# Analyse du profil d'expression immunohistochimique d'une cohorte rétrospective bicentrique de chondrosarcomes mésenchymateux et comparaison avec celui d'une cohorte de témoins correspondant aux principaux diagnostics différentiels histologiques

Marion Balesdent

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

## To cite this version:

Marion Balesdent. Analyse du profil d'expression immunohistochimique d'une cohorte rétrospective bicentrique de chondrosarcomes mésenchymateux et comparaison avec celui d'une cohorte de témoins correspondant aux principaux diagnostics différentiels histologiques. Anatomie, Histologie, Anatomopathologie [q-bio.TO]. 2024. dumas-04788824

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UNIVERSITE DE PICARDIE JULES VERNE

FACULTE DE MEDECINE D'AMIENS

Année 2024

N° 2024 - 174

ANALYSE DU PROFIL D'EXPRESSION IMMUNOHISTOCHIMIQUE D'UNE
COHORTE RÉTROSPECTIVE BICENTRIQUE DE CHONDROSARCOMES
MÉSENCHYMATEUX ET COMPARAISON AVEC CELUI D'UNE COHORTE DE
TÉMOINS CORRESPONDANT AUX PRINCIPAUX DIAGNOSTICS
DIFFÉRENTIELS HISTOLOGIQUES

THESE DE DOCTORAT EN MEDECINE
ANATOMIE ET CYTOLOGIE PATHOLOGIQUES

DIPLOME D'ETAT

PRESENTEE ET SOUTENUE PUBLIQUEMENT

LE 17 OCTOBRE 2024

PAR

MARION BALESDENT

Née le 17 novembre 1996

PRESIDENT DU JURY : Professeur CHATELAIN Denis

MEMBRES DU JURY :
Professeur HAVET Éric
Docteur HOUESSINON Aline
Docteur ATTENCOURT Christophe

DIRECTRICE DE THESE : Docteur CSANYI-BASTIEN Marie
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
A Monsieur le Professeur Éric HAVET

Professeur des Universités - Praticien Hospitalier

Anatomie - Chirurgie Orthopédique

Doyen, Directeur de l'Unité de Formation et de Recherche de Médecine d'Amiens

Chevalier de l'Ordre des Palmes Académiques

Vous me faîtes l'honneur de juger ce travail.

Merci pour votre disponibilité.

Recevez ici l'expression de ma sincère reconnaissance et de mon respect.
A Monsieur le Professeur Denis CHATELAIN

Professeur des Universités – Praticien Hospitalier

Anatomie et Cytologie Pathologiques

Chef du Service d>Anatomie et Cytologie Pathologiques du CHU d'Amiens Picardie

Vous me faîtes l'honneur de présider ce jury de thèse.

Je vous remercie pour votre gentillesse, votre expertise, votre disponibilité et pour
l'enseignement que vous m'avez prodigué au fil des années. Vous avez toujours su maintenir
une ambiance agréable et conviviale au sein du service, tout en veillant à la qualité de la
formation des internes.

Recevez ici l'expression de ma sincère reconnaissance et de mon respect.
A Madame le Docteur Aline HOUESSINON

Praticien Hospitalier Universitaire

Oncologie Médicale

Vous me faîtes l'honneur de juger ce travail.

Merci pour votre disponibilité.

Recevez ici l'expression de ma sincère reconnaissance et de mon respect.
Monsieur le Docteur Christophe ATTENCOURT

Praticien Hospitalier

Anatomie et Cytologie Pathologiques

Je te remercie Christophe pour ta pédagogie, ta gentillesse, ton expertise et ton investissement
dans la formation des internes, c'est toujours un plaisir de travailler et d'apprendre avec toi.
Merci d'avoir accepté de juger ce travail.

Je t'exprime ici ma sincère reconnaissance et mon profond respect.
A Madame le Docteur Marie CSANYI-BASTIEN

Praticien Hospitalier

Anatomie et Cytologie Pathologique, CHU de Lille

Marie, je tiens très sincèrement à te remercier pour tout l'enseignement que tu m'as apporté, pour ta bienveillance constante, ta gentillesse, ta minutie et ton exigence qui motivent à toujours faire mieux, et aussi pour les bons moments passés. Je n'aurais su tant apprécier ce semestre à Lille sans ton accompagnement. Merci de m'avoir fait confiance et d'avoir accepté de diriger ce travail.

Je n'aurais pu espérer meilleure directrice de thèse.

Je t'exprime ici ma sincère reconnaissance et mon profond respect.
<figure><img src="image_4.png" /></figure>
TABLE DES MATIERES

INTRODUCTION.................................................................................................................. 12

I. LE CHONDROSARCOME MESENCHYMATEUX........................................................................ 12

1. Données épidémiologiques.................................................................................................................. 12

2. Caractéristiques cliniques.................................................................................................................. 12

3. Aspects radiologiques.................................................................................................................. 13

4. Définition anatomopathologique.................................................................................................................. 13

5. Pathogénèse.................................................................................................................................................. 16

6. Modalités thérapeutiques.................................................................................................................. 17

7. Données d'évolution et de pronostic........................................................................................................ 18

II. LES PRINCIPAUX DIAGNOSTICS DIFFERENTIELS HISTOLOGIQUES........................................ 18

1. Présentation clinico-histologique.................................................................................................................. 18

2. Panel immunohistochimique recommandé........................................................................................................ 22

OBJECTIFS DE L'ETUDE .................................................................................................................. 23

MATERIEL ET METHODES.................................................................................................................. 24

I. CRITERES D'INCLUSION DES PATIENTS .................................................................................. 24

II. OBLIGATIONS LEGALES .................................................................................................................. 24

III. ANALYSES MOLECULAIRES A VISEE DE CONFIRMATION DIAGNOSTIQUE.................. 25

1. Whole RNA sequençing.................................................................................................................. 25

2. RNA sequencing ciblé par technique ARCHER .................................................................................. 26

3. Étude du profil de méthylation de l'ADN ........................................................................................................ 26

IV. ÉTUDE IMMUNOHISTOCHIMIQUE.................................................................................. 27

1. Réalisation de Tissue-Micro-Arrays........................................................................................................ 27

2. Étude immunohistochimique sur Tissue-Micro-Arrays .................................................................................. 28

3. Étude immunohistochimique sur lame entière ........................................................................................................ 30

RESULTATS.................................................................................................................................................. 31

I. CARACTERISTIQUES DES PATIENTS .................................................................................. 31

1. Présentation de la cohorte de cas.................................................................................................................. 31

2. Présentation de la cohorte de témoins .................................................................................................................. 39

II. RESULTATS IMMUNOHISTOCHIMIQUES OBTENUS SUR TISSUE-MICRO-ARRAYS......... 41
<table><tbody><tr><td>1. Résultats concernant les anticorps du panel recommandé par le Réseau de Référence en Pathologie des Sarcomes</td><td>41</td></tr><tr><td>2. Résultats concernant les anticorps à visée diagnostique pour le chondrosarcome mésenchymateux</td><td>47</td></tr><tr><td>3. Synthèse des résultats immunohistochimiques obtenus sur Tissue-Micro-Arrays</td><td>53</td></tr><tr><td>III. RESULTATS IMMUNOHISTOCHIMIQUES OBTENUS SUR LAME ENTIERE POUR LES MARQUEURS D'INTERET</td><td>54</td></tr><tr><td>1. Résultats pour les cas</td><td>54</td></tr><tr><td>2. Résultats pour les témoins</td><td>57</td></tr><tr><td>3. Synthèse des résultats immunohistochimiques pour les marqueurs d'intérêt obtenus sur lame entière</td><td>59</td></tr><tr><td>DISCUSSION</td><td>60</td></tr><tr><td>I. REPRESENTATIVITE DE NOTRE COHORTE DE CHONDROSARCOMES MESENCHYMATEUX</td><td>60</td></tr><tr><td>1. Aspects cliniques</td><td>60</td></tr><tr><td>2. Aspects histologiques</td><td>61</td></tr><tr><td>3. Aspects moléculaires</td><td>61</td></tr><tr><td>II. PLACE DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE DANS LE DIAGNOSTIC DE CHONDROSARCOME MESENCHYMATEUX</td><td>62</td></tr><tr><td>III. OUTILS IMMUNOHISTOCHIMIQUES POUR LE DIAGNOSTIC DE CHONDROSARCOME MESENCHYMATEUX</td><td>62</td></tr><tr><td>1. Données d'expression immunohistochimique disponibles dans la littérature</td><td>62</td></tr><tr><td>2. Nouvelles données d'expression immunohistochimique établies par notre étude</td><td>63</td></tr><tr><td>3. Données immunohistochimiques pertinentes pour le diagnostic de CSM</td><td>66</td></tr><tr><td>CONCLUSION</td><td>68</td></tr><tr><td>BIBLIOGRAPHIE</td><td>69</td></tr><tr><td>RESUME</td><td>76</td></tr></tbody></table>
ABREVIATIONS

ACP = Anatomie et Cytologie Pathologiques

ADICAP = Association pour le Développement de l'Informatique en Cytologie et en
Anatomie Pathologique

ADN = Acide DésoxyriboNucléique

ADNc = ADN complémentaire

ARN = Acide RiboNucléique

C = Cytosine

CHU = Centre Hospitalier Universitaire

CSM = ChondroSarcome Mésenchymateux

FFPE = Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (tissu fixé au formol et incus en paraffine)

HES = Hématoxyline-Éosine-Safran

IHC = ImmunoHistoChimie

LAL = Leucémie Aiguë Lymphoblastique

LL = Lymphome Lymphoblastique

OSPC = OstéoSarcome à Petites Cellules

RMS = RhabdoMyoSarcome

RRePS = Réseau de Référence en Pathologie des Sarcomes

RT = RadioThérapie

Rb = Rétinoblastome

Se = Sensibilité

Sp = Spécificité

SS = SynovialoSarcome

TDPCR = Tumeur Desmoplasique à Petites Cellules Rondes

TMA = Tissue-Micro-Arrays

TdF = Transcrit de Fusion

U = Uracile
# INTRODUCTION

## I. LE CHONDROSARCOME MESENCHYMATEUX

### 1. Données épidémiologiques

Le chondrosarcome mésenchymateux (CSM) est un sarcome rare de haut grade, ne représentant que 0,4 % des sarcomes osseux (1). C'est le sous-type le plus rare des chondrosarcomes, dont il ne représente que 2 à 4 % (1). Il survient principalement chez les jeunes adultes entre 20 et 30 ans. L'âge médian au diagnostic est de 28 ans, avec plus de trois quarts des cas se déclarant avant 40 ans. Il existe une légère prédominance masculine (ratio H:F : 1,3:1) (1-3).

Le CSM se distingue des chondrosarcomes classiques par de nombreux points tels qu'une survenue plus précoce, une grande variété des localisations primitives possibles, et un pronostic plus péjoratif (3).

### 2. Caractéristiques cliniques

Le CSM se développe dans des sites variés, tels que les os, les tissus mous et le crâne (4,5). Dans la littérature, ils sont généralement classés en CSM squelettiques lorsque le site primitif est osseux ou en CSM extra-squelettiques lorsque le site primitif est intracrânien ou dans les tissus mous.

Parmi les **CSM squelettiques**, qui représentent 40 à 60% des cas, les localisations préférentielles sont les os crânio-faciaux, avec notamment la mandibule, le maxillaire et les os de la base du crâne. Viennent ensuite par ordre de fréquence le fémur, les côtes ou la paroi thoracique, les vertèbres et l'aile iliaque (4,5). Il s'agit généralement de tumeurs intra-médullaires, les localisations à la surface osseuse étant plus rares.

Les **CSM extra-squelettiques** sont principalement retrouvés dans les tissus mous des membres inférieurs et de l'orbite. Les localisations intracraniennes correspondent à des atteintes méningées (6,7).

Les symptômes révélateurs sont liés à la douleur et/ou aux conséquences du syndrome de masse exercé par la tumeur, variables selon sa localisation : palpation d'une masse, déficit par compression d'une structure nerveuse, hypertension intracrânienne (8).
### 3. Aspects radiologiques

L'imagerie des CSM est généralement peu spécifique. Ils partagent les aspects radiologiques des chondrosarcomes classiques, à savoir des critères d'agressivité tumorale et une matrice chondroïde.

En cas de topographie osseuse, l'analyse radiologique montre une lésion ostéolytique à bords flous avec de possibles calcifications en anneau et en arc, témoignant de la présence d'une matrice chondroïde.

Sur les images tomodensitométriques (TDM), le CSM se présente généralement comme une volumineuse lésion hypodense, expansive dans l'os, détruisant la corticale avec extension dans les tissus mous adjacents. On observe des indices d'une matrice cartilagineuse dans environ 60 % des cas (9).

En imagerie par résonance magnétique (IRM), le CSM présente généralement un hyposignal T1 et un hypersignal T2, avec rehaussement hétérogène diffus ou nodulaire après injection de gadolinium (9–12).

Devant ces aspects en imagerie de tumeur agressive avec une matrice chondroïde, la réalisation d'une biopsie est indispensable pour préciser le diagnostic.

### 4. Définition anatomopathologique

Le CSM est un **sarcome biphasique** caractérisé par l'association d'un contingent de petites cellules rondes et d'un contingent cartilagineux bien différencié. Outre l'analyse morphologique, son diagnostic repose également sur des outils immunohistochimiques et de biologie moléculaire.

#### A. Histologie

Il s'agit d'une tumeur composée de **deux contingents cellulaires** (Figure 1).

Le premier est fait de nappes de petites cellules rondes d'allure indifférenciée, au rapport nucléo-cytoplasmique élevé. Les noyaux ont une chromatine hétérogène et parfois un discret nucléole. Le cytoplasme n'est quasiment pas visible. L'anisocaryose est faible, conférant à la tumeur un aspect monotone (Figure 1A) (8,13,14). Les mitoses sont fréquentes et peuvent être atypiques. Classiquement, dans ce contingent, la vascularisation est abondante et de type hémangiopéricytaire, c'est-à-dire avec des vaisseaux plus ou moins dilatés et branchés en « bois de cerf» (15). De la nécrose et des phénomènes hémorragiques peuvent être observés.
Le second contingent correspond à une proportion variable de secteurs de cartilage bien différencié, formés par une matrice hyaline abritant des logettes ou chondroplastes, où se nichent les chondrocytes au cytoplasme abondant et au noyau rond avec une chromatine hétérogène et un nucléole parfois visible (16,17).

La transition entre les deux contingents est classiquement abrupte (Figure 1B) (14,16,18,19).

Des foyers d'ossification peuvent être retrouvés au sein de la matrice cartilagineuse.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 1** : Aspect histologique du chondrosarcome mésenchymateux.</figcaption></figure>

(A) : Illustration du contingent à petites cellules rondes formé par des nappes de cellules monomorphes avec une vascularisation hémangiopéricytaire. (B) : Transition abrupte entre cartilage bien différencié à gauche et petites cellules rondes à droite.

## B. Immunohistochimie

L'immunohistochimie (IHC) est une technique complémentaire facilement accessible et largement utilisée en pratique quotidienne dans les laboratoires d'anatomie et de cytologie pathologiques (ACP), permettant de caractériser un tissu et/ou une tumeur, en étudiant son profil d'expression antigénique au moyen d'anticorps spécifiques. Elle est particulièrement utile dans le cadre diagnostique des sarcomes à petites cellules rondes. Dans le cas du CSM, elle permet de révéler l'expression de marqueurs cartilagineux tels que la **PS100** et **SOX9** (18). Ce dernier marqueur, correspondant à un facteur de transcription impliqué dans la chondrogenèse, a émergé au début des années 2000 comme un marqueur sensible pour le diagnostic du CSM (20). Sa spécificité (Sp) est cependant largement remise en cause dans différentes études récentes rapportant notamment une expression dans plusieurs autres sarcomes à cellules monotones tels que le synovialosarcome (SS) et le sarcome d'Ewing (8,21–23). Les données du profil d'expression immunohistochimique du CSM sont cependant
limitées. L'expression d'autres marqueurs tels qu'**EMA**, **CD99** qui est principalement utilisé pour le diagnostic du sarcome d'Ewing et des marqueurs musculaires tels que **Desmine**, **Myogénine** et **MYOD1** peut être retrouvée dans le CSM (24).

### C. Données moléculaires

Contrairement aux tumeurs malignes à cellules pléomorphes qui comportent des anomalies caryotypiques complexes, les tumeurs à cellules monotones comme le CSM sont basées sur une génomique simple telle que la présence d'un transcrit de fusion (TdF). Les TdF correspondent souvent à un mécanisme oncogénique activateur conférant à la cellule des avantages sélectifs et de prolifération.

Dans 75 à 90% des cas, les CSM présentent un TdF résultant de la fusion des gènes **HEY1** et **NCOA2** (25). Ce TdF **HEY1::NCOA2**, découvert par Wang *et al*. en 2012, est causé par une délétion interstitielle sur le bras long du chromosome 8, del(8)(q13.3q21.1) résultant de deux points de cassure double brin de l'ADN (Acide DésoxyriboNucléique) (Figure 2). Ce mécanisme de constitution, lié à une anomalie structurelle de l'ADN, correspond à un mécanisme de formation canonique du TdF (26-28). Ce TdF **HEY1::NCOA2**, absent dans les autres sous-types de chondrosarcome, est un argument majeur pour le diagnostic moléculaire de CSM (29).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 2** : Illustration du mécanisme de constitution canonique du TdF **HEY1::NCOA2** par une délétion interstitielle sur le bras long du chromosome 8 (source : El Beaino et al, 2018).</figcaption></figure>
Bien que la fusion *HEY1::NCOA2* soit considérée comme spécifique du CSM, elle n'est pas la seule qui ait été décrite dans cette entité. Un cas de CSM avec fusion entre les gènes *IRF2BP2* et *CDX1* a été rapporté, mais la physiopathologie de ce TdF est encore inconnue.

Des anomalies des gènes suppresseurs de tumeurs, tels que *TP53* et *Rb*, ont également été rapportées, avec une dérégulation de la voie de Rb (rétinoblastome) dans 70% des CSM (29,30). Contrairement aux chondrosarcomes conventionnels ou dédifférenciés, aucune mutation dans les gènes *IDH1* ou *IDH2* n'a été notée (29,31).

## 5. Pathogénèse

Les recherches sur le CSM s'accordent sur le fait qu'en dépit d'une architecture biphasique, il serait constitué d'un unique type cellulaire correspondant à un progéniteur chondroblastique. Ce dernier serait présent dans un état plus ou moins avancé dans la voie de la chondrogenèse, selon que l'on considère respectivement le contingent cartilagineux bien différencié ou à petites cellules (le progéniteur étant alors dans un état de blocage partiel de maturation) (15,28,32,33).

Du point de vue moléculaire, *HEY1* code pour un facteur de transcription répressif impliqué dans le développement musculosquelettique et *NCOA2* pour un coactivateur transcriptionnel. Le TdF *HEY1::NCOA2* agit comme un activateur transcriptionnel qui up-régule les cibles de *HEY1*, favorisant la prolifération des cellules progénitrices et régissant la différenciation des chondrocytes *via* SOX9 et RunX2 (28).

