AVERTISSEMENT

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INRA

U.F.R. Sciences et Techniques Biologiques
Ecole Doctorale Ressources Procédés Produits Environnement
Département de Formation Doctorale des Géosciences

Laboratoire de Biogéochimie des
Ecosystèmes Forestiers (BEF-INRA),
UR 1138, Centre de Recherche Forestière,
54280 Champenoux (France)

SCD UHP NANCY 1
Bibliothèque des Sciences
Rue du Jardin Botanique - CS 20148
54601 VILLARS LES NANCY CRDEX

Thèse

présentée pour l'obtention du titre de

**Docteur de l'Université Henri Poincaré, Nancy I**

en Géosciences

par **Christophe Calvaruso**

Quantification de l'effet des racines d'arbres et des microorganismes associés sur l'altération des minéraux de sols forestiers : observations en forêt et expérimentations

Soutenance publique le 13 novembre 2006

Membres du jury :

<table><tr><td>Mr Jacques Berthelin</td><td>Président du jury</td></tr><tr><td>Directeur de Recherche au CNRS-UHP, Nancy I</td><td></td></tr><tr><td>Mr Michel Aragno</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Professeur à l'Université de Neuchâtel, Suisse.</td><td></td></tr><tr><td>Mr Philippe Hinsinger</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Directeur de Recherches à l'INRA de Montpellier</td><td></td></tr><tr><td>Mr George Gobran</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Professeur à l'Université du Luxembourg</td><td></td></tr><tr><td>Mme Elisabeth Leclerc-Cessac</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Andra, Châtenay-Malabry</td><td></td></tr><tr><td>Mr Jacques Ranger</td><td>Directeur de thèse</td></tr><tr><td>Directeur de Recherches à l'INRA de Nancy</td><td></td></tr><tr><td>Mme Pascale Frey-Klett</td><td>Encadrant</td></tr><tr><td>Chargée de recherches à l'INRA de Nancy</td><td></td></tr><tr><td>Mme Marie-Pierre Turpault</td><td>Encadrant</td></tr><tr><td>Chargée de Recherches à l'INRA de Nancy</td><td></td></tr></table>
Remerciements

Je voudrais tout d'abord remercier Marie-Pierre Turpault, Pascale Frey-Klett et Jacques Ranger pour la qualité et la complémentarité de leur encadrement. Ils ont toujours été disponibles pour me guider tout au long de cette thèse. J'ai appris énormément à leur contact. Je remercie également Stéphane Uroz qui est arrivé en cours d'aventure et qui m'a apporté une petite partie de ses connaissances et a participé à faire progresser ce travail.

Je tiens à remercier l'Andra et tout particulièrement Elisabeth Leclerc-Cessac ainsi que la région Lorraine sans qui cette thèse n'aurait pu se faire.

Je remercie Jean Garbaye et Francis Martin pour la relecture des articles et pour leurs conseils avisés.

Je voudrais également remercier toutes les personnes que j'ai eu la chance de côtoyer durant ma thèse. Car c'est une chance de travailler à l'INRA de Champenoux. Au contact de gens toujours prêts à rendre service. N'est-ce pas Louisette ? J'espère pouvoir retrouver une telle convivialité et une telle complicité dans le futur. Merci encore à tous : Louisette, Dodo, Gilles, Claude, Carine, Nicolas, Jérôme, Pierre-Emmanuel, Béatrice, Arnaud, Louis, Theodora, Jacqueline, Dominique V., Etienne, Frédéric Gé., Frédéric Gu., Ann-Gret, Nathalie, Christophe R., Christophe N., Vanessa C., Emmanuel, Bernd, Pascal, Isabelle, Aurélie, Sèverine, Serge, Cécile, Christine, Jean-Louis, Patrice, Marc, Daniel, Sébastien.

J'ai passé quatre superbes années dans cet institut.

Bisous à toute ma famille qui m'a encouragé tout au long de cette thèse : maman, papa, Sandra, Vincent, Jean-François et bien sûr Krista, Flora et Luca.

Enfin, je tiens à remercier Michel Aragno et Philippe Hinsinger qui ont accepté d'être rapporteurs de cette thèse ainsi que les membres du jury : Elisabeth Leclerc-Cessac, Jacques Berthelin, Georges Gobran.
Table des matières

Index des figures

Index des tableaux

Index des annexes

PREAMBULE 1

CHAPITRE I : INTRODUCTION GENERALE 2

1. LE CONTEXTE DE NOS RECHERCHES : la disponibilité des éléments minéraux dans les écosystèmes forestiers 2

1.1 Le cycle biogéochimique des éléments minéraux dans les écosystèmes forestiers 2

1.2 Les minéraux du sol comme réserve de nutriments et le flux d'altération comme moteur de la disponibilité de ces nutriments. 3

2. LE FLUX D'ALTERATION ISSU DES RESERVES MINERALES DU SOL : un processus générateur de nutriments essentiels pour la croissance des plantes sous dépendance des racines et des microorganismes associés 5

2.1 Les différents réactions d'altération 5

2.2 Les processus biologiques d'altération des minéraux. 7

2.2.1 Désagrégation physique 7

2.2.2 Stabilité structurale du sol 8

2.2.3 Absorption de nutriments et échange d'ions 8

2.2.4 Production d'agents altérants 9

2.2.5 Production d'agents oxydants et réducteurs et réactions enzymatiques 12

3. LA RHIZOSPHERE : un environnement particulier et un lieu d'interactions privilégiées entre les racines, le sol et les microorganismes 14

3.1 Historique et définitions 14

3.2 Impact de la racine sur son environnement : l'effet rhizosphère 14

3.2.1 Caractéristiques physico-chimiques de la rhizosphère 14

3.2.2 Caractéristiques microbiologiques de la rhizosphère 15

3.3 Variabilité spatio-temporelle de la rhizosphère 17
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>3.4 Les interactions bénéfiques pour la santé et la croissance de la plante au sein de la rhizosphère</td>
      <td>18</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4.1 Les microorganismes promoteurs de la croissance des plantes (PGPM, Plant Growth Promoting Microorganisms)</td>
      <td>18</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4.2 L'interaction plante - champignon mycorhizien</td>
      <td>19</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4.3 Les interactions microorganismes – microorganismes</td>
      <td>20</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4. OBJECTIFS DE LA THESE ET DEMARCHE SCIENTIFIQUE</td>
      <td>22</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>CHAPITRE II : IMPACT DE LA RHIZOSPHERE D'ARBRES SUR L'ALTERATION DES MINERAUX EN FORET</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. CONTEXTE ET OBJECTIFS</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. ETUDES ET EXPERIMENTATIONS MISES EN ŒUVRE</td>
      <td>25</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. RESULTATS</td>
      <td>25</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1 Propriétés physico-chimiques du sol global et de la rhizosphère d'arbres (site de Bure)</td>
      <td>25</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2 Etude en forêt : évolution des minéraux dans le sol global et la rhizosphère d'arbres (site de Breuil)</td>
      <td>29</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Article : Rapid clay weathering in the rhizosphere of different tree species in an acid forest ecosystem.</td>
      <td>30</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3 Quantification de l'altération de minéraux-tests dans le sol global et la rhizosphère d'arbres (site de Fougères)</td>
      <td>43</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4. SYNTHESE ET DISCUSSION</td>
      <td>50</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
CHAPITRE III : STRUCTURATION FONCTIONNELLE DES
COMMUNAUTES MICROBIENNES DANS LES SOLS FORESTIERS
EN RELATION AVEC L'ALTERATION DES MINERAUX

53

1. CONTEXTE ET OBJECTIFS

53

2. BIOTESTS IN VITRO

53

3. RESULTATS

55

3.1 Effet de la mycorhizosphère sur la structuration fonctionnelle des communautés microbiennes du sol en relation avec leur capacité à mobiliser des éléments minéraux in vitro.

55

*Article*: Impact of ectomycorrhizosphere on the functional diversity of soil bacterial and fungal communities from a forest stand in relation to nutrient mobilization process.

56

3.2 Effet de la mycorhizosphère sur la diversité génotypique et métabolique des communautés bactériennes du sol en relation avec leur capacité à altérer un minéral-test in vitro

71

*Article*: Mycorrhizosphere effect on the genotypic and metabolic diversity of the soil bacterial communities involved in mineral weathering in a forest soil.

72

3.3 Effet de différentes essences forestières sur la structuration fonctionnelle des communautés bactériennes du sol en relation avec leur capacité à altérer un minéral-test in vitro.

88

*Article*: Forest trees select high mineral weathering bacteria to balance low nutrient availability

89

4. SYNTHESE ET DISCUSSION

95
## CHAPITRE IV : QUANTIFICATION DE LA PART RESPECTIVE DES DIFFERENTS PARTENAIRES BIOLOGIQUES DE LA RHIZOSPHERE DANS LE PROCESSUS D'ALTERATION DES MINERAUX : EXPERIENCES EN COLONNES

99

### 1. CONTEXTE ET OBJECTIFS

99

### 2. DISPOSITIF EXPERIMENTAL EN COLONNES

99

### 3. RESULTATS

104

3.1 Quantification du processus d'altération au cours de l'interaction biotite - microorganismes - solution

104

3.2 Quantification du processus d'altération au cours de l'interaction biotite - arbre forestier - bactéries - solution

108

*Article :* Root-associated bacteria contribute to mineral weathering and to mineral nutrition in trees: a budgeting analysis.

109

3.3 Quantification du processus d'altération au cours de l'interaction biotite - arbre forestier - microorganismes - solution

126

### 4. SYNTHESE ET DISCUSSION

132

## CHAPITRE V : DISCUSSION GENERALE

137

### 1. SYNTHESE DES RESULTATS

138

### 2. ROLE MAJEUR DE LA RHIZOPHERE D'ARBRES FORESTIERS DANS LE PROCESSUS D'ALTERATION DES MINERAUX DU SOL

140

### 3. LES ARBRES INTERAGISSENT AVEC LEUR ENVIRONNEMENT : UNE QUESTION DE SURVIE

141

### 4. LA SYMBIOSE ECTOMYCORHIZIENNE COMME MOTEUR DE LA STRUCTURATION DES COMMUNAUTES BACTERIENNES DANS LES SOLS FORESTIERS

142
5. LA DISPONIBILITE DES ELEMENTS MINERAUX CONTROLERAIT L'ACTIVITE RHIZOSPHERIQUE DANS LES ECOSYSTEMES FORESTIERS 143

6. LA COMPLEMENTARITE FONCTIONNELLE PLANTE - MICROORGANISMES: UNE STRATEGIE NUTRITIONNELLE POUR LES ARBRES FORESTIERS 144

7. PLASTICITE ET DURABILITE DE L'ECOSYSTEME FORESTIER: LA BIODIVERSITE MICROBIENNE COMME FACTEUR-CLE 145

8. APPORTS DE CES ETUDES DANS LE CONTEXTE D'UN STOCKAGE A LONG TERME DE DECHETS RADIOACTIFS DANS DES SOLS FORESTIERS 144

9. PERSPECTIVES 147

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 152
Index des figures

**Figure P.1** : Contribution de la rhizosphère d'arbres forestiers dans le processus dans le processus d'altération des minéraux du sol

**Face p1**

**Figure I.1** : Les principaux flux d'éléments nutritifs dans les écosystèmes forestiers tempérés.

**Face p2**

**Figure I.2** : Photo de filaments mycéliens de *Scleroderma citrinum* autour de particules de biotite.

**Face p8**

**Figure I.3** : Structures chimiques de différents acides organiques.

**Face p11**

**Figure I.4** : Représentation schématique des différents objectifs de cette étude.

**Face p22**

**Figure II.1** : Concentration en protons (A) et en potassium (B) dans le sol global et la rhizosphère d'un site forestier proche de Bure.

**Face p27**

**Figure II.2** : Modèle conceptuel, à compartiments et à flux, de la dynamique d'un élément minéral dans un sol forestier.

**Face p28**

**Figure II.3** : Représentation schématique de la dynamique du potassium dans un sol forestier.

**Face p29**

**Figure II.4** : Differences between the concentrations of an element in the rhizosphere and in the bulk soil clays in the forest site of Breuil.

**Face p37**

**Figure II.5** : Percentage of elements lost in the rhizosphere of the surface horizon calculated by the method of isoelement chemical weathering balance.

**Face p38**

**Figure II.6** : XRD patterns of Ca saturated oriented bulk clays (B) in layer 1: (i) without pre-treatment (B, Ca), (ii) ethylene glycol solvated (B, Ca, EG), and ethylene glycol solvated and pre-treated citrate (B, Ci, Ca, EG).

**Face p38**

**Figure II.7** : XRD patterns of Ca saturated oriented clay from oak rhizosphere (R, Ca) and bulk soil (B, Ca) in layer 1.

**Face p39**

**Figure II.8** : XRD patterns of Ca saturated oriented clay in layer 1 from Norway spruce bulk soil.

**Face p39**

**Figure II.9** : Relationship between $SiO_{2}total$ and $Al_{2}O_{3}total$ in the clay fraction of rhizosphere and bulk soil for Oak and Norway spruce sampled at three depths in the forest site of Breuil.

**Face p42**
**Figure II.10** : Représentation schématique du dispositif d'exclusion des racines utilisé sur le site de Fougères. **Face p45**

**Figure II.11** : Photo de la mise en place d'un sachet de minéral-test dans le sol du site de Fougères. **Face p45**

**Figure II.12** : Photos réalisées en microscopie électronique à balayage, de grains d'apatite et de plagioclase après quatre années d'incubation dans le sol du site de Fougères, en présence ou en absence de racines. **Face p46**

**Figure II.13** : Nombre de figures de dissolution et d'hyphes observés par microscopie électronique à balayage (x80) sur les surfaces des grains d'apatite dans les traitements témoin et fertilisé après quatre années d'incubation dans le sol du site de Fougères. **Face p47**

**Figure II.14** : Pourcentage de dissolution de l'apatite et du labrador dans les traitements contrôle et fertilisé, et avec et sans racines, après quatre années d'incubation dans le sol du site de Fougères. **Face p47**

**Figure II.15** : Schéma de synthèse résumant le niveau de l'altération des argiles dans le site forestier de Breuil et l'altération de minéraux-tests dans le site forestier de Fougères. **Face p51**

**Figure III.1** : Stratégies d'échantillonnage des souches bactériennes et fongiques sur le site forestier de Breuil. **Face p53**

**Figure III.2** : Photo d'une racine de chêne mycorhizée par le champignon ectomycorrhizien *Scleroderma citrinum*. **Face p54**

**Figure III.3** : Photos des tests semi-quantitatifs *in vitro* de mobilisation du fer et du phosphore par les microorganismes. **Face p54**

**Figure III.4a** : Dispositif de micro-incubation en microplaques filtrantes utilisé pour caractériser le potentiel d'altération de souches bactériennes. **Face p54**

**Figure III.4b** : Photo d'une plaque de révélation des résultats du test *in vitro* en microplaque de mobilisation du fer et d'acidification du milieu par l'activité microbienne. **Face p54**

**Figure III.5** : Relationship between the mean values of the discolouration diameters of CAS and TCP media and the mobilization efficacies for the bacterial and fungal strains isolated in the soil of the Breuil forest site. **Face p64**

**Figure III.6** : Distribution of the bacterial isolates according to their compartment of origin and the intensity of their discolouring effect on the CAS and/or TCP media. **Après p64**
**Figure III.7** : Effect of the soil horizon and the compartment of origin of the bacterial and fungal isolates on the discolouration diameters on CAS medium and on TCP medium.

Face p65

**Figure III.8** : Relationship between the mean values of iron released from the biotite, the mean values of pH and the three compartments of origin of the bacterial isolates: PN (Bulk soil), PML (mycorrhizosphere) and PMB (mycorrhiza).

Face p79

**Figure III.9** : Projection of the 61 bacterial isolates in function of their individual biotite weathering potential.

Face p79

**Figure III.10** : Distribution of the 61 bacterial isolates according to their zone of origin (bulk soil; mycorrhizosphere and mycorrhiza) and their biotite weathering efficacy in three weathering classes

Après p79

**Figure III.11** : Phylogenetic tree constructed with the neighbor-joining method showing the relationship between the 61 bacterial isolates of the present study and reference strains from the literature, based on PCR-sequencing of a portion of the 16S rRNA gene (pA-pH primers).

Face p80

**Figure III.12** : Influence of the carbon source on the biotite weathering potential.

Face p81

**Figure III.13** : Projection of the 61 isolates on the plane defined by the first two principal components. The classification of the isolates into three homogeneous metabolic groups named A, B and C was achieved using the K-means method.

Face p82

**Figure III.14** : Component principal analysis of the metabolic profiles of the 61 bacterial isolates. Projection of the 95 carbon substrates from the Biolog GN microplates on the plane defined by the first two principal components.

Face p82

**Figure III.15** : Iron and proton concentrations issue from biotite weathering generated by bacterial activity in function of their original compartment under oak II, beech II and Norway spruce II.

Face p92

**Figure III.16** : Projection of the bacterial isolates in function of their individual biotite weathering potential.

Face p92

**Figure III.17** : Iron and proton concentration issue from biotite weathering in the solution, generated by bacterial activity in function of their original compartment under oak I and oak II.

Face p93
**Figure III.18** : Schéma de synthèse représentant la structuration des communautés bactériennes isolées du sol du site de forestier de Breuil sous les différentes essences d'arbres testées.

Face p96

**Figure III.19** : Schéma de synthèse représentant les différences de comportement des racines ectomycorhizées d'arbres forestiers dans la mobilisation des éléments par altération de la phase minérale.

Face p97

**Figure IV.1** : Photo du dispositif expérimental en colonnes.

Face p99

**Figure IV.2** : Calcul du bilan d'altération pour des éléments comme le potassium et le magnésium.

Face p102

**Figure IV.3** : Compartiment d'origine des souches bactériennes PML1(12) et PMB4(3) et des souches fongiques PN4(3) et PML2(10).

Face p104

**Figure IV.4** : Localisation des souches bactériennes PML1(12) et PMB4(3) dans le diagramme fer/pH établi à partir des résultats obtenus lors du test en microplaques de l'ensemble des souches bactériennes de la collection réalisée sous le peuplement de chêne en 2001.

Face p104

**Figure IV.5** : Logarithme des densités de bactéries cultivables mesurées après 21 jours d'expérimentation dans le substrat des colonnes.

Face p105

**Figure IV.6** : Evolution du pH de la solution percolée au cours du temps pour les différents traitements bactériens et fongiques alimentés en solution nutritive avec glucose et sans glucose.

Après p105

**Figure IV.7** : Quantités totales de fer (A) et de potassium (B) libérées en solution après 21 jours d'expérimentation.

Face p106

**Figure IV.8** : Mass-balance of potassium (A) and magnesium (B) released into leaching solution (grey) and taken up by plants (black).

Face p119

**Figure IV.9** : SEM photography of biotite surfaces without plant and bacteria (A) and with plant inoculated with the bacterial strain PML1(12) (B and C).

Après p119

**Figure IV.10** : Relation between the magnesium and the potassium quantities leached into the solution and taken up by plants, i.e. mobilised in the biotite.

Face p120

**Figure IV.11** : Increase of the root (black) and total plant (grey) biomass during the 76 days of the growth chamber experiment in the different treatments.

Face p120
**Figure IV.12** : Low vacuum SEM photography of a non-inoculated root (A) and a root inoculated with the bacterial strain PML1(12), which presents many root hairs (B).

Après p120

**Figure IV.13** : Growth of the plants during the 102 days of the greenhouse experiment in the different treatments.

Après p120

**Figure IV.14** : Augmentation de la biomasse sèche des plants de pin durant l'expérience en colonnes.

Après p127

**Figure IV.15** : Quantité de potassium (drainée en solution et immobilisée par le plant de pin) mobilisée par altération de la biotite durant l'expérience en colonnes.

Face p128

**Figure IV.16** : Pourcentage de potassium immobilisé par les plants de pin (= quantité de potassium immobilisée par le plant de pin / (quantité de potassium drainée en solution + quantité de potassium immobilisée par le plant de pin)) durant l'expérience en colonnes.

Face p128

**Figure IV.17** : Augmentation de la biomasse sèche des plants de pin durant l'expérience en colonnes.

Après p128

**Figure IV.18** : Logarithme des densités de la microflore bactérienne cultivable totale après 56 d'expérimentation.

Après p128

**Figure IV.19** : Quantité de potassium (drainée en solution et immobilisée par le plant de pin) mobilisée par altération de la biotite durant l'expérience en colonnes.

Après p128

**Figure IV.20** : Pourcentage de potassium immobilisé par les plants de pin (= quantité de potassium immobilisée par le plant de pin / (quantité de potassium drainée en solution + quantité de potassium immobilisée par le plant de pin)) durant l'expérience en colonnes.

Après p128

**Figure IV.21** : Quantité de césium (drainée en solution et immobilisée par le plant de pin) mobilisée par altération de la biotite durant l'expérience en colonnes.

Face p129

**Figure IV.22** : Quantité de césium (drainée en solution et immobilisée par le plant de pin) mobilisée par altération de la biotite durant l'expérience en colonnes.

Après p129

**Figure IV.23** : Schéma de synthèse résumant tous les effets observés dans les expérimentations en colonne utilisant la biotite comme minéral-test.

Face p132
**Figure IV.24** : Schéma de synthèse résumant les effets observés dans l'expérience en colonnes lors de l'ajout de composés toxiques comme l'uranium et le cadmium dans la solution nutritive.

Face p136
# Index des tableaux

**Tableau I.1 :** Composition chimique des principaux minéraux présents dans le sol du site forestier de Vauxrenard (Beaujolais).

Face p3

**Tableau II.1 :** Physicochemical characteristics of the soil in the experimental forest site of Breuil (central France)

Face p34

**Tableau II.2 :** Root densities and pH in the rhizosphere (R) and bulk soil (B) at three depths (0 to 3 cm, 3 to 10 cm and 10 to 23 cm) and for the two species (Norway spruce and oak).

Face p36

**Tableau II.3 :** Results of total analysis in the bulk and rhizosphere soil clays of the forest site of Breuil.

Face p37

**Tableau II.4 :** Tableau récapitulatif des principaux artefacts liés à l'utilisation de la méthode des minéraux-test dans un sol forestier.

Face p50

**Tableau III.1 :** Tableau récapitulatif des effectifs de souches bactériennes et fongiques isolées dans le sol du site de Breuil.

Face p53

**Tableau III.2 :** Physicochemical characteristics of the bulk and rhizosphere soils from the oak stand in the experimental forest site of Breuil (central France)

Face p59

**Tableau III.3 :** Origin of the Breuil collections of bacterial and fungal isolates.

Face p60

**Tableau III.4 :** pH in the horizon 3 to 10 cm in the bulk and rhizosphere soil under oak and Norway spruce in the site of Breuil.

Face p93

**Tableau IV.1 :** Les paramètres des différentes expériences d'interactions réalisées à l'aide du dispositif expérimental en colonnes.

Face p100

**Tableau IV.2 :** Résumé des analyses effectuées lors des différentes expériences d'interactions réalisées à l'aide du dispositif expérimental en colonnes.

Face p102

**Tableau IV.3 :** Différents traitements de l'expérience d'interactions microorganismes – minéral – solution.

Face p105

**Tableau IV.4 :** Quantités de fer et de potassium dans la solution percolée et pH de la solution percolée dans les traitements avec et sans glucose.

Après p105
**Tableau IV.5** : Capacity of the three bacterial strains selected for the column experiments to mobilise iron and phosphorus in three *in vitro* tests.

Face p113

**Tableau IV.6** : Molecular identification of the three bacterial strains.

Face p113

**Tableau IV.7** : Semi-quantitative estimation of the number of lateral roots and the number of root hairs in the different treatments according to binocular microscopy observations.

Après p120

**Tableau IV.8** : Traitements de l'expérience d'interactions arbres forestiers - microorganismes – minéral – solution.

Face p127

**Tableau IV.9** : Taux de mycorhization des racines courtes de plants de pin en début et en fin d'expérience.

Face p127

**Tableau IV.10** : Augmentation de biomasse sèche des parties aériennes et racinaires des plants de pin en fonction du traitement biologique.

