Les conditions biologiques de la production
de la glycérine par la méthode fermentative

Par

IRÈNE LIPSKA

Le fait que la fermentation alcoolique donne de la glycérine est connu depuis le temps de Pasteur. En consultant la littérature plus récente concernant les vins de raisin et de fruits, nous constatons que les conditions de la production de la glycérine ont été le sujet de plusieurs travaux, dont nous ne citerons que ceux de: H. Müller-Thurgau [19, 21], J. Laborde [13] et R. Reisch [31]. L'emploi de l'acide sulfureux pour empêcher les altérations du vin est connu depuis longtemps dans la pratique de la vinification. C'est H. Kerp [11] et V. Martinand [18] qui ont étudié le côté chimique de ce procédé et ont constaté que l'acide sulfureux disparaît rapidement dans un moût de raisin fermentant, en passant à l'état de combinaison aldéhydique. L'action physiologique de l'acide sulfureux sur les levures, notamment leur tolérance pour cet acide, leur pouvoir de s'y accommoder ont été étudiés par H. Müller-Thurgau [20] et W. Seifert [33]. La fermentation normale s'effectue généralement dans un milieu légèrement acide, à une concentration de ions H+ déterminée par: H. v. Euler et O. Svanberg [7], H. Lüers [17] et Fr. Boas [2]. Cette acidité reste à peu près stationnaire pendant toute la durée de la fermentation. La possibilité de la fermentation alcoolique en milieu alcalin a été reconnue déjà par Pasteur. C'est C. Neuberg et ses collaborateurs qui ont étudié et élucidé ce processus durant 1918-20 [22, 23, 24, 25, 26, 27]. La transformation du sucre au moyen des levures en glycérine et en aldéhyde acétique fut appliquée à la production technique par W. Connstein et K. Lüdecke [5], qui en ont obtenu une licence en 1915. Pendant la grande guerre on a fabriqué en gros la glycérine par cette méthode biologique pour l'utiliser ensuite comme nitroglycérine.
Vu que dans ce sujet c'est la question biologique qui nous in-
téresse tout spécialement, nous nous bornerons à donner un bref
récit des faits constatés par C. Neuberg et ses collaborateurs. La
présence du sulfite de sodium dans un liquide en fermentation déter-
mine une augmentation de glycérine, une accumulation de l'aldéhyde
et un rendement plus faible en alcool. Le sucre, d'après ces auteurs,
subit la transformation suivante: $C_6H_{12}O_6 = CH_3CHO + C_3H_8O_3 + CO_2$.
Une relation équimoléculaire existe entre la production de la glycé-
rine et celle de l'aldéhyde. De fait que le poids moléculaire de la
glycérine est à peu près le double de celui de l'aldéhyde, il résulte
que la quantité de glycérine est deux fois plus élevée que celle de
l'aldéhyde. La marche de la décomposition du sucre est suivante:
la glucose se dédouble en aldéhyde glycérique et dioxyacétone; ce
dernier composé se transforme en méthylglyoxal; de l'aldéhyde glycé-
rique par réduction se forme la glycérine; le méthylglyoxal par oxy-
dation donne de l'acide pyruvique; par l'action de la carboxylase
ou de lazymase cet acide est décomposé en aldéhyde acétique et
$CO_2$. Comme dans cette fermentation le sulfite de sodium intervient
également, on a la réaction finale: $C_6H_{12}O_6 + Na_2SO_3 + H_2O =
C_3H_8O_3 + NaHCO_3 + CH_3CH(OH)OSO_2Na$. Le complexe aldéhy-
dique est ensuite dissocié grâce au milieu alcalin et l'aldéhyde se
transforme en alcool. On voit de cet exposé que les levures produi-
sent principalement ces composés intermédiaires dont la formation
est la plus facile. Le seul moyen utilisé dans ce but est un échange
inter et intramoléculaire de H et de OH; grâce à cette simplicité
d'action chimique une admirable économie est réalisée dans la fermen-
tation décrite. C. Neuberg avec ses collaborateurs a constaté en outre
la même production de l'aldéhyde acétique et sa fixation par les sul-
fites dans les fermentations déterminées par les bactéries, à savoir:
dans la fermentation lactique, acétique et butyrique [23, 28, 29]. De
plus on a pu démontrer, grâce à l'affinité des sulfites pour les aldé-
hydes, que dans la décomposition du sucre par les moisissures il y a
de nouveau une formation de l'aldéhyde acétique [4, 30]. Il suit de
toutes ces constatations que le principe de la dégradation des sucres
est toujours le même, tandis que ses produits peuvent être différents,
conformément aux exigences vitales spéciales des microorganismes
qui les engendrent.