**SOX9** est un facteur de transcription clé dans la chondrogenèse. Il est nécessaire pour les étapes successives de formation et de maturation du cartilage. En maintenant SOX9 actif, *HEY1::NCOA2* assure la différenciation des cellules progénitrices en chondrocytes, tout en contribuant à la formation de matrice cartilagineuse (25,26,31).

*HEY1::NCOA2* interagit également avec **RunX2**, un autre facteur de transcription crucial pour la différenciation des cellules osseuses et cartilagineuses. Cette interaction serait particulièrement importante pour l'induction des chondrocytes pré-hypertrophiques et aurait un effet répressif sur la différenciation terminale des chondrocytes (28,34,35).

Un résumé de cette théorie physiopathologique est représenté dans la **Figure 3**.
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

**Figure 3** : Implication du transcrit HEY1::NCOA2 dans la physiopathologie du CSM.

HEY1::NCOA2 entraîne une augmentation de l'expression du gène HEY1, menant à une augmentation du nombre de cellules progénitrices ; l'activation de SOX9 favorisant la chondrogenèse ; et l'interaction avec RunX2 favorisant la formation de chondrocytes préhypertrophiques, mais empêchant les chondrocytes d'atteindre leur différenciation finale.

(Source : HEY1-NCOA2 expression modulates chondrogenic differentiation and induces mesenchymal chondrosarcoma in mice, JCI Insight 2023).

# 6. Modalités thérapeutiques

En raison de la rareté de cette tumeur, il n'existe pas de protocole clairement établi pour le traitement des CSM. Les outils thérapeutiques sont la chirugie, la chimiothérapie et la radiothérapie (RT) car le CSM est considéré comme plus chimio et radiosensible que les autres chondrosarcomes. Leur choix dépend du site de la tumeur, de son accessibilité et du caractère localisé ou non de la maladie (5,36).

Le traitement optimal des CSM localisés repose sur la **chirugie** avec des recommandations de marges larges. En effet, plusieurs études mettent en avant l'importance de marges chirurgicales négatives (> 0,5 cm) pour réduire le taux de récidive locale et améliorer la survie globale (4,8,37).

La **chimiothérapie adjuvante** et/ou **néoadjuvante** est souvent recommandée avec des protocoles similaires à ceux utilisés dans le sarcome d'Ewing. Ces derniers combinent généralement la doxorubicine et le cyclophosphamide (38).

La **RT** est recommandée comme traitement adjuvant dans les CSM lorsque les marges sont positives, dans les tumeurs non résécables ou à visée symptomatique chez les patients en situation palliative. Une dose relativement élevée de RT, supérieure à 60 Gy (60-72 Gy), est nécessaire pour obtenir un traitement radical. Dans les zones où l'application de fortes doses de
RT est difficile en raison d'organes à risque, des techniques modernes comme la RT conformationnelle avec modulation d'intensité, la radiochirurgie stéréotaxique comme le Gamma Knife ou la radiochirurgie robotique (Cyberknife) peuvent être envisagées (4).

## 7. Données d'évolution et de pronostic

Le CSM est une tumeur agressive avec des taux de survie à 5 ans et 10 ans estimés respectivement à 60% et 40%. La survie est influencée par la taille de la lésion, la présence de métastases lors du diagnostic initial, et dans une moindre mesure, par le site d'origine de la tumeur (3).

Des métastases peuvent survenir jusqu'à 20 ans après le diagnostic, soulignant l'intérêt d'une surveillance à long terme dans la prise en charge (3).

L'agressivité de cette tumeur rare et sa propension à toucher de jeunes patients soulignent l'importance d'un diagnostic précis afin d'obtenir une prise en charge précoce et adaptée.

# II. LES PRINCIPAUX DIAGNOSTICS DIFFERENTIELS HISTOLOGIQUES

## 1. Présentation clinico-histologique

Le diagnostic de CSM repose sur l'association très spécifique entre un contingent à petites cellules et des secteurs cartilagineux bien différenciés. Cependant, le diagnostic peut devenir difficile lorsque sur un échantillon biopsique, seule la composante sarcomateuse à petites cellules rondes est représentée. Cela pose alors le diagnostic différentiel des autres sarcomes à petites cellules rondes qui correspondent à de très nombreuses entités. Il s'agit de tumeurs malignes très agressives, pouvant affecter les os et les tissus mous, et touchant principalement les populations pédiatriques ainsi que les jeunes adultes.

En histologie, ces tumeurs se caractérisent souvent par des plages de cellules rondes à fusiformes, plus ou moins monotones, au rapport nucléo-cytoplasmique élevé, et d'allure indifférenciée.

Parmi les diagnostics différentiels figurent :

- Les sarcomes indifférenciés à petites cellules rondes, dont le chef de file est représenté par le **sarcome d'Ewing** (Figure 4A) et qui comprennent également les sarcomes
« Ewing-like » avec fusion du gène *EWSR1* à des gènes n’appartenant pas à la famille ETS (tels que *NFATC2* et *PATZ1*); les sarcomes avec altération de *BCOR* et les sarcomes avec réarrangement de *CIC*.

Ces sarcomes indifférenciés à petites cellules rondes affectent principalement les enfants ou les adultes jeunes, se localisent dans l'os ou les tissus mous, et sont caractérisés par une expression plus ou moins importante de CD99 ; de NKX2.2 pour les sarcomes d'Ewing et « Ewing like » ; de WT1 pour le sarcome *CIC* ; ou de BCOR dans les sarcomes *BCOR* (39–43).

- Le **rhabdomyosarcome** (RMS) (**Figure 4B**) qui correspond au sarcome pédiatrique le plus fréquent, affectant les parties molles notamment de la région tête et cou ou de la région génito-urinaire. Il est caractérisé par une expression des marqueurs musculaires tels que Desmine, Myogénine et MyoD1 (13,44–48).

- L'**ostéosarcome à petites cellules** (OSPC) qui est un sous-type histologique rare d'ostéosarcome, affectant préférentiellement les os longs « près du genou, loin du coude » (fémur distal, tibia proximal, humérus proximal). Histologiquement, la mise en évidence d'une ostéoformation maligne est un élément clé du diagnostic (**Figures 4C et 4D**). L'IHC est peu utile pour ce diagnostic, l'expression de SATB2 étant rapportée mais de manière inconstante (49).

- Le **SS**, touchant des adolescents ou des sujets plus âgés et survenant principalement dans les tissus mous profonds des membres. Il est caractérisé en histologie par une architecture monophasique (**Figure 4E**) ou biphasique à partir de cellules monotones fusiformes ou épithélioïdes. En IHC, les SS expriment l'EMA, la CKAe1/Ae3, la PS100, ainsi que l'anticorps SS18-SSX, spécifique de cette entité, témoignant de la fusion caractéristique entre les gènes *SS18* et *SSX* (50).

- La **tumeur desmoplasique à petites cellules rondes** (TDPCR), de topographie surtout abdominale chez des sujets jeunes, caractérisée par un stroma desmoplasique assez caractéristique renfermant des nids de petites cellules rondes (**Figure 4F**) et par une fusion génique *EWRS1::WT1* (51). En IHC, les cellules tumorales sont positives pour la desmine, les cytokératines, EMA et WT1.

- La **leucémie aiguë/lymphome lymphoblastique** (LAL/LL), retrouvée chez les enfants et les adolescents et se manifestant par une infiltration médullaire de petites cellules rondes lymphoblastiques. L'atteinte extra-médullaire (système nerveux central, testicules, ganglions, foie, rate) est courante, constituant par définition le principal site d'atteinte des LL. Sur le plan immunohistochimique, le diagnostic différentiel avec les
sarcomes à cellules rondes est en général aisé grâce à l'utilisation de TdT, un marqueur hématopoïétique d'immaturité (52).

- La **tumeur rhabdoïde**, de location axiale thoracique, abdominale ou pelvienne et touchant presque exclusivement les jeunes enfants avec un âge moyen au diagnostic de 1 an. Le diagnostic repose surtout sur la perte d'expression d'INI1, codé par *SMARCB1* témoignant de l'inactivation de ce gène (47,53,54).

Le diagnostic différentiel du **chondrosarcome classique** (Figure 4G) se pose moins car celui-ci touche essentiellement les os plats des sujets âgés ou certains patients atteints d'enchondromatose (16,55). Néanmoins, il serait au premier plan en cas de prélèvement biopsique n'ayant intéressé que le contingent cartilagineux bien différencié du CSM.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 4** : Illustration des principaux diagnostics différentiels histologiques du CSM. (A) : Sarcome d'Ewing ; (B) : Rhabdomyosarcome ; (C et D) : Ostéosarcome à petite cellules rondes avec (C) et sans (D) ostéoformation maligne ; (E) : Synovialosarcome monophasique avec vascularisation hémangiopéricytaire ; (F) : TDPCR ; (G) : Chondrosarcome avec secteur bien différencié de grade 1 à gauche et de grade 2 à droite.</figcaption></figure>
## 2. Panel immunohistochimique recommandé

Face à une tumeur à petites cellules rondes, un panel immunohistochimique de base est recommandé par le RRePS (Réseau de Référence en Pathologie des Sarcomes) afin d'orienter le diagnostic.

Ce panel comprend en première intention :

- CD45 (marqueur lymphoïde)

- Desmine, myogénine (marqueurs musculaires)

- AE1/AE3 ; EMA (marqueurs épithéliaux)

- PS100

- CD99

- INI1

Il peut être élargi selon les circonstances à :

- NKX2.2

- WT1

- BCOR

- MyoD1

- SATB2

- SS18

- TdT

- SOX10
# OBJECTIFS DE L'ETUDE

Le CSM est une tumeur rare dont les aspects cliniques et d'imagerie ne sont pas spécifiques. Le diagnostic histologique peut être complexe lorsqu'il ne repose que sur la présence du contingent d'allure indifférencié à petites cellules rondes sans secteur cartilagineux bien différencié.

Les outils immunohistochimiques pour son diagnostic sont limités car les données du profil d'expression immunohistochimique du CSM sont peu nombreuses. Les données de la littérature à propos de l'expression des marqueurs cartilagineux sont de plus contradictoires. En effet, les performances diagnostiques de SOX9 sont très variables selon les études avec, dans certaines publications, une Sp proche de 100 % alors que dans d'autres, l'expression de SOX9 a été rapportée jusque dans 90 % des diagnostics différentiels tels que le SS et le sarcome d'Ewing (21,22). L'expression d'autres marqueurs a été testée pour tenter de mieux discriminer le CSM parmi l'ensemble des diagnostics différentiels, tels que la **β-caténine** notamment impliquée dans la voie de signalisation Wnt régulant la chondrogenèse et la **p65** qui est un effecteur de cette voie (56). D'autres marqueurs, couramment utilisés comme outils diagnostiques dans des tumeurs variées, comme **NKX3.1** dans la prostate et **OLIG2** dans les gliomes, ont été décrits comme exprimés dans le CSM sans que les mécanismes physiopathologiques ne soient clairement établis (57-59). Cependant, le nombre de CSM testés est limité en raison de la rareté de cette tumeur et il ne semble pas exister de marqueur aux performances diagnostiques suffisantes.

Afin de trouver des outils immunohistochimiques facilitant le diagnostic histologique du CSM et d'orienter au mieux les études moléculaires à la recherche des TdF diagnostiques, nous nous sommes fixés deux objectifs :

**L'objectif principal** étant de constituer une cohorte de ce type tumoral rare afin d'en détailler les caractéristiques épidémiologiques, morphologiques, immunohistochimiques, moléculaires et pronostiques.

**L'objectif secondaire** étant d'établir un profil d'expression immunohistochimique du CSM vis-à-vis des marqueurs communément utilisés dans le diagnostic des tumeurs à petites cellules rondes et de tester les performances diagnostiques de nouveaux anticorps en se basant notamment sur la physiopathologie du CSM et sur les données disponibles dans la littérature.
# MATERIEL ET METHODES

## I. CRITERES D'INCLUSION DES PATIENTS

Il s'agit d'une étude réalisée de façon rétrospective et bicentrique dans les Centres Hospitaliers Universitaires (CHU) de Lille et d'Amiens.

Tous les cas correspondant aux CSM diagnostiqués entre le 1er janvier 2004 et le 1er septembre 2024 ont été recensés en interrogeant la base de données du logiciel métier « Diamic » des services d'ACP des CHU de Lille et d'Amiens en utilisant le code ADICAP (Association pour le Développement de l'Informatique en Cytologie et en Anatomie Pathologique) spécifique aux CSM (C7A7) et le code générique des sarcomes (X7K0).

Toutes les lames des CSM ont été revues sur le plan histologique et les données moléculaires ont été collectées lorsqu'elles étaient disponibles.

Pour chacun des cas inclus dans l'étude, des données cliniques et d'imagerie ont été extraites par l'intermédiaire des logiciels de gestion des dossiers médicaux de patients (Sillage à Lille, et DxCare à Amiens).

Des témoins correspondants aux principaux diagnostics différentiels histologiques ont été recherchés, par code ADICAP (sarcome d'Ewing : X7L0 ; RMS : R7C0 ; SS : S7R0 ; TDPCR : X7P9 ; chondrosarcome conventionnel : C7A0 ; tumeur rhabdoïde : X7R8) ou par mots clés dans les comptes-rendus lorsqu'il n'y avait pas de code ADICAP dédié (OSPC ; sarcomes avec réarrangement des gènes *NFATC2*, *BCOR* et *CIC*). Nous nous étions fixé comme objectif d'obtenir trois échantillons tumoraux pour chaque catégorie diagnostique.

Les lames correspondantes ont été revues sur le plan histologique et les données moléculaires ont été collectées.

## II. OBLIGATIONS LEGALES

L'étude a fait l'objet d'une déclaration auprès du représentant de la Commission Nationale de l'Informatique et des Libertés au CHU de Lille (déclaration réalisée le 26 avril 2024, n° de dossier DEC24-102).
### III. ANALYSES MOLECULAIRES A VISEE DE CONFIRMATION DIAGNOSTIQUE

Pour les cas de CSM qui n'avaient pas bénéficié d'une analyse moléculaire au moment du diagnostic ou dont l'analyse était négative ou non contributive, une étude moléculaire a été effectuée dans le service d'Oncobiologie Moléculaire du CHU de Lille, afin de valider le diagnostic de CSM.

Lorsque pour un patient, nous disposions de la tumeur primitive, des récidives et des métastases, la tumeur primitive était privilégiée sauf pour les tumeurs datant d'avant 2020, où l'échantillon tumoral le plus récent était utilisé afin de réserver pour l'analyse les tumeurs avec les acides nucléiques les moins dégradés.

Pour rechercher le TdF, nous avons utilisé la technique de whole RNA-seq (séquençage total de l'ARN), en cours de déploiement au CHU de Lille. Quand celle-ci était négative ou non contributive, nous avons eu recours à la méthode de séquençage ciblé ARCHER, utilisée en routine diagnostique. Lorsque ces deux techniques étaient négatives ou non contributives, une étude du profil de méthylation de l'ADN était réalisée.

#### 1. Whole RNA sequencing

A partir du bloc FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) le plus représentatif de la tumeur de chaque patient, des copeaux de 10 µm ont été réalisés. Les ARN (Acide RiboNucléique) totaux ont été extraits à l'aide du kit QIA AMP DNA FFPE (QIAGEN) puis qualifiés avec l'automate TapeStation 4200 et convertis en ADN complémentaire (ADNc).

L'étape de préparation de la librairie a été réalisée en utilisant 200 ng d'ADNc de chaque échantillon tumoral auquel a été ajouté un mélange de sondes spécifiques de toutes les régions exoniques d'intérêt couplées à des billes magnétiques (méthode d'enrichissement par capture). Cette étape a été réalisée sur l'automate Agilent Magnis NGS Prep System en utilisant les kits Agilent RNA Exome V8. Les fragments d'ADNc non hybridés (contenant les séquences introniques et intergéniques) ont été lavés et éliminés. La solution d'ADNc obtenue à l'issue de la capture pour chaque patient a été déposée sur une flowcell P2 pour la réalisation du séquençage avec la technologie Illumina®, basée sur une amplification en pont (bridge PCR), sur l'automate NextSeq1000.
Après alignement des séquences ainsi obtenues par rapport à un génome de référence, toutes les fusions géniques contenues dans les échantillons ont pu être identifiées. Leur visualisation a été permise par le logiciel Arriba-visualization.

## 2. RNA sequencing ciblé par technique ARCHER

La technique a été réalisée à partir de copeaux de blocs FFPE représentatifs de chaque tumeur. Les ARN totaux ont été extraits, puis dosés avec le système de quantification fluorométrique Qubit Flex.

Une quantité minimale de 250 ng d'ARN total a été convertie en ADNc. Cet ADNc a ensuite été soumis à une réparation des extrémités (étape n'existant pas en whole RNA sequencing), à l'ajout d'une queue poly-A, puis à la ligature d'adaptateurs universels.

L'ADNc a ensuite été amplifié par deux étapes successives de PCR basées sur le principe de la PCR ancrée ou Anchored PCR. Ce concept utilise une seule amorce spécifique à la cible d'intérêt (ici, le gène driver), tandis que la deuxième amorce se fixe sur la région commune issue de l'étape de ligature précédente (adaptateur universel), ce qui permet d'identifier les TdF dont au moins un des deux partenaires est ciblé par l'amorce spécifique.

Les échantillons de chaque patient ainsi obtenus ont été qualifiés par qPCR TaqMan et mis en concentration équimolaire pour constitution de la librairie.

Ils ont été déposés sur une puce Ion 540 et séquencés par la méthode Ion torrent® (basée sur une amplification en microbilles) sur un séquenceur Ion S5XL.

Les données brutes ont été traitées et analysées à l'aide du logiciel ArcherDx.

## 3. Étude du profil de méthylation de l'ADN

L'étude du profil de méthylation de l'ADN, véritable carte d'identité moléculaire de la tumeur, a été réalisée en dernier recours. Elle repose sur une étape d'extraction de l'ADN, suivie d'une conversion au bisulfite utilisant le kit EZDNA Methylation Gold (Zymo Research, USA). Il s'agit d'une étape clé permettant de distinguer les cytosines (C) non méthylées transformées en uraciles (U), des C méthylées restées des C.

L'ADN double brin était ensuite dénaturé, amplifié et hybridé sur une puce Infinium II Methylation EPIC (850k) d'Illumina®, permettant l'étude du statut méthylé ou non méthylé de 850 000 sites d'intérêt répartis sur l'ensemble du génome.
Un dispositif iScan d'Illumina® permettait de lire le type et l'intensité de la fluorescence à chaque position du génome (un signal vert associé à la guanine indiquait une C méthylée, tandis qu'un signal rouge associé à l'adénine indiquait une C non méthylée devenue une U).

