# L'IRM par contraste CEST: applications aux produits agroalimentaires

Charbel Assaf

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Charbel Assaf. L'IRM par contraste CEST: applications aux produits agroalimentaires. Ingénierie des aliments. 2018. hal-02784985

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# Rapport de stage de Master 2

L'IRM par contraste CEST : applications aux produits agroalimentaires

Par

Charbel ASSAF

Maître de Stage : M. Guilhem PAGES

Tuteur de Stage : M. Patrice LAQUERRIERE
# UFR PHYSIQUE ET INGENIERIE

## MASTER2-Physique de Rayonnements, Instrumentation, Détecteurs et
Imagerie (PRIDI)

## Rapport de stage

**Auteur** : Charbel ASSAF

**Titre** : L'IRM par contraste CEST : applications aux produits agroalimentaires

**Promotion** : 2017 / 2018

**Structure d'accueil** : UR 0370 Qualité des Produits Animaux, Plateforme AgroResonance

**Département / pays** : INRA-Centre Auvergne-Rhône-Alpes / France

**Code APE (NAF)** : 7219Z

**Abstract** : Nowadays, non-coeliac gluten sensitivity is a major issue in our occidental countries. Indeed, an increase number of person is complaining about this problem without any medical diagnostic. One hypothesis regarding this problem deals with a longer and more complex gluten network leading to a lower digestibility. To validate this hypothesis, it is necessary to have an analytical method able to image it. The gluten network is made by the formation of disulfide bonds from thiols functions. From a chemical point of view, it is dealing with an oxidation process and the loss of one exchangeable proton. Exchangeable proton can be imaged by MRI using the so-called chemical saturation transfer contrast. While this method has been applied to hydroxyl and nitrogen based moieties, it has never been done to thiols functional groups. The aim of my internship is to (i) demonstrate that thiols moieties can be imaged by CEST-MRI and (ii) apply this contrast to dough. While my first task was readily performed by using a cysteine phantom, the presence of non-mobile macromolecules significantly broadens the Z-spectrum envelope. I tried to extract the CEST effect by simulation the dough Z-spectrum thanks to a 3-pool model. The water and MT pools were correctly modeled; however, I could not convincingly simulate the CEST effect. In the second part of my internship, I plan to pursue my efforts with the simulations. I will also use different sample preparations as well as different flours containing or not gluten to better understand the CEST envelope.

**Mots clés** : Chemical Exchange Saturation Transfer, CEST ; Gluten ; Imagerie par Résonance Magnétique, IRM ; Magnetization Transfer, MT ; Pâte
REMERCIEMENTS

Il n'est jamais facile à un étudiant de trouver un stage. C'est pourquoi je remercie l'INRA de m'avoir accueilli. Ces 6 mois passés à l'INRA ont été pour moi une source immense d'enrichissements scientifique et technique. Ils m'ont aussi permis de faire des rencontres humaines formidables.

Tout d'abord, Je tiens à remercier vivement mon maitre de stage, **M. Guilhem PAGES**, pour son encadrement, son aide quotidienne et son soutien aux instants difficiles de mon stage. Ces moments de recherche, d'expérimentations et aussi de détente m'ont été très plaisants et particulièrement instructifs.

J'aimerais remercier **M. Jean Marie BONNY** pour le temps qu'il m'a consacré pendant mon stage, pour son appui continu, pour sa motivation ainsi que pour les notions et les conseils qu'il m'a avancé et qui m'ont permis de consolider mes connaissances.

Je remercie également tous les membres de la plateforme AgroResonance, pour leur accueil et leur esprit d'équipe. Je remercie en particulier **M. Amidou TRAORE** pour les nombreux échanges scientifiques que nous avons pu avoir sur l'IRM.

Je remercie les stagiaires pour les moments de franche rigolade passés ensemble. J'espère que l'esprit de la « salle d'ambiance » perdurera.

Faire mon stage de dernière année à INRA a été un plaisir et un honneur. J'ai pu apprendre beaucoup grâce à vous, et j'ai surtout été conforté dans mon projet professionnel, ce qui est un aboutissement de mon cursus universitaire.

Je remercie infiniment, mon tuteur de stage **M. Patrice LAQUERRIERE** pour son suivi pendant ce parcours.
# SOMMAIRE

1. PRESENTATION DE L'INRA .................................................................................................................. 5

1.1. L'institut national de la recherche agronomique (INRA) ................................................................ 5

1.2. Le Centre Auvergne-Rhône-Alpes .................................................................................................... 5

1.3. La Plateforme AgroResonance ........................................................................................................ 5

2. INTRODUCTION .................................................................................................................................................. 6

3. CONTEXTE DU STAGE .................................................................................................................................. 7

3.1. Présentation de L'IRM ........................................................................................................................ 7

3.2. Présentation du contraste par échange chimique (CEST) ................................................................ 7

3.2.1. Modélisation d'un spectre CEST .................................................................................................... 9

4. MATERIEL ET METHODE .................................................................................................................................. 10

4.1. Préparation des solutions témoins........................................................................................................ 10

4.2. Préparation de la pâte et du gluten .................................................................................................... 10

4.3. Enregistrement des images .................................................................................................................. 10

4.4. Paramètres de simulation .................................................................................................................. 11

4.5. Mesures des constantes physiques pour la modélisation................................................................ 11

5. RESULTATS ET DISCUSSION .................................................................................................................. 12

5.1. Validation de l'effet CEST des fonctions thiols ........................................................................ 12

5.1.1. Contraste CEST et concentration.................................................................................................. 12

5.2. IRM sur les produits issus de la panification .................................................................................. 14

1. Mesure des constantes pour la population CEST ........................................................................ 15

2. Mesure des constantes pour la population d'eau........................................................................ 16

3. Mesure des constantes pour la population MT ........................................................................ 17

5.3. Simulation des données expérimentales .................................................................................... 18

5.4. Discussion des différences entre les 3 courbes : ........................................................................ 20

5.5. Discussion des différences entre les spectres simulés et expérimentaux : ................................ 21

6. CONCLUSION .................................................................................................................................................. 22

7. LES APPORTS DU STAGE .................................................................................................................... 23

7.1. Habiletés acquises ............................................................................................................................ 23

7.2. Obstacles affrontés et solutions restituées.................................................................................. 23

7.3. Le travail en groupe ........................................................................................................................ 23

8. REFERENCES .................................................................................................................................................... 24
# 1.PRESENTATION DE L'INRA

## 1.1. L'institut national de la recherche agronomique (INRA)

L'INRA est le premier institut de recherche agronomique en Europe et le deuxième en sciences agricoles au niveau mondial. Les thématiques de recherche de l'INRA sont au service d'enjeux de taille pour la société : alimentation, agriculture et environnement. Ses missions sont diverses et variées en allant par exemple de la prévention des zoonoses1 à la mise en place d'une alimentation saine et durable.

