L’ostéogenèse imparfaite (OI) est une maladie génétique rare du tissu osseux, causée principalement par une mutation autosomique dominante des gènes COL1A1 ou COL1A2, codant pour les chaînes alpha du collagène de type 1. Dans les formes sévères et chez les patients non marchants, chez qui la pratique d’exercice physique est difficile, l’exposition de l’os aux stimulations mécaniques, en favorisant les mouvements, notamment par la physiothérapie et les aides à la mobilité, est un point essentiel de la pratique clinique. Cependant, les effets de la stimulation mécanique au niveau cellulaire restent inconnus pour cette pathologie.

L’hypothèse de cette étude est que les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSCs) de patients atteints d’OI sont aussi sensibles à la stimulation mécanique que celles de patients sains, justifiant la pratique clinique actuelle.

Des hMSCs ont été extraites chez trois témoins sains et trois patients atteints d’OI lors d’une ostéotomie programmée d’un os long du membre inférieur. Les CSM saines et celles souffrant d’OI ont été exposées à des contraintes de cisaillement de 0, 0,7, 1,5 et 3Pa à une fréquence de 2,8Hz pendant 30minutes à l’aide d’un système commercial Ibidi. L’expression génétique de la prostaglandine endoperoxyde synthase 2 (PTGS2), précoce et mécanosensible, a été examinée une heure après la stimulation afin de déterminer la meilleure valeur de la stimulation mécanique. Pour ce niveau de stimulation mécanique, l’expression de sept autres gènes mécanosensibles a également été examinée après exposition à une contrainte de cisaillement intermittente de 1,5Pa.

Dans toutes les hMSCs, la stimulation mécanique a induit la surexpression du gène PTGS2 avec un maximum après l’exposition à une contrainte de cisaillement intermittente de 1,5Pa et sans différence significative entre les donneurs OI et les donneurs sains. À l’exception du facteur de croissance des fibroblastes 2, l’expression des gènes chez les donneurs OI s’est avérée significativement différente de celle des hMSCs non exposées à la contrainte de cisaillement. De plus, l’expression relative associée à la stimulation mécanique n’était pas significativement différente entre les donneurs sains et les donneurs OI pour la plupart des autres gènes.

Cette étude est la première à décrire que les hMSCs de patients atteints d’OI sont aussi sensibles à la contrainte mécanique de cisaillement que les hMSCs de patients sains. La valeur de la contrainte mécanique qui entraîne le plus grand changement dans l’expression de PTGS2 chez les patients atteints d’OI est similaire à celle rapportée dans la littérature pour les patients sains. Ces résultats constituent une étape importante vers d’autres études fondamentales visant à confirmer l’effet du stress mécanique au niveau cellulaire à long terme et, plus important encore, vers le développement de protocoles cliniques pour la stimulation mécanique des patients.

III ; étude comparative avec groupe témoin.

Osteogenesis imperfecta (OI) is a rare genetic bone disorder, mainly caused by autosomal dominant mutations of the COL1A1 or COL1A2 genes that encode the alpha chains of type 1 collagen. In severe forms and in nonambulatory patients, for whom physical exercise is difficult, exposing the bone to mechanical stimuli by promoting movement, especially with physiotherapy and mobility aids, is an essential part of clinical practice. However, the effects of mechanical stimulation at the cellular level remain unknown for this disease.

The study hypothesis was that human mesenchymal stem cells (hMSCs) from patients with OI were as sensitive to mechanical stimulation as those from healthy patients, validating the current clinical practice.

hMSCs were harvested from 3 healthy control subjects and 3 patients with OI during an elective osteotomy of a long bone of the lower limb. The healthy and OI hMSCs were then exposed to mechanical stimuli, such as intermittent shear stress of 0, 0.7, 1.5, and 3 Pascal (Pa) at a frequency of 2.8 Hertz (Hz) for 30minutes using a commercial ibidi system. The immediate early gene expression of the mechanosensitive prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2) was examined 1hour after stimulation to determine the best level of mechanical stimulation. The expression of 7 other mechanosensitive genes was also examined for this level of mechanical stimulation after applying intermittent shear stress at 1.5Pa.

In all hMSCs, mechanical stimulation induced PTGS2 gene overexpression with a maximum after exposure to intermittent shear stress of 1.5Pa and without significant differences between OI and healthy donors. Except for fibroblast growth factor 2, gene expression in OI donors was found to be significantly different from that in hMSCs not exposed to shear stress. Moreover, the relative expression associated with mechanical stimulation was not significantly different between healthy and OI donors for most other genes.

