastes cultivés dans un milieu appauvri en sérum manifestent de l'actine corticale et quelques fibres de stress. (b) Cdc42 provoque l'apparition de structures nommées filopodes à la périphérie de la cellule. (c) Rac génère la formation de lamellipodes s'étendant sur toute la circonférence cellulaire.

(d) Rho provoque l'assemblage de fibres de stress denses.

L'équilibre entre les forces exercées par la polymérisation de l'actine et la tension de la membrane plasmique [9] influence également l'adhésion cellulaire. La membrane plasmique des cellules est une couche de lipides très hétérogène, traversée par de nombreuses protéines et organisée en micro-domaines liés au cortex d'actine de la cellule. La tension de la membrane plasmique des cellules dépend de la polymérisation du cytosquelette d'actine et des adhésions déjà présentes entre la cellule et le substrat [22]. En effet, une cellule s'étale pour adhérer : cela augmente la tension membranaire, ce qui en retour mo-

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>FIGURE 1.3 – Schéma des étapes principales de la mésenchymateuse des fibroblastes.</figcaption></figure>

FIGURE 1.4 – Influence de l'injection de protéines Rho GTPases (Cdc42, Rac, Rho) sur l'organisation de l'actine de fibroblastes fixés. Marquage à la phalloïdine fluorescente. Adapté de [20] citant [21].

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>FIGURE 1.5 – Allures des polarisations cellulaires possibles selon la tension de la membrane plasmique. Adapté de [22]</figcaption></figure>
difie la polymérisation de l'actine. En général, une faible tension de membrane est associée à la formation de plusieurs protusions nommées lamellipodes, tandis qu'une forte tension membranaire est associée à un front de protusion plus large – Figure 1.5.

### 1.1.2.2 Transmission des forces

Les adhésions focales font la jonction entre la cellule et la matrice extra-cellulaire. Elles sont composées d'un grand nombre de protéines dont la dynamique d'organisation n'est pas encore élucidée, même si les techniques d'imagerie récentes laissent deviner une structure à plusieurs couches [23]. Les protéines assurant la liaison des cellules au substrat sont les intégrines – comme mentionné précédemment. Il s'agit de protéines transmembranaires composées de 2 feuillets glyprotéiques qu'on note $\alpha$ et $\beta$. On a dénombré 24 types d'intégrines dans l'espèce humaine, issus des combinaisons entre les 18 feuillets $\alpha$ et les 8 feuillets $\beta$ recensés [2]. La Figure 1.6 illustre de manière simplifiée l'assemblage de protéines auquel un dimère d'intégrine participe afin de relier le cytosquelette à la matrice extra-cellulaire. La taline est généralement présente comme adaptateur, mais n'est souvent pas seule. Une même inté-grine peut présenter des variations d'affinités avec différents composants de la matrice extra-cellulaire, et cette liaison est notamment affectée par la concentration d'ions $Mg^{2+}$ et dans une moindre mesure $Ca^{2+}$. Les adhésions focales formées à l'aide des intégrines manifestent une diversité en taille : elles peuvent être petites, discrètes et transitoires – à la limite de diffraction, et de quelques min de durée de vie [24] – ou grandes, proéminentes et durables – d'environ 0,5-1,5 µm selon leur maturité, pour une durée de vie de 10 à 20 min [25].

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>FIGURE 1.6 – Intégrine active, reliant l'ECM à l'actine du cytosquelette. Adapté de [2].</figcaption></figure>

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Les signaux reçus de l'extérieur de la cellule peuvent agir par le biais de divers mécanismes intracellulaires pour stimuler l'activation des intégrines. Dans les plaquettes, comme illustré ici, la protéine de signal extra-cellulaire nommée thrombine active un récepteur couplé à une protéine G à la surface de la cellule, initiant une voie de signalisation qui conduit à l'activation de Rap1, un membre de la famille des GTPases monomériques. Rap1 activé interagit avec la protéine RIAM, qui recrute ensuite la taline à la membrane plasmique, avec une autre protéine appelée kindline. La taline interagit avec la kindline et la chaîne $\beta$ de l'intégrine pour déclencher l'activation. La taline interagit ensuite avec des protéines adaptatrices telles que la vinculine, ce qui entraîne la formation d'un lien avec l'actine du cytosquelette.

<caption>FIGURE 1.7 – Exemple d'une voie de signalisation pour l'activation des intégrines. Adapté de [2].</caption>
Diverses études comme celles utilisant la microscopie électronique et la diffraction des rayons X suggèrent que intégrines se présentent dans 2 conformations, une forme active ou inactive [2]. La transmission effective des forces⁷ résultant notamment de la polymérisation et dépolymérisation du cytosquelette d'actine requiert la formation de liens avec l'ECM, donc l'activation des intégrines, ce qui peut se produire par diverses voies de signalisations internes comme externes [4]. La Figure 1.7 donne l'exemple d'une voie de signalisation interne. La liaison des intégrines au ligand RGD (voie de signalisation externe) peut elle aussi promouvoir l'activation de nouvelles intégrines, ce qui renforce l'adhésion focale [2] et conduit à la formation de plaques d'adhésion focales denses et structurées – Figure 1.8.

7. Le modèle de référence de la transmission des forces stabilisant les cellules en adhésion ou créant du mouvement est celui du *molecular clutch* [9, 26, 27]. Les différents mécanismes mentionnés dans cette section sont fortement couplés [4] et contribuent ensemble aux comportements des cellules [9, 28, 29].

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

FIGURE 1.8 – Représentation de la structure moléculaire (à un instant *t*) d'une plaque d'adhésion focale, reconstituée à partir d'observations en microscopie super-résolue. Adapté de [23].

#### 1.1.2.3 L'adhésion sur substrat *in vitro*

Lorsque des lignées cellulaires sont étudiées en laboratoire, elles sont entretenues et observées dans un milieu de culture approprié. La préparation des cellules nécessite leur détachement, à l'aide d'une enzyme par exemple. La suspension de cellules obtenue est ensuite déposée sur une lamelle d'observation souvent recouverte de fibronectine, la protéine de l'ECM à laquelle se lient un certain nombre d'intégrines des cellules. On observe alors un processus d'adhésion qui peut être découpé en 3 phases – Figure 1.9. Lors de la *sédimentation*, le corps cellulaire interagit avec le substrat de façon non spécifique. La formation de contacts focaux transitoires à l'aide des intégrines permet l'*étalement* progressif des cellules, ce qui s'accompagne de la polymérisation de l'actine. Une fois bien étalées, les cellules poursuivent la *maturation* des contacts focaux en plaques d'adhésion focales tout en réorganisant leur cytosquelette. Selon le type cellulaire et le type de substrat utilisé, on observera alors des comportements de migration ou bien d'adhésion renforcée, qui s'accompagnent, après un certain temps, de la production par les cellules de leur propre matrice extra-cellulaire – on parle alors d'adhésion fibrillaire.

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

FIGURE 1.9 – Schéma des étapes principales de l'adhésion cellulaire *in vitro*.
## 1.2 TECHNIQUES POUR ÉTUDIER L'ADHÉSION

Du fait de la richesse des interactions mises en jeu, de nombreuses méthodes sont utilisées pour étudier l'adhésion, que ce soit par la mesure de force ou par l'imagerie de leurs comportements. Je me contenterai de présenter les méthodes utilisées pour l'analyse à l'échelle des cellules uniques ⁸. La Figure 1.10 présente un résumé des grands types d'applications de l'étude de l'adhésion.

Mesure de forces d'adhésion

Traitement médicamenteux

Voies de signalisation

Ingénierie des tissus

Chimiotaxie

Études cinétiques

Adhésion inter-cellules

Métastases de cancer

Modification de substrat

Compatibilité de biomatériaux

Études sur population de cellules

Études sur cellule unique

Mesure de forces d'adhésion

Modélisation de l'adhésion

Migration cellulaire

Forces de traction

Cytotoxicité

Études cinétiques

Morphologie cellulaire

Différentiation cellulaire

Traitement médicamenteux

8. Il existe aussi de nombreuses méthodes où l'étude se fait à l'échelle de populations de cellules, comme les tests de rinçage, les chambres à flux et la microfluidique, etc. [30].

FIGURE 1.10 – Résumé de la diversité des applications de l'étude de l'adhésion cellulaire. Adapté de [30].

### 1.2.1 MÉTHODES POUR L'ÉTUDE DES FORCES D'ADHÉSION

L'ensemble des techniques consistant à mesurer les forces d'adhésion à l'échelle locale – voire de la molécule unique – sur des cellules individuelles est regroupé sous l'acronyme SCFS ⁹. Une revue récente de Roca-Cusachs et al. présente ces différentes méthodes [31]. Dans cette section, je présenterais quelques exemples choisis, représentatifs des approches actuellement utilisées.

9. Single Cell Force Spectroscopy.

#### 1.2.1.1 Mesure par interaction directe avec les cellules

L'emploi d'une micropipette est une méthode déjà ancienne [33, 34] et elle est encore largement utilisée [30, 35]. Elle permet, par aspiration locale, de mesurer la tension du cortex cellulaire. Cela permet également de détacher une cellule par l'application une force – Figure 1.11. Le détachement est produit par augmentation progressive de la force d'aspiration ou par un déplacement de la micropipette. Dans le même temps, la cellule est observée au microscope pour rendre compte des évolutions globales. La sensibilité va de la fraction de pN au nN [36]. Cela a par exemple permis d'étudier la force d'adhésion de cellules sur de la fibronectine [37], ou les différences de forces d'adhésion entre cellules normales et cancéreuses [38]. Il existe de nombreuses variantes ¹⁰ permettant de mesurer la tension de membrane ou la tension corticale [35], ou de caractériser des interactions ligand-récepteur. Des montages plus sophistiqués combinant cette méthode avec la micropipette de fluorescence ont permis le suivi de voies de signalisation déclenchées par la réponse des cellules à la force d'aspiration [39]. Les principales limites de cette méthode sont sa faible résolution temporelle et son aspect souvent invasif sur les cellules étudiées.

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

FIGURE 1.11 – Principe d'une étude par aspiration à l'aide d'une micropipette. Inspiré de [32].

10. Montage avec plusieurs micropipettes, avec cellule ou vésicules attachées à des billes fonctionnalisées par un ligand, etc.
Les pinces optiques, proposées en 1986 par Ashkin et al. [40] permettent de faire des mesures à l'échelle de la molécule unique, comme un récepteur membranaire. Un laser focalisé permet de piéger et déplacer des billes diélectriques microscopiques, ou même des cellules – Figure 1.12. Le contrôle de la force est extrêmement précis et permet d'étudier une grande variété de phénomènes biologiques, sur une gamme de allant des fN aux pN, et avec une résolution temporelle de l'ordre de la milliseconde. Cet outil très versatile a pu être utilisé de nombreuses manières, comme par exemple pour l'étude de la liaison d'un complexe ligand-récepteur purifié [41], ou la réponse mécanique locale de cellules en adhésion [42, 43]. Tout comme l'aspiration par micropipettes, il existe diverses configurations d'expériences, dont certaines utilisant plusieurs pièges optiques [44]. Leur limite se situe au niveau de leur principe même : la focalisation du laser implique des irradiances d'illumination élevées, difficilement compatibles avec des expériences de suivis de cellules vivantes sur des temps longs.

Dans le cadre de l'étude de l'adhésion, la microscopie à force atomique (AFM) a initialement été utilisée pour quantifier la force de liaison de complexes ligands-récepteurs [46], puis peu de temps après pour étudier l'adhésion de cellules fixées directement sur le levier AFM, et servant directement de sonde lorsque mises en contact avec un substrat fonctionnalisé avec une espèce chimique contenant le tri-peptide RGD [47]. Des agencements cellule-cellule ont aussi été utilisés – Figure 1.13. Le principe est d'opérer une mise en contact précise pendant un temps donné, puis de retirer la pointe de l'AFM. Les ruptures sur l'évolution de la force selon la distance donnent accès aux forces d'adhésion avec une sensibilité de l'ordre du pN. Il a ainsi été possible d'étudier la liaison fibronectine-intégrine $\alpha_5\beta_1$ [48]. Dans une situation type substrat-cellule, il est de plus possible de sonder un couple ligand-récepteur présent sur la partie dorsale d'une cellule alors même que cette dernière est en adhésion sur un substrat par le biais d'un autre couple ligand-récepteur [49]. Comme les méthodes précédentes, il s'agit d'une technique limitée par son aspect invasif.

### 1.2.1.2 Mesure par la déformation de l'environnement

En utilisant des substrats de rigidité très faible, les forces exercées par les cellules sur leur environnement peuvent conduire à des déformations mesurables. La microscopie de force de traction (TFM) est la première des méthodes ayant étudié ce phénomène [50, 51]. Elle pose sur l'imagerie des variations de la position de marqueurs fluorescents incorporés dans le substrat ou attachés à sa surface – Figure 1.14. Cela permet alors d'établir une cartographie des forces de traction générées par une cellule<sup>11</sup>, sur un large champ. Si les mises en œuvre initiales avaient recours à une image de référence pour effectuer les comparaisons, il est possible de s'en passer par un contrôle précis de la régularité du positionnement des marqueurs [52, 53]. Il s'agit de plus d'une méthode compatible avec l'étude dynamique de

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>FIGURE 1.12 – Principe d'une étude à l'aide de pinces optiques.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>FIGURE 1.13 – Principes de base des montages expérimentaux basés sur l'AFM pour l'étude de l'adhésion cellulaire. Inspiré de [45].</figcaption></figure>

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>FIGURE 1.14 – Principe de base d'une étude par microscopie de force de traction.</figcaption></figure>

<footnote n="11">11. On mesure en réalité une force par unité de surface, i.e. une pression en Pa. La sensibilité est d'environ 1 Pa.</footnote>
l'adhésion en 3D de cellules, ce qui a permis de mettre en évidence l'évolution des tensions corticales lors du phénomène de migration [54] ; la différence de directionnalité des forces exercées selon que les cellules soient cancéreuses ou non [55] ; ou encore, une différence notable de comportement des adhésions focales par rapport à la situation sur substrat [56]. C'est une méthode dont les combinaisons avec d'autres techniques d'imageries [57-60] sont très prometteuses, qui est essentiellement limitée par la complexité de l'analyse des données [61].

Une autre manière de procéder repose sur l'utilisation de micro-
piliers – Figure 1.15. Les déformations de ces derniers étant seule-
ment fonction de la force exercée, les calculs permettant d'obtenir les
forces mises en jeu sont simplifiés tout en permettant une sensibilité de
l'ordre de 10 pN. Il est de plus possible de fabriquer des micro-piliers
magnétiques pour exercer une stimulation mécanique contrôlée [62,
63], ou créer des paliers de raideur variables de manière à diriger la
migration des cellules [64]. Cependant, cette structuration du substrat
peut affecter le comportement cellulaire selon les dimensions des micro-
piliers [65]. Le potentiel de combinaison avec d'autres méthodes d'ima-
gerie est identique à la TFM. La méthode est cependant limitée par
son caractère discret, et le faible intervalle de raideurs actuellement
accessibles.

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>FIGURE 1.15 – Principe d'une étude à l'aide de micro-piliers.</figcaption></figure>

1.2.2 MÉTHODES D'IMAGERIE OPTIQUE POUR L'ÉTUDE DE L'ADHÉSION

Il existe un ensemble de méthodes d'imageries n'ayant pas pour
centre d'intérêt la mesure des forces d'adhésion, mais l'identification
des structures biologiques impliquées dans l'adhésion cellulaire et leur
dynamique. On peut les distinguer en 2 grandes catégories : techniques
avec ou sans fluorescence.

1.2.2.1 Méthodes sans fluorescence

Tout d'abord, on trouve plusieurs techniques d'imagerie interféro-
métriques dont l'utilisation est largement répandue dans le contexte
de l'adhésion. La microscopie à contraste de phase est une méthode
optique ancienne [66], mais très utile pour les études de morphologie
cellulaire au cours de l'étalement [67]. À l'aide d'un objectif adapté, les
différences d'indices de réfraction créent le contraste des images obte-
nues – Figure 1.16. Ainsi, même des échantillons transparents comme
les cellules peuvent être étudiés.

Cependant, un halo est observable sur le pourtour des cellules. Afin de s'en affranchir, on peut utiliser deux autres méthodes interférentielles – Figure 1.17. La première de ces méthodes, RICM (*Reflection Interference Contrast Microscopy*), repose sur l'observation des interférence produites par les réflections aux interfaces entre le verre et le milieu d'observation, ainsi qu'entre le milieu d'observation et la cellule – plus exactement, dans le gap entre le substrat et la membrane plasmique. C'est d'ailleurs à l'aide d'une méthode très proche de la RICM – mais n'utilisant pas de faisceau polarisé circulairement

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>FIGURE 1.16 – Exemple d'image en contraste de phase, sur cellules U87MG à 37°C.</figcaption></figure>
– que l’on a pu réaliser les premières mises en évidence des adhésions focales [16, 17]. Même si cette méthode est latéralement limitée par diffraction, elle est axialement très résolue, et permet de remonter à des distances membrane-substrat avec une précision nanométrique, tout en bénéficiant d’une bonne vitesse d’acquisition. Elle est de plus compatible avec de longs suivis des cellules [68, 69]. Cela étant dit, l’absence de marquage fluorescent empêche de réaliser l’observation spécifique des protéines d’adhésion, et les fortes hétérogénéités d’indices de réfraction du cytoplasme empêchent des quantifications rigoureuses des distances. En transmission, une méthode très utilisée est l’imagerie à contraste interférentiel différentiel – abrégée DIC, pour *Differential Interference Contrast*. En utilisant un prisme de Nomarski et une lumière polarisée linéairement, il est possible d’imager de façon très nette les contours de cellules et étudier leur comportement global sur de long temps d’observation [70].

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>FIGURE 1.17 – Exemples d’images obtenues par contraste à interférence.</figcaption></figure>

(a) Cellules MDA-MB-231.

(b) Cellules WPMY-1.

### 1.2.2.2 Méthodes utilisant la fluorescence

Les méthodes optiques par marquage fluorescent sont très répandues, en particulier les approches par immunofluorescence récentes qui permettent d'observer les protéines d'adhésion par imagerie confocale ou épifluorescence. La microscopie TIRF (*Total Internal Reflection Fluorescence*) est à ce titre idéale pour étudier l'adhésion. C'est une méthode qui utilise le principe de réflexion totale interne dans le substrat en verre [71]. En générant une excitation par onde évanescente¹², elle permet de réduire l'illumination à la partie ventrale des cellules, ce qui permet d'imager avec un très bon rapport signal sur bruit. Dans sa version classique, l'imagerie TIRF est avant tout qualitative, mais il est possible d'accéder à des mesures de distance cellule-substrat par son extension nommée vaTIRF (*variable angle TIRF*). Dans ce type de montage, sur lequel travaille notre équipe depuis une dizaine d'années [20, 72], l'acquisition d'une succession d'images en faisant varier l'angle d'incidence de l'illumination permet d'accéder à une cartographie des distances avec une résolution axiale nanométrique, mais

12. Une présentation détaillée du TIRF est donnée dans le chapitre suivant, section 2.3.2.
aussi à la cartographie des indices de réfraction effectifs [73, 74]. En combinant ces 2 informations – hauteur de membrane et indice – il est possible de cartographier les interactions spécifiques et non-spécifiques, les aires de contact cellules-substrat, et surtout les énergies d'adhésion, permettant alors de quantifier finement l'adhésion des cellules.

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>(A) Une des images TIRF de la série utilisée pour le calcul – la membrane plasmique a été marquée au DiO. (B) Topographie de la membrane cellulaire correspondante. (C) Indice de réfraction $n_{cortex}$. (D) Localisation 2D des forts contacts d'adhésion (tâches rouges sur fond bleu). (E) Histogramme des distances obtenu à partir de l'image (B). Les sous-populations correspondant aux forts et faibles contacts d'adhésion sont respectivement représentées en rouge et en bleu. Barres d'échelle : 10 µm.</figcaption></figure>

La microscopie par illumination structurée, ou SIM (*Structured Illumination Microscopy*), est une manière astucieuse de s'affranchir de la limite de diffraction et d'observer l'adhésion cellulaire [75]. L'utilisation de multiples motifs d'illumination différents pour chaque plan focal permet d'obtenir par reconstruction numérique des images avec une résolution 3D environ égale à la limite de diffraction divisée par 2 ou 3 [76]. Pour augmenter la compatibilité de cette méthode avec les cellules vivantes, et diminuer sa sensibilité aux phénomènes de diffusion lors de l'étude de cellules, elle peut être combinée avec une illumination de type TIRF [77-79], ce qui a permis d'étudier les dynamiques du cytosquelette de cellules ou des protéines impliquées dans l'adhésion focale – Figure 1.19. On obtient ainsi une réduction du volume d'observation et une augmentation de la vitesse d'acquisition, jusqu'à plus de 100 images/s [80]. L'absence de faiblesse majeure de cette méthode en fait un outil très prometteur.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>FIGURE 1.19 – Image SIM des protéines d'adhésion focale mTagRFP-vinculine (violet) et mEmerald-paxilline (vert) dans une cellule HFF-1. Adapté de [78].</figcaption></figure>

La région encadrée en (a) est donnée agrandie en (b), montrant un gradient de concentration accrue de paxilline vers la périphérie de la cellule. Acquisition de 1,67 s sous une illumination de 30 à 100 W/cm². Barres d'échelle :
(a) 5 µm (b) 1 µm.
Les méthodes d'imagerie par localisation de molécules uniques, abrégées SMLM (*Single-Molecule Localization Microscopy*), ont initialement été développées en parallèle sous des noms différents : PALM [81] (*Photo-Activated Localization Microscopy*) et STORM [82] (*STochastic Optical Reconstruction Microscopy*). Dans les 2 cas, il s'agit d'enregistrer des dizaines de milliers d'images de l'émission fluctuante de molécules fluorescentes individuelles sous une forte irradiance d'illumination, puis de construire numériquement une image unique résolue représentant la localisation des molécules<sup>13</sup>. Ces techniques permettent d'obtenir une résolution d'environ 10 nm [84]. Il existe plusieurs variantes de ces techniques, comme le dSTORM<sup>14</sup>, qui simplifie considérablement la technique en permettant d'utiliser cette méthode avec des molécules fluorescentes organiques classiques [85]. L'iPALM est une autre variante, qui utilise le phénomène d'interférence pour étendre l'acquisition en 3D – on atteint ainsi une résolution axiale de 20 à 30 nm. C'est notamment l'usage de l'iPALM qui a permis la reconstruction nanométrique des plaques d'adhésions focales [23] illustrée en Figure 1.8. Quelques unes des images ayant permis cette reconstruction sont données Figure 1.20 à titre d'exemple. Dans tous les cas, les irradiances d'illuminations importantes et le très grand nombre d'images nécessaires à acquérir restreignent essentiellement ces techniques à des études de cellules fixées.

