Nous tenons à remercier Guy André du Laboratoire Méditerranéen de Préhistoire Europe Afrique (LAMPEA), et Alain Tonetto de la Plateforme de Recherche Analytique Technologique et d'Imagerie (PRATIM) pour leur aide dans la mise en place de ce protocole de préparation de lames minces. Nous remercions également Anaïs Coccaro-Turet pour les illustrations et les corrections d'anglais, Jean-Philip Brugal pour son aide et les relecteurs pour leurs corrections utiles qui ont amélioré ce travail. Enfin, nous tenons à remercier Mike Mathieu et Christelle, qui nous ont fourni les coquilles d'œufs d'autruche utilisées dans cette étude.

# Introduction

Les coquilles d'œufs de dinosaures non-aviens et d'autruches font l'objet de nombreuses études liant les méthodes utilisées en paléontologie et en archéologie. L'étude des coquilles repose sur des critères morphologiques microscopiques et macroscopiques. Les critères d'identification des différentes oofamilles sont principalement basés sur la forme des unités cristallines observées en sections radiales, vues par transparence en lumière polarisée transmise (nicols parallèles et croisés). Ces critères ont été décrits par Mikhailov (Mikailov 1994). Cette parataxonomie permet une meilleure compréhension de l'évolution de la distribution géographique et chronologique via des corrélations biostratigraphiques et ootaxonomiques. La découverte d'œufs contenant des embryons fossilisés a permis aux scientifiques de lier certaines oofamilles à des taxons connus.

L'étude des coquilles nécessite un large éventail de méthodes, de l'analyse de surface à la préparation de lames minces. En plus des approches classiques telles que la microscopie optique, le MEB et la cathodoluminescence, de nouvelles méthodes utilisant la tomographie ont émergé pour étudier les structures internes de la coquille en trois dimensions (3D). Chaque méthode fournit des informations différentes, permettant de mieux comprendre les phénomènes biologiques, géographiques, éthologiques et climatiques liés aux animaux pondeurs.

Il a été démontré que les coquilles d'œufs d'autruche du Pléistocène possédaient des caractéristiques permettant leur identification au niveau spécifique (Mikhailov & Zelenkov 2020). Ces coquilles sont bien documentées dans les dépôts du Pléistocène et de l'Holocène (Segalen & Person 2017, Texier et al. 2013) et l'étude de leurs lames minces permettrait d'affiner les informations sur leur répartition taxonomique et leur état de conservation. De même, d'autres auteurs ont montré que certaines coquilles d'œufs de dinosaures du Mésozoïque ont été travaillées par des humains et utilisées comme perles au cours des périodes préhistoriques (Andrew 1932, Pauc & Buffetaut 1998). L'étude des coquilles d'œufs fossiles est donc un domaine de recherche faisant appel à différentes disciplines et employant diverses méthodes et techniques.

La préparation paléontologique des échantillons de coquilles d'œufs de dinosaures doit permettre à la fois l'étude et la conservation du matériel. La préparation de lames minces de coquilles d'œufs utilise la coquille individuellement, la séparant ainsi d'une partie de son contexte lorsqu'elle provient d'une ponte contenant plusieurs œufs. La préparation de lames minces multiples facilite la préservation et l'étude des relations que certaines coquilles pourraient avoir entre elles.

La plus ancienne lame mince de coquille d'œuf de dinosaure du Sud-Est de la France apparaît dans les travaux de Paul Gervais (Gervais 1877). Depuis, les méthodes de préparation ont considérablement évolué et une grande diversité de produits d'enrobage, de machines-outils et de supports sont désormais utilisés par les préparateurs en paléontologie du monde entier. Plusieurs auteurs ont décrit des protocoles permettant de réaliser des lames minces de coquilles fossilisées (Lamm 2013, May et al. 1994, Quinn 1994) et ces méthodes sont bien maîtrisées et reproduites dans de nombreux laboratoires de paléontologie (May et al. 1994). « Preparation and Sectioning of Specimens » par Ellen-Thérèse Lamm (Lamm 2013) est un ouvrage important en préparation paléontologique. Ce travail donne une vision très complète des étapes à suivre pour la préparation de lames minces de différents fossiles. De plus, la liste des différents consommables, machines et équipements de protection permet d'élaborer un protocole adapté aux besoins de l'étude.