Les forces de recherche de l'INRA se déclinent dans 250 unités de recherche et 48 unités expérimentales. Ces entités sont organisées scientifiquement autour de 14 départements de recherche, reparties géographiquement sur 17 centres implantés sur tout le territoire.

Le département « caractérisation et d'élaboration des produits issus de l'agriculture » (CEPIA), ses développe des recherches sur les processus (chimiques, biologiques, ...) mis en jeu lors de la transformation de matières premières.

## 1.2. Le Centre Auvergne-Rhône-Alpes

L'unité Qualité des Produits Animaux (QuaPA) au sein de laquelle j'ai effectué mon stage est implantée sur le site de Theix du Centre INRA Auvergne-Rhône-Alpes. Les thématiques de recherche développées sur le centre sont multidisciplinaires et s'insèrent dans une large gamme allant des ressources biologiques (animales, végétales, microbiennes) au territoire en passant par le produit et l'homme.

Les objectifs scientifiques de l'unité permettent de répondre à certains défis sociétaux. En effet, il s'agit d'approfondir les adaptations nécessaires à la transition alimentaire mondiale, plus particulièrement aux besoins en protéines, à la durabilité des systèmes de production, et aux besoins de certaines populations ciblées (seniors, sportifs...).

## 1.3. La Plateforme AgroResonance

Mon stage s'est déroulé au sein de la plateforme analytique AgroResonance. Une plateforme analytique est un ensemble composé de personnels qualifiés autour d'un équipement de haut niveau technologique ouvert à la communauté scientifique. AgroResonance est spécialisée en imagerie et spectroscopie RMN et répond à des questions de recherche dans les domaines de l'agroalimentaire, du végétal, de la nutrition et de la santé. De par son rattachement à l'unité QuaPA, la plateforme mène des recherches sur des matrices agroalimentaires. Elle est équipée de trois spectromètres de RMN de dernière génération permettant de couvrir une large gamme d'application en imagerie ou spectroscopie RMN.

<footnote n="1">¹ Maladie infectieuse atteignant les animaux, et qui peut être transmise à l'homme.</footnote>
## 2. INTRODUCTION

Dans l'alimentation occidentale, les produits à base de céréales, et plus particulièrement de blé, sont nombreux : pains, pâtes, biscuits, ... Ces produits contiennent du gluten qui est responsable de deux maladies diagnostiquées médicalement :

La maladie cœliaque (MC) qui est une intolérance permanente à une ou plusieurs fractions protéiques du gluten et l'allergie qui est liée à la présence des protéines de blé. Depuis quelques années, une troisième forme de pathologie se développe : l'hypersensibilité non cœliaque au gluten. Les symptômes de cette pathologie sont nombreux et le plus fréquemment consistent en des troubles fonctionnels digestifs (douleurs abdominales, alternance diarrhée-constipation, ballonnement abdominal). Aucun diagnostic médical ne peut à l'heure actuelle être posé sur cette pathologie ; les personnes s'auto diagnostiquant hypersensible à la suite de l'élimination des produits à base de gluten et la disparition des symptômes.

Une des hypothèses pour expliquer cette augmentation significative d'hypersensibles au gluten réside dans une modification des propriétés du réseau de gluten due notamment à la sélection végétale opérée en amont. En effet, le gluten, ou plus exactement le réseau de gluten, est un réseau de macromolécules qui se forme lors de la préparation de la pâte. Les gliadines et gluténines, deux types de macromolécules présentes dans le grain de réserve de la céréale, vont se mettre en réseau grâce à la formation de ponts disulfures entre ces macromolécules, créant ainsi le gluten. Pour vérifier cette hypothèse, il est indispensable d'avoir un outil analytique permettant de caractériser et d'observer le réseau de gluten.

Le but de mon stage est donc de développer une méthodologie IRM pour observer la formation du réseau de gluten. Pour cela, je me suis appuyé sur une méthode imageant l'échange chimique entre un soluté et l'eau : l'IRM CEST (chemical exchange saturation transfer).

Les objectifs de ce stage étaient les suivants :

* Démontrer la présence d'un effet CEST sur les fonctions thiols ;

* Développer une méthodologie pour observer la formation du réseau de gluten sur des produits -panifiés ;
# 3.CONTEXTE DU STAGE

## 3.1. Présentation de L'IRM

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) du proton ($^1$H) est une technique de choix pour imager localement les propriétés de l'eau. Le principe de l'IRM permet d'étudier tout objet, corps ou tissu contenant des atomes d'hydrogène. Placés dans un puissant champ magnétique statique, les atomes d'hydrogène s'orientent dans la même direction. Ils sont alors excités par un champ magnétique radiofréquence (RF) durant une très courte période et sont ainsi mis en résonance. A l'arrêt de cette stimulation, les atomes restituent l'énergie accumulée en produisant un signal qui est enregistré et traité sous forme d'image.

La faible sensibilité de la méthode est compensée par la, généralement, forte proportion d'eau dans les produits biologiques. En contrepartie, l'observation de métabolites, présents en faible quantité, en IRM est complexe et il est en général nécessaire de développer des approches originales pour pouvoir les étudier. L'une d'elles exploite les transferts de protons entre l'eau et les métabolites contenant des protons échangeables comme les protéines ou les sucres.

