Virologie 2024, 28 (3): 199-215

# Les viroïdes : des ARN infectieux non codants

## Viroids : infectious non coding RNAs

Charith Raj Adkar-Purushothama
Pauline Lejault
Marc-Antoine Turcotte
Jean-Pierre Perreault

Groupe ARN, Département de Biochimie et Génomique fonctionnelle, Faculté de Médecine et des Sciences de la santé, Pavillon de Recherche appliquée au cancer, Université de Sherbrooke, 3201 rue Jean-Mignault, Sherbrooke, Québec, Canada, J1E 4K8

Article accepté le 13 mai 2024

**Résumé.** Les viroïdes sont les plus petits ARN non codants (entre 246 et 401 nucléotides) infectieux connus comme étant hautement structurés et se répliquant de manière autonome dans les plantes hôtes. Bien qu’ils ne codent pour aucun peptide, les viroïdes induisent des symptômes visibles chez les plantes hôtes sensibles. Cet article résume leurs propriétés physiques et biologiques, les maladies causées par ces derniers et rapporte leur importance chez les plantes. Les mécanismes sous-jacents à l’expression des symptômes chez les plantes hôtes, leur détection et les stratégies pour prévenir les maladies sont également développés.

**Mots clés :** viroïde, ARN circulaire, ARN non codant, agent infectieux

**Abstract.** Viroids are the smallest non-coding infectious RNAs (between 246 and 401 nucleotides) known to be highly structured and replicate autonomously in the host plants. Although they do not encode any peptides, viroids induce visible symptoms in susceptible host plants. This article provides an overview of their physical and biological properties, the diseases they cause and their significance for the plants. The mechanisms underlying the expression of symptoms in host plants, their detection and various strategies employed for diseases prevention are also developed.

**Key words:** viroid, circular RNA, non coding RNA, infectious agent

## Introduction

Découverts par T. O. Diener en 1971, les viroïdes sont des ARN non codants et infectieux capables de se multiplier et de se propager dans un organisme [1]. Composés exclusivement d'un ARN circulaire de 246 à 401 nucléotides (nt), ils sont environ vingt fois plus petits que le génome du virus de la mosaïque du tabac (tobacco mosaic virus, TMV) et six fois plus petits que le génome du virus de l'hépatite delta (hepatitis delta virus, HDV) humaine décrits comme étant les plus petits agents infectieux à ce jour (~1800 nt). Contrairement aux virus, les viroïdes ne codent pour aucune protéine et, par conséquent, ne sont pas encapsidés. Ils ont la capacité de s'accumuler in vivo sous forme d'acides nucléiques circulaires « nus ». En raison de la forte auto-complémentarité de leur séquence nucléotidique, leur ARN génomique se replie dans une conformation compacte et fortement structurée.

Malgré leur petite taille et leur simplicité, les viroïdes peuvent infecter un large éventail d'espèces végétales et induire des pathologies chez plusieurs hôtes. Leurs effets peuvent varier d'asymptomatique à l'élét, dépendamment des hôtes et des viroïdes. Depuis plusieurs décennies, les biologistes tentent de comprendre comment de tels ARN circulaires peuvent affecter le fonctionnement cellulaire et induire une pathologie [2]. En effet, la modification d'un

<footnote>**Correspondance :** C. Adkar-Purushothama, Jean-P. Perreault
<Charith.adkar@usherbrooke.ca>
>Jean-Pierre.Perreault@usherbrooke.ca></footnote>
seul nucléotide du viroïde du tubercule en fuseau de la pomme de terre (potato spindle tuber viroid, PSTVd) peut entraîner une augmentation de sa pathogénicité passant d'un état non infectieux à létal [3]. Cette découverte fondamentale a permis d'identifier plusieurs motifs structuraux impliqués dans l'induction de la maladie, notamment les structures en épingle à cheveux (incluant des boucles et des renflements au sein de l'ARN). Leur importance a été confirmée lorsque les chercheurs ont découvert que des plants de tomates transgéniques exprimant une construction en épingle à cheveux du PSTVd (se composant de répétitions inversées) présentaient des symptômes similaires aux viroïdes [4]. L'étude de la pathogénicité des viroïdes a alors pris un tournant en évaluant le rôle de l'interférence par l'ARN (iARN) dans la pathogénicité des viroïdes. Entre-temps, d'autres études sur les interactions viroïde-hôte ont révélé différentes facettes de la pathogénicité des viroïdes, telles que l'expression différentielle de certains gènes de l'hôte induite par l'infection d'un viroïde ou encore l'interaction directe d'un viroïde avec des protéines de l'hôte [5].

Les viroïdes sont à l'origine de pertes considérables à l'échelle mondiale que ce soit chez les espèces végétales monocotylédones et dicotylédones, que chez les plantes herbacées et ligneuses. Des études menées sur le terrain et en serre ont démontré que les viroïdes se transmettent par différentes voies : par des outils contaminés, par contact entre les plantes, par les semences, par le pollen et mécaniquement par les insectes. À l'heure actuelle, il n'existe pas de mécanisme de résistance naturelle connu contre les viroïdes, c'est pourquoi la lutte repose sur la détection moléculaire et l'éradication des plantes infectées. Dans cette revue, nous tenterons de comprendre les propriétés des viroïdes, leur pathogénicité et la gestion de la maladie.

## Symptômes associés aux viroïdes chez la plante hôte

Bien que les viroïdes soient connus comme des agents pathogènes destructeurs, certains viroïdes n'induisent pas automatiquement de pathologies sévères tandis que d'autres peuvent entraîner la mort de la plante hôte. Par exemple, le viroïde australien de la vigne (australian grapevine viroid, AGVd) n'est pas connu pour induire des symptômes chez ses plantes hôtes (vignes). À l'inverse, les infections par le viroïde cadang cadang du cocotier (coconut cadang-cadang viroid, CCCVd) entraînent la mort de celui-ci [6, 7]. La plupart des espèces de viroïdes induisent des symptômes chez des plantes hôtes où l'intensité peut varier en fonction de

l'hôte, de la variété cultivée, de la séquence du viroïde et des facteurs environnementaux, tels que la température. Pour citer un exemple, la souche intermédiaire du PSTVd-I est connue pour induire de graves symptômes chez la variété de tomate Rutgers, alors qu'elle ne provoque généralement aucun symptôme sur la variété Moneymaker. De plus, quelques modifications nucléotidiques sur le PSTVd-I le convertissent en une souche modérée, le PSTVd-M, qui induit des symptômes légers chez les plants Rutgers [8].

