la capacité d'une rhizobactérie à promouvoir la croissance de la plante soit en réduisant
le contact entre la souche promotrice de croissance et les racines de la plante
(colonisation racinaire) soit en interférant avec les mécanismes impliqués dans l'effet
promoteur de croissance. Dans notre cas, il se pourrait que la souche co-inoculée,
perturbe l'activité de B. glathei PML1(4) et par conséquent inhibe sa capacité à produire
des composés altérants.

Nous avons montré que l'inoculation des plants de pin avec le champignon
ectomycorhizien *Laccaria bicolor* S238N n'augmente pas l'altération de la biotite mais
favorise le prélèvement des nutriments par les plants, contribuant ainsi à leur croissance.
Il est à présent clairement établi que l'amélioration du prélèvement liée aux
champignons ectomycorhiziens résulte principalement du développement d'un
important réseau de fins filaments mycéliens colonisant le sol, permettant ainsi à la
plante d'accéder à une plus grande quantité d'éléments en solution et de prospecter une
plus grande surface minérale (Lamhamedi et Fortin, 1991 ; Tinker et al., 1992). Si
certaines souches de champignons ectomycorhiziens ont été décrites comme de réels
agents d'altération (Paris et al., 1995), il est possible que d'autres souches et/ou d'autres
espèces de champignons mycorhiziens jouent uniquement un rôle dans le prélèvement
et le transfert des nutriments depuis le sol jusqu'aux cellules racinaires. Tel serait le cas
de la souche *L. bicolor* S238N.

Nous n'avons mis en évidence aucun effet positif de la souche bactérienne *P. fluorescens* BBc6R8 sur l'altération de la biotite et la croissance des plants du fait probablement de la disparition de cette souche bactérienne dans les colonnes après inoculation. Il pourrait être pertinent à l'avenir de mettre en place une nouvelle expérience associant le champignon *L. bicolor* S238N avec une souche bactérienne non seulement potentiellement altérante mais aussi adaptée à nos conditions expérimentales de manière à apprécier la mise en place éventuelle de relations de type complémentarité fonctionnelle entre le champignon et les bactéries : les bactéries altèreraient le minéral présent dans les colonnes alors que le champignon lui, prélèverait en retour, les nutriments ainsi libérés.

Nos expériences en colonnes ont également permis de quantifier le césium, aussi bien
dans la solution drainée que dans la biomasse végétale. Nous avons montré que, dans
nos conditions expérimentales, le césium mobilisé lors de l'altération de la biotite est
prélevé en moyenne à plus de 85% par la plante alors que le potassium l'est à moins de
40%. De même, ces expériences ont révélé un effet inhibiteur de l'uranium sur l'activité
<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>Figure IV.24 : Schéma de synthèse résumant les effets observés dans l'expérience en colonnes lors de l'ajout de composés toxiques comme l'uranium et le cadmium dans la solution nutritive. La largeur des flèches représente le niveau d'altération de la biotite, plus la largeur de la flèche est importante, plus l'altération a été forte. La même symbolique a été utilisée pour caractériser la croissance des parties racinaires et des parties aériennes des plants de pin, ainsi que la densité bactérienne dans le sol rhizosphérique (cercle).</figcaption></figure>
biologique et la croissance des plantes (Figure IV.24). Tous ces résultats seront discutés
dans une partie consacrée à la problématique Andra présentée dans le chapitre qui suit.
DISCUSSION GENERALE
DISCUSSION GENERALE

Notre travail visait à quantifier l'altération des phases minérales au sein de la rhizosphère d'arbres forestiers et à déterminer la part de chacun des partenaires biologiques de ce compartiment du sol dans ce processus et dans la dynamique de certains éléments minéraux nutritifs ou non. La rhizosphère est un environnement complexe, hétérogène, dynamique et interactif, qui dépasse la simple notion d'interface entre le sol et les plantes. Elle est le lieu d'interactions fortes entre le monde végétal, le monde microbien et le monde minéral. En conséquence, pour comprendre le fonctionnement de la rhizosphère, il est nécessaire non seulement d'intégrer les paramètres régissant le fonctionnement de la plante dans son ensemble, des microorganismes, de la phase minérale, de la solution et des gaz, mais également de considérer les nombreuses interactions et rétroactions existant entre toutes ces composantes du sol. C'est pourquoi l'intérêt majeur de mon travail et son originalité résident dans l'association de plusieurs approches méthodologiques complémentaires permettant d'apprécier l'importance de ces différentes interactions au sein de la rhizosphère d'arbres forestiers à différentes échelles de complexité. D'une part, j'ai mené des études et des expérimentations en forêt prenant en compte la multiplicité des fonctions et des partenaires dans la rhizosphère, la diversité des associations plante - microorganismes, ainsi que la complexité des interactions entre processus physiques, chimiques et biologiques qui se déroulent dans la rhizosphère. D'autre part, j'ai mis au point et utilisé des biotests in vitro (boîtes de Petri et microplaques) permettant de caractériser rapidement le potentiel d'altération des communautés microbiennes cultivables des sols forestiers. Enfin, j'ai élaboré des dispositifs de culture simplifiés de type colonnes permettant de découpler les effets de la plante, des bactéries et des champignons, et également de limiter et de contrôler les paramètres du milieu (plante, microorganismes, milieu et solution nutritifs, minéral, conditions de température, luminosité, humidité). Mon travail a permis d'apporter un certain nombre de résultats déjà discutés dans les précédents chapitres et dont je présente la synthèse ci-après, qui constituera la base de la discussion générale.
# 1. SYNTHESE DES RESULTATS

Les différentes études et expérimentations mises en œuvre durant cette thèse ont permis de mettre en évidence :

## ➤ En forêt :

* un impact de la rhizosphère d'arbres forestiers sur la dynamique du potassium dans un sol du site de Bure : le potassium s'accumule dans la rhizosphère des arbres,

* un effet stimulant de la rhizosphère d'arbres forestiers sur les processus d'altération, dissolution et transformation, des minéraux dans un sol du site de Breuil. Des estimations suggèrent que le flux d'altération des minéraux au sein de la rhizosphère contribuerait à près de la moitié du flux total d'altération dans l'horizon de surface (0-3 cm) de ce sol forestier, alors que ce compartiment représente moins de 10% du volume de sol,

* un comportement différent des essences forestières vis-à-vis du processus d'altération des minéraux : l'épicéa altère principalement par acidification de la rhizosphère alors que le chêne n'acidifie pas la rhizopshère,

* un effet stimulant de la rhizosphère d'arbres forestiers sur le niveau d'altération des minéraux qui est fonction de la biodisponibilité en nutriments des sols : dans les sols fertilisés du site de Fougères, l'effet stimulant de la rhizosphère n'est pas observé.

## ➤ In vitro :

* une bonne adaptation des biotests à la caractérisation de l'activité des souches bactériennes, mais des améliorations sont nécessaires pour caractériser les souches fongiques,

* une structuration fonctionnelle des communautés bactériennes dans les sols forestiers : les souches bactériennes à fort potentiel d'altération de la biotite colonisent principalement la mycorhizosphère du chêne et du hêtre,

* un effet de l'essence sur la structuration fonctionnelle des communautés bactériennes dans les sols forestiers : cette structuration n'est pas observée sous
épicéa qui, contrairement au chêne et au hêtre, exsude une grande quantité de composés acides,

* une relation entre le potentiel d'altération des isolats bactériens, leur genre et leur métabolisme : les isolats bactériens les plus efficaces dans l'altération des minéraux appartiennent aux genres *Burkholderia* et *Collimonas* et métabolisent le tréhalose.

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

En laboratoire

* un effet stimulant des souches bactériennes rhizosphériques *B. glathei* PML1(12) et *B. glathei* PMB4(3) et à un degré moindre des souches fongiques SN2(3) et PML2(10) sur l'altération de la biotite,

* un effet stimulant des plants de pin non inoculés sur l'altération des minéraux : les quantifications révèlent des augmentations du niveau d'altération comprises entre 30 et 100%,

* un effet promoteur de croissance (+ 50%) de la souche bactérienne rhizosphérique *B. glathei* PML1(12) sur les plants de pin, lié à une augmentation de l'altération de la biotite (+ 40%),

* un effet promoteur de croissance (+ 70%) du champignon ectomycorhizien *Laccaria bicolor* S238N sur les plants de pin lié à une augmentation du prélèvement de nutriments (+ 50%) sans stimulation du niveau d'altération de la biotite,

* une immobilisation très forte par les plants de pin du césium (85%) issu de l'altération de la biotite,

* un effet inhibiteur de l'uranium à une concentration de 59.5 mg.l⁻¹, sur l'altération de la biotite (- 70%), la croissance des plantes (- 60%) et les densités bactériennes (- 99%).

* un effet de la disponibilité en nutriments sur l'activité altérante de la souche bactérienne rhizosphérique *B. glathei* PML1(12) : cette souche, associée à un plant de pin, ne stimule l'altération de la biotite qu'en présence d'une solution nutritive pauvre en nutriments.
## 2. ROLE MAJEUR DE LA RHIZOPHERE D'ARBRES FORESTIERS DANS LE PROCESSUS D'ALTERATION DES MINERAUX DU SOL

Les tests in vitro ont clairement démontré la capacité d'une grande partie des bactéries et des champignons isolés dans la rhizosphère de différentes essences d'arbres à altérer un minéral-test. Toutes les expériences que nous avons réalisées en conditions contrôlées ayant pour but de simuler un écosystème forestier très simplifié, ont démontré l'effet stimulant, à des intensités différentes, du plant de pin, de plusieurs souches bactériennes et fongiques rhizosphériques, ainsi que des associations plant de pin - bactéries rhizosphériques sur l'altération de la phase minérale. Enfin, les expérimentations et les études réalisées en forêt ont clairement mis en évidence l'impact de la rhizosphère de plusieurs essences d'arbres sur l'altération des minéraux dans les sols forestiers et son implication dans l'évolution pédogenétique.

Considérés individuellement, les résultats obtenus dans ces différentes études et expérimentations n'auraient pas permis d'émettre une conclusion formelle, mais la convergence des observations effectuées à trois échelles et à trois niveaux de complexité différents amène à une conclusion unique: **l'activité biologique au sein de la rhizosphère représente un moteur de l'altération des minéraux et par conséquent de la mobilisation des éléments minéraux dans les sols.**

Ces résultats remettent notablement en cause le mode de calcul du flux d'altération des minéraux dans les écosystèmes forestiers proposé par l'ensemble des modèles géochimiques comme par exemple le modèle PROFILE (Sverdrup et Warfvinge, 1995) qui ne prend en considération que le sol global. En effet, ce modèle détermine le flux d'altération des minéraux dans un sol en fonction de ses propriétés minéralogiques, physico-chimiques et hydrologiques et de la composition des solutions à l'échelle de l'horizon entier, qui sont très différentes de celles de la rhizosphère principalement du fait de l'activité des racines et des microorganismes associés. Ceci implique une sous-estimation importante de ce flux total d'altération, facteur pourtant déterminant dans la nutrition des arbres et dans la durabilité de l'écosystème. Mais comment calculer plus précisément ce flux d'altération des minéraux dans les sols forestiers compte-tenu de la complexité et de la variabilité spatio-temporelle du sous-système rhizosphère ?
## 3. LES ARBRES INTERAGISSENT AVEC LEUR ENVIRONNEMENT : UNE QUESTION DE SURVIE

Au contraire des animaux qui peuvent se déplacer sur de grandes distances à la recherche de nourriture, les plantes n'ont accès qu'aux nutriments minéraux présents dans l'environnement proche de leurs racines. De plus, comme nous l'avons déjà précisé dans notre préambule, ces nutriments minéraux constitués principalement par la phase minérale des sols sont d'une part peu abondants dans la plupart des écosystèmes forestiers tempérés et d'autre part non directement assimilables par les racines dans leur grande majorité, puisque seuls les éléments sous forme soluble le sont. En conséquence, les arbres vont devoir modifier leur environnement afin d'optimiser l'exploitation des ressources nutritives. Ceci est possible car leur développement racinaire est remarquablement sensible aux variations d'approvisionnement et de distribution des nutriments minéraux dans le sol. Ainsi, dans le but d'acquérir les nutriments nécessaires à leur croissance, les arbres sont notamment capables de modifier la structure et l'architecture de leur système radiculaire (Robinson, 1994; Schöttelndreier et Falkengren-Grerup, 1999; Forde et Lorenzo, 2001; Hodge, 2004), de modifier la composition et la quantité des exsudats racinaires (Lynch, 1990; Neumann et Römheld, 1999; Neumann et Martinoia, 2002; Rengel et Marschner, 2005) et également de s'associer avec des microorganismes, notamment des champignons ectomycorhiziens qui comme nous l'avons décrit dans notre introduction, sont capables de contribuer de manière efficace au processus d'altération. Nos résultats suggèrent que **ces associations entre les racines et les microorganismes du sol résultent d'une sélection des souches microbiennes à fort potentiel d'altération et par conséquent, favorables à la nutrition de la plante.** Mais quel est le moteur de cette structuration des communautés dans les sols ?
4. LA SYMBIOSE ECTOMYCORHIZIENNE COMME MOTEUR DE LA STRUCTURATION DES COMMUNAUTES BACTERIENNES DANS LES SOLS FORESTIERS

Nous avons proposé l'hypothèse que la symbiose ectomycorhizienne exercerait
une pression de sélection sur les communautés bactériennes environnantes en
faveur des souches possédant un fort potentiel d'altération des minéraux. Cette
hypothèse implique l'envoi de signaux par la symbiose ectomycorhizienne aux
communautés microbiennes environnantes. Les résultats des tests in vitro ont clairement
montré que les isolats possédant un fort potentiel d'altération sont majoritairement
associés à S. citrinum et consomment notamment du tréhalose, un carbohydrate
accumulé dans le mycélium de S. citrinum. Ce sucre synthétisé par de nombreux
champignons mais très rarement produit par les plantes, a déjà été décrit comme moteur
de l'effet mycorhizosphérique de la symbiose Douglas - L. bicolor sur les communautés
de Pseudomonas en pépinière forestière (Frey et al., 1997). C'est pourquoi, nous
proposons l'hypothèse que le couple racines d'arbre - champignon ectomycorhizien
produirait des sucres spécifiques qui agiraient sur les communautés microbiennes
environnantes en sélectionnant des souches à fortes capacités de mobilisation des
éléments. De Boer et al. (2006) contestent l'idée d'une sélection exercée par les
exsudats racinaires car ils considèrent que la nature plutôt générale des exsudats
racinaires ne peut pas être à l'origine de réponses microbiennes hautement spécifiques.
Cependant, un grand nombre d'auteurs (Barbour et al., 1991 ; Grierson et al., 1992 ;
Zheng et al., 1996 ; De Weert et al., 2002 et Walker et al., 2003) estime que les acides
organiques et les amino-acides exsudés par les racines dans la rhizosphère sont dotés de
propriétés chimiotactiques pour les microorganismes. Ceci suggère qu'en modifiant la
composition des exsudats racinaires, la symbiose ectomycorhizienne pourrait influer sur
les microorganismes colonisant la rhizosphère. Reste à comprendre comment le
chimiotactisme de certains microorganismes vis-à-vis de ces exsudats particuliers peut-
être corrélé à une activité métabolique très ciblée, comme l'altération des minéraux du
sol ? Nous avons montré que dans le sol du peuplement d'épicéa, la structure des
communautés bactériennes potentiellement altérantes n'est pas affectée par la présence
de mycorhizes de S. citrinum. Si notre hypothèse d'effet sélectif de certains sucres et/ou
exsudats fongiques, tel le tréhalose, sur la diversité fonctionnelle des communautés
bactériennes est exacte, alors nous devons nous interroger sur les raisons de l'absence de structuration fonctionnelle des communautés bactériennes sous épicéa. La production des exsudats de champignons ectomycorhiziens serait-elle dépendante de l'essence hôte ? La question reste ouverte pour le moment car à notre connaissance aucun travail n'a encore jamais été réalisé en ce sens. Néanmoins, Dell et al. (1989) avaient pu montrer dans le cas d'une enzyme impliquée dans l'assimilation de l'ammonium, la glutamate déhydrogénase à NADP, que l'activité de cette enzyme chez le champignon ectomycorhizien *Hebeloma crustuliniforme* était différemment exprimée selon que le champignon était en symbiose avec l'épicéa ou le hêtre. Ce travail abonde dans le sens de notre hypothèse car il suggère que le métabolisme fongique varierait selon l'hôte végétal. Mais le métabolisme de la symbiose ectomycorhizienne n'est vraisemblablement pas le seul facteur à prendre en compte pour expliquer la structuration fonctionnelle des communautés bactériennes. Des facteurs physico-chimiques tels que la biodisponibilité en nutriments pourraient jouer un rôle également.

