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# Evolution des génomes bactériens : application à Lactococcus lactis

Pascal Le Bourgeois

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## To cite this version:

Pascal Le Bourgeois. Evolution des génomes bactériens: application à Lactococcus lactis. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Toulouse 3 - Paul Sabatier, 2011. tel-04276882

HAL Id: tel-04276882

https://hal.science/tel-04276882

Submitted on 9 Nov 2023

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Université
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Université
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TOULOUSE III

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Rapport en vue de l'obtention de l'Habilitation à Diriger les Recherches

EVOLUTION DES GENOMES BACTERIENS :
APPLICATION à LACTOCOCCUS LACTIS

Pascal Le Bourgeois, Maître de Conférences
Table des matières

<table><tr><td>Introduction générale</td><td>1</td></tr><tr><td>1) Diversité en taille des génomes bactériens</td><td>2</td></tr><tr><td>2) Diversité en contenu génétique : le pangénome</td><td>3</td></tr><tr><td>3) Pangénome et espèce bactérienne</td><td>7</td></tr><tr><td>4) Une nouvelle source d'innovation génétique : la micro-diversité</td><td>8</td></tr><tr><td>5) Evolution des génomes : Le transfert horizontal de gènes</td><td>8</td></tr><tr><td>6) Les contraintes au transfert horizontal</td><td>9</td></tr></table>

Partie 1 : Variabilité génétique et génomique de *Lactococcus lactis*

<table><tr><td>Présentation des travaux</td><td>15</td></tr><tr><td>Article 1 (PLoS One, 2010, 5(12): e15306)</td><td>19</td></tr><tr><td>Données complémentaires</td><td>41</td></tr><tr><td>Projet de recherche</td><td>46</td></tr></table>

Partie 2 : Inversions chromosomiques expérimentales chez *Lactococcus lactis*

<table><tr><td>Présentation des travaux</td><td>49</td></tr><tr><td>Article 2 (Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68(5):2359-2367)</td><td>51</td></tr><tr><td>Article 3 (Mol. Microbiol., 2004, 51(2):511-522)</td><td>60</td></tr></table>

Partie 3 : Recombinaison Xer chez les Streptocoques

<table><tr><td>Présentation des travaux</td><td>73</td></tr><tr><td>Article 4 (PLoS Genet., 2007, 3(7): e117)</td><td>77</td></tr><tr><td>Article 5 (Nucleic Acids Res., 2010, 38(19):6477-6489)</td><td>98</td></tr><tr><td>Données complémentaires</td><td>115</td></tr><tr><td>Projet de recherche</td><td>126</td></tr></table>

Bibliographie 131

Curriculum vitae 155
# MISE EN BOUCHE

## « L'acte sexuel chez les animaux »

Rubrique-à-Brac, Tome 4, janvier 1973, Dargaud éditeur
L'ACCOUPLEMENT, ÉVÈNEMENT
IMPORTANT DANS LA VIE D'UN ANI-
MAL, A LIEU D'UNE CEUX-ICI-
ATTEINT L'ÂGE OU IL SE TROUVE
PHYSIologiquement ET SEXUEL-
LEMENT ADULTE. LE COUPLE SE
LIVRE À UNE SÉRIE DE GESTES
RITUELS QUI SONT LES MÉMES,
QUEL QUE SOIT SON DEGRÉ D'ÉVO-
LUTION DANS L'ÉCHELLE ANIMALE.
C'EST UNE VÉRITABLE CÉRÉMO-
NIE QUI SERT DE PRÉLUDE À L'AC-
TE SEXUEL PROPREMENT DIT.
ÉTUONS LES DIFFÉRENTES
ÉTAPES DE CETTE CÉRÉMONIE, AU
TRAVERS DE QUELQUES ESPÈ-
CES ANIMALES DIFFÉRENTES,
CHOISIES AU HASARD.

L'ÂGE OU L'ANIMAL SORT DE
L'ADOLESCENCE POUR PARVE-
NIR À L'ÉTAT ADULTE, SEXUEL-
LEMENT PARLANT, EST VARIABLE
SELON LES ESPÈCES. CHEZ
L'AMIBE, PAR EXEMPLE, IL EST
DE 4 À 6 HEURES ENVIRON.

CHEZ LA SOURIS, IL EST DE QUINZE
À VINGT JOURS, À PEU DE CHOSES
PRES, SAUF ERREUR OU OMISSION.

LE COCHON DEVRA ATTENDRE, POUR ÊTRE EN
ÉTAT, UN OU DEUX ANS. À MOINS QUE JE NE
ME TROMPE, MAIS QU'EST-CE QUE CA PEUT
FAIRE, LE RÉSULTAT EST LE MÊME.

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L'ÉLEPHANT DEVIENT UN HOMME AUX ALEN-
TOURS DE CINQ ANS. EN GROS. EN FIN, À
UN POIL PRÈS QUOI.

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QUANT À L'HOMO SAPIENS, LA MUTATION À
LIEU ENTRE 14 ET 16 ANS. À NOTER QUE C'EST
L'ANIMAL LE PLUS ATTARDE EN CE DOMAINE.

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LA PREMIÈRE ÉTAPES DE
LA CÉRÉMONIE RITUELLE
CONSISTE, POUR LA FE-
MELLE, À EMETTRE UNE
PUISSANTE ODEUR À
VERTU APHRODIISIAQUE
DESTINÉE À ATIRER
L'ATTENTION DU MALE.

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SECONDE ÉTAPES DU CÉ-
RÉMONIAL : LE MALE,
EXCITE PAR L'ODEUR,
POUSSE UN MÉLODIEUK
CRI D'AMOUR. (CHEZ
L'AMIBE, CE CRI SE SI-
TUE DANS LA GAMME
DES ULTRA-SONS).

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## Introduction générale

Il est communément accepté que le sexe, enfin plutôt le brassage génétique généré à chaque méiose, constitue une innovation majeure dans l'évolution des êtres vivants (Otto & Lenormand, 2002 ; Goddard et al., 2005). En effet, à chaque génération, la recombinaison méiotique permet de générer une diversité génétique considérable en produisant un nombre illimité de combinaisons des gènes, et de purger les mutations défavorables. La reproduction sexuée, au travers du concept d'interfécondité, est également considérée comme moteur essentiel dans les phénomènes de spéciation [concept d'espèce biologique (Mayr, 1942)]. Comment expliquer alors qu'un organisme dépourvu de sexualité et simplifié à l'extrême (une cellule constituée grosso modo d'un ou deux chromosomes baignant dans un cytoplasme entouré de couches successives de lipides, de protéines et de polysaccharides) puisse constituer l'élément prépondérant de la biosphère (Pace, 1997) et posséder une variabilité génétique lui permettant de coloniser l'ensemble du globe terrestre (des glaces de l'Antarctique aux sources hydrothermales) et du monde vivant (on les retrouve à la surface ou l'intérieur de la plupart des organismes), et d'utiliser ou produire un nombre illimité de composés ? En effet, on a longtemps considéré que les organismes procaryotes évoluaient essentiellement par mutations successives (évolution clonale) malgré l'existence de mécanismes d'échanges génétiques entre cellules, et que chaque espèce possédait un chromosome relativement statique avec un nombre fini de gènes. Or, les données de génomique obtenues ces vingt dernières années ont provoqué une révolution conceptuelle en microbiologie évolutive (Abby & Daubin, 2007) : la diversité génétique des procaryotes semble illimitée (Lapierre & Gogarten, 2009) et l'échange de gènes, qu'il soit intra- ou interspécifique, bien plus fréquent que prévu (Narra & Ochman, 2006 ; Dagan & Martin, 2009). De plus, le chromosome bactérien apparaît comme une structure très dynamique (Casjens, 1998) et hautement organisée (Rocha, 2008 ; Touzain et al., 2011). Enfin, nombre de fonctions cellulaires fondamentales pour la transmission fidèle de l'information génétique de générations en générations, comme par exemple certaines étapes de la réplication/réparation de l'ADN (Dervyn et al., 2001 ; Chedin & Kowalczykowski, 2002 ; Neylon et al., 2005), de la condensation et de la ségrégation des chromosomes (Yamaichi & Niki, 2004 ; Bernhardt & de Boer, 2005 ; Le Bourgeois et al., 2007 ; Lim & Oh, 2009), sont assurées par des analogues fonctionnels chez plusieurs groupes bactériens. Les différentes observations montrent que la diversité génétique, la structure, et les mécanismes d'évolution des génomes et des populations varient selon les espèces considérées. Il apparaît donc de moins en moins évident d'établir des paradigmes applicables à l'ensemble du monde bactérien à partir d'études réalisées sur un nombre limité d'espèces modèles, tels qu'Escherichia coli ou Bacillus subtilis.
1) Diversité en taille des génomes bactériens.

La taille des génomes bactériens varie de 144 Kb pour *Hodgkinia cicadicola* (McCutcheon et al., 2009), une α-protéobactérie endosymbionte d'insecte, à 13 Mb pour *Sorangium cellulosum* (Schneiker et al., 2007), une δ-protéobactérie (myxobactérie) du sol. Cette variation d'un facteur 100 est bien inférieure à celle observée chez les organismes Eucaryotes (facteur 30000, avec des tailles de génome haploïde variant de 2.9 Mb pour *Encephalitozoon cuniculi*, une microsporidie parasite des mammifères, à plus d'une centaine de Gb pour certaines plantes ou amphibiens)(Gregory, 2004). Cependant, contrairement aux eucaryotes pour lesquels le nombre de gènes n'est pas corrélaté à la taille du génome (Lynch & Conery, 2003), la densité génique et la longueur des séquences codant des protéines (CDS, pour *CoDing Sequence*) restent constantes dans tout le domaine procaryote, avec des distributions gaussiennes centrées respectivement autour de 90 % et de 0,9 Kb (Koonin & Wolf, 2008 ; Kuo et al., 2009), ce qui fait qu'un *Streptomyces* ou une myxobactérie ne contient que deux à trois fois moins de CDS que le génome humain. Il a été observé depuis assez longtemps une distribution bimodale des tailles de génomes bactériens, avec un pic autour de 2 Mb (correspondant aux bactéries considérées un temps comme « spécialistes ») et un second autour de 5 Mb (correspondant aux bactérie « généralistes ») (Shimkets, 1998 ; Ranea et al., 2005 ; Koonin & Wolf, 2008) . Ceci suggérerait l'existence de deux tailles « optimales » de génomes bactériens, bien qu'on ne puisse exclure un biais d'échantillonnage vers les espèces d'intérêt (notamment les pathogènes) ou vers celles possédant un génome plus facilement séquençable.

L'augmentation de taille des génomes bactériens correspond essentiellement à l'acquisition de
nouvelles fonctions par transfert horizontal (HGT) (Ochman et al., 2000 ; Lerat et al., 2005 ; Pal et al.,
2005a ; Cordero & Hogeweg, 2009) et parfois à des évènements de duplication (Jordan et al., 2001).
On observe également que les fonctions indépendantes de la taille du génome sont celles impliquées
dans le métabolisme cellulaire de base (transcription, traduction, réplication/réparation de l'ADN,
synthèse des constituants cellulaires, métabolisme énergétique, division cellulaire,...) (Ranea et al.,
2004), alors que celles dépendantes de la taille des génomes correspondent plutôt à des fonctions
adaptatives (facteurs alternatif de transcription, motilité cellulaire, transport, catabolisme ou
biosynthèse de molécules diverses,...) ou à une complexification des réseaux de régulation (Ranea et
al., 2004). Ainsi, la taille du génome d'une espèce bactérienne semble dictée par son « style de vie »,
sa complexité augmentant avec les capacités adaptatives du microorganisme. Il semble cependant
exister une contrainte à l'expansion de taille des génomes bactériens. En effet, Il a été montré que
l'augmentation du nombre de familles de gènes (COGs, pour Cluster of Orthologous Groups) suivait
une loi linéaire (y=ax+b) pour les gènes de métabolisme, et une loi de puissance (y=ax<sup>k</sup>) pour les
gènes régulateurs (Ranea et al., 2004). Par analogie avec les théories de microéconomie, et en
considérant que les gènes de métabolisme offrent un gain adaptatif (le revenu) alors que les gènes régulateurs représentent un coût pour la cellule (coût logistique), il a été estimé que pour une taille de génome supérieure à 10.5 Mb le nombre de gène régulateurs dépassait celui des gènes de métabolisme (Ranea et al., 2005). Autrement dit, un niveau de complexité supplémentaire entrainait un coût supérieur au revenu généré. De manière surprenante, la taille optimale d'un génome bactérien pour obtenir une proportion égale entre gènes métaboliques et régulateurs (rapport correspondant à la meilleure productivité) a été estimée à environ 4800 Kb (Ranea et al., 2005), ce qui correspond à la taille moyenne observé pour les bactéries considérées comme « généralistes ».

L'analyse comparative des génomes permet de reconstruire les génomes ancestraux et d'en déduire les modes d'évolutions des différentes espèces. Cette évolution semble varier selon la niche écologique des espèces : si certains groupes bactériens évoluent essentiellement par réduction de génomes, tels *Listeria* spp. (den Bakker et al., 2010), *Mycobacterium leprae* (Gomez-Valero et al., 2007) et les parasites/endosymbiontes intracellulaires *Rickettsia* (Blanc et al., 2007) et *Buchnera* (Moran & Mira, 2001 ; Klasson & Andersson, 2004), d'autres évoluent plutôt par acquisition de gènes comme les streptocoques (Lefebure & Stanhope, 2007), ou par flux équilibré de perte/gain de gènes comme le groupe *E. coli* / *Shigella* (Touchon et al., 2009). Il existe également une variabilité importante de la taille des génomes à l'intérieur des espèces bactériennes. Cette variation intraspécifique a été estimée entre 15 et 20 % chez certaines espèces comme *Escherichia coli* (Bergthorsson & Ochman, 1998), *Salmonella enterica* (Thong et al., 1997), *Vibrio splendidus* (Thompson et al., 2005), *Lactobacillus sakei* (Chaillou et al., 2009), ou *Lactococcus lactis* (Passerini et al., 2010), ce qui correspond à des différences en « capacité de codage génétique » de 500 à 1000 gènes en fonction des souches. Cette variabilité ne semble pas être corrélée avec la phylogénie des souches, basée sur la séquence de quelques gènes, au moins pour *V. splendidus* et *L. lactis*.

## 2) Diversité en contenu génétique : le pangénome.

Une des découvertes majeures de cette dernière décennie concerne la variabilité exceptionnelle du contenu génétique entre les souches d'une même espèce. En 2000, une première analyse des chromosomes d'un nombre limité de souches de quatre espèces bactériennes (Lan & Reeves, 2000) a conduit à proposer la notion de « génome d'espèce » (species genome), correspondant à l'ensemble des gènes présents dans une espèce. Ce génome serait composé de deux catégories de gènes : les « gènes cœurs » (core set of genes), présents dans 95 % des souches, et les « gènes auxiliaires ». Ce concept a été repris et amélioré en 2005 (bien que les auteurs n'aient
<table><caption>Table 1. Pangénomes bactériens (Décembre 2010)</caption><thead><tr><th>Espèce ou genre</th><th>Nb<br>génomes</th><th>Taille pangénome<sup>a</sup><br>- génome cœur<sup>a</sup></th><th>Ratio génome cœur par<br>génome individuel (%)</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td>Bacillus spp.</td><td>20</td><td>19043 - 814</td><td>16</td><td>(Alcaraz et al., 2010)</td></tr><tr><td>Bifidobacterium spp.</td><td>14</td><td>5125 - 1025</td><td>46</td><td>(Bottacini et al., 2010)</td></tr><tr><td>Vibrio spp.</td><td>32</td><td>26504 - 488</td><td>10.4</td><td>(Thompson et al., 2009)</td></tr><tr><td>Vibrio spp.</td><td>11</td><td>6629 - 1882</td><td>43</td><td>(Lilburn et al., 2010)</td></tr><tr><td>Streptococcus spp.</td><td>26</td><td>5550 - 611</td><td>30</td><td>(Lefebure & Stanhope, 2007)</td></tr><tr><td>Pectobacterium spp.</td><td>3</td><td>6060 - 3264</td><td>68</td><td>(Glasner et al., 2008)</td></tr><tr><td>C. coli</td><td>42+9</td><td>2600 - 1450</td><td>83.5</td><td>(Lefebure et al., 2010)</td></tr><tr><td>C. jejuni</td><td>43</td><td>2600 - 1330</td><td>82.4</td><td>(Lefebure et al., 2010)</td></tr><tr><td>C. jejuni</td><td>5</td><td>3221 - 847</td><td>50</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>E. coli</td><td>61</td><td>16000 - 993</td><td>19.2</td><td>(Lukjancenko et al., 2010)</td></tr><tr><td>E. coli</td><td>20</td><td>17838 - 1976</td><td>40.5</td><td>(Touchon et al., 2009)</td></tr><tr><td>E. coli</td><td>22</td><td>13099 - 2610</td><td>55</td><td>(Snipen et al., 2009; Hall et al., 2010)</td></tr><tr><td>H. influenzae</td><td>13</td><td>5230 - 1461</td><td>74</td><td>(Hogg et al., 2007)</td></tr><tr><td>S. enterica</td><td>16</td><td>9966 - 2055</td><td>46</td><td>(Hall et al., 2010)</td></tr><tr><td>S. enterica</td><td>14</td><td>9868 - 2425</td><td>55</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>Y. pestis</td><td>14</td><td>4844 - 3668</td><td>80</td><td>(Eppinger et al., 2010)</td></tr><tr><td>Y. pestis</td><td>7</td><td>5798 - 2385</td><td>63</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>V. cholerae</td><td>11</td><td>6923 - 1520</td><td>38</td><td>(Thompson et al., 2009)</td></tr><tr><td>V. cholerae</td><td>23</td><td>6953 - 2432</td><td>65</td><td>(Chun et al., 2009)</td></tr><tr><td>H. pylori</td><td>7</td><td>2070 - 1223</td><td>80</td><td>(Fischer et al., 2010)</td></tr><tr><td>H. pylori</td><td>6</td><td>2650 - 917</td><td>60</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>L. pneumophila</td><td>5</td><td>2957 - 1979</td><td>57</td><td>(D'Auria et al., 2010)</td></tr><tr><td>B. pseudomallei</td><td>11</td><td>7500 - 4900</td><td>78</td><td>(Nandi et al., 2010)</td></tr><tr><td>B. pseudomallei</td><td>8</td><td>7500 - 5300</td><td>81</td><td>(Losada et al., 2010)</td></tr><tr><td>B. mallei</td><td>7</td><td>5700 - 3456</td><td>63</td><td>(Losada et al., 2010)</td></tr><tr><td>L. monocytogenes</td><td>13</td><td>4950 - 2032</td><td>66</td><td>(den Bakker et al., 2010)</td></tr><tr><td>B. cereus</td><td>10</td><td>12211 - 1993</td><td>38</td><td>(Hall et al., 2010)</td></tr><tr><td>B. cereus</td><td>8</td><td>11276 - 2421</td><td>45</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>S. agalactiae</td><td>8</td><td>2500 - 1806</td><td>80</td><td>(Tettelin et al., 2005)</td></tr><tr><td>S. pyogenes</td><td>12</td><td>3283 - 1311</td><td>69</td><td>(Hall et al., 2010)</td></tr><tr><td>S. pyogenes</td><td>13</td><td>3433 - 1073</td><td>60</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>S. pneumoniae</td><td>17</td><td>3170 - 1454</td><td>69</td><td>(Hiller et al., 2007)</td></tr><tr><td>S. pneumoniae</td><td>44</td><td>3221 - 1536</td><td>74</td><td>(Donati et al., 2010)</td></tr><tr><td>S. pneumoniae</td><td>11</td><td>3934 - 1455</td><td>68</td><td>(Hall et al., 2010)</td></tr><tr><td>S. pneumoniae</td><td>6</td><td>3327 - 1213</td><td>60</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>S. thermophilus</td><td>47</td><td>ND - 1271</td><td>58</td><td>(Rasmussen et al., 2008)</td></tr><tr><td>E. faecium</td><td>7</td><td>3884 - 2240</td><td>80</td><td>(van Schaik et al., 2010)</td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>14</td><td>4221 - 1923</td><td>72</td><td>(Hall et al., 2010)</td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>14</td><td>4646 - 1485</td><td>59</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>C. botulinum</td><td>8</td><td>9606 - 824</td><td>24</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>A. pleuropneumoniae</td><td>9</td><td>3303 - 1709</td><td>82</td><td>(Xu et al., 2010)</td></tr><tr><td>Thiomonas</td><td>8</td><td>ND - 2061</td><td>56</td><td>(Arsène-Ploetze et al., 2010)</td></tr><tr><td>R. solanacearum</td><td>6</td><td>9093 - 2543</td><td>45</td><td>(Remenant et al., 2010)</td></tr><tr><td>P. aeruginosa</td><td>5</td><td>ND - 5021</td><td>77</td><td>(Mathee et al., 2008)</td></tr><tr><td>P. fluorescens</td><td>3</td><td>9122 - 3642</td><td>61</td><td>(Silby et al., 2009)</td></tr><tr><td>C. burnetii</td><td>5</td><td>3308 - 963</td><td>52</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>A. baumanii</td><td>6</td><td>6421 - 1555</td><td>45</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>B. aphidicola</td><td>6</td><td>1051 - 159</td><td>29</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>R. palustris</td><td>6</td><td>10542 - 1820</td><td>40</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>F. tularensis</td><td>7</td><td>2524 - 824</td><td>53</td><td>(Snipen et al., 2009)</td></tr><tr><td>P. marinus</td><td>12</td><td>7567 - 726</td><td>39</td><td>(Kettler et al., 2007; Snipen et al., 2009)</td></tr></tbody></table>

