# Identification des déterminants physiologiques et moléculaires à l'origine de la réponse différentielle d'agrumes diploïdes et polyploïdes vis-à-vis de la maladie du Huanglongbing (HLB).

Gary Sivager

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Gary Sivager. Identification des déterminants physiologiques et moléculaires à l'origine de la réponse différentielle d'agrumes diploïdes et polyploïdes vis-à-vis de la maladie du Huanglongbing (HLB). Sciences de l'environnement. Université des Antilles, 2022. Français. NNT: tel-04057206

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Public Domain
Université des Antilles
École doctorale n° 589 – Milieu insulaire tropical à risques

Thèse présentée pour l'obtention du grade de
DOCTEUR

Soutenue publiquement par

SIVAGER Gary

Le 29 Avril 2022

Identification des déterminants physiologiques et
moléculaires à l'origine de la réponse différentielle
d'agrumes diploïdes et polyploïdes vis-à-vis de la maladie
du Huanglongbing (HLB)

Thèse soutenue publiquement devant le jury composé de :

<table><tr><td>M. MORILLON Raphaël</td><td>Directeur de recherche, CIRAD</td><td>Directeur de thèse</td></tr><tr><td>M. GROS Olivier</td><td>Professeur, Université des Antilles</td><td>Co-directeur de thèse</td></tr><tr><td>Mme PRAT-LEONHARDT Nathalie</td><td>Directrice de recherche, CEA</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. GALAUD Jean-Philippe</td><td>Professeur, Université Paul Sabatier</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Mme TONIUTTI Lucile</td><td>Chercheur, CIRAD</td><td>Examinatrice</td></tr><tr><td>Mme HUFNAGEL Bárbara</td><td>Chercheur, CIRAD</td><td>Examinatrice</td></tr></table>
REMERCIEMENTS

Les travaux de thèses présentés dans ce manuscrit ont été effectués au sein du CIRAD de Guadeloupe (Station de Roujol à Petit-Bourg, Station de Capesterre-Belle-Eau et Station de Duclos), à l'Université des Antilles dans le Laboratoire C3MAG ainsi que COVACHIM. Je remercie la Collectivité Territoriale de Martinique d'avoir financé mes travaux de thèse, ainsi que l'École Doctorale 589 de l'Université des Antilles.

Dans un premier lieu, j'aimerais remercier le Directeur Régional du CIRAD Antilles-Guyane, MARTINEZ Dominique, pour m'avoir permis de réaliser toute la durée de ma thèse au sein du CIRAD de Guadeloupe.

Je remercie le Docteur MORILLON Raphaël, mon directeur de thèse de m'avoir accueilli au sein de l'équipe SEAPAG. Je lui adresse ces remerciements pour sa bienveillance et sa détermination tout au long de ces années de thèse. Je le remercie pour l'implication dont il a fait part et pour tous ses élans de motivation dans tous les moments difficiles que j'ai pu rencontrer. Merci pour ton apport pédagogique, tes connaissances scientifiques, ta disponibilité, ton aide tout au long de cette thèse et notamment la correction de ce manuscrit et les différents articles publiés et soumis. Merci !

Je remercie également le Professeur GROS Olivier, mon co-directeur de thèse, de m'avoir aidé notamment pour les aspects de microscopie et corrections qu'il a pu m'apporter concernant le résultat de mes données. Merci pour la disponibilité, le soutien, les différents encouragements et les voies possibles concernant mon projet professionnel. Je le remercie également pour les différentes démarches dont il a pu me faire part afin de pouvoir apporter mon savoir aux étudiants en faisant des vacations à l'UFR Sciences Exactes et Naturelles au Campus de Fouillole de l'Université des Antilles – Pôle Guadeloupe.

Je tiens à remercier l'ensemble de mon comité de pilotage, le Pr. DRIOUICH Azzedine, le Dr. SANTINI Jérémi, le Dr. CORMIER Fabien, le Dr. BRAT Pierre et mes deux directeurs pour l'intérêt envers mon travail, les différentes corrections, pour les orientations à prendre durant ces années de thèse. J'apporte une attention au Pr. DRIOUICH et le remercie de m'avoir pris en stage dans le laboratoire GlycoMEV à l'Université de ROUEN. Merci pour
l'opportunité et les différents conseils reçus.

Je remercie le Dr. INAMO-VATIN Magalie de m'avoir pris sous son aile et de m'avoir fait confiance pour les différents enseignements que j'ai pu effectuer aux étudiants de Licence 1 et 3 ainsi qu'au Master 1 de Biologie-Santé à l'Université des Antilles.

Ayant été principalement à la Station de Roujol, je tiens à remercier non seulement l'ensemble de l'équipe agrumes de la station (BRUYÈRE Saturnin, BOISNE-NOC Rosiane et tous les techniciens terrain), je remercie également l'ensemble du personnel de la station de Roujol qui comprend l'équipe Igname mais aussi le personnel du Centre de Ressources Biologiques et celui de l'Institut Technique et Tropical. Je remercie également les membres de mon Comité de Suivi Individuel, le Dr. CEBRIAN-TORREJON Gerardo, le Dr. FERDINAND Sandrine et ROUX-CUVILLIER Michel.

Je remercie également MIRANDA Maëva pour la réalisation des banques RNAseq, DEREEPER Alexis pour l'aide apportée lors des analyses en bioinformatique et également le Dr. HUFNAGEL Bárbara et le Dr. OLLITRAULT Patrick pour leur aide lors de la relecture de mes travaux.

J'apporte une apporte une attention particulière à ANDYPAIN Sandrine, technicienne de laboratoire au CIRAD de Capesterre-Belle-Eau pour sa disponibilité, son aide lors des différentes analyses biochimiques. Merci pour tout le temps dont tu as pu me faire part, de ta bienveillance, ta bonne humeur et ta grande sympathie toutes les fois où j'ai dû venir au laboratoire réaliser mes diverses expériences.

Je tiens à remercier grandement deux individus qui ont rythmé ces années de thèse. Tout d'abord, je remercie HEUGUET Benoît, ancien VSC dans l'équipe agrumes, qui m'a apporté les différentes connaissances, son savoir-faire dans ce monde végétal mais aussi pour sa bonne humeur et son savoir-être. Je remercie ensuite, mon collègue doctorant CALVEZ Lény, qui, je sais, ira loin dans le monde de la recherche. Merci pour l'aide, le soutien, les encouragements, ton humeur, le travail d'équipe durant ces différentes années. Merci à vous deux et également LAURENT Lévy (IT2) pour la bonne humeur et les repas organisés afin que l'on puisse tous décompresser.

Je remercie les différents stagiaires que j'ai pu avoir et avec qui j'ai eu le plaisir de
travailler, UGOLIN Magalie, FILLON Inès, MONDÉLICE François-Xavier, MORINO Elsa et MISANTROPE Mélanie. Merci d'avoir joué le jeu et d'avoir montré votre envie tout au long de vos périodes de stage. Je n'oublie pas les bons petits plats lors de vos pots de départs et tous les échanges que l'on a pu avoir.

D'un point de vue plus personnel, je remercie ma mère qui m'a soutenue pendant toutes ces années d'études et qui m'a encore soutenu dans cette envie de réaliser un doctorat en biologie. Merci pour tout ce grand soutien, ton amour et toute l'éducation que tu as pu m'apporter afin de faire face aux différents aspects de la vie pour pouvoir relever la tête quel que soit la situation. Merci de me faire confiance dans mes choix. Tu ne seras pas déçue. Je remercie également mes sœurs pour le soutien et plus particulièrement ma sœur cadette qui a toujours été là pour moi, dans les bons comme les mauvais moments.

Je remercie également mes amis Alexandre, Fanny, Stessie, Ludivine, Marie-Andrée, Alicia, Laura, mais aussi ceux de l'île sœur, Stanley, Maria et Émilie qui m'ont dit de ne jamais lâcher l'affaire même dans les moments de doute. J'appuie mes remerciements pour Stanley qui est devenu mon meilleur ami guadeloupéen, sans qui la vie aurait pu être bien fade. Merci pour tout ! Je remercie également mon ancienne propriétaire, Fanny, qui est devenue une amie sans faille et à qui j'ai pu me confier et qui a su me conseiller et surtout m'épauler quand ça n'allait pas. Merci pour tous ces moments où l'on a pu échanger, regarder des séries et rigoler, rigoler et encore rigoler. Merci.

Enfin, mes derniers remerciements vont tout simplement à tous ceux qui ont pu m'aider, me conseiller, m'épauler, m'encourager de près comme de loin. Merci pour votre attention, votre apport, votre disponibilité, votre savoir-faire et savoir-être mais aussi tous ces moments de joie dont je serai éternellement reconnaissant.

Merci pour tout !
# TABLE DES MATIÈRES

<table><tr><td>REMERCIEMENTS</td><td>2</td></tr><tr><td>TABLE DES MATIÈRES</td><td>5</td></tr><tr><td>LISTE DES ABBRÉVATIONS</td><td>10</td></tr><tr><td>FIGURES ET TABLEAUX</td><td>12</td></tr><tr><td>1. SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE</td><td>16</td></tr><tr><td>1.1. Les agrumes</td><td>17</td></tr><tr><td>1.1.1. Origine et diffusion</td><td>17</td></tr><tr><td>1.1.2. Taxonomie des agrumes</td><td>18</td></tr><tr><td>1.1.3. Les porte-greffes</td><td>19</td></tr><tr><td>1.1.4. Contexte économique</td><td>21</td></tr><tr><td>1.1. Polyploïdie</td><td>23</td></tr><tr><td>1.1.1. Généralités</td><td>23</td></tr><tr><td>1.1.2. Impact de la polyploïdie chez les agrumes</td><td>26</td></tr><tr><td>1.2. Mécanisme de défense de la plante</td><td>29</td></tr><tr><td>1.2.1. Le stress oxydant</td><td>29</td></tr><tr><td>1.2.1.1. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS)</td><td>30</td></tr><tr><td>1.2.1.2. Mécanisme de défense antioxydant</td><td>32</td></tr><tr><td>1.2.2. Réaction d'hypersensibilité (HR) et réaction systémique acquise (SAR)</td><td>35</td></tr><tr><td>1.2.3. Acide jasmonique (JA) et éthylène (ET)</td><td>38</td></tr><tr><td>1.2.4. Acide abscissique (ABA)</td><td>38</td></tr><tr><td>1.3. Le Huanglonbing</td><td>39</td></tr><tr><td>1.3.1. Histoire et origine</td><td>39</td></tr><tr><td>1.3.2. Agents pathogènes et vecteurs de la maladie du Huanglongbing</td><td>40</td></tr><tr><td>1.3.3. Stratégie de lutte contre le HLB</td><td>41</td></tr><tr><td>1.3.3.1. Lutte chimique</td><td>42</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>1.3.3.2.</td>
      <td>Lutte biologique</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.3.3.</td>
      <td>Implication du génome dans la réponse au Huanglongbing</td>
      <td>43</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.4.</td>
      <td>Symptômes de la maladie</td>
      <td>44</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.4.1.</td>
      <td>Impact de la maladie du Huanglongbing au niveau foliaire</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.4.2.</td>
      <td>Impact du Huanglongbing sur les fruits</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.4.3.</td>
      <td>Impact du Huanglongbing sur le massif racinaire</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td colspan="2">PROBLÉMATIQUE</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td colspan="2">2. MATÉRIELS ET MÉTHODES</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.</td>
      <td>Matériel végétal</td>
      <td>56</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.</td>
      <td>Technique Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)</td>
      <td>56</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.</td>
      <td>Réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR)</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.</td>
      <td>Analyses comportement physiologique sur pétioles de limettier Mexicain 2x et limettier Tahiti 3x</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.5.</td>
      <td>Microscopie Électronique à Balayage (MEB) sur pétioles de limettiers Mexicain 2x ; limettier Tahiti 3x ; racines de Citrumelo Swingle 2x et 4x</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.6.</td>
      <td>Coloration au bleu d'aniline sur pétioles de limettiers Mexicain 2x ; limettier Tahiti 3x ; racines de Citrumelo Swingle 2x et 4x</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.</td>
      <td>Dosages biochimiques sur pétioles 2x et 3x</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.1.</td>
      <td>Malondéhyde (MDA), indicateur de la peroxydation des lipides</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.2.</td>
      <td>Peroxyde de dihydrogène (H2O2), indicateur de stress oxydatif</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.3.</td>
      <td>Catalase (CAT), enzyme du système antioxydant</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.4.</td>
      <td>Ascorbate peroxydase (APX), enzyme du système antioxydant</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.5.</td>
      <td>Ascorbate total (AsA), antioxydant</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.6.</td>
      <td>Dosage de l'amidon</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.8.</td>
      <td>Dosages des composés phénoliques et analyse électrochimique sur racines de Citrumelo Swingle 2x et 4x</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.9.</td>
      <td>Hybridation in situ à fluorescence (FISH) sur racines de Citrumelo 2x et 4x</td>
      <td>60</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.10.</td>
      <td>Extraction d'ARN sur pétioles feuilles de limettiers 2x et 3x et sur racines de</td>
      <td></td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
Citrumelo 2x et 4x, création de banque et analyse RNAseq ................................................60

2.10.1. Isolation de l'ADN total, préparation d'ADNc et séquençage ................................60

2.10.2. Traitement des données RNAseq................................................................60

2.10.3. Analyse d'expression différentielle et catégorisation fonctionnelle ............61

2.10.4. Analyse de réseaux de gènes................................................................61

2.11. Analyse hormonale de feuilles de limettiers Mexicain 2x, Tahiti 3x et sur racines de porte-greffes citrumelo 2x et 4x................................................................62

3. Chapitre 1 : Specific Physiological and Anatomical Traits Associated With Polyploidy and Better Detoxification Processes Contribute to Improved Huanglongbing Tolerance of the Persian Lime Compared With the Mexican Lime ................................................................................................................63

3.1. Résumé ..................................................................................................................64

3.1. Article..................................................................................................................67

3.2. Données complémentaires : analyses des composés de parois cellulaires de feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti................................................................................82

3.2.1. La paroi végétale................................................................................................82

3.2.1.1. Les pectines................................................................................................82

3.2.1.2. Les hémicelluloses................................................................................................83

3.2.2. Matériels et Méthodes ................................................................................................84

3.2.3. Résultats et analyses des composés de paroi cellulaires chez les feuilles de limettier Mexicain et Tahiti................................................................................................84

3.2.3.1. Analyse des fractions enrichies en pectines....................................................84

3.2.3.2. Analyse des fractions enrichies en hémicelluloses................................................85

3.2.4. Conclusion................................................................................................................90

4. Chapitre 2 : Better tolerance to Huanglongbing is conferred by tetraploid Swingle citrumelo rootstock and is influenced by the ploidy of the scion ....................................................................................................................91

4.1. Résumé ..................................................................................................................92
<table><tr><td>4.2. Article</td><td>95</td></tr><tr><td>5. Chapitre 3 : L'expression des génomes des agrumes polyploïdes est-elle à l'origine de leur meilleure tolérance face au HLB par rapport aux diploïdes ?</td><td>109</td></tr><tr><td>5.1. Contexte</td><td>110</td></tr><tr><td>5.2. Résultats</td><td>110</td></tr><tr><td>5.2.1. Analyse RNAseq</td><td>110</td></tr><tr><td>5.2.1.1. Analyse générale</td><td>110</td></tr><tr><td>5.2.1.2. Analyse subjective de gènes impliqués dans le développement et la défense des plantes</td><td>113</td></tr><tr><td>5.2.1.3. Création de réseaux de gènes issus des feuilles de limettiers 2x et 3x et des racines de porte-greffes 2x et 4x</td><td>116</td></tr><tr><td>5.2.2. Résultats des dosages hormonaux</td><td>121</td></tr><tr><td>5.2.2.1. Résultats de dosage de phytohormones au niveau des greffons de limettiers diploïdes et triploïdes</td><td>122</td></tr><tr><td>5.2.2.2. Résultats des dosages de phytohormones au niveau des racines de porte-greffes diploïdes et tétraploïdes</td><td>124</td></tr><tr><td>5.2.3. Résultats du métabolome</td><td>127</td></tr><tr><td>5.3. Discussion</td><td>129</td></tr><tr><td>5.4. Conclusion</td><td>133</td></tr><tr><td>6. CONCLUSION GÉNÉRALE & PERSPECTIVES</td><td>134</td></tr><tr><td>ANNEXES</td><td>143</td></tr><tr><td>Annexe 1</td><td>144</td></tr><tr><td>Annexe 2</td><td>145</td></tr><tr><td>Annexe 3</td><td>146</td></tr><tr><td>7. ENCADREMENTS</td><td>147</td></tr><tr><td>7.1. Encadrements de stagiaires</td><td>148</td></tr><tr><td>7.2. Enseignements vacataires</td><td>149</td></tr></table>
# LISTE DES ABBRÉVATIONS

* **\*OH**: radical hydroxyle

**2x / 3x / 4x**: di- / tri- / tétraploïde

## A

**ABA**: acide abscissique

**ACP**: psylle asiatique des agrumes

**ADN**: acide désoxyribonucléique

**APX**: ascorbate peroxydase

**Ara**: arabinose

**AsA**: acide ascorbique / ascorbate

**ASN**: asparagine

## C

**C3MAG**: Centre Commun de Caractérisation des Matériaux des Antilles et de la Guyane

**CAT**: catalase

**Cu**: Cuivre

**Cis-ZR**: cis zeatine-ribose

**Cit**: Citrumelo

**CTV**: virus de la tristeza

## E

**ET**: éthylène

**ETI**: Effector-Triggered Immunity

## F

**FDR**: First Division Restitution

**Fe**: fer

**Fe²⁺**: ion ferreux

**FISH**: Hybridation in situ à fluorescence

## G

**GABA**: acide gamma-aminobutyrique

**Gal**: galactose

**GalA**: acide galacturonique

**GDE**: gènes différentiellement exprimés

**Glc**: glucose

**GO**: gene ontology

**GSH**: glutathion

## H

**H₂O₂**: peroxyde d'hydrogène

**HCi**: hémicelluloses insolubles

**HCs**: hémicelluloses solubles

**HLB**: Huanglongbing

**HR**: réaction d'hypersensibilité

## I

**IPR**: adenine-riboside

## J

**JA**: acide jasmonique

## L

**Laf / Lam / Las**: Candidatus Liberibacter

africanus / - americanus / - asiaticus

**Las⁺**: infecté par Las

**Las⁺AS**: asymptomatique / stade précoce

**Las⁺S**: symptomatique / stade tardif

**Las⁺T**: témoin

**LM**: limettier Mexicain

**LOX**: lipoxygénase

**LT**: limettier Tahiti (Persian lime en anglais)

## M

**MDA**: malondialdéhyde

**MEB**: microscopie électronique à balayage

**miRNA**: microRNA

**Mt**: milliers de tonnes

## N

**NPR1**: Non-expressor of Pathogenesis-Related

## O

**O₂**: dioxygène

**O₂⁻**: anion superoxyde

## P

**PAD4**:

**PAMP**: Pathogen-associated Molecular Pattern

**PCR**: réaction en chaîne par polymérase

**Pro**: proline

**PTI**: PAMP-Triggered Immunity

## Q

**qPCR**: réaction en chaîne par polymérase quantitative
R

**Rha** : rhamnose

**ROS** : reactive oxygene species

S

**SA** : acide salicylique

**SAR** : résistance systémique acquise

**SDR** : Second Division Destitution

T

**TGA** : facteurs de transcriptions TGA

U

**USA** : États-Unis d'Amérique

V

**vs** : versus

W

**WRKY** : facteurs de transcription WRKY

X

**Xyl** : xylose

Z

**Zn** : zinc
FIGURES ET TABLEAUX

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure 1 - Carte de l'expansion des agrumes dans le monde (Curk, Luro, &amp; Ollitrault, 2019)</td>
      <td>18</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2 - Origines phylogénétiques des agrumes cultivés (F. Curk, P. Ollitrault, CIRAD)</td>
      <td>19</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3 - Évolution de la production (en milliers de tonnes) d'agrumes cultivés dans le bassin caribéen entre 2008 et 2016 (FAO, 2017)</td>
      <td>22</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 4 - Les différents types de polyploïdes (Thèse Julie Oustirc d'après Chen, 2007)</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 5 - Conséquences de la FDR et SDR lors de la méiose (Thèse Julie Oustric d'après Bretagnolle &amp; Thompson, 1995)</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 6 - Microscopie de tige 2x (A), 4x (B) et de racines 2x (C) et 4x (D) (Allario et al., 2011)</td>
      <td>27</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 7 - Comportement d'une variété d'orange greffées avec un porte-greffes (limettier Rangpur) 2x et 4x après un déficit hydrique de 11 jours (Allario et al., 2013)</td>
      <td>29</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 8 - Effet des ROS sur l'arbre d'après Krishnamurthy &amp; Rathinasabapathi, (2013). Flèches rouges : effets négatifs ; flèches vertes : effets positifs</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 9 - Mécanisme de défense : Réaction d'Hypersensibilité (HR) et Résistance Systémique Acquise (SAR), d'après Dutt et al., (2015)</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 10 - Diaphorina citri au stage adulte (A) (Cadwell, (1998)) et Trioza erytreae au stage adulte (B) (Gobierno de Canarias)</td>
      <td>41</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 11 - Larve de psylle de D. citri (gauche) parasitée par T. radiata (droite) origine photo ?</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 12 - Dépôt de callose (flèche noire) au niveau des pores (flèche blanche) des cellules cribles du phloème (Koh et al., 2012)</td>
      <td>44</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 13 - Différence physiologique au niveau des cellules du phloème entre plants infectés (Las+) ou non (Las-) par Las</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 14 - Symptômes foliaires induits par le HLB (a) ou par une carence en métaux (b)</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 15 - Zone verte sur un fruit d'agrumes infecté par Las (A). Coupe interne d'un fruit infecté par Las (B). Flèches blanches : verdissement ; flèches rouges : graines avortées ; flèche jaune : couleur jaunâtre au niveau de la columelle, flèche bleue : axe courbé</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 16 - Racines infectées (B) ou non (A) par Las</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 17 - Résidus de monomères d'acide galacturonique liés en α-(1,4)</td>
      <td>83</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 18 - Impact du HLB sur la composition en monosaccharides des fractions enrichies en pectines dans les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti. Les proportions en monosaccharides</td>
      <td></td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table>
  <tr>
    <td>colorés indiquent l'intensité de la surexpression.</td>
    <td>118</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 26 - Cluster "Magenta" obtenu sous R de feuilles de limettiers 2x et 3x greffés respectivement avec un porte-greffe citrumelo 2x et 4x en condition infecté (orange ; Las+) et témoin (bleu ; Las-).</td>
    <td>118</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 27 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de feuilles de limettier Tahiti greffé avec citrumelo 2x en comparant la condition infecté par rapport à celle témoin dans le cluster Magenta. Les cercles colorés indiquent l'intensité de la surexpression.</td>
    <td>119</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 28 - Cluster "Brown" obtenu sous R de racines de porte-greffes 2x et 4x greffés respectivement avec des limettiers 2x et 3x en condition malade (orange ; Las+) et témoin (bleu ; Las-).</td>
    <td>119</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 29 - Réseau de gènes sous-exprimés après analyse de racines de porte-greffe citrumelo 2x greffé avec LT 3x et LM 2x en comparant la condition infecté dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la sous-expression.</td>
    <td>120</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 30 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffe citrumelo 2x greffé avec LT 3x et LM 2x en comparant la condition dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent l'intensité de la surexpression.</td>
    <td>121</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 31 - Dosages des hormones ABA, Cis.ZR, IPR, JA et SA dans les feuilles de limettiers Mexicain 2x et Tahiti 3x HLB+ ou HLB- greffés respectivement avec des porte-greffes Citrumelo 2x et 4x.</td>
    <td>124</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 32 - Dosages des hormones ABA, Cis.ZR, IPR, JA et SA dans les racines de porte-greffes Citrumelo 2x et 4x greffés respectivement avec des limettiers Mexicain 2x et Tahiti 3x HLB+ et HLB-</td>
    <td>127</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 33 - Spectre visuel de feuilles de greffons infectés (courbe bleue) ou non (courbe rouge) par le HLB. Couleur inversée dans le graphe pour GABA.</td>
    <td>128</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 34 - Résumé des résultats du métabolome greffons 2x (A) et 3x (B) en fonction de l'infection à la maladie (rouge), l'interaction greffon/porte-greffe (vert) et de la ploïdie du porte-greffe (bleu).</td>
    <td>128</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 35 - Impact du HLB (Las+) ou non (Las-) sur au niveau des pores du phloème de pétioles de feuilles ou de racines diploïdes ou polyploïdes entrainant des conséquences externes.</td>
    <td>142</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 36 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffe citrumelo 2x greffé avec LT 3x et LM 2x en condition témoin dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la sous-expression.</td>
    <td>144</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Figure 37 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffe citrumelo 4x greffé avec LT 3x et LM 2x en condition témoin dans le cluster Brown. Les cercles colorés</td>
    <td></td>
  </tr>
</table>
indiquent sur l'intensité de la sous-expression .................................................... 145