Après p127

**Tableau IV.11** : Augmentation de biomasse sèche des parties aériennes et racinaires des plants de pin en fonction du traitement chimique.

Après p128

**Tableau IV.12** : Pourcentage de césium immobilisé par les plants de pin.

Face p129
# Index des annexes

**Annexe 1** : Article: Altération microbienne des minéraux, Biofutur (2006).

**Annexe 2** : Le site-atelier de Breuil (Morvan).

**Annexe 3** : Protocole d'analyses des fractions argileuses du site de Breuil.

**Annexe 4** : Synthèse des méthodes d'extraction sélectives utilisées pour l'étude des sols global et rhizosphérique des sites forestiers de Bure et de Breuil.

**Annexe 5** : Composition des milieux de culture utilisés dans les différentes expérimentations.

**Annexe 6** : Protocole d'échantillonnage des mycorhizes *S. citrinum* et du sol global.

**Annexe 7** : Protocoles de préparation des inocula bactériens et fongiques pour les biotests *in vitro* et les expérimentations en colonnes.

**Annexe 8** : Expérience d'interactions champignon – phlogopite en boîtes de Petri.

**Annexe 9** : Article en préparation : Alteration of Chrysotile in the Rhizosphere of the Nickel Hyperaccumulator *Leptoplax emarginata*.

**Annexe 10** : Propriétés physico-chimiques des sols de Bure, Breuil et Fougères.

**Annexe 11** : Liste des articles issus de ce travail de thèse.
# PREAMBULE
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure P.1 : Contribution de la rhizosphère d'arbres forestiers dans le processus d'altération des minéraux du sol. Les flèches noires représentent les apports d'éléments minéraux dans la solution du sol. Les flèches blanches représentent les pertes d'éléments minéraux dans la solution du sol</figcaption></figure>
# PREAMBULE

Pour croître, les arbres ont un besoin essentiel d'éléments minéraux tels que l'azote, le potassium, le phosphore, le calcium, le magnésium, le soufre, le fer, le manganèse, le bore, le zinc, le cuivre et le molybdène. Mis à part l'azote, les éléments nutritifs des écosystèmes forestiers non fertilisés proviennent principalement des minéraux présents dans le sol. Cependant, cette réserve d'éléments minéraux est (i) relativement pauvre dans les sols acides qui caractérisent la majorité des forêts françaises et (ii) ne représentent pas une source de nutriments directement accessibles aux arbres car les éléments sont piégés dans la phase minérale. Nous pouvons donc nous demander comment les arbres font pour acquérir ces éléments minéraux et ainsi se développer dans la mesure où, en outre, ils n'ont accès qu'à ceux présents dans l'environnement proche de leurs racines, la rhizosphère. Le rôle de l'altération des minéraux comme processus favorisant la biodisponibilité des nutriments est aujourd'hui reconnu. En revanche, la contribution du facteur biologique dans ce processus reste à quantifier : qu'en est-il de l'effet des différentes composantes biologiques de la rhizosphère des arbres, racines et microflore associée (Figure P1) ? L'objectif de notre travail est de répondre à cette question générale.

Etant donné l'interdisciplinarité de ce questionnement, le premier chapitre de ce manuscrit sera consacré à une introduction qui présentera tout d'abord, une analyse des caractéristiques inhérentes au contexte forestier de nos recherches, puis à un état de nos connaissances actuelles sur l'altération des minéraux dans les sols, et enfin nous nous intéresserons plus spécifiquement à la rhizosphère avec une description des particularités et des différentes composantes de ce compartiment du sol. Le partie suivante, dédiée aux résultats, comportera trois chapitres consacrés successivement à (i) une quantification de l'altération des minéraux dans le sol global et la rhizosphère d'arbres en forêt, (ii) une évaluation du potentiel d'altération in vitro, des communautés microbiennes isolées à partir du sol global et de la rhizosphère de différentes essences d'arbres, et (iii) une détermination de la part respective des différents partenaires biologiques de la rhizosphère dans le processus d'altération des minéraux, à l'aide de dispositifs de culture simplifiés faisant interagir la plante, les microorganismes, le minéral et la solution. Enfin, le dernier chapitre de ce manuscrit présente une synthèse des principaux résultats obtenus, une discussion générale et les perspectives.
## CHAPITRE I :
INTRODUCTION GENERALE
Figure 1.1: Les principaux flux d'éléments nutritifs dans les écosystèmes forestiers tempérés. Les flux avec des signes "+" représentent des entrées d'éléments, les flux avec des signes "-" représentent des sorties d'éléments du sol. Les végétaux assurent leur nutrition minérale en prélevant par leurs racines l'élément minéral dissout dans la solution du sol [1] qui est ensuite distribué dans tout l'arbre [2]. Puis, par des restitutions essentiellement solides [3], l'élément retourne dans le sol [4].

<figure><img src="image_6.png" /></figure>
## 1 LE CONTEXTE DE NOS RECHERCHES :

### La disponibilité des éléments minéraux dans les écosystèmes forestiers

D'une manière générale, un écosystème et en particulier l'écosystème forestier se compose d'une série de biocénoses (phytocénose, zoocénose, microbiocénose et mycocénose) en forte interaction avec l'environnement abiotique (climat, sol) (Duvigneaud, 1974). Il se caractérise par une multitude de relations entre le sol, les plantes, la microflore, la faune, le climat et par un mode de fonctionnement à travers une série de cycles (de l'énergie, de l'eau et des éléments minéraux), se traduisant par une productivité plus ou moins élevée selon les conditions offertes par le milieu et les exigences de l'essence considérée.

Ainsi, l'écosystème forestier fonctionne suivant certaines lois qu'il est nécessaire de connaître afin de prévoir son évolution à plus ou moins long terme. Notamment, l'évolution de la qualité des sols forestiers nécessite la connaissance du fonctionnement minéral de l'écosystème forestier, autrement dit de la dynamique du cycle biogéochimique des éléments nutritifs. Ce dernier représente l'ensemble des mécanismes intervenant dans la biodisponibilité des éléments nutritifs pour la croissance des végétaux. Il constitue une adaptation des écosystèmes forestiers pour produire de la biomasse à partir de réserves minérales limitées et non renouvelées.
En effet, les forêts françaises sont principalement développées sur des sols pauvres en nutriments et non fertilisées (Badeau *et al.*, 1999).

#### 1.1 Le cycle biogéochimique des éléments minéraux dans les écosystèmes forestiers

Le cycle biogéochimique (Figure I.1) d'éléments minéraux tels que l'azote, le phosphore, le potassium ou le magnésium, représente la circulation permanente de ces éléments entre les végétaux et les horizons prospectés par les racines. Ainsi, les éléments prélevés servent à l'élaboration de la biomasse annuelle et pérenne ; une partie de ces éléments est fixée (immobilisation), une autre est restituée au sol (litière et récrétion). Quatre principaux flux peuvent modifier le bilan d'éléments minéraux dans l'écosystème (Duvigneaud, 1974 ; Bormann et Likens, 1979 ; Ranger et Turpault, 1999) : les dépôts atmosphériques et l'altération des minéraux du sol (flux d'entrée), le drainage et l'exportation de biomasse (flux de sortie).
<table><caption>Tableau I.1 : Composition chimique (en % poids) des principaux minéraux présents dans le sol du site forestier de Vauxrenard (Beaujolais).</caption><thead><tr><th rowspan="2">Minéral</th><th colspan="9">Eléments</th></tr><tr><th>SiO<sub>2</sub></th><th>Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub></th><th>MgO</th><th>CaO</th><th>Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub></th><th>TiO<sub>2</sub></th><th>P<sub>2</sub>O<sub>5</sub></th><th>Na<sub>2</sub>O</th><th>K<sub>2</sub>O</th></tr></thead><tbody><tr><td>Plagioclase</td><td>67.89</td><td>20.18</td><td></td><td>0.45</td><td></td><td></td><td></td><td>11.08</td><td>0.17</td></tr><tr><td>Feldspath K</td><td>64.4</td><td>18.64</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>0.25</td><td>16.17</td></tr><tr><td>Mica blanc</td><td>50.38</td><td>32.09</td><td>1.51</td><td></td><td>1.55</td><td>0.41</td><td></td><td>0.01</td><td>9.23</td></tr><tr><td>Apatite</td><td></td><td></td><td></td><td>55.88</td><td></td><td></td><td>42.00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz</td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
* Les dépôts atmosphériques apportent à l'écosystème des quantités non négligeables d'éléments. Ils peuvent être sous forme de dépôts humides dissous dans la pluie, de dépôts occultes correspondant aux gouttelettes de brouillards ou aux dépôts orographiques (nuages) et de dépôts secs composés de particules ou de gaz se déposant sur la canopée. Leur origine peut être naturelle ou anthropique.

* L'altération des minéraux du sol permet la mise à disposition d'éléments qui étaient jusque là inaccessibles aux organismes de l'écosystème. La quantité de minéraux contenant des éléments nutritifs d'un sol dépend des caractéristiques du matériau parental du sol appelé "roche-mère" et de l'évolution du sol. Elle constitue une ressource limitée non renouvelable (Ezzaïm, 1997 ; Fichter, 1997).

* Lorsque des précipitations efficaces, i.e. bilan d'eau positif, atteignent l'écosystème, la migration des eaux gravitaires dans le sol draine en profondeur une partie des éléments du sol solubles ou en suspension, entraînant une acidification du sol.

* Dans les forêts exploitées par l'homme, une partie de la biomasse est périodiquement prélevée à l'écosystème. Cette exportation de biomasse contenant des éléments nutritifs tels que le potassium, le calcium et le magnésium qui tamponnent le pH du sol, constitue donc une perte pour le système (Le Goaster et al., 1991) favorisant l'acidification du sol (Glatzel, 1991).

## I.2 Les minéraux du sol comme réserve de nutriments et le flux d'altération comme moteur de la disponibilité de ces nutriments

Le sol constitue la principale réserve en nutriments minéraux pour les arbres. Ainsi, par exemple dans un écosystème forestier comme celui de Vauxrenard (Beaujolais), les réserves de magnésium et de potassium contenues dans le sol sont respectivement estimées à 24 et 127 tonnes par hectare sur une couche de 65 cm. Le tableau I.1 indique les principaux minéraux présents dans le sol de ce site forestier acide et les éléments qu'ils contiennent. Cependant la présence de ces éléments en grande quantité dans les sols ne signifie pas qu'ils sont disponibles pour les racines d'arbre. Le terme "biodisponibilité" a d'ailleurs été introduit pour rendre compte du fait que seule une fraction d'un nutriment dans le sol est susceptible d'être prélevée par un organisme
vivant. Pour un système sol - arbre, la biodisponibilité d'un élément est définie comme l'aptitude de cet élément à être transféré d'un compartiment du sol vers le système racinaire de l'arbre, lieu de son prélèvement. Ce transfert s'effectue essentiellement par l'intermédiaire de l'absorption de l'élément contenu dans la solution du sol par les racines (Marschner, 1995). La biodisponibilité d'un élément dépend donc de la spéciation, de toutes les propriétés physico-chimiques qui gouvernent la spéciation, et par conséquent la mobilité de l'élément dans le sol, mais aussi de l'espèce végétale considérée (Ebbs et al., 1996). La majeure partie de ces éléments étant piégée dans la structure des minéraux, c'est donc le flux lié à l'altération de la phase minérale qui va constituer à long terme la principale source de renouvellement des éléments nutritifs dans la solution du sol.

> Les forêts se caractérisent par un milieu où les éléments nutritifs se recyclent constamment et de manière relativement intense dans les divers compartiments de l'écosystème. La pérennité de la plupart des forêts repose sur l'existence de ce cycle biogéochimique qui optimise l'efficience des éléments nécessaires à la croissance des arbres. Cependant, l'accumulation dans le bois et le drainage constituent des pertes majeures en nutriments dans le sol. C'est le flux lié à l'altération de la phase minérale du sol qui constitue la principale source de renouvellement de ces nutriments dans les écosystèmes à faibles intrants comme la plupart des forêts françaises.
## 2. LE FLUX D'ALTERATION ISSU DES RESERVES MINERALES DU SOL :
Un processus générateur de nutriments essentiels pour la croissance des plantes sous dépendance des racines et des microorganismes associés

Depuis leur formation sous des conditions thermodynamiques très différentes de celles régnant à la surface du globe actuellement, les roches sont déstabilisées par les conditions géochimiques et biologiques du sol. Sous l'effet de l'eau de pluie, du gaz carbonique, de l'oxygène et des variations thermiques, elles évoluent jusqu'à l'individualisation d'un nouveau matériau, le sol, qui est constitué par des minéraux qui lui sont propres et qui sont parfaitement stables dans le milieu ambiant. On désigne sous le nom d'altération l'ensemble des phénomènes relatifs à cette évolution qui conduisent à la destruction, la transformation et la néoformation de minéraux.

L'altération des roches et des minéraux étant due à l'action combinée de processus physiques, chimiques et biologiques, nous aborderons tout d'abord les différentes réactions d'altération en nous focalisant sur la dissolution des minéraux silicatés avant de décrire les processus d'altération faisant intervenir les racines des plantes, les bactéries et les champignons du sol.

### 2.1 Les différents réactions d'altération

Cinq types de réactions sont mises en jeu lors de l'altération supergène des minéraux du sol : (i) la microdivision, (ii) la dissolution, (iii) la transformation, (iv) la néoformation et (v) l'échange d'ions. La microdivision, c'est-à-dire le fractionnement de la roche en fragments de plus en plus petits sans modification de sa composition minéralogique, est une transformation physique liée aux agents climatiques tels que le vent (abrasion), le gel ou l'eau, mais également aux racines des plantes, aux macroorganismes et aux microorganismes. La microdivision intervient indirectement dans le flux d'altération car elle conduit à une augmentation de la surface des minéraux exposés aux solutions du sol. Trois réactions participent directement au flux d'altération : la dissolution, la transformation et la néoformation. Lors de la dissolution, tous les ions constituant le réseau cristallin du minéral sont solubilisés. Lors des réactions de transformation, seule une partie des ions constitutifs du minéral peut-être extraite et transférée en solution, l'autre partie va servir à la formation d'un minéral
secondaire avec une restructuration partielle du réseau silicaté du minéral primaire. Lors de la néoformation, les minéraux secondaires précipitent uniquement à partir des ions en solution. Le bilan des ions qui passent en solution lors de ces réactions constitue le flux d'altération.

La dissolution, c'est-à-dire l'attaque par l'eau souvent chargée d'éléments plus ou moins agressifs en solution, provoque un réarrangement important des réseaux cristallins. Elle s'effectue de différentes manières : dissolution en milieu alcalin, complexation, dissolution acide. Ainsi, le taux de dissolution d'un minéral silicaté est principalement gouverné par le pH et le potentiel rédox qui influence la solubilisation du fer et du manganèse de la solution (Drever, 1994 ; Welch et Ullman, 1996 ; Harley et Gilkes, 2000). A ces facteurs s'ajoutent deux autres facteurs intrinsèques inhérents au minéral lui-même ((i) et (ii)) ainsi que des facteurs externes ((iii), (iv), (v)) qui participent également au processus de dissolution des silicates :

(i) la surface spécifique du minéral : plus elle est développée, plus la surface d'interaction entre l'eau et le minéral est importante, ce qui implique que la désagrégation physique du minéral favorise sa dissolution chimique,

(ii) la constante de stabilité du minéral : elle est propre à chaque minéral et dépend de sa composition et de sa structure,

(iii) la température : elle influence l'énergie d'activation de la réaction minéral – fluide. Plus la température est élevée, plus la réaction est forte,

(iv) les paramètres hydrologiques : la rétention en eau, par exemple, augmente le temps de contact entre la solution et le minéral et favorise donc la dissolution,

(v) la composition de la solution : la nature des cations et des agents altérants présents en solution et qui interagissent avec la surface du minéral, affecte la dissolution. Par exemple, certains composés d'origine biologique comme les acides organiques ou les polysaccharides, peuvent accentuer la dissolution de la phase minérale (Huang and Keller, 1970 ; Welch *et al.*, 1999).

En conséquence, tous ces paramètres permettent de définir une loi de dissolution $V_M$ (en moles par an) d'un minéral m (Madé, 1991) :

$$V_M = k_M \cdot S_M \cdot a_i^n \cdot (1 - (Q_M / K_M)) \quad (1)$$

Avec :

$K_M$ : constante de vitesse intrinsèque au minéral M (en moles.m⁻².an⁻¹),

$S_M$ : surface de contact effective entre le minéral M et un kilogramme de solution (en m².kg⁻¹),
$a_i$ : activité de l'espèce aqueuse i, i est l'ion $H^+$ en milieu acide et l'ion $OH^-$ en milieu basique,

n : exposant qui permet de tenir compte de la dépendance de la vitesse de dissolution du minéral M par rapport à l'espèce aqueuse i,

$$(1-(Q_M/K_M))$$ : index de saturation du minéral m en solution, avec $Q_M$ le produit ionique d'activité du minéral M et $K_M$ la constante d'équilibre thermodynamique du minéral m à la température et la pression fixées.

## 2.2 Les processus biologiques d'altération des minéraux

L'activité biologique contribue non seulement à la dégradation de la matière organique et à la formation de composés organiques spécifiques du sol mais elle participe aussi à l'altération des minéraux du sol. Ce sont essentiellement les microorganismes et les végétaux supérieurs qui interviennent (Berthelin et al., 1994), la faune apparaissant moins active.

Dès 1845, Ebelmen suggéra que les racines des plantes et les acides organiques qu'elles sécrètent, stimulaient l'altération des roches. En réalité, nous savons aujourd'hui qu'une grande variété de processus biologiques affecte l'altération des minéraux du sol, incluant des actions mécaniques et chimiques directes et des actions indirectes des produits du métabolisme des racines et des microorganismes (Barker et al., 1997; Banfield et al., 1999).

### 2.2.1 Désagrégation physique

Les racines et les hyphes fongiques désagrègent physiquement les minéraux, exposant ainsi de nouvelles surfaces minérales et augmentant de ce fait la quantité de surfaces réactives, i.e. accessibles aux agents altérants.

Le pivot et les racines charpentières, assurent l'ancrage mécanique des arbres dans le sol. Les racines moyennes et fines, quant à elles, pénètrent dans les pores grossiers et fins du sol. Cette pénétration des racines dans le sol engendre une fragmentation de ce dernier. Denef et al. (2002) ont suggéré que la plus forte proportion de petits agrégats dans les sols résultait de la dissociation des gros agrégats par les racines. Par ailleurs, les racines s'associent avec des champignons symbiotiques, les champignons mycorhiziens dont les hyphes, du fait de leur très faible diamètre (quelques micromètres), pénètrent
Figure 1.2 : Photo de filaments mycéliens de Scleroderma citrinum autour de particules de biotite.

<figure><img src="image_7.png" /></figure>
dans les roches et les minéraux (Jongmans *et al.*, 1997) occasionnant une séparation et une microdivision des minéraux.

## 2.2.2 Stabilité structurale du sol

La stabilisation du sol augmente la rétention en eau, allongeant la durée de contact entre la solution et la phase minérale et favorisant ainsi les réactions d'altération. De plus, la stabilisation augmente la diffusion d'oxygène et par conséquent stimule la colonisation du sol par les organismes.

Les pores formés par les racines sont principalement des macropores (> 30 µm) (Gibbs et Reid, 1988) qui améliorent la structure du sol (Lesturgez *et al.*, 2004) et la circulation de l'eau (Beven et Germann, 1982). Par ailleurs, pour faciliter leur pénétration et leurs mouvements dans le sol, les racines, au niveau de leurs zones apicales, se couvrent d'une couche de mucilage. Ce composé de haut poids moléculaire a diverses fonctions biologiques : lubrification, protection contre la dessiccation en maintenant une humidité favorable tout en évitant les vides qui isoleraient du sol les surfaces d'absorption (Callot, 1982). Les exopolysaccharides qu'il contient favorisent également l'agrégation du sol dans la rhizosphère en liant les particules d'argiles, créant ainsi des agrégats de tailles et de natures différentes qui vont laisser entre eux une porosité importante (McCully, 1999 ; Czarnes *et al.*, 2000 ; Berge *et al.*, 2004).

Les microorganismes participent également à ces phénomènes de formation et de stabilisation des agrégats des sols et donc d'amélioration de la structure. En effet, de par leur réseau de filaments, les champignons sont responsables de l'enchêvêtrement des particules de sol par les champignons filamenteux (Figure I.2). Par ailleurs, les produits du métabolisme microbien, essentiellement exopolysaccharidiques (Amellal *et al.*, 1998) forment parfois des assemblages très stables appelés biofilms qui contribuent à l'agrégation des particules de sol. Les bactéries interviendraient également dans la formation de petits agrégats à l'échelle du micromètre, où elles sont liées aux particules d'argiles, chargées également négativement, par des ponts ioniques *via* des cations divalents (Berthelin *et al.*, 1994).

## 2.2.3 Absorption de nutriments et échange d'ions

L'absorption et l'échange d'ions liés à l'activité des racines et des microorganismes entraînent des modifications substantielles des concentrations d'éléments en
solution. Ces modifications ont pour effet de déplacer les équilibres chimiques régissant la dynamique de ces éléments dans le sol et affectent par conséquent l'altération des minéraux.

Les plantes prélèvent dans le sol, l'eau dont elles ont besoin. Elles prélèvent aussi dans la solution du sol tous les éléments minéraux nécessaires à leur croissance. Ce prélèvement est sélectif, c'est-à-dire que les flux d'éléments minéraux sont contrôlés par des processus physiologiques complexes qui ont pour fonction d'ajuster précisément ces flux aux besoins des plantes. L'évolution de la concentration de la solution du sol au voisinage des racines résulte à la fois des besoins de la plante et de la disponibilité des éléments dans le sol. Ainsi, certains éléments se trouvent en excès dans la solution du sol, et en quantité très supérieure aux besoins de la plante. Ces éléments vont donc se concentrer et peuvent même précipiter au voisinage des racines, formant des encroûtements périracinaires, des manchons minéraux qui isolent les racines de leur environnement. (Jaillard, 1980). En revanche, d'autres éléments sont peu disponibles et le fort prélèvement exercé par la plante peut engendrer un appauvrissement de la solution au voisinage des racines.

Les parois racinaires et fongiques ainsi que les parois bactériennes et les polymères extracellulaires possèdent des constituants (polysaccharides, protéines, lipopolysaccharides,...) qui portent des groupements fonctionnels (-NH₂, -COOH, -OH, -PO₄H₂,..) leur conférant des propriétés d'échanges anioniques et cationiques, et de complexation des métaux en solution.

Cependant, tous ces composés ou d'autres produits du métabolisme peuvent aussi, dans certaines conditions, inhiber la dissolution minérale. De nombreux composés organiques microbiens sont connus pour s'adsorber irréversiblement sur les surfaces ou pour réagir avec les surfaces et les solutions pour produire des phases secondaires stables. Ces phénomènes d'adsorption et de précipitation peuvent avoir pour effet de limiter les échanges entre la surface minérale et la solution de sol, réduisant ainsi le taux de dissolution (Chou et Wollast, 1985 ; Ullman *et al*., 1996).

### 2.2.4 Production d'agents altérants

Les plantes et les microorganismes du sol produisent divers composés organiques et inorganiques dotés de propriétés altérantes. Ainsi, les protons altèrent directement la surface minérale. En revanche, l'action des acides et des ligands organiques sur l'altération des minéraux est double : i) ces molécules peuvent se
fixer sur les surfaces minérales et en mobiliser les éléments et ii) elles peuvent complexer les éléments en solution, déplaçant ainsi les équilibres solide – solution et accélérant indirectement le taux de dissolution des minéraux.

