consequence, and despite potential plant influences on soil processes, N and S mineralization is most
likely determined by meteorological conditions in our system. According to the meteorological factors
determining protease and arylsulfatase activity as well as abundance of arylsulfatase bacteria, N and S
mineralization are likely to be negatively correlated to temperature and precipitations.

Conclusion

The microbial abundances were influenced by the crop species, with a higher abundance of fungi (estimated by 18S rDNA) and a lower abundance of bacteria (estimated by 16S rDNA) and proteolytic bacteria (estimated by *apr* gene) under oilseed rape than under barley and pea. Arylsulfatase and protease activity, as well as the abundance of culturable bacteria were not influenced by the crop species. Nevertheless, all the microbial variables were more influenced by the meteorology than by the crop species, microbial abundances being more influenced by precipitations and microbial activities by temperature. The precipitations and temperature effects on microbial variables depended of the crop species, with a stronger link between temperature and enzymatic activities under oilseed rape than under other crops. It seemed also likely that the influence of meteorology on microbial communities was partly mediated by the plant development. Nevertheless, further studies are required in order to understand the way meteorological factors interact with different plant species to modify microbial abundances and activities. Aerial or root functional traits could be useful tools in this context. This importance of meteorology also highlights the necessity to conduct multiyear data collection when considering the influence of plants on microbial communities. Those combined influences of crop species and meteorology resulted in modifications of N and S net mineralization mainly due to variations of protease activity, arylsulfatase activity and abundance of arylsulfatase bacteria. As enzymatic activities were strongly responding to meteorological factors in our study, we suppose that the influence of meteorology over pass the influence of crops for N and S mineralization.

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Effet de la composition de la rotation sur l'abondance, la
composition et l'activité des communautés microbiennes sous le blé

**Résumé** : Les plantes peuvent influencer les communautés microbiennes pendant et après la fin de leur cycle de développement et modifier ainsi les processus de minéralisation et d'immobilisation résultant de l'activité des communautés microbiennes. Ces effets varient en fonction des caractéristiques des rhizodépôts, des résidus et des reliquats minéraux laissés par les plantes. Ainsi le pois produit des résidus en petite quantité comparé au colza ou aux céréales mais avec un C/N plus bas et un C/S plus intermédiaire. Afin de suivre en conditions naturelles l'effet du pois intégré dans différentes rotations culturales sur les communautés microbiennes, nous avons analysé sur deux années consécutives (2012 et 2013) l'abondance et la composition taxonomique (par des techniques de pyroséquençage) des communautés microbiennes totales, l'abondance et l'activité de certains groupes fonctionnels microbiens possédant l'activité protéase ou arylsulfatase et la minéralisation nette de N et S sur des échantillons de sol sous couvert de issus de trois rotations culturales différentes intégrant ou non du pois. Nous n'avons pas observé d'effet de la composition de la rotation sur l'abondance de la communauté microbienne totale, les activités arylsulfatase et protéase, ainsi que sur l'abondance des bactéries responsables de ces activités, sous le blé. En conséquence, la minéralisation d'azote et de soufre n'était pas non plus influencée par la composition de la rotation. Les effets sur la composition et la diversité de la communauté bactérienne sont réduits à des variations d'abondance de quelques taxons, probablement en interaction avec les conditions de l'année.

**Mots clés** : Brassica napus, Hordeum vulgare, Pisum sativum, rotation, arylsulfatase, protéase, minéralisation, azote, soufre, pyroséquençage
## Introduction

Les plantes peuvent modifier les communautés microbiennes au cours de leur développement par la rhizodéposition et/ou le prélèvement de nutriments (Haynes and Francis, 1993 ; Chantigny et al., 1996 ; Haynes et Beare, 1997 ; Vong et al., 2003 ; Paterson et al., 2007 ; Inselsbacher et al., 2010 ; Legay et al., 2014 ; Kuramae et al., 2012 ; Bell et al., 2015). De plus, à l'issue de leur cycle de développement, les plantes annuelles peuvent aussi influencer la disponibilité en composés organiques et nutriments du sol et modifier ainsi les processus de minéralisation et d'immobilisation résultant de l'activité des communautés microbiennes. Cet effet précédent cultural peut être lié à la persistance dans le sol des rhizodépôts plusieurs mois après la culture (Jensen, 1996c), aux reliquats d'éléments minéraux après la récolte (Carrouée et al., 1999 ; Eriksen et al., 2002 ; 2009 ; Sieling et Kage, 2006) ou encore à des modifications de la structure du sol (Edwards, 1992 ; Yang et Kay, 2001 ; Carter et al., 2009). Néanmoins, l'effet précédent cultural est surtout lié à l'enfouissement des résidus racinaires et aériens (Dornbush, 2007). Les résidus peuvent persister plusieurs années dans les sols (Lupwayi et al., 2006), suggérant une capacité de la plante à modifier durablement son environnement (Knops et al., 2002 ; Chapman et al., 2005). Dans les agrosystèmes, en plus de la matière organique, les résidus végétaux incorporés dans le sol sont une source importante de carbone labile et d'éléments minéraux pour la nutrition des plantes. L'effet de la composition chimique des résidus végétaux sur les taux de décomposition a été largement étudiée au cours des dernières décennies (Trinsoutrot et al. 2000 ; Gentile et al. 2011), de même que l'interaction entre les cycles du carbone, de l'azote et du soufre au cours de la décomposition (Mary et al., 1996 ; Jensen et al., 2005 ; Niknahad-Gharmakher et al., 2012). L'incorporation de résidus végétaux dans les sols provoque généralement une augmentation de l'abondance des microorganismes (Sainju et al., 2012 ; McDaniel et al., 2014), positivement corrélée à la quantité de résidus apportés et une augmentation du ratio bactéries/champignons (Marschner et al., 2003). Ces effets sur la biomasse microbienne dépendent aussi de la nature des résidus et de leur qualité biochimique. Wu et al., (1993) ont ainsi montré que le ratio C/S de la biomasse microbienne est réduit de moitié suite à l'incorporation dans le sol de résidus de moutarde. L'incorporation de résidus de culture, du fait d'une teneur en carbone labile plus importante que la matière organique du sol, induit aussi des changements de la structure génétique des communautés microbiennes. Ainsi, les résidus favorisent à court terme les microorganismes copiotrophes et, à plus long terme, les microorganismes oligotrophes (Pascault et al., 2013 ; Chen et al., 2014). A l'échelle de la communauté, les Bacteroidetes (copiotrophes) peuvent être ainsi favorisée en début de dégradation et les Actinobacteria (oligotrophes) en fin de dégradation (Chen et al., 2014). L'augmentation de l'abondance
microbienne, tout comme l'apport de substrats facilement dégradables, stimulent les activités enzymatiques microbiennes impliquées dans la décomposition et la minéralisation de la matière organique (Zhang et al., 2004 ; Melero et al., 2011 ; Ailincai et al., 2008 ; Perucci et al., 1997 ; Ekenler et Tabatabai, 2002 ; Klose et al., 1999 ; Klose et Tabatabai, 2000 ; de Varennes et al., 2007 ; Dodor et Tabatabai, 2003). Ils entraînent ainsi des augmentations des activités protéase (Cayuela et al., 2009) et arylsulfatase (Perucci et al., 1984 ; Perucci et Scarponi, 1984 ; Piutti et al., 2015). Ces modifications peuvent se refléter sur la minéralisation de la matière organique, les résidus provoquant une augmentation de la minéralisation de carbone et, en fonction de leur stœchiométrie, une augmentation de la minéralisation ou de l'immobilisation de l'azote et du soufre (Recous et al., 1996 ; Niknahad-Gharmakher et al., 2012 ; Churka Blum et al., 2013).

L'ensemble des mécanismes contribuent à l'effet précédent des plantes qui est fréquemment observé sur l'abondance microbienne (Carter et al., 2009 ; Sainju et al., 2012), la composition de la communauté microbienne (Yin et al., 2010 ; Zhao et al., 2014 ; Li et al., 2012), les activités enzymatiques (Klose et al., 1999 ; Klose et Tabatabai, 2000 ; Ailincai et al., 2008) et la minéralisation de la matière organique (Carpenter-Boggs et al., 2000 ; Rasmussen et al., 1998).

Les plantes cultivées, du fait de différences en termes de (i) qualité et quantité de leurs rhizodépôts, (ii) de reliquats azotés et soufrés à la récolte, (iii) de quantité et composition de leurs résidus, sont susceptibles d'avoir des arrière-effets différents sur l'abondance, la composition et l'activité des communautés microbiennes des sols sur des durées plus ou moins longues (Lupwayi et al., 2006). A la différence des céréales, le pois, qui correspond à la légumineuse d'intérêt dans notre étude, est capable en fin de cycle de développement de libérer dans le sol des rhizodépôts à faible C/N (ie. 17 ; Wichern et al., 2007a,b) susceptibles de se minéraliser très rapidement (Jensen, 1996c ; Wichern et al., 2007a) et des reliquats d'azote minéral supérieurs de 20 à 40 kg ha⁻¹ à ceux du blé (Carrouée et al., 1999). Le pois produit moins de résidus aériens et racinaires en comparaison des céréales et du colza (10 à 11 T de biomasse aérienne par hectare ; Carrouée et al., 1999) mais avec un C/N, en moyenne de 44 pour les résidus aériens (Soon et Arshad, 2002 ; Lupwayi et al., 2006 ; Kumar et Goh, 2002 ; Gan et al., 2011 ; Engstrom et Linden, 2012 ; Jensen, 1996b, 1997 ; Arcand et al., 2014) et de 20 pour les résidus racinaires (Soon et Arshad, 2002 ; Jensen, 1996b ; Arcand et al., 2014). Ces valeurs de C/N sont inférieures à celles généralement répertoriés chez des céréales et du même ordre de grandeur de celles du colza (Niknahad-Gharmakher et al., 2012 ; Churka-Blum et al., 2013). Les valeurs de C/S des résidus de pois proches de 239 sont intermédiaires du colza et des céréales (Churka-Blum et al., 2013). L'incorporation des résidus de pois induit une augmentation de la biomasse microbienne et de l'activité arylsulfatase (Biederbeck et al., 2005 ; Piotrowska-Długosz et Wilczewski, 2014) mais les effets sur l'activité protéase sont peu clairs, du fait des variations intersaisonnière et interannuelle (Biederbeck et al., 2005 ; Piotrowska-Długosz et Wilczewski, 2014). Seul 15 à 30% de l'azote des résidus
de pois est minéralisé au cours du cycle de développement de la culture suivante (Jensen, 1996a, 1996b; Evans et al., 2001; Lupwayi et al., 2006), ce qui suggère l'existence d'un arrière-effet des résidus du pois sur les communautés microbiennes sur une période supérieure à un an. A notre connaissance aucune étude n'a suivi en conditions naturelles sur plusieurs années cet effet du pois intégré dans différentes rotations culturales sur les communautés microbiennes. Nous avons analysé sur deux années consécutives (2012 et 2013) d'une part l'abondance et la composition taxonomique (par des techniques de pyroséquençage) des communautés microbiennes totales et d'autre part l'abondance et l'activité de certains groupes fonctionnels (ie. possédant l'activité protéase ou arylsulfatase) et la résultante en termes de flux nets de minéralisation de N et S sur des échantillons de sol sous couvert de issus de trois rotations culturales différentes intégrant ou non du pois. Nous faisons l'hypothèse que du fait d'une succession culturale de plantes avec des exigences en nutriments et des compositions biochimiques de résidus contrastées, les trois rotations testées ont des effets différents d'une part sur l'abondance et la composition de la communauté microbienne totale et d'autre part sur l'abondance et l'activité de certains groupes fonctionnels microbiens impliqués dans la minéralisation de l'azote et du soufre de la culture suivante.

## Matériels et Méthodes

### Expérimentation au champ

L'expérimentation a été mise en place sur la ferme expérimentale de la Bouzule (Champenoux, France, 48° 73' N, 6° 31' E) pendant la saison de culture 2008-2009. Le climat de la région est océanique dégradé avec une somme de précipitations moyenne annuelle de 734 mm et une température de l'air moyenne annuelle de 9,9 °C sur la période 2008-2013. Le sol est un sol brun hydromorphe sur argile limoneuse (vertic (clayic) cambisol dans la classification FAO-WRB) contenant en moyenne 62% d'argile, 35% de limon et 3% de sable. L'essai est constitué de 4 blocs (100x72m), perpendiculaires à un gradient de pH (de 7,21 à 8,04) et de teneur en calcaire actif (8 000 à 12 800ppm de CaO). Chaque bloc était divisé en 8 unités expérimentales de 50x18 m.

Deux successions culturales ont été mises en œuvre sur le dispositif expérimental : une succession de 3 ans (colza d'hiver-blé d'hiver-orge d'hiver) et une succession de 5 ans (colza d'hiver-blé d'hiver-orge d'hiver-pois de printemps-blé d'hiver). Dans chaque bloc, 3 unités expérimentales étaient cultivées en rotation de 3 ans (colza d'hiver-blé d'hiver-orge d'hiver) et 5 unités expérimentales en rotation de 5 ans (colza d'hiver-blé d'hiver-orge d'hiver-pois de printemps-blé d'hiver). Sur chacune de ces unités expérimentales une rotation a été commencée à un stade différent, de sorte que toutes les cultures d'une même rotation soient présentes chaque année (Figure 3) (plan d'expérimentation en décalage
de phase ; Yates, 1954). Durant la campagne 2011-2012, les parcelles semées en blé d'hiver ont subi d'importants dégâts de gel et ont dû être retournées puis emblavées en blé de printemps.

## Conduite des cultures

Les règles de décision mises en œuvre sur l'essai ont été homogénéisées sur les deux systèmes de cultures. Le travail du sol a consisté en un labour profond réalisé chaque année sur l'ensemble des unités expérimentales. Les semis ont été réalisés avec le même outil (semoir combiné à une herse rotative) quelle que soit la culture implantée. Le raisonnement de la fertilisation azotée s'est fait selon la méthode du bilan pour les céréales et selon la réglette azote pour le colza. Les parcelles ont été fertilisées en août 2009 avec du fumier de bovins, à raison de 30T/ha, soit 170 kgN/ha, 111 kgP/ha and 120 kgK/ha. Les années suivantes, la fertilisation N et S a été réalisée avec du nitrate d'ammonium, de l'urée et du sulfonitrate d'ammonium. La fertilisation annuelle était en moyenne de 174 kgN/ha et 60 kgS/ha pour le colza, de 206 kgN/ha pour l'orge et de 183 kgN/ha pour le blé. Le pois n'a reçu ni fertilisation N ni fertilisation S. Concernant la protection phytosanitaire, les interventions ont été déclenchées de façon raisonnée en fonction des seuils du Bulletin de Santé du Végétal pour les maladies et les ravageurs. Sachant que le travail visait aussi au suivi des évolutions de communautés d'adventices, la pression herbicide a été réduite. Ainsi sur les 5 ans d'expérimentation, l'Indice de Fréquence de Traitement (IFT) Herbicides est compris entre 20 et 70% des références régionales, à l'exception du pois, où l'IFT Herbicides a été maintenu au niveau des références régionales en raison de la faible compétitivité de cette culture en début de cycle. Après récolte, les pailles de céréales ont été exportées alors que les pailles de colza et de pois ont été enfouies.