Les données de fluorescence de chaque patient étaient ensuite converties en données brutes sous forme d'un fichier IDAT vert (sites méthylés) et IDAT rouge (sites non méthylés) qui ont été téléchargés sur la plateforme *molecularneuropathology.org* afin d'être comparés au profil de méthylation d'une cohorte de sarcomes de référence. Grâce à l'utilisation d'un algorithme de classification (*sarcoma classifier* ; version 12.3), un score de probabilité de 0 à 1 a été attribué à chaque classe diagnostique pour chaque échantillon. Un score supérieur à 0,9 pour les échantillons permettait de les classer.

# IV. ÉTUDE IMMUNOHISTOCHIMIQUE

## 1. Réalisation de Tissue-Micro-Arrays

Dans un premier temps, nous avons eu recours à la méthode des Tissue-Micro-Arrays (TMA) pour étudier sur l'ensemble des cas et des témoins, d'une part l'expression des marqueurs recommandés par le RRePS et, d'autre part l'expression de potentiels marqueurs diagnostiques du CSM sélectionnés en fonction d'éléments physiopathologiques et de recherches bibliographiques.

Dans le bloc FFPE le plus représentatif de la tumeur du patient, en privilégiant quand plusieurs échantillons tumoraux étaient disponibles, la tumeur ayant reçu le moins de traitement néoadjuvant/adjuvant et la plus récente, nous avons prélevé, dans les zones d'intérêt repérées sur lames HES (Hématoxyline-Éosine-Safran), des carottes de 0,6 mm de diamètre grâce à un tissue arrayer semi-automatique (MiniCore 2, Excilone, France).

Les carottes paraffinées récupérées pour les cas ont été fondues et reformées sous forme d'un « bloc TMA cas » selon un plan préétabli permettant de relier chaque pastille tumorale au cas dont elle est issue. Pour chaque cas, nous avons prélevé deux carottes en contingent à petites cellules rondes et une en secteur cartilagineux bien différencié (Figure 5).

De la même façon, les carottes paraffinées récupérées pour les témoins ont été fondues puis reformées sous forme d'un « bloc TMA témoin » selon un plan de bloc préétabli. Pour chaque témoin, deux carottes ont été prélevées.

Une lame colorée par l'HES a été réalisée à partir de chaque bloc de TMA afin d'évaluer la qualité des carottes obtenues.
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Figure 5** : Principe de constitution d'un bloc TMA à partir de carottes tissulaires prélevées dans un bloc FFPE. **A gauche** : Illustration d'une lame HES correspondant à un CSM pour lequel deux spots sur des secteurs indifférenciés (en rouge) et un spot en secteur cartilagineux (en noir) ont été marqués, puis repérés sur le bloc de paraffine correspondant. **Au milieu** : Réalisation d'un punch tissulaire d'un bloc FFPE récupéré pour constituer un bloc TMA (source : Marie Alice Poul, Institut de recherche en cancérologie, Montpellier). **A droite** : Illustration d'un bloc TMA ainsi obtenu.

## 2. Étude immunohistochimique sur Tissue-Micro-Arrays

A partir de chaque bloc (TMA cas et TMA témoin), 25 coupes de 4 µm ont été effectuées pour appliquer d'une part les immunomarquages recommandés par le RRePS pour les tumeurs à petites cellules rondes (CD99, BCOR, CKAe1/Ae3, EMA, PS100, desmine, myogénine, MyoD1, INI1, SATB2, SS18-SSX et TdT) et d'autre part de potentiels marqueurs diagnostiques sélectionnés en fonction d'éléments physiopathologiques et de recherches bibliographiques sur le CSM (B-caténine, p65, SOX9, SOX10, GRM1, OLIG2, RB, TP53, NKX3.1, NKX2.2, RunX2, H3K27me3 et STAT6).

L'ensemble des techniques immunohistochimiques a été réalisé sur un automate BenchMark Ultra® (Ventana Medical Systems, USA). Les étapes successives de l'IHC correspondaient dans un premier temps au déparaffinage (EZ prep), à une réhydratation, puis au blocage des peroxydases endogènes par ajout d'H₂O₂ pendant 4 minutes.

L'étape de pré-traitement ensuite réalisée pour hydrolyser les liaisons covalentes formées par le formol et faciliter le démasquage antigénique, était dépendante des anticorps utilisés (voir **Tableau 1**). Il pouvait s'agir d'un pré-traitement à la chaleur et/ou par digestion protéique.

Le démasquage antigénique grâce à la chaleur a été réalisé à l'aide d'un tampon de type Tris à un pH 8,4 (Cell Conditioning solution 1, CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) à une température de 100°C ou à l'aide d'un tampon de type Citrate à un pH 6 (Cell Conditioning Solution 2, CC2, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) à une température de 91°C.
La *digestion enzymatique* s'est faite par l'ajout d'une protéase de type Ficine (protease 3, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) à une concentration de 0.24 µg/ml à 37°C.

Par la suite, l'incubation des différents anticorps primaires a été faite à une température de 37°C pendant 20 à 60 minutes (**Tableau 1**).

La révélation du complexe anticorps-antigène, après lavage, a été faite de façon indirecte à l'aide du kit UltraView Universal DAB Detection (Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) en associant un anticorps anti-Ig de lapin/souris à un multimère marqué par la peroxydase de Raifort pour amplifier le signal. L'anticorps secondaire était appliqué 8 minutes à une température de 37°C. Après lavage, la diaminobenzidine était ajoutée comme substrat chromogène, permettant alors la mise en évidence de la formation du complexe anticorps-antigène par une couleur brune, grâce à la réaction enzymatique par la peroxydase de Raifort. Dans un dernier temps, une contre-coloration par l'hématoxyline a été réalisée, puis les lames ont été rincées et une post-contre-coloration au bluing reagent (solution aqueuse de carbonate de lithium tamponné) a été effectuée. Les coupes de tissus ont enfin été rincées, déshydratées puis montées entre lame et lamelle.

Les résultats obtenus avec les anticorps qui paraissaient les moins discriminants ont été classés en quatre catégories de répartition de marquage (aucun ; rare ; hétérogène ; homogène) et en trois catégories d'intensité de marquage (faible ; modéré ; fort).

Les résultats obtenus avec les anticorps paraissant les plus discriminants ont été classés de façon semi-quantitative en quatre catégories (0% ; rares ; < 50% ; > 50%) et en trois catégories d'intensité de marquage (faible ; modéré ; fort).
<table><caption>Tableau 1 : Caractéristiques techniques des anticorps utilisés.</caption><thead><tr><th></th><th>ANTICORPS</th><th>FABRICANT</th><th>CLONE</th><th>DILUTION</th><th>HOTE</th><th>DÉMASQUAGE (minutes)</th><th>INCUBATION (minutes)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="10">Panel recommandé par le RRePS</td><td>CD99</td><td>Ventana Roche</td><td>O-13</td><td>Prédilué</td><td>Souris</td><td>CC1 (30)</td><td>32</td></tr><tr><td>BCOR</td><td>Santa Cruz</td><td>C-10</td><td>1/50</td><td>Souris</td><td>CC1 (60)</td><td>60</td></tr><tr><td>CKAe1/Ae3</td><td>Dako</td><td>AE1/AE3</td><td>1/100</td><td>Souris</td><td>CC1 (36)</td><td>20</td></tr><tr><td>EMA</td><td>Dako</td><td>E29</td><td>1/25</td><td>Souris</td><td>CC1 (32)</td><td>32</td></tr><tr><td>PS100</td><td>Zytomed/Diagomics</td><td>4C4.9</td><td>1/100</td><td>Souris</td><td>CC1 (8) + P3 (4)</td><td>28</td></tr><tr><td>Desmine</td><td>Dako</td><td>D33</td><td>1/50</td><td>Souris</td><td>CC1 (60)</td><td>20</td></tr><tr><td>Myogénine</td><td>Ventana - Cell Marque</td><td>F5D</td><td>Prédilué</td><td>Souris</td><td>CC1 (64)</td><td>32</td></tr><tr><td>MyoD1</td><td>Ventana - Cell Marque</td><td>EP212</td><td>Prédilué</td><td>Lapin</td><td>CC1 (64)</td><td>32</td></tr><tr><td>BAF47 (INI1)</td><td>Biosciences</td><td>25/BAF47</td><td>1/50</td><td>Souris</td><td>CC2 (60)</td><td>32</td></tr><tr><td>SATB2</td><td>Abcam</td><td>EPNCIR130B</td><td>1/200</td><td>Lapin</td><td>CC2 (44)</td><td>32</td></tr><tr><td rowspan="4">Panel à visée diagnostique pour le CSM</td><td>SS18-SSX</td><td>Cell Signaling</td><td>E9X9V</td><td>1/800</td><td>Lapin</td><td>CC1 (64)</td><td>32</td></tr><tr><td>TdT</td><td>Leica</td><td>SEN28</td><td>1/25</td><td>Souris</td><td>CC1 (90)</td><td>60</td></tr><tr><td>B-Caténine</td><td>Biosciences</td><td>14/Bcatenine</td><td>1/500</td><td>Souris</td><td>CC1 (32)</td><td>60</td></tr><tr><td>p65</td><td>Cell Signaling</td><td>D14E12</td><td>1/400</td><td>Lapin</td><td>CC1 (36)</td><td>32</td></tr><tr><td>SOX9</td><td>Bio SB</td><td>EP317</td><td>1/200</td><td>Lapin</td><td>CC1 (64)</td><td>32</td></tr><tr><td>SOX10</td><td>Cell Marque</td><td>EP268</td><td>1/150</td><td>Lapin</td><td>CC1 (36)</td><td>32</td></tr><tr><td>GRM1</td><td>Invitrogen</td><td>JM11-61</td><td>1/250</td><td>Lapin</td><td>CC2 (44)</td><td>60</td></tr><tr><td>OLIG2</td><td>Epitomics</td><td>EP112</td><td>1/1000</td><td>Lapin</td><td>CC1 (30)</td><td>32</td></tr><tr><td>RB</td><td>Cell Signaling</td><td>4H1</td><td>1/1600</td><td>Souris</td><td>CC1 (36)</td><td>32</td></tr><tr><td>p53</td><td>Dako</td><td>DO-7</td><td>1/100</td><td>Souris</td><td>CC1 (60)</td><td>32</td></tr><tr><td>NKX3.1</td><td>Biocare</td><td>poly</td><td>Prédilué</td><td>Lapin</td><td>CC2 (68)</td><td>32</td></tr><tr><td>NKX2.2</td><td>Abcam</td><td>EPR14334</td><td>1/1000</td><td>Lapin</td><td>CC1 (64)</td><td>16</td></tr><tr><td>RunX2</td><td>Bio SB</td><td>EP336</td><td>1/50</td><td>Lapin</td><td>CC1 (64)</td><td>32</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>poly</td><td>1/750</td><td>Lapin</td><td>CC1 (60)</td><td>32</td></tr><tr><td>STAT6</td><td>Abcam</td><td>YE361</td><td>1/100</td><td>Lapin</td><td>CC1 (60)</td><td>32</td></tr></tbody></table>

### 3. Étude immunohistochimique sur lame entière

Les anticorps qui semblaient les plus discriminants pour le diagnostic de CSM après analyse des résultats obtenus sur TMA ont fait l'objet d'une seconde analyse sur lame entière de cas et de témoins afin de mieux apprécier la répartition du marquage et son intensité.

Les résultats obtenus pour ces anticorps ont été classés de façon semi-quantitative en quatre catégories de répartition de marquage (0%; rares ; < 50%; > 50%) et en trois catégories d'intensité de marquage (faible ; modéré ; fort).
# RESULTATS

## I. CARACTERISTIQUES DES PATIENTS

### 1. Présentation de la cohorte de cas

#### A. Caractéristiques cliniques, d'imagerie, de traitement et d'évolution

Les caractéristiques cliniques de l'ensemble des cas sont présentées dans le **Tableau 2**.

La cohorte de 14 CSM se composait de 8 hommes (57%) et 6 femmes (43%) (**sex-ratio homme/femme de 1,3**). L'âge des patients au moment du diagnostic était compris entre 5 et 67 ans, avec un âge moyen de 31 ans. L'âge médian était de 30 ans et l'écart-type de 17 ans. La **localisation de la tumeur primitive** était squelettique dans 8 cas (57%) et extra-squelettique dans les 6 autres (43%).

Parmi les **CSM squelettiques**, 5 siégeaient dans les os de la face et du crâne (36%) (mandibule n=2, ethmoïde n=2 et maxillaire n=1), et les autres dans la fibula (7%) ; une vertèbre (7%) et une côte (7%).

Parmi les **CSM extra-squelettiques**, 5 étaient dans les tissus mous (36%) (au niveau des membres inférieurs n=2, rétro-orbitaire n=1, cervical n=1 et thoracique n=1) et 1 cas était méningé (7%).

Les **symptômes** au moment du diagnostic correspondaient à la douleur en regard du site tumoral pour 10 patients (71%) ; un syndrome de masse pour 5 patients (36%) responsable d'une exophtalmie chez 2 patients et/ou de signes neurologiques tels qu'un déficit oculomoteur, une hypoacousie, une hyposmie, une compression médullaire. Une masse était palpable chez 3 patients (21%).

La **taille de la tumeur** au moment du diagnostic, disponible pour 12 des 14 patients, variait de 2,5 cm à 12 cm, avec une moyenne de 6,3 cm et une taille médiane de 5,8 cm.

A l'imagerie, des calcifications étaient notées dans 43% des cas. Les localisations squelettiques se manifestaient principalement sous forme de lésions intra-médullaires lytiques, avec infiltration des tissus mous adjacents.

Au moment du diagnostic, seul un patient présentait des **métastases** (7%).

Une **exérèse chirurgicale** a été réalisée pour 12 des 14 patients (86%). Parmi les deux patients qui n'en ont pas bénéficié, l'un était métastatique au moment du diagnostic et l'autre, dont le
diagnostic était très récent au moment de l'étude, était dans un projet de contrôle local de la
lésion avant un éventuel geste chirurgical.

Parmi les 12 patients opérés, l'exérèse était classée **R1** (marges macroscopiquement saines mais microscopiquement atteintes) chez 7 patients (58%) et **R0** (marges microscopiquement saines) chez 4 patients (33%). La qualité de l'exérèse n'était pas connue pour un patient (9%).

Parmi les 7 patients qui avaient été classés R1, 6 (86%) avaient bénéficié d'une RT adjuvante, couplée à une chimiothérapie néoadjuvante dans 1 cas et à une chimiothérapie adjuvante dans 1 autre cas.

Parmi les 4 patients qui avaient été classés R0, 2 avaient reçu une chimiothérapie néoadjuvante poursuivie après la chirurgie dans 1 cas et 1 avait reçu de la RT.

Le statut à 5 ans du diagnostic était disponible pour 12 des 14 patients. Parmi eux, 4 étaient décédés (33%) dont 3 (75%) avaient présenté des métastases au cours du suivi. Sur les 8 patients vivants à 5 ans (66%), 3 avaient présenté une **récidive locale** (37,5%) dont 1 avec des métastases ; 2 autres patients étaient **métastatiques** (25%) et 3 ne présentaient **pas d'évolution de la maladie** (37,5%). Parmi ces 3 patients, 2 avaient été classés R1 et traités par chimio ou RT adjuvante et le dernier était R0 traité par chirurgie seule.

Parmi les 8 patients sur 12 vivants au terme des 5 ans de suivi, 5 patients (62,5%) étaient encore vivants en 2024, leur durée totale du suivi post-traitement s'étendant entre 9 et 18 ans après le diagnostic.
<table><caption>**Tableau 2 : Caractéristiques cliniques des cas de CSM**</caption><thead><tr><th>Patient n°</th><th>Sexe</th><th>Age au diag (années)</th><th>Année du diag</th><th>Localisation tumeur primitive</th><th>Localisation précise</th><th>Présentation clinique Symptomes</th><th>Taille de la tumeur (cm)</th><th>Métastase au diag</th><th>Chimiothérapie néoadjuvante</th><th>Qualité de l'extrése chirugicale</th><th>Chimiothérapie adjuvante</th><th>Radiothérapie adjuvante</th><th>Statut à 5 ans du diagnostic</th><th>Récidive locale à 5 ans</th><th>Métastases à 5 ans</th><th>Statut en 2024</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>F</td><td>24</td><td>2008</td><td>Extra-squelettique</td><td>Intra-cranien (méningé : faux du cerveau)</td><td>Céphalées inhabituelles</td><td>4,3</td><td>-</td><td>-</td><td>R1 (multifragmentée)</td><td>-</td><td>Oui (55 gray)</td><td>Vivant (en 2013)</td><td>Oui</td><td>-</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>2</td><td>H</td><td>5</td><td>2016</td><td>Extra-squelettique</td><td>Tissus mous (néro-orbitaire droit)</td><td>Sd de masse (exoplasmie, diplopie)</td><td>2,5</td><td>-</td><td>Oui 6 cycles (VIDE)</td><td>R0</td><td>Oui 8 cycles (VINC-DAC-CYC)</td><td>-</td><td>Décédé (en 2021 parAVP)</td><td>-</td><td>-</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>3</td><td>H</td><td>32</td><td>2015</td><td>Extra-squelettique</td><td>Tissus mous (jambe)</td><td>Douleur Tumefaction palpable</td><td>7,5</td><td>-</td><td>-</td><td>R0</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Décédé (en 2020)</td><td>-</td><td>Oui (vertébrale)</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>4</td><td>F</td><td>30</td><td>2015</td><td>Extra-squelettique</td><td>Tissus mous (5ème espace intercostal/plèvre)</td><td>Douleur thoracique (hemothorax)</td><td>4,5</td><td>-</td><td>-</td><td>R0</td><td>-</td><td>-</td><td>Vivant (en 2020)</td><td>-</td><td>-</td><td>Vivant (9 ans ap le diag)</td></tr><tr><td>5</td><td>F</td><td>30</td><td>2011</td><td>Squelettique</td><td>Mandibule</td><td>Douleur</td><td>9</td><td>-</td><td>-</td><td>R1</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Vivant (en 2016)</td><td>-</td><td>Oui (poumon)</td><td>Vivant (13 ans ap le diag)</td></tr><tr><td>6</td><td>F</td><td>31</td><td>2005</td><td>Squelettique</td><td>Vertèbre T9</td><td>Sd de masse (compression médullaire)</td><td>6</td><td>-</td><td>-</td><td>R1</td><td>Oui (DOX-IFOS-CIS)</td><td>Oui (55 gray)</td><td>Vivant (en 2010)</td><td>Oui</td><td>Oui (poumon)</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>7</td><td>H</td><td>15</td><td>2006</td><td>Squelettique</td><td>Fibula droite</td><td>Douleur</td><td>11</td><td>-</td><td>Oui (DOX-IFOS)</td><td>R0</td><td>-</td><td>-</td><td>Vivant (en 2011)</td><td>-</td><td>Oui (poumon)</td><td>Vivant (18 ans ap le diag)</td></tr><tr><td>8</td><td>F</td><td>67</td><td>2011</td><td>Extra-squelettique</td><td>Tissus mous (muscles cervicaux postérieurs)</td><td>Tumefaction palpable</td><td>3,5</td><td>-</td><td>-</td><td>R1</td><td>-</td><td>Oui (Cyber Knife)</td><td>Vivant (en 2016)</td><td>-</td><td>-</td><td>Vivant (13 ans ap le diag)</td></tr><tr><td>9</td><td>H</td><td>20</td><td>2005</td><td>Squelettique</td><td>Ethmoïde / fosses nasales</td><td>Céphalées Sd de masse (paralésie IV)</td><td>ND</td><td>-</td><td>-</td><td>R1</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Vivant (en 2010)</td><td>Oui</td><td>-</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>10</td><td>H</td><td>59</td><td>2006</td><td>Extra-squelettique</td><td>Tissus mous (jambe)</td><td>Douleur</td><td>ND</td><td>-</td><td>-</td><td>ND</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Décédé (en 2011)</td><td>-</td><td>Oui (poumon)</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>11</td><td>H</td><td>42</td><td>2014</td><td>Squelettique</td><td>Sinus maxillaire droit</td><td>Douleur Sd de masse (hypoaccousie)</td><td>6</td><td>-</td><td>Oui (DOX-IFOS)</td><td>R1</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Décédé (en 2019)</td><td>-</td><td>Oui (poumon)</td><td>Décédé</td></tr><tr><td>12</td><td>H</td><td>13</td><td>2008</td><td>Squelettique</td><td>Mandibule</td><td>Douleurs Tumefaction palpable</td><td>3,6</td><td>-</td><td>-</td><td>R1</td><td>Oui</td><td>ND</td><td>Vivant (en 2013)</td><td>-</td><td>-</td><td>Vivant (16 ans ap le diag)</td></tr><tr><td>13</td><td>F</td><td>24</td><td>juin 2024</td><td>Squelettique</td><td>Ethmoïde / fosses nasales</td><td>Sd de masse (hyposmie, épistaxis, exoplasmie)</td><td>5,6</td><td>-</td><td>NA</td><td>NR</td><td>Oui (pour contrôle local ?)</td><td>Oui (pour contrôle local ?)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Vivant</td></tr><tr><td>14</td><td>H</td><td>47</td><td>janvier 2024</td><td>Squelettique</td><td>6ème côte</td><td>Douleurs</td><td>12</td><td>Oui (multiples)</td><td>NA</td><td>NR</td><td>Oui (DOX-IFOS)</td><td>-</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Vivant</td></tr></tbody></table>