## 3.2. Présentation du contraste par échange chimique (CEST)

L'imagerie par transfert de saturation par échange chimique (CEST) est une approche de contraste IRM relativement nouvelle dans laquelle des composés exogènes ou endogènes contenant des protons échangeables ou des molécules échangeables sont sélectivement saturés et, après transfert de cette saturation, détectés indirectement par le signal de l'eau [1].

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1: Principe de l'imagerie CEST. (A) : les protons du soluté sont saturés puis transférés aux molécules d'eau Ceci se traduit sur le spectre RMN par une diminution de l'intensité du signal de l'eau. (B) : mesure du signal IRM de l'eau ($S_{sat}/S_0$) en fonction de la fréquence de saturation (spectre-z). La perte de signal à 3,5 ppm est caractéristique de la présence d'un proton échangeable. L'analyse du spectre-z par l'approche asymétrique est représentée en dessous du spectre-z.</figcaption></figure>

Les principes de l'imagerie CEST sont très simples et décrit sur la Figure 1. Les protons échangeables du soluté qui résonnent à une fréquence différente de ceux de l'eau sont sélectivement saturés par une
irradiation radiofréquence (RF). L'aimantation est ensuite transférée à l'eau lors de l'échange des protons du soluté (Figure 1A haut). Le signal de l'eau est alors atténué (Figure 1A bas).

Les effets de saturation en fréquence sont visualisés par le spectre-z qui consisté à tracer l'intensité du signal IRM de l'eau en présence d'une saturation à une fréquence spécifique ($S_{sat}$) normalisé par le signal IRM de l'eau en absence de saturation ($S_0$) (Figure 1B haut). L'atténuation totale du signal à l'offset 0 ppm correspondant à une irradiation directe (saturation directe (DS)) de l'eau. Cette saturation directe peut interférer avec la détection des effets CEST. Pour détecter uniquement l'échange chimique, une analyse de l'asymétrie du rapport de transfert d'aimantation ($MTR_{asym}$) est appliquée pour éliminer la saturation directe de l'eau (Figure 1B bas). Cette analyse fait l'hypothèse que les transferts d'aimantation ne sont présents que pour des offsets positifs et que les offsets négatifs ne représentent que les effets de la DS de l'eau. La quantification de l'échange chimique est donc obtenue en réalisant la différence entre le signal IRM de l'eau à un offset négatif et celui à la même valeur d'offset mais positive.

Pour effectuer une telle analyse, il est indispensable que la fréquence de l'eau soit parfaitement ajustée pour chacun des pixels. Or, en raison des inhomogénéités de champ magnétique, il existe des variations locales de celui-ci et donc de la fréquence de résonance de l'eau. Il est donc indispensable de mesurer ces variations pour, lors d'une étape de post-procession, appliquer une correction des valeurs d'offsets. Pour effectuer une telle mesure, Kim [2] a proposé de réaliser des images contrastées par la DS uniquement et aucun autre effet de transfert d'aimantation. Cette méthode est connue sous le nom de water saturation shift referencing (WASSR).

Dans les milieux complexes comme *in-vivo* ou sur des matrices alimentaires, aux effets de l'échange chimique et de la DS peuvent s'ajouter des transferts d'aimantation de macromolécules mobiles ($MTC_{mm}$) et immobiles ($MTC_{im}$). La Figure 2 représente l'effet de ces différents types de transfert d'aimantation. Cette figure montre clairement que dans de tels cas, l'hypothèse d'asymétrie considérée dans l'analyse $MTR_{asym}$ n'est plus valable. Pour s'affranchir de ces problèmes, Jin [3] a proposé d'estimer l'enveloppe des effets DS et ($MTC_{im}$) en traçant une ligne droite entre deux offsets de référence, l'atténuation du signal supplémentaire étant due à l'effet CEST.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2 : (A) : comparaison schématique du spectre Z en présence de DS uniquement (spectre gris), de DS et de transferts d'aimantation des macromolécules immobiles ($MTC_{im}$) (noir) et avec ajout des transferts d'aimantation des macromolécules mobiles ($MTC_{mm}$) (spectre rouge). (B) : illustration de l'approche proposée par Jin pour quantifier les transferts d'aimantation en considérant une ligne de base droite.</figcaption></figure>
### 3.2.1. Modélisation d'un spectre CEST

Une expérience CEST peut être modélisée en prenant en compte les différentes populations qui s'échangent avec l'eau. Dans l'exemple de la Figure 2, un modèle à 3 populations permet de décrire le système d'échange (Figure 3). La première population est celle d'eau, il existe ensuite une population pour laquelle il existe un échange chimique et une autre pour laquelle se sont les transferts d'aimantation qui dominent. Chaque population est caractérisée par ses constantes de relaxation $R1$ et $R2$, par les fractions s'échangeant (f) et par les vitesses d'échanges (k) ainsi que la fréquence à laquelle cet échange se déroule ($\Delta\omega$).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 3 : Modèle à trois populations. Une première population contient les protons d'eau (pool a), un autre le soluté s'échangeant avec l'eau (pool CEST b) et un troisième caractérisant les macromolécules (pool MT c).</figcaption></figure>

Zaiss [4] a montré qu'en présence de macromolécules le spectre Z du mélange peut être décrit en superposant les effets de relaxation de chacune des populations :

$$R_{1\rho}(\Delta\omega) = R_{eff}(\Delta\omega) + R_{ex}^{mt}(\Delta\omega) + R_{ex}^{cest}(\Delta\omega) \quad [1]$$

Où, $R_{eff}$ représente la relaxation de la composante de DS ;

$R_{ex}^{cest}$ représente la relaxation de l'échange pour la population CEST ;

$R_{ex}^{mt}$ représente la relaxation dépendant de l'échange pour les macromolécules ;

$\Delta\omega$ est le décalage de fréquence RF par rapport à la fréquence de résonance de l'eau ;

