# Utilisation de l'ADN environnemental pour détecter la présence d'espèces rares : Cas d'étude d'une espèce migratrice l'Esturgeon Européen Acipenser sturio.

Leni Guillotin

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Leni Guillotin. Utilisation de l'ADN environnemental pour détecter la présence d'espèces rares : Cas d'étude d'une espèce migratrice l'Esturgeon Européen Acipenser sturio. Sciences de l'environnement. 2022. hal-05275292

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RAPPORT DE STAGE MASTER 2 BIODIVERSITÉ ÉCOLOGIE ÉVOLUTION (BEE)

PARCOURS FONCTIONNEMENT ET GESTION DES ÉCOSYSTÈMES MARINS (FOGEM)
UNIVERSITÉ DE LILLE, FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNOLOGIE

PARCOURS COASTAL AND MARINE BIOLOGY AND ECOLOGY (CMBE)
UNIVERSITÀ DEL SALENTO (ITALIE), DOUBLE DIPLÔME INTERNATIONAL

ANNÉE 2021-2022

UTILISATION DE L'ADN ENVIRONNEMENTAL POUR DÉTECTER LA PRÉSENCE D'ESPÈCES RARES : CAS D'ÉTUDE D'UNE ESPÈCE MIGRATRICE L'ESTURGEON EUROPÉEN Acipenser sturio.

RÉDIGÉ PAR
LÉNI GUILLOTIN

AVEC LE SOUTIEN DE
MADAME ACOLAS MARIE-LAURE – MAÎTRE DE STAGE
MONSIEUR VILLENEUVE BERTRAND – MAÎTRE DE STAGE
MADAME GENTILEHOMME VALÉRIE – RESPONSABLE DE STAGE

RÉALISÉ POUR L'INSTITUT NATIONAL DE RECHERCHE POUR L'AGRICULTURE, L'ALIMENTATION ET L'ENVIRONNEMENT, ET COFINANCÉ PAR L'OFFICE FRANÇAIS DE LA BIODIVERSITÉ.
REMERCIEMENTS

Je souhaite adresser mes remerciements à tous ceux qui m'ont aidé à réaliser ce travail.

Tout d'abord, je remercie Henrique CABRAL, de m'avoir accueilli au sein de l'unité de recherche EABX (Écosystèmes Aquatiques et Changements Globaux) qu'il dirige, et d'avoir toujours été à l'écoute des stagiaires.

Je remercie particulièrement Marie-Laure ACOLAS et Bertrand VILLENEUVE de m'avoir accueilli au sein de l'équipe FREEMA (Fonctionnement et Restauration des Écosystèmes Estuariens et des populations de Migrateurs Amphihalins). Merci à eux d'avoir été là pour me guider et m'épauler tout au long de ce stage, de m'avoir partagé leurs expériences et su être à l'écoute.

Je remercie également l'UMR BIOGECO (Biodiversité Gènes et Communautés) de m'avoir accueilli au sein de la plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux, et plus spécialement Émilie CHANCEREL et Olivier LEPAIS pour leur bienveillance, et avec qui il était toujours très agréable de travailler et d'échanger.

Mes remerciements vont également à Sébastien BOUTRY pour avoir consacré de son temps au mien, dans la mise en place et la bonne compréhension des outils statistiques. Pour sa bonne humeur, sa pédagogie et son aide précieuse.

Je remercie grandement le personnel de la station d'expérimentation de Saint-Seurin-sur-l'Isle ainsi que ceux de l'association MIGADO (Migrateurs Garonne Dordogne), pour avoir pris le temps de me présenter la complexité de leur travail, et surtout de m'avoir permis de constater de mes propres yeux la beauté et la fragilité des êtres pour lesquelles nous travaillons.

Enfin, je remercie l'ensemble des personnes que j'ai peu côtoyer au cours de ce stage, pour les échanges enrichissants, la bonne humeur quotidienne et les afterwork autour d'une bière ou d'une session surf.

Pour terminer, je voulais également dire merci à Valérie GENTILHOMME, l'Université de Lille, l'Université de Salento et l'INRAE, pour s'être rendu disponible et avoir fait en sorte que cette dernière année d'étude se coordonne parfaitement malgré les contraintes de temps et de géographie, dans un contexte sanitaire encore perturbé.
TABLE DES MATIÈRES

<table><tr><td>I – INTRODUCTION</td><td>4</td></tr><tr><td>II – MATÉRIELS ET MÉTHODES</td><td>8</td></tr><tr><td>2.1 – Étude bibliographie</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2 – Suivi en métabarcoding des frayères historiques d'Esturgeon européen (A.sturio)</td><td>9</td></tr><tr><td>2.2.1 – Échantillonnage</td><td>10</td></tr><tr><td>2.2.2 – Méthodes analytiques en métabarcoding</td><td>12</td></tr><tr><td>2.3 – Développement d'une nouvelle méthode de détection rapide in situ de l'Esturgeon européen (Acipenser sturio)</td><td>14</td></tr><tr><td>2.3.1 – Recherche des amorces et échantillonnage</td><td>15</td></tr><tr><td>2.3.2 – Mise en place de tests de détection rapide</td><td>15</td></tr><tr><td>III – RÉSULTATS</td><td>16</td></tr><tr><td>3.1 – Étude bibliographique</td><td>16</td></tr><tr><td>3.1.1 – Avantages et inconvénients de l'ADN environnemental (ADNe)</td><td>17</td></tr><tr><td>3.1.2 – Persistance de l'ADNe selon les milieux</td><td>19</td></tr><tr><td>3.2 – Analyse du suivi en métabarcoding des frayères historiques de l'Esturgeon européen (Acipenser sturio)</td><td>22</td></tr><tr><td>3.2.1 – Analyse de la richesse spécifique</td><td>22</td></tr><tr><td>3.2.2 – Comparaison des sites amont/aval et des fleuves Dordogne/Garonne</td><td>26</td></tr><tr><td>3.2.3 – Comparaison des méthodes de détection par pêche électrique et échantillonnage ADNe</td><td>27</td></tr><tr><td>3.3 – Analyse des tests de détection rapide</td><td>28</td></tr><tr><td>IV – DISCUSSION</td><td>29</td></tr><tr><td>4.1 – Étude bibliographique</td><td>29</td></tr><tr><td>4.2 – Analyse du suivi en métabarcoding des frayères historiques de l'Esturgeon européen (Acipenser sturio)</td><td>30</td></tr><tr><td>4.3 – Développement d'une nouvelle méthode de détection rapide in situ de l'Esturgeon européen (Acipenser sturio)</td><td>31</td></tr><tr><td>V – CONCLUSION ET PERSPECTIVES</td><td>33</td></tr><tr><td>BIBLIOGRPAHIE</td><td>34</td></tr><tr><td>ANNEXES</td><td>37</td></tr><tr><td>TABLE DES FIGURES</td><td>52</td></tr><tr><td>TABLE DES TABLEAUX</td><td>52</td></tr><tr><td>TABLE DES ANNEXES</td><td>52</td></tr><tr><td>RÉSUMÉ</td><td>54</td></tr><tr><td>SUMMARY</td><td>55</td></tr></table>
# I – INTRODUCTION

La réalisation de ce rapport s'effectue dans le cadre de mon stage de Master 2. Celui-ci est proposé par l'INRAE (Institut National de Recherche en Agriculture Alimentation et Environnement) et à lieu au sein de l'unité EABX (Écosystème Aquatique et changement globaux) dans l'équipe FREEMA (Fonctionnement et Restauration des Écosystèmes Estuariens et des populations de Migrateurs Amphihalins). Ce stage est encadré par la présence et le soutien de Mme Marie-Laure ACOLAS, chargée de recherche, et Mr Bertrand VILLENEUVE, ingénieur de recherche. Enfin, ce travail s'intègre dans le cadre du projet MOMIE (MOuvement MIgratoire de l'Esturgeon européen, *Acipenser sturio*) cofinancé par l'OFB (Office Français de la Biodiversité).

Depuis la révolution industrielle, nombres de milieux naturels ne cessent d'être impactés par les activités humaines. Ces impacts négatifs provoqués de façon direct et parfois indirect, sont à l'origine de la chute actuelle de la biodiversité (Reid et al. 2019). Tout écosystème est aujourd'hui impacté et l'estuaire de la Gironde n'y échappe pas. En effet, les milieux aquatiques ouverts sont soumis à de nombreuses et diverses pressions. Les populations de poissons s'y trouvant et notamment les migrateurs amphihalins ont été affectés par des facteurs multiples : la destruction d'habitats essentiels, les ruptures de connectivité, la surpêche, ainsi que l'extension du commerce maritime, ce qui a engendré une forte décroissance des stocks<fnref n="1" /> (Limburg et Waldman 2009). En effet ces espèces dites diadromes c.a.d. qui effectue une partie de leur cycle vital en fleuve/rivière et le reste en mer, ou inversement, fréquentent diverses zones d'habitats (fluviales, estuariens et côtiers). Malgré la mise en place de politiques règlementaires, les populations de poissons restent impactées et les effets du changement climatique s'ajoutent aux pressions locales (Drouineau et al. 2018).

Si l'on recontextualise à notre zone d'étude, les fleuves de la Garonne et de la Dordogne, sont influencés par l'activité industrielle, avec plus d'un siècle de métallurgie du zinc, l'activité agricole, liée à la forte activité viticole et l'utilisation de pesticide qu'elle engendre, et enfin l'activité urbaine, avec la présence de la ville de Bordeaux et de son agglomération (RTE, 2018).

<footnote n="1">¹ Partie exploitable de la population d'une espèce dans une zone donnée (Ifremer).</footnote>
En 2009, l'OFB classe alors l'estuaire fluvial de la Garonne Aval comme n'ayant pas atteint le « bon » état chimique recommandé par la directive cadre sur l'eau. L'état chimique de la partie aval est quant à lui inconnu, et celui de la Dordogne considéré comme « bon ». En 2015, l'estuaire fluviale de la Garonne Aval va atteindre le « bon » état chimique de cette directive, alors que ceux de la partie amont, et l'ensemble de la Dordogne seront inconnu. A cette influence chimique, s'ajoute une influence écologique due à une fragmentation des habitats par la présence de barrage impactant la migration de certaines espèces de poissons. En 2009 l'état écologique de ces deux fleuves est inconnu, mais en 2015, l'estuaire fluvial amont et aval de la Garonne et de la Dordogne est évalué « médiocre » (OFB, 2016).

Concernant l'estuaire de la Gironde, il fait partie des plus grands estuaires européens, où la pollution organique est modérée en comparaison des autres (Abril et al. 2002). Cependant un trafic portuaire y est présent, avec également la présence d'un bouchon vaseux, caractérisé par une zone de turbidité maximale (Allen 2002), due à l'asymétrie de la marée et la circulation résiduelle de densité (Allen et al. 1980). Ces éléments font de la Gironde un estuaire où le bon état chimique n'a pas été atteint en 2009 ni en 2015, et où la continuité écologique est considérée comme « médiocre » (OFB, 2016). Enfin, l'état chimique des eaux côtières s'est avéré « bon » depuis 2009, et il en est de même pour l'état de la continuité écologique depuis 2015, (OFB, 2016).

Parmi les espèces anadromes, c.a.d. qui se reproduisent en eau douce et qui effectuent leur croissance majoritairement en mer (Rulifson 1989), nous retrouvons l'esturgeon européen, *Acipenser sturio*, qui a la particularité d'effectuer une partie de sa croissance en milieu estuarien (Morais et Daverat 2016). Dans le bassin de la Gironde-Garonne-Dordogne, la naissance et la première année de croissance des juvéniles va avoir lieu en eau douce, puis se poursuivra pendant 2 à 6 ans au sein de l'estuaire avec des va et vient entre la mer et l'estuaire selon ses besoins. La majorité de sa croissance aura lieu en mer et, après avoir atteint sa maturité sexuel (10-12 ans chez les mâles et 13-16 ans chez les femelles) l'esturgeon va pouvoir retourner en eau douce pour se reproduire (Acolas et al. 2011) (Figure 1).
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1 :** Cycle de vie de l'esturgeon européen, *Acipenser sturio*. (1) et (6) Zone de frayère et Développement embryonnaire, (2) 1ère année de vie en eau douce, (3) Migration vers la zone estuarienne, (4) Migrations répétés entre mer et estuaire (5) Individu mature retournant en zone de frayère pour se reproduire.</figcaption></figure>

Avec une taille pouvant atteindre les trois mètres de long, cela en fait le plus grand poisson migrateur d'Europe de l'Ouest. Différentes espèces d'esturgeon sont présentes sur l'ensemble de l'hémisphère nord et certaines d'entre elles peuvent atteindre jusqu'à 6 mètres de long, avec des durées de vie comparable à celle des humains et allant parfois à plus de 100 ans pour certains individus (Magnin 1959). Souvent considéré comme le « dinosaure des rivières » l'esturgeon existe depuis près de 250 millions d'années.