Il est bien compréhensible que les chimistes ont fixé leur atten-
tion sur le côté chimique de ce cas exceptionnel de la fermentation
alcoolique et ne se sont pas intéressés à son côté biologique. A pré-
sent, quand grâce à leur travail le chimisme de ce processus est
bien connu, ce sont les biologues qui doivent à leur tour entre-
prendre leur étude physiologique. En faisant connaissance de ces
travaux chimiques, dont les résultats principaux nous avons relatés
plus haut, le biologue est frappé par l'affirmation que le rendement
de la glycérine n'est influencé ni par la température, ni par la nature
du sucre, ni par la race de levure; seule l'aération le diminue nota-
blement. C'est justement l'incompatibilité de ces constatations avec
les observations déjà citées de H. Müller-Thurgau [20] sur la
différence des races et sur la possibilité d'accoutumer les levures
aux doses croissantes d'acide sulfureux et de sulfites, qui nous a dé-
cidé à étudier cette fermentation sulfitique. En se proposant de
travailler sur ce sujet, il faut en premier lieu avoir à sa disposition
une méthode pour déterminer la glycérine; méthode assez exacte,
bien rapide et qui ne demande en même temps ni appareils chers,
ni composés chimiques difficiles à se procurer. Le choix de la méthode
et les déterminations de la glycérine, durant les expériences exposées
dans ce travail, ont été faits par M. R. Kwieciński, chimiste,
assistant de la Sous-Section des Fermentations. Nous profitons de
cette occasion et nous le remercions pour sa bienveillante collabo-
ration. Passons maintenant à la description sommaire des méthodes
employées. La plus connue est la méthode officielle de la détermi-
nation de glycérine employée couramment dans l'analyse des vins,
voir A. Beythien [1]. Cette méthode est assez longue (elle demande
au moins deux jours), elle est assez dispendieuse car l'alcool et l'éther
y sont nécessaires; quant à son exactitude elle n'est pas satisfaisante,
car les résultats sont toujours trop hauts, vu que la chaux ne pré-
cipite complètement ni le sucre, ni d'autres composés organiques.
En second lieu, nous avons étudié la méthode de H. v. Törring [34].
Son principe repose sur la distillation du liquide fermenté à une
haute température et sous une pression diminuée. Le liquide distillé
doit être ensuite oxydé. Nous l'avons chauffé avec le bichromate
de potasse et l'acide sulfurique concentré suivant la méthode de
O. Hehner [9], perfectionnée par K. Braun [3]. Cette méthode
combinée présente l'inconvénient que pendant la distillation une partie
de glycérine se décompose en acroléine et que pendant l'oxydation
outre la glycérine sont oxydées d'autres substances organiques. Nous
n'avons pu étudier la troisième méthode de S. Zeisel et R.
Fanto [36], vu l'impossibilité de nous procurer l'appareil spécial,
qui y est nécessaire. La dernière méthode dont nous avons fait
l'étude est celle de K. Fleischer [8]. Elle repose sur le même
principe de la distillation du liquide fermenté que la deuxième, mais
l'auteur y a introduit deux perfectionnements importants: première-
ment la distillation s'opère avec la vapeur d'eau surchauffée et secon-
dement il y emploie deux réfrigérants: dans le premier circule l'eau
chauffée à 70° C, tandis que dans le second — l'eau froide. Par
ces deux importantes modifications de la méthode de H. v. Törring
K. Fleischer a réussi d'y éliminer complètement les inconvénients
cités plus haut. Nous avons approprié cette méthode à notre but
en adoptant les dimensions plus petites des ballons pour opérer
avec des portions de liquide de 100 cm³; ce qui nous a permis de
réduire la durée d'une détermination de glycérine à deux heures
à peu près, ce qui présente un grand avantage dans notre travail
où il a fallu en faire par dizaines. Après avoir fait plusieurs déter-
minations parallèles de la glycérine avec les trois méthodes indiquées,
nous nous sommes arrêtés définitivement sur celle de K. Fleischer,
car elle correspond parfaitement à nos besoins, en réunissant la pré-
cision voulue à la commodité et la rapidité du travail.

Après avoir ainsi résolu le problème du choix de la méthode
de la détermination de glycérine nous avons pu nous mêttre à notre
travail proprement dit, qui est l'étude biologique de la fermentation
alcoolique en milieu alcalin. Nous allons d'abord passer en revue
les principales questions de la fermentation sulfitique, qui nous ont
intéressés plus spécialement. Ce sont d'abord: l'influence de la tem-
pérature, de la race des levures, de l'état physiologique de celles-ci
et de la grandeur de leur ensemencement sur le rendement de gly-
cérine. Ce sont ensuite: l'influence de la composition chimique du
milieu de fermentation en premier lieu de la dose de sucre employé
et de la proportion de sulfite ajoutée sur le rendement de glycérine
et enfin la possibilité d'une stimulation des levures par l'addition
des sels à l'action spécifique. Ensuite nous avons pensé à aborder
l'étude de la fermentation alcoolique où la réaction alcaline du milieu
a été obtenue par l'addition d'autres sels que les sulfites, pour finir
par l'examen d'une troisième méthode biologique de la production
de glycérine, méthode décrite par A. Koch [12]. Malheureusement,
nos conditions de travail se sont changées de manière que nous
sommes forcés de renoncer à ce sujet, ce qui nous a décidé à publier
nos résultats malgré qu'ils soient incomplets.

Nous avons commencé notre étude de la fermentation sulfitique
en 1923 par l'examen des levures de notre collection, pour en choisir
ensuite les races quiproduisent le plus de glycérine. Nous avons employé
comme milieu de culture et de fermentation la mélasse des sucreries,
car elle présente une source de sucre très bon marché, ce qui est
bien important au point de vue de la production technique de glycérine. Dans cent grammes de notre mélasse il y avait juste 50·2 gr. de sucre. Pour travailler dans les conditions d'une stérilité complète, ce qui est absolument indispensable, nous avons toujours stérilisé séparément la mélasse et le sulfite de soude avec de l'eau distillée. Nous avons fait la dilution de manière à avoir dans 100 cm³ de liquide 10 p. c. de sucre et 2 p. c. de sulfite ($Na_2SO_3 \cdot 7H_2O$). Pour l'ensemencement de la fermentation nous avons utilisé un dépôt de levures cultivées 72 heures à 30° C sur 100 cm³ de mélasse diluée et additionnée de 1% de peptone. La fermentation avait toujours lieu durant 72 heures à la même température. Une expérience préliminaire faite dans ces conditions avec nos 50 races de levures nous a montré qu'il y en a beaucoup qui se sont refusées à fermenter. Nous avons répété la même expérience en choisissant les vingt levures qui ont présenté un assez vif dégagement de $CO_2$ et en y déterminant la glycérine produite avec la méthode de K. Fleischer. Les résultats sont réunis dans la table I, qui se trouve à la fin du travail. Les premiers dix numéros de cette table se rapportent aux levures de brasserie, les huit suivants à celles de distillerie, les deux derniers — à celles de vinification; en somme on y voit vingt races de levures dont le rendement de glycérine et la proportion d'alcool présentent des variations assez considérables. Les meilleures levures sont P6 et G1 avec lesquelles nous avons travaillé dans les deux séries qui suivent. Il importe beaucoup de ne pas perdre de vue que ce résultat est intimement lié aux conditions de la température et de la composition chimique du milieu. Comme l'activité des levures dépend surtout de ces deux principales conditions, il est bien probable, qu'en opérant à une température plus basse nous ayons trouvé plus de races de levures capables de produire une fermentation sulfitique. Il se peut aussi, que la race de Champagne (W11) qui produit le plus de glycérine (0,8%), dans les vins (voir notre travail [16]) et qui n'a pas fermenté dans la mélasse sulfitée, puisse être acclimatée à ce nouveau milieu en procédant à un large ensemencement à sa température optimum.