## 5. LA DISPONIBILITE EN ELEMENTS MINERAUX CONTROLERAIT L'ACTIVITE RHIZOSPHERIQUE DANS LES ECOSYSTEMES FORESTIERS

Les différentes études que nous avons réalisées, ont montré que le processus d'altération de la phase minérale variait considérablement en fonction du traitement considéré. Ainsi, nous avons montré que : (i) l'altération des minéraux-tests en forêt développée sur sol acide est stimulée dans la rhizosphère d'arbres uniquement en l'absence de fertilisation, (ii) la sélection des communautés bactériennes rhizosphériques à fortes capacités à altérer la biotite *in vitro* n'est effective que pour les essences (chêne et hêtre) produisant moins de composés acides altérants, (iii) l'effet positif de la souche bactérienne PML1(12) sur l'altération de la biotite n'est observée que dans les conditions de pauvreté en nutriments de la solution. L'ensemble de ces résultats suggère que l'activité rhizosphérique agissant sur le processus d'altération des minéraux serait contrôlée par la disponibilité en nutriments dans le sol. Ainsi, des coopérations positives entre les différents partenaires biologiques de la rhizosphère deviendraient actives dans des conditions de stress nutritionnel.
## 6. LA COMPLEMENTARITE FONCTIONNELLE ARBRE – MICROORGANISMES : UNE STRATEGIE NUTRITIONNELLE POUR LES ARBRES FORESTIERS

+

Les phénomènes de sélection des communautés bactériennes à fort potentiel d'altération ont été observés dans l'ectomycorhizosphère du champignon *Scleroderma citrinum*. Or ce champignon ectomycorhizien a démontré de faibles capacités à altérer des minéraux-test dans des expérimentations *in vitro*. C'est pourquoi, nous proposons l'hypothèse d'une complémentarité fonctionnelle entre ce champignon, peu altérant, et les souches bactériennes sélectionnées. En d'autres termes, en conditions de carences nutritives, la symbiose sélectionnerait des souches bactériennes à fort pouvoir d'altération pour compenser le faible pouvoir altérant du champignon. Par exemple, Frey-Klett *et al.*, 2005 a mis en évidence que le champignon ectomycorhizien *Laccaria bicolor*, caractérisé par un faible potentiel d'altération des minéraux dans une de nos expérimentations d'interactions en colonnes (chapitre IV), a un effet structurant sur la diversité fonctionnelle des souches bactériennes : les souches à fort potentiel d'altération se localisant principalement dans l'ectomycorhizosphère.

Cette complémentarité fonctionnelle entre différents partenaires de la rhizosphère en condition de stress, a déjà été observée plusieurs fois, notamment par l'équipe scientifique de Barea et Azcon (Barea *et al.*, 2005) qui ont mis en évidence l'effet bénéfique d'une association entre un champignon endomycorhizien (*Glomus*) et différentes espèces bactériennes du sol (*Bacillus*, *Brevibacillus*) sur la santé et la croissance de plantes soumises à des carences en phosphore (Vassilev *et al.*, 1996 ; Toro *et al.*, 1997 ; Medina *et al.*, 2003) et à des toxicités en cadmium et en zinc (Vivas *et al.*, 2003 ; Medina *et al.*, 2005 ; Vivas *et al.*, 2005 et Vivas *et al.*, 2006). D'autres effets synergiques d'association bactéries - champignons ont été mis en évidence par Jayasinghearachchi et Seneviratne (2006) qui ont montré que la co-inoculation de bactéries du sol et de champignons (*Penicillium*) augmentait l'altération d'une roche phosphatée.
# 7. PLASTICITE ET DURABILITE DE L'ECOSYSTEME FORESTIER : LA BIODIVERSITE MICROBIENNE COMME FACTEUR-CLE

L'hypothèse de l'existence de phénomènes de complémentarité fonctionnelle entre les différentes composantes biologiques de la rhizosphère, qui s'activeraient afin d'améliorer la nutrition de l'arbre en conditions de stress nutritionnel requérant le maintien d'une importante biodiversité dans l'écosystème, est nécessaire pour la durabilité tant du système sol - arbre que de l'écosystème forestier dans son ensemble (Holdgate, 1996 ; Van der Putten et al., 2004). En effet, plus la diversité microbienne dans un environnement est forte, plus le réservoir de fonctions potentiellement activables suivant les conditions du milieu est vaste. Une étude récente (De Ridder-Duine et al., 2005) a suggéré que la composition des communautés microbiennes de la rhizosphère est limitée par les populations microbiennes disponibles dans le pool général de microorganismes du sol global. En d'autres termes, les communautés microbiennes rhizosphériques seraient issues des communautés du sol global ayant répondu aux stimuli envoyés par la symbiose ectomycorhizienne et ayant supporté les conditions régnant au sein de la rhizosphère (rhizocompétence). Or, dans les sols forestiers, la diversité microbienne est très forte (Hackl et al., 2004), nettement supérieure à celle observée dans les sols agricoles ou fertilisés, ce qui laisse à penser que *via* les communautés microbiennes qu'ils abritent, **les écosystèmes forestiers** seraient dotés d'une grande plasticité vis-à-vis des contraintes environnementales et notamment nutritionnelles.

# 8. APPORTS DE CES ETUDES DANS LE CONTEXTE D'UN STOCKAGE A LONG TERME DE DECHETS RADIOACTIFS DANS DES SOLS FORESTIERS

Les études mises en oeuvre dans cette thèse ont apporté des résultats d'intérêt pour la qualification des sites de stockage profond dans le cadre de la considération de l'écosystème forestier. En effet, en ce qui concerne les études réalisées en forêt, nous avons observé une mobilisation et une accumulation de potassium dans la rhizosphère des arbres. Du fait de ses propriétés physico-chimiques voisines de celles du potassium, le césium pourrait donc avoir tendance, lui aussi, à s'accumuler dans la rhizosphère des
arbres forestiers. Cependant, une simple analogie de comportement physico-chimique entre le césium et le potassium ne permet pas d'apporter une réponse définitive concernant la dynamique du césium dans les sols forestiers. Notamment, l'expérimentation d'interactions arbre forestier – microorganismes – minéral – solution en colonnes, qui a permis de quantifier le césium, aussi bien dans la solution drainée que dans la biomasse végétale, met clairement en évidence que, dans nos conditions expérimentales, le césium mobilisé lors de l'altération de la biotite est prélevé en moyenne à 88% par la plante alors que le potassium ne l'est qu'à 37%. Ce qui suggère un prélèvement préférentiel du césium par la plante. Ce phénomène de prélèvement préférentiel d'éléments – traces a également été observé lors d'une expérimentation en colonnes faisant interagir une plante hyperaccumulatrice *L. emarginata*, des microorganismes résistants au nickel et un minéral-test riche en nickel, le chrysotile (présentée en annexe 9). Cette plante, qui a accéléré la dissolution du chrysotile, a prélevé plus de 90% du nickel mobilisé lors de l'altération du chrysotile soit près de 2% du nickel contenu dans le minéral.

Ces résultats améliorent les connaissances en ce qui concerne l'une des problématiques de recherche de l'Andra, à savoir la dynamique (mobilisation, prélèvement et accumulation) du césium dans les sols forestiers. A l'avenir, il apparaît indispensable de continuer l'analyse de la dynamique du césium dans l'écosystème forestier, en mesurant l'ensemble des flux intervenant dans le cycle biogéochimique de cet élément en forêt. Ce suivi nécessite une forte instrumentation de l'écosystème : des sites-ateliers comme ceux de Fougères et de Breuil sont tout à faits adaptés à ce type d'étude.

Les expériences en colonnes ont également permis de tester l'effet de composés toxiques sur l'activité biologique et la croissance des plantes. Les résultats sont sans équivoque, dans ce type d'environnement et à une telle concentration, l'uranium est nocif pour les plants de pin et pour les microorganismes : une inhibition non seulement de la croissance des organismes, mais également de leur activité est observée. Ces résultats suggèrent que, bien qu'il soit généralement considéré comme en équilibre en regard des perturbations qui caractérisent son environnement comme par exemple la présence d'agents pathogènes, l'écosystème forestier pourrait être très vulnérable aux perturbations induites par des agents qui lui sont étrangers. Toutefois, ces expérimentations sont très réductionnistes car la microflore présente, inoculée ou non, y est très simplifiée. On peut ainsi se demander si dans un sol forestier naturel, un arbre
mature ne pourrait pas mettre en œuvre un certain nombre de stratégies telles que l'association avec des communautés bactériennes ou fongiques détoxifiantes qui limiteraient l'impact de l'uranium. On sait déjà que de nombreux champignons ectomycorhiziens protègent leur hôte en limitant la toxicité en métaux lourds (Wilkins, 1991).

## 9. PERSPECTIVES

Au vu des résultats concernant la structuration fonctionnelle des communautés bactériennes dans les sols forestiers en relation avec l'altération des minéraux, de nombreuses hypothèses écologiques et mécanistes peuvent être émises mais elles restent encore à valider.

Dans un premier temps, il est indispensable de vérifier, à l'aide des tests *in vitro* en microplaques, l'existence d'une structuration des communautés microbiennes associées à d'autres symbioses ectomycorhiziennes, sur d'autres sites forestiers développés sur des sols possédant des niveaux de fertilité différents. Ces analyses sont obligatoires si l'on veut valider le caractère générique des conclusions proposées dans cette thèse.

Par la suite, il serait nécessaire de mettre en œuvre des expériences permettant de valider les hypothèses que nous avons formulées quant à la capacité de la symbiose ectomycorhizienne à modifier ses exsudats en conditions de carences nutritives et la sélection exercée par ces exsudats sur les communautés bactériennes à fort pouvoir d'altération. Pour cela, il serait nécessaire de mettre en place des dispositifs en forêt de type microbougies permettant de prélever les exsudats racinaires d'arbres forestiers développés sur des sols possédant des niveaux de fertilité différents. En parallèle, une caractérisation du potentiel d'altération des communautés microbiennes prélevées dans la rhizosphère et le sol global sur ces différents sites serait entreprise.

Par ailleurs, nos expérimentations en laboratoire étaient basées sur l'étude de souches bactériennes cultivables et, même si cette phase est un prérequis indispensable quand on étudie une fonction dont on ne connaît pas les déterminants génétiques, elle ne constitue qu'une étape. Ceci est d'autant plus vrai que les avancées technologiques nous permettent, de nos jours, d'avoir accès à des outils extrêmement performants dans le domaine de la microbiologie environnementale. A l'avenir, l'étude du rôle de
l'ensemble des communautés microbiennes rhizosphériques dans l'altération des minéraux nécessitera des approches polyphasiques impliquant notamment la construction de banques génomiques et métagénomiques (Lombard et al., 2006) qui serviront à lier la fonction d'altération aux gènes et aux microorganismes impliqués (Lemanceau et al., 2006). Une fois les microorganismes et les déterminants génétiques identifiés, des études de diversité fonctionnelle, des études d'expression et de localisation in situ des principaux gènes impliqués, devront être engagées afin de mieux comprendre les processus d'altération qui régissent la bodisponibilité (fertilité) et la toxicité des éléments dans les sols.

A l'heure actuelle, deux banques de mutants d'insertion ont été réalisées sur les souches modèles *Burkholderia glathei* PML1(4) et PML1(12). Le criblage de ces banques sur milieu gélosé TCP est en cours. Plusieurs mutants d'intérêt de la souche PML1(4) ont d'ores et déjà été obtenus et la caractérisation des gènes interrompus est en cours. L'identification de la fonction déterminée par ces gènes devrait permettre de mieux comprendre les processus d'altération bactériens. Parallèlement, une étude globale sur une niche jusque-là non étudiée : la minéralosphère (zone d'influence des minéraux) est en cours. Cette approche basée sur le métagénome des communautés microbiennes associées aux minéraux devrait permettre d'identifier (i) quels sont les microorganismes présents à la surface des minéraux et (ii) si la nature du minéral influe sur la diversité microbienne. Ce travail est un préambule à la recherche en masse de déterminants génétiques impliqués dans la fonction d'altération. L'ensemble des données accumulées par ces travaux devrait permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de l'altération et de développer des marqueurs pour étudier ce processus in situ.

En ce qui concerne les études et expérimentation visant à quantifier le niveau d'altération des minéraux en forêt, il paraît tout d'abord nécessaire de déterminer la contribution de la rhizosphère aux flux d'éléments issus de l'altération des minéraux dans des écosystèmes forestiers variés (climat, sol, essence). Ceci afin de donner un caractère plus générique à cette étude. Le croisement des approches, observation et expérimentation en forêt, semble une bonne voie. Cependant, ces méthodes doivent être affinées afin de mieux évaluer cette contribution.

Si nos hypothèses se confirment, les modèles utilisés actuellement pour évaluer le flux d'altération des minéraux dans les sols forestiers seraient absolètes ou tout du moins très approximatifs. Cela impliquerait la mise au point de modèles plus performants mais
singulièrement plus complexes, intégrant la plante et les microorganismes du sol. Ainsi, on pourrait imaginer faire intervenir dans les calculs du flux d'altération, l'essence d'arbres, les microorganismes associés et les interactions entre plantes et microorganismes. Ces différents paramètres biologiques seraient affectés d'un coefficient relatif à leur potentiel d'altération dans certaines conditions du milieu et obtenus grâce à des tests *in vitro*.

De nombreuses applications de ces recherches sont attendues pour les écosystèmes forestiers notamment dans quatre domaines : la nutrition des arbres développés sur sols pauvres, la gestion de la mobilité d'éléments toxiques ou radioactifs, la gestion des sols forestiers liée à l'introduction de nouvelles essences d'arbres, et l'évaluation biologique de la fertilité des sols.

## Nutrition en sol pauvre

L'inoculation de souches bactériennes à fort potentiel d'altération dans des sols très pauvres en nutriments pourrait être un moyen d'améliorer la nutrition des plantes. Nos résultats suggèrent même qu'il pourrait être bénéfique de réaliser des co-inoculations champignons ectomycorhiziens – bactéries rhizosphériques avec, par exemple une souche bactérienne possédant un fort potentiel d'altération et une espèce de champignon mycorhizien optimisant le prélèvement de nutriments en solution. Il est évident que ces méthodes biologiques de fertilisation des sols pourraient être plus durables et économiquement avantageuses comparés à des fertilisations chimiques. Néanmoins, il se pose le problème de la viabilité des associations champignon - bactéries réalisées, et de la sélection de souches performantes, adaptées à l'environnement dans lequel elles seront inoculées. En effet, l'expression de fonctions par un microorganisme peut être affectée par l'essence végétale et les propriétés biologiques et physico-chimiques du sol dans lequel elles sont introduites (Goddart et al., 2001 ; Tan et al., 2004). Dans le contexte forestier, cette application pourrait toutefois s'avérer coûteuse.

## Gestion de la mobilité d'éléments anthropiques

Dans le même ordre d'idée, il serait envisageable de planter, sur des sols pollués, des espèces végétales hyperaccumulatrices et/ou de gérer la densité des arbres afin de limiter le drainage de certains éléments. De plus si l'objectif est de mobiliser les
éléments présents dans les minéraux et de les stocker dans les végétaux, ces plantes pourraient être inoculées avec des souches bactériennes possédant de forts potentiels d'altération des minéraux. Les souches stimuleraient ainsi la mise en solution des polluants qui seraient par la suite prélevés abondamment par la plante. Toutefois, il est primordial de s'assurer qu'il n'existe pas de découplage dans le temps ou dans l'espace de l'activité mobilisatrice des microorganismes et de l'activité de prélèvement des racines. D'une manière plus générale, les connaissances acquises sur le fonctionnement des essences (ORE Breuil-Chenue) sont un bon point de départ pour choisir des essences les plus adaptées, cependant la connaissance du cycle de ces éléments dans les écosystèmes forestiers apporterait un complément indispensable.

