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CHAPITRE V

Origine et diversité génétique des
populations du nématode à kyste de la
pomme de terre introduites en Europe
Dans le paragraphe précédent, nous avons émis l'hypothèse que *G. pallida* a colonisé les Andes à partir du lac Titicaca au fur et à mesure que la montagne s'élevait en progressant depuis le sud vers le nord, grâce à la progression conjointe de son hôte (les Solanum tubéreux sauvages). Lors de la domestication de la pomme de terre, *G. pallida* aurait parasité les pommes de terre cultivées à plusieurs reprises et ceci de façon indépendante dans chacun des cinq clades. Ce travail met en évidence que l'étude d'un parasite à des fins agronomiques permet aussi d'appréhender des questions de recherches fondamentales comme la phylogéographie des espèces andines et de façon plus inattendue la géologie de la Cordillère des Andes (annexe 3).

Dans les trois chapitres précédents, le patron génétique de *G. pallida* a été appréhendé dans son berceau d'origine. Se pose maintenant la question de la description de son patron génétique dans un milieu d'introduction. En Europe, l'homme a probablement introduit *G. pallida* avec l'importation de tubercules de pommes de terre contaminés. La pomme de terre serait arrivée en Europe vers la fin du XVIe siècle, et ceci par deux portes d'entrée différentes ; la première fut l'Espagne vers 1570 (Salaman 1937), la seconde les îles Britanniques en 1590 (Gerard 1597). Puis à partir de l'Europe, la pomme de terre a été dispersée dans le reste du monde (figure 5.1). Le développement de la culture en Europe commence réellement au cours du XVIIIe siècle. D'abord marginale, cultivée sur jachère ou chènevière, la pomme de terre prend progressivement une place plus importante (Spire et Rousselle 1996). En 2003, la production mondiale s'est élevée à 311 millions de tonnes (blé=573 ; riz=383 ; orge=135 and maïs=604) pour 19,2 millions d'hectares plantés (source : « Food and Agriculture Organization »). Actuellement en Europe, *G. pallida* se développe dans des parcelles cultivées de pommes de terre. Sur le vieux continent, le patron génétique de *G. pallida* est fortement lié (1) aux perturbations apportées par l'homme (nombre d'introductions), (2) au niveau de diversité génétique des populations importées et (3) à l'origine géographique des populations importées. À partir de l'étude de génétique des populations et de l'étude phylogéographique au Pérou, nous allons tenter dans ce dernier chapitre d'éclaircir ces zones d'ombre, mais aussi de comparer le fonctionnement génétique des populations dans ces deux régions.
<figure><img src="image_26.png" /></figure>

**Figure 5.1** : Dispersion de la pomme de terre à travers le monde (Turner & Evans 1998).
# Origin and genetic diversity of European populations of *Globodera pallida*
inferred from mitochondrial sequences and microsatellite loci

Keywords: phylogeography, population genetics, invasive pest, origin, introduction, cytochrome B, potato cyst nematode, Europe, Peru, South America

## 5.1. Introduction

The potato cyst nematode *G. pallida* is an important world wide pest of potato (Marks and Brodie, 1998). After a migration inside root tissue, this specialised endoparasite nematode modifies the expression of plant cells by producing a syncitium on which it feeds to the detriment of its host-plant. It's generally accepted that *G. pallida* is native to South America (Stone 1979), where it is the principal pest of Andean potato crops (Atkinson et al., 2001). Although a few records of *G. pallida* have been made in Bolivia (Evans, Franco et al., 1975; Franco, 1977), its main range lies in Peru, Ecuador and Colombia, i.e. to the north (15.6°S) while its sibling species, *G. rostochiensis* is found to south of this latitude. In South America, this cyst nematode is mainly found between 2000 and 4000 m above sea level with the heaviest infestations between 2900 and 3800 m.a.s.l. (Franco 1997). It has been introduced in many parts of the world and particularly in Europe (Minnis et al., 2002), but also in USA (Brodie, 1998), Canada, New-Zealand (Marshall, 1993) and in numerous other countries where potatoes are grown intensively.

Until its description by Stone in 1972, *G. pallida* was not distinguished from the golden potato cyst nematode *G. rostochiensis*. This improvement to the *Globodera* genus systematic has had numerous practical and economical consequences. For example, this distinction between the 2 species is especially necessary as numerous resistance genes against one species are not efficient against the other (Bakker et al., 1993). For this reason, an in-depth description of intraspecific genetic variability of *G. pallida* is necessary to efficiently control this pest.

The identification of the geographical origin of a pest is a common feature for introduced pests (O'Donnell et al., 2000; Davies et al., 1999; Huffbauer et al., 2004). The origin(s) of the potato cyst nematodes found in Europe is an old question already considered by several authors. Before the use of molecular markers, most hypotheses were poorly supported by any tangible data or only based on the geographical distribution of resistance genes among wild potatoes (Franco, 1977). The intraspecific polymorphism revealed in European populations of *G. pallida* by various molecular markers provided new information to solve this issue. However, those studies did not include any Peruvian populations (Phillips et al., 1992; Folkertsma et al., 1994; Folkertsma et al.,
1996a; Folkertsma *et al.*, 1996b; Folkertsma *et al.*, 2001; Thiery and Mugniery, 1996; Burrows *et al.*, 1996; Manduric and Andersson, 2003) or did not allow precise identification of the origin of European populations due to the low representation of Peruvian samples (Blok and Phillips 1995; Blok *et al.* 1997; 1998; Subbotin 2000, Grenier *et al.* 2001). Moreover, the molecular markers used in those studies were not always adequate enough for phylogeographical purpose (cf. 2-DGE; Folkertsma *et al.* 1996, 2001, or hybridisation with satellite DNA; Grenier *et al.* 2001). Without dealing with poorly reproducible markers such as RAPD, the ideal marker should be polymorphic enough (for such purpose, the ITS sequence seems too be insufficient at the intra-specific level -see for example Subbotin 2000-, without dealing with troubles due to among copies polymorphism in this gene with more than 150 copies per genome) but not too variable otherwise homoplasy and saturation could obscure the phylogenetic signal in the data.

In a previous study (Picard and Plantard submitted [chapter 4]), using an extensive
sampling regime along a 1500 km transect from the south to the north border of Peru, we have
been able to describe a clear phylogeographical pattern among Peruvian populations with a
colonisation from south to north (Picard and Plantard submitted [chapter 4]). To identify precisely
the origin of European populations, we have obtained the partial cytb sequence and genotyped the
same microsatellite loci of European populations, and investigated the location of the haplotypes
or multilocus genotype European populations in phylogenetical trees containing the Peruvian
samples.

Using this data set, we address the following issues: (1) from how many different Peruvian regions *G. pallida* has been introduced in Europe? (2) is there any geographical pattern in genetic variability in Europe that could help to reconstruct the history of the introduction? (3) how much genetic variability has been lost during the introduction from South America to Europe through founder effects, bottlenecks and subsequent genetic drift?

The insights of those results for the understanding of the population genetics of this soil nematode will be discussed, as well as their consequences for the control of this pest in Europe and elsewhere in the world.

**5.2. Material and Method**

**5.2.1. <u>Sampling and data collection</u>**

Fifteen European populations directly collected from potato fields (i.e. not from laboratory rearing) from France (9 populations), UK (3 populations), Netherlands (2 populations) and Spain (1 population) have been genotyped with 7 microsatellite loci (loci GP20, GP32, GP33, GP34, GP36, GP38 and GP42; Table I; see Picard *et al.* 2004 for the description of the methods used).
Partial sequences of the cytB gene (872 bp) (see Picard and Plantard submitted for the description of the methods used [chapter 4]) have been obtained for one individual of each of those 15 European populations (except 4 French populations; table I), to which two sequences have been added: one from the Chavornay population (a reference and laboratory strains from Switzerland) and the other being a sequence obtained by Armstrong *et al.* (2000) from an individual from the Gourdie population in Scotland (see Picard and Plantard submitted for the description of the methods used).

<table><caption>**Table I:** list of the European populations studied indicating the country from which the samples came, their precise location, and if they have been used for sequencing or for microsatellite genotyping (as well as sample size for the microsatellite data).</caption><thead><tr><th></th><th>Location</th><th>Country</th><th>Cyt b</th><th>µsat</th><th>N</th></tr></thead><tbody><tr><td>FR-1</td><td>Ouessant</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>30</td></tr><tr><td>FR-2</td><td>Ile de ré (Ars-en-ré)</td><td></td><td></td><td>+</td><td>57</td></tr><tr><td>FR-3</td><td>Ile de ré (Saint Clément 7)</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>30</td></tr><tr><td>FR-4</td><td>Ile de ré (Saint Clément 48)</td><td></td><td></td><td>+</td><td>29</td></tr><tr><td>FR-5</td><td>Ile de ré (Bois plage)</td><td>France</td><td>+</td><td>+</td><td>22</td></tr><tr><td>FR-6</td><td>Nourmoutier (Pinaudières)</td><td></td><td></td><td>+</td><td>57</td></tr><tr><td>FR-7</td><td>Nourmoutier (Roussière)</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>21</td></tr><tr><td>FR-8</td><td>Nourmoutier (Loubinc)</td><td></td><td></td><td>+</td><td>22</td></tr><tr><td>FR-9</td><td>Saint Méloir des Ondes</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>59</td></tr><tr><td>SW</td><td>Chavornay</td><td>Switzerland</td><td>+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP</td><td>Majorca</td><td>Spain</td><td>+</td><td>+</td><td>28</td></tr><tr><td>NL-1</td><td>Centre</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>23</td></tr><tr><td>NL-2</td><td>North</td><td>Netherland</td><td>+</td><td>+</td><td>30</td></tr><tr><td>UK-1</td><td>Shropshire</td><td>England</td><td>+</td><td>+</td><td>29</td></tr><tr><td>UK-2</td><td>Sacrewell Peterborough</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>30</td></tr><tr><td>UK-3</td><td>Gourdie</td><td>Scotland</td><td>+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UK-4</td><td>South</td><td></td><td>+</td><td>+</td><td>19</td></tr></tbody></table>

The samples from the native area used for comparison is constituted by twenty seven Peruvian populations sampled along a 1500 km transect from the Bolivian to the Equatorial boarder (figure 1). All Peruvian individuals sequenced or genotyped have already been used in Picard and Plantard (submitted [chapter 4]), except the microsatellite multilocus genotype of three populations from the southern “clade I” region (see Picard and Plantard submitted [chapter 4]), namely the Sicuani, Colca canyon and Arapa populations (whose haplotypes where already used in the previous study mentioned above).

Because of the presence of both *G. pallida* and *G. rostochiensis* in Europe (sometimes in the same field), the species identification of each individual sequenced or genotyped in the present study has been checked by PCR-RFLP of the ITS region (see Picard *et al.* 2004 for a description of this method).
<figure><img src="image_27.png" /></figure>

**Figure 1** Map of Peru indicating the location of sampling sites. The limits among the five phylogeographical clades (Picard and Plantard submitted) are indicated and numbered from I to V.
### 5.2.2. Data analysis

The phylogenetic trees based on the cytB sequences and the microsatellite multilocus populations were constructed according to the same method as described in Picard and Plantard (submitted, chapter 4).

For the haplotype tree, Modeltest was used to choose the best-fit model (maximum likelihood) according to the Akaike information criterion. The best fit substitution model was the HKY85 + G model (nucleotide frequencies 16.6%, 14.0%, 19.1% and 50.3% for A, C, G and T respectively; transition to transversion ratio = 3.85; Gamma distribution shape parameter = 1.91). Then Phylip (Felsenstein, 2004) was used to reconstruct the phylogenetic tree by maximum likelihood, maximum parsimony and neigbour-joining method using the parameters obtained by Modeltest. Robustness of the ML, MP and NJ trees were assessed by bootstrap analysis (Felsenstein 1985) using 500 iterations. A sequence of *G. mexicana* (the sister group of *G. pallida*) was used as an outgroup in our phylogenetic analysis (see Picard and Plantard submitted [chapter 4]).

For tree reconstruction based on microsatellite multilocus data, $D_A$ distances were used (see Picard and Plantard submitted for a justification of this method). All the genetic distances and the NJ trees were performed using Populations 1.2.28 (available at http://www.cnrs-gif.fr/pge). Statistical support estimates for phylogram nodes were obtained by resampling loci across 500 bootstrap iterations for each genetic distance.

The allelic richness of each population was estimated by the rarefaction index (ElMousadik and Petit, 1996) using the Populations 1.2.28 software. This method avoids the biased error of the allele number variations due to different sample sizes among populations (n is fixed as the smallest number of individual genotypes in a field). In those analyses, all individuals with amplification failure at one locus were excluded because a null amplification is considered as an absence of an allele that leads to an underestimation of the allelic richness.

The Genepop software (Raymond and Rousset, 1995) was used to estimate *Fst* values between pair of European populations, and to test Hardy-Weinberg equilibrium in each Peruvian or European population (see Picard *et al.*, 2004). Significance of *Fis* for each population was also tested using the permutation by population procedure of the Genetix software (Belkhir *et al.*, 1996).

## 5.3. Results

### 5.3.1. Origin and genetic diversity of the European populations inferred from the cytB sequences

According to the cytB tree (figure 2), all the haplotypes found in Europe belong to the same clade (Ic) corresponding to the southern region of Peru (i.e. the Altiplano from the Bolivian
boarder, on the north shore of the Titicaca lake, to the Sicuani area). Only four haplotypes are represented among the 13 populations sampled from 5 European countries: the haplotype Ic3 is found in 9 European populations; a very similar haplotype Ic4 is found in the populations from FR-3 (only 1 substitution between Ic3 and Ic4). The Peruvian haplotype from Colca Canyon (Ic5) is the sister group of this main European group, with only 4 (and 3 substitutions with the Ic3 and Ic4 haplotype respectively); this Peruvian-European group of haplotypes (called Ic(P+E)1) is supported by a high bootstrap value (99%). The second group of European populations is represented by two haplotypes, Ic6 – with one population from UK-3 (Scotland) - and Ic7 – 2 populations (FR-1 and NL2) - , with 1 substitution between those two haplotypes. The haplotype Ic3 is also found in two Peruvian populations (Sicuani and Arapa-2). This second Peruvian-European group of haplotypes (called Ic(P+E)1) is supported by a 100% bootstrap value. However, a weaker bootstrap value is observed between those two mix Peruvian-European groups (Ic(P+E)1 and Ic(P+E)2 (62%). The two other haplotypes of the clade Ic are represented only by Peruvian populations (Ic1 - with the Puno-1 population - and Ic2 – with the Puno-2 and -3, Juliaca, Amantani-1 to -3 populations). Note that Puno, Juliaca and Amantani are situated to the south of the region where the three previous populations mentioned as belonging to mix Peruvian-European groups of haplotypes (i.e. Sicuani, Colca canyon and Arapa; figure 1) were sampled.

5.3.2. Origin and genetic diversity of the European populations inferred from the microsatellite loci

Although most nodes are weakly supported by bootstrap values (data not shown; figure 3), the phylogenetic tree based on microsatellite loci is compatible with the topology of the cytB tree: the Clades *Im*, *IIm*, *IIIm*, *IVm* and *Vm* also form monophyletic groups (except Arapa-2, which constitutes a different clade on its own, instead of being in clade I; all the European populations are included in the clade *Im*, and this clade is paraphyletic if the European populations are not included. However, in contrast to the cytochrome B tree, the European populations form a monophyletic group, without any Peruvian populations among them. Most internal nodes (i.e. between each of the 5 clades) are poorly resolved with most populations situated on long branches. Among the European populations, geographic pattern/structure variability can be deduced from the analysis of microsatellite variability. All four samples collected on the French "île de Ré" (from 1 to 15 km apart; FR-2 to -5), or the three samples from "île de Noirmoutier" (from 1 to 3 km apart; FR-6 to -8) and the two populations from the Netherlands (NL-1 and -2), each forms a monophyletic group (although low bootstrap values are associated with these 3 groups).
<figure><img src="image_28.png" /></figure>

**Figure 2** Phylogenetic tree of the mitochondrial haplotypes (based on partial cytochrome B sequences) found in Peru and in Europe (in bold). The five clades (numbered from Ic to Vc) and the detail of each haplotype found in the clade Ic are indicated by a vertical bar. The Neigbour-Joining tree was constructed using Phylip and a HKY85 + G model as determined according to Modeltest. Bootstrap analysis based on 500 iterations is indicated.
<figure><img src="image_29.png" /></figure>
<caption>**Figure 3:** Dendrogram of *G. pallida* populations based on multilocus microsatellite genotypes. This Neigbour-Joining tree is based on *D*<sub>A</sub> distances and was performed using Populations 1.2.28</caption>
### 5.3.3. Genetic structure among European populations

When considering *Fst* between pairs of populations, lowest values are observed between the samples from the same area in France (i.e. among the 4 populations from “île de Ré” – except FR-4 - ; *Fst* < 0.0675, or the 3 populations from Noirmoutier - *Fst* < 0.0873 - ; Table II), while larger *Fst* values are usually observed between populations from different countries. However, low *Fst* values between European populations belonging to different countries are sometimes observed (e.g. 0.0219 between FR-9 – France – and SP – Spain -, 0.0517 between UKS-2 and FR-5-). The two populations from Netherlands, the UK-4 and the FR-1 populations appear to be more divergent from all other European populations.