La deuxième série d'expériences faite en été de 1924 présente un perfectionnement important par rapport à la technique employée auparavant. Nous avons préparé d'avance des filtres avec les entonnoirs bien enveloppés par une feuille de papier-parchemin et stérilisés ensemble. Le dépôt des levures servant à l'ensemencement recueilli sur le filtre a été ensuite mis dans la mélasse sulfitée avec le filtre. De cette manière nous avons évité l'introduction d'une
quantité variable de mélasse déjà fermentée dans un liquide mis à l'expérience. L'addition des levures sans liquide influe moins sur le volume de mélasse sulfitée, ce qui assure des résultats plus comparables et précis. Nous nous sommes proposés dans cette série d'expériences d'élucider plusieurs questions concernant la production des levures d'ensemencement et de celles de fermentation. Nous avons employé cette fois-ci comme agent de la fermentation la race P6, une de nos meilleures levures. Les expériences ont été faites ici toujours par deux, pour qu'elles ne diffèrent entre elles que par un seul facteur, voir la table II. L'examen de cette table nous montre que les premières quatre paires se rapportent aux levures d'ensemencement et les onze suivantes — aux levures de fermentation. Les deux premières épreuves devaient nous renseigner s'il est plus avantageux d'employer pour l'ensemencement des levures cultivées durant 48 ou 72 heures à 33° C. Le résultat est en faveur d'une culture plus jeune où il y a un surplus de 0,6 p. c. de glycérine; dans ce cas il faut encore prendre en considération une économie de temps et de chauffage. Cette constatation nous a fait fixer dorénavant l'âge de nos cultures d'ensemencement à 48 h. Les deux expériences suivantes avaient pour but de nous informer quelle température est plus favorable à la culture des levures, celle de 23° ou — de 33° C. Naturellement il faut ne pas oublier que ces levures seront ensuite forcées à fermenter à 33° C. Les quantités de glycérine obtenue se prononcent cette fois-ci très clairement en faveur de la culture faite à la même température que celle de la fermentation, l'avantage est de 2,5 p. c. Ce résultat est bien naturel pour un biologue, vu la grande sensibilité de tous les êtres vivants à un changement brusque de la température; dans notre cas il est de dix degrés, ce qui est énorme. Ensuite nous avons voulu étudier l'influence de la grandeur d'ensemencement des levures. La troisième expérience double montre qu'il y a un rapport direct entre ces deux valeurs, quoique le gain de glycérine ne soit pas considérable (1, 67 p. c.). La dernière question touchant les levures d'ensemencement a été résolue par la quatrième épreuve. Conformement aux résultats déjà obtenus nous avons cultivé nos levures à 33° C pendant 48 heures: une portion sur la mélasse et une seconde — sur le moût de malt, tous les deux contenant 10 p. c. de sucre. Cette fois-ci nous avons obtenu une parfaite concordance des rendements de la glycérine, ce qui semble prouver que les deux milieux ont satisfait complètement les fonctions vitales des levures. Avant de passer aux questions de la fermentation nous pouvons, en nous basant sur les données obtenues, constater
que les levures P6, cultivées sur la mélasse (10 p. c. de sucre) 48 heures à 33º C et fermentant ensuite la même mélasse additionnée de sulfite (66 p. c. de sucre), peuvent produire la glycérine en quantité de 10—13 p. c. de sucre. Ceci dit, nous pouvons relater les résultats de la cinquième expérience où une portion avait fermenté 48 heures sur la mélasse bouillie après l'addition de sulfite stérilisé, tandis que la seconde avait fermenté pendant le même temps sur la mélasse sulfitée non bouillie. Nous avons obtenu dans ces conditions un meilleur rendement de la glycérine dans la portion bouillie, où il s'est produit un dépôt abondant, blanc et lourd; vu au microscope ce dépôt présente des concrétions sphériques. La sixième expérience montre une comparaison de deux portions, dont l'une a fermentée à la température de 23º C et l'autre à 33º C. On voit que la différence des résultats n'est pas très prononcée, quoique la quantité de glycérine produite à 33º C soit de 0·7 p. c. plus haute. L'expérience suivante a été faite aussi avec les deux températures, mais la quantité de sulfite y est trois fois plus petite et de plus nous y avons ajouté à la mélasse 2 p. c. de $CaCO_3$. On ne doit pas s'étonner que le rendement de glycérine est bas, vu le petit pourcentage de sulfite. On peut dire que ce résultat est peu engagant pour l'emploi de la craie. Nous passons maintenant à la relation d'effet d'une dose plus forte de sulfite. Dans la huitième expérience nous avons ajouté 10 gr. de sulfite en ensemençant une portion de la mélasse d'un double dépôt des levures. La quantité de glycérine produite a augmenté cette fois-ci considérablement; d'ailleurs, l'effet de l'ensemencement plus fort ne se fait pas sentir. La neuvième expérience devait servir d'une répétition de la précédente, nous n'y avons ajouté que 2 p. c. de $CaCO_3$; malheureusement le rendement y est au-dessous même de la norme obtenue pour 6·6 p. c. de sulfite. On peut reconnaître, que la fermentation y avait marché autrement, par le fait que le pourcentage d'alcool y est plus haut que celui de la huitième expérience. L'influence de la plus grande quantité de sucre dans la mélasse a été étudiée dans notre dixième expérience où nous avons ajouté à chacune de deux portions (sulfitées de nouveau avec 6·6 p. c. de sel) 5 p. c. de saccharose après 24 heures de la fermentation. Les portions n'ont pas différé entre elles que par un double ensemencement de la deuxième. L'addition du sucre dans ces conditions ne se fait sentir que par une plus forte production d'alcool, ce qui n'est pas désirable. Pour mieux résoudre cette question nous avons répété dans la suivante expérience l'addition de la même quantité de sucre, mais en employant en même
temps 10 p. c. de sulfite. Encore cette fois-ci le résultat obtenu
nous montre que cette addition de sucre n'est pas avantageuse;
de fait on obtient moins de glycérine que de 10 p. c. de sucre, voir
la huitième expérience. Il est intéressant de déterminer, quel est le
maximum de sulfite supporté par nos levures P6; c'est pour pou-
voir le préciser que nous avons fait deux expériences suivantes:
dans la douzième les levures devaient fermenter en présence de 15 p. c.
de sulfite, tandis que dans l'épreuve treizième le pourcentage de sel
a été éléve jusqu'à 17 p. c. (170 p. c. de sucre). Les résultats de ces
deux cas nous montrent clairement, que le sulfite est bien supporté
par la race étudiée des levures, mais que le rendement de glycérine
baisse à cette concentration du sel au lieu d'augmenter. Cette con-
statation nous a fait renoncer à l'élévation de la dose de sulfite.
Il nous reste encore à relater les deux dernières expériences de cette
série: dans la quatorzième nous avons voulu voir l'effet d'une ération
continue faite durant toute la fermentation. Une pompe à eau a été
réunie avec deux portions communiquant entre elles pour remuer
continuellement la mélasse. Malgré que l'air inspiré par la pompe
a passé par un tube de verre rempli de coton stérilisé la mélasse
a été contaminée par les microbes. Vu que cette infection bactérienne
a pu fausser les résultats nous n'avons pas cette fois déterminé la
quantité d'alcool. La quinzième expérience devait nous montrer si
une addition de l'urée est suivie d'une augmentation de rendement
de glycérine. La consultation de la table II. nous fait voir que dans
les conditions de notre expérience ce n'est que la teneur en alcool
de mélasse qui augmente un peu.

