# 1. Étapes pour la validation (Max Feinberg, 2010<sup>b</sup>)

## 1.1. Étape 0 : description du mode opératoire

### Objectif de la méthode

Quantifier 15 HAP (naphtalène, acénaphtène, fluorène, phénantrène, anthracène, fluoranthène, pyrène, benzo(a)anthracène, chrysène, benzo(b)fluoranthène, benzo(k)fluoranthène, benzo(a)pyrène, dibenzo(ah)anthracène, benzo(ghi)pérylene, indéno(1,2,3-cd)pyrène) contenus dans des eaux de pluie. La méthode doit être juste (nous avons besoin des concentrations en ng/l pour calculer les flux de HAP *via* l'eau de pluie et les comparer au stock du sol, qui est déterminé par une autre méthode analytique). La méthode doit être fidèle (les analyses sont réalisées une fois par an, il n'y a pas de répétition par échantillon). Les résultats sont destinés aux scientifiques utilisant le dispositif expérimental.

### Méthode analytique optimisée et mode opératoire rédigé sous trame qualité du laboratoire

Voici quelques informations concernant le mode opératoire (Bourdat-Deschamps et al., 2007). Les eaux de pluies sont collectées de façon hebdomadaire et sont congelées. Après décongélation, un échantillon moyen mensuel est réalisé. Dans un volume de 10 ml d'eau de cet échantillon, additionné de 200 µl d'acétonitrile, on place un Twister® (barreau aimanté recouvert d'un film polymérique), préalablement conditionné. L'extraction est réalisée dans un bain marie à 25°C, avec une agitation de 800 tr/mn pendant 140 mn. Le barreau est ensuite placé dans un flacon HPLC avec insert. Un volume de 100 µl d'acétonitrile est rajouté. L'étape de désorption réalisée à l'abri de la lumière dure 25 mn dans un bain marie à 50°C. Le barreau est ensuite sorti du flacon. Le flacon est rebouché, stocké à l'abri de la lumière avant analyse par HPLC-fluorescence (colonne à polarité de phases inversée spéciale HAP, gradient acétonitrile-eau). La quantification est réalisée par étalonnage externe : dopage d'eau milli-Q à 4 ou 5 niveaux de concentrations de HAP, extraction des HAP selon la procédure détaillée ci-dessus, quantification des HAP contenus dans l'eau de pluie avec la droite d'étalonnage réalisée dans l'eau milli-Q dopée.

Initialement, la méthode prévoyait deux désorptions successives dans l'acétonitrile afin de maximiser le rendement de désorption. Cependant la réalisation de deux désorptions successives limitait à 8 le nombre d'expériences qui pouvaient être réalisées dans une journée. Afin d'augmenter à 12 le nombre d'expériences réalisables par jour, le protocole a été modifié et désormais une seule désorption est réalisée.

En général, 12 échantillons d'eau de pluie sont extraits par jour. Le lendemain, ce sont les échantillons d'étalonnage (eau Milli-Q dopée) qui sont extraits. Puis, l'analyse HPLC est réalisée pour l'ensemble des échantillons d'eau de pluie et d'étalonnage.

**Caractérisation réalisée** : linéarité, répétabilité à deux niveaux de concentration, fidélité intermédiaire, limite de quantification (pour eau milli-Q) (Cf. Bourdat-Deschamps et al., 2007).

**Teneurs approximatives des échantillons à analyser** : nous avons analysé des échantillons d'eau de pluie à l'aide de la méthode décrite ci-dessus. Les teneurs sont variables selon les HAP et selon les saisons (de quelques ng/l à quelques dizaines de ng/l).
## 1.2 Étape 1 : Définition du mesurande

**Que mesure-t-on ?** Chacun des 15 HAP contenu dans de l'eau de pluie (échantillon moyen mensuel)

**Comment exprime-t-on le résultat final ?** Un seul échantillon d'eau par mois est analysé (pas de répétition). La teneur (ng/l) est déterminée par étalonnage externe (eau milli-Q dopée).

## 1.3 Étape 2 : paramètres de la validation

**Domaine d'application (a priori) :** d'après l'étude de linéarité (caractérisation de la méthode) : de 1 à 50 ng/l (voire jusqu'à 100 ou 200 ng/l pour certains HAP). Les analyses préalables d'échantillons d'eau de pluie ont montré que les teneurs maximales de chaque HAP n'excédaient pas 30 ng/l. Le domaine d'application choisi a donc été de 1 à 30 ng/l.

**Limites d'acceptabilité (λ) :** ±20%, ce qui signifie que pour une teneur de 1ng/L le résultat sera compris au maximum entre 0,8 et 1,2 ng/L et pour une teneur de 30 ng/L, il sera compris au maximum entre 24 et 36 ng/L.

**Intervalle de tolérance (β) :** 80 % (pas de réglementation pour cette application, en général, on choisit $β ≥ 80\%$).

## 1.4 Étape 3 : échantillons de validation et définition des valeurs de référence

**Quels échantillons pour l'étape de validation ?** Afin de représenter au mieux la matrice « eau de pluie », un échantillon moyen a été réalisé en rassemblant des eaux de pluies récoltées tous les mois d'une année. Cet échantillon a été homogénéisé et a été stocké à l'abri de la lumière à 4°C pour la durée des expériences de validation. Afin de minimiser la modification de la matrice au cours du temps (développements microbiens), l'ensemble des expériences pour la validation a été réalisé sur 1,5 semaine.

**Quelle est la valeur de référence pour chaque échantillon ?** Des ajouts dosés à différentes concentrations ont été réalisés sur la matrice ainsi préparée, avec une solution étalon commerciale contenant les 15 HAP, chacun à la même concentration.

## 1.5 Étape 4 : essais de validation

**Quatre niveaux de concentration (1,9 ; 4,7 ; 9,5 ; 28,5 ng/l) ont été choisis.** Selon les saisons et les HAP, certaines teneurs risquent d'être proches des limites de quantification. Lors de la caractérisation de la méthode, ces limites avaient été évaluées (rapport signal sur bruit de l'ordre de 10) autour de 1 à 5 ng/l selon les HAP, ce qui explique notre choix pour les deux niveaux bas de concentration.

La matrice que nous avons dopée contient probablement des HAP (c'est de l'eau de pluie naturelle). **Un échantillon non dopé** a également été analysé.

**Deux répétitions par niveau de concentration ont été réalisées car nous pouvons effectuer au maximum 12 extractions par jour.** Or (4 niveaux de concentration + 1 échantillon non dopé) × 2 répétitions = 10 extractions.

**Trois séries de mesures ont été réalisées, sur trois jours.**
## 1.6 Étape 5 : essais d'étalonnage

Nous avons choisi d'appliquer le protocole d'extraction SBSE aux échantillons d'étalonnage qui sont constitués d'eau Milli-Q dopée avec les HAP.

Comme indiqué dans le mode opératoire à l'étape 0, les extractions des échantillons de terrain sont réalisées un jour et les extractions des échantillons d'eau milli-Q dopée sont réalisées un autre jour. Nous avons donc procédé de même pour la validation de la méthode. **Pour chaque série, les extractions SBSE des échantillons d'étalonnage ont été réalisées le lendemain des extractions d'échantillons de validation. Ensuite, les injections HPLC de tous ces échantillons de la même série ont été réalisées sur une nuit.**

**Cinq niveaux de concentration** (de 0,9 à 27,6 ng/l) ont été choisis. Le point le plus élevé de la gamme d'étalonnage est légèrement inférieur à celui de la gamme de validation. Comme le rendement d'extraction SBSE est inférieur à 83 %, cela ne posera pas de problème car les aires obtenues pour les échantillons de validations seront comprises dans la gamme des aires des échantillons d'étalonnage.

**Une analyse par niveau** a été réalisée. Ce choix a été fait car dans l'organisation de la semaine de travail, il n'était pas possible de réaliser deux répétitions (le conditionnement des barreaux demandant beaucoup de temps). Par ailleurs, le coefficient de variation caractérisant la répétabilité de la méthode pour chaque HAP, déterminé notamment pour de l'eau Milli-Q dopée à 5ng/l, est inférieur à 10% (excepté pour le benzo(ghi)pérylene : 12,8 %), ce qui a conforté ce choix.

**Trois séries de mesures** ont été réalisées c'est-à-dire trois jours, comme pour les échantillons de validation.

## 1.7 Étape 6 : réalisation des essais (validation et étalonnage)

Pour les étapes 6 à 9, seuls les résultats concernant le pyrène seront présentés, la méthodologie étant la même pour les 14 autres HAP.

### Essais de validation

<table><caption>**Tableau 1 :** mesurages correspondant aux essais de validation (eau de pluie dopée)</caption><thead><tr><th rowspan="2">niveaux</th><th rowspan="2">séries</th><th rowspan="2">valeur ref<br>(ng/L)</th><th colspan="2">Mesurages pyrène (aires)*</th></tr><tr><th>rep 1</th><th>rep 2</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">1</td><td>1</td><td rowspan="3">1,9</td><td>36539</td><td>36785</td></tr><tr><td>2</td><td>60086</td><td>35295</td></tr><tr><td>3</td><td>57695</td><td>59731</td></tr><tr><td rowspan="3">2</td><td>1</td><td rowspan="3">4,7</td><td>102066</td><td>98495</td></tr><tr><td>2</td><td>99897</td><td>93547</td></tr><tr><td>3</td><td>115298</td><td>111584</td></tr><tr><td rowspan="3">3</td><td>1</td><td rowspan="3">9,5</td><td>188665</td><td>191294</td></tr><tr><td>2</td><td>188657</td><td>198683</td></tr><tr><td>3</td><td>221678</td><td>194983</td></tr><tr><td rowspan="3">4</td><td>1</td><td rowspan="3">28,5</td><td>595999</td><td>604704</td></tr><tr><td>2</td><td>520857</td><td>501025</td></tr><tr><td>3</td><td>557258</td><td>541355</td></tr></tbody></table>

<footnote>* pour chaque série, les aires contenues dans les « blancs » (matrice non dopée) ont été soustraites aux aires obtenues pour chaque niveau.</footnote>
# Essais d'étalonnage avec l'eau milli-Q dopée subissant l'intégralité du protocole

<table><caption>**Tableau 2 :** mesurages correspondant aux essais d'étalonnage (eau milli-Q dopée)</caption><thead><tr><th>niveaux</th><th>séries</th><th>valeur ref (ng/L)</th><th>Mesurages pyrène (aires)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">1</td><td>1</td><td rowspan="3">0,9</td><td>43083</td></tr><tr><td>2</td><td>24719</td></tr><tr><td>3</td><td>35684</td></tr><tr><td rowspan="3">2</td><td>1</td><td rowspan="3">4,6</td><td>117767</td></tr><tr><td>2</td><td>112319</td></tr><tr><td>3</td><td>115840</td></tr><tr><td rowspan="3">3</td><td>1</td><td rowspan="3">9,2</td><td>238120</td></tr><tr><td>2</td><td>202957</td></tr><tr><td>3</td><td>249807</td></tr><tr><td rowspan="3">4</td><td>1</td><td rowspan="3">18,4</td><td>450132</td></tr><tr><td>2</td><td>398342</td></tr><tr><td>3</td><td>440029</td></tr><tr><td rowspan="3">5</td><td>1</td><td rowspan="3">27,6</td><td>682393</td></tr><tr><td>2</td><td>611523</td></tr><tr><td>3</td><td>633748</td></tr></tbody></table>

## 1.8 Étape 7 : Modèle d'étalonnage pour chaque série

À partir des données du **tableau 2**, pour chaque série d'étalonnage, les coefficients du modèle d'étalonnage sont déterminés (**tableau 3**), sachant que dans notre cas, le modèle d'étalonnage est une droite. Ensuite, à partir des mesurages réalisés sur les échantillons de validation (**tableau 1**), ces coefficients permettent de calculer les concentrations retrouvées des échantillons de validation (**tableau 4**).

La figure 1 est une représentation graphique des tableaux 1 et 2.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 1 :** représentation graphique des aires mesurées lors des essais d'étalonnage et de validation, en fonction de la concentration</figcaption></figure>
<table><caption>**Tableau 3 :** détermination des coefficients du modèle d'étalonnage pour chaque série</caption><thead><tr><th></th><th>a<sub>1</sub></th><th>a<sub>0</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>étalonnage série 1</td><td>24031</td><td>14563</td></tr><tr><td>étalonnage série 2</td><td>21757</td><td>5845</td></tr><tr><td>étalonnage série 3</td><td>22431</td><td>22707</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Tableau 4 :** concentrations retrouvées des échantillons de validation</caption><thead><tr><th rowspan="2">Niveaux</th><th rowspan="2">Séries</th><th rowspan="2">Valeur de référence (ng/l)</th><th colspan="2">Concentrations pyrène (ng/l)</th></tr><tr><th>Rép. 1</th><th>Rép. 2</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">1</td><td>1</td><td rowspan="3">1,9</td><td>0,91</td><td>0,92</td></tr><tr><td>2</td><td>2,49</td><td>1,35</td></tr><tr><td>3</td><td>1,56</td><td>1,65</td></tr><tr><td rowspan="3">2</td><td>1</td><td rowspan="3">4,7</td><td>3,64</td><td>3,49</td></tr><tr><td>2</td><td>4,32</td><td>4,03</td></tr><tr><td>3</td><td>4,13</td><td>3,96</td></tr><tr><td rowspan="3">3</td><td>1</td><td rowspan="3">9,5</td><td>7,24</td><td>7,35</td></tr><tr><td>2</td><td>8,40</td><td>8,86</td></tr><tr><td>3</td><td>8,87</td><td>7,68</td></tr><tr><td rowspan="3">4</td><td>1</td><td rowspan="3">28,5</td><td>24,20</td><td>24,56</td></tr><tr><td>2</td><td>23,67</td><td>22,76</td></tr><tr><td>3</td><td>23,83</td><td>23,12</td></tr></tbody></table>

## 1.9 Étapes 8 et 9 : calcul et tracé du profil d'exactitude

Les données du **tableau 4** sont saisies dans le fichier Excel® pour réaliser les calculs et tracer le profil d'exactitude. L'exploitation des données de chaque HAP, comme présentée aux paragraphes 1.7 à 1.9 permet de tracer le profil d'exactitude pour chacun des HAP.

# 2. Résultats et interprétations

## 2.1 Résultats pour le pyrène

Le tracé du profil d'exactitude pour le pyrène est présenté sur la **figure 2**.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 2 :** profil d'exactitude pour le pyrène (d'après tableau 4), pour $\lambda=20\%$ et $\beta=80\%$</figcaption></figure>
La méthode présente un **biais systématique** (la ligne de recouvrements moyens n'est pas à 100%) qui est explicable par un effet matrice. Or cela invalide la méthode puisque nous avons besoin qu'elle soit juste. En traçant les concentrations retrouvées (données du **tableau 4**) en fonction des concentrations théoriques pour les échantillons de validation (**figure 3**), il est possible de déterminer la pente moyenne des taux de recouvrement. L'inverse de cette pente moyenne donne le **facteur de correction** (1,20) que l'on peut appliquer à chacune des concentrations retrouvées afin de retracer un profil d'exactitude corrigé (**figure 4**).