13. Pour les échantillons denses en fluorophores, il est nécessaire de n'avoir excité qu'une partie des émetteurs pour chaque image expérimentale, ce qui est obtenu en induisant un clignotement de l'émission à l'aide d'une solution tampon adéquate, ou avec un couple d'émetteurs se transférant alternativement l'énergie d'excitation, ou en utilisant des molécules fluorescentes photo-commutables [83].

14. Employant une excitation à 2 lasers.

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Les images du haut représentent la vue d'ensemble, et celles du bas les histogrammes *fités* de distribution de présence selon l'axe vertical, à partir de la zone encadrée. Barres d'échelle : (haut) 5 µm (bas) 500 nm.

Une alternative à cette famille de méthodes pour les études structurales de l'adhésion est l'imagerie par déplétion émission-stimulée [86], ou STED (*STimulated Emission Depletion*). Elle repose sur un montage optique confocal où l'échantillon est scanné, sous une haute puissance laser, avec 2 faisceaux femtoseconde synchronisés dont l'un produit un volume d'observation creux en forme de *donut*. L'émission des molécules fluorescentes en périphérie est désactivée par émission-stimulée, ce qui réduit la zone fluorescente à un *spot* de taille inférieure à la limite de diffraction – Figure 1.21. La résolution ainsi atteinte, sans post-traitement des images, est alors typiquement d'environ quelques dizaines de nm en 3D [87, 88]. La combinaison de cette technique

FIGURE 1.20 – Exemples d'images iPALM des protéines d'adhésion focale. Adapté de [23].
avec les méthodes de localisation photo-activée, décrites au paragraphe précédent, a donné lieu à des développements récents sous les noms de MINFLUX [89] et MINSTED [90], où la résolution dans les 3 dimensions est de l'ordre du nm.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>FIGURE 1.21 – Étude STED de la localisation d'intégrines $β_3$. Adapté de [91].</figcaption></figure>

L'image (a) donne pour comparaison une image confocale (noir et blanc).

L'image (c) est un grandissement de la zone encadrée en pointillée sur (b).

Enfin, il existe une méthode d'imagerie plus récente, basée sur le transfert d'énergie métal-induit [92]. De manière analogue à l'image-rie NEF, l'imagerie MIET (*Metal-Induced Energy Transfert*) utilise un transfert d'énergie non-radiatif pour sonder des distances entre des molécules fluorescentes et ici une surface recouverte d'une couche métallique. En pratique, il s'agit de mesurer les variations de durée de vie d'un émetteur selon leur interaction plasmonique avec un substrat recouvert d'une fine couche d'or – Figure 1.22. Il s'agit donc d'une amélioration de la méthode FLIM [93] (*Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy*), mais qui nécessite des traitements de données parfois complexes. L'imagerie MIET possède une résolution axiale non-métrique sur des distances d'observation complémentaires 15 au FRET [94-97]. La combinaison du MIET avec de l'imagerie FRET de localisation a notamment été employée pour reproduire les résultats obtenus en iPALM par Kanchanawong et al. [23] concernant la structure de plaques d'adhésions focales [98]. Le montage optique utilise cependant un microscope confocal, et implique des puissances d'excitations importantes non-adaptées au suivi dynamique de cellules vivantes avec un large champ d'observation.

15. Le phénomène employé étant particulièrement notable pour des distances au-delà de 20 nm.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>(a-c) Exemples de reconstructions tridimensionnelles de la membrane ventrale des cellules (a) MDCK-II, (b) MDA-MB-231, et (c) A549. (d) Distance moyenne entre la membrane ventrale et la surface d'or pour les 3 lignées cellulaires, avec *fit* gaussien.</figcaption></figure>

<caption>FIGURE 1.22 – Comparaison de 3 lignées cellulaires par imagerie MIET. Adapté de [94].</caption>
### 1.2.3 CONTRÔLE DE L'ADHÉSION ET MIGRATION CELLULAIRE

#### 1.2.3.1 Variabilité des comportements sur substrat homogène

In *situ*, les cellules sont entourées par des cellules voisines et/ou la matrice extra-cellulaire, ce qui impose des limites géométriques et mécaniques spécifiques influençant la morphologie des cellules, mais aussi les diverses facettes de leur comportement. À l'inverse, les cellules étudiées *in vitro* sont considérées comme des systèmes vivants "artificiels", où l'organisation de l'environnement et des autres cellules peut donner naissance à des comportements aléatoires, comme nous pouvons le voir sur la Figure 1.23. L'étude de ce type de situations produit des résultats non-immédiatement transposables à des cellules en situation physiologique *in vivo*, et augmente le risque de résultats ar-tefactuels. Pour outrepasser limitations, il faut généralement observer un grand nombre de cellules ou contrôler l'adhésion et/ou la migration cellulaire.

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

La cellule (1) est très étalée et déplace simplement le barycentre de sa position. La cellule (2) fait globalement des allers-retours successifs entre 2 positions. La cellule (3) montre une migration dirigée vers la cellule (2).

#### 1.2.3.2 Méthodes de contrôle du comportement cellulaire

Plusieurs stratégies ont été mises au point pour contrôler le micro-environnement des cellules et donc leur comportement. La méthode classique est celle des chambres à flux, qui a beaucoup été utilisée pour les études d'adhérence sur des populations de cellules [30] mais aussi l'étude des forces d'adhésion, à l'échelle d'un couple ligand-récepteur [99]. Sa version moderne repose sur la microfluidique, avec un apport majeur en termes de miniaturisation, d'intégration et de possibilités de contrôle et d'automatisation [100]. Avec ce type de dispositifs, on étudie par exemple le processus d'adhésion dans une situation mimant la circulation sanguine [101], ou les capacités de métastatisation de cellules tumorales [102]. Les études sur cellules uniques sont elles aussi possibles [103], et aussi sur des modèles artificiels de membranes comme les vésicules [104].

Une méthode plus compatible avec la plupart des méthodes d'imagerie présentées dans les sections précédentes est le micropatterning cellulaire, dont M. Théry a fait une revue d'ensemble [7]. Comme l'illustre la Figure 1.24, le principe est de mimer les contraintes du

FIGURE 1.23 – Images RICM successives de cellules MDA-MB-231 en adhésion sur du col-lagène de type I.
micro-environnement *in vivo* de manière à ce que les cellules étudiées *in vitro* manifestent des comportements les plus proches possible des conditions physiologiques.

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>FIGURE 1.24 – Le micro-environnement cellulaire *in vivo* et *in vitro*. Adapté de [7].</figcaption></figure>

En structurant le dépôt de la couche d'adhérence – typiquement, une protéine de l'ECM comme la fibronectine – on peut dans une certaine mesure contrôler la morphologie des cellules et la contractilité de leur cytosquelette, comme présenté sur la Figure 1.25. Cette méthode a donné lieu à de nombreuses études¹⁶ sur l'adhésion cellule-substrat, l'adhésion cellule-cellule, ou encore la polarité cellulaire, la croissance et la différentiation, etc. Bien qu'il existe des designs bien connus pour leurs effets, notamment sur la structure du cytosquelette, il est néanmoins nécessaire de sélectionner un motif bien adapté au type cellulaire que l'on souhaite étudier, comme on aura l'occasion de le montrer dans le chapitre 6.

16. Un résultat original et amusant est la *World Cell Race*, où un collectif de laboratoires a réalisé une évaluation standardisée de la vitesse de migration entre différents types cellulaires [105].

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>FIGURE 1.25 – Création de motifs d'ECM et conséquences sur l'organisation du cytosquelette d'actine. Adapté de [7].</figcaption></figure>

Enfin, comme mentionné précédemment, les micro-piliers peuvent aussi permettre un contrôle du comportement cellulaire. Lee *et al.* [64] ont notamment montré qu'un gradient de raideur du substrat ¹⁷, conduisait à une migration dirigée des cellules mais aussi à une augmentation de la vitesse de migration suivant la raideur perçue par la cellule.

17. À l'aide de micro-piliers de base variable, dont la partie supérieure était recouverte de fibronectine pour permettre l'adhésion des cellules.
## 1.3 CONCLUSIONS SUR L'ÉTUDE DE L'ADHÉSION CELLULAIRE

L'adhésion cellulaire est un phénomène riche qui peut être étudié de multiples manières. Chaque dispositif expérimental a ainsi ses points forts et ses points faibles, ce qui donne lieu à des possibilités de combinaisons entre méthodes. Dans le cas de l'imagerie, qui vise notamment à observer les points focaux d'adhésion, il existe effectivement un gap à relier entre les méthodes permettant une bonne vitesse d'acquisition, un large champ d'observation – compatibles avec les cellules vivantes – et les méthodes permettant une grande résolution spatiale mais généralement plus performantes sur de petits champs d'observations et des cellules fixées – Table 1.1. L'imagerie RICM est la seule méthode permettant à la fois d'étudier des interactions très proches du substrat avec une bonne résolution temporelle, tout en restant compatible avec les cellules vivantes. Cependant, en l'absence de marquage, elle ne permet pas d'imager de façon spécifique des éléments particuliers des contacts focaux d'adhésion. L'imagerie basée sur le FRET permet cette sélection : la présentation des éléments théoriques et expérimentaux spécifiques à ces méthodes – et notamment l'imagerie NEF – sont donc l'objet du chapitre suivant.

<table><caption>TABLE 1.1 – Récapitulatif des caractéristiques typiques pour les différentes familles de méthodes d'imageries.</caption><thead><tr><th>Méthode</th><th>Rés. XY<br>(nm)</th><th>Rés. Z<br>(nm)</th><th>Source<br>d'excitation</th><th>Observation<br>sur cellules</th><th>Profondeur<br>de champ</th><th>Marquage<br>fluorescent</th></tr></thead><tbody><tr><td>RICM</td><td>250</td><td>10</td><td>LED ou lampe à vapeur</td><td>Vivantes</td><td>∞</td><td>Non</td></tr><tr><td>TIRF</td><td>250</td><td>20</td><td>Laser</td><td>Vivantes</td><td>0-300 nm</td><td>Quelconque</td></tr><tr><td>SIM</td><td>100</td><td>100</td><td>Laser</td><td>Vivantes</td><td>0-10 µm</td><td>Quelconque</td></tr><tr><td>SMLM</td><td>10-20</td><td>20</td><td>Laser</td><td>Fixées</td><td>0-1 µm</td><td>Plutôt spécifique</td></tr><tr><td>STED</td><td>1-20</td><td>1-100</td><td>Laser</td><td>Fixées</td><td>0-10 µm</td><td>Plutôt spécifique</td></tr><tr><td>MIET</td><td>250</td><td>3</td><td>Laser</td><td>Vivantes</td><td>10-100 nm</td><td>Quelconque</td></tr></tbody></table>
# Dispositif expérimental :
principes, théorie, et montage

2

Dans ce chapitre, je vais introduire la théorie de l'imagerie NEF, c'est-à-dire la luminescence et le transfert d'énergie non-radiatif de type Förster. Je décrirai aussi les principes de l'imagerie grand-champ TIRF ainsi que le montage optique utilisé dans mon travail de thèse.

## 2.1 FLUORESCENCE & LUMINESCENCE

### 2.1.1 INTRODUCTION

Comme je l'ai introduit dans le chapitre précédent, un grand nombre de méthodes d'imagerie du vivant utilisent des marqueurs fluorescents comme agents de contraste. L'imagerie de fluorescence offre également une certaine sélectivité en biologie par l'intermédiaire de différentes molécules de liaisons – des anticorps, par exemple. La proposition d'imagerie NEF s'inscrit dans cette famille de méthodes.

Une légère confusion existe quant à l'utilisation des termes *luminescence* et *fluorescence*. L'usage du mot luminescence est attribué au physicien et historien des sciences Eilhardt Wiedemann, qui l'intro- duisit en 1888 pour qualifier l'émission de lumière n'étant pas condi- tionnée à une élévation de température, par opposition à l'incandes- cence [106, 107]. On rajoute communément un préfixe au terme lu- minescence, pour désigner son origine¹. Ainsi, la photoluminescence est l'émission de lumière spontanée résultant d'une excitation elle- même lumineuse. Le terme de fluorescence² a été introduit par G. G. Stokes en 1852 [106, 107] pour décrire un cas de photoluminescence provenant d'un cristal de fluorite appartenant à la famille générale des *fluorspar*/*fluorspath*, par analogie avec le terme "opalescence"³. La luminescence et la fluorescence correspondent au même processus physique : l'émission spontanée. À l'heure actuelle, on réserve plutôt le terme *luminescence* lorsque l'émission provient d'atomes ou d'ions en phase condensée – cristalline ou amorphe – et le terme *fluorescence* lorsque l'émission est produite par des molécules organiques en phase diluée.

### 2.1.2 BASES DE LA THÉORIE QUANTIQUE DE LA FLUORESCENCE

#### 2.1.2.1 Diagramme d'énergie schématique

Dans ce cadre théorique⁴, la lumière est considérée comme un en- semble de photons, dont l'énergie est définie par l'Éq. (2.1.1), où $h$ est la constante de Planck ($\text{J}\cdot\text{s}^{-1}$); $\nu$ la fréquence d'oscillation du champ électromagnétique (Hz), $c$ la vitesse de la lumière dans le vide

2.1 Fluorescence & luminescence 27

Introduction

Bases de la théorie quantique de la fluorescence

2.2 Transfert d'énergie non-radiatif de type Förster 30

FRET : formalisme théorique

Exemples d'imagerie FRET en biologie

Analyse quantitative en FRET

2.3 Imagerie de fluorescence grand-champ 39

Imagerie en épifluorescence

Principes de l'imagerie TIRF

2.4 Montage expérimental 41

Description du montage

Caractérisation du dispositif TIRF

2.5 Conclusions sur le dispositif expérimental NEFI 49

1. Quelques exemples : la chimilu- minescence lorsque l'émission résulte d'une réaction chimique; la biolumi- nescence, lorsque cette réaction s'ins- crit dans des processus biologiques; mais aussi la mécaluminescence qui se divise en plusieurs types selon la forme de la stimulation mécanique.

2. Même si la première observation rap- portée de fluorescence revient à N. Mo- nardes en 1565 [107].

3. La présence du préfixe "fluor" n'est donc pas lié à l'élément Fluor – qui ne luminesce d'ailleurs pas – mais à une généalogie partagée : le terme fluor, dérivé du latin *fluere*, était employé pour exprimer l'idée d'une fluidité, et donc accolé à ces pierres que l'on pou- vait aisément fondre [106].

4. Cette section s'appuie essentielle- ment sur les références [108, 109].

$$E = h\nu = h\frac{c}{\lambda} \qquad (2.1.1)$$
(m·s⁻¹) et λ la longueur d'onde du rayonnement (m). Pour présenter synthétiquement la dynamique intra-moléculaire associée à la fluorescence, il est convenu de recourir à un diagramme d'énergie simplifié permettant de visualiser les principales transitions entre les niveaux d'énergie – Figure 2.1. Chaque ligne horizontale principale du diagramme représente un niveau d'énergie Eᵢ⁵, identifié par sa multipli-cité de spin Mₛ, définie par l'Éq. (2.1.2), où s est la résultante des spins électroniques sⱼ – Éq. (2.1.3) et (2.1.4). Dans un cas simple à 2 électrons délocalisés, les spins peuvent être parallèles (↑↑) ou anti-parallèles (↑↓), ce qui entraine une résultante des spins électroniques s = 0 ou 1. Les valeurs de Mₛ seront alors respectivement de 1 (état singulet S) ou 3 (état triplet T). Lorsqu'on excite à résonance la transition S₀→S₁ avec un photon d'énergie E = hν ≈ E₁-E₀, la molécule passe de l'état fondamental S₀ à l'état excité S₁ en absorbant le photon incident. La molécule ainsi excitée peut redescendre dans son état fondamental soit par émission spontanée⁶ soit par différents processus non-radiatifs. Ces derniers peuvent impliquer des transitions S₁→S₀ (conversion interne CI) ou des transitions S₁→T₁, puis T₁→S₀ (croisement inter-systèmes CIS). Des cascades de relaxations vibrationnelles rapides peuvent également se produire au sein des états électroniques eux-mêmes.

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

L'émission spontanée s'effectue nécessairement entre le niveau vibrationnel le plus bas de l'état singulet S₁ vers l'état fondamental S₀ – loi dite de Kasha. Par conséquent, la longueur d'onde du photon émis est toujours plus grande que celle du photon incident. Il en résulte un décalage entre les spectres d'absorption et d'émission, qu'on nomme décalage de Stokes – cf. Figure 2.2.

La conversion inter-systèmes est une transition non-radiative peu probable, car elle nécessite un changement de spin de l'électron excité. Sachant que la durée de vie de l'état excité S₁ est de l'ordre de la nanoseconde, une molécule soumise à une excitation continue va cycler un grand nombre de fois entre S₀ et S₁. Dans ces conditions, la transition S₁→T₁, même peu probable, pourra se réaliser. La relaxation de la molécule est alors fortement retardée car le temps de

5. Les lignes horizontales secondaires correspondent aux différents sous-états vibrationnels.

$$M_s = 2s + 1 \qquad (2.1.2)$$

$$s = \sum s_j \qquad (2.1.3)$$

$$s_j = \pm \frac{1}{2} \qquad (2.1.4)$$

6. La fluorescence, qui est la seule voie de relaxation radiative.

FIGURE 2.1 – Diagramme d'énergie simplifié pour une molécule organique fluorescente.

Les processus radiatifs sont représentés en traits pleins, les processus non-radiatifs en pointillés.

CI : Conversion interne

CIS : Croisement inter-systèmes

RV : Relaxation Vibrationnelle

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

FIGURE 2.2 – Spectres d'absorption et de fluorescence de la Rhodamine 6G
vie de l'état $T_1$ est typiquement de l'ordre de la microseconde à la milliseconde. Puisque la relaxation $T_1 \rightarrow S_0$ est non-radiative dans les molécules organiques, le passage par l'état triplet interrompt les cycles absorption/émission pendant un laps de temps définit par le taux de croisement inter-systèmes et la durée de vie de $T_1$.

### 2.1.2.2 Propriétés photophysiques des fluorophores

Dans le système à 3 niveaux représenté sur la Figure 2.1, et sous l'approximation d'une faible excitation laser à la longueur d'onde $\lambda_e$, l'intensité du signal de fluorescence I émis par une molécule fluorescente sous excitation est égal au produit du taux d'excitation $k_{\lambda_e}$ et du rendement quantique $\phi$ – Éq. (2.1.5). Le premier terme quantifie la probabilité de passer de l'état fondamental $S_0$ à l'état excité $S_1$, et est définit par l'Éq. (2.1.6). Il dépend de la section efficace d'absorption $\sigma_{abs}^{\lambda_e}$ (cm$^2$), qui correspond à la probabilité des photons incidents de longueur d'onde $\lambda_e$ d'être absorbés par le fluorophore; ainsi que du rapport entre l'irradiance d'excitation laser $L^{\lambda_e}$ (W/cm$^2$) et l'énergie $h\nu_e$ (J) des photons incidents. Cette section efficace $\sigma_{abs}^{\lambda_e}$ peut être déterminée à partir du coefficient d'extinction molaire $\varepsilon^{\lambda_e}$ (L/mol/cm) – cf. Éq. (2.1.7), où $N_A$ est le nombre d'Avogadro. Le rendement quantique $\phi$ correspond à la probabilité que la relaxation de la molécule excitée se fasse par recombinaison radiative plutôt que par un processus non radiatif. Sa définition formelle – Éq. (2.1.8) – est donc le rapport entre le taux de recombinaisons radiatives et la somme des taux de relaxation radiatives et non-radiatives, respectivement notés $k_r$ et $k_{nr}$. Le taux de recombinaisons non-radiatives $k_{nr}$ correspond à la probabilité de l'ensemble des processus CI et CIS définis en section précédente – cf. Éq. (2.1.9). Il est également possible d'expliciter $\phi$ en fonction de la durée de vie de fluorescence $\tau$, définie par l'Éq. (2.1.10). Ainsi les espèces chimiques à grand rendement quantique et forte extinction molaire seront toujours privilégiées en imagerie de fluorescence traditionnelle – e.g. la Rhodamine 6G, avec $\phi = 0,95$ et $\varepsilon_{max}^{530 \text{ nm}} = 115\,000$ L/mol/cm dans l'éthanol.

