# Sur la composition en acides aminés libres et peptidiques du liquide séminal de carpe (Cyprinus carpio)

Yves Menezo, Marie-Gwénola Ploudy, Roland Billard

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Yves Menezo, Marie-Gwénola Ploudy, Roland Billard. Sur la composition en acides aminés libres et peptidiques du liquide séminal de carpe (Cyprinus carpio). Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série III, Sciences de la vie, 1983, 296, pp.67-70. hal-01600964

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Submitted on 2 Jun 2020

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PHYSIOLOGIE ANIMALE. — Sur la composition en acides aminés libres et peptidiques du liquide séminal de Carpe (Cyprinus carpio). Note (*) de Yves Menezo, Marie-Gwénola Ploudy et Roland Billard, présentée par Maurice Fontaine.

Les acides aminés libres et peptidiques ont été mesurés dans le plasma séminal de Carpe. Certaines d'entre eux comme l'acide glutamique plus glutamine, la taurine, la glycine et la proline sont exceptionnellement abondants, alors que d'autres comme la lysine, l'arginine et l'histidine n'apparaissent qu'en quantité extrêmement faible. Globalement, la teneur en acides aminés reste beaucoup plus élevée que dans le liquide séminal d'autres espèces de Vertébrés. Comme les teneurs observées dans le plasma séminal sont systématiquement plus élevées que dans le plasma sanguin, on suppose qu'il s'agit d'une néoformation d'un liquide original au niveau du tractus génital.

ANIMAL PHYSIOLOGY. — Free and Peptidic Amino-Acid Composition of the Carp (Cyprinus carpio) Seminal Plasma.

Free and peptidic amino acids were measured in the seminal plasma of carp. Some acids such as glutamic acid and glutamine, taurine, glycine and proline were exceptionally abundant, while others like lysine, arginine and histidine were found in small amounts. Generally, the amino acid level was higher in carp seminal plasma than in that of other Vertebrate species. As this level was systematically higher than in the blood plasma, it is supposed that there was neoformation of an original fluid in the genital tract.

La physiologie des spermatozoïdes de Poisson reste mal connue. On sait que les spermatozoïdes, immobiles dans le tractus génital mâle, sont mis en mouvement dans le milieu où ils sont émis et dilués. La durée de motilité est brève et n'excède pas quelques minutes mais peut être légèrement prolongée en procédant à une dilution dans un milieu de composition (pression osmotique et pH) appropriée [1] ou en augmentant la teneur endogène en AMP cyclique ([2]-[3]). Les mécanismes métaboliques mis en œuvre et les substrats énergétiques impliqués n'ont pas encore été clairement établis. L'établissement de la composition du liquide séminal constitue une première étape de la connaissance de la physiologie du sperme. Dans le présent travail, les teneurs en acides aminés sont mesurées chez la Carpe commune.

En captivité la production de sperme de cette espèce est faible et on pratique généralement une stimulation de la spermiation par une administration d'extraits hypophysaires (technique dite d'hypophysation) [4]. L'augmentation de la production de sperme qui en résulte est généralement brève (quelques jours) et pour obtenir un effet plus prolongé, de nouvelles injections hormonales sont nécessaires. Dans la présente étude, les teneurs en acides aminés du liquide séminal sont suivies après administration de deux traitements gonadotropes pratiqués à 19 jours d'intervalle.

MATÉRIEL ET MÉTHODES. — Les Carpes sont élevées dans la pisciculture du laboratoire de Jouy-en-Josas en eau recyclée et épurée [5] à une température variant entre 13 et 20°C, et sous photopériode naturelle, c'est-à-dire 16 L-8 N. Les expériences étant pratiquées en juin, les mâles sont alors à un stade avancé de la spermatogenèse avec une forte dominance des spermatozoïdes dans les lobules séminifères.