## Gestion durable des sols par l'introduction de nouvelles essences

Cette étude ainsi que tous les travaux entrepris sur l'effet de la substitution d'essences dans le site ORE de la forêt de Breuil-Chenue permettent de mieux comprendre l'impact de l'introduction de nouvelles essences sur un sol, notamment les effets sur les cycles du carbone et de l'azote et les interactions avec les cycles des autres nutriments et les communautés biologiques (thèses de Jérome Jaffrain et de Louis Mareschal ; contrats de recherche Biodiversité, ORE, ACI, MICROGER,...). Il apparaît que le fonctionnement de l'écosystème est sous forte dépendance de l'essence. Par exemple, pour acquérir les nutriments, les essences semblent adopter des stratégies très diverses (production d'acides organiques *via* la racine ou la litière, de protons localement dans la rhizosphère ou massivement via le cycle de l'azote, sélection de communautés microbiennes,...). Les bilans de dissolution minérale, de perte par drainage, d'immobilisation dans la biomasse,... pour les différents éléments sont propres à chaque essence. En fonction, de la fertilité « géochimique » des sols et des contraintes environnementales, il devrait être possible de recommander une essence et des aménagements sylvicoles.

## Microorganismes comme indicateur de fertilité des sols

Une autre application envisageable serait l'utilisation des microorganismes, notamment les bactéries, comme indicateur « biologique » de la fertilité des sols. Cette application nécessite toutefois la connaissance des gènes impliqués dans l'altération et l'existence d'une corrélation entre le géotype et la fonction. Les travaux visant à répondre à ces
questions sont en cours de réalisation dans notre laboratoire et devrait nous donner des indications dans les mois à venir.
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ANNEXES
# Altération microbienne des minéraux

Au croisement de plusieurs disciplines, la géomicrobiologie est une science jeune, mais essentielle pour l'environnement tant sur le plan de la recherche fondamentale, que sur un plan économique et social. Elle devrait constituer à l'avenir un outil solide en matière de gestion des sols et de qualité de l'eau.

Stéphane Uroz*, Christophe Calvaruso**, Marie-Pierre Turpault**, Pascale Frey-Klett*

L'étude des interactions entre les micro-organismes et les minéraux, ou géomicrobiologie, est une science récente, issue du dialogue entre les chercheurs de différents domaines, tels la microbiologie, l'éologie, la géologie, la géochimie, la minéralogie et l'hydrobiologie. Cette discipline résulte de la découverte récente de micro-organismes capables non seulement de coloniser les environnements les plus extrêmes, jusque-là considérés comme inaccessibles, mais aussi d'agir sur les cycles des éléments notamment en altérant les minéraux à la surface de la Terre. L'altération microbienne des minéraux joue un rôle essentiel dans l'environnement car elle participe à la libération des éléments nutritifs clés contenus dans ces minéraux, tels que le calcium, le magnésium, le potassium, le phosphore et le fer, indispensables à la vie de ces micro-organismes, mais aussi à celle des plantes et des animaux. C'est pourquoi comprendre les interactions micro-organismes/minéral, tout comme les mécanismes moléculaires impliqués dans l'altération biologique des minéraux, s'avère essentiel, aussi bien d'un point de vue fondamental, que pour la gestion économique et sociale de notre environnement. En effet, les connaissances acquises en géomicrobiologie devraient permettre de relever des challenges tels que la gestion durable de la fertilité des sols, la réhabilitation des sols industriels et urbains, le stockage des gaz, des déchets miniers et radioactifs dans les sols, ainsi que la gestion de la qualité de l'eau. L'accès à la séquence génomique de certains des micro-organismes impliqués dans les cycles des éléments minéraux (nutriments ou éléments toxiques) constitue un outil de choix pour cette recherche des mécanismes de l'altération microbienne des minéraux.

## Pourquoi s'intéresser à l'altération des minéraux ?

Les roches, notamment magmatiques et métamorphiques, ont été formées dans des conditions de hautes températures et de hautes pressions. Leur exposition aux conditions de surface, à l'eau de pluie, aux variations thermiques ainsi qu'à l'oxygène induit des réactions d'altération qui conduisent à la dissolution et à la cristallisation de nouveaux minéraux. Cette altération joue un rôle fondamental, car elle est à l'origine de la disponibilité des éléments minéraux bénéfiques ou toxiques pour les organismes vivants dans les milieux aquatiques ou terrestres. De plus, depuis des temps géologiques reculés, les minéraux de la Terre subissent un fractionnement important, d'origine géochimique et biologique, conduisant notamment à la formation des sédiments et des sols tels que nous les connaissons aujourd'hui. L'altération minérale et son impact considérable sur l'Homme et son environnement, n'est plus à démontrer, car elle influe sur l'évolution de nos paysages, la fertilité des sols ou encore sur la qualité de l'eau. Ce phénomène est aussi susceptible d'affecter notre intégrité physique ainsi que notre patrimoine architectural et artistique. En effet, les micro-organismes qui colonisent la surface de nos dents *1 sont capables d'altérer la structure de l'émail causant des dégâts parfois importants. Par ailleurs, les statues, les monuments et façades des bâtiments en pierre par exemple, sont eux aussi soumis à une forte altération d'origine microbienne (figure 1). Cependant, l'altération biologique des minéraux ne cause pas que des désagréments : elle a

<footnote>* Inra, Unité Mixte de Recherche</footnote>

<footnote>« Interactions Arbres/Micro-organismes »,</footnote>

<footnote n="54280">54280 Champenoux ;
uroz@nancy.inra.fr</footnote>

<footnote>** Inra, Unité de Recherche</footnote>

<footnote>« Biogeochimie des Éco-systemes
Forestiers », 54280 Champenoux</footnote>

<footnote>*1 Nos dents ainsi que nos os sont des minéraux d'origine biologique, composés d'hydroxyapatite.</footnote>
aussi des applications industrielles. Certains micro-organismes sont notamment utilisés pour extraire des métaux ou des éléments toxiques présents dans des minerais pauvres ou des déchets miniers, comme dans le cas de la neutralisation des sulfures issus de la mine désafectée de Matsuo au Japon. Ce processus est appelé bio-lixiviation. En conséquence, comprendre les mécanismes de l'altération nous permettra de mieux comprendre et gérer notre environnement, de trouver des moyens pour protéger notre patrimoine.

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

© DR

<caption>**Figure 1** Altération des minéraux : action des micro-organismes</caption>

Ces différents supports minéraux ont subi (partie droite) ou non (partie gauche) l'action du biologique. **A** et **B**) Observation au microscope électronique à balayage de cristaux d'apatite ayant séjourné ou non, quatre années dans la rhizosphère de hêtres de 80 ans (© Turpault, Inra). **C)** Statue détériorée ou non par l'action du biologique (d'après *International Biodeterioration & Bio-degradation* 46 Th. Warscheida, J. Braamsb, *Biodeterioration of stone: a review* (2000) 343-368, © Elsevier) ; et **D)** dent saine ou cariée (© M.B. Ecole-plus.com).

## Des organismes et des environnements variés

Une grande diversité d'organismes est capable de coloniser et d'altérer des surfaces minérales de nature variée et dans différents environnements, allant de la cavité buccale à la surface des roches et au sol.

La cavité buccale est un exemple méconnu d'écosystème dans lequel l'altération minérale a son importance. Elle peut être considérée comme un environnement extrême du fait de la forte acidité qui la caractérise. Les dents constituent un support stable sur lequel les bactéries vont pouvoir se fixer et se multiplier. Elles sont susceptibles d'y former des biofilms, véritables matrices complexes formées de polysaccharides dans lesquels cohabitent diverses bactéries et champignons. Ces bactéries utilisent les sucres que nous consommons et produisent en retour des acides tels que l'acide lactique. Leur action conduit d'une part à la formation de la plaque dentaire (micro-environnement favorable à la survie des micro-organismes) et d'autre part à une décalcification localisée de la dent : la carie (figure 1). Les souches bactériennes fréquemment impliquées dans ce processus appartient aux genres *Streptococcus* et *Lactobacillus* (1).

Les lichens sont aussi capables de coloniser et d'altérer pendant des décennies la même surface minérale d'un rocher ou d'un monument. Ils sont classiquement décrits comme une symbiose entre un champignon et une algue photosynthétique. Le fonctionnement de cette symbiose implique des échanges de matières favorables aux deux partenaires. Les sucres produits par l'algue durant la photosynthèse alimentent le champignon en carbone. En retour, parallèlement aux processus d'altération physique comme la succession de phases de gel-dégel ou l'action répétée des gouttes de pluie, les hyphes du champignon, qui explore l'environnement proche du lichen et pénètrent dans les fissures des roches, produisent des molécules organiques comme l'acide oxalique et libèrent ainsi les éléments minéraux nécessaires à la croissance du lichen. Les observations au microscope électronique à transmission montrent une interaction fine de contact du lichen avec la surface minérale, *via* une sorte de ciment naturel contenant des polysaccharides, des argiles et des oxydes de différents éléments chimiques en phase d'être assimilés. Dans les zones inaccessibles, car de porosité trop faible, le lichen est également capable de mobилиer les éléments minéraux à distance *via* l'action d'acides organiques excrétés (2).

Le sol, et tout particulièrement l'environnement proche de la racine des plantes, appelé rhizosphère ou mycorhizosphère *,2*, sont tous deux conditionnés par l'altération microbienne des minéraux. Tandis que certains micro-organismes telluriques vivent dans la solution du sol, d'autres colonisent la surface des minéraux (figure 2), dont ils peuvent affecter la structure. Par ailleurs, grâce aux sucres, acides organiques et acides aminés qu'elle produit au niveau de ses racines, la plante sélectionne et maintient une communauté microbienne rhizosphérique mixte, fongique et bactérienne, très active qui se multiplie, explore le sol environnant et mobilise des éléments nutritifs tels que le fer, le calcium, le potassium et le phosphore, à partir des minéraux du sol. Il apparaît qu'un minéral s'altère visiblement plus lorsqu'il est situé dans une rhizosphère que lorsqu'il est localisé dans un sol dépourvu de racines (figure 1). Cette altération ne peut néanmoins être imputée uniquement aux micro-

<footnote>(1) Loesche WJ (1986)
*Microbiol Rev* 50(4) 353-80</footnote>

<footnote>(2) Banfield JF et al. (1999)
*Proc Natl Acad Sci USA* 96(7)
3404-11</footnote>

<footnote>*2 Selon que la racine est ou non associée à un champignon symbiotique mycorhizien.</footnote>
organismes qui colonisent cette niche. En effet, la plante joue aussi un rôle prépondérant dans l'altération biologique des minéraux dans la rhizosphère : la production de métabolites tels que les acides organiques ou les protons au niveau des racines, agit directement sur la cinétique d'altération des minéraux. Mais l'impact des bactéries n'est cependant pas négligeable. Il a été récemment montré que l'inoculation d'une souche bactérienne sélectionnée permet de multiplier par un facteur 1,4 à 1,5 l'altération d'un minéral de référence, la biotite, en comparaison avec l'effet d'une plante non inoculée (3).

## Une clé de la durabilité de nos écosystèmes forestiers ?

Comment expliquer que nos forêts poussent ? Question qui peut paraître étonnante en apparence, mais à laquelle la réponse n'est pas si simple. En effet, parmi les environnements terrestres, l'écosystème forestier est l'un de ceux qui ne subit généralement pas de fertilisation de la part de l'Homme, contrairement, par exemple, aux terres agricoles. D'où viennent les nutriments nécessaires à la croissance durable des écosystèmes forestiers ? Mis à part les apports liés aux pluies et aux retombées atmosphériques ainsi que le recyclage de la matière organique *via* la chute des feuilles et les racines mortes, les minéraux des sols constituent le seul réservoir en nutriments disponibles pour le fonctionnement de ces écosystèmes (figure 3). Mais comment s'opère cette altération minérale ? Il est important de rappeler ici que les forêts sont principalement situées sur des sols pauvres et souvent acides (4). Cette acidité a pour conséquence majeure pour les plantes de générer dans le sol de fortes concentrations en ions tels que les ions Al3+ et H+ qui inhibent la croissance racinaire. Dans les écosystèmes forestiers, les arbres se sont associés à des micro-organismes rhizosphériques (bactéries et champignons symbiotiques) avec lesquels ils coopèrent pour libérer les nutriments nécessaires à leur croissance (5, 6). Par exemple, il a été récemment montré que dans la rhizosphère de plants de chênes de 30 ans, et plus particulièrement au niveau des mycorhizes d'un champignon symbiotique ubiquiste dans nos forêts, *Scleroderma citrinum*, les proportions de bactéries capables de mobiliser le fer ou le phosphore à partir de réserves inorganiques, ainsi qu'à altérer un minéral de référence, la biotite, étaient significativement plus importantes au niveau de la mycorhize que dans le sol nu.

## Que sait-on de l'impact des micro-organismes ?

Les micro-organismes, et tout particulièrement les bactéries, sont remarquables dans leur diversité, qu'elle soit phylogénétique ou métabolique, et pour leur faculté à s'adapter et à coloniser les environnements les plus extrêmes que ne tolèrent pas les champignons. Comme décrit précédemment, les bactéries et les champignons sont capables de former des structures en biofilm que ce soit sur la surface des minéraux du sol, sur nos dents, sur des statues ou pierres de construction. Cette association permet aux micro-organismes de créer des microenvironnements plus favorables à leur survie, dans lesquels ils sont protégés contre les agressions extérieures.

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Figure 2 Colonisation microbienne de la surface des minéraux</figcaption></figure>

Particules de biotite (phylosilicate, K($Fe_2Mg_3AlSi_3O_{10}(F.OH)_2$) observées au microscope à transmission en lumière polarisée (A) et en épifluorescence (B). Les bactéries (de l'ordre du µM) apparaissent comme de petits bâtonnets colorés en rouge ou en vert. Cette coloration est due à l'utilisation d'un colorant (LIVE DEAD®) qui se fixe sur les acides nucléiques, colorant ainsi les cellules bactériennes. Les bactéries intactes sont colorées en vert, tandis que celles qui présentent une membrane endommagée apparaissent en rouge. Les bactéries colonisent souvent les arrêtes (symbolisée par une flèche blanche) des particules de biotite (C). Une diversité morphologique des bactéries présentes sur cette particule minérale est observée (D).

Dans ces environnements particuliers, les bactéries prélèvent les nutriments et l'énergie nécessaires à leur croissance à partir de la matrice minérale, *via* notamment de nombreuses réactions d'oxydation (perte d'électron) et de réduction (gain d'électron) ou par la production de molécules chélatrices (molécules présentant la capacité de fixer les ions).

Contrairement aux eucaryotes supérieurs qui misent sur l'oxygène pour leur respiration, de nombreuses bactéries excellent dans l'utilisation d'autres accepteurs d'électrons terminaux pour subvenir aux besoins énergétiques de leur métabolisme. Ces bactéries se rencontrent souvent dans des environnements particuliers dépourvus d'oxygène, dans l'eau, dans les sols engorgés ou sur la face inférieure des biofilms qu'elles créent à la surface de minéraux ou dans les canalisations. Parmi ces bactéries, des souches appartenant aux espèces *Gallionella ferruginea*, *Geobacter sulfurreducens*, *Leptothrix sp.*, *Shewanella oneidensis* ou *Thiobacillus ferrooxidans*, ont été caractérisées pour leur capacité à oxyder ou à réduire des éléments chimiques simples comme le fer, le chrome, le manganèse, le mercure, l'arsenic, le sélénium ou l'uranium. On parle de corrosion ou de biocorrosion pour qualifier l'impact des bactéries sur ces composés métalloïdes simples. Les réactions chimiques impliquées sont relativement bien connues et associent réactions géochimiques et dégradation de la matière organique. Dans le cas de minéraux plus complexes contenant ces éléments chimiques, comme les silicates par exemple, les réactions chimiques induites par les bactéries conduisent à des modifications de structure des minéraux par dissolution ou transformation. D'un point de vue chimique, ces processus requièrent des couples rédox (couple d'éléments chimiques comprenant un oxydant et réducteur) ayant des potentiels assez élevés pour produire la quantité d'énergie nécessaire au bon fonctionnement et à l'intégrité des cellules bactériennes impliquées. Notons que le fonctionnement de nos cellules est basé sur le même processus fondamental : capter de l'éner-

© UROZ INRA

<footnote>(3) Calvaruso C *et al.* (2006) *Appl Environ Microbiol* 72(2) 1258-66</footnote>

<footnote>(4) Badeau V *et al.* (1999) *Étude et Gestion des Sols* 6(3) 165-80</footnote>

<footnote>(5) Paris F *et al.* (1995) *Plant and Soil* 177, 191-201</footnote>

<footnote>(6) Frey-Kleitt P *et al.* (2005) *New Phytol* 165(1) 317-28</footnote>
gie en couplant des donneurs d'électrons à des accepteurs d'électrons. Chez les bactéries, le flux électrochimique résultant de ce couplage produit de l'énergie utilisée par exemple pour le transport d'éléments en solution, la rotation des flagelles et la synthèse de composés chimiques riches en énergie connus, comme l'adénosine triphosphate (ATP).