This is the first study to demonstrate that hMSCs from patients with OI are as sensitive to mechanical shear stress as those from healthy donors. The mechanical stress that resulted in the greatest change in the expression of PTGS2 in patients with OI was similar to that previously reported in the literature for healthy subjects. These findings are an important step toward further fundamental research aimed at confirming the effects of mechanical stress at the cellular level over the long term and, more importantly, toward developing clinical protocols for delivering mechanical stimuli to these patients.

III; comparative case-control study.

# Introduction

L’ostéogenèse imparfaite (OI) est une maladie génétique rare avec une prévalence de 1/15 000 naissances [1,2]. En 1979, Sillence a proposé une classification clinique en quatre types [3] : le type I (forme la plus légère), le type II (forme périnatale létale), le type III (forme la plus sévère compatible avec la vie), et le type IV (groupe intermédiaire). Cette classification permet de catégoriser actuellement 85–90 % des patients atteints d’OI porteurs de mutations autosomiques dominantes dans les gènes codant pour le collagène de type I (COL1A1 ou COL1A2). L’augmentation constante de la découverte de nouveaux gènes permet de distinguer plus de seize types et une nouvelle classification basée sur les voies métaboliques a été proposée [1,4].

Il n’existe pas, actuellement de traitement curatif pour l’OI, et le traitement symptomatique, associant ostéosynthèses préventives [5–7] et administration de bisphosphonates, pour moduler l’activité des ostéoclastes et prévenir la résorption osseuse [8], restant pour certains controversée [9] ainsi que des thérapies émergentes, visant à stimuler les ostéoblastes [10,11]. Les patients atteints d’OI sévère ne sont généralement pas marchants ou ont de grandes difficultés à se déplacer. Cette activité physique réduite a des conséquences sur le processus de remodelage osseux avec une diminution de la masse osseuse, et donc une augmentation de la fragilité osseuse [12]. Ainsi, la période d’immobilisation nécessaire à la consolidation des fractures a été décrite comme préjudiciable [13]. La thérapie physique, la rééducation et les aides à la mobilité sont des points majeurs de la prise en charge de ces patients, en période postopératoire et tout au long de la vie. Stimuler naturellement ces patients sur le plan mécanique semble favoriser le processus de consolidation. Cependant, les connaissances actuelles et le rationnel de ces pratiques cliniques à l’échelle cellulaire restent inconnus. En particulier, la sensibilité mécanique des cellules souches mésenchymateuses (CSM) n’a pas encore été montrée dans cette population contrairement à celles d’individus sains. En effet, de plus en plus de travaux montrent que les cellules mésenchymateuses humaines (CSMh) de patients sains sont sensibles à une stimulation mécanique [14], phénomène de mécanotransduction ; qui est, pour le tissu osseux sain, observable à la fois pour des stimulations à court terme, sur l’expression génique ; ou pour des stimulations à plus long terme, sur le processus d’ostéogenèse [15–18]. Dans tous ces travaux, la stimulation mécanique la plus efficiente est une contrainte de cisaillement de l’ordre du Pascal appliquée de manière cyclique à une fréquence de 1 à 3 Hertz. Ces valeurs reflètent assez bien les mesures in vivo [19] et l’exercice physique quotidien des sujets sains.

Ainsi chez les patients atteints d’OI, avec leur fragilité osseuse et pour certains le caractère non marchant, il est important de savoir si leur exposition à des contraintes mécaniques peut être bénéfique sur le plan du tissu osseux.

L’objectif de cette étude est d’étudier et de comparer les réponses précoces des CSMh de patients atteints d’OI et de donneurs sains à une contrainte de cisaillement intermittente. L’hypothèse de ce travail est que les CSMh provenant de patients atteints d’OI sont également sensibles aux stimulations mécaniques, comme pour les patients sains, rationalisant les pratiques cliniques courantes dans cette pathologie.

# Matériel et méthodes

## Population

Dans cette étude prospective, des CSMh ont été extraites de déchets opératoires provenant d’ostéotomie programmée d’un os long provenant de trois individus témoins sains (une arthroplastie de hanche pour coxite et une pour séquelle d’épiphysiolyse ; et une ostéotomie d’humérus pour cubitus varus) et de trois patients atteints d’OI. Les données cliniques des patients sont présentées dans le tableau I
                        . Tous les tissus osseux ont été prélevés avec le consentement éclairé des patients et de leurs parents, conformément aux directives éthiques établies par la loi française et le comité d’éthique français Sud Est III (no 20.06.06.76213).

