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UNIVERSITÉ DE LORRAINE

ÉCOLE DOCTORALE « Ressources Procédés Produits Environnement »

Laboratoire Sols et Environnement

UMR 1120, Université de Lorraine-INRA

THÈSE

Présentée en vue de l'obtention du grade de

Docteur de l'Université de Lorraine en Sciences Agronomiques

par Joan Dupuy

Soutenue le 15 décembre 2014

Interactions entre les hydrocarbures aromatiques polycycliques et les plantes supérieures : prélèvement et réponses toxiques

Composition du jury :

Pierre-Marie BADOT, Professeur, Université de Franche-Comté

Rapporteur

Pierre BENOIT, Chargé de Recherche INRA, HDR, AgroParisTech

Rapporteur

Francis DOUAY, Professeur, ISA Lille

Examinateur

Jean Louis MOREL, Professeur, Université de Lorraine

Examinateur

Stéphanie OUVRARD, Chargé de Recherche INRA, LSE

Co-directrice

Thibault STERCKEMAN, Ingénieur de Recherche INRA, HDR, LSE

Directeur

Pierre LEGLIZE, Maître de conférences, Université de Lorraine

Invité
<figure><img src="image_1.png" /></figure>
REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier les membres du jury, Pierre-Marie Badot, Pierre Benoit, Francis Douay et Jean Louis Morel, pour avoir accepté de juger ce travail.

Je remercie très sincèrement mes directeurs de thèse, Thibault Sterckeman et Stéphanie Ouvrard, ainsi que mon encadrant « officieux » Pierre Leglize, pour m'avoir donné la chance de réaliser ce projet. Je tiens à leur exprimer ma reconnaissance pour m'avoir guidée durant ce long parcours, pour leur confiance, et surtout pour leur soutien infaillible durant certains moments difficiles. Je souhaite à tous doctorants de pouvoir évoluer dans un cadre aussi enrichissant que l'a été le mien durant ces trois dernières années.

Je tiens également à adresser mes remerciements à Jean Louis Morel et Christophe Schwartz, directeurs du Laboratoire Sols et Environnement, pour leur accueil au sein de cette unité si chaleureuse et productive.

Un grand merci à toute l'équipe technique qui m'a aidée à de nombreuses reprises à la bonne conduite de mes expérimentations et analyses : Adeline Bouchard, Stéphane Colin, Jean-Claude Bégin, Romain Goudon, Alain Rakoto, Lucas Charrois, ainsi que Rémi Baldo du GISFI et Jean-Claude Gallois pour les phytotrons. Merci également à Séverine Bonenberger, Sylvia L'Huillier et Laetitia Despouy pour leur grande aide dans les méandres de l'administration et de m'avoir ainsi permis d'éviter de nombreux tracas. Je remercie également l'ensemble des chercheurs du laboratoire pour leur bonne humeur et leur accessibilité : Appoline Auclerc, Marie-Laure Bonis, Élodie Chenot, Sophie Leguédois, Catherine Sirguey, Françoise Watteau, Émile Benizri, Guillaume Echevarria et Geoffrey Seré.
J'adresse aussi mes sincères remerciements à Catherine Lorgeoux du G2R pour son grand
secours dans mes analyses en GC-MS, Christophe Robin du LAE pour ses conseils en
physiologie végétale et Christian Mustin du LIEC pour son aide précieuse en microscopie. Je
tiens à remercier également Alexander Lux, Marek Vaculik, Michal Martinka ainsi que le reste
de l'équipe pour leur accueil chaleureux et enrichissant à l'Université de Coménius, à Bratislava.

Une partie de ce travail n'aurait pas pu être réalisée sans l'aide de mes supers stagiaires,
Sébastien Dewitt et Quentin Vincent, qui ont vraiment assumé leurs rôles. Je les en remercie.

Tous mes remerciements aux anciens doctorants, Fabien, Jean-Marc, Lucie, Hermine et Audrey,
pour leurs conseils avisés et bon courage aux futurs docteurs Sophie, Amina et Billy.

Merci à Elise, Catherine, Mélanie, Anne, Moktar, Cédric, Sarah, Tenghaobo, Pierre, Lucia, Ivan,
mes compagnons de route et amis. Nous aurons vécu de belles aventures tous ensemble. Une
pensée particulière à mon frère d'arme, présent depuis le début, le célèbre Frédéric. Nous avons
parcouru ce long parcours ensemble, et ce, toujours dans la bonne humeur et autour d'une tasse
de thé. Merci pour ton écoute et ta sagesse alsacienne. Cette aventure n'aurait pas été la même
sans notre cher camarade Robin ! Ton flegme britannique a enrichi notre thé de lait et nos soirées
de bières orléanaises. Ces déjeuners en votre compagnie au RU étaient des moments privilégiés.
Merci aussi à Marie, touche féminine mais renversante du groupe. Ton énergie a apporté un
nouveau souffle mais n'oublie pas de respirer entre deux manips ! Merci également à Ryad. Ta
gentillesse et tes boureks ont souvent réchauffé nos cœurs et estomacs. Vous êtes devenus des
amis précieux et que ça continue !
Je tiens à remercier mes parents, mes grands-parents, mes frères, ma belle-sœur, mes chenapans de neveux et nièce, pour m'avoir soutenue toutes ces années et transmis la chaleur du sud-ouest qui me manque tant. Merci également à ma belle-famille pour m'avoir accueillie à Nancy.

Le destin me réservait de belles surprises à Nancy et une rencontre a changé ma vie. Aujourd'hui, j'ai pu accomplir une étape professionnelle importante, et ce, grâce au soutien sans faille de celui qui est devenu mon mari, Dimitri. Les mots me manquent pour t'exprimer toute la reconnaissance et la gratitude que j'ai pour toi. Merci pour tout mon bien aimé.

Mes derniers mots sont pour toi, notre petit amour à venir, notre nouvelle aventure.
<figure><img src="image_2.png" /></figure>
# VALORISATIONS SCIENTIFIQUES

## Publications

Dupuy, J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T. 2015. Morphological and physiological responses of maize (Zea mays) exposed to sand contaminated by phenanthrene. Chemosphere, 124, 110-115.

Dupuy, J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T., Prediction of PAH Plant Uptake: Comparison of Passive Sampler and Tenax Extraction Methods. En préparation.

Dupuy, J., Leglize, P., Vincent, Q., Ouvrard, S., Mustin, C., Zelko, I., Sterckeman, T., Effect of phenanthrene exposure on suberization of apoplastic barriers of maize, consequence on plant development. En préparation.

Kleja, D. B., Enell, A., Pettersson, M., Kumpiene, J., Cornelissen, G., Arp, H. S., Dupuy, J., Leglize P., Ouvrard, S., Sterckeman T., Smolders, E., Hamels, F., Sonnet, P. 2015. IBRACS: Integrating Bioavailability in Risk Assessment of Contaminated Soils: opportunities and feasibilities. SNOWMAN NETWORK: Final Research Report (Project No. SN03-06).

## Posters

Dupuy, J., Leglize, P., Ouvrard, S., Sterckeman, T. Symptômes d'intoxication du maïs exposé au phénanthrène. Séminaire de l'école doctorale RP2E, Nancy (France), 13 janvier 2013.

Dupuy, J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T. Symptoms of intoxication in maize exposed to phenanthrene. 10th International Phytotechnologies Conference, Syracuse (New York, US), 1-4 octobre 2013.
Dupuy, J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T. Morphological and physiological responses of maize (Zea mays) exposed to formerly multicontaminated soils. 11<sup>th</sup> International Phytotechnologies Conference, Heraklion (Grèce), 30 septembre - 3 octobre 2014.

Dupuy, J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T. Evaluation of availability tools for PAH plant uptake prediction. 10<sup>th</sup> SETAC Europe Special Science Symposium « Bioavailability of organic chemicals: Linking science to risk assessment and regulation », Bruxelles (Belgique), 14-15 octobre 2014.

Communications orales

Dupuy J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T. 2012. Physiological responses of maize to polycyclic aromatic hydrocarbons - preliminary results. Université Coménius, Bratislava (Slovaquie), 4 octobre 2012.

Dupuy, J., Ouvrard, S., Leglize, P., Sterckeman, T. Intégration de la biodisponibilité dans l'évaluation du transfert sol/plante des hydrocarbures aromatiques polycycliques. 3<sup>èmes</sup> Rencontres Nationales de la Recherche sur les Sites et Sols Pollués, Paris (France), 18-19 novembre 2014.
# SOMMAIRE

<table><tr><td>Introduction générale</td><td>1</td></tr><tr><td>Chapitre 1 : État de l'art</td><td>5</td></tr><tr><td>1 Les sols de friches industrielles pollués par les HAP</td><td>7</td></tr><tr><td>1.1 Définition, origine et propriétés des HAP</td><td>7</td></tr><tr><td>1.2 Dynamique des HAP dans le sol</td><td>11</td></tr><tr><td>1.2.1 Principaux mécanismes réactionnels</td><td>11</td></tr><tr><td>1.2.2 Disponibilité</td><td>13</td></tr><tr><td>1.3 Réhabilitation des sols pollués par les HAP</td><td>16</td></tr><tr><td>1.3.1 Principes et mécanismes de la phytoremédiation</td><td>17</td></tr><tr><td>1.3.2 Avantages et inconvénients liés à la phytoremédiation</td><td>18</td></tr><tr><td>2 Fonctionnement de la plante en présence de HAP</td><td>20</td></tr><tr><td>2.1 Généralités sur la physiologie des plantes supérieures</td><td>20</td></tr><tr><td>2.2 Le système racinaire</td><td>22</td></tr><tr><td>2.2.1 Structure et développement</td><td>22</td></tr><tr><td>2.2.2 Fonctionnement</td><td>26</td></tr><tr><td>2.3 Les relations HAP-plante-microorganismes</td><td>27</td></tr><tr><td>2.3.1 Effets de la plante sur le polluant</td><td>27</td></tr><tr><td>2.3.2 Biodégradation des HAP par les micro-organismes</td><td>27</td></tr><tr><td>2.3.3 Transfert des HAP dans la plante : du sol aux racines</td><td>30</td></tr><tr><td>2.3.4 Mécanismes de prélèvement</td><td>30</td></tr><tr><td>2.3.5 Transport des HAP dans la plante</td><td>32</td></tr><tr><td>2.3.6 Modélisation du prélèvement des HAP par les plantes</td><td>32</td></tr><tr><td>2.3.7 Phytotoxicité des HAP</td><td>37</td></tr><tr><td>3 Conclusion et objectifs de thèse</td><td>42</td></tr><tr><td>Chapitre 2 : Matériels et méthodes</td><td>45</td></tr><tr><td>1 Matériels</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1 La plante : le maïs (Zea mays)</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1.1 Variété</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1.2 Pré-germination</td><td>47</td></tr><tr><td>1.2 Support de culture</td><td>48</td></tr><tr><td>1.2.1 Sable contaminé en phénanthrène</td><td>48</td></tr><tr><td>1.2.2 Terres industrielles polluées</td><td>49</td></tr><tr><td>1.3 Solution nutritive</td><td>53</td></tr><tr><td>2 Expérimentations de culture en conditions contrôlées de laboratoire</td><td>53</td></tr><tr><td>2.1 Cultures sur sable contaminé par le phénanthrène</td><td>53</td></tr><tr><td>2.1.1 Pour l'étude histologique de la racine séminale principale – Expérience I</td><td>54</td></tr><tr><td>2.1.2 Pour l'étude physiologique de la plante – Expérience II</td><td>54</td></tr><tr><td>2.2 Culture sur terres industrielles – Expérience III</td><td>56</td></tr><tr><td>3 Méthodes de caractérisation et outils d'analyses</td><td>57</td></tr><tr><td>3.1 Préparation et conditionnement des échantillons</td><td>57</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>3.1.1</td>
      <td>Lyophilisation</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.2</td>
      <td>Broyage</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>Méthodes de caractérisation des terres</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1</td>
      <td>Mesure de la capacité de rétention en eau (CRE)</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2</td>
      <td>Quantification du PHE total du sable</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.3</td>
      <td>Quantification des HAP dits « totaux » des terres industrielles</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.4</td>
      <td>Estimation de la fraction de HAP disponibles</td>
      <td>61</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.5</td>
      <td>Estimation de la concentration en HAP dans l'eau porale par échantillonneur passif</td>
      <td>62</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3</td>
      <td>Caractérisation des plantes</td>
      <td>64</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.1</td>
      <td>Quantification des éléments nutritifs</td>
      <td>64</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.2</td>
      <td>Dosage du carbone organique et de l'azote</td>
      <td>64</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.3</td>
      <td>Photosynthèse et transpiration</td>
      <td>65</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.4</td>
      <td>Humidité pondérale</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.5</td>
      <td>Allocation de la biomasse</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.6</td>
      <td>Caractéristiques géométriques du système foliaire</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.7</td>
      <td>Caractéristiques géométriques du système racinaire</td>
      <td>67</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.8</td>
      <td>Évaluation de la subérification de la racine séminale principale</td>
      <td>68</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.9</td>
      <td>Quantification des HAP dans le système racinaire</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.10</td>
      <td>Quantification des HAP dans le système aérien</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4</td>
      <td>Caractérisation des solutions de culture</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4.1</td>
      <td>Quantification du PHE</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4.2</td>
      <td>Dosage des nitrates en solution</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.5</td>
      <td>Méthodes d'analyse</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.5.1</td>
      <td>Analyse et quantification des HAP par HPLC</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.5.2</td>
      <td>Analyse et quantification des 16 HAP par GCMS</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.5.3</td>
      <td>Localisation du PHE par microscopie en épifluorescence</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.5.4</td>
      <td>Observations en microscopie confocale à balayage laser</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.5.5</td>
      <td>Analyses statistiques</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td colspan="2">Chapitre 3 : Transfert des HAP du sol à la plante</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1</td>
      <td>Évaluation de la bioaccumulation des HAP dans le maïs</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1</td>
      <td>Caractérisation de la contamination organique et des HAP totaux dans les terres industrielles</td>
      <td>83</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2</td>
      <td>HAP accumulés dans les racines</td>
      <td>86</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3</td>
      <td>HAP transloqués aux parties aériennes</td>
      <td>89</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2</td>
      <td>Estimation de la disponibilité des HAP dans les terres</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1</td>
      <td>Fraction extraite par résine Tenax®</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2</td>
      <td>Concentration en HAP dissous dans l'eau porale</td>
      <td>96</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3</td>
      <td>Prédiction de la bioaccumulation des HAP dans le maïs</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1</td>
      <td>Corrélation avec les fractions de HAP quantifiées dans les terres</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>Modélisation du prélèvement racinaire des HAP</td>
      <td>101</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3</td>
      <td>Modélisation de la translocation aux parties aériennes des HAP</td>
      <td>114</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4</td>
      <td>Localisation d'un HAP dans les racines à l'échelle cellulaire</td>
      <td>118</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5</td>
      <td>Conclusion</td>
      <td>124</td>
    </tr>
    <tr>
      <td colspan="2">Chapitre 4 : Fonctionnement du maïs exposé aux HAP</td>
      <td>127</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1</td>
      <td>Fonctionnement du maïs exposé aux HAP</td>
      <td>130</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1</td>
      <td>Allocation de la biomasse</td>
      <td>130</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>1.2</td>
      <td>Géométrie racinaire</td>
      <td>134</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3</td>
      <td>Nutrition minérale</td>
      <td>138</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.1</td>
      <td>Prélèvement de l'eau</td>
      <td>138</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.2</td>
      <td>Éléments dans les racines</td>
      <td>140</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.3</td>
      <td>Éléments dans les parties aériennes</td>
      <td>147</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.4</td>
      <td>Effets des terres sur le fonctionnement du maïs</td>
      <td>153</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2</td>
      <td>Fonctionnement du maïs exposé au PHE</td>
      <td>156</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1</td>
      <td>Devenir du PHE dans le milieu</td>
      <td>156</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.1</td>
      <td>Observation du PHE au sein du support de culture</td>
      <td>156</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.2</td>
      <td>Devenir dans le temps</td>
      <td>156</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2</td>
      <td>Réponses physiologiques du maïs</td>
      <td>160</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.1</td>
      <td>Allocation de la biomasse</td>
      <td>160</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2</td>
      <td>Géométrie du système foliaire</td>
      <td>163</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.3</td>
      <td>Géométrie du système racinaire</td>
      <td>164</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.4</td>
      <td>Fonctions physiologiques</td>
      <td>168</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3</td>
      <td>Subérification des tissus racinaires</td>
      <td>174</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3</td>
      <td>Conclusion</td>
      <td>179</td>
    </tr>
    <tr>
      <td></td>
      <td>Conclusion générale et perspectives</td>
      <td>184</td>
    </tr>
    <tr>
      <td></td>
      <td>Table des illustrations</td>
      <td>206</td>
    </tr>
    <tr>
      <td></td>
      <td>Annexes</td>
      <td>219</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
# INTRODUCTION

## GÉNÉRALE
Le déclin de l'industrie sidérurgique et minière à la fin du siècle passé a engendré l'apparition de milliers d'hectares de friches à travers le territoire européen. La Lorraine est l'une des régions françaises les plus concernées, avec le Nord Pas de Calais et la Loire. Si une grande partie de ces friches a pu être requalifiée pour accueillir de nouvelles activités industrielles et commerciales, une part non négligeable est restée sans changement depuis l'arrêt de l'activité. Ces anciennes exploitations se caractérisent par des contaminations variées, à la fois organiques (hydrocarbures) et minérales (métaux, sels). Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) y sont parmi les polluants organiques les plus répandus. Du fait de leur caractère récalcitrant, ils sont toujours présents en concentrations très élevées à ce jour. Le long temps de contact entre les HAP et les particules du sol contribue à la complexité de leur état réactionnel. La nocivité de ces composants étant reconnue, leur présence dans l'environnement engendre des risques immédiats ou différés pour la santé humaine et les écosystèmes. Parmi les procédés de dépollution classiques, les techniques physico-chimiques sont efficaces et rapides, mais relativement coûteuses et nécessitent généralement l'excavation des terres à traiter. De plus elles entraînent la perte des fonctions biologiques du sol. Les méthodes biologiques font appel à la capacité d'épuration des microorganismes endogènes des sols, stimulée par l'utilisation éventuelle d'amendements. Moins coûteuses, elles permettent de préserver l'intégrité biologique, chimique et physique des sols limitant la perte de leur fertilité. La rhizodégradation est une déclinaison de ces procédés biologiques qui utilise les végétaux et la microflore associée comme vecteur de la dégradation des polluants organiques. Toutefois, l'efficacité de cette technique, démontrée en conditions contrôlées de laboratoire, est limitée *in situ* par de fortes mortalités ou l'inhibition de croissance de la plante. De plus, la biomasse cultivée sur ces sols de friches représente une menace pour la chaine alimentaire du fait d'un risque d'accumulation des polluants. Les contraintes d'utilisation de la rhizodégradation soulèvent alors une série de questions sur les interactions entre les plantes
et les HAP de sols industriels contaminés : à quelle fraction de HAP la plante est-elle exposée ?

À quel niveau la plante peut-elle accumuler des HAP ? Quels sont les mécanismes impliqués dans le prélèvement des HAP par la plante ? Comment le fonctionnement de la plante est-il affecté ?

Cette thèse a pour objectif général la compréhension des mécanismes de transfert et de translocation des HAP dans la plante et l'identification des réponses toxiques de celle-ci. Dans cette optique, les travaux de cette thèse se sont attachés à :

i. aider à l'amélioration de modèles existant pour l'évaluation de la fraction de HAP absorbable par la plante,

ii. étudier le comportement de HAP dans le sol et la plante en caractérisant les facteurs contrôlant le transfert des HAP à la plante,

iii. évaluer l'impact des HAP sur les végétaux.

Le premier chapitre présente une synthèse des connaissances déjà acquises sur l'évolution des HAP dans le sol et le fonctionnement de plantes supérieures en leur présence. L'accent est porté sur la pollution des sols de friche industrielle, les caractéristiques des HAP étudiés, leur dynamique dans les sols et l'intérêt de la rhizodégradation dans un contexte de dépollution de ces composés. Sont également présentés le fonctionnement général d'une plante et les relations HAP-plante connues. Le second chapitre présente les matériels sélectionnés ainsi que l'ensemble des techniques analytiques et expérimentations utilisées au cours de ces travaux de thèse. Le troisième chapitre porte sur le transfert des HAP dans le maïs. Il est consacré à l'évaluation d'outils et modèles pour prédire la bioaccumulation des HAP par les plantes afin de valider les mécanismes de prélèvements, caractériser les facteurs pouvant contrôler la bioaccumulation des
## Introduction générale

HAP dans la plante et déterminer où et comment un HAP pénètre le système racinaire de la plante. Le quatrième chapitre s'intéresse au fonctionnement physiologique du maïs exposé aux HAP. Leurs effets sur la plante sont évalués sur des systèmes de complexité croissante, depuis un sable contaminé avec un HAP à des terres multicontaminées d'anciennes friches industrielles, à différentes échelles, allant de la cellule à la plante entière. Enfin la dernière partie synthétise les principaux résultats afin de proposer un modèle de fonctionnement de la plante en présence de HAP et d'ouvrir sur de nouvelles perspectives pour aider à l'amélioration de la rhizodégradation appliquée aux terres de friches industrielles.
# CHAPITRE 1 : ÉTAT

DE L'ART
## SOMMAIRE CHAPITRE 1

<table><tr><td>1</td><td>Les sols de friches industrielles pollués par les HAP</td><td>7</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Définition, origine et propriétés des HAP</td><td>7</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Dynamique des HAP dans le sol</td><td>11</td></tr><tr><td>1.2.1</td><td>Principaux mécanismes réactionnels</td><td>11</td></tr><tr><td>1.2.2</td><td>Disponibilité</td><td>13</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Réhabilitation des sols pollués par les HAP</td><td>16</td></tr><tr><td>1.3.1</td><td>Principes et mécanismes de la phytoremédiation</td><td>17</td></tr><tr><td>1.3.2</td><td>Avantages et inconvénients liés à la phytoremédiation</td><td>18</td></tr><tr><td>2</td><td>Fonctionnement de la plante en présence de HAP</td><td>20</td></tr><tr><td>2.1</td><td>Généralités sur la physiologie des plantes supérieures</td><td>20</td></tr><tr><td>2.2</td><td>Le système racinaire</td><td>22</td></tr><tr><td>2.2.1</td><td>Structure et développement</td><td>22</td></tr><tr><td>2.2.2</td><td>Fonctionnement</td><td>26</td></tr><tr><td>2.3</td><td>Les relations HAP-plante-microorganismes</td><td>27</td></tr><tr><td>2.3.1</td><td>Effets de la plante sur le polluant</td><td>27</td></tr><tr><td>2.3.2</td><td>Biodégradation des HAP par les micro-organismes</td><td>27</td></tr><tr><td>2.3.3</td><td>Transfert des HAP dans la plante : du sol aux racines</td><td>30</td></tr><tr><td>2.3.4</td><td>Mécanismes de prélèvement</td><td>30</td></tr><tr><td>2.3.5</td><td>Transport des HAP dans la plante</td><td>32</td></tr><tr><td>2.3.6</td><td>Modélisation du prélèvement des HAP par les plantes</td><td>32</td></tr><tr><td>2.3.7</td><td>Phytotoxicité des HAP</td><td>37</td></tr><tr><td>3</td><td>Conclusion et objectifs de thèse</td><td>42</td></tr></table>
# 1 Les sols de friches industrielles pollués par les HAP

En 2014, l'Agence Européenne de l'Environnement (AEE) estime à 2,5 millions le nombre de sites potentiellement contaminés à travers l'Europe. Parmi ceux-là, environ 14 % seraient pollués et nécessiteraient une réhabilitation. Un tiers de ces sites sont déjà identifiés et 15 % ont été traités. Chaque année, la gestion des sites et sols pollués en Europe coûterait près de 6,5 millions d'euros aux contribuables et au secteur privé ("Soil contamination widespread in Europe", AEE). En France, près de 5600 sites et sols pollués (ou potentiellement pollués) sont recensés à ce jour et appellent à une action des pouvoirs publics, à titre préventif ou curatif. Ce chiffre est en constante augmentation car régulièrement mis à jour d'après des données historiques sur les anciens sites industrialisés, généralement à l'état de friche. Avec l'accroissement des populations et l'étalement urbain, il convient de réhabiliter des friches industrielles en zones résidentielles ou récréatives. La Lorraine est une des régions des plus concernées, avec quasiment 400 sites répertoriés. En terme d'occurrence, les principaux polluants constatés à l'échelle nationale sont organiques : les hydrocarbures (25 %) et les HAP (11 %), seuls ou en mélange avec des polluants d'autre nature (Ministère de l'Écologie, du Développement Durable et de l'Énergie).

