# Utilisation des marqueurs moléculaires, RAPD et SCAR, dans les études des gènes de résistance à des agents pathogènes identifiés chez les laitues sauvages

Brigitte B. Maisonneuve, Yannick Bellec

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Brigitte B. Maisonneuve, Yannick Bellec. Utilisation des marqueurs moléculaires, RAPD et SCAR, dans les études des gènes de résistance à des agents pathogènes identifiés chez les laitues sauvages. Réunion du groupe de travail Marqueurs moléculaires chez les végétaux, Mar 1995, Méribel, France. hal-02777967

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MERIBEL 1995
# Utilisation des marqueurs moléculaires, RAPD et SCAR, dans les études des gènes de résistance à des agents pathogènes identifiés chez les laitues sauvages

## Brigitte Maisonneuve et Yannick Bellec

Station de Génétique et d'Amélioration des Plantes, 78026-Versailles Cedex

La laitue est l'une des plantes maraîchères importante pour la production française avec une balance commerciale excédentaire. S'agissant d'un légume feuilles consommé en frais, il faut fournir au consommateur un produit sain et sans résidu. Or l'agriculteur est confronté à de nombreux problèmes parasitaires dûs, en particulier, à des attaques de champignons ou de virus. L'utilisation de résistances génétiques constitue la meilleure réponse à ces problèmes.

La laitue, *Lactuca sativa*, est une espèce diploïde ($2n=18$) avec un génome estimé à $1950cM$ ($2 \times 10^9 pb$). Une carte génétique assez détaillée a été constituée par l'équipe de R. Michelmore (Kesseli et al, 1994 ; Michelmore et al, 1994). Elle comporte plus de 400 locus avec des caractères morphologiques, des résistances aux maladies, des marqueurs moléculaires (7 isozymes, 152 RFLP, plus de 250 RAPD). Parmi les 17 gènes de résistances cartographiés, 15 sont regroupés sur 3 groupes de liaison.

A l'INRA, les programmes d'amélioration sont centrés sur la recherche de nouvelles résistances à un champignon (*Bremia lactucae*) et à 2 virus (virus de la mosaique de la laitue, LMV ; virus de la jaunisse occidentale de la betterave, BWYV). L'une des voies suivie est la recherche de gènes de résistance dans le genre *Lactuca*. Ainsi, nous avons, en particulier, introduit des résistances à *B. lactucae* identifiées chez *L. serriola* dans des lignées de laitue. D'autre part, nous étudions des résistances aux virus identifiées chez *L. virosa*.

Au cours des études du déterminisme génétique et de l'introduction des gènes chez la laitue, plusieurs problèmes sont apparus :

- un facteur de résistance identifié par une ségrégation de type monogénique (3:1) ne recouvre-t-il pas un groupe de gènes très liés conférant des résistances vis à vis de souches différentes? Cette question est posée dans les études des gènes de résistance à *B. lactucae*, agent du mildiou.

- des aberrations de ségrégations dans des descendances sont-elles dûes à des anomalies de méiose, des problèmes de tests, des variations d'expression de la résistance,...? Pour la résistance au LMV, identifiée chez *L. virosa*, l'analyse de larges effectifs de $F_3$ intra-virosa donne des résultats souvent non conformes avec notre hypothèse (un gène à dominance incomplète) ; de plus, la résistance semble difficile à fixer dans les descendances des croisements interspécifiques.

Nous utilisons les marqueurs moléculaires, RAPD et SCAR, pour essayer de répondre à ces questions.

## I- Déterminisme génétique des résistances à *B. lactucae* identifiées chez *L. serriola*

### a- Exemple de problème dans l'étude du déterminisme génétique des résistances à *B. Lactucae* : un facteur de résistance (R) recouvre-t-il un ou plusieurs gènes (Dm)?

