## IV. Les microplastiques

En 2014, alors que mon recrutement au laboratoire MMS date de près de 4 ans, l'idée de développer un nouveau champ d'investigation dans la thématique écotoxicologique de l'équipe ECEm me traverse l'esprit. Afin de m'insérer dans la mouvance écotoxicologique du moment, je me lance dans l'écriture d'une réponse à appel à projets ANR JCJC sur les microplastiques appelé MIPPOP pour « *MiCroPlastic and POP pollution: exposure, bioaccumulation and biological effects on Mytilus edulis* », que j'ai soumise à candidature en septembre 2014 en tant que porteuse du projet.

Malheureusement, cette proposition n'a pas passé le premier tour des sélections de l'ANR. Au sein de l'équipe, nous décidons de la retravailler pour la soumettre à l'appel à projets pari scientifique régional. Pour des raisons politiques et stratégiques, le projet MiPlAqua pour « Approche combinée terrain/laboratoire pour l'évaluation de l'impact des microplastiques sur des organismes aquatiques d'intérêt socio-économique (moules, huîtres) » a été déposé sous la tutelle de l'Université Catholique de l'Ouest, Catherine Mouneyrac devenant la porteuse. Dans le même temps, Nam Ngoc Phuong, l'étudiant vietnamien que j'ai encadré en stage de Master 2, m'annonçait son souhait de réaliser une thèse, que je co-encadrerai, sur un sujet libre étant donné qu'il bénéficiait d'une bourse du gouvernement de son pays d'origine. Après discussion au sein de l'équipe, nous lui avons proposé de travailler sur les microplastiques afin de pouvoir initier ce volet de recherche. Finalement, le projet MiPlAqua, envisagé pour 3 ans, a été retenu par la région Pays de la Loire et la bourse de thèse de Nam Ngoc Phuong est venue en complément de ce financement. Le projet a débuté en milieu d'année 2015 alors que Nam Ngoc Phuong avait commencé à travailler sur le sujet en janvier, en rédigeant notamment une revue d'articles. Les volets que comportait ce projet étaient : (i) l'évaluation de la contamination en microplastiques de la zone côtière régionale au niveau des sédiments des vasières intertidales et de 2 espèces d'intérêt socio-économique que sont la moule bleue (*Mytilus edulis*) et l'huître creuse (*Crassostrea gigas*), (ii) l'exposition en laboratoire de ces espèces afin d'évaluer les effets de ces contaminants et (iii) l'adsorption de molécules organiques à leur surface pour évaluer leur rôle de vecteur de contamination organique (Phuong, 2018).

Ce troisième chapitre est donc consacré à ces contaminants émergents, avec une première partie qui les présente, une deuxième partie qui traite de la mise au point de méthodes d'analyse des microplastiques contenues dans une espèce marine : la moule, et dans les sédiments des vasières intertidales, pour finir avec une dernière partie qui expose la contamination des moules, des huîtres et des sédiments collectés sur le littoral de la région des Pays de la Loire.
IV.I. Présentation des microplastiques

Comme le montre la Figure 27, l'arrivée des microplastiques dans le champ d'investigation des scientifiques du domaine environnemental est beaucoup plus récente que celle des HAP, mais également que celle des nanoparticules métalliques. L'engouement de la communauté scientifique pour ces contaminants émergents commence à se voir en 2015, année à partir de laquelle le nombre d'articles scientifiques à leur sujet a dépassé la centaine par an dans les domaines de l'environnement, la biologie, la chimie, la médecine, la toxicologie de Science Direct. Ces deux dernières années, le nombre d'études sur les microplastiques a généré près du double d'articles par an. Il est passé de 340 articles en 2017 à 615 en 2018. La compétition est rude avec une nécessité de veille scientifique constante et une valorisation des résultats rapides.

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 27 : Nombre d'articles référencés par année dans Science Direct avec [ microplastic ^ environment ] dans le corpus titre/mots clés/résumé (27/01/2019)</figcaption></figure>

D'un point de vue définition, les scientifiques s'accordent pour dire que les microplastiques sont constitués de différents matériaux plastiques ayant une taille inférieure à 5 mm (Arthur et al., 2009). Ils sont issus deux principales sources. La source primaire correspond aux microplastiques utilisés par l'homme en tant que tel, sous la forme de fibres, de granulés ou de microbilles qui peuvent être incorporés dans de nombreux produits cosmétiques par exemple, comme des dentifrices, des crèmes de gommages, etc. (Andrady, 2011). Cette source de contamination primaire a été réglementée dans les cosmétiques à rincer. En France, les microbilles de plastiques ont été interdites dans la loi sur la biodiversité de juillet 2016 et la mesure a pris effet au 1er janvier 2018. Même si la source de contamination primaire n'est pas négligeable, elle commence à être considérée avec une volonté politique de la limiter, alors que la source secondaire semble être beaucoup plus préoccupante. En effet, la source de contamination secondaire correspond au fractionnement des déchets plastiques qui se trouvent dans les milieux naturels (Andrady, 2011 ; Costa et al., 2010 ; Zettler et al., 2013).

Le plastique entre dans la composition de la plupart des objets de notre quotidien, leur
production mondiale atteint plusieurs centaines de millions de tonnes chaque année, avec une
croissance d'année en année. Ce matériau présente de nombreux avantages, comme leur faible
coût de production, leur légèreté, leur résistance à l'eau, la corrosion, leur inertie chimique, leur caractère isolant thermique et électrique, etc (Andrady and Neal, 2009). Cependant, les objets plastiques sont également difficilement recyclables et des quantités de l'ordre de la dizaine de millions de tonnes arrivent dans les océans chaque année, formant pour près de 60 à 80 % des plaques de déchets, en certains endroits du globe, comme celle appelée le septième continent dans le nord de l'océan pacifique, qui a une superficie de plus de 3 fois celle de la France. Une fois dans le milieu, les déchets plastiques sous l'action mécanique (vents, courants marins, etc.), chimique (eaux, rayonnements UV, etc.) et biologique (biodégradation) se déforment et se fragmentent. Ce fractionnement de plus en plus prononcé entraîne la formation de microplastiques (Andrady, 2011 ; Costa et al., 2010 ; Zettler et al., 2013) qui attirent autant l'attention des scientifiques ces 3 dernières années, et pour cause.

Une fois sous une taille micrométrique, les plastiques flottants peuvent évoluer sur de longues distances grâce aux courants et aux vents marins atteignant les plages, alors que les plastiques qui coulent s'accumulent plutôt dans le fond des milieux aquatiques, au niveau des sédiments (Engler, 2012; Thompson et al., 2009). Les organismes aquatiques sont alors exposés à ces microplastiques qui ont la caractéristique d'être ubiquistes et persistants. En fonction de leur taille, leur forme, leur couleur, leur nature, les microplastiques peuvent être ingérés par les organismes (Desforges et al., 2015; Mathalon and Hill, 2014; Van Cauwenberghe and Janssen, 2014). Certains organismes s'imprègnent de ces microplastiques inévitablement, alors que d'autres s'alimentent volontairement de ces derniers à cause d'une confusion avec leur alimentation habituelle. Des phénomènes de déjection ou d'accumulation apparaissent. L'impact potentiel de ces microplastiques sur l'environnement est méconnu. Ils pourraient être une menace pour les organismes et les écosystèmes marins, tout comme un risque pour la santé de l'homme, étant donné que celui-ci consomme de nombreux produits de la mer de façon régulière.

Une autre problématique environnementale des microplastiques est leur rôle de vecteur de contamination organique et métallique (Ogata et al., 2009 ; Rios et al., 2007 ; Teuten et al., 2007). Ce phénomène peut être étudié sous 2 angles bien distincts. Le premier angle consiste à considérer que des additifs sont ajoutés aux plastiques, dans la plupart des cas, et à des hauteurs variables dès leur fabrication. Ces additifs vont jouer un rôle sur l'esthétisme, la stabilité, le coût, la plasticité, l'ignifugation, etc. Ils peuvent être de nature organique, comme les phtalates, le bisphénol A, les retardateurs de flamme bromés (polybromodiphénylethers : PBDE, hexabromocyclododécane : HBCD) déjà connus et recherchés dans l'environnement à cause de leur caractère perturbateur endocrinien. Une fois sous l'action mécanique, chimique et biologique du milieu naturel, les plastiques se fractionnent et les additifs contenus dans ces derniers sont relargués dans le milieu et/ou dans les organismes marins. Ainsi, il existe non seulement une contamination directe et physique par les microplastiques, mais également une contamination indirecte et chimique liée au transfert des additifs du plastique vers les différents compartiments environnementaux. Le deuxième angle de considération du rôle de vecteur des microplastiques est leur caractère hydrophobe additionné à leur grande surface spécifique qui leur confère une grande capacité à sorber les contaminants organiques hydrophobes du milieu environnemental. Ce sont de véritables réservoirs mais qui restent toutefois minimes par rapport aux teneurs présentes sur la phase particulaire organique et inorganique naturelle.
## IV.2. Les difficultés de l'analyse des microplastiques dans l'environnement

De nombreuses études ont porté sur l'évaluation de la contamination en microplastiques dans les eaux et les sédiments du milieu marin. Les résultats quantitatifs globaux des eaux et des sédiments sont donnés dans les Tableaux 12 et 13 jusqu'en 2018 après mise à jour des données de la revue d'articles A19.

<table><caption>**Tableau 12 :** Résultats quantitatifs globaux de la contamination en microplastiques dans les eaux marines (47 études référencées) d'après la revue d'article A19</caption><thead><tr><th></th><th>Nombre d'études</th><th>Quantités retrouvées</th></tr></thead><tbody><tr><td>Amérique</td><td>6 en océan Atlantique<br>12 en océan Pacifique<br>1 en mer des Caraïbes</td><td>1 400 à 700 000 /km²<br>0,004 à 9 200 /m³</td></tr><tr><td>Asie</td><td>2 au golfe arabique et Qatar<br>4 au Japon, Indonésie, Chine</td><td>87 000 à 1 460 000 /km²<br>0,08 à 0,73 /m³</td></tr><tr><td>Afrique</td><td>1 en Namibie et Maroc</td><td>6 à 8,5 /m³</td></tr><tr><td>Australie</td><td>2 études</td><td>3 700 à 8 966 /km²</td></tr><tr><td>Europe</td><td>2 en mer Méditerranée<br>2 en mer du Nord<br>7 en océan Atlantique<br>8 autres mers</td><td>62 à 7.10<sup>6</sup> /km²<br>&lt; 0,04 à 700 m³<br>50 à 100 fibres/litre</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Tableau 13 :** Résultats quantitatifs globaux de la contamination en microplastiques dans les sédiments et sables marins (60 études référencées) d'après la revue d'article A19</caption><thead><tr><th></th><th>Nombre d'études</th><th>Quantités retrouvées</th></tr></thead><tbody><tr><td>Amérique</td><td>7 sur sédiment<br>7 sur sable</td><td>&lt;10 à &gt;5000/m<br>15 à 69 000 kg<br>43 à 214 /litre<br>25 à 160 /m²<br>248 /m³</td></tr><tr><td>Asie</td><td>7 sur sédiment<br>10 sur sable</td><td>37 à 1900 /kg<br>8 à 80 000 /m²<br>4137 à 26 000 /m³<br>81 mg/kg</td></tr><tr><td>Afrique</td><td>2 sur sédiment</td><td>401 à 3300 /kg</td></tr><tr><td>Australie</td><td>1 sur sable<br>1 sur sédiment</td><td>&gt;1000/m<br>3400 /L</td></tr><tr><td>Europe</td><td>21 sur sédiment<br>4 sur sable</td><td>0,3 à 6 695 /kg<br>&gt;10 à 350 /litre<br>5 à &gt;1000 /m²</td></tr></tbody></table>

Parmi les 47 études référencées dans le tableau 13 sur les milieux marins, seulement 21 mentionnent le type de plastiques, qui s'avère être plutôt du polyéthylène (PE) et du polypropylène (PP). En ce qui concerne les sédiments/sables, près de la moitié des 60 études donnent le type de microplastiques qui est principalement du PE et du PS également. Cette nature de plastique est en accord avec les quantités produites industriellement.
En s'intéressant aux valeurs données dans les tableaux, il est possible de faire deux principaux constats. Le premier est que l'unité d'expression des résultats n'est pas homogène dans toutes les études, ce qui rend difficile leur comparaison. Ces différentes unités d'expression des résultats sont dépendantes des moyens d'échantillonnage. Par exemple, pour les eaux marines, si les microplastiques sont collectés à l'aide d'un filet Manta leur nombre sera donné en fonction d'une unité de surface, alors que si des tamis et/ou des filtres sont employés alors le résultat sera exprimé par unité volumétrique. De plus, alors que le filet Manta ne retient que les particules supérieures à 330 µm, la filtration de l'eau permet de retenir des particules plus petites avec le gros inconvénient du colmatage et des quantités d'eau étudiées beaucoup plus limitées. Pour ce qui est du sédiment, les outils de prélèvements vont également varier en fonction de la zone d'étude, si elle est accessible à marée basse ou non. Ainsi, si le sédiment n'est jamais à découvert, l'utilisation d'un filet de fond ou d'une benne est indispensable, alors qu'à marée basse, le prélèvement peut se faire à la benne ou à la spatule. Les résultats seront ainsi exprimés par unité de surface (filet de fond), par unité de volume ou de masse (benne et spatule). Le deuxième constat est l'importante hétérogénéité des résultats. Il est fort probable que les contaminations en microplastiques soient dépendantes de la localisation des zones de prélèvements. Mais cette importante hétérogénéité peut aussi être attribuée aux différentes techniques de prélèvement des échantillons comme cela vient d'être discuté, aux différentes techniques de préparation d'échantillons et aux différentes méthodes analytiques qui peuvent être employées.

Les techniques de préparation d'échantillons et les méthodes analytiques employées ont également un impact sur l'hétérogénéité des résultats retrouvés dans les matrices biologiques. À ce propos, plus de 40 espèces ont déjà été étudiées et l'hétérogénéité observée est également due à des différences spatio-temporelles, inter-spécifiques et intra-spécifiques. Contrairement aux eaux marines et aux sédiments, pour ce type de matrice, les outils de prélèvement des échantillons ne seront pas une source de variabilité des résultats entre les études. De plus, les résultats sont bien souvent exprimés selon deux unités : en nombre par individu ou en nombre par masse de poids frais ou sec.

Pour revenir aux préparations d'échantillons, les points critiques se trouvent dans les différentes étapes que sont la digestion, la sédimentation et la filtration. Plusieurs réactifs (acides, bases, oxydants, enzymes, solutions hypersalines, etc.) et plusieurs filtres (nature, taille, porosité) peuvent être employés et cela impacte inévitablement le résultat final. Par exemple, certains réactifs employés lors de la digestion peuvent dissoudre les particules de nylon. Lors de l'étape de sédimentation, l'utilisation d'une solution insuffisamment dense peut entraîner la perte des microplastiques les plus denses (PVC, PET...). De même pour les filtres, si leur porosité est trop grande, il est possible de perdre les microplastiques les plus petits, mais à l'inverse, une porosité trop faible peut retenir la matière organique qui limite l'observation des filtres au microscope et l'identification des microplastiques. Les choix doivent être réfléchis en fonction du type de matrice, mais aussi en fonction de la méthode d'analyse qui suit et la procédure analytique doit être validée dans son ensemble avec des dopages.

Les principales méthodes d'analyse qui apparaissent dans la littérature sont l'observation microscopique seule ou couplée à la spectroscopie Raman ou Infra-Rouge à Transformée de Fourier (FT-IR) en mode transmission ou réflexion. À propos de ces méthodes, il s'avère que l'observation microscopique seule est insuffisante pour l'analyse des
microplastiques. En effet, dans toutes les études qui ne caractérisent pas les microplastiques, d'autres types de particules sont inévitablement comptabilisés, car il est impossible de définir la nature d'une particule en l'observant seulement, même microscopiquement. Les résultats sont surestimés et correspondent la plupart du temps aux valeurs extrêmes hautes de la littérature. En ce qui concerne la spectroscopie Raman, le principal avantage par rapport à la spectroscopie FT-IR est que la résolution est meilleure (de l'ordre du µm), ce qui conduit à l'identification de microplastiques de plus petites tailles. Malgré cet avantage, le temps d'analyse d'un filtre est extrêmement long (plusieurs dizaines d'heures), ce qui est moins le cas en spectroscopie FT-IR (environ 2 heures), même si l'identification de particules inférieures à 20 µm est impossible.

Une autre source d'hétérogénéité des résultats peut être la contamination croisée, notamment dans les études qui retrouvent de nombreuses fibres sans aller jusqu'à leur identification. Il est possible que des fibres issues des vêtements, de l'air ambiant, etc. contaminent les filtres. L'analyse de blancs négatifs, c'est-à-dire ayant subi la procédure analytique sans échantillon, est donc indispensable pour vérifier cette éventualité.

Pour finir sur cette analyse de la littérature sur l'évaluation de la contamination en microplastiques dans l'environnement, il semble indispensable que des protocoles standardisés soient mis au point et proposés à la communauté scientifique afin de pouvoir comparer les résultats les uns aux autres et véritablement pouvoir juger d'une variation spatio-temporelle de la contamination à l'échelle du globe.

Ces travaux ont fait l'objet de
1 revue d'articles : A19
1 communication orale : CO22

IV.3. La mise au point des procédures d'analyse des microplastiques

Tout comme expliqué précédemment, une attention particulière doit être apportée à la mise au point d'une procédure d'analyse des microplastiques dans les matrices environnementales. Ces mises au point ont été réalisées au laboratoire pour l'étude de la contamination en microplastiques des moules bleues (Mytilus edulis), des huîtres creuses (Crassostrea gigas) des sédiments de vasières intertidales. Le but a été de préparer l'échantillon afin de permettre l'analyse quantitative et qualitative directe des microplastiques sur filtre par microscopie couplée à un spectromètre FT-IR.

Différentes étapes se succèdent comme le montre le Tableau 14 et pour chacune d'elle, des essais ont été réalisés pour améliorer les performances de la méthode analytique.
<table><caption>**Tableau 14 :** Points testés des étapes clés de la préparation des échantillons de moules</caption><thead><tr><th>Etape de</th><th>Tests portant sur</th><th>Intérêt</th><th>Limite</th></tr></thead><tbody><tr><td>Digestion</td><td>les réactifs (HNO<sub>3</sub>, KOH, H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>...), leur volume, les temps de contact de chauffe et d'agitation</td><td>Limiter la matière organique et minérale sur les filtres facilitant l'observation microscopique et l'identification spectroscopique des microplastiques</td><td>Altération ou disparition des microplastiques</td></tr><tr><td>Sédimentation</td><td>l'ajout d'une ou plusieurs étapes de sédimentation</td><td></td><td>Élimination des microplastiques en fonction de leur densité</td></tr><tr><td>Filtration</td><td>différentes natures, porosités et tailles de filtres</td><td></td><td>Élimination des microplastiques les plus petits et adéquation avec l'analyse FT-IR</td></tr></tbody></table>

### IV.3.1 Protocole de préparation des échantillons de moules

Après différents essais, une procédure de validation par dopages avec des microplastiques de 3 types (PE, PP et polychlorure de vinyle (PVC)) et la réalisation de blancs, un protocole d'analyse des microplastiques dans les moules a été établi. Il est donné dans la Figure 28 et est publié dans l'article A22.