Figure 38 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffes citrumelo 4x et 2x greffé avec le limettier 2x en condition témoin. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la surexpression.................................................................................... 146

Tableau 1 - Rendement total des monomères de sucres analysés par GC-FID chez les fractions de pectines, hémicelluloses solubles (HCs) et insolubles (HCi) présentes chez les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti. Le rendement a été fait à partir de la masse totale initiale prise pour faire la GC-FID et la masse totale analysée après GC-FID pour chaque échantillon. Une moyenne de ces rendements a été faite afin d'obtenir le rendement total par variété chez les différentes fractions. Pour chaque fraction, LM et LT représentent la totalité des conditions (témoin, asymptomatique et symptomatique) et des répétitions prises en compte.................... 90

Tableau 2 – Impact du HLB et de la polyploïdie sur l'expression de certains gènes intervenant dans le développement et la défense des plantes. L'expression de chaque gène est indépendante et ne signifie pas qu'un même nombre de signes + confère une expression de la même importance. + : présence d'expression de gènes et - : une absence d'expression ; les colonnes grises : les plants infectés (Las+) et les blanches : les plants témoins (Las-) ; les signes noirs : expression chez les plants diploïdes et les signes rouges : expressions chez les plants polyploïdes.................................................................................................................... 113
# 1. SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
# 1.1. Les agrumes

## 1.1.1. Origine et diffusion

Les agrumes – dérivant du latin médiéval *acrumen* – ou encore « *citrus* » pour les Anglais et son dérivé « *cítricos* » pour les Espagnols (Ollitrault, Desmaret, & Griffon, 2000) représentent principalement les fruits acides (Couplan, 2012). Ce sont généralement des arbres de petite taille pouvant varier de 4 à 12m de haut. Leur feuillage peut être trifolié ou monofolié en fonction du genre auquel ils appartiennent.

L'origine géographique des agrumes est très controversée (Wu et al., 2018). Ils seraient originaire des régions tropicales et subtropicales d'Asie (Webber, 1967). Les mouvements humains vont les répartir dans les autres régions propices à leur croissance. Dans le bassin méditerranéen, le cédratier (*Citrus medica* L.) est le premier agrume importé au IIIème siècle av. JC, sûrement par l'armée d'Alexandre le Grand. Il sera utilisé en pharmaceutique, en cosmétique et sert d'arbre ornemental. Puis entre le Xème et XIIème siècle dans le bassin méditerranéen, les Portugais et les Génois auraient introduit d'autres agrumes tels que le bigaradier, les orangers et les citronniers. Des écrits décrivant ces agrumes ont été retrouvés en Espagne à cette période. Les premières cultures d'oranges sont apparues en Europe au cours du 15ème siècle. Les mandarines sont, quant à elles, arrivées plus tard au cours du 19ème siècle (Ollitrault & Navarro, 2012). Aujourd'hui le bassin méditerranéen est devenu une zone importante de la production d'agrumes frais. En 1493, Christophe Colomb introduira dans la Caraïbe de nombreuses graines d'agrumes, elles seront ensuite réparties aux États-Unis d'Amérique (USA), Brésil et le reste de l'Amérique (Camille Jacquemond et al., 2013). En Afrique, l'apparition des agrumes a été plus tardive. En effet, ils ont été introduits par les portugais en Afrique de l'Ouest au 17ème siècle. En parallèle, les hollandais les ont importés en Afrique du Sud. Les premiers citrons et oranges ont été transportés du Brésil vers l'Australie en 1769 par les colons (figure 1).

Aujourd'hui, les cultures d'agrumes sont concentrées sur une étendue géographique comprise entre le 44ème parallèle Nord et le 40ème parallèle Sud, le climat adéquat étant tropical ou tempéré (Janick, 2005).
<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Figure 1 - Carte de l'expansion des agrumes dans le monde (Curk, Luro, & Ollitrault, 2019)</figcaption></figure>

### 1.1.2. Taxonomie des agrumes

La classification des agrumes est riche et a été très discutée à la fin des années 60. Tanaka, (1961), identifie 156 espèces tandis que Swingle et Reece, (1697) en identifient seulement 16. Les agrumes ont la particularité d'être compatibles entre espèces et genres. Ceci explique la très grande complexité d'établir une classification. Les agrumes font partie de la famille des *Rutaceae* (Luro et al., 2018) qui comporte 1600 espèces et 160 genres séparés en 7 sous familles. Les agrumes appartiennent à la sous famille des *Aurantioideae* et c'est elle qui entraîne un certain débat. En effet, Swingle et Reece, (1697) s'accordent pour bien intégrer les agrumes à cette sous-famille. Cette sous famille est elle-même composée de deux tribus les *Clauseneae*, qui serait une sous-tribu plus primitive que la 2ème sous tribu, les *Citreae*. Les agrumes appartiennent à la tribu des *Citreae* qui comprend trois sous tribus dont celle des *Citrineae*. Cette sous tribu est elle-même composée de trois groupes dont celui qui nous intéresse les « agrumes vrais ». Ce dernier groupe est représenté par 6 genres botaniques : *Citrus*, *Clymenia*, *Fortunella*, *Poncirus*, *Eremocitrus*, *Microcitrus*. Néanmoins, les récents travaux de Wu et al., (2018) remettent en question les réflexions taxonomiques et phylogénétiques indiquant une possible reformulation du genre *Citrus*. Dans cette étude, après analyse des séquences et de la phylogénie du génome entier du genre *Poncirus*, il semblerait qu'il soit un genre distinct de celui du genre *Citrus*. De plus, les genres *Fortunella*, *Eremocitrus*
et *Microcitrus* seraient considérés comme des espèces du genre *Citrus* et non comme des genres apparentés.

Parmi le genre *Citrus* est retrouvé 4 grands taxons ancestraux : *Citrus micrantha*, *Citrus medica*, *Citrus reticulata* et *Citrus maxima* donnant ainsi la plupart des espèces d'agrumes cultivés. Le genre *Citrus* représente également le genre le plus diversifié (oranges, citrons, cédrats, mandarines, limes, pomelos, bigarades, etc...) (figure 2).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 2 - Origines phylogénétiques des agrumes cultivés (F. Curk, P. Ollitrault, CIRAD)</figcaption></figure>

### 1.1.3. Les porte-greffes

Dans l'agrumiculture, et de façon plus générale dans l'agriculture, l'utilisation de porte-greffes est essentielle. Un porte-greffe est défini comme un végétal sur lequel un greffon (variété d'intérêt) y sera implanté. Les porte-greffes peuvent être multipliés par culture *in vitro*, par bouturage ou encore par semis. Cependant, du fait de leur polyembryonie, certaines variétés de porte-greffes peuvent être multipliées à l'identique par semis, avec des pourcentages de conformité génétique différents (Camille Jacquemond et al., 2013).

Depuis plus d'un siècle, les agrumes ne sont plus cultivés de franc de pied. En effet, ils sont cultivés greffés avec des porte-greffes qui vont leur conférer des propriétés amenant à certaines caractéristiques de tolérances face à l'environnement (Allario et al., 2011; Khalid et al., 2020; Oustric et al., 2017; Ruiz et al., 2020) ou encore à des maladies telles que la tristeza
(Jacquemond et al., 2013). Cette association a connu un large succès et aujourd'hui la grande majorité des agrumes sont cultivés de manière bi-composite dans les systèmes de production : une variété possédant des qualités relatives à la partie aérienne (appelée « greffon ») est greffée sur une autre variété reconnue pour ses qualités racinaires (le « porte-greffe »). Chez les agrumes, les caractères juvéniles lorsque l'arbre est planté par semis persistent plusieurs années : branches épineuses, arbre très vigoureux avec un port dressé et au final entrée en production tardive (Cameron & Frost, 1968). Plusieurs espèces et variétés d'agrumes n'ont qu'une faible résistance au froid ou à certaines maladies du sol, pas ou peu de tolérance à la salinité ou au déficit hydrique qui constituent pourtant des qualités intrinsèques souhaitables pour leur survie (Bitters, 1986).

L'idée d'associer des variétés d'agrumes possédant ces qualités d'adaptation avec d'autres variétés plus sensibles mais de bonne qualité fruitière est née au XIIème siècle en Espagne. A l'époque, l'objectif était essentiellement de se prémunir contre les attaques de Phytophthora spp. (Phytophthora citrophthora et Phytophthora parasitica) une maladie de dégénérescence causée par un champignon du sol (Duportal et al., 2013). Le greffage permet ainsi de réunir deux plantes génétiquement différentes en une, en valorisant leurs caractères respectifs. De plus, les caractères juvéniles induits par le semis sont inhibés lors de la multiplication par greffage. La principale contrainte est alors la notion de compatibilité entre le greffon et le porte-greffe. Les cultivars d'agrumes sont multipliés par voie végétative par greffage pour maintenir l'intégrité du cultivar souhaité tandis que les porte-greffes sont multipliés par graines (polyembryonnées) et sont sélectionnés pour leurs résistances aux maladies et aux nématodes. Plusieurs recherches ont aujourd'hui démontré les multiples avantages procurés par cette pratique. Les caractéristiques pouvant être induites par l'association porte-greffe/greffon sont notamment :

- La tolérance de certaines associations à des maladies (Citrus Tristeza Virus, Citrus exocortis viroid),

- La résistance aux bioagresseurs du sol (phytophthora, nématodes),

- L'adaptation à la physique et chimie du sol (tolérance à la salinité, à la sécheresse, au calcaire, à l'hydromorphie) (Allario et al., 2013; Khalid et al., 2020; Oustric et al., 2017),

- L'influence sur la vigueur et la productivité, avec une rapidité de mise à fruits de la partie greffée (Jayswal & Lal, 2020),

Cette utilisation de porte-greffes a montré l'impact de ces derniers dans différents travaux sur la pastèque (Yan et al., 2018), les poivrons (Penella et al., 2015) vis-à-vis du stress salin.
D'autres travaux chez les agrumes (Allario et al., 2013) et le tabac (Liu et al., 2014) ont montré l'efficacité de certains porte-greffes face à la sécheresse et donc au déficit hydrique.

Un nombre restreint de porte-greffes est actuellement utilisé à travers le monde possédant chacun des qualités propres (*Citrus volkameriana*, Bigaradier, Limettier Rangpur, Citrange carrizo, Citrumelo swingle, Poncirus trifoliata, Mandarinier Cléopâtre...) (Stover & Castle, 2002). Aujourd'hui, du fait de sa tolérance au virus de la tristeza (CTV) et des températures froides, le porte-greffe Citrumelo Swingle 4475 (*Citrus paradisi* Macf. x *Poncirus trioliata* (M/) Raf.) est un des porte-greffes les plus utilisés dans le monde (Amérique centrale, Afrique du Sud, Australie, etc.).

### 1.1.4. Contexte économique

En 2016, c'est plus de 124 milliers de tonnes (Mt) d'agrumes qui sont produits dans le monde (FAO, 2017). Malgré des baisses de production au fil des années, la production mondiale d'agrumes de 2019 à 2020, toutes espèces confondues, s'élève à plus de 110Mt/an en Europe, sur une superficie de 7,5 millions d'hectares environ. Les oranges dominent le marché du fruit frais en représentant environ 60% de la production totale d'agrumes. Il est escompté que la production d'oranges devrait augmenter de 3,6 Mt pour la période 2020/2021. Les tangerines, mandarines, clémentines et satsumas comptent pour 23% du volume mondial. Environ 13,7 Mt de citrons et de limes, ainsi que 4,4 Mt de pamplemousses et pomelos sont produits annuellement. Néanmoins, la production globale des limes devrait, elle, baisser et atteindre les 8,3 Mt en 2021 (USDA, 2021). Toutefois, depuis plusieurs années, l'agrumiculture est en danger en raison de différentes contraintes abiotiques (sécheresse, salinité des sols, etc.) ou encore biotiques (maladies, ravageurs).

A ce jour, l'une des plus grandes contraintes pour l'agrumiculture reste la maladie du Huanglongbing (HLB, encore appelée Citrus greening) qui, depuis une quinzaine d'années, ne cesse de progresser dans le monde.

Le HLB a entraîné au fil des années un impact économique important. Cette bactériose est l'une des maladies les plus destructrices des agrumes. Dès qu'il est établi, lutter contre le HLB pour maintenir une production continue d'agrumes s'avère difficile et coûteux (Li et al., 2020). Les pertes dues à la maladie peuvent être très importantes (Gottwald, 2010) comme c'est le cas en Floride où la chute de production est estimée à près de 80% (Albrigo & Stover, 2015). Dans certains cas, des parcelles entièrement infectées ont conduits à des pertes totales de
récoltes. Une étude faite en 2016 indique que la plupart des comtés de Floride présentaient une perte de 90 à 100% de production due au HLB (Neupane & Moss, 2016). Les pertes économiques signalées en Inde, aux Philippines sont la traduction de l'infection par le HLB de plus de sept millions d'arbres. En Thaïlande et Taïwan, ce sont près de trois millions d'arbres qui ont été infectés par la bactérie responsable de la maladie. En Indonésie, les plantations ont été abandonnées ou ont disparu dans leur totalité (FAO, 2003). Une relation significative a pu être mise en évidence entre la sévérité du HLB et la perte d'agrumes au Brésil (Bassanezi et al., 2011).

Avant les années 2010, les productions d'agrumes dans la Caraïbe étaient en augmentation. Avec l'apparition de la maladie dans la Caraïbe, il y a une chute constante de la production d'agrumes dans la région (figure 3). La diminution de la production des agrumes dans le bassin caribéen s'avoisine autour de 24% entre 2008 et 2016 (FAO, 2017).

En 2019, la chute de production des agrumes continue avoisinant les 589,6 Mt dans le bassin caribéen (FAO, 2021).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 3 - Évolution de la production (en milliers de tonnes) d'agrumes cultivés dans le bassin caribéen entre 2008 et 2016 (FAO, 2017)</figcaption></figure>
En Guadeloupe, après la détection du HLB en 2012, les productions d'agrumes cultivés tels que les pamplemousses, les limes, les mandarines ou encore les oranges ont considérablement chutés.

En lien avec ces pertes économiques importantes, de nombreuses études ont été réalisées pour évaluer la résistance ou la tolérance des apparentés agrumes vis-à-vis de maladies et plus particulièrement du HLB. Les études ont souvent du mal à être concordantes sur les espèces identifiées comme résistantes ou tolérantes. Ramadugu et al., (2016) distingue deux variétés immunisées, six variétés résistantes et quatorze variétés tolérantes. Selon cette étude, ces tolérances et résistances sont la conséquence de facteurs multiples : la capacité de colonisation des psylles (insectes vecteurs de la maladie), l'absence de multiplication de la bactérie responsable de la maladie, la réplication transitoire de la bactérie, l'infection retardée ou une meilleure défense de la plante à la suite de l'infection. Enfin, la diversité des agrumes montre que selon les variétés, une tolérance plus ou moins accrue est observable. Des variétés d'agrumes comme Tangelo Jackson, mandarinier Fallglo ou encore Tangor Temple présentent une meilleure tolérance par rapport aux différentes variétés d'orangers, considérées comme variétés sensibles (Stover et al., 2015).

En plus de la diversité chez les agrumes, la polyploïdie semble être une voie prometteuse dans la tolérance aux maladies et donc au HLB.

# 1.1. Polyploïdie

## 1.1.1. Généralités

La ploïdie se définit comme une duplication du génome entier d'un organisme ou encore d'une cellule (Fox et al., 2020). Ainsi, la spécificité d'un individu polyploïde est qu'il possède un nombre de chromosomes supérieur à 2x copies. La polyploïdie aura alors un effet sur l'ensemble du génome, des cellules, etc. conférant ainsi, des avantages et aussi des inconvénients (Comai, 2005; Fox et al., 2020; Ruiz et al., 2020).

Bien qu'elle soit commune chez les plantes et rare dans le règne animal, la polyploïdie est retrouvée de manière fréquente chez les poissons ou encore chez les amphibiens (Christoffels et al., 2004; Mable et al., 2011; Otto & Whitton, 2000). La polyploïdisation est un des principaux facteurs dans l'évolution des plantes et joue un rôle majeur chez celles-ci. Il est estimé que 50 à 70% des angiospermes, plantes à fleurs qui portent des fruits, sont concernés (Masterson, 1994). Chez les angiospermes, ce phénomène est un phénomène naturel et est
responsable de l'ordre de 2 à 4% dans la création de nouvelles espèces (Otto & Whitton, 2000).

En fonction de leur génome, il peut y avoir une variation de la ploïdie et les polyploïdes peuvent être classés en deux catégories bien distinctes (figure 4) :

- Les autopolyploïdes,

- Les allopolyploïdes.

L'autopolyploïde est un individu qui a un nombre anormal de chromosomes ayant pour origine un doublement de chromosomes au sein d'une même espèce ou une fusion de gamètes non-réduits (2n). A contrario, un allopolyploïde est un individu qui a un doublement chromosomique résultant d'une hybridation entre deux espèces ou genres différents. De ce fait, les allopolyploïdes possèdent deux génomes différents contrairement aux autopolyploïdes qui possèdent un seul et unique génome.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 4 - Les différents types de polyploïdes (Thèse Julie Oustirc d'après Chen, 2007)</figcaption></figure>

La polyploïdie va conférer certains avantages comme l'hétérosis qui permettra aux
individus d'être plus vigoureux que leurs progénitures diploïdes. La redondance des gènes va permettre, quant à elle, de protéger les individus polyploïdes des effets délétères des mutations. Enfin, la polyploïdie va jouer un rôle dans la sexualité permettant ainsi une auto-fertilisation chez certaines espèces (Comai, 2005).

Deux mécanismes vont engendrer la polyploïdie. Ces mécanismes sont la polyploïdisation somatique qui est un doublement somatique du génome et la polyploïdisation sexuelle qui la formation de gamètes non-réduits.

Malgré sa rareté, la polyploïdisation somatique résulte de l'absence de mitose. L'ADN est alors répliqué sans division cellulaire. Cette polyploïdisation peut être induite également en laboratoire à partir d'agents physiques (choc thermiques) ou encore chimiques (colchicine ou colcémide) afin de produire des plants d'intérêt (Tayalé & Parisod, 2013).