Le pool MT semi-solide a également une forte influence sur la relaxation longitudinale $T1$ de l'eau. La valeur propre libre est donnée par :

$$R_{1\text{ obs}} = \frac{R_1 + F_c R_{1c}}{1 + F_c} \quad [2]$$

Toutes ces grandeurs peuvent s'exprimer grâce au modèle représenté sur la Figure 3 et à ses différents paramètres. Les équations complètes sont disponibles dans la référence [4].
Le spectre Z ajusté dans le cas représenté par la Figure 3 et contenant à la fois une population CEST et une population MT semi-solide est donc donné par :

$$Z^{ss}(\Delta\omega) = \frac{\cos^2\theta \cdot R_{1\text{obs}}}{R_{1\rho}} \quad [3]$$

$$\text{Où, } \cos^2\theta = \frac{\Delta\omega^2}{\omega_1+\Delta\omega^2}$$

# 4. MATERIEL ET METHODE

## 4.1. Préparation des solutions témoins

Les solutions témoins ont été préparées avec de la cystéine à différentes concentrations. Pour une solution mère de 400 mM, peser 240 mg de L-cystéine et ajouter 5 mL d'eau. Diluer la solution mère pour obtenir les concentrations souhaitées (400, 200, 100, ... mM).

## 4.2. Préparation de la pâte et du gluten

Pour préparer la pâte, peser 50g de farine et ajouter 25 g d'eau. Pétrir pendant 5 minutes. Pour extraire le gluten, rincer sous un mince filet d'eau jusqu'à ce que l'eau de lavage soit claire. A la fin, une boule verdâtre, spongieuse et caoutchouteuse doit être obtenue : c'est le gluten.

A la préparation « normale » de la pâte, d'autres formulations ont été préparées pour tester différentes hypothèses, notamment : une pâte sans pétrir, une deuxième avec 25g de farine et 50 g d'eau.

## 4.3. Enregistrement des images

Les images ont été enregistrées sur un imageur Bruker BioSpec 117/16 ayant un champ magnétique de 11,7 T correspondant à une fréquence de résonance de 500 MHz pour le ¹H. Une sonde volumique en quadrature de 40-mm a été utilisée pour émettre et recevoir le signal. Le déroulement d'une série d'expériences consiste à :

* préparer et fixer l'échantillon dans le support ;

* accorder l'antenne ;

* localiser l'échantillon dans le champ magnétique grâce à une séquence de type écho de gradients ;

* lancer une expérience de type (WASSR). Les paramètres utilisés (Repetition Time, TR =1000 ms ; Echo Time, TE = 4.76 ms ; Field of view, FOV = 35x 35 mm² ; size of image = 64x64 ; Impulsions de saturation = 0.2 µT ; Durée d'impulsion de 800 ms ayant une bande passante de 20 Hz ; 51 offsets entre ± 500 Hz ainsi qu'un offset à 100 000 Hz) ;

* lancer une expérience CEST (TR=4000 ms ; TE = 4.76 ms ; FOV = 35x 35 mm² ; image size = 64x64 ; Impulsions de saturation = 1,5 µT ; Durée d'impulsion de 3 secondes ayant une bande passante de 50 Hz ; 151 offsets entre ± 5000 Hz ainsi qu'un offset à 100 000 Hz) ;

* analyser les images avec Matlab ;
## 4.4. Paramètres de simulation

Pour la simulation, plusieurs paramètres ont besoin d'être mesurés. Il faut savoir pour les 3 populations, le temps de relaxation longitudinal $T_1$ et le temps de relaxation transversal $T_2$. En plus, pour les deux populations CEST et MT, le temps d'échange (k) avec l'eau doit être déterminé ainsi que la fraction de proton $M_0/M_{0a}$. Toutes les simulations ont été réalisées avec un champ $B_0$ de 11.7 T et l'irradiation était réalisée pour une impulsion RF $B_1= 1.5$ µT d'une durée de 3 secondes.

## 4.5. Mesures des constantes physiques pour la modélisation

### 1) Préparation des échantillons

Pour mesurer certains paramètres utiles à la simulation, deux flacons sont préparés. Le premier contient de la pâte mélangée avec de l'eau distillée, le deuxième contient une solution de cystéine de concentration 100 mmol.L⁻¹ préparée dans l'eau deutéré $D_2O$.

### 2) Temps de relaxation $T_1$

La séquence utilisée est une séquence de type « inversion-recovery ». Une impulsion à 180° est réalisée puis l'aimantation est laissée sous une évolution libre pendant un temps $\tau$ avant l'application d'une impulsion de lecture de 90°. La variation de ce temps $\tau$ permet d'ajuster un modèle pour déterminer le temps de relaxation $T_1$. Les valeurs de $\tau$ été comprises entre 1 ms et 20s.

### 3) Temps de relaxation $T_2$

La séquence utilisée est une séquence de type CPMG. Il s'agit d'une impulsion à 90° suivi d'un train d'impulsion à 180° séparé par un délai $\tau$. Dans la séquence utilisée, un spectre était enregistré pour chaque train d'impulsion à 180°. Le nombre d'impulsions à 180° a été varié de 2 à 256 avec un $\tau$ de 2 ms [5].

### 4) Temps d'échange $T_{ex}$

La méthode de Goldman et Shen a été appliquée. La séquence consiste à appliquer une impulsion de 90°$_{+x}$, attendre un temps de préparation $\tau_1$, puis à ramener l'aimantation dans la direction + z grâce à une impulsion 90°$_{-x}$, puis laisser l'aimantation évoluer pendant un temps variable $\tau_2$. Une impulsion de lecture 90°$_{+x}$ permet de lire le signal [6] [7]. Une série de 19 expériences est lancée en augmentant $\tau_1$ de 10 µs à 200 µs avec un pas de 10µs. Les valeurs de $\tau_2$ étaient comprises entre 100 µs et 2s.

