# Modification de l'organisation tridimensionnelle de la chromatine par l'oncogène Tax de HTLV-1 : conséquences fonctionnelles sur la transcription et l'épissage alternatif des gènes cellulaires.

Paul Alexandre Marie

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Paul Alexandre Marie. Modification de l'organisation tridimensionnelle de la chromatine par l'oncogène Tax de HTLV-1 : conséquences fonctionnelles sur la transcription et l'épissage alternatif des gènes cellulaires.. Génomique, Transcriptomique et Protéomique [q-bio.GN]. Université Claude Bernard Lyon 1, 2023. Français. NNT: tel-04135214

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Submitted on 20 Jun 2023

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THESE de DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE LYON
opérée au sein de
l'Université Claude Bernard Lyon 1

Ecole Doctorale N°340
Biologie Moléculaire, Intégrative et Cellulaire (BMIC)

Spécialité de doctorat : Biologie moléculaire, Génétique

Discipline : Science de la Vie et de la Santé

Soutenue publiquement le 14/06/2023, par :

Paul MARIE

Modification de l'organisation
tridimensionnelle de la chromatine par
l'oncogène Tax de HTLV-1 :
conséquences fonctionnelles sur la
transcription et l'épissage alternatif des
gènes cellulaires

Devant le jury composé de :

F. LUCO Reini

Chargée de Recherches CNRS

Institut Curie, Orsay

Rapporteuse

PIQUE Claudine

Directrice de Recherches CNRS

Intitut Cochin, Paris

Rapporteuse

FAURE Mathias

Professeur des Universités

CIRI, Lyon

Examinateur

GADAL Olivier

Directeur de Recherche CNRS

CBI, Toulouse

Examinateur

MORTREUX Franck

Chargé de Recherche CNRS

LBMC, Lyon

Directeur de thèse
Résumé

L'activation de la voie NF-κB contrôle la transcription de nombreux gènes engagés dans des processus physiologiques majeurs tels que l'inflammation et la réponse immune. Néanmoins, son activation chronique est fréquemment associée dans des maladies tels que les cancers. L'organisation tridimensionnelle de la chromatine joue un rôle dans la coordination des régulations transcriptionnelles mise en place lors de l'activation de la voie NF-κB. Mes travaux montrent dans un contexte d'activation de la voie NF-κB par l'oncogène Tax du rétrovirus HTLV-1 que de nombreuses dérégulations d'épissage alternatif sont médiées par le recrutement intragénique du facteur NF-κB p65/RelA à proximité des exons régulés via ses capacité d'interaction avec des facteurs d'épissage, dont l'hélicase à ARN DDX17. Par des approches de Hi-C, 4C et 3C, mes données montrent que les régulations transcriptionnelles et co-transcriptionnelles engendrées par Tax, notamment via l'activation de la voie NF-κB, s'accompagnent d'une réorganisation de l'architecture tridimensionnelle du génome, induisant la formation de complexes multigéniques composés de gènes régulés par Tax dans leur niveau transcriptionnel ou leur épissage alternatif. Les analyses de l'enrichissement à la chromatine de p65/RelA, ainsi que des approches moléculaires permettant de moduler expérimentalement le recrutement de p65/RelA à la chromatine, ont permis d'identifier que la fixation intragénique de p65/RelA participe à la formation de contacts entre gènes et à leurs régulations au niveau de la transcription et de l'épissage alternatif. Ces données apportent de nouvelles connaissances dans les mécanismes de régulation lors de l'infection par HTLV-1 mais également dans les pathologies associées à l'activation de la voie NF-κB.
# Résumé graphique

<figure><img src="image_2.png" /></figure>
Abstract

The NF-κB pathway controls the transcription of numerous genes involved in major physiological processes such as inflammation and immune response. However, its chronic activation is frequently associated with diseases such as cancer. The 3D organization of chromatin plays a role in coordinating transcriptional regulations established during NF-κB pathway activation. My work demonstrates that, in the context of NF-κB pathway activation by the HTLV-1 retrovirus oncoprotein Tax, numerous alternative splicing deregulations are mediated by the intragenic recruitment of the NF-κB p65/RelA factor near regulated exons through its interaction capabilities with splicing factors, including the RNA helicase DDX17. Using Hi-C, 4C, and 3C approaches, my data reveal that transcriptional and post-transcriptional regulations induced by Tax, particularly through the NF-κB pathway, are accompanied by a reorganization of the 3D genome architecture, leading to the formation of multigenic complexes composed of genes regulated by Tax at the transcriptional level or at the alternative splicing. Analyses of p65/RelA chromatin occupancy, as well as molecular approaches to experimentally modulate p65/RelA recruitment to the chromatin, have identified that intragenic binding of p65/RelA contributes to the formation of contacts between genes and their regulation at the transcriptional and alternative splicing levels. These findings provide new insight into the complex regulatory mechanisms involved in gene perturbations upon HTLV-1 infection as well as in pathologies associated with chronic NF-κB activation.
Remerciements
Table des matières
Table des matières

<table><tr><td>Résumé</td><td>2</td></tr><tr><td>Abstract</td><td>4</td></tr><tr><td>Table des matières</td><td>8</td></tr><tr><td>Table des illustrations</td><td>13</td></tr><tr><td>Lexique</td><td>16</td></tr><tr><td>Introduction</td><td>19</td></tr><tr><td>1. Epissage alternatif</td><td>20</td></tr><tr><td>a. Généralités</td><td>20</td></tr><tr><td>b. Régulations de l'épissage alternatif</td><td>21</td></tr><tr><td>i. Séquences cis-régulatrices et facteurs trans-régulateurs</td><td>21</td></tr><tr><td>ii. Les protéines SR, activateurs de l'épissage</td><td>23</td></tr><tr><td>iii. Les protéines hnRNP, inhibiteurs de l'épissage</td><td>23</td></tr><tr><td>iv. Structures secondaires d'ARN et modulation de l'épissage alternatif</td><td>24</td></tr><tr><td>v. Les hélicases DDX5 et DDX17 et leurs rôles dans le couplage de l'épissage et de la transcription</td><td>24</td></tr><tr><td>c. Couplage entre transcription et épissage alternatif</td><td>26</td></tr><tr><td>i. Modèle de recrutement</td><td>27</td></tr><tr><td>ii. Modèle cinétique</td><td>29</td></tr><tr><td>iii. Exemple du couplage entre transcription et épissage par les hélicases DDX5 et DDX17</td><td>31</td></tr><tr><td>iv. Facteurs de transcription et épissage alternatif</td><td>32</td></tr><tr><td>2. Organisation linéaire de la chromatine et impact sur l'expression des gènes</td><td>35</td></tr><tr><td>a. Nucléosome : l'unité de base de la chromatine</td><td>35</td></tr><tr><td>b. Histones PTM, impact sur la chromatine et la transcription</td><td>36</td></tr><tr><td>i. Remodelage de la chromatine, une nécessité pour la régulation des gènes</td><td>36</td></tr></table>
<table><tbody><tr><td>ii.</td><td>Histones PTM et impact sur l'état de la chromatine</td><td>36</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Régulation de l'épissage alternatifs par les histones</td><td>39</td></tr><tr><td>3.</td><td>Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes</td><td>43</td></tr><tr><td>a.</td><td>Généralités</td><td>43</td></tr><tr><td>b.</td><td>Organisation à différentes échelles</td><td>45</td></tr><tr><td>i.</td><td>Territoires chromosomiques</td><td>45</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Compartiments A et B</td><td>45</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Domaines d'association topologique</td><td>45</td></tr><tr><td>iv.</td><td>Boucles intragéniques</td><td>48</td></tr><tr><td>v.</td><td>Boucles de chromatine intergéniques</td><td>48</td></tr><tr><td>vi.</td><td>Facteurs de transcription et boucles de chromatine</td><td>51</td></tr><tr><td>c.</td><td>Les condensats nucléaires comme acteurs de l'organisation du génome et de l'expression des gènes</td><td>54</td></tr><tr><td>i.</td><td>Usines à transcription : une compartimentalisation de la transcription</td><td>56</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Les corps nucléaires, des condensats dédiés à l'épissage</td><td>60</td></tr><tr><td>d.</td><td>Epissage alternatif et organisation du génome</td><td>62</td></tr><tr><td>i.</td><td>Boucles promoteur-exon et impact sur l'épissage</td><td>62</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Rapprochement de gènes et épissage alternatif</td><td>64</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Corps nucléaires et organisation du génome</td><td>65</td></tr><tr><td>iv.</td><td>Localisation nucléaire et impact sur l'épissage</td><td>66</td></tr><tr><td>4.</td><td>HTLV-1, Tax et l'épissage alternatif</td><td>68</td></tr><tr><td>a.</td><td>Généralités et épidémiologie du HTLV-1 et des pathologies associées</td><td>68</td></tr><tr><td>i.</td><td>Généralités</td><td>68</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Epidémiologie</td><td>68</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Transmission du virus</td><td>69</td></tr><tr><td>iv.</td><td>Pathologies associées à HTLV-1</td><td>70</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>b.</td><td>Structure du HTLV-1 et mécanismes de réplication</td><td>71</td></tr><tr><td>i.</td><td>Structure de la particule virale</td><td>71</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Génome viral</td><td>72</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Réplication de HTLV-1</td><td>75</td></tr><tr><td>c.</td><td>L'oncoprotéine Tax</td><td>80</td></tr><tr><td>i.</td><td>Généralités et interactôme</td><td>80</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Apoptose, cycle cellulaire et instabilité génomique</td><td>81</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Transactivation des gènes viraux et cellulaires par Tax</td><td>83</td></tr><tr><td>d.</td><td>Tax et la voie NF-κB, pierre angulaire de la pathogénie du HTLV-1</td><td>91</td></tr><tr><td>i.</td><td>Généralités</td><td>91</td></tr><tr><td>ii.</td><td>Les différentes voies NF-κB</td><td>93</td></tr><tr><td>iii.</td><td>Modulation transcriptionnelle de la réponse NF-κB</td><td>95</td></tr><tr><td>iv.</td><td>Tax et la voie NF-κB</td><td>104</td></tr><tr><td>v.</td><td>Dérégulations de transcriptionnelles des gènes cellulaires par HTLV-1 et par Tax</td><td>108</td></tr><tr><td colspan="2">Problématique</td><td>113</td></tr><tr><td colspan="2">Résultats</td><td>116</td></tr><tr><td colspan="2">Résumé :</td><td>117</td></tr><tr><td colspan="2">Discussion générale et perspectives</td><td>166</td></tr><tr><td colspan="2">Spécificité de l'activation de la voie NF-κB Tax-dépendante</td><td>169</td></tr><tr><td colspan="2">Epissage alternatif et structures subnucléaires</td><td>172</td></tr><tr><td colspan="2">La réorganisation tridimensionnelle du génome par Tax dans les processus mutagènes.</td><td>176</td></tr><tr><td colspan="2">L'intégration de HTLV-1 dans le génome altère l'organisation tridimensionnelle du génome</td><td>177</td></tr><tr><td colspan="2">Conclusion</td><td>179</td></tr><tr><td colspan="2">Annexes</td><td>180</td></tr></table>
<table><tr><td>Annexe 1</td><td>181</td></tr><tr><td>Bibliographie</td><td>194</td></tr><tr><td>Résumé</td><td>234</td></tr></table>
Table des illustrations
Table des illustrations

<table><tr><td>Figure 1 : Schéma représentatif de la réaction d'épissage et de la structure</td><td>21</td></tr><tr><td>Figure 2 : Les sites d'épissage et leurs séquences consensus</td><td>22</td></tr><tr><td>Figure 3 : Les principaux types d'épissage alternatif</td><td>22</td></tr><tr><td>Figure 4 : Schéma représentatif des séquences cis-régulatrices et acteurs trans-régulateurs de l'épissage alternatif</td><td>23</td></tr><tr><td>Figure 5 : Epissage alternatif de l'exon 10 de Tau par DDX5</td><td>25</td></tr><tr><td>Figure 6 : Exemple de modèle de recrutement</td><td>28</td></tr><tr><td>Figure 7 : Modèle cinétique de l'épissage alternatif</td><td>30</td></tr><tr><td>Figure 8 : modèles d'implication des facteurs de transcription</td><td>34</td></tr><tr><td>Figure 9 : Composition et modifications post-traductionnelles des nucléosomes</td><td>38</td></tr><tr><td>Figure 10 : Schéma des grandes étapes des protocoles des principales techniques C</td><td>44</td></tr><tr><td>Figure 11 : Organisation du génome à différentes échelles et motifs associés sur les cartes d'interaction de Hi-C</td><td>47</td></tr><tr><td>Figure 12 : Schéma des altération génétiques et de leurs conséquences sur l'organisation du génome et l'expression des gènes WNT6, IHH, EPHA4 et PAX3 dans diverses pathologies</td><td>50</td></tr><tr><td>Figure 13 : Schéma des différents modes d'action des facteurs de transcription sur la formation de boucles de chromatine</td><td>53</td></tr><tr><td>Figure 14 : Représentation d'une usine à transcription</td><td>57</td></tr><tr><td>Figure 15 : Illustration de la spécialisation d'usines à transcription dans le cas de l'activation de la voie NF-κB</td><td>59</td></tr><tr><td>Figure 16 : représentation des Nuclear speckles et de leurs fonctions</td><td>66</td></tr><tr><td>Figure 17 : Distribution mondiale de HTLV-1</td><td>69</td></tr><tr><td>Figure 18 : Représentation schématique de la particule virale de HTLV-1 et de sa structure</td><td>72</td></tr><tr><td>Figure 19 : Génome proviral et transcrits de HTLV-1</td><td>73</td></tr><tr><td>Figure 20 : Cycle réplicatif du HTLV-1</td><td>75</td></tr><tr><td>Figure 21 : Représentation des trois voies de transmission cellule à cellule du HTLV-1</td><td>76</td></tr><tr><td>Figure 22 : Les différents profils de clonalité de HTLV-1</td><td>77</td></tr><tr><td>Figure 23 : Schéma des grandes étapes de l'infection par HTLV-1 et du développement de l'ATLL et de l'HAM/TSP</td><td>79</td></tr><tr><td>Figure 24 : Structure et domaines de la protéine Tax-1</td><td>80</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure 25: Schéma des effets de Tax sur la progression du cycle cellulaire</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 26: transactivation du LTR de HTLV-1 par Tax</td>
      <td>84</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 27: Schéma des voies de signalisation impactées par Tax</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 28: les acteurs de la voie NF-κB</td>
      <td>92</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 29: Schéma d'activation des voies canoniques et non-canoniques de NF-κB</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 30: modèle de la coordination hérarchique de gènes co-régulés lors de l'activation par le TNFα</td>
      <td>104</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 31: Interactions de Tax avec les protéines de la voie NF-κB</td>
      <td>106</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 32: Modèle de régulation de l'épissage alternatif par p65/RelA et DDX17</td>
      <td>111</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 33: illustration de la problématique posée</td>
      <td>115</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 34: modèle de la coordination de la régulation transcriptionnelle et co-transcriptionnelle de la voie NF-κB par Tax</td>
      <td>168</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 35: Effets de la PMA et du TNFα sur l'exclusion de l'exon 6 de RELA</td>
      <td>170</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 36: Tax co-localise avec RelA et DDX17 dans des structures discrètes subnucléaires</td>
      <td>176</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Tableau 1: Exemple de modifications post-traductionnelles d'histones reliées à l'épissage</td>
      <td>41</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Tableau 2: Composition des usines à transcription</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Tableau 3: Exemples de rapprochements de gènes co-régulés</td>
      <td>60</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Tableau 4: Les protéines virales codées par HTLV-1 et leurs fonctions</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Tableau 5: Les modifications post-traductionnelles de Tax et leurs rôles</td>
      <td>98</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
Lexique
3C - Chromosome Conformation Capture

4C - Circular Chromosome Conformation Capture

5C - Chromosome Conformation Capture Carbon Copy

ADN - Acide Désoxyribonucleique

AP-1 - Activator Protein-1

ARN - Acide Ribonucléique

ARNm - ARN messager

ARNPII - ARN Polymérase II

ATF - Activating Transcription Factor

ATF - Activating Transcription Factor

ATLL - Adult T-cell Leukemia

ATP - Adenosine triphosphate

BAFF - B-cell Activating Factor

BCL - B-cell Lymphoma

BER - Base Excision Repair

BLV - Bovine Leukemia Virus

BRD4 - Bromodomain-containing Protein 4

Brm - Brahma

BrUTP - Bromouridine Triphosphate

C/EPBβ - CCAAT/enhancer-binding protein beta

CA - Capside

CAF1B - Chromatin Assembly Factor 1B

Capture-C - Chromosome Conformation Capture-C

CARG - Cysteine-rich and Glycine-rich sequence

CARM1 - Coactivator-associated Arginine Methyltransferase 1

CBP/p300 - CREB-binding Protein/ E1A-binding Protein P300

CDK - Cyclin-dependent Kinase

cFLIP - Cellular FLICE-inhibitory Protein

C-FOS - FBJ Murine Osteosarcoma Viral Oncogene Homolog

CHD - Chromodomain Helicase DNA-binding protein

ChIA-PET - Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing

ChIP - Chromatin Immunoprecipitation

ChIP-seq - Chromatin Immunoprecipitation sequencing

Chk1/2 - Checkpoint Kinase 1/2

cIAP - cellular Inhibitor of Apoptosis

CLOU9 - CTD-like phosphoesterase domain-containing protein 9

CRE - cAMP Response Element

CREB - cAMP Response Element-Binding protein

CRISPR/Cas9 - Clustered Regularly Interspaced Short

Palindromic Repeats/CRISPR-associated Protein 9

CTCF - CCCTC-binding Factor

CTD - C-terminal Domain

DBD - DNA-binding Domain

dCas9 - Dead Cas9

DDX - DEAD-box helicase

DEAD - Asp-Glu-Ala-Asp (motif)

DNA-FISH - DNA Fluorescence In Situ Hybridization

DRB - 5,6-dichloro-1-beta-D-ribofuranosylbenzimidazole

DSB - Double-Strand Break

dUTP - Deoxyuridine Triphosphate

EDI - Extra Domain I

Egr1 - Early Growth Response 1

EHMT1/2 - Euchromatic Histone-Lysine N-Methyltransferase

Elk-1 - ETS-Like Protein 1

Env - Envelope Protein

EPHA4 - Ephrin type-A receptor 4

ERa - Estrogen Receptor alpha

eRNA - Enhancer RNA

ESE - Exonic Splicing Enhancer

ESS - Exonic Splicing Silencer

FBI-1 - Pokemon/ZBTB7A

FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching

GCH1 - GTP Cyclohydrol

GCH1: GTP cyclohydrolase 1

GLUT-1: glucose transporter type 1

GO: Gene Ontology

GPS2: G protein pathway suppressor 2

HAM/TSP: HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis

HAT: histone acetyltransferase

HBO1: KAT7 (lysine acetyltransferase 7)

HBZ: basic leucine zipper factor

HDAC: histone deacetylase

HDM: histone demethylase

HEK: human embryonic kidney

HGH: human growth hormone

Hi-C: high-throughput chromosome conformation capture

HIV: human immunodeficiency virus

HLA: human leukocyte antigen

HMT: histone methyltransferase

hnRNP: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein

HOXA9: homeobox A9

HP1: heterochromatin protein 1

HSPG: heparan sulfate proteoglycan

hTERT: human telomerase reverse transcriptase

HTLV-1: human T-cell lymphotropic virus type 1

IHH: Indian hedgehog

IKK: I kappa B kinase

IL: interleukin

INT6: integrator complex subunit 6

ISE: intronic splicing enhancer

ISS: intronic splicing silencer

ISWI: imitation switch

JNK: c-Jun N-terminal kinase

LCR: locus control region

LDB1: LIM domain binding 1

LHX2: LIM homeobox 2

LLPS: liquid-liquid phase separation

IncRNA: long non-coding RNA

LPS: lipopolysaccharide

LTR: long terminal repeat

MA: matrix protein
MAPK(KK): mitogen-activated protein kinase (kinase kinase)

MED23: mediator complex subunit 23

MEKK1: mitogen-activated protein kinase kinase 1

MMP-9: matrix metalloproteinase-9

MRG15: mortality factor-related gene 15

MSK1: mitogen- and stress-activated protein kinase 1

MyoD: myogenic differentiation 1

Nacc1: nucleus accumbens-associated protein 1

NAP1: nucleosome assembly protein 1

NC: nucleocapsid

NCAM: neural cell adhesion molecule

NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NF-YB: nuclear transcription factor Y subunit beta

NHEJ: non-homologous end joining

NIK: NF-kappa-B-inducing kinase

NMD: nonsense-mediated mRNA decay

NRP: neuropilin

NRP-1: neuropilin-1

NS: Nuclear speckle

NUP98: nucleoporin 98

PAX3: paired box gene 3

PCAF: p300/CBP-associated factor

PCNA: proliferating cell nuclear antigen

PI3K/Akt: phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B

PKA: Protein kinase A

PRC2: Polycomb repressive complex 2

Pre-mRNA: Precursor messenger RNA

Pro: Protease

PTB: Polypyrimidine tract-binding protein

P-TEFb: Positive transcription elongation factor b

PTHrP: Parathyroid hormone-related protein

PTM: Post translational modification

INO80: Phosphotransferase-related protein

MINO80

RANKL: Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand

RBM20: RNA-binding motif protein 20

RBM4: RNA-binding motif protein 4

RBP: Retinol-binding protein

RHD: Rel Homology Domain

RNA-FISH: RNA fluorescent in situ hybridization

RNP: Ribonucleoprotein

RPA: Replication protein A

RPABC3: RNA polymerase II-associated protein 3

RPAC1: RNA polymerase II-associated protein complex subunit 1

RPB2: RNA polymerase II subunit B2

RRM: RNA recognition motif

RTK: Receptor tyrosine kinase

RUNX1/RUNX1T1: Runt-related transcription factor 1/Runt-related transcription factor 1 translocation partner 1

SAF1B1/B2: Scaffold attachment factor 1B1/B2

Sam68: Src-associated in mitosis of 68 kDa

SAMD4A: Sterile alpha motif domain-containing protein 4A

SAP1: Serum response factor accessory protein 1

SAPK: Stress-activated protein kinase

Sc35: spliceosomal component 35

SF2/ASF: Splicing factor 2/alternative splicing factor

SL6C6A5: Solute carrier family 6 member 6, isoform A5

snRNP: Small nuclear ribonucleoprotein

Sp1: Specificity protein 1

SP3: Specificity protein 3

SPRITE: Split-pool recognition of interactions by tag extension

SR: Serine-arginine-rich protein

SRA: Steroid receptor RNA activator

SRE: Serum response element

SRF: Serum response factor

SRRM2: Serine/arginine repetitive matrix protein 2

SRSF3/SRp20: Serine/arginine-rich splicing factor 3/20 kDa

SS: Splice site

STAT3: Signal transducer and activator of transcription 3

STLV: Simian T-cell lymphotropic virus

SUMO: Small ubiquitin-like modifier

SUV39H1: Suppressor of variegation 3-9 homolog 1

SWI/SNF: Switch/sucrose nonfermentable complex

TAD: Topologically associated domain

TAK1: TGF-β-activated kinase 1

TaxTax1B1: T-cell leukemia/lymphoma 1B protein

TBP: TATA-binding protein

TCT: T-cell leukemia translocation

TF20: Transcription factor 20

TFIIH: Transcription factor II H

TFII-I: Transcription factor II I

TGF-β: Transforming growth factor

TNFR: Tumor Necrosis Factor Receptor

TNFα: Tumor Necrosis Factor Alpha

TNFAIP2: Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Protein 2

TrxG: Trithorax Group

TSS: Transcription Start Site

TTN: Titin

TxRE: Transcriptional Regulatory Element

U2AF65: U2 small nuclear RNA Auxiliary Factor 65

Ubx: Ultrabithorax

UPF1: Up-frameshift suppressor 1

USF1: Upstream Stimulatory Factor 1

WNT6: Wingless-Type MMTV Integration Site Family, Member 6

XIAP: X-linked inhibitor of apoptosis protein

XPB: Xeroderma Pigmentosum Group B

Zfp871: Zinc Finger Protein 871
Introduction
# 1. Epissage alternatif

## a. Généralités

Chez les eucaryotes supérieurs, les gènes codants les protéines codent des transcrit pré-messagers (pré-ARNm) composés de séquences codantes (exons) et non-codantes (introns). Chez l'homme, les quelques 22 000 gènes codants comportent en moyenne 8 introns (Hong et al., 2006). Pour former un ARN messager mature (ARNm) à partir d'un pré-ARNm, la cellule doit donc être capable de reconnaitre et d'exciser les introns. Cette étape, nommée épissage, est le plus souvent réalisée de façon co-transcriptionnelle par un complexe ribonucléoprotéique (RNP) composé de 5 protéines nucléaires complexées à des petits ARN (small nuclear ribonucleoprotein ou snRNP) et de plus de 200 autres protéines. L'ensemble de ces facteurs forment un large complexe fonctionnel, le splicéosome, qui reconnait et s'assemble sur les sites d'épissage (SS pour Splicing Sites) et réalise les étapes nécessaires à l'exclusion des introns (Figure 1). Ces étapes d'épissage sont finement régulées et peuvent parfois aboutir à l'inclusion ou l'exclusion d'un même exon au sein de l'ARNm. Ce processus appelé épissage alternatif concerne plus de 95% des gènes codants, et permet d'accroître grandement le protéome à partir d'un nombre limité de gènes. En effet, malgré les 22 000 gènes codants, 215 000 isoformes d'ARNm sont retrouvés chez l'homme (Lee and Rio, 2015). Ce phénomène et sa régulation sont impliqués dans de très nombreuses fonctions, et peuvent être spécifiques du tissu. Des épissages alternatifs aberrants sont décrits dans de nombreuses pathologies humaines telles que l'amyotrophie spinale et les cancers (Barash et al., 2010).
<figure><img src="image_3.png" /></figure>

**Figure 1 :** Schéma représentatif de la réaction d'épissage et de la structure. A. La réaction d'épissage démarre par la reconnaissance du site donneur d'épissage 5' (5' Splice Site, 5'SS) reconnu par le U1 snRNP tandis que U2 se fixe au point de branchement (Branch Point Site, BP), formant alors le complexe A (B.). C. Le tri-snRNP U4/U6.U5 est recruté pour former le complexe pré-catalytique B. D. Les snRNP U1 et U4 sont évincés du complexe B qui est alors actif et catalyse la première réaction de trans-estérification. E. Le complexe C est formé et réalise la seconde réaction de trans-estérification permettant de connecter les deux exons ensemble. F. Le lariat formé par l'intron est libéré, et les facteurs d'épissage évincés du transcrits sont recyclés pour un nouveau cycle catalytique. Adapté de Lee and Rio, 2015.