Comme expliqué durant la section précédente, les cycles absorption/émission peuvent être interrompus par le passage dans l'état triplet $T_1$. Plus l'irradiance d'excitation est élevée, plus le nombre de passages par $T_1$ augmente. L'état $T_1$ ayant une durée de vie plus longue, on observe alors un clignotement [110] de l'émission des fluorophores, comme illustré en Figure 2.3. Le peuplement de l'état triplet $T_1$ augmente la réactivité chimique des fluorophores, qui peuvent subir des transformations structurelles conduisant à la perte irréversibles de leurs propriétés d'émission [111] : on parle de photo-dégradation$^7$. Dans les cas les plus simples, cette dynamique s'exprime sous la forme d'un déclin exponentiel de la fluorescence $I(t)$ auquel on peut associer un temps caractéristique $\tau_{pd}$ dépendant de l'irradiance d'excitation et de la photo-stabilité du fluorophore concerné – cf. Éq. (2.1.11).

$$I = k_{\lambda_e} \phi \quad (2.1.5)$$

$$k_{\lambda_e} = \sigma_{abs}^{\lambda_e} \frac{L^{\lambda_e}}{h\nu_e} \quad (2.1.6)$$

$$\sigma_{abs}^{\lambda_e} = \frac{10^3 \ln(10)}{N_A} \varepsilon^{\lambda_e} \quad (2.1.7)$$

$$\phi = \frac{k_r}{k_r + k_{nr}} = k_r \tau \quad (2.1.8)$$

$$k_{nr} = k_{CI} + k_{CIS} \quad (2.1.9)$$

$$\tau = \frac{1}{k_r + k_{nr}} \quad (2.1.10)$$

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>FIGURE 2.3 – Allure générale d'un signal mesuré pour un émetteur unique en situation de clignotement puis photo-dégradé à $t = t_0$.</figcaption></figure>

$$I(t) = I(0) \cdot e^{-\frac{t}{\tau_{pd}}} \quad (2.1.11)$$

<footnote n="7">7. Dans la littérature, les termes *photo-degradation* ou *photobleaching* (photo-blanchiment) sont utilisés de manière interchangeable.</footnote>
## 2.2 TRANSFERT D'ÉNERGIE NON-RADIATIF DE TYPE FÖRS-TER

Une molécule fluorescente peut être approximée par un dipôle os-cillant [109, 112]. L'onde électromagnétique rayonnée par un tel dipôle contient plusieurs termes dont l'amplitude dépend de la distance. Ainsi, l'environnement de la molécule peut être découpé en 4 zones – cf. Figure 2.4 – à l'aide de la distance caractéristique *b* définie en Éq. (2.2.1); où λ (nm) est la longueur d'onde de l'émission de l'espèce chimique excitée et *n* l'indice de réfraction du milieu [112]. En règle générale, les valeurs de λ et *n* se situant respectivement dans les intervalles 300-800 nm et 1,3-1,6, la valeur de *b* vaut environ 100 nm.

Sur ces 4 zones, 2 sont particulièrement importantes ici : la zone de champ lointain (CL) et celle de champ proche (CP). Le rayonnement électromagnétique en champ lointain (far-field) peut éventuellement être ré-absorbé par un autre espèce chimique, ce qui correspond à un phénomène de transfert d'énergie radiatif : le transfert est médié par un photon. Si une espèce chimique compatible avec l'espèce excitée est présente dans la zone de champ-proche (near-field), un cou-plage dipôle-dipôle direct peut se produire sous certaines conditions. Un transfert d'énergie se fait alors sans photon : on parle de transfert non-radiatif. Ce régime spatial définit le domaine de validité de la théorie du FRET (Förster Resonance Energy Transfert), qui repose sur le couplage de dipôles ponctuels.

### 2.2.1 FRET : FORMALISME THÉORIQUE

#### 2.2.1.1 Développements historiques

La naissance de cette théorie a notamment pour trame l'effort de compréhension du phénomène de photosynthèse [109, 112]. Plusieurs observations avaient en effet suggéré, au début du XXe siècle, que les espèces chimiques excitées pouvaient transférer leur énergie autrement que par échange d'électron lors d'une collision, ou par formation de complexes entre espèces chimiques. Les solutions de fluorophores dans des solvants très visqueux ont été beaucoup utilisées, dans la mesure où elles permettaient l'étude de ces phénomènes *via* les modifications de polarisation de la lumière. Dans une solution visqueuse minimisant la rotation des espèces chimiques, on s'attend à ce que la polarisation de l'excitation lumineuse soit conservée lors de l'émission 8 ; et c'est bien ce qui est observé pour des solution diluées. Cependant, l'augmentation de la concentration donne lieu à une dépolarisation de l'émission. L'explication par transfert radiatif ne pouvait rendre compte des quantités de signal mesurées en raison du décalage de Stockes entre l'émission et l'absorption d'un même fluorophore. Les travaux effectués par Jean et Francis Perrin ont abouti à la proposition du concept de transfert non-radiatif, qui correspond à l'ouverture d'un processus de relaxation pour l'espèce chimique excitée (donneur) et d'un processus d'excitation pour l'espèce chimique à portée de transfert (accepteur) – cf. Figure 2.5.

$$b = \frac{\lambda}{2\pi n} \qquad (2.2.1)$$

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>FIGURE 2.4 – Schéma de l'espace autour d'un fluorophore excité pour $b = 100$ nm. Adapté de [112].</figcaption></figure>

(C) : zone de contact

(CP) : zone de champ proche

(I) : zone intermédiaire

(CL) : zone de champ lointain

<footnote n="8">8. L'excitation sélectionne une population d'émetteurs dans la bonne conformation spatiale.</footnote>
<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Cela a donné lieu à une première formalisation de la distance critique pour qu'un transfert non-radiatif ait lieu, notée $R_0$. Son expression est donnée par l'Éq. (2.2.2), où $\lambda$ est la longueur d'onde d'émission du fluorophore; $\langle t \rangle$ le temps moyen entre collisions des espèces chimiques, et $\tau_D$ la durée de vie du donneur. Plus précisément, $R_0$ correspond à la séparation spatiale entre donneur et accepteur où l'efficacité de transfert non-radiatif est de 50 %. Le travail de Théodore Förster s'inscrit à la suite de ces recherches. Sa publication initiale de 1946 – dont on peut trouver une traduction récente en langue anglaise [113] – en corrige un des postulats : les fluorophores impliqués, mêmes identiques, peuvent présenter des fréquences d'oscillation significativement différentes en raison des dispersions spectrales d'absorption et d'émission⁹. Il faut donc a minima corriger $R_0$ par le recouvrement réel des spectres, ce qui conduit à l'Éq. (2.2.3) ; où $\Omega$ représente la largeur des spectres d'absorption et d'émission et $\Omega'$ le recouvrement entre les deux spectres. Le rapport des 2 grandeurs représente ainsi la probabilité qu'un donneur et un accepteur oscillent à la même fréquence, condition de résonance du transfert d'énergie. La seconde contribution majeure de Förster réside dans la formalisation du taux de transfert $k_{FRET}$, permise par l'articulation de la théorie de l'efficacité de transfert par interaction coulombienne à diverses constantes et termes relativement simples. Ce résultat a permis les premiers tests expérimentaux de la dépendance en distance de ce phénomène de transfert, puis fait l'objet de diverses reformulations pour aboutir au formalisme actuel du FRET¹⁰.

### 2.2.1.2 Formalisations contemporaines du FRET

Le taux de transfert d'énergie non-radiatif $k_{FRET}$ est donné par l'Éq. (2.2.4), où $\kappa^2$ est le facteur d'orientation des dipôles moléculaires ; $\phi_D$ le rendement quantique du donneur ; $N_A$ le nombre d'Avogadro ($6,02 \times 10^{23} \text{ mol}^{-1}$) ; et $r$ la distance de séparation donneur-accepteur. La grandeur $\tau_D$ reste associée à la durée de vie du donneur, et $\overline{F_D}(\lambda)$ représente l'émission du donneur normalisée telle que $\int \overline{F_D} d\lambda = 1$ ; $\varepsilon_A(\lambda)$ le coefficient d'extinction molaire de l'accepteur (L/cm/mol).

FIGURE 2.5 – Transfert d'énergie non-radiatif entre 2 molécules.

Les lettres D et A identifient respectivement le donneur et l'accepteur. Les processus radiatifs sont représentés en traits pleins. Pour simplifier la lecture, seul le processus non-radiatif FRET est représenté, en pointillés.

$$R_0 = \frac{\lambda}{2\pi} \sqrt[6]{\frac{\langle t \rangle}{\tau_D}} \quad (2.2.2)$$

9. F. Perrin ne prenait en compte que la dispersion liée aux collisions entre molécules, ce qui a pour conséquence de sous-estimer la dépendance de l'efficacité de transfert à la distance donneur-accepteur.

$$R_0 = \frac{\lambda}{2\pi} \sqrt[6]{\frac{\Omega'}{\tau_D \Omega^2}} \quad (2.2.3)$$

10. Pour une revue de ces travaux, voir [112].

$$k_{FRET}(r) = \frac{9\ln(10)\kappa^2\phi_D}{128\pi^5 n^4 N_A r^6 \tau_D} \int \overline{F_D} \varepsilon_A \lambda^4 d\lambda \quad (2.2.4)$$
Cette relation peut être simplifiée, comme le montre l'Éq. (2.2.5), où la distance critique $R_0$, aussi nommée rayon de Förster, est reformulée à partir des différentes constantes – Éq. (2.2.6). La version proposée par l'Éq. (2.2.7) combine ces différentes constantes pour une expression aussi simplifiée que possible. Le terme $J(\lambda)$, défini en Éq. (2.2.8), représente l'intégrale de recouvrement spectral du donneur et de l'accepteur. Lorsque la longueur d'onde $\lambda$ est exprimée en nm, la valeur de $R_0$ est obtenue en Å. L'efficacité du phénomène de transfert, notée $E$, est définie par le poids relatif du taux de transfert $k_{FRET}$ par rapport à l'ensemble des taux de recombinaisons du donneur – cf. Éq. (2.2.9) – ce qui permet d'obtenir en Éq. (2.2.10) la relation reliant $E$ et $R_0$. Sur le plan empirique, cette efficacité de transfert peut être mesurée de 2 manières principales : via l'émission dite "sensibilisée" de l'accepteur – voir section 2.2.3.2 ; ou via la diminution du signal du donneur en présence de l'accepteur $I_D^{[DA]}$ par rapport au signal du donneur seul $I_D^{[D]}$ (quenching), selon la relation donnée en Éq. (2.2.11). Les grandes $I_i^j$ peuvent d'ailleurs être remplacées par les valeurs de durée de vie d'émission $\tau_i^j$ correspondantes, ce qui est la base de l'imagerie FRET à l'aide d'un dispositif FLIM.

### 2.2.1.3 Dépendances spatiale, spectrale et orientationnelle

#### (a) Influence de la distance donneur-accepteur

Dans le cas simple d'un couple donneur-accepteur, l'efficacité $E$ du FRET dépend de l'inverse de la distance $r$ à la puissance 6, selon l'Éq. (2.2.10), tracée Figure 2.6. Pour une valeur typique de ~5 nm pour $R_0$, l'efficacité du FRET devient très faible au-delà de 10 nm. La probabilité du FRET augmente rapidement en-dessous de 10 nm, ce qui fait de ce transfert d'énergie un indicateur de choix pour sonder des variations de distances dans le champ proche à partir d'une mesure en champ lointain. L'allure de $E$ et sa dérivée par rapport à $r$ montrent que $E$ varie notablement autour de $R_0$. Autrement dit, une étude FRET des variations de distances entre 2 espèces chimiques sera particulièrement sensible pour les distances proches de $R_0$.

Trois phénomènes peuvent affecter la dépendance spatiale de $E$ : la stœchiométrie des donneurs et accepteurs ; les configurations géométriques restreignant les degrés de liberté orientationnelle des espèces chimiques en jeu ; et la diffusion des accepteurs. Ce dernier cas n'est significatif que si la durée de vie de l'émission du donneur est bien plus longue que le temps de diffusion de l'accepteur dans le volume d'interaction. Dans le cas d'une variation de la stœchiométrie des donneurs et accepteurs, Clapp et al. [114] ont proposé et confirmé expérimentalement une variante de l'expression de l'efficacité de transfert, notée $E_{MA}$. Cette expression est donnée en Éq. (2.2.12), où $n^{A/D}$ représente le nombre d'accepteurs par donneur. La partie supérieure de la Figure 2.7 (a) schématise la modélisation sous-jacente et le graphe correspondant sur la Figure 2.7 (b) donne l'évolution de $E_{MA}$ en fonction de $n^{A/D}$. En ce qui concerne les configurations géométriques parti-

$$k_{FRET}(r) = \frac{1}{\tau_D} \left(\frac{R_0}{r}\right)^6 \quad (2.2.5)$$

$$R_0 = \sqrt[6]{\frac{9 \ln(10) \kappa^2 \phi_D}{128 \pi^5 n^4 N_A}} J(\lambda) \quad (2.2.6)$$

$$R_0^6 = 8,79 \cdot 10^{-5} \frac{\kappa^2 \phi_D}{n^4} J(\lambda) \quad (2.2.7)$$

$$J(\lambda) = \int \overline{F_D \varepsilon_A \lambda^4 d\lambda} \quad (2.2.8)$$

$$E = \frac{k_{FRET}}{k_{FRET} + k_r + k_{nr}} \quad (2.2.9)$$

$$E = \frac{R_0^6}{r^6 + R_0^6} \quad (2.2.10)$$

$$E = 1 - \frac{I_D^{[DA]}}{I_D^{[D]}} \quad (2.2.11)$$

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>FIGURE 2.6 – Évolution théorique de l'efficacité du FRET selon la distance, pour un couple donneur-accepteur.</figcaption></figure>

$$E_{MA} = \frac{R_0^6}{\frac{1}{n^{A/D}} r^6 + R_0^6} \quad (2.2.12)$$
culières, la dérivation analytique effectuée par Wolber & Hudson [115] pour le cas d'un donneur en présence d'un plan d'accepteurs est particulièrement importante. L'efficacité $E_{PA}$ correspondante est donnée par l'Éq. (2.2.13), où $\rho_A$ correspond à la densité d'accepteurs dans le plan considéré. Dans cette situation, l'efficacité du FRET dépend de l'inverse de $r$ à la puissance 4, ce qui conduit à un étalement de la courbe plus important que dans le cas d'une simple variation de la stœchiométrie donneurs-accepteurs, comme illustré dans la partie inférieure de la Figure 2.7 (b). Dans les 2 cas, l'augmentation du nombre d'accepteurs implique une augmentation de la portée du FRET.

$$E_{PA} = \frac{R_0^6}{\frac{1}{2\pi\rho_A}r^4 + R_0^6} \quad (2.2.13)$$

MA : Multiples Accepteurs

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

PA : Plan d'Accepteurs

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

(a)

(b)

(a) Lorsqu'un donneur (vert) peut se coupler avec plusieurs accepteurs (rouges) dans son volume d'interaction FRET, l'augmentation de l'efficacité $E$ qui en résulte peut être envisagée comme l'addition des influences des accepteurs individuels. La taille accrue de l'accepteur virtuel résultant représente la force de couplage améliorée. Dans le cas du plan d'accepteurs, la logique est identique mais la forme en "goutte" représente l'effet de la contribution d'accepteurs plus éloignés. (b) Variation de $E$ selon $n^{A/D}$ et $\rho_A$ sur l'intervalle 1-9. Dans le cas du plan d'accepteurs, la densité d'accepteurs est donnée sous la forme du nombre d'accepteurs 1-9 présents à la distance $R_0$.

### (b) Influence de l'intégrale de recouvrement spectral $J(\lambda)$

Le recouvrement spectral des 2 espèces chimiques donneur et accepteur est un autre paramètre particulièrement déterminant du FRET. Contrairement à ce que son nom laisse suggérer, l'intégrale de recouvrement spectral $J(\lambda)$ ne correspond pas strictement à l'intégrale du recouvrement entre le spectre d'émission du donneur et le spectre d'absorption de l'accepteur, illustré en Figure 2.8 (a). Comme en atteste sa définition formelle, donnée en Éq. (2.2.8), le terme $J(\lambda)$ dépend aussi à la puissance 4 de la longueur d'onde considérée sur l'intervalle de recouvrement. Les couples donneur-accepteur décalés vers le rouge présentent donc généralement des efficacités FRET plus élevées que ce

FIGURE 2.7 – Influence de la stœchiométrie des donneurs et accepteurs sur $E$. Adapté de [109].
que l'on pourrait attendre de leur seul strict recouvrement spectral. La Figure 2.8 (b) illustre la double évolution de $J(\lambda)$ selon le recouvrement, dont l'indicateur est ici la séparation (nm) des pics d'émission du donneur et d'absorption de l'accepteur ; et la longueur d'onde $\lambda$ (nm), représentée par le maximum d'émission du donneur.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>(a) Configuration spectrale favorable au FRET avec des QDs (donneur) et l'Alexa Fluor 647 (accepteur).</figcaption></figure>

(c) Contribution du facteur d'orientation $\kappa^2$

Pour qu'un transfert résonant puisse se produire, il ne suffit pas que les dipôles électroniques des espèces chimiques en présence oscillent à la même fréquence : l'orientation des moments dipolaires $\vec{\mu}_D$ (donneur) et $\vec{\mu}_A$ (accepteur) joue un grand rôle sur la force du couplage. Cet élément est pris en compte via le facteur $\kappa^2$ définit en Éq. (2.2.14) et (2.2.15), et illustré Figure 2.9. Le phénomène de FRET est maximisé lorsque les moments dipolaires des 2 espèces chimiques sont colinéaires ($\kappa^2 = 4$), et au contraire inexistant en cas d'orientation orthogonale ($\kappa^2 = 0$). Les orientations parallèles/anti-parallèles ($\kappa^2 = 1$) créent elles aussi des conditions bien moins optimales. Dans les expériences réalisées en solution, le postulat de liberté de mouvement et rotation des molécules permet de considérer $\kappa^2$ comme égal à $\frac{2}{3}$, valeur correspondant à la moyenne statistique des configurations possibles. Dans ce cas, il est impératif de contrôler la polarisation de l'émission des donneurs et accepteurs pour aboutir à une quantification rigoureuse des distances entre les 2 membres du couple FRET. En effet, $R_0$ varie de 7 % lorsque $\kappa^2$ varie de $\frac{2}{3}$ à 1, et de 26 % lorsque $\kappa^2$ varie de 1 à 4.

Si ce facteur est souvent vu comme une "nuisance" introduisant une incertitude sur l'évaluation de $R_0$, les travaux de Van der Meer [116] ont fourni une base sur laquelle s'appuyer pour au contraire mobiliser $\kappa^2$ de manière à étudier l'orientation et la rotation de molécules.

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>(b) Évolution de $J(\lambda)$ selon le recouvrement spectral strict et la longueur d'onde. Adapté de [109].</figcaption></figure>

<caption>FIGURE 2.8 – Illustration du recouvrement spectral et évolution théorique de $J(\lambda)$.</caption>

$$ \kappa = \vec{\mu}_D \cdot \vec{\mu}_A - 3(\vec{\mu}_D \cdot \vec{r})(\vec{\mu}_A \cdot \vec{r}) \quad (2.2.14) $$

$$ \kappa^2 = (\cos\vartheta_{DA} - 3 \cdot \cos\vartheta_D \cdot \cos\vartheta_A)^2 \quad (2.2.15) $$

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>FIGURE 2.9 – Schéma des angles entre moments dipolaires $\vec{\mu}_D$ (donneur) et $\vec{\mu}_A$ (accepteur), et valeurs remarquables du facteur d'orientation $\kappa^2$. Adapté de [109, 112].</figcaption></figure>
## 2.2.2 EXEMPLES D'IMAGERIE FRET EN BIOLOGIE

La très grande sélectivité spatiale du phénomène de FRET en fait un outil de choix pour étudier les structures et les interactions internavant en biologie. Les premières utilisations du FRET datent des années 1970 [117]. L'existence du phénomène étant essentiellement restreinte à l'intervalle 1-10 nm, cela permet de dépasser de très loin la résolution spatiale de la microscopie optique conventionnelle (~λ/2). Ses implémentations sont nombreuses : elles vont du marquage des éléments étudiés à des techniques d'amplification du signal [118, 119]. Nous nous contenterons ici de donner quelques exemples d'études FRET représentatives, avant de présenter l'originalité de la méthode d'imagerie NEF.

### 2.2.2.1 Co-localisation d'espèces biochimiques en 3D

Le FRET a ainsi été utilisé pour étudier et visualiser l'activité enzymatique de kinases [120], de protéases/peptidases [121-123], ou les dynamiques intercellulaires d'ions calcium $Ca^{2+}$ [124]. Dans ces situations, il n'est souvent pas nécessaire d'avoir accès à des mesures fines de distance entre les espèces chimiques du couple FRET : la présence ou non du transfert renseigne sur l'occurrence du phénomène étudié. Le couple donneur-accepteur sélectionné peut être utilisé sur 2 éléments marqués entrant en présence, comme lors de l'hybridation de brins d'ADN ou présent sur une même espèce, comme un peptide clivé par une enzyme – Figure 2.10. Il existe aussi des travaux où le calcul des distances entre les donneurs et accepteurs permet de sonder une force ou une tension à l'échelle moléculaire, dont une revue récente a été réalisée par Gayrard & Borghi [125]. Ces méthodes tentent de sonder les forces contractiles générées par le cytosquelette des cellules afin d'étudier l'adhésion cellule-substrat [126] ou l'adhésion intercellulaire [127].

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>FIGURE 2.10 – Exemples typiques de principes d'étude FRET par co-localisation sans mesure de distance.</figcaption></figure>

### 2.2.2.2 Imagerie NEF

Contrairement aux méthodes précédentes, l'imagerie NEF développée dans notre équipe depuis plus d'une dizaine d'année repose sur l'idée de fixer les donneurs de manière à sonder les interactions d'interface. Dans la publication initiale [5], la méthode utilisait une couche de boites quantiques immobilisées dans du PMMA¹¹. La molécule acceptrice pouvait diffuser librement en solution¹² ou être présente sur la membrane de cellules vivantes, permettant alors d'imager l'adhésion de cellules uniques sur un substrat, lors de la formation de points foveaux d'adhésion (FA). Comme je l'ai présenté dans le chapitre 1, cette approche a ensuite été poursuivie et il a été démontré qu'il était possible de mesurer des distances avec une précision nanométrique dans le cas de membranes supportées [6]. Les boites quantiques sont depuis liées au substrat sans matrice d'immobilisation¹³, ce qui ouvre la voie à leur biofonctionnalisation par des protéines promouvant l'adhésion cellulaire¹⁴.

11. Polyméthacrylate de méthyle acrylique.

12. Étudiée par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS).

13. Voir chapitre 4

14. Voir chapitres 5 et 6.
<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>FIGURE 2.11 – Principe et exemple d'imagerie NEF. Extrait et adapté de [5].</figcaption></figure>

(a) Illustre le principe d'illumination grand-champ donnant accès au signal caractéristique d'une adhésion focale.