Il appartient à la classe des Ostéichtyens (poissons osseux), et à la sous-classe des chondrostéens. Il a une morphologie atypique avec une forme pentagonale et une bouche protractile, de plus, l'absence d'écailles et la présence de plaques osseuses (scutelles) ont rendu leur classification difficile. On recense aujourd'hui 27 espèces d'esturgeon dans le monde (CITES, 2010), toutes, se trouvent sur la liste rouge de l'UICN et 17 d'entre elles sont considérées comme étant en danger critique d'extinction (état 2010), dont fait partie l'esturgeon européen *Acipenser sturio*.
En effet, la population n'a cessé de décliner depuis le 19ème siècle, et la dernière population sauvage est issue du bassin de la Gironde. Après une dernière reproduction naturelle observée dans les années 1994, différentes actions historiques menées en France, ont permis d'éviter la disparition de l'espèce mais également de constituer un stock d'individus captifs (Williot et al., 2011). Ce dernier a eu et a toujours pour objectif de mettre en place des reproductions assistées, afin de pouvoir relâcher des juvéniles en milieu naturel et relancer la dynamique de la population. Cette méthode, dite de **repeuplement**<fnref n="2" />, s'est principalement déroulée entre 2007 et 2015, pour un total de plus d'1.7 million de juvéniles lâchés au sein de leur habitat naturel (Roques et al. 2018). Par conséquent, sur la base des connaissances antérieures sur leur cycle de vie, les premiers géniteurs devraient commencer à revenir dans les cours d'eau pour se reproduire, et ce autour de 2020-2022.

S'agissant d'une espèce rare, *Acipenser sturio* est difficilement détectable, qui plus est au vu de son habitat. En effet, la largeur des cours dans lequel il se trouve, rend difficile la détection par méthode classique. La rareté de cette espèce, nécessite un échantillonnage intensif si l'on souhaite avoir la possibilité de rencontrer l'espèce, ce qui peut engendrer des effets invasifs pour le milieu, les individus et les espèces présentes à proximité. Une des parties du projet MOMIE vise donc à tester une méthode peu invasive quant à la détection du retour de ces géniteurs en fleuves, basé sur l'ADN environnemental (ADNe).

Depuis les années 2010, l'utilisation de l'ADN environnemental comme moyen de détection des espèces, connait une forte croissance, notamment dans l'étude des milieux aquatiques (Belle, Stoeckle, et Geist 2019). En effet dans ce milieu son utilisation est multiple, elle permet d'évaluer la biodiversité présente et par conséquent de détecter la présence d'espèces rares (e.g. en danger d'extinction) ou invasives. Chez les poissons, l'origine de cet ADNe provient de plusieurs sources : excrétion, sécrétion, reproduction, décomposition, etc. A la suite de quoi l'ADN se retrouve dans le milieu environnemental à l'état dégradé, et dont sa conservation est influencée par le temps et les conditions du milieu dans lequel il subsiste. Son utilisation intervient alors dans trois grands types d'approches : l'identification d'espèces seules souvent détectées par barcoding, l'identification par métagénomique, c.a.d. sans distinction des espèces, et l'identification par metabarcoding, qui elle ciblera un ou plusieurs gènes particuliers à une ou plusieurs espèces (Alberdi et al. 2018).

<footnote n="2">² Introduction d'organismes élevés par alevinage ou capturés à l'état sauvage afin d'y restaurer la biomasse de reproduction de stocks, à des niveaux qui lui permettent d'assurer à nouveau des rendements durables.</footnote>
L'utilisation de cet ADNe se révèle être plus sensible et plus rapide que les méthodes traditionnelles (Olds et al., 2016), tout en couvant une surface d'étude plus importante en un temps plus court (Meulenbroek et al. 2022). Par conséquent, et au vu de son fort intérêt pour la détection d'espèces rares, en dangers ou insaisissables (Sigsgaard et al. 2015), cela en fait un axe d'étude non négligeable pour le projet MOMIE.

Sur cette base, mes objectifs sont :

i) Entreprendre une synthèse bibliographie des avantages et inconvénients de l'utilisation d'ADNe comme méthode de détection.

ii) Analyser le suivi en métabarcoding des frayères historiques de l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*), au cours des années 2019, 2020 et 2021.

iii) Comparer les sites amont/aval des fleuves de la Dordogne et de la Garonne.

iv) Comparer les deux méthodes de détections utilisées (pêche électrique et échantillonnage ADNe).

v) Participer au développement d'une nouvelle méthode de détection rapide in Situ de l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*).

# II – MATÉRIELS ET MÉTHODES

## 2.1 – Étude bibliographie

S'agissant de science expérimentale récente, aucun consensus international n'est encore établi notamment sur la méthode de récolte de l'ADNe, et les effets que comporte chaque milieu. Cette partie a donc pour but d'en résumer les fondements méthodologiques dans un premier temps, et de mettre à profit par la suite ces connaissances dans l'analyse et l'interprétation des résultats obtenus dans le cadre du projet MOMIE, afin de pouvoir *in fine* proposer des perspectives pour de futurs projets.

En traitant uniquement les données de la base *Web of science*, la synthèse proposée dans ce rapport souhaite d'abord informer quant à l'évolution du nombre de publication sur « l'ADN environnemental de poisson » au cours du temps. Dans quels types d'habitats se focalisent les recherches ? Quelles en sont les objectifs ? Et quelles sont les nations les plus utilisatrice ?
Les recherches seront effectuées à partir des termes « *eDNA fishes* » ou « *environmental DNA fishes* », dans le champ de recherche « Topic », incluant uniquement le titre, le résumé, et les mots clés de chaque publication. Et cela au sein de trois milieux aquatiques distincts : la mer, l'estuaire et le fleuve. Pour cette recherche les mots clés utilisés ont été les suivants : « *Sea* », « *Ocean* », « *Estuar* » et « *River* », croisés avec les termes précédents. Enfin, l'ajout d'une troisième catégorie vient préciser les recherches afin de comparer les contraintes rencontrées sur des problématiques d'étude similaires. Ces termes sont les suivants : « *Rare species* », « *in danger* », « *Amphihaline* », « *Migrator* *fish* »». Sur cette base, l'analyse souhaite par la suite mettre en lumière les avantages et inconvénients de cette méthode qui vient bousculer l'utilisation de techniques d'échantillonnage plus classiques.

## 2.2 – Suivi en métabarcoding des frayères historiques d'Esturgeon européen (*A.sturio*)

A la suite des repeuplement effectués en 2007 dans l'estuaire de la Gironde, un retour vers les fleuves des premiers géniteurs est possible, en supposant des taux de survies satisfaisants. Au cours des années 2019, 2020 et 2021 la mise en place d'un protocole orienté vers la détection de juvéniles basé sur les techniques d'ADN environnemental (ADNe) en Garonne et en Dordogne a été préféré à la détection des géniteurs. Les avantages sont (1) d'identifier si une reproduction naturelle a eu lieu et de localiser le secteur des frayères potentiellement fréquentées, et (2) de maximiser les chances de détection de l'espèce car la durée de fréquentation des frayères par les géniteurs est méconnue et peu s'étaler sur plusieurs mois, le risque de manquer un géniteur au vu de leur rareté aurait donc été important.

Le but était également de caractériser le cortège d'espèces piscicoles présent au niveau des frayères historiques et notamment de détecter les espèces exotiques d'esturgeons présents en milieu naturel, potentiellement lié à des échappements accidentels, afin d'identifier les risques (hybridation, transmission de pathogènes, risque de confusion à la capture) à l'échelle du bassin versant (Acolas 2021).

C'est pourquoi la technique du métabarcoding a été choisie, suite à une étude préliminaire en 2018.
### 2.2.1 – Échantillonnage.

Les échantillonnages ont été réalisés à l'automne 2019, 2020 et 2021, sur les parties aval de la Garonne et de la Dordogne, par du personnel formé, suivant le protocole de prélèvement du bureau d'étude SPYGEN évitant tout risque de contamination. Concernant les points de prélèvements, il ont été définit autour des zones de frayères historiques de l'esturgeon européen (Jego et al. 2002), avec un site à l'amont et un site à l'aval de celles-ci, mais également au niveau des sites de suivis pêche électrique (PE) de l'OFB, dans le but de pouvoir comparer les résultats d'ADNe avec de ceux de la PE (Figure 2).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2** : Sites de prélèvement d'eau pour analyse de l'ADNe en 2019, 2020 et 2021. Localisation en fonction des frayères historiques d'A. sturio (figure modifiée par Acolas (2021) d'après Jego et al., (2002)).</figcaption></figure>
La distance entre 2 sites de prélèvements a été définie à partir de la littérature et d'échanges avec des spécialistes (Pont et al. 2018). En effet pour caractériser les frayères, des distances allant de 16 à 23 km ont été choisies (à l'exception des stations autour des points de pêches électriques de l'OFB), ce qui ne permet pas l'indépendance de 2 échantillonnages consécutifs (50 km conseillés pour de grands fleuves comme le Rhône (Pont et al. 2018)) mais qui maximise les chances de détections au vu de la rareté de l'espèce. Pour chaque site, deux réplicas ont été réalisés, dans la veine principale en 2019, puis en réalisant un transect en zigzag de berge à berge pour l'année 2020 et 2021 (Annexe 1), à la suite de récentes études en grand cours d'eau montrant que cette méthode maximisait les chances de détecter l'ensemble des espèces présentes.

Une fois le plan d'échantillonnage mis en place, les prélèvements ont pu être réalisés par le personnel qualifié. À pied ou en bateau, selon la profondeur des sites, et à l'aide d'une pompe électrique à main, la filtration dans une capsule adaptée a été réalisée pendant 30 min (Figure 3). À chaque réplica est associée une capsule d'échantillonnage, ainsi qu'un ensemble de paramètres physico-chimiques mesurés au moment du prélèvement : profondeur, vitesse du courant, température, oxygène, conductivité, salinité, pH, et turbidité.

À la suite de ces prélèvements, chaque capsule d'échantillon a été transmise au laboratoire d'analyse SPYGEN, afin qu'ils puissent extraire l'ADN présent sur les filtres et transmettre en retour une liste des espèces présentes, obtenue par méthode de métabarcoding.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3** : Prélèvement d'ADNe à l'aide d'une pompe (A) détail de la capsule de filtration (B) (Acolas 2021).</figcaption></figure>
## 2.2.2 – Méthodes analytiques en métabarcoding

Les résultats envoyés par SPYGEN à la suite des échantillonnages, nous donne les informations suivantes : « Nombre de réplicas positifs (/12) » et « Nombre de séquence ADN », pour chaque réplica et chaque espèce. C'est donc à partir de ces informations que les analyses de biodiversité ont pu être effectué. En parallèle des données d'ADNe, l'OFB nous a fourni les données acquises au cours de pêches électriques effectuées en 2019 sur le site « Garonne à Couthures », et en 2020 sur les sites « Garonne à Couthures » et « Dordogne à Pessac ». Dans le cas de la pêche électrique les informations récoltées sont plus précises, avec notamment : l'effectif, le poids et la densité pondérale et numérique par hectare pour chaque espèce.

L'acquisition de cet ensemble de données permet de traiter les objectifs ii, iii, et iv.

⇒ ii) Identifier les espèces présentes au niveau des frayères historiques de l'Esturgeon européen (Acipenser sturio) :

Cette analyse s'initie par le calcul de diversité alpha : regroupant la richesse spécifique (S) et l'indice de Shanon (H') (Saud, Khan, et Khan 1984) (Annex 2). Dans la littérature aucune corrélation n'a été démontrée quant au lien entre données acquises par PE et celles obtenues par ADNe. En l'état, les informations données par SPYGEN révèlent uniquement la présence ou l'absence des espèces. Ces indices ont été calculés pour l'ensemble des prélèvements de la Dordogne et Garonne et sur les 3 années, à l'aide du logiciel de programmation R-Studio, du package « *Vegan Community Ecology* » et des fonctions respectives « *specnumber* » et « *diversity* ».