En général, une plante infectée par un viroïde présente des symptômes sur les feuilles, les tiges et les organes reproducteurs. Le rabougrissement est le symptôme le plus fréquemment induit par la plupart des viroïdes. D'autres symptômes sont également notables, tel que l'épinastie, la chlorose, la nécrose, la distorsion, l'éclaircissement des nervures, la fissuration de l'écorce, des nervures, l'écaillage, le gommage, les piqûres et le piquetage. Pour ce qui est de l'infection des organes reproducteurs, la réduction du nombre de fleurs, le changement de la forme et de la couleur des fleurs et des fruits et la stérilité sont également observés [6, 7]. Comme les viroïdes se déplacent à travers les tissus par l'intermédiaire du phloème, ils sont également connus pour affecter le système racinaire en réduisant son volume et en provoquant des malformations (par exemple, les tubercules en forme de fuseau provoqués par le PSTVd chez la pomme de terre) [7].

## Taxonomie des viroïdes

En raison de la simplicité des viroïdes, leur structure est utilisée comme critère fondamental pour la classification et la taxonomie. La taxonomie permet l'organisation systématique et cohérente des organismes selon leurs caractéristiques prédéterminées (structure secondaire, motif ARN répété, etc.). Les viroïdes sont répliqués par des polymérides à ARN de l'hôte [9]. En utilisant une matrice d'ARN, ces polymérides à ARN dépendante de l'ADN sont alors sujettes à un taux d'erreur beaucoup plus élevé. De ce fait, les viroïdes s'accumulent chez les hôtes sous forme de populations hétérogènes de variants de séquences étroitement liées et légèrement différentes les unes des autres, appelées « quasi-espèces » [10]. Il est donc important de tenir compte de la variabilité des séquences lors de la classification des viroïdes. Bien que les viroïdes diffèrent des virus sur plusieurs aspects essentiels, leur classification est officiellement régllementée par le Comité international de taxonomie des virus (ICTV, https://talk.ictvonline.org/). Les virus et les viroïdes sont des éléments génétiques mobiles, comme
le précise l'ICTV dans le Code international de classification et de nomenclature des virus (ICVCN) (https://ictv.global/about/code).

Sur la base de leurs caractéristiques structurelles et biologiques, les viroïdes sont regroupés en deux familles : les *Pospiviroidae* et les *Avsunviroidae* (figure 1). Les membres de la famille des *Pospiviroidae* ont un ARN génomique qui adopte une conformation en bâtonnet ou quasi-bâtonnet (figure 1A). Deux répétitions imparfaites situées de part et d'autre de la région centrale conservée forment une structure transitoire, appelée épingle à cheveux, qui est impliquée dans la réplication des membres de cette famille (figure 1A, flèches rouges). Plusieurs analyses biochimiques, microscopiques, de biologie

moléculaire sur trois viroïdes (le PSTVd, le viroïde de l'exocortis du citronnier (*citrus exocortis viroid*, CEVd) et le viroïde du nanisme du chrysanthème (*chrysanthemum stunt viroid*, CSVd)) ont permis de proposer cinq domaines structuraux et fonctionnels pour cette famille qui sont : le domaine terminal gauche (TG), le domaine de pathogénicité (P), le domaine central (C), le domaine variable (V) et le domaine terminal droit (TD) [11, 12]. Parmi ces domaines, deux régions nucléotidiques conservées dans le domaine C sont décrites comme la région centrale conservée (RCC). Par ailleurs, le domaine C est en mesure de former deux ou plusieurs structures alternatives qui sont décrites comme pouvant réguler la réplication (figure 1A) [2].

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>**Figure 1.** Principales caractéristiques des familles de viroïdes. **A.** Les viroïdes de la famille des *Pospiviroidae* adoptent une structure secondaire en forme de bâtonnet contenant une région centrale conservée (RCC, en jaune) et la région conservée terminale (RCT, en bleu) ou l'épingle à cheveux conservée terminale (ECCT, en vert). Le brin supérieur du RCC et les répétitions inversées (flèches rouges) qui l'encadrent forment une épingle à cheveux métastable impliquée dans la réplication (en bas à gauche). Les nucléotides conservés dans tous les membres de la famille *Pospiviroidae* au sein de l'épingle sont identifiés en rouge. **B.** Les viroïdes classés dans la famille *Avsunviroidae* adoptent une conformation en bâtonnet, semi-branchée ou ramifiée selon le genre. Des structures d'auto-coupure en tête de marteau sont également retrouvées (les domaines conservés sont représentés par des boîtes roses et bleues). Les tirets bleus entre les deux boucles de *Pelamoviroid* correspondent au repliement tertiaire et l'interaction entre les deux boucles.</figcaption></figure>

Cette figure a été inspirée par un article publié en [5] sous la licence Creative Commons Attribution 4.0 International.
Les membres classés dans la famille des *Avsunviroidae* ont une conformation en quasi-bâtonnet, semi-ramifiée ou ramifiée (figure 1B). Aucun domaine particulier n'a été mis en lumière et ils semblent également être dépourvus de RCC. En revanche, ils se caractérisent par la présence de séquences d'auto-clivage « en tête de marteau » (ou ribozyme *hammerhead*) dans les brins (+) et (-) de ces viroïdes (figure 1B).

Les deux familles de viroïdes sont sous-divisées en genres, basés sur la présence ou non de motifs conservés, de structures secondaires et par certaines particularités. Plus spécifiquement les membres de la famille des *Pospiviroidae* ont été classés dans cinq genres en fonction : i) du type de RCC ; ii) de la présence ou de l'absence de deux autres régions conservées, la région conservée terminale (RCT) et l'épingle à cheveux conservée terminale (ECCT) [13-15] ; et, iii) du regroupement dans les arbres phylogénétiques basés sur les séquences du génome entier [16], pour conduire aux cinq genres de *Pospiviroidae*: *Apscaviroid*, *Coleviroid*, *Cocadviroid*, *Hostuviroid* et *Pospiviroid*. Les membres de chaque genre partagent un RCC caractéristique et contiennent la séquence RCT ou ECCT (voir figure 1A et tableau 1).

Dans la famille des *Avsunviroidae*, les critères de genres sont basés sur le contenu en G/C, la conformation des ARN brin (+) (en bâtonnets, semi-ramifiés ou ramifiés), qui est liée à la solubilité dans le chlorure de lithium, et à la morphologie des séquences d'auto-clivage en tête de marteau (figure 1B). Sur la base de ces critères, trois genres ont été créés, nommés *Avsunviroid*, *Pelamoviroid* et *Elaviroid* [17]. Par exemple, le viroïde de la tache solaire de l'avocat (*avocado sunblocht viroid*, ASBV), membre unique du genre *Avsunviroid*, adopte une conformation en bâtonnets *in silico*, *in vitro* et *in vivo* (figure 1B et tableau 1). Il est soluble dans le chlorure de lithium (2 M), a une faible teneur en G/C et possède des séquences d'auto-clivage en tête de marteau thermodynamiquement instables. En fait, pour observer une réaction d'auto-coupure, il doit y avoir au préalable synthèse d'un ARN viroïde multimérique permettant de former une structure plus stable impliquant deux motifs en tête de marteau [18, 19]. En revanche, les membres du genre *Pelamoviroid* ont un ARN génomique ramifié stabilisé par un élément structurel tertiaire d'interactions inter-boucles, sont insolubles dans le chlorure de lithium (2 M), ont une teneur élevée en G/C et contiennent des séquences d'auto-clivage en tête de marteau thermodynamiquement stables (figure 1B) [20]. Des structures stables d'auto-clivage en tête de marteau sont également formées par des variants de l'espèce unique du viroïde latent de l'aubergine (*Eggplant latent viroid*, ELVd),

