# Techniques de collecte, conditionnement et conservation des échantillons en vue de l'analyse

Christian Mougin, Stephen Mulero, Cindy Arnoldi, Olivier Ravel, Alyssa Clavreul

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Christian Mougin, Stephen Mulero, Cindy Arnoldi, Olivier Ravel, Alyssa Clavreul. Techniques de collecte, conditionnement et conservation des échantillons en vue de l'analyse. École thématique. Webinaire Respire - AnaEE-France, France. 2024. hal-04853548

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# Techniques de collecte, conditionnement et conservation des échantillons en vue de l'analyse

Christian Mougin, Stephen Mulero, Cindy Arnoldi, Olivier Ravel, Alyssa Clavreul

17 décembre 2024

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Introduction

* Les échantillons environnementaux (sols), formés d'éléments biotiques et abiotiques, sont complexes et hétérogènes

* Le prélèvement des échantillons est l'étape initiale clé qui va influer sur la qualité et la pertinence des résultats analytiques

* Le prélèvement (la collecte) est indissociable de l'analyse (caractérisation), en passant par la conservation, voire la distribution entre plusieurs partenaires

* Il faut tenir compte des questions scientifiques posées, des mesures qui seront effectuées *in fine*, d'éventuelles réutilisations, et des répercussions qui peuvent en découler sur les paramètres mesurés

* De nombreux points sont à considérer !

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Quelques points d'attention

* Définir les objectifs scientifiques

* Préparer et appliquer un plan d'échantillonnage :

* Elaborer des stratégies d'investigation de site en recueillant des informations sur les propriétés du sol, leur variabilité et leur répartition spatiale

* Décrire les échantillons à prélever, la façon de les prélever en intégrant les contraintes éventuelles et l'endroit où les prélever (géolocalisation)

* Prendre en compte les exigences de l'analyse (par exemple essais biologiques, essais physiques, échantillons remaniés ou non remaniés), échantillonnages composites, spécifiques...

* Choisir et appliquer les techniques de prélèvement : prélever des échantillons représentatifs

* Choisir le matériel et les techniques à employer (différentes profondeurs...)

* Prélèvements élémentaires > Echantillon global (composite) > trié > réduit (quartage) pour laboratoire

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INRAE
# Quelques grandes étapes

* Choix des sites : noter sur une carte, repères spécifiques, SIG, marquage des points

* Description du lieu de prélèvement : historique du site, topographie, couverture, zonage > visite

* Conditions d'échantillonnage : humidité, température, profondeur, date/saison si suivi pluri annuel ou traitement (fertilisation...), autres intervenants (programme pluri partenaires)

* Méthode d'échantillonnage : aérobie/anaérobie, débris végétaux

* Etiquetage : numéro unique, marquage permanent, lien avec le lieu de prélèvement

* Conditions de transport : maintien des propriétés, délai, abri de la lumière, température (congélation...), règlementation (propriété, quarantaine, APA...)

* Condition et durée de conservation : dépendent des analyses à réaliser

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INRAE
Les outils

* Les normes, guides et lignes directrices (par exemple ISO > AFNOR...)

* Le PGD : le PGD doit être un outil pour construire le PGE

* Solution de géolocalisation : SIG

* Solution informatique de gestion des échantillons : Collec-Science https://www.collec-science.org/

* Echantillon + données = ressources (biologique)

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Plateforme CA-SYS Dijon

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# Exemple : les activités enzymatiques des sols

* Conditions de prélèvement

* Matériel

* Prélèvement

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<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Exemple de prélèvements</figcaption></figure>

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# Des prélèvements adaptés aux paramètres à mesurer

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# Stratégie d'échantillonnage spatiale

## Proposition : sur le site d'échantillonnage du RMQS

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# Stratégie d'échantillonnage temporelle

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Conservation des échantillons de sols vs activités enzymatiques