Suite à cela, des courbes de nombre d'espèces cumulées ont été estimés pour chaque année et l'ensemble des années. L'objectif étant de déterminer si le nombre d'échantillon donne une bonne représentativité du cortège d'espèce présent, par l'atteinte d'un plateau. Dans le cas contraire le nombre de prélèvements pourrait être à redéfinir. Les courbes cumulatives ont été réalisées sur l'ensemble des espèces et générées par la fonction « *Speccacum* » utilisant R-Studio et le package « *Vegan Community Ecology* ». L'ajout au script de la fonction « *specpool* » permet une obtention de valeurs d'extrapolations à ces courbes, quant au nombre d'espèce non observées par rapport au nombre de sites échantillonnés. Et ce, selon 4 méthodes : Chao, Jack1, Jack2 et Boot.
Enfin, les données récoltées nous permettent de comparer les peuplements piscicoles d'un fleuve à l'autre au cours des années, en y intégrant les paramètres physico-chimiques retrouvé sur site. Pour ce faire, une Analyse en Composante Principale (ACP) par année a été réalisée, dans le but de définir si les sites présents en Dordogne sont différents de ceux présents en Garonne, selon les paramètres physico-chimique suivant : Vitesse du courant, pH, Turbidité, Température, Oxygène dissout, Conductivité et Profondeur. Par la suite, et afin de comparer les cortèges piscicoles selon les fleuves et leurs sites, une Analyse Factorielle des Correspondances (AFC) a été effectué sous le logiciel R-Studio et à l'aide du package « *Factoshiny* ». Pour plus de facilité d'interprétation, les AFCs ont été réalisé à partir d'un regroupement des espèces (Annexe 3) et non de façon unitaire.

⇒ iii) <u>Comparable les sites amont/aval des fleuves de la Dordogne et de la Garonne.</u>

La comparaison des sites amont/aval de la Dordogne et de la Garonne est possible grâce
au calcul de la diversité beta. Cette diversité peut être exprimée par plusieurs indices. Celui qui
a été choisi ici est l'indice de Jacquard (I) (McCormick, Lyons, et Hutcheson 1992), qui
convient davantage aux informations acquises. En effet, cet indice attribue une valeur de
dissimilarité lorsque l'on compare deux sites ensemble, par conséquent il permet de définir la
similitude des espèces entre deux sites. De plus, celui-ci se trouve être plus approprié aux
valeurs de présences/absences. La formule est la suivante :

$$
I = \frac{N_c}{(N1 + N2 - N_c)}
$$

Nc est le nombre de taxons communs aux stations 1 et 2.

N1 et N2 sont le nombre de taxons présents respectivement aux stations 1 et 2

L'indice de Jaccard a été calculé grâce au logiciel R-Studio, en utilisant la fonction « *Vegdist* » du package « *Vegan Community Ecology* », et la méthode « *Jaccard* ». L'objectif ici est de définir si l'on peut observer un gradient amont/aval quant à la similitude des espèces présentes le long de la Dordogne et de la Garonne. Dans le but de pouvoir également comparer les fleuves entre eux, la distance entre chaque site avec l'embouchure où les deux fleuves se rejoignent pour former l'estuaire de la Gironde (le Bec d'Ambès) a été mesurée sous logiciel de cartographie QGIS.
⇒ iv) Comparer les deux méthodes de détections utilisées (PE & ADNe).

Le dernier point d'étude souhaite comparer les deux méthodes de détection afin de définir dans un premier temps si l'on observe des cortèges piscicoles similaires avec les méthodes utilisées. Cette comparaison a été réalisée selon la méthode précédente, utilisant l'indice de Jaccard. Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la possibilité de corrélation entre les informations obtenues des données de pêche électrique et celles obtenues par ADNe.

Pour cela, après avoir vérifié la significativité des résultats par un test de Wilcoxon-Man-Withney, des tests de corrélation de Pearson ont été effectués entre le pourcentage de séquence ADN, et le pourcentage de densité pondérale, le pourcentage d'effectif et le pourcentage de poids par espèces.

## 2.3 – Développement d'une nouvelle méthode de détection rapide in situ de l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*)

En parallèle des analyses réalisées avec le bureau d'étude SPYGEN, mon stage s'intègre au projet AGIS (Analyses Génétiques In Situ), porté par la Plateforme Génome Transcriptome de Bordeaux (PGTB) adossée à l'UMR BIOGECO. L'objectif ici est de mettre en place des outils d'analyse génomique, qui habituellement sont mis en œuvre en laboratoire, pour des applications directes sur le terrain. Ce type d'analyses *in situ* s'avérerait intéressant pour identifier rapidement les secteurs colonisés en eau douce par l'esturgeon européen, par exemple au cours de la migration des géniteurs ou de la dévalaison des juvéniles.

Cet usage émergent nécessite une phase de test avec différentes technologies et différents modèles d'étude, qui permettraient *in fine* d'avoir un résultat quasi en direct de la présence ou de l'absence de l'espèce recherchée. Ce projet aurait pour avantage de limiter les délais d'analyses SPYGEN en laboratoire, habituellement d'une durée d'environ 3 mois. L'objectif au cours de ce stage a donc été de tester différents kits d'extraction d'ADN dans le but d'expérimenter la détection *in situ* avec la méthode préalablement validée.
### 2.3.1 – Recherche des amorces et échantillonnage

Cette méthode de détection *in situ*, détecte uniquement l'espèce recherchée et non tout le cortège piscicole. Par conséquent des amorces spécifiques à l'espèce d'intérêt ont été mises au point en 2020. La recherche de ces amorces spécifique à *A. sturio* a été réalisé selon deux protocole d'amplification. Une amplification par la méthode qPCR et une amplification par la méthode LAMP, tous deux réalisés sur les gènes : NADH5, CytB et COI. Une fois les amorces définies, un système de filtration (Smith-Rooth) a été testé en milieu naturel à l'aval du rejet de la station d'expérimentation de Saint-Seurin-sur-l'Isle, où le stock captif est maintenu (Acolas 2021). Un total de 8 volumes d'eau a été prélevé puis laisser sédimenter afin d'éviter tout problème de colmatage lors de la filtration. Les filtrations ont pu par la suite être effectuées, où différents volumes d'eau ont été prélevés avec deux tailles de pores de filtre (Figure 4).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4 :** Filtration (Smith-Rooth) après sédimentation (A), Schéma des prélèvements ainsi que des volumes et des tailles de pores associées (B).</figcaption></figure>

### 2.3.2 – Mise en place de tests de détection rapide.

La dernière étape consiste en l'extraction de l'ADNe présent sur les filtres, selon différents protocoles, et suivi de plusieurs méthodes d'amplification dans le but de sélectionner la technique la plus efficace. Un total de 3 kits d'extraction a été utilisé sur l'ensemble des échantillons : *Qiagen B&T*, *Qiagen PowerWater* et *Biomeme*. Ces kits ont été sélectionnés selon l'évolution des résultats, du fait de leur différente précision. Une fois les extractions d'ADN effectuées, leurs amplifications ont été réalisés à l'aide d'une qPCR portative *Biomeme*, utilisable sur le terrain. Les quantités d'ADN ont également été modifié au cours de la manipulation, selon les premiers résultats. Chaque prélèvement a également été amplifié par ddPCR afin de s'assurer de l'absence d'ADN, (Tableau 1). L'ensemble des protocoles d'extraction de chaque kit est disponible en annexe 4.
<table><caption>**Tableau 1 :** Récapitulatif des Kit d'extraction et des méthodes d'amplifications utilisées pour chaque prélèvement.</caption><thead><tr><th>Prélèvement et quantité d'ADN utilisé</th><th>Kit d'extraction</th><th>Méthode d'amplification</th></tr></thead><tbody><tr><td>T1 (1µL)</td><td>Qiagen B&T + Biomeme</td><td>qPCR portative + ddPCR</td></tr><tr><td>T2 (2µL)</td><td>Qiagen B&T</td><td>qPCR portative + ddPCR</td></tr><tr><td>T3 (1µL)</td><td>Qiagen B&T + Biomeme</td><td>qPCR portative + ddPCR</td></tr><tr><td>T4 (2µL)</td><td>Qiagen B&T</td><td>qPCR portative + ddPCR</td></tr><tr><td>T5 (2µL)</td><td>Qiagen B&T</td><td>qPCR portative + ddPCR</td></tr><tr><td>T6 (2µL)</td><td>Qiagen B&T</td><td>qPCR portative + ddPCR</td></tr><tr><td>T7 (1µL & 5µL)</td><td>Qiagen PowerWater</td><td>qPCR portative</td></tr><tr><td>T8 (1µL & 5µL)</td><td>Qiagen PowerWater</td><td>qPCR portative</td></tr></tbody></table>

# III – RÉSULTATS

## 3.1 – Étude bibliographique.

La synthèse proposée dans ce rapport confirme le nombre croissant de publication liées à l'ADNe de poisson avec une multiplication par 3.5 en 10 ans (Figure 5). Ces publications se focalisent sur deux principaux types d'habitats, à savoir le milieu dulcicole et le milieu marin. Seul 6% d'entre elles se concentre sur l'utilisation d'ADNe en milieu saumâtre ou à forte turbidité (Figure 6a).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 5 :** Nombre de publication par an, entre 2010 et 2021, contenant les termes "eDNA fishes" ou "environmental DNA fishes" (n=2095). Source : Web of science. Résultats obtenus par l'utilisation de "Topic" incluant uniquement le titre, le résumé, et les mots clés de la publication dans son champ de recherche.</figcaption></figure>
Leurs objectifs quant à eux, se concentrent principalement sur le **monitoring** des espèces rattachées à un bassin ou sous bassin versant, mais également sur l'évaluation de la biodiversité au sein d'un milieu, en la comparant notamment à des techniques d'échantillonnage dites plus traditionnelles. La publication d'articles utilisant l'ADNe comme moyen de détection des espèces rares ou en dangers, regroupe seulement 8% des objectifs, dont 10 publications concernent les espèces d'esturgeons, sans qu'aucune d'entre elles ne concerne *A. sturio* (**Figure 6b**). Concernant la répartition géographique de ces études ADNe poisson, l'Amérique du Nord arrive en première position en termes de nombre de publications, suivie par l'Europe, l'Asie et l'Australie (**Annexe 5**).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 6 :** Types d'habitats (a) et objectifs (b)</figcaption></figure>

### 3.1.1 - Avantages et inconvénients de l'ADN environnemental (ADNe).

L'utilisation d'ADNe génère un certain nombre d'avantages et inconvénients. Communs à l'ensemble des milieux aquatiques les avantages de cette méthode sont obtenus en comparaison des méthodes traditionnelles avec lesquelles ils partagent des objectifs similaires. C'est le cas de la pêche électrique, qui dans certains cas va bénéficier de l'ADNe comme soutien, au vu de la morphologie du cours d'eau, permettant de couvrir une surface d'étude plus importante en un temps plus court (Meulenbroek et al. 2022), ou de la rareté des espèces recherchés, car plus sensible et plus rapide (Olds et al. 2016). Ce qui vient souligner son fort intérêt pour la détection d'espèces rares, en dangers ou insaisissables (Sigsgaard et al. 2015).
Par conséquent, ce gain de temps est aussi un gain en termes de coût, car bien que l'analyse moléculaire représente un coût dans l'identification des espèces, l'utilisation d'ADNe réduit nettement les dépenses liées au temps et à la logistique nécessaire des techniques plus traditionnelles. Enfin, l'ADNe est un outil non-invasif pour les espèces étudiées en comparaison par exemple à la pêche électrique et du chalut utilisée pour les mêmes objectifs, implique une manipulation des individus (Snyder 2003).

Malgré son fort intérêt, l'ADNe possède certaines limites de détections. En effet, ses résultats nous informent uniquement sur la présence ou l'absence des espèces, mais en rien sur le stade de vie des organismes ainsi que leur abondance absolue. De plus, sa détection peut-être biaisée par l'apport originel de l'ADNe et la présence de faux positifs : eaux usées, décomposition d'un individu, ou encore, proies ingérées (Pont et al. 2018).

