# Origine de la diversité des insectes pollinisateurs d'altitude: le cas des diptères Empidinae dans le Parc National du Mercantour

Vincent Lefebvre

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Vincent Lefebvre. Origine de la diversité des insectes pollinisateurs d'altitude: le cas des diptères Empidinae dans le Parc National du Mercantour. Sciences du Vivant [q-bio]. Museum National d'Histoire Naturelle (MNHN), 2017. Français. NNT: 2017MNHN0019. tel-04055096

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MUSEUM NATIONAL

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D'HISTOIRE NATURELLE

Ecole Doctorale Sciences de la Nature et de l'Homme – ED 227

Année 2017

N° attribué par la bibliothèque

## THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DU MUSEUM NATIONAL D'HISTOIRE NATURELLE

Spécialité : « Ecologie / Entomologie »

Présentée et soutenue publiquement par

Vincent Lefebvre

Le 22 Novembre 2017

# Origine de la diversité des insectes pollinisateurs d'altitude : le cas des diptères Empidinae dans le Parc National du Mercantour

Sous la direction de : Mme Claire Villemant, Maître de Conférences du MNHN, et
M. Christophe Daugeron, Maître de Conférences du MNHN

## JURY :

M.

Mme Villemant, Claire

M. Daugeron, Christophe

M. Michez, Denis

M. Sarthou, Jean-Pierre

Mme Dajoz, Isabelle

M. Bœuf, Gilles

M. Fontaine, Colin

Docteur, Muséum national d'Histoire naturelle, Paris (France)

Docteur, Muséum national d'Histoire naturelle, Paris (France)

Professeur, Université de Mons, Mons (Belgique)

Professeur, INRA / INP-ENSAT (Paris VII), Toulouse (France)

Professeur, Université Paris-Diderot (UMPC-iEES), Paris (France)

Professeur, Université Pierre-et-Marie-Curie (Paris VI), Paris (France)

Docteur, Chargé de recherches CNRS, Paris (France)

Président

Directrice de Thèse

Directeur de Thèse

Rapporteur

Rapporteur

Examinateur

Examinateur

Invité
À Benoît Holliger

Et à Clément, né entre deux pages de ce manuscrit
REMERCIEMENTS

MERCI à toutes les personnes qui ont contribué à cette thèse, en espérant n'oublier personne :

Merci Claire et Christophe pour m'avoir fait confiance, sur le terrain comme au laboratoire. Vous m'avez offert l'opportunité de travailler dans des environnements stimulants et privilégiés tant au Museum que dans les prairies alpines. Je me souviendrai toujours de certaines matinées où, arrivant pour échantillonner au col de la Cayolle au milieu des orchidées, des edelweiss et des marmottes sifflant sous un ciel presque trop bleu, je me disais qu'une thèse dans le Mercantour, ça devrait durer au moins 15 ans. C'était grâce à vous ! Vous m'avez fait découvrir la recherche de la plus belle façon.

Merci Colin, maître-ès-écologie-et-statistiques ! Pour ta gentillesse, ta patience, ton optimisme et tes enseignements : j'ai beaucoup appris grâce à toi aussi. Mais oui, on va arriver à les rentrer en une page A4, ces réseaux de 5500 interactions (ah... ?).

Cyrille et Éric, un énorme merci pour votre disponibilité, votre humeur, votre humour, votre expertise en phylogénie, et aussi évidemment pour le BoEM. Merci à Alexia, stagiaire de l'équipe en 2014 dans ce labo de biologie moléculaire, pour tous ses conseils pratiques.

Merci à Emmanuel Delfosse, vraiment un grand merci Manu, pour toute l'aide que tu m'as apportée. Il serait trop long d'énumérer les occasions où tu as facilité ma vie de thésard.

Jocelyne, mille mercis pour être la bibliothécaire-entomologiste parfaite. Le temps que tu as généreusement passé à exhumer ces feuilles de chou introuvables parce que « Ce serait quand même pas mal que je la lise, cette référence... » m'en a tellement fait gagner. Et encore des mercis pour ces inoubliables Creusois aux noisettes, et ces petits chèvres bio.

Merci aux taxonomistes qui ont consacré du temps à l'identification des insectes collectés dans les prairies du Mercantour : David R. Smith (Hymenoptera Symphyta), Adrian Pont (Diptera, Muscidae et Anthonyiidae), Axel Ssymank (Diptera, Syrphidae et Stratiomyidae), Knut Rognes (Diptera, Calliphoridae), Hans-Peter Tschorsnig (Diptera, Tachinidae), Pascal Leblanc (Coleoptera, Mordellidae), Robert Constantin (Coleoptera, Dasytidae et Malachiidae), Matthieu Aubert (Hymenoptera, Apidae, Halictidae, Megachilidae, Colletidae), David Genoud (Hymenoptera, Andrenidae, Halictidae), Eric Dufrêne (Hymenoptera, Apidae – *Nomada*), Jérôme Barbut et Axel Dehalleux (Lepidoptera).

Merci à l'équipe chaleureuse, accueillante et passionnée des gardes du secteur Verdon-Ubaye du Parc National du Mercantour, pour m'avoir aiguillé vers ces magnifiques prairies alpines où mes prospections ne m'auraient probablement jamais conduit. Des mercis tout particuliers à
François Breton : pour les Meyries, pour l'Isabelle, ou plutôt la troupe d'Isabelles... Cette merveille, la star des papillons de France, c'était comme un rêve de gosse.

Merci Martin ! Pour ta gentillesse, pour avoir simplement décidé de ne pas faucher ta prairie l'année ou j'ai échantillonné chez toi, et pour ces quelques soirées agréables sous le ciel de Pra-Loup. Pour m'avoir montré comment démonter une roue récalcitrante dans des conditions... de montagne. J'ai eu l'occasion de passer ce savoir à... il se reconnaitra :)

Merci à Lorène Lombard, souriante et énergique t ôlière de Séolane, et à Yves Aglio, Sylvain Antiq, Fabrice Bouvet, Jean-Paul Fortoul, Isabelle Le Hir et Joël Rougon pour m'avoir laissé appauvrir leurs prairies fleuries d'un certain nombre de pollinisateurs.

Merci à tous les chercheurs passionnés et compétents des équipes du muséum, amis et collègues, que j'ai eu la chance de côtoyer durant cette thèse, et particulièrement la « troupe du café », réunion pétillante d'entomologistes dont les discussions animées autour d'une petite douceur (encore ce Creusois...) ont donné une autre saveur à mes après-midis : Thierry, Dominique, Armand, Hélène, Stéphane, Jean-Marc, Azadeh,... et merci aussi à toute l'équipe « papillons-drosophiles » : Vincent, Antoine, Marianne, Violaine et tous les autres. Merci Adrien (tu l'as, ton poste de MC !) et Clément pour toutes ces discussions chargées de conseils.

## MERCI à toutes les personnes de mon entourage qui m'ont supporté pendant ce doctorat, rien n'aurait été pareil sans vous :

La famille évidemment, Merci Maman, Papa et le Frangin ! Vous avez toujours été là pour soutenir mes choix, et toujours été là pour tout. Merci ! Les deux J, grâce à vous qui avez également été productifs en cette fin de thèse, je suis Tonton !!! C'était le meilleur texto de 5h02 du matin que je puisse recevoir. Espérons qu'il reste encore longtemps des petites fleurs et des marmottes dans les prairies alpines pour t'écarquiller les yeux, petit Clément. En tout cas, promis, on y travaille.

Merci Marina, tu es celle qui a partagé les meilleurs et les pires moments au quotidien ; tes capacités d'encaissement défient jusqu'aux torrents froids du Mercantour où contrairement à toi je n'ai pas eu le cran de me baigner (même de glisser un orteil entier, en fait). Bisous pupak !

Merci aux potos, à vous aussi désolé pour les absences de ces dernières années : Léo (l'entomologie, c'est en grande partie grâce à toi !), Cédric (on va pouvoir se remettre à ramper sous terre), Manu (toi aussi, maintenant tu changes les couches), Colin (à toute pour une petite mousse), Yanis, Marie, Elodie, les Guillaume(s), Thibaut... Merci Julien pour nos longues discussions du midi (Pickle Rick !).
# SOMMAIRE

## I. INTRODUCTION : POLLINISATION, INSECTES ET ALTITUDE .................................... 4

1. Pollinisation entomogame....................................................................................5

1. 1. Reproduction des Angiospermes : le rôle des insectes....................................5

1. 2. Pourquoi étudier la pollinisation le long d'un gradient altitudinal ? ............10

1. 3. Objectifs de la thèse....................................................................................15

2. Groupe modèle : les Empidinae (Diptera, Empididae)....................................17

2. 1. Les Empidinae : positionnement systématique et biologie................................18

■ Présentation du groupe (article publié dans *Insectes*) ....................................19

■ Description de deux espèces nouvelles (article publié dans *Zoosystema*)............23

2. 2. Anthophilie chez les Empidinae : revue synthétique....................................30

3. Cadre de l'étude : Le nord du Mercantour ....................................................36

## II. STRUCTURATION DES COMMUNAUTES ANTHOPHILES LE LONG D'UN GRADIENT

ALTITUDINAL ........................................................................................................40

■ Structuration spatiale, temporelle et trophique de l'entomofaune floricole le long d'un gradient altitudinal :
  « Altitudinal, temporal and trophic partitioning of flower visitors in Alpine communities » (article soumis à *Ecography*) ....................................42

## III. VISITES ET POLLINISATION : LE RÔLE DES EMPIDINAE ....................................75

1. Importance des Empidinae dans les réseaux plantes-visiteurs à l'étage subalpin : « Are empidine dance flies major flower visitors in alpine environments ? A case study in the Alps, France » (article publié dans *Biology Letters*) ....................................................................................77

2. Mesure de l'efficacité pollinisatrice des Empidinae : le cas du Geranium des bois : « Size matters : traits influence pollination efficiency more than species identity » (Manuscrit in prep) ....................................82

## IV. ANTHOPHILIE EN ALTITUDE CHEZ LES EMPIDINAE : APPORTS DE LA

PHYLOGENIE ................................................................................................................100

■ Rôle de l'anthophilie dans la diversification des Empidinae et origine des adaptations à l'altitude....................................................101

## V. DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES .................................................................115

REFERENCES ..................................................................................................................126
ANNEXES ..................................................................................................................132

ANNEXE 1 : Carte des sites d'étude..................................................................133

ANNEXE 2 : Annexes du chapitre I : Synthèse des interactions Empidinae-
Angiospermes..................................................................................135

ANNEXE 3 : Annexes du chapitre II : « Supplementary material » de l'article
soumis à *Ecography*. ....................................................................150

Appendix 1 : Additionnal graphs and tables for the manuscript............151

Appendix 2 : Species-level networks - overlap between orders............182

Appendix 3 : Species-level networks - overlap between fly families........184

ANNEXE 4 : Annexes du chapitre III : « Supplementary material » de l'article
publié dans *Biology Letters*. ....................................................187

ANNEXE 5 : Annexes du chapitre IV :

1. Table 1 : Espèces incluses dans la phylogénie des Empidinae............194

2. Figure 1 : Phylogénie moléculaire des Empidinae....................199

3. Figure 2 : Structure du proboscis chez les Empidini....................200

4. Figure 3 : Cladogramme des grands groupes d'Angiospermes............201
"If one browses the more general alpine literature, one gets the impression that abundance and activity of pollinators decreases with elevation, so that alpine plants have a problem."

Körner 1999

"Among plants, the nuptials cannot be celebrated without the intervention of a third party to act as a marriage priest."

Rothrock 1867
# PARTIE I

## INTRODUCTION GENERALE :

## POLLINISATION, INSECTES ET ALTITUDE
# I. 1. POLLINISATION ENTOMOGAME

## 1. 1. Reproduction des Angiospermes : le rôle des insectes

### Compenser l'immobilisme en déléguant le transport du pollen

La pollinisation est une étape obligatoire de la reproduction sexuée des Angiospermes qui précède la fécondation. Il s'agit de la fixation sur le pistil d'une fleur d'au moins un grain de pollen, dont la germination produira le tube pollinique par lequel les gamètes mâles rejoindront le gamète femelle. Les Angiospermes étant des organismes fixes, et à l'exception des fleurs qui s'autofécondent (dites autogames), le transport des grains de pollen depuis l'étamine jusqu'au pistil est tributaire d'un agent externe : c'est la pollinisation croisée ou **allogamie** (Fig. 1). Ce régime de pollinisation génère un brassage génétique entre individus cons spécifiques qui n'a pas lieu en situation d'autogamie et confère des avantages sélectifs majeurs. En générant de la variabilité entre individus, l'allogamie augmente le potentiel adaptatif de l'espèce face aux changements environnementaux. Elle permet aussi d'éviter la dépression de consanguinité inhérente à l'autofécondation, et de masquer les mutations délétères récessives qui apparaissent aléatoirement dans le génome. La majorité des plantes ne sont ni complètement autogames ni complètement allogames : elles utilisent les deux régimes de reproduction dans des proportions variables, et ce caractère est donc à considérer comme un trait continu (Vogler & Kalisz 2001). Quand la fécondation croisée devient impossible, en général par déficit d'agent externe transporteur de pollen, c'est l'autofécondation qui assure alors le maintien des populations. Seules les plantes auto-incompatibles, chez qui l'autofécondation est impossible, dépendent totalement d'un intermédiaire pour leur pollinisation.

### Le pollen peut être transporté soit par un vecteur abiotique aléatoire...

Deux stratégies d'allogamie existent, la première étant celle des Gymnospermes qui incluent tous les conifères : produire une très grande quantité de pollen dispersée par un vecteur abiotique et aléatoire, le vent dans 98% des cas (Willmer 2011). La probabilité infime qu'un grain de pollen rencontre un pistil cons spécifique est compensée par leur très grand nombre, responsable des « nuages polliniques » qui saturent l'air pendant la floraison de l'espèce : c'est l'anémogamie. Chez les Angiospermes, on retrouve ce mode de pollinisation chez environ 10% des espèces (Ackermann 2000), dont les graminées et beaucoup d'arbres des forêts tempérées (Pesson et Louveaux 1984), comme les noisetiers (Corylaceae) et les peupliers (Salicaceae). Les fleurs à pollinisation anémogame montrent des adaptations typiques, qui tendent à diminuer le gaspillage massif de pollen inhérent à ce type de reproduction : en particulier les pistils sont
grands, très exposés au vent et en général plumeux pour retenir le pollen (Fig. 2.a). Les caractéristiques florales issues des coévolutions avec les butineurs sont souvent absentes, notamment la fragrance, les pétales grands et colorés et les glandes nectarifères. Chez les Angiospermes, le caractère ancestral de la pollinisation par l'intermédiaire des animaux fait maintenant consensus, car les analyses indiquent que les anémogames sont le résultat de réversions (Friedman et Barrett 2008). C'est le cas dans plus de 60 familles d'Angiospermes, qui comprennent la plupart du temps quelques espèces anémogames seulement ; mais pour d'autres ce régime de pollinisation est redevenu prédominant, comme chez les orties (Urticaceae), les graminées (Poaceae) ou les carex (Cyperaceae).

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

**Figure 1.** Les différents régimes de pollinisation. Pour certains auteurs, l'allogamie désigne tout acte de pollinisation qui n'a pas lieu au sein d'une fleur unique, et comprend donc la geinotogamie (qui se produit entre deux fleurs distinctes d'un même pied). L'allogamie entre deux pieds différents s'appelle alors xénogamie. Dans la terminologie adoptée ici, l'allogamie (=xénogamie ou « pollinisation croisée ») désigne toute acte de pollinisation entre deux pieds distincts (Pesson & Louveaux 1984 ; Willmer 2011).

## ... soit par les animaux

La seconde stratégie, plus efficace car plus ciblée, a participé au succès de la diversification des Angiospermes et concerne presque 90% d'entre eux (Linder 1998 ; Ollerton et al. 2011). La dispersion des grains de pollen n'est plus totalement aléatoire, car le vecteur qui les transporte est un animal qui trouve un intérêt à venir régulièrement visiter les fleurs (ou qui se fait leurrer dans ce but) : c'est la **zoogamie** (Fig. 1). Le pollen voyage ainsi de fleur en
fleur, et la probabilité qu'il rencontre un pistil conspécifique dépend de caractéristiques propres à l'animal, comme sa morphologie, sa façon de butiner et la fréquence de ses visites. Les zones où le pollen est déposé sont partiellement restreintes aux fleurs visitées, mais le succès reproducteur de la plante butinée n'est susceptible d'augmenter que si le pollen déposé appartient à la même espèce. Un ratio défavorable entre pollen conspécifique et hétérospécifique sur un même pistil peut réduire le succès de fécondation (Morales et Traveset 2008). Il existe donc une compétition pour les pollinisateurs entre les espèces qui fleurissent simultanément dans un habitat, chacune d'elle ayant intérêt à maximiser les flux de pollen conspécifique. En comparaison des plantes anémogames, ce mode de pollinisation permet également de réduire considérablement la quantité de ressources allouée à la production du pollen.

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Figure 2.** Exemples d'adaptations de plusieurs espèces d'angiospermes à deux régimes de pollinisation. (a) **Anémogamie** - à gauche, apex d'un épi de maïs (*Zea mays* L.) avec de longs pistils très nombreux ; à droite, chatons de noisetier (*Corylus* sp.) pleins de pollen. (b) **Entomogamie** - fleurs d'espèces entomogames de quatre familles différentes (de gauche à droite : Crassulaceae, Asteraceae, Gentianaceae, Orobanchaceae), avec des pétales colorés.
L'écrasante majorité des pollinisateurs sont des insectes

Sur le continent Américain certaines plantes zoogames sont pollinisées majoritairement par des oiseaux (ornithogamie), souvent des colibris (Lange et al. 2000). Dans les zones tropicales, des chauves-souris (chiroptérogamie) peuvent également jouer ce rôle (Gardner 1977, Tschapka 2003) ; et certaines espèces sont mêmes adaptées à une pollinisation par des escargots (Willmer 2011), des écureuils (Yumoto et al. 1999) ou encore des lézards (Olesen & Valido 2003). Mais pour une immense majorité des plantes à fleurs, le transport des grains de pollen depuis les anthères jusqu'à la partie réceptive du stigmate dépend des interactions entre la fleur et le cortège des insectes qui la visite : c'est l'entomogamie (Fig.1 et 2.b). Ce mutualisme plantes-insectes passionne les biologistes depuis des siècles (Baker 1983), et a nourri une abondante littérature : outre le fait qu'il rend possible ou améliore, au moins partiellement, plus d'un tiers de la production végétale composant notre alimentation (Klein et al. 2007), il explique aussi la grande diversité de formes, de couleurs et d'odeurs rencontrées chez les fleurs.

Pour que l'entomogamie procure des avantages par rapport à l'anémogamie, il faut qu'un insecte donné visite les fleurs d'une même espèce avec une certaine récurrence. En effet il ne peut déposer du pollen que s'il en a préalablement accumulé sur le corps, en visitant d'autres fleurs aux anthères déhiscentes. Les plantes entomogames présentent donc des caractères attractifs capables d'influencer l'assiduité relative des anthophiles, c'est-à-dire leur degré de spécialisation. La longue co évolution plantes-butineurs a favorisé la sélection de multiples traits floraux qui, à l'instar des adaptations citées précédemment chez les plantes anémogames, tendent à augmenter le succès de cette stratégie de reproduction. Les formes, la symétrie, les couleurs (Fig. 2.b), les odeurs, le type et la quantité de récompense éventuellement fournie, l'exposition, la hauteur, la phénologie ou encore l'heure d'ouverture d'une fleur contribuent à façonner le cortège des insectes qui la visitent ; réciproquement, les butineurs les plus efficaces jouent un rôle dans la sélection de ces caractères.