## b. Régulations de l'épissage alternatif

### i. Séquences cis-régulatrices et facteurs trans-régulateurs

Chaque site d'épissage peut être défini par une séquence consensus très conservée (Figure 2). Les sites d'épissage peuvent être « forts » ou « faibles ». Les sites d'épissages forts ou faibles peuvent être définis selon leur degré de divergence par rapport au motif consensus, permettant ainsi une reconnaissance plus ou moins efficace de ces sites par les snRNP, respectivement. Des sites forts induiront un épissage constitutif et les exons correspondants seront toujours retrouvés dans l'ARNm. En revanche, un site faible d'épissage verra son utilisation varier et donc le pourcentage d'inclusion de l'exon variera selon le contexte cellulaire.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 2 : Les sites d'épissage et leurs séquences consensus. D'après McManus and Graveley, 2011.</figcaption></figure>

Selon la position des sites d'épissage forts et faibles, plusieurs évènements d'épissage alternatif ont alors lieu, tels que l'exclusion/inclusion d'un exon ou encore l'utilisation d'un SS 3' ou 5' alternatif (Figure 3). L'utilisation de ces sites faibles peut être régulée par des séquences cis-régulatrices, et par d'autres facteurs agissant en trans.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 3 : Les principaux types d'épissage alternatif. Plusieurs évènements d'épissage alternatifs différents existent, selon la position des sites d'épissage utilisés. Ces évènements sont l'exclusion d'exon entier, la rétention d'intron, l'inclusion d'exons mutuellement exclusifs, ou l'utilisation de 3' ou 5' SS alternatifs menant à l'inclusion ou non d'une partie d'un exon. D'après Zhang et al., 2021.</figcaption></figure>

Les séquences cis-régulatrices sont contenues dans les introns et exons, et peuvent affecter positivement ou négativement la reconnaissance des sites d'épissage. Ils sont ainsi nommés selon leur effet et leur localisation sur le transcrit, et forment 4 familles :
- Les éléments introniques activateurs ou ISE (intronic splicing enhancer)

- Les éléments introniques inhibiteurs ou ISS (intronic splicing silencer)

- Les éléments exoniques activateurs ou ESE (exonic splicing enhancer)

- Les éléments exoniques inhibiteurs ou ESS (exonic splicing silencer).

Ces séquences cis-régulatrices sont la cible des facteurs trans-régulateurs de l'épissage. Ces derniers se distribuent en deux grandes familles : les protéines SR (Ser/Arg-rich) activant les sites d'épissage, et les membres de la famille des RNP nucléaires hétérogènes (heterogeneous ribonucleoprotein particle ou hnRNP), inhibant l'utilisation des sites d'épissage (Figure 4).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 4 : Schéma représentatif des séquences cis-régulatrices et acteurs trans-régulateurs de l'épissage alternatif. Des séquences cis-régulatrices peuvent influencer les décisions d'épissage alternatif. Ces séquences peuvent être introniques (ISS, ISE) ou exoniques (ESE, ESS) et sont de deux types. Les séquence de type enhancer (ISE et ESE) permettent de recruter des protéines activatrices telles que les protéines SR favorisant le recrutement des snRNP. Les séquences de type silencer (ISS et ESS) recrutent des protéines inhibitrices telles que les hnRNP qui inhibent l'assemblage du splicéosome sur l'ARN. D'après McManus and Graveley, 2011.</figcaption></figure>

## ii. Les protéines SR, activateurs de l'épissage

La famille des protéines SR contient des facteurs tels que SF2/ASF (splicing factor 2/alternative splicing factor) ou Sc35 (spliceosomal component 35). Les protéines SR se caractérisent par leur domaine riche en dipeptides arginine et sérine, et par un domaine de fixation à l'ARN (RNA Recognition motif ou RRM) (Long and Caceres, 2008). Elles se fixent sur les sites ISE et ESE et favorisent la reconnaissance des sites d'épissage notamment en stabilisant snRNP U1 au 5'SS et/ou U2AF au 3'SS, ainsi que les interactions protéine-protéine permettant de relier les 5' et 3'SS (Shen et al., 2004). Les protéines SR sont à la fois impliquées dans les processus d'épissage constitutif et alternatif.

## iii. Les protéines hnRNP, inhibiteurs de l'épissage

Les hnRNP présentent aussi un domaine RRM permettant la fixation sur les sites ISS et ESS. Les facteurs hnRNP induisent une répression des sites d'épissage. Les mécanismes de cette
répression restent peu décrits, mais impliquent une oligomérisation sur les exons, cachant les
sites d'épissage, ou une répression de la fixation des snRNP (Busch and Hertel, 2012). Outre
les processus d'épissage, Les protéines hnRNP sont engagées dans de nombreux autres
mécanismes dont la stabilisation des ARNm et les régulations transcriptionnelles et
traductionnelles (Geuens et al., 2016).

iv. Structures secondaires d'ARN et modulation de l'épissage alternatif

Les ARN sont capables de repliements par hybridation intramoléculaire et forment de
nombreuses structures secondaires. Les facteurs d'épissage (comme les hnRNP) fixent pour la
plupart des séquences monocaténaire d'ARN (Auweter et al., 2006). Les structures secondaires
d'ARN peuvent masquer des motifs cis-régulateurs et affecter la régulation des sites d'épissage
par le splicéosome (Buratti and Baralle, 2004; Warf and Berglund, 2010). Ce processus a été
impliqué dans la régulation de l'inclusion de l'exon 3 du gène HGH, où une tige-boucle d'ARN
en amont du site 3'SS de l'exon 3 du transcrit HGH masque le site 3'SS alternatif (Estes et al.,
1992). Des mutations déstabilisant ou stabilisant cette structure permet d'induire une
augmentation ou une réduction de l'utilisation du site 3'SS, respectivement. Ces structures
secondaires d'ARN peuvent être déroulées par des hélicases à ARN, définissant ainsi ces
facteurs comme des acteurs majeurs de l'épissage constitutif et alternatif. Nous nous
intéresserons ici plus particulièrement aux hélicase de la famille des DEAD-box p68/DDX5 et
p72/DDX17.

v. Les hélicases DDX5 et DDX17 et leurs rôles dans le couplage de l'épissage et de la transcription

i. Structure et fonction des hélicases DDX5 et DDX17

Les hélicases DDX5 et DDX17 sont deux hélicases paralogues, appartenant à la famille des hélicases à domaine DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) leur conférant une activité hélicase dépendante de l'ATP (Bourgeois et al., 2016). Ces deux hélicases partagent un domaine ATPase et hélicase très conservé, ayant plus de 90 % d'homologie entre elles, mais présentent des extrémité N- et C-terminales divergentes (Giraud et al., 2018). Ces deux hélicases sont retrouvées exprimées
de façon ubiquitaire, bien que leur expression puisse varier lors du processus de différentiation neuronale (Dardenne et al., 2014; Lambert et al., 2018). Ces hélicases jouent un rôle dans de nombreux processus des ARN, dont le contrôle des microARN. Ces hélicases sont aussi impliquées à la fois dans la régulation transcriptionnelle et l'épissage alternatif, et notamment dans le couplage entre ces deux processus.

## ii. Régulation de l'épissage alternatif par DDX5 et DDX17

Les hélicases DDX5 et DDX17 jouent un rôle dans la modulation de l'épissage alternatif, via la déstructuration de structures secondaires qui masquent des sites d'épissage ou des éléments cis-régulateurs (Camats et al., 2008; Hönig et al., 2002). Par exemple, p68/DDX5, dans le cas de l'exon 10 du transcrit Tau, est recrutée par le facteur d'épissage RBM4 (se fixant sur un ISE), et déroule une structure en tige-boucle au niveau du site de fixation du snRNP U1 en aval de l'exon 10 (Figure 5). La déstructuration de cette tige boucle par p68/DDX5 permet ainsi la fixation de U1 snRNP et l'inclusion de l'exon 10, dont des défauts d'épissage sont impliqués dans des Tauopathies (Kar et al., 2011). Cette régulation est dépendante de l'activité ATPase de p68/DDX5, car un mutant déficient en activité ATPase induit une exclusion de l'exon 10. Outre son implication dans l'épissage alternatif, p68/DDX5 est également impliqué dans la réaction canonique d'épissage, en permettant la dissociation de l'U1 snRNA du site 5'SS, de façon dépendante de son activité ATPase (C. Lin et al., 2005).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 5 : Epissage alternatif de l'exon 10 de Tau par DDX5. La présence d'une structure secondaire au niveau du 5'SS de l'intron 10 de Tau empêche la reconnaissance du 5'SS par U1 snRNP, induisant l'exclusion de l'exon 10. Le recrutement de DDX5 par RBM4, permet de déstructurer cette boucle grâce à son activité hélicase, rendant accessible le 5'SS et permettant l'inclusion de l'exon 10. D'après Ramanouskaya and Grinev, 2017.</figcaption></figure>
c. Couplage entre transcription et épissage alternatif

Il est dorénavant bien établi que, contrairement aux premiers modèles proposés, les étapes de maturation des pré-ARNm ne sont pas réalisées de manière séquentielle après la synthèse du pré-ARNm, mais de manière concomitante à sa transcription. On parle de procédés co-transcriptionnels qui sont mis en place pour la régulation de la coiffe 5', l'épissage, et la polyadénylation.

La première démonstration *in vivo* de ce mécanisme co-transcriptionnel de l'épissage a été faite lors d'expériences de microscopie électronique avec des ARN naissants d'embryons de drosophiles, où il a été observé une excision d'un intron avant la transcription de l'intron localisé en aval (Beyer and Osheim, 1988). Cette même étude a montré par ailleurs que certains transcrits naissant subissent également une exclusion d'exon, indiquant que ce processus de couplage avec la transcription concerne également les mécanismes de régulation de l'épissage alternatif. Toujours chez la drosophile, des expériences de séquençage à haut débit d'ARN naissants ont également pu démontrer qu'une vaste majorité (87 %) des introns sont épissés préférentiellement de manière co-transcriptionnelle, et que la longueur et la position des introns influencent leur degré d'épissage (Khodor et al., 2011). Par la suite, ces mécanismes ont pu être confirmés chez l'homme dans des cellules de cerveau et de foie (Ameur et al., 2011). Cependant, certains ARNs peuvent présenter des introns après leur transcription, qui ne seront épissés que de manière post-transcriptionnelle. C'est notamment le cas lorsque des structures secondaires fortes masquent des sites d'épissage (Vargas et al., 2011).

Un couplage entre transcription et épissage alternatif suggère que ces deux phénomènes peuvent s'influencer l'un l'autre. En effet, des éléments clés de la régulation transcriptionnelle tels que la structure du promoteur, des facteurs de transcription ou de remodelage de la chromatine, sont capable d'influencer les décisions d'épissage (Kornbliht et al., 2013). De la même manière, certaines protéines décrites initialement comme des facteurs d'épissage peuvent exercer un rôle sur la transcription. Deux modèles, qui ne sont pas mutuellement exclusifs, ont été proposés afin d'expliquer le couplage étroit entre épissage alternatif et
transcription : les modèles de couplage par recrutement, et le modèle de couplage par cinétique d’élongation de la transcription.

## i. Modèle de recrutement

Le modèle de couplage par recrutement repose sur la capacité de la machinerie de transcription à recruter des facteurs allant affecter les décisions d’épissage. Ainsi, l’ARN polymérase II (ARNPII) apparait comme l’acteur majeur de ce modèle, notamment via son domaine C-terminal (C-terminal domain ou CTD) qui, chez l’homme, est composé de 52 répétitions de l’heptapeptide Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Plus particulièrement, les Sérines 2 et 5 sont des cibles de phosphorylations qui régulent l’initiation et l’élongation productive de la transcription par l’ARNPII (Phatnani and Greenleaf, 2006).

Le CTD exerce un rôle central dans le couplage de la transcription et des mécanismes de maturation des ARN. Il a été montré qu’une troncature du CTD engendre une inhibition du coiffage, de l’épissage et du clivage et polyadénylation (McCracken et al., 1997), (Fong and Bentley, 2001). Par ailleurs, une inhibition de la phosphorylation du CTD par le DRB (5,6-Dichlorobenzimidazole 1-β-D-Ribofuranoside) permet d’inhiber l’épissage co-transcriptionnel dans les ovocytes du xénope (Bird et al., 2004). De nombreux facteurs d’épissage comme les protéines SR ou U1snRNP, interagissent avec le CTD (Das et al., 2007). L’ARNPII joue ainsi le rôle de plateforme de recrutement pour des facteurs d’épissage, modulant ainsi l’épissage alternatif. Dans le modèle de minigène utilisant le domaine fibronectin extra domain I (EDI), il a été montré que le recrutement de SRp20 (SRSF3) au niveau du CTD permet d’induire l’exclusion de l’EDI, tandis que l’utilisation d’une ARNPII dépourvue de CTD, et donc incapable d’interagir avec SRp20, induit une inclusion de l’EDI (Figure 6) (de la Mata and Kornbliytt, 2006).
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 6 :** Exemple de modèle de recrutement. A. Dans un contexte wild-type, l'ARN polymérase II, via son CTD, permet de recruter la protéine SR SRp20, qui va induire l'exclusion de l'exon EDI de la fibronectine en inhibant le recrutement du splicéosome. B. Une polymérase présentant une troncature du CTD n'est plus capable d'interagir avec SRp20, et induira donc un plus grand niveau d'inclusion de l'EDI. D'après Muñoz et al., 2010.</figcaption></figure>

Un second exemple intéressant est le rôle du complexe Médiator, acteur majeur dans la régulation de la transcription. Une de ses sous-unité, MED23, joue un rôle dans l'épissage alternatif, via son interaction avec des facteurs d'épissage notamment hnRNP L (dont l'interaction est validée *in vitro* et *in vivo*), dont le niveau d'occupation au niveaux d'exons régulés est modulé par MED23. De façon intéressante, leurs données de spectrométrie de masse ont permis d'identifier d'autres facteurs d'épissage dont DDX17 ou encore hnRNP H1 (Huang et al., 2012).

L'état de phosphorylation du CTD permet de moduler le recrutement des facteurs trans-régulateurs de l'épissage alternatif. La forme hyperphosphorylée de l'ARNPII interagit *in vitro* avec des facteurs d'épissage snRNP et SR (Mortillaro et al., 1996). En particulier, la forme Ser5P (phosphorylation en Sérine 5) du CTD, interagit spécifiquement avec des composants du splicéosome, dont les snRNA U1, U2, U4 et U5, les protéines Sm, U1 et U2 snRNP) (Nojima et al., 2018). Une ARNPII modifiée de telle sorte que la Ser2 du CTD n'est pas phosphorylable a
été montrée incapable de recruter les facteurs UAF65 et le snRNA U2, et en conséquence induit des défauts d'épissage du gène C-FOS (Gu et al., 2013).

Cette influence de la transcription sur les décisions d'épissage est également réciproque selon ce modèle. En effet, le recrutement de facteurs d'épissage par le CTD peut influencer la transcription (Fong and Zhou, 2001). Une déplétion du facteur Sc35 induit une accumulation d'ARNPII aux niveau des corps des gènes, suggérant une pause de cette dernière (Lin et al., 2008). Cette accumulation est associée à une diminution de l'interaction entre le CTD et P-TEFb (complexe catalysant la phosphorylation du CTD en Sérine 2 afin d'induire une élongation productive), et donc également à une diminution de Ser2P. Ces données suggèrent que le facteur d'épissage Sc35 joue donc un rôle dans la transcription, en promouvant l'interaction entre P-TEFb et le CTD, afin de stimuler l'élongation.

## ii. Modèle cinétique

Le second modèle de couplage entre transcription et épissage repose sur la vitesse d'élongation de l'ARNPII. Selon ce modèle, la cinétique d'élongation régit l'épissage alternatif en modulant la vitesse à laquelle les sites d'épissages et leurs séquences régulatrices apparaissent sur le transcrit naissant durant l'élongation de l'ARNPII (Figure 7). Une polymérase lente favorisera l'inclusion d'exons alternatifs, tandis qu'une élongation rapide induira leur exclusion (Fong et al., 2014). Il est proposé qu'une élongation lente permet d'agrandir la fenêtre temporelle durant laquelle des séquences d'épissages faibles peuvent être mieux reconnues et utilisées par le splicéosome. Dans ce contexte, un exon défini par des sites d'épissage faibles sera sélectionné et inclus dans l'ARNm lors d'un ralentissement ou d'une pause de l'ARNPII. Au contraire, une élongation rapide diminuera cette fenêtre temporelle, car des séquences plus fortes situées en aval seront reconnues plus rapidement, et le splicéosome favorisera alors l'utilisation de ces sites plus forts, induisant une exclusion de l'exon faible.
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Figure 7 : Modèle cinétique de l'épissage alternatif.** A. Lors de la transcription par l'ARN polymérase II, une vitesse d'élongation rapide va favoriser l'inclusion d'un exon en aval portant un site 3'SS plus fort que l'exon en amont, induisant l'exclusion de l'exon portant un 3'SS faible. B. Une vitesse d'élongation faible permet de laisser plus de temps pour recruter les composants du splicéosome avant que le site 3'SS fort en aval soit transcrit et reconnu par le splicéosome. Dans ce contexte, un exon portant un site 3'SS faible sera alors inclus. D'après Kornbliytt et al., 2013.

En utilisant l'exemple de l'EDI mentionné plus haut, il a été démontré qu'une mutation de l'ARNPII menant à une transcription plus lente (mutant C4), induit une augmentation du taux d'inclusion d'EDI, et de l'exon 18 de *NCAM* (de la Mata et al., 2003; Schor et al., 2009). De la même façon, une inhibition de l'élongation par une drogue (le DRB) permet une plus forte inclusion d'EDI (Nogues et al., 2002). Cette observation a également été faite à l'échelle génomique dans des cellules T lymphoïdes (Jurkat), de même qu'avec une autre drogue interférant avec l'élongation de l'ARNPII, la camptothécine (Ip et al., 2011). Au niveau de l'exon 5 du gène CD45, il a été montré qu'une pause de l'ARNPII induite par la fixation du facteur CTCF, agissant comme une barrière transcriptionnelle, permet l'inclusion de cet exon faible (Shukla et al., 2011). De façon inverse, une stimulation de l'élongation par l'enhancer SV40 ou le facteur Tat de HIV induisent une exclusion de l'EDI.
Outre CTCF, la sous unité Brm du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF interagit avec les composants du splicéosome U1 et U5 (Batsché et al., 2006). Notamment, Brm interagit avec le facteur Sam68 pour induire un épissage alternatif de l'exon v5 du gène CD44. Cet épissage est associé à une accumulation de l'ARNPII-Ser5P, signant une pause transcriptionnelle au niveau de l'exon variable. Les auteurs suggèrent alors un modèle alliant cinétique et recrutement, où Sam68 se fixe sur l'ARN pour reconnaitre une séquence régulatrice recrutant Brm à proximité de l'ARNPII, permettant le recrutement de snRNP et induisant une pause des ARNPII suivantes, favorisant l'inclusion de l'exon v5. Ce modèle propose que la modification de la structure de la chromatine, comme dans le cas d'une relaxation des nucléosomes, peut influencer les décisions d'épissage en modulant la cinétique d'élongation. Par exemple, lors de la dépolarisation de cellules neuronale, l'exon 18 du gène NCAM est exclu (Schor et al., 2009). Les auteurs démontrent que cet évènement est lié à une hyperacétylation des histones et une décondensation de la chromatine permettant une vitesse d'élongation accrue.

La réciproque fonctionnelle, c'est-à-dire un couplage entre épissage et transcription, a également été démontrée (Fong and Zhou, 2001). Par exemple, la déplétion du facteur Sc35 induit une accumulation d'ARNPII aux niveau des corps des gènes, suggérant une pause de cette dernière (Lin et al., 2008). Cette accumulation est associée à une diminution de l'interaction entre le CTD et P-TEFb (un facteur d'élongation transcriptionnelle impliqué dans la phosphorylation de la Ser2 du CTD), et donc également à une diminution de Ser2P. Ces données suggèrent que le facteur d'épissage Sc35 influence la cinétique de transcription, en favorisant l'interaction entre P-TEFb et le CTD, afin de stimuler l'élongation de l'ARNPII.

### iii. Exemple du couplage entre transcription et épissage par les hélicases DDX5 et DDX17

Les hélicases DDX5 et DDX17 interagissent directement avec l'ARNPII et de nombreux facteurs de transcription comme NF-κB/p50, Erα, SMAD ou encore STAT3, modulant ainsi leurs fonctions dans la régulation de la transcription (Rossow and Janknecht, 2003). Au niveau de la chromatine, DDX5/17 interagissent aussi avec des facteurs de modification des histones tels que SWI/SNF, CBP/p300, HDAC1, et EHMT2. Par cette voie, DDX5/17 sont capables de moduler
l'acétylation et la méthylation des histones, et donc la régulation de l'expression des gènes. Enfin, DDX5/17 interagissent avec le facteur CTCF, régulateur de la transcription (Marino et al., 2019). Ces interactions peuvent reposer sur des ARN non codants (Akhade et al., 2014; Sallam et al., 2018). DDX5/17 ont été décrits en interaction avec le long ARN non codants (IncRNA) SRA, qui à son tour se lie à de nombreux facteurs de transcription comme Erα, Notch1, CTCF ou MyoD pour réguler leur activité (Yao et al., 2010). Un exemple est le cas de l'interaction de SRA avec le complexe trithorax (Trithorax group TrxG) et le complexe répressif polycomb 2 (polycomb repressive complex 2 ou PRC2). DDX5/17 améliorent l'interaction entre SRA et TrxG, facilitant la déposition SRA/TrxG-dépendante des marques d'histone activatrices comme H3K4me3 (Wongtrakoongate et al., 2015).

#### iv. Facteurs de transcription et épissage alternatif

Les facteurs de transcription jouent également un rôle dans la régulation de l'épissage alternatif. Ces régulations peuvent être indirectes et passer par une régulation de l'expression de facteurs d'épissage. C'est par exemple le cas du facteur RUNX1/RUNX1T1, Zfp871 et Nacc1 qui induisent une expression différentielle de facteurs d'épissage, modulant ainsi l'épissage alternatif (Grinev et al., 2021; Han et al., 2017).