Il faut donc être vigilant quant à la possible détection d'espèce, car la présence d'un ADN ne signifie pas toujours la présence de l'organisme correspondant, en vie. De plus, les travaux de (Dejean et al. 2011), nous montrent que la détectabilité de l'ADN décroit au fil du temps avec une persistance inférieure à un mois. Il est donc important de prendre en compte le cycle de vie des espèces ciblées afin de se rapprocher au maximum de la date de leurs dernières apparitions dans le milieu, et d'assurer une détectabilité. Au-delà de la technique, le protocole d'échantillonnage est donc primordial.

Dans le cas d'espèces rares et donc d'ADNe rares, l'utilisation de marqueurs spécifiques est également nécessaire (Olds et al. 2016). Cependant, il faut être vigilant sur l'exactitude de ces marqueurs, car le risque serait d'entrainer une augmentation de la présence de faux positifs due à des erreurs de séquençages (i.e. mistagging), mais également de faux négatifs, initié par un ADN trop dégradé ou la présence d'une couverture taxonomique, c.a.d. la non distinction entre deux espèces génétiquement proches (Corse et al. 2017). Bien que la plupart des inconvénients mentionnés ci-dessus soient communs à l'ensemble des milieux aquatiques, il existe des particularités en fonction du milieu étudié.
### 3.1.2 - Persistance de l'ADNe selon les milieux.

⇒ *Persistance de l'ADNe en milieu dulcicole.*

L'ADNe nécessite d'être prélevé lors d'un échantillonnage du milieu par filtration, parfois précédé d'un temps de précipitation de la matière organique afin d'éviter le colmatage. Par filtration, les volumes d'eau prélevés doivent être suffisamment représentatifs du volume d'eau présent initialement dans le milieu. Par conséquent, dans le cas des fleuves et rivières, les volumes d'eau filtrés sont généralement compris entre 10 et 100 litres en fonction des études. Par conséquent de la quantité de matières organiques en suspension les pores des filtres utilisés doivent être adaptés afin d'éviter un colmatage.

Cela vient s'ajouter à l'inconvénient initial des eaux turbides, qui dans certains travaux comme ceux réalisés en laboratoire par (Stoeckle et al. 2017), montrent que pour des organismes et des échantillons originaires du *Danube*, la présence de fin sédiment impacte négativement le succès de détection de l'ADNe. Le sédiment aurait tendance à se lier à l'ADNe libre dans la colonne d'eau, et entrainerait celui-ci vers le fond par phénomène de précipitation.

Le point intéressant de cet inconvénient, serait qu'une fois retenu par le sédiment, la durée de vie de l'ADNe s'allonge considérablement, avec des observations de préservation allant jusqu'à 132 jours, comme après le retrait d'*Hypophthalmichthys nobilis* de son écosystème (Turner, Uy, et Everhart 2015).

Les courants d'écoulements vont également venir créer des interférences quant à la détection de l'ADNe, transportant celui-ci en dehors des zones d'études, et auquel s'ajoute un effet de dilution. Quarante-huit heure après le passage d'un individu le pourcentage de présence d'ADNe diminue de plus de 50% en présence de courant, allant jusqu'à disparaitre avec l'addition de sédiment (Stoeckle et al. 2017), notamment montrer par un effet inhibiteur des sédiments siliceux. Cette même étude confirme également de précédents travaux (Kreader 1996) quant aux effets inhibiteurs de l'humus environnemental, mais également d'algues, dont certaines substances (acide humique, polysaccharides, phénols) pourraient interférées avec la réaction PCR (Schrader et al. 2012). C'est aussi le cas de l'activité bactérienne et fongique (Shapiro 2008). Leurs identifications sont donc essentielles afin d'éviter la présence de faux négatif au sein des résultats.
D'autres facteurs abiotiques vont venir nuire à la détection d'ADNe. Des températures plus chaudes peuvent augmenter le risque de dégradation de l'ADNe, en favorisant l'activité enzymatique et bactérienne (Dejean et al. 2011). A l'inverse certaines études confirment que la température élevée engendre une plus forte dégradation de l'ADNe sans que ces résultats ne soient corrélés à une activité bactérienne plus élevée (Tsuji, Yamanaka, et Minamoto 2017). Seul l'effet physique qu'engendre la température pourrait nuire à la conservation de l'ADNe. Dégradation physique également provoquer par la pénétration des UV dans l'eau, dépendamment de la turbidité de celle-ci. Enfin, le pH, qu'il soit acide, neutre, ou alcalin, n'a pas d'impact significatif sur la dégradation de l'ADNe. Cependant, combiné à d'autres facteurs, comme une forte température (>20°C), et la présence d'UV modéré, un pH neutre ou légèrement acide peut développer l'activité microbienne présente et engendrer une dégradation significative (Strickler, Fremier, et Goldberg 2015).

Dans ces milieux, les études insistent donc sur l'importance de prendre en compte les potentiels transports verticaux et horizontaux, mais également les effets de dilutions, de rétentions, d'inhibitions ou encore de dégradations, présents lors d'analyses de détection d'ADNe.

⇒ **Persistance de l'ADNe en milieu océanique :**

L'utilisation de l'ADNe en milieu marin peut représenter un défi plus important que dans les milieux d'eau douce. Le phénomène de dilution est plus élevé ; le mélange des volumes d'eau est donc plus conséquent, du fait d'une colonne d'eau plus grande, qui subit à la fois les effets des forts courants, mais également des marées et des vagues. Ces difficultés physiques sont donc généralement contrées par un volume de filtration plus important et avec une augmentation des réplicas et des zones d'échantillonnages. Là aussi, dans le cas de détection d'espèces rares la connaissance de la biologie de l'espèce est importante et permettra d'adapter les zones de prélèvement du milieu en conséquence. Par exemple, les prélèvements réalisés pour détecter la présence du calamar géant ont été réalisés dans la colonne d'eau entre 0 et 100 mètre de profondeur, à l'aide de bouteilles Niskin (Wada et al. 2020), alors que pour la raie benthique *Zearaja maugeana*, en danger et endémique de la Tasmanie, les prélèvements ont eu lieu entre 10 et 15 mètre de profondeur dans le compartiment benthique (Weltz et al. 2017).
S'ajoute à ces contraintes physiques, des contraintes chimiques, avec notamment la salinité qui va rendre la conservation et l'amplification de l'ADNe plus délicate. En effet la salinité sera davantage propice à une inhibition de l'ADNe au cours de la PCR (Wilson 1997). Pour éviter cela, une étude sur la surveillance génétique des mammifères marins menée par (Foote et al. 2012), propose une étape de lavage à l'Éthanol lors du processus d'extraction, dans le but d'éliminer la plupart des ions monovalents NA+ et donc réduire l'inhibition de la PCR liée à la salinité.

Enfin l'étude sur la persistance de l'ADNe en milieux marins, proposée par (Collins et al. 2018), démontre une plus forte dégradation (x1.6) de l'ADNe en zone côtière influencée par l'environnement et les pollutions terrestres, que dans la zone au large, sans pour autant d'effet significatif entre la saison hivernal et estival.

⇒ **Persistance de l'ADNe en milieu estuarien :**

La persistance de l'ADNe est peu référencée pour les milieux estuariens, mais se trouvant entre milieux marins et milieux dulcicole, ces écosystèmes possèdent un grand nombre de biais communs avec les milieux voisins.

En effet, comme dans les cours d'eau en amont, les estuaires vont être impactés par la turbidité et ce à un niveau plus élevé, avec parfois la présence d'un bouchon vaseux (comme dans le cas de la Gironde), qui va décroitre et nuire à la probabilité de détection de l'ADNe (Piggott et al. 2021).

En plus des courants amont/aval, les estuaires vont subir les effets de la marée, pouvant inverser le courant, vers une direction aval/amont cette fois-ci. Cet effet va créer un brassage de la turbidité mais également de l'ADN présent dans le milieu perturbant le lien entre la zone de présence de l'individu et la zone de détection de son ADN. Il est donc important de tenir compte de ce gradient lors dans l'échantillonnage de sites se trouvant dans la zone de marée dynamique. A cela, s'ajoute la présence d'un gradient de salinité dû à sa proximité avec le milieu marin, dont les effets inhibiteurs sur l'ADN sont connus (Wilson 1997).

Enfin, l'importante surface des estuaires, va engendrer un effet de largeur et donc un possible transport latéral, à prendre en compte dans le plan d'échantillonnage.
<table><caption>**Tableau 2 :** Liste subjective des avantages et inconvénients de l'utilisation de l'ADNe en milieu aquatique. (++) Fort, (+) Moyen, (-) Faible, (0) Nul, (/) Pas de données.</caption><thead><tr><th>Avantages</th><th>Inconvénients</th><th>Fleuve</th><th>Estuaire</th><th>Mer</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>Température</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td></td><td>Turbidité</td><td>+</td><td>++</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td>Salinité</td><td>0</td><td>+</td><td>++</td></tr><tr><td></td><td>UV</td><td>-</td><td>/</td><td>+</td></tr><tr><td></td><td>pH</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Coût</td><td></td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Logistique</td><td></td><td>-</td><td>-</td><td>+</td></tr><tr><td></td><td>Transport latéral</td><td>/</td><td>++</td><td>/</td></tr><tr><td></td><td>Transport linéaire</td><td>++</td><td>++</td><td>/</td></tr><tr><td></td><td>Transport vertical</td><td>+</td><td>++</td><td>/</td></tr><tr><td>Temps d'échantillonnage</td><td></td><td>-</td><td>-</td><td>+</td></tr><tr><td>Impact sur les individus</td><td></td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td></td><td>Humus</td><td>++</td><td>+</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td>Algues</td><td>++</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td></td><td>Sédiment</td><td>++</td><td>++</td><td>/</td></tr></tbody></table>

## 3.2 – Analyse du suivi en métabarcoding des frayères historiques de l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*)

### 3.2.1 – Analyse de la richesse spécifique

Les résultats envoyés par SPYGEN correspondent à une base de données incluant un cortège de 44 espèces en 2019 (annexe 6), 52 en 2020 (annexe 7) et de nouveau 44 en 2021 (annexe 8). Aucun individu du genre *Acipenser*, n'a été détecté durant les trois années sur l'ensemble des sites. Certaines espèces dites « improbables » ont été retirées de ces listes car leur présence n'est pas supposée naturelle et dû à des importations humaines (égouts, résidu de repas, usine, etc.), c'est le cas de : *Oncorhynchus mikyss* (La Truite arc-en-ciel), *Salmo salar* (Le Saumon de l'Atlantique), *Scomber sp* (Le Maquereau), *Merlucius merluscius* (Le Merlu), *Isotiophorus albicans* (Le Voilier) et *Mugil cephalus* et *auratus*, respectivement (Le Mulet cabot et le Mulet doré). La famille la plus représenté est celle des Cypriniforme avec 20 espèces réparties sur les 3 années (ex : Chevesne, Gardon, Bouvière), de plus la présence d'autres migrateurs a pu être détectée comme celle de l'Anguille européenne ou de l'Alose feinte.
Les 10 espèces avec un nombre élevé de réplicas positifs et de séquence ADN, qui ont le plus tendance à caractériser les cortèges piscicoles autour des zones de frayères sont : l'Ablette (Alburnus alburnus), le Barbeau fluviatile (Barbus barbus), la Carpe commune (Cyprinus carpio), le Goujon (Gobio sp), la Grémille (Gymnocephalus cernus), la Perche soleil (Lepomis gibbosus), la Bouvière (Rhodeus amarus), le Gardon (Rutilus rutilus), le Sandre (Sander lucioperca) et le Silure (Silurus glanis).

La première exploitation des données brutes, nous informe sur la richesse spécifique (S) et l'indice de Shannon (H') de chaque site pour chaque année (Tableau 3). Ces valeurs montrent les sites de 2020 et 2021 comme ayant un indice de diversité alpha élevé, avec un nombre d'espèce compris entre 20 et 31 selon les sites, et surtout un indice de Shannon haut, comprenant des valeurs entre 4 et 5. L'année 2019, est quant à elle plus hétérogène avec une richesse spécifique moins élevée que les années suivantes, et des indices de Shannon inférieurs, notamment pour les sites en aval des fleuves (ex : Viole, Garonne : H'=2.58 ; Libourne-Le Galet, Dordogne H'=1.58) dont l'échantillonnage n'a pas été poursuivi par la suite car considéré comme non fiable.