Chez la plupart des plantes, la polyploïdisation sexuelle reste beaucoup plus fréquente que celle somatique. Elle résulte d'anomalies méiotiques – induites par des facteurs génétiques ou environnementaux (Bretagnolle & Thompson, 1995; Ramsey & Schemske, 1998) – qui interviennent lors de la première (FDR : First Division Restitution) ou seconde division (SDR : Second Division Restitution) de méiose (De Storme & Geelen, 2013) (figure 5). La FDR est caractérisée par l'absence de la 1ère division de méiose. Elle entraine alors la formation de deux gamètes diploïdes contenant deux chromatides non-sœurs. Ainsi, au sens strict, la FDR conserve pleinement l'hétérozygotie et l'épistasie parentale. Dans certains types de FDR, l'hétérozygotie parentale n'est pas retenue par l'omission de la 1ère division de méiose mais par d'autres altérations cytologiques. Dans ce cas, l'hétérozygotie parentale n'est que partiellement conservée (Ramanna & Jacobsen, 2003). Le mécanisme de type SDR est observé lors de la 2ème division de méiose. En effet, il y a omission de celle-ci. Il y a alors formation de deux gamètes diploïdes contenant deux chromatides sœurs. Dans le cas de la SDR, la 1ère division méiotique se déroule normalement, avec appariement et recombinaison corrects, les gamètes générés sont toujours homozygotes du centromère au premier crossing-over. L'hétérozygotie parentale est conservée du coté télomérique (Ramanna & Jacobsen, 2003).
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 5 - Conséquences de la FDR et SDR lors de la méiose (Thèse Julie Oustric d'après Bretagnolle & Thompson, 1995)</figcaption></figure>

### 1.1.2. Impact de la polyploïdie chez les agrumes

La ploïdie qui domine chez les agrumes est la diploïdie. En effet, les agrumes sont généralement diploïdes et possèdent 18 chromosomes (n=9) (Ollitrault et Jacquemond, 2003). Néanmoins, il existe des agrumes polyploïdes naturels, les plus communs étant triploïdes ou tétraploïdes.
Les fruits des plants polyploïdes sont moins juteux, ont une écorce plus épaisse et présentent moins de pépins mais restent de plus grande taille. Après duplication, les deux copies de gènes peuvent se spécialiser afin de donner des fonctions complémentaires et donc de s'exprimer à des moments différents ou dans des tissus spécifiques (Allario et al., 2011). De plus la polyploïdie a, pour principale conséquence, d'augmenter la taille des cellules (figure 6) (Comai, 2005; Ruiz et al., 2020; Stebbins, 1971) et a plus grande échelle la taille des organes (Beest et al., 2012). Les plants polyploïdes sont alors plus souvent « trapus » et robustes. Il montre également une certaine augmentation de la taille de certains organes comme les fruits, les feuilles, les racines ainsi que les graines.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 6 - Microscopie de tige 2x (A), 4x (B) et de racines 2x (C) et 4x (D) (Allario et al., 2011)</figcaption></figure>
Néanmoins, les plants 4x présentent généralement un retard de croissance, ils sont donc plus petits que les plants 2x. Ce retard de croissance peut être expliqué par le fait que les cellules polyploïdes auraient besoin de plus de temps pour se développer (Corneillie et al., 2019). De plus, l'étude de Corneillie et al., (2019) a montré que la polyploïde n'aurait pas un impact sur la totalité de la plante et que le nombre total de cellules épidermiques et stomatiques diminueraient au fur et à mesure que le niveau de ploïdie augmenterait. Ce qui pouvait être retrouvé avec le nombre moins important des stomates et des chloroplastes mais avec une taille beaucoup plus importante chez les 3x tandis que le nombre de stomates et chloroplastes était plus important chez les 2x mais cette fois-ci avec une taille moindre (Lourkisti et al., 2021).

Les polyploïdes d'agrumes présentent une meilleure adaptation à leur environnement (pour revue, voir Ruiz et al., 2020) et donc une meilleure tolérance aux stress abiotiques tels que le stress salin (Khalid et al., 2020; Saleh et al., 2008), des températures froides (Oustric et al., 2017) ou encore le déficit hydrique (Vieira et al., 2016). L'étude d'Allario et de ses collaborateurs (figure 7) a démontré qu'en greffant une variété d'orange sur des porte-greffes limettier Rangpur diploïdes (2x) et tétraploïdes (4x), les variétés greffées avec les porte-greffes 4x se comportaient nettement mieux que celles greffées avec des porte-greffes 2x, après un déficit hydrique de 11 jours (Allario et al., 2013). L'étude récente de Lourkisti et al., (2021) a également montré que les variétés 3x possédaient une plus grande tolérance face au déficit hydrique par rapport à des 2x, grâce à des caractéristiques anatomiques et cytologiques apportées par la polyploïdie.
<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 7 - Comportement d'une variété d'orange greffées avec un porte-greffes (limettier Rangpur) 2x et 4x après un déficit hydrique de 11 jours (Allario et al., 2013).</figcaption></figure>

La polyploïdie modifierait ainsi l'expression des gènes dans les racines pour réguler la voie de signalisation de l'acide abscissique (ABA) et améliorait ainsi l'adaptation de la variété greffée suite à un stress (Allario et al., 2013). De plus, l'étude de Oustric et al., (2019) a montré que les génotypes d'agrumes 4x montraient une plus grande tolérance face à une carence prolongée en éléments nutritifs par rapport à leurs 2x respectifs dans des conditions de stress. En plus des stress comme le déficit hydrique ou le stress salin, certains porte-greffes sont résistants ou tolérants à certaines maladies (Jacquemond et al., 2013).

## 1.2. Mécanisme de défense de la plante

### 1.2.1. Le stress oxydant

Induit suite à différents stress biotiques ou abiotiques, le stress oxydant se définit alors comme un déséquilibre entre la production des ROS et l'élimination de celles-ci (Migdal & Serres, 2011) par le système antioxydant entrainant ainsi des dommages cellulaires.
1.2.1.1. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS)

Les espèces réactives de l'oxygène jouent un rôle clé dans le mécanisme de défense des plantes (Huang et al., 2019), exercent une action antimicrobienne directe (Dmytriiev & Kravchuk, 2005). Ce sont des petites molécules qui sont synthétisées dans différents compartiments cellulaires de la plante comme les chloroplastes, les mitochondries, les membranes plasmiques ou encore les réticulums endoplasmiques (Choudhary et al., 2020; Krishnamurthy & Rathinasabapathi, 2013). Dans des conditions normales de culture, les ROS sont continuellement produites de manière équilibrée et vont jouer un rôle dans différents processus physiologiques tels que le développement de l'arbre, le cycle cellulaire ou encore la mort programmée (figure 8) (Gill & Tuteja, 2010; Krishnamurthy & Rathinasabapathi, 2013). Cependant, certains stress peuvent modifier l'équilibre entre la production et l'élimination de ROS. Cette surproduction de ces molécules, qui sont hautement réactives, va entrainer d'importantes lésions cellulaires ainsi que l'inhibition de la photosynthèse (Choudhury et al., 2017). Une des conséquences des ROS est qu'elles peuvent nuire à la production de biomolécules comme une dégradation des acides nucléiques, protéines ou encore une peroxydation des lipides (Das & Roychoudhury, 2014; Gill & Tuteja, 2010) entrainant ainsi la mort cellulaire (Choudhary et al., 2020).
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 8 - Effet des ROS sur l'arbre d'après Krishnamurthy & Rathinasabapathi, (2013). Flèches rouges : effets négatifs ; flèches vertes : effets positifs</figcaption></figure>

Les ROS peuvent être de nature radicalaire comme l'anion superoxyde (O₂⁻), le radical hydroxyle (·OH) ou de nature non radicalaire comme l'oxygène singulet (¹O₂) et le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂).

- Contrairement aux autres ROS, l'oxygène singulet ne provient pas d'électrons mais d'un transfert d'énergie d'excitation. Il est produit dans les chloroplastes à cause de différents stress (Wituszyńska & Karpiński, 2013). Soute haute lumière, il peut être produit à partir d'un état triplet de la chlorophylle au niveau du photosystème II de la phase photochimique de la photosynthèse (Tripathy & Oelmüller, 2012). Il peut également être produit dans le système antennaire lorsqu'il y a une dissipation insuffisante de l'énergie au cours de la photosynthèse ou encore dans le centre réactionnel par recombinaisons d'une paire de radicaux (Pospíšil & Prasad, 2014).

- Le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) résulte soit d'une réduction bi-électronique de l'O₂,
soit d'une réduction mono-électronique de l'anion superoxyde. Selon sa concentration, le rôle de H₂O₂ varie. En effet, à faible concentration intracellulaire, il est impliqué dans la signalisation permettant la réponse aux stress biotiques et abiotiques mais aussi dans le renforcement des parois cellulaires, la photosynthèse ou encore le mouvement stomatique. En revanche, à forte concentration, il endommage les cellules jusqu'à entrainer leur mort (Nazir et al., 2019). Cet intermédiaire, bien qu'il ne soit pas radicalaire est relativement toxique et de plus possède une durée de vie assez longue, de l'ordre des minutes. Il peut également diffuser loin de son site de production et peut même traverser les membranes (Parent et al., 2008).

- L'anion superoxyde ou encore le radical superoxyde (O₂⁻-) est généralement la première des ROS à être produite dans les cellules. Il est formé par la capture d'un électron par une molécule d'O₂. La toxicité de ce radical peut être directe envers les substrats bio-organiques mais également indirecte car elle peut interagir avec l'H₂O₂ et donner naissance à des *OH. Il peut être produit aussi dans les mitochondries (Choudhary et al., 2020) et tout comme l'H₂O₂, il a la capacité de diffuser loin de son site de production (Parent et al., 2008).

- Le radical hydroxyle (·OH) est l'espèce radicalaire la plus délétère. En effet, bien que sa durée soit très courte, il peut réagir avec quasiment toutes les molécules biologiques et est assez toxiques vis-à-vis de tous constituants cellulaires comme l'ADN, les protéines ou encore les lipides. Cette espèce réactive de l'oxygène peut être formée à partir du H₂O₂ interagissant avec des ions ferreux (Fe²⁺) *via* la réaction de Fenton ou avec l'O₂⁻- *via* la réaction d'Haber-Weiss (Inagaki et al., 2016; Parent et al., 2008).

Pour gérer le déséquilibre lié au stress oxydatif, les plantes sont capables d'induire une succession de réaction de détoxication.

### 1.2.1.2. Mécanisme de défense antioxydant

Le système oxydant comprend des mécanismes du stress oxydant qui sont regroupés en deux grands groupes : le système oxydant enzymatique et le système oxydant non enzymatique.

- Dans le système oxydant enzymatique on va retrouver la superoxydase dismutase (SOD) qui est une métalloprotéine présente dans tous les organismes aérobie. Elle constitue la première ligne de défense contre le stress oxydant et son rôle sera de catalyser la dismutation de 2 O₂⁻- en H₂O₂ et O₂ dans la majorité des compartiments où ils sont produits (Bowler et al., 1992).
SOD

$$2\text{O}_2^{\cdot-} + 2\text{H}^+ \rightarrow \text{O}_2 + \text{H}_2\text{O}_2$$

Trois isoformes de SOD existent et se distinguent par le métal présent au niveau de leur groupement prosthétique. Le 1er type est le Cu/Zn-SOD et on le retrouve de façon abondante dans le cytosol, le chloroplaste et le peroxysome. Le Fe-SOD se trouve principalement dans les chloroplastes alors que le Mn-SOD se retrouve dans les mitochondries et les peroxysomes (Wang et al., 2016). Des études ont montré que chaque isoforme joue un rôle unique ou synergique dans la survie des plantes dans des environnements stressants (Gill & Tuteja, 2010).

- La catalase est une molécule qui va catalyser comme réactifs les deux produits formés par la SOD en H₂O et O₂. Elle joue un rôle majeur dans le métabolisme et la protection des plantes. Elle permet de réguler l'excès d'H₂O₂ produit au cours d'un stress (Mittler, 2002).

$$\text{H}_2\text{O}_2 \xrightarrow{\text{CAT}} \frac{1}{2}\text{O}_2 + \text{H}_2\text{O}$$

La catalase (CAT) est retrouvée dans les peroxysomes dans quasiment tous les organismes exceptés quelque uns et de par sa faible affinité avec l'H₂O₂, son rôle est de dégrader celui-ci lorsqu'il est produit en excès (Mhamdi, Noctor, & Baker, 2012). Contrairement à l'ascorbate peroxydase, elle ne nécessite pas de molécules réductrices et peut agir seule sur l'H₂O₂. Une seule molécule de CAT permet de dégrader environ 6 millions de molécules d'H₂O₂ par minutes. Chez les plantes, le nombre d'isoformes de la catalase est variable (Aebi, 1984; Gill & Tuteja, 2010).

- Peroxydase la plus importante, l'ascorbate peroxydase (APX) réduit également l'H₂O₂ en H₂O en utilisant le pouvoir de l'acide ascorbique comme donneur d'électron (Jebara et al., 2005; Mittler, 2002). Contrairement à la CAT, elle possède une plus forte affinité pour l'H₂O₂ lui conférant ainsi un rôle majeur dans la dégradation de celui-ci (Wang et al., 1999).

$$\text{H}_2\text{O}_2 + \text{AsA} \xrightarrow{\text{APX}} \text{MDHA} + \text{H}_2\text{O}$$
D'autres molécules telles que gaïacol peroxydase (GPX), le monodehydroascorbate réductase (MDHAR) ou encore le dehydroascorbate réductase (DHAR) ont été décrites dans la littérature dans leur rôle dans l'élimination des ROS (Das & Roychoudhury, 2014; Uarrota et al., 2016).

Le système non enzymatique comprend le glutathion, la proline et l'ascorbate.

- Le glutathion (GSH) est un tripeptide de faible masse moléculaire et il intervient dans la régulation du développement de la plante et la réponse aux stress biotiques et abiotiques (Frendo et al., 2013). Il est considéré comme la défense intracellulaire la plus importante contre la protection des dommages oxydatifs induits par les ROS. Il est abondant sous forme réduite dans les tissus végétaux et on le retrouve dans tous les compartiments cellulaires comme le cytosol, les mitochondries, les plastes ou encore le réticulum endoplasmique. Il joue également un rôle important dans plusieurs processus physiologiques comme la régulation du transport de sulfate ou l'expression des gènes répondant au stress (Gill & Tuteja, 2010; Mullineaux & Rausch, 2005).

- La proline (Pro) est un acide aminé qui joue un rôle important chez les végétaux. Outre son rôle dans l'osmorégulation du cytoplasme, elle est considérée maintenant comme un puissant antioxydant non enzymatique chez les microbes, les animaux et le plantes afin de d'atténuer les effets toxiques des ROS. Sa synthèse a lieu principalement dans le cytosol mais aussi dans le chloroplaste lors d'un stress. Elle jouerait également un rôle dans la stabilisation des structures cellulaires et à la protection des fonctions cellulaires en dégradant directement les ROS. L'accumulation accrue de proline a été corrélée à une meilleure tolérance aux stress abiotiques tels que le stress salin ou le déficit hydrique (de Campos et al., 2011).

- L'acide ascorbique (AsA), appelé encore ascorbate ou vitamine C, reste l'antioxydant le plus important chez les végétaux car il permet de prévenir ou minimiser les dommages cellulaires que les ROS auront induits chez les plantes. Il est considéré comme un puissant antioxydant car il a la capacité de donner des électrons dans plusieurs réactions enzymatiques (cf : APX) et non enzymatiques. De plus, il peut protéger les membranes en piégeant directement l'O₂⁻ et l'•OH en régénérant l'α-tocopherol à partir du radical tocopheroxyl (Gill & Tuteja, 2010).
En plus de tous ces composés qui permettent de réduire considérablement l'excès de production de ROS, des familles de composés comme les polyphénols, une famille de molécules hydrosolubles largement présente dans le règne végétal, sont utiles également à la plante pour ses réactions de défense contre les attaques de l'environnement. Les polyphénols dont les flavonoïdes et les acides phénoliques sont les classes majoritaires, interviennent dans le développement de la plante en améliorant entre autre le métabolisme de celle-ci (Sharma et al., 2019). Les composés polyphénoliques, peuvent réduire le stress. Il a été démontré qu'ils exercent des effets antioxydants par un certain nombre de mécanismes (Agati et al., 2012; Kumar & Pandey, 2013). Leur activité antioxydante est principalement due à leurs propriétés d'oxydoréduction, les capteurs de l'oxygène singulet qui peuvent jouer un rôle dans l'adsorption et la neutralisation des radicaux libres. Suite à un stress, la concentration en composés polyphénoliques augmente afin de pouvoir lutter contre celui-ci (Sharma et al., 2019). Il est possible de doser les polyphénols. Le principe de la mesure des composés phénoliques repose sur le transfert d'électrons en milieu alcalin à partir de composés polyphénoliques pour former un chromophore bleu constitué d'un complexe phosphotungstique / phosphomolybdène où l'absorption maximale dépend de la concentration en composés polyphénoliques (Everette et al., 2010). Le réactif réduit de Folin-Ciocalteu est détectable avec un spectrophotomètre dans la plage de 690 à 710 nm.

### 1.2.2. Réaction d'hypersensibilité (HR) et réaction systémique acquise (SAR)

Suite à différentes attaques de pathogènes, les plantes sont capables de réagir suite à l'activation de mécanismes de défenses naturels. En effet, des récepteurs PPRs (Pattern-Recognition Receptors) sont capable de reconnaitre spécifiquement certaines molécules spécifiques des micro-organismes appelées PAMPs (Pathogen-Associated Molecular Pattern) situés sur la membrane des pathogènes (Asai et al., 2002; Freeman & Beattie, 2008). Les PAMPs sont des lipopolysaccharides, peptidoglycanes, flagelline bactérienne ou encore des mannanes de levure. La reconnaissance de ces molécules entraine la mise en place du PTI (PAMP-Triggered Immunity) qui est la première phase de défense active contre les pathogènes et qui prévient l'infection. Néanmoins, il a été montré que dire que ces PTI étaient associés spécifiquement à des agents pathogènes était quelque peu erroné car des agents non-pathogènes étaient capables de synthétiser ces molécules (Ausubel, 2005). Pour établir l'infection, les pathogènes ont mis en place une forme de résistance en injectant des effecteurs (E) dans les cellules des plantes. La plante se défend en synthétisant des protéines de résistance (R) afin de
contrer cette stratégie de virulence des pathogènes. La reconnaissance d'un effecteur E et d'une protéine R entraine la mise en place de l'ETI (Effector-Triggered Immunity) contre le pathogène. Les protéines R jouent alors deux rôles (figure 9).

Lors d'une attaque de pathogène, le PTI puis l'ETI se mettent en place impliquant les protéines R. Ces protéines vont stimuler la production de ROS (cf. 1.2.1.1. *Les espèces réactives de l'oxygène*) pour renforcer les parois cellulaires et former une barrière autour de l'agent pathogène afin d'empêcher sa propagation : c'est la réaction d'hypersensibilité (HR). Cette réaction d'hypersensibilité à l'aide des mécanismes de détoxication mènera à la mort cellulaire programmée (Freeman & Beattie, 2008; Gilchrist, 1998; Heath, 2000).

Le second rôle des protéines R sera de stimuler l'accumulation d'une hormone de défense appelée acide salicylique (SA). Cette hormone sera responsable de l'induction des mécanismes de résistance systémique acquise (SAR) (Durrant & Dong, 2004). La synthèse de SA se fait par deux voies incluant la catalyse de deux molécules, la chorismate et la phénylalanine qui font intervenir respectivement l'ischorismate synthase (ICS) et la phénylalanine synthase (PAL). Le gène *PAD4* participe à l'accumulation de SA (Fu & Dong, 2013; Liu et al., 2016). L'étude de Alvarez et al., (1998) a montré que les ROS pouvaient activer les défenses de la plante par le biais de la SAR dans toute la plante à faible niveau (Durrant & Dong, 2004).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 9 - Mécanisme de défense : Réaction d'Hypersensibilité (HR) et Résistance Systémique Acquise (SAR), d'après Dutt et al., (2015)</figcaption></figure>

Lors d'un stress, qu'il soit biotique ou abiotique, la concentration de SA augmente dans la plante et agit comme un signal permettant d'induire l'expression de gènes impliqués dans la défense au stress dans toute la plante. Il a été montré que l'acide salicylique permettait d'améliorer la production d'antioxydants pour maintenir les ROS à un niveau minimal dans les racines après attaques de pathogènes (Belkadhi et al., 2013).

Suite à l'accumulation de SA, il y aura activation d'un des gènes les plus importants dans la voie de signalisation de la SAR. C'est le gène *NPR1*. Ce gène participe à l'accumulation de SA mais permet aussi à la plante de résister à la toxicité de la phytohormone (Durrant & Dong, 2004). Les protéines NPR1 vont impliquer les *TGA* (Johnson et al., 2003) qui sont des facteurs de transcriptions de type bZIP régulant l'expression des gènes *PR* et donc de la production de protéines liée à la pathogénicité (Fu & Dong, 2013; Liu et al., 2016). Les protéines NPR1 participent également à l'activation des facteurs de transcriptions WRKY qui
permettent d'induire la production de protéines R. L'hormone SA et les protéines permettent à
la plante d'être protégée d'une seconde attaque pendant plusieurs jours voire semaines, en
instaurant une sorte de mémoire immunitaire. Des régulations épigénétiques font que la SAR
peut également être transmise à la descendance, le temps de quelques semaines. La SAR est
associée à la survie cellulaire, contrairement à l'ETI qui engendre la mort cellulaire. Le gène
NPR1 est considéré comme étant un des gènes les plus importants dans la mise en place de la
SAR.

Les études telles que celle réalisée par Fu & Dong, (2013) ont montré que les gènes paralogues de *NPR1*, *NPR3* et *NPR4* pouvaient être également des récepteurs à l'acide salicylique chez les plantes. Néanmoins, une étude indiquerait que les gènes *NPR3* et *NPR4* auraient un rôle opposé à celui de *NPR1*. En effet, ces gènes auraient tendance à supprimer de façon constitutionnelle l'action de SA alors que *NPR1* permettrait d'exprimer les gènes induits par SA (Ding et al., 2018).