## Prélèvement du sol

Des échantillons de sol (profondeur 0-10cm) ont été prélevés en juillet 2012 et juillet 2013 dans l'ensemble des parcelles cultivées en blé (stade phénologique : maturation en 2012 et floraison en 2013), à raison d'un échantillon par unité expérimentale, réalisés dans la même zone repérée grâce à ses coordonnées GPS. Les échantillons ont été prélevés sous couvert de blé (indiquée en gras ci-après) en 2012 et 2013 sous chacune des séquences de culture suivantes, se différenciant par le nombre d'années suivant la culture de pois de printemps, Blé-Orge-Colza-**Blé** (BOCB), Blé-Orge-Pois-**Blé** (BOPB) et Pois-Blé-Colza-**Blé** (PBCB). Les échantillons de sol prélevés ont été tamisés à 5 mm puis conservés à 4°C en attendant les mesures d'activités enzymatiques et d'abondance de bactéries cultivables (réalisées dans la semaine suivant le prélèvement). Pour chaque échantillon prélevé, un aliquote a été congelé à -20°C pour les mesures d'abondance de gènes microbiens et le pyroséquençage (Tableau 3).
## Activités enzymatiques microbiennes

L'activité potentielle arylsulfatase a été mesurée d'après le protocole de Tabatabai et Bremner (1970). Un gamme de sol a été incubé pendant 1h à 37°C avec 1mL de p-nitro-phenyl sulfate (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Etats-Unis) à 25mM (substrat de l'enzyme), 0,25mL de toluène et 4mL de tampon acétate de sodium 0,5M, pH 5,8. L'ajout de toluène permet d'empêcher la synthèse de nouvelles enzymes et de rendre accessible au substrat les enzymes intracellulaires en perméabilisant les membranes cellulaires (Frankenberger et Johanson, 1986). La réaction a été stoppée par l'ajout de 1mL de $CaCl_2$ 0,5M et de 4mL de $NaOH$ 0,5M. La solution a été filtrée sur papier filtre 2V. La quantité de p-nitro-phénol libérée pendant l'incubation a été mesurée par absorbance à 400nm avec un spectrophotomètre Cary 300 Scan (Varian, Palo Alto, Etats-Unis) et le logiciel Cary Win UV 3. Les blancs réactionnels ont été réalisés en incubant chaque sol dans les mêmes conditions que les échantillons, à l'exception du substrat de l'enzyme, ajouté après l'arrêt de la réaction. Une gamme étalon a été réalisée à l'aide de p-nitro-phénol, pour des concentrations allant de 9 à 15 µg mL⁻¹. L'activité potentielle arylsulfatase a été exprimée en µg p-nitro-phénol h⁻¹ g sol sec⁻¹.

L'activité potentielle protéase a été mesurée d'après le protocole de Ladd et Butler (1972). Un gamme de sol frais a été incubé pendant 4h à 45°C avec 2,5mL de tampon Tris-HCl 0,1M, pH 8 et 2,5mL d'une solution de caséinate de sodium (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Etats-Unis) à 2% (substrat de l'enzyme). Cinq millilitres d'acide trichloroacétique à 10% ont été ajoutés à la fin de l'incubation pour stopper la réaction. Après centrifugation à 16 000g pendant 2min, 0,5mL de surnageant ont été mélangés avec 0,75mL de carbonate de sodium à 1,4M et 0,25mL de réactif de Folin-Ciocalteu à 16,5%. Après 5 min d'incubation, la quantité de tyrosine libérée pendant l'incubation a été déterminée par colorimétrie à 680nm avec un spectrophotomètre Cary® 300 (Varian, Palo Alto, Etats-Unis) et le logiciel Cary Win UV 3. Les blancs réactionnels ont été réalisés en incubant chaque sol dans les mêmes conditions que les échantillons, à l'exception du substrat de l'enzyme, ajouté après l'arrêt de la réaction. La gamme étalon était composée de tyrosine de 100 à 500µg mL⁻¹. L'activité potentielle protéase a été exprimée en µg Tyr h⁻¹ g sol sec⁻¹.

## Cinétiques de minéralisation de l'azote et du soufre

Les cinétiques de minéralisation ont été réalisées sur 10g équivalent sec de sol maintenu à 100% de la capacité au champ et à 20°C à l'obscurité. Le sol a été placé dans des conditions non limitantes en azote et en soufre par ajout de 70µg N-KNO₃ g⁻¹ sol sec et de 20µg S-Na₂SO₄ g⁻¹ sol sec (Recous et al., 1995). A 0, 3, 7, 14 et 28 jours après mise en incubation, les nitrates et les sulfates ont été extraits du sol par agitation orbitale de 5g de sol dans 25mL de $KH_2PO_4$ 16mM pendant 30min (Walker et Doornenbal, 1972). Le mélange sol-$KH_2PO_4$ a ensuite été filtré une première fois sur papier filtre 2V
(Whatman, Maidstone, Royaume-Uni) et une deuxième fois sur filtre Minisart® 0,45µm (Sartorius AG, Göttingen, Allemagne). Les extraits KH₂PO₄ ont été congelés à -20°C en attendant le dosage de la teneur en nitrates et sulfates par chromatographie ionique Dionex, réalisée au Laboratoire Sol et Environnement (Vandoeuvre-lès-Nancy, France).

## Abondance des bactéries cultivables

Les abondances de bactéries cultivables ont été déterminées à partir d'une suspension de 10g de sol frais réalisée dans 100mL de tampon PBS stérile (NaCl 8 g L⁻¹, Na₂HPO₄ 1,44 g L⁻¹, KH₂PO₄ 0,24 g L⁻¹, pH 7,2) par agitation à 120rpm pendant 30min.

Les bactéries cultivables totales ont été dénombrées par étalement de la suspension de sol diluée de 1000 à 10 000 fois en triplicata sur un milieu de culture solide TSA au 10ᵉme (trypticase soy agar 4g L⁻¹, agar 13,5g L⁻¹, pH 7,3). Les colonies ont été comptées après 10 jours d'incubation à 28°C. L'abondance de bactéries a été exprimée en Unités Formant Colonies (UFC) par g⁻¹ sol sec.

Les bactéries cultivables possédant l'activité arylsulfatase ont été dénombrées par étalement de la suspension de sol diluée de 1000 fois en triplicata sur un milieu de culture solide M9 supplémenté en X-sulf (Na₂HPO₄, 7H₂O 12.8 g L⁻¹, KH₂PO₄ 3 g L⁻¹, NaCl 0.5 g L⁻¹, NH₄Cl 1 g L⁻¹, glucose 4 g L⁻¹, MgCl₂, 6H₂O 0.4 g L⁻¹, CaCl₂, 2H₂O 1.47x10⁻² g L⁻¹, biotine 5 mg L⁻¹, thiamine 5 mg L⁻¹, cycloheximide 100 mg L⁻¹, agar 15 g L⁻¹, et 0.1 g L⁻¹ de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl sulfate potassium salt (X-sulf, Sigma, France), pH 7) (Cregut et al., 2009). Le X-sulf est un substrat chromogène qui se colore en bleu lorsque la liaison ester sulfate est hydrolysée (Wyss, 1989). Les colonies bleues (exprimant l'activité arylsulfatase) ont été comptées après 21 jours d'incubation à 28°C. L'abondance de bactéries a été exprimée en Unités Formant Colonies (UFC) par g⁻¹ sol sec.

Les bactéries cultivables possédant l'activité protéase ont été dénombrées par étalement de la suspension de sol diluée de 1000 à 10 000 fois en triplicata sur un milieu de culture solide caséinate de calcium-agar 30,7g L⁻¹, pH 7. Les colonies entourées d'un halo clair (exprimant l'activité protéase extracellulaire) ont été comptées après 10 jours d'incubation à 28°C. L'abondance de bactéries a été exprimée en Unités Formant Colonies (UFC) par g⁻¹ sol sec.

## Extractions d'ADN de sol et PCR quantitative

L'abondance des communautés bactériennes et fongiques totales ainsi que des communautés bactériennes possédant des gènes codant des métalloprotéases alcalines (gènes *apr*) et des subtilisines (gènes *sub*) a été évaluée par PCR quantitative en temps réel ciblant, respectivement, les gènes ADNr 16S, ADNr 18S, *apr* et *sub*.
L'ADN du sol a été extrait à partir de 0,5 g de sol avec le kit Fast DNA® SPIN Kit for Soil (MP Biomedical, Santa Anna, USA), selon les recommandations du fournisseur.

La quantification de l'ADNr 16S a été réalisée grâce aux amorces 341F et 534R (Lopez-Gutiérrez et al., 2004) dans un volume réactionnel de 10 µL, contenant 10 ng d'ADN, du Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) 1x, 1 µM de chaque amorce et 250 ng de T4Gene 32 (MP Biomedicals, Strasbourg, France). Les conditions de PCR étaient : 95 °C pour 10 min, 35 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 60 °C, 30 s à 72 °C (Lopez-Gutiérrez et al., 2004). La lecture de la fluorescence a été réalisée à 80 °C. La quantification de l'ADNr 18S a été réalisée grâce aux amorces FR1 et FF390 (Prévost-Bouré et al., 2011) dans un volume réactionnel de 20 µL, contenant 10 ng d'ADN, du Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) 1x, 1,25 µM de chaque amorce et 200 ng de T4Gene 32 (MP Biomedicals, Strasbourg, France). Les conditions de PCR étaient : 95 °C pour 10 min, 40 cycles de 15 s à 95 °C, 30 s à 50 °C, 60 s à 70 °C (Prévost-Bouré et al., 2011). La lecture de la fluorescence a été réalisée à 75°C. Pour les gènes *apr* et *sub*, le mélange réactionnel, d'un volume final de 20 µL, contenait 10 ng d'ADN, du Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, USA) 1x, 1,75 µM de chaque amorce (respectivement, *apr* I et *apr* II ou *sub* I et *sub* II ; Bach et al., 2002) et 150 ng de T4Gene 32 (MP Biomedicals, Strasbourg, France). Les conditions de PCR étaient : 95 °C pour 10 min, 40 cycles de 20 s à 95 °C, 30 s à 53 °C, 60 s à 72 °C (Gschwendtner et al., 2010). La lecture de la fluorescence a été réalisée à 78 °C pour le gène *apr* et à 80 °C pour le gène *sub*.

Chaque échantillon a été amplifié en triplicata sur différentes plaques PCR. Les PCR ont été réalisées dans un thermocycleur StepOnePlus™ (Applied Biosystems, Foster City, USA). Les courbes étalons ont été construite à partir de 5 dilutions (10^3, 10^4, 10^5, 10^6 et 10^7 copies par réaction PCR) de plasmide pCR®8/GW/TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis) linéarisés avec l'enzyme Xba I et contenant une séquence standard de chacun des gènes cibles. Les séquences standard étaient un gène d'ARNr 16S de *Rhodococcus sp*, un gène d'ARNr 18S d'une souche de *Fusarium sp* isolée à partir de sol agricole, une séquence *sub* clonée à partir d'ADN extrait de sol agricole et une séquence *apr* de *Pseudomonas aeruginosa* PAO1.

Le contrôle du cycle de PCR, la collecte des données et les calculs de concentration ont réalisés avec le logiciel StepOne™ Software v.2.1. La spécificité de l'amplification a été contrôlée par analyse des courbes de fusion et par électrophorèse des produits de PCR sur gel d'agarose 1,5% (m/v).

## Pyroséquençage de l'ADNr 16S et traitement des données

Le séquençage des régions V3 et V4 de l'ADNr 16S à partir des échantillons d'ADN extraits de sol a été réalisé par Genoscreen (Lille, France) sur un séquenceur GS-FLX 454 (Roche Diagnostics, Meylan,
France), basé sur la chimie du titane. A l'issue du séquençage les séquences obtenues ont été pré-traitées par Genoscreen (Lille, France) suivant leur stratégie MetaBiote®. Les séquences inférieures à 200 ou supérieures à 600 paires de bases, présentant des bases ambigües, un code de qualité moyen inférieur à 25, des homopolymères de plus de 6 bases ou des erreurs dans la séquence des amorces ou des SIMs® ont été éliminées. Vingt et un pourcent des séquences ont été éliminées à cette étape. Les séquences ont ensuite été traitées séparément pour chaque année conformément à la procédure standard de Schloss et al. (2011) avec le logiciel Mothur v.1.35.1 (Schloss et al., 2009). Les séquences ont été alignées par rapport à la base de données SILVA v.102 (Pruesse et al., 2007) avec un seuil de confiance de 50%. Les séquences potentiellement chimériques ont été éliminées grâce au programme UCHIME (Edgar et al., 2011) implémenté dans Mothur v.1.35.1 en utilisant les séquences comme leur propre référence. Un total de 43 166 séquences en 2012 et de 57 560 séquences en 2013, ayant une longueur médiane de 465 paires de bases, ont été conservées après ces étapes de traitement. Les séquences ont été regroupées en Operational Taxonomic Unit (OTU) au seuil de 97% d'homologie en utilisant l'algorithme « average neighbor », et la séquence la plus abondante a été choisie comme la séquence représentative. En 2012, un total de 13 365 OTU différents a été observé. En 2013, un total de 20 757 OTU différents a été observé. Les séquences ont reçu une affiliation taxonomique par comparaison avec la base de données Ribosomal Database Project v.9 (Cole et al., 2014) en utilisant la méthode de Wang et al. (2007) avec un seuil de confiance de 80%. Quarante-neuf pourcent des séquences de 2012 et 42% des séquences de 2013 ont été affiliées au niveau du genre. Quatre-vingt-douze pourcent des séquences de 2012 et 93% des séquences de 2013 ont été affiliées au niveau du phylum. L'abondance relative des groupes phylogénétiques a été exprimée comme le nombre de séquences affiliées à ce groupe divisé par le nombre de séquences totales de l'échantillon.

Un arbre phylogénétique a été généré pour chaque année à partir de l'ensemble des séquences de
tous les échantillons en utilisant l'algorithme « relaxed neighbor joining » (Evans et al., 2006).

