# Impact d'un traitement antioxydant sur le transfert de gène par un vecteur AAVr dans un modèle murin de la dystrophie musculaire de Duchenne

Jean-Baptiste Dupont, Benoît Tournaire, Romain Durand, Béatrice Marolleau, Émilie Bertil, Christophe Georger, Émilie Lecomte, Benjamin Cogné, Bernard Gjata, Laetitia Van Wittenberghe, Alban Vignaud Richard, O. Snyder, Philippe Moullier, Adrien Léger

**Jean-Baptiste Dupont**
Benoît Tournaire
**Romain Durand**
Emilie Lecomte
**Benjamin Cogné**
**Adrien Léger**
UMR Inserm 1089,
Atlantic Gene Therapies,
Nantes, France
jeanbaptiste.dupont@
univ-nantes.fr

**Béatrice Marolleau**
Emilie Bertil
**Christophe Georger**
Bernard Gjata
**Laetitia van**
**Wittenberghe**
**Alban Vignaud**
Généthon, Évry, France
**Richard O. Snyder**
UMR Inserm 1089,
Atlantic Gene Therapies,
Nantes, France
Department of Molecular
Genetics
and Microbiology,
University of Florida
College of Medicine,
Gainesville, Florida,
États-Unis
Center of Excellence
for Regenerative Health
Biotechnology, University
of Florida College
of Medicine, Gainesville,
Florida, États-Unis

**Philippe Moullier**
UMR Inserm 1089,
Atlantic Gene Therapies,
Nantes, France
Center of Excellence
for Regenerative Health
Biotechnology, University
of Florida College
of Medicine, Gainesville,
Florida, États-Unis

Les vecteurs recombinants dérivés du virus adéno-
associé (AAVr) sont des outils prometteurs pour la
thérapie génique de la dystrophie musculaire de
Duchenne (DMD). Plusieurs études menées chez des
modèles murins ou canins de la DMD ont en effet
décrit des améliorations phénomotypiques significatives
sans effet toxique notable suite à l'injection d'impor-
tantes quantités de vecteur [1, 2]. Même si ces études
sont prometteuses, le maintien à long terme de
l'expression du transgène demeure peu ou pas docu-
menté. Dans plusieurs modèles de souris DMD,
notre équipe et d'autres laboratoires avons ainsi
démontré que cette expression diminuait progressi-
vement, même après injection de doses de vecteurs
AAVr cliniquement pertinentes [3, 4]. En corréla-
tion, nous avons observé une perte des génomes de
vecteurs résultant de la nécrose des cellules muscu-
laires DMD, ainsi que des dommages oxydatifs affec-
tant les molécules d'ARNm du transgène. Ces obser-
vations soulignent l'importance du contexte
tissulaire dans lequel sont injectés les vecteurs AAVr,
et l'impact majeur qu'il peut avoir sur leur efficacité.
Mais elles permettent également de dégager des
perspectives d'amélioration : en neutralisant ces
« facteurs de restriction » préalablement à l'injection
d'AAVr, la persistance et l'efficacité de ces vecteurs
pourraient se trouver renforcées. Dans le cas de la
DMD, le stress oxydatif semble occuper une posi-
tion centrale à la fois dans la physiopathologie cel-
lulaire, et dans la dégradation de l'ARNm du trans-
gène [4, 5]. Par conséquent, nous avons développé
une stratégie innovante utilisant un composé anti-
oxydant fréquemment employé en médecine
humaine. Des souris DMD, prétraitées ou non par
cette molécule, ont reçu dans un deuxième temps
un vecteur AAVr portant un transgène rapporteur.
L'efficacité de transduction, l'expression et l'activité
du transgène ont ensuite été mesurées deux mois
après injection. Le résultat de cette approche

innovante sera certainement précurseur pour de
futurs protocoles de traitement combinatoires pour
la DMD, alliant l'efficacité de molécules pharmaco-
logiques à celle des vecteurs AAVr de thérapie
génique.

## Impact of an antioxidant treatment on rAAV-mediated gene transfer in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy

Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based
vectors are promising tools for the gene therapy of
Duchenne muscular dystrophy (DMD) (Figure 1).
Several studies in murine and canine models of
DMD reported significant phenotype improvements
without any notable toxicity following the injection
of substantial amounts of vector [1, 2]. While this
has raised hope for future translations in DMD
patients, long term maintenance of the therapeutic
benefits is an important, and yet unresolved issue.
In previous studies conducted in DMD mice, we and
others have demonstrated that rAAV-mediated
transgene expression is progressively reduced, even
after injection of clinically relevant vector doses [3,
4]. This could be explained, at least in part, by the
loss of vector genomes resulting from muscle cell
necrosis but also by the oxidative damage affecting
transgene mRNA molecules. These elements sup-
port the fact that the tissue context in which rAAV
vectors are delivered is of critical importance and
can significantly affect their efficiency. But they also
open new avenues for improvement, since we can
now consider counteracting these "restriction" phe-
notypes prior to rAAV injection. In the case of
DMD, oxidative stress seems to occupy a central
position in both muscle cell pathophysiology and
rAAV transgene mRNA degradation [4, 5]. There-
fore, we designed an innovative strategy using a rele-
vant antioxidant agent routinely used in human
# Impact of an antioxidant treatment on recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector-mediated gene transfer in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy

