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**Conflict of Interest:** The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

**Publisher's Note:** All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

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## 3.2. Données complémentaires : analyses des composés de parois cellulaires de feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti

### 3.2.1. La paroi végétale

La paroi végétale est un composé rigide qui entoure les cellules végétales et se situe à l'extérieur de la membrane cellulaire. Elle apporte un soutien structural et est l'une des premières défenses contre les pathogènes (Staehelin, 2019). Elle est composée principalement de cellulose, hémicelluloses, pectines et glycoprotéines. Ces quatre fractions représentent respectivement, chez les dicotylédones, environ 30%, 30%, 35%, et 5% (Fry, 1988; Voragen et al., 2009). Afin de pouvoir être parfaitement efficace, ces différents composés s'organisent de la façon suivante : les microfibrilles de cellulose sont organisées pour former une matrice. L'hémicellulose est liée à la surface de la cellulose pour empêcher les microfibrilles de celle-ci de s'agglutiner. La pectine et les protéines sont intégrer dans le complexe cellulose/hémicellulose pour favoriser l'assemblage des composants. Enfin, avec la lignine, cela permet de fournir une résistance mécanique supplémentaire (Rao & Dixon, 2017).

Il existe deux types de parois cellulaires (Vogel, 2008) :

- Les parois de type I qui sont présentent chez dicotylédones, les monocotylédones non graminées et les gymnospermes

- Les parois cellulaires de type II qui, elles, sont présentes chez les graminées (Fincher, 2009).

#### 3.2.1.1. Les pectines

Synthétisées dans les différents compartiments de l'appareil de Golgi (Mohnen, 2008; Nebenführ & Staehelin, 2001), les pectines assurent plusieurs fonctions comme par exemple la formation des parois cellulaires ou encore l'induction de la lignification et de l'accumulation de protéases. Les pectines sont des hétéro-polysaccharides dont l'homogalacturonane est le polysaccharide peptidique le plus présent (~60 à 65%) (Rao & Dixon, 2017). Cet homopolymère est composé majoritairement de chaines d'acide galacturonique liées en α-(1,4) (figure 17; Mohnen, 2008; Voragen et al., 2009). Les monomères les plus fréquemment retrouvés, en plus de l'acide galacturonique, sont l'arabinose, le galactose ou encore le xylose et le rhamnose.
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 17 – Résidus de monomères d’acide galacturonique liés en α-(1,4)</figcaption></figure>

### 3.2.1.2. Les hémicelluloses

Les hémicelluloses, polymères de sucres, représentent le deuxième composé le plus important dans la biomasse herbeuse (Bajpai, 2018). Elles sont présentes dans presque toutes les parois cellulaires des plantes terrestres. Les hémicelluloses sont composées principalement de différents monomères de sucres comme le glucose, le mannose, le xylose, l’arabinose ou encore l’acide galacturonique (Bajpai, 2018; Li et al., 2013). Le ratio de ces monomères dépend de la nature de la plante étudiée. Ces polymères de sucres sont beaucoup plus solubles que la cellulose donc sont beaucoup plus sensibles à la dégradation chimique.

Une étude de (Corneillie et al., 2019) a indiqué que la polyploïdie serait à l'origine du grossissement de la taille des cellules chez les polyploïdes car celle-ci impacterait la composition des parois cellulaires. En effet, le développement des polyploïdes serait plus lent ce qui permettrait une augmentation cellulaire. Cependant le nombre de cellules serait moindre chez les polyploïdes par rapport à leurs homologues diploïdes. Ainsi une taille cellulaire plus grande chez les polyploïdes, notamment avec des pores du phloème plus grands, expliquerait certainement le plus faible impact de certaines maladies chez les polyploïdes. Nos résultats de microscopie électronique à balayage faites chez le limettier Tahiti montraient une plus grande taille des pores des cellules cribles du phloème et un faible dépôt de callose par rapport à celle du limettier Mexicain. De plus, les analyses biochimiques montrent une activation supérieure des systèmes de détoxification des ROS chez les 3x (*cf* 3.1 du Chapitre 1). Vu l'importance de la paroi végétale et des affaissements tissulaires observés au niveau du phloème chez la variété 2x, il m'a été proposé de faire un stage au laboratoire GlycoMEV à l'Université de Rouen pendant une période d'un mois et demi afin d'extraire les composés de parois cellulaires et de les analyser afin de vérifier si des dégradations des composés de parois spécifiques entre 2x et 3x pouvaient être mis en évidence.
### 3.2.2. Matériels et Méthodes

Dans le cadre de ma thèse, il a été convenu d'analyser les composés de ces parois cellulaires chez les feuilles de limettier Mexicain diploïde (2x) et de limettier Tahiti triploïde (3x) greffés avec du Citrumelo Swingle 4475 2x et vérifier si le HLB avait un impact sur ces composés. L'analyse a été faite sur des plants en condition témoin, infectés par le HLB mais qui ne présentaient pas de symptômes foliaires, et infectés présentant des symptômes foliaires. Le matériel utilisé à était le même que celui du **Chapitre 1**.

L'extraction de ces résidus insolubles dans l'alcool (AIR) a été faite selon la méthode décrite dans l'article de Plancot et al., (2019). Le travail d'analyse des composés de parois a été réalisé à l'Université de Rouen au laboratoire GlycoMEV par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (GC-FID).

### 3.2.3. Résultats et analyses des composés de paroi cellulaires chez les feuilles de limettier Mexicain et Tahiti

#### 3.2.3.1. Analyse des fractions enrichies en pectines

En condition témoin, il est possible de remarquer qu'il n'y a aucune présence de glucose chez les 2x et les 3x ce qui signifie que l'élimination de l'amidon par traitement à l'α-amylase et l'amyloglucosidase a réussi. De plus, il est possible d'observer que les sucres qui sont présents chez les pectines sont bien présents chez les feuilles des 2x et 3x (Mohnen, 2008). En effet, les résultats ont montré en grande majorité l'acide galacturonique (GalA) puis l'arabinose (Ara), le galactose (Gal) et enfin le rhamnose (Rha). Néanmoins, aucune différence significative n'a pu être mise en évidence pour GalA entre LTT et LTS ou encore pour l'arabinose entre LMT et le reste des échantillons (figure 18). Toutefois une différence notable a pu être mise en évidence pour le glucose (Glc) entre les échantillons témoins et asymptomatiques comparés aux échantillons symptomatiques. De plus, cette différence peut être observée également entre les échantillons 2x et 3x symptomatiques. Lors de la méthode d'extraction des différents composés l'amidon a été éliminé, il serait alors intéressant de savoir quel type de glucose se retrouve au niveau des échantillons symptomatiques.
<figure><img src="image_23.png" /></figure>

Figure 18 – Impact du HLB sur la composition en monosaccharides des fractions enrichies en pectines dans les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti. Les proportions en monosaccharides ont été obtenues par analyse GC-FID. Les barres noires représentent la variété diploïde (limettier Mexicain 2x) et les blanches, la variété triploïde (limettier Tahiti 3x). Les moyennes des valeurs ont été obtenues avec trois réplications biologiques et une réplication technique. Des tests ANOVA et Turkey ont permis d'indiquer s'il y avait une différence significative entre les variétés et une différence au cours de la maladie. La significativité est représentée par des lettres différentes.

### 3.2.3.2. Analyse des fractions enrichies en hémicelluloses

L'analyse des hémicelluloses dans les plants témoins a permis de mettre en évidence les différents composés présents dans celles-ci (figure 19). Le xylose (Xyl) était présent en majorité puis Ara, Gal, mais également Glc et GalA. Une diminution de la présence Xyl peut
être observée pour LT au cours de l'évolution de la maladie. A contrario, il y a une légère augmentation de Xyl pour LM sans toutefois que cette différence soit significative. Tout comme les pectines, les variations des sucres présents dans les hémicelluloses ne sont pas grandement et significativement différentes au cours de la maladie. Néanmoins, la proportion de Glc augmente également pour les échantillons LMS et LTS.

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Figure 19 – Impact du HLB sur la composition en monosaccharides des fractions enrichies en hémicelluloses dans les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti. Les proportions en monosaccharides ont été obtenues par analyse GC-FID. Les barres noires représentent la variété diploïde (limettier Mexicain 2x) et les blanches, la variété triploïde (limettier Tahiti 3x). Les moyennes des valeurs ont été obtenues avec trois réplications biologiques et une réplication technique. Des tests ANOVA et Turkey ont permis d'indiquer s'il y avait une différence significative entre les variétés et une différence au cours de la maladie. La significativité est représentée par des lettres différentes.
Les premières analyses des composés telles que les pectines et les hémicelluloses ne montrent pas de grandes différences entre les variétés 2x et 3x. Ces résultats ne seraient donc pas totalement en accord avec les résultats de Corneillie et al., (2019) qui indiquaient un impact de la ploïdie sur la composition des composés des parois cellulaires. Cependant, il est important de noter que les analyses de ces composés, faites par son équipe, ont été réalisés sur des plants 2x, 4x, 6x et 8x d'Arabidopsis thaliana, donc des lignées pures autopolyploïdes, ce qui diffère des analyses faites lors de notre étude qui, elle, a été faite sur des plants 2x et 3x. Il est important de noter que le limettier Tahiti est un allopolyploïde car il est issu d'un croisement entre le limettier Mexicain doublé (Citrus aurantifolia 4x) et d'un citronnier (Citrus limon 2x). Des études comme celles d'Adams et al., (2003) ont montré que les plants de cotons allotétraploïdes présentaient une forte hétérozygotie et donc pouvaient présenter une modification de leurs gènes d'environ 25%. À contrario, les autopolyploïdes avaient un effet limité sur la modification de leur génome quand on les compare à leurs diploïdes respectifs (Allario et al., 2011; Dai et al., 2015). De ce fait, le triploïde analysé présenterait une plus forte hétérozygotie par rapport aux polyploïdes de l'étude de Corneillie et al., (2019) et expliquerait certainement les faibles différences des proportions des sucres des parois cellulaires.

En ce qui concerne la maladie du HLB, une variation du taux de Glc était observable peu importe la fraction étudiée (pectine, hémicellulose). Suite à l'infection par la bactérie responsable du HLB, une forte synthèse de callose peut être observée au niveau des parois des cellules cribles du phloème (Koh et al., 2012). De ce fait, plus l'arbre est infecté, plus la présence de callose doit être importante. Il se pourrait donc que l'augmentation de glucose observée chez les échantillons LMS et LTS dans les différentes fractions provienne de la forte synthèse de callose induite par le HLB. Afin de vérifier cette hypothèse, l'utilisation d'anticorps anti-callose sur les différents échantillons permettrait de confirmer la présence de callose tout au long de la maladie. Dans un second temps, il sera intéressant de déterminer quels sont les différents types de sucres composant les différentes fractions d'hémicellulose et de pectines. En effet, dans le cas du mannose chez les hémicelluloses, ce dernier peut être sous forme de mannane, glucomannane ou encore galactomannane. De ce fait, faire une analyse immunologique slot-blot permettrait d'identifier le profil exact des sucres retrouvés dans les composés des parois cellulaires des feuilles du limettier Mexicain et du limettier Tahiti.
Après extraction des AIR, il a été possible de séparer les hémicelluloses en deux catégories : les hémicelluloses dites solubles (HCs) – présentées en **figure 19** – et les hémicelluloses dites insolubles (HCi). En effet, lors de l'étape de fractionnement, en neutralisant le pH à l'aide de l'acide acétique glacial, il a eu formation d'un précipité qui ne se solubilisait pas. Ces HCi ont donc également fait l'objet d'analyse par GC-FID.

Après analyse des HCi, bien que les résultats semblent indiquer une différence entre les échantillons témoins et symptomatiques (**figure 20**), ces résultats sont difficilement interprétables car de grands écart-types sont observables.
<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Figure 20 - Impact du HLB sur la composition en monosaccharides des fractions enrichies en hémicelluloses insolubles dans les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti. Les proportions en monosaccharides ont été obtenues par analyse GC-FID. Les barres noires représentent la variété diploïde (limettier Mexicain 2x) et les blanches, la variété triploïde (limettier Tahiti 3x). Les moyennes des valeurs ont été obtenues avec trois réplications biologiques et une réplication technique. Des tests ANOVA et Turkey ont permis d'indiquer s'il y avait une différence significative entre les variétés et une différence au cours de la maladie. La significativité est représentée par des lettres différentes.

Comme pour l'analyse des pectines et des hémicelluloses solubles, la plus grande différence notable, chez les différents composés, est celle du Glc. Malgré cette différence significative
pour le Glc, ces résultats ne seraient pas interprétables car une infime partie des composés présents dans les HCi a été analysée. En effet, le calcul des rendements a été effectué sur les différentes fractions (pectines, HCs et HCi) en utilisant la masse de départ et la masse de sucres analysés au total et les résultats (tableau 1) ont été les suivants :

<table><caption>Tableau 1 - Rendement total des monomères de sucres analysés par GC-FID chez les fractions de pectines, hémicelluloses solubles (HCs) et insolubles (HCi) présentes chez les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti. Le rendement a été fait à partir de la masse totale initiale prise pour faire la GC-FID et la masse totale analysée après GC-FID pour chaque échantillon. Une moyenne de ces rendements a été faite afin d'obtenir le rendement total par variété chez les différentes fractions. Pour chaque fraction, LM et LT représentent la totalité des conditions (témoin, asymptomatique et symptomatique) et des répétitions prises en compte.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Rendement par variétés (%)</th><th colspan="2">Pectines</th><th colspan="2">HCs</th><th colspan="2">HCi</th></tr><tr><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>71,9</td><td>84,0</td><td>67,3</td><td>59,0</td><td>3,9</td><td>7,9</td></tr></tbody></table>

Le tableau ci-dessus, a permis de noter qu'au total seulement 10% des sucres présents chez les HCi ont été analysés. Ces rendements étant très faibles, par rapport à ceux des pectines et des HCs. Ces résultats suggèrent qu'il n'a pas été possible de rendre cette fraction d'hémicelluloses insolubles solubles lors des différentes étapes (bains dans le trifluoroacétique acide, dérivation...) précédent la GC-FID.

### 3.2.4. Conclusion

Les différentes analyses réalisées dans le laboratoire GlycoMEV à l'Université de Rouen n'ont pas permis de montrer une grande différence entre les parois cellulaires des deux variétés. En effet, aucune différence significative ne pouvait être réellement observée lors de l'analyse des différents composés de la paroi cellulaire chez les 2x et les 3x. Néanmoins, un point intéressant reste l'augmentation du glucose en condition symptomatique qui serait sûrement caractéristique d'une augmentation de callose due à la maladie du HLB.

Enfin, il a été montré qu'il y avait une perte racinaire malgré un enrichissement en amidon et autres hydrates de carbone (Kumar et al., 2018). Ainsi, même si aucune différence notable n'a pu être démontré du fait d'une plus forte hétérozygotie chez la variété 3x, il serait important de faire ces travaux d'analyse de composés de parois cellulaires au niveau du compartiment racinaire de porte-greffes 2x et 4x tels que le Citrumelo Swingle 4475 2x et 4x.
4. Chapitre 2 : Better tolerance to Huanglongbing is conferred by tetraploid Swingle citrumelo rootstock and is influenced by the ploidy of the scion
## 4.1. Résumé

Le deuxième chapitre de cette thèse fait l'objet d'un article publié le 3 Novembre 2022
Frontiers in Plant Science.