<table><caption>Tableau 3 : Résultats de la diversité alpha pour chaque site selon les années. (S) Richesse spécifique, (H') Indice de Shannon.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Fleuve</th><th rowspan="2">Site</th><th colspan="2">Année 2019</th><th colspan="2">2020</th><th colspan="2">2021</th></tr><tr><th>S</th><th>H'</th><th>S</th><th>H'</th><th>S</th><th>H'</th></tr></thead><tbody><tr><td>Garonne</td><td>Agen</td><td>18,0</td><td>4,17</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Port Saint-Marie</td><td>14,0</td><td>3,81</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Tonneins</td><td>18,0</td><td>4,17</td><td>28,0</td><td>4,81</td><td>24,0</td><td>4,58</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Caumont</td><td>13,0</td><td>3,70</td><td>20,0</td><td>4,32</td><td>21,0</td><td>4,39</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Couthure Amont</td><td>16,0</td><td>4,00</td><td>25,0</td><td>4,64</td><td>27,0</td><td>4,75</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Couthure Aval</td><td>17,0</td><td>4,09</td><td>25,0</td><td>4,64</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Meilhan</td><td>14,0</td><td>3,81</td><td>23,0</td><td>4,52</td><td>26,0</td><td>4,70</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Caudrots</td><td>22,0</td><td>4,46</td><td>24,0</td><td>4,58</td><td>27,0</td><td>4,75</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Beautiran</td><td>8,00</td><td>3,00</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>Viole</td><td>6,00</td><td>2,58</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>Bergerac</td><td>27,0</td><td>4,75</td><td>30,0</td><td>4,91</td><td>31,0</td><td>4,95</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>Le Fleix</td><td>25,0</td><td>4,64</td><td>29,0</td><td>4,86</td><td>26,0</td><td>4,70</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>Pessac/Dordogne Amont</td><td>25,0</td><td>4,64</td><td>28,0</td><td>4,81</td><td>26,0</td><td>4,70</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>Pessac/Dordogne Aval</td><td>22,0</td><td>4,46</td><td>24,0</td><td>4,58</td><td>25,0</td><td>4,64</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>Ste Terre</td><td>16,0</td><td>4,00</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>Libourne - Le Galet</td><td>3,00</td><td>1,58</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>St Pardon</td><td>9,00</td><td>3,17</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Isle</td><td>St Seurin/L'Isle</td><td>-</td><td>-</td><td>27,0</td><td>4,75</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>
Les courbes d'espèces cumulées présentent ci-dessous (Figure 7), nous dévoilent dans un premier temps que les espèces présentes dans les eaux de la Dordogne sont un peu plus nombreuses comparativement à ceux de la Garonne. D'un point de vue annuel (Annexe 9), l'atteinte d'un plateau n'est pas observable même si on peut constater une légère tendance ; tendance davantage observable lors de la mise en commun des trois années, avec un plateau se dessinant autour de 42 espèces pour la Garonne et 45 pour la Dordogne.

Les valeurs d'extrapolations (Annexe 10) confirment la mise en place d'un plateau autour de ces grandeurs avec des variations selon les méthodes utilisées.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 7** : Courbe d'accumulation du nombre d'espèce en fonction du nombre de site de prélèvement.</figcaption></figure>

Les cartes (Annexe 11) correspondent à un bilan de l'analyse effectuée sur la richesse spécifique de chaque site. Elles permettent de constater la présence non systématique, mais visible sur plusieurs séries de site, d'un gradient de cette richesse spécifique évoluant de façon croissant de l'aval vers l'amont de la Dordogne et de la Garonne.

Les ACPs effectué en 2019, 2020 et 2021 ne révèle aucun site singulier. Pour l'année 2019 et 2020 (Annexe 12.1 et 12.2) deux premiers axes de l'analyse expriment respectivement 53.85% et 55.5% de l'inertie totale du jeu de donnée.
Cependant l'inertie observé sur le premier est inférieure à la valeur de référence<fnref n="3" /> étant respectivement 58.35% et 68.72%, et donc faible en comparaison. Par conséquent la variabilité entre les deux fleuves, exprimé par cette analyse, n'est pas significative. Le test de Wilks indique un p-value respective de 0.12 et 0.26. En 2021 les deux premiers axes expriment 82.19% de l'inertie total du jeu de donnée (Annexe 12.3). C'est un pourcentage élevé dont le premier plan représente bien la variabilité, et dont la valeur est supérieure à la valeur de référence (74.21%). La variabilité entre les fleuves, expliqué par ce plan est très significative, avec un p-value = 0.005 selon le test de Wilks. Les 3 paramètres environnementaux contribuant le plus à variabilité durant cette année sont : la turbidité, la conductivité et la température, et permettent de séparer les deux fleuves.

Les deux premiers axes de l'analyse AFC de 2019 (Annexe 13.1), expriment 92.12% de l'inertie total du jeu de données, nettement supérieur à la valeur de référence de 71.6%, la variabilité expliquée par ce plan est donc hautement significative. La dimension 1 oppose le site St Pardon (aval de la Dordogne) qui partage une forte fréquence avec les familles Clupéiformes et Siluriformes, aux sites Caudrots, Ste Terre et Agen, qui eux partagent une forte fréquence avec la famille des Cypriniformes.

En 2020, 78.1% de l'inertie total du jeu de donnée est résumé par les deux premières dimensions de l'AFC (Annexe 13.2). La dimension 2 une légère fréquence de partage entre le site de Bergerac et la famille des Cyprinidontiformes. La dimension une, est quant à elle fortement représentée par la famille des Carnassiers et des Pleuronectiforme. Enfin en 2021 (Annexe 13.3), les deux premières dimensions expriment 82.02% de l'analyse, inférieur à la valeur de référence (89.1%). La variabilité exprimée par l'analyse n'est donc pas significative. La dimension 1 oppose les sites Pessac/Dordogne amont et aval et Le Fleix (Dordogne) qui partage une forte fréquence pour la famille des Cypriniformes, aux sites Caumont, Couthure amont et Tonneins (Garonne amont) qui partagent une faible fréquence avec la famille des Pleuronectiformes et Carnassiers. Les milieux et peuplement sont donc sensiblement différents cette année-là.

<footnote n="3">³ Quantile 0.95 de la distribution des pourcentages d'inertie obtenue en simulant un certain nombre de jeux de données aléatoires de dimension comparable sur la base d'une distribution uniforme.</footnote>
### 3.2.2 – Comparaison des sites amont/aval et des fleuves Dordogne/Garonne.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 8** : Comparaison de la diversité beta par la méthode de Jaccard pour les sites de la Garonne (A), de la Dordogne (B), et entre les fleuves (C) sur l'année 2019. En bleu, la distance depuis le bec d'Ambès. Les sites sont ordonnés de l'amont vers l'aval de bas en haut pour l'axe des y et de gauche à droite pour celui des x.</figcaption></figure>

Les résultats de 2019 (Figure 8) dévoilent la présence d'un gradient de similitude vis-à-vis des cortèges d'espèces que l'on retrouve pour chaque fleuve (A et B). Il s'agit ici d'un gradient aval/amont. En effet l'indice de Jaccard révèle une forte dissimilarité entre les sites prélevés en aval et ceux prélevés en amont de chaque fleuve. De plus il est observable que les sites voisins en aval on des cortèges d'espèce similaire avec des valeurs inférieures à 0.4, ce qui n'est pas le cas pour les sites voisins en amont ou les valeurs de dissimilarité sont supérieurs à 0.6. Enfin, si l'on compare les sites Dordogne et Garonne en fonction de leur distance au Bec d'Ambès (C), une dissimilarité élevée entre les sites en aval et plus réduite pour ceux en amont est constatable.

Pour les années 2020 (Figure 9) et 2021 (Figure 10), les résultats obtenus sont semblables entre eux. On retrouve ce gradient aval/amont (A) et (B) à une échelle plus réduite mais cette fois-ci la dissimilarité des cortèges piscicoles est plus forte pour les site voisins aval que ceux en amont, bien que les valeurs soient nettement plus faibles qu'en 2019 et inférieure à 0.5. Les résultats inter-fleuves sont plus homogène et sans présence de gradient, mais en cohérence avec les résultats de 2019 au vu de leur localisation.
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 9** : Comparaison de la diversité beta par la méthode de Jaccard pour les sites de la Garonne (A), de la Dordogne (B), et entre les fleuves (C) sur l'année 2020. En bleu, la distance depuis le bec d'Ambès. Les sites sont ordonnés de l'amont vers l'aval de bas en haut pour l'axe des y et de gauche à droite pour celui des x.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 10** : Comparaison de la diversité beta par la méthode de Jaccard pour les sites de la Garonne (A), de la Dordogne (B), et entre les fleuves (C) sur l'année 2021. En bleu, la distance depuis le bec d'Ambès. Les sites sont ordonnés de l'amont vers l'aval de bas en haut pour l'axe des y et de gauche à droite pour celui des x.</figcaption></figure>

### 3.2.3 – Comparaison des méthodes de détection par pêche électrique et échantillonnage ADNe.

Dans un premier temps une étude comparative de la diversité beta utilisant comme précédemment l'indice de Jaccard, a été effectuée entre les captures de pêche électrique (PE) et les données d'ADNe (Tableau 4). Les résultats montrent une bonne similitude entre les cortèges piscicoles ADNe et PE pour l'année 2019 sur les deux sites, avec des indices de dissimilarité inférieur à 0.4. Concernant l'année 2020 et le site « Couthure » la dissimilarité est en moyenne 0.5, ce qui signifie que la moitié du cortège présent en PE n'est pas détecté en ADNe (Annexe 14, 15 et 16).
<table><caption>**Tableau 4 :** Comparaison de la diversité beta entre les sites ADNe et PE, illustré par l'indice de Jaccard.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Site</th><th colspan="2">2019</th><th colspan="2">2020</th></tr><tr><th>Couthure PE</th><th>Dordogne à Pessac PE</th><th>Couthure PE</th><th>Dordogne à Pessac PE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Couthure Amont ADNe</td><td>0,35</td><td>-</td><td>0,58</td><td>-</td></tr><tr><td>Couthure Aval ADNe</td><td>0,39</td><td>-</td><td>0,45</td><td>-</td></tr><tr><td>Dordogne à Pessac Amont ADNe</td><td>-</td><td>0,37</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dordogne à Pessac Aval ADNe</td><td>-</td><td>0,36</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Par la suite, les tests de Pearson (Tableau 5) ont montré pour nos valeurs une corrélation positive entre le pourcentage de séquence ADNe et le pourcentage des effectifs obtenus par PE. Des diagrammes en bâtons illustrent ces deux informations afin d'avoir une idée de la proportion des espèces en fonction de la méthode d'échantillonnage et de la localisation du prélèvement ADNe (Annexe 17).