De façon intéressante, certains facteurs de transcription semblent jouer un rôle plus direct dans l'épissage alternatif. Chez la levure, il a été montré que le facteur mei4 est capable d'interagir avec l'ARNPII en élongation (phosphorylée en Ser2/Ser5), et de recruter directement les composants du splicéosome sur plusieurs ARN comme *rem1*, permettant leur épissage (Moldón et al., 2008). Chez la drosophile, il a été fait la même observation avec le facteur Ubx qui interagit à la fois avec des RBP et le CTD de l'ARNPII, et permet de médier un épissage alternatif à la fois dépendant de la cinétique d'élongation et du recrutement actif de facteurs d'épissage (Carnesecchi et al., 2021, 2020). De plus, Ubx est retrouvé fixé non seulement aux promoteurs mais également de façon intragénique, suggérant un rôle supplémentaire que celui de recrutement de la machinerie de transcription. Ces deux études argumentent un modèle où les facteurs de transcription seraient recrutés au promoteur, mais via leur interaction avec l'ARPII pourraient « traverser » le gène avec l'ARNPII et ainsi recruter le splicéosome sur les exons cibles. Le facteur de transcription FBI-1, en interagissant avec Sam68, permet d'inhiber sa fixation sur l'ARN de BCL-X, favoriserent ainsi la forme longue anti-
apoptotique BCL-XL (Bielli et al., 2014). En revanche, la déplétion de FBI-1 ou l'expression d'un
mutant de Sam68 incapable d'interagir avec FBI-1, favorisent la forme courte BCL-XS médiée
par la fixation de Sam68 sur l'ARN. Egalement, le facteur de transcription oncogène c-myc
induit une inclusion de l'exon 3 de Sam68 en se fixant au promoteur du gène et en induisant
une elongation rapide de l'ARNPII, qui s'accompagne d'une faible fixation de hnRNPF (Caggiano
et al., 2019). En revanche, une déplétion de c-myc induit une baisse de la cinétique
d'élongation de l'ARNPII et un recrutement plus important de hnRNPF, permettant d'induire
l'exclusion de l'exon 3 de Sam68. Ces études récentes suggèrent ainsi que les facteurs de
transcription sont capables d'exercer un rôle supplémentaire que leur régulation de la
transcription. En effet, que ce soit par une modulation de la cinétique de transcription, ou par
le recrutement de facteurs d'épissage, différents mécanismes semblent être employés par les
facteurs de transcription afin de réguler l'épissage alternatif (Figure 8).

Outre ces effets sur la machinerie de transcription, toutes les composantes de la structure de
la chromatine, à l'échelle du gène ou de l'espace tridimensionnel du noyau, semblent
impliquées dans la régulation de l'épissage alternatif. Ces points seront l'objet des deux
prochaines parties.
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Figure 8 : modèles d'implication des facteurs de transcription.** (a) Les facteurs d'épissage peuvent moduler les décisions d'épissage alternatif via leur seule fixation au promoteur. (b,c) La fixation de facteurs de transcription sur les promoteurs ou enhancers peut stimuler l'épissage alternatif via la formation de boucle de chromatine. (d) La fixation des facteurs de transcription peut influencer la nature des ARNm via la sélection de TSS ou de promoteur alternatif. (e) La fixation intragénique des facteurs de transcription peut directement altérer l'épissage alternatif. (f) La fixation des facteurs de transcription peut altérer l'épissage alternatif par un remodelage de la chromatine. (g) L'interaction des facteurs de transcription avec l'ARNPII au promoteur permet leur traversée sur les gènes, et d'influencer directement l'épissage. (h) L'interaction des facteurs de transcription avec l'ARNPII peut permettre le recrutement de facteurs d'épissage ou le remodelage de la chromatine influençant l'épissage alternatif. (i) Les facteurs de transcription peuvent directement interagir avec des RBP dans divers afin de réguler leur recrutement et leur fonction sur l'épissage alternatif. (j) Les facteurs de transcription peuvent moduler la localisation subnucléaire de RBP régulant ainsi leurs fonctions. (k) Les facteurs de transcription peuvent également réguler l'épissage alternatif en interagissant avec l'ARN naissant. D'après Boumpas et al., 2023.
## 2. Organisation linéaire de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

### a. Nucléosome : l'unité de base de la chromatine

La chromatine est un assemblage nucléoprotéique complexe, composé d'ADN génomique, d'ARN, et de protéines (histone et non-histones). Dans une cellule eucaryote, l'ADN génomique est habillé d'octamères d'histones autour desquels s'enroule des unités de base de l'organisation de la chromatine appelées nucléosomes (Luger et al., 1997). Ces structures nucléoprotéiques découvertes par Albrecht Kossel en 1884 se replient les unes sur les autres pour former des fibres de 30 nm de diamètre, puis des structures de différentes échelles qui permettent d'assurer la compaction de près de deux mètres d'ADN au sein d'un noyau d'une dizaine de µm de diamètre. Outre ces effets de structuration de l'ADN, les nucléosomes jouent un rôle de plateforme mise en jeu dans le recrutement de nombreux facteurs de régulation de l'expression des gènes ou de la réplication de l'ADN.

Le nucléosome est un complexe formé d'une séquence d'ADN de 147 pb en moyenne et de deux copies respectives des histones H2A, H2B, H3 et H4 (Figure 9). L'histone H1 maintient quant à elle l'ADN enroulé sur le nucléosome (McGinty and Tan, 2015). La formation des nucléosomes, c'est-à-dire l'interaction de l'ADN nu avec les histones, s'opère au cours de la réplication. Les histones présentent des extrémités N- et C-terminales non structurées, qui émanent du cœur du nucléosome. Exposées au solvant, elles constituent des cibles de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTM, pour post translational modifications) permettant la régulation fine de la structure de la chromatine et de l'expression des gènes.
## b. Histones PTM, impact sur la chromatine et la transcription

### i. Remodelage de la chromatine, une nécessité pour la régulation des gènes

De par le rôle de compaction du génome, les nucléosomes sont un obstacle à l'accessibilité des séquences de régulations. Des facteurs de remodelage des histones permettent de lever ces obstacles. Quatre grandes familles de remodeleurs sont aujourd'hui définies : switch/sucrose nonfermentable (SWI/SNF), imitation switch (ISWI), chromodomain-helicase-DNA-binding protein (CHD), et inositol-requiring 80 (INO80) (Saha et al., 2006). Ces facteurs comportent tous un domaine ATPase qui permet de réguler le dépôt, le positionnement, l'éviction, et la composition des nucléosomes. Ces complexes sont engagés dans divers mécanismes, comme par exemple la réparation de l'ADN pour les facteurs du complexe INO80 ou l'assemblage de la chromatine lors de la réplication de l'ADN avec le complexe ISWI (Collins et al., 2002; Fyodorov and Kadonaga, 2002). Les facteurs du complexe SWI/SNF sont recrutés sur des histones arborant des lysines acétylées, notamment au niveau des promoteurs (Singh et al., 2007), et permettent la translocation et l'éviction des nucléosomes, rendant l'ADN accessible à la machinerie transcriptionnelle.

### ii. Histones PTM et impact sur l'état de la chromatine

Initialement, la chromatine fut divisée en deux états : l'euchromatine, présentant une chromatine décondensée, accessible et présentant un niveau de transcription élevé, et l'hétérochromatine, une forme plus condensée et présentant un faible niveau de transcription. Ces deux états de la chromatine sont réversibles et interchangeables via des modifications épigénétiques. Une des régulations majeures de la structure et de l'état de la chromatine réside dans la modulation des marques apposées sur les histones. Leurs extrémités N- et C- terminales sont la cible de nombreuses modifications covalentes post-traductionnelles. L'ensemble de ces modifications, et leur combinaison, permettent de définir un « code chromatinien » qui, lu par divers facteurs, peut définir des événements fonctionnels localisés (Strahl and Allis, 2000). Il existe une myriade de PTM des histones dont la méthylation, l'acétylation, la phosphorylation, et l'ubiquitylation, la sumoylation, qui sont les plus étudiées, mais également d'autres modifications plus récemment identifiées telles que la butyrylation,
ou encore la crotonylation (Figure 9). Seuls seront abordés plus après les mécanismes et l'impact fonctionnel des acétylations et méthylations des histones. En dehors des PTM, il est à noter que certaines histones comportent également des variants qui participent à la régulation fine de la chromatine (Henikoff and Smith, 2015). Il existe des variants d'histone pour H1, H2A, H2B, H3 ainsi que H4, et ces variants peuvent être déposés sur la chromatine de façon réplication-indépendante, en remplaçant les histones évincées. Par exemple, le variant de H2A, H2A.X, comporte un motif phosphorylable en C-terminal, qui une fois phosphorylé (on parle alors de γH2A.X) joue un rôle dans le recrutement d'enzymes de réparations aux cassures double brin (Kuo and Yang, 2008). Le variant H3.3 est retrouvé chez de nombreuses espèces comme l'homme, la drosophile, et Arabidopsis. Il remplace H3 au niveau des régions actives transcriptionnellement lors de l'éviction des nucléosomes par l'ARNPII, et, et joue un rôle dans la reprogrammation épigénétique de la lignée germinale (Ooi et al., 2006).
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 9 : Composition et modifications post-traductionnelles des nucléosomes. (a) Un nucléosome est canoniquement composé des histones H2A, H2B, H3, H4 et de l'histone linker H1. Les variants d'histones existants sont représentés. (b) Les histones composant les nucléosomes sont la cible de nombreuses modification post-traductionnelle. Les modifications principales déposées sur les extrémités C- et N-terminales sont représentées, ainsi que leurs positions. Ac : acétylation ; Me : méthylation ; Ph : phosphorylation ; Ub : ubiquitinylation. D'après (Zhao et al., 2013).</figcaption></figure>

L'avènement de techniques d'analyse de la chromatine a permis d'établir une carte de la répartition sur le génome des différentes marques d'histone et de leur associer un rôle. Ces analyses reposent principalement sur des données de MNase-seq (MNase digestion followed by high-throughput sequencing), technique permettant l'identification de la distribution des nucléosomes, et de ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing) des marques d'histones, permettant de connaître la distribution de chaque marque d'histone. Les marques et combinaisons de marques portées par les histones permettent de définir des sites fonctionnels spécifiques de la chromatine, comme les promoteurs, enhancers, les régions de
répression transcriptionnelle, les sites de réplication ou les sites de dommage à l'ADN. Le rôle
des PTM d'histone est de pouvoir recruter des facteurs spécifiques, appelés « readers », et
sont chacune déposées et retirées par des enzymes spécifiques, nommés « writers » et
« erasers » respectivement. Ainsi, les acétylations et méthylations d'histones sont déposées
par des acétyltransférase/méthyltransférase (HAT/HMT) et retirées par des
déacétylases/déméthylases (HDAC/HDM). L'acétylation est la première modification post-
traductionnelle des histones découverte en 1963 (Phillips, 1963). Elle concerne les lysines de
la queue N-terminale (Zentner and Henikoff, 2013) et permet d'affaiblir l'interaction ionique
avec la molécule d'ADN (chargée négativement). Elle est donc associée à une chromatine
ouverte, offrant une meilleure accessibilité aux facteurs de transcription (Hong et al., 1993).
L'acétylation des histones est reconnue par le facteur BRD4 (bromodomain-containing protein
4), qui active l'ARNPII pour l'élongation transcriptionnelle, montrant un lien direct entre
acétylation et transcription (Devaiah et al., 2012). Il est aujourd'hui bien établit que les régions
de la chromatine acétylées sur les Lysines 9 et 27 de l'histone 3 (H3K9ac et H3K27ac
respectivement) sont des région transcriptionnellement actives (Allfrey et al., 1964), tandis
que l'hypo-acétylation des histones s'accompagne d'une répression de la transcription.

L'impact fonctionnel de la méthylation des lysines est plus complexe. Elle peut s'associer à une activation ou une répression de la transcription en fonction de la position du résidu modifié. Contrairement à l'acétylation, la méthylation des histones n'affecte pas leur charge mais elle influence le recrutement de « readers ». La méthylation des Lysines d'histones peut être de type mono-, di- ou tri-méthylés. Certaines marques sont associées à une répression de la chromatine comme la méthylation des Lysines 9, 20 et 27 de l'histone H3 (H3K9me, H3K20me et H3K27m3 respectivement), tandis que les méthylations des Lysines 4, 36 et 79 (H3K4me, H3K36me, H3K79me) sont associées à une activation de la transcription, que ce soit au niveau d'enhancers, de promoteurs ou de corps des gènes (Gates et al., 2017).

iii. Régulation de l'épissage alternatifs par les histones

La répartition des nucléosomes comporte une répartition génomique non-aléatoire. Des
analyses de données de MNase-seq ont pu démontrer notamment un biais de répartition des
nucléosomes au sein des gènes chez l'homme, la drosophile et *Caenorhabditis elegans* (Schwartz et al., 2009). Ainsi, les nucléosomes présentent une occupation plus importante des
bornes des exons (qu'ils soient définis comme exons constitutifs ou alternatif) que des introns.
La préférence des histones pour les régions riches en GC peut expliquer en partie cette
distribution (Andersson et al., 2009). Il apparaît également que le niveau d'occupation des
nucléosomes est inversement proportionnel à la force des sites d'épissage des exons (Tilgner
et al., 2009). Le positionnement et l'enrichissement des nucléosomes aux bornes des exons
pourrait ainsi favoriser la définition des exons et, notamment au niveau des exons faibles,
induire un ralentissement de l'elongation par l'ARNPII en créant un obstacle physique à
l'ARNPII, laissant une fenêtre temporelle plus grande au splicéosome pour reconnaitre et
épisser l'exon (Brodsky et al., 2005). Les niveaux d'occupation des nucléosomes sur les exons,
aussi bien que les introns, sont inversement corrélés au niveau de transcription des exons, ce
qui est cohérent avec une déplétion globale des nucléosomes dans les régions fortement
transcrites. Outre le niveau d'occupation des histones entre les introns et exons, certaines PTM
d'histones sont également enrichies au niveau des exons (Kolasinska-Zwierz et al., 2009; Spies
et al., 2009). En effet, une étude de la distribution de différentes marques d'histones sur le
gène FGFR2 montre que certaines marques, telles que H3K36me3 et H3K27me3, présentent
un enrichissement différent au cours de la transition epithélio-mésenchymateuse, et
coïncident avec un épissage différent des exons IIIb et IIIc (Luco et al., 2010). Notamment, la
régulation de l'épissage de FGFR2 passe par le recrutement de la protéine adaptatrice PTB
reconnaissant ces marques, qui va pouvoir à son tour recruter le facteur MRG15 permettant
la modulation de l'épissage du gène. Plus récemment, l'utilisation de dérivés du système
CRISPR/Cas9 afin d'induire des modifications locales des marques d'histones a pu révéler que
les marques H3K27me3 et H3K27Ac sont suffisantes pour induire des changement d'épissage
des exons de 2 de CTNND1 et IIIb/IIIc de FGFR2 (Segelle et al., 2022). Une étude a également
pu observer qu'un sous-groupe d'exons alternatifs arbore des histones avec des PTM
habituellement retrouvées au niveau de promoteurs (H3K27ac, H3K4me3, H3K9ac) (Curado et
al., 2015)

En considérant que les modèles cinétiques et de recrutement comme régulateurs de l'épissage
alternatif ne sont pas mutuellement exclusifs, la distribution des nucléosomes, de même que
les marques portées par les histones, permettraient de moduler l'épissage alternatif de façon
exon-spécifique. C'est ainsi le cas du gène CD44, gène modèle de l'étude de l'épissage
alternatif, comportant un cluster d'exons variables. Il a été observé que ces exons variables
comportent un enrichissement en H3K9me3 de façon cellule-spécifique, ce qui induit une accumulation de l'ARNPII, suggérant son ralentissement et ainsi favorisant l'inclusion de ces exons alternatifs (Saint-André et al., 2011). L'analyse computationnelle de diverses marques d'histones par ChIP-seq et de leur niveau d'enrichissement à différents sites d'épissages (sites accepteurs, donneurs, corps des exons) a également identifié les marques H3K36me3 et H3K4me1 comme les plus significativement associées à des évènements d'épissage alternatif (Hu et al., 2017). D'autres études qui ont pu mettre en avant le lien entre les modifications d'histones et des évènements d'épissage alternatifs, sont listés dans le tableau ci-dessous.

<table><caption>Tableau 1 : Exemple de modifications post-traductionnelles d'histones reliées à l'épissage.</caption><thead><tr><th colspan="2">Modification</th><th>Effet sur l'épissage alternatif</th><th>Mécanisme (facteurs mis en jeu)</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Méthylation</td><td>H3K4me3</td><td>Recrutement de facteurs d'épissage pour faciliter l'épissage des pré-mRNA</td><td>Interaction avec CHD1 et recrutement de facteurs de splicéosome (U2snRNPs/ protéines SR)</td><td>(Sims et al., 2007)</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Inclusion d'exons variables de CD44, PKN2, TAF4B<br>/</td><td>Diminution de la cinétique d'élongation de l'ARNPII (HP1v, EHMT1/2, U2AF65)<br>Interaction avec des protéines SR (SRp20, ASF/F2) et HP1</td><td>(Saint-André et al., 2011)<br>(Loomis et al., 2009)</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Répression de l'exon IIIb du gène FGFR2<br>Epissage alternatif de SRSF11</td><td>Induction de l'épissage d'exons dépendant de PTB via une protéine adaptatrice (MRG15, PTB)</td><td>(Luco et al., 2010)<br>(Schor et al., 2009)<br>(Xu et al., 2021)</td></tr><tr><td rowspan="2">Acétylation</td><td>H3ac, H4ac</td><td>Exclusion de l'exon 2 de MCL1<br>Exclusion de l'exon 25 de FN1</td><td>Augmentation de la cinétique d'élongation de l'ARNPII (PCAF, HBO1)<br>Augmentation de la cinétique d'élongation de l'ARNPII (SRp40)</td><td>(Khan et al., 2014)<br>(Hnilicová et al., 2011)</td></tr><tr><td>H3K9ac</td><td>Exclusion de l'exon 18 de NCAM</td><td>/</td><td>(Schor et al., 2009)</td></tr></tbody></table>
L'ensemble de ces données suggèrent que l'épissage alternatif est un phénomène intimement
lié à la transcription mais également à la structure linéaire de la chromatine. Cependant, dans
le noyau, la chromatine s'organise de façon tridimensionnelle, et cette organisation a de
nombreuses conséquences transcriptionnelles et co-transcriptionnelles, qui sont discutées
dans la partie suivante.
## 3. Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

### a. Généralités

Le développement des techniques d'imagerie du génome tels que le DNA-FISH et des outils d'analyse des contacts de la chromatine (Chromosome Conformation Capture ou 3C) ont contribué à l'émergence d'un nouveau champ d'étude de la régulation épigénétique à l'échelle tridimensionnelle (Dekker et al., 2002). Depuis, de nombreuses techniques dérivées du 3C, baptisées techniques « C » (4C, Hi-C, ChIA-PET), ont vu le jour, permettant d'interroger grâce au Hi-C l'organisation simultanée du génome entier à l'échelle du kilobase (Figure 10) (Denker and Laat, 2016). Elles reposent toutes sur l'identification de régions chromatiniennes en contacts l'une de l'autre par un procédé de ligation de proximité de régions génomiques à l'origine distantes à l'échelle cis ou trans-chromosomique (Dekker et al., 2002). Les spécificités de certaines de ces techniques les plus utilisées, telles que les Hi-C et 4C, sont présentées dans la Figure 10 (Denker and Laat, 2016).

Le développement de ces techniques « C » a permis de questionner les interactions et proximités spatiales entre loci, à des échelles de plus en plus résolutes afin de comprendre le repliement local, et global du génome. En effet, l'espace nucléaire n'est pas un amas de protéines et d'acides nucléiques aléatoirement distribué. Il est au contraire un organelle hautement régulé sur le plan structurel, présentant de nombreux compartiments et sous-compartiments chromatiniens à l'échelle inter- et intra chromosomique (Figure 11). Cette organisation intervient dans la compaction du génome, mais elle semble également jouer un rôle fonctionnel dans la régulation dynamique de la chromatine et dans l'expression des gènes. Notamment, la transcription, longtemps considérée d'un point de vue linéaire comme une polymérase se déplaçant sur une séquence d'ADN statique, apparaît en réalité comme un acteur majeur dans l'organisation tridimensionnelle du génome.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Introduction Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes</figcaption></figure>

**Figure 10 :** Schéma des grandes étapes des protocoles des principales techniques C. Les techniques C reposent partagent des étapes premières communes : Les cellules sont fixées (crosslink) grâce au formaldéhyde afin de figer les interactions entre loci distants de chromatine. La chromatine fixée est ensuite fragmentée par une enzyme de restriction (H et D), et dans le cas du ChIA-PET, une étape d'immunoprécipitation est également réalisée. Une étape de ligation de proximité est ensuite réalisée, permettant de favoriser la ligation des fragments cross-linkés (ligation intramoléculaire au sein du complexe cross-linké) au détriment de la ligation intermoléculaire par collision aléatoires de deux molécules d'ADN. Une librairie d'ADN chimérique est alors obtenue, témoignant de la fréquence d'intération entre deux loci d'ADN. Ces interactions peuvent être quantifiées par plusieurs façons. Le 3C (Chromosome Conformation Capture) permet l'amplification spécifique par une paire d'oligonucléotides permet d'interoger l'interaction entre deux locis spécifiques. Le 4C (Circular Chromosome Conformation Capture) utilise un second cycle de digestion et de ligation permettant l'obtention de molécules circularisées. Ces molécules sont amplifiées par PCR-inverse avec des oligonucléotides spécifiques d'une région à questionner. L'ADN amplifié est ensuite séquencé et permet d'obtenir l'ensemble des régions formant des interactions avec cette région d'intérêt, appelé aussi viewpoint. La technique de Hi-C utilise un séquençage haut-débit en paire de tous les fragments après ligation. Les séquences obtenues sont formées de deux séquences correspondant aux deux locis interagissant ensemble. Ces séquences sont alors alignées sur le génome et permettent de définir la fréquence d'interaction entre tous les locis à l'échelle du génome. Le ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Pairend-End Tag Sequencing) permet de combiner le Hi-C avec le ChIP-seq, via l'immunoprécipitation de la chromatine. Cette technique permet ainsi de caractériser l'ensemble des interactions associées à la fixation d'une protéine d'intérêt.
## b. Organisation à différentes échelles

### i. Territoires chromosomiques

Les territoires chromosomiques constituent l'échelle la plus large de l'organisation du génome (Figure 11.a). Dans le noyau les chromosomes occupent chacun des domaines distincts, avec peu de contacts inter-chromosomiques à leurs interfaces (Cremer and Cremer, 2010).

### ii. Compartiments A et B

Au sein des chromosomes, à l'échelle de quelques mégabases, la chromatine se répartit en deux compartiments principaux, bien que des données récentes suggèrent des sous-compartiments distincts (Rao et al., 2014). Ces deux compartiments A et B, sont définis selon leur préférence d'interaction entre eux (les compartiments A interagissent préférentiellement avec d'autres compartiments A et vice-versa). Ils se définissent par des données de Hi-C en réalisant une analyse par composante principale. Le compartiment A correspond à des domaines majoritairement actifs et enrichi en gènes transcris et en marques activatrices (H3K27ac, H3K4me3). La chromatine des compartiments A est donc plus ouverte, et se retrouve préférentiellement au centre du noyau (Lieberman-Aiden et al., 2009) (Figure 11.b). A l'inverse, les compartiments B correspondent à des régions de chromatine inactives, plus condensées, associées aux lamines nucléaires et donc à la périphérie du noyau. Contrairement à d'autres niveau d'organisation du noyau comme décrits ci-après, les compartiments A et B ne sont pas aussi conservés et peuvent être cellule-spécifiques (Dixon et al., 2015). Les compartiments A et B peuvent être subdivisés en sous-compartiments, dont le nombre et la définition n'est à ce jour pas totalement établie. Les sous compartiments A1 sont associés à une chromatine très ouverte enrichie en marques activatrices (H3K4me1, H3K36me3, H3K27ac) et en gènes fortement transcrits. Les sous-compartiments B1 et B2 sont quant à eux associés à des marques répressives (comme H3K27me3) et les compartiments B2 et B3 sont associés à la lamine (Liu et al., 2021; Rao et al., 2014).

### iii. Domaines d'association topologique

Des domaines structuraux dits domaines d'association topologique (Figure 11.c) (TAD, pour Topologically Associated Domains) sont définis à l'échelle de la Mégabase (entre 40 kb et 3Mb
## Introduction
Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

en moyenne) (Rao et al., 2014). Les TADs sont délimités par des frontières formant de fortes interactions, majoritairement enrichies en protéines insulatrices comme CTCF (CCCTC-binding factor) et protéines du complexe cohésine, deux acteurs majeur de l'organisation du génome (Dixon et al., 2012). Ces domaines sont relativement conservés à travers les lignées cellulaires et les espèces. Ils forment des structures permettant de confiner les interactions de la chromatine au sein du même TAD, tandis que les interactions entre TADs sont moins fréquentes. La formation de TADs repose principalement sur le modèle d'extrusion de la chromatine. Dans ce modèle, le complexe cohésine (formant une structure en anneau) se fixe à la chromatine et est capable de transloquer une boucle d'ADN, à la manière d'une boucle de corde passée à travers un anneau. Cette boucle d'ADN formée est ensuite extrudée au travers de l'anneau de cohésine, grandissant donc selon l'avancée de l'anneau, jusqu'à la dissociation du complexe, ou jusqu'à rencontrer des sites CTCF. Cependant, ce modèle semble questionné par de récentes études (Banigan and Mirny, 2020; Pradhan et al., 2022). Selon leurs orientations, le rapprochement des sites CTCF va induire la formation d'un homodimère stable de CTCF, stoppant la cohésine, et délimitera alors le TAD. Cependant certains TADs CTCF-indépendants peuvent être définis selon leur état transcriptionnel, suggérant donc que la transcription elle-même puisse jouer un rôle dans l'organisation du génome (Rowley and Corces, 2018), pouvant expliquer la présence de certains TADs cellule-spécifique. Dans ce sens, des études ont montrées que certaines bordures de TADs sont dépendantes de l'interaction de CTCF avec des ARNs (Hansen et al., 2019; Saldaña-Meyer et al., 2019).