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 3 :** concentrations de pyrène retrouvées en fonction des concentrations théoriques des échantillons de validation</figcaption></figure>

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>**Figure 4 :** profil d'exactitude pour le pyrène en appliquant un facteur de correction (1,20) aux concentrations de validation ($\lambda$=20% et $\beta$=80%)</figcaption></figure>
En corrigeant les valeurs retrouvées avec le facteur de correction, la **méthode devient juste** (biais inférieur à 3% pour des concentrations entre 5 et 28 ng/l).

Afin de valider le facteur de correction, une nouvelle série de mesures a été réalisée (échantillons de validation : 4 niveaux et 2 répétitions par niveau ; échantillons d'étalonnage : 5 niveaux sans répétition). Le facteur de correction déterminé auparavant a été appliqué aux concentrations retrouvées. Les teneurs corrigées se situent dans le profil d'exactitude présenté **figure 4**.

La **limite de quantification basse** est déterminée par l'intersection entre la limite d'acceptabilité et la limite de tolérance. Elle est de 4,7 ng/l. La **limite de quantification haute** correspond au point haut de gamme des échantillons de validation (28,5 ng/l).

La **méthode est donc validée entre 4,7 et 28,5 ng/l** ($\lambda$ = 20 % et $\beta$ = 80 %) car dans ce domaine, l'intervalle de tolérance est compris dans l'intervalle d'acceptabilité.

En dessous de 4,7 ng/l, **les limites de tolérance haute et basse divergent très rapidement et de façon symétrique**.

Vers 10 ng/l, **la limite haute de tolérance est proche de la limite d'acceptabilité haute**, ce qui signifie que le risque moyen d'avoir en routine une proportion moyenne de résultats non acceptables est proche de 1/10 (car $\beta$ = 80 %, soit une proportion moyenne de 1/5, et l'intervalle de tolérance est proche de la limite d'acceptabilité sur la partie haute du profil seulement, ce qui divise le risque par 2). Mais une proportion moyenne de 1/10 signifie qu'elle peut varier autour de cette moyenne. Comme les intervalles de tolérance se resserrent de 10 à 28 ng/l, ce risque diminue fortement.

Le profil d'exactitude peut être employé pour **choisir les teneurs des contrôles qualités (CQ)** qui seront employés lors des analyses en routine. En effet, on pourra choisir un CQ proche de 10 ng/l. Le CQ se comportant comme les échantillons, s'il ne passe pas, il faudra refaire la série d'analyse. Si on choisit d'utiliser 3 CQ de niveaux de concentrations différents, on peut choisir un CQ à 5 ng/l (proche de la limite de quantification basse), un CQ à 10 ng/l (concentration « critique » du profil) et un CQ à 25 ng/l (proche de la limite haute).

Les résultats présentés à la **figure 1** ont été obtenus en prenant une droite ($a_1 \times X + a_0$) comme modèle d'étalonnage. D'autres modèles d'étalonnage ont été testés (droite passant par zéro, modèle quadratique), ainsi que des pondérations ($1/X$) de ces modèles. Ces modèles d'étalonnage, pondérés ou non, ont été déterminés à partir des données du **tableau 2**, en utilisant le logiciel Statgraphics Plus 4.1. Les coefficients de ces modèles ont été appliqués aux données du **tableau 1** afin de déterminer les concentrations de pyrène retrouvées dans chaque échantillon de validation. Les profils d'exactitude (avec application d'un facteur de correction aux données de validation) correspondant à chaque modèle ont été tracés (**figure 5**).

Aucun modèle ne donne de profil plus satisfaisant (justesse, étroitesse de l'intervalle de tolérance, étendue du domaine de validité de la méthode) que le profil obtenu avec le modèle linéaire avec facteur de correction (**figure 4**).
<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 5 : profils d'exactitude pour le pyrène (λ=20% et β=80%)**</figcaption></figure>

(a) modèle linéaire ($a_1 X + a_0$) pondéré (1/X), facteur de correction (1,20)

(b) modèle linéaire passant par zéro ($a_1 X$), facteur de correction (1,16)

(c) modèle linéaire passant par zéro ($a_1 X$) pondéré (1/X), facteur de correction (1,16)

(d) modèle quadratique ($a_2 X^2 + a_1 X + a_0$), facteur de correction (1,20)

Nous avons choisi d'appliquer aux échantillons d'étalonnage l'ensemble du protocole expérimental (extraction SBSE, désorption, analyse HPLC) (cf. étape 5). Cependant, nous pourrions choisir comme échantillons d'étalonnage des solutions dans un solvant organique (HAP dans l'acétonitrile), qui ne subiraient pas le protocole d'extraction. Cette méthode présente l'avantage de raccourcir la durée des expérimentations, mais l'inconvénient de ne pas montrer l'impact de l'extraction sur la fonction de réponse (droite dans notre cas). Le profil d'exactitude, **figure 6**, a été déterminé en réalisant les essais d'étalonnage avec des étalons de HAP dans l'acétonitrile (4 niveaux de concentrations, 2 répétitions par niveau, 3 séries, qui ont été injectés en HPLC en même temps que les échantillons de validation et les échantillons d'étalonnage subissant l'intégralité du protocole), et en appliquant un facteur de correction de 1,5. La méthode n'est juste (biais inférieur à 5 %) qu'entre 10 et 28 ng/l et la limite de quantification inférieure est assez élevée (13,4 ng/l), ce qui nous conforte dans notre choix de faire subir aux échantillons d'étalonnage l'intégralité du protocole extraction-analyse.
<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 6 :** profil d'exactitude pour le pyrène en appliquant un facteur de correction (1,5) aux concentrations de validation (λ = 20% et β = 80 %).</figcaption></figure>

Les échantillons d'étalonnage étaient des étalons de HAP dans l'acétonitrile et n'ont pas subi le protocole d'extraction.

## 2.2 Autre exemple de résultats : le benzo(k)fluoranthène

Pour le benzo(k)fluoranthène (figure 7a), la méthode présente un biais (effet matrice) qui est plus important que dans le cas du pyrène (car celui-ci est plus apolaire que le pyrène et présente de plus fortes interactions avec la matière organique dissoute de l'eau de pluie).

Après application d'un facteur de correction (figure 7b), le biais est corrigé pour les teneurs entre 8 et 18 ng/L, mais il subsiste un biais qui s'accentue quand la concentration diminue.

La méthode non corrigée est assez fidèle (figure 7a), mais après application du facteur de correction (figure 7b), les intervalles de tolérance s'élargissent considérablement. Ce qui normal puisque le facteur de correction est supérieur à 1 et a pour effet d'augmenter les écarts-types.

Après application du facteur de correction, la limite haute de tolérance dépasse la limite haute d'acceptabilité à 17,5 ng/l, ce qui correspond à la limite basse de quantification. Sachant que les teneurs en benzo(k)fluoranthène dans les échantillons d'eau de pluie sont généralement inférieures à cette valeur, la méthode n'est donc pas validée pour réaliser les analyses de ce composé.
<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure 7** : profils d'exactitude pour le benzo(k)fluoranthène pour λ=20% et β=80%, modèle d'étalonnage : droite</figcaption></figure>

(a) tracé à partir des valeurs des plans d'expériences d'étalonnage et de validation

(b) après application d'un facteur de correction (1,81)

Pour que la méthode soit validée, le facteur β pourrait être diminué (70 % par exemple, **figure 8**) ; dans ce cas, le risque moyen d'avoir un résultat qui ne sera plus acceptable serait augmenté et il est peu raisonnable d'augmenter ce risque (on choisit en général un β d'au minimum 80 %).
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 8 :** profil d'exactitude pour le benzo(k)fluoranthène pour $\lambda = 20\%$ et $\beta = 70\%$, avec facteur de correction (1,81)</figcaption></figure>

En revanche, augmenter la limite d'acceptabilité $\lambda$ à 25 % (avec $\beta = 80\%$) (figure 9) permet de valider la méthode sur un domaine plus large (entre 6 et 28,5 ng/l), tout en conservant un risque acceptable. Augmenter $\lambda$ de 20 à 25% signifie que pour une teneur de 10 ng/l, le résultat sera compris au maximum entre 7,5 et 12,5 ng/l (au lieu de 8 à 12 ng/l). Ceci reste acceptable pour l'utilisation des résultats qu'il est prévu de faire. À la limite de quantification basse (6 ng/l), le biais est de 10%. Il devient inférieur à 3% entre 8 et 28 ng/l.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 9 :** profil d'exactitude pour le benzo(k)fluoranthène pour $\lambda = 25\%$ et $\beta = 80\%$, avec facteur de correction (1,81)</figcaption></figure>
D'autres profils d'exactitude ont été tracés avec différents modèles d'étalonnages (pondérés ou non). Il s'avère que le modèle linéaire donne le profil (figure 9) le plus adapté aux objectifs de la méthode (intervalle de tolérance le plus étroit, meilleure justesse, limite de quantification la plus basse).

Comme dans le cas du pyrène, nous avons tracé le profil d'exactitude en utilisant des échantillons d'étalonnage dans l'acétonitrile (ne subissant pas le protocole d'extraction) (figure 10), et après application d'un facteur de correction (2,45). La figure 10 est à comparer avec la figure 7b, où les échantillons d'étalonnage ont subi l'intégralité du protocole extraction-analyse.

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 10 :** *profil d'exactitude pour le benzo(k)fluoranthène*
*pour λ = 20 % et β = 80%, après application d'un facteur de correction (2,45)*</figcaption></figure>

La méthode est juste entre 8 et 28 ng/l (biais inférieur à 5 %), comme c'était le cas figure 7b. En revanche, figure 10, l'intervalle de tolérance se situe à l'intérieur des limites d'acceptabilité entre 8,8 et 28 ng/l. Le domaine de validité de la méthode ainsi défini, avec $\lambda = 20\%$ et $\beta = 80\%$, est plus étendu que celui du profil d'exactitude figure 7b. Pour valider la méthode en utilisant des étalons qui subissent le protocole d'extraction, nous avions été contraints d'augmenter $\lambda$ à 25 % (figure 9), mais le domaine de validité était plus étendu (entre 6 et 28 ng/l). Dans le cas du benzo(k)fluoranthène, le choix de la méthode d'étalonnage est à orienter en fonction des besoins scientifiques : domaine de validité étendu et $\lambda = 25\%$ (ce que nous avons choisi) ou domaine de validité plus restreint (limite basse de quantification plus élevée) et $\lambda = 20\%$.
Conclusion

Nous avons réalisé un total de 47 essais pour essayer de valider la méthode d'analyse de 15 HAP contenus dans de l'eau de pluie selon la méthode du profil d'exactitude. Les expériences ont été réalisées avec le mélange des 15 HAP (méthode multi-analytes), mais les résultats ont été traités individuellement pour chaque HAP.

L'étendue du domaine de validation varie selon les HAP. Pour la plupart des HAP, il est nécessaire d'appliquer un facteur de correction afin de corriger le biais (effet matrice) et de valider la méthode. Pour certains HAP, nous avons choisi d'augmenter la limite d'acceptabilité λ à 25 % (au lieu de 20 %) afin de valider la méthode sur un domaine de concentration plus large (mais toujours compris entre les niveaux bas et haut des échantillons de validation, l'extrapolation hors du domaine testé étant proscrite).

Outre l'intérêt pour la validation de la méthode, le profil d'exactitude est également un outil diagnostic pour déterminer les points faibles de la méthode et également pour choisir judicieusement les contrôles qualité qui seront employés en routine. Le tracé des profils d'exactitude pour des modèles d'étalonnages variés, pondérés ou non, permet de déterminer le modèle d'étalonnage qui donnera le profil le plus en adéquation avec les objectifs scientifiques. De même, le tracé des profils d'exactitude en prenant des échantillons d'étalonnage qui subissent ou non le protocole d'extraction permet de déterminer la procédure d'étalonnage qui valide la méthode.

Bibliographie

Azimi S., Rocher V., Muller M., Moilleron R., Thevenot D. (2005) Source, distribution and variability of hydrocarbons and metals in atmospheric deposition in an urban area (Paris, France). Sci. Total Environ. 337:223-239

Bourdat-Deschamps M., Daudin J.-J., Barriuso E. (2007) An experimental design approach to optimize the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons from rainfall water using stir bar sortpive extraction and high performance liquid chromatography – fluorescence. J. Chromatogr. A. 1167:143-153

Feinberg M. (2010<sup>b</sup>) Mise en œuvre du profil d'exactitude in Validation des méthodes d'analyse quantitatives physico-chimiques par le profil d'exactitude. *Le Cahier des Techniques de l'Inra*, numéro spécial : 27-44
# Validation de la méthode de dosage du pigment chlorophylle *a* dans l'eau douce par extraction et par HPLC-DAD

Jérôme Lazzarotto<fnref n="1" />, Jennifer Maherou

**Résumé** : La chlorophylle *a* est un pigment vert présent dans tous les végétaux, dont les algues. L'unité mixte de recherche CARRTEL de l'Inra de Thonon-les-Bains, mesure la concentration de ce pigment dans des lacs alpins afin d'étudier ces écosystèmes. Ce pigment est dosé dans l'eau par HPLC-DAD après une étape de filtration / extraction. Cette méthode qui fait l'objet d'un protocole défini, est utilisée depuis plusieurs années au laboratoire de l'unité. Afin de mieux répondre aux besoins des chercheurs et de se conformer à la démarche qualité de l'Inra, cette méthode a été validée par un profil d'exactitude. Cette validation a été effectuée en deux étapes afin d'évaluer la méthode dans son ensemble : une étape avec un matériau de référence puis à partir de cultures d'algues. Cet article décrit le plan d'expérience et la validation de cette méthode avec un profil d'exactitude dans ce contexte.

**Mots clés** : limnologie, phytoplancton, chlorophylle *a*, validation, profil d'exactitude

## Introduction

L'unité mixte de recherche CARRTEL de l'Inra de Thonon-les-Bains étudie les écosystèmes lacustres ; son laboratoire de chimie réalise les analyses des eaux et des sédiments lors d'études limnologiques. Depuis plusieurs années, le laboratoire de chimie est engagé dans une démarche qualité selon le Référentiel Inra. Un des objectifs du plateau technique est que toute méthode utilisée en routine soit validée.

Afin d'étudier les écosystèmes lacustres, la biomasse algale des lacs doit être évaluée. Cette biomasse peut être évaluée soit par une détermination taxonomique soit par une estimation en quantifiant les pigments présents.

Nous traiterons ici de la validation de la méthode d'analyse de la chlorophylle *a* par chromatographie liquide avec détections sur barrette de diodes (HPLC-DAD) après extraction liquide-solide avec la méthode du profil d'exactitude (Max Feinberg, 2010b).

## 1. Contexte d'application de la méthode

Depuis le milieu du XXème siècle, la qualité de l'eau des grands lacs s'est fortement dégradée avec le phénomène d'eutrophisation. Un apport excessif en nutriments par les effluents urbains et par les terres agricoles a provoqué une abondante prolifération phytoplanctonique. La décomposition de cette importante biomasse a entraîné une désoxygénation des eaux. Le phosphore est le facteur limitant de ce phénomène d'eutrophisation (Barroin, 2004). Il est aussi l'un des principaux indicateurs de la qualité de l'eau avec la biomasse algale et la transparence (DCE, 2000 ; Seq-EAU, 1999).