Légende : DOX = Doxorubicine ; CIS = Cisplastine ; IFOS = Ifosfamide ; CYC = cyclophosphamide ; VINC = vincristine ; DAC = dactinomycine ; ETO = étoposide ; VIDE = Vincristine, Ifosfamide, Doxorubicine, étoposide / Sd = syndrome ; Diag = diagnostic ; ap = après NA = non applicable / NR = non réalisé / ND = données non disponibles

<table><thead><tr><th>RESULTATS</th><th>Sexe :</th><th>Localisation :</th><th>Symptomes :</th><th>Métastases au diagnostic :</th><th>Chimiothérapie adjuvante</th><th>Statut 5 ans après le diagnostic</th><th>Récidive locale à 5 ans</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>Homme : 8 (57%)</td><td>- Os de face et base du crâne : 5 (62,5%)</td><td>- Douleur : 10/14 (71%)</td><td>- Non : 13/14 (93%)</td><td>- Non : 9/14 (64,3%)</td><td>Vivant : 8/12 (66,7%)</td><td>- Non : 9/12 (75%)</td></tr><tr><td></td><td>Femme : 6 (43%)</td><td>- Vertèbre : 1 (12,5%)</td><td>- Syndrome de masse : 5/14 (36%)</td><td>- Oui : 1/14 (7%)</td><td>- Oui : 5/14 (35,7%)</td><td>Décédé : 4/12 (33,3%)</td><td>- Oui : 3/12 (25%)</td></tr><tr><td></td><td>Sex ratio H/F = 1,3</td><td>- Côtes : 1 (12,5%)</td><td>- Tumefaction palpable : 3/14 (21%)</td><td>- Non : 9/12 (75%)</td><td>- Oui : 3/12 (25%)</td><td>NA : 2/14</td><td>- NA : 2/14</td></tr><tr><td></td><td>Age au diagnostic :</td><td>Extra-squelettique (43%) (n=6) :</td><td>Taille de la tumeur</td><td>Chimiothérapie néo-adjuvante :</td><td>Radiothérapie adjuvante</td><td>Statut en 2024</td><td>Métastases à 5 ans</td></tr><tr><td></td><td>Moyenne = 31,4 ans</td><td>- Tissus mous : 5 (83%)</td><td>- Moyenne : 6,3 cm</td><td>- Non : 4/14 (28,6%)</td><td>- ND : 1/14 (7,1%)</td><td>Vivant : 7/14 (50%)</td><td>- Oui : 6/12 (50%)</td></tr><tr><td></td><td>Médiane = 30 ans</td><td>Membre inférieur : 2</td><td>- Médiane : 5,8 cm</td><td>- ND : 1/14 (7,1%)</td><td>- ND : 1/14 (7,1%)</td><td>Décédé : 7/14 (50%)</td><td>- Non : 6/12 (50%)</td></tr><tr><td></td><td>Ecart-type = 17 ans</td><td>Rétro-orbitaire : 1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>- NA : 2/14</td></tr></tbody></table>
## B. Données histologiques

La présence des **deux contingents** à petites cellules rondes et cartilagineux a été observée dans 13 cas sur 14 (93%), seul un cas ne présentant pas de composante cartilagineuse (7%).

Le contingent prédominant était toujours celui à petites cellules rondes (14/14), formé de cellule monotones au noyau rond sans nucléole proéminent et au cytoplasme mal visible.

Le **contingent cartilagineux**, présent dans 13 cas sur 14 (93%), était toujours bien différencié (Figure 6A). Il se présentait sous forme de plages / lobules de chondrocytes dans 6 cas sur 13 (46%) ou bien sous forme de chondrocytes isolés et dispersés parmi les cellules rondes dans 1 cas (8%) (Figure 6 B). Dans les 6 autres cas (46%), ces deux configurations étaient présentes simultanément.

Une **vascularisation hémangiopéricytaire** était notée dans 13 cas sur 14 (93%) (Figure 6C).

L'**activité mitotique** était variable : faible dans 7 cas (50 %), modérée dans 2 cas (14%), et élevée dans 5 cas (36%).

De la **nécrose** était observée dans 6 cas (43%), et des **emboles vasculaires** étaient présents chez 6 patients (43%) (Figure 6D).
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 6** : Illustration des aspects histologiques de la cohorte de CSM.</figcaption></figure>

La composante cartilagineuse se présentait soit sous forme de lobules cartilagineux bien différenciés (A), soit sous forme de chondrocytes isolés au sein des cellules rondes (B). La vascularisation était souvent hémangiopéricytaire (C). Illustration d'un embole tumoral (D).
### C. Aspects moléculaires

Dans notre cohorte de 14 CSM, le TdF *HEY1::NCOA2* avait été détecté au moment du diagnostic chez 7 patients (50%). La recherche d'une preuve moléculaire du diagnostic a donc été réalisée pour les 7 autres (50%).

#### a. Résultats obtenus par whole RNA seq

Le whole RNA Seq a permis de mettre en évidence le TdF *HEY1::NCOA2* (Figure 7) chez 4 des 7 patients testés (57%). L'analyse était contributive mais négative pour 2 patients (29%) et non interprétable pour 1 patient (14%).

Le TdF *IRF2BP2::CDX1* n'a été retrouvé chez aucun des cas testés.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 7 :** Représentation par le logiciel Arriba-visualization du TdF *HEY1::NCOA2* mis en évidence chez un des 7 patients testés.</figcaption></figure>

Le TdF se forme par cassures dans l'exon 4 de *HEY1* et l'exon 14 de *NCOA2*, suivies de la fusion de la partie proximale 5' de *HEY1* (exons 1-4) avec la partie distale 3' de *NCOA2* (exons 14-23).

#### b. Résultats obtenus par séquençage ciblé ARCHER

Une seconde recherche de TdF par technique de séquençage ciblé ARCHER a été réalisée chez les 3 patients pour lesquels le whole RNA Seq était négatif ou non contributif.

*HEY1::NCOA2* était mis en évidence chez l'un des trois patients concernés (33%) (Figure 8).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 8 :** Visualisation de la présence du TdF *HEY1::NCOA2* par le logiciel ArcherDx.</figcaption></figure>
### c. Résultats obtenus par étude du profil de méthylation de l'ADN

L'étude du profil de méthylation de l'ADN a été réalisée pour les 2 patients sans preuve moléculaire obtenue malgré deux approches de séquençage de l'ARN.

Pour l'un des 2 patients, le résultat du méthylome était interprétable et permettait de le classer dans la catégorie des CSM avec un score supérieur à 0,9 confirmant le diagnostic (Figure 9).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 9** : Illustration du résultat obtenu sur la plateforme molecularneuropathology.org à l'aide de l'algorithme de classification spécifique aux sarcomes (sarcoma classifier ; version 12.3), permettant de classer avec certitude (score supérieur à 0,9) la tumeur du patient dans la catégorie des CSM.</figcaption></figure>

Pour ce patient, une nouvelle analyse par séquençage ciblé ARCHER a été entreprise à partir d'un autre échantillon tumoral. Elle a pu confirmer la présence du transcrit *HEY1::NCOA2*.

Pour l'autre patient, le méthylome n'était pas interprétable.

### D. Synthèse des données moléculaires

Au terme des différentes techniques de biologie moléculaire mises en œuvre, dont le résumé est présenté sur la **Figure 10**, le diagnostic de CSM était confirmé par la présence du Tdf *HEY1::NCOA2* chez 13 des 14 patients (93%).

De manière intéressante, un cas additionnel de CSM avait initialement été inclus sur la base de son code ADICAP. Il a finalement été reclassé en ostéosarcome de haut grade, à la suite de nos
études moléculaires. Il ne présentait aucun TdF, et son profil de méthylation le classait avec un score supérieur à 0,9 dans la catégorie des ostéosarcomes de haut grade (Figure 11). Les lames histologiques avaient été revues. Elles montraient une tumeur à petites cellules rondes mêlées à des ilots de cartilage avec un petit foyer d'ostéogenèse maligne, permettant de retenir avec certitude le diagnostic d'OSPC.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 10** : Résumé des étapes du processus de confirmation moléculaire des cas de notre cohorte de CSM.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 11** : Illustration du résultat obtenu sur la plateforme molecularneuropathology.org à l'aide de l'algorithme de classification spécifique aux sarcomes (sarcoma classifier ; version 12.3), permettant de reclasser avec certitude (score supérieur à 0,9) en ostéosarcome le patient initialement inclus comme 15ème CSM.</figcaption></figure>

## 2. Présentation de la cohorte de témoins

La cohorte de témoins comprenait 21 patients dont le résumé des caractéristiques cliniques est présenté dans le **Tableau 3**.

L'objectif de trois patients par catégorie tumorale a pu être respecté pour le sarcome d'Ewing, le RMS, le SS et le chondrosarcome conventionnel, correspondant aux catégories tumorales les plus fréquentes. Pour les diagnostics de sarcome *NFATC2*, de sarcome *BCOR*, d'OSPC et de TDPCR, seuls deux patients ont pu être obtenus, et pour le sarcome *CIC* un patient seulement a pu l'être en raison de la rareté de ces types tumoraux. Aucun cas de LAL/LL ni de tumeur rhabdoïde n'a été inclus en raison du faible nombre de ces tumeurs dans nos archives histologiques et de la nécessité de réserver une épargne tissulaire suffisante pour les patients dont le matériel tumoral était peu abondant.

Les témoins retenus avaient été diagnostiqués par un expert en pathologie tumorale osseuse et des tissus mous et avaient bénéficié de la mise en évidence de la preuve moléculaire lorsqu'elle
était disponible (TdF des sarcomes d'Ewing ; NFATC2 ; BCOR ; CIC ; SS et TDPCR) ou d'une confirmation par relecture dans un centre expert d'un type tumoral précis (RMS).

En dehors des patients atteints de chondrosarcomes conventionnels (témoins 19 à 21), par définition plus âgés (moyenne d'âge au diagnostic de 55 ans), l'âge moyen des témoins était de 24 ans, avec une médiane de 16 ans. La localisation primitive était osseuse dans 57% des cas (12/21), et dans les tissus mous dans 43% des cas (9/21).

<table><caption>**Tableau 3** : Résumé des caractéristiques de la cohorte de témoins.</caption><thead><tr><td>N°</td><td>Diagnostic</td><td>Sexe</td><td>Age au diagnostic</td><td>Localisation</td></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>OSPC</td><td>H</td><td>17</td><td>Côte</td></tr><tr><td>2</td><td>OSPC (Initialement inclus comme CSM puis reclassé)</td><td>F</td><td>15</td><td>Base du crâne</td></tr><tr><td>3</td><td>Sarcome CIC</td><td>H</td><td>40</td><td>Tissus mous main</td></tr><tr><td>4</td><td>RMS</td><td>H</td><td>5</td><td>Paroi abdominale</td></tr><tr><td>5</td><td>RMS</td><td>F</td><td>35</td><td>Ethmoïde</td></tr><tr><td>6</td><td>RMS</td><td>H</td><td>13</td><td>Prostate</td></tr><tr><td>7</td><td>Sarcome NFATC2</td><td>H</td><td>22</td><td>Fémur</td></tr><tr><td>8</td><td>Sarcome NFATC2</td><td>H</td><td>43</td><td>Fémur</td></tr><tr><td>9</td><td>Sarcome BCOR</td><td>H</td><td>20</td><td>Tibia</td></tr><tr><td>10</td><td>Sarcome BCOR</td><td>F</td><td>64</td><td>Utérus</td></tr><tr><td>11</td><td>TDPCR</td><td>F</td><td>18</td><td>Ovaire</td></tr><tr><td>12</td><td>TDPCR</td><td>F</td><td>13</td><td>Ovaire</td></tr><tr><td>13</td><td>Sarcome d'Ewing</td><td>H</td><td>9</td><td>Côte</td></tr><tr><td>14</td><td>Sarcome d'Ewing</td><td>F</td><td>12</td><td>Scapula</td></tr><tr><td>15</td><td>Sarcome d'Ewing</td><td>H</td><td>6</td><td>Para-vertébral</td></tr><tr><td>16</td><td>SS monophasique</td><td>F</td><td>73</td><td>Os cuboïde</td></tr><tr><td>17</td><td>SS biphasique</td><td>H</td><td>12</td><td>Tissus mous main</td></tr><tr><td>18</td><td>SS monophasique</td><td>H</td><td>13</td><td>Langue</td></tr><tr><td>19</td><td>Chondrosarcome conventionnel</td><td>H</td><td>50</td><td>Bassin</td></tr><tr><td>20</td><td>Chondrosarcome conventionnel</td><td>H</td><td>67</td><td>Sternum</td></tr><tr><td>21</td><td>Chondrosarcome conventionnel</td><td>H</td><td>49</td><td>Vertèbre</td></tr></tbody></table>
## II. RESULTATS IMMUNOHISTOCHIMIQUES OBTENUS SUR TISSUE-MICRO-ARRAYS

### 1. Résultats concernant les anticorps du panel recommandé par le Réseau de Référence en Pathologie des Sarcomes

#### A. Résultats pour les cas

Les résultats sont présentés dans le **Tableau 4**.

Une expression de CD99 était notée sur les cellules rondes dans 11 cas sur 14 (79%). Elle était considérée comme significative, c'est-à-dire avec un marquage homogène membranaire en cadre quelle que soit l'intensité, dans 6 cas sur 14 (43%) (Figure 12A).

L'expression de BCOR (considérée comme significative si d'intensité supérieure ou égale à celle du témoin) était retrouvée sur les cellules rondes dans 3 cas sur 14 (21%).

La PS100 était exprimée dans 12 cas sur 14 (86%), principalement par la composante cartilagineuse dans 11 cas (79%) selon une intensité et une répartition variables. Parmi les 12 cas, seuls 5 (36%) montraient une positivité sur les cellules rondes, sous forme d'un marquage faible de rares cellules (Figure 12B).

SATB2 était également exprimé dans 12 cas sur 14 (86%). 6 cas sur 12 montraient un marquage des cellules rondes et du cartilage ; 3 cas ne montraient qu'un marquage des cellules rondes et 3 cas ne montraient qu'un marquage du cartilage. La répartition et l'intensité de marquage étaient variables, ce dernier étant souvent plus fort et diffus dans la composante cartilagineuse (7 cas sur 12, soit 58%) (Figure 12C).

Une expression fréquente des marqueurs musculaires était observée sur les cellules rondes. La desmine était exprimée dans 8 cas sur 14 (57%), toujours sous la forme d'un marquage faible de rares cellules (Figure 12D). MyoD1 était positif dans 10 cas sur 14 (71%) sous forme d'un marquage faible de rares cellules dans 4 cas sur 10 et hétérogène modéré dans 6 cas sur 10 (Figure 12E). La myogénine était exprimée dans 1 cas sur 14 (7%) sous forme d'un marquage faible de rares cellules (Figure 12F). Ainsi, parmi les 14 CSM, 3 cas (21%) n'exprimaient aucun marqueur musculaire ; 4 cas (29%) en exprimaient 1 ; 6 cas (43%) en exprimaient 2 et 1 seul cas (7%) exprimait les 3. Il n'y avait jamais d'expression forte ou homogène de marqueur musculaire.

Aucun cas n'exprimait les marqueurs épithéliaux (EMA et CKAe1/Ae3).