### 5) Fraction d'échange $f$

La fraction d'échange est le rapport d'aimantation d'une population $M_0$ sur l'aimantation total. La population d'eau étant majoritaire alors l'aimantation totale est celle d'eau. Une telle fraction est donc donnée par :

$$f_p = \frac{M_{0p}}{M_{0A}} \quad [4]$$

Où, $M_{0p}$ représente l'aimantation de la population étudiée ;

$M_{0A}$ représente l'aimantation de l'eau ;
# 5. RESULTATS ET DISCUSSION

## 5.1. Validation de l'effet CEST des fonctions thiols

Les ponts disulfures qui se forment dans le réseau du gluten proviennent d'un acide aminé : la cystéine. La cystéine qui a des groupements thiols et amide est un modèle intéressant pour vérifier notre première hypothèse de travail qui est :

* L'échange chimique entre les fonctions thiols et l'eau est observable par IRM CEST.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 4 : Structure moléculaire de la Cystéine.</figcaption></figure>

### 5.1.1. Contraste CEST et concentration

La Figure 5 représente le spectre Z de 8 solutions de cystéine à différentes concentrations (0, 5, 10, 25, 50, 100, 200 et 400 mM).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5 : (Gauche) : spectre Z de la cystéine à différentes concentrations. (Droite) : analyse de l'aire sous la courbe par l'approche MTCmm.</figcaption></figure>

Nous pouvons observer la présence de deux atténuations de signal. La première vers + 1500 Hz est typique des échanges chimiques entre l'eau et des fonctions amines. La seconde qui nous intéresse vers -1200 Hz correspond aux fonctions thiols. La présence d'échange chimique à un offset négatif ne nous permet pas d'utiliser la méthode d'analyse classique basée sur l'asymétrie ($MTR_{asym}$), nous devons donc utiliser la méthode de Jin [3], pour mesurer l'aire sous chacun des pics. La figure 5 représente l'aire pour chacun des groupements échangeables de la molécule en fonction de la concentration en cystéine.

Une image contrastée CEST est générée, selon l'analyse de Jin [3] pixel par pixel sur les régions d'intérêts. La Figure 6 montre l'image de référence et les images contrastées CEST pour les fonctions thiols (région de -2100 à -1000 Hz) et amines (région de 828 à 2225 Hz). Tandis qu'aucun contraste n'existe entre les différents tubes sur l'image de référence, les deux images contrastées CEST permettent de différentier les tubes en fonction de leur concentration en cystéine.
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Figure 6: (A) : image de référence des tubes contenant différentes concentrations de cystéine et images contrastées CEST pour les fonctions (B) -NH2 et (C) -SH.

Ces résultats, nous permettent de valider notre première hypothèse qui est l'observation de l'échange chimique entre les fonctions thiols et l'eau par IRM CEST. Fort de ces résultats, la deuxième partie du travail peut être mise en œuvre. Il s'agit de mettre en place une méthode pour observer ces effets CEST sur des produits panifiés.
## 5.2. IRM sur les produits issus de la panification

La Figure 7 représente le spectre Z de 3 pâtes préparées dans différentes conditions : une première classiquement, une deuxième pâte n'a pas été pétrie tandis que pour la troisième la quantité d'eau a été doublée. Pour faciliter la comparaison, le spectre Z d'une solution de cystéine (100 mM) a été ajouté.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 7 : Spectre Z de la pâte préparée normalement (bleu clair), sans pétrissage (rouge) ou en mettant deux fois plus d'eau (noir) ainsi que d'un tube de référence contenant de la cystéine à 100 mM (bleu foncé).</figcaption></figure>

Nous pouvons déjà remarquer l'absence des effets de l'échange sur le spectre Z des pâtes. Cela est dû à la présence du large transfert de magnétisation semi-solide (MT) provenant de protons immobiles. Les contrastes CEST endogènes peuvent être fortement affectés par le bruit de fond MT. De plus, le spectre Z s'élargit lorsque le réseau macromoléculaire est de plus en plus dense entrainant ainsi une diminution de l'intensité du spectre.

Pour extraire l'effet CEST en présence du transfert d'aimantation des macromolécules, nous décidons de modéliser les spectres Z à l'aide du modèle à 3 populations proposé par Zaiss [4]. Dans un premier temps, plusieurs paramètres décrits dans la Figure 3.
# 1. Mesure des constantes pour la population CEST

Cette population est caractérisée par ses constantes de relaxation R1b et R2b, par la fraction s'échangeant $f_b$ et par la vitesse d'échange $k_{ba}$. Les mesures sont faites sur l'échantillon de la cystéine dans l'eau deutérée D₂O.

## i) Temps de relaxation $T_1$ et $T_2$

La Figure 8 représente l'intensité de signal RMN de la cystéine en fonction du temps.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 8: Evolution de signal RMN de la cystéine lors d'une expérience de type (A) : inversion-recovery pour déterminer le $T_1$ et (B) : CPMG pour mesurer le $T_2$</figcaption></figure>

L'ajustement du signal RMN est réalisé selon un modèle exponentiel (courbe rouge). La valeur du $T_1$ est mesurée à 1.875 s tandis que la valeur du $T_2$ est de 1.5s. Les constantes de relaxation R1b et R2b pour la population CEST sont donc de 0.53 s⁻¹ et 0.667 s⁻¹.

## ii) Fraction échangeable $f$

La mesure de la fraction de proton s'effectue selon l'équation (4). La concentration de la solution de cystéine est 100 mmol. L⁻¹. Le nombre de proton échangeable de la fonction de thiols est 1. La fraction devient

$$f_b = \frac{M_{0b}}{M_{0A}} = \frac{1*100}{2*55.5*1000} = 0.09\%$$

## iii) Temps d'échange $T_{ex}$

Le spectre-z de la solution de cystéine à 100 mmol. L⁻¹ (Figure 5 Gauche) est utilisé. Le modèle de Zaiss est appliqué sur ce spectre Z en négligeant la participation de la population MT. La seule inconnue dans ce modèle est le temps d'échange. Cette valeur est donc ajustée manuellement pour que le modèle se superpose au mieux avec les données expérimentales.

La Figure 9 représente les deux spectres Z ainsi que la différence entre le spectre expérimental et simulé.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 9 : Spectre Z d'une solution de cystéine à 100 mM (rouge) et spectre simulé (bleu). Le résidu (différence entre les deux spectres) est représenté en noir.</figcaption></figure>

Cette différence montre que le temps d'échange des fonctions thiols de la cystéine est $T_{ex}$ CEST = 0.03 s.