Les mâles et les femelles sont élevés dans des compartiments séparés mais reçoivent la même eau. L'alimentation est fournie sous forme de granulés (Poissons d'étang) au taux de 1,5 % du poids vif par jour et cesse la veille des prélèvements de sperme. Neuf mâles pesant entre 0,7 et 2,2 kg reçoivent une première injection de poudre hypophysaire de Carpe contenant 64 µg d'équivalent GTH (hormone gonatrope) ([10], [11]) par milligramme et administrée à la dose de 1,5 mg/kg. Un prélèvement de sperme est pratiqué par cathétérisation dans le spermiducte 24 h plus tard. 19 jours après le premier traitement, 6 de ces mâles reçoivent une injection similaire suivie d'un prélèvement de sperme le lendemain. Immédiatement après prélèvement le sperme dont le volume varie entre 2 et
TABLEAU

Teneur du plasma séminal de Carpe commune en acides aminés libres et peptidiques (nMoles/ml). Les acides aminés peptidiques sont mis en évidence après une hydrolyse de 24 h. Le sperme est recueilli 24 h après stimulation hormonale gonadotrope. Deux stimulations sont pratiquées à 19 jours d'intervalle. L'analyse porte sur un mélange de plasmas séminaux collectés sur 9 mâles dans le premier cas et sur 6 dans le second.

Free and peptidic amino acids in common Carp seminal plasma (nMoles/ml). The peptidic amino acids were measured after 24 hrs. hydrolysis. Sperm was collected 24 hrs. after gonadotropin stimulation. Two stimulations were carried out at 19 days interval. Analyses were made on a pool of seminal plasmas from 9 males in the first sampling and 6 in the second.

<table><thead><tr><th rowspan="2">Acidés aminés</th><th colspan="2">1<sup>re</sup> stimulation<br>(9 ♂)</th><th rowspan="2">(%)<br>augmentation<br>apr. hydrolyse</th><th rowspan="2">2<sup>me</sup> stimulation<br>(6 ♂)<br>sans hydrolyse</th></tr><tr><th>sans<br>hydrolyse</th><th>avec<br>hydrolyse</th></tr></thead><tbody><tr><td>Phosphosérine, taurine.</td><td>3 127</td><td>2 157</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Phosphoéthanolamine</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Urée</td><td>2 234</td><td>-</td><td>-</td><td>1 127</td></tr><tr><td>Méthionine sulfoxide.</td><td>+++ (1)</td><td>1 000</td><td>-</td><td>+++ (1)</td></tr><tr><td>Acide aspartique.</td><td>142</td><td>948</td><td>568</td><td>214</td></tr><tr><td>Hydroxyproline</td><td>258</td><td>-</td><td>-</td><td>131</td></tr><tr><td>Thréonine</td><td>623</td><td>1 788</td><td>187</td><td>829</td></tr><tr><td>Sérine</td><td>320</td><td>610</td><td>90,6</td><td>455</td></tr><tr><td>Ac. glutamique, glutamine.</td><td>7 110</td><td>14 369</td><td>102</td><td>7 507</td></tr><tr><td>Sarcosine</td><td>50</td><td>-</td><td>-</td><td>43</td></tr><tr><td>Proline</td><td>5 413</td><td>7 335</td><td>35,5</td><td>4 663</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>2 118</td><td>2 623</td><td>23,8</td><td>1 941</td></tr><tr><td>Alanine</td><td>822</td><td>1 929</td><td>135</td><td>1 402</td></tr><tr><td>Ac. α-aminobutyrique.</td><td>115</td><td>191</td><td>66</td><td>88</td></tr><tr><td>Valine</td><td>336</td><td>458</td><td>36,3</td><td>288</td></tr><tr><td>Cystine</td><td>27</td><td>-</td><td>-</td><td>33</td></tr><tr><td>Méthionine</td><td>17</td><td>1 429</td><td>8 306</td><td>0</td></tr><tr><td>Cystathionine</td><td>362</td><td>132</td><td>-</td><td>231</td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>173</td><td>251</td><td>45</td><td>153</td></tr><tr><td>Leucine</td><td>408</td><td>582</td><td>42</td><td>370</td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>355</td><td>515</td><td>45</td><td>268</td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>195</td><td>212</td><td>8,7</td><td>136</td></tr><tr><td>β-analine</td><td>90</td><td>58</td><td>-</td><td>40</td></tr><tr><td>Ac. β-aminoisobutyrique.</td><td>41</td><td>42</td><td>-</td><td>42</td></tr><tr><td>Ac. β-aminobutyrique.</td><td>148</td><td>174</td><td>17,5</td><td>190</td></tr><tr><td>Ornithine</td><td>21</td><td>75</td><td>257</td><td>16</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>93</td><td>391</td><td>320</td><td>142</td></tr><tr><td>Methylhistidine</td><td>27</td><td>-</td><td>-</td><td>12</td></tr><tr><td>Arginine</td><td>13</td><td>118</td><td>808</td><td>69</td></tr><tr><td>Histidine</td><td>276</td><td>309</td><td>12</td><td>230</td></tr><tr><td>Thryptophane</td><td>23</td><td>-</td><td>-</td><td>16</td></tr></tbody><tfoot><tr><td>TOTAL</td><td>24 937 (2)</td><td>36 696 (2)</td><td></td><td>20 636 (3)</td></tr></tfoot></table>