L'étude faite dans cet article est axée principalement sur les racines de porte-greffes Citrumelo Swingle 4475 diploïde (2x) et tétraploïde (4x) et de leur réponse face au Huanglongbing. Ces différents porte-greffes étaient greffés avec du limettier Mexicain 2x et du limettier Tahiti 3x (Persian lime en anglais).

L'analyse phytosanitaire réalisés sur les feuilles de LM et LT a permis de montrer qu'il y avait bien une différence significative de la charge bactérienne, celle-ci étant plus importante pour la variété 2x par rapport au 3x peu importe que le porte-greffe associé soit 2x ou 4x (Table 1).

Des analyses macroscopiques et microscopiques ont été réalisées. Les photos macroscopiques des racines secondaires Las- (témoin) et Las+ (infecté) ont montré un brunissement de la couleur des racines dû à la maladie (Figure 1). Ces photos ont montré que les racines secondaires de citrumelo 4x sont plus épaisses que celles de citrumelo 2x avec des racines très fines en quantité plus limitées. L'infection a induit une dégradation des racines fines chez Cit 2x (Fig. 1, E & G vs C & A) alors que des changements limités ont été observés chez Cit 4x (Fig. 1, F & H vs D & B). Les analyses microscopiques par MEB ont montré que le diamètre et la surface des racines étaient plus importants dans le Cit 2x que dans le Cit 4x (Tableau 2, Figure 2). Dans les échantillons Las- et Las+, le cortex, la surface du phloème, la surface du xylème et le cylindre central étaient également plus grands dans le Cit 4x que dans le Cit 2x. En revanche, la microscopie n'a pas permis de visualiser un dépôt de callose au niveau des pores des cellules du phloème (supporté par les résultats de coloration au bleu d'aniline ; Supp. Figure 1). Ces résultats étaient donc en relation avec les travaux de Achor et al., (2020) suggérant que les pores du phloème des racines ne présentaient pas de callose, pouvant ainsi expliquer pourquoi les racines seraient un réservoir de la bactérie afin de se multiplier et de se développer dans le reste des plants (Johnson et al., 2013).

Différentes études ont montré l'impact de la polyploïdie dans la meilleure tolérance des porte-greffes face au stress oxydatif induit par différents stress abiotiques. Cependant, ces études étaient réalisées principalement sur les feuilles de ces porte-greffes (Khalid et al., 2020;
Oustric et al., 2019). Nos analyses ont porté sur la réponse des porte-greffes face au stress oxydatif induits par le HLB. Nous avons focalisé notre étude sur le compartiment racinaire dans le cadre d'une analyse électrochimique couplée à un dosage des polyphénols. Celle-ci a montré que pour le Cit2x associé au LT, il y a une forte diminution du signal dans les racines Las+ suggérant que les composants antioxydants oxydables à des potentiels élevés sont favorisés dans le Cit2x/LT par rapport à ceux du Cit2x/LM et que ces composants antioxydants sont très sensibles à l'infection. L'analyse des racines de porte-greffes 4x associés avec LM 2x, a montré une différence de signal par rapport au Cit2x associé à la LM. Ces résultats étaient en accord avec la meilleure tolérance du porte-greffe 4x par rapport au 2x.

L'analyse du dosage des polyphénols des racines de citrumelo 2x et 4x était très contrastée (Figure 5). Si dans les échantillons témoins, les teneurs étaient assez faibles, les racines 4x présentaient toujours des teneurs plus élevées que dans celles des 2x quelle que soit la ploïdie du scion. Ces résultats seraient en accord avec une préadaptation au stress en limitant le stress oxydatif comme proposé précédemment pour les génotypes polyploïdes (Allario et al., 2013). Il est intéressant de noter que l'infection par HLB a conduit à une augmentation de 10 fois le contenu en polyphénols dans les racines 4x par rapport à 2x. Puisque les polyphénols jouent un rôle crucial dans l'adaptation des plantes à l'environnement en raison de leur rôle dans la défense contre les stress biotiques (Cheynier et al., 2013) et abiotiques (Cheruiyot et al., 2007; Šamec et al., 2021; Tuladhar et al., 2021), qui est attribué à leur activité antioxydante (Martinelli et al., 2016), les polyphénols peuvent contribuer à la meilleure adaptation des polyploïdes face au HLB. Cette augmentation était encore plus forte lorsque les porte-greffes 4x étaient greffés avec le LT 3x, soulignant l'importance des interactions polyploïdes porte-greffes/scion comme moyen pour limiter le stress oxydatif induit par le HLB.

En se consacrant au compartiment racinaire, cette étude a permis de montrer l'impact de la polyploïdie face à la meilleure tolérance au HLB, rejoignant ainsi les résultats obtenus dans l'étude présenté dans le **Chapitre 1** (Sivager et al., 2021). Les différenciations anatomiques, physiologiques et biochimiques dues à la variation de ploïdie expliquent en grande partie le meilleur comportement des associations citrumelo 4x / 2x et 3x (Figure 7). En effet, si les pores des cellules racinaires du phloème 2x et 4x n'étaient pas bouchés par la callose dans les échantillons Las+, le stress oxydatif dans les racines 2x était beaucoup plus important et était associé à des teneurs plus faibles en polyphénols, ce qui peut à son tour expliquer la plus grande dégradation des racines observée dans les associations citrumelo 2x / 2x et 3x. Il est intéressant de noter que nos résultats démontrent que la ploïdie du scion a un impact important
sur la tolérance au HLB, qui est même améliorée lorsqu'il est associé à un porte-greffe 4x. Ainsi,
des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déchiffrer les déterminants moléculaires
de la meilleure tolérance au HLB des porte-greffes et des scions polyploïdes ainsi que les
interactions porte-greffes / scions polyploïdes.
<figure><img src="image_26.png" /></figure>

**OPEN ACCESS**

EDITED BY
Qibin Yu,
University of Florida, United States

REVIEWED BY
Ahmad A. Omar,
University of Florida, United States
Mikeal Levi Moose,
University of California, Riverside,
United States

*CORRESPONDENCE
Raphaël Morillon
raphael.morillon@cirad.fr

SPECIALTY SECTION
This article was submitted to Plant Pathogen Interactions, a section of the journal Frontiers in Plant Science

RECEIVED 29 August 2022
ACCEPTED 12 October 2022
PUBLISHED 03 November 2022

CITATION
Sivager G, Calvez L, Bruyere S, Boisne-Noc R, Hufnagel B, Cebrian-Torrejon G, Doménech-Carbó A, Gros O, Ollitrault P and Morillon R (2022) Better tolerance to Huanglongbing is conferred by tetraploid Swingle citrumelo rootstock and is influenced by the ploidy of the scion. *Front. Plant Sci.* 13:1030862. doi: 10.3389/fpls.2022.1030862

COPYRIGHT
© 2022 Sivager, Calvez, Bruyere, Boisne-Noc, Hufnagel, Cebrian-Torrejon, Doménech-Carbó, Gros, Ollitrault and Morillon. This is an open-access article distributed under the terms of the [Creative Commons Attribution License (CC BY)](https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.

# Better tolerance to Huanglongbing is conferred by tetraploid Swingle citrumelo rootstock and is influenced by the ploidy of the scion

Gary Sivager¹, Leny Calvez¹, Saturnin Bruyere¹,
Rosiane Boisne-Noc¹, Barbara Hufnagel¹,
Gerardo Cebrian-Torrejon², Antonio Doménech-Carbó³,
Olivier Gros⁴,⁵, Patrick Ollitrault¹ and Raphaël Morillon¹*

¹Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD), Unite Mixte de Recherche Amélioration Génétique et Adaptation des Plantes méditerranéennes et tropicales (UMR AGAP) Institut, Equipe Structure Evolutive des Agrumes, Polyploidie et Amélioration Génétique (SEAPAG), F-97170 Petit-Bourg, Guadeloupe, French West Indies—Unité Mixte de Recherche Amélioration Génétique et Adaptation des Plantes méditerranéennes et tropicales (UMR AGAP) Institut, Univ. Montpellier, Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD), Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement (INRAE), Institut Agro, Montpellier, France, ²Connaissance et Valorisation: Chimie des Matériaux, Environnement, Energie (COVACHIM-M2E) Laboratory Equipe Associée (EA) 3592, Unité de Formations et de Recherche (UFR) des Sciences Exactes et Naturelles, Université des Antilles, Pointe-à-Pitre, Guadeloupe, ³Departament de Química Anàlitica, Facultat de Química, Universitat de València, Valencia, Spain, ⁴Centre commun de caractérisation des matériaux des Antilles et de la Guyane (C3MAG), Unité de Formations et de Recherche (UFR) des Sciences Exactes et Naturelles, Université des Antilles, Pointe-à-Pitre, Guadeloupe, ⁵Institut de Systématique, Evolution, Biodiversité, Muséum National d'Histoire Naturelle, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Sorbonne Université, École Pratique des Hautes Etudes (EPHE), Université des Antilles, Campus de Fouillole, Pointe-à-Pitre, France

Huanglongbing (HLB) is a disease that is responsible for the death of millions of trees worldwide. The bacterial causal agent belongs to *Candidatus Liberibacter* spp., which is transmitted by psyllids. The bacterium lead most of the time to a reaction of the tree associated with callose synthesis at the phloem sieve plate. Thus, the obstruction of pores providing connections between adjacent sieve elements will limit the symplastic transport of the sugars and starches synthesized through photosynthesis. In the present article, we investigated the impact of the use of tetraploid Swingle citrumelo (*Citrus paradisi* Macfrad × *Poncirus trifoliata* [L.] Raf) rootstock on HLB tolerance, compared to its respective diploid. HLB-infected diploid and tetraploid rootstocks were investigated when grafted with Mexican and Persian limes. Secondary roots were anatomically studied using scanning electron microscopy (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) to observe callose deposition at the phloem sieve plate and to evaluate the impact of the bacterium's presence at the cellular level. Voltammetry of immobilized microparticles (VIMP) in roots was applied to determine the oxidative stress status of root samples. In the field, Mexican and Persian lime leaves of trees grafted onto tetraploid rootstock presented less symptoms of HLB. Anatomical analysis showed much stronger secondary root degradation in diploid rootstock, compared to tetraploid
rootstock. Analysis of the root sieve plate in control root samples showed that pores were approximately 1.8-fold larger in tetraploid Swingle citrumelo than in its respective diploid. SEM analyses of root samples did not reveal any callose deposition into pores of diploid and tetraploid genotypes. VIMP showed limited oxidative stress in tetraploid samples, compared to diploid ones. These results were even strongly enhanced when rootstocks were grafted with Persian limes, compared to Mexican limes, which was corroborated by stronger polyphenol contents. TEM analysis showed that the bacteria was present in both ploidy root samples with no major impacts detected on cell walls or cell structures. These results reveal that tetraploid Swingle citrumelo rootstock confers better tolerance to HLB than diploid. Additionally, an even stronger tolerance is achieved when the triploid Persian lime scion is associated.

KEYWORDS

citrus, detoxification, Huanglongbing (HBL), lime, polyploidy, rootstock

Introduction

Huanglongbing (HLB) is one of the most severe citrus
diseases in the world and is caused by a phloem-restricted
alphaproteobacterium (Candidatus Liberibacter spp.) (Bové,
2006). Three species of this gram-negative bacteria have been
described in the taxonomy Candidatus Liberibacter asiaticus
(CLas) (Bové, 2006), Ca. L. africanus (Jagoueix et al., 1994), and
Ca. L. americanus (Teixeira et al., 2005). Diaphorina citri and
Trioza erytreae, vectors of these species, spread the disease
effectively. Economic losses are important (Santivañez et al.,
2013; Neupane and Moss, 2016) because HLB leads to a
production decrease due to impairments in tree development
and fruit quality (Dala-Paula et al., 2019; Koh et al., 2020) and,
eventually, tree- death. One of the most striking symptoms is
observed on the leaves, which show asymmetrical yellow
mottling on both sides of the midrib (Bové, 2006). Many of
the symptoms of HLB are due to physiological disturbances
related to the strong biosynthesis of callose at the phloem sieve
plate, thus preventing the flow of elaborated sap (Achor et al.,
2010; Koh et al., 2012). As a result, photosynthetic products,
such as starch, accumulate in the leaves (Etxeberria et al., 2009;
Achor et al., 2010). The accumulations of sugars, amino acids,
fatty acids, and secondary metabolites were shown to be
significantly remodeled depending on the tissues and species
investigated (Chin et al., 2014; Padhi et al., 2019; Chen et al.,
2022). These foliar symptoms, although they are the most visible,
are rather late symptoms because they develop 6 months or
more after those at the root level (Graham et al., 2013). Although
many studies focused on the implication of HLB in the canopy,
research on the root system is still limited. Johnson et al. (2013)
showed that the root system was a bacterial reservoir. Indeed, the

bacterial quantity seemed more important at the root level than
it was at the foliar level. Moreover, a relation between the
decrease of the bacterial quantity in roots and the appearance
of new flushes indicated that the roots were a place of
multiplication and development for the bacteria to colonize
the rest of the plant. Different studies (Johnson et al., 2013;
Achor et al., 2020) demonstrated that, unlike the canopy, no
callose deposition could be observed at the phloem sieve plate to
explain why the roots would be the bacterial reservoir. Finally,
HLB-infected plants show a strong oxidative stress, inducing
detoxification mechanisms in order to eliminate the reactive
oxygen species (ROS) produced in excess (Martinelli et al.,
2016). ROS, which are free radicals and non-radical molecules,
are key components of the network of signaling pathways and
act as major regulators of plant cell physiology and cellular
responses to environmental factors (Bhattacharjee, 2012).
Likewise, families of molecular compounds, such as
polyphenols, are useful in the defense against environmental
stress. It has been shown that these compounds also have
antioxidant effects (Agati et al., 2012; Kumar and Pandey,
2013) in order to reduce the cell toxicity of ROS. Therefore,
following a stress, the concentration of phenolic compounds
increases to fight against it (Sharma et al., 2019).

It has long been considered that there is no genetic resistance
to HLB in genus *Citrus*. However, important variabilities of
behavior under HLB constraints have been reported for the
different species of the genus *Citrus* (Stover et al., 2015; Miles
et al., 2017), which should be associated with better adaptation to
the bacteria or differential attractiveness to the vector. For the
related genera *Poncirus*, the lower susceptibility of trifoliate
orange could be related to a lower leaf appetence of
*Diaphorina citri*, which, in turn, would limit the possibilities of
infection and development of CLas (Westbrook et al., 2011; Richardson and Hall, 2013). More recently, the evaluation of HLB symptoms in germplasm collections under HLB constraints revealed complete resistance to HLB in related genera and, particularly, in Australian citrus species (Ramadugu et al., 2016; Alves et al., 2021). Several HLB-tolerant citrus hybrids and relatives were shown to synthetize antimicrobial peptides that can inhibit infections by CLas (Blaustein et al., 2018; Huang et al., 2021).

Furthermore, studies have shown that polyploid plants are generally more tolerant to various biotic and abiotic stresses (for review, see Ruiz et al., 2020). For example, the effectiveness of citrus tetraploid (4x) rootstocks has been shown against water deficit (Allario et al., 2013). In a recent work, it was reported that triploid varieties, such as Persian lime, have better anatomical and physiological properties than diploid (2x) species do. These present a better antioxidant mechanism, explaining why triploids behave much better in the field regarding HLB disease (Sivager et al., 2021). Other studies suggested that some 4x rootstocks could limit the impact of HLB (Grosser and Gmitter, 2011; Grosser et al., 2012). However, there are no published studies specifically analyzing the impact of rootstock polyploidy on HLB.