Suite à cette simulation sur un modèle à deux populations, nous allons ajouter la troisième population, celle entraînant le MT.

## 2. Mesure des constantes pour la population d'eau

Cette population est caractérisée par ses constantes de relaxation R1a et R2a. Les mesures sont faites sur l'échantillon de la pâte sans pétrissage.

### i) Temps de relaxation $T_1$ et $T_2$

La Figure 10 représente l'intensité de signal RMN de la pâte sans pétrissage en fonction du temps.

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 10 : (A) : Temps de relaxation $T_1$ et (B) : en $T_2$</figcaption></figure>
L'ajustement des courbes de relaxation de l'eau dans la pâte répond à un modèle bi exponentiel (courbe rouge). La pâte présente plusieurs populations d'eau : une eau liée et une eau libre. Les constantes de la population d'eau qui nous intéressent pour nos simulations correspondent à celles qui ont les temps de relaxations les plus longs. La courbe de la Figure 10A a une allure exponentielle croissante avec 2 valeurs de $T_1$ qui correspondent aux molécules, d'eau liées $T_1=0.12$ s et d'eau libre $T_1=0.69$ s. La valeur de R1a pour la population d'eau est $1.44 \text{ s}^{-1}$. La courbe de la Figure 1B a une allure exponentielle décroissante avec 2 valeurs de $T_2$ qui correspondent aux molécules, d'eau liée $T_2=0.01$ s et d'eau libre $T_2=0.019$ s. La valeur de R2a pour la population d'eau est de $52.63 \text{ s}^{-1}$.

### 3. Mesure des constantes pour la population MT

Cette population est caractérisée par ses constantes de relaxation R1c et R2c, par la fraction s'échangeant fc et par la vitesse d'échange kbc. Selon Stanisz [8] la valeur de $T_{1c}$ varie entre 100 ms et 1 s et celle de $T_{2c}$ varient entre 10 µs et 100 µs ; la fraction de proton quant à elle se situe aux alentours de 20%.

#### i) Temps d'échange $T_{ex}$

La mesure a été effectuée par la méthode de Goldman et Shen. La Figure 11 représente les intensités du signal obtenues dans 19 expériences.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 11 : Intensités du signal en fonction de la valeur de $\tau_2$. La valeur de $\tau_1$ varie entre 10 et 200 µs par pas de 10 µs</figcaption></figure>

Dans la Figure 11, le creux observé est caractéristique de la présence d'échange entre les macromolécules et l'eau. Nous allons analyser les résultats suivant l'approche utilisée dans l'article de Pages [6]. La première étape consiste à ajuster chacune des courbes obtenues avec différents $\tau_1$ par l'équation :

$$M_f(\tau) = M_f^0(1 + C^+e^{-R^+\tau} + C^-e^{-R^-\tau}) \quad [5]$$
L'ajustement selon l'équation (5) sur chacune de 19 courbes nous permet de déterminer les valeurs de C⁺, C⁻, R⁺ et R⁻. Le graphe à droite de la Figure 12 est ensuite tracé. L'ajustement linéaire de ces données nous permet d'extraire la valeur de la constante d'échange à partir de la pente.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 12 : (Gauche) illustration d'un des 19 fits selon l'équation (5). (Droite) ajustement des données pour la déterminer la constante d'échange</figcaption></figure>

Le temps d'échange obtenu pour la pâte sans pétrissage est de 86.7 ms.

### 5.3. Simulation des données expérimentales

Nous appliquons le modèle à 3 populations sur les données expérimentales acquises sur la pâte. En plus des paramètres mesurés expérimentalement, le modèle contient des variables inconnues qui sont toutes liées à la population des macromolécules. Pour la population MT, les paramètres ont été variés en se basant sur les valeurs reportées par Stanisz [8] (voir ci-dessus). Le Tableau 1 représente les paramètres utilisés pour simuler le spectre Z représenté dans la Figure 13.

<table><caption>Tableau 1 : Paramètres utilisés pour simuler le spectre de la Figure 13 (pâte sans pétrissage).</caption><thead><tr><th>Population</th><th>Paramètres</th><th>Pâte sans pétrir</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">EAU</td><td>T<sub>1a</sub> (s)</td><td>0.69</td></tr><tr><td>T<sub>2a</sub> (s)</td><td>0.019</td></tr><tr><td rowspan="4">CEST</td><td>T<sub>1b</sub> (s)</td><td>1.8573</td></tr><tr><td>T<sub>2b</sub> (s)</td><td>1.5</td></tr><tr><td>f<sub>c</sub> %</td><td>0.09</td></tr><tr><td>T<sub>ex</sub> (s)</td><td>0.03</td></tr><tr><td rowspan="4">Macromolécules</td><td>T<sub>1c</sub> (s)</td><td>0.3</td></tr><tr><td>T<sub>2c</sub> (s)</td><td>10*10<sup>-6</sup></td></tr><tr><td>f<sub>c</sub> %</td><td>0.4</td></tr><tr><td>T<sub>ex</sub> (s)</td><td>0.0867</td></tr></tbody></table>
La Figure 13 représente le spectre z d'une pâte non pétrie (orange). Le spectre Z généré à partir d'un modèle à 3 populations et avec les paramètres décrits dans le Tableau 1 est représenté en bleu.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 13 : Spectres z (orange) expérimental de la pâte sans pétrissage, (bleu) simulé et (rouge) aire sous la courbe du spectre simulé</figcaption></figure>

Nous appliquons la même démarche sur une pâte pétrie et une pâte contenant une double quantité d'eau. Les valeurs utilisées pour les spectres Z simulés sont représentées dans le Tableau 2 tandis que la Figure 14 représente la superposition des spectres Z (expérimentaux et simulés) pour chacune des deux pâtes.

