# Réponse mucosale aux salmonelles, entérobactéries pathogènes. Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux

Anne-Christine Lalmanach

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Anne-Christine Lalmanach. Réponse mucosale aux salmonelles, entérobactéries pathogènes. Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux. Master. Infectiologie Cellulaire et Moléculaire, Vaccinologie, Anticorps Thérapeutiques (Réponse mucosale aux salmonelles), 2016, 21 diapositives. hal-02800478

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Submitted on 5 Jun 2020

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# M2 Infectiologie Cellulaire et Moléculaire, Vaccinologie

LALMANACH A-C, UMR ISP, INRA Centre de Recherche Val de Loire, Nouzilly

## Module 5 Réponse mucosale aux salmonelles, entérobactéries pathogènes

**Exemple particulier de relation hôte-Salmonella:**
le portage intestinal chez les oiseaux.
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## La volaille est un réservoir:

* Colonisation du tube digestif des oiseaux par S. Enteritidis, contamination des élevages de volailles.

* Poussins sensibles à l'infection : plus les animaux sont jeunes, plus le taux de mortalité est important.

* Poulet et adulte : persistance intestinale (caecum) principalement asymptomatique et excrétion fécale.

* Contaminations horizontale et verticale.

* Contamination de la chaîne alimentaire (œufs, viande).
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## Moyens de lutte:

* Sélection génétique d'animaux résistants

* Vaccination, amélioration de la protection immune

* Traitements alternatifs aux antibiotiques...

Une nécessité commune : mieux connaître les facteurs immuns de résistance des volailles
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## Identifier les facteurs de l'hôte impliqués dans la résistance: recherche de gènes différentiellement exprimés chez R/S

**Moyens:**

Comparaison de lignées de volailles divergentes selon la colonisation intestinale: expression des gènes d'intérêt.

* Inoculation orale de S. Enteritidis: $5.10^4$cfu (poussin), $10^8$ cfu (poule).

* Analyse du portage (numération des bactéries, caecum).

* Analyse de l'expression des gènes des facteurs ciblés (dans la zone lymphoïde caecale) par qRT-PCR en temps réel:
  TLR4, TLR5,
  IL-8, MCP, IL-12, IL-18, IFN-γ,
  iNOsynthase, NRAMP1, défensines.
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## Analyse comparée de la charge bactérienne des salmonelles entre deux lignées consanguines

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chez le jeune poulet

chez la poule

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Charge bactérienne caecale

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<table><thead><tr><th rowspan="2">Weeks<br>pi</th><th colspan="2">Line 6</th><th colspan="2">Line 15</th></tr><tr><th>Log CFU/g</th><th>Positive<br>animals</th><th>Log CFU/g</th><th>Positive<br>animals</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>4.37 ± 0.53</td><td>7/7</td><td>5.03 ± 0.50</td><td>7/7</td></tr><tr><td>2</td><td>0.96 ± 0.14</td><td>6/6</td><td>2.25 ± 0.44</td><td>8/8</td></tr><tr><td>4</td><td>ND</td><td>0/8</td><td>ND</td><td>4/6</td></tr></tbody></table>

* Phénotype divergent entre lignées

* Phénotype fonction de l'âge

* Les jeunes sont plus sensibles → immaturité immunitaire?
Exemple particulier de relation hôte-Salmonella :
le portage intestinal chez les oiseaux.

Analyse comparée de l'expression du gène de l'IFN-γ entre poulets des deux lignées

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Lignée 6 : s

Lignée 15 : r

* L'IFN-g est « down-régulé » dans le caecum des jeunes animaux sensibles
## Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## Analyse comparée de l'expression du gène des médiateurs anti-infectieux des phagocytes

Lignée 6 : s

Lignée 15 : r

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• La production de monoxyde d'azote (NO) et de NRAMP1 sont elle-même dérégulées chez les jeunes animaux sensibles . 7
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Chez le jeune poulet, la lignée qui porte le moins de salmonelles:

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► Accroît progressivement l'expression intestinale des gènes de cytokines inflammatoires et anti-infectieuses.

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Augmentation des médiateurs anti-bactériens.

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Meilleure résolution de l'infection.
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella :
le portage intestinal chez les oiseaux.

Analyse comparée de l'expression des gènes des
défensines entre poulets des deux lignées

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► Expression intrinsèque élevée des défensines aviaires AvBD1 et 2 dans le caecum des animaux les plus sensibles .

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L'hôte ne semble pas en tirer profit.

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Problème de maturité, fonctionnalité?
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

## Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## Analyse comparée de l'expression des gènes de récepteur et de chimiokine entre poules (adultes) des deux lignées

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TLR4

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IL-8

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Lignée 6 : R

Lignée 15 : S

* La production d'IL-8 est « up-régulée » chez les jeunes animaux résistants, en liaison avec une expression accrue du TLR4.
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Chez la poule, la lignée qui porte le moins de salmonelles:

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Exprime plus de récepteurs qui sondent le LPS.

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Répond par production d'IL-8 qui recrute les phagocytes.

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Exprime plus de cytokines IL-18 et IFN-γ.

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Répond en stimulant l'activité anti-microbienne des phagocytes.