Aucun cas ne montrait de perte d'expression d'IN11 ni d'expression de SS18-SSX ou TdT.
<table><caption>**Tableau 4 :** Résultats immunohistochimiques du panel recommandé par le RRePS obtenus sur les TMA des cas</caption><thead><tr><th rowspan="3">N°Patient</th><th colspan="11">Panel d'anticorps recommandé par le RRePS</th><th rowspan="3">Tdt</th></tr><tr><th rowspan="2">CD99</th><th rowspan="2">BCOR</th><th rowspan="2">CK AE1/AE3</th><th rowspan="2">EMA</th><th colspan="2">PS100</th><th rowspan="2">Desmine</th><th rowspan="2">Myogénine</th><th rowspan="2">MyoD1</th><th rowspan="2">INI1 (positif si perte d'expression)</th><th colspan="2">SATB2</th><th rowspan="2">SS18-SSX</th></tr><tr><th>Cellules rondes</th><th>Cartilage</th><th>Cellules rondes</th><th>Cartilage</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hom, F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>2</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>rares ; F</td><td>rares ; F</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>3</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>&lt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>4</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>5</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>6</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>hét ; F</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>7</td><td>hom ; m</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; f</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>8</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>9</td><td>hom ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>10</td><td>hom ; m</td><td>hét ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; m</td><td>hét ; F</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>11</td><td>hom ; m</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; F</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>12</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>NI</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>13</td><td>hom ; m</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>NA</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>NA</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>14</td><td>hom ; F</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>hom, F</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>hét ; m</td><td>pas de perte</td><td>rares ; m</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td></tr><tr><td>Règles d'interprétation</td><td>positif si hom en cadre</td><td>positif si intesité ≥ témoin</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Résultats</td><td>pos : 6/14<br/>nég : 8/14</td><td>pos : 3/14<br/>nég : 11/14</td><td>pos : 0/14<br/>nég : 14/14</td><td>pos : 0/14<br/>nég : 14/14</td><td>pos : 5/14<br/>nég : 9/14</td><td>pos : 11/14<br/>nég : 2/14<br/>NA : 1/14</td><td>pos : 8/14<br/>nég : 6/14</td><td>pos : 1/14<br/>nég : 13/14</td><td>pos : 10/14<br/>nég : 4/14</td><td>pos : 0/14<br/>nég : 13/14<br/>NI : 1/14</td><td>pos : 9/14<br/>nég : 5/14</td><td>pos : 9/14<br/>nég : 4/14<br/>NA : 1/14</td><td>pos : 0/14<br/>nég : 14/14</td><td>pos : 0/14<br/>nég : 14/14</td></tr><tr><td>Légende</td><td colspan="4">Marqueurs d'interet :<br/>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br/>Quantité de cellules marquées : % : 0 ; rare ; &lt; 50% ; &gt; 50%</td><td colspan="8">Autres marqueurs :<br/>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br/>Quantité de cellules marquées : aucune = - ; rares ; hétérogène = hét ; homogène =<br/>hom</td><td>NI = non interprétable<br/>NA = non applicable<br/>pos = positif<br/>nég = négatif</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 12** : Illustration des résultats des immunomarquages par les anticorps du panel du RRePS obtenus sur TMA pour les cas de CSM.</figcaption></figure>

(A) : Expression diffuse en cadre de CD99 ; (B) : Expression homogène et forte de la PS100 dans les chondrocytes mais très rares dans les cellules rondes (C) : Expression hétérogène d'intensité modérée de SATB2 ; (D) : Expression de la Desmine par de rares cellules ; (E) : Expression hétérogène d'intensité modérée de MyoD1. (F) : Expression de très rares cellules par la Myogénine.
## B. Résultats pour les témoins

Les résultats sont présentés dans le **Tableau 5**.

L'expression de CD99 était forte et homogène en cadre dans tous les sarcomes d'Ewing (3/3) (Figure 13A) et dans le sarcome CIC. Elle était homogène modérée en cadre dans 1 sarcome NFATC2 sur 2 ; dans les 2 sarcomes BCOR et dans 2 des 3 SS. Elle était homogène faible en cadre dans un OSPC sur 2.

L'expression de BCOR, au moins équivalente au témoin, était retrouvée dans les 2 sarcomes BCOR (Figure 13B) mais aussi dans 1 des 3 SS et dans 1 RMS sur 3.

L'expression de la PS100 était constante dans les chondrosarcomes conventionnels (3/3) (Figure 13C). Elle était hétérogène dans 1 OSPC et 1 SS.

L'expression de SATB2 était forte et diffuse pour 1 des 2 OSPC (Figure 13D) ; modérée et diffuse pour 1 des 2 sarcomes BCOR ; et modérée hétérogène dans les 3 RMS et 1 TDPCR sur 2.

Les marqueurs musculaires (Desmine, Myogénine et MyoD1) étaient diffus et homogènes dans les 3 RMS (Figure 13E). La desmine était exprimée de façon isolée dans les 2 TDPCR.

Les marqueurs épithéliaux (EMA et CKAe1/Ae3) étaient fortement exprimés dans les TDPCR. Ils l'étaient également dans 2 SS et seul l'EMA était exprimé dans le 3ème SS (Figure 13F). Au moins un des marqueurs épithéliaux était faiblement exprimé dans de rares cellules pour 1 RMS ; le sarcome CIC ; les 2 sarcomes NFATC2 et 1 sarcome BCOR.

SS18-SSX était exclusivement exprimé dans les 3 SS.

Aucune tumeur ne montrait de perte d'INI1 et aucune tumeur n'exprimait TdT.
<table><caption>**Tableau 5** : Résultats immunohistochimiques du panel recommandé par le RRePS obtenus sur les TMA des témoins</caption><thead><tr><th rowspan="2">Diagnostic</th><th rowspan="2">N°<br>patient</th><th colspan="10">Panel d'anticorps recommandé par le RRePS</th></tr><tr><th>CD99</th><th>BCOR</th><th>CKAE1/AE3</th><th>EMA</th><th>PS100</th><th>Desmine</th><th>Myogénine</th><th>INII<br>(pos si perte d'expression)</th><th>SATB2</th><th>SS18-SSX</th><th>Tdt</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">OSPC de haut grade</td><td>1</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>2</td><td>hom ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>≥ 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Sarcome CIC</td><td>3</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">RMS</td><td>4</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>hom ; F</td><td>hom ; F</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>5</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>hom ; F</td><td>hom ; F</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hom ; m</td><td>hom ; F</td><td>hom ; F</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">Sarcomes NFATC2</td><td>7</td><td>hom ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>8</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">Sarcomes BCOR</td><td>9</td><td>hom ; m</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>≥ 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>10</td><td>hom ; m</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">TDPCR</td><td>11</td><td>-</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>rares ; m</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>12</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; F</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">Sarcomes d'Ewing</td><td>13</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>14</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>15</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">SS</td><td>16</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td></tr><tr><td>17</td><td>hom ; m</td><td>hét ; m</td><td>hom ; F<br>(contingent ép)</td><td>hom ; F<br>(contingent ép)</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td></tr><tr><td>18</td><td>hom ; m</td><td>hét ; f</td><td>rares ; faible</td><td>hom ; F</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">Chondrosarcomes<br>conventionnels</td><td>19</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>20</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>21</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Règles<br>d'interprétation</td><td></td><td>positif si<br>hom en cadre</td><td>positif si<br>intensité ≥ témoin</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total</td><td></td><td>pos = 10/21<br>nég = 11/21</td><td>pos = 4/21<br>nég = 17/21</td><td>pos = 6/21<br>nég = 16/21</td><td>pos = 8/21<br>nég = 13/21</td><td>pos = 5/21<br>nég = 16/21</td><td>pos = 5/21<br>nég = 15/21</td><td>pos = 3/21<br>nég = 18/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 6/21<br>nég = 15/21</td><td>pos = 3/21<br>nég = 18/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th rowspan="2">Légende</th><th colspan="3">Marqueurs d'interet:</th><th colspan="3">Autres marqueurs:</th><th colspan="3">NI = non interprétable<br>NA = non applicable</th></tr><tr><th>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : % : 0 ; rare : &lt; 50% ; &gt; 50%</th><th>Quantité de cellules marquées : aucune = - ; rares ; hétérogène = hét ; homogène = hom</th><th>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : aucune = - ; rares ; hétérogène = hét ; homogène = hom</th><th>pos = positif</th><th>nég = négatif</th><th>ép = épithélial</th><th>pos = positif</th><th>nég = négatif</th><th>ép = épithélial</th></tr></thead></table>
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 13** : Illustration des résultats des immunomarquages par les anticorps du panel du RRePS obtenus sur TMA pour les témoins.</figcaption></figure>

(A) : Expression forte et diffuse de CD99 dans un sarcome d'Ewing ; (B) : Expression hétérogène modérée de BCOR dans un sarcome BCOR ; (C) : Expression de la PS100 dans un chondrosarcome conventionnel ; (D) : expression intense et diffuse de SATB2 dans un OSPC ; (E) : Expression intense et diffuse de la myogénine dans un RMS ; (F) : Expression intense et diffuse de CKAE1/AE3 dans un SS (à gauche) et une TDPCR (à droite).
## 2. Résultats concernant les anticorps à visée diagnostique pour le chondrosarcome mésenchymateux

### A. Résultats pour les cas

Les résultats sont présentés dans le **Tableau 6**.

**SOX9** était diffusément exprimé de façon constante dans tous les CSM (100%), de manière forte dans 13 cas (93%) (**Figure 14B**) et faible dans 1 cas (7%). Le marquage était identique entre la composante à petites cellules et la composante cartilagineuse.

**RunX2** était exprimé de façon diffuse dans tous les CSM (100%), avec une intensité forte dans 9 cas (64%) (**Figure 14C**), modérée dans 3 cas (22%) et faible dans 2 cas (14%). Là encore, le marquage était identique sur les 2 composantes tumorales.

**NKX2.2** était exprimé dans 12 cas sur 14 (86%), de manière diffuse dans 7 cas avec une intensité modérée à forte ; ou hétérogène dans 5 cas selon une intensité faible à modérée (**Figure 14D**). Le marquage était moins intense sur la composante cartilagineuse.

Une perte d'expression supérieure ou égale à 50% de **RB** était retrouvée dans 12 des 13 cas (92%) (**Figure 14E**).

La **p53** montrait une positivité hétérogène des cellules rondes, modérée à forte dans 11 cas sur 14 (79%). Elle était exprimée par de rares cellules dans 2 cas et n'était pas interprétable dans 1 cas. Aucun cas ne montrait de positivité forte et diffuse.

**NKX3.1** montrait une positivité rare ou hétérogène des cellules rondes d'intensité faible dans 4 cas sur 14 (29%).

**OLIG2** était positif dans 5 cas sur 14 (36%), sous forme de rares cellules rondes faiblement marquées dans 4 cas ou d'un marquage hétérogène modéré dans 1 cas.

Il n'y avait aucune expression de **SOX10**, **GRM1**, **B-Caténine**, **p65**, **STAT6** et aucune perte d'expression de **H3K27me3** dans nos des cas de CSM.
<table><caption>**Tableau 6** : Résultats immunohistochimiques des anticorps à visée diagnostique du CSM obtenus sur les TMA des cas</caption><thead><tr><th rowspan="2">N°Patient</th><th colspan="11">Panel d'anticorps à visée diagnostique pour le CSM</th></tr><tr><th>B-caténine<br>(pos si nucléaire)</th><th>p65<br>(pos si nucléaire)</th><th>Sox9</th><th>Sox10</th><th>Olig2</th><th>GRM1</th><th>RB1</th><th>p53</th><th>NKX3.1</th><th>NKX2.2</th><th>RunX2</th><th>H3K27me3<br>(pos si perte d'expression)</th><th>STAT 6</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>&lt; 50%; f</td><td>&gt; 50%; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>2</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&lt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>3</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &lt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&lt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>4</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>hét ; f</td><td>&gt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>5</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&lt; 50%; f</td><td>&gt; 50%; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>6</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&lt; 50%; f</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>7</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte = 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&gt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>8</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>&gt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>9</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>10</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>perte = 50%</td><td>hét, m à F</td><td>hét ; f</td><td>&gt; 50%; F</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>11</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&gt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>12</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>NI</td><td>NI</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>13</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50%; m</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>14</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50%; F</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>perte &gt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>hét ; f</td><td>&gt; 50%; F</td><td>&gt; 50%; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>Règles<br>d'interprétation</td><td colspan="11">positif si perte<br>expression ≥ 50%</td></tr><tr><td>Résultats</td><td>pos : 0/14<br>nég : 14/14</td><td>pos : 0/14<br>nég : 14/14</td><td>pos : 14/14<br>nég : 0/14</td><td>pos : 0/14<br>nég : 14/14</td><td>pos : 5/14<br>nég : 9/14</td><td>pos : 0/14<br>nég : 14/14</td><td>pos : 12/14<br>nég : 1/14<br>NI : 1/14</td><td>positif si fort et<br>homogène</td><td>pos : 0/14<br>nég : 13/14<br>NI : 1/13</td><td>pos : 4/14<br>nég : 10/14</td><td>pos : 12/14<br>nég : 2/14</td><td>pos : 14/14<br>nég : 0/14</td><td>pos : 0/14<br>nég : 14/14</td><td>pos : 0/14<br>nég : 14/14</td></tr></tbody></table>

<table><tr><td rowspan="3">Légende</td><td colspan="4">Marqueurs d'interet:</td><td colspan="6">Autres marqueurs:</td></tr><tr><td colspan="4">Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : % : 0 ; rare ; &lt; 50% ; &gt; 50%</td><td colspan="6">Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : aucune = - ; rares ; hétérogène = hét ; homogène =<br>hom</td></tr><tr><td colspan="4">NI = non interprétable<br>NA = non applicable<br>pos = positif<br>nég = négatif</td><td colspan="6"></td></tr></table>
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 14** : Illustration des immunomarquages par les anticorps à visée diagnostique du CSM obtenus sur TMA pour le patient n°4. Grossissement x 200.</figcaption></figure>

A : lame HES ; B : Expression forte et diffuse de SOX9 ; C : Expression forte et diffuse de RunX2 ; D : Expression modérée de plus de 50% des cellules tumorales de NKX2.2 ; E : Perte d'expression de RB dans plus de 50% des cellules tumorales.
## B. Résultats pour les témoins

Les résultats sont présentés dans le **Tableau 7**.

**SOX9** était positif dans 15 cas sur 21 (71%), notamment de façon forte et diffuse dans 8 cas (les 3 chondrosarcomes conventionnels (**Figure 15A**), les 3 SS (**Figure 15B**), 1 sarcome *BCOR* sur 2, et 1 OSPC sur 2 (**Figure 15C**)). L'expression était hétérogène mais forte dans les 2 sarcomes *NFATC2* et modérée dans 2 des 3 RMS.

**RunX2** était positif pour 17 témoins sur 21 (81%), notamment fort et diffus dans 4 cas (1 OSPC, 1 RMS, 1 sarcome BCOR et 1 SS). En dehors de ces 4 cas, il s'agissait principalement d'un marquage faible de rares cellules.

**NKX2.2** était positif pour 8 témoins sur 21 (38%), fort et diffus dans 4 cas (3 sarcomes d'Ewing (**Figure 15D**), et 1 sarcome *BCOR* (**Figure 15E**)). Il était rare et faible dans les 2 sarcomes *NFATC2* et 2 des 3 SS.

Aucun témoin ne présentait de perte d'expression supérieure ou égale à 50% de **RB**. Une perte d'expression sur moins de 50% des cellules tumorales était retrouvée dans 2 cas sur 21 (10%), correspondant à 1 OSPC et 1 sarcome *NFATC2*.

L'expression de **p53** était forte et diffuse dans 1 des 2 OSPC (**Figure 15F**), et le sarcome *CIC* (2 cas sur 21, soit 10%).

Aucun témoin n'exprimait **NKX3.1**.

**OLIG2** marquait faiblement 2 des 3 RMS, soit 2 des 21 témoins (10%).

Aucun témoin n'exprimait **SOX10**, **GRM1**, **Bcaténine**, **p65** ni **STAT6**.

L'expression de **H3K27m3** n'était jamais totalement perdue mais était diminuée dans 4 cas sur 21 (19%) correspondant à 2 des 3 RMS, 1 des 3 SS et 1 des 2 sarcomes *NFATC2*.
<table><caption>**Tableau 7 : Résultats immunohistochimiques des anticorps à visée diagnostique du CSM obtenus sur les TMA des témoins.**</caption><thead><tr><th rowspan="2">Diagnostic</th><th rowspan="2">N°<br>patient</th><th colspan="11">Panel d'anticorps à visée diagnostique pour le CSM</th></tr><tr><th>B-caténine<br>(pos si nucleaire)</th><th>p65<br>(pos si nucleaire)</th><th>Sox9</th><th>Sox10</th><th>GRM1</th><th>Olig2</th><th>RB1</th><th>p53</th><th>NKX3.1</th><th>NKX2.2</th><th>RunX2</th><th>H3K27me3<br>(pos si porte<br>d'expression)</th><th>STAT 6</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">OSPC de haut grade</td><td>1</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &lt; 50%</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>2</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>Sarcome CIC</td><td>3</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">RMS</td><td>4</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>perte &lt; 50%</td><td>-</td></tr><tr><td>5</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; f</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>perte &lt; 50%</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">Sarcomes NFATC2</td><td>7</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>perte &lt; 50%</td><td>-</td></tr><tr><td>8</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>perte &lt; 50%</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">Sarcomes BCOR</td><td>9</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>10</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>rares ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>&lt; 50% ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">TDPCR</td><td>11</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>12</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">Sarcomes d'Ewing</td><td>13</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>14</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>15</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">SS</td><td>16</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>perte &lt; 50%</td><td>-</td></tr><tr><td>17</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>18</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>hét, m à F</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">Chondrosarcomes<br>conventionnels</td><td>19</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>20</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>21</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td></tr><tr><td>Règles<br>d'interprétation</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>positif si perte<br>expression ≥ 50%</td><td>positif si fort<br>et hom</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total</td><td></td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 15/21<br>nég = 6/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 2/21<br>nég = 19/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 2/21<br>nég = 19/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 8/21<br>nég = 13/21</td><td>pos = 17/21<br>nég = 4/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td><td>pos = 0/21<br>nég = 21/21</td></tr></tbody></table>

<table><tr><td rowspan="2">Légende</td><td>Marqueurs d'interêt:</td><td>Autres marqueurs:</td><td rowspan="2">NI = non interprétable<br>NA = non applicable<br>pos = positif<br>nég = négatif<br>ep = épithélial</td></tr><tr><td>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : % ; 0 ; &lt; 50% ; &gt; 50%</td><td>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : aucune ; - ; rares ; hétérogène = hét ; homogène = hom</td></tr></table>
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 15** : Illustration des résultats des immunomarquages à visée diagnostique du CSM obtenus sur les TMA des témoins.</figcaption></figure>

(A) : Expression de SOX9 par un chondrosarcome conventionnel ; (B) : Expression diffuse et intense de SOX9 par un SS ; (C) : Expression modérée à forte de plus de 50% des cellules tumorales de SOX9 dans un OSPC. (D) : Expression diffuse et intense de NKX2.2 dans un sarcome d'Ewing ; (E) : Expression diffuse modérée de NKX2.2 dans un sarcome BCOR ; (F) : Expression diffuse de p53 dans un OSPC.
### 3. Synthèse des résultats immunohistochimiques obtenus sur Tissue-Micro-Arrays

L'étude du profil d'expression immunohistochimique sur TMA des CSM a révélé une expression significative :

- Parmi les anticorps recommandés par le RRePS :

* Du CD99 (43% des CSM)

* De la PS100 (86%, cependant rare sur les cellules rondes (36%))

* De SATB2 (86%)

* Des marqueurs musculaires (au moins un marqueur exprimé dans 79% des cas)

* De BCOR dans quelques cas (21%)

- Parmi les anticorps recherchés à visée diagnostique du CSM :

* De SOX9 (100% des CSM)

* De RunX2 (100%)

* De NKX2.2 (86%)

* Et une perte de RB (92%)

Après analyse du profil d'expression immunohistochimique sur TMA des témoins, il existait une **expression fréquente de SOX9** (71% des témoins), **RunX2** (81%), **CD99** (48%) et une **expression moins fréquente de NKX2.2** (38%), **SATB2** (29%) et **PS100** (24%). **Aucune perte d'expression significative de RB** n'était notée.

Ainsi, parmi les 7 marqueurs exprimés par le CSM (CD99, PS100, SATB2, SOX9, RunX2, NKX2.2 et RB), aucun ne paraissait à la fois sensible et spécifique isolément.