(b) Superposition d'une image DIC (niveaux de gris) d'une cellule MCF-7 et du signal FRET de l'accepteur DiD marquant la membrane (rouge). Barre d'échelle : 10 µm.

### 2.2.3 ANALYSE QUANTITATIVE EN FRET

#### 2.2.3.1 Une problématique méthodologique fondamentale

L'étude des conditions dans lesquelles l'utilisation du FRET peut être prolongée d'une analyse proprement quantitative des distances entre donneurs et accepteurs relève d'un champ de recherche à part entière, car cela nécessite d'obtenir des valeurs fiables et précises de l'efficacité *E* du FRET. Pour une revue synthétique de l'étendue des méthodes étudiées il y a de cela 10 ans déjà, on peut se rapporter au travail de Zeug *et al.* [128].

Les méthodes basées sur la durée de vie de l'émission des donneurs¹⁵ sont reconnues comme quantitatives, tout en nécessitant une instrumentation et des calculs analytiques sophistiqués. Les méthodes basées sur l'intensité de l'émission elle-même impliquent des stratégies variées pour tenir compte de facteurs comme les différents bruits de fond. Les éléments apparaissant immédiatement comme critiques à prendre en compte sont : (a) le signal de débordement spectral des donneurs, collecté dans la fenêtre de détection des accepteurs ; et (b) l'excitation directe de l'accepteur à la longueur d'onde d'excitation des donneurs. Ces signaux doivent être déterminés pour que leurs contributions soient soustraites au signal détecté. Gordon *et al.* [130] avaient à ce titre formalisé en 1998 une normalisation nommée FRETN, passant par l'obtention d'un triplet d'images séparant : signal des donneurs ; signal FRET des accepteurs ; et signal des accepteurs seul, *via* une excitation de longueur d'onde adaptée¹⁶. Cependant, comme l'ont vite montré Xia *et al.* [133] en 2001, les valeurs de $E_{FRET}$ obtenues sont si dépendantes de la concentration des espèces chimiques en jeu que cette méthode est limitée à des configurations où les donneurs et accepteurs sont présents dans des concentrations comparables. Leur proposition de normalisation, $N_{FRET}$, reprend certains éléments de cette étude fondatrice, en particulier l'utilisation d'un triplet d'images adéquat, mais n'était cependant pas suffisante. Hochreiter *et al.* [134] ont notamment montré en 2019 que ces 2 normalisations échouaient à prédire un plateau de *E* lors d'une grande augmentation du ratio accepteur / donneur, et ont proposé leur propre méthode de normalisation : DFRET¹⁷.

15. Nous avons eu l'occasion d'évoquer ces dispositifs, dits FLIM (*Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy*) en partie 1.2.2.2. La publication de Thaler *et al.* [129] est un exemple d'application de ces méthodes dans le cadre d'expérimentations FRET.

16. Sous l'inspiration de Youvan *et al.* [131, 132], dont le *design* expérimental initial donnera son nom à cette famille de méthodologies, dites stratégies 3-cube.

17. Notons que les auteurs ont pris soin de rendre les procédures ImageJ, RS-tudio, et MS-Excel développées disponibles en accès libre :
https://github.com/BHochreiter.
De nombreuses méthodes différentes ont ainsi été proposées, avec chacune ses avantages et inconvénients¹⁸. Sur la base des équations données en section 2.2.1.2, il est en effet possible de dériver diverses méthodes d'obtention de E [135] selon que l'on sélectionne l'émission des donneurs ou des accepteurs¹⁹; selon que l'on procède à une analyse spectrale [136, 137]; que l'on réalise une comparaison avant/après photo-blanchiment d'une des espèces en jeu [138] ou en utilisant un standard de référence [139]; ou encore que l'on emploie plusieurs ex-citations laser [140]. Chaque équipe introduisant de plus ses propres notations pour leurs calculs de correction des bruits de fond, la comparaison directe de valeurs de E obtenues dans différents contextes expérimentaux devenait difficile, alors même que le champ d'étude des molécules uniques²⁰ montrait qu'une harmonisation des pratiques était tout à fait susceptible de produire des résultats consistants [141].

### 2.2.3.2 L'apport du cadre QuanTI-FRET

C'est dans ce contexte qu'il faut situer le travail de Coullomb et al. [142, 143]. L'objectif annoncé est de repartir des équations physiques pour déterminer l'origine du signal dans les 3 grandes configurations d'imagerie FRET, de manière à prendre en compte au mieux les artefacts photo-physiques; et de proposer une méthode expérimentale simple de calibration à même de déterminer aisément les facteurs de correction à appliquer. Cette méthode repose sur l'utilisation de 2 sources d'excitation – chacune spécifique au donneur et accepteur utilisé – et la séparation des signaux $I_i$ mesurés, via un jeu de filtres adéquats. Chacun de ces signaux est défini par le nombre de donneurs et d'accepteurs $n^D$ et $n^A$, l'efficacité du phénomène de FRET notée E, ainsi que les différents paramètres photo-physiques et instrumentaux mis en jeu – Éq. (2.2.16) à (2.2.18). $L_i/h\nu_i$ désigne le flux d'excitation à la longueur d'onde choisie pour l'excitation de l'émetteur i; $\sigma_i^j$ la section efficace d'absorption de j à la longueur d'onde d'excitation de i; $\phi_i$ le rendement quantique de i; et $\eta_i^j$ est l'efficacité de détection des photons émis par j dans la fenêtre de détection de i. Dans le détail, les images correspondant aux signaux à acquérir sont donc :

- $I_{AA}$ : le signal mesuré dans la fenêtre de détection de l'accepteur à la longueur d'onde d'excitation de l'accepteur – Éq. (2.2.16). On reconnait les composantes de la définition du signal de fluorescence en section 2.1.2.2, complétées par l'efficacité de détection $\eta_{Adet}^{Aem}$ du signal de l'accepteur dans sa fenêtre de détection dédiée.

- $I_{DD}$ : le signal mesuré dans la fenêtre de détection du donneur à la longueur d'onde d'excitation du donneur – Éq. (2.2.17). Cette équation est construite de la même manière que la relation définissant $I_{AA}$, en ajoutant la prise en compte du quenching du donneur par le facteur $(1-E)$.

- $I_{DA}$ : le signal mesuré dans la fenêtre de détection de l'accepteur à la longueur d'onde d'excitation du donneur – Éq. (2.2.18). Le 1er terme correspond au signal provenant effectivement du FRET. Le 2ème renvoie à la contribution du débordement spectral des donneurs

18. Amenant avec elles de nombreux sigles spécifiques :
    sFRET (Spectral FRET)
    APB (Acceptor Photo-Bleaching)
    lux-FRET (Linear-Unmixing FRET)
    etc.

19. Causant alors une variabilité des valeurs d'efficacité FRET obtenues pour une même expérience.

20. smFRET (Single-Molecule FRET).

$$I_{AA} = n^A \cdot \frac{L_A}{h\nu_A} \cdot \sigma_{Aex}^A \cdot \phi_A \cdot \eta_{Adet}^{Aem} \quad (2.2.16)$$

$$I_{DD} = n^D \cdot \frac{L_D}{h\nu_D} \cdot \sigma_{Dex}^D \cdot (1-E) \cdot \phi_D \cdot \eta_{Det}^{Dem} \quad (2.2.17)$$

$$ \begin{aligned} I_{DA} = & n^D \cdot \frac{L_D}{h\nu_D} \cdot \sigma_{Dex}^D \cdot E \cdot \phi_A \cdot \eta_{Adet}^{Aem} \\ & + n^D \cdot \frac{L_D}{h\nu_D} \cdot \sigma_{Dex}^D \cdot (1-E) \cdot \phi_D \cdot \eta_{Adet}^{Dem} \\ & + n^A \cdot \frac{L_A}{h\nu_A} \cdot \sigma_{Aex}^A \cdot \phi_A \cdot \eta_{Adet}^{Aem} \end{aligned} \quad (2.2.18) $$
dans la fenêtre de détection de l'accepteur (*bleedthrough*, ou *BT*), et le 3ème terme correspond à la contribution de l'excitation directe de l'accepteur à la longueur d'onde d'excitation du donneur (*direct excitation*, ou *DE*).

Revenir à ces définitions permet alors aux auteurs·ice·s de définir formellement les facteurs de correction :

— $\alpha^{BT}$ : la proportion de *BT* des donneurs dans la fenêtre de détection de l'accepteur – Éq. (2.2.19).

— $\delta^{DE}$ : la proportion de *DE* des accepteurs à la longueur d'onde d'excitation du donneur – Éq. (2.2.20).

— $\gamma^M$ : quantifiant la différence d'efficacité de détection entre les fenêtres de détection utilisées – Éq. (2.2.21).

— $\beta^X$ : la différence d'efficacité d'excitation concernant les canaux d'excitation utilisés – Éq. (2.2.22).

En définissant le signal $I_{DA}^{corr}$ obtenu après prise en compte des corrections de *diaphotie* entre les signaux (*crosstalk* corrections, ou bruits de fond) avec l'Éq. (2.2.23), ainsi que la stœchiométrie *S* des fluorophores présents dans chaque pixel d'une image de l'échantillon en Éq. (2.2.24), il devient possible d'obtenir *in fine* 2 équations maîtresses pour *E* et *S* – cf. Éq. (2.2.25) et (2.2.26). L'efficacité *E* est ici définie de manière *phénoménologique*, i.e. sans modèle physique sous-jacent du FRET : on peut, dans un second temps, remonter à des distances en choisissant la modélisation la plus appropriée par rapport à la situation expérimentale.

Si les facteurs de correction $\alpha^{BT}$ et $\delta^{DE}$ ne nécessitent respectivement que d'imager les situations de donneur seul et d'accepteur seul, il est généralement plus compliqué de déterminer les paramètres $\gamma^M$ et $\beta^X$. En effet, le rendement quantique $\phi$ ainsi que la section efficace d'absorption $\sigma$ dépendent fortement de l'environnement des émetteurs, d'autant plus si ces derniers sont au voisinage immédiat d'une interface. L'originalité du travail de Coullomb *et al.* réside dans la démonstration d'une méthode de calibration simple nécessitant uniquement un échantillon de stœchiométrie *S* connue et de distance entre donneur et accepteur fixée. Cette calibration peut être vérifiée en traçant un histogramme 2D de *S* en fonction de $E^{21}$. Après une "bonne" calibration, il est alors même possible d'imager la stœchiométrie *S*, de manière à interpréter plus finement les potentielles variations de l'efficacité du FRET lors d'une étude par imagerie.

Nous avons présenté le phénomène de FRET depuis ses formalisations théoriques jusqu'aux applications récentes, notamment en imagerie. La seconde partie de ce chapitre sera dédiée à la présentation du dispositif d'imagerie utilisé dans ce projet doctoral.

$$ \alpha^{BT} = \frac{\eta_{Det}^{Dem}}{\eta_{Det}^{Dem}} = \frac{I_{DA}^{[D \text{ isolé}]} I_{DD}^{[D \text{ isolé}]} I_{DD}^{[D \text{ isolé}]} I_{DA}^{[D \text{ isolé}]} \quad (2.2.19)} $$

$$ \delta^{DE} = \frac{\frac{L_D}{h\nu_D} \cdot \sigma_{Ddex}^A}{\frac{L_A}{h\nu_A} \cdot \sigma_{Aex}^A} = \frac{I_{DA}^{[A \text{ isolé}]} I_{AA}^{[A \text{ isolé}]} \quad (2.2.20)} $$

$$ \gamma^M = \frac{\phi_A \cdot \eta_{Det}^{Aem}}{\phi_D \cdot \eta_{Det}^{Dem}} \quad (2.2.21) $$

$$ \beta^X = \frac{\frac{L_A}{h\nu_A} \cdot \sigma_{Adex}^A}{\frac{L_D}{h\nu_D} \cdot \sigma_{Ddex}^D} \quad (2.2.22) $$

$$ I_{DA}^{corr} = I_{DA} - \alpha^{BT} I_{DD} - \delta^{DE} I_{AA} \quad (2.2.23) $$

$$ S = \frac{n^D}{n^D + n^A} \quad (2.2.24) $$

$$ E = \frac{I_{DA}^{corr}}{\gamma^M I_{DD} + I_{DA}^{corr}} \quad (2.2.25) $$

$$ S = \frac{\gamma^M I_{DD} + I_{DA}^{corr}}{\gamma^M I_{DD} + I_{DA}^{corr} + \frac{I_{AA}}{\beta^X}} \quad (2.2.26) $$

21. Les grandeurs *E* et *S* n'étant pas corrélées sur une échantillon où *S* est fixé, les nuages de points obtenus avec un tel histogramme 2D doivent être quasi parfaitement horizontaux. La présence d'une corrélation entre *E* et *S* indique au contraire une mauvaise détermination de $\gamma^M$ et $\beta^X$.
## 2.3 IMAGERIE DE FLUORESCENCE GRAND-CHAMP

### 2.3.1 IMAGERIE EN ÉPIFLUORESCENCE

#### 2.3.1.1 Généralités sur la microscopie

Un microscope a pour fonction essentielle de réaliser l'image agrandie d'un échantillon sur un photo-détecteur : le plus souvent, une caméra CCD, EMCCD, ou CMOS. La Figure 2.12 présente les éléments de base nécessaires pour enregistrer ce type d'images. L'objectif est un composant optique constitué d'un agencement de plusieurs lentilles qui sert à collecter le signal provenant de l'échantillon. Lorsque l'on fait la mise au point, on déplace l'objectif de manière à conjuguer le plan de l'échantillon avec celui du photo-détecteur. À la sortie de l'objectif, l'image de l'échantillon est projetée à l'infini. Pour produire une image dans le plan de la caméra, il faut donc utiliser une lentille convergente, appelée lentille de tube, de focale $f_{LT}$. En microscopie optique classique, l'échantillon est illuminé en transmission : on parle de diascopie. En microscopie de fluorescence, le chemin d'excitation passe par l'objectif, ce qui correspond à une configuration en épiscopie (épifluorescence). Cette approche en réflexion requiert l'introduction d'une lame réfléchissante ou d'un miroir dichroïque entre l'objectif et la lentille de tube, de manière à séparer l'illumination du signal de l'échantillon²².

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>FIGURE 2.12 – Schéma général d'un microscope optique.</figcaption></figure>

#### 2.3.1.2 Paramètres instrumentaux et résolution

Le grandissement *G*, défini en Éq. (2.3.1), quantifie le rapport entre la taille de l'image A'B' produite sur la caméra et celle de l'objet AB dans le plan de l'échantillon. L'ouverture numérique ON de l'objectif est définie en Éq. (2.3.2), où $\theta_{max}$ est l'angle maximum de collection de la lumière et *n* l'indice de réfraction du milieu entre l'objectif et l'échantillon. Ces grandeurs, ON et $\theta_{max}$, sont utilisées pour déterminer la limite de résolution latérale $\Delta r$ et axiale $\Delta z$ de l'objectif – cf. Éq. (2.3.3) et Éq. (2.3.4), où $\lambda_{em}$ est la longueur d'onde émise par l'échantillon. La résolution, ici donnée selon le critère de Rayleigh, définit la distance de séparation limite à partir de laquelle 2 objets ponctuels proches ne peuvent plus être distingués sur l'image en raison du phénomène de diffraction de la lumière. Lorsque l'on illumine un objet ponctuel dans un échantillon, son image est limitée par diffraction – Figure 2.13 (a). La distribution 3D d'une telle image est nommée fonction d'étalement du point, ou PSF²³. La Figure 2.13 (b) illustre le phénomène de superposition des PSF lorsque la distance de séparation $\Delta r$ entre 2 objets ponctuels devient trop faible pour les distinguer. Pour augmenter les capacités de résolution en microscopie de fluorescence, le moyen le plus évident consiste à augmenter le plus possible l'ouverture numérique ON. Pour cela, on utilise des objectifs à immersion à eau ou à huile, ce qui permet d'augmenter l'indice de réfraction *n* du milieu entre l'objectif et l'échantillon. On peut ainsi atteindre aisément ON = 1,4.

22. Notre dispositif optique, décrit en Figure 2.15 illustre ce type de montage.

$$G = \frac{A'B'}{AB} \qquad (2.3.1)$$

$$ON = n \cdot \sin\theta_{max} \qquad (2.3.2)$$

$$\Delta r = 1,22 \frac{\lambda_{em}}{2ON} \qquad (2.3.3)$$

$$\Delta z = \frac{\lambda_{em}}{n(1 - \cos\theta_{max})} \qquad (2.3.4)$$

23. Point Spread Function.
<figure><img src="image_54.png" /></figure>

(a) La distance *d* sur le profil d'intensité représente la distance entre le maximum de signal et le premier minimum.

(b) Les représentations graphiques des PSF sont extraites de [109]. (c) PSF (x,z) de la figure de diffraction en échelle log, calculée pour un objectif d'ON = 1,2 sous illumination à λ = 488 nm dans l'eau.

La microscopie d'épifluorescence présente toutefois un inconvénient majeur lorsque l'on souhaite imager des phénomènes d'interface entre une cellule et son substrat, car l'ensemble de la cellule est illuminée. Aucune sélection axiale n'est réalisée : tout le corps cellulaire est donc irradié et la caméra collecte un signal hors focus important, qui induit un très mauvais rapport signal sur bruit.

FIGURE 2.13 – Limite de résolution latérale à partir du critère de Rayleigh. Inspiré de [20].

## 2.3.2 PRINCIPES DE L'IMAGERIE TIRF

Une manière de minimiser le problème posé en fin de section précé-
dente est de recourir à une illumination de l'échantillon par réflection
totale interne, comme introduit par Axelrod [71] en 1981. Le principe
de cette méthode, qu'on nomme configuration TIRF 24, est illustré Fi-
gure 2.14. La différence d'indice de réfraction entre le verre et le milieu
d'observation aqueux 25 induit l'existence d'un angle critique θ_c au-delà
duquel il y a réflexion totale interne dans le verre. Si l'angle d'incidence
θ_i est supérieur ou égal à l'angle critique θ_c, défini en Éq. (2.3.5), alors
le faisceau est totalement réfléchi dans le milieu le plus réfringent – ici,
le verre, cf. Figure 2.14 (a). Une onde électromagnétique évanescente
existe alors dans le milieu de faible indice, Figure 2.14 (b). Son intensité
est donnée par la relation en Éq. (2.3.6), où la grandeur κ représente la
distance d'atténuation – parfois nommée profondeur de pénétration –
de l'onde évanescente. Cette dernière, définie par l'Éq. (2.3.7) pour θ ≥
θ_c, prend des valeurs typiques de l'ordre de 100-200 nm dans le visible.
Ainsi, à l'aide des ondes évanescentes, l'illumination de l'échantillon
devient quasiment négligeable au-delà de quelques centaines de nm
au-dessus de l'interface. Comme l'illustrent les Figures 2.14 (c) et (d),
cela a pour conséquence que seuls les fluorophores présents sur la par-
tie ventrale d'une cellule seront excités, minimisant ainsi à la source le
bruit issu de l'illumination de fluorophores hors focus 26.

24. *Total Internal Reflection Fluorescence.*

25. Dans notre cas, à 458 nm :
$n_v \sim 1,533$
$n_m \sim 1,338$

$$
\theta_c = \arcsin \frac{n_m}{n_v} \qquad (2.3.5)
$$

$$
I(z) = I_0 \cdot e^{-\frac{z}{\kappa}} \qquad (2.3.6)
$$

$$
\kappa(\theta) = \frac{\lambda}{4\pi} \frac{1}{\sqrt{n_v^2 \sin^2(\theta) - n_m^2}} \quad (2.3.7)
$$

26. Ce qui optimise le contraste des images au niveau de l'interface, et augmenté très significativement le rapport signal sur bruit.
<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>(a) Réflection totale interne lorsque $\theta_i \ge \theta_c$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>(c) Épifluorescence $\theta_i = 0$</figcaption></figure>

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>(b) Onde évanescente</figcaption></figure>

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>(d) TIRF $\theta_i \ge \theta_c$</figcaption></figure>

Nous avons présenté quelques contributions de l'imagerie TIRF à l'étude de l'adhésion cellulaire au chapitre précédent. En imagerie NEF, on utilise aussi ce type d'illumination, de manière à confiner l'excitation de l'échantillon au voisinage immédiat sur l'interface verre/eau, préservant ainsi le corps cellulaire de toute photo-dégradation.

FIGURE 2.14 – Comparaison des méthodes d'illumination Épifluorescence et TIRF. Les angles $\theta_c$, $\theta_i$, $\theta_r$, $\theta_t$ désignent respectivement les angles critique, incident, réfléchi, transmis. Inspiré de [20].

## 2.4 MONTAGE EXPÉRIMENTAL

### 2.4.1 DESCRIPTION DU MONTAGE

Il existe différents montages optiques permettant de faire de l'imagerie TIRF, résumés dans la référence [20]. Dans le cadre de ce projet doctoral, j'ai mis en œuvre un montage optique qui intègre les impératifs suivants : adaptabilité aux dispositifs commerciaux existants; prise en main rapide pour n'importe quelle personne utilisant un microscope de façon récurrente. C'est pourquoi la base de notre dispositif expérimental repose sur un microscope commercial²⁷ dont le bâti n'est modifié qu'à la marge, et complémenté par un montage extérieur sur table optique, employant les composants les plus simples possibles. Le schéma du montage final que nous avons développé est détaillé sur la Figure 2.15. On peut y distinguer 4 parties fonctionnelles, qui sont expliquées dans les sections suivantes.

27. Microscope inversé Zeiss Axio Observer D1.

#### 2.4.1.1 Voies d'excitation et polarisation

Deux sources laser sont utilisées dans le montage, de longueur d'onde $\lambda = 458$ nm pour l'excitation des boites quantiques (donneuses FRET), et 633 nm pour l'excitation directe des molécules acceptrices²⁸. Afin de minimiser les fluctuations de pointé, les lasers fonctionnent toujours au maximum de leur puissance et l'on contrôle l'irradiance au niveau

28. Références respectives : Sapphire 458-50 CW CDRH 50 mW, Coherent et HNL150-EC, 35 mW, Thorlabs.
des échantillons par un jeu de filtres neutres absorbants – définis par leur densité optique DO – placé juste après les lasers sur le chemin optique.