La chlorophylle *a* est le pigment le plus répandu dans les différentes classes d'algues. Sa quantification permet une estimation de la biomasse algale en présence.

<footnote n="1">¹ UMR0042 CARRTEL – Centre alpin de recherche sur les réseaux trophiques des écosystèmes mimniques –
INRA - F-74200 Thonon-les-bains 📠04 50 26 78 21 ☒ lazzarotto@thonon.inra.fr</footnote>
L'analyse de la chlorophylle a est réalisée en routine par le laboratoire de chimie de l'unité CARRTEL par extraction liquide-solide puis HPLC-DAD.

Ces analyses sont effectuées lors de programmes de recherche limnologique afin d'évaluer la qualité d'un milieu lacustre (Lazzarotto et Rapin, 2008). Le stade d'eutrophisation d'un milieu est estimé d'après plusieurs paramètres, dont la chlorophylle a : oligotrophe : Chl a < 35 µg/l ; mésotrophe : 35µg/l < Chl a < 100 µg/l ; et eutrophe : Chl a > 100 µg/l (Vollenweider and Kerekes, 1982). D'autre part ces études sont effectuées avec plusieurs analyses, au minimum 4 prélèvements différents dans l'année.

Les exigences des demandeurs d'analyses seront fixées selon ces fréquences d'observation et les distinctions entre les stades d'eutrophisation.

## 2. Matériel et méthode

L'eau est filtrée pour mesurer sa teneur en chlorophylle a. L'analyse de la chlorophylle a est réalisée par extraction liquide-solide à partir du filtre puis HPLC-DAD.

Cette méthode est établie et fixée par un mode opératoire, inspiré de la norme NF T90 116.

Les pigments sont photosensibles et thermosensibles, les échantillons sont donc conservés au froid et à l'obscurité jusqu'à l'analyse.

### 2.1 Filtration – Extraction

L'eau brute est filtrée sur un filtre GFC. Le volume filtré est choisi entre 50 ml et 5 l selon la transparence de l'échantillon. Les algues contenant les pigments sont retenues sur ce filtre.

Les filtres sont déposés dans un tube à centrifuger avec

le solvant d'extraction (méthanol/acétate d'ammonium 0.5 M (98/2 ; v/v)). Ils sont soumis à des ultra-sons afin de briser les cellules algales et de libérer les pigments. Les tubes sont ensuite centrifugés.

Le surnageant est récupéré et filtré à travers un filtre seringue pour le séparer des débris

### 2.2 HPLC-DAD

L'extrait est ensuite analysé par HPLC-DAD, sur une chaine Waters avec un passeur d'échantillons. 100 µl sont injectés et élués selon un gradient d'élution à base de 3 éluants (méthanol / 0,5 M acétate d'ammonium (80/20) ; acétonitrile/eau (90/10) ; éthyle acétate) de 30 mn.

La chlorophylle a est identifiée par son temps de rétention ainsi que par son spectre d'absorption spécifique (Jeffrey *et al.*, 1997).

### 2.3. Expression du résultat

La quantification est permise grâce à un étalonnage externe à partir d'étalons certifiés de chlorophylle a dissous dans du méthanol. La quantité mesurée dans le volume injecté est rapportée au volume d'eau filtré. La concentration ainsi mesurée est exprimée en µg Chl a/l.

## 3. Démarche de validation avec le profil d'exactitude

Afin de valider cette méthode, nous avons utilisé la méthode du profil d'exactitude. Cet outil permet de vérifier si une méthode répond aux exigences fixées. En effectuant plusieurs
analyses sur plusieurs jours, il détermine les paramètres pris en compte pour la validation de
méthode tels que la justesse, la fidélité intermédiaire et les incertitudes.

Pour cette démarche, nous avons choisi de différencier les deux étapes de la méthode : l'extraction puis la quantification. Dans un premier temps, nous établissons le profil d'exactitude pour la quantification seule *via* HPLC-DAD, avec des matériaux de référence certifiés (MRC) et différents de ceux utilisés pour effectuer l'étalonnage. Nous validons ainsi la justesse de la méthode et nous estimerons la variabilité de cette étape.

Dans un second temps, nous établissons le profil d'exactitude pour la méthode entière, soit l'extraction puis la quantification. Pour ce faire, nous utilisons plusieurs cultures d'algues.

L'étape d'extraction peut apporter un biais qu'il faut considérer. Les pigments présents dans l'échantillon initial peuvent ne pas être extraits en totalité. Nous ne pouvons pas déterminer le recouvrement réel de la méthode. Nous avons estimé en étude préliminaire le rendement maximum de la méthode. Nous avons effectué des mesures en modifiant la méthode et en utilisant une méthode d'extraction considérée comme optimale, avec une étape supplémentaire de broyage du filtre. Le recouvrement observé par rapport à la méthode considérée comme optimale est de 78 % pour des quantités entre 0.1 µg Chl *a* et 6 µg Chl *a* extraites. Ce recouvrement n'est pas un recouvrement absolu mais relatif et correspond au recouvrement maximum possible de la méthode.

D'après ces connaissances de la méthode que nous utilisons en routine, nous suivons la démarche de validation décrite par Max Feinberg (2010b)

## 3.1 La quantité mesurée

La quantité mesurée est la concentration en chlorophylle *a* dans le phytoplancton de l'eau. La méthode est une méthode indirecte qui nécessite un étalonnage à partir d'extraits méthanoliques étalons.

Les résultats sont exprimés en µg Chl *a* extrait, cette quantité est ensuite reportée au volume filtré. L'expression finale du résultat est en µg Chl *a* / l.

## 3.2 Les objectifs de la validation

### 3.2.1 Le domaine de validation

Les résultats habituels observés varient entre 0,2 et 100 µg Chl *a* / L, avec des volumes filtrés entre 50 ml et 5 l. La quantité extraite varie donc entre 1 et 5 µg Chl *a*.

Le domaine de validation est exprimé en quantité extraite. Il est choisi plus large qu'entre 1 et 5 µg Chl *a* extraite afin de pouvoir mesurer le pigment si le volume filtré n'est pas optimal et de ne pas avoir à refaire une filtration. Le domaine de validation choisi est de 0,4 à 8,0 µg Chl *a* extrait.

### 3.2.2 Les limites d'acceptabilité et intervalle de tolérance

Les exigences des demandeurs d'analyses sont fixées selon les fréquences d'observation et les distinctions entre stades d'eutrophisation explicitées en 1. Il est souhaité que au moins 3 analyses sur 4 donnent un résultat à +/- 25 % de la valeur vraie de l'échantillon, soit que 75 % des résultats obtenus aient un recouvrement de 25 %.

Ainsi les limites d'acceptabilité (□) sont de 25 % et l'intervalle de tolérance (□) est de 75 %.
## 3.3 Les échantillons de validation

Il existe des étalons certifiés d'extrait de chlorophylle a méthanolique. Mais il n'existe pas de solution d'algue avec une concentration connue en chlorophylle a, du fait des problèmes liés à l'évolution des algues. Il est impossible aussi de doper une matrice puisque le pigment mesuré est à l'intérieur des cellules de plancton.

Pour cette validation, nous avons choisi de différencier les deux étapes de la méthode : l'extraction puis la quantification.

Dans un premier temps, nous établirons un profil d'exactitude pour la quantification seule via HPLC-DAD, avec des étalons d'extrait de chlorophylle a méthanolique certifiés. Nous validons ainsi la justesse de la méthode et la variabilité liée à cette étape.

Dans un second temps, nous établirons deux profils d'exactitude pour la méthode entière, soit l'extraction puis la quantification. Pour ce faire, nous utilisons deux cultures d'algues, afin de contrôler les espèces d'algues en présence et l'évolution de la biomasse. Nous ne connaissons pas la valeur vraie de la concentration en chlorophylle a de ces cultures. Ces profils d'exactitude nous renseignerons sur la variabilité globale de la méthode.

Ces profils sont effectués pour deux algues cultivées spécifiques : diatomées et cyanobactéries. Ces cultures seront filtrées dans les mêmes conditions que les échantillons.

## 3.4 Les essais de validation

### 3.4.1 Etape HPLC-DAD

Nous avons choisi 4 niveaux de quantité de chlorophylle a : 0,4 ; 0,8 ; 2,0 ; 8,0 µg Chl a. Afin d'évaluer la répétabilité et la fidélité intermédiaire de cette étape, nous avons réalisé pour chacune de ces quantités 3 réplicats et cela pendant 3 jours. Soit 9 mesures par niveau, soit 36 mesures au total.

### 3.4.2 Analyse globale extraction – HPLC-DAD

Nous avons filtré différentes quantités des cultures d'algues afin d'approcher les quantités évaluées lors de la première étape : 1 ml ; 3 ml ; 10 ml ; 90 ml. Afin d'évaluer la répétabilité de cette étape, nous avons réalisé pour chacune de ces filtrations 3 réplicats. Etant donné que la culture d'algues évolue dans le temps, la fidélité intermédiaire ne peut être déterminée en effectuant plusieurs mesures sur différents jours, nous avons donc effectué 3 séries de filtration dans la même journée avec deux opérateurs. Soit 9 mesures par niveau, 36 mesures par culture d'algues et 72 mesures au total.

## 3.5 L'étalonnage

L'étalonnage est effectué avec des solutions étalons méthanoliques injectées à 3 niveaux : 0,28 µg Chl a ; 4,60 µg Chl a ; 9,20 µg Chl a. L'étalonnage est effectué avec une analyse par niveau.

L'étalonnage devant être effectué à chaque série du plan de validation, il sera effectué lors des 3 séries de mesures pour les étalons certifiés ainsi que pour les algues.
## 4. Résultats

La fonction d'étalonnage est linéaire. Les quantités extraites lors de chaque série sont calculées à partir des fonctions linéaires déterminées à chaque étalonnage.

<table><caption>Tableau 1 : Résultats des étalonnages obtenus lors de chaque série du plan (Aire = a x [Chl a] + b)</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">ESSAIS Etalons certifiés</th><th colspan="3">ESSAIS Culture cyanobactéries</th><th colspan="3">ESSAIS Culture diatomées</th></tr><tr><th>I</th><th>II</th><th>III</th><th>I</th><th>II</th><th>III</th><th>I</th><th>II</th><th>III</th></tr></thead><tbody><tr><th>a</th><td>5 851 243</td><td>5 920 726</td><td>5 955 871</td><td>5 603 378</td><td>5 738 962</td><td>5 465 850</td><td>5 451 452</td><td>5 515 275</td><td>5 645 598</td></tr><tr><th>b</th><td>-3 636</td><td>-6 268</td><td>1 621</td><td>-922</td><td>-5 150</td><td>-1 359</td><td>3 490</td><td>3 650</td><td>5 696</td></tr><tr><th>r²</th><td>1.0000</td><td>0.9999</td><td>0.9999</td><td>1.0000</td><td>0.9999</td><td>1.0000</td><td>1.0000</td><td>0.9999</td><td>0.9997</td></tr><tr><th>n</th><td>4</td><td>4</td><td>4</td><td>4</td><td>4</td><td>4</td><td>4</td><td>4</td><td>4</td></tr></tbody></table>

Les résultats des essais de validation sont insérés dans le fichier Excel (https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_techniques_validation_methodes/profil_d_exactitude). Le fichier génère automatiquement les tableaux de calcul

### 4.1 Profil d'exactitude de l'étape analytique HPLC-DAD seule

Le profil d'exactitude de cette étape analytique (figure 1) nous indique que la méthode est juste et répétable dans le domaine de 0,4 à 8,0 µg Chl a. Les incertitudes relatives sont de l'ordre de 10 % et les limites de tolérance sont comprises dans les limites d'acceptabilité jusqu'à la valeur basse de 0,4 µg Chl a.

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>Figure 1 : profil d'exactitude de la méthode d'analyse HPLC-DAD de la chlorophylle a avec des matériaux de référence</figcaption></figure>
## 4.2 Profils d'exactitude de la méthode globale extraction - analyse HPLC-DAD à partir de cultures d'algues

Les profils d'exactitude à partir des cultures d'algues ne renseignent pas sur la justesse de la méthode. La valeur cible correspond à la moyenne des mesures. Ces profils indiquent la variabilité de la méthode dans son ensemble : l'extraction et l'analyse HPLC-DAD.
Les figures 2 et 3 représentent ces profils.

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 2 : profil d'exactitude de la méthode d'analyse HPLC-DAD de la chlorophylle a avec une culture de cyanobactéries</figcaption></figure>

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Figure 3 : profil d'exactitude de la méthode d'analyse HPLC-DAD de la chlorophylle a avec une culture de diatomées</figcaption></figure>
Ces profils sont différents selon la culture d'algues. L'homogénéité des pigments dans les algues et les solutions ne sont donc pas les mêmes selon les cultures d'algues. La variabilité est acceptable de 1,8 µg Chl *a* à 12 µg Chl *a* pour la culture de diatomées et de 0,5 µg Chl *a* à 4,1 µg Chl *a* pour la culture de cyanobactéries.

## Conclusion

L'étape d'analyse HPLC-DAD est validée selon les exigences spécifiées : la justesse de la méthode est validée dans le domaine de 0,4 à 8,0 µg Chl *a*.

Les résultats des essais de la méthode globale extraction – HPLC-DAD indique une variabilité différente selon les algues en présence.

En prenant en considération ces résultats, la méthode est validée selon les exigences spécifiées dans le domaine de 4,1 µg Chl *a* à 8 µg Chl *a*, soit avec des volumes filtrés de 50 ml à 5 l de 0,8 à 160 µg Chl *a* / l. Le domaine validé correspond aux besoins usuels. 75 % des résultats indiqueront des valeurs autour de 25 % de la valeur vraie.

Étant donné l'importance de la variabilité due au prélèvement et aux classes d'algues en présence, il est conseillé d'apporter un soin particulier à l'échantillonnage sur le terrain, en effectuant par exemple plusieurs échantillons à pooler.

Une carte de contrôle à partir de solutions de chlorophylle *a* certifiées, est effectuée afin de garantir la stabilité de la méthode validée.

L'outil profil d'exactitude a facilité cette validation et a permis de confronter les exigences des demandeurs d'analyses avec les possibilités du laboratoire.

## Bibliographie

* Barroin G. (2004) Phosphore, azote, carbone... Du facteur limitant au facteur de maîtrise. Courrier Env. INRA, 52, 23-30.

* DCE, Directive Cadre Eau (2000) Directive 2000/60/CE JO CE L 327/1 du 22.12.2000, p. 72

* Feinberg Max (2010b) Mise en œuvre du profil d'exactitude in Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude. Le Cahier des Techniques de l'Inra, numéro spécial : 27-44

* Lazzarotto J., Rapin F. (2008) Évolution physico-chimique des eaux du Léman. Rapports sur les études et recherches entreprises dans le bassin lémanique. Programme quinquennal 2006-2010. Campagne 2007, p. 31-55

* SEQ-Eau (1999) Système d'évaluation de la qualité des cours d'eau, rapport de présentation SEQ-Eau. Agences de l'eau, les études des agences de l'eau n° 64 - 59p.

