# Development of a microfluidic quantitative PCR chip to monitor the dynamics of a synthetic microbial community on grapevine with potential biocontrol effects against downy mildew

Manon Chargy, Marie-Cecile Dufour, Aarti Jaswa, Valerie Martin, Sarah Audureau, Benoit Laurent, Simon Labarthe, Clémence Frioux, Franck Salin, Paola Fournier, et al.

► To cite this version:

Manon Chargy, Marie-Cecile Dufour, Aarti Jaswa, Valerie Martin, Sarah Audureau, et al. Development of a microfluidic quantitative PCR chip to monitor the dynamics of a synthetic microbial community on grapevine with potential biocontrol effects against downy mildew. Apéro VITAE - webinaire interne, VITAE (Léa Cabrol-Froget), Feb 2025, Villenave-d'Ornon, France. hal-05108055

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Submitted on 11 Jun 2025

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Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
# Développement d'une puce microfluidique de PCR quantitative

pour suivre la dynamique d'une communauté synthétique de microorganismes sur vigne ayant un potentiel effet de biocontrôle contre le mildiou

Manon CHARGY, Marie-Cécile DUFOUR, Aarti JASWA, Valerie MARTIN, Jessica VALLANCE, Sarah AUDUREAU, Benoit LAURENT, Simon LABARTHE, Clémence FRIOUX, Franck SALIN, Corinne VACHER
UMR SAVE (Santé et agroécologie du Vignoble), INRAE

6 février 2025
# La vigne est la 4ème culture la plus traitée en France

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Downy mildew**
*Plasmopara viticola*
(oomycete)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Powdery mildew**
*Erysiphe necator*
(fungi)</figcaption></figure>

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# La vigne est la 4ème culture la plus traitée en France

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Développer des solutions
de biocontrôle microbien
pour accélérer la sortie
des pesticides
# La diversité du microbiote : Un levier pour la sortie des pesticides?

<figure><img src="image_6.png" /></figure>
<figure><img src="image_7.png" /></figure>
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

Développement de solutions
de biocontrole microbien

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Suivi et quantification de l'agent
de biocontrôle
# Méthodes de suivi de l'établissement des BCA

<table><thead><tr><td>Méthode</td><td>Metabarcoding</td><td>qPCR</td><td>Puce microfluidique de qPCR</td></tr></thead><tbody><tr><td>Type de données obtenues</td><td>Séquences d'ADN, abondances relatives</td><td>Courbe de fluorescence, Ct, melting curve</td><td>Courbe de fluorescence, Ct, melting curve</td></tr><tr><td>Quantification</td><td>Relative</td><td>Absolue</td><td>Absolue</td></tr><tr><td>Type d'amorces utilisées</td><td>Universelles (16S, ITS)</td><td>Spécifiques à chaque cible</td><td>Spécifiques à chaque cible</td></tr><tr><td>Débit / rapidité</td><td></td><td>Une plaque 96 = 96 data en 2h = 50€</td><td>Une puce 48x48= 2304 data en 4h (haut débit) = 500€</td></tr></tbody></table>
# Méthodes de suivi de l'établissement des BCA

<table><thead><tr><td>Méthode</td><td>Metabarcoding</td><td>qPCR</td><td>Puce microfluidique de qPCR</td></tr></thead><tbody><tr><td>Type de données obtenues</td><td>Séquences d'ADN, abondances relatives</td><td>Courbe de fluorescence, Ct, melting curve</td><td>Courbe de fluorescence, Ct, melting curve</td></tr><tr><td>Quantification</td><td>Relative</td><td>Absolue</td><td>Absolue</td></tr><tr><td>Type d'amorces utilisées</td><td>Universelles (16S, ITS)</td><td>Spécifiques à chaque cible</td><td>Spécifiques à chaque cible</td></tr><tr><td>Débit / rapidité</td><td></td><td>Une plaque 96 = 96 data en 2h = 50€</td><td>Une puce 48x48= 2304 data en 4h (haut débit) = 500€</td></tr></tbody></table>
# Technologie microfluidique (Fluidigm, Standard biotools)

## Un outil moléculaire de qPCR à haut débit:

48 individus rencontrant 48 amorces =
2304 réactions de qPCR en simultanné se déroulant
dans des micro chambres réactionnelles

Compatible avec différentes chimies: Taqman, SYBR, Evagreen..