Par ailleurs, dans les environnements aérobies ou microaérobies, il a été montré que les micro-organismes, qu'il s'agisse cette fois-ci de bactéries ou de champignons, produisent des molécules (des protons, des acides organiques et/ou des sidérophores) qui peuvent participer à l'altération des minéraux selon deux grands procédés : la complexation des éléments et l'acidification du milieu. C'est le cas notamment du champignon ectomycorhizien *Pisolithus tintorius*, capable par exemple d'altérer un minéral de référence, la phlogopite, par une complexation des ions aluminium associée à une dissolution acide du réseau cristallin. Cette altération se traduit lors de l'observation aux rayons X par une augmentation de l'espace entre les feuillets de la phlogopite (5). Le même type d'observation a aussi été réalisé pour un autre champignon ectomycorhizien, *Laccaria laccata*, (7, 8) ainsi qui'avec des bactéries appartenant au genre *Acidithiobacillus*, *Agrobacterium* ou *Bacillus*. À l'inverse, il a été observé que des microorganismes pouvaient perturber la dissolution d'un minéral. Des études récentes ont en effet mis en évidence *in vitro* que les souches de *Shewanella oneidensis* ou de *Ramlibacter tataouinensis* inhibaient respectivement la dissolution de la calcite et du pyroxène, mais les mécanismes demeurent pour le moment méconnus (9, 10).

Parmi les acides les plus souvent cités comme étant impliqués dans les processus d'altération des minéraux silicatés, on trouve l'acide oxalique et l'acide acétique, mais aussi d'autres acides comme les acides formique, propionique, lactique, pyruvique, citrique, succinique ou sulfurique. Ces molécules sont capables d'acidifier le milieu, de casser les liaisons oxygène et de complexer les ions en solution. Cette dernière capacité est aussi décrite pour les sidérophores. Ces molécules très affines du fer sont excrétées par les micro-organismes en condition de carence en fer : elles complexent et transportent le fer jusque dans la cellule. Par ailleurs, l'enveloppe exopolysaccharidique des bactéries, du fait de sa charge électrique, est aussi capable de complexer des ions et pourrait ainsi contribuer au processus d'altération (11). L'action des acides organiques et des molécules complexantes sur l'altération des minéraux est donc double : ces molécules peuvent se fixer sur les surfaces minérales et littéralement en arracher des éléments, et elles peuvent complexer les éléments en solution, accélérant ainsi indirectement le taux de dissolution des minéraux. À l'heure actuelle, les molécules produites par les micro-organismes et impliquées dans l'altération sont loin d'être toutes identifiées.

La génomique et les géosciences :
un atout précieux

L'identification de plusieurs souches bactériennes aux
propriétés altérantes a permis de faire de grandes avan-
cées dans la compréhension des processus microbiens
impliqués dans l'altération des minéraux, par la mise
en évidence du rôle non seulement des réactions

d'oxydo-réduction, mais aussi de certaines molécules
acides, des sidérophores ou des exopolysaccharides de
l'enveloppe bactérienne.

Cependant la génétique de ces souches bactériennes est encore peu développée en comparaison à d'autres. Ceci s'explique par le fait que, si l'on considère les bactéries capables d'oxyder le fer (Fe²⁺) par exemple, la plupart n'ont été découvertes et caractérisées que dans les dix dernières années. L'accession récente au génome de bactéries telles que *Acidithiobacillus ferroxidans*, *Desulfovibrio vulgaris*, *Geobacter sulfurreducens* ou encore *Shewanella oneidensis*, permet aujourd'hui de mieux comprendre le potentiel métabolique de ces souches, et ouvre de nouvelles perspectives d'utilisation de leurs propriétés par l'Homme, en particulier pour l'extraction de minerais rares ou la gestion durable de l'environnement. En effet, les séquençages menés par *The Institute for Genomic Research* *3 ont révélé des tailles de génome relativement réduites, comprises entre 2,9 Mpb pour *A. ferroxidans* et 4,9 Mpb pour *S. oneidensis*, et ont permis de générer un véritable catalogue de gènes candidats susceptibles de coder pour des métabolismes propres à ces bactéries, par exemple la capacité à oxyder le fer. L'examen rapide du génome d'une souche de *G. sulfurreducens* a mis en évidence des capacités métaboliques jamais encore décrites : cette souche possède de nombreux systèmes senseurs permettant d'apprécier la tension en oxygène, l'état redox ou encore les niveaux d'énergie (12). Plus précisément, les génomes de *G. sulfurreducens* et *D. vulgaris* présentent de nombreuses séquences d'enzymes du type hydrogénase (enzyme catalysant la réduction des protons en hydrogène gazeux) et des protéines du type cytochrome c (protéines impliquées dans le transport des électrons).

Plin si l'ensemble de ces données de génomique vient com-
pléter les informations déjà acquises par des techniques
de génétiques plus conventionnelles mais complémen-
taires *,4*, notamment sur la souche d'A. ferroxidans. Ces
approches plus conventionnelles ont par exemple per-
mis de proposer récemment un autre rôle pour certains
métabolites secondaires produits par des bactéries du
gène Pseudomonas : substances humiques, quinones,
phenazines et riboflavine. La mutation du gène phzb *5*
rend par exemple la souche bactérienne PCL1391 de
Pseudomonas chlororaphis incapable de dissoudre des
oxydes de fer et de manganèse (13). Dans des conditions
particulières d'oxygénation du milieu ces différentes
molécules pourraient jouer un rôle dans la réduction
d'éléments tels que le fer ou le maganèse et donc contri-
buer au processus d'altération des minéraux contenant
des éléments sensibles à l'oxydo-réduction (14).

En conditions aérobies en revanche, très peu de gènes impliqués dans le processus d'altération des minéraux sont connus. Seuls des gènes participant à la synthèse de l'acide gluconique ont été identifiés dans des souches de *Pseudomonas*, d'Erwinia ou de *Rhanella*. La mutation de ces gènes conduit à une absence de production d'acide par la bactérie et s'accompagne clairement d'une incapacité à solubiliser des cristaux de phosphate de calcium (15). Cependant la même démonstration n'a pas été réalisée avec des minéraux complexes tels que les silicates. De la même manière, les gènes impliqués dans la synthèse des sidérophores semblent être de bons candidats, mais l'effet d'aucun de ces gènes n'a été testé sur des minéraux jusqu'à présent.

<figure><img src="image_79.png" /></figure>

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

<footnote>*3 TIGR :</footnote>

<footnote>www.tigr.org/tdb/mbd/
mbdcomplete.html</footnote>

<footnote>*4 Constructions de banques d'ADN génomique, clonage et criblage pour une fonction précise.</footnote>

<footnote>*5 phzb : gène impliqué dans la synthèse de la phénazine-1-carboxamide</footnote>

<footnote>(7) Leyval C, Berthelin J
(1991) Soil Sci Soc Am J 55, 4, 1009-16</footnote>

<footnote>(8) Styriakova I et al. (2004)
Can J Microbiol 50(3) 213-9</footnote>

<footnote>(9) Luttge A; Conrad PG
(2004) Appl Environ Microbiol
70(3) 1627-32</footnote>

<footnote>(10) Benzerara K et al. (2004)
Geomicrobiol J 21, 341-9</footnote>

<footnote>(11) Banfield JF, Nealson KH
(1997) Reviews in Mineralogy
35</footnote>

<footnote>(12) Methè BA et al. (2003)
Science 302(5652) 1967-9</footnote>

<footnote>(13) Hernandez ME et al.
(2004) Appl Environ Microbiol
70(2) 921-8</footnote>

<footnote>(14) Stams AJ et al. EM
(2006) Environ Microbiol Mar
8(3)</footnote>

<footnote>371-82</footnote>

<footnote>(15) Babu-Khan S et al.
(1995) Appl Environ Microbiol
(1995) Mar 61(3) 972-8</footnote>
<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>**Figure 3** Implication des micro-organismes dans le cycle des nutriments et la croissance des arêtes en forêt</figcaption></figure>

Ce cycle s'organise autour de cinq grandes composantes : prélèvements, recyclage, apports atmosphériques, exportation du bois et drainage. Deux d'entre elles (prélèvements et recyclage) sont fortement influencées par les micro-organismes du sol, qui colonisent différentes niches. On parle de minéralosphère pour qualifier l'environnement proche d'une particule minérale, de même de mycorhizosphère et de rhizosphère pour le volume de sol soumis à l'influence des racines mycorhizées ou non. Une racine est mycorhizée lorsqu'elle est associée à un champignon symbiotique du sol appelé champignon mycorhizien. Les arbres des forêts boréales et tempérées sont principalement associés à des champignons symbiotiques appelés ectomycorhiziens, du fait de la structure des organes symbiotiques qu'ils forment sur les racines courtes de leur hôte. Le complexe ectomycorhizien qui en résulte comprend non seulement des tissus racinaires et des cellules de champignon symbiotique, mais aussi des bactéries et des champignons non symbiotiques qui cohabitent dans cette niche. L'enjeu actuel est de déterminer la contribution des différentes composantes de cette microflore aux processus d dégradation de la matière organique et d'altération minérale.

Beaucoup d'efforts et d'investissement en termes de recherche sont donc encore nécessaires à l'avenir pour compléter l'identification des déterminants moléculaires microbiens des processus d'altération des minéraux et répondre à un certain nombre de questions d'importance évolutives et écologique, notamment : la séquence des gènes impliqués dans l'altération est-elle conservée ? Les mécanismes gouvernés par ces gènes sont-ils génériques ? Quels sont les facteurs environnementaux régulant l'expression de ces gènes ?

## La géomicrobiologie des sols : une discipline émergente à développer

Nous vivons actuellement les prémices d'une nouvelle discipline, la géomicrobiologie des sols. À l'avenir les études de l'écologie et de la génétique des micro-organismes impliqués dans l'altération des minéraux du sol devront se développer et se multiplier si l'on veut tirer pleinement parti des applications que cette nouvelle discipline pourra générer aussi bien dans le domaine industriel que dans celui de la protection de l'environnement. Dans l'état actuel de nos connaissances, de nombreuses hypothèses écologiques et mécanistes peuvent être émises

mais restent à vérifier. L'une d'entre elles pourrait être que les minéraux du sol constituent une niche écologique particulière, la minéralosphère, qui sélectionne les micro-organismes les plus aptes à altérer ces minéraux. La vérification de cette hypothèse nécessitera de s'intéresser aux souches microbiennes cultivables et à leurs potentialités, mais aussi de caractériser l'ensemble de la communauté microbienne présente sur les minéraux dans les sols, aussi bien du point de vue taxonomique que du point de vue fonctionnel. Le passage par l'étude des micro-organismes cultivables est un prérequis, certes restrictif car l'on estime que seuls 1 % des micro-organismes telluriques sont cultivables, mais indispensables quand on étudie une fonction dont on ne connaît pas les déterminants génétiques. L'étude de ce nouveau compartiment nécessitera des approches polyphasiques impliquant notamment la construction de banques génomiques et métagénomiques *4 qui serviront à lier la fonction d'altération aux gènes et aux micro-organismes impliqués *7. Une fois les micro-organismes et les déterminants génétiques identifiés, des études de diversité fonctionnelle, des études d'expression et de localisation in situ des principaux gènes impliqués, devront être engagées afin de mieux comprendre les processus d'altération qui régissent la fertilité et la toxicité des sols. ●

<footnote>*4 voir article de N. Lombard et al., dans ce dossier.</footnote>

<footnote>*7 voir article de P. Lemanceau et al., dans ce dossier.</footnote>
<figure><img src="image_83.png" /></figure>

INRA

Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers

Effet de l'essence forestière sur le fonctionnement biogéochimique et biologique d'un écosystème forestier.

<figure><img src="image_84.png" /></figure>

Présentation du site experimental de
la forêt de Breuil-Chenue, Morvan

Responsable scientifique : Jacques RANGER

Responsable technique : Dominique GELHAYE

INRA Centre de Nancy

Unité Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers

54280 Champenoux

tel : 03 83 39 40 68

fax 03 83 39 40 69

ranger@nancy.inra.fr

dgelhaye@nancy.inra.fr

avril 2006
# I- Avant propos

L'introduction massive de résineux plus productifs, et à développement plus rapide que la forêt native, soutenue financièrement par le Fonds Forestier National (FFN) et destinée à résorber le déficit de la filière bois après la seconde guerre mondiale, a conduit à une transformation importante des paysages, en particulier en basse et moyenne montagne. Le boisement des terres libérées par l'agriculture, associé à une sylviculture prônant des peuplements équiennes, mono-spécifiques et denses se traduit par une modification notable du paysage et parfois par un caractère inhospitalier de ces espaces boisés, qui sont relativement impénétrables dans leur phase initiale de développement.

Les observations ponctuelles trop vite généralisées sur l'évolution des sols, de la diversité biologique ou de la qualité des eaux de surface, ont conduit à des polémiques importantes sur l'opportunité des boisements résineux, traduisant en fait une prise de conscience écologique de notre Société dès les années 70.

Des études détaillées du rôle des boisements résineux sur les sols, les écosystèmes et les eaux de surface, ont alors été entreprises en France sous l'égide de la DGRST (Bonneau et al., 1977), puis du CNRS (PIREN) (Bonneau et al., 1982, 1983, 1984).

La méthode employée était naturellement celle qui pouvait donner rapidement des informations : la méthode dite des 'couples' de peuplement fut utilisée pour comparer les sols sous des peuplements existants, pour lesquels il avait été vérifié que seul le type de peuplement différait. Elle fut utilisée pour étudier l'évolution des sols (Nys, 1981, 1988), pour étudier le fonctionnement comparé des écosystèmes feuillus et résineux par approche analytique (Ranger J. et al., 1983, Ranger D. et al., 1983, Nys et al., 1983, Nys, 1988), pour étudier le fonctionnement comparé des écosystèmes feuillus et résineux par approche expérimentale in situ utilisant l'évolution de sondes minérales, les minéraux tests (Ranger et al., 1985, 1986, 1990 ; Augusto, 1999 ; Augusto et al., 2000, 2001, 2002).

Les limites de la méthode des couples, qui ne permet souvent pas de contrôler strictement tous les facteurs de variation, a conduit à la création d'un dispositif spécifique ou des plantations de diverses essences feuillues et résineuses ont été substituées à la forêt native. C'est l'origine du dispositif de Breuil installé en 1976 par la Station de Recherche sur les Sols et la Fertilisation, sous la Direction de Maurice Bonneau (Bonneau et al., 1977), et utilisé dans les projets actuels 25 ans après sa mise en place.
## II- Objectifs généraux du site atelier

Les recherches menées sur le site atelier de Breuil appartenant au réseau des sites Observatoires de Recherche sur l'Environnement (ORE F-OreT, coordonné par le GIP Ecofor) se situent sur le moyen et sur le long terme.

L'objectif général est d'étudier l'effet de la substitution d'essence sur le fonctionnement biogéochimique et biologique des écosystèmes. Les observations viseront à mettre en évidence les changements au niveau des sols (phase solide, solutions, phase minérale et phase organique). Les mécanismes sous-jacents seront identifiés, et les causes, physiques (pédoclimat induit), chimiques ou biochimiques (modifications de la qualité et de la quantité des matières organiques produites), biologiques (prélèvement de la végétation, diversité et fonctionnalité des populations microbiennes et fongiques associées) seront analysées à l'échelle du sol entier et de sites fonctionnels particuliers (humus, horizons organo-minéraux, rhizosphère), et à celle de l'écosystème.

Ces données permettront d'améliorer les connaissances théoriques sur les substitutions d'essences, et permettront d'étayer les recommandations pour les aménagements des écosystèmes forestiers. La substitution d'essence est en effet très fréquente dans les aménagements forestiers, et il est par conséquent important d'en identifier au plus juste les effets (Augusto et al., 2001).