## 1.1 Définition, origine et propriétés des HAP

Les HAP sont des molécules organiques, exclusivement constituées d'atomes de carbone et d'hydrogène et au moins deux noyaux benzéniques. Les HAP regroupent plusieurs centaines de molécules et peuvent avoir deux origines : pétrogéniques et pyrolitiques. Les HAP d'origine pétrogénique sont formés lors de la transformation géologique de la matière organique (MO) et sont présents dans les matières organiques fossiles (houille, pétrole). Les concentrations individuelles des HAP d'origine naturelle sont de l'ordre de 1 à 10 µg kg⁻¹ de sol sec soit des
concentrations totales en HAP de 500 à 1500 µg kg⁻¹ de sol sec (Wilcke 2000). Les HAP d'origine pyrolytique sont produits par la combustion incomplète ou la pyrolyse de toute MO à haute température. Les HAP produits par la combustion sont la principale source de HAP dans l'environnement (Baek et al. 1991; Menzie et al. 1992). À la fin du 18ème siècle, le charbon devint la principale source d'énergie et fut le moteur de la révolution industrielle en Europe. Grâce à ses nombreux gisements, la France put exploiter ces ressources durant près de deux siècles, notamment dans les bassins du Nord-Pas-de-Calais, de la Loire et de la Lorraine. Le charbon était ainsi le principal moteur de l'activité sidérurgique et de la production d'électricité. La sidérurgie requiert du charbon concentré en carbone quasi pur, le coke. La fabrication de celui-ci est appelée la cokéfaction. Le charbon subit une pyrolyse dans un four à plus de 1000 °C (Doumergue 1962). Le coke produit peut ensuite être mélangé à du minerai de fer pour fabriquer la fonte et l'acier. La cokéfaction produit également du gaz, transformé pour un usage domestique et des goudrons de houille. Des concentrations plus de 1000 fois supérieures à celles naturelles sont détectées dans les sols de ces anciens sites industriels, tels que des usines à gaz, cokeries et raffineries de pétrole et qui sont parmi les plus contaminés (Wilson et Jones 1993).

L'agence de protection de l'environnement des États-Unis (US-EPA) a retenu 16 HAP en tant que polluants prioritaires pour leur étude et leur élimination dans l'environnement du fait de leur potentiel toxique, cancérigène et mutagène. La Figure 1 représente les structures chimiques et les masses moléculaires de ces HAP.
Chapitre 1 : État de l'art

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 1 – Représentations des 16 HAP prioritaires retenus par l'US-EPA avec leurs abréviations et leurs masses moléculaires (d'après Mackay et al. 2006)**</figcaption></figure>

Les propriétés chimiques et physiques des HAP sont déterminées par la taille, la structure et les atomes qui composent la molécule. Elles sont dépendantes du nombre de cycles aromatiques qui les composent (Tableau 1).
<table><caption>Tableau 1 – Caractéristiques chimiques des 16 HAP prioritaires retenus par l'US-EPA
(Mackay et al. 2006)</caption><thead><tr><td>Molécule</td><td>Nombre de cycles aromatiques</td><td>Solubilité dans l'eau (mg L<sup>-1</sup> à 25°C)</td><td>Pression de vapeur (mPa à 25°C)</td><td>Log K<sub>ow</sub></td></tr></thead><tbody><tr><td>NAPH</td><td>2</td><td>31,8</td><td>10500</td><td>3,70</td></tr><tr><td>ACY</td><td>2</td><td>3,94</td><td>890</td><td>4,06</td></tr><tr><td>ACE</td><td>2</td><td>3,70</td><td>360</td><td>3,92</td></tr><tr><td>FLU</td><td>2</td><td>1,98</td><td>90</td><td>4,18</td></tr><tr><td>PHE</td><td>3</td><td>1,2</td><td>91</td><td>4,57</td></tr><tr><td>ANT</td><td>3</td><td>0,04</td><td>1,25</td><td>4,45</td></tr><tr><td>FLA</td><td>3</td><td>0,26</td><td>64</td><td>5,20</td></tr><tr><td>PYR</td><td>4</td><td>0,13</td><td>0,9</td><td>5,23</td></tr><tr><td>BaA</td><td>4</td><td>0,01</td><td>6,65 10<sup>-4</sup></td><td>5,66</td></tr><tr><td>CHY</td><td>4</td><td>2,0 10<sup>-3</sup></td><td>8,4 10<sup>-2</sup></td><td>5,86</td></tr><tr><td>BbF</td><td>4</td><td>1,5 10<sup>-3</sup></td><td>2,12 10<sup>-2</sup></td><td>6,57</td></tr><tr><td>BkF</td><td>4</td><td>8,1 10<sup>-4</sup></td><td>1,3 10<sup>-4</sup></td><td>6,84</td></tr><tr><td>BaP</td><td>5</td><td>3,8 10<sup>-3</sup></td><td>7,3 10<sup>-4</sup></td><td>6,07</td></tr><tr><td>IcdP</td><td>5</td><td>5,0 10<sup>-5</sup></td><td>1,3 10<sup>-5</sup></td><td>6,60</td></tr><tr><td>BghiP</td><td>6</td><td>5,0 10<sup>-4</sup></td><td>2,6 10<sup>-6</sup></td><td>6,73</td></tr><tr><td>dBahA</td><td>5</td><td>5,0 10<sup>-4</sup></td><td>1,3 10<sup>-5</sup></td><td>6,70</td></tr></tbody></table>

Plus le nombre de cycles aromatiques augmente, plus l'affinité pour une phase organique augmente et de ce fait, son hydrophobie comme l'atteste l'augmentation du coefficient de partage octanol/eau (K<sub>ow</sub>), exprimé en logarithme, qui correspond au rapport de concentration à l'équilibre du composé organique entre l'eau et une phase n-octanol. Inversement, moins il y a de cycles aromatiques, plus sa solubilité dans l'eau et sa volatilité (exprimée par la pression de vapeur) sont élevées. Ainsi, ces propriétés physico-chimiques vont grandement influer sur le
comportement (persistance, mobilité et biodisponibilité) de ces molécules organiques dans l'environnement.

## 1.2 Dynamique des HAP dans le sol

### 1.2.1 Principaux mécanismes réactionnels

Après introduction du polluant organique dans le sol, plusieurs mécanismes, telles que l'absorption, l'adsorption, la désorption et la diffusion peuvent être mis en jeu (Figure 2).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 2 – Mécanismes d'interaction des contaminants organiques avec le sol (d'après Semple et al. 2003)</figcaption></figure>
**L'absorption** caractérise le transfert d'une espèce chimique de l'extérieur à l'intérieur d'une phase solide, liquide ou gazeuse (Honeyman et Santschi 1988).

**L'adsorption** caractérise l'association d'une espèce chimique à la surface des composantes solides du sol par des liaisons faibles de type Van der Waals. Dans le cas des HAP, elle peut avoir lieu sur toutes les surfaces des différentes phases solides du sol ; minime sur les particules minérales, elle est très importante sur la MO (Murphy *et al.* 1990). Son mécanisme inverse est la désorption, qui permet le passage des HAP adsorbés en phase aqueuse. Mais la désorption est souvent plus lente que l'adsorption, ce qui traduit un phénomène d'hystérèse (Pignatello et Xing 1996; Alexander 2000). Il est également possible qu'une fraction des HAP ne soit pas désorbée et persiste ainsi dans le sol (Hatzinger et Alexander 1995). La fraction de HAP non désorbée augmente avec le temps de contact avec le sol, ce mécanisme est appelé « vieillissement » (Hatzinger *et al.* 1995). Les travaux de Karickhoff (1981) montrent que les HAP suivent un isotherme de sorption linéaire à faibles concentrations, dont la pente est le coefficient de partage $K_d$ qui dépend de la fraction de matière organique $f_{oc}$ dans la matrice :

$$K_d = K_{oc} \times f_{oc} \quad (\text{Équation 1})$$

où $K_{oc}$ est le coefficient de partition de la molécule entre la MO et l'eau, considéré comme le principal paramètre pour décrire le transfert et le devenir de la molécule dans le système sol-eau (Chiou *et al.* 2001; Nguyen *et al.* 2005). Le $K_{oc}$ peut être prédit par les propriétés chimiques de la molécule considérée, telle que son hydrophobie (Nguyen *et al.* 2005) :

$$\log K_{oc} = 1,14 \log K_{ow} - 1,02 \quad (\text{Équation 2}).$$
La diffusion est un mécanisme de transfert qui est contrôlé par le gradient de concentration. Il constitue un processus majeur de séquestration des composés organiques à l'intérieur des particules du sol (Pignatello et al. 1996; Semple et al. 2003). L'élément peut diffuser dans les particules du sol (minérales ou organiques) ainsi que dans la porosité formée entre les particules solides. Une fois piégés, les composés organiques s'adsorbent sur les parois. La cinétique de diffusion est lente, limitant ainsi le transfert. Ces deux effets (séquestration et vitesse de transfert limitée) contribuent à réduire l'accessibilité des HAP pour les micro-organismes et les racines de la plante.

## 1.2.2 Disponibilité

Selon l'intensité des interactions entre les HAP et la matrice solide du sol, les HAP trouver sous deux formes différentes : disponible ou non. La disponibilité d'un combine deux processus en série : la mobilisation et le transport (

Figure 3). Sous cette f (e.g. absorption par physiques (e.g. lixiv absorbables et transfor

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

giques (on) ou lécules
## **Figure 3 – Schéma général définissant la disponibilité**

Du fait des fortes interactions des HAP avec la phase solide du sol, leur disponibilité est souvent bien inférieure à leur concentration totale déterminée par extraction dans des solvants organiques (Alexander 2000). De ce fait, des techniques ont été développées pour tenter de rendre compte de la quantité ou concentration en HAP à laquelle sont exposés les organismes du sol ou les plantes.

Des extractions utilisant des solvants moins apolaires dites extractions douces, tel que le butanol, sont faciles à mettre en place (Reid et al. 2000; Liste et Alexander 2002; Swindell et Reid 2006; Oleszczuk 2009). Ces extractions présentent de bonnes corrélations avec la fraction dégradable par les microorganismes (Kelsey et al. 1996; Reid et al. 2000; Liste et al. 2002).

L'utilisation de molécules « cages» comme l'hydroxypropyl-β-cyclodextrine (HPCD) est également possible (Cuypers et al. 2002; Swindell et al. 2006; Bergknut et al. 2007; Oleszczuk 2009). Ce polymère composé de sept molécules de glucose possède une structure en tronc de cône, délimitant ainsi une cavité en son centre. Cette cavité est capable « d'encapsuler » des molécules hydrophobes tels que les HAP, du fait d'un environnement apolaire à l'intérieur de la cavité, tandis que les groupements hydroxyles en périphérie permettent une bonne solubilité du polymère en milieu aqueux. Des études ont ainsi mis en évidence une bonne corrélation entre la fraction de HAP extraits et celle minéralisée par les bactéries (Reid et al. 2000; Stokes et al. 2005).

Les extractions sur phases solides avec des résines de type Tenax® peuvent être employées. Ces résines se comportent comme des puits en piégeant les HAP présents en phase aqueuse
(Cornelissen et al. 1997; Oleszczuk 2008, 2009; Barnier et al. 2014). Les capacités de sorption de ce matériau permettent de s'en servir comme « puits » pour les composés organiques se désorbant d'un sol ou d'un sédiment (Pignatello 1990). Un protocole de mesure de disponibilité des HAP a pu être adapté au contexte particulier des sols de friches industrielles (Barnier et al. 2014). Le Tenax® a fait l'objet de nombreux travaux (MacRae et Hall 1998; ten Hulscher et al. 2003; Oleszczuk 2008, 2009; Heijden et Jonker 2009) qui montrent notamment de bonnes corrélations avec la bioaccumulation de HAP dans des vers de terre. La résine Tenax® peut également servir comme outil de prédiction pour les réponses toxiques d'organismes tels que les plantes. Une bonne corrélation avec la germination de la laitue cultivée sur la terre d'une ancienne usine à gaz (R² = 0,80) a ainsi été mise en évidence avec la concentration de 5 HAP (BaP, BkF, BaA, dBahA et IcdP) extraits par résine Tenax® (Cofield et al. 2008).

Les échantillonneurs passifs, tel que le polyoxyméthylène (POM), sont l'objet d'un intérêt grandissant car ils permettent la détermination de la concentration en HAP dans l'eau porale du sol (Hawthorne et al. 2009; Endo et al. 2011; Gomez-Eyles et al. 2012). Une étude récente a montré une bonne capacité à prédire la quantité de HAP bioaccumulés dans les vers de terre à partir des concentrations déterminées par la méthode POM (Gomez-Eyles et al. 2012).

Toutefois, ces méthodes présentent de grandes variabilités selon l'organisme cible. Dans le cas de ray-grass cultivés sur des terres historiquement contaminées, les concentrations obtenues par des extractions réalisées au butanol et au HPCD sont 10 à 1000 fois supérieures à celles mesurées dans la biomasse racinaire, quand celles obtenues avec le POM tendent à sous-estimer cette accumulation (Gomez-Eyles et al. 2012).
Prédire la bioaccumulation des HAP dans les organismes qui interagissent avec les sols contaminés représente un enjeu important dans l'évaluation quantitative du risque sanitaire et dans la réhabilitation des sites et sols pollués. Une surestimation pourrait engendrer des frais supplémentaires et des traitements plus longs et/ou plus agressifs pour le sol. Au contraire, sous-estimer les risques de transfert pourrait représenter un danger pour la santé.

## 1.3 Réhabilitation des sols pollués par les HAP

L'estimation du risque induit par la présence des HAP dans l'environnement est basée sur le croisement entre des aspects liés à leur dangerosité (détermination de leur toxicité) et l'estimation de l'exposition. Lorsque le risque est avéré, il peut y avoir nécessité de dépolluer ces sols et/ou d'en limiter la dispersion. Dans le cas de sols contaminés, il est possible de traiter le sol en place (méthodes in situ), soit après excavation directement sur le site (méthode on site) ou sur une plateforme de traitement (méthodes ex situ). À ce jour, de nombreuses stratégies de remédiation sont possibles : extraction par solvant, oxydation chimique, dégradation photo-catalytique, remédiation électrocinétique, traitement thermique... (Gan et al. 2009). Mais ces techniques, basées sur des méthodes physico-chimiques coûteuses, sont souvent peu adaptées au traitement de grandes surfaces et affectent négativement la fertilité et l'activité biologique des sols.

Bien que plus longues, des techniques biologiques telles que la bioremédiation ou la phytoremédiation sont souvent jugées plus respectueuses de l'environnement et moins coûteuses que les techniques classiques de traitement sur site et hors site. Toutefois, les procédés biologiques ne permettent de traiter que la fraction de polluants disponibles. La bioremédiation consiste en l'utilisation d'organismes vivants, en particulier les micro-organismes, pour dépolluer les sols contaminés par des processus de dégradation, d'atténuation ou de transformation (Wenzel
2009). Les micro-organismes utilisent le polluant comme source d'énergie. Il est possible d'accélérer cette biodégradation en inoculant des micro-organismes spécifiques ou en stimulant l'activité microbienne indigène par des améliorations biochimiques du milieu (e.g. apports de nutriments, pH, potentiel d'oxydoréduction). La phytoremédiation fait référence à « l'utilisation des plantes vertes et de leur microbiote associé, d'amendement du sol et de techniques agronomiques pour éliminer, contenir, ou rendre moins toxiques les contaminants environnementaux » (Cunningham et al. 1995).

## 1.3.1 Principes et mécanismes de la phytoremédiation

La phytoremédiation recouvre différents procédés dont les principaux sont la phytostabilisation, la rhizodégradation, la phytodégradation, la phytoextraction et la phytovolatilisation (Figure 4).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 4 – Principaux mécanismes de phytoremédiation (Sterckeman et al. 2012)**</figcaption></figure>

Le choix du procédé et de son efficacité potentielle dépend du type de contaminants (métalliques, organiques, multi-contamination), de leurs caractéristiques (volatilité,
biodégradabilité), de leur disponibilité ainsi que des propriétés agronomiques du sol. La phytostabilisation et la phytoextraction sont des techniques généralement utilisées pour les polluants métalliques. Dans le cas de pollutions organiques des sols, les processus impliqués sont la phytodégradation, la phytovolatilisation, la phytostimulation et la rhizodégradation (Sterckeman et al. 2012). La première, la phytodégradation, consiste à dégrader certains composés organiques à travers l'activité métabolique de la plante (e.g.. production d'enzymes de type déhalogénase, oxygénase). La seconde méthode, la phytovolatilisation, consiste en l'absorption du contaminant dans le sol, sa métabolisation sous forme gazeuse dans la plante et sa libération dans l'atmosphère. La troisième, la rhizodégradation est un processus de remédiation dans lequel les contaminants sont transformés par les micro-organismes de la rhizosphère. La plante stimule l'activité métabolique, et de ce fait, l'activité dégradante des communautés fongiques et bactériennes dans la rhizosphère.

Tous ces procédés sont actifs au sens où ils nécessitent l'implantation d'un couvert végétal spécifique. Dans certains contextes (risque plus limité), un procédé d'atténuation naturelle peut être mis en place. La rhizoatténuation consiste à laisser se développer le couvert végétal local sur le site. L'action naturelle des plantes et les mécanismes de sorption irréversibles suffisent à la dissipation lente de la pollution (Ouvrard et al. 2014), sans intervention humaine au cours des années. Ce procédé est toujours accompagné de la mise en place d'un plan de suivi de la pollution.

## 1.3.2 Avantages et inconvénients liés à la phytoremédiation

Le Grenelle de l'Environnement compte les sites et sols pollués parmi ses champs d'action prioritaires. L'article 43 de la loi Grenelle II précise que « les techniques de dépollution par les
plantes seront de préférence utilisées » pour la réhabilitation des sites pollués. En effet, la phytoremédiation est moins invasive et moins destructive que les procédés de remédiations physico-chimiques. Ces derniers déstructurent le sol et le laissent généralement biologiquement inactif. Le Tableau 2 présente des coûts estimés de traitements sur site et hors site, avec et sans plantes, dans des projets divers de réhabilitation de sites pollués en France et aux États-Unis.

<table><caption>Tableau 2 – Estimations des coûts de procédés de remédiations physico-chimiques et de phytoremédiation de sols en France et aux États-Unis (d'après Sterckeman et al. 2012)</caption><thead><tr><th rowspan="2">Procédé</th><th rowspan="2">Pays</th><th rowspan="2">Contaminant</th><th colspan="2">Coût (€ m<sup>-2</sup> de terre)</th></tr><tr><th>Minimum ou moyen</th><th>Maximum</th></tr></thead><tbody><tr><td>Confinement in situ</td><td>France</td><td>Organiques et/ou minéraux</td><td>5</td><td>60</td></tr><tr><td>Extraction chimique hors site</td><td>France</td><td>Organiques et/ou minéraux</td><td>34</td><td>546</td></tr><tr><td>Désorption thermique sur site</td><td>France</td><td>Organiques</td><td>25</td><td>46</td></tr><tr><td>Stabilisation physico-chimique sur site</td><td>France</td><td>Métaux</td><td>10</td><td>50</td></tr><tr><td>Phytoremédiation</td><td>États-Unis</td><td>Métaux</td><td>4</td><td>39</td></tr><tr><td>Phytostabilisation</td><td>France</td><td>Organiques et/ou minéraux</td><td>2</td><td>12</td></tr><tr><td>Phytoextraction</td><td>France</td><td>Métaux</td><td>&lt; 4</td><td>40</td></tr></tbody></table>

Les coûts liés à la réhabilitation d'un sol varient principalement selon la localisation du site à traiter, le type de contaminant, le niveau et l'étendue (horizontale et verticale) de la contamination, ainsi que les travaux impliqués. Néanmoins, l'excavation et les traitements physico-chimiques sont les moyens les plus onéreux, quand la phytoremédiation apparaît comme étant le procédé le moins cher. De plus, le couvert végétal peut restaurer en partie les services
écosystémiques perdus par le sol. Du fait des risques de transfert des contaminants à la plante, la biomasse ne peut être utilisée pour un usage alimentaire mais elle peut être valorisée par d'autres utilisations comme énergétique ou production de matière première (service d'approvisionnement). La nouvelle végétation peut également participer à une meilleure qualité de l'air et de l'eau alentour, diminuer l'érosion et capter le carbone atmosphérique dans le sol (services de régulation et d'assistance). Elle offre également un nouveau paysage à d'anciens sites urbains abandonnés et autres sites contaminés (service culturel).

Néanmoins, la phytoremédiation requiert plus de temps que les techniques physico-chimiques et peut nécessiter plusieurs successions culturales. De plus, dans les cas de sols fortement contaminés comme ceux de friches industrielles, les végétaux sont soumis au stress de la pollution et leur efficacité de remédiation s'en trouve affectée. Cette efficacité peut être considérée comme multifactorielle : conditions environnementales, nature (origine, type, disponibilité du polluant) et répartition de la pollution, espèce végétale (biomasse, tolérance à la pollution, potentiel absorbant, profondeur d'enracinement).

## 2 Fonctionnement de la plante en présence de HAP

### 2.1 Généralités sur la physiologie des plantes supérieures

Les plantes vascularisées, dites supérieures, établissent un réseau entre l'eau, le sol et l'air et présentent un fonctionnement physiologique complexe. Celui-ci exige l'acquisition d'éléments indispensables au développement de la plante et une organisation interne permettant de répondre à ces besoins et aux contraintes environnementales. Étant des organismes autotrophes, les plantes convertissent le carbone minéral (CO₂) et l'eau en carbone organique, sous la forme de sucres, en utilisant l'énergie solaire. C'est la photosynthèse. Ces sucres sont par la suite utilisés pour
produire l'énergie et la matière nécessaires à la plante. De façon schématique, on peut distinguer quatre principaux processus interdépendants dans le fonctionnement d'une plante : la photosynthèse, la respiration, la transpiration et la nutrition minérale (Figure 5).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 5 – Fonctionnement schématique de la physiologie d'une plante supérieure (d'après Nabors 2008)</figcaption></figure>

Les feuilles, portées par les tiges, sont notamment le siège de la photosynthèse. Cet ensemble de réactions a lieu plus exactement dans des organites microscopiques appelés chloroplastes, nombreux dans les cellules foliaires. L'énergie solaire est utilisée pour convertir le CO₂ atmosphérique et l'eau du sol en sucres par une série de réactions. Un second processus permet la dégradation des sucres pour libérer du CO₂ et produire de l'énergie et de l'eau. C'est la
respiration, interdépendante de la photosynthèse, prenant place dans les mitochondries, autres organites cellulaires. L'énergie produite sert à d'autres mécanismes physiologiques dans l'organisme végétal. La synthèse des constituants de la plante est possible grâce à l'ensemble de ces processus.

## 2.2 Le système racinaire

Un intérêt plus approfondi est porté au fonctionnement du système racinaire, premier organe de la plante en contact avec les polluants dans le sol. Deux principaux modèles architecturaux de système racinaire se distinguent : le système racinaire fasciculé, caractérisé par le développement de nombreuses racines adventives, d'égale importance, et le système racinaire pivotant, avec le développement prédominant d'une racine principale. Celle-ci est issue de la croissance de la radicule de la plantule, qui se développe et se ramifie en racines latérales, d'ordre inférieur. Les racines latérales (secondaires, tertiaires, etc.) peuvent dans certains cas prendre beaucoup d'importance dans les systèmes racinaires fasciculés (Figure 6).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 6 – Architectures racinaires de type pivotant et fasciculé (d'après « Notions essentielles de botanique générale : la racine »)</figcaption></figure>

2.2.1 **Structure et développement**

La croissance racinaire longitudinale a lieu à l'extrémité de la racine, l'apex (Figure 7). Zone méristématique, l'apex est le siège de divisions cellulaires, permettant à la racine une croissance continue en longueur. Les cellules initiales du méristème apical sont dans le centre quiescent. Une coiffe protège le méristème apical, qui a pour origine une zone située au-dessous du centre quiescent. Les cellules externes produisent une gaine de mucilage polysaccharidique ayant un rôle lubrifiant, permettant une meilleure pénétration de la racine dans le sol. Les cellules dérivées du méristème apical forment, de l'intérieur vers l'extérieur, le procambium, le méristème fondamental et le protoderme. Cette zone de division cellulaire est suivie d'une zone d'élongation des cellules, mécanisme majeur de la croissance racinaire, et d'une zone de différenciation. Le procambium est à l'origine des tissus conducteurs, le xylème et le phloème qui forment la stèle ou au cylindre central de la racine. Les tissus fondamentaux, ou de soutien, sont issus du méristème fondamental et constituent l'écorce ou cortex. Enfin, les tissus de revêtements sont des
assises cellulaires superficielles, originaires du protoderme, offrant une protection périphérique à la plante, avec pour dénomination le rhizoderme chez les racines. Certaines cellules rhizodermiques peuvent se différencier en poils absorbants, spécialisés dans le prélèvement de l'eau et des sels minéraux (Figure 7).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 7 - Structure type d'une racine (Nabors 2008)**</figcaption></figure>

Le développement racinaire dépend de la plante mais également des conditions environnementales, telles que la distribution spatiale et temporelle de l'eau et des nutriments, ainsi que des propriétés physiques du sol lui-même. Ces informations sont reconnues comme des signaux externes et relayés par des messagers internes, les hormones.
Une hormone est généralement définie comme une substance naturelle qui exerce des effets variables sur l'organisme selon sa concentration ou selon le type ou la localisation des cellules cibles. Les hormones végétales, ou encore phytohormones, sont synthétisées dans les racines même ou d'autres parties de la plante. Elles permettent la communication intercellulaire en jouant un rôle de messagers chimiques. Ces molécules se lient à des protéines associées aux membranes des cellules ciblées, déclenchant ainsi une série d'évènements, appelée voie de transduction du signal. Cette voie fait intervenir des molécules intermédiaires, des messagers secondaires, interagissant pour relayer l'information. Les informations sont véhiculées dans l'ensemble de l'organisme et régulent le fonctionnement et le développement de la plante par stimulation ou inhibition. Les réponses hormonales peuvent impliquer plusieurs voies de transduction du signal.