Les CSM ont été isolées et cultivées selon le protocole du laboratoire [18]. Sur le plan de la culture cellulaire, le passage 0 correspond à la mise en culture initiale des CSM. Après amplification, les cellules sont diluées une première fois, ce qui correspond au passage P1. Chaque dilution rajoute un passage. Les passages sont des étapes obligatoires pour obtenir un nombre suffisant de cellules. Pour toutes les expériences de l’étude, les CSMh au passage 3, ont été utilisées.

## Méthode de stimulation mécanique

L’exposition des CSMh à une contrainte de cisaillement intermittente a été réalisée à l’aide du système ibidi (ibidi-Integrated BioDiagnostics, Am Klopferspitz, Allemagne), qui consiste à faire circuler le milieu de culture cellulaire dans des microcanaux de faible épaisseur (μ-Slide I0,4) sur lesquelles des CSMh (figure 1
                        ). Une contrainte de cisaillement pulsative a été appliquée grâce à un écoulement unidirectionnel du milieu de culture cellulaire à travers ce μ-Slide à un débit en mL/min contrôlé. D’un point de vue mécanique, les cellules ont été exposées à un niveau de contrainte de cisaillement de 0,7Pa, 1,5Pa et 3Pa à une fréquence de 2,8Hz pendant 30minutes. Un échantillon contrôle sans stimulation mécanique a également été collecté dans les mêmes conditions environnementales. Une heure après la fin de la stimulation mécanique, les CSMh ont été détachées et l’ARN total a été isolé en utilisant la méthode du réactif TRIzol®. Pour chaque donneur et pour chaque niveau de contrainte, l’expérience a été répétée neuf fois.

## Méthode de mesure de l’expression génique

L’ARN collecté après stimulation mécanique a été analysé par réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR) à l’aide du kit de transcriptase inverse Superscript II (Invitrogen) et d’hexamères aléatoires (utilisés comme amorces). Chaque analyse RT-qPCR a été réalisée en trois exemplaires. Les mesures d’expression génique ont été réalisées à l’aide d’un appareil de thermocyclage iCycler (MyiQTM Single-Color Real-Time PCR ; Bio-Rad Laboratories, Marnes la Coquette, France). Les sept gènes issus de l’étude de Becquart et al. [18] montrant une réponse à une stimulation mécanique précoce de patient sains ont été étudiés.

## Analyse statistique

L’analyse statistique a été réalisée à l’aide du logiciel R (R Foundation for Statistical Computing, https://www.r-project.org/). Toutes les expériences mécaniques ont été réalisées en trois exemplaires à trois moments distincts pour chaque donneur. Des tests de Kruskal Wallis ont été effectués pour évaluer les différences statistiques entre les groupes de niveaux de stimulation mécanique. Les tests de Mann-Whitney ont été utilisés pour évaluer les différences significatives entre les niveaux d’expression génétique à deux niveaux de stimulation au sein d’un même groupe (OI ou contrôle) et entre les niveaux d’expression génétique des CSM saines et des CSM OI à une stimulation donnée. Le niveau de signification pour toutes les analyses correspondait à un risque α de 0,05.

# Résultats

## Effet de la stimulation mécanique sur les CSMh de patients sains

La figure 2
                         présente le ratio d’expression génique de PTSG2 pour des CSMh de patients sains stimulés mécaniquement par rapport aux patients non stimulés mécaniquement. Quel que soit le niveau de stimulation mécanique entre 0,7Pa et 3Pa, une surexpression significative du gène est observée. Le pic d’expression est obtenu pour un cisaillement de 1,5Pa. Il est important de noter qu’au-delà de 3Pa, les cellules se décollent.

## Effet de la stimulation mécanique sur les CSMh de patients atteints d’OI

La figure 3
                         présente le ratio d’expression génique de PTSG2 pour des CSMh de patients OI stimulés mécaniquement par rapport aux patients non stimulés mécaniquement. Dans le cas des CSMh OI, toutes les valeurs moyennes de l’induction de PTGS2 pour 0,7Pa, 1,5Pa et 3Pa étaient significativement augmentées de 6,15, 9,79 et 6,48 respectivement par rapport aux CSMh non exposées à la contrainte de cisaillement. Ces valeurs sont très proches de celles obtenues pour des CSMh provenant de patients sains où les augmentations pour 0,7Pa, 1,5Pa et 3Pa étaient de 6,52, 9,33 et 6,38. D’un point de vue statistique, aucune différence significative n’a été observée entre les valeurs moyennes mesurées à 0,7Pa, 1,5Pa et 3Pa des CSMh saines et des CSMh OI.