Analyses statistiques

La qualité de l'échantillonnage des communautés bactériennes a été évaluée grâce à l'indice de couverture de Good (Good, 1953) et aux courbe de raréfaction (Sanders, 1968). La richesse en OTU a été évaluée grâce à l'indice Chao1 (Chao, 1984) et à l'indice ACE (Chao et Yang, 1993). L'équitabilité de la distribution des OTU a été évaluée grâce à l'équitabilité de Shannon (Lloyd et Ghelardi, 1964). La diversité des OTU a été évaluée grâce à l'indice de Shannon non-paramétrique (Chao et Shen, 2003) et à l'indice de Simpson (Simpson, 1949). La diversité phylogénétique (PD) bactérienne a été calculée d'après Faith (1992), comme la longueur totale des branches terminales de l'arbre phylogénétique.
La structure et la composition taxonomique a été comparée entre les trois successions de culture pour chaque année en construisant une matrice de distance de Bray-Curtis (structure) et une matrice de distance de Jaccard (composition) entre les échantillons à partir des OTU.

La structure et la composition phylogénétique des communautés a été comparée entre les trois successions de culture pour chaque année en construisant une matrice de distance entre les échantillons à partir des arbres phylogénétiques en utilisant la méthode UniFrac (Lozupone et Knight, 2005), pondérée (structure) et non-pondérée (composition) par l'abondance des séquences. La matrice de distance résultante a été représentée grâce à un positionnement multidimensionnel non-métrique (NMDS).

L'effet des rotations sur la composition et la structure taxonomique et phylogénétique a été testé par analyse de la similarité (ANOSIM) sur les matrices de distance grâce à Mothur v.1.35.1. Pour s'abstraire des différences de pression d'échantillonnage, les indices de couverture, de diversité taxonomique et de diversité phylogénétique et les matrices de distance ont été calculés comme la moyenne de 1000 sous-échantillons de 5339 séquences (2012) ou de 7464 séquences (2013) chacun grâce au logiciel Mothur v.1.35.1 (Schloss et al., 2009).

Les différences d'abondance relative des taxons bactériens entre rotations ont été calculées séparément pour chaque année sur un sous-échantillon de 5339 séquences (2012) ou de 7464 séquences (2013) grâce au programme Metastats (White et al., 2009) implémenté dans Mothur v.1.35.1.

L'effet des successions de culture sur les indices de diversité bactérienne, les abondances de gènes, les activités enzymatiques et les cinétiques de minéralisation a été analysé par un test de Friedman sur les données appariées par année et par bloc, avec la succession de cultures comme facteur. La comparaison multiple des moyennes a été réalisée grâce à un test post-hoc de Nemenyi. Les tests de Friedman et de Nemenyi ont été réalisés avec R 3.0.0 (R Development Core Team, 2014), en utilisant les packages Rcmdr (Fox, 2005) et PMCMR v.1.1 (Pohlert, 2014).

## Résultats

*Effet de la rotation sur les abondances microbiennes, les activités enzymatiques et la minéralisation nette de l'azote et du soufre dans sol prélevé sous couvert de blé*

Les abondances microbiennes, totales ou fonctionnelles, les activités arylsulfatase et protéase et la minéralisation nette de l'azote et du soufre ont été mesurés sous un couvert de blé dans trois
<table><caption>**Tableau 1** Variables microbiennes sous le blé en fonction de la rotation (moyenne de 8 réplicats ± erreur type). Composition des rotations (le sol a été prélevé sous le blé indiqué en gras) : BOCB, rotation Blé-Orge-Colza-Blé ; BOPB, rotation Blé-Orge-Pois-Blé, PBCB, rotation Pois-Blé-Colza-Blé. n.s.: pas de différence significative entre rotations</caption><thead><tr><th></th><th>BOCB</th><th>BOPB</th><th>PBCB</th><th>χ<sup>2</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>Bactéries cultivables totales (UFC g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>1.75E+08±7.27E+07</td><td>1.54E+08±7.90E+07</td><td>1.54E+08±7.16E+07</td><td>4.00n.s.</td></tr><tr><td>Bactéries cultivables protéolytiques (UFC g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>2.35E+07±1.24E+07</td><td>1.91E+07±1.16E+07</td><td>2.53E+07±1.28E+07</td><td>3.00n.s.</td></tr><tr><td>Bactéries cultivables arylsulfatase (UFC g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>1.10E+07±3.86E+06</td><td>8.68E+06±2.67E+06</td><td>1.16E+07±4.37E+06</td><td>2.25n.s.</td></tr><tr><td>ADNr 16S (copies g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>1.39E+08±1.46E+07</td><td>1.73E+08±2.85E+07</td><td>2.18E+08±2.43E+07</td><td>3.25n.s.</td></tr><tr><td>ADNr 18S (copies g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>8.90E+06±1.80E+06</td><td>1.39E+07±3.85E+06</td><td>1.45E+07±2.81E+06</td><td>3.25n.s.</td></tr><tr><td>apr (copies g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>2.16E+07±1.04E+07</td><td>1.83E+07±6.33E+06</td><td>3.44E+07±1.21E+07</td><td>0.75n.s.</td></tr><tr><td>ADNr 16S/ ADNr 18S</td><td>23.0±5.7</td><td>18.8±5.6</td><td>17.5±2.1</td><td>4.00n.s.</td></tr><tr><td>apr/ADNr 16S</td><td>0.145±0.052</td><td>0.134±0.045</td><td>0.184±0.066</td><td>1.75n.s.</td></tr><tr><td>Activité protéase (µgTyr h<sup>-1</sup> g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>128±25</td><td>146±26</td><td>112±22</td><td>2.00n.s.</td></tr><tr><td>Activité arylsulfatase (µgPN h<sup>-1</sup> g<sup>-1</sup> sol sec)</td><td>198±27</td><td>176±17</td><td>233±31</td><td>3.25n.s.</td></tr><tr><td>Minéralisation nette de N (mgS kg<sup>-1</sup> j<sup>-1</sup>)</td><td>1.29±0.25</td><td>1.37±0.38</td><td>1.61±0.31</td><td>2.25n.s.</td></tr><tr><td>Minéralisation nette de S (mgS kg<sup>-1</sup> j<sup>-1</sup>)</td><td>0.541±0.067</td><td>0.478±0.089</td><td>0.559±0.081</td><td>0.25n.s.</td></tr></tbody></table>

rotations différentes (rotation Blé-Orge-Colza-Blé (BOCB), rotation Blé-Orge-Pois-Blé (BOPB) et rotation Pois-Blé-Colza-Blé (PBCB)). Les abondances microbiennes totales, mesurées par les abondances de gènes (ADNr 16S et ADNr 18S) ou par des méthodes de culture (bactéries cultivables) sur les échantillons de sol sous couvert de blé ne sont pas significativement différentes au seuil p < 0.05 entre les trois rotations (Tableau 1). Toutes rotations confondues, le nombre de copies de gènes exprimé par gramme de sol sec est de 1,24E+07 ± 1,71E+06 et de 1,77E+08 ± 1,45E+07 respectivement pour l'ADNr 18S et l'ADNr 16S.
<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 1** Analyse en composante principale des variables microbiennes (diagrammes des variables et des individus). Les deux premiers axes sont représentés. Les individus sont coloriés en fonction de la rotation. Les carrés (■) représentent le centroide de la rotation. CFU tot : abondance totale de bactéries cultivables ; CFU protéase : abondance de bactéries cultivables protéolytiques ; CFU ars : abondance de bactéries cultivables présentant l'activité arylsulfatase ; protéase : activité protéase ; ars : activité arylsulfatase ; MinN : minéralisation nette de N ; MinS : minéralisation nette de S ; BOCB : rotation Blé-Orge-Colza-Blé ; BOPB : rotation Blé-Orge-Pois-Blé ; PBCB : rotation Pois-Blé-Colza-Blé</figcaption></figure>

L'abondance des bactéries cultivables est en moyenne de 1,61E+08 ± 4,12E+07 UFC gramme⁻¹ sol sec. Aucun effet significatif du type de rotation n'est mis en évidence au niveau de la taille des communautés microbiennes fonctionnelles impliquées dans la minéralisation de l'azote et du soufre (i.e. possédant respectivement les activités protéase et arylsulfatase) (Tableau 1). Toutes rotations confondues, l'abondance des gènes *apr* est de 2,47E+07 ± 5,67E+06 copies gramme⁻¹ sol sec. Les densités des bactéries cultivables exprimées en UFC gramme⁻¹ sol sec sont de 2,26E+07 ± 6,80E+06 et 1,04E+07 ± 2,06E+06 respectivement pour les bactéries possédant l'activité protéase et celles possédant l'activité arylsulfatase.

Les activités protéase et arylsulfatase ne sont pas significativement différentes au seuil p < 0.05 en fonction de la rotation (Tableau 1). Toutes rotations confondues, l'activité protéase est de 129 ± 13 µgTyr h⁻¹ gramme⁻¹ sol sec, l'activité arylsulfatase est de 203 ± 15 µgPN h⁻¹ gramme⁻¹ sol sec.

De même que pour les abondances de bactéries impliquées dans la minéralisation de l'azote et du soufre et que pour l'activité protéase et arylsulfatase, la minéralisation nette de N et S n'est pas significativement influencée par la rotation (Tableau 1). Toutes rotations confondues, la minéralisation nette de l'azote est de 1,43 ± 0,18 mgN kg⁻¹ jour⁻¹ sol sec et la minéralisation nette du soufre est de 0,53 ± 0,04 mgS jour⁻¹ kg⁻¹ sol sec. La minéralisation nette de l'azote et du soufre n'est significativement corrélée à aucune des variables d'abondance ou d'activité microbiennes mesurées.
<table><caption>**Tableau 2** Indices de diversité alpha de la communauté bactérienne totale en fonction de la rotation (moyenne ± erreur type), en 2012 et 2013. nOTU : nombre d'OTU observés, ShannonNP : indice de Shannon non paramétrique, PD : indice de diversité phylogénétique. Rotation BOCB : Blé-Orge-Colza-Blé, rotation BOPB : Blé-Orge-Pois-Blé, rotation PBCB : Pois-Blé-Colza-Blé. Les moyennes suivies par des lettres différentes sont significativement différentes entre les rotations au sein d'une même année. n.s. : différence non significative, * p< 0,05</caption><thead><tr><th></th><th>Nombre de séquences</th><th>Sous-échantillon</th><th>Indice de Good</th><th>nOTU</th><th>Chao1</th><th>ACE</th><th>Simpson</th><th>Shannon NP</th><th>Equitabilité de Shannon</th><th>PD</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="11"><strong>2012</strong></td></tr><tr><td>BOCB</td><td>6914±1139</td><td>5339</td><td>0.83±0.01</td><td>2037±334</td><td>4289±1021a</td><td>6431±1700a</td><td>0.0033±0.0007</td><td>6.92±0.12</td><td>0.88±0.00</td><td>107±17</td></tr><tr><td>BOPB</td><td>7405±1002</td><td>5339</td><td>0.83±0.01</td><td>2060±277</td><td>4581±1004b</td><td>6766±1791b</td><td>0.0035±0.0005</td><td>6.85±0.09</td><td>0.87±0.00</td><td>109±14</td></tr><tr><td>PBCB</td><td>7991±1056</td><td>5339</td><td>0.83±0.01</td><td>2218±218</td><td>5145±1016b</td><td>7865±1860b</td><td>0.0030±0.0003</td><td>6.93±0.02</td><td>0.87±0.01</td><td>115±10</td></tr><tr><td>χ<sup>2</sup></td><td>3.5n.s.</td><td></td><td>1.5n.s.</td><td>1.5n.s.</td><td>6*</td><td>6.5*</td><td>0n.s.</td><td>1.5n.s.</td><td>2n.s.</td><td>1.5n.s.</td></tr><tr><td colspan="11"><strong>2013</strong></td></tr><tr><td>BOCB</td><td>8759±263</td><td>7449</td><td>0.77±0.01</td><td>2934±141</td><td>8748±565</td><td>15063±1129b</td><td>0.0030 0.0004</td><td>7.20 0.09</td><td>0.87 0.01</td><td>176 8</td></tr><tr><td>BOPB</td><td>8673±475</td><td>7449</td><td>0.78±0.01</td><td>2760±72</td><td>7580±340</td><td>12626±784a</td><td>0.0030 0.0004</td><td>7.14 0.08</td><td>0.87 0.01</td><td>164 4</td></tr><tr><td>PBCB</td><td>8320±310</td><td>7449</td><td>0.76±0.01</td><td>2789±91</td><td>8285±410</td><td>14896±988b</td><td>0.0031 0.0004</td><td>7.16 0.08</td><td>0.87 0.01</td><td>165 4</td></tr><tr><td>χ<sup>2</sup></td><td>1.5n.s.</td><td></td><td>2n.s.</td><td>2n.s.</td><td>3.5n.s.</td><td>6*</td><td>1.5n.s.</td><td>2n.s.</td><td>1.5n.s.</td><td>2n.s.</td></tr></tbody></table>

Effets de la rotation sur la structure et la diversité de la communauté bactérienne totale du sol prélevé sous couvert de blé

Pour calculer les indicateurs de diversité, nous avons considéré le plus petit dénominateur commun aux échantillons, soit 5339 séquences pour 2012 et 7449 séquences pour 2013 (choisies aléatoirement par Mothur). En raison de la taille des jeux de données, nous avons dû traiter séparément les données de chaque année pour des raisons de puissance de calcul disponible. Les échantillons prélevés sous blé dans les trois rotations différentes présentent des richesses spécifiques similaires (i.e. nombre d'OTU observé) (Tableau 2). Les courbes de raréfaction sont loin d'atteindre l'asymptote, pour la plupart des échantillons, indiquant que la richesse observée est sous estimée, et ne permettent pas d'observer de différences de richesse spécifique entre les rotations (Figure 2). Néanmoins, les estimateurs de richesse Chao1 et ACE sont significativement supérieurs dans les rotations PBCB et BOPB par rapport à la rotation à BOCB en 2012 mais inférieurs dans la rotation BOPB par rapport aux deux autres rotations en 2013. Les indicateurs d'équitabilité, de diversité spécifique (Shannon non-paramétrique et Simpson) et de diversité phylogénétique ne sont pas significativement différents entre les blés issus des trois rotations. La structure des communautés bactériennes (nombre et abondance relative des différents OTU) a été comparée entre échantillons par le calcul d'une matrice de dissimilarité de Bray-Curtis et d'une matrice de Jaccard. Les matrices obtenues (comparaison deux à deux de tous les échantillons) ont servi de base
<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 2** Courbes de raréfaction des OTU 97% en fonction de la rotation en 2012 et 2013. Composition des rotations (le sol a été prélevé sous le blé indiqué en gras) : BOCB, rotation Blé-Orge-Colza-Blé ; BOPB, rotation Blé-Orge-Pois-Blé, PBCB, rotation Pois-Blé-Colza-Blé.</figcaption></figure>

pour la représentation graphique sous forme de graphes NMDS (Figure 4) afin de comparer les similitudes de structure. Aucune différence n'a pu être mise en évidence par ANOSIM entre les trois rotations, quel que soit l'indice utilisé et quelle que soit l'année (p>0.05).

