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May 17, 2020

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# Quantification de la callose dans les filaments de *P. patens* par microscopie confocale

DOI
**dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bghejt3e**

Yoan Coudert¹, Arthur Muller¹

¹Ecole Normale Supérieure de Lyon

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Yoan Coudert

Ecole Normale Supérieure de Lyon

OPEN ACCESS

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DOI: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bghejt3e

**Protocol Citation:** Yoan Coudert, Arthur Muller 2020. Quantification de la callose dans les filaments de P. patens par microscopie confocale. protocols.io https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bghejt3e

**License:** This is an open access protocol distributed under the terms of the [Creative Commons Attribution License](https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited

**Protocol status:** Working

**We use this protocol and it's working**

**Created:** May 17, 2020

**Last Modified:** May 17, 2020

**Protocol Integer ID:** 37126

## Before start

Protocole pour microscope Leica TCS SP8
<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Culture

1 Faire une culture de colonie sur milieu BCD (AT) pendant 15 jours en boîte carrée (10 x 10 cm)

Aniline blue staining

2 Préparer la solution de travail en diluant la solution stock d'aniline bleu 1:3 (v :v) dans du tampon phosphate pH 8,5

3 Remplir les puits d'une plaque 48 puits avec 200µL de la solution de travail d'aniline bleu

4 Prélever une petite quantité de protonema à la périphérie des colonies et la placer dans les puits de la plaque 48-puits

5 Laisser les tissues dans la solution d'aniline bleu 30 minutes à 23°C et à l'obscurité

6 Rincer les échantillons à l'eau

7 Placer les échantillons sur lame dans une d'iodure de propidium puis déposer une lamelle

Confocal imaging

8 Vérifier l'échantillon à la binoculaire

9 Régler les paramètres du microscope cf *Paramétrage du microscope Leica TCS SP8*

10 Localiser l'échantillon sur la lame au grossissement x 5 (air)

11 Observer l'ensemble de l'échantillon au grossissement x 25 puis x 40 (eau)
<figure><img src="image_6.png" /></figure>

12 Définir le nombre de tiles et leurs espacements pour l'acquisition d'images cf *Paramétrage du microscope Leica TCS SP8*

13 Faire acquisition de la paroi entre la cellule apicale et la cellule sub-apicale (50 réplicats biologiques)

14 A partir des z-stack utiliser la fonction projection maximale pour obtenir l'image finale

15 Sauvegarder fréquemment le projet

## Traitement des images avec Fiji software

16 Dupliquer les images (raccourci commande + maj + D)

17 Changer le contraste pour toutes les images Image>Adjust>Contrast>Set

18 Mettre Minimum displayed value : 0 et maximum displayed value : 4095 en 12 bit

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

19 Appliquer les fausses couleurs : Image>Lookup tables>Fire
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

20 Ouvrir le ROI T1 (modèle 360 µm²) dans le gestionnaire de ROI : analyze>tools>ROI manager

21 Déplacer la ROI dans un coin où il n'y a pas de signal et mesurer la somme de l'intensité des pixels de la ROI = signal bruit de fond :
* analyze>set measurments>cocher integrated density
* analyze>measure (cntrl + m)
* RawIntDens

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

22 Positionner la ROI au niveau de la paroi entre la cellule apical et sub-apical et mesurer la somme de l'intensité des pixels de la ROI = signal callose brut

23 Signal callose brut – signal bruit de fond = signal callose

24 Procéder de la même façon pour tous les échantillons

25 Enregistrer les données dans un tableur excel

## Analyses statistiques

26 Dans un premier temps pour visualiser les données faire un box plot avec les différentes conditions traités

## Paramétrage du microscope LEICA TCS SP8

27 Lasers

<table><thead><tr><td>Type laser</td><td>%</td></tr></thead><tbody><tr><td>Laser diode UV 405 nm (callose)</td><td>10%</td></tr><tr><td>Laser visible 488 nm (PI)</td><td>9% à 15%</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

## Détecteurs

<table><thead><tr><td>Détecteur</td><td>Observation</td><td>Gain</td><td>Offset</td><td>Intervalle nm</td></tr></thead><tbody><tr><td>PMT 2</td><td>callose</td><td>670</td><td>0,1%</td><td>440-520 nm</td></tr><tr><td>PMT4</td><td>autofluo chloroplaste</td><td>550</td><td>0,1%</td><td>600-720 nm</td></tr><tr><td>PI</td><td></td><td></td><td>560-615 nm</td><td></td></tr></tbody></table>

## Stack

- Nombre de tiles : 30

- Espacement entre les tiles : 0,70

## Autres

- Grossissement : x 40

- Zoom : 1,5

- Pinhole airy : 1

- Frame average : 8

- Scan speed : 8 000 hz

- Définition de l'image : 1024x1024

- Bit : 12

## Aniline blue

$\lambda_{ex}$ 390 nm

$\lambda_{em}$ 480 nm

## PI

$\lambda_{ex}$ 493 nm

$\lambda_{em}$ 636 nm