# SECTION XII.
## SCIENCES VÉTÉRINAIRES

DOI 10.36074/logos-08.07.2022.037

# VERS L'FARM INITIATIVE: COMMENT UN ANTIGÈNE ARTIFICIEL DE LA PESTE PORCINE AFRICAINE PEUT AIDER L'EXPORTATION AGRICOLE DE L'UKRAINE

### GROUPE DE RECHERCHE:

**Buzun Andriy-Igor**
docteur en philosophie, professeur agrégé,
responsable du Laboratoire d'Etude des Maladies du Porc
de l'Centre Scientifique National
"Institut de Médecine Vétérinaire Expérimentale et Clinique"

**Kit Marina**
étudiant diplômé, chercheur junior du Laboratoire d'Etude des Maladies du Porc
de l'Centre Scientifique National
"Institut de Médecine Vétérinaire Expérimentale et Clinique"

**Stegniy Marina**
docteur en philosophie, professeur agrégé,
responsable du Laboratoire de Biotechnologie
de l'Centre Scientifique National
"Institut de Médecine Vétérinaire Expérimentale et Clinique"

**Bobrovickaya Irina**
chercheur junior du Laboratoire d'Etude des Maladies du Porc
de l'Centre Scientifique National
"Institut de Médecine Vétérinaire Expérimentale et Clinique"

UKRAINE

Les défis actuels de la situation en Europe de l'Est, notamment en ce qui concerne l'exportation des produits agricoles, placent les "pays du tiers monde" au bord de la famine massive, ce qui conduira inévitablement à une montée encore plus grande des tensions dans les pays du G7 en raison à l'augmentation de l'activité migratoire de la population appauvrie, ainsi qu'au déclenchement de guerres locales et d'épidémies [1-5]. Une place importante dans la régulation de cette situation est occupée par la question de la préservation et du développement des opportunités d'exportation du secteur agricole de l'Ukraine [2]. À leur tour, la situation épizootique complexe concernant la peste porcine africaine (PPA) et le niveau élevé d'activité agro-terroriste de l'ennemi sont les tristes réalités des exportations agricoles modernes de l'Ukraine [3, 4, 5, 6]. A notre avis, les besoins critiques en moyens et mesures de lutte contre l'agroterrorisme (y compris PPA) sont et resteront dans un futur proche leur disponibilité budgétaire et leur adéquation à l'usage quotidien des structures de base de contrôle des exportations.
Dans la présente publication, nous analysons les données de nos propres recherches, qui nous ont convaincus des perspectives de leur utilisation possible dans des solutions à petit budget d'élevage porcin domestique sous la menace de la PPA, et donc pour les exportations agricoles ukrainiennes

**Matériaux & Méthodes** *Antigène recombinant du virus PPA* - Il existe des amorces avec des séquences cibles et des sites de clonage combinatoire Star Gate ont été utilisés pour obtenir le gène artificiel du polypeptide p32 du virus PPA (tableau 1). Le système de cellules compétentes transformées de manière appropriée de E. coli NEB Turbo (NEB, USA) a été utilisé comme vecteur du gène indiqué. Il existe des amorces avec des séquences cibles et des sites de clonage combinatoire Star Gate ont été utilisés pour obtenir le gène artificiel du polypeptide p32 du virus PPA (tableau 1). Le système de cellules compétentes transformées de manière appropriée de E. coli NEB Turbo (NEB, USA) a été utilisé comme vecteur du gène indiqué.