In this study, a comparison of the behavior of the 2x Swingle citrumelo Swingle 4475 rootstock with its respective 4x form was performed. The 2x Swingle citrumelo Swingle 4475 resulted from a cross between a grapefruit Duncan and *Poncirus trifoliate*, and the 4x was selected in seedlings of 4475 Swingle citrumelo because of chromosome duplication in nucellar tissue (Aleza et al., 2011). Thus, it was possible to limit the impact of other environmental factors. Additionally, in order to visualize the different anatomical features in field conditions and possible callose deposits, a collect of symptomatic samples on trees naturally infected by psyllids in the field was done. Different analysis by microscopy were performed to quantify the bacteria in the 2x and 4x rootstocks. Finally, quantification of polyphenols associated with an electrochemical activity to determine the antioxidant power of these two genotypes under HLB stress was done. Altogether, these findings provide insights regarding the determinants associated with better HLB tolerance in 4x Swingle citrumelo rootstock. Furthermore, these results underline the strong interaction between rootstock and scion, influencing the tolerance to this disease.

# Materials and methods

## Plant material and growth condition

The INRAE-CIRAD of San Giuliano in Corsica (France) provided 2x and 4x Swingle citrumelo 4475 (SRA 928; *Citrus paradisi* Macfrad × *Poncirus trifoliata* [L.] Raf) seeds from the collection of the “CRB Citrus” biological resource center (Luro et al., 2017). Seedlings preparation and analysis were performed according to Sivager et al. (2021).

A total of sixty genetically conform and uniform seedlings (2x and 4x) were selected for further investigation. Twenty 10-month-old 2x and 4x rootstock seedlings were grafted using budwoods collected on asymptomatic HLB leaves and control budwoods of the 2x Mexican lime (*Citrus aurantiifolia* [Christm. Swingle, SRA 140]) and the 3x Persian lime (*Citrus latifolia* [Yu. Tanaka] Tanaka, SRA 58). Among them, six control and infected trees of each genotype were grown according to Sivager et al. (2021). Twenty-eight to 38 months old trees were used for physiological, microscopic, and biochemical investigations. Field observations were also performed on 4-year-old trees of the same rootstock and variety combinations naturally infected for 2 years.

## HLB monitoring and roots preparation for ultrastructural analysis (SEM and TEM)

HLB monitoring and roots preparation for scanning electron microscopy (SEM) were performed according to Sivager et al. (2021).

Transmission electron microscopy (TEM). Fresh longitudinal sections of roots were prefixed overnight at 4°C in 2.5% glutaraldehyde in a phosphate saline buffer (PBS; pH 7.2), then for 1 hour under vacuum at RT. Samples were rinsed twice in the same buffer for 10 minutes in order to remove aldehyde before fixation of 45 minutes at room temperature in 1% osmium tetroxide in PBS. Then, samples were rinsed three times in distilled water for 5 minutes and post-fixed with 2% aqueous uranyl acetate for one more hour. After three rinses in distilled water, specimens were dehydrated through a graded acetone series at room temperature before embedding in LR white resin under vacuum. Thin sections (80 nm thick) were observed in a Tecnai G20 TEM at 200 Kv or by using STEM mode with a FEI Quanta 250 electron microscope at 20 kV.

## Root preparation for blue aniline staining, fluorescence *in situ* hybridization (FISH) of Candidatus Liberibacter asiaticus in the roots of 2x and 4x Swingle citrumelo rootstocks grafted with Mexican or Persian limes

Aniline staining and fluorescence *in situ* hybridization (FISH) were performed according to Sivager et al. (2021).

## Polyphenols contents

Roots were fixed with liquid nitrogen and then ground. Then, 500 mg of ground samples were incubated for 72 h in 10
mL 100% methanol, before filtering. The polyphenolic assays were performed with “Folin Ciocalteau Phenolic Content Quantification Assay” kit according to the manufacturer’s instructions (Biochem. A standard curve was done to determine the sample phenolic concentrations.

## Electrochemistry

Electrochemistry was done according to the method of Palmeira-Mello et al. (2021), with a Bio-Logic SP-300 tool. Electrochemical experiments were performed at 298 ± 1 K in a conventional three-electrode cell, using a platinum wire auxiliary electrode and an Ag/AgCl (3M NaCl) reference electrode. Measurements were carried out with a Bio-Logic SP-300 equipment, using 0.10 M potassium phosphate buffer at pH 7.0 as a supporting electrolyte. The working electrode was prepared by evaporating 50 µL of a methanol of ground root extract samples under air on a glassy carbon electrode (GCE, BAS MF 4012, geometrical area 0.071 cm²). To mimic the natural environment, no electrolyte degasification was performed. Three biological repetitions were done for each sample. Measurements were performed from -1.5 V to 1.5 V (red/ox), 1.5 V to -1.5 V (ox/red), and 0 to 1.5 V (short ox).

## Statistical analysis

For each given date of the experiment, data were subjected to variance analyses using a one-way analysis of variance (ANOVA; SigmaPlot version 11, from Systat Software, Inc., San Jose California USA; www.systatsoftware.com). One-way ANOVA, followed by Tukey's post hoc test, was used to assess significant differences. Statistical significance was set at $P \le 0.05$.

# Results

## Impact of the disease in field condition on the different scion/rootstock associations

In the field, when grafted onto 2x Swingle citrumelo, 4-year-old Persian lime trees show about 30% higher growth, compared to Mexican lime trees. When grafted onto 4x Swingle citrumelo rootstock, Persian lime and Mexican lime trees showed more limited growth, compared to tree associations with 2x Swingle citrumelo: 4 years after planting and 2 years after natural HLB infection, tree height onto 4x rootstock was approximately 20% lower. Leaf mottling induced by HLB was quite similar in Persian lime leaves whatever the rootstock ploidy. However, leaf yellowing in Mexican lime trees was more limited when grafted onto 4x Swingle citrumelo, compared to 2x Swingle citrumelo. SPAD and effective quantum yield of PSII values measured in symptomatic leaves of Mexican and Persian leaves grafted onto 4x Swingle citrumelo, compared to the respective 2x Swingle citrumelo, were higher (Table 1). Also fruit production in the third year was estimated and showed a trend with a higher production when grown onto scions are grafted onto 4x Swingle citrumelo. Also fruit weight was significantly increased for both genotypes when grafted onto 4x Swingle citrumelo (Table 1)

## Anatomical impact of Huanglongbing in 2x and 4x rootstock

Investigations of phloem cells of CLas+ Mexican and Persian lime grafted onto 4x Swingle citrumelo were performed. In asymptomatic petiole leaves, the presence of callose and the plugging of the pores were similar to the Mexican lime and Persian grafted onto 2x Swingle citrumelo (Suppl. Figure 1). The infections by HLB in control and infected trees grown in greenhouse conditions were tested by qPCR. As expected,

<table><caption>TABLE 1 Leaf physiological characterization of Mexican and Persian limes. Leaf greenness (SPAD unit), effective quantum yield of PSII (ΦPSII) within light-adapted leaves, measured in symptomatic leaf from Mexican and Persian limes, grafted onto 2x and 4x Swingle citrumelo rootstocks, respectively.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Scion</th><th colspan="2">Mexican lime</th><th colspan="2">Persian lime</th></tr><tr><th>Swingle citrumelo 2x</th><th>Swingle citrumelo 4x</th><th>Swingle citrumelo2x</th><th>Swingle citrumelo 4x</th></tr></thead><tbody><tr><td>Rootstock</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPAD (AU)</td><td>41.5 ± 5.98a</td><td>52.42 ± 4.6ab</td><td>56.28 ± 11.94b</td><td>59.13 ± 9.43b</td></tr><tr><td>QY (AU)</td><td>0.36 ± 0.13a</td><td>0.47 ± 0.01b</td><td>0.50 ± 0.13b</td><td>0.59± 0.06c</td></tr><tr><td>Fruit production (kg)</td><td>20.78 ± 2.35a</td><td>32.84 ± 4.11b</td><td>24.26 ± 4.71ab</td><td>27.38 ± 5.1ab</td></tr><tr><td>Fruit weight (g)</td><td>35.1 ± 0.8a</td><td>45.1 ± 1.75b</td><td>83.7 ± 1.65c</td><td>108.7 ± 2.6d</td></tr></tbody></table>

Fruit production and fruit weight after three years of plantation for the different scion/rootstock associations are also presented. Results are expressed as mean +SE (n = 5 to 20 measurements). ANOVA tests were performed to determine if HLB led to significant differences. Data with a different letter are statistically different. Results with Swingle citrumelo 2x are extracted from Sivager et al. (2021).
controls were negative, and trees infected by HLB were positive (Table 2). For infected trees, the titer of the bacterium of the bacterium using the Ct value quantified in 2x and 4x Swingle citrumelo rootstocks remained non-determined, as if the bacterium was not present independently of the ploidy level of the scion grafted on it. Investigations of the bacterial load at root level remain limited, and we did not find literature on CLas qPCR in Swingle citrumelo roots to compare with our results. Thus, a quantification of CLas in sour orange root has been done, which was previously shown to have high titer (Park et al., 2018). In that case, CLas titer was high in the petiole, with Cts being close to 18. The unexpected results obtained in 2x and 4x Swingle citrumelo may be explained by an absence of the bacterium or an inhibition of the qPCR. This last hypothesis is supported by FISH analysis using a probe targeted against CLas on the same amount of ground root material. Interestingly, fluorescence in the root of 2x Swingle citrumelo grafted with Persian lime was much higher than in root of 2x Swingle citrumelo grafted with Mexican lime (Suppl. Figures 2C, E). When grafted onto 4x Swingle citrumelo, the observed fluorescence was more limited (Suppl. Figures 2D, F). For CLas+ asymptomatic (AS) petiole leaves, the titer of the bacterium quantified in Persian lime trees was much lower than in Mexican lime trees (Ct of 28 versus 23; Table 2). Nevertheless, the use of 4x rootstock did not affect the titer of the bacterium in petioles.

Investigations were also performed at the microscopic and biochemical levels on trees grown in greenhouse conditions. Macroscopic pictures of secondary roots of CLas- and CLas+ rootstocks showed a browning of the root color due to the disease (Figure 1). Tetraploid Swingle citrumelo secondary roots are thicker than 2x Swingle citrumelo, with more limited numbers of very fine roots. Infection induced a degradation of fines roots in 2x Swingle citrumelo (Figures 1E, G versus C, A), whereas limited changes were observed in 4x Swingle citrumelo (Figures 1F, H versus D, B). To decipher the disease's impact in the phloem, scanning microscopy analyses were performed in the leaf petioles of the different genotypes. The root diameters and areas were greater in 4x Swingle citrumelo, than these were in 2x Swingle citrumelo (Table 3, Figure 2). In CLas- and CLas+ samples, the cortex, the phloem area, the xylem area, and the

central cylinder were also greater in 4x Swingle citrumelo, compared to 2x Swingle citrumelo. Interestingly, the infection caused a tissue and vessel collapse in the 2x secondary roots of the Mexican lime/2x Swingle citrumelo association tree but not in the 2x secondary roots of the Persian lime/2x Swingle citrumelo association (Figures 2B versus F; Table 3). Transversal SEM of 2x and 4x Swingle citrumelo secondary roots did not allow us to see the pores inside the walls of phloem cells (Suppl. Figure 3). Thus, longitudinal SEM were performed in CLas- and CLas+ secondary roots of 2x and 4x Swingle citrumelo (Figure 3). For the CLas- and CLas+ secondary roots, 2x Swingle citrumelo presented phloem cells and pores between cells that were smaller than in Swingle citrumelo 4x (Table 3; Figure 3). No callose deposition and starch grains was observed in CLas+ samples. Aniline blue staining in the same samples confirmed the absence of specific staining in the phloem and thus callose deposition in infected 2x and 4x secondary roots (Suppl. Figure 4). Investigations were performed by TEM in order to visualize the presence of CLas and its possible implication at the cellular level. Cross sections of phloem cells in CLas- samples indicated the presence of the pores allowing the transfer of the sap between cells (Figures 4A–F). As expected in 4x root samples, cell walls were thicker, with a mean thickness of 1104 ± 65 µm, compared to 654 ± 39 µm for 2x roots (Figures 4A–D respectively). In our hands, CLas was visible in CLas+ samples of 2x and 4x Swingle citrumelo rootstocks grafted with Mexican lime and Persian limes. Figures 4E, F illustrates the presence of CLas in 2x and 4x CLas+ Swingle citrumelo rootstocks grafted with Persian lime. CLas was present close to the pores and the cell walls. Degradation of cell walls was not obvious in 2x Swingle citrumelo rootstocks when compared to 4x.

## Electrochemical analysis of 2x and 4x secondary roots of Swingle citrumelo rootstocks infected by Huanglongbing

Cyclic voltammograms (CV) of roots of 2x and 4x Swingle citrumelo immersed in air-saturated aqueous phosphate buffer at pH 7.0 were studied. Figure 5 compares the CV of glassy carbon electrode (GCE) in 2x (Figures 5A, B) or 4x (Figures 5C, D) Swingle citrumelo roots grafted with Mexican lime

<table><caption>TABLE 2 Quantitative real-time PCR in roots of 2x and 4x Swingle citrumelo and petioles from Mexican and Persian limes of the control (CLas-) and infected samples (CLas+).</caption><thead><tr><th rowspan="2">Rootstock</th><th rowspan="2">Scion</th><th colspan="2">CLas-</th><th colspan="2">CLas+</th></tr><tr><th>Root</th><th>Petiole</th><th>Root</th><th>Petiole</th></tr></thead><tbody><tr><td>Swingle citrumelo 2x</td><td>Mexican lime</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td><td>22.58 ± 0.73a</td></tr><tr><td>Swingle citrumelo 2x</td><td>Persian lime</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td><td>26.51 ± 0.69b</td></tr><tr><td>Swingle citrumelo 4x</td><td>Mexican lime</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td><td>22.85 ± 0.45a</td></tr><tr><td>Swingle citrumelo 4x</td><td>Persian lime</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td><td>27.81 ± 0.30b</td></tr></tbody></table>

For petioles, asymptomatic leaves were selected. Ct results are expressed as mean +SE (n = 3) and ND means Not Determined. Data with a different letter are statistically different.
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**FIGURE 1**
Macroscopic pictures of 2x (A, C, E, G) and 4x (B, D, F, H) Swingle citrumelo rootstocks secondary roots in control (CLas-) and HLB infected (CLas+) trees. ML and PL mean Mexican lime ad Persian lime. Cit2x and Cit4x mean 2x Swingle citrumelo and 4x Swingle citrumelo. Bars = 1 cm.</figcaption></figure>

(Figures 5A, C) or Persian lime (Figures 5B, D) infected or not by HLB. For the analysis of grafted Swingle citrumelo reaction to the infection, we focused the study on the scanning of the potential in the negative direction (Figure 5). In the case of 2x Swingle citrumelo grafted with Mexican lime, healthy roots (Figure 5A, green curve) displayed a cathodic signal at ca. -1.0 V (C₁) and a weak anodic wave (A₁) ca. 0.7 V preceding a rising current at ca. 1.4 V corresponding to the second anodic signal (A₂) superimposed to the oxygen evolution reaction (OER). The cathodic signal C₁ is superimposed to the reduction of dissolved oxygen (Cox), as denoted by blank experiments at unmodified