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Chaque faisceau passe ensuite à travers un polariseur de Glan-Taylor noté $P_{GT}$, dont le principe est schématisé sur la Figure 2.16 (a). Constitué de 2 prismes triangulaires joints, ce composant sert à définir la polarisation des faisceaux laser le plus parfaitement possible. Une lame demi-onde, notée $\lambda/2$, permet d'ajuster la polarisation du faisceau afin de se placer en polarisation *s* sur l'échantillon, tel qu'explicité en Figure 2.16 (b). Il reste néanmoins une faible composante du faisceau non polarisée *s* car l'émission laser ne se réduit pas au mode fondamental TEM$_{00}$. L'élimination des modes résiduels – TEM$_{01}$, TEM$_{10}$, et TEM$_{11}$, etc. – nécessite la mise en place d'un filtrage spatial, qui permet également d'obtenir un profil gaussien d'illumination homogène.

FIGURE 2.15 – Schéma général du montage optique. Seul le laser à 458 nm est représenté sur le chemin optique partagé par les 2 lasers (après le *pinhole*).

$P_{GT}$ : Polarisateur de Glan-Taylor (Thorlabs)

DO : Jeu de densités optiques

$\lambda/2$ : Lame demi-onde (Thorlabs)

$L_{ir}$ et $L_{er}$ : Lentilles convergentes de focales $f_{ir}$ et $f_{er}$ = 19 et 40 mm

$DM_C$ : Dichroïque Di63-R488-t3

$L_i$ et $L_e$ : Lentilles convergentes de focales $f_i$ et $f_e$ = 25 et 300 mm

pinhole = 15 µm

$D_{ia}$ : Diaphragme réglable

$P_{Rot}$ : Platine de rotation PRS-110, PI miCos, Résolution $2 \cdot 10^{-5}$°

$L_T$ : Lentille de tube, $f_T$ = 300 mm

$DM_B$ : Dichroïque Di03-R473-t3

$DM_R$ : Dichroïque Di03-R635-t3

BFP : Plan focal arrière de l'objectif

Objectif : Zeiss αPlan-Apochromat À huile ; x 63 ; ON = 1,46

$F_D$ et $F_A$ : Jeux de filtres, voir 2.4.1.4

$M_{Am}$ : Miroir amovible

$L_{TM}$ : Lentille de tube du microscope de focale $f_{TM}$ = 164,5 mm

$F_S$ : Passe haut BLP01-488R-25

$L_S$ : Lentille convergente

$f_T$ = 30 mm
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>(a) Polariseur de Glan-Taylor.</figcaption></figure>

<caption>(b) Incidence sur l'échantillon.</caption>

FIGURE 2.16 – Principe du polariseur de Glan-Taylor.

(a) Le gap d'air permet la réflection de la lumière polarisée *s* et la transmission de la lumière polarisée *p* par rapport au plan du polariseur.

(b) Cette lumière arrive polarisée *s* par rapport au plan de l'échantillon et son orientation ne varie donc pas avec l'angle d'incidence, contrairement à la lumière qui arriverait polarisée *p* par rapport au plan de l'échantillon.

### 2.4.1.2 Largeur des faisceaux laser et filtrage spatial

Tout d'abord, notons que le champ d'observation final sur l'échantillon est directement lié à la largeur *D* du faisceau laser<sup>29</sup> : il sera d'autant plus grand que le faisceau est étendu. Pour cela, on utilise un jeu de 2 lentilles convergentes<sup>30</sup> montées dans un système afocal<sup>31</sup>. Elles sont disposées de manière à ce que la focale image $F'_i$ de la première lentille $L_i$ corresponde au point focal objet $F_e$ de la seconde – Figure 2.17. Ainsi, le faisceau émergent est collimaté, et sa taille $D_e$ est définie par le rapport de focale – Éq. (2.4.1). Le filtrage spatial est réalisé en introduisant un *pinhole* en $F'_i$. Au premier niveau, le choix du *pinhole* répond à un critère simple : sa taille doit être proche de celle d'un spot limité par diffraction produit à travers $L_i$.

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

La taille $D_s$ d'un tel spot dépend de la longueur d'onde incidente $\lambda_i$, de la focale de la lentille $L_i$, et la taille du faisceau laser incident $D_i$ – Éq. 2.4.2. Cette dernière est donnée par le waist $\omega$. La détermination expérimentale de $\omega$ a été faite via la "méthode du cou-teau". Il s'agit de mesurer l'évolution de la puissance laser<sup>32</sup> au fur et à mesure de l'obstruction du faisceau incident à l'aide d'une lame de rasoir placée dans le front d'onde. La lame est installée sur une pla-tine de translation micrométrique pour contrôler finement sa position. En dérivant numériquement la courbe obtenue, on remonte au profil gaussien de l'intensité du faisceau, qu'il est possible de fitter à l'aide de l'Éq. (2.4.3) afin d'en extraire la valeur de $\omega$. La Figure 2.18 donne les résultats de mes mesures.

29. Défini par l'ouverture du diaphragme $D_{ia}$ Figure 2.15.

30. Communément appelé "Étendeur de faisceau" / *Beam Expander*.

31. Par définition, un système optique afocal conserve la paralléléité des rayons lumineux.

$$D_e = \frac{f_e}{f_i} D_i \quad (2.4.1)$$

FIGURE 2.17 – Schéma de principe d'un étendeur de faisceau réalisé à partir de 2 lentilles convergentes.

$$D_s \approx 1,22 \frac{\lambda_i f_i}{D_i} \quad (2.4.2)$$

32. PM100A, Thorlabs, Sonde : S120VC, 200-1100 nm, 50 mW.

$$I(x) = I_0 e^{-\frac{2(x-x_0)^2}{\omega^2}} \quad (2.4.3)$$
<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>FIGURE 2.18 – Mesure du waist par la "méthode du couteau".</figcaption></figure>

L'illumination à 458 nm étant notre mode d'excitation principal, ce laser sert de référence pour le choix du couple de lentilles et du pinhole afin de permettre un bon filtrage sans pour autant perdre trop de puissance. Après plusieurs essais, nous avons sélectionné une lentille $L_i$ de distance focale $f_i = 25$ mm et un pinhole de 15 µm de diamètre. La valeur de $\omega$ déterminée pour cette lentille prédit $D_s(458 \text{ nm}) \approx 20$ µm et $D_s(633 \text{ nm}) \approx 24$ µm. Empiriquement, on obtient un bon filtrage à 458 nm au prix d'une perte raisonnable de 12,8 % du signal. Dans ces conditions, la perte à 633 nm s'élève, elle, à 33 %, ce qui nous a conduit à installer un étendeur de faisceau³³ en amont de la lame dichroïque $DM_C$ combinant les chemins optiques des 2 lasers. Cette extension conduit le faisceau à être plus focalisé par la lentille $L_i$ et plus compatible avec le pinhole sélectionné. De fait, la perte de signal mesurée à 633 nm n'était plus que de 12,5 % après cet ajout. Enfin, à la suite de la lentille $L_e$ collimatant les faisceaux, le diaphragme $D_{ia}$ positionné juste après permet de finaliser le filtrage spatial, en ne laissant passer que le disque central du motif de diffraction – la partie centrale de la tâche d'Airy.

### 2.4.1.3 Inclinaison des faisceaux et conjugaison des plans

Une fois les faisceaux filtrés et collimatés, ils arrivent sur la partie critique du montage TIRF : le miroir d'inclinaison qui permet de contrôler l'angle $\theta$ du faisceau sur l'échantillon. Ce dernier est monté sur une platine de rotation motorisée, notée $P_{Rot}$ sur la Figure 2.19, placée avant l'entrée du bâti du microscope. Le tilt, ou inclinaison du miroir, est noté $\alpha$. Pour éviter toute distorsion du champ d'illumination lors de la variation de l'angle $\alpha$ et donc de $\theta$, il faut que le plan pivot du miroir d'inclinaison soit parfaitement conjugué avec le plan de l'échantillon. Aussi l'ensemble des 3 grands miroirs permettant l'alignement précis du faisceau avec la lentille de tube $L_T$ sont montés sur une plateforme équipée de platines de translation micrométriques pour chaque miroir, de manière à parfaire leur positionnement respectif. Il faut de plus noter que les lames dichroïques ³⁴ $DM_B$ et $DM_R$ sont collées sur leur support dans la tourelle interne du

33. Jeu de lentilles sélectionné :

$f(L_{ir}) = 19 \text{ mm}$

$f(L_{ir}) = 40 \text{ mm}$

L'élargissement de 2,1 implique une nouvelle valeur prédite pour $D_s(633 \text{ nm}) \approx 12 \text{ µm}$

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>FIGURE 2.19 – Arrivée des faisceaux d'excitation sur le microscope. La lentille de tube $L_T$ focalise le faisceau incident sur le plan focal arrière de l'objectif (BFP). Elle est orientée de façon à pré-compenser les aberrations sphériques.</figcaption></figure>

34. Via données Semrock :

$DM_B - B$ pour Bleu

Réflex. $\ge 94 \%$ 457,9-478,0 nm

Transm. $\ge 93 \%$ 486,6-1200 nm

$DM_R - R$ pour Rouge

Réflex. $\ge 94 \%$ 632,8-641,7 nm

Transm. $\ge 93 \%$ 658,8-1200 nm
microscope, afin d'éviter leur déformation – malgré le fait qu'il s'agisse de lames de 3 mm d'épaisseur. L'ajustement de la position des 3 miroirs d'entrée avant la lentille de tube $L_T$ doit ainsi être optimisé afin de précisément ajuster la conjugaison entre le plan pivot du miroir et celui de l'échantillon. Après les différents aller-retours d'alignement et ajustement, le décalage angulaire résiduel constaté était de -0.28°, par rapport à un enchaînement parfait de miroirs à 45° les uns des autres jusqu'à l'échantillon.

### 2.4.1.4 Détection du signal

Le signal est collecté par le même objectif qu'utilisé pour générer les ondes évanescentes. Selon le positionnement du miroir $M_{Am}$, ce signal est transmis : soit (a) à un spectromètre UV-visible³⁵ installé sur la table optique ; soit (b) à une caméra CMOS³⁶ à travers la lentille de tube $L_{TM}$ du microscope. Dans le cas (a), le signal est filtré en $F_S$³⁷ et les jeux de filtres $F_D$ et $F_A$ sont absents. La lentille $L_S$, par son choix de distance focale de 30 mm, permet de focaliser le signal sur une fibre optique³⁸ de 105 µm de cœur, ce qui correspond à une zone de détection de 11,5 µm de diamètre. Dans le cas (b) on souhaite pouvoir créer 2 fenêtres de détection³⁹ bien distinctes pour imager séparément le signal des QDs, donneuses FRET ($I_{DD}$), de celui des molécules acceptrices, qu'elles soient imagées via leur signal en FRET ($I_{DA}$) ou à leur longueur d'onde d'excitation "naturelle" ($I_{AA}$). Pour cela, on introduit 2 jeux de filtres bien choisis, que l'on note $F_D$ pour la fenêtre de détection du donneur FRET, et $F_A$ pour la fenêtre de détection de l'accepteur.

### 2.4.2 CARACTÉRISATION DU DISPOSITIF TIRF

#### 2.4.2.1 Irradiance laser

Pour déterminer l'irradiance laser sur l'échantillon, il faut en premier lieu évaluer le waist des faisceaux à 458 et 633 nm sur l'échantillon. Pour caractériser le faisceau à 458 nm, nous avons utilisé une lamelle fonctionnalisée par une monocouche de QDs. En ce qui concerne le faisceau à 633 nm, il s'agit d'une lamelle recouverte par de l'Alexa Fluor 647. La Figure 2.21 synthétise les différents aspects de cette caractérisation. Les images acquises en épifluorescence et en TIRF, pour les 2 sources d'illumination, peuvent faire l'objet d'un fit avec une fonction gaussienne 2D – cf. Éq. (2.4.4) – ce qui donne accès à la valeur du waist latéral W de l'illumination. L'intensité laser est déterminée avec la même sonde que celle utilisée pour la méthode du couteau en section 2.4.1.2. Dans cette situation, la sonde est positionnée au-dessus de l'échantillon installé sur le microscope, et le jeu de filtres neutres absorbants permet de modifier l'intensité incidente. La Figure 2.22 synthétise donc l'évolution de l'irradiance laser à 458 nm et 633 nm en fonction des densités optiques installées sur le montage.

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>FIGURE 2.20 – Collection du signal</figcaption></figure>

35. USB2000+, Ocean Optics

36. Orca Flash 4.0, C11440, Hamamastu

37. Via données Semrock : 
Filtre spectromètre $F_S$ 
Passe haut pour éliminer le résidu d'excitation laser à 458 nm 
BLP01-488R-25 
Transm. $\ge$ 93 % 504,7–900 nm

38. AFS105/125Y, Thorlabs 
$D_{coeur}$ = 105 µm $\pm$ 2 % 
$D_{cladding}$ = 125 µm +1/-3 µm

39. Via données Semrock : 
Filtrage donneur $F_D$ 
Passe-haut pour éliminer le résidu d'excitation laser à 458 nm 
LP02-473RS-25 
Transm. $\ge$ 93 % 483,9–1066,9 nm 
Passe-bande pour sélectionner l'émission des QDs. Deux choix possibles selon le pic d'émission : 
FF01-590/20-25 
Transm. $\ge$ 93 % 580–600 nm 
FF01-600/14-25 
Transm. $\ge$ 93 % 593–607 nm 
Filtrage accepteur $F_A$ 
Passe-haut pour éliminer le résidu d'excitation laser à 633 nm 
BLP01-635R-25 
Transm. $\ge$ 93 % 660–1200 nm 
Passe-bande pour sélectionner l'émission des molécules acceptrices 
FF01-684/24-25 
Transm. $\ge$ 93 % 672–696 nm

$$I(x) = I_0 e^{\frac{(x - x_0)^2 + (y - y_0)^2}{W^2}} \quad (2.4.4)$$
<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>FIGURE 2.21 – Caractérisation du champ d’illumination à 458 et 633 nm.</figcaption></figure>

On peut tout d'abord remarquer que le passage du mode épifluorescence au mode TIRF décale légèrement la position latérale du maximum d'intensité d'excitation, en particulier à 633 nm. De même, le *waist* du champ d'illumination diminue dans les 2 cas.

Pour déterminer l'irradiance laser, nous travaillons avec les valeurs de *waist* obtenues en TIRF, soit $767,99 \pm 0,03$ px (458 nm) et $1596 \pm 0,11$ px (633 nm).

Après mesure, la taille de nos pixels vaut 98,73 ± 0,99 nm.

Les valeurs de *waist* sont donc, en raison de la propagation des incertitudes : 75,8 ± 0,8 µm (458 nm) et 157,6 ± 1,6 µm (633 nm).

### 2.4.2.2 Calibration de l'angle d'incidence en TIRF

Pour déterminer de façon fiable la relation de grandissement entre l'angle $\alpha$, que l'on contrôle avec la platine de rotation $P_{Rot}$, et l'angle $\theta$ sur l'échantillon, une méthode de calibration a été mise au point par l'équipe [144]. Elle est adaptée à tous les montages TIRF sans prisme. La procédure nécessite de modifier temporairement le montage en remplaçant le spectromètre, la fibre optique et la lentille $L_S$ par une caméra 40 et une lentille de distance focale 150 mm, selon un montage "4f". Cela nous permet d'imager sur cette caméra le plan focal arrière de l'objectif noté BFP 41. Comme on peut le constater sur la Figure 2.23, on peut y distinguer 2 régions : (a) l'émission sous-critique, notée UAF 42, qui correspond au disque central ; et (b) l'émission super-critique (SAF) 43, l'anneau brillant périphérique. Son épaisseur définit le domaine de fonctionnement de l'imagerie TIRF, comprenant tous les angles compris entre $\theta_c$ et $\theta_{max}$. Il dépend des indices de réfraction $n_s$ du substrat et $n_m$ du milieu d'observation, ainsi que de l'ouverture numérique ON de l'objectif. L'intensité et l'allure du signal SAF dépend aussi de la distance entre les émetteurs et la surface, ainsi que de leur diagramme de rayonnement, ce qui peut être exploité pour des mesures de distance cellule-substrat [145-147].

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>FIGURE 2.22 – Caractérisation de l'irradiance laser sur l'échantillon pour les 2 sources laser d'excitation.</figcaption></figure>

40. VS92-M-S, Artemis CCD Cameras.

41. Back Focal Plane.

42. Under Critical Fluorescence

43. Super Critical Fluorescence
<figure><img src="image_67.png" /></figure>

La frontière entre ces 2 zones étant caractéristique du passage à l'angle critique $\theta_c$, il est possible de déterminer l'angle $\alpha_c$ correspondant (Figure 2.24) et lui associer une valeur théorique de $\theta_c$ à partir des lois de Snell-Descartes – Éq. (2.3.5).

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>FIGURE 2.23 – Évolution de la zone SAF selon l'indice de réfraction du milieu déposé sur le verre (mélange Eau/Glycérol).</figcaption></figure>

En faisant varier $n_m$ via des mélanges d'eau et de glycérol, on peut alors obtenir plusieurs mesures de $\alpha_c$ correspondant aux valeurs de $\theta_c$ théoriques, et ainsi remonter à la relation de grandissement entre $\alpha_c$ et $\theta_c$ par interpolation polynomiale, Figure 2.25 (a). L'indice $n_m$ résultant des différents mélanges est précisément mesuré à l'aide d'un réflectomètre de Abbe$^{44}$. L'écart-type issu des 10 mesures faites pour chaque mélange est négligeable par rapport à l'incertitude sur $\alpha_c$. Pour une interface verre/eau, notre domaine TIRF commence donc pour le couple ($\alpha_c$ ; $\theta_c$) de valeurs (0,3325 ; 60,83)°. Définir la fin du domaine de fonctionnement nécessite de déterminer l'angle $\theta_{max}$. Il s'agit théoriquement de l'angle où le faisceau laser sort de l'objectif, défini par son ouverture numérique. En pratique, l'apparition d'aberrations optiques restreint le domaine de fonctionnement selon la taille du champ d'observation dont on a besoin. Dans notre cas, l'angle $\theta_{max}$ est déterminé par l'angle où se manifestent des aberrations gênantes lors de l'observation d'échantillons biologiques (cellules étalées sur un substrat). La Figure 2.25 (b) synthétise ces expériences, réalisées avec un marquage cellulaire par de la DiO et de la DiD, de manière à distinguer les spécificités des situations d'excitation à 458 et 633 nm. On observe une grande variation de $\alpha_{max}$ ($\theta_{max}$) selon la taille des cellules observées et leur étalement dans le champ d'observation.

<caption>FIGURE 2.24 – Exemple de détermination de l'angle $\alpha_c$, ici dans le cas de l'interface verre / eau.</caption>

44. Abbe 60/ED
Bellingham+Stanley, Xylem.
<figure><img src="image_69.png" /></figure>

En particulier, un large étalement des cellules selon l'axe horizontal de la caméra conduit à l'apparition rapide d'aberrations gênant l'observation, ce qui se traduit par des valeurs de $\alpha_{max}$ comprises entre 0,342 et 0,352, soit $\theta_{max}$ entre 63,6 et 67,5°.

<caption>FIGURE 2.25 – Caractérisation du domaine de fonctionnement TIRF.</caption>

### 2.4.2.3 Longueur de pénétration de l'onde évanescente

À partir de cette calibration ($\alpha$; $\theta$) et de la détermination du domaine de fonctionnement TIRF, il est possible de calculer l'évolution de la distance d'atténuation $\kappa$ dans les différentes configurations qui nous sont accessibles d'après l'Éq. (2.3.7). La Figure 2.26 montre que nous pouvons approcher une valeur de $\kappa$ d'environ 120 nm pour $\theta = 63,6°$ à 458 nm. On constate que cette distance d'atténuation diminue rapidement avec l'augmentation de l'angle d'incidence. La valeur de $\kappa$ est de plus sensible à l'indice de réfraction du milieu$^{45}$. Par exemple, nous représentons sur la Figure 2.26 le cas extrême d'un indice de réfraction de valeur 1,40. Pour limiter au maximum l'illumination en profondeur de nos échantillons, nous avons quoi qu'il arrive tout intérêt à fonctionner à l'angle d'incidence le plus élevé possible. L'onde évanescente est classiquement considérée négligeable$^{46}$ à partir de 3 à $4\kappa$ – Figure 2.14. Dans notre configuration, la portée maximale de notre onde évanescente en fin du domaine de fonctionnement TIRF peut donc être considérée comme valant $\sim 400$ nm pour l'illumination à 458 nm.

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>FIGURE 2.26 – Variation de la distance d'atténuation $\kappa$ selon l'angle d'incidence $\theta$</figcaption></figure>

### 2.4.2.4 Fenêtres spectrales de détection

La caractérisation des voies de détection en FRET est relativement simple à mettre en œuvre. On dépose de l'Alexa Fluor 647 sur une surface fonctionnalisée par des QDs$^{47}$ et l'on acquiert tout d'abord un spectre sous excitation à 458 nm en l'absence des jeux de filtres. On recommence l'opération en ajoutant alternativement $F_D$ puis $F_A$.

45. Ce phénomène est à la base de la méthode de cartographie des indices de réfraction effectifs de cellules individuelles par vaTIRF [72-74].

46. En effet :
$$I(3\kappa) \approx 0,050 \cdot I_0$$
$$I(4\kappa) \approx 0,002 \cdot I_0$$

47. Pour une présentation détaillée de ce type d'expérimentations, voir Chapitre 5 et tout particulièrement la partie 5.3.3.
Les différents spectres résultants sont normalisés et présentés sur la Figure 2.27, où la séparation spectrale est manifeste.