<table><caption>**Table II:** pairwise *Fst* distances between European populations.</caption><thead><tr><th></th><th>FR-1</th><th>FR-2</th><th>FR-3</th><th>FR-4</th><th>FR-5</th><th>FR-6</th><th>FR-7</th><th>FR-8</th><th>FR-9</th><th>SP</th><th>NL-1</th><th>NL-2</th><th>UK-1</th><th>UK-2</th></tr></thead><tbody><tr><td>FR-2</td><td>0.321</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-3</td><td>0.269</td><td>0.040</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-4</td><td>0.248</td><td>0.176</td><td>0.120</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-5</td><td>0.248</td><td>0.048</td><td>0.036</td><td>0.068</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-6</td><td>0.249</td><td>0.311</td><td>0.308</td><td>0.298</td><td>0.249</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-7</td><td>0.258</td><td>0.236</td><td>0.231</td><td>0.236</td><td>0.177</td><td>0.064</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-8</td><td>0.285</td><td>0.273</td><td>0.277</td><td>0.252</td><td>0.211</td><td>0.021</td><td>0.017</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FR-9</td><td>0.170</td><td>0.121</td><td>0.117</td><td>0.071</td><td>0.046</td><td>0.208</td><td>0.162</td><td>0.184</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP</td><td>0.176</td><td>0.171</td><td>0.126</td><td>0.048</td><td>0.082</td><td>0.230</td><td>0.195</td><td>0.205</td><td>0.033</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NL-1</td><td>0.372</td><td>0.281</td><td>0.256</td><td>0.230</td><td>0.223</td><td>0.408</td><td>0.352</td><td>0.377</td><td>0.175</td><td>0.145</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NL-2</td><td>0.326</td><td>0.230</td><td>0.174</td><td>0.197</td><td>0.163</td><td>0.347</td><td>0.270</td><td>0.316</td><td>0.130</td><td>0.105</td><td>0.201</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UK-1</td><td>0.230</td><td>0.163</td><td>0.133</td><td>0.057</td><td>0.089</td><td>0.282</td><td>0.235</td><td>0.250</td><td>0.056</td><td>0.013</td><td>0.172</td><td>0.121</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UK-2</td><td>0.129</td><td>0.151</td><td>0.095</td><td>0.094</td><td>0.052</td><td>0.213</td><td>0.180</td><td>0.209</td><td>0.071</td><td>0.061</td><td>0.261</td><td>0.174</td><td>0.061</td><td></td></tr><tr><td>UK-4</td><td>0.351</td><td>0.446</td><td>0.414</td><td>0.297</td><td>0.364</td><td>0.345</td><td>0.358</td><td>0.351</td><td>0.213</td><td>0.216</td><td>0.448</td><td>0.340</td><td>0.239</td><td>0.299</td></tr></tbody></table>

### 5.3.4. Comparison of European versus Peruvian allelic richness

The comparison of allelic richness between European and Peruvian populations (figure 4) must be taken with caution as the sample size differed between the two data sets (in particular, European samples contain more missing data. Moreover, allelic richness of each population should be considered as belonging to a particular Peruvian clade, i.e. in its phylogeographical context: Due to the different age of each Peruvian clade (the northern being the youngest), there is a south to north decreasing gradient of allelic richness (Picard and Plantard submitted [chapter 4]). Despite those caveats, the mean estimated allelic richness of European populations lies between 20.9 (for a sample size of 7 individuals) to 28.4 (for a sample size of 35). This allelic richness is similar to the one estimated for the northern Peruvian clade *Vm* (20.3 for a sample size of 7 to 34 for a sample size of 35), but is one third less rich than mean allelic richness estimated for the southern clade *Im*
(30.4 for a sample size of 7 to 34 for a sample size of 30, or even 33.3 for a sample size of 7 to 43.2 for a sample size of 30 when excluding the atypical Arapa-2 populations that exhibit a drastic impoverishment in allelic richness relative to the other populations of this clade *Im*).

### 5.3.5. Insights on the origin of European populations from assigning methods

When K is set to 2 (figure 5a), two geographically homogenous entities are recognized (hereafter called the "north entity" – in purple – and the "south + Europe" entity – in blue -): all individuals belonging to the northern clades (*Vm*, *IVm*, *IIIm*) form the first group, with more than 95% of their genome being characteristic of the “North” entity (except one individual from the Ayacucho population), while all individuals from Europe are found in the second group (i.e. the "south + Europe" entity); individuals from clade *IIm* (i.e. the Cuzco-3 population) appear to be in intermediate position (with some individuals with more than 50% of their genome being assigned to the "north entity", while others have more than 50% of their genome assigned to the "south+ Europe" entity). Two kinds of Peruvian populations can be recognized in the populations belonging to the clade I; some populations (Arapa-1, Sicuani, Colca canyon) have most of their individuals with part of their genome assigned to the north entity, but always at less than 50% (except 2 individuals from Arapa-1, 4 individuals from Sicuani and 1 individual from Colca canyon that have more than 50% of their genome assigned to the "north entity"); other populations (Arapa2 and Amantani) have all their individuals at more than 90% assigned to the "south + Europe" entity (except one individual from both populations which are assigned at only 70% to the "European group", in blue-grey).

When K is set to 10 (figure 5b), the clades *IIm* to *Vm* each constitute an homogenous entity of the same colour (i.e. all individuals - except a few exceptions – have more than 90% of their genome characteristic of this entity). Clade V is divided in two homogenous entities. Clade *Im* is now subdivided in 3 entities (3 colours): (1) the Arapa-2 population (in orange in the figure 5b), (2) the Amantani-2 and Arapa-1 populations that are both constituted by individuals whose 90% of their genome belong to the same entity (in yellow) and (3) the Colca canyon population (in blue). The Sicuani population seems to be a mixture of individuals from the last two entities plus some alleles from the Cuzco population. Except the UK-4 population (which seems to have most of its individuals with their genome being characteristic of the same entity of some Peruvian populations, i.e. the yellow colour as Arapa-1 or Amantani-2 populations), most European populations have their individuals with most of their genome being assigned to two genetic entities (in purple or in blue-grey). Among those European populations, some are homogenous with almost all their individuals corresponding to one genetic entity (FR-1, FR-6 or FR-7 in purple, or NL-1 or NL-2 in blue-grey for example), while others are some mixture of the two entities (FR-5 or FR-9 for example).
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Mean allelic richness</figcaption></figure>
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 4:** Mean allelic richness of each population estimated by the rarefaction index (ElMousadik and Petit, 1996). Note that the means are calculated on decreasing number of populations as sample size increases (excluding the use in this mean of some populations as they did not contain the minimum sample size).</figcaption></figure>
**Figure 5:** Results of assigning methods to reveal genetic structure on the global data set (Peruvian + European populations) using the Structure software. Each individual is represented by a thin vertical line, which is partitioned into K colored segments that represent the individual's estimated membership fractions in K clusters. Black lines separate the 5 Peruvian clades as well as the European populations, with their name labeled above the figure; details of each Peruvian populations belonging to clade I and of all European populations are indicated below the figure. (a) results when setting K to 2; (b) results when setting K to 10.
### 5.3.6. Comparison of European versus Peruvian inbreeding through analysis of *Fis* and departure from Hardy-Weinberg equilibrium

Analysis of *Fis* using a permutation test reveals that all 27 Peruvian populations have 100% of observed *Fis* values superior to the expected *Fis* value corresponding to the Hardy-Weinberg equilibrium (data not shown). Five out of the 14 European populations have less than 94% of observed *Fis* values superior to the expected *Fis* value corresponding to the Hardy-Weinberg equilibrium (data not shown).

Among the 27 Peruvian populations and the 7 loci tested, 47% out of the possible tests (n=181) exhibit a significant homozygote excess, while 29% out of all possible tests (n=121) were significant among the European populations. When considering all loci together, all 27 Peruvian populations exhibit a significant difference between observed and expected heterozygosity according to the Hardy-Weinberg equilibrium, while only 12 out of the 18 European populations showing a significant heterozygote deficit.

## 5.4. Discussion

### 5.4.1. Geographical origin of the European populations

As far as we know, this study is the first one that seeks to identify the origin of European populations of *G. pallida* conjointly with an extensive sampling of Peruvian populations from known geographical areas. Using two complementary molecular markers evolving at different rates, we have been able to precisely determine the origin of European populations: they all come from the same area in the south of Peru, in the Altiplano that goes from the north shore of the Titicaca Lake to the south of the Cuzco area. This result is clearly illustrated by the cytochrome B tree: all the European individuals studied have an haplotype identical to the one observed in Peruvian populations of this region – haplotype Ic7 – or an haplotype being the sister group of the Peruvian haplotype Ic5 which is also only found in this same Peruvian region. This result is confirmed by the microsatellite tree: all European populations form a monophyletic group branching among Peruvian populations of the same southern region of Peru. The results of the assigning method, dividing the whole data set in two groups with one comprising all European populations and all Peruvian populations from clade Im are also congruent with this interpretation.

### 5.4.2. Single or multiple introductions?

As two clusters containing European haplotypes are observed, each being associated to a particular Peruvian haplotype, a double origin of European populations could be hypothesized.
However, we have not investigated in the present study intra-population haplotype diversity in the native Peruvian populations. Thus, we can not exclude the hypothesis of a unique introduction event from a single Peruvian population from this southern region and containing those two haplotypes. Although we can not conclude for one or the other of those two alternative hypotheses, it remains true that the original population(s) from which is (are) all European *G. pallida* individuals came from this southern Peruvian region located among, Colca canyon (Arequipa) and Sicuani.

When considering allelic richness, a relatively large genetic variability is still found in Europe, as this variability is higher than the one observed in the northern Peruvian clade. However, as this genetic variability is a subset of the variability of the southern Peruvian region which is also the most diverse one, a reduction in allelic richness is observed in this area of introduction, as expected due to the consequences of genetic drift, founder events and bottlenecks (to which should be added selection by particular potato varieties and even partial resistant varieties such as in the UK; Trudgill *et al.*, 2003). Even if some alleles could have appeared in Europe since the introduction of this species (cf the high mutation rate of this marker – compared to the cytB markers, for which the production and conservation of a new haplotype in Europe in less than 300 years is unlikely due its much lower mutation rate), the most likely hypothesis to explain the existence of numerous common alleles in Europe and in those southern Peruvian populations is to consider that the introduction is not a single introduction of a single cyst but rather the introduction of one or several groups of cysts bearing their own genetic variability. The relatively low level of reduction in allelic richness between the introduced and the native area (when considering only the native southern region, not all the Peru) can be partly explained by the partition of genetic variability at different spatial scales. Indeed, as 96% of the genetic variability observed inside a region is found inside a field or even 97% at the scale of a few plant (Picard *et al.*, 2004), it's not surprising that even if all European cysts are the offspring of a few cysts that were associated with a single contaminated potato plant, a large part of the genetic variability of this region has been introduced in European soils. Moreover, numerous pathogens (bacteria, fungi...) predators (mites, collembola, other nematodes...) or antagonists (other plant-parasitic nematodes associated to potato) of this cyst nematodes must be absent in European soils; partial resistant varieties have been used only for a short time in Europe and only on very limited area (Trudgill *et al.*, 2003). Thus, once introduced in a potato field in Europe, *G. pallida* could multiply quickly, producing huge population sizes (billions of individuals per hectare) preventing the effect of genetic drift that could otherwise reduce allelic richness.
### 5.4.3. Which European population is the sister group of all other European populations?

By identifying the locality of the first introduction in Europe, it could help to reconstruct the history of the introduction of *G. pallida* in the “old world”. With only two branches containing European haplotypes (excepting I4 from FR-3 which is minor variation of more common I3 haplotype), it is not possible to identify the most basal haplotype in the I1+2+3 group (figure 2). Increasing the cytB sequence length and obtaining other sequences from the clade I geographical region could help to solve this issue. According to the microsatellite data (i.e. the topology of the NJ-tree and the Structure result), the UK-4 population from Scotland is a likely candidate to be the sister group of all other European populations. The introduction history of the potato cyst nematode (*G. pallida* and *G. rostochiensis*) is poorly documented, as its spread in Europe was not documented (see for example Stone and Sunnucks 1993 for a well documented case of colonisation due to mans activity by a conspicuous, above ground pest in western Europe since the 17th century). *G. pallida* was described first in 1882 in Rostock (Germany) where it was probably already a secondary introduction and while other European countries were probably already contaminated. However, several authors have made various hypotheses concerning the scenario of its introduction. Jones (1970) considered that *Globodera spp.* may have been introduced during the second half of the 19th century in England, following the numerous introductions of wild *Solanum* plants in Europe to screen for potato blight resistance that caused the Irish potato famine. This hypothesis is compatible with our finding (but does not allow us to conclude with confidence). As they were able to find potato cyst nematodes in only 100 g of guano, Inagaki and Kegasawa (1973) made an alternative hypothesis by considering that this fertiliser (that was at the origin of major commercial exchange between Peru and Europe during the 19th), could have been at the origin of the introduction. The Humber port of Hull was a major entrance for the guano from Peru (Franco, 1977). However, those island are very far away for major potato culture area; as no plants are able to survive in such a place, it seems an unlikely explanation (see also Franco 1977 for other arguments against this hypothesis). Another hypothesis made by Franco (1977) is that the same bags were used for guano transport and for potato exchange in Peru; thus, contaminated soil could have been still present in those bags, when they were used for guano transport. The location in the cytB tree of the haplotype of *G. pallida* that could be found in the Azores islands would also be interesting as those islands are usually considered as a “garden” for European botanists on they way back from South America to Europe in the 19th century. Because of the high resolution of our mitochondrial marker, the sequencing of cytB from cysts found on the Peruvian island from which guano is extracted (will it belong to the clade I group? will it be the sister group of all European haplotypes?) / from the Azores Island or around the Humber port of Hull (will it be the sister
group of all European haplotypes) could enable the reconstruction of the history of the
introduction of the potato cyst nematode.

5.4.4. <u>Geographical Pattern among European populations</u>

With only 3 haplotypes found in Europe, the cytB marker is not useful for the description
of any structure in the genetic variability observed in Europe; we can only notice that the
association of some European populations sharing the same haplotype is not correlated with their
geographical location (e.g. the Gourdie haplotype from Scotland has the same haplotype as a Dutch
and a French populations, while other populations from each of these three countries are found in
the other haplotype group). Because of their larger mutation rate, microsatellite loci are more
informative for this issue. Inside each country, some clustering of populations is observed among
populations from the same region (e.g. the four populations from the French Noirmoutier Island,
with a 83% bootstrap value, which is also illustrate by the low Fst values among those populations).
However, other examples can be found in which the different populations from the same country
do not cluster together (e.g. the three populations from UK). Thus, because the pattern of
geographical variability observed in the microsatellite data seems to be contingent on historical
events such as commercial exchange among countries that promote cyst nematode spreading, we
did not conduct any investigation concerning any pattern of isolation by distance among
European populations (see Plantard and Picard submitted[chapter 2]). Among different countries,
bootstrap values are low and thus clustering is not consistent. Some populations exhibit particularly
long branches, suggesting that they have highly diverged, possibly due to genetic drift following
founder effects or bottlenecks (e.g. the FR-1 populations, which has been found on the Ouessant,
an island with low exchange with the mainland).

Our results also illustrates the usefulness of the sampling a pest in its native area (Cattan-
Toupance *et al.*, 1998; Niederhauser *et al.*, 1991): with only European populations available, it would
have been impossible to distinguish the relative effect of genetic drift, bottleneck and founder
events to understand gene flow, dispersal abilities and population genetic structure of this cyst
nematodes (Folkertsma, 2001).

5.4.5. <u>Comparison of inbreeding level in Europe and Peru</u>

The comparison of *Fis* values revealed a contrasting situation between the native and the
introduced areas, with populations in Peru being more inbred than in Europe. Rather than a
“biological explanation”, this result could be due to a lower allelic richness in Europe than in Peru
(especially when comparing European populations to Peruvian populations from the clade *Im* from
which all the European populations came). However, although, a similar allelic richness is found in
the populations from the northern Peruvian clades and in European populations, a similar higher
level of inbreeding is still observed in those Peruvian clades when compared to the European
populations. A difference in inbreeding level could also be due to the age of the European
populations: being youngest (less than 300 years), those populations could be less close to the
equilibrium than the Peruvian populations (i.e. European population are still growing in a given
European field; they could be formed by two separate introduction events forming genetically
distinct focus in the same fields that come secondarily into contact, causing a higher heterozygote
deficiency). Despite being the youngest among the Peruvian populations, this should hold true
even for the northern clade Peruvian populations, who have probably diverged from southern
populations for one million years (Picard and Plantard submitted [chapter 4]). However with such a
departure from the equilibrium state in Europe, we would expect that the recent introduction of
European populations would increase inbreeding compared to Peru, while the opposite is
observed. Finally, we hypothesize that the difference in inbreeding level between the two
geographically areas is due to different agronomical practices: in Peru, soil perturbation is very low
compared to Europe. Most potato fields in Peru are ploughed at low depth, usually manually, while
in Europe those fields are heavily disturbed by the numerous agriculture devices (tillage...). A
homogenising effect on potato cyst densities in soil due to such activities has already been reported
(Mugniéry and Zaouchi 1976), and we hypothesized that it also could be observed on population
genetics of this pest. Because of the recent interest for low disturbance soil activities, these results
could provide cues for ongoing studies aimed at studying the advantage of such agricultural
practices.