L'idée que les caractéristiques florales d'une espèce d'angiosperme puissent permettre de
prédire le taxon animal majoritairement impliqué dans sa pollinisation a donné naissance au
concept de **syndromes de pollinisation** (Faegri & Van Der Pijl 1979), qui sont en réalité
la formalisation d'hypothèses proposées il y a presque un siècle et demi (Delpino 1873-1874).
Depuis, la fiabilité et la pertinence de ces syndromes ont fait l'objet de nombreux débats. Les
prédictions du pollinisateur majoritaire d'après l'observation des fleurs se révèlent généralement
correctes en région tropicale, et pour les plantes totalement dépendantes des pollinisateurs pour
leur reproduction (Rosas-Guerrero et al. 2014). Dans la plupart des autres cas, elles s'avèrent
erronées : les syndromes actuellement définis se recouvrent entre eux, et ne décrivent pas l'ensemble des morphotypes floraux existants dans la nature (Hingston & McQuillan 2000 ; Ollerton et al 2009). Dans les prairies alpines particulièrement riches en flore de petite taille et où les seuls pollinisateurs disponibles sont des insectes, il est en général impossible de formuler des prédictions basées sur les syndromes de pollinisation.

## A l'exception des abeilles, l'entomofaune anthophile est méconnue

Parmi la trentaine d'ordres d'insectes actuellement décrits (Delfosse 2015), quatre comportent un grand nombre d'espèces floricoles susceptibles de polliniser les plantes visitées : les Coléoptères, les Diptères, les Lépidoptères et les Hyménoptères. On trouve des visiteurs de fleurs réguliers ou obligatoires dans d'autres ordres, certains étant des pollinisateurs reconnus comme les Thysanoptères (thrips) malgré leur très petite taille (Williams & Adam 2010 ; Eliyahu et al. 2015). Beaucoup de ces espèces anthophiles ont pour unique ressource alimentaire une ou plusieurs productions florales : le pollen (abeilles, symphytes, syrphes, longicornes, thrips), le nectar (abeilles, symphytes, papillons, mouches), les étamines entières voire les pétales (cétoines, longicornes, symphytes), ou encore des sécrétions huileuses ou cireuses pour certaines abeilles spécialisées (Rasmussen & Olesen 2000).

Malgré cette grande diversité d'insectes dont au moins une partie du cycle de vie est lié aux fleurs, une écrasante majorité des travaux d'anthécologie (= biologie de la pollinisation) s'est longtemps focalisée sur un groupe particulier d'Hyménoptères, les apoïdes. Ce sont majoritairement des abeilles solitaires, avec quelques genres incluant des espèces sociales comme les bourdons (*Bombus* spp.) et les abeilles du genre *Apis*, depuis longtemps exploitées par l'homme. Leur prépondérance dans la littérature s'explique d'abord par la richesse spécifique de ce groupe : plus de 25 000 espèces ont été décrites à ce jour, et on estime que leur nombre total dépasse 40 000 (Willmer 2011). Ensuite, par leur biologie et leur éthologie : les apoïdes dépendent toute leur vie du nectar et du pollen, qui satisfont leurs besoins énergétiques et constituent les réserves permettant le développement des larves. Ils passent donc l'essentiel de leur vie adulte à visiter les fleurs, ce qui les place parmi les butineurs les plus visibles et les pollinisateurs les plus efficaces. Enfin, par le fait que la majorité des études sur les relations plantes-butineurs ont été conduites dans des milieux où les apoïdes dominent : les zones de basse altitude des régions tempérées et tropicales. Durant les dernières décennies, le nombre croissant d'études similaires réalisées dans les zones froides de haute altitude et/ou latitude ont révélé que cette prédominance des apoïdes n'était pas généralisable à l'ensemble des régions du globe, et que divers groupes de Diptères semblent alors prendre leur place (Mani 1968; Hocking
1968; Kevan 1972; Mani & Giddings 1980; Kearns 1992; Elberling & Olsen 1999; Larson et al. 2001; Zoller et al. 2002; Ssymank et al. 2008; Olito et al. 2014; Tiusanen et al. 2016; Wagner et al. 2016).

# 1. 2. Pourquoi étudier la pollinisation le long d'un gradient altitudinal ?

## L'environnement change avec l'altitude

Le cortège des insectes qui pollinisent une plante dans un habitat donné est par nature un sous-ensemble de la faune entomologique qui y prospère. Les conditions biotiques et abiotiques qui règnent dans cet habitat constituent un filtre qui détermine la présence ou l'absence des divers taxons animaux et végétaux, et qui varie avec l'altitude. Parallèlement aux facteurs écologiques, les interactions plantes-pollinisateurs sont donc susceptibles d'évoluer le long d'un gradient altitudinal (Sundqvist et al. 2013 ; Hoiss et al. 2015). Or la pollinisation croisée de la majorité des plantes alpines repose sur les insectes (Pojar 1974 ; Primack 1978 ; Arroyo et al. 1982 ; Bingham & Orthner 1998).

L'étude d'un phénomène le long d'un gradient altitudinal nécessite de dissocier deux catégories de paramètres abiotiques : ceux qui sont physiquement liés à l'élévation par rapport au niveau de la mer, et ceux qui ne le sont pas (Körner 2007). Dans la première catégorie, les plus importants sont les diminutions croissantes de surface disponible (Fig. 3.a) et de température annuelle moyenne quand l'altitude augmente, avec une perte d'environ 5.5°C à 6.5°C par étage de 1000 m (Anslow & Shawn 2002 ; Barry 2008). A chaque kilomètre la pression atmosphérique diminue également d'environ 11% (Peacock 1988), donc les quantités d'O₂ et de CO₂ décroissent pour un même volume d'air ; à l'inverse, le rayonnement solaire et la proportion d'UV-B augmentent (Iziomon & Mayer, 2002). Les conditions de vie sont donc plus rudes en altitude qu'en plaine, ce qui implique chez les insectes des adaptations métaboliques, développementales, et comportementales (Hodkinson 2005).

Bien que n'évoluant pas systématiquement en corrélation directe avec l'altitude, les paramètres de la seconde catégorie influencent aussi la présence et la survie des organismes. Parmi eux les précipitations ont tendance à augmenter le long du gradient altitudinal pour les montagnes des régions tempérées (Körner 2007 ; Barry 2008 ; Fig. 3.b) et donc les Alpes, où l'ensemble des données de la thèse ont été collectées. Il en va de même pour la force du vent (Hodkinson 2005) et la persistance de la couverture neigeuse (Laternser & Schneebeli, 2003), qui diminue significativement la durée de la saison favorable au développement des insectes (Coulson et al., 1995). Cela implique que globalement l'humidité du sol augmente avec
l'altitude, tandis que la durée de la belle saison décroit. Les patrons d'évolution de ces paramètres sont cependant très variables entre les différentes régions du globe, et en fonction de la topographie du massif montagneux considéré (Körner 2007). Selon que l'on se situe en climat tropical ou tempéré, et donc selon la latitude, ces tendances peuvent aller jusqu'à s'inverser, notamment pour les précipitations (Fig. 3.b).

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

**Figure 3.** Effets de l'altitude sur la surface de terrain disponible et les précipitations. (a) Répartition de la surface de terrain par pas de 100 m dans les Alpes, à partir de 1500 m au-dessus du niveau de la mer. (b) Tendances globales des niveaux de précipitations en fonction de l'altitude, pour deux zones latitudinales : T = Tempérée (lat. 40-60°), E = Equatorial (lat. 0-10°). Figures d'après Körner (2007) et Lauscher (1976).

Ces facteurs abiotiques impactent directement la croissance (Hodkinson 2005), les performances métaboliques (Dillon et al. 2010) et par conséquent la capacité de survie des animaux ectothermes que sont les insectes, limitant l'amplitude de leur distribution altitudinale. Il en va de même pour les plantes (Inouye 2000). Le long d'un gradient altitudinal, les variations des facteurs abiotiques s'accompagnent donc d'une modification progressive de l'environnement biotique pour chaque taxon (relations de compétition, prédation, mutualisme, parasitisme...). Les interactions interspécifiques sont ainsi susceptibles de changer avec l'altitude, et en particulier les interactions plantes-pollinisateurs qui engagent deux taxa éloignés sur le plan phylogénétique, et dont les réponses à l'altitude sont très différentes (Guo et al. 2013).
Les insectes ne réagissent pas tous de la même façon à ces changements

En entomologie, environ 75% des études sur les relations entre altitude et richesse spécifique révèlent une distribution unimodale (McCoy 1990 ; Rahbek 2005), avec un maximum souvent situé à l'étage montagnard autour de 1000m. L'altitude de ce pic peut varier selon l'hémisphère, la latitude, l'étendue du gradient, les valeurs des altitudes de ses points extrêmes, mais surtout le groupe taxonomique considéré (Guo et al. 2013). L'autre patron le plus fréquemment observé est une décroissance monotone de richesse spécifique tout le long du gradient. Il en résulte que, indépendamment de la montagne et du groupe d'insectes considérés, tous les pollinisateurs se raréfient au-delà d'une certaine altitude. Cependant, au sein des quatre ordres d'insectes qui totalisent la plupart des espèces anthophiles et donc pollinisatrices (Coléoptères, Diptères, Hyménoptères, Lépidoptères), on constate des différences notables de réponse à l'augmentation de l'altitude entre les différents clades (Mani 1968). Par exemple chez les Hyménoptères, la tendance générale pour toutes les familles d'abeilles (Apiformes) est une diminution nette de richesse et d'abondance le long du gradient, ce qui aboutit à leur absence aux plus hautes altitudes (Hoiss et al. 2012). Pourtant certaines espèces, notamment dans le genre *Bombus*, sont adaptées aux conditions montagnardes et prospèrent en zone alpine, où elles peuvent être d'importantes pollinisatrices (Moldenke 1979a).

Le long du gradient altitudinal, ces différences de réaction à l'altitude entre les groupes
anthophiles entrainent un changement de leurs proportions relatives dans la communauté des
pollinisateurs disponibles. Malgré le faible nombre de travaux sur le sujet, les grandes tendances
de ces patrons de variations, c'est-à-dire à l'échelle de l'ordre, semblent communes à l'ensemble
des montagnes du globe en ce qui concerne les richesses spécifiques (Fig. 4). En résumé, on
observe le long des gradients altitudinaux une diminution des proportions d'Hyménoptères et
de Coléoptères dans les fleurs, une réponse variable pour les Lépidoptères, et une augmentation
de la proportion des Diptères. Le groupe de pollinisateurs dominant en plaine, les abeilles,
semble donc remplacé progressivement par des mouches quand l'altitude augmente. Parmi les
nombreuses familles de Diptères floricoles, celles qui ont été observées dans les fleurs dans les
zones froides sont d'une part quelques familles de Nématocères contenant des espèces de très
petite taille (regroupées familièrement sous l'appellation de « moucherons » : Chironomidae,
Cecidomyiidae, Ceratopogonidae, Sciaridae, ...), et d'autre part des familles de Brachycères (les
mouches « vraies » : Anthonyiidae, Bombyliidae, Calliphoridae, Conopidae, Empididae,
Fannidae, Muscidae, Syrphidae, Tachinidae...). A ce jour une seule étude publiée, conduite
dans les Rocky Mountains au Colorado (U.S.A.), analyse les effets de l'altitude sur l'abondance
et la richesse des groupes de Diptères (Kearns 1992). Le point bas de ce gradient est à 2500m
d'altitude et les prairies subalpines apparaissent vers 3000m, ce qui rend difficile les comparaisons avec d'autres chaînes de montagnes où la zonation altitudinale est différente. Par exemple au-dessus de 2700m dans le sud des Alpes, la végétation est déjà quasi-inexistante (Fig. 5). L'évolution des communautés de pollinisateurs dans l'espace et le temps, particulièrement les Diptères censés représenter le groupe floricole majoritaire aux hautes altitudes, reste encore non documentée à l'heure actuelle dans la plupart des montagnes du globe.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 4.** Richesse spécifique relative des quatre principaux groupes d'insectes anthophiles par étage altitudinal. Figure modifiée et complétée à partir des données de Warren et al. (1988).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>
Dans un contexte où le réchauffement climatique commence à perturber non seulement la phénologie, la distribution géographique (latitudinale ou altitudinale) mais aussi la physiologie des espèces animales et végétales (Scaven & Rafferty 2013), la fonction écosystémique majeure qu'est la pollinisation se retrouve fragilisée. Elle engage en effet deux groupes d'êtres vivants, plantes et insectes, dont les réactions face aux perturbations environnementales peuvent être bien différentes, aboutissant à des changements dans la structure de leurs réseaux d'interactions. Les asynchronies temporelles (phénologie), spatiales (distribution) et fonctionnelles (physiologie) induites par le réchauffement peuvent en outre se combiner et précipiter la dégradation de telles associations mutualistes. Potentiellement, le nombre d'espèces d'angiospermes et d'insectes floricoles affectés directement par ces perturbations est déjà considérable; mais il faut en plus y ajouter la totalité des animaux qui sera obligatoirement, même si parfois indirectement, touchée par la diminution des produits de la pollinisation. Ces conséquences pourraient être dramatiques pour le fonctionnement des écosystèmes, et ne peuvent être anticipées qu'en améliorant notre compréhension des éléments structurant les réseaux de pollinisation. Les gradients altitudinaux représentent un cadre idéal pour de telles études : ils sont assimilables à des laboratoires en conditions naturelles, où il devient possible d'essayer de prédire les effets du réchauffement.

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**Figure 5.** Amplitude altitudinale du gradient échantillonné au cours de la thèse (barre orange) par rapport à la zonation altitudinale du sud des Alpes ; la vallée de l'Ubaye montre une zonation intermédiaire entre les Alpes centrales et les Préalpes du sud (Brousse et al. 2011).
## 1.3. Objectifs de la thèse

Ce travail est organisé en deux grands axes. Le premier axe a consisté à étudier la communauté anthophile dans son ensemble, par une analyse des éléments qui déterminent sa composition le long du gradient altitudinal. Le second axe s'est focalisé sur un groupe que le premier axe a révélé comme étant central dans cette communauté : les Empidinae. Nous l'avons utilisé comme groupe modèle pour étudier d'abord leur action pollinisatrice, souvent considérée négligeable chez les visiteurs non apoïdes, puis les origines évolutives de leur diversification en relation avec l'anthophilie et l'altitude.

* **Axe 1 – Structure des communautés anthophiles le long du gradient altitudinal**

Le premier objectif de cette thèse est d'analyser comment évolue la composition des communautés anthophiles en relation avec l'augmentation de l'altitude. Plus précisément, j'ai étudié les effets de l'altitude, du groupe taxonomique et de la phénologie sur 1) l'abondance des interactions plantes-visiteurs et 2) la richesse spécifique de ces visiteurs, le long d'un gradient altitudinal allant de 970 à 2700 m dans le sud des Alpes. J'ai également testé dans quelle mesure les espèces des groupes de butineurs majoritaires se partagent les fleurs disponibles à chaque altitude, et plus globalement le long du gradient. Ces analyses reposent sur des données collectées au cours de deux années consécutives, de mai à juillet 2014 et 2015, sur un total de 13 sites répartis tout le long du gradient. Afin que cet état des lieux puisse servir de référence, en particulier dans le cadre de travaux traitant des effets du réchauffement climatique sur les interactions plantes-pollinisateurs, j'ai suivi un protocole d'échantillonnage strict et reproductible durant toute l'étude. D'après le peu de littérature publiée sur le sujet, la seule hypothèse prédictive formulée était un remplacement des abeilles par divers groupes de diptères aux hautes altitudes. Cette étude est présentée dans la **PARTIE II**.

* **Axe 2 – Anthophilie chez les Empidinae : écologie et évolution**

Le second objectif consiste à évaluer l'importance relative du groupe modèle, les Empidinae, dans le réseau d'interactions plante-pollinisateurs d'une prairie subalpine. Cette prairie est très abondamment fleurie et riche en diptères floricoles, supposés être les acteurs majeurs de la pollinisation en altitude. Deux paramètres principaux sont à étudier pour évaluer l'importance d'un insecte dans la pollinisation d'une angiosperme : 1) la fréquence de ses visites, et 2) l'efficacité de chaque visite en termes de bénéfices apportés au succès reproducteur de la plante. J'ai donc d'abord comparé les fréquences de visite des Empidinae à celles des deux groupes
témoins les plus réputés pour leur activité pollinisatrice : les abeilles (Hymenoptera, Apoidea Apiformes) et les syrphes (Diptera, Syrphidae). Cette étude est présentée dans la **PARTIE III.1**. Ensuite, pour tester si les Empidinae sont des pollinisateurs efficaces comparativement aux autres visiteurs, j'ai sélectionné dans le réseau construit à l'étape précédente une plante qu'ils visitent fréquemment : *Geranium sylvaticum* L. (Geraniaceae). J'ai utilisé le nombre de graines produites par une fleur après une visite unique comme un estimateur de l'efficacité pollinisatrice de chaque espèce de butineur. J'ai conduit ces expériences matin et après-midi, dans différentes conditions d'exposition, et en attribuant différentes catégories de taille aux visiteurs, grâce à des manipulations d'isolement de fleurs par ensachage. Cette étude est présentée dans la **PARTIE III.2**.

Le troisième objectif de la thèse vise à analyser l'origine du succès des Empidinae en tant que pollinisateurs d'altitude, par l'analyse de leur histoire évolutive. J'ai plus précisément cherché à comprendre : 1) l'origine et l'historique de leurs interactions avec les Angiospermes, ainsi que l'évolution de la structure de leurs pièces buccales, pour estimer le rôle de la floricolie dans leur diversification ; et 2) l'origine de leur abondance en altitude. Ces analyses reposent sur une phylogénie moléculaire des Empidinae que j'ai construite sur la base de quatre marqueurs moléculaires, et dont l'échantillonnage taxonomique représente environ 15% des 2000 espèces décrites actuellement. Cette étude est présentée dans la **PARTIE IV**.
## I. 2. GROUPE MODELE : LES EMPIDINAE (DIPTERA, EMPIDIDAE)

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>*Empis tessellata* chargé de pollen sur *Sanguisorba minor* (Angleterre) - Photo : Heath McDonald</figcaption></figure>
I. 2. 1. Positionnement systématique et éléments de biologie

1. Article de vulgarisation scientifique paru dans Insectes :

Daugeron, C., and V. Lefebvre. 2014. Les Empidinés : une composante essentielle de l’entomofaune d’altitude. *Insectes* 172(1): 35-37.

https://www7.inra.fr/opie-insectes/pdf/i172-daugeron-lefebvre.pdf
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Par Christophe Daugeron et Vincent Lefebvre

# Les Empidinés : une composante essentielle de l'entomofaune d'altitude

Dans les prairies d'altitude du parc du Mercantour, les Diptères occupent une place de choix parmi les pollinisateurs. La sous-famille – nombreuse – des Empidinés en particulier, n'a gardé de ses ancêtres prédateurs que la particularité de capturer des proies en guise d'offrande sexuelle. Beaucoup sont nectarivores et grands transporteurs de pollen.