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>FIGURE 2.27 – Caractérisation spectrale des fenêtres de détection $F_D$ et $F_A$</figcaption></figure>

Nous avons vu en section 2.2.3 qu'une estimation précise des quantités – même minimes – associées au débordement spectral des QDs dans la fenêtre de détection $F_A$ et de l'excitation directe du fluorophore accepteur à $\lambda = 458$ nm est nécessaire lorsque l'on souhaite faire de l'imagerie FRET quantitative. Selon le couple QDs / fluorophore accepteur FRET, les résultats varieront. Les quantifications détaillées seront donc précisées pour chaque cas de figure lors des présentations des différentes expériences FRET – chapitres 5 et 6.

## 2.5 CONCLUSIONS SUR LE DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL NEFI

Nous avons eu l'occasion de présenter le principe de l'imagerie grand-champ de luminescence / fluorescence, outil important dans les études de biophysique de l'adhésion cellulaire présentées en chapitre 1. À travers l'explication de la théorie du FRET, il a été possible de montrer l'intérêt de ce phénomène pour extraire des informations nanométriques d'une observation en champ lointain. La méthode d'imagerie NEF, développée par notre équipe, est ainsi adaptée à l'étude d'interactions ayant lieu à l'interface verre/eau. Elle repose sur l'usage d'un substrat "optiquement actif" ajouté en complément d'un montage d'imagerie TIRF classique. J'ai donc présenté en détail le dispositif expérimental utilisé pour ce projet doctoral, ainsi que sa caractérisation. Le chapitre suivant va alors nous permettre de présenter le travail réalisé sur la synthèse des boites quantiques, nanocristaux de matériaux semi-conducteurs dont les caractéristiques en font de parfaits candidats pour jouer le rôle de donneurs en FRET.
<figure><img src="image_72.png" /></figure>
# Boites quantiques (QDs) : synthèse et caractérisations

3

Ce chapitre présente les propriétés générales des boites quantiques, leur synthèse ainsi que leur caractérisation photo-physique.

## 3.1 PROPRIÉTÉS FONDAMENTALES

### 3.1.1 STRUCTURE ET CONFINEMENT ÉLECTRONIQUE

#### 3.1.1.1 Généralités

Les boites quantiques sont des nanocristaux de matériaux semi-conducteurs. Leur taille nanométrique dans les 3 dimensions de l'espace induit des propriétés électroniques et optiques particulières, proches des systèmes atomiques, bien qu'ils soient constitués de plusieurs dizaines de milliers d'atomes. À la différence des émetteurs organiques, les QDs se caractérisent par un large spectre d'absorption combiné à un spectre d'émission étroit, dont les positions sont majoritairement déterminées par leur taille. Le développement de ces objets a démarré dans les années 1980, avec les travaux de Ekimov & Onuschenko [148, 149] pour la synthèse dans une matrice de verre; ainsi que Rossetti & Brus [150] et Alfassi et al. [151] pour la synthèse colloïdale en solution. Ce 2ème procédé connut un saut important avec la contribution de Murray et al. [152] au début des années 1990, rendant possible l'obtention de solution colloïdales relativement mono-disperses. Enfin, Efros et Rosen [153-156] sont reconnus comme les précurseurs majeurs de la formalisation théorique des propriétés optiques de ces nanocristaux.

#### 3.1.1.2 Éléments de théorie des bandes électroniques

Les propriétés optiques des semi-conducteurs sont décrites par la théorie des bandes. Dans un matériau *bulk* ou massif, un grand nombre d'atomes sont en interaction, conduisant à un "mélange" des niveaux d'énergie accessibles pour les différents électrons, comme le représente la Figure 3.1. La représentation en niveaux d'énergie discrets, caractéristique des atomes, s'efface au profit d'ensembles pouvant être assimilés à des bandes d'énergie continues – séparées par ce que l'on appelle une bande interdite. Dans les intervalles accessibles, les électrons "remplissent" les bandes selon la loi statistique de Fermi-Dirac, définissant un niveau d'énergie $E_F$ du solide tel qu'à 0 K, tous les électrons ont une énergie $E \le E_F$. La position de $E_F$ permet de définir la bande de valence (BV), la bande énergétique qui précède $E_F$, et la bande de conduction (BC), bande immédiatement supérieure. L'énergie de gap $E_g$ correspond au saut d'énergie entre BV et BC. Sachant que l'énergie

3.1 Propriétés fondamentales 51
Structure et confinement
électronique
Propriétés photophysiques des QDs

3.2 Synthèses et caractérisations en solution 56
Banc de synthèse
Synthèses réalisées
Caractérisations photo-physiques

3.3 Échanges de ligands de surface 70
Diversité des molécules et applications

Protocoles d'échanges de ligands
Caractérisations spectrales en
solution et sur surfaces

3.4 Conclusions sur les boites quantiques 79

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>FIGURE 3.1 – Représentation schématique des conséquences du passage de l'atome au matériau massif sur la structure des niveaux d'énergie, en fonction du nombre N d'atomes. Adapté de [157].</figcaption></figure>
de gap $E_g \approx 1$ eV pour un grand nombre de semi-conducteurs, l'absorption d'un photon dans l'UV ou le visible¹ permet la transition d'un électron $e^-$ de BV à BC. Le processus fait apparaître une lacune électronique dans la BV, aussi appelée trou² et notée $h^+$. Dans une nanoparticule, l'électron de la BC et le trou de la BV interagissent forte-ment : le modèle physique utilisé est alors celui des hydrogènoïdes, où le trou $h^+$ remplace le noyau. Cette paire électron-trou $e^- - h^+$ en interac-tion coulombienne est nommée exciton. La recombinaison de l'exciton peut être radiative (luminescence)³ ou non-radiative, selon la même logique qu'exposée au chapitre précédent – section 2.1.2. Pour une présentation plus détaillée de la détermination de la structure de bande du séléniure de cadmium (CdSe)⁴ massif, nous renvoyons à la thèse d'E. Cassette [158], qui synthétise clairement les travaux théoriques historiques. Par nécessité pour la suite, nous devons introduire la no-tion de rayon de Bohr, noté $a_B$, qui définit la distance caractéristique $e^- - h^+$ pour un matériau semi-conducteur donné – voir Éq. (3.1.1), où $\epsilon_r$ est la constante diélectrique du matériau semi-conducteur; $m_0$ la masse de l'électron libre; $\mu^*$ la masse effective réduite de l'exciton; $a_0$ le rayon de Bohr de l'atome d'hydrogène. Dans le cas du CdSe, cette valeur vaut 5,6 nm.

### 3.1.1.3 Confinement spatial et excitons

La réduction de la taille des cristaux semi-conducteurs génère un confinement quantique des trous et des électrons⁵, modifiant les com-portements possibles des excitons. Lorsque le rayon $R$ d'un nano-cristal semi-conducteur est inférieur au rayon de Bohr du matériau, l'électron et le trou d'un exciton sont traités comme 2 particules indépendantes soumises à un potentiel sphérique $V$ infini, tel que $V = 0$ pour $r < R$; et $V = \infty$ pour $r > R$. Les calculs montrent alors que le confine-ment quantique des $e^-$ et $h^+$ évolue en $1/R^2$ tandis que l'attraction coulombienne évolue en $1/R$ [159] – cf. Éq. (3.1.2), où $\hbar = h/2\pi$ est la constante de Planck réduite (J/s); $e$ la charge élémentaire de l'électron (C); et $\epsilon_0$ la permittivité diélectrique du vide (F/m). Les niveaux d'énergie des $e^-$ et $h^+$ sont discrétisés comme dans un système ato-mique, et l'énergie des transitions inter-bandes augmente avec la di-minution de la taille du nano-cristal, comme cela est illustré en Fi-gure 3.2 (a). Étant donné que la relaxation radiative a lieu entre les états de plus faible énergie uniquement⁶, il est ainsi possible d'obtenir une longueur d'onde de photoluminescence souhaitée simplement en ajustant la taille des nano-cristaux, sans changer leur composition⁷. Une autre conséquence du confinement spatial est que les effets de surface deviennent prédominants : en effet, plusieurs dizaines de pour-cents du nombre total d'atomes peuvent se retrouver en surface du na-nocristal, avec des liaisons dites "pendantes". En fournissant des états d'énergie intermédiaires entre la bande de valence et de conduction, ces liaisons pendantes peuvent agir comme des pièges pour les électrons délocalisés, induisant une relaxation non-radiative des excitons, ce qui diminue le rendement quantique du QD considéré.

1. $\lambda = 800 \text{ nm} \rightarrow E = 1,6 \text{ eV}$
$\lambda = 400 \text{ nm} \rightarrow E = 3,1 \text{ eV}$

2. En anglais : hole.

3. La convention est d'employer le terme de luminescence plutôt que celui de fluorescence – même si l'on peut trouver nombre de travaux parlant de "fluorescence des QDs".

4. Matériau semi-conducteur de type II-VI historique des boites quantiques, et bien étudié. Dans le cadre de ce projet doctoral, les QDs synthétisés l'ont tous été sur base de CdSe, et les résultats théoriques ou empiriques cités relèvent quasi-systématiquement de ce matériau.

$$a_B = \varepsilon_r \frac{m_0}{\mu^*} a_0 \quad (3.1.1)$$

5. Typiquement pour des rayons de cristaux $R \le 10$ nm.

$$\Delta E \approx E_g + \frac{(\hbar\pi)^2}{2\mu^* R^2} + \frac{1,8e^2}{4\pi\varepsilon_0\varepsilon_r R} \quad (3.1.2)$$

6. De manière analogue à ce qui a été décrit en section 2.1.2, une cascade de conversions internes non-radiatives ra-pides ($10^{-12}$ s) relaxe $e^-$ et $h^+$ aux niveaux les plus bas.

7. Dans le cas des nano-cristaux CdSe, les différentes tailles maîtrisées per-mettent d'accéder à l'ensemble du spectre visible – cf. Figure 3.2 (b).
<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>(a) Dépendance théorique des niveaux des $e^-$ et $h^+$ selon R</figcaption></figure>

<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>(b) Illustration schématique de l'émission selon la taille R des QDs</figcaption></figure>

(a) est extraite de [156]. Les énergies des électrons sont tracées par rapport au niveau le plus faible de la BC; les énergies des trous par rapport au niveau le plus haut de la BV. Les principales transitions optiques correspondant au spectre d'absorption Figure 3.4 (a) sont représentées en vert – inspiré de [158]. (b) est inspirée de [160].

Pour éviter cela, les boites quantiques couramment utilisées sont en réalité des hétéro-structures dites "cœurs/coquilles", dont il existe différents types : I ($e^-$ et $h^+$ confinés dans le cœur); II ($e^-$ et $h^+$ séparés spatialement); quasi-II ($e^-$ ou $h^+$ est délocalisé). Par exemple, pour un cœur optiquement actif de CdSe, une coquille à base de sulfure de zinc (ZnS) sert souvent de couche de passivation des pièges de surface, depuis leur introduction par Hines & Guyot-Sionnest en 1996 [161]. L'usage de cette hétéro-structure de type-I est l'explication principale des hauts rendements quantiques mesurés pour ces QDs – souvent dans l'intervalle 0,7-1 en solution. En effet, comme l'illustre la Figure 3.3, cette coquille crée une barrière de potentiel augmentant ainsi la présence des porteurs de charge au niveau du cœur des QDs, et donc la probabilité de recombinaison radiative de la paire $e^-$–$h^+$.

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>FIGURE 3.3 – Schéma des allignements de la BV et la BC pour les QDs à hétéro-structures, et des fonctions d'onde des $e^-$ et $h^+$ résultantes. Adapté de [158].</figcaption></figure>

### 3.1.2 PROPRIÉTÉS PHOTOPHYSIQUES DES QDS

#### 3.1.2.1 Asymétrie des spectres d'absorption et d'émission

La Figure 3.4 (a) donne un exemple de spectres d'absorption et d'émission pour une solution colloïdale de nanocristaux CdSe. Ces spectres sont très différents de ceux des molécules fluorescentes organiques, dans le sens où ils ne présentent pas de symétrie. Cela s'explique tout d'abord par la présence de plusieurs transitions d'absorption excitoniques, dont la largeur dépend de la température ainsi que la dispersion en taille des QDs. Les transitions précisées sur la Figure 3.4 (a) correspondent à celles mises en avant Figure 3.2 (a). On observe ensuite une forte augmentation de l'absorbance due à l'absorption inter-
bande caractéristique des semi-conducteurs⁸. L'émission de photoluminescence est issue de la relaxation fondamentale $1S_e \rightarrow 1S_{3/2}$. Elle présente quant à elle un profil spectral quasi-gaussien, dont la largeur est un moyen d'évaluer la variance de la distribution des tailles des nanocristaux. Le décalage de Stokes s'explique par la structure fine du premier niveau excitonique comportant 5 sous-états dont 2 uniquement inactifs [156, 158]. Cette structure fine dépend du rayon des boites quantiques⁹, de l'anisotropie de forme des QDs, et dans une moindre mesure [163] du champ cristallin¹⁰. Le peuplement des sous-états composant cette structure dépend de la température selon une statistique de Boltzmann, ce que l'on utilisera lors de l'estimation du rendement quantique des QDs.

8. Pour des énergies d'excitation élevées par rapport à $\Delta E$, la section efficace d'absorption des QDs peut alors être approximée par le modèle des petites particules absorbantes, ce qui a permis l'élaboration d'une relation empirique entre la taille des QDs et leur section efficace d'absorption à 350 nm [162].

9. Déterminant l'intensité de l'interaction d'échange entre $e^-$ et $h^+$.

10. Selon que l'agencement des atomes soit wurtzite (WZ) / zinc-blende (ZB).

<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>Ces spectres ont été réalisés en solution pour des concentrations de QDs identiques (~100 nM). (a) Les pics excitoniques correspondent aux transitions indiquées en Figure 3.2. (b) La structure des coquilles mixtes est CdS/CdZnS/ZnS.</figcaption></figure>

La Figure 3.4 (b) montre que l'ajout d'une coquille ne modifie pas cette asymétrie spectrale, mais augmente la section efficace d'absorption et la photoluminescence émise. Le décalage de Stokes entre les cœurs et les hétéro-structures cœurs/coquilles est dû à l'emploi d'une coquille mixte pour minimiser les écarts de paramètre de maille et permettre l'encapsulation par une plus grande épaisseur de coquille¹¹.

FIGURE 3.4 – Spectres d'absorption et photoluminescence de QDs à température ambiante, pour des cœurs et hétéro-structures cœurs/coquilles.

11. L'écart des paramètres de maille entre CdSe et ZnS valant environ 12 %, les contraintes mécaniques en jeu ne permettent pas de faire croître une coquille sans défauts au-delà d'une épaisseur de 0,5 nm si le rayon des cœurs $\ge$ 4 nm [158]

### 3.1.2.2 Phénomènes de clignotement

Comme les fluorophores organiques, les boites quantiques manifestent une dynamique d'émission intermittente, mise en évidence en 1996 [164], Ce phénomène de clignotement (blinking), illustré Figure 3.5, est lié à plusieurs processus de relaxation non-radiatifs. Il peut s'agir d'une relaxation Auger¹², ou bien de la combinaison d'un effet de solvatisation dû au milieu et un effet tunnel au niveau de la coquille du QD [165]. Différents travaux sur les espèces excitoniques "exotiques" [166-168] comme les biexcitons et trions¹³, ou sur les conti-

12. Dans un cas de co-existence de plusieurs excitons, l'énergie de l'un peut être totalement cédée à l'autre sous l'effet des interactions d'échange. Cela conduit une éjection du $e^-$ de l'exciton restant hors du QDs et à la ionisation de ce dernier.

13. Biexciton : couplage de 2 excitons. Trion : couplage chargé d'un $e^-$ ou $h^+$ avec un exciton existant.
nuums d'états émissifs, ont permis de mettre en évidence que les taux de recombinaisons non-radiatives $k_{nr}$ sont très variables [169-171], ce qui a donné lieu à divers modèles dont certains reposent uniquement sur l'existence de pièges énergétiques internes, sans phénomène d'ionisation. Yuan et al. ont cependant montré en 2018 que les 2 phénomènes pouvaient se produire dans une même boite quantique, et proposé un modèle synthétique [172] pour expliquer – et limiter – le clignotement des QDs.

### 3.1.2.3 Photo-blanchiment et photo-activation

Les coquilles sont également responsables de la relative résistance des boites quantiques au photo-blanchiment en comparaison avec les fluorophores organiques traditionnels, ce qui rend les QDs très intéressants pour l'imagerie sous illumination continue. Plus exotique encore, les boites quantiques se différencient des fluorophore organiques classiques par leur susceptibilité à se photo-activer – i.e. augmentation de leur émission sous illumination continue, cf. Figure 3.6. Initialement rapportée en 2000 par Cordero et al [173] sur de simples nanocristaux CdSe, ce phénomène a pu être constaté sur des hétéro-structures classiques CdSe/ZnS [174] ou à coquille mixte CdSe/CdS/ZnS [175], et sur des compositions variées de matériaux de QDs ou de ligands ¹⁴ [176]. Malgré la similarité des résultats observés, il s'agit de processus physiques différents selon les situations, mais qui tendent aux mêmes effets : la passivation des pièges énergétiques et donc la fermeture des canaux de recombinaisons non-radiatives.

### 3.1.2.4 Intérêt des QDs pour l'imagerie NEF et précautions instrumentales

Dans le contexte de l'imagerie FRET, l'intérêt des QDs réside en premier lieu dans leurs caractéristiques spectrales. La possibilité de les exciter loin des fenêtres spectrales de détection permet de supprimer tout bruit issu du laser employé. Ensuite, leur grande section efficace d'absorption et leur haut rendement quantique minimisent l'irradiance laser à apporter pour obtenir un bon rapport signal sur bruit. L'importance du phénomène de clignotement pourrait être un grand désavantage des boites quantiques, en raison du décalage entre mesures sur QDs uniques et mesures d'ensemble. Heureusement, il a pu être montré que l'ajout de coquilles bien choisies ¹⁵ permettait de forte-ment réduire – voire supprimer – le phénomène de clignotement [177-182]. La photo-activation des QDs induit une nécessité de précaution instrumentale pour l'imagerie NEF : il est nécessaire de caractériser l'évolution de la photoluminescence à différentes irradiances laser et veiller à garantir la stabilité de l'émission avant d'effectuer une étude FRET – en particulier si l'on emploie le calcul d'efficacité basé sur le quenching de photoluminescence des donneurs ¹⁶.

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>FIGURE 3.5 – Exemple du signal d'émission d'une boite quantique unique.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>FIGURE 3.6 – Signal moyen normalisé à $t = 0$, mesuré pour une monocouche de QDs sur verre, sous une illumination continue à 4,5 W/cm².</figcaption></figure>

14. Les ligands entourant les QDs ont été volontairement mis de côté jusqu'ici pour simplifier la présentation. Leur rôle est cependant important, et est détaillé dans la section 3.3.

15. Relativement épaisses, résultant de couches mixtes comme annoncé en section précédente.

16. Voir Éq. (2.2.11) du chapitre précédent.
## 3.2 SYNTHÈSES ET CARACTÉRISATIONS EN SOLUTION

Depuis les premières synthèses dans les années 1980, de nombreuses méthodes ont été développées pour l'obtention de différents types de nanocristaux. En particulier, la transition de techniques empruntées à l'industrie des puces électroniques vers des synthèses en chimie humide a permis de simplifier l'obtention de ces nanoparticules, tout en réduisant les coûts de fabrication. Cependant, les hautes températures nécessaires – 200-350 °C – ont depuis longtemps joué contre l'industrialisation des procédés, en raison de la difficulté à maintenir ces températures de réaction stables sur des volumes importants. Ainsi, les premières boites quantiques commerciales datent de 2002, et c'est à partir des années 2010 que, poussée par la demande issue des domaines de l'optique et l'opto-électronique, la production de QDs a réellement pris un essor significatif [183]. Les boites quantiques sont donc devenues des objets utilisés couramment par un grand nombre de chercheur-euse-s, même si les prix d'achat restent élevés, et varient selon le type de ligands stabilisateurs utilisés. Le coût actuel est plutôt élevé, pour des concentrations et des temps de conservation relativement faibles ¹⁷.

Pour ces différentes raisons, il a donc été décidé de synthétiser nous-mêmes les boites quantiques que nous utiliserions dans le cadre de ce projet doctoral, avec l'aide de Thomas Pons du LPEM ¹⁸. En plus d'apporter son savoir-faire au laboratoire, ce choix nous a permis de bénéficier de l'expérience de spécialistes du domaine et d'adapter finement nos QDs à nos besoins, que ce soit sur le plan de leur luminescence que de leur fonctionnalisation.

### 3.2.1 BANC DE SYNTHÈSE

Le banc mis en place pour les besoins de la synthèse des boites quantiques est schématisé sur la Figure 3.7. La réaction est réalisée dans un ballon tricol.

17. À titre d'exemple, chez un four-nisseur classique de composés chi-miques comme Sigma-Aldrich, les QDs CdSe/ZnS sont actuellement vendus 340 € les 10 mg avec ligands oc-tadécylamine; 140-145 € pour 1 mg avec ligands amine ou acide carboxy-lique fonctionnalisés

18. Laboratoire de Physique et d'Étude des Matériaux, ESPCI Paris

<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>FIGURE 3.7 – Schéma du banc de synthèse utilisé pour la synthèse des QDs.</figcaption></figure>
Sur un pied réhausseur se superposent un contrôleur de tempéra-
ture¹⁹ relié à une sonde de température et un chauffe-ballon²⁰. Ce
dernier est posé sur un agitateur magnétique permettant une mise
en mouvement continue de la solution contenant les réactifs. Le col
principal du ballon est relié à des colonnes de circulation servant à,
au choix : (a) dégazer le milieu avant le lancement des réactions chi-
miques via une pompe à vide; (b) alimenter le ballon en gaz neutre
– ici, de l’argon – avec une légère sur-pression pour obtenir un milieu
de réaction continuellement renouvelé. Cette sur-pression est contrôlée
par un manomètre en début de circuit et un bulleur à sa fin. Le dernier
col est quant à lui fermé par un bouchon en caoutchouc à jupe rabat-
table²¹ rendant l’ensemble étanche, tout en permettant des injections
ou prélèvements au cours de la synthèse.