1.2.3. Acide jasmonique (JA) et éthylène (ET)

Le gène *NPR1* permet de faire le lien avec d'autres voies de signalisation de SA et les
voies du de l'acide jasmonique (JA) (Ruan et al., 2019) et de l'éthylène (ET) (Broekaert et al.,
2006) qui confèrent des résistances à certains insectes et pathogènes nécrophiles (Durrant &
Dong, 2004). En effet, l'acide jasmonique, et ses dérivés appelés jasmonates, est une hormone
dérivée de l'acide gras α-linolénique et agit conjointement avec l'éthylène qui est une hormone
végétale, un gaz hydrocarbure dérivé de l'acide aminé méthionine. Après l'attaque d'un
pathogène, ou même d'un herbivore, une accumulation importante mais transitoire du JA se
produit à l'endroit où la blessure aura été faite conférant ainsi une défense localisée. L'acide
jasmonique, tout comme l'acide salicylique, sera converti en jasmonate de méthyle (MeJA) et
pourra ainsi être transmis par voie aérienne entre les feuilles endommagées ou non. Il pourra
également être transmis entre les plantes adjacentes. L'utilisation de phytohormone reste une
stratégie dans la défense contre les nuisibles et la perte de production des vergers (Poveda,
2020).

1.2.4. Acide abscissique (ABA)

Découvert pour la première fois en 1963, l'acide abscissique (ABA) est également une
phytohormone. Elle est synthétisée à partir d'un caroténoïde intermédiaire qui se trouve dans
les chloroplastes ou d'autres plastes (Taiz & Zeiger, 2002). En fonction de sa concentration,
l'acide abscissique aura un double rôle. A faible concentration, l'ABA joue au rôle majeur dans la régulation de l'initiation et du maintien de la dormance des graines et des bourgeons (Baron et al., 2012). A contrario, en cas de stress, la concentration de l'ABA augmente considérablement dans les racines permettraient de maintenir le développement racinaires en augmentant la conductivité hydraulique (Barnabas et al., 2007). L'ABA permet alors de limiter l'impact engendré par le déficit hydrique.

Ces différents mécanismes de détoxication – enzymatiques ou non enzymatiques – permettent alors de réguler les ROS induites après les différents stress abiotiques et biotiques et ainsi limiter leur toxicité chez l'organisme végétal. De plus, tous les mécanismes non antioxydants vont permettre également de gérer les différents stress induits par l'environnement pour maintenir le bon développement des plantes.

Néanmoins, malgré tous ces mécanismes de défense, une maladie ravage depuis deux décennies les vergers d'agrumes.

## 1.3. Le Huanglonbing

### 1.3.1. Histoire et origine

Depuis plusieurs années, une maladie est devenue l'un des problèmes phytosanitaires le plus important dans l'agrumiculture : le Huanglongbing. Ce sont les agriculteurs de la région de Chaozhou, à l'est de Canton en Chine, qui donnent le nom de Huanglongbing à la maladie dans leur dialecte ; avec « bing » pour maladie, « long » pour dragon et « huang » pour jaune (Lin, 1956). Ainsi, le HLB est encore appelé maladie du dragon jaune ou citrus greening. Cette maladie s'est propagée et est présente dans le monde entier dans toutes les zones d'agrumes cultivés à l'exception, pour l'heure, du bassin méditerranéen et du Moyen-Orient, même s'ils restent très menacés. Même si des suspicions de plants malades ont eu lieu tout au long du XXème siècle, notamment en Chine, Thaïlande, Philippines, Afrique du Sud, etc., il est indiqué que les premiers symptômes, induits par le HLB, seraient apparus à la fin du XIXème siècle en Chine (Bové, 2006). Depuis les années 2010, le bassin caribéen est touché par la maladie du HLB. En 2012, les premiers symptômes sont décrits en Guadeloupe. Un an plus tard, la FREDON rapporte que ces derniers sont décrits également en Martinique même si son impact semble limité sur l'île.

Lin (1956) montre pour la première fois que la maladie était transmissible par inoculation du greffon, il indique que la cause de cette transmission était sans doute virale. Neuf
ans plus tard, les travaux de McClean & Oberholzer, (1965) montreront que la maladie était
transmissible par greffage. En 1967, les travaux menés par Lilian Fraser et ceux de Carpoor
indiquent que cette bactérie était transmise par les psylles des agrumes (Bové, 2006). Dans les
années 1970, l'observation de microorganismes dans les cellules du phloème a été effectuée et
ce n'est qu'en 1984 que Bové et ses collaborateurs décrivent pour la première fois une bactérie
à Gram négatif présente dans les cellules du phloème (Bové, 2006).

1.3.2. Agents pathogènes et vecteurs de la maladie du Huanglongbing

Identifiée comme une maladie bactérienne, le microorganisme associé au HLB est une bactérie à Gram négatif nommée *Candidatus* Liberibacter spp. (Bové, 2006). Cette bactérie appartient à la sous division α des protéobactéries, est exclusivement phloèmique et est retrouvée sous forme de bacilles mesurant entre 500 et 2000 nm (Shokrollah et al., 2010) de longueur et 20 à 25 nm de largeur. Les trois espèces connues, décrites dans la taxonomie, ont été nommées en fonction de leur géolocalisation :

- La souche *Candidatus* Liberibacter asiaticus (Las) (Bové, 2006) est originaire d'Asie. Retrouvée en Asie, Amérique du Sud, Centrale et au Sud des États-Unis d'Amérique (USA), c'est la souche la plus répandue dans le monde et donc la plus commune. Cette espèce est également responsable de la maladie dans le bassin caribéen (Etienne, 2001).

- *Candidatus* Liberibacter americanus (Lam) (Teixeira et al., 2005; Teixeira et al., 2005) est une souche assez similaire à Las et a été identifiée pour la première fois à São Paulo au Brésil en 2005.

- Enfin, on retrouve *Candidatus* Liberibacter africanus (Laf) (Jagoueix et al., 1994) qui se distingue des deux autres souches de par sa sensibilité aux températures (Bové et al., 1974). Cette souche est principalement retrouvée en Afrique du Sud et à l'île de la Réunion et est retrouvée dans les régions en altitude où le climat est frais.

Aujourd'hui, malgré de nombreux travaux de recherche, il n'est toujours pas possible de cultiver les souches de cette bactérie. En revanche, une étude récente (Ha et al., 2019) pourrait être un précurseur dans la culture de la souche asiatique. En effet, cette étude montre qu'il a été possible de cultiver Las à partir d'un inoculum dans des conditions spécifiques à l'aide d'un réacteur à membrane biofilm. Cette étude pourrait être le début du développement à long terme de Las à partir d'une culture pure.

A ce jour, deux vecteurs responsables de la transmission du HLB dans les zones de cultures d'agrumes ont été identifiés. Ces vecteurs sont des insectes piqueur-suceur appelés
psylles d'agrumes :

- Appelé *Trioza erytreae* (Hemiptera : Triozidae) (**figure 10B**), cet insecte à l'âge adulte est responsable de répandre Laf et ne résisterait pas aux températures élevées.

- Le 2ème est le psylle asiatique des agrumes (ACP) : *Diaphorina citri* Kuwayama (Hemiptera : Liviidae) (**figure 10A**). A l'âge adulte, il mesure environ 3 à 4 mm de long et présente un corps brun tacheté et a une inclinaison proche de 30°. Les nymphes de ce dernier mesurent 0,25 mm au 1er stade et jusqu'à 1,7 mm au stade 5 (Mead, 2017). C'est à partir des stades 4 ou 5 et à l'âge adulte qu'il sera capable d'acquérir la bactérie lors d'un repas et de la disséminer tout au long de sa vie. *D. citri* permet de répandre Las et sûrement Lam car ce psylle serait présent au Brésil depuis plus de 60 ans (Teixeira et al., 2005).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 10 - Diaphorina citri au stage adulte (A) (Cadwell, (1998)) et Trioza erytreae au stage adulte (B) (Gobierno de Canarias)</figcaption></figure>

Bien que le psylle africain ne soit présent qu'en Afrique, il semblerait que la présence du psylle asiatique ait été observée dans plusieurs régions africaines dont notamment le Kenya et d'autres régions de l'est de l'Afrique. (Ajene et al., 2020). Avec la présence de cet insecte, les risques de contaminer des parcelles d'agrumes augmenteraient avec la possibilité de pouvoir transmettre la souche asiatique.

### 1.3.3. Stratégie de lutte contre le HLB

La perte de production des agrumes due au HLB est considérable à l'échelle mondiale. Néanmoins, il existe différents moyens de lutte contre le HLB qui ont pour l'heure un impact plus ou moins limité.
#### 1.3.3.1. Lutte chimique

Un an après la découverte de la maladie au Brésil, il a été rendu obligatoire d'éliminer les arbres symptomatiques même si cela n'a pas été fait de manière rigoureuse par tous les agriculteurs (Lopes et al., 2007). En Floride – et même au Brésil – la lutte chimique reste très fortement employée afin de limiter les populations de psylles mais cette technique rencontre des limites suite au phénomène de résistance. A cela, il faut ajouter que les auxiliaires des psylles restent sensibles aux produits chimiques et pourraient disparaître plus rapidement que les psylles.

#### 1.3.3.2. Lutte biologique

Aux Antilles, la lutte biologique est préconisée avec l'intervention de *Tamarixia radiata*. Dès l'apparition du psylle vecteur du HLB en Guadeloupe en 1998, il y aura introduction de la micro-guêpe *T. radiata* en 1999. Les larves de *T. radiata* vont pondre leurs œufs à l'intérieur des larves de *D. citri*. Elles vont ensuite se nourrir des larves du psylle et donc parasiter ces dernières (figure 11) (Étienne et al., 2001). Elle a la capacité de parasiter tous les stades larvaires de *D. citri*. Afin de favoriser la présence de cette micro-guêpe, il est conseillé de diminuer les produits phytosanitaires et de privilégier des zones de refuges comme des haies ou encore des bandes fleuries.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 11 - Larve de psylle de *D. citri* (gauche) parasitée par *T. radiata* (droite) origine photo ?</figcaption></figure>

Il est également conseiller de détruire, aux alentours des zones de cultures, les arbres hôtes des psylles tels que l'oranger jasmin (*Murraya paniculata*) ou encore *Triphasia trifolia*. Néanmoins une étude a montré récemment que l'oranger jasmin pouvait être un moyen de piéger les psylles vecteurs de la maladie afin de les éradiquer. En effet, en plantant de l'oranger jasmin et en le traitant avec des insecticides, il est possible d'attirer et tuer *D. citri* pour éviter sa dispersion de, permettant ainsi de diminuer la cause primaire de la propagation du HLB (Tomaseto et al.,
2019). L'étude de Ramadugu et al., (2016) a révélé néanmoins que des apparentés d'agrumes
pourrait être résistants à la maladie car aucune détection de la bactérie ne serait faite même
après deux ans d'infection. Dans la mesure où ils sont sexuellement compatibles, envisager un
croisement entre apparentés et agrumes cultivés serait une stratégie afin de créer et sélectionner
des arbres résistants à la maladie.

En plus des arbres hôtes, l'élimination des parcelles infectées peut faire l'objet d'une stratégie contre le HLB, bien qu'elle reste coûteuse car elle reste liée à une perte considérable de production (Gottwald, 2010). Il a été montré qu'en protégeant les agrumes avec des éliciteurs de défense des plantes, de l'engrais azoté, du compost ou encore de la thermothérapie, il était possible de protéger les arbres faiblement malades (Li et al., 2019). Enfin, il est possible de déplacer les cultures vers des zones plus fraiches pour limiter l'impact du psylle, cependant les conditions restent moins optimales pour les agrumes réduisant ainsi la production.

1.3.3.3. Implication du génome dans la réponse au
Huanglongbing

L'implication de la SAR (cf 1.2.2. Réaction d'hypersensibilité (HR) et de résistance
systémique acquise (SAR)) montre que l'expression de certains gènes des plantes pourrait être
un outil de tolérance face à des pathogènes et donc au HLB. En plus des gènes comme le *NPR1*
qui ont une importance clé dans l'induction de la SAR, d'autres gènes et protéines semblent
être impliquées dans la défense et le développement des plantes. La superfamille du cytochrome
P450 (CYP) est impliqué dans les mécanismes de défenses suite à différents stress biotiques et
abiotiques (Xu et al., 2015). Cette superfamille est aussi retrouvée chez les mammifères, que
chez les insectes, les bactéries et plus encore. En fonction de la famille, les fonctions des CYP
seront différentes. En effet, si *CYP77A19* et *CYP77A20* interviennent dans la biosynthèse de
certains composés de la paroi cellulaire (Grausem et al., 2014) qui reste l'une des premières
barrières contre les pathogènes (Staehelin, 2019), d'autres CYP, comme *AtCYP709B*, jouent un
rôle dans l'ABA et la réponse au stress salin (Mao et al., 2013).

L'étude de Wang et al., (2016) a montré l'implication de gènes tels que *NPR1*, *DMR6*-like ou encore la lipoxygenase (LOX) pouvait être impliquer dans la tolérance au HLB dans le cadre d'une comparaison entre un pomelo hybride Jackson – qui semblait plus tolérant – face à un pomelo Marsh plus sensible. Il a été montré que des gènes de résistance constitutive aux maladies (CDR) pouvaient être impliqués dans la tolérance aux HLB chez le genre *Citrus* et *Poncirus* (Rawat et al., 2017). De plus, la majorité des gènes CDR codent pour des protéines à répétitions riche en leucine et à des sites de liaison aux nucléotides (NBS-LRR). Elles
représentent la plus grande famille des protéines de résistance (Liu et al., 2019; Meyers et al., 2003). L'importance des protéines riche en leucine (LRR) est qu'elles sont impliquées dans la détection de diverses pathogènes comme les bactéries ou encore les champignons (McHale et al., 2006).

L'importance de certaines hormones face à certains pathogènes a déjà été montré (Belkadhi et al., 2013; Durrant & Dong, 2004). En effet, l'étude de Nehela et al., (2018) a montré que les hormones telles que SA (cf 1.2.2. Réaction d'hypersensibilité (HR) et de résistance systémique acquise (SAR)) et JA (cf. 1.2.3. Acide jasmonique (JA) et éthylène (ET)), qui sont des hormones importantes dans la réponse aux pathogènes, avaient une concentration plus importante chez les plants infectés par le HLB par rapport aux plants témoins. L'utilisation de plants avec une expression de gènes qui permettent une meilleure tolérance face à la maladie du HLB serait alors une des voies de lutte contre la maladie.

### 1.3.4. Symptômes de la maladie

En général, suite à différents stress comme des blessures, stress physiologiques ou encore des attaques par des pathogènes, les plantes vont fortement bio-synthétiser un β-glucane appelé callose (Chen & Kim, 2009; Stone & Clarke, 1992). La piqûre induite par le psylle au niveau des tissus conducteurs de la feuille et l'intégration de la bactérie dans les vaisseaux du phloème va induire une forte synthèse de callose (figure 12) au niveau des pores des cellules cribles du phloème (Achor et al., 2020; Koh et al., 2012) empêchant les flux de la sève élaborée. De plus, la bactérie aura tendance à coloniser la plante bien avant l'apparition de symptômes visibles (Folimonova & Achor, 2010).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 12 - Dépôt de callose (flèche noire) au niveau des pores (flèche blanche) des cellules cribles du phloème (Koh et al., 2012)</figcaption></figure>
#### 1.3.4.1. Impact de la maladie du Huanglongbing au niveau foliaire

Pouvant être considérées comme l'une des parties les plus importantes de l'arbre, les feuilles sont essentielles dans la production de carbohydrates résultant du processus de photosynthèse. La photosynthèse est un mécanisme complexe pouvant être sous divisée en deux partie avec dans un premier temps les réactions lumineuses qui sont conduites par des électrons et passent par différents complexes protéiques ayant lieux dans les thylakoïdes chloroplastes et dans un deuxième temps, les réactions du cycle de Calvin de fixation photosynthétiques du CO2 dans les stromas des chloroplastes (Baslam et al., 2020; Renger, 2007). C'est au niveau des feuilles qu'il y aura production d'amidon afin d'alimenter les organes puits via la sève élaborée. En fonction de ses besoins biologiques, l'amidon est catégorisé en 2 types : transitoire ou de stockage. Cet amidon est synthétisé à partir de la photosynthèse le jour et se dégrade la nuit afin de soutenir le métabolisme, la production d'énergie et la biosynthèse en absence de photosynthèse (Pfister & Zeeman, 2016).

Un des symptômes les plus marquants à l'œil nu est celui observé chez les feuilles. En effet, avec l'arrêt des flux de la sève élaborée, les produits de la photosynthèse, comme l'amidon, ne peuvent être transportés vers les organes puits tels que les racines ou encore les fruits et s'accumulent au niveau des feuilles (figure 13) (Achor et al., 2010; Etxeberria et al., 2009; Etxeberria & Narciso, 2015).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 13 – Différence physiologique au niveau des cellules du phloème entre plants infectés (Las+) ou non (Las-) par Las.</figcaption></figure>
Il a été montré que le saccharose s'accumule plus régulièrement que l'amidon, le glucose ou encore le fructose chez les feuilles infectées par Las durant les saisons chaudes et froides (Weng et al., 2018). Ce phénomène d'accumulation des sucres et de l'amidon est alors caractérisé par l'apparition de marbrures jaunâtres et asymétriques de part et d'autre de la nervure centrale des feuilles matures (figure 14A) (Bové, 2006).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 14 - Symptômes foliaires induits par le HLB (a) ou par une carence en métaux (b)</figcaption></figure>

Néanmoins, les symptômes foliaires induits par le HLB peuvent être rapidement confondus avec ceux induits par une carence en métaux comme le zinc ou le fer. Ces symptômes restent tout de même différenciables car une carence en nutriments va entrainer la présence de marbrures jaunâtres symétriques par rapport à la nervure centrale de la feuille (figure 14B) (Weir, 2003). Un arbre infecté par le HLB peut présenter à la fois, au hasard au niveau de la canopée, les symptômes dus à la maladie mais également ceux dus à une carence en nutriments. Généralement, les arbres infectés par le HLB ont tendance à avoir des feuilles plus petites que celles des arbres témoins. Cependant, les feuilles infectées peuvent parfois être plus épaisses et plus fermes que celles ne présentant pas de HLB. La distribution aléatoire des symptômes foliaires est due à la répartition irrégulière de la bactérie dans l'arbre.

En plus de l'assimilât important d'amidon et des différents sucres, au fur et à mesure que la maladie progresse, le phloème aura tendance à s'affaisser et s'effondrer afin de créer une barrière de parois cellulaires quasi solide, par rapport aux cellules de phloème issues de feuilles de plants sains (Etxeberria & Narciso, 2015). L'étude de Deng et al., (2019) a montré que certaines variétés, notamment le citron « Bearss », présentaient moins de dommages au niveau de leur phloème et avaient une plus grande capacité à renouveler leur phloème par rapport aux
variétés dites plus sensibles. Ce résultat est en accord avec un taux d'amidon moins élevé observé dans les feuilles des variétés les plus tolérantes.

De plus, les arbres infectés par la bactérie produisent pendant un certain temps des fruits plus ou moins propres à la consommation, signifiant ainsi un moyen alternatif de transports des assimilats vers les autres organes de la plante.

#### 1.3.4.2. Impact du Huanglongbing sur les fruits

Les autres symptômes marquants et observables à l'œil nu sont ceux observés chez les fruits. Lorsqu'un arbre est atteint par la maladie du HLB, ses fruits sont généralement plus petits, présentent forme anormale (Bassanezi et al., 2009) et restent parfois verts sur certaines parties même lorsqu'ils sont mûrs. C'est ce qu'on appelle le « verdissement » (figure 15A), d'où « citrus greening » en anglais. En plus de ce verdissement, au niveau interne, les fruits vont présenter des graines avortées, un axe courbé ou encore une couleur jaune orangé, voire même brunâtre au niveau de leur columelle (figure 15B). De plus, la couleur de la peau des agrumes semblent plus clairs lorsqu'ils sont infectés par la bactérie (Bassanezi et al., 2009; Dala-Paula et al., 2019; Koh et al., 2020).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 15 - Zone verte sur un fruit d'agrumes infecté par Las (A). Coupe interne d'un fruit infecté par Las (B). Flèches blanches : verdissement ; flèches rouges : graines avortées ; flèche jaune : couleur jaunâtre au niveau de la columelle, flèche bleue : axe courbé</figcaption></figure>

Généralement, les fruits malades sont impropres à la consommation. Le blocage des assimilats vers les fruits vont engendrer une altération gustative de ceux-ci. Des études, comme celles de Bassanezi et al., (2009), montrent que les fruits ont tendance à être généralement plus acides que les fruits sains. En effet, le taux en saccharose (Brix) des fruits sera significativement plus bas par rapport aux fruits sains, rendant ces fruits beaucoup plus acides. De plus, cette étude a mis en évidence que la perte relative de la qualité des fruits dans différents cultivars d'oranges douces pourrait être liée à leur âge et que les cultivars précoces et de mi-saison seraient
possiblement plus tolérants que ceux en fin de saison. Enfin, l'aigreur et l'amertume retrouvé chez les fruits inféctés sont dues par les composés comme les limonoïdes ou encore les flavonoïdes amers ainsi que les acides organiques (Dala Paula et al., 2018).

#### 1.3.4.3. Impact du Huanglongbing sur le massif racinaire

Les racines, tout comme les feuilles, sont un élément clé dans le maintien du développement de l'arbre. Le système racinaire primaire des agrumes comprend des racines latérales verticales et horizontales ligneuses. Ce sont ces racines qui vont assurer l'ancrage et le soutien dans le sol. De plus, elles vont servir de conduit pour le transport des nutriments et de l'eau. Les racines latérales, plus petites et les plus subtiles, sont une masse de racines plus fines appelées racines fibreuses qui fournissent l'essentiel de l'eau et de l'absorption des nutriments. La majeure partie de la masse racinaire fibreuse réside à moins de 60 à 75 cm de la surface du sol (Freeland, 2016). Chez les agrumes, ces racines fibreuses ont différents niveaux de plasticité pour l'acquisition de nutriments, l'accumulation de biomasse et les réponses morphologiques et physiologiques lors de divers stress environnementaux (Rewald et al., 2012; Sorgonà' et al., 2007). Les racines inférieures sont caractérisées par leur capacité d'absorption, leur taux de respiration et leur concentration en azote plus élevés. Cependant, les racines supérieures sont caractérisées par leur capacité de transport, leur durée de vie, leur cellulose et leurs glucides (McCormack et al., 2015; Rewald et al., 2012).