<table><caption>Tableau 1. Liste des espèces de viroïdes reconnues par le Comité international de taxonomie des virus (ICTV).</caption><thead><tr><th>Famille</th><th>Genre</th><th>Espèce</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="22">Pospiviroidae</td><td rowspan="12">Apscaviroid</td><td>Apple dimple fruit viroid</td></tr><tr><td>Apple scar skin viroid</td></tr><tr><td>Apscaviroid aclsvd</td></tr><tr><td>Apscaviroid cvd-VII</td></tr><tr><td>Apscaviroid dvd</td></tr><tr><td>Apscaviroid glvd</td></tr><tr><td>Apscaviroid lvd</td></tr><tr><td>Apscaviroid plvd-I</td></tr><tr><td>Apscaviroid pvd</td></tr><tr><td>Apscaviroid pvd-2</td></tr><tr><td>Australian grapevine viroid</td></tr><tr><td>Citrus bent leaf viroid</td></tr><tr><td>Citrus dwarfing viroid</td></tr><tr><td>Citrus viroid V</td></tr><tr><td>Citrus viroid VI</td></tr><tr><td>Grapevine yellow speckle viroid 1</td></tr><tr><td>Grapevine yellow speckle viroid 2</td></tr><tr><td>Pear blister canker viroid</td></tr><tr><td rowspan="4">Cocadviroid</td><td>Citrus bark craking viroid</td></tr><tr><td>Coconut cadang cadang viroid</td></tr><tr><td>Coconut tinangaja viroid</td></tr><tr><td>Hop latent viroid</td></tr><tr><td rowspan="5">Coleviroid</td><td>Coleus blumei viroid 1</td></tr><tr><td>Coleus blumei viroid 2</td></tr><tr><td>Coleus blumei viroid 3</td></tr><tr><td>Coleviroid cbvd-5</td></tr><tr><td>Coleviroid cbvd-6</td></tr><tr><td>Hostuviroid</td><td>Dahlia latent viroid Hop stunt viroid</td></tr><tr><td rowspan="10">Pospiviroid</td><td>Chrysanthemum stunt viroid</td></tr><tr><td>Citrus exocortis viroid</td></tr><tr><td>Columnea latent viroid</td></tr><tr><td>Iresine viroid 1</td></tr><tr><td>Pepper chat fruit viroid</td></tr><tr><td>Pospiviroid plvd</td></tr><tr><td>Potato spindle tuber viroid</td></tr><tr><td>Tomato apical stunt viroid</td></tr><tr><td>Tomato chlorotic dwarf viroid</td></tr><tr><td>Tomato planta macho viroid</td></tr><tr><td rowspan="4">Avsunviroidae</td><td>Avsunviroid</td><td>Avocado sunblotch viroid</td></tr><tr><td>Elaviroid</td><td>Eggplant latent viroid</td></tr><tr><td rowspan="3">Pelamoviroid</td><td>Apple hammerhead viroid</td></tr><tr><td>Chrysanthemum chlorotic mot-tle viroid</td></tr><tr><td>Peach latent mosaic viroid</td></tr></tbody></table>

classée dans le genre *Elaviroid*, qui présente des propriétés structurelles intermédiaires entre les membres des deux autres genres (figure 1B).

Au total, le rapport le plus récent de l'ICTV dénombre deux familles, huit genres et trente-quatre espèces de
viroïdes [16, 17]. Très récemment, le nombre d'espèces de viroïdes classées est passé à quarante-trois, principalement dû à la technologie de séquençage à haut débit qui rend leur identification plus accessible. En 2022, de nouveaux critères de classification des espèces de viroïdes ont également été adoptés par l'ICTV à la suite des résultats de séquençage. Le tableau 1 résume toutes les espèces de viroïdes reconnues à ce jour par l'ICTV.

## Mécanisme de réplication

Dans les cellules infectées, les viroïdes se répliquent de manière indépendante de l'ADN par un mécanisme de cercle roulant qui suit un mode symétrique ou asymétrique (figure 2). En mode symétrique, le monomère circulaire infectant (à qui est attribué à une polarité positive par convention ; brin (+)) est répliqué en brins négatifs multimériques linéaires (brin (-), qui sont ensuite épissés et ligaturés, produisant des monomères circulaires (-).

En utilisant ce dernier ARN comme matrice, les trois mêmes étapes sont répétées pour produire la descendance. En revanche, dans le mode asymétrique, les brins multimères linéaires (-) servent directement de modèle pour la synthèse de brins multimères linéaires (+). Par conséquent, les monomères (-) linéaires et circulaires sont produits uniquement en mode symétrique. La présence des brins monomères circulaires de polarité (-) pour des membres de la famille des *Avsunviroidae* constitue la preuve qu'ils se répliquent grâce au mode symétrique [9, 21]. De même, l'absence de monomère circulaire de polarité (-) pour les membres de la famille des *Pospiviroidae* est la preuve qu'ils se répliquent par le mode asymétrique [9, 21].

Le site subcellulaire de réplication et d'accumulation est également différent pour les membres des deux familles. En effet, plusieurs membres représentatifs de la famille des *Pospiviroidae* se répliquent et s'accumulent dans le noyau et, par extension, cette organelle est considérée comme le site de réplication et d'accumulation pour tous

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 2. Mécanisme de réplication en cercle roulant avec les deux modes utilisés par les membres de la famille des Pospiviroidae (asymétrique) et Avsunviroidae (symétrique).** Les lignes rouges et bleues font référence respectivement aux brins (+) et (-). Les flèches marquent les sites de clivage d'une ribonucléase III (RNase III) de l'hôte ou de la structure d'auto-coupure en tête de marteau (hammer-head ribozyme, HHRz). Les groupes terminaux résultants sont indiqués (5'hydroxyle, 5'OH ; 2'-3'-phosphocyclique (2'P3'). L'allongement des brins d'ARN est catalysé par l'ARN polymérase II nucléaire (ARN pol II) ou l'ARN polymérase chloroplastique encodée nucléairement (nuclear encoded polymerase, NEP), tandis que la circularisation est catalysée par une ADN ligase I ou une ARnt ligase.</figcaption></figure>

Cette figure est inspirée de l'article publié en [9] après modification selon la licence Creative Common CC.
les membres de la famille [9, 21]. Quant aux membres de la famille des *Avsunviroidae*, ils se répliquent et s'accumulent dans les chloroplastes [9, 21]. En raison de leur localisation subcellulaire différente, les enzymes de l'hôte impliquées dans la réplication, l'épissage et la circularisation du viroïde résultant de la ligation d'une unité linéaire sont également distinctes et spécifiques du noyau pour les *Pospiviroidae* et des chloroplastes pour les *Avsunviroidae* [5]. Par exemple l'enzyme responsable de la synthèse des brins naissants a été identifiée comme l'ARN polymérase II chez les *Pospiviroidae* tandis que la polymérase chloroplastique est utilisée pour les *Avsunviroidae*. L'épissage des brins multimériques est le fruit de l'action d'une ribonucléase III (*RNase III*) chez les *Pospiviroidae* tandis qu'il résulte d'une réaction autocatalytique par le motif en tête de marteau chez les *Avsunviroidae*. Finalement, la réaction de ligation des brins monomériques est catalysée par une ligase chez les membres des deux familles.