En faisant une récapitulation des données obtenues, nous costa-
tons que la fermentation sulfitique est un processus excessivement
délicat où on est maintes fois témoin des perturbations graves dans
sa marche régulière sans qu'on puisse préciser leurs causes, voir les
expériences: III, V, IX et XII. Ce n'est que l'étude approfondie de
cette fermentation qui nous peut en faire le maître et nous préserver
à l'avenir de tout hasard. C'est dans cet ordre d'idées que nous
avons entrepris la troisième et la dernière série d'expériences. Cette
série présente en partie une répétition des questions étudiées dans
les séries précédentes, mais nous nous sommes servis cette fois de
la race G1 comme d'agent de la fermentation pour voir si les faits
observés chez la race P6 ont un caractère plus général. D'autre part
nous avons employé pour la fermentation aussi on milieu artificiel avec
1 p. c. de peptone, 0,5 p. c. de K2HPO4 et 10 p. c. de saccharose pour
assurer à notre travail plus de précision. En somme nous avons fait
vingt trois expériences nouvelles, dont les résultats sont réunis sur les six tables servant chacune à éclairer une certaine question spéciale. Les conditions du milieu, de la température et de la durée de ces expériences étaient les mêmes que celles qui ont été fixées par la deuxième série, c'est-à-dire: nous avons employé une mélasse diluée à 10 p. c. de sucre, ensemencée avec un dépôt filtré des levures pures et qui a fermentée 48 heures à l'étuve à 33º C. La table III nous présente les données de dix essais qui démontrent une fois de plus la spécificité des levures au point de vue de leur résistance à la dose croissante de bisulfite de soude. Il est intéressant de comparer entre elles les races G 1 et P 6 qui ont fermenté deux fois dans la mélasse de 10 et 15 p. c. de sucre additionnée de la même quantité de sulfite. Dans les deux cas c'est la race G 1 qui a produit plus de glycérine, en donnant la même quantité d'alcool, ce qui semble prouver que sa manière de travailler soit plus économique que celle de la race P 6. Ensuite nous pouvons comparer entre elles les races G 1 et G 3 dans deux cas: le premier où elles ont fermenté la mélasse de 10 p. c. de sucre en présence de 6·6 p. c. de sulfite et le second — où la mélasse contenait 15 p. c. de sucre et 10 p. c. de sel. Cette fois-ci le résultat nous apprend que la race G 3 qui a remporté un certain avantage dans le premier cas où les conditions de la fermentation ont été moins difficiles, s'était montrée moins résistante et productive au moment où la concentration de sucre et de sulfite a augmenté. Ajoutons que les trois races réagissent de la même manière à une concentration plus forte de sucre — elles diminuent alors la formation de la glycérine, en augmentant en même temps la production d'alcool. La plus sensible à l'addition de sulfite parmi les cinq races étudiées est la race P 12, laquelle donne la plus faible quantité de glycérine et produit en même temps très peu d'alcool. Nous avons mis à l'expérience encore cette fois les races W 8 et W 11 (de la première série), mais de nouveau elles ont refusé à fermenter.

L'influence de la quantité de bisulfite de soude ajouté au milieu de la fermentation a été étudiée en neuf expériences dont les résultats sont réunis à la table IV. Cette table nous montre que la race G 1 réagit sur les deux milieux: un naturel à 10 et 15 p. c. de sucre et l'autre artificiel à 10 p. c. de la même manière à la proportion croissante de sulfite. On observe dans tous les cas une augmentation du rendement de la glycérine et une diminution correspondant du rendement alcoolique. Dans la deuxième série nous avons déjà observé que l'augmentation de la dose de sulfite n'est pas suivie d'une
augmentation proportionnelle de glycérine; la quantité de cette der-
nière ne croît que relativement peu. La richesse en sucre fait
ressortir cette disproportion encore plus; ainsi à un dédoublement
de sulfite (8,3 p. c.) correspond une augmentation de glycérine
de 4·5 p. c., voir les expériences N 2 et 16. L'influence défavorable
de l'addition de sucre ressort nettement de nos expériences, nous
y reviendrons à la suite pendant la discussion de la table VI.