<table><caption>**Tableau 5 :** Valeurs de p-value pour les tests de Wilcoxon-Man-Withney et Pearson. En vert les valeurs significatives et en rouge les valeurs non significatives.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Garonne à Couthure<br>2019</th><th colspan="2">% Densité pondérale</th><th colspan="2">% Effectif</th><th colspan="2">% Poids</th></tr><tr><th>WMW</th><th>Pearson</th><th>WMW</th><th>Pearson</th><th>WMW</th><th>Pearson</th></tr></thead><tbody><tr><td>% Sequence ADN amont</td><td>0,36</td><td>0,15</td><td>0,38</td><td>0,68</td><td>0,31</td><td>0,15</td></tr><tr><td>% Sequence ADN aval</td><td>0,25</td><td>0,13</td><td>0,28</td><td>0,71</td><td>0,21</td><td>0,13</td></tr></tbody><thead><tr><th rowspan="2">Dordogne à Pessac<br>2019</th><th colspan="2">% Densité pondérale</th><th colspan="2">% Effectif</th><th colspan="2">% Poids</th></tr><tr><th>WMW</th><th>Pearson</th><th>WMW</th><th>Pearson</th><th>WMW</th><th>Pearson</th></tr></thead><tbody><tr><td>% Sequence ADN amont</td><td>0,28</td><td>0,17</td><td>0,43</td><td>0,83</td><td>0,08</td><td>0,17</td></tr><tr><td>% Sequence ADN aval</td><td>0,54</td><td>0,14</td><td>0,80</td><td>0,80</td><td>0,21</td><td>0,14</td></tr></tbody><thead><tr><th rowspan="2">Garonne à Couthure<br>2020</th><th colspan="2">% Densité pondérale</th><th colspan="2">% Effectif</th><th colspan="2">% Poids</th></tr><tr><th>WMW</th><th>Pearson</th><th>WMW</th><th>Pearson</th><th>WMW</th><th>Pearson</th></tr></thead><tbody><tr><td>% Sequence ADN amont</td><td>0,02</td><td>0,35</td><td>0,03</td><td>0,58</td><td>0,01</td><td>0,35</td></tr><tr><td>% Sequence ADN aval</td><td>0,15</td><td>0,32</td><td>0,19</td><td>0,64</td><td>0,10</td><td>0,32</td></tr></tbody></table>

### 3.3 – Analyse des tests de détection rapide.

Les résultats de la qPCR portative n'affichent aucune amplification pour les 6 premiers échantillons (Tableau 6 ; Annexe 18), où l'ADN a été extrait avec le kit *Qiagen B&T* ou *Biomeme*, pour des amplifications de 1ère ou 2ème élution avec des volumes d'ADNe de 1µL ou 2 µL. Il en est de même pour l'amplification par ddPCR. Les résultats T7 et T8 amplifient respectivement au bout de 38.78 et 39.47 (>35) ce qui signifie une amplification tardive mais une présence certaine d'A. sturio au sein de ces deux échantillons. Il faut rester prudent quant à leur interprétation. L'amplification T7 a eu lieu pour 1L d'ADNe et non pour 5L. A l'inverse T8 n'a pas amplifié pour 1µL mais bien pour 5µL.
<table><caption>**Tableau 6 :** Résultats de détection *d'Acipenser sturio* en rivière par amplification PCR selon différents kits d'extraction.</caption><thead><tr><th>Échantillon & ADN</th><th>Kit d'extraction</th><th>Résultat amplification élution 1 (Nbr cycle)</th><th>Résultat amplification élution 2 (Nbr Cycle)</th></tr></thead><tbody><tr><td>T1</td><td>Qiagen B&T + Biomeme</td><td>0.00 & 0.00</td><td>-</td></tr><tr><td>T2</td><td>Qiagen B&T</td><td>0.00</td><td>-</td></tr><tr><td>T3</td><td>Qiagen B&T + Biomeme</td><td>0.00 & 0.00</td><td>-</td></tr><tr><td>T4</td><td>Qiagen B&T</td><td>0.00</td><td>0.00</td></tr><tr><td>T5</td><td>Qiagen B&T</td><td>0.00</td><td>0.00</td></tr><tr><td>T6</td><td>Qiagen B&T</td><td>0.00</td><td>0.00</td></tr><tr><td>T7</td><td>Qiagen PowerWater (1µL & 5µL d'ADN)</td><td>38.78 & 0.00</td><td>-</td></tr><tr><td>T8</td><td>Qiagen PowerWater (1µL & 5µL d'ADN)</td><td>0.00 & 39.47</td><td>-</td></tr></tbody></table>

# IV – DISCUSSION

## 4.1 – Étude bibliographique.

Cette synthèse a permis de balayer un grand nombre de publications traitant sur le sujet, afin de mettre en avant les difficultés que l'on peut rencontrer lors de la réalisation d'études mettant en pratique l'ADNe. Avec 54% des études d'ADNe représentée par le taxon des poissons (Belle et al. 2019), la présente analyse montre que celles-ci se concentrent davantage sur les individus appartenant au milieu dulcicole, et très peu sur les espèces présentes en milieux saumâtres, où l'ADNe est soumis à une accumulation de contraintes environnementales (turbidité, saliné, courant vertical, horizontale et transversal). Poursuivre la recherche dans ce type d'habitat est donc d'un réel intérêt pour le suivi, la protection et la gestion des espèces piscicoles et notamment migratrices.

Malgré le nombre de données et de connaissance qui augmente au fil des années, cette étude bibliographique montre que l'utilisation d'ADNe comme outil de détection d'espèces aquatiques rares, reste une science expérimentale récente. Par conséquent, sans consensus international, notamment sur la méthode de récolte de l'ADNe, et les effets que comporte chaque milieu, il est préférable de rester vigilant dans l'interprétation des résultats. Il est également important que les résultats négatifs ou les échecs de certaines méthodes de détection ADNe, soient publiés afin de donner une image réaliste de la complexité de ce sujet. Utiliser le package R *bibliometrix* (Aria et Cuccurullo 2017), pour comparer plusieurs bases de données entre elles, permettrait d'améliorer et d'affiner la cette synthèse.
## 4.2 - Analyse du suivi en métabarcoding des frayères historiques de l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*)

Les sites présents en zone de marée dynamique en 2019, n'ont pas été reconduit en 2020 et 2021 du fait de différences trop importantes entre les deux réplicas de chaque site. La grande quantité de matières en suspension dans cette zone correspondrait à l'élément inhibiteur pour la bonne détection de l'ADN. Le problème étant connu (Stoeckle et al. 2017), l'interprétation des sites Beautiran, Viole, St Pardon, Libourne-LeGalet et St Terre, est à prendre avec précaution.

Aucun signal correspondant au genre *Acipenser*, mais surtout à notre cas d'étude, l'espèce *sturio*, n'a été détecté. On ne peut donc émettre aucune hypothèse positive sur une reproduction naturelle effective ou alors en très faible quantité que ce soit sur les sites de la Garonne ou de la Dordogne, pour 2019, 2020 et 2021.

La richesse spécifique est similaire sur les trois années regroupées, et est comparable à ce qui a été décrit lors du recensement des espèces présentes dans l'estuaire amont et aval de La Loire entre 2009 et 2014, avec un total de 46 espèces (Carpentier, Feunteun, et Acou 2014). Les résultats des courbes cumulatives et de leur extrapolation, nous indique qu'une augmentation du nombre de site d'étude pourrait tout de même venir affinée les données qualitatives du cortège piscicole présent, notamment pour la Dordogne.

Ce cortège piscicole localisé autour des zones de frayères historiques de l'esturgeon européen, apparaît diversifié. On retrouve des individus carnassiers, comme le Sandre, ou des individus au régime dit « fouisseurs » comme c'est le cas de la Carpe commune et du Barbeau fluviatile. Ce cortège est également caractérisé par des espèces à dominance différente, avec la présence de petits individus comme les gardons et les perches soleil, mais également des individus ayant une taille similaire aux esturgeons, comme c'est le cas des silures. L'ensemble de ces éléments interroge donc sur les relations interspécifiques et l'avantage ou non qu'il confère à la présence d'une espèce rare comme l'esturgeon européen (ex. présence ou non de compétition alimentaire).

Malgré une différence significative entre les paramètres environnementaux de la Garonne et de la Dordogne en 2021, ce constat ne concerne pas les années 2019 (l'année avec le plus de sites étudiés) et 2020. Par conséquent et au vu du nombre faible de sites analysés en
2021, les résultats des ACP ne nous permettent pas d’affirmer un changement dans la composition des cortèges piscicoles dû à ces facteurs. Les AFC quant à elles ne mettent pas en avant de schéma préférentiel (Dordogne/Garonne, amont/aval) et répété sur les années, que peuvent avoir une ou des familles piscicoles en particulier.

Concernant l'étude comparative entre la pêche électrique et l'ADNe, le cortège piscicole de 2019 obtenu en pêche électrique est similaire à 63% avec le cortège piscicole obtenue par ADNe sur le site Couture où la Carpe miroir n'a pas été détecté par l'ADNe, contre 63,5% sur le site Pessac/Dordogne où seul les espèces Gambusie et Lamproie ont été détecté en PE et non en ADNe. En 2020 la similitude retombe à 51.5%, où seul le Carassin Argenté n'est pas détecté en ADNe, mais un nombre supérieur d'espèce uniquement recensé par ADNe. Contrairement aux pêches électriques l'échantillon d'ADNe se fait dans les veines principales de courant des deux rives du cours d'eau mais pas en berge, ce qui pourrait expliquer les espèces détectées en plus et pouvant être plus en pleine d'eau que vers les berges ou avec une bonne capacité d'échappement à la pêche électrique. De plus, étant donné qu'on a un signal à la fois à l'amont et l'aval, les espèces peuvent également être présentent plus à l'amont et non sur le site, le signal ADNe se propageant sur plusieurs kilomètres (Acolas 2021).

Enfin, malgré une corrélation de Pearson significative entre le %Effectif et le %Séquence ADN dans notre étude, la littérature montre une certaine contradiction avec une corrélation, qui pour certains serait davantage lié à la biomasse des organismes (Takahara et al. 2012), et pour d'autre à la densité des individus (Ficetola et al. 2008; Nathan et al. 2015; Stoeckle et al. 2017). En effet, il est encore difficile de nuancer entre la provenance d'ADN d'un banc de poissons ou bien de gros individus.

## 4.3 - Développement d'une nouvelle méthode de détection rapide in situ de l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*).

La première étape lors de la mise en place d'une nouvelle méthode de détection rapide d'ADNe in situ, intervient dès l'échantillonnage, qui plus est pour une espèce rare. Dans cette phase d'échantillonnage le volume prélevé mais également le type de filtre utilisé peut influencer la détection à *posteriori*. Ici les prélèvements ont été effectués sur des filtres *Smith-Rooth*, ayant une surface nettement plus réduite que ceux présents au sein des capsules de filtrations *VigiNDA 0.45µm* utilisé par SPYGEN pour le projet MOMIE.
Bien que des détections ont eu lieu pour des filtres comprenant des pores de 1.2 µm, le peu d'échantillon effectué ne nous permet pas de conclure quant à l'intérêt d'utiliser une taille de pores en particulier.

A la suite des prélèvements, le choix du kit d'extraction va jouer un rôle important quant à la détection et la bonne conservation de l'ADN recherché. Parmi les 3 kits utilisés (Qiagen Blood&Tissu, Biomeme et Qiagen PowerWater), c'est le kit Qiagen PowerWater qui semble le plus adapté. Cependant ce constat est à nuancer car plusieurs paramètres rentrent en compte. Premièrement aucune extraction n'a été réalisée sur les échantillons T7 et T8 à partir des kits Qiagen Blood&Tissu, et Biomeme, pour lesquelles une détection aurait pu être possible si présence il y avait. Dans un second temps, bien que les prélèvements aient été effectués proches les uns des autres, T7 et T8 sont les plus à proximité de la station d'expérimentation, ce qui peut également influencer la détection. De plus, d'autres kits d'extraction (Miseq Kit V3 – ILLUMINA) ont récemment fait leur preuves sur la détection d'ADNe d'individu du genre Acipenser (Paul et al. 2022).

Enfin, le volume d'ADN utilisé pour l'amplification par qPCR peut influencer la détection. Ici, trois volumes ont été testé : 1µL, 2 µL, et 5µL. Les résultats obtenus ne montrent pas de tendance particulière puisqu'une détection a eu lieu à 1µL pour le kit Qiagen PowerWater et non pour les kits Qiagen Blood&Tissu et Biomeme. A 2 µL, aucune présence recherchée pour les kits Qiagen Blood&Tissu n'a lieu. Les amplifications réalisées à partir du kit Qiagen PowerWater montrent certaines incohérences, du fait notamment que pour l'échantillon T8, l'ADN d'Acipenser sturio est détecté pour un volume 5µL mais pas pour celui de 1µL, ce qui pose question. Une erreur de manipulation n'est pas à écarter.

Cette première étude expérimentale soumet quelques hypothèses quant au protocole à mettre en place pour la détection in situ, sans pour autant en établir un précis. En effet pour ce faire l'idéal serait de réaliser une expérience similaire, mais en utilisant autant de réplicas que nécessaire, selon les filtres, les kits et les volumes d'ADN à tester. Toutefois ce type d'expérience implique un coût important notamment dans l'achat de kits d'extraction. L'objectif étant de détecter rapidement l'ADN sur le terrain, il est important de sélectionner un kit dont l'extraction est rapide et limite le plus possible le risque de contamination extérieur. Dans ce cas il est peut-être préférable de choisir un kit dont l'extraction est plus longue mais aussi plus précise, et ainsi réaliser l'extraction et l'amplification le lendemain en laboratoire.
# V – CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Ce stage a permis de mettre en avant la richesse et la complexité d'utiliser l'ADN environnemental comme moyen de détection d'espèce rare. Aujourd'hui en l'absence de consensus international quant à la méthode à utiliser, l'interprétation en est rendue complexe, qui plus est lors d'une étude sur un espèce rare se trouvant seulement dans une partie du monde. La détection *in situ* reste une méthode prometteuse vers laquelle la recherche doit poursuivre ses efforts, dans le but de diminuer les contraintes qui lui sont imposées par le suivi d'espèces rares.