## Structure du viroïde

Les viroïdes doivent compter sur les composants endogènes de l'hôte tels que les enzymes et autres facteurs protéiques pour assurer leur maintien, leur réplication, leur transport et leur pathogenèse. En d'autres termes, la séquence nucléotidique et les motifs structurels des viroïdes doivent détourner les machineries de l'hôte. Par conséquent, leurs stabilités, leurs modes d'action et les structures secondaires et tertiaires ont une importance cruciale pour comprendre leurs fonctions.

La caractérisation des structures adoptées par les ARN des viroïdes a été obtenue principalement par trois approches. La première résulte de la prédiction de la structure secondaire des espèces de viroïdes à l'aide d'outils informatiques (études *in silico*) [10-12]. La seconde approche repose sur des méthodes biochimiques, dont notamment la technique d'acylation 2'-hydroxyle (2'-OH) sélective analysée par extension d'amorce, communément appelée « SHAPE » (*Selective 2' Hydroxyl Acylation analyzed by Primer Extension*), qui a permis d'élucider les structures de la plupart des espèces de viroïdes en solution et également leur repliement directement dans la cellule chez un nombre limité d'hôtes [22, 23]. Dans ce cas, la réaction d'acylation a lieu uniquement sur le ribose des nucléotides en simple brin, en raison de leur flexibilité intrinsèque, ce qui permet de distinguer les nucléotides en simple brin de ceux en double brin. Finalement, la troisième, la microscopie à haute résolution a permis d'obtenir des structures tridimensionnelles.

La structure secondaire du brin d'ARN (+) du viroïde de la mosaïque latente de la pêche (*peach latent mosaic viroid*, PLMVd) a été élucidée par SHAPE (figure 1B) [20, 24, 25]. Cette structure complexe implique une région d'où émergent plusieurs branches. L'application ultérieure des prédictions de structure basées sur le SHAPE du PLMVd a révélé de nouveaux motifs strukturaux tels que des pseudonœuds et une forme cruciforme [26]. La prédiction de structure assistée par ordinateur pour l'ASBVd a révélé une structure secondaire de type quasi-bâtonnet (aussi appelée tige). Il est intéressant de noter que l'élucidation de la structure secondaire de l'ASBVd basée sur le SHAPE des transcripts (+) et (-) a révélé que les deux polarités se replient en formant différentes structures, ce qui explique les différences observées dans la mobilité électrophorétique en conditions natives et dans leurs profils de dénataration thermique [27]. Le même phénomène a été révélé par l'analyse SHAPE à haut débit réalisée chez des membres de la famille des *Avsunviroidae* [25].

Plus récemment, l'amplification rapide des extrémités d'ADNc par l'intermédiaire de la ligase (RNA Ligase-Mediated – Rapid Amplification of cDNA Ends, RLM-RACE) en combinaison au SHAPE sur des préparations d'ARN obtenues à partir de tissus infectés par l'ELVd a révélé que les sites d'initiation de la transcription des brins de cette espèce correspondent à des motifs de séquence/structure différents dans les conformations d'ARN dérivées *in vivo* [28]. De manière étonnante, certains membres de la famille des *Pospiviroidae* s'écartent de la structure décrite comme étant en bâtonnets. Par exemple, le viroïde latent de la columnea (*columnea latent viroid*, CLVd) et le viroïde OS du citron (*citrus viroid OS*, CVd-OS) présentent des ramifications, contrairement aux structures en bâtonnets prédites par la thermodynamique [29, 30]. À la suite de l'élucidation de la structure d'un variant de séquence pour tous les viroïdes des *Pospiviroidae*, l'identification de chaque genre est maintenant basée sur les caractéristiques structurelles [22].

Finalement, la microscopie a permis d'élucider directement les structures natives de trois ARN de viroïdes (PSTVd, famille des *Pospiviroidae*, PLMVd et ELVd, famille des *Avsunviroidae*) à une haute résolution (de l'ordre du nanomètre). En particulier, la structure 3D des ARN de viroïdes a été étudiée par microscopie à force atomique (AFM) à 0 et 4 mM de chlorure de magnésium afin d'évaluer leurs compactions en condition saline. Cette augmentation en sel a engendré une compaction de la longueur totale du bâton de PSTVd-ml(+) de 43 à 35 nm [31]. Les résultats ont confirmé le rôle stabilisateur des structures tertiaires telles que les
interactions inter-boucles du PLMVd et leurs conformations fonctionnelles. Ces études mettent en lumière la complexité structurelle de ces quasi-espèces d'ARN et l'importance de multiplier les approches pour élucider la cartographie complète des structures secondaires des viroïdes.

## Domaines et motifs structuraux impliqués dans la pathogénicité des viroïdes

Des études de mutagenèse dirigée ont confirmé l'importance de certaines interactions dans le maintien des structures mais aussi dans la pathogénicité des viroïdes. Chez les variants du PSTVd sur des cultivars de tomates sensibles (ici les tomates *Rutgers*), les résultats ont montré que plusieurs nucléotides situés dans les domaines de la pathogenèse (P) et du centre (C) jouent un rôle crucial dans les symptômes induits par le viroïde sur les plantes [3, 32]. Par exemple, l'unique substitution U257A dans le domaine C de l'ARN du PSTVd entraîne la conversion de la souche intermédiaire de type sauvage en une souche létale pour la tomate. De même, une modification d'un à trois nucléotides du domaine P du PSTVd affecte la sévérité des symptômes, probablement en affectant la capacité de la région modulatrice de la virulence (RMV) à interagir avec des facteurs non identifiés de l'hôte [33, 34]. La région RMV se situe entre les domaines TD et P chez le PSTVd [11]. Cependant, l'implication des domaines P et C ne semble pas applicable chez tous les viroïdes qui ne jouent pas de rôle similaire chez le CEVd [32]. Des expériences avec plusieurs chimères interspéci-fiques formées entre le CEVd et le viroïde de nanisme apical de la tomate (le *tomato apical stunt viroid*, TASVd) ont révélé l'implication du domaine TG plutôt que du domaine P ou C dans la sévérité des symptômes. Ceci a conduit à l'identification de trois régions de séquence qui pourraient correspondre à ces déterminants de pathogénicité. La présence de tels déterminants de pathogénicité en dehors du domaine P a aussi été décrite chez d'autres membres de la famille des *Pospiviroidae* [12]. En particulier, un groupe de six changements spécifiques dans le domaine V des viroïdes des agrumes du groupe II liés au viroïde du nanisme du houblon (*hop stunt viroid*, HSVd) a provoqué des symptômes de cachexie chez les agrumes [35]. En outre, les mutations des domaines TG et P ont influencé l'induction des symptômes, tandis que les mutations des domaines V et TD ont exercé une influence minime sur l'accumulation systémique du viroïde et l'expression des symptômes [8]. Par la suite, la présence de plusieurs nucléotides