Parmi ces marqueurs, nous n'avons pas retenu le CD99 car ses performances diagnostiques étaient insuffisantes : Se = 43% et Sp = 52%. Nous n'avons pas non plus retenu la PS100 bien que sa Se soit de 86% et sa Sp de 76% car elle ne marquait que rarement et faiblement le contingent à cellules rondes dans 36% des CSM.

Les performances diagnostiques obtenues sur TMA pour les 5 anticorps que nous avons retenus sont présentées dans le **Tableau 8**.
<table><caption>**Tableau 8 :** Performances diagnostiques des 5 anticorps sélectionnés après étude sur TMA</caption><thead><tr><th></th><th>RunX2</th><th>SOX9</th><th>NKX2.2</th><th>SATB2</th><th>RB</th></tr></thead><tbody><tr><th>CSM</th><td>14/14</td><td>14/14</td><td>12/14</td><td>12/14</td><td>12/13</td></tr><tr><th>Sensibilité (Se)</th><td>100%</td><td>100%</td><td>86%</td><td>86%</td><td>92%</td></tr><tr><th>Spécificité (Sp)</th><td>19%</td><td>29%</td><td>62%</td><td>71%</td><td>100%</td></tr></tbody></table>

Aucun marqueur ne présentant de Se et Sp suffisante pour diagnostiquer les CSM, nous avons couplé ces anticorps sous forme de panel. Le **Tableau 9** présente l'utilité de cette approche par panel immunohistochimique élargi.

<table><caption>**Tableau 9 :** Performances diagnostiques des différents panels immunohistochimiques pour le diagnostic de CSM sur TMA</caption><thead><tr><th>PANEL IMMUNOHISTOCHIMIQUE</th><th>SENSIBILITE<br>(Pour le diag de CSM)</th><th>SPECIFICITE<br>(Par rapport aux témoins)</th></tr></thead><tbody><tr><td>RunX2</td><td>100%</td><td>19%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9</td><td>100%</td><td>43%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2</td><td>86%</td><td>76%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2 ; SATB2</td><td>79%</td><td>95%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2 ; SATB2 ; RB1</td><td>77%</td><td>100%</td></tr></tbody></table>

A l'issue de cette étude sur TMA, nous avons analysé l'expression de ces 5 anticorps d'intérêt sur lame entière de cas et de témoins afin de vérifier si le marquage était homogène en dehors des zones initialement sélectionnées pour les TMA et de réévaluer les performances de notre panel.

Nous avons également étudié sur lame entière de CSM l'expression des autres marqueurs rapportés dans cette tumeur (CD99, PS100, desmine, myogénine, et myoD1), bien qu'ils ne soient pas diagnostiques, afin de valider les données de TMA.

### III. RESULTATS IMMUNOHISTOCHIMIQUES OBTENUS SUR LAME ENTIERE POUR LES MARQUEURS D'INTERET

#### 1. Résultats pour les cas

Les résultats sont présentés dans le **Tableau 10**.

Globalement, les résultats obtenus sur lame entière sont identiques à ceux observés sur TMA pour chaque anticorps.
L'expression de **SOX9** était diffuse et constante dans 100% des cas, forte dans 13 cas (93%) et faible dans 1 cas (7%).

L'expression de **Runx2** était diffuse dans 100% des cas, forte dans 11 cas (79%), modérée dans 1 cas (7%) et faible dans 2 cas (14%).

L'expression de **NKX2.2** était notée dans 12 cas sur 14 (86%), diffuse dans 11 cas et sous forme de rares cellules dans 1 cas.

**RB** indiquait une perte d'expression supérieure ou égale à 50% dans 13 cas sur 14 (93%).

**SATB2** était positif dans 12 cas sur 14 (86%). Dans 8 cas, il marquait les cellules rondes et le cartilage ; dans 3 cas il ne marquait que le cartilage ; et sur le dernier cas il ne marquait que les cellules rondes. L'expression était plus forte sur le cartilage.

L'expression aberrante des marqueurs musculaires était retrouvée dans des proportions sensiblement identiques à celles observées sur TMA. On ne notait pas d'expression de marqueur musculaire dans 4 cas sur 14 (29%) ; l'expression d'un marqueur dans 2 cas (14%) ; de deux marqueurs dans 5 cas (36%) et des trois marqueurs dans 3 cas sur 14 (21%).

Le **CD99** était positif dans 11 cas sur 14 (79%) avec une positivité significative dans 6 cas (43%).

La **PS100** était positive dans 13 cas sur 14 (93%), toujours hétérogène. Elle marquait principalement la composante cartilagineuse dans 12 des 13 cas parmi lesquels elle était présente (92%) sous forme de rares cellules. Sa positivité au sein du contingent à petites cellules rondes était moins fréquente (7 cas sur 14 soit 50%) limitée à de rares cellules marquées.
<table><caption>**Tableau 10** : Résultats immunohistochimiques incluant les marqueurs d'intérêt obtenus sur lame entière pour les cas de CSM</caption><thead><tr><th rowspan="3">N° de patient</th><th colspan="10">Panel d'anticorps recommandé par le RRePS</th><th colspan="4">Panel d'anticorps à visée diagnostique</th></tr><tr><th rowspan="2">CD99</th><th colspan="2">S100</th><th rowspan="2">Desmine</th><th rowspan="2">Myogénine</th><th rowspan="2">MyoD1</th><th colspan="2">SATB2</th><th rowspan="2">Sox9</th><th rowspan="2">RB1</th><th rowspan="2">NKX2.2</th><th rowspan="2">RunX2</th></tr><tr><th>Cellules rondes</th><th>Cartilage</th><th>Cellules rondes</th><th>Cartilage</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>2</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; F</td><td>rares ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>3</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>hét ; f</td><td>het ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte = 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>4</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>rares ; f</td><td>het ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>5</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>rares ; f</td><td>&lt; 50% ; m</td></tr><tr><td>6</td><td>&lt; 50% ; f</td><td>rares ; f</td><td>hom ; F</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; m</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>7</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>rares ; f</td><td>hom ; F</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>8</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>9</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>het ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>-</td><td>50% ; f</td></tr><tr><td>10</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>hét ; m</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte = 50%</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>11</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>rares ; f</td><td>hom ; m</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>hét ; m</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>12</td><td>-</td><td>-</td><td>rares ; f</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; f</td><td>perte &gt; 50%</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; f</td></tr><tr><td>13</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>rares ; f</td><td>NA</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>hét ; m</td><td>hét ; f</td><td>NA</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &lt; 50%</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>14</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>rares ; f</td><td>hom ; F</td><td>rares ; f</td><td>rares ; f</td><td>hét ; m</td><td>rares ; f</td><td>hét ; m</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>Interprétation :</td><td colspan="10">positif si &gt; 50% en cadre</td><td>pos si perte expression ≥ 50%</td></tr><tr><td>Résultat :</td><td>pos = 6/14<br/>nég = 8/14</td><td>pos = 7/14<br/>nég = 7/14</td><td>pos = 12/13<br/>nég = 1/13<br/>NA = 1</td><td>pos = 8/14<br/>nég = 6/14</td><td>pos = 3/14<br/>nég = 11/14</td><td>pos = 10/14<br/>nég = 4/14</td><td>pos = 9/14<br/>nég = 5/14</td><td>pos = 11/14<br/>nég = 2/14<br/>NA = 1/14</td><td>pos = 14/14<br/>nég = 0/14</td><td>pos = 13/14<br/>nég = 1/14</td><td>pos = 12/14<br/>nég = 2/14</td><td>pos = 14/14<br/>nég = 0/14</td></tr><tr><td>Légende</td><td colspan="5">Marqueurs d'interet:<br/>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br/>Quantité de cellules marquées : % : 0 ; rare ; &lt; 50% ; &gt; 50%</td><td colspan="5">Autres marqueurs:<br/>Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br/>Quantité de cellules marquées : aucune = - ; rares ; hétérogène = hét ; homogène =<br/>hom</td><td colspan="3">NI = non interprétable<br/>NA = non applicable<br/>pos = positif<br/>nég = négatif</td></tr></tbody></table>
## 2. Résultats pour les témoins

Les résultats sont présentés dans le **Tableau 11**.

Globalement, les résultats obtenus sur lame entière sont identiques à ceux observé sur TMA pour chaque anticorps, sauf pour RB.

**SOX9** était exprimé chez 14 témoins sur 20 (70%), fort et diffus dans les 3 chondrosarcomes ; 1 SS ; 1 sarcome *BCOR* ; 1 OSPC et les 2 sarcomes *NFATC2*.

**Runx2**, exprimé chez 13 témoins sur 20 (65%), était fort et diffus dans 1 sarcome *BCOR* et 1 OSPC.

**NKX2.2** était exprimé chez 8 témoins sur 20 (40%). Il était fort et diffus dans 4 cas (3 sarcomes d'Ewing et 1 sarcome *BCOR*).

**SATB2** était positif chez 6 des 20 témoins (30%), notamment fort et diffus dans 1 OSPC et 1 RMS.

Une perte d'expression de **RB** était significative pour 6 des 20 témoins (30%), représentant davantage de tumeurs que ce qui était observé sur TMA (2 des 3 chondrosarcomes ; 1 SS ; 1 sarcome d'Ewing ; 1 sarcome *NFATC2* et 1 OSPC).
<table><caption>**Tableau 11** : Résultats immunohistochimiques des marqueurs d'intérêt obtenus sur lame entière pour les témoins</caption><thead><tr><th>Diagnostic</th><th>N°<br>patient</th><th>SATB2</th><th>Sox9</th><th>RB1</th><th>NKX2.2</th><th>RunX2</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">OSPC de haut grade</td><td>1</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>&gt; 50 % ; m</td><td>perte &gt; 50%</td><td>-</td><td>&lt; 50 % ; m</td></tr><tr><td>2</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>Sarcome CIC</td><td>3</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">RMS</td><td>4</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>&lt; 50% ; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&lt; 50 % ; m</td></tr><tr><td>5</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>6</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>rares ; f</td></tr><tr><td rowspan="2">Sarcomes NFATC2</td><td>7</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>&lt; 50 % ; m</td><td>&lt; 50 % ; m</td></tr><tr><td>8</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte = 50%</td><td>rares ; f</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">Sarcomes BCOR</td><td>9</td><td>&gt; 50% ; f</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>&gt; 50% ; F</td></tr><tr><td>10</td><td>-</td><td>&gt; 50 % ; f</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&lt; 50 % ; f</td></tr><tr><td rowspan="2">TDPCR</td><td>11</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>12</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&lt; 50 % ; m</td></tr><tr><td rowspan="3">Sarcomes d'Ewing</td><td>13</td><td>-</td><td>-</td><td>perte = 50%</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td></tr><tr><td>14</td><td>-</td><td>-</td><td>pas de perte</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>-</td></tr><tr><td>15</td><td>-</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>pas de perte</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>rares ; f</td></tr><tr><td rowspan="4">SS</td><td>16</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>pas de perte</td><td>rares ; f</td><td>&lt; 50 % ; f</td></tr><tr><td>17</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; m</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>&lt; 50 % ; m</td></tr><tr><td>18</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>&lt; 50 % ; f</td><td>&gt; 50% ; m</td></tr><tr><td>19</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; m</td></tr><tr><td rowspan="3">Chondrosarcomes<br>conventionnels</td><td>20</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>perte &gt; 50%</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>21</td><td>-</td><td>&gt; 50% ; F</td><td>pas de perte</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Interprétation :</td><td></td><td></td><td>pos si perte<br>expression<br>≥ 50%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total</td><td></td><td>pos = 6/20<br>nég = 14/20<br>NA : 1</td><td>pos = 14/20<br>nég = 6/20<br>NA : 1</td><td>pos = 6/20<br>nég = 14/20<br>NA : 1</td><td>pos = 8/20<br>nég = 12/20<br>NA : 1</td><td>pos = 13/20<br>nég = 7/20<br>NA : 1</td></tr><tr><td>Légende :</td><td colspan="6">Intensité : f = faible ; m = modérée ; F = forte<br>Quantité de cellules marquées : % : 0 ; &lt; 50% ; &gt; 50%<br>NI = non interprétable<br>NA = non applicable<br>pos = positif<br>nég = négatif</td></tr></tbody></table>
### 3. Synthèse des résultats immunohistochimiques pour les marqueurs d'intérêt obtenus sur lame entière

Les performances sur lame entière des 5 anticorps que nous avions retenus à l'issue des analyses sur TMA sont présentées dans le **Tableau 12**.

Elles sont assez superposables à celles observées sur TMA, sauf pour RB dont la perte d'expression présentait un caractère moins spécifique des CSM.

<table><caption>**Tableau 12** : Performances diagnostiques des marqueurs d'intérêt sur lame entière</caption><thead><tr><th></th><th>RunX2</th><th>SOX9</th><th>NKX2.2</th><th>SATB2</th><th>RB</th></tr></thead><tbody><tr><th>CSM</th><td>14/14</td><td>14/14</td><td>12/14</td><td>12/14</td><td>13/14</td></tr><tr><th>Sensibilité</th><td>100%</td><td>100%</td><td>86%</td><td>86%</td><td>93%</td></tr><tr><th>Spécificité</th><td>35%</td><td>30%</td><td>60%</td><td>70%</td><td>70%</td></tr></tbody></table>

De la même manière que sur TMA, nous avons confirmé qu'aucun de ces marqueurs utilisé isolément n'était assez sensible et spécifique pour le diagnostic de CSM. En couplant ces anticorps sous forme de panels, nous avons obtenons une Se maximale de 71% et une Sp de 100% pour le diagnostic de CSM (**Tableau 13**).

<table><caption>**Tableau 13** : Performances diagnostiques des différents panels immunohistochimiques pour le diagnostic de CSM sur lame entière</caption><thead><tr><th>Panel immunohistochimique</th><th>Sensibilité<br>(Pour le diag de CSM)</th><th>Spécificité<br>(par rapport aux témoins)</th></tr></thead><tbody><tr><td>RunX2</td><td>100%</td><td>35%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9</td><td>100%</td><td>45%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2</td><td>86%</td><td>75%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2 ; SATB2</td><td>79%</td><td>95%</td></tr><tr><td>RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2 ; SATB2 ; RB1</td><td>71%</td><td>100%</td></tr></tbody></table>
# DISCUSSION

Les sarcomes à cellules rondes sont des tumeurs rares de haut grade touchant principalement les enfants et jeunes adultes. Ils correspondent à des entités variées nécessitant un diagnostic précis pour appliquer une prise en charge adaptée. Bien que le diagnostic histologique soit supporté par la biologie moléculaire, le recours à l'IHC est nécessaire pour permettre une caractérisation tumorale fiable et rapide. Or, il n'existe pas de marqueur immunohistochimique performant pour distinguer, parmi tous les sarcomes à cellules rondes, le CSM dont le diagnostic histologique est complexe en l'absence de composante cartilagineuse bien différenciée.

Notre étude, rassemblant une cohorte de 14 CSM, apporte des données supplémentaires sur le profil d'expression immunohistochimique de cette tumeur rare et décrit un panel de 5 anticorps permettant de faciliter son diagnostic. Par son effectif, elle constitue une des plus grandes cohortes histologiques internationales de CSM à ce jour, la plus grande cohorte histologique décrite à notre connaissance comportant 22 cas (60).

## I. REPRESENTATIVITE DE NOTRE COHORTE DE CHONDROSARCOMES MESENCHYMATEUX

### 1. Aspects cliniques

Les caractéristiques cliniques et d'évolutivité de notre cohorte de patients atteints de CSM sont en adéquation avec les données décrites dans la littérature. Dans notre étude, les CSM survenaient chez une légère majorité d'hommes (sex-ratio homme/femme de 1,3) d'un âge médian de 30 ans (61). Ils se distribuaient en proportion équivalente entre les os, principalement crâniaux-faciaux et du squelette axial et les tissus mous des membres, de l'orbite et des méninges (5). Lorsque les données d'imagerie de nos patients étaient disponibles, elles révélaient des lésions agressives, ostéolytiques en cas de siège osseux, comportant dans un peu moins de la moitié des cas (43%) des calcifications, pouvant indiquer la présence d'une éventuelle matrice cartilagineuse. Ce chiffre est relativement cohérent avec l'étude de Yinyin Chen *et al*. décrivant des signes d'agressivité et la présence d'une matrice cartilagineuse dans
60 % de leurs cas, cependant systématiquement relus par des radiologues experts en pathologie tumorale des os et tissus mous (9).

Les données de suivi de notre cohorte révèlent un taux de survie à 5 ans de 67%, en adéquation avec les taux rapportés dans la littérature oscillant entre 55 et 70% (3,61). En dépit de l'absence de protocole thérapeutique clairement établi, lorsque les tumeurs de nos patients étaient localisées, la chirurgie était l'option thérapeutique principale (92%), parfois couplée à de la chimiothérapie néoadjuvante et adjuvante (46%), et surtout à de la RT complémentaire en cas d'exérèse R1 (86%) (4,37).

## 2. Aspects histologiques

Pour l'ensemble des CSM, on observait une composante sarcomateuse à petites cellules rondes monotones, toujours majoritaire, associée dans 93% des cas à une composante cartilagineuse bien différenciée majoritairement sous forme de plages de chondrocytes et/ou plus rarement sous forme de chondrocytes isolés dispersés. La vascularisation était presque toujours hémangiopéricytaire (93%). Des signes d'agressivité à type d'activité mitotique élevée, de nécrose et d'embole vasculaire étaient observés dans respectivement 36%, 43% et 43% des cas. Sur le plan immunohistochimique, l'expression des marqueurs cartilagineux SOX9 et PS100 était respectivement constante et fréquente (93%). L'ensemble de ces éléments était en accord avec la littérature (6–8,14,18).

## 3. Aspects moléculaires

Nos études moléculaires complémentaires ont permis d'apporter la preuve du diagnostic par la détection du TdF *HEY1::NCOA2* dans 6 des 7 cas pour lesquels elle n'était pas disponible lors de l'inclusion dans l'étude. Ainsi, 93% de nos CSM comportaient le TdF *HEY1::NCOA2*. Ce taux est en accord avec les données de la littérature où la présence de ce TdF est rapportée dans 75 à 90% des CSM (25). Le patient pour lequel aucune preuve moléculaire n'a pu être obtenue malgré la réalisation de 3 techniques moléculaires différentes (cas n°12), a tout de même été inclus car ses données cliniques (tumeur osseuse de la mandibule) et histologiques (contingent à petites cellules rondes prédominant mêlé à des plages de tumeur cartilagineuse bien différenciée), mais également immunohistochimiques (positivité diffuse de SOX9 et marquage hétérogène du cartilage par la PS100) étaient en accord avec les données de la littérature et des autres patients de notre cohorte. Cette observation rappelle l'importance de l'analyse
morphologique et immunohistochimique comme outils diagnostiques en complément de la
biologie moléculaire qui bien que requise pour le diagnostic, peut parfois être mise en défaut.