Les résistances actuellement caractérisées sont déterminées par des gènes dominants. Les relations *B. lactucae* / laitue répondent à la théorie gène pour gène de Flor. Ainsi les isolats sont définis par leurs gènes de virulence vis à vis d'une collection de 13 hôtes différentiels. Pour avoir une résistance, il faut que la plante et le champignon possèdent les gènes dominants, respectivement de résistance et d'avirulence, correspondant.

Les résultats obtenus aux Pays-Bas, publiés récemment, illustrent bien le problème lié au déterminisme génétique (Bonnier et al, 1994). Les auteurs ont étudié le déterminisme génétique de la résistance de plusieurs
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1- Groupe de liaison porteur des gènes *Dm1* et *Dm3* (d'après P. Anderson, équipe de R. Michelmore, 1993)</figcaption></figure>
lignées par des analyses de larges populations F₂ vis à vis de plusieurs isolats. Pour 2 génotypes (var. Mariska et lignée CS-RL), les résultats concordent avec un déterminisme monogénique dominant (ségrégation 1:3 sur 500 à 750 plantes d'une population F₂ avec une variété sensible, analyse sur 6 à 7 isolats). Aucune plante sensible n'est trouvée sur près de 500 F₂ dans des croisements avec une variété possèdant le gène *Dm1*. De plus, aucune plante sensible n'est identifiée dans la F₂ (CS-RL x Mariska) testée avec 3 isolats (500 plantes par test). Ces résultats permettent valablement d'avancer l'hypothèse d'un même gène chez les 2 génotypes, gène très lié à *Dm1*. Cependant, un isolat différenciant ces résistances a été identifié : seule Mariska est attaquée. Par conséquent, l'hypothèse précédemment avancée d'après les études de ségrégations de la résistance était fausse. Il pourrait s'agir de 2 gènes différents liés ou bien la résistance de CS-RL est multigénique et possède le gène de Mariska plus un autre gène très lié.

En raison de la complexité du système (plus de 13 gènes d'avirulence, donc plus 16384 isolats potentiels) et du regroupement sur 4 linkats des 13 gènes *Dm* déjà caractérisés, il sera très difficile de déterminer précisement les déterminismes génétiques. Or, il est important pour la sélection et les dossiers d'inscription de bien déterminer si 2 variétés ont le même gène de résistance ou des gènes différents, donc de bien définir si on dispose d'un gène ou d'un linkat.

Dans le passé, les caractérisations des gènes *Dm* ont été réalisées par des études du déterminisme génétique des facteurs de virulence correspondant (Ilott et al, 1989) rendues possible par l'existence d'une phase sexuée chez *B. lactucae*. Mais ce travail est lourd et nécessite l'identification d'un isolat attaquant bien le gène à étudier.

Une autre méthode peut être envisagée. En effet, si plusieurs gènes sont impliqués, il est possible de trouver des individus présentant une recombinaison entre ces gènes. Cependant, il faut étudier des effectifs très larges, incompatibles avec un travail de production de F₃ et des tests avec plusieurs souches. Mais l'identification de marqueurs moléculaires, faciles à utiliser, permet d'envisager ce travail. Il s'agirait de présélectionner à l'aide des marqueurs les recombinants potentiels. Nous appliquons actuellement cette technique à l'étude de la résistance de Mariska.