déterminant le pouvoir pathogène et situés en dehors du domaine P a été signalée à la fois chez le PSTVd et chez d'autres membres des *Pospiviroidae*. Un exemple de ceux-ci est retrouvé dans une étude détaillée sur deux isolats du PSTVd (PSTVd-Dahlia [PSTVd-D] et PSTVd-intermédiaire [PSTVd-I]) qui diffèrent par neuf nucléotides [36]. Dans la tomate cultivar *Rutgers* [36], le PSTVd-D induit des symptômes très légers, tandis que le PSTVd-I induit des symptômes sévères [36]. Il est clair que l'identification d'un domaine de pathogénicité universelle n'est pas simple et qu'une meilleure compréhension est nécessaire.

Au-delà des domaines, des motifs structuraux, tels que des tiges-boucles, permettent le recrutement de différentes protéines de l'hôte et seraient directement impliqués dans la pathogénicité, en particulier par l'intermédiaire de la conformation spécifique de la RMV du PSTVd. Plusieurs différences structurales entraînant une différence de stabilité ont mené à une pathogenèse différente. Une interaction entre la RMV et une protéine de l'hôte a notamment été mise en évidence [30-33]. Cette observation a été étayée par l'établissement d'une corrélation entre la virulence du PSTVd et l'activation de la protéine kinase p68 [37]. Cette protéine est un analogue de la PKR, la protéine kinase dépendante de l'ARN double brin des mammifères, impliquée dans la régulation de l'expression de virus à ARN [38]. Au contraire, des données récentes sur la structure *in vivo* du PSTVd dans les feuilles de *nicotiana benthamiana* ont montré que l'ARN s'accumule sous une forme « nue » plutôt qu'associé à des protéines protectrices de l'hôte [29]. Des études de mutagenèse sur deux isolats du PSTVd qui se répliquent et induisent des symptômes de maladie de manière différentielle dans les pieds de tomates ont montré l'importance de la formation d'une structure en tige-boucle qui inclut la position 201 [12]. Cette structure lie spécifiquement la protéine Virp1, ce qui conduit par la suite à l'importation du viroïde au noyau [39, 40].

À ce jour, il existe au moins trois modifications nucléotidiques ou structurales chez les membres de la famille *Avsunviroidae* qui agissent comme déterminant pour les symptômes spécifiques chez les plantes hôtes (figure 3). Premièrement, l'insertion d'un résidu uridine entre les positions nucléotidiques 115 à 118 (quatre résidus uridine) est associée à la panachure et au blanchiment des feuilles (figure 3A) [41, 42]. Deuxièmement, les variants de séquence du viroïde des marbrures chlorotiques du chrysanthème (*Chrysanthemum chlorotic mottle viroid*, CChMVd) diffèrent dans la séquence nucléotidique (UUUC au lieu de GAAA, figure 3B), entraînant la formation d'une boucle plus stable, et sont associés à
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 3.** Motifs des membres de la famille Avsunviroidae impliqués dans la pathogenèse. **A.** La structure secondaire du brin d'ARN de polarité (+) de l'ASBVd est illustrée. Les positions 115 à 118 sont indiquées par le carré pointillé dans la boucle terminale à droite. **B.** Les brins d'ARN de polarité (+) des variants partiels de la séquence d'ARN du CChMVd sont montrés. Le changement dans la séquence de quatre nucléotides (encadrés en noir) convertit un variant latent de CChMVd en un CChMVd symptomatique sévère. **C.** La présence d'une épingle à cheveux de 12-13 nt dans le PLMVd induit l'effet calicot (c'est-à-dire un blanchiment des feuilles) chez les cultivars de pêcher sensibles tels que GF305 (photographie).</figcaption></figure>

Cette figure est adaptée de la figure 3 du chapitre 11, *Viroid Pathogenicity*, du livre *Fundamental of Viroid Biology* [95] (numéro de licence : 5715990873765, Elsevier) et la figure 2 de C.R. Adkar-Purushothama et J.P. Perreault (2020) [64] avec le numéro de licence 5712000771390 John Wiley and Sons.
des infections latentes ou symptomatiques (marbrure chlorotique des feuilles) dans un cultivar de chrysanthème sensible (figure 3B) [42]. Troisièmement, l'inser-tion d'une boucle en épingle à cheveux de 12-13 nt à l'extrémité gauche (dans la boucle L11, entre les posi-tions 1 et 338) du PLMVd est responsable de l'albi-nisme sur la plupart des parties des feuilles de pêchers (peach calico) infectés (figure 3C) [43].

## Interactions des viroïdes avec les protéines de l'hôte

L'analyse de l'ARN du PSTVd en présence des pro-téines de tomate par électrophorèse (gel de polyacrylamide) et par des expériences d'immuno-buvardage de type Northwestern a apporté la première preuve d'une interaction viroïde-protéine de l'hôte [44]. Cette étude a démontré l'interaction du PSTVd avec quatre his-tones et avec deux protéines nucléaires d'une taille de 31 et 41 kDa. Cependant, la première preuve de l'in-teraction directe d'une protéine spécifique de l'hôte avec un motif structurel d'un viroïde est venue des extraits de germes de blé dans lesquels l'ARN polymérase II interagissait avec les deux boucles ter-minales du PSTVd [45]. Cela a permis de montrer que la transcription du brin (-) du PSTVd par l'ARN polymérase II commence probablement dans la boucle terminale gauche du brin circulaire (+) [46]. À ce jour, plusieurs protéines de liaison aux viroïdes ont été car-actérisées, notamment la liaison de Virp1 (protéine de tomate contenant un bromodomaine) à l'épingle à cheveux de 71 nt du PSTVd incluant plusieurs renfle-ments. Tel que mentionné précédemment, cette inter-action contribue au déplacement sur de longues distances des pospiviroïdes dans le système vasculaire de l'hôte [39, 40]. Un autre complexe ribonucléopro-téique formé entre l'ARN du HSVd et la protéine de liaison à l'ARN du phloème PP2 isolée de *cucumis sativus* (CsPP2) est impliquée dans le trafic à longue distance de l'ARN du viroïde [47, 48]. Cependant, la caractérisation du gène codant la PP2 du concombre a révélé que l'interaction viroïde-PP2 semble être non spécifique. En effet, la PP2 peut lier un certain nombre d'autres molécules d'ARN. Il est donc peu probable que cette interaction déclenche la pathogenèse du viroïde [2]. L'examen des protéines de l'hôte au cours de l'infection par les viroïdes à l'aide d'analyses comparatives des protéines et des transcriptomes a révélé que, peu importe l'espèce de viroïde, les viroïdes indu-isent l'expression de protéines liées à la pathogenèse (pathogen related, PR) au cours de l'infection [2]. Les