Bien que les consommables et les machines se soient modernisés, les principes généraux de préparation des lames minces analysés dans ces publications sont similaires, avec des adaptations selon le type d'équipement et les méthodes d'analyse (Quinn 1994). Des méthodes de préparation des coquilles d'œufs pour l'étude macroscopique de surface ont été expérimentées (Val et al. 2013), et de nombreuses études scientifiques utilisent des lames minces radiales de coquilles en complément des observations de l'état de surface. Ces études concernent divers domaines tels que la parataxonomie (Fernández & Khosla 2014, Garcia & Vianey-Liaud 2001, Hirsch 1996, Mikhailov 1991, 1997, Mohabey 1996, 1998, Sellés et al. 2014a, Vianey-Liaud et al. 1994), la paléobiologie (Jackson et al. 2004, Jackson & Varricchio 2003, Sellés et al. 2017, Zelenitsky & Hills 1997) ou la taphonomie (Dauphin 1990, Fiorelli et al. 2013, Grellet-Tinner et al. 2010, Moreno-Azanza et al. 2016).

La préparation des coquilles d'œufs doit donc s'adapter à une diversité d'analyses pour des domaines de recherche spécialisés. Cependant, dans la plupart de ces études, le protocole de préparation des lames minces est peu décrit, et seule l'épaisseur finale des échantillons préparés est indiquée (Coria et al. 2010, Deeming 2006, Fernández & Khosla 2014, Jackson et al. 2013, Jackson & Varricchio 2016, Salgado et al. 2009, Sellés et al. 2013, 2014b).

Cet article propose une méthode simple et reproductible de préparation de lames minces multiples pour des coquilles d'œufs modernes et fossiles, utilisable en étude microscopique classique (lumière polarisée transmise, nicols parallèles et croisés), en cathodoluminescence et en analyse par fluorescence.

# Matériel et méthodes

Le matériel utilisé dans cette étude provient de coquilles d'œufs de dinosaures Megaloolithidae collectées dans les dépôts du Crétacé supérieur (Campanien et Maastrichtien) du Bassin de l'Arc et de coquilles d'œufs d'autruche (Struthio camelus). Des coquilles provenant de différents contextes de fossilisation ont été utilisées et parfois montées sur la même lame. Les coquilles sont composées principalement de carbonate de calcium (CaCO3) et ont une épaisseur comprise entre 0,7 mm et 3 mm. Les spécimens étudiés étaient préservés dans des roches calcaires et des sédiments argileux. Certaines coquilles ont été lavées au préalable dans une cuve à ultrasons pour tester si la présence de microfissures avait un impact sur la production de lames minces. Les échantillons ont été lavés 15 minutes dans un mélange d'eau et de détergent au Laboratoire Méditerranéen de Préhistoire Europe Afrique (LAMPEA). La conclusion fut que les potentielles microfissures causées par la cuve à ultrasons n'avaient pas d'impact négatif sur la réussite de la préparation des lames minces.

La création du protocole et sa mise en œuvre ont été réalisées au Centre Européen de Recherche et d'Enseignement de Géosciences de l'Environnement (CEREGE). Tous les échantillons ont été préparés en utilisant les mêmes consommables et les mêmes machines. Le nombre d'échantillons placés sur chaque lame variait entre 2 et 10. La préparation des consommables, ainsi que l'utilisation des machines, ont été réalisées en adéquation avec les consignes de sécurité et l'équipement approprié (hottes aspirantes, gants, masques et lunettes de protection). Ce protocole doit servir de base et être adapté par chaque préparateur en paléontologie selon les différents types d'échantillons et de consommables utilisés.

# Protocole

La première étape dans la production de lames minces est le choix des échantillons. L'ordre de chaque échantillon sur la lame peut être important s'ils partagent des points communs. Ce choix appartient à la fois au préparateur et à la personne qui étudiera les échantillons, selon leur nature et les différentes possibilités de les placer sur la lame.