5.4.6. Conclusion and consequences for the control of *G. pallida*

Due to (1) an extensive sampling of populations in both its native and introduced area, (2) the existence of a well structured phylogeographical pattern in its native area (Picard and Plantard submitted) and (3) the use of two complementary molecular markers providing information on evolutionary processes occurring at the scale from millions (cytB) to hundreds of years (microsatellite), we have been able for the first time to unambiguously identify the Southern region of Peru (from the north shore of the Titicaca lake to the Sicuani region) as being the region from which all European populations have been introduced. The identification of the origin of this pest has major consequences for its control in Europe. In particular, it can be used to *a priori* select particular germplasm resources according to their geographical origin in Peru (see for example Castelli, *et al.*, 2003; Chavez, *et al.*, 1988). Because of the long co-evolutionary process between *G*.
*pallida* and various wild *Solanum* in this southern region, we can hypothesize that a higher number
of still effective resistance genes will be found in this region (but this hypothesis should be checked
first; see Castelli *et al.*, 2003). Because the other Peruvian northern clades are probably a subset of
the genetically richest areas located in the south (except the Clade II that could have its own
genetic variability being located basally in the cytB tree; Picard and Plantard submitted [chapter 4]),
these resistance sources could also be efficient for other Peruvian areas. In other introduced areas
such as in USA (Marks and Brodie, 1998), a similar investigation could also be conducted to
identify the origin of those North American populations and provide important information to
control this pest. In Europe, quarantine measures should still be taken, with a particular attention
taken to avoid the introduction of new *G. pallida* gene pools from South America (especially from
the clade II which is also genetically diverse) (Brasier *et al.* 1999). Concerning the durability of
resistance genes (which is the favoured control method in most countries due to the high toxicity
of nematicide products), the evaluation of the genetic diversity of the pest is a central issue (Mac
Donald and Linde, 2002). The relatively large genetic variability of European *G. pallida* compared
to Peruvian populations (already observed by several authors although they had no or limited
Peruvian populations among their samples; see the references quoted in the introduction) suggests
that the control of this pest in Europe should be more difficult than for a pest with a narrow gene
pool (all things being equal by elsewhere – i.e. same life history traits… –; compare for example the
case of the Oomycetes *Phytophthora infestans* – Goodwin *et al.*, 1994 – with *Fusarium oxysporum* –
O’Donnell *et al.*, 2000–). Finally, our results concerning the higher inbreeding level in Peru
compared to Europe suggest that a population genetics approach should also provide important
information concerning the reproductive mode of pest populations that could have important
consequences for their control. In particular, it could provide a new tool to examine the
consequences of some agricultural practices such as tilling, ploughing or any soil activities that
could affect resistance durability of soil pests such as nematodes but also fungi.
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# CHAPITRE VI

## CONCLUSION GÉNÉRALE
Pour l'étude populationnelle du nématode de la pomme de terre *Globodera pallida* dans son berceau d'origine, nous avons mis en œuvre deux types d'échantillonnages, l'un hiérarchisé au niveau d'une région, d'un champ, d'une plante, l'autre le long d'un transect, ainsi qu'un diptyque méthodologique associant la génétique des populations et la phylogéographie. Cette approche évolutive nous a permis de mieux comprendre la biologie, la capacité de dispersion et l'histoire en des temps géologiques de ce nématode parasite de la pomme de terre. Certaines de ces avancées dépassent le cadre des nématodes endoparasites de plantes et peuvent s'appliquer à d'autres organismes telluriques. Nous avons ainsi mis en évidence au niveau intraspécifique chez *G. pallida* :

* une importante consanguinité

* un flux de gènes considérable à l'intérieur de bassins de production de la pomme de terre

* un isolement par la distance entre groupes d'individus séparés de plus de 50 km

* une structuration génétique forte entre des populations isolées par de puissants reliefs géographiques

* cinq clades ayant divergé à l'échelle de millions d'années sur des Solanum sauvages

* de multiples changements d'hôtes entre les Solanum sauvages et cultivés

* l'identification de l'origine des populations européennes.

Les résultats obtenus au cours de cette thèse s'incluent dans deux thématiques majeures (génétique des populations et phylogéographie) pour lesquelles nous suggérons, après un rappel détaillé de nos principaux résultats et leur discussion, de faire la synthèse des éléments qui constituent un fil rouge de ce travail (capacité de dispersion et les apports de ce travail au niveau agronomique). En conclusion, nous exposerons les orientations de recherches qui pourraient être développées à la suite de ce travail.
# 6.1. Génétique des populations et Phylogéographie : les principaux résultats

## 6.1.1. Description du fonctionnement génétique des populations de *Globodera pallida* dans son berceau d'origine (le Pérou) à partir d'un échantillonnage hiérarchisé

Au Pérou, *G. pallida* s'est avéré très consanguin. Deux hypothèses ont été émises pour expliquer le déficit en hétérozygotes significatif observé :

* ✓ Une reproduction préférentielle entre individus apparentés (« assortative mating »)

* ✓ Lors de l'éclosion d'un kyste, des centaines de frères et sœurs se dispersent activement à distance réduite (paragraphe 1.2.2) favorisant ainsi une reproduction entre individus étroitement apparentés et ceci à chaque génération.

Jusqu'alors, les flux de gènes de *G. pallida* étaient considérés comme négligeables (cf. paragraphe 1.2.2). On s'attendait alors à observer une augmentation de la variabilité génétique au fur et à mesure que l'on augmentait le nombre de parcelles analysées dans une région donnée. Toutefois, pour les trois régions analysées (jusqu'à 35 km) correspondant à des bassins importants de production de la pomme de terre, nos résultats montrent que la quasi-totalité de la variabilité génétique observée dans une région se retrouve à l'échelle de la rhizosphère d'une plante. En ce qui concerne la structure génétique, celle-ci n'a pas pu être détectée dans ces trois régions, ce qui reflète une forte dispersion passive des kystes. À partir de ce premier résultat majeur, on peut dire que la capacité de dispersion de *G. pallida* a été jusqu'ici largement sous-estimée, ce constat est probablement généralisable à l'ensemble des nématodes à kyste. Une structuration génétique n'a été constatée uniquement qu'à l'échelle la plus large, c'est-à-dire entre les trois régions distantes de plusieurs centaines de kilomètres les unes des autres. Cette structure génétique s'est avérée très forte. Nous l'expliquons par les puissants reliefs géographiques que présente la Cordillère des Andes (annexe 2) et qui sont autant de barrières à la dissémination passive des kystes.

Il y a une apparente contradiction entre les importants flux de gènes au sein d'un bassin de production et la consanguinité observée. Nonobstant, à l'échelle de la rhizosphère d'une plante, la faible dispersion active des juvéniles et des adultes mâles entraîne la consanguinité, alors que sur de longues distances, les flux géniques sont la conséquence de la dispersion passive des kystes (annexe 2). En effet, de nombreux facteurs biotiques et abiotiques permettent une large dispersion passive des kystes comme nous l'avons vue en détail dans le paragraphe 1.2.2.

Nous observons donc une absence de structuration génétique entre parcelles séparées jusqu'à 35 km et une très forte structure génétique entre régions séparées de plus de 320 km. Où,
pourquoi et comment passe-t-on de tout à rien ? Autrement dit : (a) quelles sont les limites géographiques de l'absence de structuration génétique ? (b) quels sont les facteurs (biologiques, topographiques...) à l'origine de l'apparition de la structure génétique ? (c) le passage de l'absence à la forte structuration génétique se fait-il suivant un patron d'isolement par la distance (Isolation By Distance en anglais ; IBD) ? (d) qu'est ce qu'une population pour ce nématode à kyste ?

### 6.1.2. Patron d'« isolement par la distance » le long d'un transect de 1.500 km dans la cordillère des Andes et structuration génétique chez un organisme du sol de 500 micromètres

Bien que les organismes telluriques aient pour la plupart une distribution continue comme certaines plantes (par exemple les chênes ou certaines graminées sous nos latitudes), les nématodes à kyste ont une distribution discontinue limitée par la présence de leur hôte. Cependant, les régions de production de la pomme de terre sur les hauts plateaux andins sont constituées de parcelles contiguës où la pomme de terre est régulièrement cultivée (rotation courte de trois à quatre ans), formant ainsi un territoire où le nématode est distribué de façon continue (figure 6.1). Aux altitudes les plus hautes de ces régions de production (> 4.000m), l'homme cultive actuellement la pomme de terre suivant une pratique culturale ancestrale et utilise des variétés andines déjà adoptées par les Incas (annexe 1 ; figure 6.2). Ces communautés des hautes terres vivent plus ou moins en autarcie, ce qui se traduit pour la culture de pomme de terre par la mise en réserve d'une partie des tubercules récoltés pour être plantés l'année suivante, le reste étant dévolu à la consommation de la communauté et à la vente sur les marchés locaux (annexe 1). Les variétés andines cultivées à cette altitude doivent nécessairement résister au gel et leurs semences ne sont pas commercialisées, alors qu'aux altitudes plus basses où le climat est moins rigoureux, les variétés cultivées sont souvent issues de sélections récentes (Hijmans et al. 2003). Ces régions de culture sont séparées par des zones plus ou moins larges où toute culture est absente et où par conséquent *G. pallida* est aussi absent, provoquant des discontinuités dans sa distribution (figure 6.1). Toutefois, en dehors des zones de très hautes altitudes (> 4.900 m), des zones tropicales dans les vallées et des zones arides, des foyers de Solanum tubéreux sauvages contaminés par *G. pallida* peuvent persister.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 6.1** : Photo prise près de Chinchero (Cuzco). Le premier plan montre une région agricole des hauts plateaux andins et l'arrière plan montre une zone sans cultures pouvant induire une barrière à la dispersion des kystes.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_33.png" /></figure>

**Figure 6.2** : Photo prise à 4.150 m dans la province de Huancavelica. À cette altitude, des variétés andines résistant au gel sont cultivées. Une rotation d'une à trois cultures (dont la première année est réservée à la culture de tubercules) suivies de huit ans ou plus de jachères, laisse un paysage dominé par les graminées sauvages des hautes altitudes des Andes (« la puna »).

L'approche bayésienne de regroupement décèle une structuration génétique entre les régions séparées par une zone non cultivée, la structuration pouvant être très forte pour des régions isolées les unes des autres par de puissantes barrières géographiques. Par ailleurs, nous ne constatons pas de structure génétique à l'intérieur des régions agricoles où la distribution du nématode à kyste est continue. Cependant, à la plus haute altitude (> 4.000m) où persistent quelques parcelles cultivées éparses, une structuration génétique, toutefois moins importante qu'entre régions, a été décelée. Deux hypothèses peuvent expliquer la structuration génétique observée à haute altitude :
✓ Une diminution de la dissémination de kystes, donc du flux génétique, due à l'absence ou aux faibles échanges de tubercules associés à de la terre contaminée entre les parcelles de hautes altitudes et celles de plus basses altitudes. Dans ce cas, l'homme, par ces pratiques, est directement lié à la structuration génétique observée.

✓ L'existence de génotypes de *G. pallida* adaptés aux génotypes de variétés andines résistant au gel. Dans ce cas, c'est le processus de co-évolution entre l'hôte et le parasite qui est lié à la structuration génétique observée.

L'étude du patron d'isolement par la distance donne des résultats similaires à ceux obtenus par l'analyse bayésienne. À l'intérieur des bassins de production, aucun IBD n'a été détecté, bien que des parcelles soient distantes de 120 km. Un patron d'isolement par la distance émerge dès l'apparition de zones exemptes de cultures entre bassins de production et ne devient plus détectable pour les régions séparées par des distances supérieures à ~ 400 km. Pour expliquer cette absence d'IBD, deux hypothèses peuvent être envisagées pour les distances supérieures à ~ 400 km :

✓ L'IBD entre populations persiste, mais les populations atteignent une telle divergence que les marqueurs microsatellites sont soumis à l'homoplasie.

✓ L'IBD est absent. À cette échelle, l'espèce serait fragmentée en plusieurs lignées entre lesquelles le flux génique serait nul ou négligeable. Des événements historiques (colonisation, fragmentation...) auraient mis ces lignées en place (figure 6.3).

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 6.3** : Généalogie de gènes pour une espèce avec des flux géniques limités à l'intérieur de chaque région séparée par une barrière physique. Les ovales grisés représentent l'étendue géographique de chaque lignée et les flèches la magnitude spatiale contemporaine de dispersion. (d'après Avise 2000).</figcaption></figure>
Dans cette étude, aucun IBD et aucune structuration génétique (à l'exception des parcelles de hautes altitudes) ne sont détectés jusqu'à 50 km. Il est possible qu'une analyse statistique plus puissante avec un échantillonnage plus important permette d'observer un patron d'isolement par la distance à cette échelle. Mais dans tous les cas, la diminution du flux génique associée à l'augmentation de la distance resterait ténue. Nous pouvons considérer qu'il n'existe qu'une seule population pour des distances inférieures à 50 km. Toutefois, (1) comme les plus petites distances entre deux parcelles séparées par une zone non cultivée sont légèrement supérieures à 50 km et (2) comme aucun IBD ni aucune structuration génétique (à l'exception des parcelles de hautes altitudes) n'ont été observés à l'intérieur des trois régions agricoles, nous émettons donc l'hypothèse qu'il n'y a qu'une seule population à l'intérieur d'une région agricole où la distribution de *G. pallida* est continue. Cette hypothèse est limitée par la distance maximale de 120 km entre deux parcelles dans une même région agricole.

Cette approche combinant patron d'isolement par la distance et structuration génétique apparaît puissante pour appréhender les limites d'une population de nématodes à kyste. A l'aide de cette méthodologie, il serait intéressant de regarder comment le patron génétique observé dans notre étude se généralise à d'autres organismes telluriques, voire même à des plantes dont la dispersion passive des graines peut s'apparenter à celle des kystes.

Nous avons émis l'hypothèse qu'il n'y a qu'une seule population à l'intérieur d'une région agricole où la distribution de *G. pallida* est continue et nous avons observé qu'un patron d'isolement par la distance émerge dès l'apparition de zones exemptes de cultures entre bassins de production et ne devient plus détectable pour les régions séparées par des distances supérieures à ~ 400 km. Quelles sont les relations historiques entre les populations séparées par une forte structuration génétique ? Quelles sont les causes de l'origine de la disparition de l'IBD à des distances supérieures à ~ 400 km (voir les deux hypothèses ci-dessus) ?

### 6.1.3. Une colonisation du sud vers le nord de la Cordillère Andine par le nématode à kyste de la pomme de terre au cours des temps géologiques suggère de multiples changements d'hôtes des espèces sauvages aux espèces cultivées

La dissémination de *G. pallida* apparaît fortement limitée par les reliefs géographiques des Andes. À l'inverse de nombreux organismes ubiquistes, la capacité de dispersion limitée par la topographie fait de *G. pallida* un candidat intéressant pour aborder son histoire. En effet, l'arbre élaboré à partir de séquences nucléotidiques (gène cytochrome b) permet de décrire cinq clades
robustes concordants avec l'origine géographique des individus analysés. Tous les résultats (topologie des arbres basés sur les marqueurs cytochrome b et microsatellite ; longueur des branches dans l'arbre cytochrome b ; patron géographique de la diversité allélique obtenu avec l'analyse des loci microsatellites) convergent vers la même hypothèse d'une colonisation des Andes, du sud vers le nord (du lac Titicaca à la frontière de l'Équateur). Les divergences entre les séquences cytochrome b (ADN mitochondrial) obtenues sont bien trop fortes pour que cette colonisation du sud vers le nord soit consécutive à la domestication des pommes de terre il y a quelques milliers d'années. En effet, le niveau de divergence obtenu avec le gène mitochondrial est du même ordre de grandeur que celui d'autres nématodes, d'insectes et de mammifères ayant divergé depuis plusieurs dizaines à plusieurs centaines de millions d'années. Le taux de divergence de séquences d'ADN nucléaire (ITS1-5.8S-ITS2) renforce ce résultat.

La même hypothèse d'une colonisation des Andes du sud (Bolivie) vers le nord (Venezuela) à l'échelle de millions d'années, est acceptée chez l'unique autre étude en phylogéographie d'espèces inféodées à de hautes altitudes et endémiques de la Cordillère andine (Doan 2003). Ces espèces appartiennent au genre *Proctoporus* (lézard). En recoupant des données (centre de biodiversité, phylogénie) sur les Solanum tubéreux sauvages (Castillo et Spooner 1997 ; Hijmans et Spooner 2001 ; Carputo et al. 2003), une colonisation des Andes similaire à celle observée pour le genre *Proctoporus* est vraisemblable dans le cas de *G. pallida*. L'hôte de *G. pallida* (Solanum tubéreux), *G. pallida* et le genre *Proctoporus* sont des espèces de hautes altitudes de la Cordillère andine et à ce titre ont donc été influencés par la géologie de cette chaîne de montagne. En effet, il y a concordance entre la direction du processus de colonisation de ces organismes et l'orogenèse des Andes ainsi que la datation de ces processus : l'érection des Andes aurait commencé durant le début du Miocène (~ 24 millions d'années) à l'emplacement de l'actuel Altiplano (figure 1.9), à partir de ce point, l'érection aurait progressé vers le nord (annexe 3).

