# Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules souches humaines MuStem : rôle potentiel en médecine régénératrice ?

Alice Rannou, Marine Charrier, Isabelle Leroux, Laurence de Beaurepaire, Denis Chrétien, Karl Rouger, Laetitia Guevel

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## To cite this version:

Alice Rannou, Marine Charrier, Isabelle Leroux, Laurence de Beaurepaire, Denis Chrétien, et al. Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules souches humaines MuStem : rôle potentiel en médecine régénératrice?. XXXème congrès de l'AFH: les nouveaux mondes de l'histologie, Jun 2017, Nantes, France. 2017. [hal-01595117](https://hal.science/hal-01595117v1)

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# Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules souches humaines MuStem : rôle potentiel en médecine régénératrice ?

Alice RANNOU¹,², Marine CHARRIER¹,², Isabelle LEROUX¹, Laurence DE BEAUREPAIRE³, Denis CHRETIEN⁴, Karl ROUGER¹ & Laëtitia GUEVEL¹,²

## Introduction

La **Dystrophie Musculaire de Duchenne** (DMD) est une des plus importantes pathologies génétiques humaines, de part son incidence élevée avec **1/5000 garçons nouveau-nés**, et son évolution clinique invalidante dès l'enfance et fatale chez le jeune adulte (Emery, 1991 ; Hoffman and Connor, 2013). Dans 90 % des cas, la mutation du gène de la dystrophine aboutit à l'absence de la protéine dystrophine ce qui provoque une instabilité membranaire aboutissant à une nécrose des fibres musculaires. Un remplacement du tissu musculaire par du tissu fibreux et adipeux engendre une faiblesse musculaire. De nos jours, il n'existe aucun traitement curatif de la DMD (Vulin et al., 2012 ; Meregalli et al., 2013).

L'UMR 703 a identifié une population de cellules souches résidentes du tissu musculaire, les **cellules MuStem**, qui ont montré leur efficacité thérapeutique chez le **chien GRMD** (Rouger et al., 2011). Le chien, suite à l'injection par voie systémique de ces cellules, présente une **amélioration clinique majeure et persistante** avec une limitation des altérations du tissu musculaire, une augmentation de l'activité de régénération malgré une faible restauration de l'expression de la protéine dystrophine (<6 %). Cet impact clinique est du à des **effets directs et indirects** des cellules, directs via la fusion des cellules avec les fibres endogènes et indirects via le remodellage complet du tissu avec l'activation de nombreuses voies via la **sécrétion cellulaire** (Robriquet et al., 2015, 2016 ; Lardenois et al., 2016). Suite à ces résultats, une étude du sécrétome et plus particulièrement des **propriétés immunomodulatrices** des cellules MuStem a été mise en place au laboratoire. Ces différents éléments permettent de positionner la cellule MuStem comme **candidat prometteur** dans une stratégie de **thérapie cellulaire innovante**.

L'objectif principal de cette étude a été, dans un premier temps, d'isoler et de caractériser les vésicules extracellulaires provenant des cellules MuStem et dans un second temps, d'analyser l'activité biologique de ces vésicules en testant leur effet sur des myoblastes afin de déterminer leur rôle potentiel en médecine régénératrice.

## Contexte scientifique

### Cellules MuStem

**Origine :**

* Muscle squelettique sain (Chien, Homme) ; définies par un déficit d'adhérence initial

* Progéniteurs myogéniques d'origine péritasculaire mésenchymateuse

**Propriétés des cellules canines**

**Preuve de concept :**

**Administration systémique de cellules allogéniques**

**Bénéfice clinique et tissulaire** dans un modèle canin de la dystrophie musculaire de Duchenne (GRMD)

Impact dû à des effets directs et indirects (sécrétome)

(Rouger et al., 2011; Robriquet et al., 2015,2016; Lardenois et al., 2016)

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**Propriétés des cellules humaines**

**Isolement et expansion :**

Procédé de production compatible avec la clinique

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**Caractérisation**

n > 15

* Oligopotence

* Phénotype myogénique

* Potentiel de prolifération

* Propriétés immunomodulatrices

* Clonogénicité

(Lorant et al., in revision)

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Population MuStem : candidat thérapeutique potentiel

### Profil sécrétoire des cellules MuStem :
**Propriétés immunomodulatrices**

**Intérêts thérapeutiques majeurs :**

* Définition moins restrictive du **couple donneur / receveur**

* Diminution des traitements immunosuppresseurs

* Limitation du rejet de greffe / Augmentation de l'efficacité thérapeutique

(Baiguera et al., 2012; English et al., 2013)

**Action des cellules MuStem sur :**

Un acteur de l'immunité innée

* Inhibition de la cascade du **complément**

Un acteur de l'immunité adaptative

* Inhibition de la prolifération des **lymphocytes**

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Sécrétion de molécules immunomodulatrices