* Les protons : lors du phénomène de respiration, les racines produisent du CO₂. De son côté, la microflore hétérotrophe oxyde les composés carbonés, conduisant à la minéralisation de la matière organique et en phase finale à la formation de CO₂. Ce CO₂ va réagir avec l'eau pour former de l'acide carbonique qui est un acide faible mais présent en grande quantité dans l'environnement proche de la racine (Schwartzmann et Volk, 1989). Pour sa croissance, la plante absorbe des quantités inégales de cations (NH₄⁺ + Ca²⁺ + Mg²⁺ + K⁺ + Na⁺) et d'anions (NO₃⁻ + Cl⁻ + SO₄²⁻ + H₂PO₄⁻) nutritifs. L'équilibre des charges ioniques en son sein est maintenu par l'excrétion d'une quantité d'ions H⁺ et OH⁻ qui est stoechiométriquement égale à l'excès respectif de cations et d'anions prélevés. Dans la plupart des cas, la plante absorbe plus de cations que d'anions, ce qui conduit à la libération d'ions H⁺ dans la rhizosphère. Par exemple, la forme d'azote fixée (NH₄⁺ ou NO₃⁻) par les plantes affecte considérablement l'évolution du pH au sein de la rhizosphère (Marschner et Römheld, 1983). Par ailleurs, le prélèvement actif des ions et leur transport à travers la membrane plasmique nécessite une force conductrice qui est générée par l'extrusion d'ions H⁺ (Haynes, 1990). Enfin, les phénomènes d'oxydation, notamment du fer, induits par la plante et les microorganismes engendrent la libération de protons et par conséquent une acidification de la rhizosphère (Begg et al., 1994).

* les acides inorganiques : les microorganismes produisent des acides inorganiques forts tels que l'acide sulfurique et l'acide nitrique par oxydation de composés sulfurés et azotés réduits. Ces réactions se produisent généralement à l'interface entre des environnements oxygénés et anoxiques comme par exemple les biofilms microbiens et peuvent engendrer localement une sévère chute de pH (Berthelin, 1983). A ce titre, ces acides sont impliqués dans l'altération de la roche (Berthelin, 1985) et entraînent parfois une destruction complète du minéral avec la mise en solution de tous ses éléments constitutifs.

* Les acides organiques : les plantes et les microorganismes excrètent des composés organiques solubles principalement de bas poids moléculaires. Dans la rhizosphère, ces composés sont détectés à de faibles concentrations variant de
<table><caption>Figure 1.3 : Structure chimique de différents acides organiques.</caption><thead><tr><th>Acides organiques monofonctionnels</th><th>Acides organiques polyfonctionnels</th></tr></thead><tbody><tr><td>Acide formique<br>H-C-OH</td><td>Acide oxalique<br>HO-C-C-OH</td></tr><tr><td>Acide acétique<br>H-O<br>| ||<br>H</td><td>Acide succinique<br>H-O-C-C-C-C-OH</td></tr><tr><td>Acide propionique<br>H H O<br>| ||<br>H H</td><td>Acide lactique<br>H OH O<br>| ||<br>H H</td></tr><tr><td>Acide pyruvique<br>H O O<br>| || ||<br>H</td><td>Acide malique<br>H H OH O<br>| || ||<br>H H H</td></tr><tr><td></td><td>Acide citrique<br>H O<br>| ||<br>H-C-C-OH<br>| ||<br>H-O-C-C-OH<br>| ||<br>H-C-C-OH<br>| ||<br>H</td></tr></tbody></table>
1 à 50 µM (Bazira-Makenga et al., 1995) et leur durée de vie est courte vraisemblablement inférieure à 2 heures (Jones et Darrah, 1994 ; Van Hees et al., 2003) car ils sont rapidement dégradés par les microorganismes. Les acides organiques sont caractérisés par la présence d'un ou plusieurs groupes carboxyles (COOH). Parmi les acides les plus souvent cités comme étant impliqués dans les processus d'altération des minéraux silicatés, on trouve des acides polyfonctionnels comme les acides oxalique, succinique, malique, lactique et citrique et des acides monofonctionnels comme les acides acétique, formique, propionique, pyruvique (Figure 1.3). En condition acide, les acides polyfonctionnels sont significativement plus efficaces dans le processus de dissolution des minéraux que les acides monofonctionnels du fait de la présence de plusieurs groupes carboxyliques libérant chacun un ion H⁺ par dissociation. Ces acides organiques agissent par l'intermédiaire de leurs groupes hydroxyles et carboxyles ("ligand-promoted mechanism") et de leurs protons ("proton-promoted mechanism") (Berthelin, 1983; Amrhein et Suarez, 1988; Bennett et al., 1991 ; Welch et Ullman, 1996) et peuvent augmenter la dissolution d'un minéral plus qu'une simple attaque de protons. Par exemple, l'acide oxalique sécrété par les racines forme des complexes solubles avec l'aluminium et le fer. Ce processus augmente la dissolution des minéraux contenant de l'aluminium et du fer en retirant le fer et l'aluminium insolubles de la solution (Drever et Vance, 1994, Berner et Cochran, 1998). En exsudant de l'acide oxalique, les champignons ectomycorhiziens de l'espèce *Pisolithus* sont eux aussi capables par exemple d'altérer un minéral de référence, la phlogopite, par une complexation des ions aluminium associée à une dissolution acide du réseau cristallin (Paris et al., 1995 ; Yuan et al., 2004). Cette altération se constate en diffraction de rayons X par une augmentation de l'espace interfoliaire de la phlogopite (Paris et al., 1995). Le même type d'observation a été réalisé pour un autre champignon ectomycorhizien, *Laccaria laccata*, (Leyval et Berthelin, 1991) ainsi qu'avec des bactéries appartenant aux genres *Acidithiobacillus*, *Agrobacterium* ou *Bacillus*.

* Les ligands organiques : même si dans la plupart des sols, le fer est présent en grande quantité, il l'est sous des formes insolubles donc non disponibles pour les plantes et les microorganismes. C'est pourquoi, les plantes et les
microorganismes ont mis en place des stratégies de mobilisation du fer *via* notamment la libération de sidérophores. Ces molécules très affines du fer, mais qui peuvent également fixer d'autres micronutriments tels que le cuivre, le manganèse et le zinc (Brantley *et al.*, 2001 ; Kalinowski *et al.*, 2004), sont excrétées en condition de carence en fer (Schmidt, 2003). Plus de 200 sidérophores ont été isolés, la majorité étant des hydroxamates ou des phénolates – catécholates. Watteau et Berthelin (1994) et Liermann *et al.* (2000b) ont respectivement montré que la production de sidérophores par le champignon ectomycorhizien *Suillus granulus* et la bactérie *Streptomyces sp.* était impliquée dans la dissolution d'un hydroxyde et d'un oxyde de fer (goethite et hématite).

### 2.2.5 Production d'agents oxydants et réducteurs et réactions enzymatiques

Les racines et les microorganismes, en modifiant l'état d'oxydation des métaux vont soit les solubiliser, soit les insolubiliser, affectant ainsi le processus d'altération des minéraux.

Les conditions rédox déterminent la dynamique des éléments qui possèdent plusieurs degrés d'oxydation. C'est notamment le cas du fer dont la forme réduite $Fe^{2+}$ est très soluble alors que sa forme oxydée $Fe^{3+}$ l'est très peu en condition aérobie et aux pH proches de la neutralité.

La plante exsude des acides phénoliques et aliphatiques (Brown et Ambler, 1973) qui peuvent modifier les conditions d'oxydo-réduction au sein de la rhizosphère (Bienfait *et al.*, 1983). Ces dernières induisent des changements dans la solubilité des nutriments qui peuvent parfois provoquer l'accumulation de composés organiques phytotoxiques comme $l'Al^{3+}$. C'est pourquoi les plantes adaptées aux sols engorgés maintiennent un haut potentiel rédox dans la rhizosphère par le transport d'O$_2$ et exsudent également des composés organiques qui vont la protéger en chélatant $l'Al^{3+}$ dans la rhizosphère sous forme de complexes non toxiques.

Contrairement aux eucaryotes supérieurs qui misent sur l'oxygène pour leur respiration, de nombreuses bactéries excellent dans l'utilisation d'autres accepteurs d'électrons terminaux pour subvenir aux besoins énergétiques de leur métabolisme. Ces bactéries se rencontrent souvent dans des environnements particuliers dépourvus en oxygène, dans l'eau, dans les sols engorgés ou sur la face inférieure des biofilms qu'elles créent à la surface de minéraux. Parmi ces bactéries, des souches appartenant aux espèces
Geobacter sulfurreducens, Geobacter metallireducens ou Shewanella oneidensis ont été caractérisées pour leur capacité à oxyder ou à réduire des éléments chimiques simples comme le fer, le chrome, le manganèse, le mercure, l'arsenic, le sélénium ou l'uranium (Sasaki et al., 1998 ; Weiss et al., 2004). Ces mécanismes d'oxydation et de réduction nécessitent toutefois un contact entre les microorganismes et le minéral (Mustin et al., 2004).

De plus, pour assurer leur nutrition, les racines de la plante produisent des exoenzymes comme les phosphatases ou les phytases qui sont impliquées dans l'hydrolyse catalytique des phosphates organiques et par conséquent dans la biodisponibilité du phosphore dans le sol (Tarafdar et Jungk, 1987 ; Findenegg et Nelemans, 1993). Les champignons ectomycorhiziens et les bactéries du sol produisent également des enzymes extracellulaires qui jouent un rôle important dans le cycle des nutriments tels que le phosphore, l'azote et le soufre (Bowen et Rovira, 1999).

C'est le processus d'altération des minéraux du sol qui est le principal générateur de nutriments et par conséquent, il a un impact déterminant sur notre environnement et notamment la fertilité des sols. Les géologues ont longtemps considéré l'altération comme une simple interaction eau - roche, négligeant de ce fait l'effet du paramètre biologique. Or les nombreux processus inhérents à l'activité de la racine, des bactéries et des champignons associés sont de mieux en mieux connus. L'importance de leur rôle dans le domaine de l'altération minérale et donc sur la mobilisation des éléments minéraux nutritifs ou non ne fait plus aucun doute aujourd'hui, notamment dans un compartiment particulier du sol : la rhizosphère.
## 3. LA RHIZOSPHERE :

Un environnement particulier et un lieu d'interactions privilégiées entre les racines, le sol et les microorganismes.

### 3.1 Historique et définitions

C'est Lorenz Hiltner, bactériologiste du sol et professeur d'agronomie à Munich qui, en 1904, utilise pour la première fois le terme "rhizosphère" pour désigner les interactions entre diverses bactéries et les racines de légumineuses. Il insiste sur le rôle primordial des activités microbiennes au sein de la rhizosphère dans la nutrition et la santé des plantes. Selon lui, la nutrition des plantes dépend de la composition de la microflore du sol au sein de la rhizosphère. Il fait également l'hypothèse que les plantes attirent les bactéries par le biais de leurs "excrétions". Par ces deux hypothèses, Hiltner a déjà identifié deux impacts majeurs de la rhizosphère sur les plantes, à savoir (i) le rôle de la rhizosphère dans la nutrition, la croissance et le développement de la plante et (ii) l'effet sélectif de la rhizosphère sur les communautés microbiennes.

Durant tout le vingtième siècle et notamment durant les trois dernières décennies, de multiples travaux dans des disciplines très variées telles que la minéralogie (April et Keller, 1990 ; Courchesnes et Gobran, 1997), la physico-chimie (Nye, 1981 ; Jones et Darrah, 1994 ; Marschner, 1995 ; Hinsinger et al., 2003) et la microbiologie (Berthelin et Leyval, 1982 ; Linderman, 1988 ; Grayston et Campbell, 1996 ; Frey-Klett et al., 2005) ont été consacrés à la caractérisation la rhizosphère et beaucoup de définitions se sont succédées (Curl and Truelove, 1986). Cependant, de nos jours, une définition générale, formulée par Darrah (1993), est communément acceptée : c'est le volume de sol entourant les racines (Rhiza en grec) et soumis à leur influence.

### 3.2 Impact de la racine sur son environnement : l'effet rhizosphère

#### 3.2.1 Caractéristiques physico-chimiques de la rhizosphère

La rhizosphère est considérée comme un environnement spécifique où les flux de matière et d'énergie entre le sol et la plante sont particulièrement intenses, affectant les conditions physico-chimiques et les conditions microbiologiques du sol. Dans la rhizosphère, la plante absorbe l'eau et les éléments minéraux nécessaires à son
développement et à sa croissance induisant ainsi des modifications importantes du potentiel de l'eau et des concentrations ioniques du sol rhizosphérique (Hinsinger, 1998). Ces échanges ioniques et gazeux entre les racines des végétaux et le sol contribuent à modifier de façon notable le pH (Nye, 1981 ; Hoffland, 1992 ; Hinsinger, 2003) et le potentiel d'oxydo-réduction (Brown et Ambler, 1973 ; Bienfait et al., 1983 ; Marschner, 1995) de la rhizosphère et, par la suite, la biodisponibilité de nombreux éléments minéraux nutritifs ou non (Marschner, 1995 ; Hinsinger, 1998 ; Jones, 2003).

De plus, les racines des plantes libèrent divers composés organiques dans le sol environnant. Ce processus, nommé rhizodéposition (Shamoot et al., 1968), comprend les cellules détachées de la coiffe, les lysats, les mucilages et les exsudats. Il est d'importance écologique. En effet, une grande partie du carbone net assimilé par la plante lors de la photosynthèse [15 à 25% selon Kuziakov (2002) et 17% selon NGuyen (2003)] est rhizodéposée sous forme de composés tels que les sucres simples et les polysaccharides, les acides phénoliques, aminés et organiques, les peptides et les protéines, les ectoenzymes (Bowen et Rovira, 1999 ; NGuyen, 2003 ; Jones et al., 2004), qui interviennent dans les processus d'acquisition des nutriments, notamment dans les environnements pauvres (Dakora et Phillips, 2002). Ainsi, selon Marschner (1995), la rhizodéposition semble être stimulée en réponse à des phénomènes de carences nutritives. Ceci suggère que les plantes mettraient en œuvre des stratégies de nutrition pour surmonter les conditions chimiques défavorables du sol. Cette hypothèse est étayée par les résultats de plusieurs équipes de chercheurs. Kraffczyk et al. (1984) ont par exemple montré qu'en conditions de carence en potassium, les exsudats produits sont enrichis en acides organiques qui interviennent efficacement dans la mobilisation du potassium. De même, Zhang et al. (1991) ont montré qu'en conditions de carence en zinc, les exsudats sont enrichis en composés mobilisant le zinc comme les acides aminés et les acides phénoliques. De nombreux facteurs liés à la plante (espèce, âge et stade de développement), à la microflore environnante ou aux conditions du milieu (température, luminosité, humidité, atmosphère et biodisponibilité en nutriments) vont aussi affecter l'exsudation racinaire (NGuyen, 2003).

### 3.2.2 Caractéristiques microbiologiques de la rhizosphère

L'activité microbienne est généralement déterminée par la disponibilité en carbone (Anderson et Domsch, 1978). Logiquement, les interactions microbiennes sont donc
plus intenses dans la rhizosphère où il y a un apport constant de sources de carbone facilement disponibles pour les microorganismes hétérotrophes (Cheng et al., 1993). Ainsi, le processus de rhizodéposition, qui constitue à la fois une source nutritive nécessaire pour former la biomasse microbienne et une source d'énergie pour les microorganismes, stimule la croissance et l'activité microbienne (Lynch, 1990). Bowen et Rovira (1976) ont même montré que les microorganismes vivant dans la rhizosphère ont une activité métabolique élevée et se multiplient très rapidement : les cellules de *Pseudomonas*, par exemple, se divisent en moyenne toutes les 5 heures dans la rhizosphère de *Pinus radiata* contre une division toutes les 77 heures dans le sol non rhizosphérique. Cependant la rhizosphère n'exerce pas uniquement une modification quantitative mais également une modification qualitative des populations microbiennes. Ainsi, Davet (1996) décrit la rhizosphère comme un lieu où les densités de population sont très fortes mais où la diversité des espèces est plus faible que dans le reste du sol. Cette réduction de la diversité bactérienne a été mise en évidence, génétiquement, par Mavingui et al. (1992) au sein de populations de *Bacillus polyxyma* dans la rhizosphère de blé, et phylogénétiquement par Marilley et Aragno (1999) au sein de populations bactériennes dans la rhizosphère de *Trifolium* et *Lolium*. Davet (1996) explique que ce sont les conditions de vie dans la rhizosphère qui exercent un effet sélectif sur les populations du sol : seules celles qui sont adaptées aux conditions régnant à la surface des racines pourraient s'y établir et s'y maintenir. Pour s'établir, les microorganismes doivent d'abord percevoir un signal plus ou moins spécifique émis par les racines. Ce signal met en route un processus de chimiotactisme ou de croissance active, dirigée préférentiellement vers la racine. Parce que les bactéries répondent différemment aux composés exsudés par les racines, des différences dans la composition des exsudats peuvent influencer le type de bactéries présent dans la rhizosphère (Grayston et Campbell, 1996). Pour se maintenir, les microorganismes qui auront répondu au signal devront être capables de supporter les conditions particulières qui règnent dans la rhizosphère : pH, toxicité de certains exsudats,.... Ainsi, Ahmad et Baker (1987) définissent un microorganisme capable de croître, de fonctionner et de se maintenir dans la rhizosphère au fur et à mesure que la racine s'allonge, comme rhizocompétent. Un organisme rhizocompétent doit non seulement supporter l'environnement physico-chimique de la racine mais aussi la forte compétition qui y règne. Cette aptitude peut se traduire par la production d'antibiotiques, par la résistance aux antibiotiques étrangers ou par l'utilisation optimale des molécules disponibles. Par exemple, Latour et al.
(2003) indiquent que les *Pseudomonas spp.* Fluorescents adaptés à la rhizosphère présentent un métabolisme spécifique, caractérisé par l'efficacité de leur système d'acquisition du fer basé sur les pyoverdines et par leur aptitude à réduire les oxydes d'azote.

### 3.3 Variabilité spatio-temporelle de la rhizosphère

La rhizosphère est un milieu dynamique, ce qui lui confère une grande hétérogénéité aussi bien spatiale que temporelle (Hinsinger et al., 2005).

* L'étendue de cette zone d'influence des racines peut varier du millimètre pour les communautés microbiennes et les nutriments peu mobiles comme les phosphates, quelques dizaines de millimètres pour l'eau et les nutriments mobiles comme les nitrates et le potassium, à plusieurs dizaines de millimètres pour les composés volatiles et les gaz (Gregory, 2006). En plus de cette hétérogénéité radiale, les racines créent des hétérogénéités spatiales sur l'ensemble de leur longueur. En effet, de nombreuses fonctions racinaires impliquées dans les processus biochimiques, chimiques et physiques se produisant dans la rhizosphère, ne se distribuent pas uniformément sur toute la racine, l'apex racinaire se comportant souvent différemment (Hinsinger et al., 2005). Par exemple la libération de protons et l'acidification de la rhizosphère qui en résulte, est plus forte dans la région subapicale des racines (Marschner et al., 1982 ; Marschner, 1995). Ainsi, dans certaines conditions, une acidification de la rhizosphère peut se produire à l'apex des racines alors qu'une alcalinisation se produit dans les parties basales du système racinaire (Vansuyt et al., 2003). Les hétérogénéités spatiales au sein de la rhizosphère résultent également de la spécialisation de certaines parties de la racine. C'est notamment le cas lors de l'association des racines des arbres forestiers avec des champignons ectomycorhiziens qui génère la formation d'un manteau d'hyphes autour des racines courtes des arbres.

* Les activités de la racine sont hétérogènes dans le temps : le prélèvement en eau et la production de phytosidérophores sont des phénomènes principalement diurnes (Marschner et al., 1987 ; Doussan et al., 2003). Un autre facteur d'hétérogénéité temporelle de la rhizosphère réside dans la croissance très dynamique de la racine. Ceci a pour conséquence le fait qu'une fraction de sol
donnée, après avoir été colonisée par une extrémité de racine en croissance, sera successivement exposée à différentes régions de la racine plus ou moins subérisées et possédant des propriétés différentes. Comme il a été estimé qu'une racine peut croître de 3 cm par jour, l'effet de l'extrémité racinaire sera exercée sur une même fraction de sol pendant de courtes périodes (Fischer *et al.*, 1989).

## 3.4 Les interactions bénéfiques pour la santé et la croissance de la plante au sein de la rhizosphère

De nombreux travaux ont déjà montré l'importance des microorganismes du sol sur la croissance et la santé des plantes (Dommergues et Mangenot, 1970 ; Davet, 1996 ; Lemanceau et Heulin, 1998). Dans cette partie, nous nous focaliserons sur les interactions entre les plantes et les microorganismes et sur les interactions entre les microorganismes au sein de la rhizosphère, qui s'avèrent bénéfiques pour la plante. Les autres types d'interactions, ne seront pas détaillés.

### 3.4.1 Les microorganismes promoteurs de la croissance des plantes (PGPM, Plant Growth Promoting Microorganisms)

Comme leur nom l'indique, les PGPM sont bénéfiques pour les plantes. Ils peuvent promouvoir la croissance de la plante de différentes manières :

* Effet hormonal

La croissance des plantes est dépendante de différents signaux endogènes, en particulier via la régulation hormonale. Des composés hormonaux tels que les auxines ou les cytokinines sont produits par certaines cellules végétales aux différents stades de la croissance de la plante (division et différenciation des cellules, elongation et dominance apicale). La plupart des régulateurs de croissance connus chez les végétaux supérieurs peuvent être synthétisés par des microorganismes du sol. Ceux-ci sont donc susceptibles de stimuler le développement racinaire et de promouvoir la croissance des plantes. C'est notamment le cas de la bactérie *Azospirillum* qui produit de l'acide indole-3-acétique (AIA) par différentes voies métaboliques, essentiellement à partir du tryptophane (Zimmer *et al.*, 1991). D'autres bactéries et champignons appartenant à des espèces indigènes de la rhizosphère produisent de l'auxine et/ou de la cytokinine, tels que *Pseudomonas fluorescens*, *Pseudomonas putida*, *Pseudomonas alcaligenes*
(Lemanceau, 1992 ; Digat, 1994 ; Garcia de Salamone et al., 2001 ; Egamberdiyeva et
Höflich, 2003).

* Effet nutritionnel

La croissance des plantes est également sujette à des facteurs exogènes, telle l'accession
aux ressources nutritionnelles du sol. En effet, pour se développer, la plante a besoin de
prélever dans le sol des éléments minéraux qui lui sont souvent inaccessibles. Dès le
début des années 70, Jackson et Voigt (1971) et Boyle et Voigt (1973), puis Leyval et
Berthelin (1989), ont mis en évidence l'action positive de certains microorganismes de
la rhizosphère sur la croissance des arbres *via* la mobilisation d'éléments tels que le
calcium et le potassium par altération de minéraux silicatés. Plus récemment, Puente *et al.* (2004) ont souligné que l'effet positif de souches bactériennes rhizosphériques telles que *Pseudomonas fluorescens* sur la croissance de plants de cactus était lié à la
production par ces souches d'acides organiques dissolvant non seulement les
phosphates mais également les roches ignées extrusives, les marbres et les calcaires,
procurant ainsi du phosphore, du potassium, du fer et du magnésium à la plante. De
même, Pandey *et al.* (2005) ont montré que l'inoculation de souches de *Pseudomonas aeruginosa* productrices de sidérophores avait significativement réduit les symptômes
de chlorose, augmenté le taux de chlorophylle et par conséquent favorisé la croissance
de haricots, suggérant que les sidérophores bactériens auraient été captés par la plante
(Loper et Henkels, 1999). Enfin, certaines bactéries chimiohétérotrophes de la
rhizosphère comme *Azotobacter*, en milieu aérobie alcalin ou neutre, et *Beijerinckia* et
*Derxia*, plutôt en milieu aérobie acide, *Clostridium*, en milieu anaérobie, ou
chimioautotrophes comme *Thiobacillus ferrooxidans* sont des fixateurs libres d'azote.
C'est-à-dire que ces souches bactériennes sont capables de fixer l'azote atmosphérique
(N₂) et de le transformer en ions NΗ₄⁺ assimilables par les racines, favorisant donc la
croissance de la plante (Paul et Clarck, 1988).