<footnote>a : Expressées en Kb, nombre de CDS, ou nombre de familles (COG) selon les publications.</footnote>
pas cité le travail précédent), suite à l'analyse comparative du chromosome de 8 souches de *Streptococcus agalactiae*, 5 souches de *Streptococcus pyogenes*, et 8 souches de *Bacillus anthracis* (Tettelin *et al.*, 2005). La terminologie précédente a été modifiée en « pangénome », défini comme l'ensemble des gènes présents chez une espèce ; « génome cœur » (core genome), défini comme l'ensemble des gènes présents chez toutes les souches de l'espèce ; et « génome accessoire » (dispensable genome), correspondant aux gènes spécifiques de souches ou de lignées. C'est cette terminologie qui a été « naturellement sélectionnée » par l'usage. Une analyse mathématique a permis d'extrapoler les résultats à un nombre plus élevé de souches et a conduit à l'hypothèse que certaines espèces, comme *S. agalactiae*, et *S. pyogenes*, possédaient un pangénome « ouvert » (Tettelin *et al.*, 2005), c'est-à-dire que chaque génome supplémentaire séquencé apporterait de nouveaux gènes (33 pour *S. agalactiae* et 27 pour *S. pyogenes*), alors que d'autres, comme *B. anthracis*, avaient un pangénome « fermé » car aucun nouveau gène n'était trouvé à partir de 4 génomes (Tettelin *et al.*, 2005 ; Medini *et al.*, 2005). L'existence de pangénomes ouvert ou fermé reste controversée car elle dépend d'éventuels biais de représentativité de la diversité des souches étudiées (on peut par exemple imaginer que les 8 souches de *S. agalactiae* décrivent déjà l'ensemble de la diversité génique de l'espèce), d'erreurs taxonomiques [*B. anthracis* ne constitue qu'une lignée particulière de *Bacillus cereus*, (Kolsto et al., 2009)], ou du modèle mathématique utilisé pour l'extrapolation. On peut ainsi remarquer que les auteurs de cette étude ont eux-mêmes modifié ce modèle mathématique (Tettelin *et al.*, 2008) et sont arrivés à des conclusions différentes (par exemple *S. pyogenes* devient une espèce avec un pangénome fermé). Les analyses récentes, obtenues sur un plus grand nombre de souches, semblent néanmoins confirmer l'existence de pangénomes plus ou moins étendus. Par exemple, la comparaison des génomes de 61 souches d'E. coli révèle toujours une augmentation linéaire du nombre de gènes (Lukjancenko *et al.*, 2010), alors que celle de 43 génomes de *Campylobacter jejuni* et 42 de *Campylobacter coli* indique un pangénome fini pour chacune de ces espèces (Lefebure *et al.*, 2010).

Fin décembre 2010, les caractérisations du pangénome d'une trentaine d'espèces bactériennes ont été publiées (Table 1). En fonction des espèces analysées et des méthodes utilisées, le génome cœur représente de 6 % 0 75 % et du pangénome, et de 24 à 83 % du génome d'une souche. D'autre part, on constate que près de 90 % des gènes du pangénome ont une distribution biaisée. Ainsi, pour le groupe *E. coli* / *Shigella*, la grande majorité de ces gènes (75 %) n'est présente que chez un nombre limité de souches, voire chez une seule souche pour la moitié d'entre eux (Fig. 1). Ces gènes, appelés « gènes volatiles » (Touchon *et al.*, 2009), correspondent essentiellement aux transposases des séquences d'insertions et aux gènes de prophages, ou bien codent des fonctions inconnues. Les 15 % restants, correspondant aux « gènes persistants » (Fang *et al.*, 2005), sont
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Fig. 1.** Répartition des gènes du pangénome dans 20 génomes d'E. coli / Shigella. La couleur des rectangles indique la classe des gènes (Touchon et al., 2009).</figcaption></figure>

présents dans la quasi-totalité des souches, et codent soit des fonctions cellulaires de bases soit des fonctions spécifiques de l'espèce. Cette répartition bimodale a également été observée, bien qu'avec des ratios différents, chez *Staphylococcus aureus* (Hall et al., 2010), *Haemophilus influenzae* (Hogg et al., 2007), les genres *Streptococcus* (Lefebure & Stanhope, 2007) et *Vibrio* (Lilburn et al., 2010), et pourrait être généralisable à l'ensemble du pangénome bactérien (Lapierre & Gogarten, 2009).

En résumé, on constate que les bactéries utilisent une stratégie très différente de celle des eucaryotes pour générer, à partir de leur pool de gènes, la variabilité phénotypique nécessaire à leur adaptation à de nombreux environnements. En effet, les eucaryotes possèdent un faible nombre de gènes en regard de leur complexité et de leur capacité à interagir avec leur environnement, mais cette limitation est compensée par l'existence d'au moins deux mécanismes générant la diversité : l'épissage alternatif, qui permet à un gène de coder une multitude de protéines, et les modifications épigénétiques, qui permettent la variation réversible du patron d'expression des gènes sous l'influence de l'environnement. Chez les bactéries, qui ne possèdent pas (ou peu) de tels mécanismes, la limitation du nombre de gènes portés par un génome individuel est compensée par l'existence d'un réservoir important de gènes disponibles au niveau de l'espèce. On peut ainsi supposer que l'adaptation d'une espèce bactérienne à différentes niches écologiques ou aux variations environnementales soit liée à la combinatoire des gènes du pangénome, la taille importante du réservoir de gènes permettant d'obtenir toujours la (ou les) composition(s) génétique(s) adéquates.
### 3) Pangénome et espèce bactérienne.

Il existe un consensus pour considérer que le transfert horizontal de gènes contribue à l'évolution des génomes procaryotes. Il subsiste néanmoins une forte controverse sur la part relative de cette contribution comparée à la transmission verticale des gènes car, selon la méthodologie utilisée pour détecter les gènes soumis au transfert horizontal (gènes xénologues), selon les espèces ou la période temporelle considérées, la part de xénologues varie de 5 % (Kunin et al., 2005) à 81 % (Dagan et al., 2008). Il y a donc un débat contradictoire entre les partisans d'une faible contribution du transfert horizontal, plutôt attachés à la structure en arborescence du vivant du modèle classique de « l'Arbre du vivant » (Tree Of Life) et à la notion d'espèces (Kurland et al., 2003 ; Ochman et al., 2005 ; Kurland, 2005 ; Abby & Daubin, 2007 ; Galtier & Daubin, 2008), et ceux qui privilégient le transfert horizontal comme moteur évolutif prépondérant, et qui tendent à rejeter le modèle classique ainsi que la notion d'espèce chez les procaryotes (Charlebois et al., 2003 ; Dagan et al., 2008 ; Koonin, 2009 ; Bapteste et al., 2009 ; Koonin & Wolf, 2009 ; Doolittle & Zhaxybayeva, 2009).

Malgré l'existence de groupes génétiquement cohérents chez les procaryotes, il n'y a pas de définition consensuelle de l'espèce bactérienne en tant qu'unité évolutive (Gevers et al., 2005 ; Konstantinidis et al., 2006a). Pour tenir compte de la variabilité intraspécifique du contenu génétique des génomes procaryotes, il a été proposé le concept « d'espèce génomique » (genome species concept) qui définit le génome cœur de l'espèce, peu permissif aux transferts horizontaux, comme unité taxonomique et évolutive (Lan & Reeves, 2000). Bien que considéré comme trop simpliste (Doolittle & Zhaxybayeva, 2009) car il ne tient pas compte du génome accessoire (qui représente la majeure partie du pangénome), ce concept reste compatible avec les modèles évolutifs classiques, comme : le concept d'écotypes [populations génétiquement cohérentes et écologiquement distinctes résultant d'une purge de la diversité génétique par sélection périodique (Cohan, 2001)] et celui d'espèces biologiques [population génétiquement distinctes résultant d'un isolement reproductif par l'existence de barrières à la recombinaison homologue (Mayr, 1942 ; Dykhuizen & Green, 1991)]. Le concept « d'espèce génomique » est également compatibles avec les modèles alternatifs comme : le concept de « réseau latéral minimal » [évolution essentiellement par transfert horizontal donnant une structure en réseau (Dagan et al., 2008)] ou celui de « Big-bang biologique » [alternance de périodes d'évolution rapide (explosion) par recombinaison, HGT, fusion, fission, invasion d'EGM, et de périodes d'évolution lente par divergence nucléotidique permettant l'émergence de lignées génétiques évoluant selon une structure arborescente (Koonin, 2007)], ce dernier modèle correspondant à l'application aux procaryotes de la théorie des équilibres ponctués (Eldredge & Gould, 1972).
4) Une nouvelle source d'innovation génétique : la micro-diversité.

La possibilité de comparer finement la variabilité intraspécifique des génomes en utilisant des méthodes d'alignements multiples (Chiapello et al., 2005) a récemment permis de mettre en évidence un niveau supplémentaire de diversité génétique chez plusieurs espèces bactériennes (une γ-protéobactérie et deux firmicutes): les loci de micro-diversité (Touzain et al., 2010). La majorité des régions variables identifiées (63 à 72 % selon les espèces) correspond à des segments d'ADN inférieurs à 500 pb, avec une taille moyenne située entre 60 et 90 pb. Ces loci, que l'on pourrait comparer aux microsatellites des génomes eucaryotes et qui semblent apparaître principalement par glissement de polymérase (replication slippage), pourraient être relativement instables à l'échelle évolutive et avoir une contribution non négligeable dans la variabilité phénotypique des souches. En effet, près de la moitié (35 à 55 %) de ces loci ont une localisation intragénique et ne perturbent pas la phase de lecture des CDS, entrainant ainsi une modification de la séquence protéique. Selon la souche, cette variabilité intragénique touche de 3 à 6 % des gènes. De plus, un tiers des loci (16 à 33 %) sont localisés juste en amont d'un CDS (moins de 500 pb) et sont donc susceptibles de modifier l'expression du gène correspondant. L'analyse d'un plus grand nombre d'espèces devrait permettre de déterminer l'ampleur de cette micro-diversité dans le domaine procaryote.

5) Evolution des génomes : Le transfert horizontal de gènes.

L'extrême variabilité des génomes observée chez les procaryotes souligne l'importance du transfert horizontal de gènes (HGT) dans l'adaptation et l'évolution de ces organismes. Ce transfert peut se faire selon trois processus : la transformation, la transduction, et la conjugaison (Thomas & Nielsen, 2005). L'intégration du (ou des) xénologue(s) dans le chromosome bactérien est réalisé par recombinaison homologue (Didelot & Maiden, 2010), par recombinaison spécifique de site ou par transposition. Le plus souvent, les gènes soumis au transfert horizontal ont tendance à se regrouper pour constituer des régions variables généralement appelées îlots génomiques. On peut cependant différencier ces îlots sur la base de leur mode d'intégration dans le chromosome bactérien. On rassemble sous le terme « éléments génétiques mobiles » (EGM), ce que certains appellent le « mobilome » (Frost et al., 2005), les îlots contenant un module d'intégration qui correspond aux protéines nécessaires à leur excision/intégration, qu'il s'agisse de recombinases ou de transposases. Parmi ces EGMs, on distingue les bactériophages tempéré, les séquences d'insertion et les transposons (simples ou composites), les intégrons, les PRCIs (Phage-Related Chromosomal Islands), ainsi que les ICEs ou dérivés (IMEs pour Integrative and Mobilizable Elements)(Burrus et al., 2002). On considère généralement que les EGMs sont les moteurs principaux de l'évolution des génomes
bactériens car ils portent des gènes augmentant la « valeur sélective » (fitness) de la cellule réceptrice, notamment la majorité des facteurs de virulence et des gènes de résistance aux antibiotiques pour les espèces bactériennes pathogènes (Boyd & Brussow, 2002 ; Novick, 2003 ; Burrus & Waldor, 2004 ; Mazel, 2006 ; Novick et al., 2010). La contribution relative de chaque type d'EGM à cette évolution semble cependant dépendre de l'espèce considérée. Par exemple, ce sont les bactériophages tempérés qui sont les déterminants majeurs de la variabilité génétique observée chez S. pyogenes (Beres et al., 2002 ; Beres & Musser, 2007), alors que ce sont essentiellement les ICEs chez S. agalactiae (Brochet et al., 2008a) et les espèces voisines (Haenni et al., 2010), et une combinaison de différents EGM chez Staphylococcus aureus (Lindsay & Holden, 2004). De part leur capacité à coder les facteurs nécessaires à leur mobilité, il est connu depuis longtemps que la plupart des EGMs sont capables passer la barrière d'espèce et de se transférer entre organismes phylogénétiquement éloignés (Frost et al., 2005).

Une partie significative des îlots génomiques, notamment plus de la moitié de ceux identifiés chez E. coli (Touchon et al., 2009), ne sont pas considérés comme des EGMs car ils ne contiennent pas de module d'intégration. Ils ont cependant un rôle important dans la macro-diversité intraspécifique des génomes bactériens. En effet, l'analyse phylogénétique des régions bordant ces îlots a révélé une incongruence avec la phylogénie générale des souches (obtenue par concaténation des gènes du génome cœur), ce qui suggère que les îlots sont capables de se propager d'une souche à l'autre par recombinaison homologue au niveau de leur séquences flanquantes (Touchon et al., 2009 ; Schubert et al., 2009). Certains îlots étant insérés au niveau d'ARNt, ceci suggère l'intégration ancestrale d'un EGM suivie de la délétion des modules de conjugaison et d'intégration. Chez S. agalactiae, des signatures d'échange de grandes régions chromosomiques entre isolat naturels ont également été identifiées (Brochet et al., 2008b). Dans ces deux espèces, le transfert de grandes régions chromosomiques a été observé expérimentalement. Ces transferts sont liés à la présence d'ICEs chez S. agalactiae (Brochet et al., 2008b) ou du plasmide F chez E. coli (Schubert et al., 2009). Un mécanisme de transfert conjugatif de fragments chromosomiques a également été mis en évidence chez une bactérie phylogénétiquement éloignée des entérobactéries et des firmicutes, Mycobacterium smegmatis (Wang et al., 2005). On peut supposer que ce mode d'échange génétique intraspécifique est en réalité plus répandu que prévu chez les procaryotes, ce que semble indiquer une récente analyse bioinformatique (Kloesges et al., 2011).
## 6) Les contraintes au transfert horizontal.

Outre les barrières à leur installation dans la cellule réceptrice (Thomas & Nielsen, 2005), les gènes xénologues sont soumis à différentes contraintes pour pouvoir être maintenus au cours de l'évolution. La première est de type fonctionnel car elle est liée à la compatibilité entre les fonctions codées par ces gènes et les réseaux métaboliques ou protéiques préexistant dans la cellule réceptrice. Il a par exemple été observé que les gènes codant certains facteurs de virulence étaient préférentiellement associés à des génotypes particuliers dans le groupe *E. coli / Shigella* (Escobar-Paramo *et al.*, 2004), ou que la probabilité d'acquisition de gènes codant des activités métaboliques était supérieure si des voies métaboliques couplées étaient déjà présentes (Pal *et al.*, 2005a ; Pal *et al.*, 2005b). Il semble également que l'appartenance à un réseau complexe (Wellner *et al.*, 2007), principalement via le nombre d'interactions protéines-protéines (Cohen *et al.*, 2010) ou l'interaction avec une protéine du génome cœur (Davids & Zhang, 2008), constitue un facteur prépondérant à la transférabilité des gènes. En effet, selon « l'hypothèse de la complexité » (Jain *et al.*, 1999), les gènes intégrés à des systèmes cellulaires complexes montrent une propension moindre au transfert horizontal.

La seconde contrainte au maintien des gènes xénologues semble plutôt structurelle et est liée à l'existence de forces s'exerçant sur l'organisation des chromosomes bactériens, notamment celles liées à leur réplication et à leur ségrégation. En effet, si le nombre de réplicons peut parfois varier selon les espèces, la grande majorité des bactéries possède un seul chromosome circulaire dont la réplication est assurée par deux fourches de réplication progressant dans des directions inverses (réplication bidirectionnelle) à partir d'une origine de réplication unique (*oriC*), et se rencontrant dans une zone opposée à *oriC*, la région de terminaison de la réplication *terC*. Ce mode de réplication définit un axe de symétrie appelé axe *oriC / terC* (ou *oriC / dif*), autour duquel s'organise le chromosome bactérien (Fig. 2).

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Fig. 2.** Les différents niveaux d'organisation du chromosome bactérien autour de l'axe de symétrie *oriC / dif*. (Rocha, 2008)</figcaption></figure>
Dès les premières analyses de génomique comparative, il fut observé que la synténie entre gènes orthologues disparaissait graduellement selon l'éloignement phylogénétique (Tillier & Collins, 2000 ; Rocha, 2003), ce qui suggérait une grande plasticité dans ces génomes. Cependant, la comparaison de génomes d'espèces proches laissa apparaitre des profils caractéristiques en « X » (Fig. 3), indiquant que les réarrangements chromosomiques n'étaient pas aléatoires et que les inversions symétriques à l'axe oriC/terC constituaient le moteur principal de l'évolution des génomes procaryotes (Eisen et al., 2000 ; Tillier & Collins, 2000 ; Darling et al., 2008). La contribution de ces inversions à la plasticité des génomes dépend essentiellement du nombre d'éléments répétés présents (cibles pour la recombinaison homologue), notamment les séquences d'insertion (IS), et du style de vie des organismes (Fig. 3) (Mira et al., 2002 ; Parkhill et al., 2003 ; Blanc et al., 2007).