Les mots-clés de ce projet sont les suivants ; écologie fonctionnelle, écologie quantitative, biogéochimie, biologie, cycles biogéochimiques, processus du fonctionnement des sols, approche systémique, modélisation

## III- Matériels et Méthodes

### III-1 Le site expérimental

- La situation géographique : le site expérimental est situé dans les parcelles 7 et 8 de la forêt domaniale de Breuil-Chenue (Nièvre-Morvan) (figure 1). Il constitue une série
Recherche dans l'aménagement du massif. L'altitude est de 650 m et la situation morphologique locale du terrain est un plateau légèrement incliné vers le Sud.

- Le climat général : la pluviométrie moyenne annuelle trentenaire à Château-Chinon est de 1280 mm (dominante hivernale, et minimums relatifs en avril et juillet), la température moyenne annuelle de 9°C (5,4°C de moyenne des minimas mensuels, et 12,5°C de moyenne des maximas mensuels) et l'ETP de 640 mm.

- La géologie : le substrat géologique est constitué par le granite leucocrate à gros grains et deux micas de la Pierre-qui-Vire, dont les compositions minéralogique et chimique sont les suivantes (Seddoh, 1973) : 23,5 % de quartz, 44 % de feldspath K, 28,5 % de plagioclase, 1,6 % de biotite chloritisée et 1,6 % de muscovite, conduisant à des teneurs de 0,5 % de MgO, 0,6 % de CaO, et 4,4 % de K₂O. Ce granite est recouvert par une couche variable mais peu épaisse de limon éolien ; l'ensemble ayant subi une cryoturbation de surface variable mais généralisée au cours du quaternaire (Aurousseau, 1976).

- Les sols : Il s'agit de sols acides (pH compris entre 4 et 4,5) et désaturés (taux de saturation compris entre 5 et 15 % en fonction des horizons) de type Alocrisols. La texture du sol est sablo-limoneuse (60 % de sables et moins de 20 % d'argiles), plus argileuse dans l'arène en profondeur. Les blocs de granité altéré sont répartis de manière erratique sur le plateau, avec une augmentation de fréquence en rupture de pente. L'humus de la forêt native est dégradé (dysmoder épais) et une crypto-podzolisation apparaît en surface, morphologiquement marquée par un horizon brun chocolat discontinu. L'enracinement est profond.

- les peuplements : la forêt native, un taillis-sous-futaie vielli à réserves de hêtre (dominant) (*Fagus sylvatica* L) et de chêne (*Quercus sessiliflora* Smith) et taillis de diverses essences (*Quercus sessiliflora* Smith, *Betula verrucosa* Ehrh., *Corylus avelana* L.) a été coupée à blanc et remplacée par des plantations de diverses essences feuillues et résineuses : le chêne (*Quercus sessiliflora* Smith), le Hêtre (*Fagus sylvatica* L.), l'épicéa commun (*Picea abies* Karst.), le Douglas (*Pseudotsuga menziesii* Franco), le sapin de Nordmann (*Abies nordmanniana* Spach.), le pin laricio de Corse (*Pinus nigra* Arn. *ssp laricio* Poiret var corsicana).
- le dispositif expérimental : il s'agit d'un dispositif en deux 'faux' blocs comprenant chacun les traitements suivants :

- une parcelle représentant la forêt initiale qui n'est pas un témoin expérimental puisqu'elle n'a pas subi la préparation par andainage (bloc I) ou brûlage (bloc II) des rémanents d'exploitation.

- les 5 parcelles plantées en hêtre, chêne, épicéa, Douglas, sapin et pin.

- 4 parcelles d'épicéa commun, de Douglas de pin Laricio et de sapin de Nordmann, fertilisées et amendées dès la plantation pour tester a priori l'effet de la remédiation à l'acidification du sol lié à l'introduction des essences résineuses.

Le dispositif a été installé en 1976 dans le cadre d'un contrat DGRST « Modification de la fertilité des sols sous boisements artificiels de résineux purs » coordonné par Maurice Bonneau, Directeur de la Station de Recherches sur les Sols et la Fertilisation de l'INRA de Champenoux. : Maurice Bonneau (Directeur de Recherches), Claude Nys (Assistant de Recherche cartographie – sols), Michel Adrian (TR terrain), Dominique Gelhaye (Adjoint terrain), Jitka Lhomme (analyste chimiste).

Chaque parcelle fait environ 10 ares. Les apports d'amendements et fertilisation sont les suivants : en 1979 (37 g de P2O5, 15 g de K2O, 3,4 g de N appliqués par plant sous forme de superphosphate triple à 45 %, sulfate de potasse et ammonitrate) et en 1983 épandage en plein de 160 kg de P2O5 et 1120 kg de CaO sous forme de Récalcit compacté (calcaire broyé phosphaté). La densité de plantation pour les peuplements feuillus est de 15000 plants/ha et de 1600 plants/ha pour les peuplements résineux.

Le plan de l'expérience est présenté à la figure 2.

### III-2 – Le climat local et le pédoclimat

Une station météorologique a été mise en place en 2005. Elle est positionnée sur une tour de 12m où sont mesurés les paramètres suivants : température de l'air, intensité lumineuse globale, vitesse du vent, humidité relative de l'air, pluviométrie. Ces données permettent de calculer l'ETP locale sur un pas de temps semi-horaire. De plus, la pluie fait l'objet d'un prélèvement journalier grâce à un partiteur automatique ; les échantillons seront analysés pour quantifier les dépôts humides.
Le microclimat du peuplement et le pédoclimat sont observés depuis 2001 dans deux couples de peuplements feuillus et résineux : hêtre-Douglas et chêne-épicéa. La température et l'humidité relative de l'air sont mesurées à 1,30 m au pas de temps horaire. La température du sol est mesurée sous la litière (4 répétitions), à 15 cm (4 répétitions, et à 30 et 60 cm de profondeur (2 répétitions). L'humidité du sol est mesurée sur 5 profils au pas de temps de deux heures, par peuplement, à 15, 30 et 60 cm de profondeur, par des sondes enterrées (TDR Système Trase BE Soil Moisture).
<figure><img src="image_85.png" /></figure>

extrait de la carte Michelin 243 1:200000

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

extrait de la carte ign 1:25000 monsauche-les settons 2823 0

<caption>Figure 1</caption>
Forêt de Breuil-Chenue

Bloc I

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

Bloc II

<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>figure 2</figcaption></figure>
### III-3 Mesure des stocks d'éléments dans les compartiments

Le tableau 1 décrit les mesures réalisées ou en cours de réalisation, sur les peuplements et les sols pour entre autres quantifier les stocks des différents éléments, et les réserves en eau et éléments nutritifs disponibles pour la végétation.

Le dispositif implique un suivi diachronique car l'effet de peuplements ne présentant pas la même vitesse de développement doit être appréhendé au cours des différent stades de leur développement.
<table><thead><tr><th>Compartiment</th><th>Mesure des stocks</th></tr></thead><tbody><tr><td>Biomasse et minéralomasse</td><td><ul><li>Inventaire annuel de tous les peuplements</li><li>Prélèvement destructif d'arbres répartis sur toutes les classes de circonférence dans le bloc I (résineux :10 arbres ; feuillus : 15 arbres)</li><li>Mesures in situ des paramètres dendrométriques et des poids des différents compartiments (tronc à différentes découpes ; branches)</li><li>Echantillonnage par compartiment pour mesurer le degré de siccité et réaliser les analyses chimiques totales (C, N, P, K, Ca, Mg)</li><li>Etablissement de tarifs de biomasse et minéralomasse</li><li>Quantification des biomasse et minéralomasse compartimentées</li></ul></td></tr><tr><td>Sols</td><td><ul><li>Description d'une fosse pédologique dans chaque peuplement</li><li>Prélèvement des échantillons pour une caractérisation globale des sols</li><li>Prélèvement systématique en 16 points (plantations) ou 20 points (forêt native) répartis sur une grille géoréférencée pour tester l'existence d'une structure géographique liée la variabilité spatiale naturelle ou induite par l'andainage.</li><li>'horizons' prélevés [0-5], [5-10], [10-15], [15-25], [25-40], [40-55], [55-70]</li><li>Mesures physiques : granulométrie (4 profils complets dans chaque peuplement + horizons profonds de la fosse centrale) ; densité apparente (tous les prélèvements) ; densité réelle, stabilité structurale, infiltrométrie, courbes rétention en eau (sur des sous-échantillons)</li><li>Mesures physico-chimiques et chimiques :<ul><li>éléments totaux :<ul><li>horizons holorganiques : C, N, P K Ca, Mg sur 1/2 profils</li><li>horizons organo-minéraux et minéraux : tous éléments sur 2 profils par peuplement</li></ul></li><li>éléments libres : Fe, Al, Si (voire autres éléments de type Mg) sur 8 profils par peuplement de 0 à 15 cm et 4 profils sur tout le profil ; méthodes</li></ul></li></ul></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>Mehra et Jackson (1962), Tamura (1958), Tamm (1922), McKeague et Schuppli (1982)<br/>- éléments échangeables : analyse systématique sur tous les échantillons (Rouiller et al, 1981)<br/>- pHéau, pH KCl, tous les échantillons<br/>- Corg, Norg, [0-5], [5-10], [10-15], [15-25], [25-40]<br/>- Passi. sur tous les échantillons (Duchaufour et Bonneau, 1959)<br/>- Minéralogie : séparations granulométriques et détermination qualitative des minéraux par RX et analyses chimiques ; étude des argiles y compris les phases très fines (&lt;0,1µ) (4 profils par peuplement en surface et 2 en profondeur)</td></tr></table>

### III-4- Mesure des flux entre les compartiments de l'écosystème

Le tableau 2 résume les flux mesurés dans cette expérience et les méthodologies utilisées.

<table><thead><tr><td>Flux mesuré</td><td>Méthode</td></tr></thead><tbody><tr><td>Chutes de litière</td><td>- 5 collecteurs de 0,5 m² dans les plantations et de 10 collecteurs dans le TsF<br/>- Récolte tous les 3 mois (matière sèche, tri par compartiments, contenu minéral)</td></tr><tr><td>Prélèvement de nutriments par les arbres</td><td>- Quantification à partir de l'immobilisation moyenne annuelle et des restitutions par les litières et la récrétion (Ranger et Bonneau, 1984).</td></tr><tr><td>Minéralisation de la matière organique</td><td>- Minéralisation potentielle de C et N (nette et brute) effectuées sur des échantillons frais de sols et mis à incuber en conditions contrôlées (Kunde, 2001 ; Colin-Belgrand et al., 2002, Pasteur, 2005, Zeller, 2005)<br/>- Mesures de biodégradation in situ : substrats modèles cellulose & lignine, litières (Moukoumi et al., 2006).<br/>- Etude des populations responsables de la biodégradation (Kulhankova et al., 2006)<br/>- Mise en place de litière de hêtre marquée par <sup>15</sup>N pour suivre la dynamique de décomposition dans les hêtraies (native et plantation)</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th></th><th>(Zeller et al., 2001)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Pluies incidentes</td><td>- Pluviomètre avec récolte journalière d'échantillon</td></tr><tr><td>Pluviolessivats</td><td>- 4 gouttières de 2m par peuplement (remplacées par 4 bacs en hiver)<br>- 10 collecteurs de ruissellement de troncs (2 fonctionnels en hiver)</td></tr><tr><td>Solutions du sol</td><td>- Litières : 2 répétitions de 5 gouttières de 50 x 4 cm par peuplement<br>- Horizons organo-minéraux : 5 répétitions de bougies poreuses à – 15 cm ; - 30 cm ; - 60 cm dans tous les peuplements + 4 répétitions à –100 cm dans le peuplement témoin de la forêt native.<br>- Mini-horizons de surface 4 fois 8 répétitions à -5 et –10 cm dans TsF, épicéa et chêne<br>- Les solutions fortement liées seront prélevées par centrifugation d'échantillons frais (bloc II) (Jaffrain et al., 2006)</td></tr></tbody></table>

La planche photo de la dernière page de couverture présente ces matériels installés dans le cadre du site de Breuil.

Détails méthodologiques concernant les solutions (pluies, pluviolessivats, solutions du sol):

- Prélèvements : systématiques toutes les 4 semaines depuis Octobre 2001

- Conditionnement : filtration sur filtre inerte à 0,45µ ; stockage en chambre froide en attendant leur analyse réalisée en général sous huitaine

- Analyse chimique minérale:

- Analyses totales : par spectrophotométrie d'émission atomique à plasma induit (ICP Ultrase Jobin Yvon) pour les éléments Si, Al, Fe, Ca, Mg, Mn, Na, K, S et P ; pour C et N l'analyse de COD et NOD sont effectuée sur analyseur Shimatzu ; pour N minéral, analyse sur Traacs 2000 par spectrométrie moléculaire microflux.

- Analyses spécifiques : les spéciations chimiques sont réalisées pour

. N (Ntot, Norg (Shimatzu), NO₃⁻ et NH₄⁺) : spectromètre moléculaire microflux, chromatographie ionique et analyseur N organique.

. S (Stot, SO₄²⁻) : ICP + Chromatographie ionique

. Al (Al monomérique, Al polymérique, Al lié à MO, SO₄²⁻, F, P, Si etc...) : extraction et modélisation à partir d'analyse en ICP et en Chromatographie ionique (au Limos par JP Boudot protocole publié, Boudot et al., 2000)

- Analyse chimique organique :

Le carbone organique dissous (COD) est caractérisé par spectrométrie UV et décomposition des spectres (Simonsson et al., 2003 ; Jaffrain, 2006) pour l'encombrement moléculaire et les
groupes fonctionnels. Un protocole spécifique est en cours de mise au point pour l'étude du caractère complexant de la COD (Titeux, travail en cours).

### III-5 Minéralisation de la matière organique

La biodégradation de la matière organique est étudiée pour la matière organique fraîche (MOF) et pour la matière organique humifiée (MOH).

La biodégradation des MOF est suivie par l'intermédiaire de substrats modèles ou de litières mis à décomposer *in situ*. Des sachets micro-poreux contenant de la cellulose, de la lignine ou des litières de feuilles sont placés dans les 5 premiers cm des horizons superficiels de 4 peuplements (TsF, hêtre chêne Douglas et épicéa). Des tests ont été réalisés sur des mélanges feuillus-résineux pour le suivi de la perte de masse et d'indicateurs biochimiques divers.

La biodégradation des MOH a été observée en conditions contrôlées sur des échantillons prélevés dans les horizons de surface (0-5 cm en général) des sols sous tous les peuplements (forêt native et plantations) à différentes dates, dans les deux blocs. Les paramètres mesurés sont : la minéralisation du carbone par le dosage du CO₂ dégagé, la minéralisation de l'azote par le dosage de NH₄⁺ et NO₃⁻, les composés organiques, les éléments minéraux hydrosolubles et les éléments minéraux échangeables et biodisponibles.

Une approche spécifique a été réalisée sur la minéralisation de fractions granulométriques correspondant à des liaisons carbone-matière minérale de plus en plus forte allant des fractions grossières aux fractions fines. L'objectif est de discriminer les MOH récentes issues des peuplements actuels de celles relicuelles du peuplement primitif.

### III-6- Etude de la rhizosphère

La rhizosphère est définie comme la zone étroite du sol qui est influencée par le fonctionnement de la racine notamment par les exsudations et le prélèvement. Des mesures semblables à celles pratiquées dans les horizons entiers sont réalisées (tableau 3) après adaptation des méthodes (protocoles échantillonnage, capteurs, protocoles analytiques,...). Ces mesures sont réalisées sur les différents compartiments de la rhizosphère (sol, solution, microbiologie).
<table><thead><tr><th>Compartiments</th><th>Mesures</th></tr></thead><tbody><tr><td>Sols</td><td><ul><li>Prélèvement systématique en 18 fosses calibrées (35*80 cm) par plantation à trois niveaux [0-3], [3-10], [10-23]</li><li>Séparation du sol rhizosphérique (accolé aux racines fines) et du sol global.</li><li>Mesures physico-chimiques et chimiques sur tous les échantillons tamisés à 200µm: éléments échangeables (Rouiller et al, 1981) ; pHéau, pH KCl ; Corg, Norg</li><li>Minéralogie sur des échantillons moyens: séparations granulométriques et détermination qualitative des minéraux par RX et analyses chimiques ; étude des argiles y compris les phases très fines (&lt;0,1µ) ; analyses des éléments libres.</li></ul></td></tr><tr><td>Solutions du sol</td><td><ul><li>Par peuplement, 12 répétitions de solution rhizosphérique et solution globale</li><li>Solutions récoltées à l'aide de micro-capteurs (Göttlein, 1990) à travers une fenêtre racinaire (prélèvement toutes les 4 semaines et mêmes analyses que celles pratiquées sur les solutions des horizons entiers). Mise au point méthodologique pour les mesures sur faibles volumes.</li></ul></td></tr><tr><td>Microbiologie</td><td><ul><li>Prélèvement de sol dans le peuplement de chêne, dans et hors mycorhizosphère de scléroderme à trois niveaux de profondeur</li><li>Collection de bactéries et de champignon pour tous les échantillons</li><li>Bio-tests pour définir l'agressivité de ces souches envers les minéraux du sol</li></ul></td></tr></tbody></table>

De plus, certains flux potentiels (minéralisation et altération des minéraux) sont également déterminés à l'échelle de la rhizosphère (tableau 4).