## b- Etude du déterminisme génétique de la résistance (facteur R18) à *B. lactucae* de la variété Mariska

La résistance introduite à partir de *L. serriola* dans la variété Mariska (obtention Nunhems) est actuellement la seule résistance non surmontée par les isolats couramment identifiés en France. Les sélectionneurs introduisent ce facteur R18 dans une large gamme de variétés sans savoir s'il sera moins vite surmonté que les gènes *Dm* déjà utilisés. Parallèlement à l'étude réalisées aux Pays-Bas (Bonnier et al, 1994), une étude d'hérédité sur des croisements entre variétés a été menée à l'INRA ; elle confirme l'unicité et la dominance du facteur R18. De plus, en collaboration avec R. Michelmore, nous avons cartographié R18 sur le linkat regroupant *Dm1*, *Dm3* et 5 autres gènes *Dm* (Fig. 1). Parmi les marqueurs moléculaires de cette région, 8 étaient polymorphes entre les parents de notre croisement (Cobham Green x Mariska). Ces informations nous ont permis d'identifier rapidement deux SCAR codominants (Fig. 2) encadrant R18 (Maisonneuve et al, 1994 a et b). L'utilisation de ces marqueurs, faciles à utiliser, permettrait alors d'éliminer rapidement, dans une large population en ségrégation, les individus sans recombinaison dans la portion du génome contenant le facteur R18. Seules, les plantes potentiellement intéressantes seraient retenues pour les études des résistances.

La recherche des individus F₂ (Cobham Green x Mariska) recombinant dans la région de R18 s'est effectuée selon 3 étapes :
a- Cartographie (analyse par BSA de 85 plantes F₂)

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b- Profils obtenus avec le SCAR SCI11 après digestion par l'enzyme MboI (ou Dnel)

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

c- Profils obtenus avec le SCW09 après digestion par l'enzyme TaqI

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Profils : Puits 1 à 4 = résultats des PCR de Cobham Green(1 et 3) et Mariska (2 et 4) sans digestion (1 et 2) ou après digestion par une enzyme de restriction (3 et 4). Puits 5 = échelle 123pb. A droite de l'échelle, profil des individus F₂ (Cobham Green x Mariska) après digestion enzymatique des produits de PCR (7 individus homozygotes sensibles, 17 individus hétérozygotes pour R18, 7 individus homozygotes pour R18)

Figure 2- Marqueurs moléculaires, SCAR et RAPD, encadrant le facteur de résistance R18 de Mariska à B. lactucae : étude dans la F₂ (Cobham Green x Mariska)
1- extraction de l'ADN de plantules F₂ âgées de 2 semaines (40 à 50 extractions par personne par jour) et test avec les deux SCAR, SCW09 et SCI11 (notation des profils : A=Cobham Green, H= hybride ; B=Mariska)

→ sur 405 plantes testées : 27 recombinants entre SCW09 et SCI11 (5=A-H ; 6=H-A ; 10=B-H ; 6=H-B), donc 378 plantes éliminées après la double PCR

2- étude des individus A-H et H-A avec le marqueur RAPD dominant OPAD19 (bande présente chez Mariska) situé entre SCI11 et R18

→ sur 11 plantes testées : 7 recombinants entre SCW09 et OPAD19 (2=A-C ; 5=H-A), donc 4 nouvelles plantes éliminées

3- production des graines sur des recombinants SCW09-SCI11 de type H-B ou B-H. Extraction de l'ADN de 8 à 16 plantules F₃ par lignée et test avec OPAD19

→ sur 15 lignées testées : 11 recombinants entre SCW09 et OPAD19 (8=B-H ; 3=H-B), une lignée reste à tester.

Ainsi, une étude rapide avec deux SCAR codominants (3,7 cM entre SCW09 et SCI11) encadrant R18 a permis d'éliminer 386 plantes non intéressantes pour la suite de l'analyse. Cette méthode a permis d'économiser l'utilisation d'une serre (170m²) sur plusieurs mois et le travail correspondant. D'après les tests de résistance effectués et les quelques contrôles réalisés avec les autres marqueurs de la région (toutes les plantes ont été analysées avec OPAD19), nos résultats sont fiables.

Ces premiers résultats montrent donc la fiabilité des marqueurs SCAR et RAPD dans une sélection et leur intérêt dans un programme où les tests pathologiques sont lourds ou non informatifs. Ces marqueurs pourraient donc servir à cumuler R18 avec un autre gène conférant une résistance aux mêmes isolats et marqué par d'autres SCAR.