<footnote>(1) La détermination de la méthionine sulfoxide ne peut s'effectuer correctement qu'après hydrolyse. En effet, elle est éluée en même temps qu'un ou plusieurs peptides majeurs.</footnote>

<footnote>(2) Compte non tenu de la méthionine sulfoxide.</footnote>

<footnote>(3) Le total ne comprend pas le complexe phosphosérine, taurine, phosphoéthanolamine non dosé.</footnote>
7 ml par mâle est centrifugé 20 mn à 3600 g. Le surnageant est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions. Une aliquote de 100 µl est prélevée sur chacun des liquides séminaux et le mélange est congelé à -20°C pendant quelques semaines avant de réaliser les dosages.

L'analyse chromatographique est réalisée à l'aide d'un appareil « Kontron Liquimat III ». Les échantillons sont déprotéinisés par addition de 30 mg d'acide sulfosalicylique dans 1 ml de liquide séminal, une quantité connue de standard interne de coloration (Norvaline : 1000 nMoles) est ajoutée simultanément. Le précipité est éliminé par centrifugation 10 mn à 3500 g. Une partie du surnageant est diluée (V/V) par de l'acétate de lithium (0,2 N) en vue de réaliser une analyse directe. L'autre partie est utilisée pour la détermination des acides aminés peptidiques après hydrolyse pendant 24 h à 110°C, sous azote et en présence d'HCl 6 N. La durée d'hydrolyse limitée à 24 h est apparue suffisante pour libérer la totalité des acides aminés engagés dans les liaisons peptidiques car il s'agit de solutions déprotéinisées ayant des molécules peptidiques de tailles très faibles avec peu de liaisons CONH. Après évaporation, le résidu sec est repris par l'acétate de lithium 0,2 N pour analyse. L'analyse après hydrolyse n'a été pratiquée que sur la première série de prélèvement.

RÉSULTATS. — Le liquide séminal contient 1,5 % de matière sèche, dont 58 % de matières organiques; la teneur totale en acides aminés et petits peptides atteint 37 µMole/ml dont 86 % sont représentés par sept acides aminés principaux : l'acide glutamique, la proline, la glycine, les pics cumulés de phosphosérine + taurine + phosphoéthanolamine, l'alanine, la thréonine et la méthionine. La détermination de la méthionine sulfoxyde ne peut se faire qu'après hydrolyse, son pic d'élution étant contaminé par la présence de peptides. Les composés peptidiques peuvent constituer une forme de réserve pour des composés peu ou pas présents sous forme libre comme par exemple la méthionine. Il existe parmi les acides aminés libres ou peptidiques un fort déséquilibre en faveur des composés acides ou neutres. Quelques acides aminés sont très faiblement représentés comme l'arginine, la méthionine, l'ornithine, le tryptophane, la méthyhistidine, la cystine, l'acide amino-iso-butyrique et la sarcosine dont les teneurs sont inférieures à 50 nMole/ml.

La comparaison entre les résultats obtenus après la première et la deuxième stimulation fait apparaître des différences importantes qui voient du simple au double pour certains composés comme l'urée, l'acide aspartique, l'hydroxyproline, l'alanine, la β-alanine, la lysine, la methylhistidine et l'arginine. Par contre d'autres acides aminés restent remarquablement constants; par exemple l'acide glutanique + glutamine, la glycine, l'isoleucine, l'acide β-aminoisobutyrique et l'acide β-aminobutyrique. A la suite de la deuxième stimulation, la teneur totale en acides aminés apparaît plus faible d'environ 20 % qu'à la suite de la première stimulation (cas de dosages sans hydrolyse).