<table><thead><tr><th>Flux</th><th>Méthodes</th></tr></thead><tbody><tr><td>Minéralisation de la matière organique</td><td><ul><li>Sur les échantillons de sol de surface de 5 fosses par peuplement (sol rhizosphérique et global) prélevés</li><li>Mesures de minéralisation potentielle (brute) effectuées sur des</li></ul></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>échantillons frais de sols et mis à incuber en conditions contrôlées (Colin-Belgrand et al., 2002)</td></tr><tr><td>Altération biologique des minéraux</td><td><ul><li>Pour chaque peuplement du bloc 2, et pour 2 horizons</li><li>Approche expérimentale utilisant des minéraux-test (apatite, plagioclase et phlogopite) placés dans des sacs à mailles variables (minéraux accessibles ou non aux racines) mis à incuber in situ.</li></ul></td></tr></table>

Parallèlement à l'approche in situ des travaux en conditions contrôlées visent à déterminer les mécanismes mis en jeu dans l'altération des minéraux et la biodégradation des matières organiques.

### III-7 Etude concernant les micro-horizons diagnostics de surface

Le sol 'climax' se caractérise par le développement d'une crypto-podzolisation de surface assez bien marquée morphologiquement. Il est donc important d'identifier ce mécanisme et d'en qualifier les traits (matière organique, minéralogie, solutions) et l'origine (acido-complexolyse et, et/ou dégradation hydromorphe ?). Le bouleversement voire le léger décapage superficiel du sol lors de la préparation du site pour la plantation font que cet horizon est peu net et relicteul dans les plantations. Il sera intéressant de voire quelle essence favorise le développement le plus rapide de ce mécanisme et d'en analyser les causes

Les test suivants seront réalisés (tableau 5):

<table><tr><td>Phase solide organique</td><td>Caractérisation globale (C, N) et fractionnement granulométrique</td></tr></table>
<table><tr><td>Phase solide minérale</td><td><ul><li>Minéralogie totale et minéralogie des fractions argileuses en particulier des fines qui devraient concentrer les smectites de dégradation</li><li>Approche expérimentale utilisant des vermiculites calées (Al) au laboratoire et mises à incuber in situ.</li></ul></td></tr><tr><td>Solutions du sol</td><td><ul><li>Installation de collecteurs de solution de faible dimension (rhizons) pour récolter les solutions dans les micro-horizons de surface</li><li>Spéciation chimique (organique et minérale)</li></ul></td></tr></table>

### III-8 Observation des acteurs biologiques et identification de leur activité

#### III-81 La macroflore fongique

Les observations portent sur les communautés des champignons ectomycorhiziens et les communautés de champignons saprophytes. Ces deux communautés essentielles pour la nutrition minérale des arbres et la décomposition de la matière organique, sont décrites par plusieurs campagnes de terrain (printemps et automne). Leur fonctionnalité sera décrite à partir des connaissances acquises et des indicateurs isotopiques de type $\delta^{15}$N, $\delta^{13}$C traçant l'origine du carbone utilisé. De plus, les techniques de biologie moléculaire permettront de comparer les profils locaux aux bases de données existantes ; une étude spécifique sera conduite sur *Laccaria* sous feuillus natifs et Douglas introduits pour comparer cette population.

#### III-82 La microflore du sol

Les observations portent sur l'abondance, la diversité des micro-organismes du sol et abordent le domaine de l'activité. Ces déterminations portent sur 4 traitements : épicéa, Douglas, chêne, hêtre de plantation et taillis sous futaie natif.

L'abondance est estimée à travers la mesure de biomasse microbienne, en utilisant la méthode de fumigation-extraction. Avec cette méthode, on détermine la quantité globale de matière organique « vivante », que l'on exprime d'une part en valeur absolue, d'autre part en pourcentage du carbone organique total du sol.

La diversité microbienne est appréciée par différentes approches. La microflore globale par la méthode dite des empreintes génétiques, identifiée à partir de l'ADN microbien directement extrait du sol. Les profils de bandes obtenus sont indicateurs de la complexité et de la
structure populationnelle des communautés bactériennes et fongiques. Les populations fongiques et bactériennes colonisant les matériaux en incubation *in* et/ou *ex situ* sont analysées par diverses techniques de biologie moléculaire. L'analyse statistique permet de discriminer les peuplements.

L'activité est abordée par diverses méthodes : utilisation des traceurs isotopiques, utilisation de marqueurs spécifiques d'activité, activité potentielle via les banques de données, approche moléculaire par l'étude de l'ARN.

### III-9 Modélisation biogéochimique

Elle consistera à utiliser un modèle mécaniste (WHAM) pour étudier la distribution des espèces chimiques dans les solutions (c.a.d. la spéciation aqueuse), en plaçant une attention toute particulière sur la complexation des éléments métalliques (en particulier Al, mais pas exclusivement), aux principaux composés du carbone organique dissous (COD). Cet outil devrait aider à appréhender un éventuel effet essence sur la spéciation des solutions et indirectement sur certaines réactions hétérogènes, en particulier celles de dissolution et de précipitation des minéraux.

La modélisation couplée biogéochimie-transferts sera ensuite progressivement utilisée pour le calcul de bilan des éléments nutritifs au sein des différents écosystèmes, notamment à travers le calcul du drainage profond et du flux d'altération (utilisation du modèle MIN3P). Une des étapes préliminaires sera de simuler le bilan hydrique et de valider rigoureusement cette modélisation par rapport aux mesures d'humidité du sol par sondes TDR.

### III-10 Base de données

Actuellement, l'ensemble des données concernant le climat (méso et pédo-climat), le sol (solide et solutions) et la végétation, a été mis en base de données structurée de type ACCESS par Dominique Gelhaye et Pascal Bonnaud (AI - BEF Nancy), avec l'assistance de Damien Maurice (IE GIP Ecofor).

Ces données sont accessibles aux acteurs des projets menés sur Breuil, moyennant le respect des critères habituels pour leur utilisation.
# Annexe 3 : Protocole d'analyses des fractions argileuses du site de Breuil

Les 12 échantillons de sol sont au préalable soumis à **une destruction de la matière organique** qui dure plusieurs mois. La destruction de la matière organique est engendrée par l'ajout d'eau oxygénée et par un léger chauffage (fig. 1 première phase). Le but étant de détruire la matière organique sans altérer la phase minérale. Lorsque la totalité de la matière organique est détruite, les échantillons sont conservées au réfrigérateur à 4°C jusqu'à ce que tous les échantillons de sol soient dépourvus de matière organique.

**Une séparation des différentes fractions granulométriques** (argiles : particules de diamètre inférieures à 2 µm, limons fins : particules de diamètre compris entre 2 et 20 µm, limons grossiers : particules de diamètre compris entre 20 et 50 µm et sables fins : particules de diamètre compris entre 50 et 200 µm) est ensuite réalisée à l'aide d'allonges pour les argiles et les limons fins (fig. 1 deuxième phase) et de tamis pour les limons grossiers et les sables fins (fig. 1 troisième phase). Une partie de la fraction argileuse (< 2µm) est envoyée à l'université de Poitiers où est effectuée une séparation de la fraction (< 0.1µm) par L. Caner et L. Mareschal (stage de 6 mois de DEA de Science du Sol).

**Une détermination de la granulométrie** (proportion des différentes fractions granulométriques) dans les échantillons de sol est alors réalisée (fig. 1 quatrième phase).

Les deux fractions argileuses (< 0.1 µm et < 2µm) seront par la suite soumises à différentes analyses (fig. 1 cinquième phase) : traitement au tricitate-bicarbonate-dithionite (traitement Mehra-Jackson) et au citrate à chaud (traitement Tamura) afin d'extraire certains composés amorphes. Le fer et l'aluminium extraits sont dosés à l'aide de la torche à plasma (JY180 ULTRACE). Ces échantillons bruts et après traitement sont saturés par Mg et K et sont analysés par diffraction de RX (Siemens D5000) sur dépôts orientés. Les diffractogrammes obtenus sont décomposés à l'aide du logiciel (DECOMP). Ainsi une analyse fine des minéraux interstratifiés peut être obtenue.

Remarque : Tout le travail effectué dans cette partie minéralogie des sols est détaillé dans un cahier de laboratoire INRA intitulé "Sols de Breuil" et dans un fichier word intitulé "protocole d'analyses" dans le dossier Sols de Breuil.
Première phase : destruction de la matière organique

<figure><img src="image_89.png" /><figcaption>Figure 1 : Représentation des différentes étapes de traitement des sols rhizosphériques et globaux</figcaption></figure>

Deuxième phase : séparation des argiles et des limons fins selon la loi de Stockes :

<figure><img src="image_90.png" /></figure>
Troisième phase : séparation des limons grossiers et des sables fins par tamisage

La séparation des limons grossiers et des sables fins est effectuée à l'aide d'un tamis en
utilisant le jet de la pissette comme énergie pour déplacer et faire migrer les particules sur et à
travers le tamis. On contrôle la séparation tamis par tamis. Puis on récupère, on sèche et on
pèse les différentes fractions.

Quatrième phase : détermination de la granulométrie

Les différentes fractions obtenues par la méthode des allonges et par tamisage sont séchées et pesées. On peut ainsi calculer le pourcentage de chacune des différentes fractions granulométriques par rapport à la masse totale d'échantillon introduit dans l'allonge.

En ce qui concerne les argiles, étant donnée qu'une partie est envoyée à l'état humide à
Poitiers, il est nécessaire de connaître la masse totale humide des argiles récupérées (= masse
de l'ensemble bécher + argiles humides) – (masse du bécher)). Puis on met une partie des
argiles humides (celles que l'on garde à Nancy) dans un pilulier taré et on pèse l'ensemble
pilulier + argiles humides. L'ensemble est placé à l'étuve à 35°C pendant plusieurs jours et est
ensuite pesé. On peut ainsi obtenir la masse sèche totale d'argiles qui est égale à la masse
totale humide des argiles récupérées multipliée par le rapport (masse sèche des argiles
conservées à Nancy / masse humide des argiles conservées à Nancy).

<figure><img src="image_91.png" /></figure>
Cinquième phase : analyses des fractions argileuses

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

Sixième phase : interprétation des différentes analyses effectués sur les 12 échantillons prélevés
# Annexe 4 : Synthèse des méthodes d'extraction sélectives utilisées pour l'étude du sol global et/ou des minéraux-test (par Pascal Bonnaud)

## Rappel des différentes formes sous lesquelles ont peut trouver les cations dans un sol ou un minéral

+ Les éléments de constitution (pour les minéraux primaires ou néoformés) sont les éléments du réseau caractérisé par un motif cristallin (maille) et une distribution atomique (composition chimique). Pour les déterminer qualitativement et quantitativement, il est nécessaire de détruire le matériau initial

1) par fusion alcaline (analyse totale) qui consiste à abaisser le point de fusion des silicates par l'intermédiaire d'un fondant (Soude, Carbonates, Métaborates, etc.), détruire la structure cristalline et faire passer les éléments de constitution en solution dans de l'acide nitrique.

2) par attaque avec des acides concentrés à chaud (HF, HCl, triacides, nitroperchlorique, eau régal,...).

+ Les formes libres qui se divisent en deux groupes :

- les oxydes ou oxyhydroxydes : ils se présentent sous forme cristallisée, ils sont formés par des groupements avec de l'oxygène ou des groupes oxhydrile (OH). On ne peut toutefois associer la magnétite ($Fe_3O_4$) dans ce groupe, du fait de sa formation particulière qui ne peut être obtenue au cours de la pédogenèse (minéral primaire).

- Les amorphes qui sont des produits provenant de l'altération des formes déjà exposées et qui ne présentent pas de forme cristallines ou tout au moins, une organisation suffisante pour obtenir des figures de diffraction en conditions classiques.

+ Les éléments échangeables :

La présence de cette forme est due aux substitutions qui interviennent au niveau des éléments de constitution, qui se traduisent par des déséquilibres électriques et impliquent la fixation d'éléments en périphérie (éléments échangeables) de manière à conserver la neutralité électrique du minéral initial.

La somme de ces éléments constitue le stock de cations minéraux directement assimilables par les plantes.
Remarque : il existe une capacité d'échange anionique dans les sols, en particulier quant ils contiennent des oxydes (sols méditerranéens ou tropicaux). Celle-ci est très faible en sols tempéré (sauf pour les Andosols).

## Les méthodes et protocoles d'analyses physico-chimiques

Dans tous les cas, un témoin minéral initial ou un échantillon de référence devra être traité en même temps que les échantillons. Il servira de référence analytique pour comparer les résultats des différentes séries analysées dans le temps.

### 1) Le pH de contact.

Il permet de faire une première approche du type d'évolution qu'à pu subir le sol ou le minéral. Par exemple, un pH de contact se situant vers le pôle très acide (3,5) traduit souvent une capacité d'échange élevée donc un faible blocage des sites échangeables d'une vermiculite. (l'aluminium est fixé sous forme échangeable : $Al^{3+}$) Par contre un pH voisin du $pK_a$ de l'aluminium (4 à 5) peut traduire un blocage de l'aluminium à l'état non échangeable (baisse de la capacité d'échange). Un pH supérieur au $pK_a$ de l'aluminium, traduit la non intervention de ce dernier.

### 2) La capacité d'échange cationique (CEC). (Rouiller J., Guillet B. et Bruckert S., 1980)

Cette méthode informe sur la nature et la quantité d'éléments échangeables qui sont disponibles pour la végétation et qui caractérisent le fonctionnement et la fertilité actuelle du sol. Pour évaluer cette CEC, une double extraction (KCl et $NH_4Cl$) est nécessaire. L'extrait KCl servant à doser le Ca, Mg, Mn, Na, Fe, Al, H et l'extrait $NH_4Cl$ le K.

La méthode de routine pour la détermination de la CEC est la méthode regroupant les résultats des deux extractions KCl N et $NH_4Cl N$ (protocole ci après).

A la suite de différents tests effectués aux laboratoire, cette méthode de référence à été légèrement adaptée pour permettre d'évaluer correctement la CEC des vermiculites de "basse charge". De ce fait, pour déterminer la CEC de la vermiculite de "basse charge" (vermicuite de Prayssac) la solution d'extraction KCl est remplacée par une solution normale de $SrCl_2$ pour le dosage de K,Ca, Mg, Mn, Na, Fe et Al. Le proton ($H^+$) est déterminé par dosage de l'acidité sur une extraction à KCl normal ($H^+ n$ est pas déterminable par titration à partir de l'extrait $SrCl_2$ car le pH de celui-ci est supérieur à 5.5).
3) Les éléments "libres".

Ce sont les éléments non disponibles directement par la végétation, leur quantification permet, comme pour la CEC de connaître le fonctionnement d'un sol. De manière générale, quand la quantité d'éléments "libres" augmente, la capacité d'échange (CEC) a tendance à diminuer ce qui entraîne une baisse de fertilité.

Par ailleurs, nous savons que les éléments susceptibles de bloquer la capacité d'échange sont principalement le fer et l'aluminium donc, les extractions utilisées pour quantifier ces éléments seront spécifiques :

De nombreux protocoles existent pour extraire ces éléments, ils sont tous basés sur le même principe initial qui s'appuie sur le fait que le Fer est sensible à la réduction et l'aluminium à la complexation. En ce qui nous concerne, nous avons adopté les extractions suivantes.

- le réactif Mehra et Jackson (Mehra O.P., et Jackson M.L., 1960), réducteur du Fer par la présence de dithionite et complexant par son tricitrate est tamponné à pH environ 7 par le bicarbonate. (quantification Fer libre).

- le réactif Tamura (Tamura T., 1957 Tamura T., 1958) puissant complexant de l'aluminium par la présence de tricitrate (quantification Aluminium libre).