À ce jour, six groupes d'hormone végétale ont été définis : les auxines (substances possédant des propriétés physiologiques voisines et une conformation chimique apparentée à l'acide indole-acétique), les cytokinines (substances proches des bases puriques), les gibbérellines (molécules diterpènes, possédant toutes un noyau énantiomère du gibbérelane), les brassinostéroïdes (autres molécules organiques ayant une activité biologique), l'acide abscissique (ABA), et l'éthylène (hydrocarbure gazeux simple).

Les hormones sont en interaction constante et peuvent affecter les différents processus de la croissance des racines de multiples façons. Les auxines, produites dans le méristème (Leyser 2006), interviennent notamment dans la formation et le développement des ramifications racinaires (Benková et al. 2003; Blilou et al. 2005). A contrario, les cytokinines inhibent l'initiation des racines latérales et la vitesse d'élongation des racines (Aloni et al. 2006; Laplaze et al. 2007). De même, l'accumulation d'ABA stimule la croissance racinaire, et au niveau des parties aériennes, son accumulation a une action inhibitrice (Sharp 1996). A l'inverse,
l'augmentation de la concentration en acide gibbérellique (AG) inhibera la croissance racinaire,
et notamment des racines latérales, et stimulera la croissance aérienne (Chaves et al., 2007, Gou
et al., 2010). D'autres signaux chimiques peuvent participer comme l'éthylène qui stimule la
biosynthèse d'auxines (Hodge 2009). En contrôlant le développement racinaire, ces hormones,
parfois antagonistes, ont un rôle important dans la modulation du prélèvement et de
l'assimilation des nutriments (Rubio et al, 2009).

2.2.2 Fonctionnement

L'absorption de l'eau et des solutés présents dans la solution du sol se produit au niveau des cellules non lignifiées du rhizoderme, relativement perméables. Les poils absorbants constituent une zone d'absorption maximale, qui cheminent l'eau et les solutés vers le xylème dans la stèle centrale. La force principale qui permet l'extraction de l'eau et sa conduction dans le xylème est la transpiration foliaire et la tension qu'elle induit sur la colonne d'eau dans la plante. L'eau transpirée est remplacée par celle absorbée. Les racines peuvent prélever des nutriments, sous la forme d'ions, dissous dans la phase aqueuse du sol. Les solutés doivent cependant traverser des membranes pour pénétrer dans la racine. La Figure 8 présente la voie empruntée par l'eau enrichie en solutés pour rejoindre le xylème.
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 8 - Voie d'absorption et de transports de l'eau et des sels minéraux dans les racines (Nabors 2008)**</figcaption></figure>

L'eau passe par l'apoplasme du rhizoderme et des cellules de l'écorce jusqu'à l'endoderme. L'endoderme est l'assise cellulaire la plus interne de l'écorce, possédant une bande imprégnée de subérine, appelée cadre de Caspary. La subérine est un polymère proche de la lignine, à caractère lipophile et riche en fonctions phénoliques et aromatiques. Le cadre de Caspary oblige l'eau et les sels minéraux à traverser la membrane plasmique des cellules endodermiques par osmose et à passer de cellule en cellule jusqu'aux tissus conducteurs, *via* les plasmodesmes. Ce mouvement à travers les cellules est aussi appelé transport symplastique, le symplasme étant l'ensemble des cytoplasmes interconnectés.

## 2.3 Les relations HAP-plante-microorganismes

### 2.3.1 Effets de la plante sur le polluant

La rhizosphère est la partie du sol sous l'influence des racines. Les caractéristiques de celle-ci dépendent ainsi de l'espèce végétale implantée et des propriétés du sol. L'action des végétaux sur la dégradation des HAP peut se faire de manière directe ou indirecte. En effet, les racines
produisent des enzymes de type peroxydase, capables d'oxyder les HAP. Cependant, le principal facteur de la rhizosphère sur la dégradation des HAP est la rhizodéposition. Les racines libèrent du carbone par la perte de tissus ou cellules et l'exsudation de différents types de composés i.e. les mucilages (polysaccharides de haut poids moléculaire), des acides organiques (acide malique, citrique...) et des minéraux (Jones et al. 2004). La majorité des molécules excrétées est utilisée comme source de carbone et d'énergie par les microorganismes environnant et va ainsi stimuler l'activité microbienne de la rhizosphère. Ce mécanisme constitue le processus clef de la rhizodégradation des molécules organiques (Shann 1995).

## 2.3.2 Biodégradation des HAP par les micro-organismes

Des voies métaboliques de dégradation des HAP ont été mises en évidence pour des champignons et des bactéries (Haritash et Kaushik 2009). Il a été démontré que la présence de mycorhizes favorise la dissipation des HAP dans des sols fortement contaminés (Binet et al. 2001; Fan et al. 2008). Les mycorhizes peuvent conférer aux racines une barrière biologique contre l'exposition directe aux polluants et faciliter l'acquisition de nutriments (Leyval et Binet 1998; Gao et Zhu 2004; Gao et al. 2010).

Néanmoins, la dégradation bactérienne en aérobiose représente le processus majeur de minéralisation des HAP dans les sols avec une première étape primordiale de dioxygénation des HAP (Peng et al. 2008; Haritash et al. 2009). Plus rare, une dégradation en conditions d'anaérobie peut se produire, notamment en présence d'ions nitrates, ferreux ou sulfates, intervenant comme réducteurs des HAP (McNally et al. 1999; Chang et al. 2002). La première phase de dégradation des HAP est majoritairement imputée à la croissance rapide de certaines bactéries, telles que *Flavobacterium et Pseudomonas*, favorisées par des ressources abondantes
(Admon et al. 2001; Kaplan et Kitts 2004). Lors de la seconde phase de dégradation bactérienne, la diminution des ressources permet le développement d'espèces à croissance plus lente, de type *Alcaligenes, Microbacterium et Bacteroides* par exemple (Kaplan et al. 2004). En outre, la biodégradation des HAP de haut poids moléculaire est ralentie par l'hydrophobie plus élevée des molécules (Peng et al. 2008).

De nombreuses études de rhizodégradation de HAP donnent des résultats prometteurs en conditions contrôlées de laboratoire (Tableau 3). Les résultats positifs de rhizodégradation sont toutefois à modérer. En effet, les essais de culture sont plus couramment conduits sur des sols artificiellement contaminés avec un nombre limité de molécules pendant de courtes périodes. Ces conditions constituent un environnement plus propice à la biodégradation, avec une disponibilité des polluants élevée et quasiment illimitée mais non conformes à la réalité du terrain (Qiu et al. 1997; Ouvrard et al. 2011, 2014).
<table><caption>Tableau 3 – Exemples d'études sur la rhizodégradation d'HAP ou d'hydrocarbures de sols contaminés</caption><thead><tr><td>Auteurs</td><td>Espèces végétales</td><td>Conditions de culture</td><td>Contamination</td><td>Observations</td></tr></thead><tbody><tr><td>Binet et al. (2000)</td><td>Ray-grass (Lolium perenne)</td><td>Pot de végétation ; 6 mois</td><td>Artificielle ; huit HAP ; 1000 mg kg<sup>-1</sup></td><td>Meilleur taux de dégradation dans la rhizosphère</td></tr><tr><td rowspan="2">Chaineau et al. (2000)</td><td rowspan="2">Maïs (Zea mays)</td><td>Pot de végétation ; 120 j</td><td>Artificielle ; hydrocarbures ; 3300 mg kg<sup>-1</sup></td><td>Vitesse de biodégradation élevée lors de la croissance de la plante mais l'effet plante disparaît à la fin de la phase végétative</td></tr><tr><td>Hydroponie ; 40 j</td><td>Hydrocarbures ; 850 mg L<sup>-1</sup></td><td>Effet positif de la plante sur la biodégradation mais compétition avec les microorganismes pour les nutriments</td></tr><tr><td>Chiapusio et al. (2007)</td><td>Ray-grass (Lolium perenne) et trèfle des près (Trifolium pratense)</td><td>Pot de végétation ; 30 j ; trois terres</td><td>Artificielle ; PHE ; 1000 mg kg<sup>-1</sup> ; deux mois de vieillissement</td><td>Meilleure biodégradation avec le ray-grass et dans un sol riche en argile</td></tr><tr><td>Parrish et al. (2005)</td><td>Ray-grass (Lolium perenne), fétuque (Festuca arundinacea) et mélilot jaune (Melilotus officinalis)</td><td>Pot de végétation ; compostage pendant 12 semaines avant culture ; 12 mois</td><td>Historique ; 400 à 5000 mg kg<sup>-1</sup></td><td>Diminution de la concentration en HAP disponible en présence de plante</td></tr><tr><td>Rezek et al. (2008)</td><td>Ray-grass (Lolium perenne)</td><td>Pot de végétation ; 18 mois</td><td>Historique ; 15 HAP ; fertilisation ; 346 mg kg<sup>-1</sup></td><td>Pas d'effet plante sur la biodégradation</td></tr></tbody></table>
### 2.3.3 Transfert des HAP dans la plante : du sol aux racines

Le transfert des HAP du sol à la plante par les racines est la voie d'entrée principale identifiée dans les cas de pollutions supérieures à 100 mg kg⁻¹ sol sec (Collins et Finnegan 2010). Selon leurs pressions de vapeur, certains composés peuvent également se volatiliser depuis le sol et pénétrer la plante par le système foliaire mais en des quantités négligeables (Paterson et al. 1990). Les HAP peuvent également s'adsorber à la surface des racines (Schwab et al. 1998; Jiao et al. 2007; Ling et al. 2013), pénétrer les tissus (Wild et al. 2005a) et être transloqués aux parties aériennes (Kipopoulou et al. 1999; Fismes et al. 2002; Samsøe-Petersen et al. 2002; Gao et al. 2004; Gao et Collins 2009).

### 2.3.4 Mécanismes de prélèvement

Le développement de techniques en microscopie confocale a permis l'observation directe de deux HAP (PHE et ANT) accumulés dans des racines de blé et de maïs âgés de 56 jours (Wild et al. 2004, 2005a, 2006). Les composés sont localisés à la surface des cellules épidermales dans les zones d'élongation, pilifère et de ramification. Les molécules ne sont pas détectées au niveau de la coiffe et l'apex de la racine. Les composés semblent entrer radialement dans l'épiderme et pénétrer le cortex, pour se diriger vers les parties aériennes par des mouvements latéraux lents, majoritairement par voie apoplasmique. Un « flux » longitudinal permettrait le transport des HAP des racines vers la partie aérienne (Wild et al. 2005a). La pénétration des polluants organiques dans le symplasme des racines peut se faire par transport actif ou passif, selon l'espèce végétale, la nature du polluant ainsi que la concentration en solution (Zhan et al. 2010). Le transport passif est un processus trouvant son origine dans un gradient de concentration, il est communément accepté que l'entrée des composés organiques non polaires, tels que les HAP, dans les tissus
racinaires se fait par diffusion (Ryan *et al.* 1988; Collins *et al.* 2005), facilitée par des
aquaglycéroporines (Zhan *et al.* 2012). Cependant, un transport actif, exigeant un apport direct
d'énergie d'origine métabolique serait associé à ce transport passif dans les plantes supérieures.
Une étude menée par Zhan *et al.* (2010) consistant à exposer des plants de blé (Triticum aestivum
L), âgés de 14 jours, simultanément à du PHE et du NAPH, en solution durant 36 h a mis en
évidence une compétition de prélèvement entre les deux molécules. Les auteurs suggèrent
l'existence d'un mécanisme de transport en commun, caractérisé par une inhibition réciproque du
prélèvement racinaire de ces deux HAP. En effet, à faible température (4 °C), les auteurs
montrent que le prélèvement racinaire diminue alors que la concentration en PHE en solution
n'est pas affectée par une température plus élevée (25°C). De ce fait, la température n'affecte pas
la solubilité du PHE mais le métabolisme de la plante. L'exposition des racines au 2,4-
dinitrophénol, inhibiteur de la production d'ATP, a un effet négatif similaire à la température sur
le prélèvement du PHE. Ces observations suggèrent une action d'origine métabolique sur
l'absorption du PHE par le blé, et mettent en exergue l'existence potentielle d'un mécanisme de
transport actif des HAP dans les plantes supérieures, en plus d'un transport passif. Le
prélèvement du PHE entraîne une augmentation du pH de la solution externe, laissant supposer
que l'entrée de PHE est régulée par un système symport PHE/H⁺ (Zhan *et al.* 2012) dont l'efflux
de proton est lié à l'influx d'ions K⁺ (Zhan *et al.* 2013a). Néanmoins, ces travaux réalisés en
hydroponie ne sont pas représentatifs des équilibres osmotiques s'établissant entre la plante et le
sol. Les résultats obtenus ne sont pas nécessairement transposables à ce système aux interactions
plus complexes.
### 2.3.5 Transport des HAP dans la plante

Des études ont observé l'accumulation de HAP dans les parties aériennes d'espèces végétales cultivées sur des terres contaminées (Kipopoulou et al. 1999; Bakker et al. 2000; Fismes et al. 2002; Samsøe-Petersen et al. 2002; Tao et al. 2004; Gao et al. 2004, 2009; Xu et al. 2005). Toutefois, il est admis que les HAP ayant une masse moléculaire faible à moyenne (i.e. NAPH, PHE, PYR) présentent une accumulation plus importante dans le système aérien après prélèvement par les racines que les molécules ayant une masse moléculaire élevée (Kipopoulou et al. 1999; Bakker et al. 2000; Fismes et al. 2002; Tao et al. 2004; Gao et al. 2004; Xu et al. 2005; Gao et al. 2009). A contrario, les HAP à haut poids moléculaire auraient un potentiel d'adsorption plus élevé et ne pourraient pas traverser les tissus racinaires (Kipopoulou et al. 1999). Cette hypothèse est pourtant contredite par les travaux de Fismes et al. (2002) et Meudec et al. (2006) qui ont mis en évidence du BaP et du BghiP ainsi que du IcdP et du dBahA dans des parties aériennes après prélèvement racinaire.

### 2.3.6 Modélisation du prélèvement des HAP par les plantes

Des facteurs de bioconcentration permettent d'exprimer une concentration observée d'un contaminant dans une plante en fonction de la concentration du composé dans le sol (Figure 9).
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 9 - Illustration des voies de transfert des polluants organiques, depuis les phases solide et liquide d'un sol aux différents organes (racines, tige, feuilles et fruits) de la plante.**

*Kd* = coefficient de partition du polluant entre les phases solide et liquide du sol;
*RCF* = facteur de concentration racinaire;
*TSCF* = facteur de concentration dans le flux de transpiration;
*SCF* = facteur de concentration dans la tige;
*BCF* = facteur de bioconcentration sur masse sèche ou fraîche (d'après McKone et al. 2007).</figcaption></figure>

Des modèles existent pour prédire le prélèvement de molécules organiques, tels que les HAP, par les racines en considérant leurs concentrations dans l'eau porale et le **facteur de concentration racinaire** (« *Root Concentration Factor* » ou RCF) :

$$[\text{HAP}]_{\text{prédits}} = [\text{HAP}]_{\text{dissous}} \times \text{RCF} \quad (\text{Équation 3}).$$

Dans le cas où la concentration des HAP dans l'eau porale n'est pas mesurée directement, il est possible de l'estimer à partir de la concentration en HAP extractibles et des lois de partage comme proposé par van der Heijden et Jonker (2009) et Gomez-Eyles *et al.* (2012) :
Chapitre 1 : État de l'art

$$ [\text{HAP}]_{\text{dissous}} = \frac{[\text{HAP}]_{\text{extractibles} \times \text{foc}}}{K_{oc}} \quad (\text{Équation 4}), $$

Où $f_{oc}$ représente la fraction de carbone organique du sol et $K_{oc}$ est estimé d'après la relation de Nguyen *et al.* (2005) (Équation 2).

Le RCF permet d'exprimer le ratio de la concentration d'un polluant organique dans les racines fraîches sur la concentration de la molécule dissoute dans le sol :

$$ \text{RCF} = \frac{\text{concentration dans les racines fraîches (mg kg}^{-1}\text{)}}{\text{concentration en solution du sol (mg L}^{-1}\text{)}} \quad (\text{Équation 5}). $$

Le modèle le plus couramment utilisé pour les molécules organiques non ioniques, tels que les HAP, est celui de Briggs *et al.* (1982) où :

$$ \text{RCF} = 10^{0,77\text{LogKow} - 1,52} + 0,82 \quad (\text{Équation 6}). $$

Ce modèle a été établi pour le prélèvement et la translocation de pesticides dans l'orge, et ce, en hydroponie. Ce modèle considère que l'efficacité de transfert augmente avec la solubilité de la molécule dans l'eau. Sa formulation se base donc sur l'hydrophobicité de la molécule, exprimée par le coefficient de partage octanol-eau, le $K_{ow}$. Les composés ayant un log $K_{ow}$ supérieur à 4, comme la plupart des HAP, ont un potentiel important de rétention par la racine (Wild et Jones 1992b) et présenteraient un RCF élevé du fait d'une forte adsorption à la surface racinaire sans pénétration dans la plante (Briggs *et al.* 1982). Les composés organiques ayant un log $K_{ow}$ compris entre 0,5 et 3 pourraient pénétrer plus aisément dans la racine, en empruntant les voies de transports des composés solubles (Figure 8). Toutefois, les facteurs impliqués ainsi que les mécanismes de prélèvement des HAP par les racines restent incertains. De plus, dans cette relation assez ancienne, Briggs *et al.* (1982, 1983) supposent que l'accessibilité des molécules
testées n'est pas limitée. Le modèle ne considère ni la capacité de rétention d'un milieu tel que le sol, ni la capacité d'accumulation de la plante, et notamment celle des racines.

Des travaux plus récents relient le prélèvement racinaire à la teneur en lipide (Schwab et al. 1998; Gao et al. 2004; Collins et al. 2010; Kang et al. 2010) et en carbone (Zhang et Zhu 2009; Zhan et al. 2013b) de l'espèce végétale considérée. Le modèle de Zhang et al. (2009) complexifie le modèle réactionnel, en distinguant deux compartiments réactifs dans la racine : les lipides d'une part et l'ensemble des éléments carbonés de la plante d'autre part. Dans ce cas, le terme glucide comprend la cellulose et l'hémicellulose (présentes dans les parois des cellules végétales), les protéines ainsi que les nutriments. Les HAP ont une affinité plus élevée pour la fraction lipidique que pour celle glucidique. Toutefois, la fraction glucidique ne doit pas être négligée car elle est plus abondante que la fraction lipidique. Ainsi, le modèle de Zhang et al. (2009) considère les fractions lipidique ($f_{lip}$) et carbonée ($f_{ch}$) des racines et les coefficients de partition avec les lipides ($K_{lip}$) et éléments carbonés ($K_{ch}$) :

$$RCF = f_{lip} \times K_{lip} + f_{ch} \times K_{ch} \text{ (Équation 7)},$$

Avec $Log K_{lip} = 1,23 Log K_{ow} - 0,78$ et $Log K_{ch} = 1,23 Log K_{ow} - 2,42$. Dans le cas du maïs, on peut utiliser les valeurs déterminées pour le blé par Li et al. (2005) $f_{lip} = 1,1 \%$ et $f_{ch} = 15,3 \%$ (Brennan et al. 2014).

Le facteur de bioconcentration sur masse sèche (« Bioconcentration Factor » ou BCF) est donné par la relation suivante :

$$BCF = \frac{\text{concentration dans la biomasse sèche (mg kg}^{-1}\text{)}}{\text{concentration sur sol sec (mg kg}^{-1}\text{)}} \text{ (Équation 8).}$$
Le transfert des polluants aux parties aériennes de la végétation représente un enjeu important pour la sécurité de l'alimentation humaine et animale. Il s'agit donc d'évaluer la capacité des polluants à être transloqués dans le système aérien des plantes pour améliorer les prédictions de transfert. La translocation racines-feuille des HAP se ferait via le xylème, avec le flux de sève conditionné par la transpiration de la plante, et dépendrait de la solubilité de la molécule (Gao et al. 2009). En considérant une translocation passive, dirigée par la transpiration, l'efficacité du transport du composant organique des racines vers les parties aériennes peut être exprimée par le facteur de concentration dans le flux de transpiration (« Transpiration Stream Concentration Factor » ou TSCF), basé sur la concentration en solution du sol et celle dans le xylème après prélèvement par les racines (Briggs et al. 1982) :

$$TSCF = \frac{\text{concentration dans le flux de transpiration (mg L}^{-1}\text{)}}{\text{concentration en solution du sol (mg L}^{-1}\text{)}} \quad (\text{Équation 9}).$$

Le coefficient peut être associé au log K<sub>ow</sub> d'après la relation de Briggs et al. (1982) :

$$TSCF = 0,784 e^{-(\log K_{ow}-1,78)^2/2,44} \quad (\text{Équation 10}).$$

Un autre facteur de bioconcentration relie la concentration en solution du sol à celle de la tige, c'est le facteur de concentration dans le système aérien (« Shoot Concentration Factor » ou SCF) :

$$SCF = \frac{\text{concentration dans la tige (mg kg}^{-1}\text{)}}{\text{concentration en solution du sol (mg L}^{-1}\text{)}} \quad (\text{Équation 11}).$$

De la même façon que pour le prélèvement racinaire, Briggs et al. (1983) a proposé un modèle pour déterminer le SCF :

$$SCF = [10^{(0,95 \log K_{ow}-2,05)} + 0,82] \times 0,784 e^{-(\log K_{ow}-1,78)^2/2,44} \quad (\text{Équation 12}).$$
Toutefois, ces modèles n'incluent pas la capacité de rétention des constituants des vaisseaux de la plante. La sorption des HAP aux parois cellulaires pourrait être un facteur clef du transport des molécules dans la plante (Zhang et Zhu 2009). Plus la lipophilie du composé est élevée, plus l'accès au flux transpiratoire est difficile, même s'il existe un équilibre de concentration au niveau de la racine (Briggs et al. 1983). De même, la capacité de détoxification de la plante n'est pas prise en considération.

### 2.3.7 Phytotoxicité des HAP

La phytotoxicité des polluants est une donnée indispensable pour la mise en place d'un processus de phyto-dépollution. La phytotoxicité est la capacité d'une substance à altérer de façon passagère ou durable le fonctionnement des végétaux, pouvant aller jusqu'à la mortalité. L'espèce végétale sélectionnée doit pouvoir tolérer la pollution pour un développement suffisant sur le sol à dépolluer.

Les données bibliographiques montrent que les HAP ont des effets au niveau de la croissance et du fonctionnement des plantes supérieures. Des tests de germination en milieux liquide et solide ont été conduits sur un ensemble de 17 espèces végétales (Henner et al. 1999; Henner 2000), sélectionnées pour leurs présences fréquentes sur des friches industrielles (carotte sauvage, *Daucus carota* ; chénopode blanc, *Chenopodium album* ; coquelicot, *Papaver rhoeas* ; érigéron âcre, *Erigeron acer* ; matricaire perforée, *Matricaria maritima* ; millepertuis perforé, *Hypericum perforatum* ; silène dioïque, *Silene dioica* ; sysimbre officinal, *Sysimbrium officinal* ; vipérine commune, *Echium vulgare*) ou pour leur usage courant en agriculture (colza d'hiver, *Brassica napus* ; fétuque rouge, *Festuca rubra* ; lupin blanc doux, *Lupinus albus* ; luzerne, *Medicago sativa* ; maïs, *Zea mays* ; orge de printemps, *Hordeum vulgare* ; ray-grass anglais, *Lolium*
perenne ; trèfle violet, *Trifolium pratense*). Cinq HAP ont été testés en solution aqueuse à 0,2 mg mL⁻¹ (NAPH, PHE, FLA, CHY, BaP), ainsi que deux terres d'anciennes usines à gaz avec des teneurs des 16 HAP EPA proches de 1600 mg kg⁻¹ et 3500 mg kg⁻¹. Les graminées (i.e. maïs, orge et ray-grass) ne sont pas affectées par la présence de contamination dans les terres testées, tandis que les dicotylédones (i.e. trèfle, le millepertuis, le coquelicot, la matricaire et l'érigéron) présentent des taux d'inhibition de germination compris entre 15 et 40 %. Dans les cas d'exposition à des HAP isolés en solution, le NAPH a le plus fort pouvoir inhibiteur sur la germination des espèces cultivées, quand les composés de plus haut poids moléculaire, tels que CHY et le BaP, ne présentent pas d'effet négatif sur la germination. À l'issue de ces travaux, Henner *et al.* (1999) ont ainsi émis l'hypothèse que la phytotoxicité des sites contaminés est essentiellement due aux composés les plus volatiles, tels que le NAPH chez les HAP, et serait levée une fois complète volatilisation de ces polluants dans le sol. Pourtant, Henner (2000) a mis en évidence une action inhibitrice des terres contaminées sur la croissance d'espèces végétales avec des sensibilités variables, observations également rapportées par d'autres études (Chaineau 1995; Kummerová et Kmentová 2004; Liu *et al.* 2009a). Pourtant, certaines espèces végétales présentent un taux de germination élevé et une croissance diminuée en présence de HAP (Li *et al.* 1997; Smith *et al.* 2006). Ces différences peuvent être attribuées aux conditions expérimentales qui ont une influence directe sur la biodisponibilité du polluant (contamination fraiche ou ancienne, propriétés agronomiques du sol, dispositif clos ou ouvert, etc.). Malgré tout, les tests de germination ne permettent pas de prédire l'implantation d'une espèce végétale dans les cas de pollutions de sols par les HAP.

