# Détection de micro-ARNs in situ : utilisation de sondes LNA

Candice Babarit

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Candice Babarit. Détection de micro-ARNs in situ : utilisation de sondes LNA. XXXème congrès de l'AFH: les nouveaux mondes de l'histologie, Association Française d'Histotechnologie (AFH). FRA., Jun 2017, Nantes, France. hal-01547549

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École Nationale
Vétérinaire, Agroalimentaire et de l'Alimentation
Sante et alimentation au cœur de la vie

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INRA
SCIENCE & IMPACT

# Détection de micro-ARNs in situ :
utilisation de sondes LNA

Candice BABARIT

UMR703 PAnTher

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Les micro-ARNs

➤ ARNs de petite taille : 20-25 nucléotides

➤ Synthétisés à partir de l'ADN génomique

➤ non traduits en protéine

➤ Acteurs clés de la régulation post-transcriptionnelle
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

# Les micro-ARNs

* ARNs de petite taille : 20-25 nucléotides

* Synthétisés à partir de l'ADN génomique

* non traduits en protéine

* Acteurs clés de la régulation post-transcriptionnelle

<figure><img src="image_9.png" /></figure>
Pourquoi s'intéresse t-on aux micro-ARNs ?

* Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement ...
# Pourquoi s'intéresse t-on aux micro-ARNs ?

* ✓ Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement ...

Oncotarget. 2015 Apr 20; 6(11): 8474-8490.

Published online 2015 Apr 2. doi: 10.18632/oncotarget.3523

## MicroRNAs in apoptosis, autophagy and necroptosis

Zhenyi Su,<sup>#1,2</sup> Zuozhang Yang,<sup>#3,4</sup> Yongqing Xu,<sup>#4</sup> Yongbin Chen,<sup>#5</sup> and Qiang Yu<sup>#6</sup>

Adv Drug Deliv Rev. 2015 Jul 1; 88: 3-15.

Published online 2015 Apr 14. doi: 10.1016/j.addr.2015.04.004

## MicroRNA-mediated Regulation of Differentiation and Trans-differentiation in Stem Cells

Sang-Ging Ong,<sup>1,2</sup> Won Hee Lee,<sup>1,2</sup> Kazuki Kodo,<sup>1,2</sup> and Joseph C. Wu<sup>1,2,3,4</sup>

Genes Dev. 2007 Mar 1; 21(5): 578-589.

doi: 10.1101/gad.1522907

## Dynamic regulation of miRNA expression in ordered stages of cellular development

Joel R. Neilson,<sup>1</sup> Grace X.Y. Zheng,<sup>1,2</sup> Christopher B. Burge,<sup>2,3</sup> and Phillip A. Sharp<sup>1,3,4</sup>
Pourquoi s'intéresse t-on aux micro-ARNs ?

✓ Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement ...

➤ Implication dans les processus physiopathologiques :
# Pourquoi s'intéresse t-on aux micro-ARNs ?

* ✓ Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement ...

* ➤ Implication dans les processus physiopathologiques :

Oncotarget. 2015 Sep 8;6(26):21802-15.

**MicroRNA-224 is implicated in lung cancer pathogenesis through targeting caspase-3 and caspase-7.**

Cui R<sup>1,2</sup>, Kim T<sup>3</sup>, Fassan M<sup>1,4</sup>, Meng W<sup>5</sup>, Sun HL<sup>1</sup>, Jeon YJ<sup>1</sup>, Vicentini C<sup>6</sup>, Tili E<sup>1,7</sup>, Peng Y<sup>8</sup>, Scarpa A<sup>9</sup>, Liang G<sup>10</sup>, Zhang YK<sup>11</sup>, Chakravarti A<sup>5</sup>, Croce CM<sup>1</sup>.

Biochem Soc Trans. 2010 Dec;38(6):1565-70. doi: 10.1042/BST0381565.

**The involvement of microRNAs in Type 2 diabetes.**

Ferland-McCollough D<sup>1</sup>, Ozanne SE, Siddle K, Willis AE, Bushell M.

Front Physiol. 2015; 6: 40.

Published online 2015 Feb 12. doi: 10.3389/fphys.2015.00040

**The emerging role of microRNAs in Alzheimer's disease**

Grazia D. Femminella,<sup>1</sup> Nicola Ferrara,<sup>1</sup> and Giuseppe Rengo<sup>2,*</sup>

FASEB J. 2009 Oct;23(10):3335-46. doi: 10.1096/fj.08-128579. Epub 2009 Jun 15.