La moule est constituée en grande majorité de matière organique. L'étape de digestion est donc indispensable et réalisée à chaud et sous agitation dans du KOH (10%) après avoir décongelé et ôté la coquille des organismes. Le KOH s'est avéré être le meilleur compromis en termes de préservation des microplastiques et d'efficacité de digestion. Puis, une étape de multi-sédimentation suit avec l'utilisation de KI (50%) qui est une solution hypersaline, donc dense, qui permet de séparer le restant de matrice non digéré et les sables des microplastiques qui se trouvent alors dans une solution filtrée sur un filtre de nitrate de cellulose de 25 mm de diamètre et 12 µm de porosité. Ce choix de filtre a été fait en considérant la résolution de 20 µm et le fonctionnement de l'appareillage analytique en mode réflexion utilisé ensuite pour l'identification des microplastiques. Le faible diamètre permet une analyse plus rapide de sa surface.

Les taux de recouvrement des 20 microplastiques par type de plastique ajoutés à la matrice pour la validation de la méthode sont en moyenne (n = 3) de 98 ± 5%, 70 ± 21% et 85 ± 5% pour PE, PP et PVC respectivement. Dans les 3 blancs, une seule particule qui n'est pas faite de matière plastique a été retrouvée.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 28 : Procédure de préparation des échantillons de moules (d'après l'article A22)</figcaption></figure>

IV.3.2 Protocole de préparation des échantillons de sédiment

Un protocole final d'analyse des microplastiques dans les sédiments de vasières intertidales a été établi après différents essais, une procédure de validation par dopages avec des microplastiques de 4 types (PE, PP, PVC et polyéthylène téréphtalate (PET)) et des blancs.
Il a été publié dans l'article A24.

La prise d'essai de départ était de 25 g de sédiment, qui ont tout d'abord été séchés et tamisés à 1 mm après décongélation. Les deux fractions ont ensuite été analysées séparément. Contrairement aux organismes, une étape de digestion n'a pas été nécessaire. Pour ce qui est l'étape de sédimentation, elle a été réalisée à l'aide d'une centrifugation avec de l'eau milliQ, à 18°C, pendant 5 minutes à 500 tours par minute. Le surnageant récupéré à la pipette Pasteur a été filtré sur le même filtre que pour les organismes (filtre de nitrate de cellulose de 25 mm de diamètre et 12 µm de porosité), pour les mêmes raisons. Les avantages de cette méthode résident dans sa facilité de mise en place, son faible coût, son temps de réalisation limité et sa préservation de l'environnement par l'utilisation d'aucun produit chimique.

Les taux de recouvrement des 10 microplastiques par type de plastique ajoutés à la matrice pour la validation de la méthode sont en moyenne (n = 3) de 107%, 83%, 93% et 83% pour PE, PP, PVC et PET respectivement. Dans les 10 blancs, une seule particule qui n'est pas faite de matière plastique a été retrouvée.
### IV.3.3 Analyse des filtres par spectroscopie FT-IR

L'identification et la caractérisation des microplastiques présents sur les filtres issus des préparations d'échantillon, que ce soit moules ou sédiments, ont été réalisés par spectroscopie FT-IR en mode réflexion. Chaque surface des filtres a entièrement été observée microscopiquement. Puis, la taille, la couleur et la forme ont pu être déterminés pour toutes les particules observées et ayant une taille supérieure à 20 µm. Enfin, la nature de la matière plastique a été déterminée après comparaison des spectres à une bibliothèque et un score de recherche supérieur à 60%. Ce travail a donc permis de mettre en place un protocole et qualitatif et quantitatif éventuellement standardisable.

Ces travaux ont fait l'objet de

2 articles : A22 et A24

1 communication orale : CO18

2 posters : P19 et P23

## IV.4. Les microplastiques dans l'environnement côtier des Pays de la Loire

Après avoir mis au point les procédures d'analyse quantitative et qualitative des microplastiques dans des matrices biologiques et sédimentaires, elles ont été appliquées aux échantillons de sédiments, de moules, mais aussi d'huîtres, prélevés sur le littoral de la région des Pays de la Loire. Les sédiments et les huîtres ont été prélevés en trois sites : Pen-Bé, Coupelasse et le nord de la baie de l'Aiguillon (Figure 29). La répartition des moules étant plus limitée que celle des huîtres, les moules ont été collectées à deux sites seulement : Pen-Bé et la baie de l'Aiguillon.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 29 : Points d'échantillonnage de la côte de la région Pays de la Loire</figcaption></figure>
Le choix des sites a été décidé conjointement avec l'équipe d'écotoxicologie d'IFREMER Nantes qui a également participé à l'échantillonnage. En plus de la variation spatiale de la contamination, ces prélèvements ont aussi eu lieu à deux saisons : automne et printemps, afin de mettre en évidence un potentiel effet temporel. De plus, pour chaque espèce de bivalves, des individus cultivés et d'autres sauvages ont été récoltés pour étudier un potentiel effet de leur mode de vie sur leur contamination en microplastiques.

IV.4.1 Les moules et les huîtres

Les moules et les huîtres sont les matrices biologiques étudiées dans le cadre de cette étude, car elles présentent des intérêts écologiques, biologiques et socio-économiques. Les résultats sont publiés dans l'article A23. Ces espèces ont été choisies, car elles se nourrissent des matières en suspension dans l'eau par une activité de filtration importante. Elles ont une large distribution géographique, un mode de vie sédentaire, sont bien représentées et sont également consommées par l'homme. Ce sont donc de bons bioindicateurs de la qualité des eaux et la moule est déjà utilisée en tant que telle dans des réseaux de surveillance. Au niveau de la région des Pays de la Loire, ces espèces sont cultivées à hauteur de 16 000 tonnes et exportées pour une consommation nationale moyenne de 10 kg /an /habitant.

Les résultats quantitatifs des microplastiques contenus dans les moules et les huîtres sont présentés dans la Figure 30 en nombre par individu. Au total, 120 moules (par lots de 3) et 60 huîtres (individuelles) ont été analysées.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 30 : Microplastiques dans les moules (I) et les huîtres (II) en fonction du site de prélèvement, la saison et le mode de vie exprimé en nombre de microplastique par individu. Le nom des groupes d'individus est abrégé par mode de vie (Wild = sauvage et Cultivated = Cultivée) et saison (Oct = Octobre 2015 et March = Mars 2016). N = 5 et les boites à moustaches représentent le minimum, 1er quartile, médiane, 3e quartile et maximum</figcaption></figure>

Aucune différence quantitative significative n'a été observée entre les saisons d'échantillonnage et les deux ou trois sites d'échantillonnage, respectivement pour les moules et les huîtres, sur les côtes de la région Pays de la Loire, même si ces sites sont séparés d'environ 140 km. Les quantités retrouvées sont comparables à celles d'autres études antérieures, même si les protocoles de préparation d'échantillon et les méthodes d'analyse sont différents (De Witte et al., 2014, Van Cauwenberghe and Janssen, 2014, Vandermeersch et al., 2015). Mathalon and Hill (2014) ont montré différents niveaux de contamination entre des moules sauvages et
cultivées, ce qui n'est pas le cas dans cette étude, même si environ 90% des moules cultivées contenaient des microplastiques contre seulement 60% des moules sauvages. La plus grande fréquence de contamination des moules cultivées s'explique peut-être par une exposition accentuée aux microplastiques provenant de la dégradation des matières plastiques (PE, PP, polyester) utilisées en mytiliculture et conchyliculture comme des cordes, filets et tuyaux.

Au regard des résultats quantitatifs globaux, une grande variation de contamination par individu est observée entre les moules et les huîtres, avec respectivement 0,608 ± 0,564 et 2,10 ± 1,71 microplastiques par individu. Cependant, en exprimant les résultats en microplastiques par gramme de tissus mous frais, les résultats ne sont plus si différents, avec 0,228 ± 0,197 et 0,158 ± 0,160 microplastiques/g respectivement pour les moules et les huîtres. Les différences de quantités par individu de moules et d'huîtres peuvent s'expliquer par les taux de filtration qui atteignent jusqu'à 1,8 L/heure chez la moule (Clausen and Riisgard, 1996) et 5 L/heure chez l'huître (Barillé et al., 1997). En filtrant plus de deux fois plus que les moules, les huîtres sont plus exposées aux microplastiques conduisant à une plus grande bioaccumulation par individu.

En ce qui concerne les résultats qualitatifs, ils sont représentés dans la Figure 31 pour les deux espèces. Malgré une production mondiale de PVC d'environ 10% (PlasticsEurope, 2015), ce type de plastique n'est pas retrouvé dans les moules et les huîtres étudiées, ce qui est aussi montré dans la littérature. Pour les deux espèces de bivalves, les microplastiques sont en majorité des fragments et de couleur grise ce qui pourrait appuyer l'hypothèse d'une origine due à la fragmentation des déchets (source secondaire de contamination) et d'un long séjour passé dans l'environnement. En croisant les résultats sur la couleur et le type de microplastiques, tous ceux faits d'acrylonitrile butadiène styrène (ABS) sont de couleur verte. Cela pourrait signifier que ces microplastiques d'ABS proviendraient d'une même source. Ce type de plastique est généralement utilisé dans les jouets et dans l'industrie automobile. À propos de leur taille, les microplastiques sont plus grands que ceux trouvés dans des moules par Van Cauwenberghe and Janssen (2014) qui observent majoritairement des microplastiques inférieurs à 25 µm. Cette différence de tailles retrouvée dans les bivalves peut être attribuée à une contamination en microplastiques différente, mais aussi aux différentes techniques analytiques utilisées. En effet, Van Cauwenberghe and Janssen (2014) ont utilisé la spectroscopie Raman pour l'identification des microplastiques qui permet une meilleure résolution et par conséquent l'identification de microplastiques inférieurs à 20 µm, ce qui est impossible avec la spectroscopie µFT-IR.
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 31 : Analyse qualitative des microplastiques trouvés dans les moules (a) et les huîtres (b).
Distribution en fonction du type de plastique (I), de la couleur (II) et de la taille (III)</figcaption></figure>

La Figure 31 montre que le type de plastique prédominant n'est pas le même pour les deux espèces étudiées (Figure 31 : Ia et Ib). Chez la moule, il s'agit du PP, puis de PE, tandis que l'inverse est observé chez l'huître. Une autre différence notable est l'abondance de microplastiques faits d'ABS dans les huîtres (15%) par rapport aux moules (2%). La comparaison des tailles (Figure 31 : IIa et IIb) montre que la proportion de microplastiques de 50 à 100 µm est similaire aux deux espèces (environ 50%) et qu'une inversion est observée pour les autres gammes de taille : les plus petits (de 20 à 50 µm) étant plutôt observés chez la moule et les plus gros (> 100 µm) chez l'huître. Ces différentes distributions de tailles entre les espèces peuvent s'expliquer par la taille des individus (longueur de la coquille de 4,42 ± 0,48 et 9,60 ± 1,53 cm respectivement pour les moules et les huîtres). Les huîtres possèdent de plus grandes branchies et palpes labiaux qui conduisent probablement à leur imprégnation en de plus grosses particules que les moules. De plus, les plus gros microplastiques retrouvés dans les bivalves mesurent 400 et 1300 µm pour les moules et les huîtres respectivement. Néanmoins, ils devaient être probablement situés à l'extérieur des organismes, car il semble impossible que de si gros fragments puissent pénétrer les branchies et les palpes labiaux.
Enfin, comme pour le volet quantitatif, le site d'échantillonnage, la saison, le mode de vie, ou les combinaisons de ces facteurs, n'ont pas d'effet significatif sur les résultats qualitatifs des microplastiques chez les bivalves.

IV.4.2 Les sédiments

Dans un second temps, les contenus en microplastiques des sédiments issus des mêmes sites que les bivalves, collectés aux mêmes saisons, ont été étudiés.

La prise d'essai en sédiment qui était en adéquation avec la procédure d'analyse était de 25 g. Etant donné qu'elle n'est pas très élevée et limitée à cause de l'étape de centrifugation, une première étude a porté sur la détermination du nombre de réplicats nécessaires à une bonne représentativité des résultats. Ainsi, 20 prises d'essai d'un sédiment échantillonné pris au hasard ont été analysées et la moyenne des réplicats a été calculée après l'ajout successif des résultats de chacune des prises d'essai. La Figure 32 illustre ce qui en résulte et montre qu'il faut au moins 10 réplicats pour assurer une bonne représentativité.

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 32 : Moyenne du nombre de microplastiques trouvé dans le sédiment en fonction du nombre de prises d'essai de 25 g analysé</figcaption></figure>

Après avoir pris en compte le nombre de réplicats nécessaire à une bonne représentativité et avoir fait l'analyse des 10 prises d'essai par échantillon de sédiment, des résultats quantitatifs ont été obtenus pour chaque site et saison et sont présentés dans la Figure 33. Au total, une moyenne de 67 ± 76 microplastiques par kg de sédiment sec a été trouvée. Comme pour les bivalves, aucune influence significative spatiale ou temporelle n'a été mise en évidence.
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 33 : Abondance des microplastiques dans les sédiments du littoral de la région Pays de la Loire en 3 sites (Pen Bé, Coupelasse, baie de l'Aiguillon) en octobre 2015 (October) et mars 2016 (March), exprimé en nombre par kg de sédiment sec. N = 10 et les boites à moustaches représentent le minimum, 1er quartile, médiane, 3e quartile et maximum</figcaption></figure>

Au niveau qualitatif, les formes des microplastiques retrouvées étaient principalement des fragments à 84% contre 16% de filaments. Les informations collectées sur la nature du polymère, la taille est la couleur sont reportées sur le Figure 34.

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 34 : Analyse qualitative des microplastiques trouvés dans les sédiments. Distribution en fonction du type de plastique (I), de la couleur (II) et de la taille (III)</figcaption></figure>

Un total de dix polymères différents a été retrouvé, parmi lesquels PP et PE sont prédominants, 38% et 24% respectivement. Puis, le PVC, et le polystyrène représentent 9% chacun. Cette composition globale montre une contamination de diverses origines qui semble illustrer la production mondiale et européenne de matières plastiques.
Par ailleurs, il est important de souligner que la présence de microplastiques de PP et PE n’était pas forcément attendue dans les sédiments puisque ce sont des matières plastiques moins denses que l’eau qui devraient flotter. La colonisation de la surface des microplastiques par les microorganismes et les algues, l’adsorption de matières organiques, leur agrégation sont autant de facteurs susceptibles d’augmenter leur densité et engendrer leur sédimentation. En 2015, Enders et al. ont également montré que le processus de sédimentation des microplastiques de taille inférieure à 100 µm peut arriver naturellement, quelle que soit la nature du plastique.

En ce qui concerne la couleur, celles qui étaient prédominantes étaient le gris (60%) et le blanc (13%) qui montre peut-être que les microplastiques se décolorent dans l'environnement. Huit autres couleurs ont également été observées (rouge, vert, noir, bleu, rose et jaune).

Pour ce qui est de la taille, la plus petite taille de particule était la largeur d'une fibre de 40 µm. La majorité des microplastiques avait une taille comprise entre 50 et 100 µm, atteignant 48%. Peu de microplastiques de grande taille ont été observés ce qui corrobore les études de modélisation réalisées sur le transport et la distribution des microplastiques dans le milieu marin en fonction de leur taille (Enders et al., 2015).

Ces travaux ont fait l'objet de

2 articles : A23, A24

3 communications orales : CO23, CO24 et CO25

## IV.5. Bilan sur les microplastiques

L'étude bibliographique réalisée sur les microplastiques et valorisée sous la forme d'une revue d'articles a permis de mettre en évidence une grande disparité des résultats reportés sur la contamination environnementale en microplastiques. La grande diversité des méthodes employées pour caractériser la contamination ne permet pas de comparer spatialement les résultats, en mettant par exemple en évidence l'influence de facteurs abiotiques (courants marins, distance de la côte, pression de contamination, etc.). Il semble évident que des standardisations de méthodes sont nécessaires.

Les études expérimentales menées jusqu'ici contribuent à la mise au point de méthodes d'analyse des microplastiques avec toutes les difficultés impliquées au niveau de la digestion de la matière organique, la séparation des microplastiques par densité, la filtration sur des filtres de taille de pores suffisamment petits et l'analyse spectroscopique finale. Deux protocoles sont proposés pour les matrices biologiques et sédimentaires. Celui applicable aux sédiments des vasières intertidales présente l'avantage d'être rapide, facile à mettre en œuvre et respectueux de l'environnement. Cependant, le protocole pour les moules et celui pour les sédiments marins ne sont probablement pas applicables à d'autres types de matrices biologiques comme le poisson ou d'autres sédiments, notamment terrestres.

L'application des protocoles a contribué à l'évaluation de la contamination en microplastiques du milieu côtier de la région des Pays de la Loire, qui n'avait pas encore été investigué. Même si aucune influence spatiale et temporelle n'a été démontrée sur la contamination, peu d'études de la littérature avaient déjà combiné ces deux facteurs. Une autre
originalité des travaux se trouve dans la comparaison des deux espèces de bivalves : moules et huîtres. Ainsi, une différence de la distribution des classes de taille a pu être observée, en concordance avec la taille des individus étudiés, ce qui permet de conclure à une complémentarité de l'étude des deux espèces. En comparant les résultats obtenus pour les compartiments biologique et sédimentaire, les distributions de taille sont également différentes entre les compartiments, ce qui laisse suggérer une potentielle filtration sélective des petits microplastiques (<100 µm) par les bivalves. Ces derniers présentent aussi une accumulation plus importante que le sédiment, ce qui permet de dire que ce sont de bons bioindicateurs de la contamination en microplastiques du milieu marin. Les matières plastiques prépondérantes étaient le PP et le PE, avec une proportion notable d'ABS particulièrement dans les huîtres. Cependant, la variété importante de matières plastiques, de couleurs et de tailles permet difficilement de déterminer la source de ces microplastiques. Seule la forme de fragment apparaît comme un critère relativement constant, quelle que soit la matrice étudiée.

Finalement, les moules et les huîtres étant consommées par l'homme, ces études participent à l'évaluation de son exposition aux microplastiques par voie alimentaire. En considérant une consommation de ces deux espèces à hauteur de 10 kg/an/habitant, une valeur approximative de 240 microplastiques/an/habitant peut être calculée.

Ce chapitre sur la présentation des principaux résultats obtenus durant mes activités de recherche étant achevé, je vais présenter les axes de recherche vers lesquels je souhaite me diriger dans le troisième et dernier chapitre de ce dossier de demande d'Habilitation à Diriger des Recherches.
Troisième partie :

Projets de recherche à venir associés à leur contexte

# DES SOURCES DE CONTAMINATION À L'ÉVALUATION DE LA QUALITÉ DES MILIEUX
Le premier chapitre de ce dossier de demande d'Habilitation à Diriger des Recherches a permis de présenter mon CV, associé à mes activités d'enseignement et de recherche. Puis, dans le second chapitre, j'ai exposé les principaux résultats obtenus en termes de contamination environnementale par 3 grandes familles de contaminants : les HAP, les nanoparticules métalliques et les microplastiques. Dans ce troisième et dernier chapitre, je vais maintenant présenter les axes de recherche sur lesquels je projette de travailler à court, moyen et long terme. Ces axes seront présentés selon trois principaux projets auxquels j'associerai leur contexte pour ceux qui ont déjà été initiés. Le premier axe traitera du continuum terre-mer auquel je souhaiterais m'intéresser afin de mieux caractériser les transferts des contaminants continentaux vers le milieu estuarien, voir côtier in fine. Puis, la deuxième partie présentera des travaux qui seront réalisés sur des contaminants émergents qui n'étaient encore pas analysés au laboratoire : les terres rares. Pour terminer, je présenterai un projet novateur de développement de la spectroscopie proche infrarouge (SPIR) comme outil de caractérisation de la qualité des milieux environnementaux en s'intéressant aux sédiments et aux organismes marins de type bivalves.