GCE. In the case of cathodic scan of infected rootstocks (Figure 5B, red curve), a similar reduction signal in the same region of potentials than C₁ was detected with clearly lower intensity, while the anodic wave A₁ becomes also lowered. Similar reduction signals were detected in the case of 2x Swingle citrumelo grafted with Persian lime (Figure 5B). However, this signal is dramatically depleted in the CLas+ rootstocks. Figure 5C presents the cyclic voltammograms recorded for GCEs modified with films of 4x Swingle citrumelo secondary roots grafted with Mexican lime. Upon scanning the potential in the negative direction, healthy roots

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>**FIGURE 2**
Transversal SEM pictures of 2x (A, B, E, F) and 4x (C, D, G, H) roots of Swingle citrumelo rootstocks grafted with 2x or 3x limes infected or not by CLas. Full white arrows show the central cylinder (phloem & xylem) of the root, and empty white arrows show the root cortex. Bars = 0.5 mm.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>FIGURE 3
Longitudinal SEM of 2x (A, B, E, F) and 4x (C, D, G, H) root phloem cells of Swingle citrumelo rootstocks grafted with 2x or 3x limes infected (CLas+) or not (CLas-). White arrows indicate the pores in the phloem cell wall. Bars = 15 µm.</figcaption></figure>

present two cathodic signals at approximately -0.8 (C₂) and -1.35 (C₃) V. These signals appear at potentials clearly different from those for the signal C₁ recorded with the 2x Swingle citrumelo CVs. The voltammograms of the infected rootstocks show a decrease in the intensity of the peak C₂ and the disappearance of the peak C₃, which is apparently substituted by a cathodic signal at -1.45 V(C₄). Finally, cyclic voltammograms were recorded at GCEs modified with the

films of roots of 4x Swingle citrumelo grafted with Persian lime (Figure 5D). Cathodic signals at approximately -0.8 (C₂) and -1.35 (C₂) V were recorded again. In CLas+ trees, a new signal at ca. -0.95 V (C₅) appeared, replacing the signals of the healthy sample (C₂ and C₃). The signal C₄ appearing at 4x Swingle citrumelo grafted with Mexican lime (Figure 5C) was entirely absent here; whereas, the strong A2 + OER signal was considerably decreased in 2x Swingle citrumelo grafted with

<table><caption>TABLE 3 Anatomical characterization of 2x or 4x Swingle citrumelo Swingle rootstock grafted with Mexican lime or Persian lime, infected (CLas+) or not (CLas-) by Candidatus Liberibacter asiaticus.</caption><thead><tr><th rowspan="3"></th><th colspan="4">CLas-</th><th colspan="4">CLas+</th></tr><tr><th colspan="2">Mexican lime</th><th colspan="2">Persian lime</th><th colspan="2">Mexican lime</th><th colspan="2">Persian lime</th></tr><tr><th>Cit 2x</th><th>Cit 4x</th><th>Cit 2x</th><th>Cit 4x</th><th>Cit 2x</th><th>Cit 4x</th><th>Cit 2x</th><th>Cit 4x</th></tr></thead><tbody><tr><td>Roots diameter<br>(mm ± SE)</td><td>2.0 ± 0.3<br>b</td><td>3.2 ± 0.2<br>c</td><td>2.1 ± 0.2<br>b</td><td>3.6 ± 0.2<br>c</td><td>1.3 ± 0.1<br>a</td><td>3.7 ± 0.2<br>c</td><td>1.9 ± 0.2<br>b</td><td>3.5 ± 0.1<br>c</td></tr><tr><td>Roots area (µm² ± SE)</td><td>1844228 ±<br>137256<br>b</td><td>4061130 ±<br>5525<br>c</td><td>2282794 ±<br>650487<br>b</td><td>4418763 ±<br>387606<br>c</td><td>1245116 ±<br>169565<br>a</td><td>4456783 ±<br>512842<br>c</td><td>1730391 ±<br>187135<br>ab</td><td>43188613 ±<br>430822<br>c</td></tr><tr><td>Cortex area (µm² ± SE)</td><td>1638197 ±<br>117490<br>b</td><td>3493397 ±<br>155576<br>d</td><td>2000482 ±<br>572185<br>bc</td><td>3847399 ±<br>246901<br>d</td><td>1007908 ±<br>147775<br>a</td><td>4460485 ±<br>314249<br>d</td><td>1912855 ±<br>49466<br>c</td><td>3712759 ±<br>350772<br>d</td></tr><tr><td>Phloem area (µm² ± SE)</td><td>50117 ±<br>7018 ab</td><td>168679 ±<br>48079<br>d</td><td>66560 ±<br>16565<br>b</td><td>100230 ±<br>6637<br>c</td><td>42938 ±<br>3384<br>a</td><td>240533 ±<br>33692<br>d</td><td>72616 ±<br>2909<br>b</td><td>163728 ±<br>20463<br>d</td></tr><tr><td>Phloem cell area (µm² ± SE)</td><td>444 ± 43<br>a</td><td>637 ± 59<br>b</td><td>458 ± 18<br>a</td><td>705 ± 62<br>b</td><td>890 ± 103<br>b</td><td>804 ± 64<br>b</td><td>839 ± 97<br>b</td><td>877 ± 106<br>b</td></tr><tr><td>Area of the pores of phloem cells<br>(µm² ± SE)</td><td>1.1 ± 0.2<br>a</td><td>2.1 ± 0.1<br>b</td><td>1.4 ± 0.1<br>a</td><td>2.2 ± 0.2<br>b</td><td>1.5 ± 0.1<br>a</td><td>2.2 ± 0.1<br>b</td><td>1.2 ± 0.1<br>a</td><td>2.3 ± 0.1<br>b</td></tr><tr><td>Xylem area (µm² ± SE)</td><td>65404 ±<br>3574<br>a</td><td>260109 ±<br>61723<br>c</td><td>126557 ±<br>19918<br>b</td><td>294223 ±<br>60531<br>c</td><td>67196 ±<br>2474<br>a</td><td>393654 ±<br>58604<br>c</td><td>111796 ±<br>5548<br>b</td><td>316340 ±<br>57269<br>c</td></tr><tr><td>Central cylinder area (µm² ± SE)</td><td>164687 ±<br>17597<br>a</td><td>404791 ±<br>80462<br>b</td><td>167617 ±<br>22661<br>a</td><td>387409 ±<br>24934<br>b</td><td>132275 ±<br>6643<br>a</td><td>494866 ±<br>66518<br>b</td><td>218919 ±<br>12855<br>a</td><td>429525 ±<br>31188<br>b</td></tr></tbody></table>

Results are express as the mean ± SE (n = 8 to 25). ANOVA tests were performed to determine if HLB led to significant differences. Data with a different letter are statistically different. Cit2x means 2x Swingle citrumelo and cit4x means 4x Swingle citrumelo.
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>FIGURE 4</figcaption></figure>

Transmission electron microscopy of phloem sieve plate in 2x (A, B) and 4x (C, D) roots of Swingle citrumelo grafted with Mexican lime and Persian lime infected (CLas+) by CLas. White arrows in pictures (A-D) indicate pores in the cell wall that are opened and not plugged by callose (A-C). Visualization of CLas (black arrows) in 2x (E) and 4x (F) CLas+ root samples of Swingle citrumelo grafted with Persian lime.

Persian lime (Figure 5B). Interestingly, the C5 peak is essentially coincident with the peak C1 recorded for 2x forms (Figures 1B, 5A).

## Polyphenol content and tissue structure in 2x and 4x secondary roots of Swingle citrumelo rootstocks infected by Huanglongbing

Polyphenol contents were estimated in 2x and 4x Swingle citrumelo roots infected by HLB and in control samples. In CLas- the polyphenol contents were limited (<30 µg/mL) but

were all higher in 4x rootstocks, compared to 2x rootstocks (Figure 6). Interestingly, trees grafted with Persian lime presented greater polyphenol contents in roots than when grafted with Mexican lime. In CLas+ root samples, polyphenols contents were dramatically increased. Tetraploid rootstocks displayed a greater increase, compared to 2x. Finally, the scion also influenced the polyphenols contents in CLas+ 2x and 4x Swingle citrumelo rootstocks: a two-fold increase of the polyphenol root contents were measured when grafted with Persian lime, compared to Mexican lime, regardless of the rootstock's ploidy level (Figure 6).
<figure><img src="image_31.png" /></figure>

FIGURE 5
CV profiles of 2x or 4x roots of Swingle citrumelo rootstocks grafted with Mexican lime or Persian lime infected (CLas+, red curves) or not (CLas-, green curves). (A) Mexican lime/2x Swingle citrumelo; (B) Persian lime/2x Swingle citrumelo; (C) Mexican lime/4x Swingle citrumelo; (D) Persian lime/4x Swingle citrumelo. Potential scan initiated at 0.0 V in the negative direction; potential scan rate 10 mV s⁻¹.

# Discussion

## Anatomical differentiation between Mexican lime and Persian lime trees grafted on 2x and 4x Swingle citrumelo

In the field, when grafted onto Swingle citrumelo 2x, infected Persian lime scion showed higher growth, compared to infected Mexican lime scion (Sivager et al., 2021). Such phenotypic differentiation associated with polyploidy has been reported in numerous studies (for review, see Ruiz et al., 2020). Among them, one may indicate greater cell sizes, organ sizes, and higher leaf greenness (Mouhaya et al., 2010; Allario et al., 2011; Sivager et al., 2021). In our hands, when grafted onto 4x Swingle citrumelo compared to 2x Swingle citrumelo, the fruit production in the third year of plantation were similar or higher for Persian lime and Mexican lime. This result may be related to the beneficial impact of the ploidy of the rootstock regarding HLB since it had been previously reported that the tetraploidy of the rootstock would drastically limit the cumulative fruit production of clementine compared to the production onto the respective diploid (Hussain et al., 2012). Fruit weight was significantly higher for both limes when grafted onto 4x Swingle citrumelo compared to 2x Swingle citrumelo.

Similar results were reported in citrus by Hussain et al. (2012) and in other plant species (Ruiz et al., 2020). When grafted onto 4x Swingle citrumelo, the height of Mexican lime and Persian lime scions were smaller than when grafted onto the respective 2x Swingle citrumelo, as previously observed (Hussain et al., 2012). Previous investigations showed that the polyploidy in rootstocks and canopies has an antagonist effect on photosynthetic and respiratory function. The photosynthetic activities of 4x seedlings (Allario et al., 2011) and 2x sweet orange grafted on 4x rootstocks (Allario et al., 2013) were shown to be reduced, compared to plants with 2x root systems. This reduction was associated with higher constitutive ABA biosynthesis in 4x roots (Allario et al., 2013). In the field, it has been also showed that the tree size reduction in clementine scion, which was related to the use of 4x rootstocks, was indeed related to more limited photosynthesis activity (Hussain et al., 2012).

The investigation of secondary roots of 2x and 4x Swingle citrumelo showed the 4x were thicker and less numerous than those in 2x (Figures 1, 2, Table 3), as previously mentioned (Allario et al., 2011; Oliveira et al., 2017). Such a phenotype has been associated in 4x Swingle citrumelo with better tolerance to abiotic stress, such as water deficit, when investigated in potted conditions (Allario et al., 2013).
## Anatomical characterization at scion and secondary roots levels in 2x and 4x Swingle citrumelo grafted with Mexican and Persian lime cultivars grown under HLB stress

Previous observations in the field showed that the Persian lime trees were much less affected than Mexican lime trees regarding HLB, which fits other observations (Deng et al., 2019; Sivager et al., 2021). This tolerance was associated with the maintenance of vigorous growth and fruit yield. In greenhouse conditions, it has been observed that, when grafted onto 2x Swingle citrumelo, infected Mexican lime leaves were much more yellow than Persian lime leaves (Sivager et al., 2021). Interestingly, Mexican lime leaf yellowing and leaf mottling were more limited when grafted onto 4x Swingle citrumelo rootstock, suggesting a beneficial impact regarding rootstock HLB on the scion. The greater values of SPAD and effective quantum yield of PSII measured in symptomatic leaves of Mexican and Persian limes grafted onto 4x Swingle citrumelo, compared to the respective 2x Swingle citrumelo, are in agreement with this hypothesis (Table 1). Koh et al. (2012) showed that HLB leads to increased callose synthesis in the phloem vessels, resulting in clogging of the pores at the sieve plate between cells (Achor et al., 2010; Sivager et al., 2021). The specific phenology of the Persian lime, with a slower plugging of phloem cell pores and a better phloem regeneration observed in Bearss lemon (Deng et al., 2019), is in agreement with a longer leaf lifetime of that genotype, compared to the Mexican lime genotype (Sivager et al., 2021). However, it is important to note that the genetic origin of the

Persian lime (it is a hybrid between a Mexican lime and a lemon) may also explain in part the observed better tolerance of that genotype as previously mentioned by Sivager et al. (2021). Investigation by SEM of CLas+ petiole asymptomatic phloem cells of Mexican and Persian limes grafted onto 4x Swingle citrumelo did not indicate a more limited clogging of the pores, compared to the same scions grafted onto 2x Swingle citrumelo, suggesting that the callose deposition was not impacted by the rootstock ploidy status. Thus, we investigated the impact of HLB at the root level. Interestingly, HLB induced a browning of the root color, with a degradation of fines roots in 2x Swingle citrumelo that was much more significant than it was in 4x Swingle citrumelo (Figure 1). To verify whether the 4x in the root may favor a better adaption to HLB due to more limited intercellular sieve pore plugging, we performed SEM. Transversal cross sections did not indicate the pores in the secondary root phloem cells because of their longer size and the limited chance to cut at the right place when preparing the samples (Suppl. Figure 3). Indeed, the length of phloem cells were often > 150 µm, favoring long distance transport of the sap without cell walls to cross. Longitudinal SEM of secondary roots confirmed that phloem cells and sieve plate pores of 4x Swingle citrumelo were larger than those of 2x Swingle citrumelo were. In HLB-infected secondary roots, the phloem cell sieve pores were not obstructed by callose deposition, whatever the ploidy status of the rootstock, as previously reported (Achor et al., 2020). According to these authors (Achor et al., 2020), the maintaining phloem sap flux due to non-callose deposition at the sieve plate of the phloem cells explains why the roots would be a bacterial reservoir. Thus, root degradation would more likely relate

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>FIGURE 6
Polyphenols content in 2x and 4x roots of Swingle citrumelo rootstocks grafted with Mexican lime and Persian lime infected (CLas+) or not (CLas-). Cit2x and Cit4x mean 2x swingle citrumelo and 4x swingle citrumelo, respectively. Data with a different letter are statistically different. Vertical bars indicate the mean value ± SE.</figcaption></figure>
to a direct impact of the bacterium than to perturbation of sieve flux. Furthermore, better phloem regeneration in tolerant genotypes, as proposed by Deng et al. (2019), may also occur in 4x roots and may favor adaptation to HLB.

## Differential response to oxidative stress in Mexican and Persian limes

Oxidative stress genes coding for antioxidant enzymes were shown to be upregulated in HLB-susceptible citrus, compared to tolerant citrus (Tang and Vashisth, 2020), which induces mature-fruit drop in HLB-infected citrus trees. Previous results showed that, in Persian lime, detoxification processes favored the maintenance of the phloemic flow in the plant and, thus, resulted in a better HLB-tolerance (Sivager et al., 2021). In Persian lime leaves, greater malondialdehyde (MDA) contents and stronger ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) activities were measured, compared to Mexican limes.

