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open science

# Utilisation des marqueurs moléculaires - Sélection pour la résistance à la sécheresse

Laurent Bouffier

► To cite this version:

Laurent Bouffier. Utilisation des marqueurs moléculaires - Sélection pour la résistance à la sécheresse. Journées Pinus pinaster, May 2022, Vitoria, Spain. hal-04712220

HAL Id: hal-04712220

https://hal.inrae.fr/hal-04712220v1

Submitted on 27 Sep 2024

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Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
Utilisation des marqueurs moléculaires
Sélection pour la résistance à la sécheresse

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

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INRAE

Laurent Bouffier, INRAE (UMR BIOGECO Pierroton)

laurent.bouffier@inrae.fr

Journées Pinus pinaster - Vitoria - 4-5 Mai 2022
## 1/ Les marqueurs moléculaires: apports pour la sélection génétique

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>
# Qu'est-ce qu'un marqueur moléculaire?

Fragment d'ADN
avec une position bien définie dans le génome (locus)
et présentant du polymorphisme dans la population

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Environ 30 000 gènes chez les espèces forestières,
beaucoup dont les fonctions sont inconnues

## Single Nucleotide Polymorphism (SNP):

Variation d'une seule paire de bases du génome entre individus d'une même espèce

Individu 1 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 2 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 3 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 4 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 5 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 6 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 7 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 8 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 9 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
Individu 10 CCCTGAAAGCCTCTTGTAATGTCGACTAATAAAAAGATTTCCTTCCTCAATAGC
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

1- récolte d'aiguilles

2- mise en plaque

3- extraction d'ADN

4- génotypage

<table><thead><tr><th>SAMPLE_NAME</th><th>SNP_01</th><th>SNP_02</th><th>SNP_03</th><th>SNP_04</th><th>SNP_05</th><th>SNP_06</th><th>SNP_07</th><th>SNP_08</th><th>SNP_09</th><th>SNP_10</th></tr></thead><tbody><tr><td>3110</td><td>GG</td><td>GC</td><td>CG</td><td>TT</td><td>GT</td><td>CA</td><td>TC</td><td>A</td><td>TT</td><td>GA</td></tr><tr><td>0004</td><td>GT</td><td>GG</td><td>CG</td><td>TT</td><td>TT</td><td>AA</td><td>CC</td><td>GG</td><td>TC</td><td>AA</td></tr></tbody></table>

...

...

Profil moléculaire

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

5- lecture des profils
# Outils moléculaires disponibles chez *Pinus pinaster*

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

## Puce haute-densité = 12 000 SNP

- Puce 4TREE développée dans le cadre du projet européen B4EST

- puce commerciale multi-espèces: *Populus* sp, *Fraxinus* sp, *Pinus* pinaster et *Pinus pinea*

- génotypage réalisé aux Etats-Unis (Axiom Thermofisher)

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Identifier des régions du génome liées à un caractère

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Sélection génomique

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

## Puces basse-densité = 40 à 80 SNP

- Développées à l'INRAE

- Génotypage réalisé en interne (INRAE Pierroton)

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Population d'amélioration: vérifier les identités et les pedigrees

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Vergers à graines: estimer la pollution pollinique et les contributions parentales

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Contrôle origine d'un peuplement ou d'un lot de graines
# Outils moléculaires disponibles chez *Pinus pinaster*

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

## Puce haute-densité = 12 000 SNP

- Puce 4TREE développée dans le cadre du projet européen B4EST

- puce commerciale multi-espèces: *Populus* sp, *Fraxinus* sp, *Pinus* pinaster et *Pinus pinea*

- génotypage réalisé aux Etats-Unis (Axiom Thermofisher)

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

## Puces basse-densité = 40 à 80 SNP

- Développées à l'INRAE

- Génotypage réalisé en interne (INRAE Pierroton)

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

Identifier des régions du génome liées à un caractère

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Sélection génomique

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Population d'amélioration: vérifier les identités et les pedigrees