## Analyse de l’expression des gènes mécanosensibles précoces au pic de réponse mécanique du PTGS2.

La figure 4
                         donne l’expression relative des gènes mécanosensibles précoces mesurée une heure après l’exposition des CSMh à une contrainte de cisaillement (1,5Pa à 2,8Hz pendant 30min) et comparée à l’expression mesurée dans les CSMh non exposées à la contrainte de cisaillement mécanique. Dans les deux cas, à l’exception du gène IGF1 chez l’OI qui est sous-exprimé, l’ensemble des gènes est surexprimé sous l’effet d’une contrainte de cisaillement. En particulier, les gènes PTGS2 et IER3 sont les gènes le plus significativement surexprimé que cela soit pour les donneurs sains ou OI.

L’expression relative du gène EGR1 diminue significativement, passant d’une valeur moyenne de 2,45±1,2 pour les donneurs sains à 0,53±0,6 pour les donneurs OI alors que l’expression relative du gène IGFBP1 augmente significativement, passant d’une valeur moyenne de 2,16±1,8 pour les donneurs sains à 4,23±1,6 pour les donneurs OI. Pour les autres gènes, l’expression relative liée à la stimulation mécanique n’est pas significativement différente entre les donneurs sains et les donneurs OI.

# Discussion

L’exercice physique est connu pour être bénéfique sur la santé physique et mentale, et surtout pour les enfants en situation de handicap. Cependant, l’exercice ou le type d’activité physique à privilégier chez les enfants atteints d’OI est encore inconnu. De plus, afin de rationaliser la pratique clinique qui a tendance à réduire le temps d’immobilisation, par rapport au délai habituel, dans le traitement des fractures chez les patients atteints d’OI, cette étude a étudié et comparé les réponses précoces des CSMh de patients sains et atteints. Les résultats montrent, comme dans le cas des donneurs sains, une sensibilité des CSMh OI à ce régime de stimulation mécanique.

Les effets de la stimulation mécanique des CSMh en contexte osseux ont fait l’objet de plusieurs études [15,16,18,20] ces dernières années, mais restent toujours un enjeu majeur [21] dans la compréhension des mécanismes de consolidation. Toutes ces études menées sur des CSMh de patients sains ont montré que le meilleur régime de stimulation mécanique était une contrainte de cisaillement intermittente allant de 1 à 3Pa, à une fréquence de 1 à 3Hz et une durée de 30minutes à 2heures par jour, ce qui correspond à l’exercice physique quotidien et aux valeurs in vivo obtenues par Weinbaum [19]. Dans cette étude, le gène PTGS2 est significativement le plus surexprimé pour le niveau de cisaillement de 1,5Pa que cela soit chez les CSMhs saines ou OI. Cette valeur de stimulation se situe dans la gamme des valeurs expérimentales données dans la littérature et est très proche de la valeur de 2Pa trouvée chez les donneurs sains dans l’étude in vitro de Stavenschi et al. [20].

Il s’agit de la première description de l’effet de la stimulation mécanique sur les CSMh de patients atteints d’OI. Comme dans le cas des cellules saines l’analyse de l’expression d’un panel de gènes associés aux réponses cellulaires OI liés au chargement mécanique montre une réponse significative par rapport à celles obtenues sur des cellules non stimulées mécaniquement. En particulier le gène IER3, qui est présenté dans la littérature comme un des premiers gènes sensibles à la contrainte mécanique [22,23], est surexprimé comme chez les patients sains. Cette étude montre également que la réponse précoce des CSMh OI à la contrainte de cisaillement intermittente n’est différente de celle des CSMh saines que pour deux gènes, EGR1 et IGFBP1. L’expression génique de EGR1 est sous-exprimée chez les patients atteints d’OI et surexprimée chez les patients sains, ce qui pourrait suggérer un effet négatif de la sollicitation mécanique. En effet EGR1 est impliqué dans le développement, l’homéostasie et les processus de réparation tissulaire osseux. L’induction de EGR1 est nécessaire dans la différenciation osseuse, et ce gène semble également impliqué pour les éléments de la matrice extracellulaire (fibronectine, collagène, ostéopontine). Cependant, un grand nombre de stress dont les interactions restent encore peu étudiées modifie la réponse de ce gène [24–26]. Au contraire, la contrainte mécanique semble avoir un rôle favorable sur IGFBP1 qui joue un rôle dans la formation osseuse [27]. Les différences observées dans cette étude nécessitent des recherches supplémentaires, telles que des analyses protéomiques ou des essais fonctionnels des molécules sécrétées afin de statuer sur leurs effets dans la formation osseuse à long terme. En résumé, les résultats observés dans cette étude montrent que la contrainte de cisaillement intermittente a un impact similaire sur les CSMh provenant de patients sains et celles de patients atteins d’OI. Par conséquent, les CSMh OI sont sensibles à la stimulation mécanique, une des composantes essentielles du microenvironnement nécessaire à la formation osseuse [17].