<table><caption>Tableau 1
Ensembles d'amorces utilisés pour concevoir des protéines recombinants [7]</caption><thead><tr><th>Primer name</th><th>Primer sequence, 5'→3'</th><th>Encoded gene</th><th>Amplicon length, bp</th><th>Annealing temperature, °C</th></tr></thead><tbody><tr><td>p10_F</td><td>AGCGCGTCTCCAATGCCTACAAAAGCTGGC</td><td rowspan="2">K78R</td><td rowspan="2">237</td><td rowspan="2">59</td></tr><tr><td>p10_R</td><td>AGCGCGTCTCCTCCCTTTTGACCGTTTAATTTTTTTCTCC</td></tr><tr><td>p32_F</td><td>AGCGCGTCTCCAATGGATTTTATTTTAAATATATCCATG</td><td rowspan="2">CP204L</td><td rowspan="2">615</td><td rowspan="2">52</td></tr><tr><td>p32_R</td><td>AGCGCGTCTCCTCCCAACATTAAATGTAGGTGAG</td></tr><tr><td>p54_F</td><td>AGCGCGTCTCCAATGGATTCTGAATTTTTTCAACCGG</td><td rowspan="2">E183L</td><td rowspan="2">552</td><td rowspan="2">52</td></tr><tr><td>p54_R</td><td>AGCGCGTCTCCTCCCAAGGAGTTTTCTAGGTC</td></tr><tr><td>p54ΔT_F1</td><td>GCCGCGTCTCGAATGGATTCTGAATTTTTTCAAC</td><td rowspan="4">E183LΔ</td><td>115</td><td rowspan="4">50</td></tr><tr><td>p54ΔT_R1</td><td>CACCACACGTCTCGAACCGCCACCGAAGAAGCTCGG</td></tr><tr><td>p54ΔT_F2</td><td>GCCGCGTCTCAGGTTTCGATTATTATCATCG</td></tr><tr><td>p54ΔTM_R2</td><td>CGGCCGTCTCATCCCCAAGGAGTTTTCCAGGTC</td></tr><tr><td>ligase_F</td><td>AGCGCGTCTCCAATGCTAAATCAATTTCCTGGG</td><td rowspan="2">NP419L</td><td rowspan="2">1260</td><td rowspan="2">52</td></tr><tr><td>ligase_R</td><td>AGCGCGTCTCCTCCCAATGATTTCTAAAAACATTTATCGG</td></tr><tr><td>ligaseΔDBD_F</td><td>TAATCGTCTCAAATGAGAGGAATGATCCCCCCTATG</td><td rowspan="2">NP419LΔ</td><td rowspan="2">928</td><td rowspan="2">60</td></tr><tr><td>ligaseΔDBD_R</td><td>CGGCCGTCTCATCCCAATGATTTCTAAAAAC</td></tr></tbody></table>

Pour l'expression et la purification de la protéine p32 recombinante, une culture d'une nuit d'E. coli BL21 Lemo (D3) transformée a été diluée à 1:50 dans du milieu LB frais avec de la carbénicilline et cultivée à 37°C jusqu'à une DO de 0,4 à 0,6. L'expression de la protéine a été induite par l'anhydrotétracycline (200 ng/ml) suivie d'une incubation de 3 heures à 37°C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 6700 g pendant 10 minutes et conservées à -20°C jusqu'à utilisation. Pour extraire du polypeptide p32 recombinant, les cellules ont été détruites par homogénéisation pendant 30 s à 6 m/s. Sa purification a été réalisée par chromatographie d'affinité à l'aide de colonnes Strep-TactinXT 4Flow remplies de résine Strep-TactinXT 4Flow (IBA Lifesciences, Allemagne). La purification du produit natif a été réalisée selon les instructions du fabricant de la colonne. Cependant, la purification des protéines dans des conditions dénaturantes, en présence d'urée, a permis d'augmenter significativement l'efficacité de la procédure de purification. Ces procédures sont décrites plus en détail plus haut (Kit M. Yu., 2021). Comme il a été établi dans les tests de contrôle, l'antigène artificiel obtenu dans la dilution optimale (1: 100 par tampon carbonate-bicarbonate, pH 9,5) a permis avec une reproductibilité et une spécificité de 100% de détecter des anticorps contre l'agent causal de l'ARP - à la fois dans des séums de porc hautement et faiblement actifs (n = 14).

**Réactifs de référence** - "Antigène cytoplasmique" du virus PPA produit par le Centre national de recherche espagnol "CISA-INIA" (t. Valdealomos), fourni par NSC
"IECVM" NAAS d'Ukraine dans le cadre d'une subvention de l'UE Dr. M. Arias à des fins de scientifique par du personnel formé; Sérumes spécifiques de virus - sérumes de référence contre les virus ASF, CSF et PCV-2 (positifs, faiblement positifs et négatifs pour ces virus), obtenus auprès des centres de référence de l'OIE au NSC espagnol "CISA-INIA" (t. Valdealomos) et le NIS polonais "PIWet" (Pulawy) dans le cadre de subventions de l'UE pour une utilisation dans la recherche par du personnel certifié. Dilution de travail 1:800 par tampon carbonate-bicarbonate, pH 9,5