**Common micro-RNA signature in skeletal muscle damage and regeneration induced by Duchenne muscular dystrophy and acute ischemia.**
# Pourquoi s'intéresse t-on aux micro-ARNs ?

* Rôle physiologique : apoptose, différenciation cellulaire, développement ...

* Implication dans les processus physiopathologiques :

* Compréhension des processus pathologiques

* Biomarqueurs diagnostiques

* Biomarqueurs d'efficacité de la réponse aux traitements

* Cibles thérapeutiques (Gougelet *A et al*, 2015)
# Techniques d'analyse des micro-ARNs

## Approches globales

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- Microarray

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

- Séquençage haut débit
# Techniques d'analyse des micro-ARNs

## Approches globales

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- Microarray

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- Séquençage haut débit

## Approches ciblées

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

- RT-qPCR

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- Hybridation in situ
La détection des micro-ARNs par hybridation in situ:
un véritable challenge

➤ Nature instable des ARNs (travailler en condition RNase free)

➤ Petite taille des micro-ARNs

➤ Séquences très proches entre certains micro-ARNs

<figure><img src="image_16.png" /></figure>
# Les sondes LNA : Gold standard pour la détection des micro-ARNs

* Développement de sondes oligonucléotidiques avec incorporation d'acides nucléiques modifiés

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Urbanek *et al*, 2015

<figure><img src="image_18.png" /></figure>
# Les sondes LNA : Gold standard pour la détection des micro-ARNs

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

* Sondes LNA: sonde ADN avec incorporation d'acides nucléiques « verrouillés » (30% de LNA)

* Les acides nucléiques LNA:

* augmentent l'affinité de liaison avec le nucléotide complémentaire

* augmentent la spécificité de l'hybridation
# Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

## FIXATION

* PFA 4%

* Ethyl diéthylaminopropyl carbodiimide (EDC)
# Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

* PFA 4%

* EDC

* Optionnelle

* Triton X-100

* Proteinase K
# Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

* PFA 4%

* EDC

* Optionnelle

* Triton X-100

* Proteinase K

* Sonde LNA

* Marquage en 3' ou 5' ou 3'/5'

* Haptène ou fluorophore

* Contrôle négatif : scramble-miR
# Détection des micro-ARNs par hybridation in situ

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

* PFA 4%

* EDC

* Optionnelle

* Triton X-100

* Proteinase K

* Sonde LNA

* Marquage en 3' ou 5' ou 3'/5'

* Haptène ou fluorophore

* scramble-miR

* Chromogénique

* Fluorescence

<figure><img src="image_23.png" /></figure>
# La myopathie de Duchenne

* Maladie génétique provoquant une perte progressive de la masse musculaire

* Touche 1 garçon / 5000

* Mutation du gène DMD codant la dytrophine

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

(votresant.skyrock.com)

Muscle sain

Muscle myopathe

dystrophine

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<figure><img src="image_26.png" /></figure>

Absence de dystrophine
# Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

Absence de dystrophine

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Fragilisation de la membrane

<figure><img src="image_28.png" /></figure>
# Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

Absence de dystrophine

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Fragilisation de la membrane

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intracelluiar

Entrée de calcium

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Activation des protéases

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Nécrose des fibres
# Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

Absence de dystrophine

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Fragilisation de la membrane

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

intracellulaire

Entrée de calcium

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Activation des protéases

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Nécrose des fibres

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Régénération

<figure><img src="image_39.png" /></figure>
# Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

Absence de dystrophine

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Fragilisation de la membrane

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

intracellulaire

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Entrée de calcium

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

Activation des protéases

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Nécrose des fibres

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Régénération

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↓ masse musculaire

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

Infiltration du tissu adipeux

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# Physiopathologie de la myopathie de Duchenne

<figure><img src="image_52.png" /></figure>
micro-ARNs et physiopathologie

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

Cacchiarelli *et al* 2011, Greco *et al* 2009, Roberts *et al* 2012, Liu *et al* 2012, Eisenberg *et al* 2007
Le modèle du chien GRMD
Golden Retriever Muscular Dystrophy