### Effet de la rotation sur la composition phylogénétique de la communauté bactérienne totale du sol prélevé sous couvert de blé

Les données issues du pyroséquençage ont permis d'identifier 19 et 21 phyla bactériens dans les échantillons de sol prélevés respectivement en 2012 et 2013. Les phyla dominants sont, en 2012 comme en 2013, les Proteobacteria (49% des séquences en 2012 et 45% des séquences en 2013), les Actinobacteria (19% en 2012, 28% en 2013), les Bacteroidetes (8,3% en 2012, 8,5% en 2013) et les Gemmatimonadetes (7,5% en 2012, 4,13% en 2013) (Figure 3). Quatre classes de Proteobacteria ont été identifiées, les Alphaproteobacteria (13% des séquences en 2012, 16% en 2013), les Betaproteobacteria (6,1% en 2012, 5,2% en 2013), les Gammaproteobacteria (8,5% en 2012, 10% en 2013) et les Deltaproteobacteria (20% en 2012, 12% en 2013). Aux rangs taxonomiques inférieurs, 51 classes, 83 ordres, 142 familles et 328 genres ont été identifiés en 2012 et 51 classes, 86 ordres, 148 familles et 349 genres en 2013. Toutes rotations confondues, les genres les plus abondants en 2012 étaient les *Gemmatimonas* (7,54%), les *Gaiella* (6,70%), les *Sphingomonas* (2,77%), et les *Kofleria* (1,20%). Les genres les plus abondantes en 2013 étaient les *Gaiella* (8,93%), les *Gemmatimonas* (4,13%), les *Sphingomonas* (3,49%) et les *Arenimonas* (1,27%).
<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure 3** Abondance relative des phyla et des classes de protéobactéries, abondants (>1% de la communauté) (A) et rares (<1% de la communauté) (B), en fonction de la rotation en 2012 et 2013. Composition des rotations (le sol a été prélevé sous le blé indiqué en gras) : BOCB, rotation Blé-Orge-Colza-Blé ; BOPB, rotation Blé-Orge-Pois-Blé, PBCB, rotation Pois-Blé-Colza-Blé. *12 Abondance significativement différente entre rotations en 2012, *13 Abondance significativement différente entre rotations en 2013</figcaption></figure>
Néanmoins, plusieurs taxons présentent des variations d'abondance relative en fonction de la rotation. Ainsi au niveau taxonomique du phylum, l'abondance des Deltaproteobacteria et des Gemmatimonadetes sous couvert de blé est significativement différente selon la rotation en 2012 mais pas en 2013. L'abondance des Deltaproteobacteria suit le gradient suivant : rotation PBCB (22,8 ± 1,09%) > rotation BOPB (18,4 ± 1,63%) > rotation BOCB (17,6 ± 0,7%). L'abondance des Gemmatimonadetes est supérieure sous couvert de blé dans des rotations incluant du pois (8,13 ± 1,96% pour BOPB et 8,57 ± 0,56% pour PBCB) que dans la rotation BOCB (5,90 ± 0,72%). Parmi les phyla les plus rares (représentant moins de 1% de la communauté totale), l'abondance des Firmicutes et des Latescibacteria varie en fonction de la rotation en 2013 mais pas en 2012. Les Firmicutes sont plus

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

**Figure 4** Positionnement multidimensionnel non-métrique (NMDS) des communautés microbiennes en 2012 et 2013, basé sur la matrice de distance Unifrac, non-pondérée (composition phylogénétique ; A et C) ou pondérée par l'abondance (structure phylogénétique ; B et D). Composition des rotations (le sol a été prélevé sous le blé indiqué en gras) : BOCB, rotation Blé-Orge-Colza-Blé ; BOPB, rotation Blé-Orge-Pois-Blé, PBCB, rotation Pois-Blé-Colza-Blé. L'analyse par ANOSIM n'a montré différence significative entre rotations au seuil p<0.05

abondants sous la rotation PBCB (1,79 ± 0,22%) que dans les rotations BOCB (0,975 ± 0,188%) et BOPB (0,911 ± 0,075%). Les Latescibacteria sont plus abondantes dans la rotation BOPB (0,039 ± 0,011%), moins abondantes dans la rotation PBCB (0,008 ± 0,008%) et intermédiaires dans la rotation BOCB (0,022 ± 0,007%).
Au niveau du genre, 22 genres en 2012 et 13 genres en 2013 ont des abondances relatives qui varient en fonction de la rotation (Tableau 3). A l'exception de *Gemmatimonas*, *Bradyrhizobium* et *Pseudomonas*, ces genres sont généralement peu abondants (i.e. abondances relatives inférieures à 1%). Seules les abondances relatives des genres *Methylophilus*, *Nannocystis*, *Panacagrimonas* et *Pseudomonas* varient en fonction de la rotation à la fois en 2012 et en 2013. Les *Nannocystis* et les *Panacagrimonas* sont plus abondantes dans la rotation BOCB et moins abondantes dans la rotation

<table><caption>**Tableau 3** Abondance relative en pourcentage (moyenne ± erreur type) des genres bactériens sous le blé en fonction de la rotation en 2012 et en 2013. Composition des rotations (le sol a été prélevé sous le blé indiqué en gras) : BOCB, rotation Blé-Orge-Colza-Blé ; BOPB, rotation Blé-Orge-Pois-Blé, PBCB, rotation Pois-Blé-Colza-Blé. Les moyennes suivies par des lettres différentes sont significativement différentes entre les rotations au sein d'une même année (p<0.05)</caption><thead><tr><th colspan="4">2012</th><th colspan="4">2013</th></tr><tr><th>Genre bactérien</th><th>BOCB</th><th>BOPB</th><th>PBCB</th><th>BOCB</th><th>BOPB</th><th>PBCB</th></tr></thead><tbody><tr><td>Beijerinckia</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,015±0,011ab</td><td>0,019±0,004b</td><td>0,005±0,003a</td><td>0,019±0,013ab</td><td>0,02±0,005b</td></tr><tr><td>Bradyrhizobium</td><td>0,617±0,086a</td><td>1,019±0,043b</td><td>0,864±0,282ab</td><td>0,713±0,099b</td><td>0,326±0,056a</td><td>0,519±0,074ab</td></tr><tr><td>Gemmatimonas</td><td>5,905±0,727a</td><td>8,138±1,96ab</td><td>8,578±0,563b</td><td>0,038±0,014b</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,00±0,00a</td></tr><tr><td>Geodermatophilus</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,017±0,007b</td><td>0,011±0,004b</td><td>0,012±0,009a</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,064±0,015b</td></tr><tr><td>Janibacter</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,019±0,011ab</td><td>0,023±0,008b</td><td>0,032±0,003b</td><td>0,011±0,007a</td><td>0,018±0,008ab</td></tr><tr><td>Kofleria</td><td>0,845±0,099a</td><td>1,355±0,227ab</td><td>1,393±0,041b</td><td>0,078±0,015a</td><td>0,086±0,026a</td><td>0,181±0,018b</td></tr><tr><td>Lentzea</td><td>0,029±0,004b</td><td>0,015±0,005a</td><td>0,002±0,002a</td><td>0,204±0,028b</td><td>0,084±0,025a</td><td>0,12±0,055ab</td></tr><tr><td>Limnobacter</td><td>0,009±0,005a</td><td>0,015±0,006a</td><td>0,042±0,004b</td><td>0,216±0,034b</td><td>0,106±0,021a</td><td>0,127±0,018b</td></tr><tr><td>Luteibacter</td><td>0,017±0,00a</td><td>0,019±0,007ab</td><td>0,005±0,005b</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,011±0,008b</td><td>0,012±0,005b</td></tr><tr><td>Marmoricola</td><td>0,067±0,02b</td><td>0,046±0,02ab</td><td>0,013±0,007a</td><td>0,706±0,162a</td><td>0,836±0,213a</td><td>1,881±0,403b</td></tr><tr><td>Methylophilus</td><td>0,115±0,019b</td><td>0,121±0,03ab</td><td>0,044±0,02b</td><td>0,002±0,002a</td><td>0,011±0,00b</td><td>0,012±0,004ab</td></tr><tr><td>Microlunatus</td><td>0,03±0,01b</td><td>0,022±0,013ab</td><td>0,00±0,00a</td><td>0,017±0,003a</td><td>0,051±0,013b</td><td>0,036±0,013ab</td></tr><tr><td>Microvirga</td><td>0,45±0,032a</td><td>0,295±0,102ab</td><td>0,232±0,054b</td><td>0,048±0,016b</td><td>0,056±0,008ab</td><td>0,015±0,009a</td></tr><tr><td>Nannocystis</td><td>0,144±0,032b</td><td>0,025±0,012a</td><td>0,046±0,022a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nocardioides</td><td>0,267±0,033b</td><td>0,25±0,062ab</td><td>0,103±0,02b</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Panacagrimonas</td><td>0,201±0,032b</td><td>0,115±0,017a</td><td>0,12±0,02ab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenylobacterium</td><td>0,265±0,017a</td><td>0,584±0,102b</td><td>0,721±0,166b</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phyllobacterium</td><td>0,047±0,03ab</td><td>0,037±0,012b</td><td>0,005±0,002a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas</td><td>2,36±1,494ab</td><td>0,879±0,216b</td><td>0,341±0,061a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rhizobacter</td><td>0,088±0,023b</td><td>0,024±0,01a</td><td>0,036±0,012ab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorangium</td><td>0,036±0,008b</td><td>0,01±0,003a</td><td>0,012±0,012ab</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

BOPB. En revanche, l'abondance des genres *Methylophilus* et *Pseudomonas* ne varie pas de la même manière en fonction de la rotation les deux années. Dans le cas des échantillons sous couvert de blé issus de la rotation sans pois (BOCB), les genres *Lentzea*, *Marmoricola*, *Methylophilus*, *Microlunatus*, *Nannocystis*, *Nocardioides*, *Panacagrimonas*, *Rhizobacter* et *Sorangium* sont particulièrement abondants en 2012 alors que les genres *Conexibacter*, *Cytophaga*, *Nannocystis*, *Panacagrimonas* et *Smaragdicoccus* sont particulièrement abondants en 2013. Pour les échantillons de sol sous couvert de blé à précédent pois (BOPB), les genres *Bradyrhizobium*, *Geodermatophilus*, *Phenylobacterium*, *Phyllobacterium* et *Pseudomonas* sont particulièrement abondants en 2012 et les genres *Pelomonas*,
Rickettsia et Shinella en 2013. Enfin pour les échantillons de sol de la PBCB, les genres Beijerinckia, Gemmatimonas, Geodermatophilus, Janibacter, Kofleria, Limnobacter, Luteibacter, Methylophilus, Microvirga, Nocardioides et Phenylobacterium sont particulièrement abondants en 2012 et les genres Aeromonas, Demequina, Methylophilus, Panacagrimonas, Pelomonas et Pseudomonas en 2013.

## Discussion

### Effet de la rotation sur les abondances microbiennes et les activités enzymatiques en lien avec la minéralisation de N et de S

La composition des différentes rotations n'a pas d'effet significatif sur l'abondance des communautés microbiennes, infirmant notre première hypothèse. L'absence de différences entre les rotations BOCB et BOPB qui ne diffèrent que par le précédent cultural (colza ou pois) pourrait être attribué à la durée séparant l'enfouissement des résidus et le prélèvement de sol, qui pourrait être suffisante pour atteindre une dégradation importante des résidus et estomper toute différence d'abondance microbienne liée à des différences de qualité biochimique des résidus. Ainsi, en conditions contrôlées, pour des résidus de colza (C/N = 30), la minéralisation atteint environ 60% du C incorporé au bout de 175 jours contre 47% pour des résidus de blé (Niknahad-Gharmarkher et al., 2012). La vitesse de dégradation des résidus dans les sols est fonction de la nature biochimique des résidus et des ratios C/N et C/S. Les cinétiques de minéralisation du carbone pour des résidus de pois et de colza ayant des C/N identiques (environ 13) et des C/S contrastés (respectivement 239 et 37) sont différentes (Churka Blum et al., 2013). Les effets des résidus sur la taille du compartiment microbien dépendent de leur nature avec des effets très transitoires sur la biomasse carbonée après l'incorporation de résidus de moutarde en comparaison de résidus de blé (Piutti et al., 2015). Les différences de biomasse microbienne azotée induites par l'introduction de résidus de pois et d'orge disparaissent après 40 jours (Jensen, 1997). En conditions naturelles, Biederbeck et al. (2005) observent un effet de l'introduction pois dans la rotation sur la biomasse microbienne carbonée 1 an après l'enfouissement des résidus de pois au champ. Néanmoins les traitements comparés, une monoculture et des rotations de deux ans, sont susceptibles d'entraîner des écarts plus importants que l'introduction d'un pois dans une rotation de 3 ans. Si la biomasse microbienne carbonée apparait comme une variable sensible à la diversification des cultures dans la succession culturale (McDaniel et al., 2014), dans notre travail la taille du compartiment microbien a été appréhendé par quantification du nombre de copies de gènes 16S et 18S. Dans une étude menée sur des microcosmes de sol, Dandie et al. (2007) mettent en évidence une corrélation positive (r²=0.69) entre l'estimation de la taille du compartiment microbien
appréhendé par méthode moléculaire (16S rRNA gene) et la méthode par fumigation-extraction.
L'absence de différence entre les précédent pois et colza sur les abondances microbiennes sous blé
pourrait aussi être due à des vitesses de décomposition élevées des résidus de Légumineuses et de
Brassicacées qui se décomposent plus vite que les résidus de céréales (Cookson et al., 1998 ; Rahn et
Lillywhite, 2001 ; Kriauciuniene et al., 2008 ; Wu et al., 2011).

