> L'ARN n'a pas dit son dernier mot... avec l'émergence des ARN circulaires (circARN). Quatorze pour cent des gènes humains produisent en effet des circARN par un mécanisme d'épissage alternatif : le rétro-épissage. Chez l'homme, plus de 100 000 circARN différents ont ainsi été répertoriés. Dans le noyau, ils régulent la transcription ou l'épissage des ARNm, alors que, dans le cytoplasme, ils séquestrent des miARN et des protéines, ou sont traduits par un mécanisme d'initiation interne de la traduction. Ces circARN constituent en fait un outil biotechnologique performant car leur traduction est très stable dans le temps, et les circARN exogènes induisent moins de réponses immunitaires que les ARNm linéaires. Dans cette revue, nous discuterons, après les avoir décrits, du rôle des circARN dans différents processus pathologiques et de leur utilisation en biotechnologie. <

Durant des décennies, la fonction de molécules régulatrices n'a été attribuée qu'aux seules protéines. C'est seulement au début des années 1990 qu'est apparu un rôle pour l'ARN comme régulateur des fonctions cellulaires avec la découverte de l'interférence ARN et des ARN-guides. Deux familles de petits ARN non codants, les microARN (miARN) et les piARN (Piwi-interacting RNA), ont ainsi été découvertes chez les eucaryotes [33] (→).

L'importance des séquences non codantes s'est en fait imposée dans les années 2000 avec le séquençage du génome humain qui a révélé l'existence de beaucoup moins de gènes codants que ce à quoi on s'attendait : à peine plus de 20 000 ! Les séquences codantes ne couvrent en effet que 1,5 % du génome humain, bien que 90 % de ces séquences d'ADN soient transcrites en ARN. La majorité des transcrits sont donc des ARN non codants ! Les locus intergéniques sont en fait capables

# L'ARN circulaire nous joue-t-il des tours ?

Éric Lacazette¹, Leila Halidou Diallo¹,
Florence Tatin¹, Barbara Garmy-Susini¹,
Anne-Catherine Prats¹

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¹UMR 1048-12MC (Institut des maladies métaboliques et cardiovasculaires), Inserm, Université de Toulouse, UT3, Toulouse, France.
Anne-Catherine.Prats@inserm.fr

de produire de longs ARN non codants (IncARN), d'une taille allant de 200 nucléotides (nt) à plus de 100 kilobases (kb). Ceux-ci interviennent dans la régulation de l'expression des gènes par différents mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels [1].

Depuis bientôt 60 ans, nous savons que l'ARN joue un rôle absolument central dans la transmission de l'information génétique [2]. L'actualité scientifique récente ne dément pas cette assertion puisque l'ARN n'a pas encore dit son dernier mot ! On assiste en effet actuellement à la montée en puissance d'une nouvelle famille d'ARN, les ARN circulaires ou circARN. Ces ARN ont été identifiés il y a plus de 25 ans mais ils ont été considérés, alors, comme des artefacts de la machinerie d'épissage, jusqu'à ce que des études récentes révèlent leur implication fonctionnelle dans le contrôle de l'expression génique physiologique et pathologique. C'est en 2012, à partir de données de transcriptomique à haut débit, que Salzman et al. ont identifié 2 748 circARN potentiels chez l'homme, ceux-ci résultant de l'assemblage de séquences d'exons non colinéaires [3]. Très rapidement, Memczak et al., en 2013, ont identifié 2 000 circARN chez l'homme, 1 900 chez la souris et 900 chez le nématode [4]. En éliminant les ARN linéaires, par l'action d'une exoribonuclease 3', la RNase R, incapable de dégrader ces ARN circulaires, Jeck et al. ont réussi à enrichir les échantillons en circARN, ce qui a facilité leur identification. Ils ont ainsi évalué à 14 % la proportion de gènes transcrits produisant des circARN dans les fibroblastes humains [5]. En mars 2019, les progrès des technologies à grande échelle d'analyse des ARN ont permis d'approfondir encore plus le paysage du transcriptome : Ji et al. ont réalisé par séquençage d'ARN (RNASeq) des banques de transcriptomes de l'homme, du macaque et de la souris, et ont dénombré respectivement chez ces