* Vollenweider, R.A., and Kerekes, J. (1982) Eutrophication of waters. Monitoring, assessment and control. OECD Cooperative programme on monitoring of inland waters (Eutrophication control), Environment Directorate, OECD, Paris. P. 154
# Validation d'une méthode automatisée de titration de l'alcalimétrie complète dans l'eau douce

Jérôme Lazzarotto<fnref n="1" />

**Résumé** : Le titre alcalimétrique complet (TAC) d'une eau est la mesure du pouvoir alcalin de la solution. Le TAC est principalement expliqué par le pH et la concentration en ions carbonate. Cette titration est effectuée de manière automatisée à l'unité mixte de recherche CARRTEL de l'Inra de Thonon-les-Bains

Cette méthode a été validée avec un profil d'exactitude afin de comparer les besoins des études utilisant cette mesure avec ses caractéristiques.

Cet article décrit le plan d'expérience choisi pour cette validation ainsi que les résultats.

**Mots clefs** : limnologie, hydrologie, titre alcalimétrique complet, carbonate, validation, profil d'exactitude

## Introduction

L'unité mixte de recherche CARRTEL de l'Inra de Thonon-les-Bains étudie les écosystèmes lacustres et son laboratoire de chimie réalise les analyses des eaux et sédiments lors d'études limnologiques, notamment pour son observatoire de recherche environnemental : ORE Lacs.

Depuis plusieurs années, le laboratoire de chimie est engagé dans une démarche qualité selon le Référentiel Inra, et l'un de ses objectifs est que toute méthode utilisée en routine soit validée. La mesure du TAC est effectuée en routine dans l'étude des lacs et des rivières des bassins versants de l'ORE Lacs.

Nous traiterons ici de la validation de la méthode automatisée de titration de l'alcalimétrie complète avec la méthode du profil d'exactitude (Feinberg M., 2010b- 2010c).

## 1. Contexte d'application de la méthode

L'ORE Lacs représente un suivi établi depuis plusieurs dizaines d'années des trois grands lacs alpins (Léman, Annecy et Bourget). Durant ce suivi, les paramètres physico-chimiques de base sont analysés dans les eaux. Le TAC fait partie de ces paramètres.

Dans l'étude d'un écosystème lacustre, la connaissance du TAC est nécessaire pour le calcul de la production primaire. Il estime le carbone inorganique présent pouvant être consommé avec les nutriments lors de la photosynthèse (Lazzarotto J. et Rapin F., 2008). D'autre part, dans un cours d'eau et un lac, le TAC est un des paramètres indiquant la minéralisation d'une eau.

Le TAC n'est pas un polluant, mais le système d'évaluation de la qualité des cours d'eau (SEQ-Eau) indique des seuils de variations pour l'utilisation en production d'eau potable et en tant qu'indicateur de la qualité de l'eau par altération (Seq-EAU, 2003). Ces seuils et les indices d'aptitude correspondants sont décrits dans le **tableau 1**.

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

<footnote n="1">¹ UMR0042 CARRTEL – Centre alpin de recherche sur les réseaux trophiques des écosystèmes mimiques –
INRA - F-74200 Thonon-les-Bains
04 50 26 78 21
lazzarotto@thonon.inra.fr</footnote>
<table><caption>**Tableau 1 : valeurs seuils du TAC selon le SEQ-Eau**</caption><tr><td>TAC (°f)</td><td>8 à 40</td><td>5 à 58</td><td>3 à 75</td><td>0 à 100</td></tr><tr><td>TAC (méq/l)</td><td>1,6 à 8,0</td><td>1,0 à 11,6</td><td>0,6 à 15,0</td><td>0,0 à 20,0</td></tr><tr><td>État du milieu</td><td>Très bon (bleu)</td><td>Bon (vert)</td><td>Mauvais (orange)</td><td>Très mauvais (rouge)</td></tr></table>

## 2. Matériel et méthode

La mesure de l'alcalinité complète est une titration acide-base. Au laboratoire de l'unité CARRTEL, la méthode utilisée est une titration automatique avec mesure du point final déterminé à l'aide de la dérivée seconde du pH en fonction du volume d'acide. Cette méthode est inspirée de la norme NF T90-036 qui utilise une titration manuelle avec indicateur coloré. Le pH est mesuré avec une électrode de verre connectée au titrateur. Le titrateur utilisé est un Metrohm Basic Titrino 794 avec un passeur d'échantillons 730.

La prise d'essai est de 100 ml. La burette a un volume de 20 ml de HCl à 0.1 mol/l. Le TAC est calculé par équivalence de la quantité d'acide ayant réagi avec l'ensemble des espèces alcalines de la solution.

## 3. Démarche de validation avec le profil d'exactitude

Afin de valider cette méthode, nous avons utilisé la méthode du profil d'exactitude. Cet outil permet de vérifier si une méthode répond aux exigences fixées. En effectuant plusieurs analyses sur plusieurs jours, il détermine les paramètres pris en compte pour la validation de méthode tels que la justesse, la fidélité intermédiaire et les incertitudes.

La mesure du TAC utilise la mesure du pH. La méthode de pH a été validée, l'étalonnage est effectué lors de chaque essai avec des solutions de référence certifiées. La stabilité du système est contrôlée avec une carte de contrôle.

Pour cette validation, nous suivons la démarche de validation décrite par Max Feinberg (2010<sup>b</sup>).

### 3.1 La quantité mesurée

La quantité mesurée est la quantité d'espèces alcalines présentes dans l'eau à analyser. Cette quantité est ramenée au volume de la prise d'essai. Le résultat est exprimé en méq/l.

### 3.2 Les objectifs de la validation

#### Le domaine de validation

Les eaux douces des écosystèmes que nous étudions ont un TAC qui varie entre 1 et 5 méq/l. Le volume de la burette permet d'atteindre des valeurs de 20 méq/l.

Afin que le domaine d'utilisation soit compris dans le domaine de validation, nous choisissons un domaine de 0,5 à 10,0 méq/l.
## Les limites d'acceptabilité et intervalle de tolérance

Les exigences pour ces analyses sont définies en fonction de leur utilisation dans l'ORE Lacs et d'après les seuils indiqués par le SEQ-Eau. Les écarts entre les valeurs minimales (environ 1 méq/l) sont de l'ordre de 0,5 méq/l et de l'ordre de 4 méq/l pour les valeurs maximales (environ 15 méq/l), soit des variations de 36 à 50 %. La limite d'acceptabilité doit donc être inférieure à 36 % afin de pouvoir discriminer deux valeurs de seuils maximales. La limite d'acceptabilité est donc choisie à 25 %.

Par rapport à la fréquence des échantillonnages et des analyses de l'ORE, il est souhaité que au moins 4 résultats sur 5 soient dans les limites d'acceptabilité, soit 80 % des résultats avec un recouvrement de 25 %.

Ainsi les limites d'acceptabilité (□) sont de 25 % et l'intervalle de tolérance (□) est de 80 %.

## 3.3 Les échantillons de validation

Étant donné que le volume de la prise d'essai est important (100 ml) et qu'un plan d'expérience minimal nécessitera au minimum 27 mesures (avec 3 réplicats à 3 niveaux pendant 3 jours), le volume minimal d'étalon utilisé serait de 2,7 l. Le coût de cette validation serait donc trop élevé si nous utilisons des solutions de référence certifiées, par rapport à l'utilisation de la mesure.

Nous choisissons donc de réaliser des solutions étalons à base de carbonate de sodium et d'hydrogénocarbonate de sodium.

Les échantillons de validation seront donc préparés à partir de poudres séchées puis pesées sur des balances vérifiées, ensuite dissoutes dans des fioles de classe A vérifiées.

## 3.4 Les essais de validation

Étant donné que la méthode est automatisée et que le domaine est grand, nous choisissons 5 niveaux de TAC dans le domaine de validation. Les 5 niveaux choisis sont : 0,5 ; 1,0 ; .5 ; 5.0 et 10,0 méq/l. Afin d'évaluer la répétabilité et la fidélité intermédiaire de cette étape, nous avons réalisé pour chacun de ces niveaux 3 réplicats et cela pendant 5 jours, soit 15 mesures par niveaux, soit 75 mesures au total.

## 3.5 L'étalonnage

La détermination du TAC est une méthode directe qui ne nécessite pas d'étalonnage.

## 4. Résultats

Les résultats des essais de validation sont insérés dans le fichier Excel (https://intranet.inra.fr/mission_qualite/acces_thematiques/formations_et_ecoles/ecole_des_techniques_validation_methodes/profil_d_exactitude). Le fichier génère automatiquement les tableaux de calcul et le profil d'exactitude (figure 1).
<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>**Figure 1 :** profil d'exactitude de la méthode de titration de l'alcalimétrie complète d'une eau</figcaption></figure>

Le profil d'exactitude de cette méthode indique que la méthode est validée par rapport aux exigences pour l'ensemble du domaine de validation, de 0,5 à 10,0 méq/l. Le fichier du profil d'exactitude calcule l'incertitude de la méthode pour chaque niveau en fonction de la fidélité mesurée. L'incertitude relative de cette méthode varie entre 4 et 2 %.

## Conclusion

La méthode de détermination du TAC a été validée dans le domaine de 0,5 à 10,0 méq/l avec une limite d'acceptabilité de 25 % et un intervalle de tolérance de 80 %.

## Bibliographie

* AFNOR (1996) Norme NF T90-036 / NF EN ISO 9963-1 : Détermination de l'alcalinité. Qualité de l'eau, T2 :115-125

* Feinberg Max (2010b) Mise en œuvre du profil d'exactitude in Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude. *Le Cahier des Techniques de l'Inra*, numéro spécial : 27-44

* Feinberg M. (2010c) Interprétation du profil d'exactitude in Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude. *Le Cahier des Techniques de l'Inra*, numéro spécial : 45-59

* Lazzarotto J., Rapin F. (2008) Évolution physico-chimique des eaux du Léman. Rapports sur les études et recherches entreprises dans le bassin lémanique. Programme quinquennal 2006-2010. Campagne 2007, 31-55

* SEQ-Eau (2003) Système d'évaluation de la qualité des cours d'eau, rapport de présentation SEQ-Eau. Agences de l'eau, les études des agences de l'eau n° 64, p. 59
# Méthode d'approche globale de l'estimation des incertitudes de mesure

Annie Guerin et Henri Ciesielski<fnref n="1" />

**Résumé :** Afin de répondre aux besoins des chercheurs ainsi qu'aux exigences de la norme ISO 17025, à l'Inra, le LAS, unité de service accréditée par le COFRAC (comité français d'accréditation), a développé une méthode originale d'estimation des incertitudes de mesures. Cette méthode, basée sur le traitement des données issues de cartes de contrôle et de résultats d'essais sur des sols d'un circuit d'essais d'aptitude, permet d'établir une relation simple entre un résultat (concentration en un élément) et l'incertitude associée, pour l'ensemble des analyses proposées.

**Mots clefs :** incertitude de mesure, analyse de sols

## Introduction

Le laboratoire d'analyses des sols d'Arras (LAS) est une unité de services de l'Inra, accréditée par le COFRAC. Au LAS, les critères de validation d'une méthode d'analyse sont choisis en fonction des objectifs de la méthode, des besoins exprimés par nos partenaires et des exigences réglementaires auxquelles nous devons nous conformer. Parmi ces critères, l'incertitude des mesures occupe une place particulière non seulement pour son intérêt scientifique mais aussi pour la difficulté à l'estimer de façon rapide, économique et compatible avec le nombre d'échantillons et de données à traiter.

L'incertitude des mesures est le reflet de leur variabilité. Les sources de variabilité sont diverses (Feinberg et Laurentie, 2006) et notamment : la préparation des échantillons (conditions ambiantes, réactifs), la méthode de mesure (étalonnage, instrument) et l'expérience de l'opérateur ainsi que la nature même de l'échantillon et de l'analyte considéré. L'incertitude totale ($I_t$) est donc propre à un laboratoire, à une matrice et à un niveau de concentration. Son calcul repose sur la répétition des analyses au sein d'une même série mais aussi sur la répétition des séries.

Le LAS traite plus de 25 000 échantillons de sols par an, correspondant à environ 200 000 analyses par an. Dans ces conditions, on comprendra aisément qu'il n'est pas envisageable d'estimer expérimentalement les incertitudes de mesure par des répétitions systématiques nécessitant du temps, une quantité d'échantillons importante et pour un coût non négligeable. L'idéal serait de disposer d'un modèle mathématique simple reliant l'incertitude à la mesure. Mais ce modèle n'existe pas dans la littérature. C'est pourquoi nous avons développé une stratégie d'évaluation des incertitudes de mesure avec pour objectif de définir une relation entre la concentration en analyte et l'incertitude associée. Afin d'illustrer cette démarche, nous exposons les résultats obtenus pour le dosage du Cadmium total dans les sols, dosé après minéralisation totale par de l'acide fluorhydrique (suivant la norme NF X 31-147).

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

<footnote n="1">¹ US0010 LAS - Laboratoire d'analyses des sols, INRA -F- 62000 ARRAS - www.lille.inra.fr/las</footnote>
# 1. Principe et méthode

## 1.1 Démarche générale

Au LAS, le suivi de la qualité des résultats est réalisé d'une part à l'aide de cartes de contrôle élaborées pour chaque analyse avec un sol témoin (échantillon de contrôle interne) et d'autre part en participant régulièrement à des circuits inter-laboratoires. Nous avons émis l'hypothèse que les données ainsi obtenues peuvent être exploitées pour apporter des informations sur les incertitudes de mesure et établir un modèle mathématique de calcul. On peut également supposer qu'en étudiant une population représentative des sols, composée de sols issus d'un circuit d'essais d'aptitude, il est envisageable d'estimer une incertitude s'adaptant à l'ensemble des sols.

L'incertitude totale ($I_t$) est définie mathématiquement par la relation : $I_t = k \times S_{\text{total}}$ (1)
avec k, facteur d'élargissement, = 2 ou 3 selon de niveau de confiance choisi
(2 pour P = 0.05 et 3 pour P = 0.01)
et $S_{\text{total}}$ est l'écart type global.

Cet écart type global est tel que $s_{\text{total}} = (s_{\text{intra}}^2 + s_{\text{inter}}^2)^{1/2}$ (2)
où $s_{\text{intra}}$ est l'écart type intra série (répétitions au sein d'une même série)
et $s_{\text{inter}}$ est l'écart type inter séries (lié aux répétitions des séries).

Ainsi, d'après les relations (1) et (2), pour estimer l'incertitude totale il nous faut évaluer les écarts types intra et inter séries correspondants.

L'approche originale développée au LAS consiste à estimer d'une part $s_{\text{intra}}$ en fonction de la concentration de l'analyste et d'autre part $s_{\text{inter}}$ en fonction de $s_{\text{intra}}$. Elle est basée sur les résultats d'essais de répétitions sur une population de sols d'un circuit d'essais d'aptitude judicieusement choisis ainsi que sur l'étude de nos cartes de contrôle.

Trois hypothèses sont avancées pour justifier cette démarche. D'une part, on considère que la meilleure estimation disponible des influences respectives des facteurs de répétabilité et de fidélité intermédiaire exprimée par $r = s_{\text{inter}} / s_{\text{intra}}$ est issue des cartes de contrôle du LAS.