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## Objectifs

1. Caractérisation des vésicules extracellulaires des cellules MuStem « EV<sup>hMuStem</sup> » obtenues après purification

2. Analyse de l'activité biologique des EV<sup>hMuStem</sup> par des tests *vitro* et *vivo*

### Purification des EV<sup>hMuStem</sup> par centrifugation différentielle

**Conditionnement cellulaire :**

Centrifugation de surnageants en contact **48h** avec des cellules confluentes

Milieu supplémenté avec du sérum humain **déplété en EV**

* Obtenu par ultracentrifugation à 100 000 g

Viabilité cellulaire ≥ **90%**

* Minimise les contaminations avec des corps apoptotiques

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### Caractérisation des vésicules extracellulaires :
**Microvésicules & exosomes**

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* Taille de 50 nm à 2 µm

* Bourgeonnement de la membrane cellulaire

* Enrichies en ARNm et protéines

* Taille de 30 nm à 150 nm

* Origine endosomale

* Enrichis en microARN

Adapté d'Abcam

(Choi et al., 2016; Nakamura et al., 2015; Lai et al., 2015; Lawson et al., 2016)

## Méthodes

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Quelles sont les caractéristiques des EV<sup>hMuStem</sup> ?

## Protocol expérimental

### Protéines et profil ARN comme marqueurs des vésicules extracellulaires

**Marqueurs protéiques**

**Profil ARN**

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EVs : petites molécules d'ARN

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ARN ribosomaux déplétés

### Taille et concentration des particules de la fraction EV<sup>hMuStem</sup>

avec le qNano (IZON) et la technologie TRPS

**Technologie TRPS (Tunable Resistive Pulse Sensing) :**

* Permet d'acquérir des mesures de particules en suspension dans un électrolyte et d'obtenir :

* ✓ La concentration en particules

* ✓ La distribution de taille

* Application d'un courant à travers le fluide grâce aux électrodes d'argent

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* Le passage des ions entre les électrodes à travers le nanopore crée un courant basal

* Une diminution temporaire du courant traduit le passage d'une vésicule dans le nanopore et permet d'acquérir sa taille

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en collaboration avec S. Bösch and L. De Beaurepaire

**Taille et distribution des EV<sup>hMuStem</sup>**

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Concentration : 2.10<sup>10</sup> particules/mL

Taille : Diamètre moyen de 145 nm

Distribution : Homogène

## Résultats :
Caractérisation des EV<sup>hMuStem</sup>

### Cryo-tomographie électronique, une technique innovante pour la caractérisation des vésicules extracellulaires EV<sup>hMuStem</sup>

**Préparation des échantillons :**

* Permet de figer l'échantillon dans un état **non déformé** si la température ne dépasse pas -160°C

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**Cryo-tomographie électronique :**

* Permet la reconstruction **d'images 3D non-déformées** et ainsi d'obtenir :

* ✓ La taille des particules

* ✓ La visualisation des éléments de la structure interne et externe à haute résolution

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**Tomogrammes des EV<sup>hMuStem</sup>**

n= 32 vésicules

biosit

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en collaboration avec D. Chrétien

## EV<sup>hMuStem</sup> : potentiel rôle en médecine régénératrice ?

**Tests in vitro**

* Analyse de l'activité biologique des EV<sup>hMuStem</sup> sur les myoblastes

* ✓ Test de prolifération

* ✓ Test de migration

* ✓ Potentiel myogénique

* Analyse des **propriétés immunomodulatrices** des EV<sup>hMuStem</sup>

avec M. Charrier (phD Student, UMR 703 INRA/ONIRIS)

**Tests in vivo**

Analyse de l'activité de régénération des cellules MuStem après l'administration des EV<sup>hMuStem</sup>

* Dans un contexte de remodelage important du tissu musculaire

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## Perspectives

L'objectif de cette étude est d'explorer la capacité des vésicules extracellulaires EV<sup>hMuStem</sup> à moduler le contexte inflammatoire et à préparer le tissu dans le but d'augmenter le pourcentage de greffe des cellules MuStem afin de potentialiser l'effet thérapeutique.

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<footnote>(1) PAnTher, INRA, École nationale vétérinaire, agro-alimentaire et de l'alimentation Nantes-Atlantique (Oniris), Université Bretagne Loire, (UBL), Nantes, France</footnote>

<footnote>(2) Université de Nantes, Nantes, France</footnote>

<footnote>(3) IECM, INRA, Oniris, Nantes, France</footnote>

<footnote>(4) IGDR, CNRS UMR6290, Université de Rennes 1, Rennes, France; MRIC-Biosit, CNRS UMS3480, Université de Rennes 1, Rennes, France</footnote>