La diminution de biomasse est généralement accompagnée de modifications morphologiques du système racinaire, observées lors de cultures sur sols ou hydroponiques (Wittig *et al.* 2003;
Baldyga et al. 2005; Alkio et al. 2005; Liu et al. 2009a; Kummerová et al. 2012, 2013). En présence de contamination élevée, la longueur racinaire et le nombre de racines secondaires sont réduits mais l'intensité des symptômes varie selon l'espèce végétale, le polluant et son exposition. Par exemple, les modifications de l'architecture racinaire de l'arabette des dames (Arabidopsis thaliana) s'amplifient entre 0,05 et 0,25 mM de PHE sur milieu nutritif gélosé dans des boites de pétri. Cependant, pour des concentrations comprises entre 0,25 et 0,75 mM, les symptômes sont de la même ampleur. Au-delà 1,0 mM de PHE, le taux de mortalité est de 100 % après 30 jours d'exposition (Alkio et al. 2005). Le pois (Pisum sativum) et le maïs (Zea mays) montrent des modifications similaires de leurs systèmes racinaires lors d'une exposition à du FLA (0,1 ; 1 et 7 mg L⁻¹) en hydroponie pendant 7 jours (Kummerová et al. 2013). Cependant ces effets ne sont pas les mêmes en fonction des espèces et du niveau d'exposition. En effet pour 0,1 mg L⁻¹, le maïs semble moins affecté que le pois, il voit sa croissance stimulée par rapport au témoin (augmentation de 25 % de la longueur racinaire totale et de 35 % du nombre de racines secondaires). Pour la plus forte concentration, soit 7 mg L⁻¹, le pois et le maïs présentent une très forte inhibition de la longueur racinaire totale (respectivement une diminution de 95 et 94 %) et du nombre de racines secondaires (respectivement une diminution de 78 et 94 %). Toutefois, les auteurs ont également observé à cette concentration un épaississement des racines, principalement lié à un accroissement du diamètre de la stèle (jusqu'à 50 % chez le pois et 25 % chez le maïs), une augmentation de la surface xylémienne (surface des lumières des vaisseaux sur une coupe) au niveau de l'apex (jusqu'à 385 % chez le pois et 167 % chez le maïs) et au niveau de la zone de différenciation (jusqu'à 584 % chez le pois et 70 % chez le maïs). En plus d'une modification architecturale des racines, les auteurs ont ainsi démontré i) l'effet stimulateur du FLA à faible dose sur la croissance du maïs, ii) la variabilité de réponses selon l'espèce végétale et iii) une différenciation précoce des tissus vasculaires (Kummerová et al. 2013). L'effet
stimulateur de HAP à faible dose sur la croissance d'une plante a déjà été rapporté dans certains cas (Wild et al. 1992a; Váňová et al. 2009; Kummerová et al. 2010). Cette action stimulatrice ou inhibitrice des HAP sur la croissance est semblable à celle de phytohormones. Il est intéressant de noter que les HAP et certaines hormones végétales présentent une parenté structurale, avec la présence de noyaux aromatiques (Figure 10).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Acide naphtalèneacétique (ANA)</figcaption></figure>

**Figure 10 – Représentation de la structure du squelette de l'acide naphtalèneacétique**

Ainsi, des mécanismes similaires à ceux induits par des phytohormones pourraient être impliqués dans la voie de toxicité des HAP dans la plante et ont fait l'objet de quelques études (Alkio et al. 2005; Váňová et al. 2009; Weisman et al. 2010; Ahammed et al. 2012b). Un lien a ainsi été établi entre la présence de PHE et l'acide salicylique (AS), en mettant en évidence chez l'arabette des dames la surexpression du gène codant PR1 (« *Pathogenesis Related Protein 1* ») (Alkio et al. 2005) et du gène ICS1 (« *isochorismate synthase* ») (Weisman et al. 2010), tous deux impliqués dans la synthèse d'AS et normalement activés par le système de surveillance des pathogènes de la plante (Thomma et al. 1998). L'utilisation de mutants de l'arabette des dames *eto3* (surproduction d'éthylène), *etr1-4* (sensibilité à l'éthylène nulle), *etr1-7* (sensibilité à l'éthylène améliorée) et *etr1-6;etr2-3;ein4-4* (sensibilité à l'éthylène triplée) a permis d'établir un lien entre l'éthylène, inhibiteur de croissance, et la présence de PHE dans le milieu de culture. Ainsi, les mutants *eto3*
et *etr1-6;etr2-3;ein4-4* présentent une longueur racinaire plus importante dans le milieu avec PHE que dans le milieu de contrôle. Cette observation laisse supposer que le PHE interfère négativement dans la voie de signalisation ou de la synthèse de l'éthylène, quand l'hormone est elle-même présente à des concentrations élevées ou quand elle est surexprimée. De plus, en présence de PHE, le mutant *etr1-4* présente une longueur racinaire plus fortement réduite (diminution de 60 %) que le que le mutant non exposé, suggérant que le polluant aurait une action inhibitrice sur la croissance racinaire sans interférer avec la voie de signalisation de l'éthylène. En conclusion, les symptômes connus chez l'arabette des dames et liés aux HAP ne peuvent pas être directement imputés à l'éthylène mais il est démontré ici que le PHE a un pouvoir inhibiteur sur les actions de l'éthylène lorsque celui-ci est à de forts taux dans la plante (Weisman *et al.* 2010). Des dosages directs d'ABA dans des feuilles de pois (*Pisum sativum*) ont montré une augmentation de sa concentration en lien avec l'augmentation de l'exposition au FLA (Váňová *et al.* 2009).

L'exposition aux HAP ne semble pas provoquer de baisse générale des activités métaboliques car l'expression des gènes de ménage, indispensables à la survie des cellules (Forêt 2006), n'est pas affectée par la présence de PHE chez l'arabette des dames (Alkio et al. 2005). De ce fait, l'intégrité des gènes de ménage en présence de PHE suggère l'existence de réponses plus spécifiques chez les plantes.

À l'échelle cellulaire, de nombreux dommages, répertoriés dans les plantes supérieures, ont été mis en relation avec la production d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), associée à un stress oxydatif. Le stress oxydatif se définit comme étant le résultat d'un déséquilibre entre la balance des ERO et les systèmes de défense (antioxydants), avec pour conséquence l'apparition de dégâts cellulaires souvent irréversibles. Les plus connus sont : perturbation de l'activité de protéines et
d'enzymes (Pašková et al. 2006; Li et al. 2008; Liu et al. 2009a; Ahammed et al. 2012a; b), oxydation de pigments i.e. chlorophylles a et b, caroténoïdes (Kummerová et al. 2004, 2006; Li et al. 2008; Liu et al. 2009a; Váňová et al. 2009; Og et al. 2010; Ahammed et al. 2012a; b), peroxydation lipidique (Pašková et al. 2006; Debiane et al. 2008; Li et al. 2008; Liu et al. 2009a; Ahammed et al. 2012b; Babula et al. 2012), inhibition de l'activité photosynthétique (Oguntimehin et al. 2010; Ahammed et al. 2012a; b) et mort cellulaire (Alkio et al. 2005; Babula et al. 2012).

## 3 Conclusion et objectifs de thèse

Cette étude bibliographique a mis en évidence la complexité du système impliqué dans la rhizodégradation. Quatre principaux acteurs sont ainsi mis en relation : le sol, le polluant, la plante et les micro-organismes. Leurs interactions sont nombreuses et complexes (Figure 11).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 11 - Schéma conceptuel des interactions entre les acteurs majeurs de la rhizodégradation</figcaption></figure>
La nature du sol définit le comportement des HAP dans la matrice selon les propriétés physico-chimiques du polluant. De même, l'implantation de l'espèce végétale dépend des propriétés agronomiques du sol définissant la réserve d'eau et des nutriments et modulant le développement du système racinaire, qui à son tour, peut modifier la géochimie du sol environnant (la rhizosphère). Le sol constitue également une niche pour une grande variété de micro-organismes. Ces derniers peuvent interagir avec les plantes de façon bénéfique (symbiose) ou au contraire entrer en compétition pour des ressources communes. Lors de la rhizodégradation, les exsudats racinaires vont stimuler l'activité microbiologique de la rhizosphère pour dégrader les polluants organiques tels que les HAP et les convertir en source de carbone supplémentaire. Dans certains cas, la plante peut participer directement à la dégradation du polluant par des activités enzymatiques. Toutefois, la phytotoxicité des HAP peut freiner le développement de la plante par contact dans le milieu et par absorption dans la plante, et de ce fait, perturber la rhizodégradation en retour.

Ce travail de bibliographie met également en évidence la difficulté à évaluer la fraction disponible des HAP dans le sol et susceptible d'être transférée dans la biomasse végétale. De plus, il souligne que le mécanisme général de toxicité des HAP sur les plantes n'est toujours pas pleinement identifié. Ces verrous scientifiques sont sans doute à l'origine des résultats mitigés obtenus lors d'essais de rhizodégradation en condition de terrain. C'est dans ce contexte que s'inscrit ce travail de recherche, dont l'objectif général est de contribuer à l'amélioration des outils pour l'évaluation du transfert des HAP du sol vers la plante ainsi qu'à la compréhension de l'impact des HAP sur le fonctionnement de la plante. Ce travail doit donc permettre d'intégrer des études réalisées à différentes échelles pour prendre en compte la complexité du système et de tous ses composants et la comparaison de terres réelles historiquement contaminées à des
substrats artificiels pour refléter une partie des difficultés rencontrées sur le terrain. Ainsi, les **objectifs de ce travail de thèse** sont (i) améliorer les modèles existant pour l'évaluation de la fraction de HAP absorbable par la plante depuis la fraction disponible dans le sol en comparant différents outils de mesure de la disponibilité des HAP, (ii) étudier le comportement de HAP dans le sol et la plante en caractérisant les facteurs contrôlant le transfert des HAP à la plante à l'aide de systèmes de culture simplifiés (support de végétation artificiellement contaminé) et complexes (terres réelles historiquement contaminées), et (iii) évaluer l'impact des HAP sur les végétaux à plusieurs échelles de l'organisme, plus particulièrement au niveau du système racinaire, premier organe exposé à la pollution d'un sol.

Ce travail s'articule en deux parties et fait appel à des compétences croisées en chimie analytique, physiologie et histologie. La première partie consiste à évaluer le transfert des HAP du sol vers les plantes (Chapitre III). La deuxième partie porte sur l'impact des HAP sur la plante aux échelles macro et microscopiques de la plante (Chapitre IV). La troisième et dernière partie vise à synthétiser ces résultats en proposant un modèle de fonctionnement des plantes supérieures exposées aux HAP (Chapitre V).
# CHAPITRE 2 :
## MATÉRIELS ET
### MÉTHODES
## SOMMAIRE CHAPITRE 2

<table><tr><td>1</td><td>Matériels</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1</td><td>La plante : le maïs (Zea mays)</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1.1</td><td>Variété</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1.2</td><td>Pré-germination</td><td>47</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Support de culture</td><td>48</td></tr><tr><td>1.2.1</td><td>Sable contaminé en phénanthèrene</td><td>48</td></tr><tr><td>1.2.2</td><td>Terres industrielles polluées</td><td>49</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Solution nutritive</td><td>53</td></tr><tr><td>2</td><td>Expérimentations de culture en conditions contrôlées de laboratoire</td><td>53</td></tr><tr><td>2.1</td><td>Cultures sur sable contaminé par le phénanthèrene</td><td>53</td></tr><tr><td>2.1.1</td><td>Pour l'étude histologique de la racine séminale principale – Expérience I</td><td>54</td></tr><tr><td>2.1.2</td><td>Pour l'étude physiologique de la plante – Expérience II</td><td>54</td></tr><tr><td>2.2</td><td>Culture sur terres industrielles – Expérience III</td><td>56</td></tr><tr><td>3</td><td>Méthodes de caractérisation et outils d'analyses</td><td>57</td></tr><tr><td>3.1</td><td>Préparation et conditionnement des échantillons</td><td>57</td></tr><tr><td>3.1.1</td><td>Lyophilisation</td><td>57</td></tr><tr><td>3.1.2</td><td>Broyage</td><td>58</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Méthodes de caractérisation des terres</td><td>58</td></tr><tr><td>3.2.1</td><td>Mesure de la capacité de rétention en eau (CRE)</td><td>58</td></tr><tr><td>3.2.2</td><td>Quantification du PHE total du sable</td><td>59</td></tr><tr><td>3.2.3</td><td>Quantification des HAP dits « totaux » des terres industrielles</td><td>59</td></tr><tr><td>3.2.4</td><td>Estimation de la fraction de HAP disponibles</td><td>61</td></tr><tr><td>3.2.5</td><td>Estimation de la concentration en HAP dans l'eau porale par échantillonneur passif</td><td>62</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Caractérisation des plantes</td><td>64</td></tr><tr><td>3.3.1</td><td>Quantification des éléments nutritifs</td><td>64</td></tr><tr><td>3.3.2</td><td>Dosage du carbone organique et de l'azote</td><td>64</td></tr><tr><td>3.3.3</td><td>Photosynthèse et transpiration</td><td>65</td></tr><tr><td>3.3.4</td><td>Humidité pondérale</td><td>66</td></tr><tr><td>3.3.5</td><td>Allocation de la biomasse</td><td>66</td></tr><tr><td>3.3.6</td><td>Caractéristiques géométriques du système foliaire</td><td>66</td></tr><tr><td>3.3.7</td><td>Caractéristiques géométriques du système racinaire</td><td>67</td></tr><tr><td>3.3.8</td><td>Évaluation de la subérification de la racine séminale principale</td><td>68</td></tr><tr><td>3.3.9</td><td>Quantification des HAP dans le système racinaire</td><td>71</td></tr><tr><td>3.3.10</td><td>Quantification des HAP dans le système aérien</td><td>71</td></tr><tr><td>3.4</td><td>Caractérisation des solutions de culture</td><td>72</td></tr><tr><td>3.4.1</td><td>Quantification du PHE</td><td>72</td></tr><tr><td>3.4.2</td><td>Dosage des nitrates en solution</td><td>72</td></tr><tr><td>3.5</td><td>Méthodes d'analyse</td><td>72</td></tr><tr><td>3.5.1</td><td>Analyse et quantification des HAP par HPLC</td><td>72</td></tr><tr><td>3.5.2</td><td>Analyse et quantification des 16 HAP par GCMS</td><td>75</td></tr><tr><td>3.5.3</td><td>Localisation du PHE par microscopie en épifluorescence</td><td>76</td></tr><tr><td>3.5.4</td><td>Observations en microscopie confocale à balayage laser</td><td>77</td></tr><tr><td>3.5.5</td><td>Analyses statistiques</td><td>78</td></tr></table>
Ce chapitre décrit successivement le matériel et les méthodes de préparation communs, les plans d'expérimentation des cultures réalisées sur sable artificiellement contaminé et sur des terres historiquement contaminés et enfin, les méthodes de caractérisation et les outils d'analytique communs à toute la thèse.

# 1 Matériels

## 1.1 La plante : le maïs (Zea mays)

Le choix du maïs, utilisé comme plante modèle dans cette étude, s'est fait sur plusieurs critères :

(i) Le maïs a une croissance rapide avec une biomasse élevée et un large système racinaire fasciculé qui permet son utilisation en laboratoire pour des cultures courtes avec des pratiques agricoles simplifiées,

(ii) Le maïs est une espèce dont le fonctionnement a été et continue d'être fortement étudié en terme de physiologie mais également pour son potentiel dans la rhizodégradation,

(iii) Le maïs est la troisième plante la plus cultivée après le blé et le riz et de ce fait, il présente un intérêt économique pour son usage alimentaire au niveau mondial.

### 1.1.1 Variété

Les graines de maïs MB862 utilisées dans ces travaux sont obtenues à partir d'un croisement entre la lignée F356 à type de grain denté et la lignée D171 à type de grain corné, issues la station INRA de Saint-Martin-de-Hinx (40).

### 1.1.2 Pré-germination
Avant utilisation, les graines de maïs ont été scarifiées et stérilisées chimiquement par trempage de 15 min dans un bain de détergent (TFD9, 20% v/v) suivi d'un rinçage à l'eau déminéralisée. Elles ont ensuite été mises à tremper pendant 3 min dans une solution de peroxyde d'hydrogène (10% v/v) et rincées trois fois à l'eau déminéralisée. Les graines sont finalement incubées durant 2 jours sur du coton humidifié dans l'obscurité à température ambiante.

## 1.2 Support de culture

### 1.2.1 Sable contaminé en phénanthrène

Du sable de quartz (Ø 0,4-0,8 mm, Sibelco, Hostun, France) a été utilisé comme support de culture. La contamination a été réalisée avec un seul HAP modèle, le phénanthrène (PHE), communément utilisé lors d'essais en laboratoire (Pašková et al. 2006; Gao et al. 2009; Liu et al. 2009a; Zhan et al. 2010; Desalme et al. 2011) et faisant parti des 16 HAP prioritaires de l'US-EPA. Pour éviter une colonisation microbiologique non contrôlée du sable, celui-ci a d'abord été chauffé à 200 °C en étuve pendant 2 h avant contamination. Le PHE (>97%, Acros Organics) a été dissous à 43,1 g L⁻¹ dans du dichlorométhane (DCM). Pour chaque niveau de concentration souhaité (50, 150, 250, 500 et 750 mg PHE par kg de sable), un sous-échantillon représentant 10 % (m/m) de la masse totale de sable a été contaminé par une solution fille préparée par dilution de la solution mère afin (i) d'obtenir pour chacun des sous-échantillons des concentrations finales de 0,5 ; 1,5 ; 2,5 ; 5 et 7,5 g de PHE par kg de sable (ii) que le volume de DCM apporté soit le même (16 % v/m) pour chaque sous-échantillon. Chaque sous échantillon de sable contaminé a été placé sous sorbonne pour permettre l'évaporation complète du solvant. Le sable utilisé dans la modalité témoin a également été exposé au même volume de dichlorométhane sans PHE et séché de manière similaire. Pour permettre une homogénéisation de la contamination du sable, chaque
sous échantillon a été mélangé à une masse de sable non contaminé (90 % de la masse de sable finale de sable à préparer) à l'aide d'un quarter. Les lots de sable ont ensuite été stockés dans des sacs en plastiques et conservés dans l'obscurité en chambre froide (4°C) dans l'attente de leur utilisation.

## 1.2.2 Terres industrielles polluées

Les terres industrielles utilisées pour cette thèse ont été échantillonnées sur différents sites ayant accueilli une activité industrielle. Les sites ont été sélectionnés en France, en Belgique et en Suède, pays partenaires du projet IBRACS (financement par le réseau SNOWMAN) dans lequel s'inscrit cette thèse. Ce projet a pour objectif principal de fournir aux autorités concernées des recommandations sur l'utilisation d'outils de mesure de biodisponibilité des HAP et métaux, ainsi que sur les modèles d'évaluation des risques intégrant ces mesures et utilisés pour la prise de décisions dans la gestion de risques de sols contaminés.