protéines PR font partie du système induit de résistance acquise chez les plantes en réponse à l'attaque par les pathogènes [49]. En outre, l'infection de la tomate par le PSTVd induit un ensemble de modifications de l'expression des gènes liés au stress, à la croissance, au développement et à la défense [50].

Des études similaires avec les membres de la famille *Avsunviroidae* ont également révélé des interactions avec des composants de l'hôte. Par exemple, les formes multimériques de l'ARN de l'ASBVd interagissent avec PARBP33 et PARBP35, deux petites protéines de liaison à l'ARN du chloroplaste codées dans le génome nucléaire de l'avocatier [55]. Ces protéines sont membres d'une famille impliquée dans la stabilisation, la maturation et l'édition de transcrits des chloroplastes. PARBP33 stimule *in vitro* l'auto-clivage de la tête de marteau [2]. L'analyse par spectrométrie de masse des protéines extraites de pêchers *Prunus persica* infectés par le PLMVd a révélé la présence de six protéines possédant un domaine de liaison à l'ARN [51]. L'une des protéines de liaison à l'ARN détectée est le facteur d'élongation 1-alpha (eEF1A). Son rôle sur la biologie des viroïdes n'est pas connu mais l'eEF1A est impliqué à la fois dans la réplication et la traduction de virus à ARN en interagissant directement avec l'ARN viral ou avec l'ARN polymérase dépendante de l'ARN viral [2, 49, 51]. Des études *in vitro* ont révélé que la protéine ribosomique L5 (RPL5) et le facteur de transcription IIIA (TFIIIA) d' *Arabidopsis thaliana* se lient au brin (+) du PSTVd, ce qui soutient l'idée de l'implication de ces deux protéines dans la réplication du viroïde [60]. Ceci est également confirmé par des résultats où le facteur de transcription IIIA canonique à neuf doigts de zinc (TFIIIA-9ZF) de *Nicotiana benthamiana* et sa variante TFIIIA-7ZF interagissent avec le brin (+) du PSTVd alors que seul TFIIIA-7ZF interagit avec le brin (-) du PSTVd. Des expériences *in planta* ont révélé que l'expression de TFIIIA-7ZF est en corrélation directe avec la réplication du PSTVd [52]. Plus récemment, des études *in vitro* et *in vivo* ont révélé que le PSTVd favorise l'expression de TFIIIA-7ZF, promou-vant ainsi sa réplication, en interagissant directement avec un régulateur d'épissage, la protéine RPL5, dont l'interaction avec le RCC est essentielle pour la répli-cation du PSTVd [53, 54].

Les viroïdes sont également connus pour interférer avec la machinerie de traduction de l'hôte, contribuant ainsi au développement des symptômes. Le tableau 2 présente les protéines de l'hôte dont l'expression est modifiée à la suite de l'infection d'un viroïde. Des preuves directes et indirectes démontrant les effets de l'infection par les viroïdes sur les ARN ribosomiques
<table><caption>Tableau 2. Protéines de l'hôte affectées à la suite de l'infection par un viroïde.</caption><thead><tr><th>Fonctions</th><th>Protéines</th><th>Viroïde</th><th>Hôte</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">Défense</td><td>Famille de la protéine P69 liée à la pathogenèse, P23, PR1</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Superoxyde dismutase [Fe]; [Cu-Zn], chloroplastique</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Famille P14 de l'endo-1,3-beta-glucosidase B des glucanes</td><td>PSTVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[83]</td></tr><tr><td>Peroxydase</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[84]</td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéinase</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[84]</td></tr><tr><td rowspan="5">Réplication, transcription et traduction</td><td>Facteur d'élongation 1-alpha (eEF1A)</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Semblable à la protéine ribosomique (S3)</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Protéine ribosomique S6</td><td>CEVd</td><td>N. tabacum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Protéine p68</td><td>PSTVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[85]</td></tr><tr><td>Facteur d'élongation 1-alpha (eEF1A)</td><td>PLMVd</td><td>Prunus persica</td><td>[51]</td></tr><tr><td rowspan="3">Métabolisme</td><td>Protéine d'amélioration de l'oxygène 2 (OEE2), chloroplastique</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Protéine 3 du complexe d'évolution de l'oxygène du photosystème II (OEE3)</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Protéine d'amélioration de l'oxygène 2 (OEE2), chloroplastique</td><td>CEVd</td><td>S. tuberosum</td><td>[82]</td></tr><tr><td rowspan="5">Autres fonctions</td><td>Xyloglucane endotransglycosylase LeXET2</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Composant de SKP1, ubiquitine ligase SFC</td><td>CEVd</td><td>N. tabacum</td><td>[82]</td></tr><tr><td>Protéine kinase, pkv</td><td>PSTVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[86]</td></tr><tr><td>Lipoxygénase</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[84]</td></tr><tr><td>Enzyme de type désaturase</td><td>CEVd</td><td>S. lycopersicum</td><td>[84]</td></tr></tbody></table>

Ce tableau est une modification du tableau 3 de [64] avec le numéro de licence 5712000771390 (John Wiley and Sons).

et le stress ribosomique potentiellement liés à la pathogénicité des viroïdes ont été mises en évidence sur les pieds de tomates [55, 56].

## Effets des viroïdes sur l'expression des gènes de l'hôte et sur la réponse de l'hôte à l'infection par les viroïdes

En biologie moléculaire, le dogme central décrit par F. Crick en 1958 fait référence au flux d'informations génétiques allant de l'ADN à l'ARN, puis aux protéines ou de l'ARN aux protéines. L'infection par les viroïdes interfère à tous les niveaux : avec l'ADN et l'ARN de l'hôte, ainsi qu'avec la machinerie de traduction des protéines et les protéines de l'hôte. Les effets de l'infection par les viroïdes sur l'expression des gènes de l'hôte au niveau transcriptionnel et post-transcriptionnel ont montré une répression génique dans la majorité des cas.