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Fig. 3.** Position des gènes orthologues entre paires de génomes procaryotes, en fonction de la distance phylogénétique (divergence nucléotidique moyenne > 85% colonne de gauche ; <76% colonne de droite) et du style de vie des organismes. (a) endosymbiontes ; (b) pathogènes intracellulaires ; (c) bactéries libres contenant peu d'IS ; (d) bactéries libres contenant un grand nombre d'IS. Les origines de réplication définissent le point 0 pour chaque génome. (Mira et al., 2002)</figcaption></figure>
Différentes raisons sont invoquées pour expliquer l'absence de contre-sélection de ces inversions au cours de l'évolution. Tout d'abord, elles ne modifient pas la longueur des deux bras de réplication, un fort déséquilibre dans leurs tailles respectives entrainant généralement un défaut de croissance (Louarn et al., 1985 ; Hill & Gray, 1988 ; Campo et al., 2004). Il a longtemps été supposé que les inversions symétriques auraient même pu être favorisées, car elles permettent de restaurer un équilibre de taille entre les bras de réplication à la suite de l'insertion d'îlots génomiques (Bergthorsson & Ochman, 1998). Cependant cette hypothèse a récemment été remise en cause par différentes études (Liu et al., 2006 ; Matthews et al., 2010 ; Matthews & Maloy, 2010). Ensuite, ces inversions ne perturbent ni la position ni l'orientation des gènes par rapport à l'origine de réplication. Ces deux biais sont observés chez la majorité des eubactéries et sont plus ou moins marqués selon les espèces considérées. La conservation de la position des gènes vis-à-vis d'oriC semble dépendre de leur niveau d'expression et est généralement associée à l'effet de dosage de gène observé chez les bactéries à croissance rapide (Roth & Schmidt, 1987 ; Sousa et al., 1997). Toutefois, cet effet positionnel n'apparait comme significatif que pour les gènes impliqués dans les processus de transcription et de traduction (Couturier & Rocha, 2006). Le biais d'orientation des gènes correspond à leur propension à être transcrit dans la même direction que le sens de progression des fourches de réplication afin d'éviter les collisions de front entre les réplisomes et les ARN polymérides (Brewer, 1988 ; Rudolph et al., 2007 ; Mirkin & Mirkin, 2007 ; Srivatsan et al., 2010). Ce biais semble dépendre principalement du caractère essentiel du gène (Rocha & Danchin, 2003a ; Rocha & Danchin, 2003b).

Enfin, les inversions symétriques ne perturbent aucun des biais de composition observés dans les chromosomes bactériens, tels que le biais GC (Lobry, 1996 ; Grigoriev, 1998) ou le biais de mots (Hendrickson & Lawrence, 2006 ; Touzain et al., 2011). Le biais GC correspond au fait que le brin à réplication continue (brin précoce ou « leading strand ») possède un excès de bases G par rapport aux bases C. Ce biais est observé dans la majorité des phyla bactériens, excepté les cyanobactéries et certaines archaebactéries, et se superpose parfaitement aux bras de réplication car il change de signe au niveau des sites oriC et terC (Lobry, 1996 ; Blattner et al., 1997 ; Grigoriev, 1998). Il ne semble pas avoir de fonction biologique et résulte en partie de la réplication asymétrique de l'ADN, dans laquelle le brin précoce reste sous forme simple brin plus longtemps que le brin retardé ce qui favorise la désamination spontanée des cytosines et leur transformation en thymines. Contrairement au biais GC, les biais de mots (ou biais de motifs) reflètent une structuration du chromosome (Touzain et al., 2011) indispensable au bon déroulement de i) sa réplication (boites DnaA pour l'initiation de la réplication), ii) de la réparation des mésappariements par le système MutHLS (sites GATC de méthylation dam chez E. coli) ou des cassures double brin par les systèmes RecBCD ou AddAB (sites chi), iii) de sa ségrégation (sites GATC pour l'attachement d'oriC à la membrane chez E. coli, parS ou migS pour la ségrégation des origines de réplication, KOPS / SRS pour la translocation
active des chromosomes et la résolution des dimères de chromosomes), iv) ainsi que sa compaction en macrodomaines (sites *matS* pour l'organisation du macrodomaine *Ter* chez *E. coli*) équivalents aux territoires chromosomiques observés chez les eucaryotes (Meaburn & Misteli, 2007). De ces différents motifs, seuls les sites Chi et les KOPS / SRS sont biaisés en orientation selon l'axe *oriC* / *terC* et participent à la polarisation du chromosome bactérien. Différentes observations semblent indiquer que les îlots génomiques et les EGMs possèdent une organisation adaptée à leur transfert horizontal. Par exemple, les gènes qu'ils portent sont généralement orientés dans le même sens, habituellement sous forme d'opérons, et, une fois l'élément intégré dans le chromosome bactérien, leur orientation semble être préférentiellement dans le sens de progression de la fourche de réplication (données non montrées). D'autre part, ils semble s'exercer une pression de sélection pour éviter une surreprésentation des motifs impliqués dans la structuration du chromosome bactérien, notamment ceux participant à sa polarisation tels que les sites Chi et les KOPS / SRS (Halpern et al., 2007).

Le présent manuscrit rend compte des dix dernières années de mon activité de recherche au sein de l'équipe « Génétique des bactéries lactiques », dirigée par Paul Ritzenthaler (professeur à l'Université Paul Sabatier) et hébergée jusqu'en 2013 au Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaire du CNRS (UMR5100). Mon intérêt s'est porté sur la caractérisation de la diversité génétique et génomique de *Lactococcus lactis*, une bactérie d'intérêt technologique considérée comme un des micro-organismes les plus importants pour l'industrie laitière car utilisé comme levain dans la plupart des fabrications fromagères. Au niveau phylogénétique, les lactocoques constituent le premier embranchement qui sépare le clade des *Streptococcaceae* du reste des firmicutes. La relative petite taille de leur génome et la présence d'une majorité d'espèces pathogènes dans ce clade explique en grande partie le nombre élevé de génomes séquencés disponibles (66 génomes complets et 234 projets référencés au NCBI, 240 souches de *S. pneumoniae* récemment séquencées [Croucher et al., 2011]), et en font un des groupes les mieux étudiés pour ce qui concerne l'évolution des génomes.
# Partie 1 : Variabilité génétique et génomique de *Lactococcus lactis*

## Présentation des travaux

A l'évidence, seule l'analyse phylogénomique utilisant les données de séquençage du génome de plusieurs souches d'un même taxon donne une vision exhaustive de la variabilité naturelle des espèces bactériennes (Eisen & Fraser, 2003). En effet, cette approche permet de définir le pangénome de l'espèce et de caractériser les génomes cœurs et accessoires (Tettelin et al., 2008). Elle permet également de déterminer avec robustesse les liens phylogénétiques entre souches par construction d'arbres générés à partir de la totalité des informations portées par le génome cœur (appelés « supertrees », ou « supergene trees »), et de caractériser les mécanismes responsables de l'évolution des génomes au sein de l'espèce (HGT, recombinaisons, mutations,...) (Brochet et al., 2008b; Touchon et al., 2009; Croucher et al., 2011). Malgré la révolution technologique apportée par les nouvelles méthodes de séquençage (Metzker, 2010), l'approche phylogénomique reste coûteuse et nécessite une expertise bioinformatique importante, ce qui la réserve actuellement à quelques équipes de recherche leader dans le domaine et appartenant à des grandes structures de recherche. Une approche alternative, appelée MLST (multilocus sequence typing) ou MLSA (multilocus sequence analysis), consiste à réaliser le séquençage partiel de plusieurs gènes du génome cœur (Maiden et al., 1998). Initialement développée pour l'étude des bactéries pathogènes (Maiden et al., 1998; Feil et al., 2001), elle a rapidement été étendue à de nombreuses espèces. La MLST permet de déterminer la structure des populations bactériennes, d'estimer la variabilité génétique intraspécifique, et de prédire partiellement le mode d'évolution des gènes (Feil et al., 1999). Elle permet également de déterminer avec robustesse les liens phylogénétiques entre souches en générant des topologies d'arbres congruentes aux topologies obtenues avec les génomes entiers (Konstantinidis et al., 2006b; Touchon et al., 2009). Ses avantages majeurs comparés à l'approche phylogénomique sont qu'elle permet l'analyse d'un très grand nombre de souches (près de 4000 isolats dans le cas de *Streptococcus pneumoniae*) et que les données sont facilement échangeables via internet. Elle ne donne cependant aucune information sur la variabilité génomique des souches étudiées.

Afin de mieux caractériser la diversité naturelle de *Lactococcus lactis*, nous avons initié une comparaison de sa variabilité génétique et génomique par 2 approches complémentaires, la MLST et l'électrophorèse en champs pulsés (PFGE) (article n°1). Les données antérieures, obtenues par comparaison de profils PCR (RAPD) ou de profils de restrictions (PFGE), indiquant que la sous-espèce *lactis* possédait une diversité plus étendue que la sous-espèce *cremoris* (Corroler et al., 1998; Tailliez et al., 1998; Mangin et al., 1999; Nomura et al., 2006), nous nous sommes limités à celle-ci.
Profanes en analyse MLST, nous avons été confronté à deux difficultés méthodologiques, d'une part quels étaient les meilleurs gènes candidats à cibler, et d'autre part quels outils statistiques utiliser pour tirer des informations pertinentes de cette analyse. Pour le premier point, l'analyse bibliographique montre que la majorité des schémas MLST publiés ne justifie pas le choix des loci et ne suit pas les recommandations établies pour la construction rationnelle d'un nouveau schéma (Urwin & Maiden, 2003), à savoir ; 1) l'utilisation d'une collection de souches caractérisées par d'autres méthodes de typage, 2) une sélection *a posteriori* des 5 à 7 loci du nouveau schéma à partir de l'analyse d'un nombre plus élevé de gènes candidats, et 3) l'optimisation de la localisation des oligonucléotides amorces pour l'amplification PCR et le séquençage (maximisation du nombre de SNPs, spécificité et qualité des séquences générées,...). Bien qu'une analyse MLST sur une centaine de souches de *L. lactis* ait été publiée en 2007 (Rademaker et al., 2007), le schéma ne semblait pas développé selon une démarche rationnelle. Nous avons donc construit un nouveau schéma prenant en compte de ces différentes règles et ciblant 6 loci. Ce schéma utilisé sur 32 souches a révélé 25 STs (Sequence Type) et deux complexes clonaux (ensemble des isolats possédant 5 allèles identiques sur les 6 loci séquencés). Pour le second point, il fut impossible de trouver dans la littérature une argumentation pertinente sur le choix des estimateurs statistiques utilisés. Nous avons donc réalisé une étude empirique de la robustesse des deux estimateurs les plus utilisés ; le pourcentage de sites variables ($p_s$, égal à $S/L$ ; S représentant le nombre de sites polymorphes dans l'échantillon, et L le nombre total de nucléotides dans la séquence) et la diversité nucléotidique ($\pi$, défini comme la moyenne du nombre de substitutions par site [$\eta/L$] entre 2 séquences de l'échantillon). Nous avons constaté que le calcul de $\pi$, avec la valeur de son écart-type, ainsi que la détermination du $\pi_{MAX}$ (valeur de $\pi$ entre les 2 séquences les plus divergentes de l'échantillon) permettait de révéler rapidement des biais d'échantillonnage (séquences chimères, erreurs taxonomiques,...), l'existence de lignées génétiques indépendantes, et l'étendue de la variabilité génétique de l'espèce.

L'ensemble de l'étude MLST a montré que la sous-espèce *lactis* était essentiellement clonale et possédait une variabilité génétique assez élevée, parfois équivalente à celle observée au niveau d'espèces. D'autre part, l'analyse phylogénétique semble révéler une séparation des souches autre que la séparation traditionnelle en souches laitières (isolées de lait, de produit laitiers fermentés, ou d'environnement laitiers) et non-laitières (isolées de plantes ou d'animaux). Nous postulons l'existence de deux types de souches dans cette sous-espèce :

- les souches « environnementales », responsables de la variabilité génétique observée pour la sous-espèce et capables de se développer sur différents substrats (plantes, animaux, et lait). Nous pensons que ces souches peuvent être majoritairement présentes dans le lait avant fermentation, mais qu'elles ne représentent qu'une population sous-dominante dans
les produits fermentés probablement parce qu'elles sont peu performantes pour une acidification rapide du lait.

- les souches « domestiquées », de faible variabilité génétique, capables de se développer rapidement dans le lait de manière à constituer la population bactérienne dominante dans les produits laitiers fermentés. Ces souches utilisées comme levain appartiendraient à une lignée génétique particulière issue d'un effet fondateur (genetic bottleneck) récent, probablement lié à l'utilisation d'un nombre limité de souches à partir du début du XXe siècle, période de généralisation de l'emploi de levains commerciaux pour la fabrication des produits laitiers (Hammer, 1921). Une sous-population de souches « domestiquées », génétiquement extrêmement homogène et correspondant essentiellement au biovar *diacetylactis*, serait issue d'un second effet fondateur lié à la sélection, à partir des années 60, de souches performantes pour une production à très grande échelle. La souche de référence IL1403 appartient à ce groupe et peut donc être considérée comme phylogénétiquement représentative des « souches industrielles ».

L'analyse des caractéristiques génomiques (taille du chromosome, contenu plasmidique, similarité des profils de restriction) par PFGE a montré une variabilité de 20% de la taille des génomes (15% pour les seuls chromosomes), une valeur caractéristique d'espèces bactériennes capables de coloniser plusieurs niches, suggérant ainsi un pangénome étendu pour la sous-espèce *lactis*. Il est à noter que plus de trois-quarts des souches étudiées possèdent un chromosome plus grand que celui de la souche IL1403. Son génome ne peut donc être considérée comme représentatif des capacités de codage génétique des souches de la sous-espèce. Plus remarquable, les caractéristiques génomiques ne corrèlent pas la phylogénie obtenue par MLST puisque des souches génétiquement proches (même complexe clonal), voire indistinguishables au niveau nucléotidique (même ST), peuvent avoir des profils de restriction PFGE très différents (0,40 < S<sub>D</sub> < 0,76 ; avec S<sub>D</sub> = pourcentage de fragment communs entre deux profils de restriction) et varier de près de 10% (230 kb) en taille de génome.

Le schéma MLST développé, ainsi que certains outils d'analyse statistique (calcul de π et π<sub>MAX</sub>), sont mis à la disposition de la communauté scientifique (http://www-mlst.biotoul.fr). Nous prévoyons d'implémenter le site avec d'autres espèces afin de regrouper les schémas disponibles pour les bactéries d'intérêt alimentaire, même si certains schémas sont déjà hébergés sur le site de l'Institut Pasteur (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/). Nous proposerons également des outils d'aide à la mise en place de nouveaux schémas MLST (approche « top-down).
<figure><img src="image_42.png" /></figure>

# Genes but Not Genomes Reveal Bacterial Domestication of *Lactococcus Lactis*

Delphine Passerini¹,², Charlotte Beltramo³, Michele Coddeville¹,², Yves Quentin¹,², Paul Ritzenthaler¹,², Marie-Line Daveran-Mingot¹,²*⁹, Pascal Le Bourgeois¹,²*⁹

¹ Université de Toulouse, Université Paul Sabatier, Toulouse, France, ² Laboratoire de Microbiologie et de Génétique Moléculaires, CNRS, Toulouse, France, ³ SOREDAB SAS, La Tremblaye, La Boissière-Ecole, France

## Abstract

**Background:** The population structure and diversity of *Lactococcus lactis* subsp. *lactis*, a major industrial bacterium involved in milk fermentation, was determined at both gene and genome level. Seventy-six lactococcal isolates of various origins were studied by different genotyping methods and thirty-six strains displaying unique macrorestriction fingerprints were analyzed by a new multilocus sequence typing (MLST) scheme. This gene-based analysis was compared to genomic characteristics determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE).

**Methodology/Principal Findings:** The MLST analysis revealed that *L. lactis* subsp. *lactis* is essentially clonal with infrequent intra- and intergenic recombination; also, despite its taxonomical classification as a subspecies, it displays a genetic diversity as substantial as that within several other bacterial species. Genome-based analysis revealed a genome size variability of 20%, a value typical of bacteria inhabiting different ecological niches, and that suggests a large pan-genome for this subspecies. However, the genomic characteristics (macrorestriction pattern, genome or chromosome size, plasmid content) did not correlate to the MLST-based phylogeny, with strains from the same sequence type (ST) differing by up to 230 kb in genome size.

**Conclusion/Significance:** The gene-based phylogeny was not fully consistent with the traditional classification into dairy and non-dairy strains but supported a new classification based on ecological separation between "environmental" strains, the main contributors to the genetic diversity within the subspecies, and "domesticated" strains, subject to recent genetic bottlenecks. Comparison between gene- and genome-based analyses revealed little relationship between core and dispensable genome phylogenies, indicating that clonal diversification and phenotypic variability of the "domesticated" strains essentially arose through substantial genomic flux within the dispensable genome.

**Citation:** Passerini D, Beltramo C, Coddeville M, Quentin Y, Ritzenthaler P, et al. (2010) Genes but Not Genomes Reveal Bacterial Domestication of *Lactococcus Lactis*. PLoS ONE 5(12): e15306. doi:10.1371/journal.pone.0015306

**Editor:** Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, India

**Received** September 15, 2010;

Accepted November 5, 2010;

Published December 17, 2010

**Copyright:** © 2010 Passerini et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

**Funding:** This work was carried out with the financial support of the « ANR- Agence Nationale de la Recherche - The French National Research Agency » under the « Programme National de Recherche en Alimentation et nutrition humaine », project « ANR-05-PNRA-20, Génoferment ». D. Passerini was supported by a fellowship from the Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

**Competing Interests:** The authors have declared that no competing interests exist.

* E-mail: pascal.lebourgeois@biotoul.fr (PLB); marie-line.mingot@biotoul.fr (MLDN)

9 These authors equally contributed to the work.

## Introduction

The massively increasing amount of genomic data becoming available is raising questions about the classical view of bacterial species, particularly in terms of gene content. Beginning with the pioneering observation of Lan & Reeves [1], it is now established that sequencing a single genome fails to describe the genetic content of the species, and intraspecies variation needs to be considered to gain insight into the full "species genome". This genome, alternatively named the pan-genome, is composed of a core genome made up of genes ubiquitously present in all strains of a given species, and a dispensable genome containing genes found only in single strains or particular lineages. Depending on the species and the number of strains sequenced, the core genome only represents from 40% to 80% of a single genome,

and the pan-genome may be almost 4 times the size of a genome in a single strain [2–5]. Understanding the extent of the genetic diversity within a species should help the choice of strains to be sequenced for pan-genome characterization. A powerful method for population genetic studies is multilocus sequence typing (MLST) [6], a method based on the sequencing of a limited number (generally five to seven) genes of the core genome. MLST outperforms restriction- or other PCR-based typing methods, because it provides information about key features of the evolutionary history, the population structure, and long-term epidemiology of bacterial species [7,8]. Although MLST has been principally used to study the major bacterial pathogens, several recent MLST schemes have been developed for lactic acid bacteria (LAB), the most important group of microorganisms used for food processing, including the species *Lactobacillus*

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*plantarum* [9], *Lactobacillus casei* [10,11], *Oenococcus oeni* [12], and *Streptococcus thermophilus* [13].

