# Pollution pollinique dans les vergers à graines de pin maritime

BOUFFIER Laurent, DEBILLE Sandrine, ALAZARD Pierre, PASTUSZKA Patrick, RAFFIN Annie, HARVENGT Luc, LELU-WALTER Marie-Anne, MUSCH Brigitte, TRONTIN Jean-François

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INRA
SCIENCE & IMPACT

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Office National des Forêts
# Pourquoi étudier la pollution pollinique et les contributions parentales?

* **Conséquence en terme de gain génétique**

- Hypothèses pour le calcul du gain estimé: contribution égale des parents et absence de pollution

- Gain «réel» = Gain estimé (1-pollution/2)

Si 60% de pollution (issue de parents avec un gain nul): un gain estimé à 30% donnera un gain «réel» de 21%.

* **Conséquence en terme de diversité génétique**

- Une contribution hétérogène des parents (variation du nombre de graines et / ou de la contribution pollinique par génotype) diminue la diversité génétique estimée

- La pollution pollinique peut augmenter la diversité génétique
# Deux études sur les VG pin maritime

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## Pollen contamination in a maritime pine polycross seed orchard and certification of improved seeds using chloroplast microsatellites

Can. J. For. Res. 31: 1816-1825 (2001)

C. Plomion, G. LeProvost, D. Pot, G. Vendramin, S. Gerber, S. Decroocq, J. Brach, A. Raffin, and P. Pastuszka

* VG polycross VF2 Mimizan (34 G0 x PMX) à 9 ans

* Bulk (93 graines) + 4 zones selon un axe ouest - est (216 graines)

* **6 marqueurs microsatellites chloroplastiques** (héritage paternel) → possibilité de définir des lignées paternelles donc très facile de savoir si le pollen vient de l'extérieur ou non

* Résultats: **taux de contamination** = **37%** avec une très forte variabilité entre zones (de 19% à 76%) non expliquée

* Limite principale: c'est en fait un **taux de contamination minimal**

En effet: marqueurs très peu variables → les profils ne sont pas uniques (17 profils pour 28 arbres G0). Il est probable que des arbres extérieurs au verger aient des profils moléculaires identiques aux constituants du verger.
# Deux études sur les VG pin maritime

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## Développement de marqueurs microsatellites nucléaires chez le pin maritime et utilisation dans le cadre de la traçabilité des lots de graines issus des vergers à graines

**Projet DGFAR** (Direction Générale de la Forêt et des Affaires Rurales) coordonné par Christophe Plomion et Luc Harvengt en 2005

* **3 VG polycross VF2** (34 G0 x PMX): Mimizan (analyse INRA), Berdillan (=Hourtin) et Saint Augustin (analyse FCBA), entre 11 et 17ans?

* **Marqueurs microsatellites nucléaires**

* Méthodologie différente entre INRA et FCBA

* Mimizan: 200 G1 + 75 G2 avec 8 microsat → **32% de pollution**

* Berdillan et St Augustin: 40 G1 + 290 G2 avec 6 microsat → **81% de pollution à Berdillan et 60% à St Augustin**

* Limites principales:

- le **génotype des parents n'est pas connu** → estimation indirecte du taux de pollution qui repose sur un certain nombre d'hypothèses (en particulier pour l'origine des peuplements extérieurs au verger)

- Estimation d'un **taux de contamination minimal** car les marqueurs utilisés sont faiblement discriminants (on montre, par simulations, que dans 20% des cas on ne retrouve pas les bons parents)
# Etude QUASEGRAINE (2015-2018)

Vergers clonaux de pin maritime de 3ème génération :

* Evaluer le taux de pollution génétique en fonction de trois critères:

- Localisation du verger (et zone intra-verger)

- Année de pollinisation

- Génotype de l'arbre mère

* Evaluer les contributions parentales
# Trois vergers de clones (VF3)

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- Saint-Laurent2-VF3 (Vilmorin, 2006, 15 ha) massif landais

- Beychac-VF3 (Forelite, 2002-2003, 15ha) périphérie du massif

- Saint-Sardos-VF3 (Forelite, 2003, 6ha) hors massif
# Composition génétique des vergers