- le réactif Tamm (Tamm O., 1922) qui, comme le réactif de Tamura est un complexant va jouer sur l'aluminium. La différence de complexant (oxalate pour Tamm ; tricitrate pour Tamura), ainsi que la température et le pH du réactif font que l'aluminium extrait par cette méthode est uniquement de l'aluminium "amorphe".

- L'extraction au pyrophosphate de Na (Mc Keague J.A. et Schuppli P.A., 1982)

Le pyrophosphate s'attaque à la matière organique qu'il détruit et, par son pouvoir complexant, il maintient en solution le fer et l'aluminium libéré par la destruction de la celle-ci.

Les éléments quantifiés par l'intermédiaire de cette méthode d'extraction, bien que n'appartenant pas au groupe des éléments libres extrait par les méthodes précédentes sont pris en compte dans ces trois extraits.

Ce traitement permettra donc de quantifier exactement les éléments libres extraits par les méthodes classiques.
# La capacité d'échange cationique (CEC).

Rouiller J., Guillet B. et Bruckert S., 1980 - Cations acides échangeables et acidité de surface. Approche analytique et incidences pédogénétiques. Science du Sol, Bull. A.F.E.S., 2 161-175.

## Extraction KCl 1N

Le nombre d'échantillons traités dans une même série est défini par la capacité maximum de la centrifugeuse utilisée. Dans notre cas, 40 tubes pour les extractions de volume inférieur à 20 ml et 24 tubes pour les extractions de volume inférieur à 50 ou 100 ml.

Un minimum de : un tube "échantillon témoin" et un tube "témoin de milieu" doivent être insérés dans chaque série pour permettre la validation des résultats.

Les gammes d'étalonnage des appareils de dosage doivent impérativement être réalisées dans le même milieu que les échantillons (après dilution). Pour cela, il est indispensable :

i) de préparer le volume total d'extractant nécessaire en une seule fois (dans un récipient unique) ce qui élimine le risque de travailler avec des solutions différentes.

ii) d'utiliser des échantillons "témoin de milieu" pour préparer les solutions étalons ce qui permet de s'affranchir de l'effet d'une pollution éventuelle du milieu d'origine.

## Mode opératoire :

- introduire le poids d'échantillon (cf tableau pour rapport minéral / solution en fonction du type d'échantillon) dans un tube de centrifugeuse (le choix de la capacité du tube est fonction du volume d'extractant utilisé).

- ajouter la solution de KCl 1N (cf tableau pour rapport minéral / solution en fonction du type d'échantillon) et fermer les tubes hermétiquement.

- l'extraction s'effectue sur un agitateur par retournement pendant 1 heure à température ambiante

- aussitôt après l'agitation, retirer les bouchons tout en les disposant de manière à les réutiliser sur le même tube pour la seconde extraction

- centrifugation (15 mn à 4500 tours).

- récupérer le surnageant dans un pilulier.
- faire une 2ème extraction dans les mêmes conditions sur le même culot et mélanger le nouveau surnageant avec le premier.

NB : Considérant que la concentration en éléments minéraux de chacune des solutions d'extraction recueillie est homogène.

Pour éliminer l'erreur liée i) au volume d'extractant qui reste dans le fond du tube de centrifugeuse ii) aux pertes éventuelles en cours de manipulation, les dosages seront réalisés sur la solution brute d'extraction. Le volume total de solution utilisable pour le dosage (et les calculs qui suivent) sera égal à la somme des volumes utilisés pour les deux extractions successives. Ne pas ajuster le volume final même s'il y a eu des pertes car celles ci ne vont concerner qu'un simple aliquot.

### Solution d'extraction :

+ filtration sur filtre papier (filtration moyenne) si nécessaire.

+ dosage après dilution au 1/10 (Ca, Mg, Mn, Na, Fe, Al, ...)

+ acidité :

neutraliser jusqu'à pH >8 pour prendre en compte la neutralisation du H⁺ et du Al³⁺ (H⁺ : pKa ≠4,6 et Al³⁺ : pKa ≠6,8.

Pour les minéraux tests le dosage s'effectue sur 10 cc d'extrait avec NaOH N/100.

Pour les sols, le dosage s'effectue sur 10 à 20 cc d'extrait avec NaOH N/50.

### Culot d'extraction :

D'une manière générale, le culot d'extraction de sol est éliminé mais il peut être conservé si nécessaire.

En ce qui concerne le culot d'extraction des minéraux purs (minéraux tests), celui ci est récupéré après lavage en vue de l'analyse aux rayons X.

- lavage du culot d'extraction

+ laver 3 fois ou plus avec de l'eau déminéralisée (jusqu'à élimination des chlorures : test AgNO₃)

+ récupérer le culot

+ sécher à 30°C maximum

+ RX
Extraction NH4Cl 1N

Mode opératoire :

- idem extraction avec KCl 1N

Solution d'extraction :

+ filtration sur filtre papier (filtration moyenne) si nécessaire.

+ dosage après dilution au 1/10 (K)

+ éventuellement doser le Mg pour comparer avec l'extraction KCl.

Culot d'extraction :

En général, sans intérêt pour le reste de la manipulation.

Extraction MEHRA - JACKSON

Mehra O.P., et Jackson M.L., 1960 -Iron oxide removal from soils and clays by a dithionite-citrate system buffered with sodium bicarbonate. Clays and Clays Minerals, 7, 317-327.

Le nombre d'échantillons traités dans une même série est défini par la capacité maximum de la centrifugeuse utilisée. Dans notre cas, 40 tubes pour les extractions de volume inférieur à 20 ml et 24 tubes pour les extractions de volume inférieur à 50 ou 100 ml.

Un minimum de : un tube "échantillon témoin" et un tube "témoin de milieu" doivent être insérés dans chaque série pour permettre la validation des résultats.

Les gammes d'étalonnage des appareils de dosages doivent impérativement être réalisées dans le même milieu que les échantillons (après dilution). Pour cela, il est indispensable :

i) de préparer le volume total d'extractant nécessaire en une seule fois (dans un récipient unique) ce qui élimine le risque de travailler avec des solutions différentes.

ii) d'utiliser des échantillons "témoin de milieu" pour préparer les solutions étalons ce qui permet de s'affranchir de l'effet d'une pollution éventuelle du milieu d'origine.

Pour ajouter la dose de dithionite de sodium prévue par le protocole en effectuant un travail rapide et constant, il est très vivement recommandé de les préparer à l'avance (doses
individuelles). L'ajout par l'intermédiaire d'une cuillère doseuse est à proscrire (trop imprécise).

Mode opératoire :

a) Réactif. (0,3 M tricitrate + M bicarbonate)

Dissoudre 78,42 g de tricitrate de sodium RP + 9,34 g de bicarbonate de sodium RP dans un litre. Ajuster avec de l'eau déminéralisée.

b) Extraction. (cf tableau pour rapport minéral / solution en fonction du type d'échantillon)

- Introduire l'échantillon (broyé modérément pour les sols) dans les pots de centrifugeuse en plastique (le choix de la capacité du tube est fonction du volume d'extractant utilisé).

- Ajouter un barreau aimanté et le réactif de citrate bicarbonate (cf tableau pour rapport minéral / solution en fonction du type d'échantillon).

- Porter à 80°C dans un bain-marie munie d'une agitation magnétique.

- Au bout d'un quart d'heure, ajouter une dose de dithionite de sodium (le poids de dithionite ajouté est identique au poids de matière à analyser) et laisser au bain-marie 1/2 heure.

- Centrifuger (15 mn à 5000 t/mn).

- Récupérer le surnageant dans un pilulier plastique.

- Laver le culot (5 mn) avec un volume de solution de citrate bicarbonate égal à la moitié du volume ayant servi à l'extraction.

- centrifuger et récupérer le surnageant dans le même pilulier que précédemment.

NB : Considérant que la concentration en éléments minéraux de chacune des solutions d'extraction recueillie est homogène.

Pour éliminer l'erreur liée i) au volume d'extractant qui reste dans le fond du tube de centrifugeuse ii) aux pertes éventuelles en cours de manipulation, les dosages seront réalisés
sur la solution brute d'extraction. Le volume total de solution utilisable pour le dosage (et les calculs qui suivent) sera égal à la somme des volumes utilisés (extraction et lavage). Ne pas ajuster le volume final même s'il y a eu des pertes.

- filtration sur filtre papier (filtration moyenne) si nécessaire.

c) Dosages.

Fe, Al, Si après dilution au 1/5 (pour limiter les inconvénients d'un milieu très chargé en sels).

d) culot d'extraction :

D'une manière générale, le culot d'extraction de sol est éliminé. Dans le cas ou ce culot doit être conservé, une attention particulière doit être apportée au moment des lavages à l'eau déminéralisée du fait de la dispersion des argiles saturées Na.

En ce qui concerne le culot d'extraction des vermiculites (minéraux tests), celui ci est récupéré et saturé après lavage en vue de l'analyse aux rayons X.

- lavage du culot d'extraction

+ laver 3 fois avec de l'eau déminéralisée

+ séparer le culot en deux fractions à peu près équivalentes (en tube de centrifugeuse)

+ procéder à la saturation finale en vue de l'analyse aux rayons X.

La saturation du culot d'extraction est réalisée conformément aux protocole d'extraction de la capacité d'échange cationique (Protocole "extraction avec KCl N" décrit ci avant).

Sur une partie du culot : saturation avec KCl normale pour vérifier la fermeture du feuillet (de 14 Å vers 10 Å)

Sur la seconde partie de culot : saturation avec MgCl2 normal pour vérifier la non destruction du minéral initial.

NB : cette saturation peut être différée. Dans ce cas, conserver la fraction saturée Na après séchage en étuve à 30°C maximum.
Extraction TAMURA

Tamura T., 1957. - Identification of the 14 Å clay mineral component. Am. Mineralogist 42, 107-110.

Tamura T., 1958. - Identification of clays minerals from acid soils. J. Soil Science, 9, 141-147.

Le nombre d'échantillons traités dans une même série est défini par la capacité maximum de la centrifugeuse utilisée. Dans notre cas, 40 tubes pour les extractions de volume inférieur à 20 ml et 24 tubes pour les extractions de volume inférieur à 50 ou 100 ml.

Un minimum de : un tube "échantillon témoin" et un tube "témoin de milieu" doivent être insérés dans chaque série pour permettre la validation des résultats.

Les gammes d'étalonnage des appareils de dosages doivent impérativement être réalisées dans le même milieu que les échantillons (après dilution). Pour cela, il est indispensable :

i) de préparer le volume total d'extractant nécessaire en une seule fois (dans un récipient unique) ce qui élimine le risque de travailler avec des solutions différentes.

ii) d'utiliser des échantillons "témoin de milieu" pour préparer les solutions étalons ce qui permet de s'affranchir de l'effet d'une pollution éventuelle du milieu d'origine.

Mode opératoire :

a) Réactif.:

tricitrate de sodium ($C_6H_5 Na_3 O_7 2 H_2O$) la solution d'extraction doit être normale et ajustée à pH 7.3 (ajout de HCl).

b) Extraction (rapport d'extraction : cf tableau pour rapport minéral / solution en fonction du type d'échantillon)

- Introduire l'échantillon (broyé modérément pour les sols) dans les pots de centrifugeuse en plastique (le choix de la capacité du tube est fonction du volume d'extractant utilisé).
- ajouter le tricitrate de Na (cf tableau pour rapport minéral / solution en fonction du type d'échantillon) et couvrir avec un doigt de gant (dispositif permettant de limiter les pertes d'eau par évaporation).

- plonger ces tubes dans un bain-marie à ébullition (l'ébullition est comptée à partir d'une température de 95°C).

- Après 1 heure d'ébullition :

+ retirer les tubes du bain-marie, enlever les dispositifs anti perte tout en les disposant de manière à les réutiliser sur le même tube lors de l'extraction suivante.

+ centrifuger (15 mn à 4500 tours).

+ récupérer le surnageant dans un pilulier en plastique.

d) Recommencer l'extraction encore deux fois. Le surnageant obtenu à la fin de la deuxième et troisième extraction est ajouté à celui de la première.

NB : Considérant que la concentration en éléments minéraux de chacune des solutions d'extraction recueillie est homogène.

Pour éliminer l'erreur liée i) au volume d'extractant qui reste dans le fond du tube de centrifugeuse ii) aux pertes éventuelles en cours de manipulation, les dosages seront réalisés sur la solution brute d'extraction. Le volume total de solution utilisable pour le dosage (et les calculs qui suivent) sera égal à la somme des volumes utilisés. Ne pas ajuster le volume final même s'il y a eu des pertes.

e) filtration sur filtre papier (filtration moyenne) si nécessaire.

f) Dosages.

Fe, Al, Si après dilution au 1/5 (pour limiter les inconvénients d'un milieu très chargé en sels).

g) culot d'extraction :
D'une manière générale, le culot d'extraction de sol est éliminé. Dans le cas où ce culot doit être conservé, une attention particulière doit être apportée au moment des lavages à l'eau déminéralisée du fait de la dispersion des argiles saturées Na.

En ce qui concerne le culot d'extraction des vermiculites (minéraux tests), celui ci est récupéré et saturé après lavage en vue de l'analyse aux rayons X.

- lavage du culot d'extraction

+ laver 3 fois avec de l'eau déminéralisée

+ séparer le culot en deux fractions à peu près équivalentes (en tubes de centrifugeuse)

+ procéder à la saturation finale en vue de l'analyse aux rayons X.

La saturation du culot d'extraction est réalisée conformément aux protocole d'extraction de la capacité d'échange cationique (Protocole "extraction avec KCl 1N" décrit ci avant).

Sur une partie du culot : saturation avec KCl normale pour vérifier la fermeture du feuillet (de 14 Å vers 10 Å)

Sur la seconde partie de culot : saturation avec MgCl2 normal pour vérifier la non destruction du minéral initial.

NB : cette saturation peut être différée. Dans ce cas, conserver la fraction saturée Na après séchage en étuve à 30°C maximum.
Annexe 5 : Composition des différents milieux utilisés pour les biotests :

Milieu Tryptic Soy Agar 10% (TSA) : 3 g de Tryptic Soy Broth et 15 g d'agar dans 1 l d'eau distillée stérile.

Milieu Potato Dextrose Agar (PDA) : 39 g de Potato Dextrose Agar dans 1 l d'eau distillée stérile.

Milieu Chrome Azurol S (CAS) : 34.63 g de Buffer Pipes Na₂ (tampon) ; 0.3 g de KH₂PO₄ ; 0.5 g de NaCl ; 1 g de NH₄Cl ; 0.246 g de MgSO₄,7H₂O ; 0.0147 g de CaCl₂,2H₂O ; 4 g de glucose ; 0.0905 g de Chrome Azurol S ; 0.0024 g de FeCl₃ ; 0.1640 g de HDTMA et 15 g d'agar dans 1 litre d'eau ultra-pure stérile.

Milieu Tri Calcium Phosphate (TCP) : 5 g de NH₄Cl ; 1 g de NaCl ; 1 g de MgSO₄ ; 10 g de glucose ; 20 g d' agar ; 4 g de Ca₃(PO₄)₂ dans 1 litre d'eau ultra-pure stérile.

Milieu Luria Bertani (LB) : 10 g de tryptone peptone Difco ; 5 g de Bacto yeast ; 10 g de NaCl.

Milieu Busnell-Hall modifié (BHm) : 20 mg de KCl ; 150 mg de MgSO₄, 7H₂O ; 80 mg de NaH₂PO₄ ; 2H₂O, 65 mg de (NH₄)₂SO₄ ; 100 mg de KNO₃ ; 20 mg de CaCl₂.
# Annexe 6 : Protocole d'échantillonnage des mycorhizes S. citrinum et du sol global.

## Première étape : observation de la pousse et choix des carpophores de Scleroderma citrinum.

Repérer les carpophores de S. citrinum qui sont jaunâtres et ont un diamètre d'une dizaine de centimètres. Afin d'être utilisables pour cette collection, ces carpophores doivent se trouver dans le peuplement ou en bordure (1 à 2 m maximum mais vérification que ce sont bien des racines de l'essence voulue). Choisir entre trois et cinq carpophores, dont les extrêmes géographiquement sont distants de plusieurs mètres, en vérifiant la présence de mycorhizes. Ces mycorhizes sont de couleur blanc, beige, jaunâtre et ont une odeur caractéristique.