D'après la concordance de nos résultats, avec la phylogéographie du genre *Proctoporus*, les données observées chez l'hôte de *G. pallida* et le processus d'orogenèse des Andes, nous émettons l'hypothèse qu'à partir du lac Titicaca, *G. pallida* a colonisé les Andes au fur et à mesure que l'érection de la montagne progressait vers le nord, grâce à la progression conjointe de son hôte (les Solanum tubéreux sauvages). Lors de la domestication de la pomme de terre, *G. pallida* aurait parasité les pommes de terre cultivées à plusieurs reprises et ceci de façon indépendante dans les cinq clades.

Le patron génétique de *G. pallida* a été appréhendé dans son berceau d'origine, se pose maintenant la question de la description du patron génétique dans un milieu d'introduction. En Europe, l'homme a probablement introduit *G. pallida* avec l'importation de tubercules de pommes
de terre contaminés. Actuellement, cette espèce se développe dans des parcelles cultivées en pommes de terre ou en tomates. Sur le vieux continent, le patron génétique de *G. pallida* est fortement lié au nombre d'introductions, au niveau de diversité génétique des populations importées et à l'origine géographique des populations importées. À partir de l'étude de génétique des populations et de l'étude de phylogéographique au Pérou, nous allons tenter d'éclaircir ces zones d'ombre, mais aussi d'estimer l'impact des pratiques agricoles modernes sur le patron génétique : le travail mécanique de la terre en profondeur modifie-t-il le déficit en hétérozygotes observé au Pérou ?

### 6.1.4. Origine et diversité génétique des populations du nématode à kyste de la pomme de terre introduites en Europe

Une question classique pour les ravageurs des cultures introduits est celle de leur origine géographique. En Europe, cette question est récurrente dans le cas de *G. pallida*. Plusieurs scénarii ont déjà été envisagés (Franco 1977 ; Amstrong 2000). Mais aucune hypothèse s'appuyant sur des données robustes n'a pu être énoncée jusqu'alors. Dans l'arbre phylogénétique péruvien établi à partir des séquences du gène cytochrome b, les treize haplotypes issus de populations échantillonnées dans six pays européens se sont tous placés dans le clade le plus basal correspondant au sud du Pérou. L'arbre établi à partir des données de sept loci microsatellites donne le même résultat : les quinze populations analysées se placent dans le clade correspondant aux populations situées le plus au sud du Pérou. On peut donc en conclure que les populations européennes sont originaires du sud du Pérou (clade I). En comparant la richesse allèlique observée dans les populations européennes et celle observée dans les populations péruviennes du clade I, on constate une diminution de moitié de la richesse allèlique dans les populations d'Europe. Cette diminution était attendue pour les populations introduites car elle est la conséquence des goulots d'étranglement, des effets fondateurs et de la dérive génétique. Toutefois, la richesse allèlique observée en Europe est supérieure à celle observée dans le nord du Pérou (clade V). Bien que les populations du clade V soient les plus récentes du Pérou donc les moins riches en allèles, ce résultat démontre la présence d'une diversité génétique relativement haute en Europe. La biologie de *G. pallida* peut expliquer ce résultat. En effet, la vitesse de reproduction de *G. pallida* (plus de 1000 œufs par femelle) et les effectifs considérables que peuvent atteindre *G. pallida* dans une parcelle cultivée en pomme de terre (jusqu'à dix kystes par gramme de sol) limitent l'effet de goulot d'étranglement. De plus, la quasi-totalité de la variabilité génétique observée dans un bassin agricole péruvien se retrouve à l'échelle de la rhizosphère d'une plante ce qui permet l'introduction de
nombreux allèles lors du transport d'un tubercule associé à de la terre contaminée et par
conséquent ceci restreint l'effet fondateur. En Europe, pour expliquer l'importante richesse
allèlique observée dans des populations très divergentes entre elles, nous émettons l'hypothèse
d'introductions multiples de plusieurs kystes. Les 2 haplotypes (gène cytochrome b) introduits en
Europe correspondent aux haplotypes de «Colca Canyon» d'une part et de Sicuani et d'Arapa
d'autre part. Ce résultat renforce l'hypothèse qu'il n'y a pas eu qu'une seule introduction en
Europe. Cependant pour confirmer l'hypothèse de multiples introductions de plusieurs kystes, la
diversité haplotypique (gène cytochrome b) à l'intérieur d'une parcelle devra être testée et le
nombre de parcelles analysées dans le clade V et en Europe devra être accru.

G. pallida apparaît moins consanguin en Europe qu'au Pérou. Deux hypothèses ont été émises pour expliquer la consanguinité observée au Pérou (cf. paragraphe 6.1.1.). Il n'y a apparemment pas de raison pour penser que la reproduction préférentielle entre individus apparentés (« assortative mating ») soit différente entre l'Europe et la Pérou où la diversité génétique peut y être inférieure. Pour expliquer la consanguinité observée dans les deux zones géographiques, nous posons comme postulat que la faible dispersion active des juvéniles et des mâles à chaque génération conduit à un phénomène d'agrégation entraînant un regroupement d'individus apparentés dans le sol (figure 6.4). Au Pérou, le travail de la terre est très superficiel et dans le meilleur des cas, il est analogue à celui de l'araire. Par contre en Europe, il y a une homogénéisation mécanique due à un labour profond avec un retournement complet du sol, ce qui aboutit à une certaine homogénéisation de la distribution verticale des kystes dans le sol et diminue l'agrégation des kystes (Mugniéry et Zaouchi 1976).

## 6.2. Interrelation entre le patron génétique et l'agronomie

Dans ce chapitre sont développées les thématiques dont les résultats sont répartis dans les
différentes études ci-dessus. Ces thèmes sont regroupés en une partie homogène afin de faciliter
leur compréhension.

### 6.2.1. Le transport de kystes par l'homme : mythe ou réalité ?

G. pallida peut entraîner des dégâts considérables. Le transport des tubercules associés à de
la terre contaminée est incriminé comme principale cause de dissémination des kystes de ce parasite
d'où son classement comme organisme de quarantaine dans la plupart des pays du monde.
Au Pérou, dans un bassin de production de pommes de terre, une structuration génétique est observée entre des parcelles de hautes altitudes et celles de basses altitudes. Cependant, cette structuration reste faible et un flux génétique persiste en dépit de l'absence ou de faibles échanges de tubercules entre les parcelles de hautes et basses altitudes. Il apparaît donc directement que les kystes peuvent se disperser autrement que par le transport de tubercules contaminés. À l'échelle du pays, l'absence de structuration génétique entre la région agricole d'Andahuaylas et celle d'Ayacucho (chapitre 3), séparées par une vaste zone sans culture de pommes de terre peut s'expliquer par un échange récurrent de tubercules contaminés. Cette dispersion due à l'homme peut aussi expliquer les rares haplotypes typiques d'un clade qui ont été échantillonnés en dehors de l'aire géographique correspondant à leur clade (chapitre 4). Il serait nécessaire d'augmenter le nombre de taxons dans l'arbre basé sur le marqueur mitochondrial pour le confirmer. L'évolution de *G. pallida* en cinq clades divergeant depuis des millions d'années montre les limites de la capacité naturelle (non anthropique) de dispersion du nématode. Pendant ces millions d'années, les échanges d'individus entre clades ont été nuls ou rares.

Le transport de tubercules avec de la terre contenant des kystes engendre vraisemblablement des flux génétiques importants. Cependant, même si les mesures de quarantaine limitent la dissémination du parasite à longue distance, elles n'ont visiblement qu'une influence réduite à l'intérieur des bassins de production de la pomme de terre.

Toutefois, il faut noter que l'échantillonnage accompli au cours de la thèse a été effectué dans des parcelles avec des effectifs de *G. pallida* souvent considérables. Dans ces conditions, pour pouvoir détecter un flux de gènes entre des parcelles à fort effectif, il est nécessaire que le nombre de kystes échangés soit considérable. Il en résulte que l'absence de flux génétique constaté dans cette étude ne signifie pas qu'il y ait une absence totale de migration de kystes. Par ailleurs, un seul kyste permet d'établir une nouvelle population dans une parcelle vierge de *Globodera*. Il est donc envisageable que *G. pallida* puisse contaminer des régions agronomiques isolées situées à plusieurs centaines de kilomètres, sans transport de kystes par l'homme. Toutefois, les mesures de quarantaine restent intéressantes pour empêcher des flux de gènes importants à travers toute l'Europe et ainsi limiter la propagation d'éventuels génotypes virulents. Si une variété résistante permet de réduire de façon drastique les populations de *G. pallida*, les mesures de quarantaine permettraient d'éviter une rapide dissémination à toute l'Europe (si elles ne peuvent l'empêcher) d'un génotype virulent se dévoilant localement.
6.2.2. Apport de la thèse en agronomie

Au Pérou, *G. pallida* est (1) fortement consanguin, (2) capable de se disséminer à longue distance, (3) possède à l'échelle de la rhizosphère d'une plante une large part de la variabilité génétique observée à l'échelle de toute une région agronomique (chapitre 2 et 3) et (4) est présent dans les parcelles cultivées en pomme de terre avec des effectifs souvent très élevés. D'après ces caractéristiques, *G. pallida* peut être considéré comme un parasite ayant une forte capacité à contourner un gène de résistance selon la classification McDonald et Linde (2002). Les observations fréquentes de contournement de résistance rapportées dans la littérature (Llontop et al. 1989; Janssen et al. 1990; Turner et Fleming 2002) sont en accord avec cette interprétation, ainsi qu'avec la théorie gène pour gène (Flor 1955) : face à un gène de résistance dominant chez l'hôte correspond un gène d'avirulence récessif pour le pathogène. Comme la plupart des variétés résistantes sont constituées à partir de gènes dominants, seuls les individus homozygotes pour la virulence peuvent parvenir au stade femelle sur les plantes résistantes. La reproduction consanguine favorise la production d'individus homozygotes et donc le contournement de résistance. En Europe, *G. pallida* apparaît moins consanguin qu'au Pérou, ce qui peut s'expliquer par un travail accru de la terre entraînant la déstructuration de groupes d'individus apparentés au niveau de la rhizosphère d'une plante (chapitre 5 ; figure 6.4). Si cette hypothèse était confirmée, le travail de la terre serait recommandé pour diminuer le nombre d'individus homozygotes et ainsi favoriser la durabilité de la variété résistante. Van den Bosch et Gilligan (2003) soulignent l'importance de combiner les approches de génétique des populations et de dynamique des populations afin d'estimer la durabilité de la résistance à l'aide d'un modèle épidémiologique. Les résultats obtenus ici apportent de nouvelles données pour la réalisation de ce type de modèle.

Les résultats de l'approche phylogéographique (chapitre 4 et 5) pourront être utilisés par les
services phytosanitaires pour déterminer la diversité génétique et l'origine géographique des
populations introduites de *G. pallida*. La méthodologie utilisée dans cette étude leur apporte un outil
d'identification des populations de *G. pallida*. Pour les sélectionneurs européens de variétés
résistantes à *G. pallida*, nos résultats (chapitre 5) indiquent qu'il est préférable d'utiliser des
populations du sud du Pérou pour tester l'efficacité d'un gène de résistance. Mais pour les
sélectionneurs péruviens, mieux vaut utiliser des populations de chacun des cinq clades identifiés
(chapitre 4). De la sorte, ces efforts permettront d'augmenter la probabilité que la résistance soit
effective sur l'ensemble des populations de *G. pallida* concernées (O'Donnell et al. 2000). Il en est
de même dans le domaine médical. L'élaboration d'un vaccin nécessite d'appréhender la diversité
génétique d'un pathogène pour augmenter son efficacité (Koufopanou et al. 1997).
Cette étude permettra de suivre les modifications du patron génétique lors du déploiement de gènes de résistance en Europe et ainsi d'estimer le potentiel évolutif du nématode face à une forte pression de sélection. Nous développerons plus cet aspect dans le paragraphe suivant.

## 6.3. Perspectives

### 6.3.1. Consanguinité, flux génique et structure génétique

La structuration en groupes d'individus apparentés au niveau de la rhizosphère d'une plante (cf. paragraphe 6.1.4) est une hypothèse qui mériterait d'être confirmée. Dans une parcelle où la terre est peu travaillée, un échantillonnage le long d'un transect vertical et horizontal au niveau des racines d'une plante (figure 6.4) pourrait être conduit avant et après le labour. Ainsi, l'existence d'une structuration génétique ou d'un isolement par la distance à cette échelle seraient testés, tout comme l'impact d'un labour profond sur le patron génétique. Ce travail serait facilité par le choix d'une parcelle ayant une importante diversité génétique comme dans le sud du Pérou.

Toutefois, même si la faible capacité de dispersion active et la structuration génétique à l'échelle d'une plante est l'hypothèse privilégiée pour expliquer la consanguinité observée, la reproduction préférentielle entre individus apparentés (« assortative mating ») ne peut être encore définitivement exclue. Pour répondre à cette question, des manipulations biologiques en boîte de Petri peuvent être envisagées. Des individus mâles originaires des cinq clades pourraient être mis en compétition pour se reproduire avec une femelle originaire d'un clade donné. L'utilisation de marqueurs microsatellites permettrait de savoir si les individus les plus apparentés se reproduisent ensemble de façon significative, ainsi que de déterminer quantitativement l'influence de chacun des mâles lors de la reproduction.

Un échantillonnage sur des Solanum sauvages, bien que très difficile à réaliser [les Solanum sauvages sont ardus à trouver ; la prévalence (pourcentage d'hôtes parasités) et la charge parasitaire sont nettement inférieures à celles observées chez les Solanum cultivés] permettrait de décrire la structure génétique de *G. pallida* dans son milieu naturel et d'estimer les flux géniques entre le compartiment sauvage et cultivé. Il en résulterait une meilleure compréhension des modifications sur le patron génétique des nématodes phytoparasites engendrées par l'agriculture et une meilleure estimation de la capacité naturelle de dispersion des kystes. Comme nous l'avons vu dans un paragraphe précédent (paragraphe 6.2.1), il est difficile d'évaluer l'impact des activités humaines sur l'augmentation de la dissémination des kystes et par conséquent d'apprécier l'intérêt des mesures de
quarantaine ou de mesures prophylactiques comme la désinfection de machines agricoles. Une étude de génétique des populations sur des Solanum sauvages apporterait de nombreuses informations à ce sujet en décrivant la part de la dissémination naturelle par rapport celle observée dans la thèse.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 6.4** : Schématisation de l'échantillonnage au niveau de la rhizosphère d'une plante ; les cercles représentent les zones échantillonnées (20 cm de diamètre) le long de deux transects de 1,50 mètre ; les points de couleurs représentent les kystes, chaque couleur symbolise un groupe d'individus apparentés (hypothèse à tester).</figcaption></figure>

### 6.3.2. Co-évolution entre l'hôte et le parasite

L'étude de la modification du patron génétique de *G. pallida* soumis à des pressions de sélection enrichirait les connaissances sur le potentiel évolutif de ce parasite. Au Pérou, une monoculture sur une dizaine d'années de différentes espèces de Solanum cultivées (cf. paragraphe 1.3.1) ou sauvages dans des parcelles séparées permettrait de suivre une éventuelle modification du patron génétique de *G. pallida*. Ainsi, nous testerions si certains génotypes du parasite sont particulièrement adaptés à certains génotypes de son hôte, ce qui indiquerait une forte
spécialisation (co- évolution) de *G. pallida* associée à un fort potentiel adaptatif. Une étude similaire
pourrait être réalisée avec des variétés de pommes de terre résistantes (la variété Hualash) ou avec
un clone de Solanum sauvage dont le gène de résistance à *G. pallida* est connu, cartographié voir
séquencé (Van der Vossen et al. 2000). Une telle étude nous permettrait de mieux comprendre
pourquoi la variété Maria Huanca, lorsqu'elle a été cultivé dans deux parcelles voisines (région
d'Otuzco), s'est avérée résistante dans l'une et sensible dans l'autre. Ce cas particulier, rapporté par
Maria Schurrah va à l'encontre des résultats obtenus avec des marqueurs neutres (les parcelles
d'une même région agricole sont identiques génétiquement ; chapitre 3). Cependant une explication
peut être avancée. Il est avéré que la variété Hualash est résistante à *G. pallida*. Il est probable qu'il
existe d'autres variétés résistantes à *G. pallida* dans la multitude des variétés péruviennes
actuellement cultivées. La culture d'une de ces variétés dans une parcelle peut entraîner
l'augmentation ponctuelle de la fréquence d'un gène de virulence, dont la variété Maria Huanca
aurait fait les frais. L'identification de gènes de virulence reste un point crucial pour comprendre les
stratégies de contournement de variétés résistantes, mises en place par le parasite.