Pour notre étude sur le déterminisme de R18, le travail se poursuit par des tests des lignées F₃ intéressantes avec une collection d'isolats. Si deux isolats donnent une réponse différente pour une même population F₃, il sera possible de conclure que R18 est un linkat de plusieurs gènes très liés.

## II- Déterminisme génétique de la résistance au LMV identifiée chez L. virosa

Le LMV est un potyvirus transmis par des pucerons et par la graine. Il peut être hébergé par de nombreuses adventices servant de réservoir (Dinant et Lot, 1992). Deux gènes de tolérance ont été identifiés voici plus de 20 ans : *g* dans la variété Gallega (Bannerot et al, 1969) et *mo* chez une L. sativa sauvage (Ryder, 1970). D'après nos études et des travaux anglais (Pink et al., 1992 a et b), ces 2 gènes seraient des allèles que nous appelons désormais *mo1¹* (=g) et *mo1²* (=mo). Ils confèrent une résistance à la transmission par la graine de la souche commune (pathotype II) et un fort retard dans l'apparition des symptômes permettant une bonne couverture en culture. Mais une évolution du virus nous a conduit à définir plusieurs pathotypes surmontant ces résistances (pathotype III = sensibilité de *mo1¹* et résistance de *mo1²* ; pathotype IV = attaque des 2 gènes). Aucune résistance aux souches de pathotype IV identifiées par H. Lot (INRA, Pathologie végétale, Montfavet) en Espagne et en France n'a pu être trouvée chez la laitue ou les espèces faciles à utiliser en sélection comme L. serriola.

En collaboration avec H. Lot, nous avons identifié une résistance à tous les pathotypes chez L. virosa. Cette espèce est difficile à croiser avec la laitue et les hybrides F₁ sont totalement stériles voire nécrotiques au stade plantule. En utilisant la culture *in vitro* d'embryons immatures (Maisonneuve, 1987), nous avons obtenu quelques descendances par rétro-croisement par la laitue. En raison de ces problèmes d'incompatibilité, nous avons étudié le déterminisme génétique de cette résistance dans des croisements intra-virosa. Nos premières
<table><caption>Tableau 1- Hérédité de la résistance au LMV de L. virosa</caption><thead><tr><th rowspan="2">Génotypes</th><th rowspan="2">Souches</th><th colspan="3">Nombre de plantes obtenues</th><th rowspan="2">χ² calculé<br>hypo 1:2:1</th></tr><tr><th>Mosaïque forte<br>et DO forte</th><th>Nécroses</th><th>Pas de symptômes<br>et DO faible à nulle</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="6">L. virosa, génotypes parentaux :</td></tr><tr><td>résistant</td><td>LMV-E</td><td>0</td><td>0</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>sensible</td><td>(pathotype IV)</td><td>5</td><td>0</td><td>0</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">F₁ (sens x rés)</td><td>LMV-E</td><td>0</td><td>4</td><td>0</td><td></td></tr><tr><td>LMV-13</td><td>3</td><td>8</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td>LMV-0</td><td>0</td><td>0</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>F₁ (rés x sens)</td><td>LMV-13</td><td>0</td><td>10</td><td>0</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">F₂ (sens x rés)</td><td>LMV-E</td><td>5</td><td>10</td><td>4</td><td>0,16</td></tr><tr><td>LMV-13</td><td>17</td><td>28</td><td>13</td><td>1,14</td></tr><tr><td>LMV-0<br>(peu de plantes avec symptômes)</td><td>6</td><td>0</td><td>11</td><td>(hypo=1:3) 0,96</td></tr></tbody></table>