D'autre part, ayant observé sur nos cartes de contrôle que le rapport r est stable pour des analyses de même nature (ensemble des teneurs totales en éléments en traces dans les sols par exemple), on considère qu'il peut être généralisé à l'ensemble des échantillons et à divers niveaux de concentration.

Enfin, les éventuels écarts en justesse ne sont pas quantifiés et sont considérés comme non significatifs, dans la mesure où les résultats fournis pour des essais d'aptitude s'inscrivent dans les fourchettes de tolérance des circuits correspondants.

## 1.2 Evaluation de $s_{\text{intra}}$

Afin de mettre en évidence une relation entre l'écart type intra série, $s_{\text{intra}}$, et la concentration de l'analyte, C, nous avons étudié la répétabilité des analyses de 20 sols du circuit d'essais d'aptitude du Bipea (Bureau InterProfessionnel d'Etudes Analytiques) de caractéristiques physico-chimiques variées (**tableau 1**). Il s'agit de sols des années 2005, 2006 et 2007. L'étude de la répétabilité des mesures sur un nombre restreint de sols de caractéristiques contrastées permet d'évaluer $s_{\text{intra}}$ à différents niveaux de concentration. Les déterminations étudiées sont de type agronomique (pH, oligo-éléments, cations échangeables,...) et environnementale (éléments en traces métalliques). Pour chaque type d'analyse, 3 répétitions ont été réalisées. A partir des données obtenues, les $s_{\text{intra}}$ de chaque échantillon ont été calculés
puis des relations linéaires de type $s_{\text{intra}} = a \times C + b$ (3) ont été recherchées pour chaque paramètre déterminé (a et b étant respectivement la pente et l'ordonnée à l'origine de la droite de régression linéaire).

<table><caption>**Tableau 1 :** Quelques caractéristiques physico-chimiques globales des sols étudiés.</caption><thead><tr><th></th><th>pH eau</th><th>CEC (cmol+/kg)</th><th>Cd Total (mg/kg)</th><th>Argiles (g/kg)</th><th>Limons (g/kg)</th><th>Sables (g/kg)</th><th>C (g/kg)</th><th>N (g/kg)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Mini</td><td>5.48</td><td>3.27</td><td>0.06</td><td>82</td><td>96</td><td>34</td><td>4.49</td><td>0.42</td></tr><tr><td>Maxi</td><td>8.38</td><td>16.2</td><td>1.04</td><td>374</td><td>825</td><td>819</td><td>112</td><td>2.44</td></tr><tr><td>Médiane</td><td>7.42</td><td>13.1</td><td>0.25</td><td>180</td><td>554</td><td>217</td><td>16.4</td><td>1.35</td></tr><tr><td>Moyenne</td><td>7.28</td><td>11.3</td><td>0.31</td><td>203</td><td>527</td><td>270</td><td>25.0</td><td>1.39</td></tr></tbody></table>

## 1.3 Evaluation de $s_{\text{inter}}$

L'intérêt de définir une méthode d'évaluation de $s_{\text{inter}}$ en fonction de $s_{\text{intra}}$ est de pouvoir s'affranchir de « répéter les répétitions » des analyses de sols du Bipea réalisées pour évaluer $s_{\text{intra}}$.

Le LAS dispose de cartes de contrôle pour chaque type de paramètre proposé, construites à partir des données de répétitions intra-série et inter-séries d'un échantillon de contrôle interne. A partir de ces données, nous avons recherché des relations de type $s_{\text{inter}} = K \times s_{\text{intra}}$ (4) entre les écarts types intra-série et les écarts types inter-séries obtenus pour un groupe d'éléments cohérent (différents éléments dosés par une même méthode analytique par exemple) sur une période d'un semestre. Dans le cas du dosage du cadmium total, nous avons recherché une relation entre les $s_{\text{inter}}$ et les $s_{\text{intra}}$ obtenus pour Cd, Cr, Cu, Co, Mo, Ni, Pb, Tl et Zn, ces éléments étant tous dosés par des techniques spectrométriques (ICP-AES et ICP-MS) dans le même minéralisat de sol.

## 1.4 Evaluation de l'incertitude de mesure

Si l'on reprend les équations (1) et (2), nous obtenons :

$$I_t = k \times (s_{\text{intra}}^2 + s_{\text{inter}}^2)^{1/2}$$

En intégrant l'équation (4), cette relation devient :

$$ \begin{gathered} I_t = k \times [s_{\text{intra}}^2 + (K \times s_{\text{intra}})^2]^{1/2} \\ \text{d'où } I_t = k \times [s_{\text{intra}}^2 \times (K^2 + 1)]^{1/2} \\ \text{et } I_t = k \times s_{\text{intra}} \times (K^2 + 1)^{1/2} \end{gathered} $$

En intégrant la relation (3), nous obtenons :

$$ \begin{gathered} I_t = k \times (a \times C + b) \times (K^2 + 1)^{1/2} \\ \text{d'où } I_t = k \times a \times (K^2 + 1)^{1/2} \times C + k \times b \times (K^2 + 1)^{1/2} \end{gathered} $$

que l'on peut reformuler en :

$$ \begin{gathered} I_t = a' \times C + b' \\ \text{avec } a' = k \times a \times (K^2 + 1)^{1/2} \quad (5) \\ \text{et } b' = k \times b \times (K^2 + 1)^{1/2} \quad (6) \end{gathered} $$

Ainsi, en évaluant expérimentalement « a' » et « b' » à partir de « a », « b » et « K » nous pouvons estimer l'incertitude totale de mesure en fonction de la concentration mesurée.
## 2. Résultats

Afin d'alléger la présentation des résultats, seuls quelques exemples représentatifs sont exposés ci-après et plus particulièrement celui du dosage de la teneur en cadmium total dans les sols. La figure 1 montre la bonne relation obtenue entre les écarts types intra-série $s_{intra}$ et les teneurs en Cd des 20 sols de circuit d'essais d'aptitude étudiés. Ainsi, pour Cd, $s_{intra}=0.026 \times C - 0.001$. Le coefficient $a$ (pente de la droite) est étroitement lié au coefficient de variation des mesures (CV) : une relation satisfaisante entre C et $s_{intra}$ est le reflet d'un CV relativement constant sur l'ensemble de la gamme de concentration étudiée. De fait, lorsque la relation obtenue n'est pas satisfaisante, $a$ est calculé à partir du CV moyen obtenu pour l'ensemble des 17 sols ($a = CV_m/100$) et $b$ (ordonnée à l'origine) est fixé comme étant égal au plus faible $s_{intra}$ de la série. Il est également possible d'avoir $a = 0$; dans ce cas l'incertitude est indépendante de la concentration, comme constaté pour le pHeau (figure 2). La valeur de $b$ est alors fixée comme étant égale au $s_{intra}$ de l'échantillon de contrôle interne du LAS.

La figure 3 représente la relation entre les $s_{inter}$ et les $s_{intra}$ de l'échantillon de contrôle interne du LAS issus des cartes de contrôle de Cd, Cr, Cu, Co, Mo, Ni, Pb, Tl et Zn (dosés après minéralisation totale suivant la norme Afnor NF X 31-147). Pour l'ensemble de ces éléments, nous considérons donc que $s_{inter} = 0.95 \times s_{intra}$, d'où $K \approx 1$.

Au final, si nous reprenons comme exemple le cas de Cd total, qu'en est-il de l'estimation de l'incertitude des mesures ?

Nous avons défini que :

$$s_{intra} = 0.026 \times C - 0.001 \text{ (figure 1)}$$

$$s_{inter} = 1 \times s_{intra} \text{ (figure 3)}$$

$$\text{avec } a = 0.026, b = -0.001 \text{ et } K = 1$$

d'où, si l'on reprend les relations (5) et (6) :

$$a' = k \times 0.026 \times 2^{1/2} = k \times 0.037$$

$$b' = k \times (-0.001) \times 2^{1/2} = k \times (-0.001)$$

Avec $k = 3$, nous obtenons :

$$I_t = 0.11 \times C + 0.004$$

Ainsi, à partir de cette formule, il nous est possible d'estimer l'incertitude de mesure de la concentration C en cadmium total dans les sols.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 1 : relation entre la concentration en Cd total dans les sols et l'écart type intra série</figcaption></figure>
<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Figure 2 :** relation entre le pHeau des sols et l'écart type intra série.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**Figure 3 :** relation entre $s_{intra}$ et $s_{inter}$ de éléments en traces (Cd, Cr, Co, Cu, Mo, Ni, Pb, Tl et Zn) dans les minéralisats HF de l'échantillon de contrôle interne du LAS.</figcaption></figure>

**3. Conclusion**

A partir de l'étude de 20 sols de nature variée, issus d'un circuit d'essais d'aptitude et en exploitant les données de ses cartes de contrôle internes, le LAS a défini une méthode propre d'estimation des incertitudes de mesure d'une partie des déterminations qu'il propose. Afin de couvrir l'ensemble des déterminations du catalogue du LAS, des études similaires ont été
réalisées avec d'autres sols de circuits inter-laboratoires ainsi qu'avec des boues. De fait, les coefficients a' et b' utilisés pour estimer l'incertitude des mesures sont disponibles et fournis sur demande auprès du LAS.

Bibliographie

Bipea, rapports 2005, 2006, 2007

Feinberg M., Laurentie M. (2006) A global approach to method validation and measurement uncertainty. *Accred Qual Assur*, 11: 3-9.

Norme NF X 31-147 : (Qualité des sols) : Sols, sédiments – Mise en solution totale par attaque acide
# Validation d'une méthode de chimie analytique

## Application au dosage des anions fluorure, chlorure, nitrite, bromure, nitrate, phosphate et sulfate par chromatographie ionique

Monique Mayor, Guilhem Bourrié<fnref n="1" />

La validation d'une méthode de chimie analytique passe par l'estimation de l'erreur de justesse, ou biais systématique, et de l'erreur aléatoire, qu'il faut combiner pour vérifier si la méthode remplit les objectifs qui lui ont été assignés. La construction d'un modèle statistique permet d'évaluer quantitativement ces notions, qui peuvent être visualisées graphiquement, suivant la méthode du profil d'exactitude (Feinberg, 2010a, b et c), et de se donner les moyens de contrôler le maintien dans le temps des performances de la chaîne de mesure, par la construction des cartes de contrôle.

**Résumé** : La validation d'une méthode d'analyse passe par différentes étapes qui visent : (i) à tester la normalité de la distribution des mesures ; (ii) à estimer les composantes de l'incertitude de mesure, fidélité, justesse, spécificité ; (iii) à définir des tests de contrôle de la non dégradation des performances de la méthode. Après un rappel des définitions et des concepts métrologiques, cet article présente les différentes étapes qui permettent de valider une méthode d'analyse. La méthode consiste en la construction d'un modèle statistique, d'un plan d'expérience et l'utilisation d'un matériau de référence certifié (MRC), utilisé (i) pour évaluer le biais (ou « erreur systématique »), (ii) pour calculer « l'incertitude composée », somme de l'incertitude sur la moyenne (« erreur aléatoire ») et de l'incertitude sur la valeur exacte du MRC et (iii) pour construire les cartes de contrôle. Cette méthode est appliquée au dosage des anions contenus en solution aqueuse par chromatographie ionique, et le modèle choisi est linéaire. Les résultats montrent : (i) que les distributions ne sont pas significativement différentes de la loi normale ; (ii) qu'il existe généralement un biais significativement différent de zéro et qu'il faut corriger ; (iii) qu'il n'existe aucune liaison entre le biais et la concentration de l'analyte ; (iv) que l'intervalle de confiance peut être calculé par application de la loi de Student avec l'incertitude composée. La représentation graphique suivant la méthode du « profil d'exactitude » aide à visualiser les performances de la méthode pour chacun des analytes. La méthode des ajouts dosés permet de vérifier la spécificité de la méthode et d'établir le pourcentage de recouvrement. Les droites de régression obtenues permettent de corriger les concentrations brutes de l'erreur systématique. Les cartes de contrôle permettent de déceler la dégradation des performances dans le temps et la stabilité des étalonnages.

**Mots clés** : Anions, bromure, chimie analytique, chimiométrie, chromatographie ionique, chlorure, étalonnage, fluorure, incertitude, nitrate, nitrite, phosphate, statistiques, sulfate, validation.

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

<footnote n="1">¹ UR1119, Géochimie des sols et des eaux - INRA - F-13545 Aix-en-Provence</footnote>
## Introduction

Toute analyse chimique nécessite des procédures de mise au point de méthodes de dosage, d'étalonnage et de validation des résultats. La démarche Qualité a pour objectif d'assurer la fiabilité et la traçabilité des résultats. Nous présentons ici le protocole expérimental et les méthodes statistiques utilisées pour valider une méthode d'analyse. La démarche est appliquée ici au dosage d'anions en solution par chromatographie ionique et peut être étendue sans difficultés à d'autres méthodes. Plus précisément, l'objectif de cet article est d'évaluer statistiquement la validité de cette méthode de dosage dans le domaine de concentration de $10^{-5}$ à $10^{-3}$ M, et de décrire les procédures d'étalonnage multiparamétrique, de correction de biais, de calcul d'incertitude par l'utilisation d'étalons certifiés et la méthode d'ajouts dosés.

## 1. Principe de la méthode et description de la technique

Le choix d'une méthode analytique doit être fait en fonction du problème posé. Au centre Inra d'Avignon, les travaux de l'unité « Géochimie des sols et des eaux » nécessitent l'analyse des eaux dans les sols hydromorphes et les sols salés. Dans ces milieux, la salinité totale varie très largement. La chromatographie ionique a l'avantage d'être multiparamétrique, de nécessiter peu d'échantillon, environ 2 ml, et d'être rapide. Le détecteur utilisé ici est conductimétrique et peu coûteux.

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Figure 1 : l'échange ionique : (1) l'anion déplace l'éluant ; (2) l'éluant déplace l'anion</figcaption></figure>

### 1.1 Principe de la chromatographie ionique

La chromatographie est une technique de séparation d'espèces dans un mélange par partage entre une phase mobile (gaz ou liquide) et une phase stationnaire (liquide ou solide). Chaque soluté injecté dans la colonne est soumis à deux effets antagonistes : l'entraînement par la phase mobile dans laquelle il est soluble et la rétention par la phase stationnaire avec laquelle il interagit. La séparation est possible grâce aux différences d'affinités de ces composés pour
les phases mobile et stationnaire. La phase stationnaire, la colonne, est un échangeur d'ions constitué de particules de résine (figure 1).

L'appareil utilisé est un chromatographe ionique Dionex hautes performances monocanal modèle DX 100 muni d'un passeur diluteur Dionex modèle AS50, le tout piloté par le logiciel de gestion « Chroméléon™ CM-CHM-1-IC version 6.5».