L'influence de la composition chimique du milieu de la fermen-
tation sur la production de la glycérine est fort prononcée. C'est
dans la table V que nous avons réuni les résultats des onze expé-
riences qui concernent l'étude de cette question. L'examen de cette
table prouve que le milieu artificiel satisfait mieux les exigeances
vitales de la race G1 que la mélasse. La cause de cette préférence
accordée par nos levures au milieu artificiel s'explique peut être par
le fait qu'il ne contient que les composés nécessaires à l'activité des
levures et en juste proportion, tandis que la mélasse qui est un
produit final des maintes opérations chimiques contient un grand
surplus de sels, en premier lieu celui de potassium [32, 35]. Cette
richesse des sels devient surtout gênante en cas d'une addition à la
mélasse encore d'une forte dose de sulfite. Dans ce cas on obtient
avec le milieu artificiel un surcroît de glycérine encore plus prononcé
(4·2 p. c.). L'action favorable du milieu artificiel devient moins effi-
cace au moment où la concentration de sucre augmente; le rendement
n'y est supérieur que de 1 p. c. de glycérine. Si nous comparons
l'effet de la mélasse et du moût de malt comme milieu de fermentation,
nous constatons que la première donne un meilleur résultat, la quantité
de glycérine y est de 3·3 p. c. plus grande que sur le moût.

Passons maintenant à la table VI où sont réunies les données
concernant l'influence de la dose du sucre. Ces résultats nous mon-
trent que l'action d'une plus forte concentration de sucre est défa-
vorable; la quantité de glycérine diminue, tandis que celle d'alcool
augmente. Cet effet modérant la production de la glycérine se fait
sentir surtout sur le milieu artificiel, où nous avons constaté une
baisse de 52 p. c. de glycérine, tandis que sur la mélasse cette dimi-
nution n'est que de 2·3 p. c. dans les mêmes conditions. Quant à
l'augmentation du rendement d'alcool elle est égale à 1.7 p. c. sur
la mélasse et à 2·0 p. c. sur le milieu artificiel. Ces expériences nous
font constater que la race G 1 travaille plus économiquement et
donne un meilleur rendement de glycérine avec 10 p. c. de sucre
dans le milieu de fermentation; le sucre ajouté au-dessus de ce
pourcentage est presque entièrement transformé en alcool.
Il est connu que plusieurs sels peuvent être considérés comme des excitants, qui stimulent le pouvoir fermentatif des levures à doses modérées et qui sont pour elles toxiques à doses un peu élevées, voir : E. Kayser [10] et F. Lafar [14]. Dans cet ordre d'idées nous avons fait trois expériences avec l'addition de $\frac{1}{10000}$ Mol. de CuSO$_4$, ZnSO$_4$ et MnSO$_4$ au milieu artificiel, qui nous a donné les meilleurs résultats. C'est dans la table VII que nous avons réuni ces données, qui ne sont pas d'ailleurs bien encourageantes. Nous voyons que dans tous les cas la quantité de glycérine a plus ou moins diminué. Relativement le meilleur résultat est obtenu avec le sulfate de Zn, parce que le rendement n'y a diminué que de 1·1 p. c., tandis que les essais faits avec les sulfates de Mn et de Cu donnent une baisse respectivement de 2·1 p. c. et de 3·2 p. c. Il est bien possible que le mauvais résultat ait été causé par la dose trop grande des sels et que sa diminution eût pu occasionner un effet excitant le pouvoir fermentatif des levures. Malheureusement nous n'avons pu répéter ces expériences en les changeant dans le sens indiqué. Il ne nous reste que de donner une relation de la troisième série d'expériences composée de trois essais présentés dans la table III. Nous y sommes revenus à la question de l'influence de l'état physiologique des levures d'ensemencement, question qui a déjà été traitée dans la deuxième série. Cette fois-ci dans nos trois expériences nous avons voulu par la différence du milieu de culture provoquer un change-ment de l'activité vitale des levures et de cette manière intervenir dans la production ultérieure de glycérine. Certes les levures le mieux nourries seront plus fortes, ce qui influencera à son tour leur pouvoir fermentatif et le rendement de la glycérine deviendra plus considérable. Les résultats obtenus parlent en faveur du moût de malt comme un excellent milieu de culture, tandis que comparativement la mélasse a donné le plus faible rendement de glycérine; la différence y est énorme, elle est égale à 6·6 p. c. de glycérine. L'expérience N 6 où un ensemencement a été fait avec un dépôt des levures de mélasse et un second — des levures de moût de malt par son résultat prend la place entre les deux précédents, ce qui est bien expressif et en donne plus de valeur. Il est intéressant de souligner que l'influence bienfaisante du milieu de culture ne se fait sentir que par la richesse croissante de glycérine. De fait, nous voyons que la quantité d'alcool produite dans les trois essais reste sensiblement la même. Cette constatation est bien compréhensible, vu la grande complication de la fermentation en présence du bisulfite, ce qui nécessite une spécificité fermentative poussée bien loin. Rappelons,
que dans le deuxième série (expérience IV) nous avous obtenu le même rendement de la glycérine avec la mélasse et le moût de malt, mais là c'est la race P6 qui a fermenté et les conditions d'expérience y ont été plus favorables aqec 6·6 p. c. de sulfite et 10 p. c. de sucre. La pleine vigueur vitale des levures ne se fait sentir qu'au moment où les conditions de la fermentation deviennent plus difficiles comme c'était le cas dans les expériences citées de la troisième série.

