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# Préparation en routine par micro-ondes pour l'observation ultrastructurale

A Geeverding, L Berry, J.-P Baudoin, C Gillet, C Cazevieille, M Trichet, C Boulogne, Christine Péchoux, A Canette

► To cite this version:

A Geeverding, L Berry, J.-P Baudoin, C Gillet, C Cazevieille, et al. Préparation en routine par micro-ondes pour l'observation ultrastructurale. LES TECHNIQUES DE PREPARATION D'ECHANTILLON " Préparation chimique, Cryo-préparation, Artéfacts ", May 2023, Porquerolles, France. . hal-04692298

HAL Id: hal-04692298

https://hal.science/hal-04692298v1

Submitted on 9 Sep 2024

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# Préparation en routine par micro-ondes pour l'observation ultrastructurale

A. Geeverding<fnref n="1" />, L. Berry<fnref n="2" />, J.-P. Baudoin<fnref n="3" />, C. Gillet<fnref n="4" />, C. Cazevieille<fnref n="5" />, M. Trichet<fnref n="1" />, C. Boulogne<fnref n="4" />, C. Péchoux<fnref n="6" /> and A. Canette<fnref n="1" />

En favorisant l'agitation moléculaire, la réactivité chimique et la diffusion des solutions, les micro-ondes ont un intérêt à chaque étape :

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Fixation, contraste et polymérisation plus rapides

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Meilleure imprégnation (tissus denses, imperméables ou spongieux)

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Appareils commerciaux dédiés = reproductibilité, flexibilité, simplicité et ergonomie

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Améliorations optionnelles (chambre sous vide, agitation, refroidissement local et automatisation)

A travers l'utilisation en routine de 3 appareils commerciaux, nous illustrons ici les résultats obtenus sur une variété d'échantillons.

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### Pelco Biowave

+ : compartiment sous vide, refroidissement local

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### Virus

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Osman I.O. et al. Control of CDH1/E-Cadherin Gene Expression and Release of a Soluble Form of E-Cadherin in SARS-CoV-2 Infected Caco-2 Intestinal Cells: Physiopathological Consequences for the Intestinal Forms of COVID-19. Front Cell Infect Microbiol. 2022.

### Bactéries

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Ezzeroug Ezzraimi A et al. Microscopic Description of Platelet Aggregates Induced by *Escherichia coli* Strains. Cells. 2022.

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### Protozoaires

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Renaud E.A. et al. Disrupting the plastidic iron-sulfur cluster biogenesis pathway in Toxoplasma gondii has pleiotropic effects irreversibly impacting parasite viability. J Biol Chem. 2022.

<caption>Exemple d'un protocole complet dans le Biowave</caption>

J.-P. Baudoin

<table><thead><tr><th>Step#</th><th>Description</th><th>User Prompt (on/off)</th><th>Time (Hr:min:sec)</th><th>Power (Watts)</th><th>Temp (°C)</th><th>Load Cooler (off/auto/on)</th><th>Vacuum Pump</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>2</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>0</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>3</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>4</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>0</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>5</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>6</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>0</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>7</td><td>Glut Fix</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>8</td><td>0.1M Cacodylate/0.2M Saccharose Buffer</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>9</td><td>0.1M Cacodylate/0.2M Saccharose Buffer</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>10</td><td>OsO4 1%</td><td>On</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>11</td><td>OsO4 1%</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>0</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>12</td><td>OsO4 1%</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>13</td><td>OsO4 1%</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>0</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>14</td><td>OsO4 1%</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>15</td><td>OsO4 1%</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>0</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum ON 20mm Hg</td></tr><tr><td>16</td><td>OsO4 1%</td><td>Off</td><td>0:2:0</td><td>100</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>17</td><td>Water</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>18</td><td>Water</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>19</td><td>30% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>20</td><td>50% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>21</td><td>70% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>22</td><td>90% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>23</td><td>96% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>24</td><td>100% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>25</td><td>100% ETOH</td><td>On</td><td>0:0:40</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>Off</td></tr><tr><td>26</td><td>Resin 25%</td><td>On</td><td>0:3:0</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>27</td><td>Resin 50%</td><td>On</td><td>0:3:0</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>28</td><td>Resin 75%</td><td>On</td><td>0:3:0</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>29</td><td>Resin 100%</td><td>On</td><td>0:3:0</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>30</td><td>Resin 100%</td><td>On</td><td>0:3:0</td><td>250</td><td>50</td><td>Off</td><td>vacuum AUTO 20mm Hg 15s/15s</td></tr><tr><td>31</td><td>EPOXY CURE</td><td>On</td><td>0:30:0</td><td>200</td><td>100</td><td>ON (30deg)</td><td>Off</td></tr><tr><td>32</td><td>EPOXY CURE</td><td>On</td><td>0:45:0</td><td>375</td><td>100</td><td>ON (30deg)</td><td>Off</td></tr><tr><td>33</td><td>EPOXY CURE</td><td>On</td><td>0:45:0</td><td>375</td><td>100</td><td>ON (30deg)</td><td>Off</td></tr></tbody><tfoot><tr><td colspan="8">Total 2h50</td></tr></tfoot></table>