*Lactococcus lactis* is the major LAB species used in milk fermentation, a preservation process probably first developed in the Early Neolithic [14]. This type of fermentation involving natural starters has been used empirically at a small scale for thousands of years, through the practice of back-slopping. Industrial scale fermentation started in the early-20th century with the use of defined single- and multiple-strain commercial starters [15]. *L. lactis* is a microorganism that is generally recognized as safe (GRAS), and is also now used as a cell factory for production of recombinant proteins [16], and as a therapeutic drug delivery vector [17,18]. Taxonomically, it is a mesophilic Gram-positive species related to the *Streptococcaceae* [19]; it is subdivided into three subspecies, *L. lactis* subsp. *hordniae*, *L. lactis* subsp. *lactis* (including the biovar *diacetytlactis*), and *L. lactis* subsp. *cremoris*. The two latter subspecies differ by less than 0.7% in their 16S rDNA sequences [20] but display an average of only 85% DNA identity at the genome level [21], a value slightly higher than that between *Escherichia coli* and *Salmonella typhimurium* [22]. *L. lactis* subsp. *lactis* is found in various environments including animal sources, dairy products and plant surfaces [23,24], whereas the subspecies *cremoris* is only isolated from raw milk and dairy products [24,25], with few exceptions [26,27]. This ability of *L. lactis* subsp. *lactis* to colonize a larger ecological niche is associated to a greater genomic diversity, as revealed by DNA-fingerprinting analyses including random amplification of polymorphic DNA (RAPD) and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE): subspecies *lactis* strains are spread across many clusters whereas subspecies *cremoris* strains are grouped in a small number of closely related clusters [24,28,29]. Dairy strains of both subspecies tend to display lower diversity than non-dairy strains [26,30,31]. The sole MLST scheme reported to date for *L. lactis* analyzed the nucleotide variability at five genetic loci of 89 *L. lactis* subsp. *lactis* and *L. lactis* subsp. *cremoris* isolates [31] and substantiated these previous observations. However, this study gave little information about the population structure and gene diversity/evolution of the species.

We report an analysis of the diversity of *L. lactis* subsp. *lactis* strains at both gene (MLST) and genome (PFGE) levels. Seventy-six lactococcal isolates were analyzed by various molecular typing methods to validate a collection of 36 strains. A new MLST scheme was constructed using a rational “top-down” approach, and the population structure, the genetic diversity, and a gene evolution model were estimated for this subspecies. Genome characteristics, including chromosome size and plasmid content, and genomic relatedness were estimated by PFGE analysis. The findings are informative about the origin and the ecology of the strains analyzed.

## Results

### Methodological considerations about bacterial genetic diversity

MLST is currently considered to be the gold standard method for studying strain relationships and the population structure of bacteria [7]. Though dozens of MLST schemes have been developed to date, many of them do not follow the good practices for the rational development of MLST schemes [32], such as appropriate initial population sampling, rational choice of the genetic loci to be characterized, and use of suitable statistics (referred in this study as the quantity calculated from a set of data) for a robust estimation of genetic diversity.

### Methodological considerations: 1) Constitution of the *L. lactis* subsp. *lactis* sample collection

Exploration of bacterial diversity by MLST requires the use of an appropriate strain collection validated by different genotyping methods. We therefore obtained 76 isolates from several public and industrial collections and used various phenotypic (ability to grow in milk or to utilize lactose) and genotypic (ribotyping, ARDRA, and partial 16S rDNA sequencing) methods to study them. Eighteen strains were discarded from the analysis because they presented ARDRA and/or ribotyping results that were either ambiguous or inconsistent with an affiliation to the *L. lactis* subsp. *lactis* group. Indeed, partial 16S rDNA sequencing (data not shown) revealed that these strains belonged either to the *cremoris* subspecies or to genera other than *Lactococcus* (*Enterococcus faecalis*, *Enterococcus pseudoavium*, *Lactobacillus casei*, and *Leuconostoc citreum*). The remaining 57 strains were subjected to *SmaI*-macrorestriction analysis by PFGE; an additional 21 strains were thereby excluded because they displayed a macrorestriction fingerprint identical to that of strains already selected for the collection. This observation enlightens strain redundancy that may exist in laboratory collections, probably because these collections are mostly constituted from phenotypic characterizations. Moreover, the PFGE analysis not only confirmed the close genomic relationships between known pairs of strains (IL594 and its plasmid-free derivative IL1403 [33], S86 and its [Lac]⁻ spontaneous derivative S86-B), but also identified unexpected close relatedness between some other pairs of strains, such as LD01/LD02 and UCMA5713/UCMA5733. As strains of each pair differed by only one *SmaI* fragment identified as the lactose plasmid (by Southern-hybridization against the *lacE* gene carried on the lactose plasmid [34]), the pairs presumably correspond to [Lac] variants of the same strains. Thus, the bacterial collection validated for this study consisted of 36 strains displaying different *SmaI* macrorestriction patterns (pulsotype). Twenty-three of the strains originated from dairy environments, such as milk, fermented products, or starter strains, and 13 strains had been isolated from various non-dairy environments, including plants, animal skin, and sourdough bread (Table S1, provided as supplementary material).

### Methodological considerations: 2) Rational development of a MLST scheme for lactococcal population study

Some of the criteria for the choice of the gene set have changed since the first proposals of MLST schemes. For instance, targeting only housekeeping genes emerged as optional [35], whereas choosing loci that follow the same evolutionary route (i.e. displaying congruent tree topology) may be essential to minimize noise when extracting phylogenetic signals from concatenated sequences [36]. According to good practice for the rational development of a MLST scheme [32], we developed a new lactococcal MLST scheme using a four-step “top-down” approach. First, 33 loci were evaluated by *in silico* analysis using publicly available lactococcal nucleotide sequences, with emphasis on DNA polymorphism, chromosomal distribution, and gene paralogy. These loci were either markers commonly used in other eubacterial MLST schemes, including the five loci used for the previous *L. lactis* MLST scheme (*atpA*, *bcaT*, *pepN*, *pepXP*, and *rpoA*) [31], or indicators of the overall rate of genome divergence between bacterial species (*recN*, *glyA*, and *metS*[*metG*]) [37].

Fourteen loci (*bcaT*, *glyA*, *pgk*, *dprA*, *pfk*, *comX*, *metS*, *mutX*, *rpoA*, *recN*, *tkt*, *pepXP*, *pdp*, and *xerS*) fulfilling the above criteria were selected for the second step of the analysis: the determination of the entire DNA sequences of these genes in a subset of 13 strains of the collection displaying various levels of genomic diversity as

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assessed by PFGE analysis (data not shown). Five loci were rejected following this analysis: three loci (*comX*, *mutX*, and *xerS*) gave sequence data of too short length or of poor quality, one (*rpoA*) provided only a weak phylogenetic signal with only three SNPs among the 13 strains, and one (*metS*[metG]) did not clearly separate the *lactis* and *cremoris* subspecies. The findings for the *metS*[metG] marker support the recent observation that some genes encoding aminoacid-tRNA synthetases, though belonging to the core of the minimum bacterial gene set [38,39], may be horizontally transferred between species or subspecies [31,40,41].

The third step of the MLST scheme design consisted of selecting the most polymorphic region of ≈500 bp in length for each of the nine loci selected, and determining the sequence of this region in each strain of the entire validated collection, excluding one strain from each parent/derivative pair (Table S1). For each locus, the quality of the phylogenetic signal was investigated by split decomposition analysis [42], a method allowing the visualization of conflicting signals in phylogenetic studies by representing incompatibilities between data as networks. Five loci (*pepXP*, *recN*, *pdp*, *pgk*, and *glyA*) gave classical tree-like structures, whereas three loci (*dprA*, *pfk*, and *bcaT*) gave little network-like structures (Fig. S1, provided as Supporting Information). In contrast, the *tkt* locus displayed a split-network arrangement typical of phylogenetic incompatibilities within data (Fig. S1) and was rejected from the scheme. Comparative analysis with four different lactococcal genomes revealed that *tkt* flanked a genomic island (data not shown), a chromosomal position prone to intragenic recombination leading to phylogenetic incongruence among *Escherichia coli* strains [5].

Finally, the MLST scheme was optimized to give the best compromise between a small number of loci to sequence and a large number of sequence types (STs) generated. With 10 to 13 alleles per locus, the combination of the eight loci selected allowed 26 STs to be distinguished among the 32 strains analyzed. As the five loci displaying no conflicting trees were uniformly distributed on the three sequenced genomes (data not shown), they were used as the backbone for the MLST scheme. This five-locus scheme generated 23 STs and addition of *dprA*, *pfk*, or *bcaT* loci individually generated 24, 25, and 25 STs respectively, whereas only the simultaneous addition of *pfk* and *bcaT* increased the number of STs to 26. These observations allowed the rejection of the *dprA* locus from the scheme. In addition, the *pfk* and *bcaT* loci are located only 51 kbp apart in the three sequenced genomes, and the phylogenetic tree generated by the concatenated sequence from the six-locus scheme did not change either its topology or its robustness relative to the seven-loci tree (data not shown); consequently, the *pfk* locus was removed from the scheme.

In conclusion, the new MLST scheme targeted six loci uniformly distributed along the chromosome (Fig. S2, provided as Supporting Information) and displaying little phylogenetic inconsistency: three housekeeping genes (*glyA*, *pgk*, and *pdp*), two catabolic genes (*bcaT*, and *pepXP*) genes, and one gene of the SOS regulon (*recN*). Note that two of these loci (*recN* and *glyA*) belong to the gene set identified as the best predictors of whole-genomes relatedness [37], whereas only two loci described in the previous lactococcal MLST scheme [31], *bcaT* and *pepXP*, were retained. The new MLST scheme allowed 25 ST to be distinguished among the 32 strains analyzed.

### Methodological considerations: 3) choice of appropriate statistics for genetic diversity estimation

Survey of MLST studies showed that several statistics are used, sometimes with redundancy, to estimate the bacterial genetic diversity. In addition, many studies compare the level of genetic

diversity between bacterial species although the loci selected for each MLST scheme are generally different and may have diverse evolutionary rates. Therefore, selecting which statistic to use for estimation of bacterial gene diversity level is not a trivial task since no comparative study has been performed to date. We analyzed the robustness of two statistics most commonly used in MLST studies -the percentage of variable sites and the nucleotide diversity ($\pi$, [43])- using concatenated DNA sequences obtained from MLST data of several bacterial species (Table 1). The maximal nucleotide diversity ($\pi_{MAX}$), defined as the number of nucleotide differences per site between the two most divergent sequences within the population, was also included (Table 1). The sensitivity of these statistics to the sample size was estimated by calculating their values both from all available STs and then from a random sample of 25 STs (the size of our ST sample). As isolate redundancy within each ST cannot be exclude in absence of complementary genotypic characterization, this analysis was performed using only one sample from each ST (non redundant STs).

As expected [44], the percentage of variable sites was found to be very sensitive to the sample size and it rapidly reached large values, close to site saturation and without biological meaning, as the sample size increased (n>500). This behavior illustrates how the use of this statistic to estimate DNA polymorphism in MLST studies may be misleading. By contrast, the nucleotide diversity ($\pi$) was only slightly affected by the sample size. However, it was found strongly affected by the set of loci selected, as illustrated by the significant ($p<0.0001$, Welch's test) differences between $\pi$ values found when comparing the two MLST schemes developed for the *Acinetobacter calcoaceticus* - A. baumannii (*Acb*) complex [45,46]. This indicates that $\pi$ is inappropriate for comparing genetic diversity between bacterial species, unless using the same MLST scheme. In addition, $\pi$ displayed high standard deviation values for some species, especially when the sample size was small (see for instance the values computed for 25 STs in *Enterococcus faecium* or *Acb* complex, Table 1). This statistic gives a global characterization of gene diversity and does not reveal sampling biases, such as errors in datasets (e.g. chimeric sequences or taxonomically misclassified isolates) or non-uniform population structures (e.g. the existence of independent genetic lineages within a species). These sampling biases were easily revealed by the maximal nucleotide diversity ($\pi_{MAX}$), which is not directly sensitive to sampling size but only to the extreme values of sequence divergence, and by calculating the maximal to average pairwise nucleotide differences ratio ($\pi_{MAX}/\pi$). For most species, this ratio was between 1.97 and 5.62, even for species known to contain several genetic lineages, for example *Listeria monocytogenes* [47]. In contrast, four species (*Streptococcus pneumoniae*, *Staphylococcus aureus*, *Enterococcus faecalis*, and *E. faecium*) displayed ratios of between 8.25 and 22.65, with $\pi$ values generally higher than 10%. Phylogenetic trees computed with ST sequences from these species (data not shown) revealed that only few STs (less than 4% of the population) contributed to these high values, such that the values fell to become similar to those for other species after removal of these “outlier” STs. For instance, $\pi_{MAX}$ value for *E. faecalis* dropped from 7.53% ($\pi_{MAX}/\pi$ ratio = 10.31) to 1.71% ($\pi_{MAX}/\pi$ ratio = 2.34) after removal of ST80, a chimeric ST made of *E. faecalis* and *E. faecium* sequences (data not shown). Similar chimeric STs also explained the aberrant values found for *E. faecium* (data not shown). This analysis led us to conclude that only $\pi$ with its standard deviation, and $\pi_{MAX}$ statistics were appropriate for estimating intraspecific genetic diversity of data samples and for detecting particular population structures or sample biases. In addition, it led us to assume that $\pi_{MAX}$ might be suitable for

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<table><caption>**Table 1.** Study of some statistics used to measure gene diversity according to the size and the population structure of strain samples.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Species</th><th rowspan="2">n<sup>a</sup></th><th colspan="2">% of variable sites</th><th colspan="2">π<sup>b</sup> (%)</th><th colspan="2">π<sub>MAX</sub> (%)</th><th rowspan="2">π<sub>MAX</sub>/π ratio<br>(Pop.)</th></tr><tr><th>(Pop.)</th><th>(25 STs)</th><th>(Pop.)</th><th>(25 STs)</th><th>(Pop.)</th><th>(25 STs)</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>S. pneumoniae</i></td><td>3913</td><td>44.38</td><td>6.43</td><td>1.07</td><td>1.15±0.14</td><td>16.21 (5.05)<sup>c</sup></td><td>3.09</td><td>15.15 (4.71)<sup>c</sup></td></tr><tr><td><i>S. aureus</i></td><td>1557</td><td>30.98</td><td>4.75</td><td>0.78</td><td>0.89±0.06</td><td>17.67 (3.50)<sup>d</sup></td><td>1.75</td><td>22.65 (4.49)<sup>d</sup></td></tr><tr><td><i>H. pylori</i></td><td>1120</td><td>49.91</td><td>15.67</td><td>4.11±0.02</td><td>3.88±0.12</td><td>8.11</td><td>5.70</td><td>1.97</td></tr><tr><td><i>H. influenzae</i></td><td>672</td><td>19.33</td><td>9.68</td><td>2.40±0.04</td><td>2.46±0.21</td><td>5.50</td><td>4.58</td><td>2.29</td></tr><tr><td><i>B. cereus</i></td><td>544</td><td>26.29</td><td>13.68</td><td>4.40±0.07</td><td>4.26±0.17</td><td>10.53</td><td>6.08</td><td>2.39</td></tr><tr><td><i>E. faecium</i></td><td>521</td><td>19.46</td><td>14.86</td><td>1.60±0.11</td><td>2.23±0.78</td><td>13.22 (4.16)<sup>e</sup></td><td>3.85</td><td>8.25 (2.6)<sup>e</sup></td></tr><tr><td><i>S. uberis</i></td><td>387</td><td>6.62</td><td>2.24</td><td>0.61±0.01</td><td>0.66±0.04</td><td>1.59</td><td>1.21</td><td>2.61</td></tr><tr><td><i>S. zooepidemicus</i></td><td>228</td><td>14.00</td><td>7.79</td><td>2.47±0.05</td><td>2.51±0.14</td><td>8.33</td><td>4.49</td><td>3.37</td></tr><tr><td><i>E. faecalis</i></td><td>261</td><td>12.35</td><td>2.73</td><td>0.73±0.05</td><td>0.65±0.03</td><td>7.53 (1.71)<sup>f</sup></td><td>0.99</td><td>10.31 (2.34)<sup>f</sup></td></tr><tr><td><i>S. pyogenes</i></td><td>209</td><td>10.11</td><td>3.92</td><td>0.75±0.02</td><td>0.75±0.05</td><td>2.01</td><td>1.44</td><td>2.68</td></tr><tr><td><i>E. coli</i></td><td>197</td><td>19.24</td><td>10.57</td><td>2.82±0.05</td><td>2.95±0.13</td><td>6.35</td><td>4.25</td><td>2.25</td></tr><tr><td><i>S. suis</i></td><td>170</td><td>25.35</td><td>13.50</td><td>3.23±0.11</td><td>2.85±0.32</td><td>9.24</td><td>7.17</td><td>2.86</td></tr><tr><td><i>L. monocytogenes</i></td><td>161</td><td>18.43</td><td>10.21</td><td>3.61±0.21</td><td>3.53±0.33</td><td>11.53</td><td>7.39</td><td>3.19</td></tr><tr><td><i>Acb complex (pubMLST.org)</i></td><td>137</td><td>20.98</td><td>10.98</td><td>1.94±0.09</td><td>1.87±0.35</td><td>10.92</td><td>7.11</td><td>5.62</td></tr><tr><td><i>Acb complex (Pasteur.fr)</i></td><td>84</td><td>19.89</td><td>17.57</td><td>3.21±0.56</td><td>2.76±1.01</td><td>11.49</td><td>11.49</td><td>3.57</td></tr><tr><td><i>S. thermophilus</i></td><td>84</td><td>5.03</td><td>3.77</td><td>0.57±0.03</td><td>0.64±0.08</td><td>1.83</td><td>1.83</td><td>3.21</td></tr><tr><td><i>V. vulnificus</i></td><td>81</td><td>10.79</td><td>7.76</td><td>2.32±0.04</td><td>2.33±0.35</td><td>3.96</td><td>3.85</td><td>1.70</td></tr><tr><td><i>S. oralis</i></td><td>77</td><td>27.94</td><td>22.51</td><td>6.46±0.26</td><td>6.40±0.44</td><td>11.18</td><td>10.44</td><td>1.73</td></tr><tr><td><i>C. difficile</i></td><td>50</td><td>5.04</td><td>4.61</td><td>0.64±0.15</td><td>0.72±0.21</td><td>3.31</td><td>3.27</td><td>5.17</td></tr><tr><td><i>S. agalactiae</i></td><td>46</td><td>2.23</td><td>1.85</td><td>0.50±0.02</td><td>0.49±0.03</td><td>1.04</td><td>0.98</td><td>2.08</td></tr><tr><td><i>F. psychrophilum</i></td><td>33</td><td>1.79</td><td>1.64</td><td>0.53±0.03</td><td>0.55±0.04</td><td>0.91</td><td>0.91</td><td>1.71</td></tr><tr><td><i>L. casei (Pasteur.fr)</i></td><td>32</td><td>1.99</td><td>1.96</td><td>0.39±0.02</td><td>0.40±0.02</td><td>0.68</td><td>0.68</td><td>1.74</td></tr></tbody></table>

comparing genetic diversity between bacterial species, even if estimated from different MLST schemes.

## Lactococcal strains involved in milk processing clustered in two clonal complexes

Twenty-two of the 25 STs included only single strains and the other three STs contained between two and seven strains (Table S1), with the most represented ST (ST6) including the reference strain IL1403 (with its parent IL594), LD01 (with its derivative, LD02), LD61 [48], LD90, and LD42. Genetic lineages in *L. lactis* subsp. *lactis* were identified by eBURST analysis [49], with clonal complex defined as group of STs sharing five of the six loci, and ancestor ST of each clonal complex defined as the ST with the highest number of neighboring STs (single locus variants, SLV). The 25 STs were distributed in 14 unique ST (singletons) and two clonal complexes (Fig. 1). The major clonal complex (CC1) included nine STs (corresponding to 20 strains) with ST15 identified as the ancestor genotype, whereas the second complex (CC2) comprised only two STs. A good correspondence was observed between strain origin and ST clustering, since the two clonal complexes (CC1 and CC2) contained only strains involved in milk processing (isolated from fermented products, or used as starters), with the exception of strains UCMA5713 and its [Lac]⁻

variant UCMA5733. A dairy origin was, however, strongly suspected for these two UCMA strains because both were isolated from grassland close to a dairy factory (N. Desmasure, personal communication); also, strain UCMA5713 rapidly ferments milk (data not shown) and contains both *lacE* and *prtP* genes (Table S1). In contrast, eleven of the 14 singletons corresponded to non-dairy strains. Relaxing the parameters for lineage definition to double-locus-variants (DLV, defined as STs sharing 4/6 loci) resulted in the merging of only three STs into a single group (ST11, ST13 and ST19, Fig. 1). The remaining 11 STs differ from each other by three to six loci, suggesting high level of genetic diversity among the corresponding isolates.