## II. PLACE DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE DANS LE DIAGNOSTIC DE CHONDROSARCOME MESENCHYMATEUX

Les implications diagnostiques dans les sarcomes à petites cellules rondes étant lourdes de
conséquences sur le plan thérapeutique et pronostique, le recours à la biologie moléculaire est
aujourd'hui systématique dans ces situations afin de confirmer le diagnostic élaboré sur la base
des analyses morphologiques et immunohistochimiques. Il faut cependant noter que ces
analyses moléculaires nécessitent le recours à un plateau technique suffisant, souvent
disponible dans les CHU, et que leurs résultats ne sont obtenus qu'à l'issue d'un délai moyen de
deux semaines.

La nécessité de support moléculaire du diagnostic est bien illustrée par le 15ème cas de CSM que nous avions initialement inclus dans notre cohorte de cas. Il s'agissait d'une jeune fille de 15 ans présentant une lésion de la base du crâne. À l'histologie la tumeur correspondait à des petites cellules rondes monotones mélangées à des îlots cartilagineux bien différenciés. L'expression de SOX9 était forte et diffuse et la PS100 soulignait les secteurs cartilagineux. Le diagnostic de CSM avait initialement été porté, sans recours à la biologie moléculaire. Nos deux méthodes de séquençage de l'ARN n'avaient pas montré de TdF. L'étude du profil de méthylation avait permis de redresser le diagnostic en OSPC. À la relecture attentive des documents histologiques, un minime foyer d'ostéogenèse maligne avait par ailleurs été observé, permettant de confirmer le diagnostic d'OSPC. De plus, quelques discordances étaient notées sur les autres marqueurs étudiés en IHC (données détaillées par la suite).

## III. OUTILS IMMUNOHISTOCHIMIQUES POUR LE DIAGNOSTIC DE CHONDROSARCOME MESENCHYMATEUX

### 1. Données d'expression immunohistochimique disponibles dans la littérature

Nos résultats immunohistochimiques confirment la positivité des cellules tumorales, notamment du contingent sarcomateux à petites cellules rondes, principalement pour l'anticorps anti-SOX9 (marquage dans 100% de nos CSM). SOX9, cible de HEY1::NCOA2, favorisant la
chondrogenèse, est connu comme étant un marqueur très sensible du CSM mais dont la Sp varie selon les études (22,60). Des études ont notamment rapporté son expression dans une variété de sarcomes, y compris les SS, et le sarcome d'Ewing (21). Nos résultats sont concordants avec ces données, révélant une Se de 100% mais une Sp de 30%, s'expliquant par l'expression de SOX9 dans les chondrosarcomes conventionnels, les sarcomes *NFATC2*, *BCOR*, quelques SS et OSPC. Cet anticorps, jusqu'à présent décrit comme le principal outil immunohistochimique du diagnostic de CSM ne peut donc pas être utilisé isolément. Nos résultats montrent également la positivité des cellules tumorales, principalement du contingent sarcomateux à petites cellules rondes, vis-à-vis du CD99 (marquage dans 79% de nos CSM) ; et l'expression de la PS100 cependant principalement sur la composante cartilagineuse bien différenciée (92%) et plus rarement et faiblement sur les cellules rondes (43%), ce qui s'accorde avec les données disponibles dans la littérature (8), mais ne permet pas d'en faire un marqueur pertinent de CSM face à un sarcome à petites cellules rondes. Il en était de même pour l'expression aberrante des marqueurs musculaires **desmine**, **myogénine** et **MyoD1** (marquant respectivement 57%, 21% et 71% de nos CSM) ; avec expression d'1 seul marqueur musculaire dans 14% des cas ; de 2 marqueurs musculaires dans 36% des cas et de 3 marqueurs musculaires dans 21% des cas, cependant sans aucune expression forte ou diffuse de ces marqueurs. Enfin, aucun de nos CSM n'exprimait l'**EMA**, contrairement à ce qui est indiqué dans le livre de référence sur la pathologie tumorale des os et de tissus mous de l'Organisation Mondiale de la Santé (18).

## 2. Nouvelles données d'expression immunohistochimique établies par notre étude

### A. Sur la base de l'exploitation des données de physiopathologie du chondrosarcome mésenchymateux

La physiopathologie du CSM, basée sur le TdF *HEY1::NCOA2*, implique l'interaction de ce TdF avec deux effecteurs : SOX9 (déjà détaillé au paragraphe précédent) et RUNX2 (28). L'expression de **RunX2**, n'avait à notre connaissance jamais été testée spécifiquement à visée diagnostique dans les CSM. Son rôle en tant que facteur de transcription impliqué dans la chondrogenèse est bien établi dans la littérature (34,62), mais son expression n'avait été rapportée que dans des tumeurs cartilagineuses bénignes comme le chondroblastome (63). Pour RunX2, nous avons observé une Se de 100% mais une Sp de seulement 35% en raison de sa positivité dans la quasi-totalité des diagnostics différentiels testés dans notre étude. Cependant,
de manière intéressante nous avons constaté que son expression était forte et diffuse dans 79% des CSM mais dans seulement 2 diagnostics différentiels (1 OSPC et 1 sarcome BCOR).

Dans respectivement 70% et 39% des CSM, des anomalies des gènes suppresseur de tumeur *Rb* et *TP53* ont été rapportées (64). Nos résultats montrent en effet une perte d'expression en IHC de **RB** témoignant de l'altération de cette voie dans 93% de nos CSM. Il est à noter que les cas pour lesquels l'expression de RB était diminuée, comportaient par ailleurs le TdF *HEY1::NCOA2*, témoignant de l'existence concomitante de ces deux altérations moléculaires, non mutuellement exclusives l'une de l'autre. En revanche, aucun de nos CSM ne présentait de positivité forte et diffuse pour l'anticorps anti-*p53*. Une telle positivité forte et diffuse de TP53 était observée sur le cas initialement inclus comme 15ème CSM mais finalement reclassé en ostéosarcome de haut grade. De manière intéressante, les études moléculaires complémentaires disponibles chez cette patiente avaient mis en évidence une altération constitutionnelle de *TP53* indiquant qu'elle était porteuse d'un syndrome de Li-Fraumeni, dans lequel la survenue d'ostéosarcomes est assez courante contrairement au CSM, n'étant pas décrit comme associé à ce syndrome, en dehors d'un seul cas rapporté dans la littérature (65).

Bien que la voie Wnt impliquant la **béta caténine** et son effecteur **p65** soit décrite comme intervenant dans la chondrogenèse (66), aucun de nos CSM ne présentait de marquage nucléaire vis-à-vis de ces anticorps.

## B. Sur la base de l'exploitation des données bibliographiques

En exploitant les données des rares études d'expression immunohistochimique disponibles dans la littérature, nous avons décidé de tester l'expression de **NKX2.2**, marqueur récemment décrit comme très sensible pour la détection des sarcomes d'Ewing, mais dont l'expression a également été rapportée dans 75% des CSM (67). Nos résultats montraient la positivité de NKX2.2 sur 86% de nos CSM, quasiment toujours de manière diffuse. Nous avions également pu constater sa positivité parmi 40 % des diagnostics différentiels, notamment dans tous nos sarcomes d'Ewing et 1 sarcome BCOR, ce qui concorde avec les données de la littérature rapportant son expression courante dans le sarcome d'Ewing (67,68) et moins fréquente d'autres rares cas de sarcomes (69).
Nous avons également analysé sur nos CSM l'expression de **SATB2** parfois utilisé comme aide pour le diagnostic des OSPC pour mettre en évidence la différenciation ostéoblastique, ce qui, à notre connaissance, n'avait jamais été testé. Nos résultats indiquent une Se de 86% et une Sp de 70% de SATB2, ce qui en fait un marqueur utile pour le diagnostic de CSM.

**OLIG2** a également été décrit dans la littérature comme positif dans les CSM (57). L'hypothèse physiopathologique rapportée suggère que SOX9 et OLIG2 soient liés par leur co-expression dans certains types cellulaires, leur rôle dans le développement neuronal, et leur régulation commune par la signalisation FGF. Dans notre étude, nous avons observé un marquage faible ou hétérogène dans 36% de nos CSM. Il était par ailleurs également exprimé de manière faible et hétérogène dans quelques RMS. Le clone utilisé dans la littérature était cependant différent du nôtre, des études complémentaires comparant les performances diagnostiques des différents clones permettraient de clarifier l'utilité de ce marqueur pour le diagnostic du CSM.

Nous avons également décidé de tester l'anticorps anti-STAT6, dont l'expression aberrante a été décrite dans 1 seul cas de CSM dans la littérature comportant par ailleurs le TdF *HEY1::NCOA2*, mais sans TdF impliquant STAT6 (70,71). Nous n'avons détecté aucune expression de STAT6 parmi nos 14 CSM, ni parmi nos 21 témoins. Ce résultat renforce la Sp de l'immunomarquage STAT6 réservé pour le diagnostic de tumeur fibreuse solitaire.

Plusieurs études ont proposé NKX3.1 comme marqueur diagnostique potentiel du CSM, décrivant une Sp de 100% et une Se variant de 36% (72) à 80% (58). Dans notre étude, nous avons observé un marquage rare ou hétérogène de NKX3.1 dans 29% de nos CSM, sans marquage parmi les témoins, confirmant la bonne Sp de l'anticorps. Les clones utilisés dans la littérature étant cependant différents du nôtre, des études complémentaires seraient nécessaires pour clarifier l'utilité de ce marqueur pour le diagnostic du CSM.

Nous avons également testé SOX10, car il est très couramment associé à la PS100, ces deux marqueurs étant positifs en cas de différenciation nerveuse ou mélanocytaire. La positivité de la PS100 est connue dans le cartilage, mais aucune donnée d'expression de SOX10 sur le cartilage n'était disponible. Aucun de nos CSM n'était marqué par SOX10, indiquant que SOX10 n'est pas pertinent pour mettre en évidence une différenciation cartilagineuse.

**GRM1** est un gène codant pour un récepteur au glutamate, dont l'expression est constante dans le fibrome chondromyxoïde, une tumeur cartilagineuse bénigne, et semble assez spécifique de cette entité (73). Nous n'avons en effet observé aucun marquage de nos CSM par cet anticorps.
Nous nous sommes également intéressés à **H3K27me3**, marqueur de la triméthylation de la lysine 27 de l'histone H3, dont la perte, rapportée dans certains types tumoraux (gliomes, tumeur maligne des gaines des nerfs périphériques), modifie l'expression de gènes et favorise la tumorigenèse. Une étude rapporte que la lysine 27 de l'histone H3 contrôle la région promotrice des gènes *SOX9* et *COL2A1* (74). Cependant, dans notre étude, nous n'avons retrouvé aucune perte d'expression significative de H3K27me3 parmi nos CSM.

### 3. Données immunohistochimiques pertinentes pour le diagnostic de CSM

À l'issue de notre étude, en plus de la positivité de CD99, PS100, et des marqueurs musculaires dans les CSM, rapportée dans la littérature, nous mettons en évidence la **positivité de RUNX2, SOX9, NKX2.2, SATB2 et la perte d'expression de RB** dont l'usage couplé sous forme d'un panel à 5 anticorps permet d'aboutir à une Se de 71% et une Spé de 100% pour le diagnostic de CSM. La Se de ce panel pourrait même être potentiellement supérieure à 71% car le cas 12 était négatif pour NKX2.2 et SATB2, mais ces deux résultats pourraient correspondre à des faux négatifs étant donné que le matériel histologique disponible pour ce cas datait de 2008 et avait par ailleurs reçu un prétraitement par l'éosine pouvant dégrader la qualité tissulaire et l'expression antigénique.

Il est par ailleurs à préciser que les 5 anticorps de ce panel sont d'accès facile, et constituent déjà des outils diagnostiques utilisés par les centres d'ACP disposant d'un domaine d'expertise en pathologie osseuse des tissus mous.

Nos résultats indiquent par ailleurs que parmi les sarcomes à petites cellules rondes, **les principaux diagnostics différentiels sur le plan immunohistochimique du CSM** sont représentés par :

- l'**OSPC** où nous avons montré une expression constante de SOX9, RUNX2, SATB2 et une possible perte de RB, cependant sans positivité de NKX2.2 et dont le critère diagnostique principal reste la mise en évidence d'une ostéoformation maligne au sein de la tumeur ;

- le **sarcome NFATC2** présentant une positivité constante de SOX9, RUNX2, avec possible expression de NKX2.2 et perte de RB, cependant sans positivité de SATB2 et pour lequel le diagnostic de certitude est apporté par la biologie moléculaire ;
- le sarcome BCOR présentant une positivité constante de SOX9, RUNX2, avec possible expression de NKX2.2 et SATB2 mais sans perte de RB et pour lequel l'anticorps anti-BCOR constitue un outil diagnostique supplémentaire avant la preuve moléculaire ;

- le SS présentant une positivité constante de SOX9 et RUNX2 et fréquente de NKX2.2 cependant sans expression de SATB2 ni perte constante de RB et pour lequel l'anticorps dirigé contre la fusion spécifique SSX::SS18 constitue un outil supplémentaire.

Il faut par ailleurs se souvenir de la forte positivité de NKX2.2 commune au CSM et au sarcome d'Ewing, cependant sans expression constante de SOX9, RUNX2, SATB2 ni perte de RB pour ce dernier.

Le CSM présente enfin quelques points communs avec les chondrosarcomes conventionnels comme l'expression constante de SOX9, moins fréquente de RUNX2 et la perte de RB, cependant sans expression de NKX2.2 ni SATB2.
CONCLUSION

Parmi la large gamme diagnostique des sarcomes à petites cellules rondes, le CSM correspond
à une entité rare, dont le diagnostic histologique est difficile. L'utilisation d'outils
immunohistochimiques est essentielle pour suspecter ce diagnostic, avant confirmation
moléculaire par mise en évidence du TdF classiquement retrouvé dans les CSM correspondant
à *HEY1::NCOA2* voire *IRF2BP2::CDX1* décrit jusqu'à présent dans un seul cas de CSM. Les
données de la littérature sur le profil d'expression immunohistochimique du CSM sont
cependant limitées à la positivité de CD99, PS100, SOX9, dont les performances diagnostiques
sont insuffisantes, et des marqueurs musculaires, peu spécifiques ; très peu d'autres anticorps
ayant été testés sur ce type tumoral rare. Par le biais de notre travail, consistant à former une
cohorte de 14 cas de ce type tumoral rare, (l'une des plus grandes cohortes histologiques
internationales à ce jour, la cohorte histologique la plus importante à notre connaissance
rassemblant 22 cas (60)), en apportant la preuve moléculaire lorsqu'elle était absente ; et une
cohorte des principaux diagnostics différentiels utilisés comme témoins, et à y étudier
l'expression de nombreux marqueurs immunohistochimiques de manière exploratoire sur TMA
puis sur lame entière ensuite, nous avons confirmé l'expression de CD99, PS100
(principalement limité à la composante cartilagineuse dans 92% des cas, ne marquant que
rarement et faiblement les cellules rondes dans 50% des cas) et SOX9 dans les CSM avec
cependant des performances diagnostiques insuffisantes pour chacun de ces anticorps (dont les
chiffres de Se et Sp sont respectivement de 43% et 52% pour CD99 ; 93% et 76% pour PS100
et 100% et 30% pour SOX9), ainsi que des marqueurs musculaires. Nous avons également
découvert les propriétés diagnostiques de 5 anticorps : RunX2 ; SOX9 ; NKX2.2 ; SATB2 et
RB, faciles d'accès et souvent utilisés en pratique courante dans les centres d'ACP disposant
d'une expertise en os et tissus mous, dont les performances diagnostiques sont insuffisantes de
manière individuelle (leurs chiffres de Se et Sp étant respectivement de 100% et 35% pour
RUNX2 ; 100% et 30% pour SOX9 ; 86% et 60% pour NKX2.2 ; 86% et 70% pour SATB2 ;
et 93% et 70% pour RB) mais dont l'usage sous forme d'un panel, permet d'approcher le
diagnostic de CSM avec une Se de 71% et une Sp de 100%.
BIBLIOGRAPHIE

1. Van Praag (Veroniek) VM, Rueten-Budde AJ, Ho V, Dijkstra PDS, Fiocco M, Van De Sande MAJ, et al. Incidence, outcomes and prognostic factors during 25 years of treatment of chondrosarcomas. Surg Oncol. sept 2018;27(3):402-8.

2. Xu B, Rooper LM, Dermawan JK, Zhang Y, Suurmeijer AJH, Dickson BC, et al. Mesenchymal chondrosarcoma of the head and neck with *HEY1:: NCOA2* fusion: A clinicopathologic and molecular study of 13 cases with emphasis on diagnostic pitfalls. Genes Chromosomes Cancer. nov 2022;61(11):670-7.

3. Frezza AM, Cesari M, Baumhoer D, Biau D, Bielack S, Campanacci DA, et al. Mesenchymal chondrosarcoma: Prognostic factors and outcome in 113 patients. A European Musculoskeletal Oncology Society study. Eur J Cancer. févr 2015;51(3):374-81.

4. Dudzisz-Śledź M, Kondracka M, Rudzińska M, Zając AE, Firlej W, Sulejczak D, et al. Mesenchymal Chondrosarcoma from Diagnosis to Clinical Trials. Cancers. 15 sept 2023;15(18):4581.

5. Schneiderman BA, Kliethermes SA, Nystrom LM. Survival in Mesenchymal Chondrosarcoma Varies Based on Age and Tumor Location: A Survival Analysis of the SEER Database. Clin Orthop. mars 2017;475(3):799-805.

6. Wang K, Ma X jian, Guo TX, Wang L, Li D, Hao SY, et al. Intracranial Mesenchymal Chondrosarcoma: Report of 16 Cases. World Neurosurg. août 2018;116:e691-8.

7. Arora K, Riddle ND. Extraskeletal Mesenchymal Chondrosarcoma. Arch Pathol Lab Med. 1 nov 2018;142(11):1421-4.

8. Shakked RJ, Geller DS, Gorlick R, Dorfman HD. Mesenchymal Chondrosarcoma: Clinicopathologic Study of 20 Cases. Arch Pathol Lab Med. 1 janv 2012;136(1):61-75.

9. Chen Y, Wang X, Guo L, Li Y, Deng S, Liu Y, et al. Radiological features and pathology of extraskeletal mesenchymal chondrosarcoma. Clin Imaging. juill 2012;36(4):365-70.

10. Khurana JS, McCarthy EF, Zhang PJ. Essentials in Bone and Soft-Tissue Pathology [Internet]. Boston, MA: Springer US; 2010 [cité 29 sept 2024]. Disponible sur: http://link.springer.com/10.1007/978-0-387-89845-2
11. Wei S, Siegal GP. Atlas of Bone Pathology [Internet]. New York, NY: Springer New York; 2013 [cité 29 sept 2024]. Disponible sur: https://link.springer.com/10.1007/978-1-4614-6327-6

12. Kim JH, Lee SK. Classification of Chondrosarcoma: From Characteristic to Challenging Imaging Findings. Cancers. 10 mars 2023;15(6):1703.

13. Sharma S, Kamala R, Nair D, Ragavendra T R, Mhatre S, Sabharwal R, et al. Round Cell Tumors: Classification and Immunohistochemistry. Indian J Med Paediatr Oncol. juill 2017;38(03):349-53.