Plusieurs limites de cette étude doivent être mentionnées. Toutes les expériences ont été réalisées en deux dimensions. Or pour reproduire à l’identique le processus de consolidation, les résultats doivent être confirmés en utilisant un scaffold en trois dimensions [28]. De plus, il est également démontré que la stimulation mécanique a un effet bénéfique sur la différenciation ostéogénique de CSM humaines saines à long terme, les CSM de la moelle osseuse étant les progéniteurs communs des ostéoblastes et des ostéocytes. Ces cellules ne représentent que 0,01 % à 0,001 % de toutes les cellules nucléées [29], mais elles sont responsables du maintien du renouvellement du tissu osseux. Cependant, les similitudes de réponse à court terme entre les deux types de CSM, saines et OI, ne permettent pas de démontrer directement qu’à plus long terme, la différenciation ostéogénique se comportera de la même manière.

Ces nouvelles informations sur le plan cellulaire de la sensibilité aux stimuli mécaniques des cellules chez les patients atteints d’OI similaires aux patients sains représentent des informations importantes pouvant améliorer les prises en charge médicale, comme l’application de dispositifs externes [30].

Dans cet objectif d’appliquer des contraintes mécaniques pour stimuler le tissu osseux, des plateformes vibrantes ont été développées [31]. Elles ont été testées chez les patients atteints d’OI [32] et dans d’autres pathologies chez des enfants non marchants [33], avec des résultats mitigés [34,35].

Une étude retrouvant que les plateformes vibrantes n’avaient pas d’effet sur le tissu osseux des patients atteints d’OI [32], a suggéré que le tissu OI avait une réponse mécanique réduite. Notre étude retrouvant que les CSM de patients atteints d’OI étaient mécanosensibles, suggère que l’absence d’effet mécano-stimulant pouvait alors être lié à la fonctionnalisé des plateformes.

Dans l’avenir, la prochaine étape sera d’associer à toutes ces thérapies médicamenteuses émergentes ciblant la diminution de la résorption osseuse [36], cette approche mécanique avec le développement de nouveaux dispositifs capables de transmettre des stimulations mécaniques aux cellules du tissu osseux.

# Conclusion

Cette étude est la première à décrire que les CSMh de patients atteints d’OI sont, comme pour celles de patients sains, sensibles aux contraintes mécaniques de cisaillement. Ces résultats constituent une étape importante permettant d’envisager d’autres études fondamentales pour confirmer l’effet à l’échelle cellulaire des contraintes mécaniques sur le long terme, et surtout pour développer des protocoles cliniques visant à stimuler mécaniquement les patients.

# Déclaration de liens d’intérêts

les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts.

# Financement

cette recherche n’a bénéficié d’aucune subvention spécifique de la part d’organismes de financement des secteurs public, commercial ou à but non lucratif.

# Contribution des auteurs

A.B. a contribué à l’analyse et à l’interprétation des données, à l’analyse statistique et à la rédaction du manuscrit.

P.L.D. a contribué à l’acquisition des données, aux révisions critiques et à la révision du manuscrit.

E.P., N.L. ont contribué à l’analyse et à l’interprétation des données, à l’analyse statistique.

P.M., R.V. ont contribué aux révisions critiques, à la révision du manuscrit.

M.B., T.H. et M.B. ont contribué à la mise en place et la supervision de l’étude, à l’analyse et à l’interprétation des données, aux révisions critiques, à la rédaction du manuscrit, à l’examen du manuscrit et à l’analyse statistique.

# Déclaration de l’IA générative et des technologies assistées par l’IA

aucune assistance n’a été utilisée pour écrire ce manuscrit.