## Strains from the same ST reveal unexpected genome plasticity

The small contribution of homologous recombination to gene and genome evolution (see below) allowed strain relatedness to be assessed by classical tree-based phylogenetic analysis [42]. We used the neighbor-joining method [50] with concatenated sequences (2,934-bp) of the six loci (Fig. 2a). This analysis revealed that STs corresponding mainly to strains involved in milk processing (i.e. STs from CC1, CC2, and ST12) formed a genetic lineage distinct from other STs (bootstrap value 90%) and split in two clusters (G1

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

<footnote><sup>a</sup>: Number of different STs in the population studied.</footnote>

<footnote><sup>b</sup>: Standard deviation (SD) values from datasets containing more than 1500 STs were not calculated due to the limitations of the DnaSP software.</footnote>

<footnote><sup>c</sup>: New π<sub>MAX</sub> value and π<sub>MAX</sub>/π ratio after removal of 7 STs are indicated in parentheses.</footnote>

<footnote><sup>d</sup>: New π<sub>MAX</sub> value and π<sub>MAX</sub>/π ratio after removal of 17 STs are indicated in parentheses.</footnote>

<footnote><sup>e</sup>: New π<sub>MAX</sub> value and π<sub>MAX</sub>/π ratio after removal of 22 STs are indicated in parentheses.</footnote>

<footnote><sup>f</sup>: New π<sub>MAX</sub> value and π<sub>MAX</sub>/π ratio after removal of ST80 are indicated in parentheses.</footnote>

<footnote>doi:10.1371/journal.pone.0015306.t001</footnote>
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 1.** *eBURST* analysis of 32 *L. lactis* subsp. *lactis* strains. White circles correspond to dairy strains, and black circles to non-dairy strains. The size of the circles is proportional to the number of strains belonging to each ST (indicated in brackets). Clonal complexes (CC) are indicated in gray. Solid lines link SLV (Single Locus Variant, i.e. STs sharing five of the six loci). Dotted lines link DLV (Double Locus Variant, i.e. STs sharing four of the six loci). The ST15 is predicted to be the ancestor genotype of the major CC.
doi:10.1371/journal.pone.0015306.g001</figcaption></figure>

and G2, bootstrap value 99%). Except for the two strains isolated from animal skin (ST13 and ST19), which grouped together with one strain isolated from milk (ST11), the remaining STs corresponding to strains isolated from plants or raw milk showed no tendency to cluster. However, the genetic distance within the subspecies was far below the distance observed between *lactis* and *cremoris* subspecies, as assessed by including the corresponding 2,934-bp sequences of the two sequenced *cremoris* strains, MG1363 [21] and SK11 [51] (Fig. 2b). This strongly supports the notion that subspecies *lactis* and *cremoris* indeed constitute two distinct genetic lineages that presumably diverged a long time ago [21,52].

The genome relatedness of the 36 strains was estimated by computing Dice coefficients ($S_D$) from pairwise comparisons of SmaI-macrorestriction patterns obtained by PFGE (Fig. S3a, provided as Supporting Information). Two-thirds of the strains (23/36) displayed values ($S_D$<0.6) typical of unrelated strains [53,54], with 55% of these values being between 0.11 and 0.35, the range observed when comparing the subspecies *cremoris* MG1363 strain to any subspecies *lactis* strain in the collection (yellow, Fig. S3a). This large diversity in genome fingerprints impeded robust UPGMA-based strain clustering, as no internal node was found to be significant when performing a bootstrap analysis (data not shown). Nevertheless, strains involved in milk processing were clearly separated from the other strains (compare Fig. 3 and Fig. S3b). However, strains belonging to the same ST were not necessarily clustered together, as fingerprints displayed unexpectedly low $S_D$ values (0.44<$S_D$<0.76 for strains belonging to ST6, $S_D$<0.48 for strains belonging to ST15, and $S_D$ = 0.4 for those from ST9, Fig. S3a). Since PFGE essentially monitors genome rearrangements rather than mutations, such $S_D$ values strongly suggest high variability either in genome organization (for

instance through rearrangements such as large inversions), or in genome content (through insertions/deletions of mobile genetic elements such as phages, ICEs, genomic islands etc.) within the subspecies *lactis*.

## *L. lactis* subsp. *lactis* is essentially clonal and displays low rate of recombination

We measured intergenic recombination by estimating the linkage disequilibrium between the six loci, using the standardized index of association statistic, $I_A^S$ [55]. To minimize linkage disequilibrium introduced by sampling bias or recent expansion of adaptive genotypes [56], only one sample from each ST was analyzed. A significant linkage disequilibrium was found when considering either the 25 STs of the collection ($I_A^S$ = 0.387, $p$<0.001) or the 14 singletons ($I_A^S$ = 0.1214, $p$<0.01), but not when grouping the STs from CC1 and CC2 ($I_A^S$ = 0.055, $p$ = 0.198); this indicates that *L. lactis* subsp. *lactis* is essentially clonal. The intragenic recombination was estimated by empirical calculation of the per site ratio of recombination to mutation (r/m) statistic, which gives the relative probability that an individual nucleotide site will change by recombination or mutation [57]. Briefly, this method compares allelic variation from the ancestral ST to the SLV belonging to the clonal complex. If the variant allele differs by one SNP from the ancestral sequence, with this SNP not found in other ST, the nucleotide difference is counted as a point mutation (m), and if the variant allele either differs from the ancestral sequence by several SNPs, or is found in unrelated ST(s), these different nucleotides are considered originating from a recombination event (r). Three loci (*bcaT*, *pgk*, and *recN*) displayed allelic variation within the CC1 (Table S1), with eight allelic changes from the ancestor sequence (ST15) corresponding to 14

<figure><img src="image_48.png" /></figure>
<figure><img src="image_49.png" /></figure>

**Figure 2. Phylogenetic relationships between lactococcal strains.** The unrooted neighbor-joining tree (bootstrap 1000, Kimura 2-parameter model) was constructed from the 2,934-bp concatenated DNA sequences of the six loci. a) Tree constructed from the 32 subspecies *lactis* strains. b) Same tree after addition of the concatenated sequences from two subspecies *cremoris* strains. Only bootstrap values >80% are indicated. Open and closed circles correspond to dairy strains and non-dairy strains, respectively. The phylogenetic position of the recently sequenced strain KF147 [69] is indicated by an asterisk. This strain differs from strain NCDO2118 (ST25) by only one SNP.
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SNPs (Fig. S4). Four SNPs could be assigned to point mutations whereas ten SNPs were considered to have occurred by recombination, giving a per site r/m ratio of 2.5:1, a low value for a bacterial species [10,36]. The main contributor for recombination events was *pgk*. Note that alleles 7 and 8 of this locus are closer to alleles 11 and 13 present in CC2 than to any allele present in CC1 (Fig. S4). Consequently, genetic variations at this locus may be responsible for the discrepancies in strain classifications observed between the allele- (eBURST, Fig. 1) and nucleotide-based (phylogenetic tree, Fig. 2a) methods. Both inter- and intragenic recombination tests, as well as the observation that only two loci (*tkt* and *metS*) displayed phylogenetic incompatibil- ities, among the 10 loci selected for the MLST scheme design, suggest that recombination may have happened, but has not played a major role in *L. lactis* subsp. *lactis* evolution.

## Gene diversity and evolution of lactococcal strains

We calculated the nucleotide diversity at each locus in *L. lactis* subsp. *lactis* (Table 2); it was from 0.66% for *bcaT* and *pepXP*, to 1.1% for *glyA*, with $\pi_{MAX}$ ranging from 1.87% (*pgk*) to 3.07% (*recN*). These values confirmed the different evolution rates of the genes used in the new MLST scheme. In addition, the $\pi$ values for *glyA* and *recN*, two loci whose variability is strongly correlated to the overall genome pair variability [37], were very close to the value obtained for concatenated sequences (see below). This validated the new MLST scheme as representative of the core genome relatedness within the subspecies *lactis*. We computed $\pi$ and $\pi_{MAX}$ from the concatenated sequences of the six loci: they

were 0.82% (±0.1%) and 2.01%, respectively (Table 2). This $\pi_{MAX}$ value falls within the range of values calculated for several species including *S. aureus* and some *Streptococci* (Table 1). However, the diversity was distributed unequally between strains of different origins, with strains involved in milk processing (cluster G1+G2) displaying almost fivefold lower diversity than other strains (Table 2). Thus, the non-dairy strains are the essential contributors to the genetic diversity within the subspecies. Inclusion into the analysis of DNA sequences from the subsp. *cremoris* strains MG1363 and SK11 not only raised the $\pi$ and $\pi_{MAX}$ values to 2.44% and 12.4% respectively, but also increased the $\pi$ standard deviation to 0.98%, a value considered to be characteristic of highly divergent sequences (Table 1). These results strongly support the idea of the early separation of subspecies *lactis* and *cremoris* into two independent genetic lineages as suggested by the phylogenetic tree (Fig. 1b). Indeed, they indicate that the two subspecies should be analyzed separately in MLST studies.

A gene evolution model is generally established from MLST studies by computing the *dN/dS* ratio (ratio of the number of non-synonymous changes per non-synonymous site to the number of synonymous changes per synonymous sites). However, it has been demonstrated that the *dN/dS* ratio is not appropriate for inferring selection pressures from single bacterial populations, in which most differences between sequences represent segregating polymorphism rather than fixed substitutions, as assumed by the model [58]. Therefore, we developed a gene evolution model using the less controversial statistical tests of neutrality, such as the Tajima's *D* test [44], and the coalescent-based Fu & Li's *D* and *F* tests [59]. As substantial evidence indicates the separation of *cremoris* and *lactis*

<figure><img src="image_50.png" /></figure>
<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure 3.** Comparison of gene-based phylogeny, strain origins, and genome properties. The genome features (chromosome/plasmid content size, presence of genes of industrial importance) of the 36 *L. lactis* subsp. *lactis* strains are compared to MLST-based strain relatedness. From left-to-right: neighbor-joining tree of the 36 strains, strain name; strain origin (color code: green = plant, brown = animal skin, white = milk, red = starter strains, black = cheese, unmarked = uncertain origin); genetic groups determined from the NJ tree; clonal complexes determined by eBURST; ST numbering; presence of *citP* gene (red dot), *lacE* gene (blue diamond), and *prtP* gene (green triangle); chromosome (black rectangles) and plasmid content (white rectangles) sizes. Derivative strains are indicated by an asterisk. The two dashed red lines indicate mean chromosome and genome size, respectively.</figcaption></figure>

doi:10.1371/journal.pone.0015306.g003

subspecies into two genetic lineages, the requirement of Fu & Li's *D* and *F* test for an outgroup sequence [59] could be fulfilled using DNA sequences from the subsp. *cremoris* strain MG1363. All three tests gave values that did not significantly deviate from zero (*p*>0.05, Table 2), indicating that the six loci evolved by random genetic drift.

## Genome properties are unrelated to strain origin or gene-based phylogeny

Although the first lactococcal genome sequence available was of a strain belonging to subspecies *lactis* [60], little is known about

genome variability in this subspecies. In addition, previous analyses essentially focused on dairy strains [53,61] and no information is available for strains of other origins. To estimate the extent of genome size differences between strains, and the contribution of plasmids and the chromosome to this genome size variation, various PFGE analyses were performed. Each strain contained from one to ten plasmids ranging from 2.2 kb to 120 kb in size (data not shown), making up 1% (35 kb, strain NCDO2118) to 12% (329 kb, strain UCMA5713) of the total genome (Table S1). Plasmid genetic markers determining metabolic properties

<figure><img src="image_52.png" /></figure>
<table><caption>**Table 2.** Gene diversity and evolution among *L. lactis* subsp. *lactis* strains.</caption><thead><tr><th>Sequence</th><th>π (%)</th><th>π<sub>MAX</sub> (%)</th><th>Tajima's D</th><th>Fu & Li's D<sup>a</sup></th><th>Fu & Li's F<sup>a</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>Locus</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bcaT (516 bp)</td><td>0.66±0.15</td><td>2.51</td><td>-1.783 #</td><td>-2.116 #</td><td>-2.436 #</td></tr><tr><td>glyA (453 bp)</td><td>1.10±0.17</td><td>2.87</td><td>-0.672</td><td>-0.055</td><td>-0.281</td></tr><tr><td>pdp (492 bp)</td><td>0.82±0.14</td><td>2.85</td><td>-1.233</td><td>-2.125 #</td><td>-2.270 #</td></tr><tr><td>pepXP (504 bp)</td><td>0.67±0.16</td><td>2.58</td><td>-0.731</td><td>0.682</td><td>0.298</td></tr><tr><td>pgk (480 bp)</td><td>0.74±0.06</td><td>1.87</td><td>0.110</td><td>-0.736</td><td>-0.558</td></tr><tr><td>recN (489 bp)</td><td>0.95±0.15</td><td>3.07</td><td>-1.384</td><td>-1.367</td><td>-1.577</td></tr><tr><td>Concatenated sequence (6 loci, 2934 bp)</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 STs</td><td>0.82±0.10</td><td>2.01</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>12 STs (cluster G1+G2)</td><td>0.23±0.03</td><td>0.40</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>13 STs (other)</td><td>0.99±0.12</td><td>2.01</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

#, 0.05<p<0.1 (two tailed test)

ª, DNA sequences from the *cremomis* strain MG1363 were used as outgroup.

-, Not Determined.

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important for dairy product manufacture, such as lactose (*lacE* gene) or casein catabolism (*prtP* gene), and citrate utilization (*citP* gene), were assigned to particular plasmids by Southern hybridization (Fig. 3, and Table S1). The two strains isolated from animal skin (NCDO2633 and NCDO2146) contained a copy of the *lacE* gene, but all other non-dairy strains had none of these markers. Among the dairy strains, nearly half (10/22) contained *prtP* and *lacE*, and the others either contained *prtP* (2/22) or *lacE* (6/22) alone, or neither (4/22). Therefore, although these two markers were generally associated with dairy strains, neither allowed unambiguous identification of strain origin. Strains containing the *citP* gene were grouped in three STs (ST6, ST15, and ST16) of the clonal complex CC1 (Fig. 3, and Table S1). This strongly supports the view that biovar *diacetylactis* may be distinguished by differences in chromosomal sequences not uniquely related to citrate utilization [62], and corresponds to a close genetic lineage among *L. lactis* subsp. *lactis* dairy strains.

The mean chromosome size was 2475 kb overall with about 15% difference between the smallest (2,304±41 kb in strain S188) and the largest (2,725±72 kb in strain A12) (Fig. 3 and Table S1). This is a larger range than found for streptococcal species assumed to contain an “open” genome [63]. Indeed, this size spread ranks the subspecies *lactis* amongst bacterial species with high genome diversity (Fig. 4). The mean genome size for the different isolates (the sum of chromosome and all plasmids) was 2,619 kb, with about 20% difference between the extremes (2,359 kb in strain S188 and 2,930 kb in strain A12) (Fig. 3). Although the plasmid content significantly contributed to the genome size (Spearman ρ = 0.69, *p*<10⁻⁵), no correlation between chromosome and plasmid sizes was detected (Spearman ρ = 0.1, *p* = 0.57). In addition, no correlation was found between strain origin and the size of its plasmid content (Mann-Whitney test, *p* = 0.948), or its plasmid profile (data not shown). This was also true of other genomic characteristics (Fig. 3): there was no significant difference between dairy and non-dairy strains as concerns mean chromosome size (Mann-Whitney's test, *p* = 0.616), or mean genome size (Mann-Whitney test, *p* = 0.766). Lastly, the genomic features did not correlate with the MLST-based phylogenetic relationships between strains: some strains belonging to the same ST differed by up to 230 kb in total genome size (see for instance strains IL594 and LD61, Fig. 3), whereas some unrelated strains had similar chromosome sizes and plasmid contents (see for instance strains Co1 and LD02, Fig. 3).

## Discussion

To contribute to the characterization of the natural variability of *L. lactis*, we report a comparative evaluation of the genetic and genomic diversity of a collection of 36 strains isolated from different ecological sources and geographical areas. The various analyses revealed unexpectedly high variability within the subspecies *lactis* at both gene and genome levels, and gave clues about its population structure and evolution. These findings were not entirely coherent with the traditional division into dairy (i.e. isolated from dairy substrates) and non-dairy (i.e. isolated from other sources) strains, but rather support a new classification based on ecological separation between several ecotypes [64] corresponding to “domesticated” and “environmental” strains.

At the gene level, MLST analysis revealed two clonal complexes (CC1 and CC2) and 14 singletons. This genetic structure clearly clustered strains involved in milk processing, a human activity, and isolated from dairy starters (13 strains, Table S1) or fermented product (3 strains). These “domesticated” strains were almost exclusively found in the two clonal complexes, whereas “environmental” strains, isolated from various sources such as plant and animals (including raw milk), were scattered into unique STs. This demarcation was also observed in the phylogenetic tree built using the concatenated sequences, with “domesticated” strains clustering as a single clade that could be further decomposed into two genetic groups, G1 and G2 (with G1 including most strains from the biovar *diacetylactis*). In contrast, “environmental” strains were spread evenly across the phylogenetic tree and constitute the major contributors to the genetic diversity observed within the subspecies. The allelic distribution of all loci used in the MLST scheme strongly supported this opposition between the two ecotypes. This type of evolutionary pattern appears to be a general trend among the subspecies *lactis* and is not due to geographic sampling bias, because a similar separation has been observed when examining the phylogenetic tree produced by the alternative MLST scheme for lactococcal strains of other geographical origins [31].

The phylogenetic trees from both studies, rooted with strains from the subspecies *cremomis*, indicate that “environmental” strains appeared first, and that “domesticated” strains emerged only recently from a single founder event. It is assumed that high

<figure><img src="image_53.png" /></figure>
<figure><img src="image_54.png" /></figure>

**Figure 4.** Comparison of chromosome size diversity within several bacterial species. For each species, the genome size distribution, summarized as a boxplot, is plotted according to the mean size. The species are ordered by increasing chromosome size diversity. Chromosomes sizes were obtained from sequence data (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/genlist.cgi?taxid = 2&type = 1&name = Bacteria%20Complete%20Chromosomes). The number of chromosomes sequenced is indicated in brackets. Abbreviations: Lm, *L. monocytogenes*; St, *S. thermophilus*; Sa, *S. agalactiae*; Hp, *H. pylori*; Hi, *H. influenzae*; Sau, *S. aureus*; Se, *S. enterica*; Spy, *S. pyogenes*; Vc, *V. cholerae*; Spn, *S. pneumoniae*; Cb, *C. botulinum*; Ll, *L. lactis* subsp. *lactis*; Ab, *A. baumannii*; Ec, *E. coli*. doi:10.1371/journal.pone.0015306.g004

genetic diversity of “environmental” strains explains their
ubiquitous presence in various natural environments (plants,
animals and milk), but allows only poor growth during milk
processing where they become a subdominant population. Such
strains are expected to be only infrequently isolated from
fermented products by standard bacteriological methods, as in
the case of strains LD98 (Table S1 and Fig. 3) or ATCC 19435T
[31]. This hypothesis is further supported by the identification of
numerous “environmental” strains in raw milks from different
areas (data not shown). The emergence of the “domesticated”
strains through a single founder event suggests acquisition of
adaptative mutations that allowed the descendant of this lineage to
become the dominant *lactis* subspecies population during milk
processing. Possibly, the founder event was acquisition of the
plasmid-encoded genes involved in casein or lactose catabolism,
because both genes i) are highly prevalent in the “domesticated”
strains, ii) are undoubtedly advantageous for rapid growth in milk
as strains containing both functions are able to ferment milk, and
iii) the lactococcal plasmids are known to carry other functions of
adaptive value in milk [65,66]. However, in view of the versatility
of such extra-chromosomal elements [67,68], illustrated in this
study by the complex distribution pattern of *prtP* and *lacE* genes
with nearly half “domesticated” strains lacking one or both (Fig. 3),
it appears more likely that there were several independent events,
involving plasmid acquisition and loss. Indeed, the instability
suggests that genes brought by these plasmids are not the key
features responsible for the emergence of “domesticated” strains,
and that only their presence in a subsample of the bacterial
complex is essential, an assumption supported by the fact that
artisanal whey, sourdoughs, and even defined commercial starters,
are generally composed of several *L. lactis* strains.