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>**Figure 2 :** schéma de principe d'un équipement de chromatographie ionique</figcaption></figure>

## 1.2 Mise au point de la méthode

Il est nécessaire avant de valider une méthode d'optimiser les conditions d'analyse, en faisant varier le débit, la température, en modifiant la nature ainsi que la concentration de l'éluant, en optimisant le choix de la colonne. On peut ainsi minimiser le temps de l'analyse, fixé par le temps du dernier composé élué, tout en préservant une bonne résolution pour que la méthode reste spécifique, c'est-à-dire qu'elle produise une réponse uniquement pour l'analyte d'intérêt.

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>**Figure 3 :** dégradation des performances d'une colonne de chromatographie ionique.</figcaption></figure>

La résolution de la méthode est le pouvoir de séparation des composés, elle est quantifiable par exemple par le rapport R = *d*/*m*, où *d* est la distance séparant les sommets des 2 pics, et *m* la moyenne des largeurs à la base des pics. Si on considère des pics rapprochés, par exemple les pics du phosphate et du sulfate, il apparaît qu'une résolution R = 1,12 n'est pas suffisante, mais qu'avec une résolution supérieure à 2, les pics sont bien résolus. **La figure 3 montre la différence entre une bonne résolution et une résolution incorrecte due à la dégradation des performances de la colonne avec le temps.**
# 2. Théorie, modèle statistique et méthodes de traitement des données

## 2.1 Modèle statistique

La construction d'un modèle statistique permet d'évaluer quantitativement les grandeurs métrologiques définies ci-dessus à partir de séries de résultats expérimentaux. Le modèle choisi ici est additif : Résultat = valeur vraie + erreur systématique + erreur aléatoire.

La démarche choisie consiste d'abord à tester la normalité de la distribution des résultats, puis à évaluer l'erreur systématique, l'erreur aléatoire, l'incertitude composée, la spécificité de la méthode, les limites de détection et de quantification, l'intervalle de confiance du résultat de mesure, enfin à construire la procédure de carte de contrôle.

## 2.2 Méthodes

### 2.2.a Normalité

La normalité est testée en construisant la droite de Henry : si les points sont alignés sur la droite, on ne peut pas infirmer l'hypothèse de normalité de la distribution.

### 2.2.b Évaluation du domaine d'analyse

La détermination du domaine d'analyse permet de vérifier si la technique est adaptée aux valeurs ou aux concentrations recherchées. La courbe d'étalonnage peut être linéaire mais cela ne fait pas partie des exigences. L'exigence de linéarité s'applique à la relation entre la concentration calculée et la concentration introduite et non pas à la fonction de réponse qui est la relation entre le signal et la concentration introduite. Il est en revanche nécessaire que la fonction de réponse soit strictement croissante ou décroissante. Le calcul de la courbe d'étalonnage par la méthode des moindres carrés suppose la constance de la variance de la réponse à toutes les concentrations.

### 2.2.c Calcul des limites de détection et de quantification

À partir d'une mesure faite sur un blanc analytique, on calcule l'écart type du signal. La limite de détection LOD correspond à la concentration qui conduit à un signal dont l'intensité est égale à 3 fois celle de l'écart type du blanc $y_d = y_b + 3 s_b$. La limite de quantification LOQ est calculée en prenant comme valeur du signal 10 fois la valeur de l'écart type du blanc $y_q = y_b + 10 s_b$. (ACS, 1980).

### 2.2.d Calcul des incertitudes

L'incertitude de la mesure, qui caractérise la dispersion, est exprimée sous la forme d'un écart-type $s$ qui est la racine carrée de la somme de l'ensemble des variances associées aux sources d'erreur :

- le biais du résultat ou erreur systématique est la différence entre l'espérance des résultats d'essais et la valeur de référence acceptée, et dépend de la méthode, de l'opérateur et de l'instrument. L'estimation de l'erreur systématique, c'est-à-dire l'incertitude systématique, est évaluée en utilisant un étalon certifié. On obtient alors un facteur de correction, qu'on applique au résultat de mesure. Mais comme l'étalon certifié (MRC) n'est connu qu'avec
une certaine incertitude, soit $u_{mrc}$, celle-ci doit être comptée dans l'incertitude de mesure. Cette incertitude est donnée par l'organisme certificateur, sous la forme de l'incertitude élargie, $U_{mrc}$, telle que : $U_{mrc} = k_{mrc}u_{mrc}$. Sauf indication contraire, dûment documentée, $k_{mrc} = 2$ pour un niveau de confiance de 95 % (Taylor et Kuyatt, 1994);

- la fidélité ou erreur aléatoire, est définie comme la dispersion de la moyenne. Son estimation, ou incertitude aléatoire est :

$$u_a = s/\sqrt{n}, \qquad (1)$$

Où $n$ est le nombre de mesures. Le matériau de référence certifié doit avoir une matrice identique à celle des échantillons. Ceci implique l'égalité des variances et peut également être testé par la méthode des ajouts dosés. Dans ces conditions, $s$ est mesuré sur le MRC. On obtient donc l'incertitude composée :

$$u_c = \sqrt{u_{mrc}^2 + u_a^2}, \text{ ou encore } u_c = \sqrt{\left(\frac{U_{mrc}}{k_{mrc}}\right)^2 + \left(\frac{s}{\sqrt{n}}\right)^2}. \quad (2)$$

### 2.2.e Calcul de l'intervalle de confiance du résultat

L'intervalle de confiance au seuil $\alpha$ (niveau de confiance 1-$\alpha$) délimite la zone dans laquelle se trouve probablement la moyenne de la population d'où est extrait l'échantillon. On fixe le risque acceptable pour cette affirmation. L'intervalle de confiance à 95 % signifie que l'on accepte un risque de 5 % de se tromper en affirmant que la moyenne de la population est comprise entre [moyenne - IC et moyenne + IC].

Si $x$ est la grandeur recherchée (exemple la concentration) et $y$ la grandeur mesurée (exemple la hauteur du pic) et si l'étalonnage linéaire est donné par la droite de régression de $x$ par rapport à $y$, alors $x = C_1y + C_2$, et l'intervalle de confiance de la moyenne de $n$ mesures est :

$$\bar{x} \pm k(\alpha, \nu)u_c, \qquad (3)$$

Où $\bar{x}$ est la moyenne corrigée de toutes les erreurs systématiques identifiées, $k$ suit une loi de Student à $\nu$ degrés de liberté, $\nu = n - 1$, $\alpha$ est le niveau de confiance, généralement $\alpha = 0,05$ pour $P = 0,95$, $n$ est la taille de l'échantillon, et $u_c$ est l'incertitude composée définie ci-dessus. Le produit $U_c = ku_c$ est l'incertitude élargie.

### 2.2.f Spécificité

La spécificité est la capacité à établir l'existence de la substance à analyser en présence d'autres composants présents. Il s'agit de démontrer que la substance analysée au sein de la matrice est bien l'analyte recherché. La spécificité se fonde sur une absence d'interférences. Elle sera estimée par la méthode des ajouts dosés en calculant le pourcentage de recouvrement.
## 3. Protocole expérimental

Le protocole expérimental est présenté dans le **tableau 1**, et l'ensemble des étapes dans le **tableau 2**.

<table><caption>**Tableau 1 : protocole expérimental**</caption><thead><tr><th>Jour 1</th><th>Jour 2</th><th>Jour 3</th><th>Jour 4</th><th>Jour 5</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Mettre les sels à déshydrater dans l'étuve à 105 °C pendant 24 h en vue de la préparation de la solution multiéléments</td><td><strong>Préparation des solutions multiéléments</strong><br>à 0, 1 ; 0,25 ; 0,5 et 1 mmol/l en Fluorure, Chlorure, Nitrite, Bromure, Nitrate, Phosphate, Sulfate</td><td>Plan d'étalonnage<br><strong>Fidélité</strong><br>3 répétitions des solutions multiéléments, niveaux 1, 2, 3, 4</td><td>Plan d'étalonnage<br><strong>Fidélité</strong><br>3 répétitions des solutions multiéléments, niveaux 1, 2, 3, 4</td><td>Plan d'étalonnage<br><strong>Fidélité</strong><br>3 répétitions des solutions multiéléments, niveaux 1, 2, 3, 4</td></tr><tr><td><strong>Dilution de la solution certifiée multiélément à</strong><br>1 mmol/l au 1/10 ; 1/4 ; 1/2 en Fluorure, Chlorure, Nitrite, Bromure, Nitrate, Phosphate, Sulfate</td><td>Plan de validation<br><strong>Justesse</strong><br>5 répétitions des solutions certifiées, niveaux 1, 2, 3, 4</td><td>Plan de validation<br><strong>Justesse</strong><br>5 répétitions des solutions certifiées, niveaux 1, 2, 3, 4</td><td>Plan de validation<br><strong>Justesse</strong><br>5 répétitions des solutions certifiées, niveaux 1, 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Normalité de la distribution : 30 répétitions de la solution certifiée à 0,5 mmol/L</td><td><strong>Spécificité</strong><br>Doser la matrice seule et la matrice + 3 concentrations d'ajouts dosés</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

- Pour vérifier **la normalité** de la distribution, nous mesurons 30 fois le matériau de référence certifié sous des conditions de répétabilité.

- Pour apprécier **la fidélité**, nous utilisons le plan d'étalonnage en faisant 9 répétitions des solutions multiéléments préparées sans la matrice, à 4 niveaux de concentrations, (0,1 mmol/l; 0,25 mmol/l; 0,5 mmol/l et 1 mmol/l) ; les dosages sont réalisés sur 3 jours avec le même opérateur. L'équation de la droite d'étalonnage journalière est utilisée pour calculer les concentrations qui serviront pour le calcul de justesse. Le coefficient de variation CV des aires est calculé pour les 7 analytes, ceci pour les différents niveaux de concentration.

- Pour apprécier **la justesse**, nous mesurons 15 répétitions du matériau de référence certifié multiélément (MRC) de valeurs connues, réalisées sur 3 jours ceci aux 4 niveaux de concentrations ci-dessus (**tableau 1**), ce qui permet d'apprécier la correction à apporter au résultat obtenu, ainsi que d'effectuer les calculs d'incertitudes.

- Pour apprécier **la spécificité** et les effets de matrice, nous dosons un échantillon de solution du sol représentatif du contexte géochimique étudié, d'abord seul, puis après addition de l'analyte à trois concentrations différentes.
<table><caption>**Tableau 2 : résumé des différentes étapes de la validation**</caption><thead><tr><th>Principales étapes</th><th>Protocole</th><th>Tests et calculs</th></tr></thead><tbody><tr><td>Vérification de la normalité de la distribution</td><td>30 répétitions du matériau de référence certifié : MRC multiélément à une concentration de 0,5 mmol/l en Fluorure, Chlorure, Nitrite, Bromure, Nitrate, Phosphate, Sulfate sous des conditions de répétabilité.</td><td>Vérification visuelle et droite de Henry</td></tr><tr><td>Plan d'étalonnage : Fidélité</td><td>9 répétitions des Solutions multiéléments préparées sans la matrice, à 4 niveaux de concentrations, dosages réalisés 3 jours différents avec le même opérateur.</td><td>Calcul de la moyenne, variance, écart-type des 9 mesures et du coefficient de variation CV = <sup>s</sup>/<sub>x&#772;</sub>×100.</td></tr><tr><td>Plan de validation : Justesse</td><td>15 répétitions du matériau de référence certifié multiélément de valeurs connues réalisés sur 3 jours différentes, ceci à 4 niveaux de concentrations, ce qui permet d'apprécier la correction à apporter au résultat obtenu ainsi que les calculs des incertitudes.</td><td>Biais ou erreur systématique :<br>Différence entre résultat obtenu et valeur fournie par le laboratoire certifié.<br>Érreur aléatoire : u<sub>a</sub> = s / √n<br>tenir compte de l'incertitude de l'étalon<br>U<sub>crm</sub> = k<sub>crm</sub>u<sub>crm</sub><br>Incertitude de la mesure :<br>u<sub>c</sub> = √(u<sub>crm</sub><sup>2</sup> + u<sub>a</sub><sup>2</sup>)<br>Intervalle de confiance du résultat<br>(t de Student) x&#772; ± t(α, ν)u<sub>c</sub><br>Calculer le taux de recouvrement,<br>à partir des pentes des droites de régression et démontrer la linéarité entre les concentrations calculées et les concentrations introduites.</td></tr><tr><td>Spécificité<br>Vérification de l'absence d'un effet de matrice</td><td>Par la méthode des ajouts dosés, en dosant un échantillon de solution du sol sans ajout et avec 3 ajouts successifs.</td><td>LOD : y<sub>d</sub> = y<sub>b</sub> + 3 s<sub>b</sub><br>LOQ : y<sub>d</sub> = y<sub>b</sub> + 10 s<sub>b</sub><br>Déduire les concentrations de LOD et LOQ à partir de la valeur de leur signal grâce à l'équation : x = C<sub>1</sub>y + C<sub>2</sub> de la droite d'étalonnage de chaque élément.<br>Courbe d'étalonnage : s'assurer que la fonction de réponse est strictement croissante ou décroissante.</td></tr><tr><td>Évaluation du domaine d'analyse, Limite de Détection et de Quantification</td><td>A l'aide de mesures faites sur un blanc analytique, on déduit la valeur du bruit de fond y<sub>b</sub> qui est la réponse au blanc « terrain »<br>Et on calcule l'écart-type de la réponse au blanc « terrain » s<sub>b</sub></td><td></td></tr></tbody></table>

Pour valider une méthode, il faut :

- que les CV dans des conditions de fidélité intermédiaire soient inférieurs à une valeur de tolérance, par exemple 10 % ;

- que la régression permettant de relier les concentrations calculées aux concentrations introduites soit parfaitement linéaire dans la gamme de concentrations étudiées ;

- que la différence entre le résultat obtenu et la valeur vraie inconnue de l'échantillon soit petite ou du moins inférieure à une limite d'acceptation : pour cela, les estimateurs de biais et de variance obtenus grâce à des expériences effectuées sur des échantillons connus nous renseignent si la procédure va pouvoir quantifier avec une exactitude suffisante.
# 4. Résultats et discussion

Les résultats (histogramme et droite de Henry) montrent que l'hypothèse de normalité de la distribution ne peut pas être rejetée.

## 4.1 La fidélité

Les résultats complets pour la fidélité sont reportés dans le tableau 3. Toutes les valeurs des coefficients de variation sont inférieures à 4 %. La valeur admise dans notre protocole est de 10 %.