Même si les recherches sur le système racinaire des agrumes atteints du HLB sont plus limitées que celles faites sur la canopée, des études comme celle de Li et al., (2009) ont montré que la bactérie peut se retrouver dans toutes les parties de l'arbre contenant du phloème et donc dans les racines. En 2013, Johnson et al., a montré que les racines pouvaient être un réservoir de Las. Les résultats de cette étude ont montré que la population de la bactérie était plus constante au niveau racinaire qu'au niveau foliaire démontrant ainsi l'implication des racines dans le développement et la multiplication de la bactérie. De plus, une relation pouvait être établie entre la présence de la bactérie au niveau des racines et la présence de la bactérie chez les nouvelles pousses feuillées. En effet, des analyses quantitatives ont démontré que la charge bactérienne racinaire diminuait après l'apparition de nouvelles pousses feuillées, indiquant un déplacement de la bactérie des racines vers les feuilles. Ce résultat pourrait s'expliquer par le fait qu'au niveau des racines, la réaction de la plante semble différente. Contrairement à la forte synthèse de callose observée au niveau des cellules cribles du phloème des feuilles, aucun dépôt de callose n'est retrouvé au niveau du phloème des racines (Achor et al., 2020). Bien que le
système racinaire soit plus difficile à analyser que la canopée, il a été proposé que la dégradation du massif racinaire aurait lieu beaucoup plus tôt que les symptômes observés chez les feuilles (Graham et al., 2013), ceci réduisant le massif racinaire viable (figure 16) (Kumar et al., 2018). Ainsi, la maladie va provoquer une perte d'environ 30 à 50% des racines fibreuses de l'arbre avant même que les symptômes de la canopée ne soient visibles (Johnson et al., 2013). Contrairement aux feuilles, où Las aurait une action indirecte (callose, bouchage, augmentation de la concentration d'amidon) sur les symptômes observés, la bactérie aurait une action directe sur les racines entrainant ainsi leur mort. En effet, malgré l'enrichissement en amidon des cellules corticales des racines secondaires, une observation du déclin du système racinaire peut être observé, ceci suggérant que les hydrates de carbone solubles ne sont pas un facteur limitant dans la perte du système racinaire (Kumar et al., 2018).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 16 - Racines infectées (B) ou non (A) par Las</figcaption></figure>

*In fine*, le HLB entrainera la chute des feuilles, des fruits et la destruction des racines menant ainsi à une mort plus ou moins rapide de l'arbre.
# PROBLÉMATIQUE
L'UMR **AGAP** (Unité Mixte de Recherche Amélioration Génétique et Adaptation des Plantes méditerranéennes et tropicales) qui fait partie du **CIRAD** (Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement) comprend de nombreuses équipes scientifiques dont l'équipe **SEAPAG** (Structure Evolutive des Agrumes, Polyploïdie et Amélioration Génétique). L'objectif de cette équipe est de développer des variétés et des porte-greffes d'agrumes adaptés à des systèmes de production et de commercialisation durables. Par durable, il est question de matériel végétal résistant ou tolérant à certains bio-agresseurs (notamment le HLB) mais aussi adapté aux diverses contraintes environnementales. L'équipe SEAPAG a coordonné le projet 'CAVALBIO' (CAractérisation et VALorisation de la BIOdiversité végétale tropicale d'intérêt agronomique; 2015 - 2021) qui contribue au développement de filières ignames et agrumes durables. Ce projet a été financé par l'Union Européenne (FEDER) et la région Guadeloupe.

Face à la contrainte du HLB qui entraine une baisse considérable des productions d'agrumes dans le monde entier (FAO, 2017), mon sujet de thèse avait pour objectif de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la meilleure tolérance des agrumes polyploïdes face au HLB par rapport aux agrumes diploïdes. Cette thèse a fait l'objet d'un financement par la CTM (Collectivité Territoriale de Martinique).

Les travaux antérieurs du collectif Agrumes au CIRAD ont permis de montrer que la polyploïdie, notamment la tétraploïdie, conduit à une augmentation de la taille des organes, de la taille des cellules et des vaisseaux (Allario et al., 2011). L'augmentation de taille des cellules chez les triploïdes (3x) et 4x (Corneillie et al., 2019; Lourkisti et al., 2021) pourrait donc limiter l'impact des dépôts de callose lors de l'infection par le HLB et pourrait permettre le maintien des flux de sève phloèmique.

Dans le cadre de ma thèse, il m'a été proposé d'évaluer l'impact du HLB sur différentes associations de greffons/porte-greffes avec des niveaux de ploïdie différents. Ces associations greffons/porte-greffes ont été mises en place dans un dispositif en serre et au champ, les greffons utilisés étant infectés ou non par le HLB :

- Limettier Tahiti 3x / Citrumelo 2x (LT3x / Cit2x)

- Limettier Tahiti 3x / Citrumelo 4x (LT3x / Cit4x)

- Limettier Mexicain 2x / Citrumelo 2x (LM2x / Cit2x)

- Limettier Mexicain 2x / Citrumelo 4x (LM2x / Cit4x)
Dans le **Chapitre 1**, le travail a été axé sur la partie aérienne (canopée) des plants.
L'étude a été conduite uniquement sur les associations LM/2x et LT/Cit2x. Les échantillons de
feuilles témoins et de feuilles asymptomatiques ont été prélevés sur des plants en serre inoculés
par greffage. Les échantillons de feuilles symptomatiques ont été prélevés sur des arbres au
champ (inoculation naturelle par des psylles) dans la mesure où il était difficile d'obtenir de tels
symptômes en serre.

Grâce à ces différents greffons et porte-greffes, il m'a été proposé de caractériser
l'impact que peut avoir la polyploïdie sur la tolérance des différentes associations suite à une
infection par la bactérie responsable du HLB.

Différentes questions se posaient à nous : comment se comporte le LM et LT au niveau
physiologique ? Le dépôt de callose est-il plus important chez les diploïdes que chez les
polyploïdes ? Les mécanismes de défenses sont-ils différents chez les polyploïdes ? Sont-ils
plus efficaces chez les polyploïdes ? A quel moment entrent-ils en jeu ? Connaître les différents
facteurs qu'apporte la polyploïdie devait permettre ainsi de comprendre pourquoi les
polyploïdes sont plus tolérants au HLB.

Dans un premier temps, il a fallu vérifier par PCR quantitative que les plants
potentiellement infectés par greffage en serre avaient bien été infectés par le HLB. Dans un
second temps, j'ai initié l'analyse de la présence de callose sur des échantillons de pétiole de
feuilles asymptomatiques de limettiers 2x et 3x greffés sur des porte-greffes 2x. En effet des
analyses réalisées précédemment sur des pétioles de feuilles 2x et 3x symptomatiques (forte
marbrures foliaires) ont montré des contenus en amidon très importants mais sans différence
significative entre les deux génotypes. De même, les analyses par microscopie à balayage
n'avaient pas révélé de différence, les pores entre cellules du phloème 2x et 3x étant bouchés
par de la callose. Réaliser des analyses sur des feuilles asymptomatiques avait donc pour but de
vérifier si les pores des cellules du phloème des 3x étaient moins bouchés que ceux des 2x et
ensuite confirmer la quantification du dépôt de callose à l'aide d'une coloration au bleu
d'aniline.

Le HLB induit également un stress oxydatif. Ce stress oxydatif sera alors caractérisé par
une augmentation de ROS qui sont toxiques et donc néfastes pour la plante lorsqu'elles sont
produites en excès. Afin de vérifier si une surproduction de ROS était plus importante chez les
diploïdes que chez les polyploïdes, des dosages de différentes ROS ont été réalisés. De plus, il
a fallu vérifier également si le processus de détoxification, et donc d'élimination des ROS, était
plus efficace en fonction du niveau de polyploïdie, il a été important de réaliser certains dosages
biochimiques afin de connaitre la réponse des 2x et 3x face à la maladie.
Suite à cette étude sur le compartiment aérien, pour le **Chapitre 2**, l'étude a été axée sur l'analyse de porte-greffes Citrumelo Swingle 4475 2x et 4x. Aujourd'hui, même s'il semblerait que le massif racinaire soit un lieu de multiplication et de développement de la bactérie (Johnson et al., 2013), l'impact que peut avoir la bactérie, et donc de la maladie, sur le système racinaire reste une zone d'ombre. Cette étude avait pour objectif de pouvoir identifier des différences physiologiques entre ces deux porte-greffes. Tout comme pour la partie aérienne, il a fallu vérifier si les plants greffés étaient bien infectés par Las. Il a été important de déterminer s'il y avait une possibilité d'observer de la callose au niveau du phloème des racines. Et si oui, est-ce qu'il y avait une différence entre les différents génotypes ? Ensuite, la quantification de ce dépôt sera faite par la coloration au bleu d'aniline sur les racines de ces porte-greffes.

L'analyse des capacités antioxydantes des porte-greffes d'agrumes face à différents stress est généralement réalisée sur des feuilles issues de la canopée de ces derniers. Comme les agrumes ne sont plus cultivés de franc-pied, il était aussi important de connaitre la réponse des racines des porte-greffes en ce qui concerne une possible augmentation de ROS due au HLB. Ainsi, afin d'explorer le plus large potentiel antioxydant de ces agrumes, un dosage des composés polyphénoliques sur les racines de porte-greffes d'agrumes 2x et 4x couplée à une analyse électrochimique a également fait l'objet d'une étude.

Enfin, après avoir travaillé de façon « indépendante » sur chaque compartiment, racinaire ou foliaire, l'étude du **Chapitre 3** s'est portée aussi bien au niveau foliaire qu'au niveau racinaire par des analyses de l'expression des génomes. En effet, le but de ce chapitre était de déterminer l'impact de la ploïdie des génomes dans la réponse à la maladie du HLB. Comme il a été dit précédemment, des études ont montré que certains génotypes sont plus tolérants au HLB grâce à une concentration accrue de SA, ou encore JA, impliquée elle-même dans la signalisation du gène *NPR1*. Une étude récente (Nehela et al., 2018) a montré que la concentration en acide salicylique augmentait de façon considérable chez les plants infectés par la bactérie responsable de la maladie du dragon jaune.

De ce fait, les analyses du transcriptome, des hormones et du métabolome ont été faites sur l'ensemble des associations avec des niveaux de ploïdes différents (2x/2x ; 2x/4x ; 3x/2x ; 4x/4x). Toutes ces analyses permettront de mettre en exergue des gènes différentiellement exprimés (GDE) qui seront parfois synonyme d'une meilleure tolérance au HLB. Ainsi, tout comme les précédents chapitres, il sera possible d'analyser si la polyploïdie augmente la tolérance face à cette maladie. Ces résultats, couplés aux analyses hormonales, devraient permettre de vérifier si des hormones clés, comme l'acide salicylique ou encore la lipoxygénase
notamment, sont bien synthétisées afin de se défendre contre la bactérie et tous les processus
qu'elle engendre. Grâce à ces différents dosages, un lien pourra être éventuellement mis en
relation avec les données de RNAseq obtenues. De plus, il est indiqué que certains métabolites
étaient retrouvés dans les arbres tolérants à la maladie du HLB (Suh et al., 2021) et que les
porte-greffes pouvaient influencer la composition de certains métabolites au niveau des feuilles
(Albrecht et al., 2019). Des analyses de spectroscopie à résonnance magnétiques nucléaires
vont permettre d'identifier différents métabolites et permettre également de connaître l'impact
de la polyploïdie vis-à-vis du HLB par rapport à la composition des métabolites au niveau des
feuilles et des racines.
2. MATÉRIELS ET MÉTHODES
## 2.1. Matériel végétal

Durant ces années de thèse, mon travail s'est porté sur 4 associations variétés/porte-greffes différentes issues de trois agrumes : limettier Mexicain 2x (Citrus aurantiifolia), limettier Tahiti (Citrus Latifolia) et citrumelo Swingle 2x ou 4x (Citrus paradisi Macf. x Poncirus trifoliata). Les 4 associations étaient infectées ou non par Candidatus Liberibacter asiaticus et étaient les suivantes :

$$ - \text{Limettier Mexicain (2x) x Citrumelo 2x} = \text{LM/Cit2x} $$

$$ - \text{Limettier Mexicain (2x) x Citrumelo 4x} = \text{LM/Cit4x} $$

$$ - \text{Limettier Tahiti (3x) x Citrumelo 2x} = \text{LT/Cit2x} $$

$$ - \text{Limettier Tahiti (3x) x Citrumelo 4x} = \text{LT/Cit4x} $$

L'INRAE-CIRAD de San Giuliano en Corse (France) a fourni des graines diploïdes de Citrumelo (SRA 928 ; Citrus sinensis [L.] Osbeck x Poncirus trifoliata [L.] Raf) provenant de la collection du centre de ressources biologiques "CRB Citrus" (Luro et al., 2017). Les plantules ont été plantées dans du substrat et ont été conservées en serre pendant 10 mois. L'état de ploïdie de 2 plantules a été vérifié et confirmé par cytométrie en flux (Partec I) selon Froelicher et al., (2007). La conformité génétique des plantules a été confirmée en utilisant les marqueurs SNPs développés par Bruyère et al., (2016).

Les arbres témoins et infectés de chaque génotype ont été cultivés dans des pots de 40 L dans des serres proches, mais distinctes, pendant 18 mois, avec des températures diurnes et nocturnes de 25-32 °C et 22-28 °C respectivement, et une humidité relative variant entre 70 et 98%. Ces arbres ont été utilisés pour l'étude les études physiologiques, microscopiques et biochimiques. Des observations concernant les symptômes de la maladie de HLB et une collection de feuilles symptomatiques (Las+S) ont été effectuées sur les mêmes combinaisons de porte-greffe et de variété de 4 ans plantées en plein champ et infectées naturellement pendant 2 ans.

## 2.2. Technique Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP)

La méthode d'amplification LAMP a été mise au point par Notomi et al., (2000). Pour notre étude nous avons utilisé des kits « DNAble Molecular Detection for HLB *Liberibacter asiaticus* » développées par la société Envirologix. Ces tests moléculaires permettent d'indiquer la présence ou non de la bactérie responsable du HLB dans le pétiole des feuilles. La méthode LAMP est une méthode dérivée de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la réaction étant réalisée à température constante, 55°C. Il est à noter que cette méthode, bien que très sensible est qualitative et ne permet pas d'estimer la charge bactérienne d'un échantillon.
Elle a été utilisée principalement pour les témoins afin de vérifier le niveau phytosanitaire négatif de ces échantillons.

## 2.3. Réaction de polymérisation en chaîne quantitative (qPCR)

La quantification de la bactérie responsable du HLB dans des échantillons de pétioles de limettier Mexicaine et limettier Tahiti a été réalisée par PCR quantitative à temps réel. Afin de réaliser la PCR quantitative, une extraction d'ADN de la bactérie a été faite à l'aide du kit « Qiagen DNAeasy plant mini kit ». La qPCR a été réalisée selon la méthode de (Li et al., 2006) et a été faite à partir de 2µl d'ADN pour un volume réactionnel de 11µl.

## 2.4. Analyses comportement physiologique sur pétioles de limettier Mexicain 2x et limettier Tahiti 3x

Les mesures des taux de photosynthèse nette, de conductance stomatique et de transpiration ont été réalisées à l'aide d'un système infrarouge d'analyse de gaz (IRGA) (ADC LCpro, Royaume-Uni) et sous un rayonnement photosynthétique croissant de 200 à 2000 µmol m⁻² s⁻¹. Les mesures ont été effectuées le matin (7 h à 9 h) pour éviter une température extérieure élevée sur 3 feuilles présentant un même stade de développement situées dans la partie médiane de l'arbre.

## 2.5. Microscopie Électronique à Balayage (MEB) sur pétioles de limettiers Mexicain 2x ; limettier Tahiti 3x ; racines de Citrumelo Swingle 2x et 4x

Plusieurs segments transversaux de pétioles de limettiers Mexicain (LM, 2x) et Tahiti (LT 3x) ont été découpés. Ces échantillons ont été immergés une nuit dans du glutaraldéhyde à 2,5%. Ces échantillons ont subi différents lavages dans du tampon phosphate et de l'eau distillée et ensuite une déshydratation à l'acétone. Les échantillons de LM et LT ont été ensuite analysés par microscopie électronique à balayage après avoir subis un point critique et une métallisation au laboratoire C3MAG de l'Université des Antilles - Pôle Guadeloupe (Campus Fouillole). La MEBE utilise des électrons et non des photons (cas de la microscopie optique). Le pouvoir de résolution est plus grand car les longueurs d'ondes utilisées sont plus faibles qu'une microscopie photonique permettant ainsi de distinguer des détails plus fins.

La même méthode a été réalisée pour des coupes transversales et longitudinales de racines de Citrumelo Swingle 4475 2x et 4x.
## 2.6. Coloration au bleu d'aniline sur pétioles de limettiers Mexicain 2x ; limettier Tahiti 3x ; racines de Citrumelo Swingle 2x et 4x.

Plusieurs coupes transversales de pétioles frais ont été réalisées et mises dans du tampon de fixation (formaldéhyde 4%). Ces échantillons ont subi également différents lavages puis ont été déshydratés. La coloration se fait dans une solution de bleu d'aniline à 0.1%. L'observation se fait au microscope optique. Cette coloration au bleu d'aniline permet de marquer certains composés pariétaux comme la callose, ces composés apparaissant blanc en microcopie à fluorescence.

Le même protocole a été réalisé pour des coupes transversales et longitudinales de racines de Citrumelo Swingle 4475 2x et 4x

## 2.7. Dosages biochimiques sur pétioles 2x et 3x

### 2.7.1. Malondéhyde (MDA), indicateur de la peroxydation des lipides

Ce biomarqueur a été dosé selon la méthode décrite par Léchaud et al., (2013). Des échantillons de feuilles 2x et 3x ont été placés à l'étuve à 60°C (min 24h) afin de récolter des échantillons secs. Ils ont ensuite été broyés et 1g de matériel a été utilisé pour ce dosage. La formation du complexe acide tio-barbiturique (TBA)-MDA est mesurée par spectrophotométrie. Une première lecture est réalisée à 532 nm puis à 600nm afin d'éliminer un éventuel bruit de fond. Le coefficient d'extinction molaire de $155 \text{ mM}^{-1} \cdot \text{cm}^{-1}$ a été utilisé pour rapporter les DO à une concentration en µmole de MDA. $g^{-1}$ de protéines.

### 2.7.2. Peroxyde de dihydrogène (H₂O₂), indicateur de stress oxydatif

Tout comme le dosage du MDA, les échantillons ont été placés en étuve à 60°C puis broyés. 1g de matériel sec a été utilisé pour ce dosage. Le protocole utilisé au cours du stage est une méthode adaptée de Velikova et al., (2000). Elle consiste à mesurer la réaction colorimétrique d'oxydation de l'iodure de potassium (KI) par $H_2O_2$ en milieu acide. L'absorbance est lue à 350 nm.

### 2.7.3. Catalase (CAT), enzyme du système antioxydant

La catalase permet d'accélérer la dismutation du peroxyde d'hydrogène en dioxygène et en eau. La mesure de l'activité de la catalase est adaptée de la méthode décrite par Aebi, (1984) et 1,5g d'échantillon frais ont été utilisés pour ce dosage. L'activité CAT est estimée en mesurant la diminution de la vitesse de réaction à 240 nm pendant 20 minutes. Le coefficient
d'extinction molaire utilisé est de 43,6 M⁻¹.cm⁻¹.

### 2.7.4. Ascorbate peroxydase (APX), enzyme du système antioxydant

Le dosage de l'APX a été réalisé selon la méthode proposée par Nakano and Asada (1981). Le dosage a été effectué sur 0,5g de matériel frais. Ici, l'activité a été mesurée à 290 nm. Le coefficient d'extinction molaire est de 2800 M⁻¹.cm⁻¹.

### 2.7.5. Ascorbate total (AsA), antioxydant

Le dosage de l'AsA total a été effectué selon la méthode de Kampfenkel et al., (1995) et a été réalisé à l'aide d'1,5g de matériel frais. L'absorbance est lue à 525 nm.

### 2.7.6. Dosage de l'amidon

Le dosage de l'amidon a été réalisé à partir de méthode de Holm et al., (1986) sur 200mg de matériel végétal séché à l'étuve. C'est une méthode enzymatique basée sur l'hydrolyse des différentes fractions d'amidon en glucose. Ce dernier est dosé par spectrophotométrie via le complexe glucose oxydase/peroxydase. En présence de glucose oxydase, le glucose induit la formation d'acide gluconique et de peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène oxyde un chromogène dont on mesure l'absorbance à 510 nm contre le blanc de la courbe d'étalonnage.

## 2.8. Dosages des composés phénoliques et analyse électrochimique sur racines de Citrumelo Swingle 2x et 4x

24 échantillons (infectés ou non par Las) de racines de Citrumelo 2x et 4x ont été plongés dans de l'azote liquide puis broyés afin d'être conservés à -20°C. Ensuite, 500mg de poudre de racines ont été plongés dans 10mL de méthanol pendant 72h puis filtrés afin de récupérer les composés antioxydants dont les polyphénols.

Le dosage des polyphénols a été faite à l'aide du kit « Folin Ciocalteau Phenolic Content Quantification Assay » en suivant les instructions du constructeur.

L'analyse des familles de composés antioxydants a été réalisée par des techniques électrochimique. Ces techniques électrochimiques reposent sur la possibilité d'oxyder/réduire la molécule d'intérêt, convertissant ainsi une information chimique (nature de l'espèce et concentration) en information électrique (courant à un potentiel donné).

L'analyse a été faite selon la méthode de Palmeira-Mello et al., (2020). Chaque échantillon de racine a subi une mesure de réduction et d'oxydation avec l'appareil Bio-Logic SP-300 avec
booster 1A/48V en allant de -1.5V à 1.5V.