## Deuxième étape : Echantillonnage du sol global et des mycorhizes avec leur sol adhérant.

Elimination de la litière et du sol sur 5 cm. En effet, cette collection ne sera réalisée que dans l'horizon 5-10 cm (minéral).

Recherche des morphotypes de mycorhizes S. citrinum sur les racines.

Collecter 20 à 30 mycorhizes par carpophore (si possible) et les mettre dans un sac. Recouvrir les mycorhizes avec un peu de sol et fermer hermétiquement.

Prélever du sol global dans la même zone et placer dans un sac que l'on ferme hermétiquement.

Penser à baliser la zone de prélèvement et numéroter les carpophores. Tous les prélèvements sont replacés sur un plan et les sacs contenant les échantillons sont numérotés. Par exemple le sac contenant les mycorhizes prélevées sous le carpophore numéro 3 sera indexé PM3. Le sol global prélevé à proximité du carpophore 3 sera indexé PN3.

Conserver tous les d'échantillons dans une glacière.

Collecter les carpophores sous lesquels ont été effectués les prélèvements et les rapporter au laboratoire dans une glacière.
# Annexe 7 : Protocoles de préparation des inocula bactériens et fongiques.

❖ Préparation d'un inoculum bactérien pour les biotests en boîtes de Petri, en microplaques et pour les expériences en colonnes.

1) Réalisation d'étalements trois secteurs : LE VENDREDI (J0)

A l'aide d'un cure-dent, on étale à trois densités différentes, une souche bactérienne pure conservée au congélateur à -80°C, sur une boîte de Petri contenant du milieu TSA 10%. Les boîtes sont placées en chambre de culture à 25°C et à l'obscurité durant 2 jours et demi.

2) Réalisation d'un tapis bactérien : LE LUNDI (J+3)

On prélève des bactéries dans le secteur le plus dense à l'aide d'un râteau.

On place ces bactéries dans un tube à bouchon rouge contenant 2 ml d'EUP stérile.

On homogénéise la solution en la vortexant.

On prélève 20 microlitres de cette solution que l'on inocule au centre d'une boîte de Petri contenant du milieu TSA 10%.

On étale cette goutte à l'aide d'un râteau (mouvement de rotation de la boîte jusqu'à ce que le râteau colle au milieu).

Les boîtes sont placées en chambre de culture à 25°C et à l'obscurité durant 2 jours et demi.

3) Préparation de la solution bactérienne : LE JEUDI (J+6)

On injecte sur la boîte de Petri 2 ml d'EUP stérile et à l'aide d'un râteau, on récupère le maximum de bactéries (tapis bactérien).

On récupère la solution dans un tube eppendorf.

On centrifuge 10 minutes à 14000 tours/minutes.

On retire le surnageant, on ajoute 100 microlitres d'EUP stérile et on homogénéise.

On centrifuge 10 minutes à 14000 tours/minutes.

On retire le surnageant, on ajoute 100 microlitres d'EUP stérile et on homogénéise.

On centrifuge 10 minutes à 14000 tours/minutes.

On retire le surnageant, on ajoute 100 microlitres d'EUP stérile et on homogénéise.

On prélève 20 microlitres de cette solution bactérienne concentrée que l'on dilue dans 2 ml d'EUP stérile (dilution 100X) dans un tube à bouchon rouge.

On mesure la DO de cette solution diluée 100X.

On calcule la concentration bactérienne dans cette solution : $S_0 = 10^{(8.3+DO)}$.
On calcule le facteur de dilution à utiliser pour obtenir une solution bactérienne dont la concentration est de $10^{7.6}$ : $F = (100*10^{(8.3+DO)})/10^{7.6}$.

On calcule la quantité de solution bactérienne concentrée Q à ajouter à la quantité d'EUP stérile nécessaire pour l'inoculum X (cette quantité est fonction du volume de substrat à inoculer) afin d'avoir une concentration de $10^{7.6}$ UFC/ml : $Q = X/F$.

### 4) Inoculation : LE JEUDI (J+6)

Pour l'expérience en microplaques, on inocule 20 microlitres de la suspension ainsi préparée dans chaque puits.

Pour l'expérience en colonnes, on inocule 1.8 ml de la solution bactérienne précédemment définie dans chaque colonne.

En parallèle, on réalise des étalements au Spiral system de la suspension bactérienne dans quatre boîtes de Petri contenant du milieu TSA 10%, afin de vérifier la quantité de spores inoculée dans les colonnes.

## Préparation d'un inoculum fongique pour les expériences en colonnes.

### 1) Repiquage des implants : LE VENDREDI (J+0)

On prélève à l'aide d'une pince un morceau de champignon contenu dans le tube (glycérol) de la collection et conservé au frigo à 4°C. On le dépose sur du milieu PDA (39 g.l⁻¹ of Potato Dextrose Agar from Difco) recouvert d'une membrane de cellophane qui a été précédemment bouillie dans de l'eau ultra-pure contenant de l'EDTA (372 mg.l⁻¹) durant 15 minutes et lavée abondamment avec de l'eau ultra-pure puis stérilisée deux fois par autoclavage. Les boîtes sont placées en chambre de culture à 25°C et à l'obscurité durant 7 jours.

### 2) Repiquage des implants : LE VENDREDI (J+7)

A l'aide d'un emporte-pièce de 6 mm de diamètre, on prélève un morceau de champignon en périphérie de la colonie et on le transfert au centre d'une boîte de Petri contenant du milieu PDA recouvert d'une membrane de cellophane traitée identiquement à la première phase. Les boîtes sont placées en chambre de culture à 25°C et à l'obscurité durant 6 jours.

### 3) Préparation de l'inoculum fongique : LE JEUDI (J+13)

Récupération des spores sur le milieu PDA en injectant 10 ml d'EUP stérile sur chaque boîte puis on mélange les 40 ml prélevés dans un tube à bouchon vert. Par la suite, on réalise des
comptages au microscope, du nombre de spores par millilitre de la suspension fongique à l'aide de lames de Malassez. On réalise des dilutions afin d'obtenir une concentration d'environ 1000 spores par millilitre.

## 4) Inoculation : LE JEUDI (J+13)

Inoculation de 1.8 ml de suspension fongique dans les colonnes.

En parallèle, on inocule 100 µl de la suspension fongique dans une boîte de Petri contenant du milieu PDA afin de vérifier la quantité de spores inoculée dans les colonnes.

### ❖ Préparation de plants de pin mycorhizés pour les expériences en colonnes.

On prépare un mélange tourbe (tamisée à 1 cm) – vermiculite en proportions 50-50. Ce mélange est légèrement humidifié.

On mélange l'inoculum de *Laccaria bicolor* S238N (bocaux) avec le substrat tourbe – vermiculite en proportion 10% d'inoculum pour 90% de substrat. On dépose 4 graines par godet que l'on recouvre de 2-3 mm de substrat sans tasser.

Les plaques sont placées en serre pendant deux mois.
# Annexe 8 : protocole de l'expérience d'interactions champignon – phlogopite en boîtes de Petri.

1) Stérilisation de la phlogopite 0.5-1 mm par ionisation.

2) – Préparation des milieux

- Milieu sur lequel on va déposer le champignon:
pour un litre, 1.250 g de (NH₄)₂SO₄ ; 0.869 g de NaH₂PO₄·2H₂O ; 0.050 gr. de CaCl₂ ; 0.1 ml de solution d'oligoéléments Kanieltra (6.0 g/l de fer, 0.27 g/l de molybdène, 8.45 g/l de bore, 5.0 g/l de manganèse, 0.625 g/l de Cu, 2.27 g/l de Zn) ; 1 ml de thiamine HCl à 100 mgr. par litre ; 1 ml de biotine à 5 mg par litre ; 1 g de glucose anhydre et 20 g d'agar.

- Milieu sur lequel on va déposer le minéral:

5 g de glucose et 20 g d'agar

Les deux solutions sont mises à l'autoclave 20 minutes à 120°C.

3) Préparation de la cellophane:

Faire bouillir les membranes prédécoupées dans un bain d'EDTA à 372 mg par litre d'eau ultra-pure pendant 15 minutes.

Bien rincer les membranes à l'eau ultra-pure.

Autoclaver 2 fois 20 minutes à 120°C les membranes rincées dans de l'eau ultra-pure dans une boîte de Petri en verre.

4) Coulage des milieux

Coulage des 2 milieux dans les deux compartiments de la boîte de Petri en prenant soin que la quantité de milieu déposée arrive à la limite de la barrière centrale afin qu'il y ait le moins de dénivelé possible.

5) Pose de la cellophane sur le milieu eau gélosée.

6) Dépôt de 25 mg de phlogopite sur la cellophane en utilisant un système permettant de répartir de manière homogène le minéral sur le milieu.

7) Repiquage de 5 mycélia de champignons espacés de 5 mm et à 5 mm du milieu eau gélosée.
8) Laisser incuber à 25°C durant 105 jours.

9) Echantillonnage des minéraux :

Mettre le champignon dans un tube à bouchon rouge contenant 2 ml d'EUP stérile et vortexer
30 secondes à puissance maximale afin de détacher les minéraux du champignon.

10) Réalisation de dépôts orientés sur des lames à partir du minéral prélevé. Analyses par diffractométrie de rayons X des particules de phlogopite.
# Alteration of Chrysotile in the Rhizosphere of the Nickel Hyperaccumulator *Leptoplax emarginata*

Vanessa Chardot¹, Guillaume Echevarria¹, Christophe Calvaruso², Marie-Pierre Turpault², Jean-Louis Morel¹

¹Laboratoire « Sols et Environnement », ENSAIA/INRA-INPL, 2, avenue de la Forêt de Haye, BP 172, 54505 Vandoeuvre-Lès-Nancy, Cédex, France; ²Laboratoire « Biogéochimie des Ecosystèmes Forestiers », UR INRA 1138, Centre INRA de Nancy, 54280 Champenoux, France.

## ABSTRACT

Ni phytoextraction processes need further understanding of the relationships between Ni availability in soils and its absorption by plant roots. It was established that both the efficient metal uptake and the release of organic ligands (citrate or malate) by several hyperaccumulator species could accelerate the weathering process of Ni-bearing phases in the rhizosphere. Columns experiments were performed to assess the effect of *L. emarginata* and the contribution of both rhizobacteria and organic acids on the dissolution rate of the Ni-bearing chrysotile (low-available Ni source). Mineral weathering was monitored by measuring Ni and Mg contents leached and absorbed by plant along the experiment. *L. emarginata* increased more than 2-fold chrysotile dissolution and more than 7-fold Ni mobilization. Inoculation of Ni-resistant bacteria in the rhizosphere of *L. emarginata* showed no significant changes on chrysotile dissolution in this context. But, citric acid treatment (without plant) increased about 1.5-fold chrysotile dissolution rate and so its exudation by *L. emarginata* could be involved for Ni uptake. Finally, after 15 weeks of culture, up to 2.00 % of the total Ni content of the system was mobilized in the plant treatments compared to 0.03 % in the control treatment. Moreover, 88 % in average of total mobilized Ni was removed by the hyperaccumulator *L. emarginata*.

## INTRODUCTION

The mineralogy of serpentine soils largely depends on the geochemistry and the mineralogy of the ultramafic parent rock e.g. serpentinized peridotite. Current minerals in these soils are
serpentine with global formula Mg₃Si₂O₅(OH)₄, or others silicates such as talc, smectite, chlorite, and Fe oxides such as goethite or magnetite (1, 2). Chrysotile is one type of serpentine minerals. It is a trioctahedral hydrous phyllosilicate based on a 1:1 layer structure: one Si-occupied tetrahedral layer is bonded to one Mg-occupied octahedral layer (brucite) (3). Chrysotile is easily recognizable compared to the others species of the serpentine group (i.e. lizardite and antigorite) because of its typical fibrous form which is due to elementary cross-fiber associations (4). In serpentinic soils, serpentine dissolution releases Mg and Si to the soil solution. Translocation and concentration of these serpentine dissolution products can result in neoformation of a low-charge, Mg-rich dioctahedral smectite (5). Mg release from chrysotile exhibits smaller pH dependence than observed for cation release from other silicate and oxide minerals. This suggests that Mg hydroxide is more easily dissolved than minerals such as aluminium oxide, and that attack by H₂O and H⁺ are both important in chrysotile dissolution. The dissolution rate of chrysotile suspended in a 0.1 mol l⁻¹ inorganic electrolyte at pH 8 is 10⁻¹⁵.⁷ mol cm⁻² s⁻¹ (6). The dissolution rate of chrysotile is however limited with time. The initial rate for Mg release is of the same order of magnitude as that for brucite dissolution in the pH 7.5-8.5 (i.e. 10⁻¹³ mol cm⁻² s⁻¹). The gradual decline in rate with time could in part reflect a decrease in the total number of surface Mg sites as well as a decrease in the number of higher energy sites created during sample preparation (6). In weak complexing environments (e.g. oxalic acid at 10⁻⁶ or 10⁻⁴ M), Mg lixiviation largely slows down because of the development of a superficial hydrated silica layer (4, 7).

Serpentine soils often contain large amounts of Ni, included for example in serpentine minerals trough substitutions with Mg. The rich-Mg biogeochemistry and the high available metal contents of these soils often conduct to distinctive or unique plant communities such as hyperaccumulator species. Hyperaccumulators can actively take up metals from the soil and accumulate them to extremely high levels in shoots (> 1000 mg kg⁻¹ for Ni) (8, 9). Phytoextraction is a cheap and non-destructive strategy consisting of making successive croppings of these plants to achieve stabilization and/or decontamination of metal polluted soils. The optimization of this process largely depends on metal phytoavailability in soils and on the plant's potential to produce biomass and to extract metal (10, 11, 12). It was established that both the efficient metal uptake and the release of organic ligands (citrate or malate in particular) by several hyperaccumulator species could accelerate the weathering process of Ni-bearing phases in the rhizosphere (13, 14). Plants usually absorb Ni from the soil solution as the free hydrated ions Ni²⁺ (15, 16). Ni availability largely depends on Ni speciation: Ni is more available for plants when it is located on border sites of minerals,
especially amorphous iron oxides (17). Recently, the hyperaccumulator species *Thlaspi caerulescens* J & C Presl and *Alyssum murale* Waldst. & Kit., despite their high metal uptake, were shown to extract Ni only from the labile pool in soils i.e. the pool of isotopically-exchangeable ions (11, 18). However, many studies showed that plants could accelerate mineral weathering. For example, goethite (Fe-hydroxide) weathering, except for alkaline pH, was promoted by plant root exudations of organic compounds (citrate or malate) (19) and plagioclase dissolution rates in solutions containing organic acids were enhanced up to ten times more than the rates determined in solutions containing inorganic acids, at the same acidity (20). A strong correlation between the levels of Ni and citric acid in the leaves of several New Caledonian hyperaccumulators species was found (21). And, high Ni accumulation in shoots of ryegrass was closely related to high xylem transport rates of Ni and to accumulation of citric and malic acids (22). Moreover, rhizospheric interactions between plant roots and microorganisms seem to play a major role in increasing the weathering of minerals (23, 24, 20) and consequently improving plant nutrition (25). Specific microflora of hyperaccumulators could have significant impact on Ni mobilization and so on Ni absorption by plants. Re-inoculation of seeds of *A. murale* grown in nonsterile soil with its specific rhizobacteria increased Ni-uptake into shoot up to 30 % compared to uninoculated controls (26). These results show that rhizobacteria, hyperaccumulator performance and Ni speciation in soils are all important factors for the optimization of phytoextraction. Currently, the relationships between these parameters are still seldom studied and would need further understanding.

*Leptoplax emarginata* (Boiss.) O.E. Schulz is an efficient Greek Ni hyperaccumulator endemic to serpentine soils recently studied for its phytoextraction potential (12). This plant shows high capacities to accumulate Ni in its aerial parts, especially because of its high biomass production. Consequently, it seems to be a potential species for phytomining. This work was undertaken to show whether *L. emarginata* was able to enhance Ni-bearing mineral dissolution in the case of low availability of Ni. We studied the impact of *L. emarginata* on the weathering of chrysotile, a low-available Ni source, in two columns experiments. The first one consisted in the evaluation of the role of *L. emarginata*, and also the role of inoculated Ni-resistant bacteria, in Ni mobilization and its consequences on the absorption by the hyperaccumulator plant. The second one consisted in the estimation of the contribution of an organic acid potentially released by hyperaccumulator roots (i.e. citric acid) on chrysotile dissolution.