(→) Voir la Synthèse de L. Fressigné et M.J. Simard, *m/s* n° 2, février 2018, page 137
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<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 1.** Formation des ARN circulaires par le mécanisme de rétro-épissage. Un ARN pré-messager est schématisé. Les boîtes colorées représentent les exons numérotés de 1 à 4, tandis que le trait noir représente les séquences introniques. Les flèches au niveau des introns représentent des séquences répétées de type Alu. Les ARN circulaires se forment par un épissage entre un site donneur d'épissage situé en aval du site accepteur d'épissage utilisé (alors que c'est l'inverse pour les ARN linéaires). La présence de séquences répétées favorise ce processus par hybridation de séquences complémentaires. La circularisation peut aussi être générée par liaison puis dimérisation de RBP. Les EcARN sont constitués de séquences exoniques et ont une localisation cytoplasmique, tandis que les ElciARN et le ciARN sont respectivement constitués de séquences exoniques et introniques pour les premiers et introniques pour les seconds. Ces deux dernières catégories ont une localisation nucléaire. SA : site accepteur d'épissage ; SD : site donneur d'épissage ; EcARN : exonic circRNA ; ElciARN : exon-intron circRNA ; ciARN : circular intronic RNA.</figcaption></figure>

trois espèces 104 388, 96 675 et 82 321 circARN [6]. Cette analyse a également montré que les circARN produits à partir de gènes orthologues entre les trois espèces, avaient un profil évolutif spé-cifique, indiquant que cette nouvelle famille d'ARN possédait des fonctions biologiques importantes pour les cellules.

La production de ces ARN circulaires par les cellules eucaryotes apparaît ainsi aujourd'hui comme un phénomène de grande ampleur, dont les conséquences sur la régulation de l'expression génique et la physiopathologie ne peuvent plus être négligées.

## Quelle est l'origine des circARN ?

Les circARN proviennent majoritairement de gènes codants. Ils sont produits par un mécanisme d'épissage alternatif de l'ARN pré-messager, appelé rétro-épissage, dans lequel le spliceosome lie un site d'épissage donneur à un site d'épissage accepteur situé en amont (Figure 1) [3]. Le rétro-épissage forme ainsi une jonction spécifique pour chaque circARN, jonction qui est absente de l'ARNm linéaire correspondant, et représente la « signature » de l'ARN circulaire. Le rétro-épissage peut d'ailleurs entrer en compétition avec la maturation de l'ARNm linéaire. Ce n'est pas un phénomène exceptionnel : les isoformes circulaires de centaines de transcrits humains sont présentes dans les cellules à un niveau équivalent à celui du transcrit linéaire correspondant [3]. Le rétro-épissage est contrôlé par

la présence de répétitions inverses complémentaires, comme les séquences répétées Alu<fnref n="1" /> chez l'homme, et de sites de liaisons de RBP (RNA-binding proteins) dans les introns flanquant le site donneur et le site accepteur situé en amont (Figure 1). L'appariement des séquences complémentaires, ou la formation de dimères de RBP, permet ainsi de rapprocher les deux sites d'épissage et d'induire la formation de l'ARN circulaire. Chez les primates, les séquences Alu constituent les séquences répétées les plus abondantes et ont un rôle majeur dans la formation des ARN circulaires [5]. En ce qui concerne les RBP, on peut citer de manière non exhaustive NF90/NF110, activateur du rétro-épissage qui stabilise la structure appariée, et l'adénosine désaminase ADAR1 qui a un rôle inhibiteur en déstabilisant l'appariement [7, 8]. Si aucune donnée n'est encore disponible sur la régulation de cet épissage, on peut postuler que l'édition de l'ARN joue un rôle important dans ce processus.

<footnote n="1">¹ Une séquence Alu est un court fragment d'ADN appartenant à la famille des petits éléments nucléaires dispersés SINE (short interspersed nuclear element). Elles sont caractérisées par la présence d'un site de restriction de l'endonucléase de restriction AluI (5'-AGCT-3').</footnote>
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 2.** **Fonctions des circARN.** Les fonctions décrites pour les circARN nucléaires (a-b) sont leurs capacités à interférer avec l'épissage de leur isoforme linéaire (ce mécanisme pourrait en partie être contrôlé par la protéine ADAR) et leur capacité à stimuler la transcription du gène dont ils sont issus. Les fonctions décrites pour les circARN cytoplasmiques (c-d) sont un rôle d'éponge à microARN ou RBP, ou une fonction d'ARN messager lorsqu'ils possèdent un élément permettant l'initiation interne de la traduction (IRES ou m⁶A) et un cadre de lecture autorisant la synthèse d'un peptide ou d'une protéine. RBP : RNA-binding protein ; IRES : internal ribosome entry site ; m6A : N6-methyladenosine.</figcaption></figure>