<table><caption>Tableau 2 : Paramètres des simulations utilisés pour générer les spectres Z simulés représentés dans la Figure 14.</caption><thead><tr><th>Population</th><th>Paramètres</th><th>Pâte en double quantité d'eau</th><th>Pâte pétrie</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">EAU</td><td>T<sub>1a</sub> (s)</td><td>0.8</td><td>0.5</td></tr><tr><td>T<sub>2a</sub> (s)</td><td>0.024</td><td>0.008</td></tr><tr><td rowspan="4">CEST</td><td>T<sub>1b</sub> (s)</td><td>1.8573</td><td>1.8573</td></tr><tr><td>T<sub>2b</sub> (s)</td><td>1.5</td><td>1.5</td></tr><tr><td>f<sub>c</sub> %</td><td>0.09</td><td>0.09</td></tr><tr><td>T<sub>ex</sub> (s)</td><td>0.03</td><td>0.03</td></tr><tr><td rowspan="4">Macromolécules</td><td>T<sub>1c</sub> (s)</td><td>0.2</td><td>0.4</td></tr><tr><td>T<sub>2c</sub> (s)</td><td>6*10<sup>-6</sup></td><td>15*10<sup>-6</sup></td></tr><tr><td>f<sub>c</sub> %</td><td>0.2</td><td>0.5</td></tr><tr><td>T<sub>ex</sub> (s)</td><td>0.05</td><td>0.1</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 14 : Spectre z expérimental (orange) et simulés (bleu) (Gauche) de la pâte préparée en doublant la quantité d'eau et (Droite) la pâte pétrie</figcaption></figure>

## 5.4. Discussion des différences entre les 3 courbes :

Les résultats montrent que la pâte préparée avec une double quantité d'eau a une enveloppe moins large que la pâte non pétrie qui elle-même est moins large que la pâte pétrie. Ceci provient des effets de MT qui sont moins importants lorsque l'échantillon à un réseau macromoléculaire moins dense. De plus, l'amplitude du signal pour des offsets élevés s'approche de 1 contre seulement 0,85 pour la pâte ayant une préparation normale. Nous pouvons noter que la pâte la plus hydratée présente des signes encourageants pour la détection de l'effet CEST désiré.

En effet, un effet CEST est observé à un offset de 1 ppm. Cet effet peut être attribué aux fonctions hydroxyles (-OH), probablement celles de l'amidon présent dans la pâte. Cette préparation avec une quantité d'eau plus importante permet de rendre le spectre Z moins sensible aux phénomènes de transfert d'aimantation.

De même, l'asymétrie à des offsets négatifs due à la population MT est moins visible dans la pâte préparée avec une quantité d'eau plus importante. De plus, l'enveloppe pour laquelle nous observons une asymétrie s'élargit lorsque le milieu devient plus dense. Pour la population CEST, un effet sur le spectre z expérimental entre les offsets -2 ppm et -4 ppm est remarqué pour la pâte préparée avec une double quantité d'eau et la pâte sans pétrissage. Cependant, aucun effet n'est observé avec la pâte pétrie.
## 5.5. Discussion des différences entre les spectres simulés et expérimentaux :

L'enveloppe globale des spectres Z expérimentaux est relativement bien simulée. Par contre, l'effet CEST mis en évidence sur les spectres simulés n'apparait pas sur les spectres expérimentaux. Plusieurs facteurs sont susceptibles d'expliquer cette différence.

### 1. L'évolution de l'échantillon est trop rapide par rapport à la durée de l'expérience

Le spectre Z expérimental est un spectre moyen sur l'ensemble des pixels sélectionnés dans la région d'intérêt. La pâte est un milieu hétérogène dont la structure évolue à la fois au cours du temps et en fonction des conditions expérimentales. Par exemple, nous avons remarqué que la viscosité de la pâte ainsi que la localisation de petites bulles d'air évoluaient au cours de l'expérience. Des expériences réalisées en dehors de l'aimant ont mis en évidence que la pâte subit un gonflement au cours du temps. De telles modifications affectent directement l'effet CEST qui n'est pas visualisé expérimentalement, pouvant ainsi être noyé probablement par les effets bruités déjà mentionnés.

### 2. Les fonctions thiols ne sont pas détectables dans les produits panifiés

La Figure 5, montre que la diminution de la concentration entraîne une diminution de l'effet CEST des fonctions thiols. Ce facteur pourrait contribuer à la diminution de l'effet CEST sur le spectre expérimental. En l'absence de méthode de référence, il est difficile de mesurer la concentration des fonctions thiols. Ce paramètre doit être ajusté pour générer les spectres simulés.

### 3. L'effet CEST est décalé en fréquence

L'effet CEST des fonctions thiols a été mesuré à une fréquence de -2,5 ppm sur des échantillons modèles. Il est possible que dans le milieu complexe qu'est la pâte la fréquence de l'effet CEST change. Dans le spectre enregistré avec une pâte contenant plus d'eau qu'une préparation classique, une asymétrie est observée pour les offsets négatifs proches de zéro.

### 4. Les valeurs des constantes physiques utilisées dans la simulation ne sont pas correctes

Tandis que certaines constantes liées aux populations des MT et de l'eau ont pu être mesurées expérimentalement sur un échantillon proche du cas réel, ceci n'a pas été possible pour la population CEST. Les paramètres utilisés ont été ceux mesurés dans une solution liquide contenant de l'eau et de la cystéine. Les temps de relaxation mesurés sont probablement trop longs pour être ceux de la population CEST dans la pâte. De plus, dans la population MT, certains paramètres ne peuvent pas être mesurés ($T_2$ par exemple).

Actuellement, ce travail n'est pas terminé et l'ajustement sera amélioré dans la suite du stage.
Les expériences montrent qu'il faut travailler sur plusieurs facteurs dont les paramètres pour simuler correctement l'effet CEST (notamment la fréquence de distribution des échanges), la qualité du spectre expérimental et la possibilité d'ajuster automatiquement le spectre simulé.
# 6. CONCLUSION

Les résultats obtenus au cours de la première moitié de mon stage, m’ont permis de valider ma première hypothèse de travail, à savoir que l’échange chimique entre les fonctions thiols et l’eau est observable par IRM CEST ;

L’application de l’IRM CEST sur les produits issus de la panification est complexe à cause de la structure très rigide du matériau. Les premiers résultats obtenus par simulation sont encourageants. L’enveloppe globale du spectre Z est correctement simulée. Le modèle doit maintenant être amélioré modéliser correctement l’effet CEST.