LMV-E et LMV-13 sont classés en pathotype IV, LMV-0 en pathotype II

<table><caption>Tableau 2- Résistance au LMV-0 de quelques lignées F₃ intra-virosa</caption><thead><tr><th rowspan="3">Lignées</th><th rowspan="3">N°<br>Tests</th><th colspan="5">Nombre de plantes F₃ inoculées par le LMV-0</th><th rowspan="3">Cumul<br>Lignée F₃</th></tr><tr><th colspan="4">Multiplication virale entre 12 et 28 jours</th><th rowspan="2">Bilan</th></tr><tr><th>=témoins inoc</th><th>forte Xn</th><th>faible Xn</th><th>=non inoc</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">2-2</td><td>2</td><td>13</td><td>9</td><td>0</td><td>0</td><td>22+</td><td>38+</td></tr><tr><td>5</td><td>1</td><td>15</td><td>0</td><td>0</td><td>16+</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">2-10</td><td>3</td><td>20</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>22+</td><td>33+</td></tr><tr><td>5</td><td>8</td><td>3</td><td>0</td><td>0</td><td>11+</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">1-8</td><td>(1993)</td><td>9</td><td>5</td><td>0</td><td>0</td><td>14+</td><td>50+</td></tr><tr><td>(1994)</td><td>16</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>16+</td><td></td></tr><tr><td>(1995)</td><td>5</td><td>15</td><td>0</td><td>0</td><td>20+</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">2-3</td><td>2</td><td>8</td><td>8</td><td>0</td><td>1</td><td>16+/1R</td><td>37+/1R</td></tr><tr><td>5</td><td>8</td><td>13</td><td>0</td><td>0</td><td>21+</td><td></td></tr><tr><td>2-17</td><td>3</td><td>16</td><td>17</td><td>1</td><td>0</td><td>33+/1R</td><td>33+/1R</td></tr><tr><td rowspan="2">2-8</td><td>2</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>17</td><td>17R</td><td>32R</td></tr><tr><td>5</td><td>0</td><td>0</td><td>3</td><td>12</td><td>15R</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">2-14</td><td>3</td><td>0</td><td>0</td><td>4</td><td>21</td><td>25R</td><td>44R</td></tr><tr><td>4</td><td>0</td><td>0</td><td>8</td><td>11</td><td>19R</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">1-15</td><td>(1993)</td><td>0</td><td>0</td><td>2</td><td>19</td><td>21R</td><td>61R</td></tr><tr><td>(1994)</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>12</td><td>12R</td><td></td></tr><tr><td>(1995)</td><td>0</td><td>0</td><td>7</td><td>21</td><td>28R</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">1-14</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>15</td><td>1+/15R</td><td>1+/32R</td></tr><tr><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>17</td><td>17R</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">1-3</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>1</td><td>15</td><td>16R</td><td>1+/34R</td></tr><tr><td>6</td><td>0</td><td>1 (surinoc)</td><td>9</td><td>9</td><td>1+/18R</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">3-2</td><td>6</td><td>2</td><td>0</td><td>1</td><td>17</td><td>2+/18R</td><td>2+/32R</td></tr><tr><td>7</td><td>0</td><td>5</td><td>9</td><td>14R</td><td>5+/23R</td><td>(χ²=6,6)</td></tr><tr><td rowspan="2">2-4</td><td>2</td><td>3</td><td>0</td><td>0</td><td>20</td><td>5+/20R</td><td>3+/44R</td></tr><tr><td>4</td><td>0</td><td>0</td><td>12</td><td>12</td><td>24R</td><td>(χ²=8,7)</td></tr><tr><td rowspan="2">2-20</td><td>3</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>19</td><td>2+/19R</td><td>4+/39R</td></tr><tr><td>5</td><td>0</td><td>2</td><td>15</td><td>5</td><td>2+/20R</td><td>(χ²=5,7)</td></tr><tr><td rowspan="2">3-9</td><td>6</td><td>2</td><td>1</td><td>5</td><td>14</td><td>3+/19R</td><td>6+/35R</td></tr><tr><td>7</td><td>2</td><td>1</td><td>8</td><td>8</td><td>3+/16R</td><td>(χ²=2,3)</td></tr><tr><td rowspan="2">1-70</td><td>2</td><td>13</td><td>6</td><td>6</td><td>15+/12R</td><td>18+/41R</td><td></td></tr><tr><td>3</td><td>0</td><td>7</td><td>22</td><td>3+/29R</td><td>(χ²=1,0)</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">2-5</td><td>1</td><td>6</td><td>0</td><td>2</td><td>13</td><td>7+/15R</td><td>9+/37R</td></tr><tr><td>2</td><td>1</td><td>0</td><td>0</td><td>10</td><td>2+/10R</td><td>(χ²=0,7)</td></tr><tr><td>4</td><td>2</td><td>0</td><td>6</td><td>6</td><td>2+/12R</td><td></td></tr><tr><td rowspan="3">1-46</td><td>(1993)</td><td>0</td><td>9</td><td>4</td><td>15</td><td>9+/19R</td><td>16+/60R</td></tr><tr><td>(1994)</td><td>1</td><td>1</td><td>0</td><td>17</td><td>2+/17R</td><td>(χ²=0,6)</td></tr><tr><td>(1995)</td><td>3</td><td>2</td><td>4</td><td>20</td><td>5+/24R</td><td></td></tr></tbody></table>
études nous ont permis d'avancer l'hypothèse d'un gène à dominance incomplète vis à vis du pathotype IV et dominant vis à vis du pathotype II (Tabl. 1). Mais nous observons, sur de grands effectifs en F₃, des résultats non compatibles avec cette hypothèse ; de plus, dans les lignées issues des croisements interspécifiques nous avons des difficultés pour fixer la résistance.