In the absence of reliable universal molecular clock in bacteria
[39], it is difficult to infer divergence times for the different
evolutionary steps. Nevertheless, empirical cheese production at

local scale by spontaneous fermentation or back-slopping over
thousands of years would presumably have allowed the emergence
of several independent genotypes adapted to milk processing;
consequently, the uniqueness of the origin of “domesticated”
strains, and low DNA polymorphism, are inconsistent with early
lactococcal domestication of the order of 10,000 years ago. A
simpler explanation would be that “domesticated” strains
originate from a bottleneck event caused by the sampling of a
very limited number of strains isolated from natural starters in the
early 20th century, when defined commercial starters were first
used for standardized cheese production [15]. Subsequently, the
emergence of the genetic group G1 is presumably associated with
a second bottleneck allowing the emergence of fast acid-producing
strains (corresponding to “modern” industrial strains) more
adapted to the large-scale cheese production developed 40–50
years ago. These successive founder effects associated with human
subsampling are supported by the different tests of neutrality, all of
which indicate that each locus of the MLST scheme evolved by
random genetic drift.

In contrast to the gene phylogeny, the macrorestriction analysis
by PFGE did not allow robust strain clustering, except for few
“modern” industrial strains of biovar *diacetylactis* belonging to the
major ST (including the sequenced strain IL1403). In addition, the
low S<sub>D</sub> values within this ST revealed unexpectedly high genome
plasticity within the subspecies, with most macrorestriction
fingerprints being as disparate within the subspecies as between
subspecies *lactis* and *cremoris*. As 84% of the *Sma*I restriction sites
found in the KF147 chromosome [69] are also present in the
IL1403 chromosome (data not shown), the low S<sub>D</sub> values
corresponded mostly to genome rearrangements such as inversions
and insertion/excision of mobile genetic elements. This genome
variability was also evident in the substantial variation in
chromosome and total genome sizes (15% and 20%, respectively),
indicating high fluctuation in strain-to-strain coding capacity. This

<figure><img src="image_55.png" /></figure>
range of genome size variability indicates that the pan-genome is as large as generally observed for species inhabiting diverse ecological niches, such as *Lactobacillus sakei* [70], *Pseudomonas aeruginosa* [71], and *E. coli* [72]. As most of the strains analyzed (28/36) have a chromosome larger than the IL1403 chromosome, this strain cannot be considered as representative of the coding capacities of the subspecies. In addition, genome characteristics (chromosome size, plasmid content size, plasmid profile, and total genome size) did not correlate with strain origin or with MLST-based phylogeny, with strains indistinguishable by MLST displaying up to 230 kb differences in genome size. This suggests that clonal diversification and phenotypic variability of the “domesticated” strains are largely the consequences of substantial genomic flux within the dispensable genome. Although large differences between the sizes of genomes of closely related strains has been suggested to be common in prokaryotes [73], this has been reported to date for only few proteobacteria, notably *Vibrio splendidus* [74], *Sinorhizobium meliloti* [75] and *E. coli* [5].

In conclusion, the core genome-based phylogeny substantiates early separation of the *L. lactis* subspecies *lactis* and *cremoris*, leads to the proposal of a new strain classification within the subspecies *lactis*, and suggests that there have been several genetic bottlenecks in the evolutionary history of strains involved in milk processing. The use of MLST will be of great help in defining the ecological and phylogenetic status of new lactococcal strains, and may be more informative than other genotyping methods. The high genome variability suggests a large pan-genome for the subspecies. However, this variability correlated with neither the strain origin nor the gene-based phylogeny, so numerous strains from the different ecotypes will need to be sequenced to characterize the lactococcal pan-genome.

## Materials and Methods

### Bacterial strains and culture conditions

*Lactococcus lactis* strains were obtained from various laboratory and industrial collections (LMGM-Toulouse, France for Sx strains; LMA-Caen, France for UCMAx strains; LBAE-Auch, France for the A12 strain; SOREDAB-La Boissiere Ecole, France for LLx and LDx strains). NCDO strains were obtained from the collection held at INRA (Jouy-en-Josas, France). Bacteria were grown at 30°C on M17-broth (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) supplemented with 5 g.l⁻¹ (w/v) of lactose or glucose. The lactose fermentation test was performed on milk-citrate BCP agar medium [76]. Strains are listed in Table S1 (provided as Supporting Information).

### DNA manipulation

Genomic DNA was extracted using the “DNeasy™ tissue” kit according to the manufacturer’s instructions (Qiagen, Hilden, Germany). DNA probes corresponding to genetic markers of important industrial traits (*lacE*, encoding the lactose-specific Enzyme II of the PTS system; *prtP*, encoding the cell envelope-associated serine proteinase; and *citP*, encoding the membrane bound citrate permease involved in citrate uptake) were obtained by PCR amplification, and radiolabeled with dATP-³²P using the “Megaprime™ DNA labeling system” (GE Healthcare Europe, GmbH). Restriction enzymes were purchased from New England Biolabs (Ipswich, USA). The automated RiboPrinter® (DuPont Qualicon, Wilmington, USA) device was used for *EcoRI*-ribotyping, according to the manufacturer’s instructions. The V1-V4 region of the 16S DNA was amplified and double-strand sequenced (Eurofins MWG operon, Ebersberg, Germany), using primers E8_F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) and E807_R

(5’-TGGACTACCAGGGTATCTAATC-3’). Internal fragments of each of the six loci, *pepXP* (X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase), *recN* (ATPase involved in DNA repair), *pdp* (pyrimidine-nucleoside phosphorylase), *pgk* (phosphoglycerate kinase), *glyA* (serine hydroxymethyltransferase), and *bcaT* (branched-chain-amino-acid aminotransferase), were amplified and double-strand sequenced (Eurofins MWG operon, Ebersberg, Germany) using the primers listed in Table S2 (Supporting Information). Primers were designed by standard procedures using Clone Manager version 9.0 software (Sci-Ed Software). PCR conditions were: initial denaturation at 94°C for 3 min; 30 cycles at 94°C for 45 s, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min using a MJ Mini thermocycler (Bio-Rad, Hercules, USA) in a 50 µl-mixture containing 10 ng of genomic DNA, 200 µM of each dNTP, 0.2 µM of each primer, 2.5 U *Taq* polymerase in 1x thermopol buffer (New England Biolabs). PCR products were purified using the “QIAquick PCR” Purification Kit (Qiagen). The quality of every sequence chromatogram was checked manually and each SNP was considered as correct if present on both DNA strands.

### PFGE analyses

Preparation of lactococcal DNA embedded in agarose matrix, digestion of DNA, pulsed field gel electrophoresis (PFGE), and Southern-blot with dried agarose gels were performed as previously described [77]. The size of each digested restriction fragment was estimated manually by comparison with either λ DNA concatemers (lambda ladder PFG marker, New England Biolabs) or *L. lactis* IL1403 *SmaI* restriction fragments [78], with PFGE conditions optimized for optimal resolution (pulse times of 2 to 210 s, depending on the fragment size to be determined). The size of the chromosome in each strain was estimated by averaging the sum of restriction fragment sizes calculated from either single *SmaI* digestion or double *I-CeuI/NolI* digestions. *SmaI* endonuclease has previously been used to estimate the genome size of various lactococcal strains [53,61] but generally cuts large plasmids in one or two fragments, leading to a slight overestimation of the chromosome size. In contrast, *I-CeuI* and *NolI* do not cut lactococcal plasmids but generate a very large chromosomal fragment (>1.5 Mb) whose size is difficult to determine accurately by electrophoresis [79]. When applied to the IL1403 chromosome, this averaging method gave a value (2,411±14 kb) close to the size (2,365 kb) calculated from the chromosome sequence [60]. Plasmid DNA was linearized by S1 nuclease digestion [80]. Briefly, DNA embedded in agarose matrix was incubated at 37°C for 40 min with 2.5 units of S1 nuclease in 200 µl of 1x S1 buffer (Promega, Madison, USA). The reaction was stopped by adding 1 ml of TE 10/50 (Tris-Cl pH 8, 10 mM; EDTA 50 mM) and samples were kept on ice until PFGE electrophoresis.

### Computational analyses

The genomic relatedness of bacterial strains was estimated from pairwise comparisons of PFGE *SmaI*-macrorestriction patterns, and a matrix of binary data was constructed based on the presence/absence of each band. Dice coefficients ($S_D$) for each pairwise comparison and corresponding genomic distances (1-$S_D$) were calculated from the matrix using the WINBOOT program [81]. A UPGMA dendrogram was constructed with the NEIGHBOR program in the PHYLIP package v3.69 [82]. Bootstrap analysis of the UPGMA tree was performed using the WINBOOT program with 1000 pseudoreplications. For MLST analysis, forward and reverse DNA sequences were trimmed, aligned, and analyzed using MEGA4 v4.1 [83]. Conflicting phylogenetic signals were analyzed by split decomposition using SplitsTree v4.10 [42]. Allele and isolate dataset creation, arbitrary allele

<figure><img src="image_56.png" /></figure>
numbering, and Sequence Type (ST) assignation were done using
mlstdbNet software [84]. STs clustering into clonal complexes
(CC) and founder assignation were performed using eBURST
[49]. Neighbor-joining trees (bootstrap 1000 using the Kimura
two-parameter model [85]) were established with MEGA4 v4.1.
The number of segregating sites (S), nucleotide diversity (π),
Tajima's D, and Fu & Li's D and F values were calculated using
DnaSP v5.10 [86]. The standardized index of association (I<sub>A</sub><sup>S</sup>) was
calculated using LIAN 3.5 (http://gump.auburn.edu/cgi-bin/
lian/lian.cgi.pl). The MLST data from several bacterial species
were downloaded from different MLST web sites (http://
www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/, http://www.mlst.
net/, http://pubmlst.org/). Sequences with missing data were
removed from the database by manual inspection using MEGA4
v4.1, and redundant sequences were removed using the NRDB
program (http://pubmlst.org/perl/mlstanalyse/mlstanalyse.pl?site =
pubmlst&page=nrdb&referer=pubmlst.org). π<sub>MAX</sub> values were ex-
tracted from the squared similarity matrix calculated with the
DNADIST program (D option set to "similarity table") in the
PHYLIP v3.69 package [82].

Nucleotide sequence accession number

Allele sequences of the six MLST loci were deposited in
Genbank/EMBL under the accession numbers HM597775 to
HM597845. Sequence data are also available through our MLST
web site (http://www-mlst.biotoul.fr/).

**Supporting Information**

<caption>**Table S1** *L. lactis* subsp *lactis* characteristics of the strains used in this study.
(PDF)</caption>

**References**

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<caption>**Table S2** Primers used for the MLST.
(PDF)</caption>

**Figure S1** Split decomposition analysis of the different alleles at each individual locus. The conflicting phylogenetic tree topologies are illustrated by interconnected network. Numbers indicate allele number.
(PDF)

**Figure S2** Location of loci used in the MLST scheme on the chromosome of IL1403 strain.
(PDF)

**Figure S3** a) Matrix of S<sub>D</sub> values for all pairwise comparisons of PFGE fingerprints. b) UPGMA dendrogram derived from the S<sub>D</sub> values.
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**Figure S4** Polymorphic nucleotide sites found in the 32 *L. lactis* subsp. *lactis* strains at the six MLST genes. Only polymorphic sites are shown, with numbering starting at the beginning of the aligned sequence portion of each gene.
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**Acknowledgments**

This work is dedicated to Dr. Pascal Le Bourgeois' friend and colleague Jean-Marc Reyrat (deceased 10-28-2009). We thank Véronique Monnet, Emmanuelle Maguin, Nathalie Desmasure, and Catherine Faucher for providing bacterial strains, Stephane Chailloux and Emmanuelle Maguin for helpful discussions.

**Author Contributions**

Conceived and designed the experiments: DP CB MLDM PLB. Performed the experiments: DP CB MC. Analyzed the data: DP YQ PR MLDM PLB. Wrote the paper: DP YQ PR MLDM PLB.

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<figure><img src="image_58.png" /></figure>
<table><caption>Table S1. *L. lactis* subsp *lactis* characteristics of the strains used in this study.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Name<sup>a</sup></th><th rowspan="2">Origin</th><th rowspan="2">ST</th><th colspan="8">MLST allele number</th><th colspan="4">Southern-hybridization</th><th rowspan="2">Reference</th></tr><tr><th>bcaT</th><th>glyA</th><th>pdp</th><th>pepXP</th><th>p8k</th><th>recN</th><th>Chromosome size<sup>b</sup></th><th>Plasmid size</th><th>citP</th><th>lacE</th><th>prtP</th><th>EcoRI</th></tr></thead><tbody><tr><td>IL1403</td><td>laboratory strain, derivative of IL594</td><td>6</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2411 ± 14</td><td>0</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>58-S-6</td><td>(Chopin et al. 1984)</td></tr><tr><td>IL594 (S491)</td><td>starter (Poligny, France)</td><td>(6)<sup>c</sup></td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>2344 ± 23</td><td>131</td><td>9</td><td>50</td><td></td><td>58-S-6</td><td>(Chopin et al. 1984)</td></tr><tr><td>LD90 (S461)</td><td>goat cheese (France), 2005</td><td>6</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2437 ± 16</td><td>120</td><td>9</td><td>46</td><td>65</td><td>58-S-6</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD01 (S451)</td><td>soft cheese starter (France), 1995</td><td>6</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2493 ± 18</td><td>150</td><td>9</td><td>95</td><td>-</td><td>58-S-6</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD02 (S453)</td><td>Brindza, goat cheese (Slovakia), 2004</td><td>(6)<sup>d</sup></td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>2445 ± 30</td><td>55</td><td>9</td><td>-</td><td>-</td><td>58-S-6</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD42 (S465)</td><td>soft cheese starter (France), 1996</td><td>6</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2521 ± 29</td><td>169</td><td>9</td><td>63</td><td>-</td><td>58-S-6</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD61 (S460)</td><td>soft cheese starter (France), 2000</td><td>6</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>2579 ± 59</td><td>125</td><td>9</td><td>50</td><td>55</td><td>58-S-6</td><td>(Raynaud et al. 2005)</td></tr><tr><td>S87 (S479)</td><td>starter (France)</td><td>15</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>1</td><td>2442 ± 41</td><td>129</td><td>9</td><td>65</td><td>62</td><td>58-S-6</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD56 (S467)</td><td>soft cheese starter (France), 2006</td><td>15</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>1</td><td>2377 ± 68</td><td>50</td><td>9</td><td>-</td><td>50</td><td>197-S-3</td><td>This study</td></tr><tr><td>S188 (S484)</td><td>starter (France)</td><td>15</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>1</td><td>2304 ± 41</td><td>55</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD48 (S457)</td><td>soft cheese starter (France), 1995</td><td>16</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>7</td><td>1</td><td>2498 ± 1<sup>b</sup></td><td>119</td><td>9</td><td>60</td><td>-</td><td>58-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>LL75 (S468)</td><td>paneer cheese (Gurgaon, India), 2004</td><td>9</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>5</td><td>2509 ± 22</td><td>123</td><td>-</td><td>50</td><td>50</td><td>3766-S-7</td><td>This study</td></tr><tr><td>S175 (S482)</td><td>starter (France)</td><td>9</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>5</td><td>2420 ± 35</td><td>188</td><td>-</td><td>65</td><td>-</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>S86 (S477)</td><td>starter (France)</td><td>10</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>12</td><td>1</td><td>2482 ± 35</td><td>110</td><td>-</td><td>55</td><td>55</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>S86-B (S478)</td><td>[Lac] derivative of S86</td><td>(10)<sup>e</sup></td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(12)</td><td>(1)</td><td></td><td>2430 ± 18</td><td>55</td><td>-</td><td>-</td><td>55</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>UCMA5713 (S432)<sup>f</sup></td><td>grassland (Normandy, France), 2003</td><td>18</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>11</td><td>2362 ± 14</td><td>329</td><td>-</td><td>65</td><td>92</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td>UCMA5733 (S436)<sup>f</sup></td><td>grassland (Normandy, France), 2003</td><td>(18)<sup>g</sup></td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(1)</td><td>(5)</td><td>(11)</td><td>2348 ± 28</td><td>264</td><td>-</td><td>92</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>S170 (S480)</td><td>starter (France)</td><td>22</td><td>3</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>1</td><td>2522 ± 49</td><td>165</td><td>-</td><td>-</td><td>1797-S-1</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD09 (S454)</td><td>Brindza, goat cheese (Slovakia), 2004</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>8</td><td>1</td><td>2442 ± 99</td><td>253</td><td>-</td><td>48</td><td>65</td><td>3338-S-4</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD55 (S459)</td><td>Camembert (Normandy, France), 2006</td><td>23</td><td>10</td><td>1</td><td>1</td><td>1</td><td>5</td><td>1</td><td>2595 ± 93</td><td>309</td><td>-</td><td>75</td><td>120</td><td>1797-S-4</td><td>This study</td></tr><tr><td>LD27 (S508)</td><td>soft cheese starter (France), 1999</td><td>4</td><td>1</td><td>1</td><td>6</td><td>8</td><td>13</td><td>1</td><td>2492 ± 42</td><td>139</td><td>-</td><td>75</td><td>64</td><td>199-S-7</td><td>This study</td></tr><tr><td>LL52 (S466)</td><td>soft cheese starter (France), 2003</td><td>7</td><td>1</td><td>1</td><td>6</td><td>8</td><td>11</td><td>1</td><td>2677 ± 27</td><td>227</td><td>-</td><td>65</td><td>62</td><td>199-S-7</td><td>This study</td></tr><tr><td>LL08 (S464)</td><td>raw milk (Normandy, France), 2001</td><td>12</td><td>1</td><td>1</td><td>11</td><td>8</td><td>7</td><td>12</td><td>2545 ± 33</td><td>141</td><td>-</td><td>-</td><td>70</td><td>199-S-7</td><td>This study</td></tr><tr><td>NCDO2054 (S493)</td><td>milk, Slow lactose fermentation, 1976</td><td>11</td><td>2</td><td>2</td><td>2</td><td>2</td><td>3</td><td>3</td><td>2452 ± 27</td><td>205</td><td>-</td><td>74</td><td>-</td><td>nd<sup>h</sup></td><td></td></tr><tr><td>NCDO2146 (S497)</td><td>mastitis, 1979</td><td>19</td><td>2</td><td>11</td><td>13</td><td>2</td><td>3</td><td>3</td><td>2488 ± 21</td><td>84</td><td>-</td><td>84</td><td>-</td><td>199-S-1</td><td></td></tr><tr><td>NCDO2633 (S495)</td><td>rectum of cow 330, 1981</td><td>13</td><td>2</td><td>2</td><td>2</td><td>2</td><td>2</td><td>2</td><td>2387 ± 21</td><td>159</td><td>-</td><td>90</td><td>-</td><td>nd<sup>h</sup></td><td></td></tr><tr><td>LD98 (S462)</td><td>paneer cheese (Gurgaon, India), 2004</td><td>14</td><td>4</td><td>4</td><td>3</td><td>4</td><td>6</td><td>6</td><td>2421 ± 40</td><td>105</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>520-S-2</td><td>This study</td></tr><tr><td>Col1 (S424)</td><td>corn (USA), 1993</td><td>8</td><td>2</td><td>3</td><td>7</td><td>7</td><td>3</td><td>3</td><td>2443 ± 69</td><td>80</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>199-S-1</td><td>(Salama et al. 1993)</td></tr><tr><td>NCDO2727 (S449)</td><td>mung bean (China), 1983</td><td>17</td><td>6</td><td>3</td><td>5</td><td>5</td><td>3</td><td>7</td><td>2571 ± 98</td><td>166</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>199-S-1</td><td></td></tr><tr><td>NCDO2118 (S423)</td><td>frozen peas, 1978</td><td>25</td><td>9</td><td>9</td><td>10</td><td>10</td><td>10</td><td>10</td><td>2634 ± 11</td><td>35</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>3872-S-1</td><td></td></tr><tr><td>UCMA5716 (S433)</td><td>grassland (Normandy, France), 2003</td><td>2</td><td>1</td><td>6</td><td>6</td><td>6</td><td>3</td><td>8</td><td>2651 ± 108</td><td>143</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>3872-S-4</td><td>This study</td></tr><tr><td>NCDO2111 (S450)</td><td>frozen peas, 1978</td><td>21</td><td>5</td><td>5</td><td>4</td><td>1</td><td>9</td><td>3</td><td>2471 ± 17</td><td>203</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>3872-S-5</td><td></td></tr><tr><td>A12 (S473)</td><td>sourdough bread (Auch, France)</td><td>20</td><td>2</td><td>10</td><td>12</td><td>11</td><td>3</td><td>13</td><td>2725 ± 72</td><td>205</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>520-S-2</td><td>This study</td></tr><tr><td>NCDO2110 (S422)</td><td>frozen peas, 1978</td><td>3</td><td>7</td><td>7</td><td>8</td><td>2</td><td>13</td><td>3</td><td>2381 ± 31</td><td>195</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>3883-S-3</td><td></td></tr><tr><td>NCDO2091 (S421)</td><td>seeds of Chinese radish (Japan)</td><td>5</td><td>8</td><td>8</td><td>9</td><td>9</td><td>10</td><td>9</td><td>2483 ± 18</td><td>75</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>3883-S-3</td><td></td></tr><tr><td>NCDO1867 (S492)</td><td>frozen peas (England), 1966</td><td>24</td><td>2</td><td>3</td><td>2</td><td>3</td><td>4</td><td>4</td><td>2422 ± 68</td><td>194</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>3931-S-6</td><td></td></tr></tbody></table>