# I. Projet continuum terre-mer

Après avoir caractérisé la contamination des zones estuariennes en HAP et des zones côtières en microplastiques, l'idée qui a suivi était d'essayer de mieux comprendre et d'évaluer l'apport continental en ces contaminants. C'est ainsi que nous nous sommes associés au Laboratoire Eau et Environnement (LEE) de l'IFSTTAR et au BRGM pour proposer deux projets, qui ont été réalisés sur 2 années consécutives, sur deux sites se trouvant sur les rives de l'estuaire de la Loire. Le premier projet a été financé par le programme Pollusols et portait sur le site d'une ancienne décharge, située dans la Prairie de Mauves à l'est de Nantes. Le second, financé par l'OSUNA, s'est intéressé à un bassin de rétention des eaux de ruissèlement du pont de Cheviré. Ces deux projets, que j'ai portés, nous ont donné l'opportunité d'initier des collaborations avec l'IFSTTAR et le BRGM. Ils sont, je l'espère, le point de départ de collaborations pérennes avec ces équipes de recherche, le but étant maintenant de proposer ensemble des réponses à appels à projets de plus grande envergure (ANR, EC2CO, etc.) sur cette problématique.

## I.1. Étude sur la prairie de Mauves

Cette étude était intitulée « Évaluation du transfert de contaminants organiques de l'ancienne décharge de la Prairie de Mauves vers la Loire ». Dans le cadre du suivi environnemental de l'ancienne décharge de la Prairie de Mauves, de nombreuses interrogations se posent sur le transfert de contaminants à la Loire. Les contaminants issus des déchets stockés peuvent migrer de deux façons : 1) par transfert depuis les lixiviats du massif de déchets vers la nappe alluviale de la Loire sous-jacente, le fond de la décharge n'étant pas étanche ; 2) par infiltration de lixiviats dans le collecteur d'eaux pluviales dans sa partie dégradée située à la base du massif de déchets. Ce dernier se jette ensuite dans un étier rejoignant la Loire. Une remontée d'eau de la Loire dans l'étier en période de forte marée est aussi observée. Le suivi environnemental porte actuellement de façon ponctuelle (2 à 4 campagnes par an) sur les polluants métalliques classiques et quelques familles de polluants organiques (HAP
notamment) présents dans les eaux souterraines. Les résultats acquis ont montré une saisonnalité des transferts. Le suivi ponctuel de polluants émergents a été mené en outre sur 2 années. Il a permis d'en quantifier certains, d'en détecter d'autres, d'autres encore étaient en dessous de la limite de quantification. Ces mesures ponctuelles ne sont pas suffisantes pour caractériser la présence de polluants à très faibles concentrations.

Dans ce contexte, l'objectif de cette étude était d'acquérir des données complémentaires sur le transfert de certains contaminants organiques hydrophobes de la décharge vers la Loire. Cette étude comportait deux volets. Le premier concernait la quantification de contaminants dans les masses d'eaux souterraines et les lixiviats de décharge. Pour cela, des capteurs passifs intégratifs, de type SPMD (semipermeable membrane device) ont été utilisés. Ces outils permettent de concentrer un large spectre de contaminants organiques hydrophobes (log Kow > 3) tels que les HAP, les AP, les PCB, les PBDE et les pesticides organochlorés. Ces capteurs passifs ont été déployés dans quelques piézomètres du réseau de suivi existant sur la Prairie de Mauves. Le second volet de l'étude sur le transfert de contaminants à l'estuaire de la Loire a été de réaliser l'étude quantitative des niveaux de contaminants dans les sédiments de l'étier.

Un échantillonnage permettant une analyse spatiale a été réalisé en parallèle du déploiement des capteurs passifs SPMD lors de la campagne d'échantillonnage faite au mois de mars 2017. Des duplicats d'échantillonneurs passifs ont été déployés dans 5 piézomètres installés sur le site pilote et des sédiments ont été prélevés dans l'étier, en différents points, afin d'assurer une étude de la répartition spatiale des contaminants (récolte du sédiment de surface en triplicats dans 4 zones définies le long de l'étier). Les analyses de HAP et AP ont été réalisées au laboratoire MMS par UPLC-Fluo. L'analyse des PCB, PBDE et des pesticides organochlorés a été sous-traitée à un laboratoire prestataire de services.

Les résultats obtenus à l'aide des capteurs passifs déployés dans les piézomètres du site montrent que l'ancienne décharge de la Prairie de Mauves est une source de contamination en HAP et PCB majeure puisque leurs masses adsorbées sur les SPMD sont bien plus importantes au niveau du piézomètre situé au cœur de la décharge. Les masses de contaminants adsorbées sur les SPMD diminuent ensuite avec l'éloignement à la décharge pour atteindre des valeurs inférieures à celles du puits localisé en amont hydraulique de la décharge, considéré comme référence. La présence de dieldrine détectée au niveau du piézomètre au cœur de la décharge pourrait être due au stockage de déchets verts lorsque la décharge était encore en fonctionnement ou à leur stockage en surface de la décharge, qui est pratiqué depuis de nombreuses années. Des masses plus importantes en HCB et dieldrine ont été retrouvées au niveau du puits de référence et pourraient s'expliquer par sa situation au sein d'une zone de maraîchage dans laquelle ces pesticides ont pu être utilisés. La distribution en HAP un peu particulière de ce puits de référence pourrait provenir de sa proximité avec le technicentre de la SNCF qui pourrait constituer une source de pollution en HAP. Enfin, une hypothèse aux masses les plus faibles retrouvées pour tous les composés organiques dans le piézomètre le plus en aval serait liée à des mécanismes dits d'atténuation naturelle : l'adsorption sur les phases réactives (matières organiques, argiles, etc.) et la biodégradation, même si celle-ci reste discutable étant donné le caractère récalcitrant de ces familles de contaminants. Enfin, aucun des PBDE recherchés n'a été détecté.
En ce qui concerne l'étude des sédiments de l'étier qui relie le collecteur des eaux pluviales à la Loire, des résultats ont aussi été obtenus. Les teneurs en PCB et en HAP en sortie du collecteur sont supérieures à celles de l'embouchure de l'étier, en aval, plus de 2 et de 5 fois respectivement. Deux hypothèses peuvent être avancées. D'une part, les composés peuvent être adsorbés, dégradés par photolyse, hydrolyse ou activité biologique dès leur sortie du collecteur et jusqu'à l'embouchure. D'autre part, les phénomènes de marées emportent peut-être les sédiments de surface de l'étier, mais de façon plus limitée avec le rapprochement de la sortie du collecteur, menant à l'établissement d'un gradient de contamination. Les valeurs moyennes en HCB et HAP des sédiments de la zone de l'estuaire de la Loire, où se trouve le rejet de l'étier, sont proches de celles de l'embouchure de celui-ci. Par contre, la teneur en HAP reste près de 2 fois plus importante dans les sédiments de l'embouchure de l'étier comparée à celle des sédiments de Loire. Pour finir, aucun PBDE n'a été détecté dans les sédiments.

Ces travaux ont fait l'objet de
1 poster : P22

## I.2. Étude sur le Pont de Cheviré

Cette étude avait pour abréviation MICROBARET pour « Contamination en microplastiques dans des bassins de rétention d'eaux de ruissellement urbaines ». Il visait tout d'abord à réaliser un état des lieux de la contamination en microplastiques d'un ouvrage de gestion des eaux pluviales urbaines, le bassin de rétention-infiltration collectant les eaux de ruissellement du pont de Cheviré sur la commune de Nantes. En effet, l'intérêt récent des scientifiques vis-à-vis de la problématique des microplastiques fait que de nombreux écosystèmes restent encore non explorés. C'est le cas des ouvrages de gestion des eaux pluviales pour lesquels les données publiées dans la littérature scientifique sont rares. Pourtant, ces ouvrages reçoivent les eaux de ruissellement des réseaux routiers, chargées en macrodéchets et en polluants et pouvant conduire à une concentration en microplastiques élevée. Le premier objectif de cette étude était donc innovant puisque les microplastiques ont été caractérisés et quantifiés pour la première fois dans un bassin de rétention-infiltration. Les compartiments étudiés étaient la colonne d'eau et le sédiment. Par ailleurs, les eaux et sédiments des bassins de rétention peuvent présenter des niveaux de contamination en polluants organiques relativement élevés, notamment en HAP. En effet, ils sont produits par des phénomènes de combustion, ils se retrouvent notamment libérés dans l'environnement par le chauffage urbain ou les moyens de transport. Les microplastiques étant susceptibles de sorber des composés organiques, des mesures d'HAP sur les macrodéchets plastiques récoltés sur le terrain ont été entreprises dans cette étude. En parallèle, la contamination en HAP des eaux et des sédiments du bassin de rétention a également été caractérisée, permettant ainsi d'atteindre le second objectif de cette étude qui était d'appréhender la capacité de sorption des macroplastiques dans un environnement bien particulier qu'est le bassin de rétention-infiltration du pont de Cheviré.

Cette zone d'étude représente une superficie d'environ 800 m² et comporte une surverse vers la Loire qui fonctionne rarement, car il n'y a pas de membrane imperméable dans le fond du bassin, ce qui fait que le bassin est en eau seulement lors de forts épisodes pluvieux. Trois zones ont été définies au niveau du bassin : une zone au niveau de l'émissaire, une zone
intermédiaire et une dernière zone la plus éloignée de l'émissaire. Des prélèvements d'eau, de sédiments superficiels et de macrodéchets plastiques ont été réalisés en triplicats en février 2018 afin d'analyser les microplastiques et les HAP dans ces différents prélèvements.

Toutes les données n'ont pas encore été complètement exploitées. Cependant, quelques conclusions ressortent des premiers résultats obtenus. En ce qui concerne la colonne d'eau, les concentrations en HAP de la phase particulaire sont comprises entre 83,7 et 226,3 ng/L avec des teneurs significativement plus élevées au niveau du rejet des eaux de ruissellement dans le bassin de rétention. La colonne d'eau contient également des microplastiques qui vont de 2,3 ± 1,0 à 5,3 ± 3,5 microplastiques par litre. Pour ce qui est du sédiment, les teneurs en HAP vont de 734,2 à 1379,2 µg/kg et celle en microplastiques dans la zone la plus éloignée de l'émissaire est de 0,53 ± 0,24 microplastiques par kg. Près de 70% de l'ensemble des microplastiques sont faits de PP, qui se trouve être la matière plastique la plus utilisée dans l'industrie automobile (Plasticeurope, 2017). La taille des microplastiques est majoritairement entre 100 et 200 µm dans la colonne d'eau et 50 et 100 µm dans les sédiments. Pour finir, les teneurs en HAP déterminées sur les déchets plastiques trouvés sur le terrain sont dépendantes de la nature du plastique. Les teneurs moyennes en HAP sont 476,6 ± 316,1 et 9,9 ± 11,8 µg/kg respectivement pour les déchets de PE et de PET. Ce qu'il est intéressant de relever c'est que les teneurs en HAP sont finalement plus faibles dans les déchets plastiques que dans le sédiment. Cela étant, ils n'en sont pas moins de bons adsorbants en HAP, particulièrement ceux constitués de PE, et sont aussi capables de les transporter sur de longues distances. Finalement, il était impossible de quantifier les HAP sorbés sur les microplastiques comme nous souhaitions le faire au départ. Ces derniers sont trop peu nombreux pour représenter une masse suffisante pour l'extraction et permettre de dépasser les limites de détection de l'appareillage analytique. De plus, il faudrait également s'assurer que le protocole permettant leur isolement ne désorbe pas les contaminants de surface.

## I.3. Projet à venir

Le partenariat développé dans ces deux projets ouvre des perspectives. Les 3 partenaires, forts de leurs axes de recherche respectifs et de leur complémentarité, souhaitent pérenniser ce partenariat en participant à des appels à projets régionaux ou nationaux (EC2CO INSU - CNRS ou ANR) sur les problématiques de pollution des sols urbains et les transferts vers le littoral et impacts associés. Ce projet pourrait concerner une étude plus approfondie des transferts de contamination le long du continuum continent/estuaire ligérien en y associant d'autres acteurs régionaux sur cette thématique, tels que l'IFREMER, l'IMMM, l'unité Écosystèmes, Biodiversité, Évolution (ECOBIO) de Rennes ou encore le Laboratoire Eau et Environnement des Systèmes Urbains (LEESU) de l'École des Ponts et Chaussées, spécialisée en hydrologie urbaine et qui a entamé des travaux sur les microplastiques dans les eaux de ruissellement.

Cette étude du continuum continent/estuaire ligérien pourrait permettre d'étendre l'évaluation de la contamination en microplastiques à d'autres bassins de rétention de différentes constitutions et réceptionnant par exemple, des eaux de provenances diverses (urbaines, agricoles). Ainsi, les sources et le devenir des microplastiques dans ces écosystèmes pourraient être déterminés plus précisément. L'étude portant sur la capacité de sorption des
plastiques en d'autres familles de polluants organiques (PCB, retardateurs de flamme bromés, AP, etc.) et celle sur les transferts de polluants plastiques et organiques à la Loire constituent d'autres pistes d'exploration. La dimension écotoxicologique pourrait être ajoutée au travail avec la mesure d'effets engendrés par ces contaminants sur des organismes terrestres, qui relève de l'expertise de l'unité ECOBIO, et sur des organismes marins, qui est aussi un volet d'expertise de notre équipe ECEm. Il serait intéressant d'exposer des organismes à des macrodéchets plastiques récoltés dans l'environnement, associés ou non à une contamination en contaminants organiques afin d'évaluer si le déchet plastique constitue une source de contaminants organique qui mène à une imprégnation et des effets sur les organismes ou bien s'il s'agit au contraire d'un puits permettant de limiter l'exposition des organismes.

## II. Les éléments terres rares

Lorsque j'ai réalisé mon travail doctoral, j'ai eu l'opportunité de doser les terres rares dans les sols de forêt au sein du LARC du CEA de Cadarache avec lequel était établie une collaboration. Cela fait près de dix ans et à ce moment-là, il n'y avait pas réellement de problématique environnementale les concernant. Ils avaient été ajoutés à la liste des métaux analysés puisque cela ne demandait pas beaucoup de travail additionnel lors de l'analyse en ICP-MS. La recherche de ces éléments dans les sols de forêt était plutôt prospective. À titre indicatif, des effets des feux de forêt avaient été mis en évidence sur les teneurs en terres rares.

Par la suite, l'opportunité de travailler à nouveau sur les terres rares s'est présentée avec l'implication de notre équipe dans un projet financé par l'ANR intitulé EcotREE pour « Ecotoxicology of rare earth elements in aquatic systems ». Ce projet a débuté en 2016 en collaboration avec le Laboratoire Interdisciplinaire des Environnements Continentaux (LIEC), le Luxembourg Institute of Science and Technology (LIST) et le Laboratoire Réactions et Génie des Procédés (LRGP). Dans ce cadre-là notre travail consiste principalement à réaliser des dosages en terres rares dans des matrices aqueuses et biologiques issues des milieux d'expositions réalisées dans d'autres laboratoires. Finalement, nous avons voulu approfondir ce champ d'investigation et nous avons déposé une demande de financement de thèse à ce sujet qui a été validée par l'école doctorale pour Marjorie Lortholarie, qui a débuté son contrat en septembre 2017. Je fais partie de son encadrement et je la suis quotidiennement dans le suivi de son travail. Ainsi, la suite de cette partie va présenter ces contaminants émergents, les premiers résultats obtenus et les perspectives.

### II.1. Présentation des terres rares

Les terres rares sont étudiées depuis de nombreuses années, principalement dans des contextes biogéochimiques, nucléaires et médicaux. Le nombre d'articles scientifiques qui les concernent dans les domaines de l'environnement, la biologie, la chimie, la médecine, la toxicologie de Science Direct dépasse plusieurs milliers par an. Étant donné qu'elles sont de plus en plus utilisées dans des objets du quotidien, des problématiques écotoxicologiques émergent. Lorsque le mot clé « ecotoxicology » est ajouté à celui des « rare earth elements » dans le moteur de recherche de Science Direct, beaucoup moins d'articles sont proposés même si une légère tendance à la hausse ces dernières années est observable comme le montre la Figure 35.
<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 35 : Nombre d'articles référencés par année dans Science Direct avec [ rare earth element ^ environment ^ ecotoxicology ] dans le corpus titre/mots clés/résumé (27/01/2019)</figcaption></figure>

Les terres rares sont des éléments non essentiels relativement abondants dans la croûte terrestre appartenant à la 3e période du tableau de Mendeleïev. Elles sont au nombre de 17 : le scandium, l'yttrium et les 15 lanthanides. Leur distribution est dépendante de la nature des minerais constituant la roche mère (Humphries, 2012 ; Ondrejka et al., 2007 ; Spear and Pyle, 2002) et globalement, l'altération de cette dernière mène à une distribution assez stable des terres rares dans le milieu naturel. Leur configuration électronique leur confère des propriétés communes et particulières qui rendent incontournable leur utilisation sur le plan socio-économique. Elles sont hautement réactives grâce à leur configuration électronique unique (Huang, 2011 ; Koyanagi and Bohme, 2001), réagissent avec la plupart des éléments non métalliques (H, O, S) et forment des complexes avec des ligands inorganiques (carbonates, phosphates) et des ligands organiques (acides fulviques et humiques) (Nockemann et al., 2006 ; Tang and Johannesson, 2003).

Les terres rares entrent dans la composition de nombreux produits de notre quotidien (écrans à cristaux liquides, panneaux solaires, batteries, aimants permanents, céramique, alliages métallurgiques, etc.) et apparaissent aussi comme de possibles substituts à l'énergie pétrolière (éoliennes, véhicules hybrides, éclairages à LED) (Gambogi, 2014 ; Guimarães et al., 2016 ; Ramos et al., 2016 ; Xie et al., 2014 ; Tan et al., 2015). La consommation mondiale en 2014 atteignait 120 000 tonnes et reste en constante augmentation les dernières années. La Chine domine de loin le marché des terres rares avec une production d'environ 98% de la production mondiale (Alonso et al., 2012). À cause de leur importance économique et stratégique, les terres rares sont caractérisées comme des matériaux dont la ressource est critique pour les nombreuses applications technologiques et industrielles (Du and Graedel, 2011 ; Massari and Ruberti, 2013).