Aucune différence d'activité protéase et arylsulfatase n'a pu être mise en évidence entre les
différentes rotations. Cette absence d'effet de la composition de la rotation sur les activités
enzymatiques semble cohérente avec l'absence de variation des abondances microbiennes. Si nous
avons montré qu'en conditions contrôlées, les résidus du pois provoquaient une augmentation de
l'activité protéase dans les mois suivant leur incorporation (Chapitre 3), il faut noter que la
comparaison semble difficile du fait d'une part de conditions de culture différentes et d'autre part d'un
suivi des activités peu de temps (10-90 jours) après l'incorporation des résidus de pois en conditions
contrôlées. Certains auteurs ont mis en évidence au champ des effets positifs du type de rotation sur
les activités arylsulfatase et ou protéase. Après plusieurs cycles de rotation, Biederbeck et al. (2005)
ont mis en évidence un effet positif d'une rotation pois/blé comparé au blé en monoculture sur
l'activité arylsulfatase. Des effets du précédent pois ont également été montrés sur l'activité protéase
mais ces effets variaient en fonction de l'année et de la saison d'échantillonnage (Biederbeck et al.,
2005 ; Piotrowska-Długosz et Wilczewski, 2014). Nous avons vu au chapitre précédent en considérant
différentes cultures que les variations de la minéralisation nette de N et S pouvaient être expliquées
par les variations d'activités protéase, arylsulfatase et d'abondance de bactéries protéolytiques. De
manière cohérente avec l'absence d'évolution des activités et des abondances microbiennes, la
minéralisation nette de N et S n'est pas influencée par la composition de la rotation.

Effet de la rotation sur la composition de la communauté microbienne

La communauté bactérienne de notre sol est dominée par des bactéries appartenant aux Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes et Gemmatimonadetes qui correspondent aux phyla les plus fréquemment identifiés dans les sols agricoles (Janssen, 2006 ; Yin et al., 2010 ; Xuan et al., 2012 ; Zhao et al., 2014). Néanmoins, les Acidobacteria, qui sont souvent bien représentées, sont peu abondantes dans notre sol, ce qui pourrait être lié à des valeurs de pH élevé (Lauber et al., 2009). Il est intéressant de noter que les phyla les plus abondants dans notre étude sont généralement considérés comme copiotrophes (Cleveland et al., 2007 ; Fierer et al., 2007 ; Nemergut et al., 2010 ; Pascault et al., 2010 ; Cederlund et al., 2014).

Si la nature de la succession culturale a un effet sur la richesse en OTU des communautés microbiennes,
le gradient de richesse entre les 3 rotations comparées n'est pas le même selon l'année considérée
limitant de ce fait l'interprétation. En revanche la nature de la succession culturale n'a pas d'effet significatif ni sur la structure, ni sur la composition taxonomique de la communauté bactérienne. Néanmoins, les abondances de certaines familles et/ou genres varient en fonction du type de rotation. En 2012, les Deltaproteobacteria sont plus abondantes dans la rotation Pois-Blé-Colza-Blé que dans la rotation Blé-Orge-Colza-Blé alors que ces dernières ont le même précédent cultural. Si les Proteobacteria sont considérées comme copiotrophes (Bernard et al., 2007 ; Eilers et al., 2010 ; Pascault et al., 2013), les Deltaproteobacteria pourraient être plutôt oligotrophes (Bastian et al., 2009 ; Goldfarb et al., 2011). Par ailleurs, un certain nombre de Deltaproteobacteria sont impliquées dans la réduction du soufre (Foti et al., 2007) ou prédatrices de bactéries (Berleman et Kirby, 2009). Les Gemmatimonadetes sont moins abondantes dans la rotation Blé-Orge-Colza-Blé que dans les deux autres rotations incluant le pois. Si peu de choses sont connues sur les Gemmatimonadetes (DeBruyn et al., 2011) du fait d'une faible cultivabilité des espèces appartenant à cette famille, les Gemmatimonadetes semblent plutôt oligotrophes (Pascault et al., 2013) et adaptées à des milieux peu humides (DeBruyn et al., 2011). En 2013, les Firmicutes sont plus abondantes dans la rotation Pois-Blé-Colza-Blé que dans les autres rotations alors que les Latescibacteria qui sont peu décrites (Youssef et al., 2015) sont plus abondantes dans la rotation Blé-Orge-Pois-Blé que dans la rotation Blé-Orge-Colza-Blé. Les Firmicutes sont plutôt intermédiaires entre les stratégies oligotrophes et copiotrophes (Pascault et al., 2013). Parmi les genres dont l'abondance varie en fonction de la rotation, certains sont rarement répertoriés dans les sols agricoles (Geodermatophilus, Kofleria, Lentzea, Panacagrimonas, Sorangium, Smaragdicoccus, Demequina, Rickettsia), d'autres sont fréquemment observées mais leur écophysiologie est méconnue (Gemmatimonas (DeBruyn et al., 2011), Limnobacter (Liu et al., 2013), Nannocystis (Bernard et al., 2007), Nocardioides (Acosta-Martinez et al., 2008), Phenylobacterium (Baldrian et al., 2012), Conexibacter (Seki et al., 2012), Aeromonas (Li et al., 2011), limitant les possibilité d'interprétation des résultats.

Les variations incohérentes sur les deux années des abondances de phyla et de genres tendent à soutenir l'idée que les analyses de pyroséquençage, comme les autres analyses portant sur les communautés microbiennes des sols, doivent être réalisées sur plusieurs années afin de faire apparaître des tendances significatives. A l'exception de Jung et al., (2015), très peu d'études utilisant le pyroséquençage ont étudié l'effet des rotations sur plusieurs années. Les variations interannuelles pourraient être liées à des différences de conditions météorologiques mais avec seulement deux années, il n'est pas possible de rechercher les facteurs météorologiques responsables.
## Conclusion

Nous n'avons pas observé d'effet de la composition de la rotation et ainsi d'effet précédent différentiel sur l'abondance de la communauté microbienne totale, les activités arylsulfatase et protéase, ainsi que sur l'abondance des bactéries responsables de ces activités, sous le blé. En conséquence, la minéralisation d'azote et de soufre n'était pas non plus influencée par la composition de la rotation. Les effets sur la composition et la diversité de la communauté bactérienne sont réduits à des variations d'abondance de quelques taxons en interaction certainement avec les conditions de l'année.

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Effect of crops species on crop-weeds functional niches overlap and
weeds functional traits involved in competition

Nicolas Romillac<sup>a,b</sup>, Séverine Piutti<sup>a,b</sup>, Sophie Slezack-Deschaumes<sup>a,b</sup>, Bernard Amiaud<sup>c,d</sup>,

Mis en forme pour PLOS ONE

<footnote><sup>a</sup> Université de Lorraine, Laboratoire Agronomie et Environnement, UMR 1121, TSA 40602, F-54518 Vandœuvre cedex, France</footnote>

<footnote><sup>b</sup> INRA, Laboratoire Agronomie et Environnement, UMR 1121, TSA 40602, F-54518 Vandœuvre cedex, France</footnote>

<footnote><sup>c</sup> Université de Lorraine, UMR 1137, Ecologie et Ecophysiologie Forestière, F-54500 Vandoeuvre lès Nancy, France</footnote>

<footnote><sup>d</sup> INRA, UMR 1137, Ecologie et Ecophysiologie Forestière, F-54280 Champenoux, France</footnote>
**Abstract:** In agroecosystems, weed communities are involved in competition with the crops. Nevertheless, the relationships between disturbance-like agricultural practices, crops-weeds relationships and weed communities' functional composition are not fully understood. Using functional traits involved in resource acquisition and competitive ability measured at the individual scale in a rotation experiment, we compared the weed functional diversity in two crops (oilseed rape and pea) which differ in their competitive ability and their sowing date, and in two wheat crops following either oilseed rape or pea. We quantified the overlap between weeds and crop functional traits values as a proxy of competition. In the less competitive crop, i.e. pea, weed communities were more abundant, presented a more competitive phenotype (i.e. higher height and lateral spread) and were functionally more diverse, revealing a higher diversity of ecological strategies than in the oilseed rape crop. As a consequence, the weeds functional niche overlapped more with the pea niche, resulting in a potentially more competitive weed flora in pea than in oilseed rape. Weeds community in wheat with different previous crop were taxonomically different but presented near identical functional identity and diversity for height, lateral spread, specific leaf area and leaf dry matter content. The overlap between wheat and weeds functional traits was not influenced by the previous crop, except for the height. Nevertheless, weed communities in wheat after pea are far less abundant than in wheat after oilseed rape. This should ultimately reduce the crop-weed competition in wheat after pea compared to wheat after oilseed rape.

**Key words:** *Brassica napus*, *Pisum sativum*, functional niche, niche overlap, crop-weed competition, functional diversity, specific leaf area, leaf dry matter content, height, lateral spread

**Introduction**

At the level of plant communities, many biotic and abiotic factors are considered to lead to a specific assemblage of species within the community (Belyea and Lancaster, 1999). These factors acts as environmental filters (Garnier and Navas, 2012) at different global (Ulrich et al., 2014), regional (Tanaka and Koike, 2011) and field scales (Petit and Fried, 2012). Ecological theories and recent field studies show that functional approach is a useful tool to understand such assembly rules (Garnier and Navas, 2012; Gaba et al., 2014), especially in the understanding of relationships between species and their realized ecological niche (McGill et al., 2006; Weiher et al., 2011). The classical niche-based theory describes the ability of species to exploit a variability of environment which leads to a niche differentiation (Hutchinson, 1957; Vandermeer, 1972; Silvertown, 2004). In this point of view, niche differentiation limit competition between species within the communities. Niche differentiation should result in niche complementarity, which leads to a higher exploitation of the diverse resources and a decrease of competition (Smith et al., 2009). However, taking into account a functional approach it is possible to go further in understanding the assemblage rules. Indeed, in this context functional studies focused on two main hypotheses: habitat filtering, which can decrease functional diversity through abiotic constraints (Garnier and Navas, 2012), and competitive interactions that limit similarity
between species and increase functional diversity (Schwilk and Ackerly, 2005). A recent literature has suggested that niches quantification may be done by measurements of functional traits (Rosenfeld, 2002; Mouillot et al., 2005; McGill et al., 2006; Kearney et al., 2010). Functional traits are considered as morphological, physiological and phenological characteristics of individuals that are directly related to plant performance (Violle et al. 2007). The traits based approaches should allow assessing the dominant processes involved in the community assemblage. Habitat filtering should result in functional traits convergence while niche differentiation should result in a divergence of functional trait values (Grime, 2006; Navas and Violle, 2009; Garnier and Navas, 2012; de Bello et al., 2012).

The relative importance of habitat filtering and niche differentiation for community assemblage varies according to the disturbance frequency and resource availability (Pakeman et al., 2011; Bernard-Verdier et al., 2012; May et al., 2013). Agroecosystems are characterized by frequent disturbance and abundant resources such as soil nutrients or light due to fertilization and a high share of open space for plant communities. In agroecosystems, plant communities including crops and weed communities observed among crops, are submitted to frequent disturbances. Despite the niche differentiation theory, in rich environment some studies demonstrated the coexistence of species with similar functional distribution of sampled traits (Bernard-Verdier et al., 2012; Price et al., 2014). Nevertheless, the relationships between disturbance like agricultural practices, crops-weeds relationships and weed communities' functional composition are not fully understood (Hernández Plaza et al., 2015). Storkey (2006) identified weed functional groups having different competitiveness toward crops, based on trade-offs between traits. Traits databases and nationwide weed surveys (Fried et al., 2009, 2012, 2015) or traits databases and modeling (Storkey et al., 2014; Colbach et al., 2014) proved their usefulness to identify functional traits involved in competition between crops and weed species. Exception for the plant height, most of the pertinent traits identified by these authors were traits linked to phenology and reproduction, such as chilling requirement to break dormancy, germination season, flowering onset and duration or seed mass. Nevertheless, traits involved in reproduction and traits involved in resource acquisition can respond in different ways to disturbances and biotic relationships (Grime, 2006). Furthermore, traits involved in resource acquisition and competition response, such as height and specific leaf area, can present strong intraspecific variability (Perronne et al., 2014), which challenges the use of trait values databases. This element argues for traits measurements in field conditions. As quantifying competition between plants in natural conditions is difficult and the methodology is controversial (Freckleton et Watkinson, 1999; Freckleton et al., 2009), we chose an indirect approach based on estimating the overlap between the crop and weeds ecological niche based on functional traits measurements. The overlap between functional trait values of crops
and weeds communities will be considered the proxy of an overlap between ecological niches (Mouillot et al., 2005; Mason et al., 2011).

Using data collected in a rotation experiment, we compared weed functional diversity in two crops (oilseed rape and pea) which differ in their competitive ability (Gunton et al., 2011) and their sowing date, and in two wheat crops preceded by either oilseed rape or pea, as well as the overlap between weeds and crop functional traits values. Specifically, we hypothesized that (1) in pea crops, weeds will be more abundant, and functionally more diverse than in oilseed rape due to the low competitiveness and late sowing date of pea; that (2) wheat following pea will have a functionally more diverse weed community, compared to wheat following oilseed rape, as weed populations are largely determined by the field history; we then hypothesized that (3) a functionally more diverse weed community will lead to less overlap between crop and weeds. In order to test thes hypotheses, we quantified the functional diversity of 4 traits involved in resources acquisition and competitive response, i.e. height, lateral spread, specific leaf area and leaf dry matter content (Dingkuhn et al., 1999; Caton 2001; Den Hollander et al., 2007; Deveikyte et al., 2008; Singh et al., 2012). The present study analyses the effect of competition between weed and crops on both the mean value (i.e. community weighted mean) and on the distribution (i.e. functional trait diversity) of response traits within different crop and weed communities using the Mason's et al. (2005) functional diversity framework, i.e. measuring functional identity, functional richness, functional evenness and functional divergence.

# Material and methods

## Field experiment

A field experiment has been established at the Bouzule experimental farm (Champenoux, France, 48° 74' N, 6° 35' E) in the cropping season 2008-2009. The climate of the region is continental with an average annual rainfall of 775 mm and an annual average temperature of 10 °C. The soil is a Vertic Cambisol with the following characteristics: 62% clay, 35% silt, 3% sand, 6% organic matter, 26 g kg⁻¹ organic carbon and 2.6 g kg⁻¹ total nitrogen, pH (water) 7.1.

The experimental design consisted of 3 blocks (100 x 72 m). Each block was divided in 8 plots of 50 x 18 m. Prior to the experiment the site was cultivated with the sequence maize (2005-2006) – maize (2006-2007) - spring barley (2007-2008). Crops were cultivated in 3- or 5-years rotations in a randomized “phases differences” design (Yates, 1954), allowing each of the cropping phases of the two rotations to be present each year in each block. The 3 years' rotation was: winter oilseed rape (*Brassica napus* L.), winter wheat (*Triticum aestivum* L.) and winter barley (*Hordeum vulgare* L.). The 5 years’
rotation was: winter oilseed rape, winter wheat, winter barley, spring pea (Pisum sativum L.) and winter wheat. Rape crop and wheat crop were thus replicated twice per block per year while only one pea crop per block was present each year. During the 2011-2012 crop cycle, winter wheat was destroyed by intense frost and replaced by spring wheat.