<table><caption>Tableau 3 : résultats du test de fidélité, aux quatre niveaux de concentration des solutions multiéléments.
Valeurs en aires de pics (µS min)</caption><thead><tr><th></th><th>F<sup>-</sup></th><th>Cl<sup>-</sup></th><th>NO<sub>2</sub><sup>-</sup></th><th>Br<sup>-</sup></th><th>NO<sub>3</sub><sup>-</sup></th><th>P-PO<sub>4</sub><sup>3-</sup></th><th>SO<sub>4</sub><sup>2-</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="8">Solution multiélément 0,10 mmol/l</td></tr><tr><td>Moyenne</td><td>0,547</td><td>0,688</td><td>0,526</td><td>0,655</td><td>0,658</td><td>0,502</td><td>1,324</td></tr><tr><td>Écart type</td><td>0,015</td><td>0,017</td><td>0,018</td><td>0,013</td><td>0,021</td><td>0,019</td><td>0,034</td></tr><tr><td>Variance</td><td>0,000</td><td>0,000</td><td>0,000</td><td>0,000</td><td>0,000</td><td>0,000</td><td>0,001</td></tr><tr><td>CV</td><td>2,74%</td><td>2,44%</td><td>3,40%</td><td>1,98%</td><td>3,25%</td><td>3,79%</td><td>2,59%</td></tr><tr><td colspan="8">Solution multiélément 0,25 mmol/l</td></tr><tr><td>Moyenne</td><td>1,439</td><td>1,883</td><td>1,416</td><td>1,730</td><td>1,661</td><td>1,324</td><td>3,463</td></tr><tr><td>Écart type</td><td>0,032</td><td>0,038</td><td>0,027</td><td>0,032</td><td>0,028</td><td>0,026</td><td>0,066</td></tr><tr><td>Variance</td><td>0,001</td><td>0,001</td><td>0,001</td><td>0,001</td><td>0,001</td><td>0,001</td><td>0,004</td></tr><tr><td>CV</td><td>2,24%</td><td>2,02%</td><td>1,88%</td><td>1,83%</td><td>1,66%</td><td>1,99%</td><td>1,90%</td></tr><tr><td colspan="8">Solution multiélément 0,5 mmol/l</td></tr><tr><td>Moyenne</td><td>2,974</td><td>3,750</td><td>2,900</td><td>3,514</td><td>3,409</td><td>2,747</td><td>7,104</td></tr><tr><td>Écart type</td><td>0,094</td><td>0,122</td><td>0,089</td><td>0,104</td><td>0,103</td><td>0,065</td><td>0,210</td></tr><tr><td>Variance</td><td>0,009</td><td>0,015</td><td>0,008</td><td>0,011</td><td>0,011</td><td>0,004</td><td>0,044</td></tr><tr><td>CV</td><td>3,17%</td><td>3,25%</td><td>3,09%</td><td>2,97%</td><td>3,03%</td><td>2,38%</td><td>2,95%</td></tr><tr><td colspan="8">Solution multiélément 1 mmol/l</td></tr><tr><td>Moyenne</td><td>6,167</td><td>8,184</td><td>6,168</td><td>7,682</td><td>7,369</td><td>5,815</td><td>15,358</td></tr><tr><td>Écart type</td><td>0,155</td><td>0,165</td><td>0,105</td><td>0,147</td><td>0,140</td><td>0,126</td><td>0,338</td></tr><tr><td>Variance</td><td>0,024</td><td>0,027</td><td>0,011</td><td>0,022</td><td>0,020</td><td>0,016</td><td>0,114</td></tr><tr><td>CV</td><td>2,51%</td><td>2,02%</td><td>1,70%</td><td>1,91%</td><td>1,90%</td><td>2,17%</td><td>2,20%</td></tr></tbody></table>

## 4.2 La justesse

Les résultats du test de justesse montrent (non présentés ici, données disponibles sur demande) que le biais (estimation de l'erreur systématique) est significativement différent de zéro, en général positif, ce qui correspond à une surestimation ; il est négatif pour le chlorure et pour le fluorure et pour ce dernier, le biais maximum est observé à la concentration 0,1 et atteint - 6,2 %, ce qui est considérable. On n'observe pas de variation ordonnée du biais avec la concentration. Il faut donc corriger les valeurs mesurées de ce biais estimé.

Une fois corrigées de ce biais, les valeurs sont accompagnées d'une incertitude composée obtenue selon l'équation ci-dessus (éq. 2), qui permet de calculer l'intervalle de confiance du résultat. Ici, le nombre de mesures effectuées pour estimer la moyenne de la concentration d'un échantillon inconnu est de 5. L'intervalle de confiance est donc obtenu par application de l'équation (3) avec $n = 5$, $k (0,95 ; 4) = 2,78$ et $u_c$ l'incertitude composée. Les résultats obtenus montrent que les moyennes journalières sont comprises dans les intervalles de confiance de la moyenne ainsi calculés. Elles peuvent donc être considérées comme des estimations indépendantes de la même grandeur. Ceci veut dire que les performances instrumentales et que l'étalonnage sont restés stables pendant les 3 jours consécutifs des mesures. On peut en déduire également le nombre de mesures nécessaires pour obtenir un intervalle de confiance sur la moyenne donnée, puisqu'on est dans les conditions de validité de la loi normale.
## 4.3 Les profils d'exactitude

Une autre représentation possible est celle du « **profil d'exactitude** » (Feinberg, 2000a et b, 2006, 2010a, b, c). On se fixe une limite d'acceptabilité (ici 10 %) et une probabilité de tolérance (95 %). Par exemple pour le sulfate (tableau 4, figure 4) au niveau 3, concentration moyenne du MRC, le biais a une valeur de 3,9 % avant correction et le taux de recouvrement est de 103,9 %.

<table><caption>Tableau 4 : profil d'exactitude du sulfate</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="4">Avant correction du biais</th><th colspan="4">Après correction du biais</th></tr><tr><th>95 %</th><th>10 %</th><th>95 %</th><th>10 %</th><th>95 %</th><th>10 %</th><th>95 %</th><th>10 %</th></tr></thead><tbody><tr><td>Probabilité tolérance (bêta)</td><td>95 %</td><td></td><td></td><td></td><td>95 %</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limite d'acceptabilité</td><td>10 %</td><td></td><td></td><td></td><td>10 %</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niveaux</td><td>1</td><td>2</td><td>3</td><td>4</td><td>1</td><td>2</td><td>3</td><td>4</td></tr><tr><td>Valeur cible</td><td>0,100</td><td>0,250</td><td>0,500</td><td>1,000</td><td>0,100</td><td>0,250</td><td>0,500</td><td>1,000</td></tr><tr><td>Moyenne niveau</td><td>0,101</td><td>0,259</td><td>0,519</td><td>1,020</td><td>0,097</td><td>0,249</td><td>0,500</td><td>0,981</td></tr><tr><td>Écart-type de fidélité (s<sub>FI</sub>)</td><td>0,002</td><td>0,006</td><td>0,003</td><td>0,021</td><td>0,002</td><td>0,006</td><td>0,004</td><td>0,021</td></tr><tr><td>Valeur basse tolérance</td><td>0,097</td><td>0,246</td><td>0,512</td><td>0,974</td><td>0,093</td><td>0,236</td><td>0,492</td><td>0,935</td></tr><tr><td>Valeur haute tolérance</td><td>0,105</td><td>0,271</td><td>0,527</td><td>1,066</td><td>0,101</td><td>0,261</td><td>0,509</td><td>1,027</td></tr><tr><td>Biais (%)</td><td>1,07</td><td>3,49</td><td>3,89</td><td>2,00</td><td>-2,90</td><td>-0,51</td><td>0,05</td><td>-1,90</td></tr><tr><td>Recouvrement (justesse) (%)</td><td>101,07</td><td>103,49</td><td><strong>103,9</strong></td><td>102,00</td><td>97,10</td><td>99,49</td><td>100,05</td><td>98,10</td></tr><tr><td>Limite basse tolérance (%)</td><td>97,18</td><td>98,57</td><td>102,38</td><td>97,42</td><td>93,27</td><td>94,57</td><td>98,37</td><td>93,52</td></tr><tr><td>Limite haute tolérance (%)</td><td>104,95</td><td>108,42</td><td>105,40</td><td>106,58</td><td>100,93</td><td>104,42</td><td>101,74</td><td>102,68</td></tr><tr><td>Limite d'acceptabilité basse</td><td>90,00</td><td>90,00</td><td>90,00</td><td>90,00</td><td>90,00</td><td>90,00</td><td>90,00</td><td>90,00</td></tr><tr><td>Limite d'acceptabilité haute</td><td>110,00</td><td>110,00</td><td>110,00</td><td>110,00</td><td>110,00</td><td>110,00</td><td>110,00</td><td>110,00</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Figure 4 : profil d'exactitude du sulfate
a) avant correction du biais ; b) après correction du biais</figcaption></figure>
La correction du biais (figure 4b) permet de satisfaire plus largement au critère d'acceptabilité, et ramène le taux de recouvrement à 100 %. Les profils d'exactitude pour les autres analytes sont représentés sur les figures 5 à 10 et démontrent que la méthode pour ces éléments est parfaitement adaptée aux objectifs fixés : elle est donc valide sans avoir à affecter un facteur de correction aux futures mesures.

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Figure 5 : profil d'exactitude du fluorure</figcaption></figure>

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Figure 6 : profil d'exactitude du bromure</figcaption></figure>

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Figure 7 : profil d'exactitude du chlorure</figcaption></figure>
<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>**Figure 8 :** profil d'exactitude du nitrate</figcaption></figure>

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>**Figure 9 :** profil d'exactitude du nitrite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>**Figure 10 :** profil d'exactitude du phosphate</figcaption></figure>
## 4.4 La spécificité et l'absence d'effets de matrice

Elles sont estimées par la méthode des ajouts dosés (figure 11 et tableau 5). Dans tous les cas, on observe une très bonne linéarité entre la concentration retrouvée et la concentration ajoutée. Toutes les valeurs du test de Fisher sont largement supérieures à la valeur limite. Les pourcentages de recouvrement obtenus par la méthode des ajouts dosés sont déduits des pentes des droites de régression. Des tests sur les ordonnées à l'origine ont montré que celles-ci n'étaient pas significativement différentes de zéro. Les pentes des droites de régression ont donc été recalculées en forçant le passage par l'origine. Les pentes des droites de régression donnent alors directement le pourcentage de recouvrement.

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>**Figure 11 :** relation linéaire entre concentration retrouvée et concentration ajoutée par la méthode des ajouts dosés. Cas du fluorure</figcaption></figure>

<caption>**Tableau 5 :** pourcentages de recouvrement obtenus par la méthode du profil d'exactitude et par la méthode des ajouts dosés.</caption>

a. moyenne des 4 valeurs de gamme ; b. pente de la droite de régression forcée à passer par l'origine

<table><thead><tr><td>Analyte</td><td>Profil d'exactitude <sup>a</sup></td><td>Ajouts dosés <sup>b</sup></td></tr></thead><tbody><tr><td>Fluorure</td><td>98,0</td><td>98,3</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>100,0</td><td>102,2</td></tr><tr><td>Nitrite</td><td>102,0</td><td>96,5</td></tr><tr><td>Bromure</td><td>102,0</td><td>95,0</td></tr><tr><td>Nitrate</td><td>101,6</td><td>95,4</td></tr><tr><td>Phosphate</td><td>100,5</td><td>97,9</td></tr><tr><td>Sulfate</td><td>102,6</td><td>100,2</td></tr></tbody></table>

Les valeurs obtenues par les pentes des droites de régression sont différentes des valeurs obtenues par la méthode du profil d'exactitude, et plus éloignées de 100 %. Ceci peut être attribué au fait que la méthode du profil d'exactitude a été appliquée à des solutions multiéléments en solution pure, tandis que la méthode des ajouts dosés intègre l'effet de matrice sur un échantillon naturel représentatif du milieu géochimique étudié. On peut considérer que la méthode du profil d'exactitude (figures 4 à 10) permet de visualiser l'ordre de grandeur des biais des méthodes, mais qu'il vaut mieux utiliser les droites de régression obtenues (figure 11) pour corriger les concentrations brutes, car ces droites tiennent compte de l'effet de matrice.
Dans ces conditions, le résultat d'analyse est simultanément corrigé des effets de matrice et du biais suivant la relation :

$$ \bar{x} = (C_1y + C_2)/C_3 \pm k(\alpha, v)u_c, \quad (4) $$

Où $C_1$ et $C_2$ sont les coefficients de la courbe de réponse, ici supposée linéaire, et $C_3$ le pourcentage de recouvrement divisé par 100.

## 4.5 Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ)

Elles sont reportées dans le tableau 6. Par convention :

* y < LOD : l'analyte n'est pas détecté ;

* LOD < y < LOQ : l'analyte est détecté, mais non quantifiable ;

* LOQ < y : l'analyte est quantifiable.

<table><caption>**Tableau 6 : limites de détection et de quantification des méthodes (mmol/l)**</caption><thead><tr><th>Analyte</th><th>Fluorure</th><th>Chlorure</th><th>Nitrite</th><th>Bromure</th><th>Nitrate</th><th>Phosphate</th><th>Sulfate</th></tr></thead><tbody><tr><td>LOD</td><td>0,018</td><td>0,013</td><td>0,018</td><td>0,014</td><td>0,015</td><td>0,019</td><td>0,007</td></tr><tr><td>LOQ</td><td>0,060</td><td>0,045</td><td>0,060</td><td>0,047</td><td>0,050</td><td>0,063</td><td>0,024</td></tr></tbody></table>

Les LOD sont toutes de l'ordre de 15 à 20 µmol/l, sauf celle du sulfate, qui est deux fois plus faible. Ceci est dû à la pente plus grande de la droite d'étalonnage, qui traduit une sensibilité plus grande, du fait que le sulfate est un ion bivalent. La chromatographie ionique semble donc plus performante pour le dosage des sulfates, qui pose problème avec les méthodes traditionnelles comme la néphélométrie après précipitation du sulfate de baryum.

## 5. Tests de conformité

Les tests de conformité sont des tests permettant de vérifier que, pendant l'analyse, les performances du système restent compatibles avec le cahier des charges de la méthode.

La vérification permet de s'assurer que les écarts entre les valeurs indiquées par un appareil de mesure et les valeurs connues correspondantes d'une grandeur mesurée sont tous inférieurs aux erreurs maximales tolérées.

### 5.1 Construction de la carte de contrôle et calcul des erreurs maximales tolérées.

La carte de contrôle est un enregistrement utilisé pour contrôler la stabilité d'une méthode dans le temps. On utilise comme « étalon de surveillance » le Matériau de Référence Certifié (MRC) qui a servi au contrôle de la justesse. On réalise un nombre assez important de mesures groupées en séries, les résultats sont reportés sur un graphique. Il est préférable de faire une moyenne sur une trentaine de répétitions au moins et dans ces conditions, les valeurs du t de Student peuvent être prises égales à 2 et 3 respectivement.
Les limites de surveillance LS et de contrôle LC sont calculées suivant les formules :

$$LS = \text{moyenne} \pm 2 u_c, \qquad (5)$$

$$LC = \text{moyenne} \pm 3 u_c, \qquad (6)$$

et reportées sur la carte.

## 5.2 Surveillance

La surveillance complète les opérations de vérification et d'étalonnage afin de détecter les dérives éventuelles de l'équipement entre ces mesures.

Il s'agit d'enregistrer les écarts entre les valeurs d'indication de l'équipement de mesure et les valeurs vraies du contrôle certifié. Ces opérations de surveillance sont consignées sur des enregistrements tels que la carte de contrôle. A chaque nouvelle analyse, le résultat du contrôle est ajouté, ce qui permet de vérifier s'il est bien à l'intérieur des limites admises, et ainsi d'entreprendre des actions correctives si nécessaire. Cela permet également de contrôler au cours du temps que les valeurs expérimentales sont réparties d'une façon aléatoire par rapport à la moyenne et de nous alerter sur une éventuelle dérive de l'appareil (Tableau 7).