Leur utilisation à l'échelle mondiale, stimulée par la multiplication des applications de haute technologie, perturbe les cycles biogéochimiques naturels. Ces perturbations sont très marquées dans des sites miniers d'extraction de terres rares, leurs eaux usées et les déchets (Chakhmouradian and Wall, 2012 ; Haque et al., 2014 ; Humphries, 2012 ; Jordens et al., 2013 ; Navarro and Zhao, 2014 ; Paulick and Machacek, 2017) ainsi que les sols alentours qui contiennent des quantités en terres rares pas moins de 100 fois celle de la croute terrestre (Sloof,
1995). En dehors de ces sites de production, des terres rares ont été détectées et quantifiées dans les milieux terrestres et aquatiques dans de nombreux pays comme les États-Unis, la Chine, le Royaume-Uni, la France, le Canada, l'Allemagne, etc. (Hatje et al., 2016 ; Klaver et al., 2014 ; Kulaksiz and Bau, 2011a, 2011b ; MacMillan et al., 2017 ; Möller et al., 2014 ; Wei et al., 2013) avec des potentiels enrichissements en La, Gd et Sm mis en évidence dans les cours d'eau. En effet, une fois rejetées dans l'environnement, les terres rares vont pouvoir être mobilisées et transportées sur de longues distances (Cao et al., 2017 ; Möller et al., 2014) en fonction de leur spéciation, de leur nature, et de celle du milieu récepteur. La salinité, les conditions redox, le pH, la matière organique, les agents chélatant sont autant de facteurs pouvant influencer leur distribution dans l'environnement (Guo et al., 2010 ; Marsac et al., 2011 ; Piper and Bau, 2013 ; Wilke et al., 2017). De manière générale, les terres rares présentent certaines propriétés physico-chimiques générales dans l'environnement comme une faible solubilité et une forte affinité avec la matière organique. Ainsi, dans les milieux aquatiques, les terres rares se retrouveront plutôt dans la matrice sédimentaire.

Néanmoins, le corpus de connaissances sur les terres rares, et notamment les données sur leur écotoxicité au sens large reste très fragmentaire (Gwenzi et al., 2018). De ce fait, des études complémentaires sont absolument nécessaires. En particulier, peu d'informations sont disponibles sur les teneurs biodisponibles, les voies et mécanismes de bioaccumulation et leur toxicité sur des organismes vivants dans les milieux aquatiques, et notamment estuariens et marins, réceptacle ultime de nombreux contaminants d'origine anthropique (Gwenzi and Chaukura, 2017).

La relation dose-effet des terres rares a montré une tendance avec 2 phases distinctes : à faibles concentrations des effets bénéfiques sur la croissance des organismes terrestres et aquatiques (Wang et al., 2000) et à hautes concentrations des effets toxiques, observés par exemple sur le rat ou la souris (Pagano et al., 2015). Chez la daphnie, le La a présenté des délais de maturation (*Daphnia carinata* ; Barry and Meehan, 2000) et le Gd de la mortalité (Perrat et al., 2017). Le Gd s'est également avéré toxique sur des organismes marins comme l'oursin ou des bivalves (Martino et al., 2017, 2018; Perrat et al., 2017; Trifuoggi et al., 2017). Des expositions en laboratoire avec de fortes doses en terres rares peuvent mener à une multitude de réponses chez les organismes et aucun mécanisme n'est encore accepté par l'ensemble des écotoxicologues pour interpréter ces effets (Lu et al., 2003). Il a été montré tout de même que la toxicité diminue avec l'augmentation du numéro atomique des lanthanides (Zielhuis, 2006). Dans la plupart des cas, les études sont réalisées avec un seul élément parmi les terres rares (souvent le Ce, le La ou le Gd), ce qui est complètement dissocié de la réalité environnementale, puisque toutes les terres rares y sont retrouvées en mélange (Pagano et al., 2015).
## II.2. Étude en cours

### II.2.1 Les objectifs

Les objectifs du projet sur les terres rares sont d'apporter des éléments d'information pour l'évaluation les risques environnementaux en documentant les sources, le devenir et le transfert des terres rares dans les différents compartiments d'un écosystème aquatique anthropisé tel qu'un estuaire. Ils se répartissent en trois axes :

1. L'étude des sources potentielles de terres rares sur l'estuaire de Loire. Elle vise à caractériser les activités humaines consommatrices de terres rares présentes sur l'estuaire (d'Ancenis à St Nazaire). Une enquête sur les volumes utilisés et les rejets sera réalisée afin de localiser les secteurs les plus exposés.

2. La caractérisation du contenu en terres rares du milieu estuarien ligérien. L'étude portera sur le compartiment sédimentaire, zone de stockage préférentielle des terres rares. Puis, la colonne d'eau sera étudiée au travers d'une approche intégrative, à l'aide d'échantillonneurs passifs, afin de permettre la détection et la quantification de ces éléments malgré leur faible concentration. Une phase de mise au point sera essentielle et menée en laboratoire au préalable puisque cette technique est encore très peu utilisée pour l'analyse des terres rares. Cette seconde partie du travail permettra de caractériser les niveaux de concentration auxquels sont exposés les organismes aquatiques, et de mettre en évidence d'éventuels enrichissements d'origine anthropique.

3. La bioaccumulation par deux espèces clés de l'écosystème estuarien ligérien : l'anguille européenne (Anguilla anguilla) et le flet commun (Platichthys flesus). Le choix de ces espèces est d'autant plus pertinent qu'elles (i) sont benthiques, donc vivant au contact des sédiments, (ii) présentent de forts enjeux socio-économiques au niveau régional, et (iii) sont consommées par l'homme. Après une étude approfondie de l'organotropisme des terres rares, les variations spatio-temporelles, intra- et inter-spécifiques seront évaluées.

La réalisation de ce travail bénéficiera d'échantillons de sédiments, d'anguilles et de flets récoltés lors de campagnes d'échantillonnage saisonnières réalisées dans le cadre de 2 précédentes thèses sur l'écosystème ligérien (suivi de 2009 à 2012), auxquels seront ajoutés des échantillons récoltés lors de nouvelles campagnes. Ainsi, l'étude des variations temporelles pourra être réalisée sur un du long terme.

### II.2.2 Les premiers résultats

* Caractérisation des sources en estuaire de la Loire

Étant donné que les terres rares ne font pas partie des composés prioritaires à analyser dans l'environnement, aucun suivi n'est réalisé de façon systématique par un organisme dédié. De fait, la caractérisation des sources en terres rares au niveau de l'estuaire de la Loire a été réalisée au travers l'envoi d'un questionnaire à toutes les entreprises ayant des activités susceptibles de rejeter des terres rares dans l'estuaire choisies dans 2 bases de données : l'ICPE (Installations Classées Pour l'Environnement) et l'IREP (Registre des Émissions Polluantes). Sur les 95 enquêtes envoyées, seulement 10 ont été retournées et aucune ne faisait état d'une utilisation ou d'une émission de terres rares dans l'environnement. Pourtant, il semblerait bien que certaines entreprises, faisant partie du tissu industriel local, fassent entrer les terres rares dans leurs procédés industriels.
• Teneurs en terres rares des compartiments abiotiques

Même si les terres rares sont potentiellement plutôt retrouvées dans les matrices sédimentaires du milieu aquatique, l'objectif du projet est de déterminer les teneurs à la fois dans les sédiments et la colonne d'eau.

- Sédiments

En tout premier lieu, une méthode a été mise au point et validée pour l'analyse simultanée des 17 éléments ciblés (Sc, Y, et les 15 lanthanides). Cette méthode fait intervenir une étape de minéralisation par micro-ondes et une étape d'analyse par ICP-MS. Après différents essais, la procédure optimale est obtenue avec de l'eau régale. Sa validation faite en utilisant un matériau de référence certifié (CRM 667 : estuarine sediment n°4024) de sédiment montre des rendements corrects, compris entre 90 et 110%, pour les éléments les plus légers : Sc, Y et ceux du La au Tb. Par contre, les rendements diminuent ensuite avec l'augmentation de la masse atomique pour atteindre la plus basse valeur de rendement autour de 55% pour le plus lourd, le Lu.

Quelques échantillons de sédiments collectés en 2012, dans le cadre de la thèse de Mickaël Couderc, ont été étudiés avec la méthode d'analyse faisant intervenir l'eau régale. Ils étaient lyophilisés et tamisés à 2 mm. Les résultats obtenus sont en cours de normalisation à partir d'échantillons standards pour mettre en évidence de potentiels enrichissements ou appauvrissements. Les premières ébauches suggèrent un enrichissement en Sm et Gd sur certains sites de l'estuaire.

- Colonne d'eau

L'évaluation des terres rares dans la colonne d'eau se fera par l'utilisation d'échantillonneurs passifs de type DGT, étant donné que les terres rares sont assez peu solubles dans l'eau et probablement en faibles concentrations. Cette partie a commencé à être appréhendée par l'étude des coefficients de diffusion des éléments au travers le gel diffusif du dispositif, au laboratoire. Étant donné qu'il existe un gradient de salinité dans l'estuaire, il est important d'évaluer la variabilité des coefficients de diffusion en fonction de celle-ci. Les expérimentations se font grâce à la réalisation et l'utilisation de cellules émettrices et réceptrices en verre entre lesquelles est positionné le gel diffusif habituellement utilisé dans les DGT. Le suivi de la concentration en terres rares dans la cellule émettrice permet d'évaluer le transfert des éléments au travers du gel.

• Teneurs en terres rares des anguilles et des flets

L'anguille européenne (Anguilla anguilla) et le flet commun (Platichthys flesus) sont des espèces que nous avons déjà étudiées lors de 2 précédentes thèses réalisées dans notre équipe de recherche. Les questions à la recherche étaient différentes, puisque le travail portait sur les perturbations endocriniennes, mais ces espèces ont été choisies pour plusieurs raisons. En effet, elles sont sédentaires (excepté à maturation sexuelle pour les anguilles), benthiques et euryhalines. Elles représentent un fort poids socio-économique et sont consommées par l'homme. Par ailleurs, l'anguille est aussi une espèce en déclin, qui présente de fortes teneurs lipidiques et qui se trouve haut dans le réseau trophique estuarien. Pour toutes ces raisons, ces espèces semblent être des espèces modèles de choix.
Tout comme pour les sédiments, la première approche à cette partie de l'étude sur les terres rares a été de mettre au point la méthode d'analyse. Pour cela, un CRM de moules (BCR-668) a été utilisé. Les teneurs en terres rares dans les tissus de moules et de poissons étaient trop faibles pour utiliser la méthode mise au point pour les sédiments. Il a fallu envisager la « concentration » de l'échantillon. Pour ce faire, après consultation de l'état de l'art, une étape de calcination de l'échantillon a été ajoutée après la lyophilisation et le broyage des échantillons, et avant leur minéralisation avec un mélange HNO₃:HCl (4,5:0,5 v/v). Les rendements obtenus sont satisfaisants atteignant des valeurs entre 100 et 120% pour tous les éléments, excepté l'Y qui est surestimé et le Sc, l'Ho et le Pm qui n'appartiennent pas à la liste des éléments certifiés dans l'échantillon de référence. Les résultats préliminaires obtenus pour les anguilles de la campagne d'échantillonnage de la thèse de Mickaël Couderc montrent quelques variations spatiales des teneurs en Nd, Dy, Er et Yt chez l'anguille jaune, qui est sédentaire, ainsi que des variations des teneurs en La, Ce et Nd, relatives au genre pour les anguilles argentées. L'étude des branchies et des foies montrent des variations quantitatives et qualitatives en fonction des organes. Les terres rares sont en plus grandes concentrations dans le foie, puis les branchies et enfin les muscles. Chaque organe montre une empreinte en terres rares qui lui est propre et qui est assez peu dépendante des facteurs spatio-temporels pour le foie et les branchies.

## II.3. Perspectives à court terme

Afin d'atteindre les objectifs fixés, tous les axes précédents méritent encore d'être approfondis. En ce qui concerne la détermination des sources en terres rares, l'idée est de déployer des DGT en entrée et sortie de stations d'épuration (STEP) et d'en étudier les boues lorsque les méthodes seront au point.

Pour ce qui est de la contamination abiotique de l'estuaire, les sédiments collectés en 2012 seront analysés avec une méthode qui sera mise au point avec une minéralisation à l'acide fluorhydrique pour améliorer les rendements d'extraction des éléments les plus lourds. Ces essais seront réalisés en collaboration avec le laboratoire Environnements et Paléoenvironnements Océaniques et Continentaux (EPOC) de l'Université de Bordeaux. Une nouvelle campagne d'échantillonnage est en cours. Ainsi, des comparaisons spatio-temporelles des teneurs en terres rares dans les sédiments sont envisagées avec la poursuite de la détermination des enrichissements et appauvrissements. Les résultats seront aussi confrontés à d'autres caractéristiques du sédiment comme la granulométrie et la charge en COT afin de mettre en évidence des facteurs d'influence.

Lorsque les coefficients de diffusion auront été déterminés pour les DGT, ainsi que l'étude sur l'impact de la salinité sur ces derniers, ces échantillonneurs passifs seront déployés le long de l'estuaire afin de déterminer les concentrations en terres rares dans la colonne d'eau. Ces déploiements se feront simultanément à une collecte des échantillons de sédiment et sur une durée de 21 jours.

En plus des anguilles, les flets collectés en 2012 dans le cadre de la thèse de Mickaël Couderc sont en cours d'analyse. Ainsi une étude des variations interspécifiques pourra être réalisée en comparant les résultats à ceux des anguilles. Une campagne d'échantillonnage d'anguilles a débuté en novembre pour les organismes argentés et une autre aura lieu
prochainement pour les organismes jaunes. Ainsi, l'influence du stade de développement sur les teneurs en terres rares pourra être étudiée. Pour ces nouveaux organismes, la dissection sera plus poussée afin d'approfondir l'étude de l'organotropisme en ajoutant l'analyse des gonades, du cerveau, de la rate et du sang à celle des muscles, des branchies et du foie. En plus de rechercher des variations spatio-temporelles des teneurs en terres rares chez les organismes piscicoles, d'autres facteurs, cette fois-ci biotiques, seront mis à l'étude comme la taille, le poids, l'âge ou encore la maturité sexuelle. Pour se faire, la lecture des otolithes (concrétions de l'oreille interne) sera réalisée dans les prochaines semaines pour caractériser l'âge des organismes.

## II.4. Projet à venir

Dans la continuité de l'étude sur les terres rares en estuaire de Loire et pour répondre aux besoins en termes d'évaluation du risque environnemental de ces contaminants, une autre étude va être proposée à l'appel à projets « Pari scientifique 2019 » de la Région des Pays de la Loire.

Ce projet visera à atteindre plusieurs objectifs :

1. Établir un premier état des lieux de la contamination en terres rares des zones côtières de la région Pays de la Loire au niveau des eaux et des sédiments.

2. Réaliser l'état des lieux de la contamination en terres rares dans un réseau trophique de l'estuaire de la Loire.

3. Evaluer l'impact des terres rares sur ces mêmes organismes via des expositions en laboratoire à des contaminations de terres rares en mélange et très proches de celles relevées dans le milieu nature.

4. Comparer les espèces de moules et huîtres : la contamination, les effets, la capacité de métabolisation/détoxication.

Les principales originalités du projet par rapport à l'état de l'art sont : (i) la zone d'étude, pour laquelle aucune donnée de teneurs en terres rares dans les matrices abiotiques et biotiques ont été publiées, (ii) l'exposition en laboratoire aux terres rares en mélange représentatif du milieu naturel d'un point de vue qualitatif et quantitatif, qui est souvent faite avec un seul élément et (iii) l'évaluation de l'exposition de l'homme aux terres rares par la consommation de ces espèces.

Ce projet sera réalisé en collaboration avec le laboratoire d'écotoxicologie d'IFREMER Nantes.
### III. Développement de la SPIR en écotoxicologie

#### III.1. La spectroscopie proche infrarouge

##### III.1.1 Généralités

Dans les années 1940-1950, l'utilisation de la spectrophotométrie dans le moyen infrarouge a débuté pour répondre à une application précise qui était l'identification et l'élucidation structurale de composés organiques (Bureau et al., 2019). Avec les progrès technologiques grandissants, l'augmentation de la puissance de calcul et le développement de logiciel de traitement de données, couplés à une diminution des coûts et à la taille des spectromètres, l'utilisation de la spectrométrie dans le proche infrarouge est apparue tardivement (McLure, 1994) et a été développée et employée pour de nombreuses autres applications bien différentes.

La spectroscopie proche infrarouge (SPIR) associée à des outils chimiométriques est une technique analytique mature (Pasquini, 2018), très actuelle et largement répandue dans de nombreux domaines tels que l'industrie pharmaceutique (Jamrógiewicz, 2012), l'industrie agroalimentaire (Bureau et al., 2019), l'industrie pétrochimique, la médecine, etc. (Blanco and Villarroya, 2002). Dans le domaine pharmaceutique, la SPIR est notamment employée dans le contrôle qualité des matières premières et des produits finis (Rodionova et al., 2019), qui doivent respecter des spécifications (uniformité, homogénéité, teneurs en eau, teneurs en principe actif, etc.) avant de pouvoir être utilisées ou commercialisées. De plus, tout au long du processus de fabrication, des analyses rapides peuvent être faites grâce à la SPIR pour répondre à des problématiques d'assurance-qualité (Jamrógiewicz, 2012). Dans l'agroalimentaire, la SPIR permet par exemple d'évaluer la maturité et la qualité des fruits et légumes (Bureau et al., 2009, 2013; Clark, 2016; Cozzolino et al., 2011), tracer l'origine des produits (Cozzolino, 2016; Giusti et al., 2011; Huang et al., 2009) ou encore contrôler la contamination biologique (He and Sun, 2015; Huang et al., 2009).

La détermination des différents paramètres dans des produits pharmaceutiques ou agroalimentaires fait intervenir des méthodes de référence souvent longues à mettre en œuvre, nécessitant des réactifs coûteux et polluants et de la main-d'œuvre qualifiée. C'est dans ce contexte que la SPIR trouve sa place, car elle va se substituer aux méthodes de référence en présentant de nombreux avantages (Blanco and Villarroya, 2002). En effet, lorsque les modèles sont bâts et validés, l'analyse est très rapide, elle ne nécessite pas l'utilisation de réactifs, elle est peu coûteuse et non destructive de l'échantillon. Par ailleurs, plusieurs déterminations de teneurs peuvent être réalisées à partir d'une seule analyse en SPIR. La contrepartie de ces nombreux avantages est la durée et la complexité de la phase de mise au point de la méthode. D'ailleurs elle nécessite de connaitre les valeurs de référence pour construire un modèle de prédiction quantitative et le valider, grâce à des outils chimiométriques utilisant l'algorithme de régression partielle des moindres carrés (PLS), accompagnés de divers prétraitements mathématiques des spectres (normalisation, correction, dérivation, etc.) (Blanco and Villarroya, 2002).
### III.1.2. La SPIR en environnement

Dans un contexte environnemental, la spectroscopie a été utilisée pour estimer des paramètres physico-chimiques d'échantillons solides : sols, composts, biote, mais aussi d'échantillons liquides et gazeux (Gredilla et al., 2016). Le développement de méthodes est croissant au cours du temps comme le montre la Figure 36 issue de la revue de Gredilla et al. (2016).