## ~50 génotypes peu apparentés
nombre de ramets / génotype variable

<table><thead><tr><th>Génotype</th><th>PICARD</th><th>VAQUEY</th><th>SAINT-SARDOS</th><th>Génotype</th><th>PICARD</th><th>VAQUEY</th><th>SAINT-SARDOS</th></tr></thead><tbody><tr><td>F1.2853</td><td>4,1%</td><td>2,7%</td><td>1,6%</td><td>3831-3</td><td>2,2%</td><td>2,2%</td><td>0,5%</td></tr><tr><td>F1.0783</td><td>3,5%</td><td>2,3%</td><td>3,3%</td><td>0248-1</td><td>2,2%</td><td>2,4%</td><td>2,0%</td></tr><tr><td>F1.2499</td><td>3,5%</td><td>1,9%</td><td>3,5%</td><td>0024-2</td><td>2,2%</td><td>1,4%</td><td>1,7%</td></tr><tr><td>F1.2836</td><td>3,5%</td><td>1,9%</td><td>2,5%</td><td>0045-1</td><td>2,2%</td><td>2,4%</td><td>2,3%</td></tr><tr><td>F1.2631</td><td>3,4%</td><td>1,5%</td><td>4,1%</td><td>0161-1</td><td>2,0%</td><td>2,0%</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>F1.0721</td><td>3,2%</td><td>3,0%</td><td>2,6%</td><td>4305-1</td><td>2,0%</td><td>1,7%</td><td>1,5%</td></tr><tr><td>F1.0724</td><td>3,2%</td><td>2,4%</td><td>2,9%</td><td>4308-2</td><td>1,8%</td><td>2,8%</td><td>2,4%</td></tr><tr><td>F1.2643</td><td>3,1%</td><td>3,0%</td><td>1,8%</td><td>F1.0731</td><td>1,7%</td><td>2,7%</td><td>3,3%</td></tr><tr><td>F1.0770</td><td>3,0%</td><td>3,2%</td><td>1,9%</td><td>0251-6</td><td>1,7%</td><td>0,9%</td><td>2,9%</td></tr><tr><td>F1.2368</td><td>3,0%</td><td>3,0%</td><td>2,8%</td><td>0123-1</td><td>1,6%</td><td>2,7%</td><td>1,6%</td></tr><tr><td>F1.0974</td><td>2,9%</td><td>2,5%</td><td>3,2%</td><td>13T15-1</td><td>1,4%</td><td>0,0%</td><td>0,0%</td></tr><tr><td>F1.2580</td><td>2,9%</td><td>2,8%</td><td>3,5%</td><td>F1.2535</td><td>1,3%</td><td>1,2%</td><td>1,9%</td></tr><tr><td>F1.0790</td><td>2,9%</td><td>3,0%</td><td>2,6%</td><td>06T02-2</td><td>1,2%</td><td>1,3%</td><td>1,7%</td></tr><tr><td>3107-4</td><td>2,9%</td><td>1,5%</td><td>3,5%</td><td>0217-3</td><td>1,2%</td><td>2,0%</td><td>0,1%</td></tr><tr><td>3830-1</td><td>2,8%</td><td>3,1%</td><td>1,6%</td><td>06T02-1</td><td>1,1%</td><td>1,6%</td><td>1,9%</td></tr><tr><td>F1.2859</td><td>2,7%</td><td>2,2%</td><td>3,7%</td><td>3820-4</td><td>1,0%</td><td>2,5%</td><td>0,8%</td></tr><tr><td>4303-2</td><td>2,6%</td><td>2,4%</td><td>1,9%</td><td>0022-3</td><td>0,9%</td><td>1,5%</td><td>0,8%</td></tr><tr><td>F1.0766</td><td>2,5%</td><td>3,2%</td><td>2,8%</td><td>3820-3</td><td>0,8%</td><td>0,0%</td><td>0,2%</td></tr><tr><td>F1.0765</td><td>2,5%</td><td>2,2%</td><td>3,3%</td><td>0217-2</td><td>0,8%</td><td>1,9%</td><td>0,7%</td></tr><tr><td>4318-2</td><td>2,4%</td><td>2,8%</td><td>2,2%</td><td>0022-2</td><td>0,8%</td><td>0,8%</td><td>0,5%</td></tr><tr><td>F1.0140</td><td>2,3%</td><td>2,3%</td><td>2,7%</td><td>F1.0810</td><td>0,0%</td><td>1,5%</td><td>0,8%</td></tr><tr><td>3602-3</td><td>2,3%</td><td>2,6%</td><td>2,0%</td><td>F1.2849</td><td>0,0%</td><td>2,4%</td><td>3,3%</td></tr><tr><td>00T41-1</td><td>2,3%</td><td>2,6%</td><td>1,2%</td><td>3115-1</td><td>0,0%</td><td>1,0%</td><td>1,7%</td></tr><tr><td>F1.2826</td><td>2,2%</td><td>1,7%</td><td>3,2%</td><td>38T18-4</td><td>0,0%</td><td>1,3%</td><td>2,6%</td></tr></tbody></table>
# Echantillon-A

* 3 vergers x 2 années x 4 génotypes x 1-2 ramets x 30 graines → 1524 graines

- Vergers: Picard, Vaquey, Saint-Sardos
    2 zones à Picard (centre et nord)

- Années: 2012 et 2014 (pollinisation 2011 et 2013)