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# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella :
le portage intestinal chez les oiseaux.

## Analyse comparée de l'expression des gènes des défensines entre poules des deux lignées

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AvBD1

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AvBD2

Lignée 6 : R

Lignée 15 : S

* Chez la poule, la lignée qui porte le moins de salmonelles :

* Exprime intrinsèquement plus de défensines aviaires AvBD1 et 2.

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Apparaît efficace pour réduire la charge bactérienne.
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Différence majeure entre jeune poulet et poule pondeuse:

La lignée 6 exprimant dix fois plus les défensines aviaires AvBD1 et 2

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Pas de lien avec la protection contre la colonisation intestinale des salmonelles chez le jeune.

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Forte corrélation avec le contrôle de la colonisation intestinale des salmonelles chez l'adulte.

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**Cellules productrices de défensines aviaires?**

**Mode d'action? Efficacité contre les salmonelles?**
## Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Les défensines aviaires: questions posées

* Expression d'AvBD1 et AvBD2 par d'autres cellules que les hétérophiles* (=neutrophiles des oiseaux) dans l'intestin?

* Comme chez les mammifères, épithelium intestinal = source de β-défensines?

* Activité des AvBD1 et 2 contre S. Enteritidis?
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella :
le portage intestinal chez les oiseaux.

* Les granulocytes hétérophiles de l'intestin sont les seules cellules source d'AvBD1 and 2 ?

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► L'infiltration précoce des granulocytes dans le caecum des oiseaux infectés n'est pas corrélée à l'expression des gènes d'AvBD1 et 2.
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Les cellules épithéliales intestinales des oiseaux sont elles source d'AvBD1 and 2 ?

Intestins d'embryons de poulets: isolement d'explants avec entérocytes embryonnaires en monocouche cellulaire

Culture primaire: marqueurs épitheliaux

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AvBD1

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AvBD2

Cellules épithéliales capables d'exprimer les gènes AvBD1 et AvBD2 selon la lignée dont elles sont issues
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

## Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Les AvBD1 and 2 sont-elles actives contre Salmonella?

Préparation des défensines à partir de la moelle osseuse de poulet: (site actif de la granulopoïèse, tissu exprimant fortement les gènes des AvBDs)

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- Extraction des peptides en acide acétique 10%

- Chromatographie d'exclusion de taille (Biogel P10, Biorad) puis RP-HPLC

- Analyse des fractions par spectrométrie de masse

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Purification d'AvBD2 (C) et d'AvBD1 (B, amidation W en C-terminal)
Purification d'une nouvelle AvBD7 (A).
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

## Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Les AvBD1, 2 et 7 sont-elles actives contre Salmonella?

Préparation des défensines à partir de la moelle osseuse de poulet: défensines matures? Identiques à celles des neutrophiles?

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AvBD1, AvBD2 et AvBD7 identiques en masse à celles de la moelle osseuse.

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Produites sous forme mature dans la moelle osseuse.

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Utilisables en test de diffusion radiale en gélose
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-*Salmonella*: le portage intestinal chez les oiseaux.

* Les AvBD1, 2 et 7 sont-elles actives contre *Salmonella*?

<table><thead><tr><th rowspan="2">Bacterial strains</th><th colspan="4">MIC in µM</th></tr><tr><th>MSI94</th><th>AvBD1</th><th>AvBD2</th><th>AvBD7</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>B. subtilis</i></td><td>0.73</td><td>0.19</td><td>0.28</td><td>0.21</td></tr><tr><td><i>B. cereus</i></td><td>0.32</td><td>0.21</td><td>0.47</td><td>0.20</td></tr><tr><td><i>S. aureus</i></td><td>0.34</td><td>0.08</td><td>0.42</td><td>0.11</td></tr><tr><td><i>L. monocytogenes</i></td><td>0.41</td><td>0.26</td><td>0.22</td><td>0.31</td></tr><tr><td><i>S. Enteritidis 14026</i></td><td>0.32</td><td>0.17</td><td>0.80</td><td>0.16</td></tr><tr><td><i>S. Enteritidis LA5</i></td><td>0.31</td><td>0.16</td><td>6.05</td><td>0.21</td></tr><tr><td><i>S. Typhimurium</i></td><td>0.37</td><td>0.15</td><td>2.39</td><td>0.21</td></tr><tr><td><i>E. coli</i></td><td>0.59</td><td>0.27</td><td>0.72</td><td>0.28</td></tr><tr><td><i>K. pneumoniae</i></td><td>0.26</td><td>0.10</td><td>0.71</td><td>0.32</td></tr></tbody></table>
# Réponse mucosale aux entérobactéries pathogènes

Exemple particulier de relation hôte-Salmonella: le portage intestinal chez les oiseaux.

## Etude des défensines aviaires - Perspectives

- Activité sur bactéries multirésistantes aux antibiotiques

- Synergie d'activité antimicrobienne entre défensines

- Robustesse: résistance à la dégradation par les protéases

- Autres fonctions: activité chimiotactique, immunostimulante

- Intérêt thérapeutique AvBD1, 2 et 7: essais in vivo sur modèles infectieux