Au sein des TADs, de plus petites structures sont observées (à l'échelle sous-mégabase), appelées sub-TAD (Berlivet et al., 2013; Llères et al., 2019; Phillips-Cremins et al., 2013). Il existe plusieurs types de boucles longues ou courte distances au sein des TAD (Figure 11.d). En effet des boucles peuvent concerner plusieurs éléments d'un même gène (boucles intragéniques), ou bien des éléments différents (comme boucles enhancer-promoteur) ou entre plusieurs gènes (boucles intergéniques).
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 11 :** Organisation du génome à différentes échelles et motifs associés sur les cartes d'interaction de Hi-C. (a) A l'échelle du génome, les chromosomes s'organisent en terriroires chromosomiques et forment quelques interaction trans-chromosomiques (b) les chromosomes sont composés de compartiments de même nature épigénétique (actifs en bleu et gris ; inactifs en vert, orange et rouge), appelés compartiments A et B respectivement. (c) A l'échelle de quelques mégabases, la chromatine se ségrége sous forme de TAD, observables sur la carte de Hi-C correspondante (les TAD sont délimités par des lignes noires). Ces TAD peuvent être fonctionnellement enrichis en marques activatrices ou répressives comme indiqué par les représentations des marques d'histones. Les TAD sont bordés par la fixation de CTCF stabilisant des complexes d'extrusion de boucle. (d) A l'échelle des kilobases, différentes boucles peuvent exister et mettre en contact différents régions régulatrices de gènes (promoteur-enhancer, promoteur terminateur) au travers de différents facteurs (tels que CTCF ou le complexe Mediator). D'après Bonev and Cavalli, 2016.</figcaption></figure>
#### iv. Boucles intragéniques

Des boucles intragéniques entre promoteur et terminateur d'un même gène ont été observées, pouvant participer à l'orientation et au recyclage de l'ARNPII, impactant donc le niveau d'expression des gènes (Ansari and Hampsey, 2005; O'Sullivan et al., 2004; Tan-Wong et al., 2012). Il existe également des boucles intragéniques reliant le promoteur et un exon d'un même gène (Curado et al., 2015; Ruiz-Velasco et al., 2017; Shukla et al., 2011)

#### v. Boucles de chromatine intergéniques

Au sein des TADs ont lieu de nombreuses interactions longue distance de l'ordre de plusieurs kilobases entre des régions régulatrices de l'expression des gènes. En effet, un TAD permet de mettre en contact des promoteurs et leurs éléments régulateurs en cis comme les enhancer, situés parfois à plusieurs kilobases de leurs gènes cibles (Li et al., 2012). Ces éléments régulateurs portent des marques activatrices, dont H3K4Me1 et H3K27Ac, et sont capables de recruter l'ARNPII et d'activer la transcription via la formation du complexe de pré-initiation. La formation de TAD participe à la formation d'un environnement tridimensionnel contraint dans lequel un enhancer va pouvoir diffuser et « trouver » facilement son ou ses promoteurs cibles par la formation de boucles chromatiniennes. La structure des TAD permet également de limiter les contacts d'un enhancer à un seul sous-ensemble de gènes, évitant une diffusion plus large à de nombreux gènes de façon aléatoire, ce qui peut induire une expression incontrôlée de gènes et des dysfonctions pathologiques (Franke et al., 2016; Spielmann et al., 2018).

Un exemple permettant d'illustrer l'importance des TADs dans la régulation de l'expression et les pathologies pouvant en découler concerne une région du chromosome 2. Il a été démontré que cette région est découpée en trois TADs adjacents qui comprennent les gènes WNT6 et IHH (TAD 1), EPHA4 (TAD 2), et enfin PAX3 (TAD 3) (Figure 12.a). Des malformations des membres chez l'homme ont été associées à des perturbations de ces bordures de TAD (Lupiáñez et al., 2015). Des analyses de Hi-C et 4C chez des patients et des souris modifiées par CRISPR pour reproduire ces altérations ont permis de montrer que pour le cas de la brachydactylie, une délétion de la séquence de bordure de TAD entre les TAD 2 et 3, aboutit à la formation d'un néo-TAD qui permet l'interaction entre l'enhancer activant le gène EPHA4 et PAX3, induisant la surexpression de PAX3, et ainsi la malformation (Figure 12.b). Le syndrome
Introduction

Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

F (dysplasie acro-pectoro-vertébrale) est quant à lui associé à une inversion au niveau de la bordure entre le TAD 1 et 2, induisant une interaction entre WNT6 et l'enhancer de EPHA4, menant à une surexpression de WNT6 (Figure 12.c). Enfin, une délétion au niveau de la bordure entre le TAD 1 et 2 est associée à une fusion entre ces deux TADs en un néo-TAD, et à un contact entre l'enhancer de EPHA4 et IHH qui est alors surexprimé, entrainant la polydactylie (Figure 12.c).
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 12 : Schéma des altération génétiques et de leurs conséquences sur l'organisation du génome et l'expression des gènes WNT6, IHH, EPHA4 et PAX3 dans diverses pathologies. D'après (Lupiáñez et al., 2015).</figcaption></figure>

Ces boucles locales au sein d'un TAD ne sont pas aussi conservées, et elles peuvent varier selon le type cellulaire. C'est le cas notamment du locus control region (LCR) de la β-globine, où un
## Introduction
Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

contact est observé entre un enhancer et ses gènes cibles seulement dans les lignées erythroïdes qui expriment ce gène (Schoenfelder et al., 2010).

## vi. Facteurs de transcription et boucles de chromatine

Les boucles d'ADN ne concernent cependant pas seulement les enhancers et promoteurs. Il a été montré que des gènes co-régulés par un même facteur de transcription peuvent interagir physiquement, comme c'est le cas avec les gènes de la β-globine, où le facteur de transcription Klf1 induit le des gènes co-régulés, ou encore les facteurs de transcription STAT qui induisent des rapprochements de gènes co-régulés lors de la différentiation des cellules T (Hakim et al., 2013). Récemment, il a été montré que le facteur de transcription EWS/FLI, retrouvé dans les sarcomes d'Ewing, engendre un réarrangement tridimensionnel de la chromatine qui permet de réguler l'expression des gènes ciblés (Showpnil et al., 2022).

Cette formation de boucles longue distante par des facteurs de transcription peut être attribuée à plusieurs mécanismes propres aux facteurs de transcription (Figure 13):

- Ces boucles peuvent être formées grâce à la capacité de certaines protéines de fixer deux loci directement. C'est par exemple le cas des facteurs GATA qui dans leur domaine de fixation à l'ADN (DBD) comportent deux doigts de zinc et sont capable de fixer directement deux sites de fixations comme ce fut déterminé pour GATA3 par cristallographie (Chen et al., 2012).

- D'autres facteurs sont capables de former des homodimères, et ainsi de fixer et rapprocher deux loci distants, comme c'est le cas avec CTCF. Les facteurs de transcription peuvent également s'associer pour former des hétérodimères et induire une boucle de chromatine entre deux loci. Un exemple impliquant la voie NF-κB concerne les facteurs NF-κB p65 et AP-1/c-Jun. En effet des expériences de ChIP et 3C montrent qu'après stimulation au LPS, les sites de fixation NF-κB et AP-1 du promoteur du gène de l'osteopontine (OPN) forment une boucle d'ADN et le gène est exprimé de façon NF-κB dépendante (Zhao et al., 2011). De même, après stimulation au TNFα, les sites de fixation NF-κB et AP-1 du promoteur du gène MMP-9 sont fixés par les facteurs p65 et c-Jun, respectivement, et forment une boucle de chromatine, résultant en une augmentation transcriptionnelle du gène (Chen and Chang, 2015).
## Introduction
Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

- Les boucles d'ADN peuvent être également médiées par des protéines adaptatrices ne fixant pas directement l'ADN, mais interagissant avec plusieurs facteurs de transcription. Un exemple de ce type de boucle concerne les neurones sensoriels olfactifs et plus particulièrement les gènes des récepteurs olfactifs. Ces derniers clustérisent en cis- et trans- grâce à la protéine adaptatrice LDB1, qui en interagissant avec le facteur de transcription LHX2 est capable d'induire des boucles de chromatine par dimérisation (Monahan et al., 2019). Dans ce sens, une manipulation du site d'auto-association de LDB1, en fusion avec des domaines à doigts de zinc spécifiques ciblant le LCR et un gène de globine embryonnaire ont permis de montrer que les deux protéines de fusion dimérisent et induisent une boucle de chromatine entre ces deux sites dans des érythroblastes de souris adultes, permettant ainsi de restaurer l'expression de ce gène (Deng et al., 2014).

- Enfin, d'autres forces, plus faibles que des interactions spécifiques entre protéines, peuvent médier la formation de boucles de chromatine, via des interactions de faible forces et aspécifiques, au sein de condensats. Ceci comme a récemment été démontré pour le facteur de transcription fusion NUP98-HOXA9 retrouvé dans des leucémies, qui établit des boucles de chromatines via sa capacité à former des condensats (Ahn et al., 2021)
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 13 : Schéma des différents modes d'action des facteurs de transcription sur la formation de boucles de chromatine. D'après Kim and Shendure, 2019</figcaption></figure>

Des données récentes, cartographiant la localisation des gènes au sein du noyau, ont pu démontrer que la transcription pourrait jouer un rôle dans l'organisation du génome. En effet, plusieurs observations montrent que les régions fortement exprimés et riches en gènes résident au centre du noyau, à proximité de compartiments nucléaires (Bickmore, 2013; Chen et al., 2018). A l'inverse, des gènes réprimés sont situés en périphérie nucléaire, aux abords de
## Introduction
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la lamine, associés à des marques répressives. Ces données suggèrent qu'en plus de l'organisation hiérarchique de la chromatine, l'état de transcription du génome joue un rôle sur cette organisation.

### c. Les condensats nucléaires comme acteurs de l'organisation du génome et de l'expression des gènes

De nombreux condensats sans membranes sont présents dans le noyau. Ils peuvent héberger différents processus, comme la biogénèse des ARN ribosomiques pour le nucléole ou l'assemblage de snRNP pour les corps de Cajal (Mao et al., 2011). Ces condensats présentent des propriétés physiques de gouttelettes liquides comme leur capacité de fission ou de fusion de façon dynamique. La formation de ces condensats a été décrite comme répondant aux lois de la transition de phase liquide-liquide (LLPS pour Liquid-Liquid Phase Separation) (Bhat et al., 2021). La LLPS est médiée par des interactions protéine-protéine ou protéine-ARN, multivalentes et de faibles affinités. Les protéines contenant des régions de désordre intrinsèques (IDR) ou de faible complexité structurale sont capables d'engager des interactions aspécifiques avec de nombreux partenaires, ce qui participe à induire ou stabiliser la LLPS. C'est le cas en particulier des hélicases à ARN de type DDX (Hondele et al., 2019; Nott et al., 2015). D'un point de vue fonctionnel, la LLPS aboutit à la formation d'un microenvironnement isolé qui concentre les enzymes, substrats et cofacteurs nécessaires à la régulation de mécanismes fonctionnels. Il a été montré que de nombreuses protéines nucléaires sont en réalité capables de faire de la LLPS.

La chromatine elle-même présente intrinsèquement des caractéristiques propices à la LLPS grâce notamment à l'histone linker H1 qui, sur de la chromatine reconstituée in vitro, induit la formation de gouttelettes (Gibson et al., 2019). La formation de condensats de chromatine est également dépendante des modifications d'histone. En effet, l'hétérochromatine riche en marques répressives comme H3K9me3 est reconnue par le « reader » HP1α (Heterochromatin protein 1) qui est capable de former des gouttelettes par LLPS, à la fois in vitro et in vivo (Larson et al., 2017; Strom et al., 2017). Ces données suggèrent que la régulation de l'hétérochromatine est en partie médiée par la LLPS, et que cette dernière est une force majeure de l'organisation du génome.
Outre l'hétérochromatine, des régions actives de la chromatine ont été identifiées dans la formation de LLPS, et notamment au niveau de régions riches en enhancer. Le régulateur transcriptionnel BRD4, qui reconnait les histones acétylées H3K27Ac, a été montré impliqué dans la formation de la LLPS via la multivalence de ses bromodomaines multiples, qui montrent de façon isolée leur fonction de LLPS (Gibson et al., 2019; Han et al., 2020). Le complexe Mediator, régulateur des enhancers et retrouvé co-localisé avec BRD4, apparait également impliqué dans la LLPS (Sabari et al., 2018). Une étude basée sur de l'imagerie super-résolutive de cellules vivantes a permis de démontrer que les clusters de Mediator et d'ARNPII sont présents sous formes de condensats transitoires, mais également sous forme de larges clusters stables (Cho et al., 2018). Ces clusters sont définis comme condensats selon deux techniques principales utilisées en LLPS : une sensibilité à l'hexanediol et une récupération rapide observée par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Une inhibition de la transcription par le DRB permet d'induire une perte des condensats enrichis en ARNPII mais non en Mediator, suggérant que la LLPS générée par Mediator a lieu en absence d'ARNPII, et précède son recrutement et la transcription au niveau des enhancers. La formation et le maintien des condensats associés à Mediator est également médiée par les ARN, et notamment les ARN non codants transcrits à partir d'enhancer (eRNAs). Selon leur abondance, ceux-ci sont capable d'induire la LLPS, ou au contraire de dissoudre les condensats, soulignant l'importance des interactions ribonucléoprotéiques dans la formation et la stabilité des condensats (Henninger et al., 2021). Les ARN longs non codants (lncRNA) jouent également un rôle dans la formation de séparation de phase (Somasundaram et al., 2022). En effet, en présentant une grande taille et une grande flexibilité, les lncRNA sont capable de former des structures secondaires jouant le rôle de plateforme pour des RBPs et d'autres ARNs. Il a été proposé que la présence de lncRNA dans les condensats influencerait leur degré de viscosité et leur dynamique. Plusieurs études rapportent un lien direct entre l'inhibition d'ARNInc et le blocage de la formation de condensats (Huo et al., 2020; Lee et al., 2021; Pessina et al., 2019). Le mécanisme de formation de ces structures dynamiques n'est pas entièrement connu, et des arguments contradictoires existent. En effet, il a été démontré qu'après une inhibition courte de la transcription, ces condensats persistent, suggérant un recrutement dynamique des gènes au sein de structures préassemblées plutôt qu'un assemblage sur les gènes, dépendant de leur transcription (Mitchell and Fraser, 2008). Bien que la plupart des études soient réalisées en
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utilisant des cellules fixées, ces observations ont également été validées par microscopie in vivo, montrant que les foci d'ARNPII se regroupent et se dissolvent de façon transitoire et dynamique (Cho et al., 2018; Cisse et al., 2013).

Ces données remettent en cause le modèle classique du mécanisme transcriptionnel qui repose sur le chargement d'une polymérase au niveau d'un promoteur et le déplacement de cette même ARNPII le long du gène pour le transcrire. Les travaux de l'équipe de Peter Cook, et d'autres, proposent un modèle revisité dans lequel les condensats riches en ARNPII constitueraient des usines à transcription (transcription factories), où se regrouperaient plusieurs gènes co-régulés (Papantonis and Cook, 2013).

# i. Usines à transcription : une compartimentalisation de la transcription

## 1. Généralités

Au cours des années 1990, plusieurs études basées sur l'incorporation de précurseurs à l'ARN naissant (BrUTP ou de dUTP radiomarqué) ont permis de montrer que la répartition des ARN naissants n'est pas totalement diffuse dans le nucléoplasme, mais comporte des sites discrets où la transcription par l'ARN pol I, II ou III est concentrée (Hozak et al., 1994; Jackson et al., 1993). Cette même observation a été faite avec l'ARNPII, montrant encore une fois une répartition en partie en clusters dans le noyau, impliquant ainsi une transcription dans des sites discrets par l'ARNPII (Iborra et al., 1996; Jackson et al., 1998). Des études et des modèles montrent que l'ARNPII est capable de former des condensats (Cho et al., 2018), et que les PTM présentent sur le CTD permettent d'induire des interactions protéine-protéine et d'augmenter la concentration locale en protéines, induisant la LLPS (Guo et al., 2019; Hnisz et al., 2017). Bien que les trois ARN polymérase forment des usines à transcription, il ne sera discuté ci-après que de celles concernant l'ARNPII qui seront nommées par le terme général d'usines à transcription. Le nombre d'usines à transcription dans le noyau varie entre 200 et environ 10 000 selon les types cellulaires étudiés. Ce sont des complexes multiprotéiques de plusieurs MDa, et d'un diamètre d'environ 90 nm en moyenne (Eskiw et al., 2008). Ces structures reposent sur un cœur protéique dense, contenant en moyenne 8 ARNPII, réparties en périphérie et engagées ou non sur des séquences d'ADN différentes (Martin and Pombo,
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2003). Ce modèle propose donc que les polymérides sont retenues dans les usines à transcription, et que les gènes viennent à la rencontre des usines à transcription en diffusant dans le noyau (Figure 14). Ces données suggèrent que lorsqu'un gène rencontre une usine à transcription, il peut y être fixé de façon transitoire. La concentration locale de facteurs de transcription permettrait ainsi de catalyser la réaction de transcription (Sofiadis and Papantonis, 2018). Ainsi, les usines à transcription, et les facteurs de transcription, en se liant à plusieurs régions distantes simultanément, sont des acteurs également de l'organisation tridimensionnelle de la chromatine de façon locale, mais permettent une régulation coordonnée de l'expression de plusieurs gènes (Osborne et al., 2004). Des analyses de ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing) de la forme S5P (phosphorylation en Sérine 5) du CTD l'ARNPII, et donc centrée sur les promoteurs, ont montré que les gènes interagissant entre eux présentent des niveaux de transcriptions similaires, soulignant la coopérativité de leur expression au travers de leurs contacts (Li et al., 2012). De plus, la comparaison de données de ChIA-PET dans différentes lignées montrent que les interactions intergéniques entre promoteurs peuvent être spécifiques du type cellulaire, tandis que les gènes de ménage restent regroupés ensemble dans les différents types cellulaires. Ceci suggère la mise en place de programmes spécifiques d'expression des gènes au travers de contacts multigéniques formés par les usines à transcription.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 14 :** Représentation d'une usine à transcription. L'usine à transcription comporte des ARNPII à sa périphérie et des facteurs de transcription pouvant ancrer la chromatine à la surface des usines. Les ARNPII transcrivent alors les gènes présents à la surface des usines, permettant la synthèse à d'ARN naissants codant ou non. D'après Sofiadis and Papantonis, 2018.</figcaption></figure>
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## 2. Composition des usines à transcription

La purification native des usines à transcription et leur analyse par des méthodes de protéomiques a permis de mettre en lumière la composition et les fonctions de ces condensats non-membranaires (Caudron-Herger et al., 2015; Melnik et al., 2011). L'ARNPII y est évidemment retrouvée, de même que des facteurs généraux de transcription et des facteurs de remodelage de la chromatine. De façon intéressante, de nombreuses RBP, comme des composants du splicéosome, des facteurs d'épissage et des hélicases à ARN sont également présents ( Tableau 2). La présence de ces protéines suggère donc un lien étroit entre ces compartiments et la régulation co-transcriptionnelle de l'épissage.

<table><caption>Tableau 2 : Composition des usines à transcription.</caption><thead><tr><td>Groupe de protéines</td><td>protéines</td></tr></thead><tbody><tr><td>RNA polymérase II</td><td>RPB2, RPB3, RPB4, RPB7, RPB9, RPABC3, RPA2, RPA12, RPAC1</td></tr><tr><td>facteurs de transcription</td><td>TFII-I, TFIIH, XPB, TF20, AP-2, AP-4, SP3, SAF1B1 &amp; B2, USF1</td></tr><tr><td>Régulateur de l'architecture du génome</td><td>CTCF</td></tr><tr><td>Composants du splicéosome / facteurs d'épissage/ hélicases à ARN</td><td>U2AF65, HnRNPs, snRNPs (Sm, U1, U5, U1, U4/U6, H/ACA), SF-1, SR proteins, DDXs (1, 18, 24, 3X, 10, 47, 49, 5), DHX15</td></tr><tr><td>Facteurs de remodelage de la chromatine/ modifications d'histone</td><td>SWI/SNF, CAF1B, HMTs (EZH2, SUV39H1, SUV39H2)</td></tr></tbody></table>

## 3. Spécialisation des usines à transcription

Les usines à transcription sont capables de se spécialiser pour organiser la transcription de différents gènes d'une même voie ou régulés par un même facteur de transcription. C'est ce qui fut notamment démontré pour les facteurs NF-κB (Figure 15) (Papantonis et al., 2010). La fixation de différents promoteurs dans une même usine à transcription permet ainsi d'induire des boucles d'ADN intergéniques (intra- ou inter-chromosomiques), de même qu'une ré-initiation de la transcription du gène dans la même usine à transcription induira des boucles intragéniques (Larkin et al., 2013). D'autres exemples attestent également d'un
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rapprochement spatial de gènes co-régulés par un ou plusieurs facteurs de transcription,
soulignant une spécialisation des usines à transcription, listés dans le tableau ci-dessous.

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

**Figure 15 :** Illustration de la spécialisation d'usines à transcription dans le cas de l'activation de la voie NF-κB. Avant activation, l'usine à transcription (rouge) transcrit les gènes 1, 3 et 5 non spécifiques de la voie NF-κB tandis que les gènes 2, 4 et 6 répondant à la voie NF-κB ne sont pas recrutés dans l'usine à transcription et ne sont pas transcrits. Après stimulation par le TFNa, les facteurs NF-κB transлюcent dans le noyau et envahissent les promoteurs et/ou les usines à transcription. Les promoteurs des gènes 2, 4 et 6 peuvent ainsi diffuser dans les usines à transcription et être transcrits, formant ainsi une usine à transcription spécialisée dans la voie NF-κB, mais pas seulement, car des gènes initialement présents comme le gène 1 peuvent toujours être présents et transcrits. Les gènes 2 et 4 sont ainsi co-transcrits dans cette usine, mais le gène 6 situé à proximité pourra envahir cette usine selon la temporalité d'activation de la voie. D'après Papantonis and Cook, 2013.
<table><caption>Tableau 3 : Exemples de rapprochements de gènes co-régulés.</caption><thead><tr><td>Fonction des gènes co-régulés et contacté / facteurs mis en jeu</td><td>méthode d'observation</td><td>références</td></tr></thead><tbody><tr><td>TNFα / NF-κB</td><td>3C, 4C, ChIA-PET, RNA-FISH, ChIP-seq</td><td>(Fanucchi et al., 2013; Larkin et al., 2013; Papantonis et al., 2012, 2010)</td></tr><tr><td>TGFB / SMADs</td><td>4C, ChIP-seq</td><td>(Papantonis et al., 2012)</td></tr><tr><td>ERα</td><td>ChIA-PET, ChIP-seq</td><td>(Fullwood et al., 2009; Li et al., 2012)</td></tr><tr><td>ERG</td><td>Hi-C, 3C, ChIP-seq</td><td>(Rickman et al., 2012)</td></tr><tr><td>Gènes d'interleukines/cytokines (activation des cellules T<sub>H2</sub>) / SATB1</td><td>3C, ChIP-loop, ChIP</td><td>(Cai et al., 2006)</td></tr><tr><td>Gènes érythroïdes</td><td>RNA-FISH</td><td>(Brown et al., 2008, 2006; Osborne et al., 2004)</td></tr><tr><td>Recombinaison V(D)J de l'immunoglobuline / KIf1, cohésine, CTCF, E2A</td><td>DNA-FISH, RNA-FISH, ChIP-4C,</td><td>(Corcoran, 2010; Karki et al., 2019a, 2019b; Park et al., 2014; Schoenfelder et al., 2010)</td></tr><tr><td>Récepteurs olfactifs</td><td>DNA-FISH, RNA-FISH, 4C</td><td>(Clowney et al., 2012)</td></tr><tr><td>Protocadherin cluster / CTCF, cohesine</td><td>ChIP-seq, 3C</td><td>(Guo et al., 2012)</td></tr></tbody></table>

## ii. Les corps nucléaires, des condensats dédiés à l'épissage

### 1. Les corps nucléaires dans la régulation de l'épissage et la transcription

Chez les mammifères, de nombreux composants du splicéosome sont retrouvés concentrés au sein de foci nucléaires (Spector et al., 1991, 1983). Ces structures, observées pour la première fois dans les années 1910, présentent des tailles variables de 1 et plusieurs micromètres et ont
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tantôt été nommées « interchromatin granules », « splicing factor compartment » ou domaines Sc35, avant d'être définis de façon générique comme nuclear speckles (NS) ou corps nucléaires (NS) en 1961. Ces compartiments nucléaires interchromatiniens sont enrichis en facteurs d'épissage U1, U2, U4, U5, U6 snRNP, en protéines SR et également en kinases spécifiques de facteurs d'épissage. Certaines études montrent également à leur périphérie la présence d'ARN naissants, de facteurs d'initiation et d'élongation de la transcription, des régulateurs de l'export et de maturation 3' des ARN, ainsi que acteurs du remodelage de la chromatine tels que des HATs, HMTs et HDACs. Ces données soulignent les liens étroits qui peuvent exister entre les NS et les régulations de la chromatine et de la machinerie transcriptionnelle (Galganski et al., 2017; Smith et al., 1999; Spector and Lamond, 2011). Les NS sont des structures dynamiques au sein desquelles, et depuis lesquelles, les composants diffusent rapidement, suggérant qu'ils constituent des sites d'assemblage et de modification du splicéosome permettant de fournir les facteurs d'épissage appropriés aux sites transcriptionnellement actifs (Misteli et al., 1997). Dans ce sens, il a été montré qu'une inhibition de la transcription induit une augmentation de la taille des NS, soulignant leur rôle de stockage et de redistribution des facteurs d'épissage au cours de la transcription.