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### Milestone KOS

+ : portoir-paniers ergonomiques et économies en produits

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### Poumon

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Ranchoux B. et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 2015.

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### Placenta

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Robles M. et al. Effects of dietary arginine supplementation in pregnant mares on maternal metabolism, placental structure and function and foal growth. Sci Rep. 2019.

<caption>Exemple d'un protocole partiel pour tissus dans le KOS</caption>

C. Péchoux

<table><thead><tr><th>Etapes</th><th>Durée</th><th>Température (°C)</th><th>Puissance (%)<br>100% = 800W</th></tr></thead><tbody><tr><td>1 OTE 0,2 % (filtré)</td><td>20 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>rinçage à l'eau</td><td>1 fois x 5min</td><td>hors KOS</td><td></td></tr><tr><td>2 OsO4 1%, ferrocyanure 1,5%</td><td>20 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>rinçage à l'eau</td><td>2 fois x 5 min</td><td>hors KOS</td><td></td></tr><tr><td>3 Ethanol 30%</td><td>5 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>4 Ethanol 50%</td><td>5 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>5 Ethanol 70%</td><td>5 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>6 Ethanol 90%</td><td>5 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>7 Ethanol 100%</td><td>10 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>8 Acétone</td><td>10 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>9 Acétone</td><td>10 min</td><td>37</td><td>15</td></tr><tr><td>10 Acétone/Epon sans DMAE (1/1)*</td><td>45 min</td><td>45</td><td>10</td></tr><tr><td>11 Epon sans DMAE</td><td>60 min</td><td>45</td><td>10</td></tr></tbody></table>

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### pour maitriser la température :

- Faible puissance : entre 100 et 400 W (< 1000 W des µondes domestiques)

- Température plafond → arrêt automatique des µondes

- Cycles On / Off des µondes pendant les étapes sensibles

- Solutions avant emploi à 4°C

- Etapes avec durées courtes

- Systèmes de bain-marie

- Systèmes de point froid, refroidisseur intégré...

→ A adapter (préenrobage agarose low melting point...)

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### pour sécuriser les manipulations :

- Appareil entièrement sous sorbonne

- Tuyau d'évacuation de l'appareil connecté sous sorbonne

- Contenants scellés pour passages sorbonne - appareil

- Port d'un masque adapté pour passages sorbonne - appareil

- Proscire les produits « pièges » comme l'Oxyde de Propylène

<footnote n="1">¹Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de Microscopie Électronique (IBPS-SME), Paris, France.</footnote>

<footnote n="2">²LPHI, University of Montpellier, CNRS, UMR5235, Montpellier, France.</footnote>

<footnote n="3">³Aix-Marseille Univ, MEPHI, APHM, IRD, IHU Méditerranée Infection, Marseille, France.</footnote>

<footnote n="4">⁴Imagerie-Gif, Electron Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Univ. Paris-Sud, Université Paris-Saclay, Gif-sur-Yvette, France.</footnote>

<footnote n="5">⁵Institut de Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier-INSERM, 34091 Montpellier, France.</footnote>

<footnote n="6">⁶Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, GABI, MIMA2 Imaging Core Facility, 78350 Jouy-en-Josas, France.</footnote>