Les Empididés forment une famille de Diptères Brachycères de petite taille (1 à 12 mm) qui se divise en trois sous-familles (Clinocérinés, Hémérodromiinés et Empidinés) auxquelles s'ajoutent quelques genres isolés dont la position phylogénétique est encore incertaine.

Les Clinocérinés sont parrmi les Diptères prédateurs les mieux adap-

tés aux cours d'eau où ils s'installent souvent sur les rochers humides à la recherche de petites proies. Ils sont capables de chasser à la surface de l'eau, au sol et même en vol. Ils sont communs partout dans l'Hémisphère nord, rares sous les tropiques.

Les Hémérodromiinés, également prédateurs, ont une morphologie très caractéristique : les pattes an-

terieures sont ravisseuses et présentent une ou plusieurs séries d'épines en particulier sur la surface ventrale des fémurs. On les trouve principalement dans les milieux humides et ombragés des forêts tempérées et tropicales.

## ■ UNE VASTE SOUS-FAMILLE

Les Empidinés forment le groupe le plus diversifié, sans morphologie particulièrement spécialisée ; cependant on peut facilement les reconnaître grâce à leurs pièces buccales souvent allongées, à l'appareil reproducteur du mâle généralement très développé, et à leur pilosité souvent dense, en particulier sur
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>*Empis glandis* : accouplement après offrande d'une proie à la femelle (Afrique du Sud) - Cliché Cyrille D'Haese</figcaption></figure>

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>*Empis abdominalis* sur le sainfoin (*Onobrychis viciifolia*) (Parc national du Mercantour) - Cliché Vincent Lefebvre</figcaption></figure>

les pattes et le thorax. Ils ont colonisé toutes les zones tempérées ou froides de la Planète (l'ensemble de la Région holarctique, la Patagonie, l'Afrique du Sud, l'Australie du Sud-Ouest et du Sud-Est, Tasmanie comprise, la Nouvelle-Zélande) et la plupart des massifs montagneux, y compris ceux des zones tropicales. Quelques espèces sont même connues du Basin arctique (Alaska, Ellesmere, côtes du Groenland, Svalbard). Il existe cependant quelques groupes d'espèces qui se sont aussi adaptés aux forêts tropicales de basse altitude dans le bassin de l'Amazone, en Afrique tropicale, ou encore en Asie du Sud-Est. Cette sous-famille, traditionnellement divisés en deux tribus, Empidini et Hilarini, inclut plus de 2 000 espèces connues à travers le monde alors que les Clinocerinés et Hemerodromiinés comptent moins de 600 espèces à elles deux. Un grand nombre d'espèces restent à décrire y compris dans les régions historiquement très étudiées telles que l'Europe de l'Ouest ou l'Amérique du Nord.

## ■ SEXE ET OFFRANDE

La prise de nectar est un caractère dérivé des Empidinés, et il semble qu'au moins toutes les espèces d'Empidini soient des nectarivores obligatoires à des degrés divers alors que ce comportement est plus rare et probablement accessoire chez les Hilarini. Dans tous les cas la prédation a été conservée durant la période de reproduction

pendant laquelle les individus se regroupent en essais d'une dizaine à plusieurs centaines d'individus selon les espèces : les mâles collectent des proies qui sont offertes aux femelles au moment de l'accouplement. Les Empidini attrapent des insectes vivants de taille variée, dont la femelle se nourrira

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Mâles d'Empis animosa, chargés de leurs proies, s'apprêtant à convoler (Chili) - Cliché Cyrille D'Haese</figcaption></figure>

pendant l'accouplement, alors que les Hilarini collectent plutôt des insectes morts de petite taille flottant à la surface de l'eau (rivières, étangs...). Grâce à des glandes séricigènes présentes dans leurs pattes antérieures, les mâles d'Hilarini emballent leur offrande dans un cocon de soie. Parfois, ils se contentent d'offrir un cocon vide. Selon les hypothèses actuelles, le comportement d'offrande serait apparu conjointement à la nectarivorie, afin d'assurer aux femelles l'apport des protéines nécessaires à la maturation des œufs. Secon-

dairement la nectarivorie aurait disparu (la plupart des Hilarini) et le comportement de cour se serait ritualisé ; dans ce cas l'offrande est constituée d'un insecte mort ou d'un objet non comestible (tel qu'une graine) emballé dans la soie, ou encore d'un cocon vide, et possède une valeur nutritive faible ou nulle ; elle joue alors uniquement le rôle d'un caractère sexuel secondaire permettant d'attirer les femelles.

La prise de nourriture n'est donc probablement pas obligatoire pour les adultes de nombreux Hilarini ; les réserves accumulées durant la vie larvaire étant suffisantes au moins chez le mâle, alors que des mécanismes physiologiques complexes se sont peut-être mis en place chez la femelle afin de permettre la production d'œufs sans apport protéique externe (autogénie).

Dans les essais les femelles ont le choix entre de nombreux mâles pour s'accoupler, et la qualité de l'offrande associée à la qualité du vol est souvent l'un des principaux critères de sélection du partenaire sexuel. Dans certains cas le comportement de cour est inversé : les femelles courtisent et les mâles choisissent leur partenaire sexuel ; dans ce cas ce sont les femelles, qui présentent des caractères sexuels secondaires (soies plumeuses sur les pattes, ailes élargies, sacs abdominaux, couleurs métalliques) afin de séduire les mâles.
## DES POLLINISATEURS ESSENTIELS

L'inventaire biologique généralisé réalisé dans le Mercantour a été une occasion unique d'améliorer nos connaissances sur la biodiversité des Empidinés en zone d'altitude. Les collectes ont été effectuées principalement au piège Malaise entre mai et octobre sur les communes de Valdeblore, Saint-Martin-de-Vésubie et Saint-Dalmas-le-Selvage (col de Salèse, Le Boréon, vallons de Sestrière et de Saint-Dalmas) en 2009, de Saorge (forêt de Caïros) en 2010, de Meyronnes et Larche (col de Larche) en 2011. Des collectes complémentaires ont eu lieu en 2012 et 2013 aux cols de la Bonnette, Vars et la Cayolle. Pour le moment seuls les Empidini ont été étudiés avec environ 80 espèces inventoriées, dont au moins 4 nouvelles pour la science.

En 2012 nous avons mené une étude davantage orientée sur l'impact pollinisateur des Empidinés en altitude. Cette étude a eu lieu entre la fin mai et la mi-juillet au col de la Bonnette sur le plateau des Meyries à 1 800 m, dans le nord du parc (commune de Jausiers). Il s'agit d'une prairie parsemée de mélèzes âgés, fauchée tardivement. Le nombre de visites des différents pollinisateurs a

été suivi pour 23 espèces de plantes à fleurs. Nos analyses ont montré que les Diptères, et plus particulièrement les Empidinés étaient les principaux visiteurs. Par exemple, en comparant les Empidinés aux seuls abeilles et bourdons, nous avons trouvé que les premiers étaient les principaux visiteurs de 11 des 23 espèces de plantes étudiées alors que les seconds étaient les visiteurs ma-

joritaires de seulement 5 espèces. Par leur diversité et leur abondance, les Empidinés sont sans aucun doute une composante majeure de l'entomofaune d'altitude ; si on y ajoute leur impact pollinisateur, ils sont aussi un élément clé du fonctionnement des écosystèmes alpins. De ce point de vue ils apparaissent aujourd'hui comme un modèle d'étude particulièrement intéressant pour comprendre le rôle joué par les facteurs écologiques et historiques dans la mise en place des relations entre les plantes à fleurs d'altitude et les pollinisateurs. Ils devraient nous aider à mieux expliquer la transition des Hyménoptères aux Diptères le long du gradient altitudinal.

À l'heure où les populations de l'Abeille domestique connaissent un déclin sans précédent, il devient particulièrement pertinent d'étudier l'impact de ces pollinisateurs traditionnellement considérés comme secondaires. ■

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Grains de pollen retenus dans la pilosité d'une patte d'Empidiné. En bas, détail.</figcaption></figure>

Cliché Julien Cillis et Christophe Daugeron

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Empis liberalis sur une fleur en Patagonie chilienne - Cliché Steve Marshall</figcaption></figure>

## Contact

Muséum national d'Histoire naturelle, Institut Systématique, Évolution, Biodiversité, UMR 7205 MNHN, CNRS, UPMC, EPHE, 45 rue Buffon, CP 50, 75005 Paris

Courriel : daugeron@mnhn.fr
## 2. Description de deux nouvelles espèces du Mercantour

**Daugeron, C. and V. Lefebvre.** 2015. Description of two new species of Empidinae Rondani, 1841 (Diptera: Empididae) from the Mercantour National Park, France.

*Zoosystema* 37(4): 605-610. http://dx.doi.org/10.5252/z2015n4a6

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Les deux sous-genres auxquels appartiennent les deux nouvelles espèces décrites dans l'article : *Rhamphomyia* (*Lunstroemiella*) sp. (haut, cliché Françoise Vaselli) et *Empis* (*Xanthempis*) sp. (bas, cliché V. Lefebvre)</figcaption></figure>
# Descriptions of two new species of Empidinae Schiner, 1862
(Diptera: Empididae) from the Mercantour National Park,
France

Christophe DAUGERON
Vincent LEFEBVRE

Institut de Systématique, Évolution, Biodiversité,
ISYEB, UMR 7205, MNHN, CNRS, UPMC, EPHE,
Muséum national d'Histoire naturelle, Sorbonne Universités,
case postale 50, 57 rue Cuvier, F-75231 Paris cedex 05 (France)
daugeron@mnhn.fr

Published on 31 December 2015

urn:lsid:zoobank.org:pub:CD1DF64F-8103-4ADB-9B75-73BCB99A68AB

Daugeron C. & Lefebvre V. 2015. — Descriptions of two new species of Empidinae Schiner, 1862 (Diptera: Empididae) from the Mercantour National Park, France, in *Daugeron C., Deharveng L., Isaia M., Villemant C. & Judson M. (eds), Mercantour/Alpi Marittime All Taxa Biodiversity Inventory*. *Zoosystema* 37 (4): 605-609. http://dx.doi.org/10.5252/z2015n4a6

## ABSTRACT

Two new species of Empidinae Schiner, 1862, belonging to the tribe Empidini Collin, 1961, are described. *Empis (Xanthempis) fusca* n. sp. was collected as part of the All Taxa Biodiversity Inventory (ATBI) conducted in the Mercantour National Park between 2009 and 2011, while *Rhamphomyia (Lundstroemiella) brevis* n. sp. was collected in autumn 2013 at 2100 m in one of the highest passes in Europe (Col de la Bonette).

## KEY WORDS

Mercantour National Park,
All Taxa Biodiversity Inventory
(ATBI),
Alps,
new species.

## RÉSUMÉ

*Description de deux espèces nouvelles d'Empidinae Schiner, 1862 (Diptera: Empididae) collectées dans le Parc national du Mercantour.*

Deux espèces nouvelles d'Empidinae Schiner, 1862, appartenant à la tribu des Empidini Collin, 1961 sont décrites : *Empis (Xanthempis) fusca* n. sp. a été collectée dans le cadre de l'Inventaire biologique généralisé mis en place dans le Parc national du Mercantour entre 2009 et 2011, alors que *Rhamphomyia (Lundstroemiella) brevis* n. sp. a été collectée à l'automne 2013 à 2100 m d'altitude dans l'un des plus hauts collets d'Europe (col de la Bonette).

## MOTS CLÉS

Parc national du Mercantour,
Inventaire biologique généralisé
(IGB),
Alpes,
espèces nouvelles.
## INTRODUCTION

Empidinae Schiner, 1862, (Diptera Linnaeus, 1758: Empididae Latreille, 1804), or empidine dance flies, form a strongly diversified subfamily of more than 2000 species. Their distribution is worldwide, with the exception of Antarctica, and they are especially found in temperate areas (Holarctic, Patagonia, South Africa, South Western and South Eastern Australia [including Tasmania] and New Zealand) and most mountainous regions of the world, where they probably play a key role as pollinators (Lefebvre et al. 2014). The number of species found in these areas is so large that the biodiversity of the group is only partially known, even in historically well-studied regions (Europe and North America).

The All Taxa Biodiversity Inventory (ATBI) conducted in the Mercantour National Park was an opportunity to sample the subfamily in an area where the climate and topography are particularly suitable for this group. Among the material collected during the ATBI (2009-2011) and several field trips that followed (2012-2014), a number of species were identified as new. The aim of this paper is to describe two of them, belonging to the tribe Empidini Collin, 1961.

## MATERIAL AND METHODS

This study is primarily based on the material collected with Malaise traps in the framework of the "Terrestrial Invertebrates fieldwork module" of the ATBI Mercantour project between 2009 and 2011 (Deharveng et al. 2015) which greatly contributed to the biodiversity inventory undertaken in this national park (Villemant et al. 2015, this issue). Additional collections were made in or near the Park in spring and summer of 2012 and 2014, and the spring and autumn of 2013.

Morphological terminology follows McAlpine (1981), except for the antennal structure, which follows Stuckenberg (1999). Interpretation of male genital scleres is based on Daugeron (1997). Male genitalia were dissected and then macerated in hot 10% KOH, positioned in glycerine and drawn using a camera lucida.

All the material studied in this work is deposited in the Diptera collection of the Muséum national d'Histoire naturelle.

### ABBREVIATIONS

#### *Abbreviations used in the figures*

cer cercus;

epn epandrium;

ej ap ejaculatory apodeme;

hyp hypandrium;

ph phallus.

#### *Institution*

MNHN Muséum national d'Histoire naturelle, Paris.

## SYSTEMATICS

Order DIPTERA Linnaeus, 1758

Family EMPIDIDAE Latreille, 1804

Subfamily EMPIDINAE Schiner, 1862

Genus Empis Linnaeus, 1758

Subgenus Xanthempis Bezzi, 1909

*Empis (Xanthempis) fusca* n. sp.

(Figs 1, 2)

**TYPE MATERIAL.** — *Holotype*. Male, France, Larche (04), forêt de Boisset, Larch forest, 1986 m, 44.422731°N, 6.878456°E, 24.VI-8. VII.2011, Malaise trap (M11-LAR2000T3-M2), MNHN.

**Paratypes.** 23 ♂, 11 ♀, same data; 15 ♂, 24 ♀, same data except (M11-LAR2000T3-M1); 10 ♀, same data except 26.V-9.VI.2011 (M11-LAR2000T1-M2), MNHN.

**ETYMOLOGY.** — From the Latin word *fuscus*, *a*, *um* meaning *dark*, with reference to the unusual dark blackish-brown colour of this *Xanthempis* species.

### DESCRIPTION

Species of medium size; thorax blackish; abdomen, including male hypopygium, entirely brown (phallus and lower part of epandrial lamella yellowish); fore-femur bicolour, brown dorsally to yellow ventrally.

### Male

**Head.** Occiput blackish, with 2 rows of rather strong, short setae. Ocellar triangle not very prominent, with a pair of fine, short setae. Antenna blackish, postpedicel long, stylus black and short. Frons as broad as face, with minute bristly hairs along margins of eyes. Dichoptic, all ommatidia of equal size. Gena narrow but visible, dark brown. Labrum yellowish, 1.5 × longer than head height, labium brownish, labella thick, with distinct setae, palpus yellow with a few short, bristly hairs.

**Thorax.** Dark, blackish-brown. Antepronotum bilobed, with about 6-7 rather strong, short setae on each side. Proepisternum bare, prosternum with a few yellowish, bristly hairs. Strong, long setae as follows: 1 postpronotal, 1 notopleural, 1 postalar, 2 scutellars. Acrostichals absent, dorsocentrals uniserial, distinct, short, ending in 2 stronger, longer setae in prescutellar depression. 1 finer, shorter notopleural. Laterotergite with fan of 5-6 strong, long setae.

**Wing** (about 5.5 mm). Rather clear, tinted brown with faint brown stigma, veins brown except for the yellowish base of Sc and R1. Halters whitish. A1 complete. Anal lobe not strongly developed, anal angle obtuse.

**Legs.** Coxae yellow, weakly brownish basally, trochanter yellowish-brown. Fore femur distinctly bicolour: dark brown dorsally, yellow ventrally. Mid and hind femora brown. Foretibia yellowish brown at base to dark brown apically. Mid and hind tibiae brownish, darker apically. All tarsi dark, blackish-brown. Legs covered with setulae, fore and mid tibiae with a few more distinct dorsal setae, never longer than tibia depth.

**Abdomen.** Entirely brownish, with very short, pale setae; stronger, longer blackish setae at posterior margin of segment 8.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>FIG. 1. — Empis (Xanthempis) fusca n. sp. Male habitus, paratype. Length: about 6 mm.</figcaption></figure>

**Hypopygium** (Fig. 2). Very similar to those of *E. (X.)* *semicinerea* Loew, 1867, *E. (X.)* *pseudosemicinerea* Daugeron, 2000 and *E. (X.)* *styriaca* Strobl, 1893, but entirely brown except for the yellowish phallus and the yellow lower part of the epandrial lamella. Cercus cleft posterodorsally, epandrial lamella somewhat rectangular, with distinct ventral setae, hypandrium bare, truncate at tip.

**Female**

Similar to male, except for usual sexual differences.

**REMARKS**

The subgenus *Xanthempis* has been intensively investigated during the past twenty years (Chvála 1994, 1996; Daugeron 1997, 2000, 2009; Shamshev 1998, 2007; Shamshev & Kus-

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>FIG. 2. — Empis (Xanthempis) fusca n. sp. Male hypopygium in lateral view. Scale bar: 0.35 mm.</figcaption></figure>

tov 2008) and the new species described here can be easily compared with the other known species using the extensive bibliography. This species is closely related to the greyish *Xanthempis* species found in the Alps, such as *E. (X.)* *styriaca*, *E. (X.)* *semicinerea* and *E. (X.)* *pseudosemicinerea* (see Daugeron 2000), which all have very similar male genitalia. However *E. (X.)* *fusca* n. sp. can be distinguished from them by its blackish thorax, entirely dark brown abdomen and bicoloured fore femur.

Genus *Rhamphomyia* Meigen, 1822

Subgenus *Lundstroemiella* Frey, 1922

*Rhamphomyia (Lundstroemiella) brevis* n. sp.
(Figs 3, 4)

**TYPE MATERIAL.** — **Holotype.** Male, France, Parc national du Mercantour, Col de la Bonette, Larch forest, 2100 m, 44°21′32.90″N, 6°47′03.16″E, 01.X.2013, MNHN.

**Paratypes.** 7 ♂, 5 ♀, same data; 7 ♀, same data, except 3.X.2013, MNHN.

**ETYMOLOGY.** — From the Latin word *brevis*, *e*, meaning *short*, with reference to the very short, C-shaped phallus of this species.

**DESCRIPTION**

Greyish to brown species with postpedicel elongated, male eyes dichoptic, legs dark brown to yellowish. Male genitalia closed with short phallus concealed between epandrial lamellae.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>FIG. 3. — *Rhamphomyia* (*Lundstroemiella*) brevis n. sp. Male habitus, holotype. Length: about 5 mm.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>FIG. 4. — *Rhamphomyia* (*Lundstroemiella*) brevis n. sp. Male hypopygium in lateral view. Scale Bar: 0.1 mm</figcaption></figure>

### Male

**Head.** Occiput greyish, with distinct, black, postocular setae. Ocellar triangle prominent, with pair of distinct setae. Eyes dichoptic, all ommatidia of equal size. Frons broader than face, greyish, with bristly hairs along eye margin. Face greyish, bare. Antenna blackish, postpedicel elongated, stylus very short. Proboscis dark brown, labrum as long as head height, labium very thick, with labella bearing distinct fine setae, palpus blackish with distinct short setae.