1 puce 48*48 = 24 plaques 96 puits en qPCR Classique =>
**Haut débit**

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<figure><img src="image_11.png" /></figure>
# Technologie microfluidique (Fluidigm, Standard biotools)

Prime

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Pipette

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Chargement

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

qPCR
Biomark HD

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Analyse

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Fermeture des valves
nanoflex

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Dépôt des amorces
et ADN sur la puce

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

Les amorces sont
poussées dans les
chambre reactionnelles

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

Amplification et lecture
de la **fluorescence** via le
système Biomark HD

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Courbes
d'amplification, Ct,
heatmap ..

**Applications** : Quantification absolue, génotypage, expression de gènes..

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Puce NeoViGen:
Défenses de la plante
# Applications pour la quantification de microorganismes

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

## Resolving Species Level Changes in a Representative Soil Bacterial Community Using Microfluidic Quantitative PCR

Hannah Kleyer*, Robin Tecon and Dani Or

## Microfluidic qPCR Enables High Throughput Quantification of Microbial Functional Genes but Requires Strict Curation of Primers

Sally L. Crane¹, Josie van Dorst¹, Grant C. Hose², Catherine K. King² and Belinda C. Ferrari¹*
# Isolement et création de la communauté synthétique

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

## 1. Experimental design

Long-term
epidemiological records

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Selection of 5 grapevine
plot pairs

Mildew symptoms
frequency and intensity

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Spring 2022 :
Sampling of young
leaves and top soil

## FEUILLES

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

Echantillonnage sur 4
parcelles en AB (avant les
premiers traitements)

## COLLECTION MICROBIENNE

Isolements sur 4 milieux
dont 1 à base d'extraits de
feuilles de vigne

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

### 998 isolats :

- 451 bactéries (42 genres)

- 243 levures (17 genres)

- 304 champignons filamenteux (31)

## COMMUNAUTE SYNTHETIQUE

Choix de souches prévalentes dans la
phyllosphère ou suspectées d'avoir
une activité de biocontrôle

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

SynCom

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

### 42 isolats (2 achetés) :

- 17 bactéries (15 genres)

- 19 levures

- 6 champignons (21 genres)
# Composition de la communauté synthétique

<table><thead><tr><th colspan="2">Filamentous fungi and Yeast</th></tr></thead><tbody><tr><td><em>Epicoccum nigrum</em></td><td><em>Trametes versicolor</em></td></tr><tr><td><em>Aureobasidium pullulans</em></td><td><em>Bullera alba</em></td></tr><tr><td><em>Vishniacozyma victoriae</em></td><td><em>Cystofilobasidium macerans</em></td></tr><tr><td><em>Sporobolomyces roseus</em></td><td><em>Udeniomyces pyricola</em></td></tr><tr><td><em>Filobasidium wieringae</em></td><td><em>Clonostachys rosea</em></td></tr><tr><td><em>Filobasidium magnum</em></td><td><em>Papiliotrema flavescens</em></td></tr><tr><td><em>Rhodotorula nothofagi</em></td><td><em>Cystofilobasidium infirmominiatum</em></td></tr><tr><td><em>Cladosporium ramotenellum</em></td><td><em>Meyerozyma guilliermondii</em></td></tr><tr><td><em>Dioszegia hungarica</em></td><td><em>Curvibasidium cygneicollum</em></td></tr><tr><td><em>Naganishia globosa</em></td><td><em>Leucosporidium scottii</em></td></tr><tr><td><em>Vishniacozyma carnescens</em></td><td><em>Bjerkandera adusta</em></td></tr><tr><td><em>Buckleyzyma aurantiaca</em></td><td><em>Plectosphaerella cucumerina</em></td></tr><tr><td><em>Filobasidium oeirense</em></td><td></td></tr></tbody></table>