➤ Phénotype clinique proche de l'Homme

➤ **Taille** comparable à celle des enfants dystrophiques

➤ Référence pour les essais précliniques

<figure><img src="image_54.png" /></figure>
Le modèle du chien GRMD
Golden Retriever Muscular Dystrophy

➤ Phénotype clinique proche de l'Homme

➤ Taille comparable à celle des enfants dystrophiques

➤ Référence pour les essais précliniques

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<figure><img src="image_56.png" /></figure>

Absence de données sur l'expression tissulaire des micro-ARNs dans le muscle du chien GRMD
Expression tissulaire des miR-206 et miR-486 chez le chien GRMD

<figure><img src="image_57.png" /></figure>
# Démarche expérimentale

## Niveau d'expression tissulaire

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

Extraction des petits ARNs

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Transcription inverse

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

qPCR

miRNA mature

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

Sonde RT

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

Sens

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

Sonde Taqman

Anti-sens

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

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# Démarche expérimentale

## Niveau d'expression tissulaire

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Extraction des petits ARNs

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

Transcription inverse

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

qPCR

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

## Localisation cellulaire et phénotypage

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

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# Démarche expérimentale

## Niveau d'expression tissulaire

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

Extraction des petits ARNs

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

Transcription inverse

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qPCR

miRNA mature

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Sonde RT

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Sens

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

Anti-sens

Sonde Taqman

## Localisation cellulaire et phénotypage

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

Coupes au cryostat

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

Hybridation *in situ*

<figure><img src="image_79.png" /></figure>

NBT-BCIP

Précipité Bleu

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

MicroRNA
<figure><img src="image_81.png" /></figure>

# Démarche expérimentale

## Niveau d'expression tissulaire

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

Extraction des petits ARNs

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

Transcription inverse

<figure><img src="image_84.png" /></figure>

qPCR

miRNA mature

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

Sonde RT

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

Sens

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

Anti-sens

Sonde Taqman

## Localisation cellulaire et phénotypage

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

Coupes au cryostat

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

Hybridation *in situ*

Immunomarquage
MyH Cd

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

<figure><img src="image_91.png" /></figure>
Expression du miR-206 chez le chien GRMD

<figure><img src="image_92.png" /></figure>
Expression du miR-206 chez le chien GRMD

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Expression du miR-206 chez le chien GRMD

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

p = 0.6, test Mann-Whitney

Échelle: 25 µm
Expression du miR-486 chez le chien GRMD

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Expression du miR-486 chez le chien GRMD

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Expression du miR-486 chez le chien GRMD

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p = 0.1, test Mann-Whitney

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

Échelle: 25 µm
<figure><img src="image_99.png" /></figure>

Conclusion

➤ Sondes LNA : puissants outils pour la détection de micro-ARNs

➤ Description du profil d'expression tissulaire des miR-206 et miR-486 chez le chien GRMD

➤ Les techniques quantitatives ne permettent pas de détecter des dérégulations du profil d'expression
# Perspectives de développement à l'UMR703: Hybridation in situ quantitative

## Micro-ARN
LNA-ELF-FISH

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ELF : Substrat de la phosphatase alcaline hydrolysé en précipité fluorescent

## ARNm
SM-FISH

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Utilisation de plusieurs sondes oligonucléotidiques pour un même ARNm
<figure><img src="image_102.png" /></figure>

Merci

UMR 703 PAnTher

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<figure><img src="image_104.png" /></figure>

École Nationale
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Nantes Atlantique

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

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Nantes Atlantique
Soutiendraiment au cours de la vie

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# Dérégulation de micro-ARNs dans la myopathie de Duchenne

<figure><img src="image_107.png" /><figcaption>sciencephotolibairy</figcaption></figure>

<figure><img src="image_108.png" /><figcaption>Robriquet et al, 2015</figcaption></figure>

<table><thead><tr><td></td><td>Patient DMD</td><td>Souris mdx</td><td>Chien GRMD</td></tr></thead><tbody><tr><td>miR-206</td><td>Surexprimé</td><td>Surexprimé</td><td>Non dérégulé</td></tr><tr><td>miR-486</td><td>Sous exprimé</td><td>Sous exprimé</td><td>Sous exprimé</td></tr></tbody></table>
Biogenèse de micro-ARNs

<figure><img src="image_109.png" /></figure>

<figure><img src="image_110.png" /></figure>