6.3.3. Phylogéographie et systématique

Couplée à la géologie, la phylogéographie s'est avérée une approche efficace pour retracer
l'histoire de *G. pallida*. L'utilisation de cette approche dans ce travail soulève de nombreuses
questions captivantes. L'altiplano se serait soulevé en premier (figure 1.9) et l'érection des Andes se
serait poursuivie vers le nord (Colombie) et vers le sud (Patagonie). Vers le nord, nous avons émis
l'hypothèse vraisemblable d'une colonisation de *G. pallida* concomitante avec l'orogenèse des
Andes (annexe 3). L'étude de la phylogéographique de *Globodera rostochiensis* distribué plus au sud
que *G. pallida* pourrait confirmer cette hypothèse. Il serait intéressant de confirmer le patron de
colonisation avec l'étude de *G. pallida* sur des Solanum sauvages, ce qui permettrait aussi de tester
l'hypothèse d'une co- évolution à l'intérieur des cinq clades décrits (chapitre 4) entre l'hôte et le
parasite.

La divergence entre *Globodera pallida* et *G. rostochiensis* (figure 1.2 ; chapitre I) est forcément
antérieure à la diversification intra-spécifique observée entre les 5 clades de *G. pallida* (qui serait,
elle, contemporaine de l'érection des Andes). Comme *G. rostochiensis* est actuellement aussi inféodé
aux hautes altitudes, il serait intéressant d'étudier la phylogéographie de cette espèce au sud du lac
Titicaca afin de la comparer avec le pattern observé chez *G. pallida* et vérifier si cette espèce s'est
indépendamment adaptée aux *Solanum* tubéreux sauvages de cette zone. Ce tableau
biogéographique pourrait aussi être étendu à l'ensemble des espèces du genre *Globodera* et plus
particulièrement des espèces inféodées aux Solanacées, qu'on trouve toutes dans les Amériques (cf *G. mexicana*, en amérique centrale, *G. tabacum* en Amérique du nord ; figure 1.3). Les temps de divergence entre ces groupes étant encore plus anciens, ces études pourraient permettre d'affiner la calibration moléculaire de ce genre, en ajoutant plusieurs points de calibration.

Etant donné l'ancienneté des divergences entre les 5 clades péruviens, il est étonnant d'observer l'absence de barrière à la reproduction et de différenciation morphologique au sein de cette espèce (voir cependant Franco – 1977 – qui a toutefois noté quelques différences morphologiques entre les populations péruviennes du nord et du sud). Dans la plupart des phyla du règne vivant, une telle divergence aurait conduit à la formation d'espèces distinctes. La lente mise en place de barrière à la reproduction s'observe entre les espèces américaines du genre *Globodera* : (1) Une femelle de *G. pallida* et un mâle de *G. mexicana* donnent une descendance interféconde, (2) *G. rostochiensis* et *G. pallida* donnent une descendance viable mais stérile, (3) *G. rostochiensis* et *G. tabacum* donnent une descendance interféconde bien que peu prolifique et (4) Une femelle de *G. tabacum solanacearum* et un mâle de *G. mexixana* donnent une descendance interféconde. D'un autre côté, on peut restituer ces observations dans le cadre de nos résultats sur le fonctionnement génétique des populations de *G. pallida*. En effet, cette espèce s'est avéré très consanguine dans les parcelles cultivées du Pérou. Il est possible que cette consanguinité s'accroisse dans son milieu naturel. En effet, l'absence totale de travail de la terre et la dispersion clairsemée en foyers des Solanum tubéreux sauvages doivent limiter la dispersion passive des kystes et renforcer la consanguinité. Dès lors, la lente mise en place de barrière à la reproduction présente l'avantage sélectif de limiter la consanguinité et par conséquent l'accumulation d'allèles délétères. L'absence de mise en place de barrière reproductive pourrait donc être une adaptation de ces organismes pour compenser leur faible capacité de dispersion (effet Allee ?). Néanmoins, un tel phénomène aurait pour conséquence indirecte de freiner l'adaptation locale de ces nématodes. Dans un contexte coévolutif, où ce parasite doit perpétuellement s'adapter aux mécanismes de défense mis en place par sa plante hôte, une telle stratégie pourrait donc se révéler coûteuse. L'estimation précise des bénéfices et des coûts de ces différentes stratégies représenterait une avancée importante dans le cadre des études sur l'évolution de la virulence, qui constitue actuellement une branche très dynamique de la biologie évolutive
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# ANNEXE 1

## Le Pérou, berceau d'origine du nématode de la pomme de terre
# Le Pérou, berceau d'origine du nématode de la pomme de terre

Pour limiter l'emploi de nématicides dans la lutte contre le nématode à kyste de la pomme de terre, le recours à des variétés résistantes est une des alternatives possibles. La 1re étape consiste à aborder la diversité génétique du parasite. L'Inra-Rennes mène l'enquête depuis 2002.

Par Damien Picard et Pauline Casters

Inra-Rennes, U.M.R. "Biologie des organismes et des populations appliquée à la protection des plantes".

Le nématode à kyste de la pomme de terre (Globodera pallida) est un sérieux parasite des racines. Il se maintient dans le sol sous forme de kystes (sorte de sac de moins d'1 mm de diamètre) pendant plus de 10 ans en absence de pomme de terre. En présence de la plante, le kyste libère des centaines de larves envahissant les racines. Les symptômes au champ se matérialisent par des foyers de plantes chétives, comparables à un flétrissement dû à un déficit hydrique. Parasite de quarantaine* en Europe et dans pratiquement tous les pays du monde, il peut occasionner des pertes de rendement allant jusqu'à 50 %. En France, la contamination d'un champ entraîne l'interdiction d'y produire des semences pendant 5 ans, renouvelable par période de 3 ans le cas échéant, jusqu'à ce que les analyses de sols ne révèlent plus d'individus vivants ni de kystes contenant des larves viables. Sa dissémination par le vent, les engins agricoles et surtout la terre adhérant aux semences lui permet de coloniser progressivement une grande partie du monde. Originaire des hauts plateaux andins, comme la pomme de terre sauvage (photo 1) à laquelle il est associé depuis des millions d'années, le nématode se rencontre aujourd'hui sur toutes les variétés cultivées de pommes de terre. Il a été importé sur le vieux continent avec l'introduction de la pomme de terre au XVIe siècle. Dans le monde, les dégâts dus au nématode sont importants en terme de rendement. Au Pérou, ils sont occultés par les dégâts liés aux coléoptères des Andes. Jusqu'alors employés en masse, les nématicides dévoilent leurs limites (toxicité pour l'homme, l'environnement, et pertes d'efficacité) et poussent l'Europe à développer d'autres moyens de lutte. L'une de ces méthodes consiste à utiliser des plantes résistantes. Les recherches menées à l'INRA de Rennes depuis 20 ans visent à connaître la variabilité des populations** de nématodes phytoparasites et celle des pommes de terre dans le cadre de la recherche de résistances: identification d'individus résistants, étude du mode de résistance et de l'hérédité de cette résistance, mise en place d'un schéma de sélection, durabilité de la résistance... Quelques soient les types de résistances trouvées, un délai de 15 ans est nécessaire pour obtenir une nouvelle variété commerciale, résistante à un nématode ... Ce travail s'effectue en liaison et collaboration avec les sélectionneurs français.

*engendrant des dégâts très importants, l'organisme de quarantaine fait l'objet d'une surveillance phytosanitaire particulière. En cas de présence sur le territoire, la législation impose de prendre des mesures pour empêcher sa dissémination et l'éradiquer.

** groupe d'individus interférends habitant dans une même zone géographique (même bassin de production de la pomme de terre).
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Photo 1 : Fleur de pomme de terre sauvage (photo D. Picard).</figcaption></figure>

## LA CORDILLÈRE PÉRUVIENNE : UN SITE IDÉAL POUR L'ÉCHANTILLONNAGE

La lutte variétale repose sur la recherche de gènes de résistance isolés à partir d'espèces de pommes de terre sauvages. Mais ces gènes ont une efficacité variable selon la population (souche, lignée) de nématodes. Ainsi, en 1990, l'utilisation de variétés de pommes de terre résistantes s'est avérée efficace ou non selon les localités péruviennes. La description génétique des nématodes à l'échelle du territoire permettra d'identifier les populations du Pérou et leurs limites géographiques. Par la suite, les sélectionneurs pourront tester si les nouvelles variétés de pommes de terre résistantes possèdent une efficacité totale ou partielle sur l'ensemble des populations identifiées. De plus, l'origine géographique de l'importation en Europe du nématode pourra être établie précisément.

L'Amérique du Sud, et plus précisément la Cordillère des Andes, est le berceau d'origine de la pomme de terre ; on y retrouve des milliers de variétés, sauvages, andines ou améliorées, offrant une multitude de couleurs et de formes. Au Pérou, la diversité du nématode est maximale du fait de la longue histoire de l'association hôte-parasite. Ce pays constitue donc une zone d'observation idéale. Les études sur d'autres pathogènes de la pomme de terre (mildiou...) de cette région soulignent l'intérêt de l'échantillonnage dans le berceau d'origine.

L'échantillonnage a nécessité une mission de 3 mois durant l'été 2002, dont 9 semaines de prélèvements sur le terrain et 3 semaines d'extraction des kystes au laboratoire du Centre international de la pomme de terre (C.I.P.) de Lima, capitale du Pérou.
## Le test de la bouteille : une méthode qui a fait ses preuves

Comment identifier un champ sain d'un champ infesté ? Les ingénieurs péruviens ont mis au point une méthode qui a fait ses preuves. Cette dernière consiste à :

- prélever quelques poignées de terre sèche sur l'ensemble du champ,

- placer quelques centimètres de cette terre dans une bouteille,

- compléter par de l'eau.

Après agitation, les kystes, plus légers que l'eau, flottent en surface permettant une 1re estimation de l'état d'infestation de la parcelle, qui devra être confirmée par un échantillonnage et une analyse plus poussés.

## VARIÉTÉS ET PRATIQUES CULTURALES SELON L'ALTITUDE

Les variétés les plus communément cultivées au Pérou sont des variétés modernes sélectionnées en station expérimentale, aussi appelées **pommes de terre améliorées**. Elles sont le plus souvent cultivées à des **altitudes inférieures à 3 800 m**. Des échanges importants de plants existent à l'échelon régional, voire national. Or, les contrôles sanitaires ne prennent pas en compte les nématodes à kystes, qui ne sont pas des organismes de quarantaine dans ce pays. Un déplacement important des nématodes existe donc dans les zones où sont cultivées ces pommes de terre. En outre, ce phénomène est accentué par la production de semences dans des zones très contaminées.

Les variétés plus anciennes que les pommes de terre améliorées, dites **pommes de terre andines**, présentent une plus grande diversité génétique. Elles sont sélectionnées sur place depuis de nombreuses générations. Les civilisations andines, dès 2 000 ans avant J.-C., réussirent à domestiquer la pomme de terre sauvage. La pomme de terre andine (photo 2) est la descendante directe de ces pommes de terre. Actuellement, elle est le plus souvent cultivée à des **altitudes supérieures à 3 800 m**, de par sa résistance au gel.

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Photo 2 : Variété andine : la 'Kitipchu' (photo D. Picard).</figcaption></figure>
**Aux altitudes inférieures à 2 500 m,** où règne un climat équatorial, la culture de pomme de terre se caractérise par des rendements élevés pouvant atteindre 40 à 50 t/ha et des pratiques culturales modernes. Le nématode ne parvient pas à se développer dans cette zone au climat trop chaud.

**Entre 2 500 m et 3 000 m,** la culture de la pomme de terre en saison sèche implique le recours à l'irrigation. À cette altitude, le maïs domine. Cultivé principalement en saison humide et chaude, il peut alterner avec la pomme de terre, plutôt cultivée en saison sèche.

**De 3 000 m à 3 800 m,** la production de pomme de terre est importante (photo 3). Les terrains escarpés et souvent peu accessibles offrent peu de possibilités de mécanisation, et les rendements restent inférieurs à 20 t/ha. À cette altitude, les pommes de terre sont le plus souvent des variétés "modernes". Elles sont conditionnées sur place (photo 4) et vendues à des négociants pour les marchés urbains.

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Photo 3 : Récolte de pomme de terre vers 3 500 m d'altitude (photo D. Picard).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Photo 4 : Le tri des pommes de terre en bord de champ (photo D. Picard).</figcaption></figure>

Entre 3 800 à 4 200 m, l'agriculture se raréfie et les rotations s'allongent. La pratique la plus courante est : une jachère d'au moins 7 ans, suivie d'une année de pomme de terre et d'une année de céréale (blé, seigle). Les jachères, fortement dominantes dans ces zones, sont colonisées rapidement par des graminées sauvages broutées par les moutons, vaches, lamas et alpagas. La pomme de terre cultivée est andine. À la fin de la récolte, les tubercules de petits calibres sont réservés pour la semence, les autres étant destinés à la consommation familiale et à la vente en cas de surplus. La présence de nématodes à kyste est rare, mais ces zones sont intéressantes par l'isolement des populations présentes. Il est donc probable que les populations de nématodes qui s'y développent ont divergé de façon considérable en raison de leur isolement géographique.

## Deux cas particuliers d'une pratique agricole limitant le développement du nématode

La dispersion de semences de pommes de terre fortement contaminées par les nématodes a pour conséquence une dissémination de la maladie dans toutes les zones de production du Pérou. La vallée de Colca (région nord d'Arequipa, voir figure 1) est un cas particulier : les agriculteurs ont pour coutume de nettoyer les plants dans l'eau à l'aide de filets de pêcheur ; la terre et donc les kystes sont ainsi éliminés, avec pour conséquence la décontamination des semences. Les régions d'élevage à longues rotations rencontrées dans le Nord sont aussi faiblement infestées. La pratique du pâturage est plus longue que la survie du nématode, permettant ainsi de décontaminer les parcelles pour les cultures de pomme de terre suivantes.
# UN LARGE PANEL DE POPULATIONS DE NÉMATODES À ANALYSER GÉNÉTIQUEMENT

La prospection a eu lieu entre 2 500 et 4 200 m d'altitude dans toute la cordillère péruvienne. Elle a permis de prélever un nombre important de populations représentatives de la diversité des nématodes.

Chaque champ échantillonné est caractérisé par ses coordonnées géographiques (latitude, longitude et altitude) à l'aide du G.P.S.* Ces données permettront de rééchantillonner au même endroit le cas échéant. L'exposition du champ, la rotation pratiquée et la variété de pomme de terre cultivée sont aussi prises en compte. Sur les 342 champs échantillonnés, l'analyse du sol en laboratoire s'est révélée positive pour 281 échantillons (tableau 1). Quatre-vingt quinze champs s'avèrent peu contaminés (5 kystes pour 100 g de terre), mais une grande partie (100 champs) l'est fortement (plus de 200 kystes pour 100 g de terre).

<table><caption>Tableau 1. Niveaux d'infestation des 342 champs échantillonnés.</caption><thead><tr><th>infestation</th><th>nulle</th><th>faible</th><th>moyenne</th><th>forte</th><th>très forte</th></tr></thead><tbody><tr><td>nombre de kystes/100 g de sol (estimation)</td><td>0</td><td>0-50</td><td>50-150</td><td>150-300</td><td>plus de 300</td></tr><tr><td>nombre de champs</td><td>61</td><td>95</td><td>86</td><td>63</td><td>37</td></tr></tbody></table>

L'analyse génétique des nématodes sera réalisée à l'aide de techniques modernes (génotypage de loci microsatellites consistant en l'analyse de la taille d'une partie du génome dont la longueur est hypervariable, séquençage de gènes) développées sur la plate-forme de génotypage Grand-Ouest (programme d'achat et de gestion d'appareils de haute technologie). Cette analyse permettra d'identifier les populations du Pérou, mais aussi d'estimer leurs variabilités génétiques et la capacité du nématode à migrer d'une population à l'autre. Une approche permettant de retracer l'historique des populations selon leur dispersion géographique sera utilisée pour trouver l'origine des populations européennes et le nombre d'événements d'introduction. Ces connaissances fondamentales sur ce parasite constitueront une aide appréciable pour mieux gérer la durabilité de variétés de pommes de terre résistantes.

<footnote>*Global positioning system.</footnote>
# ANNEXE 2

Génétique des populations de *Globodera pallida* dans son berceau d'origine (le Pérou) : consanguinité et fort flux de gènes
# Population genetics of the potato cyst nematode in Peru: high inbreeding but long range dispersal

D. Picard, O. Plantard & D. Mugniéry

UMR INRA-AGROCAMPUS BiOP, Domaine de la Motte, B.P. 35327, 35653 Le Rheu cedex, France.

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

## Aim: Assessment of the genetic variability and the gene flow at various spatial scales, and the reproductive mode

Globodera pallida is native of the Andean Cordillera (the origin of its unique host plant, Solanum spp.) and has been recently introduced in Europe. A sampling was done in Peru to avoid any distortion in the population genetics study due to multiplication cycles in the laboratory and stochastic effect of genetic drift in introduced populations.

Three fields in three regions (Otuzco, Huancayo and Andahuaylas) were sampled. For each field, 40 juveniles (each from a different cyst and from a different soil sample) were genotyped with 8 microsatellite loci.

## RESULTS

### 1- Long range dispersal

e.g. Locus GP20: each allele is represented by a distinct circle with an area proportional to allele frequency.