## 2.9. Hybridation in situ à fluorescence (FISH) sur racines de Citrumelo 2x et 4x.

Chaque échantillon de racines fraîches 2x et 4x a été broyé dans 2ml de tampon phosphate (0,1M – pH 7,2). Les échantillons ont ensuite été fixés dans une solution finale de paraformaldéhyde de 4% dans le même tampon pendant 4h à 4°C sur des lames silanisées en chambre humide. La méthode d'hybridation a été faite selon Brissac et al., (2011). Une fois les lames séchées, la sonde cible (Hilf et al., 2013) marquée au cyanine 3 (Las406 : 5'-CATTATCTTCTCCGGCG-3') a été ajoutée pour une hybridation d'une nuit dans une solution de formamide à 20%. Les lames ont été contre-colorées par SYBR Green et montées avec le milieu de montage fluorescent Cytomation (Dakocytomation®, France) avant visualisation sous un microscope à épifluorescence, Eclipse 80i (Nikon®, France).

## 2.10. Extraction d'ARN sur pétioles feuilles de limettiers 2x et 3x et sur racines de Citrumelo 2x et 4x, création de banque et analyse RNAseq

### 2.10.1. Isolation de l'ADN total, préparation d'ADNc et séquençage

24 échantillons de feuilles (12 témoins et 12 infectés) de limettiers 2 et 3x greffés avec du citrumelo 2x ou 4x et 24 de racines de porte-greffes 2x et 4x greffés avec des limettiers 2x ou 3x ont été plongés dans de l'azote liquide puis ont été broyés. L'ARN total a été extrait de 100 mg de poudre congelée de feuilles et de racines à l'aide du kit RNeasy® Plant Mini (Qiagen, Hilden, Germany) selon les instructions du fabricant. La qualité et la quantité d'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre à microvolume mySPEC (VWR, Radnor, PA, USA). Pour chaque échantillon d'ARN, des bibliothèques d'ADNc ont été préparées pour le séquençage à partir d'ARN total en utilisant le kit Truseq Stranded mRNA (Illumina, San Diego, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Les bibliothèques ont ensuite été séquencées sur Illumina HiSeq2000 (Illumina, San Diego, CA, USA) par la société GENEWIZ (https://www.genewiz.com, South Plainfield, USA) et les lectures ont été générées au format 150 bp pair-end.

### 2.10.2. Traitement des données RNAseq

Le « nettoyage » des lectures de séquençage brutes a été effectué à l'aide du logiciel trimmomatic (Bolger et al., 2014) en supprimant les bases de faible qualité, les lectures vides
et les adaptateurs. Les gènes filtrés ont ensuite été alignés sur le génome de référence de *C. clementina* disponible sur https://phytozome.jgi.doe.gov (Wu et al. 2014) en utilisant MapSplice (Wang et al., 2010). Le comptage des lectures a été réalisé avec l'outil Python Htseq-count (Anders et al., 2015). Les valeurs d'expression ont été rapportées en tant que « Reads » par kilo base par million mapped reads (RPKM). Plus de 20000 gènes ont été retenus.

Pour évaluer la qualité des données RNAseq filtrées et mettre en évidence les relations entre les échantillons, une analyse en composantes principales (ACP) et une analyse discriminante partielle des moindres carrés (PLSDA) ont été réalisées à l'aide du paquet R mixOmics (Rohart et al., 2017).

### 2.10.3. Analyse d'expression différentielle et catégorisation fonctionnelle

Les gènes exprimés de manière différentielle (GED) ont été identifiés à l'aide du package R EdgeR (Robinson, McCarthy, et Smyth 2010) en utilisant le seuil suivant : log2FC ≥2 (FC, Fold Change) et des valeurs P < 0,05 ajustées par la méthode de Benjamini et Hochberg (1995). La représentation de Venn et le niveau d'expression des gènes ont été réalisés sur le site web (https://bioinfo-web.mpl.ird.fr/cgi-bin2/microarray/public/diffexdb.cgi).

Tous les DEG ont été classés fonctionnellement par Gene Ontology (GO) en utilisant WEGO 2.0 (http://wego.genomics.org.cn/). La visualisation des catégories GO a été effectuée à l'aide du graphique d'annotation de l'ontologie génique du web en utilisant le logiciel WEGO 2.0 (Ye et al., 2006).

### 2.10.4. Analyse de réseaux de gènes

Pour identifier les modèles de corrélation entre les gènes dans les échantillons de feuilles et de racines, une analyse de réseau de coexpression génétique pondérée (WGCNA) a été réalisée à l'aide du paquet R WGCNA (Langfelder & Horvath, 2008). Les gènes faiblement exprimés ont été supprimés avec un seuil minimum de 10 comptes. Avec les paramètres suivants pour l'échantillon de feuilles (Power = 9, minModuleSize=30, MEDissThres=0,20) et pour l'échantillon de racines (Power 6 ; minModuleSize=30 ; MEDissThres=0,10).

Des analyses de regroupement d'ontologies génétiques ont été réalisées sur le réseau de modules couplé à l'analyse Log2Fold from DEGs à l'aide du logiciel Biological Network Gene Ontology (BINGO), (version 3.9.0) (Maere et al., 2005) et d'un plug-in Cytoscape (V3.9.0 disponible sur www.cytoscape.org). Pour identifier les termes GO significativement enrichis ou surreprésentés, un test hypergéométrique et une correction des tests multiples ont été appliqués
en utilisant la correction du taux de fausse découverte de Benjamini et Hochberg avec un niveau
de signification de 0,05.

2.11. Analyse hormonale de feuilles de limettiers Mexicain 2x, Tahiti 3x et sur racines de porte-greffes citrumelo 2x et 4x

Le matériel végétal est le même que celui-ci utilisé dans le **2.10**. L'ensemble des
hormones dosées a été fait par sous-traitance et réalisé par le plateau technique de Toulouse
MetaToul – AgromiX, LRSV UMR 5546 UP/CNRS. Les hormones dosées dans les feuilles et
les racines étaient les suivantes : ABA (acide abscissique), cis-ZR (cis zeatine-ribose), IPR
(adenine-riboside), JA (acide jasmonique) et SA (acide salicylique).
3. **Chapitre 1 : Specific Physiological and Anatomical Traits Associated With Polyploidy and Better Detoxification Processes Contribute to Improved Huanglongbing Tolerance of the Persian Lime Compared With the Mexican Lime**
**3.1. Résumé**

Le premier chapitre de cette thèse a fait l'objet d'un article publié le 26 Août 2021 dans *Frontiers in Plant Science*.

L'étude faite dans ce papier a été axée principalement sur la canopée et donc sur les variétés (greffons) diploïdes (2x) et triploïdes (3x) et de leurs réponses face à la bactérie responsable du HLB. Les variétés choisies ont été le limettier Mexicain (2x) et le limettier Tahiti (Persian lime en anglais, 3x) et étaient toutes les deux greffées avec du Citrumelo Swingle 4475 2x afin d'étudier uniquement l'aspect variétal. Ce choix a été fait pour des raisons éco-agricoles par rapport aux partenaires. En effet, aux Antilles les limes, appelé « citron vert » de façon familiale, font partie des agrumes les plus cultivés par rapport à la demande des consommateurs (repas, jus, boissons alcoolisées, assaisonnements). De plus il a été montré que malgré la maladie, au champ, les variétés 3x semblaient mieux se comporter que les variétés 2x (Gómez et al., 2008).

Ainsi, pour pouvoir identifier les déterminants physiologiques et biomoléculaires associées à la meilleure tolérance à la maladie, différentes analyses moléculaires, microscopiques et biochimiques ont été faites.

Les analyses sanitaires par qPCR ont permis de montrer que les arbres infectés étaient bien malades et que les témoins étaient bien négatifs. De plus, au stade précoce de la maladie ; Las+ Asymptomatique (Las+ AS), une différence significative entre les variétés LM et LT a pu être observée. En effet, le nombre de copies de la bactérie était beaucoup plus élevé chez la variété 2x par rapport à la variété 3x, caractérisé par un Ct plus faible pour LM (Table 1 ; (Sivager et al., 2021) suggérant déjà un niveau de tolérance moins élevé. Pour le stade tardif ; Las+ symptomatique (Las+ S), aucune différence significative n'a pu être observée. L'impact de la polyploïdie au niveau phénotypique est étudiée depuis des décennies (Ruiz et al., 2020) et a montré qu'elle pouvait avoir des conséquences notamment en augmentant la taille des cellules et des organes chez les agrumes (Allario et al., 2011; Corneillie et al., 2019; Mouhaya et al., 2010). Les résultats obtenus sur l'épaisseur et la taille des feuilles (Table 2) ont montré que ces caractères étaient plus importants chez les variétés 3x. De même, la taille des cellules stomatiques et épidermiques était significativement plus grande chez les feuilles de limettier Tahiti. Toutefois, la densité stomatique était diminuée chez les 3x par rapport au 2x (Table 2). Néanmoins ces résultats restaient tout de même en accord avec ceux obtenus sur d'autres
polyploïdes mettant en relation l'augmentation des cellules foliaires mais une diminution de la densité stomatique (Allario et al., 2011; Lourkisti et al., 2020; Padoan et al., 2013). La forte couleur verte retrouvée chez les feuilles a montré également une différence significative entre les deux variétés même si cette valeur avait tendance à diminuer avec les différents stades de la maladie. Cependant, le niveau de verdure restait toujours plus important chez la variété 3x. Ces résultats étaient en corrélation après les analyses de photosynthèse (Figure 1) où l'activité photosynthétique était toujours plus élevée chez les 3x par rapport aux 2x peu importe le stade de la maladie. Cette meilleure activité photosynthétique chez les limettiers 3x a déjà pu être montrée dans l'étude de Lourkisti et al., (2020) où les variétés hybrides 3x présentaient une photosynthèse plus efficace que les variétés hybrides de clémentinier 2x. A ces valeurs de l'activité photosynthétique, ont été couplées des mesures de conductance stomatiques et de transpiration qui étaient nettement supérieurs chez les 3x (Figure 1). Ces fonctions photosynthétiques et respiratoires plus élevées peuvent donc expliquer la plus grande vigueur observée chez le limttier Tahiti 3x ce qui pourrait être favorable sous la contrainte du HLB (Deng et al., 2019).

La synthèse de callose est une des premières réponses de la plante face à la maladie (Achor et al., 2020; Koh et al., 2012). De ce fait, des études de microscopie électronique à balayage (MEB) ont été réalisées afin de visualiser le dépôt de callose au niveau des pores des cellules cribles du phloème et de noter l'éventuelle différence entre les deux variétés (Figure 2). Dans un premier temps, en condition contrôle (Las-) il a été possible d'observer une taille des pores des cellules cribles du phloème beaucoup plus grande au sein des pétioles de la variété 3x (Figure 2, Table 4) liée à un effet de la polyploïdie. De plus, aucune présence de callose ne pouvait être observée car les plants n'étaient pas infectés par la bactérie. En revanche pour les pétioles issus de feuilles symptomatiques (stade foliaire tardif ; présence de marbrures asymétriques), aucune différence significative ne pouvait être observée car les deux variétés présentaient un fort dépôt de callose au niveau des cribles du phloème ; résultats qui avaient déjà été obtenus dans différentes études (Achor et al., 2010; Albrigo et al., 2014; Koh et al., 2012) suggérant ainsi une altération du métabolisme chez les deux variétés. Des travaux récents réalisés par Deng et al., (2019) ont montré que la tolérance à l'HLB du citron « Bearss » et de la mandarine « LB8-9 » Sugar Belle® est associée à une régénération plus efficace du phloème, limitant la distorsion de la paroi cellulaire et l'effondrement des éléments criblés. Leur conclusion est en accord avec les augmentations du diamètre du pétiole, du phloème et de la surface du cortex du pétiole que nous avons observé chez le limettier Tahiti mais pas chez le
limettier Mexicain. Ceci laisserait donc supposer que le LT a connu une meilleure régénération du phloème que le LM, limitant la dégradation et l'effondrement du phloème. Enfin, au stade précoce de la maladie (Las+ AS), une différence notable entre les deux variétés pouvait être observée. La présence de callose au sein des pores des cellules cribles du phloème du LM était beaucoup plus importante par rapport à la variété 3x. Ce bouchage des pores de façon aussi précoce chez le LM était associé à une forte accumulation de grain d'amidon (Figure 2C ; Table 3) impliquant le fort impact du HLB comme cela avait pu être déjà démontré (Etxeberria et al., 2009; Schneider, 1968). Dans les feuilles du LM, la concentration en amidon était cinq fois plus élevée que celle des feuilles de LT. La plus grande taille des pores et le moindre bouchage des pores par la callose chez le limettier Tahiti permettrait alors de maintenir le flux de sève élaborée et continuer l'alimentation de la plante. Les résultats obtenus par MEB étaient en corrélation avec la visualisation de la callose après coloration au bleu d'aniline (Figure 3).

Le HLB conduit à un stress oxydatif et il a été montré que ce stress pouvait être lié à la chute des fruits matures infectés par la maladie (Tang & Vashisth, 2020). Dans le cas de notre étude, la concentration de MDA (Table 4), marqueur de stress qui correspond à la peroxydation des lipides (Luna et al., 2000; Tabassum et al., 2017), était deux fois plus élevée chez les feuilles 2x Las+AS que dans les feuilles 2x Las-. Aucun changement n'était observé dans les mêmes conditions pour les feuilles 3x, ce qui suggérait que le HLB engendrait un stress oxydatif beaucoup plus important et beaucoup plus tôt chez la variété 2x que chez la variété 3x. Tout ceci était en corrélation avec les analyses précédentes de microscopie (Figure 2 et 3) ou encore de photosynthèse (Figure 1). Les travaux de Lourkisti et al., (2020) et Oustric et al., (2017) sur les agrumes soumis à des températures basses, ou encore ceux ayant subi un déficit hydrique (Lourkisti et al., 2021) ou encore un stress salin (Khalid et al., 2020) montrait tous une valeur de MDA moins importante chez les polyploïdes indiquant ainsi un stress moindre chez les polyploïdes. De même, tout comme les résultats obtenus dans ces différents travaux sur les agrumes soumis à différents stress, le teneur des molécules (CAT, APX et AsA) qui permettent de limiter et d'éliminer l'excès de production des espèces réactives de l'oxygène (ROS) semblait plus important chez le LT que chez le LM, indiquant encore une meilleure adaptation du limettier Tahiti par rapport au limettier Mexicain face au HLB.

L'étude de Inoue et al., (2020) a montré qu'une concentration de fer (Fe²⁺) au niveau foliaire pouvait soulager les effets induits par le HLB. Dans notre étude, différents métaux ont été dosés dans les feuilles de limettiers 2x et 3x. La concentration de Fe observé chez le limettier Mexicain dès le stade précoce montrerait également un impact beaucoup plus important du
HLB chez cette variété par rapport à la 3x. Néanmoins, l'association entre le H₂O₂ et le Fe²⁺ peut donner naissance à une des espèces radicalaires hautement délétère : les radicaux hydroxyles (Inagaki et al., 2016; Migdal & Serres, 2011).

L'étude faite dans le **Chapitre 1** a permis de donner des informations sur la meilleure
adaptation des 3x observée au champ par rapport aux diploïdes (Gómez et al., 2008). En effet,
les traits anatomiques spécifiques du limettier Tahiti, comme une plus grande taille des feuilles
ou encore des pores des cellules du phloème, liés à une meilleure activité photosynthétique et
un bouchage partiel des pores au stade précoce de la maladie suggèreraient la meilleure
tolérance de celle-ci. De plus, le dosage des molécules du système antioxydant ainsi que le
dosage des métaux permettraient de valider l'hypothèse entre la polyploïdie et la meilleure
tolérance au HLB.

**3.1. Article**
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# Specific Physiological and Anatomical Traits Associated With Polyploidy and Better Detoxification Processes Contribute to Improved Huanglongbing Tolerance of the Persian Lime Compared With the Mexican Lime

## OPEN ACCESS

**Edited by:**

Jeremy Astier,
INRA UMR 1347 Agroécologie,
France

**Reviewed by:**

Qibin Yu,
University of Florida, United States
Subhas Hajeri,
Citrus Pest Detection Program,
United States

**\*Correspondence:**

Raphaël Morillon
raphael.morillon@cirad.fr

**Specialty section:**

This article was submitted to Plant Pathogen Interactions, a section of the journal Frontiers in Plant Science

Received: 25 March 2021

Accepted: 09 June 2021

Published: 26 August 2021

**Citation:**

Sivager G, Calvez L, Bruyere S, Boisne-Noc R, Brat P, Gros O, Ollitrault P and Morillon R (2021) Specific Physiological and Anatomical Traits Associated With Polyploidy and Better Detoxification Processes Contribute to Improved Huanglongbing Tolerance of the Persian Lime Compared With the Mexican Lime. Front. Plant Sci. 12:685679. doi: 10.3389/fpls.2021.685679

Gary Sivager¹, Leny Calvez¹, Saturnin Bruyere¹, Rosiane Boisne-Noc¹, Pierre Brat², Olivier Gros³, Patrick Ollitrault¹ and Raphaël Morillon¹*

¹CIRAD, UMR AGAP Institut, Equipe SEAPAG, Petit-Bourg, Guadeloupe, French West Indies—UMR AGAP Institut, Univ. Montpellier, CIRAD, INRAE, Institut Agro, Montpellier, France, ²CIRAD UMR Qualisud Dpt PERSYST-Qualisud, Univ. Montpellier, Avignon Université, CIRAD, Institut Agro, IRD, Université de La Réunion, Montpellier, France, ³C3MAG, UFR des Sciences Exactes et Naturelles, Université des Antilles, Pointe-à-Pitre, Guadeloupe

Huanglongbing (HLB) is presently a major threat to the citrus industry. Because of this disease, millions of trees are currently dying worldwide. The putative causal agent is a motile bacteria belonging to *Candidatus* Liberibacter spp., which is transmitted by psyllids. The bacteria is responsible for the synthesis of callose at the phloem sieve plate, leading to the obstruction of the pores that provide connections between adjacent sieve elements, thus limiting the symplastic transport of the sugars and starches synthesized in leaves to the other plant organs. The Persian triploid lime (*Citrus latifolia*) is one of the most HLB-tolerant citrus varieties, but the determinants associated with the tolerance are still unknown. HLB-infected diploid Mexican lime (*Citrus aurantiifolia*) and Persian lime were investigated. The leaf petiole was analyzed using scanning electron microscopy (SEM) to observe callose deposition at the phloem sieve plate. Leaf starch contents and detoxification enzyme activities were investigated. In the field, Persian lime leaves present more limited symptoms due to HLB than the Mexican lime leaves do. Photosynthesis, stomatal conductance, and transpiration decreased compared with control plants, but values remained greater in the Persian than in the Mexican lime. Analysis of the petiole sieve plate in control petiole samples showed that pores were approximately 1.8-fold larger in the Persian than in the Mexican lime. SEM analyses of petiole samples of symptomatic leaves showed the important deposition of callose into pores of Mexican and Persian limes, whereas biochemical analyses revealed better detoxification in Persian limes than in Mexican limes. Moreover, SEM analyses of infected petiole samples of asymptomatic leaves showed much larger callose depositions into the Mexican lime pores than in the Persian lime pores, whereas biochemical traits
revealed much better behavior in Persian limes than in Mexican limes. Our results reveal that polyploids present specific behaviors associated with important physiological and biochemical determinants that may explain the better tolerance of the Persian lime against HLB compared with the Mexican lime.

**Keywords:** callose deposition, citrus, detoxification, huanglongbing, lime, triploid

INTRODUCTION

Huanglongbing (HLB) is one of the most devastating citrus
diseases worldwide and is caused by a phloem-restricted gram-
negative α-proteobacteria (*Candidatus* Liberibacter spp.; Bové,
2006). Three HLB-associated species were described in the
taxonomy that were named according to their presumptive
geographical origin: *Candidatus Liberibacter asiaticus* (Las
(Bové, 2006), *Candidatus Liberibacter africanus* (Jagoueix et al.,
1994), and *Candidatus Liberibacter americanus* (Teixeira et al.,
2005). In the Caribbean area, Las is the only strain that has been
present since 2006 (Luis et al., 2009). The Asian citrus psyllid
(*Diaphorina citri*), which efficiently spreads the disease, is the
vector of Las. HLB affects tree development, fruit quality (Dala-
Paula et al., 2019; Koh et al., 2020), and yields, which cause heavy
economical loss (Tania Santivañez et al., 2013; Neupane and
Moss, 2016) and can lead to tree death. A distinctive symptom
of HLB is leaf yellowing with an asymmetrical pattern of blotchy
yellowing or mottling of the leaf (Bové, 2006). Dieback of the
canopy (Bové, 2006; Gottwald, 2010) follows the leaf symptoms.
The disease causes relate to plant physiological perturbations
that lead to increased callosis synthesis in phloem cells, which
is responsible for plugging the sieve plate pores of the phloem
cells (Achor et al., 2010; Koh et al., 2012; Albrigo and Stover,
2015), thus limiting symplastic transport between phloem cells.
This callose deposition is often followed by phloem cell wall
distortion, which may lead to sieve element collapse (Etxeberria
and Narciso, 2015). Sugars and starch granules accumulate in the
leaves (Schneider, 1968; Ed Etxeberria et al., 2009; Achor et al.,
2010) because they can no longer be translocated to other organs.
In the meantime, the starch and sugar contents in the symptom-
presenting, HLB-infected leaves are much higher than in the
controls (Achor et al., 2010; Fan et al., 2010). Such modifications
of the leaf and root metabolisms (Bowman et al., 2016) have
consequences, including deficiencies of microelements, such as
zinc in the leaves and boron in the roots (Aubert, 2009). When
infected, the tree is subjected to significant oxidative stress,
leading to the induction of detoxification mechanisms that have
crucial roles in disease adaptation (Martinelli et al., 2016).