A défaut de pouvoir affirmer l'absence ou la présence d'une espèce menacée, la détection par ADNe reste un bon outil quant à la détermination du cortège piscicole qui partage les sites historiques de présence.

Un des éléments serait de poursuivre les recherches en réalisant une augmentation du nombre de site de détection ADNe pour les prochaines années, afin d'affiner nos connaissances quant au nombre d'espèces caractérisant le cortège piscicole, en se rapprochant du plateau et des valeurs d'extrapolation. L'augmentation du nombre de site permettrai également d'avoir une meilleure connaissance et interprétation des données physico-chimiques dans le but d'avoir plus d'élément de comparaison entre la Dordogne et la Garonne.

En parallèle ou bien dans l'impossibilité d'augmenter le nombre de site, une augmentation du volume ou de la durée de prélèvement pourrait améliorer les résultats. Le risque est celui du colmatage, par conséquent un temps de décantation de la matière organique pourrait être envisageable. Enfin, réaliser des réplicas avec des variations de volume pour un même site permettrait de déterminer le volume « idéal » pour ce type fleuve.

Une des perspectives possibles et déjà utilisée dans le suivi de diversité (Rivera et al. 2022) est l'étude du biofilm aquatique. Par exemple la mise en place de récepteur de biofilm (type bloc rocheux) à proximité des zones de frayères historique de l'esturgeon européen permettrai de récupérer son ADN et d'éviter les contraintes liées à la sédimentation ou au courant.
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Takahara, Teruhiko, Toshifumi Minamoto, Hiroki Yamanaka, Hideyuki Doi, et Zen'ichiro Kawabata. 2012. « Estimation of Fish Biomass Using Environmental DNA » édité par J. A. Gilbert. *PLoS ONE* 7(4):e35868. doi: 10.1371/journal.pone.0035868.

Tsuji, Satsuki, Hiroki Yamanaka, et Toshifumi Minamoto. 2017. « Effects of Water PH and Proteinase K Treatment on the Yield of Environmental DNA from Water Samples ». *Limnology* 18(1):1-7. doi: 10.1007/s10201-016-0483-x.

Turner, Cameron R., Karen L. Uy, et Robert C. Everhart. 2015. « Fish Environmental DNA Is More Concentrated in Aquatic Sediments than Surface Water ». *Biological Conservation* 183:93-102. doi: 10.1016/j.biocon.2014.11.017.

Wada, Toshifumi, Hideyuki Doi, Daisuke Togaki, Ryotaro Kaida, Mariko Nagano, Izumi Katano, Masami Suzuki, Tetsuya Ohtani, et Hiromune Mitsuhashi. 2020. « Exploring a Legendary Giant Squid: An Environmental DNA Approach ». *Marine Biology* 167(11):160. doi: 10.1007/s00227-020-03773-z.

Weltz, Kay, Jeremy M. Lyle, Jennifer Ovenden, Jessica A. T. Morgan, David A. Moreno, et Jayson M. Semmens. 2017. « Application of Environmental DNA to Detect an Endangered Marine Skate Species in the Wild » édité par H. Doi. *PLOS ONE* 12(6):e0178124. doi: 10.1371/journal.pone.0178124.

Wilson, I. G. 1997. « Inhibition and Facilitation of Nucleic Acid Amplification ». *Applied and Environmental Microbiology* 63(10):3741-51. doi: 10.1128/aem.63.10.3741-3751.1997.
# ANNEXES

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Annexe 1 :** Schéma simplifié de l'échantillonnage au niveau des sites de prélèvements en 2020 et 2021, positionnement des réplicas en fonction du sens du courant, (Acolas 2021).</figcaption></figure>

<table><caption>**Annexes 2 :** Liste des indices de biodiversité alpha.</caption><thead><tr><th>Indice de biodiversité alpha</th><th>Définition</th><th>Formule</th></tr></thead><tbody><tr><td>Richesse spécifique (S)</td><td>Nombre d'espèces (S) dans un peuplement ou une région.</td><td></td></tr><tr><td>Indice de Shanon (H')</td><td>Diversité spécifique d'un milieu, c'est-à-dire du nombre d'espèces de ce milieu (richesse spécifique) et de la répartition des individus au sein de ces espèces (équitabilité spécifique).<br>Représentée par un nombre réel positif souvent compris entre 0 et 5, mais n'ayant en théorie pas de maximum.</td><td>H' = - &sum;<sub>i=1</sub><sup>S</sup> p<sub>i</sub> log<sub>2</sub> p<sub>i</sub><br><br>i : une espèce du milieu d'étude.<br>S : richesse spécifique.<br>pi : Proportion d'une espèce i par rapport au nombre total d'individus (N) dans le milieu d'étude, qui se calcule de la façon suivante : p(i) = ni/N où ni est le nombre d'individus pour l'espèce i et N est l'effectif total (les individus de toutes les espèces).</td></tr></tbody></table>
(1) https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&lang=en

(2) https://protocols.hostmicrobe.org/biomeme

(3) https://www.qiagen.com/us/Resources/ResourceDetail?id=58f43d7e-172a-4970-84f0-9cb335a8d262&lang=en

**Annexe 4** : protocole des kits d'extraction *Qiagen B&T* (1), *Biomem* (2) et *Qiagen PowerWater* (3).

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**Annexe 5** : Carte arborescente des dix premiers pays qui publient sur "eDNA Fishes". Source : *Web of science*.
Résultats obtenus par l'utilisation de "Topic" incluant uniquement le titre, le résumé, et les mots clés de la publication dans son champ de recherche.
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Annexe 9 : Courbe cumulative du nombre d'espèce par site pour l'année 2019, 2020 et 2021.</figcaption></figure>

<table><caption>Annexe 10 : Extrapolation des courbes cumulées croissantes</caption><thead><tr><th rowspan="2">Fleuve</th><th rowspan="2">Année</th><th rowspan="2">Espèces<br>Observées</th><th colspan="4">Extrapolation</th><th rowspan="2">Nbr<br>prélevements</th></tr><tr><th>Chao</th><th>jack1</th><th>Jack2</th><th>Boot</th></tr></thead><tbody><tr><td>Garonne</td><td>2019</td><td>30</td><td>34.41 ± 4.41</td><td>36.3 ± 3.5</td><td>38,34</td><td>33.02 ± 2.31</td><td>10</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>2020</td><td>34</td><td>35.73 ± 2.16</td><td>38.17 ± 3.67</td><td>38,3</td><td>36.22 ± 2.48</td><td>6</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>2021</td><td>34</td><td>43.8 ± 10.62</td><td>39.6 ± 3.53</td><td>42,9</td><td>36.5 ± 1.92</td><td>5</td></tr><tr><td>Garonne</td><td>2019, 2020 & 2021</td><td>43</td><td>45.98 ± 3.50</td><td>47.76 ± 2.54</td><td>48,85</td><td>45.42 ± 1.69</td><td>21</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>2019</td><td>36</td><td>78.85 ± 51.13</td><td>44.57 ± 6.58</td><td>51,12</td><td>39.56 ± 3.41</td><td>7</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>2020</td><td>35</td><td>41.12 ± 6.33</td><td>40.25 ± 3.60</td><td>42,75</td><td>37.41 ± 1.97</td><td>4</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>2021</td><td>33</td><td>51.37 ± 23.43</td><td>38.25 ± 5.14</td><td>41,41</td><td>35.28 ± 2.72</td><td>4</td></tr><tr><td>Dordogne</td><td>2019, 2020 & 2021</td><td>45</td><td>91.67 ± 55.64</td><td>54.33 ± 5.41</td><td>62,19</td><td>48.78 ± 2.76</td><td>15</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_15.png" /></figure>

1

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

2

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

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<caption>Annexe 11 : Cartes représentatives de la richesse spécifique de 2019 (1), 2020 (2) et 2021 (3)</caption>
1

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

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<figure><img src="image_19.png" /></figure>

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<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Annexe 12 : ACP Biplot des paramètres environnementaux de 2019 (1), 2020 (2) et 2021 (3).</figcaption></figure>
1

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

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<figure><img src="image_22.png" /></figure>

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<figure><img src="image_23.png" /></figure>

**Annexe 13** : AFC comparative des sites de prélèvement en fonction des groupes d'espèces de 2019 (1), 2020 (2) et 2021 (3)
<table><thead><tr><th>Nom scientifique</th><th>Nom Vernaculaire</th><th>ADNe Amont</th><th>ADNe Aval</th><th>PE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Alburnus alburnus</td><td>Ablette</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Anguilla anguilla</td><td>Anguille Europe</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Barbus barbus</td><td>Barbeau fluviatile</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Blicca bjoerkna</td><td>Brème bordelière</td><td>✗</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Chelon ramada</td><td>Mulet porc</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinidae Complexe 2</td><td>Cyprinidae Complexe 2</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinidae Complexe 3</td><td>Cyprinidae Complexe 3</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinus carpio</td><td>Carpe commune</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Cyprinus carpio carpio</td><td>Carpe miroire</td><td>✗</td><td>✗</td><td>✓</td></tr><tr><td>Gobio sp</td><td>Goujon</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Gymnocephalus cernuus</td><td>Grémille</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Lepomis gibbosus</td><td>Perche soleil</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Leuciscus burdigalensis</td><td>Vandoise</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Pseudorasbora parva</td><td>Pseudorasbora parva</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Rhodeus amarus</td><td>Bouvière</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Rutilus rutilus</td><td>Gardon</td><td>✗</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Sander lucioperca</td><td>Sandre</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Silurus glanis</td><td>Silure glane</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Squalius cephalus</td><td>Chevesne</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td colspan="2">TOTAL</td><td>12 (±4)</td><td>12 (±3)</td><td>11</td></tr></tbody></table>

Annexe 14 : Comparaison de la présence et de l'absence des espèces sur le site *Garonne à Couthure* en 2019.

✓ Présent sur les 2 réplicas, ✓ Présent sur un seul réplicas, ✗ Absent. (PE : Pêche électrique).
<table><thead><tr><th>Nom scientifique</th><th>Nom Vernaculaire</th><th>ADNe Amont</th><th>ADNe Aval</th><th>PE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Abramis brama</td><td>Brème commune</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Alburnoides bipunctatus</td><td>Spirlin</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Alburnus alburnus</td><td>Ablette</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Anguilla anguilla</td><td>Anguille d'europe</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Barbatula barbatula</td><td>Loche franche</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Barbus barbus</td><td>Barbeau fluviatile</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Blicca bjoerkna</td><td>Brème bordelière</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Carassius sp</td><td>Carrassin argenté</td><td>✗</td><td>✗</td><td>✓</td></tr><tr><td>Chelon ramada</td><td>Mulet porc</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinidae Complee_2</td><td>Cyprinidae Complexe 2</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinidae Complexe_3</td><td>Cyprinidae Complexe 3</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinus carpio</td><td>Carpe commune</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Gobio sp</td><td>Goujon</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Gymnocephalus cernuus</td><td>Grémille</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Lepomis gibbosus</td><td>Perche soleil</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Leuciscus sp</td><td>Vandoise</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Leuciscus burdigalensis</td><td>Vandoise</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Oncorhynchus sp</td><td>Oncorhynchus sp</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Oncorhynchus mykiss</td><td>Truite arc-en-ciel</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Pseudorasbora parva</td><td>Pseudorasbora parva</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Rhodeus amarus</td><td>Bouvière</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Rutilus rutilus</td><td>Gardon</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Salmo salar</td><td>Saumon atlantique</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Sander lucioperca</td><td>Sandre</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Silurus glanis</td><td>Silure glane</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Squalius cephalus</td><td>Chevesne</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td colspan="2">TOTAL</td><td>23 (±2)</td><td>19</td><td>11</td></tr></tbody></table>