3.4.2 L'interaction plante - champignon mycorhizien

L'interaction plante - champignon mycorhizien, déjà brièvement évoquée précédemment, est un exemple type des connexions qui peuvent s'établir entre différents partenaires de la rhizosphère associant symbiose et effet promoteur de la nutrition. En effet, les plantes, accédant difficilement à certains minéraux du sol, ont établi des interactions fines avec certains champignons dits mycorhizogènes, capables
de former des structures particulières autour (ectomycorhizes) ou à l'intérieur (endomycorhizes) des tissus racinaires. Il s'agit ici d'une symbiose mutualiste, le champignon mycorhizien étant complètement dépendant de son hôte en ce qui concerne les carbohydrates tandis que la plante hôte reçoit l'eau et les nutriments prélevés par les hyphes du champignon (Brunner, 2001 ; Smith et Barker, 2002). Les champignons mycorhiziens sont connus pour leur action bénéfique sur la santé des plantes en favorisant l'acquisition d'eau et de nutriments par la plante par une meilleure colonisation du sol ou par la production de composés favorisant la mobilisation des éléments (Jongmans et al., 1997 ; Van Breemen et al., 2000 ; Landeweert et al., 2001 ; Van schöll et al., 2005), en produisant des hormones de croissance (Rupp et Mudge, 1985 ; Frankenberger et Poth, 1987), et surtout en augmentant leur tolérance aux métaux lourds (Wilkins, 1991 ; Van schöll et al., 2005) et aux maladies (Linderman, 1994).

Dans les écosystèmes forestiers, tempérés et boréaux, la très grande majorité des arbres vit en étroite association avec des champignons ectomycorhiziens. Ceux-ci sont estimés entre 5000 et 6000 espèces et la plupart d'entre eux est capable de s'associer avec une large variété d'espèces de plantes hôtes. Les champignons ectomycorhiziens enveloppent les racines fines des arbres d'un manchon mycélien (le manteau), puis ses hyphes pénètrent entre les cellules du cortex racinaire et génèrent le réseau de Hartig, zone privilégiée des échanges métaboliques entre la plante et le champignon (Smith et Read, 1997). En plus de modifier la morphologie racinaire, la symbiose ectomycorhizienne influence qualitativement et quantitativement l'exsudation racinaire en utilisant certains exsudats et en modifiant les fonctions métaboliques des racines (Leyval et Berthelin, 1993 ; Rambelli, 1973 ; Rygiewicz et Andersen, 1994). La symbiose peut également produire des antibiotiques (Olsson et al., 1996). Elle crée ainsi un environnement particulier, la mycorhizosphère (zone du sol soumise à l'influence des racines mycorhizées) où l'équilibre microbien est différent du sol rhizosphérique (Linderman, 1988 ; Marschner et Baumann, 2003).

### 3.4.3 Les interactions microorganismes - microorganismes

Les interactions entre les individus au sein des populations ou des communautés microbiennes peuvent être d'ordre mutualiste, commensale, amensale, antagoniste. Ainsi, certaines populations microbiennes sont favorables à la santé des plantes soit en
exerçant une action antagoniste à l'encontre de champignons phytopathogènes conduisant à une réduction de la fréquence des infections racinaires, soit en stimulant les réactions de défense des plantes (Cook et al., 1995 ; Bano et Musarat, 2003 ; Bevivino et al., 2005). Baker et Cook (1974) ont même démontré que c'est la plante par l'intermédiaire de ses exsudats racinaires qui favorise le développement de bactéries antagonistes du champignon pathogène *Fusarium*. De même, l'établissement de la symbiose ectomycorhizienne sur les racines d'arbres est affecté par les populations microbiennes de la rhizosphère (Garbaye et Bowen, 1987) et notamment par certaines bactéries qui peuvent favoriser la formation des mycorhizes (Garbaye et Bowen, 1989 ; Bending et al., 2002) qui sont bénéfiques à la plante. Ces bactéries, qui sont capables d'agir à très faibles concentrations dans le sol sont définies comme des bactéries auxiliaires de la mycorhization (BAM) ou mycorrhiza helper bacteria (MHB) (Garbaye, 1994).

La rhizosphère est un compartiment particulier du sol qui diffère du sol nu (non soumis à l'influence des racines) par un grand nombre de processus biologiques, biochimiques, chimiques et physiques, inhérents à la croissance racinaire, au prélèvement d'eau et de nutriments, à la respiration et à la rhizodéposition (Hinsinger, 2005). Ces changements induits par les racines dans la rhizosphère sont d'une importance décisive dans la mobilisation des nutriments, les plantes étant même capables de moduler qualitativement et quantitativement leur exsudation racinaire afin d'optimiser la disponibilité en nutriments. Les racines vont également s'associer avec certains microorganismes du sol, notamment les bactéries et les champignons ectomycorhiziens afin d'accroître la quantité de nutriments biodisponibles. A ce titre, ces multiples interactions s'avèrent indispensables dans le domaine de la nutrition des arbres.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure I.4 : Représentation schématique des différents objectifs de cette étude.</figcaption></figure>
# 4. OBJECTIFS DE LA THESE ET DEMARCHE SCIENTIFIQUE

Dans cette introduction, nous avons souligné trois faits majeurs : (i) le flux lié à l'altération des minéraux du sol est la principale source de nutriments des arbres forestiers, (ii) cette altération est au moins en partie due à l'activité des racines et des microorganismes du sol et (iii) la rhizosphère est une zone d'intenses activités biologiques. A l'issue de cette introduction, une question reste néanmoins en suspend : quel est l'impact de l'activité biologique rhizosphérique sur la mobilité des nutriments minéraux dans les sols forestiers *via* l'altération des minéraux ?

Le travail présenté dans cette thèse a pour but de tenter de répondre à cette question, étape nécessaire pour mieux comprendre la durabilité des écosystèmes forestiers qui sont fréquemment développés sur des sols à faibles réserves en nutriments minéraux. Parallèlement à ce travail, une partie de nos recherches a aussi été consacrée à l'analyse de l'impact de la rhizosphère sur la mobilité d'un élément traces tel que le césium à partir des minéraux des sols ainsi qu'à l'étude de l'impact d'éléments toxiques tels que l'uranium et le cadmium sur les acteurs de l'altération biologique.

Pour répondre à cette problématique, ma démarche scientifique s'est organisée autour de trois objectifs opérationnels (Figure I.4) :

**Objectif 1 : quantifier l'altération des minéraux dans le sol global et la rhizosphère d'arbres en forêt.**

**Objectif 2 : évaluer la capacité des communautés microbiennes isolées dans le sol global et la rhizosphère d'arbres à altérer des minéraux.**

**Objectif 3 : quantifier la part respective des différents partenaires biologiques de la rhizosphère (racines, bactéries et champignons) dans le processus d'altération des minéraux.**

La complexité du fonctionnement des écosystèmes forestiers montre clairement qu'il ne peut pas être élucidé exclusivement à partir d'approches expérimentales réductrices. Celles-ci n'autorisent pas la prise en compte des nombreuses actions, rétroactions et interactions qui régissent le fonctionnement de ces écosystèmes. C'est pourquoi, pour répondre aux trois objectifs opérationnels de mon travail de thèse, j'ai non seulement
mis en œuvre des études et des expérimentations en plantations forestières, mais également des expérimentations en laboratoire ayant pour objectif commun de mieux caractériser et quantifier l'altération de la phase minérale au sein de la rhizosphère.

Dans le but d'évaluer l'impact de la rhizosphère d'arbres sur la dynamique du potassium dans un sol, j'ai réalisé une étude en forêt sur un site proche de Bure en Champagne - Ardennes (Axe 1). Parallèlement à ce travail, j'ai contribué à une étude en forêt sur le site atelier de Breuil en Bourgogne dont l'enjeu était de comparer le niveau d'altération de la fraction argileuse dans le sol global et la rhizosphère d'arbres (Axe 1). Cette étude permettait également de comparer différentes essences et de corréler les données minéralogiques au fonctionnement physico-chimique d'une essence (Axe 2). Afin de quantifier le degré d'altération de minéraux-tests placés dans le sol en présence ou en l'absence de racines (Axe 1), j'ai contribué à un projet en forêt sur le site atelier de Fougères en Bretagne utilisant une approche expérimentale in situ : les minéraux-test. Cette expérimentation permettait également de tester l'impact du niveau de fertilisation sur le processus d'altération (Axe 3).

Dans le cadre de nos recherches sur le rôle des microorganismes de sols forestiers dans l'altération des minéraux, j'ai plus particulièrement analysé l'impact du compartiment d'origine des souches microbiennes et l'effet de l'essence forestière sur le potentiel d'altération des microorganismes (Axe 5).

Enfin, dan le but de déterminer la part respective des différents partenaires biologiques de la rhizosphère dans le processus d'altération des minéraux (Axe 6), j'ai mis en place des expérimentations en laboratoire de type colonnes. Ces expériences m'ont permis de tester, en outre, l'impact de différents facteurs comme la richesse en nutriments de la solution (Axe 7) et la présence d'éléments toxiques dans la solution (Axe 8), sur la fonction "altération" et l'activité des microorganismes.
# CHAPITRE II :

## IMPACT DE LA RHIZOSPHERE D'ARBRES SUR
L'ALTERATION DES MINERAUX EN FORET
# 1. CONTEXTE ET OBJECTIFS

Les deux sites d'interactions privilégiées entre les plantes, les microorganismes et les minéraux du sol sont la litière et la rhizosphère, où les microorganismes sont stimulés par les apports de carbone et d'énergie d'origine végétale (Rouatt et al., 1963 ; Rovira, 1965). De ce fait, la rhizosphère peut être considérée comme un condensé des processus physiques, chimiques et biologiques qui régissent le fonctionnement des sols (Jaillard et Hinsinger, 1993). De nombreux travaux ont déjà clairement montré l'influence de l'activité rhizosphérique sur le sol et notamment dans les processus d'altération de la phase minérale (Spyridakis, 1967 ; Jackson et Voigt, 1971 ; Boyle et Voigt, 1973 ; Berthelin et Leyval, 1982 ; Callot et al., 1982 ; Barber, 1984 ; Leyval et Berthelin, 1991 ; Hinsinger et al., 1992 ; Bakker et al., 2004). Cependant, la majorité de ces travaux porte sur des plantes agricoles et/ou est réalisée en laboratoire afin de s'affranchir de la complexité du fonctionnement des écosystèmes et de maximiser l'impact des racines sur le minéral en augmentant le rapport racine/sol (Mortland et al., 1956 ; Youssef et Chino, 1987 ; Hinsinger et al., 1993). Ainsi, la rhizosphère n'a été, jusqu'à présent, que très peu étudiée *in situ* dans les écosystèmes forestiers (Kelly et Mays, 1989 ; April et Keller, 1990 ; Clegg et al., 1997 ; Gobran et Clegg, 1998 ; Gobran et al., 2005 ; Séguin et al., 2005). Or, des études réalisées sur la cinétique de dissolution des minéraux ont mis en évidence une forte discordance entre les expériences en conditions contrôlées et les études *in situ* (Paces, 1983 ; Brantley, 1992 ; Swoboda-Colberg et Drever, 1992 ; Velbel, 1993, White et Brantley, 2003) qui peuvent s'expliquer par (i) le vieillissement des surfaces minérales dans la zone altérée due à la diminution de sites réactifs de surface avec le temps (White, 1995), (ii) l'incertitude sur les mesures de la surface en contact avec la solution dans les conditions *in situ* (White, 1995 ; Swoboda-Colberg et Drever, 1992), (iii) les contacts imparfaits entre les minéraux du sol et la solution percolante (Swoboda-Colberg et Drever, 1992), (iv) les solutions naturelles plus complexes qui modifient les équilibres solide – solution (Amrhein et Suarez, 1992) (v) les effets inhibiteurs de l'aluminium dissous (Chou et Wollast, 1985 ; Swoboda-Colberg et Drever, 1992 ; Oelkers et al., 1994) et (vi) l'hétérogénéité du sol 'naturel'.

C'est pourquoi cette partie de notre travail a pour objectif de quantifier l'impact de la rhizosphère sur l'altération de la phase minérale et la dynamique des éléments minéraux
dans les sols en forêt. De plus, dans le contexte des études de sûreté à long terme concernant un stockage géologique profond des déchets nucléaires de haute activité et à vie longue, en formation argileuse, l'Andra a pour objectif de mieux comprendre la mobilité, dans les sols forestiers, d'un élément tel que le césium. Compte tenu du comportement physico-chimique voisin entre césium et potassium, mieux connaître le comportement du potassium dans les sols forestiers et en particulier dans la rhizosphère des arbres devrait permettre d'évaluer les risques d'un stockage souterrain en sous-sol forestier de déchets riches en césium.

Dans ce cadre, l'une de nos études a porté spécifiquement sur l'impact de la rhizosphère sur la dynamique du potassium dans un sol forestier.

## 2. ETUDES ET EXPERIMENTATIONS MISES EN ŒUVRE

Pour répondre à ces objectifs, trois études en forêt ont été mises en œuvre. La première visait à déterminer les propriétés physico-chimiques du sol global et de la rhizosphère sur un site forestier proche de Bure (Haute-Marne). La deuxième avait pour but de caractériser les propriétés minéralogiques et chimiques des argiles du sol global et de la rhizosphère sur le site forestier de Breuil (Bourgogne). La troisième a consisté en la quantification de l'altération de minéraux-test dans le sol global et la rhizosphère sur le site forestier de Fougères (Bretagne).

## 3. RESULTATS

### 3.1 Propriétés physico-chimiques du sol global et de la rhizosphère d'arbres (site de Bure)

Afin de répondre au questionnement de l'Andra sur la dynamique du césium dans les sols forestiers, cette étude consiste à comparer la dynamique du potassium dans le sol global et dans la rhizosphère dans un écosystème forestier proche du site de Bure (Haute-Marne).
Cette étude a bénéficié des acquis obtenus par l'unité INRA "Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers" sur différents sites ateliers, qui ont permis la validation d'un modèle conceptuel à flux et à compartiments de la dynamique des éléments minéraux dans les sols forestiers. Nous avons utilisé ce modèle afin de mieux comprendre la mobilité, dans la rhizosphère des arbres forestiers, d'un élément comme le potassium et d'aborder la question de la dynamique du césium par analogie de comportement.

## Matériel et méthodes

* Choix du site d'échantillonnage

Le choix s'est porté sur un site forestier proche de Bure où se trouve le laboratoire de recherche souterrain de Meuse/Haute-Marne. Une étude préliminaire de la carte pédologique du site de Meuse-Haute-Marne (Bure) et une visite sur ce site nous ont permis de sélectionner une zone appropriée à notre étude, à savoir des sols bruns calcaires marmorisés localement hydromorphes (Maillant, 2003) sous forêt. Ces sols à humus peu épais et développés sous des hêtres centenaires, présentent une structure grumeleuse et contiennent des cailloux calcaires.

* Analyses et préparation des échantillons de sols global et rhizosphérique

Un échantillonnage systématique pour les différents compartiments de sol (rhizosphérique et global), a été effectué en 10 points distants de quelques mètres. L'ensemble des racines de diamètre inférieur à 2 mm a été prélevé manuellement, après avoir brisé tous les agrégats de sol supérieurs à 1 cm. Après tri des racines, le sol restant sur la bâche a été échantillonné et séché durant une semaine dans une étuve ventilée à 30°C. Ce sol a été appelé G (pour sol global). Les racines ont également été séchées durant une semaine dans une étuve ventilée à 30°C. Le sol se détachant spontanément des racines après séchage a été nommé R (pour sol rhizosphérique). Afin d'éliminer les débris de racines dans les échantillons et de comparer des échantillons de granulométrie identique, les sols (G et R) ont été tamisés à 200 µm sur tamis inox (type AFNOR NFX 11504). Les échantillons de granulométrie inférieure à 200 µm ont été séchés durant trois jours à 30°C puis 300 mg de sol ont été introduits dans des tubes de centrifugation pour effectuer les extractions par $NH_4Cl \ 1N$ permettant l'extraction du potassium (cf. protocole en annexe 4). Ce dosage a été effectué par spectrométrie d'émission ICP-AES
Figure II.1: Concentration en protons (A) et en potassium (B) dans le sol global et la rhizosphère d'un site forestier proche de Bure. Les barres représentent les écart-types. Chaque histogramme représente la moyenne de 10 répétitions. Les moyennes associées à des lettres différentes sont significativement différentes selon une ANOVA (P = 0.05) (compartiment du sol) et le test de Bonferroni-Dunn.

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

<figure><img src="image_10.png" /></figure>
(torche à plasma JY180 ULTRACE). Le pH<sub>eau</sub> a été mesuré dans la suspension de sol en utilisant le pH mètre Mettler TSDL25 (norme NF ISO 10390).

* Analyses statistiques

L'effet du compartiment d'origine du sol (rhizosphère ou global) sur les concentrations en protons et en potassium des sols a été déterminé en utilisant des analyses de variance (ANOVA) à un facteur (compartiment) à un seuil de P = 0.05 et le test de Bonferroni-Dunn. Le logiciel Superanova a été utilisé pour toutes les analyses.

Résultats

La quantité de protons extraite à l'eau des sols est significativement plus importante dans la rhizosphère du hêtre comparativement au sol global. Les pH restent toutefois proches de la neutralité : 6.56 pour le sol rhizosphérique et 7.52 pour le sol global (Figure II.1A). La quantité de potassium échangeable est deux fois plus importante dans le sol rhizosphérique comparativement au sol global, respectivement 2.71 et 1.38 cmol_c.kg<sup>-1</sup> (centimole de charge par kilogramme de sol sec) (Figure II.1B).

Interprétation et discussion des résultats

La baisse de pH que nous avons observée dans la rhizosphère est liée à l'activité des arbres forestiers et des microorganismes associés à leurs racines. Elle résulte de la production de CO₂ par les racines et les microorganismes lors du processus de respiration qui joue un rôle majeur dans le contrôle du pH dans ces types de sol, de l'équilibre de charges qui s'établit au niveau des racines suite à l'absorption d'ions, et/ou de l'exsudation de composés acides par les racines et les microorganismes. Tous ces mécanismes ont déjà été décrits en détails dans les parties "altération biologique des minéraux" et "effet rhizosphère", présentés dans l'introduction générale de ce manuscrit. Le pH du sol rhizosphérique reste toutefois proche de la neutralité car il s'agit d'un sol calcaire dont le pouvoir tampon est élevé.

Les résultats obtenus sur le site de Bure montrent une accumulation de potassium sur la capacité d'échange cationique du sol rhizosphérique. Ces résultats obtenus dans un sol brun calcaire sous une hêtraie sont en accord avec ceux obtenus dans d'autres écosystèmes forestiers développés sur des sols acides en climat boréal sous épicéa (Clegg et Gobran, 1997 ; Clegg *et al.*, 1997 ; Gobran et Clegg, 1998, Courchesnes *et al.*, 1998 ; Gobran *et al.*, 1999 ; Gobran *et al.*, 2005) et en climat tempéré sous épicéa,
Figure II.2: Modèle conceptuel, à compartiments et à flux, de la dynamique d'un élément minéral dans un sol forestier. Dans la rhizosphère, les différents compartiments du sol (matières organiques, minéraux, microorganismes, racine, solution et gaz) sont représentés par des encadrés en pointillés, les échanges d'éléments entre ces compartiments par des petites flèches et les 5 principaux flux d'éléments minéraux dans un sol (flux de masse, pluie incidente, prélèvement, drainage et dégagement gazeux) par des flèches larges. Les signes entre parenthèses correspondent à l'apport (+) ou à la perte (-) de l'élément dans la solution de sol rhizosphérique.

1) le flux de masse et la diffusion (+) : la plante, en quête d'eau et de nutriments, agit comme une pompe et puise la solution du sol par l'intermédiaire des ses racines. Ce flux convectif d'eau et d'éléments, appelé flux de masse, est lié à la transpiration des arbres. Le flux de diffusion correspond à un transfert passif d'un élément d'un point de concentration plus élevé vers un point de concentration plus faible.

2) les pluies incidentes (+) : l'eau de pluie se charge en éléments minéraux en traversant la canopée et en ruisselant le long des troncs.

3) le prélèvement (-) : la plante, absorbe la solution du sol et les éléments qu'elle contient dans le volume de sol prospecté. Cependant, en fonction de ses besoins métaboliques, la plante absorbe sélectivement les éléments. Les microorganismes absorbent également les éléments.

4) le drainage (-) : la solution du sol rhizosphérique percole et se trouve évacuée du système.

5) le dégagement gazeux (-) : des réactions (respiration, dénitrification, ...) provoquent le dégagement de certains éléments sous forme de gaz.

6) l'échange d'ions à la surface de la matière organique et des minéraux avec des phénomènes d'adsorptions (-) et de désorptions (+) en fonction des conditions physico-chimiques régnant.

7) la minéralisation de la matière organique (+) : libération d'éléments par voie chimique et biologique (microorganismes).

8) l'altération des minéraux (+) : libération d'éléments par voie chimique et biologique (plante et microorganismes) à partir des réserves inaltérées.

9) la précipitation de minéraux (-) : formation de minéraux à partir d'éléments en solution.

10) l'exsudation par la plante et les microorganismes d'éléments (+).

11) la mort des organismes (+) : contribue à la reformation de matière organique.

<figure><img src="image_11.png" /></figure>
chêne, Douglas et hêtre (Turpault et al., 2005 ; Turpault et al., données non publiées). Ces observations pourraient résulter d'une colonisation préférentielle des zones de sols riches en potassium par les racines comme le suggère Schöttelndreier et Falkengren-Grerup (1999). Cependant, Turpault et al. (données non publiées) ont montré que cette accumulation de potassium dans la rhizosphère des arbres forestiers se produit même sur un sol homogénéisé, i.e. sol mélangé afin d'éliminer les hétérogénéités de composition. Ces observations impliquent que cet enrichissement en potassium échangeable de la rhizosphère, observé quels que soient le sol, l'essence et le climat, serait bien dû à l'activité des racines et des microorganismes associés.

L'enrichissement de la rhizosphère des arbres en potassium implique également que la diffusion, qui est le principal mécanisme de transfert du potassium à l'interface sol - racine dans les écosystèmes agricoles (80%; Barber, 1984), n'est pas le processus dominant dans les écosystèmes forestiers étudiés. En effet, le flux de déplacement d'un élément par diffusion ne peut s'effectuer que d'un point de concentration plus élevé vers un point de concentration plus faible (loi de Fick). Ainsi, au vu de nos résultats, il semble que le mécanisme principal de transfert de potassium du sol vers les racines dans les écosystèmes soit le flux de masse, i.e. flux convectif d'eau et de nutriments du sol vers la surface des racines, lié à la transpiration des arbres, dans un système où la solution est relativement riche en potassium. En considérant le modèle conceptuel de la dynamique d'un élément minéral dans un sol forestier défini à partir des données issues des différents sites forestiers étudiés en climat boréal et tempéré (Figure II.2), l'enrichissement de la rhizosphère des arbres forestiers pourrait s'expliquer par un bilan positif entre les flux de potassium entrants et sortants de la rhizosphère. Ainsi, dans les écosystèmes forestiers le transfert de potassium dans la rhizosphère principalement par flux de masse, issu de l'altération des minéraux et de la minéralisation de la matière organique, serait supérieur au flux lié au prélèvement de cet élément par les racines. Il est important de préciser que les écosystèmes forestiers sont caractérisés par un recyclage considérable du potassium par le biais des pluviolessivats et des écoulements de tronc. Les mesures effectuées sur le site de Breuil montrent que les pluies traversant le feuillage et ruisselant le long des troncs de hêtre s'enrichissent considérablement en potassium : 0.25 à 2 mg.l⁻¹. Dambrine et al. (1998) ont montré que, dans un peuplement d'épicéa, la majeure partie du potassium présent dans les pluviolessivats résultait du phénomène de récrétion, c'est-à-dire la mise en solution d'éléments minéraux à partir de tissus végétaux par dissolution et échange d'ions. Ce potassium très soluble doit
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure II.3: Représentation schématique de la dynamique du potassium dans la rhizosphère d'un arbre forestier.</figcaption></figure>
participer largement au flux de masse. En conséquence, la solution de sol rhizosphérique s'enrichirait en potassium (bilan flux entrants - flux sortants positif) qui se fixerait alors sur la capacité d'échange cationique des minéraux de la rhizosphère (Figure II.3). Ces observations sont confirmées par les analyses de la composition des solutions de plusieurs sols forestiers qui mettent en évidence une concentration en potassium plus forte dans la solution de sol rhizosphérique comparativement à celle du sol global (Turpault *et al.*, 2005).