It has long been considered that there is no genetic resistance
to HLB in citrus. However, important variabilities of behavior
under HLB constraints have been reported for the different
species of the genus *Citrus* (Stover et al., 2014; Miles et al.,
2017), which should be associated with better adaptation to the
bacteria or differential attractiveness to the vector. For the related
genera *Poncirus*, the lower susceptibility of trifoliate orange
could be related to a lower leaf appetence of *D. citri*, which, in
turn, would limit the possibilities of infection and development
of Las (Westbrook et al., 2011; Richardson and Hall, 2013).
More recently, the evaluation of HLB symptoms in germplasm

collections under HLB constraints revealed complete resistance
to HLB in related genera and particularly in Australian citrus
species (Ramadugu et al., 2016; Alves et al., 2021). Several HLB-
tolerant citrus hybrids and relatives were shown to synthetize
antimicrobial peptides that can inhibit Las infections (Blaustein
et al., 2018; Huang et al., 2021).

Within the genus *Citrus*, the triploid Persian lime (*Citrus x latifolia* Tan.) is one of the least susceptible to HLB (Gmitter et al., 2010; Evans et al., 2014). Recent work suggested that the tolerance of Persian lime is favored by a specific phloem regeneration mechanism that maintains the phloem sap flow (Deng et al., 2019). However, the phylogenetic origin and triploid level of this horticultural group should also be the major determinants of the better behavior under an HLB constraint. Persian lime results from the fusion between a diploid male gamete of *Citrus x aurantiifolia* (Christm.) Swing and a haploid female gamete of *Citrus x limon* L. (Burm; Ahmed et al., 2019, 2020). These two species are a result of interspecific hybridization between *Citrus medica* L. (citron) as the male parent and *C. x aurantium* L. and *Citrus medica x micrantha* Wester for *C. x lemon* and *C. x aurantiifolia*, respectively (Curk et al., 2016). Previous observations suggested that citron in the pedigree significantly correlated with HLB tolerance (Miles et al., 2017). As they both have a citron pedigree, the two varieties should have a greater tolerance to HLB. However, the Persian lime is the only genotype to present a greater tolerance to HLB compared to other cultivated genotypes (Evans et al., 2014).

Polyploidy is recognized as a major force driving plant
evolution (Soltis and Soltis, 2009; Chen, 2010). Polyploidy is often
associated with a wide range of morphological and physiological
changes that may be advantageous under harsh environments
(Brochmann et al., 2004). Indeed, several investigations have
shown that polyploidization improves stress tolerance under
adverse environmental conditions (for review, see Ruiz et al.,
2020), which remains true in woody grafted plant species (Khalid
et al., 2020; Ruiz et al., 2020). Most citrus are diploid, and several
citrus species produce apomictic seeds favoring the natural
occurrence of polyploidy among seedlings (Aleza et al., 2011).
Interestingly, when subjected to varied stress, triploid (Lourkisti
et al., 2020, 2021) and tetraploid citrus (Allario et al., 2013; Tan
et al., 2015; De Souza et al., 2017; Oustric et al., 2017, 2019;
Khalid et al., 2020) were more tolerant to oxidative stress because
of more efficient oxidative systems. Recent observations suggest
that some tetraploid rootstocks may limit the development of
HLB (Grosser and Gmitter, 2011; Grosser et al., 2012). Reactive
oxygen species (ROS) are free radicals and non-radical molecules,
which are key components of the signaling pathway network and
act as the main regulators of plant cell physiology and cellular
responses to environmental factors (Bhattacharjee, 2012). Among
them, hydrogen peroxide (H₂O₂) is an important, relatively
stable, non-radical ROS. At low concentrations, H₂O₂ acts as a signal molecule involved in the regulation of specific biological and physiological processes (e.g., photosynthetic functions; cell cycle, growth, and development; and plant responses to biotic and abiotic stresses). Oxidative stress and eventual cell death in plants can be caused by excess H₂O₂ accumulation. As stress factors provoke an enhanced production of H₂O₂ in plants, severe damage can be induced at the cellular level. Plants are endowed with several H₂O₂-metabolizing enzymes and, primarily, with catalases (CAT) or ascorbate peroxidases (APX). CAT is a peroxisome-localized enzyme which do not require any reductant for catalyzing a dismutation reaction. APXs have a high affinity for H₂O₂ and utilizes ascorbate (AsA) as a specific electron donor (Sofo et al., 2015).

In the present work, we compared the behavior under the HLB constraint and the control condition of the Mexican diploid lime (C. x. aurantiifolia) and the Persian triploid lime, which are known for their contrasted tolerance to HLB, respectively. We performed investigations in asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) leaves of infected trees compared to the control to understand the disease development process better. Control (Las−) and asymptomatic samples were collected on trees grown in distinct insect-proof greenhouses. Infection was obtained after grafting-infected budwoods to determine the precise moment of the infection. Thus, it was possible to limit the impact of other environmental factors. Symptomatic samples were collected on trees naturally infected by psyllids in the field because, in the greenhouse, we rarely acquire symptomatic leaves. The physiological leaf behavior was evaluated by measuring leaf gas exchanges. In this article, we performed anatomical measurements using scanning electron microscopy (SEM) and fluorescent microscopy, which were associated with the investigation quantification of antioxidant molecules enzymes involved in detoxification processes. Taken together, our findings provide new knowledge on the determinant of the phenotypic differentiation between Mexican limes and Persian limes, which highlighted the importance of ploidy for HLB disease tolerance within the genus *Citrus*.

# MATERIALS AND METHODS

## Plant Material and Growth Condition

The INRAE-CIRAD of San Giuliano in Corsica (France) provided diploid Citrumelo (SRA 928; *Citrus sinensis* [L.] Osbeck × *Poncirus trifoliata* [L.] Raf) seeds from the collection of the “CRB Citrus” biological resource center (Luro et al., 2017). Seedlings were planted in substrate and were kept in a greenhouse for 10 months. The ploidy status of 2× seedlings was checked and confirmed by flow cytometry (Partec I) according to Froelicher et al. (2007). Genetic conformity of the seedlings was confirmed by using SNPs markers developed by Bruyère et al. (2016).

Thirty genetically identical and uniform 2× seedlings were selected for further investigation. To compare the HLB tolerance of genotypes, controlling the development of the disease and transmitting the disease by grafting was necessary. Ten 10-month-old rootstock seedlings were grafted using budwoods collected near asymptomatic HLB leaves and control leaves of

the 2× Mexican lime [C. aurantiifolia (Christm. Swingle, SRA 140)] and the 3x Persian lime [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka, SRA 58]. The budwoods of asymptomatic HLB leaves were collected from a single tree initially infected in the greenhouse by using psyllids collected in the field. Budwoods of that tree tested molecularly positive for HLB. Inverted t-budding was performed 30 cm above the ground. Six control and infected trees of each genotype were grown in 40-L pots in close, but distinct, greenhouses for 18 months with day and night temperatures of 25–32°C and 22–28°C, respectively, and a relative humidity varying between 70 and 98%. These trees were used for the physiological, microscopic, and biochemical investigations.

Observations regarding the tree symptoms of HLB and a collection of symptomatic leaves (Las+S) were performed on the same 4-year-old rootstock and variety combinations planted in the field and naturally infected for 2 years.

## HLB Monitoring

DNA of *Candidatus Liberibacter asiaticus* was extracted from control leaves (Las−) and at different disease stages (Las+AS; Las+S) by using the Qiagen DNAeasy plant mini kit. The molecular detection of the bacteria was performed by using quantitative polymerase chain reaction (qPCR), according to Li et al. (2006), with the same primers and probes. Quantitative PCR were regularly performed (almost every 6 months) to characterize the infection status. After 18 months, all the trees presented a similar uniform size and were all positive for HLB.

## Leaf Physiological Parameters

The leaf thickness and area of each genotype were measured using a micrometer (IP65, Mitutoyo) and were scanned using Image J software.<fnref n="1" /> Leaf greenness was measured using a SPAD meter (Minolta, SPAD-502, Japan). Leaf stomatal conductance (g_s), transpiration (E), and photosynthesis (A) were periodically measured with LCpro + Portable Photosynthesis Systems (ADC BioScientific Ltda., Hoddeston, United Kingdom). The intrinsic photosystem II quantum yield (QY), which is the equivalent to (F_m'-F_0)/F_m', was checked using a leaf fluorometer (Fluorpen FP 100, Photos System Instrument, Czechia). Measurements were performed within light-acclimated leaves; thus, QY corresponds to the QY of antennas but not to the whole photosystem (Genty et al., 1989). The light pulse was set at 3,000 µmol photons m⁻² s⁻<fnref n="1" /> (100%) to measure QY automatically according to the operation manual.

Each measurement (g_s, E, A, SPAD, and QY) was taken between 9 and 11 am on 9–12 mature leaves selected at medium plant height. Measurements were then done using a photosynthetic photon flux density (PPFD) maintained at 1,400 µmol photons m⁻² s⁻<fnref n="1" />.

Ten leaves of Mexican and Persian limes were used to measure their relative water contents (RWCs). Leaves were harvested in the morning at 9 am. The RWC (%) was determined as

$$W = 100 \times ([M_f - M_d] : [M_t - M_d]),$$

<footnote n="1">¹http://rsbweb.nih.gov/ij/</footnote>
where $M_f$ is the fresh mass; $M_t$ is the turgid mass after leaf rehydrating; and $M_d$ is the dry mass after drying the leaves in an oven. The leaf RWC takes into account the turgid mass of leaves. Thus, RWC corresponds to the proportion of the leaf water content related to the maximum water content contained in the leaf (Barrs and Weatherley, 1962).

Slides for the analyses of stomatal and epidermal cells and the number of stomata per unit of leaf surface area (stomatal density) were prepared by using the protocol developed by Morillon and Chrispeels (2001). Sixty stomata were measured from three different slide preparations that used three different mature leaves.

The starch content was estimated on leaves by using the method developed by Holm et al. (1986), with the absorbance measured at 510 nm.

## Petiole Preparation for SEM

Fresh cross sections of 2× (Mexican lime) and 3× (Persian lime) petioles were fixed overnight at 4°C in 2.5% glutaraldehyde in a phosphate saline buffer (pH 7.2). The sections were then dehydrated in a series of acetone solutions for increasing concentration until reaching 100% acetone. Samples were then dried to a critical point in CO₂ and sputter-coated with gold before observation with a FEI Quanta 250 electron microscope at 20 kV. At least four independent preparations of three leaf petioles were used for each genotype for SEM analysis. These samples were also used for blue aniline staining preparations (see below). Some of the samples were also used for qPCR analysis (Table 1).

## Petiole Preparation for Blue Aniline Staining

Fresh cross sections of 2× and 3× petioles were fixed in formaldehyde overnight and then washed with a phosphate buffer (PBS, pH 7.2), followed by distilled water. The sections were dehydrated in a series of acetone solutions of increasing concentration and then incubated overnight in 100% acetone. The sections were analyzed after washing them quickly with phosphate buffer and staining for 10 min in an aqueous 0.1% blue aniline solution.

## Analysis of Stress Biomarkers and Detoxification System

All biochemical assays were performed by a Tecan Infinite 200 PRO machine and were done on control, asymptomatic, and

symptomatic leaves. To evaluate the presence of stress biomarkers in both limes, the presence of Malondialdehyde (MDA) was determined according to the method described by Léchaud et al. (2013). The first absorbance reading was performed at 532 nm and the second at 600 nm. The method used for H₂O₂ content estimation was adapted from Velikova et al. (2000), and the absorbance was read at 350 nm. Enzymes of the detoxification system were also dosed. The CAT assay was adapted from Aebi (1984), and the activity was estimated by Aebi (1984) by measuring the reaction rate at 240 nm for 20 min. An APX assay was performed according to Nakano and Asada (1981), with the measured activity at 290 nm. A total ascorbate (AsA) assay was performed according to the method by Kampfenkel et al. (1995). The absorbance was read at 525 nm.

## Fluorescence in situ Hybridization (FISH) of Candidatus Liberibacter asiaticus in the Petioles of Mexican and Persian Limes

For each sample, 330 g of petioles was ground in a 2-ml solution buffer (Na₂HPO₄/NaH₂PO₄; 0.1 M—pH 7.2). The ground samples were fixed in a final solution of 4% paraformaldehyde in the same buffer for 4 h at 4°C on silane-coated glasses placed in a wet chamber. Hybridization experiments were similar to those previously described by Brissac et al. (2011). Once the slides dried, the Cy3-marked target probe (Las406: 5'-CATTATCTTCTCCGGCG-3') used in Hilf et al. (2013) was added for an overnight hybridization in a 20% formamide solution. Slides were counterstained by SYBR Green and mounted with Cytomation fluorescent mounting medium (Dakocytomation®, France) before visualization under an epifluorescence microscope (Eclipse 80i Nikon®, France).

## Statistical Analysis

For each given date of the experiment, data were subjected to variance analyses using a one-way ANOVA (SigmaPlot version 11, from Systat Software, Inc., San Jose, CA, United States).<fnref n="2" /> One-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test was used to assess significant differences. Statistical significance was set at $P \le 0.05$.

<table><caption>**TABLE 1** | Quantitative real-time PCR in the petioles of the control (Las–) as well as infected leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Las-</th><th colspan="2">Las+AS</th><th colspan="2">Las+S</th></tr><tr><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th></tr></thead><tbody><tr><th>Ct</th><td>ND</td><td>ND</td><td>25.7 ± 0.4a</td><td>29.4 ± 0.4b</td><td>24.7 ± 0.2a</td><td>25.4 ± 0.7a</td></tr></tbody></table>

Results are expressed as mean + SE (n = 3). For each given datum, different letters indicate a statistical difference between genotypes (one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, $P \le 0.05$).

<footnote n="2">²www.systatsoftware.com</footnote>
RESULTS

In the field, Persian lime trees show higher growth compared with Mexican lime trees: 4 years after planting and 2 years after natural HLB infection, tree height is approximately 30% higher. Leaf yellowing and leaf mottling are quite uniform on most Mexican lime leaves. In Persian lime trees, leaf symptoms (Las+S) with asymmetric yellow mottling can be observed on some twigs, but other twigs present leaves without any apparent symptom (Las+AS). The impact of HLB on leaf phenology is also different. The number of leaves is higher in the Mexican lime, but the leaf maintenance on the Persian lime twigs seems to be much longer. This result correlates with the presence of numerous dead Mexican lime leaves at the bottom of the trees.

Control and infected trees grown in greenhouse conditions were tested by qPCR. As expected, controls were negative, and trees infected by HLB were positive (Table 1). Moreover, infected trees presented HLB symptoms. For Las+AS petiole leaves, the copy number of the bacterium quantified in Mexican lime trees was much higher than in Persian lime trees (Ct of 25.7 versus 29.4). In Las+S petiole leaves, the Ct values were similar for both genotypes (close to 25). These results are supported by fluorescence *in situ* hybridization (FISH) analysis using a probe targeted against Las on the same amount of grounded petiole material (Supplementary Figure 1). As expected, control samples did not present any fluorescence. However, the fluorescence in Mexican lime Las+AS was much higher than in Persian lime Las+AS (Supplementary Figures 1C,D). In Mexican and Persian lime Las+S petiole samples, the observed fluorescences were quite similar (Supplementary Figures 1E,F). Investigations were also performed at physiological, microscopic, and biochemical levels on the trees grown in greenhouse conditions. For control trees (Las−), the values of thickness, surface area, and RWC leaf values of Persian limes are significantly greater than those of the Mexican limes (Table 2). In addition, the stomatal size in the Mexican lime was smaller than in the Persian lime, which was the opposite of stomatal density, regardless of the plant's sanitary status. The epidermal cell area followed the same trend

as the stomata cell area. The leaf thickness values remained higher in Persian limes compared with Mexican limes. Finally, a decrease in SPAD, QY, and RWC values were observed in the Mexican Las + leaves compared with the Las− leaves. Gas exchange measurements were performed on leaves of Las− trees (Figure 1A), as well as on Las+AS (Figure 1B) and Las+S (Figure 1C) leaves of infected trees. For leaves of Las− trees, an increase in light intensity during measurements led to an increase in the measured values of the stomata conductance (gs; Figure 1D), of the photosynthesis (A; Figure 1G) and transpiration (E; Figure 1J); these parameters were always higher in Persian lime leaves compared with Mexican lime leaves. In Las+AS and Las+S leaves, the value increases observed in control (Figures 1G,J) due to the increasing light intensity are much more limited than in Las + AS and Las + S (Figures 1H,I,K,L). However, they remained consistently higher in Persian limes compared with Mexican limes (Figures 1F,I,L). Similar observations were also true for SPAD and QY (Table 2).

Measurements of starch content at the leaf level showed a higher amount in the Persian lime Las− leaves compared with the Mexican lime leaves (Table 3). In Las+AS leaves, a strong increase was found in the Mexican lime leaves compared with the control (about 10×), but it was only doubled in Persian lime leaves. For Las+S leaves, the starch content in Mexican limes and Persian limes are strong and not significantly different than for Las+AS Mexican limes (Table 3).

To decipher the impact of the disease in the phloem, SEM analyses were performed in the leaf petioles of the different genotypes. The petiole diameters and areas were greater in Persian limes than in Mexican limes (Table 4). In Las+ samples, the cortex, the phloem and xylem areas, and the pith area were also greater in Persian lime compared with Mexican lime. For the Las− leaves, Mexican limes presented phloem cells and pores between cells that were smaller than in Persian limes (Table 4 and Figures 2A,B). For Las + leaf petiole samples, tissue and vessel collapses were observed. The pores in the petiole phloem cell walls of Las+AS Mexican lime leaves were no longer visible because they were clogged by callose deposits (Figure 2C).

<table><caption>TABLE 2 | Leaf physiological characterization of Mexican and Persian limes.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Las-</th><th colspan="2">Las+AS</th><th colspan="2">Las+S</th></tr><tr><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th></tr></thead><tbody><tr><td>Thickness (mm)</td><td>0.30 ± 0.06 a</td><td>0.41 ± 0.08 b</td><td>0.31 ± 0.07 a</td><td>0.45 ± 0.09 b</td><td>0.32 ± 0.05 a</td><td>0.54 ± 0.09 b</td></tr><tr><td>Leaf area (mm²)</td><td>1648 ± 340 a</td><td>3203 ± 695 b</td><td>1523 ± 280 a</td><td>3312 ± 825 b</td><td>1356 ± 312 a</td><td>3598 ± 1170 b</td></tr><tr><td>SPAD (AU)</td><td>57.2 ± 8.8 b</td><td>64.23 ± 8.61 b</td><td>55.2 ± 7.1 b</td><td>60.42 ± 8.6 b</td><td>41.5 ± 5.98 a</td><td>56.28 ± 11.94 ab</td></tr><tr><td>QY (AU)</td><td>0.61 ± 0.10 b</td><td>0.65 ± 0.07 b</td><td>0.62 ± 0.93 b</td><td>0.66 ± 0.12 b</td><td>0.36 ± 0.13 a</td><td>0.50 ± 0.13 ab</td></tr><tr><td>RWC (%)</td><td>80.4 ± 2.6 a</td><td>83.8 ± 0.7 b</td><td>79.2 ± 1.6 a</td><td>82.7 ± 2.6 b</td><td>76.2 ± 2.4 a</td><td>80.6 ± 3.2 a</td></tr><tr><td>Stomata area (µm²)</td><td>338 ± 7 a</td><td>360 ± 9 b</td><td>320 ± 12 a</td><td>370 ± 10 b</td><td>340 ± 13 a</td><td>366 ± 11 b</td></tr><tr><td>Stomata density/mm²</td><td>442 ± 7 b</td><td>381 ± 9 a</td><td>445 ± 6 b</td><td>390 ± 11 a</td><td>450 ± 10 b</td><td>401 ± 16 a</td></tr><tr><td>Epidermal cell area (µm²)</td><td>177 ± 5 b</td><td>210 ± 7 c</td><td>168 ± 4 b</td><td>221 ± 13 c</td><td>150 ± 8 a</td><td>230 ± 17 c</td></tr></tbody></table>

Leaf thickness, leaf area, leaf greenness (SPAD unit), effective quantum yield of PSII (ΦPSII) within light-adapted leaves, relative water content (RWC), and leaf stomatal size and density, measured in the control (Las−) as well as infected leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively. Results are expressed as mean + SE (n = 6–100 measurements). ANOVA tests were performed to determine if HLB led to significant differences. For each given datum, different letters indicate a statistical difference between genotypes (one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, P ≤ 0.05).
<figure><img src="image_18.png" /></figure>

For Persian lime asymptomatic leaves, the pores were still not clogged, and no starch grain was present (Figure 2D). Interestingly, a large number of starch grains were visible in the petioles of Mexican lime Las+AS leaves (Figure 2C) but not in Persian lime leaves. For Mexican lime and Persian lime Las+S samples, pores were clearly plugged by callose deposits. Using the same type of samples, aniline blue staining was performed

to quantify the callose deposits. No deposits were observed for the controls (Figures 3A,B). On the other hand, a white ring was clearly visible at the phloem location for Las+AS Mexican lime samples, which was not the case for the Persian lime samples (Figures 3C,D). For the Mexican lime and Persian lime Las+S samples, a callose ring was present in both genotypes, but the ring was more intense for Mexican limes (Figure 3).
<table><caption>**TABLE 3** | Starch contents in the control (Las−) as well as infected leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Las-</th><th colspan="2">Las+AS</th><th colspan="2">Las+S</th></tr><tr><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th></tr></thead><tbody><tr><td>Starch (µg<sup>-1</sup> DM)</td><td>0.63 ± 0.01 a</td><td>1.30 ± 0.24 b</td><td>11.4 ± 0.03 d</td><td>2.13 ± 0.03 c</td><td>9.24 ± 0.10 d</td><td>10.85 ± 0.35 d</td></tr></tbody></table>

Results are expressed as mean ± SE (n = 3). ANOVA test was used to determine if HLB led to significant differences. For each given datum, different letters indicate a statistical difference between genotypes (one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, P ≤ 0.05).