<table><thead><tr><th>SOILS</th><th>STORAGE</th><th>TIME (day)</th><th>ARYLS</th><th>PHOS</th><th>GLU</th><th>URE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="15">LNC (% evolution of activity from fresh soil)</td><td rowspan="2">fresh (mU/g dw)</td><td>0</td><td>91</td><td>70*</td><td>99</td><td>36*</td></tr><tr><td>1</td><td>82*</td><td>76*</td><td>100</td><td>88</td></tr><tr><td rowspan="5">dry 5 weeks and rewetted 80%WRC</td><td>2</td><td>90</td><td>100</td><td>126*</td><td>106</td></tr><tr><td>4</td><td>73*</td><td>78*</td><td>120*</td><td>83*</td></tr><tr><td>7</td><td>82*</td><td>89</td><td>117*</td><td>82*</td></tr><tr><td>11</td><td>81*</td><td>88</td><td>113*</td><td>78*</td></tr><tr><td>15</td><td>78*</td><td>78*</td><td>121*</td><td>84*</td></tr><tr><td rowspan="5">Stored at 4°C</td><td>3</td><td>100</td><td>107</td><td>134*</td><td>97</td></tr><tr><td>6</td><td>103</td><td>110</td><td>134*</td><td>88</td></tr><tr><td>9</td><td>102</td><td>110</td><td>159*</td><td>91</td></tr><tr><td>15</td><td>95</td><td>102</td><td>118*</td><td>26*</td></tr><tr><td>30</td><td>85*</td><td>98</td><td>112</td><td>43*</td></tr><tr><td rowspan="4">Frozen at -20°C</td><td>60</td><td>94</td><td>101</td><td>125*</td><td>83*</td></tr><tr><td>15</td><td>90</td><td>89</td><td>109</td><td>69*</td></tr><tr><td>30</td><td>80</td><td>88</td><td>124*</td><td>79*</td></tr><tr><td>60</td><td>89</td><td>85*</td><td>119*</td><td>56*</td></tr><tr><td rowspan="3">ultrafreeze at -80°C</td><td>15</td><td>92</td><td>113*</td><td>123*</td><td>78*</td></tr><tr><td>30</td><td>94</td><td>90</td><td>143*</td><td>78*</td></tr><tr><td>60</td><td>98</td><td>107</td><td>130*</td><td>58*</td></tr></tbody></table>
# Conservation des échantillons vs activités enzymatiques

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>## Sec vs réhumidifié</figcaption></figure>
Des préconisations (conservation) ISO 18400-206

<table><thead><tr><th>Test objective</th><th>International Standard</th><th>Wet 4 °C</th><th>Wet -20 °C<sup>a</sup></th><th>Wet -80 °C or liquid nitrogen (-180 °C)<sup>a</sup></th></tr><tr><td></td><td></td><td>days/months</td><td>years</td><td>years</td></tr></thead><tbody><tr><td>Effects on invertebrates</td><td>ISO 11267<br>ISO 11268-1<br>ISO 11268-2<br>ISO 15952<br>ISO 16387<br>ISO 17512-1<br>ISO 17512-2<br>ISO 20963</td><td>three months</td><td>—</td><td>—</td></tr><tr><td>Effects on higher plants</td><td>ISO 11269-1<br>ISO 11269-2<br>ISO 17126<br>ISO 18763<br>ISO 22030<br>ISO 29200</td><td>three months</td><td>—</td><td>—</td></tr><tr><td>Phospholipid Fatty Acid,<br>Phospholipid ether lipids</td><td>ISO/TS 29843-1<br>ISO/TS 29843-2</td><td>7 d</td><td>2</td><td>10</td></tr><tr><td>DNA</td><td>ISO 11063</td><td>—</td><td>2</td><td>10</td></tr><tr><td>RNA<sup>[13]</sup></td><td></td><td>—</td><td>—</td><td>10</td></tr></tbody></table>
# Des préconisations (conservation) ISO 18400-206

<table><thead><tr><th>Test objective</th><th>International Standard</th><th>Wet 4 °C<br>days/months</th><th>Wet -20 °C<sup>a</sup><br>years</th><th>Wet -80 °C or liquid nitrogen (-180 °C)<sup>a</sup><br>years</th></tr></thead><tbody><tr><td>Biomass</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>— substrate-induce<br>respiration method</td><td>ISO 14240-1</td><td>7 d</td><td>1</td><td>—</td></tr><tr><td>— Fumigation-extraction<br>method</td><td>ISO 14240-2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potential ammonium oxidation</td><td>ISO 15685</td><td>7 d</td><td>1</td><td>—</td></tr><tr><td>Nitrogen mineralization</td><td>ISO 14238</td><td>7 d</td><td>1</td><td>—</td></tr><tr><td>Microbial soil respiration</td><td>ISO 16072</td><td>7 d</td><td>1</td><td>—</td></tr><tr><td>Soil respiration curves</td><td>ISO 17155</td><td>7 d</td><td>—</td><td>—</td></tr><tr><td>Dehydrogenase activity</td><td>ISO 23753-1<br>ISO 23753-2<br>ISO 18187</td><td>7 d</td><td>1</td><td>—</td></tr><tr><td>Enzyme activity patterns<sup>[14]</sup></td><td>ISO/TS 22939<br>ISO 20130</td><td>15 °C / 4 d</td><td>—</td><td>≥ 4 month</td></tr><tr><td>Denitrifying enzyme activity</td><td>ISO 20131-1<br>ISO 20131-2</td><td>7 d</td><td>1</td><td>—</td></tr></tbody></table>
# Analyses possibles en fonction de la conservation