Pour citer deux exemples, la transcription du gène de l'expansine LeExp2, connue pour être impliquée dans l'expansion cellulaire, est diminuée par l'infection avec PSTVd [57]. Cette réduction suggère un rôle possible de ce gène dans le retard de croissance, un symptôme commun associé à l'infection par les viroïdes. De même, l'infection par le CEVd a entraîné une réduction des niveaux de transcription de la gibbérelline 20-oxydase dans les plantes d'agrumes, une autre enzyme impliquée dans la croissance des plantes [58]. Il existe aussi des exemples d'augmentation de la transcription des gènes liés notamment à la défense et au stress à la suite de l'infection, y compris les gènes codant les protéines PR et les β-1,3-glucanases [59, 60].

Deux grands mécanismes de répression génique ont été répertoriés selon l'étape à laquelle la répression se produit chez la plante, soit au niveau transcriptionnel (transcriptional gene silencing, TGS), soit au niveau post-transcriptionnel (post-transcriptional gene silencing,
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 4.** Modification du transcriptome de l'hôte par la production des vd-siARNs. **A.** Au cours de la réplication en cercle roulant, le brin (+) (en bleu) de la molécule de viroïde est transcrit en brin (-) (en rouge), puis le brin (-) est transcrit pour produire un brin (+) d'une longueur supérieure à l'unité. Ces brins multimériques (+) transcrits sont ensuite transformés en unités de longueur unitaire, puis circularisés pour produire la molécule de viroïde mature. La molécule circulaire mature du viroïde est composée de structures d'ARN double brin formées entre les molécules des brins (+) et (-) au cours de la réplication du viroïde. Elle déclenche la machinerie de réponse de l'hôte qui la clive en petits ARN (vd-siARN). **B.** Séparation des ARN matures et les vd-siARN de l'ARN total isolé de plants de tomates infectés par PSTVd.</figcaption></figure>

Cette figure a été adaptée de la figure 2 du chapitre 15, *Viroid-induced RNA silencing and its secondary effect on the host transcriptome*, du livre *Fundamental of Viroid Biology* [96] (numéro de licence : 5715990272227; Elsevier).

PTGS). Dans le cas du TGS, le mécanisme est nucléaire et la répression transcriptionnelle est souvent liée au dépôt de marques épigénétiques (méthylation de l'ADN). En effet, la méthylation sur la position C5 de la cytosine (5-méthylcytosine) permet le recrutement de protéines impliquées dans la répression de gènes ou l'inhibition de la liaison de facteurs de transcription à l'ADN [61]. La première association entre l'ARN d'un viroïde et la méthylation date de 1994, lorsque le PSTVd a entraîné une méthylation *de novo* d'un transgène uniquement en condition d'infection dans des plants de tabac. Depuis, d'autres rapports ont montré plusieurs modifications du méthylome, directement dans le génome de l'hôte, en présence d'autres viroïdes (par exemple, *hop stunt viroid* (HSVd) et PSTVd) [62, 63].

Le PTGS, également appelé iARN, est un mécanisme cytoplasmique. L'ARN est bloqué avant l'étape de production par la dégradation de l'ARN messager. Tout comme pour les virus, les viroïdes en réplication déclenchent la machinerie de l'iARN des plantes [64]. En effet, les viroïdes produisent des intermédiaires d'ARN double brin pendant la réplication qui agissent à la fois comme des inducteurs et des cibles de l'iARN (figure 4A) [5, 65, 66]. L'ARN des viroïdes matures est directement ciblé par les ribonucléases de type DICER

ou DCL RNase III, ce qui entraîne leur clivage en petits fragments (*small interfering RNA*, siRNA) de 21 à 24 nt appelés petits ARN dérivés des viroïdes (*viroid derived siRNA*, vd-siRNA) (figure 4B) [67].

Au début des années 2000, des vd-siARN ont été détectés dans des plantes infectées par des viroïdes appartenant aux deux familles, ce qui suggère que ces viroïdes sont pris en charge par l'hôte, quelles que soient leurs localisations subcellulaires (chloroplastes ou noyaux) pendant la réplication [57, 58, 61, 68]. Ces expériences *in planta* ont démontré que les vd-siARN sont produits à partir des brins (+) et (-) de l'ARN du viroïde [64]. L'accumulation de vd-siARN dans différentes combinaisons viroïde-hôte à l'aide de technologie de séquençage de nouvelle génération montre que le brin (+) produit plus de vd-siARNs que le brin (-) [69-71]. Aussi, les siARN qui ne sont pas parfaitement complémentaires à l'ARN de l'hôte affectent son transcriptome (figure 4B). La diminution globale des niveaux de transcription des cellules hôtes par la production des vd-siARNs et les symptômes associés sont connus pour les membres des deux familles *Pospiviroidae* et *Avsunviroidae*. Les séquences des vd-siARN ainsi que leurs cibles connues à ce jour sont regroupées dans le tableau 3.
<table><caption>Tableau 3. Liste des cibles de vd-siARN ainsi que leurs cibles dans différentes plantes hôtes expérimentales.</caption><thead><tr><th>Séquences du vd-siARN (3'-5')</th><th>Gènes ciblés</th><th>Viroïdes</th><th>Hôte</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>UCCUUGUUUUCAAGAACUUCU</td><td>EF-1-alpha</td><td>PLMVd</td><td>Pêche</td><td>[87]</td></tr><tr><td>UUCUUGAAAACAAGGAGUUUU</td><td>Protéine de choc thermique 90</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CGGAAGAAAAAAAAGAAC</td><td>Pyrophosphatase inorganique soluble de Nicotiana (siPPase)</td><td>PSTVd</td><td>N. benthamiana, N. tabacum</td><td>[88]</td></tr><tr><td>UGUUUCUAUCUCUUUUCUC</td><td>Protéine WD40</td><td>TPMVd</td><td>Tomate</td><td>[89]</td></tr><tr><td>AAAAAGAAAAGACGAGUCCUC</td><td>Callose synthase 11-like ; Callose synthase 12-like</td><td></td><td></td><td>[90]</td></tr><tr><td>GCUCCUCCUGUGGGCUUCUU</td><td>Protéine du canal chlorure CLC-b-like ARNm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUUUUCUUUUCUCCGCCGCG</td><td>Protéine ribosomique du type S3A de la sous-unité 40S</td><td>PSTVd</td><td>Tomate</td><td>[91]</td></tr><tr><td>GGAAGAAAAAAAAGACGA</td><td>LRR-RSTPK ; P14KA1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCGUGAGGGGUGGCAGGAAAA</td><td>STPK</td><td></td><td></td><td>[92]</td></tr><tr><td>AAAUCGGGAACCUUGGCGUCA</td><td>RSTPK, PPR, VMP1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCAAGGCUCCUUGGUUGACGC</td><td>ARNm de la protéine 3 de type FRIGIDA (FRL3)</td><td></td><td></td><td>[93]</td></tr><tr><td>GACGUCCGUCAUUUCUUUUUUU</td><td>Gène 1 de l'activateur de traduction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UCCCCGCUCCGCGAAGUCGCU</td><td>Argonaute 2a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GUGGACUGGGACGUCCGUCAU</td><td>Protéine probable de liaison à l'ARN</td><td>CEVd</td><td>Tomate</td><td>[94]</td></tr><tr><td>CGUGGUGUCCUUGGAGUUCUU</td><td>Epoxyde hydrolase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCCUUGGACCUCCUUCAGCU</td><td>Membre de la superfamille de la transmembrane 9</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Ce tableau est une adaptation de la liste publiée en 2020 avec le numéro de licence 5712000771390 (John Wiley and Sons) [64].