3.2.2 SYNTHÈSES RÉALISÉES

Dans la suite de ce document, les ligands de surface²² utilisés pour
stabiliser les QDs en solution sont précisés entre crochets. Par exemple :
QDs[OA] si l'acide oléique joue le rôle de ligand. Le protocole de
synthèse nous a été fourni par T. Pons, et est essentiellement structuré
en 2 parties distinctes : la synthèse des cœurs ; puis la croissance des
coquilles autour de ceux-ci. J'ai réalisé un peu plus d'une trentaine de
synthèses au cours du projet doctoral.

3.2.2.1 Synthèse des cœurs CdSe – aussi notés QDs$_{cœurs}$

(a) Préparation des précurseurs pour les cœurs de QDs

Les cœurs des QDs, de structure zinc-blende (ZB) sont synthétisés
via une adaptation de la procédure "Cao" [184]. La nouveauté apportée
par Yang *et al*. en 2005 tient à ce qu'il n'est pas nécessaire de réaliser
d'injection de précurseurs au cours de la réaction. Il faut néanmoins
réaliser la synthèse *ex situ* d'un des deux réactifs : le myristate de
cadmium Cd(Myr)₂. Pour ce faire, on commence par dissoudre 3,13 g
de myristate de sodium NaMyr²³ dans 250 mL de méthanol²⁴, sous
agitation à température ambiante pendant 1 h. En parallèle, 1,23 g de
nitrate de cadmium tetrahydraté (Cd(NO₃)₂ + 4 H₂O)²⁵ est dissout
dans 40 mL de méthanol. Après 1 h, on ajoute lentement à la pipette
le Cd(NO₃)₂ dans la solution de NaMyr en maintenant l'agitation. Se
forme alors un précipité blanc que l'on va filtrer via l'utilisation d'une
fiole à vide²⁶, un entonnoir Büchner²⁷, et un filtre en cellulose²⁸. Le
résultat est séché sous vide pendant une nuit dans un tube à centri-
fuger²⁹ de 50 mL dont le bouchon est percé. La poudre finalement
obtenue est stable pendant plusieurs mois à température ambiante et
peut donc être utilisée pour de nombreuses synthèses de QDs. À titre
d'exemple : je n'ai réalisé que 3 synthèses de myristate de cadmium
Cd(Myr)₂ sur l'ensemble du projet doctoral.

19. Gemini-230, J-KEM Scientific.

20. Le chauffe-ballon utilisé dépend du volume du ballon nécessaire à l'expérimentation :
100 ou 250 mL, Duran.

21. 407015-20, ∅ 14,9 mm, Saint-Gobain Performance Plastics.

22. Voir section 3.3 pour une présentation détaillée.

23. M0483, ≥ 98 %, TCI.

24. 34860-2-2.5L-R, ≥ 99,9 %, Sigma-Aldrich.

25. 642045-100G, ≥ 98 %, Aldrich Chemistry.

26. 500 mL, Simax.

27. 127C-0a, Haldenwanger.

28. Rotilabo Rundfilter 113A, Ø 47 mm, Carl Roth GmbH+Co.

29. Falcon, 734-0448, VWR
(b) Synthèse des QDs$_{cœurs}$

Concernant la synthèse des cœurs, on pèse 174 mg de Cd(Myr)$_2$ directement dans le ballon tricol de 100 mL. La quantité stœchiométrique de sélénium en poudre – soit de 12 mg – est pesée dans un pilu-lier; dissoute dans 16 mL d'octadécène$^{30}$ via l'aide d'un bain à ultrasons$^{31}$, puis ajoutée dans le ballon. Une fois le tout mis en place sur le banc décrit en Figure 3.7, on commence par dégazer la solution à température ambiante environ 15 min, sous agitation, jusqu'à ce que les bulles à la surface du mélange disparaissent. On remplace ensuite le vide créé par de l'argon en légère sur-pression, pour gazarantir sa circulation, et l'on chauffe$^{32}$ jusqu'à atteindre le plus vite possible une température entre 220 et 240 °C selon la taille de QDs que l'on souhaite atteindre – voir section 3.2.2.3. Quand on atteint la température souhaitée, on la maintient durant quelques minutes puis on refroidit rapidement le mélange avec un pistolet à air comprimé, en ajoutant 500 µL d'acide oléique OA$^{33}$ vers 200°C pour stopper la réaction. La solution obtenue est lavée par centrifugation : après séparation dans 2 tubes de 50 mL, on ajoute dans chacun 5-10 mL d'OA, complétés par de l'éthanol$^{34}$. L'ensemble est centrifugé 10 min à 6000 RPM. Si tout n'a pas bien précipité, on rajoute 5 mL d'OA et l'on re-centrifuge. Ajouter au moins 7,5 mL d'OA dès le départ permet généralement d'éviter cette seconde centrifugation. Le surnageant contenant les restes de réactifs est jeté, et le précipité de QDs$_{cœurs}$[OA] est repris dans un total de 10 mL d'héxane$^{35}$. Une telle solution de cœurs de boites quantiques est stable quelques jours uniquement si l'on ne réalise pas la croissance des coquilles. Une petite quantité (10 µL) est prélevée et diluée dans 3 mL d'héxane pour caractériser le résultat en absorbance, photo-luminescence, et durée de vie de l'émission.

### 3.2.2.2 Croissance des coquilles mixtes CdS/CdZnS/ZnS

(a) Caractérisation de la solution de QDs$_{cœurs}$

Cette seconde étape de la synthèse est basée sur la méthode SI-LAR$^{36}$, utilisée pour la fabrication de couches minces sur substrats. Son usage pour les synthèses colloïdales de nanocristaux a été introduite par Li *et al.* en 2003 [186]. Les coquilles sont ainsi générées par l'injection séquentielle de quantités de précurseurs correspondant à la formation d'une seule mono-couche par nanoparticule. Son intérêt principal est de permettre un contrôle fin de la composition des différentes couches des coquilles. Cette méthode passe par le traitement du spectre d'absorption des QDs$_{cœurs}$[OA], dont un exemple est donné Figure 3.8. La position du premier pic excitonique permet d'estimer la taille moyenne des cœurs suivant la relation empirique de Peng [187] donnée en Éq. (3.2.1). Même si cette relation a originellement été dérivée pour des cœurs de QDs CdSe de structure wurtzite (WZ), elle est suffisamment juste au regard de nos injections faites avec une précision de l'ordre de quelques dizaines de µL. Pour des concentrations faibles, l'absorbance A(λ)

30. O806-1L, 90 %, Sigma-Aldrich.

31. Elmasonic S 10, Elma.

32. Une représentation simplifiée de la synthèse de nanocristaux, comme la théorie LaMer-Dinegar [185], découpe 3 étapes principales. 1) La nucléation correspondant à l'apparition des premières unités périodiques stable, se produisant lorsque la température approche le niveau nécessaire à la réaction de synthèse. 2) La croissance homogène des nanocristaux à partir des nucléis : les réactifs encore présents sont consommés préférentiellement par les plus petites particules, conduisant à une homogénéisation des tailles de cristaux. 3) Le mûrissement d'Ostwald, c'est-à-dire la consommation des petites particules pour nourrir la croissance des plus grandes, qui tend à se produire lorsque la concentration en réactifs devient faible. Pour obtenir une solution de QDs homogènes, on a donc intérêt à combiner une montée en température rapide et un temps de réaction court.

33. 364525-1L, $\ge$ 90 %, Sigma-Aldrich

34. E/0600DF/21, 99 %, VWR.

35. 34859-2.5L-M$\ge$ 97 %, Sigma-Aldrich.

36. *Successive Ion Layer Adsorption and Reaction*, ou adsorption et réaction séquentielle de mono-couche ionique

$$r_{Peng} = \frac{1}{2}(1,612210^{-9}\lambda^{4} - 2,657510^{-6}\lambda^{3} + 1,624210^{-3}\lambda^{2} - 0,4277\lambda + 41,57) \quad (3.2.1)$$
d'une solution, mesurée via une cuve standard de largeur $l = 1$ cm est directement reliée à la concentration C de l'espèce chimique d'extinction molaire $\varepsilon(\lambda)$, selon la loi de Beer-Lambert – cf. Éq. (3.2.2).

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

Dans le cas des nanocristaux CdSe dans l'hexane, à 350 nm³⁷, il existe un excellent accord entre les mesures de section efficace d'absorption $\sigma$ et les calculs théoriques, tout comme une relative absence d'effet des ligands stabilisateurs, ce qui fait de cette longueur d'onde une référence de choix pour estimer la concentration – Éq. (3.2.4) à (3.2.6).

À partir de ces valeurs, il est alors possible de calculer les quantités nécessaires à chaque injection de précurseur pour la croissance des coquilles. Comme dans le cas de la synthèse des cœurs, ces derniers sont fabriqués ex situ.

### (b) Préparation des précurseurs pour coquilles CdS/CdZnS/ZnS

Pour l'oléate de cadmium $Cd(OA)_2$, on souhaite obtenir une solution à 0,5 M. Ce niveau de concentration entraine une solidification à température ambiante mais est très stable. On pèse pour cela 6,42 g d'oxyde de cadmium $CdO$³⁸ dans un ballon de 250 mL. On ajoute 100 mL d'OA, le tout chauffé à 160°C sous agitation en atmosphère argon jusqu'à ce que la solution soit incolore. On redescend alors la température à 120°C en refroidissant avec de l'air comprimé. La température est stabilisée à 100°C et l'on dégaze pour évacuer l'eau. L'oléate de zinc – $Zn(OA)_2$ – est préparé pour une même concentration finale : 4,07 g d'oxyde de zinc $ZnO$³⁹ sont pesés dans le ballon auquel est ajouté 100 mL d'acide oléique. Le reste de la dissolution suit les mêmes étapes que précédemment, si ce n'est que la température est élevée jusqu'à 280°C pendant 1h. Enfin, nous avons besoin d'une solution de Soufre-ODE à 0,1 M : 100 mL d'ODE sont tout d'abord dégazés à 60°C. On ajoute ensuite 0,32 g de soufre⁴⁰ pesés dans un tube Eppendorf et l'on augmente la température à 120°C. Une fois

$$A(\lambda) = \varepsilon(\lambda)Cl \quad (3.2.2)$$

FIGURE 3.8 – Exemple de détermination du rayon des nanocristaux et de la concentration de la solution colloïdale de cœurs de QDs à partir d'un spectre d'absorption.

Dilution de 10 µL de QDs cœurs dans un volume final de 3 mL d'héxane.

La valeur de A(350 nm) est corrigée par A(700 nm) où les QDs n'absorbent pas.

37. D'après Leatherdale et al. [162], avec $\sigma$ en cm² et r en cm :

$$\sigma_{350} = 5,501 \cdot 10^5 \cdot r^3 \quad (3.2.3)$$

$$C = \frac{A_{350}}{\varepsilon_{350}l} \quad (3.2.4)$$

$$\sigma_{350} = \frac{\varepsilon_{350}1000\ln(10)}{N_A} \quad (3.2.5)$$

Donc

$$C = \frac{A_{350}1000\ln(10)}{N_A\sigma_{350}l} \quad (3.2.6)$$

38. 244783-100G, ≥ 99,5 %, Sigma-Aldrich.

39. 255750-100G, 99,99 %, Sigma-Aldrich

40. 213292-50G, 99,99 %, Aldrich Chemistry.
la dissolution terminée, la solution est stockée dans une bouteille en verre. L'ensemble de ces précurseurs est stable sur une longue durée et préparé dans des quantités suffisantes pour plusieurs synthèses : les oléates de cadmium ou de zinc n'ont eu à être préparé qu'une fois durant toute la thèse, et 3 fois pour la solution de S-ODE.

(c) Croissance des coquilles sur QDs<sub>cœurs</sub>

Le tableau 3.1 récapitule l'ensemble des injections nécessaires à la formation des coquilles, à partir d'un exemple concret. Les quantités à injecter sont déterminées à l'aide d'une feuille de calcul reprenant la méthode SILAR, dont les entrées sont le rayon des cœurs, le volume et la concentration de leur solution. La solution de 10 mL de QDs<sub>cœurs</sub>[OA] est mélangée à 10 mL d'ODE auxquels on ajoute 2 mL d'oleylamine<sup>41</sup> pour dissoudre les ligands OA qui, sinon, entraveraient la croissance des coquilles sur les cœurs. Pendant que l'on dégaze l'ensemble dans un tricol de 250 mL à 30°C, on chauffe un aliquot de Cd(OA)<sub>2</sub> et de Zn(OA)<sub>2</sub>, respectivement à 200 et 300°C, afin de retourner à l'état liquide et prélever le volume nécessaire à diluer pour obtenir les solutions de précurseurs à 0,1 M qui vont être injectées. Le Zn(OA)<sub>2</sub> à 0,1 M peut être conservé liquide à condition d'être maintenu à 60°C dans une étuve. Lorsque le dégazage de l'héxane est terminé, on remplace le vide créé par une atmosphère d'argon en légère sur-pression.

<table><thead><tr><th>Couche</th><th>Injection (mL)</th><th>T (°C)</th><th>Timing</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">CdS</td><td>Cd = 0,29</td><td rowspan="2">30</td><td>t<sub>0</sub></td></tr><tr><td>S = 0,29</td><td>t<sub>0</sub></td></tr><tr><td rowspan="2">CdS</td><td>Cd = 0,45</td><td rowspan="2">230</td><td>Arrivée à T</td></tr><tr><td>S = 0,45</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td rowspan="2">CdS</td><td>Cd = 0,63</td><td rowspan="2">230</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td>S = 0,63</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td rowspan="2">CdZnS</td><td>CdZn = 0,93</td><td rowspan="2">250</td><td>Arrivée à T</td></tr><tr><td>S = 0,93</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td rowspan="2">CdZnS</td><td>CdZn = 1,20</td><td rowspan="2">250</td><td>Arrivée à T</td></tr><tr><td>S = 1,20</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td rowspan="2">CdZnS</td><td>Zn = 1,65</td><td rowspan="2">250</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td>S = 1,65</td><td>+ 10 min</td></tr><tr><td>Zn</td><td>Zn = 2,00</td><td>250</td><td>+ 10 min</td></tr></tbody></table>

Une fois toutes les injections faites, on attend 10 min avant de refroidir à 100°C avec le pistolet à air comprimé. La solution est séparée dans 4 tubes à centrifuger de 50 mL auxquels on ajoute 5-10 mL d'OA, complétés par de l'éthanol. Le mélange est centrifugé à 6000 RPM durant 5 min. Comme pour les cœurs, le surnageant est jeté et le précipité de QDs<sub>cœurs/coquilles</sub>[OA] est repris dans un total de 10 mL d'héxane.

41. 129540010, ≥ 80-90 %, Acros Organs.

<caption>TABLE 3.1 – Récapitulation des injections nécessaires à la croissance des coquilles de QDs. Exemple correspondant aux cœurs CdSe présentés en Figure 3.8.</caption>

On réalise les 2 premières injections à 30°C via des seringues de 1 mL graduée à 0,01 mL adjointe d'une aiguille verte 21G. La température est ensuite augmentée au plus vite jusqu'à 230°C. On injecte le volume de Cd(OA)<sub>2</sub> requis puis, 10 min après, un volume identique de S-ODE, et l'on ré-attend 10 min avant de procéder à l'étape suivante. Chaque mono-couche CdS décale le spectre de photo-luminescence d'environ 10 nm vers le rouge. Après cela, on monte la température à 250°C et l'on procède aux injections suivantes selon le même rythme. À noter que les injections "CdZn" sont obtenues à partir d'un mélange 50/50 de Cd(OA)<sub>2</sub> et Zn(OA)<sub>2</sub>.
De nouveau, 10 µL sont prélevés et dilués dans un volume final de 3 mL pour caractériser le résultat en absorbance, photo-luminescence, et durée de vie de photo-luminescence. En supposant négligeables les pertes de matière entre la solution de cœurs CdSe et la solution de CdSe/CdS/CdZnS/ZnS après croissance des coquilles, on peut calculer le coefficient d'extinction molaire de la solution obtenue en cette toute fin de synthèse, *via* le ratio entre l'absorbance à 350 nm des QDs<sub>coeurs/coquilles</sub>[OA] et des QDs<sub>coeurs</sub>[OA]. Une telle solution est, pour le coup, stable plusieurs mois à température ambiante<sup>42</sup>.

42. Avec une concentration typique de 25-30 µM.

### 3.2.2.3 Influence des paramètres de la synthèse

#### (a) Température et temps de réaction de la synthèse des cœurs

Dans la publication originale de la méthode de synthèse "Cao" [184], la température de synthèse était fixée à 240°C. L'étude du temps de réaction, comme on peut le voir sur la Figure 3.9, montrait qu'il s'agissait d'un paramètre permettant de contrôler simplement les caractéristiques principales de la synthèse<sup>43</sup>. L'augmentation de la taille des cœurs est associée, comme attendu, à un décalage du spectre d'absorption vers les grandes longueurs d'onde / faibles niveaux d'énergie. De façon plus surprenante, cela conduit aussi à resserrer la distribution en taille des nanocristaux, comme le montre les pics d'absorption et les spectres de photo-luminescence plus étroits.

43. Prolonger le temps de réaction permet d'augmenter la taille des cœurs de boites quantiques obtenus mais diminue la concentration de la solution de produits réactionnels.

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

FIGURE 3.9 – Évolution temporelle, au cours de la synthèse, du a) spectre de photo-luminescence, noté (f) pour "fluorescence"; b) du spectre d'absorption; c) du diamètre (D) des nanocristaux; d) de la concentration (C) des nanocristaux; e) la largeur à mi-hauteur (W) du spectre de photo-luminescence. Extrait de [184].

Autrement dit, dans cette situation, le phénomène de mûrissement d'Ostwald<sup>44</sup> ne semble pas se produire. Nous avons reproduit cette expérience de variation temporelle, à 1 et 10 min de temps de réaction, pour deux groupes de synthèses. La Figure 3.10 (a) présente les spectres d'absorption des cœurs de boites quantiques pour 1 min, et la Fi-

44. Voir section 3.2.2.1 (b).
gure 3.10 (b) pour 10 min. Nous obtenons des cœurs de rayon moyen proche dans les 2 cas, mais avec une dispersion bien plus importante pour 1 min par rapport à 10 min de temps de réaction : 1,48 ± 0,20 et 1,52 ± 0,07 nm. On peut aussi remarquer que nous n'obtenons pas de concentration plus élevée pour le temps de réaction le plus court, comme attendu : 20,98 ± 7,14 µM (1 min) contre 28,95 ± 4,13 µM (10 min).

<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>(a) $t = 1$ min
$Cd(\text{Myr})_2$ (1)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>(b) $t = 10$ min
$Cd(\text{Myr})_2$ (1) et (2)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>(c) $t = 10$ min
$Cd(\text{Myr})_2$ (2) et (3)</figcaption></figure>

Les 3 synthèses de précurseur $Cd(\text{Myr})_2$ sont notées (1), (2), et (3). N correspond au nombre de synthèses réalisées.

Ce phénomène peut avoir plusieurs origines, comme une montée en température pas assez bien maîtrisée pour ces premières synthèses, et/ou une stœchiométrie des réactifs non parfaitement respectée⁴⁵. Comme le montre d'ailleurs divers spectres répartis sur l'ensemble des tracés, la synthèse de précurseur ⁴⁶ $Cd(\text{Myr})_2$ s'est révélée être un paramètre important : le niveau de rinçage des restes de réactifs en fin de synthèse de ce dernier peut effectivement affecter le respect de la stœchiométrie des réactifs et donc le résultat produit pour une pesée donnée. Pour certaines synthèses, le rayon des cœurs obtenus était systématiquement trop important : proche de 1,60 nm, ce qui après croissance des coquilles donnait des spectres de photo-luminescence centrés sur des valeurs ≥ 610 nm. T. Pons nous ayant indiqué qu'il était possible de faire varier la température de synthèse pour stopper la croissance des cœurs ⁴⁷, nous avons repris notre protocole pour les synthèses de $Cd(\text{Myr})_2$ (2) et (3) de manière à explorer l'intervalle de températures 220-230°C, pour 10 min de temps de réaction. Les Figures 3.10 (b) et (c), attestent que cela permet effectivement de retrouver nos valeurs cibles de rayon moyen des cœurs (1,41 ± 0,09 nm), voire légèrement inférieur, ce qui est cette fois-ci associé comme attendu à une augmentation de la concentration moyenne de la solution obtenue (32,69 ± 9,03 µM), à nuancer par la dispersion de la distribution des concentrations pour les solutions concernées. Les courbes correspondant aux synthèses à 225 et 230°C tracées sur les Figures 3.10 (b) et (c) montrent que la variation de température de réaction semble bien être moins important que le $Cd(\text{Myr})_2$ employé, confirmant la synthèse de ce précurseur comme facteur crucial. Il a donc été nécessaire de déterminer, pour chaque synthèse de $Cd(\text{Myr})_2$,

<caption>FIGURE 3.10 – Spectres d'absorption des cœurs $CdSe$.</caption>

45. Mais suffisamment proches pour que cela ne se traduise pas par l'apparition de 2 populations de cœurs

46. Que l'on a détaillée en partie 3.2.2.1 (a).

47. Nous n'avons pas trouvé de publication spécifique reprenant la méthode "Cao" pour étudier l'effet du paramètre température de synthèse, comme son potentiel croisement avec le paramètre du temps de réaction.
quelle était la température de réaction la plus appropriée pour obtenir, de manière reproductible, les QDs<sub>coeurs/coquilles</sub> finaux correspondant à nos besoins<sup>48</sup>.

(b) *Injections et architecture des coquilles*

Pour différentes synthèses de cœurs, les spectres normalisés de photo-
luminescence après croissance des coquilles sont récapitulés sur la Fi-
gure 3.11. Certains spectres ont été obtenus via une excitation à 350 nm,
d'autres à 458 nm, ou même 534 nm – cela n'impacte pas le profil du
spectre d'émission des QDs. Si on peut constater une reproductibilité
importante, avec des pics d'émission plutôt bien centrés à λ ≈ 600 nm
– Figure 3.11 –, les quelques exceptions permettent d'aborder les pa-
ramètres déterminants de cette réaction.