The voltammetry of immobilized microparticles (VIMP) is a solid state electrochemical technique (Scholz and Meyer, 1998; Scholz et al., 2014), which is capable of providing analytical information on a variety of sparingly soluble solids (Doménech-Carbó et al., 2013). VIMP method has been applied to test antioxidant properties of fruits and vegetables (Komorsky-Lovrić and Novak, 2011), to screen impurities in herbal remedies (Doménech-Carbó et al., 2013), and to test the reactivity of plant compounds with ROS (Doménech-Carbó et al., 2015). The use of VIMP was previously described for defining electrochemolomic profiles at the taxonomic level (Doménech-Carbó et al., 2015) and for monitoring plant defense responses to external stress (Doménech-Carbó et al., 2015). An evaluation of the voltammetric response in 2x and 4x Swingle citrumelo rootstock of infected and control trees in order to decipher the induced oxidative stress was performed. In Figure 5A, the voltammetric response can be interpreted in terms of the reduction ($C_1$) and oxidation ($A_1$) of electroactive components of 2x Swingle citrumelo grafted with Mexican lime that became totally or partially inactivated upon infection, so that the $C_1$ wave is abruptly lowered. In 2x Swingle citrumelo grafted with Persian lime (Figure 5B), the dramatic decrease of the signal in the CLas+ rootstocks suggests that (i) antioxidant components oxidizable at high potentials are promoted in Persian lime/2x Swingle citrumelo relative to those in Mexican lime/2x Swingle citrumelo, and (ii) such antioxidant components are quite sensitive to the infection.

Cyclic voltammograms in roots of 4x Swingle citrumelo grafted with Mexican lime showed signals at potential clearly different than the signal $C_1$ recorded with the 2x Swingle citrumelo CVs (Figure 5C). Accordingly, these signals can be attributed to the reduction of different natural products. The voltammograms of the infected rootstocks show a decrease in the intensity of the peak $C_2$ and the disappearance of the peak $C_3$, which is apparently substituted by a cathodic signal at -1.45

$V(C_4)$. These results are an agreement with a higher tolerance to HLB of 4x Swingle citrumelo, compared to 2x rootstocks. In this case, the $A_2$ plus OER signal is high, but compared to the 2x Swingle citrumelo/Persian lime, the infection does not decrease its intensity (Figure 5C). As these are reduction peaks, the compound(s) responsible for the signals C1, C2, and C3 are not antioxidants (they should be easily oxidized); rather, these compounds would be "antireductants."

In 4x Swingle citrumelo grafted with Persian lime, the cyclic voltammograms recorded at GCEs modified with the films of roots of 4x Swingle citrumelo (Figure 4D) showed that the cathodic region of the voltammograms of 4x Swingle citrumelo forms clearly differ from that of the 2x forms. This cathodic region was much more sensitive to infection by HLB than the corresponding region of the 2x ones were. Thus, this strong modification confirms the higher reactivity of 4x Swingle citrumelo against HLB infection. The anodic regions of the infected grafted forms (2x and 4x) experience sharp differences with the anodic region of the corresponding pristine forms.

Polyphenol contents analysis in 2x and 4x Swingle citrumelo rootstocks were very contrasted (Figure 6). If in CLas- root samples polyphenol contents were quite low, 4x presented higher contents, than those in 2x, whatever the scion. Those results would be in agreement with preadaptation to stress by limiting oxidative stress as previously proposed for polyploid genotypes (Allario et al., 2013; Khalid et al., 2021; Lourkisti et al., 2022). Interestingly, HLB infections led to a 10-fold increase of the polyphenol contents in 4x rootstocks, compared to 2x. As polyphenols play a crucial role in plant-environmental adaptation because of their role in biotic (Cheynier et al., 2013) and abiotic stress (Cheruiyot et al., 2007; Šamec et al., 2021; Tuladhar et al., 2021) defense, which is commonly attributed to their antioxidant activity (Martinelli et al., 2016), polyphenol may contribute to the better adaptation of polyploidy to HLB. The increase was even stronger when 4x rootstock was grafted with triploid Persian lime, underlining the importance of the polyploid rootstock-scion interactions as a tool to limit the oxidative stress induced by HLB. Finally, due to the TEM investigations performed in the root phloem cells, the presence of CLas in infected 2x and 4x Swingle citrumelo secondary roots was clearly demonstrated. However, this method was not adapted to quantify the bacterium within the tissues and did not indicate a link between cell wall degradation and membrane perturbation to detoxification processes, as was observed in the 4x root (Figure 4).

## Conclusion

In the field, the Persian grafted onto 2x Swingle citrumelo showed to be much more tolerant to HLB, compared to the Mexican lime (Sivager et al., 2021). In this present article, we investigated the same scion-varieties grafted onto 2x and 4x Swingle citrumelo, and we focused our investigation at the root
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>FIGURE 7</figcaption></figure>

Impact of polyploidy at the rootstock and scion levels regarding different phenotypic traits modified by HLB. Scion/rootstock associations are evaluated in control (CLas-) and HLB infected trees (CLas+). AS leaf means asymptomatic leaf, and S leaf means symptomatic leaf. Data in the 2x and 3x scions grafted onto 2x rootstock are extracted from (Sivager et al., 2021).

compartment. Anatomical, physiological, and biochemical differentiations due to ploidy variation explain a large part of the better behavior of 3x scion/(4x/2x) Swingle citrumelo rootstock associations (Figure 7). Indeed, if the pores of 2x and 4x phloem root cells were not plugged by callose in CLas+ samples, oxidative stress in 2x roots was much more damaging and was associated with lower polyphenols contents, which may explain the greater root degradation observed in 2x scion/2x Swingle citrumelo rootstock associations. Interestingly, these findings demonstrate that the scion strongly impacts the tolerance to HLB, which is improved when associated with 4x Swingle citrumelo rootstock. To confirm the interest of polyploidy as a source of better tolerance to HLB, it would be required to investigate other 4x rootstock genotypes and 3x scion varieties. Investigations are also needed to decipher the molecular determinants of the better HLB-tolerance of 4x Swingle citrumelo rootstock and 3x Persian lime scion, as well as the polyploid scion/rootstock interactions.

## Data availability statement

The original contributions presented in the study are included in the article/Supplementary Materials. Further inquiries can be directed to the corresponding author.

## Author contributions

GS, LC, SB, RB, and BH performed the experiments and collected the physiological data. GS, AD-C, GC-T, and RM performed the statistical analyses, interpreted the results, and drafted the manuscript. GS and OG performed the analyses by SEM and TEM. BH and OG helped to draft the manuscript. All authors contributed to the article and approved the submitted version.

## Funding

GS and LC were supported by the “Collectivité Territoriale de Martinique” and the “Région Guadeloupe.” Investigations were supported by the “TROPICSAFE” project funded by European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under grant agreement No. 727459 and the “CAVALBIO” project funded by FEDER and the Guadeloupe Region (2015–2021).

## Acknowledgments

The data presented have been presented in the D.3.4 report (Morillon et al., 2022) of the “TROPICSAFE” project that granted our research (European Union’s Horizon 2020 research and innovation program under grant agreement No. 727459).

## Conflict of interest

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

## Publisher’s note

All claims expressed in this article are solely those of the authors and do not necessarily represent those of their affiliated organizations, or those of the publisher, the editors and the reviewers. Any product that may be evaluated in this article, or claim that may be made by its manufacturer, is not guaranteed or endorsed by the publisher.

## Supplementary material

The Supplementary Material for this article can be found online at: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.1030862/full#supplementary-material
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5. Chapitre 3 : L'expression des génomes des agrumes polyploïdes est-elle à l'origine de leur meilleure tolérance face au HLB par rapport aux diploïdes ?
**5.1. Contexte**

Dans le cadre du **Chapitre 3** de cette thèse, l'étude a été réalisée sur les différentes associations présentées dans le **Chapitre 2**.

Dans cette partie, nous avons voulu vérifier si l'expression des génomes des polyploïdes apporte un certain avantage par rapport à la maladie du HLB. Pour cela nous avons réalisé des analyses RNAseq. En condition contrôle, il nous est apparu intéressant de vérifier si les polyploïdes exprimaient spécifiquement certains gènes de manière constitutive face au HLB. De plus, il était également important de vérifier si une interaction entre porte-greffe et greffon pouvait-être mise en évidence et si chacun des compartiments des plants étudiés pouvait apporter un avantage supplémentaire en fonction de leur niveau de ploïdie.

Il a été démontré depuis plusieurs années que le gène *NPR1* a une importance dans l'accumulation de l'acide salicylique. De ce fait, il nous a paru intéressant de vérifier si des hormones comme SA ou encore JA étaient impliquées dans la meilleure tolérance au stress induit par le HLB et si la polyploïdie et le HLB modulait les concentrations de ces hormones.

**5.2. Résultats**

**5.2.1. Analyse RNAseq**

**5.2.1.1. Analyse générale**

Après l'extraction des ARN et la réalisation des banques, celles-ci ont été séquencées.
Il a été possible d'analyser les gènes différentiellement exprimés (GDE) pour les différents plants en condition témoin versus condition malade.

Le diagramme de Venn pour les feuilles (Figure 21A) de plants 2x et 3x a montré que plus le niveau de ploïdie augmentait, plus il y avait une diminution du nombre de GDE. En effet, il est possible d'observer pour la :

- Liste 1 : LT/Cit2x stress vs LT/Cit2x ctrl, 326 GDE

- Liste 2 : LT/Cit2x stress vs LT/Cit2x ctrl, 337 GDE

- Liste 3 : LM/Cit4x stress vs LM/Cit2x ctrl, 144 GDE

- Liste 4 : LM/Cit4x stress vs LM/Cit2x ctrl : 44 GDE.

Pour celui concernant les racines (figure 21B), le même schéma est observable avec le compartiment racinaire pour la :

- Liste 1 : 425 GDE

- Liste 2 : 373 GDE

- Liste 3 : 309 GDE
- Liste 4 : 208 GDE.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 21 - Diagramme de Venn pour les feuilles (A) de greffons de limettiers 2x et 3x et pour les racines de porte-greffes Citrumelo 2x et 4x</figcaption></figure>

Ces résultats montrent qu'il y a une surexpression ou une sous-expression de certains gènes causés par la maladie du HLB et également un lien avec le niveau ploïdie.

Suite à ces résultats une catégorisation fonctionnelle (figure 22) a été faite à partir du logiciel WEGO (https://wego.genomics.cn/) et 3 grands groupes ont pu être obtenus :

- Composant cellulaire

- Fonction moléculaire

- Processus biologique.
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 22 - Catégorisation fonctionnelle de gènes différentiellement exprimés d'une comparaison entre plants infectés ou non par Las</figcaption></figure>

Grâce à cette catégorisation, dans le cadre d'une comparaison témoin/malade, il est possible d'observer des GDE impliqués dans des processus métaboliques cellulaires ou encore dans des processus d'oxydo-réduction.
### 5.2.1.2. Analyse subjective de gènes impliqués dans le développement et la défense des plantes

Les gènes étudiés ont été sélectionnés par rapport aux données obtenues dans les Chapitre 1 et Chapitre 2.

<table><caption>Tableau 2 – Impact du HLB et de la polyploïdie sur l'expression de certains gènes intervenant dans le développement et la défense des plantes. L'expression de chaque gène est indépendante et ne signifie pas qu'un même nombre de signes + confère une expression de la même importance. + : présence d'expression de gènes et - : une absence d'expression ; les colonnes grises : les plants infectés (Las+) et les blanches : les plants témoins (Las-); les signes noirs : expression chez les plants diploïdes et les signes rouges : expressions chez les plants polyploïdes.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2"></th><th colspan="2">F ; Las-</th><th colspan="2">F ; Las+</th><th colspan="2">F ; Las-</th><th colspan="2">F ; Las+</th><th colspan="2">R ; Las-</th><th colspan="2">R ; Las+</th><th colspan="2">R ; Las-</th><th colspan="2">R ; Las+</th></tr><tr><th colspan="2">Cit2x</th><th colspan="2">Cit2x</th><th colspan="2">Cit4x</th><th colspan="2">Cit4x</th><th colspan="2">LM</th><th colspan="2">LM</th><th colspan="2">LT</th><th colspan="2">LT</th></tr><tr><th></th><th></th><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th></tr></thead><tbody><tr><td>HSP20-like chaperones superfamily protein</td><td>Ciclev10022300m.g</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>++++</td><td>++++</td><td>-</td><td>-</td><td>++++</td><td>+++</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Ascorbate peroxidase 2</td><td>Ciclev10012554m.g</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>+</td><td>++</td><td>+++</td><td>+++</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>++</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>Auxin-induced in root cultures 1</td><td>Ciclev10024106m.g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>++</td><td>++</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>+++</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>Lipoxigenase 3</td><td>Ciclev10024819m.g</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>+++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>+++</td><td>++</td><td>+++</td></tr><tr><td>Cytochrome P450 superfamily</td><td>Ciclev10018297m.g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>+++</td><td>+++</td><td>+</td><td>+</td><td>+++</td><td>+++</td><td>-</td><td>+</td></tr><tr><td>Ethylene-forming enzyme</td><td>Ciclev10015965m.g</td><td>+</td><td>+++</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>+</td><td>++</td><td>+++</td><td>+++</td><td>++</td><td>++</td><td>+++</td><td>+++</td><td>++</td><td>++</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th rowspan="3"></th><th rowspan="3"></th><th colspan="2">F ; Las-</th><th colspan="2">F ; Las+</th><th colspan="2">F ; Las-</th><th colspan="2">F ; Las+</th><th colspan="2">R ; Las-</th><th colspan="2">R ; Las+</th><th colspan="2">R ; Las-</th><th colspan="2">R ; Las+</th></tr><tr><th colspan="2">Cit2x</th><th colspan="2">Cit2x</th><th colspan="2">Cit4x</th><th colspan="2">Cit4x</th><th colspan="2">LM</th><th colspan="2">LM</th><th colspan="2">LT</th><th colspan="2">LT</th></tr><tr><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>LM</th><th>LT</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th><th>Cit2x</th><th>Cit4x</th></tr></thead><tbody><tr><td>NPR1-like protein 3</td><td>Ciclev10031343m.g</td><td>+</td><td>++</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>+</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td><td>++</td></tr><tr><td>WRKY DNA-binding protein 35</td><td>Ciclev10021624m.g</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>++</td><td>++</td><td>+++</td><td>+++</td><td>++</td><td>++</td><td>+++</td><td>+++</td></tr><tr><td>Acclimation of photosynthesis to environment</td><td>Ciclev10012434m.g</td><td>++</td><td>+++</td><td>+</td><td>++</td><td>++</td><td>+++</td><td>+</td><td>++</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>
La catégorisation fonctionnelle (figure 22) montre que certains gènes sont sous ou surexprimés dans les feuilles de greffons 2x ou 3x ainsi que dans les racines de porte-greffes 2x ou 4x et que ces gènes se regroupent par famille.

Dans le tableau 2, certains gènes ayant une importance dans le développement ou encore la défense des plantes ont été sélectionnés. Il est possible d'observer une diminution de l'expression du gène *Ciclev10012554m.g* codant l'ascorbate peroxidase 2 au niveau des racines de porte-greffes de Citrumelo 2x et 4x. En revanche, au niveau des feuilles, l'APX2 semble augmenter et notamment pour l'association LT/Cit4x.