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 36 :** Nombre d'articles référencés entre 1980 et 2014 sur l'utilisation de la spectroscopie non destructive appliquée à des échantillons environnementaux solides (sols, sédiments, biote), liquides ou gazeux (d'après Gredilla et al., 2016)</figcaption></figure>

De façon plus précise, jusqu'en 2014, la SPIR a été utilisée dans environ 2 articles sur l'eau, 11 sur les plantes, 26 sur les sols et 2 sur les sédiments (Gredilla et al., 2016). Les paramètres étudiés étaient relatifs à la matrice d'étude. Il s'agissait de la détermination des teneurs en hydrocarbures dans les études sur l'eau (Gammoun et al., 2006, 2007). Pour les plantes, les études avaient pour objectif de quantifier le carbone, l'azote, la cellulose, l'eau, les protéines, les tanins par SPIR. (Hein et al., 2010 ; Higa et al., 2013 ; Kleinebecker et al., 2009 ; Kobori et al., 2009 ; Liu et al., 2009 ; Mao et al., 2014 ; Shetty et al., 2012 ; Wu et al., 2012 ; Xin et al., 2012 ; Yan et al., 2011). Pour les sols et les sédiments, de nombreux modèles ont été validés pour quantifier des paramètres variés comme le carbone, l'azote, la matière organique, les teneurs en métaux, des éléments nutritifs, etc. (Gao et al., 2014 ; Hahn et al., 2011 ; Moros et al., 2009 ; Todorova et al., 2014 ; Vohland et al., 2011). Cet objectif était aussi celui de deux publications scientifiques dont je suis l'auteure qui portaient sur le compost (A1) et les sols incendiés (A2). Lors d'une première étude que j'ai réalisée, le processus de maturation du compost a été suivi dans un centre de compostage des boues de STEP. Différents paramètres physico-chimiques (température, humidité, pH, carbone organique, azote organique et inorganique, substances humiques) et biochimiques (fraction soluble, hémicellulose, cellulose, lignine) ont été analysés et modélisés. Cette méthode alternative qu'est la SPIR a permis de s'affranchir des analyses d'origine longues et chères, pour évaluer les paramètres physico-chimiques et biochimiques, et *in fine* la maturité du compost. De bonnes prédictions ont été obtenues pour l'ensemble des paramètres physico-chimiques, mais l'erreur du modèle était trop importante pour prédire l'âge du compost. En ce qui concernait les paramètres biochimiques,
cette étude était plutôt préliminaire en montrant l'intérêt de l'approche, mais aussi la nécessité d'approfondissements. Lors de mes travaux de thèse, j'ai utilisé à nouveau cette méthodologie dans le but de prédire les propriétés physico-chimiques des sols de forêt impactés par des incendies. Des mesures de carbone et d'azote organique total, des substances humiques, des teneurs en NH₄⁺, phosphore, Ca²⁺, Mg²⁺, K⁺ ont été prises. L'étude a montré que la SPIR peut être considérée comme un bon outil de suivi des paramètres physico-chimiques des sols à l'exception des teneurs en K⁺. Cette méthode semblait donc utile pour cartographier l'état des sols de forêt plus ou moins affectés par les feux en permettant d'envisager des réhabilitations futures adéquates.

D'autres publications, non mentionnées dans la revue d'articles de Gredilla et al (2016) traitent de l'utilisation de la SPIR pour étudier des organismes aquatiques. Étant donné que le but de ces études était plutôt d'évaluer la qualité et limiter les risques sanitaires des produits consommés par l'homme, ces travaux n'ont pas été utilisés dans la revue d'articles de Gredilla et al. (2016). C'est en 2014 qu'était parue une autre revue d'articles traitant du sujet (Cheng et Sun, 2014). Ainsi, la SPIR a été utilisée sur les poissons pour prédire les lipides et l'humidité du bar européen (Ottavian et al., 2012) et du saumon (Folkestad et al., 2008) ainsi que la fraîcheur de l'espadon (Bøknæs et al., 2002) et du cabillaud (Fasolato et al., 2012). Pour ce qui est des bivalves, des études ont porté sur l'huître (Brown, 2011 ; Madigan et al., 2013) pour quantifier la composition biochimique en protéines, lipides et glucides. Plus récemment, une autre étude s'est intéressée à cinq espèces de bivalves, dont l'huître et la moule, afin de quantifier les lipides, les glucides et les protéines avec deux buts annoncés en préambule, la qualité des produits comestibles et la surveillance environnementale (Bartlett et al., 2018a). Puis, cette même équipe de chercheurs a réalisé une seconde étude sur les mêmes espèces dans un but bien plus environnemental, puisqu'elle a porté sur l'évaluation de l'allocation énergétique cellulaire (Bartlett et al., 2018b). En effet, l'allocation énergétique cellulaire est la différence entre la disponibilité et la consommation d'énergie des organismes et correspond à un biomarqueur d'évaluation d'état de santé, de développement et de reproduction des espèces.

2 articles : A1, A2

1 communication orale : CO6

2 posters : P5, P8

### III.2. Projet à venir

Les axes de recherche de l'équipe ECEm ont pour objet l'étude des milieux côtiers et estuariens et notamment les sédiments et les organismes marins. Les milieux côtiers et estuariens sont soumis à des pressions de contaminations anthropiques fortes. Par conséquent, la qualité des milieux et la santé des organismes doivent être évaluées. La Directive Cadre sur l'Eau (DCE) et la Directive Cadre Stratégie pour le Milieu Marin (DCSMM) imposent aux états membres de l'Union Européenne d'atteindre ou de maintenir un bon état écologique du milieu marin à l'horizon 2020. L'atteinte et le maintien de ce bon état écologique nécessite au préalable une évaluation de la qualité des milieux. Souvent, des méthodes longues et coûteuses sont réalisées pour atteindre cet objectif.
Dans ce contexte, le but du projet que je propose ici serait de développer des méthodes d'évaluation d'une part, de la qualité sédimentaire et d'autre part, de la qualité de l'eau associée à l'état de santé des organismes marins, en utilisant une méthode d'analyse simple et peu couteuse : la SPIR.

Les sédiments sont le réceptacle ultime de nombreux contaminants, ce qui en fait un objet d'étude privilégié. À ma connaissance, seulement deux études sur l'analyse de paramètres sédimentaires ont été publiées (Hahn et al., 2011 ; Moros et al., 2009). Ainsi, des teneurs en métaux, carbone, silice et azote total ont pu être prédites grâce à la SPIR. L'approfondissement de ces études semble judicieux en ajoutant éventuellement d'autres paramètres à prédire comme la matière organique, l'azote organique, les éléments nutritifs, etc. Il serait intéressant d'essayer de prédire des contaminants environnementaux. Cela étant, leurs concentrations sont souvent faibles, trop faibles pour dépasser les limites de détection élevées en SPIR, qui représente un des principaux inconvénients de la méthode (Cozzolino, 2016). Les autres inconvénients se trouvent au niveau de la préparation d'échantillon (séchage, broyage, homogénéisation), des tailles de particules, des effets de matrice et du nombre d'échantillons qui doit être important (Cozzolino, 2016). Si les teneurs en contaminants ne peuvent être prédites, un indice de pression anthropique pourrait être développé en fonction des paramètres physico-chimiques des sédiments et de leur contamination en métaux et en composés organiques. Cet indice pourrait alors potentiellement être prédit par SPIR. Ainsi, une évaluation rapide de la qualité sédimentaire pourrait être effectuée et mènerait à l'établissement d'une cartographie des pressions anthropiques sur les milieux aquatiques. De plus, il serait un bon outil d'aide à la décision grâce aux faibles coûts engendrés et à sa rapidité d'obtention des résultats. Si le développement peut être réalisé et la méthode validée sans préparation d'échantillon, l'utilisation d'appareillages portatifs pourrait même permettre l'évaluation directe sur le terrain.

Pour ce qui est des matrices biologiques, l'organisme marin modèle choisi pour mener à bien ce projet est la moule bleue (Mytilus edulis), sur laquelle notre équipe de recherche possède à présent de l'antériorité. En effet, les moules sont souvent considérées comme de bons bioindicateurs car ce sont des organismes filtreurs, sessiles, ayant une durée de vie relativement longue et qu'elles sont tolérantes aux stress environnementaux (Anacleto et al., 2015). De plus, elles représentent un fort poids socio-économique au niveau régional, mais aussi national. Les moules sont utilisées pour déterminer les niveaux de contamination des milieux puisque ce sont de bons bioaccumulateurs (Farrington et al., 1995) en contaminants chimiques (organiques et inorganiques), mais aussi physiques (microplastiques). Par ailleurs dans un but d'évaluation des risques environnementaux, la moule est également utilisée pour réaliser des expérimentations en laboratoire pour évaluer, par exemple, des relations doses de contaminants /effets sur les organismes. L'objectif du second volet de ce projet est donc de mettre au point des méthodes de SPIR pour évaluer la qualité de l'eau des milieux, à travers l'utilisation des moules, qui seront considérées comme des échantillonneurs intégrateurs. Pour approfondir ce qui a déjà été réalisé dans de précédentes études, sur l'évaluation de certains paramètres biochimiques (détermination des teneurs en protéines, lipides, glycogène et allocation énergétique cellulaire ; Bartlett et al., 2018a, 2018b), des modèles de prédiction impliquant d'autres biomarqueurs, dont l'analyse et l'interprétation sont maîtrisées au laboratoire, seront développés. Ces biomarqueurs reposent actuellement sur des analyses biochimiques, au niveau individuel ou d'un organe, comme la glande digestive, et permettent d'apprécier les mécanismes de défense et/ou de
dommage au sein des organismes, en réponse à une exposition à des contaminants chimiques et/ou physiques. Ces biomarqueurs font intervenir différentes enzymes (Glutathion S Transferase (GST), détoxification ; Superoxyde dismutase et catalase (SOD, CAT), défense oxydative ; Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS), oxydation ; acétylcholinestérase (AChE), neurotoxicité). Chacun de ces biomarqueurs implique l'utilisation d'une méthode de préparation d'échantillon et d'analyse différente. L'intérêt de la SPIR serait d'apporter des informations sur tous ces critères d'état de santé des organismes grâce à une seule et unique analyse. Un travail pour essayer d'établir une corrélation entre l'état de santé des organismes et la qualité de l'eau est ensuite envisagé pour permettre d'extrapoler les résultats obtenus sur la moule, à l'eau du milieu. Comme pour les contaminants chimiques dans les sédiments, les biomarqueurs évoqués seront peut-être difficilement prédictibles par SPIR à cause des limites de détection de la méthode. Pour contourner cela et atteindre le but fixé, un indice d'état de santé des organismes pourra être développé à partir des valeurs des biomarqueurs et la SPIR permettra potentiellement de prédire cet indice.

Un appareillage spectrophotométrique proche infrarouge muni d'une sphère d'intégration est nécessaire à ce projet, comme celui utilisé par Bartlett et al. (2018a, 2018b), et que j'ai également utilisé lors de mon stage de M2 et mon travail doctoral. En ce qui concerne le sédiment, des analyses spectrophotométriques sur échantillons frais, mais aussi secs, ainsi que broyés ou non, seront testés. Des analyses *in situ* sont également envisagées. Pour la matrice biologique, des analyses seront réalisées directement sur l'individu entier décoquillé, voire séché et/ou broyé, ou encore sur la coquille. L'intérêt de travailler sur des individus entiers non préparés repose sur la rapidité d'analyse, en limitant les étapes de préparation d'échantillon.

Dans un second temps, il serait pertinent de pouvoir investiguer la qualité des prédictions sur la matrice biologique à l'échelle de l'organe, notamment la glande digestive. Aucun article ne traite de cela dans l'état de l'art à ma connaissance. Afin de pouvoir enregistrer des spectres proche infrarouge sur les organes, la microscopie couplée à la spectroscopie proche infrarouge serait l'appareillage *ad hoc*. Même si une dissection des échantillons sera indispensable dans ce cas, cet appareil ouvre un champ d'investigations supplémentaires, en permettant d'étudier les organismes à une échelle infra-individuelle.
Conclusion
Ce manuscrit présenté en trois parties principales présente mon profil, la synthèse de mes travaux de recherche et les projets en cours et à venir, en vue d'obtenir l'Habilitation à Diriger des Recherches (HDR). Durant les 13 années de recherche passées, les principales activités que j'ai menées jusqu'ici concernent le domaine de la chimie environnementale associée à des problématiques écotoxicologiques, et s'inscrivent globalement dans un objectif d'évaluation des risques environnementaux. Les contaminants que j'ai eu l'occasion d'étudier sont divers et représentent des composés organiques hydrophobes, des métaux sous forme nanoparticulaire ou dissoute, ou encore des microplastiques. Ces études se positionnent au niveau de la détermination de l'exposition et de l'imprégnation des espèces dans un schéma global relatif à l'écotoxicologie comme le montre le rectangle bleu sur la figure 37.

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 37 : L'écotoxicologie et le positionnement de mes activités de recherche passées et en cours en bleu et à venir en rouge</figcaption></figure>

Les écosystèmes auxquels je me suis intéressée jusqu'ici sont continentaux, avec la forêt du Massif des Maures, mais également estuariens, notamment celui de la Loire, et également côtiers au niveau de la région des Pays de la Loire. Les compartiments étudiés étaient abiotiques avec à la fois des mesures sur les sols, sédiments, et eaux, faisant intervenir des mesures directes ou indirectes, par le biais d'échantillonneurs passifs. Enfin, pour ce qui est du compartiment biotique, des végétaux ont été analysés, ainsi que des espèces animales ayant divers intérêts au niveau écosystémique, écotoxicologique, biologique, sanitaire, et/ou socio-économique avec un vers de vase : *Hediste diversicolor*, trois bivalves : *Mytilus edulis*, *Crassostrea gigas*, *Scrobicularia plana* et enfin deux espèces piscicoles : *Anguilla anguilla*, *Platichthys flesus*.

La diversité des écosystèmes, des compartiments et des espèces vivantes a mené à la mise au point, la validation et/ou l'utilisation de nombreuses méthodes analytiques. Afin de répondre aux différentes problématiques sur lesquelles j'ai pu travailler, des stratégies d'échantillonnage ont dû être élaborées, des préparations d'échantillons testées et des méthodes analytiques adaptées. Cette diversité peut être considérée comme le point fort de mon dossier avec l'opportunité de travailler sur de nombreux sujets tout aussi intéressants les uns que les autres, en permettant de développer des facultés d'adaptabilité. Mais elle peut aussi être vue comme un frein avec parfois une discontinuité des nombreux sujets et un manque d'approfondissement.
En plus d'une faculté d'adaptation, mes activités de recherche m'ont permis d'acquérir une expérience sur :

* le volet analytique (échantillonnage, préparation de l'échantillon, analyse, adaptés à différents types de matrices),

* la formation par la recherche avec l'encadrement de 7 stagiaires de M1, 6 de M2 et 4 doctorants,

* le montage et le management de projet, en étant porteuse et/ou coordinatrice MMS de certains,

* la diffusion des connaissances, en publiant et relisant des articles scientifiques, en participant à des congrès nationaux et internationaux et en enseignant auprès des étudiants de la faculté de pharmacie et de master.

Les projets à venir s'inscrivent dans la continuité de ce que j'ai réalisé dans mon parcours professionnel avec toujours un intérêt pour de nouveaux objets de recherche comme le montre le cadre rouge de la Figure 37. En effet, une étude sur des contaminants encore non étudiés au laboratoire : les terres rares, a été entamée. Le continuum terre-mer est également une problématique que je souhaiterais approfondir pour mieux caractériser les flux provenant du milieu continental qui impactent les milieux estuariens et côtiers. Pour finir, je souhaiterais vivement me diriger vers le volet de l'évaluation des effets sur les organismes en écotoxicologie sur lequel j'ai encore peu travaillé. L'idée serait de développer des méthodes de spectroscopie proche infrarouge et mettre au point un outil d'évaluation de la santé des organismes tels que les moules issues soit du milieu naturel, soit d'expositions en laboratoire.
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(A19) **Phuong NN, Zalouk-Vergnoux A**, Poirier L, Kamari A, Châtel A, Mouneyrac C, Lagarde F. 2016. Is there any consistency between the microplastics found in the field and those used in laboratory experiments? Environ. Pollut. 211, 111-123.
IF: 5,10 ; citations: 102 ; Q1 ; doi:10.1016/j.envpol.2015.12.035

(A20) Van Bohemen AI, **Zalouk-Vergnoux A**, Poirier L, **Phuong NN**, Inguimbert N, Ben Haj Salah K, Ruiz N, Pouchus YF. 2016. Development and validation of LC-MS methods for peptaibol quantification in fungal extracts according to their lengths. J. Chrom. B, 1009-1010, 25-33.
IF: 2,21 ; citations: 5 ; Q1 ; doi:10.1016/j.jchromb.2015.11.039

(A23) **Phuong NN**, Poirier L, Lagarde F, **Zalouk-Vergnoux A**. 2018. Factors influencing the microplastic contamination of bivalves from the French Atlantic coast: location, season and/or lifestyle? Mar. Pollut. Bull. 129, 664-674.
IF: 3,24 ; citations : 17 ; Q1 ; doi:10.1016/j.marpolbul.2017.10.054
# A Mesocosm Study of Fate and Effects of CuO Nanoparticles on Endobenthic Species (*Scrobicularia plana*, *Hediste diversicolor*)

Pierre-Emmanuel Buffet,† Marion Richard,‡,§ Fanny Caupos,‡ Aurore Vergnoux,†

Hanane Perrein-Ettajani,† Andrea Luna-Acosta,‡ Farida Akcha,|| Jean-Claude Amiard,†

Claude Amiard-Triquet,† Marielle Guibbolini,⊥ Christine Risso-De Faverney,⊥ Helene Thomas-Guyon,‡

Paul Reip,# Agnieska Dybowska,▽ Deborah Berhanu,▽ Eugenia Valsami-Jones,▽,○

and Catherine Mouneyrac*,**

†Groupe Mer, Molécules, Santé (MMS), Université de Nantes et Université Catholique de l'Ouest, Angers, France

‡Littoral Environnement et Sociétés (LIENSs), Université de La Rochelle, France

§UMR, 5805 EPOC, Université de Bordeaux 1, Talence, France

||IFREMER, Laboratoire d'Ecotoxicologie, Rue de L'Ile d'Yeu, BP 21105, 44311 Nantes cedex 03, France

⊥ECOMERS, Université de Nice Sophia-Antipolis, France

#Intrinsiq Materials Ltd., Hants, United Kingdom

▽Department of Earth Sciences, Natural History Museum London, Cromwell Road, London, SW7 5BD, United Kingdom

○University of Birmingham, School of Geography, Earth and Environmental Sciences, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, United Kingdom

**S Supporting Information**

**ABSTRACT:** The fate and effects of CuO nanoparticles (CuO NPs) were examined in endobenthic species (*Scrobicularia plana*, *Hediste diversicolor*), under environmentally realistic conditions in outdoor mesocosms (exposure to Cu at 10 µg L⁻¹ in particulate (CuO NPs) or soluble salt (CuNO₃) forms) for 21 days. Labile Cu was determined in water and sediment by using diffusive gradient in thin films. No labile Cu being detected from CuO NPs; the observed effects in invertebrates exposed to CuO NPs were mainly attributed to the toxicity of nanoparticulate rather than dissolved Cu toxicity. Bioaccumulation of CuO NPs was observed in both species. Biomarkers were examined at different levels of biological organization: biochemical markers of defense and damage, biomarkers of genotoxicity (comet assay), and behavioral biomarkers (feeding and burrowing). Behavioral biomarkers, antioxidant defenses (catalase, glutathion S-transferase, metallothionein), and genotoxicity are the most sensitive tools to highlight the effect of soluble or nanoparticulate metal forms. Concerning other biomarkers of defense (superoxide dismutase, lactate dehydrogenase, laccase) and damage (thiobarbituric acid reactive substances, acetylcholinesterase, acid phosphatase), no significant effects were detected. This experiment shows the suitability of mesocosms for studying the environmental effects of nanoparticles.

