# Un système d'expression par intégration ciblée chez Yarrowia lipolytica : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée

Catherine Madzak, Claude Jolivalt, Christian Mougin, Pierre Briozzo, David Kopecny, Nicole Houba-Hérin, Michel Laloue, Jean-Marie Beckerich

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## ► To cite this version:

Catherine Madzak, Claude Jolivalt, Christian Mougin, Pierre Briozzo, David Kopecny, et al.. Un système d'expression par intégration ciblée chez Yarrowia lipolytica : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée. Rencontres des microbiologistes de l'INRA, Jun 2006, Dourdan, France. 2006. [hal-01607933](https://hal.science/hal-01607933v1)

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# Un système d'expression par intégration ciblée chez *Yarrowia lipolytica* : application à l'étude de protéines hétérologues par mutagénèse dirigée

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INRA

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Catherine MADZAK, Claude JOLIVALT, Christian MOUGIN, Pierre BRIOZZO, David KOPECNY, Nicole HOUBA-HÉRIN, Michel LALOUE & Jean-Marie BECKERICH

UMR1238 Microbiologie et Génétique Moléculaire, INRA / CNRS / INA-PG, 78850 Thiverval-Grignon

en collaboration avec :

UMR7573 Synthèse Sélective Organique et
Produits Naturels, CNRS / ENSCP, 75005 Paris

UR251 Physicochimie et Ecotoxicologie des Sols

UMR206 Chimie Biologique,

INRA / INAPG, 78850 Thiverval-Grignon

UR501 Biologie Cellulaire,

INRA, 78026 Versailles

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## Un système d'intégration ciblée pour l'expression/sécrétion de protéines hétérologues chez *Yarrowia*

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* des vecteurs navettes basés sur pBR322

* une cassette d'expression comprenant :

* un promoteur recombinant breveté : hp4d

* une séquence signal de sécrétion

* une fréquence de transformation de *Yarrowia* très élevée (de l'ordre de $10^5$ transformants par µg)

* une intégration ciblée par homologie avec le génome

* des transformants comportant une seule copie du gène hétérologue, intégrée en un site défini (plateforme pBR)

* la sécrétion dans le milieu de la protéine hétérologue

* la production efficace (10-100 mg/l) de protéines complexes sous leur forme active

Madzak et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2000) 2, 207-216

Madzak et al., J. Biotechnol. (2004) 109, 63-81

Madzak et al., FEMS Yeast Res. (2005) 5, 635-646

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sélection
chez *E. coli*

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souche réceptrice Po1g
plateforme pBR

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souche productrice

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### La souche Po1g a été optimisée pour la production hétérologue :

* introduction d'une plateforme pBR dans le génome

* délétion des gènes codant pour des protéases extracellulaires

* capacité à métaboliser le saccharose (donc les mélasses)

protéine recombinante
sécrétée dans le
milieu de culture

Ce système d'expression/sécrétion par intégration ciblée permet d'analyser l'effet de mutations du gène hétérologue par simple comparaison des propriétés des protéines recombinantes, mesurables dans les surnageants de cultures. La fréquence de transformation très élevée du système devrait permettre de l'utiliser pour l'optimisation d'enzymes, par le biais de mutagénèse au hasard par PCR, ou d'évolution moléculaire.

## Production et mutagénèse dirigée de la laccase LacIIB du Basidiomycète ligninolytique *Trametes versicolor*

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Les laccases fongiques sont utilisées dans des procédés oxydatifs industriels, et ont de nombreuses autres applications potentielles, notamment dans le domaine de la dépollution.

Nous avons déterminé la première structure d'une laccase active, complexée avec son substrat, par l'analyse de cristaux de LacIIB purifiée à partir de *T. versicolor*. La structure du site actif a mis en évidence l'interaction d'un acide aminé, l'Aspartate (D) 206, avec le substrat.

La production de *TvLacIIB* recombinante chez *Yarrowia*, pour analyse biochimique, ayant donné des résultats satisfaisant, nous avons entrepris une mutagénèse dirigée de l'Asp206, avec production chez *Yarrowia* des LacIIB mutées.

Parmi les résultats obtenus, nous avons pu en particulier obtenir, avec le mutant D206N, un déplacement vers la neutralité du pH optimal vis-à-vis d'un substrat phénolique. C'est une 1ère étape dans l'optimisation de l'enzyme pour des applications environnementales, qui pourrait permettre la dégradation *in situ*, dans des sols à pH neutre, de polluants environnementaux de structure phénolique.

Jolivalt et al., App. Microbiol. Biotechnol. (2005) 66, 450-456

Madzak et al., Protein Eng. Des. Sel. (2006) 19(2), 77-84

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Bertrand et al., Biochemistry
(2002) 41, 7325-7333
Mougin et al., Environ. Chem. Lett.
(2003) 1, 145-148

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## Production et mutagénèse dirigée de la cytokinine oxydase CKO1 de Zea mays

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La production de *ZmCKO1* recombinante chez *Yarrowia* a permis sa purification, son analyse biochimique, sa cristallisation, et l'étude de sa structure par diffraction aux rayons X (résolution : 1,95 Å).

Une analyse de la structure des complexes formés par l'enzyme avec différents inhibiteurs et accepteurs d'électrons est en cours, par le biais de la co-cristallisation ou de l'infiltration des cristaux.

L'analyse de la *ZmCKO1* recombinante par MALDI-MS a montré que 5 sites de N-glycosylation, sur 8 sites potentiels, étaient glycosylés chez *Yarrowia*, la longueur moyenne des chaînes de mannoses étant de 17 résidus (l'hyperglycosylation, problème fréquent dans les systèmes d'expression chez d'autres levures, correspond à des chaînes de l'ordre de 50-150 mannoses).

Les données cristallographiques obtenues ont permis de cibler des acides aminés pour une mutagénèse dirigée, afin d'analyser finement les mécanismes réactionnels de l'enzyme. La production chez *Yarrowia* des CKO1 mutées, actuellement en cours, permettra leur étude biochimique et leur cristallisation pour étude structurale. Les premiers résultats ont déjà permis de confirmer la prédiction d'un résidu clef de la catalyse, et de définir des limites stériques pour l'accessibilité du substrat.

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Massonneau et al., J. Exper. Botany (2004) 55, 2549-2557

Kopecny et al., Acta Crystal. D (2004) 60, 1500-1501

Kopecny et al., Biochimie (2005) 87, 1011-1022