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

A large allelic richness was observed at all loci. Most alleles in each region are identical and indicate a lack of genetic structuration. Most alleles between regions are different and indicate a large genetic structuration.

#### Intra region dispersal

A lack of genetic structuration was observed between fields within regions and supported by weak FST values that are indicative of **high intra region gene flow**.

Such a long range dispersal (more than 35 km) could be explained by an effective passive transport of cysts due to:

* ✓wind, water or transport of soil and seed tubers

* ✓huge population size

up to 9 billions cysts by hectare

* ✓founding a population with one cyst is possible containing hundreds eggs

* ✓conservation form

a cyst is viable more than 10 years

#### Inter region dispersal

A large genetic structuration was observed between regions and supported by high FST values that are indicative of low inter region gene flow. Such a limited dispersal of cyst at more than 320 km is probably due to major biogeographic barriers (deep valleys and high mountains) in the Andean Cordillera.

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

### 2- High inbreeding

High Fis values (high deficit of heterozygotes) were observed and are indicative of **a high inbreeding**.

To explain this result, we must remember that:

* ✓ Cysts contain hundreds siblings

* ✓ Juveniles and males disperse actively at weak distance in the soil (a few cm)

Therefore, a large number of weakly dispersing siblings leads to inbreeding.

## CONCLUSION

There is an apparent contradiction between long range dispersal and high inbreeding. However, even if cysts disperse passively at long distance, the weak active dispersal of hundreds siblings occurs at each generation allowing to maintain inbreeding.
# ANNEXE 3

Orientation et datation de l'orogenèse des Andes induits par la phylogéographie de *Globodera pallida*
# Direction and timing of Andean uplift propagation deduced from the molecular phylogeny of highland biota

Damien Picard<fnref n="1" />, Thierry Sempere<fnref n="2" /> & Olivier Plantard<fnref n="1" />

## Abstract

Because the rise of mountains creates new ecosystems and triggers evolutionary changes, biological data may be used to assess the development and timing of surface uplift. Here we apply this idea to the Peruvian Andes through a molecular phylogenetic and phylogeographic study of *Globodera pallida*, a potato parasite nematode that requires cool temperatures and thus thrives above 2000-2500 m in these tropical highlands. The Peruvian populations of this species exhibit a clear evolutionary pattern with basal lineages occurring in Andean southern Peru and more derived lineages progressively occurring northwards. Genetically diverging *G. pallida* populations thus progressively colonised northerly-expanding uplifted areas, demonstrating that altitude in the Peruvian Andes was acquired longitudinally from south to north, i.e. in the direction of decreasing orogenic volume. After calibration by consistent geological and biological events, the phylogeny of *G. pallida* is used as a molecular clock, which indicates that the 2000-2500 m critical elevation range was reached in the Early Miocene (~23-18 Ma) in southern Peru, in the Middle Miocene (~16-11 Ma) in southern central Peru, and in the latest Miocene (~9-6 Ma) in central and northern Peru.

## 1. Introduction

The Central Andes result from crustal thickening (James, 1971) but their uplift history is poorly known (Gregory-Wodzicki, 2000). Orogeny imposed adaptive pressure on western South American biota, creating new ecosystems and triggering a variety of speciations among plant and animal groups, which resulted in the Andean region being one of the world's high biodiversity centers (Balslev, 1993). In particular, orogeny produced a marked decrease in mean annual temperature (MAT) in areas being uplifted. Biomolecular data concerning highland species inform on synorogenic biotic evolution and should thus provide an indirect way to assess and date the acquisition of altitude.

At tropical latitudes, i.e. between ~20°N and ~20°S, areas of lower MATs are highlands. Jumps in altitudinal range and related adaptation to cooler conditions were associated with Andean speciations (e.g., Willmott et al., 2001). Among plants, one major adaptation to highland conditions is exemplified by the wild potatoes (*Solanum* section *Petota*), with several Central Andean species showing a pronounced tolerance to frost (Spooner et al., 1999; Hijmans & Spooner, 2001; Hijmans et al., 2003). Potato parasites such as cyst-nematodes, which coevolved with the wild potatoes, are also cold-adapted (see below; Franco, 1977; Picard, 2005; Picard & Plantard, 2005).

Here we use the molecular phylogeny and phylogeography of highland potato cyst-nematodes, along with other published biological and geological data, to characterise and date aspects of the Andean uplift in Peru. We observe that the uplift ages deduced from molecular clocks and those

<footnote n="1">¹ UMR INRA-ENSAR BiO3P, Domaine de la Motte, B.P. 35327, 35653 Le Rheu cedex, France</footnote>

<footnote n="2">² IRD, Laboratoire "Mécanismes et Transferts en Géologie", 14 avenue Edouard Belin, 31400 Toulouse, France</footnote>
obtained by more classical geochronological tools are generally consistent and mutually help to constrain the geological and biological evolutions of the Peruvian Andes.

## 2. Andean surface uplift and its timing: a poorly resolved geologic issue

The Andes are considered as a mountain belt built along a continental margin by tectonic and magmatic processes produced by subduction of an oceanic plate, in an apparently non-collisional setting (James, 1971; Isacks, 1988, Kono et al., 1989; James & Sacks, 1996). This outstanding orogenic belt shows considerable longitudinal variations (Fig. GEOL).

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Fig. GEOL. Segmentation of the Andes Cordillera (after Sempere et al., 2002).</figcaption></figure>

The Central Andes are the largest and most mountainous segment of the cordillera. This ~4000 km-long segment is itself segmented into the northern Central Andes (5°30′S-~13°S; entirely located in Peru), Bolivian Orocline (~13°S-28°S; over southern Peru, Bolivia, northern Chile, northwestern Argentina), and southern Central Andes (28°S-37°S; over central Chile and western Argentina). The Bolivian Orocline covers an area of ~1.300.000 km² and its orogenic volume is by far the largest of the entire Andes. Orogenic volume clearly decreases along strike north and south of the Orocline. In Peru, it is characteristic that the width of the emerged orogen
is ~500 km between Lake Titicaca and Cusco, ~360 km in south-central Peru, and ~240 km in northern Peru; correspondingly, mean maximum elevations decrease northwards (Fig. WW).

Although considerable work has been performed in the Central Andes during the last decades, the chronology of the orogeny and related uplift is still debated. For instance, in the Bolivian Orocline, onset of the main orogeny in the Eastern Cordillera has been estimated at ages as contrasted as ~26 Ma (Sempere et al., 1990) and ~40 Ma (Lamb & Davis, 2003); according to fission track analyses, uplift in the Bolivian Orocline seems to have slowly started about 46 Ma (Anders et al., 2002), and exhumation rates in the Eastern Cordillera near La Paz, Bolivia, would have increased at ~25 ± 5 Ma (Kennan, 2000) or ~15-10 Ma (Masek et al., 1994). More independent data are clearly needed to resolve current discrepancies, and we believe biological data may help to constrain the Central Andean uplift chronology.

### 3. Methods

We address the emergence of Andean highlands by selecting the potatoes and their cyst-nematode parasites because they originated in response to uplift and because molecular data, including phylogenetic trees, are available. We therefore analyse biological information concerning plants of the *Solanum* genus (potatoes, tomatoes, eggplant) and cyst-nematode parasites (Heteroderidae: Punctoderinae, with special attention to the *Globodera* genus).

We estimate relevant divergence ages in phylogenetic dendrograms concerning the *Solanum* and *Globodera* genera by using appropriate chronological tie-points and making the assumption that evolutionary rates were approximately constant during the corresponding time intervals (we use phylogenetic trees as molecular clocks because we favor the idea that it is preferable to have rough chronological indications than none; Bromham et al., 1999). Results from molecular clock analyses are compared for mutual consistency and confronted with geological data. In particular, coevolution of the wild potatoes and their cyst-nematode parasites provides a test for checking the accuracy of the respective independent molecular clocks.

### 4. Andean highland plants: the wild potatoes

#### 4.1. Potatoes and tomatoes

The wild potatoes (*Solanum* section *Petota*) comprise >200 species irregularly distributed from the southwestern USA to southern South America; most species are rare and endemic; 75 % of all species occur above 2300 m and 91 % above 1750 m, with an average elevation at about 2770-2890 m and a maximum altitude near 4900 m; low-elevation occurrences in both hemispheres are from latitudes >20°, where MATs are cooler (Hijmans & Spooner, 2001). Species richness is strongly correlated to highlands between latitudes 20°N and 20°S, the highest numbers of species being found in Peru (93) and Bolivia (39), and the highest number of species in a 50 km x 50 km grid cell (22) occurring in southern Peru (Hijmans & Spooner, 2001). The highest species richness is observed along the eastern Andes between 12°S and 26°S (southern Peru, central Bolivia, northwestern Argentina) and along all highlands between 12°S and 6°S (central Peru), and wild potatoes are thus thought to have originated in the Central Andes (Hijmans & Spooner, 2001).

The wild tomatoes (*Solanum* section *Lycopersicum*) comprise 8 species native to northwestern South America, and 1 endemic to the Galapagos Islands and most probably resulting from dispersal across seawater from the former region. Apart from the more widespread *S. lycopersicum*, the continental species grow along the western Central Andes, from central Ecuador through Peru to northern Chile, and from sea level up to ~3300 m (Peralta & Spooner, 2001). Wild tomatoes thus probably originated in the western lowlands of the Central Andes, while wild potatoes originated in the Central Andean highlands.
Potatoes and tomatoes belong to the same subgenus *Potatoe* and form indeed closely related sister
groups (Olmstead & Palmer, 1997; Olmstead et al., 1999). Divergence of the former from the latter
was characterised by the development of tuberisation, a complementary reproductive strategy that
is likely to have accompanied adaptation of wild potatoes to emerging harsher, cooler conditions.
Thus biological datings of the divergence between potatoes and tomatoes should provide a
tentative estimate of the early development of Andean uplift.

## 4.2. Dating the potato-tomato divergence

Although both generic and species level diversity in the family Solanaceae is presently
concentrated in the Andes, the family has a classic Gondwanan distribution (Symon, 1991),
suggesting it emerged after breakup of Pangea but before long-distance dispersal of the
Gondwanan continental blocks, i.e. at some time within the ~185-90 Ma interval (dates after
Veevers, 2004). We underline that biogeography and geological timing of continental separations
place constraints on evolutionary history that apparently require older dates than currently
considered for divergence of main orders of phanerogams; accordingly, it has been suggested that
diversification of angiosperms occurred much earlier than their first, Early Cretaceous, fossil record
(e.g., McLoughlin, 2001; Morley, 2003). The Gondwanan distribution of Solanaceae thus suggests
that the ~90 Ma age estimated for the divergence of the order Solanales, as illustrated by Davies et
al. (2004), is only a minimum age.

*Solanum*, with over 1000 species, is one of the largest angiosperm genera, and is dominantly
represented in South America (Olmstead et al., 1999). Some species of *Solanum* however occur in
the Old World. In particular, *S. melongena* (the eggplant), a native of Africa or India related to
African species (Doganlar et al., 2002), belongs to the monophyletic subgenus *Leptostemonum*, that
has wild representatives in Gondwanan continents (South America, Africa, India, Australia) and
whose African and Australian members derive from New World ancestors (Olmstead and Palmer,
1997). The African *Leptostemonum* species form a monophyletic clade (Olmstead and Palmer, 1997)
that must have diverged from South American *Leptostemonum* populations at a time when plant
interchanges were still possible between Africa and South America. Considering the estimated
young age of emergence of the order Solanales (90 Ma; Davies et al., 2004), the admitted time of
final separation between Africa and South America (also 90 Ma; Pitman et al., 1993; Veevers,
2004), the probability that the *Leptostemonum* subgenus diverged some time before this separation,
and the possibility of plant dispersal across seawater over moderate distances, we propose that this
divergence occurred at 100 ± 20 Ma, i.e. at some time within the 120-80 Ma interval.

Using this broad time range as a tie-point, the age of the potato-tomato divergence can be
estimated by comparing evolutionary chromosomal structural changes between *S. tuberosum* (the
potato), *S. lycopersicum* (the tomato) and *S. melongena* (the eggplant). The tomato and potato genomes
differ by a total of 5 chromosomal rearrangements (5 inversions and 0 translocation; Tanksley et
al., 1992) whereas the tomato and eggplant genomes differ by 28 rearrangements (23 inversions and
5 translocations; Doganlar et al. 2002), and the potato and eggplant genomes by 24 rearrangements
(19 inversions and 5 translocations; Doganlar et al. 2002).

Taking into account the numbers of chromosomal inversions only, the divergence age of the
tomato and potato lineages is thus younger than that of the tomato and eggplant lineages
approximately by a factor 5/23, and than that of the potato and eggplant lineages approximately by
a factor 5/19. In this case, estimates for the potato-tomato divergence are respectively the 26.1-
17.4 Ma and 31.6-21.1 Ma intervals. The common intersection of these two intervals is 26.1-21.1
Ma (interval I).

Taking into account the total numbers of chromosomal rearrangements, the divergence age of the
tomato and potato lineages is younger than that of the tomato and eggplant lineages approximately
by a factor 5/28, and than that of the potato and eggplant lineages approximately by a factor 5/24
(Table 1). In this case, estimates for the potato-tomato divergence are respectively the 21.4-14.3 Ma
and 25.0-16.7 Ma intervals. The common intersection of these two intervals is 21.4-16.7 Ma
(interval I+T).

The common intersection of these four intervals is 21.4-21.1 Ma (interval R1), i.e. 21.25 ± 0.15 Ma. Because larger uncertainties are likely, and given the nucleotide information below, we expand this narrow interval to 22.5-20.0 Ma (interval R2), i.e. 21.25 ± 1.25 Ma.

The age of the potato-tomato divergence can also be estimated by using rough assessments of the amount of nucleotide changes, which suggest that the tomato and eggplant are diverged 2.5 to 3.5 times more than the tomato and potato (Doganlar et al. 2002). This leads to a rougher age estimate, namely the 44-20 Ma interval (interval N). The younger part of this interval N based on assessment of nucleotide changes however includes both the interval R1 calculated on the basis of chromosomal rearrangements and the expanded interval R2. These calculations thus consistently suggest that the potato and tomato lineages diverged in the Early Miocene, tentatively within the 22.5-20.0 Ma interval, which is compatible with geologic data (see below).

**5. Andean highland plant parasites: the potato cyst-nematodes**

**5.1. The highland nematodes *Globodera pallida* and *G. rostochiensis***

Coevolution of hosts and parasites is a well known phenomenon, and plant nematodes make no exception (Sturhan, 2002; Subbotin et al., 2004). The cyst-nematode parasites of wild potatoes coevolved with their hosts and thus originated in the Andes (Jones, 1951; Willi et al., 1952; Franco, 1977; Stone, 1985). The two known species, *Globodera pallida* and *G. rostochiensis* (Heteroderidae: Punctoderinae), require cool to cold conditions because of their initial adaptation to highlands (Franco, 1977; Canto Saenz & Scurrah, 1977; Picard, 2005). Adaptation of both species to cool climatic conditions is demonstrated by their unfortunately successful introduction by humans in low-elevation cool-temperate climates worldwide (Franco, 1977).

However, *G. pallida* is better adapted to cold MATs than *G. rostochiensis*, and the wild potato species most resistant to *G. pallida* are also the most resistant to frost, suggesting that speciation of *G. rostochiensis* occurred on the eastern, warmer side of the paleo-Andes, and that speciation of *G. pallida* occurred in a colder environment (Franco, 1977). Although they are both found around Lake Titicaca, the two species display almost distinct distributions as *G. rostochiensis* is only known south of Lake Titicaca whereas *G. pallida* is mostly known north of it. In Peru, Martin et al. (1963) observed infestations by *G. pallida* mostly between 2000 and 4000 m, with the heaviest infestations between 2900 and 3800 m, whereas Picard (2005) observed that *G. pallida* principally occupies altitudes comprised between 2500 and 400 m. Although it is apparently adapted to somewhat warmer MATs, *G. rostochiensis* also require cool conditions *but its altitudinal range is not securely known*.

Phylogenetic trees show that (1) *G. pallida* and the poorly known species *G. mexicana* form a monophyletic clade, whereas (2) *G. rostochiensis* and *G. tabacum* form its sister monophyletic clade (Fig. WW; Picard, 2005; Picard & Plantard, 2005). Too little is known about *G. mexicana* to compare its MAT range with its sister taxon *G. pallida*. But, because development and reproduction of *G. tabacum* (subsp. *solanacearum*) is optimum at 27 ± 3 °C (Adams et al., 1982), it is clear that speciation of its sister taxon *G. rostochiensis* was necessarily accompanied by a significant decrease in optimum MAT, hence corroborating that divergence of this potato cyst-nematode coevolved with its hosts while these adapted to emerging cooler, highland conditions. Hence dating the divergence of *G. rostochiensis* and *G. tabacum*, and the speciation of *G. pallida*, should provide two other estimates of the time at which the Andes reached elevations sufficient to produce speciations of cold-adapted biota.

Furthermore, in contrast with *G. tabacum* which parasites a wider range of Solanaceae (including, for the latter, the genus *Nicotiana*, i.e. the tobaccos), *G. rostochiensis*, as *G. pallida*, preferentially parasites potatoes (although these two species retain the ability to parasite other Solanum species under forced experimental conditions), suggesting that *G. rostochiensis* is specialized when compared
to *G. tabacum*, from which it diverged. The same may be true for *G. pallida* in relation with *G. mexicana*, but lack of data concerning the latter precludes any secure interpretation.