**Thorax.** Antepronotum and proepisternum without distinct setae, prosternum with a few fine, short, yellowish setae. Scutum greyish. Acrostichals absent, dorsocentrals uniserial, strong, rather short, longer in prescutellar depression. Strong, long black setae as follows: 1 postpronotal, 1 anterior and 1 posterior supra-alars, 1 notopleural, 1 postalar, 4 scutelars. Notopleuron with 2 additional, finer, shorter setae. A

few short anterior postpronotals. Laterotergite with fan of a few yellowish fine setae.

**Wing** (about 4.5 mm). Clear, with brown stigma. Anal lobe feebly developed, with anal angle very obtuse. R4+5 unforked. CuA1 (M3) distinctly stronger than M1 and M2. Halter whitish.

**Legs.** Coxae dark brown yellowish with distinct anterior yellowish setae. Femora dark brown to yellowish ventrally, tibiae dark brown, sometimes yellowish basally, tarsi dark, blackish-brown. All legs with only setulae, except for a few more distinct apical setae on femora.

**Abdomen.** Dark brown to blackish, with fine, rather short, whitish setae, marginal setae of tergites longer.

**Hypopygium** (Fig. 4) blackish. Cercus simple, small, without distinct seta, only short bristly hairs. Epandrial lamella subrectangular, with a few fine, short setae. Hypandrium simple, not divided into two lamellae, bare. Phallus yellowish, very short, C-shaped, concealed between epandrial lamellae and cerci.

### Female

Similar to male, except for the usual sexual differences and the following characters: setae finer and shorter, especially on abdomen; wing tinted slightly brown.

### REMARKS

This species of the subgenus *Lundstroemiella* was probably overlooked until now because of its occurrence in autumn; Barták (1985, 1999, 2006) did not mention any species of this subgenus occurring in October. *Rhamphomyia* (*L.*) brevis n. sp. can only be compared to *R. (L.*) magellensis* Frey, 1922, as the two species have their male genitalia closed with the phallus short and thick, concealed between epandrial lamellae, and the hypandrium simple and bare. The remaining *Lundstroemiella* species have their male genitalia more or less open, with the phallus long, thin and partly visible (see Barták 1985, 1999, 2006). However, *R. (L.*) brevis* n. sp. and *R. (L.*) magellensis* can be distinguished by
their very different coloration: the first is greyish to brown including brownish legs, while the second has yellowish legs, bicoloured brown/yellow tergites and only the thorax entirely brownish-black.

## Acknowledgements

The All Taxa Biodiversity Inventory + Monitoring Mercantour/Alpi Marittime project was launched by the European Distributed Institute of Taxonomy (EDIT) (2006-2011).

The ATBI was coordinated by M.-F. Leccia (Mercantour National Park) and M. De Biaggi (Parco Naturale Alpi Marittime), who provided the relevant permits.

Some specimens studied in this paper were collected as part the Terrestrial Invertebrates Module, coordinated by the Muséum national d'Histoire naturelle, during which Malaise trap samples were obtained by J. Molto, M. Torjman and E. Minssieux (Mercantour National Park) and sorted to family level by M. Czyrnek and T. Théry (MNHN).

We also thank Jean-Luc Printemps (Centre Séolane, Barcelonnette), Emmanuel Delfosse (MNHN), and Patrick Grootaert and Igor Shamshev for their helpful comments on the manuscript.

This work received support from the National Research Agency under ANR-10-LABX-0003-BCDiv as part the program No. ANR- IDEX-11-0004-02.

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Submitted on 19 March 2015;
accepted on 17 July 2015;
published on 31 December 2015.
I. 2. 3. <u>Anthophilie chez les Empidinae : revue synthétique</u>

Sur la base d'observations menées en Grande-Bretagne avec son fils, Darwin (1862 ; 1870)
avait déjà reconnu les Empis comme des pollinisateurs importants de plusieurs espèces
d'orchidées. A la même période, son ami et correspondant allemand Hermann Müller (1873)
constatait que les Empidinae visitent et très probablement pollinisent de nombreuses fleurs
dans les Alpes. Depuis, les mentions de visites de fleurs par les Empididae se sont
accumulées dans l'abondante littérature traitant des interactions entre angiospermes et
insectes anthophiles. Environ 170 espèces (dont 81 dans le genre Empis et 62 dans le genre
Rhamphomyia) sont associées à plus de 300 espèces de plantes à fleurs, réparties dans 50
familles différentes. Ces chiffres qui synthétisent les données de 48 publications sont largement
sous-estimés pour les Empidinae, puisque dans beaucoup d'articles les identifications s'arrêtent
à la famille, rendant impossible l'évaluation du nombre de genres et d'espèces masqués sous la
détermination « Empididae ». Dans une moindre mesure, c'est aussi le cas pour les plantes
visitées quand les taxons sont identifiés seulement au genre ou à la famille. En regard de la
diversité spécifique estimée des Empidinae (plus de 2000 espèces déjà décrites, mais des
centaines d'espèces au moins sont encore à décrire ; Marshall 2012), ces chiffres sont toutefois
remarquablement faibles. Ils n'intègrent par exemple aucune donnée en zone tropicale ni dans
tout l'hémisphère sud (à l'exception du cas australien traité dans le paragraphe suivant), où
l'on sait pourtant que les Empidinae sont présents et visitent les fleurs (comm. pers. C.
Daugeron). Ainsi, alors que l'activité floricole et/ou pollinisatrice des Empidinae est
documentée et considérée comme cruciale dans les régions froides où les autres pollinisateurs
sont peu abondants, on ne connait étonnamment rien de leur place dans les réseaux de
pollinisation de la majorité des écosystèmes du globe.

Toutefois fin 2016, dans le sud-est de l'Australie (état de Victoria), un cas exceptionnel
d'interaction Empidinae-Angiosperme a été découvert chez une orchidée du genre *Pterostylis*.
La plupart des espèces de ce genre se font polliniser en attirant de petits diptères appartenant
à deux familles, les Mycetophilidae et les Sciaridae (Kuiter 2016). Mais l'espèce *Pterostylis
plumosa* Cady leurre les mâles d'une espèce d'Empidinae, qu'elle attire à la fois visuellement
et chimiquement, à l'aide de kairomones supposées très semblables à celles émises par les
femelles. Les mâles s'approchent de la fleur, puis essaient d'offrir une proie qu'ils tiennent entre
les pattes à l'excroissance apicale aplatie et colorée du labelle de la fleur (Fig. 6.a). Cette
excroissance s'agite au moindre souffle d'air, et ils la confondent probablement avec une femelle
en vol qui cherche à s'accoupler. En pliant sous le poids des deux insectes, le labelle révèle une
ouverture dans la colonne formée par le lobe supérieur de l'orchidée (ou galéa, Fig 6.b). Si le mâle s'y engouffre, le labelle se redresse et obture de nouveau l'entrée de la galéa. Pour ressortir, il est alors obligé de remonter la colonne, frottant son thorax successivement au pistil puis aux pollinies de la fleur. Si l'individu avait déjà visité une autre fleur de cette espèce et s'était collé des pollinies sur le thorax (Fig. 1.c), il pollinise alors la fleur. Il se colle éventuellement des pollinies sur le thorax, si celles de la fleur visitée sont encore présentes.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 6.** (a) *Empis* sp. mâles en vol d'approche autour du labelle de la fleur, tenant dans leurs pattes les offrandes (proies) destinées aux femelles pour l'accouplement ; (b) intérieur de la galéa de *P. plumosa*, avec les pollinies visibles en haut de la colonne ; (c) un mâle sans proie mais avec des pollinies collées sur le thorax, après être ressorti de la fleur de l'orchidée. Photos : (a) et (b) Rudie Kuiter ; (c) Neil Blair (toute première photographie d'un pollinisateur de *P. plumosa*).</figcaption></figure>

Les données d'interactions Empidinae-Angiospermes issues de la synthèse bibliographique de ce chapitre, complétées par celles de la thèse et quelques observations communiquées par différents collègues, sont synthétisées dans le tableau de l'Annexe 2. La particularité du mutualisme Empidinae-Angiospermes est qu'à quelques exceptions près, qui demanderaient à être confirmées par d'autres observations, ces derniers ne visitent les fleurs que pour le nectar, et ne consomment pas de pollen. Chez les Empidini les pièces buccales, très fines et allongées par rapport à celles de la plupart des autres groupes de diptères floricoles (à l'exception notamment des Bombyliidae), ne permettent probablement pas l'absorption du pollen. Ce type de régime nectarivore serait lié à leur comportement de cour, unique chez les diptères, où le mâle chasse et offre une proie à la femelle juste avant l'accouplement. Les protéines nécessaires au développement des œufs seraient alors consommées par la femelle durant la copulation, de sorte que la consommation de pollen ne serait pas nécessaire.
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## I. 3. CADRE DE L'ETUDE : LE NORD DU MERCANTOUR

L'intégralité du travail de terrain a été effectué dans les Alpes-de-Haute-Provence (04), aux environs immédiats de la vallée de l'Ubaye qui est la plus septentrionale du Parc National du Mercantour (Fig. 7.a). Ses altitudes minimales et maximales sont de 800 m et 2655 m, avec plusieurs pics dépassant 3300 m. La ville principale de la vallée qui est aussi la sous-préfecture du département, Barcelonnette, a vu une partie de ses anciennes casernes militaires rénovées en un centre d'hébergement remarquablement équipé pour chercheurs scientifiques, le centre Séolane. J'y ai logé pendant deux « saisons » d'environ 3 mois en 2014 et 2015, durant la période couvrant le pic de floraison tout le long du gradient (de Mai à Juillet). Le laboratoire très spacieux m'a permis d'effectuer une partie du travail d'entomologie, principalement le tri et le conditionnement des insectes à l'ordre ou à la famille, chaque jour immédiatement après les sessions d'échantillonnage sur le terrain (Fig. 7.b).

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 7.** (a) Localisation de la vallée de l'Ubaye dans le Parc National du Mercantour ; (b) Tri à l'ordre des insectes récoltés durant la journée d'échantillonnage, le soir au laboratoire de Séolane.</figcaption></figure>

Outre les importantes variations topographiques favorisant les études le long de gradients altitudinaux, le choix de cette localité pour étudier les interactions fleurs-insectes en relation avec l'altitude s'est imposé naturellement pour deux raisons principales. D'abord, cette région des Alpes est à la fois un hotspot de biodiversité et une zone de fort endémisme pour les angiospermes (Casazza et al. 2007), l'une des plus importantes de tout le bassin méditerranéen (Médail & Quézel 1997). Le parc du Mercantour affiche même une statistique impressionnante, concentrant 42% de la flore indigène de la métropole française sur 0,4% de la surface de son
territoire (Noble & Diadema 2012). La vallée de l'Ubaye en particulier est riche d'une exceptionnelle diversité botanique et entomologique, étant soumise à la fois aux rudesses du climat montagnard et aux influences méditerranéennes qui lui assurent une moyenne de 300 jours d'ensoleillement par an (Brousse et al. 2011). Le choix du nord du Mercantour se justifie également par notre connaissance du groupe modèle et plus globalement de l'entomofaune dans cette région. En effet, à partir de 2007, un inventaire biologique généralisé (IBG, ou ATBI pour « All Taxa Biodiversity Inventory ») a été conduit pendant plusieurs années dans les limites du Parc. Les Empidinae, mais aussi plusieurs autres groupes majeurs de floricoles (syrphes, abeilles...) faisaient partie des taxons d'insectes étudiés (Deharveng et al. 2015). L'effort d'échantillonnage et les méthodes de piégeage utilisées au cours de l'ATBI n'ont certainement pas permis de détecter toutes les espèces appartenant à ces groupes et habitant cette partie des Alpes, mais les données collectées constituaient un état de référence de leur diversité spécifique dont nous n'aurions pas pu profiter ailleurs.

Les 13 sites d'étude, à l'exception du point inférieur du gradient situé à une altitude basse qu'on ne trouve qu'à l'entrée de la vallée, étaient distribués soit le long de la route du col de la Cayolle (2330 m), soit à proximité de la plus haute route d'Europe, qui mène au col de Restefond (col de la Bonette, 2715 m ; cf. carte Annexe 1). L'amplitude altitudinale du gradient constitué par ces sites est d'environ 1700 m (de 970 à 2660 m). Dans l'étude des interactions plantes-pollinisateurs, il s'agit à notre connaissance du gradient altitudinal le plus étendu et avec le grain (différence d'altitude entre deux sites consécutifs) le plus fin jamais réalisé sur une aire géographique homogène en termes de faune et de flore. Seule l'étude réalisée pendant de nombreuses années en Californie par Moldenke (1976) comprend des altitudes plus basses et plus hautes, mais elle concerne des sites distants entre eux de plusieurs centaines de kilomètres. Cela rend très difficile voire impossible de séparer l'effet « distance géographique » de l'effet « altitude » dans la caractérisation des changements des communautés de floricoles.

Dans la mesure du possible, le mode de gestion des prairies d'étude sélectionnées était la fauche tardive. Effectuée bien après le pic de floraison, elle permet à beaucoup d'espèces d'angiospermes de former et de disséminer leurs graines. Toutefois la majorité des prairies du Mercantour souffrent de surpâturage, particulièrement en Ubaye (Evin 2005) ; il n'a donc pas été possible de trouver de prairies non pâturées à certains étages altitudinaux, en général à partir de 2000 m. Cela ne signifie pas que les prairies d'étude ont été pâturées pendant la période d'échantillonnage (à ces altitudes le passage des moutons est tardif), mais que les zones concernées sont généralement moins riches en plantes à fleurs. Elles sont en effet partiellement
envahies par les « refus », ces espèces résistantes délaissées par les herbivores, comme sur le site S08 à environ 2100 m (Fig. 8). Même à court terme, les conséquences de cette pression de

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

**Figure 8.** Effets du surpâturage sur une pelouse subalpine (site S08, début de saison, altitude 2086m). La mosaïque des touffes de *Patzkea paniculata* (anciennement dans le genre *Festuca*) se densifie d'année en année car cette espèce fait partie des refus, plantes non broutées par les moutons en raison de leur rigidité après le stade de première pousse.

pâturage sont dramatiques. Les prairies du col de Vars, par exemple, ont vu leur richesse spécifique botanique s'effondrer sous l'effet du pâturage ovin, passant de 62 espèces sur 4m² en 1962 à seulement 5 espèces pour la même unité de surface en 2001 (Evin 2005). Elles constituent malheureusement un exemple représentatif d'une grande partie des pâturages du Mercantour. Parmi les sites d'étude choisis, le site S08 (Fig. 8) était le seul concerné. Sur tous les autres sites, les transects ont été effectués dans des quadrats ne montrant pas ou peu de signes de surpâturage (Fig. 9). A l'exception des sites les plus hauts sous gestion communale, toutes les prairies d'études étaient privées et j'ai donc dû discuter plus ou moins longtemps avec les éleveurs pour obtenir l'autorisation d'échantillonner les pollinisateurs sur leurs terrains.
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 9.** Quatre des 13 sites d'études, situés à 4 altitudes différentes : (a) 1200 m; (b) 1800 m; (c) 2350 m, col de la Cayolle; (d) 2660m, col de la Bonette (= col du Restefond).</figcaption></figure>
# PARTIE II

STRUCTURATION DES COMMUNAUTES
ANTHOPHILES LE LONG D'UN GRADIENT
ALTITUDINAL
## II. Structuration spatiale, temporelle et trophique de l'entomofaune floricole le long d'un gradient altitudinal

Lefebvre, V., Villemant, C., Fontaine, C. and C. Daugeron. 2017.

Altitudinal, temporal and trophic partitioning of flower-visitors in Alpine communities.

Article soumis à *Ecography*.
Altitudinal, temporal and trophic partitioning of flower-visitors
in Alpine communities

Vincent Lefebvre<fnref n="1" />, Claire Villemant<fnref n="1" />, Colin Fontaine<fnref n="2" /> and Christophe Daugeron<fnref n="3" />

**Corresponding author** : Vincent Lefebvre, Muséum national d'Histoire naturelle, ISYEB (UMR 7205), 45 rue Buffon, CP 50, 75005 Paris, France. E-mail :
[vincent.lefebvre@mnhn.fr](mailto:vincent.lefebvre@mnhn.fr) (ORCID : 0000-0002-6829-1938)

**Keywords:** Elevation gradient, pollination, alpine ecosystems, Alps, Diptera

<footnote n="1">¹ Muséum national d'Histoire naturelle, ISYEB, UMR 7205 MNHN, CNRS, UPMC, EPHE, 45 rue Buffon, CP 50, 75005 Paris, France</footnote>

<footnote n="2">² Muséum national d'Histoire naturelle, CESCO, UMR 7204 MNHN, CNRS, UPMC, 55 rue Buffon, 75005 Paris, France</footnote>

<footnote n="3">³ Muséum national d'histoire naturelle, Centre National de la Recherche Scientifique, Mécanismes adaptatifs et évolution, UMR 7179 MNHN-CNRS MECADEV, CP 50, 45 rue Buffon, 75005 Paris, France.</footnote>
Abstract

Although most alpine angiosperms depend on the flower-visiting entomofauna to achieve cross-pollination, the elevational distribution of anthophilous insects is limited by the harshness of high-altitude climatic environment. In the context of global warming, altitudinal gradients are open-sky laboratories allowing studying the expected changes in temporal (phenologies) and spatial (altitudinal) distribution of both plant and animal species. However, we are still largely unaware of how pollinator communities and their interactions with plants currently change with elevation and during the favourable season along altitudinal gradients. This makes the detection of endangered interactions and species challenging. In this study, we aimed at providing such a reference, and tested if and how the major flower-visiting insect orders and families segregated by altitude, phenology and foraging preferences along an elevational gradient from 970 m to 2700 m in the southern Alps. The data set includes two consecutive years of collection at 13 different sites along the gradient. Due to their unusual patterns of abundance and species richness, flies were the main potential pollinators from 1500 m to the upper end of the gradient, while bees and beetles decreased with increasing elevation. Diptera, Coleoptera and Hymenoptera had similar phenologies, but differed significantly in their use of floral resources. Within Diptera, the predominant group, major families segregated by both phenology and foraging preferences along the gradient. Empidids, muscids and anthomyiids, whose role in pollination has never been investigated, dominated the upper part of the gradient. Our results thus suggest that flies and the peculiar plants they visit might be particularly at risk under global warming, and highlight the blatant lack of studies about critical components of these rich, yet fragile mountain ecosystems.
# 1. Introduction

Mountains are biodiversity hotspots with high endemism that harbour one-quarter of terrestrial life, including a remarkably high plant richness in alpine life zones (Spehn et al. 2010). This proves especially true for angiosperms in the southern Alps (Casazza et al. 2008), whose specific diversity is now well documented (Barbero 2003). Most of these alpine flower-plants depend on insects for pollination (Müller 1873, Pojar 1974, Primack 1978, Arroyo et al. 1982, Ollerton et al. 2011), forming complex networks of dependencies among species (Bascompte et al. 2003). Because climate change is expected to strongly affect mountain ecosystems (Spehn et al. 2010), it becomes urgent to develop a better knowledge of the insects involved in the pollination of alpine plants, as well as to investigate the factors structuring plant-pollinator networks along altitudinal gradients. Additionally, such gradients represent valuable baselines to detect species declines, range shifts and extinction risks, notably in the current climate change issue (Parmesan 2006).