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# Analyses possibles en fonction de la conservation

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# La génomique environnementale

* Les acides nucléiques environnementaux (ANe) :

Un mélange complexe d'ADN et d'ARN, libres ou complexés, pouvant être isolés d'une matrice environnementale. Ils proviennent des différents organismes vivant ou ayant vécu dans l'écosystème étudié. Modifié de Taberlet, et al., 2012 et 2018

* La génomique environnementale :

Elle désigne l'ensemble des informations pouvant être acquise sur les organismes et les écosystèmes présents et passés par l'analyse de la séquence, de génomes, de métagénomes et de l'expression de gènes. La génomique environnementale, Faure, Joly, 2016

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# Principales caractéristiques des ANe

## Les ANe, des molécules éphémères

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Deiner, et al., 2022

## Et informatives mais à différentes échelles

<table><tr><td rowspan="3">Local</td><td>Glace profonde</td><td>Air</td></tr><tr><td>Sols argileux</td><td>Eau de mer<br>Sédiments fluviatiles/marins<br>Eau fluviatile</td></tr><tr><td>Sols profonds</td><td>Eau lacustre<br>Sédiments lacustres<br>Sols de surface Litière</td></tr><tr><td colspan="2">Passé</td><td>Neige<br>Tissus/Sang/fèces</td></tr></table>

Modifié de Deiner, et al., 2017
# Quelques questions pour orienter l'échantillonnage

## L'Objectif de l'étude :

* Renaturation ?
* Bio invasion ?
* Diagnostic ?
* Communautés ?
* Régimes alimentaires ? ...
* Permet d'orienter vers une approche espèce spécifique ou généraliste ainsi que d'orienter les analyses subséquentes (inventaire, fonctionnelles, spatiales etc...)

## Que recherche t-on ?

* Une espèce ?
* Une abondance ?
* Une diversité ?
* Permet également d'orienter vers une approche espèce spécifique ou généraliste
* Mais aussi de concevoir un échantillonnage adapté

## Dans quels milieux ?

* Aquatiques ?
* Terrestres ?
* Un hôte ?
* Aérien ? ...
* Permet de définir le type de matrice environnementale sur laquelle travailler

## Quand le recherche t-on ?

* Présence récente ?
* Contemporaine ?
* Ancienne ?
* Une dynamique ?
* Permet de définir l'échantillonnage dans le temps (cinétique de prélèvements) et l'espace (profondeur/volume)
# Quelques questions pour orienter l'échantillonnage

## Une dépendance à la saisonnalité ?

Pic d'activité (pollinisation, sporulation, reproduction, etc..)

Permet de savoir quand prélever

## Mode de vie ?

Régime alimentaire ? Mode de vie caché ? Fixe/mobile ? Diurne/nocturne ?

Affine la période de prélèvement

## Capacité de dispersion ?

Quelques cm ? m ? km ?

Sélection de la technique d'échantillonnage et du volume (sol, eau, ...)

## Historique du site ?

Pollution ? Anthropisation ? Aléas climatiques ?

Va impacter la faune et la flore, les fonctions écosystémiques, etc.

Les aléas climatiques (pluie, sècheresse, etc.) impacteront la campagne d'échantillonnage
# Attention aux contaminations !

Port de gants fortement recommandé ainsi que l'utilisation de matériel stérile, unitaire ou décontaminé.

► Décontaminer entre chaque prélèvements ou sites (si échantillons composites).

* **Outils de décontamination**

Alcool : fixe les cellules, mais sans les détruire

Javel : Destruction des membranes et débris cellulaires

UV : fragmentation des ANe

Flamme : Destruction ANe

DNases et RNases : Destruction des ANe

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# Complément pour l'échantillonnage de sols

Tenir compte de la **capacité de dispersion** des organismes:

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# Exemple : Le prélèvement d'eau par filtration

* Conditions de prélèvement (liquide)

* Matériel

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Sterivex (petits volumes)</figcaption></figure>

Caractéristiques des membranes :

**Hydrophile, 0,45 µm, PES ou NC (le plus courant)**

* Prélèvement

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Keonhee, et al., 2021</figcaption></figure>

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Waterra (grands volumes)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Argaly</figcaption></figure>

* Favoriser le prélèvement à effort constant (même volume ou durée)
# Dynamique spatiale et temporelle des ANe dans l'eau

Prélever de l'aval vers l'amont en positionnant le dispositif à contre courant:

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# Conservation des échantillons

## Liquides

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Mavisseau et al., 2021

- Précipitation (Alcool)