## 5.2. Phylogeography of *Globodera pallida*

Evidence for 5 biogeographically structured lineages of *G. pallida* (Fig. WW; Picard, 2005; Picard & Plantard, 2005) indicates a significant evolutionary history of reproductive isolation within this species. This developed most likely in coevolution with wild potatoes, each *G. pallida* lineage independently having infected cultivated potatoes in its respective area only during the last millenia. When rooted with its closest *Globodera* relatives, the *G. pallida* dendrogram exhibits a clear south-to-north phylogeographic pattern, with the most basal clade grouping the southernmost populations (Lake Titicaca area) and the most terminal clade grouping populations of northern Peru. Characteristically, the more derived is a clade in a dendrogram, the more northern are its representatives. The tree topologies obtained by using the mitochondrial (cytb) and nuclear (microsatellite) markers are concordant in this respect (Fig. WW).

The same south-to-north pattern is also observed for allelic richness, which is similar between fields in each clade defined by the cytb tree (Picard, 2005). A consistent correlation is evident between mean allelic richness and latitude (Fig. WW). The southern allelic richness is nearly twice the northern one. The same pattern is also observed for the genetic divergence between the cytb haplotypes of each clade. Total pairwise sequence divergences among *G. pallida*, including *G. mexicana* (as outgroup), range from 0 to 15 % (Fig. WW). The variation in percentage divergences between pairwise individuals is much larger for the southern clade (0-11 %) and decreases dramatically northwards (south central Peru: 0-5%; north central Peru: 0-1%; northern Peru: 0-0.5 %). When mitochondrial or nuclear markers are considered, the branches between haplotypes or fields are longer in the south and shorter in the north. *G. pallida* populations in Peru are thus also characterised by clear south-to-north decreases in allelic richness and pairwise sequence divergence.

## 5.3. Dating the divergence of highland cyst-nematodes

Although nematologic biogeography is hampered by incomplete knowledge of the distribution of known species and by incomplete identification of taxa parasiting non-cultivated plants (Ferris, 1979), available data permit to work out a coarse phylogeography of the genus *Globodera*. First, no *Globodera* species is known to be native to any Gondwanan continent except South America. Second, molecular studies (Subbotin et al., 2001; Tanha Maafi et al., 2003; Picard, 2005) show that the genera *Punctodera* and *Globodera* form a monophyletic clade which splits into a *Punctodera* clade, an apparently Laurasian genus parasiting Poaceae (Ferris, 1979), and a *Globodera* clade which comprises a Eurasian subclade (with species such as *G. achilleae* and *G. artemisiae*, parasiting Asteraceae; Ferris, 1979) and a South American subclade (grouping species parasiting Solanaceae). This variety of hosts confirms that related cyst-nematode groups may parasite distantly related or unrelated plant taxa (Sturhan, 2002; Subbotin et al., 2004), suggesting that speciation among cyst-nematodes may also have occurred by opportunistic parasiting of new host groups.

One explanation of these phylogeographic relationships would be that the *Punctodera-Globodera* clade originated in Laurasia (as proposed by Ferris, 1979) and that a form ancestral to the South American *Globodera* species spread from North America to South America during a period when both continents were connected, and after South America had become isolated from Africa (~90 Ma; Pitman et al., 1993; McLoughlin, 2001; Veevers, 2004). Another explanation would be that the *Globodera* clade is of South American origin and that a population ancestor to the Eurasian species dispersed to North America (and later to Eurasia) when both continents were connected. In both hypotheses divergence of the two *Globodera* subclades is explained by vicariance following the breakup of a temporary connection between North and South America, after separation of the latter from Africa. This connection was necessarily comprised in the ~80~55 Ma interval during which substantial biotic interchanges are known to have occurred between North and South America (Gayet et al., 1992; Marshall and Sempere, 1993; Marshall et al., 1997). Vicariance was
imposed by subsequent isolation of South America from North America (until the Pliocene emergence of the Panama isthmus; Stehli & Webb, 1985), and from Antarctica starting ~35 Ma (McLoughlin, 2001).

We thus propose that the divergence of the South American and Laurasian *Globodera* sub-clades occurred between 80 and 55 Ma, and we use this age range to calibrate a molecular clock for the former. We find that the *G. mexicana* - *G. pallida* and *G. tabacum* - *G. rostochiensis* clades diverged at some time within the 29.0-19.9 Ma interval; that *G. rostochiensis* diverged from *G. tabacum* in the 19.1-13.1 Ma interval; and that *G. pallida* diverged from *G. mexicana* in the ww-ww Ma interval. Within the *G. pallida* species, the “Amantani” and “Cusco-Huancabamba” clades diverged within the 16.0-11.0 Ma interval, and finally the “Cusco” and “Huancabamba” sub-clades diverged within the 8.9-6.1 Ma interval.

Other divergence age estimates can be obtained by using another chronological tie-point, namely by assuming that the divergence of Punctoderinae and Heteroderinae occurred before the breakup of Pangea (Ferris, 1979), thus before 185 Ma (Veevers, 2004). In this hypothesis, the largest sequence divergences among Heteroderidae (14.7%; Subbotin et al., 2001) corresponds to this >185 Ma divergence. Applying this calibration date to our ITS1-5.8S-ITS2 sequences, the divergence observed among in the *G. pallida* clades corresponds to between clades I and IV (sequence divergence between AmantaniXX and HuancabambaXX = 1.9%), 19 My between clades I and II (AmantaniXX / CuscoXX = 1.5%) and 9 My between clades II and IV (CuscoXX / HuancabambaXX = 0.8%). [autre phrasé possible:] speciation of *G. pallida* occurred before 23 Ma, the “Amantani” and “Cusco-Huancabamba” clades diverged before 19 Ma, and the “Cusco” and “Huancabamba” sub-clades diverged before 9 Ma.

# 6. Discussion

## 6.1. *Globodera pallida* as a paleoaltitudinal marker

Current observations show that *G. pallida* and most of its potato hosts thrive above 2000-2500 m in the Andes (Martin et al., 1963; Hijmans & Spooner, 2001; Picard, 2005). Because abrupt jumps in altitudinal range are generally associated to speciation induced by uplift (e.g., Willmott et al., 2001), we thus consider hereafter the 2000-2500 m elevation range as the critical altitude range for colonisation of an Andean area by *G. pallida*.

## 6.2. Phylogeographic evidence for south-to-north propagation of Andean uplift

The marked south-to-north phylogenetic pattern evidenced above for *G. pallida* indicates that dispersion of its populations developed northwards from an ancestral stock in the Altiplano. Colonisation is likely to have propagated northwards as highlands were being uplifted above 2000-2500 m. Such a phenomenon clearly points to a northward propagation of Andean uplift in Peru.

The wild potatoes (*Solanum* section *Petota*) being the natural hosts of *G. pallida*, a similar south-to-north evolutionary pattern is obviously expected. However, the situation for the host is much less clear than for the parasite, as current taxonomic classifications of wild potatoes are being seriously challenged by molecular studies (e.g., Castillo & Spooner, 1997). Some data may however be mentioned. On the basis of cpDNA restriction analyses, wild potatoes of the series *Conicibaccata* do exhibit a south-to-north phylogenetic pattern from the Central Andes to Mexico, with all Peruvian and Bolivian taxa forming the most basal and longest branches (Castillo & Spooner, 1997). Furthermore, all 20 species from Peru and Bolivia are diploids (with only 3 noteworthy exceptions: 1 tetraploid from the Peru-Bolivia border area, 1 tetraploid from central Peru, and 1 hexaploid from northern Peru) whereas all 11 species from Ecuador to Mexico are tetraploids or hexaploids (Castillo & Spooner, 1997): because among plants polyploids derive from diploids, the Peruvian and Bolivian *Conicibaccata* species again appear as basal, and data concerning polyploidy in this series are compatible with the idea that diversification occurred from Bolivia northwards.
Furthermore, a cladistic analysis of the external morphology of the Andean highland lizard genus *Proctoporus* concluded that speciation within this genus has occurred from south to north along the Andes, from Bolivia to Venezuela (Doan, 2003).

These three south-to-north phylogenetic patterns of highland biota are clearly consistent. Applied to Peru, they support that altitude was acquired from south to north, i.e. that Andean uplift propagated northwards starting from the Bolivian Orocline region.

### 6.3. Mutual consistency of molecular clocks

The primary time intervals independently estimated above for the respective divergences of *Solanum* sect. *Petota* (intervals I and I+T) and of *Globodera pallida* and *G. rostochiensis* (intervals ww-ww) are distributed in the Early and Middle Miocene, agreeing fairly and supporting the hypothesis of coevolution of the wild potatoes and their *Globodera* parasites. A comparison of our more precise estimate for the divergence of *Solanum* sect. *Petota*, namely the 22.5-20.0 Ma interval (interval R2), with the ages obtained for the two highland cyst-nematodes, namely 19.1-13.1 Ma and before 16.0 Ma or 23.0 Ma, suggests that the 23-18 Ma interval is an acceptable estimate for coevolutionary speciations of wild potatoes and their *Globodera* parasites.

It must be underlined here that these phylochronologic estimates strikingly agree with the geological data that identify the Early Miocene (23.8-16.4 Ma) as a period of major uplift in the Bolivian Orocline region. Data from more northern areas also provide uplift information concerning the Middle Miocene (16.4-11.2 Ma) and Late Miocene (11.2-5.3 Ma).

### 6.4. Consistency of results with available geological data

Using the assumed critical altitude range specified above, the age estimates presented here indicate that the Andes of southern Peru, i.e. the northern part of the Bolivian Orocline, were above 2000-2500 m at ~23-18 Ma. This result fairly agrees with Sébrier et al.'s (1988) independent conclusion, based on geomorphic observations, that the same region was at least 2000 m-high at ~20-17 Ma. In the Pacific Andean slope of southernmost Peru, regional uplift triggered incision of deep valleys into a thick, 23-18 Ma old, ignimbrite blanket shortly after the end of emplacement of these ignimbrites, thus starting ~18-17 Ma (Flores & Sempere, 2002). Our results also support that the main orogeny started at ~26 Ma in the Eastern Cordillera of western Bolivia (Sempere et al., 1990), and that exhumation rates in the same area increased at ~25 ± 5 Ma (Kennan, 2000).

These results stand in apparent conflict with MATs and altitude estimates drawn from the analysis of fossil leaf morphology, according to which a locality of the western Bolivian Altiplano, close to southern Peru and now at 3940 m, was only at 1160 ± 600 m at 10.7 Ma (Gregory-Wodzicki et al., 1998; Gregory-Wodzicki, 2000, 2002). It has been shown, however, that determination of paleoaltitudes on the basis of leaf morphology analysis commonly overestimates MATs and thus underestimates elevations (Kowalski, 2002), and we suggest our results may be viewed as an independent confirmation of the potential bias attached to this method.

Our results estimate that the region located southwest of Cusco was uplifted above 2000-2500 m in the Middle to Late Miocene. In southern Andean Peru, apatite fission-track ages indicate that the Apurímac valley southwest of Cusco underwent exhumation in the Middle and Late Miocene (van Heiningen et al., 2004).

Because vertical-axis tectonic rotations evidenced by paleomagnetism reflect mountain building (Rousse et al., 2003), timing of rotations provide indirect information about uplift. It is therefore interesting that the Ayacucho area of south-central Peru (13.5°-13°S) underwent 11 ± 5° of counterclockwise rotation between 9 and 7 Ma (Rousse et al., 2002). Our results indicate that the Ayacucho region was uplifted above 2000-2500 m slightly before 9-6 Ma.

Our results estimate that central Peru was uplifted above 2000-2500 m at about 9-6 Ma. The main geological feature of the Cordillera Blanca area of north-central Peru (10°-9°S) is a Late Miocene granodioritic batholith (Beckinsale et al., 1985; McNulty et al., 1998; Garver et al., 2005). This area underwent 15 ± 7° of counterclockwise rotation during exhumation of the batholith between 8 and
3 Ma (Rousse et al., 2003). Apatite fission track analyses indicate that the mean exhumation rate of the batholith has been high, ~1 km/Myr, since ~8 Ma (Montario, 2001). A major phase of canyon incision was produced between 8 and 5 Ma by coeval uplift (Montario et al., 2005). Regional fission track and U+Th/He ages consistently indicate that uplift was especially vigorous between 6 and 2 Ma (Garver et al., 2003; Perry & Garver, 2004; Garver et al., 2005). In central Peru, available geological data are thus also in agreement with our phylochronologic results.

## 7. Conclusions

In Peru, altitudes in excess of 2000-2500 m were acquired first in the Bolivian orocline area. Uplift produced a profound modification of surface conditions which led to speciations of cold-adapted highland biota, such as the wild potatoes and their cyst-nematode parasites, and the *Proctoporus* lizards. Uplift progressively propagated northwards along the orogen, rising new areas above the critical altitude range of 2000-2500 m and thus making them available for colonisation by southern highland biota. Accordingly, these biota display phylogenetic patterns that reflect a marked south-to-north phylogeographic structure.

Because it yields ages consistent with other biological and geological chronologic data, the *Globodera pallida* molecular clock can be used to assess the timing of uplift propagation. It indicates that the 2000-2500 m critical elevation range was reached in the Early Miocene (~23-18 Ma) in southern Peru, in the Middle Miocene (~16-11 Ma) in southern central Peru, and in the latest Miocene (~9-6 Ma) in central and northern Peru.

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Subbotin, S. A., Krall, E. L., Riley, I. T., Chizhov, V. N., Staelens, A., De Loose, M. & Moens, M. Evolution of the gall-forming plant parasitic nematodes (Tylenchida: Anguinidae) and their relationships with hosts as inferred from Internal Transcribed Spacer sequences of nuclear ribosomal DNA. *Molecular Phylogenetics and Evolution* **30**, 226-235 (2004).

Symon, D. E. Gondwanan elements of the Solanaceae. In: *Solanaceae III: Taxonomy – Chemistry – Evolution*, J. G. Hawkes, R. N. Lester, M. Nee, N. Estrada (eds). Royal Botanic Gardens, Kew: 139-150 (1991).

Tanha Maafi, Z., Subbotin, S. A. & Moens, M. Molecular identification of cyst-forming nematodes (Heteroderidae) from Iran and a phylogeny based on ITS-rDNA sequences. *Nematology* **5**, 99-111 (2003).

Tanksley, S. D., Ganal, M. W., Prince, J. P., Vicente, M. C. de, Bonierbale, M. W., et al. High density molecular linkage maps of the tomato and potato genomes. *Genetics* **132**, 1141-1160 (1992).

Van Heiningen, P., Ruiz, G., Andriessen, P., Zuloaga, A. & Romero, L. Landscape evolution of the Apurímac River drainage basin. *XII Congreso Peruano de Geología*, 249-251 (2004).

Veevers, J. J. Gondwanaland from 650-500 Ma assembly through 320 Ma merger in Pangea to 185-100 Ma breakup: supercontinental tectonics via stratigraphy and radiometric dating. *Earth-Science Reviews* **68**, 1-132 (2004).

Willi et al. 1952 nematodes Andes — ref chez Franco 1977

Willmott, K. R., Hall, J. P. W. & Lamas, G. Systematics of Hypanartia (Lepidoptera: Nymphalidae: Nymphalinae), with a test for geographical speciation mechanisms in the Andes. *Systematic Entomology* **26**, 369-399 (2001).
# ANNEXE 4

Listes des espèces du genre *Globodera*, du genre *Punctodera* et autre espèces citées dans la thèse
*Cactodera estonica* (Kirjanova & Krall, 1963) Krall & Krall, 1978

*Caenorhabditis briggsae* (Dougherty & Nigon, 1949) Dougherty, 1953

*C. elegans* (Maupas, 1899) Dougherty, 1953

*Fusarium oxysporum* Schlecht.

*Globodera achilleae* (Golden & Klindié 1973) Behrens, 1975

*G. artemisiae* (Eroshenko & Kazachenko, 1972) Behrens, 1975

*G. chuabattia* (Gupta & Edward, 1973) Wouts, 1984

*G. hypolysi* Ogawa, Ohshima & Ichinohe, 1983

*G. leptonepia* (Cobb & Taylor, 1953) Skarbilovich, 1959

*G. mexicana* Franco, 1977

*G. millefolii* (Kirjanova & Krall, 1965) Behrens, 1975

*G. mirabilis* (Kirjanova, 1971) Mulvey & Stone, 1976

*G. pallida* (Stone, 1973) Behrens, 1975

*G. pseudorotochiensis* (Kirjanova, 1963) Mulvey & Stone, 1976

*G. rostochiensis* (Wollenweber, 1923) Skarbilovich, 1959

*G. tabacum solanacearum* (Miller & Gray, 1972) Behrens, 1975

*G. tabacum tabacum* (Lownsbery & Lownsbery, 1954) Skarbilovich, 1959

*G. tabacum virginae* (Miller & Gray, 1968) Stone, 1973

*G. zelandica* Wouts, 1984

*Gomphiocephalus hodgsoni* Carpenter, 1908

*Heterodera avenae* Wollenweber, 1924

*H. schachtii* A. Schmidt, 1871

*Lycopersicon esculentum* Mill. [(Solanum L. subsect. *Lycopersicon*, an autonym of *Solanum* section *Lycopersicon* (Mill.) Wettst.)]