Concernant la HSP20-like protein *Ciclev10022300m.g*, au niveau racinaire et en condition témoin (R ; Las-), pour l'ensemble des associations, l'expression semble importante. En revanche, pour les plants malades (R ; Las+), une diminution considérable de cette protéine est observée suggérant une régulation par la maladie. Au niveau des feuilles 2x et 3x, en condition témoin et pour les plants malades, l'expression est relativement faible. Néanmoins, lorsque le niveau de ploïdie est le plus élevé (LT/Cit4x), cette expression semble plus élevée contrairement au reste des associations.

L'observation de la meilleure expression de certains gènes pour l'association LT/Cit4x (F ; Las+) se répète avec les gènes « ethylene-forming enzyme » *Ciclev10015965m.g*, ou encore l'analogue du gène *NPR1*, « NPR1-like protein 3 » *Ciclev10031343m.g*. De plus, il semble avoir une surexpression de ces gènes pour la variété LT contrairement à la variété LM, peu importe le porte-greffe. Au niveau racinaire, aucune différence n'a pu être mise en évidence pour l'analogue de *NPR1*. En revanche, pour le gène codant l'ethylene-forming enzyme (*Ciclev10015965m.g*), même si aucune différence d'expression n'existe entre racines de porte-greffes 2x et 4x, une sous-expression du gène est observée quand les plants sont infectés par la maladie, ceci en comparaison avec les plants témoins.

Il n'existe aucune expression des gènes « auxin-induced in roots culture 1 » *Ciclev10024106m.g*, et « cytochrome P450 superfamily » *Ciclev10018297m.g*, dans les feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti peu importe la condition. En revanche, une sous-expression est observée lors de l'infection au HLB au niveau des racines de porte-greffes 2x et 4x.

Une expression faible est notée chez les feuilles de limettiers 2x et 3x, concernant la lipoxigenase 3, *Ciclev10024819m.g*. De plus, l'expression de ce gène semble être plus importante chez les racines 4x par rapport aux racines 2x. Néanmoins, en condition Las+, une diminution de l'expression peut être observée dans les deux cas, sans différence significative entre racines 2x et 4x.
Concernant le gène WRKY35 *Ciclev10021624m.g*, bien qu'il semble présenter une faible expression au niveau foliaire, au niveau des racines des porte-greffes, une augmentation de cette expression est observable en présence de Las+ par rapport aux plants témoins. Cependant, aucune différence n'a pu être constatée entre racines de porte-greffes 2x et 4x.

Enfin, pour le gène *Ciclev10012434m.g*, aucune expression n'est notable dans les racines mais pour les feuilles une différence peut être observée entre limettier 2x et 3x, où l'expression est plus forte chez les 3x en conditions témoin. En condition Las+, une diminution de l'expression est observée, mais celle-ci reste plus forte chez les limettiers 3x par rapport aux 2x.

### 5.2.1.3. Création de réseaux de gènes issus des feuilles de limettiers 2x et 3x et des racines de porte-greffes 2x et 4x

Après obtention des différents clusters (portant différents noms de couleur) par analyse R, la création de réseaux de gènes a été faite sur le logiciel Cytoscape® afin d'analyser l'expression des gènes dans des catégories bien précises. Une surexpression ou une sous-expression est représentée par une coloration (p value) jaune à orange en fonction de l'intensité de l'expression en comparant deux conditions bien précises.

Les premiers réseaux de gènes (figure 24 et 25) ont été obtenus à l'aide du cluster intitulé Turquoise (figure 23).

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 23 - Cluster "Turquoise" obtenu sous R de feuilles de limettiers 2x et 3x greffés respectivement avec un porte-greffe citrumelo 2x et 4x en condition malade (orange ; Las+) et témoin (bleu ; Las-).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 24 – Réseau de gènes surexprimés après analyse de feuilles de limettier Tahiti greffé avec citrumelo 2x en comparant la condition malade par rapport à celle témoin dans le cluster Turquoise. Les cercles colorés indiquent l'intensité de la surexpression.</figcaption></figure>

Le réseau de gènes de la comparaison LT/Cit2x (Las+) vs LT/Cit2x (Las-) indique qu'il y a une surexpression de gènes pour LT/Cit2x (Las+) par rapport à la condition témoin (figure 24). Les catégories où il y a cette surexpression de gènes sont celles appartenant aux processus métabolique, de biosynthèse de peptides ou encore d'amides, la traduction ou encore l'expression des gènes.
<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Figure 25 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de feuilles de limettier Mexicain greffé avec citrumelo 4x et citrumelo 2x en condition malade dans le cluster Turquoise. Les cercles colorés indiquent l'intensité de la surexpression.

La **figure 25** montre un réseau de gènes qui compare LM/Cit4x vs LM/Cit2x en condition Las+. Ce réseau indique qu'il y a une surexpression de gènes qui interviennent dans la réparation des cassures double brins dans les feuilles de LM lorsque le porte-greffe associé est un porte-greffe 4x.

Le prochain réseau de gènes a été obtenu en analysant les gènes du cluster Magenta (**figure 26**) sur le logiciel Cytoscape®.

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Figure 26 - Cluster "Magenta" obtenu sous R de feuilles de limettiers 2x et 3x greffés respectivement avec un porte-greffe citrumelo 2x et 4x en condition infecté (orange ; Las+) et témoin (bleu ; Las-).
<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 27 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de feuilles de limettier Tahiti greffé avec citrumelo 2x en comparant la condition infectée par rapport à celle témoin dans le cluster Magenta. Les cercles colorés indiquent l'intensité de la surexpression</figcaption></figure>

Dans le cluster Magenta, tout comme dans la **figure 26**, il y a une surexpression de gènes pour la variété LT/Cit2x en condition Las+ par rapport à celle témoin (**figure 27**). De plus, même s'il semble y avoir plus de catégories de gènes surexprimés, globalement ces catégories sont les mêmes.

Au niveau des racines de porte-greffes, différents réseaux de gènes ont pu être obtenus dans le cluster Brown (**figure 28**).

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 28 - Cluster "Brown" obtenu sous R de racines de porte-greffes 2x et 4x greffés respectivement avec des limettiers 2x et 3x en condition malade (orange ; Las+) et témoin (bleu ; Las-).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 29 - Réseau de gènes sous-exprimés après analyse de racines de porte-greffe citrumelo 2x greffé avec LT 3x et LM 2x en comparant la condition infectée dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la sous-expression.</figcaption></figure>

Sur la figure 29, il est mis en évidence une sous-expression de gènes impliqués dans la phosphorylation des protéines dans les racines de porte-greffes greffés à la variété 3x par rapport aux racines de porte-greffes 2x greffés à la variété 2x. Néanmoins, d'autres comparaisons ont montré une surexpression de gènes impliqués dans la phosphorylation de protéines (voir annexes 1, 2 et 3) pour :

- LT/Cit2x par rapport LM/Cit2x en condition témoin

- LT/Cit4x par rapport LM/Cit4x en condition témoin

- LM/Cit4x par rapport LM/Cit2x en condition témoin

De plus, tout comme pour la partie foliaire où il y a une surexpression de gènes impliqués dans la biosynthèse de peptide, une surexpression est retrouvée dans les racines de porte-greffes 2x greffés avec LT comparé aux racines 2x lorsque le greffon est LM en condition Las+ (figure 30).
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 30 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffte citrumelo 2x greffé avec LT 3x et LM 2x en comparant la condition dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent l'intensité de la surexpression.</figcaption></figure>

### 5.2.2. Résultats des dosages hormonaux

Les hormones dosées dans les feuilles et les racines étaient les suivantes : ABA (acide abscissique), cis-ZR (cis zeatine-ribose), IPR (adenine-riboside), JA (acide jasmonique) et SA (acide salicylique).
<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>5.2.2.1. Résultats de dosage de phytohormones au niveau des greffons de limettiers diploïdes et triploïdes</figcaption></figure>

<figure><img src="image_45.png" /></figure>
<figure><img src="image_46.png" /></figure>

<figure><img src="image_47.png" /></figure>
<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 31 - Dosages des hormones ABA, Cis.ZR, IPR, JA et SA dans les feuilles de limettiers Mexicain 2x et Tahiti 3x HLB+ ou HLB- greffés respectivement avec des porte-greffes Citrumelo 2x et 4x.</figcaption></figure>

Les dosages de l'ABA dans les feuilles 2x et 3x ont montré qu'il y avait le plus souvent une augmentation de la quantité de cette hormone pour les plants infectés. Cette observation peut également être faite pour le Cis.ZR et de l'IPR. Toutefois, aucune différence significative n'a été faite entre les 2x et 3x. Dans le cas de l'acide jasmonique (JA), aucune différence significative n'a pu être observée. Les résultats concernant l'acide salicylique (SA) ont montré une augmentation considérable lors de l'infection au HLB (figure 31).

### 5.2.2.2. Résultats des dosages de phytohormones au niveau des racines de porte-greffes diploïdes et tétraploïdes
<figure><img src="image_49.png" /></figure>

<figure><img src="image_50.png" /></figure>
<figure><img src="image_51.png" /></figure>

<figure><img src="image_52.png" /></figure>
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 32 - Dosages des hormones ABA, Cis.ZR, IPR, JA et SA dans les racines de porte-greffes Citrumelo 2x et 4x greffés respectivement avec des limettiers Mexicain 2x et Tahiti 3x HLB+ et HLB-.</figcaption></figure>

Pour l'ensemble des hormones dosées dans les racines (figure 32), à l'exception de SA, aucune différence significative n'a pu être observée entre les différentes associations greffons/porte-greffes. Concernant l'acide salicylique, une nette augmentation est observable dans les racines des plants infectés par la bactérie responsable du HLB par rapport aux données observées chez les plants témoins.

### 5.2.3. Résultats du métabolome

Les analyses du métabolome ont été réalisées par le plateau technique de Bordeaux. Les résultats préliminaires de ces analyses du métabolome concernent uniquement les greffons 2x et 3x greffés avec des porte-greffes 2x et 4x. A ce jour, les résultats racinaires n'ont pas encore été obtenus.
<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 33 - Spectre visuel de feuilles de greffons infectés (courbe bleue) ou non (courbe rouge) par le HLB. Couleur inversée dans le graphe pour GABA.</figcaption></figure>

La spectroscopie à résonnance magnétique nucléaire (RMN) a révélé qu'il y avait une chute de l'acide gamma-aminobutyrique (GABA) dans les feuilles de plants infectés par le HLB contrairement à ceux témoins. De plus, l'observation du spectre de l'asparagine (ASN) semble indiquer une diminution de ce métabolite chez les plants infectés.

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>Figure 34 - Résumé des résultats du métabolome greffons 2x (A) et 3x (B) en fonction de l'infection à la maladie (rouge), l'interaction greffon/porte-greffe (vert) et de la ploïdie du porte-greffe (bleu).</figcaption></figure>
Les résultats de l'ensemble de l'analyse du métabolome pour le greffon 2x indiquent qu'il y a un effet dû à l'infection sur 195 variables et aucun dû à la ploïdie du porte-greffe ou encore à l'interaction. En revanche, les résultats pour le greffon 3x montrent qu'il y a un effet de l'infection sur uniquement 44 variables mais aussi un effet dû à l'interaction sur 21 variables (figure 34).

### 5.3. Discussion

Le but principal de ce **Chapitre 3** était de vérifier si l'expression du génome des polyploïdes pouvait être à l'origine d'une meilleure tolérance face à la maladie du HLB. Il est connu dans la littérature que différents gènes (Wang et al., 2016) sont impliqués dans la meilleure tolérance au HLB. Les premiers résultats obtenus par RNAseq ont permis d'indiquer qu'il y avait bien des gènes différentiellement exprimés suite à l'infection par Las. Le diagramme de Venn a révélé un certain nombre de GDE lors de la comparaison entre les témoins et les plants infectés. La catégorisation fonctionnelle a permis de mettre en évidence les catégories dans lesquelles les GDE étaient associés. Différentes catégories ont pu être identifiées comme les gènes impliqués dans les « activités d'oxydoréductase » mais aussi les « processus métaboliques cellulaires » ou encore les « liaisons d'ions » ou « de protéines ». Il a été démontré, chez les agrumes, que la polyploïdie apportait un avantage concernant le stress oxydatif induit par les différents stress biotiques (Allario et al., 2013; Khalid et al., 2020; Lourkisti et al., 2021, 2021 (1); Oustric et al., 2017, 2019) qu'ils soient de franc pieds ou greffés avec un porte-greffe. Ainsi, avec la catégorisation fonctionnelle (figure 22) il est possible d'observer l'association qui semble présenter le plus de GDE est celle présentant le niveau de ploïdie le plus bas, LM/Cit2x. Ces résultats seraient en accord avec le diagramme de Venn qui montre un nombre de GDE plus élevé pour LM/Cit2x, variété comme on l'a vu fortement sensible au HLB (cf. **Chapitre 1** : Sivager et al., 2021). De plus, ce diagramme semble indiquer un impact de la polyploïdie où plus le niveau de ploïdie augmente, plus le nombre de GDE semble diminuer sûrement caractéristique du plus faible impact de la maladie chez les polyploïdes. D'autres gènes impliqués dans l'élimination des ROS, caractéristique du stress oxydatif induits par le HLB, ont montré l'importance de la polyploïdie où l'association avec le niveau de ploïdie le plus élevé montre une surexpression de ceux-ci (**tableau 2**). Impliqué dans la réponse au stress, l'APX est une enzyme capable de réduire, à l'aide du co-substrat AsA, l'H₂O₂ en H₂O, limitant ainsi l'impact toxique de cette molécule (Caverzan et al., 2012). Dans le tableau récapitulatif des gènes exprimés, il est indiqué que l'association LT/Cit4x se comportait mieux que LM/Cit4x en condition témoin et en condition Las+, schéma que l'on
pouvait retrouver dans le **Chapitre 1** quand le dosage de l'APX a été réalisé pour les mêmes variétés mais greffés avec un porte-greffe 2x. Le **Chapitre 2**, qui faisait l'objet d'une analyse plus générale du pouvoir antioxydant, montrait également une défense antioxydante plus efficace pour les polyploïdes contrairement aux 2x. Une autre corrélation mise en évidence entre le premier chapitre et celui-ci est celle pour le gène impliqué dans la photosynthèse, *Ciclev10012434*. En effet, à cause du blocage des pores du phloème, les produits photosynthétiques ne sont pas transloqués créant des marbrures asymétriques et réduisant ainsi la photosynthèse. Les résultats de l'expression de ce gène montrent bien une expression plus grande pour les polyploïdes en condition témoin et en condition malade. De plus, l'impact de la maladie est également observable avec une baisse de l'expression de ce gène en condition Las+, ce qui avait pu être observé dans le 1er Chapitre avec les résultats des analyses physiologiques (photosynthèse, transpiration...). Ainsi, malgré une baisse de l'expression de ce gène, la variété 3x qui présente une meilleure activité photosynthétique serait en mesure de continuer à alimenter le reste de la plante avec les produits photosynthétiques nécessaires.