In response to elevation, patterns of abundance and species richness often reveal a monotone decrease or a mid-elevation peak for both plants and animals, but vary among taxa and geographic areas (Rahbek 2005, Kessler et al. 2011, Guo et al. 2013, Sundqvist et al. 2013). Those patterns are partly shaped by abiotic factors physically tied to elevation (Körner 2007) that become life-limiting at high altitudes, including a temperature lapse rate of 6°C per 1000 m on average (Barry 2008), a decline of available land area, and a decreasing atmospheric pressure (Peacock 1998). Additional abiotic factors affecting living organisms such as precipitation, soil moisture, persistence of snow cover or seasonality often change with elevation, but also depend on local peculiarities (Lauscher 1976, Körner 2007). By significantly reducing the duration of the growth period (Coulson et al. 1995) and metabolic rates (Dillon et al. 2010) in insects, harsher environmental conditions influence their survival and hence their altitudinal distribution range (Guo et al. 2013). Because the different anthophilous
insect groups seem affected to various degrees (Mani 1968), communities of pollinators involved in the reproduction of mountain angiosperms are expected to vary along elevational gradients.

However, studies focusing on altitudinal gradients of plants-pollinators interactions are scarce (Müller 1880, Heithaus 1974, Moldenke 1976, Arroyo et al. 1982, Warren et al. 1988; Medan et al. 2002) and often have significant sampling biases. Most of them focus on minimal gradients with only two different elevations, and lack a reproducible sampling protocol (Supplementary material Appendix 1, Table A1). In spite of their very different locations, durations and methods, they agree that both abundance and diversity of pollinators decrease with increasing elevation, and that the proportion of flower-visiting flies increases while the proportion of bees and beetles decreases. The predominance of flies in alpine flowers has been confirmed in several distant locations (Mani and Giddings 1980, Inouye and Pyke 1988, Kearns 1992, Pont 1993, Zoller et al. 2002, Lefebvre et al. 2014, Wagner et al. 2016) and this pattern was also observed at high latitudes (Hocking 1968, Kevan 1972, Elberling and Olsen 1999, Ssymank et al. 2008, Tiusanen et al. 2016), which suggests that low temperatures favor the dominance of flies as flower-visitors and pollinators in cold habitats.

Besides elevation, two major dimensions of anthophilous insects' ecological niche contribute to shape the structure of plant-pollinator networks along an altitudinal gradient. First, phenology can vary among flower-visiting groups at a given elevation, but also among elevations for a given group. From a plant species viewpoint, it means that the assemblages of potential pollinators may vary in both time and space over the gradient and favorable season. To our knowledge, this issue has never been investigated in temperate mountains, although phenology was found to be the main driver of species' interactions in a bird-flowering plant network in the high Andes of Peru (Gonzalez and Loiselle 2016) and is known to shape pollination networks in lowland areas (Olesen et al. 2008). Second, insect species involved in pollination interactions can exhibit
different foraging preferences, resulting in different dominant pollinator group among different flowering plant species. To what extent the sets of flowers visited by the different orders or families of anthophilous insects overlap across elevation gradients is still not widely known.

In the present study, we examined how the abundance and species richness of flower visitors varied along an altitudinal gradient, in order to understand how they segregate according to space (elevation), time (phenology) and trophic resource (species of plants visited). We especially investigated (1) how elevation, time and taxa influenced the abundance and richness of foraging insects, at both order and family levels; (2) whether the species belonging to those taxa overlapped in their use of available floral resource, at each elevation level and across the entire gradient. We suggest and discuss several hypotheses involving ecological and historical factors that may explain the patterns observed, as well as their implications in a context of global climate change.

## 2. Material and methods

### (a) Study sites

The study was carried out in the Ubaye valley, near and in the Mercantour National Park, Southern Alps, France. The minimum and maximum elevations in the valley are 800 m and 2700 m respectively, with the highest peak reaching 3412 m. The 13 study sites consisted of montane, subalpine and alpine meadows at elevations ranging from 972 m to 2659 m altitude (Supplementary material Appendix 1, Table A2). We selected them for their distribution along the elevational gradient, their abundant flower cover, their low levels of anthropogenic disturbances and their type of management: late-summer mowing or grazing.
(b) **Sampling protocol**

Sampling sessions were conducted from mid-May to late July in 2014 (sites S01 to S09) and from late May to mid-July in 2015 (sites S10 to S13), only on non-rainy days and with at most a light wind. The protocol was inspired by Forup and colleagues (2008). At the beginning of both fieldwork seasons, a square plot of 60 x 60 m was delimited in each site. A sampling day at one site consisted of four 60 m-long transects connecting two opposite sides of the square plot, two in the morning and two in the afternoon.

Each transect was randomly established by selecting one of the plot edges from which the collector can face the sunlight and progress along the transect without his shadow scaring insects ahead. A point was drawn on this edge from which the transect started, with an end at the opposite side. Insects visiting flowers in a 1.5 m wide swathe on each side of the transect line were either collected using an aspirator or a killing jar with potassium cyanide, or identified by sight when capture wasn't necessary (e.g. honey bees and several species of butterflies and beetles). A sweep-net was intentionally discarded to avoid disturbing insects foraging along the transect. Specimens were stored in 96% ethanol together with related collection data: site, flowering plant species, time and date. A second pass was made to record the identity and abundance of every entomophilous plant species blooming along the transect.

(c) **Processing of collected specimens**

Collected insects belonging to the main families of Coleoptera, Diptera and Hymenoptera were identified to species or morphospecies by specialist taxonomists, and we identified the remaining specimens to family, genus or species level (Supplementary material Appendix 1, Table A3). During the identification process, the location data have been lost for 113 bee specimens of the genus *Bombus* (representing 2% of the collected specimen and 6 species), which were therefore not
included in the analyses. All the specimens included in the analyses are stored in the
entomological collections of the Muséum national d'Histoire naturelle, Paris (MNHN).

(d) Statistical analyses

Statistical analyses have been performed with R Software version 3.3.1 (R
Development Core Team 2016). Plant—flower-visitor networks were generated with
the bipartite package (Dormann et al. 2008). For both plants and insects, we log-
transformed abundance and species richness (responses variables) to improve the
normality of their distribution. We performed all ANOVAs using a type 3 sum of
squares.

*Abundance and diversity of flowering plants*

We investigated how the abundance and richness of plant communities vary with
elevation and time using linear models. The dependent variables were either plant
abundance or plant species richness, and the explanatory variables were elevation,
Julian day (JD), as well as their quadratic terms to test for curvilinear responses. We
also included the interactions between elevation and JD, elevation and $JD^2$, and
between $elevation^2$ and JD to test for temporal shifts in phenology peaks with altitude.

*Abundance and diversity of flower-visitors*

Order-level analyses include every species of Diptera, Hymenoptera, Coleoptera and Lepidoptera, which together represented more than 99% of all recorded insect-flower interactions. Within each order, family-level analyses include the families exhibiting the highest abundances so that their cumulated number of visits represented at least 75% of the visits of the focus order: Andrenidae, Apidae, Halictidae, Tenthredinidae (Hymenoptera); Anthonyiidae, Empididae, Muscidae, Syrphidae (Diptera); Cerambycidae, Cetoniidae, Chrysomelidae, Oedemeridae, Rutelidae (Coleoptera); Adelidae, Hesperiidae, Nymphalidae, Zygaenidae (Lepidoptera).
We investigated how the abundance and species richness of those anthophilous groups varied with elevation, time and taxonomic group by fitting linear models with either abundance or species richness as a dependent variable and elevation, JD, their quadratic terms, and taxonomic group as explanatory variables. We also included the following two-way interactions: elevation:JD, elevation:JD², elevation:taxonomic group, elevation²:JD, elevation²:taxonomic group, taxonomic group:JD, taxonomic group:JD², and the following three-way interactions: taxonomic group:JD:elevation, taxonomic group:JD²:elevation and taxonomic group:JD:elevation². For Lepidoptera, data were too scarce for family-level analysis of abundances and species richness, but corresponding tables and graphs are provided in Supplementary material (Appendix 1, Tables A13 and A14; Figs A9 and A10).

## Overlap in floral resource use by two groups of insects

To test whether two insect taxa T₁ and T₂ (two orders or families) differed significantly in their use of available floral resources at a given site, we calculated the mean overlap in resource use among the pollinator species of the two taxa using Bray-Curtis distances (*vegdist* function of the “vegan” R package, Oksanen et al. 2016). To avoid analyzing under-sampled insect taxa, we only analyzed cases where, at a given site, both taxa had at least 50 visits and 10 species at order level, or 20 visits and 5 species at family level. We then compared the observed distance to 50 000 random mean distances calculated after shuffling the pollinator species identity. Finally, we tested whether the observed distances were different from the random expectations across the altitudinal gradient with Jost’s formula for combining significance levels from multiple analyses on the *p* values obtained at all sites. The formula is a generalization of Fisher’s combined probability test and is calculated as

$$P_{T1T2} = K * \sum_{i=0}^{N-1} \frac{(-\ln(K))^i}{i!}, \text{ where N is the number of analyses and K is the product of the N corresponding p-values. Because of the thresholds fixed, this analysis was possible at order level but only within Diptera for family level.}$$
### 3. Results

#### (a) Species identification and community composition

At the 13 study sites, 5502 flower-visiting insects were collected or identified in field, representing a minimum of 521 species and 206 genera in 69 different families (Supplementary material Appendix 1, Table A16). 4224 of them were identified to species level, 583 to morpho-species, 387 to groups of species, 287 to family and 21 to order level. They were caught foraging on 118 different flowering-plant species belonging to 83 genera in 31 families (Supplementary material Appendix 1, Table A15). More than 99.8% of them belonged to the four major orders of anthophilous insects: Diptera accounted for 49.2% (N=2706, 253 species) of the interactions, Hymenoptera 27.5% (N=1511, 134 species), Coleoptera 18% (N=989, 102 species) and Lepidoptera 5.2% (N=289, 29 species).

#### (b) Effects of time and altitude on the abundance and species richness of flowering plants

After model simplification, we found that the interaction between JD and elevation² significantly influenced both abundance and species richness of flowering plants along transects (Supplementary material Appendix 1, Table A4 and A5). Angiosperm diversity increased with altitude to plateau around 2000 m, and the peaks of abundance and richness varied with altitude, with a delayed peak at higher elevations (Supplementary material Appendix 1, Fig. A1).

#### (c) Altitudinal and temporal variations in abundance and diversity of anthophilous insect orders and overlap in their resource use

Both the abundance and species richness of flower visitors were significantly influenced by the three-way interaction between insect order, elevation and JD² (Supplementary material Appendix 1, Table A6). This indicates that the number of
visits – or number of species – had a hump-shaped relationship with JD and a linear relationship with elevation, with both those effects depending on insect order.

Model predictions indicated strong differences in response to altitude among insect orders. While both visitation frequency and species richness of Hymenoptera, Coleoptera and Lepidoptera decreased monotonically with increasing elevation, Diptera increased in species richness and abundance to reach a peak between 1800 and 2200 m. (Fig. 1 and Supplementary material Appendix 1, Fig. A3). At approximately 1500 m elevation, the major flower-visiting order shifted from either Hymenoptera, Diptera or Coleoptera, depending on the site (and whether or not honey bee numbers are taken into account, see Supplementary material Appendix 1, Fig. A2), to Diptera at every site (Fig. 2).

The insect orders also exhibited differences in phenology. The abundance of Hymenoptera and Diptera peaked simultaneously at each elevation, one week before Coleoptera (Fig. 1). Regarding species richness, the temporal segregation of insect orders was slightly more pronounced: flies reached their maximum one week before bees and two weeks before beetles (Supplementary material Appendix 1, Fig. A3). Butterflies exhibited a distinct temporal pattern with no abundance or diversity peaks at any elevation. Abundances and species richness peaks of flies, bees and beetles were delayed by one week on average for every additional 300 m increase in altitude (Fig. 1 and Supplementary material Appendix 1, Fig. A3).

Our analysis of the visitation networks revealed that the resource overlap among species from different insect orders was lower than expected. The pairwise Bray-Curtis dissimilarities between Diptera, Hymenoptera and Coleoptera species calculated per site were most often higher than random expectation, but rarely significantly. However, this tendency was highly significant when considering all the sites (Jost's combined significance test, p < 0.0001; table S7). This result indicates that across the elevation
gradient, the species from different orders exhibited different foraging preferences: among the 90 plants visited by these 3 orders, 20%, 14% and 2% of them were exclusively visited by bees, flies and beetles respectively (Fig. 3). Lepidoptera were excluded from the analysis due to their insufficient number of visits per site.

(d) *Altitudinal and temporal variations in abundance and diversity of the main
anthophilous families of Diptera and overlap in their resource use*

The abundance of flower-visiting flies was significantly influenced by the two-way
interactions between JD and elevation², between insect family and elevation (as well
as its quadratic term) and insect family and JD (Supplementary material Appendix 1,
Table A8). This indicated that fly families had different phenologies, which also depend
on elevation.

The model predictions showed that the main anthophilous Diptera families reached
their highest visitation frequency at different altitudes, with syrphid abundance
peaking at mid-elevation around 1600 m, empidids between 1400 and 2100 m and
anthomyiids and muscids above the tree line, from 2300 m. As a result, the
predominant fly family within the anthophilous Diptera community varied along the
altitudinal gradient, with syrphids being the main visitors at the lower part of the
gradient, empidids at the intermediate part and anthomyiids and muscids at the
highest elevations (Fig. 4).

Regarding the species richness of these dipteran families, we found a significant
effect of the three-way interactions between family, elevation and both JD and JD²
(Supplementary material Appendix 1, Table A8). This indicated that the phenology
differed among fly families and elevations, with elevation effect also depending on
family. Syrphids with 93 species were by far the most speciose group among flies, but
also in the whole study. They exhibited a higher diversity than any other fly family
from the lower limit of the gradient up to 1800 m. Empidids were the second most
speciose family with 45 species, their maximum species richness occurring at intermediate altitudes between 1800 and 2100 m. Anthonyiids (25 species) and muscids (33 species) showed a maximum species richness between 2200 and 2500 m, where they were the most speciose families (Supplementary material Appendix 1, Fig. A4).

The phenology of fly families also varies. When analyzing visitation frequencies, for any given altitude, the syrphids had their abundance peaks ten days before anthomyiids and muscids, which peaked themselves ten days before empidids. Abundance peaks of the four main fly families were also delayed with increasing elevations (Fig. 4).

The diet overlap among species of the major fly families was lower than expected. When comparing the flowers visited, pairwise distances between each couple of fly families (Anthomyiidae, Empididae, Muscidae and Syrphidae) were all significantly larger than expected at random, with the exception of the Syrphidae-Anthomyiidae pair (Supplementary material Appendix 1, Table A9). It indicates that over the altitudinal ranges where several of those fly families were well represented, they did not interact with the same assemblages of flowering-plants. Among the 61 angiosperms they visited, empidids were the exclusive fly-visitors for 9 (15%) species and syrphids for 4 (6.5%) species (Fig. 5).

(e) *Altitudinal and temporal variations in abundance and diversity of the main anthophilous families of Hymenoptera and overlap in their resource use*

The flower-visiting frequency and species richness of Hymenoptera were significantly influenced by the two-way interactions between JD and elevation², JD² and elevation, and insect family and elevation² (Supplementary material Appendix 1, Table A10). This indicated that elevation affected Hymenoptera phenology in a direction and with an intensity that depend on the family.

Model predictions show that three of the four major families (Andrenidae, Apidae and Halictidae) showed decreasing visit frequency and species richness with elevation.
Sawflies (Symphyta, Tenthredinidae), however, revealed a different pattern with abundance increasing with elevation, making them the most abundant hymenopteran group in the upper part of the gradient from 2200 m (Fig. 6). Halictidae, whose number of visits was lower than that of Apidae, was the most speciose bee family (38 species) with the maximum species diversity among Hymenoptera up to a 2200 m elevation; conversely, Apidae, the most abundant family, ranked second in bee species richness with 26 species, including 18 species of bumblebees (Fig. 6 and Supplementary material Appendix 1, Fig. A5). The honey bee, which accounted for more than 38% of all Hymenoptera visits, was responsible for this Apidae prevalence: removing it from the analysis resulted in Halictidae being both the most abundant and speciose group from the lower limit of the gradient up to 2200 m. (Supplementary material Appendix 1, Fig. A5 and A6).

The four major Hymenoptera families peaked concurrently at a same elevation but all showed delayed abundance peaks at higher elevations (no significant interaction effect between date and family, Fig. 6 and Supplementary material Appendix 1, Fig. A5).

(f) *Altitudinal and temporal variations in abundance and diversity of coleopteran flower-visitors*

The abundance and species richness of Coleoptera were both significantly influenced by the three-way interaction between family, JD and altitude (Supplementary material Appendix 1, Table A12). This indicated that the phenology differed among beetle families and elevations, with effect of elevation depending on families.

Model predictions showed that both abundance and richness of beetles decreased with increasing elevation (Supplementary material Appendix 1, Figs A7 and A8), especially above 2000 m. They disappeared completely above 2300 m altitude, except for some leaf beetles in the genus *Cryptocephalus* (Chrysomelidae) and small anthophilous Staphylinidae. Regardless of insect order, long-horned beetles
(Cerambycidae) and leaf beetles were among the most abundant families in the lower part of the gradient up to 1500 m, both including 16 different species.

The major beetle families exhibited very distinct phenologies over their elevation range. Long-horned beetles' peaks of abundance and richness were not delayed at higher elevations, and occurred more than a month after those of leaf beetles over the lower part of the gradient. However, as the phenology of leaf beetles showed an average delay of 10 days for every 300m altitude increase, these two beetles families exhibited a simultaneous maximum abundance and richness around 1800 m altitude (Supplementary material Appendix 1, Figs A7 and A8).

## Discussion

*Community composition of flower visitors along the altitudinal gradient*

So far as we are aware, this is the first study investigating plant-visitor interactions along an elevation gradient with such an extensive altitudinal scope, a fine altitudinal and taxonomic resolution, and a sustained sampling effort including all flower-visiting insects during peak flowering at all elevations. Our findings highlight the differences in response to altitude among various natural groups of insects including 4 orders and 17 families, and the resulting changes in pollinator communities along the gradient. At order-level, a major shift occurs around 1500 m, altitude above which flies constantly predominate as flower-visitors, and below which the most conspicuous flower-visiting order varied among sites with no consistent altitudinal pattern. This transition is due to the inverse altitudinal gradient of abundance and richness exhibited by anthophilous flies over most of the gradient, a unique pattern within insects at this taxonomic level (Brehm et al. 2003, Sanders et al. 2003). Conversely bees, beetles and butterflies conformed to a pattern commonly observed in arthropods with a monotonical decrease in abundance and species diversity over the entire gradient (Stevens 1992, Rahbek
1995, Hodkinson 2005). Flies therefore represent the most diverse and abundant biotic
vector for the diurnal cross-pollination of alpine angiosperms.