Il nous reste encore à dire un mot de quelques expériences où suivant les données de W. Connstein [5], C. Neuberg [22.24], J. Eoff [6] et A. Ling [15] nous avons obtenu l'alcalinité du milieu au moyen de l'addition de Na₂CO₃ et Na₂HPO₄. Le maximum du rendement obtenu dans ces conditions a été de 8 p. c. de glycérine, tandis qu'avec l'addition du bisulfite c'était le minimum produit par les mêmes levures de la même quantité de sucre (10 p. c.). Probablement la fermentation alcoolique s'opère alors suivant son troisième mode établi par C. Neuberg [25], on a là une formation d'alcool, de glycérine et d'acide acétique. Pour finir avec nos propres expériences relatons encore un essai fait suivant l'intéressant principe exposé par A. Koch [12]. Nous avons employé pour cette fermentation le même milieu artificiel qui nous a déjà donné de bons résultats dans la troisième série, mais cette fois-ci il était additionné de 40 p. c. de sucre. Une instalation appropriée nous a permis d'opérer durant la fermentation (72 heures) une distillation de l'alcool formé à la pression diminuée. Par cet artifice ingénieux on évite son accumulation et la fermentation peut être poussée bien loin en donnant lieu à un enrichissement progressif de glycérine. Notre race G1 a bien travaillé dans ces conditions, elle a produit beaucoup d'alcool et une quantité assez considérable de glycérine. Nous mentionnons cet essai pour réunir dans notre travail les essais concernant les trois modes de la fermentation alcoolique. Tous, ils peuvent donner lieu à une production assez abondante de la glycérine. Le procédé de A. Koch présente plusieurs avantages pour la technique, à savoir: il est simple, il épargne les frais d'addition des sels et de production de grandes quantités de levures pour l'ensemencement; de plus, comme la fermentation s'y opère dans un milieu légèrement acide, on peut travailler avec les milieux simplement pasteurisés, ce qui présente une considérable économie des frais du chauffage.

Passons maintenant à la discussion de nos résultats, en les comparant en même temps aux données des autres auteurs. Comme le but de notre étude ne fut qu'étudier les conditions biologiques
de la production de la glycérine par la méthode fermentative, nous avons fixé notre attention à la précision des expériences, en laissant de côté les soins pour obtenir le rendement maxima de glycérine. Dans cet ordre d'idées nous avons toujours travaillé avec des cultures pures de levures et la fermentation se passait en pleine stérilité contrôlée au microscope. C'est justement l'observation de ces conditions qui nous a obligé de renoncer à un ensemencement de 10 p. c. de volume du liquide employé par les autres. Pour la même raison nous avons raccourci la durée de la fermentation à 48 heures, car c'est le temps pendant lequel se forme le gros de glycérine. C'est ce qui explique sans doute le fait constaté par nous que le rendement de la glycérine dans nos expériences était plus faible que celui noté par les autres auteurs. D'ailleurs la spécificité des levures demontrée par nos expériences laisse espérer qu'en poursuivant les recherches on parviendra à trouver une race de levures qui sera plus tolérante au sulfite et qui donnera un rendement supérieur de glycérine. Nous avons constaté d'accord avec W. Connstein et C. Neuberg que l'influence du bisulfite de soude sur le rendement de glycérine est en raison directe de la quantité ajoutée. De même il y a une coïncidence de nos résultats avec ceux des auteurs cités, notamment en ce qui concerne l'influence défavorable de la teneur trop grande de sucre, la dose de 10 pour cent étant optimale. Par contre, nous n'avons pu confirmer les données de W. Connstein que les levures puissent opérer huit fermentations de suite avec un bon rendement; car dans nos expériences les levures même quelque peu âgées ont déjà travaillé moins bien.

Comme on voit d'après nos expériences le rendement de la glycérine varie non seulement avec l'espèce des levures, mais dépend aussi de la composition du milieu de culture, de l'âge des levures, de la concentration du sucre et du bisulfite dans le milieu de la fermentation et d'autres conditions. Ceci posé, on voit que le sujet est bien vaste et que nos expériences n'ont qu'effleuré la question. Ajoutons que justement cette complication des conditions réglant la marche régulière de cette fermentation en milieu alcalin permet de prévoir qu'elle peut être poussée plus loin par l'accoutumance des levures au bisulfite de soude ou activée par l'addition des anti-septiques.

## Conclusions.

1. Le rendement de glycérine varie avec l'espèce et même avec la race de levures.
2º Un bon état physiologique des levures est indispensable pour l'obtention d'un bon rendement de glycérine.

3º L'âge des levures influe sur la production de glycérine, il faut opérer de préférence avec des cultures jeunes.

4º La quantité de glycérine produite est en relation avec la composition du milieu de fermentation.

5º La température de 32º C convient bien à la fermentation sultifique.

6º La teneur élevée en sucre du milieu de fermentation n'est pas favorable, le 10 p. c. donne les meilleurs résultats.

7º L'addition d'une dose croissante de bisulfite de soude jusqu'à 10 p. c. est suivie d'une augmentation du rendement de glycérine.

8º La circulation d'air gêne la fermentation et diminue la quantité produite de glycérine.

9º L'addition de 10 p. c. de bisulfite de soude au milieu de fermentation ne donne pas des garanties contre une contamination bactérienne.