Cependant, il a été montré que les NS sont directement capable d'épisser des transcrits naissants, et l'accumulation de certains facteurs d'épissage dans les NS est nécessaire pour la régulation des exons qu'ils ciblent (Xing et al., 1995; Ying et al., 2017). Les NS sont dépourvus de gènes mais elles co-localisent fréquemment avec l'ARNPII active (Ser2P). Elles sont également retrouvées à proximité de régions fortement transcrites et peuvent contribuer à stimuler l'expression des gènes (Brown et al., 2008; Kim et al., 2019; Mortillaro et al., 1996).
Les composants du splicéosome, et les ARN naissants apparaissent ainsi enrichis en périphérie des NS, tandis que les ARNm matures sont retrouvés au cœur des NS, avant leur export. L'ARN naissant serait alors maturé co-transcriptionnellement à l'interface des NS et du nucléoplasme avant de pénétrer au centre de ces dernier avant l'export. Cette accumulation locale permettrait de jouer un rôle dans la régulation de la maturation et l'export de ces ARN.

Les mécanismes de formation des NS ont longtemps été débattus. Il a été démontré très récemment que ces structures répondent aux propriétés physiques de la LLPS (Liao and Regev, 2021). En effet, par des approches d'imagerie en temps réel de cellules HEK293T exprimant une version taguée et fluorescente du facteur d'épissage SRRM2, un composant majeur des
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NS, Xu et ses collègues ont observé que les régions de désordre intrinsèque de SRRM2 induisent la formation de condensats par séparation de phase (Ilik et al., 2020; Xu et al., 2022).

Récemment, un nouveau modèle d'épissage à l'interface des NS a été proposé sur les observations suivantes (Liao and Regev, 2021):

1) Les NS sont enrichis en facteurs SR mais dépourvu de hnRNP.

2) Les séquences exoniques sont enrichies en motifs SR tandis que les introns sont enrichis en motifs hnRNP.

3) les composants du splicéosome sont enrichis en périphérie des NS.

4) les introns ne pénètrent pas les NS, seuls les transcrits épissé et dépourvu d'introns sont retrouvé à l'intérieur des NS.

Ces données proposent que selon un processus de transition de phase organisé par les NS, les transcrits naissants se retrouveraient à l'interface nucléoplasme-NS. Dans ce contexte, les exons pénètreraient dans les NS, les introns restant dans le nucléoplasme. Les sites d'épissage se localiserait ainsi à l'interface NS-nucléoplasme où le splicéosome exercerait sa fonction d'épissage des introns.

## 2. ARNPII et échanges entre condensats

De façon intéressante, l'ARNPII est capable de transiter entre différents condensats transcriptionnellement actifs. En effet, lors de l'initiation, les condensats d'ARNPII fusionnent avec des condensats enrichis en Mediator (Guo et al., 2019). En revanche, lors de l'élongation et de la modification de la phosphorylation du CTD, l'ARNPII co-localise avec les NS. Ces données suggèrent une interface étroite entre les deux types de condensats entre lesquels les gènes transitent selon leur état transcriptionnel, permettant ainsi de réguler les phases d'initiation de la transcription puis de maturation co-transcriptionnelle des ARN naissants (Ishov et al., 2020).

# d. Epissage alternatif et organisation du génome

## i. Boucles promoteur-exon et impact sur l'épissage

Il a été montré par des analyses de données de ChIA-PET de l'ARNPII que certains exons partagent des marques épigénétique avec des promoteurs, que ce soit via une proximité sur
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## Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

la chromatine (exons en 5' du gène ou au sein du gène à proximité de TSS alternatifs) ou dans l'espace nucléaire tridimensionnel (Curado et al., 2015). Ces données proposent que les interactions tridimensionnelles promoteur-exon participent au mécanisme de couplage de la transcription et de l'épissage alternatif.

Les travaux de Mercer et al., ont identifié pour la première fois qu'un sous-groupe d'exons hypersensibles à la DNasel (DHS exons) sont retrouvés enrichis en marques activatrices de la transcription, telles que H3K4me1, H3K4me3, H3K9ac, H3K27ac, et certains facteurs de transcription comme p300 (Mercer et al., 2013). Par des approches de ChIA-PET ciblant l'ARNPII et de 3C, les auteurs ont démontré que ces marques correspondaient à des marques dites « fantômes », résultant d'un rapprochement spatial entre les exons et les promoteurs. En effet, les essais classiques de ChIP utilisant des agents de pontage entre les protéines (formaldéhyde...), deux régions chromatiniennes en contact proche dans l'espace peuvent être liées entre elles de façon covalente et être co-immunoprécipitées. Pour la cible H3K4me3, un ChIP natif (dépourvu de pontage protéine-protéine) ne permettait pas de confirmer l'enrichissement aux exons de la marque indiquant que cette marque était le résultat d'un contact promoteur-exon. Outre, les promoteurs, ces exons ont également été retrouvés formant des boucles d'ADN avec des enhancers, expliquant pour partie la détection par ChIP d'un enrichissement des marques H3K4me1 et H3K4me2 et du facteur p300 au niveau des exons. Ce type de rapprochement tridimensionnel des exons avec des promoteurs et des enhancers pourrait favoriser un environnement enrichi en facteurs de transcription et/ou d'épissages, qui contribuerait à la dynamique du processus d'épissage alternatif. La formation de boucles promoteur-exon de certains gènes est également due à la présence de sites CTCF au niveau de ces régions, permettant de rapprocher l'exon du promoteur. C'est ce qui a été démontré pour le gène CD45, dont l'exon 5 est inclus de façon corrélée à l'enrichissement de CTCF sur l'exon. Cette régulation apparaît spécifique du type cellulaire en fonction des niveaux de méthylation de l'ADN cible, qui altèrent la fixation de CTCF (Shukla et al., 2011). Cette observation a été élargie à l'ensemble du génome par des expériences de ChIP-seq démontrant une fixation de CTCF en aval de certains exons dont l'épissage est sensible à la déplétion de CTCF. D'un point de vue mécanistique, il a été montré que la fixation de CTCF au niveau de l'exon induit un ralentissement et une pause de l'ARNPII, permettant la reconnaissance de sites faibles d'épissage et l'inclusion de l'exon, en accord avec le modèle cinétique.
Une seconde étude a également démontré le rôle de CTCF dans la formation de boucles promoteur-exons (Ruiz-Velasco et al., 2017). Les auteurs ont montré ici par une approche intégrative de CHIP-seq, RNA-seq, Hi-C et 4C, que des gènes comportant des sites CTCF convergent entre leur promoteur et la région intronique en amont d'un exon. La boucle formée entre ces deux régions est alors associée à une inclusion de l'exon. Les auteurs proposent 2 mécanismes possibles : un ralentissement de l'ARNPII lié à la présence de CTCF créant un encombrement stérique bloquant l'ARNPII (modèle cinétique), ou le recrutement de facteurs d'épissages présents au niveau du promoteur (modèle de recrutement). En effet des facteurs d'épissage ont été retrouvés au niveau des promoteurs, suggérant qu'un rapprochement spatial exon-promoteur régule l'épissage alternatif (Huang et al., 2012; Terrone et al., 2022).

### ii. Rapprochement de gènes et épissage alternatif

Récemment, A. Bertero et ses collègues ont montré que la différentiation cardiomyocytaire coïncide avec des changements de compartiments, et notamment des transitions de compartiments B (inactifs) vers A (actifs) (Bertero et al., 2019). Ces changements B vers A s'accompagnent d'une augmentation de l'accessibilité et de la transcription des gènes, dont plusieurs gènes engagés dans la régulation cardiaque. Ces gènes ont été retrouvés associés entre eux à la fois en *cis*- et en *trans*- dans des foci enrichis en facteur d'épissage RBM20 qui régule l'épissage alternatif des gènes en contact. Cette étude révèle également que ces rapprochements sont dépendant de la transcription du gène cardiaque *TTN*, dont le transcrit abrite de nombreux sites de fixation de RBM20. Ainsi, en concentrant de nombreuses molécules de RBM20, l'expression de *TTN* permet la nucléation des foci de RBM20. Les auteurs proposent donc que la transcription de *TTN* permet la formation de « RBM20 splicing factories » qui incluent des d'interactions *trans*-chromosomiques impliquant d'autres gènes dont l'épissage est régulé également par RBM20. Ces données montrent un exemple de réarrangement du génome transcription-dépendante, permettant la mise en place d'un programme d'épissage alternatif impliqué dans la différenciation cellulaire.
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### iii. Corps nucléaires et organisation du génome

En observant les sites de transcription par marquage d'ARN naissants et leur répartition par rapport aux NS, Wansink et ses collègues ont pu démontrer que l'ARNPII co-localise uniquement avec des NS faiblement enrichis en Sc35 (Wansink et al., 1993). Les auteurs suggèrent que les niveaux d'enrichissement des NS en sc35 permettrait de distinguer des NS engagés dans le stockage, l'assemblage et/ou le recyclage de la machinerie d'épissage, des NS impliqués dans les processus d'épissage co-transcriptionnels, contenant une faible proportion de Sc35 et co-localisant avec des ARN naissants (Figure 16). Des gènes co-régulés dans leur épissage ont tendance à être retrouvés à proximité d'un même NS, ce qui est en faveur de la formation de « d'usines à épissage » permettant d'orchestrer à l'échelle de l'exon la co-régulation de l'expression des gènes (Brown et al., 2006; Moen et al., 2004).

En utilisant une technique alternative aux techniques C, nommée SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension), Sofia A. Quinodoz et ses collègues ont pu démontrer que des régions denses en gènes, fortement transcrites et comportant une forte densité en ARNPII, interagissent préférentiellement entre elles et sont retrouvées à proximité des NS (Quinodoz et al., 2018). Ces données suggèrent que les NS sont impliqués dans l'organisation du génome en jouant le rôle de « hubs » d'interactions intra- et inter-chromosomiques dépendant du niveau d'expression des gènes. Ces données sont en accord avec d'autres études montrant une interaction entre les gènes fortement transcrits et les NS, et posent la question des mécanismes qui relient la conformation tridimensionnelle de la chromatine, la transcription et des NS dans l'organisation du génome et le lien étroit avec l'épissage co-transcriptionnel (Brown et al., 2008; Crosetto and Bienko, 2020; Shopland et al., 2003).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 16 :** représentation des Nuclear speckles et de leurs fonctions. Les nuclear speckles présentent des gènes actifs à leur périphérie, et peuvent ainsi prendre en charge l'épissage des transcrits naissants. Ils peuvent également servir de lieux de stockage et de recyclage des composants du splicéosome, et ainsi réguler l'épissage cellulaire. D'après Faber et al., 2022.</figcaption></figure>

#### iv. Localisation nucléaire et impact sur l'épissage

De récents travaux ont pu démontrer que la localisation des gènes dans le noyau influence leur épissage alternatif et se décompose en deux sous-compartiments nucléaires (Tammer et al., 2022). Les données montrent que les gènes pauvres en GC sont plus fréquemment situés à la périphérie nucléaire et associés à la lamine, tandis que des gènes riches en GC sont plutôt retrouvés au centre du noyau. De façon élégante, les auteurs ont montré que la simple localisation d'un minigène à la périphérie ou au centre du noyau suffit à moduler le niveau d'exclusion d'exon ou de rétention d'intron, respectivement. De même, l'augmentation du %GC de ces minigènes suffit à orienter sa position vers le centre du noyau, suggérant que la composition nucléotidique d'un gène influence sa localisation nucléaire et son épissage alternatif. Ces données suggèrent que ces deux compartiments nucléaires sont le siège de régulations d'épissage différentes. Dans ce contexte, il est montré que les ARN issus des gènes périphériques sont caractérisés comme interagissant préférentiellement avec des hnRNP et
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Organisation tridimensionnelle de la chromatine et impact sur l'expression des gènes

sont régulés essentiellement par exclusion d'exon. A l'inverse, les ARN issus des gènes situés au centre du noyau apparaissent enrichis en facteurs d'épissage de type SR et en hélicases à ARN de type DDX, protéines associées aux NS, et leur épissage repose sur un mécanisme de reconnaissance de l'intron. Ces données sont en accord avec le rôle des NS dans l'organisation du génome, qui pourraient être un point d'ancrage au centre du noyau pour les gènes avec un fort %GC. Dans ce sens, une seconde étude démontre que les gènes présents aux abords des NS présentent un fort niveau de rétention d'introns lors de l'épissage ayant un fort %GC, et ces introns sont de petites tailles (Barutcu et al., 2022). Ces gènes retrouvés à proximité des NS sont fonctionnellement impliqués dans des processus de maturation des ARNs, de traduction et de cycle cellulaire. Les auteurs suggèrent ainsi que ces structures joueraient un rôle dans la coordination de plusieurs processus cellulaires via la régulation de l'épissage de complexes multigéniques.

Ensemble, ces données relient les régulations de l'épissage alternatif au couplage avec la transcription et des données récentes, impliquant l'organisation tridimensionnelle de la chromatine qui influencent également l'épissage alternatif.
# 4. HTLV-1, Tax et l'épissage alternatif

## a. Généralités et épidémiologie du HTLV-1 et des pathologies associées

### i. Généralités

Le virus T-lymphotrope humain de type 1 (en anglais Human T cell Leukemia/lymphoma virus type 1 ou HTLV-1) est le premier rétrovirus humain oncogène découvert en 1980 aux Etats-Unis par Robert Gallo (Poiesz et al., 1980). Ce virus fait partie du genre *deltaretrovirus*, qui comprend quatre types HTLV (1 à 4), 3 types de l'équivalent simien STLV (1 à 3) et le virus de la leucémie bovine (BLV). HTLV-1 est l'agent étiologique de pathologies inflammatoires dont la paraparésie spastique tropicale, ou myélopathie associée à HTLV-1 (HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis ou HAM/TSP), et de la leucémie/lymphome T de l'adulte (Adult T cell Leukemia/Lymphoma ou ATLL), une hémopathie maligne de phénotype T-CD4+ très agressive.

### ii. Epidémiologie

Du fait du peu d'études épidémiologiques de la population globale dans les régions endémiques et dans le monde, la prévalence de ce virus reste difficile à déterminer et reste très largement faussée dans les études (Gessain et al., 2012). Cependant, le rassemblement de toutes ces données permettent d'estimer le nombre de porteurs de HTLV-1 entre 5 et 10 millions de personne mondialement. HTLV-1 est endémique dans plusieurs régions du globe, dont l'Amérique du sud, les Caraïbes, l'Afrique de l'est et centrale, et le Japon (Figure 17). Ce virus n'est pas réparti de façon égale sur le globe, et se concentre en foyers de haute endémie. La prévalence peut donc varier énormément entre des régions non endémiques (comme la France métropolitaine avec 0,0039% de prévalence) et des régions de forte endémie (jusqu'à 36,4% dans certaines régions japonaises) (Watanabe, 2011). Cette répartition est encore mal comprise mais peut s'expliquer en partie par un effet de fondation dans certaines populations, suivi de la persistance d'un fort taux de transmission lors des primo-infections. L'épidémiologie
de ce virus se caractérise par un biais de séroprévalence pour les adultes, et également pour
les femmes.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 17: Distribution mondiale de HTLV-1. Estimations du nombre de porteurs de HTLV-1 dans le monde. D'après Gessain et al., 2012.</figcaption></figure>

iii. Transmission du virus

HTLV-1 se propage principalement par trois voies de transmission: la voie verticale de la mère à l'enfant (par allaitement), et les voies horizontales par les contacts sexuels et les produits contaminés par le sang infecté (transfusions ou réutilisation de seringues par exemple). HTLV-1 se distingue des autres rétrovirus par son mode de transmission. L'infection par HTLV-1 dépend très fortement des contacts de cellule à cellule, les particules virales étant très peu infectieuses par elles-mêmes (Igakura et al., 2003; Majorovits et al., 2008; Tezuka et al., 2020). Une exposition prolongée à l'infection chez les enfants allaités par une mère séropositive constitue donc le principal mode de transmission du virus, entraînant une séropositivité de 10 à 25% chez les enfants allaités. La majorité des cas d'ATLL survient chez les individus infectés par transmission verticale durant leur enfance.
iv. Pathologies associées à HTLV-1

1. La leucémie T de l'adulte (ATLL)

Les premiers cas d'ATLL furent rapportés en 1977 au Japon, trois ans avant la caractérisation
de HTLV-1 (Uchiyama et al., 1977). Il s'agit d'une maladie lymphoproliférative maligne des
lymphocytes T CD4+ infectés. Au japon, l'ATLL représente plus de 700 cas par an, et se
déclenche chez 3 à 5 % des hommes et 1 à 2 % des femmes infectées par HTLV-1 (Yamaguchi
and Watanabe, 2002). Bien que l'incidence varie selon les régions endémiques, l'incidence
globale est estimée entre 1 et 5% des patients infectés. Cette maladie se manifeste après une
période de latence longue, d'au moins 20 à 40 ans suivant l'infection par HTLV-1,
majoritairement chez des individus infectés pendant l'enfance via l'allaitement prolongé
(transmission verticale) (Itabashi and Miyazawa, 2021). Les mécanismes de développement de
la maladie restent encore mal connus. Cependant, certains facteurs génétiques, des
haplotypes HLA, la charge provirale, et une transmission verticale mère-enfant semblent
influencer le risque de développement d'ATLL (Murphy et al., 2004; Plancoulaine et al., 2000;
Takenouchi et al., 2003; Yashiki et al., 2001).

D'un point de vue clinique, l'ATLL se subdivise en quatre formes (Lunning et al., 2020; Panfil et al., 2016) :

- Deux formes indolentes, à pronostic défavorable, représentant 55 à 75 % des cas d'ATLL :

o La forme chronique, peu sévère, à évolution lente, principalement cutanée. Le taux de survie est de 17 à 24 mois.

o La forme subaiguë ou « smoldering », impliquant des lésions cutanées et pouvant évoluer en forme aiguë. Cette forme présente une durée de survie de 34 mois à plus de 5 ans.

- Deux formes agressives, à pronostic défavorable car pouvant mener à des résistances multi-drogues, une défaillance d'organes, une infiltration des cellules leucémiques et de nombreuses infections opportunistes du fait de l'immunodéficience engendrée par l'ATLL :

o La forme aiguë, s'accompagne de lymphoadénopathies, splénomégalie, hépatomégalies, lésions cutanées, et hypercalcémie. Le taux de survie est
estimé entre 4 à 6 mois. Cette forme présente de nombreuses cellules
leucémiques circulantes. Les cellules immortalisées sont retrouvées dans les
organes touchés ou le sang périphérique et la moelle osseuse.

○ Enfin, la forme lymphomateuse présentant les mêmes signes cliniques que la forme aiguë, mais se différenciant par la présence des cellules immortalisées dans les organes lymphoïdes. Cette forme présente une durée de survie de 9 à 10 mois.

2. Autres maladies associées à HTLV-1

En plus de l'ATLL, HTLV-1 est associé à diverses pathologies inflammatoires incluant une paraparésie spastique tropicale (HAM/TSP), une uvéite associé à HTLV-1, et plusieurs pathologies cutanées (Gonçalves et al., 2010). La HAM/TSP se développe chez 3 à 5% des individus infectés par HTLV-1 et touche préférentiellement les femmes adultes de plus de 40 ans. Il s'agit d'une méningomyélite associée à une démyélinisation et une dégénération axonale des substances blanches et grises de la moelle épinière. Les lésions dans le système nerveux central sont dues à une infiltration des lymphocytes infectés pro-inflammatoires, classant la HAM/TSP comme maladie inflammatoire chronique. Cette maladie se manifeste par des faiblesses et paralysies spastiques des membres inférieurs et des problèmes sensoriels.

b. Structure du HTLV-1 et mécanismes de réplication

i. Structure de la particule virale

Le virus HTLV-1 est une particule virale enveloppée d'environ 100 nm de diamètre. Elle présente à sa surface une bicouche protéolipidique issue de la membrane cellulaire lors du bourgeonnement du virus, sur et sous laquelle s'organisent les protéines virales pour structurer la particule virale (Figure 18).
<figure><img src="image_20.png" /></figure>

**Figure 18 :** Représentation schématique de la particule virale de HTLV-1 et de sa structure. L'enveloppe est constituée d'une bicouche protéolipidique et est chargée en protéines et glycoprotéines virales de surface et transmembranaires (gp46 et gp21). Sous cette enveloppe se situe la couche de matrice, constituée de p19 (ou MA) et de protéase p14 (ou pro), qui organise la capside icosaédrique constituée de p24 (ou CA). Cette capside renferme un complexe RNP constitué de deux molécules du génome viral sous forme d'ARN monocaténaire de polarité positive, habillées de protéines de nucléocapside (p15 ou NC) et d'autres protéines virales comme la transcriptase inverse ou l'intégrase). D'après Verdonck et al., 2007.