Elevation also shaped anthophilous communities at family level at least within the
two main orders. Altitudinal structuring was especially marked among fly families, with
each main family adapted to a different elevation range. Hoverfly abundance and
richness peak around 1500 m and become scarce above 2000 m, as for most insects
(Rahbek 2005). Such scarcity of syrphids at high altitude has already been found
(Ssymank and Lair 2014) and echoes what is found at high latitudes (Oliver 1963,
McAlpine 1964, 1965a & 1965b, Pont 1995), suggesting that they only play a minor
role in the pollination of alpine flowers. On the contrary, empidids, muscids and
anthomyiids all peaked between 1800 and 2500m. Unlike hoverflies, the importance of
those families for pollination has been poorly addressed. Therefore, further studies are
needed to investigate to what extent the reproductive success of alpine plants benefits
from their visits. Within Hymenoptera, the decreasing abundance and richness with
altitude of bees - congruent with the results of Hoiss and colleagues (2012) - contrasts
with the altitudinal response of sawflies, peaking around 1900 m. This questions the
existence of a phylogenetic effect. Bee families are closely related to each other while
sawflies are distant relatives to bees, with both groups having very different life cycles
and larval life patterns: free-living sawfly larvae feed on plant leaves, while bee larvae
are hidden in a nest and consume the pollen harvested by their mother. Finally, no
clear altitudinal structuring was found among butterfly families, mostly because their
abundance and diversity became too low - or they were absent - over the upper half of
the gradient. The different anthophilous insect groups present at high elevations are
not closely related to each other (Bombus and Symphyta within Hymenoptera;
Anthomyiidae, Empididae and Muscidae within Diptera), showing that life-history
traits related to cold tolerance have emerged independently in several lineages within
arthropods.
Our results are in agreement with the scant literature on flower-visitor networks at high altitude but also at high latitudes (Hocking 1968, Kevan 1972, Elberling and Olsen 1999, Ssymank et al. 2008), suggesting that the limiting abiotic factors structuring pollinator communities are mainly temperature and humidity. Although exceptions exist, flies prefer cool and moist conditions (Kearns 1992) while bees search for warmer and drier habitats (Linsley 1958). Life-history traits that could favour flies over other anthophilous groups in alpine areas still need to be investigated. However, larval stages, which most often last much longer than adult stages in insects, probably focus most of the selective pressures that limit their spatial distribution. The majority of anthophilous beetles, whose larval growth depends on fresh, dead or decayed wood simply cannot thrive above the timberline. The scarcity of solitary bees at altitude could result from various foraging or nesting constraints, while in contrast, the success of bumblebees is likely favoured by both their rapid development allowed by sociality (Shpigler et al. 2013), and their ability to fly and forage at lower temperatures than small bees (Kearns 1992). Several families of flies appear particularly well adapted to mountain habitats (i.e. empidids, muscids, anthomyiids), and, although we do not know the biology of most species thriving at altitude, the few documented cases suggest that their larvae develop in moist to wet soils or in dung, where they feed on small organisms (Skidmore 1985; Smith 1989). Sheep and cattle grazing, cool temperatures and snowmelt contribute to the abundance of those suitable habitats at mid and high elevations. Additional factors, including the large amount of time they spend basking in sun-exposed flowers to thermoregulate (Hocking and Sharplin 1965, Kevan 1975, Stanton and Galen 1989, Luzar and Gottsberger 2001), also promote the conspicuousness of Diptera as flower-visitors in high altitude areas.

*Temporal distribution of flower visitors along the altitudinal gradient*

As expected both flowers and insects peaked later at higher elevations, where
snowmelt occurs later and the favourable season is shorter. No temporal segregation
appeared between the major orders of anthophilous species. Diptera and Hymenoptera had a similar phenology at each elevation, and, although Coleoptera peaked slightly later, the three orders had a simultaneous period of high abundance over the lower part of the gradient. All considered Hymenoptera families also peaked concurrently. Those overlapping phenologies are probably due to a synchronicity with the flowering peak of angiosperms.

However, as for the vertical partitioning, the main anthophilous fly families exhibited different temporal patterns. All along the gradient syrphids peaked before, muscids and anthomyiids during, and empidids after the peak bloom date. This pattern results in the high abundance of interactions between syrphids and early-blooming plant species (i.e. *Ranunculus* spp., *Meum athamanticum*), and between empidids and late-blooming plant species (i.e. *Phyteuma* spp., *Knautia* spp., *Scorzonera* spp., *Persicaria bistorta*). Consequently, over the altitudinal ranges where these major families co-occur, they complement each other in time for the pollination of the angiosperm community.

***Foraging preferences of flower visitors along the altitudinal gradient***

For the first time, we show that the three main orders, as well as all but one pair of fly families, segregate significantly by their choice of flowering-plant species along the gradient. As a consequence, several plant species were visited by a unique order. The mechanisms that led the anthophilous insect groups to exploit different floral resources were not tested in this study, but could be partly related to floral traits resulting from flower-insect coevolution. For instance, zygomorphic flowers were visited mostly by bees, which is consistent with the association between bilateral floral symmetry and bee pollination reported in the literature (Nikkeshi et al. 2015). It suggests that at low and mid- elevations, the three main orders pollinate different assemblages of flowering-plant species. Similarly, the differences in foraging patterns among flies indicate that when several families are present over a given altitudinal
range, they likely provide pollination to different guilds of angiosperms. Moreover, the fact that the flowers visited by flies differ significantly among families and from those visited by the other orders challenges their alleged generalism as flower visitors and pollinators, which should encourage further studies in this area.

## Limitations

Several considerations that could influence our results have to be taken into account. First, sampling periods stopped at latest at the end of July, probably explaining the strikingly low abundance of Lepidoptera, which seemed to have a later phenology compared to other orders. The fact that sampling took place only during the day could also introduce a bias, given that most lepidopterans are nocturnal and were thus not included in this study. Second, the relative abundance and species richness of each group over the gradient, as well as the transition altitude above which Diptera become predominant, are likely to vary with the geographic area, but also with local peculiarities, year and climatic conditions. For instance, this transition occurs around 700 m altitude in Tasmania (Hingston and McQuillan 2000) whereas we observed it around 1500 m; it is very likely that the higher the latitude, the lower this transition altitude. Third, although pollination occurs at species level and the abundance of visits was very unevenly distributed among anthophilous species within each group, we performed our analyses at order and family levels and thus do not take these ratios into account. For instance, only 5.2% of the flower-visiting species were responsible for more than 50% of the 5500 interactions, while 39% were involved in only one interaction. Therefore, additional studies at a finer taxonomic scale are necessary to understand the role of each species in pollination networks.

## Conclusions

Elevational gradients allow the investigation of plant-visitor networks in a changing environment where temperature depends on altitude, and where niche partitioning
among insect pollinator communities can occur mainly through spatial, temporal and
trophic segregation. Our results show that the different orders segregated by both
altitude and resource, and that within flies, the predominant order, families segregated
by the three niche dimensions along the gradient. Further, they point to several key-
taxa on which future investigations should focus: although Anthonyiidae, Empididae
and Muscidae are predominant over a great part of the gradient, and therefore the
main available visitors of alpine flowers, their foraging behaviour and pollination
efficiency have never been formally studied. Moreover, while the abundance of muscids
has been reported as the main predicator for seed set in *Dryas integrifolia*, a key plant-
species in the arctic, a first study reported their decline over the last years in the same
area (Høye et al. 2013).

In a context where global warming is expected to change the spatio-temporal
distribution of anthophilous insect, our results should provide valuable insights for
conservation biologists investigating how plant-pollinator interactions will be affected.
Bees are expected to shift toward higher elevation, whereas fly groups already present
at the highest altitude levels can either disappear or shift their phenology. Whether
plant-pollinator networks in alpine areas will face an impoverished or changed
pollinator fauna depends on how the different anthophilous groups will respond to
rising temperatures. In this context, further studies addressing the effects of warming
at species level are needed, and would advance our ability to predict how global
warming could reshape plant-pollinator networks in fragile alpine ecosystems.

**Acknowledgements.** We thank Emmanuel Delfosse (MNHN) for his invaluable help with all the entomological work; Adrian C. Pont for helping us improve the manuscript; Yves Aglio, Sylvain Antiq, Fabrice Bouvet, Jean-Paul Fortoul, Martin Holliger, Isabelle Le Hir and Joël Rougon for having kindly allowed us to carry out this study in their meadows; François Breton and the whole Ubaye-Verdon ranger team of the Mercantour National Park (MNP) for their advice in finding the study sites; the MNP staff for the
collecting permits; all the taxonomists listed in table S2 for the time they spent on the determinations. This work was supported by a grant from Agence Nationale de la Recherche under the LabEx ANR-10-LABX-0003-BCDiv, in the program "Investissements d'avenir" n°ANR-11-IDEX-0004-02.
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Figures
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 1.** Abundances of the four major anthophilous orders over time at 6 different elevations along the gradient (associated graphs for species richness in Supplementary material Appendix 1, Fig. A3).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 2.** Order-level flower-visitation networks for each study site, showing the changes in the proportion of each major anthophilous order. The number indicated above each order bar is the number of species collected in that site and order. Site code, elevation and total number of visits are given below each network.</figcaption></figure>
**Figure 3.** Plant-visitor network illustrating the use of floral resources by Hymenoptera (yellow), Coleoptera (green), and Diptera (blue). For legibility reasons, the species-level networks corresponding to the overlap analyses between each pair of orders are provided in the Supplementary material, Appendix 2. Flower codes are listed in Supplementary material Appendix 1, Table A15.

<figure><img src="image_27.png" /></figure>
**Figure 4.** Abundances of the four major dipteran families over time at 6 different elevations along the gradient (associated graphs for species richness in Supplementary material Appendix 1, Fig. A4).

<figure><img src="image_28.png" /></figure>
**Figure 5.** Plant-visitor network illustrating the use of floral resources by the four main Diptera families (from left to right: Anthomyiidae, Muscidae, Syrphidae, Empididae). For legibility reasons, the species-level networks corresponding to the overlap analyses between each pair of fly families are provided in the Supplementary material, Appendix 3. Flower codes are listed in Supplementary material Appendix 1, Table A15.

<figure><img src="image_29.png" /></figure>
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 6.** Abundances of the four major hymenopteran families over time at 6 different elevations along the gradient (associated graphs for species richness in Supplementary material Appendix 1, Fig. A5).</figcaption></figure>
# PARTIE III

## VISITES ET POLLINISATION :
LE ROLE DES EMPIDINAE
### III. 1. Importance relative des diptères et des Empidinae au sein du réseau d'interactions plantes-butineurs d'une prairie subalpine

Lefebvre, V., Fontaine, C., Villemant, C., and C. Daugeron. 2014.

Are empidine dance flies major flower visitors in alpine environments?

A case study in the Alps, France. *Biology Letters* 10: 20140742.

http://dx.doi.org/10.1098/rsbl.2014.0742

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Echantillonnage en cours dans la prairie où ont été conduites les deux études du Chapitre III. Plateau des Meyries, Jausiers, Alpes-de Haute-Provence ; altitude 1800 m (cliché : Claire Villemant)</figcaption></figure>
# Are empidine dance flies major flower visitors in alpine environments? A case study in the Alps, France

Vincent Lefebvre, Colin Fontaine, Claire Villemant and Christophe Daugeron

*Biol. Lett.* 2014 **10**, 20140742, published 5 November 2014

**Supplementary data** "Data Supplement" http://rsbl.royalsocietypublishing.org/content/suppl/2014/11/04/rsbl.2014.0742.DC1.html
Research

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

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**Cite this article:** Lefebvre V, Fontaine C, Villemant C, Daugeron C. 2014 Are empidine dance flies major flower visitors in alpine environments? A case study in the Alps, France. *Biol. Lett.* **10**: 20140742.
http://dx.doi.org/10.1098/rsbl.2014.0742

Received: 15 September 2014

Accepted: 16 October 2014

**Subject Areas:**

ecology, behaviour, plant science

**Keywords:**

mountain ecology, foraging behaviour, flower visitors, Empidinae, Mercantour National Park

**Author for correspondence:**

Christophe Daugeron

e-mail: daugeron@mnhn.fr

Electronic supplementary material is available
at http://dx.doi.org/10.1098/rsbl.2014.0742 or
via http://rsbl.royalsocietypublishing.org.

# Are empidine dance flies major flower visitors in alpine environments? A case study in the Alps, France

Vincent Lefebvre<fnref n="1" />, Colin Fontaine<fnref n="2" />, Claire Villemant<fnref n="1" />
and Christophe Daugeron<fnref n="1" />

Pollination is one of the most important ecosystem services and bees the most important pollinators. As a population decline of bees has been documented in numerous regions of the world, it is crucial to develop understanding on other possible pollinators. Here, we study the potential pollination impact of Diptera, and among them Empidinae, in an alpine environment, where the abundance of bees is naturally lower. Interactions between 19 entomophilous plants and their flower visitors were recorded in a subalpine meadow in the French Alps during six weeks. Visitation frequencies were used to build the flower–visitor network. Our results show that interactions between flies and plants are dominant; flies represent more than 60% of all visitors, with 54% of them being Empidinae. We especially found that flies, Empidinae and bees are the main visitors of 11, three and one plants, respectively. When considering both bees and Syrphidae together, six plants were more visited by Empidinae; when considering bees and Syrphidae separately, 10 plants were more visited by Empidinae than by bees or Syrphidae. The results support the idea that flies widely replace bees as main flower visitors at altitude, and among them the Empidinae might play a key role in pollination.

## 1. Introduction

Pollination by insects is one of the most important ecosystem services, but is threatened by pollinator decline [1]. Bees, which are known to be the main pollinators of flowering plants, are particularly affected [2]. In this context, it is highly relevant to study the pollinator impact of other insects, especially in areas where bees are naturally scarcer, such as cool temperate to cold habitats. Diptera, of which many families are well known to be flower visitors, are often more abundant and diverse than bees in such habitats [3]. It was hypothesized that high elevation areas offer favourable ecological conditions (wet soils, stream edges) for fly larvae and, unlike bees, flies take better advantage of microhabitats for thermoregulation [4] as they do not spend their time building and provisioning nests. Therefore, at higher elevations, Diptera could take over from Hymenoptera and be more efficient pollinators than other well-known pollinators that thrive in low-altitude conditions, such as solitary bees. Bumblebees, which can also thermoregulate efficiently, seem to be the exception among bees.

The subfamily Empidinae (Diptera, Empididae), or empidine dance flies, has never been formally studied as a group of pollinators, although most observations suggest that it could be a key group of insects for the pollination of angiosperms in various mountains and cold habitats of the world (e.g. in the Snowy Mountains of Australia, the Arctic regions or in Patagonia, see [5–7]). The anthophilous empidine species belong to the tribe Empidini, which includes about 1200 known species.

<footnote n="1">¹Muséum national d'Histoire naturelle, ISYEB, UMR 7205 MNHN, CNRS, UPMC, EPHE, 45 rue Buffon, CP 50, Paris 75005, France</footnote>

<footnote n="2">²Muséum national d'Histoire naturelle, CESCO, UMR 7204 MNHN, CNRS, UPMC, 55 rue Buffon, CP 53, Paris 75005, France</footnote>
Many of them visit flowers frequently, due to their exclusive dependence on nectar as a food source on which they feed using their elongated proboscis (electronic supplementary material, figure S1). While foraging, they often carry high loads of pollen due to increased hair density on some body parts, further suggesting their potential role as pollinators.

As a prerequisite for assessing the pollinator impact of flies and more particularly Empidinae in mountain environments, our study was to build the flower-visitor network of a subalpine meadow, with the aim to test the following assumptions: (i) the dominance of flies as flower visitors relative to other orders of insects foraging for pollen or nectar and (ii) the dominance of Empidinae as flower visitors over two groups known as the most efficient pollinators in temperate areas, bees and syrphids (Diptera, Syrphidae).

## 2. Material and methods

### (a) Study site

The study was conducted from 29 May to 10 July 2012 in the north of Mercantour National Park, France (electronic supplementary material, figure S2). The site, called Plateau des Meyries (1800 m, 6°46'36.7" E, 44°23'53.4" N), is a semi open subalpine area of about 6 ha, largely flat and with no particular slope, including a large meadow dotted with larches (Larix decidua). Mowing usually occurs in late summer.

### (b) Plant visitation

Pollination depends on many factors, some of which are used as more or less relevant proxies. For example, flower visitation is considered either as a poor pollination proxy [8] or an acceptable one [9]. However, an insect has a potential pollinator impact only if it visits a flower and deposits conspecific pollen grains on its stigma. Therefore, building the flower-visitor network of an ecosystem is a prerequisite to detect potential pollinators, provided that the quality of the foraging behaviour is taken into account. In this study, the network is based on visits for which the foraging insect came into contact with either the stamen or stigma of the flower.

### (c) Monitoring of plants

Monitoring involved observation sessions for each selected plant species (electronic supplementary material, table S1) on non-rainy days with a temperature above 12°C. Each session was focused on a single plant species: insect visits on every flower of this plant species were counted at sight by walking in the survey area. Sessions lasted 10 min at most depending on the plant density and were distributed throughout the day between 9.30 and 17.00. As many sessions as possible were done for each plant species during its flowering time.

The monitored plants were chosen for being visited by foraging insects. Indeed, many plants known as entomophilous were actually not visited by insects during the study (e.g. some species of Orchidaceae). Finally, 19 species for which at least one session every 2 days was available were retained for analysis.

Owing to their different flowering time (electronic supplementary material, figure S3), the number of sessions varied for each plant species. This did not impact on the results as we did not compare plants but the number of visits on a given plant by various pollinators.

### (d) Identification of insects

Flower visitors were identified on-site as Empidinae, Syrphidae, other Diptera, bees, other Hymenoptera, Coleoptera, Lepidoptera, Heteroptera and Neuroptera. Empidinae were also

collected on each plant species for accurate identification to species or morphospecies level in the laboratory.

### (e) Data analyses

All statistical analyses were performed using R [10]. The flower-visitor network was generated with the bipartite package [11] using visitation frequencies: the thickness of a link between a plant species and a group of visitors is equal to the visitation frequency calculated as $N_v/T$, where $N_v$ is the total number of visits by this group of insects on this plant species and $T$ the total time of monitoring for this plant species (electronic supplementary material, table S1).

The correspondence analysis to visualize associations of flowers and visitors was performed with ade4 package for R [12] using the relative proportions of each group of visitors on each flowering plant species.

The significance of the differences in the number of visits of each taxon on a given plant species was tested with the non-parametrical Wilcoxon test, as data from counting insects on flowers is not normally distributed (electronic supplementary material, table S2).

## 3. Results

The flower-visitor network is dominated by two groups of insects: Diptera and Hymenoptera with 62% and 23% of all visits, respectively (figure 1). Diptera composed more than 50% of all visits for 14 plants, and the proportion of flies to other insects was significantly higher for 11 of them (Wilcoxon test, *p* < 0.05).

Fifty-four per cent of the flower-visiting Diptera were empidines. They represent at least 50% of all visits for seven plant species, this proportion being significantly higher for three of them (Wilcoxon test, *p* < 0.05). The number of visits of empidines was significantly higher than visits by syrphids and bees considered together for six plant species (Wilcoxon test, *p* < 0.05). When considering syrphids and bees separately, four additional species were significantly more visited by empidines than by syrphids (Campanula rotundifolia, Hieracium cymosum, Onobrychis viciifolia and Ornithogalum umbellatum; Wilcoxon test, *p* < 0.05) and another four species were significantly more visited by empidines than by bees (Myosotis decumbens, Ranunculus bulbosus, Persicaria bistorta and H. cymosum, Wilcoxon test, *p* < 0.05).