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Vergers à graines: estimer la pollution pollinique et les contributions parentales

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Contrôle origine d'un peuplement ou d'un lot de graines
# Principe général de la sélection génomique

## Population d'entrainement

Tous les individus sont
phénotypés (performances) et
génotypés (marqueurs ADN)
→ construction d'un modèle prédictif

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

## Population d'application

Tous les individus sont
uniquement génotypés
→ leurs performances sont prédites
avec le modèle

<figure><img src="image_35.png" /></figure>
# Sélection génomique chez les arbres forestiers

* >40 articles publiés depuis 2012 (*Eucalyptus*, *Pinus*, *Picea...*)

* *Pinus pinaster*: deux articles publiés en 2016 et un PhD (Victor Papin, projet B4EST) en cours (génotypage haut-débit de ~2000 individus des 3 générations d'amélioration de la population landaise)

* Premiers résultats encourageants: bonne prédiction des valeurs familiales

* Principales limites:

* mauvaise prédiction de la valeur intra-famille

* coût du génotypage
# Perspectives de la sélection génomique

* Sélection précoce → accélération des cycles de sélection

Possibilité de sélectionner ou réaliser un pre-screening en utilisant uniquement l'information moléculaire

* Prédiction de caractères difficiles à évaluer → intégration de nouveaux critères de sélection

Phénotypage focalisé sur la population d'entrainement ce qui permet d'envisager des mesures plus couteuses / complexes (résistance aux maladies, à la sécheresse...)
# Outils moléculaires disponibles chez *Pinus pinaster*

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

## Puce haute-densité = 12 000 SNP

- Puce 4TREE développée dans le cadre du projet européen B4EST

- puce commerciale multi-espèces: *Populus* sp, *Fraxinus* sp, *Pinus* pinaster et *Pinus pinea*

- génotypage réalisé aux Etats-Unis (Axiom Thermofisher)

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Identifier des régions du génome liées à un caractère

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Sélection génomique

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

## Puces basse-densité = 40 à 80 SNP

- Développées à l'INRAE

- Génotypage réalisé en interne (INRAE Pierroton)

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

Population d'amélioration: vérifier les identités et les pedigrees

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

Vergers à graines: estimer la pollution pollinique et les contributions parentales

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

Contrôle origine d'un peuplement ou d'un lot de graines
# Contrôle des identités et des pedigrees

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

(from Marjorie Vidal PhD, 2016)

* Nombreuses sources d'erreur d'identification

* Processus cumulatif au cours des générations de sélection
Estimation du taux d'erreur de pedigree dans la population d'amélioration (80 SNPs)

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Archives conales (G1)**
(524 G1 trees x 5 ramets / tree)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_48.png" /></figure>
Pourquoi corriger ces erreurs?

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

L'évaluation génétique sera d'autant plus précise que le taux d'erreur de pedigree sera faible
<figure><img src="image_50.png" /></figure>
<figure><img src="image_51.png" /></figure>
<figure><img src="image_52.png" /></figure>
# Outils moléculaires disponibles chez *Pinus pinaster*

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

## Puce haute-densité = 12 000 SNP

- Puce 4TREE développée dans le cadre du projet européen B4EST

- puce commerciale multi-espèces: *Populus* sp, *Fraxinus* sp, *Pinus* pinaster et *Pinus pinea*

- génotypage réalisé aux Etats-Unis (Axiom Thermofisher)

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

## Puces basse-densité = 40 à 80 SNP

- Développées à l'INRAE

- Génotypage réalisé en interne (INRAE Pierroton)

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

## Identifier des régions du génome liées à un caractère

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

## Sélection génomique

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

## Population d'amélioration: vérifier les identités et les pedigrees

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

## Vergers à graines: estimer la pollution pollinique et les contributions parentales

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

## Controle origine d'un peuplement ou d'un lot de graines
# Taux de pollution dans les vergers à graines

<caption>CSO-1</caption>

PICARD
SAINT-LAURENT-MEDOC

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

<figure><img src="image_63.png" /></figure>
Contributions parentales dans les vergers à graines