- Solutions tampon

- Lyophilisation

- Membranes filtrantes en Longmire

## Solides

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- Sols frais

- Congélation

- Lyophilisation

## Tissus

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- Solutions tampon

- Alcool

- Atmosphère contrôlée
# Le prélèvement d'ADNe en général

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DEVELOPMENT AND APPLICATION OF AN eDNA METHOD TO
DETECT AND QUANTIFY A PATHOGENIC PARASITE IN
AQUATIC ECOSYSTEM

J. R. Huver¹, J. Koprivnikar²

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¹P. J. Johnson and ²P. J. Johnson, *J. R. Huver*, *J. Koprivnikar*, *P. J. Johnson* and *J. Koprivnikar* survey animal and plant communities

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## Un manque de standardisation dans la littérature...

Mais des projets et initiatives en cours pour standardiser :

PEPR OneWater, OFB, LNE...

Et des normes existantes sur lesquelles s'appuyer in natura:

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## 2. Filtration

Application of Environmental DNA Analysis for the
viverrini DNA in Water Samples

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SPYGEN®

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Molecular detection of marine nematodes from
environmental samples: overcoming eukaryotic
interference

Punyasloke Bhadury¹,²,³,*, Melanie C. Austen¹, David T. Billon²,
P. John D. Lambshouse³, Alex D. Rogers⁴,*, Gary R. Smerdon⁴

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ENVIRONNUM
SOLUTIONS ENVIRONNEMENTALES

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NDE™: A fully integrated environmental DNA sampling
system

A. C. Thomas¹

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Jesse Howard¹

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Phong L. Nguyen¹

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S. Goldberg¹

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# Quand nous contacter ?

## Déroulement d'un projet classique :

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- Financement de CDD possible
- Meilleur accompagnement
- Meilleure planification

Le plus tôt sera le mieux !
# Quelques liens utiles

* Plateforme Biochem-Env

* https://www.biochemenv.fr/

* contact-biochemenv@inrae.fr

* Plateforme eDNA

* edna-anaee@univ-grenoble-alpes.fr

* Infrastructure AnaEE-France

* https://www.anaee-france.fr/

* Infrastructure RARE

* https://www.agrobrc-rare.org/

* Pilier environnement : [contact-brc4env@inrae.fr](mailto:contact-brc4env@inrae.fr)

* RESPIRE (CNRS)

* https://extra.core-cloud.net/collaborations/RESPIRE/SitePages/Accueil.aspx

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# L'importance d'AnaEE et des IR

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AnaEE

Analysis and Experimentation on Ecosystems

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Montage de projet multi-plateformes, coordination
Veille sur les opportunités de financements PEPR, Biodiversa, Horizon ...

France

Experimental platforms

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Ecotrons

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Semi-natural

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In natura

Analysis and measurements

Information systems and models

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Instruments

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In silico

Shared activities

Access rules

Shared protocols

Technologies

Metadata semantics

Data ontology

Syntheses

Les principales missions d'AnaEE France

* Offrir un accès complet à l'étude d'écosystèmes continentaux terrestres et aquatiques.

* 36 dispositifs en France :

* Plateformes écosystémiques in natura

* Plateformes écosystémiques fermées

* Plateformes analytiques

* Plateformes de modélisation

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AnaEE

Analysis and Experimentation on Ecosystems

France

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ISIA

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AnaEE

Eric

Analysis and Experimentation
on Ecosystems

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Expérimental

Analytique

Collecte /
Prélèvement

Identification

Conservation

Caractérisation

Gestion des
données

Distribution
Quelques textes ISO

* 18400-101 - Qualité du sol - Échantillonnage - Partie 101 : Cadre pour la préparation et l'application d'un plan d'échantillonnage

* 18400-102 - Qualité du sol - Échantillonnage - Partie 102 : Choix et application des techniques d'échantillonnage

* 18400-104 - Qualité du sol - Échantillonnage - Partie 104 : Stratégies

* 18400-105 - Qualité du sol - Échantillonnage - Partie 105 : Emballage, transport, stockage et conservation des échantillons

* 18400-107 - Qualité du sol — Échantillonnage - Partie 107 : Enregistrement et notification

* 18400-202 - Qualité du sol — Échantillonnage - Partie 202 : Investigations préliminaires

* 18400-205 - Qualité du sol — Échantillonnage - Partie 205 : Recommandations relatives aux modes opératoires d'investigation des sites naturels, quasi naturels et cultivés

* 18400-206 - Qualité du sol — Échantillonnage - Partie 206 : Collecte, manipulation et conservation de sols destinés à l'évaluation de paramètres biologiques fonctionnels et structurels en laboratoire

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Merci pour votre attention !