Column to the left in each category represents abundant species on grapevine leaves

Column to the right in each category contain rare species

<table><thead><tr><th colspan="2">Bacteria</th></tr></thead><tbody><tr><td><em>Bacillus pumilus</em></td><td><em>Paenibacillus xylanexedens</em></td></tr><tr><td><em>Sphingomonas melonis</em></td><td><em>Duganella sp.</em></td></tr><tr><td><em>Microbacterium oxydans</em></td><td><em>Pseudarthrobacter defluvii</em></td></tr><tr><td><em>Methylobacterium brachiatum</em></td><td><em>Frondihabitans sp.</em></td></tr><tr><td><em>Groupe Pseudomonas fluorescens</em></td><td><em>Mycolicibacterium sp.</em></td></tr><tr><td><em>Curtobacterium flaccumfaciens</em></td><td><em>Stenotrophomonas rhizophila</em></td></tr><tr><td><em>Bacillus thuringiensis</em></td><td></td></tr><tr><td><em>Prestia megaterium</em></td><td></td></tr><tr><td><em>Pantoea agglomerans</em></td><td></td></tr><tr><td><em>Erwinia persicina</em></td><td></td></tr><tr><td><em>Streptomyces sp.</em></td><td></td></tr></tbody></table>

Species known for biocontrol in literature shown in green
# Etapes de développement de la puce microfluidique

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1. Sélection des souches:
Rôle de biocontrole
Et/ou
Prévalentes dans la phyllosphère
+ 4 pathogènes à quantifier

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2. Développement d'amorces spécifiques à chacune des espèces de la Syncom
Ciblant des gènes unicopie (Gyrase, B tubuline..)

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3. Vérification de la spécificité in vitro
En testant la puce sur les espèces de la Syncom seules (souches pures)
# Validation d'amorces

## Amorces

ADN

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CT

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# Validation d'amorces

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# Validation d'amorces

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# Validation d'amorces

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# Validation d'amorces

## Amorces

ADN

10 amorces restent à reconcevoir:
**5 aspecifiques / 5 ne s'hybrident pas**

Mauvaise identification? Polymorphisme dans la séquence?

Séquençage long read et short read en cours pour
perfectionner le design

CT

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# Application : Suivi de la dynamique de la communauté sur feuilles au cours du temps

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

Prélèvement
de disques foliaires
à chaque temps
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# Application : Suivi de la dynamique de la communauté sur feuilles au cours du temps

<figure><img src="image_56.png" /></figure>
# Intégration des données de la puce dans une approche multi-omique

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ADN
Génomique

ARN
Transcriptomique

Biochimie
Métabolomique

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Time series

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Compléter les données de génomique obtenues avec la puce par des approches transcriptomiques et métabolomiques des échantillons du Time series

**=> Modélisation des reseaux d'interactions plante-microbiote-pathogène**

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Amélioration du dispositif actuel d'épidémiosurveillance des maladies fongiques :

Recherche d'indicateurs microbiens de sensibilité au mildiou

## Stage de Yannis (M2) :

Peut-on détecter les microorganismes présents sur la puce dans les échantillons de sporée aérienne récoltés des capteurs de spores?
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Amélioration du dispositif actuel d'épidémiosurveillance des maladies fongiques :

Recherche d'indicateurs microbiens de sensibilité au mildiou

Stage de Yannis (M2) :

Peut-on détecter les microorganismes présents sur la puce dans les échantillons de sporée aérienne récoltés des capteurs de spores?
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Merci pour votre attention !