Each culture was managed according to regional recommendations for fertilization and sowing date. The plots were deep-tilled one time a year with a mouldboard plough. Sowing was realized with a harrow-seed drill combination. Each year, winter wheat and winter barley were sown in October, winter oilseed rape and spring pea were sown in September and March, respectively. Nitrogen and sulphur fertilization was realized with ammonium nitrate, urea or ammonium sulfonitrate, depending on years. Annual fertilization was on average 174 kg N ha⁻¹ and 60 kg S ha⁻¹ for rape and 206 kg N ha⁻¹ for barley. Pea plots did not receive N or S fertilization. All plots were fertilized with 95 kg P-Ca(H₂PO₄)₂ and 63 kg K-KCl ha⁻¹ in March 2011. Cereals straw was exported. Plant protection was managed according to the regional alert thresholds.

## Weeds and crops sampling

Oilseed rape and pea weed populations were sampled in June 2011 and wheat weed populations were sampled in June 2012. Prior to herbicide applications, three spots per plot were excluded from herbicide treatments by covering them with 5 x 15 m plastic sheets during treatments. Sheets were disposed on the diagonal of the plot and at least 4.5 m apart from the edges in order to avoid edge effect. In each of the spot, weeds were sampled 3 times at 4 m intervals within a 0.5 x 0.5 m quadrat (Fig. 1). In each quadrat, every weed species was determined and the abundance of every species was recorded and expressed as a number of individuals per square meter. A maximum of 20 individuals per weed species were sampled for the measure of functional traits. Twenty crop individuals per plot were also randomly sampled in order to determine functional traits for each crops sampled.

## Measure of functional traits of crops and weeds

The following functional traits were measured according to the recommendations of Cornelissen et al. (2003): vegetative height, lateral spread (LS), specific leaf area (SLA) and leaf dry matter content (LDMC). Vegetative height and the lateral spread represent a surrogate of the ability to compete for light or space with crops (Gaba et al. 2014, Perronne et al. 2014) and are proxy of plant competitive ability (Navas and Moreau-Richard, 2005). The most recently unfolded leave was collected, stored in deionized water and brought back to the lab for the measurement of the other functional traits
(Garnier et al., 2001). The fresh weight was determined after 24 h rehydration in deionized water in the dark. The dry weight was measured after 72 h drying at 60 °C. The leave surface was determined using a planimeter LI 3050 (LI-COR Biosciences, Lincoln, USA). SLA calculated as the ratio of leave area to leave dry mass and LDMC calculated as the ratio of leave dry mass over leave fresh mass are considered functional markers of plant resource acquisition strategy (Weiher et al., 1999).

## Species and functional diversity calculations

The species diversity was estimated at the quadrat scale by species richness, species evenness and the Simpson dominance index (Simpson, 1949). The Shannon species evenness was calculated as the ratio of Shannon index (Shannon, 1948) of the observed community over the maximum theoretically possible Shannon index with the same number of species (Lloyd and Ghelardi, 1964).

The functional diversity was assessed independently for every trait at the quadrat scale, using one single trait value per individual. We focused on functional identity, richness, evenness and divergence as proposed by Mason et al. (2005). The functional identity was calculated as the average of the community traits values, i.e. as the Community Weighted Mean (CWM) (Garnier et al., 2004). Functional richness (FRic) was calculated as the difference between the highest and the lowest trait values in the community (Villegier et al. 2008). Functional evenness was evaluated with the FEve indice (Villeger et al., 2008), calculated with the function 'dbFD' in the 'FD' 1.0-11 package (Laliberté and Shipley, 2011). Functional divergence was evaluated with the FDvar indice (Mason et al., 2003), calculated with the software f-Diversity (Casanoves et al., 2010).

The overlap between weeds and crop functional niches was calculated for every trait at the plot scale, using one single trait value per individual, using the Niche Overlap index developed by Mouillot et al. (2005). Briefly, this index calculation consists in drawing two probability density functions, one for the crop and one for the weed community, representing the distribution of trait values using kernel density estimation (Stine and Heyse, 2001). The overlap of the two density functions is then estimated and expressed as a percentage of the density function area. This approach has been successfully used by Mason et al. (2011) to unravel "limiting similarity" and "habitat filtering" processes in prairial plant communities.

## Statistical analysis

All the statistical analyses were conducted separately for the year 2011 (oilseed rape and pea) and the year 2012 (wheat after oilseed rape or pea) with the R 3.1.2 software (R Core Team, 2014).

All the examined variables were analyzed using a Kruskal-Wallis test with the crop species (oilseed rape or pea) as a factor for 2011 data and with the crop sequence (wheat after oilseed rape or wheat after oilseed pea) as a factor for 2012 data. The means were grouped using the kruskalmc function in the
pgirmess package v. 1.5.8 (Giraudoux, 2013) to allow for multiple comparisons. The dissimilarity of species composition between weed communities was assessed using non-metric dimensional scaling (NMDS) based on a Bray-Curtis distance matrix calculated on log-transformed species abundances. Distance matrix calculation and NMDS were realized with the vegan package 2.2-1 (Oksanen et al., 2015). The effects of the factors (crop or previous crop) on the species composition were evaluated using a Kruskal-Wallis test done on the individuals coordinates in the NMDS plane.

The functional identity of weed communities was assessed through principal component analysis (PCA) realized with community weighted means of the four functional traits. PCA was calculated with the FactoMineR package v1.28 (Lê et al., 2008).

## Results

### Taxonomic diversity and composition of weed community

Weed abundance varied according to crop and according to the previous crop in wheat (Figure 1). It was higher in pea (9.06 ± 0.96 individuals m⁻²) than in oilseed rape (5.56 ± 0.69 individuals m⁻²) (χ² = 8.03, p < 0.01) in 2011 but higher in wheat following oilseed rape (26.14±4.86 individuals m⁻²) than in wheat following pea (10.48 ± 2.38 individuals m⁻²) (χ² = 7.40, p < 0.01).

The most abundant weed species in oilseed rape were *Sonchus asper* (L.) Hill (on average 6.36 individuals m⁻²), *Chenopodium album* L. (5.92 individuals m⁻²) and *Polygonum persicaria* L. (5.24 individuals m⁻²). The most abundant weeds in pea were *Echinocloa crus-galli* (L.) P.Beauv. (25.6 individuals m⁻²), *C. album* (4.00 individuals m⁻²). The most abundant weeds in wheat following oilseed rape were *Hordeum vulgare* L. (73.5 individuals m⁻²), *Alopecurus myosuroides* Huds. (9.04 individuals m⁻²), *Chenopodium polyspermum* L. (5.48 individuals m⁻²) and *Sonchus arvensis* L. (4.00 individuals m⁻²). The most abundant weeds in wheat following pea were *E. crus-galli* (22.4 individuals m⁻²) and *A. myosuroides* (7.40 individuals m⁻²). All other species were less abundant than 1 individual per quadrat on average (see Appendix 1).

The weed community species composition was affected by the crop or by the previous crop, as assessed in a NMDS based on Bray-Curtis distance matrix (Figure 2). Oilseed rape weed communities and pea weed communities were segregated on the two first dimensions of the NMDS (χ²=35.32, p<0.001 on the first dimension; χ²=10.82, p<0.01 on the second dimension). Wheat weed communities were segregated according to the previous crop on the two first dimensions of the NMDS (χ²=11.67, p<0.001 on the first dimension; χ²=10.52, p<0.01 on the second dimension).
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 1** Boxplots of weed abundance in oilseed rape and pea in 2011 (A) and wheat according to rotation in 2012 (B). Values followed by different letters are significantly different at *p* < 0.05. Boxplots indicate median, interquartiles (25-75%), maximum, minimum and outliers.</figcaption></figure>

However, the indices of species diversity (i.e. species richness, Shannon species evenness and Simpson dominance) did not vary according to the crop or the preceding crop (p > 0.05). Species richness, measured as the observed number of species per quadrat, was on average 2.73 ± 0.24 weeds in oilseed rape, 2.56 ± 0.17 in pea, 3.25 ± 0.36 in wheat following oilseed rape and 2.44 ± 0.28 in wheat following pea. Shannon species evenness was on average 0.88 ± 0.02 in oilseed rape, 0.75 ± 0.04 in pea, 0.68 ± 0.06 in wheat following oilseed rape and 0.76 ± 0.05 in wheat following pea. Simpson dominance was on average 0.56 ± 0.05 in oilseed rape, 0.61 ± 0.04 in pea, 0.63 ± 0.05 in wheat following oilseed rape and 0.69 ± 0.05 in wheat following pea.

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>**Figure 2** Non metric dimensional scaling of weed communities based on species composition, using a Bray-Curtis distance matrix, in oilseed rape and pea in 2011 (A) and in wheat in 2012 (B). Crop: OR, oilseed rape; P, pea; W/OR, wheat after oilseed rape; W/P, wheat after pea. S: stress</figcaption></figure>
## Functional diversity of the weed communities

Crops functional traits differed according to the crop species but not according to the previous crop (Table 1). Pea had a lower height and lateral spread than oilseed rape but a higher SLA and a higher LDMC. However, wheat functional traits where not impacted by the previous crop.

<table><caption>**Table 1** Crops functional traits and weed communities' functional diversity indices in oilseed rape and pea in 2011 and wheat in 2012. Values are means±standard error. CWM: community weighted mean, FRic: functional richness, FEve: functional evenness, FDvar, functional divergence. Significance: n.s. = non significant at *P* < 0.05</caption><thead><tr><th></th><th>Oilseed rape</th><th>Pea</th><th></th><th>Wheat/Oilseed rape</th><th>Wheat/Pea</th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="7"><strong>Crop functional traits</strong></td></tr><tr><td>Lateral spread (cm)</td><td>66.95±2.11</td><td>33.70±0.92</td><td>*</td><td>15.54±0.77</td><td>13.97±1.72</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>Height (cm)</td><td>92.91±1.17</td><td>63.95±1.50</td><td>*</td><td>82.24±2.21</td><td>82.50±1.98</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>SLA (m² kg⁻¹)</td><td>13.14±0.32</td><td>20.38±0.80</td><td>*</td><td>23.27±0.77</td><td>22.63±0.89</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>LDMC (mg g⁻¹)</td><td>219.01±5.58</td><td>247.79±4.85</td><td>*</td><td>251.90±5.60</td><td>257.07±6.22</td><td>n.s.</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Weed communities diversity indices</strong></td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Functional identity</strong></td></tr><tr><td>CWM Height (cm)</td><td>10.79±1.15</td><td>21.34±1.25</td><td>*</td><td>73.49±5.73</td><td>77.24±6.22</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>CWM Lateral spread (cm)</td><td>7.60±0.64</td><td>14.76±1.10</td><td>*</td><td>15.32±1.08</td><td>21.48±1.98</td><td>*</td></tr><tr><td>CWM SLA (m² kg⁻¹)</td><td>34.92±1.52</td><td>47.29±2.47</td><td>*</td><td>35.56±1.69</td><td>44.11±3.60</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>CWM LDMC (mg g⁻¹)</td><td>204.64±12.64</td><td>167.73±4.17</td><td>*</td><td>191.03±7.45</td><td>203.73±10.15</td><td>n.s.</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Functional richness</strong></td></tr><tr><td>FRic Height (cm)</td><td>16.10±3.42</td><td>36.90±2.83</td><td>*</td><td>62.00±6.48</td><td>56.87±8.55</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FRic Lateral spread (cm)</td><td>10.18±2.40</td><td>29.35±2.86</td><td>*</td><td>20.05±2.36</td><td>22.72±3.54</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FRic SLA (m² kg⁻¹)</td><td>19.32±2.93</td><td>59.36±20.42</td><td>*</td><td>26.95±4.21</td><td>48.34±13.91</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FRic LDMC (mg g⁻¹)</td><td>122.26±19.33</td><td>104.40±11.22</td><td>n.s.</td><td>105.13±31.11</td><td>147.20±31.11</td><td>n.s.</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Functional evenness</strong></td></tr><tr><td>FEve Height</td><td>0.57±0.03</td><td>0.53±0.02</td><td>n.s.</td><td>0.51±0.02</td><td>0.42±0.03</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FEve Lateral spread</td><td>0.55±0.04</td><td>0.44±0.02</td><td>*</td><td>0.51±0.03</td><td>0.47±0.03</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FEve SLA</td><td>0.56±0.03</td><td>0.51±0.03</td><td>n.s.</td><td>0.41±0.04</td><td>0.49±0.03</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FEve LDMC</td><td>0.45±0.03</td><td>0.50±0.02</td><td>n.s.</td><td>0.45±0.04</td><td>0.48±0.03</td><td>n.s.</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Functional divergence</strong></td></tr><tr><td>FDvar Height</td><td>0.48±0.05</td><td>0.68±0.03</td><td>*</td><td>0.40±0.07</td><td>0.34±0.07</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FDvar Lateral spread</td><td>0.37±0.04</td><td>0.65±0.02</td><td>*</td><td>0.47±0.05</td><td>0.45±0.06</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FDvar SLA</td><td>0.16±0.03</td><td>0.26±0.03</td><td>*</td><td>0.22±0.04</td><td>0.26±0.04</td><td>n.s.</td></tr><tr><td>FDvar LDMC</td><td>0.15±0.02</td><td>0.16±0.02</td><td>n.s.</td><td>0.15±0.03</td><td>0.22±0.05</td><td>n.s.</td></tr></tbody></table>
The functional identity of the weed community, evaluated by the weighted mean functional traits CWM, was strongly affected by the crop in 2011, as shown by PCA (Figure 3A). Precisely, weeds had higher height, lateral spread and SLA in pea crops than in oilseed rape crops, but lower LDMC (Table 1). However, the previous crop had no effects on the functional identity of the wheat weed community (Figure 3B). Functional traits community weighted means did not vary according to the previous crop, with the exception of the lateral spread, which was higher in the wheat following pea than in the wheat following oilseed rape (Table 1).

Other components of the functional diversity were less affected by the crops and previous crops than the functional identity (Table 1). Functional richness (FRic) was higher in the weed community of the pea than in the oilseed rape community for height, lateral spread and SLA but LDMC was unaffected by the crops. The functional richness of the wheat weed communities was unaffected by the previous crop. The functional evenness (FEve) of most of the traits was unaffected by crop or previous crop, with the exception of lateral spread values, which were more evenly distributed in the oilseed rape

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>**Figure 3** Principal component analysis (PCA) of weeds functional traits community weighted mean (CWM) with crop as supplementary factor. (A) Weed communities of oilseed rape and pea in 2011, (B) weed communities in wheat in 2012. Squares (■) represent the centroid of the crop species. Functional traits: H, height CWM; LS, lateral spread CWM; SLA, specific leaf area CWM; LDMC, leaf dry matter CWM content. Crops: OR, oilseed rape; P, pea; W/OR, wheat after oilseed rape; W/P, wheat after pea</figcaption></figure>
than in the pea. The functional divergence (FDvar) presented a similar pattern to functional richness, with a higher divergence of height, lateral spread and SLA in the pea than in the oilseed rape weed community, while LDMC was unaffected by the crop. The divergence of the functional traits was unaffected by the previous crop in the weed community of the wheat.