## ii. Génome viral

Le génome de HTLV-1 se présente sous forme de deux copies d'ARN simple brin, compactes de 9kb (Figure 19). Lors de l'infection, cet ARN viral est rétrotranscrit pour former une molécule d'ADN bicaténaire, qui est ensuite intégrée en séquence provirale dans le génome humain, préférentiellement dans des régions actives transcriptionnellement, à proximité de certains gènes spécifique, et au niveau d'un large motif consensus (AATTAAAGTGGATATCCACTTAAATA) (Gillet et al., 2011; Kirk et al., 2016; Melamed et al., 2013). Le provirus comporte à ses extrémités 5' et 3' deux régions répétées appelées LTR (pour Long Terminal Repeats). Chaque LTR comporte trois régions (U5, R & U3). Ces LTR présentent les sites de fixation des facteurs
de transcription ATF (Activating Transcription Factor), CREB (cAMP Response Element-Binding protein) et AP-1 (Activator Protein 1) nécessaires à la transactivation du promoteur viral, ainsi que les séquences terminatrices des ARN viraux. Le génome du provirus présente sur son brin positif les gènes essentiels de la famille des rétrovirus : gag, pol et env. Il comporte également en partie 3' une région appelée pX, qui code les protéines Tax, Rev, ainsi que d'autres protéines auxiliaires (Tableau 4). Le brin négatif code quant à lui la protéine HBZ. Le provirus génère des ARN non-épissés, mono-épissés et doublement épissés, issus de l'épissage alternatif (Figure 19). Lors de la traduction, des décalages du cadre de lecture ou des sites d'initiation différents permettent de produire différentes protéines à partir d'un même ARN. De la même manière, certaines polyprotéines comme Gag ou ses précurseurs par exemple sont ensuite clivés par la protéase afin de générer l'ensemble des protéines codées par le provirus. Des études récentes montrent également que la région pX se caractérise par la présence d'un site CTCF viral (vCTCF) ainsi que d'un enhancer (Matsuo et al., 2022; Satou et al., 2016). Ces deux éléments ont notamment été associés à l'altération de l'expression des gènes cellulaires à proximité du site d'intégration, via la formation de boucles de chromatine longue distance entre le site vCTCF et un site CTCF endogène.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 19 :** Génome proviral et transcrits de HTLV-1. Les régions gag, pol, env et pX sont flanquées de deux séquences LTR en 5' et 3'. La région pX code via divers cadres de lecture les protéines p21, p12, p13, p30 ainsi que Tax, et Rex. HBZ est transcrit via une transcription antisens à partir du LTR 3'. D'après Matsuoka and Jeang, 2007.</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 4 : Les protéines virales codées par HTLV-1 et leurs fonctions. D'après Verdonck et al. 2007 et Michael et al., 2004.</caption><thead><tr><th>Protéine</th><th>Rôle</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="2"><strong>Protéines d'enveloppe</strong></td></tr><tr><td>Glycoprotéine de surface (gp46)</td><td>Fixation aux récepteurs cellulaires</td></tr><tr><td>Protéine transmembranaire (gp21)</td><td>Fusion</td></tr><tr><td colspan="2"><strong>Protéines structurales codées par gag</strong></td></tr><tr><td>Protéine de Matrice (MA, p19)</td><td>Participe à l'organisation du virus à la membrane interne</td></tr><tr><td>Capside (CA, p24)</td><td>Forme la capside qui protège le complexe RNP viral</td></tr><tr><td>Nucléocapside (NC, p15)</td><td>Protège l'ARN viral en le fixant</td></tr><tr><td colspan="2"><strong>Protéines de fonction codées par pol</strong></td></tr><tr><td>Protéase (Pro, p14)</td><td>Permet le clivage des polyprotéines Gag/GagProPol</td></tr><tr><td>Transcriptase inverse (p95)</td><td>Réalise la rétrotranscription de l'ARN viral génomique</td></tr><tr><td>Intégrase</td><td>Permet l'intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte</td></tr><tr><td colspan="2"><strong>Protéines régulatrices</strong></td></tr><tr><td>Tax</td><td>Régulateur transcriptionnel du virus, régulateur de voies de signalisation, oncoprotéine virale</td></tr><tr><td>HTLV-1 bZIP-factor (HBZ)</td><td>Régulateur transcriptionnel, oncoprotéine virale</td></tr><tr><td>Rex</td><td>Modulateur de l'export des ARN</td></tr><tr><td>12<sup>1</sup></td><td>Module l'activation et la réponse des cellules T</td></tr><tr><td>P27<sup>1</sup></td><td>Fonction inconnue</td></tr><tr><td>p13<sup>11</sup></td><td>Cible et altère les mitochondrie</td></tr><tr><td>p30<sup>11</sup></td><td>Régulateur transcriptionnel</td></tr></tbody></table>
### iii. Réplication de HTLV-1

#### 1. Cycle réplicatif et cellules cibles

Les cellules ciblées par HTLV-1 sont principalement les cellules T CD4+ et CD8+, et dans une moindre proportion les monocytes et cellules dendritiques (Koyanagi et al., 1993; Longo et al., 1984). La reconnaissance des cellules cibles par les particules virale s'opère via l'interaction des protéines d'enveloppe de HTLV-1 avec les récepteurs membranaires de Héparin Sulfate protéoglycans (HSPG), et neuropilin-1 (NRP-1) pour la fixation, et de type transporteurs de glucose (GLUT-1) pour l'étape de fusion (Jones et al., 2006, 2005; Lambert et al., 2009; Manel et al., 2003). S'opère alors un cycle viral permettant la synthèse de nouveaux virions (Figure 20).

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 20 :** Cycle réplicatif du HTLV-1. A) la particule virale de HTLV-1 se fixe et fusionne avec la membrane plasmique cellulaire en reconnaissant des récepteurs de surface grâce aux protéines virale de l'enveloppe. B) La particule subit l'étape de décapsidation, libérant l'ARN génomique viral. C) l'ARN viral est alors rétrotranscrit par la transcriptase inverse pour former un ADN double brin. D) l'ADN génomique est intégré dans le génome de la cellule hôte grâce notamment à l'intégrase, lors de la division cellulaire. E,F) le provirus est transcrit par la machinerie cellulaire et maturé pour permettre la formation des transcrits viraux, G) exportés dans le cytoplasme et H) traduites. I) les protéines de structures Gag, Gag-Pol et Env sont adressées à la membrane plasmique avec deux copies d'ARN du génome viral. J) Les protéines virales s'assemblent avec l'ARN génomique pour former une particule virale immature, L) qui émergent par bourgeonnement de la surface de la membrane plasmique. K) Enfin, les polyprotéines virales sont clivées par la protéase afin de former une particule virale mature. D'après Martin et al., 2016.</figcaption></figure>
## 2. Transmission cellule à cellule

Les virions étant peu infectieux en l'absence de cellules, l'infection de nouvelles a majoritairement lieu via une transmission directe de cellule à cellule (Fan et al., 1992). Cette transmission repose principalement sur trois phénomènes induits par HTLV-1 : les biofilms viraux, la synapse virologique, et les conduits cellulaires (Figure 21) (Gross and Thoma-Kress, 2016). Les biofilms viraux sont des structures extracellulaires composées de protéines, d'acides nucléiques et de sucres, qui permettent aux particules virales d'adhérer à la surface des cellules cibles et de faciliter la transmission du virus. La synapse virologique, une structure spécialisée formée entre une cellule infectée et une cellule cible, facilite la transmission directe du virus d'une cellule à une autre. Cette synapse virologique protègerait également le virus de la réponse immunitaire. Les conduits cellulaires, ou conduits viro-induits sont quant à eux des structures filamenteuses composées de protéines du cytosquelette qui se forment entre les cellules infectées et les cellules cibles, permettant le transfert direct du matériel viral (Van Prooyen et al., 2010).

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 21 :** Représentation des trois voies de transmission cellule à cellule du HLTV-1. A) la synapse virologique se forme entre une cellule infectée et une cellule cible. (1) L'interaction entre les deux cellules est médiée par des molécules d'adhérence (ICAM-1, LFA-1) et via l'interaction entre des protéines de la cellule et des protéines virales exprimées à la surface des cellules (CD82 et NRP-1 avec SU). (2) Au niveau de la synapse, les virions bourgeonnent. (3) Les virions se fixent sur la cellule cible, au niveau des récepteurs (ici représentés par GLUT-1) présents au niveau de la synapse. B) le biofilm viral. Les particules virales sont présentes dans la matrice extracellulaire des cellules infectées. Ce biofilm est caractérisé par la présence de nombreuses glycoprotéines (agrine, collagène, HSPG, galectine). Les virions sont incorporés dans cette matrice et retenus via leur interaction avec HSPG et la tétherine. C) Le conduit viro-induit forme un canal sortant de la cellule infectée, vers une cellule cible. Cette protubérance est formée par des faisceaux d'actine et relie directement la cellule cible. La protéine virale p8 est impliquée dans la formation de ces conduits. D'après Rizkallah et al., 2015.</figcaption></figure>
### 3. Expansion clonale

La voie cellule à cellule de HTLV-1 est un mécanisme clé de la transmission du virus lors de la primo-infection. Cependant, lors de la phase chronique de l'infection, le virus se propage en grande majorité par l'expansion clonale des cellules hôtes infectées (Wattel et al., 1996). Ce mécanisme repose sur la capacité du provirus à induire l'accumulation de cellules infectées en favorisant leur prolifération cellulaire en particulier pour les lymphocytes T CD4+, ou en inhibant les processus pro-apoptotiques pour les lymphocytes T CD8+ infectées (Bangham, 2018; Sibon et al., 2006). Un patient infecté peut ainsi présenter jusqu'à $10^5-10^6$ clones différents, présentant un site d'intégration du virus unique. Cependant, le nombre de clone et leur ampleur ne sont pas identiques à tous les stades de l'infection. Les patients atteints de HAM/TSP et les porteurs asymptomatiques présenteront un profil oligo/polyclonal.

En comparaison, les ATLL se caractérisent par un unique clone dominant composé d'un seul site d'intégration, pouvant représenter jusqu'à plus de 80% de la charge provirale totale, accompagné de quelques clones de plus faible ampleur (Figure 22) (Cavrois et al., 1996; Cook et al., 2014).

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

**Figure 22:** Les différents profils de clonalité de HTLV-1. Les cellules primo-infectées et infectées de novo par transmission cellule à cellule comportent chacune un site d'intégration unique du provirus (caractérisé par une couleur de cellule différente). Lors de l'expansion clonale de cellules infectées, plusieurs profils de clonalité seront observés, selon la propension de chaque clone à proliférer. Les porteurs asymptomatiques et les patients atteints de HAM/TSP se caractériseront par un profil polyclonal (de nombreux clones d'ampleur comparable) ou oligoclonal (de nombreux clones dont plusieurs d'ampleur majoritaire). Les patients atteints d'ATLL seront caractérisés par un profil monoclonal (un clone unique très largement majoritaire).
Ces données indiquent que l'ATLL survient à partir de la transformation maligne d'un unique
clone cellulaire infecté, parmi les autres clones constituant la charge proviral de l'individu
infecté (). L'expansion clonale repose sur des mécanismes complexes de perturbations
géniques, en grande partie générées par les protéines régulatrices virales dont les oncogènes
Tax et HBZ et leurs partenaires cellulaires. Ces mécanismes s'opèrent dans un contexte de forte
instabilité génomique, médié par Tax et HBZ, et participent à la transformation des cellules
infectées et développement de l'ATLL (Kataoka et al., 2015; Kogure and Kataoka, 2017). Le rôle
de Tax dans l'activation de la voie NF-κB et son impact sur la transformation maligne sera
particulièrement décrit dans ce mémoire de thèse. Cependant, HBZ est également impliquée
dans de nombreux mécanismes de l'infection et de la pathogenèse associée à HTLV-1 (Zhao,
2016). L'expression de Tax est souvent perdue dans les cellules d'ATLL par des phénomènes de
méthylation, de mutations de la séquence codante, ou de délétions du LTR 5' (Takeda et al.,
2004). Cependant, des travaux récents ont montré que Tax peut être retrouvée exprimée de
façon transitoire, sous forme de « bursts». La perte totale de l'expression de Tax dans les
cellules tumorales induit par ailleurs l'apoptose des cellules (Billman et al., 2017; Mahgoub et
al., 2018). Cela suggère donc un rôle central de Tax tant dans les processus d'initiation de la
leucémogenèse que dans le développement de l'ATLL.
<figure><img src="image_25.png" /></figure>

**Figure 23 :** Schéma des grandes étapes de l'infection par HTLV-1 et du développement de l'ATLL et de l'HAM/TSP. Après la primo infection des lymphocytes T, le virus se transmet via un contact cellule à cellule. En résulte de nombreux clones (cellules portant un site d'intégration unique, représentés par des cellules de couleurs différentes), qui prolifèrent par expansion clonale. L'accumulation dse dérégulations épigénétiques et des mutations somatiques peut mener à l'immortalisation d'un clone, menant à l'ATLL. Les cellules infectées peuvent également s'infiltrer dans le système nerveux central et aboutir à son inflammation chronique, menant au développement de l'HAM/TSP.
c. L'oncoprotéine Tax

i. Généralités et interactôme

Tax est une protéine composée de 353 acides aminés (40 kDa), qui comporte de nombreux domaines d'interaction, lui permettant d'interagir avec de nombreuses protéines cellulaires (Figure 24). Tax joue un rôle majeur dans la pathogénicité de HTLV-1. En effet, Tax est capable *in vitro* d'immortaliser des cellules T (Robek and Ratner, 1999). *In vivo*, elle induit des tumeurs et un phénotype proche de l'ATLL chez des souris transgéniques (Grossman et al., 1995; Hasegawa et al., 2006). Il a été proposé que le pouvoir oncogène de Tax repose sur la large composition de son interactôme et sa capacité à altérer les fonctions et les voies de signalisation cellulaire. Tax altère de nombreux mécanismes essentiels à l'homéostasie de la cellule tels que le cycle cellulaire, la réparation des dommages à l'ADN ou encore l'apoptose et la prolifération (Boxus et al., 2008). Tax est par ailleurs la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles qui permettent de moduler la fonction de Tax, sa localisation, et son action sur son interactôme (Martella et al., 2022; Shirinian et al., 2013).

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 24 :** *Structure et domaines de la protéine Tax-1.* La protéine Tax présente de nombreux domaines, notamment permettant sa dimérisation (Leucine zipper), sont import nucléaire (NLS, Nuclear localization signal) ou son export nucléaire (NES, nuclear export signal), sont ciblage dans les Tax bodies (TSLS, Tax speckles localization signal). Tax est également composé de domaines d'interaction à de nombreux facteurs cellulaires comme CBP/p300, ATF ou IKKγ, ou PBM (PDZ-binding motif). Tax est également la cible de nombreuses modifications post traductionnelles sur l'ensemble de sa séquence protéique (les résidus cibles de modifications et la nature de leurs modifications sont représentées sur l'axe de la séquence protéique et dans l'encadré). D'après Martella et al., 2022.</figcaption></figure>
## ii. Apoptose, cycle cellulaire et instabilité génomique

Tax est capable d'induire l'expression de plusieurs gène anti-apoptotiques, comme les gènes *BCLX*, *cFLIP*, *survivin*, *xlAP*, *cIAP1* et *cIAP2*, de façon dépendante à l'activation de la voie NF-κB. De plus Tax induit directement une résistance à l'apoptose, à travers notamment l'inactivation de p53 (Bernal-Mizrachi et al., 2006; Pise-Masison et al., 2000). Tax induit également la prolifération cellulaire via son rôle dans diverses voies contrôlant le cycle cellulaire (Figure 25). Tax interagit (directement ou non) avec plusieurs kinases dépendantes des cyclines (Cyclin-Dependant Kinases ou CDK) et leurs cyclines ou inhibiteurs associés, et est capable de réguler leur expression. Par exemple, Tax renforce l'interaction entre CDK4/CDK6 et la Cycline D2, tout en stimulant l'expression de la Cycline D2 (Fraedrich et al., 2005; Iwanaga et al., 2008). Ces CDK régulent le cycle cellulaire, et notamment le passage de la phase G1 à la phase S. Ainsi, en interagissant avec les cyclines/CDK, Tax promeut une prolifération cellulaire tout en altérant le cycle cellulaire, notamment via l'activation de la voie NF-κB. En plus d'induire la prolifération cellulaire, Tax altère les points de contrôle du cycle cellulaire en interagissant avec les protéines Chk1 et Chk2 (Marriott and Semmes, 2005). De plus, Tax interagit avec le complexe APC (Anaphase Promoting Complex) (Kuo and Giam, 2006) et induit un passage précoce en anaphase pouvant induire des défauts de ségrégation des chromatides sœurs et donc des aberrations mitotiques comme l'aneuploïdie, qui est retrouvée dans les cellules infectées par HTLV-1. L'ensemble de ces perturbations induites par Tax contribue à la déstabilisation génomique et à la transformation cellulaire associées à HTLV-1.

Les cellules infectées par HTLV-1, in vivo ou in vitro, présentent de nombreuses anomalies chromosomiques telles que des délétions, des réarrangements chromosomiques, des duplications, translocations, ou de l'aneuploïdie (Fujimoto et al., 1999). Ces altérations peuvent s'accumuler dans les cellules infectées, en partie par la capacité de Tax à inhiber les mécanismes de réparation à l'ADN. Tax active le promoteur du gène PCNA (proliferating cell nuclear antigen), qui est un facteur influençant le passage de la polymérase au travers des lésions à l'ADN lors de la réplication (Kao and Marriott, 1999). La surexpression de PCNA augmente la processivité de l'ADN polymérase δ, qui est alors capable de polymériser au travers de lésions d'ADN (Mozzherin et al., 1997). Tax et également responsable de l'inhibition du mécanisme de réparation par excision de base (Base Excision Repair, ou BER) en réprimant
l'expression de l'ADN polymérase β (Jeang et al., 1990; Philpott and Buehring, 1999). Tax induit également des cassures double brins (Double Strand Break, ou DSB), par la formation d'espèces réactives de l'oxygène générées lors de l'activation chronique de la voie NF-κB et la réplication (Baydoun et al., 2015, 2012; Kinjo et al., 2010). Tax influencerait également une attrition télomérique précoce par l'inhibition de l'expression de la sous-unité catalytique hTERT de la Télomérase, ce qui se traduit par une diminution de l'activité télomérase qui pourrait expliquer la présence de pont chromatiniens et de fusions télomèriques fréquemment observées dans les cellules T-CD4+ infectées (Escoffier et al., 2005; Gabet et al., 2003).

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 25: Schéma des effets de Tax sur la progression du cycle cellulaire.** Les effets stimulateurs de Tax sont représentés en vert, et les effets inhibiteurs en rouge.</figcaption></figure>
### iii. Transactivation des gènes viraux et cellulaires par Tax

#### 1. Transactivation du LTR de HTLV-1 par Tax

Tax joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes viraux, étant responsable de la transactivation du LTR (Felber et al., 1985), bien qu'il ne puisse pas fixer directement l'ADN. Trois répétitions de 21 pb situées dans la partie U3, nommées TxRE (pour Tax Responsive Elements), sont nécessaires pour l'activation du LTR par Tax. Les TxRE comportent une séquence homologue aux site consensus cAMP-responsive element (CRE), fixé par les facteurs de transcription CREB/ATF (CRE-binding/activating transcription factors) dont Tax facilite le recrutement et stabilise la fixation (Anderson and Dynan, 1994). De façon intéressante, Tax, en plus de recruter CREB, stimule son activité transcriptionnelle en détournant la machinerie de O-GlcNAcylation, et en induisant ainsi la O-GlcNAcylation de CREB, qui permet une transactivation plus forte du LTR qu'un mutant ne pouvant pas subir cette modification post-traductionnelle (Groussaud et al., 2017). Le complexe Tax-CREB-TxRE ainsi formé permet le recrutement des co-activateurs CBP (CREB binding protein), p300, et P/CAF (p300/CBP-associated factor) (Geiger et al., 2008; Jiang et al., 1999; Vendel et al., 2003). Grâce à l'acétylation des histones, ce complexe entraîne le recrutement de la machinerie de transcription nécessaire à la transcription des gènes viraux depuis le LTR (Figure 26). Des analyses de ChIP ont également révélé la présence de plusieurs facteurs de la famille ATF/CREB et AP-1 au niveau du LTR de HTLV-1 dans des cellules T infectées, et démontré la présence d'histones H3 et H4 acétylées (Bogenberger and Laybourn, 2008). Des études *in vitro* ont démontré que le recrutement de CBP/p300 par le complexe Tax/CREB permet non seulement une acétylation des histones H3, H4, H2A/H2B, mais également l'éviction des nucléosomes de l'ADN par l'action de l'histone chaperonne NAP1 (Nucleosome Assembly Protein 1) (Lemasson et al., 2006; Sharma and Nyborg, 2008). Une éviction des nucléosomes permettrait ainsi le recrutement des facteurs généraux de transcription et de la mise en place du complexe de pré-initiation transcriptionnelle.
<figure><img src="image_28.png" /></figure>

**Figure 26 : transactivation du LTR de HTLV-1 par Tax.** Tax interagit avec des remodeleurs chromatiniens tels que des HDAC et HMT, afin de lever la répression transcriptionnelle. Tax induit le recrutement au niveau du LTR des facteurs de transcription CREB/ATF ainsi que de remodeleurs chromatiniens supplémentaires tels que SWI/SNF, P/CAF ou CBP/p300 afin d'activer le promoteur du LTR. Additionnellement, Tax interagit avec des facteurs généraux de transcription tel que TFIID et avec l'ARNPII directement. Suite à la pause promoteur-proximale, Tax recrute P-TEFb, qui va induire la phosphorylation du CTD en sérine 2 et 5, permettant une elongation processive du génome proviral. D'après Martin et al., 2016.

## 2. Tax interagit avec de nombreux facteurs de transcription

Tax est capable d'interagir avec de nombreux facteurs de transcription cellulaires pour modifier l'expression des gènes cellulaire. En plus d'activer le LTR, Tax est également capable de recruter CREB (sous sa forme phosphorylée) et CBP au niveau de sites CRE de gènes cellulaires, lorsque la voie PKA est activée (Kwok et al., 1996). Certains gènes cellulaires sont par ailleurs réprimés par Tax au travers des facteurs CREB/ATF, tels que la cycline A, c-myc, ou également p53 (Kibler and Jeang, 2001; Mulloy et al., 1998; Semmes et al., 1996). Tax interagit directement avec des facteurs de la famille ATF également, comme ATF-4 (Reddy et al., 1997).

Tax coopère avec SRF (Serum responsive factor) et des facteurs TCF (Ternary complex factor) comme Elk-1 ou SAP-1, modifiant l'expression de gènes avec des motifs SRE (Serum Responsive Element), comme les gènes c-Jun ou encore l'oncogène c-fos (Currer et al., 2012; Fujii et al., 1994). Tax renforce la fixation de SRF sur les motifs SRE, permettant une fixation sur des boites CArG de séquences plus divergentes (Winter and Marriott, 2007). Ceci souligne la capacité de Tax de non seulement activer des gènes cellulaires par sa coopération avec des facteurs de
transcription, mais d'induire un profil de réponse spécifique, en modulant la distribution de
SRF.

Tax active de nombreux gènes de la famille des facteurs de transcription AP-1 tels que *c-Jun*,
*JunD*, ou *c-Fos*, au travers de l'activation des sites AP-1 de ces gènes. Tax est en effet capable
d'activer la transcription de gènes rapporteurs sous le contrôle de sites AP-1 ou d'une
coopération entre les sites κB et AP-1 (Iwai et al., 2001). Par exemple, le gène *IL-8* comporte à
la fois un site κB et AP-1 dans son promoteur, et la mutation de l'un ou l'autre de ces sites suffit
à rompre l'activation Tax-dépendante de ce gène, tandis qu'une construction comportant un
dimère de sites AP-1 permet une transcription Tax-dépendante (Mori et al., 1998). Ces
données montrent que l'activation de certains gènes par Tax nécessite l'activation de plusieurs
voies, et la fixation concomitante de plusieurs facteurs de transcription de familles différentes
au sein d'un même promoteur pour induire la transcription des gènes. L'activation de gènes
nécessite bien souvent l'intégration de plusieurs signaux et la fixation de plusieurs facteurs de
transcription sur un même promoteur. L'intégration de la fixation de ces multiples facteurs
semble donc jouer un rôle important dans la régulation des gènes cellulaires également par
Tax. En effet, Tax cible de nombreux autres facteurs de transcription, interagissant avec NF-YB,
C/EPBβ, Sp1 et Egr1, activant des gènes cellulaires tels qu'*IL-1β* et le complexe majeur
d'histocompatibilité de classe II (Dittmer et al., 1997; Nadella et al., 2008; Pise-Masison et al.,
1997; Tsukada et al., 1997). Enfin, Tax interagit avec des acteurs généraux de la transcription,
tels que TFIIA, TFIID, TFIIH, CDK9 et la cycline T1, facilitant le recrutement de l'ARNPII et
stimulant la transactivation du LTR (Caron et al., 1993; Cho et al., 2007; Clemens et al., 1996;
Martella et al., 2020; Zhou et al., 2006).
### 3. Tax et les facteurs de remodelage de la chromatine

#### a. HAT/HDAC

En dehors de ses interactions directes avec des facteurs de transcription, Tax est capable d'altérer l'expression des gènes au travers de ses multiples interactions avec des facteurs de remodelage de la chromatine. En effet, comme décrit plus tôt, Tax interagit avec plusieurs HAT, comme p300/CBP et P/CAF (p300/CBP Associated Factor) (Jiang et al., 1999).

De façon intéressante, des études réalisées par ChIP des lignées intégrant un gène rapporteur sous le contrôle du LTR de HTLV-1 ont montrées que Tax et les HDAC1, -2 et -3 sont mutuellement exclusifs sur le promoteur viral (Lemasson et al., 2004). En effet, l'expression de Tax diminue la fixation de HDAC (-1, -2 et -3) présente sur le LTR inactif. Tax est capable d'interagir directement avec le répresseur HDAC-1, et de le décrocher du promoteur afin de permettre la transcription du LTR (Ego et al., 2002; Lu et al., 2004). Outre le LTR, Tax permet le recrutement HDAC-1 au niveau de promoteurs cellulaires, comme celui de SHP-1, où ce complexe permet de décrocher les facteurs NF-κB préalablement fixés, et d'induire la répression du gène (Cheng et al., 2007). Tax est donc capable d'induire une activation ou une répression des gènes cellulaires en fonction des facteurs et des gènes cibles.