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

■ INTRODUCTION

Engineered nanoparticles of copper oxide (CuO NPs) are widely used (http://www.us-nano.com/inc/sdetail/602), increasing the risk of their introduction into the environment. Once in the aquatic medium, metal-bearing NPs can either be dissolved into the water column, or aggregated, favoring their deposition onto bottom sediment.¹ Thus, endobenthic bivalves and polychaetes could be especially at risk. CuO NPs do not readily dissolve to copper ions in both freshwater²⁻⁴ and seawater.⁵,⁶ In our previous paper (Buffet et al.⁵) dealing with fate and effects of CuO NPs from the same batch in seawater, we have shown that (i) CuO NPs, with initial size ranging from 10 to 100 nm, highly aggregated/agglomerated and (ii) the

hydrodynamic size (or Z-average) increased rapidly to values of around 1000 nm. These findings are in agreement with previous studies on CuO NPs, indicating aggregation in seawater (Gomes et al.⁶). It is uncertain whether Cu in labile and the nanoparticulate form is accumulated at the same level in biota and can induce the same stress in animal tissues. In a freshwater gastropod, CuO NPs had greater effects than aqueous Cu on growth, feeding rate, and reproduction.⁷ Recent

Received: August 29, 2012

Revised: December 12, 2012

Accepted: December 16, 2012

Published: December 17, 2012
<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 1.** Experimental cores deployed in a mesocosm device equipped with tidal cycle system (A) and positioning of DGT units in sediment and water (B).</figcaption></figure>

studies have shown that CuO NPs have a distinct biological effect not caused entirely by the release of soluble metal ions.³,⁸

Oxidative stress is one of the most commonly recognized effects of NPs.¹,⁹ In vivo studies in *Mytilus galloprovincialis* mussels have revealed that CuO NPs induced oxidative stress in the gills.⁶ In *Hediste diversicolor* and *Scrobicularia plana*, the activity of antioxidant defenses (catalase CAT in both species, superoxide dismutase SOD in clams) was increased with no oxidative damage when considering the levels of thiobarbituric reactive substances (TBARS).⁵ Genotoxic effects of NPs were observed in *H. diversicolor* exposed to Ag NPs by using the Comet assay on coelomocytes.¹⁰ In *S. plana*, the Comet assay is also a relevant tool to examine genotoxicity in hemocytes.¹¹ Oxidative stress and apoptosis revealed by caspases as biomarkers are documented for different metal NPs, particularly CuO NPs.¹² Metallothionein (MT) is involved in ionic/soluble Cu detoxification¹³ and also in the defense against oxidative stress.¹⁴ In mussels exposed to CuO NPs (10 µg Cu L⁻¹), MT increased linearly with time of exposure.⁶ At the same exposure concentration, a similar trend was observed in the clam *S. plana*.⁵ Acetylcholinesterase (AChE) activity, a biomarker of neurotoxicity was significantly decreased in mussels exposed to NPs,⁶ whereas no significant differences were observed in clams.⁵ Acid phosphatase (AP) and phenoloxidase (PO), two components of immunity, can provide important early warning signals of the sublethal effects of contaminants and the susceptibility of animals to infectious diseases.¹⁵⁻¹⁷

Behavioral biomarkers are sensitive tools to assess the impact of contaminants.¹⁸ In the clam *S. plana*, exposure to waterborne CuO NPs affected both burrowing time and feeding rates.⁵

Previous studies were carried out in laboratory microcosms with organisms exposed to NPs in seawater. The aim of the present study was to reach a more environmentally realistic assessment of fate, bioaccumulation and effects of CuO NPs on *S. plana* and *H. diversicolor*, with the use of outdoor mesocosms equipped with a system of tidal cycle. A mesocosm refers to "an experimental system that simulates real-life conditions as closely as possible, while allowing the manipulation of environmental factors".¹⁹ This experimental strategy has been already used successfully to study the transformations and distribution of manufactured Ag NPs in a freshwater emergent wetland mesocosm²⁰ or in estuarine mesocosms²¹ and the transfer of gold nanoparticles in an estuarine food web.²²

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

## MATERIAL AND METHODS

**Implementation of the Mesocosm Approach.** Sediments were collected from a relatively clean intertidal mudflat (Bay of Bourgneuf, France; French "Mussel Watch" Program, Réseau National d'Observation, 2006 http://www.ifremer.fr/envlit/documents/bulletins/rno). Worms (*H. diversicolor*) and clams (*S. plana*) were gently excluded from the sediment by hand and placed into water with air diffusers. Sediment was mixed before being introduced in experimental cores (Figure 1). Twenty individuals per species were placed in each core at a density (1000 individuals m⁻²) commonly observed in intertidal mudflats.²³

Experimental cores were composed of a PVC tube (H: 15 cm, 20 cm Ø) capped with foam for aquarium filter (1–2 mm Ø) and canvas. Four cores were deployed in each mesocosm device (Figure 1), composed of two tanks (H, W, L: 40 × 60 × 80 cm), two evacuation tubes, a hose (16 mm Ø), a pump (Eheim compact 1000 L h⁻¹) and a mechanical timer (IDK PMTF 16A) allowing the mimicking the tidal cycle (6 h of low tide, 6 h of high tide, 2 tides/day). Water was aerated all the time by an air diffuser.

Nine mesocosm devices (36 cores) were installed outside and filled with natural seawater (Saltmarsh of Lauzières, l'Houmeau, France). Three of the nine mesocosm devices were qualified as controls. Three others were contaminated with soluble Cu (10 µg Cu L⁻¹ prepared by dilution of pure copper metal in 2% HNO₃, purchased from Fluka), and the latter three were contaminated with CuO NPs (eq 10 µg Cu L⁻¹). Analytical CuO nanopowder was obtained from a commercial source (supplied by Intrinsiq Materials Limited) with the particle primary size specified by manufacturer as 10–100 nm.⁵ A stock suspension of these CuO NPs in deionized water (DIW) (25 mg L⁻¹) was sonicated for 5 min (Ultrasonicator BRANSON B-1200 E2 HF 100 W). Addition of Cu was carried out at the water surface in the upper tank with the experimental cores at high tide in order to mimic the input of Cu-contaminated water in the coastal environment.

The average size of the nanoparticles was determined from transmission electron microscopy (TEM) images (29.5 nm), and the suspension stability was assessed by measuring, in deionized water and seawater, the hydrodynamic size (197 and 810 nm, respectively) and ζ-potential (26.3 and −8.2 mV, respectively) of the CuO NPs and published in Buffet et al.⁵ CuO NPs characterization data are summarized in the
Supporting Information, Table S1 and Figures S1, S2, S3. The hydrodynamic size and ζ-potential of CuO NPs in DIW and in seawater were determined by N.H.M. and published in Buffet et al.⁵ One core per tank was randomly collected after 7 and 14 days of exposure (Figure 1). At 21 days, the remaining two cores were sampled per tank. Worms and bivalves were gently sorted by hand and stocked into aerated water before tests.

Every three days at 2 P.M. (local time UT + 2), temperature, salinity, and dissolved oxygen were measured in control tanks, using probes (WTW 315i, OXI 3310). Nitrates and nitrites were controlled in each tank with NO₂, nitrite, and NO₃, nitrate, tests sets JBL (JBL GmbH & Co.). In addition, a Micrel probe was deployed into one of the three control tanks. It recorded temperature and salinity every 15 min during all the experiment. After 7, 14, and 21 days, sediment was collected using a cut-off 60 mL disposable syringe to determine chlorophyll a (Chl a) and phaeophytin a (Phaeo a) concentrations in the top 1 cm of sediment cores.

**Characterization of Exposure.** Widely available instruments do not yet permit the characterization of NPs in sediment. Nevertheless, labile Cu was estimated in both the water column and the sediment by using DGT tools purchased from DGT Research Ltd. (Lancaster, U.K.). DGT units were used for the water compartment (loaded solution deployment unit C-LSDU), and other DGT units were used for sediments (loaded sediment probe for metals C-LSPM). Three water DGT and three sediment DGT units were deployed in each mesocosm (9 mesocosms: a total of 27 units). At day 7, 14, and 21, one water DGT unit and one sediment DGT unit were removed for each mesocosm device (3 DGT units per treatment: control, soluble Cu, and CuO NPs). To evaluate potential contamination during the deployment, three water and sediment DGT units used as blanks were deployed and analyzed in the same conditions as the others.

After sampling, DGT units were washed with ultrapure water (Milli-Q). For the water DGT units, the totality of the resin was placed in 2 mL vials, whereas for the sediment DGT units, the resin was cut every cm and then each piece was placed in a 2 mL vial. 1.5 mL of 1 M HNO₃ was added to the vials and left for more than one day to dissolve Cu from the Chelex resin. Cu quantification of these neat or diluted solutions was performed by electrothermal atomic absorption spectrometry (EAAS) (Varian SpectrAA 800).

**Copper Bioaccumulation.** Copper was determined in the whole soft tissues of bivalves and worms that had been allowed to depurate in seawater for 48 h (n = 10 per condition, for each species). Animal tissues were digested by heating (90 °C) with Aqua Regia (HCl/HNO₃ 75/25). Then, the quantification of Cu concentrations was performed by using flame atomic absorption spectrophotometry (FAAS, Varian SpectrAA55 spectrophotometer) in ragworms, whereas analyses in clams were performed using EAAS. The accuracy of the analyses was checked by using internal quality control with standard reference material (mussel tissue SRM 2976, National Institute of Standards and Technology). Three measurements were achieved, and results (4.481 ± 0.156 µg g⁻¹) were in agreement with the certificate of analysis (4.02 ± 0.33 µg g⁻¹).

**Biochemical Markers.** For each biomarker, clams and ragworms were collected at day 21 from three cores, each of them selected at random in one of the three replicated mesocosm devices corresponding to each experimental treatment (control, exposure to soluble Cu, or exposure to CuO NPs). The total weight of clams was determined; then, the

worms and the soft tissues of clams were weighed individually and stored at -80 °C until biochemical analysis. The condition index of clams was calculated as follows:

$$CI = (\text{total fresh tissue weight/total weight})/100 \quad (1)$$

Methodologies applied for the determination of biochemical markers (MT, GST, LDH, CAT, SOD, TBARS, AChE) have been described in detail by Buffet et al.⁵ MT analysis was performed only in S. plana, since MT is not relevant as a biomarker in H. diversicolor.²⁴ Briefly, MTs were quantified by differential pulse polarography (DPP) analysis²⁵ after partial purification in soft tissue homogenates. Lipid peroxidation was estimated by the formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), quantified by reference to MDA absorbance at 530 nm.²⁶ For GST, CAT, SOD, AChE, and LDH activities, tissues were homogenized and enzyme activities were determined spectrophotometrically in the enzyme fraction (S9 fraction), as described by Habig et al.²⁷ for GST, Claiborne²⁸ for CAT, McCord and Fridovich²⁹ for SOD, Galgani and Bocquene³⁰ for AChE, and Diamantino et al.³¹ for LDH.

CSP3-like activity was determined by measuring the release of aminotrifluoromethylcoumarin (AFC) from the caspase tetrapeptide substrate Ac-DEVD-AFC (N-acetyl-Ile-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin). After homogenization of the pooled soft tissues, an aliquot of S9 was mixed with buffer B (312.5 mM HEPES pH 7.5, 31.25% sucrose, 0.3% CHAPS, 50 a.m. of DEVD-AFC). The fluorescence of free AFC was measured by using a fluorometer (Safas FLX Xenius, Monaco) at an excitation/emission wavelength of 390/530 nm every 3 min for 45 min. CSP3-like activities were expressed in pmoles AFC min⁻¹ mg⁻¹ protein, according to a standard curve obtained from AFC. AP activity was determined according to the method of Bergmeyer et al.,³² by using the Sigma Acid Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, France). Laccase-type PO activity was determined according to methodology described previously,³³ by using p-phenylenediamine (PPD) as substrate. The protocol assay was adapted to H. diversicolor and S. plana samples (data not shown).

All the results were expressed with reference to protein concentrations determined according to Bradford.³⁴ For MT, LDH, AP, and laccase-type PO, and digestive enzymes, determinations were carried out individually (n = 10 per species and per treatment, control, and Cu, either soluble or as CuO NPs). For GST, CAT, SOD, TBARS, AChE, and CSP3-like determinations were carried out on 5 pools of 3 individuals per species and per treatment.

**Comet Assay.** After exposure, H. diversicolor (n = 10) and S. plana (n = 7) were collected at day 21 from one core selected at random in the three replicated mesocosm devices corresponding to each experimental treatment (control, exposure to soluble Cu, or exposure to CuO NPs). Coelomocytes of worms were taken by carefully inserting a syringe into the posterior region of the worm. Using the same procedure, hemocytes of clams were taken from the adductor muscle. The blood cells were mixed with PBS then stored on ice briefly before use. Before the assay was performed, viability of cell was determined by a trypan-blue exclusion test. A rate of cellular viability above 85%³⁵ validated the condition of the test limiting measurement of broken DNA from death cells.

The Comet assay is a modified version of that previously described by Singh et al.³⁶ Positive controls consisting of cell exposed in vitro for 10 min to 100 µM hydrogen peroxide were
carried out in parallel to ensure the validity of measurements. All steps described were conducted under dim red light and performed at 4 °C to prevent any DNA damage. The cell suspension was carefully mixed with 1% low melting point agarose and was transferred onto a conventional microscope slide precoated with 0.8% normal melting point agarose. The gel was solidified on ice for 10 min, and the coverslip was removed. A third layer of 0.5% low melting point agarose was added. Slides were left on ice again for 10 min to solidify before the coverslip was removed. Then, slides were immersed in a cold lysing solution (2.5 M NaCl, 100 mM Na₂EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% N-laurylsarcosinate, with 1% Triton X-100 and 10% DMSO added immediately before use) for 2 h. After lysis, slides were washed with an alkaline buffer (1 mM Na₂EDTA and 300 mM NaOH, pH > 13) and placed in a horizontal electrophoresis tank filled with the same buffer for 45 min to unwind DNA. Electrophoresis was then performed for 21 min at 15 V, 300 mA. At the end of the electrophoresis, slides were washed twice (10 min) in a neutralization buffer (0.4 M Tris, pH 7.5), dehydrated in absolute ethanol (5 min), and taken out to dry. Nuclear DNA was stained with 30 µL of ethidium bromide (20 µg mL⁻¹) and observed using an optical fluorescence microscope (BX 60 Olympus) coupled to an Andor camera and an image analysis system (Komet 6, Kinetic Imaging Ltd.). For each animal, one slide was prepared. On each slide, 75 nonoverlapping comets were scored randomly on the all gel surface of the slide. DNA damages were expressed as the percentage of broken DNA in the comet tail.

**Behavioral Experiments.** Behavioral tests were carried out with animals collected from three cores, each of them selected at random in one of the three replicated mesocosm devices corresponding to each experimental treatment (control, exposure to soluble Cu, or exposure to CuO NPs). Burrowing experiments were carried out with natural sediment collected from the sampling site.

Clams (n = 20 per treatment) were submitted to burrowing tests at day 21, as described by Bonnard et al.³⁷ Burrowing behavior was studied by placing individuals at the sediment surface and observing the number that had burrowed at frequent intervals; every 5 min in the first hour, every 10 min in the second hour, every 20 min in the third and fourth hours, and then every hour until 6 h of testing.

Automated behavioral toxicity tests with ragworms *H. diversicolor* were carried out with the multi-freshwater biomonitor (MFB) and primarily developed using two individuals. One end of each chamber of the MFB was closed with mesh, and the other was open in order to visually identify the animal movements. The chambers were placed vertically in plastic tank with a shallow layer of sediment and topped up with 1 L seawater. The lower half of the chamber was filled with sediment, and *H. diversicolor* was placed at the surface within each chamber and given 1 h to acclimate before MFB recording. The behavioral patterns were analyzed visually by observing *H. diversicolor* movements in combination with the MFB oscilloscope signals. Polychaetes (n = 7 per treatment) collected at day 7 and day 14 were added individually to each test chamber. One chamber without organisms was used as control for noise signals. The MFB recordings started after 1 h acclimation and were made over a 7 h period.

Post exposure feeding tests were carried out at day 14 for both species (n = 30 clams per treatment, n = 20 ragworms per treatment). The feeding rate of *S. plana* (n = 30 per treatment) was quantified according to the methodology described by

Worrall and Widdows.³⁸ *Tetraselmis suecica* algae obtained from the Nantes Cultures Collection of MMS (strain NCC62) were used as food (10 000 cell mL⁻¹) in each of three replicated aquaria containing 2 L of seawater (n = 10 specimens per aquaria) for each treatment. The concentration of algae not ingested by bivalves was measured after 1 h.

The feeding rate of *H. diversicolor* was quantified, as described by Moreira et al.³⁹ Twenty worms were fed 100 *Artemia salina* larvae in individual plastic beakers. They were left undisturbed for 1 h; then, the remaining larvae were counted.

**Statistical Treatment.** Results are presented as means ± standard deviations. The assumptions of normality and homoscedasticity of all results were evaluated using Shapiro–Wilk and Fisher tests to choose appropriate parametric or nonparametric statistics and to compare treatments (controls, soluble Cu, and CuO NPs). Thus, an ANCOVA with post hoc Tukey test was performed on burrowing kinetic data, a two-way ANOVA (treatments and species) was performed on comet assay data, and Mann–Whitney tests were performed on data from other biomarkers. Significant differences were considered at *p* < 0.05.

## RESULTS

**Biotic and Abiotic Factors.** At the end of the experiment (21 days), no mortality was observed. For each treatment, the condition index determined for 100 clams did not show any significant difference between treatments (controls, 26 ± 5; soluble Cu, 25 ± 6; CuO NPs, 25 ± 6).

Chlorophyll *a* (27.7 ± 2.05 µg g⁻¹ dw) and Phaeophytin *a* (25.3 ± 1.7 µg g⁻¹ dw) did not significantly vary according to treatment and time (7, 14, 21 days). Water temperature varied daily with maximal mean observed at 3 P.M. (23.6 ± 2.6 °C) and minimal mean recorded at 6:30 A.M. (12.8 ± 2 °C). During the experiment, temperature varied between 18.5 and 25.5 °C at 2 P.M. Salinity was regularly adjusted with an addition of water purified by reverse osmosis (RO). Nitrate concentration did not significantly vary during the experiment (<0.5 mg L⁻¹). At the beginning of the experiment, nitrite concentration was above 0.1 mg L⁻¹. It decreased after 7 days to become constant at <0.01 mg L⁻¹. The mean of oxygen saturation was 97.1 ± 0.6%. The mean oxygen concentration was 8.5 ± 0.1 mg L⁻¹.