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

Tout d'abord, les volumes injectés à chaque étape de croissance
doivent être le plus proche possible des quantités calculées pour cor-
respondre à la formation de mono-couches, en particulier sur les injec-
tions correspondant aux couches CdS ⁴⁹, au risque de décaler l'émission
vers le rouge de façon trop importante. De plus, le temps laissé entre
chaque injection doit lui aussi être respecté le plus scrupuleusement
possible. Les 2 spectres dont le pic d'émission se situe au-delà de
600 nm, en Figure 3.11 (b), relèvent typiquement d'une croissance
de coquille où ces éléments ont trop dérivé. Enfin, la répartition des
spectres de photo-luminescence, selon la température de synthèse des
cœurs de boites quantiques et les différents précurseurs Cd(Myr)₂, est
quasiment identique à ce qui était observé sur la Figure 3.10 concernant
les spectres d'absorption avant croissance des coquilles. Cela corrobore
le fait que la première étape de croissance des cœurs influence majo-
ritairement le positionnement des spectres de photo-luminescence, et
que les déviations au protocole de croissance des coquilles induisent
seulement des décalages minimes. Ces différentes données nous ont
permis de peaufiner notre démarche de synthèse de boites quantiques
de manière à pouvoir, au pied levé, obtenir des QDs dont l'émission
pouvait être centrée à environ 590 nm ou 600 nm, selon nos besoins.

48. Pour décaler l'émission des QDs finaux loin vers le rouge, outre la température de réaction, il est aussi possible de procéder à une ré-injection des précurseurs au cours de la création des cœurs. Cette méthode nous a permis d'obtenir un spectre d'émission plus étroit et une solution plus concentrée qu'avec une température de réaction augmentée à 250°C. Dans un cas comme dans l'autre, nous n'avons pas eu besoin de ces protocoles pour la suite de la thèse, aussi nous ne détaillerons pas plus ces éléments.

<caption>FIGURE 3.11 – Spectres normalisés de photo-luminescence des différentes solutions de QDs après croissance des coquilles.</caption>

Les 3 synthèses de précurseur Cd(Myr)₂ différentes sont notées (1), (2), et (3). N : nombre de synthèses réalisées. Les couleurs reprennent l'agencement défini en Figure 3.10. Le pic à 534 nm correspond au laser d'excitation utilisé pour certains spectres, sur un montage sans filtre passe-haut.

49. Il est aussi possible de jouer sur l'architecture des coquilles : par exemple, remplacer une couche CdS par une couche CdZnS, permet de limiter le décalage spectral et, dans une certaine mesure, de minimiser la largeur à mi-hauteur du spectre de photo-luminescence.
### 3.2.2.4 Reproductibilité des synthèses

J'ai évalué la qualité des synthèses de plusieurs manières. En ce qui concerne les cœurs, les éléments quantitatifs appropriés⁵⁰ ont été présentés dans la partie précédente. Dans le cadre de l'imagerie NEF, les caractéristiques les plus importantes de nos QDs$_{coeurs/coquilles}$ sont la position du pic d'émission et sa largeur à mi-hauteur du spectre. Le tableau 3.2 ci-dessous récapitule mes résultats⁵¹, où sont exclues du calcul les synthèses où un problème quelconque de manipulation – au niveau de la montée en température, de l'injection des couches, etc. – a pu être explicitement constaté. Lorsque ces précautions sont prises, on peut effectivement constater un faible écart-type pour les différentes grandeurs contrôlées⁵², ce qui accrédite l'idée d'une bonne reproductibilité du protocole de synthèse.

<table><thead><tr><th>Synthèse cœurs</th><th>240°C 10 min</th><th>220°C 10 min</th></tr></thead><tbody><tr><td>Rayon des cœurs (nm)</td><td>1,52 ± 0,07</td><td>1,4 ± 0,1</td></tr><tr><td>Concentration (µM)</td><td>29 ± 4</td><td>33 ± 9</td></tr><tr><td>Pic d'émission cœurs/coquilles (nm)</td><td>599,9 ± 0,2</td><td>591,93 ± 0,04</td></tr><tr><td>LMH émission cœurs/coquilles (nm)</td><td>31,4 ± 0,1</td><td>30,4 ± 0,1</td></tr></tbody></table>

50. Rayon des cœurs et concentration de la solution colloïdale.

51. Obtenus pour chaque spectre via l'outil *Multipeak Fitting 2* du logiciel Igor Pro, puis moyennés.

52. Excepté la concentration, dans le cas de la synthèse ciblant une émission finale de 590 nm.

<caption>TABLE 3.2 – Compilation des éléments de reproductibilité de nos synthèses de QDs.</caption>

### 3.2.3 CARACTÉRISATIONS PHOTO-PHYSIQUES

#### 3.2.3.1 Méthodes empiriques de détermination du rendement quantique

Pour pouvoir faire de l'imagerie FRET quantitative, il est nécessaire d'estimer le rendement quantique⁵³ de l'espèce donneuse, i.e. les QDs dans le cas de l'imagerie NEF, afin d'estimer au mieux le rayon de Förster $R_0$. L'estimation rigoureuse de ce paramètre est souvent plus compliquée qu'il n'y parait à première vue.

53. Qu'on note $\phi$ pour référer à la notion de rendement quantique en général.

#### (a) Méthodes usuelles

La comparaison avec un fluorophore "connu" est la méthode la plus utilisée en raison de son apparente simplicité. Comme le montrent Grabolle et al. [188], cette méthode présente pourtant de nombreuses sources d'incertitudes pouvant se croiser, et généralement non quantifiées : la pertinence du fluorophore choisi comme référence⁵⁴ ; les paramètres précis d'instrumentation⁵⁵ ; ou encore la prise en compte de variabilités photo-physiques⁵⁶. Lorsque ces différents éléments sont pris en compte au mieux, il est possible de déterminer des valeurs de $\phi$ précises à quelques % près. L'utilisation d'une sphère d'intégration, comme introduit par Porrès et al. [189] pour les solutions, est une autre manière classique d'accéder à une valeur de $\phi$, et qui permet normalement d'en mesurer directement une valeur absolue. En plus de ne pas reposer sur une référence potentiellement discutable, ses intérêts expérimentaux principaux sont de s'affranchir des problèmes

54. Même longueur d'onde d'excitation que pour l'application prévue; pureté du fluorophore; rendement quantique relativement consistant à travers la littérature.

55. Largeur de la fente de détection des spectromètres et fluorimètres utilisés; prise en compte de l'irradiance effective de l'échantillon à la longueur d'onde d'excitation.

56. Différences de diagramme de rayonnement entre le standard utilisé et les QDs; dépendance de $\phi$ à la concentration, à l'équilibre d'adsorption / désorption des ligands, au solvant utilisé, à l'irradiance d'excitation.
issus de potentielles anisotropies d'émission, puisque l'ensemble de la lumière émise est – supposément – collectée; et de pouvoir test-ter rigoureusement la dépendance de $\phi$ à la longueur d'onde et l'ir-radiance d'excitation sur une large gamme. À condition de disposer d'une telle sphère d'intégration, et de pouvoir garantir sa parfaite étanchéité et réflectivité, il est ainsi possible d'atteindre, "simplement", une précision sur $\phi$ également de l'ordre de quelques %.

### (b) Méthodes particulières

Il existe par ailleurs diverses méthodes alternatives, nécessitant sou-vent des dispositifs expérimentaux spécifiques, et permettant une esti-mation plus ou moins précise de $\phi$. Les travaux de thèse de X. Brok-mann [190] ont permis de montrer qu'il était possible d'estimer, avec une précision de l'ordre de 10 à 15 %, le rendement quantique de na-nocristaux CdSe individuels *via* une altération de leur environnement immédiat<sup>57</sup>, à travers l'obtention du diagramme de rayonnement et des taux de recombinaison radiatives et non-radiatives dans les deux situations [191, 192]. Par la suite, cette idée générale se retrouve chez Chizhik *et al.* [193], qui ont montré la possibilité de mesurer le rende-ment quantique de multiples émetteurs présents dans un mélange, via l'utilisation de nano-cavités Fabry-Pérot de taille variable et plusieurs fenêtres de détection spécifiques sur un montage confocal – incertitude de 5 %. Il existe aussi plusieurs propositions méthodologiques repo-sant globalement sur la thermo-optique. Que ce soit par TSL<sup>58</sup> [194] ou PTQYm<sup>59</sup> [195], le principe repose sur l'analyse de la perte de chaleur vers l'environnement.

### (c) Méthode choisie

Enfin, il existe une méthode basée sur la relation de Strickler-Berg [196] ou sa version étendue par Briks-Dyson [197]. Dérivées directe-ment à partir des coefficients d'Einstein, elles servent à produire une es-timation du taux de recombinaisons radiatives $k_r$ à partir des mesures expérimentales des spectres d'absorption et de photo-luminescence. Complété par une mesure expérimentale de la durée de vie de fluores-cence $\tau$, cela permet de remonter à une valeur de $\phi$. Étant donné que l'acquisition de ces spectres était une procédure routinière de contrôle de nos synthèses de QDs, et que nous disposions d'un montage de mesure de durée de vie de fluorescence durant une partie de ce pro-jet doctoral, nous avons employé cette méthode, dont je présente les résultats dans la section suivante. Les Éq. (3.2.7) à (3.2.9) rappellent la définition générale du rendement quantique $\phi$ par rapport aux taux de recombinaisons radiatives $k_r$ et non radiatives $k_{nr}$ ($s^{-1}$), ainsi que de la durée de vie de l'émission $\tau$ (s) – qu'il s'agisse de luminescence ou fluorescence.

57. En l'occurrence, des QDs individuels sont emprisonnés dans une couche de polyméthacrylate de méthyle acry-lique (PMMA) de 45 nm d'épaisseur; l'altération de l'environnement se fait par l'ajout d'une couche de poly-diméthylsiloxane (PDMS) de 200 µm d'épaisseur.

58. *Thermal Lens Spectrometry.*

59. *Photo Thermal Quantum Yield measurement.*

$$ \phi = \frac{k_r}{k_r + k_{nr}} \qquad (3.2.7) $$

$$ \tau = \frac{1}{k_r + k_{nr}} \qquad (3.2.8) $$

Donc

$$ \phi = k_r \cdot \tau \qquad (3.2.9) $$
### 3.2.3.2 Détermination du taux de recombinaisons radiatives

#### (a) Développement historique du formalisme

À partir de la relation, établie par Einstein, entre les probabilités d'absorption et d'émission spontanée d'un photon pour une molécule donnée, plusieurs tentatives de définition du taux de relaxations radiatives $k_r$ par rapport au spectre d'extinction ont été proposées durant la première partie du XXᵉ siècle – dont une par Förster [198]. L'équation établie par Strickler et Berg, Éq. (3.2.10) et (3.2.11), est le premier formalisme rigoureux d'une telle relation [196]. Elle est exprimée en fonction du nombre d'onde $\tilde{\nu}$ (cm$^{-1}$) et d'un coefficient numérique résultant de plusieurs constantes. La grandeur $n$ représente l'indice de réfraction du milieu ; F l'intensité de fluorescence relative ; et $\epsilon(\tilde{\nu})$ le coefficient d'extinction molaire (L·mol$^{-1}$·cm$^{-1}$), dont l'intégrale est définie sur la bande d'absorption correspondant aux transitions concernées. La dégénérescence des niveaux électroniques est prise en compte par le facteur $g_l/g_u$$^{60}$. Pour une fluorescence issue de transitions entre états singulets, $g_l/g_u = 1$. Les travaux de Birks et Dyson [197] ont conduit à formaliser une version étendue de cette définition du taux de recombinaisons radiatives $k_r$, Éq. (3.2.12), qui prend en compte la potentielle dispersion optique du solvant des molécules considérées, avec $n_a$ et $n_f$ les indices de réfraction des milieux d'absorption et d'émission. À partir des années 2010, les travaux de Gong et al. [199, 200] ont entrepris de montrer la pertinence d'une telle approche pour les QDs, en proposant une adaptation de ces relations – cf. Éq. (3.2.13) et (3.2.14). Le coefficient $C_{fs}$ – où $k_B$ représente la constante de Boltzmann – remplace le rapport de dégénérescence des niveaux d'énergie, et sert à prendre en compte la population [201, 202] et les forces d'oscillateur relatives des différentes transitions excitoniques. Comme expliqué en section 3.1.2.1, la structure électronique fine des nanocristaux CdSe implique que certains niveaux d'énergie excitoniques thermiquement accessibles seront émetteurs et d'autres non. La prise en compte de tous ces niveaux est donc impérative dans le calcul. Pour calculer $C_{fs}$, il est alors nécessaire de connaître, pour un niveau d'énergie $E_i$ donné, la fraction de force d'oscillateur correspondante $f_i$.

#### (b) Calculs du taux $k_r$ de recombinaisons radiatives des cœurs CdSe

La section qui suit ne concerne que le calcul de $k_r$ pour le cas des cœurs de QDs. Dans chaque cas étudié, les intégrales spectrales sont obtenues à partir de l'outil *Multipeak Fitting 2* du logiciel Igor Pro. Les spectres ont été réalisés dans une solution d'héxane $n = 1,375$. L'obtention de $C_{fs}$ est plus complexe$^{61}$, car elle nécessite d'utiliser divers détails des travaux de Efros & Rosen [154, 156]. Dans notre approximation, nous considérons la transition fondamentale $1S_{3/2}-1S_e$ uniquement$^{62}$. L'évaluation des différentes énergies relatives $E_i$ des sous-états $i$ de la structure fine nécessite essentiellement de déterminer la contribution de l'interaction d'échange, notée $4\eta$, et qui suit la loi

$$k_r = 2,88 \cdot 10^{-9} n^2 \langle \tilde{\nu}_f^{-3} \rangle^{-1} \frac{g_l}{g_u} \int \frac{\epsilon(\tilde{\nu})}{\tilde{\nu}} d\tilde{\nu} \quad (3.2.10)$$

$$\langle \tilde{\nu}_f^{-3} \rangle^{-1} = \frac{\int F(\tilde{\nu}) d\tilde{\nu}}{\int F(\tilde{\nu}) \cdot \tilde{\nu}^{-3} d\tilde{\nu}} \quad (3.2.11)$$

60. Le niveau $l$ (lower) correspondant à l'état fondamental, et le niveau $u$ (upper) à l'état excité, $g_l$ et $g_u$ représentent respectivement les multiplicités des états $l$ et $u$.

$$k_r = 2,88 \cdot 10^{-9} \frac{n_f^3}{n_a} \langle \tilde{\nu}_f^{-3} \rangle^{-1} \frac{g_l}{g_u} \int \frac{\epsilon(\tilde{\nu})}{\tilde{\nu}} d\tilde{\nu} \quad (3.2.12)$$

$$k_r \approx 2,88 \cdot 10^{-9} n^2 \langle \tilde{\nu}_f^{-3} \rangle C_{fs} \int \frac{\epsilon(\tilde{\nu})}{\tilde{\nu}} d\tilde{\nu} \quad (3.2.13)$$

$$C_{fs} = \frac{\sum_i f_i \cdot e^{-\frac{E_i}{k_B T}}}{\sum_i e^{-\frac{E_i}{k_B T}}} \quad (3.2.14)$$

61. On rappelle à ce titre qu'un déroulement pas-à-pas en langue française est proposé en [158].

62. Gong et al. [199, 200] recommandent de prendre en compte les populations d'excitons $1P_{3/2}-1S_e$, thermiquement accessibles, si l'on souhaite les résultats les plus fins possibles.
$4\eta(R) = 48/R^3$ dans le cas d'un coeur sphérique ZB de CdSe – R étant le rayon moyen des nanocristaux. Dans ces conditions, l'effet du champ cristallin et de l'anisotropie de forme peuvent être considérées comme nulles.

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

La séparation des différents niveaux d'énergie obtenue est représentée en Figure 3.12 (a), où les sous-états notés $\pm 1^U$ et $0^U$ sont les états émetteurs, de forces d'oscillateurs respectives valant 2 et 1; et les sous-états notés $\pm 1^L$ sont les 2 états sombres, de force d'oscillateur nulle$^{63}$. Ces éléments nous permettent de calculer $C_{fs}$ – Figure 3.12 (b) – et donc d'aboutir à une estimation des $k_r$ de nos cœurs de boites quantiques, donnés en Figure 3.12 (c). Par exemple, pour un rayon de cœur de 1,52 nm, $k_r \approx 16 \times 10^6$ s$^{-1}$.

<caption>FIGURE 3.12 – Détermination de $k_r$ d'après la structure fine de la 1ère transition excitonique.</caption>

63. Lorsque l'on normalise par les valeurs des niveaux d'énergie non-émissifs, on retrouve l'allure des courbes produites dans la littérature [163].

### 3.2.3.3 Durée de vie de la photoluminescence

Le second élément nécessaire pour l'estimation du rendement quantique est la durée de vie de la photoluminescence. Les mesures de cette grandeur ont été réalisées sur un montage dédié, à l'aide d'un laser à impulsion picoseconde$^{64}$, émettant à 532 nm. L'histogramme des temps d'arrivée des photons a été enregistré en mode comptage de photons$^{65}$ à l'aide d'une carte appropriée$^{66}$. La Figure 3.13 présente un exemple typique de déclin de photoluminescence obtenue par cette méthode. Ce type de caractérisation ayant été faite de manière rouinière après nos synthèses, à la suite de nos spectres d'absorption et de photoluminescence, la concentration des solutions étudiée était de l'ordre de 100 nM. Pour un signal d'environ 10 000 coups/s, nous avons effectué des acquisitions de 2 min pour construire des courbes de déclin de qualité suffisante. Ces dernières ont ensuite été fitées par une fonction multi-exponentielle à l'aide du logiciel SymPhoTime, en prenant en compte la réponse impulsionnelle du solvant – cf. Éq. (3.2.15), où A est l'amplitude totale et $a_i$ le poids de chaque déclin $\tau_i$, avec $\sum_i a_i = 1$. La convergence du fit pouvant varier selon les bornes choisies, 5 à 10 fits ont été réalisés par courbe de déclin en faisant varier ces bornes.

64. NdYAG doublé, taux de répétition 20 MHz, Time-Bandwidth.

65. Time-correlated single photon counting (TCSPC).

66. PicoHarp 300, PicoQuant. Réponse instrumentale ~0,1 ns.

$$F(t) = A \cdot \sum_{i} a_i \cdot e^{-\frac{t}{\tau_i}} \quad (3.2.15)$$
<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>FIGURE 3.13 – Exemple de mesure de déclin de la photoluminescence de cœurs CdSe et cœurs/coquilles CdSe/CdS/CdZnS/ZnS.</figcaption></figure>

La prise en compte de la réponse impulsionnelle du solvant aide à la détermination des composantes au temps court. La qualité du *fit* est évaluée par la méthode des moindres carrés, où le résidu *Res* doit rester au plus proche de zéro.

La Table 3.3 donne les résultats numériques moyens concernant le *fit* illustré en Figure 3.13. Dans le cas des QDs, le déclin de photoluminescence n’est en effet pas mono-exponentiel. Dans ce cas, il est préférable d’estimer le rendement quantique à partir de la détermination de la durée de vie moyenne $\tau_m$, définie par l’Éq. (3.2.16). Or le nombre de déclins physiquement envisageables est un choix *a priori* sur le modèle utilisé pour la régression, qui influence plus ou moins la valeur finale attribuée au temps de durée de vie moyen $\tau_m$.

<table><thead><tr><th>a<sub>1</sub></th><th>τ<sub>1</sub></th><th>a<sub>2</sub></th><th>τ<sub>2</sub></th><th>a<sub>3</sub></th><th>τ<sub>3</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>0,32±0,01</td><td>15,2±0,6</td><td>0,58±0,05</td><td>0,9±0,1</td><td>0,102±0,006</td><td>2,4±0,1</td></tr><tr><th>A</th><th>τ<sub>m</sub></th><th>χ<sup>2</sup></th><th></th><th></th><th></th></tr><tr><td>1573,2±3,8</td><td>13,4±1,1</td><td>1,0</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

$$ \tau_m = \frac{\int_0^\infty F(t) \cdot t \cdot dt}{\int_0^\infty F(t) \cdot dt} = \frac{\sum_i a_i \cdot \tau_i^2}{\sum_i a_i \cdot \tau_i} \quad (3.2.16) $$

<caption>TABLE 3.3 – Résultats moyens des 10 *fits* tri-exponentiels réalisés pour le déclin de cœurs CdSe donné en Figure 3.13. $\tau_i$ (ns).</caption>

La Figure 3.14 récapitule les valeurs de durée de vie moyenne $\tau_m$ mesurées pour les différentes synthèses, ainsi que les valeurs des différents déclins $\tau_i$, accompagnées de leur poids relatif. Nous avons constaté qu’avec une régression bi-exponentielle, la valeur moyenne de l’estimateur de la qualité de la régression $\chi^2$ est, sauf exception, systématiquement plus grand que 1, compris dans l’intervalle 1,06-4,42, et surtout plus dispersée à travers les échantillons. Dans le cas où l’on utilise un modèle tri-exponentiel : les valeurs moyennes de $\chi^2$ sont dans l’intervalle 0,95-1,17, ce qui est plus acceptable. Les *fits* à 3 exponentielles permettent de distinguer nettement 3 déclins. Les 2 premiers, présents dans le modèle à 2 exponentielles, sont de durées de vie respectives $\tau_1 = 12-17$ ns et $\tau_2 \le 1$ ns. Ce 2ème déclin est nettement majoritaire, avec un poids $a_2 = 0,49-0,96$, alors que les valeurs de $a_1$ se situent sauf exception dans l’intervalle 0,02-0,43. Les valeurs de durée de vie $\tau_3$ du 3e déclin se situent dans l’intervalle 1,45-3 ns, avec un poids $a_3 = 0,01-0,32$ équivalent à $a_1$. Divers travaux dans la littérature [167-170, 203, 204] permettent d’interpréter ces différents déclins : la composante longue $\tau_1$ est à associer aux excitons simples (X); la composante $\tau_2$