Most of the flower-visiting Hymenoptera observed during the study were bees (approx. 88%), but bees were the main visitors only for Rubus idaeus (Wilcoxon test, *p* < 0.001), with at least 85% of the visits by Apis mellifera and Bombus spp. In addition, three plant species were significantly more visited by bees than by empidines (Knautia arvensis, Centaurea uniflora and O. viciifolia; Wilcoxon test, *p* < 0.05).

None of the flowering plants had syrphids as main visitor. However, Meum athamanticum (Apiaceae) was significantly more visited by syrphids than by empidines (Wilcoxon test, *p* < 0.01).

The data are particularly well structured: the correspondence analysis (figure 2) segregates two distinct clusters of plants, each one overlapping with empidines and bees, respectively; a third cluster reveals that flowers visited by syrphids mostly attract insects other than empidines and bees (various flies, sawflies and beetles).

Twenty-two species of Empidinae were collected foraging on flowers. Thirteen of them were collected on one plant species only, but some were found on up to five different plant species.
<figure><img src="image_33.png" /></figure>

**Figure 1.** Flower–visitor network obtained in a subalpine meadow at 1800 m in the Mercantour National Park. Insects: Hym., Hymenoptera; Col., Coleoptera; Lep., Lepidoptera; Het., Heteroptera, Neu., Neuroptera, Orth., Orthoptera. Plants: G.s., *Geranium sylvaticum*; G.p., *Geranium pyrenaicum*; S.h., *Scorzonera hispanica*; H.m., *Hypochaeris maculata*; T.p., *Tragopogon pratensis*; C.a., *Cerastium arvense*; O.u., *Ornithogalum umbellatum*; O.v., *Onobrychis viciifolia*; S.a., *Sisymbrium austriacum*; C.r., *Campanula rotundifolia*; K.a., *Knautia arvensis*; R.b., *Ranunculus bulbosus*; H.c., *Hieracium cymosum*; M.d., *Myosotis decumbens*; P.b., *Persicaria bistorta*; V.l., *Viburnum lantana*; M.a., *Meum athamanticum*; C.u., *Centaurea uniflora*; R.i., *Rubus idaeus*.

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

**Figure 2.** Two-dimensional graphical representation of the correspondence analysis of the flowers/visitors data table. Main contribution to axis 1 (34% of inertia) comes from bees visiting *O. viciifolia* and *R. idaeus*, and main contribution to axis 2 (25% of inertia) comes from Empidinae. For abbreviations, see legend of figure 1.

## 4. Discussion

For the set of plant species monitored in the study site, our results do confirm the conspicuousness of anthophilous Diptera compared with bees. Although flower visitation does not equal pollination, the prevalence of flies as flower visitors in subalpine areas suggests that they could be major pollinator agents at this elevation. Among them, Empidinae seem to play a key role compared with bees or syrphids. This can be explained by their abundance as well as their diversity: 22 species were collected on flowers during the study, but more than 70 species were identified for the purpose of the recent 'All Taxa Biodiversity Inventory' recently conducted in the Mercantour National Park (2009–2011) (Daugeron and Lefebvre 2012, unpublished data).

Owing to their foraging behaviour and abundant hairiness, they are more likely to fertilize the visited plants than most other Diptera: as they only feed on nectar, they

commute between flowers continuously, while many opportunist flies also feeding on other resources (e.g. Muscoidea, Tachinidae) seem to have a low frequency of visit and a reduced activity on flowers.

Although Diptera are usually considered as generalist foragers, this might not apply to some empidine species. For instance, *Empis* sp. 2 was observed 52 times on *C. rotundifolia*, but never seen or captured on another flower, nor was *C. rotundifolia* visited by other empidine species. This suggests a strong ecological link between the two taxa. Certain empidine species could thus be specialized for foraging and pollination, which could be explained by co-evolution events. However, the factors making a given flowering plant species preferred by an empidine are still unknown.

Empidinae, bees and syrphids have to visit flowers because of their life cycle, which entirely or in part depends on nectar and/or pollen. At this elevation, solitary bees showed, as expected, a relative scarcity, but surprisingly syrphids did not appear as major visitors of the monitored plant species.

Our study shows that empidines are a key component of the flower-visitation networks in temperate altitude meadows and could have a higher fertilization impact than bees and other well-known pollinators. In this respect, they could be an excellent model for understanding the role played by both ecological and historical factors in the evolution of plant-pollinating insect relationships at altitude, and why bees are widely replaced by flies. For that it could be particularly relevant to determine the altitude at which the pollinator shift from Hymenoptera to Diptera occurs, and how the mutualistic relationships between the flora and the available pollinators change with elevation. If strong specific mutualisms could be revealed, it would be interesting to assess if the diversity of angiosperms in alpine areas is partly related to the diversity of empidine flies.

**Acknowledgements.** We thank François Breton, Marie-France Leccia (Mercantour National Park), Jean-Philippe Siblet (MNHN), Adrian Plant (National Museum of Wales), Gabrielle Names (École Normale Supérieure, Paris), Jean-Luc and Charline Printemps (Centre Séolane, Barcelonnette) and three anonymous reviewers.

**Funding statement.** This study was partially funded by the Mercantour National Park and the Service du Patrimoine Naturel (MNHN).
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### III. 2. Efficacité pollinisatrice des visites d'Empidinae : le cas du Geranium des bois, *Geranium sylvaticum* L.

Lefebvre, V., Daugeron, C., Villemant, C., and C. Fontaine. 2016.

"Size matters: traits influence pollination efficiency more than species identity."

Manuscrit *in prep*.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Un *Leptempis* butinant au milieu de fleurs ensachées</figcaption></figure>
Size matters: traits influence pollination efficiency
more than species identity

Vincent Lefebvre,¹ Christophe Daugeron,² Claire Villemant,¹ and Colin Fontaine³

1 Muséum national d'Histoire naturelle, ISYEB, UMR 7205 MNHN, CNRS, UPMC, EPHE, 45 rue Buffon, CP 50, 75005 Paris, France

2 Muséum national d'histoire naturelle, Centre National de la Recherche Scientifique, Mécanismes adaptatifs et évolution, UMR 7179 MNHN-CNRS MECADEV, CP 50, 45 rue Buffon, 75005 Paris, France.

3 Muséum national d'Histoire naturelle, CESCO, UMR 7204 MNHN, CNRS, UPMC, 55 rue Buffon, 75005 Paris, France

**Keywords:** Pollination, Diptera, Seed set, *Geranium sylvaticum*, Mercantour National Park, Empidinae
Abstract

Most flowering plants species rely on insects for pollination, this successful
mutualism allowing them to reproduce over wide areas while flower-visitors are
rewarded with food. This association is so conspicuous in the case of bees that other
groups of potential pollinators, especially flies, have long been overlooked. In this study,
we assessed the pollination effectiveness of *Geranium sylvaticum* flower-visitors using
single visits seed-set experiments, in a subalpine meadow where flies are predominant.

We found that: (i) large pollinators were more efficient than small pollinators
irrespectively of their identity; (ii) large empidine dance flies were the most frequent
visitor of *G. sylvaticum*; therefore, large species of empidines were the main pollinator
of this plant. Considering the high diversity and abundance of flower-visiting flies, such
results showing their ability to be as effective pollinator as bees should encourage
further investigations on anthophilous dipteran families.
# 1. Introduction

Insect pollination is a key ecological interaction, involved in the reproduction of more than 80% of angiosperms (Ollerton et al. 2011) and the production of about 75% of world leading crops (Klein et al. 2007). Until recently, most of the studies addressing the role of insects as pollinators focused on bees, but the awareness of the collapse of their populations has sparked a growing interest on other flower-visiting insects (non-bee Hymenoptera, Diptera, Coleoptera, Lepidoptera) as potential pollinators (Rader et al. 2016). However even in agricultural landscapes, where wild insects have proven efficient pollinators by increasing fruit set independently of honeybees' abundance (Garibaldi et al. 2013), studies measuring pollination effectiveness of non-bee flower-visiting insects are scarce; they are usually restricted to butterflies and hoverflies (Diptera, Syrphidae). Consequently, despite the proliferating new knowledge on flower-visitor networks in both natural and agricultural landscapes, the actual role played by most anthophilous insects in the pollination of flowering remains largely unknown.

Flies (Diptera) represent the most conspicuous group of flower-visitors and potential pollinators after bees (Larson et al., 2001; Ssymank et al. 2008), especially in cool to cold habitats of high altitude or latitude where wild bees become naturally scarcer (Mani 1968; Kevan 1972; Arroyo et al. 1982; Pont 1993; Kearns et al. 1994; Hoiss et al. 2012). However, most studies including dipterans address only flower visitation frequencies, which King et al. (2013) consider as a poor proxy for pollinator efficiency. Visitors are indeed not always pollinators, a visit being likely to enhance the reproductive success of a plant only when it results in conspecific pollen deposition on its stigma. Therefore, direct measures of pollinator efficiency and plant reproductive success should be performed respectively through single-visit stigmatic pollen deposition (SVD) and seed set after a single visit experiments (Gross 2005; Ne'eman et al. 2009). To our knowledge, very few studies include such experiments on flower-visiting Diptera, although some of them challenge the common assumption that bees
are the best pollinators: e.g. hoverflies can pollinate strawberries as efficiently as bees (Albano et al. 2009), and a blowfly (Calliphoridae) was shown to be as efficient as honeybees and other flower-visitors together in pollinating hybrid carrots (Howlett 2011). Moreover, the first study comparing syrphids, the supposed most efficient pollinators among flies, to other Diptera, found no differences in pollen-loads or specialization (Orford et al. 2015). Those results cast light on the lack of knowledge about the role played by most fly families in the pollination of angiosperms (e.g. various Nematocera, Conopidae, Empididae, Muscidae, Tachinidae...).

Since the complementarity of functional traits between different pollinators of the same flowering plant has revealed a better predictor of pollination efficiency than the diversity and/or abundance of those pollinators (Hoehn et al. 2008; Fründ et al. 2013), the importance of flies relative to co-occurring flower-visitors in pollination services should be studied regarding to those traits, and not only their identity. For example, size, optimal conditions of activity (sun exposure, time of the day) and foraging behavior of an insect are likely to influence both quantity and quality of its visits. To assess the efficiency of dipterans as pollinators of a wild plant relative to other foraging insects, we chose *Geranium sylvaticum* L. and its flower-visitors as a model, in a subalpine environment where wild bees are scarce. Our objectives were: (i) to quantify the visitor cortege of *G. sylvaticum*; (ii) to assess the pollination efficiency of the main flower visitors using single visits seed set experiments; (iii) to assess whether pollination effectiveness was related to species identity or species traits, such as body size or visit duration.
## 2. Material and methods

### 1. Study site

The study was conducted from 15 June to 15 July 2015 in the north of Mercantour National Park, France. The site is a largely flat, semi open subalpine area at 1800 m altitude (6°46'33.8" E, 44°23'59.1" N), which consists of large meadows dotted with larches (*Larix decidua*). Near bushes and under larches thrive numerous populations of *Geranium sylvaticum*, some of them reaching several hundred individuals. Snow cover usually lasts from November until May and mowing occurs twice, in late summer.

### 2. Study model: *G. sylvaticum* and its flower-visiting insects

*Geranium sylvaticum* is a rhizomatous, perennial, gynodioecious and protandrous plant which occurs in meadows, woodlands and roadsides. It is widely distributed in Europe and temperate Asia; in France, its populations are confined to mountainous areas, the east and the north of the country. Three main sexual types, depending on their number of functional stamens – female (= male-sterile = pistillate) (0), intermediate (1-9), hermaphrodite (10) – have been identified (Vaarama and Jääskeläinen 1967). All our experiments were restricted to hermaphrodites, as previous studies found that seed set could vary depending on the sexual type (Vaarama & Jääskeläinen 1967; Asikainen & Mutikainen 2003; Ramula & Mutikainen 2003).

Newly opened flowers first undergo a male phase, lasting approximately half a day, during which the ten stamens release the pollen; then a female phase of a few hours, during which the five lobes of the hitherto immature stigma unfold and become receptive for pollen. On the study site, flowers of *G. sylvaticum* are mainly visited by dipterans, especially empidines (Lefebvre et al. 2014).
### 3. Monitoring of visits

Flower visitors were recorded between 19 June and 1st July 2015 by monitoring groups of 10 flowers for 10 minutes, in three different conditions: full sun, dappled sun and full shade. The 18 sessions were all performed between 10:00 and 16:00 on non-rainy days with a temperature above 18°C. For each visitor that came into contact with the reproductive parts of the flower, the following information was recorded: hour of the visit, taxonomic group (order and family at least) and size class (A: > 10mm or B: < 10mm).

### 4. Pollination regimes experiments

For all the following bagging experiments, including those of part (e), we used organza bags with a very fine mesh of about 0.16mm2. Fruits were harvested just before dehiscence, around 3 or 4 weeks after bagging depending on weather conditions.

To assess the dependence on pollinator of *G. sylvaticum*, we selected 36 healthy plants for which three flowers were applied a different pollination regime: (1) self-pollination, to test if the protandry succeeded in preventing self-fertilization, the flower was bagged just before blooming. The expected number of seeds was 0; (2) open-pollination, to get the number of seeds produced by entomogamy in natural conditions, the flower was bagged after the stigma became unreceptive, when the petals started dropping; (3) hand-pollination, to get the maximal number of seeds in the local conditions on the study site, a receptive stigma was pollinated with freshly harvested pollen from distant *G. sylvaticum* flowers, then the flower was bagged.

### 5. Single visits seed-set experiments

To assess the pollination effectiveness of the main flower visitors, 32 flowers were bagged between male and female phase to prevent pollen contamination of the bag. The day after bagging, we unbagged the flower when the stigma was freshly receptive
and waited for the first visit of a foraging insect. Its taxonomic group and size class
(A: > 10mm or B: < 10mm), as well as the length of the visit were recorded.

6. Statistical analyses

All statistical analyses have been performed with R Software version 3.2.5 (R
Development Core Team 2016). The *Geranium sylvaticum*-visitors source network was
generated with the bipartite package (Dormann et al. 2008). To determine if the
number of visits to *G. sylvaticum* differed between taxonomic groups (count data with
non-normal distribution), we used a non-parametric Wilcoxon two-sample paired rank
test.

We analyze the seed sets of single visits (proportion data) using a generalized linear model (“glm” procedure) that included an effect of taxonomic group, size, visit duration (log transformed to obtain homoscedasticity) and their interactions, with quasi-binomial error distribution as exploratory analyses indicated overdispersion.

To test the effects of taxonomic group, size, exposure, time of the day and their
interactions on the number of visits by each group of visitors, we used a linear mixed-
effects model (« lme » procedure of « nlme » library) that incorporated a random
effect of the session, a session representing a 10-flowers patch monitored for 10 min.

3. Results

(a) Visitors of *Geranium sylvaticum*

We recorded 329 visits, 80.6% were made by Diptera and 18.2% by Hymenoptera.
The remaining 1.2% were butterflies and beetles. The number of visits by empidine
dance flies, representing 74.2% of all visits, was significantly higher than the number
of all the visits by other insects considered together (Wilcoxon test, p<0.005). They
were not equally distributed by size classes: one large species, *Empis* (*Leptempis*)
*pandellei* Daugeron, was responsible for 62% of all visits by empidines. Bees made 17% of all visits; 86% were honeybees (*Apis mellifera* L.), remaining 14% were medium-sized solitary bees.

When restricting analyses to bees and empidines (98.8% of the visits), frequency of visits was significantly influenced by size, taxonomic group and time of the day. Most frequent visitors were empidines and for both groups, large visitors were predominant. There were more visitors in the afternoon than in the morning, and exposure had a near-significant effect: the number of visits increased with sunlight and no visit by bees was observed in the shade (Table 1, Fig. 1).

(a) Pollination regimes experiments

None of the flowers tested for auto-fertilization produced seed (mean=0, N=36). Hand-pollinated flowers produced the same total number of seeds (93) than open pollinated flowers (open-pollinated: 2.58 ± 0.24; hand-pollinated: 2.58 ± 0.32, mean ± SE, N=36).

(b) Single-visits seed set

Thirty-two single visits were recorded, 18 were empidines and 11 were bees. When considering all visits together, average number of seeds was 2.16 ± 0.28 per single visit (mean ± SE, N=32). Size of the visitor has a significant effect, as visits by large-sized flies and bees (>=10mm) produced more seeds than visits by smaller ones (F₁,₂₇=5.26, p=0.03) (Fig. 2). Taxonomic group and duration of the visit did not influence the seed set, although average duration of visits (by empidines (335 ± 60 sec) was much longer than the average duration of visits by bees (54 ± 17 sec).
<table><caption>**Table 1.** ANOVA table of the minimum adequate linear mixed-effects model testing the influence of taxonomic group, exposure, half-day, size of the insect and their interactions on the number of visits to *G. sylvaticum* flowers.</caption><thead><tr><th></th><th>numDF</th><th>denDF</th><th>F</th><th>p</th></tr></thead><tbody><tr><td>Group</td><td>1</td><td>52</td><td>45.76</td><td>&lt;.0001</td></tr><tr><td>Exposure</td><td>2</td><td>14</td><td>3.58</td><td>0.055</td></tr><tr><td>Half-day</td><td>1</td><td>14</td><td>7.47</td><td>0.016</td></tr><tr><td>Size</td><td>1</td><td>52</td><td>5.90</td><td>0.018</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure 1.** *Geranium sylvaticum*-visitors networks under three different conditions of exposure. The width of a block is proportional to the average number of visits by each taxon. Abbreviations: BEE = Bees; COL = Coleoptera; EMP = Empidinae; FLY = Other flies; LEP = Lepidoptera; SAW = Sawflies; SYR = Syrphidae.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 2.** Number of seeds produced by *G. sylvaticum* flowers after single visits by small (left) and large (right) bees (light grey) and empidines (dark grey) respectively.</figcaption></figure>

## 4. Discussion

(a) Visitors of *Geranium sylvaticum* are necessary...

Our results confirm that sexual reproduction of *Geranium sylvaticum* depends on flower-visiting insects, as flowers under self-pollination treatment produced no seed. Among those visitors, empidine dance flies were the most frequent. The proportions of flies (80.6%) and empidines (74.2%) that visited *G. sylvaticum* were consistent with the results of a previous study conducted in 2012 in the same area following a completely different protocol (Lefebvre et al. 2014).

(b) ...and influenced by abiotic conditions
As only visits by flies were recorded in shadow condition, and *G. sylvaticum* is a partial shade species growing in cool habitats, its main visitors and pollinators could be predicted by their functional traits like the ability to forage at lower temperature or to detect flowers without direct sunlight. Compared to bees, flies can thrive in colder and damper conditions, both of these parameters increasing with altitude. Effects of abiotic factors observed in this study at a very local scale probably exist at a much larger scale, for example along an altitudinal gradient, partially explaining the predominance of flies at altitude.

### (c) Pollination efficiency, size and foraging behavior

Large visitors were the most efficient pollinators regardless of their taxonomic group, which might be explained by their foraging behavior. In relation to the morphology of the flower, the size of the flower-visiting insect determines if and how it can access the food source: during a visit, large species like *Empis* (*Leptempis*) *pandellei* or *Apis mellifera* place their body upon the sexual parts of the flower, as allowed by their long legs and mouthparts, resulting in many contacts with the anthers and the stigma. Smaller species usually land on a petal then access the nectaries, on the base of the stamens, by passing under the sexual parts of the flower.
As visits by large bees or empidines resulted in the same average number of seeds, and the latter were the most frequent visitor with 46% of all visits, they were the most efficient pollinators of *G. sylvaticum* on the study site.