<figure><img src="image_64.png" /></figure>
# Outils moléculaires disponibles chez *Pinus pinaster*

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

## Puce haute-densité = 12 000 SNP

- Puce 4TREE développée dans le cadre du projet européen B4EST

- puce commerciale multi-espèces: *Populus* sp, *Fraxinus* sp, *Pinus* pinaster et *Pinus pinea*

- génotypage réalisé aux Etats-Unis (Axiom Thermofisher)

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

Identifier des régions du génome liées à un caractère

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

Sélection génomique

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

## Puces basse-densité = 40 à 80 SNP

- Développées à l'INRAE

- Génotypage réalisé en interne (INRAE Pierroton)

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

Population d'amélioration: vérifier les identités et les pedigrees

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

Vergers à graines: estimer la pollution pollinique et les contributions parentales

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

Contrôle origine d'un peuplement ou d'un lot de graines
# Contrôle de l'origine d'un peuplement ou d'un lot de graines

Forte structuration génétique entre les populations de *Pinus pinaster*

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

## 7 genepools

1. France atlantique (Landes)

2. France sud est (Maures)

3. Corse

4. Ibérique atlantique
(Portugal, Galice)

5. Ibérique méditerranéen
(Espagne centre et sud est)

6. Italie

7. Maroc

This distribution map, including both natural and naturalized occurrence of *Pinus pinaster* was compiled by members of the EUFORGEN Programme
# Développement d'un jeu de 80 marqueurs moléculaires pour différencier ces 7 genepools

<figure><img src="image_76.png" /></figure>
Janvier 2022: récolte de 30 arbres x 3 sites

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

<figure><img src="image_79.png" /></figure>
<figure><img src="image_80.png" /></figure>

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

* Origine corse des 3 peuplements analysés (analyses préliminaires)

* Composition génétique légèrement différente des peuplements corses de référence

* Des analyses complémentaires sont en cours (génotypage haute-densité)

Analyses réalisées par Mathilde Flores
## 2/ Sélection pour la résistance à la sécheresse

<figure><img src="image_82.png" /></figure>
Nombre maximum de jours
consécutifs sans pluie en été

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

Maximum number of successive days without rain in summer (ANR
SCAMPEI http://www.cnrm.meteo.fr/scampei/)

* Enjeu = maintenir la productivité des peuplements malgré des contraintes climatiques croissantes (fréquence, durée et intensité des sécheresses estivales)

• Actions :

- Réponse génétique : exploration de la diversité génétique et sélection

- Réponse sylvicole : gestion de la compétition

- gestion du sous-bois : fréquences, méthodes

- coupes partielles : intensité, fréquence
# Stratégies mises en place dans le programme d'amélioration génétique du pin maritime

1. Accélérer les cycles de selection pour proposer régulièrement des variétés adaptées au climat en évolution

2. Tester les variétés actuelles et sélectionner les variétés futures dans un milieu plus sec

3. Explorer la variabilité génétique naturelle et augmenter la diversité dans les variétés en utilisant les provenances du sud de l'aire naturelle

4. Etudier de nouveaux critères de sélection : la plasticité phénotypique

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>Valencia (ESPAGNE)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>Murcia (ESPAGNE)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_86.png" /><figcaption>Landes (FRANCE)</figcaption></figure>
# 1. Accélérer les cycles de selection pour proposer régulièrement des variétés adaptées au climat en évolution

## L'évolution des outils

* informatiques et statistiques (estimation des valeurs génétiques individuelles)

* moléculaires (contrôle des pédigrées, correction des erreurs d'identité grâce aux marqueurs de l'ADN)

permet une estimation **plus précise** des performances de chaque individu

Ce qui permet désormais au GPMF de mettre en place une nouvelle stratégie de sélection basée sur :