Les échantillons sont imprégnés une première fois individuellement dans de la résine Araldite 2020 pour maintenir la cohérence structurelle durant les premières étapes de découpe (fig. 1.a). Les échantillons sont plongés dans la résine à l'aide de pinces, puis placés sous vide pour éliminer les bulles d'air. Cette étape doit être réalisée sur des coquilles fragiles ou mal conservées mais n'est pas nécessaire pour des coquilles en bon état. Après un séchage de 24 h, les coquilles sont coupées et polies sur leur section radiale transversale dans le sens de leur courbure naturelle (fig. 1.a). La surface de coupe de l'échantillon doit être cohérente avec la mise en évidence des caractéristiques de la coquille recherchées pour l'étude. Cette étape permet d'obtenir une section plane pour placer tous les échantillons verticalement sur une lamelle couvre-objet de 150 µm d'épaisseur. L'ordre des échantillons et leurs références sont inscrits sur une étiquette adhésive placée à côté de chaque lamelle. Cette lamelle permet de maintenir les échantillons verticalement durant la seconde phase d'imprégnation et ne sera pas conservée lors des étapes finales de préparation.

Les échantillons sont disposés et fixés avec de la colle forte (fig. 1.b). Pour les sections tangentielles, la coquille est collée avec la face externe en contact avec la lamelle (le protocole ne change pas pour les étapes suivantes).

Après séchage (2 h), les échantillons sont fixés, et la lamelle est placée dans un moule en silicone, la lame vers le bas et les échantillons vers le haut. Les références des échantillons sont notées sur une étiquette adhésive collée au moule. La résine époxy d'imprégnation Araldite 2020 est alors versée dans le moule jusqu'à ce que toutes les coquilles soient complètement recouvertes (fig. 1.c). Le moule est placé sous vide dans une enceinte d'imprégnation pour faire sortir les éventuelles bulles d'air, à une pression négative de -0,9 bar (fig. 1.d).

Une fois les bulles d'air expulsées, le moule est placé dans une étuve pour sécher pendant 24 heures.

Une fois la résine sèche, une marque est faite sur le bloc de résine pour indiquer l'ordre de distribution des échantillons. Ensuite, le côté du bloc de résine ayant reçu la lamelle est poli sur un disque diamanté (fig. 1.e). Le bloc de résine poli est ensuite déshydraté puis poli à nouveau sur un plateau en fonte avec un mélange de carbure de silicium (grain de 8 µm) et d'eau. Le bloc de résine est ensuite nettoyé à l'eau et placé sur une plaque chauffante réglée à 40°C pendant deux heures. Le bloc de résine est ensuite aligné sur la lame et les références y sont annotées, selon la distribution des échantillons dans le bloc. De la résine époxy de collage Hillquist est utilisée pour coller le bloc de résine sur la lame avec les échantillons face à leurs références respectives (fig. 1.f). Le bloc de résine est placé sur la lame et maintenu par une presse de collage (fig. 2.a).

Le séchage est effectué à froid car le phénomène de retrait de la résine époxy est amplifié par la chaleur. Étant donné la grande surface de résine en contact avec la lame, le verre n'est pas assez résistant et se fissure lorsque la résine se rétracte rapidement. Le bloc de résine est laissé à sécher à froid sur une période d'au moins 48 heures. De plus, une température et un poids constants permettent une distribution uniforme de la résine de collage entre le bloc et la lame.

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Crédit : Anaïs Coccaro-Turet

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Crédit : Anaïs Coccaro-Turet

Une fois le bloc de résine fixé sur la lame, la coupe est effectuée avec une lame circulaire (fig. 2.b). L'échantillon est ensuite réduit à une épaisseur d'environ 50 μm avec une rectifieuse de précision (fig. 2.c). Une fois cette étape terminée, l'épaisseur de l'échantillon est vérifiée avec un micromètre.

La lame est placée sur un porte-échantillon avec des butées diamantées réglées à 30 μm d'épaisseur. Le porte-échantillon est placé sur une machine de polissage avec un plateau en fonte (fig. 2.d). Le polissage est effectué en ajoutant un premier mélange avec un grain de 6 μm, puis un second avec un grain de 3 μm. À la fin de chaque cycle, la lame est contrôlée au micromètre et l'opération est répétée jusqu'à atteindre une épaisseur de 30 μm (fig. 2.e). Une fois l'épaisseur désirée atteinte, la lame subit un traitement final avec un mélange de polissage à grain de 1 μm pour les analyses en cathodoluminescence.