Ces résultats suggèrent qu’un élément comme le césium, analogue du potassium pourrait s’accumuler dans la rhizosphère des arbres. Ce résultat sera discuté dans la partie consacrée à la problématique Andra, présentée dans le chapitre "discussion générale".

## 3.2 Evolution des minéraux dans le sol global et la rhizosphère d'arbres (site de Breuil)

Etant donné le faible nombre de données sur l'évolution des minéraux dans la rhizosphère d'arbres forestiers, nous avons entrepris une étude sur le site-atelier de Breuil dans l'objectif de comparer qualitativement et quantitativement, l'évolution chimique et minéralogique des argiles du sol global et de la rhizosphère. Afin de déterminer si cet effet rhizosphère est généralisable sur des essences à fonctionnements nutritionnels contrastés, nous avons choisi d'étudier le chêne, qui est développé sur un sol contenant de l'azote principalement sous forme nitrique (NO₃⁻) et l'épicéa, qui est développé sur un sol contenant de l'azote très majoritairement sous forme ammoniacale (NH₄⁺). (Colin-Belgrand, 2003).

Ce travail a été réalisé en collaboration avec Louis Mareschal, étudiant en thèse de l'unité INRA "Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers", dont le thème de recherche est l'impact des essences forestières sur l'altération des minéraux du site de Breuil.
## Article : Rapid clay weathering in the rhizosphere of different tree species in an acid forest ecosystem.

Calvaruso Christophe¹, Mareschal Louis¹, Turpault Marie-Pierre¹,*, Leclerc Elisabeth².

¹ INRA, UR 1138 "Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers", Centre INRA de Nancy, 54280 Champenoux, France.

² ANDRA, Direction Scientifique/Service Transferts, 92298 Châtenay-Malabry, France

*En préparation*

## Résumé

La source majeure de nutriments des arbres dans les écosystèmes forestiers réside dans les éléments libérés par l'altération des minéraux du sol. De nombreux tests *in vitro* ont déjà démontré la capacité des plantes et des microorganismes (champignons et bactéries) à augmenter l'altération des minéraux. En complément, des études en forêt ont montré que la rhizosphère des arbres possède des propriétés physico-chimiques et biologiques très différentes de celles du sol global du fait de l'activité des racines, des bactéries et des champignons (prélèvement, équilibre de charge, exsudation, respiration). L'effet de la rhizosphère sur l'évolution des minéraux présents dans les sols forestiers ayant été très peu abordé, nous avons entrepris de déterminer l'impact des racines d'arbres et des microorganismes sur les propriétés physico-chimiques, chimiques et minéralogiques du sol d'une plantation forestière (site de Breuil, Morvan en France) développé sur un sol acide. Dans ce but, nous avons comparé les sols globaux et rhizosphériques dans trois horizons de sol distincts (0-3 cm; 3-10 cm; 10-23 cm), à partir d'un échantillonnage portant sur 18 à 20 points.

Les analyses physico-chimiques, chimiques et minéralogiques de sol ont été réalisées pour deux essences : le chêne sessile (*Quercus petraea*) et l'épicéa (*Piceas abies*). Sur la fraction de sol inférieure à 200 µm, le pH et le rapport K/CEC ont été mesurés. Sur la fraction argileuse (< 2 µm), les analyses totales, les extractions sélectives d'aluminium par citrate de sodium à chaud et du fer par citrate - bicarbonate - dithionite ont été entreprises et la composition minéralogique a été étudiée par diffraction de rayons X. Afin de quantifier l'altération des argiles, la méthode du bilan iso-zirconium d'altération chimique a été appliquée.
Les différents résultats obtenus dans cette étude à partir des analyses physico-chimiques, des extractions sélectives, des analyses chimiques totales, des analyses de diffraction de rayons X et du bilan iso-zirconium d'altération chimique, convergent et mettent en évidence des processus de dissolution et de transformation des minéraux argileux plus marqués dans la rhizosphère des deux essences étudiées par rapport aux sols globaux respectifs. Ces observations peuvent être expliquées par l'activité des racines et des microorganismes associés, notamment la production de composés altérants et le prélèvement racinaire. Nos résultats soulignent également que cet effet de la rhizosphère sur l'évolution des argiles se produit sous des essences à fonctionnements contrastés, à savoir l'épicéa qui exude une grande quantité de protons dans la rhizosphère pour compenser l'absorption massive d'ions $NH_4^+$ et le chêne qui acidifie nettement moins la rhizosphère. Cette dernière observation suggère l'implication de mécanismes d'altération différents en fonction de l'essence forestière.

**Mots-clés:** arbres forestiers, minéralogie, phyllosilicates, physico-chimie, quantification du bilan d'altération, rhizosphère.

## Abstract

The elements released during the soil mineral weathering remain the primary nutrient source of trees in the forest ecosystems. Numerous tests in vitro have already shown the capacity of plants and microorganisms (fungus and bacteria) to increase mineral weathering. Furthermore, forest studies have shown that the rhizosphere of trees possesses physicochemical and biological properties very different from those of the bulk soil due to the activity of roots, bacteria and fungi (uptake, charge balance, exudation and respiration). The effect of the rhizosphere on the evolution of minerals present in the forest soils having been little studied, we have strived to determine the impact of tree roots and microorganisms on the soil chemical and mineralogical properties in a forest stand (site of Breuil, Morvan in France) developed on an acidic soil. For this purpose, we have compared the bulk and rhizosphere soils in three distinct soil horizons (0 to 3, 3 to 10 and 10 to 23 cm), from samples taken from 18 to 20 points. Soil chemical and mineralogical analyses have been realised for two species: the oak (*Quercus petraea*) and the Norway spruce (*Piceas abies*). On the soil fraction inferior to 200 µm, the pH was measured. On the clay fraction (< 2 µm), total analyses, selective extractions of aluminium by hot Na-citrate and iron by dithionite-citrate-bicarbonate were realised and the mineralogical composition was assessed by X-ray diffraction. In
order to quantify clay mineral weathering, the isozirconium chemical weathering balance method was used.

The results obtained in this study from the selective extractions, total chemical analyses, X-ray diffraction and isozirconium chemical weathering balance converge and underline dissolution and transformation processes of the clay minerals more important in the rhizosphere for the two species studied compared to those of the bulk soil. These observations could be explained by root and associated microorganism activity, notably the production of weathering agents and the root uptake. Our results equally show that this rhizosphere effect on the clay evolution under species possessing contrasting functioning, i.e. the Norway spruce which exudes a great quantity of protons in the rhizosphere to balance massive absorption of $NH_4^+$ and the oak which doesn't acidify its rhizosphere. This last observation suggests the existence of different weathering mechanisms depending on the forest tree species.

**Key-words:** forest trees, mineralogy, phyllosilicates, physicochemistry, rhizosphere, weathering budget quantification.

## Introduction

The soil serves as a water and nutrient reserve from which organisms can draw, as well as a support into which the plants may grow. Furthermore, root development is linked to soil properties (Barber, 1984) and conversely, root growth modifies the soil properties, making the soil a particularly heterogeneous environment (Marschner, 1995). The biological and physicochemical properties existing at the soil-root interface differ in many aspects from those existing at a distance from the roots (Angers and Caron, 1998; Hinsinger, 2005; Gregory, 2006) due to the penetration, respiration, absorption (water and nutrients) and exudation (protons, mineral ions, organic and complexing acid compounds) of the roots. Darrah (1993) called this zone of soil affected by the roots, the rhizosphere, and the root-free material surrounding the rhizosphere soil, the bulk soil. The conditions existing in the rhizosphere stimulate bacterial and fungal activities and particularly the release of microbial organic and complexing compounds. The vast majority of trees, notably, in temperate and boreal forest ecosystems, are associated with symbiotic fungi which form a connection between tree roots and the soil environment *via* a broad network of hyphae. This network contributes to plant nutrition by carrying water and the nutrients they released
by weathering the primary minerals, far away from the roots and very small pores,
(Landeweert *et al.*, 2001). These soil modifications induced by the roots and their
associated microorganisms play a key-role in the mineral weathering processes (Kelly *et
al.*, 1998; Welch *et al.*, 1999; Van Breemen *et al.*, 2000) and element mobility in the
soil (Mengel and Kirkby, 1987; Jones *et al.*, 2003) particularly in forest ecosystems
(April and Keller, 1990; Tice *et al.*, 1996; Gobran *et al.*, 1998; Nordborg and Olsson,
1999), and make the nutrients from the minerals more accessible to the plants (Ochs *et
al.*, 1993; Grayston *et al.*, 1996; Dakora and Phillips, 2002). In an experimental forest,
Bormann *et al.* (1998) demonstrated that red pine (*Pinus resinosa*) plants improved the
quantities of calcium and magnesium released by the weathering of primary minerals in
a forest soil by factors of 2.4 and 1.8 respectively.

However, only a few studies have determined the impact of the forest-tree rhizosphere,
which is the most reactive soil fraction because of its large specific surface, on clay
mineral evolution. For example, Courchesnes and Gobran (1997), who studied the
effect of the rhizosphere of Norway spruce on the clay mineralogy, demonstrated that
the rhizosphere soil contained lower amounts of amphibole and expandable
phyllosilicates than the bulk soil. Furthermore, the relationship between mineral
evolution in the rhizosphere of mature trees in the forest and the quantitative mobility of
nutrients was not established.

The first aim of this study was to determine the clay evolution and the clay mineral
weathering rates in the bulk soil and in the rhizosphere under two tree species in a
temperate forest ecosystem, Norway spruce and oak. To achieve this, we associated
different methods: X-Ray Diffraction, total analyses, selective extractions and the iso-
zirconium chemical weathering budget method. The latter method consists of
determining the quantitative losses or gains of an element (Si, Fe, Al, Mg, K,...) by
normalizing concentrations to that of an invariant element such as Zr (Chadwick et al.,
1990; Bain et al., 1994), considered to be unaffected by weathering processes. The
second aim consisted of determining possible correlations between the clay mineral
weathering rate and tree function, i.e. its effect on the soil properties, by comparing clay
mineralogical and soil physicochemical data.
<table><caption>Table II.1: Physicochemical characteristics of the soil from the native forest stand in the experimental forest site of Breuil (central France), at three different depths (Turpault et al., in preparation).</caption><thead><tr><th rowspan="2">Depth (cm)</th><th rowspan="2">pH (water)</th><th colspan="4">Particle size distribution % mineral Fine Earth</th><th rowspan="2">C ‰</th><th rowspan="2">N ‰</th><th colspan="3">Exchangeable cations cmol<sub>c</sub>. kg<sup>-1</sup> Fine Earth</th><th rowspan="2">CEC cmol<sub>c</sub>. kg<sup>-1</sup></th><th rowspan="2">S/T</th></tr><tr><th>Clay</th><th>Fine Silt</th><th>Coarse Silt</th><th>Fine Sand</th><th>Ca</th><th>Mg</th><th>K</th></tr></thead><tbody><tr><td>0-8</td><td>4.3</td><td>16</td><td>10</td><td>5</td><td>5</td><td>7.9</td><td>n.d.</td><td>0</td><td>0.5</td><td>0.3</td><td>12.2</td><td>7.7</td></tr><tr><td>10-18</td><td>4.6</td><td>13</td><td>19</td><td>7</td><td>8</td><td>1.2</td><td>n.d.</td><td>0</td><td>0.3</td><td>0.2</td><td>10.5</td><td>5</td></tr><tr><td>20-28</td><td>4.7</td><td>14</td><td>18</td><td>6</td><td>7</td><td>0.9</td><td>n.d.</td><td>0</td><td>0.2</td><td>0.1</td><td>8.9</td><td>3.5</td></tr></tbody></table>
## Materials and methods

* Site description

The soil samples were collected from the Breuil-Chenue experimental forest site established in 1976 and located in the Morvan (47°18′N, 4°5′E, France). The forest is situated on a shelf at an altitude of 638 m, on a slight, north-west facing slope. Mean annual air temperature is 9°C and the annual precipitation averages 1280 mm.yr⁻¹. The native forest was clear-felled and replaced by monospecific plantations distributed in plots of 10 ares of different species (oak, beech, Norway spruce and Douglas-fir). The soil is classified as a "Typic dystrochrept" (USDA, 1994), developed on a thin layer of loamy deposits covering the "Pierre qui Vire" granite (Seddoh, 1973). It has a sandy texture (60% sands), is desaturated with a saturation rate of 5 to 15% depending on the soil horizon and has a pH of about 4 (Table II.1). The humus form is a moder in the native forest.

* Soil sampling

In this study, we compared soil samples taken under two adjacent stands of Norway spruce (Picea abies Karst.) and oak (Quercus sessiflora Smith). After removing the forest floor, systematic soil sampling was carried out in June at three depths (0-3, 3-10 and 10-23 cm) in 18 (Norway spruce) and 20 (oak) calibrated pits (80 x 35 cm) distributed throughout each plantation plot. On site, roots with diameters less than 2 mm were removed carefully by hand. Root free soil fractions were collected and immediately air-dried to give the bulk soil fraction (B). Roots with adhering soil aggregates < 1 cm were dried immediately in a steam-air dryer at 30°C. The soil fraction that came off spontaneously from the roots after drying was collected to give the rhizosphere soil sample (R). After soil removal, the collected roots were weighed. In order to exclude the root debris and to compare samples with the same particle size distribution, the bulk and rhizosphere soils were sieved at 200 µm. The pH<sub>water</sub> of these soil samples with diameter less than 200 µm was measured in a soil suspension using a Mettler TSDL25. Given the cost and preparation time of each soil sample for the mineralogical analyses, a composite soil sample was made from the individual samples (0-200 µm) for each species, compartment and layer. Thus, 12 soil samples were treated: 2 species (Norway spruce and oak) x 2 compartments (B and R) x 3 depths (0-3, 3-10 and 10-23 cm). After organic matter removal by H₂O₂ and dispersion with NaOH,
the clay (< 2 µm) and fine silt (2-20 µm) fractions of the 12 composite samples were separated by sedimentation. The coarse silt (20-50 µm) and fine sand (50-200 µm) were subsequently isolated by wet sieving in order to establish the particle size distribution.

* Analyses on the 0-2 µm fraction (clay fraction)

### Chemical analyses

The sub-samples of 0-2 µm fractions were treated with Na-citrate at 100°C (Tamura, 1958) and by dithionite-citrate-bicarbonate (Mehra and Jackson, 1960). The Al and Fe extracted by hot Na-citrate (Al₂O₃(c) and Fe₂O₃(c)) and by dithionite-citrate-bicarbonate (Al₂O₃(d) and Fe₂O₃(d)) were analysed by Inductively Coupled Plasma spectrometry (ICP-AES; JY180 ULTRACE). The total chemical analyses of the 12 soil samples were carried out after Ba-saturation by Inductively Coupled Plasma spectrometry (ICP-AES) for the major elements (SiO₂tot ± 1%, Al₂O₃tot ± 1%, Fe₂O₃tot ± 2%, MgOtot ± 5%, K₂Otot ± 5%,...) and by Inductively Coupled Plasma spectrometry (ICP-MS) for trace elements (Zrtot ± 8%,...), after using LiBO₂ and dissolution by HNO₃. These total chemical analyses were recalculated in order to consider the residual organic carbon, measured by elementary analyser CHN Thermoquest NCS 2500, remaining in the soil samples after organic matter destruction.

The iso-zirconium chemical weathering budget method was used to estimate the element release rate. Usually, the weathering balance with iso-zirconium method is used at the profile scale and allows one to compare a soil horizon with its reference (parent material). It is assumed that the original parent material is uniform; however, according to Green (1966), this assumption can have a large effect on the calculation of gains and losses. In our case, the clay fraction of the bulk soil was used as the reference and this concept was applied to the estimation and the comparison of the weathering intensity in both rhizosphere and bulk soil for the clay fraction. Zirconium (Zr) was chosen as the index element, rather than another invariant element like titanium (Ti), because Zr concentrations increased (like silicon) in the clay fraction towards the profile surface both in the rhizosphere and the bulk soil. The calculation of the latter is in accordance with the following modified formula from Busacca (1989):

$$ \text{Percentage of elements lost} = 100-\left[\frac{(Xr.Sb)}{(Xb.Sr)}\right] \times 100 $$

Where Xr is the concentration of the element of interest in the rhizosphere, Xb is the concentration of the same element in the bulk soil, Sr is the concentration of an index
<table><caption>Table II.2: Root densities and pH in the rhizosphere (R) and bulk soil (B), at three depths (0 to 3 cm, 3 to 10 cm and 10 to 23 cm) and for two species (Norway spruce and oak). Values represent the mean of 18 replicates for Norway spruce and 20 replicates for oak. After a one-factor (compartment of soil) ANOVA (P < 0.05) and the Bonferroni-Dunn test: the 0 to 3 cm horizon values with different letters (a or b), the 3 to 10 cm horizon values with different letters (A or B) and the 10 to 23 cm horizon values with different letters (α or β) are significantly different.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Depth (cm)</th><th colspan="2">Root densities (g.dm<sup>-3</sup>)</th><th colspan="4">pH</th></tr><tr><th>Norway spruce</th><th>Oak</th><th>Norway spruce</th><th>B</th><th>Norway spruce</th><th>Oak</th></tr><tr><th>R</th><th>R</th><th>R</th><th>B</th><th>R</th><th>B</th></tr></thead><tbody><tr><td>0 to 3</td><td>9.8</td><td>2.5</td><td>3.8<sup>a</sup></td><td>4.1<sup>b</sup></td><td>4.1<sup>a</sup></td><td>4.1<sup>a</sup></td></tr><tr><td>3 to 10</td><td>1.7</td><td>0.6</td><td>4.0<sup>A</sup></td><td>4.3<sup>B</sup></td><td>4.3<sup>A</sup></td><td>4.3<sup>A</sup></td></tr><tr><td>10 to 23</td><td>1.0</td><td>0.5</td><td>4.5<sup>a</sup></td><td>4.7<sup>b</sup></td><td>4.7<sup>a</sup></td><td>4.7<sup>a</sup></td></tr></tbody></table>
element (Zr) in the rhizosphere while Sb is the concentration of that element in the bulk soil.

## Mineralogical analyses

X-ray diffraction (XRD) was carried out using a Siemens D5000 diffractometer, equipped with a graphite monochromator and selecting Cu Kα radiation (30 mA/40 kV). Diffractograms were recorded using a DACO-MP recorder associated with a microcomputer using Diffrac AT software (Socabim). Clay fractions were analysed as oriented deposits on glass slides after Ca saturation, followed by ethylene glycol solvation (EG); and K saturation, followed or not by heating to 110, 220, 330, 440, 550°C before and after hot Na-citrate and dithionite-citrate-bicarbonate treatments, that is to say 288 diffractograms. The intensity ratios of 1.0 and 1.4 nm peaks saturated with Ca were calculated for the different clay samples. The peak intensity was measured after background removal.

The Student-Fischer test was used to establish significant differences between soil types at the 10% (*) and 5% (**) level (R and G) for SiO₂tot, Al₂O₃tot, Fe₂O₃tot, MgOtot, K₂Ot, Al₂O₃(c), Fe₂O₃(c), Al₂O₃(d) and Fe₂O₃(d).

## Results

* Root densities

The fine root densities measured in the Norway spruce and oak soils decreased with depth from about 10 in the surface horizon (0 to 3 cm) to 1 g. dm⁻³ in the deepest horizon (10 to 23 cm) for the Norway spruce and from 2.5 in the surface horizon to 0.5 g. dm⁻³ in the deepest horizon for the oak (Table II.2).

The fine root density was more higher in the Norway spruce soil in comparison with that of the oak at all depths and more particularly in the surface horizon where the values were about 3 times greater (Table II.2).

* Particle size distribution

The proportion of the clay-sized fraction (% mineral weight) in the rhizosphere of the 0 to 23 cm soil horizon was not different from that of the bulk soil, being 17.0 % and 17.2 % respectively for the Norway spruce, and, 19.2% and 19.6 respectively for the oak.
<table><caption>Table II.3: Results of total analyses obtained for the bulk soil (B) and the rhizosphere (R) clays sampled at three depths in oak and Norway spruce stands in the forest site of Breuil.</caption><thead><tr><th>Tree Species</th><th>Soil compart.</th><th>Depth (cm)</th><th>Zr<sub>tot</sub> (ppm)</th><th>SiO<sub>2</sub><sub>tot</sub> (% w.)</th><th>Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sub>tot</sub> (% w.)</th><th>Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub><sub>tot</sub> (% w.)</th><th>MgO<sub>tot</sub> (% w.)</th><th>K<sub>2</sub>O<sub>tot</sub> (% w.)</th><th>Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>(c) (% w.)</th><th>Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub>(d) (% w.)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="6">Oak</td><td rowspan="3">B</td><td>0-3</td><td>121</td><td>51.3</td><td>30.0</td><td>6.1</td><td>1.0</td><td>2.3</td><td>1.0</td><td>3.4</td></tr><tr><td>3-10</td><td>112</td><td>48.9</td><td>30.7</td><td>7.6</td><td>1.1</td><td>2.2</td><td>1.7</td><td>4.8</td></tr><tr><td>10-23</td><td>111</td><td>48.0</td><td>31.4</td><td>8.3</td><td>1.1</td><td>2.2</td><td>2.9</td><td>5.6</td></tr><tr><td rowspan="3">R</td><td>0-3</td><td>136</td><td>52.1</td><td>29.7</td><td>5.6</td><td>1.0</td><td>2.4</td><td>0.9</td><td>3.0</td></tr><tr><td>3-10</td><td>110</td><td>49.1</td><td>30.5</td><td>7.3</td><td>1.1</td><td>2.3</td><td>1.5</td><td>4.3</td></tr><tr><td>10-23</td><td>110</td><td>48.2</td><td>31.4</td><td>8.2</td><td>1.1</td><td>2.2</td><td>2.6</td><td>5.4</td></tr><tr><td rowspan="6">N. spruce</td><td rowspan="3">B</td><td>0-3</td><td>138</td><td>51.8</td><td>28.3</td><td>6.3</td><td>1.1</td><td>2.4</td><td>1.0</td><td>3.6</td></tr><tr><td>3-10</td><td>120</td><td>49.5</td><td>29.5</td><td>8.3</td><td>1.2</td><td>2.4</td><td>1.9</td><td>4.6</td></tr><tr><td>10-23</td><td>123</td><td>48.1</td><td>30.3</td><td>9.1</td><td>1.2</td><td>2.3</td><td>3.1</td><td>5.9</td></tr><tr><td rowspan="3">R</td><td>0-3</td><td>166</td><td>53.8</td><td>28.1</td><td>5.0</td><td>1.0</td><td>2.5</td><td>0.8</td><td>2.4</td></tr><tr><td>3-10</td><td>121</td><td>49.8</td><td>29.1</td><td>7.9</td><td>1.2</td><td>2.4</td><td>1.6</td><td>4.6</td></tr><tr><td>10-23</td><td>121</td><td>48.5</td><td>29.9</td><td>9.0</td><td>1.2</td><td>2.3</td><td>2.6</td><td>5.9</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure II.4: Differences between the concentrations of an element in the rhizosphere (R) and in the bulk soil (B) clays in the forest site of Breuil. Histograms represent the mean value of six replicates (2 species and 3 depths). Values are significantly different according to a Student-Fischer analyse, respectively *p* = 0.05 (**) and *p* = 0.10 (*).</figcaption></figure>
* pH of the 0-200 µm soil fraction (Table II.2)

The pH was significantly lower in the rhizosphere in comparison with the bulk soil at all depths for the Norway spruce whereas there was no difference for the oak. A more acidic pH was observed in the surface horizon for both species. The pH was significantly lower in the Norway spruce rhizosphere compared to that of the oak at all depths.