**Annexe 15 :** Comparaison de la présence et de l'absence des espèces sur le site *Garonne à Couthure* en 2020.

✓ Présent sur les 2 réplicas, ✓ Présent sur un seul réplicas, ✗ Absent. (PE : Pêche électrique).
<table><thead><tr><th>Nom scientifique</th><th>Nom Vernaculaire</th><th>ADNe Amont</th><th>ADNe Aval</th><th>PE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Abramis brama</td><td>Brème commune</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Alburnus alburnus</td><td>Ablette</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Anguilla anguilla</td><td>Anguille Europe</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Barbatula barbatula</td><td>Loche franche</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Barbus barbus</td><td>Barbeau fluviatile</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Blicca bjoerkna</td><td>Brème bordelière</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Carassius sp</td><td>Carrassin argenté</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Chelon ramada</td><td>Mulet porc</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinidae Complexe 2</td><td>Cyprinidae Complexe 2</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Cyprinus carpio</td><td>Carpe commune</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Esox lucius</td><td>Brochet</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Gambusia affinis</td><td>Gambusie</td><td>✗</td><td>✗</td><td>✓</td></tr><tr><td>Gobio sp</td><td>Goujon</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Gymnocephalus cernuus</td><td>Grémille</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Lampetra sp</td><td>Lamproie</td><td>✗</td><td>✗</td><td>✓</td></tr><tr><td>Lepomis gibbosus</td><td>Perche soleil</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Leuciscus burdigalensis</td><td>Vandoise</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Micropterus salmoides</td><td>Black-bass</td><td>✓</td><td>✗</td><td>✗</td></tr><tr><td>Perca fluviatilis</td><td>Perche commune</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Pseudorasbora parva</td><td>Pseudorasbora parva</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Rhodeus amarus</td><td>Bouvière</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Rutilus rutilus</td><td>Gardon</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Sander lucioperca</td><td>Sandre</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Scardinius erythrophthalmus</td><td>Rotengle</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✗</td></tr><tr><td>Silurus glanis</td><td>Silure glane</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Squalius cephalus</td><td>Chevesne</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td>Tinca tinca</td><td>Tanche</td><td>✓</td><td>✓</td><td>✓</td></tr><tr><td colspan="2">TOTAL</td><td>24 (±1)</td><td>19 (±3)</td><td>19</td></tr></tbody></table>

Annexe 16 : Comparaison de la présence et de l'absence des espèces sur le site *Dordogne à Pessac* en 2019.

✓ Présent sur les 2 réplicas, ✓ Présent sur un seul réplicas, ✗ Absent. (PE : Pêche électrique).
Comparaison des données ADNe (Amont & Aval) et PE sur le site Dordogne à Pessac échantilloné en 2019

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Comparaison des données ADNe (Amont & Aval) et PE sur le site Garonne à couthure échantilloné en 2020

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Comparaison des données ADNe (Amont & Aval) et PE sur le site Garonne à couthure échantilloné en 2019

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Annexe 17 : Comparaison des données ADNe (% séquence ADN) et PE (% effectif)</figcaption></figure>
<figure><img src="image_27.png" /></figure>

Annexe 18 : Courbe d'amplification qPCR en visualisation multi seuil, T+ correspond au témoin positif.
## TABLE DES FIGURES

**Figure 1:** Cycle de vie de l'esturgeon européen, *Acipenser sturio*. (1) et (6) Zone de frayère et Développement embryonnaire, (2) 1ère année de vie en eau douce, (3) Migration vers la zone estuarienne, (4) Migrations répétés entre mer et estuaire (5) Individu mature retournant en zone de frayère pour se reproduire.

**Figure 2:** Sites de prélèvement d'eau pour analyse de l'ADNe en 2019, 2020 et 2021. Localisation en fonction des frayères historiques d*A. sturio* (figure modifiée par Acolas (2021) d'après Jego et al., (2002)).

**Figure 3:** Prélèvement d'ADNe à l'aide d'une pompe (A) détail de la capsule de filtration (B) (Acolas 2021).

**Figure 4:** Filtration (Smith-Rooth) après sédimentation (A) Schéma des prélèvements ainsi que des volumes et des tailles de pores associées (B).

**Figure 5:** Nombre de publication par an, entre 2010 et 2021, contenant les termes "eDNA fishes" ou "environmental DNA fishes" (n=2095). Source: *Web of science*. Résultats obtenus par l'utilisation de "Topic" incluant uniquement le titre, le résumé, et les mots clés de la publication dans son champ de recherche.

**Figure 6:** Types d'habitats (a) et objectifs (b)

**Figure 7:** Courbe d'accumulation du nombre d'espèce en fonction du nombre de site de prélèvement.

**Figure 8:** Comparaison de la diversité beta par la méthode de Jaccard pour les sites de la Garonne (A), de la Dordogne (B), et entre les fleuves (C) sur l'année 2019. En bleu, la distance depuis le bec d'Ambès. Les sites sont ordonnés de l'amont vers l'aval de bas en haut pour l'axe des y et de gauche à droite pour celui des x.

**Figure 9:** Comparaison de la diversité beta par la méthode de Jaccard pour les sites de la Garonne (A), de la Dordogne (B), et entre les fleuves (C) sur l'année 2020. En bleu, la distance depuis le bec d'Ambès. Les sites sont ordonnés de l'amont vers l'aval de bas en haut pour l'axe des y et de gauche à droite pour celui des x.

**Figure 10:** Comparaison de la diversité beta par la méthode de Jaccard pour les sites de la Garonne (A), de la Dordogne (B), et entre les fleuves (C) sur l'année 2021. En bleu, la distance depuis le bec d'Ambès. Les sites sont ordonnés de l'amont vers l'aval de bas en haut pour l'axe des y et de gauche à droite pour celui des x.

## TABLE DES TABLEAUX

**Tableau 1:** Récapitulatif des Kit d'extraction et des méthodes d'amplifications utilisées pour chaque prélèvement.

**Tableau 2:** Liste subjective des avantages et inconvénients de l'utilisation de l'ADNe en milieu aquatique. (++) Fort, (+) Moyen, (-) Faible, (0) Nul, (/) Pas de données.

**Tableau 3:** Résultats de la diversité alpha pour chaque site selon les années. (S) Richesse spécifique, (H') Indice de Shannon.

**Tableau 4:** Comparaison de la diversité beta entre les sites ADNe et PE, illustré par l'indice de Jaccard.

**Tableau 5:** Valeurs de p-value pour les tests de Wilcoxon-Man-Withney et Pearson. En vert les valeurs significatives et en rouge les valeurs non significatives.

**Tableau 6:** Résultats de détection d*Acipenser sturio* en rivière par amplification PCR selon différents kits d'extraction.
# TABLE DES ANNEXES

**Annexe 1** : Schéma simplifié de l'échantillonnage au niveau des sites de prélèvements en 2020 et 2021, positionnement des réplicas en fonction du sens du courant, (Acolas 2021).

**Annexes 2** : Liste des indices de biodiversité alpha.

**Annexe 3** : Regroupement des espèces utilisée dans la réalisation des AFC.

**Annexe 4** : protocole des kits d'extraction *Qiagen B&T* (1), *Biomem* (2) et *Qiagen PowerWater* (3).

**Annexe 5** : Carte arborescente des dix premiers pays qui publient sur "eDNA Fishes". Source : *Web of science*.
Résultats obtenus par l'utilisation de "Topic" incluant uniquement le titre, le résumé, et les mots clés de la publication dans son champ de recherche.

**Annexe 6** : Résultats metabarcoding SPYGEN, 2019.

**Annexe 7** : Résultats metabarcoding SPYGEN, 2020.

**Annexe 8** : Résultats metabarcoding SPYGEN, 2021.

**Annexe 9** : Courbe cumulative du nombre d'espèce par site pour l'année 2019, 2020 et 2021.

**Annexe 10** : Extrapolation des courbes cumulées croissantes

**Annexe 11** : Cartes représentatives de la richesse spécifique de 2019 (1), 2020 (2) et 2021 (3)

**Annexe 12** : ACP Biplot des paramètres environnementaux de 2019 (1), 2020 (2) et 2021 (3).

**Annexe 13** : AFC comparative des sites de prélèvement en fonction des groupes d'espèces de 2019 (1), 2020 (2) et 2021 (3)

**Annexe 14** : Comparaison de la présence et de l'absence des espèces sur le site *Garonne à Couthure* en 2019.

✓ Présent sur les 2 réplicas, ✓ Présent sur un seul réplicas, ✗ Absent. (PE : Pêche électrique).

**Annexe 15** : Comparaison de la présence et de l'absence des espèces sur le site *Garonne à Couthure* en 2020.

✓ Présent sur les 2 réplicas, ✓ Présent sur un seul réplicas, ✗ Absent. (PE : Pêche électrique).

**Annexe 16** : Comparaison de la présence et de l'absence des espèces sur le site *Dordogne à Pessac* en 2019.

✓ Présent sur les 2 réplicas, ✓ Présent sur un seul réplicas, ✗ Absent. (PE : Pêche électrique).

**Annexe 17** : Comparaison des données ADNe (% séquence ADN) et PE (% effectif).

**Annexe 18** : Courbe d'amplification qPCR en visualisation multi seuil, T+ correspond au témoin positif.
# RÉSUMÉ

Mots-clés : Poisson migrateur - Esturgeons – *Acipenser sturio* – ADN environnemental – Garonne – Dordogne – Espèces menacées – Anadrome.

La compréhension des écosystèmes aquatiques s'effectue en partie par la connaissance acquise sur les communautés qui les composent. Cette étude fait suite aux menaces qui pèse sur le plus grand poisson migrateur de l'Europe de l'Ouest, peuplant encore et seulement le bassin de La Gironde : l'Esturgeon européen (*Acipenser sturio*). Depuis les années 1900, l'espèce subit un ensemble de pressions anthropiques engendrant une diminution de ses stocks et la classant par l'UICN comme espèce «en danger critique d'extinction». Entre 2007 et 2009, 1.7 millions d'individu ont été relâché en milieu naturel, dans le but de restaurer la population. L'objectif de ce stage a été de détecter le retour de ces individus et leur reproduction, mais également de caractériser le cortège piscicole autour des zones de frayères historiques de l'espèce. Les campagnes de détection ont eu lieu en 2019, 2020 et 2020 par métabarcoding. Ce stage a aussi eu pour intérêt de participer au développement d'une méthode de détection *in situ*. Les résultats n'ont dévoilé aucune présence de l'Esturgeon européen sur ces trois années. Le cortège piscicole autour des frayères montrent une diversité des espèces, avec des richesses spécifiques comparables entre les deux fleuves. Les ACP et AFC réalisées ne permettent pas d'identifier une préférence de certaines familles pour des sites présents en Dordogne plutôt qu'en Garonne, et inversement. La méthode de détection par ADNe environnemental donne des résultats similaires émet légèrement plus importants en nombre d'espèce, que par la méthode de pêche électrique. Enfin, le développement de méthode de détection *in situ*, suggère d'après les premiers tests de favoriser l'utilisation de kits d'extraction *Qiagen B&T*, plus sensibles aux espèces rares. L'ensemble de ces recherches permettent un développement plus adapter et plus efficace sur une nouvelle méthode de détection, dans un but de compréhension et de conservation de nos écosystèmes aquatiques.
# SUMMARY

**Keywords:** Migratory fish - Sturgeon - *Acipenser sturio* - Environmental DNA - Garonne - Dordogne - Endangered species - Anadromous.

The understanding of our aquatic ecosystems is partly based on the knowledge acquired on the communities that compose them. This study follows the threats to the largest migratory fish in Western Europe, which still lives only in the Gironde basin: the European sturgeon (Acipenser sturio). Since the 1900s, the species has been subjected to a series of various anthropic pressures that have led to a decrease in its stocks and to its classification by the IUCN as "critically endangered". Between 2007 and 2009, 1.7 million individuals have been released in natural environment, in order to restore the population. The objective of this internship was to detect the return of these individuals and their reproduction, but also to characterize the fish community around the historical spawning grounds of the species. The detection programs took place in 2019, 2020 and 2020 by metabarcoding. This internship also had the interest of participating in the development of an *in-situ* detection method. The results did not show any presence of the European sturgeon over these three years. The fish community around the spawning grounds shows a diversity of species, with a specific richness comparable to similar rivers. The PCA and CFA carried out do not make it possible to recognize a preference of certain taxon for sites present in the Dordogne rather than in the Garonne. The method of detection by environmental eDNA was found to have similar results and more important in number of species, than by electric fishing method. Finally, the development of *in situ* detection methods suggests, according to the first tests, the use of Qiagen B&T extraction kits, more sensitive to rare species. All these research allow a more adapted and efficient development of a new detection method, in order to understand and conserve our aquatic ecosystems.