Sept terres françaises (FR01 à FR07), une terre belge (BE01) et cinq terres suédoises (SW01 à SW05) ont été utilisées comme supports de culture. **FR01, FR02 et FR03** sont des terres prélevées dans des zones de contamination décroissante de la friche industrielle de l'ancienne cokerie de Homécourt (Meurthe et Moselle, 54). **FR06** provient d'un lot de terre FR01 ayant été traitée par biopile. Cette technologie consiste en l'utilisation de micro-organismes de sol pour dégrader des polluants organiques présents. **FR04** provient du site de l'ancienne cokerie de Neuves-Maisons (Meurthe et Moselle, 54). **FR05** provient d'un site d'une ancienne usine à gaz en région parisienne. La terre **FR07** provient d'une ancienne usine à gaz de Toulouse (Haute Garonne, 31). **BE01** est issue d'une ancienne usine à gaz en Belgique. Les terres **SW01 à 05** ont été prélevées sur le site d'une ancienne usine à gaz à Karlstad en Suède.
Le Tableau 4 présente les principales caractéristiques physico-chimiques de terres échantillonnées. Les analyses ont été réalisées par le laboratoire d'analyse des sols de l'INRA selon des méthodes normalisées
<table><caption>Tableau 4 – Propriétés agronomiques des terres de friches étudiées. (1) NF X 31-10711263, (2) NF ISO 10694, (3) NF ISO 13878, (4) NF ISO 10390, (5) NF ISO 10693, (6) NF ISO 11263, (7) NF X 31-130, (8) méthode ICP-Ms INRA, (9) NF X 31-147, NF ISO 22036 et NF EN ISO 17294-2.</caption><thead><tr><th></th><th>Paramètres</th><th>Unité</th><th>FR01</th><th>FR02</th><th>FR03</th><th>FR04</th><th>FR05</th><th>FR06</th><th>FR07</th><th>BE01</th><th>SW01</th><th>SW02</th><th>SW03</th><th>SW04</th><th>SW05</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">Granulométrie (1)</td><td>Argile (&lt; 2 µm)</td><td></td><td>98</td><td>86</td><td>119</td><td>155</td><td>62</td><td>96</td><td>121</td><td>149</td><td>61</td><td>51</td><td>36</td><td>56</td><td>84</td></tr><tr><td>Limons fins (2 à 20 µm)</td><td></td><td>126</td><td>99</td><td>144</td><td>129</td><td>106</td><td>147</td><td>183</td><td>87</td><td>113</td><td>81</td><td>67</td><td>100</td><td>151</td></tr><tr><td>Limons grossiers (20 à 50 µm)</td><td>g kg<sup>-1</sup></td><td>84</td><td>85</td><td>122</td><td>71</td><td>109</td><td>108</td><td>101</td><td>109</td><td>126</td><td>109</td><td>92</td><td>121</td><td>141</td></tr><tr><td>Sables fins (50 à 200 µm)</td><td></td><td>151</td><td>153</td><td>183</td><td>87</td><td>191</td><td>201</td><td>107</td><td>387</td><td>238</td><td>272</td><td>141</td><td>290</td><td>161</td></tr><tr><td>Sables grossiers (200 à 2000 µm)</td><td></td><td>541</td><td>577</td><td>432</td><td>558</td><td>532</td><td>448</td><td>488</td><td>268</td><td>462</td><td>487</td><td>664</td><td>433</td><td>463</td></tr><tr><td rowspan="7">Paramètres agronomiques</td><td>Capacité de rétention d'eau</td><td>g/100 g</td><td>27,4</td><td>29,5</td><td>28,5</td><td>23,4</td><td>27,4</td><td>17,5</td><td>13,8</td><td>35,7</td><td>21,2</td><td>15,3</td><td>19,5</td><td>23,2</td><td>26,5</td></tr><tr><td>Carbone organique (2)</td><td>g kg<sup>-1</sup></td><td>113,0</td><td>177,0</td><td>212,0</td><td>91,1</td><td>335,0</td><td>146,0</td><td>28,0</td><td>48,9</td><td>65,4</td><td>22,7</td><td>75,9</td><td>103,0</td><td>600,0</td></tr><tr><td>Azote total (3)</td><td>g kg<sup>-1</sup></td><td>1,9</td><td>3,2</td><td>3,3</td><td>2,5</td><td>4,2</td><td>2,3</td><td>0,7</td><td>1,4</td><td>0,8</td><td>0,3</td><td>1,0</td><td>1,3</td><td>8,9</td></tr><tr><td>ratio C/N</td><td></td><td>60,5</td><td>56,0</td><td>63,6</td><td>36,4</td><td>79,8</td><td>64,3</td><td>41,4</td><td>33,9</td><td>83,1</td><td>72,6</td><td>77,6</td><td>80,8</td><td>67,4</td></tr><tr><td>pH (4)</td><td></td><td>8,5</td><td>8,2</td><td>8,4</td><td>7,5</td><td>8,1</td><td>8,3</td><td>8,5</td><td>7,6</td><td>7,1</td><td>8,6</td><td>7,8</td><td>6,0</td><td>7,7</td></tr><tr><td>CaCO<sub>3</sub> (5)</td><td>g kg<sup>-1</sup></td><td>357,0</td><td>175,0</td><td>217,0</td><td>20,5</td><td>71,8</td><td>210,0</td><td>34,9</td><td>13,3</td><td>&lt;1</td><td>8,1</td><td>&lt;1</td><td>&lt;1</td><td>&lt;1</td></tr><tr><td>P Olsen (6)</td><td>g P<sub>2</sub>O<sub>5</sub> kg<sup>-1</sup></td><td>0,06</td><td>0,03</td><td>0,04</td><td>0,06</td><td>0,08</td><td>0,09</td><td>0,04</td><td>0,05</td><td>0,01</td><td>0,02</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,01</td></tr><tr><td>Capacité d'échange cationique (7)</td><td>cmol<sup>-1</sup> kg<sup>-1</sup></td><td>8,6</td><td>11,0</td><td>14,9</td><td>9,7</td><td>7,3</td><td>11,0</td><td>7,7</td><td>10,0</td><td>2,0</td><td>2,2</td><td>2,4</td><td>1,8</td><td>3,6</td></tr><tr><td rowspan="8">Éléments échangeables à la cobaltihexamine (8)</td><td>Al</td><td></td><td>0,02</td><td>&lt;0,02</td><td>0,02</td><td>&lt;0,02</td><td>&lt;0,02</td><td>0,02</td><td>0,06</td><td>&lt;0,02</td><td>0,04</td><td>0,04</td><td>&lt;0,02</td><td>0,20</td><td>&lt;0,02</td></tr><tr><td>Ca</td><td></td><td>10,8</td><td>12,4</td><td>15,4</td><td>112,0</td><td>12,0</td><td>12,9</td><td>8,5</td><td>29,2</td><td>2,5</td><td>4,1</td><td>2,8</td><td>1,7</td><td>3,4</td></tr><tr><td>Fe</td><td></td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,05</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,05</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>0,01</td></tr><tr><td>K</td><td>cmol<sup>-1</sup> kg<sup>-1</sup></td><td>0,30</td><td>0,31</td><td>0,45</td><td>0,47</td><td>0,31</td><td>0,67</td><td>0,11</td><td>0,38</td><td>0,10</td><td>0,11</td><td>0,08</td><td>0,08</td><td>0,05</td></tr><tr><td>Mg</td><td></td><td>2,61</td><td>0,43</td><td>0,70</td><td>3,51</td><td>0,37</td><td>0,79</td><td>0,22</td><td>0,85</td><td>0,07</td><td>0,05</td><td>0,05</td><td>0,14</td><td>0,12</td></tr><tr><td>Mn</td><td></td><td>&lt;0,005</td><td>&lt;0,005</td><td>&lt;0,005</td><td>0,01</td><td>&lt;0,005</td><td>&lt;0,005</td><td>&lt;0,005</td><td>0,01</td><td>&lt;0,005</td><td>&lt;0,005</td><td>&lt;0,005</td><td>0,01</td><td>&lt;0,005</td></tr><tr><td>Na</td><td></td><td>0,06</td><td>0,02</td><td>0,03</td><td>0,64</td><td>0,06</td><td>0,14</td><td>0,11</td><td>0,26</td><td>0,05</td><td>0,03</td><td>0,02</td><td>0,07</td><td>0,99</td></tr><tr><td>Cd</td><td></td><td>7,3</td><td>1,2</td><td>0,7</td><td>2,5</td><td>1,3</td><td>2,9</td><td>0,4</td><td>4,4</td><td>0,8</td><td>0,3</td><td>0,4</td><td>0,2</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Co</td><td></td><td>11,5</td><td>12,7</td><td>12,2</td><td>29,0</td><td>14,7</td><td>17,7</td><td>14,0</td><td>10,8</td><td>9,4</td><td>6,0</td><td>6,6</td><td>7,0</td><td>5,4</td></tr><tr><td>Cr</td><td></td><td>63,1</td><td>172</td><td>57,8</td><td>824</td><td>76,9</td><td>87,7</td><td>65,5</td><td>62,5</td><td>23,8</td><td>36,3</td><td>24,5</td><td>18,8</td><td>19,7</td></tr><tr><td>Cu</td><td></td><td>44,3</td><td>55,0</td><td>99,5</td><td>139</td><td>78,8</td><td>41,0</td><td>32,4</td><td>134,0</td><td>38,0</td><td>61,4</td><td>51,1</td><td>48,1</td><td>31,8</td></tr><tr><td>Mo</td><td></td><td>1,6</td><td>9,3</td><td>2,1</td><td>10,4</td><td>2,6</td><td>2,6</td><td>1,5</td><td>2,2</td><td>1,8</td><td>2,0</td><td>1,2</td><td>1,5</td><td>2,3</td></tr><tr><td>Ni</td><td></td><td>27,3</td><td>31,3</td><td>32,1</td><td>103</td><td>38,6</td><td>44,2</td><td>34,1</td><td>34,9</td><td>16,7</td><td>15,7</td><td>14,1</td><td>14,5</td><td>16,9</td></tr><tr><td>Pb</td><td></td><td>144</td><td>329</td><td>210</td><td>711</td><td>130</td><td>197</td><td>352</td><td>652</td><td>85</td><td>56</td><td>68</td><td>85</td><td>77</td></tr><tr><td>S</td><td></td><td>2790</td><td>3030</td><td>2210</td><td>39000</td><td>3110</td><td>2540</td><td>415</td><td>5970</td><td>480</td><td>292</td><td>706</td><td>1240</td><td>1680</td></tr><tr><td>Teneurs élémentaires totales (9)</td><td></td><td>mg kg<sup>-1</sup></td><td>1,0</td><td>0,3</td><td>0,5</td><td>0,8</td><td>0,3</td><td>0,7</td><td>0,5</td><td>0,6</td><td>0,6</td><td>0,6</td><td>0,5</td><td>0,6</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>395</td><td>346</td><td>581</td><td>2680</td><td>266</td><td>765</td><td>184</td><td>328</td><td>171</td><td>216</td><td>150</td><td>85</td><td>38</td></tr></tbody></table>
L'ensemble des terres présente une texture à tendance limono-sableuse, exceptée la terre SW03 qui est plutôt sableuse. Leurs capacités de rétention d'eau (CRE) sont pourtant variables, les terres FR07 et BE01 se distinguant par les CRE les plus contrastées, respectivement 14 et 36 g/100 g. Une grande variation des teneurs en carbone organique est observée, le taux de carbone organique de référence (terre agricole) étant autour de 100 g kg⁻¹. Les terres suédoises SW01, SW02, SW03 et SW04, les terres françaises FR04 et FR07, ainsi que la terre BE01, présentent des teneurs faibles à moyennes, celles-ci étant comprises entre 23 et 91 g kg⁻¹. Les terres issues de la cokerie d'Homécourt FR01, FR02, FR03 et FR06 ont des teneurs en carbone organique un peu plus élevées, comprises entre 113 et 212 g kg⁻¹. Quant à la terre FR05 et la terre SW05, ces dernières présentent des teneurs en carbone organique très élevées, 335 et 600 g kg⁻¹ respectivement. La teneur en azote total confère à l'ensemble des terres des ratios C/N compris entre 34 et 83, les valeurs les plus faibles étant retrouvées dans les terres FR04, FR07, BE01 et les plus fortes dans les terres suédoises et FR05. Les terres de la cokerie d'Homécourt se distinguent également par de fortes concentrations en CaCO₃, comprises entre 175 et 357 g kg⁻¹, leur conférant des pH supérieurs à 8. La terre SW04 se distingue par un pH acide, avec la plus faible valeur égale à 6. Les terres suédoises ont les plus faibles CEC, ainsi que des faibles teneurs en phosphore (proches de 0,1 g P₂O₅ kg⁻¹), quand les teneurs sont 4 à 9 fois supérieures dans les autres terres. Il en est de même pour les cations échangeables Ca²⁺, K⁺, Mg²⁺ et Fe³⁺ et les éléments traces. Au contraire, la terre FR04 présente les teneurs en cations et en éléments traces les plus élevées en comparaison aux autres terres. Ceci est la conséquence d'une importante quantité de laitiers de hauts-fourneaux, sous-produits de la fabrication de la fonte. Ces derniers sont essentiellement constitués de chaux (CaO), de silice (SiO₂), d'alumine (Al₂O₃), de magnésie (MgO) mais également d'oxydes secondaires tels que FeO et MnO et des composés sulfurés. La
terre BE01 se distingue également avec des concentrations en Cu et Pb élevées, supérieurs à 130 et 650 mg kg⁻¹ respectivement.

## 1.3 Solution nutritive

Pour les expérimentations, une solution nutritive, dite Ruakura, a été utilisée. Cette solution a été adaptée aux besoins nutritionnels du maïs (Smith *et al.* 1983) : 2,8 mM Ca(NO₃)₂, 0,8 mM Mg(NO₃)₂, 4,2 mM NH₄NO₃, 0,9 mM KNO₃, 0,5 µM KH₂PO₄, 0,3 µM K₂HPO₄, 3,3 µM K₂SO₄, 0,2 µM Na₂SO₄, 0,1 µM NaCl, 8,2 µM MnCl₂, 0,6 µM ZnCl₂, 0,6 µM CuCl₂, 41,7 µM H₃BO₃, 0,1 µM (NH₄)₆Mo₇O₂₄ et 41,7 µM FeC₆H₅O₇ dans de l'eau déminéralisée. La solution présente un pH de 6,5.

# 2 Expérimentations de culture en conditions contrôlées de laboratoire

Toutes les cultures de maïs sur sable contaminé ou sur terres contaminées ont été réalisées en chambre de culture dans les conditions suivantes : 16 h de photopériode, 23 °C le jour et 18 °C la nuit avec 70 % d'humidité atmosphérique. La teneur en eau du substrat a été maintenue à 80 % de la CRE. Afin de garantir un apport suffisant en éléments nutritifs, les systèmes ont été initialement humidifiés avec la solution nutritive de Ruakura décrite précédemment.

## 2.1 Cultures sur sable contaminé par le phénanthrène

Deux types de culture ont été menés sur sable contaminé par le PHE, selon l'objectif des investigations : l'étude histologique de la racine séminale principale (§2.1.1) et l'étude physiologique de la plante (§2.1.2). Dans les deux cas, des pots de culture en verre non teinté ont été utilisés pour limiter la sorption du PHE sur les parois. L'exposition du substrat et des racines à la lumière a été limitée en enveloppant l'extérieur des pots avec de la bâche noire. L'humidité
des dispositifs a été contrôlée par pesée et maintenue constante tout au long de la culture par des arrosages trihebdomadaires avec de l'eau déminéralisée.

## 2.1.1 Pour l'étude histologique de la racine séminale principale – Expérience I

Cette culture de maïs a été réalisée dans des pots en verre, de 15 cm de hauteur et 6 cm de diamètre. Les dispositifs contiennent 400 g sec de sable, contaminés selon trois niveaux de PHE : 0, 50 et 150 mg kg⁻¹. Cinq répétitions ont été préparées pour chaque niveau de contamination et pour chaque temps d'arrêt de la culture, 10 et 20 j. L'expérimentation a ainsi regroupé un total de 30 pots de culture. Chacun a reçu trois graines de maïs germées. Après la disposition des graines, les pots de culture ont été scellés avec du parafilm les trois premiers jours pour éviter un desséchement en surface. Le plant de maïs le plus grand sur les trois semés a été conservé après de 2 j de culture. Celui-ci a été sélectionné d'après la hauteur du système aérien afin de diminuer la variabilité entre les répétitions par modalité. À l'issue de la récolte, à 10 et 20 j, la racine principale séminale a été prélevée, rincée à l'eau déminéralisée et conditionnée pour l'étude histologique.

## 2.1.2 Pour l'étude physiologique de la plante – Expérience II

Cette culture de 28 jours a été réalisée dans des pots en verre de 21 cm de hauteur et 10 cm de diamètre. Les dispositifs contenaient 2 kg sec de sable, contaminés selon six niveaux de PHE : 0, 50, 150, 250, 500 et 750 mg kg⁻¹.

Après l'apport du polluant, un inoculum bactérien a été ajouté avec la solution nutritive afin de limiter le développement de bactéries favorables à la dégradation des HAP. Celui-ci a été préparé à partir d'un sol agricole (Chènevières, Meurthe-et-Moselle). Pour cela, 10 g de sol ont été mis en suspension dans 100 mL d'une solution saline (NaCl 8,5 g L⁻¹) avec des billes en verre. Après 12
h d'agitation, 100 µL du surnageant ont été prélevés pour inoculer 40 mL de milieu de culture LB (Luria Broth). Douze tubes ont été préparés de cette manière. Après 48 h d'inoculation à 27 °C, les tubes ont été centrifugés pendant 10 min à 4 °C à 4000 RPM. Le milieu LB surnageant a été évacué pour ne conserver que le culot, auquel est rajouté 10 mL de solution saline (NaCl 8,5 g L⁻¹). Les tubes ont été mélangés à l'aide d'un vortex puis assemblés trois à trois. Les quatre tubes falcons résultant ont subi la même procédure que précédemment pour être ensuite assemblés deux à deux. Il en a été de même pour les deux tubes résultant qui ont ensuite été assemblés. Le nombre de bactéries a été déterminé dans ce dernier tube par comptage cellulaire au microscope (cellule de Thoma). Un volume spécifique a été alors prélevé et mélangé à la solution de Ruakura utilisée pour l'humidification initiale afin d'obtenir au final 1,5 × 10⁵ bactéries g⁻¹ de sable.

Pour la modalité « avec plante », six répétitions ont été préparées pour chaque niveau de contamination en PHE avec une graine de maïs germé par pot. La modalité « sans plante » a été suivie pour trois niveaux de contaminations à 0, 150 et 750 mg PHE kg⁻¹, en six répétitions. L'expérimentation regroupait ainsi un total de 54 pots de culture. Une rotation hebdomadaire des blocs a été instaurée pour limiter l'effet lié à la position des répétitions. Un système de prélèvement de la solution interstitielle RHIZON, de type MOM (Ø 2,5 mm x 10 cm) a été implanté dans chaque dispositif. Ces bougies sont formées d'une tête de prélèvement en fibres de verre, à l'intérieur de laquelle se trouve une fine tige en acier. Des prélèvements hebdomadaires (de la solution du milieu) ont pu être réalisés par une mise en dépression au moyen d'une seringue hypodermique en plastique pour la quantification du PHE, des nitrates et des éléments nutritifs au cours du temps. Après 25 j de culture, des mesures des échanges gazeux ont été réalisées sur la deuxième feuille de chaque plant de maïs comme indicateur des activités photosynthétiques et transpiratoires. À l'issue de la culture, un échantillon de sable a été prélevé après
homogénéisation du milieu pour quantifier le PHE total. La plante a été récoltée, en séparant les racines, la tige et les feuilles. L'allocation de biomasse et l'humidité pondérale ont été mesurées pour chaque organe. Les architectures des feuilles et racines ont été étudiées. La quantification des éléments nutritifs a ensuite réalisée sur les systèmes racinaire et aérien (tige et feuilles compris). Ces différentes méthodes sont détaillées dans les paragraphes qui suivent.

## 2.2 Culture sur terres industrielles – Expérience III

La culture de 35 jours a été réalisée avec 13 terres de sites historiquement contaminés et du sable non contaminé comme substrat de référence. Les dispositifs étaient constitués de tubes en PVC fermés à une extrémité, de 45 cm de hauteur et 15 cm de diamètre. Un sachet plastifié a été mis en place dans chaque tube afin de faciliter le dépotage et la récupération du système racinaire du maïs cultivé. Dans ces systèmes, l'adsorption des HAP sur les parois plastiques a été considérée comme négligeable. Quatre répétitions ont été préparées par type de sol. L'expérimentation regroupait ainsi un total de 56 pots de culture. Chacun a reçu trois graines de maïs germés. Le plant de maïs le plus grand a été conservé après 2 j de culture. Une rotation hebdomadaire des blocs a été instaurée pour éviter un effet lié à la position des répétitions. À l'issue de la culture, la plante a été récoltée, avec séparation des racines, la tige et les feuilles. L'allocation de biomasse et l'humidité pondérale ont mesurées pour chaque organe. La géométrie racinaire a été étudiée. La quantification des HAP et des éléments nutritifs ont ensuite réalisée sur les systèmes racinaire et aérien (tige et feuilles compris). Les extractions de HAP totaux, disponibles et dissous dans l'eau porale ont respectivement été réalisées avec un solvant organique, la résine Tenax® et la membrane POM. Ces différentes méthodes sont détaillées dans les paragraphes qui suivent. La Figure 12 précise les conditions de mise en place et conduite de la culture et synthétise les méthodologies de caractérisation des matériaux utilisées.
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 12 – Plan des traitements physiques, chimiques et techniques analytiques utilisés lors des expérimentations menées sur les terres anciennement contaminées. CRE = capacité de rétention en eau ; DCM = dichlorométhane ; ACN = acétonitrile ; MOE = matière organique extractible</figcaption></figure>

# 3 Méthodes de caractérisation et outils d'analyses

## 3.1 Préparation et conditionnement des échantillons

### 3.1.1 Lyophilisation

Les échantillons de sol ou de biomasse végétale fraîche peuvent nécessiter une élimination de l'eau qu'ils contiennent. Pour limiter la dégradation des HAP, la lyophilisation est favorisée. Cette méthode consiste en la dessiccation d'un produit par sublimation de l'eau. Pour cela, l'échantillon est congelé à -18 °C pendant une nuit. Durant la lyophilisation, la température est
maintenue négative et la pression atmosphérique réduite à 0,3 mbar. L'eau contenue passe de l'état solide à l'état gazeux (sous forme de vapeur). Pour éliminer la totalité de l'eau de l'échantillon, 48 heures de lyophilisation ont été nécessaires. Lorsque le cycle de lyophilisation est terminé, le vide est « cassé » et l'échantillon est amené à pression atmosphérique puis stocké à -18 °C au congélateur dans des flacons en verre hermétiques.

## 3.1.2 Broyage

Pour l'analyse des HAP, les échantillons de terre ont été broyés à l'aide d'un broyeur en agate jusqu'à obtention de grains inférieurs à 500 µm (contrôle par tamisage). Cette étape de broyage permet une meilleure homogénéisation de l'échantillon et l'amélioration des rendements d'extraction de la matière organique extractible (MOE) au solvant. Les échantillons de terre utilisés pour les extractions des HAP disponibles n'ont pas subi de broyage.

La biomasse végétale sèche a été broyée à l'aide d'un broyeur mécanique à bille (Broyeur MM40, Retsch), jusqu'à obtention d'une poudre aux grains inférieurs à 250 µm. La fréquence et la durée du broyage a été adaptée en fonction de l'organe du maïs et son volume. Pour les racines et les tiges, une fréquence de 27,5 Hz a été appliquée durant 40 ou 50 s pour les petits ou gros volumes. Le broyage des feuilles nécessitait une durée et une fréquence légèrement plus élevées, 50 à 65 s à 28 Hz.

## 3.2 Méthodes de caractérisation des terres

### 3.2.1 Mesure de la capacité de rétention en eau (CRE)

La CRE des terres a été déterminée à pF 2 à l'aide d'une presse à membrane d'après la norme NF ISO 11464 X31-412 (décembre 1994). Les terres étaient contenues dans des anneaux métalliques
et saturés en eau sur plaque poreuse à basse pression. Le dispositif a été placé dans une enceinte
hermétiquement fermée pendant 24 h à 0,1 bar. L’eau retenue a été déterminée par la mesure de
l’humidité de la terre à la sortie de l’extracteur (Extracteur à plaque basse pression, LaboTest).

3.2.2 Quantification du PHE total du sable

L'extraction des HAP dans le sable a été réalisée sur une aliquote de masse précise autour de 1 g.
Elle a été mise dans un flacon en verre ambré fermé avec 10 mL de dichlorométhane (DCM) et
placé dans un bain à ultra-sons (Branson 5210, 19 W, 47 kHz) pendant 2 h. L'opération a été
répétée une deuxième fois. Les deux extraits au DCM ont été récupérés à l'aide d'une pipette
pasteur, assemblés et évaporés sous flux d'azote (TurboVap® LV, Caliper Life Science) jusqu'à
un volume d'environ 3 mL. Un volume plus important d'acétonitrile (ACN) a été ensuite ajouté.
Une nouvelle évaporation sous flux d'azote a été réalisée pour éliminer le restant de DCM.
L'extrait a été ajusté à 5 mL dans une fiole jaugée. Les échantillons ont ensuite stockés dans un
congélateur (-20 °C) dans l'attente d'être analysés en chromatographie liquide (HPLC, « High
Performance Liquid Chromatography »).

3.2.3 Quantification des HAP dits « totaux » des terres industrielles

L'extraction des HAP dans les terres a été réalisée à l'aide d'un extracteur à solvant sous pression
(« Accelerated Solvent Extractor », ASE 350, Dionex). La méthode consiste en l'injection d'un
solvant organique à forte pression et haute température à travers une cellule contenant un
échantillon de terre à analyser. Les températures et les pressions élevées permettent de maintenir
le solvant à l'état liquide et d'augmenter la vitesse de dissolution des composés organiques. Les
cellules de 10 mL recevant l'échantillon ont d'abord été rincées pour éviter toute contamination
des extraits par la cellule ou les réactifs. Elles ont été conditionnées selon la méthode décrite en
Figure 13.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 13- Schéma du remplissage des cellules de l'ASE</figcaption></figure>

Les filtres en verre Whatman empêchent le passage des particules sans sorption des HAP et la dispersion du contenu de la cellule. Du cuivre en poudre a été utilisé pour piéger le soufre élémentaire pouvant interférer lors de l'analyse ultérieure. Pour cela, le cuivre a été préalablement activé à l'acide chlorhydrique puis rincé à l'eau, à l'éthanol et au DCM. Du sulfate de sodium anhydre a également été utilisé pour capturer l'eau résiduelle. Les billes de verre ont permis de réduire le volume mort de la cellule et en conséquence, de diminuer la consommation de solvants. Le rinçage a été réalisé avec un mélange acétone/DCM (50/50 v/v) à 130 °C et 100 bars. Après rinçage de la cellule, 2 g de terre lyophilisée et broyée ont été introduits dans la cellule pour subir deux extractions successives au DCM à 100 °C et 100 bars. Les deux extractions ont été réunies et mises à évaperer sous flux d'azote (TurboVap® LV, Caliper Life Science) à 10 psi et 20 °C, jusqu'à un volume d'environ 3 mL. L'extrait organique ainsi concentré a été ajusté avec du DCM à 20 mL dans une fiole jaugée. Une aliquote de 3 mL a été
transvasée dans un pilulier pré-pesé, mis à sec par évaporation sous sorbonne (environ 24 h) et pesé. Le bilan de masse a permis de déterminer la quantité de MOE de l'échantillon. Les extraits ont été stockés dans un congélateur (-20 °C) dans l'attente d'être analysés en chromatographie en phase gazeuse, couplée à un spectromètre de masse (GCMS, « Gas Chromatography Mass Spectrometry »). Par souci de simplification, les HAP extraits de la terre par cette méthode d'extraction sont désignés par « HAP totaux ».

### 3.2.4 Estimation de la fraction de HAP disponibles

La quantité de HAP disponibles a été déterminée grâce à une extraction réalisée à l'aide de résine Tenax®, d'après le protocole mis en place par Barnier *et al.* (2014) et adapté de Cornelissen *et al.* (1997). Une aliquote de 2 g du terre non broyée et séchée à l'air libre a été mise en suspension dans 300 mL d'une solution saline (0,01 M CaCl₂) complémentée en azoture de sodium pour inhiber toute activité biologique (200 mg L⁻¹ NaN₃) avec 2 g de résine Tenax® TA (177-250 µm). Le dispositif a été agité sur un agitateur rotatif à 15 rpm pendant 30 heures dans une pièce thermostatée à 21 °C. À l'issue de l'agitation, le flacon a été laissé au repos pendant 1 h pour une meilleure séparation entre les particules de terre et la résine Tenax®, qui flotte en surface. La résine a été aspirée par un système sous vide dans un erlenmeyer pour être ensuite récupérée à l'aide d'un tamis de maille à 50 µm. Les particules de résine ont été rincées à l'eau distillée et placées sous sorbonne pendant une nuit pour éliminer toute trace d'eau. Une fois sèche, la résine a été transférée dans un tube en verre avec 20 mL de solution acétone/hexane (50/50 v/v) qui a été placé dans un bain à ultrason (Branson 5210, 19 W, 47 kHz) durant 1 h. L'extraction a été répétée une fois en récupérant la résine à l'aide d'un tamis de maille à 50 µm et en renouvelant le solvant. Cette étape permet de s'assurer de la récupération complète des molécules adsorbées sur la résine. Les deux extraits ont été réunis et mis à évaporer sous flux d'azote (TurboVap® LV,
Caliper Life Science) à 10 psi et 20 °C, jusqu'à environ 3 mL. L'extrait organique ainsi concentré est ajusté à 5 mL dans une fiole jaugée avec le mélange acétone/hexane (50/50 v/v). Les échantillons sont stockés dans un congélateur (-20 °C) dans l'attente d'être analysés en GCMS.