* Chemical analyses of the clay fraction (Table II.3)

The percentage weights of $SiO_{2tot}$ varied between 45 and 54% in the soil samples. Its concentrations decreased with depth and increased in the rhizosphere soil for both species. In contrast, for $Al_2O_3tot$ (28.1 to 31.4%), $Fe_2O_3tot$ (5 to 9.1%), $Al_2O_3(c)$ (0.8 to 3.1%) and $Fe_2O_3(d)$ (2.4 to 5.9%), the concentrations increased with depth and decreased in the rhizosphere soil for both species. Whatever the depth and the soil compartment, $K_2O_{tot}$ and $MgO_{tot}$ concentrations remained relatively stable, between 2.2 and 2.5% and 1.0 to 1.2%, respectively.

The results presented in Figure II.4 correspond to the average concentrations calculated from 6 samples for each soil compartment (2 species and 3 depths) of the differences between the concentration for one element in the rhizosphere and that of the same element in the bulk soil. A significant increase in the proportions of $SiO_{2tot}$ ($P = 0.10$) was observed in the rhizosphere clay. Conversely, significant decreases in the proportions of $Al_2O_3tot$ ($P = 0.05$), $Fe_2O_3tot$ ($P = 0.10$), $Al_2O_3(c)$ ($P = 0.05$) were observed in the rhizosphere clay. The increase or decrease in the proportion of one element in the rhizosphere clay was always higher in the surface horizon for both species (Table II.3).

* Iso-zirconium chemical weathering budget

This method was only applied to the surface horizon, as the differences in Zr concentrations between bulk and rhizosphere clays obtained in deeper horizons fell into the ± 8% level of uncertainty of analyses. Element budgets calculated by this method underlined a loss of $SiO_{2tot}$, $Al_2O_3tot$, $Fe_2O_3tot$, $MgO_{tot}$, $K_2O_{tot}$, $Al_2O_3(c)$ and $Fe_2O_3(d)$ in the rhizosphere of both species (Figure II.5). These losses varied as a function of the element considered: 7 to 13% for $K_2O_{tot}$, 10 to 14% for $SiO_{2tot}$, 12 to 18% for $Al_2O_3tot$,
Figure II.5: Percentage of elements lost in the rhizosphere of the surface horizon for the two species calculated by the isoelement chemical weathering balance method. In white, oak and in grey, Norway spruce.

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

Figure II.6: XRD patterns of Ca saturated oriented bulk clays (B) in layer 1: (i) without pre-treatment (B, Ca), (ii) ethylene glycol solvated (B, Ca, EG), and (iii) ethylene glycol solvated and pre-treatment with citrate (B, Ca, Ca, EG).

<figure><img src="image_15.png" /></figure>
14 to 22% for MgO<sub>tot</sub>, 19 to 33 for Al<sub>2</sub>O<sub>3(c)</sub>, 19 to 34% for Fe<sub>2</sub>O<sub>3tot</sub> and 21 to 46% for Fe<sub>2</sub>O<sub>3(d)</sub>.

* XRD analyses of the clay fraction

*Identification of the different constituent minerals of the clay fraction*

From 288 XRD patterns, similar clay minerals were identified in the rhizosphere and the bulk soil under Norway spruce and oak.

XRD patterns of oriented Ca saturated samples exhibited peaks of mica (1.0, 0.5 and 0.333 nm), kaolinite (0.715 and 0.350 nm; the decrease in the 0.715 nm peak after K saturation and heating at 440°C was observed but not shown), gibbsite (0.484 nm; the disappearance of this peak after K saturation and heating at 330°C was observed but not shown), K-feldspar (0.323 nm) and quartz (0.426 and 0.333 nm) (Figure II.6).

The 1.4 nm peak corresponded to different minerals:

- chlorite was identified by the persistence of the 1.4 nm peak after K saturation and heating at 550°C (data not shown).

- smectite layers were identified by swelling after Ca saturation and EG solvation (Figure II.6).

- vermiculite was identified in layers 1 and 2 by the partial collapse of the 1.4 nm peak to 1.0 nm after K saturation without heating.

- hydroxy-interlayered phyllosilicate occurrence was shown by progressive collapse as temperatures increased (data not shown). The hydroxy-interlayered-smectite (HIS) was identified in layer 1 because swelling increased after Ca saturation, citrate pre-treatment and EG solvation but the swelling did not increase without citrate pre-treatment (Figure II.6). The hydroxy-interlayered-vermiculite (HIV) was identified by an increase in the intensity ratio of 1.0 and 1.4 nm peaks after citrate pre-treatment and K saturation but the intensity ratio of 1.0 and 1.4 nm peaks did not increase without citrate pre-treatment. This increase was present for all depths but was more marked in layer 3 (not shown).

The different treatments of the clay fraction demonstrated the presence of complex interstratified minerals (with micas, vermiculite, smectite, HIS and HIV layers) in the 6-8 2θ scale region which were not studied in detail in this paper.

*Rhizosphere effect on the clay minerals*
Figure II.7: XRD patterns of Ca saturated oriented clay from oak rhizosphere (R, Ca) and bulk soil (B, Ca) in layer 1.

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Figure II.8: XRD patterns of Ca saturated oriented clay in layer 1 from Norway spruce bulk soil: (i) without treatment (B, Ca) and (ii) ethylene glycol solvated (B, Ca, EG) and from the rhizosphere: (iii) ethylene glycol solvated (R, Ca, EG).

<figure><img src="image_17.png" /></figure>
An increase of the intensity ratio of 1.0 and 1.4 nm peaks treated with Ca saturation was observed in the rhizosphere clay minerals in comparison with that of the bulk soil, for five out of six soil samples. The Figure II.7 represents one of these soil samples.

The diffractograms of clay treated with Ca saturation and EG solvation showed greater swelling near the 1.4 nm peak in the surface horizon rhizosphere compared to that of the bulk soil, but only for the Norway spruce (Figure II.8).

## Discussion

In this study we chose to assess the effect of the rhizosphere under mature trees, on clay mineral weathering. To that end, we used different analytical methods, namely selective extractions, total chemistry and XRD analyses and an iso-zirconium chemical weathering budget which allowed us to qualify and quantify mineral weathering. The different results obtained with these methods, were concordant and showed (i) the transformation process of clays in the rhizosphere, (ii) the dissolution process of clays in the rhizosphere and (iii) the impact of the rhizosphere on pedogenesis.

* Transformation process of clays in the rhizosphere

### Al mobility

The extractions by hot Na-citrate clearly demonstrated that the rhizosphere clay had lost greater amounts of aluminium hydroxide than that of the bulk soil. This extraction of aluminium hydroxide can result from the release of aluminium hydroxide minerals and/or from the destabilisation of interlayer aluminium polymers. Moreover, the observation of the diffractograms revealed the presence of a swelling after EG solvation for the Norway spruce rhizosphere clays. This swelling after EG solvation indicated a destabilisation of interlayer aluminium polymers in the rhizosphere phyllosilicates.

### K fixation on the clay fraction

The presence of a higher proportion of mica-like-layer observed on the diffractograms, underlined the fixation of potassium on the clay fraction. These results confirmed observations under other tree species in the same experimental forest site at Breuil (Turpault et al., in preparation) and at other experimental forest sites (Clegg et Gobran, 1997; Clegg et al., 1997; Gobran et Clegg, 1998, Courchesnes et al., 1998; Gobran et
al., 1999 ; Gobran et al., 2005, Turpault et al., 2005). In fact, they showed an increase in the potassium concentrations in the tree rhizosphere compared to the bulk soil. This increase in potassium concentrations could be due to positive differences between element input fluxes, principally by mass flow, mineral weathering and organic matter mineralization, and element output fluxes, principally by plant uptake in the rhizosphere (Turpault et al., 2005).

The formation of mica-like-layers in the rhizosphere could thus be explained by a two-step mechanism. The acid and complexing compounds produced in the rhizosphere release the interlayer aluminium of the hydroxy-interlayered vermiculite and generate the formation of vermiculite which is characterized by a free interlayer space. Then, the potassium, present in large quantities in the rhizosphere solution due to a positive transfer budget, and possessing a strong affinity for the high charge phyllosilicate like vermiculite, becomes fixed in the interlayer space to form mica-like-layer (Turpault et al., 2005).

* Dissolution process of clays in the rhizosphere

The results obtained by total chemical analyses showed that the rhizosphere clays contained significantly more silicon and less iron and aluminium than the bulk soil, showing that there had been dissolution of the minerals containing iron and aluminium. Effectively, the results of selective extractions confirmed a decrease in the amorphous phases (aluminium hydroxide) in the rhizosphere. Moreover, use of the iso-zirconium method, which allowed us to estimate the gain or loss of an element in the soil in comparison with an element considered as invariant, i.e. unweatherable, demonstrated a partial loss of all elements in the rhizosphere compared to the bulk soil.

All these observations were in concordance and revealed more intense dissolution of the clay minerals in the rhizosphere of Norway spruce and oak. April and Keller (1990) also observed preferential dissolution of biotite close to root surfaces in some forest soils in the eastern United States. This impact of the rhizosphere results from the production of weathering agents by the roots and their associated micro-organisms (Barker et al., 1997). Thus, organic acid and complexing compounds contained in the root and microbial exudates are implicated in mineral weathering (Drever, 1994; Ström, 1997; Jones, 1998; Liermann et al., 2000; Arocena and Glowa, 2000; Rufyikiri et al., 2004).
However, the two species seemed to accelerate clay mineral weathering by different mechanisms. The soil pH obtained at the Breuil experimental site, clearly demonstrated acidification in the rhizosphere of the Norway spruce at all depths, notably in the surface horizon ($|pH(R - B)| \sim 0.3$). Thus, the increase in clay mineral weathering in the rhizosphere of the Norway spruce seemed to be due to the exudation of large quantities of acid compounds which are considered to be the principal factors controlling mineral dissolution (Drever, 1994). According to Haynes (1990), the pH of the rhizosphere differs from that of the bulk soil mainly because of the predominant form of nitrogen taken up. Thus, the lower pH observed in the Norway spruce rhizosphere soil compared to that of the bulk soil, might be due to the type of N uptake by the trees. In fact, the majority of the N present in the Norway spruce soil is the $NH_4^+$ form (Colin-Belgrand et al., 2003, Zeller et al., in preparation), implying that the Norway spruce principally consumes $NH_4^+$. So, by way of charge balance, the Norway spruce roots exude protons and therefore acidify their surrounding environment (Turpault et al., in preparation).

Conversely, our results showed that the oak does not acidify the surrounding environment ($|pH(R - B)| \sim 0$). One explanation could be that the clay mineral weathering observed in the oak rhizosphere depends on different mechanisms to those of the Norway spruce. In particular, the rhizosphere effect could principally result from element uptake by the oak roots which depend on the nutritional requirements of the trees. Element uptake generates disequilibrium between the solution and the mineral phase and therefore accelerates mineral dissolution. We could equally well propose that oak and Norway spruce root exudates differ greatly, both qualitatively and quantitatively, from each other. In fact, as well as producing large numbers of protons, the Norway Spruce roots is known to produce abundant quantities of soluble organic compounds, principally polycarboxilic acids, such as malic, oxalic and shikimic acids (Heim et al., 2000). In contrast, oak root exudation could be more local, less abundant and could contain compounds which are less acidic, like monocarboxylic acids such as acetic and lactic acids.

* Effect of the rhizosphere on pedogenesis

Minerals change when they are subjected to attack by chemical and the biological weathering agents. However, the weatherability varies with the mineral considered.
Figure II.9: Relationship between SiO₂tot and Al₂O₃tot in the clay fraction of rhizosphere and bulk soil for Oak and Norway spruce sampled at three depths in the Breuil forest site.

<figure><img src="image_18.png" /></figure>
Quartz is one of the most resistant minerals to weathering in temperate soils, and this is why the proportion of this mineral in a soil increases as the weathering increases. Figure II.9 compares the concentrations of Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>tot and SiO<sub>2</sub>tot in the clay minerals sampled at three distinct depths in the rhizosphere and in the bulk soil of oak and Norway spruce. The proportion of the Si-content in the clay fraction is higher (i) in the surface horizon compared to the deeper one for the same soil compartment and the same tree species, (ii) in the rhizosphere of Norway spruce compared to the oak for the same depth and the same soil compartment and (iii) in the rhizosphere compared to the bulk soil for the same depth and the same species.

These results demonstrate three tendencies:

(i) Processes in soil are depth dependent in the bulk and in the rhizosphere soils: mineral weathering increases towards the surface. The presence of greater amounts of organic matter and roots in the surface horizon could explain this observation.

(ii) Forest tree species affect the pedogenesis in the bulk soil and in the rhizosphere: mineral weathering is more intense under Norway spruce. This is probably linked to the functioning of the biological cycle of the different species, i.e. exudation, water and nutrient uptake, litter quality and decomposition.

(iii) Pedogenesis is influenced by the root and associated microorganism activities: mineral weathering is more intense in the rhizosphere.

Our results confirmed that the rhizosphere is a zone of intense activity in which mineral weathering is accelerated (Spyridakis *et al.*, 1967; April and Keller, 1990) and these processes have a considerable impact on the pedogenesis, notably in the surface horizon.

## Acknowledgements

We thank G. Nourrisson, P. Bonnaud and J. Marchand for their technical help and the analyses. This work was supported by the Andra (Agence Nationale de Gestion des Déchets Radioactifs), the Ministry of French Research (ACI quantitative ecology project) and the “Lorraine” Region.
### 3.3 Quantification de l'altération de minéraux-tests dans le sol global et la rhizosphère d'arbres (site de Fougères)

En complément de l'étude de la fraction argileuse du site de Breuil, une expérimentation en forêt visant à quantifier l'altération de minéraux-tests incubés quatre années dans le sol en présence ou en absence de racines, a été mise en place sur le site de Fougères (Bretagne) et de Breuil (Bourgogne), respectivement en 2000 et 2002 par Marie-Pierre Turpault. Le niveau d'altération des minéraux-test placés sur le site de Breuil étant trop faible pour être interprétable, nous avons alors décidé d'utiliser, dans cette thèse, les données obtenues sur le site de Fougères car elles apportent un certain nombre d'éléments clés permettant d'affiner la réflexion issue de nos autres études. Les objectifs des expériences étaient de (i) quantifier la dissolution des minéraux-tests en présence ou en absence de racines d'arbres et de (ii) comparer le niveau de dissolution de ces minéraux dans un sol fertilisé ou non.

Les résultats présentés par la suite sont extraits d'une publication en préparation, intitulée : Biological, environmental and anthropogenic effects on the test-mineral dissolution in a forest ecosystem (Turpault M.-P., Nys C. et Calvaruso C).

## Matériel et méthodes

* Description de l'écosystème

Le choix du site forestier de Fougères a été motivé par i) l'homogénéité, l'acidité et la pauvreté en nutriments (particulièrement le calcium) du sol, ii) la présence de parcelles non fertilisées et de parcelles fertilisées établies en 1973 (Le Tacon et Oswald, 1977) et (iii) des mesures intensives depuis 1997 sur les dépôts atmosphériques, la litière, l'immobilisation dans la biomasse, la chimie de la solution du sol et les propriétés du sol.

Ce site forestier de 1660 ha à dominance hêtre, est localisé en Ille et Vilaine (Bretagne, France, 48°23′N, 1°9′W, altitude de 150m). Le climat est océanique avec des températures moyennes annuelles de 12.9°C et des précipitations moyennes annuelles de 868 mm, bien réparties tout au long de l'année (Lebret, 2002). Les sols sont des alocrisols - néoluvisols (AFES, 1995) développés sur des limons éoliens non carbonatés (Van Vliet-Lanoë et al., 1995), d'une épaisseur de 1.5 m, contenant environ 15%
d'argiles et 75% de limons et couvrant le granite tardiconyen Vire (600MA). L'humus est de type dysmull dans les parcelles étudiées.

* Les peuplements de hêtre étudiés

Deux peuplements de hêtres de 86 ans en 2000 ont été sélectionnés. Ils font partie d'un site expérimental du ORE F-ORE-T (Observatoire de Recherche Environnementale), instrumenté pour l'étude des cycles biogéochimiques. Les deux parcelles sont adjacentes dans un site très uniforme (Lecointe et al., 2006). La parcelle fertilisée correspond à un des quatre blocs du traitement de fertilisation complète (NPKCa) de l'expérience mise en place en 1973 (Le Tacon et Oswald, 1977) : 100 kg.ha⁻¹ de N (nitrate d'ammonium) répandus en mai 1973 et renouvelés en mai 1974 ; 150 kg.ha⁻¹ de P₂O₅ (triple super phosphate) répandus en avril 1973 ; 1500 kg.ha⁻¹ de CaO (carbonate de calcium) répandus en avril 1973 ; 150 kg.ha⁻¹ de K₂O (sulphate de potassium) répandus en avril 1973. La parcelle témoin correspond à un peuplement âgé de 86 ans, sans fertilisation.

* Les minéraux-test :

Ils ont été choisis sur les critères suivants :

1) leur présence dans ces sols,

2) ils constituent la principale source de calcium dans ces sols acides,

3) leur altération est assez rapide,

4) la disponibilité dans le commerce de minéraux chimiquement et minéralogiquement purs et homogènes.

Deux minéraux-test ont été choisis, un plagioclase labrador provenant de Norvège et une fluoro-apatite provenant du Mexique (Durango). Les minéraux-test ont été fournis par la Compagnie Générale de Madagascar (Paris). Le plagioclase initial est composé à 99.9% de labrador et à 0.1% d'ilménite (Augusto et al., 2000). Les analyses chimiques montrent que l'apatite contient cinq fois plus de CaO que le plagioclase. La formule structurale du labrador est Si₂.49 Al₁.49 K₀.02 Ca₀.52 Na₀.45 O₈ (Augusto et al., 2000). La fluoroapatite de Durango (Mexico) se présente en cristaux individuels. Son système cristallographique est hexagonal (Young et al, 1969; Hughes et al., 1989; Elliot 1994).
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure II.11: Photo de la mise en place d'un sachet de minéral-test dans un sol forestier.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_20.png" /></figure>
Sa formule structurale est $(Ca_{9.77}La_{0.03}Ce_{0.04}Sr_{0.007}Fe_{0.003}Si_{0.06})(P_{1.02}O_{4})_{6}F_{2.08}Cl_{0.12}$
(Park et al., 2004)

Les grains minéraux initiaux ou les cristaux ont été concassés dans un broyeur à mâchoires. Les labradors et les apatites ont ensuite été tamisées à 100 – 200 µm et 0.5 - 1 mm, respectivement. La fraction 100 – 200 µm de labrador a été triée magnétiquement afin de retirer les grains contenant de l'ilménite. Les grains de labrador et d'apatite ont alors été traités par ultrasons et lavés dans de l'eau distillée afin de retirer les particules fines. Nous avons utilisé une fraction plus fine pour le labrador car sa constante de dissolution est plus faible. La surface spécifique du labrador (100 - 200 µm) mesurée par la méthode BET était de $0.11 \pm 0.01 \text{ m}^2\text{.g}^{-1}$ (Augusto et al., 2000). Comme la surface spécifique de l'apatite (0.5 - 1 mm) était trop faible pour être mesurée par la méthode BET, elle a été calculée en utilisant le modèle de la sphère : $0.0023 \text{ m}^2\text{.g}^{-1}$

Trois grammes ($\pm$ 0.0005 g) de labrador (100 - 200 µm) et d'apatite (0.5 - 1 mm) ont été placés dans des sachets (10 x 5cm) de mailles de 20 µm et 300 µm, respectivement. Les mailles de 300 µm permettent la pénétration des racines tandis que les mailles de 20 µm ne permettent que la pénétration des hyphes de champignons et des bactéries associées.

* Le dispositif expérimental

Dans le but de tester l'effet rhizosphere nous avons créé pour les deux traitements (témoin et fertilisé) une zone d'exclusion des racines de 15 mètres sur 3.5 mètres. Au moment de l'installation, une tranchée de 40 cm de large sur 1 mètre de profondeur a été creusée dans une zone forestière sans arbre. La bâche en plastique a été introduite dans le sol autour de cette zone et la tranchée a été bouchée coté extérieur de la fosse (Figure II.10).

Quatre sachets d'apatite et six sachets de labrador ont été insérés horizontalement dans chaque fosse à trois profondeurs de sol : -2.5, -10 et -20 cm (Figure II.11). Les fosses on ensuite été rebouchées couche par couche. Dans les zones d'exclusion, la végétation a été arrachée régulièrement ou traiter avec un herbicide de type glyphosate.
Figure II.12: Photographies réalisées au microscope électronique à balayage, de grains d'apatite et de plagioclase incubés durant quatre années dans le sol du site de Fougères, en présence ou en absence de racines: (a) Grain d'apatite avant incubation dans le sol; (b) Détail de la photo a, une surface plane d'un grain d'apatite; (c) Détail de la photo a, une arête d'un grain d'apatite; (d) Grain d'apatite après incubation dans le sol à 2.5 cm (traitement fertilisé sans racine); (e) Détail de la photo d, intersection de deux surfaces planes de grain d'apatite; (f) Détail de la photo d, surface présentant des aiguilles résiduelles d'altération; (g) Grain d'apatite présentant des figures linéaires de dissolution courbes (traitement contrôle avec racines à 10 cm); (h) Surface de grain couverte par des hyphes (traitement contrôle avec racines à 10 cm); (i) Hyphes dans une structure linéaire de dissolution à la surface d'un grain d'apatite (traitement contrôle avec racines à 10 cm); (j) Surface de grain de plagioclase couverte d'hyphes et de matière organique (traitement contrôle avec racines à 2.5 cm); (k) Détail de la photo j; (l) Grain de plagioclase qui présente de petites figures de dissolution.

<figure><img src="image_21.png" /></figure>
* Analyses des minéraux-test après incubation

Après 4 années d'incubation dans le sol, les sachets de minéraux ont été collectés ainsi qu'un échantillon de sol afin de déterminer l'humidité. Les minéraux ont été lavés et traités aux ultrasons afin d'éliminer le sol accolé. Ils ont ensuite été séchés et pesés avec une précision de 0.0005 g.

Le pourcentage de dissolution de chaque minéral correspond à la perte de masse durant les 4 années d'incubation. Plusieurs échantillons ont été observés après lavage par microscopie électronique à balayage (Hitachi S 2500 LB). Afin de déterminer le nombre d'hyphes et de figures linéaires de dissolution, quatre sous-échantillons d'apatite introduits à 2.5 cm de profondeur dans le sol avec racines ont été prélevés dans deux sacs dans les traitements témoins et fertilisés. Dix grains de chaque sous-échantillon orientés aléatoirement, ont été photographiés (x 80) et les figures linéaires de dissolution et les hyphes présents ont été comptés sur la face observée de chaque grain (soit 20 par traitement).

* Analyses statistiques

Les données de dissolution des minéraux ont été analysées par analyses de variance et le test t de Student-Fisher. Le programme Unistat 5.2 a été utilisé pour les analyses statistiques. La signification des tests statistiques est notée ainsi: \* = P < 0.05, (\*) = P < 0.10 et n.s. = P > 0.10.

## Résultats

* Observation des minéraux-test

Les grains de minéraux avant introduction dans le sol étaient ovoïdes pour l'apatite (Figure II.12A) et plus tabulaire pour le labrador. Ils avaient des cassures nettes fréquemment conchoïdales. L'état de surface était généralement lisse (Figures II.12B et II.12C). Après quatre années dans le sol, des figures d'altération sont bien visibles sur les surfaces des grains d'apatite et de plagioclase (Figures II.12D, II.12E, II.12F, II.12G et II.12J). Pour un même traitement, les grains peuvent être plus ou moins altérés (Figures II.12G et II.12H) et les figures d'altération ne sont pas uniformément réparties à la surface des grains (Figures II.12D et II.12G). Des hyphes sont très fréquemment observés sur la surface des grains d'apatite et de labrador en ce qui concerne les
**Figure II.13:** Nombre de figures de dissolution et d'hyphes observés par microscopie électronique à balayage (x80) sur les surfaces des grains d'apatite dans les traitements témoin et fertilisé après quatre années d'incubation dans le sol du site de Fougères. Chaque histogramme représente la moyenne de 20 observations. Les moyennes associées à des lettres différentes sont significativement différentes selon un test t de Student - Fischer (P = 0.05).