*Orchesella cincta* Linnaeus, 1758
*Phytophthora infestans* (Mont.) de Bary

*Punctodera chalcoensis* Stone, Soa Moss & Mulvey, 1976

*P. matadorensis* Mulvey & Stone, 1976

*P. punctata* (Thone, 1928) Mulvey & Stone, 1976

*Solanum tuberosum* Linnaeus, 1753

*S. tuberosum* L. subsp. *andigenum* (Juz. & Bukasov) Hawkes, 1956

*S. tuberosum* L. subsp. *tuberosum*

*S. ajanhuiri* Juz. & Bukasov, 1930

*S. acaule* Bitter, 1921

*S. brevicaule* Bitter, 1912

*S. chaucha* Juz. & Bukasov, 1929

*S. chiquidenum* Ochoa, 1954

*S. curtilobum* Juz. & Bukasov, 1929

*S. goniocalyx* Juzepczuk & Bukasov, 1929

*S. juzepczukii* Bukasov, 1929

*S. leptophyes* Bitter, 1913

*S. melongena* Linnaeus, 1753

*S. megistacrolobum* Bitter, 1912

*S. phureja* Juz. & Bukasov, 1929

*S. pimpinellifolium* Linnaeus, 1755

*S. sparsipilum* (Bitter) Juz. & Bukasov, 1937

*S. stenotomum* Juz. & Bukasov, 1929
ANNEXE 5

Tailles (axe Y) et fréquences (diamètre des cercles) des allèles microsatellites représentées à l'aide de graphiques bulles

Les individus péruviens analysés sont regroupés par clades définis dans le chapitre IV.
Nombre d'individus par groupe :

✓ Clade V, n=347

✓ Clade IV, n=261

✓ Clade III, n=193

✓ Clade II, n=40

✓ Clade I, n=168

✓ Europe, n=486
Locus GP 20

<figure><img src="image_45.png" /></figure>
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CLADE
Locus GP 34

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

CLADE
Locus GP 36

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CLADE
<figure><img src="image_50.png" /></figure>
Locus GP 42

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

CLADE
FREQUENCES ALLELIQUES POUR CHAQUE POPULATION

<table><thead><tr><th colspan="7">GP20</th></tr><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>106</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>109</td><td>0.0016</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>120</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0898</td><td>0</td></tr><tr><td>123</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0278</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>132</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0158</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>134</td><td>0.0142</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>135</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>136</td><td>0.0126</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>139</td><td>0.0047</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>140</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0278</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>143</td><td>0.011</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>145</td><td>0.0016</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.006</td><td>0</td></tr><tr><td>146</td><td>0.0267</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>147</td><td>0.0267</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>148</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0269</td><td>0</td></tr><tr><td>149</td><td>0.2736</td><td>0.0471</td><td>0.0132</td><td>0.1389</td><td>0.006</td><td>0</td></tr><tr><td>150</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0658</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>151</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0278</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>153</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0278</td><td>0.0988</td><td>0</td></tr><tr><td>155</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0079</td><td>0</td><td>0.012</td><td>0</td></tr><tr><td>156</td><td>0.0063</td><td>0</td><td>0.0053</td><td>0.0278</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>157</td><td>0.0786</td><td>0.0078</td><td>0</td><td>0.0417</td><td>0.1257</td><td>0.0936</td></tr><tr><td>158</td><td>0.0063</td><td>0</td><td>0.0053</td><td>0</td><td>0.003</td><td>0.0011</td></tr><tr><td>159</td><td>0.0031</td><td>0.0078</td><td>0.0974</td><td>0.2083</td><td>0.1407</td><td>0.4681</td></tr><tr><td>160</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0184</td><td>0.0139</td><td>0.0629</td><td>0</td></tr><tr><td>161</td><td>0</td><td>0.0451</td><td>0.0105</td><td>0.1944</td><td>0.1377</td><td>0</td></tr><tr><td>162</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0.0053</td><td>0.0556</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>163</td><td>0.1195</td><td>0.0471</td><td>0.0789</td><td>0.1806</td><td>0.006</td><td>0</td></tr><tr><td>164</td><td>0.0047</td><td>0</td><td>0.1</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>165</td><td>0</td><td>0</td><td>0.4289</td><td>0</td><td>0.1377</td><td>0.2159</td></tr><tr><td>166</td><td>0.0016</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1407</td><td>0</td></tr><tr><td>167</td><td>0.0031</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.2214</td></tr><tr><td>168</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0395</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>169</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0053</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>170</td><td>0.0047</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0278</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>171</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>172</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0658</td><td>0</td><td>0.006</td><td>0</td></tr><tr><td>174</td><td>0.0016</td><td>0.0059</td><td>0.0053</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>175</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0053</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>177</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0079</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>187</td><td>0.0204</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>188</td><td>0.0016</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>205</td><td>0.0173</td><td>0.0235</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>207</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>208</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>209</td><td>0.0063</td><td>0.0118</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>211</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0.0132</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>212</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>213</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>221</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>222</td><td>0.2925</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>228</td><td>0.0063</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>230</td><td>0.0047</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>234</td><td>0.0173</td><td>0.7725</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>236</td><td>0</td><td>0.0059</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>238</td><td>0.0063</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>240</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>242</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>247</td><td>0.0016</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>255</td><td>0</td><td>0.0098</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>256</td><td>0.0031</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>261</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>263</td><td>0.0016</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr></table>

<table><caption>GP32</caption><thead><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>183</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0276</td><td>0</td></tr><tr><td>185</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1842</td><td>0.0092</td><td>0</td></tr><tr><td>187</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0288</td><td>0.4737</td><td>0.1656</td><td>0.2033</td></tr><tr><td>189</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0789</td><td>0.0153</td><td>0.6656</td></tr><tr><td>191</td><td>0</td><td>0.0019</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>193</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.2761</td><td>0.1044</td></tr><tr><td>194</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0056</td></tr><tr><td>195</td><td>0.0014</td><td>0.0389</td><td>0.0026</td><td>0.0132</td><td>0.0399</td><td>0</td></tr><tr><td>196</td><td>0.1744</td><td>0.0019</td><td>0.0916</td><td>0</td><td>0.2025</td><td>0.0144</td></tr><tr><td>197</td><td>0</td><td>0.0311</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0123</td><td>0.0067</td></tr><tr><td>198</td><td>0.0014</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>199</td><td>0.817</td><td>0.9183</td><td>0.3272</td><td>0.1974</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>200</td><td>0.0014</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0.0132</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>201</td><td>0.0043</td><td>0.0078</td><td>0.4398</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>202</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.2393</td><td>0</td></tr><tr><td>203</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0395</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>204</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0061</td><td>0</td></tr><tr><td>205</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>207</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1047</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>

<table><caption>GP33</caption><thead><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>143</td><td>0.0043</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>144</td><td>0.0824</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>145</td><td>0</td><td>0.0077</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>146</td><td>0</td><td>0.4537</td><td>0.0763</td><td>0.0128</td><td>0.0091</td><td>0.0054</td></tr><tr><td>147</td><td>0.0029</td><td>0.1042</td><td>0.1263</td><td>0.5128</td><td>0.1758</td><td>0.303</td></tr><tr><td>148</td><td>0</td><td>0.0019</td><td>0.05</td><td>0.1026</td><td>0.0394</td><td>0</td></tr><tr><td>149</td><td>0.6127</td><td>0.2664</td><td>0.4421</td><td>0.0897</td><td>0.1061</td><td>0.2359</td></tr><tr><td>150</td><td>0.2789</td><td>0.0618</td><td>0.0711</td><td>0.0897</td><td>0.1212</td><td>0.0325</td></tr><tr><td>151</td><td>0.0058</td><td>0.0869</td><td>0.0105</td><td>0.0385</td><td>0.0212</td><td>0</td></tr><tr><td>152</td><td>0</td><td>0.0116</td><td>0.0921</td><td>0.0513</td><td>0.1333</td><td>0.0097</td></tr><tr><td>153</td><td>0</td><td>0.0019</td><td>0.0342</td><td>0</td><td>0.097</td><td>0</td></tr><tr><td>154</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0395</td><td>0.1026</td><td>0.0061</td><td>0</td></tr><tr><td>155</td><td>0</td><td>0</td><td>0.05</td><td>0</td><td>0.0061</td><td>0</td></tr><tr><td>156</td><td>0</td><td>0.0019</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1909</td><td>0</td></tr><tr><td>157</td><td>0</td><td>0.0019</td><td>0.0053</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>159</td><td>0.0116</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0091</td><td>0</td></tr><tr><td>161</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>162</td><td>0.0014</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.4134</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>180</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0061</td><td>0</td></tr><tr><td>181</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.003</td><td>0</td></tr><tr><td>187</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0061</td><td>0</td></tr><tr><td>195</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0091</td><td>0</td></tr><tr><td>196</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.003</td><td>0</td></tr><tr><td>198</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0242</td><td>0</td></tr><tr><td>200</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0212</td><td>0</td></tr><tr><td>206</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0121</td><td>0</td></tr></table>

GP34

<table><thead><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>178</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0046</td></tr><tr><td>179</td><td>0.0015</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0132</td><td>0.0912</td><td>0</td></tr><tr><td>180</td><td>0.3235</td><td>0.0041</td><td>0.7124</td><td>0.0789</td><td>0.0472</td><td>0</td></tr><tr><td>181</td><td>0.5191</td><td>0.0164</td><td>0.0881</td><td>0.4474</td><td>0.2233</td><td>0</td></tr><tr><td>182</td><td>0.0015</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.022</td><td>0</td></tr><tr><td>184</td><td>0.1206</td><td>0.9283</td><td>0.1943</td><td>0.3421</td><td>0.3648</td><td>0.7432</td></tr><tr><td>185</td><td>0</td><td>0.0369</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>186</td><td>0.0132</td><td>0.0061</td><td>0.0026</td><td>0.0132</td><td>0.0975</td><td>0.2523</td></tr><tr><td>187</td><td>0.0059</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0063</td><td>0</td></tr><tr><td>188</td><td>0.0029</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0132</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>189</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0094</td><td>0</td></tr><tr><td>190</td><td>0.0074</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0943</td><td>0</td></tr><tr><td>191</td><td>0.0044</td><td>0.0061</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>193</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0252</td><td>0</td></tr><tr><td>194</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0921</td><td>0.0094</td><td>0</td></tr><tr><td>195</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr></tbody></table>

GP36

<table><thead><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>119</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1351</td><td>0.0156</td><td>0.0185</td></tr><tr><td>121</td><td>0.0048</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0063</td><td>0</td></tr><tr><td>122</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0467</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>123</td><td>0.0064</td><td>0.2308</td><td>0.0192</td><td>0.027</td><td>0.2937</td><td>0.3141</td></tr><tr><td>124</td><td>0.0176</td><td>0</td><td>0.0357</td><td>0</td><td>0.1406</td><td>0</td></tr><tr><td>125</td><td>0.1182</td><td>0.0283</td><td>0.2143</td><td>0.0135</td><td>0.0156</td><td>0</td></tr><tr><td>126</td><td>0.0431</td><td>0</td><td>0.0055</td><td>0</td><td>0.0063</td><td>0</td></tr><tr><td>127</td><td>0.1789</td><td>0.1336</td><td>0.6621</td><td>0.4865</td><td>0.25</td><td>0.2293</td></tr><tr><td>128</td><td>0.0176</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>129</td><td>0.3594</td><td>0.17</td><td>0.0165</td><td>0.0676</td><td>0.05</td><td>0.438</td></tr><tr><td>130</td><td>0.0032</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>131</td><td>0</td><td>0.0951</td><td>0</td><td>0.2568</td><td>0.1312</td><td>0</td></tr><tr><td>132</td><td>0.0176</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0531</td><td>0</td></tr><tr><td>133</td><td>0.1278</td><td>0.1498</td><td>0</td><td>0.0135</td><td>0.0094</td><td>0</td></tr><tr><td>134</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>135</td><td>0.0256</td><td>0.0951</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0219</td><td>0</td></tr><tr><td>137</td><td>0</td><td>0.0466</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>139</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>140</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>141</td><td>0.0799</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>146</td><td>0</td><td>0.004</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>152</td><td>0</td><td>0.0081</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>153</td><td>0</td><td>0.0162</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>156</td><td>0</td><td>0.002</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>160</td><td>0</td><td>0.0061</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>162</td><td>0</td><td>0.0081</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>
<table><caption>GP38</caption><thead><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>97</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0088</td></tr><tr><td>98</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0128</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>99</td><td>0.6412</td><td>0.9459</td><td>0.2</td><td>0.0641</td><td>0.3204</td><td>0.2737</td></tr><tr><td>100</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0033</td></tr><tr><td>101</td><td>0.1383</td><td>0.0444</td><td>0.3816</td><td>0.6154</td><td>0.491</td><td>0.0298</td></tr><tr><td>102</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0011</td></tr><tr><td>103</td><td>0.0029</td><td>0.0097</td><td>0.0079</td><td>0.2949</td><td>0.0539</td><td>0.0872</td></tr><tr><td>105</td><td>0.2176</td><td>0</td><td>0.1947</td><td>0</td><td>0.003</td><td>0</td></tr><tr><td>107</td><td>0</td><td>0</td><td>0.2105</td><td>0.0128</td><td>0.012</td><td>0</td></tr><tr><td>109</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0053</td><td>0</td><td>0.1168</td><td>0.4106</td></tr><tr><td>112</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0022</td></tr><tr><td>114</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1777</td></tr><tr><td>118</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0055</td></tr><tr><td>122</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.003</td><td>0</td></tr></tbody></table>

<table><caption>GP42</caption><thead><tr><th>LOCUS</th><th>CladeV</th><th>CladeIV</th><th>CladeIII</th><th>CladeII</th><th>CladeI</th><th>Europe</th></tr></thead><tbody><tr><td>205</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0052</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>206</td><td>0.0235</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>208</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1432</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>212</td><td>0.0777</td><td>0</td><td>0.138</td><td>0.1538</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>213</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0859</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>214</td><td>0.0235</td><td>0.0061</td><td>0.0599</td><td>0.0769</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>215</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0.0769</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>216</td><td>0.0205</td><td>0</td><td>0.0599</td><td>0</td><td>0.0061</td><td>0</td></tr><tr><td>217</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>218</td><td>0.1334</td><td>0.0041</td><td>0.0286</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>219</td><td>0.0279</td><td>0.0082</td><td>0.0026</td><td>0.0128</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>220</td><td>0</td><td>0.0615</td><td>0.013</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0</td></tr><tr><td>221</td><td>0</td><td>0.0082</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>222</td><td>0</td><td>0.1496</td><td>0.1641</td><td>0.1026</td><td>0.0521</td><td>0.3829</td></tr><tr><td>223</td><td>0</td><td>0.0328</td><td>0.0208</td><td>0</td><td>0.0184</td><td>0</td></tr><tr><td>224</td><td>0.0088</td><td>0.0389</td><td>0.099</td><td>0.1282</td><td>0.0706</td><td>0.1224</td></tr><tr><td>225</td><td>0.0044</td><td>0.0348</td><td>0.0417</td><td>0</td><td>0.0828</td><td>0.019</td></tr><tr><td>226</td><td>0.0029</td><td>0.127</td><td>0.0052</td><td>0.2179</td><td>0.0429</td><td>0.0011</td></tr><tr><td>227</td><td>0.044</td><td>0.0861</td><td>0.0026</td><td>0.0385</td><td>0.0491</td><td>0</td></tr><tr><td>228</td><td>0.0367</td><td>0.1352</td><td>0.0052</td><td>0.0385</td><td>0.0828</td><td>0.0759</td></tr><tr><td>229</td><td>0.0015</td><td>0.0266</td><td>0.0156</td><td>0.1154</td><td>0.0153</td><td>0</td></tr><tr><td>230</td><td>0</td><td>0.0287</td><td>0.0026</td><td>0.0385</td><td>0.0092</td><td>0.0686</td></tr><tr><td>231</td><td>0</td><td>0.2213</td><td>0.0156</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>232</td><td>0.3416</td><td>0.0061</td><td>0.026</td><td>0</td><td>0.0123</td><td>0</td></tr><tr><td>233</td><td>0.0029</td><td>0.0082</td><td>0.0052</td><td>0</td><td>0.184</td><td>0.193</td></tr><tr><td>234</td><td>0.0367</td><td>0.0041</td><td>0.0339</td><td>0</td><td>0.0552</td><td>0</td></tr><tr><td>235</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0182</td><td>0</td><td>0.0031</td><td>0.0105</td></tr><tr><td>236</td><td>0.2038</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1266</td></tr><tr><td>237</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0491</td><td>0</td></tr><tr><td>238</td><td>0.0103</td><td>0</td><td>0.0026</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>239</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.1902</td><td>0</td></tr><tr><td>241</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0.0675</td><td>0</td></tr><tr><td>248</td><td>0</td><td>0.0123</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>
# ANNEXE 6

## Gène cytochrome b (Test de la saturation dans le jeu de donnée, Divergence nucléotidique et Séquences)