### 3.2.5 Estimation de la concentration en HAP dans l'eau porale par échantillonneur passif

Cette technique permet d'estimer la concentration en HAP dans l'eau interstitielle d'une terre à l'équilibre (Hawthorne et al. 2009, 2011). Elle consiste en l'adsorption des HAP sur un échantillonneur passif, constitué de polyoxyméthyleène (POM, C.S Hyde Co., Lake Villa, IL, USA). Avant utilisation, les bandes de POM d'une masse précise proche de 100 mg nécessitent un rinçage méticuleux. Pour cela, les bandes ont été mises en agitation rotative dans du méthanol pendant 1 j. Le méthanol a ensuite été remplacé par de l'heptane et agité pendant 1 j. Cinq rinçages successifs à l'eau distillée d'un jour chacun ont alors été réalisés avant utilisation des bandes POM. Pour réaliser l'extraction des HAP en solution à l'équilibre, 5 g de terre ont été mis en suspension dans 30 mL d'une solution saline (0,01 M CaCl₂), complémentée en azoture de sodium pour inhiber toute activité biologique (200 mg L⁻¹ NaN₃), dans un flacon en verre ambré de 50 mL. Une bande de POM d'une masse connue proche de 100 mg a été utilisée par dispositif. Les flacons ont ensuite mis sur un agitateur rotatif à 10 rpm pendant 28 j dans une pièce thermostatée à 21 °C. Une fois l'agitation de 28 j finie, les bandes POM ont été récupérées et rincées à l'eau distillée pour enlever toutes les particules de terre à la surface. L'eau restant en surface a été éliminée à l'aide de papier absorbant propre. Cette manipulation doit durer moins d'une minute pour éviter une exposition prolongée des bandes POM à la lumière et à l'air libre, afin de limiter la contamination par des molécules présentes dans l'air ambiant et la photodégradation. Une fois sèches, les bandes POM ont été placées dans des flacons de 50 mL
avec 20 mL d'une solution d'heptane/acétone (80/20 v/v) et mises à agiter 2 jours à 10 rpm dans l'obscurité afin d'extraire les HAP adsorbés sur la membrane. Les extraits ont été ensuite concentrés par évaporation sous flux d'azote (TurboVap® LV, Caliper Life Science) puis ramenés à 5 mL dans une fiole jaugée avec le même mélange heptane/acétone (Figure 14). Les échantillons ont été stockés dans un congélateur (-20 °C) dans l'attente d'être analysés en GCMS.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 14 – Schéma de synthèse des interactions entre les molécules de HAP originaires de terre contaminée avec l'eau et la membrane POM.</figcaption></figure>

Le dosage de l'extrait indique la quantité de HAP adsorbés ($Q_{POM}$) qui, ramenée à la masse de la membrane POM ($m_{POM}$), permet l'estimation de la concentration sur la membrane $C_{POM}$ :

$$C_{POM} = \frac{Q_{POM}}{m_{POM}} \text{ (Équation 13)}$$

La concentration pour chaque molécule de HAP dissoute à l'équilibre dans l'eau porale (« Pore water Concentration » ou $C_{pw}$) peut être déduite d'après la formule suivante :
$$C_{pw} = \frac{C_{POM}}{K_{POM}} \text{ (Équation 14)}$$

Avec $K_{POM}$ le coefficient de partition du polluant entre la membrane POM et l'eau connu pour chaque HAP (Hawthorne et al. 2011).

## 3.3 Caractérisation des plantes

### 3.3.1 Quantification des éléments nutritifs

Les teneurs en micro et macro éléments ont été dosées dans les parties racinaires et aériennes (feuilles et tiges). La minéralisation a été effectuée sur une biomasse connue proche de 10 mg sèche et broyée à l'aide des tubes et bloc chauffant thermostaté Digiprep® (SCP Science). Elle consistait en deux attaques successives avec 2 mL de HNO₃ (5 M) pendant 12 h à froid puis 30 min à 70 °C suivi de 2 mL de H₂O₂ (3 M) pendant 3 h à 95 °C. Les extraits ont ensuite été filtrés à 0,45 µm (filtre à seringue Acrodisc®) et le volume du filtrat ajusté à 10 mL avec de l'eau déminéralisée. Pour chaque série de mise en solution, deux échantillons de référence ont été utilisés : des feuilles de *Noccæa cærulescens* (contrôle interne ; R21001002_V02.1) et des feuilles de maïs finement broyées (INRA USRAVE). Les éléments dans les extraits aqueux acidifiés ont été dosés par spectrométrie d'émission atomique en plasma induit d'argon (ICP-AES, ICAP 6300, Thermo Scientific). À chaque analyse, des blancs ont été utilisés pour déterminer les limites de détection et de quantification.

### 3.3.2 Dosage du carbone organique et de l'azote

Les teneurs totales en carbone et azote ont été déterminées par combustion sèche d'une prise d'essai de masse connue proche de 50 mg d'échantillon enfermé dans une capsule en étain, en
utilisant un analyseur élémentaire CHNS (Vario micro, Elementar), selon les normes AFNOR NF
ISO 10694 et NF ISO 13878 respectivement.

3.3.3 Photosynthèse et transpiration

La photosynthèse et la transpiration ont été déterminées sur une surface foliaire connue à l'aide
d'un appareil portatif mesurant les échanges de gaz, le Li-Cor 6200 (Li-Cor Inc). Cet appareil
permet de réaliser des mesures directement sur une feuille, sans distinction des faces. La feuille
est placée dans une chambre laissant passer la lumière (Figure 15), dans laquelle ont été mesurées
la température de l'air et de la feuille, et l'humidité relative.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 15 – Chambre de mesure des échanges gazeux d’un Li-Cor 6200</figcaption></figure>

Une pompe aspire l'air de la chambre pour le faire passer par un analyseur de CO₂, avant d'être
réinjecté dans la chambre. Les échanges de CO₂ entre la feuille et l'atmosphère sont calculés en
mesurant respectivement le changement de concentration de CO₂ et d'humidité relative dans la
chambre fermée contenant la feuille, dans un intervalle de temps court (30 s). L'assimilation nette
de CO₂ et la transpiration ont alors été calculées en utilisant les taux de changement de CO₂ et H₂O mesurés, la surface de feuille enfermée, la température et la pression atmosphérique.

### 3.3.4 Humidité pondérale

L'humidité pondérale (HMP, en %) des racines, feuilles et tiges a été déterminée par différence de masse avant et après lyophilisation. La teneur en eau des tissus a pu être déduite selon le calcul suivant :

$$HMP = \frac{BMF - BMS}{BMF} \times 100 \text{ (Équation 15),}$$

Où BMF est la biomasse fraîche (en g) et BMS est la biomasse sèche (en g).

### 3.3.5 Allocation de la biomasse

L'allocation de biomasse (ABM, en %) a été déterminée de la façon suivante :

$$ABM_{org} = \frac{BMS_{org}}{BMS_{T}} \times 100 \text{ (Équation 16),}$$

Où BMS<sub>org</sub> est la biomasse sèche de l'organe considéré et BMS<sub>T</sub> est la biomasse sèche de la plante entière (en g).

### 3.3.6 Caractéristiques géométriques du système foliaire

La surface foliaire (SF, en m²) de la plante a été mesurée à l'aide d'un planimètre (LI-3000C Portable Area Meter). Plusieurs paramètres morphologiques sont alors déterminés (Vile *et al.* 2005) :
* Surface foliaire spécifique (« Specific Leaf Area » ou SLA, en m² kg⁻¹) :

$$SLA = \frac{SF}{BMS\ feuilles} \times 10^3 (\text{Équation 17}),$$

* Teneur en matière sèche foliaire (« Leaf Dry Matter Content » ou LDMC, en mg g⁻¹) :

$$LDMC = \frac{BMS\ feuilles}{BMF\ feuilles} \times 10^3 (\text{Équation 18}),$$

* Épaisseur foliaire (« Estimated leaf thickness » ou ELT, en µm) :

$$ELT = \frac{1}{SLA \times LDMC} (\text{Équation 19}).$$

### 3.3.7 Caractéristiques géométriques du système racinaire

Le système racinaire fraîchement récolté puis rincé a été scanné (Figure 16). L'image numérique obtenue (800x800 ppp) a été traitée par le logiciel d'analyse d'image WinRhizo® Reg (WhinRhizo, 2005, Regent Instruments Inc.). Le paramètre étudié est la longueur totale (en cm) par classe de diamètre : 0 à 0,2 mm ; 0,2 à 0,4 mm ; 0,4 à 0,6 mm ; 0,6 à 0,8 mm ; 0,8 à 1,2 mm et 1,2 à 1,8 mm.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 16 – Photographie du scanner adapté à l'utilisation du logiciel d'analyse d'image WinRhizo® Reg et image d'un système racinaire de maïs de 28 jours cultivé sur du sable non contaminé.</figcaption></figure>

### 3.3.8 Évaluation de la subérification de la racine séminale principale

Pour évaluer la subérification, la racine séminale principale a été prélevée et incluse dans de l'agarose à 6 % (w/v). Après solidification de l'agarose, la racine est segmentée à intervalle régulier, tous les 5 % de la longueur totale de la racine, de l'apex vers la graine (Figure 17). À chaque extrémité de segment, 5 coupes d'une épaisseur de 200 µm sont réalisées de part et d'autre au vibratome (Leica).
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 17 – Schéma de la découpe régulière de la racine principale et la réalisation des coupes histologiques par vibratome</figcaption></figure>

Les tissus racinaires sont visualisés par l'autofluorescence de la cellulose, lignine et subérine par un filtre UV-1A. La distinction de la subérine est réalisée par la coloration au *fluorol yellow* 088 (Sigma) (Lux *et al.* 2005). La solution colorante (0,01 % w/v) est préparée dans du polyéthylène glycol (PEG; MW 400 Da) maintenu liquide par chauffage à 90 °C, en bain marie. La solution est conservée à +4 °C, dans l'obscurité. Avant utilisation, le colorant est dilué dans du glycérol 90 % (pureté ≥ 99,5 %, Roth) à hauteur de 1:1 (v/v). Cette solution est de nouveau diluée à 1/50 (v/v) dans de l'eau déminéralisée. Les coupes sont recouvertes de cette solution pendant 30 min à l'obscurité. Suite à cela, deux à trois gouttes de $FeCl_3$ à 0,1% dilué dans du glycérol (50/50 v/v) permettent de stabiliser la coloration pour l'observation. Les coupes sont observées grâce à un microscope à épifluorescence (NIKON Eclipse 80i), équipé d'un illuminateur à fibre (C-HGFIE Intensilight) pour l'excitation. La subérine est visible par excitation au filtre FITC (λex : 465-495 nm ; 480/30X, 505LP, 535/40M) et l'autofluorescence racinaire est visible sous UV-1A (filtre UV-1A ; λex : 330-380 nm).
Une caméra digitale noire et blanche (NIKON Digital Sight D5-U3) permet la photographie de l'aire de la stèle, de la coupe racinaire et la subérification de l'exoderme à l'aide d'un objectif X2 (3,19 µm/pixel), ainsi que de la subérification de l'endoderme avec un objectif X10 (0,64 µm/pixel) (Figure 18). L'analyse d'image est effectuée sur le logiciel ImageJ 1.45s (National Institutes of Health) employant les plugins Bio-Formats© (Rueden et Linkert (2005-2014) – Open Microscopy Environment) et Biorad Reader©. L'évaluation de la subérification de l'endoderme est estimée via le rapport du nombre de cellules subérifiées sur le nombre total de cellules de l'endoderme. Pour la subérification de l'exoderme, seule une estimation semi-quantitative a été réalisée (sur une échelle de 0 à 100 %, par intervalle régulier de 5 %). Il est considéré ici qu'une structure histologique est totalement subérifiée si elle comporte plus de 85 % de cellules subérifiées. Conceptuellement, cela correspond à une CE85 (Concentration Efficace donnant 85 % de réponse) où la concentration est remplacée par la distance à l'apex. Ce paramètre est appelé intensité de subérification (ISendo ou ISexo).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 18 - Photographies de coupes de racines de maïs colorées au Fluorol Yellow 088 et observées au filtre FITC en microscopie à épifluorescence : A) endoderme subérifié à 89 % (objectif x10) ; B) exoderme subérifié à 100 % (objectif x2). Barre blanche : 200 µm.</figcaption></figure>
### 3.3.9 Quantification des HAP dans le système racinaire

Pour l'extraction des HAP dans les racines, une masse connue proche de 0,5 g de biomasse sèche et broyée, a été transférée dans un flacon en verre avec 10 mL de DCM, placée dans un bain à ultrason (Branson 5210, 19 W, 47 kHz) pendant 2 h. Après décantation, la solution surnageante a été récupérée à l'aide d'une pipette en verre. Trois extractions successives ont été réalisées pour chaque échantillon, de façon à récupérer la totalité des HAP présents dans les racines. Les trois extraits ont été réunis et évaporés sous flux d'azote (TurboVap® LV, Caliper Life Science). Le volume final a été ramené à 5 mL dans une fiole jaugée avec du DCM. Les échantillons ont été filtrés à 0,45 µm (filtre à seringue Whatman, PTFE) et stockés dans un congélateur (-20 °C) dans l'attente d'être analysés en GCMS.

### 3.3.10 Quantification des HAP dans le système aérien

Pour l'extraction des HAP dans le système aérien (feuilles et tige mélangées), une masse connue proche de 0,5 g de biomasse sèche et broyée a été transférée dans un flacon en verre avec 10 mL de DCM, placée dans un bain à ultrason (Branson 5210, 19 W, 47 kHz) pendant 2 h. Après décantation, la solution surnageante a été récupérée à l'aide d'une pipette en verre. Trois extractions ont été réalisées successivement sur la même prise d'essai, de façon à récupérer la totalité des HAP présents dans les racines. Les trois extraits ont été réunis et évaporés sous flux d'azote (TurboVap® LV, Caliper Life Science). L'extrait a été repris dans de l'ACN puis ramené à 5 mL dans une fiole jaugée. Les échantillons ont été filtrés à 0,45 µm (filtre à seringue Whatman, PTFE) et stockés dans un congélateur dans l'attente d'être analysés en HPLC. Cette technique a été privilégiée pour éviter une étape de purification de l'extrait nécessaire pour éliminer la chlorophylle qui perturbe l'analyse en GCMS.
## 3.4 Caractérisation des solutions de culture

### 3.4.1 Quantification du PHE

L'extraction de la solution libre du sable a été faite par succion, à travers une bougie poreuse installée dans chaque pot de culture. Les pores étant de diamètre compris entre 0,12 et 0,18 µm, la filtration a permis l'élimination des bactéries. Les échantillons de solution aqueuse sont conservés dans des piluliers en verre et sont stockés dans un congélateur (-20 °C) dans l'attente d'être analysés en HPLC.

### 3.4.2 Dosage des nitrates en solution

La concentration en ion $NO_3^-$ en solution a été mesurée en chromatographie ionique (Dionex). La colonne utilisée était une colonne d'échange anionique ION PAC® AS11-HC 4x250 mm.

## 3.5 Méthodes d'analyse

### 3.5.1 Analyse et quantification des HAP par HPLC

La ligne HPLC (High Performance Liquid Chromatography) utilisée est composée d'une pompe (9012 Solvent Delivery System, Varian), d'un passeur d'échantillon (ProStar 410 Autosampler, Varian), d'un détecteur à barrette de diode PDA (ProStar 330 PDA Detector, Varian) et d'un détecteur à fluorescence (ProStar 363 Fluorescence Detector, Varian). La colonne utilisée est une Pursuit 3 PAH (Varian), de taille 100 x 4,6 mm, 3 µm placée dans un four thermostaté à 25 °C.

La quantification du PHE en solution aqueuse et du sable se fait en fonction de la gamme de concentration attendue en UV à 249 nm ou en fluorescence (250/365 nm excitation/émission).
L'analyse se fait après injection de 10 µL d'échantillon avec une élution isocratique ACN/eau 80/20 (v/v) à un débit de 1 mL min⁻¹. Le temps de rétention du PHE est alors de 2,6 min.

La quantification de 15 HAP extraits des feuilles a été réalisée uniquement par fluorescence.

L'analyse a été faite après injection de 10 µL avec un gradient d'élution ACN/eau à un débit de 1,3 mL min⁻¹ (Tableau 5).

<table><caption>Tableau 5 – Gradient d'élution ACN/Eau pour la séparation de HAP en HPLC sur la colonne Pursuit 3 PAH, détectés en fluorescence</caption><thead><tr><td>Temps (min)</td><td>Eau (%)</td><td>ACN (%)</td></tr></thead><tbody><tr><td>0</td><td>40</td><td>60</td></tr><tr><td>3</td><td>40</td><td>60</td></tr><tr><td>15</td><td>10</td><td>90</td></tr><tr><td>25</td><td>10</td><td>90</td></tr><tr><td>25,10</td><td>0</td><td>100</td></tr></tbody></table>

Les différents temps d'élution et longueurs d'ondes excitation/émission pour chaque HAP sont donnés dans le Tableau 6.
<table><caption>Tableau 6 – Temps de rétention et longueurs d'onde en fluorescence utilisés pour l'analyse de 15 HAP extraits depuis la biomasse aérienne de maïs</caption><thead><tr><td>Molécule</td><td>Temps de rétention (min)</td><td>Longueur d'onde d'excitation (nm)</td><td>Longueur d'onde d'émission (nm)</td></tr></thead><tbody><tr><td>NAPH</td><td>3,072</td><td>226</td><td>330</td></tr><tr><td>ACE</td><td>4,623</td><td>276</td><td>324</td></tr><tr><td>FLU</td><td>4,914</td><td>276</td><td>324</td></tr><tr><td>PHE</td><td>5,869</td><td>250</td><td>390</td></tr><tr><td>ANT</td><td>6,880</td><td>250</td><td>390</td></tr><tr><td>FLA</td><td>7,994</td><td>280</td><td>466</td></tr><tr><td>PYR</td><td>8,833</td><td>270</td><td>380</td></tr><tr><td>BaA</td><td>11,831</td><td>260</td><td>420</td></tr><tr><td>CHY</td><td>12,513</td><td>260</td><td>420</td></tr><tr><td>BbF</td><td>15,073</td><td>290</td><td>430</td></tr><tr><td>BkF</td><td>16,306</td><td>290</td><td>430</td></tr><tr><td>BaP</td><td>17,219</td><td>290</td><td>430</td></tr><tr><td>dBahA</td><td>19,559</td><td>290</td><td>418</td></tr><tr><td>BghiP</td><td>20,668</td><td>290</td><td>418</td></tr><tr><td>IcdP</td><td>21,998</td><td>300</td><td>464</td></tr></tbody></table>

Un chromatogramme type montrant la séparation de 15 HAP par la colonne est présenté en Figure 19.
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 19 – Chromatogramme de 15 HAP (0,54 mg L⁻¹) séparés sur la colonne Pursuit 3 PAH, détectés en fluorescence</figcaption></figure>

3.5.2 Analyse et quantification des 16 HAP par GCMS

Les analyses ont été effectuées par chromatographie couplée à un spectromètre de masse (GCMS, GCMS-QP2010Ultra, Shimadzu) avec un injecteur split-splitless La séparation chromatographique a été réalisée avec une colonne capillaire en silice fondue DB-5MS, de taille 30 m x 0,25 mm. Celle-ci a été faite selon le programme de température suivant : 70 °C pendant 2 min, puis 130 °C à 15 °C min⁻¹ et un dernier palier jusqu'à 315 °C à 4 °C min⁻¹ pendant 25 min.

La température de l'injecteur était à 300 °C et la ligne de transfert à température équivalente du dernier palier de température du programme, soit 315 °C pour éviter la précipitation des HAP du fait de la différence de température. Le gaz vecteur utilisé était l'hélium avec un débit constant de 1,4 mL min⁻¹. Le gaz vecteur a ainsi séparé progressivement les molécules en fonction de leur taille et de leur polarité.
La quantification des HAP a été réalisée par étalonnage interne. Cette méthode de quantification consiste en l'ajout d'une molécule de référence, appelée étalon interne, en quantité précise et connue, dans les échantillons à analyser et les solutions étalons pour la calibration. L'étalon interne ne peut pas être une molécule naturellement présente dans les échantillons mais doit avoir une structure très proche de la molécule cible pour avoir des propriétés physiques et chimiques similaires et ainsi s'affranchir des effets de matrice. Les standards internes utilisés était un mélange de six HAP deutérés (Internal Standards Mix 26, CIL Cluzeau®) : napthalène-D8, 1,4-dichlorobenzène-D4, acénaphtène-D10, phénanthrène-D10, chrysène-D12 et pérylène-D12. Le détecteur a dû être préalablement calibré, à l'aide d'une solution contenant un mélange des HAP d'intérêt (QTM PAH mix, Sigma Aldrich). Pour la quantification des extraits des HAP des terres, l'appareil a été calibré d'après une gamme « haute », allant de 0,3 à 1,5 µg HAP mL⁻¹. Les extraits issus de l'extraction par résine Tenax® ou par la membrane POM et de la biomasse végétale nécessitaient la calibration de l'appareil sur une gamme « basse », de 0,024 à 0,3 µg HAP mL⁻¹.

### 3.5.3 Localisation du PHE par microscopie en épifluorescence

Le PHE est visible sous UV-1A (filtre UV-1A ; λext : 330-380 nm). Les observations ont été réalisées à l'aide d'une caméra couleur (NIKON D5-Qi1Mc). En effet, dans les conditions d'observation, le PHE émettait un rayonnement d'émission bleu qui permettait de le distinguer sur la coupe, ce qui n'était pas possible avec une prise de photographie noire et blanche (voir partie 3.3.8). L'évaluation quantitative de l'accumulation de PHE a été estimée par traitement d'image en calculant le taux de recouvrement de la surface occupée par les cristaux de PHE sur la surface de la section racinaire et exprimé par la formule suivante :
$$TR_{PHE} = \frac{Aire\_cristaux}{Aire\_coupe} \times 1000 \text{ (Équation 20),}$$

Où $TR_{PHE}$ = Taux de recouvrement en PHE (‰), $Aire\_cristaux$ = Aire totale occupée par les cristaux de PHE (µm²) et $Aire\_coupe$ = Aire de la coupe histologique racinaire (µm²).

### 3.5.4 Observations en microscopie confocale à balayage laser

Dans le but d'affiner la localisation du PHE, des coupes, sélectionnées pour leur netteté, ont également été observées à l'aide d'un microscope confocale à balayage laser. Les coupes histologiques n'ont subis aucune préparation chimique préalable. Elles ont été immergées dans une goutte d'eau déminéralisée durant l'acquisition d'image, placée sur une lame simple.

Les observations confocales sont réalisées à l'aide d'un microscope inversé Nikon TE 2000 U Eclipse, équipé d'une tête confocale Radiance 2100 AGR-3Q-Rainbow (Biorad). Cette tête de balayage est reliée par une série de fibres optiques aux quatre sources lasers fournissant sept raies d'excitation différentes, réparties entre le proche UV et le rouge : (1) une diode violette pour l'excitation à 405 nm, (2) un laser Argon quatre raies à 457, 476, 488 et 514 nm, (3) un laser He-Ne émettant à 543 nm et (4) une diode rouge à 637 nm. Les informations se trouvant hors du plan focal du microscope ont été éliminées et seules les informations provenant de la structure éclairée ont été enregistrées dans l'image finale de l'échantillon.

Les objectifs Plan Apo x4 (N.A 0.3) et x20 (N.A. 0.75) ont été utilisés pour réaliser les acquisitions d'images. Les acquisitions d'images confocales de fluorescence ont été réalisées en mode séquentiel sur trois canaux à l'aide des lasers à 405 nm et 637 nm. Le premier canal (dit "bleu") collectait l'émission de fluorescence entre 420 et 450 nm générée principalement par l'excitation à 405 nm du PHE (fin du spectre d'excitation). Le second canal (dit "vert") collectait
l'autofluorescence des composés cellulaires (lignine, cellulose, subérine...) dans une bande de 460-500 nm après une excitation à une longueur d'onde de 405 nm. Enfin, le troisième canal servait à collecter l'image en transmission obtenue par l'éclairage de la préparation avec le laser rouge (RLD à 637 nm). Pour améliorer le rapport signal/bruit, les signaux de fluorescence ont été acquis par comptage de photons (i.e. les photons émis aléatoirement sont éliminés) (Földes-Papp et al. 2003). De plus, la commutation d'une lentille de type télescope au sein de la tête confocale a pu améliorer la collection des photons émis sans perte de résolution. Les observations ont été stockées sous forme d'images composite (type RGB), chaque couleur étant associée à un canal d'émission. Le logiciel accompagnant le microscope confocal était LaserSharp2000TM software Bio-Rad Cell Science Division. L'objectif x20 a permis d'obtenir une résolution de 4,015 pixels par micron, pour une taille du voxel (pixel tridimensionnel) de 0,25 x 0,25 x 3,00 µm³ (x,y,z).

### 3.5.5 Analyses statistiques

Les analyses statistiques sont réalisées à l'aide du logiciel XLstat (version 2012 4.03). Les données présentées sous forme de graphique ou de tableau sont les moyennes et les erreurs-standards. Un test de Shapiro-Wilk est utilisé pour vérifier la distribution d'un échantillon. Une analyse de la variance (ANOVA) à un facteur est réalisée selon une distribution normale, suivi d'un test de comparaisons multiples de Tuckey's (HSD). Pour une distribution non-paramétrique, un test de Kruskal-Wallis est réalisé. Les moyennes partageant les mêmes lettres ne sont pas significativement différentes (p < 0,05).
# CHAPITRE 3 :
## TRANSFERT DES HAP
### DU SOL À LA PLANTE
## SOMMAIRE CHAPITRE 3

<table><tr><td>1</td><td>Évaluation de la bioaccumulation des HAP dans le maïs</td><td>82</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Caractérisation de la contamination organique et des HAP totaux dans les terres industrielles</td><td>83</td></tr><tr><td>1.2</td><td>HAP accumulés dans les racines</td><td>86</td></tr><tr><td>1.3</td><td>HAP transloqués aux parties aériennes</td><td>89</td></tr><tr><td>2</td><td>Estimation de la disponibilité des HAP dans les terres</td><td>93</td></tr><tr><td>2.1</td><td>Fraction extraite par résine Tenax®</td><td>93</td></tr><tr><td>2.2</td><td>Concentration en HAP dissous dans l'eau porale</td><td>96</td></tr><tr><td>3</td><td>Prédiction de la bioaccumulation des HAP dans le maïs</td><td>99</td></tr><tr><td>3.1</td><td>Corrélation avec les fractions de HAP quantifiées dans les terres</td><td>99</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Modélisation du prélèvement racinaire des HAP</td><td>101</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Modélisation de la translocation aux parties aériennes des HAP</td><td>114</td></tr><tr><td>4</td><td>Localisation d'un HAP dans les racines à l'échelle cellulaire</td><td>118</td></tr><tr><td>5</td><td>Conclusion</td><td>124</td></tr></table>
L'étude bibliographie a montré que les HAP pouvaient pénétrer le système racinaire des plantes en s'adsorbant à la surface de celui-ci (Schwab et al. 1998; Jiao et al. 2007; Ling et al. 2013), pénétrer les tissus (Wild et al. 2005a) et se transloquer aux parties aériennes (Kipopoulou et al. 1999; Fismes et al. 2002; Samsøe-Petersen et al. 2002; Gao et al. 2004). Que ce soit dans un objectif de phytoremédiation ou d'aménagement paysager d'un ancien site industriel, l'implantation d'un couvert végétal fait face à ce risque de transfert de polluants dans la plante. Comprendre les mécanismes de transfert et de translocation dans la plante pourrait aider à identifier plus précisément les réponses toxiques de la plante. De plus, ce transfert peut être à l'origine d'un risque de contamination de la chaîne alimentaire dans le cas de la consommation de la biomasse végétale implantée. Il est ainsi nécessaire d'intégrer ce transfert dans l'évaluation quantitative du risque sanitaire dans la gestion des risques de sites et sols pollués. De ce fait, les objectifs de ce chapitre sont i) tester des outils et modèles pour prédire la bioaccumulation des HAP par les plantes afin de valider les mécanismes de prélèvements supposés, ii) caractériser les propriétés de terres multicontaminées pouvant contrôler la bioaccumulation des HAP dans la plante et iii) déterminer où et comment un HAP pénètre le système racinaire de la plante.