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

**Figure II.14:** Pourcentage de dissolution de l'apatite (A et C) et du labrador (B et D) dans les traitements témoin (A et B) et fertilisé (C et D) en présence ou en absence de racines après quatre années d'incubation dans le sol du site de Fougères. Les barres représentent les écart-types. Les histogrammes représentent la moyenne de quatre répétitions pour l'apatite et de six répétitions pour le labrador. Les données de dissolution des minéraux ont été analysées par analyses de variance et le test t de Student-Fisher. La signification des tests statistiques est notée ainsi: * = P < 0.05, (*) = 0.05 < P < 0.10 et n.s. = P > 0.10.

<figure><img src="image_23.png" /></figure>
traitements avec racines (Figures II.12H, II.12I, II.12J et II.12K). Par ailleurs, des
figures généralement courbes plus ou moins larges (0.1 à 1.6 mm) et profondes
apparaissent fréquemment (Figure II.12G) dans le traitement témoin avec racines. La
figure II.13 montre que ces traces sont environ trois fois plus nombreuses sur les
apatites dans le traitement témoin par rapport au traitement fertilisé. Ces figures
d'altération sont absentes des traitements sans racine. Dans le traitement témoin avec
racines, nous avons mis en évidence des figures de dissolutions plus fines (10 - 100 µm)
dans lesquelles ont pu être observés des hyphes (Figure II.12I) qui peuvent également
traverser ces structures altérées ou cheminer sur des surfaces non altérées (figure
II.12K). Les grains d'apatite du traitement témoin sont environ six fois plus colonisés
par des hyphes que les grains du traitement fertilisé (Figure II.13). Pour l'apatite, la
fréquence et la géométrie de ces figures de dissolution sont de plus dépendantes de
l'orientation cristallographique (Figures II.12E et II.12F). Les surfaces dans les plans
(100) sont moins corrodées que les faces perpendiculaires, ce qui laisse apparaître des
aiguilles résiduelles de dissolution (Figures II.12E et II.12F).

* L'effet rhizosphère

Dans le traitement témoin, la dissolution du labrador est significativement plus forte en présence des racines comparativement au traitement sans racine et ce quelle que soit la profondeur (Figure II.14A). De même, la dissolution de l'apatite est toujours plus forte en présence des racines comparativement au traitement sans racine, et notamment en profondeur où la différence y est significative (Figure II.14B). Le pourcentage de dissolution du labrador et de l'apatite est même trois fois plus important en présence des racines à 20 cm de profondeur.

Dans le traitement fertilisé, la présence de racines n'augmente pas la dissolution du labrador, au contraire, la dissolution est même significativement plus importante en l'absence de racines à 2.5 cm de profondeur (Figure II.14C). De même, aucune différence significative de dissolution de l'apatite entre les traitements avec et sans racine n'est observée (Figure II.14D).
## Discussion

L'utilisation de minéraux-tests incubés durant quatre années dans le sol du site de Fougères nous a permis de tester l'effet de la rhizosphère et l'effet de la fertilisation chimique sur le niveau d'altération des minéraux :

* L'effet rhizosphère

La géométrie des figures de dissolution observées sur l'apatite semble être contrôlée par deux facteurs :

(i) un facteur cristallographique qui s'applique à l'ensemble des traitements. La dissolution de l'apatite a conduit à la formation d'aiguilles résiduelles sur la face basale, comme cela a déjà été observé par Thirioux (1990) sur cette même fluoroapatite. Ce qui traduit vraisemblablement une forte contribution de cette face à la dissolution du minéral, comme cela a été montré pour d'autres types de minéraux tels que les inosilicates (Xie et Walther, 1994) ou les phyllosilicates (Turpault et Trotignon, 1994).

(ii) un facteur "contact biologique" qui ne concerne que les grains introduits dans les traitements avec racines. En effet, en présence de racines, les grains présentent des figures de dissolution continues qui semblent correspondre à des empreintes de racines. Des figures similaires dues à l'activité des racines ont déjà été observées dans les calcaires (Trolldenier, 1987; Hinsinger et al., 2003). Dans notre étude, le contact entre la racine et le minéral n'a pas été conservé lors de l'observation au MEB car les minéraux ont été préalablement ultrasoniqués. Etant données les formes et les tailles des figures observées et la localisation uniquement dans les traitements avec racines, ces figures sont clairement attribuables au fonctionnement des racines et des microorganismes associés.

De plus, ces empreintes sont beaucoup plus nombreuses dans le traitement témoin par rapport au traitement fertilisé ; ce qui pourrait traduire des activités rhizosphériques locales dépendantes du niveau de fertilisation du sol. Des figures plus fines sont également observables dans l'ensemble des traitements avec racines. Certaines figures colonisées par des hyphes fongiques suggèrent fortement le rôle de ces champignons dans la formation de ces figures de dissolution. Un tel résultat a déjà été mis en évidence par le passé, par plusieurs auteurs (Paris et al., 1995, Jongmans et al., 1997; Wallander et Wickman, 1999).
Dans le traitement témoin, la dissolution des minéraux observée dans la zone avec racines est plus forte que dans la zone sans racine. Cette différence augmente en profondeur pour atteindre un facteur trois dans l'horizon le plus profond. Cela peut s'expliquer par le fait qu'en surface, la plus forte humidité dans le traitement sans racine (en moyenne 11% ± 5% soit environ un tiers de plus d'humidité, D. Epron, communication personnelle), liée à l'absence de prélèvement, accentue l'altération de la phase minérale et génère par conséquent une sous-estimation de la différence de dissolution des minéraux entre les traitements avec racines et sans racine.

Dans l'étude réalisée sur la parcelle témoin développée sur un sol acide et pauvre en nutriments, nous mettons donc clairement en évidence que les racines et les microorganismes associés accélèrent la dissolution des minéraux. Ces résultats confirment ceux obtenus par Gobran *et al.* (2005) qui avaient déjà montré dans des forêts boréales composées d'épicéas que la dissolution de la fluoroapatite était augmentée en présence de racines. En conséquence, la rhizosphère des arbres forestiers semble jouer un rôle considérable dans les processus d'altération des minéraux, de mobilisation des nutriments minéraux et par conséquent de nutrition des arbres forestiers dans les écosystèmes tempérés et boréaux.

* L'effet de la fertilisation chimique

Aucun effet stimulant de la rhizosphere sur la dissolution des minéraux n'est observé dans le traitement fertilisé. Il semble donc que l'activité rhizosphérique contribuant à l'altération des minéraux soit régulée par la disponibilité des nutriments dans le sol. Ce même effet de régulation a également été observé dans un site forestier expérimental au sud de la Suède (Gobran *et al.*, 2005). Ces observations suggèrent un haut degré de plasticité de l'activité rhizosphérique en ce qui concerne la production d'agents altérants, contribuant ainsi à maintenir une certaine disponibilité des nutriments pour les plantes. De nombreux autres exemples peuvent être cités pour illustrer ce type de régulation comme la production de phytosidérophores induite par des carences en fer dans le milieu (Römheld, 1991), la production d'acides organiques induite par la toxicité aluminique (Zheng *et al.*, 1998) et la production de phosphatases dans des milieux carencés en phosphore (Tadano et Sakai, 1991).
<table><caption>Tableau II.4 : Tableau récapitulatif des principaux artefacts liés à l'utilisation de la méthode des minéraux-test dans un sol forestier. Le signe + indique une surestimation du flux d'altération de la phase minérale.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Artefacts</th><th colspan="2">Compartiment du sol</th></tr><tr><th>Rhizosphère</th><th>Sol global</th></tr></thead><tbody><tr><td>Perturbation du sol (creusement d'une fosse)</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>Sachet (propriétés capillaires)</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>Surfaces fraîches</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>Absence de racines (absence de prélèvement d'où augmentation d'humidité)</td><td></td><td>+</td></tr><tr><td>Attraction des racines et augmentation de leur activité (prélèvement et exsudation)</td><td>+</td><td></td></tr><tr><td>Attraction des microorganismes et augmentation de leur activité (prélèvement et exsudation)</td><td>+</td><td></td></tr></tbody></table>
# 4 SYNTHESE ET DISCUSSION

Notre étude des sols calcaires du site de Bure a démontré que la rhizosphère des arbres forestiers s'enrichit en potassium, confirmant, une fois encore, que la dynamique de cet élément dans les sols forestiers est très différente de celle observée dans les sols agricoles où des appauvrissements de la rhizosphère en cet élément sont observés. Ainsi, dans la rhizosphère d'arbres forestiers, le bilan des flux de potassium entrant, principalement par le flux de masse et par le flux d'altération des minéraux, et sortant par le biais du prélèvement racinaire, est positif.

La méthode des minéraux-test, choisie car elle permet de quantifier la dissolution de minéraux après seulement quelques années d'incubation dans le sol, a nettement mis en évidence un effet positif de la rhizosphère d'arbres sur l'altération des minéraux-test dans le site de Fougères : les pourcentages de dissolution de l'apatite (phosphate de calcium) et du labrador (feldspath calco-sodique) indiquent que l'altération y est multipliée par des facteurs variant de 1.2 à 3 suivant la profondeur et le minéral étudiés. Cependant, l'utilisation de cette méthode pour la quantification de l'altération des minéraux dans les sols forestiers, combinant la mise en place de minéraux-test et d'une zone d'exclusion des racines, amplifie les processus d'altération soit dans la rhizosphère soit dans le sol global, ce qui peut aboutir à des sure estimations ou à des sous-estimations de l'effet de la rhizosphère sur le taux de dissolution des minéraux (Tableau II.4). Ainsi, l'absence de prélèvement par les racines dans la zone d'exclusion a pour conséquence d'augmenter l'humidité du sol dans la zone d'exclusion. Etant donné que la vitesse de dissolution des minéraux est proportionnelle à la surface minérale en contact avec la solution du sol, cette augmentation d'humidité dans la zone d'exclusion peut accroître la dissolution des minéraux. Cette augmentation de la dissolution des minéraux dans le sol global va par conséquent engendrer une sous-estimation de l'effet de la rhizosphère sur le taux de dissolution des minéraux. D'autre part, les minéraux-test sont des minéraux riches en éléments nutritifs et possédant des surfaces fraîches, qui pourraient exercer un effet attractif sur les racines. Cet "effet minéralosphère" a d'ailleurs déjà été mis en évidence par Robinson (2001) qui a démontré que des zones de sol riches en phosphore et en azote engendraient non seulement une prolifération des racines latérales à leur contact mais également une stimulation du prélèvement, impliquant une augmentation de l'altération de la phase minérale. De plus, selon Bennett et al. (2001), cet "effet minéralosphère" ne se limiterait pas aux racines mais affecterait également les
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure II.15: Schéma de synthèse résumant le niveau de l'altération des argiles dans les site forestiers de Breuil et de Fougères.</figcaption></figure>
microorganismes du sol. En effet, ces auteurs expliquent que dans des environnements pauvres en phosphates, les bactéries peuvent coloniser et altérer plus particulièrement un minéral contenant du phosphore. L'utilisation de minéraux-test ne permet donc qu'une estimation de l'effet de la rhizosphère sur l'altération des minéraux, impliquant que cette approche permet d'estimer les processus d'altération des minéraux dans un sol, mais n'est pas facilement extrapolable au niveau de l'écosystème.

C'est pourquoi, une approche complémentaire, sans perturbation du sol et sans interférence avec les composantes biologiques, basée sur l'utilisation de la fraction argileuse des sols comme marqueur de l'altération de la phase minérale des sols forestiers a été utilisée sur le site de Breuil. Cette étude a confirmé l'augmentation significative de la dissolution des minéraux dans la rhizosphère comparativement au sol global, déjà observée avec la méthode des minéraux-test. En effet, une perte en silice supérieure de 10 à 14% à celle du sol global, a pu être mesurée à l'aide de la méthode du bilan iso-zirconium d'altération chimique, dans la rhizosphère de l'horizon de surface (0-3 cm). De plus, cette étude a mis en évidence des processus de transformation de la fraction argileuse dans la rhizosphère de cet horizon, reposant sur une déstabilisation des polymères alumineux interfoliaires et une fixation de potassium plus importante concernant les argiles de la rhizosphère. Cette approche reste cependant réductrice car la fraction argileuse représente moins d'un cinquième du sol du site de Breuil. Toutefois, c'est cette fraction du sol qui, de par sa surface développée importante lui conférant une forte sensibilité au processus d'altération, représente la fraction minérale la plus réactive et de plus, c'est la fraction porteuse de la majorité des nutriments dans le sol.

C'est pourquoi, à défaut de permettre une quantification précise de l'effet de la rhizosphère sur l'altération des minéraux dans les sols forestiers, l'utilisation de ces deux méthodes complémentaires met tout de même en évidence un résultat majeur : quel que soit le site, les processus d'altération sont plus poussés dans la rhizosphère que dans le sol avoisinant, et ce pour trois essences d'arbres différentes : chêne, hêtre et épicéa (Figure II.15). A partir des analyses chimiques totales de la fraction argileuse, il nous est tout de même possible d'estimer la perte d'un élément dans une couche de sol pour une surface et sur une période données. Les résultats obtenus sur le site de Breuil montrent que, sur les 23 premiers centimètres de sol, la perte en magnésium dans la rhizosphère du chêne et de l'épicéa est comprise entre 1.3 et 6.3 kilogrammes par hectare. A l'aide du modèle PROFILE, Ezzaïm (1997) et Fichter et al. (1997) ont
montré que, dans des écosystèmes forestiers comparables à celui de Breuil, les pertes en magnésium dans les 60 premiers centimètres du sol global étaient comprises entre 0.3 et 3 kilogrammes par hectare et par an. Bien qu'approximatives, ces données montrent que le flux d'altération lié à la rhizosphère serait équivalent au flux d'altération dans le sol global de l'horizon de surface d'un sol forestier, alors que la rhizosphère représente moins de 10% du volume de sol total dans cet horizon. Cette évaluation n'étant basée que sur quelques observations, des analyses complémentaires sur d'autres sites forestiers sont nécessaires avant de donner un caractère générique à ces résultats.

Ces études démontrent toutefois que la rhizosphère joue un rôle important dans la biodisponibilité des éléments minéraux dans les sols forestiers. Si l'on considère l'action des différents partenaires biologiques de la rhizosphère tels que les racines, les bactéries, les champignons mycorhiziens et saprophytes, la rhizosphère correspond donc à une juxtaposition d'une multitude de microsystèmes d'altération.

Notre travail a également démontré que l'impact de la rhizosphère dans la biodisponibilité des nutriments variait considérablement en fonction du niveau de fertilité des sols. En effet, nous n'avons pas observé d'effet stimulant de la rhizosphère sur la dissolution des minéraux-test dans les sols soumis à une fertilisation minérale.

De même, si pour l'épicéa, l'exsudation massive de composés acides peut expliquer cette augmentation de l'altération des minéraux dans la rhizosphère, en revanche d'autres mécanismes, peut-être plus localisés, semblent impliqués en ce qui concerne le chêne. C'est pourquoi, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la microflore présente dans les sols forestiers sous ces différentes essences et notamment, la capacité de la microflore de la rhizosphère et du sol global à altérer la phase minérale, qui constituera notre chapitre suivant.
## CHAPITRE III :

STRUCTURATION FONCTIONNELLE DES
COMMUNAUTES MICROBIENNES DANS LES
SOLS FORESTIERS EN RELATION AVEC
L'ALTERATION DES MINERAUX
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Tableau III.1: Tableau récapitulatif des effectifs de souches bactériennes et fongiques isolées sur le site de Breuil (ne = non échantillonné).</figcaption></figure>

<table><thead><tr><th rowspan="3">Essence d'arbre</th><th colspan="8">Souches bactériennes</th><th colspan="2">Souches fongiques</th></tr><tr><th colspan="2">Chêne I (2001)</th><th colspan="2">Chêne II (2004)</th><th colspan="2">Hêtre II (2004)</th><th colspan="2">Epicéa II (2004)</th><th colspan="2">Chêne I (2001)</th></tr><tr><th>0-3</th><th>3-5</th><th>0-3</th><th>3-5</th><th>0-3</th><th>3-5</th><th>0-3</th><th>3-5</th><th>0-3</th><th>3-5</th></tr></thead><tbody><tr><td>Profondeur (cm)</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sol global</td><td>43</td><td>48</td><td>ne</td><td>21</td><td>ne</td><td>32</td><td>ne</td><td>67</td><td>27</td><td>31</td></tr><tr><td>Interface mycorhize-sol</td><td>39</td><td>48</td><td>ne</td><td>13</td><td>ne</td><td>133</td><td>ne</td><td>97</td><td>26</td><td>23</td></tr><tr><td>Manchon symbiotique</td><td>42</td><td>44</td><td>ne</td><td>ne</td><td>ne</td><td>ne</td><td>ne</td><td>ne</td><td>0</td><td>11</td></tr></tbody></table>
# 1. CONTEXTE ET OBJECTIFS

Les bactéries et les champignons, de par leur très grande diversité génétique et fonctionnelle et leurs propriétés physico-chimiques, sont des composantes essentielles de la communauté biotique des sols forestiers. En effet, ils contribuent au fonctionnement de l'écosystème, *via* notamment leur capacité à mobiliser les nutriments par minéralisation de la matière organique et par altération de la phase minérale du sol (Paul et Clarck, 1985). Il est déjà clairement établi que la rhizosphère influence significativement la diversité génétique des populations microbiennes environnantes (Davet, 1996). Mais qu'en est-il de l'effet de la rhizosphère sur la diversité fonctionnelle de ces populations, et notamment en ce qui concerne la fonction "altération des minéraux" ? C'est pour répondre à cette question que nous avons réalisé une étude *in vitro* visant à analyser le potentiel de souches microbiennes isolées dans le sol global et la rhizosphère d'arbres forestiers, à altérer des minéraux. En parallèle, les souches bactériennes ont été décrites génotypiquement et métaboliquement, dans le but de définir si les souches possédant un fort potentiel d'altération des minéraux appartenaient majoritairement à un ou plusieurs groupes taxonomiques particuliers. Enfin, cette étude aura également pour objectif de comparer la structuration des communautés bactériennes sous des essences d'arbres forestiers à nutrition azotée contrastée.

# 2. BIOTESTS IN VITRO

Dans le but de répondre à ces différentes questions, nous avons procédé à l'isolement d'une collection de 745 souches microbiennes, d'une part dans le sol global et d'autre part dans l'ectomycorhizosphère du champignon ectomycorhizien *Scleroderma citrinum* (Figure III.1) associé à différentes essences forestières, et ce à une ou deux profondeurs distinctes dans l'horizon organo-minéral (Tableau III.1). Le protocole d'échantillonnage des mycorhizes *S. citrinum* et du sol global est décrit en annexe 5. Le choix s'est porté sur le champignon ectomycorhizien *S. citrinum* car c'est un champignon ubiquiste qui forme des carpophores et dont les mycorhizes sont
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure III.3: Photos des tests semi-quantitatifs in vitro de mobilisation du fer et du phosphore par les microorganismes.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure III.4a: Dispositif de micro-incubation en microplaques filtrantes utilisé pour caractériser le potentiel d'altération de souches bactériennes.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure III.4b: Photo de la plaque de révélation du test quantitatif in vitro d'altération bactérienne de la biotite basé sur le dosage de la quantité d'ions ferriques et ferreux mobilisés à partir du minéral et sur le dosage des ions $H^+$ libérés en solution</figcaption></figure>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>
facilement identifiables sur le terrain du fait de leur présence à proximité des
carpophores, de leur couleur blanche et de leur odeur très caractéristique (Figure III.2).
Les protocoles d'isolement des souches bactériennes et fongiques sont détaillés dans la
partie "matériel et méthodes" de la publication intitulée "Impact of
ectomycorrhizosphere on the functional diversity of soil bacterial and fungal
communities from a forest stand in relation to nutrient mobilization process". Les
souches de la collection ont ensuite été caractérisées au moyen de deux tests *in vitro* :

(i) des tests en boîtes de Petri sur milieu gélosé contenant soit du fer insoluble (milieu Chrome Azurol Soufre) soit du phosphore insoluble (milieu Tri Calcium Phosphate). Ces tests sont basés sur la détection d'activités bactériennes et fongiques pouvant jouer un rôle dans l'altération minérale, à savoir la production de protons, d'acides organiques complexants et de sidérophores impliqués dans la mobilisation du fer et du phosphore. Ils consistent à rechercher le changement d'aspect de deux milieux de culture, sous l'effet de l'activité bactérienne (Figure III.3). Le milieu CAS (Alexander *et al.*, 1990) contenant du fer insoluble, initialement bleu, devient orange en présence d'une souche capable de mobiliser le fer par la production d'acides organiques complexants et/ou de sidérophores. Le milieu TCP contenant un phosphate tricalcique insoluble, initialement trouble, devient limpide en présence d'une souche capable de solubiliser le phosphore par la production d'acides et d'acides organiques.

(ii) un test en microplaques est le fruit de la collaboration entre Christian Mustin, chercheur au "Laboratoire des Interactions Microorganismes - Minéraux - Matière Organique dans les Sols" (LIMOS) et nos unités INRA "Interactions Arbres - Microorganismes" (IAM) et "Biogéchimie des Ecosystèmes Forestiers" (BEF). Une publication relative à la mise au point de ce biotest est en cours de rédaction par Christian Mustin et Stéphane Uroz. Ce test, dont le protocole est décrit dans la partie "matériel et méthodes" de la publication intitulée "Mycorrhizosphere effect on the genotypic and metabolic diversity of the soil bacterial communities involved in mineral weathering in a forest soil" vise à quantifier l'altération d'un minéral test au contact d'une suspension bactérienne. Il est réalisé grâce à un dispositif de micro-incubation utilisant des microplaques filtrantes inertes de 96 puits. Comme chacun des puits peut être filtré séparément, une analyse conjointe des solutions d'équilibre et des minéraux qu'ils contiennent peut être entreprise (Figure III.4a). Le test est basé sur l'utilisation d'indicateurs colorés réagissant à la quantité d'ions ferriques et ferreux libérée (ferrospectral) et au pH de la solution (bromocrésol vert) (Figure III.4b). Il consiste à
mesurer la quantité de fer libérée et le pH engendré par l'activité d'une souche bactérienne incubée en présence d'un minéral-test, la biotite. Ce dernier a été choisi parce que c'est un minéral relativement rapidement altérable et porteur de nutriments fréquemment présents dans les sols acides et notamment sur le site de Breuil. Ce test permet de mettre en évidence la production par les bactéries d'acides, d'acides organiques et d'acides organiques complexants qui vont altérer la biotite et donc mobiliser le fer. La valeur de pH mesurée dans la solution permet d'apprécier la quantité de protons présents en solution, libérés par les microorganismes, et donc de déterminer les différents mécanismes mis en jeu par les bactéries : acidification ou complexation.

## 3 RESULTATS

### 3.1 Effet de la mycorhizosphère sur la structuration fonctionnelle des communautés microbiennes du sol en relation avec leur capacité à mobiliser des éléments minéraux *in vitro*.

L'objectif de cette partie est de comparer la capacité de souches bactériennes et fongiques isolées dans le sol global et dans l'ectomycorhizosphère d'un arbre forestier à mobiliser des nutriments (fer et phosphore) insolubilisés dans un milieu gélosé.
## Article : Impact of ectomycorrhizosphere on the functional diversity of soil bacterial and fungal communities from a forest stand in relation to nutrient mobilization process.

Calvaruso Christophe¹,², Turpault Marie-Pierre¹, Leclerc-Cessac Elisabeth³, Frey-Klett Pascale².

¹INRA, UR 1138 "Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers", Centre INRA de Nancy, 54280 Champenoux.

²INRA, UMR 1136 "Interactions Arbres-Microorganismes", Centre INRA de Nancy, 54280 Champenoux.

³ ANDRA, Direction Scientifique/Service Transferts, 92298 Châtenay-Malabry, France.