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<table><caption>Table I.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Races</th><th>Durée</th><th>Température</th><th>Milieu de ferment.</th><th>Alcool 0/0 vol.</th><th>Glycérine 0/0 de sucre</th><th>No</th><th>Races</th><th>Alcool 0/0 vol.</th><th>Glycérine 0/0 de sucre</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>P 1</td><td>72 h.</td><td>30° C</td><td>Mélasse</td><td>6.16</td><td>4.8</td><td>11</td><td>G 1</td><td>6.09</td><td>8.7</td></tr><tr><td>2</td><td>P 2</td><td>”</td><td>”</td><td>10% de sucre +</td><td>4.07</td><td>7.7</td><td>12</td><td>G 2</td><td>5.93</td><td>7.0</td></tr><tr><td>3</td><td>P 3</td><td>”</td><td>”</td><td>2% de Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></td><td>5.44</td><td>7.0</td><td>13</td><td>G 3</td><td>7.18</td><td>3.7</td></tr><tr><td>4</td><td>P 4</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>5.30</td><td>7.5</td><td>14</td><td>G 4</td><td>6.80</td><td>3.0</td></tr><tr><td>5</td><td>P 5</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>4.27</td><td>7.6</td><td>15</td><td>G 5</td><td>6.00</td><td>5.8</td></tr><tr><td>6</td><td>P 6</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>4.65</td><td>8.8</td><td>16</td><td>G 6</td><td>6.10</td><td>6.3</td></tr><tr><td>7</td><td>P 7</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>3.64</td><td>6.5</td><td>17</td><td>G 7</td><td>6.16</td><td>3.9</td></tr><tr><td>8</td><td>P 8</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>4.88</td><td>6.4</td><td>18</td><td>G 8</td><td>6.63</td><td>4.6</td></tr><tr><td>9</td><td>P 9</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>3.90</td><td>7.8</td><td>19</td><td>W 1</td><td>5.05</td><td>8.0</td></tr><tr><td>10</td><td>P 10</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>4.14</td><td>8.1</td><td>20</td><td>W 2</td><td>5.48</td><td>6.6</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Table III.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Races</th><th>Saccharose</th><th>Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></th><th>Glycérine 0/0 de sucre</th><th>Alcool 0/0 vol.</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>P 6</td><td>10°/0</td><td>6.60/0</td><td>10.65</td><td>3.07</td></tr><tr><td>2</td><td>G 1</td><td>”</td><td>”</td><td>12.12</td><td>3.00</td></tr><tr><td>12</td><td>P 12</td><td>”</td><td>8.00/0</td><td>9.61</td><td>1.75</td></tr><tr><td>14</td><td>G 1</td><td>”</td><td>”</td><td>13.03</td><td>2.86</td></tr><tr><td>5</td><td>W 6</td><td>”</td><td>”</td><td>13.42</td><td>2.44</td></tr><tr><td>11</td><td>G 3</td><td>”</td><td>”</td><td>13.90</td><td>2.69</td></tr><tr><td>3</td><td>P 6</td><td>15°/0</td><td>”</td><td>9.27</td><td>3.85</td></tr><tr><td>4</td><td>G 1</td><td>”</td><td>”</td><td>12.05</td><td>3.87</td></tr><tr><td>22</td><td>G 3</td><td>”</td><td>10°/0</td><td>11.72</td><td>4.12</td></tr><tr><td>6</td><td>G 1</td><td>”</td><td>”</td><td>12.35</td><td>3.95</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Table II</caption><thead><tr><th rowspan="2">No</th><th colspan="2">Durée</th><th colspan="2">Température</th><th colspan="2">Milieu</th><th rowspan="2">Alcool<sup>0</sup>/<sub>0</sub> vol.</th><th rowspan="2">Glycérine<sup>0</sup> de sucre</th><th rowspan="2">No</th><th rowspan="2">Durée de cult. et ferm.</th><th rowspan="2">Temperature de cult. et ferm.</th><th rowspan="2">Milieu de culture et ferment</th><th rowspan="2">Alcool<sup>0</sup> vol.</th><th rowspan="2">Glycérine<sup>0</sup> de sucre</th></tr><tr><th>de culture</th><th>de ferment</th><th>de culture</th><th>de ferment.</th><th>de culture</th><th>de ferment.</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>48 h.</td><td>72 h.</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>Moût de malt 10% de s.</td><td>Mélasse 10% de sucre +</td><td>3.35</td><td>13.1</td><td>9</td><td>48 h</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>1 portion</td><td>10% sulf.</td><td>4.43</td><td>6.38</td></tr><tr><td>2</td><td>72 h.</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>3.64</td><td>12.5</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>2 portions</td><td>+2<sup>0</sup>/<sub>0</sub>CaCO<sub>3</sub></td><td>4.58</td><td>5.74</td></tr><tr><td>3</td><td>48 h.</td><td>72 h.</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>1 portion 2 portions</td><td>”</td><td>4.51</td><td>12.90</td><td>10</td><td>”</td><td>”</td><td>1 portion 2 portions</td><td>6,6<sup>0</sup>/<sub>0</sub> sulf.</td><td>6.63</td><td>6.87</td></tr><tr><td>4</td><td>48 h.</td><td>48 h.</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>Mélasse Moût</td><td>”</td><td>4.76</td><td>6.98</td><td>11</td><td>”</td><td>”</td><td>1 portion 2 portions</td><td>+5<sup>0</sup>/<sub>0</sub> sucre</td><td>6.32</td><td>7.20</td></tr><tr><td>5</td><td>48 h.</td><td>48 h.</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>Moût</td><td>Mélasse bouillie Mél.non b.</td><td>3.49</td><td>11.50</td><td>13</td><td>”</td><td>”</td><td>1 portion</td><td>15<sup>0</sup>/<sub>0</sub> sulf.</td><td>4.52</td><td>13.00</td></tr><tr><td>6</td><td>”</td><td>”</td><td>33<sup>0</sup> C</td><td>23<sup>0</sup> C</td><td>Moût</td><td>Mélasse</td><td>5.33</td><td>7.42</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>1 portion 2 portions</td><td>10<sup>0</sup>/<sub>0</sub> sulf.