### Overlap between the weed and crop functional traits

Overlaps between the weeds and the crop traits ranged from 0.01 to 0.59 depending on the functional trait and crop (Figure 4). Overall, the 2012 wheat overlapped more with the weeds, with overlaps ranging from 0.20 to 0.59, than the pea or oilseed rape in 2011 (overlaps ranging from 0.01 to 0.46). Most of the weeds were smaller than the crop, and their overlap with the crop height depended on the crop. Pea overlapped more with the weeds than the oilseed rape and the wheat following oilseed rape overlapped more with the weeds than the wheat following pea. Lateral spread presented the same pattern, with crops having higher lateral spreads than most of the weeds. Pea overlapped more with the weeds lateral spread than oilseed rape and the overlap of wheat and weeds' lateral spread was unaffected by the previous crop. Crops tended to have lower SLA than weeds and pea overlapped more with weeds than oilseed rape while wheat overlap with weeds was unaffected by the previous crop. Crops tended to have LDMC higher than those of weeds, but the overlap between crops and weeds LDMC was not significantly different between pea and oilseed rape nor between wheat following pea or following oilseed rape.
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Figure 4** Overlap between density function representing crop functional traits (blue) and weeds functional traits (red). NO: niche overlap (mean of three replicates±standard error). Niche overlaps followed by different letters in the same year and same functional trait are significantly different at *P* < 0.05</figcaption></figure>
Discussion

Effect of oilseed rape and pea on weed communities

To our knowledge, there is no study comparing weed density in spring pea and winter oilseed rape but a higher biomass of weeds in pea compared to cereal has previously been reported in the literature (Deveikyte et al., 2009; Sarunaite et al., 2013). In our study, weeds were more abundant in pea plots than in oilseed rape. These results are usually attributed to a low height, lateral spread and biomass of the pea compared to cereal crops, resulting in a low competitive ability against weeds. This could also explain our observed pattern, as oilseed rape presents a higher height and lateral spread than pea, and its rosette architecture is considered as particularly competition-efficient by Gunton et al. (2011). Moreover, in their recent study, Tribouillois et al. (2015) have also highlighted the higher competitive ability of Brassicaceae in comparison with Fabaceae. Plants with higher height and lateral spread are considered to be more competitive (Navas et Fayolle, 2012; Violle et al., 2009; Deveikyte et al., 2008; Gerhold et al., 2013) for light. Nevertheless, the higher height and lateral spread of weeds in pea compared to oilseed rape could more likely be attributed to the higher amount of nitrogen available resources in pea than in oilseed rape. This result is supported by the ruderal character sensu Grime (1977) of Fabaceae highlighted by Tribouillois et al. (2015). Ruderal species, adapted to frequently disturbed environments, present higher SLA and lower LDMC compared to competitive species due to investment in leaves structures and high rate of resource acquisition, necessary to cope with perturbations (Westoby, 1998; Grime, 2001; Pierce et al. 2013). Furthermore, Perronne et al. (2014), studying intraspecific variability of traits in weeds, observed higher SLA in individuals growing in the field core, thus experiencing high disturbance rate, compared to individuals growing in the field edge. This is in accordance with the Leaf-Height-Seed scheme (Westoby, 1998) and experimental works that relate leaf traits to resource utilization rather than resource acquisition (Lavorel et Garnier, 2002). The higher SLA and lower LDMC of weeds growing in pea compared to weeds growing in oilseed rape could also be attributed to the spring sowing season and short life cycle of pea. The crops sowing season is known to be a major determinant of weed functional composition (Hallgren et al., 1999; Bohan et al., 2011; Fried et al., 2008, 2012) and a spring sowing season is likely to favor spring germinating weeds with a short life-cycle, thus well adapted to disturbed environment

Other components of functional diversity were also impacted by the crop. Pea weed communities had larger functional richness and divergence for all traits except LDMC. The higher richness of weed functional traits in pea could be attributed to the greater number of available niches in pea compared to oilseed rape due to the low competitive pressure exerted by pea. Many growth and architecture strategies could be successful in pea while the oilseed rape pressure should allow only some strategies
to be successful. The higher functional divergence of pea weeds traits could be linked to their higher richness. The coexistence of different ecological strategies in pea weeds, with a mixture of, for example, low height shade tolerant species, high height competitive species and high SLA ruderal species leads to a higher overlap with pea crop. Indeed, the overlap between the crop and the weeds functional traits was higher for pea than for oilseed rape, for all traits except LDMC. This could be attributed to the higher functional diversity of the pea crop. Pea, being smaller and having a lower lateral spread than oilseed rape, created a low pressure for limiting similarity between crop and weeds, thus increasing the probability of functional overlap. Contrary to our hypothesis, the pea weeds presented a more competitive phenotype than oilseed rape weeds and overlapped more with pea, resulting in a potentially more competitive weed flora in pea than in oilseed rape

Effect of the previous crop on weed communities in wheat

Interestingly, despite having previous crop with different nutrient requirements (Taureau et al., 1987), thus potentially resulting in different soil nutrient availability (Churka Blum et al., 2013), no differences in the four wheat functional traits was observed due to the previous crop.

Despite higher weed abundance in pea than in oilseed rape, wheat following pea had less weeds per square meter than wheat following oilseed rape. This can be attributed to the phenology of the pea, which was sown in spring in a rotation previously composed of winter crops, disrupting the winter weeds cycle. It was previously shown by several studies that a winter crop following a spring pea presents a lower weed abundance compared to a winter crop following a winter crop (Stevenson et al. Kessel, 1996; Chauvel et al., 2001; Colbach et al., 2010). In the condition of our experimentation, the wheat crop sampled was in fact, spring wheat. Nevertheless, a winter wheat crop had been established previously in autumn and be destroyed by deep freeze in winter, before the sowing of spring wheat. Thus, the weed community experienced the autumn disturbance due to tillage and the subsequent autumn competition between crops and weeds as well as any winter crop weed community, which could explain the observed result. Weed communities in wheat following pea or oilseed rape had different species composition. Nevertheless, they presented no differences of functional diversity (with the exception of the lateral spread community weighted mean). We could attribute this discrepancy between functional composition and species composition to the strong filter effect exerted by the crop on the weeds which lead to traits convergence, due either to weed phenotypic plasticity (Perronne et al., 2014) or species turnover. This filter could be particularly important in cereal crops which, compared for example to pea, produce a high amount of biomass,
tillers and root length, as well as presenting a higher height (this study), thus exerting a strong
competition for light and nutrients on weeds (Corre-Hellou et al., 2011).

This functional diversity similarity in the presence of dissimilar weeds communities could be
interpreted in the light of competition theory as an evidence of a competitive hierarchy acting on
species niches instead of limiting similarity. Competitive hierarchy postulate that only species with a
specific set of traits can cope with competition, leading to trait convergence (Navas and Fayolle, 2012;
Kunstler et al., 2012; Fort et al., 2014). This phenomenon has already been observed in weed
communities by Gunton et al. (2011) who observed that weed communities of more competitive crops
occupied narrower functional niches. As a result of this near absence of functional dissimilarity of
weeds between crops, the overlap between crops and weeds functional traits was not influenced by
the previous crop, except for the height which presented a lower functional overlap with the wheat
following pea. Thus, based on the four traits we studied, we can reject the hypothesis that previous
pea creates a weed community with a higher diversity of functional niches (compared to previous
oilseed rape), and with functional niches dissimilar from the functional niche of wheat. Nevertheless,
despite similar functional niches, weed communities in wheat after pea are far less abundant than in
wheat after oilseed rape. This should ultimately reduce the crop-weed competition in wheat after pea
compared to wheat after oilseed rape. Further work is needed to assess the cause of functional
similarity between the two wheat weed communities, i.e. if the convergence is due to intense pressure
phenotypic plasticity or to a species turnover.

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Résumé du Chapitre 4

Les résultats de l'expérimentation en plein champ ont permis (i) d'étudier l'effet de différentes cultures (colza, orge, pois) sur les communautés microbiennes du sol et d'adventices au cours de leur développement et sous la culture suivante (blé), (ii) d'appréhender l'importance de la variabilité climatique interannuelle dans le déterminisme des variables microbiennes.

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure 1** Effets des plantes cultivées et du climat sur les communautés microbiennes observés au champ</figcaption></figure>

En plein champ, les plantes cultivées entraînent des modifications plus ou moins marquées d'abondance des communautés microbiennes en fonction de leur caractéristiques écophysiologiques (durée de cycle de développement, stratégies d'allocation du carbone, quantité et nature des rhizodépôts, exigences en nutriments...) (Figure 1). Par des approches moléculaires ciblées sur les communautés microbiennes totales, nous avons ainsi mis en évidence des abondances de champignons et de bactéries supérieures sous le colza comparativement au pois, l'orge occupant une position intermédiaire. Cette influence significative du colza est également observée sur la communauté bactérienne portant le gène de la métalloprotéase alcaline. Ces différences d'abondances peuvent être attribuées à des différences de quantité et de qualité des rhizodépôts et
des résidus racinaires, le colza produisant de grandes quantités de biomasses racinaires tandis que le
pois présente des rhizodépôts et des racines à faible C/N (Swinnen 1994 ; Mayer et al., 2003 ; Gan et
al., 2009 ; Wichern et al., 2007a,b ; Arcand et al., 2013). Néanmoins, ces différences d'abondances
microbiennes n'entrainent pas de différences significatives des activités protéase et arylsulfatase entre
les cultures suggérant que la taille de la biomasse microbienne n'est pas le déterminant majeur de
l'activité.

Si l'abondance des communautés microbiennes est significativement influencée par l'espèce cultivée, aucune influence du précédent cultural n'a pu être mise en évidence en comparant des successions culturales différentes. Ainsi les variables microbiennes (abondance et activité) mesurées sous couverts de blé précédés par des cultures de colza ou de pois sont identiques. En revanche, des différences de richesse et de composition taxonomique ont été mises en évidence suggérant un découplage entre l'abondance, la composition et les fonctions réalisées par les communautés microbiennes. L'absence d'effet significatif des plantes sur les activités enzymatiques au cours de leur développement ainsi que l'absence d'effet de la culture précédente sur les communautés microbiennes est en contradiction avec les observations en microcosme. Ces absences d'effet peuvent être liées à la variabilité climatique interannuelle (Figure 1). En effet, dans notre expérimentation, les conditions climatiques constituent un déterminant important des abondances microbiennes et des activités enzymatiques. Les abondances microbiennes sont négativement corrélées aux précipitations tandis que les activités enzymatiques sont positivement corrélées à la température. En conséquence, la prédiction des flux de minéralisation nette d'azote et de soufre en fin de cycle de développement de la culture est probablement plus déterminée par le climat de l'année que par les caractéristiques de la plante cultivée.

L'effet des cultures (pois et colza) sur l'abondance et la diversité fonctionnelle des adventices est fort,
le pois présentant une communauté d'adventices plus abondante que le colza mais également plus
diversifiée fonctionnellement, avec des individus de plus grande taille et de plus grande largeur que
dans la communauté d'adventices du colza. Cet effet est probablement dû à la faible compétitivité du
pois (Deveikyte et al., 2009 ; Sarunaite et al., 2013). Les adventices du pois ont également un SLA plus
fort et un LDMC plus faible que les adventices du colza, ce qui peut être lié à une communauté
d'adventices plus rudérale en raison de la date de semis tardive du pois. En conséquence, les
distributions des valeurs de traits fonctionnels du pois et de ses adventices sont plus fortement
chevauchantes que ce qui est observé entre le colza et ses adventices (Figure 2).

Ces différences dans la composition fonctionnelle des communautés d'adventices du pois et du colza
sont peut-être responsables des différences taxonomiques observées entre les communautés
d'adventices du blé faisant suite au pois et du blé faisant suite au colza. Cependant, ces deux
communautés d'adventices n'étaient pas différentes fonctionnellement. Il apparaît donc que l'identité
de la culture constitue un filtre très important des traits fonctionnels des adventices, capables de
rendre fonctionnellement similaires deux communautés taxonomiquement différentes. Cet effet peut
être attribué à la grande plasticité phénotypique des adventices (Perronne et al., 2014).

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 2** Effets du pois et du colza sur les communautés d'adventices observés au champ pendant et après leur cycle de développement</figcaption></figure>

En résumé, contrairement aux résultats obtenus en microcosmes (pour les communautés microbiennes), les plantes cultivées en conditions naturelles, modifient les communautés microbiennes et adventices pendant leur cycle de développement. Néanmoins, cet effet s'estompe sous la culture suivante en raison des effets exercés par les pratiques culturales, la culture implantée et surtout par les facteurs climatiques de l'année.
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# Chapitre 5. Discussion générale
## Discussion générale

L'assemblage des communautés végétales ou de microorganismes qui influencent le fonctionnement des agroécosystèmes dépend d'un ensemble de facteurs qui peuvent modifier la disponibilité en ressources, les conditions du milieu et/ou détruire partiellement ou totalement les communautés (perturbations). Ces facteurs agissent ainsi comme des filtres (Bardgett et al., 2001 ; Decaëns, 2010 ; Saunders et al., 2010 ; Navas, 2012 ; Gaba et al., 2014 ; Ranjan et al., 2015) et modifient la composition des communautés microbiennes et végétales ce qui peut conduire à des modifications des fonctions écosystémiques comme les interactions compétitives entre plantes ou la minéralisation de l'azote et du soufre. L'influence relative de ces différents facteurs dépend des échelles spatiales et temporelles d'analyse. Ainsi, en se positionnant à des échelles d'analyse différentes, de la plus globale (parcelle, succession de cultures) à la plus fine (plante), il est possible d'intégrer l'effet du climat, du type de sol (pH, texture, disponibilité en éléments nutritifs...), des pratiques agricoles et des espèces végétales cultivées (traits fonctionnels, exigences en éléments nutritifs...). Concernant plus particulièrement les espèces végétales cultivées, celles-ci agissent comme des filtres en modifiant la disponibilité en ressources et en conditionnant les régimes de perturbation (pratiques agricoles). Au cours de leur croissance, les plantes modifient la disponibilité en ressources en interceptant la lumière, en absorbant l'eau et des nutriments minéraux (selon leur exigence en éléments nutritifs). Les plantes modifient également la disponibilité en ressources en : i) libérant dans l'environnement racinaire un ensemble de composés organiques (processus de rhizodéposition) qui constituent des sources de C, N et S et d'énergie pour les communautés microbiennes du sol (Nguyen, 2003 ; Wichern et al., 2008) et, ii) en produisant et restituant des litières racinaires et aériennes, dont la qualité (C/N, C/S...) varie selon l'espèce végétale considérée. Ainsi, les différentes espèces végétales d'une rotation modifient successivement la nature (formes organiques et minérales) et la disponibilité des pools de nutriments dans le sol. Ces effets influencent la composition et les activités des communautés microbiennes du sol (van der Krift et al., 2001 ; Biederbeck et al., 2005 ; Xuan et al., 2012 ; Bell et al., 2015) et modifient la fonction la minéralisation des matières organiques dont N et S (Rasmussen et al., 1998 ; Carpenter-Boggs et al., 2000 ; Arcand et al., 2013, 2014 ; Kuzyakov et Zu, 2013).