14. Strach MC, Grimison PS, Hong A, Boyle R, Stalley P, Karim R, et al. Mesenchymal chondrosarcoma: An Australian multi-centre cohort study. Cancer Med. janv 2023;12(1):368-78.

15. De Andrea CE, San-Julian M, Bovée JVMG. Integrating Morphology and Genetics in the Diagnosis of Cartilage Tumors. Surg Pathol Clin. sept 2017;10(3):537-52.

16. Bone & joints Chondrosarcoma Mesenchymal chondrosarcoma. Disponible sur: https://www.pathologyoutlines.com/topic/softtissueeskchondrosarcomamesenchymal.html

17. Nielsen GP, Rosenberg AE. Bone. 2. edition. Philadelphia, PA: Elsevier; 2017. 443 p. (Diagnostic Pathology).

18. C. Fanburg-Smith JC. Mesenchymal chondrosarcoma. In: WHO classification of tumors [Internet]. Disponible sur: https://tumourclassification.iarc.who.int/chaptercontent/33/145

19. Meera H. Malignant Cartilage-Forming Tumors.

20. Wehrli BM, Huang W, De Crombrugghe B, Ayala AG, Czerniak B. Sox9, a master regulator of chondrogenesis, distinguishes mesenchymal chondrosarcoma from other small blue round cell tumors. Hum Pathol. mars 2003;34(3):263-9.

21. Sharma AE, Pytel P, Cipriani NA. SOX9 and SATB2 immunohistochemistry cannot reliably distinguish between osteosarcoma and chondrosarcoma on biopsy material. Hum Pathol. mars 2022;121:56-64.

22. Cajaiba MM, Jianhua Luo, Goodman MA, Fuhrer KA, Rao UNM. Sox9 Expression Is Not Limited to Chondroid Neoplasms: Variable Occurrence in Other Soft Tissue and Bone Tumors With Frequent Expression by Synovial Sarcomas. Int J Surg Pathol. oct
2010;18(5):319-23.

23. Ming Z, Vining B, Bagheri-Fam S, Harley V. SOX9 in organogenesis: shared and unique transcriptional functions. Cell Mol Life Sci. oct 2022;79(10):522.

24. Fanburg-Smith JC, Auerbach A, Marwaha JS, Wang Z, Santi M, Judkins AR, et al. Immunoprofile of mesenchymal chondrosarcoma: aberrant desmin and EMA expression, retention of INI1, and negative estrogen receptor in 22 female-predominant central nervous system and musculoskeletal cases. Ann Diagn Pathol. févr 2010;14(1):8-14.

25. Y H Ha. Detection and analysis of HEY1-NCOA2 fusion gene in mesenchymal chondrosarcoma. 8 juin 2020;

26. Qi W, Rosikiewicz W, Yin Z, Xu B, Jiang H, Wan S, et al. Genomic profiling identifies genes and pathways dysregulated by *HEY1-NCOA2* fusion and shines a light on mesenchymal chondrosarcoma tumorigenesis. J Pathol. août 2022;257(5):579-92.

27. Alekseyev YO, Fazeli R, Yang S, Basran R, Maher T, Miller NS, et al. A Next-Generation Sequencing Primer—How Does It Work and What Can It Do? Acad Pathol. janv 2018;5:2374289518766521.

28. Tanaka M, Homme M, Teramura Y, Kumegawa K, Yamazaki Y, Yamashita K, et al. HEY1-NCOA2 expression modulates chondrogenic differentiation and induces mesenchymal chondrosarcoma in mice. JCI Insight. 22 mai 2023;8(10):e160279.

29. Meijer D, De Jong D, Pansuriya TC, Van Den Akker BE, Picci P, Szuhai K, et al. Genetic characterization of mesenchymal, clear cell, and dedifferentiated chondrosarcoma. Genes Chromosomes Cancer. oct 2012;51(10):899-909.

30. Jeong W, Kim HJ. Biomarkers of chondrosarcoma. J Clin Pathol. juill 2018;71(7):579-83.

31. Baumhoer D, Amary F, Flanagan AM. An update of molecular pathology of bone tumors. Lessons learned from investigating samples by next generation sequencing. Genes Chromosomes Cancer. févr 2019;58(2):88-99.

32. Ferreira E, Gatrell LB, Childress L, Wu H, Porter RM. A Transgenic Rat for Noninvasive Assessment of Chondrogenesis in Vivo. CARTILAGE. déc 2021;13(2_suppl):1720S-1733S.
33. Tanaka M, Nakamura T. Modeling fusion gene-associated sarcoma: Advantages for understanding sarcoma biology and pathology. Pathol Int. oct 2021;71(10):643-54.

34. Yoshida CA, Yamamoto H, Fujita T, Furuichi T, Ito K, Inoue K ichi, et al. Runx2 and Runx3 are essential for chondrocyte maturation, and Runx2 regulates limb growth through induction of *Indian hedgehog*. Genes Dev. 15 avr 2004;18(8):952-63.

35. Komori T. Regulation of Proliferation, Differentiation and Functions of Osteoblasts by Runx2. Int J Mol Sci. 4 avr 2019;20(7):1694.

36. Casali PG, Abecassis N, Bauer S, Biagini R, Bielack S, Bonvalot S, et al. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO-EURACAN Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. oct 2018;29:iv51-67.

37. Mendenhall WM, Reith JD, Scarborough MT, Stechmiller BK, Mendenhall NP. Mesenchymal Chondrosarcoma. Int J Part Ther. sept 2016;3(2):300-4.

38. Casali PG, Bielack S, Abecassis N, Aro HT, Bauer S, Biagini R, et al. Bone sarcomas: ESMO-PaedCan-EURACAN Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. oct 2018;29:iv79-95.

39. Sbaraglia M, Righi A, Gambarotti M, Dei Tos AP. Ewing sarcoma and Ewing-like tumors. Virchows Arch. janv 2020;476(1):109-19.

40. asad U. Ewing Sarcoma and Ewing-Like Sarcoma and the Role of NKX2.2 Immunoreactivity. Disponible sur: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8457536/

41. Yoshida A. Ewing and Ewing-like sarcomas: A morphological guide through genetically-defined entities. Pathol Int. janv 2023;73(1):12-26.

42. Kao YC, Owosho AA, Sung YS, Zhang L, Fujisawa Y, Lee JC, et al. BCOR-CCNB3 Fusion Positive Sarcomas: A Clinicopathologic and Molecular Analysis of 36 Cases With Comparison to Morphologic Spectrum and Clinical Behavior of Other Round Cell Sarcomas. Am J Surg Pathol. mai 2018;42(5):604-15.

43. CIC-rearranged sarcoma. Disponible sur: https://tumourclassification.iarc.who.int/chaptercontent/33/230

44. Alveolar rhabdomyosarcoma [Internet]. Disponible sur: https://tumourclassification.iarc.who.int/chaptercontent/33/105
45. Goldblum JR, Folpe AL, Weiss SW, Enzinger FM, Weiss SW. Enzinger and Weiss's soft tissue tumors. 6th ed. Philadelphia, PA: Saunders/Elsevier; 2014. 1155 p.

46. Hornick JL. Practical soft tissue pathology: a diagnostic approach. 2nd ed. Philadelphia: Elsevier; 2019. (Pattern recognition series).

47. Round cell sarcoma with EWSR1-non-ETS fusions. Disponible sur: https://tumourclassification.iarc.who.int/chaptercontent/33/244

48. Agaram NP. Evolving classification of rhabdomyosarcoma. Histopathology. janv 2022;80(1):98-108.

49. Righi A, Gambarotti M, Longo S, Benini S, Gamberi G, Cocchi S, et al. Small Cell Osteosarcoma: Clinicopathologic, Immunohistochemical, and Molecular Analysis of 36 Cases. Am J Surg Pathol. mai 2015;39(5):691-9.

50. Thway K, Fisher C. Synovial sarcoma: defining features and diagnostic evolution. Ann Diagn Pathol. déc 2014;18(6):369-80.

51. Chang F. Desmoplastic Small Round Cell Tumors: Cytologic, Histologic, and Immunohistochemical Features. Arch Pathol Lab Med. 1 mai 2006;130(5):728-32.

52. Sandlund JT. Non-Hodgkin Lymphoma in Children. Curr Hematol Malig Rep. sept 2015;10(3):237-43.

53. Martínez-Cuevas R, Medellín-Ortega A, López-Facio EE, Escareño-Zuñiga RL, Alvarado-Jiménez G, González-Prado-García CM, et al. Extrarenal rhabdoid tumor of anterior mediastinal location. Bol Méd Hosp Infant México. 3 mars 2023;80(1):9447.

54. Yoshinao O. Extrarenal rhabdoid tumour. In: WHO Classification of Tumours [Internet]. Disponible sur: https://tumourclassification.iarc.who.int/chaptercontent/33/128

55. Hogendoorn PCW. Chondrosarcoma and Its Precursors.

56. Fumiko Y. The canonical Wnt signaling pathway promotes chondrocyte differentiation in a Sox9-dependent manner.

57. Yao K, Duan Z, Yang S, Du Z, Wang Y, Qi X. OLIG2 Immunolabeling of Mesenchymal Chondrosarcoma: Report of 14 Cases. J Neuropathol Exp Neurol. 1 sept 2020;79(9):959-65.

58. Ramanayake N, Vargas AC, Talbot J, Bonar F, Wong DD, Wong D, et al. NKX3.1
immunohistochemistry is highly specific for the diagnosis of mesenchymal chondrosarcomas: experience in the Australian population. Pathology (Phila). oct 2021;53(6):705-12.

59. Rosenberg AE, Spasi S. Confirmation of NKX3-1 Expression in EWSR1-NFATC2 Sarcoma and Mesenchymal Chondrosarcoma Using Monoclonal Antibody. Am J Surg Pathol. 2021;45(4).

60. Wehrli BM, Huang W, De Crombrugghe B, Ayala AG, Czerniak B. Sox9, a master regulator of chondrogenesis, distinguishes mesenchymal chondrosarcoma from other small blue round cell tumors. Hum Pathol. mars 2003;34(3):263-9.

61. Xu J, Li D, Xie L, Tang S, Guo W. Mesenchymal Chondrosarcoma of Bone and Soft Tissue: A Systematic Review of 107 Patients in the Past 20 Years. Loeb DM, éditeur. PLOS ONE. 7 avr 2015;10(4):e0122216.

62. Kim YI, Tseng YC, Ayaz G, Wang S, Yan H, Du Bois W, et al. SOX9 is a key component of RUNX2-regulated transcriptional circuitry in osteosarcoma. Cell Biosci. 25 juill 2023;13(1):136.

63. Toda Y, Yamamoto H, Iwasaki T, Ishihara S, Ito Y, Susuki Y, et al. Expression of SATB2, RUNX2, and SOX9 and possible osteoblastic and chondroblastic differentiation in chondroblastoma. Pathol - Res Pract. janv 2023;241:154239.

64. Meijer D, De Jong D, Pansuriya TC, Van Den Akker BE, Picci P, Szuhai K, et al. Genetic characterization of mesenchymal, clear cell, and dedifferentiated chondrosarcoma. Genes Chromosomes Cancer. oct 2012;51(10):899-909.

65. Ventura E, Dionísio S, Ferreira Â, Saleiro R, Marques H, Magalhães M, et al. Maxillary mesenchymal chondrosarcoma leading to a diagnosis of Li-Fraumeni syndrome. J Surg Case Rep. 1 janv 2020;2020(1):rjz386.

66. Fanburg-Smith JC, Auerbach A, Marwaha JS, Wang Z, Rushing EJ. Reappraisal of mesenchymal chondrosarcoma: novel morphologic observations of the hyaline cartilage and endochondral ossification and β-catenin, Sox9, and osteocalcin immunostaining of 22 cases. Hum Pathol. mai 2010;41(5):653-62.

67. Hung YP, Fletcher CDM, Hornick JL. Evaluation of NKX2-2 expression in round cell sarcomas and other tumors with EWSR1 rearrangement: imperfect specificity for Ewing sarcoma. Mod Pathol. avr 2016;29(4):370-80.
68. Ullah A, Sinkler MA, Velasquez Zarate L, Clavijo A, White J. Ewing Sarcoma and Ewing-Like Sarcoma and the Role of NKX2.2 Immunoreactivity. Cureus [Internet]. 23 août 2021 [cité 3 oct 2024]; Disponible sur: https://www.cureus.com/articles/66627-ewing-sarcoma-and-ewing-like-sarcoma-and-the-role-of-nkx22-immunoreactivity

69. Saeed SM, Hassan U, Hussain M, Mushtaq S, Ishtiaq S. Expression of NKX2.2 in Non-Ewing Tumors With Round Cell Morphology. Cureus [Internet]. 18 déc 2023 [cité 18 mai 2024]; Disponible sur: https://www.cureus.com/articles/210785-expression-of-nkx22-in-non-ewing-tumors-with-round-cell-morphology

70. Broggi G, Mazzucchelli M, Covello R, Casini B, Barbagallo GMV, Salvatorelli L, et al. A mesenchymal chondrosarcoma with aberrant nuclear expression of STAT6: a potential diagnostic pitfall. Pathol - Res Pract. avr 2022;232:153803.

71. Cheah AL, Billings SD, Goldblum JR, Carver P, Tanas MZ, Rubin BP. STAT6 rabbit monoclonal antibody is a robust diagnostic tool for the distinction of solitary fibrous tumour from its mimics. Pathology (Phila). août 2014;46(5):389-95.

72. Glauser S, Ameline B, Andrei V, Harder D, Pauli C, Trautmann M, et al. NKX3.1 immunohistochemistry and methylome profiling in mesenchymal chondrosarcoma: additional diagnostic value for a well-defined disease? Pathology (Phila). août 2023;55(5):621-8.

73. Toland AMS, Lam SW, Varma S, Wang A, Howitt BE, Kunder CA, et al. GRM1 Immunohistochemistry Distinguishes Chondromyxoid Fibroma From its Histologic Mimics. Am J Surg Pathol. oct 2022;46(10):1407-14.

74. Bereza M, Dembiński M, Zając AE, Piątkowski J, Dudzisz-Śledź M, Rutkowski P, et al. Epigenetic Abnormalities in Chondrosarcoma. Int J Mol Sci. 25 févr 2023;24(5):4539.
## RESUME

ANALYSE DU PROFIL D'EXPRESSION IMMUNOHISTOCHIMIQUE D'UNE COHORTE RÉTROSPECTIVE BICENTRIQUE DE CHONDROSARCOMES MÉSENCHYMATEUX ET COMPARAISON AVEC CELUI D'UNE COHORTE DE TÉMOINS CORRESPONDANT AUX PRINCIPAUX DIAGNOSTICS DIFFÉRENTIELS HISTOLOGIQUES

**Introduction** : Le chondrosarcome mésenchymateux (CSM) est une tumeur rare des os et tissus mous des sujets jeunes. Le diagnostic, difficile, nécessite une preuve histologique, associant du cartilage mature et un contingent à petites cellules rondes, soulevant, s'il est seul échantillonné sur biopsie, de nombreux diagnostics différents (DD). En l'absence de marqueur performant en immunohistochimie (IHC), le diagnostic est supporté en biologie moléculaire (BM) par la fusion *HEY1::NCOA2*.

Nos objectifs étaient d'établir une cohorte de CSM et trouver des outils diagnostiques en IHC.

**Matériel et Méthodes** : Nous avons constitué une cohorte rétrospective bicentrique de CSM, étudiés en BM en l'absence de preuve moléculaire, et de témoins correspondant aux DD. Nous avons étudié sur tissue micro arrays (TMA) l'expression de marqueurs d'IHC recommandés par le Réseau de Référence en Pathologie des Sarcomes (RRePS) et d'autres marqueurs potentiellement diagnostiques du CSM d'après les données physiopathologiques et de la littérature. L'expression des marqueurs d'intérêt a été vérifiée sur lame entière.

**Résultats** : Entre 2004 et 2024, 14 CSM étaient inclus, dont 13 confirmés en BM. Les études d'IHC sur TMA ont montré l'expression de CD99, PS100 et de marqueurs musculaires par le CSM et ont révélé 5 anticorps (RunX2, Sox9, NKX2.2, RB et SATB2) dont les performances diagnostiques individuelles étaient insuffisantes pour discriminer le CSM, mais dont l'usage en panel permettait d'atteindre une sensibilité de 77 % et une spécificité de 100 % ; corrigées après étude sur lame entière à respectivement 71% et 100%.

**Conclusion** : L'utilisation de RunX2, SOX9, NKX2.2, RB et SATB2, en complément du panel du RRePS face à un sarcome à cellules rondes, permet de suspecter le diagnostic de CSM avant obtention de la preuve moléculaire.

**Mots clés** : Chondrosarcome mésenchymateux ; sarcome à petites cellules rondes ; tumeur cartilagineuse ; immunohistochimie ; *HEY1::NCOA2*

## ABSTRACT

IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPRESSION PROFILE ANALYSIS OF A BICENTRIC RETROSPECTIVE COHORT OF MÉSENCHYMAL CHONDROSARCOMAS AND COMPARISON WITH A COHORT OF CONTROLS REPRESENTING THE MAIN HISTOLOGICAL DIFFERENTIAL DIAGNOSES

**Introduction:** Mesenchymal chondrosarcoma (MCS) is a rare tumor of bones and soft tissues of young adults. Its diagnosis is difficult and requires a histological confirmation, based on both mature cartilage and small round cells. When small round cells are solely sampled in a biopsy, it raises numerous differential diagnoses (DD). Because of no reliable marker of CSM in immunohistochemistry (IHC), the diagnosis must be supported in molecular biology (MB) by *HEY1::NCOA2* fusion.

Our objectives were to establish a cohort of MCS and to identify diagnostic tools in IHC.

**Materials and Methods:** We gathered a bicentric retrospective cohort of MCS, which were analyzed in MB in the absence of molecular evidence at the diagnosis, and a cohort of controls corresponding to the DD. On tissue microarrays (TMA), we analyzed by IHC the expression of markers recommended by the French Sarcoma Pathology Network (FSPN), as well as other markers potentially diagnostic of MCS based on pathophysiology and literature data. The expression of the most interesting markers was controlled on whole tissue slides.

**Results:** Between 2004 and 2024, 14 MCS were included, of which 13 were confirmed by MB. IHC studies on TMA revealed the expression of CD99, S100, and muscle markers by MCS, and identified 5 antibodies (RunX2, Sox9, NKX2.2, RB, and SATB2) whose individual diagnostic performances were insufficient to discriminate MCS. However, using these markers in a panel achieved a sensitivity of 77% and a specificity of 100%, which were corrected to 71% and 100%, respectively, after verification on whole slides.

**Conclusion:** The use of RunX2, SOX9, NKX2.2, RB, and SATB2, in addition to the FSPN panel in the context of a small round cell sarcoma, allows reasonably diagnostic suspicion of MCS before obtaining molecular evidence.

**Keywords:** Mesenchymal chondrosarcoma; small round cell sarcoma; cartilaginous tumor; immunohistochemistry; *HEY1::NCOA2*