## 2G1445

### 膜流動性画像の三次元再構築

○麻生健、大場哲彦 (東北大院・理学・物理)

環境感受性色素 Laurdanは脂質二重層に入り込み、周囲の脂質がゲル相の時440nm、液晶相の時490nmに発光ピークを示す。この二波長の発光強度を用いて、GP=(I440-I490)/(I440+I490)と定義すると、GPは膜の流動性を表す指標となる。我々はGPの空間分布を調べるため、二波長の蛍光画像を顕微鏡下で同時に取得し、画像処理をすることによりGP画像を取得できるシステムを開発し、リボンームや細胞に対して適用してきた。しかし、顕微鏡下においては、非焦点面からの光の混入により、解像度は低下する。

そこで、本研究では、Washington University のJ.A.Conchelloらによる、非焦点面からの情報を除去する画像処理ソフト (XCOSM) を用いて、光学切片像から三次元像を再構成することを試みた。XCOSMは実測及び計算により求めた点像分布関数(psf)をもちいて、LLS法及びEM法により三次元再構成が可能である。

まず、コンピュータ制御により焦点面を冷却CCDカメラと連動して移動させ、焦点面をずらしながら画像を取得できるソフトを開発した。点光源として蛍光色素でコートしたビーズを用いて実測したpsfと計算により求めたpsfを比較した結果、実測から求めたpsfでは円対称にならず、円周に沿った明暗が見られたが、$\lambda$軸方向の光の減衰は、計算したpsfとほぼ同じ結果を示した。

T.Aso, T.Ohba: 3-D reconstruction of images of membrane fluidity

## 2G1500

### 1分子観察法におけるプローブ分子の違いによる脂質膜の流動性の評価

○小林舞、日比野政裕 (室蘭工大・応化)

細胞膜は細胞が生きる上で必要な情報の伝達の場である。この細胞膜の構造は均一なものではなく、局所的に流動性が異なる領域が存在すると考えられる。領域ごとの観察には1分子観察法が優れている。昨年までに、生体膜のモデルとしてカバーガラス上に脂質二重層膜を作り、膜中の個々の脂質分子をリアルタイムで直接観察することによって飽和リン脂質膜と不飽和リン脂質膜における流動性の違いを検討した。そこで今回は第一に、プローブとして用いる脂質分子の足の本数の違いによる膜中での分子の運動の差を検討した。

脂質膜の作成法は、水面に不飽和リン脂質分子パミルトイレオレオイルホスホコリン (POPC) を展開して水平法でカバーガラス上に一層目を作った。膜の二層目には蛍光色素を微量入れた単分子膜を同様の方法で積層した。すなわち、ガラス面側の膜には蛍光分子が入っていない、蛍光分子は水に面した2層目に入っていることになる。蛍光色素は脂質分子の頭部を修飾したものを使用した。

蛍光顕微鏡での直接観察の結果、膜中の蛍光1分子がそれぞれブラウン運動している様子が観察された。この膜中で疎水鎖が1本であるオクタデシルローダミンB分子の拡散係数は$0.81 \pm 0.59 \mu m^2/s$、また、2本であるTRITC DHPE分子は$0.81 \pm 0.69 \mu m^2/s$であった。一般的に疎水鎖の本数が増えると、膜中での運動のにおいて抵抗が大きくなると考えられるが、1本鎖と2本鎖の脂質分子ではそのような運動の差は観察されなかった。

年会では、分子の流動性が制限された場合についても報告する。

M.Kobayashi and M.Hibino: Study of fluidity of lipid membranes using single molecules microscopy with different probe molecules

## 2G1515

### パルス整形フェムト秒励起レーザーを用いたEGFP二光子励起蛍光における退色化の抑制

○河野弘幸¹、鍋川康夫¹、須田亮¹、大石裕¹、水野秀昭²、宮脇 教史²、緑川克美¹ (¹理研 レーザー物理工学研究室、²理研 細胞機能探索技術開発チーム)

二光子顕微鏡で蛍光分子を励起してその蛍光シグナルを観測するにあたり、高出力レーザー光の照射による蛍光分子の退色化が問題となっている。本研究では、フェムト秒励起レーザーの位相を制御することによって、単位蛍光強度当たりの励起光強度を抑制できる条件について検討した。

試料として濃度1mg/mlの改变緑色蛍光蛋白質 (EGFP) 水溶液を用いた。励起光 (波長815nm、時間幅20 fs、繰返し80 MHz、平均出力80 mW@セル) の位相を全固体空間光変調器により制御し、焦点距離5 cmのレンズで溶液セル中に集光した。得られた蛍光強度を光電子増倍管にて測定した。

図に示すような位相分散を励起光の各スペクトル成分に与えたところ、フーリエ変換限界 (FTL) パルスで励起した時と比較して蛍光強度が約50%増加した。特に励起スペクトル中の長波長成分 (830 850 nm) の位相制御が蛍光強度増加に大きな効果を示した。これはEGFPの二光子吸収断面積がこの波長領域に対して大きいためであると考えられる。

本研究の結果から、パルス整形励起レーザーを用いることで蛍光色素の退色化を最小限に抑えながら大きなシグナルが得られることが可能になる考えられる。

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H. Kawano, Y. Nabekawa, A. Suda, Y. Oishi, H. Mizuno, A. Miyawaki and K. Midorikawa: Suppression of photobleaching of EGFP two-photon fluorescence by using chirped femtosecond laser pulses

## 2G1545

### デジタルマイクロミラーデバイス(DMD)を用いた蛍光顕微鏡の開発

○深野天、宮脇 教史 (理研・脳研・細胞機能探索技術開発チーム)

コンベンショナル顕微鏡においてグリッドを用いた線投影法により共焦点顕微鏡と同様に光学断層像を得ることができる[1]。しかし、実際の観察においては、試料やその蛍光量に応じ光学切片の厚さを観察中に自由かつ容易に可変できることが求められている。そこで、デジタルマイクロミラーデバイス (DMD) を用いた蛍光顕微鏡を提案する。DMDは倒立顕微鏡の視野絞りの位置に置かれているので、対物レンズの焦点位置にある試料は、DMD上に描かれたパターンと同一のパターンで励起される。このパターンに従って励起された試料からの蛍光は、対物レンズに対して共役位置に置かれているCCD上に結像する。位相を90°ずつシフトした3つの正弦波の繰パターンで順に試料を励起し、撮像した3枚の画像から光学断層像とコンベンショナル像とが同時に求められる。蛍光薄膜を用い深度応答を測定し、その半値全幅の繰周期依存性を測定した。これにより、光学切片の厚さは繰周期に比例することがわかった。[1] M. Neil, et al. Opt. Lett. 22, 1905 (1997).

T. Fukano and A. Miyawaki: Whole-filed fluorescence microscope with digital micromirror device