**Biomatériaux de terrain**- les échantillonneurs de salive de sanglier ont été fabriqués à partir d'une corde de coton brut non peinte, dont l'extrémité a été plongée de 15 à 20 cm dans l'appât. L'appât est composé de farine de maïs, de lait en poudre, d'huile de coco, de paraffine et d'arôme d'amande sous un film protecteur. Pour recueillir le liquide buccal des sangliers, le personnel du parc national a retiré le film protecteur de l'appât et l'a attaché à un arbre de sorte que l'appât soit suspendu à une hauteur de 15 à 20 cm du sol. À une température ambiante <0oC, les échantillonneurs ont été vérifiés une fois tous les 7 jours, lorsque la température augmentait - une fois tous les 2-3 jours.

**L'analyse immunodiagnostique** a été réalisée en utilisant les méthodes du test ÉLISA [6] et de la réaction d'hémagglutination passive, H.A.P. [8] dans les modifications suivantes : 1) Test ÉLISA : réaction Ag-Ab à une température de 45°C pendant 20 min. dans un bain-marie; la comptabilisation des résultats est visuelle - en comparaison avec les puits témoins de référence. 2) H.A.P.: les antigènes érythrocytaires "recombinants" et "cytoplasmiques" ont été préparés par la méthode de leur réticulation covalente avec des érythrocytes fixés d'oiseaux, stockés à une température (moins 8-12)°C dans du glycérol, leur utilisé à une concentration de 0,8-1,0 %, à une dose de 0,25µl; diluant - tampon véronal-gélatine modifié pH 7,5-7,8, volume réactionnel total 100µl; la durée de la réaction "Ag-Ab" à une température de (18-24)°C est de 45-60 minutes.

**Dosage de allergie**- sur des cobayes pesant 180-250 g. A deux d'entre eux, dans des conditions de biosécurité appropriées, une dose de 2 ml a été injectée par voie intrapéritonéale avec du sang de cobaye stabilisé avec le contenu du virus de la maladie d'Aujeski, et deux avec le contenu du virus PPA. 1,5 semaines après cela, le polypeptide recombinant p32, dilué à 1:25, a été injecté dans la lèvre supérieure à une dose de 0,1 ml à tous les animaux. Comptabilisation des réactions - pendant les 24 heures.

**Résultats**- Les résultats propres les plus significatifs sont visualisés dans le collage des Figs. 1. Malheureusement, après le 24 février 2022, la loi martiale ne nous a pas permis d'atteindre le niveau de probabilité nécessaire, nous les annonçons donc comme une base concrète pour de nouvelles recherches dans cette direction - éventuellement avec des subventions.

Ainsi, sur la base d'un panel d'échantillons de sang de terrain provenant de porcs suspectés d'éclosion de peste porcine africaine (n = 3) par rapport à des échantillons témoins positifs et négatifs (n = 4) en 5 répétitions, des résultats ELISA reproductibles à 100 % avec une compatibilité visuelle (Fig. 1A). Les données obtenues ont démontré la même spécificité du polypeptide recombinant p32 (ci-après - antigène artificiel) et de l'antigène « cytoplasme » CISA-INIA. Les trois sérumes de terrain à une dilution de 1:50 et plus étaient négatifs, ce que les développeurs de l'exigence CISA-INIA indiquent la séronégativité des têtes de porc respectives. Ces deux antigènes dans l'ELISA ont été ignorés par les anticorps dirigés contre l'agent pathogène de la peste porcine africaine dans des échantillons de salive de sanglier (n = 6), qui provenaient d'une des réserves de la zone endémique de la peste porcine africaine, selon nos données.
D'autre part, les deux antigènes dans le diagnostic érythrocytaire du PPA ont révélé 3 positifs pour les anticorps contre les échantillons de PPA provenant des 6 échantillons de salive de sanglier mentionnés ci-dessus (illustrés à la Fig. 1C). Dans le même temps, aucun anticorps contre le PPA n'a été détecté dans le HAP lors du test d'un panel d'échantillons de sang de terrain provenant de porcs suspectés d'éclosion de PPA

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Fig. 1. Visualisation des effets potentiellement significatifs propres résultats sur l'adéquation de l'antigène artificiel du virus PPA pour le diagnostic immuno- et allergologique des méthodes de mesures de contrôle du PPA.
Voir le texte pour plus de détails</figcaption></figure>

(n = 3) par rapport aux échantillons de référence positifs et négatifs (n = 4), dans 7 répliques. L'un des deux cobayes, qui a été "sensibilisé" avec le pathogène PPA, a montré une violente réaction allergique à l'antigène artificiel à partir de la 4ème heure après l'administration (Fig. 1D). Au site d'injection de cet antigène, une tumeur d'un diamètre allant jusqu'à 0,7 mm s'est formée, typique d'une réaction d'hypersensibilité de type retardé. Après 3 jours, comme le montre la photo, il s'est transformé en un foyer de nécrose cutanée. Cela n'a été observé chez aucun des trois animaux de laboratoire restants.