<footnote>a: alternative nomenclature</footnote>
b: error calculated as the average deviation.

c: not determined (deduced from ST profile of its plasmid free derivative IL1403)

d: not determined (deduced from ST profile of strain LD01)

e: not determined (deduced from ST profile of strain S86)

f: these two closely related strains display archetypal phenotype and genotype of domesticated dairy strains.

g: not determined (deduced from ST profile of strain UCMA5713)

h: not determined (strains were not available at the time of analysis)

## References

Chopin A, Chopin MC, Moillo-Batt A, Langella P. 1984. Two plasmid-determined restriction and modification systems in *Streptococcus lactis*. *Plasmid*. 11: 260-263.

Raynaud S, Perrin R, Cocaign-Bousquet M, Loubiere P. 2005. Metabolic and transcriptomic adaptation of *Lactococcus lactis* subsp. *lactis* biovar *diacetylactis* in response to autoacidification and temperature downshift in skim milk. *Appl Environ Microbiol*. 71: 8016-8023.

Salama MS, Sandine WE, Giovannoni SJ. 1993. Isolation of *Lactococcus lactis* subsp. *cremoris* from nature by colony hybridization with rRNA probes. *Appl Environ Microbiol*. 59: 3941-3945.
<table><caption>Table S2. Primers used for MLST</caption><thead><tr><th>Locus</th><th>Name (position<sup>a</sup>)</th><th>PCR amplification<sup>b</sup></th><th>Internal sequencing<sup>b</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">bcaT</td><td>bcaT_PCR_F (1,322,807)</td><td>5'-AATTTAGACTGGGAAAATTTAGG-3'</td><td>bcaT_SEQ_F (1,322,787)</td><td>5'-AGGATTCAGCTATCGGAACTTAC-3'</td></tr><tr><td>bcaT_PCR_R (1,321,829)</td><td>5'- CAACATCACCAAACTGAATG-3'</td><td>bcaT_SEQ_R (1,322,166)</td><td>5'- TTTAGTATGTGTGCTTGGGTCAA-3'</td></tr><tr><td rowspan="2">glyA</td><td>glyA_PCR_F (590,943)</td><td>5'-ATGATTTTTGATAAAGAAGATTTTGA-3'</td><td>glyA_SEQ_F (591,069)</td><td>5'-GTTATGGCAGCACAAGGTTC-3'</td></tr><tr><td>glyA_PCR_R (592,077)</td><td>5'-CTTCAACTTCTTTAAATCCTCT-3'</td><td>glyA_SEQ_R (591,622)</td><td>5'-GTTGTTGTAACGACATCAGCATAAG-3'</td></tr><tr><td rowspan="2">pdp</td><td>pdp_PCR_F (1,465,707)</td><td>5'-ATGGTTGATCTCATTCAAAAGAA-3'</td><td>pdp_SEQ_F (1,465,542)</td><td>5'-TCACGATGGCAATGGTTCATTC-3'</td></tr><tr><td>pdp_PCR_R (1,464,497)</td><td>5'-TTCAGTAACTAATTCGTCAG-3'</td><td>pdp_SEQ_R (1,464,955)</td><td>5'-TCATTCATTCGATTTCCGATAGC-3'</td></tr><tr><td rowspan="2">pepXP</td><td>pepXP_PCR_F (2,135,739)</td><td>5'-GGCTTATGGTGCTGCTACTACT-3'</td><td>pepXP_SEQ_F (2,136,084)</td><td>5'-CTGGAATGTTACACCCGAACA-3'</td></tr><tr><td>pepXP_PCR_R (2,136,963)</td><td>5'-CACACTTCAATAGGAATAATGAG-3'</td><td>pepXP_SEQ_R (2,136,696)</td><td>5'-AGGAAGTTCAACCAAATCATCTAACA-3'</td></tr><tr><td rowspan="2">pgk</td><td>pgk_PCR_F (242,797)</td><td>5'-TGGCAAAATTGACTGTAAAAAGA-3'</td><td>pgk_SEQ_F (242,999)</td><td>5'-CAAAGCTGGTAAATCACTTGCAC-3'</td></tr><tr><td>pgk_PCR_R (243,988)</td><td>5'-TTTTCAGTCAAAGCTGCAAGTC-3'</td><td>pgk_SEQ_R (243,606)</td><td>5'-TGTGGTCAAGTGGCAAAATCAA-3'</td></tr><tr><td rowspan="2">recN</td><td>recN_PCR_F (883,409)</td><td>5'-TTGTCGAATCAATGGTCAAATGG-3'</td><td>recN_SEQ_F (883,611)</td><td>5'-CGTCAACAGCTCAATTTACGAC-3'</td></tr><tr><td>recN_PCR_R (884,272)</td><td>5'-TCCATATAAAGCTCAGAAAGTTCG-3'</td><td>recN_SEQ_R (884,221)</td><td>5'-GCAATTTTATGGCGCGCTTC-3'</td></tr></tbody></table>

<sup>a</sup>: position of the first 5' base of the primer on IL1403 chromosome (GenBank accession number: NC_002662)

<sup>b</sup>: corresponding primers specific for subsp. *cremoris* strains are available upon request to the authors.
<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Fig. S1.** Split decomposition analysis of the different alleles at each individual locus. The conflicting phylogenetic tree topologies are illustrated by interconnected network. Numbers indicate allele number</figcaption></figure>
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Fig. S2. Location of loci used in the MLST scheme on the chromosome of IL1403 strain.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Fig. S3. a) Matrix of SD values for all pairwise comparisons of PFGE fingerprints. b) UPGMA dendrogram derived from the SD values.</figcaption></figure>
<table><caption>**Fig. S4.** Polymorphic nucleotide sites found in the 32 *L. lactis* subsp. *lactis* strains at the six MLST genes. Only polymorphic sites are shown, with numbering starting at the beginning of the aligned sequence portion of each gene.</caption><tr><td>bcaT-1</td><td>A</td><td>C</td><td>A</td><td>T</td><td>A</td><td>A</td><td>T</td><td>C</td><td>C</td><td>A</td><td>C</td><td>A</td><td>C</td><td>g</td><td>g</td><td>g</td><td>C</td><td>g</td><td>A</td><td>T</td><td>A</td><td>T</td><td>T</td><td>C</td></tr><tr><td>bcaT-2</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-3</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-4</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>C</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>A</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-5</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>g</td><td>g</td><td>C</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-7</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-8</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>g</td><td>T</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>bcaT-9</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td></tr><tr><td>bcaT-10</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></table>

<table><tr><td>glyA-1</td><td>T</td><td>C</td><td>g</td><td>T</td><td>T</td><td>T</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>C</td><td>T</td><td>T</td><td>g</td><td>C</td><td>g</td><td>A</td><td>g</td><td>C</td><td>g</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>A</td></tr><tr><td>glyA-2</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td></tr><tr><td>glyA-3</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td></tr><tr><td>glyA-4</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>T</td><td>C</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td></tr><tr><td>glyA-5</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>glyA-6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>glyA-7</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>C</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>T</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>T</td><td>C</td><td>-</td><td>T</td></tr><tr><td>glyA-8</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>T</td><td>C</td><td>-</td><td>T</td></tr><tr><td>glyA-9</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td></tr><tr><td>glyA-10</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td></tr><tr><td>glyA-11</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td></tr></table>

<table><tr><td>pepXP-1</td><td>T</td><td>T</td><td>C</td><td>g</td><td>A</td><td>T</td><td>g</td><td>C</td><td>T</td><td>T</td><td>g</td><td>A</td><td>C</td><td>g</td><td>C</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-2</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-3</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-4</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-5</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-7</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-8</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-9</td><td>C</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>C</td><td>A</td><td>T</td><td>C</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-10</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pepXP-11</td><td>C</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>C</td><td>A</td><td>T</td><td>C</td><td>C</td><td>T</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></table>
<table><tbody><tr><td>pdp-1</td><td>C</td><td>A</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>g</td><td>g</td><td>C</td><td>A</td><td>C</td><td>T</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>A</td><td>g</td><td>T</td><td>C</td><td>A</td><td>g</td><td>C</td><td>C</td><td>g</td><td>492</td></tr><tr><td>pdp-2</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>g</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-3</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-4</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-5</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-7</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-8</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-9</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>T</td><td>C</td><td>T</td><td>C</td><td>g</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-10</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-11</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-12</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>pdp-13</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>g</td><td>g</td><td>A</td><td>-</td><td>T</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>pgk-1</td><td>C</td><td>g</td><td>C</td><td>C</td><td>C</td><td>T</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>T</td><td>C</td><td>g</td><td>T</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-2</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>C</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-3</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-4</td><td>A</td><td>-</td><td>T</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-5</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-6</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-7</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-8</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-9</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-10</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>C</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-11</td><td>A</td><td>A</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-12</td><td>A</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr><tr><td>pgk-13</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>C</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>18</td><td>31</td><td>63</td><td>120</td><td>165</td><td>204</td><td>231</td><td>276</td><td>291</td><td>309</td><td>354</td><td>408</td><td>462</td></tr></tbody></table>

<table><tbody><tr><td>recN-1</td><td>T</td><td>g</td><td>g</td><td>g</td><td>g</td><td>A</td><td>T</td><td>C</td><td>T</td><td>g</td><td>T</td><td>A</td><td>A</td><td>A</td><td>T</td><td>A</td><td>g</td><td>C</td><td>C</td><td>g</td><td>g</td><td>C</td><td>T</td><td>A</td><td>g</td><td>T</td><td>g</td><td>A</td><td>T</td></tr><tr><td>recN-2</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-3</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-4</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-5</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-6</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>T</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-7</td><td>C</td><td>A</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-8</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-9</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>C</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>-</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-10</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-11</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-12</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>recN-13</td><td>-</td><td>-</td><td>A</td><td>A</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>C</td><td>g</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>
# Résultats complémentaires

## 1) Implémentation du schéma MLST

Ce nouveau schéma MLST a été utilisé pour caractériser 18 souches supplémentaires de la sous-espèce *lactis* (validation par séquençage de la région V1-V4 de l'ARNr 16S) et isolées uniquement de laits crus provenant de trois zones de production artisanale de fromages (AOC Rocamadour, Pélardon et Franche-Comté). Chacun des isolats possède un profil de restriction PFGE spécifique (résultat non montré), démontrant l'absence de biais d'échantillonnage (redondance des souches). A l'exception de trois souches appartenant à un ST (ST15) défini dans l'article précédent, toutes les souches se distribuent dans 9 nouveaux STs et définissent 2 nouveaux complexes clonaux (Fig. 4a). L'analyse phylogénétique montre que la majorité des isolats (13/18) se répartit parmi les souches « environnementales » (Fig. 4b), certains d'entre eux pouvant néanmoins définir de nouvelles lignées génétiques (cercles rouges, Fig. 4b). De manière intéressante, les isolats d'une même zone géographique (AOC Rocamadour) ne sont pas nécessairement génétiquement proches puisqu'ils peuvent se distribuer dans la totalité de l'arbre. De plus, ils peuvent se regrouper avec des isolats provenant d'autres zones géographiques (Franche-Comté, Cévennes, Normandie, Angleterre, Japon) ou de substrats autres que le lait (pois, radis chinois). Ces résultats semblent donc confirmer l'absence de corrélation entre origine et position phylogénétique d'une souche, ainsi que la nouvelle classification que nous proposons.

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>**Fig. 4.** Diversité génétique et position phylogénétique de 18 souches de *L. lactis* subsp. *lactis* isolées de laits crus. **a)** Structure eBURST. Les nouveaux isolats sont indiqués en jaune. **b)** arbre phylogénétique (méthode NJ, bootstrap 1000).</figcaption></figure>
## 2) Séquençage du génome d'une souche environnementale

La séquence du génome de la souche « environnementale » A12 (Robert et al., 2009), isolée d'un levain de panification, a été obtenue par pyroséquençage (technologie 454, travail sous-traité à Eurofins MWG Operon). Cette souche a été sélectionnée car elle présentait le génome le plus grand par analyse PFGE (2930 kb dont 2725 ± 72 kb d'ADN chromosomique et 205 kb d'ADN plasmidique). Les caractéristiques du séquençage sont les suivantes :

- ≈ 230000 séquences générées (56.9 Mb de séquences)

- Longueur moyenne des séquences : 247 bases

- Redondance nucléotidique, 18X en moyenne par base (1X à 172X)

- 147 « contigs » (54 pb - 448,5 kb),

- 42 « contigs » utilisables (> 1 kb), représentant 2.7 Mb

Chaque « contig » a été annoté automatiquement sur la plateforme AGMIAL (Annotation de Génomes Microbiens d' Intérêt Agroalimentaire) développée à l'INRA de Jouy-en-Josas (Bryson et al., 2006). Un assemblage « manuel » a été réalisé en utilisant différents critères. Tout d'abord, nous avons ordonné les 42 contigs en postulant une forte synténie entre les chromosomes des souches A12 et IL1403, hypothèse plus que probable puisque cette synténie existe entre les chromosomes des souches modèles IL1403 et MG1363 (Le Bourgeois et al., 1995 ; Wegmann et al., 2007), appartenant respectivement aux sous-espèces lactis et cremoris. Nous avons ensuite analysé les extrémités de chaque « contig » en recherchant des zones de forte identité nucléotidique. Pour 24 « contigs » adjacents, nous avons identifié des régions possédant entre 92 et 100% d'identité nucléotidique créant des chevauchements de 9 à 229 pb de long. Dans tous les cas sauf un, la fusion de ces séquences adjacentes reconstitue un ORF présent dans le génome des souches IL1403 ou MG1363. Sur les 30 « gaps » restants, 11 sont localisés dans une séquence d'insertion encore non décrite chez L. lactis, l'IS6770 d'E. faecalis (Thorisdottir et al., 1994). La co-occurence de répétitions directes (DR) en bordure de l'IS, signe d'un évènement simple de transposition, et d'une synténie avec le chromosome IL1403 nous a permis d'identifier des erreurs possibles d'assemblage lors du séquençage et de créer un génome « virtuel » de 2.66 Mb (Fig. 5) qui servira de base de travail pour l'étape finale de « gap closure ». Une des difficultés majeures que nous rencontrons pour l'assemblage final concerne l'identification de séquences plasmidiques présentes à l'intérieur des « contigs » chromosomiques. L'obtention récente (travail sous-traité à Phylogène SA, France) d'une carte optique (Lin et al., 1999) (Fig. 6) devrait permettre d'identifier ces régions ainsi que les erreurs d'assemblage.
<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>**Fig. 5.** Carte virtuelle du chromosome de la souche A12. Les régions en vert correspondent aux « contigs » assemblés par similarité de séquence. Celles en violet, marron, gris, bleu et rouge correspondent à aux « contigs » probablement mal assemblés lors du séquençage.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>**Fig. 6.** Carte optique à Nhel du chromosome de la souche A12.</figcaption></figure>
Une étude comparative préliminaire a été réalisée avec les deux génomes de *L. lactis* subsp. *lactis* actuellement disponibles, celui de la souche IL1403 (2.36 Mb) et celui de la souche KF147 (2.60 Mb). Un alignement MAUVE (Darling *et al.*, 2010) a été obtenu (Fig. 7) et a permis d'estimer la taille du génome cœur, du pangénome et des différents génomes accessoires. Les trois génomes ayant été annotés avec des méthodes différentes (algorithmes « SHOW » et « GENMARK » basés sur une analyse HMM pour les souches A12 et IL1403, « ORPHEUS » basé sur la recherche de similarité avec des ORF décrits pour la souche KF147), le nombre de séquences codantes (CDS) déterminé pour chaque génome ne peut être directement comparé. En particulier, seuls les ORFs de taille > 60 acides aminés ont été considérés comme des CDS putatifs et soumis à l'analyse « GENMARK ».