**Fate of CuO NPs in the Experimental Medium.** Figure S4 (Supporting Information) shows Cu masses accumulated by water DGT units, and Figure S5 (Supporting Information) shows Cu masses accumulated by the sediment DGT units during the 21 days of experiment for each treatment (control, soluble Cu, CuO NPs). Accumulated Cu by water DGT units was significantly higher in mesocosms exposed to soluble Cu than in control mesocosms whatever the experiment time (7, 14, 21 days; Figure S4, Supporting Information). Throughout the 21 days, Cu accumulated by water DGT units from mesocosms contaminated with CuO NPs was not significantly different from that accumulated by DGT units deployed in control. DGT units in sediments (Figure S5, Supporting Information) have shown that no more labile Cu was accumulated in sediment cores with Cu added as CuO NPs than in controls. These results indicate that no detectable release of labile Cu from NPs occurred. Some significant differences were observed in the sediment at day 21, with peaks at −5 cm in controls and at −10 cm in mesocosms contaminated with soluble Cu. Bioturbation operated by
<table><caption>Table 1. Means ± Standard Deviation (SD) of Biomarkers Quantified in *Hediste diversicolor* and *Scrobicularia plana* Exposed to the Experimental Conditions (Controls, Soluble Cu, CuO NPs)ª</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2"></th><th colspan="3">S. plana</th><th colspan="3">H. diversicolor</th></tr><tr><th>control</th><th>soluble Cu</th><th>CuO NPs</th><th>control</th><th>soluble Cu</th><th>CuO NPs</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">defense (21 d exposure)</td><td>MT (µg g<sup>-1</sup> tissues)</td><td>1477 (250)<sup>a</sup></td><td>2122 (242)<sup>b</sup></td><td>1947 (285)<sup>b</sup></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GST (nmol min<sup>-1</sup> mg<sup>-1</sup> protein)</td><td>222 (10)<sup>a</sup></td><td>266 (10)<sup>b</sup></td><td>354 (27)<sup>c</sup></td><td>72 (12)<sup>a</sup></td><td>86 (3)<sup>a</sup></td><td>113 (5)<sup>b</sup></td></tr><tr><td>CAT (µmol min<sup>-1</sup> mg<sup>-1</sup> protein)</td><td>67 (13)<sup>a</sup></td><td>93 (12)<sup>b</sup></td><td>116 (18)<sup>b</sup></td><td>69 (4)<sup>a</sup></td><td>109 (16)<sup>b</sup></td><td>124 (14)<sup>b</sup></td></tr><tr><td>CSP3-like (pmol min<sup>-1</sup> mg<sup>-1</sup> protein)</td><td>1.25 (0.05)<sup>a</sup></td><td>1.27 (0.05)<sup>a</sup></td><td>1.38 (0.06)<sup>b</sup></td><td>1.17 (0.08)<sup>a</sup></td><td>1.24 (0.04)<sup>a</sup></td><td>1.26 (0.07)<sup>b</sup></td></tr><tr><td>TBARS (nmol MDA mg<sup>-1</sup> protein)</td><td>0.47 (0.07)<sup>a</sup></td><td>0.44 (0.06)<sup>a</sup></td><td>0.52 (0.13)<sup>a</sup></td><td>0.82 (0.05)<sup>a</sup></td><td>0.70 (0.11)<sup>a</sup></td><td>0.66 (0.06)<sup>b</sup></td></tr><tr><td rowspan="2">behavior</td><td>burrowing slope (21 d exposure)</td><td>-0.0139<sup>a</sup></td><td>-0.0057<sup>b</sup></td><td>-0.0083<sup>c</sup></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>feeding rate (14 d exposure)</td><td>3587 (1762)<sup>a</sup></td><td>3963 (1766)<sup>a</sup></td><td>1517 (1182)<sup>b</sup></td><td>81 (11)<sup>a</sup></td><td>82 (14)<sup>a</sup></td><td>79 (19)<sup>a</sup></td></tr></tbody></table>

benthic species and the presence of animal burrows close to DGT units could explain these observations.

**Copper Bioaccumulation.** The results are depicted in Figure S6 in the Supporting Information. In *S. plana* clams, Cu concentrations in the whole soft tissues were significantly higher for both Cu treatments than in controls, the concentrations being significantly higher in those exposed to soluble Cu compared to those exposed to CuO NPs. For the *H. diversicolor* ragworms, body concentrations were significantly higher only in worms exposed to CuO NPs.

**Biochemical Markers.** The results are shown in Table 1. In clams, MT concentrations were significantly higher in specimens exposed to both forms of Cu. For defense biomarkers, no significant differences were detected in either species concerning SOD and LDH activities (not shown). On the other hand, GST and CAT activities were higher in both species and both Cu treatments with the exception of GST activity in ragworms exposed to soluble Cu. GST activity in clams was significantly higher in the presence of Cu as CuO NPs than that as soluble Cu.

Only few biomarkers of damage showed significant changes: in clams, CSP activity was increased in the presence of CuO NPs, whereas this treatment led to a decrease of TBARS levels in ragworms. No significant differences on immune responses (AP and laccase-type PO) were detected in both species.

**Comet Assay.** The cellular viabilities were between 92 and 96% in clams and between 86 and 91% in ragworms. Genotoxic damages in animals from controls and exposed to both Cu forms (soluble and nanoparticulate) were always lower than the positive control (H₂O₂). The percentage of tail DNA in worm coelomocytes was significantly higher compared to clams hemocytes (Figure 2). In both species, percentages of tail DNA were enhanced for soluble Cu and CuO NP treatments. No significant difference was detected between the two Cu treatments in both species after 21 days of exposure.

**Behavioral tests.** In *S. plana* clams, at day 21, the burrowing kinetics was significantly affected in clams exposed to both forms of Cu (soluble Cu and CuO NPs). Burrowing speed was significantly lower after exposure to soluble Cu than to CuO NPs (Table 1).

For *H. diversicolor*, two different movements can be characterized: (i) undulation associated with burrowing, occurring at 0.5 Hz frequency, and (ii) head movement associated with feeding, occurring at 1 to 2 Hz. The average time spent in burrowing/undulation and head movement/ feeding behaviors are depicted in Figure 3. No significant difference was observed after 7 days of exposure to both forms

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure 2.** DNA damage in (A) hemocytes of *S. plana* and (B) coelomocytes of *H. diversicolor* exposed to the experimental conditions (control, soluble Cu, CuO NPs) expressed as percentage of DNA in the comet tail of blood cells. For both species, biomarker levels with different capital letters differed significantly (p < 0.05).</figcaption></figure>

of Cu, whereas the two activities had significantly decreased for worms exposed during 14 days to soluble Cu and CuO NPs.

Results of feeding rates determined at day 14 (Table 1) showed a significant reduction in clams exposed to CuO NPs. In ragworms, no effect of Cu contamination was shown.

## DISCUSSION

In the course of the present experiments, ecological conditions remained favorable with good oxygenation, absence of increased levels of nitrites, and conservation of a biofilm with chlorophyll *a* in the range of natural concentrations.⁴⁰ Survival of both studied species and individual fitness were not negatively affected. Condition indexes of clams were equal or

<footnote>ªFor both species, biomarker levels with different superscripts differed significantly (p < 0.05).</footnote>
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 3.** Average frequency (%) (± error) of burrowing/undulation (0.5 Hz) and head movements/feeding of *H. diversicolor* (*n* = 7) exposed to the experimental conditions (control, soluble Cu, and CuO NPs) after (A) 7 days and (B) 14 days of exposure. Aterisks indicate significant differences with control treatment (p < 0.05).</figcaption></figure>

even higher than those encountered in field studies in the same geographical area.²³

The aggregation of CuO NPs from the same batch has been shown in seawater,⁵ a behavior favoring their deposition onto bottom sediment. As observed previously in water alone,⁵ no Cu release from the CuO NPs occurred in the water column and porewater. These findings are in agreement with many other studies indicating a poor dissolution of CuO NPs in seawater.²⁻⁶

Levels of labile Cu in the water column of both treatments (soluble Cu and CuO NPs) were lower in the present study than previously observed in waterborne contamination;⁵ the labile Cu is probably adsorbing to the sediment present in the mesocosms. While a decreased uptake was expected compared to our previous study,⁵ an increase was observed probably due to the fact that Cu body burdens determined in the present

study result from the uptake of both Cu forms, labile and particulate (labile Cu sourced either from CuO NPs or soluble Cu adsorbed to natural fine sediment particles). Bioaccumulation of CuO NPs has already been established in gastropods⁷ and fish.⁸ As highlighted in mussel gills,⁶ *H. diversicolor* ragworms, and *S. plana* clams, the rate of accumulated Cu depends on the form introduced in the experimental medium (CuO NPs or soluble Cu). Cu uptake was higher in clams exposed to soluble Cu vs CuO NPs, whereas in worms the opposite was observed. These interspecies differences could be related to different lifestyles of species. Bivalves filter large volumes of water whereas worms may be preferentially exposed to deposited NPs by ingestion of sediment particles.⁴¹

Due to their small size and high surface area, coupled to other physicochemical features such as metal content and charged/capped surfaces, nanomaterials may well have
unpredictable genotoxic properties.⁴² In vivo studies showed DNA damage in plants exposed to CuO NPs,⁴³ bivalves exposed to nanoiron,⁴⁴ and ragworms exposed to Ag NPs.¹⁰ In contrast, no significant increase in DNA damage was observed in lugworms exposed in vivo to single walled nanotubes.⁴⁵ The present study gives the first evidence for DNA damage revealed by comet assay in marine bivalves and worms exposed to CuO NPs and also to soluble Cu. Indeed, Cu as a redox active metal is an oxidative stress inducer,⁴⁶ promoting the formation of highly reactive oxygen species affecting DNA integrity.⁴⁷ As shown by Park et al.⁴⁸ in cultured cells exposed to TiO₂ NPs, in the present study, the oxidative stress by CuO NPs triggered the activation of cytosolic CSP suggesting that these NPs exert cytotoxicity by an apoptotic process. These effects were observed despite the fact that both species induce antioxidant defenses (CAT activity in both species, increased MT concentration in clams) and enhanced GST activity, a phase II enzyme that catalyzes the GSH conjugation to endogenous aldehydic products of lipid peroxidation.⁴⁶ Antioxidant defenses responded similarly when clams and ragworms were exposed to both forms of waterborne Cu.⁵ For TBARS, the only significant difference was the decrease observed in ragworms exposed to CuO NPs in mesocosms. Surprisingly, TBARS concentrations resulting from lipid peroxidation were not increased in exposed invertebrates, although genotoxicity was observed. Similar observations⁴⁹ in fish exposed to dietary TiO₂ NPs were explained as probably resulting from up-regulating of antioxidant defenses. However, in mussels' gills exposed using the same protocol applied in the present study, oxidative damage due to CuO NPs was evidenced by a breakdown of the antioxidant defense system and lipid peroxidation, as well as MT induction.⁶ Since no significant differences were detected in either species for the pollution-induced immunomodulation biomarkers determined in the present study, effects with longer times of exposure should be examined more closely.

Impairment of behavior is well documented in the case of both soluble Cu and CuO NPs in invertebrates (Bonnard et al.,³⁷ and literature cited therein ⁵,⁵⁰,⁵¹). The behavior of ragworms (feeding and burrowing) was never affected by CuO NPs, and burrowing was only affected after soluble Cu. In the present study, the MFB provided a better sensitivity of behavioral test, since significant differences were observed between controls and Cu (both soluble Cu and CuO NPs). As observed with waterborne Cu contamination,⁵,³⁷ behavioral impairments were not accompanied by an inhibition of AChE activity, but physiological disturbances could be the cause. Slower burrowing by endofauna could make it more vulnerable to predators in environments impacted by CuO NPs.

This is the first experiment with endobenthic species exposed to Cu as soluble and NP forms under environmentally realistic conditions: doses of Cu, presence of biofilm, tidal cycle effect, and natural weather fluctuations. The findings revealed effects at different levels of biological organization from biochemical to individual responses, including biomarkers of ecological relevance such as behavioral and genotoxic effects. The most streaking feature was the increased detoxification mechanism and apoptosis induction in both species exposed to CuO NPs vs soluble Cu. Finally, in agreement with previous works, this study highlights again that CuO NPs are not easily dissolved in our experimental medium and, consequently, defense mechanisms and toxic effects may be the result of a specific NP effect.

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## ASSOCIATED CONTENT

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### Supporting Information

Characterization data summary, TEM image, hydrodynamic size, concentration of Cu²⁺ released from nanoparticles suspension, mean masses of Cu accumulated by DGT units in the water column and sediment, Cu concentrations in whole soft tissues of *S. plana* and *H. diversicolor*. This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

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## AUTHOR INFORMATION

### Corresponding Author

*Phone: +33241816645. Fax: +33241816674. E-mail: catherine.mouneyrac@uco.fr.

### Notes

The authors declare no competing financial interest.

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## ACKNOWLEDGMENTS

The research leading to these results has received funding from the European Union Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under grant agreement No. 214478 (NanoReTox). Thanks are due to P. Bustamante, D. Vilday, M. Prineau, V. Huet (LIENSs, University of La Rochelle), M. L. Begout, D. Leguay, J. M. Chabirand, B. Charrier (IFREMER, L'Houmeau), O. Fossi Tankoua, M. Bonnard, P. Gaudin, G. Meynard, S. Dupouey, G. Wielgosz-Collin, and A. Couzinet-Mossion (MMS University of Nantes) for their valuable help in the implementation of the whole experiment.

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# Occurrence of POPs and other persistent organic contaminants in the European eel (Anguilla anguilla) from the Loire estuary, France

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CrossMark

M. Couderc<sup>a,*</sup>, L. Poirier<sup>a</sup>, A. Zalouk-Vergnoux<sup>a</sup>, A. Kamari<sup>a</sup>, I. Blanchet-Letrouvé<sup>a</sup>, P. Marchand<sup>b</sup>, A. Vénisseau<sup>b</sup>, B. Veyrand<sup>b</sup>, C. Mouneyrac<sup>c</sup>, B. Le Bizec<sup>b</sup>

## HIGHLIGHTS

* Levels and trends of PCBs, PBDEs, PFAS, OH-PAHs, APs and BPA were studied in eels.

* High variabilities in contaminant levels regarding site and life stage were found.

* Intermediate levels of POPs and BPA were found compared to European data.

* All eels had PBDE concentrations above the EQS and 75% had PFOS levels above the EQS.

* One third of yellow eels had PCB TEQ levels upper than the regulated maximum limit.

## ARTICLE INFO

**Article history:**

Received 2 July 2014

Received in revised form 17 September 2014

Accepted 17 September 2014

Available online 16 October 2014

Editor: Adrian Covaci

**Keywords:**

PBDEs

PCBs

PFAS

PAH metabolites

Alkyphenols

BPA

## ABSTRACT

The chemical contamination of the Loire estuary by three classes of persistent organic pollutants (POPs): the polychlorinated biphenyls (PCBs), the polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and the perfluorinated and polyfluorinated alkyl substances (PFAS), and three families of organic contaminants, the alkylphenols (APs), the polycyclic aromatic hydrocarbon metabolites (OH-PAHs) and the bisphenol A (BPA) were investigated in the muscles and bile of European eel (Anguilla anguilla). Yellow eels (n = 30) were caught in three different points along the estuary to highlight variations between sites and sources of contaminations. Silver eels (n = 15) were also studied to compare contaminant impregnation between different life stages of the species. Average concentrations in the muscles of the eel ranged between: 857 and 4358 ng/g LW for the PCBs, 26 and 46 ng/g LW for the PBDEs, 130 and 1293 ng/g LW for the PFAS; and in bile: 31 and 286 µg/g protein for the APs, 9 and 26 µg/g protein for the OH-PAHs and ND-1213 µg/g protein for the BPA. Among PCBs, PCB 153 (40% contribution to the sum of PCBs) was predominant in all eel muscles. PBDE 47 (60%) was the most predominant PBDE congeners, while perfluorooctanesulfonic acid (85%) was the most widely detected PFAS. For APs, 4p-nonylphenol (91%) was the most abundant and for the OH-PAHs, it was 1OH-Pyrene (63%). All the eels exceeded the environmental quality standards (EQS) for biota for the PBDEs and about 75% were higher than the EQS specific to PFOS. Finally, 20% of the analyzed eels presented TEQ concentrations above the maximum limits for lipid-rich species. These results supplied new data on the occurrence, levels, and patterns of 53 organic chemicals in the eels from the Loire estuary and they highlighted the need of further investigations focused notably on the potential effects of these chemicals on this species and their analysis in the water and sediments of the estuary.

© 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.

## 1. Introduction

The anthropization of fresh water systems has led to strong urban, industrial and agricultural pressures. The water systems drain via catchment all the earth surface and thus large rivers are the final receptacle to diffuse pollution including organic compounds. Estuaries are one of the

main zones receiving freshwater runoff before discharging into marine systems.

Persistent organic pollutants (POPs) are chemical substances that persist in the environment, bioaccumulate through the food chain and pose a risk of adverse effects to human health and environment. Numerous POPs were considered as priority pollutants by the Stockholm convention UNEP, 2009). The present study focused on several of these industrial chemicals of which the monitoring is of high interest. The polychlorinated biphenyls (PCBs) were used for their insulating

<footnote><sup>a</sup> LUNAM Université, Université de Nantes, MMS, EA 2160, Nantes F-44322, France</footnote>

<footnote><sup>b</sup> LUNAM Université, Oniris, Laboratoire d'Étude des Résidus et Contaminants dans les Aliments (LABERCA), Nantes F-44307, France</footnote>

<footnote><sup>c</sup> LUNAM Université, Université Catholique de l'Ouest, MMS, EA 2160, Angers F-49000, France</footnote>

<footnote>* Corresponding author. Tel.: +33 669552298. E-mail address: mikacouderc@yahoo.fr (M. Couderc).</footnote>
and flame retardant properties. Despite their ban in the 1970s in most developed countries (1981 in France), they are still measured in environmental samples. The polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) are a class of brominated flame retardants (BFRs). They have been widely used in a variety of household and industrial appliances such as textiles, electronic equipment, plastics and furniture (de Wit, 2002). The perfluorinated and polyfluorinated alkyl substances (PFAS) are largely used as additives for the production of fluoropolymers and as surfactants in industrial and consumer products (Ahrens, 2011). The PFAS were basic components in the production of carpets, textiles, paper and packaging products (Ahrens, 2011). For these two last chemical classes (PBDEs and PFAS), the Water Framework Directive of the European Commission has set environmental quality standards (EQS) in surface waters (river, lake, transitional and coastal) (European Commission, 2008, 2013). The EQS are the concentrations of a pollutant or group of pollutants in water, sediment or biota which should not be exceeded in order to protect human health and environment. Monitoring biota is a new Water Framework Directive requirement.