- Génotypes: « tardifs » (F1.0770; 3602-3); « moyen » (F1.0783); « précoce » (F1.0731)

- Ramet: 3-4 cônes récoltés par ramet

La récolte des cônes se fait sur les mêmes arbres en 2012 et en 2014.
## Echantillon-B

* Vaquey en 2014 (pollinisation 2013):
  20 génotypes x 1 ramet x 30 graines
  → 590 graines

## Echantillon-C

* Lot commercial 2015 (pollinisation 2014) reconstitué (= mélange de 40 arbres choisis au hasard avec 1 cône/arbre)

* 3 vergers x 150 graines → 450 graines
<table><thead><tr><th>Seed Orchard</th><th></th><th>Maternal genotype</th><th>Pollination year</th><th>Seed nber</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">CSO-1<br/>[St Laurent2-VF3]<br/>surrounded by<br/>maritime pine<br/>plantations</td><td>center</td><td rowspan="4">♀A+♀B+♀C+♀D</td><td rowspan="2">2011</td><td>240 (60/♀)</td></tr><tr><td>border</td><td>240 (60/♀)</td></tr><tr><td>center</td><td rowspan="2">2013</td><td>116 (27-30/♀)</td></tr><tr><td>border</td><td>120 (30/♀)</td></tr><tr><td>-</td><td>commercial seedlot</td><td>2014</td><td>147</td></tr><tr><td rowspan="4">CSO-2<br/>[Beychac-VF3]<br/>some maritime pine<br/>plantations several km away</td><td rowspan="2">20 ♀</td><td>2011</td><td>240 (60/♀)</td></tr><tr><td>2013</td><td>238 (58-60/♀)</td></tr><tr><td>commercial seedlot</td><td>2013</td><td>590 (27-30/♀)</td></tr><tr><td>2014</td><td>142</td></tr><tr><td rowspan="3">CSO-3<br/>[St Sardos-VF3]<br/>no maritime pine plantations<br/>within 20km</td><td rowspan="2">commercial seedlot</td><td>2011</td><td>240 (60/♀)</td></tr><tr><td>2013</td><td>90 (17-29/♀)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>2014</td><td>149</td></tr></tbody></table>

2,552 seeds collected from 3 seed orchards over 3 years¹⁰
# Génotypage SNPs

* 54 génotypes parentaux (2 ramets choisis dans des vergers différents) → récolte d'aiguilles

* Echantillons A-B-C → 2 552 plantules

* Utilisation de 80 SNPs (Vidal et al., 2015)

* Génotypage Sequenom sur la Plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux:
  - 54 parents x 2 ramets x 2 échantillons
  - 2 552 plantules
Jeu de SNP pour la reconstitution de pedigree

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Génotypage par réaction iplex
(Sequenom)
~12 000€ pour 1 700 échantillons

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

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Reconstitution de pedigree avec le
logiciel CERVUS

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<figure><img src="image_11.png" /></figure>

Détection des allèles par
spectrométrie de masse

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

<figure><img src="image_13.png" /></figure>
# Reconstitution paternité / parenté

* **63 SNPs validés** (séparation nette des 3 classes génotypiques, taux de génotypage > 90%)

* Population parentale: 99,4% loci génotypés

* Logiciel Cervus 3.0.7

* **Echantillons A et B: analyse de paternité**

- 2 114 individus avec 59 SNPs en moyenne (min=37; max=63)

- Confirmation de la mère si: 1 mismatch max et LOD>0

- Père retrouvé si: 1 mismatch max et trio level confidence>99%

* **Echantillon C: analyse de parenté**

- 438 individus avec 56 SNPs en moyenne (min=46; max=57)

- Toujours un parent avec 0 mismatch et LOD>0

- Parents retrouvés si: 1 mismatch max et trio level confidence>99%
# Taux de pollution pollinique par VG x année

(éch. A et C: 4 mères en 2011-2013 et lot commercial 2014)

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

- Taux de pollution élevé (CSO-1>>CSO-2>CSO-3) mais variable selon l'année (2011>>2013~2014)

- Effets confondus: proximité du massif landais, année et âge des vergers (installation CSO-1 en 2006 vs CSO-2-3 en 2002-2003)

- Pas d'effet de la zone intra-verger (CSO-1)
# Taux de pollution pollinique par mère

(éch. B: 20 mères à Vaquey, 2013)

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Phénologie femelle:
notation (note de 1 à 10) réalisée
en 2015 et 2016 (1 passage
/an/VG). La moyenne globale
(ramets, année, VG) est reportée
en abscisse.