Pour diminuer les effets de MT, je prévois dans la suite de mon stage de changer les conditions de préparation de la pâte. Pour valider que l’effet CEST que j’observerai provient bien des fonctions thiols du réseau de gluten, je pourrais (i) réaliser un suivi cinétique pour suivre leur disparition et (ii) réaliser des expériences CEST avec de la pâte ne contenant pas de gluten, en utilisant de la farine de sarrasin par exemple.
# 7.LES APPORTS DU STAGE

Tout au long de ces 6 mois de stage, j'ai acquis plusieurs informations et j'ai regroupé multiples notions. Ce stage professionnel a été bénéfique à plusieurs niveaux : niveau éducatif, niveau professionnel et niveau personnel. Il s'agit d'une expérience inoubliable et enrichissante. J'ai amplement profité de cette période pour qu'elle soit fructueuse.

Les résultats de ce stage pourraient être rassemblés sous trois titres : habiletés acquises, obstacles affrontés et solutions restituées et enfin le travail en groupe.

## 7.1. Habiletés acquises

Le stage est une étape essentielle et entièrement nécessaire. Il permet de passer de la théorie à la pratique. La plateforme AgroResonance m'a donné la possibilité de mettre en pratique mes connaissances théoriques sur l'IRM et d'exercer mon analyse critique de mes résultats.

Etant Libanais, le stage en France était une sorte de défi pour moi-même puisque tout était nouveau pour moi. Ce stage m'a permis de développer ma patience, persévérance et solidarité.

## 7.2. Obstacles affrontés et solutions restituées

Les obstacles étaient plus ou moins négligeables. D'une part, le travail sur une IRM à très haut champ magnétique était une épreuve et un projet ambitieux pour moi. J'étais suffisamment attentif et vigilant. En outre, cette tâche a amélioré ma confiance en moi et m'a rendu plus conscient de mes capacités d'adaptation.

D'autre part, les ingénieurs de recherche étaient toujours prêts à répondre à mes diverses questions et il existait une grande solidarité entre les stagiaires provenant de différents horizons et ayant des compétences très variées. Le travail se faisait en coopération avec les différents membres de l'équipe.

## 7.3. Le travail en groupe

La période de stage ne se limitait pas au travail et aux expériences professionnelles.il s'agit d'un temps de discussion, de rencontre et même de partage. La relation entre les membres de l'équipe était une relation amicale voire familiale.

Ce stage m'a permis de découvrir la vie d'un laboratoire de recherche avec les différentes réunions permettant de faire vivre le collectif : « conseil de gestion », « animation scientifique », « mensuelle scientifique » pour mon laboratoire
8. REFERENCES

[1] Zijl, Peter C. M. van. Zijl, Nirbhay N. Yadav 2011. "Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST): What is in a Name and What Isn't?" *Magnetic Resonance in Medicine*, February 17: 927-948

[2] Kim, Mina. 2009. "WAter Saturation Shift Referencing (WASSR) for chemical exchange saturation transfer experiments." *Magn Reson Med*, June 1: 1441-1450.

[3] Jin. 2013. "MR imaging of the Amide-Proton Transfer effect and the pH-insensitive Nuclear Overhauser Effect at 9.4 T." *Magn Reson Med*, March 1: 760-770.

[4] Zaiss, Moritz. 2014. "A combined analytical solution for chemical exchange saturation transfer and semi-solid magnetization transfer." *NMR IN BIOMEDICINE*, Octobre 31: 217-230

[5] Muller-Petke, M. Ronczka. 2012. "Optimization of CPMG sequences to measure NMR transverse relaxation time T2 in berhole applications." *Geoscientific Instrumentation Methods and Data Systems*, Novembre 21: 197-208

[6] Pages, Guilhem. 2013. "Suppressing magnetization exchange effects in stimulated-echo diffusion experiments." *Journal of Magnetic Resonance*, juin 10: 35-45.

[7] Topgaard, Daniel. 2001. "Diffusion of Water Absorbed in Cellulose fibers Studied with ¹H-NMR." *Langmuir*, Mai 4: 2694-2702

[8] Stanisz, Greg J. 2005. "T1, T2 Relaxation and Magnetization Transfer in Tissue at 3T." *Magnetic Resonance in Medicine*, Aout 5: 507-512
# ABSTRACT

Nowadays, non-coeliac gluten sensitivity is a major issue in our occidental countries. Indeed, an increase number of person is complaining about this problem without any medical diagnostic. One hypothesis regarding this problem deals with a longer and more complex gluten network leading to a lower digestibility. To validate this hypothesis, it is necessary to have an analytical method able to image it. The gluten network is made by the formation of disulfide bonds from thiols functions. From a chemical point of view, it is dealing with an oxidation process and the loss of one exchangeable proton. Exchangeable proton can be imaged by MRI using the so-called chemical saturation transfer contrast. While this method has been applied to hydroxyl and nitrogen based moieties, it has never been done to thiols functional groups. The aim of my internship is to (i) demonstrate that thiols moieties can be imaged by CEST-MRI and (ii) apply this contrast to dough. While my first task was readily performed by using a cysteine phantom, the presence of non-mobile macromolecules significantly broadens the Z-spectrum envelope. I tried to extract the CEST effect by simulation the dough Z-spectrum thanks to a 3-pool model. The water and MT pools were correctly modeled; however, I could not convincly simulate the CEST effect. In the second part of my internship, I plan to pursue my efforts with the simulations. I will also use different sample preparations as well as different flours containing or not gluten to better understand the CEST envelope.

**Mots clés** : Chemical Exchange Saturation Transfer, CEST ; Gluten ; Imagerie par Résonance Magnétique, IRM ; Magnetization Transfer, MT ; Pâte