# Discussion

L'intérêt d'étudier de nombreux échantillons pour surmonter les problèmes de modifications diagénétiques a été décrit tant dans des articles méthodologiques (Quinn 1994) que de recherche (Dauphin 1990).

Le protocole proposé par Betty Quinn en 1994 est très complet et donne toutes les étapes nécessaires à la préparation de lames minces de coquilles d'œufs. Cependant, il manque de figures et ne considère pas la possibilité de placer plusieurs échantillons sur une seule lame mince. La force de la méthode de préparation de lames minces multi-échantillons par rapport à un mode de préparation conventionnel est qu'elle augmente le nombre d'échantillons par lame (fig. 3), réduit les quantités de consommables utilisés, et améliore le temps d'étude. Toutefois, cette méthode nécessite quelques étapes supplémentaires augmentant le temps de préparation. Ainsi, la méthode à utiliser doit être définie à l'avance, en tenant compte à la fois du matériel à préparer et du type d'analyse à effectuer. L'étude des œufs est réalisée par des approches parataxonomiques, taphonomiques et paléobiologiques. Les œufs sont souvent trouvés en amas qui correspondent parfois à des nids, et marquent une intentionnalité des animaux qui en sont à l’origine. Une étude comparative des différentes coquilles présentes au sein d'un même amas est donc une étape nécessaire pour comprendre le comportement de nidification des dinosaures. La présence de plusieurs spécimens par lame permet une comparaison pratique des critères taxonomiques et des modifications diagénétiques (fig. 4).

Pour parvenir à ce résultat, plusieurs modifications importantes ont été apportées. Ces différences entre les méthodes classiques de préparation de lames minces et la préparation multi-échantillons résident dans le placement des échantillons avant l'enrobage et la polymérisation à froid de la résine lors du collage du bloc sur la lame. La principale difficulté était la fissuration des lames après le collage du bloc de résine. La fissuration des lames pouvait apparaître spontanément lors du séchage et de la rétractation de la résine, ou lors de l'étape de découpe (fig. 2.b).

L'étape de polissage peut également être un moment où une partie de l'échantillon est perdue s'il n'a pas été bien préparé au préalable. En effet, si le bloc de résine a une surface convexe et n'est pas parfaitement plat avant d'être collé sur la lame, le bord extérieur des échantillons disparaît lors des étapes finales de polissage. Plusieurs polissages successifs sont donc effectués après le démoulage des blocs de résine avant de les coller sur les lames.

L'étude des coquilles en cathodoluminescence ou au microscope électronique à balayage nécessite le placement des lames minces sous vide. Cette phase préparatoire implique un temps incompressible qui est renouvelé à chaque changement d'échantillon. Ainsi, la présence de plusieurs échantillons sur la même lame permet un gain de temps considérable.

Cette méthode de préparation de lames minces multiples présente certaines limites expérimentales qui restent à explorer. Les coquilles les plus fines incluses dans les lames minces multiples avaient une épaisseur de 0,8 mm. Cette méthode n'a pas été testée sur des œufs de crocodiles, de tortues ou d'oiseaux modernes autres que les autruches. De même, cette technique n'a pas été testée sur des œufs à coquille molle de dinosaures non-aviens récemment découverts (Norell et al. 2020).

# Conclusion

La production de lames minces nécessite la mise en œuvre de compétences en préparation paléontologique, des machines spécialisées, ainsi que des consommables variés et coûteux. Ainsi, le regroupement de plusieurs échantillons avec une cohérence contextuelle sur une même lame est un avantage en termes de coûts, de temps de préparation et de temps d'analyse. De plus, la présence de plusieurs échantillons sur la même lame mince a l'avantage de pouvoir surmonter les problèmes de modification diagénétique en multipliant les observations. Les conditions de conservation de certains fossiles, tels que les holotypes, sont également améliorées avec ce type de protocole qui permet de rassembler plusieurs coquilles appartenant à une nouvelle oospèce, par exemple, sur la même lame mince. Ce protocole peut être adapté à tout type de coquille d'œuf, quel que soit son état de conservation, et permet d'obtenir des vues radiales et tangentielles sur une seule lame. Les machines et consommables, répandus dans le domaine de la préparation archéologique et paléontologique, rendent cette méthode de préparation de lames minces reproductible et avantageuse.