Assays related to the quantification and the enzymatic activity of the main stress biomarkers and detoxification enzymes were performed by using leaf samples. A significant increase in MDA was observed in Las+AS Mexican lime leaves compared with the controls, but not in Persian lime leaves (Table 5). Increases in H₂O₂ and AsA contents were observed for Mexican lime and Persian lime Las+AS samples compared with controls. However, CAT activity increased in Persian lime Las+AS leaves, but it did not increase in Mexican lime leaves. Interestingly, AsA content and CAT activity in control leaves were more than double in the Persian lime compared with the Mexican lime. For Las+S samples, an increase in MDA was observed in Persian limes but did not lead to a change in H₂O₂ content compared with Las+AS (Table 5). AsA content decreased in Mexican lime and Persian lime Las+S samples compared with Las+AS samples. On the other hand, for APX, Las+S activity values were higher than for Las+AS for Mexican limes and Persian limes. For CAT, the activity values for Las+S Mexican lime remained stable compared with Las+AS, but the values decreased in Persian limes. Assays for copper (Cu), iron (Fe), and zinc (Zn) ion contents were also performed for the same type of leaf samples (Table 6). An increase in Cu content was observed in Mexican lime and Persian lime Las+S samples compared with controls. The increase is also significant regarding the Fe content in Mexican limes compared with the control and Las+AS and between Las+AS and Las+S. This same tendency was observed in Persian limes but to a lesser extent. Finally, decreases in Zn content were highlighted in Mexican lime and Persian lime Las+S samples compared with the Las+AS and control samples.

## DISCUSSION

### Anatomical and Physiological Differentiations Between Mexican Lime and Persian Lime Cultivars

Phenotypic differentiation associated with polyploidy has been extensively investigated (for review, see Ruiz et al., 2020). Ploidy in citrus leads to greater sizes cell and organ sizes, as observed for the leaf petiole diameters and the leaf surface areas of 4× compared with Mexican limes (Table 4; Mouhaya et al., 2010; Allario et al., 2011). The Persian lime cultivar has higher leaf thickness values and larger stomatal and epidermal cell sizes than Mexican lime leaves do. Similarly, the stomatal density in the Persian lime is significantly lower than in the Mexican lime cultivar (Table 1). These results are in agreement with the results

obtained with other triploid and tetraploid plants, as polyploidy induces an increase in leaf thickness, an increase in size, and a decrease in stomatal cell density (Allario et al., 2011; Padoan et al., 2013; Lourkisti et al., 2020). Leaf greenness, intrinsic photosystem II QY, and gas exchange parameters have also shown different photosynthetic activities: Persian limes generally presented higher values of SPAD, QY, gs, A, and E than Mexican limes did. These higher photosynthetic and respiratory functions may explain the greater vigor observed in 3× Persian limes that should be favorable under HLB constraint (Deng et al., 2019). In agreement with these results for Persian limes, Lourkisti et al. (2020) showed a higher photosynthetic efficiency in 3× mandarin hybrids compared with 2× clementine hybrids. Interestingly, the photosynthetic activities of tetraploid seedlings (Allario et al., 2011) and diploid sweet orange grafted on tetraploid rootstocks (Allario et al., 2013) were reduced compared to plants with diploid root systems, in association with higher constitutive ABA biosynthesis in tetraploid roots. It appears that polyploidy in roots and canopies have an antagonist effect on photosynthetic and respiratory function.

### Anatomical and Physiological Characterizations of Mexican and Persian Lime Cultivars Grown Under HLB Stress

Observations in the field showed that the Persian lime trees were much less affected than Mexican lime trees were, which fits with previous observations regarding HLB tolerance (Evans et al., 2014; Deng et al., 2019). Several cultivars, including lemons [(C. limon (L.) Burm. F.) and Persian lime] and the "LB8-9" Sugar Belle® mandarin hybrid ("Clementine" mandarin × "Minneola" tangelo; Gmitter et al., 2010) have shown apparent HLB tolerance (Albrecht and Bowman, 2012; Ramadugu et al., 2016; Killiny et al., 2017; Miles et al., 2017; Wang et al., 2017). This tolerance was associated with the maintenance of vigorous growth and fruit yield. In greenhouse conditions, infected Mexican lime leaves were much more yellow than Persian lime leaves. These results are in agreement with the variation of gas exchange between control and infected trees measured in Persian limes and Mexican limes. Triploid Persian limes maintained the highest gs, A, and E values compared with Mexican limes. For infected trees, the values measured for Mexican limes were low, suggesting that the metabolism of this cultivar was extremely affected. Koh et al. (2012) showed that HLB leads to an increased callose synthesis in the phloem vessels, resulting in clogging of the pores at the sieve plate between cells (Achor et al., 2010).
<table><caption>TABLE 4 | Anatomical characterization of leaf petioles of the control (Las−) as well as infested leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Las-</th><th colspan="2">Las+AS</th><th colspan="2">Las+S</th></tr><tr><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th></tr></thead><tbody><tr><td>Petiole diameter (mm)</td><td>1.28 ± 0.10 a</td><td>2.56 ± 0.35 b</td><td>1.31 ± 0.12 a</td><td>2.98 ± 0.41 b</td><td>1.23 ± 0.20 a</td><td>2.78 ± 0.40 b</td></tr><tr><td>Petiole area (μm²)</td><td>1327714 ± 48027 a</td><td>4579717 ± 2107471 b</td><td>1000764 ± 76969 a</td><td>4799753 ± 1131552 b</td><td>1369740 ± 51821 a</td><td>5113210 ± 670576 b</td></tr><tr><td>Cortex area (μm²)</td><td>1292947 ± 83 a</td><td>1518156 ± 603498 ab</td><td>979552 ± 438032 a</td><td>2042778 ± 815231 b</td><td>954458 ± 428548 a</td><td>2036659 ± 911788 b</td></tr><tr><td>Phloem area (μm²)</td><td>223991 ± 33838 a</td><td>572203 ± 143981 b</td><td>178772 ± 57310 a</td><td>485768 ± 73518 b</td><td>177072 ± 25140 a</td><td>614605 ± 144724 b</td></tr><tr><td>Phloem cells area (μm²)</td><td>1341 ± 435 a</td><td>2485 ± 995 b</td><td>1046 ± 385 a</td><td>2374 ± 1281 b</td><td>1362 ± 629 ab</td><td>2845 ± 1225 b</td></tr><tr><td>Pores of phloem cells area (μm²)</td><td>14.4 ± 1.5 a</td><td>26.5 ± 9.0 b</td><td>-</td><td>11.2 ± 0.8 a</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Xylem area (μm²)</td><td>251721 ± 27948 a</td><td>675409 ± 143965 b</td><td>192375 ± 56087 a</td><td>598872 ± 46435 b</td><td>199294 ± 36780 a</td><td>694855 ± 79640 b</td></tr><tr><td>Pith area (μm²)</td><td>93962 ± 33240 ab</td><td>116838 ± 17589 ab</td><td>50032 ± 3254 a</td><td>133796 ± 40519 b</td><td>58734 ± 200692 a</td><td>156156 ± 53880 b</td></tr></tbody></table>

Results are expressed as the mean ± SE (n = 6–50). ANOVA tests were performed to determine if HLB led to significant differences. For each given datum, different letters indicate a statistical difference between genotypes (one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, P ≤ 0.05).

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>FIGURE 2 | SEM of phloem of the control (Las−; A,B) as well as infected petioles from leaves that were asymptomatic (Las + AS; C,D) and symptomatic (Las + S; E,F) from Mexican and Persian limes, respectively. White arrows indicate pores not plugged by callose depositions, whereas opened arrows indicate pores with callose depositions. White triangle indicates the presence of starch grains. Bars = 30 µm.</figcaption></figure>

To verify whether the differences between Mexican lime and Persian lime cultivars could be explained by different levels of intercellular sieve pore plugging, we performed SEM on petiole control samples. Phloem cells and sieve plate pores of Persian lime trees were larger than those of Mexican lime trees. This observation can be directly related to the ploidy levels of these two varieties. In HLB-infected petiole of symptomatic leaves, the phloem cell sieve pores were found to be heavily obstructed by callose deposition in the Mexican limes and Persian limes, as previously mentioned (Achor et al., 2010; Koh et al., 2012; Albrigo et al., 2014), indicating that the metabolisms of such leaves were strongly affected for both varieties. However, the phloem cell wall distortion and a sieve element collapse induced by the bacterium (Etxeberria and Narciso, 2015) seemed to be more limited in Persian limes: In that genotype, the petiole diameter and the phloem petiole area were increased, while a strong decrease of these parameters was observed in Mexican lime. Recent work performed by Deng et al. (2019) showed that the HLB-tolerance traits of "Bearss" lemons and "LB8-9" Sugar Belle® mandarins are associated with more effective phloem regeneration, thus limiting the cell wall distortion and sieve element collapse. Their conclusion is in agreement with the increases in petiole
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**FIGURE 3** | Aniline blue staining of the petioles of the control (Las-; **A,B**) as well as infected leaves that were asymptomatic (Las + AS; **C,D**) and symptomatic (Las + S; **E,F**) from Mexican and Persian limes, respectively. White triangles indicate the presence of callose deposition at the phloem location (Xy: xylem and Ph: Phloem). Bars = 0.5 mm.</figcaption></figure>

diameter, phloem, and petiole cortex area observed in the Persian lime, suggesting that the Persian lime experienced a better phloem regeneration than the Mexican lime, limiting the phloem degradation and collapse. Interestingly, in Las+AS petioles of Persian limes, sieve pores remained open, and limited callose deposits were observed. Contrarily, the sieve pores remained plugged in infected (Las+AS and Las+S) Mexican limes. The higher callose depositions in Las+AS petioles of Mexican limes

compared to Persian limes, as observed by SEM, were confirmed by the presence of a strong white ring targeting the callose deposit when using aniline blue. The level of callose deposition is associated with a higher fluorescence labeling of Las in the Mexican lime and correlates with the lower Ct values measured in that genotype compared with the Persian lime, suggesting the faster development of the bacterium and a stronger impact at the physiological level. Starch accumulation is a classical symptom of a HLB-infected tree. A large number of starch grains were visible only in the Mexican lime, emphasizing the stronger impact of HLB in that genotype, as previously observed in different aerial organs (Schneider, 1968; Ed Etxeberria et al., 2009).

In Las- leaves of the Mexican lime compared with the Persian lime, a fivefold increase of the starch content (Table 3), a faster plugging of the pores between phloem cells (Figure 3C), and maintaining of lower values of gas exchange parameters (Figure 2) were noted. Taken together, this suggests that the larger cell and pore sizes in the Persian lime leaves and petioles, resulting from polyploidy, favored the longer maintenance period of the intercellular phloem flows in this variety (Figure 4). In turn, this reflects the specific phenology of the Persian lime, with a slower plugging of phloem cell pores and a better phloem regeneration (Deng et al., 2019), in agreement with a longer leaf lifetime of that genotype in comparison with the Mexican lime genotype.

## Differential Response to Oxidative Stress in the Mexican and Persian Limes

Mature fruit drop in HLB-infected citrus trees was shown to be related to oxidative stress genes coding for antioxidant enzymes, which were upregulated in HLB-susceptible citrus compared with tolerant citrus (Tang and Vashishth, 2020). MDA content is considered an indicator of oxidative stress as it corresponds to the final product of lipid peroxidation (Luna et al., 2000; Tabassum et al., 2017). A twofold increase in MDA content was observed in Mexican lime Las+AS leaves compared with the controls, whereas no significant change was observed in the Persian lime leaves at this disease development stage. The measured MDA concentrations suggested that Mexican limes were affected earlier by stress than the Persian limes were. In the Persian lime Las+AS leaves, the unchanged MDA

<table><caption>**TABLE 5** | Stress biomarkers (MDA, H₂O₂), antioxidant molecule (AsA) contents, and detoxification enzyme (APX, CAT) activities in the control (Las-) and infected leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Las-</th><th colspan="2">Las+AS</th><th colspan="2">Las+S</th></tr><tr><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th></tr></thead><tbody><tr><td>MDA (Arb. unit)</td><td>1 ± 0.15 a</td><td>1.15 ± 0.32 a</td><td>2.44 ± 0.06 c</td><td>1.37 ± 0.50 ac</td><td>1.98 ± 0.06 c</td><td>3.74 ± 0.36 d</td></tr><tr><td>H₂O₂ (Arb. unit)</td><td>1 ± 0.03 a</td><td>0.96 ± 0.04 a</td><td>2.15 ± 0.08 c</td><td>2.04 ± 0.11 c</td><td>1.77 ± 0.15 b</td><td>2.08 ± 0.04 c</td></tr><tr><td>AsA (Arb. unit)</td><td>1 ± 0.31 a</td><td>2.34 ± 0.08 b</td><td>3.69 ± 1.59 b</td><td>7.85 ± 0.72 c</td><td>1.16 ± 0.20 a</td><td>2.60 ± 0.38 b</td></tr><tr><td>APX (Arb. unit)</td><td>1 ± 0.69 ab</td><td>0.08 ± 0.08 a</td><td>1.05 ± 0.38 ab</td><td>1.76 ± 0.82 b</td><td>4.08 ± 0.10 c</td><td>4.74 ± 0.05 c</td></tr><tr><td>CAT (Arb. Unit)</td><td>1 ± 0.6 a</td><td>2.9 ± 0.2 b</td><td>1.6 ± 0.4 a</td><td>15.0 ± 5.7 d</td><td>2.4 ± 0.9 b</td><td>4.8 ± 0.1 c</td></tr></tbody></table>

Values of Mexican lime prior infection were used as baseline to adjust the values of Las+AS and Las+S of Mexican lime and Persian lime. Results are expressed as mean ± SE (n = 4-6). ANOVA tests were performed to determine if HLB led to significant differences. For each given datum, different letters indicate a statistical difference between genotypes (one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, P ≤ 0.05).
<table><caption>**TABLE 6** | Cu, Fe, and Zn contents in control (Las−) and infected leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Las-</th><th colspan="2">Las+AS</th><th colspan="2">Las+S</th></tr><tr><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th><th>Mexican lime</th><th>Persian lime</th></tr></thead><tbody><tr><td>Total Cu (mg/kg)</td><td>3.85 ± 0.96 a</td><td>4.92 ± 1.23 ab</td><td>2.45 ± 0.61 a</td><td>6.82 ± 1.77 bc</td><td>5.18 ± 1.30 b</td><td>9.05 ± 1.36 c</td></tr><tr><td>Total Fe (mg/kg)</td><td>86.11 ± 4.31 b</td><td>71.17 ± 3.56 a</td><td>127.74 ± 6.39 d</td><td>84.06 ± 4.20 b</td><td>253.40 ± 2.53 e</td><td>107.47 ± 1.07 c</td></tr><tr><td>Total Zn (mg/kg)</td><td>21.24 ± 1.06 b</td><td>27.07 ± 1.35 c</td><td>20.30 ± 1.02 b</td><td>27.15 ± 1.36 c</td><td>10.51 ± 0.53 a</td><td>24.18 ± 1.21 c</td></tr></tbody></table>

Results are expressed as mean ± SE (n = 4). ANOVA tests were performed to determine if HLB led to significant differences. For each given datum, different letters indicate a statistical difference between genotypes (one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test, P ≤ 0.05).

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

**FIGURE 4** | Cellular model reflecting the impact of HLB at the leaf level with regard to phloemic sap flow in the petioles of the control (Las−) as well as infected leaves that were asymptomatic (Las+AS) and symptomatic (Las+S) from Mexican and Persian limes, respectively. Vertical arrows indicate the expected strength of the phloemic sap flow. In the control petiole, the pores and the cells are bigger, and the photosynthetic rate in the Persian lime is higher compared with the Mexican lime. Thus, the phloemic sap flux is expected to be higher in Persian lime than in the Mexican lime, which may favor the growth rate of the Persian lime. In Las+AS leaves, the photosynthetic rate and the detoxification are higher in the Persian lime than in the Mexican lime. The pores in the Mexican lime are clogged, which favors the accumulation of starch in leaf; however, pores are still open in the Persian lime, which helps with maintaining the flow of phloemic sap in that genotype. In Las+S leaves, the photosynthetic rate and the detoxification are still higher in the Persian lime than in the Mexican lime even though all pores are clogged. In both genotypes, a strong increase in the starch content is observed. One may expect, however, that for a given petiole length to cross, the larger size of the cells in the Persian lime corresponds to a more limited number of cell walls of the phloem to cross than in the Mexican lime. Associated with a greater photosynthetic rate, this will help in maintaining a higher phloemic sap flow in Persian lime Las+S than in Mexican lime Las+S.

content was consistent with a better HLB tolerance associated with more limited cellular oxidative damage. In triploid citrus subjected to natural chilling (Lourkisti et al., 2020) and to

water deficits (Lourkisti et al., 2021), as well as tetraploid citrus seedlings subjected to nutrient deficiency (Oustric et al., 2019) and salinity (Khalid et al., 2020), a lower MDA content was
consistent with more limited oxidative damage, suggesting an
improved tolerance of polyploid citrus to oxidative stress. In
Mexican lime Las+S leaves, a slight decrease in the MDA
content was observed, whereas a threefold increase was observed
in the Persian lime leaves, suggesting that the bacterium
requested a longer amount of time to initiate oxidative stress
in polyploidy. If H₂O₂ contents were similar in Mexican lime
and Persian lime Las-, Las+AS, and Las+S samples, APX and
particularly CAT activities were stronger in the Persian lime
samples, which, in turn, favored the limitation of oxidative
stress in the investigation of triploid citrus subjected to stress
(Lourkisti et al., 2020, 2021). CAT, which can convert millions
of H₂O₂ to water and oxygen per second, is undoubtedly
the key marker differentiating the Persian lime from the
Mexican lime in terms of ROS balance efficiency at the earlier
disease stage. Indeed, the higher AsA content and the higher
CAT activity in the Persian lime Las- leaf compared with
the Mexican lime leaf, both of which have a similar H₂O₂
and MDA content, would be in agreement with the better
efficient antioxidant system in polyploid (Figure 4) as previously
proposed by Allario et al. (2013).

Ascorbate peroxidases reduces H₂O₂ using AsA as the
electron donor (Foyer and Noctor, 2005). AsA, with a
more than twofold concentration in the Persian lime at
the asymptomatic stage, can also act directly with ROS.
An increase in Fe content was observed in Las+AS and
Las+S leaf samples compared with the control. This increase
was even stronger in the Mexican lime compared with the
Persian lime (Table 6). HLB reduced foliar concentrations
of calcium (Ca), magnesium (Mg), manganese (Mn), zinc
(Zn), and iron (Fe) in infected leaves that were highly
symptomatic, but HLB did not affect the root concentrations
of these same essential nutrients (Hamido et al., 2019;
Inoue et al., 2020).

Huanglongbing-polyploidy interactions are contrary to the
well-known link between iron content and CAT activity
(Lombardi et al., 2003). Indeed, the iron content in the Mexican
lime is roughly tripled from Las- to Las+S and is associated with
a strong CAT activity increase, but this is not true in the Persian
lime. When HLB occurs in the Persian lime, even at the early stage
(Las+AS), the CAT increases fivefold, whereas the iron content is
close to that of the control.

The Fe and Cu increase that we observed in Las+AS and
Las+S was probably transient and would cause the plant to
limit HLB-induced stress through the translocation of these
important micronutrients from the root to the leaf. Indeed, a
foliar application of Fe²⁺ was shown to relieve the symptom
of HLB in citrus trees (Inoue et al., 2020). Also, the decrease
observed in Zn contents from Las+ to Las+AS and Las+S may
suggest that the Fe, Cu, and Zn decreases induced in strongly
infected leaves do not happen at the same time. In association
with iron (Fe²⁺), H₂O₂ can give rise to high deleterious radical
species: hydroxyl radicals (Migdal and Serres, 2011; Inagaki
et al., 2016). Indeed, the Fenton reaction induced by using
Fe²⁺ + H₂O₂ would favor the production of OH. Maintaining
a relatively low level of H₂O₂ relates to the reduction of H₂O₂
through APX and its use in the Fenton reaction.

CONCLUSION

In the field, the triploid Persian lime is one of the most HLB-
tolerant cultivars. We have shown that this variety behaves
better at a physiological and a biochemical level than its
diploid Mexican lime parent does. Anatomical, physiological,
and biochemical differentiations due to ploidy variation explain
a large part of the behavior of the Persian lime under an
HLB constraint. Using SEM analysis, we observed that the
Persian lime's better tolerance to HLB was associated with the
larger pore size in the sieve plate of the phloem cells of the
leaf petiole compared with the Mexican lime. In addition, the
investigation of infected petiole samples of asymptomatic leaves
showed much larger callose depositions onto the Mexican lime
versus the Persian lime, whereas symptomatic leaves showed
important depositions onto Mexican lime and Persian lime pores.
Our results provide insights into specific traits associated with
polyploidy, such as the size of the pores of the phloem, as
well as the Persian lime's detoxification processes, which can
help maintain the phloemic flow in the plant and, thus, result
in a better HLB-tolerance (Figure 4). Thus, investigations are
required to decipher the molecular determinants of Persian lime
cultivars' better HLB tolerance.

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The original contributions presented in the study are included
in the article/Supplementary Material, further inquiries can be
directed to the corresponding author.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

GS, LC, SB, and RB-N performed the experiments and collected
the physiological data. GS, PB, PO, and RM performed the
statistical analyses, interpreted the results, and drafted the
manuscript. GS and OG performed the analysis by SEM. LC and
OG helped to draft the manuscript. All authors contributed to the
article and approved the submitted version.

FUNDING

GS and LC were supported by the “Collectivité Territoriale de Martinique” and the “Région Guadeloupe.” Investigations were supported by the “TROPICSAFE” Project funded by European Union’s Horizon 2020 Research and Innovation Program under Grant Agreement No. 727459 and the “CAVALBIO” Project funded by FEDER and the Guadeloupe Region (2015–2021).

SUPPLEMENTARY MATERIAL

The Supplementary Material for this article can be found
online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.
685679/full#supplementary-material
**Supplementary Figure 1** | Fish analysis using a probe targeted against Las performed by using the same amount of grounded petiole material of the control (Las-; **A,B**) as well as infected leaves that were asymptomatic (Las + AS; **C,D**)

and asymptomatic (Las + S; **E,F**) from the Mexican and Persian limes, respectively. White arrows indicate the florescence resulting from the presence of Las. Bars = 12 µm.

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