Jean-Baptiste Dupont¹, Benoît Tournaire¹, Romain Durand¹, Béatrice Marolleau¹, Emilie Bertil¹, Christophe Georger¹, Emilie Lecomte¹, Benjamin Cogné¹, Bernard Ojata¹, Laetitia van Wittenberge¹, Alban Vignaud¹, Richard O. Snyder¹,², Philippe Moullier¹,² and Adrián Léger¹

1. UMR INSERM 1099, Atlantic Gene Therapies, Nantes, France; 2. GENETHON, Evry, France; 3. Department of Molecular Genetics and Microbiology, University of Florida College of Medicine, Gainesville, Florida, USA; 4. Center of Excellence for Regenerative Health Biotechnology, University of Florida College of Medicine, Gainesville, Florida, USA

Contact: jeanbaptiste.dupont@univ-nantes.fr

## Duchenne muscular dystrophy (DMD)

sarcolemma

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

glycoprotein complex

mutated dystrophin

nNOS

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

actin cytoskeleton

* semiology: muscle weakness, loss of ambulation, cardiac and respiratory failure

* etiology: mutations in the DMD gene encoding dystrophin

* pathophysiology: homeostatic ruptures (mechanical, osmotic, metabolic, etc.)

* management: only supportive care (steroids, surgeries, physical therapies, etc.)

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

## Recombinant adeno-associated virus (rAAV)

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

* viral capsid: icosahedral protein shell several serotypes with specific tropism

* recombinant genome: single-stranded, linear DNA long term persistence in host cell nuclei "chromatinized" monomers & concatemers

## rAAV vectors in DMD animal models

* more than 30 studies with different transgenes (UT, µDys, Fst, nNOS, etc.)

* average injected dose: around 1.0E+14 vector genomes (vg) / kg

* studies rarely continued over 6 months

* loss of transgene expression and vector genomes over time when the injected vector dose is subtherapeutic

**Hypothesis:** Specific DMD phenotypes impair one or several step(s) of the rAAV transduction process
**What are these "restriction factors" and can they be counteracted?**

## Study plan in 3 successive steps:

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Statistics: Mann-Whitney U test. *** p<0.001, ** p<0.01

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

ATLANTIC
GENE THERAPIES

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

GENETHON

UF

FLORIDA

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

PAYS DE LA LOIRE

AFMTELETHON

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

EVE

LYON

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

Inserm

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

U
nam

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

S

<figure><img src="image_17.png" /></figure>
medicine. DMD mice, pre-treated or not with this
compound, were subsequently injected with a rAAV
vector carrying a reporter transgene. The transduc-
tion efficiency, together with the expression and
activity of the transgene, were monitored and
compared two months later. The outcome of this
innovative approach will certainly pave the way for
future combinatorial protocols using pharmacolo-
gical agents and rAAV vectors in DMD muscles.

Impact of an antioxidant treatment on recombi-
nant adeno-associated virus (rAAV) vector-
mediated gene transfer in a mouse model of
Duchenne muscular dystrophy

LIENS D'INTÉRÊT

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article.

RÉFÉRENCES

1. Le Guiner C, Montus M, Servais L, et al. Forelimb treatment in a large cohort of dystrophic dogs supports delivery of a recombinant AAV for exon skipping in Duchenne patients. *Mol Ther J Am Soc Gene Ther* 2014; 22: 1923-35.

2. Kawecka K, Theodoulides M, Hasoglu Y, et al. Adeno-associated virus (AAV) mediated dystrophin gene transfer studies and exon skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy (DMD). *Curr Gene Ther* 2015; 15: 395-415.

3. Le Hir M, Goyenvalle A, Peccate C, et al. AAV genome loss from dystrophic mouse muscles during AAV-U7 snRNA-mediated exon-skipping therapy. *Mol Ther J Am Soc Gene Ther* 2013; 21: 1551-8.

4. Dupont JB, Tournaire B, Georger C, et al. Short-lived recombinant adeno-associated virus transgene expression in dystrophic muscle is associated with oxidative damage to transgene mRNA. *Mol Ther Methods Clin Dev* 2015; 2: 15010.

5. Tidball JG, Wehling-Henricks M. The role of free radicals in the pathophysiology of muscular dystrophy. *J Appl Physiol* 2007; 102: 1677-86.