## Les circARN, régulateurs de l'expression génique, sont-ils vraiment non codants ?

Les circARN se subdivisent en trois catégories selon l'origine des séquences qu'ils contiennent : les ciARN (circular intronic RNA) sont constitués de séquences qui sont exclusivement d'origine intronique ; les ElciARN (exon-intron circRNAs) possèdent, eux, des séquences d'origine intronique et exonique (Figure 1). Ces deux catégories de circARN se localisent au niveau nucléaire de la cellule. La troisième catégorie, les EcARN (exonic circRNA), est prédominante. Ces circARN sont formés de séquences exclusivement exoniques. Ils sont majoritairement localisés dans le cytoplasme. Ces différences de localisation ont un impact sur la fonction de ces circARN. Les circARN nucléaires modulent l'expression des gènes par au moins deux mécanismes (Figure 2). Ils peuvent, d'une part, entrer en compétition avec l'épissage de leur isoforme linéaire (Figure 2A), et, d'autre part, et c'est le cas des ElciARN, réguler la transcription de l'ARNm issu de leur gène parental. Ce processus passe par une interaction du circARN avec l'ARN polymérase II au niveau du promoteur du gène, ainsi qu'avec les snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) et hnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein) qui sont impliquées dans l'épissage de l'ARN (Figure 2B) [9].

Alors qu'au niveau nucléaire les circARN modulent essentiellement l'expression du gène parental en cis, dans le cytoplasme, ils participent à des mécanismes d'une toute autre ampleur. En effet, les EcARN (ARN circulaires exoniques) peuvent jouer un rôle de compétiteur : ils séquestrent des miARN ou des RBP qui se lient à des séquences qu'ils ont en commun avec l'ARN linéaire correspondant (Figure 2C). Par exemple, le circARN ciRS-7, qui cible plus de 70 sites présents sur le miARN miR-7, possède une fonction d'éponge pour ce miARN (en le séquestrant) et sa surexpression a un impact négatif sur le développement du système nerveux du poisson zèbre [10]. L'ARN circulaire circ-Foxo3 forme, lui, un complexe ternaire avec la cycline kinase CDK2 (cyclin-dependent kinase 2) et son co-facteur p21, deux protéines impliquées dans la division cellulaire, ce qui entraîne une inhibition de la progression dans le cycle cellulaire [11]. La stabilité importante des circARN leur procure un rôle d'éponge beaucoup plus puissant que celui des ARN non codants linéaires, même s'ils sont en quantités plus faibles.
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La grande stabilité des ARN circulaires a un impact sur leur quatrième fonction, en passe de devenir leur fonction principale : un rôle codant (Figure 2D). Les *EcARN* comportent en effet dans leur séquence, dans la plupart des cas, le codon initiateur de leur isoforme linéaire, de même que des cadres de lectures ouverts. Leur association avec les polysomes a ainsi fortement suggéré leur capacité d'être traduits, remettant en cause leur qualification d'ARN non codants [12, 13].

## Les circARN, une nouvelle classe d'ARN messagers

Chez les eucaryotes, le mécanisme classique d'initiation de la traduction implique le recrutement de la petite sous-unité du ribosome à l'extrémité 5' coiffée de l'ARNm. Kozak, en 1979, avait ainsi montré qu'un ARN circulaire ne pouvait être traduit, faute de cette extrémité [14, 15]. Cette règle du recrutement du ribosome à l'extrémité 5' de l'ARNm s'est cependant avérée, en 1988, ne pas être absolue. Il existe en effet chez de nombreux virus, mais aussi dans des ARNm cellulaires, des sites d'entrée interne des ribosomes (internal ribosome entry site, IRES) qui permettent une initiation de la traduction au sein même de la séquence de l'ARN [16, 17]. En 1995, la traduction d'un ARN circulaire synthétique a ainsi été effectivement démontrée [18] et plus récemment, il a été rapporté que la présence d'un IRES dans des ARN circulaires, produits par rétro-épissage, permet leur traduction [19]. La preuve absolue de la traduction de circARN endogènes en protéines n'a cependant été obtenue qu'en 2017, avec la détection par spectrométrie de masse, d'un peptide correspondant à la région couvrant la jonction de rétro-épissage spécifique du circMbl3, issu du locus muscleblind chez la drosophile, mettant ainsi en évidence la synthèse d'une protéine à partir d'un circARN [12]. Pour ce circARN, le codon initiateur de la traduction est identique à celui de l'ARNm linéaire muscleblind, et le codon stop se situe quelques nucléotides en aval de la zone de rétro-jonction (Figure 3) ; ces deux caractéristiques semblent être fréquemment retrouvées pour les circARN qui sont traduits. D'autres auteurs ont montré la traduction de l'ARN circulaire circZNF609, exprimé durant la myogenèse et dont l'isoforme linéaire code un facteur de transcription à doigt de zinc [20]. Comme pour circMbl3, le cadre de lecture de la protéine traduite commence au même codon initiateur de la traduction que celui de l'ARNm linéaire et le codon stop se trouve là aussi quelques nucléotides en aval de la jonction d'épissage formant le circARN (Figure 3). Dans les deux cas, la traduction nécessite un IRES. Pour circZNF609, l'activité de l'IRES dépend de l'épissage de l'ARN et est activée par un choc thermique. Ce dernier point est particulièrement intéressant car il suggère que les circARN, ou au moins certains d'entre eux, pourraient être traduits en conditions de stress. Alors que les circARN identifiés présentent généralement des IRES en 5' du codon initiateur, l'ARN circulaire circSHPRH, produit par le gène codant l'hélicase SHPRH (SNF2 histone-linker PHD RING helicase), possède un IRES qui est situé en 3' du codon initiateur et qui permet l'expression d'une protéine de 146 kDa [21, 22]. Cette particularité du circSHPRH provient de ce que la totalité de sa séquence est codante. En effet, dans cet ARN circulaire, le codon initiateur de la traduction chevauche deux codons stop répétés en tandem : UGAUGA.