Pour répondre à ces objectifs, différentes approches expérimentales complémentaires ont été menées, se distinguant par la complexité des systèmes étudiés et des échelles d'observations choisies. Une première expérimentation a mis en œuvre une culture de maïs en conditions contrôlées de laboratoire sur des terres industrielles historiquement contaminées de Suède, Belgique et France pour évaluer le transfert de HAP dans la plante (Expérience III). Sur ce dispositif, une approche de modélisation de bioaccumulation des HAP a été testée. Différentes méthodes d'extractions de HAP ont été appliquées sur ces terres pour évaluer la fraction phytodisponible de HAP. En admettant que le transfert des HAP vers la plante se fasse par
advection selon le flux d'eau du sol (Chapitre 1, §2.3.2), l'hypothèse que la concentration dans l'eau porale soit plus représentative de la fraction de polluant potentiellement absorbable par les végétaux est émise. Ainsi, une estimation de la concentration en HAP dans l'eau porale à l'équilibre a été réalisée à l'aide de membranes POM. Toutefois, les racines étant à la fois en contact avec la solution et les particules de terre, il était pertinent d'intégrer une extraction en phase solide des HAP, à l'aide d'une résine adsorbante comme le Tenax®. Les résultats obtenus par ces deux approches ont été utilisés pour vérifier les prédictions de prélèvement obtenues par les modèles classiquement utilisés dans l'évaluation du risque de transfert des polluants et présentés dans la partie bibliographique (Chapitre 1, §2.3.4). Une seconde expérimentation a consisté en l'observation, à l'aide d'outils de microscopie, d'un HAP modèle, le PHE, sur des coupes racinaires de maïs cultivé sur du sable artificiellement contaminé et le suivi de son évolution dans le temps et l'espace (Expérience I).

Dans ce chapitre, seront abordés successivement les résultats relatifs à la caractérisation de la contamination en HAP dans les terres industrielles étudiées, à la quantification des HAP dans les parties racinaires et aériennes de maïs cultivés sur des terres historiquement contaminées, l'évaluation quantitative des différentes fractions de HAP présentes dans ces terres pour prédire la bioaccumulation des HAP dans les plantes et le traçage du PHE dans une racine de maïs à l'aide d'outils de microscopie.

# 1 Évaluation de la bioaccumulation des HAP dans le maïs

Les analyses réalisées sur les maïs témoins cultivés sur sable non contaminé ont indiqué une pollution analytique importante en PHE, probablement apportée lors de la préparation des échantillons avant extraction. De même, l'analyse de blancs, pour la quantification des HAP
dissous dans l'eau porale, a indiqué une pollution en NAPH d'origine atmosphérique. Enfin,
l'ACY n'a pu être quantifié en HPLC lors des quantifications des extraits des systèmes aériens.
De ce fait, ces trois molécules n'ont pas été intégrées dans les concentrations totales présentées
dans ce chapitre. Les teneurs totales tiennent compte de treize molécules.

1.1 Caractérisation de la contamination organique et des HAP totaux dans les terres industrielles

Les teneurs en MOE, indicatrices de la pollution organique globale, varient de 0 à 30 mg g⁻¹ (Tableau 7). Ce sont les terres FR01 et FR02 qui présentent les valeurs les plus élevées, avec 29,9 et 22,1 mg g⁻¹ respectivement. Des valeurs beaucoup plus faibles sont observées pour les terres issues du même site FR03 et FR06, avec 1,2 et 8,7 mg g⁻¹. La terre FR04 montre une MOE moyenne de 12,8 mg g⁻¹; suivi par la terre BE01 avec 5,5 mg g⁻¹ de MOE. Les terres françaises FR05 et FR07, ainsi que les terres suédoises se distinguent par de très faibles valeurs, inférieures à 5 mg g⁻¹ et jusqu'à nulle. Les analyses des 13 HAP suivent les mêmes tendances. Les teneurs les plus élevées sont obtenues dans les terres FR01 (1705 mg kg⁻¹) et FR02 (982 mg kg⁻¹), suivis de FR04 (851 mg kg⁻¹) et FR06 (560 mg kg⁻¹). Les autres terres, FR03, FR05, BE01 et de Suède présentent de plus faibles concentrations en HAP, inférieures à 200 mg kg⁻¹. Les teneurs les plus importantes observées ici sont comparables à des études similaires portant sur la phytoremédiation (Parrish et al. 2005; Rezek et al. 2008). Les teneurs les plus faibles sont toutefois plus élevées par rapport à des terres agricoles. La distribution individuelle des molécules est présentée en Annexes (Tableau 12). Il apparaît que les teneurs de HAP totaux sont positivement et étroitement corrélées avec celles en MOE (R²=0,96).
<table><caption>Tableau 7 – Quantités de MOE (n = 3) et concentrations des HAP quantifiées depuis les extraits de terres par solvant (HAP totaux, n = 1).</caption><thead><tr><td>Terre</td><td>MOE (mg g<sup>-1</sup>)</td><td>Σ13 HAP totaux (mg kg<sup>-1</sup>)</td></tr></thead><tbody><tr><td>FR01</td><td>29,9 ± 1,7</td><td>1705</td></tr><tr><td>FR02</td><td>22,1 ± 1,9</td><td>982</td></tr><tr><td>FR03</td><td>1,2 ± 0</td><td>55</td></tr><tr><td>FR04</td><td>12,8 ± 0,3</td><td>851</td></tr><tr><td>FR05</td><td>4,1 ± 0,4</td><td>187</td></tr><tr><td>FR06</td><td>8,7 ± 0,3</td><td>560</td></tr><tr><td>FR07</td><td>2,0 ± 0,5</td><td>85</td></tr><tr><td>BE01</td><td>5,5 ± 0,9</td><td>131</td></tr><tr><td>SW01</td><td>4,3 ± 0,4</td><td>117</td></tr><tr><td>SW02</td><td>1,8 ± 0,2</td><td>49</td></tr><tr><td>SW03</td><td>0,9 ± 0,1</td><td>13</td></tr><tr><td>SW04</td><td>0,0 ± 0,1</td><td>6</td></tr><tr><td>SW05</td><td>3,8 ± 0</td><td>126</td></tr></tbody></table>

La distribution moléculaire des 13 HAP est étudiée selon un regroupement en quatre familles : deux, trois, quatre et cinq cycles. La Figure 20 présente leur abondance relative dans les terres contaminées.
<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 20 – Distribution en fonction du nombre de cycles des HAP totaux (%)</figcaption></figure>

La distribution des HAP montre une majorité de HAP à quatre cycles, avec une moyenne d'abondance relative de 50 %, variant entre 37 et 62 % selon la terre. Les HAP à trois cycles représentent 17 à 35 % de la quantité de HAP, avec une moyenne d'abondance près de 23 %. De même, les HAP les plus lourds, à cinq cycles, équivalent à 24 % des HAP, les valeurs dans les terres étant comprises entre 9 et 34 %. Des terres d'anciennes usines à gaz (BE01, SW02 à SW05) montrent des proportions en HAP à trois cycles plus importantes que les HAP à cinq cycles. Les HAP les plus légers (deux cycles) sont les moins présents, avec une abondance de 3 %, les proportions variant entre 0 et 24 % selon les terres. Cette faible abondance de composés de faibles poids moléculaires peut être associée à des phénomènes de dégradation et/ou de
lixiviation dans le temps. Quel que soit le passé industriel des terres analysées, la distribution moléculaire de ces 13 HAP est globalement similaire pour chaque terre.

## 1.2 HAP accumulés dans les racines

La Figure 21 présente les concentrations totales de HAP quantifiées dans les systèmes racinaires des maïs cultivés sur les terres industrielles étudiées. L'humidité pondérale, la distribution individuelle des molécules et la somme des HAP sur biomasse sèche dans les racines sont données en Annexes (Tableau 13). Les racines de maïs développés sur les terres FR01, FR02 et FR03 montrent des concentrations décroissantes, avec des valeurs respectives de 43, 6,5 mg kg⁻¹ et proche de zéro. Sur la terre BE01, l'accumulation dans les racines est élevée, avec une teneur en HAP de 29,5 mg kg⁻¹. Des concentrations similaires entre elles sont observées dans les systèmes racinaires développés sur les terres FR04, FR07 et FR05, avec des valeurs respectives de 7,9, 4,4 et 3,5 mg kg⁻¹. Les maïs de la terre FR06 présentent une faible teneur en HAP absorbés de 1,3 mg kg⁻¹. De même, les maïs cultivés sur les terres suédoises montrent des teneurs faibles mais variables, comprises entre 1,0 et 6,7 mg kg⁻¹. Ces concentrations dans les racines sont en moyenne inférieures d'un facteur 10 à celles observées dans des racines de plantes cultivées en hydroponie mais correspondent à des teneurs mesurées dans des tissus racinaires après culture sur terres contaminées (Gao *et al.* 2004). La proportion de HAP quantifiés dans les racines correspond en moyenne à 17 % des concentrations en HAP totaux. Toutefois, les concentrations sont variables avec des erreur-standards parfois importantes.
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 21 – Teneurs totales en HAP (mg kg⁻¹ BMF) quantifiées dans les racines de maïs cultivés sur les terres industrielles</figcaption></figure>

L'abondance relative des molécules dans les systèmes racinaires des maïs cultivés sur terres contaminées est représentée dans la Figure 22 selon un regroupement en quatre familles.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 22 - Distribution en fonction du nombre de cycles (%) des HAP absorbés dans le système racinaire des maïs cultivés sur terres industrielles</figcaption></figure>

La distribution montre une majorité de HAP à quatre cycles, avec une moyenne d'abondance relative de 57 %, variant entre 40 et 93 % selon la terre de culture. Les HAP à trois cycles représentent 7 à 26 % de la quantité de HAP absorbés, avec une moyenne d'abondance près de 20 %. De même, les HAP les plus lourds, à cinq cycles, équivalent à 18 % des HAP, les valeurs étant comprises entre 0 et 30 %. Les HAP les plus légers, à deux cycles, présentent une abondance de 5 %, les proportions variant entre 0 et 22 % selon la terre de culture. La distribution des familles de HAP dans les racines ressemble à celle des terres. Les molécules à quatre cycles sont les plus abondantes, suivies de celles à trois, cinq et deux cycles. Dans le cas d'une advection des HAP dans les racines selon le flux d'eau du sol, l'intensité de prélèvement racinaire d'un HAP devrait être inversement proportionnelle à son poids moléculaire
(Kipopoulou et al. 1999). La distribution relative des HAP selon le nombre de cycle dans les racines infirme cette hypothèse. Il est envisageable que des particules de terre résiduelles et porteuses de HAP aient perturbé la quantification dans la racine. Toutefois, les racines ont été soigneusement rincées après leurs récoltes. De plus, les abondances relatives moyennes des HAP à deux et quatre cycles sont plus élevées dans les racines que dans les terres, ayant augmenté en moyenne de 2 et 7 % respectivement. Cela confirme une accumulation des HAP dans la racine. Le transport passif est depuis longtemps accepté pour les molécules organiques telles que les HAP (Ryan et al. 1988; Collins et al. 2005) mais un transport actif complémentaire est soupçonné depuis peu (Zhan et al. 2010). Les auteurs avaient également mis en évidence une compétition de prélèvement dans le blé entre un HAP à deux cycles (le NAPH) et un à trois cycles (le PHE), caractérisée par une inhibition réciproque du prélèvement racinaire de ces deux HAP. Ce contrôle négatif du prélèvement entre molécules à deux et trois cycles n'est pas évident ici puisque l'abondance relative des HAP à deux cycles dans les racines est deux fois plus importante que dans la terre. Toutefois, les différences des abondances relatives dans les terres et les racines peuvent laisser envisager une compétition entre les HAP à deux et trois cycles (+ 2 % et – 3 % respectivement) et les HAP à quatre et cinq (+ 7 % et – 6 % respectivement). Cette observation renforce l'hypothèse de mécanismes de prélèvement de HAP distincts, selon le nombre de cycle dans ce cas.

## 1.3 HAP transloqués aux parties aériennes

La Figure 23 présente les concentrations totales de HAP quantifiées dans les systèmes aériens des maïs cultivés sur les terres industrielles. L'humidité pondérale, la distribution individuelle des molécules et la somme des HAP sur biomasse sèche dans les parties aériennes sont présentées en Annexes (Tableau 14). Les maïs cultivés sur les terres FR01, FR02 et FR03 montrent des
concentrations variables, avec des valeurs respectives de 0,08, 0,51 et 0,02 mg kg⁻¹. Sur la terre FR05, l'accumulation dans le système aérien est la plus élevée, avec une teneur totale en HAP de 1,27 mg kg⁻¹. Des concentrations similaires sont observées dans les systèmes aériens des maïs cultivés sur les autres terres, variant entre 0,01 et 0,06 mg kg⁻¹. La proportion de HAP quantifiés dans les parties aériennes correspond en moyenne à moins de 1 % des concentrations en HAP dans les racines et témoigne d'une translocation très faible entre ces deux compartiments de la plante.

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 23 - Teneurs totales en HAP (mg kg⁻¹ BMF) quantifiées dans les parties aériennes de maïs cultivés sur les terres industrielles**</figcaption></figure>

L'abondance relative des molécules quantifiées dans les systèmes aériens est représentée dans la Figure 24 selon un regroupement en quatre familles.
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 24 - Distribution en fonction du nombre de cycles (%) des HAP quantifiés dans les systèmes aériens de maïs cultivés sur terres industrielles</figcaption></figure>

La distribution montre une majorité de HAP à quatre cycles, avec une moyenne d'abondance relative de 56 %, variant entre 46 et 64 % selon la terre de culture. Les HAP à trois cycles représentent 21 à 43 % de la quantité de HAP absorbés, avec une moyenne d'abondance de 32 %. De même, les HAP les plus lourds, à cinq cycles, et les plus légers, à deux cycles, équivalent à 7 et 4 % des HAP, les valeurs étant respectivement comprises entre 0 et 25 % et 1 et 8 %.

L'existence de deux voies de transfert des HAP dans les feuilles des plantes supérieures a déjà été mise en évidence : la translocation depuis les racines par le xylème selon le flux de transpiration et/ou la volatilisation des polluants depuis le sol et l'assimilation par les feuilles (Henner 2000; Gao *et al.* 2009). Ces deux voies dépendraient donc de la volatilité et de la solubilité du HAP,
directement liées au poids moléculaire. Dans l'hypothèse où la voie de transfert par l'atmosphère était majoritaire, les molécules les plus légères devraient être plus abondantes que les molécules plus lourdes et dans les racines. Pourtant les HAP à deux cycles présentent une abondance relative moyenne de 4 %, soit 1 % de moins que dans les racines et 14 fois inférieure à l'abondance des HAP à quatre cycles. La translocation racinaire est donc le mécanisme le plus plausible dans ce cas. Dans cette hypothèse, les HAP les plus lourds devraient être « freinés » lors de ce transfert vers les feuilles. C'est le cas des HAP à cinq cycles, qui voient leur abondance relative fortement diminuer dans les parties aériennes (+ 11 et + 17 % dans les racines et les terres respectivement) mais sont toutefois bien présents (Fismes et al. 2002; Meudec et al. 2006).

Ces observations infirment l'hypothèse que les HAP à haut poids moléculaire auraient un potentiel d'adsorption trop élevé et ne pourraient pas traverser les tissus racinaires pour s'accumuler dans les parties aériennes (Kipopoulou et al. 1999). Les molécules à trois et quatre cycles représentent respectivement 32 et 56 % des HAP quantifiés dans les parties aériennes des maïs, des valeurs proches de celles observées dans les racines pour les HAP à quatre cycles et supérieures pour les trois cycles. Les HAP à poids moléculaires moyens ont donc la plus forte capacité de pénétration dans la racine et de translocation dans la plante (Kipopoulou et al. 1999; Bakker et al. 2000; Fismes et al. 2002; Tao et al. 2004; Gao et al. 2004; Xu et al. 2005; Gao et al. 2009). Toutefois, les concentrations en HAP dans les parties aériennes sont en moyenne 200 fois inférieures à celles observées dans les racines. Concernant le maïs, le transfert de ces 13 HAP reste donc négligeable malgré de fortes contaminations pour certaines terres.
# 2 Estimation de la disponibilité des HAP dans les terres

## 2.1 Fraction extraite par résine Tenax®

La Figure 25 présente les concentrations totales de HAP quantifiées après des extractions par résine Tenax® sur les terres industrielles étudiées. Les terres FR01, FR02 et FR03 montrent un gradient de concentrations décroissant, avec des valeurs respectives de 18,7, 9,3 et 1,7 mg kg⁻¹.

Par rapport à la fraction de HAP des terres, la fraction extraite représente ainsi 1,1, 0,9 et 3 %. La terre FR06 présente une teneur faible en HAP, celle-ci étant de 5,7 mg kg⁻¹ soit 1 % de la totalité des HAP. Une concentration proche, soit 3,4 mg kg⁻¹, est observée dans la terre FR05. Cela équivaut à 1,8 % de la fraction de HAP. Les terres françaises FR04 et FR07 montrent des teneurs plus élevées, 15 et 8,5 mg kg⁻¹ respectivement, ou 1,8 et 10 % des HAP des terres. La terre BE01 se démarque également par une forte concentration en HAP extractibles par résine Tenax, supérieure à 15,8 mg kg⁻¹, soit 12,1 % des HAP. Au contraire, les terres suédoises SW01 à SW05 ont des teneurs faibles, comprises entre 1,5 et 3,6 mg kg⁻¹. La terre SW04 présente la fraction extractible la plus importante en comparaison à sa teneur de HAP, équivalant à 28,4 %. Au contraire, la terre SW05 montre une disponibilité très faible, représentant 1,2 % de la fraction des HAP.
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 25 - Teneurs totales en HAP (mg kg⁻¹) quantifiées d'après les extractions par résine Tenax® sur les terres industrielles</figcaption></figure>

Malgré une très grande variabilité des disponibilités dans ces 13 terres, comprises entre 1 et 30 %, ces niveaux de HAP extraits par résine Tenax® sont faibles en comparaison aux niveaux mesurés sur des sédiments anciennement contaminés, variant entre 20 % (van Noort *et al.* 2003; Reeves *et al.* 2004; Schwab et Brack 2007) et 60 % (Cornelissen *et al.* 1998), en raison de teneurs en MO plus élevées dans les terres. De même, les fractions de HAP extraits par cette résine sur des terres fraîchement contaminées sont plus élevées, entre 60 et 90 % de la totalité des HAP (Cornelissen *et al.* 1997; You *et al.* 2006). En effet, plus le temps de contact entre les contaminants et les particules du sol augmente, plus la disponibilité diminue (Alexander 2000; Oleszczuk 2009).
L'abondance relative des molécules dans les extraits Tenax® des terres industrielles est représentée dans la Figure 26 selon un regroupement en quatre familles : deux, trois, quatre et cinq cycles.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>**Figure 26 - Distribution en fonction du nombre de cycles (%) des HAP extraits par résine Tenax® dans les terres industrielles**</figcaption></figure>

Le profil de distribution des HAP extraits par Tenax® présente un ordre d'abondance similaire à celui observé pour les HAP toaux. La distribution montre une majorité de HAP à quatre cycles, avec une moyenne d'abondance relative de 51 %, variant entre 38 et 65 % selon la terre. Les HAP à trois cycles représentent 11 à 27 % de la quantité de HAP toaux, avec une moyenne d'abondance près de 19 %. Les HAP à quatre cycles présentent des abondances relatives similaires, avec une moyenne de 21 %, variant entre 1 et 29 %. La contribution des HAP à deux
cycles est toutefois trois fois plus importante dans les extraits par résine que dans les terres, avec en moyenne 9 % d'occurrence, les proportions variant entre 2 et 19 % selon les terres.

Les teneurs de HAP extraits par résine Tenax® sont d'autant plus élevées que les teneurs en HAP totaux sont élevées, à l'exception de la terre BE01. En ne considérant pas cette dernière, une forte corrélation existe entre ces mesures (R² = 0,81). Aucune autre corrélation n'est observée entre la disponibilité des HAP et les paramètres physico-chimiques mesurés des terres (Chapitre 2, § 1.2.2).

## 2.2 Concentration en HAP dissous dans l'eau porale

La terre belge BE01 se démarque avec la concentration en HAP dissous la plus élevée, égale à 29,5 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$ (Figure 27). Ces valeurs sont jusqu'à 58 fois supérieures à celles observées dans les autres terres. La terre FR04 présente également une concentration en HAP dans l'eau porale élevée, équivalente à 10,1 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$. Les terres FR01, FR02 et FR03 montrent des concentrations variables, avec des valeurs respectives de 0,95 $10^{-3}$, 3,76 $10^{-3}$ et 0,05 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$.

La terre FR06, présente une teneur en HAP dissous sensiblement plus élevée, celle-ci étant de 1,09 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$. Une concentration similaire est observée dans la terre FR07, soit 1,57 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$. Quant à la terre FR05, elle présente une concentration faible, avec 0,02 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$.

Les terres suédoises ont les teneurs les plus faibles, comprises entre 0,01 $10^{-3}$ et 1,00 $10^{-3}$ µg mL$^{-1}$. Il ne semble pas il y avoir de corrélation entre les teneurs en HAP dissous et en HAP totaux ou les quantités de HAP extraits par résine Tenax®.
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 27 - Teneurs totales en HAP dissous (µg mL⁻¹) dans les terres industrielles</figcaption></figure>

L'abondance relative des molécules dissoutes dans l'eau porale de terres contaminées est représentée dans la Figure 28 selon un regroupement en quatre familles.
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 28 - Distribution en fonction du nombre de cycles (%) des 13 HAP dissous dans l'eau porale des terres industrielles</figcaption></figure>

La distribution montre une majorité de HAP à deux cycles avec une moyenne d'abondance relative de 54 %, variant entre 15 et 84 % selon la terre. Les HAP à trois cycles représentent 11 à 54 % de la quantité de HAP, avec une moyenne d'abondance près de 27 %. Les HAP à quatre cycles sont faiblement abondants, avec une moyenne de 17 %, les valeurs variant entre 5 et 40 %. Quant aux HAP les plus lourds, ceux à cinq cycles, ils sont quasiment inexistants, avec une abondance moyenne de 1 %, dont les valeurs sont comprises entre 0 et 7 %. Ainsi, les HAP à deux et trois cycles représentent la fraction de HAP la plus importante du fait de leur solubilité dans l'eau plus élevée, contrairement aux profils de distribution des HAP extraits par résine Tenax® et dans les terres, où les HAP à trois et quatre cycles sont les plus abondants. Les auteurs Gomez-Eyles et al. (2012) et Brennan et al. (2014) n'ont pas quantifié les HAP à deux cycles et
observent donc majoritairement des HAP à trois et quatre cycles dissous dans l'eau porale de terres urbaines, d'usines à gaz et de sédiments historiquement contaminés. De ce fait, les valeurs en HAP dissous mesurées dans les 13 terres étudiées sont 2 à 180 fois supérieures aux concentrations présentées dans les travaux de Gomez-Eyles et al. (2012) à des niveaux de concentrations en HAP totaux équivalents.