#### b. HMT/HDM

Tax interagit avec d'autres enzymes de modification des histones tels que les HMT SUV39H1 (suppressor of variegation 3–9 homologue 1) et CARM1 (coactivator-associated arginine methyltransferase), (Jeong et al., 2006). SUV39H1 induit des méthylations H3K9, marque répressive. Elle est retrouvée surexprimée à la fois dans des cellules exprimant Tax et dans des lignées infectées par HTLV-1 où elle induit la répression du LTR (Kamoi et al., 2006). Ces données suggèrent que Tax induit sa propre répression via SUV39H1, ce qui selon les auteurs permettrait de jouer un rôle de rétrocontrôle négatif afin de limiter l'expression des gènes de HTLV-1 et participer à son échappement au système immunitaire. A l'inverse, l'interaction de CARM1 avec Tax permet de faciliter son recrutement sur le LTR, d'induire une méthylation de H3 sur les arginines 2, 17 et 29, qui sont des marques activatrices de transcription, et résulte donc dans une activation du LTR.
Outre les interactions de Tax avec des enzymes de modification d'histones, il a été démontré
dans plusieurs lignées chroniquement infectées par HTLV-1, mais également dans des cellules
T non infectées mais exprimant Tax, une baisse du niveau d'histone global, à la fois au niveau
transcriptionnel et protéique (Bogenberger and Laybourn, 2008). Une réduction globale
d'histones permettrait ainsi d'affecter la transcription d'un nombre très important de gènes.

c. SWI/SNF

Tax interagit avec plusieurs facteurs du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF (BAF53, BAF57, BAF155 et BRG1) (Wu et al., 2004). Plus particulièrement, BRG1 est nécessaire à la transactivation du LTR de HTLV-1 par Tax. Des lignées présentant une absence ou un faible niveau d'expression de BRG1 montrent peu ou pas d'activation du LTR en présence de Tax, mais cet effet peut être inversé lorsque BRG1 est exprimé de façon ectopique. Ces données sont en accord avec une baisse d'histones observée au niveau du LTR, évincées par le complexe SWI/SNF (Easley et al., 2010; Lemasson et al., 2006). Cependant, il y a des divergences concernant la présence de BRG1 au niveau du LTR. BRG1 apparaît enrichi dans des expériences de ChIP dans des lignées 293T transfectées par un clone moléculaire de HTLV-1 activé par TNFα, mais sa fixation semble diminuer lors de l'expression de Tax dans une autre étude utilisant des CHOK1-Luc intégrant le LTR de HTLV-1. D'autres données montrent une transactivation du LTR de HTLV-1 par Tax en absence de BRG1, sans exclure une possible participation de BRG1 et du complexe SWI/SNF dans le remodelage de la chromatine au niveau du LTR (Zhang et al., 2006).

4. Dérégulations des voies de signalisation par Tax

Tax établit des interactions avec les acteurs de nombreuses voies de signalisation (Figure 27).

a. La voie PI3K/Akt et AP-1

La voie PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase) est une voie de signalisation impliquée dans la prolifération, la survie, le métabolisme, et la croissance cellulaire. Elle est activée par une multitude de stimuli qui mènent à l'activation de divers récepteurs dont les RTK (receptor tyrosine kinases). Une cascade de signalisation s'en suit menant à l'activation de Akt par sa phosphorylation (Hemmings and Restuccia, 2012) qui induit l'activation de nombreux facteurs de transcription, tels qu'AP-1. Tax interagit avec la sous-unité régulatrice p85a de PI3K,
résultant en une déstabilisation du complexe formé par p58a et p110a qui mène à l'activation
de Akt et AP-1 (Peloponese and Jeang, 2006; Ueki et al., 2002). AP-1 est retrouvée
chroniquement activée dans des cellules d'ATLL et apparaît nécessaire à la transformation de
cellules murines par Tax (Sun and Ballard, 1999). Notamment, dans un clone non transformé
exprimant Tax, la stimulation de la voie AP-1 permet sa transformation. De façon consistante,
les clones transformés par Tax présentent une importante activité PI3K (Liu et al., 2001).

b. La voie TGF-β/SMAD

La voie TGF-β (Transforming growth factor-β) joue un rôle important dans le contrôle de la prolifération et l'activation des cellules T. Cette voie se caractérise par la fixation des ligands TGF-β sur des récepteurs sous forme de complexe oligomériques (Tzavlaki and Moustakas, 2020). Le signal est transduit par une cascade de phosphorylation via les protéines médiatrices SMAD, jusqu'à l'activation transcriptionnelle par les facteurs de transcription SMAD, activant les gènes comportant des éléments de réponse à SMAD. Le TGF-β1 est retrouvé surexprimé dans des lignées cellulaires T infectées par HTLV-1, ainsi que chez des patients atteints d'ATLL (Kim et al., 1990). Le gène TGF-β1 est transactivé par Tax car il comporte des sites AP-1 sur son promoteur. A l'inverse, Tax interagit avec plusieurs protéines Smad (Smad2, Smad3, Smad4) et déstabilise la formation de complexes entre les protéines Smad et inhibe leur fixation à l'ADN, empêchant la réponse des gènes cibles de la voie (Lee et al., 2002). Bien qu'une autre étude n'ai pas observée l'interaction Tax:Smad3, celle-ci montre que Tax, en induisant c-Jun, permet la formation de complexe c-Jun:Smad3, séquestrant ce dernier et inhibant sa fixation à l'ADN (Arnulf et al., 2002). Les facteurs Smad étant incapables de se fixer aux promoteurs et d'activer la transcription des gènes cibles de la voie, les cellules T infectées par HTLV-1 ou exprimant Tax deviennent insensibles à la voie TGF-β/SMAD.

c. La voie des MAP kinases

Les Mitogen Activated Portein Kinases (MAPK) sont des kinases répondant à une multitude de
stimuli externes comme le stress, les cytokines, ou les facteurs de croissance (Morrison, 2012).
Cette voie repose également sur une cascade de phosphorylation au travers des MAP kinase
kinase kinases (MAPKKK), phosphorylant les MAP kinase kinases (MAPKK) pour enfin activer les
MAPK (Figure 27). Cette voie est impliquée dans les mécanismes de prolifération, de
différentiation et de mort cellulaire. Trois familles de MAPK existent : les JNK (Jun amino-
terminal kinases), les ERK (extracellular-signal-regulated kinases) et enfin les p38/SAPK (stress-
activated protein kinases). En amont de la voie, Tax interagit avec deux MAPKKK,
respectivement MEKK1 et TAK1 (Yin et al., 1998). L'interaction de Tax avec MEKK1 stimule son
activité kinase. MEKK1 ayant pour cible non seulement des MAPKK, mais présentant également
un crosstalk avec la voie NF-κB, la stimulation de MEKK1 par Tax induit une stimulation de
l'activité kinase de IKKβ, induisant une phosphorylation et la dégradation de l'inhibiteur de la
voie NF-κB IκBα, résultant en une activation de la voie NF-κB (Jin et al., 1997). L'interaction de
Tax avec TAK1 stimule l'interaction entre TAK1 et IKK, stimulant ce dernier et activant la voie
NF-κB, et stimule également l'activation de JNK et ATF2 (Suzuki et al., 2007; Wu and Sun, 2007).
Cependant, la déplétion de MEKK1 ou TAK1 n'a pas d'impact sur l'activation de la voie NF-κB,
suggérant que la voie MAPK n'est pas indispensable à l'activation de la voie NF-κB, stimulée
par ailleurs par Tax (Gohda et al., 2007). Tak1 est également activé de façon constitutive dans
les cellules T infectées par HTLV-1, comme la voie JNK qui est aussi retrouvée activée dans les
ATLL (Xu et al., 1996). Tax interagit également avec GPS2, un inactivateur de JNK, et empêche
son inhibition, participant à l'activation de JNK (Jin et al., 1997).
<figure><img src="image_29.png" /></figure>

**Figure 27 : Schéma des voies de signalisation impactées par Tax.** Tax interagit dans le cytoplasme avec une multitude de protéines adaptatrices et des effecteurs de la voie NF-κB, MAPK/JNK, AP-1, PI3K/Akt et AP-1, TGF-β/SMAD. Tax interagit également dans le noyau avec de nombreux facteurs de transcription comme les facteurs NF-κB ou ATF. Avec toutes ces interactions, Tax va moduler l'expression des gènes cellulaires afin d'induire la prolifération cellulaire, l'inflammation cellulaire, ainsi que les réarrangements du cytosquelette, la migration cellulaire, la formation de synapses virales et l'immortalisation cellulaire. D'après Boxus et al., 2008.
d. Tax et la voie NF-κB, pierre angulaire de la pathogénie du HTLV-1

i. Généralités

La voie de signalisation NF-κB est impliquée dans diverses fonctions cellulaires telles que la prolifération et la survie cellulaire, l'apoptose, la réponse immunitaire ou inflammatoire. Son activation chronique est fréquemment reliée à des processus oncogènes. Elle est activée par une multitude de stimuli (plus de 150) parmi lesquels l'activation de la voie SRF, des cytokines, le TNFα (Tumor Necrosis Factor-α), ou encore des LPS (lipopolysaccharides) et des infections bactériennes ou virales, comme HTLV-1. Elle régule l'expression de plus de 100 gènes répondeurs à cette voie tels que des chemokines, molécules d'adhésion ou protéines anti-apoptotiques (Brasier, 2006; Pahl, 1999). Bien que les facteurs NF-κB soient exprimés de façon ubiquitaire, la réponse engendrée par l'activation de la voie est tissu- et stimuli-spécifique.

Les facteurs de transcription NF-κB sont constitués de 5 membres : p50(NF-κB1) et p52(NF-κB2) tous deux dépourvus de domaine de transactivation, qui sont maturés de façon protéolytique à partir de leurs précurseurs respectifs p105 et p100 ; et p65/RelA(p65), c-Rel et RelB, qui sont tous trois des activateurs transcriptionnels (Figure 28). Ces facteurs comportent tous un domaine RHD (Rel Homology Domain), permettant leur homo- et hétéro-dimérisation en différents NF-κB. Ces facteurs se fixent alors à l'ADN sur les gènes cibles comportant des éléments de réponse κB. En amont des facteurs NF-κB, au niveau cytoplasmique, se trouvent les protéines IκB, inhibiteurs de la voie, ainsi que leurs kinases, les IKK (IκB kinase). Cette voie se décompose en deux sous-voies distinctes selon leur mode d'activation: la voie canonique, activant principalement le dimère p65/RelA:p50, et la voie non-canonique, impliquant principalement le dimère RelB :p52, bien qu'une multitude de dimères NF-κB existent pour les deux voies. Ces deux voies sont activées par des ligands et des stimuli distincts et, en raison des facteurs NF-κB différents sur lesquels elles reposent, elles ciblent des gènes différents.
<figure><img src="image_30.png" /></figure>

**Figure 28 : les acteurs de la voie NF-κB.** Les complexe IKK (IκB kinase) sont composés pour la voie canonique (vert) de la sous-unité régulatrice IKKγ (NEMO) et d'un homo- ou hétéro-dimère de IKKα(IKK1) et IKKβ(IKK2), les sous-unités catalytiques du complexe IKK. Pour la voie non-canonique, le complexe IKK (bleu) est composé d'un homodimère IKKα(IKK1). Les complexes IKK induisent la phosphorylation des protéines IκBs pour la voie canonique ou la protéolyse de p100 en p52. Les protéines IκB sont composées de IκBα mais aussi de IκBβ et IκBε, qui séquestrent les facteurs NF-κB dans le cytoplasme pour la voie canonique. Les facteurs NF-κB sont composés de p65/RelA/p65, RelB, c-Rel, et des facteurs p50 et p52, maturés par protéolyse à partir des précurseurs p105 et p100. Ces 5 facteurs s'organisent ensuite en homo- et hétérodimères ayant la capacité de se fixer à de nombreux sites κB plus ou moins dégénérés par rapport à la séquence consensus. Adapté d'après Shih et al., 2011.
ii. Les différentes voies NF-κB

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

**Figure 29 :** Schéma d'activation des voies canoniques et non-canoniques de NF-κB. (A) La voie canonique est stimulée par la reconnaissance de ligands pro-inflammatoires, activant la protéine adaptatrice TAK1, qui va entrainer la phosphorylation du complexe IKK (IKKα, IKKβ, IKKγ). IKK activé va à son tour entrainer la phosphorylation de IκBα qui va être adressé au protéasome pour être dégrader, et permettre la translocation du dimère NF-κB (majoritairement composé de p65/RelA/p50), qui va pouvoir se fixer sur ses sites cibles. (B) La voie non-canonique est stimulée par d'autres ligands, qui vont entrainer l'activation d'un complexe adaptateur composé de protéines TRAF (TNF Receptor-Associated Factor), qui va induire l'accumulation de la kinase NIK sous sa forme phosphorylée. NIK va à son tour phosphoryler IKKα, qui va induire la phosphorylation, l'ubiquitinylation et le clivage de p100 en p52. Le dimère NF-κB RelB/p52 va ensuite transloquer et se fixer lui aussi sur ses cibles afin d'induire la transcription. Adapté d'après Lu et al., 2021.
## 1. La voie canonique

En absence de stimuli, le dimère NF-κB (majoritairement formé de p65/RelA:p50 pour la voie canonique) est séquestré dans le cytoplasme par IκBα, un facteur de la famille des inhibiteurs IκB. IκBα interagit avec p65/RelA grâce à son domaine ARD (Ankyrin Repeats Domain) et masque son signal de localisation nucléaire (NLS, pour Nuclear Localization Signal). La voie canonique est activée par différents stimuli dont des composants microbiens (comme le LPS) et des molécules pro-inflammatoires (telles que le TNF-α ou IL-1). Une cascade de protéines adaptatrices induit alors l'activation de la kinase TAK1, phosphorylant le complexe IKK, composé pour la voie canonique des sous-unités catalytiques IKKα(IKK1) et IKKβ(IKK2) ainsi que la sous-unité régulatrice IKKγ(NEMO) (Figure 29.a). Le complexe IKK va alors phosphoryler l'inhibiteur IκBα et induire son ubiquitinylation et sa dégradation par le protéasome, ce qui va permettre l'exposition du signal de localisation nucléaire (NLS). L'import nucléaire de p65/RelA va permettre un enrichissement des séquences cibles en ce facteur de transcription et la régulation transcriptionnelle des gènes cibles. La voie canonique est caractérisée par une réponse transcriptionnelle rapide et transitoire.

## 2. La voie non-canonique

La voie NF-κB non canonique quant à elle est activée par des cytokines de la famille TNF (hormis le TNF-α), telles que BAFF (B cell activating factor), TNSF3 (lymphotoxine β) ou encore RANKL (Receptor activator of NF-κB). Cette voie alternative se caractérise par l'activation de la kinase NIK (NF-κB inducing kinase), qui est indispensable à la voie non-canonique, et qui en retour va induire la phosphorylation du complexe IKK composé pour cette voie de IKKα uniquement (Figure 29.b). IKKα va alors induire la phosphorylation du précurseur p100, stimulant son ubiquitinylation et sa maturation par clivage en p52. Le dimère NF-κB maturé (composé principalement de p52:RelB pour la voie non-canonique) va alors transloquer dans le noyau, et de la même façon que la voie canonique va pouvoir se fixer sur les sites κB cibles.

## 3. Boucle de rétrocontrôle et oscillation temporelle

La voie de signalisation NF-κB présente une boucle de rétrocontrôle et d'autorégulation afin de réguler finement la voie et sa terminaison. Un des principaux mécanismes de terminaison de la voie repose sur la transcription de *NFKBIA* (le gène codant l'inhibiteur IκBα) (Pahl, 1999). Une surexpression de l'inhibiteur de la voie permet ainsi de stopper la translocation des
facteurs NF-κB. De plus IκBα est également capable de décrocher les facteurs NF-κB liés à l'ADN, et de les exporter dans le cytoplasme afin de les séquestrer à nouveau et de réprimer la voie (Bergqvist et al., 2009). La dégradation de IκBα et sa synthèse de novo induit alors une oscillation entre activation et inhibition des gènes répondants à la voie au cours du temps, après stimulation. D'autres inhibiteurs de la voie tels que IκBβ et IκBη permettent alors de réduire cette oscillation (Fagerlund et al., 2015; Shih et al., 2009; Ting and Endy, 2002). En effet, l'expression de IκBβ et IκBη n'est pas NF-κB-dépendante, et permet de baisser le niveau d'oscillations d'activation de la voie, de même que le demi-temps de vie de ces inhibiteurs permet de déterminer la fréquence d'oscillation. D'autres mécanismes supplémentaires permettent de réguler la terminaison de la voie, dont la dégradation des facteurs NF-κB fixés aux promoteurs (Natoli and Chiocca, 2008; Saccani et al., 2004). Cette dégradation passe notamment par des régulations post-traductionnelles de p65/RelA (Lawrence et al., 2005). Certaines phosphorylations de p65 induisent son ubiquitinylation et sa dégradation, afin de réprimer la transcription p65/RelA-dépendante. D'autres facteurs permettent également de déstabiliser la fixation de NF-κB à l'ADN, de les relocaliser dans des compartiments nucléaires spécifiques où ils seront dégradés (Ghosh and Hayden, 2008).

Un autre mécanisme de rétrocontrôle est le remplacement de dimères NF-κB. EN effet, pour le gène IL-12, p65/RelA:p50, qui est un dimère induisant une réponse transcriptionnelle rapide est forte, est remplacé par RelB:p52 et mène à une réduction de la présence d'ARNPII au promoteur et une baisse transcriptionnelle. De plus, la fixation résiduelle de RelB permet d'empêcher le recrutement de p65/RelA lors d'une réinduction de la voie. Dans ce sens, IL-12 est insensible à une réinduction de la voie.

### iii. Modulation transcriptionnelle de la réponse NF-κB

#### 1. Les différents dimères NF-κB

Bien que, théoriquement, les facteurs NF-κB puissent s'associer en 15 dimères différents, seuls 11 d'entre eux ont été caractérisés jusqu'ici. Le dimère le plus abondant de la voie canonique p65/RelA:p50, largement étudié, est retrouvé de façon quasi ubiquitaire (Hayden and Ghosh, 2008). Certains types cellulaires présentent cependant d'autres dimères majoritaires, comme les cellules B matures, dont la voie est activée de façon constitutive, arborant majoritairement
l'hétérodimère p50:c-Rel (Grumont and Gerondakis, 1994). Par ailleurs, les facteurs p50 et p52 ne comportant pas de domaine de transactivation, les homodimères formés par ces deux facteurs sont incapables d'induire une réponse transcriptionnelle. En effet, l'homodimère p50:p50 est capable d'induire une répression transcriptionnelle de gènes liés à la réponse interféron (Cheng et al., 2011). Egalement, il a été démontré qu'en absence de stimulus, le dimère p50:p50 est associé à HDAC-1, induisant une répression transcriptionnelle. Après stimulation, des dimères NF-κB comportant p65/RelA transloquent dans le noyau, et en interagissant avec CBP, remplacent le complexe p50-HDAC-1, permettant l'activation de la transcription (Zhong et al., 2002). De plus, bien que l'homodimère p52:p52 ne présente pas de domaine de transactivation, ce dernier est capable d'induire ou de réprimer la transcription de gènes en interagissant ou non avec des cofacteurs tels que BCL-3 ou HDAC-3, selon le site κB (Franzoso et al., 1992; Pan et al., 2023).

Tous les dimères NF-κB ne comportent pas la même capacité à activer la transcription ni la même sensibilité aux inhibiteurs IκB, aussi bien in vitro qu'in vivo (Lin et al., 1995; Saccani et al., 2003). En effet, des études du niveau d'ARNm de certains gènes répondant à la voie en fonction de la surexpression de différents facteurs NF-κB ont permis de démontrer que p65/RelA induit le plus fort niveau de transcription, tandis que RelB ne semble pas moduler le niveau de transcription. Cependant, ces données ne prennent pas en compte l'affinité différente de chaque dimère pour certains sites κB ainsi que leurs PTM lors de stimuli, de même que la formation spécifique de dimères aux promoteurs étudiés.

## 2. Modifications post-traductionnelles de NF-κB et modulation de l'activité transcriptionnelle

La régulation post-traductionnelle de p65/RelA est une couche supplémentaire dans la régulation de l'activité transcriptionnelle portée par les facteurs NF-κB. Un des exemples les plus étudiés concerne la phosphorylation de la sérine 276 (Ser276P) de p65/RelA. Cette modification est médiée par la sous-unité catalytique de PKA (protein kinase A) et MSK1 (mitogen- and stress- activated protein kinase 1). Cette modification induit une meilleure affinité à l'ADN, mais également un changement d'affinité pour ses cofacteurs. En effet, suite à la phosphorylation de la sérine 276, p65/RelA aura une plus faible affinité au répresseur HDAC3, mais une plus grande affinité à CBP/p300 et à CDK9 et la Cycline T1, composants du
complexe P-TEFb, permettant leur recrutement au niveau de promoteurs afin d'induire leur
transcription (Nowak et al., 2008; Reber et al., 2009; Zhong et al., 1998). Cette interaction est
à double sens, car le recrutement de CBP/p300 (ou sa présence préalable) induit également
des modifications de p65/RelA par acétylation. p65/RelA comporte de nombreuses PTM
différentes ayant des effets différents sur les activités de p65/RelA. Ces modifications sont
listées dans le tableau 5 (Hoesel and Schmid, 2013; Huang et al., 2010). De la même façon que
pour les histones, il a été proposé que les PTM de p65/RelA forment un code protéique, car il
existe de nombreuses combinaisons de PTM ayant des activités spécifiques et se régulant
mutuellement.
<table><caption>Tableau 5 : Les modifications post-traductionnelles de Tax et leurs rôles.</caption><thead><tr><th>Modification</th><th>Domaine</th><th>Résidu</th><th>Enzyme modificatrice</th><th>Effet</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="12">Phosphorylation</td><td rowspan="3">Rel Homology<br>Domain (RHD)</td><td>S205</td><td>?</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td>T254</td><td>?</td><td>Effet sur la stabilité et la localisation nucléaire</td></tr><tr><td>S276</td><td>Msk-1, Pim-1, PKAc (kinases)</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td rowspan="5">Transactivation<br>Domain (TAD)</td><td>S281</td><td>?</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td>S311</td><td>PKCζ (kinase)</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td>T435</td><td>?</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td>S468</td><td>IKKs, GSK3β (kinases)</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td>T505</td><td>Chk1 (kinase)</td><td>effet pro-apoptotique</td></tr><tr><td rowspan="2">Transactivation<br>Domain (TAD)</td><td>S529</td><td>CKII (kinase)</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle</td></tr><tr><td>S536</td><td>TBK1, RSK1, IKKs (kinases)<br>PP2A, WIP1 (phosphatases)</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle, l'import<br>nucléaire, la stabilisation et diminue l'export<br>nucléaire médié par IκBα</td></tr><tr><td rowspan="12">Acétylation</td><td rowspan="4">RHD</td><td>K122</td><td>PCAF, CBP/p300 (acétylation)<br>HDAC3 (désacétylation)</td><td rowspan="2">Affinité à l'ADN diminuée (acétylation)</td></tr><tr><td>K123</td><td>CBP/p300 (acétylation)<br>HDAC3 (désacétylation)</td></tr><tr><td>K218</td><td>CBP/p300 (acétylation)<br>HDAC3 (désacétylation)</td><td>Diminue l'interaction à IκBα (acétylation)<br>Stimule l'interaction avec IκBα et inhibe<br>l'activité transcriptionnelle (désacétylation)</td></tr><tr><td>K221</td><td>CBP/p300 (acétylation)<br>HDAC3 (désacétylation)</td><td>Affinité accrue à l'ADN (acétylation)<br>Stimule l'interaction avec IκBα et inhibe<br>l'activité transcriptionnelle (désacétylation)</td></tr><tr><td>/</td><td>K310</td><td>CBP/p300 (acétylation)<br>HDAC3, HDAC1, SIRT1<br>(désacétylation)</td><td>Stimule l'activité transcriptionnelle<br>(acétylation)</td></tr><tr><td>/</td><td>K314</td><td>CBP/p300 (acétylation)</td><td>Module l'expression de certains gènes suite à<br>l'activation par le TNF-α (acétylation)</td></tr><tr><td>/</td><td>K315</td><td>Set9 (méthylation)<br>? (déméthylation)</td><td>Stabilise la fixation sur certains enhancers</td></tr><tr><td rowspan="4">Méthylation</td><td rowspan="2">RHD</td><td>K37</td><td>NSD1 (méthylation)<br>FBXL11 (déméthylation)</td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td>K218</td><td>Set9 (méthylation)<br>? (déméthylation)</td></tr><tr><td>/</td><td>K314</td><td>Induit l'ubiquinynilation et la dégradation de<br>p65/RelA fixé à la chromatine</td><td></td></tr><tr><td>/</td><td>K315</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
### 3. Contribution de la chromatine et de cofacteurs

Un des mécanismes de spécification de la voie NF-κB afin de la rendre type cellulaire dépendante est la contribution du paysage chromatinien et des cofacteurs des facteurs NF-κB. En effet, en fonction du type cellulaire, la fixation de facteurs de développement peut moduler la susceptibilité de certains gènes à l'activation par NF-κB. C'est par exemple le cas pour les cellules B et les macrophages, où le régulateur développemental PU.1 se fixe au niveau de l'enhancer *Il12b* et est associé à des marques d'enhancer actif (H3K4me1). Cependant, l'enhancer *Il12b* ne comporte des sites d'hypersensibilité à la Dnase I (caractéristique d'une chromatine ouverte et active) qu'une fois les cellules stimulées (Ghisletti et al., 2010; Heinz et al., 2010). Ces données suggèrent que pour être activés par la voie NF-κB, certains gènes nécessitent un environnement chromatinien actif (chromatine ouverte) avant stimulation, grâce à des facteurs spécifiques du type cellulaire. Cet environnement préalable permet alors de définir les gènes pouvant répondre à la voie en fonction du type cellulaire. D'autres études à l'échelle génomique ont aussi permis de comprendre que la fixation de NF-κB à des promoteurs permet d'induire une réponse qui sera sensible à n'importe quel stimuli, tandis que la fixation aux enhancers permet d'induire une réponse pour des gènes nécessitant une activation type cellulaire-spécifique (Tong et al., 2016).