Le gène ethylene-forming enzyme (EFE) est impliqué dans la catalyse de la dernière étape de biosynthèse de l'éthylène (Hamilton et al., 1991) qui est une hormone végétale intervenant dans le développement mais aussi la défense des plantes contre les différents stress abiotiques et biotiques incluant également l'attaque des pathogènes (Eckert et al., 2014). Nos données ont montré qu'au niveau foliaire il y avait généralement une différence d'expression entre les deux variétés. En effet, l'expression du gène impliqué dans la synthèse de l'EFE était généralement plus importante chez la variété 3x contrairement à la variété 2x, conférant ainsi une meilleure tolérance face aux stress. Bien qu'il semble y avoir une diminution de l'expression en condition Las+ pour la variété 3x associé à un porte-greffe 2x, ceci n'était pas observable lorsque le porte-greffe associé était 4x, conférant certainement une tolérance supplémentaire. En revanche, au niveau racinaire une diminution de l'expression de l'EFE était observable dès que les plants étaient infectés. Néanmoins, le fait qu'il y ait une expression en condition infecté pourrait être expliqué par le fait que certains microbes associés aux plantes sont capables de produire également de l'éthylène (Eckert et al., 2014; Weingart et al., 2007) et les données obtenues dans le 2ème Chapitre ont montré que les plants infectés montrent au niveau racinaire la présence de beaucoup de bactéries. L'expression de EFE serait donc peut-être due à certains microbes et non aux racines de la plante sachant qu'une forte dégradation de celles-ci est observée par rapport à la forte présence de bactéries dans les racines. De plus l'observation du gène impliqué dans le développement des racines, *Ciclev10024106m.g*, montre une sous-expression de ce gène en condition malade par rapport l'expression dans les racines de plants témoins. En effet,
une dégradation et un affaissement cellulaire étaient observés chez les racines de porte-greffe dans le 2ème chapitre.

Enfin, l'importance de la résistance systémique acquise (SAR) a montré que le gène *NPR1* permettait l'accumulation de SA (Durrant & Dong, 2004) et aussi à activer des facteurs de transcription WRKY. Dans nos données, le facteur de transcription WRKY DNA-binding protein 35, avait une expression élevée en condition *Las+* dans les racines de porte-greffes 2x et 4x, peu importe le greffon associé. Néanmoins, aucune différence d'expression n'était observée au niveau foliaire. En revanche, quand on étudie le gène paralogue de *NPR1*, ici *NPR1*-like protein 3, il est possible de constater qu'au niveau foliaire, l'expression est plus élevée chez le *LT* 3x. En effet, si la variété *LT* se comporte mieux que la variété *LM* (Gómez et al., 2008; Sivager et al., 2021), l'accumulation de *SA* ne serait pas nécessaire pour *LT* contrairement à *LM*.

En regard de l'analyse de gènes particuliers, la création de réseau de gènes a montré que les familles où il y avait une surexpression étaient principalement celles concernant les processus de biosynthèse de peptides ou encore d'amide. De plus, le réseau de gènes qui compare la variété sensible *LM* avec un porte-greffe 4x et 2x en condition *Las+*, a montré qui semble y avoir une relation entre greffon et porte-greffe comme il a été constaté plusieurs fois dans le **Chapitre 2**. Dans ce réseau, il a été montré qu'il y avait une surexpression de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN, or il est bien connu que certains stress peuvent entrainer la dégradation de l'ADN, notamment l'excès de métaux lourds (Küpper & Andresen, 2016; Lanier et al., 2019) comme par exemple le Cu. De plus, l'excès de ROS peut être nocif pour les acides nucléiques (Gill & Tuteja, 2010; Pospíšil & Prasad, 2014). En relation avec le taux de ROS généralement plus élevé pour la variété 2x par rapport à la variété 3x, il est alors intéressant de constater qu'avec un porte-greffe 4x, certains gènes sont impliqués dans la réparation de l'ADN potentiellement induite par un excès de ROS, ou encore de métaux lourds (observés dans le **Chapitre 1**).

Au niveau des racines de porte-greffes, bien qu'il y ait des catégories impliquées dans la biosynthèse de peptide ou encore d'amide, l'une des catégories les plus présentes étaient celle concernant la phosphorylation des protéines. La phosphorylation des protéines est importante dans la réponse de l'immunité des plantes et permet la survie de celles-ci avec tout un processus de signalisation impliquant les PAMPs, WRKY, etc. eux-mêmes impliqués dans la SAR (Park et al., 2012). Nos résultats ont montré que la ploïdie permettait une meilleure expression des gènes impliqués dans la phosphorylation des protéines (LM/Cit4x (*Las-*) > LM/Cit2x (*Las-*)) et que la ploïdie du greffon avait également un impact sur la meilleure expression de cette
catégorie (LT/Cit4x (Las-) > LM/Cit4x (Las-) et LT/Cit2x (Las-) > LM/Cit2x (Las-)) montrant
ainsi encore une interaction entre greffon et porte-greffes.

L'analyse hormonale a permis de montrer que les plants infectés par Las présentaient
un taux d'hormones plus élevé par rapport aux plants témoins. En effet, les résultats de dosage
hormonal chez les feuilles 2x et 3x montrent une augmentation de l'ABA. L'ABA est considéré
comme un indicateur de plants stressés (Rosales & Burns, 2011) car cette phytohormone a
tendance à augmenter en cas de stress (Gómez-Cadenas et al., 2000; Sah et al., 2016), ici par le
HLB.

Toujours chez les feuilles, une différence significative est observée chez cis-ZR entre plants
témoins et plants infectés. Or, cette différence n'est pas observée dans les racines de porte-
greffes alors qu'il est indiqué qu'elle interviendrait dans les racines afin de permettre
l'élongation des poils pour pouvoir agrandir la surface d'absorption et maintenir la
concentration en phosphate, nécessaire pour le développement des racines (Silva-Navas et al.,
2019).

Enfin, les hormones IPR et JA ne semblent pas donner d'informations concluantes dans les
dosages effectués alors que l'analyse de lipoxygénase 3 qui intervient dans la synthèse de JA
montre une meilleure expression de ce gène dans les racines de porte-greffes 4x. La
concentration de SA dans les feuilles 2x et 3x ainsi que les racines 2x et 4x augmente
considérablement chez les plants infectés contrairement aux plants témoins. Ces résultats de
taux de SA sont en accord avec les travaux de Nehela et al., (2018) qui indiquaient que les
plants infectés avaient une concentration de SA bien plus élevée que celle retrouvée chez les
plants témoins. Néanmoins, l'analyse subjective de certains gènes (cf. 5.2.1.2. Analyse
subjective de gènes impliqués dans le développement et la défense des plantes) a montré une
différence d'expression entre LM et LT concernant NPR1-like protein 3. Or, aucune différence
n'est observable concernant la comparaison diploïde/polyploïde pour une même condition
(témoin ou infecté). Bien que cette différence ne soit pas observable, il est quand même
important de noter que les plants infectés se défendent bien face à la maladie du HLB. De plus,
si l'accumulation de SA permet d'activer des gènes *NPR1* qui eux même activent des facteurs
de transcription, le taux de SA retrouvé au niveau des racines des porte-greffes infectés par le
HLB pourrait expliquer pourquoi le niveau d'expression de *WRKY35* est plus élevé chez les
porte-greffes 2x et 4x en condition infecté par rapport aux porte-greffes en condition témoin.

Récemment, l'étude de Suh et al., (2021) a montré que certains métabolites, plus
précisément deux aminoacides le glutamine et l'asparagine (ASN), augmentaient dans les
groupes d'agrumes tolérants à la maladie du HLB et ce indépendamment du statut témoin/infecté. Nos résultats, bien qu'ils ne concernent pour le moment que la partie foliaire, c'est-à-dire les greffons 2x et 3x, ont montré via le spectre de l'ASN, que ce métabolite a tendance a diminué en condition malade. Ces résultats préliminaires ne seraient pas en accord avec les différentes études (Albrecht et al., 2019; Killiny et al., 2018) qui ont montré une augmentation de ces deux aminoacides chez les cultivars d'agrumes tolérants mais aussi chez les agrumes contraints à la maladie car ceux-ci avaient tendance à augmenter en cas de stress. De plus, le spectre pour GABA semble indiquer des effets négatifs de la maladie. La tendance du GABA semble être contraire à ce qui peut être observé en cas de stress chez les plantes. En effet, il est indiqué que l'acide gamma-aminobutyrique a tendance à s'accumuler dans les tissus lors de stress biotiques ou abiotiques (Kinnersley & Turano, 2010) tels que les températures élevées, le stress oxydatif ou encore le stress salin. Son accumulation va permettre alors de moduler le développement des plantes en régulant l'activité spécifique de transporteurs d'anions spécifiques aux plantes (Ramesh et al., 2015). Nos résultats montrent une diminution de ce métabolite chez les agrumes 2x et 3x sous contrainte HLB.

Enfin, les résultats préliminaires du métabolome montrent qu'il y aurait bien un effet de la ploïdie du porte-greffe mais aussi un effet dû à l'interaction greffon/porte-greffe, effet ayant été constaté au préalable avec certains résultats obtenus dans le 2ème chapitre de cette thèse.

## 5.4. Conclusion

Les différentes analyses ont montré qu'il y avait bien un impact néfaste fort de la maladie du Huanglongbing sur l'expression de familles de gènes et sur les contenus de métabolites impliqués dans le développement de la plante. Il a été possible d'observer une forte concentration de SA qui joue un rôle crucial dans la SAR, importante contre l'attaque de pathogènes, ou encore de gènes impliqués dans la synthèse de l'éthylène. De plus, la création de réseaux de gènes a montré l'impact que pouvait avoir la ploïdie ainsi que l'interaction qu'il pouvait y avoir entre greffon et porte-greffe. Enfin, l'analyse générale (diagramme de Venn) et partielle a également permis de montrer que la polyploïdie pouvait jouer un rôle important dans la meilleure expression de certains mécanismes de défenses, notamment ceux contre les ROS et révélerait que l'association au niveau de ploïdie le plus élevé, LT/Cit4x, serait la plus tolérante face à la maladie.
6. CONCLUSION GÉNÉRALE & PERSPECTIVES
Le Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement a pour objectif de favoriser une agriculture plus durable dans les régions tropicales et méditerranéennes. C'est dans cette optique que l'UMR AGAP qui comprend l'équipe SEAPAG s'est tournée sur la compréhension de l'une des maladies les plus dévastatrices de l'agrumiculture, le Huanglongbing. En comprenant cette maladie, il sera possible de proposer aux agriculteurs des variétés d'agrumes et des porte-greffes plus tolérants. En effet, même si les apparentés d'agrumes semblent être résistant à la maladie du HLB, il n'existe pas de résistance stricte à la maladie au sein des agrumes dits « vrais ». L'équipe SEAPAG s'est orientée vers une voie prometteuse qui concerne aussi bien le règne animal que végétal : la polyploïdie. Les études réalisées portent à la fois sur les variétés et sur les porte-greffes.

Il a été démontré, au fil des années, les avantages que pouvait apporter la polyploïdie. En effet, les études sur la pastèque (Yan et al., 2018), les poivrons (Penella et al., 2015) et le tabac (Liu et al., 2014) et notamment chez les agrumes (Allario et al., 2013) ont montré les aspects de tolérance qu'apportait la polyploïdie face aux différents stress comme le stress salin ou encore le déficit hydrique. D'autres études sur les agrumes ont montré l'efficacité des agrumes polyploïdes face au stress oxydatif induit par des températures froides (Oustric et al., 2017), une carence en nutriments (Oustric et al., 2019) ou encore le stress salin (Khalid et al., 2020). Ces différentes études ont montré que le taux des enzymes du système antioxydant, telles que la catalase ou encore l'ascorbate peroxidase, était plus élevé chez les agrumes 4x par rapport à leurs homologues respectifs 2x.

Dans le cadre de cette thèse, il a été convenu de décomposer l'étude des plants d'agrumes diploïdes et polyploïdes afin de connaitre et d'identifier les différents déterminants physiologiques et moléculaires de leur réponse différentielle face à la maladie du HLB.

Le **Chapitre 1** de cette thèse a été consacré à l'étude de la réponse de limettiers Mexicain 2x et Tahiti 3x, greffés sur un porte-greffe 2x. Grâce à cette stratégie, il a été possible de connaitre l'impact direct de la maladie mais aussi de la polyploïdie du greffon vis-à-vis du HLB.

Généralement, suite à un stress ou encore à l'attaque d'un pathogène, ici *Candidatus Liberibacter asiaticus*, les plantes synthétiseront de la callose (Chen & Kim, 2009). Dans le cas du HLB, maladie exclusivement phloèmique, c'est au niveau des pores du phloème que la callose est retrouvée, bloquant ainsi le flux de sève élaborée comprenant les différents nutriments dont les sucres afin d'alimenter la plante dans les différents organes puits. Dans notre étude, en comparant les deux limettiers, il a été constaté que la synthèse du dépôt de
callose était beaucoup plus rapide dans le cas des pétioles de feuilles de limettier Mexicain 2x contrairement à ceux du limettier Tahiti 3x. Suite à ce blocage précoce au niveau des pores du phloème du LM, les activités physiologiques telles que la conductance stomatique et la photosynthèse vont chuter dès le stade Las+AS pour cette variété 2x et chuter drastiquement au stade tardif. La variété LT 3x présente également une chute de ces différentes activités mais continuera néanmoins de présenter, des activités plus élevées par rapport au LM. Cette réponse physiologique précoce du LM par rapport au LT peut certainement s'expliquer par la charge bactérienne qui est plus élevée dans LM, dès le stade Las+AS (les analyses de qPCR ont montré que le Ct était plus faible pour LM que celui du LT, ce qui était caractéristique d'une charge bactérienne beaucoup plus élevée dans LM et donc d'un stress plus important).

A ces données physiologiques, des résultats biochimiques ont permis de vérifier que le pouvoir antioxydant était beaucoup moins efficace chez LM 2x par rapport au LT 3x. Ces différents éléments comme la taille cellulaire (pores du phloème...) plus importante, des échanges respiratoires plus importants et de détoxification ainsi qu'un bouchage des pores moindre expliqueraient certainement la meilleure tolérance du LT 3x face à la maladie car celui-ci pourrait très certainement maintenir le flux de sève élaborée sur une plus longue période, permettant l'alimentation de la plante et donc de son développement.

Le but de cette thèse était de connaitre les déterminants apportant une meilleure tolérance face à la maladie du HLB chez les polyploïdes d'agrumes. Or, ce travail a aussi comme portée de pouvoir proposer des choix d'agrumes aux agriculteurs locaux et internationaux. C'est dans cette optique qu'il serait intéressant de travailler sur les fruits des agrumes diploïdes et polyploïdes infectés par la maladie. En effet, même si les polyploïdes semblent se comporter mieux que les diploïdes (Gómez et al., 2008; Sivager et al., 2021), les fruits infectés par le HLB ont tendance à chuter rapidement et à être plus acides que les fruits sains à cause du taux de saccharose relativement bas (Bassanezi et al., 2009). En effet, les symptômes foliaires semblent moins nombreux pour les polyploïdes et la chute de feuilles et de fruits semble beaucoup plus importante chez les 2x (observation au champ, données non publiées). Néanmoins, améliorer la gestion concernant l'irrigation et la nutrition (observation au champ, données non publiées) permettrait de limiter l'impact sur les fruits entrainant ainsi moins de chute de ces derniers et donc moins de perte concernant la production. Une étude comparative sur la qualité de fruits d'agrumes diploïdes et polyploïdes permettrait de proposer aux agriculteurs, non seulement des arbres plus tolérants mais également des fruits qui correspondent aux attentes des consommateurs.
Les données complémentaires du 1er chapitre n'ont pas donné de résultats très différents excepté l'augmentation de glucose au fur et à mesure de la maladie (cf. 3.2. **Données complémentaires : analyses des composés de parois cellulaires de feuilles de limettiers Mexicain et Tahiti**) qui pouvait être caractéristique du dépôt de callose induits par la bactérie (Achor et al., 2020; Koh et al., 2012; Sivager et al., 2021). Cette analyse de parois cellulaires pourrait être réalisée sur des homologues afin de pouvoir peut-être mettre en évidence des différences. En effet, bien que le limettier Tahiti soit polyploïde (3x), c'est un génotype hétérozygote et n'est pas l'homologue du limettier Mexicain. Même si nos résultats sur le dosage du MDA, qui donne des information sur la peroxydation des lipides (Luna et al., 2000; Tabassum et al., 2017), ont montré que le taux de celui-ci était plus élevé chez les 2x que chez les 3x, aucune différence significative de l'analyse des composés n'a pu être obtenue malgré l'importance des parois cellulaires dans la réponse aux stress (Seifert & Blaukopf, 2010). Ainsi, une étude d'analyse sur les parois cellulaires de feuilles d'agrumes 2x et 4x ayant le même patrimoine génétique (exemple citrumelo 2x, 4x ou encore volkameriana 2x, 4x) apporterait certainement des informations plus concrètes quant à la dégradation possible des parois cellulaires et apporterait également d'autres informations sur l'impact du HLB au niveau de la canopée.