Soumis pour publication à Microbial Ecology le 11 septembre 2006

## Résumé

La symbiose ectomycorhizienne modifie les conditions physico-chimiques et biologiques dans le sol environnant, créant ainsi un environnement particulier appelé ectomycorhizosphère dont l'effet sur l'équilibre microbien pourrait jouer un rôle dans le cycle des nutriments. Afin d'évaluer l'impact de l'ectomycorhizosphère sur la structure des communautés microbiennes potentiellement impliquées dans la mobilisation des nutriments à partir des minéraux du sol, nous avons comparé la diversité fonctionnelle de communautés fongiques et bactériennes du sol et de l'ectomycorhizosphère dans un peuplement forestier. Deux cents soixante quatre souches bactériennes et 118 souches fongiques ont été isolées à partir du sol global d'un peuplement de chêne (Quercus petraea) ainsi qu'à partir de l'ectomycorhizosphère et des ectomycorhizes du couple Scleroderma citrinum - chêne, dans deux horizons organo-minéraux de sol (0 à 3 cm et 5 à 10 cm). Les souches ont ensuite été caractérisées en utilisant deux tests in vitro relatifs à leurs capacités à mobiliser le fer et le phosphore.

Nous avons démontré que l'ectomycorhizosphère du couple S. citrinum - chêne structure significativement les communautés bactériennes cultivables dans les deux horizons de sol analysés, en sélectionnant des souches très efficaces dans la mobilisation du fer et du phosphore. Un tel effet a aussi été observé sur la diversité des communautés fongiques solubilisant le phosphore dans l'horizon de sol le plus profond. Comparé à une étude antérieure qui démontrait que l'ectomycorhizosphère du couple
*Laccaria bicolor* - Douglas fir structure la diversité fonctionnelle d'une population de *Pseudomonas fluorescens* en pépinière, notre travail souligne la généralité de l'effet mycorhizosphère sur la diversité fonctionnelle des communautés fongiques et bactériennes en relation avec les processus d'altération minérale, quels que soient l'âge du symbionte fongique, l'âge et l'espèce de la plante hôte et l'environnement (pépinière vs forêt). Nous avons par ailleurs également démontré que les intensités de mobilisation du fer et du phosphore par les bactéries de l'ectomycorhizosphère sont significativement plus fortes pour les isolats prélevés dans l'horizon de sol le plus profond, comparativement aux isolats échantillonnés dans l'horizon supérieur. Ceci révèle, pour la première fois, une stratification verticale de la diversité fonctionnelle des communautés bactériennes cultivables en relation avec le potentiel de mobilisation du fer et du phosphore.

**Mots-clés:** bactéries, champignons, diversité fonctionnelle, "effet ectomycorhizosphère", mobilisation du fer et du phosphore, peuplement forestier.

## Abstract

The ectomycorrhizal symbiosis alters the physicochemical and biological conditions in the surrounding soil, thus creating a particular environment called ectomycorrhizosphere, the effect of which on microbial equilibrium is suspected to play a role in gross production and nutrient cycling. In order to assess the ectomycorrhizosphere effect on the structure of microbial communities potentially involved in the mobilization of nutrients from the soil minerals in a poor-nutrient environment, we compared the functional diversity of soil and ectomycorrhizosphere bacterial communities in a forest stand. Two hundred and sixty four bacterial strains and 107 fungal stains were isolated from the bulk soil of an oak (*Quercus petraea*) stand and from oak-*Scleroderma citrinum* ectomycorrhizosphere and ectomycorrhizae, in two soil organo-mineral horizons (0 to 3 cm and 5 to 10 cm). They were characterized using two *in vitro* tests related to their capacities to mobilize iron and phosphorus. We demonstrated that the oak - *S. citrinum* ectomycorrhizosphere significantly structures the culturable bacterial communities in the two soil horizons by selecting very efficient strains for phosphorus and iron mobilization. This effect was also observed on the diversity of the phosphate-solubilizing fungal communities in the lower soil horizon. Comparing to a previous study which demonstrated that *Laccaria bicolor* - Douglas fir
ectomycorrhizosphere structures the functional diversity of *Pseudomonas fluorescens* population in a forest nursery, our work highlights the consistency of the mycorrhizosphere effect on the functional diversity of bacterial and fungal communities in relation to the mineral weathering process, no matter the fungal symbiont, the age and species of the host tree, or the environment (nursery vs forest). We also demonstrated that the intensity of phosphorus and iron mobilization by the ectomycorrhizosphere bacteria isolated from the lower soil horizon was significantly higher as compares to that which was isolated from the upper horizon. This reveals for the first time a stratification of the functional diversity of the culturable soil bacterial communities as related to phosphorus and iron mobilization.

**Key-words:** bacteria, fungi, functional diversity, ectomycorrhizosphere effect, forest stand, iron and phosphorus mobilization.

## Introduction

In temperate and boreal forest ecosystems, the vast majority of trees lives in close association with symbiotic fungi, primarily the ectomycorrhizal ones. These fungi connect tree roots to the surrounding soil *via* a broad network of hyphae and contribute to plant nutrition by more particularly weathering the soil minerals and mobilising the nutrients required for tree growth (Landeweert *et al.*, 2001; Van Breemen *et al.*, 2000). In addition, the ectomycorrhizal fungi modify root exudation qualitatively as well as quantitatively (Leyval and Berthelin, 1993; Rambelli, 1973; Rygiewicz and Andersen, 1994). Furthermore, some mycorrhizal fungi associated with plant roots produce antibiotics (Olsson *et al.*, 1996). As a consequence, ectomycorrhizal fungi modify the physical, chemical and microbiological characteristics of the surrounding soil and create a special environment called mycorrhizosphere, in which the microbial equilibrium is different from that of the rhizosphere soil. Linderman (1988) qualified these modifications of the microbial equilibrium, as "mycorrhizosphere effect", which concerns a number of different organisms, notably microfungi (Neal *et al.*, 1964) and bacteria (Assigbetse *et al.*, 2005; Heinonsalo *et al.*, 2000).

To date, the impact of this "mycorrhizosphere effect" on soil fungal and bacterial communities in terms of plant nutrition and plant health is poorly documented although some studies have suggested that plants, by means of their root exudates (Bais *et al.*, 2004), alter the structure and activity of microbial communities. These exudates can attract pathogens (Back *et al.*, 2002) and, at the same time, selectively favour microbial
<table><caption>Table III.2: Physicochemical characteristics of the soil from the oak stand in the experimental forest site of Breuil (central France), at two different depths and in two soil compartments (Turpault et al., in preparation). The rhizosphere compartment corresponds to the soil that was spontaneously removed from the oak roots (diameter < 2 mm) after 3 days at 30°C.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Soil compartment</th><th rowspan="3">Depth (cm)</th><th rowspan="3">pH* (water)</th><th colspan="4">Particle size distribution</th><th rowspan="2">C* ‰</th><th rowspan="2">N* ‰</th><th colspan="4">Exchangeable cations*</th><th rowspan="2">S/T*</th></tr><tr><th colspan="4">% mineral Fine Earth</th><th colspan="4">cmolc. kg<sup>-1</sup> Fine Earth</th></tr><tr><th>Clay</th><th>Fine Silt</th><th>Coars e Silt</th><th>Fine Sand</th><th>Ca</th><th>Mg</th><th>K</th><th>Fe</th></tr></thead><tbody><tr><td>Bulk soil</td><td>0-3</td><td>4.1 (0.2)</td><td>19.4</td><td>17.5</td><td>4.8</td><td>10.2</td><td>n.d.</td><td>n.d.</td><td>0.7 (0.4)</td><td>0.5 (0.1)</td><td>0.9 (0.2)</td><td>0.3 (0.1)</td><td>15 (4)</td></tr><tr><td>Rhizosphere</td><td>0-3</td><td>4.1 (0.2)</td><td>19.1</td><td>17.5</td><td>5.2</td><td>10.0</td><td>n.d.</td><td>n.d.</td><td>1.3 (0.6)</td><td>0.8 (0.2)</td><td>2.0 (0.5)</td><td>0.6 (0.1)</td><td>25 (6)</td></tr><tr><td>Bulk soil</td><td>3-10</td><td>4.3 (0.2)</td><td>20.0</td><td>17.3</td><td>3.5</td><td>11.1</td><td>68 (8)</td><td>4.0 (0.4)</td><td>0.2 (0.1)</td><td>0.3 (0.2)</td><td>0.6 (0.2)</td><td>0.2 (0.1)</td><td>8 (2)</td></tr><tr><td>Rhizosphere</td><td>3-10</td><td>4.3 (0.2)</td><td>20.5</td><td>16.9</td><td>2.3</td><td>12.1</td><td>83 (9)</td><td>4.9 (0.4)</td><td>0.3 (0.1)</td><td>0.4 (0.2)</td><td>1.6 (0.4)</td><td>0.4 (0.2)</td><td>16 (3)</td></tr></tbody></table>
communities which are beneficial to the plant (Cook et al., 1995; Dakora and Phillips, 2002). In nutrient-poor soils, microorganisms are beneficial for their contribution to the mobilization of the nutrients required for plant nutrition from soil minerals (Marschner, 1995). In this context, the aim of the study was to assess, in adult tree plantations and nutrient-poor forest soils, the impact of the ectomycorrhizosphere on the functional diversity of culturable bacterial and fungal communities potentially involved in the mobilization of iron and phosphorus from soil minerals.

For this purpose, we chose a forest stand planted with 25 year-old oak trees. We isolated bacterial and fungal strains from bulk soil, soil-ectomycorrhiza interface and ectomycorrhizae formed by *Scleroderma citrinum*, a widely distributed ectomycorrhizal fungus in the experimental site. In order to assess the impact of the abiotic environment on the structure of the microbial communities, the bacterial and fungal isolates were isolated at two different depths in the organo-mineral soil horizon. We compared the functional activity potentials of the microbial isolates with two *in vitro* tests related to phosphorus and iron mobilization, an important function in the ectomycorrhizosphere that is expected to be involved in mineral weathering and plant nutrition control.

## Methods

* Experimental site and soil properties

The experimental site, located in Breuil (central France), is heavily instrumented in order to allow intensive measurements on atmospheric deposition, litter fall, biomass immobilization, drainage, weathering flux and nutrient budgets. The oak (*Quercus petraea*) stand which was studied contained 2694 trees per ha, with an average height of 13 m. The oaks were 25 year-old. The soil cover was bare, with extremely few herbaceous plants. The soil is an alocrisol derived from granite covered by loess. It is very sensitive to acidification and nutrient deficiencies. Its physicochemical characteristics are homogenous in each soil compartment (rhizosphere or bulk soil) and in each soil horizon (0-3 cm or 3-10 cm) (Table III.2).

* Biological material

### Collections of microbial isolates

Soil samples and *Scleroderma citrinum* ectomycorrhizae were collected in autumn under four sporocarps of *S. citrinum* (approximately five meters apart) and at two different depths: at 0 to 3 cm in the upper horizon (named S) and at 5 to 10 cm in a
<table><caption>Table III.3: Origin of the collections of bacterial and fungal isolates.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">Bacterial isolates</th><th colspan="2">Fungal isolates</th></tr><tr><th>N<sup>b</sup></th><th>ML</th><th>MB</th><th>N</th><th>ML</th></tr></thead><tbody><tr><td>S horizon</td><td>43 (15, 31)</td><td>39 (27, 31)</td><td>42 (17, 34)</td><td>27 (20, 22)</td><td>26 (13, 16)</td></tr><tr><td>P horizon</td><td>48 (33, 35)</td><td>48 (29, 31)</td><td>44 (41, 28)</td><td>31 (19, 15)</td><td>23 (21, 16)</td></tr><tr><td>Total</td><td></td><td>264</td><td></td><td></td><td>107</td></tr></tbody></table>

a: Soil horizon of origin of the microbial isolates. S for upper horizon and P for lower horizon.

b: Compartment of origin of the microbial isolates. N for bulk soil, ML for soil-mycorrhiza interface and MB for mycorrhizae.

c: In bold, the total number of microbial isolates tested. Between brackets, the number of isolates that were retained for the analysis of the results on CAS and TCP media, respectively: the isolates that did not grow on these media and the ones that were tested in experiments where the behaviour of the reference strain was not reproducible along time, were rejected.
lower horizon (P). The ectomycorrhizal fungal species *S. citrinum* was chosen because it is a ubiquitous fungus, widely distributed in the experimental forest site. Moreover its mycorrhizae can be unambiguously identified *in situ* because of its colour, morphology and typical smell. In the experimental forest site, an inventory of the epigeous sporocarps, performed three times each autumn during five years, revealed 138 ectomycorrhizal species (Buée *et al.*, 2006). Among them, *S. citrinum* represented the 9th most abundant. The frequency of its mycorrhizae on oak roots was 6% at the two different depths in the organo-mineral horizon (Buée, communication personnelle).

Two hundred and sixty four bacterial strains were isolated from three different compartments and 107 fungal strains were isolated from only two compartments (Table III.3) as follows: (1) bulk soil, *i.e.* soil remaining after picking out the roots (Marilley *et al.*, 1998) and the extramatrical mycelium of *S. citrinum* aggregated in thick white strands; 50 mg of fresh bulk soil was suspended in 1 ml sterile distilled water and shaken manually (5 times up and down). The resulting suspension was called "N". (2) Ectomycorrhizosphere soil *i.e.* soil adherent to oak-*S. citrinum* ectomycorrhizae; 20 mg of fresh ectomycorrhizae were manually shaken in order to remove the non-adherent soil particles. Then, the ectomycorrhizae were suspended in 1 ml sterile distilled water and manually shaken (5 times up and down). The resulting suspension was called "ML". (3) *S. citrinum* ectomycorrhizae; 20 mg of fresh ectomycorrhizae were suspended in 1 ml sterile distilled water and manually shaken (5 times up and down). The supernatant was discarded and replaced by 1.3 ml sterile distilled water. The suspension was vortexed 1 min and the supernatant was discarded. This operation was repeated four times. The washed ectomycorrhizae were crushed in 200 µl of sterile distilled water, after which 800 µl of sterile distilled water were added in order to obtain 1 ml of suspension. The resulting suspension was called "MB".

One milliliter of each suspension (N, ML and MB) was sampled and serial dilutions were spread onto a TSA medium 10% (3 g.l⁻¹ Tryptic Soy Broth, from Difco and 15 g.l⁻¹ agar) + 100 mg.l⁻¹ Propianazole (Tilt125, a fungicide from CIBA-GEIGY) for the isolation of culturable bacterial strains, and onto malt acid + Rose Bengal + chloramphenicol medium (10 g.l⁻¹ malt, 25 mg.l⁻¹ Rose Bengal, 200 mg.l⁻¹ citric acid, 100 mg.l⁻¹ chloramphenicol and 15 g.l⁻¹ agar) for the isolation of culturable fungal strains. Plates were incubated at 25°C for 7 days. No fungal isolates grew on the selective malt acid medium within 7 days after plating the MB suspensions. The bacterial strains were purified by three successive platings on TSA 10%, then stored at -
80°C in LB medium + 20% glycerol (Sambrook *et al.*, 1989). The pure fungal plugs were stored at 4°C in sterile ultra-pure water + 10% glycerol. These mainly corresponded to fast growing and sporulating microfungi. The bacterial isolates were identified by partial *rrs* gene sequence analysis and their BIOLOG® metabolism, as members of the *Burkholderia*, *Collimonas*, *Pseudomonas* and *Sphingomonas* genera (Uroz *et al.*, submitted).

After fungal and bacterial isolations, PCR-RFLP analyses (Di Battista *et al.*, 1996) using Hinf I restriction enzyme were performed on several *S. citrinum* ectomycorrhizae. The identity of the ectomycorrhizae was confirmed by comparing their PCR-RFLP profiles to the one of the pure *S. citrinum* strain which was isolated from a sporocarp sampled in the experimental forest site.

### Reference strains

The *Pseudomonas fluorescens* BBc6R8 strain, which promotes the symbiosis between Douglas fir and the ectomycorrhizal fungus *Laccaria bicolor*, was selected by Frey-Klett *et al.* (1997). It has been used as a reference strain in the different *in vitro* biotests due to its great capacity to mobilize iron and phosphorus in these tests. Preliminary experiments revealed that the fungal strain PML2(10), isolated from the *S. citrinum*-oak ectomycorrhizosphere (ML) in the 5-10 cm horizon (P), presents a great capacity to mobilize iron and phosphorus in the different *in vitro* tests. Therefore, this fungal strain was also used as a reference strain.

### *In vitro* tests

The ability of the bacterial and fungal isolates to solubilize tricalcium orthophosphate *via* the production of acid compounds and to mobilize iron *via* the production of complexing acids and/or siderophores was assessed on the TCP and CAS media, respectively, following a modified protocol of Frey-Klett *et al.* (2005). Briefly, the different steps were as follows:

#### Bacterial inocula

Each bacterial isolate was grown on 10% TSA medium at 25°C for 48h. The bacteria were then collected and suspended in 2 ml of sterile ultra-pure water in order to obtain a
suspension with A<sub>600nm</sub> = 0.3 (about 4.10<sup>8</sup> CFU.ml<sup>-1</sup>). Ten microliters of this inoculum were dropped in the centre of three plates containing either 15 ml of CAS or TCP medium.

*Fungal inocula*

For each fungal isolate, one plug from the +4°C tube collection was placed in the centre of a Petri dish containing PDA medium (39 g.I<sup>-1</sup> of Potato Dextrose Agar from Difco). After seven days of incubation at 25°C, 6 mm-diameter fungal plugs were sampled in the periphery of the fungal colonies and transferred to the centre of three plates containing either CAS or TCP medium covered with a cellophane membrane which was previously boiled in ultra-pure water + EDTA (372 mg.I<sup>-1</sup>) during 15 minutes, washed abundantly with ultra-pure water and sterilised twice by autoclaving.

*Analysis of the test reproducibility*

Because of the number of the bacterial strains to be tested, 17 independent experiments were performed for the analysis of the behaviour of the entire microbial collection on the CAS and TCP media. The reproducibility in time of the data from the two *in vitro* tests was assessed by the analysis of the variability of the effects of the reference strains BBc6R8 and PML2(10) on CAS and TCP media in the successive experiments.

*Parameters measured for the tested bacterial isolates*

Only the bacterial isolates that grew on CAS and TCP media were retained for the functional analyses. After incubation for 7 days at 25°C on the CAS medium or 16 days on the TCP medium, two perpendicular diameters of the discolouration areas were measured and the mean values of these diameters calculated. According to these values, the bacterial isolates were distributed into three classes differing by the discolouration intensities on the CAS or TCP media (0, + and ++). The bacterial spots growing on each plate were collected by washing twice with 500 µl of sterile ultra-pure water in order to quantify the bacterial densities which were present on the media at the end of the experiment. Appropriate dilutions of the bacterial suspensions were spread on TSA 10% medium. Iron and phosphorus mobilization efficacies were then calculated for each bacterial isolate: mean value of the discolouration area diameter (cm) / (log(CFU/ml at the end of the experiment)+1). Fifty-nine and 96 bacterial isolates from the upper
horizon were tested on CAS and TCP media respectively (Table III.3). One hundred and three and 94 isolates from the lower horizon were tested on CAS and TCP media respectively (Table III.3).

### Parameters measured for the tested fungal isolates

Only the fungal isolates that grew on CAS and TCP media were retained for the functional analyses. After incubation for 7 days at 25°C on the CAS medium or 16 days on the TCP medium, the perpendicular diameters of the discolouration areas were measured and the mean values of the diameters were calculated. The fungal colonies that had colonized the cellophane membrane were collected and dried 48H at 100°C in order to determine the fungal biomass. Iron and phosphorus mobilization efficacies were then calculated for each fungal isolate: mean value of the discolouration area diameter (cm) / dry biomass of the fungal colony at the end of the experiment (mg). Statistical analyses revealed that the behaviour of the reference strain PML2(10) was not reproducible in three of the nine independent experiments. Therefore all the fungal isolates that had been tested in these three experiments were discarded. Only 33 and 38 isolates from the upper horizon, 40 and 31 isolates from the lower horizon were retained for the analysis of their behaviour on the CAS and TCP media, respectively (Table III.3).

* Statistical analyses

The mean diameters of the discolouration areas on CAS and TCP media were analysed with two one-factor (date of experiment or origin compartment of the bacterial isolates) ANOVAs. The different dates of experiment were compared with the Bonferroni-Dunn test at the threshold level of *P* = 0.05. The different compartments of origin were compared with the same test. The proportion of bacterial isolates per class, differing by the discolouration intensities on CAS or TCP media (0, + and ++), were compared between the different isolate origin compartments using a χ2 test (*P* = 0.05).

## Results

* Reproducibility of the data from the *in vitro* tests

In the case of the reference bacterial strain *P. fluorescens* BBc6R8, the mean values of the diameters of the discolouration areas and the efficacies of iron and phosphorus
Figure III.5: Relationship between the mean values of the discolouration diameters and the mobilization efficacies. A and B: bacterial isolates, C and D: fungal isolates, A and C: test on CAS medium, B and D: test on TCP medium. The linear regression take into account the experimental data related to only the isolates that were tested in the experiments where the behaviour of the reference strains was stable along time. The four linear regressions were significant: A, r² = 0.98 and P = 0.0001; B, r² = 0.95 and P = 0.0001; C, r² = 0.67 and P=0.0001; D, r² = 0.35 and P = 0.0001.

<figure><img src="image_30.png" /></figure>
mobilization on the CAS and the TCP media did not significantly vary in time according to a one-factor (date of experiment) ANOVA (*P*=0.6454 for the diameters of the discolouration areas on the CAS medium, *P*=0.5698 for the diameters of the discolouration areas on the TCP medium, *P*=0.0876 for the efficacies on the CAS medium and *P*=0.2453 for the efficacies on the TCP medium). In consequence, whatever the date of the experiment, the mean values of the discolouration diameters and the mobilization efficacies for all the bacterial isolates that grew on the CAS and TCP media were compared in the same one-factor (isolate origin compartment) ANOVA.

In the case of the reference fungal isolate PML2(10), the mean values of the diameters of the discolouration areas and the efficacy of iron and phosphorus mobilization on the CAS and TCP media significantly varied along time according to a one-factor (date of experiment) ANOVA (*P*=0.0013 for the diameters of the discolouration areas on the CAS medium, *P*=0.0007 for the diameters of the discolouration areas on the TCP medium, *P*=0.0005 for the efficacies on the CAS medium and *P*=0.0001 for the efficacies on the TCP medium). The results of the experiments in which the reference strains significantly differed from standard values were discarded. In the remaining experiments, the tested isolates were compared together using a one-factor (compartment of origin of the isolates) ANOVA performed on the discolouration diameters and the mobilization efficacies.

*   Choice of the best variable for characterizing the Fe and P mobilizing potentials

    The CAS and TCP discolouration efficacies were significantly correlated to the mean values of the discolouration diameters (*P*<0.001) for the bacterial isolates (Figures III.5A, III.5B, III.5C and III.5D). Therefore, only the data corresponding to the mean values of the discolouration diameters were afterwards presented.

*   Effect of the origin compartment of the microbial isolates on phosphorus and iron mobilization

### Bacterial isolates

No matter the horizon from which they come, according to a $\chi^2$ test (*P*<0.001), the majority of bacterial isolates from the soil-mycorrhiza interface and the mycorrhizae was able to mobilize iron or phosphorus (Figures III.6A and III.6B) in the culture
Figure III.6: Distribution of the bacterial isolates according to their compartment of origin and the intensity of their discolouring effect on the CAS and/or TCP media, ie the intensity of iron and/or phosphorus mobilization. A and B: no shading, no mobilization; shading, lowest intensity; solid, highest intensity. C: no shading, no mobilization whatever the nutrient element; vertical shading, mobilization of iron only; horizontal shading, mobilization of phosphorus only; solid, mobilization of iron and phosphorus. The proportion of bacterial isolates in each of the three classes related to the intensity of iron and/or phosphorus mobilization was significantly different between the bulk soil and the two ectomycorrhizosphere compartments (soil-mycorrhiza interface and mycorrhiza) whatever the soil horizon, according to a χ2 test (P < 0.001).

<figure><img src="image_31.png" /></figure>