Nous avons entrepris une recherche de marqueurs RAPD afin de cartographier la résistance et d'utiliser des marqueurs comme aide à la sélection. Les premiers marqueurs identifiés servent actuellement à tester plusieurs hypothèses visant à expliquer nos anomalies de ségrégation dans les tests de résistance.

## a- Problème dans l'étude du déterminisme génétique de la résistance au LMV de *L. virosa*

Nous avons étudié, en condition contrôlée, la résistance au LMV0 de lignées F₃ intra-virosa après inoculation artificielle. La présence du virus est détectée par test Elisa car l'apparition des symptômes n'est pas toujours facile à noter chez le parent virosa sensible. Toutes les plantes témoins sensibles montrent, dans chaque test, une forte multiplication du virus. L'étude d'une centaine de lignées donne un résultat compatible avec l'hypothèse d'un caractère monogénique : 23 +/+, 46 R/+, 31 R/R ($\chi^2$ = 1,92, hypothèse = 1:2:1).

Cependant, nous obtenons, à l'intérieur de plusieurs lignées F₃, des ségrégations non conformes à l'hypothèse. D'une part, chez plusieurs lignées classées (+/+) 1 à 2 plantes ne multiplient pas le virus (exemples : lignées 2-3 et 2-17, Tabl. 2). L'hypothèse de plantes échappées à l'infection peut être avancée bien que chez le parent sensible nous n'ayons jamais ce problème. Chez plusieurs lignées en ségrégation le taux de plantes sensibles est inférieur au nombre attendu (exemples : lignées 2-4 ou 2-20 ou 3-2, Tabl. 2). Dans certains cas, nous n'obtenons qu'une plante sensible sur plus de 30 individus (exemples : lignées 1-14 ou 1-3, Tabl. 2). Deux hypothèses opposées peuvent être avancées. Soit l'expression du gène de résistance est instable dans certaines conditions, génotypiques ou physiologiques ; dans ce cas, les rares plantes sensibles possèderaient le gène de résistance non exprimé et la plante F₂ parentale était homozygote. Soit nous avons des plantes échappées à l'infection ; nous obtenons alors une sous-évaluation du nombre de plantes sensibles et la plante F₂ correspondante était hétérozygote.