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**Figure 3.** *Structure caractéristique d'un circARN traduit.* Dans cet exemple, l'EcARN est formé par l'assemblage de deux exons (vert, bleu). Le cadre de lecture commence au codon initiateur [boîte rouge] en direction du codon stop [boîte noire], en passant par la jonction entre les deux exons (vert > bleu), puis la rétro-jonction qui a circularisé la molécule (trait orange). Le codon stop se situe quelques nucléotides en aval de la rétro-jonction. Les séquences permettant l'initiation de la traduction (IRES/m⁶A) se trouvent généralement entre le codon stop et le codon initiateur. Cette configuration est celle décrite pour les circZNF609 et circMbl. La liaison interne de la sous-unité 40S du ribosome à l'EcARN, puis la traduction par le ribosome 80S après association des deux sous-unités 40S et 60S, sont schématisées. EcARN : exonic circRNA ; IRES : internal ribosome entry site ; m6A : N6-methyladenosine ; Mbl : muscleblind.

Si le mécanisme reposant sur des IRES paraît être le plus fréquemment impliqué pour la traduction des circARN, un autre mécanisme permettant l'initiation de la traduction indépendante de la coiffe a été découvert : il requiert la présence d'une N⁶-méthyladénosine dans la région 5' non traduite de l'ARNm (m⁶A) [23]. Or, les ARN circulaires sont enrichis en motifs m⁶A et la spectrométrie de masse a permis de démontrer que nombre d'entre eux sont traduits grâce à la présence de courtes séquences contenant des m⁶A qui jouent le rôle d'IRES [24].

## La synthèse de protéines à partir des circARN, un enjeu biotechnologique

Résistants à toutes les exoribonucléases, les ARNm circulaires présentent l'avantage d'être beaucoup plus stables que leurs isoformes linéaires. Ils représentent donc un outil de choix pour la production de protéines recombinantes. Une telle approche a été suggérée par Wang *et al*. qui ont développé un minigène rapporteur
générant, par rétro-épissage, un circARN codant la GFP (green fluorescent protein), circGFP [19]. De même, un vecteur viral adéno-associé (rAAV) exprimant un circGFP contenant un IRES a montré son efficacité après injection chez la souris. Cette expérience a également révélé une forte spécificité tissulaire de l'expression du transgène, probablement liée à la paire d'introns et/ou à l'IRES utilisés [25]. Ces caractéristiques pourraient être mises à profit afin de cibler l'expression d'un transgène dans un tissu particulier.

