# Etude de la sécrétion d'enzymes fongiques dans les sols. Application au développement de biomarqueurs d'écotoxicité des sols et déchets

Achref Aloui, Nathalie Cheviron, Didier Chevret, Christian Mougin

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Achref Aloui, Nathalie Cheviron, Didier Chevret, Christian Mougin. Etude de la sécrétion d'enzymes fongiques dans les sols. Application au développement de biomarqueurs d'écotoxicité des sols et déchets. 4ème Séminaire d'Écotoxicologie de l'INRA, Nov 2011, St Lager, France. 2011. hal-01602051

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# Etude de la sécrétion d'enzymes fongiques dans les sols
## Application au développement de biomarqueurs d'écotoxicité des sols et déchets

Achref Aloui¹, Nathalie Cheviron¹, Didier Chevret² et Christian Mougin¹

¹Unité Physico-chimie et Ecotoxicologie des SolS d'Agrosystèmes Contaminés, INRA, Versailles

²Plateforme PAPPSO, Unité MICALIS, INRA, Jouy en Josas

## INTRODUCTION

Les activités anthropiques conduisent à une contamination de l'environnement par des composés chimiques potentiellement toxiques, susceptibles de perturber le fonctionnement des sols cultivés. L'évaluation du risque écotoxique associé à ces contaminations nécessite le développement d'outils sensibles et sélectifs pour évaluer d'éventuels effets néfastes. Dans ce contexte, les champignons filamenteux présentent de nombreux atouts dans la mesure où ils produisent des systèmes enzymatiques variés dont l'activité et la production peuvent être affectées à la suite de leur exposition à des contaminants chimiques. Les profils d'expression enzymatiques pourraient être utilisées comme des biomarqueurs d'écotoxicité pertinents.

## OBJECTIFS

Notre objectif est d'étudier les profils de sécrétion des protéines exocellulaires par le champignon filamenteux *Trametes versicolor* exposé à un contaminant organique, la 2,5-diméthylaniline (xylidine) et à un contaminant métallique, le cuivre (Cu), dans des cultures liquides.
L'approche protéomique est privilégiée, en complément d'approches transcriptomiques ou fonctionnelles déjà réalisées (Mougin et al., 2002; Lebrun et al., 2010).

## CULTURES

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

* Le basidiomycète *T. versicolor* ATCC 32745 est cultivé selon Lebrun et al. (2010, 2011). Après 3 jours d'équilibration à 28°C, 3 conditions sont testées en parallèle :

- témoin non traité,

- essai traité avec la xylidine à 0,3 mM,

- essai traité avec le cuivre à 20 ppm.

* Après 7 jours d'exposition, le milieu de cultures est récupéré, centrifugé à 4000 g pendant 10 min. Les protéines sont concentrées pour disposer de 100 µg par gel 2D, puis filtrées à 0,2 µm, et un cocktail d'antiprotéases est ajouté à la solution.

* La première dimension électrophorétique est obtenue par isofocalisation (IEF) sur des strips de 18 cm (IPG strips) dans une gamme de pH allant de 3 et 10 unités; la seconde dimension est réalisée sur gel (1mm, 19 cm, 24cm) SDS-PAGE à 12% de polyacrylamide.

## ANALYSE PROTEOMIQUE

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## RESULTATS

### 1 - GELS 2D

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

* Les gels traduisent l'évolution de l'expression des protéines en réponse à l'exposition de *T. versicolor* au Cu ou à la xylidine. Cette évolution est surtout marquée dans la zone acide du gel, où sont localisées les laccases.