En outre, il faut signaler que les plantes F₂ et F₃ intra-virosa ont un taux de fertilité très variable entre individus. Des distorsions de ségrégations dûes à ces anomalies de méiose ne sont donc pas exclues.

L'analyse de marqueurs moléculaires codominants, ou de couples de marqueurs en répulsion, encadrant le gène de résistance pourraient aider à expliquer ces résultats : distorsions de ségrégation, structure homozygote ou hétérozygote d'une lignée?

## b-. Marqueurs RAPD de la résistance au LMV de *L. virosa*

Deux bulks de lignées homozygotes, 7 à 10 résistantes vs 8 à 11 sensibles, ont été comparés avec 239 amorces aléatoires de Operon selon la technique de la BSA. Avec 11 des 213 amorces amplifiant les ADN, nous observons un polymorphisme révélant une liaison avec la résistance (Fig. 3). Les contrôles sur les individus ont confirmé 10 bandes présentes chez le parent résistant et 3 bandes présentes chez le parent sensible liées à la résistance. D'après les résultats déjà obtenus, les marqueurs se situeraient de part et d'autre du gène de résistance sur un segment de 50 à 60 cM. Certaines bandes, en particulier les bandes présentes chez le parent sensible au LMV, plus difficiles à lire, doivent être contrôlées pour réaliser une carte précise de cette région.

## c- Utilisation des marqueurs pour expliquer les anomalies de ségrégations

Si des anomalies à la méiose expliquent les aberrations de ségrégation dans nos tests de résistance, les autres gènes de cette région du génome, donc en particulier des marqueurs RAPD, devraient également présenter des distorsions. L'absence de distorsion (Tabl. 3) obtenue pour 8 bandes présentes chez le parent résistant
permet d'éliminer l'hypothèse d'anomalies de méiose. Par contre, il faut souligner le large excès, parmi les plantes classées hétérozygotes pour la résistante, d'individus ne possèdant pas les bandes du parent sensible. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées. Une erreur de lecture de ces bandes chez les plantes hétérozygotes (bandes difficiles à lire) ne peut être éliminée avant un contrôle précis de tous ces résultats. Un avortement d'une partie des gamètes porteur de l'allèle de sensibilité, et donc des bandes RAPD liées, chez les plantes hétérozygotes ; ceci expliquerait le déficit de plantes sensibles dans les lignées en ségrégation et l'excès de plantes sans la bande du parent sensible (extraction d'ADN sur des bulks de 15 à 20 individus F<sub>3</sub>).

Le faible nombre de marqueurs en répulsion ne permet pas de répondre à nos questions. La transformation de certains de ces marqueurs en SCAR codominants et plus faciles à cribler semble nécessaire pour mieux comprendre nos résultats. De même, ces marqueurs seront utiles pour envisager d'utiliser le marquage comme aide à la sélection des lignées interspécifiques. Parallèlement, un contrôle de la constitution génétique des individus de certaines F<sub>3</sub> a été réalisé par des tests sur les descendances F<sub>4</sub>. Jusqu'à présent, toutes les plantes F<sub>3</sub> notées sensibles dans les tests sont effectivement homozygotes pour l'allèle de sensibilité et les plantes F<sub>3</sub> notées résistantes sont hétérozygotes ou fixées pour la résistance. Ces résultats appuient l'idée d'un avortement de certains gamètes et incitent à rejeter l'hypothèse de problèmes de tests ou de mauvaise expression du caractère.

Tous ces résultats demandent à être confirmés pour élaborer une stratégie d'utilisation de cette résistance en sélection. Les marqueurs moléculaires nous ont permis d'avancer une hypothèse sur la transmission du caractère. De plus, s'ils se révèlent polymorphes entre le génotype de *L. virosa* résistant et les variétés de *L. sativa* utilisées dans les croisements interspécifiques, ils constitueront un outil intéressant pour la création de géniteurs de résistance ; en effet les tests sont lourds à réaliser.