L'étude d'agrumes apparentés résistants à la maladie serait une voie prometteuse dans la lutte contre le HLB (Ramadugu, 2019; Ramadugu et al., 2016). En effet, ces apparentés d'agrumes (*Eremocitrus, Microcitrus*) sont sexuellement compatibles avec les agrumes du genre *Citrus*. Ainsi, des études sur des variétés d'agrumes dits « vrais » greffées avec des porte-greffes résistants et non des porte-greffes uniquement tolérants pourraient voir le jour afin de connaître l'impact que peut avoir la maladie sur ces variétés. Une autre voie serait d'utiliser ces agrumes apparentés en tant qu'« inter-stock » entre la variété désirée et un porte-greffe polyploïde tolérant. De ce fait, avec nos données obtenues grâce à ces trois chapitres de thèse et l'évaluation d'associations « scion/inter-stock/porte-greffe » permettraient de vérifier si ces apparentés d'agrumes peuvent être à l'origine d'une résistance au HLB pour les cultivars d'agrumes dits « vrais ».

L'étude de Deng et al., (2019) a montré l'importance de la régénération du phloème dans la tolérance à la maladie au sein même d'agrumes 2x et Stover et al., (2015) a identifié des agrumes 2x qui présentaient une meilleure tolérance au HLB en comparaison avec la variété oranger Rhode red. Une première étude sur différents agrumes 2x (stage d'ingénieur de FILLON Inès que j'ai encadré – données non publiées) a montré l'impact que pouvait avoir la maladie sur ces variétés et pousser cette étude sur la possible régénération de phloème sur ces agrumes par rapport à l'oranger Rhode red, ainsi qu'une étude du pouvoir antioxydant
donnerait des informations sur la meilleure tolérance de ces derniers afin de les proposer aux agriculteurs.

Le **Chapitre 2** a permis d'obtenir des informations au niveau racinaire en analysant des porte-greffes d'agrumes 2x et 4x. Les différentes études sur les agrumes se sont souvent intéressées à des porte-greffes franc-pied en étudiant les différentes caractéristiques (système antioxydant) de ceux-ci mais au niveau de la canopée. Nos observations ont permis de montrer que la polyploïde avait toujours pour conséquence d'augmenter la taille des cellules et notamment des racines (images macro et de MEB). De plus, les images macroscopiques des racines complétées avec celle du MEB ont montré qu'il y avait une forte dégradation racinaire et un affaissement cellulaire au niveau des cortex des racines de porte-greffes 2x contrairement aux racines de porte-greffes 4x, et ce peu importe la variété associée. Néanmoins, l'affaissement cellulaire était nettement plus important pour le porte-greffe 2x associé à la variété LM, elle aussi 2x.

Cette dégradation ne serait pas liée au dépôt de callose car dans notre étude des porte-greffes d'agrumes 2x et 4x, aucun dépôt de callose ne pouvait être observé dans les pores des cellules de phloème des racines de porte-greffes et serait due à l'action directe des bactéries qui utiliseraient les racines comme un réservoir pour leur développement et leur multiplication. Tout comme la partie foliaire, une analyse des composés de parois cellulaires serait intéressante car une dégradation des racines ainsi qu'un affaissement cellulaire du cortex sont observés dans le cas des échantillons de racines infectées par la bactérie responsable de la maladie du HLB. De plus, les porte-greffes analysés ont le même patrimoine génétique dans la mesure où correspondent à des diploïdes doublés (tétraploïdes). Les résultats escomptés seraient alors prometteurs sur l'impact que peut avoir la maladie et la ploïdie sur la composition et la modification des composés cellulaires et seraient certainement en accord avec les travaux de (Corneillie et al., 2019) au niveau des plants témoins avec une modification des composés de parois cellulaires entre diploïdes et polyploïdes. Dans la mesure où une dégradation racinaire est observée et que le MDA est un marqueur de la peroxydation des lipides (Tabassum et al., 2017), un dosage biochimique de MDA pourrait compléter cette étude. Enfin, un dosage d'amidon permettrait de vérifier si, en effet, les carbohydrates ne sont pas des facteurs limitants pour la perte du système racinaire.

Nos résultats d'hybridation *in situ* à fluorescence ont montré que la charge bactérienne était beaucoup plus forte dans les racines de porte-greffes 2x par rapport à celles de porte-greffes 4x. La polyploïdie pourrait donc être un facteur limitant le développement et la propagation de Las au niveau des racines. Les conséquences du bouchage précoce des pores du phloème chez le
LM (Chapitre 1) expliqueraient pourquoi la charge bactérienne semble plus importante lorsque la variété associée au porte-greffe (2x ou 4x) est le LT. Dans la mesure où le flux de sève est altéré voire interrompu, la bactérie se retrouve au niveau des cellules du phloème dans pétioles des feuilles de la variété 2x. En revanche, avec des pores peu obstrués par le dépôt de callose au niveau des pétioles de la variété 3x, les bactéries peuvent être transportées dans le flux de sève et peuvent se retrouver dans les racines de porte-greffes 2x ou 4x afin de pouvoir se multiplier.

L'importance de la réponse des porte-greffes face au stress oxydatif est tout aussi importante étant donné que les agrumes ne sont plus cultivés de franc-pied. De ce fait, une analyse électrochimique et un dosage biochimique des polyphénols ont été réalisés afin de déterminer le pouvoir antioxydant au niveau des racines des porte-greffes 2x et 4x. Grâce à cette analyse, il a été possible d'observer que le pouvoir antioxydant des 4x était plus important que celui des 2x. Le dosage des polyphénols, molécules ayant aussi des propriétés antioxydantes, a permis de confirmer cette analyse électrochimique. Une information supplémentaire apportée par ce dosage, est qu'il existait une relation étroite entre le greffon et le porte-greffe. Cette relation avait pu être mise en évidence au travers des différents résultats de FISH.

Le **Chapitre 3** de cette thèse a eu pour but de s'intéresser à l'expression du génome chez les plants diploïdes et polyploïdes aussi bien au niveau du greffon (feuilles) que du porte-greffe (racines). Des analyses hormonales et du métabolome ont également été réalisées et ont permis de montrer l'impact de la ploïdie face au HLB, avec une diminution du nombre de gènes différentiellement exprimés quand le niveau de ploïdie augmentait (LM2/ Cit2x > LT/Cit2x > LM/Cit4x > LT/Cit4x ; diagramme de Venn). Il a été intéressant de voir que même s'il semble avoir un faible nombre de gènes différentiellement exprimés chez les individus polyploïdes, la polyploïdie jouait un rôle quant à une meilleure expression de certains gènes contre l'action des ROS ou encore dans l'implication de gènes face à l'attaque de certains pathogènes. Néanmoins, bien que certains gènes impliqués dans la photosynthèse permettent un maintien du développement des agrumes polyploïdes, il a été possible d'observer que l'impact du HLB sur les plants d'agrumes aussi bien 2x que polyploïdes était fortement néfaste sur l'expression de certains gènes intervenant dans le développement des plants d'agrumes, notamment la superfamille cytochrome P450 où une chute considérable de l'expression de ce gène était observable dans tous les porte-greffes 2x et 4x. De plus, une étude plus approfondie de l'analyse par RNAseq serait intéressante car les réseaux de gènes ont permis de montrer qu'il y avait une différence d'expression dans des catégories concernant la biosynthèse de peptide et
donc impliquées dans la synthèse de protéines au niveau des greffons et que même si ces catégories étaient retrouvées au niveau racinaire, c'est surtout la phosphorylation des protéines qui était grandement représentée. La phosphorylation des protéines joue un rôle important dans la réponse des plantes. L'approfondissement de l'étude du transcriptome devrait nous permettre d'identifier correctement les gènes apportant une meilleure tolérance face à la maladie du HLB et permettrait d'avoir un plus grand lien avec les données obtenues sur l'analyse hormonale. Cependant, contrairement aux résultats du transcriptome, l'analyse des hormones n'a pas permis de montrer l'impact de la polyploïdie. Cette analyse a néanmoins montré que malgré la maladie, les plants infectés avaient tendance à bien synthétiser l'acide salicylique, hormone clé dans la mise en place de la résistance systémique acquise. Il serait important d'augmenter le nombre d'échantillon afin de potentiellement voir l'impact de la polyploïdie sur le taux des hormones impliquées dans la réponse aux stress abiotiques. Ainsi, derrière cet énorme jeu de données de transcriptomique et d'expression hormonale existerait bien un lien sur la résistance systémique acquise qui serait certainement un atout clé quant à la réponse face à la maladie du HLB. L'étude des gènes impliqués dans la SAR serait alors une alternative dans la meilleure tolérance des plants d'agrumes 2x ou polyploïdes face à la maladie.

En plus de la littérature (Allario et al., 2013; Jayswal & Lal, 2020; Ruiz et al., 2020), les données du 2ème et 3ème chapitres ont montré qu'une relation entre greffon et porte-greffes pouvait exister, ainsi identifier les gènes clés dans la tolérance (voire résistance) au HLB permettrait la création de porte-greffes ou variétés plus tolérants.

L'importance des microRNA (miRNA) contre les stress environnementaux et leur relation avec le développement des plantes a pu être démontré chez différentes espèces de plantes afin d'agir sur différents types de stress abiotiques comme la sécheresse (Zhao et al., 2007) ou encore le stress salin et le stress oxydatif (revue Pervaiz et al., 2022). Ces miRNA jouent un rôle important dans la réponse post-transcriptionnelle en ciblant les ARNm. Identifier les gènes d'intérêt permettrait alors d'observer si la maladie du HLB induit des miRNA et altère donc l'expression de certains gènes impliqués dans le développement ou encore la défense des plantes.

Enfin, le travail partiel sur l'analyse du métabolome n'a pas permis d'obtenir de conclusion définitive sur la composition métabolomique foliaire et racinaire. Nos résultats, bien qu'ils soient préliminaires, ne sont pas en accord avec ce qui pouvait être observé dans la littérature (Albrecht et al., 2019; Killiny et al., 2018; Kinnersley & Turano, 2010). Néanmoins, ces analyses métabolomiques devront se poursuivre afin de connaître de manière plus précise les changements métabolomiques au niveau des feuilles mais aussi au niveau des racines. Il serait
intéressant de vérifier si la polyploïdie impacte sur le taux de métabolites impliqués dans la défense des plantes. En effet, les travaux de Killiny & Hijaz, (2016) ont démontré que les métabolites tels que la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane avaient un niveau plus élevé chez les cultivars d'agrumes tolérants à la bactérie et donc au HLB. Enfin, en regard des analyses du métabolome sur les feuilles de limettiers 2x et 3x, il existe un impact des porte-greffes chez les agrumes cultivés de façon bi-composite car la composition métabolique des feuilles et des racines et la réponse à *Candidatus* Liberibacter asiaticus serait influencée par les porte-greffes (Albrecht et al., 2019).

*In fine*, bien que la maladie du Huanglongbing soit la maladie bactérienne la plus dévastatrice des agrumes, les éléments apportés dans cette thèse ont permis de montrer l'importance de la polyploïdie dans la meilleure tolérance face à la maladie du HLB. De plus, les données obtenues ont permis d'identifier certains déterminants physiologiques et moléculaires à l'origine de cette meilleure tolérance dans les deux principales catégories que constitue une plante (feuilles et racines).
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Figure 35 - Impact du HLB (Las+) ou non (Las-) sur au niveau des pores du phloème de pétioles de feuilles ou de racines diploïdes ou polypleïdes entrainant des conséquences externes</figcaption></figure>
# ANNEXES
<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>Annexe 1</figcaption></figure>

Figure 36 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffte citrumelo 2x greffé avec LT 3x et LM 2x en condition témoin dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la sous-expression.
Annexe 2

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 37 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffe citrumelo 4x greffé avec LT 3x et LM 2x en condition témoin dans le cluster Brown. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la sous-expression</figcaption></figure>
Annexe 3

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Figure 38 - Réseau de gènes surexprimés après analyse de racines de porte-greffes citrumelo 4x et 2x greffé avec le limettier 2x en condition témoin. Les cercles colorés indiquent sur l'intensité de la surexpression.</figcaption></figure>
# 7. ENCADREMENTS
## 7.1. Encadrements de stagiaires

- 2018

**UGOLIN Maëlys**, Master 1, 1 mois

**Sujet** : Analyse microscopique de racines de porte-greffes (diploïdes et tétraploïdes) et de leurs interactions avec la bactérie responsable du Huanglongbing.

- 2019

**MORINO Elsa**, IUT, 3 mois

**Sujet** : Analyse des propriétés de tolérance au HLB d'associations de porte-greffes citrumelo diploïdes et tétraploïdes / greffons limettiers diploïdes et triploïdes

- 2020

**FILLON Inès**, Ingénieur, 6 mois

**Sujet** : Analyse par microscopie à balayage des vaisseaux du phloème de variétés d'agrumes potentiellement plus tolérantes / résistantes au Huanglongbing.

**MONDÉLICE François-Xavier**, Master 1, 1 mois

**Sujet** : Caractérisation au niveau cellulaire de la présence de la bactérie responsable du HLB chez des porte-greffes diploïdes et tétraploïdes

**UGOLIN Maëlys**, Master 2, 6 mois

**Sujet** : Caractérisation au niveau cellulaire de la présence de la bactérie responsable du HLB (*Candidatus Liberibacter*) chez des porte-greffes diploïdes et tétraploïdes.

- 2021

**MISANTROPE Mélanie**, Licence 3, 1 mois

**Sujet** : Mise au point d'une méthode de visualisation de la bactérie *Candidatus Liberibacter* asiaticus (Las) et de son impact au niveau du stress oxydatif de porte-greffes diploïdes et tétraploïdes d'agrumes.
## 7.2. Enseignements vacataires

- 2021 – 2021 :

Vacation au sein de l'UFR Sciences Exactes Naturelles de l'Université des Antilles sous la direction de Mme INAMO-VATIN Magalie.

* Master 1 Biologie Santé : Fondements en biologie moléculaire

* Licence 1 Sciences pour la Santé : Biochimie des macromolécules

* Licence 3 Sciences pour la Santé : Biochimie des protéines
RÉFÉRENCES
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