It may seem surprising that large visitors are so efficient that only one visit is enough to produce the same average number of seeds than open-pollinated flowers. This is likely a bias inherent to flower-bagging: insects spent a much longer time foraging in freshly unbagged, nectar-rich flowers than in recently visited flowers. While moving into the flower to access the different nectaries, they increased pollen deposition on the stigma.
(d) The *G. sylvaticum*-empidines model: a drop in the ocean

Considering how frequently interactions between empidines and numerous flowering plant species have been reported in the literature (Pesson & Louveaux 1984; Patt et al. 1989; Kudo 1993; Chvála 1994; Lindgaard Hansen & Molau 1994; Daugeron 1997; Dzhambazov & Teneva 2000 and 2002; Kozuharova 2002; Fiz et al. 2008; Lefebvre et al. 2014), it is surprising that their role in the reproductive success of those plants had never been addressed. They are obligate floral visitors which, contrary to the commonly accepted assumptions that they are generalists and poor pollinators, could reveal high levels of specialization and the same pollination efficiency than bees.

Like empidine dance flies, numerous species of calliphorids, conopids, muscids, anthomyids, tabanids, and many other families depend on nectar and pollen for feeding. In habitats where bees are unable to thrive, they could represent the only biotic vector carrying pollen grains from one flower to another. For instance, above 2500m in the Alps, flower-visitors other than muscoids (Diptera, Muscoidea) are scarce (Lefebvre, unpublished data); and even though each visit might make very little contribution to the reproductive success of the visited plant, their abundance might compensate for their low efficiency.

**Acknowledgements.** We thank Joël Rougon for letting us conduct our field study in one of his meadow, François Breton and Marie-France Leccia (Mercantour National Park) respectively for the precious advices on potential study sites and for the collecting permits, as well as Lorène Lombard and the whole Ubaye-Verdon ranger team of the Mercantour National Park. This work was supported by a grant from Agence Nationale de la Recherche under the LabEx ANR-10-LABX-0003-BCDiv, in the program "Investissements d'avenir" n°ANR-11-IDEX-0004-02.
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<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>*Empis (Leptempis) variegata* on the label of a freshly bagged bud of *G. sylvaticum*.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Plus d'une douzaine de petits Empis saturent les nectaries de deux fleurs de Geranium sylvaticum, en compagnie d'un coleoptère (Oedemera sp.). A gauche une fleur qui a perdu ses pétales et dont les anthères sont vides de leur pollen, mais dont le pistil est en phase réceptive, exhibant ses 5 lobes séparés en étoile ; les deux fleurs butinées sont entre le stade mâle et le stade femelle, avec les 5 lobes du pistil encore jointif mais les anthères déjà vidées de leur pollen. Ces petits Empis capables de passer sous les pièces sexuelles de la fleur n'ont probablement pas un grand rôle en tant que pollinisateur pour cette espèce de Geranium, mais leur abondance peut compenser la faible probabilité de pollinisation associée à chaque visite.
# PARTIE IV

ANTHOPHILIE EN ALTITUDE CHEZ LES
EMPIDINAE : APPORTS DE LA PHYLOGENIE
#### IV. Rôle de l'anthophilie dans la diversification des Empidinae et origine des adaptations à l'altitude

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>*Empis (Lissempis) nigritarsis* butinant sur une Euphorbe (*Euphorbia* sp.) – cliché Pierre Gros.</figcaption></figure>
# 1. Introduction

Dans ce chapitre, nous cherchons à comprendre le succès des pollinisateurs d'altitude par l'analyse de leur histoire évolutive. Quelles sont l'origine et l'évolution de l'anthophilie et de la distribution altitudinale chez ces taxons, et leur régime floricole est-il impliqué dans leur diversification ? La radiation évolutive des angiospermes, entre -125 et -90 Ma (Labandeira 2014), provoque l'apparition d'une ressource trophique abondante et diversifiée qui représente une nouvelle niche écologique pour les insectes. Souvent par co évolution, la diversification des plantes à fleurs s'est accompagnée de celle de leurs pollinisateurs. D'autre part, le remplacement des abeilles par des diptères dans les communautés de pollinisateurs alpines laisse supposer que ces diptères partagent des traits évolutifs qui favorisent leur survie en altitude par rapport aux autres groupes de floricoles. Nous testons ces hypothèses en utilisant le groupe modèle, les Empidinae, dont les résultats précédents ont montré l'importance dans les réseaux de pollinisation montagnards et alpins.

Pour réaliser ces analyses, j'ai construit une phylogénie moléculaire mondiale des Empidinae qui complète deux autres phylogénies plus anciennes : la première basée sur des caractères morphologiques (Daugeron et al. 2010), et l'autre sur des caractères moléculaires (Winkler et al. 2010). L'objectif de ces travaux précédents, réalisés sur la base d'un échantillonnage un peu différent de celui de la thèse, était de résoudre les relations de parenté au sein des Empidinae. Les deux genres contenant actuellement la majorité des espèces décrites, Empis (~800 sp.) et Rhamphomyia (~500 sp.), sont en effet paraphylétiques : ce sont des regroupements artificiels d'espèces qui ne reflètent pas l'histoire évolutive du groupe. L'utilisation de la phylogénie produite au cours de la thèse a permis de retracer l'évolution des adaptations à l'altitude et à l'anthophilie sur des groupes monophylétiques, et donc sur la base d'homologies et non de convergences évolutives.

Au sein de la famille des Empididae, la sous-famille des Empidinae, qui comprend toutes les espèces floricoles, est beaucoup plus diversifiée (~2040 espèces décrites) que son groupe frère dont les espèces sont prédatrices, les Hemerodromiinae (~400 espèces). Il semble donc qu'au cours de l'évolution des Empididae, un changement de niche écologique soit survenu au niveau de leur régime alimentaire, impliquant le passage de la prédation à la nectarivorie. J'ai posé l'hypothèse que cette transition était liée à la radiation adaptative des Empidinae ou au moins une partie d'entre eux, et je l'ai testée en répondant à deux questions centrales liées à leur anthophilie : 1) Quel est l'historique des interactions entre les Empidinae et les grands clades d'angiospermes ? Pour cela, j'ai d'une part compilé les données existantes sur l'âge d'apparition
des grands groupes d'angiospermes et celui des Empidinae, et d'autre part reconstruit l'état
ancestral du caractère « clades d'angiospermes visités » sur la phylogénie des Empidinae ; et
2) L'évolution de la structure du proboscis des Empidinae (élément anatomique déterminant
dans la prise de nourriture) est-elle impliquée dans leur transition vers le régime nectarivore,
et dans leur diversification ? Pour y répondre j'ai reconstruit l'état ancestral de la structure du
proboscis, et mis en relation les différents états de cette structure avec la richesse spécifique de
chacun des groupes.

Enfin, le succès des Empidinae en altitude peut avoir deux origines : soit un ancêtre
commun lui-même adapté à l'altitude, dont les descendants actuels partagent ce trait ; soit
des événements multiples d'adaptation à l'altitude chez différents taxons du groupe.
L'abondance des interactions Empidinae-angiospermes dans les régions froides (latitude élevées,
montagnes), tant dans cette étude que dans la littérature, m'a conduit à supposer que pour les
Empidinae, l'adaptation à l'altitude était ancestrale. J'ai testé cette hypothèse sur un
cladogramme restreint aux espèces du Mercantour, pour lesquelles je disposais des données de
distribution altitudinale.

**2. Matériel et méthodes**

J'ai effectué l'intégralité des manipulations de biologie moléculaire dans un laboratoire du
Muséum national d'histoire naturelle, le BoEM. J'ai d'abord extrait et amplifié par PCR l'ADN
de plus de 400 spécimens d'Empididae (Empidinae + Hemerodromiinae), puis nettoyé plus de
3000 séquences résultant du séquençage de ces manipulations. L'ensemble a nécessité plusieurs
mois de travail.

**Echantillonnage taxonomique.** L'échantillonnage inclut plus de 300 espèces provenant
de tous les continents sauf l'Antarctique, ce qui représente environ 15% de la diversité des
Empidinae actuellement décrite. Pour les analyses de ce chapitre, j'ai seulement conservé les
212 espèces pour lesquelles l'intégralité des quatre marqueurs a été amplifiée et séquencée
avec succès (Annexe 5, Table 1).

**Marqueurs moléculaires.** Les marqueurs choisis comprennent deux fragments d'ADN
codant pour l'ARN ribosomique 28S (domaines D1-D2 et D3-D5) ainsi que deux gènes
mitochondriaux, le 16S et le COI, ce dernier étant utilisé pour le barcoding des espèces. Nous
les avons sélectionnés car ils sont des marqueurs classiques et efficaces en entomologie pour
résoudre les relations phylogénétiques à différents rangs taxonomiques, qui correspondent à des événements de divergence plus ou moins lointain dans le temps.

**Extraction de l'ADN.** J'ai extrait L'ADN total de chaque espèce d'Empidinae à partir d'une ou deux pattes selon la taille de l'espèce, avec le « DNeasy Blood and Tissue DNA extraction kit » (Qiagen, Inc.) en suivant rigoureusement le protocole fourni. Pour augmenter la quantité d'ADN dans l'extraction finale, j'ai broyé les pattes directement dans les tubes contenant le buffer de lyse avec la protéinase K, à l'aide d'un micro-pilon, à la première étape du protocole. Le temps moyen d'incubation pour la lyse à 56°C était de 4h, et le volume final de la solution d'ADN extrait de 200µL.

**Amplification des marqueurs.** Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification des marqueurs (Tableau 1) ont été commandées chez Eurogentec; Les amorces pour le COI sont les amorces universelles utilisées pour le barcoding des espèces (Folmer et al. 1994) et les programmes PCR correspondants sont détaillés dans le Tableau 2. Les PCR ont été réalisées dans des volumes de 25µL contenant 2µL de l'extraction d'ADN, 2µL de Taq-&LOAD Mastermix 5X (MP Biomedicals, Illkirch, France) et 2µL de chaque amorce.

**Séquençage des produits de PCR.** La purification et le séquençage des produits de PCR ont été réalisés par Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany), et j'ai ensuite édité et corrigé les séquences brutes si nécessaire à l'aide du logiciel CodonCode Aligner (Version 6.0.2, CodonCode Corporation).

<table><caption>**Tableau 1.** Amorces utilisées pour l'amplification des marqueurs</caption><thead><tr><th>Marker (size)</th><th>(Strand) Name</th><th>Sequence</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">28S-D1D2 (~750 bp)</td><td>(F) 28S-C1dip</td><td>5' - ACCCCCTRAATTTAAGCAT - 3'</td></tr><tr><td>(R) 28S-Air</td><td>5' - CGTGTTTCAAGACGGGTC - 3'</td></tr><tr><td rowspan="2">28S-D4D5 (~670 bp)</td><td>(F) 28S-A</td><td>5' - GACCCGTCTTGAAGCACG - 3'</td></tr><tr><td>(R) 28S-D4D5r</td><td>5' - GTTACACACTCCTTAGCGGA - 3'</td></tr><tr><td rowspan="2">16S (~540 bp)</td><td>(F) 16S-A</td><td>5' - CGCCTGTTTATCAAAAACAT - 3'</td></tr><tr><td>(R) 16S-B</td><td>5' - CTCCGGTTTGAACTCAGATCA - 3'</td></tr><tr><td rowspan="2">COI (658 bp)</td><td>(F) LCO1490</td><td>5' - GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG - 3'</td></tr><tr><td>(R) HCO2198</td><td>5' - TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA - 3'</td></tr></tbody></table>
<table><caption>**Tableau 2.** Programmes utilisés pour l'amplification des différents marqueurs par PCR</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Initial denaturation</th><th rowspan="2">Cycles</th><th colspan="2">Denaturation</th><th colspan="2">Annealing</th><th colspan="2">Extension</th><th colspan="2">Final extension</th></tr><tr><th>T(min)</th><th>T°C</th><th>T(min)</th><th>T°C</th><th>T(min)</th><th>T°C</th><th>T(min)</th><th>T°C</th><th>T(min)</th><th>T°C</th></tr></thead><tbody><tr><td>28S-D1D2</td><td>02:30</td><td>95</td><td>35</td><td>00:30</td><td>95</td><td>00:40</td><td>54</td><td>00:55</td><td>72</td><td>05:00</td><td>72</td></tr><tr><td>28S-D4D5</td><td>02:30</td><td>95</td><td>35</td><td>00:30</td><td>95</td><td>00:40</td><td>56</td><td>00:50</td><td>72</td><td>05:00</td><td>72</td></tr><tr><td>16S</td><td>02:30</td><td>95</td><td>35</td><td>00:30</td><td>95</td><td>00:40</td><td>52</td><td>00:45</td><td>72</td><td>05:00</td><td>72</td></tr><tr><td>COI</td><td>03:00</td><td>94</td><td>5</td><td>00:30</td><td>94</td><td>01:30</td><td>45</td><td>01:00</td><td>72</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td>00:30</td><td>94</td><td>01:30</td><td>54</td><td>01:00</td><td>72</td><td>05:00</td><td>72</td></tr></tbody></table>

**Reconstruction phylogénétique.** La phylogénie a été générée en utilisant POY v.5.1.1 (Wheeler *et al.* 2015) sous l'hypothèse du maximum de parcimonie. Les analyses ont été réalisées d'abord pour chaque marqueur indépendamment, puis en combinant les marqueurs ensemble. Pour les marqueurs 16S, 28S d1-d2 et 28S d4-d5, les séquences ont été traitées en optimisation directe, c'est-à-dire en utilisant l'homologie dynamique (Wheeler 1996). En revanche les séquences du marqueur COI ont été vérifiées manuellement et considérées comme pré-alignées, c'est-à-dire en homologie statique. L'influence des coûts attribués aux gaps, transitions et transversions a été explorée à l'aide d'une analyse de sensibilité (« sensitivity analysis », Wheeler 1995). Trois ratios de coûts indel:transversion (1, 2 et 4) et transversion:transition (1, 2 et 4) ont été testés, soit au total neuf analyses individuelles de quatre jeux de données (16S rDNA, COI, 28S d1-d2 et les 3 marqueurs pris ensemble). La reconstruction phylogénétique suit trois étapes :

* **Étape 1** : Génération d'un jeu de 100 Wagner Trees par « random addition sequence » (RAS). Chaque arbre est soumis à une combinaison de deux approches heuristiques exploratoires de branch-swapping (TBR et SPR pour « tree bisection and reconnection » et « subtree pruning and regrafting », Swofford 1990) puis à une étape de ratcheting (Nixon 1999). Les topologies obtenues sont ensuite explorées par tree-fusing (Goloboff 1999). Finalement tous les arbres dont la longueur est supérieure d'au plus 10% à celle de l'arbre le plus court sont soumis à une nouvelle étape plus poussée de branch-swapping, à l'issue de laquelle tous les arbres optimaux sont conservés.
* Etape 2 : Pour chacun des 4 jeu de données, les arbres obtenus après les analyses avec les neufs paramètres ont été concaténés puis soumis à une étape supplémentaire d'analyse par tree-fusing.

* Etape 3 : les arbres obtenus aux étapes précédentes ont été améliorés par une dernière analyse de tree-fusing utilisant l'iterative pass (Wheeler 2003).

Afin de ne pas choisir les paramètres de façon arbitraire, nous avons fixé comme critère d'optimalité la congruence maximale entre tous les loci. Cette congruence a été mesurée à l'aide d'une métrique appelée « Incongruence Length Difference » (ILD, Mickevich and Farris 1981), que l'on calcule en divisant la différence entre la longueur de l'arbre complet (incluant tous les marqueurs), Lc, et la somme des longueurs des arbres obtenus pour chaque marqueur individuellement, $Li : ILD = \frac{(Lc - \sum Li)}{Lc}$. L'arbre résultant de cette analyse qui minimise les incongruences entre caractères parmi toutes les données est considéré comme la meilleure explication de la variation observée des caractères, et représente donc la phylogénie la plus probable.

**Optimisation des caractères sur les arbres.** Sur les cladogrammes obtenus, j'ai reconstruit les états de caractères ancestraux avec Mesquite v.3.31 (Maddison and Maddison 2017). Pour des raisons de lisibilité, ces analyses d'optimisation ont été réalisées sur des cladogrammes simplifiés à partir de la phylogénie complète (Annexe 5, Fig. 1), où les taxons terminaux sont des regroupements monophylétiques d'espèces proches.

## Origine et évolution des relations avec les grands clades d'angiospermes

J'ai regroupé les angiospermes par groupes monophylétiques selon les catégories suivantes :
(1) Rosids + Saxifragales ; (2) Asterids + Caryophyllales ; (3) Ranunculales ; (4) Monocots, représentant ainsi 4 états d'un caractère polymorphe. J'ai ensuite attribué à chaque groupe d'Empidini les états de caractères correspondants aux clades d'angiospermes visités par les espèces de ce groupe. La phylogénie utilisée est restreinte aux Empidini (= Empidinae sans les Hilarini) car pour les Hilarini les données étaient insuffisantes. Les données d'interactions qui ont servi à remplir la matrice de caractères proviennent de la base de données construite pour la revue de la Partie I.2.2 ; les données étaient manquantes pour environ un quart des groupes (10/38). L'état ancestral du caractère « clades d'angiospermes visités » a ensuite été reconstruit sous l'hypothèse du maximum de parcimonie.
## Evolution de la structure du proboscis

Le proboscis des Empidinae peut se classer en 3 catégories en fonction de sa structure : (1) court et épais, (2) long et épais, (3) long et fin. Sur la phylogénie mondiale des Empidinae simplifiée par groupes d'espèces monophylétiques, j'ai attribué à chacun des clades la catégorie correspondant à la morphologie de ses pièces buccales, puis j'ai reconstruit l'état ancestral de ce caractère sous l'hypothèse du maximum de parcimonie. Les données ont été extraites à partir des Empidinae de la collection de diptères du MNHN (Paris) par Christophe Daugeron. J'ai ensuite compilé les données sur le nombre d'espèces décrites dans chaque groupe, et le nombre d'espèces de plantes à fleurs visitées d'après la revue de la Partie I.2.2.

## Origine des adaptations à l'altitude

J'ai partagé le gradient en trois étages altitudinaux : (1) 970-1499m ; (2) 1500m-1999m ; (3) 2000m-2655m, qui représentent les différents états du caractère polymorphe « distribution altitudinale ». J'ai renseigné ces états de caractère pour chaque espèce collectée dans le Mercantour, puis reconstruit l'état ancestral de ce caractère sous l'hypothèse du maximum de parcimonie.

## 3. Résultats

### Origine et évolution des relations avec les grands clades d'angiospermes

L'association entre les Empidini et les angiospermes s'est produite durant ou après l'apparition des « core eudicots », clade qui comprend les (Rosids + Saxifragales) et les (Asterids + Caryophyllales), car l'ancêtre commun était un visiteur de ces différents groupes de plantes à fleurs (Fig. 1). Un certain nombre d'espèces visitent toutefois des groupes à divergence plus ancienne comme les Ranunculales, ou encore les Monocots qui comprennent les orchidées. Malgré l'âge ancien de ces clades, la reconstruction de l'état ancestral montre que leur association avec les Empidinae est récente, et non à la base du mutualisme entre les deux groupes. Les deux groupes butinés par l'ancêtre commun sont, avec les Monocots, les deux clades les plus diversifiés parmi les angiospermes (Annexe 5, Fig. 2).