DISCUSSION. — La teneur totale en acides aminés libres et peptidiques du plasma séminal est élevée et atteint 37 µMole/ml. Ces teneurs sont systématiquement plus élevées que celles rencontrées dans le plasma sanguin de la Carpe immature [6]. Il y a donc néoformation d'un liquide original au niveau du tractus génital dans un site qui n'est pas encore défini, soit dans les lobules séminifères par les cellules de Sertoli, soit par l'épithelium du canal déférent, ou soit encore conjointement par ces deux structures. La composition du liquide séminal de Carpe est très différente de celle retrouvée chez la Truite où les teneurs les plus fortes n'excèdent pas 100 nMoles/ml [7] ce qui est plus faible que des valeurs du plasma sanguin ([7]-[8]).
Dans le présent travail, la teneur en acides aminés libres du plasma séminal a en outre été recherchée à la suite d'une seconde stimulation hormonale pratiquée 19 jours plus tard. Cela visait à suivre l'évolution de la qualité du plasma séminal dans le cas de stimulations répétées de la spermiation quelquefois pratiquées en pisciculture. Les résultats font apparaître une diminution de l'ordre de 20 % de la teneur totale en acides aminés.

Certains composés sont en augmentation, d'autre en diminution et d'autres enfin restent stables. Cependant ce travail préliminaire n'a porté que sur des mélanges de liquides séminaux et une étude individuelle reste à faire afin de connaître les variations inter et intra-individuelles pour des prélèvements successifs, et de pouvoir discuter plus en détail de la signification biologique de cette variation globale de la teneur en acides aminés entre deux stimulations

Le rôle de ce liquide séminal original rencontre chez la Carpe peut faire l'objet de quelques hypothèses. Les acides aminés peuvent apporter une protection aux spermatozoïdes et contribuer au développement de la pression osmotique élevée qui assure dans cette espèce l'immobilisation des spermatozoïdes. Les acides aminés qui sont dans le plasma séminal de Carpe, associés à des quantités importantes de sucres et divers dérivés métaboliques [7] peuvent, seuls ou conjointement avec ces derniers, constituer un substrat énergétique pour les spermatozoïdes dont la survie et la durée de mobilité sont, dans cette espece, bien supérieures a celles observees chez les Salmonidés

<footnote>(*) Remise le 20 septembre 1982, acceptée après révision le 22 novembre 1982.</footnote>

<footnote>[1] R. BILLARD, *Actes de colloque, CNEXO*, 8, 1978, p. 59-73.</footnote>

<footnote>[2] D. DENEAU et C. TERNER, *Gametes Research*, 3, 1980, p. 247-257.</footnote>

<footnote>[3] R. BILLARD, *Comptes rendus*, 291, série D, 1980, p. 649.</footnote>

<footnote>[4] M. P. CLEMENS et F. B. GRANT, *Copeia*, 1965, p. 174-177.</footnote>

<footnote>[5] J. PETIT, *Actes de Colloque, CNEXO*, 1, 1974, p. 445-470.</footnote>

<footnote>[6] S. M. PLAKAS, T. KATAYAMA, Y. IANAKA et O. DESHIMARU, *Aquaculture*, 21, 1980, p. 307-322.</footnote>

<footnote>[7] Y. MENEZO, données non publiées. J. I. BELLAFONTE, *Thèse Doctorat*, 1978, Fac. vét. Saragosse.
L. A. TIMOSHINA, A. A. SHABALINA et A. S. MELINICKOV, *Hydrob. J.*, 3, 1981, p. 66-72.</footnote>

<footnote>[8] P. M. MEHRLE, D. L. STALLING et R. A. BLOOMFIELD, *Comp. Biochem. Physiol.*, 38, 1971, p. 373-377.</footnote>

<footnote>[9] C. GILLET et P. ROUBAUD, données non publiées. M. MORISAWA et K. SUZUKI, *Sciences*, 210, 1980, p. 1145-1147.</footnote>

<footnote>[10] B. JALABERT, B. BRETON et R. BILLARD, *Ann. Biol. anim. Bioch. Biophys.*, 14, 1974, p. 214-228.</footnote>

<footnote>[11] L'entretien des animaux est du à MM. Lebrenn et Lévilain. Le dosage de l'activité biologique de la poudre hypopnysaire de Carpe (test de maturation *in vitro* d'ovocytes de Truite) est réalise par B. Jalabert.</footnote>