Wesselhoeft et al., en 2019, ont développé un système de production de circARN par auto-épissage in vitro [26]. Ces circARN contenant un IRES en amont du gène d'intérêt (gène codant la luciférase ou l'érythropoïétine humaine), ont été utilisés pour transfecter des cellules, ainsi que pour des injections in vivo chez la souris dans des nanoparticules lipidiques. Les auteurs se sont en particulier intéressés aux mécanismes de reconnaissance des ARN exogènes par les récepteurs de l'immunité innée, RIG-1 (retinoic-acid-inducible protein 1) ou TLR (Toll-like receptors), des processus antiviraux développés par les cellules de mammifères à l'origine de réponses immunitaires induites par les ARN linéaires. Contrairement aux isoformes linéaires reconues par ces récepteurs, les circARN échappent à ces senseurs. Leur traduction en protéine n'est cependant effective que s'ils présentent un IRES, mais pas en présence d'une méthyladénosine $m^6A$ (l'autre mécanisme permettant la traduction indépendante de la coiffe) [26]. Ainsi, les ARN circulaires sont non seulement traduits car plus stables, mais ils sont également moins immunogènes que les ARN linéaires. Ils représentent donc un outil biotechnologique de choix et extrêmement prometteur pour l'expression de protéines recombinantes in vitro et in vivo, alliant production et absence de réponse de l'hôte.

## Les circARN, des acteurs impliqués dans différentes pathologies

Le grand nombre d'ARN circulaires présents dans les cellules, ainsi que leurs fonctions dans la régulation de l'expression génique, comme ARN non codants, ou dans la production de protéines comme ARN messagers traduits, en font des acteurs majeurs lors du développement de différentes pathologies.

De nombreux circARN régulent la prolifération, la migration ou l'invasion cellulaire, et agissent positivement ou négativement sur la progression des tumeurs, soit par le mécanisme d'éponge à miARN ou RBP, soit lorsqu'ils sont traduits [27]. Le circARN 100269, par exemple, se comporte comme un suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique en séquestrant par un mécanisme d'éponge à ARN, le microARN miR-630 [28]. L'ARN circ-FBXW7, quant à lui, présente la capacité de supprimer les tumeurs en inhibant la prolifération des cellules cancéreuses dans le glioblastome, en ayant, cette fois, une fonction d'ARNm qui sera traduit grâce à la présence d'un IRES [29]. La protéine produite, FBXW7-185aa, présente une activité antiproliférative en déstablisant la protéine c-Myc. L'expression de circ-FBXW7 est ainsi corrélée positivement à la survie des patients atteints de glioblastome.

L'impact des circARN s'étend à des pathologies autres que le cancer. Parmi les circARN identifiés à ce jour, plusieurs ont un rôle dans la

myogenèse ou au niveau du système nerveux [12, 20]. Le circ-ZNF609, mentionné plus haut, qui est traduit par un mécanisme IRES-dépendant, est un activateur de la prolifération des myoblastes régulé négativement lors de la myogenèse [20]. Il est retrouvé à des niveaux élevés dans des myoblastes portant la mutation du gène codant la dystrophine, responsable de la myopathie de Duchenne, suggérant son implication dans cette pathologie. Les circARN sont également impliqués dans les pathologies neurodégénératives. Notamment, l'analyse à grande échelle de l'expression des ARN circulaires dans un modèle murin de vieillissement accéléré mimant la maladie d'Alzheimer a démontré la dérégulation de 235 circARN [30]. Ils pourraient avoir un rôle crucial dans la régulation des gènes responsables de la maladie d'Alzheimer, par leur fonction d'éponge à miARN pour certains, ou de protéines, en étant traduits pour d'autres. Les circARN apparaissent de plus en plus comme des acteurs-clés du processus de vieillissement, non seulement du système nerveux, mais de tissus comme le muscle et la peau [31]. Il a même été proposé que l'accumulation des circARN soit un marqueur du vieillissement, si tant est que l'on considère ce processus comme une maladie [32]. Cette famille d'ARN ouvre ainsi des perspectives prometteuses en termes de cibles et de biomarqueurs pour de nombreuses pathologies. ◊

## SUMMARY

### Do circular RNAs play tricks on us?

RNA has not said its last word with the rise of a new RNA family, circular RNAs (circRNAs). Discovered 25 years ago, circRNAs were initially considered as splicing byproducts. Today it appears that 14% of human genes produce circRNAs, whereas more than 100 000 different circRNAs are expressed. They are produced from coding genes through an alternative splicing mechanism called backsplicing, where an acceptor site is linked with a donor site located downstream. Nuclear circRNAs regulate transcription and splicing of their linear isoform. Cytoplasmic circRNAs, which are predominant, either sequester miRNAs or RNA binding proteins, or are translated via internal initiation mechanisms. CircRNAs may constitute a powerful biotechnological tool for protein synthesis, as their translation is stable over time. In addition, exogenous circRNAs generate less immune response than their linear counterparts. We will also discuss in this review their biotechnological potential and their roles in pathological processes. ◊

## LIENS D'INTÉRÊT

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article.