# Un système d'expression par intégration ciblée chez Yarrowia lipolytica : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée

Catherine Madzak, Claude Jolivalt, Christian Mougin, Pierre Briozzo, David Kopecny, Nicole Houba-Hérin, Michel Laloue, Jean-Marie Beckerich

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## To cite this version:

Catherine Madzak, Claude Jolivalt, Christian Mougin, Pierre Briozzo, David Kopecny, et al. Un système d'expression par intégration ciblée chez Yarrowia lipolytica : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée. Congrès Levures, Modèles et Outils VII, Sep 2006, Paris, France. 2006. hal-01600913

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Submitted on 4 Jun 2020

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# Un système d'expression par intégration ciblée chez *Yarrowia lipolytica* : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée

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IRA

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Catherine MADZAK, Claude JOLIVALT, Christian MOUGIN, Pierre BRIOZZO, David KOPECNY, Nicole HOUBA-HÉRIN, Michel LALOUE & Jean-Marie BECKERICH
UMR1238 Microbiologie et Génétique Moléculaire, INRA / CNRS / INA-PG, 78850 Thiverval-Grignon

en collaboration avec :

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UMR7573 Synthèse Sélective Organique et
Produits Naturels, CNRS / ENSCP, 75005 Paris

UR251 Physico-chimie et Ecotoxicologie des Sols
d'Agrosystèmes Contaminés, INRA, 78026 Versailles

UMR206 Chimie Biologique,
INRA / INAPG, 78850 Thiverval-Grignon

UR501 Biologie Cellulaire,
INRA, 78026 Versailles

## Un système d'intégration ciblée pour l'expression/sécrétion de protéines hétérologues chez *Yarrowia*

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Yeastern Biotech Co., Ltd
益生生技开发股份有限公司
http://www.yeastern.com

* des vecteurs navettes basés sur pBR322

* une cassette d'expression comprenant :

* un promoteur recombinant breveté : hp4d

* une séquence signal de sécrétion

* une fréquence de transformation de *Yarrowia* très élevée (de l'ordre de $10^5$ transformants par µg)

* une intégration ciblée par homologie avec le génome

* des transformants comportant une seule copie du gène hétérologue, intégrée en un site défini (plateforme pBR)

* la sécrétion dans le milieu de la protéine hétérologue

* la production efficace (10-100 mg/l) de protéines complexes sous leur forme active

Madzak et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2000) 2, 207-216
Madzak et al., J. Biotechnol. (2004) 109, 63-81
Madzak et al., FEMS Yeast Res. (2005) 5, 635-646

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### La souche Po1g a été optimisée pour la production hétérologue :

* introduction d'une plateforme pBR dans le génome

* délétion des gènes codant pour des protéases extracellulaires

* capacité à métaboliser le saccharose (donc les mélasses)

Le promoteur recombinant **hp4d** dirige une **forte expression** dans des conditions de culture variées, permettant si nécessaire l'**optimisation** du milieu de production.

Son activité est maximale lorsque le plateau de croissance est atteint, ce qui permet une certaine **dissociation des phases de croissance et de production**.

La linéarisation des vecteurs dans la région "pBR322" permet de diriger efficacement leur **inte**gration par **homologie** dans une "plateforme pBR" du génome de la souche réceptrice. Les transformants ainsi obtenus contiennent une **copie unique**, intégrée en un **site défini**, sans risque d'interaction avec les fonctions cellulaires.

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protéine recombinante sécrétée dans le milieu de culture

Ce système d'expression/sécrétion par intégration ciblée permet d'analyser l'effet de mutations du gène hétérologue par simple comparaison des propriétés des protéines recombinantes, mesurables dans les surnageants de cultures. La fréquence de transformation très élevée du système devrait permettre de l'utiliser pour l'optimisation d'enzymes, par le biais de mutagénèse au hasard par PCR, ou d'évolution moléculaire.

## Production et mutagénèse dirigée de la laccase LacIIB du Basidiomycète ligninolytique *Trametes versicolor*

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Les laccases fongiques sont utilisées dans des procédés oxydatifs industriels, et ont de nombreuses autres applications potentielles, notamment dans le domaine de la dépollution.

Nous avons déterminé la première structure d'une laccase active, complexée avec son substrat, par l'analyse de cristaux de LacIIB purifiée à partir de *T. versicolor*. La structure du site actif a mis en évidence l'interaction d'un acide aminé, l'Aspartate (D) 206, avec le substrat.

La production de *TvLacIIB* recombinante chez *Yarrowia*, pour analyse biochimique, ayant donné des résultats satisfaisants, nous avons entrepris une mutagénèse dirigée de l'Asp206, avec production chez *Yarrowia* des LacIIB mutées.

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Bertrand et al., Biochemistry
(2002) 41, 7325-7333
Mougin et al., Environ. Chem. Lett.
(2003) 1, 145-148

Jolivalt et al., App. Microbiol. Biotechnol. (2005) 66, 450-456
Madzak et al., Protein Eng. Des. Sel. (2006) 19(2), 77-84

## Production et mutagénèse dirigée de la cytokinine oxydase CKO1 de Zea mays

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La production de *ZmCKO1* recombinante chez *Yarrowia* a permis sa purification, son analyse biochimique, sa cristallisation, et l'étude de sa structure par diffraction aux rayons X.

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Une analyse de la structure des complexes formés par l'enzyme avec différents inhibiteurs et accepteurs d'électrons est en cours, par le biais de l'infiltration des cristaux.

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L'analyse de la *ZmCKO1* recombinante par cristallographie et par MALDI-MS a montré que 5 sites de N-glycosylation, sur 8 sites potentiels, étaient glycosylés chez *Yarrowia*, la longueur moyenne des chaînes glycosidiques étant de 17 résidus (l'hyperglycosylation, problème fréquent dans les systèmes d'expression chez d'autres levures, correspond à des chaînes de l'ordre de 50 à 150 mannoses).

Les données cristallographiques obtenues ont permis de cibler des acides aminés pour une mutagénèse dirigée, afin d'analyser finement les mécanismes réactionnels de l'enzyme. La production chez *Yarrowia* des CKO1 mutées permet actuellement leur étude biochimique et leur cristallisation pour étude structurale. Les premiers résultats ont déjà permis de confirmer la prédiction d'un résidu clef de la catalyse, et de définir des limites stériques pour l'accessibilité du site actif au substrat.

Massonneau et al., J. Exper. Botany (2004) 55, 2549-2557
Kopecny et al., Acta Crystal. D (2004) 60, 1500-1501
Kopecny et al., Biochimie (2005) 87, 1011-1022