**Débats et conclusions** – Les résultats obtenus doivent être considérés comme préliminaires : en conséquence de l'impact sur la recherche scientifique des circonstances de force majeure de la guerre. Cependant, nous les considérons comme encourageants pour la poursuite des tests du polypeptide recombinant p32
du virus PPA obtenu avec l'aide de spécialistes allemands. Le Dr C. Gallardo etc. (2009) a montré que l'utilisation de ce polypeptide en ELISA diminue légèrement l'efficacité du suivi sérologique de la PPA par rapport au polypeptide 57, et plus encore avec l'antigène « cytoplasmique » CISA-INIA [9].

Cependant, compte tenu de la situation actuelle en Ukraine, le polypeptide recombinant p32 peut être considéré comme prometteur pour le développement de tests express de contrôle de la biosécurité sur le terrain des exportations agricoles. En particulier, l'utilisation de ce polypeptide pour la réalisation de diagnostics érythrocytaires a permis de détecter des anticorps spécifiques du virus, à notre avis, de la classe des IgA dans des échantillons de salive de sanglier. Cela simplifie grandement la procédure de suivi du PPA, car N.A.R. non seulement beaucoup moins cher que l'ELISA, mais aussi plus polyvalent pour les classes d'immunoglobulines animales. En outre, une propriété encourageante du polypeptide p32 artificiel est l'éventuelle allergénicité de ses composants individuels. Cela peut devenir la base du développement d'un test cutané pour le PPA, ce qui réduira considérablement le coût de son contrôle et le rendra plus accessible aux producteurs et exportateurs agricoles.

## Liste de références:

[1] G7 Leaders' Communiqué - Executive summary // European Council Statements and remarks, 28 June 2022. Access on site https://www.consilium.europa.eu/en/press/press-releases/2022/06/28/g7-leaders-communique/

[2] Glamann Ph. G-7 Grapples for Ways to Punish Russia While Taking on China. Access on site https://www.bloomberg.com/news/articles/2022-06-28/

[3] Putin's war threatens millions with hunger / access https://www.ft.com/con-tent/2041e0b3-bd80-44c7-a463-6c617f0facdb

[4] The importance of Ukraine and the Russian Federation for Global Agricultural Markets and the risks associated with the war in Ukraine / FAO information note (10 June 2022 Update). Access on site https://www.fao.org/3/cb9013en/cb9013en.pdf

[5] Ukraine Russia Crisis: Terrorism Briefing / Academic and Research Institution (Australia) 1 Mar 2022. Access on site http://www.economicsandpeace.org/

[6] Josep Borrell: La Russie a détruit à Mykolaïv le deuxième plus grand terminal céréalier d'Ukr. Ukrinform 03 juillet 2022 Access on site https://www.ukrinform.fr/img/logo_eng.svg

[7] Kit M. Yu. Development of recombinant antigen expression and purification for ASF serological diagnostics. Journal for Veterinary Medicine, Biotechnology and Biosafety Volume 7, Issue 3, 2021, p. 24-31. DOI 10.36016/JVMBBS-2021-7-3-4

[8] Labadie, J. P., Gérard Corthier, J. M. Aynaud, L. Renault and Josée Vaissaire. "Peste porcine classique : recherche des anticorps spécifiques par la technique d'hémagglutination passive." *Bulletin De L Academie Veterinaire De France* (1977): 533.

[9] Gallardo C., Reis A.L., Kalema-Zikusoka G, Joana Malta, Alejandro Soler, Esther Blanco, R. M. E. Parkhouse, Leitão A. Recombinant Antigen Targets for Serodiagnosis of African Swine Fever // Clinical and Vaccine Immunology /Volume 16, Issue 7, July 2009, Pages 1012-1020 https://doi.org/10.1128/CVI.00408-08