## Détection et traitement de la maladie induite par les viroïdes

Les méthodes de détection des viroïdes peuvent être divisées en trois catégories : biologique, physicochimique et moléculaire (figure 5). Quelle que soit la méthode suivie pour la détection, la première étape est la collecte de l'échantillon. Lorsqu'un viroïde pénètre dans une plante, il établit une infection systémique. Cela signifie que les viroïdes sont rapidement présents dans toute la plante avec toutefois des concentrations variables selon les tissus. Par exemple, le viroïde de la peau cicatricielle de la pomme (apple scar skin viroid, ASSVd) atteint des concentrations plus élevées dans l'écorce du pommier que dans le péricarpe du fruit alors que le HSVd atteint des concentrations beaucoup plus élevées dans les fruits mûrs de l'abricotier que dans les feuilles [72]. La faible concentration de viroïdes pourrait alors limiter sa détection. Il convient donc de collecter les tissus adéquats présentant des concentrations élevées d'ARN de viroïdes pour ainsi garantir la

fiabilité de la détection. La saison de la collecte d'échantillons peut également augmenter le succès de la détection. En effet, le suivi de la détection du HSVd dans les abricotiers pendant une année entière a révélé une diminution significative de la concentration du HSVd entre septembre et novembre [73]. Des différences saisonnières de concentration existent également pour plusieurs viroïdes des agrumes [74]. Pour ce qui est de la quantité de tissus à collecter, elle dépend principalement de la sensibilité de la méthode de détection. En général, la détection de l'ARN directement par gel de polyacrylamide et les essais biologiques nécessitent une plus grande quantité de tissu végétal que les méthodes de détection moléculaire, telles que l'hybridation moléculaire (Northern blot et hybridation sur tissus) ou la transcription inverse suivie de la réaction en chaîne de la polymérase (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR). Cela est dû à la grande sensibilité des méthodes moléculaires plus récentes. Comme nous l'avons vu précédemment, les viroïdes se propagent principalement par les boutures végétatives,
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 5. Présentation des différentes méthodes utilisées pour la détection des viroïdes.** Les méthodes de détection des viroïdes sont divisées en trois classes : biologiques, physico-chimiques et moléculaire. Dans la méthode biologique, les essais sont effectués sur les plantes indicatrices alors que, dans le cas des méthodes physico-chimiques, le viroïde est caractérisé par l'isolement et la séparation de l'ARN par différentes méthodes d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (1D, 2D, etc.). Trois sous-classes de méthodes moléculaires sont majoritairement utilisées pour détecter, identifier et caractériser le viroïde. Il s'agit de l'hybridation moléculaire, de l'amplification des acides nucléiques et du séquençage de nouvelle génération (NGS). Chaque sous-classe est divisée en plusieurs méthodes différentes.</figcaption></figure>

les outils contaminés et peuvent également l'être par les semences pour quelques-uns d'entre eux [75]. Étant donné qu'il n'existe aucune mesure de lutte contre les maladies associées aux viroïdes, la propagation ne peut être évitée que par l'utilisation d'un système de gestion multiple qui combine l'identification, l'élimination des plantes infectées et une surveillance régulière par un diagnostic de routine. Bien qu'une replantation partielle après l'élimination des plantes malades et des plantes adjacentes puisse être efficace, un meilleur contrôle a été obtenu en éliminant toutes les plantes d'une parcelle entière suivie d'une replantation de plantes certifiées exemptes de viroïdes [76]. L'élimination du houblon infecté par les viroïdes nécessite la destruction

de toutes les plantes, y compris les rhizomes, par un traitement à l'urée et à la chloropicrine en automne afin de garantir que la maladie ne se transmette pas à la culture suivante [76].

Les méthodes actuelles de lutte contre les viroïdes comprennent les programmes de certification phytosanitaire, l'exclusion, la quarantaine, la détection précoce suivie de l'éradication, et la mise en œuvre de pratiques agri-coles, telles que des mesures de décontamination du matériel avec l'hypochlorite de sodium pour prévenir la transmission mécanique. En outre, le traitement par la chaleur ou le froid, combiné à la culture de pointes de méristèmes, a permis d'éliminer les viroïdes dans certaines combinaisons viroïdes-hôtes [77].
Finalement, il existe des stratégies de protection croisée et des approches de modification transgénique pour assurer la dégradation des ARN viroïdes et de leur intermédiaire d'amplification directement par les espèces hôtes [78,79]. Plusieurs articles détaillent également différentes perspectives en matière de lutte contre les viroïdes et d'amélioration de la résistance [77, 80, 81]. Une résistance transgénique utilisant des nucléases ou des molécules d'ARN modifiées pour le contrôle des viroïdes chez des espèces cultivées donne des résultats prometteurs et l'application de la technologie CRISPR se profile à l'horizon [81]. Cependant, la technologie transgénique n'a pas encore été déployée commercialement, et il n'est pas possible de savoir si une résistance technique, durable et multivalente aux viroïdes sera réalisable et acceptable [81].

## Conclusion

Depuis la découverte des viroïdes il y a un peu plus de 50 ans, ces ARN infectieux non codants sont à l'origine de nombreuses découvertes d'importance en biologie moléculaire et cellulaire ainsi qu'en biochimie structurale. Notre compréhension de leurs structures, leurs mécanismes de réplication ainsi que des conséquences qu'ils induisent chez leurs hôtes s'améliorent. Il n'en demeure pas moins que les agents subviraux sont loin d'avoir révélé tous leurs secrets et plusieurs défis restent à relever. De plus, les tentatives de contrôler leur propagation et la réduction de leurs effets néfastes sur les plantes demeurent très limitées malgré l'impact économique majeur de la perte des cultures dans certains cas. Clairement, la recherche a encore de nombreux mystères à élucider autour de ces ARN modèles et pathogènes.

**Liens d'intérêts** : les auteurs déclarent ne pas avoir de lien d'intérêts en rapport avec cet article.

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• Juin 2018

• 12 x 20 cm • 112 pages

• ISBN : 978-2-7184-1506-2

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Dr Jérôme Cros

Anesthésiste-réanimateur, Hôpital de la Mère et de l'Enfant, C.H.U. de Limoges. Directeur du Centre de simulation en santé de la Faculté de médecine et de pharmacie de Limoges

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