<table><caption>Tableau 7 : résumé des étapes de la surveillance</caption><thead><tr><th>Principales étapes</th><th>Protocole</th><th>Tests</th></tr></thead><tbody><tr><td>1-Vérification<br>d'un taux de résolution correct<br>R > 1,2<br>d'une bonne répétabilité CV &lt; 5%</td><td></td><td>R = <sup>d</sup>/<sub>m</sub>,<br>d est la distance séparant les sommets des 2 pics, et m la moyenne des largeurs à la base des pics.<br>coefficient de variation CV = <sup>s</sup>/<sub>x</sub> × 100,</td></tr><tr><td>2-Construction de la carte de contrôle</td><td>30 répétitions du matériau de référence certifié MRC multiélément, à une concentration de 0,5 mmol/L en Fluorure, Chlorure, Nitrite, Bromure, Nitrate, Phosphate, Sulfate, sous des conditions de reproductibilité</td><td>Calculer, Moyenne, Variance s²<br>- Erreur aléatoire : u<sub>a</sub> = s / √n<br>- Incertitude de la mesure :<br>u<sub>c</sub> = √(u<sub>mrc</sub><sup>2</sup> + u<sub>a</sub><sup>2</sup>)<br>tenir compte de l'incertitude de l'étalon<br>U<sub>mrc</sub> = k<sub>mrc</sub> u<sub>mrc</sub><br>-Intervalle de confiance du résultat (t de Student) x ± t(α, ν)u<sub>c</sub><br>Évaluer les limites de surveillance et de contrôle<br>LS = moyenne ± 2 u<sub>c</sub>,<br>LC = moyenne ± 3 u<sub>c</sub><br>Construire la carte de contrôle avec les limites inférieures et supérieures des LS et LC en fonction de la « valeur moyenne de la solution certifiée ».</td></tr><tr><td>3-Surveillance quotidienne</td><td>Insérer dans la séquence analytique le MRC à peu près tous les 5 échantillons, il sert de contrôle</td><td>S'assurer que les valeurs du MRC sont comprises à l'intérieur des limites de surveillance<br>Pour les échantillons à analyser, s'assurer que la concentration obtenue est supérieure à la Limite de Quantification et se trouve bien à l'intérieur du domaine d'analyse</td></tr></tbody></table>
On fait correspondre sur cet enregistrement un point à chacune des valeurs d'une statistique calculée sur des échantillons successifs ; chacun de ces points a pour abscisse le numéro de l'échantillon et pour ordonnée la valeur de la statistique calculée sur cet échantillon.

Le but de ces tests de surveillance est de nous alerter en cas d'anomalie. Reste à définir quels seront les critères utilisés pour considérer ce qui sera anormal. Nous décidons dans notre cas d'être vigilants lorsqu'une mesure sort des limites de contrôle, ce qui déclenchera la répétition du contrôle pour confirmer ou infirmer la dérive et nous alertera lorsque la répartition des mesures fait suspecter un comportement non aléatoire. Un exemple de test de surveillance donné par le logiciel *Chroméléon™* est reporté sur la **figure 12**. On peut constater que le contrôle ne sort pas des limites autorisées.

<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>**Figure 12** : test de surveillance quotidienne</figcaption></figure>

## Conclusion

La démonstration de la normalité des distributions ne nécessite pas d'être répétée. Lors de la mise au point de la méthode d'analyse, ce test est nécessaire et permet d'assurer la validité de l'emploi des statistiques classiques et de leur puissance. Nous avons utilisé ici un modèle statistique linéaire, qui permet d'estimer le biais ou incertitude systématique (« erreur systématique») et l'incertitude aléatoire. Les résultats montrent que le biais n'est pas négligeable et doit être corrigé. L'emploi d'un Matériau de Référence Certifié (MRC) s'impose à cette fin. Ce MRC étant lui-même connu avec une incertitude, donnée par le fabricant, cette incertitude doit être ajoutée à l'incertitude aléatoire, pour donner l'incertitude composée. C'est cette dernière qui est utilisée pour calculer l'intervalle de confiance de la mesure. Ici, comme aucune relation n'a été observée entre l'incertitude composée et la concentration, la valeur de l'incertitude composée obtenue pour une valeur de concentration moyenne (milieu de gamme) a été retenue par souci de simplification. La méthode du profil d'exactitude visualise l'intérêt de corriger du biais et les limites d'acceptabilité. La méthode des ajouts dosés permet d'estimer le pourcentage de recouvrement et de vérifier la linéarité entre concentration retrouvée et concentration ajoutée dans la matrice même des échantillons analysés, c'est-à-dire pour des échantillons représentatifs des milieux étudiés. Les droites de régression obtenues sont utilisées pour corriger des biais systématiques les concentrations
brutes données par la courbe de réponse. L'incertitude composée est également utilisée pour
calculer les limites de l'intervalle de confiance acceptables, par une mesure régulière du
MRC, qui sert ainsi à effectuer les tests de surveillance et à alerter en cas de dégradation des
performances de la chaîne de mesure. L'échantillon doit bien sûr d'abord se situer au dessus
de la limite de quantification LOQ.

Matériel supplémentaire :

L'ensemble des données et des tableaux peuvent être fournis sur demande.

Bibliographie

ACS (1980) Guidelines for Data Acquisition and Data Quality Evaluation in Environmental Chemistry, *Analytical chemistry*, **52**, 14, 2242-2249

AFNOR (1994a) Norme française NF X 07-001 -Vocabulaire International des termes fondamentaux et généraux de métrologie

AFNOR (1994b) Norme NF ISO 5725-1 : Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure. Partie 1 : Principes généraux et définitions.

AFNOR (1994c) Norme NF ISO 5725-2 : Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure. Partie 2 : Méthodes de base pour la détermination de la répétabilité et de la reproductibilité d'une méthode de mesure normalisée.

AFNOR (1994d) Norme NF ISO 5725-4 : Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure. Partie 4 : Méthodes de base pour la détermination de la justesse d'une méthode de mesure normalisée.

AFNOR (1996) Métrologie dans l'entreprise : outil de la qualité.

AFNOR (1998) Norme NF ISO 5725-5 : Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure. Partie 5 : Méthodes alternatives pour la détermination de la fidélité d'une méthode de mesure normalisée.

AFNOR (1999) Norme XP T90-210 : Protocole d'évaluation d'une méthode alternative d'analyse physico-chimique quantitative par rapport à une méthode de référence.

Feinberg M. (2000) La validation des méthodes d'analyse. *Le cahier des Techniques de l'Inra*, **44**, 19-49.

Feinberg M. (2003) L'incertitude des mesures analytiques. *Le cahier des Techniques de l'Inra*, **50**, 3-10

Feinberg, M. (2006) Approche globale et harmonisée de la validation. *Spectra Analyse*, **249**, avril-mai 2006, 16-23.

Feinberg M. (2010a) Principes et vocabulaire in Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude. Le *Cahier des Techniques de l'Inra*, numéro spécial, 13-25

Feinberg M. (2010b) Mise en œuvre du profil d'exactitude in Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude. Le *Cahier des Techniques de l'Inra*, numéro spécial, 27-44
Feinberg M. (2010c) Interprétation du profil d'exactitude in *Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude. Le Cahier des Techniques de l'Inra*, numéro spécial, 45-59

ISO (1997) Guide 32 : Étalonnage en chimie analytique et utilisation de matériaux de référence certifiés.

ISO (2000) Guide 33 : Utilisation des matériaux de référence certifiés.

Taylor B.N. et Kuyatt C.E. (1994) Guidelines for Evaluating and expressing the Uncertainty of NIST Measurement Results, *NIST Technical Note 1297, 1-20*
<figure><img src="image_75.png" /></figure>

Conclusion

François Jacquet<fnref n="1" />

La validation des méthodes d'analyse quantitative physico-chimique utilisées pour produire des mesures justes et fiables est une préoccupation constante des analystes et des destinataires des résultats des analyses, car elle permet de renforcer la confiance dans la qualité de ces résultats mesurables en assurant leur fiabilité.

La validation des méthodes est un deuxième pilier, complémentaire à la maîtrise des instruments et des équipements, pour atteindre l'objectif de validité des résultats mesurables qui est l'un des objectifs de la politique qualité de l'Inra. La réflexion est en cours pour l'intégration de la validation des méthodes d'analyse quantitative dans une future version du référentiel qualité Inra.

Afin de décrire et d'expliquer cette démarche de validation des méthodes dans les laboratoires, deux écoles des techniques « Validation des méthodes d'analyse quantitative physico-chimique », en 2007 et 2008, ont rassemblé plus de cent participants.

Je remercie tous les collègues qui ont contribué à ces écoles, en les organisant et / ou en y intervenant : Sandra Arrault, Olivier Berdeaux, Laurent Debrauwer, Marjolaine Deschamps, Martine Dupupet, Denys Durand, Max Feinberg, Christophe Garin, Annie Guerin, Guy Jamet (DGCCRF), Anne Jaulin, Michel Laurentie (AFSSA), Jérôme Lazzarotto, Patricia Manzanno, Marie-Andrée Piedallu, Thierry Prunet et Agnès Thomas. Ces écoles ont été soutenues par les Départements ALIMH, CEPIA, EA et PHASE, la Formation permanente nationale et la Mission qualité / Délégation à la qualité.

<footnote n="1">¹ Délégué à la qualité de l'INRA - F- 75338 Paris cedex 03 ✉ francois.jacquet@paris.inra.fr</footnote>
Plusieurs approches, normes, méthodologies sont décrites pour la validation des méthodes. Le profil d'exactitude est l'approche, tout récemment intégrée dans une norme (V03-110:2010), que nos experts et praticiens ont jugée la mieux adaptée au contexte des laboratoires de recherche.

Ce numéro du *Cahier des Techniques de l'Inra* sera une aide précieuse pour les équipes dans la mise en œuvre de la validation de leurs méthodes d'analyse par le profil d'exactitude.

Je remercie les auteurs des articles de ce numéro du *Cahier des Techniques*, et plus particulièrement Max Feinberg et Michel Laurentie (AFSSA) qui ont mis leur expertise au service de la relecture des articles, ainsi que Marie Huyez-Levrat, cheville ouvrière du *Cahier des Techniques de l'Inra*, et la Délégation au partenariat avec les entreprises de la Direction de la valorisation de l'Inra.

La Délégation à la qualité soutient les actions des départements de recherche qui vont favoriser et accompagner cette mise en œuvre, en particulier par des formations, et contribuera à toute autre action utile pour la généralisation de la validation des méthodes d'analyse :

- mise en application de la validation des méthodes d'analyse qualitative physico-chimique telle que présentée dans ce cahier ;

- adaptation de ces méthodes à d'autres natures d'analyse quantitative ;

- travaux en vue de la construction d'outils et méthodes de validation de méthodes d'analyse « semi-quantitatives » ou qualitatives.

Pour la mise en œuvre, vous pourrez aussi faire appel, via la liste de diffusion validation-analytique-et-maitrise :

http://listes.inra.fr/wws/info/validation-analytique-et-maitrise<fnref n="2" />

et, aux experts et praticiens de la validation des méthodes, que je remercie de poursuivre ainsi leur implication dans la diffusion de ces méthodes, et de contribuer à l'amélioration de la garantie de la fiabilité des résultats sur lesquels nombre de publications se fondent.

Avec tous mes encouragements et vœux de réussite pour vos mises en application dans vos laboratoires.

<footnote n="2">² Pour s'y abonner, contacter Christophe.Garin@paris.inra.fr</footnote>
Index des auteurs

<table><thead><tr><td>Nom</td><td>Prénom</td><td>page</td></tr></thead><tbody><tr><td>Bourdat-Deschamps</td><td>Marjolaine</td><td>85</td></tr><tr><td>Bourrié</td><td>Guilhem</td><td>117,</td></tr><tr><td>Ciesielki</td><td>Henri</td><td>111</td></tr><tr><td>Durand</td><td>Denys</td><td>73</td></tr><tr><td>Feinberg</td><td>Max</td><td>5, 13, 27, 45</td></tr><tr><td>Guerin</td><td>Annie</td><td>111</td></tr><tr><td>Laurentie</td><td>Michel</td><td>61</td></tr><tr><td>Lazzarotto</td><td>Jérôme</td><td>99, 107</td></tr><tr><td>Maherou</td><td>Jennifer</td><td>99</td></tr><tr><td>Mayor</td><td>Monique</td><td>117</td></tr><tr><td>Ortigues-Marty</td><td>Isabelle</td><td>73</td></tr></tbody></table>

Ch. MAITRE/INRA
# Index des articles

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3

5 Témoignages de directeurs d'unité sur les écoles techniques

11

## Introduction

## Chapitre 1 – Validation des méthodes

13 Principe et vocabulaire, Max Feinberg

27 Mise en œuvre du profil d'exactitude, Max Feinberg

45 Interprétation du profil d'exactitude, Max Feinberg

61 Complément sur la quantification : pondération et transformation, Michel Laurentie

71

## Chapitre 2 – Application dans les laboratoires à l'Inra

73 Enjeux de la validation pour l'expérimentation en nutrition animale, Agnès Thomas, Denys Durand et Isabelle Ortigues-Marty

85 Validation de l'analyse des HAP dans les eaux de pluie par la méthode du profil d'exactitude, Marjolaine Bourdat-Deschamps

99 Validation de la méthode de dosage du pigment chlorophylle a dans l'eau douce par extraction et par HPLC-DAD, Jérôme Lazzarotto et Jennifer Maherou

107 Validation d'une méthode automatisée de titration de l'alcalimétrie complète dans l'eau douce, Jérôme Lazzarotto

111 Méthode d'approche globale de l'estimation des incertitudes de mesure, Annie Guerin et Henri Ciesielki

117 Validation d'une méthode de dosage des anions fluorure, chlorure, nitrite, bromure, nitrate, phosphate et sulfate par chromatographie ionique, Monique Mayor et Guilhem Bourrié

## Conclusion
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## Le Cahier des Techniques de l'Inra

Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude

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Délégation au Partenariat avec les Entreprises
Institut national de la recherche agronomique - 147 rue de l'Université - F-75338 Paris Cedex 07

# Numéro spécial

## Année 2010

## Validation des méthodes d'analyse quantitative par le profil d'exactitude

### Sommaire

<table><tr><td>Introduction</td><td>p. 03</td></tr><tr><td>Témoignages sur les écoles techniques</td><td>p. 05</td></tr><tr><td>Chapitre I : Validation des méthodes</td><td>p. 11</td></tr><tr><td>Chapitre II : Application dans les laboratoires à l'Inra</td><td>p. 71</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>p. 135</td></tr><tr><td>Index des auteurs</td><td>p. 137</td></tr><tr><td>Index des articles</td><td>p. 139</td></tr></table>

Participation de la Délégation à la qualité et des département s : AlimH, Cépia, EA, Phase, SA et SPE — Responsables scientifiques : Max Feinberg et Michel Laurentie — Comité éditorial : Christophe Garin, Annie Guérin, Marie Huyez-Levrat, François Jacquet, Directeur de la Publication : Jean-François Quillien, Responsable du *Cahier des Techniques de l'Inra* : Marie Huyez-Levrat
Photos ©Inra - Impression : Jouve 18, rue saint Denis 75001 Paris - N° ISSN 0762 7939

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