Other persistent organic contaminants, even if they are not included in the Stockholm Convention, are monitored in the environment. The polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) form a class of various hydrophobic organic molecules which are ubiquitous persistent pollutants of the environment. They have two origins: natural (e.g. forest fires or volcanic activity) and anthropogenic (e.g. pyrogenic or petrogenic). For monitoring PAH exposure of fish, the PAH metabolites (OH-PAHs) are used as markers as the parent compounds are rapidly metabolized (Nagel et al., 2012b). Alkylphenols (APs) such as nonylphenol, octylphenol and butylphenol principally come from the degradation of alkylphenolethoxylates (APEs). These compounds represent a class of non-ionic surfactants widely used as detergent, wetting agents, dispersants, solubilizers, and emulsifiers, e.g. in pesticide formulations and industrial products, including textiles, coating, lube oils and fuels, metals and plastics. In addition to their role of raw material for APEs, APs are used in the preparation of phenolic resins, polymers, heat stabilizers, antioxidants and curing agents (Ying et al., 2002). BisphenolA (BPA) is found ubiquitously in our environment (Vandenberg et al., 2007). This chemical is one of the most widely produced worldwide, with a production volume each year of over 2.7 million tons and it is estimated that every year over 100 tons are released into the atmosphere through production (Vandenberg et al., 2007). BPA is a monomer mainly used in the production of synthetic polymers such as the polycarbonates and the epoxy resins (Flint et al., 2012). All of these compounds (PCBs, PBDEs, PFAS, APs and the PAHs (parent compounds of OH-PAHs)) are listed as priority substances within the European Union Water Framework Directives (European Commission, 2000, 2008, 2013). Since 2013, the list of the directive identified 45 substances or group of substances being of major concern for European Waters (European Commission, 2013). These chemicals were selected from among those presenting a significant risk to or via the aquatic environment.

Chemicals released into the environment may impact ecosystems and human health. This is why it is important to monitor contaminants present in the environment in order to not only safeguard the ecosystems and man, but also target their origin in order to implement rules of restriction or prohibition of these compounds. The Water Framework Directive recommended the use of indicators for monitoring the chemical status of surface waters.

Biological indicators such as crustaceans (Munsch et al., 2013; Ricciardi et al., 2010), bivalves (Covaci et al., 2005) or fish (Bettinetti et al., 2011; Blanchet-Letrouvé et al., 2014; Bodin et al., 2014; Macgregor et al., 2010; Roosens et al., 2010; Schuetze et al., 2010; Tabouret et al., 2011; Tapie et al., 2011) were therefore used most often. Among these potential indicator species, the eel may be used. This bioindicator value is however restricted to the yellow eel phase, because of the reproduction and migratory behavior of the silver eels (Belpaire and Goemans, 2007). The European eel (Anguilla anguilla) has specific

physiological and behavioral characteristics (such as catadromous, carnivorous, fat content, wide distribution, euryhyalinity and long lifespan) favorable for use as chemical sentinel species (Belpaire and Goemans, 2007). As eel pollution profiles were shown to be significantly different along a river at small and large scales (Belpaire and Goemans, 2007; Belpaire et al., 2008), it would be a valuable fingerprint of the chemical pressure of a specific site, particularly for the lipophilic chemicals. Furthermore since 1950, the eel population has continued to decline even if the glass eel recruitment has increased slightly over the last two years (ICES, 2013). Overfishing, climate change, habitat reduction and numerous hydraulic barriers to the downstream and upstream migrations, impacts of pollution, diseases and parasitism were all factors explaining the overall decline of the stock (Dekker, 2003; Elie and Girard, 2009). In September 2008, the eel was listed as "critically endangered" in the International Union for Conservation of Nature (IUCN) Red List and one year earlier, it was included in the UN CITES Appendix II list (CITES, 2007). On the other hand, this fish species represents an important part of the human diet (Covaci et al., 2005).

For the European eel, the Loire estuary (France) represents one of the most important continental migration paths of glass eels. The Loire River is one of the largest west European rivers but also the last wild large and most preserved river in Europe. Its estuary constitutes an interesting study area because it is characterized by an important human pressure. Compared with other large French estuaries, few studies on eel contamination by organic compounds exists and they focused mainly on PCBs, dioxins and furans (PCDD/Fs) and PBDEs (Bragigand et al., 2006; Blanchet-Letrouvé et al., 2014; ONEMA, 2012). The aims of the present work were to investigate current levels and profiles of contamination of 53 organic compounds in European eels (A. anguilla) collected along the Loire estuary. In order to evaluate variations according to the spatial locations in the estuary and/or life stage, the sample collections were carried out at three locations for yellow eels and at different life stages of the eels (yellow and silver).

## 2. Material and methods

### 2.1. *Sampling locations*

From its source in the Massif Central across the Paris basin before discharging into the Atlantic Ocean, the Loire River flows for more than 1000 km and drains around 118,000 km² catchment area. The Loire estuary is highly urbanized and industrialized, with the Nantes-Saint Nazaire harbor (4th seaport of France), a refinery (2nd in France), a coal power plant, a gas storage, an aircraft industry, a shipyard, etc. and is very attractive for tourism, especially on the coast. Moreover, the estuary constitutes the main source of drinking water for the western region. Agriculture is also an important activity around the estuary. Consequently, it is an area subject to major environmental issues. In the Loire estuary, resources of glass, yellow and silver eels are exploited. For glass, yellow and silver eels, there are about 100, 220 and 3 professional fishermen in the Loire estuary respectively. The annual yields of harvested eels for human consumption are about 3, 30 and 50 tons for glass, yellow and silver eels respectively. Fig. 1 shows the three sampling locations selected in this study. Varades (47°21′58″N–1°1′31″W) is a small city (about 3550 locals), located upstream in the estuary at the limit of the salinity (100 km from the Loire mouth); it presents few industrial activities and is particularly under agricultural pressure. The two other sampling locations are upstream (47°14′15″N–1°28′2″W) and downstream (47°11′39″N–1°40′4″W) an important city, Nantes (about 600,000 locals), called Bellevue and Haute Indre respectively. These two areas are within a strong influence of the North Atlantic Ocean. The city of Nantes, located approximately 50 km from the mouth, is characterized by an industrial harbor and an urban zone including two incineration factories.
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Fig. 1. Map of the France and of the three sampling sites distribution on the Loire estuary. 1: Haute Indre; 2: Bellevue and 3: Varades.</figcaption></figure>

## 2.2. Studied species and sample collections

According to the fishing authorizations, European eels (A. anguilla) were fished by local fishermen in the three sampling areas described above at two life stages (silver (S) and yellow (Y)) in November 2011 and June 2012, respectively (Table 1). Yellow eels were collected with fyke and silver eels with stow nets. The aim is to assess the spatial and life stage influence on chemical accumulation. In function of the sampled fish, only female eels over 40 cm long were kept. The gender was confirmed during dissection. A total of 45 females were randomly collected: 10 yellow eels sampled at Varades (YV), 10 at Bellevue (YB; upstream to Nantes) and 10 at Haute Indre (YHI; downstream to Nantes), as well as 15 migrant silver eels (SV) sampled during downstream migration in the estuary (between Varades and the mouth of the estuary). The silver stage was distinguished from the yellow one using morphological and physiological changes between these two life stages, i.e. body length, ocular diameter, body color (differentiated lateral line and contrasting skin color), pectoral fin length, empty stomach with gut degeneration and gonadal maturation underlined by gonado-

somatic index (GSI) (Durif et al., 2005; Van Ginneken et al., 2007). After fish capture, the eels were conducted to the laboratory in 200 L tanks, aerated and filled with water from the sampling site. At the laboratory, the eels were acclimated during at least 12 h under a natural photoperiod and at a temperature around 12 °C ± 2, equivalent to the fishing site conditions before dissection.

## 2.3. Biological samples and biometric parameters

Before dissection, the eels were anesthetized in a water bath of 30 L with 4.5 to 6 mL of clove oil solution dissolved in ethanol (70%) added, according to their weight. Once anesthetized, biometric parameters of each individual were measured, the total length (TL in cm) and the body weight (BW in g). The animals were then sacrificed by cardiac puncture and dissected on ice (4 °C). The verification of gender was realized by direct anatomic observation of gonads. Only female eels were kept for this study. Gonads and liver were weighed to calculate the gonado-somatic index (GSI) (GSI = mass of gonads (g) × 100/body weight (g)) and the hepato-somatic index (HSI) (HSI = mass of liver

**Table 1**

Means of biometric parameters (total length (TL), body weight (BW), lipid weight (LW), gonads weight (wt.), liver weight (wt.), parasitic parameters (Anguillicola crassa number and weight (wt.)), index (Gonado Somatic Index (GSI), Hepato Somatic Index (HSI), Parasitic Index (PI)) and Fulton's condition factor (K) of European eels sampled in the Loire estuary.

<table><thead><tr><th>Life stage</th><th>Yellow eels</th><th>Yellow eels</th><th>Yellow eels</th><th>Silver eels</th></tr><tr><th>Sampling site</th><th>Varades<br>(47°21′58″N-1°1′31″W)</th><th>Bellevue<br>(47°14′15″N-1°28′2″W)</th><th>Haute Indre<br>(47°11′39″N-1°40′4″W)</th><th>Estuary</th></tr><tr><th>Catch period</th><th>November 2011</th><th>November 2011</th><th>November 2011</th><th>June 2012</th></tr><tr><th>n</th><th>10</th><th>10</th><th>10</th><th>15</th></tr></thead><tbody><tr><td>TL (cm)</td><td>50.40 ± 5.73</td><td>71.74 ± 11.35</td><td>52.22 ± 7.04</td><td>61.80 ± 9.99</td></tr><tr><td>BW (g)</td><td>192.30 ± 96.41</td><td>727.50 ± 409.24</td><td>222.20 ± 93.59</td><td>384.20 ± 247.62</td></tr><tr><td>LW (%)</td><td>6.16 ± 4.96</td><td>17.65 ± 11.05</td><td>13.32 ± 12.52</td><td>26.86 ± 4.36</td></tr><tr><td>Anguillicola crassa<br>number</td><td>4.30 ± 7.73</td><td>2.40 ± 2.07</td><td>6.10 ± 9.95</td><td>2.47 ± 3.66</td></tr><tr><td>Anguillicola crassa wt.<br>(g)</td><td>0.44 ± 0.60</td><td>2.61 ± 2.75</td><td>2.48 ± 3.12</td><td>0.22 ± 0.46</td></tr><tr><td>Gonads wt. (g)</td><td>0.62 ± 0.78</td><td>5.68 ± 6.22</td><td>1.46 ± 1.73</td><td>7.09 ± 4.05</td></tr><tr><td>Liver wt. (g)</td><td>2.20 ± 1.01</td><td>7.00 ± 3.33</td><td>2.76 ± 1.28</td><td>4.51 ± 2.73</td></tr><tr><td>GSI (%)</td><td>0.27 ± 0.15</td><td>0.66 ± 0.41</td><td>0.55 ± 0.48</td><td>1.89 ± 0.14</td></tr><tr><td>HSI (%)</td><td>1.16 ± 0.20</td><td>1.01 ± 0.14</td><td>1.22 ± 0.17</td><td>1.20 ± 0.15</td></tr><tr><td>PI (%)</td><td>0.25 ± 0.35</td><td>0.33 ± 0.22</td><td>1.01 ± 1.04</td><td>0.06 ± 0.13</td></tr><tr><td>K</td><td>0.14 ± 0.02</td><td>0.18 ± 0.03</td><td>0.15 ± 0.02</td><td>0.15 ± 0.01</td></tr></tbody></table>

(Mean ± standard deviation).
(g) × 100/body weight (g)) respectively. The GSI allowed the evaluation of developmental stage of eels; GSI values higher than 1.2 underlined the gonad maturation occurring during silvering (Durif et al., 2009). The HSI provided an indication on status of energy reserves in the liver. Biometric parameters recorded were used to calculate the Fulton condition index ($K = (BW \times 10^5) / TL^3$) which allowed the evaluation of overall global eel health. A reduction of this index has been considered, in fish, to be related to poor habitat quality, lower availability of food, changes in feeding habits and a metabolic rate increase in response to pollution and/or other environmental stresses (Hoque et al., 1998; Lloret et al., 2002).

The whole muscle (two filets) was also collected and then stored at -20 °C until chemical analysis. The bile was sampled by puncture in the gallbladder and stored at -20 °C. The swim bladder of each eel was removed and dissected to detect the presence of parasites. In case of infection, the number and weight of parasites present in the swim bladder were determined to calculate the percentage of individuals infected and the parasite index (PI) ($PI = parasite total weight (g) / body weight (g)$) to evaluate the infection level (Quadroni et al., 2013).

## 2.4. Fish muscle analysis

### 2.4.1. PCB and PBDE analysis

#### 2.4.1.1. Chemicals and reagents.
Eel muscles were analyzed for 18 PCBs and 7 PBDEs. Among the PCBs, 12 were dioxin-like PCBs (dl-PCBs: #77; 81; 105; 114; 118; 123; 126; 156; 157; 167; 169; 189) and 6 were non-dioxin-like PCBs (ndl-PCBs: #28; 52; 101; 138; 153; 180; also called PCB indicators (PCBi)). Seven PBDE congeners were monitored, i.e. BDEs 28, 47, 99, 100, 153, 154 and 183. PBDE 209 was not analyzed because it required a specific analytical procedure not developed in the laboratory. Targeted compounds including native and $^{13}$C labeled internal standards were obtained from Wellington Laboratories (Guelph, Ontario, Canada) and Cambridge Isotope Laboratories (Andover, CA, USA). All solvents (Picograde® quality) were purchased from Promochem (Wesel, Germany).

#### 2.4.1.2. Sample preparation procedure.
For PCB/PBDE analysis, eel muscles were homogenized, weighed and freeze-dried. The freeze-dried muscles were cut and milled using a turbo-mixer. Before use, all glassware was cleaned and heated overnight in a muffle furnace at 550 °C and disposable materials were used for each experiment. Sample preparation was carried out in an over pressurized room to prevent contamination, especially for PBDEs. One gram (dw) of powered sample was transferred into a cell and then extracted by accelerated solvent extraction (ASE) using a Dionex ASE 300. Before extraction, $^{13}$C-labeled PCBs and PBDEs (respectively 18 and 7) congeners were added to the sample for internal standard calibration and quantification by the isotope dilution method. The extraction temperature and pressure were set to 120 °C and 100 bars respectively. The extraction solvent was a toluene/acetone (70:30, v/v) mixture. Three successive extraction cycles, of 5 min each, were performed. The muscle lipid weight (LW in % of wet weight) was determined by gravimetry. The fat extract was dissolved in 25 mL hexane before further sample clean-up. Three steps of purification were achieved, using successively acid silica, Florisil® and celite/carbon columns. The fat was removed on the first silica gel column activated with sulfuric acid. PCBs and PBDEs were purified on the second Florisil® column. The separation of coplanar (non-ortho) PCBs from non-planar PCBs and PBDEs was performed on an activated mixture of Florisil®/Carbopack C/Celite 545 (overnight at 130 °C). Before evaporation to dryness under a gentle stream of nitrogen, injection standards ($^{13}$C$_{12}$-PCB #111 for PCBs, $^{13}$C$_{12}$-PBDE #139 for PBDEs) were added to the final purified extracts for signal correction. Eventually, the extracts were reconstituted in 20 and 50 µL toluene for coplanar PCBs and non-coplanar PCBs with PBDEs, respectively.

#### 2.4.1.3. GC-HRMS measurement.
PCB and PBDE analyses were carried out by gas chromatography coupled with high resolution mass spectrometry (GC-HRMS) using an 7890A gas chromatograph (Agilent) coupled with a JEOL JMS 700D or a JMS 800D double sector high resolution mass spectrometer (JEOL, Tokyo, Japan). The system was fitted with a DB5MS (J&W) capillary column (30 m × 0.25 mm × 0.25 µm) and injection was done in the splitless mode. Helium was used as a carrier gas (1 mL/min). The injection volume was 2 µL. The GC program for PCBs was: 3 min at 120 °C, 20 °C/min to 170 °C, 3 °C/min to 245 °C and 20 °C/min to 275 °C. For the PBDEs, the program used was: 2 min at 120 °C, 10 °C/min to 215 °C, 3 °C/min to 270 °C, 10 °C/min to 310 °C and held for 4 min. The source temperature was 280 °C. The mass spectrometer resolution was set-up at 10,000 (FWHM) and the spectrometric signals were recorded in the Single Ion Monitoring (SIM) mode focusing on two abundant ions selected in the molecular ion isotopic pattern. Ionization was achieved in the electron ionization mode (40 eV electron energy). Signals obtained were integrated by JEOL DiOK software (v.4). The limit of detection (LOD) was determined by a signal to noise ratio equal to 3 ($S/N = 3$) and was systematically calculated by JEOL Diok software for each congener in each sample. The concentrations of PCBs and PBDEs were expressed as ng/g wet weight (ww), ng/g dry weight (dw) and ng/g lipid weight (LW). For PCBs, the LOD ranged from 0.16 (PCB 169) to 1.72 (PCB 156) pg/g ww for dl-PCBs and from 0.67 (PCB 101) to 13.4 (PCB 28) pg/g ww for PCBi. For PBDEs, the LOD ranged from 1 (BDE 28) to 5 (BDE 183) pg/g ww. The recoveries ranged from 60 to 120%.

### 2.4.2. Toxic equivalency calculation

Health risk resulting from PCB toxicity was estimated by the Toxic Equivalent (TEQ) values. Concentrations of TEQs were calculated by summing the concentration of each congener weighed by a specific congener factor, the World Health Organization Toxic Equivalent Factors (WHO TEFs) for human. For comparative purposes with literature, our TEQ data have been expressed in WHO TEQ 1998 and WHO TEQ 2005 (Van den Berg et al., 1998, 2006). In addition, dl-PCBs TEQ and Total TEQ were estimated by predictive models using the indicator PCBs (Babut et al., 2009; Bodin et al., 2014).

### 2.4.3. PFAS analysis

#### 2.4.3.1. Chemicals and reagents.
PFAS and corresponding $^{13}$C-labeled internal standards (purity higher than 98%) were obtained from Wellington Laboratories (Guelph, Ontario, Canada). A total of 17 PFAS were analyzed in the eel muscles including 5 perfluoroalkylsulfonates (PFASS): perfluorobutanesulfonate (PFBS), perfluorohexanesulfonate (PFHxS), perfluoroheptanesulfonate (PFHpS), perfluorooctanesulfonate (PFOS), perfluorodecanesulfonate (PFDS); 1 perfluoroalkylsulfinate (PFASi): perfluorooctanesulfinate (PFOSi) and 11 perfluorocarboxylic acids (PFCAs): perfluorobutanoic acid (PFBA), perfluoropentanoic acid (PFPA), perfluorohexanoic acid (PFHxA), perfluoroheptanoic acid (PFHpA), perfluorooctanoic acid (PFOA), perfluorononanoic acid (PFNA), perfluorodecanoic acid (PFDA), perfluoroundecanoic acid (PFUnA), perfluorododecanoic acid (PFDoA), perfluorotridecanoic acid (PFTrDA) and perfluorotetradecanoic acid (PFTeDA). Ten labeled internal standards were used i.e. PFBA $^{13}$C$_{4}$, PFHxA$^{13}$C$_{5}$, PFHpA$^{13}$C$_{4}$, PFOA $^{13}$C$_{4}$, PFNA $^{13}$C$_{2}$, PFDA $^{13}$C$_{2}$, PFUnA$^{13}$C$_{7}$, PFDoA$^{13}$C$_{2}$, PFOS $^{13}$C$_{4}$ and PFOSi$^{13}$C$_{4}$. Methanol (Picograde® quality) was purchased from Promochem (Wesel, Germany). Ammoniac (32%), ammonium acetate, potassium hydroxide and glacial acetic acid were acquired from Merck (Darmstadt, Germany). The SPE WAX cartridges (150 mg, 6 mL) were purchased from Waters (Guyancourt, France) and the Envicarb cartridges (500 mg, 6 mL) from Supelco (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France). Ultrapure water (> 18 mΩ cm) was produced with a nanopure system (Barnstead, Germany).