</td><td>4.88</td><td>14.10</td></tr><tr><td>7</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>5.06</td><td>4.5/</td><td>15</td><td>”</td><td>”</td><td>1 portion</td><td>6,6<sup>0</sup>/<sub>0</sub> sulf.</td><td>4.36</td><td>8.30</td></tr><tr><td>8</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>4.58</td><td>5.00</td><td>”</td><td>”</td><td>”</td><td>1 portion</td><td>+0.5<sup>0</sup>/<sub>0</sub> urée</td><td>4.80</td><td>7.50</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Table IV.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Milieu</th><th>Saccharose</th><th>Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></th><th>Glycérine<sup>0/0</sup> de sucre</th><th>Alcool<sup>0/0</sup> vol.</th></tr></thead><tbody><tr><td>2</td><td>Mélasse</td><td>10<sup>0/0</sup></td><td>6.6<sup>0/0</sup></td><td>12.12</td><td>3.00</td></tr><tr><td>14</td><td>"</td><td>"</td><td>8.0</td><td>13.03</td><td>2.86</td></tr><tr><td>13</td><td>"</td><td>"</td><td>10.0</td><td>14.63</td><td>2.23</td></tr><tr><td>16</td><td>"</td><td>"</td><td>15.0</td><td>16.61</td><td>1.88</td></tr><tr><td>10</td><td>Artificiel</td><td>"</td><td>6.6<sup>0/0</sup></td><td>14.94</td><td>2.86</td></tr><tr><td>15</td><td>"</td><td>"</td><td>10.0</td><td>18.50</td><td>2.58</td></tr><tr><td>20</td><td>"</td><td>"</td><td>15.0</td><td>20.40</td><td>1.75</td></tr><tr><td>4</td><td>Mélasse</td><td>15<sup>0/0</sup></td><td>8.0</td><td>12.05</td><td>3.87</td></tr><tr><td>6</td><td>"</td><td>"</td><td>10.0</td><td>12.35</td><td>3.95</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Table V.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Milieu</th><th>Saccharose</th><th>Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></th><th>Glycérine<sup>0/0</sup> de sucre</th><th>Alcool<sup>0/0</sup> vol.</th></tr></thead><tbody><tr><td>2</td><td>Mélasse</td><td>10<sup>0/0</sup></td><td>6.6<sup>0/0</sup></td><td>12.12</td><td>3.00</td></tr><tr><td>10</td><td>Artificiel</td><td>"</td><td>"</td><td>14.94</td><td>2.86</td></tr><tr><td>13</td><td>Mélasse</td><td>"</td><td>10</td><td>14.63</td><td>2.23</td></tr><tr><td>15</td><td>Artificiel</td><td>"</td><td>"</td><td>18.50</td><td>2.58</td></tr><tr><td>16</td><td>Mélasse</td><td>"</td><td>15</td><td>16.61</td><td>1.88</td></tr><tr><td>20</td><td>Artificiel</td><td>"</td><td>"</td><td>20.40</td><td>1.75</td></tr><tr><td>23</td><td>" + 0,5<sup>0/0</sup> pept.</td><td>"</td><td>"</td><td>17.90</td><td>2.10</td></tr><tr><td>6</td><td>Mélasse</td><td>15<sup>0/0</sup></td><td>10<sup>0/0</sup></td><td>12.35</td><td>3.95</td></tr><tr><td>21</td><td>Artificiel</td><td>"</td><td>"</td><td>13.33</td><td>4.51</td></tr><tr><td>4</td><td>Mélasse</td><td>"</td><td>8</td><td>12.05</td><td>3.87</td></tr><tr><td>9</td><td>Moût demalt.</td><td>"</td><td>"</td><td>8.77</td><td>4.88</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Table VII.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Milieu</th><th>Saccharose</th><th>Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></th><th>Glycérine<sup>0/0</sup> de sucre</th><th>Alcool<sup>0/0</sup> vol.</th></tr></thead><tbody><tr><td>10</td><td>Artificiel</td><td>10<sup>0/0</sup></td><td>6.6<sup>0/0</sup></td><td>14.94</td><td>2.86</td></tr><tr><td>17</td><td>" + <sup>1</sup>&frasl;<sub>10.000</sub> Mol. CuS O<sub>4</sub></td><td>"</td><td>"</td><td>11.72</td><td>3.00</td></tr><tr><td>18</td><td>" + <sup>1</sup>&frasl;<sub>10.000</sub> Mol. Zn SO<sub>4</sub></td><td>"</td><td>"</td><td>13.84</td><td>3.00</td></tr><tr><td>19</td><td>" + <sup>1</sup>&frasl;<sub>10.000</sub> Mol. Mn SO<sub>4</sub></td><td>"</td><td>"</td><td>12.86</td><td>3.07</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Table VI.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Milieu</th><th>Saccharose</th><th>Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></th><th>Glycérine<br>0/0 de sucre</th><th>Alcool<br>0/0 vol.</th></tr></thead><tbody><tr><td>14</td><td rowspan="2">Mélasse</td><td>10/0</td><td>8/0</td><td>13.03</td><td>2.86</td></tr><tr><td>4</td><td>15</td><td>”</td><td>12.05</td><td>3.87</td></tr><tr><td>13</td><td>”</td><td>10/0</td><td>10</td><td>14.63</td><td>2.23</td></tr><tr><td>6</td><td>”</td><td>15</td><td>”</td><td>12.35</td><td>3.95</td></tr><tr><td>15</td><td rowspan="2">Artificiel</td><td>10</td><td>10</td><td>18.50</td><td>2.58</td></tr><tr><td>21</td><td>15</td><td>”</td><td>13.33</td><td>4.51</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Table VIII.</caption><thead><tr><th>No</th><th>Milieu<br>de culture</th><th>Saccharose</th><th>Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub></th><th>Glycérine<br>0/0 de sucre</th><th>Alcool<br>0/0 vol.</th></tr></thead><tbody><tr><td>7</td><td>2 Moût de malt.</td><td>15/0</td><td>10/0</td><td>14.81</td><td>4.14</td></tr><tr><td>6</td><td>1 Mél. + 1 Moût</td><td></td><td></td><td>12.35</td><td>3.95</td></tr><tr><td>8</td><td>2 Mélasses</td><td></td><td></td><td>8.25</td><td>3.97</td></tr></tbody></table>

Institut National Scientifique d'Agriculture Bydgoszcz.

(Wpłynęło do redakcji 20 marca 1925 r.).