Références

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<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 3- Marqueurs moléculaires, RAPD, encadrant la résistance au LMV de L. virosa. Comparaison avec 7 amorces de 2 L. virosa, l'une sensible (Ps), l'autre résistante (Pr), avec les bulks de lignées F₂ (Ps x Pr) homozygotes résistantes (R) ou sensibles (r). Amorces : AA03, AB19 et AB01, N05 et AC03, AC06 et AB20. Pour chaque amorce : puits 1 = Ps, puits 2 = Pr, puits 3 = R, puits 4 = r. Echelle de 100pb (Pharmacia)</figcaption></figure>

<table><caption>Tableau 3- Ségrégation des marqueurs RAPD liés à la résistance au LMV de L. virosa</caption><thead><tr><th rowspan="2">Marqueurs</th><th colspan="4">Résistance au LMV-0 des plantes F₂ (d'après F₃)</th><th rowspan="2">Total</th><th rowspan="2">Théorie 1:3</th><th rowspan="2">χ²</th></tr><tr><th>R : R</th><th>R : R?</th><th>R : +</th><th>+ : +</th></tr></thead><tbody><tr><td>Nbre pltes</td><td>30</td><td>10</td><td>36</td><td>23</td><td>99</td><td>0,16</td><td>ns</td></tr><tr><td colspan="8">Bandes chez le parent résistant (=C)</td></tr><tr><td>H12</td><td>1A:29C</td><td>1A : 3C</td><td>11A : 20C</td><td>20A : 1C</td><td>96</td><td>4,5</td><td>*</td></tr><tr><td>K20</td><td>1A : 27C</td><td>1A : 7C</td><td>1A : 31C</td><td>11A : 9C</td><td>89</td><td>3,9</td><td>*</td></tr><tr><td>L9</td><td>2A : 26C</td><td>8C</td><td>2A : 29C</td><td>13A : 5C</td><td>85</td><td>1,1</td><td>ns</td></tr><tr><td>AB1</td><td>1A : 29C</td><td>9C</td><td>3A : 33C</td><td>16A : 6C</td><td>97</td><td>1,0</td><td>ns</td></tr><tr><td>AB19</td><td>1A : 29C</td><td>9C</td><td>3A : 29C</td><td>18A : 3C</td><td>92</td><td>0,1</td><td>ns</td></tr><tr><td>AC6</td><td>1A : 27C</td><td>10C</td><td>1A : 35C</td><td>19A : 3C</td><td>96</td><td>0,5</td><td>ns</td></tr><tr><td>N5</td><td>30C</td><td>10C</td><td>1A : 33C</td><td>20A : 3C</td><td>97</td><td>0,6</td><td>ns</td></tr><tr><td>K16</td><td>27C</td><td>9C</td><td>1A:33C</td><td>19A : 3C</td><td>92</td><td>0,5</td><td>ns</td></tr><tr><td>SCAC3</td><td>30C</td><td>1A:8C</td><td>2A : 33C</td><td>18A : 3C</td><td>95</td><td>0,4</td><td>ns</td></tr><tr><td>AB20</td><td>25C</td><td>1A : 6C</td><td>20C</td><td>14A : 5C</td><td>71</td><td>0,6</td><td>ns</td></tr><tr><td colspan="8">Bandes chez le parent sensible (= D)</td></tr><tr><td>AB20</td><td>19B : 2D</td><td>3B : 1D</td><td>9B : 5D</td><td>17D</td><td>56</td><td>27,5</td><td>**</td></tr><tr><td>H12</td><td>30B</td><td>4B</td><td>25B : 6D</td><td>7B : 14D</td><td>86</td><td>122,8</td><td>**</td></tr><tr><td>K18</td><td>24B : 5D</td><td>2B : 2D</td><td>12B : 18D</td><td>18D</td><td>81</td><td>21,7</td><td>**</td></tr></tbody></table>