Parmi les plantes cultivées, une légumineuse comme le pois présente des caractéristiques particulières qui contribuent aux bénéfices associés à l'introduction de cette culture, pour les cultures lui succédant (Jensen et al., 2012). Ainsi, de par sa capacité à fixer l'azote atmosphérique, le pois prélève peu d'azote minéral au cours de sa croissance (Carrouée et al., 1999). De plus, le pois libère des rhizodépôts et restitue des résidus présentant des C/N plus faibles que ceux des céréales ou du colza (Jensen, 1996c ; Kumar et Goh, 2002 ; Lupwayi et al., 2006 ; Wichern et al., 2007a ; Gan et al., 2011). Il est donc généralement admis que les résidus de pois ont un effet positif sur la minéralisation de N et que cette
culture contribue ainsi à augmenter la disponibilité en N pour les cultures qui lui succèdent (Jensen et al., 2012 ; Stevenson and van Kessel, 1996). Concernant le soufre, le pois présente des besoins en cet élément qui sont intermédiaires à ceux du colza et des céréales (Taureau et al., 1987). Les résidus de pois présentent en conséquence des C/S intermédiaires entre ceux de ces cultures (Taureau et al., 1987 ; Churka Blum et al., 2013). Néanmoins, peu de choses sont connues sur l'effet du pois sur les communautés microbiennes du cycle du soufre.

Ainsi le pois, en modifiant la disponibilité des ressources C, N et S dans le sol, serait susceptible d'influencer, en termes de composition, abondance et activités, les communautés microbiennes impliquées dans la minéralisation de N et S.

Outre les bénéfices sur la disponibilité en éléments nutritifs dans les sols, le pois constitue aussi un levier intéressant vis-à-vis des adventices. Ainsi, même si le pois de par sa biomasse faible (Carrouée et al., 1999 ; Arcand et al., 2013b) est peu compétitif vis-à-vis des adventices (Deveikyte et al., 2009 ; Sarunaite et al., 2013), l'introduction d'un pois de printemps dans une rotation à base de cultures d'hiver permet cependant de diversifier les dates des perturbations perçues par la communauté d'adventices. Ceci conduit à la sélection de communautés d'adventices plutôt inféodées aux cultures de printemps et, de fait, peu concurrentielles sur les cultures d'hiver et permet ainsi de réduire l'abondance des adventices dans les cultures d'hiver lui succédant (Fried et al., 2008a ; Poggio, 2005 ; Stevenson et van Kessel, 1996 ; Chauvel et al., 2001 ; Colbach et al., 2010), débouchant potentiellement sur une diminution de l'intensité de la compétition.

Afin d'évaluer et comprendre l'effet de l'introduction du pois dans une succession colza - céréales sur les communautés microbiennes impliquées dans la minéralisation de N et S, sur les communautés d'adventices et sur les fonctions écosystémiques portées par ces communautés (fonction de minéralisation de l'azote et du soufre, fonction de compétition culture - adventices), nous avons mis en place des expérimentations en conditions contrôlées et *in situ* (expérimentation pluriannuelle de plein champ). Ces deux échelles d'analyse nous ont permis d'une part, d'identifier les traits fonctionnels des plantes gouvernant leurs interactions avec les communautés microbiennes / adventices et d'autre part, d'estimer le poids relatif du climat sur certains de ces interactions.

# 1. Effet des plantes cultivées sur les activités enzymatiques impliquées dans la minéralisation de l'azote et du soufre

La minéralisation de la matière organique est la résultante d'une succession d'étapes catalysées par des enzymes principalement d'origine microbienne. Ainsi, les enzymes extracellulaires sont impliquées
dans les premières étapes de décomposition de la matière organique et libèrent, à partir de polymères organiques complexes des composés organiques plus simples bio-disponibles pour les communautés microbiennes (Allison et Vitousek, 2005 ; Schimel et Bennett, 2004). Les composés organiques sont susceptibles d'être alors hydrolysés par des enzymes microbiennes qui libèrent des éléments minéraux (minéralisation). Ces activités microbiennes, dont la synthèse peut être influencée par la diversité, l'abondance des communautés microbiennes et les conditions du milieu, vont conditionner les flux d'éléments minéraux et leur biodisponibilité pour les plantes (Jan et al., 2009 ; Fornara et al., 2011 ; Schimel et Bennett, 2004). Parmi les activités enzymatiques impliquées dans la décomposition / minéralisation de N et S, les activités protéase (Zaman et al., 1999 ; Mishra et al., 2005 ; Yuan et al., 2011) d'ammonification (Bonde et al., 2001) et arylsulfatase (Riffaldi et al., 2006 ; Balota et al., 2014) peuvent être considérées comme des activités «clés» et de fait, constituent des marqueurs intéressants des fonctions de minéralisation de N/S. En effet, les protéases extracellulaires qui réalisent une étape limitante de la minéralisation de N en hydrolysant les protéines, principale forme de N organique dans les sols, et les activités d'ammonification qui libèrent de la première forme de N minéral (ammonium), ont été corrélée à la minéralisation de N dans les sols (Zaman et al., 1999 ; Bonde et al., 2001 ; Mishra et al., 2005 ; Jones et al., 2004 ; Jan et al., 2009). De manière similaire, les arylsulfatases, qui libèrent des sulfates à partir d'esters de sulfate, formes majeures et parmi les plus labiles de S organique dans les sols, sont corrélées aux flux de S (Dedourge et al., 2003, 2004 ; Vong et al., 2003, 2008 ; Riffaldi et al., 2006 ; Balota et al., 2014).

Si l'effet des espèces végétales sur les activités arylsulfatase, protéase et d'ammonification ont été décrites dans la littérature, les mécanismes fins par lesquelles les plantes, au travers de leurs caractéristiques biologiques aériennes ou racinaires, influencent ces activités sont mal connus. De plus, l'effet relatif d'autres filtres environnementaux tel que le climat sur ces activités et leurs résultantes sur la fonction de minéralisation sont également mal caractérisés.

En limitant les variations des propriétés du sol (pH, humidité...) qui sont parmi les facteurs les plus susceptibles d'influencer les communautés microbiennes du sol (Lauber et al., 2009 ; Serna-Chavez et al., 2013), les expérimentations en conditions contrôlées ont permis d'identifier certains des traits fonctionnels des plantes qui influencent les activités protéase et d'ammonification. Nous avons choisi de ne considérer que les traits racinaires, d'une part, parce que les racines sont les organes clés pour l'acquisition des éléments nutritifs et pour la libération de rhizodépôts (Bardgett et al., 2014) et, d'autre part, parce que les traits racinaires et aériens ne sont pas toujours corrélés (Orwin et al., 2010). L'expérimentation au champs, conduite sur plusieurs années, a permis de prendre en compte, en plus des effets des espèces végétales, les effets des propriétés abiotiques (variation du climat local, pH du
sol, humidité, température...) qui influencent les communautés microbiennes et leurs activités. Nous avons ainsi pu identifier, les facteurs expliquant le plus les variations de composition, d'abondance des communautés microbiennes, d'activités arylsulfatase et protéase et la résultante sur les flux de minéralisation de N / S. Enfin, il faut remarquer que nous avons tenté d'appréhender si les facteurs qui influencent des activités de décomposition des matières organiques ou des activités de minéralisation sont similaires ou non.

## 1.1 Effet des plantes cultivées sur les activités enzymatiques impliquées dans la minéralisation : ammonification et activité arylsulfatase

En conditions contrôlées, nous avons montré que l'activité potentielle d'ammonification est influencée par la croissance du pois. Ainsi, au cours du développement du pois, l'activité d'ammonification augmente fortement au stade de remplissage des graines, un stade où le pois présente de forts besoins en N (Salon et al., 2001 ; Voisin et al., 2007) et modifie son profil de rhizodéposition. En effet, aux stades reproducteurs, le pois diminue la quantité de C rhizodéposé et augmente la libération d'acides aminés (Jensen et al., 1996 ; Wichern et al., 2007, 2008 ; Arcand et al., 2013). Nous avons montré qu'une combinaison de traits racinaires permet d'expliquer plus de 50% des variations d'activité potentielle d'ammonification observées au cours de la croissance du pois. Les traits racinaires identifiés sont soit des traits liés à la croissance comme le RDMC et RMF, soit des traits d'architecture tels que longueur racinaire totale et le pourcentage de racines fines. Il faut remarquer que si ces traits qui sont reliés à l'acquisition de N et au processus de rhizodéposition (Roumet et al., 2008), influencent l'activité d'ammonification, ils n'influencent pas les variables d'abondance des communautés microbiennes. Nous avons montré que les traits racinaires identifiés influencent soit directement l'activité d'ammonification (RDMC, longueur racinaire totale et pourcentage de racines fines), soit indirectement via leurs effets sur le pool de C labile dans le sol (RMF, pourcentage de racines fines). Cependant, nous avons observé que le RDMC ne contribue que faiblement à expliquer les variations d'activité d'ammonification. Ceci permet donc de suggérer que ce sont principalement les traits d'architecture racinaire qui influencent l'activité d'ammonification soit de manière directe, soit en modulant la disponibilité du pool de C labile du sol.

Ces résultats nous permettent de proposer un modèle des relations entre l'activité d'ammonification et le pois :

Aux stades reproducteurs, en allouant le C fixé au remplissage des grains (Voisin et al., 2003), le pois réduirait l'allocation de C vers le sol. Ceci est suggéré par la relation positive observée entre le RMF, qui diminue significativement aux stades reproducteurs, et la teneur en C labile du sol. En diminuant la disponibilité en C labile dans le sol aux stades reproducteurs, le pois stimulerait la minéralisation des
acides aminés rhizodéposés *via* l'activité d'ammonification. La relation positive observée entre le pourcentage de racines fines qui jouent un rôle important dans la rhizodéposition des acides aminés (Eissenstat et al., 2005 ; Gordon et Jackson, 2000 ; Tjoelker et al., 2005 ; Jones et al., 2005) et l'activité d'ammonification renforce cette hypothèse. La minéralisation des acides aminés permettrait ainsi aux microorganismes de répondre à leurs besoins en C. Cette augmentation contribuerait également à libérer dans le sol de l'ammonium, à un stade ou le pois a de forts besoins en N (Salon et al., 2001, Voisin et al., 2007). L'ensemble de ces résultats nous laisse supposer qu'il pourrait s'agir d'une stratégie développée par le pois visant à optimiser sa fourniture en azote (Knops et al., 2002).

Au champ, nous avons analysé, sur plusieurs années, l'influence de différentes cultures de la rotation i.e. le pois, le colza, l'orge et de deux précédents du blé i.e. pois et colza sur l'activité arylsulfatase impliquée dans la minéralisation de S. Dans ces conditions, nous n'avons observé aucun effet des couverts végétaux au cours de leur développement ou en tant que précédent (via l'enfouissement de leurs résidus) sur l'activité arylsulfatase. La raison principale en est probablement la très forte influence qu'avaient les variables climatiques (notamment la température) sur cette activité enzymatique. La même tendance s'observait pour l'abondance des bactéries cultivables à activité arylsulfatase. Ce résultat met en évidence l'importance de prendre en compte l'ensemble des filtres environnementaux (Figure 1), comme la variabilité climatique interannuelle, dont l'effet sur les communautés microbiennes a plusieurs fois été observé (Franzluebbers et al., 2001 ; Sardans et Penuelas, 2005 ; Castro et al., 2010 ; Serna-Chavez et al., 2013 ; Mancinelli et al., 2013 ; Fraser et al., 2013 ; Vanegas et al., 2013).

## 1.2 Effet des plantes cultivées sur les activités enzymatiques impliquées dans la décomposition du N organique : cas de l'activité protéase

En conditions contrôlées, nous avons observé que l'activité protéase ne varie pas au cours du développement d'une culture, qu'il s'agisse du pois ou du blé. Les activités extracellulaires impliquées dans la décomposition de la matière organique telles que les protéases sont induites en réponse à la présence d'un substrat, dans des conditions limitantes en éléments nutritifs et en fonction de la disponibilité en C (Allison et Vitousek, 2005). La synthèse de ces enzymes permet aux microorganismes d'exploiter des ressources azotées complexes présentes dans le sol et ainsi, de répondre à leurs besoins en N. Ces enzymes peuvent également être synthétisées de manière constitutive ou être stabilisées sur les colloïdes du sol (Vranova et al., 2013). Sous couvert de pois, la libération de rhizodépôts présentant des C/N faibles et comprenant des quantités importantes de composés labiles
tels que des acides aminés réduit les limitations en N généralement induites par la rhizodéposition C
(Kuzyakov, 2002). En conséquence, la disponibilité importante en ressources N ne nécessiterait pas la

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Figure 1** Effet du pois sur les communautés microbiennes</figcaption></figure>

synthèse d'enzymes permettant aux microorganismes d'exploiter des ressources complémentaires de N. Par contre, nous avons observé que l'incorporation de résidus de pois conduit à l'induction de l'activité protéase au cours de la croissance du blé. Il faut noter que la présence de rhizodépôts N dans les sols amendés en résidus de pois ne module pas l'induction de cette activité. Dans les sols amendés en résidus, nous avons également observé que le ratio C/N labile du sol est supérieur à celui des sols non amendés. Ces différences de disponibilité en N labile comparativement à la disponibilité en C labile pourraient donc créer des conditions limitantes en N, combinés à l'induction de la synthèse des protéases par leur substrat (Geisseler et Horwath, 2008), qui feraient des résidus de pois, dont les teneurs en protéines sont supérieures à celles de résidus de céréales, une source privilégiée de N pour les microorganismes.