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>**Fig. 7.** Alignement MAUVE des trois génomes de *L. lactis* subsp. *lactis*. La souche A12 est en haut.</figcaption></figure>

La taille du pangénome pour ces trois souches a été estimée à 3.53 Mb, avec un génome accessoire de 1.59 Mb et un génome cœur de 1.94 Mb, soit 55 % du pangénome. Ce pourcentage est très proche de celui (60 %) déterminé pour 3 génomes à partir des données obtenues chez *E. coli* (Touchon *et al.*, 2009) et *Streptococcus* (Lefebure & Stanhope, 2007). La taille des régions spécifiques de souches varie entre 288 kb pour la souche IL1403 et 500 kb pour la souche KF147 (Fig. 8). De plus, la part du génome accessoire partagé par deux souches est relativement faible, puisqu'il varie de 39 kb pour le couple IL1403/A12 à 92 kb pour le couple IL1403/KF147 (Fig. 8). Ces résultats suggèrent que l'essentiel du génome accessoire est spécifique de chaque souche et semble confirmer l'existence d'un pangénome étendu typique d'espèces bactériennes capables de coloniser plusieurs niches. On peut également constater que les deux souches « environnementales » (A12, isolée d'un levain de panification, et KF147 isolée de germe de soja) ne partagent pas plus de gènes entre elles qu'avec la souche « domestiquée » d'origine laitière. Ceci pourrait indiquer soit qu'il y a peu de gènes spécifiques de niches, soit que l'adaptation à l'écosystème levain de panification requiert un fond génétique identique à celui permettant l'adaptation à la surface des plantes.
<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>**Fig. 8.** Diagramme de Venn représentant la répartition du pangénome pour les trois souches analysées. L'astérisque correspond à la taille du génome spécifique de la souche A12 après avoir retiré la partie plasmidique.</figcaption></figure>

La comparaison des génomes des souches A12 et IL1403 a permis de mettre en évidence une cinquantaine d'îlots pour la souche A12, et une soixantaine pour la souche IL1403. Pour la souche IL1403, ces îlots correspondent notamment aux 6 prophages caractérisés (Chopin *et al.*, 2001), à une région de 13,8 kb bordée par 2 répétitions directes de 18 pb et contenant les gènes *lcnCD* impliqués dans la sécrétion de la lactococcine A (Venema *et al.*, 1996), et une région de 17,3 kb bordée par 2 répétition directes de 122 pb et contenant une recombinase à tyrosine (Int). Cette dernière région semble correspondre à un « hot-spot » d'intégration dans les souches laitières « industrielles » car les chromosomes des souches *cremoris* MG1363 et SK11 possèdent chacun un orthologue de cette intégrase (97% de similarité protéiques) suivi d'ORFs non conservés (Fig. 9).

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>**Fig. 9.** Identification d'un « hot-spot » d'intégration spécifique des souches « domestiquées » IL1403, MG1363, et SK11. La souche végétale KF147 possède la même structure chromosomique que la souche A12.</figcaption></figure>
# Projet de recherche

Différents axes de recherches sont envisagés.

## 1) Caractérisation de la structure de population de *L. lactis*.

Une étude à plus grande échelle de la diversité génétique de la sous-espèce *lactis* sera entreprise en déterminant le profil MLST d'environ 200 isolats provenant de différentes sources (lait cru, fourrages, trayons, matériel de traite,...) liées à la production artisanale de fromages. Ces isolats proviendront d'exploitations connues pour leurs gestions différentes des écosystèmes (pratiques d'élevage, utilisation de levains commerciaux définis ou « naturels », pratique du « backslopping »). Cette étude portera sur deux types de productions : tout d'abord la zone AOC Rocamadour (collaboration avec l'EI Purpan de Toulouse), pour laquelle nous évaluerons l'impact des pratiques d'élevage sur la diversité des souches. Ce projet a été labellisé par le pôle de compétitivité AgriMip Innovation et financé pour 2 ans par la région Midi-Pyrénées (APRTT 2010). Dans un second temps, nous initierons une collaboration avec l'Instituto de Productos Lácteos de Asturias (CSIC, Espagne) sur l'analyse de 60 isolats de *L. lactis* subsp. *lactis* collectés durant la fabrication artisanale de 5 types de fromages (Alegria et al., 2010). Nous envisageons enfin d'analyser des isolats plus exotiques, par exemple ceux isolés de lait de chamelle (Khedid et al., 2009 ; Drici et al., 2010). Cette étude nous permettra de valider la nouvelle classification proposée et de délimiter les contours de la diversité génétique de la sous-espèce. Nous espérons également mettre en évidence l'existence de nouvelles lignées génétiques, autres que la lignée des souches « domestiquées », adaptées au milieu lait. Ces lignées permettraient d'une part de confirmer l'hypothèse de l'existence d'écotypes (Cohan & Koeppel, 2008) chez *L. lactis*, et d'autre part d'identifier de nouvelles souches à potentiel technologique.

Nous appliquerons également notre schéma MLST à l'étude de la diversité de la sous-espèce *cremoris*. En effet, cette sous-espèce possède quelques particularités intéressantes du point de vue évolutif. Tout d'abord les souches de cette sous-espèce sont, à quelques exceptions près (Salama et al., 1993 ; Klijn et al., 1995 ; Kelly & Ward, 2002), uniquement isolées d'environnement laitier (Urbach et al., 1997 ; Nomura et al., 2006), et leur réservoir naturel n'est pas connu. De plus, si, à l'instar de la souche SK11, la plupart d'entre elles possèdent un phénotype *cremoris* (incapacité à croître à 40°C, à pH 9,2, dans 4% NaCl, à hydrolyser l'arginine et à produire de l'acide γ-aminobutyrique [GABA]), certaines ont un phénotype *lactis* (capacité à croître à 40°C, à pH 9,2, dans 4% NaCl, à hydrolyser l'arginine et à produire le GABA), comme la souche MG1363. Bien qu'il ait été récemment proposé de remettre en cause la classification actuelle, basée sur des critères génotypiques, et de revenir à une classification phénotypique (Rademaker et al., 2007), différentes
données indiquent que le phénotype *cremoris* est simplement lié à l'inactivation de certains gènes, tels *busA* pour la résistance au stress osmotique (Obis *et al.*, 2001), *arcA* pour l'hydrolyse de l'arginine (Wegmann *et al.*, 2007) et *gadB* pour la production de GABA (Nomura *et al.*, 2002). Par l'analyse MLST d'un nombre conséquent de souches génotypiquement *cremoris* provenant de différents environnements, nous espérons déterminer si le phénotype *cremoris* correspond à l'apparition d'une lignée génétique particulière (hypothèse proposée par (Klijn *et al.*, 1995) ou s'il s'agit de convergence évolutive (homoplasie) de lignées indépendantes. Dans le premier cas, similaire à ce que nous avons observé pour les souches « domestiquées » de la sous-espèce *lactis*, une analyse statistique (tests de neutralité) permettra de préciser si cette lignée correspond à un phénomène adaptatif (écotype) ou à une dérive génétique. Nous chercherons également à déterminer si les souches de génotype *cremoris*/phénotype *lactis*, qui semblent présentes dans les environnements naturels à une fréquence plus élevée que celle décrite dans la littérature (données non montrées), constituent l'essentiel de la population de cette sous-espèce.

## 2) Caractérisation des facteurs responsables de l'évolution du génome de *L. lactis*.

Les différentes données obtenues précédemment suggèrent un pangénome étendu ainsi qu'une faible corrélation entre phylogénie et contenu génomique. Ayant formulé l'hypothèse que le moteur principal dans l'évolution à court terme des souches « domestiquées » de *L. lactis* proviendrait d'une modification rapide du génome accessoire, nous chercherons à caractériser les éléments génétiques responsables de cette diversité et à déterminer les modalités de transfert de ces éléments, notamment entre les sous-espèces *lactis* et *cremoris*.

Pour cela, nous terminerons la caractérisation du génome de la souche A12 puis nous initierons une étude de génomique comparative à plus grande échelle en réalisant le séquençage d'une cinquantaine de souches supplémentaires appartenant aux deux sous-espèces. Le choix des souches se fera en fonction des résultats de l'analyse MLST. Chaque génome sera séquencé en Illumina (Hiseq 2000, plateforme de séquençage de Toulouse, http://genomique.genotoul.fr/), en combinant les méthodologies « single-read » et « mate-pair » sequencing afin d'optimiser l'étape d'assemblage des contigs. L'augmentation du nombre de génomes séquencés permettra : i) de définir plus précisément le génome cœur et de valider la phylogénie obtenue en MLST par construction de « super-gene tree » obtenus par concaténation de tous les gènes du génome cœur, ii) de caractériser les différentes régions variables du chromosome (prophages, ICEs, ilôts génomiques,....) et de déterminer leur contribution relative à la dynamique du génome accessoire pour chacune des sous-espèces, iii) d'identifier les gènes spécifiques de lignées ou de niche.
D'autre part, *L. lactis* constitue un modèle original pour l'étude des mécanismes de spéciation chez les procaryotes. En effet, les levains naturels, ainsi que la majorité des levains commerciaux définis, contiennent un mélange de souches appartenant aux 2 sous-espèces *lactis* et *cremoris*. Or malgré cette promiscuité probablement très ancienne, on constate une divergence nucléotidique élevée entre chromosomes des deux sous-espèces, en moyenne de 15% (Wegmann *et al.*, 2007) mais pouvant atteindre 60% dans certaines régions (Delorme *et al.*, 1994). Bien que ces résultats aient été obtenus sur un nombre très limité de souches de chaque sous-espèce, nous postulons que les sous-espèces *lactis* et *cremoris* correspondent en réalité à deux espèces biologiques distinctes évoluant parallèlement l'une de l'autre et capables uniquement d'échanges génétiques à la marge, malgré l'existence de systèmes de conjugaison interspécifiques (Gasson, 1990 ; Bellanger *et al.*, 2009 ; Machielsen *et al.*, 2010). Nous chercherons à identifier dans les génomes séquencés les signatures de transfert horizontal (par exemple sur la base de la divergence nucléotidique) et à déterminer si elles correspondent à des transferts putatifs de régions du génome cœur ou du génome accessoire. Pour ces derniers, nous nous attacherons à distinguer les EGMs des îlots génomiques, ce qui (par analogie avec *S. agalactiae*) pourrait indiquer l'existence d'une conjugaison Hfr. Ce type de conjugaison a été observé chez la sous-espèce *cremoris* (C. Shearman - IFR Norwich, communication personnelle). Comme récemment observé chez *Campylobacter* (Lefebure *et al.*, 2010), l'absence de telles signatures constituerait un argument supplémentaire pour valider le concept « d'espèces génomiques ». En parallèle, nous testerons expérimentalement la résistance au transfert de gènes entre ces deux sous-espèces. En effet, la valeur de divergence nucléotidique observée entre *cremoris* et *lactis* ne doit pas être homogène et nous supposons qu'il existe, en plus des opérons ribosomiques, des régions suffisamment conservées pour constituer des cibles de recombinaison homologue efficace permettant la création de chromosomes chimères. Par différentes méthodologies expérimentales (conjugaison Hfr, fusion cellulaire,...), nous tenterons de construire des souches chimères à partir de souches dérivées des souches modèles MG1363 et IL1403. Afin de déterminer les barrières au transfert interspécifique, nous réaliserons ces expériences dans différents fonds génétiques (par exemple en inactivant le système de réparation des mésappariements).
# Partie 2 : Inversions chromosomiques expérimentales chez *Lactococcus lactis*

## Présentation des travaux

A la fin du siècle dernier, les premières analyses de génomique comparative ont révélé une plasticité jusque là insoupçonnée des génomes bactériens (Casjens, 1998). Elles ont également montré l'existence de biais structuraux dans les chromosomes (orientation préférentielle des gènes vers le terminus de réplication, biais de composition nucléotidique, longueur des bras de réplication,...) générant des contraintes sur les réarrangements chromosomiques observés. Il a en outre été observé que les inversions symétriques par rapport à l'axe oriC-TerC (aujourd'hui appelé axe oriC-dif) représentaient un des moteurs principaux de l'évolution des chromosomes bactériens (Eisen et al., 2000 ; Hughes, 2000). Des inversions chromosomiques de tailles variables ont été obtenues expérimentalement par recombinaison homologues entre 2 copie d'un même élément chez *Escherichia coli* (Rebollo et al., 1988 ; Guijo et al., 2001), *Salmonella enterica* (Segall et al., 1988) et *Bacillus subtilis* (Toda et al., 1996 ; Wu & Errington, 2002), ou par recombinaison spécifique de site Flp-FRT chez *Pseudomonas aeruginosa* (Barekzi et al., 2000). Les études les plus complètes ont été réalisées chez *E. coli* et *S. enterica*, 2 espèces phylogénétiquement très proches, et ont conduit à des interprétations opposées : chez *E. coli*, les inversions sont mécanistiquement possibles dans toutes les régions chromosomiques mais certaines ont des conséquences délétères sur la croissance, voire létales (modèle fonctionnel) (Rebollo et al., 1988 ; Guijo et al., 2001). A l'inverse, chez *S. enterica* certaines inversions sont mécanistiquement impossibles à faire par recombinaison homologue, mais toutes sont viables (modèle mécanistique) (Segall et al., 1988 ; Mahan & Roth, 1991 ; Miesel et al., 1994).

Dans l'optique de voir si ces modèles étaient généralisables à des espèces phylogénétiquement éloignées des entérobactéries, nous avons initié une étude similaire chez *L. lactis*. Nous avons tout d'abord utilisé un système équivalent à ceux d'E. coli (Rebollo et al., 1988) et B. subtilis (Toda et al., 1996), en insérant à différents endroits du chromosome deux plasmides non-réplicatifs portant le gène *tetL* du plasmide pLS1 (Lacks et al., 1986), délété respectivement soit de sa région 5', soit de sa région 3'. Un événement de recombinaison homologue entre les régions dupliquées de *tetL* conduit à l'inversion de la région chromosomique comprise entre les 2 copies inversées et la restauration du phénotype de résistance à la tétracycline. Cependant, la pression de sélection exercée par l'antibiotique conduisait uniquement à des réarrangements aberrants, notamment une amplification des constructions intégrées sans formation d'inversions (données non-montrées). Nous avons ultérieurement montré que le gène *tetL* intégré en monocopie dans le chromosome de *L. lactis* ne conférait pas de résistance à la tétracycline, ce qui pouvait expliquer les phénomènes d'amplification observés. Nous avons alors envisagé l'utilisation d'un système de
recombinaison spécifique de site, le système Cre-LoxP du bactériophage P1 (Abremski et al., 1983) pour obtenir ces inversions en absence de tout système de sélection phénotypique. La description de cet outil est détaillée dans l'article n°2 de ce manuscrit.

Dix-huit régions chromosomiques, couvrant de 80 à 1260 kb et affectant à des degrés variables la symétrie du chromosome selon l'axe oriC-TerC, ont été testées pour leur capacité à s'inverser (article n°3). Nous avons montré que toutes les inversions étaient mécanistiquement possibles (signature de recombinaison observable en PFGE) et qu'elles pouvaient être réparties en quatre classes en fonction de leur stabilité et leur conséquence phénotypique dans différentes conditions de croissance : classe I, inversions stables quelles que soient les conditions ; classe II, inversions instables en milieu riche ; classe III, inversions instables quelles que soient les conditions ; classe IV, inversions létales. Nos résultats ont permis de mettre en évidence deux zones de contrainte aux inversions, un domaine de 500 kb centré sur l'origine de réplication (domaine « Ori ») et un domaine de 250 kb centré sur la zone de jonction des réplichores (domaine « Ter »), et montrent que le chromosome de L. lactis peut tolérer une dissymétrie d'environ 20% dans la longueur des deux bras de réplication, ainsi que l'inversion de l'orientation des gènes ou des biais de composition nucléotidique (biais GC ou biais de mots) dans un même bras de réplication dans certains cas. Enfin, nous avons émis l'hypothèse que, par analogie avec les résultats obtenus chez E. coli (Perals et al., 2000), le comportement des inversions dans le « domaine Ter » pouvait être lié aux étapes ultimes de ségrégation des chromosomes, telles que la résolution des dimères de chromosomes.
# Cre-*loxP* Recombination System for Large Genome Rearrangements in *Lactococcus lactis*†

Nathalie Campo,¹ Marie-Line Daveran-Mingot,¹ Kees Leenhouts,²‡ Paul Ritzenthaler,¹* and Pascal Le Bourgeois¹

*Laboratoire de Microbiologie et Génétique Moléculaire du CNRS (UMR5100), Université Paul Sabatier, 31062 Toulouse, France,¹ and Department of Genetics, Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, Haren, The Netherlands²*

Received 6 December 2001/Accepted 26 February 2002

We have used a new genetic strategy based on the Cre-*loxP* recombination system to generate large chromosomal rearrangements in *Lactococcus lactis*. Two *loxP* sites were sequentially integrated in inverse order into the chromosome either at random locations by transposition or at fixed points by homologous recombination. The recombination between the two chromosomal *loxP* sites was highly efficient (approximately 1 × 10⁻¹/cell) when the Cre recombinase was provided in *trans*, and parental- or inverted-type chromosomal structures were isolated after removal of the Cre recombinase. The usefulness of this approach was demonstrated by creating three large inversions of 500, 1,115, and 1,160 kb in size that modified the lactococcal genome organization to different extents. The Cre-*loxP* recombination system described can potentially be used for other gram-positive bacteria without further modification.

Over the last decade, our knowledge of the structure and organization of the bacterial chromosome has increased largely thanks to the use of physical mapping methods such as pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and large-scale sequencing. Genome map comparisons have revealed unexpected and substantial differences in replicon geometry, genome size, and organization (for a review, see reference 7). However, there is now evidence that physical constraints or selective pressures exist to maintain gene position and orientation relative to the chromosomal replication origin (34), to control exogenous gene transfer in preferred chromosomal regions (17), and to conserve the relative order of some loci even in distantly related bacterial genomes (13). One aspect that remains an enigma is the dynamic state of the bacterial genomes, in particular the nature of the physical constraints or the selective pressures that act to preserve the genome organization. A direct approach to this matter consists of experimental genome shuffling by construction of artificial large genome rearrangements such as inversions, which disrupt the organization of the bacterial chromosome without altering its genetic context, and studying the phenotypic consequences of these inversions. To date, large genome inversions in bacteria have been experimentally constructed by homologous recombination between two inverse-order inactivated copies of a selectable marker (33, 35, 39). These recombination events were phenotypically selected because they led to the reconstitution of one functional copy of the marker. An alternative strategy for the generation of such rearrangements would be the use of site-specific recombination systems, such as the

Flp-FRT system from *Saccharomyces cerevisiae* (6) or the Cre-*loxP* system from coliphage P1 (1). The Cre recombinase belongs to the λ integrase family and catalyzes recombination between two identical 34-bp sites called *loxP* (locus of crossing-over). Its main function in *Escherichia coli* is to ensure stable maintenance of the plasmid form of the phage P1 by resolving DNA dimers into plasmid monomers. Both the Flp-FRT and Cre-*loxP* recombination systems have been successfully used for chromosome engineering in eukaryotic cell lines and whole organisms (18) as well as for excision of chromosomal DNA in bacteria (14, 16). However, site-specific recombination tools have never been described for the construction of large chromosomal rearrangements in bacteria, except in *Pseudomonas aeruginosa*, where a 1.59-Mb inversion was fortuitously isolated by use of the Flp-FRT system (4).

*Lactococcus lactis* is a mesophilic lactic acid bacterium that is extensively used as a starter culture in the manufacture of dairy products. It is a low-G+C, gram-positive coccus phylogenetically related to the genus *Streptococcus* and has a relatively small circular genome (2,500 kb). Due to its industrial importance, *L. lactis* serves as a model organism for genetic and biochemical studies of lactic acid bacteria, and considerable efforts have been made to develop gene tagging and targeting techniques to facilitate chromosomal gene analysis and gene cloning. The complete sequence of the genome of *L. lactis* subsp. *lactis* strain IL-1403 was recently determined (5) and revealed a structure that can be considered typical of eubacteria: the chromosome is divided into two replication arms of nearly equal length (47 and 53% of the genome), and each replication arm shows a strong bias of gene orientations, GC skew, and Chi-site orientation with respect to the direction of replication. Several studies on genome plasticity in lactococci have revealed that although the overall gene order is conserved even at the intersubspecies level, some chromosomal regions are more prone to rearrangements (10, 23). To produce artificial chromosome shuffling in *L. lactis*, we designed a new recombination strategy based on the phage P1

<footnote>* Corresponding author. Mailing address: LMGM du CNRS, Université Paul Sabatier, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex, France. Phone: (33) 561 33 58 25. Fax: (33) 561 33 58 86. E-mail: ritzenth@ibcg.biotoul.fr.</footnote>

<footnote>† This paper is dedicated to the memory of Patrick Duwat (5 January 2000).</footnote>

<footnote>‡ Present address: Biomade Technology Foundation, Mijenbergh 4, 9747 AG Groningen, The Netherlands.</footnote>