* La sélection des géniteurs sur leur valeur individuelle (et non plus sur celle des descendants) : **Gain de temps**, accélération du cycle de sélection, **renouvellement rapide des variétés**

* L'avancement en continu du gain génétique : **Diffusion du meilleur du gain génétique à chaque instant**

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

<figure><img src="image_90.png" /></figure>
## 2. Tester les variétés actuelles et sélectionner les variétés futures dans un milieu plus sec

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### Massif landais: évaluation dans différents types de Landes (sèche, mésophile, humide)

### Exploration hors-massif landais pour anticiper les changements climatiques: Portugal (2 dispositifs), Espagne (2 dispositifs)
### 3. Explorer la variabilité génétique naturelle (Le pin maritime est naturellement présent dans des conditions environnementales très variées)

Le GPMF installe, dans le massif landais, des dispositifs de comparaison de provenances (sud de l'Espagne, Corse, Maroc...) et des croisements entre provenances (Landes x Maroc, Landes x Portugal...)

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

Cazorla

climate-data.org, ref 1982-2012
## 4. Etudier de nouveaux critères de sélection : la plasticité phénotypique

**Objectif = meilleure prise en compte de l'environnement dans les critères de sélection**

Aujourd'hui: Critère de sélection très intégrateur comme la croissance à 12 ans (Σ climats)

<figure><img src="image_93.png" /></figure>

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

### Plasticité phénotypique

* capacité d'un génotype à exprimer différents phénotypes dans des environnements différents

* modélisée par une norme de réaction

* nécessite des données multisites ou des données longitudinales

Norme de réaction
Le bois, un regard rétrospectif de la réponse des arbres aux conditions environnementales

<figure><img src="image_95.png" /></figure>
# Surface du cerne en fonction de l'année

<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>Caractérisation climatique des années
(indice de sécheresse de Martonne)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

→ ré-organisation de l'axe des X en fonction de l'index climatique
Norme de réaction: performance en fonction d'un gradient environnemental

<figure><img src="image_98.png" /><figcaption>Gradient environnemental</figcaption></figure>
# Régression aléatoire

## Univariate model

Each level of the index variable = 1 trait

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

$$y_i = \mu + \beta_i + \alpha_i + \varepsilon_i$$

* $\mu$: mean

* $\beta_i$: fixed effect

* $\alpha_j$: random effects

## Multivariate model

Consideration of each level of the variable index
as correlated traits

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

$$y_{ij} = \mu_j + \beta_{ij} + \alpha_{ij} + \varepsilon_{ij}$$

* $\mu$: mean

* $\beta_i$: fixed effect

* $\alpha_j$: random effects

## Random regression

Adjustment of a trajectory according to a
meaningful index

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

$$y_{ij} = M(t_j) + F_{ij} + A_i(t_j) + P_i(t_j) + \varepsilon_{ij}$$

* $M(t_j)$: mean trajectory

* $F_{ij}$: fixed effects

* $A_i(t_j), P_i(t_j)$: random effects
# Valeur génétique en fonction d'un gradient environnemental

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

Quel critère choisir pour la sélection?

PhD Victor Papin (2021-2023)
# Dendroplasticité et résistance à la sécheresse

Densité du bois

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

D'autres caractères comme la densité du bois peuvent être étudiés selon la même méthodologie → **dendroplasticité** (densité du bois en fonction des conditions environnementales)

Un lien entre la dendroplasticité et la survie des arbres lors d'un stress hydrique sévère a été observé sur le douglas, lors de la sécheresse de 2003 : les arbres survivants ont formé plus longtemps et plus rapidement du bois d'été dense.
# Possibilité d'analyser la réponse des arbres à un niveau encore plus fin

## Instrumentation de dispositifs pour un suivi en continu

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>Croissance en diamètre suivie avec des dendromètres électroniques</figcaption></figure>

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

<figure><img src="image_106.png" /></figure>