# 3 Prédiction de la bioaccumulation des HAP dans le maïs

## 3.1 Corrélation avec les fractions de HAP quantifiées dans les terres

Le Tableau 8 présente les coefficients de corrélation linéaires (R²) entre les concentrations de HAP extraits par résine Tenax® et dissous dans l'eau porale avec les teneurs de HAP quantifiées dans les racines en fonction du nombre de cycles et la somme des 13 HAP.
<table><caption>Tableau 8 – Coefficients de détermination (R²) des corrélations linéaires entre les concentrations de HAP totaux, extraits par résine Tenax® et dissous dans l'eau porale avec les teneurs en HAP dans les racines et les feuilles de la plante (sur biomasse sèche) en fonction du nombre de cycles et la somme des 13 HAP</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">HAP totaux</th><th colspan="2">HAP extraits par Tenax</th><th colspan="2">HAP dissous dans l'eau porale</th></tr><tr><th>Racines</th><th>Aérien</th><th>Racines</th><th>Aérien</th><th>Racines</th><th>Aérien</th></tr></thead><tbody><tr><th>Deux cycles</th><td>0,82</td><td>0,06</td><td>0,53</td><td>0,001</td><td>0,10</td><td>0,006</td></tr><tr><th>Trois cycles</th><td>0,78</td><td>0,02</td><td>0,69</td><td>0,0001</td><td>0,10</td><td>0,024</td></tr><tr><th>Quatre cycles</th><td>0,81</td><td>0,004</td><td>0,70</td><td>0,006</td><td>0,26</td><td>0,004</td></tr><tr><th>Cinq cycles</th><td>0,82</td><td>0,0005</td><td>0,62</td><td>0,0091</td><td>0,31</td><td>0,059</td></tr><tr><th>Σ13 HAP</th><td>0,78</td><td>0,008</td><td>0,68</td><td>0,0006</td><td>0,22</td><td>0,004</td></tr></tbody></table>

La concentration des HAP dans les racines sur biomasse sèche est bien corrélée aux concentrations en HAP totaux, tout cycle confondu (R² entre 0,78 et 0,82) et pour la somme des 13 HAP (R² = 0,78). Les très faibles R² indiquent qu'il n'y a aucune relation linéaire entre les teneurs dans les parties aériennes avec celles des racines et les HAP totaux. Le transfert dans les parties aériennes ne semble donc pas dépendre des concentrations dans la terre et les racines.

La concentration dans l'eau porale obtenue par la méthode POM n'apparaît pas expliquer la teneur en HAP accumulés dans les racines et les parties aériennes. En revanche, les quantités de HAP extraits par résine Tenax® sont positivement corrélées aux HAP dosés dans les racines, tout cycle confondu (R² entre 0,53 et 0,70) et pour la somme des 13 HAP (R² = 0,68). Là encore il n'y a aucune corrélation avec les HAP quantifiés dans les parties aériennes. Le Tenax® peut servir
comme outil de prédiction pour les réponses toxiques d'organismes tels que les vers ou les
plantes (Cofield et al. 2008). Une bonne corrélation avec la germination de la laitue cultivée sur
la terre d'une ancienne usine à gaz (R² = 0,80) a ainsi été mise en évidence avec la concentration
de 5 HAP (BaP, BkF, BaA, dBahA et IcdP) extraits par résine Tenax®. Toutefois, les méthodes
POM et Tenax ne permettent pas d'expliquer les HAP quantifiés dans les terres et ceux
bioaccumulés.

3.2 Modélisation du prélèvement racinaire des HAP

L'application du modèle de Briggs (équation 6, page 35) a permis la comparaison des valeurs
mesurées dans les racines à celles prédites (équation 3, page 34) en utilisant soit les
concentrations en HAP dissous dans l'eau porale mesurées par la méthode POM (Figure 29) ou
les concentrations estimées grâce à l'équation 4 (page 35) et les données de concentrations en
HAP extractibles par résine Tenax® (Figure 30) ou en HAP totaux (Figure 31). Dans les figures
29, 30 et 31, la droite continue représente une relation de type 1:1 et les droites en pointillées
délimitent des intervalles d'une unité log par rapport à la relation 1:1.
<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Figure 29 – Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMF) et prédites par le modèle de Briggs et al. (1982) à partir des concentrations en HAP dissous dans l'eau porale
<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Figure 30 – Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMF) et prédites par le modèle de Briggs et al. (1982) à partir des concentrations en HAP extraits par résine Tenax
<figure><img src="image_34.png" /></figure>

Figure 31 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMF) et prédites par le modèle de Briggs et al. (1982) d'après les concentrations en HAP totaux
Les valeurs prédites par le modèle de Briggs et al. (1982) d'après les concentrations en HAP dissous obtenues par les méthodes POM et Tenax® ont tendance à sous-estimer les teneurs en HAP dans les racines en comparaison à celles réelles. Seules les prédictions établies pour les HAP à deux cycles extractibles au Tenax® se rapprochent de teneurs mesurées. Les teneurs prédites des autres molécules tendent à être sous-estimées d'un facteur 10. Dans le cas de la méthode POM, les valeurs prédites sont plus dispersées, en raison d'une plus forte variabilité liée à la méthode de mesure du fait d'un seuil de quantification plus bas. Au contraire, les estimations réalisées à partir des concentrations en HAP totaux présentent une relativement bonne relation avec les valeurs mesurées dans les racines pour les HAP à trois, quatre et cinq cycles. Toutefois, elles tendent à surestimer les valeurs des HAP à deux cycles. La répartition des points en fonction des terres (Annexes, Figure 73, Figure 74 et Figure 75) montre des regroupements distincts selon la terre étudiée. Les prédictions réalisées d'après les concentrations en HAP extractibles par résine Tenax® et totaux de SW05 sont diminuées par la très forte teneur en carbone organique de la terre (60 %). Les valeurs prédites d'après les concentrations en HAP dissous obtenues par les méthodes POM et Tenax sont fortement en deçà des valeurs réelles pour les terres FR01 et BE01. Les concentrations en HAP quantifiées dans les racines de maïs cultivés sur ces deux terres sont les plus élevées, 43 et 30 mg kg⁻¹ respectivement. Or le modèle considère uniquement les molécules absorbées par les racines et les teneurs en HAP mesurées ne distinguent pas les HAP absorbés par les racines aux HAP adsorbés à la surface racinaire. En conséquence, les teneurs en HAP mesurées dans les racines sont plus élevées que celles prédites. Cette tendance est renforcée pour les HAP les plus lourds.

Le modèle de Zhang et al. (2009) est également testé (équation 7, page 36). Les valeurs mesurées sont comparées à celles prédites (équation 3, page 34) d'après les concentrations en HAP dissous
mesurées par la méthode POM (Figure 32) et celles calculées par l'équation 4 (page 35) d'après les concentrations en HAP extractibles par la résine Tenax® (Figure 33) et dans les terres (Figure 34).

Les mêmes tendances pour les méthodes POM et Tenax sont observées avec l'application du modèle de Zhang et al. (2009), bien que l'écart entre les valeurs prédites et mesurées soit moins important qu'avec le modèle de Briggs et al. (1982). La distribution selon le nombre de cycle des HAP indique également une discrimination des HAP les plus légers, à deux cycles, lors de l'utilisation de la membrane POM. Cette sous-estimation résulte de la surreprésentation de ces HAP dans les valeurs mesurées. Les prédictions réalisées pour les terres FR05 et SW05 d'après les méthodes POM et Tenax sont particulièrement inférieures aux valeurs réelles (Annexes, Figure 76 et Figure 77). Cela s'explique par les fortes proportions en carbone organique de ces terres, 35 et 60 % respectivement. Les prédictions réalisées d'après les concentrations en HAP totaux tendent à surestimer les valeurs dans les racines d'une amplitude, à l'exception des terres SW03, SW04, SW05 et FR05 (Annexes, Figure 78). Dans ce cas, les valeurs élevées en carbone organique compensent la surestimation. Ce modèle n'est donc pas adapté à la prédiction de l'accumulation des HAP dans les plantes. De la même façon, Gomez-Eyles et al. (2012) ont démontré qu'aucune des méthodes testées pour l'estimation des HAP dissous (extractions par solvants tels que acétone/hexane ou le butanol, microextraction sur phase solide, membrane POM) ne permettait de prédire la bioaccumulation des HAP dans le ray-grass par le modèle de Zhang et al. (2009).
<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Figure 32 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMS) et prédites par le modèle de Zhang et al. (2009) à partir des concentrations en HAP dissous dans l'eau porale
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Figure 33 - Relation entre les concentrations individuelles des 14 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMS) et prédites par le modèle de Zhang et al. (2009) à partir des concentrations en HAP extraits par résine Tenax
<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Figure 34 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMS) et prédites par le modèle de Zhang et al. (2009) à partir des concentrations en HAP totaux
En conclusion, le modèle de Briggs et al. (1982) couplé aux concentrations en HAP totaux permet les meilleures prédictions parmi les différentes combinaisons testées. La méthode POM tend à sous-estimer fortement l'accumulation racinaire des HAP, à l'exception des plus légers qui sont surreprésentés lors de la quantification dans l'eau porale. Cela couplé à l'absence de corrélation entre les concentrations en HAP dissous dans l'eau porale (méthode POM) et en HAP dans les racines ainsi que la grande différence entre les distributions dans la solution et dans les racines renforcent l'hypothèse selon laquelle il existerait plusieurs voies d'entrée des HAP dans les racines et que la voie porale ne serait pas la voie principale, en particulier pour les HAP les plus lourds. De plus, la forte corrélation entre les concentrations en HAP dans les terres et en HAP dans les racines ainsi que la similarité des distributions des familles entre racines et ceux des terres laisse supposer une voie principale par sorption physique des HAP en contact direct avec les particules de terre. Ainsi, les modèles de prédiction ne devraient pas uniquement considérer la concentration en HAP dissous mais devraient prendre en compte les HAP en phase solide du sol. De plus, l'intégration de la fraction lipidique de la plante par le modèle de Zhang et al. (2009) n'améliore pas suffisamment les prédictions pour les méthodes POM et Tenax et suretime les valeurs prédites d'après les concentrations en HAP des terres. La contribution attribuée à la fraction lipidique de la plante serait donc trop importante. Bien qu'ayant une affinité avec les HAP inférieure, la fraction de carbone pourrait constituer le site de stockage des HAP le plus important dans la racine. Par ces hypothèses, un modèle est proposé, en considérant les HAP extractibles par résine Tenax® et les HAP des terres, et leur répartition entre les fractions organiques ($f_{oc}$) des terres et de la plante :

$$ [HAP]_{racine} = [HAP]_{extractibles} \times \frac{f_{oc \ racine}}{f_{oc \ terre}} \text{ (Équation 21)} $$
# Chapitre 3 : Transfert des HAP du sol à la plante

Les valeurs prédites par ce modèle d'après les concentrations en HAP extractibles par la résine Tenax® (Figure 35) et en HAP totaux (Figure 36) sont comparées à celles mesurées.
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 35 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMS) et prédites par le modèle proposé à partir des concentrations en HAP extraits par résine Tenax</figcaption></figure>
<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Figure 36 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMS) et prédites par le modèle proposé à partir des concentrations en HAP totaux
Les prédictions réalisées à partir des concentrations en HAP extractibles par résine Tenax® présentent une relativement bonne estimation des valeurs mesurées dans les racines pour les HAP, tout cycle confondu. Toutefois, l'utilisation des concentrations en HAP des terres entraîne une surestimation de l'accumulation racinaire. La répartition des points en fonction des terres (Annexes, Figure 79 et Figure 80) montre des regroupements distincts selon la terre étudiée. Avec la méthode Tenax, les prédictions pour les terres FR05 et SW05 sont sensiblement sous-estimées mais l'écart est nettement inférieur à celui observé avec le modèle de Zhang et al. (2009) malgré de fortes teneurs en carbone.

## 3.3 Modélisation de la translocation aux parties aériennes des HAP

Les concentrations en HAP dissous mesurées par la méthode POM (Figure 37) ou estimées depuis la fraction extractible au Tenax® (Figure 38) ne permettent pas de prédire correctement l'accumulation dans les parties aériennes du maïs. Les teneurs en HAP les plus lourds (quatre à cinq cycles) tendent à être sous-estimés. Cet effet est plus accentué pour les teneurs concernant la terre FR05 (Annexes, Figure 81 et Figure 82). Les estimations réalisées à partir des concentrations en HAP totaux (Figure 39) sont plus proches des valeurs réelles pour les HAP à trois et quatre cycles malgré une tendance à la surestimation des trois cycles. Les teneurs prédites pour les HAP à cinq cycles restent inférieures à celles mesurées. Ces écarts de prédiction peuvent être dus au domaine de validité du modèle qui a été établi initialement pour des molécules organiques de $K_{ow}$ inférieurs à 4 alors que les 16 HAP réglementaires ont des $K_{ow}$ compris entre 4 et 7,5. On peut également supposer que dans le cas des HAP le transfert via le xylème n'est pas la voie principale de transport des HAP depuis les racines aux parties supérieures, en particulier pour les HAP avec plus de deux cycles.
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Figure 37 – Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMF) et prédites par le modèle de Briggs et al. (1983) à partir des concentrations en HAP dissous dans l'eau porale
<figure><img src="image_41.png" /></figure>

Figure 38 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMF) et prédites par le modèle de Briggs et al. (1983) à partir des concentrations en HAP extraits par résine Tenax
<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Figure 39 - Relation entre les concentrations individuelles des 13 HAP mesurées dans les racines (mg kg⁻¹ BMF) et prédites par le modèle de Briggs et al. (1983) à partir des concentrations en HAP totaux
4 Localisation d'un HAP dans les racines à l'échelle cellulaire

Une approche par microscopie a été adoptée pour permettre l'observation du PHE dans les tissus racinaires après exposition et aider à la compréhension du transfert de ce HAP du milieu à la plante. Dans la racine principale, des amas de PHE ont essentiellement été détectés dans l'exoderme à 10 j et à la fois dans l'exoderme et l'endoderme à 20 j (Figure 40). Rien n'a pu être observé dans le cortex. Cette première observation semble montrer un mouvement centripète du PHE dans les structures racinaires avec le temps.
<figure><img src="image_43.png" /></figure>

Figure 40 - Visualisation d'un amas de PHE, dans la racine principale de maïs, exposé à 150 mg PHE kg⁻¹, sous microscope à épifluorescence, en filtre UV-1A, localisé dans l'exoderme après 10 j de culture (à gauche) ou dans l'exoderme après 20 j de culture (à droite), sur une coupe transversale (200 µm d'épaisseur) à environ 80 % de distance à l'apex. La flèche rouge désigne l'amas de PHE. EX=exoderme ; C=cortex ; EN=endoderme ; X1=xylème primaire ; X2=xylème secondaire ; S=stèle.
Les teneurs en PHE ne pouvant être mesurées directement à partir des observations, une estimation des taux de recouvrement des amas de PHE sur la surface de la section racinaire a été réalisée (Figure 41) afin d'avoir une estimation semi-quantitative de l'accumulation de PHE dans les racines. Le bruit de fond lié à l'analyse d'image est représenté par les maïs de contrôle dont les images ont subi les mêmes traitements analytiques. L'analyse de covariance (ANCOVA) révèle un effet significatif du traitement (p-value < 10⁻¹⁰), de la distance (p value < 10⁻¹⁰) et un effet combiné des deux (p-value < 10⁻¹⁰). Le temps n'exerce pas d'effet significatif (p-value < 0,4) mais des tendances apparaissent. Après 10 j de culture, les mesures indiquent des taux de recouvrement de PHE plus importants près de la graine, jusqu'à 75 % de distance à l'apex. Ces taux de recouvrement tendent à diminuer le long de la racine en direction de l'apex et sont plus élevés dans les cas d'exposition de 150 mg PHE kg⁻¹ qu'à 50 mg PHE kg⁻¹.

Après 20 j de culture, les racines exposées à 50 mg PHE kg⁻¹ montrent globalement une diminution des taux de recouvrement en PHE en plus d'une diffusion vers la partie apicale de la racine. En effet, les taux de recouvrement au-delà de 60 % de distance à l'apex ont diminué avec le temps quand ceux à mi-distance (35 à 50 %) ont augmenté. Lors d'une contamination à 150 mg PHE kg⁻¹ du milieu de culture, les taux de recouvrement près de la graine (au-delà de 75 % de distance à l'apex) sont plus importants et un gradient de taux de recouvrement décroissant est toujours observé le long de la racine jusqu'à l'apex. Cela peut notamment témoigner d'un effet cumulatif du PHE dans la racine.
Chapitre 3 : Transfert des HAP du sol à la plante

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 41 - Taux de recouvrement (‰) des amas de PHE en fonction de la distance à l'apex de la racine principale de maïs exposé à 50 et 150 mg PHE kg⁻¹ (n=5)</figcaption></figure>
Wild *et al.* (2005) ont également rapporté l'absence d'accumulation du PHE au niveau de la coiffe et de l'apex. Ils ont aussi observé une accumulation à la surface des cellules épidermales, dans la zone d'élongation, la zone pilifère et la zone de ramification. Ils ont ainsi conclu que le PHE était absorbé au niveau de la zone d'élongation puis remontait le long de la racine principale par voie apoplastique en se dirigeant vers la stèle. Toutefois, la baisse du taux de recouvrement à 20 j pour l'exposition 50 mg kg⁻¹ laisse supposer l'existence d'un système de régulation par la racine du prélèvement de PHE et/ou la métabolisation du HAP conduisant à sa dégradation. Mais à fortes concentrations en PHE dans le milieu, ces mécanismes pourraient être saturés, laissant s'accumuler davantage de PHE dans la racine. Ainsi, le PHE non dégradé pourrait constituer un réservoir interne de PHE susceptible de se dissoudre dans la plante (Wild *et al.* 2006).

Les observations en microscopie à épifluorescence ont également permis de détecter des amas de PHE en forme de bâton, parallèles à la longueur de la racine (Figure 42). Ces derniers semblent à l'intérieur de la paroi des cellules de l'exoderme et pourraient indiquer un passage dans la racine par voie apoplasmique plutôt que symplasmique. De plus, l'intensité des bâtons est plus importante lors d'expositions à 150 mg PHE kg⁻¹ qu'à 50 mg PHE kg⁻¹, suggérant une nouvelle fois un effet dose-réponse à ces concentrations.

Dans le but de préciser la localisation du PHE, des observations en microscopie confocale ont été réalisées. Des amas de PHE semblent remplir une cellule exodermale (Figure 43 A, B et C). Toutefois, ils peuvent également être issus d'une accumulation au niveau des parois communes.
<figure><img src="image_45.png" /></figure>

Figure 42 - Observations au microscope à épifluorescence des amas de PHE dans la racine principale de maïs exposés à 50 (A) et 150 (B) mg PHE kg⁻¹ pendant 10 j, à environ 60 % de distance de l'apex (images issues de la superposition de deux photographies prises sous filtre UV-1A (rouge) et filtre FITC (verte).

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Figure 43 - Visualisation des amas de PHE sous microscope confocale. (A) et (B) Amas de PHE accumulé dans l'exoderme (vue en x-y) (C) Deux amas localisés dans l'épaisseur de l'exoderme (vue en x-z). Les cristaux de PHE sont visibles en rouge et l'autofluorescence des composés constituant la racine en jaune-vert.
Ainsi, les racines seraient exposées à deux fractions du polluant dans le substrat contaminé : du PHE dissous dans l'eau porale et du PHE sous forme d'amas solides adsorbés sur les particules de sable. Les molécules de PHE dissous pourraient s'accumuler à la surface des racines du fait d'une forte affinité avec des tissus lipidiques tels que la subérine (Chen et Schnoor 2009). Le PHE complexé sur les grains de sable pourrait diffuser dans ces tissus par contact direct (Wild et al. 2006) avec les racines lors de leur croissance. Cette hypothèse concorde avec les résultats d'une étude portant sur l'observation de PHE par des outils de microscopie dans des feuilles de maïs exposés à une atmosphère contaminée (Wild et al. 2006). Les auteurs ont ainsi observé la diffusion de ce HAP à travers les cuticules, pour pénétrer dans les cellules épidermales et s'accumuler essentiellement dans les parois cellulaires, indiquant un transport apoplasmique plutôt que symplasmique, pour former un réservoir. Les observations par microscopie laissent supposer trois types de mouvement du PHE dans la racine de maïs : une diffusion radiale depuis l'exoderme à l'endoderme, confirmée par Wild et al. (2005) et une diffusion longitudinale vers l'apex dans l'exoderme selon l'élongation cellulaire, en plus d'une translocation vers la partie foliaire dans l'endoderme selon le flux de transpiration (Wild et al. 2005).

# 5 Conclusion

Ce chapitre a ainsi permis l'étude du transfert de HAP dans les racines de maïs cultivés sur des milieux complexes, des terres industrielles historiquement contaminées (Expérience III), et sur un milieu simplifié, du sable artificiellement contaminé en PHE (Expérience I). Les principaux résultats de ces deux études renforcent l'hypothèse d'une sorption physique des HAP par contact direct (Wild et al. 2006; Chen et al. 2009) avec les racines comme mécanisme principal d'entrée et non la diffusion par la voie porale (Ryan et al. 1988; Collins et al. 2005), comme illustrée en Figure 44. Les principaux arguments en faveur de cette hypothèse sont les distributions
moléculaires similaires entre les HAP totaux et extractibles par résine Tenax® avec celle dans les racines, les mauvaises corrélations entre les concentrations mesurées par la méthode POM et les racines, à la fois pour les quantités totales et les types de HAP (nombres de cycle), la surestimation des concentrations prédites par des modèles d'absorption de molécules organiques par voie porale, ainsi que la localisation du PHE en amas dans l'exoderme des racines. Les HAP dissous diffuseraient vers l'endoderme par voie apoplasmique (Wild et al. 2005). La bande de Caspari pourrait former une barrière physique aux HAP transportés et favoriser l'accumulation sous forme d'amas dans l'endoderme du fait d'une forte affinité pour la subérine (Chen et al. 2009). Les amas de PHE, observés aux intersections cellulaires sous forme de bâton, seraient liés à l'élongation des cellules épidermales et non à une diffusion longitudinale intercellulaire.

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 44 – Représentation hypothétique du transfert des HAP du sol à la racine**</figcaption></figure>

À faible concentration, un mécanisme de régulation permettrait de limiter le transfert des HAP dans les racines et la dégradation des molécules. Autrement, des réservoirs de HAP se
formeraient dans les tissus racinaires et pourraient diffuser progressivement (Wild et al. 2006).
Cette rétention des HAP dans les racines limiterait le passage aux parties aériennes. Bien que la
culture ait été réalisée sur une courte durée, l'accumulation dans la partie aérienne est restée très
faible (en moyenne 200 fois moins importantes que dans les racines) et l'effet de dilution par la
biomasse lors de la croissance de la plante écarte une potentielle menace des HAP pour
l'alimentation. De plus, malgré leur faible lipophilie, les molécules à deux cycles sont très peu
présentes dans les feuilles et tige. De même, les molécules à cinq cycles voient leur abondance
foliaire drastiquement inférieure à celle racinaire. Ces observations écartent également
l'hypothèse d'une accumulation HAP dans les feuilles par voie atmosphérique mais laissent
plutôt supposer un passage majoritaire par translocation racinaire. Ainsi, les molécules à trois et
quatre cycles ont la plus forte capacité de pénétration dans la racine et de translocation dans la
plante une fois adsorbés en surface. Ainsi, ces hypothèses de fonctionnement remettent en
question les modèles de Briggs et al. (1982) et de Zhang et al. (2009) pour les racines, et de
Briggs et al. (1983) pour les feuilles, basés sur le fait que la solution du sol serait le vecteur du
passage des HAP dans la racine et utilisés actuellement pour la prédiction de la bioaccumulation
des HAP dans les plantes supérieures. La considération des concentrations en HAP totaux permet
l'amélioration de ces prédictions. D'un point de vue pratique, la mesure de la MOE, dont les
teneurs sont fortement corrélées aux concentrations en HAP totaux, pourrait se substituer à des
analyses quantitatives des HAP, beaucoup plus compliquées et onéreuses. Toutefois, le modèle
alternatif proposé dans ce chapitre, couplé aux concentrations mesurées par la méthode Tenax
serait plus représentatif du fonctionnement global du système plante-sol.

Après avoir étudié le transfert des HAP dans les plantes, l'impact de la contamination sur le
fonctionnement du maïs est étudié dans le chapitre suivant.
# CHAPITRE 4 :
## FONCTIONNEMENT
### DU MAÏS EXPOSÉ AUX
### HAP
## SOMMAIRE CHAPITRE 4

<table><tr><td>1</td><td>Fonctionnement du maïs exposé aux HAP</td><td>130</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Allocation de la biomasse</td><td>130</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Géométrie racinaire</td><td>134</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Nutrition minérale</td><td>138</td></tr><tr><td>1.3.1</td><td>Prélèvement de l'eau</td><td>138</td></tr><tr><td>1.3.2</td><td>Éléments dans les racines</td><td>140</td></tr><tr><td>1.3.3</td><td>Éléments dans les parties aériennes</td><td>147</td></tr><tr><td>1.4</td><td>Effets des terres sur le fonctionnement du maïs</td><td>153</td></tr><tr><td>2</td><td>Fonctionnement du maïs exposé au PHE</td><td>156</td></tr><tr><td>2.1</td><td>Devenir du PHE dans le milieu</td><td>156</td></tr><tr><td>2.1.1</td><td>Observation du PHE au sein du support de culture</td><td>156</td></tr><tr><td>2.1.2</td><td>Devenir dans le temps</td><td>156</td></tr><tr><td>2.2</td><td>Réponses physiologiques du maïs</td><td>160</td></tr><tr><td>2.2.1</td><td>Allocation de la biomasse</td><td>160</td></tr><tr><td>2.2.2</td><td>Géométrie du système foliaire</td><td>163</td></tr><tr><td>2.2.3</td><td>Géométrie du système racinaire</td><td>164</td></tr><tr><td>2.2.4</td><td>Fonctions physiologiques</td><td>168</td></tr><tr><td></td><td>Photosynthèse et transpiration</td><td>168</td></tr><tr><td></td><td>Nutrition minérale</td><td>169</td></tr><tr><td>2.3</td><td>Subérification des tissus racinaires</td><td>174</td></tr><tr><td>3</td><td>Conclusion</td><td>179</td></tr></table>