- Forte variabilité du taux de pollution selon le génotype de la mère considérée

- Pas de corrélation entre phénologie femelle et le taux de contamination

- Les 4 génotypes sélectionnés pour l'échantillon-A présentent des taux de pollution élevés.
# Conclusions

## Taux de pollution pollinique:

* Même ordre de grandeur que les deux études précédentes mais estimations plus précises

* Fortement dépendant du verger: Picard >> Vaquey > Saint-Sardos

* localisation des VG:
    * proximité des plantations de pins
    * Vaquey et St Sardos fleurissent 7-10 jours avant Picard

* différence d'âge entre les VG

* Indépendant de la zone intra-verger: pas de différence entre Picard centre et nord

* Fortement dépendant de l'année: 2012 >> 2014

* âge des VG (en particulier pour Picard en 2012)

* climat?

* Dépendant du génotype de la mère
  Vaquey en 2014: pollution de 10% à 45%

# Perspectives

* Etude à approfondir pour analyser chaque facteur de manière indépendante (localisation, âge du verger, phénologie, météo...)

* Un suivi annuel du taux de pollution permettrait d'étudier les relations pollution - climat

* Étude des méthodes de réduction de la pollution (localisation des VG, verger sous serre, complementation pollinique, décalage phénologique...)
Contribution parentale (CSO-2; 2011 & 2013)

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

- Tous les pères contribuent à la descendance

- Auto-fécondation (5,4% en moyenne mais variable selon génotype)

- Contribution paternelle hétérogène non liée au nombre de ramets par génotype
<table><thead><tr><th></th><th>nbre-desc-avec-père-retrouvé</th><th>nbre-autofecondation</th><th>% autofécondation</th></tr></thead><tbody><tr><td>0022-3</td><td>26</td><td>7</td><td>27%</td></tr><tr><td>F1.0766</td><td>24</td><td>4</td><td>17%</td></tr><tr><td>F1.0810</td><td>23</td><td>4</td><td>17%</td></tr><tr><td>0251-6</td><td>22</td><td>3</td><td>14%</td></tr><tr><td>F1.0783</td><td>144</td><td>12</td><td>8%</td></tr><tr><td>F1.2368</td><td>24</td><td>2</td><td>8%</td></tr><tr><td>00T41-1</td><td>17</td><td>1</td><td>6%</td></tr><tr><td>0022-2</td><td>22</td><td>1</td><td>5%</td></tr><tr><td>F1.0731</td><td>117</td><td>6</td><td>5%</td></tr><tr><td>0045-1</td><td>23</td><td>1</td><td>4%</td></tr><tr><td>0123-1</td><td>26</td><td>1</td><td>4%</td></tr><tr><td>0217-3</td><td>25</td><td>1</td><td>4%</td></tr><tr><td>3602-3</td><td>146</td><td>6</td><td>4%</td></tr><tr><td>F1.0770</td><td>151</td><td>6</td><td>4%</td></tr><tr><td>F1.2631</td><td>25</td><td>1</td><td>4%</td></tr><tr><td>0217-2</td><td>23</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>3820-4</td><td>24</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>3831-3</td><td>22</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>F1.0140</td><td>24</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>F1.0721</td><td>25</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>F1.0724</td><td>24</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>F1.0765</td><td>26</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>F1.2643</td><td>23</td><td></td><td>0%</td></tr><tr><td>F1.2853</td><td>17</td><td></td><td>0%</td></tr></tbody></table>

# Autofécondation

## Echantilon-A-B:

2 114 plantules, père retrouvé pour 1023 plantules dont 56 autofécondation (soit 5,5%).

## Echantillon-C:

438 graines, 2 parents retrouvés pour 264 plantules dont 12 présentent une autofécondation (soit 4,5%).
# Diversité génétique

<table><thead><tr><th></th><th>CSO-1</th><th>CSO-2</th><th>CSO-3</th></tr></thead><tbody><tr><td>N<br>(census nber of genotypes)</td><td>46</td><td>47</td><td>48</td></tr><tr><td>N<sub>eff</sub><br>(effective nber of genotypes)</td><td>39.1</td><td>43.1</td><td>38.6</td></tr><tr><td>N<sub>eff,father</sub><br>(effective nber of fathers;<br>2011-2013)</td><td>14.6</td><td>31.2</td><td>13.1</td></tr><tr><td>N<sub>eff,father,cont</sub><br>(effective nber of fathers<br>including pollen contamination*;<br>2011-2013)</td><td>670.1</td><td>71.9</td><td>41.8</td></tr></tbody></table>

* $N_{eff} < N$ due to a variable number of ramets per genotype (Table 2)

* $N_{eff,Father} < N_{eff}$ due to heterogeneous paternal contribution (Table 2)

* Contamination increases genetic diversity in the CSO seedlots ($N_{eff,father,cont}$), specially in CSO-1 (Table 2)

<footnote>* each immigrant pollen is considered as a unique father</footnote>