### 2 - IDENTIFICATION DES PROTEINES

<table><thead><tr><th>n°</th><th>Nom de la protéine</th><th>Numéro d'accès<sup>1)</sup></th><th>Peptide<sup>2)</sup></th><th>pI<sup>3)</sup></th><th>PM<sup>4)</sup></th><th>Fonction possible</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>6</td><td>6,5</td><td>60</td><td rowspan="3">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>2</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>7</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>3</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>15</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>4</td><td>A chain A, active laccase</td><td>21730578</td><td>14</td><td>6,2</td><td>26</td><td>Oxydoréduction et complexion avec les métaux</td></tr><tr><td>5</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,3</td><td>17</td><td rowspan="5">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>6</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>11</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>7</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>12</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>8</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>13</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>9</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,3</td><td>17,8</td></tr><tr><td>10</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,2</td><td>48</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>11</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,8</td><td>17,3</td></tr><tr><td>12</td><td>laccase 1</td><td>Q99044</td><td>13</td><td>3,2</td><td>60</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>13</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>5,4</td><td>83</td></tr><tr><td>14</td><td>A chain A, active laccase</td><td>21730578</td><td>10</td><td>5,7</td><td>26</td><td>Oxydoréduction et complexion avec les métaux</td></tr><tr><td>15</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>5,8</td><td>34</td><td rowspan="5">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>16</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>7</td><td>6,5</td><td>33</td></tr><tr><td>17</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,1</td><td>49</td></tr><tr><td>18</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,2</td><td>23,5</td></tr><tr><td>19</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>6,9</td><td>27</td></tr><tr><td>20</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>5,6</td><td>83</td><td rowspan="2">Constituants structurels des pores nucléaires</td></tr><tr><td>21</td><td>Predicted protein</td><td>A6R705</td><td></td><td>7,5</td><td>20,5</td></tr><tr><td>22</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>6,4</td><td>37</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>23</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>6,9</td><td>25,3</td></tr><tr><td>24</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>6,5</td><td>38</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>25</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>7,2</td><td>25,3</td></tr><tr><td>26</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>9,5</td><td>35,5</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>32</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>9,6</td><td>60</td></tr><tr><td>34</td><td>laccase 1</td><td>Q99044</td><td>12</td><td>5,4</td><td>26</td><td>Oxydoréduction et complexion avec les métaux</td></tr><tr><td>35</td><td>A chain A, active laccase</td><td>21730578</td><td>15</td><td>5,4</td><td>26</td><td rowspan="2">Régulation et réparation de l'ADN</td></tr><tr><td>36</td><td>Histone H4</td><td>Q9HDF5</td><td>4</td><td>5</td><td>17,5</td></tr><tr><td>37</td><td>Putative uncharacterized protein</td><td>B8PEY4</td><td></td><td>7,4</td><td>25,4</td><td>hydrolase, glycosidase, complexion de cation, processus métabolique des carbohydrates</td></tr><tr><td>38</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>6,4</td><td>35</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>39</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>9</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>40</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>8,5</td><td>27,8</td><td>Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>41</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>10</td><td>6,5</td><td>60</td><td rowspan="2">Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>42</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>10</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>43</td><td>NI</td><td></td><td></td><td>8,5</td><td>27</td><td rowspan="2">Complexion avec les protéines et l'ATP</td></tr><tr><td>44</td><td>actine 2</td><td>Q9Y707</td><td>7</td><td>7</td><td>27,4</td></tr><tr><td>45</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>8</td><td>6,5</td><td>60</td><td>Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr><tr><td>46</td><td>laccase 2</td><td>Q12718</td><td>8</td><td>6,5</td><td>60</td><td>Oxydoréduction et dégradation de la lignine</td></tr></tbody></table>

* Le tableau rapporte la liste des protéines du secrétome fongique (identifiées par spectrométrie de masse LC-MS/MS Orbitrap), dont les volumes sont modifiés en réponse à l'exposition au cuivre ou à la xylidine (NI : non identifiées)

* Peu de séquences protéiques sont répertoriées dans les bases de données. Seules des laccases ont été majoritairement identifiées

### 3 - ANALYSE COMPARATIVE

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* L'analyse comparative des données révèle 3 groupes de protéines :

- le groupe I caractérisé par des spots protéiques augmentés en présence de xylidine,

- le groupe IIa comprend les spots réprimés en présence de l'un ou l'autre des effecteurs,

- le groupe IIb comprend les spots augmentés en présence de Cu.

## CONCLUSIONS

* Nos résultats montrent la pertinence de la démarche mise en place,

* Le manque d'informations, dans les bases de données, sur les séquences protéiques fongiques, limite l'utilisation des profils de sécrétion comme biomarqueurs,

* Ces résultats à l'échelle protéique confirment ceux obtenus précédemment au niveau transcriptomique ou fonctionnel,

* Il reste nécessaire de développer les protocoles d'extraction des protéines à partir des sols agricoles contaminés.

## Références

Mougin C., Kollmann A. and Jolivalt C. 2002. Biotechnol. Letters 24:139-142

Lebrun J.D., Trinsoutrot-Gattin I., Laval K. and Mougin C. 2010. Environ Toxicol Chem 29:902-908

Lebrun J.D., Demont-Caulet N., Cheviron N., Laval K., Trinsoutrot-Gattin I., Mougin C. 2011. Chemosphere 82:340-345

## Remerciements

Les auteurs remercient la Région Ile de France et le DIM Astrea pour l'allocation post-doctorale dont a bénéficié Achref Aloui.

Ils remercient également L. Rajou (Plateforme de Biochimie des Protéines, IJBP, INRA Versailles, pour l'aide apportée à la réalisation des gels 2D.

<footnote>a) Numéro d'accès extraits à partir d"uniprot" (http://www.uniprot.org/), sauf pour les spots 4, 14, 35 qui ont été identifiés par recherche "DENOVO" à "NCBI" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).</footnote>

<footnote>b) Numéros de peptides retenus "matched peptides".</footnote>

<footnote>c) Exp: valeurs expérimentales pour le point isoélectrique (pl) et le poids moléculaire (PM) de chaque protéine.</footnote>