L'environnement chromatinien basal des gènes est un paramètre de régulation de la temporalité de leur réponse à l'activation NF-κB. Des études basées sur des données de ChIP-seq, RNA-seq et ChIA-PET dans des cellules de lymphome B humain démontrent l'existence de plusieurs classes de gènes dont la transcription varie au cours du temps (Zhao et al., 2018). Des gènes présentant une activation transitoire et oscillatoire répondent à une induction simple par fixation (et décrochage) de NF-κB comme expliqué plus haut. Une autre classe de gène présente une activation plus tardive, qui continue même en l'absence de stimuli. Ces gènes requièrent l'activation de la voie ERK et la fixation de AP-1 pour être transcrits. La fixation de p65/RelA sur ces gènes permettrait alors d'initier et de médier la fixation de cofacteurs tels que AP-1 afin d'induire leur transcription, de façon plus tardive (Casola et al., 2000; Riedlinger et al., 2019; Saccani et al., 2002; Vlahopoulos et al., 1999). Ces données suggèrent que la coopération de p65/RelA avec d'autres facteurs permet d'expliquer la spécificité d'activation selon la lignée cellulaire et le type de stimulation, ainsi que la spécificité temporelle d'activation
des gènes. De la même façon, des gènes répondants rapidement à l'activation de la voie se trouvent dans des régions préalablement ouvertes, accessibles aux facteurs NF-κB, tandis que des gènes répondant de façon plus tardive se trouvent dans des régions nécessitant préalablement un remodelage de la chromatine (Brasier et al., 2011; Nowak et al., 2008). Dans ce sens, p65/RelA interagit avec d'autres cofacteurs tels que SP1, CBP/p300 ou encore SRC-1 qui sont nécessaire à l'activation transcriptionnelle par NF-κB. Certains sont préalablement fixés aux promoteurs en absence d'activation de la voie, tandis que d'autres sont recrutés après fixation des facteurs NF-κB (Gerritsen et al., 1997; Guo et al., 2003; Jones et al., 1997; Sheppard et al., 1998; Shiama, 1997; Yang et al., 2013). p65/RelA est également capable d'induire un remodelage de la chromatine aussi bien répresseur, qu'activateur, en interagissant avec des facteurs tels que des HDAC ou HAT permettant de moduler l'expression de certains gènes (Ashburner et al., 2001; Federman et al., 2013; Kim et al., 2012). Ensemble, ces coopérations permettent de mettre en place une réponse complexe et spécifique du type cellulaire, du stimuli d'activation de la voie NF-κB, des facteurs NF-κB et de leurs régulations, de l'activation d'autres voies et la présence de cofacteurs, de l'environnement chromatinien basal, et du type d'activation de la voie (transitoire, chronique).

## 4. Spécificité des sites κB

Le site de fixation des facteurs NF-κB, ou site κB, est une séquence de 9 à 11 nucléotides dont le consensus est 5'-GGGRN\_WYYCC-3' (R : purines, N : n'importe quel nucléotide, W : A/T, Y : pyrimidine, et le nucléotide souligné représente la base centrale du motif), mais comporte un haut degré de variabilité. Des études structurales ont pu montrer que différents sites κB imposent des contraintes structurales aux facteurs NF-κB, et vont arborer des affinités différentes aux différents dimères NF-κB. Ils déterminent également quels dimères sont recrutés par chaque site κB (Wang et al., 2012).

De manière significative, le nucléotide central seul permet de moduler la réponse transcriptionnelle. En effet, dans le cas du recrutement de p52, une fixation sur un site κB portant un A/T central induit un recrutement de HDAC3 par p52 afin d'induire une répression transcriptionnelle, tandis qu'un site avec un nucléotide central G/C permet de recruter Tip60 et d'induire la transcription. De même, l'échange des sites κB entre les promoteurs de *MCMP-1* et de *IP-10*, ne différant que d'un seul nucléotide, permet le recrutement de dimères et de
cofacteurs différents selon le stimulus (TNFα ou LPS) (Leung et al., 2004). De plus, selon le site κB, la réponse variera temporellement. Des promoteurs comportant un A/T central auront une induction rapide, tandis que des promoteurs avec un G/C central auront une induction tardive. La présence de plusieurs sites κB sur un promoteur permet de recruter différents dimères NF-κB et d'induire une transcription persistante. L'ensemble de ces données soulignent l'importance de la diversité des sites κB, ainsi que la complexité des mécanismes de leur reconnaissance par les dimères NF-κB, dans la temporalité de réponse à l'activation de la voie de signalisation.

## 5. Distribution des sites et facteurs NF-κB à la chromatine

Les estimations faites par Martone et al. portent à environ $10^4$ sites κB consensus dans le génome. Cette étude est basée sur une analyse de ChIP-seq p65/RelA dans des cellules HeLa exposées ou non au TNFα. L'analyse du chromosome 22 a mis en évidence que la fixation de p65/RelA dans les régions promotrices, définies dans cette étude par les régions (1 kbp) en amont du site d'initiation de la transcription (TSS), ne représentent que 9 % des sites de fixation de p65/RelA (Martone et al., 2003). De façon intéressante, une grande proportion des sites de fixation se situe au sein des gènes avec une majorité localisée dans les introns (40 %, contre 1 % des sites totaux dans les exons). Une seconde étude a confirmé ces observations dans des cellules Detroit 562 mettant en évidence que l'enrichissement de p65/RelA aux promoteurs ne représente que 6,6 % des sites de fixation, contre 49,1 % en intragénique et 40,6 % dans des introns (Borghini et al., 2018). Ces données suggèrent que p65/RelA pourrait exercer d'autres fonctions que celles connues dans la régulation de la transcription au niveau des promoteurs.

La distribution de p65/RelA semble dépendre en partie du type de stimulation (LPS, TNFα, Polyl:C, Pam2CSK4). Elle n'est pas non plus restreinte aux motifs consensus κB. Plus d'un tiers des sites de fixation de p65/RelA et un grand nombre (38%) de sites de fixation de p65/RelA à proximité de gènes ne sont pas associés à des modifications transcriptionnelles, soulignant la grande complexité des régulations NF-κB-dépendantes reposant sur un mécanisme multifactoriel faisant intervenir d'autres facteurs (ou cofacteurs) de transcription, des dimères NF-κB de composition différentes, et/ou des remodelages de la chromatine (Kolovos et al., 2016; Lim et al., 2007; Zhao et al., 2014).
## 6. La voie NF-κB et l'organisation tridimensionnelle du génome

Des expériences de 3C, et de validation par RNA-FISH, ont pu démontrer que les promoteurs des gènes *TNFAIP2* et *SAMD4A* répondant à la voie NF-κB et distants d'environ 50 Mb sont retrouvés en contact lors d'une activation par le TNFα, la région de contact évoluant entre les gènes en fonction de la position de l'ARNPII (Papantonis et al., 2010). Une étude à plus large échelle par des expériences de 4C, ChIP-seq, RNA-FISH et ChIA-PET a permis de montrer que la majorité des contacts observés avec *SAMD4A* changent au cours de l'activation de la voie par le TNFα, et qu'ils concernent des gènes également régulés transcriptionnellement par l'activation de la voie NF-κB et la fixation de p65/RelA aux promoteurs (Papantonis et al., 2012). Ces données suggèrent qu'il existe des hubs transcriptionnels spécialisés dans la régulation des gènes répondants à la voie NF-κB, autrement identifiés par les auteurs comme des « usines NF-κB».

De façon intéressante, les gènes codant les miARN en réponse à la voie NF-κB sont également retrouvés dans les usines NF-κB générées par l'exposition au TNFα, suggérant que ce mécanisme concerne les gènes codants et non-codants engagés dans la réponse inflammatoire. Cette spécialisation des usines à transcription a également été observée avec la voie TGF-β, à travers la formation d'«usines SMAD». De façon intéressante, un tiers de ces gènes en contact répondent également au TNFα, ce qui est cohérent avec un certain chevauchement entre les deux voies (Sullivan et al., 2009). Les auteurs proposent que ces usines à transcription seraient « naïves » en l'absence de facteurs de transcription spécifiques. En absence d'activation de la voie, les gènes répondeurs seraient à proximité des usines à transcription, pouvant parfois diffuser aux abords et être fixés de façon transitoire par l'ARNPII. Cependant, en absence de p65/RelA (ou en quantité insuffisante), ces gènes ne seraient pas transcrits. Lors de l'activation de la voie, l'import massif de p65/RelA dans le noyau permettrait d'enrichir les promoteurs et enhancers répondeurs et stabiliserait la fixation des gènes p65/RelA-dépendants dans les usines à transcription, permettant ainsi l'initiation transcriptionnel. En fixant les promoteurs de plusieurs gènes, la concentration en p65/RelA augmente, permettant de spécialiser cette usine à transcription pour les gènes de la voie NF-κB, mais de façon non exclusive, en regroupant d'autres gènes co-régulés par des voies de signalisation distinctes comme démontré à travers l'activation des cellules par le TNFα ou le
TGF-β. Une inter-spécialisation de ces usines à transcription permettrait de co-réguler des gènes communs entre plusieurs voies, et de rapidement mettre en place une réponse transcriptionnelle à plusieurs stimuli. De façon intéressante, une étude réalisée dans des cellules IMR90 a pu démontrer que de nombreuses boucles promoteur-enhancer formées au niveau d'enhancers TNFα spécifiques sont formés même en absence de stimulus (Jin et al., 2013). Ces boucles préexistantes définiraient les gènes cibles d'une activation transcriptionnelle et seraient spécifiques du type cellulaire. La fixation des facteurs NF-κB aux enhancers permettraient d'activer plus rapidement les gènes cibles déjà à proximité (Jin et al., 2013).

Outre leurs effets sur l'induction d'un profil transcriptionnel lors de l'activation de la voie NF-κB, les usines à transcription jouent un rôle dans la temporalité de la transcription des gènes répondeurs (Fanucchi et al., 2013). Une étude reposant sur l'analyse par RNA-FISH de transcrits naissants a pu montrer que lors de l'exposition des cellules au TNFα, les gènes SAMD4A et TNFAIP2 sur le chromosome 14 (espacés de 50 Mb) et le gène SLC6A5 sur le chromosome 11 co-localisent et sont transcrits dans des foci d'ARNPII active. De façon intéressante, il apparaît que ces gènes sont recrutés de façon séquentielle. SAMD4A et TNFAIP2 co-localisent dans un premier temps, pour ensuite regrouper à leur contact SL6C6A5 (Figure 30). De façon intéressante, la cassure double brin par des essais de TALEN au niveau du site de contact de SAMD4A induit une perte de sa transcription, mais également celle de TNFAIP2 et SLC6A5. Un essai de réparation de la région de contact par recombinaison homologue de SAMD4A permet de rétablir son rapprochement des gènes TNFAIP2 et SLC6A5 et sa transcription. En revanche, la perturbation de TNFAIP2 ou SLC6A n'a aucun effet sur l'expression de SAMD4A, permettant ainsi de définir une hiérarchie dans la coordination de la transcription de ces trois gènes lors de l'activation de la voie. SAMD4A serait le premier pris en charge par la machinerie de transcription et les facteurs associés. L'augmentation locale au de la concentration en facteurs de transcription et ARNPII au niveau de SAMD4A permettrait ainsi de recruter les gènes TNFAIP2 et SLC6A5, résidant dans un espace nucléaire proche. Ces travaux révèlent un nouveau mécanisme de coordination temporelle de l'expression des gènes répondeurs à l'activation de la voie NF-κB reliant la dynamique d'interaction des gènes dans l'espace nucléaire et leur transcription dans le temps.
<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Figure 30 : modèle de la coordination hérarchique de gènes co-régulés lors de l'activation par le TNFα. A l'état basal, les gènes SAMD4A et GCH1 (sur le chromosome 14) et le gène SLC6A5 (sur le chromosome 11) sont dans un seul et même TAD, mais ne sont pas transcrits et sont éloigné physiquement les uns des autres. Lors de l'activation de la voie NF-κB par le TNFα, ces gènes forment des interactions. A) dans un premier temps, aucun contact entre ces gènes n'est observé. b) Ensuite, le gène SAMD4A est transcrit. c) Le gène TNFAIP2 est ensuite recruté à proximité de SAMD4A et est également transcrit, probablement au sein d'une transcription factory. d) Une fois ces deux gènes recrutés au sein de la transcription factory, le gène SLC6A5 est alors à son tour recruté au sein de la même transcription factory et est transcrit également. D'après Fanucchi et al., 2013.

iv. Tax et la voie NF-κB

L'activation de la voie NF-κB par Tax joue un rôle central dans l'oncogenèse liée à HTLV-1.
L'activation permanente de cette voie est retrouvée dans des lignées infectées par HTLV-1 et
dans les cellules de patients atteints d'ATLL (Ballard et al., 1988; Higuchi et al., 2007; Sun and
Ballard, 1999). L'activation chronique de la voie par Tax a pour conséquence une prolifération
aberrante des cellules T qui participe à la transformation cellulaire, vraisemblablement par ses
effets également sur l'inhibition des processus apoptotique, et des systèmes de maintien de
l'intégrité du génome. Le mutant Tax M22 (G137A, L138S) défectif pour l'activation de la voie
NF-κB perd ses capacités d'immortalisation des cellules T, indiquant que cette voie est
particulièrement engagées dans les processus oncogènes associés à l'infection (Robek and
Ratner, 1999; Yamaoka et al., 1996). D'ailleurs, l'inhibition de la voie NF-κB dans les cellules
exprimant Tax ou dans les cellules ATLL est capable d'induire la mort par apoptose, indiquant
un effet d'addiction à la voie NF-κB lors de l'infection (Kitajima et al., 1992; Portis et al., 2001).

Sur le plan moléculaire, Tax active la voie NF-κB canonique et non-canonique au niveau cytoplasmique en outrepassant les récepteurs inducteurs de la voie via ses interactions avec plusieurs effecteurs de la cascade d'activation (Figure 31). Tax interagit avec MEKK1, TAK1, ainsi que NEMO (Jin et al., 1999; Wu and Sun, 2007; Yin et al., 1998). En stimulant ces kinases, Tax favorise la phosphorylation de IKKα et IKKβ, auxquelles il se fixe également pour stimuler directement leur autophosphorylation indépendamment des kinases en amont de la voie (Chu et al., 1998). En aval, Tax interagit également avec les inhibiteurs IκB afin de stimuler leur dégradation par le protéasome (avec lequel il interagit également afin de stimuler la protéolyse de p105 en p50) et libère ainsi les dimères NF-κB (Suzuki et al., 1995). Le facteur p100 est aussi ciblé par Tax qui induit sa protéolyse en p52 (Xiao et al., 2001). Tax provoque ainsi un import nucléaire permanent des facteurs NF-κB de la voie canonique et non-canonique.

Au niveau nucléaire, l'impact de Tax sur la voie NF-κB reste encore mal compris. Tax interagit avec les facteurs NF-κB p65/RelA, c-Rel, p50 et p52 in vitro (Suzuki et al., 1994). Il a également été décrit que Tax est capable de s'associer aux complexes NF-κB et de renforcer leur fixation à l'ADN in vitro (Petropoulos et al., 1996; Suzuki et al., 1994). Tax induit également une surexpression de p100 (le précurseur de p52) et de c-Rel, jouant un rôle dans l'import nucléaire constitutif de ces facteurs (Lanoix et al., 1994). L'expression de Tax induit une plus grande formation des dimères NF-κB libres, et augmente ainsi la fixation des dimères à l'ADN. En médiant la dégradation constitutive de IκBα et en diminuant la fixation de ce dernier aux facteurs NF-κB, Tax permet également de diminuer le décrochage des facteurs NF-κB liés à la chromatine.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 31 : Interactions de Tax avec les protéines de la voie NF-κB.** Tax interagit avec de nombreux facteurs de la voie canonique et non canonique de NF-κB, et permet l'activation chronique de la voie, et l'import permanent des facteurs NF-κB. Adapté de Romanelli et al., 2013.</figcaption></figure>

## 1. PTM de Tax et activation de la voie NF-κB

Tax est la cible de nombreuses modifications post-traductionnelles (PTM) (voir Figure 24) qui influencent ses fonctions. Elles jouent notamment un rôle majeur dans la relation de Tax à la voie NF-κB. L'ubiquitinylation de Tax a été démontrée comme régulant la stabilité, le trafic intracellulaire et l'activation de la voie NF-κB (Chiari et al., 2004; Peloponese et al., 2004). L'ubiquitinylation de Tax est principalement composée d'une poly-ubiquitinylation de type K63. Cette poly-ubiquitinylation agit comme une plateforme de recrutement permettant à Tax
d'interagir avec de nombreux facteurs dont les kinases de la voie NF-κB telles que TAK1 ou IKK.
L'ubiquitinylation de Tax est notamment médiée par son interaction avec l'E2 ubiquitine ligase
Ubc13, dont la déplétion affecte négativement l'activation Tax-dépendante de la voie NF-κB
(Shembade et al., 2007). Tax, sous sa forme ubiquitinylée, interagit avec NRP (NEMO-related
protein) et OPTN (Optineurin) pour former un complexe avec Tax1BP1 associé à l'appareil de
Golgi. NRP en retour stimule l'ubiquitinylation de Tax et l'activation de la voie NF-κB (Journo et
al., 2009). De plus, la localisation de Tax aux abord de l'appareil de Golgi au sein de rafts
lipidiques permet d'y recruter IKK et de participer à l'activation constitutive de la voie NF-κB
(Huang et al., 2009).

La SUMOylation de Tax sur des sites de poly-ubiquitinylation a été proposé comme régulateur de sa capacité à former des corps nucléaires (structures nucléaires enrichies en Tax). Elle permettrait également le recrutement de p65/RelA et p300 dans ces sous-compartiments (Bex et al., 1998, 1997). Le rôle de la SUMOylation de Tax dans l'activation de la voie NF-κB a été proposé mais une autre étude a démontré qu'elle n'était pas indispensable (Lamsoul et al., 2005; Pène et al., 2014).

La phosphorylation de Tax aux sérines 300 et 301 induit également une forte diminution de l'activation des gènes répondeurs à la voie NF-κB et ATF/CREB (Bex et al., 1999). L'absence de phosphorylation affecte la localisation nucléaire de Tax et empêche donc la formation de corps nucléaires Tax. Cette altération peut être secourue par l'introduction d'acides aminés mimant les phosphosérines. L'accumulation de la forme phosphorylée de Tax dans les corps nucléaires est également nécessaire pour son acétylation par p300 (Lodewick et al., 2009). Cette acétylation de Tax concerne la lysine 346, qui a été identifiée comme nécessaire à l'activation d'un promoteur porteur de site κB.
v. Dérégulations de transcriptionnelles des gènes cellulaires par HTLV-1 et par Tax

1. Dérégulations transcriptionnelles lors de l'infection par HTLV-1

in vivo

In vivo, des études par puces à ADN de la différence du niveau d'expression des gènes cellulaires entre lymphocytes immortalisées par HTLV-1 et des cellules d'ATL ont été réalisées. Ces données ont pu mettre en évidence que lors de l'infection par HTLV-1, de nombreux gènes sont altérés au niveau transcriptionnel (Pise-Masison et al., 2002). En effet, les gènes impliqués notamment dans la voie des cytokines et de leurs récepteurs sont altérés, de même que des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la réparation de l'ADN. Egalement, les précédents travaux de l'équipe ont permis de montrer que le niveau de transcription de gènes impliqués dans des voies fonctionnelles associées à la voie de signalisation MAPK, au cancer, la voie des cytokines et leurs récepteurs ou l'adhésion focale cellulaire sont altérées dans des cellules infectées par HTLV-1 et des cellules d'ATLL (Thénoz et al., 2014). Ces observations à l'échelle du génome ont par ailleurs été observées dans différentes études. Ainsi, des études ont pu montrer que plusieurs facteurs de transcription tels que c-Jun ou c-Rel sont dérégulés au niveau transcriptionnel dans les cellules immortalisées par HTLV-1 (Harhaj et al., 1999). Egalement, les gènes impliqués dans la voie du TNFα de même que ceux contrôlant les voies anti-apoptotiques sont surexprimés, tandis que des gènes pro-apoptotiques tels que Bax sont réprimés dans les cellules infectées par HTLV-1. Des analyses par puces ont également été réalisées dans des cellules de patients atteints de HAM/TSP ou de patients asymptomatiques, et révèlent l'altération d'un sous-ensemble de gènes associés à la voie de l'interféron, qui est corrélée à la sévérité de l'HAM/TSP (Tattermusch et al., 2012). Cette étude montre également que la voie de signalisation de p53 est altérée dans les cellules infectées, et que ces dérégulations peuvent être impliquées dans la pathogenèse associé à HTLV-1.

2. Dérégulations quantitatives du transcriptome par l'activation Tax-dépendante de la voie NF-κB

Plusieurs études ont lié l'activation de la voie NF-κB Tax-dépendante à la régulation transcriptionnelle de gènes cellulaires. C'est par exemple le cas des gènes codant des
interleukines et leurs récepteurs liés, comme IL-2 et IL2Rα, et IL-21/IL21R, IL13/IL-13Rα, IL-15/IL-15Rα, IL-6. La surexpression de ces gènes a été reliée à la fixation de facteurs NF-κB sur des sites κB des promoteurs (H.-C. Lin et al., 2005; Maeda et al., 2020; Mariner et al., 2001; Mizuguchi et al., 2009; Ruben et al., 1988; Silbermann et al., 2008; Wäldele et al., 2004).

Plusieurs études ont été réalisées afin d'analyser à l'échelle génomique l'impact de Tax sur la dérégulation de l'expression des gènes par des séquençage d'ARN (RNA-seq). Des analyses d'enrichissement de gènes sur ces données révèlent le terme NF-κB comme une voie spécifiquement enrichie en gènes surexprimés par Tax dans plusieurs types cellulaires (Mahgoub et al., 2018; Vandermeulen et al., 2021), (Annexe 1). Ces observations corroborent les données de ChIP-seq H327Ac (marque d'activation transcriptionnelle) dans des lignées d'ATLL (Kurita et al., 2018) (Communication de congrès, non publiées aujourd'hui sous forme d'article). De nombreux pics H3K27Ac apparaissant dans les cellules exprimant Tax coïncident avec des gènes de la voie NF-κB ainsi que des super-enhancers liés à la voie. Des analyses d'ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing) réalisées dans cette même étude ont permis de mettre en évidence la même observation. En effet, des gènes tels que TNFR2 et IL-2 présentent une plus grande accessibilité au niveau de leurs promoteurs. Egalement, l'analyse des motifs présents dans les régions présentant une chromatine ouverte révèle que les motifs NF-κB et AP-1 sont enrichis dans les cellules exprimant Tax, appuyant l'importance de la voie NF-κB dans la dérégulation transcriptionnelle lors de l'expression de Tax.

### 3. Dérégulations qualitatives du transcriptome par Tax et HTLV-1

Tax et Rex sont impliqués dans l'altération du système de contrôle qualité des transcrits par NMD (Nonsense-Mediated Decay). Le NMD est un système permettant la dégradation des transcrits présentant un codon stop prématuré. L'interaction de Tax avec UPF1, acteur majeur du NMD, induit une baisse d'affinité et de translocation sur les acides nucléiques (Fiorini et al., 2018). De plus, Tax interagit avec d'autres facteurs du NMD tels que UPF2 ou INT6/eIF3E menant à son inhibition (Mocquet et al., 2012; Morris et al., 2007). L'inhibition du NMD par Tax permet ainsi de stabiliser des transcrits présentant un codon stop prématuré, tels que les ARNm viraux, mais également des transcrits cellulaires. La protéine Rex de HTLV-1 a été